(57)【要約】本開示は、Ｈ２ならびにＣＯおよび／またはＣＯ２ガスを生物学的に利用し、または高価値の分子および生物学的材料、例えば必須アミノ酸（例えば、リジン、トレオニン、メチオニン）および動物飼料に変換することができる水素資化微生物を使用するための組成物および方法を提供する。特定の態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。
2017500896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然水素資化微生物であって、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する、非天然水素資化微生物。
【請求項２】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼ突然変異体である、請求項１に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせをそれぞれが含む突然変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子またはそれらの組み合わせによってコードされる、請求項１または２に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、トレオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５】
前記トレオニン結合部位の突然変異が、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項４に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、リジン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項７】
前記リジン結合部位の突然変異が、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項６に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項８】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、リジンおよびトレオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項９】
前記リジンおよびトレオニン結合部位の突然変異が残基Ｄ２９４にあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項８に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１０】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、リジンまたはトレオニン結合部位以外の部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１１】
前記リジンおよびトレオニン結合部位以外の部位の突然変異が、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項１０に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１２】
リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでリジンを産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１３】
前記リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１２に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１４】
前記リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１２に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１５】
前記第１の外因性核酸分子がジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１６】
前記ジヒドロジピコリン酸シンターゼが過剰発現されている、請求項１５に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１７】
トレオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１８】
メチオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項１９】
ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンデヒドロゲナーゼ突然変異体をコードする、請求項１７または１８に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２０】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２１】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２２】
ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２３】
トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでトレオニンを産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２４】
前記トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２３に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２５】
前記第１の外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードする、請求項２３に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２６】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方が過剰発現されている、請求項２５に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２７】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方が調節解除されている、請求項２５または２６に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２８】
リジン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項２９】
メチオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３０】
イソロイシン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３１】
グリシン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３２】
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードするリジンまたはイソロイシン生合成経路核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ突然変異体、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３３】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３４】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３５】
リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３６】
メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３７】
前記メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３６に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３８】
前記第１の外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方をコードするか、または前記第１の外因性核酸分子が、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方をコードする、請求項３６に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項３９】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されているか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されている、請求項３８に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４０】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方が調節解除されているか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方が調節解除されている、請求項３８または３９に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４１】
リジン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４２】
トレオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４３】
ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項４１または４２に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４４】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４５】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４６】
リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの両方である、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４７】
低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性またはそれらの両方を有する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４８】
高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いピルビン酸シンターゼ、高いアセチル−ＣｏＡシンターゼ、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項４９】
前記Ｈ２／ＣＯｘ基質が、Ｈ２、ＣＯおよびＣＯ２である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５０】
前記Ｈ２／ＣＯｘ基質が、合成ガスまたは水性ガスシフト合成ガスである、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５１】
ＣＯ２とＨ２との比が、それぞれ約１：５０〜約１０：１の範囲である、請求項４９または５０に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５２】
ＣＯ２とＨ２との比が、それぞれ約１：２〜約１：４の範囲である、請求項４９または５０に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５３】
ＣＯの総量が約１％以下である、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５４】
細菌である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５５】
前記細菌が合成ガス代謝細菌である、請求項５４に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５６】
前記合成ガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５５に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５７】
前記合成ガス代謝細菌が、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５５に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５８】
前記細菌が水素酸化細菌である、請求項５４に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項５９】
前記水素酸化細菌が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである、請求項５８に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６０】
メタン生成古細菌である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６１】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓから選択される、請求項６０に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６２】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓからなる群より選択される、請求項６１に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６３】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを産生しない、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６４】
シトクロムを産生しない前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉである、請求項６３に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６５】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを産生する、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６６】
シトクロムを産生する前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである、請求項６５に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６７】
１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターを発現または過剰発現する、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６８】
１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターをコードする外因性核酸分子をさらに含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項６９】
前記エクスポーターがｒｈｔＡまたはｌｙｓＥ遺伝子である、請求項６７または６８に記載の非天然水素資化微生物。
【請求項７０】
アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、非遺伝子改変親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる、組換え水素資化微生物。
【請求項７１】
調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する、請求項７０に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７２】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼ突然変異体である、請求項７１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７３】
アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸分子が、調節解除されたアスパルトキナーゼ突然変異体をコードする、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７４】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ突然変異体が、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７５】
前記核酸分子が、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７６】
前記外因性、内因性もしくはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性が突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個別にコードされるか、または前記外因性アスパルトキナーゼ活性が、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異もしくはそれらの任意の組み合わせをそれぞれが含む突然変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子もしくはそれらの組み合わせによって個別にコードされる、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７７】
前記外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性が、トレオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７８】
前記トレオニン結合部位の突然変異が、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項７７に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項７９】
前記外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性が、リジン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個別にコードされる、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８０】
前記リジン結合部位の突然変異が、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項７９に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８１】
前記外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性が、リジンおよびトレオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個別にコードされる、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８２】
前記リジンおよびトレオニン結合部位の突然変異が残基Ｄ２９４にあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項８１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８３】
前記外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性が、リジンまたはトレオニン結合部位以外の部位において突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個別にコードされる、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８４】
前記リジンおよびトレオニン結合部位以外の部位の突然変異が、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせにあり、前記残基ナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に対応する、請求項８３に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８５】
リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでリジンを産生する、請求項７０〜８４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８６】
前記リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項８５に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８７】
前記リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項８５に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８８】
前記第２の外因性核酸分子がジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項８９】
前記ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする前記第２の外因性核酸分子が、核酸発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項８８に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９０】
前記ジヒドロジピコリン酸シンターゼが過剰発現されている、請求項８８または８９に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９１】
トレオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える内因性核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９２】
メチオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える内因性核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項８５〜９１のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９３】
ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする内因性核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンデヒドロゲナーゼ突然変異体をコードする、請求項９１または９２に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９４】
前記第１の外因性核酸分子が、前記組換え水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項８５〜９３のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９５】
前記第１の外因性核酸分子が、前記組換え水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項８５〜９３のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９６】
ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである、請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９７】
トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでトレオニンを産生する、請求項７０〜８４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９８】
前記トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項９７に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項９９】
前記第２の外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードする、請求項９７に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１００】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードする前記第２の外因性核酸分子が、核酸発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項９９に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０１】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方が過剰発現されている、請求項１００に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０２】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方が調節解除されている、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０３】
リジン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０４】
メチオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項９７〜１０３のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０５】
イソロイシン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項９７〜１０４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０６】
グリシン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項９７〜１０４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０７】
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードするリジン生合成経路核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ突然変異体、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項１０３〜１０６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０８】
前記第１の外因性核酸分子が、前記組換え水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項９７〜１０７のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１０９】
前記第１の外因性核酸分子が、前記組換え水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項９７〜１０７のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１０】
リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである、請求項９７〜１０９のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１１】
メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、前記親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する、請求項７０〜８４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１２】
前記メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１１１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１３】
前記第２の外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方をコードするか、または前記第２の外因性核酸分子が、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方をコードする、請求項１１１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１４】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードする前記第２の外因性核酸分子が、核酸発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１１３に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１５】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されているか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されている、請求項１１４に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１６】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方が調節解除されているか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方が調節解除されている、請求項１１３〜１１５のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１７】
リジン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１８】
トレオニン生合成経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性を有する、請求項１１１〜１１７のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１１９】
ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされているか、または低い活性のジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項１１７または１１８に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２０】
前記外因性核酸分子が、前記非天然水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１１１〜１１９のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２１】
前記外因性核酸分子が、前記組換え水素資化微生物内の自己複製ベクター中にある、請求項１１１〜１１９のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２２】
リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの両方である、請求項１１１〜１２１のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２３】
低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性またはそれらの両方を有する、請求項７０〜１２２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２４】
高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いピルビン酸シンターゼ、高いアセチル−ＣｏＡシンターゼ、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項７０〜１２３のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２５】
前記Ｈ２／ＣＯｘ基質が、Ｈ２、ＣＯおよびＣＯ２である、請求項１〜１２４のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２６】
前記Ｈ２／ＣＯｘ基質が、合成ガスまたは水性ガスシフト合成ガスである、請求項１〜１２５のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２７】
ＣＯ２とＨ２との比が、それぞれ約１：５０〜約１０：１の範囲である、請求項１２５または１２６に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２８】
ＣＯ２とＨ２との比が、それぞれ約１：２〜約１：４の範囲である、請求項１２５または１２６に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１２９】
ＣＯの総量が約１％以下である、請求項１２５〜１２８のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３０】
細菌である、請求項７０〜１２９のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３１】
前記細菌が合成ガス代謝細菌である、請求項１３０に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３２】
前記合成ガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１３１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３３】
前記合成ガス代謝細菌が、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１３１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３４】
前記細菌が水素酸化細菌である、請求項１３０に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３５】
前記水素酸化細菌が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである、請求項１３４に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３６】
メタン生成古細菌である、請求項７０〜１２９のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３７】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓから選択される、請求項１３６に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３８】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓからなる群より選択される、請求項１３７に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１３９】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを産生しない、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４０】
シトクロムを産生しない前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉである、請求項６３に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４１】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを産生する、請求項１３６〜１３８のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４２】
シトクロムを産生する前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである、請求項１４１に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４３】
１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターを発現または過剰発現する、請求項７０〜１４２のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４４】
１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターをコードする外因性核酸分子をさらに含む、請求項７０〜１４３のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４５】
前記エクスポーターがｒｈｔＡまたはｌｙｓＥ遺伝子である、請求項１４３または１４４に記載の組換え水素資化微生物。
【請求項１４６】
アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための方法であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生するために十分な時間にわたって、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物を培養することを含み、前記非天然水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する、方法。
【請求項１４７】
リジンを生産するための方法であって、リジンを産生するために十分な時間にわたって、請求項１〜２２および４７〜６９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物を培養することを含み、前記非天然水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるリジン生合成経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるリジン生合成経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるリジン生合成経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルでリジンを産生する、方法。
【請求項１４８】
トレオニンを生産するための方法であって、トレオニンを産生するために十分な時間にわたって、請求項１〜１１、２３〜３５および４７〜６９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物を培養することを含み、前記非天然水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるトレオニン生合成経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるトレオニン生合成経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるトレオニン生合成経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルでトレオニンを産生する、方法。
【請求項１４９】
メチオニンを生産するための方法であって、メチオニンを産生するために十分な時間にわたって、請求項１〜１１および３６〜６９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物を培養することを含み、前記非天然水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるメチオニン生合成経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるメチオニン生合成経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるメチオニン生合成経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する、方法。
【請求項１５０】
アスパラギン酸経路アミノ酸またはアスパラギン酸経路アミノ酸含有飼料添加物を作るためのプロセスであって、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にするために十分な条件下および時間にわたって、Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在下で、請求項７０〜１４５のいずれか一項に記載の組換えアスパラギン酸経路アミノ酸分泌水素資化微生物を培養することを含み、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸が、親水素資化微生物によって産生される１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸よりも高レベルで培養培地中に産生されて蓄積する、プロセス。
【請求項１５１】
アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するためのシステムであって、
（ａ）Ｈ２／ＣＯｘ基質を含むガスの供給源；
（ｂ）アスパラギン酸生合成経路ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の非天然水素資化微生物を含むバイオリアクター；および
（ｃ）前記バイオリアクターへの前記ガスの流入を可能にするように、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されたコネクター
を含み、
前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物と比較して、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を過剰産生する、システム。
【請求項１５２】
アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するためのシステムであって、
（ａ）Ｈ２／ＣＯｘ基質を含むガスの供給源；
（ｂ）アスパラギン酸生合成経路ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項７０〜１４５のいずれか一項に記載の組換え水素資化微生物を含むバイオリアクター；および
（ｃ）前記バイオリアクターへの前記ガスの流入を可能にするように、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されたコネクター
を含み、
前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物と比較して、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を過剰産生する、システム。
【請求項１５３】
前記バイオリアクターが、液相バイオリアクター、気泡塔バイオリアクターまたはトリクルベッドバイオリアクターである、請求項１５１または１５２に記載のシステム。
【請求項１５４】
前記Ｈ２／ＣＯｘ基質が合成ガスまたは水性ガスシフト合成ガスである、請求項１５１または１５２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、９１０２１５＿４０１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは３．４ＫＢであり、２０１５年１月２日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００２】
背景
アミノ酸は、世紀の変わり目の直後に商業的な重要性を獲得し、グルタミン酸の調味性が発見され、日本ではグルタミン酸ナトリウムが販売された。いくつかのアミノ酸（動物またはヒトによって合成されないもの（必須アミノ酸と称される）を含む）は、動物飼料のための添加剤として、ヒトのための食品サプリメントとして、および重病患者を維持するための静脈内注射用溶液において使用されている。アミノ酸の米国市場は単独で世界市場の２０％に相当し、２０１６年までに２０億ドルを超えると予測され、市場の過半数が動物飼料サプリメントに関するものである。
【０００３】
商業用途のアミノ酸は、一般に、４つの方法で生産される：天然源からの抽出、化学合成、発酵、および酵素触媒反応。抽出は、特定のアミノ酸では依然として使用されているが、現在では重要性が限られている。化学合成は非常に大規模に行われ得るが、通常は、反応はラセミ混合物を生成するので、所望のエナンチオマーの分割および回収を必要とする。１つの例外は、必須アミノ酸のメチオニンであり、これは、アクロレイン、シアン化水素酸、メチルメルカプタンおよびアンモニアの出発物質からラセミ体（ＤＬ−メチオニン）として合成的に製造され、５０年を超えて飼料添加物として販売されている。動物は、非天然Ｄ型メチオニンを有益なＬ型に変換するための酵素を有するので、メチオニンのラセミ体を使用することは実行可能である。対照的に、他のアミノ酸については、Ｄ型を変換するためのこのような同等の酵素系が存在しないので、メチオニン以外のアミノ酸は、純粋なＬ型で産生されなければならない。それにもかかわらず、これらのプロセスは、厳しい生産環境を必要とするか、または環境的に有害な副生成物をもたらす。今日では、最も好ましいアミノ酸生産方法は、発酵および酵素触媒反応である。
【０００４】
高い生産性で糖から調味料Ｌ−グルタミン酸を産生することができる土壌細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの発見により、発酵によるアミノ酸生産の成功への道が開かれた（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１９３，１９５７）。過去３０年間にわたるアミノ酸市場の急速な発展は、発酵技術の進歩およびアミノ酸産生微生物、例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは大腸菌の株改良によるところが小さくなく、多くのアミノ酸の工業規模の生産が可能になった（Ｉｋｅｄａ  Ｍ（２００３）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．  Ｉｎ：Ｓｃｈｅｐｅｒ  Ｔ，Ｆａｕｒｉｅ  Ｒ，Ｔｈｏｍｍｅｌ  Ｊ（ｅｄｓ）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  ７９．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  １−３５；Ｌｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９：１，２００５）。しかし、発酵市場は、天然アルコール製品および合成アルコール製品、特にエタノールによってはるかに支配されている。アミノ酸生産に使用される炭水化物原料は、動物飼料およびバイオ燃料の生産に直接使用される。畜産物およびバイオ燃料の需要の増大は、炭水化物原料のコストを増加させており、次いで、これがアミノ酸生産のコストを増加させる。
【０００５】
原料の高価格を考慮すると、当技術分野では、コスト効率の高い方法でアミノ酸を生物学的に生産するための代替的な改善された方法が必要である。本開示は、このような必要性を満たし、他の関連利点をさらに提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１９３，１９５７
【非特許文献２】Ｉｋｅｄａ  Ｍ（２００３）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．  Ｉｎ：Ｓｃｈｅｐｅｒ  Ｔ，Ｆａｕｒｉｅ  Ｒ，Ｔｈｏｍｍｅｌ  Ｊ（ｅｄｓ）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  ７９．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  １−３５
【非特許文献３】Ｌｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９：１，２００５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単な概要
特定の態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本開示は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。
【０００９】
またさらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための方法であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生するために十分な時間にわたって、本開示の非天然または組換え水素資化微生物を培養することを含み、前記非天然または組換え水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸（例えば、リジン、トレオニン、メチオニン）を産生する方法を提供する。
【００１０】
別のさらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸またはアスパラギン酸経路アミノ酸含有飼料添加物を作るための方法であって、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にするために十分な条件下および時間にわたって、Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在下で、本開示の組換えアスパラギン酸経路アミノ酸分泌水素資化微生物を培養することを含み、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸が、親水素資化微生物によって産生される１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸よりも高レベルで培養培地中に産生されて蓄積する方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するためのシステムであって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を含むガスの供給源；（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素についての改変された調節を含む、本開示の非天然または組換え水素資化微生物のいずれか１つまたはそれを超えるものを含むバイオリアクター；および前記バイオリアクターへの前記ガスの流入を可能にするように、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されたコネクターを含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物と比較して、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸（例えば、リジン、トレオニン、メチオニン）を過剰産生するシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、リジンおよびトレオニンの存在下における、Ｇ３３３Ｒ突然変異（これは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のＬｙｓＣアミノ酸位置Ｇ２７７に対応する）を有するＭｅｔｈｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ｌｙｓＣ突然変異体Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３の調節解除された増殖速度を示す（３７℃で７２時間インキュベートした後に、ＯＤ６００を測定した）。
【００１３】
【図２】図２は、突然変異内因性アスパルトキナーゼ酵素を有するＭｅｔｈｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓによるアスパラギン酸経路アミノ酸産生のＨＰＬＣグラフを示す。親株と比較した突然変異体の産生プロファイルは、アラニン（５ｍｇ／Ｌ）、リジン（８ｍｇ／Ｌ）、トレオニン（２１ｍｇ／Ｌ）およびグリシン（７８ｍｇ／Ｌ）であった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本開示は、ガスを生物学的に利用し、または有用な組成物、例えば高価値の分子（例えば、アミノ酸）、生物学的材料（例えば、動物飼料）もしくはそれらの組み合わせに変換するための組成物および方法を提供する。例えば、合成用ガスを水素資化微生物に与えて、１つまたはそれを超える異なるアスパラギン酸経路アミノ酸を生成し得る。このアプローチは、水素ガスおよび酸化炭素（例えば、ＣＯ、ＣＯ２）を含む原料を利用し、またはリジン、グリシン、トレオニン、メチオニンもしくはそれらの任意の組み合わせに変換するための新たな宿主系として水素資化古細菌または細菌を使用することを可能にする。
【００１５】
背景として、アスパラギン酸経路アミノ酸−リジン、トレオニンおよびメチオニンなど−は、その生合成経路においていくつかの酵素（これらのうちの１つまたはそれを超えるものは、フィードバック調節、遺伝子発現の抑制またはそれらの両方を受ける）を共有する。例えば、アスパルトキナーゼ（これは、これらの工業的に重要なアミノ酸の生合成に炭素フラックスを方向付けるのに関与する最初の関与酵素である）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、トレオニンおよびリジンによるアスパラギン酸塩のリン酸化からアロステリックに阻害される（Ｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｏ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：３７３，１９７０；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８：５２１，２００７）。ホモセリンデヒドロゲナーゼは、トレオニン／メチオニン生合成経路における最初の関与酵素であるが、この酵素は、アスパルチルセミアルデヒドについて、リジン生合成経路に関与する最初の酵素（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ）と競合する。例えば、トレオニン／メチオニンまたはリジンへの炭素フラックスの制御は、どの酵素が基質を得るかに依存するであろう−例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍでは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性はトレオニンによって阻害され、発現はメチオニンによって抑制されるが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼはリジンレベルによって影響を受けない。同様に、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック調節を受ける（Ｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１４４１６，１９９９）。
【００１６】
本開示は、野生型または親微生物と比較して高レベルの特定のアミノ酸（例えば、リジン、トレオニン、メチオニン）の産生に前駆体および代謝フラックスを向け直すように水素資化微生物を代謝操作（例えば、遺伝子の改変、遺伝子発現の改変、遺伝子発現調節の改変）するための組成物および方法を提供する。特定の態様では、本開示は、アミノ酸を生産するための組成物、方法およびシステムであって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する修飾水素資化微生物の使用を含む組成物、方法およびシステムを提供する。
【００１７】
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用すべき一定の用語を定義することがその理解に役立ち得る。本開示を通して、さらなる定義を記載する。
【００１８】
本説明では、特に指示がない限り、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数範囲は、記載されている範囲内の任意の整数値、および適切な場合にはその分数（整数の１／１０および１／１００など）が含まれると理解すべきである。また、特に指示がない限り、任意の物理的特徴（ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなど）に関して本明細書に記載されている任意の数字範囲は、記載されている範囲内の任意の整数が含まれると理解すべきである。特に指示がない限り、本明細書で使用される用語「約」は、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「から本質的になる」は、指定された材料もしくは工程に、または特許請求の範囲に記載されている発明の基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに、特許請求の範囲の範囲を限定する。本明細書で使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、列挙されている構成要素の「１つまたはそれを超えるもの」を指すと理解すべきである。選択肢（例えば、「ｏｒ」）の使用は、その選択肢の一方、両方またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を有する（ｈａｖｅ）」および「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同意語として使用され、これらの用語およびその変形は、非限定的なものと解釈されることを意図する。
【００１９】
本明細書で使用される「アスパラギン酸経路アミノ酸」または「アスパラギン酸ファミリーアミノ酸」は、アスパラギン酸塩から合成される１つまたはそれを超えるアミノ酸（リジン、トレオニン、メチオニン、ホモセリン、イソロイシンおよびグリシンを含む）を指す。各アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成経路の段階は、分岐または散開し得るが、それらはすべて、アスパラギン酸キナーゼ（アスパルトキナーゼとも称される）によるアスパラギン酸塩のリン酸化によって開始する。特定の実施形態では、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成経路におけるアスパラギン酸キナーゼは、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害を受ける。さらに、「アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成経路」のタンパク質または酵素への言及は、例えば、リジン生合成経路酵素、グリシン生合成経路酵素、トレオニン生合成経路酵素、メチオニン生合成経路酵素またはそれらの任意の組み合わせを意味し得る。
【００２０】
本明細書で使用される「水素資化生物」または「水素資化生物の」は、その代謝の一環としてＨ２を消費し、Ｈ２を酸化し、またはＨ２を別の化合物に変換することができる微生物を指す。特定の実施形態では、水素資化生物は、偏性もしくは通性水素資化生物、偏性もしくは通性嫌気性生物、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、通性水素資化生物は、エネルギー源として水素の存在下もしくは非存在下で増殖し得るか、または１つもしくはそれを超える様々な炭素源、例えば炭水化物、酢酸、ギ酸、メタノール、メチルアミンもしくは酸化炭素を使用し得る（例えば、酢酸生成菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、Ｈ２の非存在下で増殖し、エネルギーおよび炭素源の両方として酢酸を使用し得る）。例示的な水素資化生物としては、酢酸生成菌、水素酸化細菌などが挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用される「Ｈ２／ＣＯｘ基質」または「Ｈ２／ＣＯｘ原料」は、水素（Ｈ２）と、二酸化炭素（ＣＯ２）または一酸化炭素（ＣＯ）またはそれらの両方との混合物であって、様々な他の成分、例えばアンモニア（ＮＨ３）、炭化水素（例えば、メタン（ＣＨ４））、ＣＯ２、ＣＯ、ホルムアルデヒド（ＣＨ２Ｏ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、硫化カルボニル（ＣＯＳ）、シアン化水素（ＨＣＮ）、水蒸気、不活性ガスまたは他のガスも含み得る混合物を指す。
【００２２】
本明細書で使用される「合成用ガス」または「合成ガス」は、一酸化炭素と水素との混合物であって、例えば、天然ガスもしくは液体炭化水素の水蒸気改質、乾燥もしくはＣＯ２改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素合成において、アンモニア合成において、メタノール合成において製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって生産され得る混合物を指す。特定の実施形態では、合成ガスは、水性ガスシフト反応によってさらにコンディショニングされ得る。合成ガスはまた、メタン、ＣＯ２、Ｈ２Ｓ、またはＣＯおよびＨ２よりも少量の他のガスを含み得る。
【００２３】
本明細書で使用される用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、アスパルトキナーゼ）を産生するように、突然変異または外因性核酸分子によって遺伝子修飾され得る細胞または微生物（例えば、古細菌、細菌）を指す。特定の実施形態では、宿主細胞は、発現される突然変異または外因性ポリペプチドに関係するまたは関係しない所望の特性（例えば、調節解除）を付与する他の遺伝子修飾を場合により既に有し得る。例えば、宿主細胞は、アスパラギン酸経路アミノ酸へのさらなるもしくは強化された炭素フラックス活性、競合アミノ酸の産生減少、高増殖、汚染物質もしくは特定の培養条件に対する耐性、さらなる炭素基質の代謝能力、または望ましい生成物もしくは中間体の合成能力を付与する遺伝子修飾を有し得るか、またはこれを有するように改変され得る。
【００２４】
本明細書で使用される用語「メタン生成菌」または「メタン生成古細菌」は、水素ガスと、様々な１つまたは２つの炭素基質（例えば、二酸化炭素、酢酸、ギ酸、ホルムアルデヒド、一酸化炭素、メタノール、メチルアミン類（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど））のいずれかとを使用して無酸素条件下で、メタンを産生することができる微生物を指す。当技術分野では、細菌は古細菌ではなく、古細菌は細菌ではないと理解されている。本明細書で使用されるメタン生成古細菌は、メタンを産生するために水素ガスを必要とする「偏性水素資化生物」であり得る。メタン生成古細菌は、水素ガスの非存在下でメタンを産生することができる「通性水素資化生物」であり得る。さらに、メタン生成古細菌は、中温性、好熱性または超好熱性であり得る。
【００２５】
本明細書で使用される「バイオマス」は、全細胞、溶解細胞、細胞外物質、産生した産物またはその一部などを含み得る生物学的起源を有する有機物質を指す。例えば、培養微生物（例えば、細菌または古細菌培養物）から採取された物質は、分泌産物を含み得るか、または分泌産物であり得るバイオマスとみなされ得る。
【００２６】
本明細書で使用される「核酸分子」（ポリヌクレオチドとしても既知である）は、ヌクレオチドと称される共有結合サブユニットから構成される高分子化合物を指す。核酸分子としては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、両方が挙げられ、これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用される用語「内因性」または「ネイティブ」は、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。また、親の遺伝子、タンパク質または活性と比較して突然変異、過剰発現、シャッフル、複製または別様に改変されている遺伝子、タンパク質または活性は、その特定の宿主細胞に対して内因性またはネイティブであると依然としてみなされる。例えば、第１の遺伝子からの内因性制御配列（例えば、プロモーター、翻訳減衰配列）は、第２のネイティブな遺伝子または核酸分子の発現を改変または調節するために使用され得、第２のネイティブな遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における正常な発現または調節とは異なる。
【００２８】
本明細書で使用される「異種」または「外因性」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞に対してネイティブではないが、宿主細胞由来の核酸分子または核酸分子の一部に対して相同であり得る核酸分子または核酸分子の一部を指す。異種または外因性の核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種に由来し得る。特定の実施形態では、例えば、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって、異種または外因性核酸分子を宿主細胞または宿主ゲノムに追加し（すなわち、内因性またはネイティブではない）、追加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の形態の自己複製ベクターとして）存在し得、複数コピーで存在し得る。加えて、「異種」は、宿主細胞が相同タンパク質または活性をコードする場合であっても、宿主細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされる非ネイティブな酵素、タンパク質または他の活性を指す。
【００２９】
用語「相同」または「相同体」は、宿主細胞、種もしくは株に見られるか、またはこれらに由来する、分子または活性を指す。例えば、異種または外因性核酸分子は、ネイティブな宿主細胞遺伝子に対して相同であり得、改変された発現レベル、異なる配列、改変された活性、またはそれらの任意の組み合わせを場合により有し得る。
【００３０】
本明細書で使用される用語「非天然」は、野生型または親の細胞または分子と異なる少なくとも１つの遺伝子改変を含む生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを指す。例えば、非天然は、内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現または遺伝子産物の活性が、野生型または親微生物と比較して改変（例えば、増加、減少、調節解除、活性化、抑制解除、抑制）されるように改変されている微生物または細胞（例えば、自然突然変異体を含む部位特異的またはランダム突然変異体）を指し得る。このような修飾としては、例えば、遺伝子またはオペロンの発現を改変する非コード調節領域内のものが挙げられる。「非天然」生物、微生物または細胞としては、組換え生物、微生物または細胞が挙げられ得る。
【００３１】
本明細書で使用される用語「組換え」は、外因性核酸分子の導入によって修飾された微生物、細胞、核酸分子もしくはベクターを指すか、または内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が制御され、調節解除され、もしくは恒常的であるように改変された微生物もしくは細胞を指し、このような改変または修飾は、遺伝子工学によって導入され得る。遺伝子改変としては、例えば、１つもしくはそれを超えるタンパク質もしくは酵素をコードする核酸分子（これは、プロモーターなどの発現制御要素を含み得る）を導入する修飾、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊もしくはこれに対する付加が挙げられ得る。例示的な修飾としては、参照または親微生物由来の異種または相同ポリペプチドのコード領域またはその機能的断片内のものが挙げられる。特定の実施形態では、本開示の生物、微生物または細胞は、非天然生物、微生物または細胞および組換え生物、微生物または細胞である。例えば、調節解除された内因性酵素（例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ）を発現または過剰発現する非天然水素資化微生物はまた、発現または過剰発現してアスパラギン酸経路アミノ酸の生合成に関与する特定の酵素活性（ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｉｔｖｉｔｉｅｓ）（例えば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ）をもたらす１つまたはそれを超える外因性または異種核酸分子を含有し得る。
【００３２】
本明細書で使用される「形質転換」は、宿主細胞への核酸分子（例えば、外因性または異種核酸分子）の導入を指す。形質転換宿主細胞は、染色体外に、または染色体に組み込まれた外因性または異種核酸分子を有し得る。宿主細胞ゲノムおよび自己複製ベクターへの組み込みは、一般に、形質転換核酸分子の遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす。形質転換核酸を含有する宿主細胞は、「組換え」または「遺伝子操作」または「形質転換」または「トランスジェニック」細胞（例えば、細菌、古細菌）と称される。
【００３３】
本明細書で使用される用語「調節解除」は、親または野生型微生物におけるそれぞれ遺伝子発現または活性と比較した、遺伝子産物の発現の減少もしくは増加、または遺伝子産物（例えば、タンパク質、酵素）の活性の減少もしくは増加を指す。例えば、遺伝子産物の発現または遺伝子産物の活性を、操作前の親または野性型微生物のそれよりも増加もしくは減少させるように、微生物を遺伝学的に操作（例えば、突然変異、遺伝子操作）し得る。特定の実施形態では、発現される遺伝子産物が高い活性を有するように、標的遺伝子を突然変異させる。例えば、発現される遺伝子産物が高い活性を有するように、標的遺伝子のコード領域を改変し得、活性を増加させるために、標的遺伝子のコピー数を増加させ得、活性を増加させるために、標的遺伝子を過剰発現させ得、またはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、発現される遺伝子産物が、フィードバック阻害に対して低下した、最小のまたは検出不可能な応答を有するように、標的遺伝子を突然変異させる（例えば、アミノ酸生合成酵素、例えばアスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼまたはホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼは、１つまたはそれを超えるフィードバック阻害物質であるリジン、トレオニンおよびメチオニンの存在下で調節解除される）。さらなる実施形態では、標的遺伝子が、発現の抑制に対して低下した、最小のまたは検出不可能な応答を有するように、標的遺伝子を突然変異させる（例えば、アミノ酸生合成酵素、例えばホモセリンデヒドロゲナーゼは、フィードバックコリプレッサーであるメチオニンの存在下で調節解除される）。あるいは、例えば、選択圧下で、上記遺伝子改変のいずれか１つまたはそれを超えるものを有する微生物を識別し得る（例えば、自然突然変異体）。上記いずれの実施形態の調節解除された遺伝子または遺伝子産物も、自然発生的な、誘導されたまたは操作された突然変異体または変異体であり得る。
【００３４】
本明細書で使用される用語「過剰発現」は、非天然または組換え微生物における遺伝子発現または遺伝子産物のレベルであって、同じ条件下で増殖させた場合の親または野生型微生物に見られる遺伝子発現または遺伝子産物のレベルよりも大きいものを指す。特定の実施形態では、過剰発現は、転写レベル、翻訳レベルまたはそれらの両方で起こり得、調節制御の改変（例えば、強力なプロモーターの使用）またはコピー数の増加またはそれらの両方に起因し得る。
【００３５】
２つまたはそれを超える核酸配列間の「同一性の割合」は、ギャップの数と、２つまたはそれを超える配列のアラインメントを最適化するために導入する必要がある各ギャップの長さとを考慮した上で、これらの配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、同一性の％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つまたはそれを超える配列間の配列の比較および同一性の割合の決定は、デフォルトパラメーターで数学的アルゴリズム（ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムなど）を使用して達成され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。
【００３６】
「保存的置換」は、当技術分野では、あるアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することとして認識されている。例示的な保存的置換は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第９７／０９４３３号の第１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．７１−７７，１９７５；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ｐ．８，１９９０を参照のこと）。
【００３７】
本明細書で使用される「阻害する」または「阻害された」は、対照、内因性または参照の分子と比べた、標的遺伝子の発現または標的分子（例えば、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ）の活性における直接的または間接的な改変、低減、ダウンレギュレーションまたは抑止であって、統計的、生物学的、産業的または臨床的に有意な改変、低減、ダウンレギュレーションまたは抑止を指す。例えば、阻害された、不活性化された、または低下した活性の（例えば、遺伝子改変）生合成酵素は、野生型または親酵素と比較して３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の活性を有し得る。
【００３８】
本明細書で使用される用語「誘導体」は、酵素の有無にかかわらず、化学的または生物学的手段による化合物の修飾を指し、修飾化合物は、親化合物と構造的に類似し、その親化合物から（実際にまたは理論的に）誘導可能である。誘導体は、親化合物と異なる化学的、生物学的または物理的特性を有し得る（例えば、親化合物と比較して親水性が高く、または応答性が改変されている）。誘導体化（すなわち、修飾）は、分子内の１つまたはそれを超える部分の置換（例えば、官能基の変化）を含み得る。例えば、水素をハロゲン（フッ素または塩素など）で置換し得るか、またはヒドロキシル基（−ＯＨ）をカルボン酸部分（−ＣＯＯＨ）で置換し得る。他の例示的な誘導体化としては、グリコシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、ユビキチン化、エステル化およびアミド化が挙げられる。
【００３９】
用語「誘導体」はまた、親化合物の、あらゆる溶媒和物、例えば水和物または付加物（例えば、アルコール付加物）、活性代謝産物および塩を指す。塩の種類は、化合物内の部分の性質に依存する。例えば、カルボン酸基などの酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、さらには生理学的に許容され得る第４級アンモニウムイオンとの塩、そしてアンモニアおよび生理学的に許容され得る有機アミン、例えばトリエチルアミン、エタノールアミンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどとの酸付加塩）を形成し得る。塩基性基は、例えば、塩酸、硫酸もしくはリン酸等の無機酸との酸付加物、または、酢酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸もしくはｐ−トルエンスルホン酸等の、有機のカルボン酸もしくはスルホン酸との酸付加塩を形成し得る。塩基性基と酸性基とを同時に含有する化合物、例えば、塩基性窒素原子に加えてカルボキシル基を含有する化合物は、双性イオンとして存在し得る。塩は、当業者に既知の通例の方法によって、例えば、溶媒または希釈剤中で無機酸もしくは有機酸または無機塩基もしくは有機塩基と化合物とを組み合わせることによって、または陽イオン交換もしくは陰イオン交換による他の塩から、得られ得る。
水素資化微生物−宿主細胞
【００４０】
本開示の親または出発水素資化微生物は、野生型（天然）株、突然変異（非天然）株（例えば、増殖速度の増加、調節解除または抑制解除された生合成酵素）または組換え株であり得、これらはそれぞれ、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアミノ酸（例えば、リジン、グリシン、トレオニン、メチオニン）を産生するようにさらに修飾され得る。特定の実施形態では、水素資化生物は、細菌またはメタン生成古細菌であり得る。
【００４１】
特定の実施形態では、本開示は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓなどのメタン生成古細菌である水素資化微生物を提供する。
【００４２】
さらなる実施形態では、水素資化微生物は、特定のメタン生成古細菌種である。例示的なメタン生成古細菌種としては、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃ���ｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓが挙げられる。
【００４３】
特定の実施形態では、メタン生成古細菌は、シトクロムを産生し、またはシトクロムを産生しない。例えば、シトクロムを産生しないメタン生成古細菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである。
【００４４】
関連の実施形態では、メタン生成古細菌は、中温性、好熱性または超好熱性であり得る。例示的な中温性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａのいくつかの種が挙げられる。例示的な好熱性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、ＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａおよびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓのいくつかの種が挙げられる。例示的な超好熱性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓおよびＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓのいくつかの種が挙げられる。
【００４５】
さらなる実施形態では、本開示は、細菌である水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、水素資化生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、ＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓなどの合成ガスまたはＣＯ代謝微生物であり得る。例示的なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種としては、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｗｏｏｄｉｉおよびＣ．ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎが挙げられ、例示的なＢｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ種は、Ｂ．ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍである。特定の他の実施形態では、水素資化生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉなどの水素酸化細菌であり得る。
【００４６】
特定の実施形態では、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。さらなる実施形態では、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。特定の実施形態では、水素資化通性嫌気性生物は、Ｈ２および酸素または酸化物（例えば、酸化鉄、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、スルホキシド）の存在下で増殖し得る。例示的な水素資化通性嫌気性生物としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（例えば、Ｃ．ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｃａｍｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｇｉｌａｒｄｉｉ、Ｃ．ｌａｈａｒｉｓ、Ｃ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃ．ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ、Ｃ．ｐａｍｐａｅ、Ｃ．ｐａｕｃｕｌｕｓ、Ｃ．ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｒｅｓｐｉｒａｃｕｌｉ、Ｃ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ種．およびＡｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ種が挙げられる。
水素資化微生物−非天然および組換え
【００４７】
目的のポリペプチドをノックアウト、低減、発現または過剰発現させるように、本開示の水素資化微生物を遺伝学的に操作し得（例えば、非天然）、組換え修飾、またはそれらを組み合わせ得、その結果、Ｈ２／ＣＯｘ基質の様々な成分を他の有用な化合物または組成物、例えばアミノ酸または飼料に変換（例えば、利用、変換、同化、酸化、還元）するために有用な組換え微生物が得られる。
【００４８】
非天然水素資化微生物を作製するための遺伝学的な操作としては、（例えば、化学誘導された、自然発生的な）ランダムまたは部位特異的な、（例えば、１つまたはそれを超える遺伝子標的の）突然変異誘発、（例えば、強い、弱い、誘導性、抑制性もしくは多数のプロモーターを除去することによる、または様々な特性を有するプロモーターでこのようなプロモーターを置換することによる）１つもしくはそれを超える遺伝子標的の発現に関連する調節配列もしくは部位の改変、１つもしくはそれを超える遺伝子標的の染色体位置の変更、１つもしくはそれを超える遺伝子標的に隣接する核酸配列（例えば、リボソーム結合部位または転写ターミネーター）の改変、１つもしくはそれを超える遺伝子標的のコピー数の減少もしくは増加、１つもしくはそれを超える遺伝子標的の転写もしくは１つもしくはそれを超える遺伝子産物の翻訳に関与する調節タンパク質、リプレッサー、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子などの修飾、または１つもしくはそれを超える遺伝子標的の発現を調節解除する任意の他の方法（アンチセンス核酸分子、短鎖干渉核酸分子、または標的タンパク質の発現をノックアウトもしくは遮断するための他の方法の使用を含む）が挙げられ得る。
【００４９】
特定の実施形態では、遺伝学的な操作は、非天然水素資化微生物をもたらす１つまたはそれを超える自然突然変異を含む。このような自然突然変異体は、例えば、所望の表現型を有する突然変異体のみが増殖する特定の選択圧下（例えば、増殖培地中における特定のアミノ酸または毒素の非存在下、抗生物質の存在下、特定の代謝産物の非存在下など）に微生物を置くことによって識別され得る。
【００５０】
細菌および古細菌の様々な種において、異種宿主における組換えタンパク質の発現に影響を与え得るコドン使用頻度バイアスの変動が観察されている（Ｓｈａｒｐら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１１４１，２００５；Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：１３１，２０１１）。特定の実施形態では、本明細書に記載されるように宿主細胞に導入する前に、核酸分子（例えば、アスパラギン酸経路アミノ酸生合成酵素をコードする核酸）をコドン最適化して、タンパク質の発現を改善または最大化し得る。コドン最適化は、遺伝子またはコード領域内のコドン配列を核酸分子レベルで改変して、前記コドンによってコードされるアミノ酸を改変せずに宿主細胞のより一般的なコドン使用頻度を反映することを指す。異種宿主における遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９８：４３，２０１１；Ｈｅｎｒｙ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２４：１０，２００７；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１３号を参照のこと）。
【００５１】
さらなる実施形態では、本開示の生合成酵素をコードする内因性または外因性核酸分子を、野生型から変化したアミノ酸配列を有するように改変し得る。これらの方法によって作製される各変異体ポリペプチドは、少なくとも５０％の活性（好ましくは、１００％またはそれを超える活性）を保持し、参照または親野生型ポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一または１００％同一のポリペプチド配列を有するであろう。特定の実施形態では、変異体が目的の活性（例えば、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、シンターゼ）を保持することを条件として、変異体ポリペプチドは、参照または親野生型酵素と比べて、１つまたはそれを超える所定の位置において、少なくとも１個のアミノ酸置換（例えば、少なくとも１個、２個、３個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個またはそれを超える、または最大２０個、２５個または３０個の置換）または特定数以下のアミノ酸置換（例えば、１個、２個、３個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個または３０個未満の置換）を含むであろう。
【００５２】
上記のように、アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成における最初の関与酵素は、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック調節を受け得るアスパルトキナーゼである。例えば、大腸菌は、３つのアスパルトキナーゼアイソザイムを有する−２つは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する二官能性であり、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ；ｔｈｒＡ）およびアスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩ（ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ；ｍｅｔＬ）と称され、他方は、アスパルトキナーゼ活性のみを有し、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫ−ＩＩＩ；ｌｙｓＣ）と称される。ＡＫ／ＨＤ−Ｉは、トレオニンによるフィードバック調節（ならびに、レオニンおよびロイシンによる発現抑制）を受けるが、ＡＫ／ＨＤ−ＩＩは、メチオニンのみによるフィードバック調節を受け、ＡＫ−ＩＩＩは、リジンのみによるフィードバック調節を受ける（Ｐａｔｔｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６：２４５，１９６７；Ｔｈｅｚｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７：１３３，１９７４を参照のこと）。対照的に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼは、リジンおよびトレオニンの両方によってフィードバック阻害される（Ｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｏ，１９７０；Ｙｏｓｈｉｄａら、２００７）。アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成に関与する他の酵素、例えばホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼもまた、フィードバック阻害を受ける。
【００５３】
したがって、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成に関与する調節解除された酵素（例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼまたはジヒドロジピコリン酸シンターゼ）であって、その活性が内因性、外因性またはそれらの両方であり得る酵素を有する水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、アスパルトキナーゼは、共役ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を場合により有し得る。フィードバック耐性突然変異体を識別するための方法は、当技術分野で既知である−例えば、毒性アミノ酸類似体、例えばリジン類似体Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）またはメチオニン類似体ＤＬ−エチオニンの存在下で増殖することができる微生物は、前記毒性類似体に対応するアミノ酸に対してフィードバック耐性であると考えられている（例えば、Ｓｈｉｉｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．５４：３２７５，１９９０；Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３：４１−６１，２００５を参照のこと）。
【００５４】
特定の態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現または過剰発現し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性は、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼ突然変異体である。他の実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせを含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。
【００５５】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リジン結合部位、リジンおよびトレオニン結合部位、リジンもしくはトレオニン結合部位以外の部位またはそれらの任意の組み合わせにおいて突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性は、メチオニン結合部位において突然変異を含む突然変異体ｍｅｔＬ遺伝子によってコードされる。
【００５６】
本開示のｌｙｓＣフィードバック耐性突然変異体について言及する場合、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングを参照のこと。例示的なトレオニン結合部位の突然変異としては、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリジン結合部位の突然変異としては、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリジンおよびトレオニン結合部位の突然変異は、残基Ｄ２９４である。例示的なリジンおよびトレオニン結合部位以外の部位の突然変異としては、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持することを条件として、上記突然変異のいずれか１つまたはそれを超えるものは、本開示のアスパルトキナーゼに含まれ得る。
【００５７】
アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成を効率的に発生させるためには、一定量の炭素フラックスが前記経路を介して流入しなければならない。アスパラギン酸経路アミノ酸の産生を増強または強化する１つの方法は、本開示によって提供されるように、この経路への炭素フラックスを最大化することである。
【００５８】
他の態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性、高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、非天然水素資化微生物は、低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性またはそれらの両方を有する。特定の他の実施形態では、非天然水素資化微生物は、高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いピルビン酸シンターゼ、高いアセチル−ＣｏＡシンターゼ、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有する。
【００５９】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性またはそれらの両方を有する。またさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いピルビン酸シンターゼ、高いアセチル−ＣｏＡシンターゼ、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有する。これらの各実施形態では、非天然水素資化微生物は、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する。
【００６０】
本明細書で述べるように、アスパラギン酸経路アミノ酸を産生する生合成酵素のいくつかは、フィードバック調節を受け（例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ）、これらの酵素をコードする遺伝子は、抑制を受け（例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ）、またはそれらの両方である（例えば、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ）。したがって、アスパラギン酸経路アミノ酸の産生は、本開示によって提供されるように、調節、抑制またはそれらの両方を解除することによって改善され得る。
【００６１】
さらなる態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からの１つまたはそれを超える調節解除および／または抑制解除されたポリペプチドを含み、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸（例えば、より高レベルのリジン、グリシン、トレオニン、メチオニン）を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、非天然水素資化微生物は、抑制解除された、調節解除された、またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）またはそれらの任意の組み合わせを有する。
【００６２】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からの１つまたはそれを超える他の調節解除および／または抑制解除されたポリペプチドを有する。またさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、抑制解除された、調節解除された、またはそれらの両方のホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）またはそれらの任意の組み合わせを有し、抑制解除または調節解除またはそれらの両方は、１つまたはそれを超える自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせによるものである。
【００６３】
１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を過剰産生することに加えて、産生されるアミノ酸の抽出または単離を回避することが有利であろう。したがって、本開示は、培養培地中で１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を強化生産するための方法であって、単離または精製方法が簡素化されている方法を提供する。
【００６４】
またさらなる態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターを発現または過剰発現し、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、非天然水素資化微生物は、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターであって、強力な発現制御配列（例えば、ｎｉｆまたはｔｅｔプロモーター）に作動可能に連結されたエクスポーター（例えば、ｒｈｔＡまたはｌｙｓＥエクスポーター）を発現または過剰発現し、他の実施形態では、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の非天然水素資化微生物トランスポーター／インポーターは、ノックアウトまたは阻害される。
【００６５】
アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の特定の生合成経路への炭素フローを確保するための別の方法は、他の競合アミノ酸の産生を除去することである。本開示で提供されるように、水素資化微生物は、１つまたはそれを超えるアミノ酸の栄養要求体（ａｕｘｏｔｈｒｏｐｈｓ）であり得る。
【００６６】
別のさらなる態様では、本開示は、非天然水素資化微生物であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求体であり、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、非天然水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。特定の他の実施形態では、非天然水素資化微生物は、リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、非天然水素資化微生物は、リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの両方である。
【００６７】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求体である。またさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。別のさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。またさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体またはそれらの両方である。
【００６８】
時として、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸を産生する１つまたはそれを超える生合成酵素の単なる過剰発現は、本開示の水素資化微生物に有用であろう。
【００６９】
またさらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドを過剰発現する非天然水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する非天然水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼが過剰発現されており、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されており、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されており、またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方が過剰発現されており、またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドが過剰発現されている。
【００７０】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドを過剰発現する。特定のさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物はまた、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ジヒドロピコリン酸レダクターゼとしても既知である）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼもしくはそれらの任意の組み合わせ；もしくはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｓｄまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（例えば、ｄａｐＡまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（例えば、ｄａｐＢまたはその変異体によってコードされる）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、ｄａｐＬまたはその変異体によってコードされる）および場合によりジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｌｙｓＡまたはその変異体によってコードされる）を過剰発現し；またはホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼもしくはそれらの両方を過剰発現し；またはホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方を過剰発現し；またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方を過剰発現し；またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する。
【００７１】
微生物において外因性または異種核酸を発現させるための組換え方法は、当技術分野で周知である。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記載を見出すことができる。発現させるべき例示的な外因性タンパク質または酵素としては、リジン生合成に関与するもの（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ、アスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ［ジヒドロピコリン酸レダクターゼとしても既知である］、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、テトラヒドロジピコリン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、アセチル−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、Ｎ−アセチルジアミノピメリン酸アセチラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせ）、トレオニン生合成に関与するもの（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはそれらの任意の組み合わせ）、メチオニン生合成（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）またはそれらの任意の組み合わせ）に関与するもの、またはアスパラギン酸ファミリーアミノ酸生合成経路への炭素フラックスに影響を与える酵素（例えば、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。酵素をコードする核酸分子またはその機能的断片に対する遺伝子修飾は、天然に存在する状態から改変された組換え細胞に生化学的または代謝的な能力を付与し得る。
【００７２】
本開示の水素資化微生物のいずれかを、少なくとも１つの外因性核酸を含むように形質転換して、新たなまたは強化した活性（例えば、酵素活性）を有する宿主を提供し得るか、または当技術分野で既知の様々な方法のいずれかを使用して内因性遺伝子の機能を除去もしくは実質的に低減するように遺伝子修飾し得る。メタン生成古細菌などの水素資化微生物における異種核酸分子の導入および発現のための遺伝学的ツールは、当技術分野で既知である（例えば、Ｒｏｔｈｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：７４５，２００５；Ｌｅｉｇｈら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３５：５７７，２０１１を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ送達（Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７６：５６４４，２０１０；Ｍｅｔｃａｌｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２６２６，１９９７），シャトルベクター（Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１４３９，１９９９；Ｍｅｔｃａｌｆら、１９９７），異種遺伝子の発現の調節（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０１，２００２；Ｃｈａｂａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５９６，２００７；Ｇｕｓｓら、Ａｒｃｈａｅａ  ２：１９３，２００８）およびノックインまたはノックアウト遺伝子交換（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：９７２，２００５；Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７０：１４２５，２００４）のためのツールが利用可能である。したがって、水素資化微生物における内因性遺伝子の機能を不活性化、ノックアウトまたは削除するための様々な方法を使用し得る。
【００７３】
特定の実施形態では、宿主水素資化微生物におけるアミノ酸生合成経路酵素をコードする外因性核酸分子の恒常的な高発現のために、プロモーター、コドン最適化またはそれらの両方を使用し得る。宿主水素資化微生物（例えば、メタン生成古細菌）における外因性核酸分子の調節された発現も利用し得る。特定の実施形態では、非天然または組換え水素資化微生物の増殖速度を最適化するために、アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸分子の調節された発現が望ましい場合がある。Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在に対する応答のためのアミノ酸生合成酵素をコードする核酸分子の制御された発現は、利用可能なＨ２／ＣＯｘ基質の様々な供給源または比の多様性に基づいて増殖を改善し得る。
【００７４】
本明細書に記載されるように、１つを超える異種または外因性核酸分子を、別個の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして宿主細胞に導入し得る。例えば、本明細書に開示されるように、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の所望の生合成酵素（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ、アスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、ホモセリンシンターゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ）をコードする２つまたはそれを超える異種または外因性核酸分子を発現するように、Ｈ２／ＣＯｘ代謝微生物を修飾し得る。２つまたはそれを超える外因性核酸分子を宿主Ｈ２／ＣＯｘ代謝微生物に導入する場合、２つまたはそれを超える外因性核酸分子を単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターによって）、別個のベクターによって導入し、単一の部位または複数の部位において宿主染色体に組み込み得ると理解される。参照異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入される別個の核酸分子の数ではなく、コード核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。
【００７５】
例えば、Ｈ２／ＣＯｘ基質（例えば、Ｈ２とＣＯ２、ＣＯまたはそれらの両方）を利用し、親微生物よりも高レベルでアスパラギン酸経路アミノ酸（例えば、リジン、トレオニンまたはメチオニン）に変換または代謝することができるポリペプチドを産生するように、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を組換えによって形質転換し得る。
【００７６】
背景として、古細菌および細菌では、少なくとも４つの異なるリジン生合成経路が存在するので、１つを超える経路が存在することは異常ではないが、一般に、４つすべてが同時に存在することはない。前記経路における異なる段階は、様々な酵素によって触媒され、したがって、リジンの産生を駆動する酵素の量を増加させるために、これらのそれぞれを過剰発現させ得る。また、これらのリジン生合成経路に必要な酵素をコードする核酸分子を、このような酵素を欠く水素資化微生物に組換えによって追加し得る。最後に、産生されるリジンの量を最大化するために、（ａ）リジン産生につながる経路と競合し得る段階を減衰、遮断またはノックアウトし得、（ｂ）リジン産生を強化し得る（例えば、炭素フラックスをリジン生合成にシフトさせる）段階を改変し得、または（ｃ）それらの両方を変化させ得る。
【００７７】
第１のリジン生合成経路は、以下の酵素を含む：アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ。第２のリジン生合成経路は、以下の酵素を含む：アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ。第３のリジン生合成経路は、以下の酵素を含む：アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ。第４のリジン生合成経路は、以下の酵素を含む：アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸アセチルトランスフェラーゼ、アセチル−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルジアミノピメリン酸アセチラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ。
【００７８】
特定の実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、非天然水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでリジンを産生する。さらなる実施形態では、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。
【００７９】
特定の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードし、ジヒドロジピコリン酸シンターゼは、場合により過剰発現されている。さらなる実施形態では、第１の外因性核酸分子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｓｄまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（例えば、ｄａｐＡまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（例えば、ｄａｐＢまたはその変異体によってコードされる）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、ｄａｐＬまたはその変異体によってコードされる）およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｌｙｓＡまたはその変異体によってコードされる）をコードする。
【００８０】
いくつかの実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるメチオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるリジン分解経路ポリペプチド（例えば、ｃａｄＡ）、または（ｅ）それらの組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンデヒドロゲナーゼ突然変異体をコードする。
【００８１】
上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。加えて、上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、非天然水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【００８２】
別のさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、非天然水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでトレオニンを産生する。さらなる実施形態では、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、調節解除されており、またはそれらの両方である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるリジン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるメチオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるイソロイシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｅ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるトレオニン分解経路ポリペプチド（例えば、ｔｄｈ）、または（ｆ）それらの任意の組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードするリジンまたはイソロイシン生合成経路核酸分子は、ノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ突然変異体、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【００８４】
上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。加えて、上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、非天然水素資化微生物は、リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【００８５】
またさらなる実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、非天然水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、調節解除されており、またはそれらの両方である。
【００８６】
特定の他の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、調節解除されており、またはそれらの両方が過剰発現されている。また他の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、大腸菌ＴｈｒＡ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ）、大腸菌ＭｅｔＬ（ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ）、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの組み合わせをコードし、ＡＫ／ＨＤ−Ｉ、ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの組み合わせは、場合により過剰発現されており、調節解除されており、またはそれらの両方が過剰発現されている。特定の実施形態では、大腸菌ＴｈｒＡ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ）は、調節解除された突然変異体であり、ＡＫ／ＨＤ−Ｉは、アミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２およびＧ４３３のうちのいずれか１つまたはそれを超える位置において突然変異されている。
【００８７】
いくつかの実施形態では、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する非天然水素資化微生物は、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるリジン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるメチオニン分解経路ポリペプチド（例えば、ｍｅｔＫ）、または（ｅ）それらの任意の組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子は、ノックアウトされているかまたは低い活性をコードする。
【００８８】
上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。加えて、上記非天然水素資化微生物のいずれにおいても、非天然水素資化微生物は、リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【００８９】
特定の態様では、本開示は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、水素資化微生物は、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つまたはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性の内因性アスパルトキナーゼ突然変異体などの調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現する。さらなる実施形態では、第１の外因性核酸分子は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現するか、または第１の外因性核酸分子は、リジン、トレオニンおよびメチオニンのうちの１つもしくはそれを超えるものによるフィードバック阻害に対して耐性の内因性アスパルトキナーゼ突然変異体などの調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性をコードする。いくつかの実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、突然変異大腸菌アスパルトキナーゼ遺伝子、例えば突然変異アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）、突然変異アスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７７３７０．１）または突然変異アスパルトキナーゼＩＩＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、アミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２およびＧ４３３のうちのいずれか１つもしくはそれを超える位置において突然変異されている大腸菌アスパルトキナーゼＴｈｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）によって提供されるか、またはアミノ酸位置Ｔ３４２において突然変異されている突然変異体大腸菌アスパルトキナーゼｌｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）によって提供される。他の実施形態では、調節解除された外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせをそれぞれ含む突然変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子またはそれらの組み合わせによって、個別にコードされる。
【００９０】
さらなる実施形態では、調節解除された外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リジン結合部位、リジンおよびトレオニン結合部位、リジンまたはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおいて突然変異を含む突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個別にコードされる。本開示のｌｙｓＣ突然変異体について言及する場合、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングを参照のこと。例示的なトレオニン結合部位の突然変異としては、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリジン結合部位の突然変異としては、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリジンおよびトレオニン結合部位の突然変異は、残基Ｄ２９４である。例示的なリジンおよびトレオニン結合部位以外の部位の突然変異としては、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持することを条件として、上記突然変異のうちのいずれか１つまたはそれを超える突然変異は、本開示のアスパルトキナーゼに含まれ得る。
【００９１】
他の態様では、本開示は、ピルビン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第３の外因性核酸分子、または低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を場合により有するそれらの任意の組み合わせを含む組換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組換え水素資化微生物は、低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性、高いピルビン酸キナーゼ活性またはそれらの両方を有する。特定の他の実施形態では、組換え水素資化微生物は、高いピルビン酸カルボキシラーゼ活性、高いピルビン酸シンターゼ、高いアセチル−ＣｏＡシンターゼ、高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性またはそれらの任意の組み合わせを有する。
【００９２】
さらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の合成のための１つまたはそれを超える生合成経路からの改変されたポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、前記１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが調節解除および／または抑制解除されており、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組換え水素資化微生物は、抑制解除された、調節解除された、またはそれらの両方のホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼまたはそれらの任意の組み合わせを有する。
【００９３】
またさらなる態様では、本開示は、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーターをコードする第１の外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組換え水素資化微生物は、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸のエクスポーター（例えば、ｒｈｔＡまたはｌｙｓＥエクスポーター）をコードする外因性核酸分子をさらに含む。他の実施形態では、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の非天然水素資化微生物トランスポーター／インポーターは、ノックアウトまたは阻害される。
【００９４】
別のさらなる態様では、本開示は、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の生合成をノックアウトするための遺伝子修飾を含む組換え水素資化微生物であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求体であり、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組換え水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。特定の他の実施形態では、組換え水素資化微生物は、リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、組換え水素資化微生物は、リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【００９５】
特定のさらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドをコードする１つまたはそれを超える外因性核酸分子を含む組換え水素資化微生物であって、前記１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドが過剰発現されており、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生することができる組換え水素資化微生物を提供する。
【００９６】
特定の実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ジヒドロピコリン酸レダクターゼとしても既知である）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせは過剰発現されており；またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｓｄまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（例えば、ｄａｐＡまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（例えば、ｄａｐＢまたはその変異体によってコードされる）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、ｄａｐＬまたはその変異体によってコードされる）およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｌｙｓＡまたはその変異体によってコードされる）は過剰発現されており；またはまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼもしくはそれらの両方は過剰発現されており；またはホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはそれらの両方は過剰発現されており；またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはそれらの両方は過剰発現されており；またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドは過剰発現されている。
【００９７】
特定の実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、組換え水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでリジンを産生する。さらなる実施形態では、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。特定の実施形態では、第２の外因性核酸分子は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードし、ジヒドロジピコリン酸シンターゼは、場合により過剰発現されており、核酸発現制御配列に作動可能に連結されており、またはそれらの両方である。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸分子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｓｄまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（例えば、ｄａｐＡまたはその変異体によってコードされる）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（例えば、ｄａｐＢまたはその変異体によってコードされる）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、ｄａｐＬまたはその変異体によってコードされる）および場合によりジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｌｙｓＡまたはその変異体によってコードされる）をコードし、１つまたはそれを超えるまたはすべての個々の核酸分子コード配列は、場合により過剰発現されており、核酸発現制御配列に作動可能に連結されており、またはそれらの両方である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、リジン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるメチオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるリジン分解経路ポリペプチド（例えば、ｃａｄＡ）、または（ｅ）それらの組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンデヒドロゲナーゼ突然変異体をコードする。
【００９９】
上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、第１の外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または第１の外因性核酸分子は自己複製ベクターに含まれている。加えて、上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、組換え水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１００】
別のさらなる実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、組換え水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでトレオニンを産生する。さらなる実施形態では、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第２の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、核酸発現制御配列に作動可能に連結されており、調節解除されており、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、トレオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるリジン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する１つもしくはそれを超える、メチオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるイソロイシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｅ）ノックアウトされているかもしくは低い活性を有する、１つもしくはそれを超えるトレオニン分解経路ポリペプチド（例えば、ｔｄｈ）、または（ｆ）それらの任意の組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードするリジンまたはイソロイシン生合成経路核酸分子は、ノックアウトされているか、または低い活性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ突然変異体、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【０１０２】
上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、第１の外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または第１の外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。加えて、上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、組換え水素資化微生物は、リジン栄養要求体、メチオニン栄養要求体、イソロイシン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１０３】
またさらなる実施形態では、アスパルトキナーゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼまたはホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼを有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、本明細書に記載されるように、組換え水素資化微生物は、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるコードされるポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第２の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、核酸発現制御配列に作動可能に連結されており、調節解除されており、またはそれらの任意の組み合わせである。特定の他の実施形態では、第２の外因性核酸分子は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの両方をコードし、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはそれらの両方は、場合により過剰発現されており、核酸制御配列に作動可能に連結されており、調節解除されており、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外因性核酸分子を有する組換え水素資化微生物は、メチオニン生合成経路からの１つまたはそれを超えるポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子をさらに含み、（ａ）ノックアウトされているか、もしくは低い活性を有する１つもしくはそれを超えるリジン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているか、もしくは低い活性を有する１つもしくはそれを超えるトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているか、もしくは低い活性を有する１つもしくはそれを超えるグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているか、もしくは低い活性を有する１つもしくはそれを超えるメチオニン分解経路ポリペプチド（例えば、ｍｅｔＫ）、または（ｅ）それらの任意の組み合わせをさらに有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子はノックアウトされているか、または低い活性のジヒドロジピコリン酸シンターゼ突然変異体、トレオニンデヒドラターゼ突然変異体、トレオニンアルドラーゼ突然変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ突然変異体もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【０１０５】
上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、第１の外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、または第１の外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。加えて、上記組換え水素資化微生物のいずれにおいても、組換え水素資化微生物は、リジン栄養要求体、トレオニン栄養要求体、グリシン栄養要求体またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される水素資化微生物は、アスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）またはジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ４．３．３．７）を発現または過剰産生するように操作され得、さらにＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８３）、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１６）またはそれらの両方を発現または過剰産生するように場合により操作され得る。特定の実施形態では、水素資化微生物は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ４．３．３．７）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．２６）およびＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８３）を発現または過剰産生するように操作される。さらなる実施形態では、水素資化微生物は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１１）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ４．３．３．７）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．２６）、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８３）および場合によりジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２０）を発現または過剰産生するように操作される。これらの実施形態のいずれにおいても、水素資化微生物は、例えば、検出可能または過剰なリジンを産生するために、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１１）をさらに場合により発現または過剰産生し得る。これらの実施形態のいずれにおいても、水素資化微生物は、リジンによるフィードバック阻害に対して耐性の突然変異ＬｙｓＣ（ＥＣ２．７．２．４）または突然変異ＡＫ／ＨＤ−Ｉ（ＥＣ２．７．２．４／ＥＣ１．１．１．３）（例えば、アミノ酸変化Ｇ４３３Ｒに対応する核酸位置Ｇ１２９７Ａ）をコードし得る。
【０１０７】
例えば、アスパルトキナーゼを発現または過剰産生するために、大腸菌（ｔｈｒＡ）、大腸菌（ｍｅｔＬ）、大腸菌（ｌｙｓＣ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｌｙｓＣ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｌｙｓＣ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性アスパルトキナーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのアスパルトキナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ３０５７３．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００２９１．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７５２２．１）、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）；大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｍｅｔＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７７３７０．１）；大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）に由来する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼアミノ酸配列またはその機能的断片は、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０由来のｔｈｒＡ、ｍｅｔＬまたはｌｙｓＣアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２、ＢＡＥ７７３７０．１またはＢＡＥ７８０２６．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２、ＢＡＥ７７３７０．１もしくはＢＡＥ７８０２６．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２およびＧ４３３（例えば、アスパラギン酸、フェニルアラニンまたはアルギニン）のうちのいずれか１つもしくはそれを超える位置において突然変異されている大腸菌ＴｈｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）であるか、またはアミノ酸位置Ｔ３４２（例えば、イソロイシン）において突然変異されている大腸菌ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）である。
【０１０９】
特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１またはＣＡＦ３０５７３．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１、ＣＡＦ３０５７３．１、ＡＦＤ００２９１．１もしくはＡＤＣ４７５２２．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
例えば、ジヒドロジピコリン酸シンターゼを発現または過剰産生するために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＤａｐＡ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ＤａｐＡ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ジヒドロジピコリン酸シンターゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２０３１２．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ３０１３２．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＣ９９２３１．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７５２１．１）に由来する。
【０１１１】
特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２０３１２．１またはＣＡＦ３０１３２．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるジヒドロジピコリン酸シンターゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２０３１２．１、ＣＡＦ３０１３２．１、ＡＦＣ９９２３１．１もしくはＡＤＣ４７５２１．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのジヒドロジピコリン酸シンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
例えば、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼを発現または過剰産生するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ（ＤａｐＬ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ６ＬＸ２６．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４６７９２．１）に由来する。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ６ＬＸ２６．１またはＡＤＣ４６７９２．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ６ＬＸ２６．１もしくはＡＤＣ４６７９２．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
例えば、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを発現または過剰産生するために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｌｙｓＣ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｌｙｓＣ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのメソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２１２７９．１）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ３６９９２．１）に由来する。
【０１１５】
特定の実施形態では、メソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２１２７９．１またはＡＡＯ３６９９２．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるメソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２１２７９．１もしくはＡＡＯ３６９９２．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのメソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のメソ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される水素資化微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）、ホモセリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３９）またはトレオニンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１）を発現または過剰産生するように操作され得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載される水素資化微生物は、例えば、検出可能または過剰なトレオニンを産生するために、ＡＫ／ＨＤ−Ｉ（ＥＣ２．７．２．４／ＥＣ１．１．１．３）およびホモセリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３９）を発現または過剰産生するように操作され得る。またさらなる実施形態では、本明細書に記載される水素資化微生物は、例えば、検出可能または過剰なトレオニンを産生するために、ＡＫ／ＨＤ−Ｉ（ＥＣ２．７．２．４／ＥＣ１．１．１．３）、ホモセリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３９）およびトレオニンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１）を発現または過剰産生するように操作され得る。これらの実施形態のいずれにおいても、水素資化微生物は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１１）をさらに場合により発現または過剰産生し得る。これらの実施形態のいずれにおいても、水素資化微生物は、トレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性の突然変異ＡＫ／ＨＤ−Ｉ（ＥＣ２．７．２．４／ＥＣ１．１．１．３）（例えば、Ｇ１２９７Ａ）をコードし得る。
【０１１７】
例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現または過剰産生するために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｈｏｍ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｈｏｍ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ホモセリンデヒドロゲナーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ３１２５８．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００６２４．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４６９９０．１）に由来する。
【０１１８】
特定の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１またはＣＡＦ３１２５８．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるホモセリンデヒドロゲナーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１、ＣＡＦ３１２５８．１、ＡＦＤ００６２４．１もしくはＡＤＣ４６９９０．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのホモセリンデヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
例えば、ホモセリンキナーゼを発現または過剰産生するために、大腸菌（ｔｈｒＢ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｔｈｒＢ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｔｈｒＢ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ホモセリンキナーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのホモセリンキナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７７．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２９８５１．１）、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｔｈｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８０．２）またはＭｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＣ９９７５８．１）に由来する。
【０１２０】
特定の実施形態では、ホモセリンキナーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８０．２、ＢＡＢ９８５７７．１またはＣＡＦ２９８５１．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるホモセリンキナーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８０．２、ＢＡＢ９８５７７．１、ＣＡＦ２９８５１．１もしくはＡＦＣ９９７５８．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのホモセリンキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のホモセリンキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１２１】
例えば、トレオニンシンターゼを発現または過剰産生するために、大腸菌（ｔｈｒＣ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｔｈｒＣ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｔｈｒＣ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性トレオニンシンターゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのトレオニンシンターゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９９６１３．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ２９６９１．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００５８４．１）、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｔｈｒＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８１．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７３４２．１）に由来する。
【０１２２】
特定の実施形態では、トレオニンシンターゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、大腸菌Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８１．１、ＢＡＢ９９６１３．１またはＣＡＦ２９６９１．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるトレオニンシンターゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５８１．１、ＢＡＢ９９６１３．１、ＣＡＦ２９６９１．１、ＡＦＤ００５８４．１もしくはＡＤＣ４７３４２．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのトレオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のトレオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１２３】
特定の実施形態では、水素資化微生物は、直接的に、Ｈ２Ｓなどの硫黄源をメチオニン生合成経路に直接的に組み込み得る。水素資化微生物によって産生されるか、または水素資化微生物による使用のために存在するあらゆる硫黄は、ホモシステイン生合成経路に入り得、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、Ｈ２ＳをＯ−アセチルホモセリンに組み込んでホモシステインを生成し、これがメチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）によってメチオニンにさらに変換され得る。
【０１２４】
例えば、本明細書に記載される水素資化微生物は、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ＥＣ２．５．１．４９）（これは、Ｈ２ＳをＯ−アセチルホモセリンに組み込んでホモシステインを生成し得る）を発現または過剰産生するように操作され得、ホモシステインをメチオニンに変換するためのコバラミン（ｃｏｂａｌｉｍｉｎ）依存性メチオニンシンターゼ（ＥＣ２．１．１．１３）またはコバラミン（ｃｏｂａｌｉｍｉｎ）非依存性メチオニンシンターゼ（ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても既知である）（ＥＣ２．１．１．１４）を発現または過剰産生するように場合により操作され得る。
【０１２５】
Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉまたはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ由来の１つまたはそれを超える遺伝子を本開示の水素資化微生物（例えば、非天然または組換えメタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７４１９．１またはＡＤＣ４６９９８．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔ１９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＲＭ４８６６４．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ亜株ＡＴＣＣ３５０２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＬ８３４１７．１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ９４８９０．１）またはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿３５１９０１．２）に由来し得る。
【０１２６】
特定の実施形態では、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１またはＡＤＣ４７４１９．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１、ＡＤＣ４７４１９．１、ＡＤＣ４６９９８．１、ＣＣＬ８３４１５．１もしくはＣＡＬ８３４１７．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
上記Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのいずれにおいても、非天然または組換え水素資化微生物は、本明細書に記載されるように、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに操作される。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載される水素資化微生物は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ＥＣ２．１．１．１３）またはコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても既知である）（ＥＣ２．１．１．１４）を発現または過剰産生するように操作され得、さらにＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生するように場合により操作され得る。
【０１２９】
例えば、コバラミン依存性メチオニンシンターゼを発現または過剰産生するために、大腸菌（ｍｅｔＨ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＨ）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、非天然メタン資化菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性コバラミン依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８９００．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｆ６６５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＲＭ５１５５９．１）またはＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧＢ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＹ９７８８５．１）に由来する。
【０１３０】
特定の実施形態では、コバラミン依存性メチオニンシンターゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のアミノ酸配列に基づくものであり、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８９００．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１、ＢＡＢ９８９００．１、ＥＲＭ５１５５９．１もしくはＡＢＹ９７８８５．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのコバラミン依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１３１】
他の実施形態では、例えば、メチオニンシンターゼを発現または過剰産生するために、大腸菌（ｍｅｔＥまたはｍｅｔＢ１２）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＥ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｍｅｔＥ）由来の１つまたはそれを超える遺伝子を水素資化微生物（例えば、非天然または組換えメタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性コバラミン非依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的断片を産生または過剰産生させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１９８４５．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８７５２１．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００４２１．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７４７０．１）に由来する。
【０１３２】
特定の実施形態では、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼのアミノ酸配列またはその機能的断片は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１のアミノ酸配列に基づくものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８７５２１．１またはＡＤＣ４７４７０．１に記載されている配列またはその機能的断片と少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組換えによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼは、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１、ＣＡＦ１９８４５．１、ＮＰ＿９８７５２１．１、ＡＦＤ００４２１．１もしくはＡＤＣ４７４７０．１に記載されている配列と同一であるか、またはこれらのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の既知のコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
上記メチルトランスフェラーゼの実施形態のいずれにおいても、非天然または組換え水素資化微生物は、本明細書に記載されるように、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに操作される。
【０１３４】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ．などのメタン生成古細菌である水素資化微生物を提供する。
【０１３５】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、特定のメタン生成古細菌種である水素資化微生物を提供する。例示的なメタン生成古細菌種は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓなどである。
【０１３６】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、シトクロムを産生し、またはシトクロムを産生しないメタン生成古細菌を含む水素資化微生物を提供する。シトクロムを産生しない例示的なメタン生成古細菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである。
【０１３７】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、細菌である水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、水素資化生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、ＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓなどの合成ガスまたはＣＯ代謝微生物であり得る。例示的なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種としては、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｗｏｏｄｉｉおよびＣ．ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎが挙げられ、例示的なＢｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ種は、Ｂ．ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍである。特定の他の実施形態では、水素資化生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉなどの水素酸化細菌であり得る。
Ｈ２／ＣＯｘ基質
【０１３８】
水素生産は、一連の改質、コンディショニングおよび分離工程を含み、これらの工程のいくつか（例えば、水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト、ＣＯ２スクラブおよび圧力スイング吸着）は、単独で、または１つもしくはそれを超える他のガス流と組み合わさって、本開示の水素資化微生物および方法の原料として有用なＨ２／ＣＯｘ基質を提供し得る、原料を提供し得る。
【０１３９】
背景として、水素生産は、高温水性ガスシフト（ＨＴＳ）反応、低温水性ガスシフト（ＬＴＳ）反応またはそれらの両方と組み合わせて、合成ガスなどのＨ２／ＣＯｘ基質を生成するための改質、部分酸化またはガス化の単一工程または複数工程を含み得る。いくつかの方法では、分子篩と共に圧力スイング吸着（ＰＳＡ）を使用することによって、酸化炭素を除去し、それによって、様々な量の二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）およびメタン（ＣＨ４）と一緒にいくらかの残留Ｈ２ガスを含むテールガスから、実質的に純粋な水素（Ｈ２）ガス流が分離される。特定の実施形態では、ガス（例えば、合成ガス）をＰＳＡに供する前に、二酸化炭素を場合によりスクラブし得る。使用される合成ガス生産プロセス、および二酸化炭素がスクラブされるかに応じて、テールガスは、様々な比のＨ２、ＣＯ２、ＣＯおよびＣＨ４を含むであろう。いくつかの実施形態では、本開示の方法に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、ＰＳＡテールガスおよびＨ２ガスの混合物を含むガス流混合物である。
【０１４０】
例えば、ＨＴＳと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、いくらかのＣＨ４（約５％）およびごくわずかなＣＯ（またはＣＯなし）と共に、主にＨ２（約７５％）およびＣＯ２（約２０％）を有するガス流を生産するであろう。別の例では、ＬＴＳと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、いくらかのＣＯ２（約５％）およびＣＨ４（約１％）と共に、主にＨ２（約７５％）およびＣＯ（約１０％）を有するガス流を生産するであろう。また別の例では、ＨＴＳおよびＰＳＡと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、かなりの量のＣＯ（約１０％）およびＣＨ４（約１５％）と共に、主にＨ２（約３０％）およびＣＯ２（約４５％）を有するテールガスを生産するであろう。この最後の実施形態では、ＣＯ２スクラブ工程が含まれる場合、テールガスは、わずかなＣＯ２（約１％）と共に、主にＨ２（約５０％）、ＣＨ４（約３０％）およびＣＯ（約２０％）を含むであろう。特定の実施形態では、ＰＳＡから生産されるパイプラインＨ２とＰＳＡテールガスを混合して、目的のＨ２／ＣＯｘ基質、例えば約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：ＣＯ２比を有するＨ２／ＣＯｘ基質を生産する。
【０１４１】
メタンの水蒸気改質は、それぞれ約１：７〜約１：１５の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４およびＨ２Ｏを含み得る。あるいは、メタンは、ＣＯ２で改質され得る（これは、乾燥改質と称される）。メタンの乾燥改質は、それぞれ約１：５〜約１：１５の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４２】
部分酸化改質（接触または非接触）および自己熱改質は、天然ガスの共反応物質として水の代わりに酸素を使用する。部分酸化改質および自己熱改質は、約１：２０であるＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４３】
ガス化（空気または酸素を有する材料（例えば、天然ガス液、ナフサ、ビチューメン、石炭、バイオマスなど）を含有する炭素の部分酸化）は、本開示の水素資化微生物および方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。例えば、石炭のガス化は、それぞれ約１：１．１〜約１：１１の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｎ２およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４４】
アンモニア合成は、一連の改質およびコンディショニング工程を含み、これらの工程の４つ（水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト）は、本開示の水素資化微生物および方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。これらの異なる各プロセスでは、それぞれ約１：３〜約１：１０の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比が提供され、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｎ２およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４５】
メタノール合成は、低温シフト、水蒸気改質および自己熱改質を含み、これらはすべて、本開示の水素資化微生物および方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。これらの３つの各プロセスでは、それぞれ約１：７〜約１：１２の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比がもたらされ、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４６】
総合製鉄所は、コークス炉（石炭からコークスを作るために）、高炉（銑鉄を作るために）および酸素炉（鋼を作るために）を含む様々なプロセスを組み合わせる。特定の実施形態では、総合製鉄所における直接還元は、銑鉄を作るための還元剤として（コークスの代わりに）改質天然ガスを使用する。これらの各炉および（炉頂ガスを生産する）直接還元改質は、それぞれ約８：１（溶鉱炉または酸素炉から）〜約１：３２（コークス炉）の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｃ２Ｈ６、Ｃ３Ｈ８、Ｎ２およびＨ２Ｏを含み得る。
【０１４７】
Ｈ２／ＣＯｘ基質の上記供給源のいずれにおいても、このようにして生産されたＨ２／ＣＯｘ原料を、任意の他の生産されたＨ２／ＣＯｘ原料、またはＨ２、ＣＯ２、ＣＯもしくはそれらの任意の組み合わせと混合して、目的のＨ２／ＣＯｘ基質、例えば約４：１または３：１のＨ２：ＣＯ２比を有する基質を生産し得る。特定の実施形態では、例えば、メタン生成菌と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：ＣＯ２比を含み、場合により、ＣＯの総量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％以下である。他の実施形態では、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍと共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：（ＣＯ２＋ＣＯ）比を含み、場合によりＣＯの総量は、少なくとも約１．０％、５．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える。これらの実施形態のいずれにおいても、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、ＰＳＡテールガスとＨ２ガスとの混合物を含み得る。
【０１４８】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、Ｈ２と、ＣＯ２またはＣＯまたはそれらの両方と、場合により本明細書に記載される様々な他の成分とから構成されるＨ２／ＣＯｘ基質を利用、代謝、酸化または変換する水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２ならびにＣＯ２およびＣＯ（ＣＯがＣＯ２よりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を場合により含む。さらなる実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２ならびにＣＯ２およびＣＯ（ＣＯ２がＣＯよりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を場合により含む。別のさらなる実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２ならびにＣＯ２およびＣＯ（ＣＯがＣＯ２およびＨ２の両方よりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を場合により含む。特定の状況では、Ｈ２／ＣＯｘを代謝する微生物は、エネルギー源としてＨ２および炭素源としてＣＯｘ（ｘは１または２である）を使用し得るか、またはエネルギー源としてＨ２およびＣＯｘならびに炭素源としてＣＯｘを使用し得る。
【０１４９】
上記非天然または組換え水素資化微生物の実施形態のいずれにおいても、本開示は、例えば、天然ガスもしくは液体炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素生産において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって生産され得るＨ２／ＣＯｘ基質を提供する。特定の実施形態では、上記改質方法のいずれによって生産されるＨ２／ＣＯｘ基質も、水性ガスシフト反応によってさらにコンディショニングされ得る。加えて、上記方法のいずれかによって生産される１つまたはそれを超えるガス流を、水素、一酸化炭素または二酸化炭素の他の供給源と混合して、Ｈ２／ＣＯｘ基質を生産または作製し得る（パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスを含む）。いくつかの実施形態では、ＣＯ２とＨ２との原料比は、それぞれ約１：５０〜約１０：１の範囲である。さらなる実施形態では、ＣＯ２とＨ２との原料比は、それぞれ約１：３〜約１：５の範囲である。
培養方法
【０１５０】
様々な培養方法が、本明細書に記載される非天然または組換え水素資化微生物（例えば、細菌、メタン生成古細菌）のために使用され得る。例えば、バッチ培養または連続培養法によって、水素資化微生物を増殖させ得る。特定の実施形態では、制御培養ユニット、例えば発酵槽、バイオリアクターまたは中空繊維膜バイオリアクター、気泡塔バイオリアクター、トリクルベッドバイオリアクターなどで、培養物を増殖させる。
【０１５１】
古典的なバッチ培養法は、培地の組成を培養開始時に設定し、培養プロセス中に外部改変を受けない閉鎖系である。したがって、培養プロセス開始時に、所望の水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を培地に接種し、いかなる物質もシステムに追加せずに増殖または代謝の活動を生じさせる。一般に、「バッチ」培養は、炭素源、ガス原料および培地成分の追加に関してバッチであり、廃ガスが排出可能であり、ｐＨなどの他の因子の制御の試みが多くの場合に行われる。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的な遅滞期から高度の対数増殖期へ、そして最終的には増殖速度が低下または停止する静止期へと緩和する。未処置の場合、静止期の細胞は、最終的に死滅するであろう。対数成長期の細胞は、多くの場合、いくつかのシステムにおいて最終生成物または中間体の大量産生を担う。他のシステムでは、静止期または対数期後の産生が得られ得る。
【０１５２】
フェドバッチシステムは、標準的なバッチシステムの変形である。フェッドバッチ培養プロセスは、培養が進行するにつれて漸増量の基質および潜在的な培地成分を追加する修正型バッチシステムを含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、および培地中の基質の量を制限することが望ましい場合、フェッドバッチシステムが有用である。ガス基質の発酵では、システムは、（廃ガスを除去し得るので）ガス基質に関して連続的であり、フェドバッチは液体（培地）に関して連続的である。バッチ培養法およびフェドバッチ培養法は一般的であり、当技術分野で既知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄ．（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２を参照のこと）。
【０１５３】
連続培養は、特定培養培地をバイオリアクターに連続的に追加し、同時に、処理のために（バイオマスまたは細胞の保持の有無にかかわらず）同量の馴化培地を除去する「開放」系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、原料および栄養素を連続的に追加し、有益な生成物、副生成物および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出し得るバイオマス、細胞保持または細胞固定化を含み得る。細胞保持は、様々な方法によって、例えばろ過、遠心分離または沈降によって実施され得る。細胞固定化は、天然材料および／または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して実施され得る。
【０１５４】
連続培養または半連続培養は、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法は、限られた栄養素（例えば、炭素源、窒素レベル、水素レベル、リンレベル）を一定の比に維持して、他のすべてのパラメータの調節を可能にし得る。他のシステムでは、成長に影響を及ぼす多くの因子を連続的に改変し得る一方、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持する。特定の実施形態では、生成物バイオマス比を増加させるために、水素資化生物のバイオマス成長は制限されている。連続培養プロセスのための栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化にするための技術は、当技術分野で周知である（Ｂｒｏｃｋ，１９８９を参照のこと）。
【０１５５】
液相バイオリアクター（例えば、撹拌タンク、充填層、一液相、二液相、中空糸膜）は当技術分野で周知であり、水素資化微生物の成長に使用され得る。
【０１５６】
多相バイオリアクターは、本開示の方法に使用され得る（例えば、気泡塔反応器、トリクルベッド反応器（固定層または充填層）、流動層反応器）。気泡塔は、泡形態の気体が液体と接触するデバイスである。トリクルベッド反応器は、培養物を成長させるために、並流または向流の気体および液体を使用する。流動層反応器は、固体を懸濁してそれを液体のように作用させるために十分な高速で、流体（気体または液体）を粒状固体材料に通過させることを含む。多相バイオリアクターの目的の１つは、液相および気相を混合することであり、物質移動および化学反応の強さに応じてより多い程度またはより少ない程度に、気体は水素資化微生物によって消費される。様々な種類の多相バイオリアクターは当技術分野で周知であり、本開示の方法において水素資化微生物の成長に使用され得る。
【０１５７】
本開示に記載される水素資化微生物を、単離された純粋な培養物として、成長を支援し得る異種非水素資化微生物と共に成長させ得るか、または１つもしくはそれを超える異なる株もしくは種の水素資化微生物を組み合わせて混合培養物を生成し得る。
【０１５８】
他の態様では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸またはアスパラギン酸経路アミノ酸含有飼料添加物を生産するための方法であって、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生するために十分な時間にわたって、上記非天然または組換え水素資化微生物のいずれかを培養することを含み、前記非天然または組換え水素資化微生物が、（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素についての改変された調節を含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物よりも高レベルで１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を産生する方法を提供する。
【０１５９】
特定の実施形態では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸またはアスパラギン酸経路アミノ酸含有飼料添加物を作るための方法であって、アスパラギン酸ファミリーアミノ酸の生合成のための１つまたはそれを超える経路からのポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にするために十分な条件下および時間にわたって、Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在下で、本開示に記載の組換えアスパラギン酸経路アミノ酸分泌水素資化微生物を培養することを含み、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸が、親水素資化微生物によって産生される１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸よりも高レベルで培養培地中に産生されて蓄積する方法を提供する。
【０１６０】
上記方法のいずれにおいても、発酵槽またはバイオリアクター、例えば液相バイオリアクター、気泡塔バイオリアクターまたはトリクルベッドバイオリアクター中で、水素資化微生物を培養し得る。
【０１６１】
非天然または組換え水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるアスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための上記方法のいずれにおいても、ガス原料は、Ｈ２／ＣＯｘ基質であり、前記原料は、Ｈ２とＣＯ２またはＣＯまたはそれらの両方とを含み、本明細書に記載される様々な他の成分を場合により含む。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは液体炭化水素の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成によって、メタノール合成によって、製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって生産される合成ガスなどの合成ガスである。
【０１６２】
非天然または組換え水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるアスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための上記方法のいずれにおいても、ガス基質は、例えば、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素生産において、アンモニア合成において、メタノール合成において製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって生産され得るＨ２／ＣＯｘ基質である。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたはそれを超える他の供給源を用いてこのようにして生産された任意のガス流の混合物である（パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む）。
【０１６３】
非天然または組換え水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるアスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための上記方法のいずれにおいても、培養される水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓなどのメタン生成古細菌である。
【０１６４】
特定の実施形態では、非天然または組換え水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ��ｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓであり得る。
【０１６５】
さらなる実施形態では、水素資化微生物は、合成ガスを代謝し得る細菌である。特定の実施形態では、合成ガス代謝細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはそれらの任意の組み合わせである。
【０１６６】
上記方法のいずれにおいても、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。上記方法のいずれにおいても、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。上記方法のいずれにおいても、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
【０１６７】
特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質を本明細書で提供される目的のアスパラギン酸経路アミノ酸に変換するための方法は、１日当たり少なくとも約または最大１キログラム（ｋｇ）、少なくとも約または最大１０ｋｇ、少なくとも約または最大１００ｋｇ、少なくとも約または最大１，０００ｋｇ、少なくとも約または最大１０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大５０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大１００，０００ｋｇ、少なくとも約または最大２５０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大５００，０００ｋｇまたはそれを超える目的のアミノ酸を生産するであろう。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸は、約１００，０００メートルトン（ＭＴ）／年（すなわち、１億ｋｇ／年または３００，０００ｋｇ／日）、約７５，０００ＭＴ／年（または２２５，０００ｋｇ／日）、約５０，０００ＭＴ／年（または１５０，０００ｋｇ／日）、約２５，０００ＭＴ（または７５，０００ｋｇ／日）または約１０，０００ＭＴ／年（または３０，０００ｋｇ／日）で生産される。
アミノ酸を作るためのシステム
【０１６８】
さらなる態様では、本開示は、アスパラギン酸経路アミノ酸を生産するためのシステムであって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を含むガスの供給源；（ａ）親水素資化微生物と比較して高い活性を有する１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を発現し；（ｂ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素を過剰発現し；または（ｃ）１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路酵素についての改変された調節を含む、上記非天然または組換え水素資化微生物のうちのいずれか１つまたはそれを超える微生物を含むバイオリアクター；および前記バイオリアクターへの前記ガスの流入を可能にするように、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されたコネクターを含み、前記非天然水素資化微生物が、親水素資化微生物と比較して、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して１つまたはそれを超えるアスパラギン酸経路アミノ酸を過剰産生するシステムを提供する。
【０１６９】
上記システムのいずれにおいても、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、生物学的材料、例えば動物飼料または肥料に変換される。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸ファミリーアミノ酸が豊富な生物学的材料、例えばリジン、トレオニン、メチオニンまたはそれらの任意の組み合わせに同化される。さらなる実施形態では、得られた１つまたはそれを超えるアスパラギン酸ファミリーアミノ酸は精製され、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントとして使用される。また他の実施形態では、１つまたはそれを超えるアスパラギン酸ファミリーアミノ酸が豊富なバイオマスは、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントに使用される。
【０１７０】
非天然または組換え水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるアスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための上記システムのいずれにおいても、ガス原料は、Ｈ２／ＣＯｘ基質であり、前記原料は、Ｈ２とＣＯ２またはＣＯまたはそれらの両方とを含み、本明細書に記載される様々な他の成分を場合により含む。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成において、メタノール合成において製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって生産される合成ガスなどの合成ガスである。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたはそれを超える他の供給源を用いてこのようにして生産された任意のガス流の混合物である（パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む）。
【０１７１】
非天然または組換え水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるアスパラギン酸経路アミノ酸を生産するための上記システムのいずれにおいても、培養される水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓなどのメタン生成古細菌である。
【０１７２】
特定の実施形態では、非天然または組換え水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ��ｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓであり得る。
【０１７３】
上記システムのいずれにおいても、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。上記方法のいずれにおいても、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。上記方法のいずれにおいても、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
【実施例】
【０１７４】
実施例１
水素資化微生物のｌｙｓＣ突然変異体
第１の工程は、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのフィードバック耐性ｌｙｓＣ（アスパルトキナーゼ）突然変異体を単離することである。例えば、１つまたはそれを超える特定の突然変異をＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのアスパルトキナーゼ遺伝子内へと操作するか、または、野生型もしくは親Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓを毒性リジン類似体、例えばＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に曝露し、ＡＥＣの存在下で成長することができる（ＡＥＣに対して耐性である）Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓを識別することによって、自然発生アスパルトキナーゼ突然変異体を識別する。毒性類似体に対する耐性は自然発生的なものでもよいし、または突然変異原、例えばＥＭＳを使用して誘導されるものでもよい。毒性類似体に対して耐性のＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ突然変異体を選択するために、毒性類似体を、他のアミノ酸類似体、例えばメチオニンもしくはトレオニンと組み合わせてもよいし、または単独で使用してもよい。加えて、調節剤、例えばトレオニン、リジンまたはこれらの２つの組み合わせの存在下で成長阻害に対してもはや感受性でない突然変異体を識別することによって、（調節解除された）フィードバック耐性を有するアスパルトキナーゼを選択する。この場合もやはり、このフィードバック耐性は、自然発生的なものでもよいし、化学的な突然変異原によって誘導されるものでもよいし、または部位特異的に導入されるものでもよい。
【０１７５】
簡潔に述べると、２５ｍＬのカザミノ酸不含ＭｃＣａｓ培地（培地の製法については、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９４：４４，２０１１（これは、ＭｃＣＶ培地について言及しており、ここではカザミノ酸または酵母抽出物を用いずに使用する）を参照のこと）中で、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０を３７℃でＯＤ６００約０．２０まで増殖させた。５ｍＬの培養物を２つの嫌気性バルクチューブに分注した。０．３ｍＬのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、Ｃａｓ不含ＭｃＣａｓで１：５０希釈）を第１のチューブに追加し、０．３ｍＬのｃａｓ不含ＭｃＣａｓを第２のチューブに追加した（対照）。Ｈ２／ＣＯ２の８０／２０混合物でチューブを４０ＰＳＩＧに加圧し、振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートした後、圧力を解放し、各チューブの０．５ｍＬを取り出し、ＭｃＣａｓ寒天プレートにプレーティングして、死滅率を決定した。
【０１７６】
残りの培養物を５（ＥＭＳ処理）または２（対照）、１．５滅菌嫌気性マイクロ遠心チューブに分注し、１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬのＣａｓ不含ＭｃＣａｓに再懸濁し、再び１０００ｇで１５分間遠心分離することによって、細胞ペレットを洗浄した。この洗浄を２回繰り返して、微量のＥＭＳすべてを除去した。最後の洗浄後、採取した細胞を２００μＬのＣａｓ不含ＭｃＣａｓに懸濁し、５ｍＬの回復用Ｃａｓ不含ＭｃＣａｓに移した。１ｍＬの２．５％Ｎａ２Ｓ×９Ｈ２０を各チューブに追加し、８０／２０Ｈ２／ＣＯ２で各チューブを４０ＰＳＩＧに加圧し、３７℃で一晩回復させた。翌朝、遠心分離によって各培養物を０．１ｍＬに濃縮し、０．１Ｍトレオニンおよび０．０２Ｍ  ＡＥＣを含有するＣａｓ不含ＭｃＣａｓにプレートにプレーティングした。１０ＰＳＩＧの８０／２０Ｈ２／ＣＯ２ガス混合物を含む３７℃のオキソイド嫌気ジャー内で、プレートをインキュベートした。ＥＭＳ処理細胞を接種したプレート上のみで増殖したコロニーを選択した。特に指定がない限り、嫌気性条件下ですべての作業を行った。
【０１７７】
図１は、Ｇ３３３Ｒ突然変異（これは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のＬｙｓＣアミノ酸位置Ｇ２７７に対応する）を有するＥＭＳ生成ｌｙｓＣ突然変異体Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３の増殖速度が、リジンおよびトレオニンの存在下で増殖させた場合に影響を受けないことを示している（３７℃で７２時間インキュベートした後に、ＯＤ６００を測定した）−換言すれば、Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３の突然変異アスパルトキナーゼは、リジンおよびトレオニンによるフィードバック阻害を受けない。図２は、Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３突然変異体によって産生され、ＨＰＬＣによって同定されたアスパラギン酸経路アミノ酸を示す。オートサンプラーによる自動誘導体化反応において誘導体化剤オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を使用し、プレカラムに充填した。反応混合物を（ホウ酸緩衝液によって）ｐＨ１０．２で緩衝して、酸で加水分解されたタンパク質／ペプチドサンプルを直接誘導体化することができるようにした。最初に、３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）を使用して、目的のアミノ酸をＯＰＡと反応させた。３−ＭＰＡがインドールに取り込まれるとそれらの疎水性が減少し、その結果、ＯＰＡ誘導体がクロマトグラフィーによって溶出した。親株と比較したＴｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３突然変異体の産生プロファイルは、以下の通りであった（そして、識別されたすべての突然変異体において概ね類似していた。データは示さず）：アラニン（５ｍｇ／Ｌ）、リジン（８ｍｇ／Ｌ）、トレオニン（２１ｍｇ／Ｌ）およびグリシン（７８ｍｇ／Ｌ）。
【０１７８】
グラム陰性菌のためのプロトコールにしたがってＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用してゲノムＤＮＡを抽出することによって、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ｌｙｓＣの突然変異を検証した。フォワードプライマー（ＬｙｓＣｆｏｒ１−５’ＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧ３’；配列番号：１）およびリバースプライマー（ＬｙｓＣｒｅｖ１−５’ＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＴ３’；配列番号：２）と共にＥａｓｙ−Ａ高忠実度ポリメラーゼを使用して、ＬｙｓＣ標的を増幅した。増幅したＤＮＡをＬｙｓＣｆｏｒ１またはＬｙｓＣｒｅｖ１のいずれかと混合し、配列決定した（Ｏｐｅｒｏｎ）。１つの自然突然変異体および８つの化学誘導突然変異体を識別した。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて以前に識別された位置Ｇ２７７の突然変異（この場合、Ｇ２７７Ｒ）に加えて、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて以前に識別されていない新たな突然変異位置（Ｓ３０２ＰおよびＧ３５９Ｅを含む）を見出した（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のＬｙｓＣからのアミノ酸位置によるナンバリング）。
【０１７９】
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉを用いて同様のアプローチを行った（ここでは、Ｔｒｅｌ１５と称されるコロニー分離株Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｌｉ  ＳＢ（ＤＳＭＺ  １２２４）を使用した）。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉの手順は、トレオニンを含まない０．０２Ｍ  ＡＥＣを選択したことを除いて、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓで行ったものと同様であった。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の結果により、ＡＥＣ耐性突然変異体におけるリジン産生の増加が示された。配列決定により、２つのＴｒｅｌ１５突然変異体は、推定ＬｙｓＣタンパク質において突然変異を有することが示された。特に、位置Ｆ３３９ＧおよびＫ３８０Ｑ（Ｍ．ｖａｎｎｉｅｌｉｉタンパク質に対応するアミノ酸位置）において。
【０１８０】
Ｔｒｅｌ１５のＬＣデータは、０（検出不可能）ｍｇ／Ｌリジン、５０ｍｇ／Ｌグリシン、２．５ｍｇ／Ｌトレオニンのアミノ酸プロファイルを示した一方、Ｔｒｅｌ１５−Ｍｕｔ  ３３９は、８．６ｍｇ／Ｌリジン、３７．５ｍｇ／Ｌグリシンおよび６．１ｍｇ／Ｌトレオニンのアミノ酸プロファイルを有しており、Ｔｒｅｌ１５−Ｍｕｔ３８０は、４．３ｍｇ／Ｌリジン、４１．５ｍｇ／Ｌグリシンおよび６．０ｍｇ／Ｌトレオニンのアミノ酸プロファイルを有していた。
実施例２
アミノ酸過剰産生水素資化微生物
【０１８１】
第１の工程は、実施例１に記載されているように、ｌｙｓＣ突然変異体を識別することである。リジンを過剰生産するための第２の工程は、リジン分岐の下流経路を不活性化することである。例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、またはホモセリンデヒドロゲナーゼの下流の任意の遺伝子（これらとしては、トレオニン生合成および／またはメチオニン生合成の遺伝子が挙げられ得る）を不活性化する。本明細書に記載されるように、遺伝子欠失によって、または自然突然変異もしくは化学誘導突然変異によるホモセリン、トレオニンおよび／もしくはメチオニン栄養要求体を選択することによって、不活性化または活性の低減を行う。
【０１８２】
場合により、リジン生合成経路の任意の遺伝子（ｌｙｓＣ、調節解除されたｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＬ、ｌｙｓＡまたはそれらの任意の組み合わせを含む）を過剰発現させる。例えば、ネイティブなプロモーターを１つもしくはそれを超える強力なプロモーターで置換するか、またはそのネイティブなプロモーターによって発現される遺伝子のさらなるコピーを供給することによるか、またはそれらの両方である。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ由来のヒストン様プロモーター（ｈｍｖ）を目的の様々な遺伝子（ｄａｐＡ、ｄａｐＡＢまたはｄａｐＡＢＬ遺伝子を含む）に作動可能に連結して、本明細書に記載されるＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ株を形質転換するために使用するマルチコピープラスミドを作製した。このような株の１つであるＴｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３は、フィードバック耐性アスパルトキナーゼをコードする染色体上に突然変異ｌｙｓＣ遺伝子を有する。表２は、ＤａｐＡ、ＤａｐＡＢまたはＤａｐＡＢＬを過剰発現するｌｙｓＣ突然変異体によって産生されるアスパラギン酸アミノ酸を示す。例示的な修飾Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓを表１に示す。
【表１】
2017500896.tif 000003
【０１８３】
加えて、代替のリジン生合成経路の酵素をコードする外因性遺伝子を水素資化微生物（例えば、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）に導入する。例えば、リジン生合成のためのｄｄｈ経路を、通常はこの経路を有さないまたは使用しない水素資化微生物に挿入する。Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら、２０１１に記載されているように、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓの形質転換を行う。製造業者によって説明されるようにＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡ抽出キットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製する。
実施例３
水素資化微生物におけるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの欠失およびｒｅｐＡの挿入
【０１８４】
プラスミド形質転換効率を改善するために、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｐｐ）遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ＭＭＰ０６８０）を、複製タンパク質Ａをコードする遺伝子（自身のプロモーターを有するｒｅｐＡ）で置換することによって、ｌｙｓＣ突然変異体Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３をゲノムレベルで修飾した（Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲと称する）。ｒｅｐＡは、ｒｅｐＡを含有するｐＵＲＢ５００プラスミドに由来するかまたはこれをベースとするプラスミドなどの、ｒｅｐＡを有するあらゆるプラスミドの、効率的な形質転換を可能にする（Ｔｕｍｂｕｌａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２９７６，１９９７を参照のこと）。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の喪失は、６−アザウラシル（６−ａｚａｕｒｃｉｌ）耐性表現型である修飾Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓをもたらす。
【０１８５】
簡潔に述べると、プライマーＴＫＨ＿０３８（５’ａａａｔｔａｔｇａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇａａｇａａｇａａｇａｇａｇ３’、配列番号：３）およびＴＫＨ＿０３９（５’ｔｇｃｔｔａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｇｔｔｃｃａｔｔｔｔａｃｃａｃｃ３’、配列番号：４）を用いて、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ００１（Ｗａｌｔｅｒｓら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：２５４９，２０１１）のゲノムＤＮＡから、ｒｅｐＡ遺伝子を（そのプロモーターと共に）増幅した。増幅したｒｅｐＡ断片を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＡｓｃＩで線状化したｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡベクターにクローニングした。最終的なプラスミドをｐＫＨ１１と命名した。ｐＫＨ１１由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで線状化したメタン生成古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ用ｐＭＥＶ１（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＷＬ（２０００）発現ベクター（Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）にクローニングした。ピューロマイシン耐性遺伝子を有する得られた自殺ベクターをｐＫＨ２０と命名した。
【０１８６】
基本的にはＳａｒｍｉｅｎｔｏら（２０１１）に記載されているように、プラスミドｐＫＨ２０をＴｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３に形質転換し、ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を含有するＭｃＣＡＳプレート上で、形質転換体を選択した。ピューロマイシンの存在下で増殖した形質転換体コロニーを、６−アザウラシル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭｃＣＡＳ液体培地に移し、一晩増殖させた。一晩培養物の一部を、０．５ｍｇ／ｍｌ  ６−アザウラシルを補充した新鮮ＭｃＣＡＳ培地に移し、再び一晩増殖させた。培養物を希釈し、次いで、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ６−アザウラシルを含有するＭｃＣＡＳプレート上に展開した。５日後、個々のコロニーを、ピューロマイシンを含むまたは含まないＭｃＣＡＳプレート上にレプリカプレーティングした。ピューロマイシンの存在下で増殖することができなかったコロニーを、６−アザウラシル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭｃＣＡＳ液体培地に移して、耐性を確認した。以下のプライマー：ｕｐｔｄｅｌｃｏｎｆ１（５’ｃａａｔｔａｃｔｇａａｃｃｃａａａｇａｃｃａｔ−３’、配列番号：５）およびｕｐｔｄｅｌｃｏｎｆ２（５’ａａｔａｇｔｔａｃｃｇｇｃｇｔｔａｃａａｔｃａ−３’、配列番号：６）を使用してＰＣＲによって、Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３ゲノム上におけるｒｅｐＡ遺伝子によるｕｐｐ遺伝子の置換を確認した。ｒｅｐＡ遺伝子によるｕｐｐ遺伝子の置換が確認された６−アザウラシルル耐性／ピューロマイシン感受性コロニーをＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲと命名した。
実施例４
水素資化微生物におけるｄａｐＡの欠失
【０１８７】
Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡの構築−Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら（２０１１）に記載されているのと基本的には同じマーカーレス突然変異誘発法を使用して、メチオニンおよびトレオニン産生を増加させるためのｄａｐＡ欠失を生成した。上流および下流領域と共にｄａｐＡ遺伝子を含有するＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｔｒｅｌ１０）ゲノム由来の約２．４ｋｂ断片を、プライマーＤａｐＡｆｏｒ２（５’ｔｃｃｃｔｇａｔｃｇａｔａｇａａａｇｔｇｔａｇｔ−３’）（配列番号：１２）およびＤａｐＡｒｅｖ２（５’−ｔｔｇｃｃｇａｔｇａａａｔｔａａａｇｔｇａａａ−３’）（配列番号：１３）を使用してＰＣＲによって合成し、プラスミドｐＴＯＰＯにクローニングしてｐＪＢ０１２を作製した。プライマーＤａｐＡｄｅｌｆｏｒ２（５’−ｇｃｇｇｇｃｇｃｇｃｃｇｃａｔａａｔｔａｃａｃｃｔｔａｔｇｃｇｔｔｃ−３’、配列番号：１４）およびＤａｐＡｄｅｌｒｅｖ２（５’−ｇｃｇｇｇｃｇｃｇｃｃｔａａｔｃａｃｇｇｔｔｃｇｔｇａｔａｃｔａｔ−３’、配列番号：１５）（これらは両方とも、５’ＡｓｃＩ部位を含有する）を用いたアウトワードＰＣＲを使用することによって、ｄａｐＡ遺伝子のインフレーム欠失断片を作製した。ＰＣＲ産物を精製し、ＡｓｃＩで消化し、ｐＴＯＰＯにライゲーションして、ｐＪＢ０１３を作製した。最後に、ｐＫＨ１４からのプライマーｕｐｐｎｅｏＦ（５’−ａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔｇｇｔａｃｃａｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｇａ−３’、配列番号：１６）およびｕｐｐｎｅｏＲ（５’−ｇｔｇｇａｔｃｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｔｇａｇａｔｃｃｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｇｇ−３’、配列番号：１７）を使用して、ｕｐｐ：：ｎｅｏ遺伝子を含有する断片をＰＣＲ増幅し、ｐＪＢ０１３のＫｐｎＩ部位にクローニングして、ｐＪＢ０１５を作製した。
【０１８８】
（前述したように）ｐＪＢ０１５をＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲに形質転換して、寒天プレート上でネオマイシン（５００ｕｇｍｇ／ｍｌ）耐性コロニーを選択した。染色体ｄａｐＡ遺伝子における単一交差事象をＰＣＲによって確認した。二重交差事象を可能にするために、単一交差を有するコロニーを非選択培地中で２４時間増殖させ、次いで、１００ｍｇ／Ｌリジンおよび０．２５ｕｇ／ｍｌ  ６−アザウラシルを含有するＭｃＣ培地上にプレーティングした。リジンを含むまたは含まないＭｃＣプレートにコロニーをパッチした。増殖にリジンを必要とするコロニーに対して、ｄａｐＡ欠失のＰＣＲ確認を実施した。このようなコロニーの１つをＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡと命名した。
実施例５
水素資化微生物におけるグリシン（ＧＹＣＩＮＥ）およびトレオニン産生の強化
【０１８９】
ＯＡＡからトレオニンへのフラックスを増加させることによって、グリシンおよびトレオニン産生の強化を達成した。（Ｗａｌｔｅｒｓら、２０１１に記載されている）プラスミドｐＡＷ４２を、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｄｕｌｉｓのための複製プラスミドとして使用した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｙｏｒｋ，Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｙｏｒｋ  ＹＯ１０  ５  ＤＤ，Ｕｎｉｔｅｄ  ＫｉｎｇｄｏｍのＣｈｏｎｇ教授から入手した）。
ｐＫＨ２４（ｐＡＷ４２−ｔｈｒＡ＊）の構築
【０１９０】
トレオニンフィードバック耐性（アミノ酸突然変異Ｇ４３３Ｒ）である二重機能酵素アスパラギン酸キナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡ＊遺伝子を、プライマーＴＫＨ＿０９４（５’ａａｃｔａａｔａｇｇｔｇａａａｃｇｃｇｔａｃａｇｇａａａｃａｃａｇａａａａａａｇｃｃ３’、配列番号：７）およびＴＫＨ＿０９５（５’ｇａｔｃｔｃｃｔａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｇａｃｔｃｃｔａａｃｔｔｃｃａｔｇａｇａｇｇｇｔａｃ３’、配列番号：８）を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ２１２７７のゲノムから増幅し、ＡｓｃＩおよびＮｓｉＩで線状化したｐＡＷ４２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＨ２４と命名した。
ｐＫＨ２７（ｐＡＷ４２−ｔｈｒＡ＊ＢＣ）の構築
【０１９１】
トレオニンフィードバック耐性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＴｈｒＡ＊）、ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ）およびトレオニンシンターゼ（ＴｈｒＣ）をコードする遺伝子クラスタを、プライマーＴＫＨ＿０９４（配列番号：７）およびＴＫＨ＿１０３（５’ｇａｔｃｔｃｃｔａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａｃｔｇａｔｇａｔｔｃａｔｃａｔｃａａｔｔｔａｃｇｃａａｃｇｃａ３’、配列番号：９）を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ２１２７７のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩおよびＡｓｅＩで線状化したｐＡＷ４２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＨ２７と命名した。
ｐＫＨ３２（ｐＡＷ４２−ｔｈｒＡ＊ＢＣ−ａｓｄ）の構築
【０１９２】
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのａｓｄ遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。この遺伝子およびその上流配列（ＲＢＳを含む）を、プライマーＴＫＨ１１５（５’ｇａｔｃｔｃｃｔａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａａａｇｇｔａｔｔｔｔｔｇａａｃｇａａｔａａｔｔｃａｇｃ３’、配列番号：１０）およびＴＫＨ１１６（５’ｃａｔｃａｇｔａａｇｇｃｇｃｇｔｔｔｔｔａｔｃｃａａａｇｇｔｇａａａｇａａｔｇａａ３’、配列番号：１１）を用いて、宿主ゲノムから増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩで線状化したｐＫＨ２７にクローニングして、ｐＫＨ３２を生産した。
アミノ酸分析のための発酵プロトコール
【０１９３】
ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を補充し、４０ｐｓｉまでＨ２：ＣＯ２（４：１）をガス供給したバルクチューブ内の５ｍｌのＭｃＣＡＳ培地中で、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ組換え体を３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。２日目に、１００μｌの一晩培養物をシード培養物として使用して、バルクチューブ内の５ｍｌの最小培地（ＭＭ）または１００ｍｌの血清培地に接種し、それぞれ４０および２０ｐｓｉの圧力までＨ２：ＣＯ２（４：１）をガス供給した。培養物を３７℃で振盪しながら７２時間放置した；Ｈ２：ＣＯ２（４：１）ガスを、培養開始時の完全な圧力まで再充填した。発酵後、１．８ｍｌの培養物をエッペンドルフチューブに移し、１２０００×ｇで細胞を除去し、得られた上清を０．２μｍフィルターに通した。アミノ酸含量について、ろ液をＨＰＬＣによって分析した。必要に応じて、ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）をシードおよび発酵培地の両方に補充した。
【表２−１】
2017500896.tif 000004
【表２−２】
2017500896.tif 000005
【０１９４】
加えて、ＣＯを追加しなかった以外は実施例９に記載されるように、バイオリアクター内で、非天然および組換えＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓを増殖させた。９６時間発酵した後、１．８ｍｌの培養物をエッペンドルフチューブに移し、１２０００×ｇで細胞を除去し、得られた上清を０．２μｍフィルターに通した。アミノ酸含量について、ろ液をＨＰＬＣによって分析した。必要に応じて、ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）をシードおよび発酵培地の両方に補充した。
【表３】
2017500896.tif 000006
【０１９５】
表３から明らかであるように、外因性ＴｈｒＡＢＣ活性を追加すると、トレオニンおよびグリシンの産生が、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに存在するレベルよりもはるかに上回るようになる。
実施例６
水素資化微生物からのアミノ酸の輸送
【０１９６】
Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓから候補ｒｈｔＡ（トレオニン）またはｌｙｓＥ（リジン）エクスポーター遺伝子を単離し、機能性について調べる。場合により、さらなる突然変異を導入して機能を高めるか、またはより強力なプロモーターに作動可能に連結することによって輸送遺伝子を過剰発現させるか、または機能性外因性ｒｈｔＡもしくはｌｙｓＥ遺伝子をＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに導入する。過剰産生されたアスパラギン酸経路アミノ酸は、培養培地から容易に回収および／または単離され得る。
実施例７
水素資化微生物における炭素フラックスのアミノ酸産生への改変
【０１９７】
水素資化微生物（例えば、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）の主な炭素フローを様々な方法でシフトさせて、より多くの炭素をアスパラギン酸アミノ酸生合成経路に提供し得る。例えば、ピルビン酸塩からホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への炭素フローの制限を、ＰＥＰシンターゼ遺伝子を不活性化またはダウンレギュレートすることによって達成する。加えて、イソロイシン経路（存在する場合）を場合によりノックアウトして、この経路によって使用されるピルビン酸およびアセチルＣｏＡを保存する。遺伝子操作（例えば、遺伝子または遺伝子の一部の欠失）によって、または突然変異（例えば、自然または誘導性）による不活性化について選択することによって、特定の酵素活性の不活性化または低減を導入し得る。あるいは、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を場合により過剰発現させて、より多くの炭素をピルビン酸からオキサロ酢酸（ＯＡＡ）に集中させる。加えて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を場合により過剰発現させて、より多くのＯＡＡをアスパラギン酸に変換する。例えば、遺伝子の複数コピーを提供することによって、またはプロモーター領域を改変してより強力な発現を提供することによって、過剰発現を達成し得る。
実施例８
非天然および組換え水素資化微生物の培養
【０１９８】
非常に大規模な高密度培養が達成されるように、嫌気性条件下の気泡塔バイオリアクター内で、培養物が定常状態条件に達するまで、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓを約７２時間〜１２０時間培養する（これは、漸増容積の一連の連続容器内で行う（例えば、５０ｍｌで開始し、この培養物を使用して１０Ｌを播種し、次いで、この培養物を使用して３００Ｌまたはそれを超えるものを播種する））。この間、このシステムはフェドバッチモードで運転し、合成ガスを発酵ブロスに連続的に供給する。このブロスそれ自体は交換しない。（分光光度計によって測定して）適切なＯＤ６００に達したら、連続培養プロセスを開始し、培地／ブロスの交換を始める。発酵槽内の培養物のＯＤ６００を考慮して、交換の割合を決定する。例えば、１日当たり、ブロスの約１．５〜約３．０全容積を交換する。
【０１９９】
培養物を約３７℃の温度（しかし、約３５℃〜約４０℃の範囲内で変動し得る）に維持し、約７．０〜７．２のｐＨに維持し（必要に応じて、ＨＣｌおよび／またはＮａＯＨでｐＨを調整）、約１．５〜約２．０のＯＤ６００に維持する。合成ガスは、４：１〜約３：１の範囲の比のＨ２：ＣＯ２（これは、約０％〜約５％（最適には、多くとも１％）の範囲の一酸化炭素を含み得、他のわずかな混入物質を含み得る）から構成される。合成ガス流量は、プロセスで使用する気泡塔またはトリクル塔の具体的な設計によって規定される。
実施例９
ＣＯによる非天然および組換え水素資化微生物の培養
【０２００】
嫌気性条件下の３．０Ｌ連続撹拌槽型バイオリアクター内で、培養物が定常状態条件に達するまで、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲを培養した。反応器のシード培養物として使用する、１００ｍｌ密封嫌気性血清ボトルに含まれる２５ｍＬの培地の接種のために使用した、グリセロールストックのアリコートから、培養を開始した。４：１の比のＨ２／ＣＯ２ガスを用いて、血清ボトルを２０ｐｓｉｇに加圧した。約３７℃およびｐＨ７．０〜７．２に維持されていた１．５Ｌの培地の接種のために、２つのこのようなボトルを使用する。主反応器の接種に使用する前に、シード培養物を約１６時間増殖させた。この間に、４：１の比のＨ２／ＣＯ２を主容器に散布した。加えて、ラッシュトンおよびスコープブレードの組み合わせを使用して、６００ｒｐｍの一定の撹拌を維持した。主容器の接種の約８時間前に、２００ｐｐｍブリードのＨ２Ｓガスを主容器に散布した。加えて、接種時に、１％（体積比）ブリードのＣＯをも主容器に散布した。培養物は、４８〜５６時間以内（これは、ＣＯなしの発酵が同じＯＤに達するのに必要な時間とほぼ同じである）に最大ＯＤに達した。
【０２０１】
Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲによるアスパラギン酸アミノ酸の発酵力価は、ＣＯなしの場合には、５６時間の時点において１２０ｍｇ／Ｌグリシンおよび２５．４ｍｇ／Ｌトレオニンであり、ＣＯありの場合には、５６時間の時点において８３ｍｇ／Ｌグリシンおよび５０ｍｇ／Ｌトレオニンであった。
【０２０２】
上記様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供し得る。本明細書で言及されているか、または出願データシートに記載されている特許および非特許刊行物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要な場合には、前記実施形態の態様を修正し得る。
【０２０３】
上記詳細な説明を考慮して、これらのおよび他の変更を前記実施形態に対して行い得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に請求項を限定すると解釈されるべきではなく、このような請求項に認められる等価物の全範囲と共にあらゆる可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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