(57)【要約】  本発明は、臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための方法であって、ａ）臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入する工程と、ｂ（ｉ））任意で、前記第１培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、ｂ（ｉｉ））任意で、前記臨床サンプル／前記培地の混合物の一部分、又は前培養を行った場合は前記臨床サンプルの培養物の一部分、を前記第１培養容器から取り出し、前記一部分を培地を含む第２培養容器に導入し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を前培養する工程と、ｃ）テストアリコートを前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器から取り出し、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を培養する又は引き続き培養する工程と、ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、ｅ）微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行う工程であって、前記核酸検査は、i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与する（identificatory）ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、を用いて行われ、前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分に対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を引き続き培養する工程と、ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を更に培養する工程と、を含む方法を提供する。本発明の方法を実施するための装置も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための方法であって、
ａ）臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入する工程と、
ｂ（ｉ））任意で、前記第１培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｂ（ｉｉ））任意で、前記臨床サンプル／前記培地の混合物の一部分、又は前培養を行った場合は前記臨床サンプルの培養物の一部分、を前記第１培養容器から取り出し、前記一部分を培地を含む第２培養容器に導入し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を前培養する工程と、
ｃ）テストアリコートを前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器から取り出し、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）微生物を同定し、前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行う工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与する（identificatory）ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養臨床サンプル及び／又は前記一部分に対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を更に培養する工程と、を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記方法は、
ａ）臨床サンプルを培地を含む培養容器に導入する工程と、
ｂ）任意で、前記培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｃ）テストアリコートを前記培養容器から取り出し、前記培養容器中の前記臨床サンプルを培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行う工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養臨床サンプルに対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記培養容器中の前記臨床サンプルを引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプルを更に培養する工程と、を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記方法は、
ａ）臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入する工程と、
ｂ（ｉ））任意で、前記第１培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｂ（ｉｉ））前記臨床サンプル／前記培地の混合物の一部分、又は前培養を行った場合は前記臨床サンプルの培養物の一部分、を前記第１培養容器から取り出し、前記一部分を培地を含む第２培養容器に導入し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を前培養する工程と、
ｃ）テストアリコートを前記第２培養容器から取り出し、前記第２培養容器中の前記一部分を培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行う工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養された一部分に対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を更に培養する工程と、を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物増殖を、サンプル中に存在する微生物細胞物質の量を判定することにより評価する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サンプル中に存在する微生物細胞物質の量を、微生物及び／又は微生物コロニー若しくは凝集体の量及び／又は数及び／又は大きさを判定することにより判定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中に存在する微生物細胞物質の量を、画像化により判定する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中に存在する微生物細胞物質の量を、画像化によって微生物バイオマスのエリアを測定することにより判定する、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記臨床サンプルは、敗血症の被検体、又は敗血症の疑いがある被検体、又は敗血症のリスクがある被検体から得られたものである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記臨床サンプルは、血液又は血液フラクションである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記培養容器は血液培養フラスコである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記培地は、前記臨床サンプルに存在する任意の抗菌剤の存在を中和する作用剤を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
微生物ＤＮＡを、前記テストアリコートから選択的に分離する又は濃縮する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）前又は工程（ｄ）と同時に、前記テストアリコートからの又は前記テストアリコート中の微生物を分離又は濃縮する工程を更に含む、 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）〜（ｅ）を一回以上繰り返す、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）〜（ｅ）を初期前培養工程なしで実施し、工程（ｅ）において微生物が同定されなかった場合、工程（ｃ）〜（ｅ）を前培養工程（ｂ）後に繰り返す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｅ）（i）の前記プローブ又はプライマーは、敗血症原因微生物パネルの微生物
を同定するよう設計又は選択されている、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｅ）（i）及び／又は（ii）において、ＰＣＲプライマーが用いられる、請求
項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｅ）（i）及び／又は（ii）において、ハイブリダイゼーションプローブが用
いられる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ハイブリダイゼーションプローブは、同定に関与するヌクレオチド配列又は薬剤耐性マーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な５’末端及び３’末端を含むパドロックプローブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
環状化パドロックプローブが、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＣＡは、ＲＣＡ産物をモノマーに切断し、前記モノマーを環状化して更なるＲＣＡ反応のテンプレートとして使用するサークル−サークル増幅（Ｃ２ＣＡ）である又はサークル−サークル増幅（Ｃ２ＣＡ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＣＡ産物は、前記ＲＣＡ産物をモノマーに切断し、前記モノマーをアレイ上にハイブリダイズし、前記アレイ上の前記モノマーを検出することによって検出される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＣＡ産物は、顕微鏡又は画像化又はフローサイトメトリー的な方法によって検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｆ）において、微生物増殖を、微生物を直接的に検出することによって判定する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物を、染料で標識化して検出する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｆ）において、微生物増殖を、微生物を間接的に検出することによって判定する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記間接的検出は、前記微生物のゲノム中のヌクレオチド配列にハイブリダイズするパドロックプローブを用い、環状化プローブをＲＣＡによって増幅し、鎖状（concatemeric）ＲＣＡ産物を検出してカウンティトすることにより行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｅ）の前記核酸検査について、分離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡにハイブリダイズ可能な捕捉プローブを用いて固定する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｅ）において単一の微生物が同定された場合、工程（ｆ）を行う、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｅ）において二以上の微生物が同定された場合、工程（ｇ）を行う、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された第１培養容器と、
任意で、培地を含む第２培養容器と、
任意で、前記第１培養容器の中身の一部分を取り出し、前記一部分を前記第２培養容器に移すポーションリムーバル装置と、を備え、
前記第１培養容器は、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記第２培養容器は、臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物を前記第１培養容器の中身の一部分として収容するよう構成され、且つ、前記一部分を培養するよう構成され、
前記微生物検出装置は、
テストアリコートとして前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の中身の一部分を取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して、微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために核酸検査を行うＤＮＡ検査装置と、を更に備え、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養により前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器に生成された前記培養臨床サンプル及び／又は培養された一部分を薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分に対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分を更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【請求項３２】
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された培養容器と、
前記培養容器の中身の一部分をテストアリコートとして取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して、微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために核酸検査を行うＤＮＡ検査装置と、を備え、前記培養容器は、前記テストアリコートの抽出後及び任意で前記テストアリコートの抽出前に、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養により前記培養容器に生成された前記培養臨床サンプルを薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養臨床サンプルに対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記培養容器中の前記臨床サンプルを更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【請求項３３】
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された第１培養容器と、
培地を含む第２培養容器と、
前記第１培養容器の中身の一部分を取り出し、前記一部分を前記第２培養容器に移すポーションリムーバル装置と、を備え、
前記第１培養容器は、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記第２培養容器は、臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物を前記第１培養容器の中身の一部分として収容するよう構成され、且つ、前記一部分を培養するよう構成され、
前記微生物検出装置は、
テストアリコートとして前記第２培養容器の中身の一部分を取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して、微生物を同定しかつ前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するために核酸検査を行うＤＮＡ検査装置と、を更に備え、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養により前記第２培養容器に生成された前記培養された一部分を薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養された一部分に対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分を更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【請求項３４】
請求項１〜３０のいずれかに記載の方法を実施するよう構成されている、請求項３１、３２又は３３のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項３５】
前記培養容器は血液培養フラスコである、請求項３１〜３４のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項３６】
前記培地は、前記臨床サンプルに存在する任意の抗菌剤の存在を中和する作用剤を含む、請求項３１〜３５のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ検査装置は、ハイブリダイゼーションプローブを用いるよう構成されている、請求項３１〜３６のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項３８】
前記ハイブリダイゼーションプローブは、同定に関与するヌクレオチド配列又は薬剤耐性マーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な５’末端及び３’末端を含むパドロックプローブであり、前記ＤＮＡ検査装置は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって環状化パドロックプローブを検出するよう構成されている、請求項３７に記載の微生物検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための方法に関する。特に本発明は更なる検査のための継続的なサンプル培養を可能にする、微生物検出と微生物特徴付けとを組み合せた高速分子検査方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染は、重大な臨床的影響及び経済的影響をもたらすメジャークラスのヒト及び動物の疾患である。微生物感染の治療及び／又は予防には様々な系統や種類の抗菌剤が入手可能な一方で、薬剤耐性は現代医学において重大で深刻な問題となっている。様々な微生物病原体の薬剤耐性株がここ２０年で増殖しており、微生物は増加する抗菌性系統、特に抗生物質系統に対してその耐性を進化し続けている。耐性機構がより多くの生物に広まるにつれ、薬剤耐性に関連する公衆衛生への影響及びコストが今後急速に増加することが予想される。従って、微生物感染の治療面では、感染微生物の性質とその薬剤感受性プロファイルに関する情報を持ち、有効な治療の確保と不要／無効な抗生物質使用の削減とを目指し、抗生物質耐性、より一般的には薬剤耐性の蔓延をコントロールすることが望ましく、むしろ重要である。これは特に早急で効果的な治療が不可欠な、重篤で生命を脅かす感染症のケースに言えることである。
【０００３】
重症感染症によって引き起こされる潜在的致死性全身炎症である敗血症は、米国における病院費用のうち最もコストのかかるコンデション・要因であり、国立病院総費用の５％を占める。重い敗血症は、適切な治療がなされなければ、死亡率が１時間毎に７％上がる。薬剤耐性敗血症を引き起こす菌株が広まるにつれ、敗血症の正しい治療予測がますます困難になる。現在最も信頼度の高い敗血症原因微生物の診断基準は、感染微生物の純粋培養物の単離と培養とを必要とする表現型・生化学的同定技術に基づく。感染症を同定し薬剤耐性微生物の感受性プロファイルを判定するための微生物同定（ＩＤ）及び抗生物質感受性検査（ＡＳＴ）には数日を要することもある。現在の臨床業務では、敗血症の疑いから１時間以内に臨床症状に基づく広域抗生物質を用いた治療を行うことが要求される。セカンドドーズを６〜８時間以内に行う必要があり、微生物が同定されその抗生物質感受性（ＩＤ／ＡＳＴ）が確立されるまでの間、この投与を６〜８時間ごとに継続する。
【０００４】
敗血症の致命的な状態のため、患者が臨床反応を経験している場合、微生物感染の性質が判定され薬剤感受性が確立されるまで、医師は最初の広域抗生物質からの治療変更をためらう。このためらいが広域抗生物質の乱用を招き、微生物間の薬剤耐性の増加を煽っている。
【０００５】
従来の検査方法では、微生物増殖に対する抗菌剤効果の評価には濁度測定又はディスク拡散を利用し、微生物の同定には伝統的な生化学的・微生物学的技術を利用している。これらの技術は、微生物の増殖に長期間のインキュベーションを要するため、臨床サンプル中の微生物を同定し特徴付けるのに数日かかりうる。従って、迅速に微生物を同定し、薬剤耐性微生物の薬剤感受性プロファイルを判定できる技術が求められており、近年サンプル採取から診断までの時間を削減するための様々な異なる技術が開発されている。
【０００６】
ＵＳ８，４８１，２６５は、臨床サンプル中の微生物を濃縮することによって長期間のインキュベーションを回避する方法を記載している。臨床サンプルからの微生物細胞の濃縮は、非微生物細胞を選択的に溶解してサンプル中の微生物細胞濃度を濃縮し、サンプル検査前の長期間のインキュベーションを回避することにより実施される。
【０００７】
ＵＳ２０１０／０１２４７６３は、微生物の培養物を濃縮し、微生物を分光学的に同定する迅速な微生物同定方法を記載している。
【０００８】
感受性判定前のインキュベーション時間を削減するために、フローサイトメトリー（Broeren et al. 2013 Clin Microbiol Infect 19, 286-291）や自動顕微鏡（Price et al. 2014 JMM. 98 50-59）を用いた迅速な感受性検査方法が開発されている。ＵＳ５，７８９，１７３に記載されているように、薬剤感受性を判定するための微生物増殖の手段として、微生物ＤＮＡの定量的ＰＣＲも用いられている。
【０００９】
微生物同定方法と感受性検査方法との組み合わせも開発されている。ＵＳ２００５／００９５６６５Ａ１は、微生物を同定し薬剤感受性を判定するために、自動マイクロタイター・ウェル・フォーマットにおいて特定の培養培地及び発色基質／蛍光発生基質のパネルとを微生物増殖の濁度測定と組み合わせて用いるシステムを記載している。自動顕微鏡観察方法も開発されている（Metzger et al. 2014 Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 79 160-165）。BD Phoenix（商標）システムも微生物の迅速な同時の同定・特徴付けを可能にするシステムであり、種々の発色基質や蛍光発生基質を利用してサンプル中の微生物とマイナーな微生物増殖を同定し、サンプル中の微生物の薬剤感受性を判定している。
【００１０】
微生物を増殖させその特性を検査するのではなく、プローブを用いて微生物細胞上又は細胞内の核酸マーカー又はタンパク質マーカーを検出する微生物同定ための分子的な方法が開発されている。これらのマーカーは、微生物の同定を可能にするものである。様々な微生物を同定するためのこのような分子検査が数多く開発されており、実際に分子検査は、特定の抗菌剤に対する耐性マーカーに関連する様々な遺伝的変異体や遺伝子的痕跡の同定にも用いられている。
【００１１】
微生物の同定及び特徴付けにこのような新しい技術が開発されているにもかかわらず、臨床医たちは依然、従来の培養や表現型・生化学的方法を超えてこれらの使用のみに頼ることに慎重であり、今日でもこのような伝統的な方法が多くの臨床研究所において主流である。特に分子検査については、入手可能なプローブでは可能性のある全ての潜在的な病原体を検出できないであろうとの認識（つまり分子検査が「不完全である」との認識）から、多くの臨床医は分子検査のみに頼ることに抵抗があり、分子検査を単なる補足的な検査と位置付けている。従って、現在の臨床業務では、分子検査方法が伝統的な培養方法を補う形で感染性疾患の診断を行っている。これらの伝統的な方法も不完全であるが、その使用が確立されていることから、感染性疾患の診断において現在最も信頼度の高い基準となっている。
【発明の概要】
【００１２】
従って、現在の臨床業務では、分子検査と伝統的な検査とを平行して行うために、患者から臨床サンプルを重複して採取する必要がある。サンプルを採取しそれを取り扱うためには追加のスタッフが必要となり、ロジスティックな問題や人材の問題が生じ、患者の感染性疾患の診断や治療において容認できない遅れが起こりうる。また臨床サンプルの採取から異物が混入するリスクが高いことから、重複採取は更なる偽陽性診断のリスクも抱えている。よって、分子検査は同定や診断を潜在的に早めうるという事実があるにもかかわらず、それを行わない場合もある。
【００１３】
本発明は、これらの問題に対処することを追及しており、特に同じ臨床サンプルを用いて分子検査方法と伝統的な検査方法との両方を行うことを組み込んだ改良ワークフローを提供する。従って、本発明は、臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための方法であって、同じ臨床サンプルを、分子検査と迅速な薬剤感受性検査（ＡＳＴ）と伝統的な培養方法とに使用して、臨床サンプルの重複採取の必要性を排除する方法を提供する。具体的には、該方法は、分子検査中にサンプルを培養して微生物を増殖させ、分子検査で微生物が同定された場合には伝統的な又は従来の検査を不要としうるよう設計されている。つまり、迅速なＡＳＴ検査と組み合わせた分子ＩＤ検査と耐性検査とで十分となり、それ以上の従来の又は伝統的な培養ベースの検査が不要になる。とはいえ、該方法はそのような検査が万が一必要になった場合に備えて、或いは結果の確認や裏付けとしてそのような追加的検査がいつでも行えるように、同じサンプルを継続的に培養することを可能にする方法である。これにより、従来の方法と比べて迅速な診断が可能となり、患者をより早く治療し、より早い段階で不必要な治療を除外することができる。微生物同定が分子検査で不十分であった場合は、同じサンプルを用いて更なる従来の検査を行うこともできる。上記問題に対するこの明快な解決策は、先行開示も提案もされていない。
【００１４】
本発明の鍵となる特徴は、患者から単一のサンプルを採取することである。この単一のサンプルを、本発明による分子検査及びＡＳＴの実施中に培養液に入れ、維持してもよい。しかしながら、単一の培養のみを準備し、インキュベート（培養）することは必須ではない。単一の初期培養をセットアップし（例えば臨床サンプルを単一の培養容器に播種する）、ここから一つ以上の継代培養物をセットアップし、初期培養物の継代培養物を本発明による分子検査やＡＳＴ検査に用いることもできる。更なる検査が必要な場合や望ましい場合に備え、初期初代培養物を維持（培養状態を維持）してもよい。
【００１５】
従って、一態様において、本発明は臨床サンプル中の微生物、特に臨床サンプルに存在しうる微生物を検出し特徴付けるための方法を提供する。前記方法は、
ａ）臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入する工程と、
ｂ（ｉ））任意で、前記第１培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｂ（ｉｉ））任意で、前記臨床サンプル／前記培地の混合物の一部分、又は前培養を行った場合は前記臨床サンプルの培養物の一部分、を前記第１培養容器から取り出し（removing）、前記一部分を培地を含む第２培養容器に導入し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を前培養する工程と、
ｃ）テストアリコート（測定用の一定分量：test aliquot）を前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器から取り出し、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出する工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与する（identificatory）ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分に対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性（identity）によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を更に培養する工程と、を含む方法。
【００１６】
本発明の方法は、最終的に従来の培養ベースの同定と感受性検査とを可能にする臨床サンプルの培養物のセットアップと、それと同時に、第一に分子検査、第二に迅速なＡＳＴを可能にし、有利には従来の検査を不要にしうる培養物からのアリコート（又は一部分）を取り出すことによることが分かるであろう。このように、該方法は、分子検査（工程（ｅ））及び任意で工程（ｆ）のＡＳＴも行いながら臨床サンプルを培養することにより、同じ臨床サンプルを更なる従来検査に用いる選択肢を残しつつ、分子検査を行える方法である。これは単一培養物（例えば臨床サンプルをインキュベートし続ける）であってもよいし、更なる培養をセットアップし、例えば第１又は初期培養物の培養を維持しながら（培養し続けながら）それを検査用アリコートの提供に用いてもよい。実際には、工程（ｅ）の分子検査中及び任意で工程（ｆ）中にサンプル又は一部分を培養し続けることによって、工程（ｅ）及び（ｆ）の分子検査及びＡＳＴ検査と平行して、更なる（例えば従来の）検査に必要な培養を効果的に行う。従って、任意の実施形態において、該方法の工程（ｆ）は、工程（ｃ）からの培養臨床サンプル又は一部分の更なるアリコートに対して薬剤感受性検査を行う工程である、とも表現できる。
【００１７】
単一の培養システムを用いて単一の初期（即ち第１）培養をセットアップし維持することは、少なくとも分子検査から陰性の結果や確定的でない結果を得るまでは簡便で便利なワークフローを提供するかもしれない。しかしながら、場合によっては、初期第１培養の継代培養（例えば第２培養）をセットアップすることにより得られる別の培養システムを用いて柔軟性を持たせることが望ましい。以下により詳細に述べられるように、例えば一旦第２培養をセットアップすると、第１培養は別の培養システム（例えば従来の培養キャビネット）に移し、第２培養は本発明の分子検査・ＡＳＴ検査専用の培養システム（例えば装置）で培養することができる（より詳細には、培養を保持する又は継続する）。
【００１８】
従って、特定の一態様において、本発明の方法は、
ａ）臨床サンプルを培地を含む培養容器に導入する工程と、
ｂ）任意で、前記培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｃ）テストアリコートを前記培養容器から取り出し、前記培養容器中の前記臨床サンプルを培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出する工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養臨床サンプルに対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記培養容器中の前記臨床サンプルを引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプルを更に培養する工程と、を含む方法。
【００１９】
上述のように、更なる態様において、更なる培養を臨床サンプルからセットアップしてもよい。そのような一実施形態において、臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入し、即座に、又は任意の前培養期間後に、第１培養容器の中身（第１培養容器中の臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物）の一部分を取り出して第２培養容器に播種してもよい。上述され以下で更に述べられるように、専用の機器又は装置を本発明の方法を実施するために準備してもよく、これを希望や必要に応じて従来検査を実施する従来の培養システム又は機器と共に用いてもよい（例えばBecton Dickinson社、Biomerieux社の培養キャビネット）。そのような専用の機器／装置は、臨床サンプルを含む第１培養容器を収容し、第１培養容器から一部分を取り出して第２培養容器に導入するよう設計されてもよい。これにより、臨床サンプルと培地とを含む第１培養容器（例えば血液培養フラスコ）を、従来手段により検査を行う更なる培養システム（例えばインキュベーター）に配置し、その一方で、そこから得られた臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物の一部分を、培養（任意の前培養を含む）並びにＡＳＴ及びＩＤ検査を行う本発明の装置で保持することができる。
【００２０】
従って、本発明の方法は、
ａ）臨床サンプルを培地を含む第１培養容器に導入する工程と、
ｂ（ｉ））任意で、前記第１培養容器中の前記臨床サンプルを前培養する工程と、
ｂ（ｉｉ））前記臨床サンプル／前記培地の混合物の一部分、又は前培養を行った場合は前記臨床サンプルの培養物の一部分、を前記第１培養容器から取り出し、前記一部分を培地を含む第２培養容器に導入し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を前培養する工程と、
ｃ）テストアリコートを前記第２培養容器から取り出し、前記第２培養容器中の前記一部分を培養する又は引き続き培養する工程と、
ｄ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離する工程と、
ｅ）前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出する工程であって、
前記核酸検査は、
i）一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ii）一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ及び／又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程と、
ｆ）工程（ｅ）において微生物が同定された場合、工程（ｃ）からの前記培養された一部分に対して薬剤感受性検査を行う工程であって、増殖又は増殖マーカーを評価することによって前記薬剤感受性検査における微生物増殖を観察し、工程（ｅ）で検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって前記薬剤感受性検査で用いる抗菌剤の種類と濃度を判定し、任意で前記第２培養容器中の前記一部分を引き続き培養する工程と、
ｇ）工程（ｅ）において微生物菌株が同定されなかった場合、微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するための更なる微生物同定と薬剤感受性検査の実施を可能するために、前記臨床サンプル及び／又は前記一部分を更に培養する工程と、を含みうる方法。
【００２１】
実際に、本発明のいずれかの実施形態において、工程（ｅ）で陽性の同定結果が得られたか否かに関係なく、従来型であるか否かを問わず、更なるＩＤ検査及び／又はＡＳＴ検査を、培養されたサンプル及び／又は一部分に対して行ってもよい。従って、該方法は、例えば裏付け又は確認として追加的な結果を提供するためだけに、臨床サンプル又は一部分を培養して、追加的な同定検査及び／又はＡＳＴ検査を行うことができる。更なる一実施形態において、工程（ｅ）のＩＤ検査及び／又は工程（ｆ）のＡＳＴ検査から陽性結果が得られたか否かを問わず、更なる検査（例えば従来検査）を行ってもよい。好ましい態様において、臨床サンプル（第１培養容器の臨床サンプル）の培養を続けることにより、更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことができる。
【００２２】
また、工程（ｅ）及び／又は（ｆ）の検査を繰り返してもよい、又は１回以上行ってもよい、即ち、第１培養又は第２培養からアリコートを１回以上（例えば周期的に）取り出し、工程（ｆ）の核酸検査を１回以上（例えば２回以上、例えば２回又は３回）実施してもよいことが理解されるであろう。任意で、工程（ｆ）のＡＳＴ検査も１回以上行ってもよく、そうすることが望ましい。上述のように、工程（ｆ）のＡＳＴ検査の進行中、及び任意で前記検査の実施後も、培養容器の臨床サンプルの培養を継続してもよい。このように、ＡＳＴ検査を繰り返したり、従来の検査を行うために培養を継続したりする可能性がある。文脈から明確なように、第１培養容器又は第２培養容器中の臨床サンプル／培地の混合物、又はそこから取り出された一部分のアリコートは、単なる一部分、つまり培養容器の中身の一部又は一部分である。アリコートを取り出し、工程（ｅ）の核酸検査（工程（ｄ）でテストアリコートからＤＮＡを分離した後）又は工程（ｆ）のＡＳＴ検査に直接用いてもよいし、工程（ｄ）／（ｅ）及び／又は工程（ｆ）の検査前にアリコートを培養する期間を設けてもよい。更に、第１培養容器又は第２培養容器から取り出されたテストアリコートをサブアリコート又はアリコート画分に分割してもよいし、サブアリコート又は画分をそこから取り出して検査又は更なる培養を行ってもよい。取り出したテストアリコート又はアリコート断片画分の培養を、培養容器中の臨床サンプルの培養又は継続的な培養と別個に又は独立して行ってもよい。
【００２３】
培養容器中の臨床サンプルを培養する工程、又は第１培養容器から取り出された一部分を培養する工程、又はテストアリコート／アリコート画分を培養する工程は、以下に詳細に述べられるように、適切な又は所望の方法を用いて行えばよい。これに関して、例えば診断用途又は微生物検出用途の臨床サンプル培養用培養装置が公知であり、それらを用いてもよい。別の培養装置又は培養システムを用いて、培養容器（例えば第１培養容器及び第２培養容器）の分離培養、及び／又は取り出されたテストアリコート／アリコート画分の分離培養、及び／又はＡＳＴ検査中に必要な培養を行ってもよい。更に、上述され以下で更に述べられるように、本明細書に記載の通り、本発明は、微生物の検出及び特徴付け方法を実施するための機器又は装置を提供することも想定している。そのような装置又はシステムは、培養容器を培養するための装置又は手段を含みうる。従って、該方法の以下の様々な培養工程を、同一の又は異なる培養システム又は培養装置において実施してもよい：第１培養容器及び／又は第２培養容器の培養／継続的な培養工程：テストアリコート（例えば第１テストアリコート）を取り出す前の前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の任意の前培養工程：テストアリコート又はアリコート画分の培養工程：又は工程（ｆ）のＡＳＴ検査中の培養工程。例えば工程（ｅ）の同定検査結果が陰性の場合、培養容器を別の培養システム／装置に移してもよい。培養容器（例えば第１培養容器及び／又は第２培養容器）は、培養装置への配置前（例えば培養容器に臨床サンプル又は一部分が導入された後）に、表面洗浄又は表面除染されてもよい。
【００２４】
従って、例えば一実施形態において、任意の前培養及び検査工程の実施中に、培養容器（例えば第１培養容器）を１つのシステム内で培養してもよい。工程（ｅ）の同定検査が陰性、及び／又は確定的でない場合、或いは工程（ｆ）のＡＳＴ検査が陰性、確定的でない、又は不完全な場合、例えば従来の同定検査及び／又はＡＳＴ検査が行えるように、更なる培養システム又は別の培養システムに培養容器を移してもよい。そのような更なる培養システム又は別の培養システムは、例えば従来の培養キャビネットであってもよいし、更なる自動微生物検査／検出システム（例えば診断システム）であってもよい。
【００２５】
代表的な例を挙げると、該方法の一実施形態において、被検体から採取した臨床サンプルを培養容器（これは第１培養容器であると考えられる）に導入する（工程（ａ））。どの培養を行うよりも前に、テストアリコートを取り出し、（工程（ｃ））、工程（ｄ）及び（ｅ）を行う。この間、培養容器を培養する。工程（ｅ）の同定検査が陽性結果の場合、更なるアリコートを培養容器から取り出し、工程（ｆ）のＡＳＴを行う。工程（ｅ）における同定検査が陰性の場合、臨床サンプルを含む培養容器を、例えば別のシステムで更に培養する。
【００２６】
第二の実施形態において、該方法は上述の通り実施されるが、工程（ｃ）においてテストアリコートを取り出す前に、前培養を行う工程を含む。
【００２７】
第三の実施形態において、テストアリコートを培養容器から取り出し（上述の工程（ｃ）と同様）、前記アリコートからの断片に対して工程（ｄ）及び（ｅ）を行う（核酸の分離と検出）。この間、更なるアリコート画分又は前記テストアリコートの残りを、前記テストアリコートが取り出された培養容器と同様に培養する。この別のアリコート／アリコート画分の培養及び培養容器の培養を、同じシステムで行ってもよいし、異なるシステムで行ってもよい。工程（ｅ）の同定検査が陽性結果の場合、培養された更なるアリコート画分／残りのアリコートに対して工程（ｆ）のＡＳＴを行う。工程（ｅ）における同定検査が陰性の場合、臨床サンプルを含む培養容器を例えば別のシステムにおいて更に培養する。
【００２８】
第四の実施形態において、一部分を第１培養容器から取り出し（前培養期間の前か後）、培地を含む第２培養容器に導入する。テストアリコートを第２培養容器から取り出し（工程（ｃ））、工程（ｄ）及び（ｅ）を行う。この間、第２培養容器を培養する。工程（ｅ）の同定検査が陽性結果の場合、更なるアリコートを第２培養容器から取り出し、工程（ｆ）のＡＳＴを行う。工程（ｅ）における同定検査が陰性の場合、サンプルアリコートを含む第２培養容器を更に培養する。更なる実施形態において、第１培養容器は、例えば別のシステムにおいて、追加的に又は代わりに更に培養されてもよい。
【００２９】
更なる実施形態において、上述の第一、第二、第三及び／又は第四の代表的な実施形態は、工程（ｅ）における同定結果が陽性か陰性かに関係なく、臨床サンプルを含む培養容器を継続的に培養することを含みうる。このようにして、サンプルから追加的な結果を得てもよい。
【００３０】
従って、任意の好ましい実施形態において、臨床サンプルの培養を行うことなく分子検査（即ち工程（ｅ）の核酸検査）が実施されることが理解されるであろう。今日実施されている多くの微生物検査手順において、同定検査は（従来の生化学的検査であるか分子検査であるかに関わらず）、微生物培養において陽性結果があった場合、即ち微生物増殖が検出された場合（陽性培養検査）に実施される。従って、例えば血液又は別のサンプルを培養容器（例えば血液培養フラスコ）に導入し、これを培養する。その培養システムは、微生物が増殖した事を（した時に）、例えば微生物増殖（例えばｐＨ変化、基質の変換／消費、微生物の代謝産物の産生等）に依存する信号を発生させる指標物質を含ませることにより、或いは、単純に何らかの手段で微生物増殖を検出することにより知らせるよう設計又は選択される。十分な微生物増殖が起こり、信号が発生した場合／検出可能な増殖が生じた場合、これは培養／微生物検出における「陽性」結果を示す（即ち、この段階では微生物の正体（アイデンティティ）は分かっていないが、臨床サンプルにおいて微生物増殖があることを示す）。この段階で、同定及び／又はＡＳＴ検査が通常行われる。微生物増殖検査は、その実施に数時間、例えば６、８、１０又は１２時間以上かかりうる。
【００３１】
本発明は、そのような培養検査において陽性結果を待つ必要がないという利点がある。即ち、微生物同定がより迅速に得られうることを意味する。工程（ｂ）は、分子検査前の任意の前培養工程を可能にする。この前培養工程は、陽性培養検査に要する期間よりも短い期間であってもよい。従って、代表的な一実施形態において、工程（ｄ）及び（ｅ）は、陽性培養検査結果が出る前に実施される。更なる実施形態において、工程（ｄ）及び（ｅ）は、陽性培養結果を得る前（又は陽性培養結果を得るのに必要となるであろう時間よりも前）に先ず実施され、陽性培養結果（又は陽性結果に必要な期間）後も繰り返し行ってもよい。即ち、好ましい一実施形態において、少なくとも１セットの核酸検査（工程（ｅ））が、陽性培養結果が出る前に又はより詳細には陽性培養結果を得るのに必要となるであろう時間よりも前に行われる。更なる代表的な実施形態において、工程（ｆ）（ＡＳＴ工程）についても、培養検査において陽性結果を得る前又は得られる前に実施してもよい。しかしながら、本発明の方法は、検査工程（ｅ）及び（ｆ）を陽性培養結果が出た後に実施すること、例えば、陽性検査結果後に工程（ｃ）のテストアリコートを取り出すことを行うこと、を排除しない。そのような場合、前培養工程（ｂ）は、陽性培養検査結果が得られるまで又は陽性培養検査結果が予想されるまで培養容器を培養することに関与しうることが分かる。
【００３２】
工程（ｅ）の核酸検査に関して、好ましい一実施形態において、微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブセットと、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のプローブセットとが使用される。そのような実施形態において、プローブハイブリダイゼーションの検出は、プローブ増幅に関与しうる、又はプローブ増幅によって起こりうる。従って、プローブハイブリダイゼーションの検出は、プローブ増幅を検出することによって実施されうる。従って、本発明の方法は、工程（ｅ）において、一つ以上のプローブ増幅プライマーの使用を含みうる。即ち、プライマーは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプローブを増幅するよう設計又は選択されている。以下に詳細に述べられるように、任意の好ましい実施形態において、前記プローブは、その標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした場合にライゲートするよう設計されてもよい（例えばプローブを環状化するよう設計されたライゲーション反応）。従って、プローブライゲーションは、標的配列の存在を表す。ライゲートした（例えば環状化した）プローブの検出は、ライゲートしたプローブを増幅することによって、例えばライゲートしたプローブをテンプレートとして用い（例えば環状化プローブはＲＣＡ反応のテンプレートとなりうる）増幅産物を生じさせることによって行ってもよく、その増幅産物を、直接的に又は増幅産物にハイブリダイズする検出プローブを用いて検出してもよい。
【００３３】
工程（ｆ）のＡＳＴ検査は、以下で更に述べられるように、便利な又は所望の方法を用いて行なわれてもよい。従って、微生物増殖は、異なる抗菌剤（例えば抗生物質）の存在下、及び／又は異なる抗菌剤量若しくは抗菌剤濃度の存在下、で評価（又は判定）されてもよい。増殖は、直接的に評価されても、マーカー増殖を評価（判定）することによって評価されてもよい。
【００３４】
従って、微生物増殖は、サンプル中に存在する微生物細胞物質の量（微生物バイオマス）を判定することによって、特にこれを直接的に評価又は判定することによって評価されてもよい。好ましい実施形態において、これは微生物バイオマス量の視覚的な判定によって、特に画像化によって達成される。特に２Ｄ画像を得て評価を行ってもよい。従って、好ましい実施形態において、微生物バイオマスのエリア（より具体的には、例えば画像内の検査中の視野における微生物バイオマスのエリア）を判定してもよい。
【００３５】
微生物増殖は、サンプル（具体的にはＡＳＴ検査のための検査微生物培養セットアップ）中に存在する微生物細胞物質の量（微生物バイオマス）を判定することによって、特にその量を直接的に評価又は判定することによって、評価されてもよい。好ましい実施形態において、これは微生物バイオマス量の視覚的な判定によって、特に画像化によって達成される。特に、光軸に対して垂直にアラインされた２Ｄ画像（ここでは「ｘｙアライン」と称す）を得て評価を行ってもよい。試料の特定のエリアを一枚のｘｙアライン画像におさめる。画像の大きさは、画像機器の光学性能に依存する。ｘｙ空間の各位置に対して、一枚以上の２Ｄ画像を、光軸又はｚ軸に沿って異なる時間間隔で収集することができる。このようにして、一連の又はスタックの２Ｄ画像を生成し、サンプル容量の３Ｄ情報を提供する。サンプルから３Ｄ情報を抽出する別の方法としては、ユニセンサー社が使用する方法が挙げられる（例えばＵＳ８７８０１８１を参照）。その方法では、光軸はｘｙ面に対して傾斜し、サンプル又は検出器はｘ面又はｙ面のいずれかに沿って移動する。ここで、ｘｙ空間に加え、ｚ空間への伸長によって一連の画像を獲得する。ｘｙ面に垂直にアラインされた２Ｄ画像のスタックも、続く画像データの変換を通して、この方法で得ることができる。
【００３６】
２Ｄ画像のスタックに内在する３Ｄ情報は、一旦抽出されると、解析容量に存在する全ての細胞集団を評価（estimate）／推測（infer）／推定（deduce）するのに利用できる。好ましい一実施形態において、例えばｚスタックを１枚の２Ｄ画像に投影（projections）することによって３Ｄ情報から２Ｄ画像を生成してもよい。得られた２Ｄ画像を用いて解析を行ってもよい。微生物バイオマスのエリアは、検査中の視野（例えば投影された２Ｄ画像）において、微生物バイオマスを示す光学濃度エリアとして判断されうる。このような方法は、当該技術において一般的な方法であり、感度を向上しうる方法である。明視野画像解析のためのアルゴリズムは、マサチューセッツ工科大学（ＵＳＡ）の公開ソフトフェアＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒから入手可能である。同様の解析を蛍光画像に行ってもよく、このための数多くの他のアルゴリズムが例えばＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒや最も一般的な画像解析システムに存在している。
【００３７】
別の実施形態において、ｘｙ空間における各位置に伸びるｚ空間における強度変化（intensitiy variation）を登録する。これは特定の位置における微生物質量（microbial mass）を示す。ｘｙ空間全体を積分することによって、全微生物容量の指標を得る。この過程のためのアルゴリズムも一般的に入手可能な画像解析ソフトウェア、例えばフリーウェアのＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒに存在する。
【００３８】
より一般的には、微生物増殖は、微生物及び／又は微生物コロニー若しくは凝集体の量及び／又は数及び／又は大きさを判定することによって評価されてもよい。以下に詳細に述べられるように、任意の好ましい実施形態において、微生物増殖は、微生物を画像化、即ち可視化することによって評価（判定）される。従って、増殖の判定（又は評価又は観察）手段として、微生物細胞（細胞の凝集体やクランプ（クラスター）を含みうる）又は微生物コロニーを可視化又は画像化してもよい。これは細胞又はコロニーのカウンティングを含みうるが、そのような方法に限定されず、微生物細胞、コロニー又は凝集体の大きさ、エリア、形、形態及び／又は数を評価（又は判定）することによって微生物の増殖量を視覚的に評価する手段を含む（用語「凝集体」は、物理的に近接した細胞の集まり（例えばクランプやクラスター）を含む;これはクローン性コロニーと同様に、凝集した又はくっついた細胞の非クローン性クランプ／クラスター（例えば凝集した隣接細胞）を含みうる）。微生物増殖の測定に用いられるパラメータは、必ずしもそうではないが、微生物のアイデンティティ（工程（ｅ）において判定）及び工程（ｆ）で使用された抗菌剤に応じて変えてもよい。実際には、細胞の形態や増殖パターンは、その生体や使用された抗菌剤によって影響を受け、例えば抗菌剤不在の「通常」又は「典型的」な形態や増殖パターンから変化又は変質するだろう。ＡＳＴ増殖観察方法の中にはそのような変化の検出に依存するものもあるが、本発明はそのような変化を考慮する必要はなく、微生物増殖の量（例えばエリア）又はバイオマスを、形態及び／又は増殖パターンに関係なく判定してもよい。このように、微生物細胞及び／又は使用された抗菌剤に関係なく、同じ増殖観察方法を用いてもよい。ＡＳＴ検査実施方法を以下に更に記載する。
【００３９】
有利には、臨床サンプル（例えばテストアリコート）を、工程（ｅ）の陽性結果後に、ＡＳＴ検査において直接用いてもよい。工程（ｄ）及び（ｅ）が行われている間に臨床サンプル／一部分／テストアリコート／アリコート画分等の培養を行えば、工程（ｆ）前に更なる継代培養を行う必要はない。実際には、有利な実施形態において、更なる継代培養工程を含まない。特に、更なる培地又は培養容器における継代培養工程を含まない。特に、ＡＳＴ前に微生物の純粋培養物を得るための継代培養工程を含まない。これは、より迅速なＡＳＴ検査が実施されうることを意味する。
【００４０】
有利には、迅速なＡＳＴ検査が実施される。従って、好ましい一実施形態において、工程（ｆ）のＡＳＴ検査は、８、７又は６時間以内、例えば４又は５時間以内に結果をもたらしうる。
【００４１】
ＡＳＴ検査における微生物増殖の観察又は評価は、増殖を連続的又は周期的（例えば６、５、６、７又は８時間以内）に観察すること、又はＡＳＴ増殖培養開始時とその後のタイムポイント（例えば４、５、６、７又は８時間以内）で増殖を比較すること、又は２以上の異なるタイムポイントで増殖を比較することにより行われてもよい。好ましい実施形態において、微生物増殖は、１を上回るタイムポイント、即ち２タイムポイント以上で判定される。
【００４２】
本発明の方法は、どの微生物の検出及び特徴付けに用いられてもよい。一般的には、臨床に関連する微生物への使用が考えられる。本明細書に記載されているように、用語微生物は、「微生物」のカテゴリーに分類されうるあらゆる微生物を含む。必須ではないが、微生物は、単細胞であっても、単細胞のライフステージを有するものであってもよい。微生物は、原核生物又は真核生物であってもよく、一般的には細菌、古細菌、真菌、藻類、原生生物（特に原生動物）を含む。特に注目されるのは、細菌（グラム陽性菌、グラム陰性菌、グラム不確定性菌、グラム非反応性菌等）及び真菌である。
【００４３】
特に、臨床に関連する細菌の属としては、Staphylococcus（コアグラーゼ陰性Staphylococcusを含む)、Clostridium、Escherichia、Salmonella、Pseudomonas、Propionibacterium、Bacillus、Lactobacillus、Legionella、Mycobacterium、Micrococcus、Fusobacterium、Moraxella、Proteus、Escherichia、Klebsiella、Acinetobacter、Burkholderia、Entercoccus、Enterobacter、Citrobacter、Haemophilus、Neisseria、Serratia、Streptococcus（アルファ溶血性及びベータ溶血性Streptococciを含む）、Bacteriodes、Yersinia、Stenotrophomas、及びその他腸内細菌属又は大腸菌属等が挙げられる。ベータ溶血性Streptococciは、グループＡ、グループＢ、グループＣ、グループＤ、グループＥ、グループＦ、グループＧ及びグループＨ Streptococciを含みうる。
【００４４】
グラム陽性菌の限定されない例としては、Staphylococcus aureus、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus schleiferei、Staphylococcus caprae、Staphylococcus pneumoniae、Staphylococcus agalactiae、Staphylococcus pyogenes、Staphylococcus salivarius、Staphylococcus sanguinis、Staphylococcus anginosus、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus mitis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus equinus、Streptococcus bovis、Clostridium perfringens、Enterococcus faecalis及びEnterococcus faeciumが挙げられる。グラム陰性菌の限定されない例としては、Escherichia coli、Salmonella bongori、Salmonella enterica、Citrobacter koseri、Citrobacter freundii、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Pseudomonas aeruginosa、Haemophilus influenzae、Neisseria meningitidis、Enterobacter cloacae、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Stenotrophomonas maltophilia、Morganella morganii、Bacteriodes fragilis、Acinetobacter baumannii及びProteus mirabilisが挙げられる。
【００４５】
臨床に関連する真菌としては、イースト、特にCandida属及びAspergillus、Fusarium、Penicilium、Pneumocystis、Cryptococcus、Coccidiodes、Malassezia、Trichosporon、Acremonium、Rhizopus、Mucor及びAbsidia属の真菌が挙げられる。特に注目されるのは、Candida及びAspergillusである。真菌の限定されない例としては、Aspergillus fumigatus、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida glabrata、Candida dubliensis、Candida parapsilosis及びCandida kruseiが挙げられる。
【００４６】
用語「検出」は、広義において微生物の有無を判定する手段を示す。従って「検出」は、何らかの方法又は形で、微生物が存在するか否かを判定、評価又は測定することを含み、質的、定量的又は半定量的な判定を含みうる。
【００４７】
用語「特徴付け」は、広義において微生物の性質及び／又は特性に関する情報を判定する手段を意味し、特に微生物の同定を含む。より具体的には、微生物を少なくとも属、好ましくは種の観点から同定する。菌株レベルの同定さえ可能な場合もある。本発明の方法は、ある抗菌剤に対する感受性の有無又は感受性の見込みの有無、或いは、ある抗菌剤に対して耐性を発揮するか又は耐性が見込まれるかを判定する（例えば薬剤感受性プロファイルを判定する）観点から、微生物を特徴付けることもできる。これを分子耐性マーカーの存在を検査することよって行ってもよい。分子耐性マーカーは、一又は複数の抗菌剤又は抗菌剤系統に関連する、又はそれらに対して耐性を示す遺伝的変異体又は特定の遺伝子配列である。もちろん、そのような分子検査が微生物の感受性を最終的に判定するわけではない。最終的な判定は、微生物増殖に対する抗菌剤の効果が直接検査される工程（ｆ）のＡＳＴ検査で行われる。
【００４８】
用語「溶解（lysing）」は、細胞の破壊を意味する。具体的には細胞が破壊され、細胞含有物（特に核酸）がリリースされる。当該技術において膨大な数の手段が公知であるように、細胞の破壊にはどのような手段を用いてもよい。例えば、ウイルス、酵素、機械的、電気的、化学的、熱、冷却、又は浸透機構等によって細胞の完全性を弱め、細胞成分を部分的又は完全に周辺の溶液にリリースする。
【００４９】
臨床サンプルは、被検体から得られるものであればどのような臨床サンプルであってもよい。被検体は通常ヒト患者であるが、どのようなヒト被検体又は動物被検体（通常は哺乳類）であってもよい。従って、臨床サンプルは、体組織、体細胞、体液等のサンプルであってもよく、体由来のサンプル（例えばスワブ、洗浄、吸引物（aspirate）、すすぎ水（rinsate））であってもよい。適切な臨床サンプルとしては、特に限定されないが、血液、血清、血漿、血液フラクション、関節滑液、尿、精液、唾液、便、脳脊髄液、胃内容物、膣分泌物、粘液、組織生検サンプル、組織ホモジネート、骨髄穿刺液、骨ホモジネート、痰、吸引物、傷からの滲出液、スワブ及びスワブすすぎ水（例えば鼻咽頭スワブ）、その他の体液等が挙げられる。好ましい一実施形態において、臨床サンプルは、血液又は血液由来のサンプル、例えば血清、血漿又は血液フラクションである。
【００５０】
微生物はどのような微生物であってもよく、特に病原微生物又は体内で感染を引き起こす微生物でありうる。従って、該方法は、被検体の体のどの部位内の又はどの部位上の微生物感染（即ち、あらゆる微生物感染）を検出又は診断するのに用いてもよく、例えば感染又は感染が疑われる症状の有無、或いは被検体の全体的な臨床症状に従って臨床サンプルの性質を判定してもよい。本発明の方法は、どのような微生物感染も包含するが、敗血症又は敗血症が疑われる場合の検出又は診断において特に有用である。従って、臨床サンプルは、敗血症の被検体、又は敗血症の疑いがある被検体、又は敗血症のリスクがある被検体から得られたものでありうる。そのような場合、前記サンプルは、通常血液又は血液由来のサンプルであろう。典型的には、サンプルは血液である。
【００５１】
該方法の第１工程（工程（ａ））において、サンプルを培地を含む培養容器に導入する。この工程は、当該技術において周知であり、文献に広く記載された標準的な手順に従って実施されうる標準的な工程である。
【００５２】
培養容器は、微生物細胞の培養に適したものであればどのような容器又はコンテナであってもよく、例えばプレート、ウェル、チューブ、ボトル、フラスコ等が挙げられる。好都合には、サンプルが血液又は血液由来の場合、培養容器としては例えばＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社）血液培養フラスコ、Ｂａｃｔｅｃ血液培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、ＶｅｒｓａＴｒｅｋ血液培養フラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）等の血液培養フラスコ、或いは、血液サンプリング用として公知の、特に微生物検出のための培養目的のチューブ、フラスコ又はボトルが挙げられる。
【００５３】
好都合には、培養容器は、培地が既に含まれた形で提供されてもよい。しかしながら、培地は別個に提供されてもよく、臨床サンプルの添加前、添加時、添加後のいずれかのタイミングで培養容器に導入されてもよい。
【００５４】
前記培地は適切なものであればよく、臨床サンプル、及び／又は疑われる微生物の性質、及び／又は被検体の臨床症状などに応じて選択すればよい。この用途に適した数多くの微生物培地が公知である。典型的には、当該技術において公知のように、培地は迅速な微生物増殖を促すよう十分な栄養を含んでもよい。多くの場合において、適切な培地としては、トリプチックソイブロス、コロンビアブロス、ブレインハートインフュージョンブロス、ブルセラブロス等の培地を含む複合培養培地や、当該技術において公知の汎用培養培地が挙げられ、特定の増殖ファクターや増殖サプリメントの添加を含みうる。培地は、液体、固体、懸濁液等、様々な形で入手可能であり、これらのうちいずれを用いてもよいが、好都合には液体培地である。培養容器が準備済みの血液培養フラスコの場合、上述のように、これらの容器は、広範囲の微生物が増殖できるよう特別に改良された特定の培地を含んでもよい。典型的には、製造業社により血液培養フラスコに供給された培地は、被検体から採取した臨床サンプルに存在する抗生物質の存在を中和する作用剤（agent）又は添加剤を含むであろう。そのような中和剤を含む又は含まないフラスコを用いてもよいし、所望であれば中和剤を培養容器に添加してもよい。
【００５５】
上記のように、工程（ｅ）の同定検査用の第１テストアリコートを、培養容器中の培地にサンプルを接触させた直後又は実質的に直後に、第１培養容器又は第２培養容器から取り出してもよい（例えばサンプルと培地とのミックス後）。これは、臨床的症状に応じて、例えばサンプルを培養容器に導入してから１０、１５、２０又は３０分以内であってもよく、それよりも長い例えば１、２又は３時間以内であってもよい。
【００５６】
工程（ｂ）は、培養容器中の臨床サンプル（又は第２培養容器に導入された第１培養容器からの一部分）を前培養する工程、即ち、分子検査を行う前にサンプル中に存在する微生物を増殖（例えば倍増）させる任意の工程である。この工程を行うか否かは、サンプルの性質や、疑われる感染症や、被検体の臨床状態によって決めればよい。例えば尿サンプルの場合、多くの微生物細胞がサンプル中に存在することが予想されるため、前培養工程は不要だろう。しかしながら、例えば血液サンプルの場合、一般的にその細胞数はそれよりも少ないと予想される。前培養工程は、分子検査に利用できる微生物細胞の数を増やしたり、微生物ＤＮＡの回収を容易にしたりするのに有利であろう。前培養を行うか否かは、微生物同定及び耐性マーカー検出に用いられる分子検査（プローブ）の性質や、核酸検査の感度及び／又は特異性によって決めればよい。
【００５７】
前培養は、一般的に微生物増殖に寄与する条件下又は適した条件下、例えば特定の温度で（例えば２０〜４０℃又は２５〜４０℃、例えば２５〜３７℃又は３０〜３５℃）培養容器をインキュベートすることに関与する。容器の性質、培地、疑われる微生物、臨床症状等に応じて、容器を攪拌、回転、振動等してもよい。
【００５８】
前培養は適切な又は所望の期間行えばよいが、該方法を迅速化するためには、前培養は８時間未満又は６時間未満の短期間であることが好ましいだろう。例えば前培養は、検査開始前、特に工程（ｃ）のテストアリコートを取り出す前に、１、２、３、４、５又は６時間以内で行えばよい。或いは、前培養は１時間未満であってもよい。前培養は６時間を超えてもよく（例えば７、８又は９時間）、９時間を超えてもよく（例えば１０又は１２時間以内）、それ以上であってもよい。しかしながら、迅速な方法を提供するには、一般的に前培養を最小限の期間にとどめ、６時間以内、特に４又は３時間以内の短い期間にすることが好ましい。上述のように、前培養は、陽性培養結果の判明に必要な期間よりも短い期間行ってもよいし、陽性培養結果が得られるまで行ってもよい。
【００５９】
工程（ｃ）におけるテストアリコートの取り出しは、培養容器の性質やインキュベートの方法に応じて便利な手段を用いて行えばよい。例えば血液培養フラスコの場合、アリコートを針とシリンジを用いて単純に抜き取ればよい。通常の臨床及び微生物プラクティス工程を採用して異物混入を回避又は制限してもよく、例えばこれを無菌状態で行ってもよい。培養容器（例えば血液培養フラスコ）のセプタムを、好ましくはアリコート抜き取り前及び／又はアリコート抜き取り後に洗浄又は除染してもよい。
【００６０】
好都合な一実施形態において、テストアリコートを取り出すための手段（例えば針及び任意でシリンジ）は、使い捨ての形、即ち消耗品であってもよい。言い換えると、該手段は使い捨てであり、再利用されないものであってもよい。
【００６１】
培養を継続しながらテストアリコートを取り出す工程（ｃ）を２回以上行ってもよい。実際には、工程（ｅ）の分子検査及び工程（ｆ）のＡＳＴ検査を実施するために、通常２つの異なるアリコートが取られるが、いずれの場合においても培養は継続される。しかしながら、上述のように分子検査用に取られたアリコートの一部分を保持・培養してもよい。この一部分を、繰り返し分子検査（例えば第２のタイムポイント）に使用してもよく、及び／又はＡＳＴ検査に使用してもよい。しかしながら、繰り返し分子検査のための別のアリコートを、例えば時間をあけて取ってもよい。従って、分子検査（工程（ｅ））は２回以上行なわれうる。そのような一実施形態において、工程（ａ）直後にアリコートを取り出し、初期分子検査を前培養工程（ｂ）の前に行ってもよい。例えば初期分子検査が陰性又は不確実な場合、前培養期間後に第２のアリコートを取り出して第２分子検査を行ってもよい。従って、一実施形態において、本発明の方法は以下の工程を含みうる。
ｉ）臨床サンプルを培地を含む培養容器に導入する工程と、
ｉｉ）テストアリコートを前記培養容器から取り出す工程と、
ｉｉｉ）前記テストアリコートからＤＮＡを分離して上記工程（ｅ）と同様に核酸検査を行う工程と、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の進行中に、前記培養容器中の前記臨床サンプルを培養する工程と、
ｖ）更なるテストアリコートを前記培養容器から取り出し、前記前記培養容器中の前記臨床サンプルを引き続き培養する工程と、
ｖｉ）前記更なるテストアリコートからＤＮＡを分離して上記工程（ｅ）と同様に核酸検査を行う工程。
【００６２】
この２回目（又はそれ以降）の分子検査が陰性の場合、該方法は工程（ｇ）に進んでもよい。このように、培養容器の培養を継続することによって更なる検査を可能にしてもよい。
【００６３】
工程（ｅ）の分子核酸検査の実施を可能にするために、取り出されたアリコート又はアリコート画分からＤＮＡを分離する（工程（ｄ））。当然、微生物ＤＮＡに分子検査を行う必要はあるが、臨床サンプルの性質によっては被検体からの細胞は相当な数になり、これが分離や続く検査を複雑化したり妨げたりする原因になる。より具体的には、微生物細胞に比べて非常に多くの血液細胞（特に白血球）が存在する血液等のサンプルの場合、被検体の細胞に存在する臨床サンプル中の非微生物ＤＮＡ（例えばヒトＤＮＡ）は、微生物ＤＮＡの検出や検査を困難にするだろう。従って、微生物ＤＮＡをテストアリコートから選択的に分離又は濃縮することが望ましいだろう。実際には、該方法は、例えばＤＮＡ分離工程又は微生物ＤＮＡ分離工程の前又はそれと同時に、テストアリコート中又はテストアリコートからの微生物又は微生物細胞を分離又は濃縮する工程を任意で含んでもよい。
【００６４】
サンプル中の微生物を濃縮するための適切な方法は、アリコートに存在する非微生物細胞を溶解すること、又は微生物細胞をアリコートから選択的に取り出すこと（即ち、アリコートからの微生物細胞のポジティブ又はネガティブ選択）を含みうる。これを行うための方法は、当該技術において公知である。微生物のアイデンティティを知ることに依存しない、サンプル中の微生物を選択的に濃縮するための非微生物細胞の選択的な溶解方法は、例えばＵＳ２０１３／０１７１６１５、ＵＳ２０１２／０２３１４４６、ＵＳ２０１０／０１８４２１０、ＵＳ７８９３２５１及びＵＳ８４８１２６５に記載されている。サンプルから真核細胞を選択的に取り出す方法は、ＵＳ２００５／０２０２４８７に記載されている。
【００６５】
ＤＮＡを分離するための方法は当該技術において公知であり、公知で記載されている様々な異なる方法のうちいずれを用いてもよい。一般的には、これらの方法は、細胞溶解（様々な手段及び方法で行われうる）と、リリースされたＤＮＡの回収（これも様々な手段及び方法が公知で利用可能であり、これらのうちいずれを用いてもよい）に関与する。一般に微生物の溶解には多くの手法が用いられうるが、溶解工程は、疑われる微生物の性質によって決めればよい。
【００６６】
上述のように、該工程は、サンプルの性質に応じて微生物ＤＮＡの分離、特に微生物ＤＮＡの選択的な分離又は濃縮、に関与することが好ましい。これは通常微生物細胞の状態を保ちつつ、サンプル中の被検体細胞を選択的に溶解することによって行なわれうる。これを達成するための多くの手法、キットが公知であり、入手可能である（例えばＭｏｌｚｙｍ社（ドイツ））。例えば、アリコートに存在する微生物細胞を溶解することなく、ヒト細胞（例えばヒト血液細胞）を容易に溶解することができる。サンプルによって存在しうる別のヒト細胞や哺乳類細胞についても、同じことが言える。血液又は血液由来のサンプルの場合、微生物ＤＮＡを分離すること、特に微生物ＤＮＡを選択的に分離することが好ましい。
【００６７】
従って、微生物細胞を溶解させないという溶解条件下で、被検体由来であってテストアリコートに存在する臨床サンプル中の細胞を溶解してもよい。例えば、適切な溶解試薬（例えば溶解バッファー）をテストアリコートに添加してもよい。この第１溶解工程でリリースされたＤＮＡ、又はより一般的には核酸は、例えば次の方法によって取り出されうる：分解（例えばＤＮＡ分解酵素（例えばＤＮａｓｅ）を使用）；及び／又は、サンプルからＤＮＡ又は核酸を分離又は取り出し可能な方法；及び／又は、未溶解の微生物細胞を分離可能な方法。分離方法としては、例えば、濾過、カラム分離、沈殿、遠心分離が挙げられるが、一実施形態において、該方法の好ましい特徴は、遠心分離を含まない。従って、一実施形態において、ＤＮＡ分離工程は遠心分離を含まず、更に好ましい実施形態において、該方法は全体として遠心分離を含まない。これらの工程に使用される酵素、特にＤＮＡ分解酵素は、加熱又はタンパク質分解酵素の更なる添加などにより不活性化又は除去されてもよい。
【００６８】
次に、処理されたアリコート（例えば第１溶解工程からの溶解物）から微生物細胞またはそこに残存する微生物細胞を、溶解条件を導入することによって、例えば微生物細胞の溶解に適した溶解試薬（例えば溶解バッファー）を添加することによって溶解する。数多くのこのようなバッファーが当該技術において公知である、及び／又は市販されている（例えばＭｏｌｚｙｍ社（ドイツ））。第２の微生物溶解工程においてリリースされた微生物ＤＮＡを、回収（例えば反応混合物（溶解物）から分離）してもよい。上述のように、このための多くの技術が利用可能であり、それらのうちいずれを用いてもよい。好ましい実施形態において、この工程は遠心分離を含まない。
【００６９】
回収されたＤＮＡ又は回収された微生物ＤＮＡに対して、次に工程（ｅ）の分子検査を行う。工程（ｅ）の分子核酸検査を行う前に、テストアリコートから分離又は濃縮された２本鎖ＤＮＡ（特に微生物ＤＮＡ）を変性することが望ましいであろう。更に工程（ｅ）の分子検査を行う前に、ＤＮＡを断片化することが有利又は望ましいであろう（ただし必須ではない）。そのような工程は、当該技術において公知のルーチン的方法によって達成してもよい。例えば断片化は、加熱又は制限エンドヌクレアーゼや他のエンドヌクレアーゼを用いた酵素分解方法によって、機械的に達成されうる。
【００７０】
基本的に、分子検査は、特定の微生物核酸配列にハイブリダイズする又は特定の微生物配列を選択的に増幅可能なよう設計された核酸プローブ又はプライマーを用いて行われる。前記核酸プローブ又はプライマーは、それらがハイブリダイズしたか否か又は伸長したか（例えば、増幅反応を引き起こしたか）否かに基づいて特定の微生物が存在するか否か、及び特定の微生物が遺伝的薬剤耐性マーカーを含むか否かを検出するのに使用できる。そのような核酸検査及びそれらの検査において用いられるハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーは、当該技術において公知であり、文献に記載されている。
【００７１】
ハイブリダイゼーションプローブは、所望の又は選択された標的配列にハイブリダイズ可能な、好ましくは特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むであろう。従って、ハイブリダイゼーションプローブは、標的配列に相補的な配列を含みうる。非標的ヌクレオチド配列の存在下、前記プローブが標的配列に特異的にハイブリダイズ可能であれば、相補性が完全又は１００％である必要はない。ハイブリダイゼーションを検出することによって、標的配列の存在の有無を検出できる。核酸プローブのハイブリダイゼーションを検出するための数多くの異なる形式のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットが公知であり、利用可能である。一般的に、工程（ｅ）の検出は、ハイブリダイゼーションプローブの検出によって行われうる。
【００７２】
上述のように、ハイブリダイゼーションプローブの検出は、ハイブリダイゼーションプローブの増幅を含みうる、又はそれに関与しうる。従って、ハイブリダイゼーションプローブに加え、一つ以上のハイブリダイゼーションプローブ用増幅プライマーが提供されうる。
【００７３】
本発明の場合、標的配列は、第一に、（工程（ｅ）（ｉ）において）微生物の同定に関与するヌクレオチド配列である、即ち、特定の微生物に固有のヌクレオチド配列であって（例えば属、種又は菌株）、その微生物を同定するための基準として用いられうるヌクレオチド配列である。従って、同定に関与するヌクレオチド配列（identicatory nucleotide sequence）は、ある特定の微生物のモチーフ若しくはシグネチャー又は配列特性と見なされうる。典型的には、前記配列は、その微生物に特有の配列（例えば属、種又は菌株レベルで）でありうる。そのような同定に関与する配列が数多く同定され報告されており、これらのうちいずれを用いてもよい。例えば、標的配列は、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子からの核酸配列であってもよい。一方で、そのようなモチーフ配列／シグネチャー配列／同定に関与する配列を例えば微生物のゲノム配列を解析するバイオインフォマティクス・ツールを用いて同定し、これらに基づき同定された配列にハイブリダイズ可能な配列を含む適切なハイブリダイゼーションプローブを設計することはルーチン的事項であろう。
【００７４】
或いはハイブリダイゼーションプローブを用いるのではなく、一つ以上のプライマーを用い、プライマーベースの方法（例えばポリメラーゼ・プライマーの伸長をベースとする方法）を用いて微生物の検出及び同定を行ってもよい。典型的には、これは増幅方法、最も一般的にはＰＣＲであろうが、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＭＤＡなどの他の増幅方法や、プライマー伸長方法を用いてもよい。プライマー又はプライマーセットは、同定に関与するヌクレオチド配列にハイブリダイズするものであってもよいし、同定に関与する配列が増幅されるようそれが（それらが）ハイブリダイズしてもよい（例えばプライマーを隣接させる（flanking it））。用語「増幅（amplified）」は、この文脈において（上記も参照）、広義には同定に関与する配列のコピー又はマーカー配列のコピー（相補的コピーも含む）を提供する方法を意味するのに用いられ、単純なプライマー伸長反応や、線形増幅、指数関数的増幅等を含む。ＰＣＲについては、各微生物同定に関与する配列に対して、プライマー対が用いられるだろう。
【００７５】
より簡単に言えば、本発明で用いるハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーは、（ｉ）微生物の同定に関与するヌクレオチド配列又は（ｉｉ）遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に対して特異的でありうる。
【００７６】
従って、上述した本発明の方法において、工程（ｅ）は以下のようにも表現されうる。
ｅ）前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことにより微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出する工程であって、
前記核酸検査は、
ｉ）特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に対して特異的な一つ以上の微生物同定用核酸プローブ及び／又はプライマーと、
ｉｉ）遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列に対して特異的な一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ及び／又はプライマーと、
を用いて行われ、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが伸長したか（例えば増幅反応が起こったか）否かを検出する工程。
【００７７】
上述のように、検出工程は、プローブの標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーション後にそのプローブを増幅することを含みうる、又は関与しうる。以下により詳細に記載されているように、増幅はハイブリダイゼーションに依存するよう設計されてもよい。従って、ハイブリダイズしたプローブのみを増幅してもよい。
【００７８】
このように、ハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーのセット又はパネルは、選択された微生物の核酸にハイブリダイズ可能であり又は選択された微生物の核酸を増幅可能であり、それにより該微生物がテストアリコート（そしてそれによりサンプル）中に存在するか否かを検出するよう組み立てる及び／又は構成することが可能である。どの微生物が存在するか（即ち、どの同定プローブがハイブリダイズするか、又はどのプライマー／プライマーセットが伸長若しくは増幅反応を引き起こすか）を検出することによって、サンプル中に存在する微生物を同定することができる。例を挙げると、微生物同定用ハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーは、それぞれ選択された微生物セット（例えばメジャー又は最も一般的に知られた敗血症病原体）の一つを特異的に同定できるプローブ又はプライマーを含みうる。例えば、上記の特定の細菌種及び真菌種のリストは最も一般的な敗血症病原体の約９５％を示し、本発明による代表的な微生物パネルを構成しうる。
【００７９】
よって、工程（ｅ）（ｉ）において、多数の同定プローブ及び／又はプライマー（若しくはプライマーセット）が有利に用いられる。用語「多数」は本明細書において広く定義され、２以上、特に３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２００、３００、４００又は５００以上を示す。複数の異なる微生物の同定だけでなく、特定の微生物の検出にも異なるプローブ又はプライマー／プライマーセットを用いてもよく、例えば標的微生物ごとに２、３、４、５又はそれ以上のプローブ又はプライマーを用いてもよい。微生物のパネルは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０以上（例えば６０、７０、８０、９０又は１００以下の微生物）を含みうるため、通常少なくとも３０以上、例えば５０、７０、８０、１００、２００、３００、４００又は５００以上の同定プローブ又はプライマー（若しくはプライマーセット）のパネル又はセットが用いられる。当該技術において公知な手法によると、プローブ又はプライマーベースの核酸検査に数千、数万もの多重プローブ又はプライマーが用いられうる。本発明は、そのような手法も包含する。
【００８０】
第二に、該方法の工程（ｅ）（ｉｉ）において、ハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーの標的配列は、薬剤耐性マーカーであるヌクレオチド配列である。そのようなマーカーは当該技術において数多く同定され報告されており、それらを検出するためのハイブリダイゼーションプローブ／プライマーも考案されてきた。これらのうちいずれを用いてもよいし、そのような同定されたマーカー配列に基づいて更なるプローブ又はプライマーを設計してもよい。また追加のマーカー配列を、ルーチン的なスクリーニング方法によって同定してもよい。薬剤耐性マーカーは、耐性機構の成分（例えば酵素又は変性タンパク質）をコードするヌクレオチド配列であってもよいし、単に抗菌剤に対する耐性に関連すると同定されたヌクレオチド配列又は配列変異体であってもよい。
【００８１】
例を挙げると、β−ラクタマーゼは、細菌の抗生物質に対する重要な耐性機構であり、特定の抗生物質系統に対する耐性に関与している。細菌の発生により、基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ産生菌）が産生される。ＥＳＢＬは、急激に進行している耐性問題の最近の一例である。多種多様なβ−ラクタマーゼを同定可能なプローブが報告されている（Barisic et al, 2013, Diagnostic Microbiology & Infectious Disease, 77(2), 118-125）。他の公知の遺伝子耐性マーカーとしては、ｍｅｃＡ、ｍｅｃＣ、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ＣＴＸ−Ｍ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＮＤＭ、ＯＸＡ−４８が挙げられる。シプロフロキサシン耐性突然変異体が例えば抗生物質耐性の野兎病菌（F. tularensis）、炭疽菌（B. anthracis）、ペスト菌（Y. pestis）において同定されており、入手可能である。
【００８２】
ハイブリダイゼーションプローブは様々な形をとってもよく、それらの最もシンプルな形としては、標的配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列と、それらのプローブを直接的又は間接的に検出するための更なる配列又は部分（moiety）とを含む。従って、そのようなプローブは以下を含みうる：直接的又は間接的に検出可能な標識（例えば分光光度的（例えば蛍光）に検出可能な標識）；又は、信号付与反応又は信号生成反応に関与しうるレポーター分子又はレポーター部分（例えば酵素、酵素基質又は酵素補因子）；又は、ハイブリダイゼーション反応後にプローブを選択的に標識化又は選択的に隔離／分離するためのアフィニティタグでありうるレポーター分子又はレポーター部分。異なる形の標識化及び標識核酸プローブが周知であり、報告されている（例えば分子ビーコンや他のＦＲＥＴベースのプローブ）。しかしながら、ハイブリダイズされたプローブの存在をそのプローブ内又はプローブ上に含まれる標識又はレポーター部分によって直接的に検出するのではなく、例えばプローブの増幅産物を検出することによってプローブを間接的に検出してもよい。種々のハイブリダイゼーションプローブのフォーマットが公知であり、これらのうちいずれのプローブを用いてもよい。例えば、分子反転プローブ、スコーピオンプローブ、パドロックプローブ等が挙げられる。
【００８３】
例えば分子反転プローブ及びパドロックプローブは、標的配列へのハイブリダイゼーション後にライゲーションによって環状化するよう設計されており、その結果生じた環状化プローブを、ＲＣＡ等の増幅により検出してもよい。
【００８４】
パドロックプローブ（Padlock Probe）は、本発明のハイブリダイゼーションプローブとして好ましいタイプのプローブである。パドロックプローブは１９９４年に初めて報告され（Nilsson et al, 1994, Science, 265, 2085-2088）、その後進化して様々なヌクレオチド配列の検出において広く用いられ、実際には、広範囲の分子のアッセイにおけるレポーターとして更に広く用いられている（例えばEP0745140、EP0964704、EP0951565及びHardenbol et al. 2003. Nat. Biotechnol. 21, 673-678を参照)。パドロックプローブは、その５’末端及び３’末端に、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な配列を含む。一実施形態において、パドロックプローブの５’末端及び３’末端は、互いに直接的に隣接するよう前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である。別の実施形態において、パドロックプローブの５’末端及び３’末端は、互いに直接的に隣接せず、その介在ギャップをハイブリダイズされた３’末端のポリメラーゼ伸長又はギャップ充填オリゴヌクレオチドが充填するよう前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である。これらの末端は共にライゲートし、好都合には後にローリングサークル増幅（ＲＣＡ）ベースの方法により検出可能な核酸サークルを形成する。二重認識（２つの標的ハイブリダイズ領域）及びライゲーションに対する要求は、パドロックプローブが非常に特異的であり、複雑なゲノムバックグラウンドにおいてユニークな配列を検出するのに非常に適していることを意味する。一分子環状化アプローチ及び環状化プローブのＲＣＡベースの検出は、共に多重検出に非常に適しており、干渉の問題なく多数のプローブを組み合せて一緒に増幅することができる。
【００８５】
ＲＣＡは、環状化パドロックプローブの検出に好ましい方法であるが、本発明はこれに限定されず、例えばＰＣＲ等の別の増幅方法や、例えば線形核酸に対して環状を選択的に検出することに基づく別の検出方法を用いてもよい。
【００８６】
ＲＣＡに適した鎖置換ポリメラーゼ酵素、例えばΦ−２９ポリメラーゼ、が公知である。
【００８７】
環状化パドロックプローブをＲＣＡにより増幅することによって、パドロックプローブ配列の補体の数百もの繰り返しを含む鎖状（concatemeric）ＲＣＡ産物が形成される。本発明の一実施形態において、ＲＣＡ産物は、蛍光標識された検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって検出されてもよい。
【００８８】
ＲＣＡ反応は線形であり増幅力が遅いため、増幅を促進しＲＣＡ反応からの信号を増加しうる方法が数多くの開発されてきた。その方法としては、例えばLizardi（US 6,183,960及びUS 6,143,495）に記載された超分岐ＲＣＡ法等が挙げられる。これらのうちいずれを用いてもよい。ＲＣＡ産物をＰＣＲによって更に増幅することもできるが、実際には、他の核酸増幅方法や信号増幅方法を用いてもよい。
【００８９】
ＲＣＡ増幅を促進するのに特に有効な方法は、サークル−サークル増幅（Ｃ２ＣＡ）である。これはDahl et al, 2004, PNAS USA, 101, 4548-4553及びWO 03/012199に記載されている。Ｃ２ＣＡは、第１ＲＣＡ反応からの鎖状（concatemeric）ローリングサークル増幅産物（ＲＣＰ）をモノマーに切断し（例えば、各モノマーはコンカテマー（concatemer）のタンデムリピートに対応する、即ち、環状化パドロックプローブの相補的コピー）、次にこれらのモノマーをそれぞれ更なる環状へと再環状化（recircularsing）して更なるＲＣＡ反応（即ちＲＣＡの更なるラウンド）のテンプレートとして使用することに関与する。これを一回以上繰り返してもよい。ＲＣＡを繰り返して信号を増幅させる。
【００９０】
ＲＣＰの切断は、ＲＣＡ産物の各リピート（モノマー）に存在する配列（制限部位配列）にオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって２本鎖制限切断部位又は認識部位を形成し、制限酵素を用いて前記産物をモノマーに切断することにより達成してもよい。切断によってリリースされたモノマーを環状化するためのライゲーションテンプレートとして、同じオリゴヌクレオチド（例えば余分に添加されたオリゴヌクレオチド）を用いてもよい。切断後に、余分な未切断のオリゴヌクレオチド又は余分に添加されたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖モノマーをリリースする変性工程を含めてもよい。
【００９１】
Ｃ２ＣＡ反応の改良については、我々の同時係属出願である英国特許出願Ｎｏ．１３２１１２３．０（２０１３年１１月２９日出願）に記載されており、その内容は参照によって本明細書に援用される。この改良されたＣ２ＣＡ手順では、第２ラウンド以降のＲＣＡ効率を環状化モノマーのサイズを小さくすることによって向上させている、つまり、最初のＲＣＡテンプレート（ここでは環状化パドロックプローブ）と比較して第２ラウンドのＲＣＡの環状テンプレートを小さくすることによって第２ラウンド（及びそれ以降）のＲＣＡ反応速度を向上させる。リリースされたモノマーサイズを小さくするためのＲＣＰ切断や、効果的なモノマー縮小工程については、前記同時係属出願に様々な方法が記載されている。
【００９２】
第２ＲＣＡ反応を行うことによってＲＣＡ反応からの信号を増幅させる他の方法も報告されており、これらのうちいずれを用いてもよい。そのような方法の一つとしては、ＷＯ２０１４／０７６２０９に記載されたＯｌｉｎｋ  ＡＢ社のｓｕｐｅｒＲＣＡ（ｓＲＣＡ）方法が挙げられる。この手順において、第１ＲＣＡ反応に依存するが第１ＲＣＡ産物を増幅しない第２ＲＣＡ反応が実施される。第２ＲＣＡ産物からの信号を第１ＲＣＡ産物に局在化させるために、第２ＲＣＡ産物は第１ＲＣＡ産物に物理的に付着した状態である。第１ＲＣＡ産物に（直接的又は間接的に）ハイブリダイズして第２ＲＣＡテンプレートサークルを増幅させるＲＣＡプライマーを利用することによって、第２ＲＣＡ産物がＲＣＡプライマーの伸長により産生され（これは本質的にプライマーのハイブリダイゼーション）、ハイブリダイズされ、第１ＲＣＡ産物に付着する。第１ＲＣＡ産物は、第１ＲＣＡ反応用のテンプレートサークルのタンデムリピート相補的コピーを含むコンカテマーであるため、第２ＲＣＡ用のＲＣＡプライマーは、第１ＲＣＡ産物全体をリピートしたその同族（cognate）プライマー結合配列の繰り返しコピーに結合するであろう。つまり、第１ＲＣＡ産物は、第２ＲＣＡ用のＲＣＡプライマーの繰り返し結合部位を各タンデムリピート（コンカテマーの「モノマー」）に一つ含むであろう。そのようなプライマーはそれぞれ第２ＲＣＡ反応を引き起こし、線形を上回る大きな増幅をもたらす。
【００９３】
ＲＣＡ反応又はＣ２ＣＡ反応のＲＣＰは、上述のように、例えばＲＣＰのタンデムリピートにおける配列にハイブリダイズ可能な標識検出オリゴヌクレオチドを用いることによって、又は標識ヌクレオチドをＲＣＰに組み込むことによって直接的に検出されてもよいし、ＲＣＰからリリースされたモノマーを検出してもよい。
【００９４】
非常に長い核酸コンカテマー（典型的には、テンプレートサークル配列を５００〜１０００コピー含む）であるＲＣＰは、ランダムコイルアモルファスのＤＮＡ「ブロブ（ｂｌｏｂ）」に又はＤＮＡボールにコラプスする。これらは容易に検出され、実際には可視化される。従って、そのようなブロブを顕微鏡又は他の便利な手段によって画像化又は検出し、それら標的に対するパドロックプローブのハイブリダイゼーション（及び続くライゲーション及びＲＣＡ／Ｃ２ＣＡによる検出）を（間接的に）検出してもよい。ＲＣＰを検出するための別の手段としては、例えばフローサイトメトリーや、固相担体上のＲＣＰをとらえ前記ＲＣＰを標識検出オリゴヌクレオチドや別の標識手段（例えば組み込まれた標識オリゴヌクレオチド、核酸染料、核酸色素等）によって検出する手段、などが挙げられる。
【００９５】
ＲＣＰブロブの検出は、便利な増幅単分子検出（ＡＳＭＤ）手段を提供する。細菌や胞子を検出するためのそのようなＣ２ＣＡ及びＲＣＰブロブのカウンティングに基づく方法の使用は、Goransson et al.、2012 PLOS one、7(2)、e31068に記載されており、本発明に従ってそのような方法を用いてもよい。ＲＣＰブロブ内での標識濃度（又は濃縮）は、ブロブ内での標識濃度が周囲の溶液と比較して高いことを意味する。これにより洗浄が不要になり、均一法（homogenous methods）を用いることができる、つまり、例えばJarvius et al.、2006、Nature Methods、3、725-727に記載されているように、反応生成物はフローセルにおいて容易に検出できる。
【００９６】
或いは、そのようにＲＣＰコンカテマーを検出するのではなく、ＲＣＰをモノマーに切断してそれらモノマーを検出してもよい。モノマーの検出は、例えば上述のように又は当該技術において周知の原理に沿って、モノマーに直接的に組み込まれた標識によって又は検出オリゴヌクレオチドをモノマーにハイブリダイズすることによって行ってもよい。例えばモノマーをマイクロアレイ上に結合し、アレイ結合（ハイブリダイズ）したモノマーを、標識化された検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって検出してもよい。このように、ＲＣＰモノマーに結合（ハイブリダイズ）可能なオリゴヌクレオチドを（例えば堆積によって）キャリーするアレイを提供してもよい。アレイオリゴヌクレオチドは、ＲＣＰモノマーに相補的であるよう設計可能であり、アミン、チオール若しくはエポキシドグループを介して又は公知の結合化学作用によってアレイ基板に共有結合されてもよい、又はフォトリソグラフィ等の公知の技術を用いてアレイ上でｉｎ  ｓｉｔｕ合成されてもよい。このようなアレイを、当該技術において周知の方法に従ってスキャン又は画像化して解析することができる。従って、特定のＲＣＰモノマーがアレイにハイブリダイズしたか否かを検出することによって、特定のパドロックプローブがその標的にハイブリダイズし、それによりライゲートして増幅したか否かを検出することができる。
【００９７】
従って、本発明のいくつかの実施形態において、固相系方法が用いられうる。固相担体を、該方法の様々な段階又は工程において採用してもよい。例えば上述のＲＣＰモノマーのアレイ検出と同様に又はそれに代わり、該方法の早い段階で固相を用いてもよい。そのような一実施形態において、分子検査用のテストアリコートから分離されたＤＮＡにおける又はＤＮＡからの標的ＤＮＡを、固相担体に固定してもよい。従って、工程（ｅ）で行われる分子検査の標的ヌクレオチド配列を含みうるＤＮＡ断片又はＤＮＡ分子を、例えば分子検査の前又はそれと同時に、捕捉プローブを用いて工程（ｄ）の分離ＤＮＡから選択的に捕捉してもよい。標的ＤＮＡにハイブリダイズする（核酸同定のためのハイブリダイゼーション部位及び耐性検出プローブ又はプライマーとは異なる部位にハイブリダイズする）捕捉プローブを用いてもよい。捕捉プローブは、例えば同定及び耐性検出プローブ又はプライマーよりも前に又はそれらと同時に、分離又は濃縮ＤＮＡに添加されてもよい。捕捉プローブは固定されてもよいし、標的ＤＮＡへの結合後に固定されるよう固定手段を備えてもよい。そのような固定手段は、例えば固相担体上に提供されたその同族結合パートナーに結合可能なアフィニティ分子を含みうる。代表的な例を挙げると、捕捉プローブは、固相担体に連結されているストレプトアビジン又はアビジン（又はその変異体）への結合のために、ビオチン化されてもよい。当該技術において公知で便利な固相担体を用いればよい。固相担体としては、例えば、マイクロアレイ、ブロッティング膜、ゲル、顕微鏡スライド、ウェル、チューブ又は他のコンテナ又は容器、或いは、ビーズ又は粒子（例えばガラス、ポリマー、プラスチック又は磁気のビーズ又は粒子）が挙げられる。或いは、標的ＤＮＡ分子は、固相担体に直接固定されてもよい。従って、本発明の好ましい一実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドを介してストレプトアビジンにコンジュゲートされた固相担体上に固定されてもよい。本発明の別の実施形態において、標的ＤＮＡ分子はビオチン化され、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた固相担体上に固定されてもよい。
【００９８】
工程（ｅ）の分子検査の実施中、臨床サンプルを含む培養容器は、培養状態が維持される（前培養工程を行った場合）又は培養工程（工程（ｃ））に供される。上述のように、培養は、ただ微生物増殖に適した条件下又は寄与する条件下で培養容器をインキュベートすることに関与するのみである。従って、この工程を上記前培養と同様に行ってもよい。この工程は、工程（ｅ）の分子検査から陽性の微生物同定が得られない場合、従来の表現型検査及び／又は生化学的検査に基づく伝統的な培養ベースの同定プロトコル用に又は別の方法による更なるＩＤ検査用に、サンプルを利用できることを意味する。即ち、培養が進行中であるためにこれらの検査に遅れが生じず、更なる臨床サンプルを採取したり更なる培養を開始したりする必要がない。実際には、工程（ｅ）において微生物が同定されない場合、そのまま培養を続けてもよいし、培養容器を別の培養システム（例えば微生物同定、及び任意で薬剤感受性検査用に設計された自動培養システム又はキャビネット）に移してもよい。適切な培養期間後、そのような更なるＩＤ検査及び感受性検査を実施してもよく、後者は、例えば従来のＡＳＴ検査手段（例えば濁度測定法で評価されたブロス希釈培養法又はＭＩＣを判定するためのディスク拡散検査）によって行なわれてもよい。
【００９９】
微生物がテストアリコートにおいて同定された場合、工程（ｃ）で培養状態が維持されていた培養臨床サンプルに対して薬剤感受性検査を行う。好都合には、培養容器から更なるアリコート（例えば第２アリコート又はそれ以降のアリコート；分子検査のために何回アリコートを取り出したかによる）を抜き取って又は取り出して、これに対してＡＳＴ検査を行うことに関与しうる。
【０１００】
該方法は、この段階で、アリコート又は培養臨床サンプルの微生物を濃縮するための工程を更に含んでもよい。この工程に適した手順は上述されており、非微生物細胞（即ち被検体細胞）をアリコート／培養サンプルから取り除く又は分離することを含んでもよい。一実施形態において、微生物細胞は例えば濾過によって分離できる。
【０１０１】
認知され規定されたＡＳＴ検査の条件がある。それらの条件に従って、他の研究所で実施された検査と比較できる又は比較しうる容易に比較可能な結果（readily comparable result）を得てもよい。これは例えば規定された培地及び培養条件を使用することに関与しうる。従って、薬剤感受性検査の開始前に、ＡＳＴ検査用に更に取り出したアリコート（又はアリコート画分／残余等）、或いはそこから分離又は濃縮された微生物を、微生物培養に適した培地（例えばＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（ＭＨ培地））に移してもよい。微生物を様々な抗菌剤の存在下で生育し、特定の抗菌剤に対する感受性を判定してもよい。本発明によると、微生物の同一性及び微生物において同定された遺伝的薬剤耐性マーカーの性質に基づいて、抗菌剤を選択してもよい。現在容認又は認知されている薬剤治療の選択に対する微生物感受性を評価するために、現在の臨床プラクティス、例えば実際に現在どの抗菌剤が同定された微生物の治療に用いられているか、に従って、抗菌剤とその使用量を選択してもよい。従って、同定された微生物に対して効果的であることが公知の抗菌剤、又はその微生物の治療に実際に現在用いられている抗菌剤に基づいて抗菌剤を選択することができ、また耐性マーカーの存在に基づいて耐性が予想される抗菌剤を除外してもよい、或いは、耐性マーカーの存在にもかかわらずそのような抗菌剤を含め、その抗菌剤が効果を発揮する量又は濃度を判定できるようその使用量を選択してもよい。抗菌剤を最終的な濃度又は量の範囲まで培養基に添加する。本発明の好ましい実施形態において、抗菌剤を段階希釈してもよい。
【０１０２】
ＡＳＴ検査におけるサンプル／微生物の増殖又は培養工程を、公知の又は便利な方法を用いて行ってもよい。固相培養又は液相培養を用いてもよい。
【０１０３】
従って、例えば好ましい一実施形態において、抗菌剤を含むプレート上又は別の固相培地内でサンプル／微生物を培養してもよく、微生物を可視化（例えば画像化）（即ちプレート等を画像化）することによって微生物増殖を判定してもよい。従って、培養は、増殖を観察する又は評価するための手段として、直接的に可視化又は画像化される。従って、好ましい一実施形態において、培養物を直接的に解析して増殖を観察／評価する。例えば、培養物をプレートのウェル内で増殖させ、そのウェルを画像化してもよい。
【０１０４】
或いは、サンプル（又はアリコート）を周期的又は異なるタイムポイントで培養物から取り出して（採取して）、その取り出したサンプル（アリコート）の微生物増殖を解析してもよい。これを分子検査（例えば核酸ベースの検査）等、どのような方法で行ってもよい。従って、微生物細胞又は微生物細胞からリリース又は分離された成分に結合する検出プローブ及び／又はプライマーを用いてもよい。これは例えば上記した工程（ｅ）の同定検査用核酸プローブ又はプライマーを含んでもよい。他の実施形態において、以下に詳細に述べられるように、微生物細胞は例えば染色によって直接的に検出されてもよい。
【０１０５】
各抗菌剤は、微生物が増殖可能な抗菌剤無しの陽性コントロールに加え、１以上の濃度で用いられることが好ましい。例えば１つの抗菌剤が、２、３、４、５、６、７又は８以上の濃度で用いられる。希釈系列において用いられる濃度差は、各濃度間で倍数であってもよい。
【０１０６】
用語「抗菌薬（antimicrobial）」は、微生物を死滅させる又はそれらの増殖を抑制するあらゆる薬剤を含む。本発明の抗菌剤は、特に抗生物質及び抗真菌薬を含みうる。抗菌剤は、殺菌性であっても静菌性（microbiostatic）であってもよい。様々な系統の抗生物質（例えば真菌や特に真菌グループに対して活性を有する抗生物質）が公知であり、これらのうち一部又は全てを用いてもよい。抗生物質としては、例えばベータラクタム抗生物質、セファロスポリン、ポリミキシン、リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン、スルホンアミド、マクロライド、リンコサミド、テトラサイクリン、アミノグリコシド、環状リポペプチド、グリシルサイクリン、オキサゾリジノン、リピアルマイシン又はカルバペナムが挙げられる。本発明の好ましい抗真菌薬としては、ポリエン、イミダゾール、トリアゾール及びチアゾール、アリルアミン又はエキノキャンディンが挙げられる。
【０１０７】
従って、工程（ｃ）から取り出したアリコート（又はアリコート画分等）又は培養臨床サンプル、或いはそこから分離又は濃縮された微生物を培養し、ある範囲のタイムポイントにわたってＡＳＴ培養物を解析することにより薬剤感受性を判定してもよい。上記の培養工程に関して、ＡＳＴのための培養は、微生物増殖を促進する温度で行えばよく、例えば約２０℃〜４０℃又は２０℃〜３７℃、好ましくは約２５℃〜３７℃、より好ましくは約３０℃〜３７℃又は３０℃〜３５℃で行えばよい。一実施形態において、ＡＳＴ培養物を３５℃で培養してもよい。微生物増殖を観察するために、ＡＳＴ培養物を複数のタイムポイントで解析してもよい。例えば培養物を、培養開始後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４時間のタイムポイントで解析してもよい。培養物を、培養開始直後つまりｔ＝０にて解析してもよい。培養物を、培養開始後から２４時間を超えた期間で解析してもよい。典型的には、培養物を、培養開始後０、１、２、３、４、６及び２４時間で解析してもよい。しかしながら、下記の実施例で得られ報告された結果から、微生物増殖の違いの検出には、短いインキュベーション時間（例えば４時間）で十分であることが分かった。従って、８、７、６、５、４、３又は２時間以内の短い総インキュベーション時間を用いてもよく、例えば１時間毎又は２時間毎又は９０分毎に解析を行えばよい。上述のように、培養物は一般的に２以上のタイムポイント、例えば培養開始後４、５又は６時間以内の２以上のタイムポイントで解析される。
【０１０８】
本発明は、薬剤感受性検査中に、微生物増殖を観察する必要がある。数多くの微生物増殖観察方法が公知であり、ＡＳＴ検査に用いられている。その観察方法としては、例えば濁度測定、比色定量、光検出、光散乱、ｐＨ測定、分光計測及び蛍光検出が挙げられる。これらのうちいずれを用いてもよい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態によると、画像化方法を用いてサンプル中の微生物細胞の数及び／又は量及び／又は大きさ及び／又はエリアを判定又は評価することにより、増殖を検出及び評価してもよい。上述のように、微生物細胞は、コロニー及び／又は凝集体内の細胞を含みうる。これを抗菌剤の存在下、公知の微生物測定方法又は検出方法を用いて、増殖前及び／又は増殖後のサンプル中に存在する微生物の数又は量を評価又は判定することにより達成してもよい。そのような判定は、微生物細胞、凝集体及び／又はコロニーの数及び／又は大きさの判定に関与しうる。この技術も公知であり、利用可能である。従って、サンプル中の微生物及び／又は微生物細胞及び／又はコロニー及び／又は凝集体の数及び／又は量及び／又は大きさを経過観察することによって、増殖を測定してもよい。この測定は、直接的であっても間接的であってもよい。サンプル中の微生物の数又は量を、血球計算法、フローサイトメトリー又は自動顕微鏡法によって直接的に測定してもよい。微生物は検出前に固定及び／又は透過処理（permeabilised）されてもよい。或いは、微生物はｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で検出されてもよい。フローサイトメトリーを用いた細菌細胞カウント観察によるＡＳＴ検査方法は、Broeren et al.,2013, Clin. Microbiol. Infect. 19. 286-291に記載されている。多チャンネル流体カセットにおいて細菌を増殖させ、自動顕微鏡法によって数えるＡＳＴ検査の実施方法は、Price et al. 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50-58、Metzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160-165及びAccelerate Diagnostics（例えば、WO 2014/040088 A1, US 2014/0278136 A1及びUS 8,460,887 B2を参照）に記載されている。これらの方法では、細菌を表面に固定して増殖させ、個別の細菌及び／又はコロニーの表面を２以上のタイムポイントで画像化することによって、その生存能力及び／又は増殖（コロニー増殖の測定も含む）を評価している。そのような方法を本発明に従って用いてもよい。他の公知の方法がFredborg et al, J Clin Microbiol. 2013 Jul;51(7):2047-53及びUnisensor(US 8780181)に記載されている。その方法では、明視野顕微鏡法を用いて溶液の一連の積層画像（対物面）を撮影することによって溶液中で細胞を画像化し、サンプル中に存在する細菌をカウントしている。
【０１０９】
微生物増殖をモニターするために画像化を使用することに基づいたどのような方法を用いてもよいが、本発明の方法は、個々の細胞をカウントすることや、個々の細胞又はコロニーの増殖をモニターすること（例えばAccelerate Diagnostics社の方法によって個々の細胞又はコロニーの大きさの変化をモニターすること）に依存しないことが好ましい。従って、本発明は、ＡＳＴ培養物又はＡＳＴ培養サンプルを画像化するための固定位置（fixed position）を使用することに限定されない（そして好ましい実施形態では、関与しない）。寧ろ本発明によると、ＡＳＴ培養物又は培養サンプルにおける細胞の総増殖（bulk growth）を、例えば視野内の大部分の細胞を画像化することによって観察することが好ましい。視野内の微生物細胞物質の量（バイオマス）（例えばエリア）を画像化によって判定してもよい。例えば明視野顕微鏡法を用いて、細胞／微生物バイオマスを直接的（例えば顕微鏡又はカメラ等）に検出してもよい、或いは、例えば規定又は所要の増殖期間後にＡＳＴ培養物又は培養サンプルに染料を添加することによって、微生物細胞を染色して検出してもよい。
【０１１０】
更なる特定の一実施形態において、微生物細胞を固定することなく（例えば画像化のために細胞を検出位置又は表面に局在化させる力を加えることなく（電気泳動など））ＡＳＴ培養物又は培養サンプルを直接的に画像化又は可視化してもよい。
【０１１１】
そのような画像化方法において、当該技術において周知の方法及び原理に従って、アルゴリズムを用いて画像から微生物増殖量の値を決定してもよい。このように、画像内の微生物細胞物質／バイオマスの数、大きさ、及び／又はエリア（例えば画像内／視野内の全ての微生物細胞物質の量、例えば画像化された全細胞物質）に基づいて、統計的方法を微生物細胞の画像に用いてもよい。アルゴリズムは、微生物の同一性と培養物中に存在する抗菌剤に基づいて、異なる増殖パターン及び／又は形態構造を考慮するよう書き込まれてもよい。
【０１１２】
そのようなカウント方法又は画像化方法によって、ＡＳＴ検査において微生物をデジタル表現型解析することができる。そのようなデジタル表現型判定が参照技術（例えばマイクロブロス希釈法（microbroth dillution））と類似したＭＩＣ値をもたらすことを示したデータが得られている。
【０１１３】
このような方法を用いる特別な利点は、広範囲の濃度又は量の微生物を含むサンプルに対して薬剤感受性検査が行える点と、薬剤感受性検査前に標準微生物タイターを使用する必要がない点である。本発明の便利な特徴は、異なる濃度の微生物を使用できる点である。１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上を含むサンプルをサンプル方法に使用してもよく、例えば１０4、１０5、１０6、１０7、１０8又は１０9ＣＦＵ／ｍｌ以上を含むサンプルを使用してもよい。或いは１０3ＣＦＵ／ｍｌ未満、例えば１０2ＣＦＵ／ｍｌ以上を含むサンプルを使用してもよい。１０2ＣＦＵ／ｍｌ未満を含むサンプルもまた、本発明の方法において用いてもよい。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、微生物は、サンプル中の微生物数／量を判定する前に、微生物染色マーカー（即ち染料又は色素）の添加によって検出されてもよいし、微生物の固有の特性を利用した方法（例えば位相コントラスト、又はサンプル中の細菌数を定量化するための当該技術において公知の他の方法等）によって検出されてもよい。適切な染料としては、微生物を可視化する手段として、着色色素又は蛍光色素（例えばグラム染色、ペプチドグリカン染色又はＤＮＡ染色のための染色）が挙げられる。本発明の特定の一実施形態において、微生物内のＤＮＡは、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）を用いて染色されうる。その他ＤＮＡ染料も周知であり利用可能である。実際に、当該技術で利用可能な細菌染色用の染料の数は膨大であり、数多くのそのような染料が記述され（標準的参照テキスト等）市販されている（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。染色による微生物の直接標識は、実施が容易であり、便利で費用効果が高く、好ましい実施形態である。
【０１１５】
従って、例えば微生物をＡＳＴ検査のためにマイクロタイタープレートのウェル内で増殖し、増殖期間の最後に色素又は染料を加えてプレートのウェルを画像化し、微生物細胞、凝集体又はコロニーの数及び／又は大きさを、例えば、カウント又は画像化等することで判定し、それによって微生物の数又は量を評価してもよい。或いは、フローサイトメータ又は類似機器（例えばＵＳ特許出願Ｎｏ．６１／９７９３１９に記載されたＱ−ｌｉｎｅａ  ＡＢ社（スウェーデン）のＡｑｕｉｌａ４００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて微生物を数え上げてもよい。
【０１１６】
別の実施形態において、微生物は、その内部又は表面上の生物学的特徴を介して特異的に標識化されてもよい。「生物学的特徴」は、例えば微生物内又は微生物上の分子、例えば細胞表面に発現又は位置するタンパク質又は他の生体分子、であってもよい。例えば標識（着色標識、蛍光標識等）は、特定の生物学的特徴に特異的に結合するタンパク質又は他のアフィニティ結合分子と結合してもよい。一実施形態において、前記タンパク質は、レクチン、アフィボディ（affibody）若しくは抗体、又は抗体断片であってもよい。このように標識化された微生物を検出してもよい（例えば上述のように数え上げてもよい）。
【０１１７】
更なる一実施形態において、近接プローブを用いて微生物内又は微生物上の特定の生物学的特徴を検出してもよい。
【０１１８】
本発明の更なる別の実施形態において、上述（分子検査における使用）のパドロックプローブ及びＲＣＡ系増幅単分子検出（ＡＳＭＤ）法を用いて、微生物を検出して数え上げてもよい。このような方法により、単一の微生物細胞を検出してカウントすることができる。このように、微生物をパドロックプローブの結合により検出し、サンプル中の微生物の数を環状化パドロックプローブのＲＣＡを介して生成された増幅信号により間接的に測定してもよい。各ＲＣＡ産物（ブロブ）は、単一の微生物を示しうる。微生物を溶解し、その微生物の一つ以上のヌクレオチド配列にハイブリダイズするよう設計されたパドロックプローブを使用してもよい。これは上述のようにＤＮＡを分離する工程を含み、好ましくは上述のように微生物ＤＮＡを選択的に分離又は濃縮する工程を含みうる。ＡＳＴ検査において、培養は通常初期の臨床サンプル培養工程と比較して単純なため、よりシンプルな微生物ＤＮＡの分離又は濃縮のためのプロトコル（例えば微生物と微生物細胞溶解物とを分離する濾過、又は単純な直接的微生物細胞溶解に関与するプロトコル）を用いてもよい。
【０１１９】
或いは、微生物上又は溶解された微生物内に存在する一つ以上の分子と結合するアフィニティ結合分子を使用してもよい。そのようなアフィニティプローブは、パドロックプローブがハイブリダイズしうる核酸標識又はタグを備える、つまり、免疫ＲＣＡ検出手法と類似している。同様に、微生物内又は微生物上の標的に結合する近接プローブを用いてもよく、その近接プローブの核酸ドメインを、パドロックプローブのライゲーションテンプレートとして用いてもよく、また任意でＲＣＡにより増幅を引き起こすのに用いてもよい。この手順は広く知られており、文献に記載されている。上述のように、Ｃ２ＣＡを信号の増幅に用いてもよい。よって、サンプル中の微生物の数は、サンプル内の標識化された（例えば上述の蛍光標識された）「プロブ」数をカウントすることによって推定できる。従って、これはデジタル表現型感受性を読み出すための別の便利な手段である。
【０１２０】
一般的に、ＡＳＴ検査の実施において、検査対象の微生物培養物が純粋培養物であること、即ち単一の微生物のみが存在すること、が有利である。従って、好ましい実施形態において、工程（ｅ）の核酸検査で単一の微生物が同定された場合、工程（ｆ）においてＡＳＴ検査が実施される。即ち、臨床サンプルが単一の微生物のみを含むと判定された場合、工程（ｆ）のＡＳＴ検査が実施される。これにより、純粋培養物のみがＡＳＴ検査に用いられる。従って、いくつかの実施形態において、２以上の微生物が同定された場合、工程（ｆ）のＡＳＴ工程は実施されず、該方法は工程（ｇ）に進む。しかしながら、これは必須の特徴ではなく、ＡＳＴ検査を実施するために可視化又は画像化に基づく微生物検出方法を用いることもできる。例えば、溶液中の細菌ではなく表面上の細菌の画像化を用いたAccelerate Diagnostics社が提供する方法、又は標識化された微生物を流体システム（例えば上述のPrice et al. 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50-58及びMetzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160-165の自動顕微鏡流体カセット系システム）において検出する方法を用いることができる。一以上の微生物を含むサンプルのＡＳＴ検査に、どのような細胞単位の検出方法・同定方法を用いてもよい。
【０１２１】
好都合なことに、本発明の方法は自動化されうる。一以上の工程、好ましくは工程（ａ）〜（ｆ）の一部又は全てを自動化してもよい。上述の様々な特定の工程又は好ましい工程（例えば分子検査及び／又はＡＳＴ検査のための好ましいパドロックプローブベースのＡＳＭＤ法や微生物／コロニーカウンティング法）は自動化に非常に適している。自動培養方法は既に開発されており（例えば微生物同定及び／又はＡＳＴ検査のための血液培養方法）、本発明に使用可能又は適合可能である。自動化は、スピード、操作の容易性、及び多重化能（multiplexing ability）などの利点をもたらすであろう。これらは臨床検査のセッティング、特に敗血症の診断において重要である。
【０１２２】
更なる一態様から、本発明は以下の微生物検出装置を提供する。
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された第１培養容器と、
任意で、培地を含む第２培養容器と、
任意で、前記第１培養容器の中身の一部分を取り出し、前記一部分を前記第２培養容器に移すポーションリムーバル装置と、を備え、
前記第１培養容器は、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記第２培養容器は、臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物を前記第１培養容器の中身の一部分として収容するよう構成され、且つ、前記一部分を培養するよう構成され、
前記微生物検出装置は、
テストアリコートとして前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の中身の一部分を取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するＤＮＡ検査装置と、を更に備え、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養により前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器に生成された前記培養臨床サンプル及び／又は培養された一部分を薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分に対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分を更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【０１２３】
更なる一態様から、本発明は以下の微生物検出装置を提供する。
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された培養容器と、
前記培養容器の中身の一部分をテストアリコートとして取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するＤＮＡ検査装置と、を備え、前記培養容器は、前記テストアリコートの抽出後及び任意で前記テストアリコートの抽出前に、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養することにより前記培養容器に生成された前記培養臨床サンプルを薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養臨床サンプルに対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記培養容器中の前記臨床サンプルを更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【０１２４】
更なる一態様から、本発明は以下の微生物検出装置を提供する。
臨床サンプル中の微生物を検出し特徴付けるための微生物検出装置であって、
培地を含み、前記臨床サンプルを保持するよう構成された第１培養容器と、
培地を含む第２培養容器と、
前記第１培養容器の中身の一部分を取り出し、前記一部分を前記第２培養容器に移すポーションリムーバル装置（portion removal device）と、を備え、
前記第１培養容器は、前記臨床サンプルを培養するための容器であり、
前記第２培養容器は、臨床サンプル／培地の混合物又は臨床サンプルの培養物を前記第１培養容器の中身の一部分として収容するよう構成され、且つ、前記一部分を培養するよう構成され、
前記微生物検出装置は、
テストアリコートとして前記第２培養容器の中身の一部分を取り出すテストアリコート抽出装置と、
前記テストアリコートからＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡに対して核酸検査を行うことによって前記微生物を同定し前記微生物における一つ以上の遺伝的薬剤耐性マーカーの有無を検出するＤＮＡ検査装置と、を更に備え、
前記ＤＮＡ検査装置は、
ｉ．一つ以上の微生物同定用核酸プローブ又はプライマーであって、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、特定の微生物の同定に関与するヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
ｉｉ．一つ以上の薬剤耐性マーカー検出用核酸プローブ又はプライマーであって、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブ若しくはプライマー、又は、遺伝的薬剤耐性マーカーを示すヌクレオチド配列を選択的に増幅可能なプライマーと、
を用いて前記核酸検査を行うよう構成され、
前記プローブ又はプライマーが前記ＤＮＡにハイブリダイズしたか否か、及び／又は、前記プライマーが増幅反応に関与したか否かを検出し、
前記微生物検出装置は、前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定された場合、前記テストアリコートの抽出後に培養することにより前記第２培養容器に生成された前記培養された一部分を薬剤感受性検査装置に渡し、前記薬剤感受性検査装置は、前記培養された一部分に対し、増殖又は増殖マーカーを評価することによって微生物増殖を観察する薬剤感受性検査を行い、
前記薬剤感受性検査で用いられる抗菌剤の種類と濃度は、前記ＤＮＡ検査装置により検出された前記微生物及び薬剤耐性マーカーの同一性によって判定され、
前記特定の微生物が前記ＤＮＡ検査装置により同定されなかった場合、前記微生物検出装置は、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器中の前記臨床サンプル及び／又は前記培養された一部分を更に培養して追加的な培養後に更なる微生物同定と薬剤感受性検査を行うことを可能にし、それにより前記微生物を同定し、その薬剤耐性プロファイルを判定するよう構成されている微生物検出装置。
【０１２５】
上記３つの態様それぞれにおいて、前記微生物検出装置は、先に説明された方法工程及び好ましい／任意の工程の一部又は全てを実施するよう構成されてもよい。従って、前記ＤＮＡ検査装置は、上記ＤＮＡ検査工程の一部又は全てを実施するよう構成されてもよく、前記薬剤感受性検査装置は、上記薬剤感受性検査工程の一部又は全てを実施するよう構成されてもよい。
【０１２６】
前記装置は、サンプル中に存在する微生物細胞物質の量（微生物バイオマス）を、特に直接的な評価又は判定によって判定するための手段を含んでもよい。これは微生物バイオマスの量を視覚的に特に画像化することにより判定することによって達成されてもよい。従って、前記機器は２Ｄ画像を得るための画像化手段（例えば顕微鏡及び任意でカメラ）を備えてもよい。前記機器は、それらの画像を処理して微生物細胞物質の量を判定するためのプロセッサーを備えてもよい。前記プロセッサーは、微生物バイオマスのエリア（特に検査中の視野（例えば画像）における微生物バイオマスのエリア）を判定するよう構成されてもよい。
【０１２７】
より一般的には、前記画像化手段及びプロセッサーは、微生物及び／又は微生物コロニー若しくは凝集体の量及び／又は数及び／又は大きさを判定するよう構成されてもよい。これは細胞又はコロニーをカウントすることを含みうるが、そのような方法に限定されず、微生物細胞、コロニー又は凝集体の大きさ、エリア、形、形態及び／又は数を評価（又は判定）することによって微生物の増殖量を視覚的に評価するものであればよい（用語「凝集体」は、物理的に近接した細胞の集まり（例えばクランプやクラスター）を含む;これはクローン性コロニーと同様に、凝集した又はくっついた細胞の非クローン性クランプ／クラスター（例えば凝集した隣接細胞）を含みうる）。微生物増殖の測定に用いられるパラメータは、必ずしもそうではないが、（工程（ｅ）において判定される）微生物の同一性及び工程（ｆ）で使用された抗菌剤に応じて変えてもよい。実際には、細胞の形態や増殖パターンは、その生体や使用された抗菌剤によって影響を受け、例えば抗菌剤不在の「通常」又は「典型的」な形態や増殖パターンから変化又は変質するだろう。ＡＳＴ増殖観察方法の中にはそのような変化の検出に依存するものもあるが、本発明はそのような変化を考慮する必要はなく、微生物増殖の量（例えばエリア）やバイオマスを形態及び／又は増殖パターンに関係なく判定してもよい。このように、微生物細胞及び／又は使用された抗菌剤に関係なく、同じ増殖観察方法を用いてもよい。
【０１２８】
培地は、装置運転前に第１培養容器及び／又は第２培養容器に添加されてもよいし、第１培養容器及び／又は第２培養容器は、その供給時に培地で満たされてもよい。典型的には、第１培養容器及び／又は第２培養容器は消耗品であろう。臨床サンプルを、微生物検出装置内の第１培養容器に添加してもよいし、微生物検出装置に挿入される前の装置外の容器に添加してもよい。第１培養容器は、臨床サンプルを収容するよう構成されてもよい。この収容は、培地を培養容器に導入する前、後、又はそれと同時に行ってもよい。
【０１２９】
第１培養容器及び／又は第２培養容器は、対象の臨床サンプルを取り扱うのに適した種類の容器であればよい。一実施例において、臨床サンプルは血液サンプルである。血液サンプルに関して、患者からの血液を微生物検出装置外の培養容器に引き抜いた後、前記サンプルと培地とを含む第１培養容器を微生物検出装置に挿入すればよい。
【０１３０】
第１培養容器及び／又は第２培養容器中の臨床サンプル又は一部分の更なる培養を、初期検査工程と同じ機器内で実施してもよいし、第１培養容器及び／又は第２培養容器を別の機器に渡してもよい（よって微生物検出装置は複数のセパレート部分を含む）。後者の場合、第１培養容器及び／又は第２培養容器は、抽出の間、更なる培養工程中に他の専用機器において培養可能なよう取り扱われてもよい。前記他の専用機器は、有利には、問題となっている施設（例えば病院）に既に配置されている機器であってもよい。従って、第１培養容器及び／又は第２培養容器は連続培養に利用でき、前工程と同じ機器内に置かれても、その機器の外であって前記装置の別のセパレート部分に置かれてもよい。
【０１３１】
本発明を、次の図面を参照しながら以下の実施例においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１Ａは、サンプル中の微生物を検出するためのサンプルマイクロアレイパネルを示し、図１Ｂは、様々な微生物に関して生成された信号の蛍光強度を示す。図１Ａにおいて、画像の四隅と左側中央にあるスポットは、画像の位置合わせに用いられる参照スポットである。３つの明るいスポットは、大腸菌に対して特異的なヌクレオチド配列が、本発明の検出方法を用いてサンプルから検出されたことを示す。図１Ｂは、大腸菌に対して特異的なプローブが用いられた場合に、様々な異なる微生物に関して生成された信号を示す。本発明の方法が、サンプル中の特定の微生物（この場合は大腸菌）の存在を検出できることを示している。
【図２】図２は、シプロフロキサシンが様々な異なる濃度で補充されたＭＨブロスにおいて増殖させた細菌の、シプロフロキサシン無しで増殖させた陽性コントロールサンプルに対する相対的な増殖を示す。細胞をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ  ｓｔａｉｎで染色し、自動顕微鏡法によってカウントした。
【図３−１】図３（図３−１及び３-２）は、いくつかの異なる抗生物質（Ａ-セフォタキシム、Ｂ-シプロフロキサシン、Ｃ-ゲンタマイシン、Ｄ-メロペネム、Ｅ-セフタジジム、Ｆ-ピペラシリン＋タゾバクタム）がそれぞれ様々な異なる濃度で補充されたＭＨブロスにおいて増殖させた細菌の、抗生物質無しで増殖させた陽性コントロールサンプルに対する相対的な増殖を示す。細胞をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ  ｓｔａｉｎで染色し、Ａｑｕｉｌａ４００によってカウントした。これらのデータは、４時間以内で異なる増殖を検出できることを示している。各抗生物質のＭＩＣ値を、４ｈ、６ｈ、２４ｈにて様々なカットオフ値で計算した。
【図３−２】図３（図３−１及び３-２）は、いくつかの異なる抗生物質（Ａ-セフォタキシム、Ｂ-シプロフロキサシン、Ｃ-ゲンタマイシン、Ｄ-メロペネム、Ｅ-セフタジジム、Ｆ-ピペラシリン＋タゾバクタム）がそれぞれ様々な異なる濃度で補充されたＭＨブロスにおいて増殖させた細菌の、抗生物質無しで増殖させた陽性コントロールサンプルに対する相対的な増殖を示す。
【図４】図４Ａは、微生物の抗生物質感受性を判定するために、サンプル内の細菌の増幅単分子検出（ＡＳＭＤ）に必要なワークフローを示し、図４Ｂは、シプロフロキサシン又はセフォタキシムが補充されたＭＨブロスにおいて増殖させた細菌の、抗生物質無しで増殖させた陽性コントロールサンプルに対する異なる増殖を示す。図４Ｂにおいて、特定の微生物ＤＮＡ配列の存在を示すＲＣＡ産物をＡＳＭＤによって検出し、Ａｑｕｉｌａ４００によってカウントした。
【図５】図５は、プローブ設計において用いられる、特定の微生物ＤＮＡ配列を検出するためのスキームを示す。微生物ＤＮＡの領域に相補的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ断片に結合し、その標的ＤＮＡ断片を固相上に固定する。パドロックプローブは、標的と相補的な２つの部分（５’／３’−アーム）と、検出（ＤＯ−ｇｅｎｅｒｉｃ）用、制限分解用及びプライミング（ＲＯ−ｇｅｎｅｒｉｃ）用のサイトを含むバックボーンと、アレイオリゴハイブリダイゼーション（ＡＯ−ｕｎｉｑｕｅ）とを含み、その相補的な５’末端配列及び３’末端配列を介して標的に結合し、ＲＣＡ増幅やＣ２ＣＡ反応前に環状にライゲートする。
【図６】図６は、１０臨床サンプル＋１スパイクサンプルからのデータを示す。
【図７】図７は、陽性化までの時間（time-to-positivity（ＴＴＰ））を示す
【０１３３】
実施例
実施例１-血液培養及び分子検査による微生物同定と微生物特徴付け
５００μｌの大腸菌懸濁液をスパイク（spike）して濃度を１０3ＣＦＵ／ｍｌにした血液を、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＦＡ  ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社）血液培養フラスコに加えた。フラスコのセプタムには針が通っている。前培養には、血液培養フラスコ（ＢＣＦ）の攪拌機に再設計されたＧｒａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｇｒａｎｔ−ｂｉｏ  ＰＴＲ−３５）の独自設計多機能ローテータを使用した。サンプルを３５℃で４ｈインキュベートした。
【０１３４】
シリンジを用いて５ｍｌのサンプル（全血液の１ｍｌと同等）を吸引した。遠心分離が不要なＭｏｌｚｙｍ社（ドイツ）の方法を用いて、細菌ＤＮＡを濃縮した。
【０１３５】
８００μｌのＥＳを１６０μｌのＭｏｌＤＮａｓｅに加え、溶解バッファーを調製する。ピペッテイングにより６回混合し、全てのＭｏｌＤＮａｓｅ溶液を１２８００μｌの溶解バッファーに加え、ピペッテイングにより６回混合する。
【０１３６】
プロテイナーゼＫの調製  １０００μｌのＥＳを４００μｌのプロテイナーゼＫに加え、ピペッテイングにより６回混合する。
【０１３７】
溶解
血液培養フラスコから抜き取った５ｍｌのサンプルを４３００μｌの溶解ＭｏｌＤＮａｓｅバッファーに加え、ピペッテイングにより８回混合する。４５℃で１０分間インキュベートする。
ＭｏｌＤＮａｓｅを不活性化し、３５０μｌのプロテイナーゼＫを溶解物に加え、ピペッテイングにより８回混合する。４５℃で１０分間インキュベートする。
【０１３８】
カラムへのサンプル捕捉及び洗浄、３ループ
６０５μｌの溶解物をフィルターカラム（Ｍｏｌｚｙｍ社製、ドイツ）に加え、１５秒間減圧する。５００μｌのＲＳをフィルターカラムに加え、１５秒間減圧する。６０５μｌの溶解物をフィルターカラム（Ｍｏｌｚｙｍ社製、ドイツ）に加え、３０秒間減圧する。５００μｌのＲＳをフィルターカラムに加え、１５秒間減圧する。６０５μｌの溶解物をフィルターカラム（Ｍｏｌｚｙｍ社製、ドイツ）に加え、４５秒間減圧する。５００μｌのＲＳをフィルターカラムに加え、１５秒間減圧する。全てのサンプルを加え終えるまで、サンプル追加後に４５秒間減圧を続ける。濾過中にフィルターが目詰まりした場合は、必要に応じて、２つ以上のフィルターを用いて溶解物を濾過してもよい。
【０１３９】
微生物用溶解バッファーの調製
５．６μｌのβ−メルカプトエタノールを６００μｌのＲＬに加え、ピペッテイングにより６回混合する。前混合された全てのＢＭ−ＲＬを８０μｌのＢｕｇＬｙｓｉｓに加え、ピペッテイングにより６回混合する。
【０１４０】
微生物の溶解
１７０μｌの調製済み溶解混合物をカラムに加え、２００ｍｓ間減圧する。４５℃で１０分間インキュベートする。２８０μｌの調製済みプロテイナーゼＫ−溶液を５２０μｌのバッファーＲＰに加える。ピペッテイングにより６回混合する。２００μｌのＰＫ−ＲＰをカラムに加える。２００ｍｓ間減圧する。４５℃で１０分間インキュベートする。
【０１４１】
微生物ＤＮＡのカラムへの結合
カラムをルームテンパードブロック（room tempered block）に移す。２分間待つ。５００μｌのＣＳＡＢをカラムに加える。２秒間減圧する。
洗浄１
５００μｌのＷＢをカラムに加える。２秒間減圧する。
洗浄２
５００μｌのＷＳをカラムに加える。２秒間減圧する。
メンブレンの乾燥
１０分間減圧する。
溶離（Ｅｌｕｔｉｏｎ）
２００μｌのＥＴをカラムに加える。
２００ｍｓ間減圧する。
室温で少なくとも５分間インキュベートする。
１分間減圧する。
もう一度繰り返して、２回溶離する。
【０１４２】
Ｇｏｒａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１２  （ｓｕｐｒａ）に記載された方法を用いて、濃縮細菌ＤＮＡサンプルに対して分子検査を行った。細菌の分子同定プロセス中、残りの血液サンプルを攪拌機にかけた。
【０１４３】
パドロックプローブと標的捕捉プローブをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ミュンヘン、ドイツ）からオーダーした。これらのプローブは、バイオインフォマティクス・ツールを介して選択される各細菌中のユニークなモチーフを検出するよう設計されている。捕捉プローブのハイブリダイゼーションと、パドロックプローブの標的ＤＮＡへのライゲーションとを同時に行った。これらの同時の実施は、断片化され変性されたゲノムＤＮＡを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１００ｎＭのパドロックプローブ、５０ｎＭの捕捉プローブ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ＭＡ、ＵＳＡ）及び２５０ｍＵ／μｌのＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＷＩ、ＵＳＡ）において、５５℃で５分間インキュベートすることにより達成された。反応したパドロックプローブとそれに付随した標的ＤＮＡをビオチン化された捕捉プローブを介して磁気粒子上に捕捉した。これは５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジンＴ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））をハイブリダイゼーション／ライゲーション反応に加え、そのサンプルを室温で３分間インキュベートすることにより達成された。余分なプローブを、１００μｌの洗浄バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）を用いて1回洗浄して除去した。続くＲＣＡ反応を妨害しうる余分なリニアパドロックプローブを除去した。
【０１４４】
反応したプローブを、ＲＣＡから始まる連続的な酵素反応を含むＣ２ＣＡにより増幅した。ＲＣＡ反応は、１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、リトアニア；３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ７．９、３７℃）、１０ｍＭ  Ｍｇ−アセテート、６６ｍＭ  Ｋ−アセテート、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２５ｎＭのプライマー及び１００ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む２０μｌのライゲーション混合物を添加して開始した。その反応を３７℃で１１分間インキュベートし、６５℃で１分間不活性化した。ＲＣＡ産物を、３７℃で１分間、３ユニットのＡｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、６００ｎＭの複製オリゴヌクレオチド、０．２μｇ／μｌのＢＳＡを１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファーに添加することによって消化し、その反応を６５℃で１分間停止した。ライゲーション反応、増幅反応及び標識反応は、１．３６ｍＭのＡＴＰ、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２８ｍＵ／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ及び１２０ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を、１×ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼバッファーに、最終量が５０μｌとなるように添加することによって行った。これらの反応を３７℃で７分間インキュベートし、６５℃で１分間停止した。上記を一回繰り返した。最終ＲＣＡ後、得られた産物を再度消化してモノマーにした。ＲＣＰの解析準備が整った。
【０１４５】
消化サンプルをマイクロアレイに移して５５℃で３０分間インキュベートし、１ｘＳＳＣを用いて室温で洗浄した。ハイブリダイズされたＲＣＡモノマーを、５５℃で３０分間で、２ｘＳＳＣ中１０ｎＭの濃度のディテクターオリゴ（detector oligo）のハイブリダイゼーションによって標識化し、室温にて１ｘＳＳＣ中で２回洗浄して脱水した。
【０１４６】
次にアレイをアレイスキャナーでスキャンして、その結果をアレイ画像解析ソフトを用いて以下のように解析した。
【０１４７】
アレイ画像を評価して、一又は数個の病原体に対応するスポットを検出する。光るスポットは、検出された病原体に対応する。病原体毎に３つのスポットが重複（redundancy）している。更に、アレイは画像の位置合わせに用いられる常時光を放つ参照スポットと、光を放つことによって分子プロトコルの各工程の成功を証明するプロトコル参照スポットとを含む。該解析は、以下の工程に分けられる。
１．参照スポットを検出し、それに従って画像の位置合わせをする。
２．スポット強度（spot intensity）とバックグラウンドを測定し、バックグラウンド補正値を計算する。
３．測定された強度を、病原体特異的バックグラウンドに対して補う（例えばプローブセットからのＤＮＡの非特異的結合は、別の病原体である）。
４．アレイ強度データを用いて、病原体ｉｄ（ｓ）及び品質値に関する応答を提供する。
ａ．アルゴリズムは、ＩＤ応答の計算の際、特定の病原体に対応する全ての複製スポットの強度値を考慮に入れる。
ｂ．ＩＤ応答は、質的（病原体の存在を報告）及び／又は定量的（サンプル中に存在する病原体量のインディケーションを報告）でありうる。
ｃ．分子プロトコルの成功を証明するために、プロトコル参照スポットを評価する。
５．その結果を集め、下流のＡＳＴ解析に転送する及び／又は結果報告において報告する。その結果は以下を含む。
ａ．検出された病原体のＩＤ
ｂ．検出された各病原体に関する半定量値
ｃ．分子プロトコルの成功率を示す品質値
【０１４８】
サンプルアレイ画像を図１Ａに示す。プレートの隅に沿った５つのスポットは参照スポットであり、画像の位置合わせに用いられる。それよりも明るいスポットは、検出された病原体（大腸菌）を示す。図１Ｂは、大腸菌に対して特異的な蛍光信号が生成されたことを示す。
【０１４９】
実施例２−実施例１の血液培養物のＡＳＴ検査
分子タイピング中に継続的に培養状態にあった血液培養ボトルの残りのサンプルから、５ｍｌをフラスコから抜き取った。
【０１５０】
抜き取ったサンプルの細菌を濃縮し、それと同時に、培地をこの場合はＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（ＭＨ培地）に変えた。０．２μｍフィルターを通過させる濾過を介して大腸菌細菌を回収し、回収された細菌をＭＨ培地に再懸濁した。６３μｌの細菌懸濁液のアリコートを、マイクロタイタープレートの特定のウェルに移した。
【０１５１】
各ウェルには、異なる抗生物質が異なる濃度で入っている。実施例１で同定された微生物が大腸菌であったため、薬剤感受性検査用に以下の抗生物質を選択した：シプロフロキサシン、ピペラシリン＋タゾバクタム、セフォタキシム、セフタジジム、メロペネム及びゲンタマイシン。抗生物質毎に、公知の臨床的ＭＩＣ値に基づいて、一連の６つの異なる濃度を準備した。陽性コントロールとして、ＭＨブロスを含み抗生物質を含まない７番目のウェルを使用した。マイクロタイタープレートは、その読み取り前に、３５℃で４ｈインキュベートした。７μｌの１０μＭ  Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ  ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を各ウェルに添加して、３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロタイタープレートの各ウェルを画像化して、細菌数をカウントした。陽性コントロールに対する異なる増殖を用いて、細菌のＭＩＣ値を判定した。図２は、シプロフロキサシンに関する結果を示す。
【０１５２】
実施例３−フローサイトメトリー型機器（Ａｑｕｉｌａ４００、Ｑ−ｌｉｎｅａ  ＡＢ社、スウェーデン）における個別細菌カウンティングを用いたＡＳＴプロファイルの判定
実施例１に記載されたように細菌を血液培養において増殖させ、分子タイピング中に継続的に培養状態にあった血液培養ボトルの残りのサンプルから５ｍｌをフラスコから抜き取った。
【０１５３】
サンプルの細菌を濃縮し、それと同時に、培地をこの場合はＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（ＭＨ培地）に変えた。０．２μｍフィルターを通過させる濾過により大腸菌細菌を回収し、回収された細菌をＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスにおける濃度が約１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＭＨ培地に再懸濁し、その後約１０6ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。
【０１５４】
抗生物質溶液を、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスにおいて、１０ｘ検査濃度で一連の２：１段階希釈で調製した。抗生物質の濃度範囲を、細菌の同一性と抗生物質に基づいて選択した。実施例１で同定された微生物が大腸菌であったため、薬剤感受性検査用に以下の抗生物質を選択した：シプロフロキサシン、ピペラシリン＋タゾバクタム、セフォタキシム、セフタジジム、メロペネム及びゲンタマイシン。公知の臨床的ＭＩＣ値に基づいて、一連の８つの異なる濃度を準備した。１００μｌの抗生物質溶液（８つの異なる濃度）と８００μｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスとを含む８つのサンプルチューブを準備した。陽性コントロールとして、９００μｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスを含み抗生物質を含まない一つの追加的チューブを使用した。１００μｌの細菌懸濁液（１０6ＣＦＵ／ｍｌ）を９つのチューブ全てに添加した。１０００μｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスを含む陰性コントロールサンプル（即ち細菌無し）を陰性コントロールとして準備した。
【０１５５】
全てのチューブを３５℃でインキュベートし、０、４、６及び２４ｈ後にサンプルを採取した。実施例２と同様にしてカウント用の細菌サンプルを調製した。Ａｑｕｉｌａ４００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｑ−ｌｉｎｅａ  ＡＢ社、スウェーデン）内のフローサイトメトリーベースの個別細菌カウンティングを用いて細菌ＡＳＴプロファイルを判定した。Ａｌｅｘａ４８８レーザーを用いてＡｑｕｉｌａ４００解析を行った。
【０１５６】
異なるタイムポイントで行った解析から、異なる抗生物質濃度を用いて異なる細菌増殖を検出して抗生物質感受性を判定するには、４時間で十分であることが明らかになった。時間短縮については既に文献に記載されているため、予想外のことではない。各抗生物質について、図３に陽性コントロールサンプルに対する異なる細菌増殖を示す。異なるタイムポイントとカットオフ値における各抗生物質のＭＩＣ値を、異なる細菌増殖に基づいて計算した。この方法により得られた値を、これまでに報告されてきた臨床的ＭＩＣ値と適切に比較して以下に示す。測定値を平均化するのではなく個別細菌をカウンティングすることによって得られたこれらの結果は、優れた精度と感度を示している。
【０１５７】
セフォタキシム
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは０．１２５μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは≦０．５μｇ／ｍｌである。
【表１】
2017518768.tif 000002
【０１５８】
シプロフロキサシン
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは０．０１６μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは≦０．０３μｇ／ｍｌである。
【表２】
2017518768.tif 000003
【０１５９】
ゲンタマイシン
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは０．５〜１μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは１μｇ／ｍｌである。
【表３】
2017518768.tif 000004
【０１６０】
メロペネム
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは０．２５〜０．５μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは≦０．２５μｇ／ｍｌである。マイクロブロス希釈法を用いＡｑｕｉｌａ４００を用いて推定されたＭＩＣは、古い抗生物質のストックが用いられたため非常に高い。
【表４】
2017518768.tif 000005
【０１６１】
セフタジジム
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは０．２５μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは≦０．５μｇ／ｍｌである。
【表５】
2017518768.tif 000006
【０１６２】
ピペラシリン及びタゾバクタム
マイクロブロス希釈法を用いたＭＩＣは４〜８μｇ／ｍｌであり、別の研究所がＥ−ｔｅｓｔで判定したＭＩＣは２μｇ／ｍｌである。
【表６】
2017518768.tif 000007
【０１６３】
実施例４−パドロックプローブとＣ２ＣＡ増幅とを用いたＡＳＴによるＡＳＴ判定を用いた方法
大腸菌がスパイクされた血液培養物をセットアップし、実施例１と同様に分子タイピングを実施した。分子タイピング中に継続的に培養状態にあった血液培養ボトルの残りのサンプルから５ｍｌをフラスコから抜き取り、そのサンプルの細菌を濃縮して実施例２と同様にＭＨ培地に移し替えた。
【０１６４】
６３μｌのアリコートをマイクロタイタープレートの特定のウェルに移した。各ウェルには、異なる抗生物質が異なる濃度で入っている。１つのマイクロタイタープレートにおいて、１２の異なる抗生物質が配置され、抗生物質毎に４濃度＋１ブランク（抗生物質無し）が準備された。マイクロタイタープレートにおいて４ｈ増殖させた後、各ウェルで細菌溶解を行って細菌ＤＮＡをリリースした。
【０１６５】
抗生物質感受性検査を、細菌の直接標識ではなく、病原体からＤＮＡを抽出して増幅産物をデジタルカウントする増幅単分子検出（ＡＳＭＤ）を用いて行った。Ｇｏｒａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１２における方法によって、細菌ＤＮＡサンプルの分子検出検査を行った。パドロックプローブと標的捕捉プローブをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ミュンヘン、ドイツ）からオーダーした。
【０１６６】
これらのプローブは、バイオインフォマティクス・ツールを介して選択される各細菌中のユニークなモチーフを検出するよう設計されている。捕捉プローブのハイブリダイゼーションと、パドロックプローブの標的ＤＮＡへのライゲーションとを同時に行った。これらの同時の実施は、断片化され変性されたゲノムＤＮＡを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１００ｎＭのパドロックプローブ、５０ｎＭの捕捉プローブ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ＭＡ、ＵＳＡ）及び２５０ｍＵ／μｌのＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＷＩ、ＵＳＡ）において、５５℃で５分間インキュベートすることにより達成された。反応したパドロックプローブとそれに付随した標的ＤＮＡをビオチン化された捕捉プローブを介して磁気粒子上に捕捉した。これは５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジンＴ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））をハイブリダイゼーション／ライゲーション反応に加え、そのサンプルを室温で３分間インキュベートすることにより達成された。余分なプローブを、１００μｌの洗浄バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）を用いて１回洗浄して除去した。続くＲＣＡ反応を妨害しうる余分な線形パドロックプローブを除去する必要がある。
【０１６７】
反応したプローブを、ＲＣＡから始まる連続的な酵素反応を含むＣ２ＣＡにより増幅した。ＲＣＡ反応は、１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、リトアニア；３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ７．９、３７℃）、１０ｍＭ  Ｍｇ−アセテート、６６ｍＭ  Ｋ−アセテート、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２５ｎＭのプライマー及び１００ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む２０μｌのライゲーション混合物を添加して開始した。その反応を３７℃で１１分間インキュベートし、６５℃で１分間不活性化した。ＲＣＡ産物を、３７℃で１分間、３ユニットのＡｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、６００ｎＭの複製オリゴヌクレオチド、０．２μｇ／μｌのＢＳＡを１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファーに添加することによって消化し、その反応を６５℃で１分間停止した。ライゲーション反応、増幅反応及び標識反応は、１．３６ｍＭのＡＴＰ、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２８ｍＵ／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ及び１２０ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を、１×ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼバッファーに最終量が５０μｌとなるように添加することによって行った。これらの反応を３７℃で７分間インキュベートし、６５℃で１分間停止した。上記を一回繰り返した。最終ＲＣＡ反応後、ＲＣＰに相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドをぞれぞれ５ｎＭの濃度で添加した。反応を６５℃で２分間、続いて３７℃で５分間インキュベートし、クールダウンした。
【０１６８】
これらのサンプルをＡｑｕｉｌａ４００（米国特許出願番号６１／９７９３１９）に投入し、ＲＣＰの数をＪａｒｖｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ、２００６（Ｊａｒｖｉｕｓ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３、７２５−７２７（２００６）に記載されているように記録した。図４は、シプロフロキサシンとセフォタキシムの各濃度で増殖させた細菌サンプルのＲＣＰ産物の数を示す。このデータを用いて、各抗生物質のＭＩＣを推定した。
【０１６９】
実施例５−プローブ設計の戦略
病原体の同定を多重に行うことができる。これに関し、それぞれに含まれる病原体は、標的ＤＮＡを探し出すのに用いられる３つ以下の特異的捕捉オリゴヌクレオチドを有する。また、各病原体は、それぞれの捕捉オリゴヌクレオチドに近い標的にハイブリダイズする３つ以下の特異的なパドロックプローブを有する。ＡＳＭＤプローブセットの設計プロセスは、最適な標的領域の発見とプローブ配列の設計との２つの主な工程に分けることができる。
【０１７０】
以下、設計工程を更に細分化する：ゲノム標的を発見する−ゲノムデータベース（例えばＮＣＢＩ）から微生物ゲノム配列を入手する−ゲノム配列を、標的グループとバックグラウンドグループとに分割する。−標的ゲノムが二つ以上の場合、全てに共通する配列を探す−フィルターセットを用いて低複雑性候補（low-complexity candidates）（ホモポリマー、high/low%-GC、リピート等）を除去する。−バックグラウンド濾過：バックグラウンド区分においてゲノムに対して高い配列類似性を有する候補を捨てる。−アクセプトした候補を報告し、プローブを作成する−プローブ設計するゲノム標的（上記ステップにて選択）をロードする−設定（プローブ長、融解温度、ヘテロ／ホモダイマーフィルター、ライゲーションフィルター等）を選択する−最適プローブ配列を発見する。−パスした候補と設計概略を提示する。
【０１７１】
ゲノムＤＮＡ標的のフィルタリング及び認識に用いられるプローブは、図５のように構成される。捕捉プローブは標的断片を固相上に導き、その後パドロックはその標的に結合し、環状にライゲートし、続くＣ２ＣＡ反応において増幅される。パドロックは、標的と相補的な２つの部分（５’／３’−アーム）と、検出（ｇｅｎｅｒｉｃ）用、制限分解用及びプライミング（ｇｅｎｅｒｉｃ）用、並びにアレイオリゴハイブリダイゼーション（ｕｎｉｑｕｅ）用のサイトを含むバックボーンとを含む。バックボーン部は、図５において、ＤＯ、ＲＯ、ＡＯと記載されている。捕捉オリゴは、標的と相補的な部分、ＣＴ−リンカー、及び固相への付着のためのビオチンからなる。
【０１７２】
実施例６−血液培養物及び分子検査による臨床サンプルの微生物同定
敗血症の疑いのあるＩＣＵの患者からの血液をＢａｃｔｅｃ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）血液培養フラスコに引き込み、血液培養キャビネットで培養した。４ｈのインキュベーション後（フラスコが血液培養キャビネットにおいて陽性化を示すよりも前）、サンプルを抜き取って分子検査に使用した。
【０１７３】
５ｍｌのサンプルをシリンジで吸引し、実施例１に記載のように、潜在的病原体ＤＮＡを抽出した。
【０１７４】
Ｇｏｒａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１２（ｓｕｐｒａ）における方法により、濃縮細菌ＤＮＡサンプルに対して分子検査を行った。
【０１７５】
パドロックプローブと標的捕捉プローブをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ミュンヘン、ドイツ）からオーダーした。これらのプローブは、自社開発のバイオインフォマティクス・ツールによって選択される各細菌中のユニークなモチーフを検出するよう設計されている。捕捉プローブのハイブリダイゼーションと、パドロックプローブの標的ＤＮＡへのライゲーションとを同時に行った。これらの同時の実施は、断片化され変性されたゲノムＤＮＡを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１００ｎＭのパドロックプローブ、５０ｎＭの捕捉プローブ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ＭＡ、ＵＳＡ）及び２５０ｍＵ／μｌのＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＷＩ、ＵＳＡ）において、５５℃で５分間インキュベートすることにより達成された。反応したパドロックプローブとそれに付随した標的ＤＮＡをビオチン化された捕捉プローブを介して磁気粒子上に捕捉した。これは５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジンＴ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））をハイブリダイゼーション／ライゲーション反応に加え、そのサンプルを室温で３分間インキュベートすることにより達成された。余分なプローブを、（１００μｌの）洗浄バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）を用いて（1回）洗浄して除去した。続くＲＣＡ反応を妨害しうる余分なリニアのパドロックプローブを除去した。
【０１７６】
反応したプローブを、ＲＣＡから始まる連続的な酵素反応を含むＣ２ＣＡにより増幅した。ＲＣＡ反応は、１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、リトアニア；３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ７．９、３７℃）、１０ｍＭ  Ｍｇ−アセテート、６６ｍＭ  Ｋ−アセテート、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２５ｎＭのプライマー及び１００ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む２０μｌのライゲーション混合物を添加して開始した。その反応を３７℃で１１分間インキュベートし、６５℃で１分間不活性化した。ＲＣＡ産物を、３７℃で１分間、３ユニットのＡｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、６００ｎＭの複製オリゴヌクレオチド、０．２μｇ／μｌのＢＳＡを１×ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼバッファーに添加することによって消化し、その反応を６５℃で１分間停止した。ライゲーション反応、増幅反応及び標識反応は、１．３６ｍＭのＡＴＰ、１００μＭのｄＮＴＰ、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ、２８ｍＵ／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ及び１２０ｍＵ／μｌのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を、１×ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼバッファーに最終量が５０μｌとなるように添加することによって行った。これらの反応を３７℃で７分間インキュベートし、６５℃で１分間停止した。上記を一回繰り返した。最終ＲＣＡ後、得られた産物を再度消化してモノマーにした。ＲＣＰの解析準備が整った。
【０１７７】
消化サンプルをマイクロアレイを含む容器に移して５５℃で３０分間インキュベートし、室温にて１ｘＳＳＣを用いて洗浄した。ハイブリダイズされたＲＣＡモノマーを、５５℃で３０分間で、２ｘＳＳＣ中濃度１０ｎＭでディテクターオリゴのハイブリダイゼーションによって標識化し、室温にて１ｘＳＳＣ中で２回洗浄して脱水した。
【０１７８】
次にアレイをアレイスキャナーでスキャンして、その結果を画像解析ソフトを用いて解析した。示されたデータは正規化され、バックグラウンドからの標準偏差が３倍の、バックグラウンドを上回るデータのみを真の信号として分類した。
【０１７９】
１０臨床サンプル＋１スパイクサンプルからのデータを図６に示す。スパイクサンプルには大腸菌がスパイクされており、それをネガティブサンプルからの血液が入った血液培養フラスコに加えた。スパイクされた細菌量は、ＢＣＦにスパイクされたオリジナル量が１０ＣＦＵ大腸菌／ｍｌ血液であった場合に存在するであろう量に対応している。その後４ｈ増殖させた。血液培養により、臨床サンプルのうち８つは陰性で、２つは陽性であることが分かった。ポジティブサンプルは、標準的な手法を用いて、後に一方は大腸菌、他方は肺炎連鎖球菌（S.pneumoniae）であることが分かった。
【０１８０】
各サンプルについて得られた唯一の陽性信号は、予想されたアレイ特徴からの信号であった。このアッセイにおいて、一つの臨床サンプルが大腸菌を含み、一つの臨床サンプルが肺炎連鎖球菌（S.pneumoniae）を含むことが分かった。スパイクサンプルも大腸菌を含むことが確認された。いずれのサンプルにおいても、バックグラウンドを上回る信号（陰性サンプルセットにおける平均信号の３倍の標準偏差と定義）は見られなかった。これらのサンプルは、伝統的な検証アッセイを用いて、後にネガディブであることが確認された。大腸菌に関して、サンプルごとに２つのアレイ特徴（Ｑ１１０１及びＱ７９９）の信号が生じた。これは、大腸菌を検出するがそれぞれ異なるアレイ特徴を報告する２つの異なるプローブシステムがこの実験で用いられたからである。
【０１８１】
実施例７−血液培養フラスコからアリコートを抜き取った後の陽性化までの時間
１０セットの血液培養フラスコに細菌をスパイクした。５セットに５００ＣＦＵ／ｍｌ血液をスパイクし、５セットに５０．０００ＣＦＵ／ｍｌ血液をスパイクした。健康なドナーからの血液１０ｍｌを各血液培養フラスコ（３０ｍｌの血液培地入）に抜き取って、全容量４０ｍｌ／培養フラスコにした。これらの血液培養フラスコを血液培養キャビネットに載置する前に、５ｍｌのアリコートを抜き取った。血液培養キャビネット内で血液培養フラスコが陽性化を示した場合、３０分毎にコントロールした。
【０１８２】
陽性化までの時間（time-to-positivity（ＴＴＰ））を図７に示す。セット間で目立った時間差は見られなかった。培養前に取り出されたアリコートを有するフラスコと、取り出されたアリコートを有さないフラスコとの間に目立った時間差は見られなかった。
【０１８３】
実施例８-血液培養フラスコからのアリコートの無菌サンプリング
８×３グループ、計２４個の血液培養フラスコ（ＢＣＦ）を以下のように処理した。
【０１８４】
グループ１：針でセプタムに穴を開ける
グループ２：針でセプタムに穴を開ける前に、大腸菌入り１０＾８ＣＦＵ／ｍｌブロスをセプタム上にスワブした
グループ３：セプタムの穴開け無し
使い捨ての無菌針を各ＢＣＦに用いた。
【０１８５】
ＢＣＦを血液培養キャビネットに載置し、５日間静置した。グループ１及びグループ３のＢＣＦには何の増殖も見られなかった。グループ２の８ＢＣＦ中の１個が、５日以内に陽性になった。ボトルが高度に汚染されている場合、アリコート採取前にセプタムを除染することの潜在的な必要性を示している（表１を参照）。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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