(57)【要約】  本発明は、核酸配列の存在に基づく、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型の検出およびキャラクタリゼーションの迅速で正確な方法、特にＰＣＲに基づく検出方法、ならびにこの方法に有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。この方法は好ましくは、食品試料中におけるおよび環境試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するために用いられる。本発明は更に、本発明の方法を実行するための複製組成物およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、前記方法は、
（ａ）推定されるイノソースイソメラーゼタンパク質（ｌｏｌＩ）遺伝子の少なくとも一部の増幅に適したプライマー対を含む反応混合物を準備すること、
（ｂ）前記工程（ａ）の反応混合物を使用して、前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施すること、および
（ｃ）前記工程（ｂ）の増幅を検出することであって、増幅の陽性検出は、前記試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在を示す、検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）が配列番号１の増幅に適したプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列番号１の核酸領域の増幅用のプライマー対が、
（Ａ）配列番号２および配列番号７、配列番号３および配列番号５、配列番号４および配列番号５、配列番号５および配列番号６、配列番号５および配列番号８、ならびに配列番号９および配列番号１０
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物が、検出する各核酸領域用の少なくとも１種の核酸プローブを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の核酸プローブが、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種の核酸プローブがそれぞれ検出可能な標識を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が食品試料または環境試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９または１０に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むプライマー。
【請求項９】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９または１０に記載のポリヌクレオチド配列を含む請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型検出配列。
【請求項１１】
前記配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含む請求項１０に記載のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型検出配列。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６に記載のに記載のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＰＣＲの実施で使用する複製組成物であって、
（ａ）下記からなる群から選択されるプライマー対のセット
（ｉ）配列番号２および配列番号７；
（ｉｉ）配列番号３および配列番号５；
（ｉｉｉ）配列番号４および配列番号５；
（ｉｖ）配列番号５および配列番号６；
（ｖ）配列番号５および配列番号８；ならびに
（ｖｉ）配列番号９および配列番号１０
を含む複製組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼが少なくとも１種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４に記載の複製組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の複製組成物を含む、試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型を検出するためのキットであって、（ｉ）前記（ａ）（ｉ）〜ａ（ｖｉ）のプライマー対および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のプローブ、または（ｉｉ）配列番号２および配列番号１１、配列番号３および配列番号１１、配列番号４および配列番号１１、配列番号６および配列番号１１、配列番号８および配列番号１１、配列番号５および配列番号１２、配列番号５および配列番号１３、配列番号１０および配列番号１４、配列番号５および配列番号１５もしくは配列番号５および配列番号１６のプローブ−プライマー対を含むキット。
【請求項１７】
前記キットが少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項１６に記載の試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型を検出するためのキット。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼが少なくとも１種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月１８日に出願された米国仮出願第６２／０２６，１３５号明細書の優先権を主張し、この明細書はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明の分野は、核酸配列の存在に基づいてリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型を検出する方法（好ましくはＰＣＲに基づく検出方法）、ならびにこの方法に有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、チーズおよびデリミート等のそのまま食べられる食品ならびにホットドッグ等の加工食品と関連する食品媒介性疾患大流行の病原体である。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）はまた、通常はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）汚染と関連しないカンタループおよびその他の食品に関連する食品媒介性疾患大流行の原因でもある。高齢者および若者でのリステリア症は、最大４０％の死亡率のために非常に致命的であり得る。妊婦も感染しやすく、結果として生じる感染症により流産、死産または胎児の疾患が起こる。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のその他の種は、持続に好都合な様々な場所で見られる一般的な環境細菌である。様々な食品製造施設は、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種の複製および未加工の食品成分または完成した食品の起こり得る汚染を可能にし得る好ましい環境を提供する場合がある。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属の多くの種は冷蔵温度下で生存することができ、増殖して数を増やし続けることができる。同じ環境中でリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の多数の種が存在し得る。食品中のまたは調理環境中のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種を検出するための古典的な微生物方法は、スクリーニングアッセイの開始後に最大５日を必要とすることがある。このスクリーニングアッセイの結果を待つ間、食品の製造業者または販売業者は、多額の費用をかけてこの食品を保存しなければならない。その後にリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の存在に関して陽性の結果である環境で作られた食品は、出荷前にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在に関してアッセイする必要があるかもしれない、または損をして在庫を廃棄する必要があるかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、結果まで短時間で、高精度でおよび優れた使いやすさでリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様は、試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、前記方法は、（ａ）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）におけるイノソースイソメラーゼ（ｉｎｏｓｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子（例えばｌｏｌｌ）の少なくとも一部の増幅に適したプライマー対を含む反応混合物を準備すること、（ｂ）前記工程（ａ）の反応混合物を使用して、前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施すること、および（ｃ）前記工程（ｂ）の増幅を検出することであって、増幅の陽性検出は、前記試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在を示す、検出することを含む、方法に関するものである。
【０００６】
別の態様は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むプライマーに関するものである。
【０００７】
別の態様は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むプライマーに関するものである。
【０００８】
更なる態様は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＳｃｏｒｐｉｏｎプローブに関するものである。
【０００９】
更なる態様は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むＳｃｏｒｐｉｏｎプローブに関するものである。
【００１０】
追加の態様は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）検出配列に関するものである。
【００１１】
追加の態様は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６に記載のポリヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）属検出配列に関するものである。
【００１２】
別の態様は、ＰＣＲの実施で使用する複製組成物であって、（ａ）配列番号２、７および１１；配列番号２および７；配列番号２および１１；配列番号３、５および１１；配列番号３および５；配列番号３および１１；配列番号４、５および１１；配列番号４および５；配列番号４および１１；配列番号５、６および１１；配列番号５および６；配列番号６および１１；配列番号５、８および１１；配列番号５および８；配列番号８および１１；配列番号５、８および１２；配列番号５および１２；配列番号５、６および１３；配列番号５および１３；配列番号９、１０および１４；配列番号９および１０；配列番号１０および１４；配列番号５、８および１５；配列番号５および１５；配列番号５、８および１６；ならびに配列番号５および１６（下記の段落０５２で表１に列挙する任意のプライマー−プローブ−プライマー、プライマー−プローブまたはプライマー−プライマーの対形成）からなる群から選択されるプライマー対のセットと、（ｂ）少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼとを含む複製組成物に関するものである。この少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることができる。
【００１３】
追加の態様は、上述した複製組成物を含む、試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（全ての血清型を含む）を検出するためのキットであって、表１に記載するように、配列番号２および７；配列番号３および５；配列番号４および５；配列番号５および６；配列番号５および８；ならびに配列番号９および１０から選択される１種または複数種のプライマー対と、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ配列番号１１、１２、１３、１４、１５または１６とを含むキットに関するものである。
【００１４】
その他の利点は、この後に続く詳細な説明を参照することにより当業者に明らかになるだろう。
【００１５】
配列の概要
配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ”）に準拠し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（Ｒｕｌｅｓ  ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびにＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＳｅｃｔｉｏｎ  ２０８およびＡｎｎｅｘ  Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに関して使用する記号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
【００１６】
配列番号１は、推定されるｌｏｌｌイノソースイソメラーゼ遺伝子である、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の標的遺伝子配列である。下記は配列番号１に関する配列表である。
【００１７】
配列番号１
【化１】
2017521083.tif 000002
【００１８】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型の検出用のプライマー配列である。
【００１９】
配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型の検出で使用するＳｃｏｒｐｉｏｎプローブである。一実施形態では、このプローブは、蛍光色素により５’−標識されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６の３’末端は、上記に列挙したプライマー（例えば配列番号５）、適切なリンカー部分（例えば６個のポリエチレングリコール単位からなるスペーサー）およびクエンチャー色素の内の１つで構成されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
出願人は、本開示で引用される全ての参考文献の全内容を具体的に援用する。更に、ある量、ある濃度またはその他の値もしくはパラメーターが、ある範囲、好ましい範囲または好ましい上限値および好ましい上限値のリストのいずれかとして示されている場合、このことは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の上限の範囲限界または好ましい値と任意の下限の範囲限界または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されたい。ある数値範囲が本明細書で列挙されている場合、別途明記しない限り、この範囲は、この範囲の端点ならびにこの範囲内の全ての整数および分数を含むように意図されている。本発明の範囲が、ある範囲を画定する場合に列挙される具体的値に限定されることは意図されていない。
【００２１】
定義
本開示では多くの用語および略語を使用する。下記に定義を記載する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の２０％内を意味しており、好ましくは１０％内を意味しており、より好ましくは５％内を意味する。
【００２３】
用語「含む」は、用語「から本質的になる」および「からなる」により包含される実施形態を含むように意図されている。同様に、用語「から本質的になる」は、用語「からなる」により包含される実施形態を含むように意図されている。
【００２４】
用語「リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＩｏＩＩ遺伝子」または「ＩｏＩＩ」は、イノソースイソメラーゼタンパク質のファミリのメンバーをコードする、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型のゲノムの領域を意味する。参考のために、本明細書では一例としてイノソースイソメラーゼに関する遺伝子配列（ＩｏＩＩ）を使用するが、イノソースイソメラーゼタンパク質のファミリにおけるその他の遺伝子も同様に考慮してもよい。ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＧ４２１７４１．１（範囲２３２６４２４〜２３２７２７８）として受託されたヌクレオチド配列は、様々な種のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）イノソースイソメラーゼタンパク質にわたり高度に保存された遺伝子配列の一例である。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略される。
【００２６】
用語「単離」は、天然に存在する環境下において通常は付随する成分または相互作用する成分を実質的に含まないまたはそうでなければこの成分から取り出されている物質（例えば核酸分子および／またはタンパク質）を意味する。単離ポリヌクレオチドを、このポリヌクレオチドが天然に存在する宿主細胞から精製することができる。当業者に既知の従来の核酸精製法を使用して単離ポリヌクレオチドを得ることができる。この用語には、組み換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含される。
【００２７】
本明細書では、用語「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」および「核酸断片」を互換的に使用する。これらの用語にはヌクレオチド配列等が包含される。ポリヌクレオチドは、合成の、非天然のまたは改変されたヌクレオチド塩基を任意選択で含む、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであることができる。ポリヌクレオチドはまたは、３個もしくは６個の炭素（それぞれプロパンジオールもしくはヘキサンジオール）部分等のリンカーにより、または３個もしくは６個のポリエチレングリコールサブユニット（それぞれトリエチレングリコールもしくはヘキサエチレングリコール）のいずれかからなるリンカーアームにより、一方のヌクレオチド配列の３’末端で他方のヌクレオチド配列の５’末端に連結されているヌクレオチド配列からなることもできる。この用途のために、当分野で既知であるあらゆる適切なリンカーまたはスペーサーが役立つだろう。ＤＮＡのポリマーの形のポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの混合物の内の１種または複数種の鎖で構成することができる。
【００２８】
用語「増幅産物」は、プライマー指向性増幅反応（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）中に生じる核酸断片を意味する。プライマー指向性増幅の典型的な方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲ法が選択される場合、複製組成物は核酸複製用の成分を含むことができ、例えばヌクレオチド三リン酸、適切な配列を有する２種の（またはより多種の）プライマー、耐熱性ポリメラーゼ、バッファー、溶質およびタンパク質を含むことができる。これらの試薬、および核酸の増幅におけるこれらの試薬の使用に関する手順を説明する詳細が米国特許第４，６８３，２０２号明細書および米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されており、参照により本明細書に援用される。ＬＣＲ法が選択される場合、核酸複製組成物は、例えば耐熱性リガーゼ（例えばテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２セットの隣接オリゴヌクレオチド（各セットの１つのメンバーは、標的鎖それぞれに対して相補的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオトレイトールおよびサケ精子ＤＮＡを含むことができる。例えばＴａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１０７４−７８（１９８５）を参照されたい。
【００２９】
用語「プライマー」は、相補鎖の合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置かれると相補鎖に沿った核酸の合成または複製の開始点として作用することができる（合成または天然に存在する）オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは検出可能な標識（例えば５’末端標識）を更に含むことができる。
【００３０】
用語「プローブ」は、目的のポリヌクレオチドに対して（必ずしも完全に相補的ではないが）相補的であり、目的のポリヌクレオチドからなる少なくとも１本の鎖とのハイブリダイゼーションによって二本鎖構造を形成する（合成または天然に存在する）オリゴヌクレオチドを意味する。プローブまたはプライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識を更に含むことができる。
【００３１】
プローブはプライマーと複合体を形成し、またはそうでなければプライマーに付着し、例えばプローブは、その３’末端を介してプライマーの５’末端へリンカーにより接続され、リンカーは、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであることができ、３個もしくは６個の炭素（それぞれプロパンジオールもしくはヘキサンジオール）部分等の非増幅性リンカー（ブロッカー）または３個もしくは６個のポリエチレングリコールサブユニット（それぞれトリエチレングリコールもしくはヘキサエチレングリコールのいずれかからなるリンカーアームであることができる。そのような場合、この複合体は「プライマー−プローブ複合体」と呼ばれるだろう。そのようなプライマー−プローブ複合体の一例を米国特許第６，３２６，１４５号明細書（この全体が参照により本明細書に援用される）中に見出すことができ、このプライマー−プローブ複合体は「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ」または「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー」と称されることが多い。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「標識」および「検出可能な標識」は検出可能な分子を意味しており、放射性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、半導体ナノ結晶、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）等が挙げられるがこれらに限定されない。検出可能な標識として、レポーターとプローブを有するクエンチャーとの組合せを挙げることもできる。
【００３３】
用語「レポーター」は、検出可能なシグナルを示すことができる物質またはこの物質の一部を意味しており、このシグナルはクエンチャーによって抑制され得る。レポーターの検出可能なシグナルは、例えば検出可能な範囲内の蛍光である。用語「クエンチャー」は、レポーターにより生じる検出可能なシグナルを例えば抑制することができる、低減することができる、阻止することができる物質またはこの物質の一部を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「クエンチング」および「蛍光エネルギー移動」は、レポーターおよびクエンチャーが極めて近接していてレポーターがエネルギー源により励起される場合に、励起状態のエネルギーの相当な部分がクエンチャーへと非放射的に移動し、この相当な部分が非放射的に消散するまたはレポーターの放射波長とは異なる放射波長で放射されるプロセスを意味する。
【００３５】
好ましくは、レポーターを、オリゴヌクレオチド（例えば末端３’炭素または末端５’炭素）への付着に適した連結基で修飾されている蛍光性有機色素から選択することができる。本発明の実施形態に応じてクエンチャーも有機色素から選択することができ、この有機色素は蛍光性でもよいし蛍光性でなくてもよい。一般に、クエンチャーが蛍光性であるかまたはレポーターから移動したエネルギーを非放射減衰により単に放出するかにかかわらず、クエンチャーの吸収バンドは、クエンチングを最適化するためにレポーターの蛍光放射バンドと少なくとも実質的に重複すべきである。非蛍光性クエンチャーまたはダーククエンチャーは典型的には、励起されたレポーターからのエネルギーを吸収することにより機能するが、放射的にエネルギーを放出しない。
【００３６】
特定のプローブに適切なレポーター−クエンチャー対の選択を、既知の技術に従って行なうことができる。蛍光性クエンチャーおよびダーククエンチャー、ならびにこれらのクエンチャーの、典型的なレポーター−クエンチャー対を選択することができる関連光学特性が、例えばＢｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１に列挙されており、および説明されており、この内容は参照により本明細書に援用される。本発明においてオリゴヌクレオチドに付加され得る一般的な反応基による共有結合性の付着のためのレポーターおよびクエンチャーの修飾の例を例えばＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９２に見出すことができ、この内容は参照により本明細書に援用される。
【００３７】
好ましいレポーター−クエンチャー対を、フルオレセイン色素およびローダミン色素等のキサンテン色素から選択することができる。これらの化合物の多くの適切な形態はフェニル基上の置換基と共に市販されており、この置換基を、オリゴヌクレオチドへの付着のための結合部位としてまたは結合官能基として使用することができる。レポーターとしての使用のための蛍光性化合物の別の好ましい基はナフチルアミンであり、アルファ位またはベータ位でアミノ基を有する。そのようなナフチルアミノ化合物に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチル−５スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）−６−ナフタレンスルホネートである。その他の色素として、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アクリジン、例えば９−イソチオシアナトアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール；スチルベン；ピレン等が挙げられる。
【００３８】
最も好ましくは、レポーターおよびクエンチャーはフルオレセイン色素およびローダミン色素から選択される。これらの色素とオリゴヌクレオチドへの付着に適した連結法とは当分野で公知である。
【００３９】
クエンチャーの適切な例を、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＢＨＱ−０（商標）、ＢＨＱ−１（商標）、ＢＨＱ−２（商標）およびＢＨＱ−３（商標）（これらはそれぞれ、ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）、ＱＳＹ−７（商標）、ＱＳＹ−９（商標）、ＱＳＹ−２１（商標）およびＱＳＹ−３５（商標）（これらはそれぞれ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である）等から選択することができる。
【００４０】
レポーターの適切な例を、例えばＳＹＢＲグリーン、５−カルボキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な５−ＦＡＭ（商標））、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＴＥＴ（商標））、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＪＯＥ（商標））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＶＩＣ（商標）色素製品、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なから入手可能なＮＥＤ（商標）色素製品、ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素製品（例えばＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０、Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、Ｒｅｄ  ５９０、Ｒｅｄ  ６１０、Ｒｅｄ  ６３５等）、ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＱｕａｓａｒ色素製品（例えばＱｕａｓａｒ  ５７０、６７０、７０５等）等の色素から選択することができる。
【００４１】
レポーターおよびクエンチャーを含むプローブの一例は、単分子コンフォメーションまたは二分子コンフォメーションのいずれかのＳｃｏｒｐｉｏｎプローブである。単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎでは、プライマー−プローブ複合体のプローブ部分は、プローブがその標的ＤＮＡから解離する場合にプローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域で挟まれている。更に、単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎでは、レポーターは典型的には、一方の自己相補的領域でまたはこの自己相補的領域付近で（例えばＳｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端で）付着しており、クエンチャーは、他方の自己相補的領域でまたはこの自己相補的領域付近で（例えば相補配列の３’末端で）付着しており、および非増幅性リンカーに隣接しており、その結果、クエンチャーはレポーターに十分近く近接しており、プローブがそのステム−ループコンフォメーションである場合にクエンチングが起こる。二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎでは、典型的には自己相補的隣接領域は用いられず、むしろ別の「ブロッキングオリゴヌクレオチド」がＳｃｏｒｐｉｏｎプローブと共に用いられる。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、プローブがその標的ＤＮＡから解離する場合にＳｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域にハイブリダイズすることができる。更に、二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎでは、レポーターは典型的には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域に（例えばＳｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端で）付着しているが、クエンチャーはブロッキングオリゴヌクレオチドに（例えばブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端で）付着しており、その結果、クエンチャーはレポーターに十分近く近接しており、プローブがその標的ＤＮＡから解離して代わりにブロッキングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合にクエンチングが起こる。
【００４２】
レポーターおよびクエンチャーを含むプローブの別の例は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術等の５’−エキソヌクレアーゼアッセイで使用するプローブである。この文脈では、オリゴヌクレオチドプローブは、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に隣接する十分な数のホスホジエステル結合を有することができ、その結果、用いられる５’→３’ヌクレアーゼ活性は、結合したプローブを効率的に分解してレポーターおよびクエンチャーを分離することができる。レポーターおよびクエンチャーを含むプローブの更に別の例はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ型プローブであり、このＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ型プローブは、このプローブの標的配列から解離する場合にこのプローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域で挟まれたプローブ領域を含む。そのようなプローブは典型的には、一方の末端でまたはこの末端付近で付着しているレポーターと、他方の末端でまたはこの末端付近で付着しているクエンチャーとを有しており、その結果、クエンチャーはレポーターに十分近く近接しており、プローブがその解離形態である場合に、従ってステム−ループ形態である場合にクエンチングが起こる。
【００４３】
用語「複製インヒビター部分」は、核酸鎖の複製のための鎖伸長の開始をブロックし得る、オリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシル基に付着しているあらゆる原子、分子または化学基を意味する。例として、３’−デオキシヌクレオチド（例えばコルジセピン）、ジデオキシヌクレオチド、リン酸塩、リガンド（例えばビオチンおよびジニトロフェノール）、レポーター分子（例えばフルオレセインおよびローダミン）、炭素鎖（例えばプロパノール）、ミスマッチしたヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはペプチド核酸単位が挙げられるがこれらに限定されない。用語「非関与的（ｎｏｎ−ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｏｒｙ）」は、核酸分子を増幅させるための反応におけるプローブまたはプライマーの関与の欠如を意味する。具体的には、非関与的なプローブまたはプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼのための基質として作用し得ないもの、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼにより伸長され得ないものである。「非関与的プローブ」は、本質的にはポリメラーゼにより鎖伸長され得ない。非関与的プローブは複製インヒビター部分を有してもよいし有さなくてもよい。
【００４４】
核酸分子は、この核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下でその他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ等の別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章およびこの章の表１１．１（参照により本明細書に完全に援用される）に例示されている。温度およびイオン強度の条件によりハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。相同核酸の予備的スクリーニングのために、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用することができ、例えば５ξＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルクおよびホルムアミドなし、または３０％のホルムアミド、５ξＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを使用することができる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応しており、例えば５ξまたは６ξのＳＳＣを含む４０％のホルムアミドに対応する。ハイブリダイゼーションでは２種の核酸が相補配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、当分野で公知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に応じて決まる。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、下記の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個超のヌクレオチドのハイブリッドのために、Ｔｍを算出する方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸（即ちオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さにより、そのオリゴヌクレオチドの特異性が決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照，１１．７−１１．８を参照されたい）。好ましい一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０個のヌクレオチドである。より好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１１個のヌクレオチド、少なくとも約１２個のヌクレオチド、少なくとも約１３個のヌクレオチド、少なくとも約１４個のヌクレオチド、少なくとも約１５個のヌクレオチド、少なくとも約１６個のヌクレオチド、少なくとも約１７個のヌクレオチド、少なくとも約１８個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２１個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、少なくとも約２３個のヌクレオチド、少なくとも約２４個のヌクレオチド、少なくとも約２５個のヌクレオチド、少なくとも約２６個のヌクレオチド、少なくとも約２７個のヌクレオチド、少なくとも約２８個のヌクレオチド、少なくとも約２９個のヌクレオチドであり、最も好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドである。更に、温度および洗浄溶液の塩濃度を、必要に応じてプローブの長さ等の因子に従って調節することができることを当業者は認識するだろう。
【００４５】
本明細書で使用する標準的な組み換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は当分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）およびＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版（１９８７）されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙにより説明されている。
【００４６】
ゲノム検出領域
出願人は、推定されるＩｏｌＩ遺伝子の同定に基づいて開発したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種検出アッセイを使用する方法によって、述べた問題を解決している。いくつかの実施形態では、このアッセイには、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型の検出用の非標識のプライマーおよびＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（ならびに、いくつかの実施形態では内部陽性コントロール（例えばｓＳＶ４０））が組み込まれている。いくつかの実施形態では、このアッセイには、蛍光シグナルの正規化用のおよびウェル間のシグナル変動を相殺するための受動参照も含まれる。
【００４７】
本開示の検出アッセイは、液体培養物中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型に対して１０４ｃｆｕ／ｍＬ以下で分析感度を有する。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の５３種の株による包括性試験（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ）では、全てが同程度の細胞密度で検出されることが示された（表４）。近縁の非リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種の６１種の株による排他性研究（ｅｘｃｌｕｓｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ）（表５）から、試験した試料はいずれもリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）検出アッセイと交差反応しないことが明らかとなった。食品富化試料を使用する試験から、優れた感度および特異性ならびにＰＣＲインヒビターに対する頑健性が明らかとなった。
【００４８】
従って、本開示は、推定されるｌｏｌｌ遺伝子配列の検出によるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の検出および同定に関する。本検出方法では、あらゆるタイプの試料（例えば食品検査、環境検査またはヒトもしくは動物の診断検査に適した試料）中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種の検出での有用性が見られる。これらの領域の検出に適した方法の例が本明細書で挙げられているが、本発明は説明された方法に限定されないことを理解されたい。むしろ、ある試料中におけるこれらのＤＮＡ領域の検出およびその後のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の検出に、あらゆる適切な方法を用いることができる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ構築物
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、増幅中にＰＣＲ産物中に組み込まれた場合にのみ発光するように設計されている発蛍光性のプライマー／プローブオリゴヌクレオチドハイブリッドである。このプライマーには下記の２種の異なる構造が組み込まれている：１）標的特異的ＰＣＲプライマーおよび２）標的特異的ＤＮＡプローブ配列
【００５０】
標的特異的プライマー
標的特異的ＰＣＲプライマーは、３個もしくは６個の炭素（それぞれプロパンジオールまたはヘキサンジオール）部分等のブロッキング部分により、または３個もしくは６個のポリエチレングリコールサブユニットのいずれかからなるリンカーアームにより、ＤＮＡプローブ配列の３’末端に共有結合的に連結されている。この部分はプローブ要素中へのポリメラーゼ伸長を防止する。典型的なＰＣＲ反応では、プライマー配列が相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）標的ＤＮＡ配列にアニールし、ヌクレオチドの存在下でのＤＮＡポリメラーゼの作用により、鋳型ＤＮＡ合成反応がプライマーの３’末端から開始される。
【００５１】
ＤＮＡプローブ配列
ＳｃｏｒｐｉｏｎプローブのＤＮＡプローブ配列は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ中に組み込まれた標的特異的プライマーの３’末端からのポリメラーゼ伸長により合成された標的遺伝子配列に対して相補的である。
【００５２】
蛍光クエンチングメカニズム
蛍光クエンチングを、二分子メカニズムまたは単分子メカニズムのいずれかにより達成することができる。二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎ形式では、クエンチャーオリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡプローブ配列に対しても相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）である。フルオロフォア分子がＤＮＡプローブ配列の５’末端に共有結合的に連結されており、ＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）色素等のクエンチャー部分がクエンチャーオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合的に連結されている。単分子メカニズムでは、プローブ配列は２つの相補配列に挾まれている。フルオロフォア分子がＤＮＡプローブ配列の５’末端に共有結合的に連結されており、クエンチャーが相補配列の３’末端に位置しており、３個もしくは６個の炭素（それぞれプロパンジオールもしくはヘキサンジオール）部分または３個もしくは６個のポリエチレングリコールサブユニットのいずれかからなるリンカーアームに隣接している。ポリメラーゼ伸長により合成された標的遺伝子配列にプローブがハイブリダイズしない場合、これらの相補配列が互いにハイブリダイズし得る。このことによりフルオロフォアおよびクエンチャーが極めて近接し、その結果、フルオロフォアのクエンチングが起こる。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドを配列番号２〜１６に記載する。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅用のプライマーとして使用することができる。好ましいプライマー対およびこのプライマー対の対応する標的ならびにプローブを表１に示す。
【００５５】
【表１】
2017521083.tif 000003
【００５６】
【表２】
2017521083.tif 000004
【００５７】
上記の表２では、下記のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ配列が、改変されることなく全配列として配列表中に示されている。配列番号１１（単分子Ｌｍｏｎｏ−３５７  ＵＭ０９）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１１中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１１中のヌクレオチド番号４６の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。同様に、配列番号１２（単分子Ｌｍｏｎｏ−ＲＣ７３７  ＵＭ１０）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１２中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１２中のヌクレオチド番号５０の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。同様に、配列番号１３（単分子Ｌｍｏｎｏ−４７１  ＵＭ１１）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１３中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１３中のヌクレオチド番号４６の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。同様に、配列番号１４（単分子Ｌｍｏｎｏ−８２１  ＵＭ１２）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１４中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１４中のヌクレオチド番号４２の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。同様に、配列番号１５（単分子Ｌｍｏｎｏ−ＲＣ７３７  ＵＭ１３）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１５中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１５中のヌクレオチド番号４８の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。同様に、配列番号１６（単分子Ｌｍｏｎｏ−ＲＣ７３７  ＵＭ１４）は、改変されることなく全配列として配列表中に示されており、このｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列番号１６中のヌクレオチド番号１の前に５’フルオロフォアＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０を有しており、配列番号１６中のヌクレオチド番号４８の後に内部ＢＨＱ２クエンチャーおよびＳＰ−１８スペーサーを有しており、更に残り２７個のヌクレオチドが続いている。
【００５８】
これらのオリゴヌクレオチドプライマーはまた、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＥＰ０３２０３０８号明細書、Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：３−２０（１９９５））、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，上記参照）、ならびに自家持続配列複製（３ＳＲ）および「Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅」（Ｐｆｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９：３７５−４０７（１９９５））等のその他の核酸増幅法にも有用であることができる。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、検出可能な標識も含むことができ、例えば５’末端標識も含むことができる。
【００６０】
加えて、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーションプローブとしても使用され得る。ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションは、食品試料中における、臨床試料中におけるおよび環境試料中における病原体の検出に頻繁に使用されており、この方法は当業者に一般に知られている。プローブハイブリダイゼーションの感度および特異性の程度が既に説明した増幅技術により達成されるものと比べて低いことが一般に認識されている。本発明の核酸プローブはまた、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイまたは５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイ（例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ）で用いられるようなレポーター−クエンチャー組合せ等の検出可能な標識を持つこともできる。
【００６１】
核酸プローブの３’末端ヌクレオチドを、本発明の一実施形態では核酸ポリメラーゼによる伸長を不可能にすることができる。ＤＮＡポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼであることができる。そのようなブロッキングを、例えば、連結部分による複製インヒビター部分（例えばレポーターもしくはクエンチャー）の核酸プローブの末端３’炭素への付着により、または３’−末端ヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることにより、実行することができる。本発明の別の実施形態では、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼが使用される。あるいは、１種または複数種の改変ヌクレオチド間結合のオリゴヌクレオチドを３’末端上に組み込むことにより、核酸プローブの３’末端をポリメラーゼの３’→５’伸長活性に対して鈍感にすることができる。最低限、３’末端ヌクレオチド間結合が改変されなければならないが、更なるヌクレオチド間結合が改変されてもよい。ＰＣＲ中に核酸プローブの３’末端からの伸長を妨げるおよび／またはＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をブロックするヌクレオチド間改変として、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ボラノホスフェート結合およびその他の同様のポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合を挙げることができる。プローブの３’伸長をブロックする代替方法は、マイトマイシンＣまたはＢａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：４７０８−１８（１９９３）等で説明されているその他の類似の抗腫瘍性抗生物質を使用してプローブの３’末端で付加物を形成することである。そのため、核酸プローブの３’末端を切断から保護する正確なメカニズムは、クエンチャーが核酸プローブから切断されない限り必須ではない。
【００６２】
３’−エキソヌクレアーゼアッセイ等の増幅に基づく検出技術において、核酸プローブ配列を本発明のプライマー配列対と共に任意選択で用いることもできる。好ましいプライマー／プローブ組合せおよびプライマー／プライマー組合せは、配列番号２、７および１１；配列番号２および７；配列番号２および１１；配列番号３、５および１１；配列番号３および５；配列番号３および１１；配列番号４、５および１１；配列番号４および５；配列番号４および１１；配列番号５、６および１１；配列番号５および６；配列番号６および１１；配列番号５、８および１１；配列番号５および８；配列番号８および１１；配列番号５、８および１２；配列番号５および１２；配列番号５、６および１３；配列番号５および１３；配列番号９、１０および１４；配列番号９および１０；配列番号１０および１４；配列番号５、８および１５；配列番号５および１５；配列番号５、８および１６；ならびに配列番号５および１６（上記の段落０５２で表１に列挙した任意のプライマー−プローブ−プライマー、プライマー−プローブまたはプライマー−プライマーの対形成）からなる群から選択される。
【００６３】
本発明の配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６はプライマー領域およびプローブ領域の両方を含み、そのため、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイ等の適切なアッセイにおいてプライマー−プローブ複合体として用いられ得る。本発明のこのプライマープローブ複合体は、プローブ領域の３’末端をプライマー領域の５’末端に連結する非増幅性リンカーを含む。この非増幅性リンカーは、相補鎖の伸長がプライマー−プローブ複合体のプローブ領域中へと進むことを妨げる。そのような非増幅性結合の例としてヘキサエチレングリコール（ｈｅｘｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）（ＨＥＧ）が挙げられ、好ましくは、３個または６個のポリエチレングリコ−ルサブユニットのいずれかからなるリンカーアームが挙げられる。本発明のプライマー−プローブ複合体は、プローブがその標的ＤＮＡから解離する場合にプライマープローブ複合体がステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域も含むことができ、この自己相補的領域は、例えば、レポーターシグナルをクエンチするためにレポーターおよびクエンチャーを互いに十分近く近接させるのに有用であることができる。好ましくは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６は、非増幅性リンカーでまたはこの非増幅性リンカー付近でＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０レポーターおよびＢＨＱ−２標識により５’末端標識されている。その他のレポーター部分および対応するクエンチャーを置き換えることができる。
【００６４】
アッセイ法
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在の検出を任意の適切な様式で達成することができる。好ましい方法は、プライマー指向性増幅法および核酸ハイブリダイゼーション法である。これらの方法を使用して、例えば汚染が疑われる動物源、環境源または食品源からの複雑なマトリックスまたは精製された培養物のいずれかである試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）単離物を検出することができる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態は、（１）非選択増殖培地中でまたは選択増殖培地中で複雑な試料混合物を培養して標的細菌を蘇生させること、（２）全標的細菌ＤＮＡを遊離させること、ならびに（３）全ＤＮＡを、本発明のプライマー対および任意選択で検出可能な標識を含む核酸プローブによる増幅プロトコルにかけることを含む。
【００６６】
プライマー指向性増幅アッセイ法
本発明で用いることができる様々なプライマー指向性核酸増幅法が当分野で知られており、このプライマー指向性核酸増幅法として、熱サイクル法（例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＬＣＲ）ならびに等温法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。好ましい方法はＰＣＲである。
【００６７】
試料調製：
本発明に係るオリゴヌクレオチドおよび方法を、試料調製を必要とすることなく任意の適切な臨床試料または環境試料に直接使用することができる。より高い感度を達成するために、および時間が制限因子ではない状況では、試料を前処理することおよび増幅前富化を実施することが好ましい。
【００６８】
食品媒介性細菌病原体の検出に関する最低の業界基準は、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，“Ｆｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎで説明されているように、２５ｇの食品マトリックス中における１つの病原体細胞の存在を確実に検出することができる方法である。この厳しい基準を満たすために、生化学的手段、免疫学的手段または核酸ハイブリダイゼーション手段による標的病原体細胞の検出を容易にするために標的病原体細胞の増殖を増強すべく、富化法および培地が開発されている。典型的な富化手段は、標的細菌の増殖および健康を増強することができるおよび存在するあらゆるバックグラウンドのまたは非標的の微生物の増殖を更に抑制することができる培地を用いる。
【００６９】
様々な細菌病原体用の選択培地が開発されており、当業者は、富化する特定の生物（例えばリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））に適した培地を選択することが分かるだろう。非選択培地および選択培地の一般的な議論およびレシピは、ＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌオンライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｆｏｏｄ／ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ／ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｔｈｏｄｓ／ｕｃｍ０７１３６３．ｈｔｍ）およびＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｕｉｔｅ  ４００，２２００  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｂｌｖｄ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ  ２２２０１−３３０１により出版されたおよび頒布されたハードコピー（１９９８）で説明されている。
【００７０】
選択的増殖後、複雑な混合物の試料を更なる分析のために取り出す。このサンプリング手順を当業者に公知の様々な手段により達成することができる。好ましい実施形態では、５μｌの富化培養物を取り出し、プロテアーゼおよび／またはムタノリシンを含む２００μｌの溶解溶液に添加する。ＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥで説明されているように、この溶解溶液を３０分にわたり５５℃で加熱し、続いて１０分にわたり９５℃でプロテアーゼを不活性化し、４℃まで冷却する。
【００７１】
ＰＣＲアッセイ法：
試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在の検出に好ましい方法は、（ａ）配列番号２、７および１１；配列番号２および７；配列番号２および１１；配列番号３、５および１１；配列番号３および５；配列番号３および１１；配列番号４、５および１１；配列番号４および５；配列番号４および１１；配列番号５、６および１１；配列番号５および６；配列番号６および１１；配列番号５、８および１１；配列番号５および８；配列番号８および１１；配列番号５、８および１２；配列番号５および１２；配列番号５、６および１３；配列番号５および１３；配列番号９、１０および１４；配列番号９および１０；配列番号１０および１４；配列番号５、８および１５；配列番号５および１５；配列番号５、８および１６；ならびに配列番号５および１６（上記の段落０５２で表１に列挙した任意のプライマー−プローブ−プライマー、プライマー−プローブまたはプライマー−プライマーの対形成）からなる群から選択されるプライマー対およびプライマープローブ対を使用してＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を得ること、ならびに（ｂ）この増幅を検出することであって、増幅の陽性検出が試料中におけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の存在を示す、検出することを含む。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、ＰＣＲ増幅を実施する前に、試料を調製する工程を実行することができる。この調製する工程は下記のプロセスの内の少なくとも１つを含むことができる：（１）細菌の富化、（２）試料からの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解および（４）全ＤＮＡ抽出。
【００７３】
増幅条件：
一般に許容されるあらゆるＰＣＲ条件を使用することにより、本発明のオリゴヌクレオチドを使用してリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の検出に成功することができ、試験する試料およびその他の実験室条件に応じて、最適な感度および特異性を達成するためにＰＣＲ条件の所定の最適化が必須の場合があることを当業者は理解するだろう。好ましくは、このＰＣＲ条件により、その他の非標的種に関するＰＣＲ結果が示されないが、意図された特定の標的種の全てからのＰＣＲ増幅結果が達成される。
【００７４】
検出／検査／分析：
様々な方法を使用してプライマー指向性増幅産物を分析することができる。均質検出（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）は、鋳型またはプライマーから増幅産物を（例えばゲル電気泳動により）分離する必要がない、増幅産物の検出の好ましい方法を意味する。均質検出は典型的には、増幅中にまたは増幅直後に反応混合物の蛍光レベルを測定することにより達成される。加えて、本発明では、検出中にまたは検出前に増幅産物の分離を含む不均質検出（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。
【００７５】
均質検出を用いることにより、本発明のプライマー対を使用して「リアルタイム」プライマー指向性核酸増幅および検出（例えば「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）を実行することができる。好ましい「リアルタイム」法は米国特許第６，１７１，７８５号明細書、米国特許第５，９９４，０５６号明細書、米国特許第６，３２６，１４５号明細書、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００７６】
特に好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第６，３２６，１４５号明細書に記載されているようなＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイであり、この明細書はその全体が参照により本明細書に援用される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイでは、プライマー−プローブ複合体としてＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（単分子または二分子のいずれか）を使用してＰＣＲ増幅を実施し、このＳｃｏｒｐｉｏｎプローブは、レポーターの検出可能なシグナルをプライマーの伸長前にクエンチすることを可能にする適切なレポーター−クエンチャー対を持つ。伸長後、クエンチング効果を除去し、存在するシグナルの量を定量化する。増幅産物の量が増加するにつれて、検出可能なシグナルの等価の増加を観測され、そのため、存在する増幅産物の量を、測定される検出可能なシグナルの量の関数として決定することが可能になる。複数種のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブをＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイで用いる場合、各プローブは、付着した異なる検出可能な標識（例えばレポーター−クエンチャー対）を有することができ、そのため、各プローブをその他のプローブから独立して検出することが可能になる。
【００７７】
別の好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されているような５’−エキソヌクレアーゼ検出法であり、これらの明細書はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイでは、修飾されたプローブをＰＣＲ中に用い、このプローブは、増幅プライマー対の２種のメンバーの中間にまたはこれらのメンバー間に結合する。この修飾されたプローブはレポーターおよびクエンチャーを持ち、このプローブがＰＣＲ中に標的核酸配列とハイブリダイズしていることを示すための検出可能なシグナルを生成するように設計されている。レポーターおよびクエンチャーの両方がプローブ上にある限り、クエンチャーは、検出可能なシグナルをレポーターが放出するのを妨げる。しかしながら、増幅中にポリメラーゼがプライマーを伸長させるにつれて、ポリメラーゼの内因性５’→３’ヌクレアーゼ活性によりプローブが分解されてクエンチャーからレポーターが分離し、検出可能なシグナルが放出され得る。一般に、増幅サイクル中に生じる検出可能なシグナルの量は、各サイクルで生成される産物の量に比例する。
【００７８】
クエンチングの効率はレポーターおよびクエンチャーの近接の強い関数であること、即ち２つの分子がより接近するほどクエンチング効率が増加することは公知である。クエンチングはレポーターおよびクエンチャーの物理的近接に強く依存することから、レポーターおよびクエンチャーは好ましくは、互いに数個のヌクレオチドの範囲内でプローブに付着しており、通常は互いに３０個のヌクレオチドの範囲内でプローブに付着しており、より好ましくは約６〜１６個のヌクレオチドだけ離れてプローブに付着している。典型的には、この間隔は、レポーター−クエンチャー対の一方のメンバーをプローブの５’末端に付着させ、他方のメンバーを約６〜１６個のヌクレオチドだけ離してヌクレオチドに付着させることにより達成される。
【００７９】
更に、複数種のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイで用いる場合、各プローブは、付着している異なる検出可能な標識（例えばレポーター−クエンチャー対）を有することができ、そのため、各プローブをその他のプローブから独立して検出することが可能になる。
【００８０】
均質検出の別の好ましい方法はＤＮＡ融解曲線分析の使用を含み、特にＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨｅａｌｔｈのＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍハードウェアおよび試薬錠剤によるＤＮＡ融解曲線分析の使用を含む。このシステムの詳細が米国特許第６，３１２，９３０号明細書ならびにＰＣＴ公報国際公開第９７／１１１９７号パンフレットおよび国際公開第００／６６７７７号パンフレットに示されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００８１】
融解曲線分析は、選択した時点での各増幅サイクル中に標的増幅産物（「標的アンプリコン」）の蛍光をモニタリングすることにより、二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出する、および定量化する。
【００８２】
当業者に公知であるように、温度がｄｓＤＮＡの融解温度と比べて高い場合、このｄｓＤＮＡの二本鎖が分離する、または融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、所与の溶液条件下で、融解がある温度（以降Ｔｍｓと示す）で始まり、別の温度（以降Ｔｍｅと示す）で完了する。よく知られている用語Ｔｍは、融解が５０％完了する温度を示す。
【００８３】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解する変性段階と、温度が、今や一本鎖である標的にプライマーが結合するのに最適であるプライマーアニーリング段階と、温度が、ＤＮＡポリメラーゼが機能するのに最適である（温度Ｔｅでの）鎖伸長段階とを含む。
【００８４】
本発明によれば、ＴｍｓはＴｅと比べて高いべきであり、Ｔｍｅは、ＤＮＡポリメラーゼが加熱不活性化される温度と比べて低い（多くの場合は大幅に低い）べきである。融解特性は、所与のｄｓＤＮＡ分子に固有の特性（例えばデオキシヌクレオチド組成およびｄｓＤＮＡの長さ）の影響を受ける。
【００８５】
インターカレーティング色素は二本鎖ＤＮＡに結合するであろう。この色素／ｄｓＤＮＡ複合体は、色素に依存する光の適切な励起波長に曝露される場合に蛍光を発することができ、この蛍光の強度はｄｓＤＮＡの濃度に比例することができる。ＤＮＡインターカレーティング色素を利用してｄｓＤＮＡを検出するおよび定量化する方法が当分野で知られている。これらの目的のために、当分野では多くの色素が知られており、使用されている。本方法はまた、そのような関係も利用する。
【００８６】
そのようなインターカレーティング色素の例として、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＴＯＴＯ（登録商標）−１｛Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ、１−１’−［１，３−プロパンジイルビス［（ジメチルイミノ）（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−，テトラヨージド｝およびＹｏＰｒｏ（登録商標）｛Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ、４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］−，ジヨージド｝が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に最も好ましいのは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）製のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）等の非対称的ではないシアン化物色素である。
【００８７】
温度を上昇させつつ蛍光の変化をモニタリングすることにより、融解曲線分析が達成される。温度が標的アンプリコンに特異的なＴＭＳに達すると、ｄｓＤＮＡが変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性すると、インターカレーティング色素がＤＮＡから解離して蛍光が減少する。温度に対してプロットした温度変化で除算した蛍光の対数の変化の負の数学的解析から、融解曲線として既知のグラフピークが得られる。
【００８８】
これらの技術の組合せを使用して、例えば、ある標的領域に向けたＳｃｏｒｐｉｏｎプローブと別の標的領域に向けたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブとを有することにより、本発明を操作することができることを理解すべきである。本発明は上記で説明した技術に限定されないことも理解すべきである。むしろ、当業者は、当分野で既知であるような増幅を検出するその他の技術も使用され得ることを認識するだろう。例えば、核酸プローブを使用して、ＰＣＲに基づく定量的配列検出（ＱＳＤ）等の技術を実施することができ、この核酸プローブは、溶液中に一本鎖状態で存在する場合にはレポーターの発光を実質的にクエンチすべくレポーターおよびクエンチャーが十分に接近するように構成されている。しかしながら、インタクトなレポーター−クエンチャー核酸プローブと増幅された標的核酸配列とのハイブリダイゼーション時に、レポーターおよびクエンチャーが互いに十分に離れる。その結果、クエンチングが大幅に弱められ、検出される蛍光発光の増加が起こる。
【００８９】
均質検出法に加えて、当分野では、本発明で用いることができる様々なその他の不均質検出法が知られており、この不均質検出法として、標準的な非変性ゲル電気泳動（例えばアクリルアミドまたはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動および温度勾配ゲル電気泳動が挙げられる。標準的な非変性ゲル電気泳動はシンプルで迅速なＰＣＲ検出法ではあるが、全ての用途に適しているわけではないかもしれない。
【００９０】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、小さいＤＮＡ断片（２００〜７００ｂｐ）の変性挙動の差異を検出する分離方法である。この分離の原理は、断片長およびヌクレオチド配列の両方に基づく。長さが同じである断片では、わずか１つの塩基対の差異を検出することができる。このことは、ＤＮＡ断片がサイズによってのみ分離される非変性ゲル電気泳動とは対照的である。非変性ゲル電気泳動のこの制限は、ＤＮＡ分子間の電荷密度の差異がほぼ中性であり、これらのＤＮＡ分子の分離においてほとんど役割を果たさないことから生じる。ＤＮＡ断片のサイズが増加するにつれて、このＤＮＡ断片のゲルを通る速度は低下する。
【００９１】
ＤＧＧＥは、同じサイズのＤＮＡ断片を、これらのＤＮＡ断片の変性プロファイルおよび配列に基づいて分離するために主に使用される。ＤＧＧＥを使用する場合、熱または化学的変性剤を適用するとＤＮＡ分子の２本の鎖が分離する、または融解する。ＤＮＡ二本鎖の変性は、下記の２つの因子の影響を受ける：１）相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）塩基対間に形成される水素結合（なぜならば、ＧＣリッチ領域は、ＡＴリッチである領域と比べて高い変性条件で融解するからである）、２）同じ鎖の隣接する塩基間の引力、即ち「スタッキング」。従って、ＤＮＡ分子はいくつかの融解ドメインを有することができ、これら融解ドメイン個々の特徴的な変性条件はそれぞれ、これら融解ドメインのヌクレオチド配列によって決定される。ＤＧＧＥは、特定の変性ドメイン内のたった１つのヌクレオチドを除いて同じ長さおよびＤＮＡ配列を有する、その他の点では同一のＤＮＡ分子が、異なる温度またはＴｍで変性することができるという事実を利用する。そのため、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片が、増加する化学的変性剤の勾配を通って電気泳動される場合、この二本鎖ＤＮＡ断片は変性し始めてコンフォメーション変化および移動性変化の両方を受ける。ｄｓＤＮＡ断片は、変性した単鎖（ｓｓ）ＤＮＡ断片と比べて早く移動することができる。なぜならば、分子の一本鎖部分の分枝構造がゲルマトリックス中で絡まるようになるからである。変性環境が増加するにつれてｄｓＤＮＡ断片が完全に解離され得、ゲルを通る分子の移動性は、ＤＮＡ鎖の特定の低変性ドメインが解離する変性剤濃度で遅延される。実際には、電気泳動を一定温度（約６０℃）で行ない、化学的変性剤を、ＤＮＡ分子の１００％を変性させることができる濃度（即ち４０％のホルムアミドおよび７Ｍの尿素）で使用する。この可変の変性剤濃度勾配は、各ＤＧＧＥゲルの組成が０％変性剤から最大１００％変性剤へと徐々に変化するように勾配メーカーを使用して作られる。当然のことながら、変性剤の小さい範囲（例えば３５％から６０％へ）を含む勾配を、ＤＮＡの分離を増加させるために入れることもできる。
【００９２】
ＤＧＧＥで使用されるこの原理を、化学的変性剤勾配の代わりに温度勾配を使用する別の方法に適用することもできる。この方法は温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）として知られている。この方法は、温度勾配を使用してｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへのコンフォメーション変化を誘発し、配列が異なるがサイズが等しい断片を分離する。ＤＧＧＥでのように、ヌクレオチド配列が異なるＤＮＡ断片はゲル中において異なる位置で不動になり得る。プライマー設計でのバリエーションを、ＰＣＲ産物のキャラクタリゼーションおよび同定に関するＤＧＧＥの有用性の増加を促進するために使用することができる。プライマー設計のバリエーションを使用するこれらの方法および原理が、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐａｇｅｓ  ７１  ｔｏ  ８８（１９８８）で説明されている。
【００９３】
器機使用：
均質検出を用いる場合、蛍光のレベルを、好ましくは例えばＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｑ７装置（ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）等のレーザー蛍光光度計を使用して測定する。しかしながら、本発明には、試料中の蛍光レベルを測定するための類似の検出システムが含まれる。
【００９４】
試薬およびキット：
あらゆる形式のあらゆる適切な核酸複製組成物（「複製組成物」）を使用することができる。ＰＣＲ増幅用の典型的な複製組成物は、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマーおよび少なくとも１種の適切なポリメラーゼを含むことができる。
【００９５】
複製組成物が液状である場合、当分野で既知の適切なバッファーを使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【００９６】
あるいは、複製組成物が錠剤形態で含まれる場合、安定剤および結合剤等の典型的な錠剤化試薬が含まれ得る。好ましい錠剤化技術が米国特許第４，７６２，８５７号明細書および米国特許第４，６７８，８１２号明細書に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９７】
本発明の好ましい複製組成物は、（ａ）配列番号２、７および１１；配列番号２および７；配列番号２および１１；配列番号３、５および１１；配列番号３および５；配列番号３および１１；配列番号４、５および１１；配列番号４および５；配列番号４および１１；配列番号５、６および１１；配列番号５および６；配列番号６および１１；配列番号５、８および１１；配列番号５および８；配列番号８および１１；配列番号５、８および１２；配列番号５および１２；配列番号５、６および１３；配列番号５および１３；配列番号９、１０および１４；配列番号９および１０；配列番号１０および１４；配列番号５、８および１５；配列番号５および１５；配列番号５、８および１６；ならびに配列番号５および１６（下記の段落０５２で表１に列挙した任意のプライマー−プローブ−プライマー、プライマー−プローブまたはプライマー−プライマーの対形成）からなる群から選択されるプライマー対またはプライマー−プローブ対のセットと、（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む。
【００９８】
本発明のより好ましい複製組成物は、（ａ）表１から選択されるプライマー対および任意の対応するプローブであって、用いられる各核酸プローブまたはプライマー−プローブ複合体は検出可能な標識を含む、プライマー対および任意の対応するプローブと、（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む。好ましくは、検出可能な標識は、検出可能なシグナルを放出することができるレポーターと、レポーターおよびクエンチャーが互いに十分近く近接する場合にレポーターを実質的にクエンチすることができるおよび検出可能なシグナルの放出を防ぐことができるクエンチャーとを含む。
【００９９】
本発明の好ましいキットは、上記複製組成物のいずれか１つを含む。本発明の好ましい錠剤は、上記複製組成物のいずれか１つを含む。より好ましくは、本発明のキットは、上述した好ましい錠剤を含む。
【０１００】
ある場合では、内部陽性コントロールを反応に含めることができる。内部陽性コントロールは、コントロール鋳型核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、コントロールプライマーおよびコントロール核酸プローブを含むことができる。ＰＣＲ反応内に含まれる内部陽性コントロールの利点が既に説明されており（米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第９７／１１１９７号パンフレット、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）、下記が挙げられる：（ｉ）このコントロールは単一プライマーを使用して増幅され得る、（ｉｉ）コントロール増幅産物の量は、試料中に含まれるあらゆる標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡから独立している、（ｉｉｉ）コントロールＤＮＡは、手動のおよび自動化された試験手順の両方での使いやすさおよび高度の再現性のためのその他の増幅試薬と共に錠剤化され得る、（ｉｖ）このコントロ−ルを均質検出で使用することができる、即ち反応物から生成物ＤＮＡを分離することなく使用することができる、ならびに（ｖ）この内部コントロールは、反応中のその他の可能性がある増幅産物と異なる融解プロファイルおよび／または標的に向けられた核酸プローブ上の検出可能な標識と異なるコントロール核酸上の検出可能な標識を有する。
【０１０１】
コントロールＤＮＡは、プライマー指向性増幅反応で増幅を可能にするのに適したサイズおよび塩基組成である。コントロール鋳型ＤＮＡ配列を、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のゲノムまたは別の供給源から得ることができるが、このコントロール鋳型ＤＮＡ配列は、標的増幅産物の増幅を可能にする同じ条件下で再現性よく増幅されなければならない。
【０１０２】
好ましいコントロール配列として、例えばＳＶ４０で発見されたものが挙げられる。使用する場合のＳＶ４０の好ましい濃度範囲は、ＰＣＲ反応当たり１０１〜１０７コピーである。
【０１０３】
【化２】
2017521083.tif 000005
【０１０４】
コントロール反応は増幅反応を検証するのに有用である。コントロールＤＮＡの増幅は試験している試料と同じ反応管内で起こり、従って、試料が標的陰性である場合に、即ち標的増幅産物が産生されない場合に、好結果の増幅反応を示す。増幅反応の有意な検証を達成するためには、コントロールＤＮＡ鋳型の適切な数のコピーが各増幅反応に含まれていなければならない。
【０１０５】
ある場合では、追加の陰性コントロール複製組成物を含むことが有用であることができる。この陰性コントロール複製組成物は、複製組成物と同じ試薬を含むがポリメラーゼを含まない。そのようなコントロールの主な機能は、方法が蛍光検出手段を用いる場合に、均質形式で疑似バックグラウンド蛍光をモニタリンすることである。
【０１０６】
複製組成物が、標的ＤＮＡまたはコントロールＤＮＡを増幅するために使用するように設計されているかどうかに応じて、この複製組成物を変更する。標的ＤＮＡを増幅することができる複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（ほとんどの場合は耐熱性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができるプライマー対、および（ｉｉｉ）増幅反応が進行するのに必須のバッファーを含むことができる。コントロールＤＮＡを増幅することができる複製組成物（陽性コントロールまたは陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（ほとんどの場合は耐熱性）、（ｉｉ）コントロールＤＮＡ、（ｉｉｉ）コントロールＤＮＡにハイブリダイズすることができる少なくとも１種のプライマー、および（ｉｖ）増幅反応が進行するのに必須のバッファーを含むことができる。加えて、標的ＤＮＡまたはコントロールＤＮＡのいずれかの増幅用の複製組成物は核酸プローブを含むことができ、好ましくは検出可能な標識を持つ核酸プローブを持つことができる。
【０１０７】
核酸ハイブリダイゼーション法
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の検出のために、本発明では、プライマー指向性増幅アッセイ法に加えて核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的な構成要素は、プローブ、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の含有が疑われる試料、および具体的なハイブリダイゼーション法を含む。典型的には、プローブ長は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）診断配列のわずか５個の塩基から全長まで様々であることができ、行なう具体的な試験に応じて決めることができる。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に対して相補的である必要がある。加えて、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間で起こり、その結果、ハイブリダイズした領域中のある特定の断片の塩基が正確な相補塩基と対形成しない。
【０１０８】
核酸ハイブリダイゼーション法で特に有用なプローブは、配列番号２〜１６のいずれかまたはこれらから誘導される配列である。
【０１０９】
試料はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含んでもよいし含まなくてもよい。試料は様々な形態を取り得るが、汚染が疑われる動物源、環境源または食品源から概して抽出されることになる。ＤＮＡを直接検出することができるが、最も好ましくは、プローブおよび標的分子の任意のハイブリダイゼーションが起こり得る前に、試料核酸がプローブと接触できるようにしなければならない。そのため、生物のＤＮＡは好ましくは細胞から遊離しており、ハイブリダイゼーションが起こり得る前に適切な条件下に置かれる。溶液中ハイブリダイゼーションの方法は、試料ＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを得ることができるようにするために、ＤＮＡの精製を必要とする。このことは、試料中の標的配列の溶液中検出法の利用では、試料の核酸を最初に精製してタンパク質、脂質およびその他の細胞成分を取り除き、次いでハイブリダイゼーション条件下でプローブと接触させなければならないことが必要であることを意味する。試料核酸の精製方法は一般的であり、当分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【０１１０】
好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイを、核酸の抽出を必要とすることなく細胞溶解物に直接行なうことができる。このことにより試料取扱プロセスからいくつかの工程が除かれ、アッセイが迅速化される。そのようなアッセイを粗細胞溶解物に実施するために、典型的には、上記で説明したように調製した細胞溶解物にカオトロピック剤を添加する。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定化させる。更に、カオトロピック剤は、室温でのＤＮＡへの短オリゴヌクレオチドプローブの敏感でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ＆  Ｃｈｅｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤として、特に塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的には、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在するだろう。必要に応じて、典型的には３０〜５０％（体積／体積）でホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に添加することができる。
【０１１１】
あるいは、プローブのハイブリダイゼーション前に試料核酸を精製することができる。様々な方法が当業者に知られている（例えば、フェノール−クロロホルム抽出、ＩｓｏＱｕｉｃｋ抽出（ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）等）。プレハイブリダイゼーション精製は、標準的なフィルタハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である。更に、精製は、インビトロなＲＮＡ増幅法を組み込むことにより、例えば自家持続配列複製（例えばＦａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９１），ｐｐ．２５−３３を参照されたい）または逆転写酵素ＰＣＲ（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（１９９０），ｐｐ．２１−２７）を組み込むことにより、アッセイ感度を増加させる処置を容易にする。
【０１１２】
ＤＮＡが放出されると、このＤＮＡを様々な方法のいずれかで検出することができる。しかしながら、最も有用な実施形態は、速度、利便性、感度および特異性の内の少なくともいくつかの特徴を有する。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション法は当分野で公知である。典型的には、プローブおよび試料を、核酸ハイブリダイゼーションを可能にすることができる条件下で混合しなければならない。このことは、適切な濃度条件および温度条件の下で無機塩または有機塩の存在下にてプローブと試料とを接触させることを含む。プローブおよび試料核酸を、このプローブとこの試料核酸との間で任意の可能なハイブリダイゼーションが起こり得る十分に長い時間にわたり接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定され得る。プローブまたは標的の濃度が高くなるほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベーション時間が短くなる。
【０１１４】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的には、これらのハイブリダイゼーション溶液は、約２０〜６０体積％の、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０体積／体積％のホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍのバッファー、例えばクエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳもしくはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）、約０．０５〜０．２％の界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液に含まれるのは、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、断片化核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺もしくはサケ精子のＤＮＡまたは酵母ＲＮＡ）および任意選択で約０．５〜２重量／体積％のグリシンであることができる。その他の添加剤、例えば様々な極性の水溶性薬剤または膨潤性薬剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートもしくはポリメチルアクリレート）およびアニオン性サッカリドポリマー（例えば硫酸デキストラン）が挙げられる体積排除剤を含めることもできる。
【０１１５】
核酸ハイブリダイゼーションは様々なアッセイ形式に適応可能である。最も好適なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能である。サンドイッチ型アッセイの主な構成要素は固体支持体である。この固体支持体には、非標識であるおよびＤＮＡ配列の一部に対して相補的である固定化核酸プローブが吸着されている、または共有結合的に連結されている。
【０１１６】
サンドイッチアッセイはアッセイキットに包含され得る。このキットは、汚染が疑われる試料の採取用の第１の構成要素と、この試料の分配および溶解用のバッファーとを含むだろう。第２の構成要素は、標的およびプローブのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション用の、ならびに不要なおよび非二本鎖形態の洗浄による除去用の、乾燥形態または液体形態のいずれかの培地を含むだろう。第３の構成要素は、本明細書で開示した配列の内の１種または複数種に対して相補的である非標識の核酸プローブが固定されている（またはコンジュゲートしている）固体支持体（ディップスティック）を含む。第４の構成要素は、第３の構成要素の固定されている非標識の核酸プローブがハイブリダイズされる同じＤＮＡ鎖の第２のおよび別の領域に対して相補的である標識付きプローブを含むだろう。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本明細書で開示するポリヌクレオチド配列またはこの誘導体を、均質アッセイ形式または不均質アッセイ形式のいずれかにおいて、３’ブロックされた検出プローブとして使用することができる。例えば、この配列から生成されたプローブは、３’ブロックされ得る、または非関与的であることができる、および核酸増幅反応により伸長され得ない、または核酸増幅反応に関与し得ない。更に、このプローブには、プローブ／分析物ハイブリッドの固定化用の付着点として作用する反応性リガンドとしてまたは検出可能なシグナルを生じさせるためのレポーターとして機能し得る標識が組み込まれている。従って、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）汚染が疑われる試料から単離されたゲノムまたはｃＤＮＡは、増幅産物を産生するために、過剰の３’ブロックされた検出プローブの存在下で標準的なプライマー指向性増幅プロトコルにより増幅される。このプローブは３’ブロックされていることから、このプローブは標的の増幅に関与も干渉もしない。最終増幅サイクル後、検出プローブは、増幅されたＤＮＡの関連部分にアニールし、次いで、アニール化複合体は反応性リガンドにより支持体上で捕捉される。
【０１１８】
ある場合では、支持体上のＰＣＲ反応産物の固定化、次いで標識付きプローブ試薬による固定化産物の検出を容易にするために、複製組成物中の標識プローブと共にリガンド標識付きｄＮＴＰが組み込まれることが望ましい。例えば、ビオチン標識付きｄＮＴＰ、ジゴキシゲニン標識付きｄＮＴＰまたはジゴキシン標識付きｄＮＴＰをＰＣＲ反応組成物に添加することができる。次いで、ＰＣＲ産物中に組み込まれたビオチン、ジゴキシゲニンまたはジゴキシンを、ストレプトアビジン、抗ジオキシンまたは抗ジゴキシゲニン抗体支持体上にそれぞれ固定することができる。次いで、固定されたＰＣＲ産物を、プローブ標識の存在により検出することができる。
【実施例】
【０１１９】
本発明を下記の実施例で更に定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すが、説明のみを目的として提供されることを理解すべきである。
【０１２０】
実施例で使用する一般的な方法および材料
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は当分野で公知である。下記の実施例での使用に適した技術を、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４）中に、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ中に、またはＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ（１９８４）中に見出すことができる。
【０１２１】
プライマーおよびプローブ（配列番号２〜１６）を、ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，２１９９Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌ  Ｂｌｖｄ．，Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ９４９５４  ＵＳＡに調製させた。全てのＰＣＲ反応を、標準的なＢＡＸ（登録商標）Ｑ７  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して実行した。
【０１２２】
略語の意味は下記の通りである：「ｈ」は時間を意味しており、「ｍｉｎ」は分を意味しており、「ｓｅｃ」は秒を意味しており、「ｄ」は日を意味しており、「ｍｌ」はミリリットルを意味しており、「μｌ」はマイクロリットルを意味しており、「ｃｆｕ」はコロニー形成単位を意味しており、「Ｍ」はモル濃度を意味しており、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味しており、「ｎＭ」はナノモル濃度を意味しており、「Ｌ．ｍｏｎｏ」はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を意味しており、Ｃｔ」はサイクル閾値を意味しており、「ＩＰＣ」は内部陽性コントロールを意味しており、「ｌｏｌＩ」はイノソースイソメラーゼタンパク質遺伝子を意味する。
【０１２３】
実施例１
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）プライマーおよびＳｃｏｒｐｉｏｎの開発
９種のプライマーおよび６種の単分子ｓｃｏｒｐｉｏｎからなる一群を評価した。表１を参照されたい。ゲルによるＰＣＲ産物の分析から、８０ｎＭ〜６４０ｎＭの範囲のプライマー濃度で試験した場合にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種標的の増幅が明らかとなった。ＰＣＲ反応条件を最適化して、標的として低レベルのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡを増幅させる際のＣｔを最小化したが、総プライマー濃度をより低く維持してプライマー二量体形成を最小化した。
【０１２４】
シグナル振幅およびベースライン蛍光強度に対する影響を確認するために、ならびに低ＤＮＡ標的レベルでのＣｔ値に対して何らかの影響を及ぼし得るかどうかを明らかにするために、プローブ（配列番号１１〜１６）の濃度を漸増しつつ、増幅を低プライマー（配列番号２〜１０）濃度で評価した。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ（配列番号１１〜１６）濃度を５ｎＭから４０ｎＭへと漸増した。漸増の結果により、１５ｎＭの配列番号１１〜１６が、最良のＰＣＲならびにベースライン蛍光、蛍光シグナル振幅およびＣｔ値に関するＳｃｏｒｐｉｏｎ性能を示した。
【０１２５】
実施例２
包括性アッセイ
国内のＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＆  Ｈｅａｌｔｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＤＤ」と表す）からの合計で５３種の株のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株（様々な血清型からなり、様々な供給源から元々単離されている）を、３５℃にて一晩Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＢＨＩ）中で増殖させた。細胞を約１０５ＣＦＵ／ｍｌまで希釈し、標準的なＢＡＸ溶解プロトコルを使用して溶解させ、リアルタイムリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）検出アッセイで試験した。全てが陽性シグナルを示した（表３）。１３種の単離物からなるサブセット（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）血清型（表２中に列挙した＃２、３、４、５、１０、１４、２２、２９、３３、３５および３９、ならびにＤＤ６５１およびＤＤ１４２３）からなる一群を表す）を約１０２ｃｆｕ／ｍＬまで連続的に希釈し、リアルタイムＰＣＲアッセイで試験した。全ての株が１０３ｃｆｕ／ｍＬ以上で陽性の結果であった。
【０１２６】
【表３】
2017521083.tif 000006
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
実施例３
排他性アッセイ
リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属のその他の種を含む非リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株の６１例の単離物を、３０℃または３７℃のいずれかにて一晩ＢＨＩ中で増殖させた。各株をＢＨＩブロスで１：１０に希釈し、標準的なＢＡＸ溶解プロトコルを使用して細胞溶解物を調製し、リアルタイムリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＰＣＲアッセイで試験した。全ての株が陰性の結果であった（表４）。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
【表７】
2017521083.tif 000010
【０１３２】
【表８】
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【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
実施例４
【０１３５】
【表１０】
2017521083.tif 000013
【０１３６】
リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）が添加富化された様々な食品マトリックスで、このアッセイの感度および特異性も評価した。簡潔に言うと、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）フリー食品マトリックスの内の２５ｇを、抗生物質が補充されている２２５ｍＬの２４ＬＥＢ（リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）富化ブロス）で富化した。列挙したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）単離物の新鮮な増殖ＢＨＩ培養物を連続的に希釈し、１×１０８、１×１０７、１×１０６、１×１０５、１×１０４および１×１０３ｃｆｕ／ｍｌの濃度を達成するように各食品富化物に添加した。標準的なＢＡＸ（登録商標）溶解プロトコルを使用して添加富化物の溶解物を調製し、凍結乾燥した錠剤形態でアッセイを実行した。このアッセイは、各リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）富化溶解物に関して約１０４ｃｆｕ／ｍＬの感度を示した。バックグラウンドのミクロフローラに対する交差反応は見られず、全てのブランク食品富化溶解物はアッセイにより陰性の結果であった。
【配列表】
2017521083000001.app
【国際調査報告】
2017521083.tif 000014
2017521083.tif 000015
2017521083.tif 000016