(57)【要約】本明細書は、概して、複数の細菌毒性因子に結合する多特異的結合分子、これらの結合分子の作製方法、及び細菌感染の治療を行うためのこれらの結合分子の使用に関する。特に、結合分子は、好ましくは抗体または抗体断片及び代替的足場など、少なくとも２つの結合ドメインを含む。第１の結合ドメインは、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質、好ましくはＳＤＲ含有タンパク質に結合可能である。第２の結合ドメインは、ブドウ球菌ロイコトキシン、好ましくはＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥに結合可能である。これらの多特異的結合化合物は、ブドウ球菌に対して殺菌活性を有し、従って、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌感染の治療、及び／または改善に使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合可能である第１の結合ドメインと、
ブドウ球菌ロイコトキシンに結合可能である第２の結合ドメインと
を含む、結合分子。
【請求項２】
グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質が、グリコシル化セリン−アスパラギン酸ジペプチド繰り返し（ＳＤＲ）含有タンパク質である、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
グリコシル化ＳＤＲ含有タンパク質が、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、またはＳｄｒＨである、請求項２に記載の結合分子。
【請求項４】
第１の結合ドメインが、全長抗体または抗体断片である、請求項１に記載の結合分子。
【請求項５】
全長抗体または抗体断片が、野生型ＩｇＧ１を切断するブドウ球菌プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性がある、請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
ブドウ球菌プロテアーゼが、配列番号６０内の残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付け）間、または配列番号６０内の残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付け）で野生型ＩｇＧ１を切断する、請求項５に記載の結合分子。
【請求項７】
ブドウ球菌プロテアーゼが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼである、請求項６に記載の結合分子。
【請求項８】
全長抗体または抗体断片が、ヒトＦｃγＲＩに特異的結合することができない、請求項４に記載の結合分子。
【請求項９】
全長抗体または抗体断片が、ヒト、ヒト化、若しくはキメラ抗体、または抗体断片である、請求項４に記載の結合分子。
【請求項１０】
全長抗体または抗体断片が、プロテインＡに特異的結合することができない、請求項４に記載の結合分子。
【請求項１１】
全長抗体または抗体断片が、Ｓｂｉに特異的結合することができない、請求項４に記載の結合分子。
【請求項１２】
全長抗体または抗体断片が、ＦｃＲｎに特異的結合することができる、請求項４に記載の結合分子。
【請求項１３】
第２の結合ドメインが、代替的足場である、請求項１に記載の結合分子。
【請求項１４】
代替的足場が、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
ＦＮ３ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ、またはこれらの任意の組み合わせに結合する、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１６】
ＦＮ３ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢを含むＬｕｋＡＢ複合体に結合する、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１７】
ＦＮ３ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤを含むＬｕｋＥＤ複合体に結合する、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１８】
第２の結合ドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、または（ｉｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥに結合するために、配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６のアミノ酸配列のいずれか１つを有するＦＮ３ドメインと競合する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項１９】
ＦＮ３ドメインが、配列番号１４〜５９及び配列番号１１３〜６６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項２０】
ＦＮ３ドメインが、配列番号１４または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項２１】
ブドウ球菌ロイコトキシンが、ロイコトキシンＡ（ＬｕｋＡ）、ロイコトキシンＢ（ＬｕｋＢ）、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）、ロイコトキシンＤ（ＬｕｋＤ）、ロイコトキシンＥ（ＬｕｋＥ）、ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）、パントン−バレンタインロイコシジンＳ（ＬｕｋＳ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジンＦ（ＬｕｋＦ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジン（ＬｕｋＳＦ／ＰＶＬ）、γヘモリシンＡ（ＨｌｇＡ）、γヘモリシンＣ（ＨｌｇＣ）、γヘモリシンＢ（ＨｌｇＢ）、γヘモリシンＡＢ（ＨｌｇＡＢ）、及びγ−ヘモリシンＢＣ（ＨｌｇＢＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２２】
ブドウ球菌ロイコトキシンが、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥである、請求項２１に記載の結合分子。
【請求項２３】
第１及び第２の結合ドメインが、リンカーペプチドを介して連結される、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２４】
第１の結合ドメインが、配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２５】
第１の結合ドメインが、配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２６】
第１の結合ドメインが、
配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域；及び
配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域
を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２７】
第１の結合ドメインが、
（１）配列番号６０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（２）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（３）配列番号６４のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（４）配列番号６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（５）配列番号６８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（６）配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（７）配列番号７２のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（８）配列番号７４のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；
（９）配列番号７６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；または
（１０）配列番号７８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬ領域
を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２８】
第１の結合ドメインが、（ｉ）配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び（ｉｉ）配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含み、
第２の結合ドメインが、配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２９】
１つ以上の追加の結合ドメインを更に含み、該追加の結合ドメインが、（ｉ）第１の結合ドメインによって結合されるものとは異なるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質と結合すること、及び／または（ｉｉ）第２の結合ドメインによって結合されるものとは異なるブドウ球菌ロイコトキシンと結合することが可能である、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子をコードする、核酸配列。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
結合分子の発現を可能にする条件下で、請求項３２に記載の宿主細胞を培養する段階と、
結合分子を培養物から回収する段階と
を含む、結合分子の製造のための方法。
【請求項３４】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子と、
薬学的に許容可能な担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
ブドウ球菌感染の治療または改善において使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子。
【請求項３６】
ブドウ球菌感染の治療、予防、または改善のための方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子を、ブドウ球菌感染の治療、予防、または改善に有効な条件下で、その必要のある対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３７】
黄色ブドウ球菌に感染したかまたは黄色ブドウ球菌に感染する危険がある対象を選択する段階を更に含み、結合分子が、選択された対象に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与を繰り返す段階を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
結合分子と共に、抗感染症剤、抗生物質、及び抗菌剤からなる群から選択される１つ以上の剤を投与する段階を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
対象におけるブドウ球菌感染を診断するための方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子と、対象由来のサンプルとを接触させる段階；
該接触させる段階に基づいて、該サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出する段階；及び
該検出する段階に基づいて、対象におけるブドウ球菌感染を診断する段階
を含む、方法。
【請求項４２】
サンプルにおけるブドウ球菌を検出するための方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子と、サンプルとを接触させる段階；及び
該接触させる段階に基づいて、該サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出する段階
を含み；これによって、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在により、サンプルにおけるブドウ球菌の存在が示される、方法。
【請求項４３】
対象におけるブドウ球菌感染を予防するための方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子または請求項３３に記載の方法に従って作製された結合分子と、対象由来のサンプルとを接触させる段階；
該接触させる段階に基づいて、該サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンを検出する段階；及び
該検出する段階に基づいて、ブドウ球菌感染の予防に好適である剤を対象に投与する段階
を含む、方法。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合分子を含む、キット。
【請求項４５】
請求項３０に記載の核酸分子、請求項３１に記載のベクター、及び／または請求項３２に記載の宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年１２月９日出願の米国特許仮出願第６１／９１３，７１４号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、少なくとも２つの異なる細菌毒性因子を標的にする多特異的結合分子に関する。特に、この結合分子は、異なるブドウ球菌タンパク質に特異的に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含む（すなわち、分子は少なくとも二重特異性である）。第１の結合ドメインは、好ましくは、抗体またはこれらの断片であり、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質、好ましくはグリコシル化セリン−アスパラギン酸ジペプチド繰り返し（ＳＤＲ）含有タンパク質に結合可能である。第２の結合ドメイン、好ましくは、代替的足場は、ブドウ球菌ロイコトキシン、好ましくはＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤまたはＬｕｋＥに結合可能である。これらの多特異的結合化合物は、ブドウ球菌に対して殺菌活性を有し、従って、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症などの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染の予防、治療、及び／または改善に使用可能である。
【背景技術】
【０００３】
背景
ブドウ球菌によって生じる細菌感染（すなわち、「ブドウ球菌感染症」）は、一般集団において非常によくみられる。個人の約２５％は、一般に、皮膚または鼻中にブドウ球菌を保持している。大抵の場合、これらの細菌による問題が発生しないか、または比較的わずかな皮膚感染が発生する。しかし、ブドウ球菌感染症は、細菌が個々の身体のより深部に浸潤した場合（例えば、血流、関節、骨、肺または心臓に入るなど）、より致命的になり得る。これまでには、致命的なブドウ球菌感染が、入院中のヒト、または慢性疾患を有するヒト、または免疫系が低下しているヒトにおいて発生したこともある。現在では、ますます、さもなければ健常な個人にとっても、致死的なブドウ球菌感染が発生することは一般的になっている。重要なのは、多くのブドウ球菌感染は、よく使用される抗生物質にもはや応答しなくなっているということである。
【０００４】
黄色ブドウ球菌は、多くの場合、「ｓｔａｐｈ」、「Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ」、または「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」とも称される主要なヒト病原体であり、表層病巣から中毒症にわたるいくつかの種類の感染や、致命的な全身状態、例えば、心内膜炎、骨髄炎、肺炎、髄膜炎、及び敗血症を引き起こし得る、多数の毒性因子を生成する（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｏ，「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５０５〜５１８（２０１１）（非特許文献1）にて検討された）。ほとんどの個人は、出生直後に黄色ブドウ球菌に遭遇し（Ｈｏｌｔｆｒｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ−Ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３００：１７６〜１９２（２０１０）（非特許文献2））、感染後には、黄色ブドウ球菌に対する抗体、及び抗黄色ブドウ球菌抗体価が増大する能力の両方を有すが、これらの抗体は、多くの場合、再発性の黄色ブドウ球菌感染を防ぐものではない（Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ，「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９４８〜９５８（２００５）（非特許文献3））。米国単独で、２０，０００件を超える年間死亡者数がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）によるものであり、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳによる死亡を超えている（Ｆｏｓｔｅｒ，ＴＪ．，「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３：９４８〜９５８（２００５）（非特許文献3）；Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４７：９２７〜９３０（２００８）（非特許文献4））。病原体は、ヒト宿主内で、あるいはヒト宿主上で生存するのをおそらく容易にする、種々の分子を産生する。
【０００５】
二成分性ポア形成ロイコトキシンは、黄色ブドウ球菌により生成された分泌毒性因子に含まれる。これらの毒素は、オリゴマーを形成する水溶性モノマーとして分泌可能であり、次いでポアを形質膜に挿入し、その後に、細胞浸透圧の平衡及び膜電位を破壊して、標的細胞（とりわけ、多形核白血球（ＰＭＮ）及び単核性食細胞）を死に至らせる（Ｂｉｓｃｈｏｇｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １２（３）：２６６〜２７５（２０１２）（非特許文献5）、これらは、その全体が参照によって援用される）。ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）の場合、宿主食細胞の標的化、結合、及び死滅は、食細胞の表面上に位置する細胞標的ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２を介して発生する（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３〜４３５（２０１２）（非特許文献6）；Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．「ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ」Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）５１〜５５（２０１２）（非特許文献7）；及びＲｅｙｅｓ−Ｒｏｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４：４５３〜４５９（２０１３）（非特許文献8））。実際、ＬｕｋＥＤの細胞標的であるＣＣＲ５が宿主免疫細胞に存在しない場合、宿主動物は、さもなければ致命的である黄色ブドウ球菌感染に耐性がある（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．「ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ」Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１〜５５（２０１２）（非特許文献7））。ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）も、宿主食細胞を死滅させることができ、微生物が宿主細胞に貪食された後、細胞の外側及び内側の双方からその細胞溶解活性を発揮することができる（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｋｉｌｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ１１ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１」ＰＮＡＳ  １１０（２６）：１０７９４〜１０７９９（２０１３）（非特許文献9））。これらのロイコトキシンが病因となることにより、ロイコトキシンは、決定的な黄色ブドウ球菌毒性因子であると考えられてきた（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ａｎ��  Ｔｏｒｒｅｓ，「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｍｉｄｓｔ  ａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｏｎｓｌａｕｇｈｔ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ」ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈ  ９（２）：ｅ１００３１４３  （２０１３）（非特許文献10））。
【０００６】
黄色ブドウ球菌の病原性遷移の別の決定因子は、その表面タンパク質の性質に依存する（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１：１８７〜２２４（２００６）（非特許文献11）,Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，「ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ」Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５〜６１７（１９９４）（非特許文献12）；及びＰａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：７５２〜７５８（１９９４）（非特許文献13））。
【０００７】
黄色ブドウ球菌は、宿主組織に接着しコロニーを形成するために、接着性マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭ）を認識する微生物表面成分を活用する。ＭＳＣＲＡＭＭは、コラーゲン、ヘパリン関連多糖、フィブリノーゲン、及び／またはフィブロネクチンを認識することができる。黄色ブドウ球菌は、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥなどを含むＭＳＣＲＡＭＭのサブセットを発現し、これはいずれも、セリン−アスパラギン酸ジペプチド繰り返し（ＳＤＲ）ドメインを含む（Ｂｅｃｈｅｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｎａＢＥ３  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｄｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ８（９）：ｅ７４７１８（２０１３）（非特許文献14））。また、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）もこのファミリーの３つのメンバー、ＳｄｒＦ，ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨ（ＭｃＣｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｒｅｐｅａｔ（Ｓｄｒ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１５３５〜１５４６（２０００）（非特許文献15）を発現する。これらのタンパク質は、いずれも、Ｎ末端のリガンド結合Ａドメイン、続いてＳＤＲドメイン、を含む類似の構造体を共有し、２５〜２７５のセリン−アスパラギン酸ジペプチド繰り返しを有し得る。これらのタンパク質のＣ末端部分は、ＬＰＸＴＧモチーフを含み、これにより、トランスペプチダーゼｓｏｒｔａｓｅＡによる細胞壁への付着が促進される。ＳＤＲ含有タンパク質中のセリン−アスパラギン酸ジペプチド領域は、２つのグリコシルトランスフェラーゼによりグリカンを連続的に付加することにより修飾される。まず、ＳｄｇＢは、セリン−アスパラギン酸ジペプチド領域内のセリン残基上でＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を付加し、次いで、糖タンパク質のＳｄｇＡ修飾が行われ、その結果、二糖類部分となる。このグリコシル化により、ＳＤＲ含有ブドウ球菌タンパク質をカテプシンＧ媒介性の分解から保護することができる（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９（１０）：ｅ１００３６５３（２０１３）（非特許文献16））。
【０００８】
更に、黄色ブドウ球菌表面上に位置するプロテインＡも、宿主ＩｇＧのＦｃドメイン並びにＩｇＧ及びＩｇＭのＶＨ３クランのＦａｂドメインを捕捉することにより、ブドウ球菌が防御免疫応答から逃れることに寄与する（Ｓｊｏｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｆｏｕｒ  Ｂｅｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｆｃ−Ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７３：３４３〜３５１（１９９７）（非特許文献17）；及びＣａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｌａｎ  Ｖ（Ｈ）  ＩＩＩ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ７１８３，  Ｊ６０６  ａｎｄ  Ｓ１０７  ａｎｄ  ＤＮＡ４  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：７６９〜７７６（１９９９）（非特許文献18））。
【０００９】
更には、黄色ブドウ球菌は、免疫グロブリン用の第２の結合タンパク質（Ｓｂｉ）と称される、第２免疫グロブリン結合タンパク質を発現し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  ＩｇＧ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：９８５〜９９１（１９９８）（非特許文献19）及びＡｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ： Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００〜１６１１（２００８）（非特許文献20））、Ｓｂｉは、分泌されているか、あるいは細胞エンベロープと会合しており（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｂｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７９：３８０１〜３８０９（２０１１）（非特許文献21）及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｂｉ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｃｃｕｒｓ  ｂｏｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ａｎｄ  Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：７８９〜８０４（２０１２）（非特許文献22））、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域への結合に関与するプロテインＡと、一対の保存的らせん体を共有する（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ：  Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００〜１６１１（２００８）（非特許文献20））。
【００１０】
更に、黄色ブドウ球菌は、免疫回避に関与しているいくつかのプロテアーゼを分泌する。Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓらは、スタフィロキナーゼ、プラスミンアクチベータータンパク質の黄色ブドウ球菌分泌により、表面−結合ＩｇＧ及び補体Ｃ３ｂをいずれも切断するプラスミンが活性化され、最終的に免疫媒介性の、黄色ブドウ球菌の破壊が減少することを示した（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉ−Ｏｐｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ」Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ７：４７６〜４８４（２００５）（非特許文献23））。黄色ブドウ球菌は、また、Ｅ２３３とＬ２３４（ＥＵ番号付け）との間の下部ヒンジ領域において、直接ヒトＩｇＧ１を切断することができるセリンプロテアーゼグルタミルエンドペプチダーゼＶ８（ＧｌｕＶ８）を分泌する（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｎｔｉｒｅ  ＧａｍｍａＧ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ」ＰＮＡＳ  ６３：７８〜８５（１９６９）（非特許文献24），Ｂｒｅｚｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＩｇＧ１  Ｈｉｎｇｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＩｇＧｓ，」Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：３１８３〜３１９２（２００８）（非特許文献25））。また、近年では、ヒトの抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧは、黄色ブドウ球菌表面に結合すると迅速に切断されることが明かになった（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｆａｌｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ＩｇＧ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４１５〜１４２２（２０１１）（非特許文献26））。
【００１１】
まとめると、これらの研究では、黄色ブドウ球菌は、直接ｍＡｂを切断すること、プロテインＡの結合によりｍＡｂが分離されること、または治療的有効性に必要なエフェクター細胞そのものを死滅させることのいずれかにより、標準的なＩｇＧ１系モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療に悪影響を与える可能性があるいくつかのメカニズムを利用することが示されている。このため、当然のことながら、現在、ヒトへの使用が最終的に承認されている黄色ブドウ球菌を標的にするいかなるｍＡｂ系治療も存在していない。したがって、（ｉ）プロテインＡとＳｂｉとの結合を回避し、（ｉｉ）ブドウ球菌が誘導するタンパク質分解を回避し、（ｉｉｉ）ロイコトキシンを中和可能にし、かつ（ｉｖ）黄色ブドウ球菌をオプソニン化し、食細胞に運搬することができるような、ブドウ球菌感染を治療可能な方法及び組成物が依然として必要である。本明細書では、こうしたニーズ及び他のニーズに適合する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｏ，「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５０５〜５１８（２０１１）
【非特許文献２】Ｈｏｌｔｆｒｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ−Ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３００：１７６〜１９２（２０１０）
【非特許文献３】Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ，「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９４８〜９５８（２００５）
【非特許文献４】Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４７：９２７〜９３０（２００８）
【非特許文献５】Ｂｉｓｃｈｏｇｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １２（３）：２６６〜２７５（２０１２）
【非特許文献６】Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３〜４３５（２０１２）
【非特許文献７】Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．「ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ」Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）５１〜５５（２０１２）
【非特許文献８】Ｒｅｙｅｓ−Ｒｏｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４：４５３〜４５９（２０１３）
【非特許文献９】Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｋｉｌｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ１１ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１」ＰＮＡＳ  １１０（２６）：１０７９４〜１０７９９（２０１３）
【非特許文献１０】Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｍｉｄｓｔ  ａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｏｎｓｌａｕｇｈｔ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ」ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈ  ９（２）：ｅ１００３１４３  （２０１３）
【非特許文献１１】Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１：１８７〜２２４（２００６）
【非特許文献１２】Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，「ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ」Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５〜６１７（１９９４）
【非特許文献１３】Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：７５２〜７５８（１９９４）
【非特許文献１４】Ｂｅｃｈｅｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｎａＢＥ３  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｄｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ８（９）：ｅ７４７１８（２０１３）
【非特許文献１５】ＭｃＣｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｒｅｐｅａｔ（Ｓｄｒ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１５３５〜１５４６（２０００）
【非特許文献１６】Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９（１０）：ｅ１００３６５３（２０１３）
【非特許文献１７】Ｓｊｏｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｆｏｕｒ  Ｂｅｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｆｃ−Ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７３：３４３〜３５１（１９９７）
【非特許文献１８】Ｃａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｌａｎ  Ｖ（Ｈ）  ＩＩＩ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ７１８３，  Ｊ６０６  ａｎｄ  Ｓ１０７  ａｎｄ  ＤＮＡ４  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：７６９〜７７６（１９９９）
【非特許文献１９】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  ＩｇＧ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：９８５〜９９１（１９９８）
【非特許文献２０】Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ： Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００〜１６１１（２００８）
【非特許文献２１】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｂｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７９：３８０１〜３８０９（２０１１）
【非特許文献２２】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｂｉ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｃｃｕｒｓ  ｂｏｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ａｎｄ  Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：７８９〜８０４（２０１２）
【非特許文献２３】Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉ−Ｏｐｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ」Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ７：４７６〜４８４（２００５）
【非特許文献２４】Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｎｔｉｒｅ  ＧａｍｍａＧ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ」ＰＮＡＳ  ６３：７８〜８５（１９６９）
【非特許文献２５】Ｂｒｅｚｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＩｇＧ１  Ｈｉｎｇｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＩｇＧｓ，」Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：３１８３〜３１９２（２００８）
【非特許文献２６】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｆａｌｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ＩｇＧ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４１５〜１４２２（２０１１）
【発明の概要】
【００１３】
概要
本開示は、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む多特異的結合分子を提供し、そのそれぞれは、異なる細菌由来毒性因子、特に、異なるブドウ球菌毒性因子に特異的に結合する。第１及び第２の結合ドメインは、任意で、リンカーペプチドを介して連結される。
【００１４】
第１の結合ドメインは、ブドウ球菌ＳＤＲ含有タンパク質などの、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合可能である。一態様では、ブドウ球菌ＳＤＲ含有タンパク質は、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨである。好ましくは、ブドウ球菌ＳＤＲ含有タンパク質は、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、またはＳｄｒＥである。
【００１５】
一態様では、第１の結合ドメインは、全長抗体または抗体断片である。好ましくは、全長抗体または抗体断片は、野生型ＩｇＧ１を切断するブドウ球菌プロテアーゼ（例えば、配列番号６０内の残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付け）の間またはそれらの残基上で野生型ＩｇＧ１を切断する、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなどのブドウ球菌プロテアーゼ）によるタンパク質分解に耐性がある。別の態様では、全長抗体または抗体断片は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、または抗体断片である。
【００１６】
一態様では、結合分子は、ヒトＦｃγＲＩへの特異的結合が不可能であり、プロテインＡへの特異的結合が不可能であり、かつ、Ｓｂｉへの特異的結合が不可能である。一態様では、結合分子は、ＦｃＲｎへの特異的結合が可能である。
【００１７】
一態様では、第１の結合ドメインは、配列番号６０、６２、６４、または６６の重鎖可変（ＶＨ）領域アミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。別の態様では、第１の結合ドメインは、配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。代替的には、第１の結合ドメインは、（ａ）配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、（ｂ）配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。一態様では、第１の結合ドメインは、（１）配列番号６０を有するアミノ酸配列のＶＨ領域及び配列番号６１を有するアミノ酸配列のＶＬ領域：（２）配列番号６２のアミノ酸配列を有するＶＨ領域及び配列番号６３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域：（３）配列番号６４のアミノ酸配列を有するＶＨ領域及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域：（４）配列番号６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域：（５）酸配列番号６８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域，及び配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；（６）配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域，及び配列番号７１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；（７）配列番号７２のアミノ酸配列を有するＶＨ領域，及び配列番号７３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；（８）配列番号７４のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；（９）配列番号７６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域及び配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域；または（１０）配列番号７８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。
【００１８】
更に別の態様では、結合分子は、（ａ）（ｉ）配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域；及び（ｉｉ）配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む第１の結合ドメイン；並びに、（ｂ）配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６の任意の一つのアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン、を含む。一態様では、第２の結合ドメインは、配列番号１４または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
第２の結合ドメインは、ブドウ球菌ロイコトキシンに結合可能である。一態様では、ブドウ球菌ロイコトキシンは、ロイコトキシンＡ（ＬｕｋＡ）、ロイコトキシンＢ（ＬｕｋＢ）、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）、ロイコトキシンＤ（ＬｕｋＤ）、ロイコトキシンＥ（ＬｕｋＥ）、ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）、パントン−バレンタインロイコシジンＳ（ＬｕｋＳ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジンＦ（ＬｕｋＦ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジン（ＬｕｋＳＦ／ＰＶＬ）、γヘモリシンＡ（ＨｌｇＡ）、γヘモリシンＣ（ＨｌｇＣ）、γヘモリシンＢ（ＨｌｇＢ）、γヘモリシンＡＢ（ＨｌｇＡＢ）、及びγ−ヘモリシンＢＣ（ＨｌｇＢＣ）からなる群から選択される。一態様では、ブドウ球菌ロイコトキシンは、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤまたはＬｕｋＥである。
【００２０】
一態様では、第２の結合ドメインは代替的足場である。一態様では、代替的足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む。一態様では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥに結合する。代替的には、ＦＮ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢを含むＬｕｋＡＢ複合体、及び／または、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤを含むＬｕｋＥＤ複合体に結合する。
【００２１】
一態様では、結合分子の第２の結合ドメインは、次のものと結合するために、アミノ酸配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインと競合する；（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、及び／または（ｉｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ。
【００２２】
一態様では、第２の結合ドメインは配列番号１４〜５９及び配列番号１１３〜６６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインである。一態様では、第２の結合ドメインは、配列番号１４または配列番号２２のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインである。
【００２３】
一態様では、結合分子は、１つ以上の追加の結合ドメインを更に含み、１つ以上の追加の結合ドメインは、以下が可能である；（ｉ）第１の結合ドメインによって結合されるものとは異なるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質と結合すること、及び／または（ｉｉ）第２の結合ドメインによって結合されるものとは異なるブドウ球菌ロイコトキシンと結合すること。
【００２４】
本開示はまた、上記の結合分子をコードする核酸配列、並びに核酸配列（複数可）を含むベクターを提供する。追加的には、本発明は、これらのベクターを含む宿主細胞を意図する。
【００２５】
さらに、本開示は上記の結合分子の製造方法を提供し、その方法は以下を含む；（ａ）本発明の結合分子をコードする核酸配列（複数可）を含むベクターを含む宿主細胞を培養することと、（ｂ）結合分子を培養物から回収すること。
【００２６】
更には、本開示は、本明細書に記載されるように、結合分子を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本明細書に提供される結合分子は、ブドウ球菌感染の治療、予防、または改善において使用され得る。一態様では、ブドウ球菌感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）などの黄色ブドウ球菌が原因である。したがって、本開示は、ブドウ球菌感染の治療、予防、改善のための方法を提供し、（ａ）本明細書に記載されるように、結合分子をその必要のある対象に投与することを含む。ブドウ球菌感染の治療、予防、改善のための方法は、本明細書に記載されるように、結合分子の反復投与、または、抗感染症薬、抗生物質、及び／または抗菌剤など１つ以上の他の薬剤と結合分子との併用投与を伴ってもよい。
【００２８】
また、本明細書に提供される結合分子は、対象におけるブドウ球菌感染を診断するための方法に使用され得る。一態様では、ブドウ球菌感染の診断方法は、本明細書に記載されるように、結合分子と対象由来のサンプルとを接触させることと、接触に基づいて、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出することと、を含む。本方法は、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの検出に基づいて、対象におけるブドウ球菌感染を診断することを更に含む。
【００２９】
サンプルにおけるブドウ球菌を検出するために、類似した方法を用いることができる。特に、サンプルにおけるブドウ球菌の検出方法は、本明細書に記載されるように、結合分子とサンプルとが接触することと、接触に基づいて、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出することと、を含み、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在により、サンプルにおけるブドウ球菌の存在が示される。
【００３０】
さらに、本発明の結合分子は、ブドウ球菌感染の予防に使用することができる。一態様では、ブドウ球菌感染を予防するための方法は、本明細書に記載された結合分子と対象からのサンプルとを接触させることと、接触の結果として、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンを検出することと、を含む。本方法は、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの検出に基づいて、対象にブドウ球菌感染の予防に好適な薬剤を投与することを更に含む。
【００３１】
また、本開示によって意図されるものは、本明細書に記載されるとおり、結合分子を含むキット、ならびに、提供される結合分子をコードする核酸分子、提供される結合分子をコードする核酸分子（複数可）を含むベクター、及び／またはこのようなベクターを含む宿主細胞を含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１のＡ及びＢは、抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインの特徴を示す。ｈＰＭＮと混合する前に、ＬｕｋＥＤ（７５ｎＭ）を、示される増加濃度でのＦＮ３ドメインと共に、３０分間混合した。細胞は１時間、毒素と接触させた。データは、少なくとも３名の独立した血液提供者から求め、エラーバーは、中央値±ＳＥＭを示す。図１Ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ測定（細胞代謝）から入手したデータを示す。図１Ｂは、ＬＤＨ測定（膜損傷）から入手した。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインの特徴を示す。ｈＰＭＮと混合する前に、ＬｕｋＡＢ（１８．８ｎＭ）を、示される増加濃度でのＦＮ３ドメインと共に、３０分間混合した。細胞は１時間、毒素と接触させた。データは、少なくとも３名の独立した血液提供者から求め、エラーバーは、中央値±ＳＥＭを示す。図２Ａは、臭化エチジウム透過性アッセイ（ＥｔＢｒ）（ポア形成／膜透過性）から得たデータを示す。図２Ｂは、ＬＤＨ測定（膜損傷）から得られたデータを示す。
【図３】抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインの特徴を示す。ｈＰＭＮと混合する前に、ＬｕｋＥＤ（７５ｎＭ）を、示される増加濃度でのＦＮ３ドメインと共に、３０分間混合した。細胞は１時間、毒素と接触させた。データは、ＬＤＨ測定（膜損傷）から得た。データは、少なくとも３名の独立した血液提供者から求め、エラーバーは、中央値±ＳＥＭを示す。
【図４Ａ】ロイコトキシン中和ドメインに結合した、ブドウ球菌抗原を標的にする抗体可変領域を含む、代表的多特異性結合タンパク質を示す。図４Ａは、単一特異性、二価の抗ブドウ球菌ｍＡｂ可変ドメイン、及び重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、単一特異性、二価の抗ブドウ球菌ｍＡｂ可変ドメイン、及び軽鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、単一特異性、二価の抗ブドウ球菌ｍＡｂ可変ドメイン、及び軽鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ中和ドメイン、及び重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、単一特異性、二価の抗ブドウ球菌ｍＡｂ可変ドメイン、及びタンデムにＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥを伴う、重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、二重特異性抗ブドウ球菌ｍＡｂ可変ドメイン、重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和ドメイン、重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和ドメイン、重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、単一特異性、二価の抗ブドウ球菌ｍＡｂ、及び重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和ドメイン、及び重鎖Ｃ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和ドメイン、を含む代表的多特異性結合タンパク質を示す。
【図５】ｍＡｂ５１３３が、黄色ブドウ球菌のＳｄｇＢ−グリコシル化ＳＤＲタンパク質を認識することを示す。異なる黄色ブドウ球菌株からの溶解産物のウェスタンブロッティングにより評価されたとおり、ｍＡｂ５１３３により、黄色ブドウ球菌のｓｄｇＢ突然変異株で高分子量バンドが検出されることはない。
【図６】ＧｌｕＶ８消化への耐性の増大が行われる下部ヒンジ領域ＩｇＧ１の突然変異を示す。重鎖のＣ末端上のＦＮ３ドメイン（それぞれ、構造体４及び構造体６）の有無にかかわらず、突然変異下部ヒンジ領域を有するＰＲＡＳＡ構造体は、野生型（ｗｔ）ヒトＩｇＧ１下部ヒンジ領域（ＩｇＧ１アイソタイプ対照及び構造体３）を含む構造体と比較して、黄色ブドウ球菌プロテアーゼＧｌｕＶ８によるタンパク質分解に耐性がある。
【図７Ａ】図７のＡ〜Ｄは、ＦＮ３ドメインの付加が、ヒトＦｃγＲに結合するＰＲＡＳＡ変異体に影響を及ぼすものではないことを示す。競合ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイを用いて、ＦｃγＲと結合する抗ブドウ球菌標的構造体の能力を評価した。図７Ａのグラフに示すとおり、ＰＲＡＳＡ構造体（構造体４〜７）は、ＦｃγＲＩとの検出可能な結合を示さない。
【図７Ｂ】いずれの構造体（ＩｇＧ１アイソタイプ対照及び構造体３〜７）も、図７Ｂに示すようにヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）に対し同様の結合を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃのグラフは、ＰＲＡＳＡ構造体（構造体４〜７）を示し、ＩｇＧ１及びＡ６構造体（それぞれ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照及び構造体３）と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合が減少している。
【図７Ｄ】図７Ｄのグラフに示すとおり、いずれの構造体（ＩｇＧ１アイソタイプ対照及び構造体３〜７）も、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）に対し同様の結合を示す。
【図８】プロテインＡの直接ＥＬＩＳＡアッセイを用いて判定するとおり、ＣＨ３突然変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆは、プロテインＡ結合を減少させる、及び／または失わせる。プレート型ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰＲＡＳＡ  Ａ６変異体（構造体４〜７）は、プロテインＡとの検出可能な結合を示さず、ヒトＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）は、プロテインＡに結合する。
【図９】ｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン結合コンジュゲートは、フローサイトメトリー系結合アッセイにおいて、黄色ブドウ球菌（Ｎｅｗｍａｎ株）に結合することが可能である。
【図１０】図１０のＡ〜Ｂは、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートの特徴を示す。ＬＤＨ測定（膜損傷）は、少なくとも３名の独立した血液提供者から求め、エラーバーは、中央値±ＳＥＭを示す。図１０Ａのグラフは、細胞曝露前に３０分間、示された増加濃度でのｍＡｂまたはＦＮ３ドメイン−ｍＡｂコンジュゲートと混合したＬｕｋＥＤ（７５ｎＭ）に曝露後、ＬＤＨがｈＰＭＮから放出されたことがわかる。細胞は１時間、毒素と接触させた。図１０Ｂのグラフは、ｈＰＭＮと混合前に３０分間、示された増加濃度でのｍＡｂまたはｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートと混合したＬｕｋＡＢ（１８．８ｎＭ）に曝露後、ＬＤＨがｈＰＭＮから放出されことがわかる。細胞は１時間、毒素と接触させた。
【図１１】ブドウ球菌  ＬｕｋＡＢ媒介性細胞傷害後のファゴサイトーシスは、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートにより中和することができることを示す。初代ヒトＰＭＮに、以前に異なるｍＡｂ５１３３抗体によりオプソニン化したまたは抗体を使用せずにオプソニン化したブドウ球菌を、感染させた。オプソニン化細菌を使用して、臭化エチジウムの存在下、ＭＯＩ＝１０で、ｈＰＭＮに感染させた。膜損傷を誘導するブドウ球菌の能力は、２時間にわたり臭化エチジウムの浸透を測定することによって評価した。データは、少なくとも３名の独立した血液提供者から求め、エラーバーは、中央値±ＳＥＭを示す。
【図１２】抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインを担持するｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン融合タンパク質は、ロイコトキシンＬｕｋＡＢを中和し、かつ、ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）が媒介する黄色ブドウ球菌の増殖制限を促進する。これらの実験では、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）を発現するプラスミドを有する黄色ブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎの変異体を用いた。新たに増殖させたＧＦＰ標識細菌を１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬに標準化し、１ｍＬアリコートを遠心分離でペレット化し、３００μｌの、異なるｍＡｂ、またはｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質１．５ｍｇ／ｍＬ、またはＰＢＳ（非オプソニン化）に再懸濁した。サンプルをＲＰＭＩ−ＨＨで最大１ｍＬとし、その後、オプソニン化のために２０分間、３７℃でインキュベートした。その後、約１０対１（細菌対ｈＰＭＮ）の感染効率（ＭＯＩ）で、オプソニン化細菌を、新たに分離した初代ｈＰＭＮ２ｘ１０５と混合した。細菌及び細胞は、７分間、１５００ＲＰＭで遠心分離により同調させ、３７℃、５％ＣＯ２インキユベーターに入れた。細菌増殖の指標として、感染５時間後、ＧＦＰ蛍光を測定した。図１２で示すように、これらの実験により、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールと比較して、Ａ６構造体３及びＰＲＡＳＡ  Ａ６構造体４の両者とも、ｈＰＭＮ媒介性の黄色ブドウ球菌増殖制限を促進することを示す。これは、５１３３ｍＡｂのオプソニン能力と一致する。重要なことに、ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメイン−ｍＡｂ５１３３コンジュゲート（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ構造体６及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ構造体７）により、ＰＲＡＳＡ  Ａ６親ｍＡｂ（構造体４）と比較して、ＰＭＮ媒介性の増殖制限が改善された。ＣＲ５１３３／抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメイン−ｍＡｂ（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ構造体５）により増殖制限が強化されない点は、エクスビボ感染モデル中、ＬｕｋＥＤ生成物が最小であるこれまでの所見と一致する。
【図１３】セリン−アスパラギン酸（ＳＤＲ）要素を担持する組換え体タンパク質（ＳｄｒＣ４）のＳｄｇＢ媒介グリコシル化によって、ｍＡｂ５１３３によって認識される特定のエピトープが作製されることを示す。黄色ブドウ球菌株ＪＥ２から調製した細胞溶解産物と共に樹脂結合ＳｄｒＣ４タンパク質をインキュベートしたもの（図１３、パネルＢ、レーン２及び６）、及び、さもなければ同質遺伝子型のｓｄｇＡ突然変異誘導体と共に樹脂結合ＳｄｒＣ４タンパク質をインキュベートしたもの（図１３、パネルＢ、レーン３及び７）は、ｍＡｂ５１３３を用いるウェスタンブロットによって特定の約９５ｋＤａ種が検出される。対照的に、ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼを発現していない、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２のｓｄｇＢ突然変異誘導体から調製された溶解産物（図１３、パネルＢ、レーン４及び８）、または、対照ＰＢＳサンプル（図１３、パネルＢ、レーン１及び５）中で、樹脂結合ＳｄｒＣ４タンパク質をインキュベートした後は、ｍＡｂ５１３３によるこうしたタンパク質バンドは検出されなかった。図１３、パネルＡには、図１３Ｂのブロットに相当するゲルのコロイドブルー染色を示し、本質的に等価量の組換え型ＳｄｒＣ４タンパク質を、レーン１〜４及びレーン５〜８に入れたことを示す。
【図１４Ａ】図１４のＡ〜Ｃは、一連のウェスタンブロットは、セリン−アスパラギン酸繰り返し（ＳＤＲ）要素を担持する組換え型タンパク質の、精製組み換え型ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼタンパク質でのインビトログリコシル化により、ｍＡｂ５１３３により認識されたエピトープが発生することを示す。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）６アフィニティタグを担持する組換え型ＳＤＲタンパク質（ＳｄｒＣ４及びＳｄｒＣ５）を、バッファ単独、バッファプラスウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）、またはバッファプラスＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃプラス黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え型とインキュベートした。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、得られたウェスタンブロットは、次のいずれかによりプローブする；（ｉ）一次抗体としてのｍＡｂ５１３３、及び検出用ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を用いる検出（図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃの、パネルＡ）、または（ｉｉ）ポリヒスチジン、（Ｈｉｓ）６アフィニティタグ特異的ＨＰＲ−コンジュゲートｍＡｂ（図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃの、パネルＢ）。
【図１４Ｂ】図１４の続きである。
【図１４Ｃ】図１４の続きである。
【図１５】ｍＡｂ５１３３は、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質（図１５、パネルＡ）には結合するが、精製黄色ブドウ球菌ＬＴＡ（図１５、パネルＢ）には結合しないことを示す。これに反して、よく特徴付けられた抗ＬＴＡ  ｍＡｂであるｐａｇｉｂａｘｉｍａｂは、精製黄色ブドウ球菌ＬＴＡ（パネルＢ）には結合するが、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質（パネルＡ）には結合しない。ＥＬＩＳＡ形式アッセイでは、プレートに固定した、組換え型ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質または精製黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、及び一次抗体ｍＡｂ５１３３、ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ、または一方の抗原の結合に関する陰性対照として呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）に特異的なｍＡｂを用いた。
【図１６】ｍＡｂ５１３３、並びにヒンジ領域内におけるＧｌｕＶ８媒介プロテアーゼ切断を消失させる突然変異（ＰＲＡＳＡ）及び／またはプロテインＡ結合突然変異（Ａ６）を担持する変異体は、ヒト（図１６、パネルＡ）及びマウス（図１６、パネルＢ）のＦｃＲｎ受容体の、両者への結合を保持することを示す。ＥＬＩＳＡ形式競合アッセイでは、銅コーティングプレート上で結合されたヒトまたはマウスＦｃＲｎ受容体のポリヒスチジン標識組換え型及び競合ｍＡｂとして、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）糖タンパク質を標的としているヒトＩｇＧ１抗体（ＣＮＴＯ  ３９２９）を使用した。
【図１７】ヒンジ領域内におけるＧｌｕＶ８媒介プロテアーゼ切断を消失させる突然変異（ＰＲＡＳＡ）及び／またはプロテインＡ結合突然変異（Ａ６）を担持しているｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン融合タンパク質、は、ヒトＦｃＲｎ受容体の両者への結合を保持することがわかる。ＥＬＩＳＡ形式競合アッセイでは、銅コーティングプレート上で結合されたヒトＦｃＲｎ受容体のポリヒスチジン標識組換え型及び競合ｍＡｂとして、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）糖タンパク質を標的としているヒトＩｇＧ１抗体（ＣＮＴＯ  ３９２９）を使用した。
【図１８Ａ】図１８のＡ〜１８Ｂは、プロテインＡ結合を消失させる突然変異（Ａ６）を担持するｍＡｂ１５３３の変異体が、黄色ブドウ球菌ＩｇＧ結合タンパク質、プロテインＡまたはＳｂｉに関与することはできないことを示す。細胞溶解産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離され、ＰＶＤＦ膜に移した、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２（プロテインＡ及びＳｂｉの両者を発現する野生型）、及び誘導体ＮＥ２８６（プロテインＡが欠失している、ＪＥ２のｓｐａ突然変異体）、ＮＥ４５３（Ｓｂｉタンパク質の発現が失われている、ＪＥ２のｓｂｉ突然変異体）及びＷｏｏｄ４６（プロテインＡの発現が認められないことが既知の株）。得られたウェスタンブロットを以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかでプローブし、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を介して二次検出した；（ｉ）ｍＡｂ５１３３（図１８、パネルＡ）、（ｉｉ）プロテインＡ結合を消失させるＡ６突然変異を担持するｍＡｂ１５３３変異体（図１８Ａ、パネルＢ）、または（ｉｉｉ）Ａ６突然変異、及びＧｌｕＶ８媒介プロテアーゼ切断を消失させるヒンジ領域突然変異（ＰＲＡＳＡ）（図１８Ｂ、パネルＣ）の両者を担持するｍＡｂ１５３３変異体。
【図１８Ｂ】図１８の続きである。
【図１９】代表的ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１５１及びＬｕｋ１２９によるγ−ヘモリシンＨｌｇＡＢの異なる結合及び中和を示す。ＦＮ３ドメインの精製組換え型ＨｌｇＡへの結合は、ＥＬＩＳＡによって判定した。ロイコトキシン中和研究に関して、ＦＮ３ドメイン被験物質を、精製組換え型ＨｌｇＡＢとインキュベートし、その後、新たに単離した初代ヒト好中球を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。損傷膜を有する細胞からの、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、残留好中球の生存度を判定した。図１９に示すとおり、ＦＮ３ドメイン変異体Ｌｕｋ１５１は、ＨｌｇＡサブユニットとの結合を示すが、ＨｌｇＡＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ１２９はＨｌｇＡサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるようにＨｌｇＡＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【図２０】代表的ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ３５７及びＬｕｋ１８８によるγヘモリシンＨｌｇＣＢの異なる結合及び中和を示す。ＦＮ３ドメインの精製組換え型ＨｌｇＣへの結合は、ＥＬＩＳＡによって判定した。ロイコトキシン中和研究に関して、ＦＮ３ドメイン被験物質を、精製組換え型ＨｌｇＣＢとインキュベートし、その後、新たに単離した初代ヒト好中球を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。損傷膜を有する細胞からの、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、残留好中球の生存度を判定した。図２０に示すとおり、ＦＮ３ドメイン変異体Ｌｕｋ３５７は、ＨｌｇＣサブユニットとの結合を示すが、ＨｌｇＣＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ１８８はＨｌｇＣサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるようにＨｌｇＣＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【図２１】代表的ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ５４０及びＬｕｋ６４７によるパントン−バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）の異なる結合及び中和を示す。ＦＮ３ドメインの精製組換え型ＬｕｋＳ−ＰＶへの結合は、ＥＬＩＳＡによって判定した。ロイコシジン中和試験では、ＦＮ３ドメイン被験物質を精製組換え型ＰＶＬロイコシジンと共にインキュベートし、その後、新たに単離した初代ヒト好中球を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。損傷膜を有する細胞からの、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、残留好中球の生存度を判定した。図２１に示すとおり、ＦＮ３ドメイン変異体Ｌｕｋ５４０は、ＰＶＬロイコトキシンのＬｕｋＳ−ＰＶサブユニットとの結合を示すが、ＰＶＬの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ６４７はＰＶＬロイコトキシンのＬｕｋＳ−ＰＶサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるようにＰＶＬロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本発明は、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質と結合可能な第１の結合ドメイン及びブドウ球菌ロイコトキシンと結合可能な第２の結合ドメインを含む結合分子を提供する。したがって、結合分子は、少なくとも２個の異なるブドウ球菌毒性因子に特異的に結合可能である、少なくとも二重特異性である。結合分子はヒトの結合分子であることが好ましい。
【００３４】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、抗体（若しくはそれらの断片）、代替的足場、またはこれらを組み合わせたものを含む（例えば、結合分子は、抗体（若しくはそれらの断片）及び代替的足場を含み、そのそれぞれが異なる細菌由来毒性因子と結合する）。これらの結合分子の製造方法も提供される。
【００３５】
好ましくは、これらの多特異的結合分子は、ブドウ球菌に対して殺菌性を示し、従って、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ感染症などのブドウ球菌感染の予防、治療、検出、診断、及び／または改善に使用可能である。
【００３６】
本発明を詳細に開示する前に、次の定義を提供する。別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３７】
用語「結合分子」は、本開示の意味では、２つ以上の異なる抗原または標的に特異的に結合可能であるか、２つ以上の異なる抗原または標的と相互作用可能であるか、または２つ以上の異なる抗原または標的を認識可能であることを示す。この意味では、本発明の結合分子は、少なくとも「二重特異性」であり、本明細書で使用するとき、この用語は、１つの抗原または標的に結合可能である少なくとも第１の結合ドメインと、別の抗原または標的に結合可能である第２の結合ドメインと、を含む分子を意味する。特に、本発明の結合分子は、ブドウ球菌ロイコトキシン及びグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合可能である、ブドウ球菌ロイコトキシン及びグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質と相互作用可能である、及び／またはブドウ球菌ロイコトキシン及びグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質を認識可能である。本発明の結合分子は、これらに限定されないが３つの結合ドメインを有する三重特異性結合分子、４つの結合ドメインを有する四重特異性分子など、２つ以上の抗原と同時に結合可能な多特異性結合分子を更に含む。多特異性結合分子の各結合ドメインは、例えば、異なるブドウ球菌抗原またはタンパク質など、異なる抗原または細菌由来のタンパク質との結合が可能である。
【００３８】
本発明によると、代表的結合分子はポリペプチドである。このようなポリペプチドとしては、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたは化学的架橋剤）を挙げることもできる。
【００３９】
用語「結合ドメイン」は、本開示に関連して、結合分子のドメインを特徴付け、例えば、ブドウ球菌ロイコトキシン（例えば、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、及び／またはＬｕｋＥ）、及び／またはグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質（例えば、ＳｄｇＢ−グリコシル化ブドウ球菌ＳＤＲ含有タンパク質）など、標的分子上で所定の標的エピトープまたは所定の標的部位に特異的に結合する／相互作用することが可能である。
【００４０】
結合ドメインは、例えば、抗体、プロテインＡ、ＩｍｍＥ７（免疫タンパク質）、ＢＰＴＩ／ＡＰＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン）、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６（ＰＤＺ−ドメイン）、カリブドトキシン（サソリ毒素）、ＣＴＬＡ−４、Ｍｉｎ−２３（ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ））、リポカリン（アンチカリン）、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス繰り返しドメインまたはチオレドキシンなどの結合ドメインドナーから誘導することができる（Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．，「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２９５〜３０４（２００５）；Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１５：１４〜２７（２００６）；Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １３：１８８２〜１８９１（２００４）；Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，「Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．７：４６３〜４６９（１９９７）、これらはすべて、参照によってその全体が援用される。）本発明の結合ドメインは、標的分子上で所定の標的エピトープまたは所定の標的部位への結合／相互作用に必要である上述の結合ドメインの任意の少なくとも上記部分を含むことが想定される。
【００４１】
上述の結合ドメインドナーの結合ドメインは、対応する標的の結合を担うこれらのドナーのその部分によって特徴付けられ、すなわち、その部分が結合ドメインドナーから除去されるとき、該ドナーは、その結合能力を消失することが予測される。「消失する」とは、結合ドナーと比較したときに、結合能力が少なくとも５０％低減することを意味する。これらの結合部位をマッピングする方法は、当該技術分野において既知であり、従って、結合ドメインドナーの結合部位を配置／マッピングすること、及び、それによって、対応する結合ドメインドナーから該結合ドメインを「誘導する」ことは当業者の標準的な知識内である。
【００４２】
結合分子の第１の及び／または第２の結合ドメインは、免疫グロブリン、例えば抗体、その断片またはその誘導体を含んでもよい。結合分子の第１の結合ドメイン及び／または第２の結合ドメインは、代替的に、代替足場を含んでもよい。一実施形態では、結合分子は、１つ以上の免疫グロブリン結合ドメイン及び１つ以上の代替的足場結合ドメインを含んでもよい。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「代替的足場」とは、典型的には、挿入、欠失、または他の置換が可能な、高コンフォメーション耐性の可変ドメインに関連した高度に構築されたコアを含む、低減した寸法（例えば、約２００アミノ酸未満）の、単鎖のポリペプチドフレームワークを意味する。これらの足場は、従来のＩｇ主鎖をベースとするか、または完全に関連の無いタンパク質から誘導される。これらの可変ドメインを修飾して、任意の標的タンパク質に向かって新規結合面を作製することができる。例えば、こうした足場は、プロテインＡ、特にそれらのＺ−ドメイン（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ＩｍｍＥ７（免疫タンパク質）、ＢＰＴＩ／ＡＰＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン）、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６（ＰＤＺ−ドメイン）、カリブドトキシン（サソリ毒素）、ＣＴＬＡ−４、Ｍｉｎ−２３（ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、リポカリン（アンチカリン）、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス繰り返しドメインまたはチオレドキシンから誘導することができる（Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．，「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２９５〜３０４（２００５）；Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１５：１４〜２７（２００６）；Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １３：１８８２〜１８９１（２００４）； Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，「Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．７：４６３〜４６９（１９９７）、これらはすべて、参照によってその全体が援用される）。代替的足場の構造体は変化するが、好ましくは、治療用として開発されたヒト起源のものである。
【００４４】
非Ｉｇ系足場は、これらに限定されないが、リポカリン（「アンチカリン」中にて使用される）、アンキリン繰り返し（ＡＲ）タンパク質類（「設計ＡＲタンパク質」または「ＤＡＲＰｉｎ」中にて使用される）、フィブロネクチンドメイン誘導体（「アドネクチン」中にて使用される）、及びアビディティ多量体（「アビマー」としても知られている）が挙げられる。
【００４５】
リポカリン主鎖を含む、遺伝子操作を受けたタンパク質足場であるアンチカリンは、本発明の結合分子にて使用するための好適な非Ｉｇ系代替的足場である。例えばステロイド、ビリン、レチノイド、及び脂質などの小型疎水性分子を移送するタンパク質ファミリーであるリポカリンは、アンチカリンの親タンパク質構造体である。リポカリンは、限られた配列相同性を有するが、８つの逆平行ｂ−バレルをベースとした、共通の三次構造の構造様式を共有している。これらのタンパク質は、強固なβ−バレル構造体上に形成された４つの露出ループを含む。代表的なリポカリンは、約１６０アミノ酸〜約１８０アミノ酸のドメインサイズを有し、４つの露出ループ内に、１６のアクセス可能なアミノ酸のランダム化を含むように開発されてきた。
【００４６】
アンキリン繰り返し（ＡＲ）タンパク質を含むタンパク質は、本発明の結合分子にて使用するための、別の好適な非Ｉｇ系代替的足場である。ＡＲタンパク質は、ループによって分離された２つのαヘリックスからなる３３のアミノ酸タンパク質モチーフを含み、繰り返しは、タンパク質-タンパク質相互作用を仲介する。設計されたアンキリン繰り返しタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、ヒトＡＲタンパク質をベースにした合理的な設計ストラテジー（例えば、複数の配列アライメント及び統計分析）に由来する、遺伝子操作を受けたタンパク質足場を含む。ＤＡＲＰｉｎは、７つのランダム化位置を有する３３のアミノ酸ＡＲモチーフをベースにして構築された組み合わせＡＲライブラリーを使用して作製することができる。ＤＡＲＰｉｎライブラリーは、リボソームディスプレイを使用して、優先的にスクリーニングされ、ライブラリーメンバーは、典型的には、大腸菌中で十分に産生され、凝集されることはなく、高い熱力学的安定性を示す。好ましくは、ＤＡＲＰｉｎは、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモチーフを有するモチーフを２つ〜４つ含んでおり、疎水性領域が遮蔽され、溶解度の増大が可能である。
【００４７】
フィブロネクチンＩＩＩ（ＦＮ３）ドメインから誘導されるタンパク質を使用して、好適な非Ｉｇ系代替的足場を作製することもできる。例えば、ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩドメイン（ＦＮ１０）は、７つのβストランド及び３つの結合ループを有するβサンドイッチに対応し、ジスルフィドブリッジを有さずにＩｇドメインと構造的相同性を示す。一態様では、ＦＮ１０の結合ループ（それぞれ、長さ約１５〜２１のアミノ酸）は、ランダム化することができ、ドメインは、ファージ及び酵母菌の双方にディスプレイされ、望ましい特性を有する足場用に選択される。アドネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ、現Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ）は、この方法でランダム化され、ディスプレイされた１０番目のＦＮ３ドメインを用いて作製された代表的な足場である。ＦＮ３ドメインを含む代替的な代表的足場は、セントリン（商標）である。セントリン（商標）は、ヒトテネイシンＣ（ＴＮＣ）のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列を含む。セントリン（商標）足場は、抗体可変ドメイン（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）に対して構造的相同性を有するループ（すなわち、ＤＥ、ＢＣ、及びＦＧ）を有し、システイン、ジスルフィド、またはグリコシル化残留物非含有の、小さく（約１０ｋＤａ）、単一であり、かつ高安定性である１つのドメインタンパク質である。これらの分子は、最良の生物物理学的性質（例えば、発現が１００ｍｇ／ｍＬ超、溶解度が１７０ｍｇ／ｍＬ超、溶融温度が８２℃超、予測される低免疫原性、及び１カ月を超える期間の血清中での安定性）を有し、安定性の向上のために遺伝子操作され得る。このため、センチリン（商標）は、本発明の結合分子中で使用するために、ＦＮドメインから誘導される好適な代替的足場である。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に記載されるように、結合分子は、センチリン（商標）または配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインを含む。本明細書に記載の結合分子の代表的なＦＮ３ドメイン配列としては、Ｌｕｋ１７及びＬｕｋ１２（それぞれ、配列番号１４及び配列番号２２）が挙げられる。
【００４９】
タンパク質主鎖としてアビマー構造体を利用して、好適な非Ｉｇ系代替的足場を作製することもできる。アビマー足場は、低密度リポタンパク質（ＬＲＬ）細胞表面レセプター由来のＡドメインのオリゴマー化をベースにしている。好ましくは、アビマー足場は、全域に保存されるＡドメインの残基を含み、長さ約３５アミノ酸であり、３つのジスルフィドブリッジを有する４つのループを含む。
【００５０】
加えて、本発明は、また、例えば、ナノボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）、ＤＡＲＴ（ｄｕａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＴａｎｄＡｂ（Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｔＡＮＤｅｍ  ＡｎｔｉＢｏｄｉｅｓ）から選択される、Ｉｇ様足場を含む結合分子を意図する（例えば、Ｗｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−Ｃｏｎｃｅｐｔ，」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（１１）：５７５〜５８２（２０１２）を参照されたい、これらはその全体が、参照によって援用される）。
【００５１】
結合分子は、代替的足場に結合された抗体、それらの断片、または誘導体を含む融合タンパク質でもあってもよい。一実施形態では、結合分子は、抗体、フィブロネクチンドメイン、または抗体フィブロネクチンドメイン融合タンパク質を含む。例えば、一態様では、本発明の結合分子は、例えば、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳＤＲ含有タンパク質などグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合可能な全長抗体または抗体断片を含み、更に、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥなどのブドウ球菌ロイコトキシンに結合可能である代替的足場を含む。ブドウ球菌の臨床的分離株は、異なる株種間で異なる配列を有し得ると理解されている。このため、一態様では、代替的足場は、配列番号１０との８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、配列番号１１との８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、配列番号１２との８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、または配列番号１３との８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｕｋＥに結合可能なＦＮ３ドメインを含む。一態様では、結合分子の代替的足場は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥに結合可能なＦＮ３ドメインを含む。別の態様では、結合分子の代替的足場は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢを含むＬｕｋＡＢ複合体を結合可能なＦＮ３ドメインを含む。別の態様では、結合分子の代替的足場は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥを含むＬｕｋＥＤ複合体を結合可能なＦＮ３ドメインを含む。
【００５２】
結合分子は、ファージディスプレイまたはライブラリースクリーニング法により作製される（または入手可能である）と予測される。別の方法としては、結合分子は、既存の（モノクローナル）抗体から足場、例えば、本明細書にて開示したような足場へのグラフト化ＣＤＲ配列により作製される。
【００５３】
用語「に結合可能である」、「結合する」、「特異的に認識する」、「に配向する」及び「と反応する」は、本発明により、結合ドメインは、エピトープの１つ以上のアミノ酸と特異的に相互作用可能であることを意味する。
【００５４】
用語「特異的に結合できない」は、本発明の結合ドメインが、試験条件下で例えば、非標的タンパク質などの別のタンパク質または抗原に結合しないことを意味する。例えば、本開示では、プロテインＡの結合は、実施例に明記された条件下で、プレート系直接ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定したが、ＣＨ３突然変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（例えば、構造体３〜７）を含む分子の結合に関して、プロテインＡへの相当量の結合が検出されることはなかった。しかし、１００〜１０００倍超のタンパク質を用いて同一の実験を実施した場合は、いくらかのプロテインＡの結合（非特異的）が検出されることもある。この一般的な原理は、本明細書に記載された条件下でのヒトＦｃγＲＩ結合（またはそれらを欠く場合）及びＳｂｉ結合（またはそれらを欠く場合）にも適用される。
【００５５】
「タンパク質」（それらの断片、好ましくは生物学的活性断片、及びペプチドなど、通常、３０未満のアミノ酸を有する）は、ペプチド共有結合を介して互いに連結される１つ以上のアミノ酸を含む（アミノ酸鎖となる）。本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、共に結合される３０超のアミノ酸鎖である。ポリペプチドは、二量体、三量体及び高オリゴマー（すなわち、２つ以上のポリペプチド分子からなる）などの多量体を形成してもよい。こうした二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子形状は、同一であっても、または同一でなくてもよい。こうした多量体の対応する高次構造体は、その結果として、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は抗体分子であり、その自然発生形態において、２つの同一の軽ポリペプチド鎖及び２つの同一の重ポリペプチド鎖からなる。
【００５６】
また、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」とは、修飾が、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化反応などの翻訳後修飾により行われる天然修飾ポリペプチド／タンパク質を意味する。本明細書で称されるとき、「ポリペプチド」は、ＰＥＧ化など化学修飾されていてもよい。こうした修飾は当業者に周知である。
【００５７】
アラニン（Ａｌａ、またはＡ）；アルギニン（Ａｒｇ、またはＲ）;アスパラギン（Ａｓｎ、またはＮ）;アスパラギン酸（Ａｓｐ、またはＤ）;システイン（Ｃｙｓ、またはＣ）;グルタミン（Ｇｌｎ、またはＱ）;グルタミン酸（Ｇｌｕ、またはＥ）;グリシン（Ｇｌｙ、またはＧ）;ヒスチジン（Ｈｉｓ、またはＨ）;イソロイシン（Ｉｌｅ、またはＩ）：ロイシン（Ｌｅｕ、またはＬ）;リジン（Ｌｙｓ、またはＫ）;メチオニン（Ｍｅｔ、またはＭ）;フェニルアラニン（Ｐｈｅ、またはＦ）;プロリン（Ｐｒｏ、またはＰ）;セリン（Ｓｅｒ、またはＳ）;スレオニン（Ｔｈｒ、またはＴ）;トリプトファン（Ｔｒｐ、またはＷ）;チロシン（Ｔｙｒ、またはＹ）;及びバリン（Ｖａｌ、またはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸など、用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、典型的には、当該技術認識された定義を有するアミノ酸を意味する。概して、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒなど）を有するものとしてグループ化され得る。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「毒性因子」とは、細菌が、宿主内の微小環境で定着（細胞への接着を含む）、免疫回避（すなわち、宿主の免疫応答の回避)、免疫抑制（すなわち、宿主の免疫応答の阻害）を達成できるようにし、細胞への進入及び細胞からの脱出を可能にし（病原体が細胞内のものである場合）、及び／または宿主から栄養を得ることができるようにする、細菌によって発現される分子を意味する。毒性因子は、バクテリオファージなどの可動遺伝因子上でコードされてもよく、また遺伝子水平伝播を介して容易に拡散され得る。黄色ブドウ球菌毒性因子の非限定的例としては、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、コアグラーゼ、リパーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンテロトキシン、及び他の毒素（例えば、ＬｕｋＡＢ，ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥなどの細胞膜に作用する毒素）が挙げられる。本発明の目的のため、ＳＤＲ含有タンパク質などのブドウ球菌表面タンパク質（例えば、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨ）もまた、毒性因子と考えられる。
【００５９】
用語「抗体」の定義としては、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体などの実施形態が挙げられる。全長抗体に加えて、この定義には、抗体誘導体類及び抗体断片、とりわけＦａｂ断片なども含まれる。抗体断片または誘導体は更に、ドメイン抗体またはナノボディなどのＦ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、または単一ドメイン抗体、単に１つの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体、または免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、これらはＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬであってもよく、他のＶ領域またはドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）；  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  ２０１０；及びＬｉｔｔｌｅ，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９を参照されたい（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）。また、該用語は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）またはＤｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）を更に含む。更に、（二重特異性）単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」（（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２などの構造体によって例示される）、「Ｆｃ  ＤＡＲＴ」及び「ＩｇＧ  ＤＡＲＴ」、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）などのマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）であるが予測される。
【００６０】
免疫グロブリンの単一可変ドメインは、単離抗体の単一可変ドメインポリペプチドのみでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の１つ以上のモノマーを包含する、より大きいポリペプチドを含む。
【００６１】
さまざまな手技が当技術分野において既知であり、こうした抗体及び／または断片の製造に使用され得る。したがって、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣体により生成することができる。更に、単鎖抗体のために記載された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ）、ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄｅｄ．２０１０，ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００９を参照されたい（そのそれぞれ全体が、参照によって本明細書に援用される））を適合させて、選択されたポリペプチド（複数可）に特異的な単鎖抗体を作製することができる。また、トランスジェニック動物を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させることができる。モノクローナル抗体の調製のため、連続細胞株培養により作製された抗体を提供することができる、任意の技術を使用できる。こうした技術の例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）、その全体が参照によって援用される）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２〜７９（１９８３）（これらはその全体が、参照によって援用される））、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６（１９８５）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍで使用するため、表面プラズモン共鳴を使用して、ＣＤ３エプシロンなどの標的ポリペプチドのエピトープに結合しているファージ抗体の効率を増大させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｇｕｉｄｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ」Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７：９７〜１０５（１９９６）；Ｍａｌｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  「ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：７〜１３（１９９５）、（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）。本発明の文脈において、用語「抗体」は、抗体構造体を含むことが予測され、とりわけウイルスまたはプラスミドベクターを介してトランスフェクトされ得る、及び／また���形質導入され得る抗体構造体などの宿主中で発現し得る。
【００６２】
更に、本明細書内で用いられるとき、用語「抗体」は、記載された抗体と同一特異性を示す、本明細書に記載の抗体の誘導体または変異体に関する。「抗体変異体」の例としては、非ヒト抗体のヒト化変異体、「アフィニティ成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ．  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２５４：８８９〜８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２〜１０８３７（１９９１）を参照されたい（そのそれぞれが、全体に参照によって援用される））及び修飾されたエフェクター官能基（複数可）を有する抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ）、ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ２ｎｄ  ｅｄ．２０１０，ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００９を参照されたい）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される））が挙げられる。
【００６３】
１つの代表的抗体作製方法としては、例えば、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーなどのスクリーニングタンパク質の発現ライブラリーが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ.）Ｓｍｉｔｈ，「Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｈａｇｅ：Ｎｏｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｉｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ，「Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７（１９８５）；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）に記載され、これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される。
【００６４】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定の抗原を使用して、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、マウス、ハムスターまたはラット）の免疫化を行うことができる。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大型断片を有するが、マウス抗体の産生が行われないマウス株を、遺伝子操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  Ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ」    Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１（２００４）、米国特許第２００３−００７０１８５号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，）ＷＯ９６／３４０９６（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，）及びＷＯ９６／３３７３５（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，）を参照されたい（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される））。
【００６５】
抗体またはこれらの断片も、ヒトＴ細胞エピトープの特定の欠失により、またはＷＯ９８／５２９７６（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ）及びＷＯ００／３４３１７（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ）（参照としてそれらの全体が本明細書に援用される）に開示されている方法による「脱免疫化」により修飾されてもよい。要約すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができ、これらのペプチドは、潜在的Ｔ細胞エピトープを示す。（ＷＯ９８／５２９７６（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）及びＷＯ００／３４３１７（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，）に定義されるとおり（そのいずれも、その全体が参照として本明細書に援用される））。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出には、「ペプチドスレッディング」と称されるコンピュータによるモデル化法を適用することができ、加えて、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフについては、（ＷＯ９８／５２９７６（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）及びＷＯ００／３４３１７（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記述されているとおり（そのいずれも、その全体が参照として本明細書に援用される））、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８種類の初代ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、このため、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少ない数のアミノ酸残基の置換、または好ましくは単一のアミノ酸置換基により消失させることができる。典型的には、保存的置換が行われる。多くの場合、排他的ではないが、ヒト生殖系列抗体配列中の任意の位置に共通のアミノ酸を使用してもよい。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ，」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６〜７９８（１９９２）；Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １６（５）：２３７〜２４２（１９９５）；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｖ  Ｋａｐｐａ  Ｄｏｍａｉｎ」  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８〜４６３８（１９９５）、（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｌ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより編集）。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲのヒト配列源として使用することが可能である。例えば、米国特許第６，３００，０６４号（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，）に記載されているように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用することができる���これらはその全体が、参照によって援用される）。ＶＨ及びＶＬを共にペアリングすることにより、単一の抗原結合部位が形成される。ＶＨに最も近位である重鎖定常（ＣＨ）ドメインは、ＣＨ１として示される。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結され、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結する。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）と称される比較的保存された配列である４つの領域で構成され、高頻度可変配列の３つの領域の足場が形成される（相補的決定領域ＣＤＲ）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含む。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として称される。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３と称され、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３と称される。
【００６６】
用語「可変」とは、それらの配列において可変性を示し、かつ特定の抗体（すなわち、「可変ドメイン（複数可）または「Ｖ領域」）の特異性及び結合アフィニティの決定に関与する、免疫グロブリンドメインの部分を称する。可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分配されるものではなく、それぞれの重鎖及び軽鎖可変領域のサブドメイン内に集中している。
【００６７】
これらのサブドメインは、「高頻度可変」領域または「相補的決定領域（ＣＤＲ）と称される。可変ドメインの、より保存される（すなわち、非高頻度可変）部分は、「フレームワーク領域（ＦＲＭ）」と称される。自然発生重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲＭ領域を含み、大きくβシート構造を取り、３つの高頻度可変領域により連結され、これは結合するループを形成し、場合によっては、βシート構造体の一部を形成する。各鎖における高頻度可変領域は、ＦＲＭによって近位に接近して一緒に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域とともに、抗原結合部位の形成に寄与している。（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，「Ａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０（１９７０）を参照されたい（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。定常ドメインは、抗原結合には直接関与していないが、例えば、抗体依存性細胞傷害及び相補的活性化など、さまざまなエフェクター機能を示す。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「高頻度可変領域」（「相補的決定領域」またはＣＤＲとしても公知である）は、（通常は、極端な配列可変性がある３つまたは４つの短い領域であり）抗原結合部位を形成する免疫グロブリンのＶ領域ドメイン内であり、かつ、抗原特異性の主要決定因子である抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲ残基の同定には少なくとも２つの方法がある：（１）異種間の配列可変性に基づく手法（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ． ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２（１９９１）（これらはその全体が、参照によって援用される）;及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）（これらはその全体が、参照によって援用される）。しかし、同一の領域ではないが、２つの残基を同定する技術が重なり合った領域を確定する程度にまで組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを確定することができる。しかし、概して、ＣＤＲ残基は、Ｋａｂａｔ（番号付け）システムに従って同定されることが好ましい。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」及び「抗体結合領域」は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を称する。本明細書内の上記に記載されるように、特異的に認識され、抗体により結合される抗原の一部は、「エピトープ」と称される。上述のように、抗原結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得るが、その両方を含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、無傷の抗原結合ドメインのうちいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例としては、次のものがあげられる；（１）ＶＬ、ＶＨ、軽鎖定常（ＣＬ）及びＣＨ１ドメインを有する一価の断片であるＦａｂ断片；（２）ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより連結されている２つのＦａｂ断片を有する二価の断片である、Ｆ（ａｂ′）２断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の一群のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  」Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６（１９８９）（これらはその全体が、参照によって援用される）、（６）分離された相補的決定領域（ＣＤＲ）；及び（７）例えばｓｃＦＶライブラリーから誘導される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）。Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、単離された遺伝子によってコードされ、組換え方法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対になり一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作成し得る合成リンカーによりそれらを結合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照されたい）（これにより、その全体が、参照によって援用される））。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、この断片の機能を無傷抗体と同じ方法で評価する。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質の抗体集団から入手した抗体を意味する（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、考えられる自然発生突然変異及び／または少量存在し得る翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である）。モノクローナル抗体は、非常に特異性が高く、単一の抗原部位に対して配向される。更に、典型的には、異なる抗原決定基（エピトープ）に対して指向される、異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上で単一抗原決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物により合成され、他の免疫グロブリンにより汚染されていないという点で有利である。
【００７１】
修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に同質な集団から得られる場合の抗体の特徴を示し、任意の特定の方法で抗体の産生に必要であるものとして解釈されるものではない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））によって記述されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される））。
【００７２】
また、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，」  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）に記載されている技術を用いて、「モノクローナル抗体」をファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００７３】
本発明のモノクローナル抗体は、特定の種から誘導される抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに族する抗体において、重鎖及び／または軽鎖の一部が、対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特異的に含み、所望の生物活性を示す限り、別の種から誘導される抗体または別の抗体クラスまたはサブクラスに族する別の抗体、並びにこうした抗体の断片において、鎖（複数可）の残部は、対応する配列と同一であるか、または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，）「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４）、これらはいずれも、参照によってその全体が援用される）。本明細書で目的とするキメラ抗体としては、非ヒト霊長類から誘導される可変ドメイン抗原結合配列（例えば、旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。
【００７４】
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得ることができ、次に、修飾し（例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ化など）、当該技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して産生することができる。キメラ抗体を作製するための種々の方法が記述されてきた。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１（１９８５）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｕｓｅ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２（１９８５）；米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＰ  ０１７１４９６（Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）；ＥＰ０１７３４９４（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，）  ＧＢ  ２１７７０９６（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）、を参照されたい。これらはいずれも、参照によってその全体が援用される。
【００７５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ほとんどの場合、ヒト配列のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）であり、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最少の配列を含有する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の高頻度可変領域（ＣＤＲも）由来の残基が、所望の特異性、アフィニティ、及び能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの、非ヒト種の高頻度可変領域由来の残基（供与体抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、本明細書で使用するとき、「ヒト化抗体」は、受容体抗体もしくは供与体抗体のいずれにも見出されることのない残基もまた含み得る。これらの修飾を行って更に抗体性能を洗練させ、最適化させる。また、ヒト化抗体は、任意で少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｏｕｓｅ」Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）、及びＲｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）（それぞれその全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【００７６】
また、例えば、ヒト化抗体は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを用いて作製されてもよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載のヒト化抗体を調整するために使用され得る例示的ＣＤＲグラフト法について記載する（米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）（これらはその全体が、参照によって援用される）。特定のヒト抗体のＣＤＲはすべて、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換されてもよく、またはわずかないくつかのＣＤＲが、非ヒトＣＤＲにより置換されてもよい。ヒト化抗体の所定の抗原への結合に必要とされるＣＤＲの数を置き換えることだけが必要である。
【００７７】
ヒト化抗体またはこれらの断片は、例えば、抗原の結合に直接関与していないＦｖ可変ドメインの配列とヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価の配列との置換によって生成され得る。ヒト化抗体またはそれらの断片を産生する代表的方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  ＳＬ．，  「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７（１９８５）；米国特許第５，５８５，０８９号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第５，６９３，７６１号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第５，６９３，７６２号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）；及び米国特許第５，８５９，２０５号）；及び米国特許第６，４０７，２１３号（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）により提供される。これらの方法としては、少なくとも１つの重鎖または軽鎖由来の、全部または一部の免疫グロブリンＦｖ可変ドメインをコードする核酸配列を単離すること、操作すること、及び発現することが挙げられる。上記のように、並びに他の供給源から、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマからこのような核酸を得ることができる。その後、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。
【００７８】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、及び／または復帰突然変異の導入により最適化され得る。こうした変化免疫グロブリン分子は、当該技術分野において公知のいくつかの技術により作製することができ（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ−Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８０：７３０８〜７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２〜７９（１９８３）；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ−−Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ」Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９２：３〜１６（１９８２）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）、ＥＰ２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ）の教示により作製され得る（これらはその全体が、参照によって援用される）。
【００７９】
用語「ヒト抗体」としては、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２（１９９１）によって記述されているもの（これらはその全体が、参照によって援用される）など、当該技術分野において公知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体が挙げられる。本発明のヒト抗体としては、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を挙げることもできる（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換した、少なくとも１つの、２つの、３つの、４つの、５つの、またはそれを超える位置を有してもよい。
【００８０】
「二重特異性」または「二機能性」抗体または免疫グロブリンは、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ'断片の連結など、様々な方法によって作製することができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：  Ａ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ」 Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５〜３２１（１９９０）を参照されたい（これらはその全体が、参照によって援用される））。抗体またはそれらの抗原結合断片を得るために当業者に既知の多数の方法が利用可能である。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる（米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ）（その全体が参照によって本明細書に援用される））。既知の方法に従って、モノクローナル抗体もハイブリドーマの作製によって生成することができる（例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，」Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）を参照されたい（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。その後、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準方法を用いて、この方法で形成されたハイブリドーマのスクリーニングを行い、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定する。免疫原として、例えば、組換え型抗原、自然発生型、任意の変異体またはこれらの断片、並びにそれらの抗原ペプチドなど、特定の抗原の任意の形態を使用してもよい。
【００８１】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」とは、相補的決定領域（ＣＤＲ）を意味し、そのうちの３つは、軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）の結合特性を構成し、かつ３つは、重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）の結合特性を構成する。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、足場またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列により分離される。正確な定義的ＣＤＲ境界及び長さを、異なる分類及び番号付け方式に供する。このため、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、コンタクトまたは他の任意の境界定義法によって言及される場合もある。異なる境界にかかわらず、これらの系はそれぞれ、可変配列内にいわゆる「高頻度可変領域」を構成する若干の重なりを有する。このため、これらの系によるＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して、長さ及び境界区域が異なってもよい。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６２：７３２（１９９６）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）を参照されたい。
【００８２】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル（限られた）構造体に分類され得る、ループ構造体を形成する。用語「カノニカル構造体」とは、抗原結合（ＣＤＲ）ループにより採択される主鎖コンフォメーションを意味する。比較構造的研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つが、入手可能なコンフォメーションの制限されたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造体は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特性を決定することができる。このため、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分における高アミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常に類似している三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１  （１９８７）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｉｎ  Ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：８００  （１９９６）（これらはそれぞれ、その全体が、参照によって援用される）。更に、採択されたループ構造体とそれを取り囲むアミノ酸配列との間に任意の関係がある。特定のカノニカルクラスのコンフォメーションは、ループの長さと、ループ内並びに保存フレームワーク内（すなわちループの外側）の主要な位置に常在するアミノ酸残基と、によって決定される。このため、特定のカノニカルクラスへの割当ては、これらの主要アミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【００８３】
用語「カノニカル構造体」には、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）によりカタログに登録されているように、抗体の線状配列に関する考察も含み得る。Ｋａｂａｔ付番スキーム（系）は、一貫した方法において抗体可変ドメインのアミノ酸残基の番号付けに関して広く採択されている標準であり、かつ、本明細書の他の場所にて言及するように、本発明において好ましいスキームである。
【００８４】
抗体のカノニカル構造体抗体を決定するために、追加の構造的考察を使用することもできる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによっては完全に反映されない差異を、Ｃｈｏｔｈｉａらの番号付け方式により記述することができ、及び／または、例えば、結晶学及び二次元または三次元コンピューターモデリングなどの他の技術により明らかにすることができる。
【００８５】
したがって、所定の抗体配列をカノニカルクラスとしてもよく、特に（例えば、種々のカノニカル構造体をライブラリー内に含むものとする要求に基づいて）、適したシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）配列を同定することが可能になる。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）（これらはその全体が、参照によって援用される）により記述されているような抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及び構造的考察並びに抗体構造体のカノニカル態様の構成に関するこれらの示唆は、文献に記載されている。
【００８６】
ＣＤＲ３は、典型的には、抗体結合部位内で分子多様性の最も大きい供給源である。Ｈ３は、例えば、２つのアミノ酸残基ほどの短さであってもよく、または２６アミノ酸を超えてもよい。免疫グロブリンの異なる分類のサブユニット構造及び三次元構造は、当該技術分野において公知である。抗体構造体の総説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８（その全体が、参照によって援用される）を参照されたい。当業者であれば、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造などそれぞれのサブユニット構造体が抗原に結合する（すなわち、抗原結合断片）、または、例えばＦｃ受容体及び／または補体に結合する及び／またはそれを活性化するＣＨサブユニットの一部に結合する、例えばＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニットの一部などの活性断片を含むことを理解するであろう。ＣＤＲは、典型的には、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  （１９９１），  ｅｄｓ．  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（その全体が、参照によって援用される）に記載されているようなＫａｂａｔＣＤＲを指す。
【００８７】
抗原結合部位の特性を決定する別の標準は、Ｃｈｏｔｈｉａにより記述されているように高頻度可変性ループに言及するものである（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７（１９８７）；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｖ  Ｋａｐｐａ  Ｄｏｍａｉｎ，」ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：４６２８〜４６３８（１９９５）（そのすべての内容全体を参照によって援用される）。更に別の標準は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアに用いられるＡｂＭ定義である。概して、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｄｕｅｂｅｌ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。）ＫａｂａｔＣＤＲに関して記述した実施形態は、Ｃｈｏｔｈｉａの高頻度可変性ループまたはＡｂＭ定義ループに対して記載された類似の関係を用いて代替的に実施することができる。組立後及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は、大きく変化し、変動遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．  Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。
【００８８】
用語「レパートリー」とは、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列から完全にまたは部分的に誘導される、少なくとも１つのヌクレオチド配列を意味する。配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、及び軽鎖のＶ及びＪセグメントを、インビボで再配置することにより生成し得る。あるいは、配列（複数可）は、例えばインビトロ刺激などの再配置が生じた場合に対応して、細胞から生成され得る。あるいは、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、及び他の方法により配列（複数可）の一部またはすべてを得てもよく、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。レパートリーとしては、１つの配列のみを挙げることができ、または遺伝学的に多様なコレクションにおける配列など、複数の配列を挙げることもできる。
【００８９】
用語「フレームワーク領域」とは、当分野で従来認識されている、更に多岐にわたる（すなわち、高頻度可変性）ＣＤＲ間に存在する抗体可変領域の部分を指す。このようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）と称され、三次元空間内に６つのＣＤＲ（３つは重鎖からであり、３つは軽鎖からである）を提示するための足場を提供し、抗原結合面を形成する。
【００９０】
本明細書で使用するとき、用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体及び原核細胞の酵素などのタンパク質内において高頻度で発生するドメインを指す（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ「Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９４（１９９２）；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ：  Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｄ  （ＣｅｎＤ），  ａ  Ｆａｍｉｌｙ  Ａ  ｂｅｔａ−１，４−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ」  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１９１０〜１９１８（１９９３）；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  Ａ１  Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＷＬ−１２  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｉｔｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６５：１５６５９〜１５６６５（１９９０）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。例えば、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）に記載されているとおり、代表的ＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、及び非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの第１０ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と称される。
【００９１】
本明細書で用いられる用語「置換する」若しくは「置換される」、または「変異する」若しくは「変異させられる」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列における１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、変更、欠失、挿入し、その配列の変異体を生成することを指す。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「ランダム化する」若しくは「ランダム化される」、または「多様化される」若しくは「多様化する」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列において少なくとも１つの、置換、挿入、または欠失を行うことを指す。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される。）に記述されている配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
【００９４】
用語「ライブラリー」は、変異体のコレクションを指す。ライブラリーは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド変異体で構成されてもよい。
【００９５】
用語「ベクター」は、生物学的系内で複製することができる、またはこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生物学的系におけるこれらのポリヌクレオチドの複製または維持のために機能する複製開始点、ポリアデニル化シグナルまたは選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物学的系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子またはこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【００９６】
発現ベクターは、生物学的系、または再構成された生物学的系において、そのベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。したがって、本明細書で使用するとき、「ベクター」は、原核生物、酵母菌、真菌、植物、昆虫類、または哺乳類細胞などの任意の細胞において、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビトロで、構成的または誘導性に発現させるための組換え型発現系を広く指す。用語としては、線状または環状の発現系が挙げられる。この用語としては、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現系が挙げられる。発現系は、すなわち、細胞内の一過性の発現のみを行うなど、自己複製能力を有しても有していなくてもよい。この用語としては、組換え型核酸の転写に必要とされる最小の要素のみを含む組換え型発現カセットが挙げられる。
【００９７】
本明細書は、概して、少なくとも２つの異なる細菌毒性因子に結合する多特異的結合分子、これらの結合分子の作製方法、及び細菌感染の検出または診断、予防、及び／または治療を行うためのこれらの結合分子の使用方法に関する。特に、結合分子は、例えば抗体または抗体断片及び代替的足場など、少なくとも２つの結合ドメインを含む。第１の結合ドメインは、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質、好ましくはＳｄｇＢグリコシル化ＳＤＲ含有タンパク質に結合可能である。第２の結合ドメインは、ブドウ球菌ロイコトキシン、好ましくはＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥに結合可能である。これらの多特異的結合分子は、結合するタンパク質抗原に対して中和活性を有し、すなわち、結合分子がその標的ブドウ球菌タンパク質に結合すると、これらのタンパク質の活性は実質的にまたは完全に取り除かれる。従って、多特異的結合分子も、ブドウ球菌自体に対して中和活性または殺菌活性を有し、メチシリン耐性及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌感染の治療、及び／または改善に使用可能である。
【００９８】
本明細書の結合分子は、とりわけ、ブドウ球菌由来の１つ以上のタンパク質及び／または（ポリ）ペプチド、あるいは、１つ以上の、組換えにより作製したブドウ球菌タンパク質及び／またはポリペプチド調製物などの、１つ以上のブドウ球菌（及び他のグラム陽性菌及び／またはグラム陰性菌）の断片への特異的結合もまた可能である。ブドウ球菌感染の治療方法及び／また予防方法については、結合分子は、ブドウ球菌のアクセス可能な表面タンパク質に特異的に結合できることが好ましい。ブドウ球菌の表面タンパク質としては、これらに限定されないが、クランピング因子（Ｃｌｆ）Ａ及びＣｌｆＢ、ＳＤＲタンパク質（例えば、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｒｄＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨ）、プロテインＡ、Ｓｂｉ、フィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎｂＡ）、及び血小板のセリンリッチ付着因子（ＳｒａＰ）が挙げられる。黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌では、すべてのＳＤＲ含有タンパク質のＳＤＲドメインは、少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ、ＳｄｇＡ及びＳｄｇＢにより高グリコシル化され、宿主プロテアーゼによるこれらのタンパク質の分解を防止し、これによって、細菌由来の宿主組織相互作用が保存される。これらの糖修飾も主要な抗体エピトープである。結合分子は、グリコシル化表面ブドウ球菌タンパク質、特に、ＳｄｇＢグリコシル化ＳＤＲタンパク質に結合することが好ましい（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９（１０）：ｅ１００３６５３（２０１３）、（これらはその全体が、参照によって援用される））。
【００９９】
本明細書に記載されるように、本明細書の結合分子は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または抗原結合断片などの無傷の免疫グロブリン分子を含むことができ、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、補体決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価の単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、及びブドウ球菌またはその断片に結合する特異的抗原を付与する十分な少なくとも１つの免疫グロブリン断片を含む（ポリ）ペプチドが挙げられる。ある実施形態では、本明細書の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体である。
【０１００】
一態様では、第１の結合ドメインは、全長抗体または抗体断片である。全長抗体または抗体断片は、野生型ＩｇＧ１を切断する、ブドウ球菌プロテアーゼ（配列番号６０内の残基２２２〜２３７の間または残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付け）で野生型ＩｇＧ１を切断するブドウ球菌プロテアーゼである、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなど）によるタンパク質分解に耐性があることが好ましい。別の態様では、全長抗体または抗体断片は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、または抗体断片である。
【０１０１】
一態様では、第１の結合ドメインは、配列番号６０、６２、６４、または６６のＶＨ領域アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。別の態様では、第１の結合ドメインは、配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。代替的には、第１の結合ドメインは、（ａ）配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、（ｂ）配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、（１）アミノ酸配列番号６０を有するＶＨ領域及びアミノ酸配列番号６１を有するＶＬ領域：（２）アミノ酸配列番号６２を有するＶＨ領域及びアミノ酸配列番号６３を有するＶＬ領域：（３）アミノ酸配列番号６４を有するＶＨ領域及びアミノ酸配列番号６５を有するＶＬ領域：（４）アミノ酸配列番号６６を有するＶＨ領域及びアミノ酸配列番号６７を有するＶＬ領域：（５）アミノ酸配列番号６８を有するＶＨ領域，及びアミノ酸配列番号６９を有するＶＬ領域；（６）アミノ酸配列番号７０を有するＶＨ領域，及びアミノ酸配列番号７１を有するＶＬ領域；（７）アミノ酸配列番号７２を有するＶＨ領域，及びアミノ酸配列番号７３を有するＶＬ領域；（８）アミノ酸配列番号７４を有するＶＨ領域、及びアミノ酸配列番号７５を有するＶＬ領域；（９）アミノ酸配列番号７６を有するＶＨ領域及びアミノ酸配列番号７７を有するＶＬ領域；または（１０）アミノ酸配列番号７８を有するＶＨ領域、及びアミノ酸配列番号７９を有するＶＬ領域を含む。
【０１０２】
本明細書に記載の結合分子は、例えば、二成分毒素など、他のブドウ球菌の分子に特異的に結合可能な第２の結合ドメインを含む。ＰＶＬ（ロイコシジンＳ／Ｆ−ＰＶまたはＬｕｋＳＦ−ＰＶとして公知である）、γ−ヘモリシン（ＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ）に加えて、黄色ブドウ球菌により産生された二成分ロイコトキシンのレパートリーは、ロイコシジンＥ／Ｄ（「ＬｕｋＥＤ」）、ロイコシジンＡ／Ｂ（「ＬｕｋＡＢ」）及びロイコシジンＭ／Ｆ（「ＬｕｋＭＦ」）を含むことが公知である。したがって、これらの二成分ロイコシジンのＳ−クラスサブユニットとしては、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＳ−ＰＶ、ＬｕｋＡ、及びＬｕｋＭが挙げられ、Ｆ−クラスサブユニットとしては、ＨｌｇＢ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ−ＰＶ、ＬｕｋＢ、及びＬｕｋＦ'−ＰＶが挙げられる。黄色ブドウ球菌のＳ−及びＦ−サブユニットは、ロイコシジン特異的ではない。すなわち、他の二成分組み合わせが白血球において機能的ポアとなり、ロイコトキシンのレパートリーを大きく増加させるように、これらには互換性がある（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ａｎｄ  Ｇａｍｍａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７７（１）：２６６−２７３（２００９））（本開示は、その全体が、参照によって援用される）。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の結合分子は、ロイコトキシンＡ（ＬｕｋＡ）、ロイコトキシンＢ（ＬｕｋＢ）、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）、ロイコトキシンＤ（ＬｕｋＤ）、ロイコトキシンＥ（ＬｕｋＥ）、ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）、パントン−バレンタインロイコシジンＳ（ＬｕｋＳ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジンＦ（ＬｕｋＦ−ＰＶ）、パントン−バレンタインロイコシジン（ＬｕｋＳＦ／ＰＶＬ）、γヘモリシンＡ（ＨｌｇＡ）、γＨｌｇＡ（ＨｌｇＣ）、γヘモリシンＢ（ＨｌｇＢ）、γヘモリシンＡＢ（ＨｌｇＡＢ）、及びγ−ヘモリシンＢＣ（ＨｌｇＢＣ）からなる群から選択される１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシンに結合される。一実施形態では、結合分子は、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥから選択される１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシンに結合する。別の実施形態では、本明細書の結合分子は、上記タンパク質の断片に特異的に結合することができ、その断片は、少なくとも、本明細書の結合分子によって認識される抗原決定基を含む。本明細書で使用するとき、「抗原決定基」は、検出可能な抗原結合分子複合体を形成するために十分に高いアフィニティを有する、本明細書の結合分子への結合可能な部分である。別の実施形態では、本明細書の結合分子は、中和エピトープを含有する上記ブドウ球菌ロイコトキシンタンパク質の断片に特異的に結合することができる。ロイコトキシンタンパク質の中和エピトープへの結合により、タンパク質の活性が無くなる、または実質的に無くなる。
【０１０４】
一態様では、ブドウ球菌ロイコトキシンに結合可能な第２の結合ドメインは代替的足場である。第２の結合ドメインは、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含み、例えば、単離組換え型及び／またはフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）繰り返しタンパク質のコンセンサス配列をベースにした合成タンパク質足場を含むことが好ましい。本発明のＦＮ３足場により、局所投与、経口投与、または血液脳関門を越えて投与する能力、哺乳細胞発現に対する供給源の機能として、タンパク質の増加した発現を可能にする大腸菌内での発現能力、複数の標的または同一の標的の複数のエピトープに結合する二重特異性分子へと遺伝子操作する能力、薬物、ポリマー、及びプローブに結合する能力、高濃度に配合する能力、こうした分子を効果的に病変組織に透過させる能力など、従来の治療法に優る利点がもたらされる。
【０１０５】
更に、ＦＮ３足場は、抗体の可変領域を模倣する折りたたみ（ｆｏｌｄ）に関して、抗体の多くの性質を有する。例えば、ＦＮ３ドメインの配向により、ＦＮ３ループを抗体補体決定領域（ＣＤＲ）と同様に露出させることができる。ループ領域は、細胞標的に結合することができ、かつ、アフィニティ成熟などによって修飾して、特定の結合または関連した性質を改善することができる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に記載の結合分子は１つ以上のＦＮ３ドメインを含む。一態様では、結合分子のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の非自然発生的ＦＮドメインから誘導される。Ｔｅｎｃｏｎは、他のＦＮ３ドメインと同様に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと称される７つのβストランドを有し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと称される６つのループによって連結されるβサンドウィッチ構造体を有する（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９２（１９９２）及び米国特許第Ｎｏ．  ６，６７３，９０１号（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、本明細書により参照によって援用される）。６つのループのうちの３つ（すなわち、ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ）は、ＦＮ３ドメインの頂部にあり、３つのループ（すなわち、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループ）は、ＦＮ３ドメインの底部にある。これらのループは、配列番号１のアミノ酸残基１３〜１６、２２〜２８、３８〜４３、５１〜５４、６０〜６４、及び７５〜８１の範囲であるか、おおよそその範囲である。ループ領域は、結合特異性及びアフィニティに関して、本明細書に記載の結合分子内で、配列番号１の残基２２〜２８、５１〜５４、及び７５〜８１で、またはおおよそその範囲で変更することが好ましい。一態様では、結合分子としては、少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つすべてのループを配列番号１の残基１３〜１６、２２〜２８、３８〜４３、５１〜５４、６０〜６４、及び／または７５〜８１において、またはおおよそその範囲で含む、代替的足場を含む１つ以上の結合ドメインが挙げられる。一態様では、本明細書に記載の結合分子としては、少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つすべてのループ領域を、配列番号１の残基２２〜２８、５１〜５４、及び７５〜８１で、またはおおよそその範囲で含む、代替的足場を含む１つ以上の結合ドメインが挙げられる。主鎖部分としてそれらの配列を保持しライブラリーを生成する他のループ領域及び／または他のストランドにより、これらのループ領域の１つ以上がランダム化され、特定のタンパク質標的に対する強力なバインダーを、高アフィニティを有するライブラリーから選択することができる。１つ以上のループ領域は、タンパク質との抗体ＣＤＲの相互作用と同様に、標的タンパク質と相互作用し得る。
【０１０７】
上述のように、ＦＮ３ドメインは、分子の反対面に２つのＣＤＲ様ループセットを含む（すなわち、ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループ、並びにＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ）。２つのループセットは、ＦＮ３構造体の中央を形成するβストランドによって分離されている。ループと同様に、これらのβストランドを変更して、結合特異性及びアフィニティを向上させてもよい。βストランド内のいくつかのまたはすべての表面露出残基が、足場固有の安定性に影響を及ぼすことなく（または最小限の影響を及ぼす）、ランダム化されることが好ましい。１つ以上のβストランドは、標的タンパク質と相互作用し得る。足場内のβストランドにより、これらの標的タンパク質上で、標的タンパク質または特定のエピトープに影響を及ぼす、（隣接するループを含むタンパク質足場内に見出される湾曲した結合表面と比較して）平坦な結合表面が提供され、足場により効果的に結合され得る。一態様では、本発明の結合分子としては、例えば、ブドウ球菌ロイコトキシンなど細菌由来毒性因子に結合する、１つ以上のβストランドを含む代替的足場を含む結合ドメインが挙げられる。
【０１０８】
一態様では、結合分子の第２の結合ドメインは、アミノ酸配列番号１０を有するＬｕｋＡ、アミノ酸配列番号１１を有するＬｕｋＢ、アミノ酸配列番号１２を有するＬｕｋＤ、アミノ酸配列番号１３を有するＬｕｋＥに結合する、ＦＮ３ドメインを含む。代替的には、結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ及び番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢを含むＬｕｋＡＢ複合体、及び／または、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤを含むＬｕｋＥＤ複合体に結合するＦＮ３ドメインを含む。
【０１０９】
一態様では、結合分子の第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬｕｋＡ、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＬｕｋＢ、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬｕｋＤ、及び／または（ｉｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬｕｋＥに結合するために、配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６のアミノ酸配列のいずれか１つを有するＦＮ３ドメインと競合する。
【０１１０】
更に別の態様では、結合分子は、（ａ）次を含む第１の結合ドメイン；（ｉ）アミノ酸配列番号６０、６２、６４、または６６を有するＶＨ領域；及び（ｉｉ）アミノ酸配列番号６１、６３、６５、または６７を有するＶＬ領域；並びに（ｂ）アミノ酸配列番号１４〜５９または配列番号１１３〜６６６の任意の一つのアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。一実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号１４または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
別の態様では、結合分子は、１つ以上の追加の結合ドメイン（例えば、第３、第４、第５などの結合ドメイン）を含む。追加の結合ドメイン（複数可）は、結合分子の第１の結合ドメインが結合するものとは異なるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合することができ、かつ結合分子の第２の結合ドメインが結合するものとは異なるブドウ球菌ロイコトキシンに結合可能である。換言すれば、結合分子の各結合ドメインは、固有の抗原に結合する。結合分子の追加の結合ドメインは、免疫グロブリンドメイン、代替的足場ドメイン、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【０１１２】
一態様では、結合分子は、他のブドウ球菌タンパク質抗原または宿主（ヒト）タンパク質抗原への非特異的結合を示すことはない。例えば、一態様では、結合分子は、ブドウ球菌プロテインＡまたは免疫グロブリン用の第２の結合タンパク質（Ｓｂｉ）への特異的結合が可能である。別の態様では、結合分子は、ＦｃγＲＩ、特にヒトＦｃγＲＩへの特異的結合が可能ではない。
【０１１３】
別の態様では、結合分子は、ＦｃＲｎへの特異的結合能力を保持する。
【０１１４】
本開示の結合分子は、例えば、共有結合相互作用を介して他のサブユニットに取り込まれてもよい。抗体定常領域のすべてまたは一部を、結合分子と結合させて、抗体様の性質（例えば、補体活性（ＣＤＣ）、半減期など）を付与する。例えば、Ｃｌｑ結合及び／またはＦｃγＲ結合を修飾することにより、かつ、それによって補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を変更することにより、例えば、エフェクター機能を提供し、及び／または制御することができる。
【０１１５】
「エフェクター機能」は、生物活性（例えば、対象において）の活性化または減少に関与している。エフェクター機能の例としては、これらに限定されないが、Ｃｌｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能のために、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、タンパク質足場ループ）、と混合させる必要がある可能性があり、かつ、さまざまなアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を用いて評価し得る。追加的に、毒素コンジュゲート、アルブミンまたはアルブミンバインダー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子は、所望の特性のために、結合分子に結合させてもよい。標準技術により、例えば、公的に利用可能な遺伝子配列を用いて、構築された組換え型融合遺伝子から結合分子を発現することによって、これらの融合をいずれも発生させ得る。
【０１１６】
本開示の結合分子は、モノマー形状で単一特異性として、または、多量体形状で二重特異性または多特異性として使用することが可能である（同一タンパク質標的上の、異なるタンパク質標的またはエピトープに対して）。この付着は、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、二量体の二重特異性結合分子は、第１の標的タンパク質またはエピトープに対して特異性を有する１つのサブユニット、及び第２の標的タンパク質またはエピトープに対して特異性を有する第２のサブユニットを有する。結合分子サブユニットは、価数及びこうした抗原結合のアビディティが増大し得る種々のコンフォメーションで結合してもよい。
【０１１７】
また、本開示の結合分子は、リンカーペプチドを含んでもよく、該リンカーペプチドが、タンパク質またはポリペプチドドメインを生物学的活性ペプチドに結合させて融合タンパク質を生成することは、当技術分野において公知である。リンカーペプチドは、２つの関連がないタンパク質から、両方のタンパク質の活性を保持する機能的融合タンパク質を作製するために使用することができる。例えば、ロイコトキシンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ブドウ球菌表面タンパク質に結合して、ブドウ球菌表面タンパク質に結合しかつ有害なロイコトキシン作用を中和する融合タンパク質を形成することができる抗体、抗体断片、ｓｃＦｖまたはペプチドリガンドに、リンカーを用いて融合することができる。融合タンパク質は、先行技術により認識されているクローニング技術により生成することができる。例えば、リンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、目的とするドメインをコードする遺伝子間でライゲートされて、単鎖タンパク質全体をコードする１つの融合遺伝子を形成する。リンカーオリゴヌクレオチドの５'末端部は、第１の遺伝子の３'末端部に融合され、リンカーの３'末端部は、第２の遺伝子の５'末端部に融合される。融合遺伝子全体を、適切な発現ベクターを用いて、宿主細胞にトランスフェクションすることができる。
【０１１８】
本発明のリンカーペプチドは、長さ及びアミノ酸組成物を変えることができる。例えば、本発明のリンカーペプチドは、長さ約２〜約５０アミノ酸、長さ約２０〜約４５アミノ酸、長さ約２５〜約４０アミノ酸、長さ約３０〜約３５アミノ酸、長さ約２４〜約２７アミノ酸、または長さ約２０アミノ酸であってもよい。
【０１１９】
ほとんどのリンカーペプチドは、１つ以上のアミノ酸グリシン及びセリンの反復モジュールで構成される。例示的リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、及び（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１〜２５の整数である）が挙げられる。リンカーの長さは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼさない限りは、適切に調整され得る。標準的な１５アミノ酸リンカーペプチド（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３は、（例えば、抗体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインの文脈内で）良く特徴付けられており、構造化されない可撓性コンフォメーションをとることが明らかにされている。加えて、このリンカーペプチドはそれが連結しているドメインのアセンブリ及び結合活性を妨げない（Ｆｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」ＦＥＢＳ  ３２０：９７（１９９３）（本開示では、その全体が、参照によって本明細書に援用される）。したがって、二機能性融合タンパク質を形成するにあたって特に効果的なリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。一態様では、リンカーペプチドは、次のアミノ酸配列を含む：（配列番号２）：
2017502002.tif 000002
。
【０１２０】
しかし、本発明のリンカーペプチドは、このリンカーペプチドの変異体形態もまた企図され、１つ以上のアミノ酸置換、追加、または欠失が、リンカーペプチドに導入されることによって作製されるように、１つ以上のヌクレオチドの置換、追加、または欠失を、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列に導入することによって作製され得る。例えば、突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発、及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準技術により導入されてもよい。リンカーペプチドの能力が変化しないように、１つ以上の非必須アミノ酸残基で、保存的アミノ酸置換が行われることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）など、類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当該技術において定義されている。このため、ｇｌｙ−Ｓｅｒモチーフ（例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、及び（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎ）を含むペプチドリンカーの文脈での保存的アミノ酸置換は、別の非荷電極性側鎖（すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）でＧｌｙ及び／またはＳｅｒを置換することが挙げられる。
【０１２１】
本発明の結合分子は、「単離」結合分子であることが好ましい。本明細書にて開示された結合分子を記述するために使用するとき、「単離」は、その生成環境の成分から、同定され、単離され、及び／または回収された結合分子を意味する。単離結合分子は、その作製環境からの他のすべての成分との会合を含まないことが好ましい。例えば、組換え型トランスフェクト細胞に起因する成分など、その作製環境の夾雑成分は、典型的には、ポリペプチドの診断用途または治療用途を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様溶質または非タンパク様溶質を挙げることもできる。好ましい実施形態では、結合分子は、（１）スピニング−カップ配列決定機器を使用して、Ｎ末端の少なくとも１５残基または内部アミノ酸配列を得るために十分な程度まで、または（２）非還元条件または還元条件下で、クマシーブリリアントブルー、または好ましくはシルバーステインを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。しかし、通常、単離結合分子は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【０１２２】
本明細書に記載の結合分子のアミノ酸配列の修飾が考えられる。例えば、抗体の結合アフィニティ及び／または他の生物学的性質を向上させることが望ましい場合もある。結合分子のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変化を結合分子核酸に導入すること、またはペプチド合成により調製される。このような修飾としては、例えば、結合分子アミノ酸配列内の残基からの欠失及び残基への挿入、残基の置換が挙げられる。プロテインＡ結合及びＦｃγＲＩ結合の消滅、またはプロテアーゼ耐性など、最終構造体が所望の特徴を有するように、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われ、最終作成物に到達する。
【０１２３】
その後、置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位で、または置換部位に対して、更なるまたは他の変異体を導入することにより洗練される。したがって、アミノ酸配列の変化形態を導入する部位はあらかじめ決定されるが、突然変異のその性質は、それ自体、あらかじめ決定している必要はない。例えば、所定部位での突然変異の成果を分析するにあたって、Ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、所望の活性に関して、発現した結合分子変異体のスクリーニングが行われる。好ましくは、アミノ酸配列の挿入としては、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端での融合、並びに、単一また複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。
【０１２４】
本明細書では、結合分子の他の修飾が考えられる。例えば、結合分子は、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールのコポリマーなど）のうちの１つに連結していてもよい。結合分子は、また、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルション中で、例えば、コアセルベーション法または界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）により調製したマイクロカプセルに取り込まれてもよい。こうした技術は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，  Ａ．，  Ｅｄ．，（１９８０）に開示され、その全体が、参照によって本明細書に援用される。
【０１２５】
治療用途として、本明細書に記載の結合分子は、薬学的に許容可能な担体中、活性成分として有効量の結合分子を含有する医薬組成物として調製してもよい。用語「担体」は、活性化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤またはヒビクルを意味する。こうしたビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、または合成物由来のものを含む、水及び油等の液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することもできる。これらの溶液は、滅菌され、概ね、粒子状物質を含まない。これらは、従来の既知の滅菌技術（例えば、ろ過）により滅菌され得る。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤等を含むことができる。こうした製剤処方中の本発明の剤の濃度は、広い範囲（すなわち、約０．５重量％未満、通常、約１％、または少なくとも約１％から１５重量％または２０重量％まで）で変化してもよく、選択された特定の投与方法により、主に投与量、流体体積、粘度などに基づいて、選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２１ＳＴＥｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，  Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，  Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００６，  Ｐａｒｔ５，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２６９１〜１０９２に記載され、特にＰＰ．９５８〜９８９を参照されたい（その全体が、参照によって本明細書に援用される）。
【０１２６】
本明細書に記載の結合分子は、非単離形態または単離形態で使用可能である。更に、本明細書の結合分子は、単独で、または本明細書の少なくとも１つの結合分子を含む混合物中で、使用可能である。換言すれば、結合分子は、例えば、本明細書の２つ以上の結合分子、これらの変異体または断片を含む医薬組成物として、組み合わせて使用可能である。例えば、単一の治療法中で、異なるが、相補的である活性を有する結合分子を組み合わせて、所望の治療的効果を達成することができるが、代替的に、単一の治療法中で、同一の活性を有する結合分子も組み合わせて、所望の予防的、治療的、治療用または診断的効果を達成することができる。任意で、本混合物は、少なくとも１つの他の治療薬を更に含む。一態様では、他の治療薬は、抗感染症剤、抗生物質、及び／またはブドウ球菌感染の予防及び／または治療において有用な抗菌剤であってもよい。別の態様では、他の治療薬は、ブドウ球菌感染関連の状態の予防及び／または治療に有用な薬剤であってもよい。
【０１２７】
本明細書の結合分子の作製方法は、本開示の追加的部分である。このような方法は、次の段階を含む；（ａ）この結合分子をコードする核酸配列（複数可）を含むベクターを含む宿主細胞を、結合分子の作製に好適な条件下で培養することと、（ｂ）結合分子を培養物から回収すること。宿主細胞は、哺乳類宿主細胞、例えば、非ヒト哺乳類宿主細胞であることが好ましい。したがって、別の態様は、結合分子（またはこれらの断片）をコードする核酸分子に関する。これらの核酸分子は、ベクター（すなわち、発現ベクター）に挿入されてもよく、その後適切な宿主細胞にトランスフェクトされ、及び／またはトランスジェニック動物内で発現されてもよい。こうして発現した結合分子（これらの断片）は、その後、当該技術分野において公知の方法により単離してもよい。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ［３ｒｄ  Ｅｄ．］  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１２８】
本発明の組換え体ベクターは、宿主細胞中、核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を備える。これは、組換え型発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞を基準にして選択された１つ以上の制御配列を含み、この配列が、発現される核酸配列に操作可能に連結されることを意味する。組換え型発現ベクター内で「操作可能に連結される」とは、ヌクレオチド配列の発現が可能な方法で、目的とするヌクレオチド配列が制御配列に連結されていることを意味することを意図している（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されるときには、宿主細胞において）。
【０１２９】
用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現抑制因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを目的としている。このような制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）に記載されている。制御配列としては、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞内のみでヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択肢や、所望のタンパク質の発現レベル、といった因子に依存し得ることが、当業者によって理解されよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入し、それによって、本明細書に記載されるように、融合タンパク質またはペプチドなど、核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドを作製することができる。
【０１３０】
宿主細胞は、本明細書に記載されるように、２つ以上の発現ベクターにより共にトランスフェクトされてもよい；オペロン及び第１の結合ドメインをコードするＤＮＡを含む第１の発現ベクター（例えば、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する抗体または抗体断片）、並びにオペロン及び第２の結合ドメインをコードするＤＮＡを含有する第２のベクター（例えば、ブドウ球菌ロイコトキシンに結合するＦＮ３などの代替的足場）。２つのベクターは、異なる選択性マーカーを含むが、好ましくは、第１の結合ドメインポリペプチド及び第２の結合ドメインポリペプチドの、実質的に同一の発現が得られる。代替的には、単一のベクターを使用してもよく、このベクターは、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインの両者をコードするＤＮＡを含む。第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインのコード配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはその両方を含んでもよい。
【０１３１】
本発明の組換え型発現ベクターは、原核細胞または真核細胞において、結合分子を産生するために設計されてもよい。例えば、本発明の結合分子は、例えば、大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母菌または哺乳類細胞など、細菌由来の細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）で更に議論されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを使用するなどして、インビトロで転写され、かつ翻訳され得る。
【０１３２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、もっとも多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれか一方の発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターにより大腸菌内で行われる。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質に、組換え型タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に加える。このような融合ベクターは、典型的には、次の３つの目的を果たす：（ｉ）組換え型タンパク質の発現を増大させること；（ｉｉ）組換え型タンパク質の溶解度を増大させること；及び（ｉｉｉ）アフィニティ精製中のリガンドとして作用することにより、組換え型タンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合部分と組換え型タンパク質の結合部に導入され、融合タンパク質の精製後、融合部分からの組換え型タンパク質の単離が可能になる。このような酵素及びそれらの同族認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶ、及びエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｅｐ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０（１９８８）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ、標的組換え体タンパク質に融合する。
【０１３３】
組換え型哺乳類発現ベクターは、特定の細胞種において、核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御要素を使用して、核酸を発現させる）。組織特異的制御要素は、当技術分野において既知である。本明細書に記載の結合分子を効果的に産生するためには、所望の宿主における発現のために最適化した発現制御配列の制御下で、結合分子をコードするヌクレオチド配列を配置することが好ましい。例えば、この配列としては、最適化された転写及び／または翻訳制御配列（例えば、修飾コザック配列）が挙げられる。
【０１３４】
大腸菌において組換え型タンパク質の発現を最大化させる１つの戦略は、組換え型タンパク質を、タンパク質分解により切断させる、正常でない能力を有する宿主細菌内でタンパク質を発現させることである（例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １８５：１１９〜１２８（１９９０）（その全体が、参照によって本明細書に援用される)を参照されたい）。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが優先的に大腸菌に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｔａｂｕｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：２１１１〜２１１８（１９９２）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい）。核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術により実施することができる。コドンバイアスを解決する別の戦略は、ＢＬ２１コドンに加えて、細菌由来株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲｏｓｅｔｔａ細菌由来株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するものであり、これらの株は、まれな大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子の複製を余分に含む。
【０１３５】
本明細書に記載の結合分子をコードする発現ベクターは、酵母菌発現ベクターであってもよい。酵母菌サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に発現させるためのベクター例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｗｈｉｃｈ  Ａｌｌｏｗｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９〜２３４（１９８７）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、ｐＭＦａ  （Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  Ｇｅｎｅ（ＭＦ  ａｌｐｈａ）：ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｆｏｕｒ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  Ｍａｔｕｒｅ  Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ」Ｃｅｌｌ  ３０：９３３〜９４３（１９８２）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  ｏｆ  ａ  ４００−ｋＤａ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ，」Ｇｅｎｅ  ５４：１１３〜１２３（１９８７）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）が挙げられる。
【０１３６】
あるいは、本明細書に記載の結合分子は、バキュロウイルスを用いて昆虫細胞中で産生され得る。培養した昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能バキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ，」Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２１５６〜２１６５  （１９９３）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｆｕｓｅｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１〜３９（１９８９）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））が挙げられる。更に別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞内に発現させる。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，「Ａｎ  ＬＦＡ−３  ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ２」Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０（１９８７）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」ＥＭＢＯＪ．６：１８７〜１９３（１９８７）（その全体が、参照によって本明細書に援用される。））、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＢ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。哺乳類細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス性調節要素により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びサルウイルス４０から誘導される。原核細胞及び真核細胞の双方の、他の好適な発現系としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（３ｒｄ  Ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）を参照されたい（これらはその全体が、参照によって援用される）。
【０１３７】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明の結合分子は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母菌、植物、または哺乳類細胞（例えば、チヤイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞）中で産生され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１３８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞内に導入することができる。本明細書で使用するとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、外部の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法など、従来から当技術分野で認識されているさまざまな方法を示すことが意図される。宿主細胞の好適な形質転換方法またはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．［Ｅｄｓ．］ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（３ｒｄ  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌｓ（２００１）に見出すことができ、その全体が、参照によって本明細書に援用される。
【０１３９】
公知の外部のヌクレオチド配列の宿主細胞への導入手法のいずれをも、使用してもよい。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、及びクローニングゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外部の遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の公知の方法が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （３ｒｄＥｄ．）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｐａｐｌｅｙ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（５ｔｈＥｄ．）Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）（その全体が参照として本明細書に援用される）を参照されたい。使用される特定の遺伝工学手法が、少なくとも１つの核酸分子を、目的とするある結合分子または複数の結合分子の発現が可能である宿主細胞に確実に導入することができることのみが、必要である。
【０１４０】
哺乳類細胞の安定的トランスフェクションのために、使用する発現ベクター及びトランスフェクション技術に依存して、ごく一部の細胞は、外部ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが公知である。これらの成分を同定し、選択するために、選択性マーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子が、概して、目的とする遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。さまざまな選択性マーカーとしては、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、及びメトトレキサートなど、薬物に耐性を付与するものが挙げられる。選択性マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載されるように、ある結合分子または複数の結合分子をコードするベクターと同一のベクター上で宿主細胞内に導入することができるか、または、別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸により安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定することができる（例えば、他の細胞が死滅しても、選択性マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存している）。
【０１４１】
培養物中の原核細胞宿主または真核細胞宿主などの本発明の宿主細胞を使用して、本発明の結合分子を産生する（すなわち、発現させる）ことができる。したがって、本発明は、更に、本発明の宿主細胞を使用する本発明の結合分子の作製方法を提供する。一実施形態では、本方法は、好適な培地内で、本発明の結合分子または複数の結合分子が産生されるように、本発明の宿主細胞を培養する（本明細書に記載されるように、結合分子をコードする組換え型発現ベクターを取り込む）ことを含む。別の実施形態では、本方法は、本発明の結合分子を培養液または宿主細胞から単離することを更に含む。
【０１４２】
発現ベクターを細胞に導入後、目的とする結合分子または複数の結合分子の発現が好ましい条件下で、トランスフェクトした細胞を培養し、その後、標準技術を使用して培養物を回収した。こうした技術の例は、当該技術分野において公知である（例えば、ＷＯ００／０６５９３（Ｚｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を参照されたい）。
【０１４３】
更に、本発明の結合分子は、ブドウ球菌感染の治療、予防、または改善のために使用することができる。ブドウ球菌感染は、どのようなブドウ球菌種によっても引き起こされ得る。一態様では、ブドウ球菌感染は、黄色ブドウ球菌のＭＲＳＡ株及びＭＳＳＡ株などの黄色ブドウ球菌が原因である。したがって、本開示は、本明細書に記載されるように、結合分子をその必要のある対象に投与することに伴う、ブドウ球菌感染の治療、予防、改善のための方法を提供する。
【０１４４】
この態様によれば、標的である「対象」は、任意の動物、例えばヒトなどの哺乳類を包含する。対象において、ブドウ球菌感染を予防することを目的とする本発明の組成物を投与する文脈において、標的対象は、ブドウ球菌に感染したか、ブドウ球菌に感染しつつあるか、またはブドウ球菌感染が進行している可能性がある、任意の対象を含む。感染しやすい対象としては、小児、若年、並びに、免疫不全の、若年、成人、及び高齢者が挙げられる。しかし、本明細書記載の方法によって、ブドウ球菌感染が発症している可能性がある任意の小児、若年、成人、若しくは高齢者、または免疫不全の個人の治療を行うこともできる。対象において、ブドウ球菌感染の治療を行うことを目的とする本発明の組成物を投与する文脈において、標的対象集団は、ブドウ球菌に感染した任意の対象を含む。特に好適な対象としては、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）若しくはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）に感染する可能性のある対象または感染した対象が挙げられる。他の好適な対象としては、例えば、皮膚の創傷及び感染症、組織膿瘍、毛嚢炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血症性関節炎、心筋炎、心内膜炎、及び毒素性ショック症候群など、ブドウ球菌に起因する状態（すなわち、ブドウ球菌関連状態）が起こる危険を有する可能性があるか、またはその状態にあるこれらの対象が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書に記載の結合分子は、ブドウ球菌感染または付随する状態が起こる可能性がある対象において、予防的に投与され、ブドウ球菌感染の発症の予防、遅延、または阻害が行われる。一態様では、本明細書に記載の１つ以上の結合分子の予防的投与は、個々において黄色ブドウ球菌感染の完全な予防に有効である。他の実施形態では、予防的投与は、さもなければ、こうした投与をせずに発症する感染の全範囲の予防に有効である（すなわち、個々において、実質的に、ブドウ球菌感染を予防する、阻害する、または最小限に抑える）。
【０１４６】
別の実施形態では、本明細書に記載の結合分子は、感染の進行及び更なる発症を阻害するために（すなわち、個体において、他の細胞への感染の拡散を阻害する及び／または予防するために、感染を減少させるために、及び感染症の１つ以上の症状を治療するまたは軽減するために）、ブドウ球菌感染を有する個体に治療的投与する。
【０１４７】
本明細書に記載の結合分子の治療的有効量は、標準的な手順によって決定することができ、例えば、医薬組成物中の結合分子濃度、投与様式及び頻度、治療される（または予防される）ブドウ球菌感染症の重症度、及び対象の詳細（例えば、年齢、体重、及び全身の健康状態及び免疫状態）など多数の因子を考慮に入れる。一般的なガイダンスは、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎの出版物及びＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）に見出される。臨床医は、単回投与において、または複数回投与プロトコルによって、所望のまたは必要とする予防的効果または治療的効果をもたらす用量に到達するまで、本明細書に記載の結合分子を含む組成物を投与してもよい。この療法の進行は、従来のアッセイにより容易にモニターすることができる。予防的用途では、長期間にわたり比較的低頻度の間隔で、比較的少ない用量が投与される。治療的用途では、疾患の進行が低減するまたは終結するまで、好ましくは、対象が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短時間の間隔で比較的多い用量が必要とされる場合もある。
【０１４８】
本発明の治療的組成物は、治療されるブドウ球菌感染の性質に依存して、単独で、または併用療法の一部として１つ以上の他の活性剤と連動して、投与され得る。このような追加の活性剤としては、当該技術分野において公知である抗感染症薬、抗生物質、及び抗菌剤が挙げられる。
【０１４９】
本明細書に記載の結合分子の投与態様は、結合分子（複数可）を宿主に送達する、以下の非経口的投与など、任意の好適な経路であってもよい；例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下、肺内；経粘膜（経口、鼻孔内、腟内、直腸内）；錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子中の配合を用いること；及び注射器、埋込みデバイス、浸透圧性ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに収容すること；または当業者に理解され、当該技術分野において公知である他の手段。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮送達によって達成され得る。
【０１５０】
また、本明細書に提供される結合分子は、対象においてブドウ球菌感染の診断方法に使用され得る。一態様では、ブドウ球菌感染の診断方法は、本明細書に記載されるように、結合分子と、診断される対象からのサンプルとを接触させること、及びサンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンを検出すること、すなわち、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出することと、を含む。ブドウ球菌感染は、対象において、こうした検出に基づいて診断される。換言すれば、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンが検出されることにより、ブドウ球菌感染の陽性診断が示される。
【０１５１】
この態様によれば、対象由来サンプルは、血液、組織、細胞、血清、または他の生体サンプルを含んでいてもよい。
【０１５２】
別の態様は、サンプル中でのブドウ球菌感染の検出方法に関する。本方法は、本明細書に記載されるように、結合分子をサンプルと接触させることと、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの存在または非存在を検出することと、を含む。グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンが検出されることにより、サンプルにおけるブドウ球菌の存在が示される。この態様に従って、サンプルは、環境、動物、またはヒトから入手した任意の生体サンプルであってもよい。
【０１５３】
対象由来のサンプルまたは別のサンプルにおける、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンの検出を含む本明細書に記載の方法は、検出可能に標識されている結合分子の使用を含む。したがって、一態様では、本明細書に記載されるように、結合分子は検出可能な標識に連結されてもよい。好適な検出可能な標識としては当該技術分野において公知であり、検出可能なタグ（例えば、ポリヒスチジン、（Ｈｉｓ６-）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ-）タグ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ-）タグ）；放射性標識（例えば、炭素（１４Ｃ）またはリン（３２Ｐ））；蛍光標識（例えば、フルオレセイン及びその誘導体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン及びその誘導体、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリン）；発光標識（例えば、ルミノール）；生物発光標識（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）；または酵素標識（例えば、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋わさびペルオキシターゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素グルコース）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシターゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼが挙げられる。あるいは、結合分子は、検出可能な標識により、結合され得る。例えば、検出可能な標識を含む二次抗体によって結合され得る。
【０１５４】
サンプルにおいて、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンに結合される標識された結合分子を検出するための検出アッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１５５】
更に、本発明の結合分子は、ブドウ球菌感染の予防に使用することができる。本明細書に記載されるように、本方法は、結合分子を対象由来のサンプルに接触させることと、接触の結果として、サンプルにおけるグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンを検出することを含む。グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質及び／またはブドウ球菌ロイコトキシンが対象サンプル中で検出された場合、ブドウ球菌感染の予防に好適である薬剤を対象に投与する。代表的な予防剤としては、これらに限定されないが、本明細書に記載の結合分子、１つ以上の抗生物質（例えば、ムピロシン、ナフシリン、セファゾリン、ジクロキサシリン、クリンダマイシン、バンコマイシン、リネゾリド、リファンピン、スルファメトキサゾール−トリメトプリム）、及び／またはブドウ球菌感染に対して効果的である他の抗感染症薬が挙げられる。
【実施例】
【０１５６】
本発明を示すために実施例を提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または操作理論に制約することを意味するものではない。
【０１５７】
実施例１  ロイコトキシンに結合し、中和する、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの構築及び選択
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は免疫グロブリン様足場である、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであり、ヒトテネイシンＣ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計されている（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ＦＮ３  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２５：１０７〜１１７（２０１２）、（本開示は、その全体が、参照によって本明細書に援用される））。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのβストランドを接続させる６つの表面露出ループを示す。ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥと結合する新規分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するために、これらのループ、または各ループ内の選択された残基を、ランダム化できる。
Ｔｅｎｃｏｎ：
2017502002.tif 000003
。
【０１５８】
手順
ＴＣＬ７（ＴＣＬ１８）及びＴＣＬ９（ＴＣＬ１７）ライブラリーの構築。ＴｅｎｃｏｎのＦ：Ｇループ、ＴＣＬ９（ＴＣＬ１７）、またはＢＣ及びＦＧループを組み合わせたもの、ＴＣＬ７（ＴＣＬ１８）のみをランダム化するために設計されたライブラリーは、ｃｉｓディスプレイ系で使用するために構築された（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＩＳ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：２８０６〜２８１０（２００４）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）。この系では、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント及びｏｒｉエレメントの配列が組み込まれた線状二本鎖ＤＮＡが作製される。インビトロ転写／翻訳系での発現時に、コードされるＤＮＡにｃｉｓで結合するＦＮ３ドメイン−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が形成される。次に、後述のように、標的分子に結合する複合体は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離され、増幅される。
【０１５９】
Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）を用いて、ランダム化ＢＣまたはＦＧループ配列を伴うＴｅｎｃｏｎ遺伝子配列をコードするＤＮＡ断片を合成して、ライブラリーのアミノ酸分布を制御し、かつ停止コドンを除去した。ＢＣループまたはＦＧループのいずれかをランダム化する２つの異なるＤＮＡ分子セットを独立して合成し、その後、ループ長さの異なる組み合わせを有するライブラリーを作製するように、後述のように混ぜ合わせた。下の表１は、これらのＴｅｎｃｏｎループライブラリーの設計特性についてまとめている。
【０１６０】
（表１）ＴＣＬ７（ＴＣＬ１８）及びＴＣＬ９（ＴＣＬ１７）ライブラリーのＢＣ及びＦＧループの設計されたアミノ酸配列。比較のために、ランダム化していないＴｅｎｃｏｎＢＣ及びＦＧループの配列を示す。Ｘは、システイン及びメチオニンを欠く１８のアミノ酸の混合物を示す。
2017502002.tif 000004
【０１６１】
ＦＧループライブラリー（ＴＣＬ９（ＴＣＬ１７））の作製。ＦＧループ中のランダム化コドンを除き、５'Ｔａｃプロモーター、続いてＴｅｎｃｏｎの完全遺伝子配列から構成される合成ＤＮＡ分子セットを作製した（米国特許公開第２０１３／００７９２４３号（Ｄｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，）、その全体が、参照によって本明細書に援用される。）。ＦＧループのランダム化に関しては、システイン及びメチオニン以外、すべてのアミノ酸が同じ割合でコードされていた。多様化部分の長さは、ＦＧループ中で７、８、９、１０、１１、または１２のアミノ酸に関してコードするようになっている。それぞれの長さの変化形態のサブライブラリーを、２μｇのスケールで個々に合成し、その後、オリゴＳｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ及びＳｌｏｎｉｎｇ−Ｒｅｖを使用して、ＰＣＲにより増幅させた。
【０１６２】
ライブラリーの３'断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、及びｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含むディスプレイのためのエレメントを含む、定常ＤＮＡ配列である。プラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ反応を実施し、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーでこの断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ＰｓｐＯＭＩにより一晩消化し、ゲル精製した。ライブラリーＤＮＡの５'部位を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む３'ＤＮＡにライゲートするために、５'ＤＮＡ ２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇ〜５６０ｎｇ）を、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素、並びにＴ４リガーゼの存在下、３７℃で一晩、同じモル量（約１．２５μｇ）の３'ｒｅｐＡ  ＤＮＡにライゲートさせた。ライゲートされたライブラリー産物を、オリゴＰＯＰ２２５０（配列番号６）及びＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号７）により、ＰＣＲ１２サイクルを用いて増幅させた。各サブライブラリーについて、１２のＰＣＲ反応由来の得られたＤＮＡを混合して、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムにより精製した。ＴＣＬ９（ＴＣＬ１７）の各サブライブラリーの収率は、３２〜３４μｇの範囲であった。
【０１６３】
ＴＣＬ７（ＴＣＬ１８）ライブラリー構造体。ＴＣＬ７(ＴＣＬ１８)ライブラリーは、ランダム化ＴｅｎｃｏｎＢＣ及びＦＧループを有するライブラリーを提供する。このライブラリーにおいて、長さ６〜９のアミノ酸のＢＣループを長さ７〜１２アミノ酸のランダム化ＦＧループと組み合わせて混合した。合成Ｔｅｎｃｏｎ断片ＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、及びＢＣ９（それぞれ、配列番号８０〜８３）を作製して、ＢＣループが６、７、８、または９のランダム化アミノ酸のいずれかに置換えられるように、残基ＶＸまでのタンパク質のＮ末端部をコードするＴｅｎｃｏｎ遺伝子を含む。Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉ突然変異（ＣＥＮ５２４３）を発見する前にこれらの断片を合成したが、これらの突然変異は、後述の分子生物学工程に取り込まれた。この断片と、ランダム化ＦＧループをコードする断片と、を混合するために、次の工程を行った。
【０１６４】
まず、Ｔａｃプロモーターと、アミノ酸Ａ１７（１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ）（配列番号８４）をコードするヌクレオチドまでのＴｅｎｃｏｎの５'配列と、をコードするＤＮＡ断片を、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号８５）及びＬＳ１１１４（配列番号８６）を用いて、ＰＣＲにより作製した。これは、ライブラリー内にＬ１７Ａ突然変異を含めて行った。次に、ランダム化ＢＣループを含むＴｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８−Ｖ７４をコードするＤＮＡ断片は、ＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、またはＢＣ９を鋳型として使用し、オリゴＬＳ１１１５（配列番号８７）及びＬＳ１１１７（配列番号８８）を使用してＰＣＲにより増幅させた。このＰＣＲ工程により、３'末端部にＢｓａＩ部位を導入した。その後、オーバーラップＰＣＲにより、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ及びＬＳ１１１７をプライマーとして使用して、これらのＤＮＡ断片を結合させた。得られたＰＣＲ生成物２４０ｂｐを貯留して、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットにより精製した。ＢｓａＩ−ＨＦにより精製されたＤＮＡを消化し、ゲル精製した。
【０１６５】
ＦＧループをコードする断片は、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号８９）及びＳＤＧ２４（配列番号９０）と共に、ＦＧ７、ＦＧ８、ＦＧ９、ＦＧ１０、ＦＧ１１、及びＦＧ１２を鋳型として使用しＰＣＲにより増幅させて、ＢｓａＩ制限酵素部位及びＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異体を組み入れた。
【０１６６】
２つのＢＣループ長さと２つのＦＧループ長さとを組み合わせて４つのライゲーション反応として、１６の可能な組み合わせにおいて、消化したＢＣ断片及びＦＧ断片を共にライゲートさせた。いずれのライゲーションも約３００ｎｇの全ＢＣ断片及び３００ｎｇのＦＧ断片を含めた。その後、オリゴＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＳＤＧ２８（配列番号９１）を用いて、ＰＣＲによりこれらの４ライゲーションプールを増幅させた。その後、各反応生成物７．５μｇをＮｏｔ１により消化し、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製カラムにより精製した。このＤＮＡ５．２ｕｇを、ＰｓｐＯＭＩにより消化した等モル量のＲｅｐＡ  ＤＮＡ断片（約１４ｕｇ）にライゲートし、オリゴＰＯＰ２２２２を使用して、生成物をＰＣＲにより増幅させた。
【０１６７】
ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４ライブラリーの設計。特定のライブラリー設計におけるランダム化させる残基の選択は、作製される相互作用表面の全体形状を左右する。ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループをランダム化したライブラリーから、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように選択された足場タンパク質を含むＦＮ３ドメインのＸ線結晶学的分析により、ＭＢＰ活性部位に適合する大きく湾曲した境界面を有することが明らかになった（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｂｉｎａｒｙ−Ｃｏｄｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ１０４：６６３２〜６６３７（２００７）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。その一方で、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリン繰り返し足場タンパク質は、更に多くの平面相互作用表面を有し、かつ、活性部位から遠いＭＢＰの外側表面に結合することが明らかになった（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５〜８２（２００４）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。これらの結果から、足場分子の結合表面の形状（曲線対水平）は、どの標的タンパク質またはこれらの標的タンパク質の特定のエピトープが、足場により効果的に結合され得るかを示し得ることが示唆される。タンパク質結合のための、ＦＮ３ドメインを含む遺伝子操作タンパク質足場関連で公表されている試みは、標的結合のために遺伝子操作されている隣接ループに依存しており、従って曲線状の結合表面が作製される。この方法では、こうした足場によって入手可能な標的及びエピトープの数が制限され得る。
【０１６８】
Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３ドメインは、分子の反対面に以下の２つのＣＤＲ様ループセットを含む；ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループによって形成される第１のセット、及びＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループによって形成される第２のセット。２つのループセットは、ＦＮ３構造体の中央を形成するβストランドによって分離されている。わずかに窪んでいる面は、ＣＤ及びＦＧループ、並びに２つの逆平行βストランド、Ｃ及びＦβストランドにより形成され、本明細書では、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と称する。Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面は、表面を形成する残基のサブセットをランダム化することによって、タンパク質足場相互作用表面のライブラリーを設計するために、鋳型として使用可能である。βストランドは、タンパク質表面に露出された他の全ての残基の側鎖を有する繰り返し構造体を有する。したがって、βストランド内で表面に露出された若干のまたはすべての残基をランダム化することにより、ライブラリーを作製することができる。βストランドにおいて、適切な残基を選択することにより、Ｔｅｎｃｏｎ足場の固有の安定性が損なわれることを最小限にし、他のタンパク質との相互作用に向けた固有の足場表面を提供する。この前提条件に基づいて構築されたライブラリーは、ＴＣＬ１４と称され、米国特許第２０１３／００７９２４３Ａ１号（Ｄｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ）に記述されている（その全体が、参照によって本明細書に援用される）。その後、ＴＣＬ１４のものと非常に類似した設計下で新規ライブラリーを作製した。使用されたＴＣＬ１４により、ＮＮＳコドンが縮重され、Ｔｅｎｃｏｎ足場が多様化したが、ライブラリーのアミノ酸分布を制御しかつ停止コドンを除去するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）を用いて合成したＴｅｎｃｏｎ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を用いて、ＴＣＬ１９（配列番号８６）を産生した。したがって、「Ｘ」以下で示した各位置を同じ１８のアミノ酸の混合物で置換した（システインまたはメチオニンなし）。
TCL19:
2017502002.tif 000005
;ここで「Ｘ」は、１８のアミノ酸の均等な混合物である（システインまたはメチオニンなし）。
【０１６９】
（表２）
2017502002.tif 000006
【０１７０】
類似の設計の、２つの追加のＴｅｎｃｏｎライブラリーを作製した。これらの２つのライブラリー、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同一位置でランダム化される（米国特許第２０１３／００７９２４３Ａ１号（Ｄｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）が、これらの位置で生じるアミノ酸の分布は変化する（以下の表３）。ＴＣＬ２１は、システイン及びメチオニンのみを除いて、各位置で１８の天然アミノ酸の等しい分布を含むように設計された（それぞれ５．５５％）。ＴＣＬ２３は、表３に示すとおり、各ランダム化された位置が、機能的抗体のＣＤＲ−Ｈ３ループに見られるアミノ酸分布に近づくように設計した（Ｂｉｒｔａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，  Ｓｅｒｉｎｅ，  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７７：１５１８〜１５２８（２００８）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。ＴＣＬ２１ライブラリーと同様に、システイン及びメチオニンは除外した。
【０１７１】
第３の追加のライブラリーを構築して、ＴＣＬ２１ライブラリーの、可能性のある標的結合表面を拡大した。このライブラリーＴＣＬ２４では、ライブラリーＴＣＬ１４、ＴＣＬ２１、及びＴＣＬ２３と比較して、４つの追加のＴｅｎｃｏｎ位置をランダム化した。これらの位置としては、ＤストランドからのＮ４６及びＴ４８、及びＧストランドからのＳ８４及びＩ８６が挙げられる。これらの残基の側鎖は、βストランドＤ及びＧから表面に露出されており、構造上、Ｃストランド及びＦストランドのランダム化部分に近接しているため、位置４６、４８、８４、及び８６を特に選択し、これによって、標的タンパク質のアクセス可能な表面積が増大する。ＴＣＬ２４に関して各位置で使用されたアミノ酸分布は、記載されたＴＣＬ２１及び表３で記述されたものと一致する。
TCL24:
2017502002.tif 000007
；ここで「Ｘ」は、１８の天然アミノ酸の均等な混合物であることを示す。
【０１７２】
（表３）ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４の、各ランダム化位置でのアミノ酸頻度（％）
2017502002.tif 000008
【０１７３】
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４ライブラリーの作製。アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を用いて、ＴＣＬ２１ライブラリーを作製した。ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４遺伝子断片は、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して作製し、アミノ酸分布を制御した。従来記載されていたとおり、ＣＩＳディスプレイ系を用いた選択に使用するために、初期合成後、ＰＣＲを使用して各ライブラリーを増幅し、次いでＲｅｐＡの遺伝子にライゲーションした（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＩＳ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：２８０６〜２８１０（２００４）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。
【０１７４】
ライブラリーのスクリーニング。Ｃｉｓディスプレイを使用して、ＴＣＬ１７、ＴＣＬ１８、及びＴＣＬ１９ライブラリーから、ロイコトキシン結合ドメインを選択した。組換え型ＬｕｋＡ'Ｂトキソイド複合体（配列番号１０及び１１）、ＬｕｋＤ（配列番号１２）、及びＬｕｋＥ（配列番号１３）ロイコトキシンは、標準方法を使用して、ビオチン化し、パニングのために使用した。本発明の実施例においてパニングのために修飾ＬｕｋＡ'Ｂトキソイド複合体を使用したが、未修飾ＬｕｋＡＢトキシンの結合及び／または中和が確認された。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）については、ライブラリーＤＮＡ２〜６μｇを、全量１００μＬ中、０．１ｍＭ完全アミノ酸、１ＸＳ３０プレミックス成分、及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μＬとインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキング溶液４５０μＬ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４に、２％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、及び１ｍｇ／ｍＬヘパリンを補充）を添加し、反応物を氷上で１５分間インキュベートした。結合させるために、ブロッキングされたＩＴＴ反応生成物５００μＬをビオチン化ロイコトキシン１００μＬと混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、結合した複合体は、磁性を有するｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎまたはストレプトアビジンビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ａｎｄ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりプルダウンした。非結合ライブラリーメンバーは、ＰＢＳＴ及びＰＢＳの連続洗浄により除去した。５、７、及び９ラウンドの洗浄後、ＤＮＡを、１０分間、６５℃まで加熱することによって、結合した複合体から溶出させ、ＰＣＲにより増幅させ、制限酵素消化、及び更なるパニングラウンドのためのライゲーションにより、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に付着させた（この工程は、ｒｅｐＡがライブラリーに取り込まれたときは任意である）。高親和性結合剤は、連続的に標的ロイコトキシン濃度を低下させることによって、各ラウンド４００ｎＭ〜２．５ｎＭで、洗浄の厳密性を増大させて単離した。パニングは、（ＬｕｋＥの場合）７つの、及び（ＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＤ）９つの連続ラウンドを介して行われた。
【０１７５】
パニング後、オリゴＭＤＤ４０（配列番号８）及びＭＤＤ６２（配列番号９）を用いて、選択されたＦＮ３ドメインをＰＣＲにより増幅させ、リガーゼ処理不要なクローニング部位を含むよう修飾されたｐＥＴベクターにサブクローニングし、標準的分子生物学技術を使用して、大腸菌での可溶性発現のために、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞を形質転換した。精製及び検出が可能になるように、Ｃ末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインに付加した。培養物は、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン／１ｍＬを補充した２ＹＴ培地中、１ｍＬの９６ウェルブロックで、３７℃にて光学密度０．６〜０．８となるまで増殖させ、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加し、温度を３０℃まで低下させた。細胞は、約１６時間後、遠心分離によって採取され、−２０℃で凍結した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で各ペレットを室温で４５分間振盪させてインキュベートすることによって、細胞溶解を行った。ニッケル精製ＦＮ３ドメインの抗原結合は、ＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１７６】
結果
各毒素／トキソイド分子のｃｉｓディスプレイパニング後、ＬｕｋＡ'Ｂ（トキソイド）、ＬｕｋＤ、及びＬｕｋＥに結合させたＦＮ３ドメインを、ＥＬＩＳＡにより同定した。バインダーのＤＮＡ配列を同定し、固有の配列を単離した。これらの配列から発現させたモノマータンパク質を同定し、予想分子量を確認した。抗原結合配列識別番号及びモノマーＦＮ３ドメインを表４に示す。
【０１７７】
（表４）ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、及びＬｕｋＥに結合するＦＮ３ドメインの特性決定
2017502002.tif 000009
2017502002.tif 000010
2017502002.tif 000011
【０１７８】
ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、及びＬｕｋＥを結合する追加のＦＮ３ドメインが、以下に配列番号１１３〜６６６として表６に開示される。
【０１７９】
まとめ
ＥＬＩＳＡにより検出されたとおり、ＬｕｋＡ'Ｂ（４）、ＬｕｋＤ（７）及びＬｕｋＥ（３５）を標的とする、配列が固有のモノマーブドウ球菌ロイコトキシン結合ＦＮ３ドメインが、Ｃｉｓディスプレイパニングによって上手く同定された。
【０１８０】
実施例２  抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインによる、ロイコトキシン媒介免疫細胞死滅の中和
単離した抗ＬｕｋＤＦＮ３ドメインの機能性を評価するために、細胞系細胞傷害中和アッセイを開発した。３つの種類のＦＮ３ドメイン（リンカーを有さないＦＮ３ドメイン、ＧＳを有するＦＮ３ドメイン、またはＧＳＭリンカーを有するＦＮ３ドメイン）を使用した。
【０１８１】
手順
中和活性に関して、抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインのスクリーニングを行うために、ＬｕｋＥＤ  ７５ｎＭ（細胞を１００％死滅させるための必要投与量、つまりＬＤ１００）を、最終体積３０μｌ中、増加濃度での異なるＦＮ３ドメインと共に、３０分間、氷上でインキュベートした。次いで、新たに単離した初代ヒト好中球（ｈＰＭＮ）、２ｘ１０５細胞／ＲＰＭＩ ７０μｌ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＡＳを、毒素−ＦＮ３ドメイン混合物に添加した。３７℃  ５％  ＣＯ２インキュベータで１時間インキュベートした後、１０μｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＡＱ  ＯＮＥ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加し、１時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒは、細胞代謝活性を観察することにより細胞生存度を評価する比色分析法である。比色分析反応を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して４９２ｎｍで測定した。生存細胞率は、次式を使用して算出した：生存率（％）＝１００ｘ［（Ａｂ４９２サンプル−Ａｂ４９２ＴｒｉｔｏｎＸ１００）／（Ａｂ４９２組織培地）］。
【０１８２】
インキュベーションの１時間後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出を観察することにより、膜損傷も測定した。上澄み５０μｌを取り出して、５０μｌ  ＬＤＨ試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の入ったウェルに添加し、更に３０分間、室温にてインキュベートした。ＬＤＨ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して測定し（励起５５５ｎｍ、発光５９０ｎｍ）、データは、０．１％  ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により誘導された１００％のＰＭＮ細胞溶解に対して正規化した。
【０１８３】
結果
図１に示すように、ヒトＰＭＮに対するＬｕｋＥＤの細胞傷害活性を中和する、選択された抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインの能力を評価した。３つの選択された抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメイン（Ｌｕｋ１０、Ｌｕｋ１２、及びＬｕｋ２２）は、ＬｕｋＥＤが媒介するｈＰＭＮの死滅を阻止することが明らかになった。こうした阻害は、細胞代謝（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ）並びに膜損傷（ＬＤＨ）を測定するときに観察された。抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインとは対照的に、ＴＥＮＣＯＮ対照ＦＮ３ドメインでは、中和は観察されなかった。
【０１８４】
まとめ
予想通り、ＴＥＮＣＯＮ分子は、ＬｕｋＥＤの細胞傷害能を阻止することはできなかった。対照的に、選択された抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインは、リンカーへの融合にかかわらず、ＬｕｋＥＤを中和した。抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインにより、用量依存的に、ＬｕｋＥＤ媒介細胞傷害を阻止した。例示的目的として、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートの生成のために、Ｌｕｋ１２抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインを選択した。
【０１８５】
実施例３  抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインによる、ロイコトキシン媒介免疫細胞死滅の中和
単離した抗ＬｕｋＡ'Ｂ  ＦＮ３ドメインの機能性を評価するために、細胞系細胞傷害中和アッセイを開発して、活用した。３つの種類のＦＮ３ドメイン（リンカーを有さないＦＮ３ドメイン、ＧＳを有するＦＮ３ドメインまたはＧＳＭリンカーを有するＦＮ３ドメイン）を使用した。
【０１８６】
手順
中和活性に関して、抗ＬｕｋＡ'ＢＦＮ３ドメインのスクリーニングを行うために、活性ＬｕｋＡＢ毒素１８．７５ｎＭ（ＬＤ１００）を、３０分間氷上で、増加濃度での異なるＦＮ３ドメインＬｕｋ１７（＋／−リンカー）のバージョンと共に、９６ウェルのブラックウェル透明底組織培養処理プレートでインキュベートした。次に、フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ中、新たに単離した２ｘ１０５の初代ｈＰＭＮを、毒素−ＦＮ３ドメイン複合体に添加し、サンプルは、１時間、３７℃、５％ＣＯ２インキユベーターでインキュベートした。膜損傷は、２つのアッセイ、臭化エチジウム透過性及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によって評価した。臭化エチジウム透過性は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して測定した（励起５３０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）。インキュベーションの１時間後に、培養物上澄みへのＬＤＨ放出も測定した。上澄み５０μｌを取り出して、５０μｌ  ＬＤＨ試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の入ったウェルに添加し、更に３０分、室温でインキュベートした。ＬＤＨ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して測定し（励起５５５ｎｍ、発光５９０ｎｍ）、データは、０．１％  ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により誘導された１００％のＰＭＮ細胞溶解に対して正規化した。
【０１８７】
結果
図２に示すように、ヒトＰＭＮに対するＬｕｋＡＢの細胞傷害活性を中和する、Ｌｕｋ１７  抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインの能力を評価した。エチジウム透過性及びＬＤＨ溶出により評価するとき、抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインは、ＬｕｋＡＢが媒介するｈＰＭＮの死滅を阻止することが明らかになった。対照的に、対照ＦＮ３ドメイン分子では、中和は観察されなかった。
【０１８８】
まとめ
予想通り、ＴＥＮＣＯＮ分子は、ＬｕｋＡＢの細胞傷害能を阻止することはできなかった。対照的に、抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインは、リンカーへの融合にかかわらず、ＬｕｋＡＢ細胞傷害性を中和した。抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインにより、用量依存的に、ＬｕｋＡＢ媒介細胞傷害を阻止した。例示的目的として、ｍＡＢ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートの生成のために、Ｌｕｋ１７抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインを選択した。
【０１８９】
実施例４：抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインによる、ロイコトキシン媒介免疫細胞死滅の中和
単離した抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインの機能性を評価するために、抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインの評価に関して記載された同一細胞系細胞傷害中和アッセイを用いた。例示的目的として、５つの抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインを使用した（リンカーを有さないＦＮ３ドメイン）。
【０１９０】
手順
中和活性に関して、抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインのスクリーニングを行うために、７５ｎＭ  ＬｕｋＥＤ（細胞を１００％の死滅させるための必要投与量、つまりＬＤ１００）を、最終体積３０μｌ中、増加濃度での異なるＦＮ３ドメインと共に、３０分間、氷上でインキュベートした。次いで、新たに単離した初代ｈＰＭＮ、２ｘ１０５細胞／ＲＰＭＩ７０μｌ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＡＳを、毒素−ＦＮ３ドメイン混合物に添加した。３７℃、５％  ＣＯ２インキュベータで１時間インキュベートした後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出を介して、細胞膜の不安定化を観察した。１時間のインキュベーション後、培養物上澄みへのＬＤＨ放出を測定した。上澄み５０μｌを取り出して、５０μｌ  ＬＤＨ試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の入ったウェルに添加し、更に３０分間、室温にてインキュベートした。ＬＤＨ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して測定し（励起５５５ｎｍ、発光５９０ｎｍ）、データは、０．１％  ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により誘導された１００％のＰＭＮ細胞溶解に対して正規化した。
【０１９１】
結果
ヒトＰＭＮに対するＬｕｋＥＤの細胞傷害活性を中和する、選択された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインの能力を評価した。試験対象の抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインはすべて、ＬｕｋＥＤが媒介する死滅を阻止することが明らかになった（図３）。
【０１９２】
まとめ
抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインによるＬｕｋＥＤ中和は投与量依存性であった。試験対照のＦＮ３ドメインでは、抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインであるＬｕｋ２６、Ｌｕｋ２７、及びＬｕｋ３８が最も高い中和の活性を示した。
【０１９３】
実施例５  融合タンパク質の構造体
構造体は、ｍＡｂ５１３３（配列番号６０及び６１）を利用して設計した。米国特許第８，４６０，６６６号（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）に記述され、Ｆａｂ  Ｖ領域を介してブドウ球菌抗原と係合し、軽鎖のＣ末端または重鎖のＣ末端の一方にロイコトキシン中和構造体を結合することを目的にしている。表５は、設計された融合タンパク質構造体についてまとめている。
【０１９４】
図４Ａの左側の構造体は、各重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。図４Ａの右側の構造体は、各重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。
【０１９５】
図４Ｂの左側の構造体は、各軽鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。図４Ｂの右側の構造体は、各軽鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体を有する、単一特異性二価のｍＡｂを示す。
【０１９６】
図４Ｃの左側の構造体は、各軽鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体及び各重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。図４Ｃの右側の構造体は、各軽鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体及び各重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。
【０１９７】
図４Ｄの左側の構造体は、各重鎖のＣ末端に結合したタンデムＬｕｋＡＢ中和構造体及びＬｕｋＡＢ中和構造体のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。図４Ｄの右側の構造体は、各重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体及びＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。
【０１９８】
図４Ｅは、ブドウ球菌抗原２を認識する重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体、及びブドウ球菌抗原１を認識する重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体を有する、二重特異性、二価のｍＡｂを示す。
【０１９９】
図４Ｆは、１つの重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＡＢ中和構造体及び反対側の重鎖のＣ末端に結合したＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ中和構造体を有する、単一特異性、二価のｍＡｂを示す。
【０２００】
（表５）融合タンパク質構造体の設計
2017502002.tif 000012
2017502002.tif 000013
2017502002.tif 000014
2017502002.tif 000015
【０２０１】
実施例６  ＭＡｂ５１３３は、黄色ブドウ球菌の異なる株に強く結合するがｓｄｇＢ突然変異株には結合しない
ｍＡｂ５１３３は、黄色ブドウ球菌の異なる株に結合し、オプソニン活性を有することがこれまでにわかった（米国特許第８，４６０，６６６号（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって援用される））。ｍＡｂ５１３３の特異性を更に評価するために、黄色ブドウ球菌の異なる株、並びに特定の遺伝子が、配列が確定しているトランスポゾン突然変異体を用いて破壊されたＵＳＡ３００親ＪＥ２株由来の亜株を用いて、ウェスタンブロッティング実験を実施し（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，」ｍＢｉｏ４（１）：ｅ００５３７−１２（２０１３）（これらはその全体が、参照によって援用される））、これらは、Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＡＲＳＡ）から入手した。 
【０２０２】
手順
細胞溶解液の調製には、Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，の「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：３４１５〜３４２６（２００６）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）の調整方法を用いた。黄色ブドウ球菌株を、３７℃、１９０ｒｐｍで、一晩、トリプチックソイブロス中で培養した。トランスポゾン挿入を行う株については、１０μｇ／ｍＬエリスロマイシンを培養培地中に含めた。培養液は、新鮮培地で１：１００に希釈し、５〜６時間培養して、約１．２のＯＤ６００とした。各株については、培養物４．５ｍＬを遠心分離し、細胞ペレットを７５μＬの溶解バッファ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０μｇ／ｍＬリソスタフィン）で再懸濁した。２０分間、３７℃でインキュベーション後、細胞溶解を完了した。その後、溶解産物を６，０００ｒｐｍ、４℃で、２０分間遠心分離にかけて、上澄みを新しいチューブに移動させた。ウェスタンブロッティング分析については、各溶解産物１２μＬを７０℃で１０分間加熱し（ＬＤＳサンプルバッファ及び５０ｍＭ ＤＴＴ）、ＭＯＰＳバッファ中、１５０ボルトで２時間、１０％ビス−トリスゲル（Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で電気泳動させた。ゲルは、ｉＢｌｏｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＶＤＦ膜でブロッティングし、ＦｅｍｔｏＭａｘ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いてＣＲ５１３３でプローブした。
【０２０３】
結果
図５に示すように、溶解液中、高分子量バンド（すなわち、５０ｋＤａ超）で検出されたｍＡｂ５１３３は、黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ２９２１３及び親ＵＳＡ３００株ＪＥ２から産生した。タンパク質ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥを含むセリン−アスパラギン酸繰り返し（ＳＤＲ）を欠失しているＮＡＲＳＡ株（レーン３  ＮＥ４３２（ｓｄｒＣ突然変異体）、レーン４  ＮＥ１２８９（ｓｄｒＤ突然変異体）、レーン５  ＮＥ９８（ｓｄｒＥ突然変異体））では、高分子量バンドもまた検出された。Ｓｏｒｔａｓｅ突然変異体（レーン８  ＮＥ１７８７（ｓｒｔＡ突然変異体）及びプロテインＡ突然変異体（レーン９  ＮＥ２８６（プロテインＡ突然変異体）では不鮮明なバンドが検出された。グリコシルトランスフェラーゼｓｄｇＢ突然変異体（レーン７  ＮＥ１０５（ｓｄｇＢ突然変異体））内では、高分子量バンドは検出されなかったが、グリコシルトランスフェラーゼｓｄｇＡ突然変異体（レーン６  ＮＥ３８１（ｓｄｇＡ突然変異体））では検出された。
【０２０４】
まとめ
ＳＤＲドメイン内のセリンは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の連続的添加（最初にＳｄｇＢ、続いてＳｄｇＡ）により修飾される。（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９（１０）：ｅ１００３６５３（２０１３）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。溶解産物中、ｓｄｇＢ変異体から、ｍＡｂ５１３３を有する高分子量バンドが検出されないことは、ＳｄｇＢによりグリコシル化されたＳＤＲエピトープを認識する５１３３と一致している。
【０２０５】
実施例７  融合タンパク質のＶ８タンパク分解
ヒトＩｇＧ１は、下部ヒンジ領域において切断されやすく、この切断により、インビトロ及びインビボの両者においてＦｃ媒介エフェクター機能が喪失し得る（Ｂｒｅｚｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ  Ｈｏｓｔ  ＩｇＧ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｉｎｇｅ」  ＰＮＡＳ  １０６：１７８６４〜１７８６９（２００９）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。黄色ブドウ球菌プロテアーゼであるＧｌｕＶ８は、下部ヒンジ領域においてアミノ酸Ｅ２３３とＬ２３４との間でヒトＩｇＧ１を切断し、この切断により、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ機能の双方を抑止することがこれまでに明らかになっている（Ｂｒｅｚｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＩｇＧ１  Ｈｉｎｇｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＩｇＧｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：３１８３〜３１９２（２００８）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。ｍＡｂ／ＦＮ３ドメイン構造体を効率良く機能させるためには、双方とも、黄色ブドウ球菌関連抗原に結合可能である必要があり、また、免疫細胞ＦｃγＲまたは補体に付着させて、ファゴサイトーシスが容易になるようにする。タンパク質分解による切断により、ｍＡｂの能力をなくして、免疫エフェクター細胞によるファゴサイトーシスを容易にする。従って、ヒンジ領域を操作して、ＧｌｕＶ８によるタンパク質分解への耐性を増大させた。
【０２０６】
手順
黄色ブドウ球菌プロテアーゼＧｌｕＶ８（ｃａｔ．Ｅ−００６）は、ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍから入手した。抗体濃度は、ＰＢＳ中３．３μＭに固定し、反応は０．６６μＭでＧｌｕＶ８を添加することにより開始し、ＧｌｕＶ８についてはモル比２０％を達成した。消化は、ｐＨ７．５、３７℃で、２４時間実施した。サンプルは、変性条件下で調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ系Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。無処置ＩｇＧの割合は、キャピラリー電気泳動による電気泳動図のプロファイルに基づいて、プロテアーゼ消化サンプル中に残存する無処置ＩｇＧの割合をプロテアーゼ非含有対照サンプル中に残存する無処置ＩｇＧの割合で割ることによって、算出した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。データを解析して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してプロットした。
【０２０７】
結果
図６に示すように、構造体ＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）及びヒトＩｇＧ１野生型（Ｅ２３３／Ｌ２３４／Ｌ２３５／Ｇ２３６）の下部ヒンジを含むＡ６（表５の構造体３）は、ＧｌｕＶ８による２４時間の消化の後でも、１５〜２５％の範囲の無処置ＩｇＧが残存した。構造体ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表５の構造体４）、及び突然変異を有する下部ヒンジ（Ｇ２３６欠失を有し、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ）を有するＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（表５の構造体６）は、２４時間のＧｌｕＶ８消化の後、７０％を超えて、無処置のＩｇＧが残存し、ＧｌｕＶ８に対する耐性の増大を示した。
【０２０８】
まとめ
これらの結果から、下部ヒンジ領域ＩｇＧ１の突然変異により、ＧｌｕＶ８消化への耐性が増大したことがわかる。更に、重鎖のＣ末端で抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインを含んでも、ＧｌｕＶ８切断の感受性に影響を及ぼさなかった。ＦＮ３ドメインを含まない下部ヒンジ突然変異構造体、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）の無処置ＩｇＧの総量は、ＦＮ３ドメインを含有する下部ヒンジ突然変異構造体であるＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ−ＡＢ（構造体６）と同様の、無処置のＩｇＧの残存割合を有した。
【０２０９】
実施例８  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）競合結合アッセイを使用したＦｃγ受容体結合測定
抗ブドウ球菌標的構造体がＦｃγＲと結合する能力を評価するために、競合ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）アッセイを用いた。構造体は、元々、ヒトＦｃγＲに結合するように設計したため、構造体の、ヒト活性化ＦｃγＲ：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）、及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）、並びに阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂへの結合能力に関して、構造体の試験を行った。
【０２１０】
手順
アッセイバッファ（ＰＢＳ、０．０５％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）の入った半量ウェルの９６ウェル不透明プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、ｐＨ７．４で競合結合試験を実施した。固定濃度のビオチン化ＩｇＧ１野生型（１ＩｇＧ：２ビオチン、ＥＺ  Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して）に対して、競合ＩｇＧ１野生型及び抗ブドウ球菌構造体を連続３倍希釈で、すべての競合試験を実施した。アッセイ中ＦｃγＲ最終濃度は、０．２μｇ／ｍｌであった。ビオチン化ＩｇＧ１（最終０．２μｇ／ｍｌ）並びにＩｇＧ１野生型及び抗ブドウ球菌構造体（１０μｌ）を連続して、９６ウェルプレートの各列に繰り返して添加した。その後、指定されたＦｃγＲを添加し、その後、１／５０希釈ニッケルキレート剤（Ｎｉ）受容体ビーズ、及び１／５０希釈ストレプトアビジン（ＳＡ）供与体ビーズ、それぞれ１０μｌを連続添加した。不透明プレートは、アルミニウムシールで覆い、遮光条件を維持し、オービタルシェーカーで３０分間振盪した。その後、シールを取り外し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）の適切なフィルターセットを装備したＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で励起／発光スペクトルの蛍光を読み取った。生データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェアに移して、最大シグナルに対して正規化し、非線形回帰曲線−フィッティングソフトウエアを使用して、競合曲線をプロットした。競合結合曲線は、次の式を使用して作成した：最大シグナル（％）＝（Ｅｘｐ-Ｍｉｎ）／（Ｍａｘ-Ｍｉｎ）ｘ１００（％）。式中、試験品ｍＡｂの最高濃度の存在下で検出されたシグナルによって最小値（Ｍｉｎ）を求め、最大値（Ｍａｘ）は、抗ブドウ球菌構造体のいずれも含まずに、ビオチン化ＩｇＧ１、ＦｃγＲ、ニッケルキレート（Ｎｉ）受容体ビーズ、及びストレプトアビジン（ＳＡ）供与体ビーズのみ含むウェル中で検出されたシグナルによって求めた。
【０２１１】
結果
ヒトＩｇＧ１野生型を有する受容体の、ヒトＦｃγファミリーへの結合に関する、いくつかの構造体の競合能力を評価した。ビオチン化ＩｇＧ１野生型により産生された最大シグナルを低減させる構造体の能力を、図７Ａ〜図７Ｄに示す。図７Ａに示すとおり、ＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）及びＡ６（構造体３）は、強固にヒトＦｃγＲＩを結合した。構造体ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（構造体６）、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）は、任意の試験濃度で、ヒトＦｃγＲＩに結合を示さなかった。構造体ＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）、Ａ６（構造体３）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（構造体６）及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）はすべて、ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）への類似した結合を示した（図７Ｂ）。構造体ＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）及びＡ６（構造体３）は、阻害性ヒトＦｃγＲＩＩｂに対して最も高い結合を示し、構造体ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（構造体６）、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）は、低検出から未検出の結合を示した（図７Ｃ）。構造体ＩｇＧ１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）、Ａ６（構造体３）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（構造体６）、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）はすべて、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）への類似した結合を示した（図７Ｄ）。
【０２１２】
まとめ
下部ヒンジ突然変異（Ｇ２３６欠失を有し、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ）を有するいずれの構造体も、ヒトＦｃγＲＩへの結合を示さず（米国特許公開第２０１３／００１１３８６（Ａ１）号参照）、重鎖または軽鎖のいずれかのＣ末端にＦＮ３ドメインのいずれかを含めても、結合に影響を与えなかった。いずれの構造体も、活性化ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）とＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）へ類似した結合を示し、ＦＮ３ドメインを含めてもこれらの受容体の結合に影響を及ぼさないことが明かになった。構造体ＰＲＡＳＡ  Ａ６（４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（６）、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（７）は、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂへの、低検出から未検出の結合を示した。ヒトＦｃγＲＩＩｂとの低結合並びに活性化受容体ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａとの正常な結合により、目的の細胞傷害の作用機序を有するｍＡｂｓの有効性の増大と考えられる性質である、阻害（Ｉ）に対する活性化（Ａ）指数が増大するため、これは利点となり得る（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ  Ｓｕｂｃｌａｓｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１５１０〜１５１２（２００５）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。
【０２１３】
実施例９  プロテインＡ結合の測定
ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたプロテインＡへの構造体の結合を評価するために、プレート系ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。プロテインＡは、ブドウ球菌毒性因子であり、ヒトＩｇＧ１野生型抗体は、ＩｇＧ１野生型Ｆｃへの結合を介して、ブドウ球菌の表面上に隔離される。本方法は、抗ブドウ球菌ｍＡｂが抗体Ｖ領域を介して表面決定基に結合する能力をなくし、かつ同時に宿主免疫系の液性及び細胞性成分とＦｃとの相互作用を阻止すると考えられる。プロテインＡ結合を除去する意図で、このブドウ球菌毒性因子を回避するために、構造体の遺伝子操作を行った。
【０２１４】
手順
透明９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）で、ＥＬＩＳＡブロッキングバッファ（３％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ）において、プロテインＡ結合の直接ＥＬＩＳＡを実施した。ＰＢＳ中、ビオチン化プロテインＡを２μｇ／ｍｌで、９６ウェルプレートに、１時間室温にてコーティングし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。次にプレートを１時間室温でＥＬＩＳＡブロッキングバッファを用いてブロックした。次いで、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファで３回洗浄した。構造体は、出発濃度１０μｇ／ｍｌでプレートに入れて、次に、プレートで連続して３倍に希釈し、１時間室温でインキュベートした。プレートは、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡブロッキングバッファで１：１５，０００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて構造体を検出し、サンプルは３０分間室温にてインキュベートした。プレートは、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファで５回洗浄した。本アッセイにおけるＨＲＰの基質はＴＭＢ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）であり、ウェルが青色になるまでプレートをインキュベートした。等体積の０．５Ｍ  ＨＣｌをＴＭＢに添加することによって反応を停止させて、プレートは、４５０ｎｍで読み取った。データは、非線形回帰曲線フィットを用いたＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。
【０２１５】
結果
ヒトＩｇＧ１野生型構造体（構造体１）は、プロテインＡとの検出可能な結合を示した。ＣＨ３の突然変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（すなわち、Ａ６（構造体３）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ（構造体６）及び、ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）を含むすべての構造体は、いずれの試験濃度でもプロテインＡへの検出可能な結合を示さなかった（図８）。
【０２１６】
まとめ
ＣＨ３の突然変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆでは、このアッセイで評価したとおり、プロテインＡ結合が上手く除去された。重鎖または軽鎖のＣ末端のいずれか一方にＦＮ３ドメインを含めても、プロテインＡ結合に影響を及ぼすことはなかった。
【０２１７】
実施例１０  フローサイトメトリーによる測定時の全細菌への結合
ｍＡｂ及びＦＮ３ドメイン−ｍＡｂコンジュゲートの黄色ブドウ球菌のＮｅｗｍａｎ株表面への結合は、フローサイトメトリー解析を使用して評価した。黄色ブドウ球菌毒性因子プロテインＡは、抗体のＦｃ部分を介してＩｇＧ１に結合することができ、分析が混同する可能性もあるため、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ突然変異を有するＡ６と称す抗体を使用して、ブドウ球菌表面上に発現したプロテインＡに対するｍＡｂのＦｃ領域の非特異的結合を取り除いた（実施例９を参照されたい）。このため、Ａ６（構造体３）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）及びｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲート（それぞれＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ突然変異を含む）を比較した。選択された黄色ブドウ球菌株に関して、構造体の結合が少ない／陰性であったため、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（Ｇ２３６欠失）Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（「ＰＲＡＳＡ  Ａ６アイソタイプ対照」と称される）の定常領域突然変異を含むリポテイコ酸（ＬＴＡ）特異的Ｖ領域を有する構造体を、陰性対照として使用した。
【０２１８】
手順
黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株は、培養液が、ＯＤ６００ｎｍ約０．５に到達するまで、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）モディファイド培地中、３７℃、２２５ｒｐｍで振盪して、増殖させた。１０％グリセロール（最終）の入った凍結保存バイアルでアリコートを凍結させた。バイアル瓶を解凍して、連続希釈及びＢＨＩ寒天プレート上での増殖によるコロニー形成単位の測定に使用した。フローサイトメトリー分析では、Ｎｅｗｍａｎ株を５ｘ１０６コロニー形成単位／ウェルで播種させて、ｍＡｂ５１３３構造体を指示された連続希釈で、３０分間、室温にて、ＦＡＣＳバッファ中で、インキュベートした。構造体を検出するためにＡｌｅｘａ６４７を結合したＦ（ａｂ'）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖）２０μｇ／ｍｌで染色する前に、サンプルをＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ及びＦｌｏｗｊｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してサンプルを分析した。これらの実験は、２回繰り返され、類似した結果となった。
【０２１９】
結果
図９に示すように、フローサイトメトリー結合により評価するとき、構造体Ａ６（構造体３）、ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ−ＡＢ（構造体６）は、黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株へ同様に結合した。抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインを軽鎖に添加することにより、ＦＮ３ドメインコンジュゲートを含まない同一の抗体と比較して、構造体ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ（構造体５）及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ（構造体７）の結合は、約２〜３倍減少した（ＥＣ５０試験、ｍＡｂ／ＥＣ５０ＰＲＡＳＡ  Ａ６（構造体４）により算出）。
【０２２０】
まとめ
抗ＬｕｋＡＢを重鎖に付加することによって黄色ブドウ球菌への抗体の結合に影響を及ぼすことはなかったが、抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメインを軽鎖のＣ末端に付加することにより、黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株への結合の検出がわずかに減少した（２つの独立した実験においてＥＣ５０が２〜３倍変動）。
【０２２１】
実施例１１  ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートによる、ロイコトキシン媒介免疫細胞死滅の中和
ｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン５１３３コンジュゲートの機能性を評価するために、ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢの中和の評価に関して記載された、細胞系細胞傷害中和アッセイを用いた。
【０２２２】
手順
ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢ中和活性に関して、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン５１３３コンジュゲートをスクリーニングするにあたって、７５ｎＭのＬｕｋＥＤ及び１８．７５のｎＭ  活性ＬｕｋＡＢ毒素を、別々に、最終体積３０μｌ中、増加濃度での、異なるｍＡｂ変異体（ＩｇＧ１アイソタイプ対照；Ａ６構造体３、ＰＲＡＳＡ  Ａ６構造体４）；ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ構造体５；ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｄ構造体８； ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ構造体６；ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ構造体７；ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  ＡＢ−Ｄ構造体９；及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  Ｄ−ＡＢ構造体１０）と、３０分間、氷上でインキュベートした。その後、新たに単離した初代ヒト好中球（ｈＰＭＮ）、２ｘ１０５細胞／ＲＰＭＩ ７０μｌ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＡＳを毒素−ｍＡｂ混合物に添加し、１時間、３７℃、５％ＣＯ２のインキユベーターでインキュベートした。インキュベーションの１時間後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出を観察することにより、膜損傷を測定した。上澄み５０μｌを取り出して、５０μｌのＬＤＨ試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の入ったウェルに添加し、更に３０分間、室温にてインキュベートした。ＬＤＨ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して測定し（励起５５５ｎｍ、発光５９０ｎｍ）、データは、０．１％  ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により誘導された１００％のＰＭＮ細胞溶解液に対して正規化した。
【０２２３】
結果
異なるｍＡｂ５１３３及びｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン５１３３コンジュゲートが、ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢのヒトＰＭＮに対する細胞傷害活性を中和する能力を評価した。これらの試験から、ＬｕｋＤ（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  構造体５及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｄ構造体８）または抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメイン（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ構造体６）を有するＦＮ３ドメイン−ｍＡｂコンジュゲートは、ＦＮ３ドメインを軽鎖または重鎖に付加するかどうかに関係なく（ＰＲＡＳＡ  Ａ６ ＬＣ−Ｄ構造体５ 対 ＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ−Ｄ構造体８）（図１０Ａ）、それぞれの毒素を中和することができることが判明した。さらに、ＬｕｋＤ及びＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインの両者のｍＡｂ５１３３への同時コンジュゲートも（ＰＲＡＳＡ  Ａ６ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ構造体７、ＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ  ＡＢ−Ｄ構造体９、及びＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ  Ｄ−ＡＢ構造体１０）（図１０Ａ〜１０Ｂ）、それぞれの毒素の強力な中和をもたらした。
【０２２４】
まとめ
これらの試験から、ＦＮ３ドメイン−ｍＡｂコンジュゲートのみが、ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢによる初代ｈＰＭＮの死滅を阻止することができるが、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、Ａ６構造体３、またはＰＲＡＳＡ  Ａ６構造体４ｍＡｂは、これを阻止することはできないことがわかる。まとめると、これらのデータにより、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートが機能的であり、かつ、強力なブドウ球菌毒素の細胞傷害活性を阻止することができることが確証される。
【０２２５】
実施例１２  ファゴサイトーシス後の、ヒト好中球の黄色ブドウ球菌−媒介死滅モデルにおけるｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートの中和効果
ブドウ球菌より産生される二成分毒素のうちＬｕｋＡＢは、生きている細菌によるエクスビボ感染中のヒト好中球（ｈＰＭＮ）の死滅に関与している。ブドウ球菌が産生するＬｕｋＡＢは、形質膜またはファゴソーム膜を標的にすることにより、ファゴサイトーシス後にｈＰＭＮを死滅させる。ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートが、ファゴサイトーシス後の生存ブドウ球菌のＬｕｋＡＢが媒介する死滅からｈＰＭＮを保護しているかどうかを評価するために、エクスビボ感染モデルを開発した。
【０２２６】
手順
ブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎ（高毒性メチシリン感受性株）を、５時間、１：１００／ＲＰＭＩ＋ＣＡＳで継代培養し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）中で１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬに標準化した。標準化した細菌の１ｍＬアリコートは遠心分離によりペレット化し、３００μｌの、異なるｍＡｂ５１３３またはｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲート１．５ｍｇ／ｍｌ、またはＰＢＳ（非オプソニン化）に再懸濁した。サンプルをＲＰＭＩ−ＨＨで最大１ｍＬとし、その後、オプソニン化のために２０分間、３７℃でインキュベートした。その後、約１０：１（細菌：ｈＰＭＮ）の感染効率（ＭＯＩ）で、ＥｔＢｒを補充したＲＰＭＩ−ＨＨ中、オプソニン化細菌を、新たに単離した初代ｈＰＭＮ２ｘ１０５と混合した。細菌及び細胞は、７分間、１５００ＲＰＭで遠心分離により同調させ、３７℃、５％ＣＯ２インキユベーターに入れた。ｈＰＭＮ膜透過性の指標として、２時間感染中、臭化エチジウム蛍光を測定した。
【０２２７】
結果
異なるｍＡｂ５１３３及びｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン５１３３コンジュゲートの、ブドウ球菌ファゴサイトーシス後に、ｈＰＭＮを保護しＬｕｋＡＢの細胞傷害活性を中和する能力を評価した。これらの実験により、ＰＢＳ処理済み細菌（ｍＡｂではなく）と比較して、Ａ６構造体３及びＰＲＡＳＡ  Ａ６構造体４ｍＡｂは、黄色ブドウ球菌が媒介する死滅からのｈＰＭＮの保護は最小限であることを実証する。その一方で、試験対象のｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲート、ＰＲＡＳＡ  Ａ６ＨＣ−ＡＢ構造体６及びＰＲＡＳＡ  Ａ６ＬＣ−Ｄ  ＡＢ構造体７の両者により、ｈＰＭＮはファゴサイトーシス後のＬｕｋＡＢ媒介膜損傷から保護された。抗ＬｕｋＡＢ及び抗ＬｕｋＤＦＮ３ドメインを両方含有するコンジュゲートと比較して、抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインのみを含有するｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲート間で、著しい差異は観察されなかった（図１１）。これらの所見は、エクスビボ感染モデルにおいて、ＬｕｋＥＤの産生を欠いている点と一致する（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４〜８２５（２０１１）；Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３〜４３５（２０１２）；ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｌａｂｏｒａｔｅｓ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ＡＢ  ｔｏ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．８１：１８３０〜１８４１（２０１３）（これらはすべて、参照によってその全体が援用される））。
【０２２８】
まとめ
これらの実験は、ファゴサイトーシス後の、ブドウ球菌ＬｕｋＡＢ媒介細胞傷害が、ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートにより細胞内から中和されることができることを確証する。
【０２２９】
実施例１３  黄色ブドウ球菌の好中球−媒介死滅モデルにおけるｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートの中和効果
ＬｕｋＡＢは、ファゴサイトーシス後、ｈＰＭＮを死滅させ、ブドウ球菌のエスケープ及び増殖を促進する（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４〜８２５（２０１１）；ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｌａｂｏｒａｔｅｓ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ＡＢ  ｔｏ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．８１：１８３０〜１８４１（２０１３）、ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｋｉｌｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ１１ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１０：１０７９４〜１０７９９（２０１３）、（これらはすべて、参照によってその全体が援用される））。ＬｕｋＡＢを欠失している同質遺伝子型の欠失変異株によるｈＰＭＮの感染は、エクスビボＯＰＫアッセイにおいて、ＬｕｋＡＢ活性を阻止することによって細菌増殖が減少することを示唆した（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４〜８２５（２０１１）；ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｌａｂｏｒａｔｅｓ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ＡＢ  ｔｏ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．８１：１８３０〜１８４１（２０１３）、ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｋｉｌｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ１１ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１０：１０７９４〜１０７９９（２０１３）、（これらはすべて、参照によってその全体が援用される））。ＬｕｋＡＢ  ｍＡｂ-ＦＮ３ドメインコンジュゲートが黄色ブドウ球菌増殖のｈＰＭＮ媒介制御を促進するかどうかを調査するために、ＯＰＫアッセイを実施し、ＧＦＰ蛍光を測定することによって細菌増殖を観察した。
【０２３０】
手順
これらの実験では、ｓａｒＡプロモーターを用いることによって、構成的に緑色蛍光タンパク質(ｇｆｐ)を発現するプラスミドを含むブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ）を用いた。ＧＦＰ標識細菌は、５時間、クロラムフェニコールを補充したＲＰＭＩ＋ＣＡＳにおいて１：１００で継代培養し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）中、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬに標準化した。標準化したバクテリアの１ｍＬアリコートは遠心分離によりペレット化し、３００μｌの、異なるｍＡｂまたはｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲート１．５ｍｇ／ｍｌ、またはＰＢＳ（非オプソニン化）に再懸濁した。サンプルをＲＰＭＩ−ＨＨで最大１ｍＬとし、その後、オプソニン化のために２０分間、３７℃でインキュベートした。その後、約１０：１（細菌：ｈＰＭＮ）の感染効率（ＭＯＩ）にて、ＲＰＭＩ−ＨＨ中、オプソニン化細菌を、新たに単離した初代ｈＰＭＮ２ｘ１０５と混合した。細菌及び細胞は、７分間、１５００ＲＰＭで遠心分離により同調させ、３７℃、５％ＣＯ２インキユベーターに入れた。細菌増殖の指標として、感染の５時間後、ＧＦＰ蛍光を測定した。
【０２３１】
結果
異なるｍＡｂ５１３３及びｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン５１３３コンジュゲートの、ｈＰＭＮが媒介するブドウ球菌の増殖制限を促進する能力を評価した。これらの実験により、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、Ａ６構造体３及びＰＲＡＳＡ  Ａ６構造体４の両者が、ｈＰＭＮが媒介する黄色ブドウ球菌増殖の制限を促進することを示す（図１２）。これは、５１３３ｍＡｂのオプソニン能力と一致する。重要なことに、ＰＲＡＳＡ  Ａ６親ｍＡｂ（構造体４）と比較して、ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメイン−ｍＡｂ５１３３コンジュゲート（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−ＡＢ構造体６及びＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ  ＨＣ−ＡＢ構造体７）により、ＰＭＮが媒介する増殖制限が改善された（図１２）。ＣＲ５１３３／抗ＬｕｋＤ  ＦＮ３ドメイン−ｍＡｂ（ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＬＣ−Ｄ構造体５）により増殖制限が強化されない点は、エクスビボ感染モデル中、ＬｕｋＥＤ生成物が最小であるこれまでの所見と一致する（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：８１４〜８２５（２０１１）；Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３〜４３５（２０１２）；ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｌａｂｏｒａｔｅｓ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ＡＢ  ｔｏ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．８１：１８３０〜１８４１（２０１３）（これらはすべて、参照によってその全体が援用される））。
【０２３２】
まとめ
これらの実験は、抗ＬｕｋＡＢ  ｍＡｂ−ＦＮ３ドメインコンジュゲートが、ＬｕｋＡＢを中和し、ｈＰＭＮが媒介するブドウ球菌の増殖制限を促進することを確証する。
【０２３３】
実施例１４：黄色ブドウ球菌細胞溶解液による、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂−結合ＳｄｒＣ４タンパク質のインビトログリコシル化により、ｍＡｂ５１３３によって認識されるエピトープとなる
ＳＤＲ含有タンパク質のＳｄｇＢ媒介グリコシル化によって、ｍＡｂ５１３３によって認識される特異的エピトープの産生がもたらされることを更に確認するために、異なる黄色ブドウ球菌株から調製された細胞溶解液及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離され、ウェスタンブロッティング分析により分析された反応生成物を使用して、代表的ＳＤＲタンパク質（大腸菌から精製された組換え型ＳｄｒＣ４タンパク質）のインビトログリコシル化が行われた。これらの試験には、ｓｄｇＡまたはｓｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼのいずれかを不活性化するトランスポゾンの挿入と共に、ＵＳＡ３００親ＪＥ２黄色ブドウ球菌株及び突然変異体を使用し（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，」ｍＢｉｏ４（１）：ｅ００５３７〜１２（２０１３））（これらはその全体が、参照によって援用される）、これらは、Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＡＲＳＡ）から入手した。
【０２３４】
手順
溶解産物は、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２、ＮＥ３８１（ＪＥ２のｓｄｇＡトランスポゾン突然変異体）及びＮＥ１０５（ＪＥ２のｓｄｇＢトランスポゾン突然変異体）から調製した。これらの菌株の２５ｍＬ培養液をトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中、３７℃、２００ｒｐｍで増殖させ、ＯＤ６００  ０．４〜０．６の時点で、細胞を遠心分離（６，０００ｒｐｍ１０分間）により採取した。細胞ペレットは、２００μｇリソスタフィン及びＵｎｉｖｅｒｓａｌヌクレアーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ８８７００）２５０ユニットを含有する１ｍＬ  ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ９０４３）で再懸濁した。細胞は、３７℃で４５分間インキュベートし、その後１３，０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離した。上澄み７５０μＬを別のチューブに入れ、氷上に置いた。大腸菌から精製された組換え型ＳｄｒＣ４タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ  １０１８２４４）に結合させた。具体的には、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース１００μＬをマイクロチューブに入れ、遠心分離して、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、完全にＥＤＴＡ非含有）を含有する５００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。その後、樹脂を、約３００μｇのタンパク質と再懸濁し、ロッキングプラットフォーム上で、４℃で１．５時間、インキュベートした。その後、樹脂を１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、５００μＬの洗浄バッファ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０、プラス、プロテアーゼインヒビター）で１回洗浄した。その後、樹脂を、３００μＬのＰＢＳまたは黄色ブドウ球菌溶解産物のいずれかで再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、サンプルを遠心分離して、５００μＬの洗浄バッファで３回洗浄し、結合したタンパク質を１５０μＬ溶出バッファ（２５０ｍＭイミダゾール含有洗浄バッファ）で、５分間、室温にて溶出した。
【０２３５】
ウェスタンブロッティング分析については、溶出したタンパク質を、１００ｍＭ  ＤＴＴ含有１ｘＬＤＳサンプルバッファ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０００７）中、７０℃で１０分間加熱し、その後、ＭＯＰＳバッファ中、１５０ボルトで、１時間４０分、２つの１０％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動させた。電気泳動後、１つのゲルをコロイドブルー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ４６−７０１５及び４６−７０１６）で染色し、他のゲルは、ｉＢｌｏｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＩＢ４０１００２）にブロッティングした。ＰＶＤＦブロットを、１：５００希釈したｍＡｂ５１３３でプローブし、その後、ＦｅｍｔｏＭａｘ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＫＣＡ００１）を使用して検出した。
【０２３６】
結果
図１３に示すとおり、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２から調製した溶解産物と共に樹脂結合ＳｄｒＣ４タンパク質をインキュベートしたもの（パネルＢ、レーン２及び６）、及びさもなければ同質遺伝子型のｓｄｇＡ突然変異誘導体（パネルＢ、レーン３及び７）により、ｍＡｂ５１３３を用いるウェスタンブロットによって特定の約９５ｋＤａ種が検出された。対照的に、樹脂結合ＳｄｒＣ４タンパク質を、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２のｓｄｇＢ変異誘導体から調製された溶解産物とインキュベーションしたもの（パネルＢ、レーン４及び８）、または細胞可溶化物がＰＢＳに置換された対照サンプル（パネルＢ、レーン１及び５）では、ｍＡｂ５１３３によるこうしたタンパク質バンドはいずれも検出されていない。図１３、パネルＡに示されたコロイドブルー染色から、本質的に等価量の組換え型ＳｄｒＣ４タンパク質がレーン１〜４及びレーン５〜８に入ったことがわかる。
【０２３７】
まとめ
ＪＥ２株のｓｄｇＢ突然変異体から調製した溶解産物によるカラム結合ＳｄｒＣ４タンパク質のインキュベート後、ｍＡｂ５１３３により約９５ｋＤａタンパク質バンドが検出されないということは、ＳｄｇＢがＳｄｒＣタンパク質に関して特異的なグリコシルトランスフェラーゼであり、ｍＡｂ５１３３のエピトープの作製に必要であるという主張を更に裏付ける。
【０２３８】
実施例１５：精製ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼタンパク質によるＳｄｒＣ４またはＳｄｒＣ５タンパク質のインビトログリコシル化により、ｍＡｂ５１３３により認識されるエピトープが発生する
ＳｄｇＢが媒介するＳＤＲ含有タンパク質のグリコシル化により、ｍＡｂ５１３３により認識される特定のエピトープが作製されることを更に確認するために、黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え形態、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離しウェスタンブロッティング分析により分析した反応生成物を使用して、代表的ＳＤＲタンパク質（ＳｄｒＣ４またはＳｄｒＣ５）のインビトログリコシル化を行った。
【０２３９】
手順
Ｃ末端にポリヒスチジン（Ｈｉｓ）６アフィニティタグ（配列番号９９）を担持する黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え形態を、大腸菌中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを介して精製した。インビトログリコシル化反応に関しては、組換え型ＳｄｒＣ４（配列番号１００）またはＳｄｒＣ５（配列番号１０１）タンパク質１００μｇを、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）＋／−３０μｇ、組換え型ＳｄｇＢ  ＋／−４μｇと、最終体積１００μｌの１００ｍＭトリスｐＨ７．５、または１００μｌの１００ｍＭトリスｐＨ７．５、プラス、１０％グリセロールで、３７℃にて１時間でインキュベートした。ウェスタンブロッティング分析では、まず、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分け、ここでは、１μｇ  タンパク質／レーンを、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル（ＮＰ０３３５ＢＯＸ）で、ダイフロントがゲル底部に到達するまで２００Ｖの定電圧で分離した。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔを用いて、ＰＶＤＦ膜にタンパク質（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉＢｌｏｔ  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ  ＰＶＤＦ  ＩＢ４０１００２）に移動させた。
【０２４０】
図１４Ａ、パネルＡでは、一次抗体は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中の、２μｇ／ｍｌの構造体３（ｍＡｂ５１３３Ａ６、配列番号６４ＨＣ及び６５ＬＣ）であり、二次検出抗体は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡで１：１０，０００希釈した、ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（１０９−０３６−０８８ロット１０１４２１））を用いるウェスタンブロッティングであった。ＨＲＰ化学発光基質検出溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ）中でインキュベート後、ブロットをＸ線フィルムに曝露した。図１４Ａ、パネルＢでは、抗Ｈｉｓタグ検出用の一次抗体は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中、１：２０００希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗６ｘヒスチジンｍＡｂ（ＭＡＢ０５０Ｈ  ｌｏｔ  ＥＧＥ０６０８０４１，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）であり、その後、Ｘ線フィルムを介して検出された。
【０２４１】
図１４Ｂ、パネルＡでは、一次抗体は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中の、２μｇ／ｍｌの構造体３（ｍＡｂ５１３３  Ａ６、配列番号６４ＨＣ及び６５ＬＣ）であり、二次検出抗体は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡで１：１０，０００希釈した、ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（１０９−０３６−０８８ロット１０１４２１））を用いるウェスタンブロッティングであった。ＨＲＰ化学発光基質検出溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ）中でインキュベート後、ブロットをＸ線フィルムに曝露した。ブロットは、その後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを用いてストリッピングし、その後、抗−Ｈｉｓ検出は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中、１：２０００希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗６ｘヒスチジンｍＡｂ（ＭＡＢ０５０Ｈ  ｌｏｔ  ＥＧＥ０６０８０４１，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、その後、Ｘ線フィルムを介して検出した（図１４Ｂ、パネルＢ）。
【０２４２】
図１４Ｃ、パネルＡでは、一次抗体は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＭＢ−０７０）中の、２μｇ／ｍｌの構造体１（ｍＡｂ５１３３、配列番号６０ＨＣ及び６１ＬＣ）であった。二次検出は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｌｉ−ｃｏｒ  ９２６−３２２３２を用いて、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩｎｆｒａＲｅｄ  ｉｍａｇｅｒで検出した。図１４Ｃ、パネルＢでは、抗−Ｈｉｓ検出は、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中、１：２０００希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗６ｘヒスチジンｍＡｂ（ＭＡＢ０５０Ｈ  ｌｏｔ  ＥＧＥ０６０８０４１，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、その後、Ｘ線フィルムを介して検出した。
【０２４３】
結果
図１４Ａ、１４Ｂ、及び１４Ｃに示すとおり、ＳｄｇＢ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの両者の存在下での、大腸菌から精製された組換え型ＳｄｒＣ４またはＳｄｒＣ５タンパク質のインキュベーションにより、構造体１（ｍＡｂ５１３３、配列番号６０ＨＣ及び６１ＬＣ）及び構造体３（ｍＡｂ５１３３  Ａ６、配列番号６４ＨＣ及び６５ＬＣ）によって検出される種が作製される。すべてのレーン中でのＳｄｒＣ４及びＳｄｒＣ５構造体の（Ｈｉｓ）６エピトープの検出により、ほぼ等量のタンパク質が存在することが確認される。
【０２４４】
まとめ
これらの結果により、ＳｄｇＢが媒介するグリコシル化の後、ｍＡｂ５１３３のみが、ＳＤＲファミリータンパク質を検出するという、これまでの観測結果が更に実証される。
【０２４５】
実施例１６:ｍＡｂ５１３３は、黄色ブドウ球菌リポテイコ酸（ＬＴＡ）に特異的に結合しない
黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸（ＬＴＡ）は、これまで、ｍＡｂ５１３３の細胞標的として同定されてきた（米国特許第８，４６０，６６６号（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，）（その全体が、参照によって援用される））。これが本当であるかを判断するために、ｍＡｂ５１３３の、黄色ブドウ球菌表面結合ＬＴＡ、及び組換え型ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質への相対的な結合を、平行ＥＬＩＳＡ形式のアッセイで判定した。ＬＴＡ結合の陽性対照として、ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ（配列番号１０２  ＨＣ  ＋配列番号１０３  ＬＣ）、よく特性決定された抗ＬＴＡ  ｍＡｂ（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｉ．，  「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，」Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２（３）：１７１〜９（２００２）；  Ｗｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ａｄｕｌｔｓ」  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９：６３９〜６４４（２００９）（その全体が、参照として本明細書に援用される）が挙げられる。ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質およびＬＴＡの両者の結合に関する陰性対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）糖タンパク質を特異的に標的にするｍＡｂであるＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣ＋配列番号１０５  ＬＣ）もまた挙げられる。
【０２４６】
手順
高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＳｄｇＢ−グリコシル化組換え型ＳｄｒＣ４タンパク質または黄色ブドウ球菌リポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ）のいずれかで、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬでコーティングし、一晩、４℃でインキュベートした。プレートは、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、ブロッキングバッファ（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔｈｅｒｍｏ  ３７５１５）で、１時間、周囲温度にてブロックした。別の希釈用プレートで、３％ＢＳＡ−ＰＢＳブロッキングバッファ中、抗体を、１０μｇ／ｍＬで開始して連続して３倍希釈した。ＥＬＩＳＡプレートは、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファで３回洗浄し、抗体希釈物は、希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移動させて、１時間、周囲温度にてインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファで３回洗浄し、二次ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−０３５−０９８）をブロッキングバッファ中１：１５，０００で希釈してプレートに添加した。プレートは、１時間、周囲温度にて二次抗体でインキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファで５回洗浄した。次に、ＴＭＢ基質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）をプレートに添加し、約４分発色させて、その後、０．５ＭＨＣｌを添加して反応を停止させた。吸光度は、４５０ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで読み取った。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して解析した。値を、ログスケールに変換して、非線形回帰Ｓ字用量反応式を用いてフィットさせ、各抗原に対する各抗体に関して、１１の点を有する曲線がもたらされる。
【０２４７】
結果
図１５、パネルＡに示すように、ｍＡｂ５１３３は、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質への強力な及び濃度依存性結合を示す。対照的に、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質への結合は、ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂまたはＣＮＴＯ３９３０のどちらでも、検出されていない。図１５、パネルＢでは、各被験物質と精製黄色ブドウ球菌ＬＴＡとの相対的な結合を示し、予想されたとおり、ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂは強力かつ濃縮依存性結合を示した。対照的に、ＣＮＴＯ３９３０またはｍＡｂ５１３３ではそれぞれ、ＬＴＡへの結合が検出されないか、または非常に弱い結合が検出される。ｍＡｂ５１３３の黄色ブドウ球菌ＬＴＡへの明らかに弱い結合は、未変性ＳＤＲタンパク質のＬＴＡ調製物への混入が原因となる可能性があり、ＬＴＡの調製物には、多くの場合、宿主タンパク質が混入していることが周知である（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２（１）：１０７〜１１８  （１９７８）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。
【０２４８】
まとめ
これらの結果から、ｍＡｂ５１３３は、ＳｄｇＢ−グリコシル化ＳＤＲファミリータンパク質を認識し、ＬＴＡを認識しないことが示唆される。
【０２４９】
実施例１７：ｍＡｂ５１３３、並びにＰＲＡＳＡ及び／またはＡ６の突然変異担持変異体は、ヒト及びマウスＦｃＲｎ受容体への結合を保持する
ＰＲＡＳＡ及びＡ６の突然変異が、抗体のインビボ半減期の決定において重要な役割を担うＦｃＲｎ受容体との結合を著しく妨げないことを示すために（Ｋｕｏ＆Ａｖｅｓｏｎ，「Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＩｇＧ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」ｍＡｂｓ  ３（５）：４２２〜３０（２０１１）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、ＥＬＩＳＡ型競合結合アッセイでの、精製したヒト及び／またはマウスＦｃＲｎ受容体への結合に関して、ｍＡｂ５１３３、並びにＰＲＡＳＡ及び／またはＡ６の突然変異を担持する変異体の試験を行った（Ｋｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８８：３０８４３〜３０８５４（２０１３）、（すべての目的において、その全体が、参照によって援用される））。
【０２５０】
手順
使用した被験物質は、ｍＡｂ５１３３（配列番号６０ＨＣ及び６１ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ（配列番号６２ＨＣ及び６３ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  Ａ６（配列番号６４ＨＣ及び６５ＬＣ）、及びｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（配列番号６６ＨＣ及び６７ＬＣ）であった。競合ｍＡｂとして、ＣＮＴＯ  ３９２９（配列番号１０６  ＨＣ及び１０７  ＬＣ）、ヒトＩｇＧ１抗体標的呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）糖タンパク質を用いた。競合的結合アッセイを使用して、ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６の組換え形態に対する異なる被験物質の相対的なアフィニティを評価した（ＦｃＲｎの膜貫通及び細胞質ドメインは、ポリヒスチジンアフィニティタグにより置き換えられた）。これらのアッセイで使用する前に、被験物質及びＣＮＴＯ  ３９２９は、ＭＥＳバッファ（０．０５Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）で、一晩、４℃で透析した。９６ウェルの銅コーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５μｇ／ｍＬでＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６を捕捉し、そのプレートを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ約５で洗浄し、その後、ブロッキング試薬（０．０５Ｍ  ＭＥＳ、０．０２５％ＢＳＡ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０、プラス、１０％ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でインキュベートした。プレートは、前述のとおり洗浄し、その後、ブロッキング試薬中で競合試験抗体を連続希釈し、固定濃度１μｇ／ｍＬのＣＮＴＯ３９２９のビオチン化調製物の存在下で、プレートに添加した。プレートを室温で、１時間インキュベートし、前述のとおり３回洗浄し、その後、１：１０，０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、室温にて、３０分間インキュベートした。プレートは、上記のとおり５回洗浄し、結合ストレプトアビジン−ＨＲＰは、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質を添加することにより、Ｓｔａｂｌｅ  Ｓｔｏｐ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で検出し、４分間インキュベートした。発色は、０．５Ｍ  ＨＣｌを添加することにより停止させた。光学密度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて波長４５０ｎｍで測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５を用いて、Ｓ字用量応答曲線にフィッテイングした。
【０２５１】
結果
図１６（パネルＡ）に示すように、ＰＲＡＳＡ及び／またはＡ６に突然変異を担持するｍＡｂ５１３３は、このインビトロ競合的結合アッセイ（ｐＨ６．０で実施）において用いられる条件下にて、ヒトＦｃＲｎ受容体への区別不能な結合を示す。同様に、図１６（パネルＢ）に示すとおり、ＰＲＡＳＡ及びＡ６の両方に突然変異を担持するｍＡｂ５１３３変異体は、このインビトロ競合的結合アッセイにおいて用いられる条件下にて、ｍＡｂ５１３３のものとほぼ同一であるマウスＦｃＲｎ受容体への結合を示す。
【０２５２】
まとめ
ＰＲＡＳＡ及びＡ６の突然変異を、単独でまたは組合わせて導入した場合、ｍＡｂ５１３３変異体の、インビトロでのヒトまたはマウスＦｃＲｎ受容体に対するアフィニティへの影響は、検出されるとしても最小である。
【０２５３】
実施例１８：ＰＲＡＳＡ及び／またはＡ６に突然変異を担持する融合タンパク質は、ヒトＦｃＲｎ受容体への結合を保持する
ｍＡｂ−ＦＮ３ドメイン融合タンパク質の文脈において、ＰＲＡＳＡ及びＡ６変異体が、ＦｃＲｎ受容体の結合を有意に妨げないことを示すために、一連の、ＰＲＡＳＡ及び／またはＡ６に突然変異を担持する融合タンパク質について、ＥＬＩＳＡ型競合結合アッセイで、精製ヒトＦｃＲｎ受容体への結合に関して、試験を行った（Ｋｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８８：３０８４３−３０８５４（２０１３）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））。
【０２５４】
手順
使用した被験物質は、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（配列番号６６  ＨＣ及び６７  ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  ＬｕｋＡＢ（配列番号７０  ＨＣ及び７１  ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  ＬｕｋＤ（配列番号７４  ＨＣ及び７５  ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  ＬｕｋＤ  ＨＣ  ＬｕｋＡＢ（配列番号７８  ＨＣ及び７９  ＬＣ）及びｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ  ＬｕｋＡＢ  ＨＣ  ＬｕｋＤ（配列番号７６  ＨＣ及び７７  ＬＣ）であった。競合ｍＡｂとして、ＣＮＴＯ  ３９２９（配列番号１０６  ＨＣ及び１０７  ＬＣ）、ヒトＩｇＧ１抗体標的呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）糖タンパク質を用いた。競合的結合アッセイを使用して、組換え形態であるヒトＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６（ＦｃＲｎの膜貫通及び細胞質ドメインが、ポリヒスチジンアフィニティタグにより置き換えられたもの）に対する、異なる被験物質の相対的なアフィニティを評価した。これらのアッセイで使用する前に、被験物質は、ＭＥＳバッファ（０．０５Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）で、一晩、４℃で透析した。９６ウェルの銅コーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５μｇ／ｍＬでＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６を捕捉し、その後、プレートを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ約５で洗浄し、その後、ブロッキング試薬（０．０５Ｍ  ＭＥＳ、０．０２５％ＢＳＡ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０、プラス、１０％ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でインキュベートした。プレートは、前述のとおり洗浄し、その後、ブロッキング試薬中で競合試験抗体を連続希釈し、固定濃度１μｇ／ｍＬのＣＮＴＯ３９２９のビオチン化調製物の存在下で、プレートに添加した。プレートを室温で、１時間インキュベートし、前述のとおり３回洗浄し、その後、１：１０，０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、室温にて、３０分間インキュベートした。プレートは、上記のとおり５回洗浄し、結合ストレプトアビジン−ＨＲＰは、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質を添加することにより、Ｓｔａｂｌｅ  Ｓｔｏｐ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で検出し、４分間インキュベートした。発色は、０．５Ｍ  ＨＣｌを添加することにより停止した。光学密度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて波長４５０ｎｍで測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５を用いて、Ｓ字用量応答曲線に対してフィッテイングした。
【０２５５】
結果
図１７に示すように、抗ＬｕｋＤ及び／または抗ＬｕｋＡＢ  ＦＮ３ドメインが重鎖に結合したｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６系融合タンパク質は、ヒトＦｃＲｎ受容体への結合を示すが、このインビトロ競合的結合アッセイ（ｐＨ６．０にて実施）において用いられる条件下では、親ｍＡｂ(ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６)と比較して、融合タンパク質に関しては若干弱い結合が観察された。
【０２５６】
まとめ
ＰＲＡＳＡ及びＡ６突然変異の導入は、インビトロでのヒトＦｃＲｎ受容体に対するｍＡｂ５１３３系融合タンパク質のアフィニティに最小の影響を有する。
【０２５７】
実施例１９：Ａ６突然変異を担持するｍＡｂ１５３３の変異体は、黄色ブドウ球菌ＩｇＧ結合タンパク質、プロテインＡ、またはＳｂｉのいずれにも関与することはできない
黄色ブドウ球菌は、２つの公知の免疫グロブリン結合タンパク質である、プロテインＡ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｔ．  Ｊ．，「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９４８〜９５８（２００５）を参照されたい（その全体が、参照によって本明細書に援用される））、及び免疫グロブリンの第２の結合タンパク質（Ｓｂｉ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  ＩｇＧ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：９８５〜９９１  （１９９８）（その全体が、参照によって本明細書に援用される）を発現し、これらは、それぞれ、細胞表面に固定された形態または分泌形態で提示され（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｂｉ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｃｃｕｒｓ  Ｂｏｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ａｎｄ  Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣｅｌｌＥｎｖｅｌｏｐｅ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ」Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８３：７８９〜８０４（２０１２）；  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  １１１（４）：１５７４〜９（２０１４）（これによって、その全体が参照によって援用される））、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域への結合に関与する保存らせん体の対を共有する（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ：  Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００〜１６１１（２００８）（これによって、その全体が参考として本明細書に援用される）。Ａ６突然変異を担持するｍＡｂ５１３３変異体が、黄色ブドウ球菌免疫グロブリン結合タンパク質のいずれか一方に関与することはできないことを更に示すために、プロテインＡ及びＳｂｉの両者のうちいずれか一方を発現する、またはこれらの２つのタンパク質のうち１方のみを発現する、一連の株から調製された溶解産物のウェスタンブロッティング分析。
【０２５８】
手順
ウェスタン分析に使用した被験物質は、ｍＡｂ５１３３（配列番号６０ＨＣ及び６１  ＬＣ）、ｍＡｂ５１３３  Ａ６（配列番号６４ＨＣ及び６５ＬＣ）及びｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（配列番号６６ＨＣ及び６７ＬＣ）であった。溶解産物は、黄色ブドウ球菌ＪＥ２株（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，」ＭＢｉｏ．４：ｅ００５３７〜１２（２０１３）（その全体が、参照によって本明細書に援用される））及びＮｅｗｍａｎ株（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００〜１０（２００８）（これらはその全体が、参照によって援用される））（なおこれらは両株とも、プロテインＡ及びＳｂｉの両者の発現に関して野生型である）、ＪＥ２から誘導されたＮＥ２８６株（ＪＥ２の、ｓｐａトランスポゾン挿入突然変異体）、およびＮＥ４５３株（ＪＥ２の、ｓｂｉトランスポゾン挿入突然変異体）、並びにＷｏｏｄ  ４６（プロテインＡの発現のないことが公知の株（Ｆｏｒｓｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：２０７（１９７６）；Ｒｉｎｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４７（１９７８）（これによって、その全体が参照によって援用される））から調製された。要約すると、これらの株の培養物をＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）中、３７℃、２００ｒｐｍで増殖させ、１ｍＬ培養液を一晩増殖させた後、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を採取した。細胞ペレットを１ｍＬリソスタフィンバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｇ／ｍＬリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−９０４３））に再懸濁した。ウェスタン分析では、各サンプル約３０μｌを約１０μｌの４ｘＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＮＰ０００７）と混合し、４〜１２％勾配のＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦ膜に移動させて、その後、ＰＢＳ／３％ミルク溶液で１時間ブロックした。ウェスタンで検出する被験物質は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ蛍光ウェスタンブロッキングバッファ中２μｇ／ｍＬで、ブロットとインキュベートし、室温にて（２時間以上）穏やかに攪拌し、１ＸＰＢＳ０．５％（各洗浄１０分）で４回洗浄した。その後、ブロットを１時間、室温にて二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｌｉ−ｃｏ−ＩＲＤｙｅ（１：１０，０００）でインキュベートし、その後、１ＸＰＢＳ０．５％中で４回洗浄した（各洗浄１０分）。洗浄後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩｎｆｒａＲｅｄ  ｉｍａｇｅｒを使用して、ウェスタンブロッティング膜を画像化した。
【０２５９】
結果
図１８Ａ、パネルＡに示すとおり、ｍＡｂ５１３３は、すべての試験対照の株において、セリン−アスパラギン酸繰り返し（ＳＤＲ）タンパク質族メンバーのグリコシル化形態に相当する一連のタンパク質（標識Ｃ）を検出する。株ＪＥ２（レーン１）については、約５５ｋＤａ及び４８ｋＤａで移動しているバンドは、それぞれ、プロテインＡ及びＳｂｉタンパク質に対応するｍＡｂ５１３３により検出される。予想通り、約４８ｋＤａ  Ｓｂｉタンパク質のみが、プロテインＡの発現を欠く２つの株（ＪＥ２ＮＥ２８６（レーン２）及びＷｏｏｄ  ４６株（レーン４））から調製した溶解産物中、ｍＡｂ５１３３により検出される。対照的に、約５５ｋＤａ  プロテインＡバンドは、Ｓｂｉタンパク質（ＮＥ４５３（レーン３））の発現を欠く株から調製した溶解産物中、ｍＡｂ５１３３により検出される。図１８Ｂ、パネルＢに示すように、プロテインＡまたはＳｂｉタンパク質のいずれか一方に対応するバンドは、これらの同じ溶解産物中ではｍＡｂ５１３３  Ａ６被験物質によって検出されることはなく、Ａ６突然変異により、双方のタンパク質への結合が消失するとの概念を裏付けている。同様に、図１８Ｂ、パネルＣに示すとおり、ｍＡｂ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６被験物質は、黄色ブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎまたはこれらのタンパク質の両方を発現するＪＥ２から調製された溶解産物中で、プロテインＡまたはＳｂｉタンパク質のいずれも検出することができない。
【０２６０】
まとめ
これらの結果から、Ａ６突然変異を担持するｍＡｂ５１３３変異体は、黄色ブドウ球菌の免疫グロブリン結合タンパク質、プロテインＡ、またはＳｂｉのいずれにも関与することはできないことが示され、一連の、Ａ６突然変異を担持する被験物質に関して、プロテインＡへの結合が検出されないという、ＥＬＩＳＡ型アッセイによるこれまでの観察結果（実施例９、図８）を裏付けた。
【０２６１】
実施例２０：ＦＮ３ドメインによる、γ−ヘモリシンＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ及びパントン−バレンタインロイコチジン（ＰＶＬ）の結合及び中和
ＦＮ３ドメインのサブセットが、複数のロイコトキシンへの結合または複数のロイコトキシンの中和を示すことができることを示すために、γ−ヘモリシンＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ及びパントン−バレンタインロイコチジン（ＰＶＬ）を用いて、一連の試験を行った。
【０２６２】
手順
これらの試験に含まれる被験物質としては、Ｌｕｋ１２９（配列番号１５１）、Ｌｕｋ１５１（配列番号１６３）、Ｌｕｋ１８８（配列番号１８５）、Ｌｕｋ３５７（配列番号３３９）、Ｌｕｋ５４０（配列番号４２４）及び、Ｌｕｋ６４７（配列番号５２６）の組換え型精製ポリヒスチジン標識型が挙げられる。ＦＮ３ドメインの精製組換え型ロイコトキシンへの結合は、ＥＬＩＳＡによって判定した。要約すると、５μｇ／ｍＬストレプトアビジン／ＰＢＳ溶液１００μｌを、９６ウェルＷｈｉｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ−ｃａｔ＃４３６１１０）の各ウェルに入れ、一晩、４℃でインキュベートした。その後、ウェルをＴＢＳＴ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄して、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ＃  ３７５４３）を用いて３００μＬ／ウェルでブロックし、４５分〜６０分、室温（ＲＴ）でインキュベートした。その後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ロイコトキシン標的抗原（１００μＬ中）のビオチン化型０．２μｇを各試験ウェルに入れ、プレートは、４５〜６０分、室温にて、穏やかに振盪させてインキュベートした。その後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。被験物質は、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０中１μＭに希釈して、１００μＬを試験ウェルに入れ、プレートは、４５〜６０分、室温にて、穏やかに振盪させてインキュベートした。その後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した被験物質の検出に関しては、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０中、１：５０００希釈ポリクローナル抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体１００μＬ／ウェルを入れ、プレートは、４５〜６０分間、室温にて穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を検出するにあたって、プレートを読取る直前に、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ−ｃａｔ＃  １１５８２９５０００１）を１００ｌμＬ／ウェル入れ、基質を加えて１５分以内に、ＰａｒａｄｉｇｍまたはＥｎｖｉｓｉｏｎ  ｒｅａｄｅｒを使用してプレートの読取りを行った。
【０２６３】
ロイコトキシン中和試験では、Ｆｎ３ドメイン被験物質（ウェルあたり４μｇ／４００μｇ／ｍｌを、１０μｌ）は、精製組換え型ロイコトキシンと、３０分間、４℃でインキュベートした。新たに単離した初代ヒト好中球（ｈＰＭＮ、２００，０００細胞／ＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ）を、毒素及びＦＮ３ドメインタンパク質の混合物に添加して、最終体積１００μｌとした。その後、臭化エチジウムを最終希釈１：２０００にて細胞に添加し、毒素添加後、３０〜６０分、プレートの読取りを行った。ＣＯ２インキユベーター中、３７℃で１時間、毒素と接触させた後、プレートを１５００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿させた後に、上澄み２５μｌを注意深く新しいプレートに移した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を残存細胞に添加し、１．５時間インキュベートした。上澄み２５μｌは、損傷膜を有する細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を迅速に測定するための同量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。培養培地へのＬＤＨの放出を、レザズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる１０分連結酵素アッセイで測定した。中和実験については、精製組換え型ロイコトキシンの次の濃度を使用した：ＨｌｇＡＢ  １．２５μｇ／ｍＬ、ＨｌｇＣＢ  ０．６３μｇ／ｍＬ及びＰＶＬ  ０．３１μｇ／ｍＬ。
【０２６４】
結果
図１９に示すとおり、Ｆｎ３ドメイン変異体Ｌｕｋ１５１は、ＨｌｇＡサブユニットへの結合を示すが、ＨｌｇＡＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ１２９は、ＨｌｇＡサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるとおり、ＨｌｇＡＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【０２６５】
図２０に示すとおり、ＦＮ３ドメイン変異体Ｌｕｋ３５７は、ＨｌｇＣサブユニットへの結合を示すが、ＨｌｇＣＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ１８８は、ＨｌｇＣサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるとおり、ＨｌｇＣＢロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【０２６６】
図２１に示すとおり、Ｆｎ３ドメイン変異体Ｌｕｋ５４０は、ＰＶＬロイコトキシンのＬｕｋＳ−ＰＶサブユニットとの結合を示すが、ＰＶＬの細胞溶解活性を中和するものではない。対照的に、Ｌｕｋ６４７は、ＰＶＬロイコトキシンのＬｕｋＳ−ＰＶサブユニットへの結合を示し、ＬＤＨ放出の完全な阻害により例示されるとおり、ＰＶＬロイコトキシンの細胞溶解活性を中和する。
【０２６７】
まとめ
ＦＮ３ドメインは、γ−ヘモリシンＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ及びパントン−バレンタインロイコチジン（ＰＶＬ）への結合及び／またはそれらの中和を示すことが認識された。
【０２６８】
（表６）本開示の核酸及びアミノ酸配列
2017502002.tif 000016
2017502002.tif 000017
2017502002.tif 000018
2017502002.tif 000019
2017502002.tif 000020
2017502002.tif 000021
2017502002.tif 000022
2017502002.tif 000023
2017502002.tif 000024
2017502002.tif 000025
2017502002.tif 000026
2017502002.tif 000027
2017502002.tif 000028
2017502002.tif 000029
2017502002.tif 000030
2017502002.tif 000031
2017502002.tif 000032
2017502002.tif 000033
2017502002.tif 000034
2017502002.tif 000035
2017502002.tif 000036
2017502002.tif 000037
2017502002.tif 000038
2017502002.tif 000039
2017502002.tif 000040
2017502002.tif 000041
2017502002.tif 000042
2017502002.tif 000043
2017502002.tif 000044
2017502002.tif 000045
2017502002.tif 000046
2017502002.tif 000047
2017502002.tif 000048
2017502002.tif 000049
2017502002.tif 000050
2017502002.tif 000051
2017502002.tif 000052
2017502002.tif 000053
2017502002.tif 000054
2017502002.tif 000055
2017502002.tif 000056
2017502002.tif 000057
2017502002.tif 000058
2017502002.tif 000059
2017502002.tif 000060
2017502002.tif 000061
2017502002.tif 000062
2017502002.tif 000063
2017502002.tif 000064
2017502002.tif 000065
2017502002.tif 000066
2017502002.tif 000067
2017502002.tif 000068
2017502002.tif 000069
2017502002.tif 000070
2017502002.tif 000071
2017502002.tif 000072
2017502002.tif 000073
2017502002.tif 000074
2017502002.tif 000075
2017502002.tif 000076
2017502002.tif 000077
2017502002.tif 000078
2017502002.tif 000079
2017502002.tif 000080
2017502002.tif 000081
2017502002.tif 000082
2017502002.tif 000083
2017502002.tif 000084
2017502002.tif 000085
2017502002.tif 000086
2017502002.tif 000087
2017502002.tif 000088
2017502002.tif 000089
2017502002.tif 000090
2017502002.tif 000091
2017502002.tif 000092
2017502002.tif 000093
2017502002.tif 000094
2017502002.tif 000095
2017502002.tif 000096
2017502002.tif 000097
2017502002.tif 000098
2017502002.tif 000099
【図１】
2017502002.tif 000100
【図２】
2017502002.tif 000101
【図３】
2017502002.tif 000102
【図４Ａ】
2017502002.tif 000103
【図４Ｂ】
2017502002.tif 000104
【図４Ｃ】
2017502002.tif 000105
【図４Ｄ】
2017502002.tif 000106
【図４Ｅ】
2017502002.tif 000107
【図４Ｆ】
2017502002.tif 000108
【図５】
2017502002.tif 000109
【図６】
2017502002.tif 000110
【図７Ａ】
2017502002.tif 000111
【図７Ｂ】
2017502002.tif 000112
【図７Ｃ】
2017502002.tif 000113
【図７Ｄ】
2017502002.tif 000114
【図８】
2017502002.tif 000115
【図９】
2017502002.tif 000116
【図１０】
2017502002.tif 000117
【図１１】
2017502002.tif 000118
【図１２】
2017502002.tif 000119
【図１３】
2017502002.tif 000120
【図１４Ａ】
2017502002.tif 000121
【図１４Ｂ】
2017502002.tif 000122
【図１４Ｃ】
2017502002.tif 000123
【図１５】
2017502002.tif 000124
【図１６】
2017502002.tif 000125
【図１７】
2017502002.tif 000126
【図１８Ａ】
2017502002.tif 000127
【図１８Ｂ】
2017502002.tif 000128
【図１９】
2017502002.tif 000129
【図２０】
2017502002.tif 000130
【図２１】
2017502002.tif 000131
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月18日(2016.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017502002000001.app
【国際調査報告】
2017502002.tif 000132
2017502002.tif 000133
2017502002.tif 000134
2017502002.tif 000135
2017502002.tif 000136
2017502002.tif 000137
2017502002.tif 000138
2017502002.tif 000139
2017502002.tif 000140
2017502002.tif 000141
2017502002.tif 000142
2017502002.tif 000143
2017502002.tif 000144
2017502002.tif 000145
2017502002.tif 000146
2017502002.tif 000147