(57)【要約】本開示は、概して、基本生理学的緩衝剤と、コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームとを含む、培地、例えば血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地に関する。培地は、本明細書に記載の血清代替物を使用しないで培養された細胞と比較して、培養物中の細胞成長を改善する利点を提供することが企図される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁液または付着性培養物中で細胞と共に使用するための培地であって、
基本生理学的緩衝液ミックスと、
（ａ）コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームであって、細胞懸濁液もしくは付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液もしくは付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が１００〜１０００ｍｇ／Ｌである量のリポソーム；または
（ｂ）ペクチン；または
（ａ）及び（ｂ）と
を含む前記培地。
【請求項２】
前記リポソームは、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸及びオレイン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸を含む、請求項１に記載の前記培地。
【請求項３】
前記リポソームは、エタノールアミン及びポリソルベートをさらに含む、請求項１または２に記載の前記培地。
【請求項４】
細胞懸濁液または付着性培養物中のペクチンの最終濃度は、２５〜５００ｍｇ／Ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の前記培地。
【請求項５】
前記基本生理学的緩衝液ミックスは、１種以上の有機塩、無機塩、緩衝剤、鉄源または鉄輸送体、グリセロール、アミノ酸、ビタミン、糖、抗酸化剤及び微量元素を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の前記培地。
【請求項６】
細胞懸濁液または付着性培養物中のグリセロールの最終濃度は、２ｕＬ／Ｌ〜０．５ｍＬ／Ｌである、請求項５に記載の前記培地。
【請求項７】
前記鉄源または鉄輸送体は、トランスフェリン、ラクトフェリン、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群から選択される、請求項５に記載の前記培地。
【請求項８】
グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−  Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸を含む、請求項５に記載の前記培地。
【請求項９】
リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ、硫酸亜鉛及び重炭酸ナトリウムからなる群から選択される１種以上の塩を含む、請求項５に記載の前記培地。
【請求項１０】
ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、ビボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、及びｉ−イノシトールからなる群から選択される１種以上のビタミンを含む、請求項５に記載の前記培地。
【請求項１１】
セレン、モリブデネート、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、銅、マンガン、バリウム、ガリウム、リチウム、スズ、チタン、臭素、ヨウ素、バナジウム、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、ジルコニウム、カドミウム、及びアルミニウムからなる群から選択される１種以上の微量元素を含む、請求項５に記載の前記培地。
【請求項１２】
前記微量元素は、セレンであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のセレンの最終濃度は、０．００５ｍｇ／Ｌ〜０．０５ｍｇ／Ｌである、請求項１１に記載の前記培地。
【請求項１３】
血清代替物、完全培地、培地添加物または凍結保存培地である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の前記培地。
【請求項１４】
リポソーム及び基本生理学的緩衝液ミックスを含む血清代替物、完全培地または培地添加物であって、前記リポソームは、ホスファチジルコリン、エタノールアミン、リノレン酸、リノール酸、コレステロール、及びポリソルベートを含み、前記基本液ミックスは、少なくとも１種の無機塩、少なくとも１種の糖、グリセロール及び少なくとも１種の微量元素を含む、前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項１５】
少なくとも１種の非イオン性界面活性剤及び少なくとも１種の鉄源をさらに含む、請求項１４に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項１６】
前記リポソームは、細胞懸濁液または付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が１００〜１０００ｍｇ／Ｌであるような量である、請求項１４に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項１７】
前記基本生理学的緩衝液ミックスは、リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、硫酸亜鉛及び塩化スズからなる群から選択される１種以上の塩を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項１８】
前記液ミックスは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムを含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項１９】
前記液ミックスは、セレン、モリブデネート、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、銅、マンガン、バリウム、ガリウム、リチウム、スズ、及びチタンからなる群から選択される１種以上の微量元素を含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２０】
前記液ミックスは、セレン及びモリブデネートを含む、請求項１９に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２１】
前記液ミックスは、トランスフェリン、ラクトフェリン、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群から選択される１種以上の鉄源または鉄輸送体を含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２２】
前記鉄源は、クエン酸第二鉄である、請求項２０に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２３】
前記液ミックスは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−６８、Ｆ６８  Ｐａｓｔｉｌｌｅ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−１２８、ソルビタン、ポリソルベート、及びブロックコポリマーからなる群から選択される１種以上の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２４】
前記非イオン性界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−６８である、請求項２３に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２５】
前記血清代替物中のコレステロールの最終濃度は、約１０〜２００ｍｇ／Ｌであり、前記血清代替物中のホスファチジルコリンの最終濃度は、約１０００ｍｇ〜１０ｇ／Ｌである、請求項１４から２４のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項２６】
前記完全培地中のコレステロールの前記濃度は、約１〜２０ｍｇ／Ｌであり、前記完全培地中のホスファチジルコリンの前記濃度は、約１００ｍｇ〜１０００ｍｇ／Ｌである、請求項１４から２４のいずれか一項に記載の完全培地。
【請求項２７】
前記培地添加物中のコレステロールの前記濃度は、約１００〜２０００ｍｇ／Ｌであり、前記培地添加物中のホスファチジルコリンの前記濃度は、約１０ｇ〜１００ｇ／Ｌである、請求項１４から２４のいずれか一項に記載の培地添加物。
【請求項２８】
ペクチンをさらに含む、請求項１４から２４のいずれか一項に記載の前記血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項２９】
前記リポソームは、ナノ粒子である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の前記培地、血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項２８または２９に記載の前記培地、血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項３１】
動物成分不含である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の前記培地、血清代替物、完全培地または培地添加物。
【請求項３２】
リポソームと、基本生理学的緩衝液ミックスとを含む、細胞凍結保存培地であって、前記凍結保存培地中のコレステロールの最終濃度は、約１０〜２００ｍｇ／Ｌであり、前記凍結保存培地中のホスファチジルコリンの最終濃度は、約１０００ｍｇ〜１０ｇ／Ｌである、前記細胞凍結保存培地。
【請求項３３】
ペクチンをさらに含む、請求項３２に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３４】
前記細胞懸濁液中のペクチンの最終濃度は、約５０ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌである、請求項３３に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３５】
グリセロールをさらに含む、請求項３２または３３に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３６】
細胞懸濁液中のグリセロールの最終濃度は、約０．０２〜５ｍＬ／Ｌである、請求項３５に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３７】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含み、前記ＤＭＳＯは、４％未満の濃度である、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３８】
ポリリシンをさらに含む、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の前記凍結保存培地。
【請求項３９】
請求項１４から３８のいずれか一項に記載の血清代替物、完全培地または培地添加物を含有する培地中で細胞を培養することを含む、細胞を培養する方法。
【請求項４０】
前記細胞は、多能性幹細胞、胚幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、リンパ幹細胞、骨髄幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肝細胞、膵臓細胞、癌腫細胞及び細胞株からなる群から選択される、請求項３９に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記細胞株は、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ  ５、ＦＳ４、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ及びがん細胞株からなる群から選択される、請求項４０に記載の前記方法。
【請求項４２】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の凍結保存培地中に細胞を懸濁させることと、前記細胞を８℃未満の環境内に入れることとを含む、細胞を凍結保存する方法。
【請求項４３】
前記細胞を解凍することと、それらを請求項１から４２のいずれか一項に記載の培地中に入れることとをさらに含む、請求項４２に記載の前記方法。
【請求項４４】
前記細胞の少なくとも３０％は、解凍後に生存したままである、請求項４２または４３に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記細胞は、多能性幹細胞、胚幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、リンパ幹細胞、骨髄幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肝細胞、膵臓細胞、癌腫細胞及び細胞株からなる群から選択される、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４６】
前記細胞株は、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ  ５、ＦＳ４、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ及びがん細胞株からなる群から選択される、請求項４５に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６１／９１８，８３３号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、無血清環境内で細胞を培養するための、熱力学的に安定なリポソーム及び液体基本ミックスを含む、細胞培養培地組成物、例えば血清代替物、完全培養培地または培地添加物に関する。リポソームは、コレステロール及びホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むことが企図される。また、凍結中の細胞の保存に使用するための、リポソームを含む凍結保存培地が企図される。
【背景技術】
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験、またはヒトもしくは動物への投与のためのｅｘ  ｖｉｖｏ培養用の細胞、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞の培養は、ヒトの疾患の研究及び治療のための重要なツールである。細胞培養は、ウイルスワクチン、モノクローナル抗体、ポリペプチド成長因子、ホルモン、酵素及び腫瘍特異的抗原等の様々な生物学的活性生成物の生成に広く使用される。しかしながら、細胞を培養するために使用される培地または方法の多くは、細胞成長及び／または未分化細胞培養の維持に悪影響を有し得る成分を含む。例えば、哺乳動物または昆虫細胞培養培地には、多くの場合、培養物中の細胞の増殖及び成長を促進する、成長因子、担体タンパク質、付着及び拡散因子、栄養物ならびに微量元素を提供するために、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等の血液由来血清が添加される。しかしながら、形質転換成長因子（ＴＧＦ）ベータまたはレチノイン酸等のＦＣＳまたはＦＢＳにおいて見られる因子は、ある特定の細胞型の分化を促進し得る（Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１３７：８３３−４３，１９９０）、または、培養物中の望ましくない細胞活性を促進する、細胞での意図されない下流シグナル伝達を開始し得る（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１１）：１１５１−６，２００６）。
【０００４】
特性決定されていない血清組成物の性質及び血清のロット間変動により、血清代替物及び望ましい無血清培地中での培養が利用されている（Ｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ａｎｄｒｏｌ．４９（５）：３３１−４２，２００３）。さらに、細胞培養において成長される治療用の細胞、組換えタンパク質またはワクチンの場合、動物由来成分の追加は、ウイルス汚染の可能性及び／またはヒトに投与された際の動物タンパク質の免疫原性作用の可能性に起因して、望ましくない。
【０００５】
血清代替物は、細胞培養に対するＦＣＳの効果を最小限化すると共に、ヒト細胞の培養に使用される動物タンパク質の量を最小限化するべく開発された。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）等の血清代替物は、血清を含まず、細胞成長に不可欠な栄養物及び他のタンパク質を含有する、既知組成培養培地と呼ばれる。ＫＮＯＣＫＯＵＴ  ＳＲ（商標）は、付着因子を含まず、この配合において不十分な細胞付着をもたらすため、支持細胞の播種におけるＦＢＳの代替物として使用することができない。ＰＣ−１（商標）無血清培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、特別に改質されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地ベース中に配合された低タンパク質無血清培地であり、既知の量のインスリン、トランスフェリン、脂肪酸及び独自のタンパク質と共に完全ＨＥＰＥＳ緩衝系を含有する。
【０００６】
Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０及びマッコイ５Ａ基本培地のミックスに基づく無血清低タンパク質培養培地である。Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）は、インスリン、トランスフェリン、コレステロール、成長または付着因子を含有しないが、微量元素及び高分子量炭水化物の混合物、追加のビタミン、非動物タンパク質源、ならびにウシ血清アルブミンを含む。
【０００７】
また、無血清培地は、国際特許公開第ＷＯ２００９０２３１９４号、同第ＷＯ２００８１３７６４１号、同第ＷＯ２００６０１７３７０号、同第ＷＯ２００１０１１０１１号、同第ＷＯ２００７０７１３８９号、同第ＷＯ２００７０１６３６６号、同第ＷＯ２００６０４５０６４号、同第ＷＯ２００３０６４５９８号、同第ＷＯ２００１０１１０１１、米国特許公開第ＵＳ２００５００３７４９２号、同第ＵＳ２００８０１１３４３３号、同第ＵＳ２００８０２９９５４０号、米国特許第４，５６０，６５５号、同第５，３２４，６６６号、同第６，１６２，６４３号、同第６，１０３，５２９号、同第６，０４８，７２８号、同第７，７０９，２２９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ２２４３８２７号において開示されている。
【０００８】
米国特許第７，２２０，５３８号は、親油性ナノ粒子及び基本栄養培地を含む細胞培養培地を記載している。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、血清代替物、完全培地または培地添加物として使用され得る、基本生理学的緩衝液ミックスと、コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームとを含む培地を提供する。培地は、細胞培養物中の初代細胞または細胞株の生存率、成長及び増殖を促進するのに有用であり、培地は、細胞維持及び成長を促す脂質プロファイルを有するリポソームを含む。また、リポソームを含む凍結保存培地も企図される。
【００１０】
様々な実施形態において、本開示は、懸濁液中または付着性培養物中の細胞と共に使用するための培地であって、基本生理学的緩衝液ミックスと、（ａ）コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームであって、細胞懸濁液または付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が１００〜１０００ｍｇ／Ｌであるような量であるリポソーム；または（ｂ）ペクチン；または（ａ）及び（ｂ）とを含む培地を提供する。
【００１１】
様々な実施形態において、リポソームは、脂質、脂肪酸、ステロール及び／または遊離脂肪酸を含む。例示的な脂肪酸は、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸及びセロチン酸を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、リポソームは、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸及びオレイン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸を含む。
【００１２】
様々な実施形態において、リポソームは、エタノールアミン及びポリソルベートをさらに含む。様々な実施形態において、リポソームは、抗酸化剤を含む。
【００１３】
様々な実施形態において、基本生理学的緩衝液ミックスは、有機塩、無機塩、緩衝剤、鉄源または鉄輸送体、グリセロール、アミノ酸、ビタミン、糖、及び微量元素のうちの１種以上を含む。任意選択で、基本生理学的緩衝液ミックスは、抗酸化剤を含む。
【００１４】
様々な実施形態において、鉄源または鉄輸送体は、トランスフェリン、ラクトフェリン、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群から選択される。
【００１５】
様々な実施形態において、基本生理学的緩衝液ミックスは、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸を含む。
【００１６】
様々な実施形態において、基本生理学的緩衝液ミックスは、リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ、硫酸亜鉛及び重炭酸ナトリウムからなる群から選択される１種以上の有機または無機塩を含む。
【００１７】
様々な実施形態において、リポソームまたは基本生理学的緩衝液ミックスは、１種以上の抗酸化剤を含む。例示的な抗酸化剤は、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、アルファ−トコトリエノール、ベータ−トコトリエノール、アルファ−トコフェロールキノン、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコペン、ベータ−カロテン、セレン、ユビキノン、ルエチン、Ｓ−アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ−アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ−カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシッスタチオニン、ならびにグリシン−グリシン−ヒスチジン（トリペプチド）を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
様々な実施形態において、基本生理学的緩衝液ミックスは、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、ビボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、及びｉ−イノシトールからなる群から選択される１種以上のビタミンを含む。
【００１９】
様々な実施形態において、基本生理学的緩衝液ミックスは、セレン、モリブデネート、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、銅、マンガン、バリウム、ガリウム、リチウム、スズ、チタン、臭素、ヨウ素、バナジウム、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、ジルコニウム、カドミウム、及びアルミニウムからなる群から選択される１種以上の微量元素を含む。様々な実施形態において、液ミックスは、セレン及びモリブデネートを含む。
【００２０】
様々な実施形態において、培地は、血清代替物、完全培地、培地添加物または凍結保存培地である。
【００２１】
様々な実施形態において、細胞培養物中で使用するための血清代替物、完全培地または培地添加物は、リポソーム及び基本生理学的緩衝液ミックスを含む。任意選択で、完全培地または培地添加物は、ペクチンを含む。様々な実施形態において、血清代替物、完全培地または培地添加物は、１種以上の有機または無機塩、鉄供与体を含み、任意選択でペクチン、グリセロール、アミノ酸、ビタミン、糖、有機塩、無機塩、及び微量元素を含む、基本生理学的緩衝液ミックスをさらに含む。
【００２２】
様々な実施形態において、本開示はまた、リポソーム及び基本生理学的緩衝液ミックスを含む血清代替物、完全培地または培地添加物であって、リポソームは、ホスファチジルコリン、エタノールアミン、リノレン酸、リノール酸、コレステロール、及びポリソルベートを含み、基本液ミックスは、少なくとも１種の有機または無機塩、少なくとも１種の糖、グリセロール、少なくとも１種の微量元素、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、及び少なくとも１種の鉄源を含む、血清代替物、完全培地または培地添加物を提供する。様々な実施形態において、リポソームまたは基本液ミックスは、少なくとも１種の抗酸化剤を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、本明細書に記載の血清代替物、完全培地または培地添加物に関して、リポソームは、細胞懸濁液または付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が１００〜１０００ｍｇ／Ｌであるような量である。
【００２４】
様々な実施形態において、リポソームは、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸及びオレイン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸を含む。企図される追加の脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸及びセロチン酸を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
様々な実施形態において、リポソームは、エタノールアミンをさらに含む。様々な実施形態において、リポソームは、ポリソルベートをさらに含む。ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０であってもよいことが企図される。例示的なポリソルベートは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む。
【００２６】
様々な実施形態において、１種以上の有機または無機塩は、リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ、硫酸亜鉛及び重炭酸ナトリウムからなる群から選択される。様々な実施形態において、液ミックスは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムを含む。
【００２７】
様々な実施形態において、培地は、鉄源または鉄輸送体をさらに含む。様々な実施形態において、鉄源または鉄輸送体は、トランスフェリン、ラクトフェリン、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群から選択される。様々な実施形態において、鉄源は、クエン酸第二鉄である。様々な実施形態において、鉄輸送体はトランスフェリンである。
【００２８】
様々な実施形態において、血清代替物は、銅源または銅輸送体（例えば、ＧＨＫ−Ｃｕ）をさらに含む。例示的な銅源は、塩化銅及び硫酸銅を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
様々な実施形態において、液ミックスは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−６８（Ｆ６８  ｐａｓｔｉｌｌｅ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−１２８、ソルビタン、ポリソルベート及びブロックコポリマーからなる群から選択される１種以上の非イオン性界面活性剤を含む。様々な実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−６８（Ｆ６８  ｐａｓｔｉｌｌｅ）である。
【００３０】
様々な実施形態において、培地は、細胞培養物、例えば細胞懸濁液または付着性培養物中のグリセロールの最終濃度が１リットル当たり約２ｕｌ〜０．５ｍＬ／Ｌであることを提供する。
【００３１】
様々な実施形態において、培地は、細胞培養物、例えば細胞懸濁液または付着性培養物中のペクチンの最終濃度が約０．２５〜０．５ｇ／Ｌ、または２５〜５００ｍｇ／Ｌであることを提供する。
【００３２】
様々な実施形態において、培地は、細胞培養物、例えば細胞懸濁液または付着性培養物中のセレンの最終濃度が約０．００５〜０．０５０ｍｇ／Ｌであることを提供する。
【００３３】
また、様々な実施形態において、血清代替物が企図され、血清代替物中のリポソームからのコレステロールの最終濃度は、約１０〜２００ｍｇ／Ｌであり、血清代替物中のリポソームからのホスファチジルコリンの最終濃度は、約５０ｍｇ〜１ｇ／Ｌ、または約１０００ｍｇ〜１０ｇ／Ｌである。
【００３４】
様々な実施形態において、本開示は、完全培地を提供し、完全培地中のリポソームからのコレステロールの濃度は、約１〜２０ｍｇ／Ｌであり、完全培地中のリポソームからのホスファチジルコリンの濃度は、約１００ｍｇ〜１０００ｍｇ／Ｌである。
【００３５】
様々な実施形態において、本開示は、培地添加物を提供し、培地添加物中のリポソームからのコレステロールの濃度は、約１００〜２０００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上であり、培地添加物中のリポソームからのホスファチジルコリンの濃度は、約１０ｇ〜１００ｇ／Ｌである。
【００３６】
様々な実施形態において、本開示は、凍結保存培地を提供し、凍結保存培地中のリポソームからのコレステロールの最終濃度は、約１０〜２００ｍｇ／Ｌであり、凍結保存培地中のリポソームからのホスファチジルコリンの最終濃度は、約１０００ｍｇ〜１０ｇ／Ｌである。
【００３７】
様々な実施形態において、リポソームは、ナノ粒子である。様々な実施形態において、ナノ粒子は、約５０〜５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００３８】
本明細書において、リポソームが熱力学的に安定であることが提供される。様々な実施形態において、リポソームは、水溶液中で安定である（例えば、沈殿しない）。様々な実施形態において、リポソームは、３７℃、２５℃、４℃、０℃、または−２０℃において、少なくとも７日、１０日、１４日、２１日、３０日、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年以上の期間、水溶液中で安定である。例示的な水溶液は、水、緩衝生理食塩水及び他の平衡塩類溶液、基礎細胞培養培地ならびに完全細胞培養培地を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
また、リポソーム、基本生理学的緩衝液ミックス、及び任意選択でペクチンを含む細胞凍結乾燥培地が本明細書において提供される。
【００４０】
また、基本生理学的緩衝液ミックス及びペクチンを含む細胞凍結乾燥培地が本明細書において企図される。
【００４１】
様々な実施形態において、凍結保存培地中、細胞懸濁液中のペクチンの最終濃度は、約０．２５〜５ｇ／Ｌ、または２５０〜５０００ｍｇ／Ｌ、または約５０ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌである。
【００４２】
様々な実施形態において、本明細書に記載の凍結保存培地は、グリセロールをさらに含む。様々な実施形態において、凍結保存培地を使用する場合、細胞懸濁液中のグリセロールは、約０．２〜５ｍＬ／Ｌの最終濃度である。
【００４３】
様々な実施形態において、凍結保存培地は、リポソームをさらに含み、リポソームは、コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含み、リポソームは、細胞懸濁液中のコレステロールの最終濃度が約１０〜２００ｍｇ／Ｌであるような量であり、細胞懸濁液中のホスファチジルコリンの最終濃度は、約１〜１０ｇ／Ｌである。
【００４４】
様々な実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含み、ＤＭＳＯは、４％以下の凍結保存培地中の濃度である。様々な実施形態において、ＤＭＳＯの濃度は、４％、３％、２％、１％または０．５％である。
【００４５】
様々な実施形態において、凍結保存培地は、ポリリシンをさらに含む。様々な実施形態において、ポリリシンは、改質ポリリシンである。様々な実施形態において、ポリリシンは、イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンである。ある特定の実施形態において、ポリリシンは、カルボキシル化アミノ基を含む。様々な実施形態において、ポリリシンは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％の最終濃度である。
【００４６】
様々な実施形態において、血清代替物または培地添加物は、細胞培養の前に基本培地に追加される。標準的な基本培地は、当該技術分野において知られており、市販されている。そのような培地の例は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハム栄養混合物Ｆ−１０（ハムＦ−１０）またはハムＦ−１２、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ１３１、クリック培地、マッコイ５Ａ培地、培地１９９、ウィリアム培地Ｅ、及び昆虫培地、例えばグレース培地及びＴＮＭ−ＦＨを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
これらの培地のいずれにも、塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝剤、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、及びグルコースまたは等価のエネルギー源が任意選択で添加される。他の任意選択の添加物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含まれてもよい。培地添加物は、当該技術分野において周知で市販されており、発明を実施するための形態においてより詳細に説明される。
【００４８】
様々な実施形態において、血清代替物が無血清完全培地として提供されるように、血清代替物自体が、基本培地の要素及び上述の添加物、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝剤、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤、及びグルコースまたは等価のエネルギー源を含むことが、さらに企図される。
【００４９】
様々な実施形態において、培地は、動物成分不含である。
【００５０】
様々な実施形態において、本明細書に記載の基本液ミックスがリポソームに投入される。さらに、細胞培養において有益な他の組成物がリポソームに投入されることが企図される。細胞培養において有益な例示的組成物は、緩衝剤、鉄輸送体、遊離脂肪酸、成長ペプチド（例えば、インスリン、ｇｌｙ−ｈｉｓ−ｌｙｓ三量体を含むＧＨＫペプチド）、アミノ酸（必須及び非必須）、ビタミン、微量元素、抗酸化剤ならびに／または塩を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
様々な実施形態において、本開示は、本明細書に記載の完全培地、または血清代替物もしくは培地添加物を含有する培地中で細胞を培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。
【００５２】
様々な実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される。様々な実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から分離される。様々な実施形態において、細胞は、初代培養物または細胞株である。様々な実施形態において、細胞は、多能性幹細胞、胚幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、リンパ幹細胞、骨髄幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肝細胞、膵臓細胞、及び細胞株からなる群から選択される。
【００５３】
企図される哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ  ５、ＦＳ４、Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）、Ｂ細胞株（例えば、ＢＪＡＢ、ＥＷ３６、ＣＡ４６、ＳＴ４８６及びＭＣ１１６、Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｖａ及びＤａｕｄｉ）、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ、がん細胞株、及び当該技術分野において周知の他の細胞株を含むが、これらに限定されない。企図される昆虫細胞株は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ（商標）、ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋（登録商標）、Ｓ２、Ｔｎ５、ＴＮ−３６８、ＢｍＮ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２、Ｄ２、Ｃ６／３６及びＫＣ細胞を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
様々な実施形態において、本開示は、任意選択でペクチンを含む、または任意選択でリポソームを含む本明細書に記載の凍結保存培地中に細胞を懸濁させることと、細胞を８℃未満の環境内に入れることとを含む、細胞を凍結保存する方法を企図する。８℃未満の例示的温度は、４℃以下、０℃以下、−２０℃以下、−７０℃以下、−１３５℃以下、または液体窒素中（−１９６℃）の温度を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
様々な実施形態において、方法は、細胞を解凍することと、それらを本明細書に記載の培地中に入れることとをさらに含む。
【００５６】
様々な実施形態において、凍結細胞の少なくとも３０％は、血清代替物、培地添加物または完全培地として使用されるか否かによらず、解凍後、本明細書に記載の培地中に入れられた際に生存したままである。様々な実施形態において、解凍後の細胞の生存率は、約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上である。
【００５７】
一実施形態において、培地（血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地）は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌまたは１Ｌの体積でパッケージされる。関連した実施形態において、血清代替物、培地添加物または凍結保存培地は、１×、５×、１０×または２０×溶液としてパッケージされる。
【００５８】
また、本明細書に記載のリポソームを作製する方法が提供される。様々な実施形態において、リポソームを作製するためのプロセスは、所望量のコレステロールを非メタノールまたは非クロロホルム溶液中に溶解させることを含む。様々な実施形態において、コレステロールは、液体リン脂質溶液中に溶解される。様々な実施形態において、コレステロールは、非メタノールもしくは非クロロホルム溶液中で室温で混合される、またはコレステロールが溶液となるまで非メタノールもしくは非クロロホルム溶液中で加熱される。溶液は、約３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃または６０℃、及び８０℃以下まで加熱され得る。溶液となったら、以下の組成物がコレステロール組成物に追加され、混合される：ポリソルベート、エタノールアミン、及び脂肪酸。最終混合物は、４℃、０℃、または−２０℃で保存される。任意選択で、コレステロール溶液は、残りの化合物の追加前に混合される。
【００５９】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるある特定の培地組成物またはリポソーム組成物が、異なる組の成分を含む培地またはリポソーム組成物と比較して、細胞の改善された培養、例えば増加した細胞成長、細胞生存率または増加した組換えタンパク質の発現を促進することが企図される。細胞の改善された培養を促進するそれらの培地またはリポソーム組成物が、さらなる実験に使用されることが企図される。
【００６０】
本明細書に記載のそれぞれの特徴もしくは実施形態、または組み合わせは、非制限的であり、本発明の態様のいずれかの実例であり、したがって、本明細書に記載される他の特徴もしくは実施形態、または組み合わせと組み合わせることができることを意図することが理解される。これらの種類の実施形態はそれぞれ、本明細書に記載の任意の他の特徴、または特徴の組み合わせと組み合わされることが意図される特徴の限定されない例であり、全ての可能な組合せを列挙する必要はない。そのような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のいずれにも適用される。範囲内に含まれる値の例が開示される場合、これらの例のいずれも、範囲の可能な端点として企図され、そのような端点の間のありとあらゆる数値が企図され、上の端点及び下の端点のありとあらゆる組み合わせが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】市販のＦＤＡ認可無血清培地と比較した、刺激された脾細胞に対する本明細書に記載の血清代替物の効果を示す図である。
【図２Ａ】ウシ胎仔血清を含む培地中での脾細胞の培養と比較した、刺激された脾細胞の成長に対する本明細書に記載の血清代替物の効果を示す図である。
【図２Ｂ】ウシ胎仔血清を含む培地中での脾細胞の培養と比較した、刺激された脾細胞の成長に対する本明細書に記載の血清代替物の効果を示す図である。
【図３Ａ】血清代替物及び成長因子が、培地及びＦＢＳよりも大幅に細胞増殖を誘導することを示す図である。
【図３Ｂ】ＦＢＳと比較して、細胞が血清代替物と共に培養される際、増殖における実験内変動が低減されることを示す図である。
【図４Ａ】血清代替物及び成長因子における細胞の培養が、培地及びＦＢＳにおいて培養された細胞と比較して、３日間の培養にわたる細胞死のレベルを低減することを示す図である。
【図４Ｂ】ＦＢＳを含む培地と比較して、細胞が血清代替物を含有する培地と共に培養される際、アポトーシスにおける実験内変動が低減されることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本開示は、基本生理学的緩衝液ミックスと、コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームとを含む培地を提供し、培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が細胞生理学に寄与する非特異的副作用なしにＦＢＳにおける成長と同等の細胞の成長を提供するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の培養において使用するための血清代替物、完全培地または培地添加物組成物であってもよい。血清代替物、完全培地または培地添加物は、血清代替物、完全培地または培地添加物中のリポソームが細胞に原形質膜と類似した環境を提供するように、脂肪酸と組み合わせて生理学的に関連した濃度でコレステロール及びホスファチジルコリンを含むリポソームを提供する。任意選択で、完全培地、血清代替物、または培地添加物は、ペクチンを含む。また、リポソーム及び／またはペクチンを含む凍結保存培地が提供される。本明細書における培地（血清代替物、完全培地、培地添加物または凍結保存培地）組成物は、ＦＢＳを含有する培地中または無血清培地中での細胞の培養に勝る利点を提供する。
【００６３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈上異なる定義が明示されていない限り、複数形及び単数形の呼称を含む。
【００６４】
「約」または「ほぼ」という用語は、当業者により決定されるような特定の値の許容され得る誤差を意味し、これは、その値がどのようにして測定または決定されるかに一部依存する。ある特定の実施形態において、「約」または「ほぼ」という用語は、１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。ある特定の実施形態において、「約」または「ほぼ」という用語は、所与の値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「培地」または「細胞培養培地」は、細胞の成長、生存能力または貯蔵を提供する水系溶液を指す。本明細書において企図される培地には、発明を実施するための形態において説明されるように、所望の細胞活性、例えば培地中で培養される細胞の細胞生存率、成長、増殖、分化を促進するために、栄養物が添加されてもよい。培地は、本明細書において使用される場合、血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地を含む。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「血清代替物」または「血清代替培地」は、培養物中の細胞成長及び生存を促進するために、基礎培地と併せて、または完全培地として使用され得る組成物を指す。様々な実施形態において、血清代替物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の培養のための培地に特徴的に追加される任意の血清の代替物として、基礎または完全培地中で使用される。血清代替物は、培養物中の細胞の成長及び生存のためのタンパク質及び他の因子を含むことが企図される。様々な実施形態において、血清代替物は、細胞培養物中での使用の前に、基礎培地に追加される。さらに、様々な実施形態において、血清代替物は、血清代替物が細胞培養のための無血清完全培地として有用となるように、基本培地及び基本栄養物、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、微量元素、抗酸化剤等を含んでもよいことが企図される。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「基礎培地」、「基本培地（ｂａｓｅ  ｍｅｄｉａ）」、「基本培地（ｂａｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」または「基本栄養培地」は、水及び正常な細胞代謝に不可欠なある特定のバルク無機イオンを細胞に提供し、細胞内及び細胞外浸透圧平衡を維持する、基礎塩栄養物または塩及び他の要素の水溶液を指す。様々な実施形態において、基本培地は、エネルギー源としての少なくとも１種の炭水化物、及び／または培地を生理学的ｐＨ範囲内に維持するための緩衝系を含む。市販の基礎培地の例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、α−最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、または多能性細胞との使用のために改変された汎用培地、例えばＸ−ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）もしくは造血基本培地を含むが、これらに限定されない。基本培地には、発明を実施するための形態においてより詳細に説明されるような栄養物が添加されてもよい。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「完全培地」は、細胞成長に寄与し得る追加された添加物、例えば成長因子、ホルモン、タンパク質、血清または血清代替物、微量元素、糖、抗生物質、抗酸化剤等をさらに含む基礎培地を指す。例えば、市販の完全培地は、エタノールアミン、グルタチオン（還元）、リン酸アスコルビン酸、インスリン、ヒトトランスフェリン、高脂質ウシ血清アルブミン、微量塩、亜セレン酸ナトリウム、アンモニウムマタバナデート、硫酸銅及び塩化マンガン（ＤＭＥＭ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ（商標）Ｍｅｄｉａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の添加物を含む。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「培地添加物」は、細胞の培養前に基本培地に追加される薬剤または組成物を指す。培地添加物は、培養物中の細胞成長に有益な薬剤、例えば成長因子、ホルモン、タンパク質、血清または血清代替物、微量元素、糖、抗生物質、抗酸化剤等であってもよい。典型的には、培地添加物は、細胞培養に適切な最終濃度に達するまで完全または基本培地に希釈される、所望の添加物の濃縮溶液である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「凍結保存培地」は、４℃以下、０℃以下、−２０℃以下、−７０℃以下、−１３５℃以下、または液体窒素（−１９６℃）中の温度を含む、８℃以下の温度での懸濁液中での細胞の保存または凍結に有用な培養培地を指す。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「ペクチン」という用語は、３０，０００ダルトン（Ｄａ）〜２５０，０００Ｄａの分子量を有する植物細胞壁から得られた構造的ヘテロ多糖類を指す。ペクチンは、主にα−１−４結合ガラクツロン酸残基で構成される。ある特定の実施形態において、ペクチンは、エステル化されており、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％またはそれ以上のエステル化を有し、高または低エステルペクチンであってもよい。様々な実施形態において、ペクチンは、カルシウム感受性である。カルシウム感受性ペクチンは、カルシウムと相互作用してゲルを形成することができ、一方非カルシウム感受性ペクチンはそうならない。ペクチンは、使用されるペクチンの種類に依存して、ｐＨ４．５〜６．９の範囲内の酸性溶液中、またはｐＨ７．５〜１０の範囲内の塩基性溶液中にあることが企図される。任意選択で、ペクチンは、７．０〜７．４のｐＨ範囲を有する溶液中にある。異なるｐＨレベルでの使用のためのペクチンは、一般知識及び当該技術を使用して決定することができ、所望のｐＨで使用されるペクチンは、ペクチンのエステル化またはカルシウム感受性のレベルにより影響される。
【００７２】
ペクチンは、商業的供給源により供給され、ナシ、リンゴ、グアバ、マルメロ、プラム、グースベリー、オレンジ及び他の柑橘系果物、サクランボ、ブドウ、ならびにイチゴ等のペクチンを有する任意の植物からのものであってもよい。様々なエステル化（メチル化）度及びカルシウム感受性を有するペクチン組成物が、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０００００８９５２号に記載されている。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「リポソーム」は、内部水性空間を包囲する外側脂質二層または多層膜を備える閉じた構造を指す。リポソームは、複数層または単層であってもよい。リポソームは、直径５〜１０μＭからナノ粒子サイズまでのサイズ範囲であることが企図される。ある特定の実施形態において、リポソームナノ粒子は、直径約５０〜５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜３００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍである。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「液体基本ミックス」または「基本生理学的緩衝液ミックス」は、細胞培養培地組成物を完成させるためにリポソームが懸濁される、血清代替物または培地添加物の基本液体溶液を指す。様々な実施形態において、液体基本ミックスは、細胞培養物中の細胞に融合した／取り込まれた際にリポソームがある量の液体基本ミックスを細胞に送達するように、リポソーム内に投入されることがさらに企図される。様々な実施形態において、液体基本ミックスまたは基本生理学的緩衝液ミックスは、基本培地、完全培地、または、血清代替物、完全培地、培地添加物もしくは凍結保存培地を形成するために本明細書におけるリポソーム及び／もしくは他の成分と併せて使用され得る生理学的緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び他の平衡塩類溶液であることが、本明細書において企図される。
【００７５】
本明細書において使用される場合、「細胞の改善された培養」は、リポソームを含まない血清代替物または無血清培地を使用した細胞の培養と比較した、本明細書に記載の培地組成物（血清代替物、完全培地または培地添加物）を使用して培養された場合の増加した細胞増殖、増加した細胞成長、減少した細胞死、または細胞の増加したタンパク質産生（組換えもしくは内因性）を指す。増加した増殖、増加した成長及び細胞死の変化は、成長曲線分析、刺激指数、トリパンブルーによる微視的評価、トリチウム標的チミジン（３Ｈ）増殖アッセイ、ＭＴＴアッセイ、レサズリンベースアッセイ及びＤＮＡラダー分析を含む、当該技術分野において周知の方法を使用して測定される。細胞の増加したタンパク質産生（組換えまたは内因性）は、全タンパク質もしくはｍＲＮＡの量子化、または対象となる特定タンパク質のレベルの定量を含む、当該技術分野において知られている技術を使用して測定される。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「動物成分不含」は、成分が動物から得られるものではない組成物を指す。成分は、動物から直接分離されるのではなく、組換えによって生成される、または植物もしくは他の源から得られることが企図される。本明細書において使用される場合、動物成分不含は、動物ベース細胞株における培地の成分の組換え産生を許容する。
【００７７】
培地組成物
脂質成分及びリポソームを含む細胞培養培地は、細胞培養における使用に関して以前に説明されているが、その成功は限られていた。例えば、Ｈａｍｓら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：５５８８−９２，１９８１）は、異なる脂質成分、例えば、コレステロール、レシチンまたは精製ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン及びビタミンＥを含むリポソームを含む培地中での、ヒト線維芽細胞の培養を開示している。しかしながら、Ｈａｍｓは、リポソームが、使用の２４時間以内に作製する必要があるという点で安定ではないと説明しており、また完全培地においてリポソームを使用するだけでは細胞成長が促進されないことを示している。Ｓｐｅｎｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２１：８７−９５，２００５）は、中でもコレステロール、シクロデキストリン、ホスファチジルコリン、ビタミンＥ、クエン酸第二鉄、プルロニック及びアミノ酸をさらに含むタンパク質不含培地中での、ＮＳ０骨髄腫細胞の培養を説明している。Ｓｐｅｎｓ（上記参照）は、高レベルの脂質が溶液から沈殿すると説明している（Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７（３）：２０３−１１，１９９５を引用）。
【００７８】
リポソームを作製する方法は、当該技術分野において知られており、複数層ベシクル（一連の同心円状脂質二重層を有する）を作製するための液体水和もしくは溶媒小球調製、衛生、フレンチプレス、溶媒噴射、洗剤除去、逆相蒸発法、カルシウム誘導融合、顕微溶液化、または単層ベシクル（脂質の単一層を有する）を調製するための凍結−解凍法が含まれる。
【００７９】
リポソーム調製は、米国特許第７，２２０，５３８号、米国特許第６，２１７，８９９号；米国特許公開第２０１０００２１５３１号、Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ．３３：３３７−４６２，１９８８；及びＧ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ：“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。薬学的使用のためのリポソームは、Ｍｏｚａｆａｒｉ，Ｍ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｖ．Ｗｅｓｓｉｎｇ  Ｅｄ．２０１０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおいて開示されている。
【００８０】
様々な実施形態において、本開示は、懸濁液中または付着性培養物中の細胞と共に使用するための培地であって、基本生理学的緩衝液ミックスと、（ａ）コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含むリポソームであって、細胞懸濁液または付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が５〜１００ｍｇ／Ｌであるような量であるリポソーム；または（ｂ）ペクチン；または（ａ）及び（ｂ）とを含む培地を提供する。
【００８１】
様々な実施形態において、培地は、血清代替物、培地添加物または完全培地である。様々な実施形態において、本開示は、リポソーム及び基本生理学的緩衝液ミックスを含み、ペクチンを任意選択で含む細胞凍結保存培地を提供し、リポソームは、コレステロール、ホスファチジルコリン及び脂肪酸を含む。様々な実施形態において、リポソームは、細胞懸濁液中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液中のホスファチジルコリンの最終濃度が５〜１００ｍｇ／Ｌであるような量である。
【００８２】
様々な実施形態において、本開示は、基本生理学的緩衝液ミックス及びペクチンを含む凍結保存培地を提供する。
【００８３】
リポソームは、複数層または単層であってもよい。リポソームは、直径５〜１０μＭからナノ粒子サイズまでのサイズ範囲であることが企図される。いくつかの実施形態において、リポソームは、ナノ粒子である。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、約５０〜５００ｎｍ、約１００〜約３００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。リポソームサイズは、動的光散乱法により粒子全体の平均直径値として粒径を測定する、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の使用を含む、当該技術分野において知られている方法を使用して測定され得る。
【００８４】
様々な実施形態において、リポソームは、脂質、脂肪酸、ステロール及び／または遊離脂肪酸を含む。様々な実施形態において、リポソームは、細胞成長のためのより生理学的に関連した環境を提供する濃度で、コレステロール及びホスファチジルコリン、ならびに脂肪酸を含む。血清代替物、完全培地または培地添加物中のリポソームの成分の例示的最終濃度を、表１に記載する。
【表１】
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【００８５】
様々な実施形態において、血清代替物リポソームは、約１０〜２００ｍｇ／Ｌ、２５〜１７５ｍｇ／Ｌ、５０〜１５０ｍｇ／Ｌ、６０〜１２０ｍｇ／Ｌ、２０〜１００ｍｇ／Ｌ、３０〜９０ｍｇ／Ｌ、４０〜８０ｍｇ／Ｌ、または５０〜７０ｍｇ／Ｌの最終濃度でコレステロールを含む。様々な実施形態において、血清代替物リポソームは、約５０ｍｇ／Ｌ、約５５ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約６５ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ、または約７５ｍｇ／Ｌの最終濃度でコレステロールを含む。
【００８６】
様々な実施形態において、血清代替物中のリポソームは、細胞懸濁液または付着性培養物中のコレステロールの最終濃度が１〜２０ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液または付着性培養物中のホスファチジルコリンの最終濃度が５〜１００ｍｇ／Ｌまたは１００〜１０００ｍｇ／Ｌであるような量である。
【００８７】
様々な実施形態において、リポソームは、１種以上の脂肪酸を含む。例示的な脂肪酸は、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸及びセロチン酸を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、血清代替物リポソームは約０．５〜５ｍｇ／Ｌ、０．７５〜４、１〜３、０．５〜３、０．５〜２、または１〜２ｍｇ／Ｌの最終濃度で脂肪酸を含む。様々な実施形態において、血清代替物リポソームは、リノール酸またはリノレン酸を、約０．５〜５ｍｇ／Ｌの最終濃度で含む。
【００８８】
様々な実施形態において、血清代替物リポソームは、約０．５〜５０ｍｇ／Ｌ、１〜５０ｍｇ／Ｌ、２．５〜４０ｍｇ／Ｌ、５〜３５ｍｇ／Ｌ、１０〜３０ｍｇ／Ｌ、または１５〜２５ｍｇ／Ｌの最終濃度でエタノールアミンを含む。様々な実施形態において、血清代替物中のエタノールアミンの最終濃度は、約１、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／Ｌである。
【００８９】
様々な実施形態において、リポソームは、ポリソルベートをさらに含む。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０である。例示的なポリソルベートは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む。血清代替物中のポリソルベートの最終濃度は、約１００〜１０００ｕｌ／Ｌ、２００〜８００ｕｌ／Ｌ、３００〜７００ｕｌ／Ｌまたは４００〜６００ｕｌ／Ｌの間であることが企図される。様々な実施形態において、血清代替物中のポリソルベートの最終濃度は、約５００ｕｌ／Ｌである。
【００９０】
血清代替物組成物に関する上述の最終濃度は、培地添加物または完全培地中での成分の濃度を計算するための基準として使用され得る。培地添加物中の各成分の最終濃度は、血清代替物組成物中で使用される最終濃度より１０倍高い。完全培地中の各成分の最終濃度は、血清代替物中で使用される最終濃度より１０倍低い。例示的な濃度を、表１及び表２に記載する。
【００９１】
さらに、血清代替物は、５倍または１０倍超の希釈率で使用されることが企図される。様々な実施形態において、血清代替物は、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００  １：１０００、１：１５００または１：２０００の希釈率で使用される。
【００９２】
凍結保存培地の場合、成分の出発濃度は、血清代替物培地に対して使用される濃度と同じであり、すなわち、完全培地において使用される濃度の１０倍濃度である。しかしながら、凍結保存培地は、成分の最終濃度及び出発濃度がほぼ等しくなるように、希釈なしで、または最小限の希釈で使用される。例えば、凍結保存培地の様々な実施形態において、細胞懸濁液中のコレステロールの最終濃度は、１０〜２００ｍｇ／Ｌであり、細胞懸濁液中のホスファチジルコリンの最終濃度は、５０ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌ、または１０００ｍｇ〜１０ｇ／Ｌである。
【００９３】
血清代替物または培地添加物における使用のためにリポソーム中にコレステロール及びホスファチジルコリンが高濃度で存在するにも関わらず、また完全細胞培養培地溶液中で使用される場合の水溶液への長期曝露を鑑みて、本明細書に記載のリポソームは、水溶液中で熱力学的に安定であることが企図される。本開示は、表１に記載される成分の最終濃度を有する本明細書に記載のリポソームが、水溶液中で安定である（例えば沈殿しない）ことを提供する。様々な実施形態において、リポソームは、３７℃、２５℃、４℃、０℃、または−２０℃において、少なくとも７日、１０日、１４日、２１日、３０日、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年以上の期間、水溶液中で安定である。例示的な水溶液は、水、緩衝生理食塩水及び他の平衡塩類溶液、基礎細胞培地ならびに完全細胞培養培地を含むが、これらに限定されない。本リポソーム組成物の利点は、優れた成長の増強を提供しながらも数日後に溶液から沈殿しない、生理学的に関連したレベルのステロール及び脂肪酸を含有することであり、これは、コレステロール及びホスファチジルコリン等の高レベルの薬剤を含む他の培地において観察されている（Ｓｐｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【００９４】
培地の液体基本ミックス成分は、ペクチン、グリセロール、セレン及び鉄源のうちの１種以上を含むことが企図される。任意選択で、液体基本ミックスは、アミノ酸、ビタミン、糖、無機塩、抗酸化剤及び微量元素をさらに含む。上述のリポソーム複合体と同様に、リポソームが作製される液体基本ミックスは、血清代替物、培地添加物または完全培地における使用のために異なる濃度で作製され得る。例示的な最終濃度を、表２に記載する。
【表２】
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【００９５】
様々な実施形態において、グリセロールは、血清代替物中、１リットル（Ｌ）当たり約０．０２〜５ｍＬ、または０．０５〜４、０．１〜３、０．５〜２．５もしくは１〜２ｍＬ／Ｌの最終濃度である。様々な実施形態において、グリセロールは、血清代替物中、約０．０２、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５ｍＬ／Ｌの最終濃度である。
【００９６】
様々な実施形態において、ペクチンは、血清代替物中、約０．２５〜５ｇ／Ｌ、０．５〜４ｇ／Ｌ、１．５〜３ｇ／Ｌ、または１〜２ｇ／Ｌの最終濃度である。様々な実施形態において、ペクチンは、血清代替物中、約０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｇ／Ｌの最終濃度である。
【００９７】
例示的な無機塩は、リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。例示的な有機塩は、重炭酸ナトリウムまたはＨＥＰＥＳを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
例示的な糖は、デキストロース、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
例示的な抗酸化剤は、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、アルファ−トコトリエノール、ベータ−トコトリエノール、アルファ−トコフェロールキノン、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコペン、ベータ−カロテン、セレン、ユビキノン、ルエチン、Ｓ−アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ−アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ−カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシッスタチオニン、ならびにグリシン−グリシン−ヒスチジン（トリペプチド）を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
例示的な微量元素は、銅、鉄、亜鉛、マンガン、ケイ素、モリブデネート、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、またはセレンを含むが、これらに限定されない。追加的な微量元素は、国際公開第ＷＯ２００６／００４７２８号において開示されている。
【０１０１】
様々な実施形態において、培地または液体基本ミックスは、鉄源または鉄輸送体を含む。例示的な鉄源は、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム、及びコハク酸第二鉄アンモニウム等の第二鉄及び第一鉄塩を含むが、これらに限定されない。例示的な鉄輸送体は、トランスフェリン及びラクトフェリンを含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
様々な実施形態において、培地または液体基本ミックスまたはリポソームは、培地が無血清完全培地として使用され得るように、基本培地の１つ以上の要素及び上述の添加物、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝剤、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤、及びグルコースまたは等価のエネルギー源を含む。
【０１０３】
様々な実施形態において、培地または液体基本ミックスは、銅源または銅輸送体（例えば、ＧＨＫ−Ｃｕ）をさらに含む。例示的な銅源は、塩化銅及び硫酸銅を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
様々な実施形態において、鉄源または銅源は、約０．０５〜２５０ｎｇ／ｍｌ、０．０５〜１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５〜１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、約０．５〜２．５ｎｇ／ｍｌ、または約１〜５ｎｇ／ｍｌの範囲内の最終濃度で血清代替物培地に追加される。さらに、鉄源または銅源は、血清代替物中、約０．０５、０．１、０．２５、０．３５、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度であることが企図される。
【０１０５】
培地または血清代替物組成物の液体ミックス中の成分に関する上述の最終濃度は、培地添加物または完全培地中での成分の濃度を計算するための基準として使用され得る。培地添加物中の各成分の最終濃度は、血清代替物組成物中で使用される最終濃度より１０倍高い。完全培地中の各成分の最終濃度は、血清代替物中で使用される最終濃度より１０倍低い。
【０１０６】
凍結保存培地に関して、血清代替物に対して企図される出発濃度範囲は、凍結保存培地に対して企図される出発濃度範囲と同じである。しかしながら、凍結保存培地は、成分の最終濃度及び出発濃度がほぼ等しくなるように、希釈なしで、または最小限の希釈で使用される。例えば、凍結保存培地の様々な実施形態において、細胞懸濁液中のペクチンの最終濃度は、約０．２５〜５ｇ／Ｌ、０．５〜４ｇ／Ｌ、１．５〜３ｇ／Ｌ、または１〜２ｇ／Ｌである。
【０１０７】
様々な実施形態において、リポソームには、細胞培養に有益な成分が投入される。細胞培養において有益な例示的組成物は、鉄輸送体、遊離脂肪酸、成長ペプチド（例えば、インスリン、ｇｌｙ−ｈｉｓ−ｌｙｓ三量体を含むＧＨＫペプチド）、アミノ酸（必須及び非必須）、ビタミン、微量元素、抗酸化剤ならびに塩を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、リポソームには、追加のエタノールアミン及び遊離脂肪酸が投入されることが企図される。
【０１０８】
様々な実施形態において、血清代替物または培地添加物は、基本培地に追加される。標準的な基本培地は、細胞培養の技術分野において知られており、市販されている。基本培地の例は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２（１：１）、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハム栄養混合物Ｆ−１０またはＦ−１２、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ１３１、クリック培地、マッコイ５Ａ培地、培地１９９、ウィリアム培地Ｅ、及び昆虫培地、例えばグレース培地及びＴＮＭ−ＦＨを含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
本明細書に記載の血清代替物及び培地添加物はまた、市販の無血清培養培地における使用にも企図される。例示的な無血清培地は、ＡＩＭ−Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＰＥＲ−Ｃ６（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
これらの培地はいずれも、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、アミノ酸、ビタミン、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン薬物）、微量元素（通常マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコースまたは等価のエネルギー源が任意選択で添加される。任意の他の必要な添加物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、当業者に明らかである。
【０１１１】
培地組成物は、単位形態でパッケージされることが企図される。一実施形態において、培地（血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地）は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌまたは１Ｌの体積でパッケージされる。関連した実施形態において、血清代替物、培地添加物または凍結保存培地は、１×、５×、１０×または２０×溶液としてパッケージされる。
【０１１２】
細胞培養
本明細書に記載の培地、例えば血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の培養に、好ましくは典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適切な成長のために血清添加物または合成培地を必要とする細胞に有用であることが企図される。そのような細胞は、哺乳動物細胞及び昆虫細胞等の真核生物細胞を含む。血清代替物、完全培地または培地添加物の使用から利益を得ることが企図される哺乳動物細胞は、限定されることなく、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、雌牛／雄牛、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、及びヒトの細胞を含む。昆虫細胞は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）から得られる細胞を含む。
【０１１３】
血清代替物、完全培地もしくは培地添加物により培養された、または凍結保存培地により凍結された細胞は、不死化細胞（細胞株）または非不死化（初代もしくは二次）細胞であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる広範な細胞型のいずれかであってもよいことが企図される。例示的な細胞型は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、卵巣細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓細胞、ならびにこれらの体細胞型の前駆体を含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
様々な実施形態において、培地との使用に企図される細胞は、哺乳動物対象から分離される。哺乳動物対象から分離された細胞は、多能性幹細胞、胚幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、リンパ幹細胞、骨髄幹細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓細胞、体細胞型の前駆体、ならびに任意の癌腫またはがん由来細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
様々な実施形態において、細胞は、細胞株である。例示的な細胞株は、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びＣＨＯ／−ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；サル腎臓ＣＶ１、ＣＯＳ−７；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝がん細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２；  ＳＫ−Ｈｅｐ）；マウス乳がん（ＭＭＴ）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、Ｂ細胞株、マウス３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、及び不死化初代細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
例示的な昆虫細胞株は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ（商標）、ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋（登録商標）、Ｓ２、Ｔｎ５、ＴＮ−３６８、ＢｍＮ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２、Ｄ２、Ｃ６／３６及びＫＣ細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
追加の細胞型及び細胞株は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００６／００４７２８号において開示されている。これらの細胞は、ＣＤ３４＋造血細胞及び骨髄系の細胞、２９３胎児腎臓細胞、Ａ−５４９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨｅＩａ、２９３ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頚部上皮細胞、ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−Ｉ）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞、ＨｅＬａ  ２２９細胞、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡｌ３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、Ｃｌｏｎｅ  Ｍ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−Ｉ細胞、Ｙ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ  ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ＴＨ−Ｉ、Ｂｌ細胞、またはそれらの誘導物、任意の組織または器官からの線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、腺様組織、扁桃腺、骨髄、及び血液）、脾臓、線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株）、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＣＯＳ−Ｉ細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−  ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−Ｉｌ細胞、ＮＯＲ−ＩＯ細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡｌ細胞、ＮＳＯ、ＮＳｌ、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、Ｊｅｎｓｅｎ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞、Ｍｉｍｉｃ細胞ならびに／またはそれらの誘導物を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書において企図される細胞培養条件は、細胞の成長に好適な任意の培養基板に適応され得る。好適な表面を有する基板は、組織培養ウェル、培養フラスコ、ローラーボトル、ガス透過性容器、平坦もしくは平行板バイオリアクタまたは細胞工場を含む。また、撹拌タンク槽内の懸濁液中に維持された微小担体または粒子に細胞が付着する培養条件も企図される。
【０１１９】
細胞培養法は、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ）、及びＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）において概説されている。他の参考文献は、Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｒｏｓｅｌｌｉ，Ｈｕ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｐｒ．１９９６）及びＬｉｍｉｔｓ  ｔｏ  Ｇｒｏｗｔｈ（Ｄ．Ｈ．Ｍｅａｄｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｅ  Ｐｕｂｌ．１９７４）を含む。組織培養用品及び試薬は、当業者に周知であり、市販されている。
【０１２０】
細胞は、血清代替物、完全培地または培地添加物と共に使用される特定の細胞株または分離された細胞型に適切な密度で、培養物中に入れられることが理解される。ある特定の実施形態において、細胞は、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６または５×１０６細胞／ｍｌで培養される。
【０１２１】
様々な実施形態において、本明細書に記載の培地は、凍結保存培地として使用されることが企図される。凍結保存は、細胞の長期保存を可能とする８℃未満の環境内での細胞または組織の保存を指し、４℃以下、０℃以下、−２０℃以下、−７０℃以下、−１３５℃以下、または液体窒素（−１９６℃）中の温度を含む、８℃未満の任意の温度であってもよい。コリン塩及びスクロースを含有する培地を用いて細胞を凍結保存するための方法が、米国特許第５，９８５，５３８号において開示されている。さらなる凍結保存組成物及び方法が、米国特許第７，９３５，４７８号及び同第７，１１２，５７６号において開示されている。本明細書に記載の凍結保存培地は、以下の薬剤のうちの１種以上をさらに含んでもよいことが企図される：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、糖（例えばスクロース、デキストロース、トレハロース、ペクチン）、タンパク質、炭水化物（例えばヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ））、デキストラン及び／またはポリリシン。様々な実施形態において、凍結保存培地は、リポソーム及び／またはペクチンを含む。
【０１２２】
様々な実施形態において、細胞の少なくとも３０％は、血清代替物、培地添加物または完全培地として使用されるか否かによらず、解凍後、本明細書における培地中に入れられた際に生存したままである。様々な実施形態において、解凍後の細胞の生存率は、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上である。
【０１２３】
凍結保存後の生存率を測定するためのさらなるアッセイは、幹細胞のコロニー形成単位の決定、細胞倍増時間及び増殖の決定、ＭＴＴアッセイ、レサズリンアッセイ、ならびに、当該技術分野において細胞生存率及び成長を測定するために使用される他のアッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるある特定の培地組成物またはリポソーム組成物が、異なる組の成分を含む培地またはリポソーム組成物と比較して、細胞の改善された培養、例えば増加した細胞成長、細胞生存率または増加した組換えタンパク質の発現を促進することが企図される。細胞の改善された培養を促進するそれらの培地またはリポソーム組成物が、さらなる実験に使用されることが企図される。
【０１２５】
様々な実施形態において、抗酸化剤を有するリポソームを含む血清代替培地は、培養物中の増加した細胞成長を補助することが実証されている。これは、抗酸化剤ビタミンＥ、またはアルファトコフェロールが、培養物中の細胞成長を抑制することを示している以前の研究と対照的である。
【０１２６】
キット
本開示は、本明細書に記載の培地、例えば血清代替物、培地添加物、完全培地または凍結保存培地、及び取扱説明書を備えるキットをさらに提供する。様々な実施形態において、培地は、血清代替物、培地添加物または凍結保存培地であり、キットは、基本培地、及び／または完全培地を形成するために有用な追加の因子を提供する。様々な実施形態において、培地は容器内にパッケージされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの使用のための組成物の使用法を記載したラベルが、容器に貼付される、またはパッケージ内に含まれる。例示的な容器は、槽、バイアル、管、アンプル、瓶、フラスコ等を含むが、これらに限定されない。さらに、容器は、培地、例えば血清代替物、培地添加物、または液体もしくは凍結形態での凍結保存培地のパッケージ用に適応されることが企図される。容器は、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、及び他のプラスチックを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において周知の材料から作製されることが企図される。様々な態様において、組成物は、単位投薬形態でパッケージされる。キットは、任意選択で、血清代替物、培地添加物または凍結保存培地を基本培地と組み合わせるために、及び代替として、培地を追加の成長因子と組み合わせるために好適なデバイスを含む。様々な態様において、キットは、細胞培養または凍結保存のための培地の使用を記載したラベル及び／または説明書を含有する。
【０１２７】
本血清代替物の追加的態様及び詳細は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例から明らかとなる。
【０１２８】
実施例１
例示的リポソーム血清代替物組成物
本明細書において企図される例示的リポソーム及び血清代替培地を作製するための方法を、以下で説明する。血清代替物において有用な成分を、表３及び４に記載する。表に列挙された成分は限定を意図せず、血清代替物中のリポソーム複合体の有効性を実証することを意図する。表３は、リポソーム組成物の例示的成分を示している。任意選択で、リポソーム複合体は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（例えば、５０ｕＬ／Ｌ）を含んでもよい。
【表３】
2017500893.tif 000004
【０１２９】
リポソームを作製するために、７００ｕｌのエタノールを１．５ｍｌの微小遠心管内に入れ、２５０ｕｌのＰＨＯＳＡＬ（登録商標）５３をエタノールに追加した。５０ｍｇのコレステロールをＰＨＯＳＡＬ（登録商標）ミックスに追加し、コレステロールが溶液となるまで５０℃に加熱した。混合物を１０で２０〜３０秒の増分で溶液が透明な琥珀色となるまでボルテックスした（ＶＯＲＴＥＸ  ＧＥＮＩＥ（登録商標）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ）（短時間ボルテックスし、脂質ミックスを加熱に戻し、溶液となるまで繰り返した）。任意選択で、５０ｕｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を脂質ミックスに追加し、ボルテックスする。混合物にエタノールアミンを追加し、ボルテックスした。次いで、リノール酸及びリノレン酸等の脂肪酸を追加し、ボルテックスにより混合した。最終脂質ミックスを、暗所で４℃で保存する。
【０１３０】
血清代替物はまた、上述の脂質ミックスと組み合わされる基本培地液体ミックスを含む。一実施形態において、基本培地液体ミックスは、以下の成分を含む：ペクチン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デキストロース、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、セレン、モリブデート、クエン酸第二鉄、グリセロール及びプルロニック。基本液体ミックスの例示的実施形態を、表４に記載する。
【表４】
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【０１３１】
デキストロース、ペクチン及びＮａＣｌを粉末として混合し、６００ｍｌの再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）に徐々に追加した。塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム粉末を、ペクチン−ＮａＣｌ溶液に追加し、溶液となるまで混合した。セレン、モリブデート及びクエン酸第二鉄をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、溶液となるまで混合した。グリセロールを追加し、１Ｎ  ＮａＯＨを使用して溶液のｐＨを７．２とした。プルロニックを溶液に追加し、ｄｄＨ２Ｏで体積を１Ｌにした。
【０１３２】
次いで、脂質及び液体ミックスを組み合わせるために、１ｍＬの脂質ミックスを１０ｍＬの血清代替物基本液体中に混合する。脂質ミックスを、低結合フィルター細孔サイズ（例えば０．２２ｕＭ）を通して濾過する。１０ｍＬの基本培地ミックスを、無菌１００ｍＬ容器に入れた。脂質ミックスを１０ｍＬの基本培地中に徐々に滴下しながら、１０ｍＬの基本培地をかき混ぜ、例えばボルテックス及び瓶の振盪により激しく混合した。任意選択で、均一サイズのナノリポソームの作製を補助するマイクロフルダイザーにリポソームミックスを通す。より大きな体積の溶液を作製するために、基本培地をかき混ぜながら、１リットル溶液に達するまで１０ｍｌのリポソームミックスを９９０ｍｌの液体ミックスに徐々に滴下した。
【０１３３】
実施例２
リポソーム血清代替物は細胞成長及び生存率を促進する。
実施例１に記載の血清代替物の、細胞成長及び細胞の増殖を促進する能力を実証するために、マウスから分離された初代細胞または細胞株を、血清代替物を含む原料培地中で培養した。
【０１３４】
以前に説明されたようにリン脂質タンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１で事前に免疫化されたＳＪＬマウスから脾細胞を分離し（ＭｃＲａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８２（１）：７５−８５，１９９５）、ＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中での細胞の成長を、市販の無血清培地ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中での成長と比較した。５×１０５細胞を９６ウェルプレート内の２００ｕＬの成長培地中に入れ、ＰＬＰ１３９−１５１（０、０．５、５または５０ｕｇ／ｍｌ）での再刺激に応答した脾細胞増殖のレベルを３日後に測定した。図１は、ＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中での細胞の培養が、無血清培地よりも大幅に高い増殖をもたらしたことを示している。ＦＢＳを含有するＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中での脾細胞の成長もまた比較した。図２Ａは、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養された細胞が、刺激されているか刺激されていないかに関わらず増殖して、低い刺激指数が得られ、一方、ＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中で培養された脾細胞の数は倍増したことを示している。図２Ｂは、脾細胞がＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳまたはＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中で培養された第２の増殖アッセイを表す。図２Ｂは、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で培養された細胞が、３を超える刺激指数を有し、一方、ＤＭＥＭ／１０％血清代替物中で培養された細胞が、３を若干下回る刺激指数を有していたことを示している。興味深いことに、図２Ａ及び２Ｂにおけるデータは、ＤＭＥＭ／１０％血清代替物中での細胞の培養が、刺激されていない細胞集団においてさえも非特異的増殖をもたらし得るＤＭＥＭ／ＦＢＳ中での細胞の培養とは対照的に、一貫した増殖結果を提供することを示している。本明細書に記載の血清代替物は、細胞刺激特性を有し得、また内部ロット間変動を伴う細胞刺激をもたらし得るＦＢＳ中での培養と比較して、より一貫した再現性のある細胞培養条件を提供する。
【０１３５】
初代細胞培養に加えて、細胞株の成長に対する血清代替物の効果を決定した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ハム（Ｆ１２）培地のみ、または１０％血清代替物を含有するハム中で培養し（９６ウェルプレート内で５×１０５）、細胞成長及び生存率を測定した。ハム培地中で培養されたＣＨＯ細胞の数は４日で倍増し、一方、ハム／１０％血清代替物中で培養されたＣＨＯ細胞の数は、４日でほぼ８倍増加した。いずれの培養物条件中の細胞の生存率も、４日でほぼ９０％であった。
【０１３６】
また、アルファトコフェロールを含むリポソームを含む血清代替培地は、抗酸化剤を含まないリポソームを有する血清代替物と比較して、細胞成長を改善することが実証された。これは、アルファトコフェロールが培養物中の細胞の成長を抑制するという報告と対照的である。例えば、Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ（ａｌｐｈａ）ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．３４（６）：３４７−５７，２００１、またはＮｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｒｏｌｅ」  Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅｐ．６（３）：１４３−５１，２００１を参照されたい。
【０１３７】
これらの結果は、本明細書に記載のリポソームを含む血清代替物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞株の成長を効果的に提供することを実証している。
【０１３８】
実施例３
リポソーム血清代替物は、血清と比較して細胞死及び実験内変動性を低減する
本明細書に記載の血清代替物を、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した培養中の細胞死を抑制または低減する能力に関しても検査した。
【０１３９】
磁気ビーズ分離プロトコル（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）分離、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡまたはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡを参照されたい）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウスの脾臓から分離した。ＤＭＥＭ＋１０％血清代替物中での細胞の成長を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での成長と比較した。また、ＦＢＳ中に見られるような追加の成長因子を補うために、血清代替物を含む培地に様々な成長因子を添加した（例えば、米国特許公開第２０１３０１３０３７３号を参照されたい）。５×１０５  ＣＤ４＋Ｔ細胞を９６ウェルプレート内の２００ｕＬの成長培地中に入れ、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８での刺激に応答したＴ細胞増殖のレベルを、ＷＳＴ−１組み込みにより３日間にわたり測定した（例えば、Ｆｒａｎｃｏｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ３：１９−２５，１９９６を参照されたい）。ＷＳＴ−１アッセイは、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の可溶性ホルマザン染料への開裂を使用して、細胞増殖を測定する。細胞数が増加するにつれて、テトラゾリウムレダクターゼのレベルが上昇し、ＷＳＴ−１から検出可能な染料への変換の増加をもたらす。染料の定量は、４４０ｎｍでの吸収により測定される。
【０１４０】
図３は、刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、培地＋ＦＢＳ中で培養された細胞において観察される増殖よりも良好に、または少なくともそれと同程度に増殖したことを示している。実験内変動が計算され得るように、各刺激群に対して８つの複製培養物を使用した。変動は、増殖において観察される標準偏差の二乗として決定された。図３Ｂは、血清代替物及び成長因子中での細胞の培養が、ＦＢＳ中での培養と比較して、最小限の実験内変動をもたらすことを示している。３日間の培養にわたる細胞死もまた、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アポトーシスアッセイにより測定した（例えば、Ｗｏｌｔｅｒｂｅｅｋ，Ｈ．Ｔ．，ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｍ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ３：６７５−６８２，２００５を参照されたい）。アッセイは、細胞膜の破裂から生じる上澄み中のＬＤＨのレベルを測定する。一連の反応を通して、ＬＤＨは、４９０〜５２０ｎｍの吸収による定量化を可能にする検出可能な可溶性染料の生成をもたらす。より高いレベルのＬＤＨは、増加したアポトーシスを示す。図４Ａは、培地＋血清代替物及び成長因子中での培養が、ＦＢＳでの培養と比較して、培養中に生じるアポトーシスのレベルを低減することを示している。図４Ｂは、この実験における実験内変動がまた、ＦＢＳを含有する培地で培養されたものと比較して、血清代替物中で培養された細胞において最小限であったことを示している。
【０１４１】
これらの結果は、リポソームを含む本明細書に記載の血清代替物、及び完全培地または培地添加物が、ＦＢＳ中での成長と同等であるがＦＢＳでの培養において見られる欠点、例えばロット間変動及び実験内変動を有さない細胞培養環境を提供することを示している。
【０１４２】
上記の例示的実施例に記載のように、本発明における数々の修正及び変形が生じることが、当業者に予測される。結果として、添付の特許請求の範囲に見られるような限定のみが、本発明に適用されるべきである。
【図１】
2017500893.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2017500893.tif 000008
【図３Ａ】
2017500893.tif 000009
【図３Ｂ】
2017500893.tif 000010
【図４Ａ】
2017500893.tif 000011
【図４Ｂ】
2017500893.tif 000012
【国際調査報告】
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2017500893.tif 000014