(57)【要約】本明細書において提供される方法および組成物の実施形態は、被験体において発毛を誘導することと関連する。一部の実施形態は、発毛を調節する因子をスクリーニングすることを含む。被験体において発毛を誘導するための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を前記被験体に投与することを含む、方法。発毛を調節する因子をスクリーニングする方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させることと、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団において、発毛に対する影響を測定することとを含む、前記方法。
2017525672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において発毛を誘導するための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団を取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
接着細胞を選択することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項４から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項４から７のいずれか一項の請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、ドナー被験体から得られる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ドナー被験体と前記被験体が同一である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ドナー被験体と前記被験体が異なる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、皮下移植を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、被験体の集団における場所であって毛を含む前記被験体の皮膚の場所に対するものである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、前記被験体の皮膚の場所に対するものである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与が、瘢痕組織を含む前記被験体の皮膚の場所に対するものである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が、脱毛症を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体が、ヒトである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
発毛を調節する因子をスクリーニングする方法であって、
誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させることと、
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団において、発毛に対する影響を測定することと
を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の増加を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の減少を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記影響が、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の特定の場所に特徴的な毛の増殖を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が、ヒトである、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｖｏで接触する、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触する、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
接着細胞を選択することを含む、請求項に３４記載の方法。
【請求項３６】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項３４から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、請求項に３８記載の方法。
【請求項４０】
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、請求項に３９記載の方法。
【請求項４１】
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、請求項に４０記載の方法。
【請求項４２】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
誘導された真皮乳頭細胞の集団を調製するための方法であって、前記集団を、誘導された神経堤細胞の集団から生成することを含む、方法。
【請求項４６】
接着細胞を選択することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４５から５６のいずれか一項に記載の方法により調製される、誘導された真皮乳頭細胞の集団。
【請求項５８】
被験体において発毛を誘導するための、誘導された真皮乳頭細胞の集団の使用。
【請求項５９】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、請求項４５から５６のいずれか一項に記載の方法により調製される、請求項５８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１４年７月９日に出願した「DERIVATION  OF  HAIR  GROWTH  INDUCING  CELLS  FROM  HUMAN  EMBRYONIC  STEM  CELLS  AND  USES  THEREOF」との表題の米国仮出願第６２／０２２，６３９号の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表を伴って出願される。この配列表は、２０１５年６月３０日作成のＢＵＲＮＨＡＭ０３６ＷＯ＿ＳＥＱＬＩＳＴとの表題の約１．９Ｋｂのサイズのファイルとして提供される。この配列リストの電子フォーマット内の情報は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
本明細書において提供される方法および組成物の実施形態は、被験体において発毛を誘導することと関連する。一部の実施形態は、発毛を調節する因子（agent）をスクリーニングすることを含む。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
胚形成において、表皮と下部に位置する中胚葉との間の相互作用により、毛嚢が形成されることが示唆されている［１、２、３、４］。真皮乳頭（ＤＰ）が、表皮のプラコード形成に反応して、真皮内に細胞凝集物として最初に発生する。毛嚢の発生の進行に伴い、プラコード内の表皮細胞は活発に増殖し、真皮凝集物を包み込み、この場合真皮乳頭と呼ばれ、これはこれらを周囲を取り巻く真皮から隔てる［５］。このような新たなニッチ条件に曝露されると、ＤＰ細胞はＢＭＰ−４、そのインヒビターであるノギン、および表面マーカーであるＮ−ＣＡＭおよびｐ−７５の発現を獲得する。さらに、ＤＰ細胞は特定の細胞外マトリックスタンパク質（例えば、バーシカン（versican）（ＶＣＡＮ））を分泌し、高レベルのアルカリホスファターゼ活性（ＡＰ）を示す［６］。ダブルレポーターＬｅｆ１−ＲＦＰ／Ｋ１４−Ｈ２ＢＧＦＰマウスを使用して、試験は、将来を見越して単離されたマウスＤＰ細胞の詳細な遺伝シグネチャーを同定し［７］、またネズミＤＰの維持および機能にとって必要なものとしてＷｎｔ、ＢＭＰおよびＦＧＦのシグナル伝達経路を同定した［８、９、１０］。ＤＰ細胞は、発毛およびサイクリングにおいて役割を演じ［６］、また毛のサイズおよび毛のタイプを決定する［１１、１２］。ＤＰ細胞は、胚形成期に限らず出生後においても毛嚢形成を誘導することができると、長く認識されている。鼻毛ＤＰ細胞は、通常は毛のない皮膚領域である成熟ラットの足蹠に移植すると、新たな毛の形成を誘導した［１３］。頭皮の皮膚から単離されたヒトＤＰ細胞は、これを齧歯類に移植すると毛の形成に寄与し［１４、１５］、また培養物内でケラチノサイトの形態形成を誘導する［１６］。
ＤＰ細胞は、脱毛疾患に対する細胞に基づく処置として提案された。しかし、ヒトＤＰ細胞は、必要量を確保できず、また培養時に毛嚢形成を誘導する能力を急速に失うので、この目的に適さない［７、８、１７、１８］。したがって、強力な発毛を誘導し得る機能性のＤＰ細胞を開発するニーズがなおも満たされずに存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hardy  MH  (1992)  The  secret  life  of  the  hair  follicle.  Trends  Genet  8:  55-61.
【非特許文献２】Jahoda  CA,  Reynolds  AJ  (1996)  Dermal-epidermal  interactions.  Adult  follicle-derived  cell  populations  and  hair  growth.  Dermatol  Clin  14:  573-583.
【非特許文献３】Millar  SE  (2002)  Molecular  mechanisms  regulating  hair  follicle  development.  J  Invest  Dermatol  118:  216-225.
【非特許文献４】Driskell  RR,  Clavel  C,  Rendl  M,  Watt  FM  (2011)  Hair  follicle  dermal  papilla  cells  at  a  glance.  J  Cell  Sci  124:  1179-1182.
【非特許文献５】Schmidt-Ullrich  R,  Paus  R  (2005)  Molecular  principles  of  hair  follicle  induction  and  morphogenesis.  Bioessays  27:  247-261.
【非特許文献６】Botchkarev  VA,  Paus  R  (2003)  Molecular  biology  of  hair  morphogenesis:  development  and  cycling.  J  Exp  Zool  B  Mol  Dev  Evol  298:  164-180.
【非特許文献７】Rendl  M,  Lewis  L,  Fuchs  E  (2005)  Molecular  dissection  of  mesenchymal-epithelial  interactions  in  the  hair  follicle.  PLoS  Biol  3:  e331.
【非特許文献８】Kishimoto  J,  Burgeson  RE,  Morgan  BA  (2000)  Wnt  signaling  maintains  the  hair-inducing  activity  of  the  dermal  papilla.  Genes  Dev  14:  1181-1185.
【非特許文献９】Rendl  M,  Polak  L,  Fuchs  E  (2008)  BMP  signaling  in  dermal  papilla  cells  is  required  for  their  hair  follicle-inductive  properties.  Genes  Dev  22:  543-557.
【非特許文献１０】Greco  V,  Chen  T,  Rendl  M,  Schober  M,  Pasolli  HA,  et  al.  (2009)  A  two-step  mechanism  for  stem  cell  activation  during  hair  regeneration.  Cell  Stem  Cell  4:  155-169.
【非特許文献１１】Weinberg  WC,  et  al.  (1993)  Reconstitution  of  hair  follicle  development  in  vivo:  determination  of  follicle  formation,  hair  growth,  and  hair  quality  by  dermal  cells.  J  Invest  Dermatol  100:  229-236.
【非特許文献１２】Driskell  RR,  Giangreco  A,  Jensen  KB,  Mulder  KW,  Watt  FM  (2009)  Sox2-positive  dermal  papilla  cells  specify  hair  follicle  type  in  mammalian  epidermis.  Development  136:  2815-2823.
【非特許文献１３】Jahoda  CA,  Horne  KA,  Oliver  RF  (1984)  Induction  of  hair  growth  by  implantation  of  cultured  dermal  papilla  cells.  Nature  311:  560-562.
【非特許文献１４】Jahoda  CA,  et  al.  (2001)  Trans-species  hair  growth  induction  by  human  hair  follicle  dermal  papillae.  Exp  Dermatol  10:  229-237.
【非特許文献１５】Wu  JJ,  et  al.  (2006)  Hair  follicle  reformation  induced  by  dermal  papilla  cells  from  human  scalp  skin.  Arch  Dermatol  Res  298:  183-190.
【非特許文献１６】Chermnykh  ES,  et  al.  (2010)  Dermal  papilla  cells  induce  keratinocyte  tubulogenesis  in  culture.  Histochem  Cell  Biol  133:  567-576.
【非特許文献１７】Lichti  U,  et  al.  (1993)  In  vivo  regulation  of  murine  hair  growth:  insights  from  grafting  defined  cell  populations  onto  nude  mice.  J  Invest  Dermatol  101:  124S-129S.
【非特許文献１８】Yang  CC,  Cotsarelis  G  (2010)  Review  of  hair  follicle  dermal  cells.  J  Dermatol  Sci  57:  2-11.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、被験体において発毛（hair  growth）を誘導するための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を被験体に投与することを含む、方法を含む。また、一部の実施形態は、誘導された真皮乳頭細胞の集団を取得することも含む。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、誘導された神経堤細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【０００８】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、幹細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、幹細胞のクラスターが形成される条件下で幹細胞の集団を培養することも含む。また一部の実施形態は、クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することも含まれる。また一部の実施形態は、基材表面に、球塊をプレーティングすることであって、表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることも含む。
【０００９】
一部の実施形態では、幹細胞の集団は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。一部の実施形態では、誘導多能性幹細胞は、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される。一部の実施形態では、幹細胞の集団は、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ドナー被験体から得られる。一部の実施形態では、ドナー被験体と被験体は同一である。一部の実施形態では、ドナー被験体と被験体は異なる。
【００１１】
一部の実施形態では、投与は、皮下移植を含む。一部の実施形態では、投与は、被験体の集団における場所であって毛を含む被験体の皮膚の場所に対するものである。一部の実施形態では、投与は、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の場所に対するものである。一部の実施形態では、投与は、瘢痕組織を含む被験体の皮膚の場所に対するものである。
【００１２】
一部の実施形態では、被験体は、脱毛症を有する。
【００１３】
一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体はヒトである。
【００１４】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、発毛を調節する因子をスクリーニングするための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させることと、誘導された真皮乳頭細胞の集団において、発毛に対する影響を測定することとを含む、方法を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、影響は、試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の増加を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、影響は、試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の減少を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、影響は、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の特定の場所に特徴的な毛の増殖を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体はヒトである。
【００１９】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験因子と接触する。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験因子と接触する。
【００２０】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、誘導された神経堤細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【００２２】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、幹細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、幹細胞のクラスターが形成される条件下で、幹細胞の集団を培養することも含む。また一部の実施形態は、クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することも含む。また一部の実施形態は、基材の表面上に球塊をプレーティングすることであって、表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることも含む。
【００２３】
一部の実施形態では、幹細胞の集団は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。一部の実施形態では、誘導多能性幹細胞は、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される。一部の実施形態では、幹細胞の集団は、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。
【００２４】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、誘導された真皮乳頭細胞の集団を調製するための方法であって、前記集団を、誘導された神経堤細胞の集団から生成することを含む、方法を含む。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【００２５】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、幹細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、幹細胞のクラスターが形成される条件下で、幹細胞の集団を培養することも含む。また一部の実施形態は、クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することも含む。また一部の実施形態は、球塊を、基材の表面上にプレーティングすることであって、表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、幹細胞の集団は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。一部の実施形態では、誘導多能性幹細胞は、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される。一部の実施形態では、幹細胞の集団は、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む。
【００２７】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、上記方法のうちの任意の１つにより調製される、誘導された真皮乳頭細胞の集団を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ−Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、ｈＥＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図１Ａは、分化戦略の略図である。図１Ｂは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養における遊走性ＮＣマーカーＳｏｘ１０およびＦｏｘｄ３の発現を表す２つの顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養におけるＮＣマーカーのインテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）およびｈＥＳＣマーカーのＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４に関するフローサイトメトリー分析を表す３つの一連のグラフである。図１Ｄは、ｈＥＳＣ−ＮＣ、ｈＤＰ（正常な皮膚に由来）、およびｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｐ−７５、ネスチン、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｅは、ＤＰパターニング期間中のｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｈＤＰマーカーのｐ−７５、ネキシン−１（Nexin−１）、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびビメンチンのＱ−ＰＣＲ分析を表す一連のグラフである。第０日＝ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞。遺伝子発現レベルは、ｈＥＳＣ−ＮＣレベルに対する倍率変化を対数で示し、１８Ｓに対して正規化した。各遺伝子について、破線は、ｈＤＰ細胞培養における遺伝子発現のレベルを表す。スケールバーは１００μｍ。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、ｈＥＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図１Ａは、分化戦略の略図である。図１Ｂは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養における遊走性ＮＣマーカーＳｏｘ１０およびＦｏｘｄ３の発現を表す２つの顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養におけるＮＣマーカーのインテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）およびｈＥＳＣマーカーのＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４に関するフローサイトメトリー分析を表す３つの一連のグラフである。図１Ｄは、ｈＥＳＣ−ＮＣ、ｈＤＰ（正常な皮膚に由来）、およびｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｐ−７５、ネスチン、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｅは、ＤＰパターニング期間中のｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｈＤＰマーカーのｐ−７５、ネキシン−１（Nexin−１）、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびビメンチンのＱ−ＰＣＲ分析を表す一連のグラフである。第０日＝ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞。遺伝子発現レベルは、ｈＥＳＣ−ＮＣレベルに対する倍率変化を対数で示し、１８Ｓに対して正規化した。各遺伝子について、破線は、ｈＤＰ細胞培養における遺伝子発現のレベルを表す。スケールバーは１００μｍ。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、ｈＥＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図１Ａは、分化戦略の略図である。図１Ｂは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養における遊走性ＮＣマーカーＳｏｘ１０およびＦｏｘｄ３の発現を表す２つの顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養におけるＮＣマーカーのインテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）およびｈＥＳＣマーカーのＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４に関するフローサイトメトリー分析を表す３つの一連のグラフである。図１Ｄは、ｈＥＳＣ−ＮＣ、ｈＤＰ（正常な皮膚に由来）、およびｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｐ−７５、ネスチン、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図１Ｅは、ＤＰパターニング期間中のｈＥＳＣ−ＤＰ培養物におけるｈＤＰマーカーのｐ−７５、ネキシン−１（Nexin−１）、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびビメンチンのＱ−ＰＣＲ分析を表す一連のグラフである。第０日＝ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞。遺伝子発現レベルは、ｈＥＳＣ−ＮＣレベルに対する倍率変化を対数で示し、１８Ｓに対して正規化した。各遺伝子について、破線は、ｈＤＰ細胞培養における遺伝子発現のレベルを表す。スケールバーは１００μｍ。
【００２９】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ヌードマウスへの皮下細胞移植の影響を表す。図２Ａは、単独移植したか、またはマウス乳児期真皮細胞（ｍＤＣ）、ｈＤＰ、ｈＥＳＣ−ＤＰ、血清中で１４日間分化させたｈＥＳＣ（ｈＥＳＣ−血清）、ヒトｈＥＳＣから誘導された神経堤細胞（ｈＥＳＣ−ＮＣ）、および７日間ＤＰに分化させたｈＥＳＣ−ＮＣ（ｈＥＳＣ−ＤＰ  ７日間）と組み合わせて移植したケラチノサイトの全組織標本に関するステレオ画像を表す一連の顕微鏡写真である。図２Ｂは、単独移植したかまたはｍＤＣ、ｈＤＰ、またはｈＥＳＣ−ＤＰと組み合わせて移植したケラチノサイトにより誘導された毛の定量を表すグラフである。図２Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ（０日目）の分化時間と共に、ＥＳＣ−ＤＰ細胞の毛誘導能力の動力学を表すグラフであり、ケラチノサイト単独（破線により可視化）と比較して、移植１回につき形成された毛の数（赤線で可視化した傾向）、または血清存在下で分化したｈＥＳＣの毛の数（青色菱形）として表す。すべてのデータを、平均値±ＳＥＭとして表し、また一元ＡＮＯＶＡを用いて分析した（クラスカル−ウォリスの検定、Ｄｕｎｎの多重比較ポストテスト）。＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．００１。スケールバーは１ｍｍ。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ヌードマウスへの皮下細胞移植の影響を表す。図２Ａは、単独移植したか、またはマウス乳児期真皮細胞（ｍＤＣ）、ｈＤＰ、ｈＥＳＣ−ＤＰ、血清中で１４日間分化させたｈＥＳＣ（ｈＥＳＣ−血清）、ヒトｈＥＳＣから誘導された神経堤細胞（ｈＥＳＣ−ＮＣ）、および７日間ＤＰに分化させたｈＥＳＣ−ＮＣ（ｈＥＳＣ−ＤＰ  ７日間）と組み合わせて移植したケラチノサイトの全組織標本に関するステレオ画像を表す一連の顕微鏡写真である。図２Ｂは、単独移植したかまたはｍＤＣ、ｈＤＰ、またはｈＥＳＣ−ＤＰと組み合わせて移植したケラチノサイトにより誘導された毛の定量を表すグラフである。図２Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ（０日目）の分化時間と共に、ＥＳＣ−ＤＰ細胞の毛誘導能力の動力学を表すグラフであり、ケラチノサイト単独（破線により可視化）と比較して、移植１回につき形成された毛の数（赤線で可視化した傾向）、または血清存在下で分化したｈＥＳＣの毛の数（青色菱形）として表す。すべてのデータを、平均値±ＳＥＭとして表し、また一元ＡＮＯＶＡを用いて分析した（クラスカル−ウォリスの検定、Ｄｕｎｎの多重比較ポストテスト）。＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．００１。スケールバーは１ｍｍ。
【００３０】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜３Ｆは、ＧＦＰ標識されたｈＥＳＣ−ＤＰおよびｈＩＰＳＣ−ＤＰの皮下移植を一連の顕微鏡写真で表す。図３Ａは、移植物全組織標本の立体視観察により、新規に形成された毛内のＤＰ（矢印頭部）および真皮性カプセル（矢印）の位置において、ＧＦＰ陽性ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞が同定された；挿入図は、ＤＰ領域の２×の拡大図を示す。図３Ｂは、ＧＦＰ標識されたｈＩＰＳＣ−ＤＰが、ＤＰおよび毛の真皮性カプセルに見出され得ることを表す：移植物全組織標本（ＧＦＰ／明視野）および８μｍ切片（明視野）。挿入図は、毛嚢のＤＰ領域内に認められたＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像である（明視野画像内のＤＰ領域の白枠四角部の２×拡大図）。図３Ｃおよび３Ｄは、新規に形成された毛のＧＦＰ陽性ＤＰ（ＧＦＰ／明視野、共焦点顕微鏡法）は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）（バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、共焦点顕微鏡法）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ、明視野）についてそれぞれ陽性であることを表す。図３Ｅは、ＧＦＰパネル内の共焦点画像により、ＮＣ由来のＧＦＰ陽性細胞が、外部毛根鞘領域（矢印）、ならびにＧＦＰ陽性ＤＰ（輪郭部）内で稀に（新規に形成された毛の約１％）検出されたことを示す。図３Ｆは、ＮＣから誘導されたＧＦＰ陽性細胞が移植物内の毛マトリックスにおいて見出されたことを表す（共焦点顕微鏡法）。挿入図は、ＧＦＰ陽性細胞の２×拡大図を示す；白色はＧＦＰ。複数のメラニン顆粒（黒色）がＧＦＰ陽性細胞全体を通じて存在することに留意する。スケールバーは、図３Ａの場合２５０μｍ；図３Ｂ〜３Ｆの場合５０μｍ。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ａ〜３Ｆは、ＧＦＰ標識されたｈＥＳＣ−ＤＰおよびｈＩＰＳＣ−ＤＰの皮下移植を一連の顕微鏡写真で表す。図３Ａは、移植物全組織標本の立体視観察により、新規に形成された毛内のＤＰ（矢印頭部）および真皮性カプセル（矢印）の位置において、ＧＦＰ陽性ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞が同定された；挿入図は、ＤＰ領域の２×の拡大図を示す。図３Ｂは、ＧＦＰ標識されたｈＩＰＳＣ−ＤＰが、ＤＰおよび毛の真皮性カプセルに見出され得ることを表す：移植物全組織標本（ＧＦＰ／明視野）および８μｍ切片（明視野）。挿入図は、毛嚢のＤＰ領域内に認められたＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像である（明視野画像内のＤＰ領域の白枠四角部の２×拡大図）。図３Ｃおよび３Ｄは、新規に形成された毛のＧＦＰ陽性ＤＰ（ＧＦＰ／明視野、共焦点顕微鏡法）は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）（バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、共焦点顕微鏡法）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ、明視野）についてそれぞれ陽性であることを表す。図３Ｅは、ＧＦＰパネル内の共焦点画像により、ＮＣ由来のＧＦＰ陽性細胞が、外部毛根鞘領域（矢印）、ならびにＧＦＰ陽性ＤＰ（輪郭部）内で稀に（新規に形成された毛の約１％）検出されたことを示す。図３Ｆは、ＮＣから誘導されたＧＦＰ陽性細胞が移植物内の毛マトリックスにおいて見出されたことを表す（共焦点顕微鏡法）。挿入図は、ＧＦＰ陽性細胞の２×拡大図を示す；白色はＧＦＰ。複数のメラニン顆粒（黒色）がＧＦＰ陽性細胞全体を通じて存在することに留意する。スケールバーは、図３Ａの場合２５０μｍ；図３Ｂ〜３Ｆの場合５０μｍ。
【図３Ｅ−Ｆ】図３Ａ〜３Ｆは、ＧＦＰ標識されたｈＥＳＣ−ＤＰおよびｈＩＰＳＣ−ＤＰの皮下移植を一連の顕微鏡写真で表す。図３Ａは、移植物全組織標本の立体視観察により、新規に形成された毛内のＤＰ（矢印頭部）および真皮性カプセル（矢印）の位置において、ＧＦＰ陽性ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞が同定された；挿入図は、ＤＰ領域の２×の拡大図を示す。図３Ｂは、ＧＦＰ標識されたｈＩＰＳＣ−ＤＰが、ＤＰおよび毛の真皮性カプセルに見出され得ることを表す：移植物全組織標本（ＧＦＰ／明視野）および８μｍ切片（明視野）。挿入図は、毛嚢のＤＰ領域内に認められたＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像である（明視野画像内のＤＰ領域の白枠四角部の２×拡大図）。図３Ｃおよび３Ｄは、新規に形成された毛のＧＦＰ陽性ＤＰ（ＧＦＰ／明視野、共焦点顕微鏡法）は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）（バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、共焦点顕微鏡法）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ、明視野）についてそれぞれ陽性であることを表す。図３Ｅは、ＧＦＰパネル内の共焦点画像により、ＮＣ由来のＧＦＰ陽性細胞が、外部毛根鞘領域（矢印）、ならびにＧＦＰ陽性ＤＰ（輪郭部）内で稀に（新規に形成された毛の約１％）検出されたことを示す。図３Ｆは、ＮＣから誘導されたＧＦＰ陽性細胞が移植物内の毛マトリックスにおいて見出されたことを表す（共焦点顕微鏡法）。挿入図は、ＧＦＰ陽性細胞の２×拡大図を示す；白色はＧＦＰ。複数のメラニン顆粒（黒色）がＧＦＰ陽性細胞全体を通じて存在することに留意する。スケールバーは、図３Ａの場合２５０μｍ；図３Ｂ〜３Ｆの場合５０μｍ。
【００３１】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ＤＰ細胞運命獲得におけるＢＭＰシグナル伝達の役割を表す。図４Ａは、選択的ＢＭＰインヒビターであるドルソモルフィン（dorsomorphin）の不存在または存在下で誘導されたｈＥＳＣ−ＤＰ細胞の形態および移植結果を表す顕微鏡写真を示す。スケールバーは、細胞培養につき５０μｍ、および細胞移植につき０．５ｍｍである。図４Ｂは、選択的ＢＭＰインヒビターであるドルソモルフィンの不存在または存在下でのｈＥＳＣ−ＤＰ細胞における、バーシカン（Versican）、コリン（Corin）、ネキシン−１、ｐ−７５、ビメンチン、およびＳＭＡの発現に関するＱ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭで表し、スチューデントｔ検定を用いて分析した。＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０，００１。
【００３２】
【図５】図５は、ｈＥＳＣ−ＮＣ培養内で間葉系のマーカー（ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４）発現について、フローサイトメトリー分析を行い、同分析によるｈＥＳＣ−ＮＣにおける間葉系のマーカーの発現を表す一連のグラフである。
【００３３】
【図６】図６は、ヒト毛嚢ＤＰ細胞におけるＤＰマーカーのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を表す一連の顕微鏡写真である。ＳＭＡ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ネスチン、およびバーシカン（Versican）凍結切片の免疫蛍光染色；ＤＡＰＩは青色。スケールバーは１００μｍ。
【００３４】
【図７】図７は、ヌードマウスの皮膚下へのヒトＤＰ細胞の移植を示す一連の顕微鏡写真であり、この場合、ＧＦＰ陽性ｈＤＰ細胞が真皮内に見出され得るが、新規に形成された毛のＤＰ領域内には取り込まれない；移植物全組織標本（挿入図は、ＤＰ領域の２×拡大図を示す）。スケールバーは、２５０μｍ。
【００３５】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ｈＩＰＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図８Ａは、ｈＩＰＳＣ−ＮＣ培養における、神経上皮マーカーであるＳｏｘ２、Ｓｏｘ９、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図８Ｂは、ヒトＩＰＳＣ−ＤＰ細胞培養におけるＤＰマーカーである平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、Ｐ−７５、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは、青色。図８Ｃは、バーシカン（Versican）、ネキシン−１、ｐ−７５、ビメンチン、およびＳＭＡの発現に関するＱ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。遺伝子発現レベルは１８Ｓに正規化されており、またｈＥＳＣ−ＮＣ発現レベルに対する倍率変化の対数として示される。スケールバーは１００μｍ。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ｈＩＰＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図８Ａは、ｈＩＰＳＣ−ＮＣ培養における、神経上皮マーカーであるＳｏｘ２、Ｓｏｘ９、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図８Ｂは、ヒトＩＰＳＣ−ＤＰ細胞培養におけるＤＰマーカーである平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、Ｐ−７５、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは、青色。図８Ｃは、バーシカン（Versican）、ネキシン−１、ｐ−７５、ビメンチン、およびＳＭＡの発現に関するＱ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。遺伝子発現レベルは１８Ｓに正規化されており、またｈＥＳＣ−ＮＣ発現レベルに対する倍率変化の対数として示される。スケールバーは１００μｍ。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ｈＩＰＳＣがＮＣ中間体を経てＤＰ様細胞へと分化することを表す。図８Ａは、ｈＩＰＳＣ−ＮＣ培養における、神経上皮マーカーであるＳｏｘ２、Ｓｏｘ９、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは青色。図８Ｂは、ヒトＩＰＳＣ−ＤＰ細胞培養におけるＤＰマーカーである平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、Ｐ−７５、およびネスチンの発現を表す一連の顕微鏡写真である。免疫蛍光染色、ＤＡＰＩは、青色。図８Ｃは、バーシカン（Versican）、ネキシン−１、ｐ−７５、ビメンチン、およびＳＭＡの発現に関するＱ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。遺伝子発現レベルは１８Ｓに正規化されており、またｈＥＳＣ−ＮＣ発現レベルに対する倍率変化の対数として示される。スケールバーは１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本明細書において提供される方法および組成物の実施形態は、被験体において発毛を誘導することと関連する。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は誘導された神経堤細胞の集団から生成され得、そしてその誘導された神経堤細胞の集団は幹細胞の集団から生成され得る。誘導された真皮乳頭細胞の集団は、被験体の皮下に移植され、そして毛を生成し得る。有利には、細胞のそれぞれの集団は、移植での使用等で使用可能な、誘導された真皮乳頭細胞の莫大な集団が提供できるように増幅され得る。誘導された真皮乳頭細胞は、皮膚障害、例えば熱傷、瘢痕、および脱毛等を有する被験体を治療するのに使用可能である。他の実施形態は、発毛を調節する因子をスクリーニングすることを含む。試験因子は、誘導された真皮乳頭細胞の集団と接触可能であり、その影響が測定され得る。発毛率、硬毛または軟毛の形成、毛幹の色、毛幹の太さ、および毛幹内のジスルフィド結合レベルと関連する影響を生み出す因子が試験され得る。
【００３７】
真皮乳頭（ＤＰ）は、毛嚢形成および増殖の周期を制御する間葉細胞の特有の集団である。発生の間、ほとんどのＤＰ細胞は、中胚葉から誘導されるが、しかし、頭部の毛の機能的に同等のＤＰ細胞は、神経堤（ＮＣ）に由来する。ＮＣは、発生の間に神経管背側から一時的に発生する細胞集団であり、また末梢神経系、副腎髄質、メラニン形成細胞、および様々な頭蓋顔面の間葉組織を含む複数の組織を生じさせる［１９］。Ｌｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｓａ２６またはＺ／ＥＧレポーターマウスを使用するＮＣ特異的（Ｗｎｔ１−Ｃｒｅ）系列追跡により、ＮＣが頭部ＤＰ細胞の集団の大きな割合に寄与するという遺伝的証拠が得られた［２０、２１、２２］。
【００３８】
出願人は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からの機能的なＤＰ様細胞の誘導を含む方法および組成物を開発した。参照によりその全体が本明細書に援用される、Gnedeva  K.らの「Derivation  of  Hair-Inducing  Cell  from  Human  Pluripotent  Stem  Cells」（２０１５年）Derivation  of  Hair-Inducing  Cell  from  Human  Pluripotent  Stem  Cells.  PLoS  ONE  １０巻（１号）:  e0116892.  doi:10.1371/journal.pone.0116892を参照。一部の実施形態では、ｈＥＳＣは、ＮＣ細胞を、次に培養で毛誘導性のＤＰ様細胞を生成させるのに使用可能である。ｈＥＳＣ誘導されたＤＰ様細胞（ｈＥＳＣ−ＤＰ）は、成人ヒトＤＰ細胞に代表的に見出されるマーカー（例えば、ｐ−７５、ネスチン、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、アルカリホスファターゼ）を発現し、また免疫不全のヌードマウスの皮下に移植したときに、毛嚢形成を誘導することが可能であった。ＧＦＰを発現するように操作された、ｈＥＳＣから誘導されたＤＰ様細胞が、新規に形成された毛嚢のＤＰに組み込まれ、適切なマーカーを発現した。ＢＭＰインヒビターのドルソモルフィンは、ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物から毛誘導活性を除去したので、ＢＭＰシグナル伝達は、ｈＥＳＣ−ＤＰ誘導物内の因子である。
【００３９】
発毛を誘導する方法
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、被験体において発毛を誘導するための方法を含む。一部のかかる実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、被験体に投与される。投与の方法は、被験体の皮膚内への誘導された真皮乳頭細胞の移植を含み得、例えば投与は誘導された真皮乳頭細胞の皮下移植を含み得る。誘導された真皮乳頭細胞は、被験体の皮膚の任意の場所、例えば頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、手、足部、および腹部等の被験体の皮膚の場所に投与され得る。一部の実施形態では、被験体の皮膚の場所には、瘢痕組織が含まれる。一部の実施形態では、被験体は脱毛症を有する。一部の実施形態では、被験体はヒト等の哺乳動物である。
【００４０】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、他の細胞型、例えば単離された誘導された神経堤細胞等から生成した真皮乳頭細胞の特徴を有する単離された細胞の集団を含み得る。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の特徴として、タンパク質、発現した核酸等の真皮乳頭細胞と関連したマーカー、毛嚢形成誘導活性、ケラチノサイト形態形成誘導活性、および毛幹増殖誘導活性等を挙げることができる。例示的なマーカーとして、ＢＭＰ−４、ノギン、Ｎ−ＣＡＭ、およびｐ−７５、細胞外マトリックスタンパク質、例えばバーシカン（versican）（ＶＣＡＮ）等、アルカリホスファターゼ活性（ＡＰ）、ネスチン、平滑筋アクチン、およびビメンチン等が挙げられる。
【００４１】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞は、誘導された神経堤細胞から生成され得る。一部の実施形態では、接着細胞は、単離された誘導された真皮乳頭細胞の集団を生成するために、誘導された神経堤細胞の集団から選択される。例えば、誘導された神経堤細胞の集団は基材上にプレーティングされ得るが、接着細胞は、基材に結合させることが可能である一方、非接着細胞は、基材から洗浄され得る。一部の実施形態では、基材はプラスチックである。
【００４２】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の特徴として、タンパク質、発現した核酸等の神経堤細胞と関連したマーカー、メラニン形成細胞等の細胞を生成する能力を有する活性、頭蓋顔面の軟骨および骨、平滑筋、末梢ニューロンおよび腸ニューロン、ならびにグリアを挙げることができる。例示的なマーカーとして、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンが挙げられる。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ベリスキャン（veriscan）、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【００４３】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞は、幹細胞の集団から生成され得る。幹細胞から誘導された神経堤細胞を生成する例示的な方法は、Bajpai  R.ら、Cell  Death  and  Differentiation（２００９年）１６巻、８０７〜８２５頁、およびCurchoe  CLら、（２０１０年）Early  acquisition  of  neural  crest  competence  during  hESCs  neuralization.  PLoS  One  ５巻:  e13890に記載されており、これら各文献を参照によりその全体が援用される。一部の実施形態では、幹細胞の集団は、幹細胞のクラスターが形成される条件下に置かれる。一部の実施形態では、クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成する。一部の実施形態では、球塊のプレーティングは、基材表面上にプレーティングされる。一部の実施形態では、その表面はフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされる。
【００４４】
一部の実施形態では、幹細胞には、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞が含まれる。誘導多能性幹細胞は、様々な供給源、例えば線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球等から生成され得る。誘導多能性幹細胞を生成する例示的な方法として、Takahashi,  K.およびYamanaka,  S（２００６年）Cell、１２６巻（４号）：６６３〜７６頁;  Zhou  Hら（２００９年）Cell  Stem  Cell、４巻（５号）：３８１〜４頁;  Zhouら、（２０１２年）Nature  Protocols、７巻（１２号）：２０８０〜２０８９頁；およびMoad,  M.ら（２０１３年）European  Urology、６４巻（５号）：７５３〜７６１頁に記載されている方法が挙げられ、これらの各文献は参照によりその全体が援用される。一部の実施形態では、幹細胞の集団は、Ｈ９細胞、またはヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞等の細胞を含む。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ドナー被験体から得られる。例えば、細胞の試料は、ドナー被験体から採取され得、そしてこの細胞の試料から、誘導された多能性幹細胞の集団が生成される。一部の実施形態では、ドナー被験体と被験体は同一である。一部の実施形態では、ドナー被験体と被験体は異なる。
【００４５】
発毛（hair  growth）を調節する因子をスクリーニングする方法
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、発毛を調節する因子をスクリーニングする方法を含む。一部のかかる実施形態は、誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させること、および誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛に対する影響を測定することを含む。一部の実施形態では、因子は、化合物、いくつかの化合物を含む組成物、ならびに温度およびｐＨ等の物理条件を含み得る。
【００４６】
一部の実施形態では、影響には、試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、誘導された真皮乳頭細胞の集団内の発毛率の変化、例えば誘導された真皮乳頭細胞の集団内の発毛率の増加または減少等が含まれ得る。発毛率は、毛幹の形成率、または毛幹形成活性を有する毛嚢の形成率により測定可能である。
【００４７】
一部の実施形態では、影響は、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の特定の場所に特徴的な毛の増殖を含み得る。被験体の皮膚の特定の場所の毛の例示的な特徴として、毛幹の太さ、長さ、強度、および毛周期の長さを挙げることができる。一部の実施形態では、影響は、硬毛または軟毛等の毛の増殖を含み得る。一部の実施形態では、影響は、毛幹の色、例えば褐色、黒色、赤色、白色、グレー、およびブロンド等を含み得る。一部の実施形態では、影響は、毛幹におけるカール具合を含み得る。一部の実施形態では、影響は、毛幹の太さを含み得る。一部の実施形態では、影響は、毛幹におけるジスルフィド結合のレベルを含み得る。
【００４８】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験因子と接触する。例えば、誘導された真皮乳頭細胞は、被験体の皮膚に移植され得る。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験因子と接触する。
【実施例】
【００４９】
ＮＣ細胞中間体を使用するｈＥＳＣ−ＤＰの誘導
ヒトＤＰ様細胞を、ＮＣ中間体を経由してｈＥＳＣから取得した（図１Ａ）。これまでの記載［２４、２５］に従い、ｈＥＳＣを誘導して、ｈＥＳＣ由来神経堤細胞（ｈＥＳＣ−ＮＣ）へと分化させた。ｈＥＳＣ−ＮＣ培養物は、神経堤マーカーであるＳｏｘ１０およびＦｏｘｄ３について、強力な発現を示した（図１Ｂ）。フローサイトメトリー分析により、培養したｈＥＳＣ−ＮＣ細胞の約８０％が、ＮＣマーカーであるインテグリンアルファ４（ＩＴＧＡ４）、フィブロネクチンの同族受容体を発現したが［２６］、ならびにＯＣＴ４およびＳＳＥＡ４の発現は認められないことが確認され、未分化のｈＥＳＣは存在しないことが示唆された（図１Ｃ）。
【００５０】
神経堤は、様々な間葉組織に関する前駆体をもたらす細胞の多能性集団である［１９］。ＦＡＣＳ分析より、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞が、分化１４日目に、間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ４７（９９．９５％）、ＣＤ１８４（２０％）、およびＣＤ４４（５２．５８％）を発現したことが示された（図５）。ＤＰ様細胞を生成するために、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で、ｈＥＳＣ−ＮＣを、追加の２週間さらに誘導して分化させた（図１Ａ）。ＤＰ細胞は、体細胞性の真皮幹細胞であり［２７］、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）マーカーを発現する［２８］。したがって、組織培養プラスチックへの優先的接着を使用して、分化中のｈＥＳＣ−ＮＣ培養物から間葉細胞を濃縮した［２９］。ルーチン的に、約２０％のｈＥＳＣ−ＮＣ培養物が、プラスチックに接着し、これを血清含有培地中で継代して、ｈＥＳＣから誘導されたＤＰ様細胞（ｈＥＳＣ−ＤＰ）を得た。これらの結果から、ｈＥＳＣから誘導されたＮＣ細胞は、単離プロトコール、ならびにＭＳＣおよびＤＰ細胞用の培養条件を使用して濃縮可能な細胞の間葉前駆体集団を含むことが示唆される。
【００５１】
ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞の特徴付け
マウス背部皮膚ＤＰ細胞のシグネチャー遺伝子がコンパイルされているが［７］、しかしヒト頭部真皮乳頭細胞における遺伝子発現についてほとんど未知である。マウスおよびヒトＤＰ細胞の両方に関するマーカーを、間葉系ｈＥＳＣ−ＤＰを特徴付けるのに使用した。ＤＰと神経堤に共通するマーカー、Ｐ−７５とネスチンに共通するマーカーが、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞、培養したヒトＤＰ細胞（ｈＤＰ）（正常なヒト皮膚から単離された）、およびｈＥＳＣ−ＤＰ細胞（図１Ｄ）において検出された［２１］。他のヒトＤＰマーカー：バーシカン（Versican）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞において検出されなかったが、ｈＤＰおよびｈＥＳＣ−ＤＰ培養物中に存在した（図１Ｄ）。ｈＤＰにおけるネスチン、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびＡＰの染色特異性を、ヒト頭皮の皮膚切片を使用して確認した（図６）。ｈＥＳＣ−ＮＣでは、ＮＣマーカーであるＰ−７５（約３０％）およびネスチン（約９０％）の発現は、ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物における発現（ｐ−７５で約４０％、ネスチンで約９０％）と類似し、そしてｈＤＰ細胞において近い発現パターンを示した（Ｐ−７５で約２０％、ネスチンで約９０％）。対照的に、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞は、バーシカン（Versican）（＜１％）、ＳＭＡ（＜３％）について陰性であり、ＡＰ活性を完全に欠いていたが、一方、ｈＥＳＣ−ＤＰの大部分は、バーシカン（Versican）（約７０％）、ＳＭＡ（約７０％）を発現し、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびＡＰについてほぼ１００％陽性であった、ヒトＤＰ細胞で見出されたのと類似した高レベルのＡＰ活性を示した。全体的な細胞形態および細胞内のマーカー局在は、ヒトＤＰ細胞およびｈＥＳＣ−ＤＰの培養物との間で類似した。ｈＥＳＣ−ＮＣからｈＥＳＣ−ＤＰへの分化の間のＤＰマーカーの発現動態を定量的に評価するために、Ｑ−ＰＣＲ分析を使用した。試験したすべてのヒトＤＰマーカー（ｐ−７５、ネキシン−１、バーシカン（Versican）、ＳＭＡ、およびビメンチン）の発現レベルは、ｈＥＳＣ−ＮＣ分化の間に徐々に増加し、２週間後にはヒト−ＤＰ細胞培養物に見出されたレベルと同等またはそれ上回った（図１Ｅ）。これらを総じて考慮すると、これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物内にヒトＤＰ様細胞が存在することを示唆する。
【００５２】
移植の際のｈＥＳＣ−ＤＰの毛誘導特性
ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞を、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウスに移植した際に、毛嚢形成を誘導する能力があるかどうか、同細胞について調査した。マウス皮膚由来の真皮前駆体の毛髪誘導能を実証するのにこれまでに使用されたパッチ式の細胞移植方法を使用した［２７］。要するに、目的の細胞を、新生動物から単離されたマウス表皮細胞（ケラチノサイト）と合わせ、濃厚な細胞懸濁物としてヌードマウスに皮下移植した。ヌードマウスは、ＢＡＬＢ／ｃ（アルビノ）遺伝的背景を有するので、移植用として毛の色が暗色のＣ５７ＢＬ／６マウス由来の表皮細胞を使用することにより、新規に形成された毛と既存の毛は区別できる。毛誘導能を、移植１回につき形成される毛髪の数として測定した。パッチ方法では、新規に形成された毛は、形態形成の進行段階において毛嚢形態を乱すので、これが皮膚表面に進入することはできない。したがって、毛嚢が形成されたが、十分には発達していない、移植１４日後に分析を実施した。表皮細胞の移植単独では、おそらく内因性のＤＰ細胞の存在に起因して、最低限の毛誘導しか引き起こさなかった（図２Ａ、２Ｂ）。マウス真皮細胞（ｍＤＣ）は、陽性対照として使用され、同一の移植モデルについてこれまでに報告された効率と類似した効率で、強力な発毛を誘導した（Ｐ＝０．０２８２）［２７］（図２Ａ、２Ｂ）。期待通りに、成人頭皮の皮膚から単離されたヒトＤＰ培養細胞は、陰性対照（ケラチノサイト単独）と比較して、有意な数の毛を誘導しなかった（図２Ａ、２Ｂ）。確かに、ヒトＤＰ細胞は、単一毛の異種間再形成に寄与することが示されているが［１４］、ヒトＤＰ細胞の強力な毛誘導能力は、マウスモデルにおいていまだ報告されていない［１８］。対照的に、ｍＤＣの毛誘導と類似したｈＥＳＣ−ＤＰによる有意な（Ｐ＝０．０００２）毛誘導が認められた（図２Ａ、２Ｂ）。
【００５３】
ｈＥＳＣがＤＰ様細胞に向かって分化する間の毛誘導特性の動力学をモニターするために、ｈＥＳＣ−ＤＰおよびいくつかの関連する細胞集団、すなわちＮＣ誘導の中間ステップを省略してＤＰ培地中で２週間分化させたｈＥＳＣ（ｈＥＳＣ）、ｈＥＳＣ−ＮＣ、および部分的に分化させたｈＥＳＣ−ＤＰ（７日間の分化）を移植した（図２Ｃ）。驚くべきことに、血清条件において分化させたｈＥＳＣならびにｈＥＳＣ−ＮＣの移植は、陰性対照と比較して、有意な発毛阻害を引き起こした（図２Ｃ）。したがって、ｈＥＳＣ−ＮＣのｈＥＳＣ−ＤＰ細胞への分化は、毛誘導能力について約１００倍の増加を引き起こした（図２Ｃ）。部分的に分化したｈＥＳＣ−ＮＣ移植物において形成された毛の数は、陰性対照と有意に異ならなかった（図２Ｃ）。
【００５４】
これらの結果は、本明細書に記載されるｈＥＳＣ−ＤＰ細胞は、新生仔期のマウス真皮細胞の毛誘導能と類似した強力な毛誘導能を有すること、およびｈＥＳＣ−ＮＣは分化手順に沿ってこの能力を獲得することを示唆する。
【００５５】
新規に形成された毛嚢のＤＰへのｈＥＳＣ−ＤＰの組み込み
移植されたｈＥＳＣ−ＤＰは、内因性のマウスＤＰ細胞を補充する／活性化させる可能性がある、または毛嚢形成において認められた誘導を直接媒介する可能性がある。この問題に対処するために、ｈＥＳＣ−ＤＰを、ＧＦＰを発現するように操作し、新規に形成された毛嚢をｉｎ  ｓｉｔｕで分析した（図３）。パッチ方法を使用してヌードマウスの皮下に移植１４日後に、毛幹の黒色色素沈着により決定可能な新規毛形成を観察した。ｈＥＳＣ−ＤＰ移植の立体視観察より、大部分のＤＰおよび新規に形成された毛の真皮性カプセルは、ＧＦＰ陽性細胞から構成されたことが示唆された（図３Ａ）。ｈＥＳＣ−ＤＰ移植物から単離された毛の全組織標本について共焦点顕微鏡法により、新規に誘導された毛内でのＧＦＰ陽性ＤＰ細胞の存在が示された（図３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ）。これらの毛のＧＦＰ陽性ＤＰは、特異的マーカー、すなわちバーシカン（Versican）（図３Ｃ）およびＡＰ（図３Ｄ）について陽性染色された。ＧＦＰ陽性ＤＰに加えて、外部および内部の毛根鞘領域内にＧＦＰ陽性細胞が存在することが認められた（図３Ｅ）。毛マトリックス内のＧＦＰ陽性細胞の細胞質内にメラニン顆粒が存在することも認められた（図３Ｆ）。これらのデータは、移植されたｈＥＳＣ−ＤＰは、ＤＰ細胞の毛誘導機能を獲得し得ることを示唆する。
【００５６】
ｈＩＰＳＣ−ＤＰの誘導および特徴付け
ヒトＥＳＣのＨ９系統に加えて、ヒト正常ＢＪ線維芽細胞から生成された、これまでに特徴付けがなされたヒト誘導多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）３系統を使用した［３０］。これまでに記載されたプロトコールに従いｈＩＰＳＣ−ＮＣ細胞を生成し、神経上皮マーカーであるＳｏｘ２、Ｓｏｘ９、およびネスチンの存在について分析した。３系統から得られたｈＩＰＳＣ−ＮＣはすべて、類似した発現パターンを示した。約５０％のｈＩＰＳＣ−ＮＣ細胞がＳｏｘ２およびＳｏｘ９を発現したに過ぎず、さらにネスチン染色により、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞と比較して、形態的な差異が明らかになった（図８Ａ、図１Ｄ）。
【００５７】
上記プロトコールを使用して、ｈＩＰＳＣ−ＮＣ細胞を分化させてｈＩＰＳＣ−ＤＰを得た。ＤＰマーカーであるＳＭＡ、ｐ−７５、およびネスチンの免疫染色、ならびにバーシカン（Versican）、ネキシン−１、ｐ−７５、ビメンチン、およびＳＭＡのＱ−ＰＣＲ分析より、１つのｈＩＰＳＣ系統（ＢＪ１６）のみが、ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞と比較して、ＤＰマーカーを若干発現する細胞をもたらすことが示された（図８Ｂ）。図８Ｃは、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞と比較して、ｈＩＰＳＣ−ＤＰの遺伝子発現レベルを示す。
【００５８】
ＢＪ１６  ＩＰＳＣ−ＤＰ細胞を、パッチ移植法によりさらに特徴付けした。この細胞集団は、陰性対照と比較して、有意な数の毛を誘導しなかった。しかし、ＧＦＰ陽性ＢＪ１６  ＩＰＳＣ−ＤＰ細胞の移植は、ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞の場合よりも頻度はかなり低いものの（５０個のうち１本の毛）、ＧＦＰ陽性真皮乳頭および真皮性カプセルを伴う毛の形成を引き起こした。これらの毛のＤＰ内にＧＦＰ陽性細胞が存在することを、切片で確認した（図３Ｂ）。
【００５９】
注目すべきこととして、移植された細胞が、新規に形成された毛の乳頭突起およびカプセル領域に組み込まれたことが、ｈＥＳＣ−ＤＰおよびｈＩＰＳＣ−ＤＰ細胞の場合に限って認められた。ＧＦＰを発現するように操作された、移植されたヒトＤＰ細胞が真皮内に存在したが、これらの細胞は、隣接した毛嚢のＤＰには見出されなかった（図７）。これらの結果は、ヒト多能性細胞由来のＤＰ様細胞は、いくつかの特定マーカーの発現について、成人ヒト皮膚から単離されたＤＰ細胞と共有するが、その毛誘導能はより高く、細胞に基づく脱毛疾患処置に適用可能であることを示唆する。
【００６０】
ｈＥＳＣ−ＤＰの誘導におけるＢＭＰシグナル伝達の役割
発生の間に遊走性ＮＣからＤＰが生成する際の、これに関係する機構は不明である。しかし、ＮＣ細胞からＤＰ分化を誘導するのに使用されるウシ胎児血清は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むことが公知であり［３１］、それは、胚発生の間の中胚葉の細胞運命（mesoderm  specification）［３２、３３］、およびｈＥＳＣからの中胚葉のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導［３４］において不可欠である。ＢＭＰシグナル伝達が、マウス背部皮膚ＤＰにおいて、毛嚢誘導能力を維持する機構であることが示された［９］。ＢＭＰシグナル伝達が、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞からｈＥＳＣ−ＤＰ細胞に誘導する際に、どのような役割を演じているか、十分に試験済みの選択的ＢＭＰインヒビターであるドルソモルフィンを使用して調べた［３５］。ＮＣからＤＰへの変換の間にドルソモルフィンを添加すると、陽性対照と比較して細胞形態に明らかな変化が生じたが、特に、ｈＥＳＣ−ＤＰ細胞は、特徴的な線維芽細胞様の引き延ばされた形態を有した一方、ドルソモルフィン処理された細胞は、六角形であり、細胞質内に多重顆粒が存在することを実証した（図４Ａ）。さらに、ヌードマウスの皮下に移植されたドルソモルフィン処理した細胞は、毛形成について誘導不能であり、ＤＰ特性の喪失を示唆する（図４Ａ）。ドルソモルフィン処理した細胞のＱ−ＰＣＲ分析により、ＢＭＰシグナル伝達を阻害すると、ＤＰ特異的マーカーのバーシカン（Versican）（Ｐ＝０．０００２）、コリン（Ｐ＝０．００２２）、ネキシン−１（Ｐ＝０．０００８）、およびビメンチン（Ｐ＝０．０００１）をコードするｍＲＮＡのレベルの有意な減少を引き起こしたが、汎ＮＣマーカーであるｐ−７５（変化なし）または平滑筋マーカーのＳＭＡ（有意に増加）には当てはまらないことが明らかにされた（図４Ｂ）。しかし、ＤＰ細胞は、ＢＭＰを唯一の分化剤として使用してｈＥＳＣ−ＮＣ培養物から誘導することはできず、他のシグナル伝達経路が頭部ＤＰ細胞運命獲得に関与することを示唆している。これらの結果は、ＢＭＰシグナル伝達は、毛誘導性ｈＥＳＣ−ＤＰをｈＥＳＣ−ＮＣ細胞から生成および／または維持するのに必要であるものの、十分でないことを示す。
【００６１】
結果は、血清含有培地中で培養された、ｈＥＳＣから誘導されたＮＣ細胞は、ヒトＤＰ細胞のマーカーを漸増的に獲得し、また毛誘導能力を有する接着細胞集団を生じることを示唆する。ヒトＤＰ細胞と比較してｈＥＳＣ−ＤＰの毛誘導能が強力であることは、異なる機構を経由して毛嚢形成を誘導することが公知である真皮乳頭前駆細胞の胚性または新生児期の集団とｈＥＳＣ−ＤＰが類似性しており、そのような主たる類似性を反映するかもしれない［３６］。
【００６２】
ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物は、不均質と思われる。この培養物が示す平均的な毛誘導能は、新生児期のマウス真皮細胞の能力と類似した。将来を見越して精製された一次マウスＤＰ細胞は、毛の誘導について、マウス真皮調製物よりも約５倍効率的であることが示された［２７］。したがって、ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物は、上記で報告された平均値よりもさらに高い毛誘導能を有する毛誘導性ＤＰ様細胞の部分集団を含んでいる可能性がある。さらに、ＧＦＰ陽性ｈＥＳＣ−ＤＰを移植したとき、毛嚢の別の区画（すなわち、外部毛根鞘、内部根鞘、および毛マトリックス）内にＧＦＰ陽性細胞の存在を認めた。メラニン形成細胞は、発生の間の遊走性ＮＣに由来することが公知であるので、ｈＥＳＣ−ＮＣ細胞の一部は、ｈＥＳＣ−ＤＰ培養物内にメラニン形成細胞前駆体を生じる可能性がある。同様に、齧歯類のＮＣ細胞は、髭のバルジ内で表皮幹細胞を生じることが可能であるので、ｈＥＳＣ−ＮＣの一部は、新規に形成された毛のケラチノサイトを生じる可能性がある［３７］。これらのデータは、ｈＥＳＣ−ＤＰが、毛誘導特性を有するＤＰ様細胞を含む、ＮＣから誘導された細胞の混合集団であるが、メラニン形成細胞およびケラチノサイト形成細胞も含み得ることを示唆する。
【００６３】
結果は、ｈＥＳＣがＮＣ系列に分化する際の中間ステップが重要と思われ、ＮＣ誘導をスキップすると、毛誘導活性が完全に失われることを示唆する。ｈＥＳＣをＮＣ細胞に方向付けることは、間葉細胞型の多様性を、皮膚においてＣ細胞よりも下流に位置する発生的に指定されたサブセット（例えば、発生の間の頭部ＤＰ、メラニン形成細胞、頭部のバルジ）に限定し得る。したがって、ｈＥＳＣ−ＤＰ様細胞は、比較的共通の間葉富化条件、例えば血清含有培地中での分化、および接着細胞型の選択等を使用して、毛誘導性ＤＰ様細胞について顕著に濃縮された状態となる。
【００６４】
異なるｉＰＳＣ系統は、ＤＰ様細胞に分化する可変の傾向を有し得る。ｈｉＰＳＣ−ＤＰ細胞は、パッチ方法を使用して移植した場合、毛嚢形成を誘導することはできず、また新規に形成された毛嚢のＤＰへの組み込み頻度は低かった。これは、ＩＰＳＣ分化に影響を及ぼすことが公知のエピジェネティックメモリー現象の結果であり得る［３８、３９、４０］。この実験で使用したＩＰＳＣ系統は、ＢＪ線維芽細胞に由来した［３０］。それが中胚葉に起源していることは、分化の第１のステップ−外胚葉神経堤細胞の誘導を困難にしているおそれがある。確かに、一部のｈＩＰＳＣ−ＮＣ細胞のみが、神経上皮のマーカーであるＳｏｘ２およびＳｏｘ９を発現した（図８Ａ、８Ｂ）。しかし、複数のｈｉＰＣＳ系統およびｈＥＳＣ系統をグローバルに比較した場合、十分に多数のｈｉＰＳＣ系統を、ｈＥＳＣ系統と比較したとき、それらの分化能における主要な重複が認められることが示唆された［４１］。したがって、絶対的な効率は、異なるｈＥＳＣ系統とｈｉＰＳＣ系統の間で変化し得るものの、多くのｈｉＰＳＣから毛誘導特性を有する細胞を誘導することが可能であるはずである［４２］。
【００６５】
最近、ＳＫＰは、毛誘導において極めて強力であることが示されたが［２７］、加齢プロセスにおいてＳＫＰが徐々に失われることが、高齢者を被験体とした毛髪再生療法のための、自己ＳＫＰの単離を妨げ得る［４３］。毛髪誘導性のＤＰ様細胞をｈＥＳＣから誘導することが、毛を失った人々を被験体とした細胞に基づく処置の開発に向けた第一歩となる。
【００６６】
材料および方法
ｈＥＳＣ培養：これまでの記載に従い、照射済（eradiated）マウス胚性線維芽細胞フィーダー層上でＨ９  ｈＥＳＣ系統を維持した［２４］。ｈＥＳＣからのＮＣ細胞の生成：分化プロトコールはこれまでに記載されている［２４、２５］。ＥＳＣ−ＤＰの生成：第１継代のＮＣ細胞を、下記の組成のＤＰ培地を用いて３日間培養した：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ  １０８２９−０１８）、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０４３７）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０−０８１）、１×抗生物質／抗真菌薬（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＡ−４０）。その後、この細胞を、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ  ２５２００）を用いて単細胞懸濁物に解離させ、そして細胞１００，０００個／ｍｍ−２の密度で未コーティングの培養皿にプレーティングした。２４時間後、接着できなかった浮遊細胞を、翌日培地変更して除去した。接着した細胞を、１日おきに培地を変更しながら未コーティングのプラスチック皿で増殖させた；培養物を４〜５日毎に継代した。
【００６７】
免疫組織化学およびＦＡＣＳ分析：細胞培養物を、ＰＢＳ中４％のＰＦＡを用いて室温で１０分間固定した；組織試料を４°で、終夜固定した。固定後、細胞を、ＰＢＳ中、５分間、３回洗浄し、そして組織試料を、凍結切片用としてＯＣＴに包埋したが、または毛の解剖および全組織標本調製で使用した。細胞および切片を、ＰＢＳ中に０．０５％〜０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８７８７）を含む４％のＢＳＡまたは１０％のヤギ血清内で、染色前に１時間ブロックした。一次抗体を４℃で、終夜適用した。細胞または切片を、次にＰＢＳ中、各１５分間、３回洗浄した。二次抗体（ＰＢＳ中で１：５００に稀釈した）を、室温、暗所で１時間適用した。細胞を、ＰＢＳ中、各１０分間、３回洗浄した。核をＨｏｅｃｈｓｔまたはＤａｐｉを用いて標識した。ＦＡＣＳ分析の場合、目的の細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて引きはがし、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で２０分間再懸濁して、非特異的結合をブロックした。次に細胞を、氷上で３０分間、一次抗体と共にインキュベーションした。次に細胞を３ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、適切な二次抗体（１：１０００）を含む３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中に３０分間再懸濁し、３ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベーションした。細胞を、蛍光により基づき分類し（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ  ＤｉＶａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。下記の抗体を使用した：マウスモノクローナルＣＤ４７（Ｒ＆Ｄ）、マウスモノクローナルＣＤ１８４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスモノクローナルＣＤ４４（Ｎｏｖｕｓ）、ヤギポリクローナルＦｏｘｄ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ウサギポリクローナルＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウスモノクローナルＩＴＧＡ４（Ｒ＆Ｄ）、マウスモノクローナルネスチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウスモノクローナルＯＣＴ３／４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ウサギポリクローナルＰ−７５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウスモノクローナルＳＭＡ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ウサギポリクローナルＳｏｘ２（Ａｂｃａｍ）、ウサギポリクローナルＳｏｘ９（ミリポア）、ウサギポリクローナルＳｏｘ１０（Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナルＳＳＥＡ４（Ｒ＆Ｄ）、マウスモノクローナルバーシカン（Versican）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００６８】
Ｑ−ＰＣＲ：全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出し、そして１μｇの全ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の提案に基づいて使用して逆転写し、そしてｃＤＮＡを作製した。Ｑ−ＰＣＲを、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎマスターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の推奨に基づいて用いて実施した。Ｑ−ＰＣＲの場合、１８Ｓ発現レベルを正規化に使用し、標準曲線方法を使用してデータを分析した。Ｑ−ＰＣＲを以下の通り実施した：初期の変性：９５℃で１０分間、４０サイクルの変性：９５℃で３０秒間、アニーリング：５６℃で１分間、伸長：７２℃で３０秒間、ならびに９５℃で１分間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリングおよび９５℃で３０秒間の最終変性の最終サイクル１回。リアルタイムＱ−ＰＣＲプライマーを表１にまとめる。
【表１−１】
2017525672.tif 000003
【表１−２】
2017525672.tif 000004
【００６９】
細胞：異なる継代のＥＳＣ−ＤＰ細胞を取得した。０．１％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  ２５２００）を用いて、細胞を単細胞懸濁物に解離し、そして一続きの遠心分離（１２００ＲＰＭで５分間）によりＰＢＳで３回洗浄した。最終的に、１００μｌ当たり５百万個の濃度で細胞をＤＰ培地中に再懸濁し、移植されるまで氷上で保管した。
【００７０】
マウス表皮細胞および真皮細胞を、ｐ０−ｐ２  ＢＬ６マウスの皮膚から取得した。背部皮膚を単離し、氷上に配置し、抗生物質／抗真菌薬（最終１×；Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＡ−４０）を含むＰＢＳで、５分間振盪しながら５回洗浄し、ＰＢＳ中の０．０１％Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）において終夜、４０℃でインキュベーションした。皮膚の表皮層を鉗子で単離し、ＰＢＳで５分間洗浄し、そして０．１％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液中、３７０Ｃで、８分間インキュベーションした。皮膚の皮層をはさみでホモジナイズし、０．１％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液により、３７０Ｃで４５分間消化した。ＤＰ培地を添加して酵素活性をブロックし、表皮または真皮を、１０分間激しくピペット処理した。細胞懸濁物を細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ９２６１３６５）で単離し、遠心分離（１２００ＲＰＭで５分間）によりＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を、１００μｌ当たり細胞５百万個でＤＰ培地中に再懸濁し、移植されるまで氷上で保管した。
【００７１】
ヒト真皮乳頭細胞：本試験でのヒト組織から誘導された試料の使用は美容上の医療行為２例から得られた廃棄皮膚組織の使用に限定された。皮膚を抗生物質／抗真菌薬（最終１×；Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＡ−４０）を含むＰＢＳ中で、５分間振盪しながら１５回洗浄した。次に脂肪を含有する毛嚢を外科用メスで単離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中の０．２％のＤｉｓｐａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）において、４０℃で、終夜インキュベーションした。毛嚢を、鉗子を用いて脂肪から単離し、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２に溶解した０．１％のコラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ）中において、５〜７時間インキュベーションした。次にＤＰを、激しいピペッティングを１０分間行うことにより、残りの濾胞から引きはがした。毛嚢が底部に沈降した後、ＤＰは上清内に留まり、これを１０００ＲＰＭで５分間遠心分離することにより単離した。
【００７２】
細胞移植：細胞移植の方法は、これまでに詳細に記載されている［２７］。要するに、目的の細胞（ＥＳＣ−ＮＣ、初期ＥＳＣ−ＤＰ、ＥＳＣ−ＤＰ、ｒＤＰ  ｐ２）の懸濁液（細胞５×１０５個）１００μｌを、表皮細胞の懸濁液（細胞５×１０５個）１００μｌと合わせ、そして皮下注射により、免疫不全マウス（胸腺欠損系統Ｎｕ／Ｎｕ）に移植した。１４〜２１日後、マウスを安楽死させ、移植物を分析した。陰性対照の場合、表皮細胞のみを移植した。
【００７３】
参考文献
下記参考文献のそれぞれを、参照によりその全体が本明細書において明示的に援用される。
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【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「を含む（comprising）」とは、「を含む（including）」、「を含む（containing）」、または「を特徴とする（characterized  by）」と同義であり、また包括的または非限定的であり、追加の、列挙されない要素、または方法のステップを除外しない。
【００７５】
上記説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示する。本発明は、方法および材料の修正、ならびに製造法および機器の変更につき、その受け入れが容易である。かかる修正は、本明細書に開示する本発明のこのような開示または実践を検討することにより、当業者にとって明白となる。したがって、本発明が、本明細書に開示の特定の実施形態に限定されるようには意図されておらず、むしろ、本発明の真の範囲および精神に含まれるあらゆる修正形態および代替法も被験体に含まれるように意図されている。
【００７６】
公開および未公開の出願、特許、および文献の参考文献を含むが、これらに限定されない本明細書に引用するすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用され、よって本明細書の一部をなす。参照により援用される刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書が、そのようなあらゆる矛盾した事項にとってかわる、および／または優先することが意図されている。
【図１Ａ−Ｃ】
2017525672.tif 000005
【図１Ｄ】
2017525672.tif 000006
【図１Ｅ】
2017525672.tif 000007
【図２Ａ】
2017525672.tif 000008
【図２Ｂ−Ｃ】
2017525672.tif 000009
【図３Ａ−Ｂ】
2017525672.tif 000010
【図３Ｃ−Ｄ】
2017525672.tif 000011
【図３Ｅ−Ｆ】
2017525672.tif 000012
【図４Ａ−Ｂ】
2017525672.tif 000013
【図５】
2017525672.tif 000014
【図６】
2017525672.tif 000015
【図７】
2017525672.tif 000016
【図８Ａ】
2017525672.tif 000017
【図８Ｂ】
2017525672.tif 000018
【図８Ｃ】
2017525672.tif 000019
【配列表】
2017525672000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月21日(2017.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において発毛を誘導するための組成物であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を含む、組成物。
【請求項２】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、接着細胞を選択することによって生成される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項３から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項３から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することによって生成される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することによって生成される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることによって生成され、ここで、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、ドナー被験体から得られる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ドナー被験体と前記被験体が同一である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ドナー被験体と前記被験体が異なる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、皮下移植によって投与されるものであることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
被験体の皮膚の場所において発毛を誘導するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記場所は、被験体の集団において皮膚が毛を含む場所である、組成物。
【請求項１９】
頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、前記被験体の皮膚の場所において発毛を誘導するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
瘢痕組織を含む前記被験体の皮膚の場所において発毛を誘導するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記被験体が、脱毛症を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記被験体が、ヒトである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
発毛を調節する因子をスクリーニングする方法であって、
誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させることと、
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団において、発毛に対する影響を測定することと
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の増加を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の減少を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記影響が、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の特定の場所に特徴的な毛の増殖を含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、哺乳動物のものである、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、ヒトのものである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｖｏで接触する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
接着細胞を選択することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
誘導された真皮乳頭細胞の集団を調製するための方法であって、前記集団を、誘導された神経堤細胞の集団から生成することを含む、方法。
【請求項４５】
接着細胞を選択することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項４４から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４４から５５のいずれか一項に記載の方法により調製される、誘導された真皮乳頭細胞の集団。
【請求項５７】
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、請求項４４から５５のいずれか一項に記載の方法により調製される、請求項１に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、被験体において発毛（hair  growth）を誘導するための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を被験体に投与することを含む、方法を含む。また、一部の実施形態は、誘導された真皮乳頭細胞の集団を取得することも含む。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、誘導された神経堤細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、誘導された神経堤細胞の集団から生成される。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、誘導された真皮乳頭細胞の集団を調製するための方法であって、前記集団を、誘導された神経堤細胞の集団から生成することを含む、方法を含む。また一部の実施形態は、接着細胞を選択することも含む。一部の実施形態では、誘導された真皮乳頭細胞の集団は、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、上記方法のうちの任意の１つにより調製される、誘導された真皮乳頭細胞の集団を含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
被験体において発毛を誘導するための方法であって、誘導された真皮乳頭細胞の集団を前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団を取得することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目１から２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
接着細胞を選択することを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目４から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、項目４から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、項目４から７のいずれか一項の項目に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、ドナー被験体から得られる、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ドナー被験体と前記被験体が同一である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ドナー被験体と前記被験体が異なる、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記投与が、皮下移植を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記投与が、被験体の集団における場所であって毛を含む前記被験体の皮膚の場所に対するものである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記投与が、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、前記被験体の皮膚の場所に対するものである、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記投与が、瘢痕組織を含む前記被験体の皮膚の場所に対するものである、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体が、脱毛症を有する、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記被験体が、哺乳動物である、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記被験体が、ヒトである、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
発毛を調節する因子をスクリーニングする方法であって、
誘導された真皮乳頭細胞の集団を試験因子と接触させることと、
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団において、発毛に対する影響を測定することと
を含む、前記方法。
（項目２６）
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の増加を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記影響が、前記試験因子と接触しなかった誘導された真皮乳頭細胞の集団と比較した、前記誘導された真皮乳頭細胞の集団における発毛率の減少を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記影響が、頭皮、顔面、上唇、頤部、まゆ毛、まつ毛、腕部、脚、背部、胴、および腹部からなる群から選択される、被験体の皮膚の特定の場所に特徴的な毛の増殖を含む、項目２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記被験体が、哺乳動物である、項目２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記被験体が、ヒトである、項目２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｖｏで接触する、項目２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、前記試験因子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触する、項目２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、誘導された神経堤細胞の集団から生成される、項目２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
接着細胞を選択することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目３４から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、項目３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、項目３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
誘導された真皮乳頭細胞の集団を調製するための方法であって、前記集団を、誘導された神経堤細胞の集団から生成することを含む、方法。
（項目４６）
接着細胞を選択することを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、Ｐ−７５、ネスチン、バーシカン、平滑筋アクチン、アルカリホスファターゼ、およびビメンチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンからなる群から選択されるマーカーを含む、項目４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く、項目４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記誘導された神経堤細胞の集団が、幹細胞の集団から生成される、項目４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記幹細胞のクラスターが形成される条件下で、前記幹細胞の集団を培養することを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記クラスターを懸濁状態で培養して、球塊を形成することを含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
基材の表面上に前記球塊をプレーティングすることであって、前記表面がフィブロネクチンまたはポリオルニチンでコーティングされていることを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記誘導多能性幹細胞が、線維芽細胞、腎上皮細胞、および血球からなる群から選択される供給源から生成される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記幹細胞の集団が、Ｈ９細胞、およびヒトＢＪ線維芽細胞から生成したヒト誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５７）
項目４５から５６のいずれか一項に記載の方法により調製される、誘導された真皮乳頭細胞の集団。
（項目５８）
被験体において発毛を誘導するための、誘導された真皮乳頭細胞の集団の使用。
（項目５９）
前記誘導された真皮乳頭細胞の集団が、項目４５から５６のいずれか一項に記載の方法により調製される、項目５８に記載の使用。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の特徴として、タンパク質、発現した核酸等の神経堤細胞と関連したマーカー、メラニン形成細胞等の細胞を生成する能力を有する活性、頭蓋顔面の軟骨および骨、平滑筋、末梢ニューロンおよび腸ニューロン、ならびにグリアを挙げることができる。例示的なマーカーとして、Ｓｏｘ１０、Ｆｏｘｄ３、インテグリンアルファ４、フィブロネクチンの同族受容体、ＣＤ４７、ＣＤ１８４、ＣＤ４４、Ｐ−７５、およびネスチンが挙げられる。一部の実施形態では、誘導された神経堤細胞の集団は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、バーシカン、平滑筋アクチン、およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるマーカーを欠く。
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月4日(2017.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017525672000001.app
【国際調査報告】
2017525672.tif 000020
2017525672.tif 000021
2017525672.tif 000022