(57)【要約】スフェロイドを形成する細胞の培養に適したプレートが開示される。
2017506887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部材を含むプレートであって、
該部材が、第１の面と、第２の面と、凹部内の底部と突起部の上端とのうち少なくとも１つを各々が有する複数の構造物と、を有し、
前記第２の面から、前記複数の構造物それぞれと前記第１の面との間の境界までの第１の距離が、第２の面と前記底部及び前記上端の少なくとも１方との間の第２の距離とは異なり、
前記複数の構造物のうちの少なくとも５つの構造物は、前記複数の構造物のうちの１つの構造物から第３の距離に配置される、プレート。
【請求項２】
前記少なくとも５つの構造物を含む前記複数の構造物のうちの６つの構造物が前記１つの構造物から第３の距離に配置される請求項１に記載のプレート。
【請求項３】
前記１つの構造物と、前記６つの構造物のうちの２つの構造物と、が実質的に正三角形を構成する請求項２に記載のプレート。
【請求項４】
前記２つの構造物が互いに近接した位置に配置される請求項３に記載のプレート。
【請求項５】
前記６つの構造物が実質的に正六角形を構成する請求項２〜４のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項６】
前記１つの構造物と、前記６つの構造物のうちの２つの構造物と、が実質的に正六角形に含まれる請求項５に記載のプレート。
【請求項７】
部材を含むプレートであって、
前記部材が第１の面と、第２の面と、を有し、
複数の第１の部分と第２の部分とが前記第１の面に形成され、
前記複数の第１の部分の試料に対する親和性が、第２の部分の前記試料に対する親和性と異なり、
前記複数の第１の部分のうちの少なくとも５つの第１の部分が、前記複数の第１の部分のうちの１つの第１の部分から第３の距離で配置されるプレート。
【請求項８】
前記少なくとも５つの構造部分を含む前記複数の第１の部分のうちの６つの第１の部分が、前記１つの第１の部分から第３の距離で配置される請求項７に記載のプレート。
【請求項９】
前記１つの第１の部分と、前記６つの第１の部分のうちの２つの第１部分と、が実質的に正三角形を構成する請求項８に記載のプレート。
【請求項１０】
前記２つの第１の部分が互いに近接した位置に配置される請求項９に記載のプレート。
【請求項１１】
前記６つの第１の部分が実質的に正六角形を構成する請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項１２】
前記１つの第１の部分と、前記６つの第１の部分のうちの２つの第１の部分と、が実質的に正六角形に含まれる請求項１１に記載のプレート。
【請求項１３】
部材を含むプレートであって、
前記部材が第１の面と、前記第１の面の反対側に第２の面と、を有し、
複数の第１の部分と、第２の部分と、複数の第３の部分と、第４の部分と、は前記第１の面に形成され、
互いに近接した位置に配置された前記複数の第１の部分のうちの２つの第１の部分の間の第１の間隔が、互いに近接した位置に配置された前記複数の第３の部分のうちの２つの第３の部分の間の第２の間隔と異なる、プレート。
【請求項１４】
前記２つの第１の部分の各々は前記第２の部分で囲まれており、且つ、前記２つの第３の部分の各々は前記第４の部分で囲まれている請求項１３に記載のプレート。
【請求項１５】
前記複数の第１の部分のうちの少なくとも４つの第１の部分が、前記複数の第１の部分のうちの１つの第１の部分から前記第１の間隔で配置され、且つ
前記複数の第３の部分のうち少なくとも４つの第３の部分が、前記複数の第１の部分のうちの１つの第３の部分から前記第２の間隔で配置されている請求項１３に記載のプレート。
【請求項１６】
前記複数の第１の部分のうちの少なくとも６つの第１の部分が、前記複数の第１の部分のうちの１つの第１の部分から前記第１の間隔で配置され、且つ
前記複数の第３の部分のうちの少なくとも６つの第３の部分が、前記複数の第１の部分のうちの１つの第３の部分から前記第２の間隔で配置されている請求項１３に記載のプレート。
【請求項１７】
前記少なくとも６つの第１の部分が正六角形を構成し、前記少なくとも６つの第３の部分が正六角形を構成する請求項１６に記載のプレート。
【請求項１８】
前記複数の第１の部分の試料に対する第１の親和性が、前記第２の部分の前記試料に対する第２の親和性と異なり、
前記複数の第３の部分の前記試料に対する第３の親和性が、前記第４の部分の前記試料に対する第４の親和性と異なる請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項１９】
前記第１の親和性が前記第２の親和性より大きく、
前記第３の親和性が前記第４の親和性より大きい請求項１８に記載のプレート。
【請求項２０】
前記複数の第１の部分の各々が、凹部と突起部のうち少なくとも１つの形状の構造物を有する請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項２１】
前記複数の第３の部分の各々が凹部と突起部のうち少なくとも１つの形状の構造物を有する請求項２０に記載のプレート。
【請求項２２】
前記複数の第１の部分と前記第２の部分とが第１の領域に形成され、
前記複数の第３の部分と前記第４の部分とが第２の領域に形成される請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項２３】
前記第１の領域が第１のフェンスに囲まれており、前記第２の領域が第２のフェンスに囲まれている請求項２２に記載のプレート。
【請求項２４】
枠をさらに含み、
前記第１のフェンスと前記第２のフェンスとのそれぞれが、前記枠の１部である請求項２２または２３に記載のプレート。
【請求項２５】
複数の第５の部分と、第６の部分と、が第１の面に形成され、
互いに近接した位置に配置された前記複数の第５の部分のうちの２つの第５の部分の間の第３の間隔が、前記第１の間隔と前記第２の間隔とは異なる請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項２６】
前記複数の第５の部分と、前記第６の部分と、が第３のフェンスに囲まれている請求項２５に記載のプレート。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプレートを使用して行われる細胞培養方法。
【請求項２８】
前記第１の間隔と前記第２の間隔の間でスフェロイドを効果的に形成するのに適した間隔が試験される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載の方法による細胞培養で形成したスフェロイドを使用して行われるスクリーニング法。
【請求項３０】
前記試料が化学物質または生物学的試料のいずれか１つである請求項７〜１２、１８及び１９のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項３１】
細胞、バクテリア、ウイルス、及び、タンパク質のいずれか１つである前記試料の請求項３０に記載のプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年2月5日に出願された米国仮特許出願第61／936,023号の関連出願であり、米国特許法第119条(e)の下でこの仮出願に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明の１つの態様は、例えば細胞と細菌とウイルスとタンパク質等の生物学的試料に適したプレートの分野に関する。本発明の別の態様は、典型的な用途が医薬品開発及び生体組織診断であるスクリーニング方法、医薬品開発及び生体組織診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
格子構造を有する細胞を培養するためのプレートが米国特許第5792653号（登録日:1998年8月11日）で開示される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１つの態様に係るプレートは部材を含む。上記部材が、第１の面と、第２の面と、凹部内の底部及び突起部の上端とのうち少なくとも１つを各々が有する複数の構造物と、を有し、上記第２の面から、複数の構造物それぞれと第１の面との間の境界までの第１の距離が、第２の面と上記底部及び上記上端の少なくとも１つとの間までの第２の距離とは異なり、上記複数の構造物のうち少なくとも５つの構造物は、上記複数の構造物のうちの１つの構造物から第３の距離に配置される。
【０００５】
上記プレートに関し、上記少なくとも５つの構造物を含む上記複数の構造物のうちの６つの構造物は、上記１つの構造物から第３の距離に配置されることが好ましい。
【０００６】
上記プレートはスフェロイドを形成する細胞の培養のために使用できる。等方性の形状またはヒト結腸腺がん細胞（ＤＬＤ−１）のようなそれらに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養において上記第３の距離は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより大きいことが好ましい。かかるがん細胞の培養において上記第３の距離は、８００μｍより大きいことがより好ましい。他方では、不定形またはヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）のようなそれらに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養において上記第３の距離は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことが好ましい。
【０００７】
正常細胞の培養において上記第３の距離は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことがより好ましい。
正常細胞の培養において上記第３の距離は、２００μｍに等しい、もしくは２００μｍより小さいことがより好ましい。
【０００８】
上記プレートに関し、上記１つの構造物と上記６つの構造物のうちの２つの構造物は、実質的に正三角形を構成することが好ましい。
【０００９】
上記プレートに関し、上記２つの構造物は互いに近接した位置に配置されることが好ましい。
【００１０】
上記プレートに関し、上記６つの構造物は実質的に正六角形を構成することが好ましい。
【００１１】
上記プレートに関し、上記１つの構造物と、上記６つの構造物のうちの２つの構造物は、実質的に正六角形に含まれることが好ましい。
【００１２】
本発明の１つの態様に係るプレートは部材を含む。上記部材は、第１の面と、第２の面を有し、複数の第１の部分と第２の部分とは第１の面に形成され、上記複数の第１の部分の試料に対する親和性は、上記第２の部分の上記試料に対する親和性と異なり、上記複数の第１の部分のうちの少なくとも５つの第１の部分は、上記複数の第１の部分のうちの１つの第１の部分から第３の距離に配置される。
【００１３】
かかる試料の例は、化学物質、及び、例えば細胞とバクテリアとウイルスとタンパク質等の生物学的試料である。
【００１４】
上記プレートに関し、上記少なくとも５つの構造部分を含んでいる上記複数の第１の部分のうちの６つの第１の部分は、上記１つの第１の部分から第３の距離に配置されるのが好ましい。
【００１５】
上記プレートはスフェロイドを形成する細胞の培養のために使用できる。等方性の形状またはヒト結腸腺がん細胞（ＤＬＤ−１）のようなそれらに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養において上記第３の距離は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより大きいことが好ましい。かかるがん細胞の培養において上記第３の距離は、８００μｍより大きいことがより好ましい。他方では、不定形またはヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）のようなそれらに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養において上記第３の距離は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことが好ましい。
【００１６】
正常細胞の培養において上記第３の距離は、４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことが好ましい。正常細胞の培養において上記第３の距離は、２００μｍに等しい、もしくは２００μｍより小さいことがより好ましい。
【００１７】
上記プレートに関し、上記１つの第１の部分と、上記６つの第１の部分のうちの２つの第１の部分とは、実質的に正三角形を構成することが好ましい。
【００１８】
上記プレートに関し、上記２つの第１の部分は互いに近接した位置に配置されることが好ましい。
【００１９】
上記プレートに関し、上記６つの第１の部分は実質的に正六角形を構成することが好ましい。
【００２０】
上記プレートに関し、上記１つの第１の部分と、上記６つの第１の部分のうちの２つの第１の部分とは、実質的に正六角形に含まれることが好ましい。
【００２１】
本発明の１つの態様に係るプレートは部材を含む。上記部材は第１の面と第１の面の反対側に第２の面とを有し、複数の第１の部分と第２の部分と複数の第３の部分と第４の部分とは上記第１の面に形成され、互いに近接した位置に配置された上記複数の第１の部分のうちの２つの第１の部分の間の第１の間隔は、互いに近接した位置に配置された上記複数の第３の部分のうちの２つの第３の部分の間の第２の間隔と異なる。
【００２２】
上記プレートに関し、それぞれの上記２つの第１の部分は上記第２の部分に囲まれ、それぞれの上記２つの第３の部分は上記第４の部分に囲まれていることが好ましい。
【００２３】
上記プレートに関し、上記複数の第１の部分のうちの少なくとも４つの第１の部分は上記複数の第１の部分うち１つの第１の部分から上記第１の間隔で配置され、複数の第３の部分のうちの少なくとも４つの第３の部分は複数の第１の部分のうちの１つの第３の部分から上記第２の間隔で配置されることが好ましい。
【００２４】
上記プレートはスフェロイドを形成する細胞の培養に使用できる。等方性の形状またはヒト結腸腺がん細胞（ＤＬＤ−１）のようなそれに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養において第１の間隔は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより大きいことが好ましい。そのようながん細胞の培養における第１の間隔は、８００μｍより大きいことがより好ましい。他方では、不定形またはヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）のようなそれに近い形状を有するスフェロイドを形成するがん細胞の培養における第１の間隔は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことが好ましい。
【００２５】
正常細胞の培養における第１の間隔は４００μｍに等しい、もしくは４００μｍより小さいことが好ましい。正常細胞の培養における第１の間隔は、２００μｍに等しい、もしくは２００μｍより小さいことがより好ましい。
【００２６】
上記プレートに関し、上記複数の第１の部分のうちの６つの第１の部分は上記複数の第１の部分のうちの１つの第１の部分から上記第１の間隔に配置され、上記複数の第３の部分のうちの少なくとも６つの第３の部分は複数の第１の部分のうちの１つの第３の部分から上記第２の間隔に配置されることが好ましい。
【００２７】
上記プレートに関し、上記６つの第１の部分は正六角形を構成することが好ましい。
【００２８】
上記プレートに関し、上記６つの第３の部分は正六角形を構成することが好ましい。
【００２９】
上記プレートに関し、上記６つの第１の部分は正六角形を構成し、上記６つの第３の部分は正六角形を構成することが好ましい。
【００３０】
上記プレートに関し、試料に対する上記複数の第１の部分の第１の親和性は、上記試料に対する上記第２の部分の第２の親和性とは異なり、及び、上記試料に対する複数の第３の部分の第３の親和性は、上記試料に対する第４の部分の第４の親和性と異なることが好ましい。
【００３１】
かかる試料の例は、化学物質、及び、例えば細胞とバクテリアとウイルスとタンパク質等の生物学的試料である。
【００３２】
上記プレートに関し、第１の親和性は第２の親和性より大きく、そして第３の親和性は第４の親和性より大きいことが好ましい。
【００３３】
上記プレートに関し、上記複数の第１の部分はそれぞれ、凹部及び突起部の少なくとも１つの形状の構造物を有することが好ましい。
【００３４】
上記プレートに関し、上記複数の第３の部分は、凹部及び突起部の少なくとも１つの形状の構造物を有することが好ましい。
【００３５】
上記プレートに関し、上記複数の第１の部分と上記第２の部分は第１の領域に形成され、複数の第３の部分と第４の部分とは第２の領域に形成されることが好ましい。
【００３６】
上記プレートに関し、上記第１の領域は第１のフェンスに囲まれ、上記第２の領域は第２のフェンスに囲まれることが好ましい。
【００３７】
上記プレートに関し、上記プレートはさらに枠を含み、それぞれ、上記第１のフェンスと第２のフェンスとは枠の一部であることが好ましい。
【００３８】
上記プレートに関し、複数の第５の部分と第６の部分は上記第１の面に形成され、互いに近接した位置に配置された上記複数の第５の部分のうちの２つの第５の部分の間の第３の間隔は、上記第１の間隔と上記第２の間隔とは異なることが好ましい。
【００３９】
上記プレートに関し、上記複数の第５の部分と上記第６の部分とは第３のフェンスに囲まれていることが好ましい。
【００４０】
本発明の１つの態様に係る細胞培養法は上述のプレートのうちいずれかを使用して行われる。
【００４１】
上記方法に関し、上記第１の間隔と上記第２の間隔との間で効果的にスフェロイドを形成するのに適した間隔は上記方法によって試験されることが好ましい。
【００４２】
本発明の１つの態様に係るスクリーニング方法は、上記の方法いずれかによって細胞を培養することにより形成したスフェロイドを使用して行われる。上記スクリーニング方法は、化学物質または薬物の薬理効果の検査に適用できる。
【００４３】
本発明の１つの態様に係る薬物製造方法は上記スクリーニング法によって検査された薬理効果の結果に基づいて行われる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
図面において、本発明を実施するための現在考えられる最良の形態を示す。
【００４５】
【図１】図１は、本発明の１つの態様に係るプレートの概観とプレートのウェルの底部に形成された親和性領域の配置を示す図である。
【００４６】
【図２】図２は、本発明の１つの態様に係るプレートのウェル底部に形成された親和性領域の配置を示す図である。
【００４７】
【図３】図３は、親和性領域が形成されたウェル底部の断面図を示す図である。
【００４８】
【図４】図４は、凹部が形成されたウェル底部の断面図を示す図である。
【００４９】
【図５】図５は、突起部が形成されたウェル底部の断面図を示す図である。
【００５０】
【図６】図６は、親和性領域のピッチが４００μｍ、６００μｍ及び８００μｍである親和性領域を使用し、ＤＬＤ−１の培養により形成されたスフェロイドを示す図である。
【００５１】
【図７】図７は、親和性領域のピッチが４００μｍ、６００μｍ及び８００μｍである親和性領域を使用し、ＳＫＢＲ３の培養により形成されたスフェロイドを示す図である。
【００５２】
【図８】図８は、ＤＬＤ−１の培養による細胞数の経時変化を示す図である。
【００５３】
【図９】図９は、ＳＫＢＲ３の培養による細胞数の経時変化を示す図である。
【００５４】
【図１０】図１０は、ＤＬＤ−１とＳＫＢＲ３から形成されたスフェロイドの輪郭を示す図である。
【００５５】
【図１１】図１１は、ＤＬＤ−１とＳＫＢＲ３から形成されたスフェロイド幅の変動係数（ＣＶ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
実験手順
【００５７】
ウェル数は、細胞の種類又は細胞の培養条件によって決定し得る。本発明の１つの態様に係る例示されたプレートは、図１に示されたようにそれぞれが黒枠に囲まれた９６つのウェルを有する。上記黒枠の一部は、前述した上記第１のフェンスまたは上記第２のフェンスに相当する。ウェル底部の構成材料は、シクロオレフィン樹脂、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール及びポリ塩化ビニリデン等の樹脂である。それらの中でも、プレートをイメージングに使用する場合、その高い透明性からシクロオレフィン樹脂が好ましい。上記構成材料がシクロオレフィン樹脂の場合、典型的には樹脂の厚さは約１９０μｍである。直径１００μｍであり、その領域の周囲と比べて細胞等の生物学的試料に高い親和性を持つ複数の円形の領域がそれぞれのウェルの底部に形成される。これは生物学的試料を固定し培養できる。上記領域の密度はプレートの部分によって異なる。上記円形親和性領域は、３つの異なるピッチ、すなわち４００、６００及び８００μｍのピッチに配置される。ウェルあたりの上記円形領域の数は、それぞれ４００、６００及び８００μｍのピッチに対して２２０、１００及び５０個である。
【００５８】
互いに近接した位置に配置された３つの上記円形親和性領域は正三角形を構成する。上記円形親和性領域の１つに近接した位置に配置された６つの上記円形親和性領域は、実質的に正六角形を構成する。
【００５９】
あるいは、鋭角で交差する２本の直線上の親和性領域は同じ距離に配置される。典型的には、２本の直線がなす上記角度は６０°である。
【００６０】
本発明の１つの態様に係る別のプレートでは、図２に示されるように親和性領域は正方形の配列を有する。互いに近接した位置に配置された４つの上記円形親和性領域は、実質的に正方形を構成する。あるいは、直角で交差する２本の直線状の親和性領域は同じ距離に配置される。
【００６１】
図３は、ウェル底部に形成された上記円形親和性領域の断面図を示す。上記親和性領域は、表面処理またはフォトリソグラフィ技術によって形成することができる。上記親和性領域は、面Ａに接触するフェンスによって囲まれている。上記フェンスは、ウェルに分注した試料を含む液体が漏れることを防ぐ。上記フェンスは枠の一部分であってもよい。上記親和性領域は、例えばポリビニルアルコールやセルロール等の親水性ポリマーまたは樹脂を用いることによって親水性部分を形成することによって形成される。
【００６２】
親和性領域を形成するかわりに、凹部や突起部のような構造物が、細胞、バクテリア、ウイルス及びタンパク質等の生物学的試料を固定し、培養するために形成される。図４は、上述したウェル底部に形成した凹部を示す。さらに図５は上記ウェル底部に形成した突起部を示す。
【００６３】
それぞれの凹部は、図４に示されるように底部と壁とから構成される。上記壁は、面Ａ（ウェル底部の表面）と上記凹部との間の境界から上記凹部の上記底部に向かって伸びている。上記凹部は面Ａに接触するフェンスによって囲まれている。上記フェンスは、上記ウェルに分注した試料を含む液体が漏れることを防ぐ。上記フェンスは枠の一部分であってもよい。
【００６４】
それぞれの突起部は、図５に示されるように上端と壁とから構成される。上記壁は、面Ａと上記突起部との間の境界から上記突起部の上端に向かって伸びている。突起部は面Ａに接触するフェンスによって囲まれている。上記フェンスは、上記ウェルに分注した試料を含む液体が漏れることを防ぐ。上記フェンスは枠の一部分であってもよい。
【００６５】
上記壁と、上記底部または上記上端とのうち少なくとも１つの表面状態は、表面処理、または、上記壁と上記底部若しくは上記上端とに使用される材料の選択によって調整することができる。
【００６６】
ヒト結腸腺がん細胞ＤＬＤ−１とヒト乳がん細胞ＳＫＢＲ３との培養は図１に示されるプレートを使用して行われた。
【００６７】
ヒト結腸腺がん細胞ＤＬＤ−１とヒト乳がん細胞ＳＫＢＲ３とを含む２つのそれぞれの懸濁液は、それぞれ円形親和性領域が３つの異なるピッチ、すなわち４００、６００及び８００μｍのピッチに配置されたプレートのウェルに分注された。
【００６８】
典型的には、１ウェルあたりに播種される細胞の数は、それぞれ４００、６００及び８００μｍのピッチに対して２８００〜５６００、１２００〜２４００及び６５０〜１３００個である。今回は、それぞれのウェルに播種した細胞の数は、それぞれ４００、６００及び８００μｍのピッチに対して２８００、１２００及び６５０個である。播種された細胞は、３７℃、５％に加湿された炭酸ガスの存在下培養された。培養培地は１〜３日ごとに新鮮なものと交換される。
【００６９】
１４日間培養後の４００、６００及び８００μｍのピッチの親和性領域を有するウェル底部に形成されるＤＬＤ−１のスフェロイドを図６に示す。明らかなスフェロイドの形成が、４００、６００及び８００μｍのピッチの全てで観察された。これは、正六角形または正三角形で構成する親和性領域を有する表面上での生物学的試料の培養がスフェロイドの形成に有効であることを意味している。
【００７０】
ピッチが８００μｍである親和性領域を持つウェル底部に形成したスフェロイドは、３種類のピッチの親和性領域を有するウェル底部に形成されるスフェロイドの中で最大のサイズであった。
【００７１】
図８は、３種類のピッチの親和性領域を有するウェル底部でのＤＬＤ−１の培養による細胞数の経時変化を示す。細胞数の変化は、上記スフェロイドから放出される発光量の変化を検出することによって観察された。顕著なスフェロイドの増殖は、１０日間の培養の後も８００μｍのピッチで観察された。
【００７２】
１４日間培養後の４００、６００及び８００μｍのピッチの親和性領域を有するウェル底部に形成されるＳＫＢＲ３のスフェロイドを図７に示す。今回の条件下では、明らかなスフェロイドの形成が４００μｍのピッチで観察されたが、スフェロイドの形成は６００及び８００μｍのピッチでは観察されなかった。
【００７３】
図９は、３種類のピッチの親和性領域を有するウェル底部でのＳＫＢＲ３の培養による細胞数の経時変化を示す。細胞数の変化は、上記スフェロイドから放出される発光量の変化を検出することによって観察された。ピッチが４００μｍである親和性領域を持つウェル底部での上記スフェロイドの増殖は、培養１０日後に止まった。
【００７４】
図１０は、ＤＬＤ−１とＳＫＢＲ３から形成したスフェロイドの輪郭とスフェロイドの測長の軸を示す。ＤＬＤ−１から形成される上記スフェロイドはほぼ球形であるが、ＳＫＢＲ３から形成される上記スフェロイドは図１０に見られるように不規則な形状を有している。軸Ｌは上記スフェロイドの最大長を含む線を示す。軸Ｌは最大長の中間点（Ｍ）を通過し、軸Ｌに垂直な線を示す。軸ＲＤとＬＤは、中間点Ｍを通過し、それぞれ４５および１３５°で軸Ｌと交差する線である。輪郭とそれぞれ４つの軸の交点の点間の距離が測られる。
【００７５】
図１１は前述の方法により測定したＤＬＤ−１とＳＫＢＲ３から形成される上記スフェロイドの変動係数（ＣＶ）の幅を示す。全ての上記スフェロイドはピッチが４００μｍである親和性領域を有するウェル底部に形成された。
【００７６】
上記４軸を使って測定した距離の変動係数は、正六角形に構成する親和性領域を有すウェル底部にＤＬＤ−１から形成したそれぞれ１５個のスフェロイドに対して評価される。
【００７７】
上記４軸を使って測定した距離の変動係数は、正方形に構成する親和性領域を有すウェル底部にＤＬＤ−１から形成したそれぞれ１５個のスフェロイドに対して評価される。
【００７８】
上記４軸を使って測定した距離の変動係数は、正六角形に構成する親和性領域を有すウェル底部にＳＫＢＲ３から形成したそれぞれ１５個のスフェロイドに対して評価される。
【００７９】
上記４軸を使って測定した距離の変動係数は、正方形に構成する親和性領域を有すウェル底部にＳＫＢＲから形成したそれぞれ１５個のスフェロイドに対して評価される。
【００８０】
正六角形のピッチを有するウェル底にＤＬＤ−１から形成される上記スフェロイドに関する変動係数は、１．８６〜７．８９まで変動するが、正方形のピッチを有するウェル底にＤＬＤ−１から形成される上記スフェロイドに関する変動係数は、２．７１〜１７．０５まで変動する。
【００８１】
１．８６〜１７．０５のＣＶを示すスフェロイドを形成する細胞は上記で説明した等方性形状を有する細胞に分類することができる。さらに具体的にいうと、１．８６〜７．８９のＣＶを示すスフェロイドを形成する細胞は等方性形状を有する細胞に分類することができる。
【００８２】
言い換えれば、正六角形のピッチを有すウェル底部にＤＬＤ−１から形成される上記スフェロイドは、正方形のピッチを有するウェル底部にＤＬＤ−１から形成される上記スフェロイドに比べて、より球形に近い傾向にある。
【００８３】
正六角形のピッチを有するウェル底部にＳＫＢＲ３から形成される上記スフェロイドに関する変動係数は、７．８０〜２４．９５まで変動するが、正方形のピッチを有するウェル底部にＳＫＢＲ３から形成される上記スフェロイドに関する変動係数は、４．８７〜２８．８１まで変動する。
【００８４】
４．８７〜２８．８１のＣＶを示すスフェロイドを形成する細胞は上記で説明した不定形な細胞に分類することができる。さらに具体的にいうと、７．８０〜２４．９５のＣＶを示すスフェロイドを形成する細胞は不定形な細胞に分類することができる。
【００８５】
ＳＫＢＲ３から形成される上記スフェロイドは、元来不規則な形状を有している傾向がある。言い換えれば、本発明の１つの態様に係るプレートは、ＳＫＢＲ３等の不規則な形状を有する細胞からスフェロイドを形成することが可能となる。
【００８６】
特に、それぞれ図１または図２に示されるように互いに異なるピッチの親和性領域または構造物を有するプレートは、不規則な形状を持つ細胞であることを考慮に入れても、上記親和性領域または構造物の最適なピッチを最小の試験によって決定できるため非常に有用である。
【００８７】
細胞型に応じて、最適なプレート、または親和性領域若しくは構造物のピッチが決定される。細胞型は上記に説明した大きさまたは形に関するパラメーターによって決定される。
【００８８】
一例では、上記に説明した４軸に基づいて得られた距離の変動係数が等しいか、または１０より大きいかによってその細胞が不規則な形状を有しているか判定できる。
【図３】
2017506887.tif 000003
【図４】
2017506887.tif 000004
【図５】
2017506887.tif 000005
【図１１】
2017506887.tif 000006
【図１】
2017506887.tif 000007
【図２】
2017506887.tif 000008
【図６】
2017506887.tif 000009
【図７】
2017506887.tif 000010
【図８】
2017506887.tif 000011
【図９】
2017506887.tif 000012
【図１０】
2017506887.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月12日(2016.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部材を含むプレートであって、
該部材が、第１の面と、第２の面と、凹部内の底部と突起部の上端とのうち少なくとも１つを各々が有する複数の構造物と、を有し、
前記複数の構造物は前記第１の面に形成され、
前記第２の面から、前記複数の構造物それぞれと前記第１の面との間の境界までの第１の距離が、第２の面と前記底部及び前記上端の少なくとも１方との間の第２の距離とは異なり、
前記複数の構造物のうち少なくとも５つの構造物は、前記複数の構造物のうちの１つの構造物から第１の間隔に配置され、
前記構造物である第１の部分と、該第１の部分以外の一部である第２の部分とが、試料に対して異なる親和性を有し、
前記複数の構造物のうちの１つの構造物と、該１つの構造物から第１の間隔に配置される前記複数の構造物のうち少なくとも５つの構造物と、が、フェンスに囲まれる、プレート。
【請求項２】
前記第１の部分が直径約１００μｍの円形領域を有する請求項１に記載のプレート。
【請求項３】
前記第１の部分が親水性ポリマーを用いて親水性部分を形成することによって形成される請求項１又は２に記載のプレート。
【請求項４】
前記少なくとも５つの構造物を含む前記複数の構造物のうちの６つの構造物が前記１つの構造物から第１の間隔に配置される請求項１〜３のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項５】
前記１つの構造物と、前記６つの構造物のうちの２つの構造物と、が実質的に正三角形を構成する請求項４に記載のプレート。
【請求項６】
前記２つの構造物が互いに近接した位置に配置される請求項５に記載のプレート。
【請求項７】
前記６つの構造物が実質的に正六角形を構成する請求項４〜６のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項８】
前記１つの構造物と、前記６つの構造物のうちの２つの構造物と、が実質的に正六角形に含まれる請求項７に記載のプレート。
【請求項９】
複数の第３の部分と、第４の部分と、を前記第１の面にさらに有し、
互いに近接した位置に配置された前記複数の第３の部分のうちの２つの第３の部分の間の第２の間隔が、前記第１の間隔と異なり、
前記第３の部分と、前記第４の部分とが、前記試料に対して異なる親和性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項１０】
前記２つの第１の部分の各々は前記第２の部分で囲まれており、且つ、前記２つの第３の部分の各々は前記第４の部分で囲まれている請求項９に記載のプレート。
【請求項１１】
前記複数の第３の部分のうちの少なくとも４つの第３の部分が、前記複数の第３の部分のうちの１つの第３の部分から前記第２の間隔で配置されている請求項９又は１０に記載のプレート。
【請求項１２】
前記複数の第３の部分のうちの少なくとも６つの第３の部分が、前記複数の第３の部分のうちの１つの第３の部分から前記第２の間隔で配置されている請求項１１に記載のプレート。
【請求項１３】
前記第１の部分の前記試料に対する親和性が前記第２の部分より大きく、
前記第３の部分の前記試料に対する親和性が前記第４の部分より大きく、
前記複数の第１の部分と前記第２の部分とが第１の領域に形成され、
前記複数の第３の部分と前記第４の部分とが第２の領域に形成される請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項１４】
前記第１の領域が第１のフェンスに囲まれており、前記第２の領域が第２のフェンスに囲まれている請求項１３に記載のプレート。
【請求項１５】
枠をさらに含み、
前記第１のフェンスと前記第２のフェンスとのそれぞれが、前記枠の１部である請求項１４に記載のプレート。
【請求項１６】
前記試料が、化学物質および生物学的試料のいずれか１つである請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプレート。
【請求項１７】
前記生物学的試料が、細胞、バクテリア、ウイルス、及び、タンパク質のいずれか１つである請求項１６に記載のプレート。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプレートを使用して行われる細胞培養方法。
【請求項１９】
前記第１の間隔と前記第２の間隔の間でスフェロイドを効果的に形成するのに適した間隔が試験される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の方法による細胞培養で形成したスフェロイドを使用して行われるスクリーニング法。
【国際調査報告】
2017506887.tif 000014
2017506887.tif 000015