(57)【要約】  キメラ遺伝子調節エレメントを使用して、植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。詳細には、構築物はトウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５から得られた上流プロモーターポリヌクレオチド配列、ならびにそれに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲを含むキメラポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む。得られたプロモーター配列は、キメラ遺伝子調節エレメントを含む。キメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを使用して導入遺伝子を発現する植物を生育する方法がさらに開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズするキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１を含む、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１からなる、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記導入遺伝子がｔｃｄＡである、請求項５に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
導入遺伝子の根優先的発現を促進する、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
前記根優先的発現がトウモロコシ根優先的発現を含む、請求項８に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
【請求項１１】
前記合成ポリヌクレオチドが配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１２】
前記合成ポリヌクレオチドが配列番号１を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１３】
前記トランスジェニック細胞が植物形質転換法により生産される、請求項１０に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１４】
前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項１３に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１５】
前記合成ポリヌクレオチドが組織優先的プロモーターである、請求項１０に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１６】
前記組織優先的プロモーターが根組織優先的プロモーターである、請求項１５に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１７】
請求項１０に記載のトランスジェニック細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１８】
単子葉植物または双子葉植物である、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される、請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
請求項１７に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月２８日出願の米国特許仮出願第６１／９４６０６６号の３５  ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下での利益を主張し、明らかに参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出される配列表への言及
配列表の公式謄本は、ファイル名「６８２４２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１５年２月２６日作成、サイズ４９．７キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマット配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出し、本明細書と同時に提出される。ＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は一般的には植物分子生物学の分野に関し、さらに詳細には植物における導入遺伝子の発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの植物種が導入遺伝子で形質転換されて農学的に望ましい形質または特徴を導入することができる。植物種は特定の望ましい形質を有するように開発されるおよび／または改変される。一般的には、望ましい形質には、例えば、栄養価品質を改善する、収率を増加させる、害虫もしくは病害への抵抗性を与える、耐乾燥性およびストレス耐性を増加させる、園芸品質（例えば、色素沈着および成長）を改善する、除草剤抵抗性を分け与える、植物由来の工業的に有用な化合物および／もしくは材料の生産を可能にする、ならびに／または医薬品の生産を可能にすることが含まれる。
【０００５】
単一のゲノム遺伝子座にスタックされている複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は植物形質転換技術により生産される。植物形質転換技術により、導入遺伝子の植物細胞への導入、植物ゲノムに導入遺伝子の安定的に組み込まれたコピーを含有する稔性導入遺伝子植物の回収がもたらされ、植物ゲノムの転写および翻訳によるその後の導入遺伝子の発現により望ましい形質および表現型を有するトランスジェニック植物が生じる。しかし、形質スタックとして工学的に作製された複数の導入遺伝子を高度に発現するトランスジェニック植物種の生産を可能にするメカニズムが望ましい。
【０００６】
同様に、植物の特定の組織または器官内での導入遺伝子の発現を可能にするメカニズムが望ましい。例えば、土壌伝播性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原体抵抗性タンパク質が植物の根内で強く発現されるように、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することにより実現し得る。代わりに、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発生期にある植物組織において導入遺伝子を発現させることが望ましい場合がある。
【発明の概要】
【０００７】
キメラプロモーター調節エレメント（例えば、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲを含むプロモーター配列）が本明細書では説明される。キメラプロモーター調節エレメントを利用する構築物および方法がさらに説明される。
【０００８】
植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が本明細書で開示される。一実施形態では、構築物はトウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５から得られた上流プロモーターポリヌクレオチド配列、ならびにそれに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲを含むキメラポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む。こうして得られたキメラプロモーター配列は、新規のキメラ遺伝子調節エレメントを含む。
【０００９】
一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結されたキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの導入遺伝子を含む。
【００１０】
キメラ遺伝子プロモーター調節エレメント（例えば、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲ）を使用して導入遺伝子を発現する植物を生育する方法が本明細書で開示されている。キメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを使用して導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法も本明細書で開示されている。一実施形態では、本明細書に開示されている方法は、植物根における組織特異的遺伝子発現を含む。キメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを含むポリヌクレオチド配列を単離する方法も本明細書で開示される。
【００１１】
一実施形態では、本開示は導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットに関し、プロモーターは配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。実施形態の続く態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の態様では、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする。さらなる態様では、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一態様では、実施形態は、３’−非翻訳領域を含む遺伝子発現カセットに関する。一実施形態では、本開示は遺伝子発現カセットを含む組換えベクターに関する。実施形態の一態様では、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される。他の実施形態では、本開示は遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞に関する。別の実施形態では、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。さらなる実施形態では、本開示はトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。実施形態の一態様では、トランスジェニック植物は単子葉または双子葉植物である。他の態様では、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、本開示はトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子に関する。別の実施形態では、プロモーターは組織優先的プロモーターである。続く実施形態では、組織優先的プロモーターは根組織優先的プロモーターである。
【００１２】
一実施形態では、本開示は、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞に関する。実施形態の一態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態のさらなる態様では、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。別の態様では、トランスジェニック植物細胞は植物形質転換法により生産される。他の態様では、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。さらなる実施形態では、本開示はトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。実施形態の一態様では、トランスジェニック植物は単子葉または双子葉植物である。他の態様では、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、本開示はトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子に関する。追加の実施形態では、プロモーターは組織優先的プロモーターである。さらなる実施形態では、組織優先的プロモーターは根組織優先的プロモーターである。
【００１３】
一実施形態では、本開示は配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズするキメラポリヌクレオチド配列に関する。実施形態の別の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる態様では、キメラポリヌクレオチド配列は導入遺伝子に作動可能に連結されている。別の態様では、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする。一態様では、キメラポリヌクレオチド配列は導入遺伝子に作動可能に連結されている。さらなる態様では、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。追加の実施形態では、本開示は遺伝子発現カセットを含む組換えベクターに関する。さらなる態様では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される。一実施形態では、本開示は遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞に関する。他の態様では、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態では、本開示はトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。追加の一態様では、トランスジェニック植物が単子葉植物である。さらなる態様では、単子葉植物がトウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態では、本開示はトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子に関する。実施形態のさらなる態様では、キメラポリヌクレオチド配列は導入遺伝子の根優先的発現を促進する。
【００１４】
一実施形態では、本開示はトランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
３’−非翻訳領域に作動可能に連結されている、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること、
遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること、
形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生させること、および
配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む方法に関する。
【００１５】
実施形態の一態様では、異種コード配列は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養品質コード配列、ＤＮＡ結合コード配列、および選択可能マーカーコード配列からなる群から選択される。他の態様では、植物細胞を形質転換することは植物形質転換法である。続く態様では、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。他の態様では、トランスジェニック植物は単子葉または双子葉トランスジェニック植物である。さらなる態様では、単子葉トランスジェニック植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態では、本開示はトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子に関する。追加の態様では、異種コード配列はトランスジェニック植物組織において発現される。続く態様では、トランスジェニック植物組織はトランスジェニック植物根組織である。
【００１６】
一実施形態では、本開示は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること、
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を作製すること、
複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅させること、および
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離すること
を含む方法に関する。
【００１７】
実施形態の別の態様では、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む単離されたポリヌクレオチド配列が導入遺伝子に作動可能に連結されている。実施形態の続く態様では、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする。
【００１８】
以下の番号の実施形態が企図され、これらは非限定的である。
１．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットであって、プロモーターが、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセット。
２．ポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項１に記載の遺伝子発現カセット。
３．作動可能に連結された導入遺伝子がポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、項１に記載の遺伝子発現カセット。
４．導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、および選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、項１に記載の遺伝子発現カセット。
５．３’−非翻訳領域をさらに含む、項１に記載の遺伝子発現カセット。
６．項１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
７．プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される、項６に記載の組換えベクター。
８．項１に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
９．トランスジェニック植物細胞である、項８に記載のトランスジェニック細胞。
１０．項９に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
１１．単子葉または双子葉植物である、項１０に記載のトランスジェニック植物。
１２．単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される、項１１に記載のトランスジェニック植物。
１３．項１０に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
１４．プロモーターが組織優先的プロモーターである、項１に記載の遺伝子発現カセット。
１５．組織優先的プロモーターが根組織優先的プロモーターである、項１に記載の遺伝子発現カセット。
１６．配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
１７．合成ポリヌクレオチドが配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項１６に記載のトランスジェニック細胞。
１８．トランスジェニック細胞がトランスジェニック植物細胞である、項１６に記載のトランスジェニック細胞。
１９．トランスジェニック植物細胞が植物形質転換法により生産される、項１８に記載のトランスジェニック細胞。
２０．植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、項１９に記載のトランスジェニック細胞。
２１．項１８に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
２２．トランスジェニック植物が単子葉または双子葉植物である、項２１に記載のトランスジェニック植物。
２３．単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される、項２２に記載のトランスジェニック植物。
２４．項２１に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
２５．プロモーターが組織優先的プロモーターである、項１６に記載のトランスジェニック細胞。
２６．組織優先的プロモーターが根組織優先的プロモーターである、項１６に記載のトランスジェニック細胞。
２７．配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズするキメラポリヌクレオチド配列。
２８．ポリヌクレオチドが配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項２７に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
２９．導入遺伝子に作動可能に連結されている、項２７に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
３０．ポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、項２９に記載の作動可能に連結された導入遺伝子。
３１．項２７の導入遺伝子に作動可能に連結されたキメラポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
３２．導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、および選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、項３１に記載の遺伝子発現カセット。
３３．項３１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
３４．ベクターが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される、項３３に記載の組換えベクター。
３５．項３１に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
３６．トランスジェニック植物細胞である、項３５に記載のトランスジェニック細胞。
３７．項３６に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
３８．単子葉植物である、項３７に記載のトランスジェニック植物。
３９．単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される、項３８に記載のトランスジェニック植物。
４０．項３７に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
４１．導入遺伝子の根優先的発現を促進する、項２７に記載のキメラポリヌクレオチド配列。
４２．トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
ａ）３’−非翻訳領域に作動可能に連結されている、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること、
ｂ）遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること、
ｃ）形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生させること、および
ｄ）配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む方法。
４３．異種コード配列が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養品質コード配列、ＤＮＡ結合コード配列、および選択可能マーカーコード配列からなる群から選択される、項４２に記載の方法。
４４．植物細胞を形質転換することが植物形質転換法である、項４２に記載の方法。
４５．植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、項４４に記載の方法。
４６．トランスジェニック植物が単子葉または双子葉トランスジェニック植物である、項４２に記載の方法。
４７．単子葉トランスジェニック植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される、項４６に記載の方法。
４８．項４２に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
４９．異種コード配列がトランスジェニック植物組織で発現される、項４２に記載の方法。
５０．トランスジェニック植物組織がトランスジェニック植物根組織である、項４２に記載の方法。
５１．配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること、
ｂ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を作製すること、
ｃ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅させること、および
ｄ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること
を含む方法。
５２．配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む単離されたポリヌクレオチド配列が導入遺伝子に作動可能に連結されている、項５１に記載の方法。
５３．作動可能に連結された導入遺伝子がポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、項５２に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書で使用されるように、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の方法で明瞭かつ明確に指示していなければ、複数の対象を含む。
【００２０】
本明細書で使用されるように、用語「戻し交配」とは、栽培者が雑種子孫をその親の１つに戻し交雑させる、例えば、第１世代の交雑Ｆ１をＦ１交雑の親遺伝子型の１つと交雑させるプロセスを指す。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「イントロン」とは、遺伝子（または対象の発現されたヌクレオチド配列）に含まれ、転写されるが翻訳はされない任意の核酸配列を指す。イントロンには、ＤＮＡの発現される配列内の非翻訳核酸配列、および、そこから転写されるＲＮＡ分子内の対応する配列が含まれる。
【００２２】
本明細書に記載される構築物は、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有していてもよい。１つのこのようなイントロンの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンバリアントの遺伝子ＩＩの第１イントロンまたは他の一般に知られている任意のイントロン配列である。イントロンはプロモーター配列と組み合わせて使用すれば、翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができる。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「５’−非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端にある非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、５’−ＵＴＲは典型的にはその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを保有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡ核外輸送、翻訳機構によるｍＲＮＡの５’末端の確認、および分解に対するｍＲＮＡの保護などの多くのプロセスに関与している。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「３’−非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端にある非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、この領域はポリ（Ａ）尾部を保有し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始、およびｍＲＮＡ輸送に多くの役割を有することが知られている。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「ポリアデニル化シグナル」とは、ｍＲＮＡ転写物中に存在し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在している場合には、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位で転写を終結してポリアデニル化することが可能な核酸配列を指す。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野では既知であり、本発明に有用である。例となる配列には、Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468に記載されているＡＡＵＡＡＡおよびそのバリアントが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「単離された」とは、生物学的成分（核酸またはタンパク質を含む）であって、成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡ）から分離されている成分を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるように、核酸分子に関して、用語「精製された」は至純（例えば、均質な調製物）である必要はない。代わりに、配列がその天然の細胞環境にあるよりも比較的純度が高いという指示を表す（その天然のレベルと比べた場合、このレベルは、例えば濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも２〜５倍であるはずである）。ＤＮＡ分子は、全ＤＮＡからまたは全ＲＮＡから直接得られる。さらに、ｃＤＮＡクローンは天然には存在していないが、むしろ部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得るのが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製を含む。個別のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから精製することができる。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築および異なるｃＤＮＡクローンの精製を含むプロセスにより、天然のメッセージのおよそ１０６倍の精製がもたらされる。同様に、プロモーターＤＮＡ配列はプラスミドにクローニングすることができる。このようなクローンは天然には存在していないが、むしろ、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの、部分的に精製された天然に存在する物質の操作により得るのが好ましい。したがって、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の精製がこれらの技法においては好都合である。
【００２８】
同様に、精製は、成分ＤＮＡ配列の化学的または機能的変化が起きたという指示を表す。「精製された」核酸分子およびタンパク質には、標準精製法により精製される核酸分子およびタンパク質が含まれる。用語「精製された」には、宿主細胞（例えば、植物細胞）において組換えＤＮＡ法により調製される核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成される核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含される。
【００２９】
用語「組換えの」とは、遺伝子組換えが起きた細胞または生物を意味する。前記用語は、ヒトの介入により人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然に）改変された分子（例えば、ベクター、プラスミド、核酸、ポリペプチド、または小分子ＲＮＡ）も含まれる。改変はその天然環境もしくは状態内の分子でも、またはそこから取り除いた分子でも実施することができる。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ（小分子ＲＮＡ分子を含む）に転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）がその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスのことである。遺伝子発現は外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加させるまたは減少させる薬剤への細胞、組織、または生物の曝露により影響されることがある。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡさらにタンパク質へ向かう経路のいずれの地点で調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシング、ｍＲＮＡなどの媒介分子の分解に作用する制御を通じて、または作製された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活化、区画化、もしくは分解を通じて、またはその組合せにより起こる。遺伝子発現は、限定なしで、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で既知のいかなる方法によっても、ＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、用語「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む一般名称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれプロモーターまたは転写される配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生のために、転写阻害（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じることがある。それぞれのプロセスに異なる細胞成分が関与していることから、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古くからの共通のメカニズムの多様化から生じることが示唆される。しかし、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較を達成するのは困難であった。なぜならば、前記比較は一般的に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に頼っているからである。単一の導入遺伝子の遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターと転写される配列に対応するｄｓＲＮＡの産生のために、ＴＧＳおよびＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。
【００３２】
本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」（３つの用語全てが互いに同義である）とは、ポリマー型のヌクレオチドを指し、これにはＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成型、ならびにその混合ポリマーが含まれ得る。「ヌクレオチド」はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの改変型を指し得る。核酸分子は、他の方法で明記されなければ、通常少なくとも１０塩基長である。前記用語は未定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指し得る。前記用語は一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連結により互いに連結された天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでいてもよい。
【００３３】
当業者であれば容易に認識するように、核酸分子は化学的にもしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体での置換、ヌクレオチド間の修飾（例えば、例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸などの非電荷連結；例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸などの電荷連結；例えば、ペプチドなどのペンデント部分；例えば、アクリジン、ソラレンなどの介入物；キレート剤；アルキル化剤；および例えば、アルファアノマー核酸などの修飾連鎖）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン状、環状、およびパドロック立体構造を含む、いかなるトポロジー立体構造も含まれる。
【００３４】
転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、ＲＮＡは、（ピロリン酸の必要な脱離を伴い、）伸長する鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の逐次付加により作製されることを意味する。線形核酸分子でも環状核酸分子でも、別々のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、他のエレメントから５’方向にある同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、そのエレメントに対して「上流」にあると称することができる。同様に、別々のエレメントは、他のエレメントから３’方向にある同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、そのエレメントに対して「下流」とすることができる。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語「塩基位」とは指定された核酸内での所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、参照核酸とのアライメントによって定義することができる。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドおよびその類似物が、相補的塩基間でのワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合によりハイブリダイズするプロセスを指す。一般には、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））、またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域の間で生じる塩基対合のことである。
【００３７】
本明細書で使用されるように、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間に安定で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするのに標的配列に対して１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に結合すると標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能が妨げられ、特異的な結合が望ましい条件下、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合には生理的条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合には特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は特異的ハイブリダイゼーションと称される。特定程度の厳密性をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）はハイブリダイゼーションの厳密性に寄与することになるが、洗浄回数も厳密性に影響を及ぼす。特定程度の厳密性を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算はSambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において論じられている。
【００３８】
本明細書で使用されるように、用語「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間にあるミスマッチが５０％未満の場合にのみハイブリダイゼーションが起きる条件を包含する。「厳密な条件」はさらに特定レベルの厳密性を含む。したがって、本明細書で使用されるように、「中程度の厳密性」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態では、厳密な条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションとそれに続く６５℃での、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる、４０分間の洗浄を含むことが可能である。以下は代表的な、非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
・超高厳密性：５×ＳＳＣバッファー中、６５℃で、１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中、室温で、それぞれ１５分間の２度の洗浄；および０．５×ＳＳＣバッファー中、６５℃で、それぞれ２０分間の２度の洗浄
・高厳密性：５〜６×ＳＳＣバッファー中、６５〜７０℃で、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中、室温で、それぞれ５〜２０分間の２度の洗浄；および１×ＳＳＣバッファー中、５５〜７０℃で、それぞれ３０分間の２度の洗浄
・中程度の厳密性：６×ＳＳＣバッファー中、室温〜５５℃で、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２〜３×ＳＳＣバッファー中、室温〜５５℃で、それぞれ２０〜３０分間の少なくとも２度の洗浄
一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は超高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は中程度の厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。
【００３９】
本明細書で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合化することにより形成することができる。自動合成装置により、数百塩基対長までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡから構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小ＤＮＡ配列の増幅のための技法である、ポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応では、オリゴヌクレオチドは典型的には「プライマー」と呼ばれ、これのおかげでＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長させて相補鎖を複製することが可能になる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されているように、微少量の核酸、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡを増幅させる手順または技法を指す。一般には、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、対象の領域の末端またはその後ろからの配列情報が入手可能である必要がある。これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対の鎖と配列が同一であるまたは類似していることになる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致していてもよい。ＰＣＲを使用して全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ由来の特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列、バクテリオファージ、もしくはプラスミド配列などを増幅させることができる。一般には、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) を参照されたい。
【００４１】
本明細書で使用されるように、用語「プライマー」とは、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合に、相補鎖に沿って合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件には、４種の異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸および逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１つの重合化誘導剤の存在が含まれる。これらは、コファクターである成分または種々の適切な温度で、ｐＨなどの条件に影響を与える成分を含んでいてもよい適切なバッファー中に存在する。プライマーは、増幅効率が最適化されるように一本鎖配列であることが好ましいが、二本鎖配列を利用してもよい。
【００４２】
本明細書で使用されるように、用語「プローブ」とは、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）スタイルアッセイ法では、プローブは２つのプライマーのアニーリング部位の間に位置する標的の一部にハイブリダイズする。プローブは、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは約８ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含む。
【００４３】
サザンブロットアッセイ法では、プローブは膜に結合しているＤＮＡ断片にハイブリダイズする。プローブは、約１０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド、または約５，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは約５００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチドを含む。
【００４４】
プローブは、例えば放射性標識、ビオチン化標識、フルオロフォア（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネートなど）などの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えばプローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置するプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。フルオロフォアを含むプローブは、クエンチャー、例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）などをさらに含むこともできる。
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「配列同一性」または「同一性」とは、互換的に使用することができ、特定の比較窓にわたって最大一致するように整列された場合に同一である２つの配列における核酸残基を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較窓にわたり２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を指し、比較窓の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比べた場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較窓における全位置数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。比較のために配列を整列させるための方法は周知である。種々のプログラムならびにアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881−90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155−65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。
【００４７】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）は、いくつかの配列分析プログラムに関連して使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネット上で利用することが可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」セクション下で入手可能である。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメータを使用して用いることができる。参照配列に対してはるかに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価した場合、パーセンテージ同一性の増加を示すことになる。
【００４８】
本明細書で使用されるように、用語「作動可能に連結された」とは、核酸が別の核酸と機能的な関係に置かれていることを指す。一般に、「作動可能に連結された」は、連結された核酸が近接していることを意味することがある。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成され得る。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを核酸にライゲートさせるまたはアニールさせ、これを使用して近接するポリヌクレオチド断片を連結させる。しかし、エレメントは、作動可能に連結されるために近接している必要はない。
【００４９】
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」とは、ＤＮＡのうち、一般に遺伝子の上流（遺伝子の５’領域方向）に位置しており、遺伝子の転写を開始させ推進するのに必要とされる領域を指す。プロモーターは、それが制御している遺伝子の適切な活性化または抑制を可能にすることができる。プロモーターは転写因子により認識される特異的な配列を含有し得る。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合することができ、これにより、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼが動員される。プロモーターとは一般には、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロン、およびリーダー配列を含む、遺伝子の上流に位置するあらゆる遺伝子調節エレメントを指す。
【００５０】
本明細書で使用されるように、用語「上流プロモーター」とは、転写の開始を指示するのに十分である近接ポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用されるように、上流プロモーターは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列、ＴＦＩＩＢ認識エレメント、および他のプロモーターモチーフを含むいくつかの配列モチーフを有する転写開始部位を包含する（Jennifer, E.F. et al, (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592）。上流プロモーターは、ＴＦＩＩＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＨのような基本的または一般的転写因子を有する多サブユニット酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩＩに作用部位を提供する。これらの因子は会合して転写開始前複合体となり、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を触媒する。
【００５１】
上流プロモーターの活性化は、調節ＤＮＡ配列エレメントの付加配列によりなされ、このエレメントに種々のタンパク質が結合し引き続いて転写開始複合体と相互作用して遺伝子発現を活性化する。これらの遺伝子調節エレメント配列は特定のＤＮＡ結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフはｃｉｓ−エレメントと称されることもある。このようなｃｉｓ−エレメントは、組織特異的または発生特異的転写因子が結合するが、独立してまたは組み合わせて、プロモーターの時空間的発現パターンを転写レベルで決定することができる。これらのｃｉｓ−エレメントは、それが作動可能に連結された遺伝子に及ぼす制御の種類が広く異なる。いくつかのエレメントは環境応答（例えば、温度、湿度、および傷）に呼応して作動可能に連結された遺伝子の転写を増加するように作用する。他のｃｉｓ−エレメントは、発生上の合図（例えば、発芽、種子成熟、および開花）にまたは空間情報（例えば、組織特異性）に応答することができる。例えば、Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。これらのｃｉｓ−エレメントは転写開始点から様々な距離に位置しており、いくつかのｃｉｓ−エレメント（近位エレメントと称される）は最小コアプロモーター領域に隣接しており、他のエレメントはプロモーターの数キロ塩基上流にまたは下流に位置していることがある（エンハンサー）。
【００５２】
「ＤＮＡ結合導入遺伝子」は、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコード配列である。ＤＮＡ結合タンパク質は、続いて別の分子に結合することができる。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自身に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成するため）および／または異なるタンパク質（複数可）の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００５３】
ＤＮＡ結合タンパク質の例には、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学的に作製」できる、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ、およびＴＡＬＥ結合ドメインが含まれる。典型的には、工学的に作製されたＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ、またはＴＡＬＥ）は、天然には存在していないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を工学的に作製するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計したＤＮＡ結合タンパク質は、天然には存在していないタンパク質であり、その設計／組成は主に合理的基準から得られる。設計のための合理的基準は、存在するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ、および／またはＴＡＬＥ設計ならびに結合データの情報を保存するデータベース内の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；６，４５３，２４２号明細書；および６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットおよび米国出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書、２０１１０２３９３１５号明細書、および２０１１９１４５９４０号明細書を参照されたい。
【００５４】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つまたは複数のジンクフィンガーにより配列特異的な様式でＤＮＡを結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、亜鉛イオンの配位により構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学的に作製」できる。ジンクフィンガータンパク質を工学的に作製するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計したジンクフィンガータンパク質は、天然には存在していないタンパク質であり、その設計／組成は主に合理的基準から得られる。設計のための合理的基準は、存在するＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース内の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；６，４５３，２４２号明細書；６，５３４，２６１号明細書；および６，７９４，１３６号明細書を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットを参照されたい。
【００５５】
他の例では、１つまたは複数のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは工学的に作製された（天然には存在していない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原細菌は、重要な作物において多くの疾患を引き起こすことが知られている。キサントモナス（Xanthomonas）の病原性は、異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入タンパク質は、植物の転写活性化因子を模倣するおよび植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様（ＴＡＬＥＮ）エフェクターである（Kay et al (2007) Science 318:648-651参照）。これらのタンパク質はＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つはキサントモナス斑点細菌病菌（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）由来のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218:127-136および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレット参照）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集合ドメインを含有し、それぞれのリピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となるおよそ３４個のアミノ酸を含有する。さらに、それらは核局在配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（検討のため、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3):256-272参照）。さらに、植物病原細菌青枯病菌（Ralstonia solanacearum）においてｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子は、青枯病菌（R. solanacearum）次亜種株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００においてキサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが分かっている（Heuer et al (2007) Appl and Enviro Micro 73(13):4379-4384参照）。これらの遺伝子は互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１５７５ｂｐの欠失により異なる。しかし、両遺伝子産物はキサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％より低い配列同一性を有する。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。リピート配列はおよそ１０２ｂｐを含み、リピートは典型的には互いに９１〜１００％相同である（Bonas et al, ibid）。リピートの多型は通常１２番目および１３番目に位置し、ＴＡＬエフェクターの標的配列において近接するヌクレオチドの同一性を有する１２番目および１３番目の超可変性の２残基の同一性間で１対１の対応があるようである（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al (2009) Science 326:1509-1512参照）。実験的には、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードは、１２番目および１３番目のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）に結合、ＮＧがＴに結合、ＮＩがＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴに、ＮＮがＡまたはＧに結合、およびＩＮＧがＴに結合するように決定される。これらのＤＮＡ結合リピートはリピートの新しい組合せおよび数を有するタンパク質に会合し、植物細胞において新しい配列と相互作用し非内在性のレポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工的な転写因子を作製する（Boch et al, ibid）。工学的に作製されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインと連結させ、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）が得られる（プラスミドベースの標的）。
【００５７】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ヌクレアーゼ系は、ゲノム工学のために使用することができる細菌系に基づく近年工学的に作製されたヌクレアーゼ系である。それは多くの細菌および古細菌の獲得免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入した場合、侵入者のＤＮＡのセグメントが「免疫」応答によりＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、このｃｒＲＮＡは、部分的に相補的な領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと結合して、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡのｃｒＲＮＡに相同な領域にＣａｓ９ヌクレアーゼを導く。Ｃａｓ９はＤＮＡを切断し、ｃｒＲＮＡ転写産物内に含有される２０ヌクレオチドのガイド配列により特定される部位のＤＳＢに平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のためｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。ここで、この系はｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを結合して１つの分子（「単一ガイドＲＮＡ」）にするように工学的に作製され、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ等価部分はＣａｓ９ヌクレアーゼを標的である任意の所望の配列にガイドするように工学的に作製することができる（Jinek et al (2012) Science 337, p.816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2: e00471, およびDavid Segal, (2013) eLife 2: e00563参照）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム中の所望の標的に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出すように工学的に作製することができ、ＤＳＢの修復はエラープローン修復の増加を引き起こす修復阻害剤の使用により影響され得る。
【００５８】
他の例では、ＤＮＡ結合導入遺伝子は工学的に作製された（天然には存在していない）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも記載される）を含む部位特異的ヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号明細書、米国特許第６，８３３，２５２号明細書；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388;Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118;Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127;Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228;Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180;Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabsカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、天然には存在しない標的部位に結合するように工学的に作製することができる。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905;Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962;Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659;Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66;米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号明細書参照。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼの文脈で変えることができ（すなわち、ヌクレアーゼが同種の切断ドメインを含むように）または異種の切断ドメインに融合することができる。
【００５９】
本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は核酸分子をそのような細胞内に導入することができるあらゆる技法を包含する。例には、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション、プラスミドベクターを用いる形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入、直接ＤＮＡ取込み、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換、および微粒子銃が含まれるがこれらに限定されない。これらの技法は、植物細胞の安定な形質転換と一過性形質転換の両方のために使用することができる。「安定な形質転換」とは、遺伝子的に安定した遺伝をもたらす宿主生物のゲノム内への核酸断片の導入を指す。安定的に形質転換されると、核酸断片は宿主生物およびそれに続くいかなる世代のゲノムにも安定的に組み込まれる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と称される。「一過性形質転換」とは、遺伝子的に安定した遺伝のない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラ内への核酸断片の導入を指す。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「形質導入する」とは、ウイルスが核酸を細胞内に移入させるプロセスである。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「導入遺伝子」とは、外来性核酸配列を指す。一例では、導入遺伝子は遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）、産業的にまたは薬剤的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業上の形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列のような小分子ＲＮＡであり、小分子ＲＮＡの発現により標的核酸配列の発現が阻害される。導入遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター、イントロン、または３’−ＵＴＲ）を含有することができる。いくつかの実施形態では、対象の核酸は導入遺伝子である。しかし、他の実施形態では、対象の核酸は、その追加のゲノムコピーが望まれる内在性核酸、または宿主生物における標的核酸の配列に関してアンチセンス方向である核酸である。
【００６２】
本明細書で使用されるように、用語「小分子ＲＮＡ」とは、非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）のいくつかのクラスを指す。用語、小分子ＲＮＡは、細菌細胞、動物、植物および菌類において産生されるｎｃＲＮＡの短鎖を記載する。これらのｎｃＲＮＡの短鎖は細胞内で天然に産生され得、短鎖またはｎｃＲＮＡを発現する外来性配列の導入により産生され得る。小分子ＲＮＡ配列はタンパク質を直接コードせず、小分子ＲＮＡ配列が転写されるだけで翻訳されないという点で、他のＲＮＡとは機能が異なる。小分子ＲＮＡ配列は、遺伝子発現および改変を含む他の細胞機能に関与する。小分子ＲＮＡ分子は、通常約２０〜３０ヌクレオチドで構成されている。小分子ＲＮＡ配列は、より長い前駆体由来であり得る。前駆体は、自己相補性の領域において互いに折り重ねた構造を形成し、次いでそれらは、ヌクレアーゼ、動物ではＤｉｃｅｒまたは植物ではＤＬＣ１により処理される。
【００６３】
小分子ＲＮＡの多くの種類は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含み、天然または人工的に生成されたかのいずれかで存在する。マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなど、小分子ＲＮＡの特定の種類は、遺伝子サイレンシングおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において重要である。遺伝子サイレンシングは、細胞内エレメント、この場合は小分子ＲＮＡにより、通常発現される遺伝子が「遮断」される遺伝的調節のプロセスである。通常この遺伝的情報により形成されるタンパク質が干渉により形成されず、遺伝子にコードされた情報は発現からブロックされる。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「小分子ＲＮＡ」は、文献において「小さいＲＮＡ」（Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489）；原核生物の「小分子ＲＮＡ」（ｓＲＮＡ）（Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45）；真核生物の「非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）」；「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」；「小分子非ｍＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）」；「機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）」；「転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」；「触媒ＲＮＡ」［例えば、自己アシル化リボザイムを含むリボザイム（Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489）；「核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）」；「ｔｍＲＮＡ」（「１０Ｓ  ＲＮＡ」としても知られる、Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29;およびGillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885）；「小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」、および「エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅ−ｓｉＲＮＡ）」、「短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」、および「小分子時間的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）」；「ダイスｓｉＲＮＡ（ｄ−ｓｉＲＮＡ）」を含むがこれらに限定されないＲＮＡｉ分子およびアプタマー、オリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのウラシル塩基を含む他の合成核酸として記載されるＲＮＡ分子を包含する。
【００６５】
本明細書で使用されるように、用語「ベクター」とは、細胞内に導入され、それによって形質転換細胞を生成する核酸分子を指す。ベクターは、宿主細胞においてベクターが複製するのを可能にする、複製起点などの核酸配列を含むことができる。例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または外来性ＤＮＡを細胞内に運搬するウイルスが含まれるがこれらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能なマーカー遺伝子、および当技術分野で既知の他の遺伝子エレメントも含むことができる。ベクターは細胞を形質導入し、形質転換し、または細胞に感染し、それによってベクターにコードされている核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、核酸分子の細胞内への進入を達成するのを支援する材料（例えば、リポソーム）を場合によって含んでいてもよい。
【００６６】
本明細書で使用されるように、用語「カセット」、「発現カセット」、および「遺伝子発現カセット」とは、特異的な制限部位でまたは相同組換えにより核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、対象の小分子ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする対象の遺伝子を含有するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切なリーディングフレームへのカセットの挿入を確実にするように設計される。一実施形態では、発現カセットは対象の小分子ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、ポリヌクレオチドに加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有することができる。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、宿主細胞での対象のポリペプチドをコードする小分子ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの増強された発現を可能にするエレメントも含むことができる。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、イントロン、５’非翻訳、３’非翻訳領域配列、終結配列、ポリアデニル化配列などを含むことができるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用されるように、用語「異種コード配列」は、正常には宿主生物には存在せず、適切な条件下で宿主細胞において発現させることができるペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば、酵素をコードする、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すのに使用される。したがって、「異種コード配列」は、細胞が、正常にはその細胞に存在しないコード配列の追加のコピーを発現するように、正常には宿主細胞に存在しないコード配列の１つまたは追加のコピーを含むことができる。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｃＤＮＡ、またはハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡであってよい。コード配列の例には、コード配列、イントロン、プロモーター領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、およびエンハンサー領域などの特長を含む完全長転写単位が含まれるがこれに限定されない。
【００６８】
「異種コード配列」は、ペプチドもしくは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドもしくは酵素のｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡ配列、ならびに完全長転写単位のコード部分、すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子、ならびに「コドン最適化」配列、切断型配列または酵素をコードするもしくは、等価なアミノ酸配列が機能的なタンパク質を生じる限り、その等価なアミノ酸配列をコードする他の形の改変された配列も含む。このような等価なアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を有してもよく、欠失はＮ末端、Ｃ末端、または内部である。切断型は、それが本明細書に示される触媒能力を有する限り、企図されている。
【００６９】
本明細書で使用されるように、用語「対照」とは、比較目的で分析手順において使用される試料を指す。対照は「陽性」でも「陰性」でも可能である。例えば、分析手順の目的が細胞または組織において差次的に発現される転写物またはポリペプチドを検出することである場合、一般には、所望の発現を示す既知の植物由来の試料などの陽性対照、および所望の発現を欠く既知の植物由来の試料などの陰性対照を含むことが好ましい。
【００７０】
本明細書で使用されるように、用語「植物」は、植物ならびに、植物細胞および葉、茎、根、花、花粉と種子などの植物組織を含むがこれらに限定されない植物部分を含む。本発明で使用することができる植物の種類は、一般に、被子植物、裸子植物、シダ類、および多細胞の藻類を含む、変異原性を受け入れられる高等および下等植物の種類と同じだけ広い。したがって、「植物」は双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例には、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス、およびレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギが含まれる。
【００７１】
本明細書で使用されるように、用語「植物原料」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切り枝、細胞もしくは組織培養物、または植物の他の任意の部分もしくは産物を指す。一実施形態では、植物原料には子葉および葉が含まれる。一実施形態では、植物原料には根組織および地下に位置する他の植物組織が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用されるように、用語「選択可能なマーカー遺伝子」とは、例えば、植物細胞を選択剤から保護するためにまたは選択剤に対する抵抗性／耐性を与えるために、場合により植物形質転換において使用される遺伝子を指す。さらに、「選択可能なマーカー遺伝子」はレポーター遺伝子を包含することを意味する。機能的選択可能マーカーを受け入れる細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂するまたは成長することができる。選択剤の例には、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびハイグロマイシンを含む抗生物質を含むことができる。これらの選択可能マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、関連抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８の遺伝子、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択可能マーカー遺伝子は、ｂａｒまたはｐａｔ（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する抵抗性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）、および分岐鎖アミノ酸の合成の第１段階を妨げるスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄ、および金属抵抗性または感受性を含む除草剤抵抗性をコードする遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例には、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするタンパク質、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどの発現されたレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が含まれる。語句「マーカー陽性」とは、選択可能マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるように、用語「検出可能なマーカー」とは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート、または酵素などの検出可能な標識を指す。検出可能なマーカーの例には以下のもの、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、検出可能なマーカーには、潜在的な立体障害を減らす種々の長さのスペーサーアームが結合することができる。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語「検出する」は、特定の分子の定性的および定量的測定の両方、例えば、特定のポリペプチドの測定を含むもっとも広い意味で使用される。
【００７５】
他の方法で明確に説明されなければ、本明細書で使用される専門用語および科学用語全てが、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における共通語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; and Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995に見出すことができる。
【００７６】
調節エレメント
基礎研究またはバイオテクノロジー応用のために使用される植物プロモーターは一般に一方向性であり、その３’末端（下流）において融合された導入遺伝子の発現を指示する。多くの場合、代謝工学および形質スタッキングのために植物内で導入遺伝子を強く発現させる必要がある。さらに、複数の遺伝子の発現を推進するためには、トランスジェニック作物中に複数の新規プロモーターが典型的には必要である。３’末端（下流）で融合された導入遺伝子の発現を指示することが可能なキメラプロモーターが本明細書では開示されている。
【００７７】
トランスジェニック産物の開発はますます複雑になっており、これは導入遺伝子を強く発現させ、単一遺伝子座に複数の導入遺伝子をスタックすることを必要とする。従来では、それぞれの導入遺伝子は発現のための独自のプロモーターを必要とし、１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるには複数のプロモーターが必要である。遺伝子スタックのサイズが増えるに従って、このことにより、単一の多遺伝子形質の発現のために異なる導入遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得るのに同一プロモーターを繰り返し使用する場合が多くなる。同一プロモーターにより推進される多遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングを引き起こし、圃場でのトランスジェニック産物の効果が低くなることで知られている。プロモーター繰り返しに起因する過剰な転写因子（ＴＦ）結合部位のために、内在性ＴＦが枯渇し転写不活化をもたらし得る。導入遺伝子のサイレンシングは、導入遺伝子を発現する生産されたトランスジェニック植物の性能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。導入遺伝子内の反復配列のために、遺伝子遺伝子座内相同組換えをもたらして、ポリヌクレオチド再編成が生じることがある。
【００７８】
組織特異的（すなわち組織優先的）、または器官特異的プロモーターは、植物のカーネル、根、葉、またはタペータムなどのある種の組織における遺伝子発現を推進する。組織および発生段階特異的プロモーターは、特定の組織でまたは植物発生中の特定の時期に発現される遺伝子の発現を推進する。組織特異的プロモーターはトランスジェニック植物産業におけるある種の適用に必要であり、組織においておよび／または発生段階選択的に異種遺伝子の特異的発現を可能にし、種々の器官、組織、および／または時間での異種遺伝子の発現を差次的に示すが他では示さないので望ましい。例えば、土壌伝播性病原菌による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原菌抵抗性タンパク質が植物の根内で強く発現されるように、植物ゲノムを病原菌抵抗性遺伝子で形質転換することにより達成し得る。代わりに、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の増殖または発生期にある植物組織において導入遺伝子を発現させるのが望ましい場合がある。別の応用では、例えば農学的形質をコードする導入遺伝子の発現を発生中の木質部に限局するように、組織特異的プロモーターを使用することが望ましい。組織特異的プロモーターの同定において残るある特定の問題は、最も重要な可能性のある遺伝子およびそれらの対応するプロモーターを同定する、ならびにこれらを細胞の特定の発生的特性に関連付ける方法である。別の問題は、クローン化ＤＮＡ断片が望ましい特定の発現パターンにおける転写を推進するように、全ての関連するｃｉｓ作用性の転写制御エレメントをクローン化することである。特定の問題は、他の植物組織では発現していない植物の特定の細胞種、発生段階および／または機能に関連する、組織特異的プロモーターを同定することである。
【００７９】
導入遺伝子発現は、プロモーター配列の下流に位置するイントロンおよび５’−ＵＴＲ領域によっても調節することができる。イントロンおよび５’−ＵＴＲに作動可能に連結された上流プロモーターを含むキメラプロモーターは導入遺伝子発現を調節することが可能である。上流プロモーターは転写を推進するのに必要であるが、イントロンおよび５’−ＵＴＲが存在すれば発現レベルを増加させ、翻訳およびタンパク質合成のためのｍＲＮＡ転写物を生ずることが可能である。上流プロモーターポリヌクレオチド配列にイントロンおよび５’−ＵＴＲを付加させると、導入遺伝子の安定した発現を助けることが可能である。
【００８０】
植物において導入遺伝子を発現するための、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５由来の上流プロモーター、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）、イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲ（例えば、リーダー）を含むキメラプロモーター遺伝子調節エレメントを使用する方法および構築物が提供される。一実施形態では、キメラプロモーターは、
【００８１】
【化１−１】
2017506516.tif 000002
【００８２】
【化１−２】
2017506516.tif 000003
のプロモーターであり得る。
【００８３】
一実施形態では、遺伝子発現カセットはプロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは本開示のキメラプロモーターであり得る。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含む。一実施形態では、キメラプロモーターを含む遺伝子発現カセットは２つ以上の導入遺伝子の発現を推進し得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含み、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。
【００８４】
選択可能マーカー
種々の選択可能マーカーは、レポーター遺伝子とも言われるが、形質転換された植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にするために、選択された発現ベクター内に組み込むことができる。例えば、ＤＮＡシークエンシングとＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、例えばホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質などのベクターから発現されたタンパク質の検出のための免疫学的方法、またはβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察を含む、形質転換された植物における選択可能マーカーの発現を確かめるための多くの方法が利用可能である（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001参照。その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
選択可能マーカー遺伝子は形質転換された細胞または組織の選択のために利用される。選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に非感受性の改変された標的タンパク質を、または除草剤が作用できる前に植物内において除草剤を分解するまたは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することにより得られてきた。ＥＰＳＰＳの遺伝子および変異体は周知であり、下でさらに説明される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒する、ｐａｔをコードする細菌遺伝子またはＤＳＭ−２、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を使用することにより得られてきた。
【００８６】
一実施形態では、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤は成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性の遺伝子は周知である。グリホサート抵抗性遺伝子は、（組換え核酸の導入ならびに／またはそれぞれ天然のＥＰＳＰ遺伝子）、ａｒｏＡ遺伝子、およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子の種々の形態のｉｎ  ｖｉｖｏ変異誘発による）変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）およびｄｇｔ−２８遺伝子を含む。他のホスホノ化合物の抵抗性遺伝子には、ストレプトミセスハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトミセスビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含む、ストレプトミセス種由来のｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）が含まれる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対する抵抗性を与える例となる遺伝子には、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３の遺伝子が含まれる。一実施形態では、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、除草剤は光合成を阻害することが可能である。
【００８７】
一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、シアナミドヒドラターゼ、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリネートシンターゼおよび脱感作アスパラギン酸キナーゼ、ｂａｒ遺伝子、トリプトファンデカルボキシラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）、ハロアリ−ルニトリラーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ  Ｉ）、ならびに３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【００８８】
一実施形態には、クロラムフェニコール、メトトレキサート、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン、ブロモキシニル、グリホサート、およびホスフィノトリシンに対する抵抗性をコードする遺伝子も含まれる。
【００８９】
選択可能マーカー遺伝子の上記リストは限定的であることを意図してはいない。本発明にはいかなるレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子でも包含される。
【００９０】
選択可能マーカー遺伝子は植物における最適発現のために合成される。例えば、一実施形態では、遺伝子のコード配列は、植物における発現を増強するためにコドン最適化により改変されている。選択可能マーカー遺伝子は特定の植物種における発現のために最適化することができる、または代わりに双子葉植物または単子葉植物における最適発現のために改変することができる。植物の好ましいコドンは、対象の特定の植物種においてもっとも大量に発現されるタンパク質におけるもっとも高い出現頻度のコドンから決定することができる。一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子は、植物においてより高いレベルで発現されて、より高い形質転換効率を生じるように設計される。遺伝子の植物最適化のための方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する手引きは、例えば、国際公開第２０１３０１６５４６号パンフレット、国際公開第２０１１１４６５２４号パンフレット、国際公開第１９９７０１３４０２号パンフレット、米国特許第６１６６３０２号明細書、および米国特許第５３８０８３１号明細書に見出すことができ、これら特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
導入遺伝子
開示された方法および組成物は、植物ゲノム内のポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるのに使用することができる。したがって、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養分、抗生物質、または治療分子をコードする遺伝子の発現を植物プロモーターにより推進させることができる。
【００９２】
一実施形態では、主題の開示のキメラ調節エレメントは、グリホサートまたは別の除草剤に対する抵抗性または耐性を与え、ならびに／あるいは選択した昆虫もしくは病害に対する抵抗性および／または滋養強壮作用、および／または改良された農学的特徴、および／またはタンパク質、または餌、食物に有用な他の産物、産業上の、医薬上のもしくは他の使用を提供するポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子と組み合わされるまたは作動可能に連結される。導入遺伝子は、植物ゲノム内で２つ以上の対象の核酸配列と一緒に「スタックする」ことができる。スタッキングは、例えば、２つ以上の事象を使用する従来の植物育種、対象の配列を含有する構築物を用いた植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的を狙った組込みを通じた新しい形質の追加により達成することができる。
【００９３】
対象のこのようなポリヌクレオチド配列には、下に提供される例が含まれるがこれらに限定されない。
【００９４】
１．有害生物または病害に対する抵抗性を与える遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物耐病性遺伝子。植物防御は多くの場合、植物中の耐病性遺伝子の産物（Ｒ）と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物の間の特異的な相互作用により活性化される。植物品種はクローン化された抵抗性遺伝子で形質転換して、特異的な病原体株に対して抵抗性である植物を工学的に作製することができる。このような遺伝子の例には、クラドスポリウムフルバム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のトマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、シュードモナスシンリンゲｐｖ．トマトに対する抵抗性の、タンパク質キナーゼをコードするトマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）、およびシュードモナスシンリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のシロイヌナズナＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089）が含まれる。
（Ｂ）バチルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルとする合成ポリペプチド、例えば、Ｂｔδエンドトキシン遺伝子（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および植物殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94参照）のヌクレオチド配列。さらに、δエンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から購入することが可能である。
（Ｃ）レクチン、例えば、いくつかのクリビアミニアタ（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
（Ｄ）ビタミン結合タンパク質、例えば、害虫に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体。米国特許第５，６５９，０２６号明細書参照。
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例には、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）、およびαアミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が含まれる。
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイド、および幼若ホルモン、その変異体、それに基づく模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、幼若ホルモンの失活剤であるクローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
（Ｇ）発現すると冒された害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例には、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ジプロプテラパンクタタ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（Pratt, 1989）、および昆虫特異的麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号明細書）が含まれる。
（Ｈ）サソリ昆虫障害性ペプチドなどの、ヘビ、スズメバチなどにより天然において産生される昆虫特異的毒液（Pang, 1992 Gene 116:165）。
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性のある別の非タンパク質分子の高度集積の原因となる酵素。
（Ｊ）生物活性分子の翻訳後修飾を含む、修飾に関与する酵素、例えば、天然であれ合成であれ、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、およびグルカナーゼ。このような遺伝子の例には、オランダカイウ（calla）遺伝子（国際公開第９３／０２１９７号パンフレット）、キチナーゼコード配列（例えば、受託番号３９９９６３７および６７１５２の下、ＡＴＣＣから入手可能である）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）、およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が含まれる。
（Ｋ）シグナル伝達を刺激する分子。このような分子の例には、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）、およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が含まれる。
（Ｌ）疎水性モメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号明細書および米国特許第５，６０７，９１４号明細書参照。後者は耐病性を与える合成抗菌ペプチドを教示している。
（Ｍ）トランスジェニックタバコ植物をシュードモナスソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum1）に対して抵抗性にするセクロピン−β溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）などの、膜パーミアーゼ、チャネルフォーマー（channel former）またはチャネルブロッカー。
（Ｎ）ウイルス侵入性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換された植物細胞内にウイルスコートタンパク質が蓄積すると、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスにより、ならびに関連するウイルスによりもたらされる病害の発症に対する抵抗性が与えられる。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチ病ウイルス、タバコラットルウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介抵抗性が形質転換された植物に与えられてきた。例えば、Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451参照。
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸における極めて重要な代謝機能を標的にした抗体であれば冒された酵素を不活化し、昆虫を死滅させることになる。例えば、Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片を産生することによるトランスジェニックタバコにおける酵素不活化を明らかにしている。
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物がウイルス攻撃から保護されていることを明らかにするTavladoraki et al. (1993) Nature 266:469を参照されたい。
（Ｑ）病原体または寄生虫により天然に産生される発育遅延タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することにより真菌定着および植物養分放出を促進する（Lamb et al., 1992）Bio/Technology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付けはToubart et al. (1992 Plant J. 2:367) に記載されている。
（Ｒ）真菌病に対する増加した抵抗性を与えるオオムギリボソーム不活化遺伝子などの、植物により天然に産生される発育遅延タンパク質(Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305。
（Ｓ）ＲＮＡ分子を使用して標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉。一例でのＲＮＡ分子は部分的にまたは完全に二本鎖であり、これがサイレンシング応答を始動させ、ｄｓＲＮＡを小分子干渉ＲＮＡに切断して、その後この小分子干渉ＲＮＡはターゲティング複合体に組み込まれて、相同ｍＲＮＡを破壊する。例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，５０６，５５９号明細書；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第６，５７３，０９９号明細書を参照されたい。
【００９５】
２．除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子
（Ａ）イミダゾリノン、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤などの、成長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。この範疇での例となる遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）としても知られる変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）をコードする。
（Ｂ）変異ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子により、またはＤＧＴ−２８、２ｍＥＰＳＰＳ、ＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子ならびにグルホシネート（ｐａｔ、ｂａｒおよびｄｓｍ−２遺伝子）およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）などの他のホスホノ化合物による代謝不活化を通して与えられるグリホサートに対する抵抗性もしくは耐性をコードする１つもしくは複数の追加の遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を与えることができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で入手可能であり、変異遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は欧州出願第０２４２２４６号明細書に提供されている。De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成を記載している。セトキシジムおよびハロキシホップなどの、アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を与える遺伝子の例は、Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435により記載されているＡｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子である。
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169はクラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２下で入手可能である。グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173により記載されている。
（Ｄ）パラヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に変換される反応を触媒する酵素である、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）に結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これには、イソキサゾール（欧州特許第４１８１７５号明細書、欧州特許第４７０８５６号明細書、欧州特許第４８７３５２号明細書、欧州特許第５２７０３６号明細書、欧州特許第５６０４８２号明細書、欧州特許第６８２６５９号明細書、米国特許第５，４２４，２７６号明細書）、特にトウモロコシの選択性除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（欧州特許第４９６６３０号明細書、欧州特許第４９６６３１号明細書）、特に２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５５０５号明細書、欧州特許第６２５５０８号明細書、米国特許第５，５０６，１９５号明細書）、特にスルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤が含まれる。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号明細書および米国特許第６，２４５，９６８号明細書ならびに米国特許出願公開第２００３００６６１０２号明細書に記載される遺伝子を含む、植物において過剰なＨＰＰＤを産生する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を与えることが可能である。
（Ｅ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も与えることができる遺伝子。このような遺伝子の例には、米国特許第７，８３８，７３３号明細書に記載されている、α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が含まれる。
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も与えることができる遺伝子。このような遺伝子の例には、国際公開第２００７／０５３４８２  Ａ２号パンフレットに記載されている、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が含まれる。
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００３０１３５８７９号明細書参照）。
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を与える遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号明細書参照）。
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳＩＩ）のコアタンパク質に結合するトリアジン系除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を与える遺伝子（Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245参照）。
【００９６】
３．付加価値形質を与えるまたはこれに寄与する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含有量を増加させるために、例えば、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）をアンチセンス遺伝子またはステアロイルＡＣＰデサチュラーゼで形質転換することによる改変された脂肪酸代謝 (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
（Ｂ）減少したフィチン酸含有量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）などのフィターゼコード遺伝子を導入すると、フィチン酸の分解が増強され、形質転換された植物にさらに多くの遊離リン酸を加える。
（２）フィチン酸含有量を減少させる遺伝子を導入することが可能であった。トウモロコシでは、これは、例えば、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ変異体の原因である単一の対立遺伝子と関連のあるＤＮＡをクローニングし次に再導入することにより達成することが可能であった（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
（Ｃ）例えば、デンプンの分枝パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによりもたらされる改変された炭水化物組成。このような酵素の例には、ストレプトコッカス（Streptococcus）粘液フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810）、枯草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）αアミラーゼ（Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., 1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）、およびトウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が含まれる。
【００９７】
形質転換
植物の形質転換に適した方法には、ＤＮＡを細胞内に導入することができるいかなる方法でも、例えばおよび限定なしで、エレクトロポレーション（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、米国特許第５，５３８，８８０号明細書、米国特許第６，１６０，２０８号明細書、米国特許第６，３９９，８６１号明細書、および米国特許第６，４０３，８６５号明細書参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号明細書、米国特許第５，８２４，８７７号明細書、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許第５，９８１，８４０号明細書、および米国特許第６，３８４，３０１号明細書参照）、およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）が含まれる。これらの方法を使用すれば、植物を安定的に形質転換することも一過性に形質転換することもできる。
【００９８】
ＤＮＡ構築物は炭化珪素繊維を用いた撹拌などの技法を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接導入することができ（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および米国特許第５，４６４，７６５号明細書参照）、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子銃などの微粒子銃法を使用して植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al., (1987) Nature 327:70-73参照）。代わりに、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換により植物細胞に導入することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１０４７００号明細書参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９９】
さらに、遺伝子導入は、根粒菌種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、およびキャッサバ葉脈モザイクウイルス、ならびに／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム（Agrobacterium）細菌またはウイルスを使用して達成することができる（例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4参照）。
【０１００】
形質転換技法の適用を通じて、ほぼどんな植物種の細胞でも安定的に形質転換することができ、これらの細胞は周知の技法によりトランスジェニック植物に成長させることができる。例えば、ワタ形質転換という文脈で特に有用である可能性がある技法は、米国特許第５，８４６，７９７号明細書、米国特許第５，１５９，１３５号明細書、米国特許第５，００４，８６３号明細書、および米国特許第６，６２４，３４４号明細書に記載されており、特にアブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技法は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号明細書に記載されており、ダイズを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号明細書に記載されており、ならびにトウモロコシを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書および米国特許第５，５９１，６１６号明細書、ならびに国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。
【０１０１】
レシピエント細胞への外来性核酸の送達をもたらした後、形質転換された細胞は一般には、さらなる培養および植物体再生のために同定される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するのに使用される形質転換ベクターと一緒に選択可能マーカー遺伝子を用いるのが望ましいことがある。例示的な一実施形態では、形質転換された細胞集団は、細胞を選択剤（単数または複数）に曝露することによりアッセイすることができる、または所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１０２】
選択剤への曝露を生き延びる細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてプラスのスコアーを得た細胞は、植物の再生を支持する培地において培養することができる。一実施形態では、いかなる適切な植物組織培養培地でも、成長調節物質などの追加の物質を含むことにより改変することができる。組織は、植物体再生の試みを開始するのに十分な組織が入手可能になるまで成長調節物質のある基本培地上で維持することができ、または、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）の手作業での選別の繰り返しラウンドに続いて、その後苗条形成に役立つ培地に移すことができる。培養物は十分な苗条形成が起こるまで定期的に移される。苗条が形成された後は、根形成に役立つ培地に移される。十分な根が形成された後、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移すことができる。
【０１０３】
再生中の植物に与えられた構築物を含む所望の核酸の存在を確かめるために、種々のアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、サザンおよびノーザンブロッティングならびにＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび／もしくはＬＣ−ＭＳ  ＭＳ分光光度法）による、または酵素機能による、タンパク質産物の存在を検出することなどの生化学的アッセイ；葉、または根アッセイなどの植物部分アッセイ；ならびに／あるいは全再生植物の表現型の分析が含まれ得る。
【０１０４】
トランスジェニック事象は、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する例えばＰＣＲ増幅によりスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予想される単離された宿主植物カルス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続いて標準クローニング、ならびにＰＣＲ増幅産物の配列分析を含むがこれらに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に説明されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用することができる。標的配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＰＣＲ増幅反応において順次使用することも多重化する（multiplex）こともできる。標的部位、導入核酸配列、および／または２つの組合せにアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを生成することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えばおよび限定なしで、植物ゲノム中の特異的な配列の増幅、植物ゲノム中の複数の特異的な配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的な配列の増幅、および前述のいずれかの組合せを含むことができる。当業者であれば、ゲノムを調べるためにプライマーおよび増幅反応の追加の組合せを工夫することができる。例えば、一組のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可）にアニールさせることができる。
【０１０５】
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、例えば、そこに含まれる対象のヌクレオチド配列内のコード領域に一致する配列で、導入された核酸分子、または核酸分子の他の部分に特異的にアニールさせることができる。プライマーは本明細書に記載されるプライマーと併せて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成してもよく、市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡより）。増幅後にクローニングおよびシークエンシング、または増幅産物の直接配列分析が続いてもよい。一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅において用いる。
【０１０６】
導入遺伝子を発現させる方法
一実施形態では、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含む植物を生育することを含む。一実施形態では、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含む植物を培養することを含む。一実施形態では、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含む植物組織または植物細胞を生育することを含む。一実施形態では、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているキメラプロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１０７】
一実施形態では、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたキメラプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を生育することを含む。
【０１０８】
一実施形態では、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現する方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたキメラプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１０９】
一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたキメラプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。ここで、キメラプロモーターは、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲから構成される。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲは配列番号１のポリヌクレオチドである。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている上流プロモーター、イントロン、および５’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。
【０１１０】
一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は導入遺伝子に作動可能に連結されたキメラプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。ここで、キメラプロモーターは、上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲから構成される。上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている上流プロモーター、イントロン、および５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。
【０１１１】
一実施形態では、本明細書に記載の方法を使用する導入遺伝子の発現は、好ましくは植物の根組織内で発現される。一実施形態では、導入遺伝子の発現は植物の根組織において発現される１つより多くの導入遺伝子を含む。一実施形態では、本明細書に記載されるようにトランスジェニック植物を生育する方法は、根優先的導入遺伝子発現を含む。一実施形態では、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現する方法は、根優先的組織および根優先的細胞を含む。一実施形態では、根優先的発現はトウモロコシ根優先的発現を含む。
【０１１２】
一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示されているキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを含むベクターを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に開示されているキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを含むベクターを含む。一実施形態では、本明細書に開示されているように、植物、植物組織、または植物細胞は遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態では、ベクターはプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、またはウイルス断片であってもよい。
【０１１３】
一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示された方法に従えば、単子葉であってよい。単子葉植物、植物組織、または植物細胞は、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギであってよいがこれらに限定されない。
【０１１４】
一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示された方法に従えば、双子葉であってよい。双子葉植物、植物組織、または植物細胞は、ナタネ、キャノーラ、カラシナ、エチオピアマスタード、ダイズ、ヒマワリ、およびワタであってよいがこれらに限定されない。
【０１１５】
遺伝子改変された植物の生産に関して、植物を遺伝子工学的に作製するための方法は当技術分野では周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための生物学的および物理学的形質転換プロトコルを含む、植物形質転換のための数多くの方法が開発されてきた（例えば、Goto−Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67−88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織形質転換のためのベクターおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養法ならびに植物の再生は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において入手可能である。
【０１１６】
当業者であれば、外来性配列は、トランスジェニック植物に安定的に組み込まれており作動可能であることが確認された後、性的交雑により他の植物に導入することができることは認識するであろう。交雑させる種に応じて、いくつかの標準育種法のいずれでも使用することができる。
【０１１７】
形質転換された植物細胞、カルス、組織、または植物は、トランスフォーミングＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によりコードされている形質について工学的に作製された植物材料を選択するまたはスクリーニングすることにより同定し単離することができる。例えば、選択は、トランスフォーミング遺伝子構築物が抵抗性を与える対象となる阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地で工学的に作製された植物材料を生育することにより実施することができる。さらに、形質転換された細胞は、組換え核酸構築物上に存在する可能性があるいかなる可視マーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより同定することもできる。このような選択およびスクリーニング法は当業者には周知である。
【０１１８】
物理的および生化学的方法を使用して、挿入された遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法は、これらに限定されないが、１）組換えＤＮＡインサートを検出しその構造を決定するためのサザン分析もしくはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し調べるためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、もしくは逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）酵素もしくはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイであり、ここではこのような遺伝子産物は遺伝子構築物によりコードされている；４）次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析；５）タンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット法、免疫沈降、もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み、ここで、遺伝子構築物産物はタンパク質である。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの追加の技法を使用して、特定の植物器官および組織において組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これらのアッセイの全てを実行するための方法は当業者には周知である。
【０１１９】
本明細書で開示される方法を使用する遺伝子操作の効果は、例えば、対象の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在しているまたはｍＲＮＡの量が増加している場合には、対応する導入遺伝子が発現されていると想定することができる。遺伝子および／またはコードされているポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。さらに、発現されるポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、すなわちＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および、電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングを用いて）など、当業者には周知の他の抗体ベースのアッセイにより、測定することができる。１つの非限定的例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用するＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；国際公開第２００５／１０７４３７号パンフレット参照）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）タンパク質の検出は、米国特許出願公開第２００９００９３３６６号明細書に記載されており、前記特許文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。導入遺伝子は、植物のいくつかの細胞型もしくは組織でまたはいくつかの発生段階で選択的に発現させることができ、または導入遺伝子は、ほぼ全ての植物組織においておよび実質的にその全生活環に沿ってかなり発現させることもできる。しかし、いかなる組合せの発現様式でも適用可能である。
【０１２０】
本開示は、上記のトランスジェニック植物の種子であって、導入遺伝子、または遺伝子発現カセットを含む種子も包含する。本開示は、上記のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株、または細胞であって、導入遺伝子、または遺伝子構築物を含む子孫、クローン、細胞株、または細胞をさらに包含する。
【０１２１】
本発明は特定の方法および実施形態に関連して説明してきたが、本発明から逸脱することなく種々の改変および変更を加えることができることを認識されよう。
［実施例］
【実施例１】
【０１２２】
新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメント
キメラプロモーター配列は、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５から得られた上流プロモーターポリヌクレオチド配列、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲで構成されている。１６４２ｂｐのトウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５上流プロモーター配列（配列番号２）は下線で示す。１１７ｂｐのトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲ（リーダー配列とも称される）配列（配列番号３）は小文字で示す。３４１ｂｐのトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６配列（配列番号４）はイタリック体で示す。
【０１２３】
【化２−１】
2017506516.tif 000004
【０１２４】
【化２−２】
2017506516.tif 000005
【実施例２】
【０１２５】
構築物設計
遺伝子発現のための新しいプロモーターを使用するベクター構築物
他の方法で示されていなければ、ここに記載される分子生物学的および生化学的操作ならびにそれに続く実施例は、例えば、Ausubel et al. (1995), およびSambrook et al. (1989)およびその更新版に開示されている標準法により実施した。実験で使用した構築物（表１）は下でさらに詳細に説明される。
【０１２６】
構築物ｐＤＡＳ５１４４（例えば、ｐＤＡＢ３６２０）は、２つの遺伝子発現カセットを含有するように構築した。第１の遺伝子発現カセット（配列番号５）は、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５上流プロモーター（国際特許出願第１９９８／０５６９２１号）、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６（Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000）およびｔｃｄＡ導入遺伝子（米国特許出願第２００９／０２２１５０１明細書）に作動可能に連結されたトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲ（Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068）を含有し、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５  ３’−ＵＴＲ（国際特許出願第１９９８／０５６９２１号）を隣接させた。第２の遺伝子発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子を含有し、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）導入遺伝子に作動可能に連結されたイネ（Oryza sativa）アクチンプロモーター（米国特許第６，４２９，３５７号明細書）で構成され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ  ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号明細書）により終結させた。この構築物は、スーパーバイナリーｐＳＢ１バイナリーベクター（日本たばこ産業株式会社、東京、日本）に動員した。完全ｐＤＡＳ５１４４に使用した構築物は制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングにより分子的に確認した。
【０１２７】
【化３−１】
2017506516.tif 000006
【０１２８】
【化３−２】
2017506516.tif 000007
【０１２９】
【化３−３】
2017506516.tif 000008
【０１３０】
【化３−４】
2017506516.tif 000009
【０１３１】
【化３−５】
2017506516.tif 000010
【０１３２】
【化３−６】
2017506516.tif 000011
【０１３３】
構築物ｐＤＡＳ５１２８（例えば、ｐＤＡＢ３６１９）は、２つの遺伝子発現カセットを含有するように構築した。第１の遺伝子発現カセット（配列番号６）は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18;675-689）、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６（Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000）およびｔｃｄＡ導入遺伝子（米国特許出願第２００９／０２２１５０１号明細書）に作動可能に連結されたトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲ（Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068）を含有し、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５  ３’−ＵＴＲ（国際特許出願第１９９８／０５６９２１号）を隣接させた。第２の遺伝子発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子を含有し、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）導入遺伝子に作動可能に連結されたイネ（Oryza sativa）アクチンプロモーター（米国特許第６，４２９，３５７号明細書）で構成され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ  ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号明細書）により終結させた。この構築物は、スーパーバイナリーｐＳＢ１バイナリーベクター（日本たばこ産業株式会社、東京、日本）に動員した。完全ｐＤＡＳ５１２８に使用した構築物は制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングにより分子的に確認した。新規のトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲは、配列番号７として本明細書において開示される。
【０１３４】
【化４−１】
2017506516.tif 000012
【０１３５】
【化４−２】
2017506516.tif 000013
【０１３６】
【化４−３】
2017506516.tif 000014
【０１３７】
【化４−４】
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【０１３８】
【化４−５】
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【０１３９】
【化４−６】
2017506516.tif 000017
【０１４０】
【化５】
2017506516.tif 000018
【０１４１】
構築物ｐＤＡＳ５１４３（例えばｐＤＡＢ３９２４）は２つの遺伝子発現カセットを含有するように構築した。第１の遺伝子発現カセット（配列番号８）は、サトウキビ桿菌状ウイルス上流プロモーター（米国特許第６，４８９，４６２号明細書）、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６（Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000）およびｔｃｄＡ導入遺伝子（米国特許出願第２００９／０２２１５０１号明細書）に作動可能に連結されたトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲ（Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068）を含有し、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５  ３’−ＵＴＲ（国際特許出願第１９９８／０５６９２１号）を隣接させた。第２の遺伝子発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子を含有し、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）導入遺伝子に作動可能に連結されたイネ（Oryza sativa）アクチンプロモーター（米国特許第６，４２９，３５７号明細書）で構成され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ  ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号明細書）により終結させた。この構築物は、スーパーバイナリーｐＳＢ１バイナリーベクター（日本たばこ産業株式会社、東京、日本）に動員した。完全ｐＤＡＳ５１４３に使用した構築物は制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングにより分子的に確認した。新規のサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲは、配列番号９として本明細書において開示される。
【０１４２】
【化６−１】
2017506516.tif 000019
【０１４３】
【化６−２】
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【０１４４】
【化６−３】
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【０１４５】
【化６−４】
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【０１４６】
【化６−５】
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【０１４７】
【化６−６】
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【０１４８】
【化７−１】
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【０１４９】
【化７−２】
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【０１５０】
対照構築物、構築物ｐＤＡＢ１４０５は、２つの遺伝子発現カセットを含有するように構築され、その両方はＲＢ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ；国際特許出願第ＷＯ９７２７２０７号パンフレット）に隣接させた。第１の遺伝子発現カセットは、緑色蛍光タンパク質導入遺伝子（米国特許第６，１７２，１８８号明細書）に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターを含有し、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５  ３’−ＵＴＲに隣接させた。第２の遺伝子発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子を含有し、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）導入遺伝子に作動可能に連結されたイネ（Oryza sativa）アクチンプロモーター（米国特許第６，４２９，３５７号明細書）で構成され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ  ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号明細書）により終結させた。この構築物は、スーパーバイナリーｐＳＢ１バイナリーベクター（日本たばこ産業株式会社、東京、日本）に動員した。完全ｐＤＡＢ１４０５に使用した構築物は制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングにより分子的に確認した。
【０１５１】
【表１】
2017506516.tif 000027
【実施例３】
【０１５２】
植物形質転換および分子的確認
植物材料。トウモロコシ（Zea．mays）ｃ．ｖ．Ｈｉ−ＩＩは、全ての形質転換実験のために使用した。植物は温室で生育し、未熟な接合体胚が長さ１〜２ｍｍの間のとき、受粉後約９〜１１日で実を収穫した。実は外皮をむき、すすいで使用１日前までの間４℃で保管した。
【０１５３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始。上記の構築物を保有するアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢ４４０４株は、−８０℃でグリセロールストックとして維持した。形質転換実験の開始前に、バクテリアをグリセロールストックから２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含有するＹＥＰプレート上にストリークした。プレートは２８℃で２４時間インキュベートし、次いで、それぞれのプレート上で細胞の菌叢が発生するまで１９℃に２日間移した。
【０１５４】
未熟胚の共培養。アグロバクテリウム（Agrobacterium）の１から２個の白金耳をそれぞれのＹＥＰプレートから取り、１００μＭのアセトシリンゴンを補充された４５ｍｌのＮ６−ｉｎｆ培地（Ｎ６塩およびビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、６．８４％のスクロース、３．６％のグルコース、ｐＨは５．２に調整した）に懸濁し、均一な懸濁液が得られるまでボルテックスした。細菌はＮｅｐｈｅｌｏ（商標）フラスコに移し、培養密度は青フィルターを使用しておよそ２００クレット単位に調整した。フラスコは７５ｒｐｍの回転式振盪機上、室温で２〜４時間振盪し、未熟胚を単離した。トウモロコシの実は、７０％エタノールで５分間すすぎ、続いて数滴のＬｉｑｕｉｎｏｘ（登録商標）を含有する２０％の漂白液に２０〜３０分間浸漬して、滅菌した。実は無菌の脱イオン水で３回すすぎ、使用するまで無菌の紙タオルとフォイルで包んだ。共培養および選択のプロトコルはFrame et al.（Plant Physiol. 129:12-22, 2005）による概要にほぼ従った。未熟な接合体胚はトウモロコシ粒から切除し、１００μＭのアセトシリンゴンを補われた２ｍｌのＮ６−ｉｎｆ培地を含有するエッペンドルフチューブに入れた。複数の実由来の胚はチューブ内に溜めるかまたは別々のままにするかのいずれかである。胚は感染培地で１〜２回洗浄し、溶液はおよそ１ｍｌの細菌懸濁液で置き換えた。チューブは数回穏やかに反転し、室温で５分間インキュベートした。胚は１００×１５ｍｍプレートにおいてＮ６−ＡＳ（ＫＷ）培地（Ｎ６塩およびビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、３００ｍｇ／ＬのＬ−システイン、３％のスクロース、３ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、１００μＭのアセトシリンゴン、ｐＨは５．８に調整した）に移した。プレートから過剰な液体を除去した後、胚は顕微鏡を使用して胚盤側を上にして正しい位置に置いた。
【０１５５】
プレートは３Ｍ（登録商標）テープまたはＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、暗所にて２０℃で３から４日間インキュベートした。ＴｃｄＡ構築物のために、５０〜１２０個の胚を構築物ごとに処置し、およそ３０〜５０個の胚を陽性対照構築物（ｐＤＡＢ１４０５）のために処置した。形質転換効率をモニターするために、推定の陽性対照単離物を２週間後のＧＦＰ発現について評価した。残りのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液は、５０００ｒｐｍの卓上遠心分離機で遠心沈殿し、ペレットを１００μｌの液体中に再懸濁し、次いでＹＥＰ＋ｓｔｒｅｐ／ｓｐｅｃ／ｔｅｔプレート上にストリークし、２８℃で３日間インキュベートさせ、次いで再評価のために使用した。トウモロコシ供与材料の組織培養応答を評価するための陽性対照として、実ごとにおよそ５個の胚を１５Ａｇ培地（Ｎ６塩およびビタミン、１００ｍｇ／Ｌの酵素のカゼイン加水分解物、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２％のスクロース、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、ｐＨ５．８、１０ｍｇ／Ｌの硝酸銀および２５ｍＭのＬ−プロリンを補充された）上にプレートし、暗所にて２８℃で２週間インキュベートした。対照の胚は２および４週間での胚形成反応について記録し、次いで廃棄した。
【０１５６】
単離、選択、および再生。共培養の３〜４日後、生存している胚をＫＷ−休止培地（Ｎ６塩およびビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、１００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３％のスクロース、８ｇ／ＬのＴＣアガー、ｐＨは５．８に調整した）に移した。１０個の胚を、それぞれ６０×２０ｍｍプレート上に置き、３Ｍ（登録商標）テープまたはＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。プレートを暗い培養室にて２８℃で７日間インキュベートした。全ての構築物は選択可能なマーカーとしてＰＡＴ遺伝子を含有するため、ビアラホスベースの製剤Ｈｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）を選択剤として使用した。胚はＮ６（１．５Ｈ）ＫＷ培地（Ｎ６塩およびビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、１００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、１００ｍｇ／リットルのセフォタキシム、１．５ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）、３％のスクロース、８ｇ／ＬのＴＣアガー、ｐＨは５．８に調整した）に移した。およそ２週間後、胚を２倍のレベルのＨｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）を有する培地に移し、続いてＮ６（３．０Ｈ）ＫＷ培地（Ｎ６塩およびビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、１００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３．０ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）、３％のスクロース、８ｇ／ＬのＴＣアガー、ｐＨは５．８に調整した）に移した。まずＮ６（３．０Ｈ）ＫＷ培地に移した後、任意の速育成の胚形成組織を、推定のトランスジェニック単離物をかさ上げするためＮ６（３．０Ｈ）ＫＷ培地の別のプレートに継代培養した。十分な量の胚形成カルス材料が得られた場合、試料は接合状態であるとみなされ発現アッセイした。コピー数および発現基準に見合う事象は２８（１Ｈ）再生培地（ＭＳ塩およびビタミン、５ｍｇ／ＬのＢＡＰ、２５μｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３％のスクロース、１ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、ｐＨは５．７に調整した）に移し、１６：８時間の光周期で弱光（１３μＥｍ−２Ｓ−１）にて７日間、続いて強光（４０μＥｍ−２Ｓ−１）にて７日間培養した。出現した芽は、１００×２５ｍｍのプレート中、３６（１Ｈ）培地（ＭＳ塩およびビタミン、３％のスクロース、１ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ（登録商標）、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、ｐＨ５．７）に移した。芽が約３〜５ｍｍの長さに達した場合、２５×１５０ｍｍのガラスチューブ中、ＳＨＧＡ発根培地（ＳＨ塩およびビタミン、１ｇ／Ｌのｍｙｏ−イノシトール、１％のスクロース、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、ｐＨ５．８）に移した。十分な根の発生が観察された後、小植物を温室に移した。
【０１５７】
温室でのＴ０植物の移動および樹立。トランスジェニック植物は、特有の識別子を割り当て、温室に移した。植物は、チューブから小さい鉢（３．５”  ＳＶＤ）に移植し、温室環境（約２８℃  日中温度／約２６℃  夜間温度／１６：８  補助照明）に植物が順応するのを助けるために、１週間Ｈｕｍｉｄｏｍｅ（商標）で覆った。次いで、植物は、小さい鉢から昆虫バイオアッセイ用のルートトレーナー（root trainer）（Spencer-Lamaire Industries, Edmonton, Alberta Canada;style Tinus 350-4）に移植した。事象ごとの３つの植物はルートトレーナーに置き、残りの事象ごとの３つの植物は温室のスタッフにより人工授粉およびＴ１種子生産のために５−ガロンの鉢に移した。ルートトレーナーへの移植のおよそ４日後、植物をバイオアッセイのために寄生させた。
【０１５８】
Ｔ１種子の生産。バイオアッセイを通過した植物およびバイオアッセイではない事象ごとの対応する３つの植物を５ガロンの鉢に移植した。観察は週ベースで行い、いかなる異常な表現型も追跡した。実が出芽したとき、迷い出た花粉による相互汚染を確実になくすため、トウモロコシの毛が出現する前に芽の袋を芽の上に置いた。覆う前に芽がトウモロコシの毛を生産した場合、記録し取り除いた。２番目の芽は、受粉に使用するために覆った。異常な芽を生産するまたは生産しない植物はデータベースに記録した。Ｔ０植物由来の雄穂を脱粒の前に取り除き、温室内のトランスジェニック花粉の流れを除去した。トウモロコシの毛を刈り込み、受粉の間花粉を受ける平らなブラシを得た。自殖のトウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．５ＸＨ７５１由来の花粉を全ての受粉に使用した。
【０１５９】
受粉が完了した後、植物は温室に置き、生育および発生させた。実は受粉後２１日で引き剥がし、ドライダウン（dry down）を促進し、続いて受粉後４２日で完全に収穫した（植物から実を取り除いた）。実を乾燥機中に１週間置き、続いて種子を処理（脱穀、計数、事前印刷した封筒に包装、および種子の数のデータベースへの入力）した。
【実施例４】
【０１６０】
トランスジェニック植物／事象のタンパク質発現
カルス植物材料におけるウェスタンブロットによるタンパク質発現。トウモロコシカルス試料は、ウェスタンブロットによりＴｃｄＡの存在について分析した。分析のための調製において、２００ｍｇのカルス試料を、９６ウェルクラスターチューブボックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に収集し、−８０℃で保存した。分析時に、４個の鋼ビーズ（３．５ｍｍ、Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）プラス２００μｌの抽出バッファー（１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の添加により試料を抽出した。試料はＫｌｅｃｏ  ｂｅａｄ  ｍｉｌｌ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）において３分間最大設定で、ビーズを使用してたたいた。処理後、試料をプレート遠心機（Ｑｉａｇｅｎ）において３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。得られた上澄みはピペッティングにより新しいチューブに移した。ウェスタン試料は、適切な量の試料バッファー（４０ｍＭのジチオトレイトールを有するＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ（商標）４×試料バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））と抽出物を混合することにより調製した。精製タンパク質陽性対照（ＰＡ１、０．４ｍｇ／ｍｌ）は上記のように試料バッファー中６．２５ｎｇ／μｌの濃度に調製した。それぞれの調製した試料および標準物質の４０マイクロリットルをＰＣＲチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において９０℃で５分間加熱した。試料は、Ｔｒｉｓ−アセテート−ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３〜８％のＴｒｉｓ−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥＡ０３７５）上で分離した。
【０１６１】
さらに、インナーゲルチャンバーはランニングバッファーに添加した抗酸化剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有した。試料は、カルス試料については試料の２５μＬ、精製タンパク質対照（２５ｎｇ）については４μｌ、および１５μｌの分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｍａｒｋｅｒ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、ゲルの規格に従ってロードした。ゲルは一定に１５０Ｖで７５分間ランした。一方、転写パッドおよび０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、転写バッファー（１×ＮｕＰａｇｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０〜２０％のメタノール）に浸漬して調製した。
【０１６２】
タンパク質をゲル上で分離した後、転写するブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびゲルを製造業者の説明書に従ってアセンブルした。次いで、ゲルは一定に４５Ｖで少なくとも１．５時間転写した（ブロットモジュールごとに２枚のゲルについて２時間）。初期のカルスのウェスタンブロットはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）システム（４〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル［Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ］および１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニングバッファー）を使用してランした。しかし、ゲルからゲルへの品質が悪いため、上に特定したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎシステムに変更する決定をした。転写後、膜を室温で３０分間、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅブロッキングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でブロックした。ブロッキング液を取り除き、一次抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｇ４．１およびＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｄ１１．１）をブロッキングバッファー中１．０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。膜は室温で少なくとも１時間インキュベートした。膜は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（商標）洗浄液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回、それぞれ５分間洗浄した。二次抗体（抗マウスＨＲＰ［Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ］）をブロッキング液中で１：３０００希釈にて調製した。上記のように洗浄する前に、膜を室温で１時間インキュベートした。膜の縁をペーパータオルに穏やかにブロットすることにより、過剰な洗浄バッファーを膜から取り除いた。膜を化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に５分間曝露した。過剰な基質を上記のように取り除き、膜をプラスチックラップで包んだ。暗室において、Ｘ線フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を膜に曝露し、バンドを可視化した。フィルムは５分間および２時間のフィルム露光について現像した。
【０１６３】
Ｔ０植物材料におけるＥＬＩＳＡによるタンパク質発現。トウモロコシの葉材料はモノ−モノＥＬＩＳＡを使用して、ＴｃｄＡの存在について分析した。温室で生育した植物由来の葉は、植物を根切り虫の卵で寄生させた１週間後、最初に完全に広がった葉の先端から２ｃｍの葉の断片をカットすることにより採取した。試料は９６ウェルクラスターチューブボックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収し、−８０℃で凍結した。試料は、３個の鋼ビーズ（３．５ｍｍ、Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）、１個の鋼ビーズ（４．５ｍｍ  Ｄａｉｓｙ）および１００μｌのＰＢＥＸ抽出バッファー（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００）の添加による抽出のために調製した。試料は、Ｋｌｅｃｏ  Ｂｅａｄｍｉｌｌ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して３分間、最大設定で粉砕した。追加の３００μｌのＰＢＥＸ抽出バッファーを試料に添加し、試料はさらに１分間処理した。処理後、試料はプレート遠心機（Ｑｉａｇｅｎ）において３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。得られた上澄みは新しいチューブに移した。ＥＬＩＳＡプレートは以下のようにＢｅａｃｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）により調製した。Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ｐｌａｔｅｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１×ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＴｃｄＡモノクローナル抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｇ４．１）で被覆した。４℃で一晩インキュベーション後、プレートはＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中１％の冷水魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でブロックした。プレートは保存のために乾燥し個別に包んだ。分析時に、プレートは室温に温め、試料をロードする前に洗浄ごとに３５０μｌのＰＢＳＴを使用して、プレートウォッシャー（ＴｏｍＴｅｃ）で４回洗浄した。精製したタンパク質参照抗原（ＰＡ１、０．４ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＥＸバッファー中で１５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、１５０ｎｇ／ｍｌから２．３４ｎｇ／ｍｌの段階希釈の標準曲線を作製するために使用した。試料は、ＰＢＥＸバッファー中、出発希釈１：８に希釈し、追加で３回段階希釈した。次に、１００μｌの全ての標準物質および試料希釈はＥＬＩＳＡプレート上に二連でロードした。試料は、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートは上記のように洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートモノクローナル抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｄ１１．１−−ＨＲＰ）（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡにより調製）はＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルごとに１００μｌでプレートに添加した。プレートは室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄した。積み重ねたプレートを１８０°回転し、洗浄ステップを繰り返した。次に、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ウェルごとに１００μｌでプレートに添加した。標準曲線の最低希釈を入れたウェルの場合、青色を示し始め、反応は５０μｌの停止液（０．４ＮのＨ２ＳＯ４）の添加により停止した。プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４５０ｎｍの波長マイナス６５０ｎｍ参照でプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。テスト試料のＴｃｄＡ濃度は、二次標準曲線の直線回帰により計算した。
【０１６４】
葉抽出物中の総可溶性タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定した。トウモロコシの葉試料は、９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を使用して希釈した。タンパク質標準物質（Ｐｒｅ−ｄｉｌｕｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ＢＳＡ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）は、出発濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、０．０６２５ｍｇ／ｍｌまでプレートの下方へ段階希釈し、一番下のウェルは水ブランクとして残した。試料はＭａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、調製したタンパク質染料（ＢｉｏＲａｄ）をウェルに添加した。プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５９５ｎｍの波長でプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。総可溶性タンパク質の濃度は二次標準曲線の直線回帰により計算した。統計分析はＪＭＰソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０．２、ＳＡＳ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して行った。タンパク質発現（ＴｃｄＡの百万分率）値はｌｏｇ＋１変換を使用して変換した。
【０１６５】
本明細書においてＥＬＩＳＡは、抗体ごとに１つのエピトープしか認識できない２つのモノクローナル抗体を使用し、したがって切断型ＴｃｄＡを認識するアッセイの能力を減少させた。この特異性のため、ＥＬＩＳＡにより決定された発現レベルは完全長のＴｃｄＡを表すことが確かである。葉試料抽出物の最低希釈は１：８であるため、１６ｎｇ／ｍｌの検出の下限値および３６ｎｇ／ｍｌの定量の下限値（背景の２倍のＯ．Ｄ．を有する最低希釈因子×最低標準物質）をもたらす。したがって３６ｎｇ／ｍｌとゼロの間のいずれの結果も正確と考えるべきではない。
【０１６６】
Ｔ１植物材料におけるＥＬＩＳＡによるタンパク質発現。非破壊的なスクリーニング法としては、定性酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）により、選択可能マーカー、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の存在についてトウモロコシ植物を分析した。温室で生育した植物由来の葉は、最初に完全に広がった葉の先端から２ｃｍの葉の断片をカットすることにより採取した。試料は、９６ウェルクラスターチューブボックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収し、−８０℃で凍結した。試料は、２つの鋼ビーズ（４．５ｍｍ、Ｄａｉｓｙ、Ｒｏｇｅｒｓ  ＡＲ）および０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０を有する１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）抽出バッファーの添加による抽出のために調製した。試料は、Ｋｌｅｃｏ  Ｂｅａｄｍｉｌｌ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して３分間、最大設定で粉砕した。追加の３００μｌのＰＢＳＴ抽出バッファーを試料に添加し、試料はさらに１分間処理した。ビーズでたたいた後、試料はプレート遠心機（Ｑｉａｇｅｎ）において３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。得られた上澄みは新しいチューブに移した。ＰＡＴ  ｋｉｔ  ＡＰ０１４（ＥｎｖｉｒｏＬｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）からのＥＬＩＳＡプレートは、使用のための調製において室温に温めた。精製タンパク質参照抗原（ＰＡＴ標準物質、ＴＳＮ  １０４７９９、６３μｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳＴバッファー中で１０ｎｇ／ｍｌに希釈し、以下の希釈：５ｎｇ／ｍｌ、０．６２５ｎｇ／ｍｌ、および０．１５６ｎｇ／ｍｌの標準曲線を作製するのに使用した。使用するプレートを調製するため、５０μｌの酵素コンジュゲート（ＥｎｖｉｒｏＬｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）をそれぞれのウェルに添加し、続いて５０μｌのＰＢＳＴを添加した。次に、５０μｌの標準物質および試料をＥＬＩＳＡプレート上のそれぞれのウェルにロードし、室温で１時間インキュベートさせた。インキュベーションに続いて、プレートは洗浄ごとに３５０μｌのＰＢＳＴを使用して、プレートウォッシャー（ＴｏｍＴｅｃ）で４回洗浄した。ＥｎｖｉｒｏＬｏｇｉｘ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商標）はウェルごとに１００μｌでプレートに添加し、１５分間インキュベートさせた。反応は１００μｌの停止液の添加により停止した。プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、Ｏ．Ｄ．４５０の波長でプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み、差分ＯＤは０．７ｎｍよりも大きかった。
【０１６７】
昆虫バイオアッセイ用に選択した植物は、モノ／モノＥＬＩＳＡにより、ＴｃｄＡの存在について分析した。葉の試料は、２つの時点で回収した：根切り虫の卵による寄生後１週間およびバイオアッセイの終わり（寄生後２１日）。葉は、最初に完全に広がった葉の先端から２ｃｍの葉の断片をカットすることにより採取した。試料は９６ウェルクラスターチューブボックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収し、−８０℃で凍結した。試料は２個の鋼ビーズ（４．５ｍｍ、Ｄａｉｓｙ）および１００μｌのＰＢＥＸ抽出バッファー（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００）の添加による抽出のために調製した。試料は、Ｋｌｅｃｏ  Ｂｅａｄｍｉｌｌ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して３分間、最大設定で粉砕した。追加の３００μｌのＰＢＥＸ抽出バッファーを試料に添加し、試料はさらに１分間処理した。ビーズでたたいた後、試料はプレート遠心機（Ｑｉａｇｅｎ）において３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。それぞれの植物の根試料は、バイオアッセイの終わりに回収した。根試料（植物ごとに２００ｍｇ）は、４個の鋼ビーズ（４．５ｍｍ、Ｄａｉｓｙ）および４００μｌのＰＢＥＸ抽出バッファーの２ｍｌチューブへの添加による抽出のために調製した。試料は、Ｋｌｅｃｏ  Ｂｅａｄｍｉｌｌ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して３分間、最大設定で粉砕した。ビーズでたたいた後、試料はプレート遠心機（Ｑｉａｇｅｎ）において３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。得られた上澄みは新しいチューブに移した。ＥＬＩＳＡプレートは以下のようにＢｅａｃｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）により調製した。ＭａｘｉＳｏｒｂ  ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１×ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＴｃｄＡモノクローナル抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｇ４．１）で被覆した。４℃で一晩インキュベーション後、プレートはＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中１％の冷水魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でブロックした。プレートは保存のために乾燥し個別に包んだ。分析時に、プレートは室温に温め、試料をロードする前に洗浄ごとに３５０μｌのＰＢＳＴを使用して、プレートウォッシャー（ＴｏｍＴｅｃ）で４回洗浄した。
【０１６８】
精製したタンパク質参照抗原（ＰＡ１、０．４ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＥＸバッファー中で１５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、１５０ｎｇ／ｍｌから２．３４４ｎｇ／ｍｌの段階希釈の標準曲線を作製するために使用した。試料は、ＰＢＥＸバッファー中、出発希釈１：８に希釈し、追加で３回段階希釈した（１：８、１：１６、１：３２、１：６４）。次に、１００μｌの標準物質および試料希釈はＥＬＩＳＡプレート上に二連でロードした。試料は、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートは上記のように洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートモノクローナル抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｄ１１−ＨＲＰ）はＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルごとに１００μｌでプレートに添加した。プレートは室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（商標）基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプレートを洗浄した。この洗浄液は、ウェルごとに１００μｌでプレートに添加した。標準曲線の最低希釈のウェルが青色を示し始めたので、反応を５０μｌの停止液（０．４ＮのＨ２ＳＯ４）の添加により停止した。プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍの波長、６５０ｎｍ参照の差分を用いてプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。テスト試料のＴｃｄＡ濃度は、二次回帰分析により計算した。
【０１６９】
バイオアッセイ後、葉および根試料のサブセットはウェスタンブロットによってＴｃｄＡの存在について分析した。ウェスタン試料は、適切な量の試料バッファー（４０ｍＭのジチオトレイトールを有するＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ（商標）４×試料バッファー［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）と抽出物を混合することにより調製した。精製タンパク質陽性対照（ＰＡ１、０．４ｍｇ／ｍｌ）は上記のように試料バッファー中６．２５ｎｇ／μｌの濃度に調製した。次に、それぞれ調製した試料および標準物質の４０μｌをＰＣＲチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）において９０℃で５分間加熱した。試料は、Ｔｒｉｓ−アセテート−ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３〜８％のＴｒｉｓ−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。さらに、インナーゲルチャンバーはランニングバッファーに添加した抗酸化剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有した。試料は、葉および根試料のそれぞれについては試料の２５μＬ、精製タンパク質対照（２５ｎｇ）については４μｌ、および１５μｌの分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｍａｒｋｅｒ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ゲルの規格に従ってロードした。ゲルは一定に１５０Ｖで７５分間ランした。ゲルをランしている間、転写パッドおよび０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、転写バッファー（１×ＮｕＰａｇｅ（商標）転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０〜２０％のメタノール）に浸漬して調製した。タンパク質をゲル上で分離した後、転写するブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびゲルを製造業者の説明書に従ってアセンブルした。次いで、ゲルは一定に４５Ｖで少なくとも１．５時間転写した（ブロットモジュールごとに２枚のゲルについて２時間）。転写後、膜を室温で３０分間、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）ブロッキングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でブロックした。ブロッキング液を取り除き、一次抗体（ＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｇ４．１およびＭＡＢ  抗ＴｃｄＡ  １４８Ｄ１１．１）をブロッキングバッファー中１．０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。膜は室温で少なくとも１時間インキュベートした。膜は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）洗浄液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回、それぞれ５分間洗浄した。二次抗体（抗マウスＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ））をブロッキング液中で１：３０００希釈に調製した。上記のように洗浄する前に、膜を室温で１時間インキュベートした。膜の縁をペーパータオルに穏やかにブロットすることにより、過剰な洗浄バッファーを膜から取り除いた。膜を化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に５分間曝露した。過剰な基質を上記のように取り除き、膜をプラスチックラップで包んだ。暗室において、Ｘ線フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を膜に曝露し、バンドを可視化した。フィルムは５分間および２時間のフィルム露光について現像した。
【０１７０】
葉および根抽出物中の総可溶性タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定した。トウモロコシの葉および根試料は、９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を使用して希釈した。タンパク質標準物質（Ｐｒｅ−ｄｉｌｕｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ＢＳＡ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））は、出発濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、０．０６２５ｍｇ／ｍｌまでプレートの下方へ段階希釈し、一番下のウェルは水ブランクとして残した。試料はＭａｘｉＳｏｒｂ  ｐｌａｔｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、調製したタンパク質染料（ＢｉｏＲａｄ）をウェルに添加した。プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、Ｏ．Ｄ．５９５ｎｍの波長で、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。総可溶性タンパク質の濃度は二次回帰分析により計算した。
【０１７１】
統計分析はＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０．２、ＳＡＳ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して行った。タンパク質発現（ＴｃｄＡの百万分率）値はｌｏｇ変換を使用して変換した。
【実施例５】
【０１７２】
Ｔ０トランスジェニック植物発現スクリーニング
Ｔ０植物におけるタンパク質発現分析。ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡのデータは、トランスジェニックｐＤＡＳ５１４４事象が、根組織においてＴｃｄＡタンパク質を特異的に発現することを示した。ｐＤＡＳ５１４４事象に関して、カルスとＴ０葉試料の両方におけるＴｃｄＡの発現は、表２に示すように驚くほど低かった。様々な構築物についてＴｃｄＡのトウモロコシの葉発現プロファイルは、百万分率（ＰＰＭ）で報告する。ｐＤＡＳ５１４４構築物におけるＴｃｄＡの発現は、他の構築物より驚くほど低かった。ｐＤＡＳ５１４４構築物におけるＴｃｄＡの平均発現は、１４ＰＰＭであった。葉材料について、この構築物からの発現の範囲は０〜２００ＰＰＭであった。葉組織におけるより低い発現レベルはプロモーターの組織特異性の結果である。
【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
Ｔ１植物におけるタンパク質発現分析。表３は、昆虫バイオアッセイ中、寄生後１週間のＴ１トウモロコシの葉から単離したＴｃｄＡタンパク質についての定性ＥＬＩＳＡ分析の結果を列挙する。様々な事象に関してＴ１トウモロコシの葉を収穫し、発現したＴｃｄＡタンパク質の有効性をテストするために昆虫バイオアッセイに供した。平均ＴｃｄＡ発現（ＰＰＭ）は、構築物ごとに範囲および最高品質結果を記録した。さらに、トウモロコシの葉における平均ＴｃｄＡ発現についてのＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ平均分離分析結果を、それぞれの事象のセットについて報告する。構築物ｐＤＡＳ５１４４を含有する植物のＴｃｄＡタンパク質発現は葉組織において無視できる。トウモロコシの葉におけるＴｃｄＡの無視できる発現にも関わらず、バイオアッセイの結果は、ｐＤＡＳ５１４４事象が昆虫の寄生（例えば、根切り虫の寄生）に耐性を与えることを示す。バイオアッセイデータとタンパク質発現データ（葉由来）の組合せの分析は、葉におけるタンパク質発現と根切り虫による根の損傷レベルの間に関係がないことを示した。根におけるＴｃｄＡの発現と相まって葉組織における低いＴｃｄＡ発現レベルは、新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントが根組織特異的な様式でｔｃｄａ導入遺伝子を発現することを示唆する。
【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
昆虫バイオアッセイ後のタンパク質発現分析。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットは、昆虫バイオアッセイ実験の完了後、葉および根材料のサブセットを分析するために使用した。表４および表５は、葉および根材料それぞれにおける平均ＴｃｄＡタンパク質発現を列挙する。構築物間でＴ１トウモロコシの葉におけるＴｃｄＡタンパク質の発現レベルにおいて重大な違いがあるが、構築物間の違いは、葉と比較した場合、昆虫バイオアッセイに続く根の分析において識別しにくい。ｐＤＡＳ５１４４事象は、アッセイしたトランスジェニック事象においてＴｃｄＡタンパク質の発現をもたらす、ＴｃｄＡタンパク質発現の最大の範囲を生ずる。比較すると、回収した総タンパク質から、葉組織においてＴｃｄＡタンパク質は検出できなかった。さらにこれらの結果は、ＴｃｄＡが新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントよって推進される、構築物ｐＤＡＳ５１４４からの導入遺伝子発現は根特異的であることを示唆する。
【０１７７】
【表４】
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【０１７８】
【表５】
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【０１７９】
発生のＶ６およびＶＴ段階におけるタンパク質発現。トウモロコシ植物発生のＶ６およびＶＴ段階における新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントによるＴｃｄＡの発現レベルを評価するために、さらなる研究を実施した。構築物５１１６、５１１７、および５１４４のそれぞれから導入遺伝子ＴｃｄＡを発現するトウモロコシ植物を生育した。タンパク質をＴ１葉組織から単離し、定量し、これらの結果を全植物から単離した総タンパク質と比較した。表６に示すように、これらの結果は、構築物ｐＤＡＳ５１４４の新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントからのｔｃｄａ導入遺伝子発現が根特異的であることをさらに確かめた。ＴｃｄＡタンパク質は、全植物から単離した総タンパク質から検出されるが、葉においてはＴｃｄＡタンパク質が検出されなかった。さらに、構築物ｐＤＡＳ５１４４の新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントは、トウモロコシの生育および発生のＶ６とＶＴ両方の段階でｔｃｄａ導入遺伝子を発現した。
【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
したがって、新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントは作動可能に連結され、遺伝子発現カセットとして導入遺伝子を発現するために使用され、得られた発現プロファイルを特徴付けた。最初の開示は、遺伝子発現構築物において使用するための、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５から得られた上流プロモーターポリヌクレオチド配列、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｉ）イントロン６およびトウモロコシ縞葉枯病ウイルス５’−ＵＴＲを含むキメラプロモーターである。新規のキメラ遺伝子プロモーター調節エレメントを発現する構築物は、根組織特異的な様式で導入遺伝子を発現することが示された。組織特異性の結果は、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５から得られた上流プロモーターポリヌクレオチド配列、それに続くトウモロコシ（Zea mays）アルコールデヒドロゲナーゼイントロン１を含むキメラプロモーターが、葉と根組織両方において導入遺伝子を発現したことを考えると、驚くべきことである。米国特許６、３８４、２０７号明細書の表２２参照。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017506516.tif 000034
2017506516.tif 000035
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