(57)【要約】本発明は、ネクロトーシスを阻害するための方法；ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法；およびネクロトーシスの阻害のための化合物に関し、これらはネクロトーシスの脱制御に関連した病態の処置に有用となり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体において、ネクロトーシスを阻害するための方法であって、混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）タンパク質の偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合する化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記化合物の投与が、ＭＬＫＬのコンフォメーション変化を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＬＫＬのコンフォメーション変化が、ＭＬＫＬの４ヘリックスバンドル（４ＨＢ）ドメインの放出を伴う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物の投与が、ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物の投与が、ＭＬＫＬの細胞膜への移行を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への前記化合物の結合が、熱シフトアッセイ；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）；および飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ−ＮＭＲ）からなる群から選択される１つまたは複数のアッセイによって判定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、ＭＬＫＬのリン酸化を阻害しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、ＭＬＫＬのリン酸化を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＬＫＬがヒトＭＬＫＬである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、約１０００Å３以下の体積を占める、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、約３００Å３〜約８００Å３の体積を占める、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、化学式
【化１】
2017521477.tif 000122
［式中、Ｒ１は、３−ＭｅＳＯ２ＣＨ２−、４−ＭｅＳＯ２ＣＨ２−、３−Ｈ２ＮＳＯ２−、および４−Ｈ２ＮＳＯ２−からなる群から選択され；かつ
Ｒ２は、ＯＣＦ３、ＣＦ３、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、およびＣＯＭｅからなる群から独立して選択される０〜２個の置換基である］
を有するか、またはその薬学的に許容される誘導体、多形体、塩、もしくはプロドラッグである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１が３−Ｈ２ＮＳＯ２−である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１が４−Ｈ２ＮＳＯ２−である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ２が０個の置換基である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２が４−ＯＣＦ３である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ２が２個の置換基であり、かつ前記２個の置換基が３−ＣＦ３および６−フルオロである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、化合物１〜４
【化２】
2017521477.tif 000123
からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、化学式
【化３】
2017521477.tif 000124
を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、化学式（Ｉ）
【化４】
2017521477.tif 000125
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）ＲＲ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が、化学式（ＩＩ）：
【化５】
2017521477.tif 000126
［式中、
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、化学式（Ｉ）：
【化６】
2017521477.tif 000127
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、
【化７】
2017521477.tif 000128
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ  Ｒ７Ｒ７Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、化学式（ＩＩ）：
【化８】
2017521477.tif 000129
［式中、
Ｄは、
【化９】
2017521477.tif 000130
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡであり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２ＲＳ、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、化学式（Ｉ）：
【化１０】
2017521477.tif 000131
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ＝Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｒ８）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｑ１、Ｑ２、またはＱ３が、Ｈ２ＮＳＯ２−またはＭｅＳＯ２ＣＨ２−である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が、骨、関節、結合組織、および軟骨の疾患、筋疾患、皮膚疾患、心血管疾患、循環系疾患、血液および血管の疾患、肺疾患、消化管疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、代謝疾患、腎臓疾患、ウイルスおよび細菌の感染、重篤な中毒、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、加齢に関連した障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、歯科障害、眼科の疾患または障害、聴覚伝導路の疾患、ミトコンドリアに関連した疾患、ならびに癌および転移からなる群から選択される疾患を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、過剰な血管新生に関連した増殖性障害に罹患していない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖性障害が癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬを含有するタンパク質溶液を候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）を、候補化合物の非存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）と比較して、アンフォールディングの転移温度の変化（ΔＴｍ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、かつ
正のΔＴｍ値により、候補化合物が変性からタンパク質を安定化し、ネクロトーシスにおけるその役割を阻害することが示される、
方法。
【請求項３０】
前記タンパク質溶液が蛍光色素を含む、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
前記蛍光色素がＳＹＰＲＯオレンジである、請求項３０に記載のスクリーニング方法。
【請求項３２】
前記方法が、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）機器で実施される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを漸増濃度の候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）結合親和性（Ｋｄ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
候補化合物の結合により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法。
【請求項３４】
前記ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインがセンサーチップ上に固定化される、請求項３３に記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
固定化されたＭＬＫＬ偽キナーゼドメインが二重のＨｉｓタグを付けられている、請求項３４に記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを含有するタンパク質溶液をヌクレオチドおよび候補化合物と接触させて、飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ−ＮＭＲ）を実施するステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルを、候補化合物の非存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルと比較するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのヌクレオチド結合部位への候補化合物の結合によるものであり、かつ
ＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル強度の消失または低下により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法。
【請求項３７】
前記ヌクレオチドがＡＴＰおよびＡＤＰからなる群から選択される、請求項３６に記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
前記ＭＬＫＬがヒトＭＬＫＬである、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
ネクロトーシスによる細胞死をレスキューする、候補化合物の能力を試験することをさらに含む、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
前記試験が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイで実施される、請求項３９に記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
前記細胞が、マウス皮膚線維芽細胞（ＭＤＦ）またはヒトＵ９３７細胞である、請求項４０に記載のスクリーニング方法。
【請求項４２】
ネクロトーシスが、ＴＮＦ（Ｔ）；Ｓｍａｃミメティック（Ｓ）；および汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（Ｑ）のいずれか１つまたは複数から選択される因子により刺激される、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４３】
それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化１１】
2017521477.tif 000132
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）ＲＲ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】
それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化１２】
2017521477.tif 000133
［式中、
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４５】
それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化１３】
2017521477.tif 000134
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、
【化１４】
2017521477.tif 000135
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ  Ｒ７Ｒ７Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４６】
それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化１５】
2017521477.tif 000136
［式中、
Ｄは、
【化１６】
2017521477.tif 000137
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡであり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２ＲＳ、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４７】
それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
2017521477.tif 000138
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ＝Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｒ８）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４８】
Ｑ１、Ｑ２、またはＱ３が、Ｈ２ＮＳＯ２−またはＭｅＳＯ２ＣＨ２−である、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が、骨、関節、結合組織、および軟骨の疾患、筋疾患、皮膚疾患、心血管疾患、循環系疾患、血液および血管の疾患、肺疾患、消化管疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、代謝疾患、腎臓疾患、ウイルスおよび細菌の感染、重篤な中毒、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患、加齢に関連した障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、歯科障害、眼科の疾患または障害、聴覚伝導路の疾患、ミトコンドリアに関連した疾患、ならびに癌および転移からなる群から選択される疾患を有する、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体が、過剰な血管新生に関連した増殖性障害に罹患していない、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記増殖性障害が癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
被験体のネクロトーシスを阻害するための薬物の調製における、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５３】
ネクロトーシスを阻害するための、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５４】
ネクロトーシスの阻害に使用するための、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法による化合物。
【請求項５５】
ネクロトーシスを阻害するために使用される場合における、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法による化合物。
【請求項５６】
化合物５〜１０および１２〜２６のいずれか１つからなる群から選択される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ネクロトーシスを阻害するための方法、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法、およびネクロトーシスの阻害のための化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患では、細胞死はアポトーシス経路および／またはネクローシス経路により媒介される。アポトーシスを制御する作用機序については多くのことが知られているが、ネクローシスの制御についてはそれほど理解されていない。細胞のネクローシスおよびアポトーシスの両方を調節する機序を理解することは、神経変性疾患、脳卒中、冠動脈心臓疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳに関連した病態などの病態の処置を可能にするために必須である。
【０００３】
細胞死は通例、形態学的な特徴に基づいて、アポトーシスまたはネクローシスのいずれかとして分類されてきた（非特許文献１）。さらに、細胞死のこれらの２つの様式はそれぞれ、制御的な（カスパーゼ依存的な）過程および非制御的な過程を介して生じると最初考えられた。しかしながら、より最近の研究によると、これらの２つの表現型をもたらす基礎となる細胞死機序は、もっとはるかに複雑であり、一部の環境下では相互に関係することが実証されている。さらに、ネクローシスをもたらす状態は、制御的なカスパーゼ非依存性過程または非制御的な過程のいずれかにより起こり得る。
【０００４】
ネクロトーシスと呼ばれる、ネクローシスに類似した形態学的特徴を有する、ある制御的なカスパーゼ非依存性細胞死が記載されている（非特許文献２）。この様式の細胞死は、種々の刺激（例えば、ＴＮＦ−［アルファ］およびＦａｓリガンド）により、また多くの細胞型（例えば、単球、線維芽細胞、リンパ球、マクロファージ、上皮細胞、およびニューロン）において、惹起され得る。高度にエネルギー依存的なアポトーシス過程が有効でない場合に、ネクロトーシスは、過剰な細胞ストレス、迅速なエネルギー損失、および大量の酸化的化学種の生成を含む病的状況下における細胞死の重要な寄与要因であり、また一部の場合には有力な様式であり得る。
【０００５】
ネクロトーシスを阻害することができる低分子量分子の同定および最適化は、疾患病態生理学におけるその役割の解明に寄与することになり、また抗ネクロトーシス治療のための化合物を提供することができよう。カスパーゼ非依存性細胞死（例えば、ネクローシスまたはネクロトーシス）を防止する化合物の発見はまた、ネクローシスが生じる状態を処置または防止する有用な治療剤を提供することになろう。これらの化合物および方法は、神経変性疾患、虚血性の脳および心臓損傷、頭部外傷、ならびに炎症性症状の処置に特に有用になろう。
【０００６】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、用品等についてのいかなる議論も、これらの事柄のいずれもまたはすべてが、本出願の各請求項の優先権主張日以前に存在したとして、従来技術の基礎の一部を形成するものである、または本開示に関連する分野で共有する一般知識であるということを承認するものと解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｙｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．６８：２５１（１９８０）
【非特許文献２】Ｄｅｇｔｅｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１１２，２００５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、混合系統キナーゼドメイン様（Ｍｉｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ）（ＭＬＫＬ）タンパク質の偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合する化合物の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【０００９】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬを含有するタンパク質溶液を候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）を、候補化合物の非存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）と比較して、アンフォールディングの転移温度の変化（ΔＴｍ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
正のΔＴｍ値により、候補化合物が変性からタンパク質を安定化し、ネクロトーシスにおけるその役割を阻害することが示される、
方法が提供される。
【００１０】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを漸増濃度の候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）結合親和性（Ｋｄ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
候補化合物の結合により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法が提供される。
【００１１】
さらなる態様では、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを含有するタンパク質溶液を、ヌクレオチドおよび候補化合物と接触させて、ＳＴＤ−ＮＭＲを実施するステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルを、候補化合物の非存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルと比較するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
ＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル強度の消失または低下により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法が提供される。
【００１２】
米国特許出願公開第２００５／００８５６３７号明細書に記載の特定の化合物が、ネクロトーシスの阻害に適していることが見出されている。
【００１３】
一態様では、したがって、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化１】
2017521477.tif 000002
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）ＲＲ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００１４】
別の態様では、それを必要とする被験体において、ネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化２】
2017521477.tif 000003
［式中、
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００１５】
別の態様では、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化３】
2017521477.tif 000004
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、
【化４】
2017521477.tif 000005
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ  Ｒ７Ｒ７Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００１６】
別の態様では、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化５】
2017521477.tif 000006
［式中、
Ｄは、
【化６】
2017521477.tif 000007
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡであり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、かつ
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２ＲＳ、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００１７】
別の態様では、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化７】
2017521477.tif 000008
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ＝Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｒ８）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、
ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、かつ
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００１８】
別の態様では、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）の新規化合物がさらに提供される。
【００１９】
別の態様では、被験体のネクロトーシスを阻害するための薬物の調製における、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）の化合物の使用が提供される。
【００２０】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物の使用が提供される。
【００２１】
さらに別の態様では、ネクロトーシスの阻害に使用するための化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物が提供される。
【００２２】
さらに別の態様では、ネクロトーシスを阻害するために使用する場合の、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物が提供される。
【００２３】
本明細書の任意の実施形態は、特に別記しない限り、他の任意の実施形態に準用されるとみなされるものとする。
【００２４】
本開示は、本明細書に記載の特定の実施形態により、範囲が限定されるべきではなく、実施形態は例示のみを目的とするものである。機能的に均等な生成物、組成物、および方法は、本明細書に記載のように、明らかに本明細書の範囲内である。
【００２５】
本明細書全体を通して、特に別記しない限りまたは文脈上別の要求がない限り、単一のステップ、組成物、一群のステップ、または一群の組成物に対する言及は、それらのステップ、組成物、一群のステップ、または一群の組成物の１つおよび複数（すなわち、１つ以上）を包含するとみなされるものとする。
【００２６】
本開示は、以下の非限定例を通して、かつ添付図を参照して以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−Ｄ】ＭＬＫＬ誘導ネクロトーシスの化合物１阻害に関する機序研究を示す図である。図１Ａは、化合物１が、熱安定性シフトアッセイを用いて、マウスＭＬＫＬ相互作用物質として同定されたことを示す図である。図１Ｂは、マウスＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの化合物１の結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検証されたことを示す図である。図１Ｃは、化合物１が、ＴＳＱで刺激された野生型ＭＤＦのネクロトーシス死を、用量依存的に阻害したことを示す図である。図示したデータは、独立した３実験の平均±標準誤差である。図１Ｄは、化合物１が、ブルーネイティブＰＡＧＥの抗ＭＬＫＬブロットにおいて膜画分への移行を遅らせたことを示す図である。細胞質画分および膜画分の純度およびタンパク質存在量は、ＧＡＤＰＨおよびＶＤＡＣ１に対する対照ブロットにより図示される。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａは、マウスＭＬＫＬへのヌクレオチド結合を示す飽和移動差（ＳＴＤ）ＮＭＲスペクトルである。このデータは、化合物１が、マウスＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの結合に対して、（ｉ）ＡＴＰおよび（ｉｉ）ＡＤＰと競合し得ることを示す。オフ共鳴スペクトルの低磁場領域は、タンパク質の非存在下において、２００μＭのＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について検出されたピークを示す。アスタリスクで示されるピークは、２μＭのマウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）の存在下で、ＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について実施されたＳＴＤ−ＮＭＲ実験で観察されたもので、これによりヌクレオチド結合が確認される。これらのピークは、２００μＭの化合物１の存在下で減少し、これにより、ＡＴＰおよびＡＤＰおよび化合物１が化合物１の添加によりマウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）から置換されることが確認される。図２Ｂは、化合物１の毒性が、濃度≧５μＭにおいて野生型ＭＤＦの死を誘導することを示す図である。３回の実験の平均±標準誤差を示す。図２Ｃは、化合物１が、ＤＭＳＯ対照（「０」レーン）と比較すると、組換えＲＩＰＫ３キナーゼ活性に影響を及ぼさないことを実証するｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示す図である。化合物１濃度≧１０μＭでは、マウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）のリン酸化が再現性よく増強される。図示した実験は、独立した３アッセイの代表である。左パネル、乾燥したクーマシー染色の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル；右パネル、同じゲルのオートラジオグラフ。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａは、ヒトＭＬＫＬへのヌクレオチド結合を示すＳＴＤ  ＮＭＲスペクトルである。このデータは、化合物１が、ヒトＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの結合に対して、（ｉ）ＡＴＰおよび（ｉｉ）ＡＤＰと競合し得ることを示す。オフ共鳴スペクトルの低磁場領域は、タンパク質の非存在下において、２００μＭのＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について検出されたピークを示す。アスタリスクで示されるピークは、２μＭのヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）の存在下で、ＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について実施されたＳＴＤ−ＮＭＲ実験で観察されたもので、これによりヌクレオチド結合が確認される。これらのピークは、２００μＭの化合物１の存在下で減少し、これにより、ＡＴＰおよびＡＤＰおよび化合物１が化合物１の添加によりヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）から置換されることが確認される。図３Ｂは、ヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）への化合物１結合が、ＳＰＲにより検証されたことを示す図である。図３Ｃは、化合物１が、ＴＳＱで刺激された野生型Ｕ９３７細胞株のネクロトーシス死を、用量依存的に阻害したことを示す図である。図示したデータは、独立した５実験の平均±標準偏差である。図３Ｄは、遺伝子編集してＭＬＫＬを欠失させたＵ９３７細胞における化合物１の毒性を示す図である。ＭＬＫＬの非存在下では、ＴＳＱ刺激細胞は、非刺激細胞と同じように反応した。ＴＳ処理により、細胞がアポトーシス死を起こす能力を保持していることが示され、これは化合物１処置により影響を受けなかった。図示したデータは、独立した２実験の平均±標準偏差である。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａは、化合物１と同様なプロテインキナーゼ標的プロファイルを有するプロテインキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが、１μＭ濃度以下で、野生型ＭＤＦのＴＳＱ誘導細胞死を阻害しなかったことを示す図である。３回の実験の平均±標準誤差を示す。図４Ｂは、化合物１と同様なプロテインキナーゼ標的プロファイルを有するプロテインキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが、野生型Ｕ９３７細胞のＴＳＱ誘導細胞死を阻害しなかったことを示す図である。２回の実験の平均±標準誤差を示す。
【図５Ａ−Ｂ】図５ＡおよびＢは、化合物３がヒトＭＬＫＬのＡＴＰ結合部位内に結合することを示す、化合物３とヒトＭＬＫＬの間の複合体を示す図である。
【図６】化合物１がポリ（Ｉ：Ｃ）誘導ＲＩＰ１非依存性ネクロトーシスを阻害することを示すグラフである。
【図７】配列番号１は、ＭＬＫＬタンパク質のヒト完全長アイソフォームのアミノ酸配列である。
【図８】配列番号２は、ＭＬＫＬタンパク質のヒト短縮アイソフォームのアミノ酸配列である。
【図９】配列番号３は、ＭＬＫＬタンパク質のマウス完全長アイソフォームのアミノ酸配列である。
【図１０】配列番号４は、４６４アミノ酸のＭＬＫＬタンパク質であるマウス短縮アイソフォームのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列表への鍵
配列番号１は、ＭＬＫＬタンパク質のヒト完全長アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＭＬＫＬタンパク質のヒト短縮アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＭＬＫＬタンパク質のマウス完全長アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号４は、４６４アミノ酸のＭＬＫＬタンパク質であるマウス短縮アイソフォームのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に開示および定義された本発明は、本文または図面に記載されたまたは明白である個々の特徴の２つ以上の別個のあらゆる組合せにまで及ぶことを理解されよう。これらの異なる組合せはすべて、本発明の様々な別個の態様を構成する。
【００３０】
プログラムされたネクローシスまたは「ネクロトーシス」は、多細胞生物において、通常の細胞死経路（アポトーシス）を補完する細胞死機序としてこの５年で明らかになってきた。アポトーシスとは対照的に、ネクロトーシスは、多細胞生物の発生において重要な役割を果たしているようには見えないが、病原微生物に対する防御においてある役割を果たしており、多くの破壊的な炎症症状の犯人である可能性がある。受容体共役タンパク質キナーゼ−３（ＲＩＰＫ３）が、２００９年にネクロトーシスの重要なエフェクターであると同定され、その基質である偽キナーゼ混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）が２０１２年に同定されたが、細胞死を誘導するために必要とされる、ＭＬＫＬのＲＩＰＫ３媒介リン酸化に続く分子イベントは不明である。ＲＩＰＫ１／ＲＩＰＫ３／ＭＬＫＬネクロソームが、ＰＧＡＭ５およびＤｒｐ１を活性化して、ミトコンドリア断片化および細胞死をもたらすと主張されているが、ネクロトーシスのためのＰＧＡＭ５、Ｄｒｐ１、およびミトコンドリアの必要条件が問われている。ＭＬＫＬは、ネクロトーシス細胞死経路に必須なエフェクタータンパク質である（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４８（１−２），２１３−２２７，２０１２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１０９（１４），５３２２−５３２７；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），４４３−４５３，２０１３）。
【００３１】
ＭＬＫＬは、Ｃ末端偽キナーゼドメインおよび２つのヘリックスリンカーにより結合したＮ末端４ヘリックスバンドル（４ＨＢ）ドメイン（「ブレース（ｂｒａｃｅ）」ヘリックス）を含有する。本開示は、ＭＬＫＬ  ４ＨＢドメインがネクロトーシスを誘導するのに十分であることを実証する、本出願者らの突然変異分析および生化学分析に基づいており、４ＨＢドメインの２つの面上にクラスター化しているいくつかの荷電残基がこの機能に必要とされる。驚くべきことに、これらの荷電残基のいくつかの極性は、マウスとヒトのＭＬＫＬ間で保存されておらず、４ＨＢドメインのα４ヘリックス上の負電荷残基をアラニンに置換すると、機能が破壊される。この発見は、４ＨＢドメインの致死活性に対するリン脂質結合の重要性に疑念を抱かせ、膜結合を、ＭＬＫＬ  ４ＨＢドメイン内の保存性に乏しい塩基性残基の相互作用のみに帰すことができないことを示す。興味深いことに、４ＨＢドメイン上の残基の第２のクラスターを突然変異させても、オリゴマー化および膜局在化が妨げられることはなく、膜移行が４ＨＢドメインの致死機能の基礎になっている可能性はあるが、細胞死を誘導するには不十分であることを示す。
【００３２】
理論に拘束されたくはないが、これらのデータは、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインが、ＲＩＰＫ３によりリン酸化されるまで、４ＨＢドメインを抑制状態に保つというＭＬＫＬ機能のモデルを支持するものであり、このリン酸化により、偽キナーゼドメインのコンフォメーション変化がもたらされ、４ＨＢドメインが放出されてオリゴマー化し、膜と結合する。ＭＬＫＬの活性化のこのステップは、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメイン内のＡＴＰ結合部位を標的にする小分子により妨害することができ、それによって、膜へのＭＬＫＬ移行が遅れ、ネクロトーシスが妨げられる。偽キナーゼのＡＴＰ結合部位または「偽活性」部位の標的化は、これまで未開拓の種類の治療標的になる。したがって、ＭＬＫＬの標的化によりネクロトーシスを防止する化合物の同定は、ネクロトーシスの脱制御に関連した病態の処置に有利になろう。
【００３３】
本開示は、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に対する親和性に基づいて同定された化合物により、ＭＬＫＬオリゴマー化および膜移行が阻害され得ることを実証する。さらに、本開示は、小分子によりＭＬＫＬオリゴマー化および膜移行が阻害されると、ネクロトーシスが阻害されることを実証する。
【００３４】
本開示の一態様では、それを必要とする被験体において、ネクロトーシスを阻害するための方法であって、混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）タンパク質の偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合する化合物の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００３５】
上記に記載するように、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインは、ＲＩＰＫ３によりリン酸化されるまで、４ＨＢドメインを抑制状態に保つと考えられ、このリン酸化により、偽キナーゼドメインのコンフォメーション変化がもたらされ、４ＨＢドメインが放出されてオリゴマー化し、膜と結合して、ネクロトーシスがもたらされる。したがって、本開示の一実施形態では、化合物の投与により、ＭＬＫＬのコンフォメーション変化が阻害される。別の実施形態では、ＭＬＫＬのコンフォメーション変化は、ＭＬＫＬの４ヘリックスバンドル（４ＨＢ）ドメインの放出を伴う。別の実施形態では、化合物の投与は、ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害する。さらに別の実施形態では、化合物の投与は、細胞膜へのＭＬＫＬの移行を阻害する。さらなる実施形態では、化合物の投与は、ＭＬＫＬのコンフォメーション変化を阻害し、ＭＬＫＬのオリゴマー化を阻害し、かつ細胞膜へのＭＬＫＬの移行を阻害する。
【００３６】
ヒトとマウスの両方のＭＬＫＬは、選択的スプライシングにより２つの転写物アイソフォームを生成する。ヒトＭＬＫＬアイソフォーム１は、より長いヒト転写物であり、４７１アミノ酸のタンパク質である完全長アイソフォームをコードする（配列番号１）。ヒトアイソフォーム２は、エキソン４〜８を欠損し、２６３アミノ酸のタンパク質である短縮アイソフォームをコードする（配列番号２）。ヒトＭＬＫＬの２つのアイソフォームは、同じＮ末端およびＣ末端を有するが（国際公開第２０１０／１２２１３５号パンフレットに記載のように）、遺伝子のより短いアイソフォームではなく、完全長のヒトＭＬＫＬは、１つのプロテインキナーゼ様ドメインを有する（国際公開第２０１０／１２２１３５号パンフレット；ヒトＭＬＫＬの１９０〜４７１（配列番号１）；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４５７（３）：３６９−７７，２０１４）。マウスＭＬＫＬのアイソフォームは両方とも、１つのプロテインキナーゼ様ドメインを含有する（アミノ酸１７９〜４７２（配列番号３）、１７９〜４６４（配列番号４））。したがって、本開示に包含される化合物は、ヒトＭＬＫＬアイソフォーム１（配列番号１）、マウスＭＬＫＬアイソフォーム１（配列番号３）および２（配列番号４）、ならびにその種々の公知の天然変異体に結合する。ヒトＭＬＫＬのプロテインキナーゼ様ドメイン内には、ＡＴＰ、ならびに以下に限定されるものではないが、ＡＭＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰＰＮＰを含む他のヌクレオチドに結合するＡＴＰ結合部位（配列番号１のアミノ酸２０９〜２１７）が存在する。ヒトＭＬＫＬでは、ＡＴＰ（および他のヌクレオチド）は、Ｎローブのβ３鎖に由来するＫ２３０および通常のプロテインキナーゼの「触媒性」ループの対応部分に由来するＫ３３１を含む不連続残基のポケットにより結合される（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４５７（３）：３６９−７７，２０１４）。ＭＬＫＬはまた、Ｎ末端４ヘリックスバンドル（４ＨＢ）ドメインを有する（配列番号１、２、３、４のアミノ酸１〜１２５内；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），４４３−４５３，２０１３）。４ＨＢは、ＭＬＫＬ内のデスエフェクタードメインであり、ＭＬＫＬの細胞致死機能は４ＨＢのオリゴマー化および形質膜結合に依存する。
【００３７】
本開示の化合物は様々な種のＭＬＫＬに結合し、ネクロトーシスを阻害し得ることが想定される。例えば、本開示の化合物は、ヒトＭＬＫＬ（配列番号１またはその変異体もしくはアナログ；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４５７（３），３６９−３７７，２０１４）に結合し、ネクロトーシスを阻害することができる。別の例では、本開示の化合物は、マウスＭＬＫＬ（配列番号３；配列番号４またはその変異体もしくはアナログ；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），４４３−４５３，２０１３）に結合し、ネクロトーシスを阻害することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、当業者により理解される「偽キナーゼドメイン」という用語は、触媒的に不活性であるか、または触媒的に欠陥のあるキナーゼドメインを含有するタンパク質を意味する。「偽キナーゼドメイン」は、これらのドメインがホスホリル転移を触媒することが知られている保存残基を欠損しているので、「プロテインキナーゼ様ドメイン」と呼ばれることが多い。偽キナーゼドメインは、主に触媒作用非依存性タンパク質相互作用モジュールとして機能すると予測されるが、いくつかの偽キナーゼドメインは予想外の触媒機能を有すると考えられていることは、当業者により理解されよう。したがって、本開示では、「偽キナーゼドメイン」という用語は、キナーゼ活性を欠損する「偽キナーゼドメイン」および弱いキナーゼ活性を保有する「偽キナーゼドメイン」を含む。
【００３９】
本明細書で使用する場合、当業者により理解される「ＡＴＰ結合部位」という用語は、ＡＴＰの標的タンパク質への結合を促進する、特定配列のタンパク質サブユニットを意味する。ＡＴＰ結合部位は、ＡＴＰが捕捉され、ＡＤＰに加水分解され、それによってタンパク質により利用されるエネルギーが放出されて、タンパク質の形状を変化させ、かつ／または酵素を触媒的に活性にすることにより機能するタンパク質微小環境である。偽キナーゼドメインでは、「ＡＴＰ結合部位」は、「偽活性部位」と呼ばれることが多い。「ＡＴＰ結合部位」という用語はまた、この部位での結合がＡＴＰ以外のヌクレオチドの結合も含むので、「ヌクレオチド結合部位」と呼ばれることもある。「ヌクレオチド」という用語が、いかなるヌクレオチドも含むことは当業者により理解されよう。例示的なヌクレオチドとしては、以下に限定されるものではないが、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＭＰＰＮＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰが挙げられる。
【００４０】
本明細書に記載のように、ネクロトーシスの阻害は、ネクロトーシスの完全阻害および部分阻害の両方を含む。一実施形態では、ネクロトーシスの阻害は完全な阻害である。別の実施形態では、ネクロトーシスの阻害は部分阻害である。
【００４１】
ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、そのような使用が当業者により適切であると見なされる任意の方法により決定することができる。本開示の一実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、以下に限定されるものではないが、熱シフトアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ−ＮＭＲ）を含む群から選択される１つまたは複数のアッセイにより決定される。別の実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、熱シフトアッセイにより決定される。さらに別の実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、ＳＰＲにより決定される。さらに別の実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、ＳＴＤ−ＮＭＲにより決定される。さらなる実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、熱シフトアッセイおよび１つまたは複数の追加のアッセイにより決定される。さらにさらなる実施形態では、追加のアッセイは、以下に限定されるものではないが、ＳＰＲおよびＳＴＤ−ＮＭＲを含む群から選択される。
【００４２】
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）とも呼ばれる熱シフトアッセイは、標的タンパク質の熱安定性およびタンパク質へのリガンドの結合後における、タンパク質の融解温度の上昇を測定する熱変性アッセイである。低分子量リガンドの結合は、タンパク質の熱安定性を増大させることができ、熱安定性の変化は、蛍光色素の存在下で熱変性曲線を得ることにより測定される。使用する蛍光色素は、典型的には、非特異的な色素（ＳＹＰＲＯオレンジなど）であり、疎水性表面に非特異的に結合し、水が蛍光色素の蛍光を強力にクエンチする。タンパク質がアンフォールドすると、露出した疎水性表面に色素が結合し、蛍光の増大が起こる。安定性曲線およびそのタンパク質アンフォールディング転移の中間値（融解温度、Ｔｍ）は、温度を徐々に上昇させて、タンパク質をアンフォールドさせ、各時点の蛍光を測定することにより得られる。タンパク質のみについての曲線およびタンパク質＋リガンドについての曲線を測定し、ΔＴｍを算出する。正のΔＴｍ値は、リガンドが変性からタンパク質を安定化すること、したがって、タンパク質に結合することを示す。蛍光ベースの熱シフトアッセイは、容易に入手可能なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）マシンなど、サンプル温度制御と色素蛍光検出を兼ね備えた機器で実施することができる。
【００４３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）手法は、表面への分子結合の測定および表面固定化タンパク質と溶液中の他のタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、または小分子などの検体との結合定数の定量に関する、標識の使用を必要としない確立された方法である。ＳＰＲ効果は、固定化表面に隣接する溶液の屈折率の変化に依存し、極めて感度がよい。結合応答は、共鳴単位（ＲＵ）で測定され、センサーチップ表面上の分子量に比例し、結果として表面上の分子数に比例する。相互作用の親和性は、速度定数（Ｋｄ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓ）の比から、または種々の濃度の検体における応答の線形もしくは非線形フィッティングにより算出することができる。
【００４４】
飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ−ＮＭＲ）は、タンパク質などの巨大分子の受容体への小分子リガンドの一過性の結合を検出可能にする。ＳＴＤ−ＮＭＲでは、受容体からその結合リガンドに伝達された磁化を、リガンド自体に由来するＮＭＲシグナルを直接観察することにより測定する。タンパク質シグナルを含有するが、リガンドシグナルを含有しない（１）Ｈ  ＮＭＲスペクトル領域に、低出力照射が加えられる。この照射は、スピン拡散の過程により膜タンパク質全体に迅速に広がり、タンパク質（１）Ｈ  ＮＭＲシグナルをすべて飽和させる。膜タンパク質に一過性に結合したリガンドからの（１）Ｈ  ＮＭＲシグナルは飽和状態になり、解離すると、遊離リガンドのプールから測定される（１）Ｈ  ＮＭＲシグナルの強度を低下させるように作用する。この実験は、リガンドへの飽和移動をもたらさない条件である、タンパク質およびリガンドのスペクトル領域の外部に設定された照射パルスで繰り返される。２つの得られたスペクトルを差し引くと差スペクトルが得られる。得られた差スペクトルから、飽和を受けた共鳴のみ、すなわち、受容体の共鳴および受容体に結合した化合物の共鳴が得られる。したがって、ＳＴＤ−ＮＭＲを使用して、化合物の結合エピトープを決定することができる。競合ＳＴＤ−ＮＭＲ法は、ＳＴＤ−ＮＭＲを競合結合実験と組み合わせて、ＮＭＲ時間スケール上でゆっくりした化学交換を受ける高親和性リガンドの検出を可能にするものである。この手法を用いると、化合物混合物中の競合する高親和性リガンドの存在を、低親和性の指標リガンドのＳＴＤシグナルの消失または低下により検出することができる。したがって、この方法を使用して、ＳＴＤ指標のシグナル強度の低下に基づき、化合物の結合親和性（Ｋｄ）を得ることができる。
【００４５】
本明細書に記載する、ＭＬＫＬタンパク質の偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合する化合物は、記載の機能を実行し、それによってネクロトーシスの阻害をもたらすいかなる化合物であってもよい。化合物は、何ら特定の化学種、形態、サイズ、形状、またはコンフォメーションに限定されるものではないことを強調する。したがって、化合物は、合成化合物、有機合成薬物、小分子有機薬物、天然小分子化合物、他の小分子化合物、およびペプチドからなる群から選択することができる。
【００４６】
そのような化合物は、当業者に公知である任意の方法で同定することができる。化合物は、標的化薬物開発を通して、または市販ライブラリーのスクリーニングを通して同定することができる。市販ライブラリーのそのようなスクリーニングには、中程度または高度スループットスクリーニングが含まれるであろう。一実施形態では、化合物は、１つまたは複数の市販ライブラリーのスクリーニングを通して同定される。
【００４７】
ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、エフェクターキナーゼによるＭＬＫＬのリン酸化を阻害することも、またはＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、エフェクターキナーゼによるＭＬＫＬのリン酸化を阻害しないこともある。本開示は、本明細書に記載する、ＭＬＫＬタンパク質の偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合する化合物が、エフェクターキナーゼによるＭＬＫＬのリン酸化を阻害することなく、ネクロトーシスを阻害することができることを実証する。一実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、エフェクターキナーゼによるＭＬＫＬのリン酸化を阻害しない。別の実施形態では、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への化合物の結合は、エフェクターキナーゼによるＭＬＫＬのリン酸化を阻害する。
【００４８】
本明細書に記載する化合物は、いかなる適切な化学種、形態、サイズ、形状、およびコンフォメーションであってもよい。一実施形態では、化合物は、約１０００Å３以下の体積を占める。一実施形態では、化合物は、約９００Å３以下の体積を占める。一実施形態では、化合物は、約８００Å３以下の体積を占める。一実施形態では、化合物は、約７００Å３以下の体積を占める。一実施形態では、化合物は、約６００Å３以下の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約９００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約８００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約７００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約３００Å３〜約９００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約３００Å３〜約８００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約３００Å３〜約７００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約４００Å３〜約６００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約３００Å３〜約６００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約６００Å３の体積を占める。別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約５００Å３の体積を占める。さらに別の実施形態では、化合物は、約２００Å３〜約４００Å３の体積を占める。
【００４９】
本開示の一実施形態では、化合物は、化学式
【化８】
2017521477.tif 000009
［式中、Ｒ１は、３−ＭｅＳＯ２ＣＨ２−、４−ＭｅＳＯ２ＣＨ２−、３−Ｈ２ＮＳＯ２−、および４−Ｈ２ＮＳＯ２−からなる群から選択され；かつ
Ｒ２は、ＯＣＦ３、ＣＦ３、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、およびＣＯＭｅからなる群から独立して選択される０〜２個の置換基である］
を有するか、またはその薬学的に許容される誘導体、多形体、塩、もしくはプロドラッグである。
【００５０】
一実施形態では、Ｒ１は、３−Ｈ２ＮＳＯ２−である。別の実施形態では、Ｒ１は、４−Ｈ２ＮＳＯ２−である。
【００５１】
一実施形態では、Ｒ２は、０個の置換基である。別の実施形態では、Ｒ２は、４−ＯＣＦ３である。さらに別の実施形態では、Ｒ２は２個の置換基であり、この２個の置換基は３−ＣＦ３および６−フルオロである。
【００５２】
さらなる実施形態では、化学式ＩＩＩの化合物は、化合物１〜４
【化９】
2017521477.tif 000010
からなる群から選択される。
【００５３】
さらに別の実施形態では、化学式ＩＩＩの化合物は化合物１
【化１０】
2017521477.tif 000011
である。
【００５４】
一態様では、ネクロトーシスを阻害するための化合物は、化学式（Ｉ）：
【化１１】
2017521477.tif 000012
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）ＲＲ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、−またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である。
【００５５】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための化合物は、化学式（ＩＩ）：
【化１２】
2017521477.tif 000013
［式中、
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、−またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である。
【００５６】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための化合物は、化学式（Ｉ）：
【化１３】
2017521477.tif 000014
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、
【化１４】
2017521477.tif 000015
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ  Ｒ７Ｒ７Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である。
【００５７】
さらに別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための化合物は、化学式（ＩＩ）：
【化１５】
2017521477.tif 000016
［式中、
Ｄは、
【化１６】
2017521477.tif 000017
であり
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡであり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２ＲＳ、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である。
【００５８】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための化合物は、化学式（Ｉ）：
【化１７】
2017521477.tif 000018
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ＝Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｒ８）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである］
による化学式を有するか、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体である。
【００５９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化１８】
2017521477.tif 000019
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）ＲＲ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、−またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化１９】
2017521477.tif 000020
［式中、
Ｄは、−Ｎ（Ｈ）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；かつ
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化２０】
2017521477.tif 000021
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ≡Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、
【化２１】
2017521477.tif 000022
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ  Ｒ７Ｒ７Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（ＩＩ）：
【化２２】
2017521477.tif 000023
［式中、
Ｄは、
【化２３】
2017521477.tif 000024
であり、
ｑは、１、２、または３であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡであり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＯであり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２ＲＳ、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ６は、−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される基であり、ここで、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｏ）ＮＲ７Ｒ７、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７Ｒ７、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７Ｒ７であり；かつ
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリール、またはヘテロアリールである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてネクロトーシスを阻害するための方法であって、化学式（Ｉ）：
【化２４】
2017521477.tif 000025
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲは、水素、ハロゲン、またはシアノであり；
Ｊは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アラルキル、シアノアルキル、−（ＣＨ２）ＰＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｔＨ、−（ＣＨ２）ＰＣ＝Ｃ（ＣＨ２）ｔＨ、またはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；
ｐは、１、２、または３であり；
ｔは、０または１であり；
Ｄは、−Ｎ（Ｒ８）（Ｘ）であり；
Ｘは、−（Ｘ１）−（Ｘ２）ｑ−（Ｘ３）により定義される基であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｃ（Ｏ）もしくはＣ（Ｓ）であり、かつｑは１であるか、または
Ｘ１は、−Ｃ（Ｏ）もしくは−Ｓ（Ｏ）２であり、かつｑは０であり、
Ｘ２は、Ｎ（Ｈ）またはＯであり、かつ
Ｘ３は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであるか、または
−（Ｘ４）ｚ−（Ｘ５）により定義される少なくとも１つの基により置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アリール、アラルキル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｘ４はＣ（Ｈ）２であり、ｚは０、１、２、３、または４であり、かつ
Ｘ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ハロ、−ＣＮ、−ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’、ＯＲ’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’’’、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、
Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；
Ｒ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、−ＮＲ３Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１、またはＣ（Ｏ）Ｒ１であり；かつ
Ｒ’’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＯＲ１、または−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｑ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ２ハロアルコキシであり；
Ｑ２は、Ａ１またはＡ２であり；
Ｑ２がＡ２である場合、Ｑ３はＡ１であり、Ｑ２がＡ１である場合、Ｑ３はＡ２であり；
ここで、
Ａ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＯＲ１であり、
Ａ２は、−（Ｚ）ｍ−（Ｚ１）−（Ｚ２）により定義される基であり、
ここで、
ＺはＣＨ２であり、かつｍは０、１、２、もしくは３であるか、または
ＺはＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
Ｚは酸素であり、かつｍは０もしくは１であるか、または
ＺはＣＨ２ＮＲ２であり、かつｍは０もしくは１であり；
Ｚ１は、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ＮＲ３Ｒ４、アリール、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ヘテロシクリル、および−ＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ５から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり；かつ
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである］
による化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６４】
別の態様では、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）の新規化合物がさらに提供される。
【００６５】
別の態様では、被験体のネクロトーシスを阻害するための薬物の調製における、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）の化合物の使用が提供される。
【００６６】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害するための、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物の使用が提供される。
【００６７】
さらに別の態様では、ネクロトーシスの阻害に使用するための化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物が提供される。
【００６８】
さらに別の態様では、ネクロトーシスを阻害するために使用する場合の、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）による化合物が提供される。
【００６９】
化学式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの塩は、好ましくは薬学的に許容されるが、薬学的に許容されない塩もまた、これらが薬学的に許容される塩の調製における中間体として有用であるので、本開示の範囲内に入る。
【００７０】
「薬学的に許容される」という用語は、任意の薬学的に許容される塩、水和物もしくはプロドラッグ、または被験体に投与すると、化学式Ｉ、ＩＩ、および／もしくはＩＩＩの化合物、またはその活性代謝物もしくは残基を（直接的または間接的に）提供することができる任意の他の化合物を記載するために使用することができる。
【００７１】
適切な薬学的に許容される塩としては、以下に限定されるものではないが、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸などの薬学的に許容される無機酸の塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、および吉草酸などの薬学的に許容される有機酸の塩が挙げられる。
【００７２】
塩基性塩としては、以下に限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アンモニウムなどの薬学的に許容されるカチオンで形成される塩、トリエチルアミンから形成される塩などのアルキルアンモニウム、エタノールアミンで形成される塩などのアルコキシアンモニウム、およびエチレンジアミン、コリン、またはアルギニン、リジン、もしくはヒスチジンなどのアミノ酸から形成される塩が挙げられる。薬学的に許容される塩のタイプおよびその形成に関する全般的な情報は、当業者に公知であり、”Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓａｌｔｓ”Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ，Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨなどの一般的なテキストに記載のとおりである。
【００７３】
塩基性窒素含有基は、塩化、臭化、およびヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチルなどの低級アルキルハライド；硫酸ジメチルおよび硫酸ジエチルのような硫酸ジアルキル；ならびにその他のものなどの試剤で四級化することができる。
【００７４】
プロドラッグとしては、アミノ酸残基、または２つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖が、化学式Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩの化合物の遊離アミノ基およびアミド基に共有結合している化合物が挙げられる。アミノ酸残基としては、３文字記号により一般に表記される２０種の天然アミノ酸が挙げられ、さらに、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デモシン、イソデモシン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン（ｎｏｒｖｌｉｎ）、β‐アラニン、γ−アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、およびメチオニンスルホンも挙げられる。プロドラッグとしてはまた、カルボネート、カルバメート、アミド、およびアルキルエステルが、カルボニル炭素プロドラッグ側鎖を介して、化学式Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩの上記置換基に共有結合している化合物が挙げられる。プロドラッグには、共有結合性の不可逆的阻害剤および可逆的阻害剤が含まれ得る。
【００７５】
固体である化合物の場合には、発明化合物、薬剤、および塩は、種々の結晶形態または多形形態で存在することができ、それらはすべて、本発明および指定した化学式の範囲内にあることが意図されることは、当業者により理解されよう。
【００７６】
「多形」という用語は、無水形態、含水形態、溶媒和形態、および混合型溶媒和形態など、化学式Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩの化合物の任意の結晶形態を含む。
【００７７】
化学式（Ｉ）、化学式（ＩＩ）、および／または化学式（ＩＩＩ）は、化合物の適用可能な溶媒和形態および非溶媒和形態を包含することが意図される。したがって、化学式（Ｉ）、化学式（ＩＩ）、および／または化学式（ＩＩＩ）は、水和または溶媒和形態ならびに非水和および非溶媒和形態を含む、指示構造を有する化合物を含む。
【００７８】
医薬組成物は、例えば、局所（例えば、経皮または点眼）、経口、頬側、経鼻、経膣、直腸、または非経口投与を含む、任意の適切な投与経路用に化学式（Ｉ）、化学式（ＩＩ）、および／または化学式（ＩＩＩ）による化合物から製剤化することができる。本明細書で使用する非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液内、および腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または点滴手法を含む。特定の実施形態では、経口使用または非経口使用に適した形態の組成物が好ましい。適切な経口形態としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤が挙げられる。静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与の場合、１つまたは複数の化合物は、レシピエントの血液と好ましくは等張である無菌水溶液と組み合わせることができる。そのような製剤は、塩化ナトリウムまたはグリシンなどの生理学的に適合する物質を含有し、生理学的条件に適合する緩衝化ｐＨを有する水に、固体の活性成分を溶解して水溶液を作製し、前記溶液を無菌にすることにより調製することができる。この製剤は、密封したアンプルまたはバイアルなどの単位用量または複数用量の容器に入れることができる。成分の例は、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ−Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９３）ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【００７９】
本明細書の文脈では、「投与すること」という用語ならびに「投与する」および「投与」を含む、その用語の変化形は、本発明の化合物または組成物を任意の適切な手段により生物または表面に接触させること、塗布すること、送達させること、または提供することを含む。
【００８０】
ネクロトーシスの阻害の場合、本発明による生物学的に活性な化合物の用量は、広範囲に変動させることができ、個々の要求に合わせることができる。本発明による活性化合物は、通常、治療有効量で投与される。好ましい用量は、１日あたり体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇの範囲である（例えば、１日当たり１患者当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。１日用量は、単回用量として投与しても、複数回で投与してもよい。単回投薬形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される被験体および特定の投与方法に応じて異なる。投薬量単位形態は、通常、活性成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間で含有する。
【００８１】
しかしながら、任意の特定の被験体に対する具体的な用量レベルは、具体的な使用化合物の活性、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、薬物併用（すなわち、被験体の処置に使用される他の薬物）、ならびに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む、種々の因子に依存することになることは理解されよう。化合物が全身的ではなく局所的に、また治療のためではなく予防のために投与される場合には、投薬量は通常減少する。そのような処置は、必要に応じて、また処置医が必要と判断した期間施される。当業者ならば、投与される化学式（Ｉ）の化合物の投薬量レジメンまたは治療有効量が各個体に対して最適化される必要があり得ることを認識されよう。医薬組成物は、約０．１〜２０００ｍｇの範囲で、好ましくは約０．５〜５００ｍｇの範囲で、最も好ましくは約１〜２００ｍｇの間の範囲で活性成分を含有することができる。約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間の１日用量が適切であることがある。１日用量は、１日当たり１〜４回投与で投与することができる。
【００８２】
また、異なる障害の処置に対しては異なる投薬量が必要となり得ることも認識されよう。薬剤の有効量とは、ネクロトーシスを統計的に有意に低下させる量である。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析の場合、ネクロトーシス阻害は、本明細書に定義される生物試験に記載されるＴＳＱ誘導ネクロトーシスを測定するために使用されるアッセイによって判定することができる。
【００８４】
「治療有効量」または「有効量」という用語は、ネクロトーシスの症状および／または関連疾患もしくはその症状の改善または治療をもたらす化学式（Ｉ）の化合物の量を指す。
【００８５】
「処置すること」、「処置」、および「治療」という用語は、治癒的治療、予防的治療、および防止的治療を指すために使用される。したがって、本開示の文脈では、「処置すること」という用語は、ネクロトーシスおよび／または関連疾患もしくはその症状の治癒、寛解、または重症度の緩和を包含する。
【００８６】
「防止すること」または「防止」とは、本発明の化合物または医薬組成物の投与後に進展する場合、ネクロトーシスの発生の防止またはネクロトーシスの重症度の緩和を意味する。
【００８７】
「被験体」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。したがって、ヒトの処置に有用であることに加えて、本発明の化合物はまた、伴侶動物および家畜、例えば、以下に限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタを含む哺乳動物の獣医学的処置にも有用であり得る。
【００８８】
「阻害する」という用語は、ネクロトーシスの防止、低減、またはさもなければ寛解をもたらす、完全阻害および部分阻害を含む任意の阻害形態を記載するために使用される。
【００８９】
本開示の方法は、被験体の以下の疾患を防止または処置するために使用することができる：
・骨、関節、結合組織、および軟骨の疾患、例えば、骨粗鬆症、骨髄炎、関節炎、例えば、骨関節炎、関節リウマチおよび乾癬性関節炎、乏血壊死、進行性化骨性線維異形成、くる病、クッシング症候群など；
・筋ジストロフィーなどの筋疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ミオパシーおよび筋無力症など；
・皮膚疾患、例えば、皮膚炎、湿疹、乾癬、老化、または瘢痕変化；
・心血管疾患、例えば、心臓虚血および／または血管虚血、心筋梗塞、虚血性心疾患、慢性または急性うっ血性心不全、不整脈、心房細動、心室細動、発作性頻脈、うっ血性心不全、肥厚性心疾患、無酸素症、低酸素症、抗癌剤治療による副次的効果；
・循環系疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ，２０１３）、動脈硬化症および末梢血管疾患、脳血管発作、動脈瘤；
・血液および血管の疾患、例えば：貧血症、血管アミロイドーシス、出血、鎌状赤血球症、赤血球細片症候群、好中球減少症、白血球減少症、髄質形成不全、汎血球減少症、血小板減少症、血友病；
・肺炎、喘息を含む肺疾患；肺の閉塞性慢性疾患、例えば、慢性気管支炎および肺気腫など；
・消化管疾患、例えば、潰瘍；
・肝臓疾患、例えば、肝炎、特にウイルス起源または原因物質として他の感染病原体を有する肝炎、自己免疫性肝炎、劇症肝炎、特定の遺伝性代謝障害、ウィルソン病、肝硬変、非アルコール性脂肪肝、毒素および薬物による肝疾患、例えば、薬剤誘発性肝障害（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２０１４））など；
・膵臓疾患、例えば、急性または慢性膵炎など（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１３）；
・代謝疾患、例えば、真性糖尿病および尿崩症、甲状腺炎；
・腎臓疾患、例えば、急性腎障害または糸球体腎炎など；
・ウイルスおよび細菌感染、例えば、敗血症；
・化学薬品、毒素、または薬物による重篤な中毒；
・後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連した変性疾患；
・加齢に関連した障害、例えば、早老症；
・炎症性疾患、例えば、クローン病を含む終末回腸炎（Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；Ｗｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１）、リウマチ様多発性関節炎、ＴＮＦ誘発全身性炎症性症候群（Ｄｕｐｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１１）；
・自己免疫疾患、例えば、紅斑性ループス；
・歯科障害、例えば、歯周病などの組織崩壊をもたらすものなど；
・眼科疾患または障害、例えば、糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、網膜変性症、網膜色素変性症、網膜円孔または網膜裂孔、網膜剥離（Ｔｒｉｃｈｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０）、網膜虚血、外傷に関連した急性網膜症、炎症性変性症、術後合併症、薬剤誘発性網膜症、白内障、錐体細胞変性症（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１２）；
・聴覚伝導路の障害、例えば、耳硬化症および抗生物質誘発性聴覚障害；
・虚血性再灌流傷害（Ｌｉｎｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｙｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，２０１２；Ｏｅｒｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｂａｓ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１２）；
・ニューロン喪失（Ｖｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１４）；
・ミトコンドリアに関連した疾患（ミトコンドリア病）、例えば、フリードリヒ運動失調症、構造的ミトコンドリア異常による先天型筋ジストロフィー、特定のミオパシー（ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＦＦ症候群、ピアソン症候群）、ＭＩＤＤ（ミトコンドリア糖尿病および聴覚障害）症候群、ヴォルフラム症候群、ジストニア；ならびに
・癌および転移、例えば、以下に限定されるものではないが、肺および気管支の癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮肺癌、細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）、肺腺癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；前立腺癌、例えば、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺癌；乳癌、例えば、転移性乳癌；膵臓癌；結腸および直腸の癌；甲状腺癌；肝臓および肝内胆管の癌；肝細胞癌；胃癌；子宮内膜癌；黒色腫；腎臓、腎盂、膀胱、子宮体部、および子宮頚部の癌；卵巣癌、例えば、進行性上皮性または原発性腹膜癌；多発性骨髄腫；食道癌、例えば、食道の扁平上皮癌および腺癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；加速期ＣＭＬおよびＣＭＬ急性転化期（ＣＭＬ−ＢＰ）を含む慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；リンパ球性白血病；骨髄性白血病；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；ホジキン病（ＨＤ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えば、濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；Ｔ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫（ＭＭ）；アミロイドーシス；ワルデンストレームマクログロブリン血症；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、例えば、不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）（過剰芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）および形質転換のＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−Ｔ）；ならびに骨髄増殖性症候群；脳の癌、例えば、神経膠腫／神経膠芽腫、退形成乏突起膠腫、および成人未分化星状細胞腫；神経内分泌癌、例えば、転移性神経内分泌腫瘍；頭頸部癌、例えば、頭頸部の扁平上皮癌および鼻咽腔癌など；口腔、咽頭、および小腸の癌；骨癌；軟部肉腫；ならびに絨毛結腸腺腫。
【００９０】
本方法はまた、移植の前、最中（摘出、運搬、および／もしくは再移植）、または後にかかわらず、細胞、組織、および／または移植臓器を保護するために使用することができる。
【００９１】
一実施形態では、本開示の方法において、被験体は過剰な血管新生に関連した増殖性障害に罹患していない。さらなる実施形態では、増殖性障害は癌である。
【００９２】
本開示はまた、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に結合することにより、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。したがって、別の態様では、本開示は、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって：
ａ）ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬを含有するタンパク質溶液を候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）を、候補化合物の非存在下で得られるアンフォールディングの転移温度（Ｔｍ）と比較して、アンフォールディングの転移温度の変化（ΔＴｍ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
正のΔＴｍ値により、候補化合物が変性からタンパク質を安定化し、ネクロトーシスにおけるその役割を阻害することが示される、
方法を提供する。
【００９３】
一実施形態では、スクリーニング方法は、蛍光色素を含むタンパク質溶液を含む。蛍光色素は、当業者により決定される、そのような使用に適した任意の色素であってよい。一実施形態では、蛍光色素はＳＹＰＲＯオレンジである。
【００９４】
スクリーニング方法は、当業者により決定される、そのような使用に適していることが公知の任意の機器で実施することができる。一実施形態では、機器において、サンプル温度制御および色素蛍光検出が一体化している。別の実施形態では、機器は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）マシンである。
【００９５】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用を可能にする条件下で、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを漸増濃度の候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）結合親和性（Ｋｄ）を決定するステップとを含み、
ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、
候補化合物の結合により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法が提供される。
【００９６】
スクリーニング方法は、当業者により決定される、そのような使用に適していることが公知の任意の方法で実施することができる。さらに、スクリーニング方法は、当業者により決定される、そのような使用に適していることが公知の任意の機器で実施することができる。一実施形態では、スクリーニング方法はＳＰＲを含み、ＳＰＲマシン上で実施される。別の実施形態では、スクリーニング方法は、センサーチップ上に固定化されたＭＬＫＬ偽キナーゼドメインの使用を含む。さらなる実施形態では、固定化されたＭＬＫＬ偽キナーゼドメインは二重のＨｉｓタグを付けられている。さらに別の実施形態では、スクリーニング方法はＳＰＲを含み、ＳＰＲマシン上で実施され、センサーチップ上に固定化されたＭＬＫＬ偽キナーゼドメインの使用を含む。
【００９７】
本開示では、「ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインと候補化合物の相互作用を可能にする条件下」という用語は、そのような相互作用が可能である条件をすべて含む。そのような条件は、公知であるか、または当業者により容易に決定されよう。
【００９８】
別の態様では、ネクロトーシスを阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを含有するタンパク質溶液を、ヌクレオチドおよび候補化合物と接触させて、ＳＴＤ−ＮＭＲを実施するステップと、
ｂ）候補化合物の存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルを、候補化合物の非存在下で得られるＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルと比較するステップとを含み、
ＭＬＫＬと候補化合物の相互作用が、ＭＬＫＬの偽キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位への候補化合物の結合によるものであり、かつ
ＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル強度の消失または低下により、候補化合物がネクロトーシスを阻害することができることが示される、
方法が提供される。
【００９９】
スクリーニング方法は、当業者により決定される、そのような使用に適していることが公知の任意の方法で実施することができる。
【０１００】
一実施形態では、スクリーニング方法は、ＡＭＰ、ＡＭＰＰＮＰ、ＡＤＰ、およびＡＴＰからなる群から選択されるヌクレオチドの使用を含む。別の実施形態では、スクリーニング方法は、ＡＴＰおよびＡＤＰからなる群から選択されるヌクレオチドの使用を含む。別の実施形態では、ヌクレオチドはＡＴＰである。別の実施形態では、ヌクレオチドはＡＤＰである。
【０１０１】
本開示では、「タンパク質溶液」という用語は、スクリーニング方法を実施することを可能にする適切な様式で、ＭＬＫＬタンパク質またはその一部を含有する任意の溶液を含む。適切な「タンパク質溶液」は、公知であるか、または当業者により容易に決定されよう。一実施形態では、「タンパク質溶液」は追加の成分を含むことができる。追加の成分は、使用されるスクリーニング方法により必要とされる任意の成分を含む。
【０１０２】
本開示のスクリーニング方法は、任意の種に由来するＭＬＫＬで実施することができる。一実施形態では、ＭＬＫＬは上記に定義されるマウスＭＬＫＬである。別の実施形態では、ＭＬＫＬは上記に定義されるヒトＭＬＫＬである。
【０１０３】
本開示のスクリーニング方法はまた、細胞のネクロトーシスを阻害する能力を判定するための細胞死アッセイを含むことができる。細胞死アッセイは、細胞培養または組織培養で実施することができる。本スクリーニング方法で使用される細胞は、天然遺伝子と組換え遺伝子の間の差に関係なく、ＭＬＫＬを発現することができる任意の細胞であってよい。さらに、ＭＬＫＬの由来は特に限定されない。さらに、ＭＬＫＬをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含有する形質転換細胞も使用することができる。
【０１０４】
細胞は、ヒト細胞でも非ヒト細胞でもよい。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。
【０１０５】
適切なヒト細胞の例には、癌細胞および非癌細胞が含まれる。一実施形態では、ヒト細胞は非癌細胞株である。別の実施形態では、ヒト細胞は癌細胞株である。一実施形態では、ヒト細胞は白血病細胞株である。白血病細胞株は、以下に限定されるものではないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄単球性白血病、およびＴ細胞白血病からなる群から選択され得る。白血病細胞株は、以下に限定されるものではないが、ジャーカットＴ細胞、ジャーカット細胞のＦＡＤＤ欠損変異株、Ｍｖ４；１１細胞、ＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞、およびＵ９３７細胞からなる群から選択され得る。一実施形態では、ヒト細胞はＵ９３７細胞である。別の実施形態では、ヒト細胞はヒト結腸腺癌細胞株である。一実施形態では、ヒト結腸腺癌細胞株はＨＴ２９である。
【０１０６】
適切な非ヒト哺乳動物細胞としては、以下に限定されるものではないが、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、ウサギ、ウマ科（例えば、ウマ）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウシ科（例えば、ウシ）、ヒツジ（例えば、ヒツジおよびヤギ）、霊長類（例えば、サル）、鳥類（例えば、ニワトリ）等が挙げられる。非ヒト哺乳動物細胞および鳥類細胞の例としては、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＤＴ４０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＭＴＫ細胞、およびＶｅｒｏ細胞；初代培養細胞；造血幹細胞；造血細胞および血液細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、白血球、単球およびマクロファージ、赤血球、および血小板；受精卵母細胞；ならびにＥＳ細胞が挙げられる。さらに、種々の組織細胞、腎臓細胞、線維芽細胞、およびミエローマ細胞などの他の細胞も使用することができる。一実施形態では、細胞はげっ歯類細胞である。別の実施形態では、細胞はマウス細胞である。別の実施形態では、細胞はマウス皮膚線維芽細胞（ＭＤＦ）である。
【０１０７】
したがって、一実施形態では、本開示は、ネクロトーシスによる細胞死をレスキューする能力を試験するステップをさらに含む、本明細書に記載するスクリーニング方法を提供する。一実施形態では、試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイで実施される。さらなる実施形態では、細胞はマウス皮膚線維芽細胞（ＭＤＦ）である。
【０１０８】
細胞死アッセイは、当業者により決定される、適切であることが公知である任意の方法で実施することができる。一実施形態では、細胞死アッセイは、ネクロトーシス刺激の非存在下または存在下における、フローサイトメトリーを使用する、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みの測定を含む。
【０１０９】
本開示の細胞死アッセイでは、ネクロトーシスは、当業者により決定される、適切であることが公知である任意の方法で細胞に誘導することができる。一実施形態では、ネクロトーシスは、以下のいずれか１つまたは複数から選択される因子により刺激される：ＴＮＦ（Ｔ）；Ｓｍａｃミメティック（Ｓ）；および汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（Ｑ）。別の実施形態では、細胞死アッセイは、ＴＮＦ（Ｔ）、Ｓｍａｃミメティック（Ｓ）、および汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（Ｑ）のネクロトーシス刺激を含み、このネクロトーシス刺激の組合せは、「ＴＳＱ」と称される。
【０１１０】
本明細書に記載の方法および化合物は、以下の例示的かつ非限定的な実施例により説明される。
【実施例】
【０１１１】
１．１  材料および方法
化合物
化合物１は、市販ライブラリーのスクリーニングで同定された。
参照される温度はすべて℃である。
以下の化合物の名称は、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ  １２．０を使用して得られた。
【０１１２】
略語
ＡｃＯＨ  酢酸
（Ｂｏｃ）２Ｏ  ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート
ＣＤＣｌ３  重水素化クロロホルム
ＣＤＩ  １，１’−カルボニルジイミダゾール
Ｃｓ２Ｃ０３  炭酸セシウム
ＤＭＳＯｄ６  重水素化ジメチルスルホキシド
ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＴＥＡ  トリエチルアミン
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＥｔＯＨ  エタノール
ｈｒ  時
ＨＡＴＵ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ  塩酸／塩化水素
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
Ｋ２ＣＯ３  炭酸カリウム
ＬＣＭＳ  液体クロマトグラフィー‐質量分析
Ｍ  モル（濃度）
ＭｅＯＨ  メタノール
ｍｉｎ  分
Ｍ／Ｚ  質量／電荷比（質量分析）
Ｎａ２ＣＯ３  炭酸ナトリウム
ＮａＨ  水素化ナトリウム
ＮａＨＣＯ３  炭酸水素ナトリウム
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４  硫酸ナトリウム
ＮＨ４Ｃｌ  塩化アンモニウム
ＮＭＰ  Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＮＭＲ  核磁気共鳴
Ｐｄ／Ｃ  活性炭上のパラジウム
Ｒｔ  保持時間
ｒｔ  室温
ＳＯＣｌ２  塩化チオニル
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴｓＯＨ  塩化トシル
【０１１３】
ＬＣＭＳ法
エレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）は、以下の方法を使用して実施した；
方法Ａ（１０分間法）：逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析（カラム：Ｇｅｍｉｎｉ  ３μ  Ｃ１８  ２０×４．０ｍｍ  １１０Ａ）、溶媒Ａ：水  ０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル  ０．１％ギ酸、グラジエント：１０分間にわたる１０〜１００％Ｂ、検出：１００〜６００ｎｍを使用し、ソース温度３００℃によるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ポジティブモードを使用するＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｍａｘ。
方法Ｂ（５分間法）：ＬＣモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００（ポンプタイプ：バイナリポンプ、検出器タイプ：ＤＡＤ）。ＭＳモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ６１１０Ａ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ。カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ−Ｃ１８、２．５μｍ、２．１×３０ｍｍ。カラム温度：３０℃。取得波長：２１４ｎｍ、２５４ｎｍ。移動相：Ａ：０．０７％ＨＣＯＯＨ水溶液、Ｂ：ＭｅＯＨ。実行時間：５分間ＭＳ：イオン源：ＥＳ＋（またはＥＳ−）。ＭＳ範囲：５０〜９００ｍ／ｚ。フラグメンター：６０。乾燥ガス流量：１０Ｌ／分。ネブライザー圧力：３５ｐｓｉ。乾燥ガス温度：３５０℃。Ｖｃａｐ：３．５ｋＶ。
【０１１４】
分取質量指示ＬＣ
方法Ａ：
機器：
Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ  ３１００−質量検出器、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５−ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ＳＦＯシステムフルイディクスオーガナイザー、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６ダイオードアレー検出器、Ｗａｔｅｒｓ  ２７６７サンプルマネージャー
【０１１５】
ＬＣ条件：
逆相ＨＰＬＣ分析
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＴＭ  Ｃ１８  ５μｍ  １９×５０ｍｍ。注入量５００μｌ
溶媒Ａ：水  ０．１％ギ酸。溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ  ０．１％ギ酸
グラジエント：４分間にわたる５％Ｂ、次いで８分間にわたる５〜１００％Ｂ、次いで４分間にわたる１００％Ｂ
流速：１９ｍＬ／分。検出：１００〜６００ｎｍ
【０１１６】
ＭＳ条件：
イオン源：シングル四重極。イオンモード：ＥＳポジティブ。ソース温度：１５０℃
脱溶媒温度：３５０℃。検出：イオンカウント。キャピラリー（ｋＶ）−３．００。コーン（Ｖ）：３０
エクストラクター（Ｖ）：３。ＲＦレンズ（Ｖ）：０．１。スキャン範囲：１００〜１０００Ａｍｕ。スキャン時間：０．５秒
取得時間：１０分間
ガス流量：
脱溶媒  Ｌ／時−６５０
コーン  Ｌ／時−１００
【０１１７】
分取ＨＰＬＣ
機器タイプ：
ＶＡＲＩＡＮ  ９４０  ＬＣ。ポンプタイプ：バイナリポンプ。検出器タイプ：ＰＤＡ
【０１１８】
ＬＣ条件：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１９×１００ｍｍ。取得波長：２１４ｎｍ、２５４ｎｍ。移動相：Ａ：０．０７％ＴＦＡ水溶液、Ｂ：ＭｅＯＨ、０．０７％ＴＦＡ。
【０１１９】
ＮＭＲ
核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ、６００ＭＨｚまたは４００ＭＨｚ）スペクトルは、他に指示がない限り、溶媒としてＣＤＣｌ３を用いて、３００Ｋで取得した。化学シフトはδ尺度にてｐｐｍで報告し、適切な溶媒ピークを基準とする。
【０１２０】
中間体Ａの合成
【化２５】
2017521477.tif 000026
ステップ１：Ｎ−メチル−４−ニトロベンゼンアミン
１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（５０．０ｇ、３５４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２００ｍＬ）溶液に、メタンアミン塩酸塩（４７．１ｇ、７０９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（９８．０ｇ、７０９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、窒素雰囲気下、７０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣ分析から、反応が完了していることが示された。混合物を水に注いで沈殿を得、それを濾別した後、追加の水で洗浄し乾燥して、所望の生成物（５０ｇ、９３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．６３分［ＭＨ］＋＝１５３．１，［ＭＮａ］＋＝１７５．１．
【０１２１】
【化２６】
2017521477.tif 000027
ステップ２：２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン
Ｎ−メチル−４−ニトロベンゼンアミン（３０．０ｇ、１９７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５０ｍＬ）溶液に、２，４−ジクロロピリミジン（２９．４ｇ、１９７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４０．８８ｇ、２９６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で一晩撹拌した。この混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で希釈し、有機相を合わせて、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、残渣を得、それをシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、１０：１〜３：１）により精製して、所望の生成物（２０ｇ、３８％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．３４分［ＭＨ］＋＝２６５．０，２６７．０，［ＭＮａ］＋＝２８７．０，２８９．０．
【０１２２】
【化２７】
2017521477.tif 000028
ステップ３：３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）溶液に、３−アミノベンゼンスルホンアミド（６５１ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）および濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を、マイクロ波下、１６０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳおよびＴＬＣ分析から、反応が完了していることが示された。溶媒を減圧除去して残渣を得た。この残渣をＮａＯＨ水溶液（４Ｍ）およびＤＣＭに溶解した。有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、残渣を得、それをシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、３０：１〜１０：１）により精製して、所望の生成物（１ｇ、６７％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．９６分［ＭＨ］＋＝４０１．１．
【０１２３】
【化２８】
2017521477.tif 000029
ステップ４：（中間体Ａ）３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（８００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、亜鉛（１．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびＮＨ４Ｃｌ（水溶液３０ｍｌ）を加えた。この反応混合物を９０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳおよびＴＬＣ分析により、反応が完了していることが示された。混合物を濾別し、液体を真空濃縮してＥｔＯＨを除去した後、混合物を濾別して所望の生成物（３２０ｍｇ、４３％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．３４（ｓ，３Ｈ）５．２２（ｓ，２Ｈ）５．６８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）６．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）６．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）７．２３（ｓ，２Ｈ）７．４１（ｍ，２Ｈ）７．８１（ｍ，２Ｈ）８．５７（ｓ，１Ｈ）８．４２（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．３７分［ＭＨ］＋＝３７０．１．
【０１２４】
中間体Ｂの合成
【化２９】
2017521477.tif 000030
ステップ１：（中間体Ｂ）３−（４−（メチル（４−（３−フェニルウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
ボトムフラスコに対して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（中間体Ａ（１．５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ピリジン（３２０ｍｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を加えた。フェニルクロロホルメート（６９８ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を、この混合物に徐々に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去した。粗製物を水（２×５０ｍＬ）、ジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）で洗浄し乾燥して、フェニル（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）カルバメート（１．５ｇ、７６％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５４（ｓ，３Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｍ，５Ｈ），７．４５（ｍ，５Ｈ），７．６８（ｍ，４Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），８．６２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．１７［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９１．２．
【０１２５】
中間体Ｃの合成
【化３０】
2017521477.tif 000031
ステップ１：Ｎ１−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ１−メチルベンゼン−１，４−ジアミン
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（中間体Ａの調製のステップ２に由来、１００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０ｍＬ）およびＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）水溶液に溶解した。亜鉛（粉末、２４５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を減圧濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて食塩水（２０  ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去して、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−メチルベンゼン−１，４−ジアミン（８０ｍｇ、９０％）を黄色固体として得、これを次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．１０［Ｍ＋Ｈ］＋＝２３５．１．
【０１２６】
ステップ２：（中間体Ｃ）１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素
ボトムフラスコに対して、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−メチルベンゼン−１，４−ジアミン（７７６ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解した。１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（６７２ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ）をこの混合物に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。白色固体を濾別し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥して、１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素（１．０６ｇ、７３％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．４０（ｓ，３Ｈ）６．２７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）７．３１（ｍ，４Ｈ）７．６０（ｍ，４Ｈ）７．９８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）８．９０（ｓ，１Ｈ）８．９３（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：３．０９［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３８．２．
【０１２７】
尿素類の合成のための基本手順Ａ：
Ｎ２下にある、中間体Ａ（１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、イソシアネート（１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を室温で１６時間撹拌し、減圧濃縮し、残渣を分取質量指示ＬＣにより精製して相当する化合物を得た。
【０１２８】
尿素類の合成のための基本手順Ｂ：
Ｎ２下にある、中間体Ｂ（１ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ溶液に、アリールアミン（２ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を６０℃に１６時間加熱し、減圧濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して相当する化合物を得た。
【０１２９】
２−クロロピリミジンにアニリンを添加するための基本手順Ｃ：
アニリン（１ｍｍｏｌ）および中間体Ｃ（１ｍｍｏｌ）の２−プロパノール（１０ｍＬ）溶液に、濃ＨＣｌ溶液（２滴）を加えた。この反応混合物を８０℃に１６時間加熱した。溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して相当する化合物を得た。
【０１３０】
化合物１
【化３１】
2017521477.tif 000032
３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ａ（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および（４−トリフルオロメトキシフェニル）イソシアネート（５５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１７ｍｇ、１２％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．５０（ｓ，３Ｈ），５．９６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｍ，３Ｈ），７．４０（ｓ，２Ｈ），７．６３（ｍ，７Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，１Ｈ），８．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．３３（ｍ，２Ｈ），１０．６６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４２分［ＭＨ］＋＝５７４．１．
【０１３１】
化合物２
【化３２】
2017521477.tif 000033
３−（３−（メチル（４−（３−フェニルウレイド）フェニル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼン−スルホンアミド
中間体Ａ（５０ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）およびフェニルイソシアネートを使用する基本手順Ａに従って、３−（３−（メチル（４−（３−フェニルウレイド）フェニル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（２．５ｍｇ、２％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５１（ｓ，３Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２５−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．５２（ｍ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．１０分［ＭＨ］＋＝４９０．４．
【０１３２】
化合物３
【化３３】
2017521477.tif 000034
３−（３−（（４−（３−（２−フルオロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェニル）（メチル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ａ（５０ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）および２−フルオロ−５−トリフルオロメチルフェニルイソシアネート（１０．９ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、３−（３−（（４−（３−（２−フルオロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェニル）（メチル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（９ｍｇ、７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５２（ｓ，３Ｈ），５．８８（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｍ，１Ｈ），７．７６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｍ，１Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｍ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．６０分［ＭＨ］＋＝５７６．３．
【０１３３】
化合物４
【化３４】
2017521477.tif 000035
ステップ１：Ｎ−（４−ニトロフェニル）アセトアミド
０℃の４−ニトロアニリン（５．０ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ（７０ｍＬ）溶液に、無水酢酸（３．７７ｍＬ、３９．８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を室温で１６時間撹拌し、減圧濃縮して、標題化合物（６．３６ｇ、９７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ２．１５（ｓ，３Ｈ），７．８０（ｄ，２Ｈ），８．１９（ｄ，２Ｈ）．
【０１３４】
【化３５】
2017521477.tif 000036
ステップ２：Ｎ−（４−アミノフェニル）アセトアミド
水素化ホウ素ナトリウム（２．８７ｇ、７５．９ｍｍｏｌ）を、メタノール／Ｈ２Ｏ（１８０ｍＬ／９０ｍＬ）混合物に溶解し、０℃に冷却した。Ｐｄ／Ｃ（０．４４３ｍｇ、１０ｍｏｌ％）をＮ２気流下、小分けして加え、次いでＭｅＯＨ（３ｍＬ）中のＮ−（４−ニトロフェニル）アセトアミド（４．５５ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で７２時間撹拌し、セライトパッドを通して濾過し、ＭｅＯＨで３回すすいだ。濾液を合わせて真空濃縮し、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ間で分配した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して、標題化合物（４．３９ｇ、８０％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  １．９５（ｓ，３Ｈ），４．８０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），６．４８（ｄ，２Ｈ），７．１８（ｄ，２Ｈ），９．４６（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：０．８２分［ＭＨ］＋＝１５１．３．
【０１３５】
【化３６】
2017521477.tif 000037
ステップ３：Ｎ−（４−（２−クロロピリミジン−４−イルアミノ）フェニル）アセトアミド
Ｎ−（４−アミノフェニル）アセトアミド（３．９１ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ／ＴＨＦ混合物（３４５ｍＬ／１１５ｍＬ）に溶解し、この溶液を氷浴中で０℃に冷却した。２，４−ジクロロピリミジン（４．６５ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、次いでＮａＨＣＯ３（４．３７ｇ、５２．０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で１６時間撹拌し、減圧濃縮した。ＥｔＯＡｃを加え、有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空濃縮して、標題化合物（６．８３ｇ）を粗固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．０１（ｓ，３Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４２−７．５４（ｍ，４Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ  １Ｈ），９．９２（ｓ，２Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．８８分［ＭＨ］＋＝２６３．２．
【０１３６】
【化３７】
2017521477.tif 000038
ステップ４：Ｎ−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド
Ｎ−（４−（２−クロロピリミジン−４−イルアミノ）フェニル）アセトアミド（６．８３ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）をＮ２下でＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（５．３９ｇ、３９．０ｍｍｏｌ）を加え、次いでＭｅＩ（１．７８ｍＬ、２８．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を室温で７２時間撹拌し、ＥｔＯＡｃと水（３５０ｍＬ／３５０ｍＬ）の間で分配した。有機層を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９８／２）により精製して、標題化合物（２．４９ｇ、２ステップにわたり３４％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．０３（ｓ，３Ｈ）３．３２（ｓ，３Ｈ）６．２１（ｍ，１Ｈ）７．２４（ｄ，２Ｈ）７．６６（ｄ，２Ｈ）７．９３（ｍ，１Ｈ）１０．０８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（酸性１０分）：４．７０分［ＭＨ］＋＝４１３．３．
【０１３７】
【化３８】
2017521477.tif 000039
ステップ５：Ｎ−（４−（メチル（２−（４−スルファモイルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセトアミド
Ｎ−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド（１．３４ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）およびスルファニルアミド（０．８４ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）を、ｉ−ＰｒＯＨ（４５ｍＬ）に溶解した。濃ＨＣｌ（１０滴）を撹拌溶液に滴下して加えた。この反応混合物を８０℃で４０時間撹拌し、室温に冷却した。形成された灰白色沈殿物を濾過により集め、ＥｔＯＡｃで洗浄し、真空乾燥して、標題化合物（１．５４ｇ、７７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．０６（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），７．２７−７．３５（ｍ，６Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），１０．２６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：２．９７分［ＭＨ］＋＝４１３．３．
【０１３８】
【化３９】
2017521477.tif 000040
ステップ６：４−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼン−スルホンアミド
Ｎ−（４−（メチル（２−（４−スルファモイルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセトアミド（１．５４ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（２．６５ｍＬ、３７．３ｍｍｏｌ）を滴下して加え、この反応混合物を室温で４８時間撹拌し、真空濃縮して、標題化合物（１．４０ｇ、１００％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．４８（ｓ，３Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｍ，２Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：０．７２分［ＭＨ］＋＝３７１．２．
【０１３９】
【化４０】
2017521477.tif 000041
ステップ７：４−（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
４−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および（４−トリフルオロメトキシフェニルイソシアネート（０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、標題化合物（１８ｍｇ、１４％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．４７（ｓ，３Ｈ），５．９６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．７３−７．７７（ｍ，４Ｈ），７．８４（ｍ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．６４分［ＭＨ］＋＝５７４．４．
【０１４０】
化合物５
【化４１】
2017521477.tif 000042
ステップ１：Ｎ−（４−（メチル（２−（２−スルファモイルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−アセトアミド
Ｎ−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド（１．１５ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）および２−アミノベンゼンスルホンアミド（７１６ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）を、ｉ−ＰｒＯＨ（４０ｍＬ）に溶解した。濃ＨＣｌ（１０滴）を撹拌溶液に滴下して加えた。この反応混合物を８０℃で１６時間撹拌し、室温に冷却した。形成された淡桃色の沈殿物を濾過により集め、ＥｔＯＡｃで洗浄し、真空乾燥して、標題化合物（１．４８ｇ、８６％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．０５（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３０−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．５０−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｍ，１Ｈ），１０．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：３．８０分［ＭＨ］＋＝４１３．４．
【０１４１】
【化４２】
2017521477.tif 000043
ステップ２：２−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼン−スルホンアミド
Ｎ−（４−（メチル（２−（２−スルファモイルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセトアミド（１．４７ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（５．０７ｍＬ、７１．３ｍｍｏｌ）を滴下して加え、この反応混合物を室温で４８時間撹拌し、真空濃縮して、標題化合物（１．２１ｇ、９２％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５１（ｓ，３Ｈ），６．００（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．４８−８．０６（ｍ，１４Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：１．０８分［ＭＨ］＋＝３７１．１．
【０１４２】
【化４３】
2017521477.tif 000044
ステップ３：２−（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
２−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および（４−トリフルオロメトキシフェニル）イソシアネート（０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、標題化合物（２８ｍｇ、２１％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．４６（ｓ，３Ｈ），６．０１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．７１分［ＭＨ］＋＝５７４．４．
【０１４３】
化合物６
【化４４】
2017521477.tif 000045
３−（３−（（４−（３−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレイド）フェニル）（メチル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ａ（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および２−フルオロ−５−メチルフェニルイソシアネート（４１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、３−（３−（（４−（３−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレイド）フェニル）（メチル）アミノ）フェニルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（９．８ｍｇ、７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５２（ｓ，３Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｍ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（８．１７（ｍ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．３７分［ＭＨ］＋＝５２２．２．
【０１４４】
化合物７
【化４５】
2017521477.tif 000046
２−（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
２−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）−アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびフェニルイソシアネート（３２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、標題化合物（３．５ｍｇ、３％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．４６（ｓ，３Ｈ），６．０１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９７（ｍ，２Ｈ）．ＬＣＭＳ（酸性１０分）：４．７１分［ＭＨ］＋＝５７４．４．
【０１４５】
化合物８
【化４６】
2017521477.tif 000047
ステップ１：３−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（中間体Ａの調製のステップ２に由来、２００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）および３−アミノベンズアミド（１１０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、濃ＨＣｌ（２滴）を加えた。この反応混合物を１６０℃で２時間加熱した。溶媒を除去し、粗製物を石油エーテル：酢酸エチル（２：１）ですすぎ、３−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミド（１８０ｍｇ、６４％）を黄色固体として得、それをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．６７分［ＭＨ］＋＝３６５．２．
【０１４６】
【化４７】
2017521477.tif 000048
ステップ２：３−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−アミドフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミド
３−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミド（１８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶解し、１０％湿潤Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）をこの溶液に加えた。この反応混合物を水素下で一晩撹拌した。触媒を濾過により除去し、溶媒を減圧除去して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド（１５０ｍｇ、８８％）を黄色固体として得、それをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．３６分［ＭＨ］＋＝３３５．１．
【０１４７】
【化４８】
2017521477.tif 000049
ステップ３：３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド
３−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−アミドフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミド（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（９５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１１６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空濃縮し、粗製物を溶出液（ＤＣＭ：メタノール、１００〜１００：２）によるカラムクロマトグラフィーにより精製して、３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド（１５２ｍｇ、６３％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．４３（ｓ，３Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｍ，７Ｈ），７．５９（ｍ，４Ｈ），７．８８（ｍ，３Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ），８．９９（ｍ，２Ｈ），９．２８（ｓ，１Ｈ），９．４７（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４７分［ＭＨ］＋＝５３８．３．
【０１４８】
化合物９
【化４９】
2017521477.tif 000050
ステップ１：Ｎ−メチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド
３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリド（１．０ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に、メチルアミン塩酸塩（３６６ｍｇ、５．４２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（２０ｍＬ）中に注いだ。形成された沈殿物を濾過により集めた。固体をロータリーエバポレーター上で乾燥して、Ｎ−メチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（８００ｍｇ、８２％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．７５分［ＭＨ］＋＝２１７．１．
【０１４９】
【化５０】
2017521477.tif 000051
ステップ２：３−アミノ−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミド
Ｎ−メチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（８００ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、炭素上のパラジウム（１０％、８０ｍｇ）を加えた。この混合物を水素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過して固体を除去し、濾液を減圧下濃縮乾固して、３−アミノ−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミド（６３０ｍｇ、９２％）を淡褐色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．３３分［ＭＨ］＋＝１８７．２．
【０１５０】
【化５１】
2017521477.tif 000052
ステップ３：Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−アミノ−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミド（１８０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブタノール（５ｍＬ）溶液に、２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（化合物１の調製のステップ２に由来、２４４ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）および濃ＨＣｌ水溶液（２滴）を加えた。得られた混合物を１６０℃で５時間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＣＭＳの分析から、反応が完了していることが示された。この混合物を室温に冷却した。固体を濾過により集め、減圧乾燥して、Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（３００ｍｇ、７９％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．１５分［ＭＨ］＋＝４１５．１．
【０１５１】
【化５２】
2017521477.tif 000053
ステップ４：Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）−フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）のメタノール（２５ｍＬ）溶液に、亜鉛粉末（１．０ｇ）および飽和塩化アンモニウム水溶液（２５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を、室温で一晩撹拌した。固体を濾別し、溶媒を減圧除去して、残渣を得、それを水と酢酸エチルの間で分配した。有機相を分離し、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ−メチルベンゼン−スルホンアミド（２５０ｍｇ、９０％）を暗褐色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．２７分［ＭＨ］＋＝３８５．２．
【０１５２】
【化５３】
2017521477.tif 000054
ステップ５：Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）−フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）−ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミド（２５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２５ｍＬ）溶液に、４−（トリフルオロメトキシ）フェニルイソシアネート（１５８ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６８ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮乾固して残渣を得、それをシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、３０：１）により精製して、Ｎ−メチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（２１０ｍｇ、５５％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．４５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），５．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），７．４９−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．６８−７．５４（ｍ，５Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝８．０および１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３９（ｓ，１Ｈ），９．１９（ｓ，２Ｈ），１０．４９（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５７分［ＭＨ］＋＝５８８．２．
【０１５３】
化合物１０
【化５４】
2017521477.tif 000055
ステップ１：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド
ボトムフラスコにおいて、Ｍｅ２ＮＨ２．ＨＣｌ（４４２ｍｇ、５．４２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に加え、この溶液を０℃に冷却した。３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリド（１ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を徐々に加え、この反応混合物を室温で撹拌した。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて水（３×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去して、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（８５０ｍｇ、８３％）を黄色固体として得、それを次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．３１［Ｍ＋Ｈ］＋＝２３１．１．
【０１５４】
【化５５】
2017521477.tif 000056
ステップ２：３−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（８５０ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解した。湿潤Ｐｄ／Ｃ（８５ｍｇ）をこの混合物に加えた。反応混合物を水素雰囲気下、一晩撹拌した。触媒を濾過により除去し、溶媒を減圧除去して、３−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド（６００ｍｇ、８０％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．４８［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０１．１．
【０１５５】
【化５６】
2017521477.tif 000057
ステップ３：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（化合物１の調製のステップ２に由来、２００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）および３−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド（１５８ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、次いで濃ＨＣｌ（２滴）を加えた。この反応混合物を１６０℃に２時間加熱した。溶媒を除去し、粗製物を石油エーテル／酢酸エチルから再結晶することにより精製して、所望の化合物（２２０ｍｇ、６８％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．１６分［ＭＨ］＋＝４２９．２．
【０１５６】
【化５７】
2017521477.tif 000058
ステップ４：３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（２２０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、エタノール（３０ｍＬ）に溶解し、次いで湿潤Ｐｄ／Ｃ（１０％、２２ｍｇ）を加えた。この反応混合物を水素下、一晩撹拌した。触媒を濾過により除去し、濾液を減圧濃縮して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド（１５０ｍｇ、７５％）を黄色固体として得、それを次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．８７分［ＭＨ］＋＝３９９．２．
【０１５７】
【化５８】
2017521477.tif 000059
ステップ５：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）−フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）−アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド（１５０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（８０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９８ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空濃縮し、粗製物を溶出液（ＤＣＭ／メタノール、１００〜１００／２）によるカラムクロマトグラフィーにより精製して、不純な生成物を得、それを石油エーテル／エタノール、１：１から再結晶して、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（４２．６ｍｇ、１９％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．６３（ｓ，６Ｈ）３．４５（ｓ，３Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｍ，５Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｍ，４Ｈ），７．９３（ｍ，２Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．８９（ｓ，１Ｈ），８．９４（ｓ，１Ｈ），９．６０（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．６６分［ＭＨ］＋＝６０２．３．
【０１５８】
化合物１１
【化５９】
2017521477.tif 000060
ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチル（４−アミノフェニル）カルバメート
ベンゼン−１，４−ジアミン（３．２４ｇ、３０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３０ｍＬ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、および水（５ｍＬ）に溶解し、次いで炭酸カリウム（１．５２ｇ、１１ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ２Ｏ（２．１８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、得られた混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を合わせて水（５０ｍＬ）で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、ｔｅｒｔ−ブチル（４−アミノフェニル）カルバメート（１．６ｇ、７７％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．５１分［ＭＨ］＋＝２０９．１．
【０１５９】
【化６０】
2017521477.tif 000061
ステップ２：ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）カルバメート
ｔｅｒｔ−ブチル４−アミノフェニルカルバメート（８００ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（７４４ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（９６７ｍｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を、２−プロパノール（２０ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を９０℃に一晩加熱した。この高温反応混合物を濾過して固体を除去した。濾液を濃縮して残渣を得た。この残渣にＤＣＭ（８０ｍＬ）を加え、懸濁液を３０分間撹拌した。沈殿した固体を濾過により集め、ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）カルバメート（１ｇ、６３％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．６３分［ＭＨ］＋＝３２１．１．
【０１６０】
【化６１】
2017521477.tif 000062
ステップ３：ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）カルバメート
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−クロロピリミジン−４−イルアミノ）フェニルカルバメート（２００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）および３−アミノ−ベンゼンスルホンアミド（１０７ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（４ｍＬ）に溶解し、次いでＴｓＯＨ（９５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をマイクロ波下、１２０℃に２時間加熱した。ＴＬＣ分析から、反応が完了していたことが示された。溶媒を除去し、粗生成物を石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（２：１）で洗浄し、乾燥して、ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−カルバメート（１２０ｍｇ、４２．３％）を黄色固体として得た。
【０１６１】
【化６２】
2017521477.tif 000063
ステップ４：３−（（４−（（４−アミノフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）カルバメート（１２０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、次いでＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去して粗製物を得、それをＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（８０ｍｇ、８６．３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．２９分［ＭＨ］＋＝３５７．１．
【０１６２】
【化６３】
2017521477.tif 000064
ステップ５：３−（（４−（（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（（４−アミノフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（８０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（４８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空濃縮し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：メタノール、１００：０〜１００：５）により精製して、３−（（４−（（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１７．８ｍｇ、１４．５％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ６．３８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｍ，１３Ｈ），７．９８（ｍ，３Ｈ），８．８４（ｓ，１Ｈ），８．９８（ｓ，１Ｈ），１０．２４（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４６分［ＭＨ］＋＝５６０．１［ＭＮａ］＋＝５８２．１．
【０１６３】
化合物１２
【化６４】
2017521477.tif 000065
ステップ１：Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１，Ｎ４−ジメチルベンゼン−１，４−ジアミン
Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−メチルベンゼン−１，４−ジアミン（中間体Ｃの調製のステップ２に由来、７００ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（９８．４ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロルエタン（１６ｍＬ）およびメタノール（８ｍＬ）に溶解し、次いで酢酸（３滴）を加えた。この反応混合物を４０℃に一晩加熱し、次いでＮａＢＨ３ＣＮ（２８１ｍｇ、４．４７ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を除去し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、３：１）により精製して、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１，Ｎ４−ジメチルベンゼン−１，４−ジアミン（２５０ｍｇ、３０％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．２２分［ＭＨ］＋＝２４９．１．
【０１６４】
【化６５】
2017521477.tif 000066
ステップ２：３−（（４−（メチル（４−（メチルアミノ）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１，Ｎ４−ジメチルベンゼン−１，４−ジアミン（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、３−アミノ−ベンゼンスルホンアミド（３５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、次いでＴｓＯＨ（３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をマイクロ波下、１２０℃に２時間加熱した。溶媒を除去し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール、１００：０〜１００：２）、次いで分取ＨＰＬＣにより精製して、３−（（４−（メチル（４−（メチルアミノ）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１６ｍｇ、２１％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．７２（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｍ，６Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），１０．７３（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．８６分［ＭＨ］＋＝３８５．１
【０１６５】
【化６６】
2017521477.tif 000067
ステップ３：３−（（４−（メチル（４−（１−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（メチル（４−（１−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（メチル（４−（メチルアミノ）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（上記ステップ２に由来、１５０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（８７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１０１ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。この混合物を真空濃縮し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：メタノール、１００〜１００：５）により精製して、黄色固体を得、それを分取ＨＰＬＣにより精製して、３−（（４−（メチル（４−（１−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼン−スルホンアミド（４０ｍｇ、１７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．３４（ｓ，３Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｍ，４Ｈ），７．５９（ｍ，６Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３９（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），１０．５１（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４０分［ＭＨ］＋＝５８８．２［ＭＮａ］＋＝６１０．１．
【０１６６】
化合物１３
【化６７】
2017521477.tif 000068
ステップ１：（３−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド
アセトニトリル（３ｍＬ）中の（３−ニトロフェニル）メタンスルホニルクロリド（７００ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸アンモニウムで飽和した濃縮アンモニアを加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。この混合物を濃縮し、残渣を冷水で希釈して沈殿物を形成させ、それを濾別し、水で洗浄して、（３−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（６４２ｍｇ、１００％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．４７分［ＭＮａ］＋＝２３９．０．
【０１６７】
【化６８】
2017521477.tif 000069
ステップ２：（３−アミノフェニル）メタンスルホンアミド
メタノール（４ｍＬ）およびＮＨ４Ｃｌ溶液（４ｍＬ）中の（３−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（１５０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の混合物に、亜鉛（４５３ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を６５℃で３時間撹拌した。炭酸水素ナトリウム溶液を用いて、この混合物のｐＨを７に調整した。固体を濾別した。濾液を酢酸エチル（３×）で抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、（３−アミノフェニル）メタンスルホンアミド（１００ｍｇ、７８％）を黄色オイルとして得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．２８分［ＭＨ］＋＝１８７．０．
【０１６８】
【化６９】
2017521477.tif 000070
ステップ３：（３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）メタンスルホンアミド
中間体Ｃ（１１７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および３−アミノベンゼンメタンスルホンアミド（５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、（３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）メタンスルホンアミド（１００ｍｇ、４５％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．５９（ｓ，３Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．１５（ｍ，６Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．６１（ｍ，３Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４８分［ＭＨ］＋＝５８８．２．
【０１６９】
化合物１４
【化７０】
2017521477.tif 000071
ステップ１：Ｎ−メチル−３−ニトロアニリン
３−ニトロベンゼンアミン（５ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）のアセトン（３０ｍＬ）溶液に、ヨードメタン（５．６５ｇ、３９．８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０ｇ、７２．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を５０℃で一晩撹拌した。混合物を減圧下、濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、１０：１）により精製して、Ｎ−メチル−３−ニトロアニリン（１．６ｇ、２９％）を赤色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：３．０１分［ＭＨ］＋＝１５３．１．
【０１７０】
【化７１】
2017521477.tif 000072
ステップ２：２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン
Ｎ−メチル−３−ニトロベンゼンアミン（１．６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液に、２，４−ジクロロピリジン（１．７２ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２．１８ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１３０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチルと水の間で分配し、有機層を分離し、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、残渣を得、それをカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、５：１）により精製して、２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（１．０ｇ、３６％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：３．０１分［ＭＨ］＋＝２６５．１．
【０１７１】
【化７２】
2017521477.tif 000073
ステップ３：３−（（４−（メチル（３−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼン−スルホンアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（１ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）溶液に、３−アミノベンゼンスルホンアミド（６８３ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（５７５ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１２０℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、アンモニア溶液（３０ｍＬ）を加えて沈殿物を形成させた。固体を濾過により集め、減圧乾燥して、３−（（４−（メチル（３−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１．４ｇ、９３％収率）を褐色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．２４分［ＭＨ］＋＝４０１．１．
【０１７２】
【化７３】
2017521477.tif 000074
ステップ４：３−（（４−（（３−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（メチル（３−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（７００ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）のメタノール（３０ｍＬ）溶液に、亜鉛粉末（３．０ｇ）および飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。固体を濾別し、溶媒を減圧除去して残渣を得、それを水と酢酸エチルの間で分配した。有機相を分離し、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して、３−（（４−（（３−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（６００ｍｇ、９２％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．４９分［ＭＨ］＋＝３７１．１．
【０１７３】
【化７４】
2017521477.tif 000075
ステップ５：３−（（４−（メチル（３−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（メチル（３−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（（３−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（２００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液に、４−（トリフルオロメトキシ）フェニルイソシアネート（１２１ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣を得、それをシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、３５：１）により精製して、３−（（４−（メチル（３−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１９０ｍｇ、６５％）を淡褐色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．４７（ｓ，３Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．２４（ｍ，４Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），９．０７（ｓ，１Ｈ），９．１０（ｓ，１Ｈ），９．５７（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５０分［ＭＨ］＋＝５７４．２，［ＭＮａ］＋＝５９６．２．
【０１７４】
化合物１５
【化７５】
2017521477.tif 000076
ステップ１：２−クロロ−Ｎ−メチルピリジン−４−アミン
密封チューブに、２，４−ジクロロピリジン（２ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）およびメタノール中の２Ｍメチルアミンを加えた。この混合物を８５℃に一晩加熱した。溶媒を除去し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３：１）により精製して、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジン−４−アミン（１．５８ｇ、８２％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．５４分［ＭＨ］＋＝１４３．０．
【０１７５】
【化７６】
2017521477.tif 000077
ステップ２：２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリジン−４−アミン
２−クロロ−Ｎ−メチルピリジン−４−アミン（２００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、４−フルオロ−ニトロベンゼン（２１７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（３６８ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に加えた。出発物質がすべて消失するまで、この反応混合物を１２０℃に加熱した。反応混合物を水（２０ｍＬ）中に注いだ。固体を濾過により集め、乾燥して、２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリジン−４−アミン（２８０ｍｇ、７５．９％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．３７分［ＭＨ］＋＝２６４．０．
【０１７６】
【化７７】
2017521477.tif 000078
ステップ３：３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼン−スルホンアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリジン−４−アミン（４００ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）、３−アミノベンズアミド（２６１ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（９９１ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）、キサントホス（１７４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）に加え、次いでＰｄ２（ｄｂａ）３（１３９ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を窒素下、１２０℃に一晩加熱した。混合物を真空濃縮し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール、１００：０〜９８：２）により精製して、３−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（３０３ｍｇ、５０％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．７５分［ＭＨ］＋＝４００．１．
【０１７７】
【化７８】
2017521477.tif 000079
ステップ４：３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（３００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ（３０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、次いで亜鉛粉末（４８７ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。固体を濾過により除去し、メタノール（３０ｍＬ）で３回洗浄した。濾液を集め、濃縮して残渣を得た。粗製物を水（３０ｍＬ）で３回洗浄した。黄色固体を集め、乾燥して、３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（２００ｍｇ、７２％）を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．３５分［ＭＨ］＋＝３７０．１．
【０１７８】
【化７９】
2017521477.tif 000080
ステップ５：３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド。３−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（２００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（１１５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１４０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空濃縮し、粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール、１００：０〜９７．５：２．５）により精製して、３−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１２０ｍｇ、３９％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．２４（ｓ，３Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２０（ｄｄ，Ｊ＝６．０および２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３９−７．１８（ｍ，８Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４Ｈ），７．８６−７．７７（ｍ，２Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），９．０４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），９．１２（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４３分［ＭＨ］＋＝５７３．２，［ＭＮａ］＋＝５９５．２．
【０１７９】
化合物１６
【化８０】
2017521477.tif 000081
ステップ１；Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）アセトアミド
２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）酢酸（６３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、中間体Ａ（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に加えた。次いで、ＨＡＴＵ（１２３ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。粗製物を溶出液（ＤＣＭ／メタノール、１００：０〜９７：３）によるカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体を得、それを分取ＨＰＬＣにより精製して、Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）アセトアミド（１５ｍｇ、１０％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ３．５５（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，２Ｈ），５．８２（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），７．１７（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．６８（ｍ，３Ｈ），７．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４２分［ＭＨ］＋＝５７３．２．
【０１８０】
化合物１７
【化８１】
2017521477.tif 000082
ステップ１：メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセテート
ＤＩＥＡ（２．２ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）を、２，４−ジクロロピリミジン（５００ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）およびメチル２−（４−アミノフェニル）アセテート（６６４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）のエタノール（２０ｍＬ）溶液に１０℃で徐々に加えた。その後、この混合物を４８時間加熱還流した。混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３：１）により精製して、メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセテート（７４０ｍｇ、７９％）を赤色オイルとして得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．３７分［ＭＨ］＋＝２７８．０．
【０１８１】
【化８２】
2017521477.tif 000083
ステップ２：メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセテート
メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）アセテート（４９０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（６ｍＬ）および炭酸セシウム（１．７ｇ、５．３ｍｍｏｌ）に溶解した。１５分後、ヨウ化メチル（３７６ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。水を加えて反応をクエンチし、得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、７：１）により精製して、メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセテート（２６０ｍｇ、６１％）を黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，２Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４８分［ＭＨ］＋＝２９２．１．
【０１８２】
【化８３】
2017521477.tif 000084
ステップ３：２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）酢酸
メチル２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセテート（３２０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１６ｍＬ）およびメタノール（８ｍＬ）溶液に、１Ｍ水酸化ナトリウム（４．８ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で２時間撹拌した。１Ｍ  ＨＣｌ溶液を用いて、この混合物のｐＨを２に調整し、酢酸エチルで数回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）酢酸（３０４ｍｇ、定量的）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．３２分［ＭＨ］＋＝２７８．２．
【０１８３】
【化８４】
2017521477.tif 000085
ステップ４：２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド
ジクロロメタン（８ｍＬ）中の２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）酢酸（３０４ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で撹拌した。４−（トリフルオロメトキシ）アニリン（１９５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２２２ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加え、次いでＥＤＣ．ＨＣｌ（２１１ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１４８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で１６時間攪拌した。混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３：１〜１：１）により精製して、２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）アセトアミド（３８０ｍｇ、７９％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．９７分［ＭＨ］＋＝４３７．１．
【０１８４】
【化８５】
2017521477.tif 000086
ステップ５：２−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド
２−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）アセトアミド。２−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および３−アミノフェニルスルファミド（３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。この混合物に、ｐ−ＴｓＯＨ．Ｈ２Ｏ（８５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した。次いで、炭酸ナトリウム溶液を用いて、混合物のｐＨを９に調整した。得られた混合物を酢酸エチルで数回抽出した。抽出物を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３０：１）により精製して、２−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−Ｎ−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド（１００ｍｇ、７６％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．４５（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｓ，２Ｈ），７．３３（ｍ，５Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），９．５５（ｓ，１Ｈ），１０．４５（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．３２分［ＭＨ］＋＝５７３．２，［ＭＮａ］＋＝５９５．２．
【０１８５】
化合物１８
【化８６】
2017521477.tif 000087
ステップ１：２−フルオロ−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ｂ（６０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４−フルオロスルホンアミド（２６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を用いる基本手順Ｃに従って、２−フルオロ−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼン−スルホンアミド（５０ｍｇ、６０％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ４）：δ  ３．６０（ｓ，３Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｍ，５Ｈ），７．６９（ｓ，２Ｈ），７．６１（ｍ，４Ｈ），７．９６−７．７４（ｍ，２Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），９．３２（ｓ，２Ｈ），１０．４９（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５０分［ＭＨ］＋＝５９２．２，［ＭＮａ］＋＝６１４．１．
【０１８６】
化合物１９
【化８７】
2017521477.tif 000088
ステップ１：Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロベンズアミド
２−メチル−５−ニトロ安息香酸（１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＤＭＦ（１滴）を加えた。この反応混合物を４時間還流した。溶媒を減圧除去した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）を加え、次いで反応混合物を減圧濃縮した。ＤＣＭ添加／濃縮サイクルを３回繰り返して、白色固体を得た。Ｍｅ２ＮＨ．ＨＣｌ（４９０ｍｇ、６．０８ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．６７ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解した。ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２−メチル−５−ニトロベンゾイルクロリド（１．０９ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を、この混合物に０℃で徐々に加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、水（３×３０ｍＬ）で洗浄し、有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して、Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロベンズアミド（６００ｍｇ、５２．２％）を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．０６分［ＭＨ］＋＝２０８．４．
【０１８７】
【化８８】
2017521477.tif 000089
ステップ２：５−アミノ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド
Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロベンズアミド（３００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、次いで湿潤Ｐｄ／Ｃ（１０％、３０ｍｇ）を加えた。反応混合物を水素下で一晩撹拌した。触媒を濾過により濾別し、濾液を減圧濃縮して、５−アミノ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド（１８０ｍｇ、７０％）を黄色固体として得、それを次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．３０分［ＭＨ］＋＝１７９．１．
【０１８８】
【化８９】
2017521477.tif 000090
ステップ３：Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド
２−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（中間体Ａの調製のステップ２に由来、２２３ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）および５−アミノ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド（１５０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（４ｍＬ）に溶解し、次いで濃ＨＣｌ（２滴）を加えた。この反応混合物を１２０℃に３時間加熱した。溶媒を除去し、粗生成物を石油エーテル／ＤＣＭ、１：１で洗浄して、Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド（２５０ｍｇ、７３％）を黄色固体として得、それをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．９６分［ＭＨ］＋＝４０７．２．
【０１８９】
【化９０】
2017521477.tif 000091
ステップ４：５−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド
Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−（（４−（メチル（４−ニトロフェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド（２５０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液に、亜鉛（４００ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）および飽和ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）水溶液を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。固体を濾過により除去し、メタノール（２０ｍＬ）で３回洗浄した。濾液を集め、有機溶媒を除去して残渣を得、それをＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去して、５−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド（１５０ｍｇ、６４％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．１２分［ＭＨ］＋＝３７７．２．
【０１９０】
【化９１】
2017521477.tif 000092
ステップ５：Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド
５−（（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルベンズアミド（１５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に、１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１５５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空濃縮し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：メタノール、１００〜１００：２）により精製して、Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンズアミド（８２ｍｇ、３５％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ４）：δ  ２．１６（ｍ，３Ｈ），２．７７（ｍ，３Ｈ），３．０１（ｍ，３Ｈ），３．４４（ｍ，３Ｈ），６．００−６．３７（ｍ，１Ｈ），７．８９−７．２１（ｍ，１２Ｈ），９．３２（ｓ，１Ｈ），９．５０（ｓ，１Ｈ），１０．５６−１０．７８（ｍ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５４分［ＭＨ］＋＝５８０．３．
【０１９１】
化合物２０
【化９２】
2017521477.tif 000093
３−（（４−（メチル（４−（３−（２−メチル−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）−アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ａ（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および２−メチル−４−トリフルオロメトキシアニリン（２４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ａに従って、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：０〜９８：２）による精製後、３−（（４−（メチル（４−（３−（２−メチル−４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（４ｍｇ、４％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ２．２５（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｍ，６Ｈ），７．８３（ｍ，２Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４８分［ＭＨ］＋＝５８８．２，［ＭＮａ］＋＝６１０．２．
【０１９２】
化合物２１
【化９３】
2017521477.tif 000094
ステップ１；２−メチル−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
中間体Ａ（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（４３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、２−メチル−５−（（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（１００ｍｇ、７５％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．５６（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），５．９９（ｍ，１Ｈ），７．３８（ｍ，７Ｈ），７．６５（ｍ，５Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），９．２４（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），１０．５０（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５２分［ＭＨ］＋＝５８８．２．
【０１９３】
化合物２２
【化９４】
2017521477.tif 000095
ステップ１：メチル２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパノエート
ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＮａＨ（６０％、３６２ｍｇ、９．１ｍｍｏｌ）の混合物に、メチル２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセテート（５３０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いでヨウ化メチル（１．２９ｇ、９．１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。１０６ｍｇのメチル２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセテートで開始して、別のバッチで繰り返した。２つのバッチを合わせて、水中に注いだ。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、３０：１）により精製して、メチル２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパノエート（４４０ｍｇ、６０％）を黄色オイルとして得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．８５分［ＭＨ］＋＝２６３．１．
【０１９４】
【化９５】
2017521477.tif 000096
ステップ２：２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸
水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１．５ｍＬ）を、メチル２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパノエート（５０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のメタノール（１．０ｍＬ）およびＴＨＦ（２．０ｍＬ）溶液に加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＨＣｌ溶液（１Ｍ）を加えてｐＨ＝１〜２にした。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸（４２ｍｇ、８９％）を褐色オイルとして得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．８０分［ＭＨ］＋＝２７１．０．
【０１９５】
【化９６】
2017521477.tif 000097
ステップ３：２−メチル−Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパンアミド
２−メチル−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸（２７０ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を窒素下でＳＯＣｌ２（４ｍＬ）に溶解し、次いでＤＭＦ（１滴）を加えた。得られた混合物を８０℃で３時間撹拌した。過剰なＳＯＣｌ２を蒸発させ、得られた残渣をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した。この溶液を、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−メチルベンゼン−１，４−ジアミン（中間体Ｃの調製のステップ２に由来、２５５ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２７５ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６ｍＬ）溶液に徐々に加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、この混合物を１Ｍ  ＨＣｌ溶液と酢酸エチルの間で分配した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して残渣を得、それをカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、２０：１）により精製して、所望の中間体（５０ｍｇ、１０％）を黄色固体として生成させた。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：３．１４分［ＭＨ］＋＝４６５．１．
【０１９６】
【化９７】
2017521477.tif 000098
ステップ４：
２−メチル−Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパンアミド
２−メチル−Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）プロパンアミド（ステップ３）（５０ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）および３−アミノベンゼンスルホンアミド（１８ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、２−メチル−Ｎ−（４−（メチル（２−（（３−スルファモイルフェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−２−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）プロパンアミド（３０ｍｇ、４７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  １．６０（ｓ，６Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），５．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３８（ｍ，６Ｈ），７．４４（ｍ，６Ｈ），７．５２（ｍ，４Ｈ），７．７９（ｍ，３Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３９（ｓ，１Ｈ），９．４１（ｓ，１Ｈ），１０．０７（ｓ，１Ｈ），１０．４０（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５２分［ＭＨ］＋＝６０１．２．
【０１９７】
化合物２３
【化９８】
2017521477.tif 000099
ステップ１：Ｎ−（２−メトキシエチル）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド
０℃に予め冷却した、３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリド（５．０ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（１２．６ｍＬ、９０．４ｍｍｏｌ）を加え、次いで２−メトキシエチルアミン（３．９ｍＬ、４５．１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を室温で２時間撹拌し、水（５０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水層をＤＣＭで２回抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して、標題化合物（５．０５ｇ、８６％）を淡黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  ３．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝７．８および７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．８０Ｈｚ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．７３分［ＭＨ］＋＝２５９．５．
【０１９８】
【化９９】
2017521477.tif 000100
ステップ２：３−アミノ−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ−（２−メトキシエチル）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（２．０ｇ、７．６８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｔ／Ｃカートリッジを使用して、Ｈ−キューブ装置（完全なＨ２モード、４０℃、２ランにわたり１ｍＬ／分）により水素化した。溶媒を減圧濃縮して標題化合物（１．８ｇ、１００％）を淡黄色オイルとして得た。さらに何ら精製することなく使用した。ＬＣＭＳ（方法Ａ）：３．８７分［ＭＨ］＋＝２３１．２．
【０１９９】
【化１００】
2017521477.tif 000101
ステップ３：Ｎ−（４−（（２−（３−（Ｎ−（２−メトキシエチル）スルファモイル）フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド
Ｎ−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド（化合物５の合成のステップ３の生成物、１００ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）および３−アミノ−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンゼンスルホンアミド（上記のステップ２に由来、１６６ｍｇ、０．７２３ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、濃ＨＣｌ（５滴）を撹拌溶液に滴下して加えた。この反応混合物を８０℃で３時間撹拌し、次いで室温に冷却した。灰白色沈殿物を濾過により集め、ＥｔＯＡｃで洗浄し、真空乾燥して、標題化合物（９０ｍｇ、５３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．２５分［ＭＨ］＋＝４７１．８
【０２００】
【化１０１】
2017521477.tif 000102
ステップ４：３−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンゼンスルホンアミド
Ｎ−（４−（（２−（３−（Ｎ−（２−メトキシエチル）スルファモイル）フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）（メチル）アミノ）フェニル）アセトアミド（上記のステップ３に由来、３０ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（０．４５ｍＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌し、真空濃縮して、標題化合物（２５ｍｇ、８９％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ａ）：３．８８分［ＭＨ］＋＝４２９．４．
【０２０１】
【化１０２】
2017521477.tif 000103
ステップ５：Ｎ−（２−メトキシエチル）−３−（４−（メチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド
３−（４−（（４−アミノフェニル）（メチル）アミノ）ピリミジン−２−イルアミノ）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンゼンスルホンアミドを用いる基本手順Ａに従って、標題化合物（４ｍｇ、１０％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）：δ  ｐｐｍ  ３．０５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），５．８６（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．７８（ｍ，１Ｈ），８．５６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ａ）：４．７５分［ＭＨ］＋＝６３２．５．
【０２０２】
化合物２４
【化１０３】
2017521477.tif 000104
ステップ１：Ｎ−シクロプロピル−４−ニトロアニリン
４−フルオロ−１−ニトロベンゼン（５．０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１５ｍＬ）溶液に、シクロプロパンアミン（４．０ｇ、７０．９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（９．８ｇ、７０．９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を７０℃で１６時間撹拌した。混合物を冷却して、水中に注いだ。固体を濾過し、乾燥して、Ｎ−シクロプロピル−４−ニトロアニリン（６．１ｇ、９７％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４２［ＭＨ］＋＝１７９．１．
【０２０３】
【化１０４】
2017521477.tif 000105
ステップ２：２−クロロ−Ｎ−シクロプロピル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−シクロプロピル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（５００ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（８３６ｍｇ、５．６１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（１．８２ｇ、５．６１ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で１６時間撹拌した。この反応混合物を酢酸エチルと水の間で分配した。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせて食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、４：１）により精製して、２−クロロ−Ｎ−シクロプロピル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（５００ｍｇ、６１％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５７［ＭＨ］＋＝２９１．１．
【０２０４】
【化１０５】
2017521477.tif 000106
ステップ３：Ｎ−１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−シクロプロピルベンゼン−１，４−ジアミン
メタノール（１５ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−シクロプロピル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（５００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物に、亜鉛粉末（１．１２ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）およびＮＨ４Ｃｌ溶液（１０ｍＬ）を加えた。この反応混合物を６０℃で３時間撹拌した。メタノールを除去し、混合物を酢酸エチルと１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の間で分配した。固体を濾別した。有機層を食塩水で洗浄し、乾燥した。溶媒を除去して、Ｎ−１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−シクロプロピルベンゼン−１，４−ジアミン（４４０ｍｇ、９８％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：１．０６［ＭＨ］＋＝２６１．１．
【０２０５】
【化１０６】
2017521477.tif 000107
ステップ４：１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（シクロプロピル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素
Ｎ−１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−シクロプロピル−ベンゼン−１，４−ジアミン（４４０ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）および１−イソシアネート−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（３８４ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を用いて基本手順Ａに従って、４−１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（シクロプロピル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）−フェニル）尿素（５００ｍｇ、６１％）を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：３．０９［ＭＨ］＋＝４６４．１．
【０２０６】
【化１０７】
2017521477.tif 000108
ステップ５：３−（（４−（シクロプロピル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）−フェニル）アミノ）−ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（シクロプロピルアミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素（９３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）および３−アミノフェニルスルファミド（３５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、３−（（４−（シクロプロピル（４−（３−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（４０ｍｇ、３３％）を、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０：１）による精製後、黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ０．５６（ｍ，２Ｈ），０．９７（ｍ，２Ｈ），３．２２（ｍ，１Ｈ），６．１７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｍ，６Ｈ），７．６１（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．９９（ｓ，１Ｈ），９．０７（ｓ，１Ｈ），９．５９（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５２分［ＭＨ］＋＝６００．２，［ＭＮａ］＋＝６２２．２．
【０２０７】
化合物２５
【化１０８】
2017521477.tif 000109
１−（４−（メチル（２−（（３−（メチルスルホニル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素
中間体Ｃ（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および３−メチルスルホニルアニリン（４７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、１−（４−（メチル（２−（（３−（メチルスルホニル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素（８０ｍｇ、６１％）を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：１〜６０：１）による精製後、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ３．１７（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｍ，４Ｈ），７．５２（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｍ，２Ｈ），８．７０（ｓ，１Ｈ），８．９４（ｓ，１Ｈ），８．９８（ｓ，１Ｈ），９．６７（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５７分［ＭＨ］＋＝５７３．２，［ＭＮａ］＋＝５９５．２．
化合物２６
【０２０８】
【化１０９】
2017521477.tif 000110
ステップ１：Ｎ−エチル−４−ニトロベンゼンアミン
ボトムフラスコにおいて、１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（３ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）、ＥｔＮＨ２．ＨＣｌ（３．４６ｇ、４２．５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（６．４６ｇ、４６．３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２０ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を８５℃で一晩撹拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）中に注ぎ、この混合物を０．５時間撹拌した。固体を濾過により集め、乾燥して、Ｎ−エチル−４−ニトロベンゼンアミン（２．９ｇ、８２％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（酸性５分）：２．２５［Ｍ＋Ｈ］＋＝１６７．１．
【０２０９】
【化１１０】
2017521477.tif 000111
ステップ２：２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン
Ｎ−エチル−４−ニトロベンゼンアミン（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（８９６ｍｇ、６．０２ｍｍｏｌ）、およびＣｓ２ＣＯ３（３．９ｇ、１２．０４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を８５℃で一晩加熱した。反応混合物を水（７０ｍＬ）中に注ぎ、得られた混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機層を合わせて水で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去して、２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（１ｇ、６０％）を黄色固体として得、それを次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（酸性５分）：２．６０［Ｍ＋Ｈ］＋＝２７９．０．
【０２１０】
【化１１１】
2017521477.tif 000112
ステップ３：Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−エチルベンゼン−１，４−ジアミン
２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）ピリミジン−４−アミン（１ｇ、３．５９ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）および飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。亜鉛（粉末、２．１３ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。有機層を減圧除去した。混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で３回抽出し、有機層を合わせてＮａＣｌ水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去し、粗残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール、１００〜１００：１）により精製して、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（２００ｍｇ、２３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（酸性５分）：２．０８［Ｍ＋Ｈ］＋＝２４９．０．
【０２１１】
【化１１２】
2017521477.tif 000113
ステップ４：１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（エチル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）尿素
１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（エチル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）−フェニル）尿素を、Ｎ１−（２−クロロピリミジン−４−イル）−Ｎ１−エチルベンゼン−１，４−ジアミンおよび４−トリフルオロフェニル−イソシアネートを用いる基本手順Ａを使用して得た。ＬＣＭＳ（酸性５分）：３．２３分［ＭＨ］＋＝４５２．１．
【０２１２】
【化１１３】
2017521477.tif 000114
ステップ５：３−（（４−（エチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）−アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド
１−（４−（（２−クロロピリミジン−４−イル）（エチル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素（２２０ｍｇ、０．４８７ｍｍｏｌ）および３−アミノベンゼンスルホンアミド（８４ｍｇ、０．４８７ｍｍｏｌ）を用いる基本手順Ｃに従って、３−（（４−（エチル（４−（３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）ウレイド）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド（６８ｍｇ、２４％）を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：０〜９７．５／２．５）による精製後、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  １．１９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），４．００（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｍ，８Ｈ），７．６０（ｍ，４Ｈ），７．８６（ｍ，２Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），８．９１（ｓ，１Ｈ），８．９５（ｓ，１Ｈ），９．５０（ｓ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（酸性５分）：２．５０分［ＭＨ］＋＝５８８．２．
【０２１３】
化合物２７
【化１１４】
2017521477.tif 000115
ステップ１：メチル（３−ニトロベンジル）スルファン
３−ニトロベンジルブロミド（３．７２ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）のエタノール（５０ｍＬ）溶液を、０℃に冷却した。ナトリウムチオメトキシド（１．４５ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、水と酢酸エチルの間で分配した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥して、メチル（３−ニトロベンジル）スルファン（約２６％の１−（エトキシメチル）−３−ニトロベンゼンが混入、３．２２ｇ、２６％）を黄色オイルとして得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．４８分［ＭＮａ］＋＝２０６．０．
【０２１４】
【化１１５】
2017521477.tif 000116
ステップ２：１−（（メチルスルホニル）メチル）−３−ニトロベンゼン
メチル（３−ニトロベンジル）スルファン（７０％、３．２２ｇ、５．２７ｍｍｏｌの純粋化合物）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解した。オキソン（９．７２ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３日間撹拌した。得られた混合物を水中に注ぎ、次いで酢酸エチルを加えた。有機層を分離し、水および食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、残渣を得、それをカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル、５：１〜１：１）により精製して、１−（（メチルスルホニル）メチル）−３−ニトロベンゼン（９４０ｍｇ、２９％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．５１分［ＭＮａ］＋＝２３８．０．
【０２１５】
【化１１６】
2017521477.tif 000117
ステップ３：３−（（メチルスルホニル）メチル）アニリン
１−（（メチルスルホニル）メチル）−３−ニトロベンゼン（５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（３ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１０％、７ｍｇ）を加えた。この反応混合物を水素下、室温で一晩撹拌した。Ｐｄ／Ｃを濾別し、濾液を濃縮して、３−（（メチルスルホニル）メチル）アニリン（４６ｍｇ、定量的）を灰色固体として得、次のステップに直接使用した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：０．２６分［ＭＨ］＋＝１８６．１．
【０２１６】
【化１１７】
2017521477.tif 000118
ステップ４：１−（４−（メチル（２−（（３−（（メチルスルホニル）メチル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）尿素
中間体Ｃ（１０８．７ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）および（メチルスルホニル）メチル）アニリン（４６ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）を使用する基本手順Ｃに従って、１−（４−（メチル（２−（（３−（（メチルスルホニル）メチル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）−３−（４−（トリフルオロ−メトキシ）フェニル）尿素（５７．７ｍｇ、４０％）を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、２０：１）による精製後、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ２．９２（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｓ，３Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｍ，５Ｈ），７．５９（ｍ，４Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｍ，２Ｈ），８．８９（ｓ，１Ｈ），８．９５（ｓ，１Ｈ），９．２９（ｍ，１Ｈ）．ＬＣＭＳ（方法Ｂ）：２．５５分［ＭＨ］＋＝５８７．２．
【０２１７】
発現コンストラクト
マウス（残基１〜４６４）またはヒト（残基１〜４７１）のＭＬＫＬをコードするｃＤＮＡを合成して、サイレント置換（ＤＮＡ２．０，ＣＡ）によりいくつかの制限部位を除去した。Ｍｏｕｊａｌｌｅｄ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ５：ｅ１０８６；Ｍｏｕｊａｌｌｅｄ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ４：ｅ４６５；およびＭｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３に記載のように、ＭＬＫＬをコードするｃＤＮＡを、ドキシサイクリン誘導のピューロマイシン選択可能ベクターであるｐＦ  ＴＲＥ３Ｇ  ＰＧＫ  ｐｕｒｏに連結した。配列は、サンガーシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｍｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＶＩＣ，ＡｕｓｔｒａｌｉａまたはＤＮＡ２．０による）により確認した。
【０２１８】
Ｖｉｎｃｅ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ  １３１（４）：６８２−６９３に記載のように、１０ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２つのヘルパープラスミド（０．８μｇのｐＶＳＶｇおよび２μｇのｐＣＭＶΔＲ８．２）と一緒に１．２μｇのベクターＤＮＡを用いてトランスフェクトすることにより、レンチウイルス粒子を生成させた。ウイルス上清を使用して、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択され、その中で維持されたトランスフェクト細胞を含む標的細胞を感染させた。
【０２１９】
試薬および抗体
Ｂｏｓｓｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（２０）：１３９６４−１３９７１に記載のように、組換えｈＴＮＦ−Ｆｃをインハウスで生成させた。ピューロマイシン、ドキシサイクリン、およびネクロスタチン−１は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｓｍａｃミメティック、化合物Ａは、Ｖｉｎｃｅ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ  １３１（４）：６８２−６９３に以前に記載されているものである。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−ＯＰＨは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。モノクローナルラット抗マウスＭＬＫＬ抗体（クローン３Ｈ１）は、Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによりインハウスで産生させた（現在、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃａｔ．ＭＡＢＣ６０４から入手可能）。抗β−アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し；抗ＶＤＡＣ１（ＡＢ１０５２７）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し；抗ＧＡＰＤＨは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し；抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）はＳｉｇｍａから購入した。転写されたタンパク質を担持するウエスタンブロット膜に対して一次抗体を使用し、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅおよびＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入したＨＲＰコンジュゲート二次抗体ならびにＥＣＬ検出法（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。
【０２２０】
細胞株および細胞死アッセイ
マウス皮膚線維芽細胞（ＭＤＦ）を、３種のＭｌｋｌ−／−マウスおよび３種のコンジェニック野生型マウスから単離し、次いで、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３に記載のように、ＳＶ４０大型Ｔ抗原により不死化して、３種の生物学的に独立した細胞株を生成させた。同様に、不死化したＭＤＦを３種のＲｉｐｋ３−／−マウスおよびコンジェニック野生型マウスから調製した。ＭＤＦおよびＨＥＫ２９３Ｔは、ＭＬＫＬに対する誘導性発現コンストラクトを安定的に形質導入された株について、８〜１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ｕ９３７細胞は、８％ｖ／ｖのＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞死アッセイは、１ウェルあたり１×１０５細胞を播種した２４ウェルプレート中で実施した。次いで、１０ｎｇ／ｍＬまたは２０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下で４時間にわたり付着させた細胞を、ネクロスタチン（５０μＭ）とＱ−ＶＤ−ＯＰｈ（５μＭ）の併用組合せで処理し、その３０分後にＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＳｍａｃミメティック（５００ｎＭ）を加えた。ＭＤＦ細胞について２４時間後またはＵ９３７細胞について４８時間後に、細胞を回収し、ＰＩ陽性細胞（１μｇ／ｍＬ）をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して定量した。
【０２２１】
図１Ｃは、化合物１が、約５００ｎＭのＩＣ５０で、ＴＳＱ誘導ネクロトーシスから野生型ＭＤＦの約５０％をレスキューしたことを示す。
【０２２２】
図３Ｃは、化合物１が、５０〜１００ｎＭのＩＣ５０で、ＴＳＱ誘導ネクロトーシスから野生型Ｕ９３７の約５０％をレスキューしたことを示す。
【０２２３】
試験化合物１〜４がＴＳＱ誘導ネクロトーシスから野生型Ｕ９３７細胞をレスキューする能力を表１に示す。
【０２２４】
図２Ｂは、化合物１の毒性が濃度≧５μＭで野生型ＭＤＦに死を誘導することを示す。３回の実験の平均±標準誤差を示す。
【０２２５】
図３Ｄは、遺伝子編集してＭＬＫＬを欠失させたＵ９３７細胞における化合物１の毒性を示す。ＭＬＫＬの非存在下では、ＴＳＱ刺激細胞は、非刺激細胞と同じように反応した。ＴＳ処理により、細胞がアポトーシス死を起こす能力を保持していることが示され、これは化合物１処置により影響を受けなかった。図示したデータは、独立した２実験の平均±標準偏差である。図４Ａは、化合物１に類似したプロテインキナーゼ標的プロファイルを有するプロテインキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが、野生型ＭＤＦにおいて、ＴＳＱ誘導ネクロトーシスを阻害しなかったことを示す。３回の実験の平均±標準誤差を示す。
【０２２６】
図４Ｂは、化合物１に類似したプロテインキナーゼ標的プロファイルを有するプロテインキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが、野生型Ｕ９３７細胞において、ＴＳＱ誘導ネクロトーシスを阻害しなかったことを示す。２回の実験の平均±標準誤差を示す。
【０２２７】
統計分析
エラーバーは、技術的なレプリケートではなく、指定数の独立したかつ／または生物学的な反復の平均＋／−標準偏差または標準誤差（図の説明文に明示）を表す。
【０２２８】
分画およびブルーネイティブＰＡＧＥ
ＭＤＦを６ウェルプレート（１ウェル当たり５×１０５）に播種し、一晩付着させた。１μＭの試験化合物またはＤＭＳＯ対照の存在下で最大６時間、細胞をＴＳＱで刺激した。細胞を擦り取り、ＰＢＳ中で１回洗浄し、０．０２５％ジギトニン（ＢＩＯＳＹＮＴＨ，Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有し、ＥＤＴＡ不含の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、２μＭ  Ｎ−エチルマレイミド、ならびにホスファターゼ阻害剤（５ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭモリブデン酸ナトリウム、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、および１００μＭフッ化ナトリウム）を補充した緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭショ糖）中で透過性にした。透過化をトリパンブルーの取り込みにより確認し、サイトゾル画分および粗膜画分を１１，０００×ｇで５分間遠心して分離した。ジギトニンを、最終濃度１％に細胞質画分に加え、また粗膜画分を、透過化緩衝液＋１％ジギトニン中でさらに可溶化し、氷上で２０分間インキュベートした。粗膜懸濁液を１１，０００×ｇで５分間遠心分離し、その上清を細胞質画分と共に４〜１６％Ｂｉｓ‐ＴｒｉｓネイティブＰＡＧＥゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦに転写した後、ＰＶＤＦを脱染し、６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、および５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中に、室温で２時間、ＰＶＤＦ膜を浸すことにより、ＭＬＫＬエピトープを露出させた。ＭＬＫＬ含有複合体を、上記に記載のように、抗ＭＬＫＬ（３Ｈ１）ウエスタンブロッティングにより検出した。
【０２２９】
図１Ｄは、化合物１が、ブルーネイティブＰＡＧＥの抗ＭＬＫＬブロットにおいて、膜画分への移行を遅延させたことを示す。細胞質画分および膜画分の純度およびタンパク質存在量は、ＧＡＤＰＨおよびＶＤＡＣ１に対する対照ブロットにより図示される。
【０２３０】
組換えタンパク質の発現および精製
ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｂベクターによりコードされた、通常のＮ末端Ｈｉｓ６タグ、またはｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターに導入された修飾２×Ｈｉｓ６タグ、ＭＳＨＨＨＨＨＨＧＳＡＧＳＡＫＫＫＧＳＡＧＳＡＨＨＨＨＨＨＧＳＡを有する組換えマウス（残基１７９〜４６４）およびヒト（１９０〜４７１）ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインを発現させ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３およびＭｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ４５７（２）：３２３−３３４に記載される確立した手順に従ってＳｆ２１昆虫細胞から精製した。手短に言えば、Ｎｉ２＋−親和性クロマトグラフィー（Ｒｏｃｈｅ  ＨｉｓＴａｇ樹脂）により、Ｓｆ２１溶解物からこれらのタンパク質を精製した。次いで、通常のＨｉｓ６タグをＴＥＶプロテアーゼと共に２５℃で１時間インキュベートして切断した後、広範な透析を行い、さらにＮｉ２＋−クロマトグラフィーを実施して、未消化タンパク質およびＴＥＶプロテアーゼを除去した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。タンパク質を、熱安定性シフトアッセイ用に２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中に、またはＮＭＲ実験用に１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中に溶出した。非切断２×Ｈｉｓ６−タグ付き偽キナーゼＮｉ２＋−溶出液を遠心限外濾過により濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供し、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰで溶出した後、表面プラズモン共鳴実験に使用した。組換えｍＲＩＰＫ３キナーゼドメインを発現させ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３  およびＣｏｏｋ  ＷＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．（印刷中）に以前に記載のように、Ｓｆ２１細胞から精製した。
【０２３１】
Ｈｅｒｃｕｓ  ＴＲ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８（８）：ｅ７４３７６およびＭｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ２８（２）：１０４−１１０に記載される確立した戦略を使用してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ）から、組換えマウスＭＬＫＬ（１〜１６９）を調製した。手短に言えば、ｍＭＬＫＬ（１〜１６９）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ末端にＴＥＶプロテアーゼ切断可能ＮｕｓＡ−Ｈｉｓ６タグを有する融合タンパク質として発現できるように、カナマイシン選択可能ベクターであるｐＥＴＮｕｓＨ  ＨＴｂ中にインフレームで連結した。細菌を、ＯＤ５９５が約０．６〜０．８に達するまで、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するスーパーブロス中、３７℃で培養した後、温度を１８℃に低下させ、２０分後、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により発現を誘導した。細胞を１８℃でさらに１６時間培養し、遠心分離により回収し、１ｍＭ  ＰＭＳＦを補充した、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中に再懸濁し、超音波処理により溶解し、遠心分離によりデブリを除去した。上清をシリンジ駆動の０．４５μＭ濾過により清澄化し、ペリスタル型ポンプによりＮｉＭＡＣカートリッジ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に負荷した。７〜１０カラム体積の３５ｍＭイミダゾール  ｐＨ７．５含有溶解緩衝液で洗浄した後、ＮｕｓＡ−Ｈｉｓ６−ｍＭＬＫＬ（１〜１６９）を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中に溶出し、０．５ｍｇのＴＥＶプロテアーゼと共に、２０℃で２時間インキュベートして、融合タグからｍＭＬＫＬ（１〜１６９）を切断した。ＴＥＶプロテアーゼの切断ステップを除いて、他の精製ステップはすべて４℃で実施した。次いで、切断反応物を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５に対して広範に透析し、イミダゾールを除去した後、透析液を回収し、再装填したＮｉＭＡＣカートリッジに再負荷して、溶解緩衝液で洗浄した。素通り画分を遠心限外濾過により濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００、２４ｍＬゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、ＡＵＣ実験用に、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に溶出した。
【０２３２】
小分子相互作用物質をスクリーニングするための熱シフトアッセイ
熱シフトアッセイは、全反応量２５μＬにおいて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ中でタンパク質を２．６μＭに希釈した後、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３，Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ４５７（２）：３２３−３３４、およびＭｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ４５７（３）：３６９−３７７に以前に記載のように、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲマシンを使用して実施した。ＳＹＰＲＯオレンジ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＣＡ）を使用して、５３０ｎｍで検出される蛍光により、タンパク質の熱アンフォールディングを検出した。ＡＴＰを０．２ｍＭで加え、リガンド結合用の陽性対照として使用した。試験化合物を最終濃度４０μＭで加えた。正のΔＴｍ値は、リガンドがタンパク質に結合し、変性からの保護を付与することを示す。図示したデータは、独立した３実験の代表である。
【０２３３】
図１Ａは化合物１に対する熱シフトアッセイを示し、化合物１がＭＬＫＬ相互作用物質であることが確認される。
【０２３４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合実験
マウスＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの化合物１結合のカイネティクスは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＳＰＲにより測定した。二重のＨｉｓタグ付きＭＬＫＬおよび無関係な陰性対照参照タンパク質を、製造業者の指示に従って、Ｎｉ２＋を充填したＮＴＡ捕捉チップ上に固定した。いくつかの例では、二重のＨｉｓタグ付きタンパク質は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で予め固定化されたカルボキシメチル化デキストラン表面を含有する一連のＳセンサーチップ上でのＮｉ２＋／ＮＴＡキレート形成により捕捉された。次いで、ＮＨＳ／ＥＤＣ混合物で表面を活性化および増強し、Ｈｉｓにより捕捉されたタンパク質をコハク酸アミドエステルとして表面に共有結合させた。その後エタノールアミンを注入して未反応エステルをすべてブロックした。非結合Ｎｉ２＋および共有結合していないタンパク質をＥＤＴＡ注入により溶出した。
【０２３５】
典型的な固定化レベルは、２０００〜３０００応答単位（ＲＵ）であった。フローセル１を参照表面としてブランクのままにした。固定化実験は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０を含有するランニング緩衝液中、２５℃で実施した。
【０２３６】
結合実験は、ランニング緩衝液＋２％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ中で実施した。３．１２５μＭ〜２００μＭ（ランニング緩衝液＋２％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ中）の範囲にある６種の化合物１濃度を、１００μＬ／分の流速で固定化タンパク質上に流し、３０秒の結合段階および９０秒の解離段階とした。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアにより、データを分解し、溶媒補正し、２重参照した。データを２状態カイネティック相互作用モデルに全体的に適合させ、（ｋｄ／ｋａ）比からＫｄを決定した。１：１結合化学量論比を定常状態結合曲線および応答単位（ＲＵ）レベルで観察された最大値から推定した。
【０２３７】
図１Ｂは、化合物１がマウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）偽キナーゼドメインに９．３μＭのＫｄ値で結合することを示す。
【０２３８】
図３Ｂは、化合物１がヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）偽キナーゼドメインに４．４μＭのＫｄ値で結合することを示す。
【０２３９】
化合物２〜４もまた、ＳＰＲによりアッセイし、結合親和性を決定した。化合物２〜４の結合親和性を表１に示す。
【０２４０】
飽和移動差（ＳＴＤ）ＮＭＲ分光法
ＳＴＤ実験の各サンプルにおいて、ヌクレオチドを、最終濃度２００μＭでＮＭＲ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０％  Ｄ２Ｏ、１０％  Ｈ２Ｏ）に溶解した。３種の異なるサンプルを各ヌクレオチドについて調製した：（１）等量のタンパク質を含有するサンプルとして加えられたタンパク質緩衝液とＡＴＰまたはＡＤＰ、（２）最終濃度２μＭのＭＬＫＬ偽キナーゼドメインとＡＴＰまたはＡＤＰ、（３）試験化合物を２００μＭで含む、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメイン（２μＭ）とＡＴＰまたはＡＤＰ。ＮＭＲスペクトルは、Ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ（商標）を装着したＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ  ６００ＭＨｚ分光計にて２８３Ｋで記録した。１Ｈ化学シフトは、４．７０ｐｐｍの１Ｈ２Ｏシグナルを基準にした。タンパク質共鳴の飽和は、−０．５ｐｐｍに中心がある、４秒連続のガウス型パルスにより達成した。参照スペクトルについては、同様の飽和パルスを、２０，０００Ｈｚのオフ共鳴に中心のある周波数で印加した。残存タンパク質シグナルが減衰できるように、取得前に、１５ミリ秒のＴ２−スピン−ロック時間を使用した。ＮＭＲデータは、ＴＯＰＳＰＩＮバージョン３．２（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）で処理した。
【０２４１】
図２Ａは、化合物１に対するＳＴＤ  ＮＭＲアッセイを示す。マウスＭＬＫＬへのヌクレオチド結合を示すＳＴＤ  ＮＭＲスペクトルである。このデータは、化合物１が、マウスＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの結合に対して、（ｉ）ＡＴＰおよび（ｉｉ）ＡＤＰと競合し得ることを示す。オフ共鳴スペクトルの低磁場領域は、タンパク質の非存在下において、２００μＭのＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について検出されたピークを示す。アスタリスクで示されるピークは、２μＭのマウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）の存在下で、ＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について実施されたＳＴＤ−ＮＭＲ実験で観察されたもので、これによりヌクレオチド結合が確認される。これらのピークは、２００μＭの化合物１の存在下で減少し、これにより、ＡＴＰおよびＡＤＰが化合物１の存在下でマウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）から置換されることが確認される。
【０２４２】
図３Ａは、化合物１に対するＳＴＤ  ＮＭＲアッセイを示す。ヒトＭＬＫＬへのヌクレオチド結合を示すＳＴＤ  ＮＭＲスペクトルである。このデータは、化合物１が、ヒトＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの結合に対して、（ｉ）ＡＴＰおよび（ｉｉ）ＡＤＰと競合し得ることを示す。オフ共鳴スペクトルの低磁場領域は、タンパク質の非存在下において、２００μＭのＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について検出されたピークを示す。アスタリスクで示されるピークは、２μＭのヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）の存在下で、ＡＴＰ（ｉ）またはＡＤＰ（ｉｉ）について実施されたＳＴＤ−ＮＭＲ実験で観察されたもので、これによりヌクレオチド結合が確認される。これらのピークは、２００μＭの化合物１の存在下で減少し、これにより、ＡＴＰおよびＡＤＰが化合物１の存在下でヒトＭＬＫＬ（１９０〜４７１）から置換されることが確認される。
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、ＤＭＳＯ対照または最終０．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ中の試験化合物を最大１２．５μＭ添加することを除いて、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（３）：４４３−４５３およびＣｏｏｋ  ＷＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．印刷中に以前に記載のように実施した。
【０２４４】
図２Ｃは、化合物１が、ＤＭＳＯ対照（「０」レーン）と比較すると、組換えＲＩＰＫ３キナーゼ活性に影響を及ぼさないことを示す。化合物１濃度≧１０μＭでは、マウスＭＬＫＬ（１７９〜４６４）のリン酸化が再現性よく増強される。図示した実験は、独立した３アッセイの代表である。左パネル、乾燥したクーマシー染色の４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲル；右パネル、同じゲルのオートラジオグラフ。
【０２４５】
１．２  アッセイの結果
本明細書に記載の化合物を、上記のようにアッセイした。アッセイの結果を下記の表に示す。
【０２４６】
【表１】
2017521477.tif 000119
【０２４７】
ＭＬＫＬタンパク質のＡＴＰ結合部位に対する、化合物１に由来するアナログである化合物３の結合を、図５ＡおよびＢに示す。
【０２４８】
その上流のアクチベーターであるＲＩＰＫ３によるＭＬＫＬのリン酸化に対する、ＭＬＫＬ偽キナーゼドメインへの化合物１結合の効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを使用して検討した。組換えＲＩＰＫ３の触媒活性もＭＬＫＬのＲＩＰＫ３媒介リン酸化も、化合物１により阻害されないことが判明した。これに対して、＞５μＭの化合物１の存在下では、ＭＬＫＬのＲＩＰＫ３媒介リン酸化が増強された。図２Ｄは、化合物１が、ＤＭＳＯ対照（「０」レーン）と比較すると、組換えＲＩＰＫ３キナーゼ活性に影響を及ぼさないことを示す。化合物１濃度≧１０μＭでは、ＭＬＫＬ（１７９〜４６４）のリン酸化が再現性よく増強される。図示した実験は、独立した３アッセイの代表である。左パネル、乾燥したクーマシー染色の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル；右パネル、同じゲルのオートラジオグラフ。
【０２４９】
ＴＳＱ誘導ネクロトーシスの阻害に対する化合物スクリーニング、９６ウェルプレート形式。
細胞株ＩＤ：Ｕ９３７ヒト組織球白血病細胞株。
細胞濃度（細胞／ウェル）：培地１２０μＬ中、ウェル当たり３５，０００個、阻害剤および死刺激の添加直前にカウントし、播種する。化合物および死刺激の添加後の、最終的なウェル量は１５０μＬ
細胞増殖培地：ＨＴＲＰＭＩ（ＷＥＨＩ  Ｍｅｄｉａ  ｋｉｔｃｈｅｎ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン、ストレプトマイシンを含有する）−７．４％ｖ／ｖ  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ．Ｌｏｔ＃１２２１４３７）を補充
インキュベーション時間（時）：化合物および死刺激の添加後４８時間。
ＤＭＳＯ最終濃度（％ｖ／ｖ）：０．２％
化合物濃度  −  ｌｏｇ用量設定：
１００００ｎＭ、５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ
死刺激カクテル中の化合物およびその最終濃度：
ｈＴＮＦ−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）−Ｓｉｌｋｅ  ｌａｂ，ＷＥＨＩの製品。
化合物Ａ（５００ｎＭ）−Ｓｍａｃミメティック、Ｔｅｔｒａｌｏｇｉｃ
Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１０μＭ）−ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ
分析：
ＰＩ染色（１μｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、フローサイトメトリーにより分析。
【０２５０】
結果の解釈：
ＴＳＱカクテル（Ｔ：ＴＮＦ；Ｓ：Ｓｍａｃミメティック；Ｑ：Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を含むアッセイ：ＴＳＱ処理は、細胞がネクロトーシス細胞死を特異的に起こすことを保証する。ＴＮＦはＴＮＦ受容体を活性化し、Ｓｍａｃミメティックは、炎症促進性シグナル伝達から離れて、ＲＩＰ１／ＲＩＰ３媒介細胞死経路の方にシグナルを導き、またＱ−ＶＤ−ＯＰｈは、アポトーシス応答がブロックされてプログラムされたネクローシス応答のみが残ることを保証する。このＴＳＱ誘導アッセイで試験した化合物（ＤＭＳＯ溶液）の活性は、ＰＩ染色後のフローサイトメトリーにより測定される、細胞死をブロックするその能力を測定することにより評価される。
【０２５１】
カウンタースクリーニング：並行して、細胞生存率に影響を及ぼす能力について、すべての化合物を試験する。同じＵ９３７細胞を、ＴＳＱカクテルを含まないＤＭＳＯ中の化合物で処理する。このカウンタースクリーニングにより、オフターゲット効果の評価が可能になる。この場合、増加、細胞生存率がＰＩ染色後のフローサイトメトリーにより測定される。
【０２５２】
上記の化合物のスクリーニング結果を下記の表２に示す。
【０２５３】
【表２】
2017521477.tif 000120
【０２５４】
【表３】
2017521477.tif 000121
【０２５５】
ポリ（Ｉ：Ｃ）実験
形質転換したｉＢＭＤＭを、２４ウェルプレート（６０．０００細胞／ウェル）に分配し、４８時間後に種々の濃度の化合物１で処理した。０．５時間後、ポリ：ＩＣ（５０ｕｇ／ｍｌ）およびｚＶＡＤ（２５ｕＭ）を加えた。細胞を４８時間後に回収した。細胞死をヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーにより分析した。
【０２５６】
図６の結果は、化合物１がポリ（Ｉ：Ｃ）およびｚＶＡＤ誘導ネクロトーシスを阻害することを示す。ポリ（Ｉ：Ｃ）およびｚＶＡＤ誘導細胞死は、ＲＩＰＫ１と無関係に生じることが知られており、これにより、化合物１がＭＬＫＬを標的にすることによりネクロトーシスを阻害することが示される。
【０２５７】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記された要素、整数、もしくはステップまたは要素、整数、もしくはステップの群を包含することを意味するものであって、他の任意の要素、整数、もしくはステップまたは要素、整数、もしくはステップの群を除外することを意味するものでないことは理解されよう。
【０２５８】
数多くの変形および／または修正が、本開示の広範な全体的な範囲から逸脱することなく、上記の実施形態になされ得ることは、当業者に認識されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点において、例示的なものであって、限定的なものではないと考えるべきである。
【図１Ａ−１Ｂ】
2017521477.tif 000139
【図１Ｃ−１Ｄ】
2017521477.tif 000140
【図２Ａ】
2017521477.tif 000141
【図２Ｂ−２Ｃ】
2017521477.tif 000142
【図３Ａ】
2017521477.tif 000143
【図３Ｂ−３Ｄ】
2017521477.tif 000144
【図４】
2017521477.tif 000145
【図５】
2017521477.tif 000146
【図６】
2017521477.tif 000147
【図７】
2017521477.tif 000148
【図８】
2017521477.tif 000149
【図９】
2017521477.tif 000150
【図１０】
2017521477.tif 000151
【配列表】
2017521477000001.app
【国際調査報告】
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