(57)【要約】  生体利用可能な鉄を含有する本発明の無毒な人工ミネラルウォーター組成物は、１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度の第一鉄イオンと、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋およびＫ＋から選択される無毒性量の少なくとも１種の金属カチオンとを含有するｐＨ１〜５の水溶液からなり、鉄濃度が２０μＭになるように該組成物を希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量が１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超える。本発明のミネラルウォーター組成物は、食餌性鉄を補給する目的で使用される生体利用可能な経口鉄を供給する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体利用可能な鉄を含有する無毒な人工ミネラルウォーター組成物であって、
１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度の第一鉄イオンと、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋およびＫ＋から選択される無毒性量の少なくとも１種の金属カチオンとを含有するｐＨ１〜５の水溶液からなり、
鉄濃度が２０μＭになるように該組成物を希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量が１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超えることを特徴とする、ミネラルウォーター組成物。
【請求項２】
第一鉄イオンの濃度が１５０〜２５０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項３】
第二鉄イオンをさらに含有し、該第二鉄イオンの濃度が７０ｍｇ／ｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／ｌ以下である、請求項１または２に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項４】
Ｃａ２＋イオンの濃度が２００ｍｇ／ｌ以下、好ましくは１００〜１９０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項５】
Ｍｇ２＋イオンの濃度が６０ｍｇ／ｌ以下、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項６】
Ｚｎ２＋イオンの濃度が６０ｍｇ／ｌ以下、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項７】
カリウムがソルビン酸カリウムの形態で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項８】
ソルビン酸カリウムの濃度が１８００ｍｇ／ｌ以下、好ましくは１０００〜１５００ｍｇ／ｌの範囲である、請求項７に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項９】
１種以上の香料成分をさらに含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項１０】
前記香料成分がリンゴ果汁、柑橘果汁およびビタミンＣから選択される、請求項９に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項１１】
ｐＨが２〜５の範囲、好ましくは２〜４の範囲、より好ましくは２．５〜３．５の範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体利用可能な鉄を含有するミネラルウォーター組成物に関する。より詳細には、本発明は、食餌性鉄を補給する目的で使用される生体利用可能な経口鉄を供給するための人工または合成のミネラルウォーター組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、多くの生物にとって必須の無機栄養素である。鉄はヒト体内では、肺から組織へ酸素を運搬するヘモグロビンの成分、筋肉細胞内で酸素の貯蔵や拡散を担うミオグロビンの成分、ミトコンドリア電子伝達系の酸化還元反応に関与する鉄硫黄タンパク質の成分などとして機能している。
【０００３】
ヒトの食餌中の鉄には、ヘム鉄と非ヘム鉄の２種類の形態がある。ヘム鉄は一般に、赤身の動物性食品中に存在し、非ヘム鉄よりも生体に吸収されやすい。非ヘム鉄源としては穀物や野菜がある。
【０００４】
ヒトの鉄欠乏症は、通常の食事による鉄摂取量がヒトでの必要量に満たない場合に起こる。一般に男性では１日あたり約１ｍｇの鉄が失われるが、これは通常、食事による鉄の摂取のみで補うことができる。子供では、急速な成長に応じて鉄が必要とされるため、鉄の必要量は比較的多い。女性では、出産や月経により大量の鉄が必要とされ、一般に１日あたり約２ｍｇの鉄が失われる。このような鉄の喪失は通常、食事による鉄の摂取により補う必要がある。
【０００５】
鉄を含有する様々な経口栄養補助剤が、一般的な栄養補助食品や特定の鉄補充療法剤として利用されている。従来、貧血の経口治療には、例えば、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、グルコン酸第一鉄などの第一鉄塩が用いられている。通常、錠剤として処方されるこのような第一鉄製剤には、バイオアベイラビリティにばらつきがあるという問題がある。したがって、第一鉄製剤は生体に吸収されにくいと考えられる。さらに、患者によっては第一鉄塩の摂取により、悪心、嘔吐、下痢、便秘および／または腹痛などの様々な症状を示す場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生体利用可能な鉄を高レベルに含有するミネラルウォーター組成物を製造可能であるという知見に基づいている。
【０００７】
本発明は、生体利用可能な鉄を含有する無毒な人工ミネラルウォーター組成物であって、１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度の第一鉄イオンと、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋およびＫ＋から選択される無毒性量の少なくとも１種の金属カチオンとを含有するｐＨ１〜５の水溶液からなり、鉄濃度が２０μＭになるように該組成物を希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量が１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超えることを特徴とするミネラルウォーター組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、上述のように、１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度の第一鉄イオンを含有する。第一鉄イオンの濃度は１５０ｍｇ／ｌ以上であることが好ましい。別の一実施形態によれば、本発明の組成物中の第一鉄イオンの濃度は２５０ｍｇ／ｌ以下である。より好ましい一実施形態によれば、第一鉄イオンの濃度は１７５〜２２５ｍｇ／ｌの範囲であり、特に約２００ｍｇ／ｌである。第一鉄イオンは硫酸第一鉄に由来するものであることが好ましい。
【０００９】
本発明のミネラルウォーター組成物は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋およびＫ＋から選択される無毒性量の少なくとも１種の金属カチオンを含有する。好ましい一実施形態によれば、本発明のミネラルウォーター組成物はＣａ２＋イオンを２００ｍｇ／ｌ以下の濃度で含有する。Ｃａ２＋濃度は１００ｍｇ／ｌ以上であることが好ましく、１５０ｍｇ／ｌ以上であることがより好ましい。別の一実施形態によれば、Ｃａ２＋濃度は１９０ｍｇ／ｌ以下であり、１８０ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。Ｃａ２＋濃度が約１７０ｍ／ｌであることが特に好ましい。カルシウムイオンはＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏに由来するものであることが好ましく、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏは、硫酸の添加により酸性に調整された水または無機物溶液に溶解してもよい。
【００１０】
本発明の組成物がＭｇ２＋イオンを含有する場合、組成物中のＭｇ２＋イオンの濃度は通常６０ｍｇ／ｌ以下であり、５０ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。別の一実施形態によれば、組成物中のＭｇ２＋イオンの濃度は、２０ｍｇ／ｌ以上であり、３０ｍｇ／ｌ以上であることが好ましく、約４０ｍｇ／ｌであることが最も好ましい。マグネシウムイオンは硫酸マグネシウムに由来するものであることが好ましい。
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、Ｃａ２＋イオンとＭｇ２＋イオンとを含有する。通常、このような組成物は、１００〜２００ｍｇ／ｌのＣａ２＋イオンと２０〜６０ｍｇ／ｌのＭｇ２＋イオンとを含有し、１５０〜１９０ｍｇ／ｌのＣａ２＋イオンと３０〜５０ｍｇ／ｌのＭｇ２＋イオンとを含有することが好ましく、約１７０ｍｇ／ｌのＣａ２＋イオンと約４０ｍｇ／ｌのＭｇ２＋イオンとを含有することがより好ましい。
【００１２】
本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、無毒性量のＺｎ２＋イオンを含有していてもよい。本発明の組成物がＺｎ２＋イオンを含有する場合、組成物中のＺｎ２＋イオンの濃度は通常６０ｍｇ／ｌ以下であり、５０ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明の合成ミネラルウォーター組成物は約４０ｍｇ／ｌのＺｎ２＋イオンを含有する。亜鉛イオンは硫酸亜鉛に由来するものであることが好ましい。
【００１３】
本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、上述のように、無毒性量のＫ＋イオンを含有していてもよい。通常、カリウムイオンは硫酸カリウムに由来するものである。好ましい一実施形態によれば、カリウムはソルビン酸（ヘキサ−２，４−ジエン酸）のカリウム塩の形態で提供されるが、その理由としてはソルビン酸カリウムが保存料として機能することが挙げられる。本発明の合成ミネラルウォーター組成物中に含まれるソルビン酸カリウムの濃度は、通常１８００ｍｇ／ｌ以下であり、１６００ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。本発明の組成物中のソルビン酸カリウムの濃度は、１０００〜１５００ｍｇ／ｌの範囲であることがより好ましい。本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明の合成ミネラルウォーター組成物中のソルビン酸カリウムの含量は１３００〜１４００ｍｇ／ｌである。
【００１４】
本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、鉄をＦｅ３＋イオンの形態で含有していてもよい。本発明者は、本発明の組成物中に第二鉄イオン（すなわちＦｅ３＋）が含まれる場合、該組成物中の第二鉄イオンの濃度は７０ｍｇ／ｌ以下であってもよく、５０ｍｇ／ｌ以下であることが好ましいことを見出した。本発明の組成物中にＦｅ３＋イオンが含まれる場合、その濃度は、通常、Ｆｅ２＋イオンの濃度の５〜２０％である。本発明の組成物中のＦｅ３＋イオンの濃度は、Ｆｅ２＋イオンの濃度の約１０％であってもよい。したがって、本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、該組成物中の第一鉄イオンの濃度と第二鉄イオンの濃度の比が約１０：１になるような濃度で第二鉄イオンを含有していてもよい。別の一実施形態によれば、本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、第一鉄イオンの濃度と第二鉄イオンの濃度とカルシウムイオンの濃度の比（Ｆｅ２＋：Ｆｅ３＋：Ｃａ２＋）が約１０：１：８〜９になるように第二鉄イオンおよびカルシウムイオンを含有している。さらに別の一実施形態によれば、本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、第一鉄イオンの濃度と第二鉄イオンの濃度とマグネシウムイオンの濃度の比（Ｆｅ２＋：Ｆｅ３＋：Ｍｇ２＋）が約１０：１：２になるように第二鉄イオンおよびマグネシウムイオンを含有している。さらに別の一実施形態によれば、本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、第一鉄イオンの濃度と第二鉄イオンの濃度と亜鉛イオンの濃度の比（Ｆｅ２＋：Ｆｅ３＋：Ｚｎ２＋）が約１０：１：２になるように第二鉄イオンおよび亜鉛イオンを含有している。
【００１５】
本発明の合成ミネラルウォーター組成物は、鉄の取り込みに悪影響を及ぼさない１種以上の他の金属カチオンを無毒性量で含有していてもよい。このような他の金属カチオンとしては、ナトリウムおよびマンガンが挙げられる。通常、ナトリウムイオンは塩化ナトリウムに由来するものである。通常、マンガンイオンは硫酸マンガンに由来するものである。
【００１６】
一実施形態によれば、本発明の組成物は１種以上の保存料を含有する。本発明での使用に好ましい保存料はソルビン酸カリウムである。しかしながら、ソルビン酸カリウムの代わりに１種以上の他の保存料を使用してもよく、ソルビン酸カリウムに加えて１種以上の他の保存料を使用してもよい。
【００１７】
さらに、本発明の組成物は１種以上の適切な無機カウンターイオンを含有する。このような適切な無機カウンターイオンは、使用される濃度において無毒であり、上述した必須かつ好ましい金属イオンの溶解状態を維持できるような溶解性を有している。本発明の組成物中で使用するのに好ましい無機カウンターイオンは硫酸アニオンであるが、リン酸アニオンおよび／または塩素アニオンなどの他のアニオンが本発明のミネラルウォーター組成物に含まれていてもよい。
【００１８】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、上述のように、１〜５の範囲のｐＨ値を有する。本発明の組成物のｐＨは２〜５の範囲が好ましく、２〜４の範囲がより好ましく、２．５〜３．５の範囲が最も好ましい。通常、本発明の組成物のｐＨは、例えば、硫酸、リンゴ酸、クエン酸およびこれらの混合物などの適切な酸を加えることにより調節される。
【００１９】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、当技術分野において公知の添加物を用いて風味を付与してもよい。好ましい香料添加物としては、リンゴ果汁や柑橘果汁などの１種以上の果汁および／またはビタミンＣが挙げられる。通常、リンゴの風味は、リンゴ濃縮物を加えることによって付与される。リンゴ濃縮物は、例えば、リンゴを浸軟して圧搾した後、得られた果汁を脱水濃縮することによって得られる。また、圧搾により得られたリンゴ果汁を濃縮する前に、デンプンおよびペクチンの除去処理を行ってもよい。果汁や濃縮物は天然由来の糖類を含有している。１種以上の糖類および／または他の甘味料を本発明のミネラルウォーター組成物に加えることもできる。
【００２０】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、第一鉄塩の滅菌濃縮原液と、他の所望の塩や添加物の１以上の滅菌濃縮原液とをそれぞれ適量ずつ滅菌水に加えることによって調製してもよい。これらの滅菌濃縮原液を添加する水は、滅菌濃縮原液の添加前に、特定量の硫酸を使用して酸性化することによってｐＨを４．０未満、好ましくは３．５以下に下げることが好ましく、これによって、調製した溶液を安定化することができる。このような調製方法は、所望の人工ミネラルウォーター組成物にカルシウムイオンが含まれる場合に特に有用である。硫酸カルシウムは溶解性が低いことから、この塩の濃縮原液を調製することは不可能である。したがって本発明者は、上述のように、酸性化した溶液に固体の硫酸カルシウム二水和物を加えて溶解することが好ましいと考えている。酸性化した溶液への硫酸カルシウム二水和物の添加は、他の塩や任意の添加物の濃縮原液を添加する前、添加する際、または添加した後に行ってもよい。必要に応じて、硫酸をさらに加えることによって、あるいはリンゴ酸および／またはクエン酸を加えることによって、得られた溶液のｐＨを所望のｐＨに調節してもよい。
【００２１】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、生体利用可能な鉄、すなわち該組成物の摂取によって容易に生体に取り込まれる形態の鉄を含有する。鉄濃度が２０μＭになるように本発明の組成物を希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量は１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超える。
【００２２】
生体での鉄吸収は、小腸の十二指腸領域で起こることが知られている。本発明によれば、鉄の取り込み量は、Ｃａｃｏ−２細胞を用いて十二指腸での吸収を模倣したインビトロ法により測定してもよい。Ｃａｃｏ−２細胞は、摂取した食品から栄養素を吸収する小腸の内面を覆っているヒト腸管上皮細胞に類似している。Ｃａｃｏ−２細胞は、ヒトの体内において鉄の取り込みや輸送を担うタンパク質の多くを発現しており、薬物吸収研究を目的として医薬業界において広く用いられている。US6,017,713には、Ｃａｃｏ−２細胞におけるフェリチン形成を指標として利用することによって、食品試料中に含まれる鉄の利用能を予測する方法が開示されている。この特許文献では、Ｃａｃｏ−２細胞を用いたインビトロ消化／細胞培養モデルが開示されている。
【００２３】
実施例において詳細に説明するが、本明細書において利用される方法によれば、胃を模倣した消化条件に本発明の人工ミネラルウォーター組成物を暴露させた後、該人工ミネラルウォーター組成物の存在下でＣａｃｏ−２細胞をインキュベートし、回収した細胞を溶解して生成されたフェリチンを遊離させる。次いで、例えばフェリチン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術などによってフェリチン量を測定することができる。このような技術は当技術分野においてよく知られており、フェリチンＥＬＩＳＡキットは市販されている。典型的な方法では、固相（マイクロタイターウェル）に固定化するためのウサギ抗フェリチンと、抗体−酵素（アルカリホスファターゼ）標識溶液中のウサギ抗フェリチンとを使用することができる。試験試料をこれらの抗体と同時に反応させると、固相と酵素結合抗体とに挟まれたフェリチン分子が得られる。インキュベーションを行った後、洗浄し、固相化フェリチン−抗体複合体を発色させ、分光光度法により発色を測定する。試験試料中のフェリチン濃度は、測定した発色強度に正比例する。
【００２４】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、上述のように、鉄濃度が２０μＭになるように希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量が１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超える。鉄の取り込み量は１５０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超えることが好ましい。本発明者は、例えば、実施例に示すように、鉄の取り込み量が１９０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超える人工ミネラルウォーター組成物を調製することに成功した。当業者であれば、鉄の取り込み量が多ければ多いほど、生体内に吸収されて利用される量が多くなりうることを理解するであろう。
【００２５】
本発明の人工ミネラルウォーター組成物は、調製後、あらかじめ滅菌された瓶やプラスチック袋などの容器に密閉保存される。
【００２６】
本発明のミネラルウォーター組成物は、食餌性鉄を補給する目的で使用される。本発明のミネラルウォーター組成物は、他の栄養補助食品と混合して使用してもよい。
【実施例】
【００２７】
下記表１に示した処方１〜９に従って本発明による様々な鉄水溶液を調製した。
【００２８】
下記処方はいずれも純水（逆浸透グレード）を使用して調製した。硫酸を用いてこの純水を酸性化し、ｐＨを３．５に調整した。（硫酸カルシウム以外の）無機添加物すべてを加えた滅菌原液と他の添加物を加えた滅菌原液とを調製し、それぞれを適量加えて表１に記載の濃度とした。硫酸カルシウムは水に不溶であるため、Ｃａ２＋イオンを含有する処方については、上記の酸性化した無機物溶液に純粋なＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ固体を適量加え、溶解することにより調製した。下記処方を有する鉄溶液をそれぞれ調製した後、硫酸を用いてｐＨを３．０に調節し、滅菌フィルター（孔径０．２μｍのメンブレンフィルター）で各溶液を濾過し、加熱滅菌した瓶に入れて保存した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
鉄取り込みアッセイ
概要
鉄の取り込み量は、ヒト腸管上皮由来Ｃａｃｏ−２細胞内に生成されたフェリチン量を測定することによって求めた。すなわち、Ｃａｃｏ−２細胞を被験試料とともにインキュベートした後、細胞を回収し、細胞から調製した溶液の分光分析を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術により行うことによってフェリチン量を測定した。フェリチン濃度は、細胞溶液の発色強度に正比例する。
【００３１】
Ｃａｃｏ−２細胞による鉄の取り込み−実験プロトコル
１．Ｃａｃｏ−２細胞を６ウェル細胞培養プレート（培地２ｍｌ／ウェル）に播種した（５０，０００／ｃｍ２）。４８時間毎に培地を補充した。
２．細胞は播種後１４日目までにすべて分化した。したがって、実験は播種後１４〜１８日目に行った。播種後１３日目に増殖培地を除去し、洗浄溶液（３７℃のハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）または３７℃の、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．７））で細胞を２回洗浄し、血清を含まない最小必須培地（ＭＥＭ）中で２４時間インキュベートした。
３．鉄を含まない調整培地（血清を含まないＭＥＭ）を使用して試験培地を調製した。（１Ｍ ＨＣｌおよび１Ｍ ＮａＯＨを使用して）試験培地のｐＨを５．８に調節した。上記処方の試験用鉄溶液はそれぞれ、胃を模倣した溶解条件（０．１Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ１．８、３７℃の条件でマグネチックスターラーを用いて２〜６時間撹拌）に暴露することにより調製した。Ｃａｃｏ−２細胞に添加するため、調製した試験用試料の一部（鉄元素２０μＭに相当）を採取した。
４．培地を吸引後（洗浄溶液で細胞を洗浄し）、各条件に対して３連で試験培地を６ウェルプレートに加えた。試験試料または対照試料を、鉄元素の最終濃度が２０μＭになるような量で試験培地に加えた。
５．上記で得た細胞を含む混合物をロータリーシェーカー（６ｒｐｍ）上で３７℃、２〜２４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、培地を吸引し、洗浄溶液で細胞を２回洗浄した。増殖培地（血清を含まないＭＥＭ（ｐＨ５．８））を細胞に加え、細胞を一晩インキュベートした（インキュベーション時間は合計２４時間であった）。
６．細胞の回収：培地を吸引し、細胞を洗浄溶液で洗浄し、次いで除去溶液（洗浄溶液＋５μＭハイドロサルファイトナトリウムおよび１μＭバソフェナントロリンスルホン酸ナトリウム塩（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸二ナトリウム塩（ＢＰＤＳ））で洗浄することによって細胞表面に結合していた鉄を除去した。次いで、細胞を洗浄溶液で再度洗浄した。
７．３５０μｌの細胞溶解緩衝液を各ウェルに加えることによって、上記６で回収した細胞を処理し、プレート振とう器（８ｒｐｍ）を用いて（冷却トレイ上で）プレートを４０分間インキュベートした。
８．細胞溶解物を回収し、ピペットでマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフ）に移した。
９．細胞溶解物を、２５Ｇの針を装着した１ｍｌシリンジに少なくとも５回通過させた。
１０．細胞溶解物の入ったマイクロ遠心チューブを１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、−２０℃で保存した。
【００３２】
上記表１に示した処方の鉄溶液をそれぞれ、上記プロトコルに従って処理し、Ｃａｃｏ−２細胞とともにインキュベートした。さらに、２００ｍｇ／ｌのＦｅ２＋および２０ｍｇ／ｌのＦｅ３＋を含有する対照溶液（ｐＨ３．０）も表１に示した処方の鉄溶液と同様に処理し、インキュベートした。それぞれの鉄溶液の存在下で得られた細胞溶解物をフェリチンＥＬＩＳＡに供し、フェリチン量を定量した。
【００３３】
フェリチンの定量分析は、「Spectro Ferritin」キット（Ramco Laboratories, Inc.（米国））を用い、以下の実験手順に従って行った。
【００３４】
フェリチンＥＬＩＳＡ手順
１．試験試料を１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。
２．ウサギ抗ヒト脾臓フェリチンでコーティングしたマイクロウェルに、各標準試料、各ブランクおよび各試験試料３０μｌをピペットにて２連で加えた。非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するためのマイクロウェルには何も加えなかった。
３．アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ヒト脾臓フェリチン２００μｌをすべてのマイクロウェルに加えた。
４．マイクロウェルの内容物を、１９５ｒｐｍにセットした回転テーブル上で室温にて２時間インキュベートした。
５．マイクロウェルを脱イオン水で満たし、振とうした後デカンテーションすることによって、マイクロウェルを洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。最後の洗浄後、マイクロウェルを逆さまにして吸収材の上に載せ、軽くたたいて約３０秒間洗浄液を吸い取らせた。
６．基質溶液（フェニルリン酸二ナトリウムおよび４−アミノアンチピリンの１０％ジエタノールアミン溶液）２００μｌを各マイクロウェルにピペットで加えた。
７．基質溶液を加えたマイクロウェルを室温で３０分間インキュベートした。
８．０．２４％フェリシアン化カリウム１００μｌを各マイクロウェルに加えて発色させ、マイクロウェルの内容物をよく混合した。
９．測光波長４９０ｎｍおよび補正波長６３０ｎｍで吸収を分光光度法により測定した。光学密度は試料中のフェリチン濃度に正比例する。キット製造業者の説明書に従ってフェリチン濃度を算出した。
【００３５】
上記表１に示した処方の鉄溶液それぞれの存在下においてＣａｃｏ−２細胞に取り込まれた（フェリチンとしての）鉄量を以下の表２に示す（３つの値の平均）。表２には、上述のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋対照（１００％とする）に対して標準化したＣａｃｏ−２細胞による鉄取り込み率（％）も示す。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
実施例１０
２２０ｍｇ／ｌ第一鉄イオン、１７０ｍｇ／ｌカルシウムイオン、４０ｍｇ／ｌマグネシウムイオンおよび１３２０ｍｇ／ｌソルビン酸カリウムからなる処方の本発明のミネラルウォーター組成物を調製し、硫酸を用いてｐＨを調節した。フェリチン形成の比較による鉄のバイオアベイラビリティの評価を上記と同様にして行った。本発明の組成物は高い鉄バイオアベイラビリティを示した。
【００３８】
実施例１１
２２０ｍｇ／ｌ第一鉄イオン、４０ｍｇ／ｌ亜鉛イオンおよび１３２０ｍｇ／ｌソルビン酸カリウムからなる処方の本発明のミネラルウォーター組成物を調製し、硫酸を用いてｐＨを調節した。フェリチン形成の比較による鉄のバイオアベイラビリティの評価を行った。本発明の組成物は高い鉄バイオアベイラビリティを示した。
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体利用可能な鉄を含有する無毒な人工ミネラルウォーター組成物であって、
１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度の第一鉄イオンと、無毒性量のＣａ２＋イオンと、無毒性量のＭｇ２＋イオンとを含有するｐＨ１〜５の水溶液からなり、
鉄濃度が２０μＭになるように該組成物を希釈した場合、細胞内フェリチンとして測定される鉄の取り込み量が１２０ｎｇ／ｍｇタンパク質を超えること、
該組成物中のＣａ２＋イオンの濃度が１００〜２００ｍｇ／ｌの範囲であること、
該組成物中のＭｇ２＋イオンの濃度が２０〜６０ｍｇ／ｌの範囲であること、ならびに
前記鉄の取込み量が、ヒト腸管上皮由来Ｃａｃｏ−２細胞を該組成物の試料とともにインキュベートする工程、インキュベーション後に細胞を回収する工程、回収した細胞を溶解して生成されたフェリチンを遊離させる工程、フェリチン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を使用してフェリチン量を測定する工程、および４９０ｎｍにおいて発色を分光光度法で測定する工程を含む方法によって求められることを特徴とする、ミネラルウォーター組成物。
【請求項２】
第一鉄イオンの濃度が１５０〜２５０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項３】
第二鉄イオンをさらに含有し、該第二鉄イオンの濃度が７０ｍｇ／ｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／ｌ以下である、請求項１または２に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項４】
Ｍｇ２＋イオンの濃度が５０ｍｇ／ｌ以下、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｌの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項５】
Ｋ＋イオンをさらに含有し、該カリウムがソルビン酸カリウムの形態で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項６】
ソルビン酸カリウムの濃度が１８００ｍｇ／ｌ以下、好ましくは１０００〜１５００ｍｇ／ｌの範囲である、請求項５に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項７】
１種以上の香料成分をさらに含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項８】
前記香料成分がリンゴ果汁、柑橘果汁およびビタミンＣから選択される、請求項７に記載のミネラルウォーター組成物。
【請求項９】
ｐＨが２〜５の範囲、好ましくは２〜４の範囲、より好ましくは２．５〜３．５の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のミネラルウォーター組成物。
【国際調査報告】
2017500890.tif 000004
2017500890.tif 000005