(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）転写因子をコードする遺伝子ならびにストレスおよび該転写因子によって活性化される第１のプロモーターを含む第１の核酸分子であって、ここで、該第１のプロモーターおよび該転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、ならびに（ｂ）目的の遺伝子および該転写因子によって活性化される第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、該第２のプロモーターおよび該目的の遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸分子を含む、発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項２】
前記転写因子が変異型熱ショック転写因子（ＨＳＦ）である、請求項１に記載の発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項３】
前記変異型ＨＳＦが脊椎動物ＨＳＦまたは昆虫ＨＳＦ由来である、請求項２に記載の発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項４】
前記脊椎動物ＨＳＦが哺乳動物ＨＳＦまたは鳥類ＨＳＦである、請求項３に記載の発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項５】
前記転写因子がキメラ転写因子である、請求項１に記載の発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項６】
（ａ）転写因子をコードする遺伝子およびストレスによって活性化される第１のプロモーターを含む第１の核酸分子であって、ここで、該第１のプロモーターおよび該転写因子をコードする遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、（ｂ）該転写因子をコードする遺伝子および該転写因子によって活性化される第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、該第２のプロモーターおよび該転写因子をコードする遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸分子、ならびに（ｃ）目的の遺伝子および該転写因子によって活性化される第３のプロモーターを含む第３の核酸分子であって、ここで、該第３のプロモーターおよび前記目的の遺伝子は作動可能に連結されている第３の核酸分子を含む、発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項７】
（ａ）第１の転写因子をコードする遺伝子およびストレスによって活性化される第１のプロモーターを含む第１の核酸分子であって、ここで、該第１のプロモーターおよび該第１の転写因子をコードする遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、（ｂ）第２の転写因子をコードする遺伝子ならびに該第１の転写因子および該第２の転写因子によって活性化される第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、該第２のプロモーターおよび該第２の転写因子をコードする遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸、ならびに（ｃ）目的の遺伝子および該第２の転写因子によって活性化される第３のプロモーターを含む第３の核酸分子であって、ここで、該第３のプロモーターおよび該目的の遺伝子は作動可能に連結されている第３の核酸分子を含む、発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項８】
該第１の核酸分子、該第２の核酸分子、および該第３の核酸分子を含む単一の核酸分子を含む、請求項６または７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
該第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター、該第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター、および該第３の核酸分子を含む第３の発現ベクターを含む、請求項６または７に記載の発現ベクターセット。
【請求項１０】
該第１および第２の核酸分子を含む第１の発現ベクター、ならびに該第３の核酸分子を含む第２の発現ベクターを含む、請求項６または７に記載の発現ベクターセット。
【請求項１１】
（ａ）転写因子をコードする遺伝子およびストレスによって活性化される第１のプロモーターを含む第１の核酸分子であって、ここで、該第１のプロモーターおよび該転写因子をコードする遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、ならびに（ｂ）目的の遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、および該転写因子によって活性化される第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、該第２のプロモーターは、該目的の遺伝子および該転写因子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている第２の核酸分子を含む、発現ベクターまたは発現ベクターセット。
【請求項１２】
該第１の核酸分子および該第２の核酸分子を含む単一の核酸分子を含む、請求項１または１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
該第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター、および該第２の核酸分子を含む第２の発現ベクターを含む、請求項１または１１に記載の発現ベクターセット。
【請求項１４】
請求項８または１２に記載の発現ベクター、または請求項９、１０もしくは１３に記載の発現ベクターセットを含む組換え真核宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞は、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞から成る群より選択される、組換え真核宿主細胞。
【請求項１５】
目的のタンパク質を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）  請求項１４に記載の組換え宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）  該培養された組換え細胞をストレスに暴露することによって、第１のプロモーターを刺激するステップ、および
（ｃ）  該培養された組換え宿主細胞から、前記目的の遺伝子によって発現される目的のタンパク質を単離するステップ、
を含んで成る上記方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｂ）が、前記組換え宿主細胞を加熱することによって達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項８または１２に記載の発現ベクターを含む、ウイルス。
【請求項１８】
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスから成る群より選択される、請求項１７に記載のウイルス。
【請求項１９】
組換え細胞において目的の遺伝子の発現を刺激するin vitro方法であって、以下のステップ：
（ａ）  請求項８または１２に記載の発現ベクター、または請求項９、１０、もしくは１３のいずれか１項に記載の発現ベクターセットのいずれか一方を宿主細胞に導入することによって組換え宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）  該組換え細胞をストレス条件に暴露するステップ、ここで、該ストレス暴露は第１のプロモーターを刺激して、該第１のプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を増加し、次いで、目的の遺伝子の発現が刺激される、
を含んで成る上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、外来遺伝子の発現を制御する方法に関する。詳細には、本発明は、ストレスを１回適用することによって、持続された遺伝子発現を誘導する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
細胞、組織および器官を、高温、重金属、酸化剤、ミトコンドリアの機能を妨害する化学物質、アルコール、低酸素、過浸透圧環境、低浸透圧環境、アミノ酸アナログ、ベンゾキノンアンサマイシン（ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｓａｍｙｃｉｎ）系薬剤などの「ストレス」に暴露すると、熱ショックもしくはストレス（ｈｓｐ）遺伝子として公知の遺伝子群の活性化または活性の上昇が生じる。例えば、Ｓｃｈａｒｆら、「熱ストレスプロモーターと転写因子」、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０，Ｎｏｖｅｒ（編）、１２５〜１６２頁（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ１９９４）を参照のこと。細胞、組織および器官を正常な状態に戻すと、ストレス遺伝子の活性は、ストレス前の低いレベルに達するまで低下する。
【０００３】
ストレス遺伝子は、少数の熱ショックまたはストレスタンパク質（Ｈｓｐ）ファミリーをコードする。ストレスタンパク質の主なファミリーは、分子量およびアミノ酸配列に基づいて区別される。例えば、ＮｏｖｅｒおよびＳｃｈａｒｆ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５３：８０（１９９７）を参照のこと。それらには、Ｈｓｐ１１０（約１１０ｋＤａのサブユニット分子量を有するＨｓｐ）、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ１０およびユビキチンが含まれる。これらのＨｓｐの多くは、タンパク質の折り畳み、タンパク質の分解およびタンパク質のトラッキングなどの基本的な細胞のプロセスに関与する分子シャペロンである。
【０００４】
ストレス遺伝子のプロモーターとしては、一般に、いわゆる熱ショックエレメント（ＨＳＥ）配列が挙げられる。これらの配列は、遺伝子をストレスによって活性化され得るようにするのに必須である。ＨＳＥは、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）と命名されるタンパク質結合部位を提供する。例えば、Ｗｕ、「熱ショック転写因子：構造と調節」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１：４４１（１９９５）；ＮｏｖｅｒおよびＳｃｈａｒｆ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５３：８０（１９９７）を参照のこと。哺乳動物細胞は、少なくとも３つの異なるＨＳＦを発現することができる。ＨＳＦ１と命名される因子は、ストレスによるｈｓｐ遺伝子の調節の原因であると思われる。ＨＳＦ１は、哺乳動物細胞において、継続的かつ偏在的に発現される。ストレスがない場合は、該因子は非活性型で存在し、ストレス遺伝子プロモーターのＨＳＥ配列に結合してそれらの転写を増強することができない。ストレス中では、ＨＳＦ１が活性化されて活性型となり、ＨＳＦ１はＨＳＥ  ＤＮＡに結合してストレス遺伝子の転写を刺激する。多ストレス状況後、該因子は比較的迅速に非活性型に戻る。従って、ストレス遺伝子の転写は終了する。ストレスの非存在下で継続的にストレス遺伝子を転写することができるＨＳＦ１の変異型が構築されている。
【０００５】
ストレス遺伝子のプロモーターは目的の遺伝子に結合され、該遺伝子を、ストレスによって活性化され得るようにしている。この種の構築物は、目的の遺伝子が熱または他の形態のストレスによって活性化され得る細胞株を調製するために使用された。例えば、ストレス遺伝子プロモーターによって制御される成長ホルモン遺伝子を含有する細胞株が調製されている。Ｄｒｅａｎｏら、Ｇｅｎｅ４９：１（１９８６）。さらに、ストレス制御下でβガラクトシダーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックハエおよびトランスジェニック線虫が作製されている。例えば、ＶｏｅｌｌｙおよびＡｎａｎｔｈａｎ、米国特許第５，３４６，８１２号ならびにＣａｎｄｉｄｏおよびＪｏｎｅｓら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ１０９：１１９（１９９６）を参照のこと。
【０００６】
ストレスプロモーターを目的の遺伝子の調節を制御するために使用する際の欠点は、ストレスプロモーターによって誘導される遺伝子発現がストレス処理の期間を超えて持続されるのは、過剰ストレスの条件下の場合のみであることである。だが、そのような過剰条件は、細胞の生存と両立しない。
【０００７】
従って、細胞の生命活動を危険にさらさない条件下でストレス誘導性の遺伝子調節を利用する必要がある。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ストレスによって活性化され得、そして目的の遺伝子の発現を調節する分子回路（モレキュラーサーキット、molecular circuit)を提供する。
【０００９】
詳細には、本発明は、（ａ）転写因子ならびにストレスおよび前記転写因子によって活性化され得る第１のプロモーターをコードする遺伝子を含む第１の核酸分子であって、ここで、前記第１のプロモーターおよび前記転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、ならびに（ｂ）目的の遺伝子および前記転写因子によって活性化され得る第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、前記第２のプロモーターおよび前記目的の遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸分子を含む、分子回路を提供する。このタイプの分子回路の１つの変異体では、前記分子回路は、トランス活性化因子（トランスアクチベーター）をコードする目的の遺伝子を含み、そして前記分子回路は、第２の目的の遺伝子および前記トランス活性化因子によって活性化され得るプロモーターを含む核酸分子をさらに含み、ここで、前記第２の目的の遺伝子およびトランス活性化因子活性化可能なプロモーターは作動可能に連結されている。該分子回路は、２つの個別の核酸分子を含んでもよく、または該分子回路は、第１および第２の核酸分子を含有する単一の核酸分子を含んでもよい。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）転写因子およびストレスによって活性化され得る第１のプロモーターをコードする遺伝子を含む第１の核酸分子であって、ここで、前記第１のプロモーターおよび前記転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、（ｂ）前記転写因子および前記転写因子によって活性化され得る第２のプロモーターであって、ここで、前記第２のプロモーターおよび前記転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸分子、ならびに（ｃ）目的の遺伝子および前記転写遺伝子によって活性化され得る第３のプロモーターを含む第３の核酸分子であって、ここで、前記第３のプロモーターおよび前記目的の遺伝子は作動可能に連結されている第３の核酸分子を含む、分子回路を含む。これらの分子回路は、（ａ）３つの個別の核酸分子、（ｂ）第３の核酸分子ならびに第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む単一の核酸分子、または（ｃ）第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子を含む単一の核酸分子を含んでもよい。
【００１１】
本発明は、（ａ）第１の転写因子およびストレスによって活性化され得る第１のプロモーターをコードする遺伝子を含む第１の核酸分子であって、ここで、前記第１のプロモーターおよび前記第１の転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、（ｂ）第２の転写因子ならびに前記第１の転写因子および前記第２の転写因子によって活性化され得る第２のプロモーターをコードする遺伝子を含む第２の核酸であって、ここで、前記第２のプロモーターおよび前記第２の転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第２の核酸、ならびに（ｃ）目的の遺伝子および前記第２の転写因子によって活性化され得る第３のプロモーターを含む第３の核酸分子であって、ここで、前記第３のプロモーターおよび前記目的の遺伝子は作動可能に連結されている第３の核酸分子を含む、分子回路をさらに考慮する。これらの分子回路は、（ａ）３つの個別の核酸分子、（ｂ）第３の核酸分子ならびに第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む単一の核酸分子、または（ｃ）第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子を含む単一の核酸分子を含んでもよい。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）転写因子およびストレスによって活性化され得る第１のプロモーターをコードする遺伝子を含む第１の核酸分子であって、前記第１のプロモーターおよび前記転写因子遺伝子は作動可能に連結されている第１の核酸分子、ならびに（ｂ）目的の遺伝子、転写因子遺伝子、および前記転写因子によって活性化され得る第２のプロモーターを含む第２の核酸分子であって、ここで、前記第２のプロモーターは、前記目的の遺伝子および前記転写因子遺伝子に作動可能に連結されている第２の核酸分子を含む、分子回路を考慮する。これらの分子回路は、２つの核酸分子を含んでもよく、または該分子回路は第１および第２の分子を含有する単一の核酸分子内に含有されていてもよい。
【００１３】
本発明の分子回路において、転写因子は、例えば、変異型熱ショック転写因子（ＨＳＦ）またはキメラ転写因子であり得る。適切な変異型ＨＳＦは、脊椎動物ＨＳＦまたは昆虫ＨＳＦより誘導することができる。例えば、適切な脊椎動物ＨＳＦは、哺乳動物ＨＳＦまたは鳥類ＨＳＦであり得る。
【００１４】
本明細書に記載の分子回路は、単一の発現ベクターに含有され得る。あるいは、分子回路核酸分子は、１組の発現ベクターに含有され得、ここで、それぞれの発現ベクターは、１つまたは２つの分子回路核酸分子を含有する。
【００１５】
本発明はまた、分子回路を含む組換え宿主細胞を考慮する。該分子回路は、上記のように、単一の発現ベクターまたは発現ベクターの組の形態を有してもよい。適切な真核宿主細胞としては、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１６】
本発明は、目的のタンパク質を製造する方法であって、次のステップ（手段）：
（ａ）前記組換え宿主細胞を培養し、（ｂ）前記培養された組換え細胞をストレスに暴露することによって、第１のプロモーターを刺激するステップ、および
（ｃ）  前記培養された組換え宿主細胞から目的のタンパク質を単離するステップ、ここで、目的のタンパク質は目的の遺伝子によって発現される、
を含んで成る上記方法をさらに考慮する。
【００１７】
本発明はまた、上記の発現ベクターを含むウイルスを考慮する。適切なウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスが挙げられる。
【００１８】
本発明はまた、製薬的に許容される担体（キャリア）および上記のような発現ベクターまたは発現ベクターの組を含む医薬組成物を含む。あるいは、本発明の医薬組成物は、製薬的に許容される担体およびウイルスを含んでもよい。
【００１９】
本発明は、対象（患者）を目的のタンパク質で処理する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記の医薬組成物を対象に投与するステップ、および
（ｂ）目的のタンパク質を必要とする対象の領域に熱を適用するステップ、ここで、前記熱処理は目的の遺伝子の発現を刺激する、
を含んで成る上記方法をさらに考慮する。
【００２０】
本発明はまた、組換え細胞において目的の遺伝子の発現を刺激する方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記のようにな発現ベクター、あるいは発現ベクターの組のいずれか一方を宿主細胞に導入することによって組換え宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）前記組換え細胞をストレス条件に暴露するステップ、ここで、前記ストレス暴露は第１のプロモーターを刺激して、前記第１のプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を増加し、次いで、目的の遺伝子の発現が刺激される、を含んで成る上記方法を含む。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参考にすることにより明らかとなろう。さらに、以下に明示した様々な参考文献の全体が参考として援用される。
【００２２】
発明の詳細な説明
１．定義
以下の説明では、多くの用語を広範に使用する。以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００２３】
本明細書で使用する「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製されるフラグメント、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって作製されるフラグメントのいずれかを指す。核酸は、天然のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）または天然のヌクレオチドのアナログ（例えば、天然のヌクレオチドのαエナンチオマー型）、あるいは両方の組み合わせであるモノマーから成る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分の修飾を有し得る。糖の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による１つ以上の水酸基の置換が挙げられ、または糖はエーテルもしくはエステルとして機能的にすることができる。さらに、全糖部分を立体的かつ電子的に類似の構造（例えば、アザ糖（ａｚａ−ｓｕｇａｒ）および炭素環式糖アナログ）で置換することができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の既知のヘテロ環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはまたはそのような結合のアナログによって結合され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリダート、ホスホロアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、ポリアミドバックボーンに付着した天然または修飾された塩基を含む。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。
【００２４】
本明細書で使用する用語「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、補助的刺激分子(co-stimulatory factor)、造血因子、およびこれらの分子の合成アナログが挙げられる。
【００２５】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のＤＮＡから分離されている免疫調節剤をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学合成された核酸分子である。
【００２６】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然のペプチドに関連する他のタンパク質性不純物などの細胞成分を本質的に含有しないポリペプチドである。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含有することは、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現によって示される。
【００２７】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に隣接する遺伝子の５’領域に位置する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は誘導因子に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写の速度は誘導因子によって調節されない。
【００２８】
「調節エレメント」は、プロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、広範に、または好ましくは特定の細胞、組織、もしくはオルガネラにおいて転写を可能にする細胞因子に結合するヌクレオチド配列を含有してもよい。これらの型の調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「オルガネラ特異的」様式で発現される遺伝子に関連する。
【００２９】
本明細書で使用する「転写因子」は、核酸に結合し、それにより、転写開始または伸長の速度を改変することによって転写に影響を及ぼす。
【００３０】
「トランス活性化因子」は、転写開始または伸長を増強する転写因子である。
【００３１】
本明細書で使用する「キメラ転写因子」は、１つのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよびもう１つのタンパク質の転写活性化ドメインを含むタンパク質である。例えば、キメラ転写因子は、ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインおよび熱ショック転写因子活性化ドメインを含んでもよい。
【００３２】
モノマーまたはホモオリゴマー転写因子の場合、用語「転写因子遺伝子」は、転写の適切な終了、ＲＮＡ産物のプロセシング、および翻訳を確実にする適切な制御エレメントを補充された転写ポリペプチドをコードする配列を指す。本明細書に記載の回路において、転写因子遺伝子は、ストレスおよび／または転写因子によって活性化され得るプロモーターに連結される。ヘテロオリゴマー転写因子の場合、用語「転写因子遺伝子」は、上記のような制御エレメントをそれぞれ補充された全てのサブユニットの合成に必要なコード配列を指す。本明細書に記載の種類の回路を構築するためには、ヘテロオリゴマー転写因子のサブユニットをコードする少なくとも１つの配列が、適切に調節され得るプロモーター（例えば、ストレスおよび／または転写因子によって活性化され得る）に連結される必要がある。プロモーターが連結した配列は、単一の核酸で存在しても、また個別の核酸で存在してもよい。あるいは、該配列は、縦列で整列しても、内部リボソーム結合部位で分離されていてもよく、そして配列の全整列は、単一のプロモーターに連結されていてもよい。
【００３３】
「ヘテロダイマー転写因子」は、２つの異なるサブユニットポリペプチドから成る転写因子である。ヘテロダイマー転写因子の例は、本明細書に記載のエクジソン受容体−レチノイン酸受容体分子である。
【００３４】
熱ショックエレメント（ＨＳＥ）は、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）に結合して遺伝子の発現を刺激する核酸分子である。ＨＳＥ配列は、通常、方向を変更する際に整列される配列モジュール「ＮＧＡＡＮ」の多数反復を含有する。例えば、Ｓｃｈａｒｆら、「熱ストレスプロモーターと転写因子」、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０，Ｎｏｖｅｒ（編）、１２５〜１６２頁（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ１９９４）を参照のこと。典型的に、機能的なＨＳＥ配列を構成するためには、少なくとも３つのモジュールの配列が存在する必要がある。
【００３５】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、酵素である逆転写酵素によってｍＲＮＡテンプレートから形成される一本鎖のＤＮＡ分子である。典型的に、逆転写の開始のために、ｍＲＮＡの部分に相補的なプライマーが用いられる。当業者はまた、用語「ｃＤＮＡ」を使用して、そのような一本鎖ｃＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖から成る二本鎖ＤＮＡを指す。
【００３６】
用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写および１つ以上のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳に関与する。本明細書に記載の調節回路を使用して、目的の遺伝子の発現を刺激し、目的のタンパク質を産生させることができる。調節回路を使用して、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子またはタンパク質よりむしろ核酸が関連最終産物である外部ガイド配列遺伝子（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ）を制御することができる。
【００３７】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製することが可能であるプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的に、ベクターに必須な生物学的機能を消失することなく外来ヌクレオチド配列を決定可能な方法で挿入することができる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いる上で適切なマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含有している。マーカー遺伝子は、典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００３８】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に、遺伝子の発現は、プロモーターの制御下に置かれる。そのような遺伝子は、プロモーターに「作動可能に連結されている」といわれる。
【００３９】
「組換え宿主」は、クローニングベクターもしくは発現ベクターのいずれか一方を含有する任意の原核または真核細胞であり得る。この用語はまた、宿主細胞の染色体もしくはゲノムにクローニングされた遺伝子を含有するように遺伝子操作されている原核または真核細胞を含む。
【００４０】
以下に記載の組換え構築物では、調節エレメントまたはプロモーターは、自然の状態では調節エレメントまたはプロモーターと結合していない遺伝子の発現を制御する。そのような構築物は、調節エレメントまたはプロモーターおよび「外来遺伝子」を含むといわれる。例えば、サイトカイン遺伝子に作動可能に連結された熱ショック転写因子によって活性化され得るプロモーターを含む核酸分子は、外来遺伝子としてサイトカイン遺伝子を含む。外来遺伝子は、「目的の遺伝子」の一形態であり、外来遺伝子の産物は、「目的のタンパク質」の一形態である「外来タンパク質」である。
【００４１】
真核生物では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは構造遺伝子の転写を触媒して、ｍＲＮＡを産生する。ＲＮＡ転写物が、特異的ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩテンプレートを含有するように、核酸分子を設計することができる。ＲＮＡ転写物を、「アンチセンスＲＮＡ」と呼び、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子を「アンチセンス遺伝子」と呼ぶ。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡに結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することが可能である。
【００４２】
「リボザイム」は、触媒中心を含有する核酸分子である。該用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を実施する核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子を「リボザイム遺伝子」と呼ぶ。
【００４３】
「外部ガイド配列」は、細胞内ｍＲＮＡの特定の種に対して内因性リボザイム、ＲＮａｓｅＰを指令し、ＲＮａｓｅＰによりＲＮＡを切断する核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子を、「外部ガイド配列遺伝子」と呼ぶ。
【００４４】
本明細書で使用する「目的の遺伝子」は、ＲＮＡ産物またはポリペプチド産物をコードするＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子である。
【００４５】
２．１型回路の構築
ここでは、調節回路を使用することにより、ストレスの１回適用で目的の遺伝子の持続された遺伝子発現を可能にするという一般的特徴を有するいくつかの調節回路について説明する。これらの回路によって調節される遺伝子の活性は、活性化ストレスの後も沈静しない。
【００４６】
最も簡単な回路は、２つのエレメント：（１）ストレス遺伝子プロモーターに機能的に連結された目的の遺伝子、および（２）ストレス遺伝子プロモーターにも機能的に連結されている構成的に活性化された変異型熱ショック転写因子（ＨＳＦ）から成る。１つの回路の例を図１に示す。２つのエレメントは、単一核酸または個別の核酸として細胞に送達され得る。細胞では、両遺伝子は無症状であるかまたはストレス非存在下で適切に低いレベルで発現される。細胞にストレスがかかると、両エレメントのプロモーターは内因性ＨＳＦで活性化され、目的および変異型ＨＳＦの遺伝子産物が発現し蓄積する。変異型ＨＳＦは継続して目的の遺伝子および該変異型ＨＳＦ自体の遺伝子の両方の転写を刺激し、目的および変異型ＨＳＦのさらなる産物を合成する。このサイクルは、細胞がもはやストレス下にない場合であっても継続する。従って、細胞が核酸を転写および翻訳する能力を消耗する時点まで、目的の遺伝子は活性のままである。従って、この２エレメント系は、単一のストレスによる目的の遺伝子のストレスによる持続された活性化を可能にするという所望される特徴を有する。
【００４７】
回路のエレメントを調製する場合、多くの因子について考慮する必要がある。先ず、変異型ＨＳＦの発現を制御するストレスプロモーターは、好ましくは厳密にストレス調節されるべきである。プロモーターからの発現のリーク（漏出）は、プロモーターからの発現を刺激するのに十分な量の変異型ＨＳＦが蓄積し、ＨＳＦのレベルが徐々に上昇して、最終的に目的の遺伝子が完全に活性化されてしまう可能性がある。厳密に調節されるストレスプロモーターの例は、ヒトｈｓｐ７０Ｂ遺伝子の発現を調節するプロモーターである。Ｖｏｅｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４９４９（１９８５）。
【００４８】
プロモーターの選択に加えて、当該分野に周知の他の操作によって、変異型ＨＳＦの基礎（基準）発現レベルを減少することができる。例えば、３’非翻訳配列のｍＲＮＡ分解を増強するエレメントを含めることによって、変異型ＨＳＦをコードするｍＲＮＡの半減期を減少することができる。ＣｈｅｎおよびＳｈｙｕ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：４６５（１９９５）。変異型ＨＳＦ１遺伝子の５’非翻訳配列に適切な長さの回文式配列を導入することによって、翻訳の速度を減少することが可能である（Ｍｕｈｌｒａｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２１４５（１９９５）、および本明細書に引用されている参考文献を参照のこと）。残基の挿入、構造的安定性を付与する配列エレメントの欠失、またはプロテアーゼ切断部位の導入によって、変異型ＨＳＦ１の安定性も減少することができる。以下に記載のように、試験回路を構築し、その性能を分析することによって、回路の操作および上記の型の操作の影響について評価することができる。
【００４９】
ストレス調節化試験回路については実施例１に記載されている。簡単に説明すると、ストレスプロモーターがホタルルシフェラーゼ配列の発現を制御するように、適切なプラスミドに、ヒトｈｓｐ７０Ｂプロモーターを含有するフラグメントおよび該ホタルルシフェラーゼの全コード領域を含有するフラグメントを挿入することによって、第１の構築物を調製することができる。変異型ＨＳＦ、例えば、ＨＳＦ１ｄ２０２−３１６をコードする遺伝子に連結されたストレスプロモーター、または蓄積レベルを減少するために、１つ以上の上記の修飾を含有する誘導体を含有する第２のプラスミドを構築することができる。当該分野に周知の一般的なサブクローニング手順を使用して、これらの構築物を調製する。次いで、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの標準的技術、ウイルスベクターなどを使用して、これらの構築物を、例えば、ヒトＨｅＬａ細胞などの適切な細胞に同時トランスフェクトする。ベクターを真核細胞に導入する技術については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）およびＭｕｒｒａｙ（編）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）に記載されている。
【００５０】
対照細胞を、ストレスプロモーター−ルシフェラーゼ構築物で個々にトランスフェクトする。例えば、サイトメトリー（血球掲載）によって容易に監視することができる緑色蛍光タンパク質を構成的に発現する遺伝子などの適切なレポーター遺伝子を同時トランスフェクトすることによって、トランスフェクションの効率を見積もることができる。トランスフェクション１日後、全ての２つの並行培養物のうちの１つを短期間熱処理し（ＨｅＬａ細胞の場合、４２〜４４℃で１時間）、次いで、さらに２日間、正常温度（ＨｅＬａ細胞の場合、３７℃）でインキュベートする。次いで、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性アッセイを行う。
【００５１】
熱処理されていないストレスプロモーター−ルシフェラーゼ構築物で単独トランスフェクトされた細胞ではルシフェラーゼ活性は測定されず、熱処理された細胞では僅かに低いレベルの活性が検出される。ルシフェラーゼおよびそのｍＲＮＡは、哺乳動物細胞では比較的不安定である。熱処理中および直後に高レベルで発現されるが、熱処理後合成は低下し、２日後、初期に合成された極僅かな酵素がなお存在する。回路が機能的である場合、熱処理されていないが、両構築物で同時トランスフェクトされている細胞は低〜検出不能なルシフェラーゼ活性を有する。一方、熱処理され、同時トランスフェクトされた細胞は、単独でトランスフェクトされた細胞で測定されるレベルよりも多数倍多いレベルのルシフェラーゼ活性を有する。高レベルのルシフェラーゼが熱処理され、同時トランスフェクトされた細胞に存在するのは、変異型ＨＳＦ１が発現かつ維持され、そしてファクターはルシフェラーゼ遺伝子からの発現を継続的に刺激するからである。熱処理されず、同時トランスフェクトされた細胞でルシフェラーゼのレベルが受容不可能に上昇した場合、先に記載された操作のいくつかを行って変異型ＨＳＦ１のレベルを低下させ、それらの効果を試験系で評価することができる。
【００５２】
任意のストレスプロモーターを回路に使用することができる。本明細書で使用するストレスプロモーターは、既知のストレス調節化遺伝子のプロモーターとして規定される。典型的に、そのようなストレスプロモーターは、交互の方向に整列される配列ＮＧＡＡＮの多数モジュールを含有するエレメントを特徴とする１つまたは数個のＨＳＥ配列を含有する。典型的に、機能的ＨＳＥ配列を構成するためには、少なくとも３つのモジュールが存在する必要がある。３つ以上のモジュールは、必ずしも連続アレイとして整列される必要はない。ＮＧＡＡＮＮＴＴＣＮＮＮＮＮＮＮＴＴＣＮＮＧＡＡＮなどの配列は機能的ＨＳＥであり得る。Ａｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３７６１（１９８８）。便利なレポーター遺伝子に機能的に連結されている基礎プロモーターより上流に推定ＨＳＥを１コピー以上導入することによって、該推定ＨＳＥの機能性を試験することができる。Ａｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１０５５（１９８７）。適切な細胞に導入することによって、得られる構築物を試験し、ストレスをかけた（例えば、熱処理をする）およびストレスをかけていない細胞でそれらの活性を分析する。
【００５３】
適切なストレス誘導性プロモーターの例としては、脊椎動物および昆虫ｈｓｐプロモーターが挙げられる。好ましい脊椎動物ｈｓｐプロモーターとしては、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、およびｈｓｐ２５−２７プロモーターが挙げられる。好ましいヒトプロモーターの例は、ヒトｈｓｐ７０Ｂプロモーターである。さらなる適切なプロモーターは当業者に公知である。例えば、Ｎｏｖｅｒ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３０（１９８７）、Ｎｏｖｅｒ、Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９１）、ＧｕｎｔｅｒおよびＷａｌｔｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ５０：９８７（１９９４）、Ｃｒａｉｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６０：４４１（１９９５）、Ｓｃｈａｒｆら、「熱ストレスプロモーターと転写因子」、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０，Ｎｏｖｅｒ（編）、１２５〜１６２頁（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ１９９４）、Ｖｏｅｌｌｙ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．４：３５７（１９９４）、ならびにＮｏｖｅｒおよびＳｃｈａｒｆ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５３：８０（１９９７）を参照のこと。
【００５４】
適切なストレスプロモーターはまた、天然のストレス遺伝子から単離もしくは増幅されるか、または化学的に合成されるかのいずれかである１つまたは複数のＨＳＥ配列を、組換え技術により非ストレス調節化プロモーターに導入することによって構築される合成プロモーターであり得る。適切なプロモーターはまた、改変ＨＳＥ配列を含有するプロモーターを含む。ＨＳＥを構成するモジュールの単一置換は認容される場合が多い。ＨＳＥは、動物および植物界を通して良好に保存されている。従って、ストレスプロモーターは、生物またはその生物の細胞において回路が確立される生物の遺伝子由来である必要はない。例えば、ハエストレスプロモーターを、哺乳動物細胞に導入された機能的回路に使用してもよい。Ａｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１９７（１９８５）。
【００５５】
目的の遺伝子は有用なタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。タンパク質は、分泌タンパク質であっても、分泌されないタンパク質であってもよい。遺伝子は、回路が確立されている細胞型由来であっても、他の任意の細胞型由来であってもよい。遺伝子は、原核生物の遺伝子であっても、真核生物の遺伝子であってもよい。
【００５６】
発現のための適切な遺伝子の例としては、免疫調節剤、例えば、サイトカイン、補助的刺激分子、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、例えば、腫瘍壊死因子、および造血因子、例えば、インターロイキン（例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー因子）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、βおよびγ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞成長因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンが挙げられる。発現のための他の適切な遺伝子としては、トキシンまたはプロトキシン（ｐｒｏｔｏｘｉｎ）、ストレスタンパク質、外来性抗原、血液因子、ポリペプチドホルモン、および他の治療タンパク質が挙げられる。より一般的には、本明細書に記載の調節回路を使用して、任意のタンパク質、特に、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ユビキチン化などの翻訳後修飾が必要な任意のタンパク質を発現させることができる。
【００５７】
脊椎動物熱ショック転写因子（ＨＳＦ）は、幾つかの保存された配列エレメントおよび変異型ＨＳＦの設計の指針を提供する保存された機能的エレメントを含む。保存された配列エレメントは、細菌σ因子のモチーフに関連する変異および構造（Ｘ線結晶学およびＮＭＲ）分析によって規定されるヘリックス・ターン・ヘリックス構造結合モチーフを有するアミノ末端に位置するＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。さらに、内部には、ＨＲ１およびＨＲ２と呼ばれる３，４型の２つの疎水性反復領域が存在する。少なくともＨＲ１は、因子のホモトリマー型の形成に必須であり、これは、ストレスを受けた細胞に存在する形態であり、ＨＳＥ配列に結合することができる。さらに内部では、HR２から５０残基以上離れて、HR３と呼ばれる第３の疎水性反復が存在する。ＨＲ２、ＨＲ３および少なくともＨＲ１の一部はオリゴマー状態のＨＳＦの正常な調節に重要である。しかし、以下に記載のように、ＨＳＦ調節に関するこの局面は、本発明に関係しない。因子のカルボキシ末端付近の配列、ＨＲ３のちょうどアミノ末端から開始して、おそらくＨＲ３を含むが、は転写活性化ドメインを含有する。
【００５８】
哺乳動物ＨＳＦ１およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＨＳＦの両方について示されているように、外因性遺伝子からの因子が過剰発現されると、ホモトリマー因子の蓄積が優勢になる。このように、過剰発現は、モノマーからホモトリマーへの変換である第１のレベルの因子の調節を超越する。しかし、過剰発現された因子は転写において不活性である。このように、不活性トリマー因子から活性トリマー因子への変換に関与する第２のレベルの調節はなお不活性である。不活性なトリマー因子は、ストレスまたは因子のリン酸化を増大させる操作によって活性化させることができる。従って、第２の調節ステップは、ＨＳＦのリン酸化のレベルによって制御されると思われる。
【００５９】
過剰発現されたＨＳＦは変異によって活性化することもできる。ヒトＨＳＦ１の約１８５位〜３１５位の残基の領域を欠失または置換すると、ストレス非存在下でストレスプロモーター駆動性レポーター遺伝子をトランス活性化する能力によって、因子が活性化される。この領域は、ＨＲ２およびＨＲ２配列直後の約１１５残基のストレッチを含む。欠失の具体的な例としては、１８６位〜２０１位の残基、２０３位〜２７７位の残基、２０３位〜３１５位の残基の欠失、および１８６位〜２０１位の残基における様々な小さな欠失がある。活性化置換は、例えば、１８９位、１９１位、２７９位、２９８位、２９０位〜２９２位および３０７位の残基で行うことができる。例えば、Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７５５７（１９９４）、Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３１９（１９９５）、Ｎｅｗｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８３９（１９９６）、およびＸｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８７４９（１９９８）を参照のこと。配列の保存に基づき、他のＨＳＦにおいて対応する領域を容易に同定することができる。
【００６０】
ＨＳＦの配列中のＤＮＡ結合ドメインおよびＨＲ配列は、容易に認識することができる。ＨＲ２領域内またはＨＲ２直後の領域に変異を導入することができる。多くの点変異およびこれらの領域における事実上全ての大きな欠失は、因子を活性化する。試験しようとする変異型ＨＳＦ変異を、ＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーターを含有するｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な哺乳動物発現ベクターに挿入することによって、活性化変異を同定することができる。得られる構築物を、ストレスプロモーターによって制御され、容易にアッセイ可能なレポーター遺伝子を含有するＨｅＬａ−ＣＡＴ（Ｂａｌｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１７：１１５１（１９９２））などのレポーター細胞株に導入することができる。ＨｅＬａ−ＣＡＴ細胞では、レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であり、ストレスプロモーターはヒトｈｓｐ７０Ｂのプロモーターである。変異型ＨＳＰはトランスフェクトされたレポーター細胞で発現されるが、変異によって活性化される場合、レポーター遺伝子をトランス活性化する。あるいは、任意の適切な細胞株を使用して、変異ＨＳＦのトランス活性可能を、Ｈｓｐ７０または小さなＨＳＰなどのストレスタンパク質のレベルの上昇として検出することができる。
【００６１】
哺乳動物ＨＳＦの研究により、ＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメインは他のＤＮＡ結合ドメインにより置換することができ、その結果、置換されたＨＳＦは、置換されたＤＮＡ結合ドメインの認識部位を含有するプロモーターによって制御される遺伝子を活性化することができるが、もはやストレス遺伝子とは相互作用しないことも分かった。例えば、Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７５５７（１９９４）、Ｎｅｗｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８３９（１９９６）を参照のこと。ＨＳＦの転写活性化ドメインはまた、他の転写因子において活性であるドメインなどの他の活性化ドメインで機能的に置換され得る。例えば、Ｎｅｗｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８３９（１９９６）を参照のこと。最後に、ＨＲ３は重要ではない。Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３１９（１９９５）；Ｎｅｗｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８３９（１９９６）を参照のこと。
【００６２】
ＨＳＦ１およびＨＳＦ２などのヒトＨＳＦおよびその変異体は好ましい熱ショック転写因子であるが、他のＨＳＦ（およびそれらの変異体）は、本明細書に記載の調節回路での使用に適切である。一般に、適切なＨＳＦは、哺乳動物および鳥類供給源などの脊椎動物供給源、ならびに昆虫組織から得ることができる。さらなる特定のＨＳＦの例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｄｍ−ＨＳＦ、マウスＭｍ−ＨＳＦ１およびＭｍ−ＨＳＦ２、ならびにＧａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ  Ｇｄ−ＨＳＦ１、Ｇｄ−ＨＳＦ２、およびＧｄ−ＨＳＦ３が挙げられる。例えば、Ｓｃｈａｒｆら、「熱ストレスプロモーターと転写因子」、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０，Ｎｏｖｅｒ（編）、１２５〜１６２頁（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４）、ならびにＮｏｖｅｒおよびＳｃｈａｒｆ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５３：８０（１９９７）を参照のこと。
【００６３】
このように、本発明において有用な変異型ＨＳＦは、ＨＳＦ由来またはもう１つのＤＮＡ結合タンパク質由来の回路のいずれかにおけるＤＮＡ結合ドメイン、トリマー化ドメイン（ＨＲ１配列）、およびＨＳＦまたはもう１つの供給源のいずれか一方の由来の転写活性化ドメインを含む。変異型ＨＳＦのサイズに依存して、核局在化シグナルもその配列に含まれるべきである。
【００６４】
本明細書に記載の調節回路の様々なエレメントを構築するための核酸分子は、それらが天然に存在する供給源、クローン化されたＤＮＡ領域由来、それらが発現される細胞由来のＲＮＡの逆転写、または化学合成による供給源から得ることができる。分子は、制限酵素部位、アダプタ、リンカーまたは適切なＰＣＲフラグメントを使用して、標準的な分子生物学技術によって結合することができる。
【００６５】
３．２型回路の構築
１型回路を使用する場合、該回路を活性化すると、目的の遺伝子だけではなく、内因性ストレス遺伝子が持続して発現される。結果として、回路を含有する細胞は正常レベルよりも高いレベルでストレスタンパク質をも蓄積し、寛容状態がおこりうる。この状態では、細胞はもはや増殖せず、プロテオトキシン障害（ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃ  ｉｎｓｕｌｔ）に対する体制を実質的に増強する。この「休止」状態は相当な期間維持させることができるが、無期限に持続されないと思われる。従って、休止細胞は最終的に死滅し得る。これが所望される結果である適用もありうるが、他の適用では、細胞を休止状態にしない回路を使用することが望ましいであろう。
【００６６】
図２は、ストレスタンパク質の継続的蓄積を刺激しないもう１つの型のストレス誘導性回路の例を示す。図２に示される例示的２型回路は、３つの点で１型回路と異なる。第１に、２型回路は、ＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、細菌リプレッサーＬｅｘＡのドメインによって置換されている。変異型ＨＳＦを含有する。この置換された因子はもはやストレスプロモーターには結合せず、ＬｅｘＡ認識部位を含有するプロモーターに結合する。そのような置換された因子の特性については、文献に詳細に説明されている。Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７５５７（１９９４）、およびＺｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３１９（１９９５）を参照のこと。第２に、目的の遺伝子の発現を制御するプロモーターはＬｅｘＡ部位を認識する転写因子によって活性化され得るように、該ＬｅｘＡ部位を含有している。そのようなプロモーターの説明については、例えば、Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３１９（１９９５）を参照のこと。最後に、変異型ＨＳＦの発現をコントロールするプロモーターは、機能的ＨＳＥおよびＬｅｘＡ認識部位の両方を含有するので、内因性ＨＳＦまたは変異型ＨＳＦのいずれかによって活性化され得る。そのようなプロモーターは、例えば、ストレスプロモーターに１コピー以上の既知のＬｅｘＡモチーフを挿入することによって、簡便に構築することができる。ＬｅｘＡモチーフは、化学的に調製してもよく、またそのようなモチーフを含有する既存のプロモーターから回収してもよい。例えば、米国特許第４，８３３，０８０号およびＧａｒｒｉｇａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３６：１２５（１９９２）を参照のこと。ＬｅｘＡリプレッサーをコードするＤＮＡ分子は、プラスミドｐＲＢ５００（アメリカンタイプカルチャーコレクション、受託番号第６７７５８号）から得ることができる。
【００６７】
２型回路は以下のように作動する。一過性ストレス後、内因性ＨＳＦが活性化され、変異型ＨＳＦが発現され、蓄積する。ストレス中およびストレス後に変異型ＨＳＦは、目的の遺伝子を制御するプロモーターおよび自身のプロモーターを活性化し、目的のタンパク質およびさらなる変異型ＨＳＦが発現される。変異型ＨＳＦの発現が継続されると、細胞の能力が消耗されるまで目的のタンパク質の合成が刺激される。
【００６８】
通常、ストレス遺伝子は最初の転写ストレスの期間のみに発現される。この誘発ストレスの後、ＨＳＦは非活性型に戻り、ストレス遺伝子の発現は終了し、ストレスタンパク質は細胞のタンパク質分解機構によって排除される。変異型ＨＳＦの発現はさらにＨＳＦの脱活性化を促進する。即ち、変異型ＨＳＦは、内因性ＨＳＦのレベルを顕著に超えるレベルで発現されるため、ＨＳＦは、強制的に２分子の変異型ＨＳＦおよび１分子のＨＳＦから成るヘテロトリマーになるからである。単一のＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメインはＨＳＥ配列に特異的に結合することができないため、ヘテロトリマーはストレス遺伝子に結合して活性化することはできない。より簡単な回路に関する前記の実験に類似の実験によって、回路の操作を評価することができる。簡単な回路について前記したと同様の注意事項および操作法は、回路のストレスが厳密に調節されることを確実にする。
【００６９】
変異型ＨＳＦのＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＲ１のアミノ末端のＨＳＦ配列に加える限り、他の多くのＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインによって置換され得る。このことは、ＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＨＲ１との間の領域が構造化されておらず、従って、任意のＤＮＡ結合ドメインを含有しうることを示す構造研究に従う。ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインをＨＲ１の様々なアミノ末端位置に加えることができ、得られるキメラは類似のＤＮＡ結合特性を有するという観察からも支持が得られる。従って、ＨＳＦ配列に関連するＤＮＡ結合ドメインの位置付けを強いて行う必要はなく、従って、機能的キメラの構築をさらなる実験を行うことなく達成することができる。修飾されたそれぞれの２型回路について、目的の遺伝子を、変異型ＨＳＦに存在する特定のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を含有するプロモーターで制御する必要がある。
【００７０】
２型回路は、発現時に構成的に活性であるＨＳＥ  ＤＮＡ結合ドメイン以外のＤＮＡ結合ドメインを含む変異型ＨＳＦをコードする遺伝子を含有する。転写因子遺伝子は変異型ＨＳＦおよび内因性ＨＳＦによって活性化され得るプロモーターによって制御される。この型の構築物は、２つの構築物（第１はストレスプロモーターによって制御される転写因子を含み、第２は第１の転写因子と同じ転写因子か、または第１の転写因子と同じヌクレオチド配列に結合する転写因子の遺伝子であって、転写因子によって活性化され得るプロモーターによって制御される遺伝子を含む）によって置換することができる。２型回路はまた、第１のエレメントの転写因子によって活性化され得るプロモーターによって制御される目的の遺伝子を含有する。
【００７１】
４．３型回路の構築
転写因子が変異型ＨＳＦではない他の形態の回路を構築することもできる。即ち、変異型ＨＳＦの代わりに、任意の構成性活性転写因子を使用することができる。３型回路を図３に示す。そのエレメントは、第１に、ストレスおよび転写因子の両方によって活性化され得るプロモーターに連結された構成性活性転写因子、ここでは、合成因子ＬｅｘＡ活性化ドメインの遺伝子を含有する構築物である。転写因子ＬｅｘＡ活性化ドメインは、転写活性化ドメインに融合した細菌リプレッサーＬｅｘＡのＤＮＡ結合および二量体化ドメインを含有する。あるいは、１つまたは２つの核酸に含有される２つの構築物を置換することができる。該構築物のうちの１つは、ストレスプロセッサーに連結された転写因子遺伝子を、他は転写因子に応答性のプロモーターに連結された転写因子遺伝子を含有する。第２のエレメントは、転写因子に応答性のプロモーターによって制御される目的の遺伝子を含有する構築物である。
【００７２】
同じ原理に基づき、目的の遺伝子の持続された発現がストレスおよび第２の刺激によって調節され、意図しない活性化の可能性をさらに減少する、さらに複雑な回路を構築することもできる。そのような系は、目的の遺伝子の発現を自由に停止することができるという新たな特徴を付加する。
【００７３】
変異型ＨＳＦを必要とせず、さらに、目的の遺伝子の活性化に第２の刺激を必要とするそのような回路の例を図４に示す。例では、転写因子は、サブユニットＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびレチノイド受容体（ＲＸＲ）から成る人工の因子である。転写因子は、昆虫ステロイドホルモンであるエクジソンまたはムリステロンＡ（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）などの誘導体の存在下でのみ活性である。この因子は、昆虫特異的ステロイドホルモンにより、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の発現の調節を可能にするために開発された。エクジソン誘導性発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【００７４】
例示された３型回路は、２つのエレメントを含有する。第１に、２つのサブユニットのＥｃＲ／ＲＸＲを発現する２つの組の構築物が存在する。一方の組は、ストエスプロモーターによって調節され、他方はＥｃＲ／ＲＸＲによって活性化され得る人工プロモーターによって調節される。第２に、サイトカイン遺伝子などの目的の遺伝子が、ＥｃＲ／ＲＸＲによって活性化され得るプロモーターによって制御される。この形態の３型回路は以下のように作動する。ストレスおよびホルモンのいずれか一方または両方が存在しない場合、目的の遺伝子は発現しない。ホルモンが存在する場合、一過性のストレスは１組の転写因子遺伝子を活性化し、ホルモンによって活性化されるＥｃＲ／ＲＸＲが蓄積する。活性因子は、第２の組の転写因子遺伝子および目的の遺伝子からの発現を活性化する。転写因子は継続的に産生されるため、目的の遺伝子の活性化は持続される。ホルモンが中止されると、転写因子が不活化され、自己活性化ループが中断される。目的の遺伝子はもはや発現されず、非活性転写因子および目的のタンパク質は最終的に細胞内のタンパク質分解系によって分解される。この型の回路は、遺伝子治療の設定に特に有利である。何故なら、該回路は、局所ストレスによって目的の遺伝子の局所活性化を可能にするだけではなくその後適切な時期に、全身に供給されるホルモンを撤去（中止）することによって不活化することができるからである。
【００７５】
ここで提供される回路は、さらなるエレメントを含めることによって増幅され得る。例えば、目的の遺伝子を、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質などのトランス活性化因子の遺伝子で置換してもよい。さらなるエレメントとして、トランス活性化因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結される目的の遺伝子をコードする構築物が付加され得る。一旦活性化されると、この修飾された回路は、本来の回路より高い速度で目的のタンパク質を産生し得る。
【００７６】
５．組換えタンパク質を調製するためのストレス誘導性回路の使用
上記のストレス誘導性回路を、目的のタンパク質の大量生産に適用することができる。例えば、第１の構築物は、ストレスプロモーターに連結される目的の遺伝子を含有することができる。第２の構築物は、ストレスプロモーターによって調節される変異型ＨＳＦ遺伝子を含むことができる。あるいは、目的の遺伝子および変異型HSF遺伝子を単一のベクター内で組み合わせることができる。適切なベクターとしては、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。１つまたは複数の構築物は、さらなる遺伝子、例えば、該構築物を含有する安定な細胞株の単離を容易にするための選択マーカーをコードする遺伝子を含有してもよい。構築物は、核酸を送達することが可能な任意の方法によって、選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン−β−ホスホトランスフェラーゼ）と共に適切な宿主細胞に導入される。細胞株は、用いた特定の選択マーカーに適応するプロトコルを使用して選択される。
【００７７】
適切な哺乳動物宿主細胞の例としては、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）、ヒト胚腎細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５４４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ２．２）、ラットヘパトーマ（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）が挙げられる。
【００７８】
さらに、適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１由来の細胞株、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａサナギ卵巣細胞株、例えば、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｅｉｄｅｒ−２細胞が挙げられる。バキュウロウイルス系の組換えタンパク質を産生するための確立された技術は、Ｂａｉｌｅｙら、「バキュロウイルスベクターの操作」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｕｒｒａｙ（編）、１４７〜１６８頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９１）、Ｐａｔｅｌら、「バキュロウイルス発現系」、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、２０５〜２４４頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、１６−３７〜１６−５７頁、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５）、およびＬｕｃｋｎｏｗ、「昆虫細胞発現技術」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｅｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌｎｄら（編）、１８３〜２１８頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供される。
【００７９】
あるいは、本明細書に記載の調節回路を使用して、培養酵母細胞において外来タンパク質を発現させることができる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手可能である。これらのベクターとしては、ＹＩｐ５などのＹＩｐに基づくベクター、ＹＲｐ１７などのＹＲｐベクター、ＹＥｐ１３などのＹＥｐベクター、ＹＣｐ１９などのＹＣｐベクターが挙げられる。当業者であれば、酵母細胞における発現のための極めて多様な適切なベクターがあることを理解するであろう。
【００８０】
細胞株を、ストレスがない場合の低レベルの目的の遺伝子の発現について、および試験回路について記載したと同様のプロトコルにより細胞をストレスに短期間暴露した後の持続発現に関し試験する。目的のタンパク質を大量生産する場合、細胞のタイプに依存して固相支持体上またはリアクター内において大規模で細胞を培養する。適切な細胞数に達したら、短期間のストレス処理によって、目的のタンパク質の産生を開始する。ストレス処理は、試験系について記載されているような熱ショック処理であってもよく、また該ストレス処理は、ストレスプロモーターを活性化することが知られている任意の化学物質または条件への一過性暴露であってもよい。あるいは、タンパク質の産生期間を通して維持され得る穏やかな条件に細胞を暴露してもよい。そのような条件下ではじめに勃発した発現の後は、細胞は、通常ストレスプロモーターからの発現をダウンレギュレートするが、調節回路を含有する細胞はそうすることができず、細胞が消耗されるまで発現を継続する。
【００８１】
ストレスプロモーターによって制御される遺伝子を発現させることを含む方法は、当業者に周知である。熱に加えて、例えば、重金属、アルコール、ベンゾキノンアンサマイシン系薬剤、スルヒドリル反応性試薬、酸化剤によってもストレスプロモーターを活性化することができる。例えば、Ｗｕ、「熱ショック転写因子：構造と調節」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１：４４１（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、ならびにＢｅｎｎｄｏｒｆおよびＢｉｅｋａ、「細胞のストレス応答：ストレスタンパク質−生理学および癌との関連」、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４３：１３０（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９７）を参照のこと。
【００８２】
適切な時間に細胞を回収して、目的のタンパク質を単離するか、または目的のタンパク質が分泌されている場合は、培地を回収して、一般的なプロトコルを使用して培地からタンパク質を精製する。目的の分泌タンパク質の場合、タンパク質を含有する培地を定期的または継続的に回収してもよい。哺乳動物系によって産生される外来タンパク質を発現および回収する一般的方法については、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「哺乳動物細胞培養における遺伝子操作されたタンパク質の発現」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）１６３頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９６）により提供されている。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離する確立された方法については、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｅｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５）が記載している。
【００８３】
６．遺伝子治療のためのストレス誘導性回路の使用
本明細書に記載の調節回路を使用して、遺伝子治療を改善することもできる。遺伝子治療は、個体の細胞へ核酸を送達することを含み、該核酸は標的細胞において治療または予防作用性タンパク質へと発現され得る。ほとんどのあらゆる想定される状況において、治療が必要な領域に正確に標的化して送達（デリバリー）することができない。従って、治療用核酸を必要としないさらなる細胞、組織および器官に、核酸が提供される。適切な標的化ができない場合は、往々にして所望されない副作用を伴う。例えば、ＩＬ−２を特定の組織で発現させて適切な免疫応答を刺激する必要がある場合、ＩＬ−２遺伝子が非標的化送達されると、サイトカインが全身で発現する恐れがある。ＩＬ−２の全身性誘導は重度の毒性副作用を伴うことがよく知られている。この問題は、上記２つのエレメント調節回路を送達することによって回避することができる。この例の場合、該回路は目的の遺伝子としてＩＬ−２遺伝子を含有し得る。標準的な送達方法を使用して、意図する組織および他の特定の組織に送達することができる。次いで、ストレスがない場合、回路のＩＬ−２遺伝子は非活性である。適切な場所での遺伝子の活性化および持続された発現は、発現を所望する特定の組織に一時的にストレスを与えることによって達成することができる。
【００８４】
遺伝子治療を単一遺伝子疾患および癌に対して標的化することができる。単一遺伝子疾患では、ただ１つの組織の遺伝子欠損を補正（訂正）すれば、対象の状態を改善または正常化するのに十分であり得る。単一遺伝子疾患の例としては、ゴシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症）、ムコ多糖症（βグルクロニダーゼ欠損症）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、血友病Ａ（血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠損症）、気腫（α１アンチトリプシン欠損症）、デュシーヌ筋ジストロフィー（ジストロフィン欠損症）、および鎌状赤血球症（βグロビン欠損症）が挙げられる。
【００８５】
遺伝子治療により癌を処置するためには様々なアプローチがある。例えば、薬物感受性を付与する自殺遺伝子を癌細胞に伝達（トランスファー）することができる。そのように導入された癌細胞は、薬物に対する該細胞の過敏性により選択的に除去される。遺伝子治療を使用して、癌遺伝子をダウンレギュレートする治療用遺伝子を転移（トランスファー）することもできる。あるいは、アンチセンス遺伝子、または標的化されたリボザイムを使用して、癌促進遺伝子を攻撃することができる。もう１つのアプローチでは、組換え抗体遺伝子を対象に導入して、腫瘍細胞の機能を妨害する抗体を産生することができる。対象の抗腫瘍免疫応答を増強する遺伝子を対象に導入することもできる。癌治療に対するそのような遺伝的アプローチについては、例えば、Ｄａｂｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：４９９（１９９６）、ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＣｕｒｉｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：７２（１９９６）、Ｓｃｈｍｉｄｔ−ＷｏｌｆおよびＳｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２０７（１９９６）、ＺｈａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１５：３８５（１９９６）、Ｂｌａｅｓｅ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ９１頁（１９９７年６月）、ならびにＲｏｔｈおよびＣｒｉｓｔｉａｎｏ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：２１（１９９７）に記載されている。
【００８６】
単一遺伝子疾患および癌に加えて、ＡＩＤＳなどの感染性疾患、動脈性疾患、慢性関節リュウマチ、および変性神経障害に対して遺伝子治療を使用することができる。
【００８７】
ストレスによって調節される治療用遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在し、これらはｅｘ  ｖｉｖｏアプローチにおいて治療用遺伝子を発現する組換え宿主細胞の使用、治療用遺伝子をコードするネイクド核酸(naked nucleic acdi)の送達、治療用遺伝子を有するカチオン脂質担体の使用、ならびに治療用遺伝子を発現する組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えアデノウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルスなどの使用を含む。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５７５（１９８８）、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）、ＢｒｅａｋｆｉｅｌｄおよびＤｅｌｕｃａ、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：２０３（１９９１）、ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８（１９９３）、ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６（１９９３）を参照のこと。
【００８８】
適切な組換えウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えば、Ｋａｓｓｅ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８（１９９３）；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２１５（１９９４）：Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０（１９９３）；およびＺａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７（１９９３）；ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９３／９１９１）、アデノウイルス随伴ウイルスベクター（Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０６１３（１９９３）；Ｆｅｒｒａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：１２９５（１９９７））、セムリキ森林熱ウイルスおよびシンドビスウイルスなどのアルファウイルス（ＨｅｒｔｚおよびＨｕａｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：８５７（１９９２）；ＲａｊｕおよびＨｕａｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒ．６５：２５０１（１９９１）；Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８（１９８９）；米国特許第５，０９１，３０９号；ＷＯ９２／１０５７８；ＷＯ９２／０７９９４）；ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第４，７６９，３３１号、同第４，８５９，５８７号、同第５，２８８，６４１号、および同第５，３２８，６８８号；ならびに国際公開ＷＯ９４／１４９７１およびＷＯ９５／０４１３９）、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７（１９９４）、ポックスウイルスベクター（Ｏｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３：６５３（１９９３）；ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：４９２７（１９８２））、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：３１７（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６（１９８９）；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３）、ならびにレトロウイルス（例えば、Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９（１９９３）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．３３：４９３（１９９２）；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２（１９９３）；Ｖｉｌｅ）およびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０（１９９３）；米国特許第５，２１９，７４０号；ＥＰ４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８５；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８）が挙げられる。様々な実施態様内で、ウイルスベクター自体またはウイルスベクターを含むウイルス粒子を、以下に記載の方法および組成物において利用することができる。
【００８９】
アデノウイルスは、複製欠損にすることができ、休止または最後まで分化した細胞に感染することができ、そして高力価で純化することができる。例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：４９９（１９９３）を参照のこと。さらに、アデノウイルスＤＮＡ宿主ゲノムに組み込まれないため、アデノウイルス関連の疾患の危険性が低減される。
【００９０】
単純ヘルペスウイルスに基づくベクターは、治療用遺伝子を非分裂細胞に送達する能力、およびヒトの多くの細胞型に感染する能力を有する。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ（編）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２７〜５６１頁（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、ならびにＰｅｐｏｓｅおよびＬｉｅｂ、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：２６６２（１９９４）を参照のこと。当業者であれば、標準的な技術を使用して、組換えＨＳＶウイルスを構築することが可能である。例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの商業的供給源からＨＳＶ−１  ＤＮＡを得ることができる。例えば、Ｍａｒｔｕｚａら、米国特許第５，５８５，０９６号（１９９６）は、対象において治療用遺伝子を発現するための複製−コンピテントＨＳＶの産生について記載している。二重変異のため、これらのＨＳＶベクターは、リボヌクレオチド還元酵素およびＫ３４．５遺伝子の産物のいずれも産生しない。
【００９１】
治療用遺伝子および調節回路の転写因子を発現することが可能な組換えウイルスの高力価のストックは、標準的な方法を用いて感染哺乳動物細胞から得ることができる。例えば、Ｂｒａｎｄｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０４３（１９９１）、Ｈｅｒｏｌｄら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１１（１９９４）、ＶｉｓａｌｌｉおよびＢｒａｎｄｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：４１９（１９９１）、Ｇｒａｕら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：２４７４（１９８９）、Ｂｒａｎｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．３６２０６（１９９２）、ならびにＢｒｏｗｎおよびＭａｃＬｅａｎ（編）、ＨＳＶ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）に記載のように、組換えＨＳＶを調製することができる。
【００９２】
遺伝子治療の特定の使用に依存して、以上タンパク質の発現を抑制することも望ましいことがある。これは、変異型遺伝子産物の転写または翻訳を阻止することによって、達成することができる。例えば、アンチセンス分子は、遺伝子産物の発現を阻止するために使用されている。
【００９３】
あるいは、調節エレメントがリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されているストレス誘導性発現ベクターを構築することができる。リボザイムを、ｍＲＮＡ分子の特定の標的配列に対して指令されるエンドヌクレアーゼ活性を発現するように設計することができる。例えば、ＤｒａｐｅｒおよびＭａｃｅｊａｋ、米国特許第５，４９６，６９８号；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、米国特許第５，５２５，４６８号；ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、米国特許第５，６３１，３５９号；ＲｏｂｅｒｓｏｎおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ、米国特許第５，２２５，３３７号を参照のこと。
【００９４】
もう１つのアプローチでは、調節エレメントが、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のＲＮａｓｅＰ介在性切断を促進することが可能なＲＮＡ転写物の産生を指令する発現ベクターを構築することができる。本アプローチに従えば、細胞リボザイムによってその後切断される細胞内ｍＲＮＡの特定の種に対して、内因性リボザイム（ＲＮａｓｅＰ）を指令するための外部ガイド配列を構築することができる。例えば、Ａｌｔｍａｎら、米国特許第５，１６８，０５３号；Ｙｕａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１２６９（１９９４）；Ｐａｃｅら、国際公開ＷＯ９６／１８７３３；Ｇｅｏｒｇｅら、国際公開ＷＯ９６／２１７３１；Ｗｅｒｎｅｒら、国際公開ＷＯ９７／３３９９１を参照のこと。好ましくは、外部ガイド配列は、目的の標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な１０〜１５ヌクレオチド配列、および３’−ＮＣＣＡヌクレオチド配列を含む。ここで、Ｎは、好ましくはプリンである。外部ガイド配列転写物は、ｍＲＮＡと相補外部ガイド配列との間の塩基対の形成によって、標的化されたｍＲＮＡ種に結合し、従って、５’側の塩基対領域に位置するヌクレオチドで、ＲＮａｓｅＰによるｍＲＮＡの切断を促進する。
【００９５】
一般に、組換えウイルスなどの調節回路を有する治療用ベクターを含む組成物の用量は、年齢、重量、身長、性、一般的な医学的症状、既往歴などの対象の因子に依存して変更される。該用量は、目的の特定遺伝子および治療のために標的化される疾患または状態にも依存する。
【００９６】
治療用ベクターの適切な経路としては、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、および腫瘍を含有する腔への注射が挙げられる。継続的注射または単回もしくは複数回ボーラスによる投与も実施することができる。
【００９７】
本発明の治療用ベクターを含む組成物を既知の方法に従って製剤化し、製薬的に許容される担体を有する混合物内にベクターまたはウイルスを組み合わせることによって、薬学的に有用な組成物を調製することができる。投与がレシピエント対象に認容され得るならば、組成物を「製薬的に許容される担体（キャリア）」という。滅菌リン酸緩衝化生理食塩水は、製薬的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｃ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第７版（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）を参照のこと。
【００９８】
治療目的のために、治療用ベクター、またはそのようなベクターを含む組換えウイルス、および製薬的に許容される担体を、治療有効量で対象に投与する。治療用ベクター（またはウイルス）および製薬的に許容される担体の組み合わせは、その量が生理学的に重要であれば、「治療有効量」で投与されるといわれる。薬剤の存在により受容対象の生理状態に検出可能な変化が認められるならば、該薬剤は生理学的に重要である。
【００９９】
投与後は、本明細書に記載の調節回路を含むベクターが対象体内で活性化しなければならない。そのような回路を活性化するのに好ましい方法は、治療遺伝子の発現が効果的である場所に熱を適用することである。非侵襲的または侵襲的手順のいずれかを使用して、身体を伴う標的組織の誘導性遺伝子を選択的局在的に加熱することができる。非侵襲加熱は、体表面から標的組織への音響経路が空気および骨を中継しない状況で、局所的に組織を加熱することが明らかにされている集束された（焦点性）超音波で達成され得る。例えば、Ｌｅｌｅ、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６０：４９４（１９６２）を参照のこと。超音波を送達するための変換器は、特定の寸法および高い強度の超音波を身体の様々な解剖学的領域に集中させるための形状で設計される。これらの超音波変換器は、音響出力を同期（phase)させることができ、そして加熱の標的化を高度に制御かつ局在化することができるような配列(アレイ）で構築することができる。
【０１００】
適合的電波位相配列（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅｄ  ｒａｄｉｏｗａｖｅ  ａｒｒａｙ）を使用して、身体の局在化された領域に非侵襲的に熱を送達することができる。例えば、９１５ＭＨｚの電波出力を、適合的フィードバック集束により送達し、送達されたエネルギー、従って、局在化された領域の温度を制御することができる。Ｆｅｎｎ、米国特許第５，２５１，６４５号（１９９３）。
【０１０１】
カテーテルを導入することによっておよび３Ｄ超音波またはコンピュータ断層撮影などの画像方法を使用して標的組織内の加熱アダプタの位置を誘導することによって、侵襲的手順によっても、身体内で局在的に加熱することができる。これらのアプリケーションは、電波周波数出力の供給源に対して身体の外側にある針の両端を接続することによって熱を発生する金属針の形態をとりうる。あるいは、カテーテルは、光学的ファイバーが、レーザーのエネルギーを送達して局在的に熱を発生するためのガイドとしても働きうる。
【０１０２】
例えば、重金属またはベンゾキノンアンサマイシン化合物などのストレスプロモーターの化学的アクチベーターの適用によって、局所のストレスを適用し得る。標的組織への直接注入によって、局所への適用を達成することができる。多くの化学物質について、特定の生物の細胞においてストレスプロモーターを活性化するのに必要な濃度が周知である。当業者であれば、特定の組織において必要とされる濃度を達成する方法および関連情報を得る方法を熟知している。
【０１０３】
低度のストレス閾での活性化が受容され得るか、または所望され得るタンパク質産生設定とは異なり、遺伝子治療の設定においては、調節回路が最も高いと思われるレベルのストレスでのみ標的化されることが重要である。ストレスプロモーターは、ヒト細胞では４１〜４２℃以上の温度で唯一強度に活性である。そのような温度は、極度の熱に対応し、ヒトにおいてまれに到達される。事実、慎重な医師は、発作などの結果を回避するため、患者がそのような熱を発症することを防ぐように可能なあらゆる手段を講じる。従って、最も異常な状況である場合を除き、ストレスプロモーターはヒトにおいて不慮に活性化されることはない。厳密にストレスを調節するプロモーターを注意深く選択することによって、また必要であれば、変異型ＨＳＦの蓄積レベルを低減するような上記の改変を導入することによって、活性化のために同様に高い閾値レベルを有するように調節回路を組み立てることができる。
【０１０４】
以上のように本発明を一般的に説明してきたが、本発明の内容は以下の実施例を参考にすればより容易に理解できるであろう。該実施例は、例示によって示されるものであって、本発明を制限することは意図していない。
【０１０５】
実施例１
試験回路の構築および操作
模範的試験回路は２つのエレメントを含有する。第１のエレメントは、ストレスプロモーターによって調節されるホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドから成る。この構築物を調整するために、Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８９：４９４９（１９８５）に記載の１０μｇのプラスミド１７３ＯＲを、供給者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｒｌｙ，ＭＡ）によって示唆された消化緩衝液を使用して、２５ユニットの制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、３７℃にて２時間消化する。消化物を０．９％アガロースゲル上で電気泳動し、ＤＮＡフラグメントを臭化エチジウムで可視化する。２．７ｋｂｐフラグメントを切り出し、電気溶出し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびおよびクロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿により精製し、小容量の水に再懸濁する。２．７ｋｂｐフラグメントは、プロモーターおよびヒトｈｓｐ７０Ｂ遺伝子のＲＮＡリーダー配列の部分を含有する。プロモーターを有さないホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する５μｇアリコートのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を同様にＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびおよびクロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿により精製し、小容量の水に再懸濁する。約１μｇのｐ１７３０Ｒフラグメントおよび０．２５μｇの消化されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒを含有する標準的な連結反応を行う。連結反応物を使用してＭＣ１０６１  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換する。アンピシリン体制形質転換体を回収し、標準的な手順によって、形質転換体培養物からプラスミドを調製する。ルシフェラーゼコード配列のすぐ上流に正確な方向でｈｓｐ７０Ｂプロモーターセグメントが挿入されている意図する構築物、ｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼを、広範な制限解析によって同定する。
【０１０６】
構築物を機能的に試験するために、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ法（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により、７０％集密度ＨｅＬａ細胞を含有する６０ｍｍディッシュあたり２〜１０μｇのｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼＤＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクション１日後、２つの平行培養物のうちの１つを、水浴中、４２〜４４℃で１時間熱処理し、並行培養物を３７℃で数時間インキュベートする。細胞を回収し、抽出物を調製し、標準的手順によりルシフェラーゼ活性を測定する。容易に測定可能なルシフェラーゼ活性を、熱処理、トランスフェクトされた培養物から認めることができるが、熱処理をしていないトランスフェクト培養物またはトランスフェクトされていない培養物からは認められない。
【０１０７】
第２のエレメントは、Ｚｕｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３１９（１９９５）に記載のＨＳＦ１変異遺伝子、ＨＳＦ１ｄ２０２−３１６を含有するプラスミド、および機能的に連結されたｈｓｐ７０Ｂプロモーターから成る。このプラスミドを構築するために、ｐ１７３ＯＲ  ＤＮＡを上記のようにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｓｐ７０遺伝子由来の３’非翻訳配列を含有する２ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離する。もう１つのアリコートのｐ１７３ＯＲ  ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子およびｈｓｐ７０ＢプロモーターおよびＲＮＡリーダー配列を含むプラスミド配列とを含有する約５ｋｂｐの長さのフラグメントを単離する。最後に、変異型ＨＳＦ１配列（Ｚｕｏ，Ｊ．（１９９４）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を有するｐＧｅｍ３Ｚｆ（＋）プラスミドクローンから、ＨＳＦ１ｄ２０２−３１６コード領域を含有する約１．８ｋｂｐの長さのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＩフラグメントを単離する。３つのフラグメントを同時連結して形質転換し、上記のように形質転換体について解析する。この方法で同定された正しいプラスミド（ｈｓｐ７０Ｂ変異型ＨＳＦ１）は、ｐ１７３０Ｒ由来のプラスミド配列背景に、ｈｓｐ７０Ｂプロモーターならびに変異型ＨＳＦ１遺伝子の開始部分に連結されたＤＮＡリーダー配列および変異型ＨＳＦ１遺伝子の終了部分に連結されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ３’非翻訳配列を含有する。
【０１０８】
上記の２つのプラスミドの組み合わせからなる試験回路を評価するために、並行な組のＨｅＬａ細胞培養物を、ポジティブコントロールとしての、構成的にルシフェラーゼを発現するプラスミド（例えば、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼでトランスフェクトするか、またはｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼおよびｈｓｐ７０Ｂ−変異型ＨＳＦ１の両方で同時トランスフェクトする。系を最適化するために、異なる割合の２つのプラスミドで同時トランスフェクトするべきである。トランスフェクション１日後、１つの組の培養物を４２〜４４℃／１時間の熱処理に供し、全ての培養物を３７℃で２〜３日間さらにインキュベートする。次いで細胞を回収し、抽出物を調製し、標準的手法でルシフェラーゼ活性を測定する。
【０１０９】
培養物の均等なトランスフェクションを確認するために、全てのトランスフェクション溶液は、増強された緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含有し得、そして蛍光顕微鏡下で蛍光を呈する細胞を計数することによって、トランスフェクション効率を監視することができる。あるいは、トランスフェクション効率のサイトメトリー決定のために、回収時に細胞の一部を取っておく。回路が十分に作動していれば、熱処理をしていない同時トランスフェクトされた細胞は、ｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼのみをトランスフェクトされた非熱処理細胞と匹敵する、低いルシフェラーゼ活性を含有するはずである。対照的に、熱処理を行い、同時トランスフェクトされた細胞はルシフェラーゼ活性を示し、該活性は、非加熱、同時トランスフェクト細胞の測定値より高いオーダーの値を示し、ｈｓｐ７０Ｂ−ルシフェラーゼ単独でトランスフェクトされた熱処理細胞で認められる活性よりも少なくとも１桁高いはずである。熱処理、同時トランスフェクトされた細胞のルシフェラーゼ活性は、構成的にルシフェラーゼを発現する構築物でトランスフェクトされた細胞の活性に等しいかそれ以上である。
【０１１０】
実施例２
ヒト成長ホルモンの大量生産のための回路の構築
ヒト成長ホルモンの産生のための例示的回路は、以下の２つのエレメントを含有する：ｈｓｐ７０Ｂ変異型ＨＳＦ１およびｈｓｐ７０Ｂプロモーターに機能的に連結されたヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡ遺伝子を含有するプラスミド。後者のプラスミドは、プラスミド１７ｈＧＨｄｈｆｒであり得る。Ｄｒｅａｎｏら、Ｇｅｎｅ  ４９：１（１９８６）。
【０１１１】
回路の操作は以下の通りである。ストレスがない場合に成長ホルモンを産生しないｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする。４２℃／１時間の熱処理で細胞にストレスを与えると、成長ホルモンの発現が誘導され、例えば、Ｄｒｅａｎｏら、Ｇｅｎｅ  ４９：１（１９８６）に記載の標準的なラジオイムノアッセイで培地における成長ホルモンの発現を測定することができる。熱処理約１日後に、成長ホルモンの発現は終了する。対照的に、ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒおよびｈｓｐ７０Ｂ変異型ＨＳＦ１を同時トランスフェクトされた細胞では、熱処理後数日間、成長ホルモンの発現が継続する。
【０１１２】
上記では、特に好適な実施態様について言及しているが、それにより本発明が限定されないことを理解されたい。当業者であれば開示された実施態様について様々な変更を加えることが可能であり、そのような変更も本発明の範囲に含まれることが意図されている。本発明の範囲は、請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  １型スイッチのエレメントの該略図であり、エレメント間の相互作用を示す。「ＨＳＥ」は、典型的なｈｓｐ遺伝子プロモーターに含有される熱ショック転写因子（ＨＳＦ）の結合部位である熱ショック配列を指す。「ｄＨＳＦ」は構成的に活性な熱ショック転写因子であり、因子の転写能を抑制するエレメントを除去するように変異されている。
【図２】  ２型スイッチのエレメントの該略図であり、エレメント間の相互作用を示す。「ＬｅｘＡｄＨＳＦ」は、構成的に活性なＨＳＦ１と細菌リプレッサーＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインによって置換された熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメインをコードするハイブリッド転写因子遺伝子を指す。
【図３】  ３型スイッチの一例のエレメントの該略図である。「ＬｅｘＡ活性化ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインに融合されたＬｅｘＡの二量体化ドメインをコードするハイブリッド転写因子遺伝子を指す。
【図４】  ３型スイッチのもう１つの形態のエレメントの該略図である。「ＥｃＲ／ＲＸＲ」は、エクジソン受容体（ＥｃＲ）およびレチノイド受容体（ＲＸＲ）サブユニットから成るヘテロダイーマーエクジソン受容体を指す。
【図５】  ヒト熱ショック転写因子ＨＳＦ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１および２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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