(57)【要約】  本発明はヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合フラグメントであり、該ｈＩＬ−２への結合は、ｈＩＬ−２のＣＤ２５への結合を阻害し、かつ以下のパラメータのいずれか一つによって特徴づけられる該抗体に関する：ｍＡｂの可変鎖が、配列番号００５又は配列番号００６のアミノ酸配列を含むこと；該ｈＩＬ−２への結合が解離定数（ＫＤ）≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌによって特徴付けられること、該ｈＩＬ−２への結合が解離速度（Ｋｏｆｆ）≦１ｘ１０−４ｓ−１によって特徴付けられること、及び／又は該抗体がマウスＩＬ−２への測定可能な交差反応性を示さないこと。【選択図】図１
2017525343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合フラグメントであり、該抗体のｈＩＬ−２への結合は、ｈＩＬ−２のＣＤ２５への結合を阻害し、かつ該抗体は、
ａ．ｍＡｂの可変鎖が配列番号００５又は配列番号００６に対して≧８５％、≧９０％、≧９５％、又は≧９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むこと、
ｂ．ｈＩＬ−２への結合が解離定数（ＫＤ）≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦３ｎｍｏｌ／Ｌ、≦２ｎｍｏｌ／Ｌ、又は≦１．５ｎｍｏｌ／Ｌによって特徴づけられること、
ｃ．ｈＩＬ−２への結合が解離速度（Ｋｏｆｆ）≦１ｘ１０−４ｓ−１、≦８ｘ１０−５ｓ−１、≦６ｘ１０−５ｓ−１、≦４ｘ１０−５ｓ−１、≦３ｘ１０−５ｓ−１、又は≦２．１ｘ１０−５ｓ−１で特徴付けられ、及び／又は
ｄ．該抗体がマウスＩＬ−２への測定可能な交差反応性を示さないこと、
というパラメータのいずれか一つによって特徴付けられる、前記ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号０１９又は０２０に対して≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬの配列を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号００７、００８、００９、０１０、０１１、又は０１２に対して８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を少なくとも一つ含むことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号００７、００８、００９、０１０、０１１、又は０１２に対して≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の全配列同一性を有する配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１０に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１１に記載のＬＣＤＲ２、配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする請求項３に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１０に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１１に記載のＬＣＤＲ２、配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする請求項４に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記請求項のいずれか一項に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が配列番号００３又は００４に対して≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の配列同一性を有する請求項６に記載の核酸分子。  
【請求項８】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１又は２２の配列を含み、又は配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１又は２２のいずれか一つの配列に対して≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項６、７又は８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項６、７若しくは８に記載の核酸分子を含む細胞、又は請求項６、７若しくは８に記載の核酸分子を発現する細胞。
【請求項１１】
請求項１から５に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合フラグメントが産生可能である細胞。
【請求項１２】
前記生産される抗体が請求項１から５の抗体であることを特徴とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１３】
薬剤としての使用するための、特に癌又はウイルス感染症の治療に使用するための、
ａ．請求項１から５のいずれか一項に記載のｈＩＬ−２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又は
ｂ．ヒトインターロイキン−２
を含む、治療製剤。
【請求項１４】
（１）癌又はウイルス感染症の患者を選択する工程、及び（２）請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体及びヒトインターロイキン２を投与する工程、による癌又はウイルス感染症の治療方法。
【請求項１５】
癌又はウイルス感染症の治療で使用するための薬剤の製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体又は分子の使用。
【請求項１６】
薬剤として使用するための、特に癌又はウイルス感染症の治療に使用するための、
ａ．ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントであり、ここで前記ポリペプチドは、
ｉ．該ｈＬＩ−２結合ポリペプチドフラグメントが、配列番号０２１又は配列番号０２２に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％又は≧９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むこと、
ｉｉ．前記ポリペプチドフラグメントのｈＩＬ−２へのｈＩＬ−２結合が解離定数（ＫＤ）≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦３ｎｍｏｌ／Ｌ、≦２ｎｍｏｌ／Ｌ、又は≦１．５ｎｍｏｌ／Ｌで特徴づけられること、
ｉｉｉ．前記ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントのｈＩＬ−２への該結合が解離速度≦１ｘ１０−４ｓ−１、≦８ｘ１０−５ｓ−１、≦６ｘ１０−５ｓ−１、≦４ｘ１０−５ｓ−１、≦３ｘ１０−５ｓ−１、又は≦２．１ｘ１０−５ｓ−１によって特徴付けられること、及び／又は
ｉｖ．該ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントがマウスＩＬ−２への測定可能な交差反応性を示さないこと、
というパラメータのいずれか一つによって特徴付けられる、前記ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメント、
ｂ．配列番号００１に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有する、ヒトＩＬ−２ポリペプチドフラグメント、かつ、任意に
ｃ．一つの単一ポリペプチド鎖となるようにｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントをヒトＩＬ−２ポリペプチドフラグメントへ結合させる、１から５０、特に５から４０、より特に１０から３０、さらに特に約１５から２５のアミノ酸のアミノ酸リンカー、
を含む融合タンパク質を含有する、治療製剤。
【請求項１７】
アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４及びＫ９６を含むヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）エピトープへ結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
該エピトープがさらにアミノ酸Ｎ５０、Ｎ５３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３、Ｎ９７のいずれか一つ以上を含む、請求項１７に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
請求項１から５に記載の抗体又は分子と同等のエピトープ認識特性を有する抗原認識表面を含む単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）へ結合する抗体に関する。より具体的には、本発明はｈＩＬ−２の特定のエピトープに結合し、エピトープへの結合時に、ｈＩＬ−２のＣＤ２５への結合を阻害することができる抗体に関する。さらに、本発明は、該抗体のインビトロ及びインビボでの治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は男性及び女性で頻発する癌型である。一度黒色腫が転移性になり、離れた部分まで広がると、５年生存率は極めて低く、１５％であると算出されている。転移性黒色腫に対する現在可能な治療戦略では、この生存率をほとんど改善しない。
【０００３】
インターロイキン−２は転移性黒色腫に対する細胞傷害性リンパ球を強力に刺激することができるサイトカインである。しかし、ＩＬ−２はまた自己免疫疾患の予防に重要な、いわゆるＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）をも刺激することができる。重要なことに、Ｔｒｅｇ細胞は細胞傷害性リンパ球による抗腫瘍応答を著しく衰退させることができ、それ故にＩＬ−２の有益な抗腫瘍効果と多少なりとも拮抗する。さらに臨床の抗腫瘍応答を達成するのに必要な用量では、ＩＬ−２は有害な副作用を発揮するかもしれない。
【０００４】
基本的なＩＬ−２免疫療法は１９８０年代前半から転移性黒色腫と転移性腎細胞癌の免疫療法のために使われてきており、それらの効能は、それぞれ１９９６年と１９９９２年にＦＤＡからの承認に至っている。高用量での投与されたＩＬ−２は、これらの致命的な転移性癌を罹患している患者の約１７％において他覚症状率が、及び約６−９％において完全な退行が示された一方で、それらの用量で投与されたＩＬ−２は、しばしば低血圧症、肺水腫、肝細胞の損傷、胃腸毒性及び全身性浮腫といった毒性の副作用に至った。さらに、前述のようにＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞を活性化し、それは順次抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性を衰退させる。
【０００５】
ＩＬ−２と特定の抗ＩＬ−２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の組み合わせは、
（１）ＩＬ−２をＴｒｅｇ細胞ではなく優先的に細胞傷害性リンパ球へ指向させ、かつ
（２）ＩＬ−２をより強力ではあるがより有毒でなくすること
によって実験的な癌免疫療法のマウスモデルにおいてＩＬ−２療法の改善が示された（Ｂｏｙｍａｎ  Ｏ、Ｋｏｖａｒ  Ｍ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ、Ｓｕｒｈ  ＣＤ、及びＳｐｒｅｎｔ  Ｊ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００６）  ３１１：１９２４−１９２７；  Ｋｒｉｅｇ  Ｃ、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｓ、Ｐａｎｔａｌｅｏ  Ｇ、及びＢｏｙｍａｎ  Ｏ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＩＬ−２  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  （２０１０）  １０７：１１９０６−１１９１１）。
【０００６】
このアプローチは、非変異で天然のＩＬ−２が抗ＩＬ−２抗体（ｍＡｂ）を介してＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞へ運ばれ、続いて強力な抗腫瘍特性を発揮し、一方で、この種の抗ＩＬ−２ｍＡｂと複合化したＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞をほとんど活性化しないという利点がある。さらにこの種の抗ＩＬ−２ｍＡｂと複合化したＩＬ−２は、マウスにおいては基本的なＩＬ−２免疫療法よりさらに毒性が低い。しかし、この治療は適切な抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂの欠如により、今日まで患者に使用可能ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｙｍａｎ  Ｏ、Ｋｏｖａｒ  Ｍ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ、Ｓｕｒｈ  ＣＤ、及びＳｐｒｅｎｔ  Ｊ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００６）  ３１１：１９２４−１９２７
【非特許文献２】Ｋｒｉｅｇ  Ｃ、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｓ、Ｐａｎｔａｌｅｏ  Ｇ、及びＢｏｙｍａｎ  Ｏ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＩＬ−２  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  （２０１０）  １０７：１１９０６−１１９１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明によって解決する課題は、インビトロ及びインビボで治療用途に使用するための、ヒトＩＬ−２の特定のエピトープを認識して結合でき、それによってＴｒｅｇ細胞と比較して細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を優先して刺激する抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体を提供することである。この課題は独立請求項の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の側面によれば、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、該抗体はｈＩＬ−２の特定のエピトープに結合でき、それによってＣＤ２５への結合を阻害し、故にｈＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒとの相互作用の免疫学的効果を制御する。本発明の抗体は、
ａ）該ｍＡｂの可変鎖は、配列番号００５又は配列番号００６に対して≧８５％、≧９０％、≧９５％、又は≧９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むこと、
ｂ）ｈＩＬ−２へ結合する該抗体は、いわゆる、ｍＡｂ＋ｈＩＬ−２⇔ｍＡｂ＊ｈＩＬ−２の反応を示し、式中、ｍＡｂ＊ｈＩＬ−２は抗体とインターロイキンの結合複合体を記号で示したものであり、解離定数（ＫＤ）≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦３ｎｍｏｌ／Ｌ、≦２ｎｍｏｌ／Ｌ、又は≦１．５ｎｍｏｌ／Ｌによって特徴付けられること、
ｃ）ｈＩＬ−２へ結合する抗体は解離速度（Ｋｏｆｆ）≦１ｘ１０−４ｓ−１、≦８ｘ１０−５ｓ−１、≦６ｘ１０−５ｓ−１、≦４ｘ１０−５ｓ−１、≦３ｘ１０−５ｓ−１、又は≦２．１ｘ１０−５ｓ−１によって特徴付けられること、
ｄ）ｈＩＬ−２へｍＡｂが結合することで、結果としてｍＡｂ＊ｈＩＬ−２複合体は効率よくヒトＩＬ−２受容体α（ＣＤ２５としても知られる）へ結合できず、そして表面プラズモン共鳴で測定する際は、遊離の（非複合体）ＩＬ−２へのヒトＣＤ２５への結合と比較して、ｍＡｂ＊ｈＩＬ−２複合体へのヒトＣＤ２５の結合は効果的にバックグランドレベルであること、及び／又は
ｅ）該抗体はマウスＩＬ−２への測定可能な交差反応性を示さないこと、
というパラメータの少なくとも一つによってさらに特徴付けられる。
【００１０】
マウスＩＬ−２との交差反応性の欠如は、通常マウスモデルを必要とする前臨床試験、例えば交差反応する抗ＩＬ−２ｍＡｂが結合して内在性マウスＴｒｅｇ細胞から内在性マウスＩＬ−２を隔離させ、それによって内在性抗腫瘍応答する可能性があるマウス腫瘍モデルの治療でｍＡｂ＊ｈＩＬ−２複合体を使用するような場合に有利である。
【００１１】
マウスＩＬ−２との交差反応性の欠如は、ヒトの患者において候補ｍＡｂを開発する前に行う前臨床の安全性及び有効性試験に対しても有利である。
【００１２】
特定の実施態様では、ｈＩＬ−２ｍＡｂは、配列番号０１９又は配列番号０２０に対して≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％又は≧９８％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬ配列を少なくとも一つ含む。
【００１３】
特定の実施態様では、ｈＩＬ−２ｍＡｂの可変鎖は配列番号００３、００４、００５又は００６に対して≧８５％、≧９０％、≧９５％、又は≧９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該ｈＩＬ−２ｍＡｂは解離定数≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦３ｎｍｏｌ／Ｌ、≦２ｎｍｏｌ／Ｌ、又は≦１．５ｎｍｏｌ／Ｌによって特徴付けられる。
【００１４】
特定の実施態様では、該ｈＩＬ−２ｍＡｂの可変鎖は配列番号００５又は００６に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は≧９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該ＩＬ−２ｍＡｂは解離速度≦１ｘ１０−４ｓ−１、≦８ｘ１０−５ｓ−１、≦６ｘ１０−５ｓ−１、≦４ｘ１０−５ｓ−１、≦３ｘ１０−５ｓ−１、又は≦２．１ｘ１０−５ｓ−１によって特徴付けられる。
【００１５】
特定の実施態様では、該ｈＩＬ−２ｍＡｂの可変鎖は配列番号００５又は００６に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は≧９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該ｈＩＬ−２ｍＡｂはマウスＩＬ−２への測定可能な交差反応性を示さない。
【００１６】
特定の実施態様では、有害な反応を避けてヒトの患者へ投与するために該ｈＩＬ−２ｍＡｂの配列はヒト化している。
【００１７】
特定の実施態様では、該ｈＩＬ−２ｍＡｂは抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）又は１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として与えられる。
【００１８】
特定の実施態様では、該ｈＩＬ−２ｍＡｂは、配列番号００７、００８、００９、０１０、０１１又は０１２に対して≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を少なくとも一つ含む。
【００１９】
本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面に記載のヒトインターロイキン−２へ結合可能なモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子が提供される。
【００２０】
特定の実施態様では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子は配列番号００３から００４に対して≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、又は≧９９％の配列同一性を含む。
【００２１】
本発明の第三の側面によれば、本発明に記載の核酸分子を含むベクターが提供される。
【００２２】
本発明の第四の側面によれば、本発明に記載の核酸分子を含む又は発現する細胞が提供される。
【００２３】
本発明の第五の側面によれば、本発明の第一の側面に記載の抗体を産生することができる細胞が提供される。
【００２４】
本発明の第六の側面によれば、該産生された抗体が本発明の第一の側面の抗体であることに特徴付けられるモノクローナル産生ハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００２５】
本発明の第七の側面によれば、癌の、又はウイルス感染症のような免疫刺激性治療の効果がある他の疾病の、治療に使用するための治療製剤であり、
ｉ．本発明の第一の側面に記載のモノクローナル抗体及び／又は
ｉｉ．ヒトインターロイキン−２又はヒトＩＬ−２変異体をその対象に同時に若しくは異なる時間に与えること、を含む。
【００２６】
本発明の第八の側面によれば、融合タンパク質が提供される。該融合タンパク質は、
ａ．ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントであって、ここで前記ポリペプチドは、
ｉ．該ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントは配列番号０２１又は配列番号０２２に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むこと、
ｉｉ．前記ポリペプチドフラグメントのｈＩＬ−２へのｈＩＬ−２結合は解離定数≦７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦５ｎｍｏｌ／Ｌ、≦３ｎｍｏｌ／Ｌ、≦２ｎｍｏｌ／Ｌ又は≦１．５ｎｍｏｌ／Ｌによって特徴付けられること、
ｉｉｉ．前記ｈＩL−２結合ポリペプチドフラグメントのｈＩＬ−２への結合が解離速度（Ｋｏｆｆ）≦１ｘ１０−４ｓ−１、≦８ｘ１０−５ｓ−１、≦６ｘ１０−５ｓ−１、≦４ｘ１０−５ｓ−１、≦３ｘ１０−５ｓ−１、又は≦２．１ｘ１０−５ｓ−１によって特徴付けられること、及び／又は
ｉｖ．該ｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントがマウスＩＬ−２と測定可能な交差反応性を示さないこと、
というパラメータのいずれか一つによって特徴付けられ、
ｂ．配列番号００１に対して≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、又は≧９８％の同一性を有するヒトＩＬ−２ポリペプチドフラグメント、かつ任意に
ｃ．一つの単一ポリペプチド鎖となるようにｈＩＬ−２結合ポリペプチドフラグメントをヒトＩＬ−２ポリペプチドフラグメントへ結合させる、１〜５０、特に５〜４０、より特に１０〜３０、さらに特に約１５〜２５のアミノ酸のアミノ酸リンカー、
を含む。
【００２７】
言い換えれば、融合タンパク質は、ヒトインターロイキン−２に結合し、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞のような選択された免疫細胞を刺激するように指示する該抗体の能力を保持している。
【００２８】
そのような融合タンパク質を使用する利点は、ヒトＩＬ−２が該抗体から解離することができないこと、そして治療が二つの製品ではなく単一の製品で構成されている、つまり製造、投与、法令順守の様々な面が容易になることである。
【００２９】
本発明の第九の側面によれば、特異的なエピトープへ結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。前記エピトープは、本発明の他の側面に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントが結合するエピトープであってもよい。ある実施態様では、単離した抗体又は分子は、アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４及びＫ９６を含むヒトインターロイキン−２エピトープへ結合する。他の実施態様では、該単離された抗体又は分子は、アミノ酸Ｎ５０、Ｎ５３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３及びＮ９７の少なくとも一つ以上をさらに含むエピトープへ結合する。他の側面に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと同等のエピトープ認識特性を有する抗原認識表面を有する単離された抗体又は分子もまた提供される。
【００３０】
例えばコード配列又は結合エピトープのような単一の分離可能な形態の選択肢が「実施態様」として示されている場合はどこでも、そのような選択肢は自由に組み合わせて、ここで開示する本発明の各々の実施態様を形成すると理解される。
【００３１】
本発明は以下の例及び図からさらに例示され、そこからさらなる実施態様と利点を引き出すことができる。これらの例は発明を例示することを意図し、その範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、抗ヒトＩＬ−２結合を示す。Ｂ細胞ハイブリドーマ融合後に得られるＢ細胞クローンの上清を、予めヒトＩＬ−２で被覆したプレートへ添加した。該抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂはビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【図２】図２は、推定される特異的ヒトＩＬ−２エピトープへ結合する抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのスクリーニングを示す。プレートは５３４４（ここで標的とした超作用薬（ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｉｃ）挙動がないｈＩＬ−２ｍＡｂ）で被覆してブロックし、続いてヒトＩＬ−２を添加して、５３４４へ該サイトカインを結合させ、ＩＬ−２の特異的エピトープで覆った。次いで第一スクリーニング（図１）で陽性シグナルを与える該上清を加えた。上清中のｍＡｂをＩＬ−２−５３４４複合体へ結合させた後、試験した上清のｍＡｂが、同じ領域（いわゆる「競合」）又はＭＡＢ６０２とは異なる領域に結合するかどうかを評価するためにビオチン化ＭＡＢ６０２抗体をプレートに添加した。該競合ｍＡｂはＭＡＢ６０２単独で得られる吸光度より２倍低い吸光度（ＯＤ４５０）を示した（Ｈ１１に示すように、この場合ＯＤ＝１．１）
【図３】図３は、Ｂ細胞ハイブリドーマの濃度依存的競合を示す。第一スクリーニングの８つの競合Ｂ細胞ハイブリドーマクローンの上清（図２参照）を本検定で使用する前に増殖させ、濃縮した。これらの８つの競合Ｂ細胞ハイブリドーマクローン（１〜８とラベルした）の上清を添加して増量した。コンピテント競合Ｂ細胞ハイブリドーマクローンは、クローン１及び２で明らかであるように、ＭＡＢ６０２と同等かそれ以上にＯＤ４５０を減少させた。異なる濃度のＭＡＢ６０２（緑のオープンサークル）はコントロールとして供給した。
【図４】図４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビボ増殖を示す。ＣＤ４５．１コンジェニックＩＬ−７トランスジェニックマウスのカルボキシフルオレセインコハク酸エステル（ＣＦＳＥ）標識ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４５．２コンジェニックＷＴレシピエントマウスへ移植し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水、ＩＬ−２、ＩＬ−２とＭＡＢ６０２（ＩＬ−２／ＭＡＢ６０２）、ＩＬ−２と５３４４（ＩＬ−２／５３４４）、ＩＬ−２とハイブリドーマ１（ＩＬ−２／Ｈｙｂ＃１）、又はＩＬ−２とハイブリドーマ２（ＩＬ−２／Ｈｙｂ＃２）を４日間毎日注射投与した。５日目にリンパ節及び脾臓のドナーＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＦＳＥの性質ついて分析した。リンパ節で得られた結果を示している。同様の結果が脾臓でも得られた。
【図５】図５は、ＩＬ−２とハイブリドーマ１及び２を用いてインビボ処置後の内在性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表現型特性を示す。マウスは図４に示す様に処置し、次いでリンパ節及び脾臓の内在性ＣＤ８＋部分集合体及びＮＫ細胞をフローサイトメトリーで評価した。（Ａ）全リンパ球のＣＤ８対ＣＤ３のプロファイル（左のグラフ）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ節細胞のＣＤ４４（活性化又は記憶Ｔ細胞）対ＣＤ１２２（活性化又は記憶Ｔ細胞上に存在するＩＬ−２受容体βサブユニット）のプロファイル、又は（Ｂ）示された処置を受けたマウスのＮＫ１．１対ＣＤ３のプロファイルを示す。活性化／記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４４については高く、かつＣＤ１２２については中から高である。ＮＫ細胞はＣＤ３が陰性であり、ＮＫ１．１は陽性である。脾臓細胞を用いても類似の結果が得られた。
【図６】図６は、リンパ節及び脾臓の活性化／記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の全細胞数を示す。実験で用いた動物は図５に示す様に処置し、分析した。リンパ節（上のパネル）と脾臓（下のパネル）のＣＤ４４高ＣＤ８＋Ｔ細胞（いわゆる記憶表現型ＭＰ  ＣＤ８＋）及びＣＤ３＋陰性ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の絶対細胞数を示す。
【図７】図７は、購入可能なモノクローナル抗体（ＭＡＢ６０２）（左のグラフ）及び本発明の主題であるモノクローナル抗体ＮＡＲＡ１（右のグラフ）のヒトＩＬ−２に対する表面プラズモン共鳴結合曲線を示す。この実験には、アミン結合ＧＬＭチップを用いた。該チップのカルボン酸基の活性化は、１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（０．２Ｍ  ＥＤＣ）とスルホＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（０．０５Ｍ  ｓ＿ＮＨＳ）の混合物を３０ｍＬ／分、４２０秒間使用して行った。該抗体ＮＡＲＡ１及びＭＡＢ６０２を、酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ４．５）の１００ｍｇ／ｍＬ溶液でチップに被覆した。次いでエタノールアミン塩酸を３０ｍＬ／分で３００秒間添加して不活性化した。最後にヒトＩＬ−２を異なる濃度（１００ｎＭで開始し、続いて三倍希釈）で１００ｍＬ／分で添加し、６００秒会合し、そして２４０秒解離させた。
【図８】図８は、モノクローナル抗体ＮＡＲＡ１へ結合したＩＬ−２と、ＩＬ−２受容体サブユニットＣＤ２５（ここではＣＤ２５−ＦｃのＦｃ融合体として使用した）、ＣＤ１２２、モノクローナル抗体ＭＡＢ６０２、又はＮＡＲＡ１及びＭＡＢ６０２と異なるヒトＩＬ−２エピトープへ結合する抗ＩＬ−２抗体との、表面プラズモン共鳴結合曲線を示す。ＮＡＲＡ１及びＭＡＢ６０２で被覆した図７に記載した該チップを再利用した。該チップの再生は１０ｍＭグリシンを用いて、ｐＨ２．５、３０ｍＬ／分、６０秒で行った。ヒトＩＬ−２は飽和濃度（１ｍＭ）で１００ｍＬ／分で添加し、１２０秒会合し、０秒解離した。抗体へのＩＬ−２の会合後直ちに第２の分析物を１００ｍＬ／分で添加し、１２０秒会合し及び２４０秒解離した。交差結合に使用した濃度は、ＭＡＢ６０２：５０ｎＭ；ＮＡＲＡ１：５０ｎＭ；陽性参照：５０ｎＭ；ＣＤ２５−Ｆｃ：５００ｎＭ；ＣＤ１２２：１３８ｎＭであった。ｈＩＬ−２をＮＡＲＡ１へ結合するとき、異なるｈＩＬ−２エピトープ（ここでは「陽性参照」と称する）を認識する抗ｈＩＬ−２抗体は期待通りにｈＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体へ強力に結合する（図８の緑の線）が、しかし、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）はｈＩＬ−２がＮＡＲＡ１へ既に結合しているとき、ｈＩＬ−２へ結合しない（図８のオレンジの線）。
【図９】図９は、モノクローナル抗体ＭＡＢ６０２（上のグラフ）及びＮＡＲＡ１のマウスＩＬ−２への表面プラズモン共鳴結合曲線を示す。図７及び８のデータ作成に使用した同一のチップを再使用した。該チップの再生は１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、３０ｍＬ／分、６０秒で行った。測定はマウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）又はヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を１０ｎＭから開始して、そして３倍希釈し、その溶液を１００ｍＬ／分で注入し、１２０秒間会合し、５と２４０秒解離した。上のグラフにＭＡＢ６０２のマウスＩＬ−２への結合による交差反応性を示した。特に、マウスインターロイキン−２の濃度を高くすると（＞１ｎＭ）、１０を上回る応答単位１０（ＲＵ）で、該結合曲線はバックグランドレベルから著しく異なる。一方、ＮＡＲＡ１（下のグラフ）は試験した全濃度でマウスＩＬ−２への交差反応性を示さない。
【図１０】図１０は、実施例１で得られたプロロイキン／Ｆａｂ−ＮＡＲＡ１複合体の三次元構造の概要を示す。
【図１１】図１１は、エピトープ残基のさらなる分析を示す。Ｘ軸は配列番号１に記載のアミノ酸配列とその番号を列挙している。Ｙ軸の上部はプロロイキン由来に対応する残基から４Å以内にあるＮＡＲＡ１−Ｆａｂの原子の総数を示しており、Ｙ軸の下部はＮＡＲＡ１−Ｆａｂへの結合の結果としてプロロイキン由来に対応する残基の溶媒接近可能領域（Å２）の減少を示す。
【図１２】図１２は、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識される最も重要なエピトープ残基を示す。
【図１３】図１３は、プロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体とＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２四次複合体の重ね合わせを示す。
【図１４】図１４は、ＩＬ−２＿Ｃ１４５Ａ（ＰＤＢ：３ＩＮＫ）、スーパーカイン（ＰＤＢ：３ＱＢ１）、ＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）及びプロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来のＣへリックスの重ね合わせを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
「ヒトインターロイキン−２」又は「ｈＩＬ−２」はＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ６０５６８で示されたタンパク質を意味し、配列番号１として再現される。
【００３４】
本明細書の文脈中の同一性とは、位置ごとの配列比較位置の結果を示している単一の定量的パラメータである。配列比較の方法は当該分野で公知であり、公に利用可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムが例として挙げられる。そのような核酸配列の比較の一つの例として、デフォルト設定を使用したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがある：期待閾値：１０；文字サイズ：２８；クエリ範囲中の最大一致：０；マッチ／ミスマッチスコア：１，−２；ギャップコスト：リニア。他の測定変数がない場合、同一性は上記仕様に従って測定される。
【００３５】
本明細書の文脈において、抗体という用語は細胞生物学及び免疫学の分野で知られているその意味で使用される；それは全抗体、任意の抗原結合フラグメント又はそれの１本鎖及び関連又は由来する構造物を指す。全抗体はジスルフィド結合によって相互結合する少なくとも２つの重（Ｈ）鎖とふたつの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。該重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインを有する。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。該軽鎖定常領域は一つのドメイン、ＣＬを含む。該ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域２０（ＣＤＲ）とよばれる超可変領域にさらに細分され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する。それぞれのＶＨとＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲを有する。重鎖と軽鎖の可変領域には抗原と相互作用する結合領域が含まれる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。
【００３６】
本明細書の文脈中において、抗原結合タンパク質又は抗原結合フラグメントという用語は細胞生物学及び免疫学の分野において知られているその意味で使用される；所与の抗原（例えばインターロイキン−２）へ特異的に結合する能力を保持する無処置の抗体の一つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は無処置の抗体のフラグメントによって行うことができる。抗原結合部分又は抗体の抗原結合フラグメントという用語に包含される結合フラグメントの例として、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインから成る一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ部分をジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント；ＶＨ及びＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメイン又はＶＬドメインから構成される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。ＨＣＤＲは重鎖のＣＤＲを意味し、ＬＣＤＲは軽鎖のＣＤＲを意味する。
【００３７】
本明細書の文脈中において、キメラ抗体という用語は細胞生物学及び免疫学の分野において知られているその意味で使用される；それは、定常領域又はその一部を改変、置換又は交換した抗体分子であり、抗原結合部位（可変領域）を、異なる若しくは改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域、又はキメラ抗体に新しい特性を与える全く異なる分子、例えば酵素、サイトカイン、毒、ホルモン、成長因子、薬物などと結合した抗体を指す。例えば抗体は定常領域をサイトカインに置換して改変してもよい。サイトカインと置換することで、該キメラ分子は抗原認識における特異性も保持することができ、一方で元のサイトカイン分子の機能又はその一部もまた有する。
【００３８】
本明細書の文脈中において、ハイブリドーマという用語は細胞生物学及び免疫学の分野において知られているその意味で使用される；それは特定の抗体を産生するＢ細胞と骨髄腫（Ｂ細胞癌）との融合によって作製した混成細胞を指す。ハイブリドーマ細胞は組織培養で育ち、単一特異性の抗体（モノクローナル抗体）を産生することができる。
【００３９】
本明細書の文脈中において、単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）という用語は細胞生物学及び免疫学の分野において知られているその意味で使用される；それは１０から約２５アミノ酸の短リンカーペプチドで連結している、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を指す。該ｓｃＦｖは定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００４０】
本明細書の文脈中において、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）という用語は細胞生物学及び免疫学の分野において知られているその意味で使用される；それは抗原へ結合する抗体上の領域を指す。それは免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）のそれぞれの一つの定常ドメイン及び一つの可変ドメインを有する。これらのドメインはそのモノマーのアミノ末端で抗原結合部位を形成する。
【００４１】
本明細書の文脈中において、解離定数（ＫＤ）という用語は化学及び物理学の分野において知られているその意味で使用される。それは、複合体がその構成成分へ分解する時のように、大きな物体がより小さな構成成分へ可逆的に分解する傾向を測定する平衡定数を指す。ＫＤはモル単位［Ｍ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分を占める［Ａｂ］の濃度に応答する。言い換えれば、非結合［Ａｂ］の濃度と［ＡｂＡｇ］複合体の濃度は等しい。その解離定数は以下の式に従って算出される。
【００４２】
【数１】
2017525343.tif 000003
［Ａｂ］：抗体の濃度；［Ａｇ］：抗原の濃度；［ＡｂＡｇ］：  抗原抗体複合体の濃度
【００４３】
本明細書の文脈中において、解離速度（Ｋｏｆｆ；［１／ｓｅｃ］）  及び結合速度（Ｋｏｎ；［１／ｓｅｃ＊Ｍ］）という用語は化学及び物理学の分野において知られているその意味で使用される。それらは抗体とその標的の抗原との解離（Ｋｏｆｆ）又は結合（Ｋｏｎ）を測定する速度定数を指す。Ｋｏｆｆ及びＫｏｎは当該分野で十分に確立された方法を用いて実験的に決定される。抗体のＫｏｆｆ及びＫｏｎの決定方法は表面プラズモン共鳴を用いる。これはＢｉａｃｏｒｅ（商標登録）又は  ＰｒｏｔｅＯｎ（商標登録）システムのようなバイオセンサーの基本となる原理である。それらはまた以下の式を用いて解離定数ＫＤを決定することができる。
【００４４】
【数２】
2017525343.tif 000004
【００４５】
本明細書の文脈において、ヒト化抗体という用語は細胞生物学及び生化学の分野において知られているその意味で使用される。それは、非ヒト種の免疫細胞によって産生される抗体であり、そのタンパク質配列はヒトの中で自然に産生される抗体変異体との類似性を高めるように改変されている。
【００４６】
本明細書の文脈において、測定可能な交差反応性がないという用語は、他の種からのオルソログタンパク質を認識し、結合する抗体の能力が欠如していることを指す。例えば、適切な条件下で、抗体のマウスインターロイキン−２への結合が、表面プラズモン共鳴の様な感受性の高い測定方法で検出できない場合、ヒトインターロイキン−２に対する該抗体はマウスインターロイキン−２に対する測定可能な交差反応性を有さない。測定可能な交差反応性がない一つの例として図９中の下のパネルの抗体に示す（ＮＡＲＡ１）。
【００４７】
ここで使用される「ｈＩＬ−２ｈへ特異的に結合」する抗体又はタンパク質とは、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下又は１０ｐＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−２ポリペプチドへ結合する抗体又はタンパク質を指す。「ヒトＩＬ−２以外の抗原と交差反応する」抗体とは１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下又は１００ｐＭ以下のＫＤでその抗原へ結合する抗体を指す。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは１００ｎＭ以上、１μＭ以上、１０μＭ以上のＫＤでその抗原に結合する抗体を指す。特定の実施態様では、抗原と交差反応しないそのような抗体は標準的な結合検定においてこれらのタンパク質に対して本質的に結合は検出されない。
【００４８】
「エピトープ」という用語は抗体へ特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖といった分子の化学的活性表面群から構成され、かつ通常は特異的な電荷特性だけでなく、特異的な三次元構造特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、変性溶媒存在下で後者ではなく前者への結合が失われることで区別される。
【００４９】
「エピトープ結合ドメイン」又は「ＥＢＤ」という用語は、結合分子の部分（例えば抗体若しくはエピトープ結合フラグメント又はその誘導体）を指し、それは特異的に標的エピトープの結合部位へ（例えば結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）相互作用する。ＥＢＤはまた、ＩＬ−２エピトープへ特異的に（例えば結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）相互作用し、シグナル伝達を阻害することができる能力を保持する抗体の一つ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントの例として、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１で構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ；ヒンジ部分をジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨで構成されるＦｖフラグメント；ＶＨドメインで構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれるがこれに限定されない。
【００５０】
ＥＢＤはまた、当該分野で公知の単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖ（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ、及びＨｕｄｓｏｎ、（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：  １１２６−１１３６  参照）、二重特性単一鎖ジアボディ又は二つの異なるエピトープに結合するように設計された単一鎖ジアボディが含まれる。ＥＢＤはまた抗体様分子又は抗体擬態物も含まれ、これに限定されないが、ミニボディ、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｉｅｓ）、Ｆｎ３に基づくタンパク質足場、アンクリンリピート（Ａｎｋｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ）（ＤＡＲｐｉｎとして知られる）、ＶＡＳＰポリペプチド、鳥類膵ポリペプチド（ａＰＰ）、テトラネクチン、アフィリリン、ノッチン、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、テンダミスタット、ネオカージノイステイン、タンパク質Ａドメイン、リポカリン、トランスフェリン及びエピトープに特異的に結合するクニッツドメインが含まれ、それらは本発明の範囲内にある。抗体フラグメントはフィブロネクチン３型（Ｆｎ３）のようなポリペプチドに基づく足場へ移植することができる。（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７０３，１９９、ｗｈｉｃｈ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ参照）
【００５１】
本発明はまた単離された抗体であるヒトＩＬ−２への抗体も含む。
【００５２】
ここでいう「単離された抗体」という語句は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ｈＩＬ−２へ特異的に結合する単離された抗体は、ｈＩＬ−２以外の抗原へ特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ｈＩＬ−２へ特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＩＬ−２分子といった他の抗原への交差反応性を有するかもしれない。さらに単離された抗体は実質的に他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５３】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」又は「配列をコードするヌクレオチド」という用語は、相互交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそれらの誘導体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し、任意の機能を実行することができる。以下にポリヌクレオチドの例を示すがこれに限定されない：遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えばプローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、ブランチポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、ＲＮＡｉ試薬及びプライマー。ポリヌクレオチドは、一つ以上の塩基、糖及び／又はリン酸を、ここで記載する又は当該分野で知られる様々な修飾又は置換のいずれかで修飾又は置換してもよい。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド誘導体のような修飾したヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への修飾はポリマーの構築前又は後にしてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断してもよい。ポリヌクレオチドは重合の後、さらにラベル化成分を結合するような修飾をしてもよい。該用語は二本鎖及び一本鎖分子の両方を指す。指定するか必要でない限り、本発明のどの実施態様も、ポリヌクレオチドは、二本鎖形態及び、二本鎖形態を形成すると知られる又は予想されるそれぞれの二本の相補的一本鎖形態を有する。
【００５４】
ポリペプチドという用語は「タンパク質」という用語と相互交換可能に使用され、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド模倣体の化合物を指す。該サブユニットはペプチド結合によって連結してもよい。他の実施態様では、該サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結してもよい。
【００５５】
ここで使用されるいずれかの疾患又は障害（例えば癌）の「治療する」又は「治療」という用語は一つの実施態様では、疾病又は障害を改善すること（例えば、疾患の進行若しくは少なくとも臨床症状の一つを遅延若しくは停止又は縮小すること）を指す。別の実施態様では、「治療する」又は「治療」という用語は、患者によって認識できないものをも含む少なくとも一つの物理パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施態様では、「治療する」又は「治療」という用語は、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理パラメータの安定化）のいずれか又は両方で）疾患又は障害を調節することを指す。以下に特に記載しない限り、疾病の治療及び／又は予防の評価方法は当該分野において一般的に知られている方法である。
【００５６】
発明の詳細な説明
これまでは、開示した発明に適したモノクローナル抗体は入手出来なかった。本発明者らは臨床応用におけるこの技術の使用と商業化に向けて以下の重要な工程を許容するそれらの抗ヒトＩＬ−２抗体ｍＡｂを開示する：
・抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのさらなる配列と詳細な特徴付け
・患者の免疫原性を回避する（又は最小にする）ために必要不可欠な、抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのヒト化
・ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、Ｆａｂ、及び単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のようなヒトＩＬ−２ｍＡｂの異なる構成の作製
・ヒトＩＬ−２及び抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ（又は抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのフラグメント）で構成される融合タンパク質の作製：そのような構成物は、ＩＬ−２が抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂへ結合する際に、二つではなく一つの成分だけで構成されるという利点を有する。
【００５７】
本発明者は、ヒトＩＬ−２へ結合でき、マウスにおけるテストの際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む細胞傷害性リンパ球へ特異的で強力に刺激することができる特異的な抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂを産生し、特徴付けた。これらの目的のために、様々な困難を克服しなくはならなかった。
【００５８】
・ヒトＩＬ−２はマウス及びラットＩＬ−２と高い類似性を示す。ゆえにヒトＩＬ−２はインビトロ及びインビボでマウスのリンパ球を刺激することができる。さらにＩＬ−２は、原発性免疫器官（例えば骨髄）において高濃度で存在し、それは、ＩＬ−２が多少なりとも「禁じられた」抗原である理由であり、ＩＬ−２に対して中和する抗体に応答するＢ細胞を産生するのが非常に困難であることを意味する。それにもかかわらず、本発明者らは精製組み換えヒトＩＬ−２抗体と補助剤を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化後、ポリクローナル抗ヒトＩＬ−２抗体応答を誘発することができた。
【００５９】
・産生した抗体応答で、いくつかのｍＡｂのみが効率的に結合し（いわゆる「結合剤」）、そしてそれらの約０．３５％のみが推定するＩＬ−２の活性部位と相互作用した。
【００６０】
・最後に、これらの抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのうちのいくつかは、インビトロ実験には置き換えることができないマウスの特殊なインビボアッセイの評価で必要な特異的かつ強力なインビボ活性を示した。
【００６１】
本発明者は、免疫化した動物の血清中及びＢ細胞ハイブリドーマ融合後に得られるＢ細胞クローンの上清中で特異的抗ヒトＩＬ−２抗体（いわゆる「結合剤」）を検出できる特異的スクリーニングアッセイを開発した。第二の工程では、標準の結合剤とヒトＩＬ−２分子の推定される特異的エピトープを標的とするものとを区別した。異なるＢ細胞クローンを用いて行ったそのようなインビトロ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）の一例を図１〜３に示す。
【００６２】
抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂのインビトロスクリーニング後、これらのｍＡｂをインビボで特性を決定した。この目的のため及び十分なｍＡｂの量を得るために、ｍＡｂをハイブリドーマの上清から濃縮し、該量はＥＬＩＳＡを用いて推測し、最後に抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂをマウス中で試験した。ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖および拡大における結果を図４〜６に示す。
【００６３】
抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂの結合特性を特徴付けるために、ヒトインターロイキン−２への結合を表面プラズモン共鳴結合アッセイによって試験した。商業的に利用可能なヒトＩＬ−２ｍＡｂ  ＭＡＢ６０２を比較対象として測定した。図７に様々な濃度におけるヒトインターロイキン−２へのＭＡＢ６０２（左のグラフ）及びＮＡＲＡ１（本発明に記載の抗体；右のグラフ）の結合曲線を示す。ＭＡＢ６０２及びＮＡＲＡ１について測定したＫｏｎ及びＫｏｆｆ並びに解離定数（ＫＤ）を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2017525343.tif 000005
表１  ヒトＩＬ−２への抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂの結合特性
【実施例】
【００６５】
本発明の抗体は、配列番号５に記載の全長重鎖及び配列番号６に記載の全長軽鎖アミノ酸配列によって得られ、単離され、構造的に特徴付けられた抗体ＮＡＲＡ１を含む。
【００６６】
対応する可変領域であるＮＡＲＡ１のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列は、配列番号１９（可変重鎖）及び配列番号０（可変軽鎖）である。
【００６７】
ＮＡＲＡ１の全長軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号３（リーダー配列を含む重鎖コード配列）及び配列番号４（リーダー配列を含む軽鎖コード配列）。
【００６８】
ＮＡＲＡ１の可変軽鎖及び可変重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号２１（可変重鎖コード配列）及び配列番号２２（可変軽鎖コード配列）である。
【００６９】
ＮＡＲＡ１のＣＤＲ領域はＫａｂａｔシステムを用いて描写している（Ｋａｂａｔ、Ｅ．  Ａ．ら  １９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２、ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｚｈａｏ＆Ｌｕ  ２００９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４７：６９４−７００）。分かり易くするために、ＣＤＲ領域がＫａｂａｔ定義に従って描写されているとき、以後それらは個々にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ぶ。ＮＡＲＡ１のＣＤＲ領域は：配列番号７に記載のＨＣＤＲ１、配列番号８に記載のＨＣＤＲ２、配列番号９に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１０に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１１に記載のＬＣＤＲ２、配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３である。
【００７０】
ＮＡＲＡ１のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は：配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１コード配列、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２コード配列、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３コード配列、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１コード配列、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２コード配列、配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３コード配列である。
【００７１】
融合タンパク質もまた配列番号２３及び配列番号２４に従って提供される。配列番号２３は、ＧｘＳリンカーを介してｈＩＬ−２のＣ末端へ、Ｎ末端を融合させたＮＡＲＡ１の可変重鎖を含む融合タンパク質である。配列番号２４はＧｘＳリンカーを介してｈＩＬ−２のＣ末端へ、Ｎ末端を結合させたＮＡＲＡ１の可変軽鎖を含む融合タンパク質である。
【００７２】
（ａ）実施例１．ＮＡＲＡ１の結晶構造
（ｉ）材料及び方法
抗体「ＮＡＲＡ１」のＦａｂフラグメント（配列番号５及び６）へ結合したヒトインターロイキン２変異体（配列番号２）（「プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）」と呼ぶ）の複合体の構造を決定した。結果として得られたプロロイキンの残基の番号付けはｗｔ  ＩＬ−２の番号付けに従って与えられる。
【００７３】
以下に詳細を記述する、プロロイキンとｗｔ  ＩＬ−２との間の配列の相違は無関係であり、プロロイキンはｈＩＬ−２の構造解析のための妥当性のあるモデルである。
【００７４】
エピトープを決定するために、Ｘ線結晶学を使用して前述の複合体の原子分解構造を解析した。Ｘ線結晶学は、抗体及びそれらと抗原との複合体を含む生体分子の構造データを作製するのに日常的に広く使用されている技術である（Ａｄｍｓら、（２０１３）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４２：２６５−２８７；  Ｇａｒｍａｎ、（２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１１０２−１１０８；  Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ、（２００９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９：５７３−５８４．）。
【００７５】
抗原、プロロイキンは賦形剤（プロロイキン１ｍｇごとに約５０ｍｇのマンニトール、０．１８ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム、０．１７３ｍｇリン酸二水素ナトリウム、及び０．８９ｍｇリン酸水素二ナトリウムと混合されている）と一緒に凍結乾燥粉末として販売されている。その複合体形成で使用する前に、プロロイキンを逆相ＨＰＬＣで精製し、該賦形剤を除去した。
【００７６】
ＮＡＲＡ１のＦａｂフラグメント（ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ）は全長抗体をパパイン切断し、プロテインＡクロマトグラフィによって作製した。簡潔には６．５ｍＬの全長ＮＡＲＡ１（９０ｍＭの塩酸を含むｐＨ７．０の５０ｍＭ  クエン酸緩衝液中９ｍｇ／ｍＬ）を５ｍＭ  ＤＴＴ及び５９０μｇパパイン（ロッシュ）と混合した。切断反応は室温で１６時間維持し、５６ｍＭ  Ｅ６４溶液（ロッシュ）を１５μＬ添加して反応を停止した。該切断溶液を、２５ｍＭ  トリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の溶液で１０倍希釈し、そして２５ｍＭ  トリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の溶液によって５カラム容積で平衡化した５ｍＬプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア）へ、その溶液をロードした。そしてＦａｂフラグメントはローディングスルー分画で得られ、ＦｃフラグメントはプロテインＡカラムに結合させて得た。
【００７７】
複合体を形成するために、ＨＰＬＣ後のプロロイキン粉末は５．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＨ２Ｏに溶解した。過剰量である６．６ｍｇのプロロイキンを１１．５ｍｇのＮＡＲＡ１  Ｆａｂフラグメント溶液に滴下した。遠心分離法を用いて現行の条件下で沈殿している過剰のプロロイキンを除去した。該複合体は、２５ｍＭ  トリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４のランニングバッファーで、セファデックス２００  １０ｘ３００（ＧＥヘルスケア）を用いたゲル濾過によって精製した。
【００７８】
ゲル濾過後のプロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体は１４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、シッティングドロップとして、蒸気拡散法によってスクリーニングした。該タンパク質溶液は１：１でリザーバ緩衝液と混合し、総容量０．４μＬとした。該実験はＰｈｏｅｎｉｘ  ｒｏｂｏｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行い、１９℃でロックイメージャーホテル（ＲｏｃｋＩｍａｇｅｒ  ｈｏｔｅｌ）  （Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）に保存し、自動で画像化した。２０％ｗ／ｖポリエチレングリコール３３５０及び０．２Ｍ  硝酸ナトリウムの条件下でスクリーニングの４日後に結晶を収集した。結晶は１０％グリセロールを含むリザーバ緩衝液で低温保護し、データ収集の前に液体窒素で急速凍結した。Ｐｉｌａｔｕｓ画素検出器がついたビームラインＰＸ−ＩＩでＳｗｉｓｓ光源（ビリゲン、スイス）の０．９９９９８ÅのＸ線放射波長を用いて、回折データを収集した。
【００７９】
データセットはＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥ（２０１０年１２月６日版）で処理し、構造は、ＩＬ−２の検索モデルとしてタンパク質データバンクエントリ「３ＩＮＫ」を用いて及びＦａｂフラグメントの検索モデルとしてタンパク質データバンクエントリ「３ＴＴＩ」を用いて、プログラムＰＨＡＳＥＲを用いた分子置換法で解析した。反復モデルの構築及び改良は、プログラムＣｏｏｔ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｔｏｏｌｋｉｔ）及びＡＵＴＯＢＵＳＴＥＲ  （Ｂｒｉｃｏｇｎｅら、２０１１）で行った。全ての図はプログラムＰｙＭＯＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；  ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）で作製した。
【００８０】
エピトープ残基は、ＮＡＲＡ１のＦａｂの任意の原子から４Å以内のプロロイキン由来の残基として決定し、ＣＣＰ４プログラムＣＯＮＴＡＣＴ及びＡＲＥＡＩＭＯＬ  （Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ  ４、ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．４．０）で確認した。類似のパラトープ残基はプロロイキンの任意の原子から４Å以内のＮＡＲＡ１のＦａｂフラグメント残基として決定した。
【００８１】
（ｉｉ）結果
プロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体は、単位格子容積ａ＝２０１．８Å、ｂ＝３６．２Å、ｃ＝８８．７Å、アルファ＝９０°、ベータ＝１０２．９°、ガンマ＝９０°で、空間グループＣ１２１中の１．９５  Åで解析した。詳細な構造統計は表２を参照する。各非対称単位には一つの複合体分子が存在する。
【００８２】
【表２】
2017525343.tif 000006
【００８３】
１）エピトープ及びパラトープ分析
図１０は、実験１で得られたプロロイキン／Ｆａｂ−ＮＡＲＡ１複合体の三次元構造の概要を示す。ＮＡＲＡ１のＦａｂフラグメントの軽鎖をＡ、ＮＡＲＡ１のＦａｂフラグメントの重鎖をＢ、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識されるエピトープ残基をＤ、及びプロロイキンをＣと指定し、かつ変位Ｃ１４５Ｓをハイライトで表示した。
【００８４】
図１１は、エピトープ残基のさらなる分析を示す。Ｘ軸は配列番号１に記載のアミノ酸配列及び番号付けを列挙する。Ｙ軸の上部側はプロロイキン由来の対応する残基から４Å以内のＮＡＲＡ１−Ｆｂの原子の総数を示し、Ｙ軸の下部側はＮＡＲＡ１−Ｆａｂへ結合後の減少した溶媒接近可能領域（Å２）を示す。
【００８５】
実験１で使用したプロロイキンはＣ１４５Ｓの変異を有する。図１０に示す様にＣ１４５Ｓはエピトープ領域から離れている。加えて、実施例１のプロロイキンと、ＣＤ２５、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）と複合体中のｗｔ  ｈＩＬ−２のＣα原子との間の、Ｃα原子の重ね合わせは０．４４７Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄを示し、それは変異が全ての構造を妨げないことを示唆する。したがって、Ｃ１４５Ｓ変異を有すプロロイキンはｗｔ  ｈＩＬ−２の構造分析をするのに妥当なモデルである。
【００８６】
ｈＩＬ−２は４−へリックスバンドルタンパク質であり、そして４へリックスはＮ末端側からＣ末端側にかけてそれぞれにＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと名付けられている。図１０に示されるＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識される該エピトープは立体配座エピトープであり、図１１に示すように２つの領域にわたる。一つの領域（Ｎ５０−Ｋ６３）はループ及びショートへリックスを含み、へリックスＡとＢを連結させ、他方の領域（Ｎ９１−Ｎ９７）はループを含み、へリックスＢとＣを連結させる。
【００８７】
エピトープ残基はＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の相互作用するパラトープと共に表３に要約されている。全てのエピトープの中で、図１１中に示されるＡｒｇ５８が、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂとの結合に最も重要なエピトープ残基であり、この残基単独でＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の４２の相互作用する原子を有し、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂへの結合の結果として、減少させる溶媒接触可能な表面領域の１７．７％を占める。さらに、Ａｒｇ５８は図１２に示す様に、ＨＣＤＲ１のＧｌｕ３５、及びＬＣＤＲ３のＡｓｐ１００とそれぞれ強い塩架橋を形成する。Ａｒｇ５８は、またＬＣＤＲ３のＴｒｙ１００の芳香族環とπ作用相互作用を形成する。Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４及びＫ９６の残基もＮＡＲＡ１−Ｆａｂへの結合に重要であると考えられる。それは、それら全てが、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の５原子かそれ以上と相互作用し、図１１に示すように溶媒接触可能領域を３２Å２以上減少させるからである。
【００８８】
【表３】
2017525343.tif 000007
【００８９】
図１２にＮＡＲＡ１−Ｆａｂを認識する最も重要なエピトープとしてＡｒｇ５８を示す。Ａはプロロイキンを表し、Ｂは重鎖を表し、かつＣは軽鎖を表す。関係する残基は棒で表している。
【００９０】
２）ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ結合特性
図１３にＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２の４つの複合体とプロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆｓｂ複合体との重ね合わせ示す。４つの複合体の構造はＰＤＢエントリ「２Ｂ５Ｉ」から得られ、その淡いシアン色のイラストＤはｗｔ  ｈＩＬ−２を表し、赤色のイラストＢはＣＤ１２２を表し、青色のイラストＣはＣＤ１３２を表し、そして緑色の表面ＡはＣＤ２５を表す。プロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体の構造において、ｗｔ  ｈＩＬ−２で重ね合わされたシアン色のイラストＤはプロロイキンを表し、マゼンタ色のイラストＥは重鎖、黄色のイラストＦは軽鎖を表す。
【００９１】
図１３に示される２つの複合体の構造の重ね合わせは、ＮＡＲＡ１−ＦａｂはＣＤ２５に対して直接競合を形成するが、ＣＤ１２２／ＣＤ１２３に対しては直接競合を形成しないことを明らかに示しており、それは、ＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体が、ｐｒｏ−Ｔｒｅｇ細胞の活性よりもむしろｐｒｏ−Ｔエフェクター細胞の活性を主に示すという観測と一致する。
【００９２】
３）４つの複合体中のそれと類似した立体構造をとる、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂと複合体を形成しているプロロイキンのＣへリックス
図１４は、ＩＬ−２Ｃ１４５Ａ（ＯＤＢ：３ＩＮＫ）、スーパーカイン（ＰＤＢ：３ＱＢ１）、ＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）及びプロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来のＣへリックスの重ね合わせを示している。
【００９３】
ＩＬ−２及びＣＤ１２２のへリックスＣ間の極性界面は、２つの部分の間の結合において重要な役割を果たす（Ｗａｎｇら（２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１１５９−１１６３）。２０１２年レビンらは、ＩＬ−２変異体であるスーパーカイン単独で、４つの複合体のそれと似た立体構造をとるヘリックスＣを有し、スーパーカインはｗｔ  ＩＬ−２よりＣＤ１２２に対する結合親和性が２１５倍以上高いことを示した（Ｌｅｖｉｎら、（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９−５３３）。へリックスＣにおける立体配座の変化は、立体配座の安定化に関連し、そしてＣＤ１２２への結合のエネルギー損失を減少させることが観測された。図１４に示すとおり、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂとの複合体中のプロロイキンのへリックスＣの立体配座もまた、Ｌ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２の４つの複合体中と同様にスーパーカイン中に観測されるものと類似しており、それゆえプロロイキン／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体はｗｔ  ｈＩＬ−２よりＣＤ１２２に対して高い結合親和性を示す可能性がある。
【００９４】
（ｂ）実施例２  ＮＡＲＡ１及びＭＡＢ６０２の直鎖ペプチドマッピング
ＮＡＲＡ１及びＭＡＢ６０２抗体のエピトープをマッピングするためにヒトＩＬ−２の配列に基づいて１５残基ペプチドの第一ライブラリーを作製した。選択された１５残基ペプチドの第二のライブラリーも３つの特異的残基Ｆ（６２）、Ｙ（６５）、Ｌ（９２）の変異に基づいて作製した。後者の変異はＷＯ２０１２／１０７４１７Ａ１の開示されている、これら３つの変異を有するＲｏｃｈｅ／Ｇｌｙｃａｒｔ  ＩＬ２変異タンパク質に基づいて行った。研究所ボイマンで行われた以前の研究では（未発表）、Ａ１と類似の機能を有する市販のマウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡＢ６０２はＩＬ−２のＦ４２Ａ変異体（ＣＤ２５へのＩＬ２結合部位の一つ）への結合を強く減少させることが示された。
【００９５】
（ｉｉ）材料と方法
従って、第一のライブラリー中の各ペプチドは１５コのアミノ酸を有し、そして配列はＮ末端から出発して３残基進めて目的の配列（表４参照、参照ペプチド１から４１）を走査することによって該配列を得られる。したがってラダーが作製され、ラダー中、各ペプチドは前ペプチドと重複する１２残基を含み、次のペプチドと重複する１２残基を含む。合計で、発現されたヒトＩＬ−２の配列から４１のペプチドを作製した。
【００９６】
ペプチドの第二のライブラリーは、上記の第一ライブラリーの対応する全ペプチド中のＦ（６２）、Ｙ（６５）及び  Ｌ（９２）をアラニンへ変異することによって作製した（表４参照、参照ペプチド４２から６０）。
【００９７】
両方のライブラリーについて、非特異的結合を避けるために、元のシステインをセリンに置き換えている（下線部の残基）。
【００９８】
【表４】
2017525343.tif 000008
2017525343.tif 000009
【００９９】
両方のペプチドセットをマイクロアレイスライド上に３重でプリントし、目的の抗体（ＭＡＢ６０２及びＮＡＲＡ１）及びコントロール抗体をインキュベートした。同じアイソタイプ（マウス対照ＩｇＧ２ａ／λ及びマウス対照ＩｇＧ２ａ／κ）由来の無関係の抗体及び二次抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  ８４５４５、ＤＬ６５０ラベル）又は抗マウスＩｇＧ（ＪＩＲ  １１５−１７５−０７２、Ｃｙ５ラベル））を追加でインキュベートした。実験は基本的にＭａｋｓｉｍｏｖ  Ｐら  ２０１２、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３４２１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３４２１２に記載のとおりに行った。
【０１００】
ペプチドマイクロアレイ（３重）を一次抗体とインキュベートした後、一次抗体のＦｃ部分に結合する蛍光標識した二次抗体でインキュベートし、レプリトープ（ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ）分析によってペプチド−抗体結合の測定を行った。全ての工程は、高い信頼性と再現性のある洗浄およびインキュベーション工程が可能であるＴＥＣＡＮマイクロアレイ処理ステーション上で実施された。インキュベーション工程を行い、次いで最後の洗浄工程（未結合の二次抗体を除去するための）後、該マイクロアレイを窒素流で乾燥させ、適切な波長設定のある高分解能マイクロアレイスキャニングシステムでスキャンした。対照のインキュベーションは偽陽性シグナルを排除するために同じアイソタイプを有する無関係の抗体を用いて行った。
【０１０１】
得られた画像をスポット認識ソフトウエアジェネピクス（ＧｅｎｅＰｉｘ）（モレキュラーデバイス）を用いて分析し、定量した。各スポットについて、平均シグナル強度を抽出した（０〜６５５３５間の任意の単位）。さらなるデータの解析について、ＭＭＣ２の値を決定した。ＭＭＣ２はマイクロアレイ上の３つの全ての実測値の平均値に等しい。変動係数（ＣＶ）（標準偏差を平均値で割ったもの）が０．５より大きいものを除外し、この場合２つの最も近い値（ＭＣ２）の平均値がＭＭＣ２に割り当てられる。
【０１０２】
(ii)結果
データを表５に要約する。
抗ＩＬ−２抗体（ＮＡＲＡ１）は、固定化ペプチドに対して優位な反応性を示さなかった。ペプチド１０のみが弱い応答を示したが、しかしこのペプチドはマウスの対照抗体によっても弱く認識された。市販の抗体ＭＡＢ６０２（ｍｌｇＧ２ａ）はペプチド２２〜２６にいくらかの弱いシグナルを示し、ペプチド１０〜１３にはいくらか強いシグナルを示した。
【０１０３】
【表５】
2017525343.tif 000010
【０１０４】
両方のペプチドセット内の重複配列は、標的抗体に対する結合アミノ酸を含有すると考えられる（表５）。一方の伸長はＭＡＢ６０２に対する強力な結合剤であり、他方はＭＡＢ６０２に対する弱い結合剤である：
【０１０５】
強い：  （５７）  ＴＲＭＬＴＦ  （６２）
弱い：  （９６）  ＫＮＦ  （９８）
【０１０６】
特定の残基Ｆ４２（６２）、Ｙ４５（６５）、Ｌ７２（９２）に対するＡｌａの変異は、残基Ｆ４２（６２）が抗体ＭＡＢ６０２（表６）への結合にとって明らかに重要な残基であることを示した。
【０１０７】
【表６】
2017525343.tif 000011
【０１０８】
配列リスト
本発明を実施するための有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列を表７に示す。
【０１０９】
【表７】
2017525343.tif 000012
2017525343.tif 000013
2017525343.tif 000014
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【図１】
2017525343.tif 000016
【図２】
2017525343.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
2017525343.tif 000020
【図６】
2017525343.tif 000021
【図７】
2017525343.tif 000022
【図８】
2017525343.tif 000023
【図９】
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【図１０】
2017525343.tif 000025
【図１１】
2017525343.tif 000026
【図１２】
2017525343.tif 000027
【図１３】
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【図１４】
2017525343.tif 000029
【配列表】
2017525343000001.app
【国際調査報告】
2017525343.tif 000030
2017525343.tif 000031
2017525343.tif 000032