(57)【要約】Ｗ８と名付けられたバレイショ栽培品種が開示される。本発明は、バレイショ栽培品種Ｗ８の塊茎、バレイショ栽培品種Ｗ８の種子、バレイショ栽培品種Ｗ８の植物および植物部分、バレイショ栽培品種Ｗ８から産出される食物製品、ならびにバレイショ栽培品種Ｗ８とそれ自体とを、もしくは別のバレイショ変種とを交配することによって、バレイショ植物を産生するための方法に関する。本発明はまた、トランスジェニックバレイショ植物を産生するための方法、ならびにそれら方法によって産生されるトランスジェニックバレイショ植物および部分に関する。本発明はまた、バレイショ栽培品種Ｗ８に由来するバレイショ植物および植物部分、バレイショ栽培品種Ｗ８に由来する他のバレイショ植物もしくは植物部分を産生するための方法、ならびにそれら方法の使用に由来するバレイショ植物およびそれらの部分に関する。
2017518061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレイショ栽培品種Ｗ８のバレイショ塊茎、もしくは塊茎の一部であって、ここで該塊茎の代表的サンプルは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１０７９の下で寄託された、バレイショ塊茎、もしくは塊茎の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の塊茎もしくは塊茎の一部を生育させることによって産生される、バレイショ植物、もしくはその一部。
【請求項３】
請求項２に記載の植物の生理学的および形態学的特徴の全てを有し、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、バレイショ植物。
【請求項４】
請求項２に記載の植物から産生される細胞の組織培養物であって、ここで該組織培養物の該細胞は、葉、花粉、胚芽、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、雌蕊、葯、花、幹および塊茎から成る群より選択される植物部分から産生され、該組織培養される細胞は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、組織培養物。
【請求項５】
前記植物は、バレイショ栽培品種Ｗ８の生理学的および形態学的特徴のうちの全てを有する、請求項４に記載の組織培養物から再生されるバレイショ植物。
【請求項６】
請求項１に記載のバレイショ塊茎、もしくは該塊茎の一部を生育させることによって産生されるバレイショ種子であって、ここで該種子は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、バレイショ種子。
【請求項７】
請求項６に記載の種子を生育させることによって産生される、バレイショ植物、もしくはその一部。
【請求項８】
請求項７に記載のバレイショ植物の組織培養物から再生されるバレイショ植物であって、ここで該再生された植物は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、バレイショ植物。
【請求項９】
バレイショ種子を産生するための方法であって、該方法は、２つのバレイショ植物を交配する工程、および結果として得られるバレイショ種子を採取する工程を包含し、ここで少なくとも一方のバレイショ植物は、請求項２に記載のバレイショ植物である、方法。
【請求項１０】
バレイショ種子を産生するための方法であって、該方法は、２つのバレイショ植物を交配する工程、および結果として得られるバレイショ種子を採取する工程を包含し、ここで少なくとも一方のバレイショ植物は、請求項７に記載のバレイショ植物である、方法。
【請求項１１】
前記種子は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、請求項１０に記載の方法によって産生されるバレイショ種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のバレイショ種子を生育させることによって産生される、バレイショ植物、もしくはその部分。
【請求項１３】
前記種子は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、請求項１２に記載の植物から産生されるバレイショ種子。
【請求項１４】
前記バレイショ植物のうちの一方は、バレイショ栽培品種Ｗ８であり、第２のバレイショ植物は、トランスジェニックである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
バレイショ種子を産生するための方法であって、該方法は、２つのバレイショ植物を交配する工程および結果として得られるバレイショ種子を採取する工程を包含し、ここで該バレイショ植物のうちの一方は、請求項７に記載のバレイショ植物であり、第２のバレイショ植物は、トランスジェニックである、方法。
【請求項１６】
前記植物は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、請求項１４に記載の方法によって産生される種子を生育させることによって産生される、バレイショ植物、もしくはその一部。
【請求項１７】
所望の形質をバレイショ栽培品種Ｗ８に導入するための方法であって、ここで該方法は、
（ａ）Ｗ８植物であって、ここで塊茎の代表的サンプルは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１０７９の下で寄託されたＷ８植物と、子孫植物を産生するために所望の形質を含む別のバレイショ栽培品種の植物であって、ここで該所望の形質は、雄性不稔性、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝および細菌性の病気、真菌の病気もしくはウイルス性の病気に対する抵抗性から成る群より選択される別のバレイショ栽培品種の植物とを交配する工程；
（ｂ）該所望の形質を有する１もしくはこれより多くの子孫植物を選択する工程；
（ｃ）該選択された子孫植物とＷ８植物とを戻し交配して、戻し交配子孫植物を産生する工程；
（ｄ）該所望の形質を有する戻し交配子孫植物を選択する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）を２回もしくはこれより多く連続して反復して、該所望の形質を含む選択された第３もしくはより高次の戻し交配子孫植物を産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記植物は、前記所望の形質を有し、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、請求項１７に記載の方法によって産生されるバレイショ植物。
【請求項１９】
前記所望の形質は、除草剤抵抗性であり、該抵抗性は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グリホセート、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノトリシン、トリアジンおよびベンゾニトリルから成る群より選択される除草剤に付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２０】
前記所望の形質は、昆虫抵抗性であり、該昆虫抵抗性は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素をコードするトランスジーンによって付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２１】
前記所望の形質は、改変された脂肪酸代謝もしくは改変された炭水化物代謝であり、該所望の形質は、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼおよびデンプン分枝酵素から成る群より選択されるタンパク質をコードする核酸、またはステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンスをコードするＤＮＡによって付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２２】
商用植物製品を産出するための方法であって、該方法は、請求項２に記載の植物もしくはその一部を得る工程、および該商用植物製品を、該植物もしくはその植物部分から産出する工程を包含し、ここで該商用植物製品は、フレンチフライ、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレークおよびポテト顆粒から成る群より選択される、方法。
【請求項２３】
前記製品は、内因性アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子のための内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて含む栽培品種Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含み、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１および内因性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現の阻害に有効なバレイショＤＮＡの逆方向反復を含むＷ８に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入領域をさらに含む、請求項２２に記載の方法によって産生される商用植物製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、Ｗ８と名付けられた新規なバレイショ（ｐｏｔａｔｏ）栽培品種、並びに、そのバレイショ変種によって産生された塊茎、植物、植物部分、培養組織物及び種子に関する。本発明は、さらに、バレイショ栽培品種Ｗ８から作製された食物製品、例えば、フレンチフライ、ポテトチップス、脱水ポテト材料（dehydrated  potato  material）、ポテトフレーク及びポテト顆粒に関する。本出願において挙げられる全ての刊行物は、本明細書中で、参考によって組み込まれる。
【０００２】
バレイショは、世界で四番目に重要な食物収穫物であり、断然最も重要な野菜である。バレイショは、現在、米国のほぼ全ての州で、市販用に育てられている。年間のバレイショ生産量は、米国内で１８００万トンを超え、世界中で３億トンを超える。バレイショの人気は、主に、その汎用性及び栄養的な価値に起因する。バレイショは、新鮮なまま、冷凍して又は乾燥させて使用されてもよく、又は、粉末、デンプン又はアルコールに加工されてもよい。これらは、炭水化物の複合体を含み、カルシウム、ナイアシン及びビタミンＣが豊富である。
【０００３】
食品産業においてバレイショの品質は、２つの重大な要因により、有害に作用する：（１）バレイショは、揚げる際又は焼く際に迅速に酸化されて発癌物質であるアクリルアミドを形成する非必須アミノ酸であるアスパラギンを大量に含む；及び（２）バレイショは、傷ついたバレイショの損傷プラスチドからポリフェノールオキシダーゼが漏れ出した際に起こる望まざる事象である酵素的褐色化及び変色を、非常に受け易い。細胞質において、酵素は、フェノールを酸化し、これは、迅速に重合体化して、暗色の色素を生成する。塊茎は、大量のリン酸化デンプンを含み、これらの幾らかは、保存の間に分解されて、グルコース及びフルクトースを生成する。これらの還元糖は、１２０℃を超える温度で加熱された場合に、アミノ酸と反応してアクリルアミドを含むメイラード産物を形成する。デンプンリン酸化に関与する２つの酵素は、水ジキナーゼＲ１及びホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１及びＰｈＬ）である。褐色化はまた、デンプンのグルコース及びフルクトースへの部分的分解の結果として、非酵素的にも起こる。
【０００４】
多くのバレイショ栽培品種は、後期胴枯れ病（late  blight）（真菌様卵菌病原体Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされる壊滅的な病気）に罹りやすい。バレイショの後期胴枯れ病は、急速に拡大し得かつ壊死し得る葉および幹上の黒色／褐色病変によって同定される。ひどい後期胴枯れ病の流行は、Ｐ．  ｉｎｆｅｓｔａｎｓが増殖し、宿主作物で急速に再生する場合に起こる。
【０００５】
今日まで、低アクリルアミド含有量、増大した黒色斑傷耐性、低下した還元糖、および後期胴枯れ病への増大した抵抗性を有する塊茎を産生するバレイショ植物変種は存在しない。従って、毒性化合物の低下したレベルおよび病気への増大した抵抗性を有するが、未知もしくは外来核酸の使用がないバレイショ変種を開発することが必要である。本発明は、この必要性を満たす。
【０００６】
関連技術及びそれに関連する制限の上記の例は、例示を意図し、排除を意図しない。関連技術の他の限定は、本明細書を読んだ際に、当業者に明らかになる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施形態及びその局面は、システム、ツール及び方法と組み合わせて記載され、これらは、例示を意味し、範囲の限定を意味しない。種々の実施形態において、上記の問題の１つもしくはそれより多くは、軽減されているか又は排除されており、他方で、他の実施形態は、他の改善を指向する。
【０００８】
この目的のために、本発明は、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり、外来性ＤＮＡ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＤＮＡ、ウイルスマーカー又はベクター骨格配列を含まない核酸配列によって、形質転換された新規なバレイショ変種Ｗ８を提供する。むしろ、バレイショ変種Ｗ８のゲノム内に挿入されたＤＮＡは、バレイショに対してネイティブであるか、又はバレイショに性的に適合する植物であるワイルドポテト（ｗｉｌｄ  ｐｏｔａｔｏ）に対してネイティブである非コードポリヌクレオチドであり、黒色斑傷の発現、アスパラギン蓄積及び老化甘味（senescence  sweetening）に関与する遺伝子をサイレンシングする。
【０００９】
従って、１つの実施形態において、本発明は、第１サイレンシングカセット及び第２サイレンシングカセットを含むｐＳＩＭ１２７８と呼ばれる植物ベクターを提供し、第１サイレンシングカセットは、アンチセンス方向で、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（ｆＡｓｎ１）の断片とポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’−非翻訳配列とを含む２コピーのＤＮＡセグメントを有し、第２サイレンシングカセットは、アンチセンス方向で、バレイショホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子の断片とバレイショＲ１遺伝子の断片とを含む２コピーのＤＮＡセグメントを含む。ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支持し且つ植物細胞の形質転換の際には植物細胞内に移動しない９，５１２ｂｐの骨格領域、及び形質転換の際に植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む１０，１４８ｂｐのＤＮＡ挿入領域を含む。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセット、および植物液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖに関するサイレンシングカセットを含む第２の植物ベクター（ｐＳＩＭ１６７８といわれる）を提供する。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、後期胴枯れ病への広い抵抗性を付与するそのネイティブプロモーターおよびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域から成るのに対して、サイレンシングカセットは、植物プロモーターであるｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐを対向させることによって隣接されるバレイショＶＩｎｖ遺伝子に由来する配列の逆方向反復から成る。ｐＳＩＭ１６７８ベクターは、植物形質転換の前に植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞へと移入されない９，５１２ｂｐ骨格領域、および形質転換の際に植物細胞のゲノムへと安定的に組み込まれるネイティブＤＮＡを含む９，０９０ｂｐ  ＤＮＡ挿入領域を含む。
【００１１】
異なる実施形態において、本発明は、本発明の一方または両方の植物ベクターによって形質転換した植物細胞を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、本発明の植物ベクターによって形質転換した１つもしくはそれより多くの細胞を含むバレイショ植物変種を提供する。本発明の１つの局面において、バレイショ植物変種は、ベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットのうち少なくとも１つを発現し、ベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現し、そしてサイレンシングカセットの発現は、植物の塊茎においてアスパラギンシンセターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子及び液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい局面において、少なくとも１つのサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種の塊茎は、同じ変種の非形質転換植物の塊茎に存在しない２つもしくはそれより多くの所望の形質を提示する。本発明の最も好ましい局面では、２つもしくはそれより多くの所望の形質が、低アスパラギン蓄積、黒斑傷の低下、熱誘導性アクリルアミド形成の低下、及び貯蔵中の還元糖の蓄積低下から成る群より選択される。
【００１２】
本発明の異なる局面において、バレイショ植物変種は、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８のサイレンシングカセットの両方を発現し、ベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現し、そしてサイレンシングカセットの発現は、バレイショ植物変種の塊茎において、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子、ジキナーゼＲ１遺伝子および液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい局面において、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットを発現しかつベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種の塊茎は、同じ変種の非形質転換植物の塊茎に存在しない２つもしくはそれより多くの所望の形質を提示する。好ましい実施形態において、２つもしくはそれより多くの所望の形質が、低アスパラギン蓄積、黒斑傷の減少、保存の間の還元糖の蓄積の低下、及び熱誘導性アクリルアミド形成の低下から成る群より選択される。本発明の１つの局面において、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットおよび植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｗ８変種である。
【００１３】
本発明の別の局面において、本発明のバレイショ植物変種Ｗ８は、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１６７８の後期胴枯れ病抵抗性遺伝子（Ｒｐｉ−ｖｎｔ１）を発現する。本発明のさらなる局面において、本発明のバレイショ植物変種Ｗ８は、後期胴枯れ病感染への増大した抵抗性を有する。
【００１４】
従って、本発明に従い、Ｗ８と名付けられたソラナム・ツベロサムＬ．（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）の属及び種の新規なバレイショ栽培品種が、提供される。従って、本発明は、バレイショ栽培品種Ｗ８、バレイショ栽培品種Ｗ８の塊茎、バレイショ栽培品種Ｗ８の植物、バレイショ栽培品種Ｗ８の種子、バレイショ栽培品種Ｗ８から作製された食物製品、並びに、バレイショ栽培品種Ｗ８を自家受粉することによるか、又はバレイショ栽培品種Ｗ８を別のバレイショ栽培品種と交配することによって産生されるバレイショ植物を作製するための、及びバレイショ栽培品種Ｗ８の変異誘発若しくは形質転換によるバリアントの作製のための方法に関する。
【００１５】
従って、栽培品種Ｗ８を用いるこのような任意の方法が、本発明の実施形態である：自家受粉、戻し交配、ハイブリッド産生、集団に対する交配など。少なくとも親の一方としてバレイショ栽培品種Ｗ８を用いて産生される全ての植物が、本発明の範囲内である。好都合にも、このバレイショ栽培品種は、他の異なるバレイショ植物との交配において使用されて、優れた特徴を有する第１世代（Ｆ１）バレイショハイブリッド塊茎、種子及び植物を産生してもよい。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、バレイショ栽培品種Ｗ８の単一若しくは複数遺伝子変換植物を提供する。１つの実施形態において、移入された遺伝子（複数可）は、優性対立遺伝子（複数可）であっても、又は劣性対立遺伝子（複数可）であってもよい。幾つかの実施形態において、移入された遺伝子（複数可）は、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病気に対する抵抗性、雄性稔性、雄性不稔、栄養品質の増大、均一性、並びにデンプン及び他の炭水化物の濃度の増大、傷のでき易さの低下及びデンプンから糖への変換率の低下などの形質を付与する。この遺伝子（複数可）は、天然に存在するバレイショ遺伝子であっても、遺伝子操作技術、戻し交配又は変異を通して導入された導入遺伝子であってもよい。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、バレイショ栽培品種Ｗ８の組織培養物における使用のための、再生可能な細胞を提供する。１つの実施形態において、組織培養物は、上記のバレイショ植物の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する植物を再生すること、並びに、上記のバレイショ植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することが、可能である。幾つかの実施形態において、このような組織培養物における再生可能細胞は、胚芽、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌蕊、子葉、胚軸、根、根端（root  tip）、花、種子、葉柄、塊茎、芽又は幹である。なおさらに、本発明は、本発明の組織培養物から再生されたバレイショ植物を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、バレイショ植物変種Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｗ８の塊茎から作製される食物製品を提供する。好ましくは、食物製品は、熱処理製品である。なおより好ましくは、食物製品は、フレンチフライ、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレーク又はポテト顆粒である。
【００１９】
上記の例示的局面及び実施形態に加え、さらなる局面及び実施形態が、以下の記載の研究によって、明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを図示する。左側のベクター骨格領域は、９，５１２ｂｐ長であり、１０，１４９ｂｐの位置にて開始し、１９，６６０ｂｐの位置にて終わる。骨格ＤＮＡは、主に、植物形質転換の前のＤＮＡ挿入物の維持の支持を提供する細菌ＤＮＡから成る。隣接する境界配列を含め、ＤＮＡ挿入領域（右側）は、１０，１４８ｂｐ長（１ｂｐ〜１０，１４８ｂｐ）である。ＤＮＡ挿入物は、ネイティブのＤＮＡのみから成り、形質転換の際にバレイショ遺伝子内に安定的に組み込まれた。
【００２１】
【図２】図２は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター内に挿入されたＤＮＡ挿入物内のサイレンシングカセットの概略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーによって隔てられた２つの遺伝子断片の２コピーを含む。４つの標的遺伝子、すなわちＡｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、Ｐｈｌ及びＲ１の断片を含む２コピーのＤＮＡセグメントは、Ｐｒｏとして示される２つの収束プロモーター（convergent  promoter）の間に逆方向反復として挿入され、これは、塊茎内で優性に活性である。結果として生じたサイレンシングカセットを含む植物は、塊茎において多様でありポリアデニル化されていない一連のＲＮＡ分子を産生し、これらは、企図する標的遺伝子を動的かつ激しくサイレンシングする。ＲＮＡ分子のサイズは、一般に、使用した２つのプロモーター間の距離よりも短い。何故なら、収束転写は、衝突転写（collisional  transcription）をもたらすからである。
【００２２】
【図３】図３は、本発明のｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターを示す。ベクター骨格領域（左側）は、９，０９１ｂｐの位置にて始まり、１８，６０２ｂｐの位置にて終わるので、９，５１２ｂｐの長さである。骨格ＤＮＡは、植物形質転換前にＤＮＡ挿入物の維持の支持を提供する細菌ＤＮＡから主に成る。隣接する境界配列を含め、ＤＮＡ挿入領域（右側）は、９，０９０ｂｐの長さ（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）である。ＤＮＡ挿入物は、ネイティブＤＮＡのみから成る。これは、形質転換の際にバレイショゲノムへと安定的に組み込まれた。
【００２３】
【図４】図４は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターに挿入されるＤＮＡ挿入物中のサイレンシングカセット（上側の構築物）およびｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターに挿入されるＤＮＡ挿入物中のサイレンシングカセット（下側の構築物）の概略図を提供する
【００２４】
【図５】図５は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照（ＷＴ）とともに、２つの事象（Ｗ３およびＷ８）に関する圃場生育植物の塊茎から単離された全ＲＮＡ（２０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットを、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１、およびＶＩｎｖ転写物に特異的なプローブとハイブリダイズした（上側パネル）。内部対照１８ｓ  ｒＲＮＡに対して特異的なプローブ（中央パネル）およびエチジウムブロミド染色した全ＲＮＡ（下側パネル）を、内部対照およびローディング対照として使用した。各ブロットは、各サンプルに関する２つの独立した生物学的複製物を含む。Ｗ３＝提出されなかったさらなる事象。
【００２５】
【図６】図６は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照（ＷＴ）とともに、２つの事象（Ｗ３およびＷ８）に関する圃場生育植物の葉から単離された全ＲＮＡ（２０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットを、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１、およびＶＩｎｖ転写物に特異的なプローブとハイブリダイズさせた（上側パネル）。内部対照１８ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（中央パネル）およびエチジウムブロミド染色した全ＲＮＡ（下側パネル）を、内部対照およびローディング対照として使用した。各ブロットは、各サンプルに関する２つの独立した生物学的複製物を含む。Ｗ３＝提出されなかったさらなる事象。
【００２６】
【図７】図７は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照（ＷＴ）とともに、２つの事象（Ｗ３およびＷ８）に関する圃場生育植物の幹から単離された全ＲＮＡ（２０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットを、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１、およびＶＩｎｖ転写物に特異的なプローブとハイブリダイズさせた（上側パネル）。内部対照１８ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（中央パネル）およびエチジウムブロミド染色した全ＲＮＡ（下側パネル）を、内部対照およびローディング対照として使用した。各ブロットは、各サンプルに関する２つの独立した生物学的複製物を含む。Ｗ３＝提出されなかったさらなる事象。
【００２７】
【図８】図８は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照（ＷＴ）とともに、２つの事象（Ｗ３およびＷ８）に関する圃場生育植物の根から単離された全ＲＮＡ（２０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットを、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１、およびＶＩｎｖ転写物に特異的なプローブとハイブリダイズさせた（上側パネル）。内部対照１８ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（中央パネル）およびエチジウムブロミド染色した全ＲＮＡ（下側パネル）を、内部対照およびローディング対照として使用した。各ブロットは、各サンプルに関する２つの独立した生物学的複製物を含む。Ｗ３＝提出されなかったさらなる事象。
【００２８】
【図９】図９は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照（ＷＴ）とともに、２つの事象（Ｗ３およびＷ８）に関する圃場生育植物の花から単離された全ＲＮＡ（２０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ブロットを、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１、およびＶＩｎｖ転写物に特異的なプローブとハイブリダイズさせた（上側パネル）。内部対照１８ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（中央パネル）およびエチジウムブロミド染色した全ＲＮＡ（下側パネル）を、内部対照およびローディング対照として使用した。各ブロットは、各サンプルに関する２つの独立した生物学的複製物を含む。Ｗ３＝提出されなかったさらなる事象。
【００２９】
【図１０】図１０は、ポリフェノールオキシダーゼ活性に関する３つの異なるカテコールアッセイの結果を示す。各アッセイに関して、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照は、上にあり、変種Ｗ８は、下にある。暗褐色は、黒色斑傷減少についての形質が存在しないことを示す。図１０からわかるように、Ｗ８は、黒色斑傷減少についての形質を有するのに、対照はそれを有さない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
以下の記載及び表において、多くの用語が使用される。このような用語が与えられる範囲を含めて、本明細書及び特許請求の範囲の明らか且つ一定した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
【００３１】
対立遺伝子。対立遺伝子は、１つの形質又は特徴に関する遺伝子の１つもしくはそれより多くの代替形態のいずれかである。二倍体細胞又は生物において、所定の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【００３２】
アミノ酸配列。本明細書中で使用される場合、植物から単離されたか、植物にネイティブであるか、若しくは植物において天然に存在するか、又は、内在性対応物の核酸配列を含む以外は合成的に作製される、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質及びそれらの断片を含む。
【００３３】
人為的に操作された。本明細書中で使用される場合、「人為的に操作された」は、手で、又は機械的手段によって、又は遺伝子操作技術によるなどの組換え的手段によって、植物又は植物細胞を移動するか、配置するか、操作する（operate）か、又は制御することにより、操作されない（unmanipulated）天然に存在する対応物と比較して異なる生物学的、生化学的、形態学的、又は生理学的な表現型及び／又は遺伝子型を有する植物又は植物細胞を産生することを意味する。
【００３４】
無性繁殖。葉の切断物、幹の切断物、根の切断物、塊茎の芽、匍匐茎、単一植物細胞プロトプラスト、カルスなどから完全な植物を生成することによる子孫の産生であり、配偶子の融合を含まない。
【００３５】
骨格。移入することを企図するＤＮＡ挿入配列を除外した、バイナリーベクターの核酸配列。
【００３６】
戻し交配。戻し交配は、ブリーダーが、ハイブリッド子孫を親の一方に戻して繰り返し交配するプロセス、例えば、第１世代ハイブリッドＦ１をＦ１ハイブリッドの親遺伝子型の一方と交配するプロセスをいう。
【００３７】
細菌輪腐病。細菌輪腐病は、細菌クラビバクター・ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ）亜種によって生じる病気である。細菌輪腐病は、塊茎内の維管束輪の特徴的崩壊にその名を由来する。この輪は、しばしば、クリームイエローから明褐色の、チーズ様の腐敗として現れる。バレイショの外側表面において、重度に侵された塊茎は、わずかにくぼみ、乾燥し、割れた領域を示す。感染塊茎の維管束組織における細菌輪腐病の兆候は、上記よりも明らかでなく、崩壊した散発的に表れる暗色の線としてのみ、又は連続的な黄変色として現れる場合がある。
【００３８】
黒色斑傷。損傷した塊茎組織において見出される黒色斑は、細胞の損傷の後に産生され組織を茶色、灰色又は黒色の外観にする、メラニンと呼ばれる色素の結果である。メラニンは、細胞損傷の結果として、フェノール基質及び適切な酵素が互いに接触した際に形成される。この損傷は、細胞を壊すことを必要としない。しかし、この基質と酵素との混合は、通常、組織が衝撃を受けた（impacted）際に必ず起こる。暗色斑は、まず、維管束輪のすぐ下の辺縁組織において生じるが、皮層組織の部分を含むには十分な大きさであり得る。
【００３９】
境界様配列。「境界様」配列は、改変するために選択された植物種、又は改変するための植物種と性的に適合する植物から単離され、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の境界配列と同様に機能する。すなわち、本発明の境界様配列は、それが連結するポリヌクレオチドの組み込みを促進し且つ容易にする。本発明のＤＮＡ挿入物は、好ましくは境界様配列を含む。ＤＮＡ挿入物の境界様配列は、５〜１００ｂｐ長、１０〜８０ｂｐ長、１５〜７５ｂｐ長、１５〜６０ｂｐ長、１５〜５０ｂｐ長、１５〜４０ｂｐ長、１５〜３０ｂｐ長、１６〜３０ｂｐ長、２０〜３０ｂｐ長、２１〜３０ｂｐ長、２２〜３０ｂｐ長、２３〜３０ｂｐ長、２４〜３０ｂｐ長、２５〜３０ｂｐ長又は２６〜３０ｂｐ長の間である。ＤＮＡ挿入物の左境界配列及び右境界配列は、改変される植物のゲノムから単離され、及び／又はこれに対してネイティブである。ＤＮＡ挿入物の境界様配列は、任意の公知のアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡ境界配列に対して、ヌクレオチド配列において同一ではない。従って、ＤＮＡ挿入物の境界様配列は、アグロバクテリウム種、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に由来するＴ−ＤＮＡ境界配列とは異なる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ超のヌクレオチドを有し得る。すなわち、本発明のＤＮＡ挿入物の境界配列又は境界様配列は、アグロバクテリウム種、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネス由来のＴ−ＤＮＡ境界配列と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ挿入物の境界」および「ＤＮＡ挿入物の境界様」との記述用語は、交換可能である。境界様配列は、植物ゲノムから単離され、かつ改変されるか又は変異され得、それにより別のヌクレオチド配列内にヌクレオチド配列を組み込むことができる効率を変化させることができる。他のポリヌクレオチド配列が、本発明の境界様配列に付加されるか、又はこれの内に組み入れられてもよい。従って、ＤＮＡ挿入物の左境界又はＤＮＡ挿入物の右境界は、５’−及び３’−マルチクローニング部位又はさらなる制限部位を有するように、改変されてもよい。ＤＮＡ挿入物の境界配列は、同伴するベクターからの骨格ＤＮＡが植物ゲノム内に組み込まれない確度を高めるために改変されてもよい。
【００４０】
本質的に成る。特定の要素から「本質的に成る」組成物は、これらの要素、並びに、本発明の組成物の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素を含むことに限定される。従って、組成物が、本発明の基本的及び新規な特徴に影響を及ぼさない、すなわち、選択された植物種又は選択された植物種と性的に適合する植物由来でない外来性ＤＮＡを含まない限り、この組成物は、「本質的に成る」の語によって特徴づけられる本発明の組成物の構成要素であると考えられてもよい。
【００４１】
子葉。子葉は、種子の葉の種類である。子葉は、種子の食物保存組織を含む。
【００４２】
縮重プライマー。「縮重プライマー」は、類似であるが完全な相同性はない配列にハイブリダイズする際に塩基ミスマッチを受け入れ得る、十分なオリゴヌクレオチドバリエーションを含むオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）。胚芽が２枚の種葉（seed  leaf）又は子葉を有する、顕花植物。ｄｉｃｏｔの例としては、タバコ、トマト、バレイショ、カンショ、キャッサバ、アルファルファ及びダイズを含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、カボチャ、ヒナギク及びサボテンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ＤＮＡ挿入物。本発明に従い、植物のゲノム内に挿入されるＤＮＡ挿入物は、この植物にネイティブであるポリヌクレオチド配列を含むか、又はこの植物に対しネイティブな遺伝子エレメントを有する。１つの例において、例えば、本発明のバレイショ変種Ｗ８のｐＳＩＭ１２７８からのＤＮＡ挿入物は、バレイショ又はバレイショに性的に適合する植物であるワイルドポテトにネイティブである１０，１４８ｂｐの非コードポリヌクレオチドであり、形質転換の際に植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれて、黒色斑傷の発現、アスパラギン蓄積及び老化甘味に関与する遺伝子をサイレンシングする。ＤＮＡ挿入物は、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１カセットは、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配置して含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優性に活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１カセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターと作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から成る。第２のＤＮＡ挿入物は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットおよび植物液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖのサイレンシングカセットを含むｐＳＩＭ１６７８といわれる形質転換ベクターに由来する。上記Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、後期胴枯れ病への広い抵抗性を付与するためにそのネイティブプロモーターおよびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域から成るのに対して、上記サイレンシングカセットは、植物プロモーターであるｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐを対向させることによって隣接されるバレイショＶＩｎｖ遺伝子に由来する配列の逆方向反復から成る。これらの発現カセットは、外来性ＤＮＡを含まず、選択された植物種又は選択された植物種と性的に適合する植物のいずれかからのＤＮＡのみから成る。
【００４５】
胚芽。胚芽は、成熟種子内に含まれる未熟な植物である。
【００４６】
外来性。「外来性」は、核酸に関して、その核酸が、非植物生物に由来するか、若しくは形質転換される植物と同一の種でない植物に由来するか、又は形質転換される植物と交配可能でない植物に由来せず、標的植物の種に属さないことを意味する。本発明に従い、外来性ＤＮＡ又はＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳類、魚類又は鳥類の遺伝的性質において天然に存在するが、形質転換される植物において天然に存在しない核酸を表す。従って、外来性核酸は、例えば、形質転換植物によって天然に産生されないポリペプチドをコードするものである。外来性核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。本発明に従い、所望の遺伝子内植物は、そのゲノム内に組み込まれる外来性核酸を何ら含まないものである。
【００４７】
遺伝子。本明細書中で使用される場合、「遺伝子」は、コード領域をいい、この領域の５’−又は３’−であるヌクレオチド配列を含まない。機能的遺伝子は、プロモーター又はターミネーターに作動可能に連結したコード領域である。遺伝子は、形質転換又は種々の繁殖方法を用いて、異なる種又は同じ種のいずれかに由来の種のゲノム内に導入され得る。
【００４８】
遺伝子変換された（変換）。遺伝子変換された（変換）植物は、戻し交配と呼ばれる植物繁殖技術によって開発された植物をいい、ここで、変種の所望の形態学的及び生理学的特徴の本質的に全てが、この変種内に戻し交配技術を介して、遺伝子操作を介して、又は変異を介して移入された１つもしくはそれより多くの遺伝子に加えて、回復されている。１つもしくはそれより多くの遺伝子座もまた、移入され得る。
【００４９】
遺伝的再構成。遺伝物質の新規な構成を導入する、インビボで並びにインビトロで自発的に起こり得る、遺伝子エレメントの再集合をいう。例えば、異なる染色体遺伝子座にポリヌクレオチドを一緒にスプライシングすることは、植物発生及び性的組換え（sexual  recombination）の両方の間に、自発的にインビボで起こり得る。従って、非天然の遺伝子改変技術によるインビトロでの遺伝子エレメントの組換えは、インビボで性的組換えを通しても起こり得る組換え事象に類似する。
【００５０】
ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｏｌｄｅｎ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）。ジャガイモシストセンチュウとして一般に公知であるグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）は、バレイショ植物の根及び塊茎を冒す植物寄生性線虫である。兆候としては、貧弱な植物成長、しおれ、水ストレス及び栄養不足が挙げられる。
【００５１】
胚軸。胚軸は、子葉と根との間の、胚芽又は苗の部分である。従って、これは、苗条と根との間の遷移区域と考えられ得る。
【００５２】
インフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）。ヌクレオチドトリプレット（コドン）は、植物細胞において、所望の組換えタンパク質の初期のアミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第２の核酸にリーディングフレーム内で連結した第１核酸を企図し、ここで、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子であり、第２のヌクレオチド配列は、プロモーター又は類似の調節エレメントである。
【００５３】
組み込む。選択された植物種に由来する又は選択された植物と同じ種由来である植物に由来する又は選択された植物種と性的に適合する植物に由来する核酸配列の、選択された植物種の細胞のゲノム内への挿入をいう。「組み込み」は、ネイティブの遺伝子エレメントのみの植物細胞ゲノム内への組み入れをいう。ネイティブの遺伝子エレメントを、例えば相同組換えによって組み込むために、本発明は、このようなプロセスにおける工程として、非ネイティブのＤＮＡを「使用」し得る。従って、本発明は、特定のＤＮＡ分子の「使用」と特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノム内への「組み込み」との間を区別する。
【００５４】
導入。本明細書中で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換又は形質移入を含む方法による、細胞への核酸配列の挿入をいう。
【００５５】
単離された。「単離された」は、その通常のネイティブな環境から物理的に分離されている任意の核酸又は化合物をいう。単離された物質は、例えば、溶媒、バッファ、イオンまたは他の構成要素を含む好適な溶液中で維持されてもよく、精製された形態であっても、精製されていない形態であってもよい。
【００５６】
後期胴枯れ病。卵菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされかつバレイショ植物の葉、幹、果実、および塊茎に感染し破壊し得る「バレイショ胴枯れ病（potato  blight）」としても公知のバレイショの病気。
【００５７】
リーダー。遺伝子に先行する（すなわち５’側である）、転写されるが翻訳されない配列。
【００５８】
遺伝子座。遺伝子座は、１つもしくはそれより多くの形質、例えば、雄性不稔、除草剤耐性、昆虫抵抗性、病気抵抗性、ワキシーデンプン、改変された脂肪酸代謝、改変されたフィチン酸代謝、改変された炭水化物代謝及び改変されたタンパク質代謝などを付与する。この形質は、例えば、戻し交配、天然若しくは誘発された変異によりこの変種のゲノム内に導入された天然に存在する遺伝子、又は遺伝子形質転換技術を通して導入されたトランスジーンによって付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体位置に組み込まれた１つもしくはそれより多くの対立遺伝子を含み得る。
【００５９】
市場性のある収量（ｍａｒｋｅｔａｂｌｅ  ｙｉｅｌｄ）。市場性のある収量は、直径２〜４インチの間である収穫された全ての塊茎の重量である。市場性のある収量は、ｃｗｔ（ハンドレッドウェイト）（ｃｗｔ＝１００ポンド）で測定される。
【００６０】
単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ）。胚芽が１枚の子葉又は種葉を有する、顕花植物。ｍｏｎｏｃｏｔの例としては、ターフグラス、トウモロコシ、コメ、カラスムギ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ラン、アイリス、ユリ、タマネギ及びヤシが挙げられる。
【００６１】
ネイティブな。「ネイティブな」遺伝子エレメントは、形質転換される植物のゲノム内に天然に存在するか、これに由来するか、又はこれに属する、核酸をいう。従って、形質転換される植物又は植物種のゲノムから単離されるか、又は形質転換される植物種と性的に適合するすなわち交配可能である植物又は植物種から単離される任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの分子は、この植物種に「ネイティブ」である、すなわち、この植物種に固有である。言い換えると、ネイティブな遺伝子エレメントは、古典的植物繁殖を通した植物の改良のために、植物ブリーダーにアクセス可能である全ての遺伝子材料を表す。ネイティブな核酸の任意のバリアントはまた、本発明に従って、「ネイティブである」と考えられる。この観点で、「ネイティブな」核酸はまた、植物又はその性的に適合する種から単離されかつは改変されるかまたは変異され得、それにより結果として得られたバリアントが、植物から単離された未改変でネイティブな核酸に対して、ヌクレオチド配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％超または９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％類似している。ネイティブな核酸バリアントはまた、ヌクレオチド配列において、約６０％未満、約５５％未満、又は約５０％未満類似していてもよい。植物から単離された「ネイティブな」核酸はまた、この核酸から転写され、翻訳された、天然に生じたタンパク質産物のバリアントをコードしてもよい。従って、ネイティブな核酸はまた、核酸が単離された植物において発現される未改変且つネイティブなタンパク質に対して、アミノ酸配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％超または９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％類似しているタンパク質をコードし得る。
【００６２】
ネイティブな遺伝子エレメント。「ネイティブな遺伝子エレメント」は、本発明に従う選択された植物種ゲノム内に組み入れられて、組み込まれ得る。ネイティブな遺伝子エレメントは、選択された植物種に属する植物又は選択された植物種と性的に適合する植物から単離される。例えば、栽培されたバレイショ（ソラナム・ツベロサム）内に組み入れられたネイティブなＤＮＡは、Ｓ．ツベロサムの任意の遺伝子型に由来しても、又はＳ．ツベロサムと性的に適合するワイルドポテト種（例えば、Ｓ．デミッスム（Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ））の任意の遺伝子型に由来してもよい。
【００６３】
天然に存在する核酸。天然に存在する核酸は、選択された植物種のゲノム内で見出され、ＤＮＡ分子であっても、又はＲＮＡ分子であってもよい。通常植物種のゲノム内に存在する制限部位の配列は、制限部位がゲノムから物理的に単離されなかったとしても、外因性ＤＮＡ分子、例えばベクター又はオリゴヌクレオチド内で操作され得る。従って、本発明は、ヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識配列の合成的作製を、その配列が、形質転換される選択された植物種のゲノム又は選択された植物種と性的に適合する植物におけるゲノム内に天然に存在する限り、許容する。
【００６４】
作動可能に連結した。２つもしくはそれより多くの分子を、これらが植物細胞内で組み合わせて適切に機能する様式で組み合わせること。例えば、プロモーターは、このプロモーターが構造遺伝子の転写を制御する場合、構造遺伝子に作動可能に連結されている。
【００６５】
植物。本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、被子植物類及び裸子植物類、例えば、バレイショ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、テンサイ、キャッサバ、カンショ、ダイズ、トウモロコシ、ターフグラス、コムギ、コメ、オオムギ、ソルガム、カラスムギ、オーク、ユーカリ、クルミ及びヤシが挙げられるが、これらに限定されない。従って、植物は、ｍｏｎｏｃｏｔであってもｄｉｃｏｔであってもよい。語「植物」は、本明細書中で使用される場合、有性的に産生されたか無性的に産生されたかに拘わらず、植物細胞、種子、植物子孫（plant  progeny）、繁殖体、並びにこれらのいずれかの派生物（descendent）、例えば切断物若しくは種子をも、包含する。植物細胞としては、浮遊培養物、カルス、胚芽、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、芽胞体、花粉、種子及び小胞子が挙げられる。植物は、種々の成熟段階であり得、ポット内、温室若しくは野外で、液体若しくは固体培養において成長させられても、又は土壌において若しくは好適な培地中で、成長させられてもよい。導入されたリーダー、トレイラー又は遺伝子配列の植物における発現は、一時的であっても、恒久的であってもよい。「選択された植物種」は、これらの「植物」のいずれか１つの種であり得るが、これらに限定されない。
【００６６】
植物部分。本明細書中で使用される場合、用語「植物部分」（又はバレイショ植物若しくはその部分）としては、プロトプラスト、葉、幹、根、根端、葯、雌ずい、種子、胚芽、花粉、胚珠、子葉、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
植物種。少なくとも何らかの性的適合性を示す、種々の公的に命名された植物種に属する植物の群。
【００６８】
植物形質転換及び細胞培養。広範には、植物細胞が遺伝的に改変され、維持、さらなる成長、及び／又はさらなる発生のために、適切な植物培養培地に移されるプロセスをいう。
【００６９】
的確繁殖。核酸、例えば選択された植物種から又は選択された植物と同じ種の別の植物から又は選択された植物種と性的に適合する種から単離された、ネイティブな遺伝子及び調節エレメントの、個々の植物細胞への安定的導入、並びにその後のこれらの遺伝的に改変された植物細胞の植物全体への再生による、植物の改善をいう。未知の又は外来性の核酸が恒久的に植物ゲノム内に組み入れられないので、本発明の技術は、従来的植物繁殖を通しても利用可能である、同じ遺伝物質を用いる。
【００７０】
子孫。本明細書中で使用される場合、少なくとも一方の植物がバレイショ栽培品種Ｗ８を含む２種のバレイショ植物の交配から産生されたＦ１バレイショ植物を含み、子孫はさらに、反復親系統（recurrent  parental  line）との世代間交配であるその後のＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びＷ８を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、通常は連続的に分布している、ある程度数値的に表すことが可能である形質を、制御する遺伝子座をいう。
【００７２】
組換え体。本明細書中で使用される場合、遺伝子がクローニングされ得、ＤＮＡが配列決定され得、タンパク質産物が産生され得る、種々の技術を広範に記載する。本明細書中で使用される場合、この用語はまた、遺伝子の植物宿主系の細胞への移入後に産生されているタンパク質もまた、記載する。
【００７３】
再生。再生は、組織培養物からの植物の発生をいう。
【００７４】
調節配列。植物系において目的の遺伝子の転写又はその結果生じたＲＮＡの翻訳を増大し及び／又は最大化するために、発現ベクター内に含まれ得る、標準的且つ当業者に公知である配列をいう。これらとしては、プロモーター、ペプチド輸送シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、及び転写終結部位が挙げられるが、これらに限定されない。核酸構築物を植物における発現レベルを上げるように改変する方法もまた、全体として当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら，２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３１〜３８，１９８５；Ｃｏｒｎｅｊｏら，２３  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６７：８１，１９９３を参照されたい）。タンパク質の転写の速度に影響を及ぼすための植物系の操作において、種々の因子が当該分野で公知であり、これらとしては、正又は負に作用する配列であるエンハンサー及びサイレンサーなどの調節配列が挙げられ、並びに、クロマチン構造が、影響を有し得る。本発明は、これらの因子の少なくとも１つが、目的のタンパク質を発現するように植物を操作する際に利用され得ることを提示する。本発明の調節配列は、ネイティブな遺伝子エレメントであり、すなわち、改変されるために選択された植物種から単離される。
【００７５】
選択可能マーカー。「選択可能マーカー」は、代表的に、抗生物質、除草剤又は毒性化合物に対しある種の抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を同定するために使用される。選択可能マーカーの例としては、ストレプトマイシン抵抗性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−ホスフェートをフルクトース−６ホスフェートに変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子、カナマイシン及びゲネチシンの抵抗性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する抵抗性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ又はａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニルウレア型除草剤に対する抵抗性をコードするアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子、例えばホスフィノトリシンすなわちｂａｓｔａ（例えば、ｂａｒ遺伝子）又は、当該分野で公知の他の類似の遺伝子が挙げられる。
【００７６】
センス抑制。トランスジェニック植物における内因性遺伝子の全て又は部分の、１つもしくはそれより多くのさらなるコピーの発現による該内因性遺伝子の発現の低下。
【００７７】
比重。本明細書中で使用される場合、「比重」は、密度の表現であり、バレイショ品質の測定値である。塊茎の比重及びデンプン含量と乾燥物質の百分率又は全固体との間の高い相関性が、存在する。より高い比重は、加工製品のより高い回収率及びより良い品質に寄与する。
【００７８】
Ｔ−ＤＮＡ様。「Ｔ−ＤＮＡ様」配列は、選択された植物種から、又は選択された植物種と性的に適合する植物から単離される核酸であり、アグロバクテリウム種Ｔ−ＤＮＡと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を共有するが、１００％は共有しない。Ｔ−ＤＮＡ様配列は、各々がヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチド内に組み込むことできる、１つもしくはそれより多くの境界配列若しくは境界様配列を含み得る。
【００７９】
総収量。総収量は、全ての収穫塊茎の総重量をいう。
【００８０】
トレイラー。遺伝子に続く（すなわち３’側である）、転写されるが翻訳されない配列。
【００８１】
転写ＤＮＡ。遺伝子並びにその遺伝子に関連する非翻訳リーダー及びトレイラーの両方を含むＤＮＡであり、これは、先行するプロモーターの作用によって、単一のｍＲＮＡとして転写される。
【００８２】
植物細胞の形質転換。ＤＮＡが植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるプロセス。「安定的」は、細胞ゲノムにおける及び細胞ゲノムによる、ポリヌクレオチドの恒久的な、若しくは非一時的な、保持及び／又は発現をいう。従って、安定的に組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換した細胞ゲノム内の固定物（fixture）であり、該細胞又はその結果生じた形質転換植物の引き続く子孫によって複製されかつ増殖され得るポリヌクレオチドである。形質転換は、天然の条件下又は当該分野で周知の種々の方法を用いる人為的条件下で生じ得る。形質転換は、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞への核酸配列の挿入のための、任意の公知の方法に依存し得、その方法としては、アグロバクテリウム媒介型形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウィスカー法、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、マイクロインジェクション及び微粒子銃が挙げられる。
【００８３】
トランスジーン。タンパク質コード領域を含む宿主ゲノム内に挿入される遺伝子。本発明の文脈において、トランスジーンを含むエレメントは、宿主ゲノムから単離される。
【００８４】
トランスジェニック植物。少なくとも１つのトランスジーンを含む遺伝的に改変された植物。
【００８５】
バリアント。本明細書中で使用される場合、「バリアント」は、特定の遺伝子又はタンパク質の、標準的又は所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列から逸脱する、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味すると理解される。用語「アイソフォーム」、「イソ型」及び「アナログ」もまた、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の「バリアント」形態をいう。１つまたはそれより多くのアミノ酸の付加、除去若しくは置換、又はヌクレオチド配列の変更により改変されているアミノ酸配列は、「バリアント」配列と考えられ得る。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変更、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置き換えを有し得る。バリアントは、「非保存的」変更、例えば、グリシンのトリプトファンによる置き換えを有し得る。同様な僅かな変動はまた、アミノ酸欠失若しくは挿入、又は両方を含み得る。どのアミノ酸残基が置換され得るか、挿入され得るか、又は欠失され得るかの決定における手引きは、当該分野で周知のコンピュータープログラム、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，ＭＤ）ソフトウェアを用いて見出され得る。
【００８６】
つる熟成。つる熟成は、炭水化物を利用すること及び光合成することを続ける植物の能力をいう。つる熟成は、１〜５の段階において評点し、ここで、１＝死んだつる、及び５＝つるは緑色、未だ開花している。
【００８７】
所望の形質のバレイショ植物のゲノム内への挿入は、特に困難を示す。何故なら、バレイショは、四倍体であり、高度に異型接合であり、且つ近交弱勢に感受性であるからである。従って、従来の繁殖を用いる処理の間に、より少ないアクリルアミドを産生し、有害なメイラード反応産物がより少ない、トランスジェニックバレイショ植物を効率的に開発することは、非常に困難である。有害なメイラード反応産物としては、以下が挙げられる：Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロチラミン（Ｗａｎｇら，Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７０：１０〜５，１９９５）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラニル（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉら，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３８：８０１〜９，２０００）、及び変異誘発特性を有する他のメイラード反応産物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３０４：３５９〜７６，１９８９）。
【００８８】
プロセスの変更、デキストロースの低減、並びにアスパラギナーゼ、シトレート及び競合アミノ酸などの添加物を通してアクリルアミドを低減するために、幾つかの方法が試験されており、研究が進行中である。バレイショ産業を通したプロセス変更を実施するための所要の資本経費は、数百万ドルにも及ぶ。経費に加え、これらのプロセス変更は、添加物、例えばアスパラギナーゼ若しくはシトレートに伴う潜在的に負である風味を含む、重要な欠点を有する。代表的には、揚げ物製造者は、フレンチフライの加工の間に、所望の金褐色を発色させるためにデキストロースを加えるが、デキストロースはまた、メイラード反応を通してアクリルアミドの形成を増大する。アクリルアミドにおける有意な低減は、単に、プロセスからデキストロースを省くことによってもたらされるが、金褐色のサインは、何らかの他の方法で（例えば、アナトーなどの色素の添加を通して）発色させなければならない。代替の色素の使用は、これらの褐色化反応を通して発する代表的な風味の非存在をもたらす。アスパラギンなどの反応物を低減するための、添加物の使用による別の課題は、凍結保存の間に起こる水分移動であり、これは、表面へのアスパラギンの戻り（return）及びアクリルアミドの増大をもたらす。最後に、バレイショが傷ついたのちに起こる黒色化は、フレンチフライ及びポテトチップスの加工の際の品質並びに回収率に影響を及ぼす。損傷し傷ついたバレイショは、処理の前に削り取るか、又は取り除かれなければならず、品質の課題又は経済的損失をもたらす。
【００８９】
本発明の「ネイティブ技術」戦略は、黒色斑傷に関与するポリフェノールオキシダーゼ−５（ＰＰＯ−５）の発現、アクリルアミド形成の前駆体であるアスパラギンの蓄積に関与するアスパラギンシンセターゼ−１（Ａｓｎ−１）の発現を低減すること、スクロースをグルコース及びフルクトースへと変換する酵素液胞インベルターゼの発現、及び／又は、通常はアスパラギンなどのアミノ酸と反応してアクリルアミドを含む毒性のメイラード産物を形成する還元糖の蓄積に関連する酵素であるホスホリラーゼ−Ｌ及びキナーゼ−Ｒ１の発現を低減することによる、バレイショの農業特徴及び栄養的価値を改善するための、バレイショ産業の需要に対処する。塊茎におけるこれらの遺伝子の部分的又は完全なサイレンシングは、アクリルアミドを産生する可能性を低下させる。本発明のネイティブな技術の使用は、バレイショ植物から又はバレイショ植物と性的に適合する植物から得た遺伝物質である、非コード調節領域のみを含む「ネイティブな」遺伝物質のみによる、何ら外来性の遺伝物質を植物ゲノム内に組み込むことなくバレイショの形質転換により、市場で価値のあるバレイショ植物変種のゲノム内への所望の形質の組み入れを可能にする。所望の形質は、衝撃誘導型の黒色斑傷に対する高度な耐性、後期胴枯れ病感染に対する抵抗性の増大、アクリルアミド前駆体であるアスパラギンの形成の低減及び還元糖の蓄積の低減、及びその結果としてのアクリルアミドを含む毒性のメイラード産物の蓄積の低減、改善された品質並びに食品色調節を含む。既存のバレイショ変種へのこれらの所望の形質の組み入れは、従来型繁殖を通して達成することは不可能である。何故なら、バレイショは、四倍体であり、高度に異型接合であり、且つ近交弱勢に感受性であるからである。
【００９０】
本発明において使用される非コードバレイショ植物ＤＮＡ挿入配列は、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり、何らアグロバクテリウムＤＮＡを含まない。ＤＮＡ挿入物のうちの１つは、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１カセットは、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配置して含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優性に活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１カセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターと作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から成る。これらの発現カセットは、外来性遺伝子を含まず、選択された植物種又は選択された植物種と性的に適合する植物のいずれかからのＤＮＡのみから成る。第２のＤＮＡ挿入物は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットおよび植物液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖのサイレンシングカセットを含むｐＳＩＭ１６７８といわれる形質転換ベクターに由来する。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、後期胴枯れ病への広い抵抗性を付与するためにそのネイティブプロモーターおよびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域から成るのに対して、サイレンシングカセットは、植物プロモーターであるｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐを対向させることによって隣接されるバレイショＶＩｎｖ遺伝子に由来する配列の逆方向反復から成る。第１のカセットの機能は、後期胴枯れ病への抵抗性を付与することである一方で、第２のカセットの機能は、液胞インベルターゼ遺伝子をサイレンシングしてグルコースおよびフルクトースを低減することである。
【００９１】
本発明において使用される商業的に価値のあるバレイショ植物変種は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋである。Ｌｕｔｈｅｒ  Ｂｕｒｂａｎｋは、この品種を、１８７０年代初頭に開発した。植物は、育ちがよく、シーズンを通して連続したつるの成長を有する。幹は太く、突角を成し、細かな斑を有する。葉は、長い〜中程度の幅であり、明るい〜中程度の緑色である。花は僅かで、白色であり、不稔である。栽培品種は、痩果病（common  scab）に耐性であるが、フザリウム属及びバーティシリウム属の萎ちょう病、葉巻病及び網状壊死、バレイショウイルスＹ、並びに後期胴枯れ病に感受性である。植物は、コブ、尖頭及びアレイ状突起を有さない塊茎を産生するために、高く且つ均一な土壌水分及び制御された窒素稔性の条件を必要とする。植物がストレスに曝された際、ゼリー末端及びシュガーエンドを発生させる。産生された塊茎は、大きな褐色の皮及び白色の中身であり、良好な長期保存特徴を示し、優れたベーキング及び加工品質についての標準を表す。Ｒｕｓｓｅｔｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種は、黒色斑傷を発生し易さが高く、高い遊離のアスパラギン含量及び高い老化甘味能力を有する（Ａｍ．Ｊ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｒｅｓ（１９６６）４３：３０５〜３１４）。この変種は、稔性であり、特にフレンチフライの生産のために、北西部及び中西部において広く育てられている。
【００９２】
本発明は、形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８によって形質転換され、続いて第二の形質転換ベクターｐＳＩＭ１６７８で形質転換が行われ、マーカーよりもむしろポリメラーゼ連鎖反応を用いて同定され、そして首尾よく増殖されている、顕著な市場価値を有するバレイショ変種、すなわちＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋを、提供する。また、本発明のバレイショ植物変種Ｗ８の塊茎から製造された食物製品が、提供される。バレイショ栽培品種Ｗ８は、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）により、以下の独特の植物変種識別子を有する：ＳＰＳ−φφφＷ８−４。
【００９３】
ネイティブＤＮＡでサイレンシングする標的化された遺伝子は、バレイショ植物変種Ｗ８の塊茎において標的化された遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを低下させる。バレイショ栽培品種Ｗ８は、複数の機構によって塊茎における還元糖のレベルを低下させる発現カセットを含む。ｐＳＩＭ１２７８での形質転換を通じて、サイレンシングカセットを、デンプン関連遺伝子（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターのために導入した一方で、ｐＳＩＭ１６７８での形質転換は、インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ；  Ｙｅら，  ２０１０）のサイレンシングカセットを導入した。一緒になると、これら形質は、デンプンおよびスクロースを還元糖（グルコースおよびフルクトース）へと変換するのを遅らせることによって機能する。
【００９４】
従って、本発明のバレイショ植物変種Ｗ８の塊茎は、揚げるか又は焼く際のアクリルアミド形成の低下に関連する、遊離のアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンにおける比の低下を含む、非常に望ましい形質を組み入れる。具体的には、本発明のバレイショ変種Ｗ８は、遊離アスパラギン含量の２分の１〜４分の１を下回るまでの低下、黒色斑傷に関連する変色の低減及び後期胴枯れ病に対する抵抗性の増大によって特徴づけられる。さらに、本発明のバレイショ変種Ｗ８は、保存の間の、デンプンの還元糖であるグルコース及びフルクトースへの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換の不全は、老化甘味及びアクリルアミド形成をさらに低下させ、熱誘導型褐色化を制限する。
【００９５】
本発明のバレイショ変種Ｗ８は、従って、その塊茎が加熱処理の際に有意に少ないアクリルアミドしか産生せず、潜在的に有害な外来性遺伝子を何ら有さないので、バレイショ産業及び食物市場において非常に価値が高い。
【実施例】
【００９６】
本発明は、ネイティブ技術を使用して、ネイティブな非コードＤＮＡを選択されたバレイショ植物変種のゲノム内に組み込み、新規な遺伝子内バレイショ植物変種を開発する。本方法は、形質同定、ベクターの設計、ベクターのアグロバクテリウム内への組み入れ、レシピエントバレイショ変種の選択、植物形質転換、オープンリーディングフレームの非存在の証明、及び新規なバレイショ変種がネイティブなＤＮＡのみを含むことの確認を含む。本発明のバレイショ栽培品種Ｗ８は、非形質転換対応物よりも、アクリルアミドを形成する潜在能がより低く、スクロースの量が低く、黒色斑傷に対してより抵抗性である。さらに、本発明のバレイショ栽培品種Ｗ８は、後期胴枯れ病に対する抵抗性が増大している。
【００９７】
実施例１．ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター
本発明において使用される形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８は、ｐＳＩＭ１０６に由来し、これを、０．４−ｋｂバレイショ植物ＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５６６５５５として寄託される）を、プラスミドｐＶＳ１及びｐＢＲ３２２由来の細菌の複製起点並びにカナマイシンに対する細菌抵抗性のためのｎｐｔＩＩＩ遺伝子を有するｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の５．９−ｋｂ  ＳａｃＩＩ−ＳｐｈＩ断片に連結することによって作製した。Ｕｂｉ−３プロモーター（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｂｅｌｋｎａｐ，１９９４）が先行するアグロバクテリウムｉｐｔ遺伝子及びそれに続くＵｂｉ−３ターミネーターを含む発現カセットを、ベクター骨格内に、２．６−ｋｂ  ＳａｃＩＩ断片として導入した（Ｒｏｍｍｅｎｓら，２００４）。２つのサイレンシングカセットを有するネイティブな１０−ｋｂ  ＤＮＡセグメントのｐＳＩＭ１０６のＤＮＡ挿入物への挿入は、ｐＳＩＭ１２７８を生じた。このベクターを、全ての形質転換に用いた。ｐＳＩＭ１２７８ベクターマップを、図１に示す。ベクター骨格領域は、９，５１２ｂｐであり、１０，１４９ｂｐの位置にて開始し、１９，６６０ｂｐの位置にて終わる。骨格ＤＮＡは、主に、細菌ＤＮＡから成り、植物形質転換の前のＤＮＡ挿入物の維持の支持を提供する。骨格部分は、植物細胞内に形質移入されない。骨格の種々のエレメントを、表１に記載する。ｐＣＡＭＢＩＡベクターの一般的構造マップは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｄａｉｓｙ／ｃａｍｂｉａ／５８５．ｈｔｍｌにおいて見出され得る。
【表１】
2017518061.tif 000003
【００９８】
実施例２．ｐＳＩＭ１２７８植物ＤＮＡ挿入物およびそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物領域（ｐＳＩＭ１２７８において使用される隣接境界配列を含む）は、１０，１４８ｂｐの長さ（１ｂｐから１０，１４８ｂｐまで）である。ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物は、ネイティブＤＮＡのみから成り、バレイショゲノムへと安定的に組み込まれる。上記ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物もしくはその機能的部分は、本発明のバレイショ植物変種の中に組み込まれるベクターｐＳＩＭ１２７８の唯一の遺伝物質である。上記ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物は、図２および以下の表２に記載される。上記ＬＢおよびＲＢ配列（各々２５ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに由来するＴ−ＤＮＡ境界に類似でありそのように機能するように合成して設計した。ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ５６６５５５を、境界領域のＤＮＡの供給源を明らかにするために改定した。遺伝子エレメント５および１０と記載されるＡＳＮ１は、Ｃｈａｗｌａら，  ２０１２においてＳｔＡｓｔ１といわれる。
【表２−１】
2017518061.tif 000004
【表２−２】
2017518061.tif 000005
【００９９】
本発明のバレイショ系統Ｗ８を作製するために使用される表２に記載のＤＮＡ挿入物は、隣接する遺伝子を活性化せず、バレイショ植物変種Ｗ８の表現型に有害な影響を及ぼさない。加えて、本発明のバレイショ植物変種Ｗ８は、ＤＮＡ挿入物によってコードされるオープンリーディングフレームに関連する新規なタンパク質を産生しない。
【０１００】
実施例３．ｐＳＩＭ１６７８  形質転換ベクター
本発明において使用される形質転換ベクターｐＳＩＭ１６７８を、実施例１においてｐＳＩＭ１２７８に関して記載される同じ方法を使用して形質転換した。ｐＳＩＭ１６７８ベクターマップは、図３に示される。ベクター骨格領域は、９，０９１ｂｐの位置において始まり、１８，６０２ｂｐの位置において終わるので、９，５１２ｂｐである。骨格ＤＮＡは、細菌性ＤＮＡから主に成り、植物形質転換の前に、ＤＮＡ挿入物の維持の支持を提供する。骨格部分は、植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントは、表１に記載される。表１に示される番号付けシステムは、ｐＳＩＭ１２７８に基づくが、骨格配列は、ｐＳＩＭ１６７８に関して同一である。
【０１０１】
実施例４．ｐＳＩＭ１６７８植物ＤＮＡ挿入物およびそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入物領域（隣接境界配列を含み、ｐＳＩＭ１６７８において使用される）は、９，０９０ｂｐの長さ（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）である。ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入物は、ネイティブＤＮＡのみから成り、バレイショゲノムへと安定的に組み込まれる。ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入物もしくはその機能的部分は、本発明のバレイショ植物変種の中に組み込まれるベクターｐＳＩＭ１６７８の唯一の遺伝物質である。ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入物は、図３および以下の表３に記載される。表３において、ＬＢおよびＲＢ配列（各２５ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに由来するＴ−ＤＮＡ境界に類似しそのように機能するように合成して設計した。ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ５６６５５５を、境界領域に関するＤＮＡの供給源を明らかにするために改訂した。
【表３】
2017518061.tif 000006
【０１０２】
実施例５．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびトランスフェクション
Ｃ５８由来Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ１を、高毒性プラスミドｐＴｉＢｏ５４２のトランスファーＤＮＡを正確に欠失させることによって開発した（Ｌａｚｏら  １９９１）。形質転換した植物を、抗生物質チメンチン（これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生存を防止し、従って、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが存在しない植物を選択する）を含む培地上で生育させた。選択の後、植物は、抗生物質およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをともに含まず、バレイショ由来発現カセットが植物ゲノムの中に挿入されている。
【０１０３】
ストック植物を、３％  スクロースおよび２ｇ／ｌ  ゲルザン（ｇｅｌｚａｎ）を含む４０ｍｌの１／２に希釈された（ｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）Ｍ５１６（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地（増殖培地）を有するマジェンタボックスの中で維持した。４〜６ｍｍのバレイショ節間セグメントを、４週齢の植物から切り出し、ｐＳＩＭ１２７８を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＡＧＬ１株に感染させ、３％  スクロースおよび２ｇ／ｌ  ゲルザンを含む組織培養培地（共培養培地）に移した。感染した外植片を、２日後に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去するために３％  スクロース、２ｇ／ｌ  ゲルザン、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび１．２ｍｌ  植物保護培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むＭ４０４（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地（ホルモン非含有培地）へと移した。植物がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ非含有であるという証拠を、形質転換事象の幹および／もしくは葉の断片を、ニュートリエントブロス−酵母抽出物（ＮＢＹ培地）上で２週間にわたって２８℃においてインキュベートし（２回反復）、増生がなかったことによって得た。形質転換した植物を輸送し、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがない場合にのみ圃場に植えた。上記方法の詳細は、他の箇所に記載される（Ｒｉｃｈａｅｌら  ２００８）。
【０１０４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、右側境界（ＲＢ）部位での切断において有効であるが、それはしばしば、ＤＮＡ挿入物を、左側境界（ＬＢ）部位での切断によっても、そのプラスミドベクターから十分に放出し損なう（Ｇｅｌｖｉｎ  ２００３）。結論として、いくつかの感染した植物細胞が、ＤＮＡ挿入物自体を、ならびに骨格マーカー遺伝子、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｙｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ｉｐｔ）を含むさらなるプラスミド骨格配列を、植物ホルモンであるサイトカイニン（これは、植物における生育および発生プロセスを一般に調節する）のために受容した。過剰発現は、矮化表現型、異常な葉、もしくはサイトカイニン過剰生成に起因して発根の不能を生じ、これらを、骨格ＤＮＡを含む植物に対して選択するために使用した（Ｒｉｃｈａｅｌら  ２００８）。２週間毎に、感染した外植片を、いかなる合成ホルモンも欠いている新しい培地に移し、２４℃において１６時間の光周期の下で、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバ中でインキュベートすると、これらが苗条を形成し始めた。多くの苗条は、ｉｐｔ遺伝子を発現し、サイトカイニン過剰発現表現型を示した；これら苗条を廃棄し、さらなる分析には考慮しなかった。ＰＣＲ遺伝子型決定によって、残っている苗条のうちの約０．３〜１．５％は、ＤＮＡ挿入物のうちの少なくとも一部を含むと同時に、ｉｐｔ遺伝子を欠いていることが実証された。
【０１０５】
上記Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｗ８事象は、異なるプラスミドによる２つの別個の形質転換に由来する挿入物を含む。第１の挿入物であるプラスミドｐＳＩＭ１２７８は、塊茎において、最大４種のバレイショ遺伝子Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、Ｒ１、およびＰｈＬをサイレンシングするように設計された逆方向反復から成る２つのカセットを含む。同様に、第２のプラスミドであるｐＳＩＭ１６７８は、塊茎においてＶＩｎｖ遺伝子をサイレンシングするための逆方向反復から成ると同時に、そのネイティブバレイショプロモーターの下でＲｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子のコピーをも含むカセットを含む。
【０１０６】
事象Ｗ８を生成するためのｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８によるＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋの形質転換と関連した上記挿入物の遺伝的および構造的性質決定は、両方の形質転換が、各プラスミドのための単一の組み込み部位を生じることを示した。ｐＳＩＭ１２７８の形質転換に由来するＤＮＡの構造は、元の挿入物の構造に対して複雑であった。挿入されたＤＮＡは、形質転換の間に再構成を受けたようであり、Ａｓｎ１／Ｐｐｏ５サイレンシングカセットのタンデムリピート、続いて、ほぼ完全なｐＳＩＭ１２７８構築物、ならびにｐＲ１／ｐＰｈｌサイレンシングカセットの複製物を含む逆方向反復およびＧｂｓｓプロモーターと介在Ｐｈｌ配列とのタンデム複製物から成る構造を生じる。
【０１０７】
この構造は予期されているより複雑であるが、この複製されたサイレンシングカセットはインタクトであり、組織特異的プロモーターの制御下にあるままである。上記構造は、上記生成物の安全性もしくは形質効力（trait  efficacy）に負の影響を与えない。
【０１０８】
Ｗ８はまた、組み込みの単一遺伝子座にあるｐＳＩＭ１６７８に由来するＤＮＡの単一コピーを含む。ｐＳＩＭ１６７８のＤＮＡ挿入物は、Ｔ−ＤＮＡ左側境界全体およびＲｐｉ−ｖｎｔ１プロモーターのうちの１３７ｂｐを除去する３３０ｂｐ欠失を有するほぼインタクトなＤＮＡ挿入物を含む。上記プロモーターにおけるこの小さな欠失は、上記遺伝子が後期胴枯れ病抵抗性を付与する能力に影響を与えない。また、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子と関連するＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して実証した。
【０１０９】
実施例６．ベクター骨格ＤＮＡの非存在の証拠
以下の方法を使用して、プラスミドの骨格部分が、商業的目的で開発された事象に存在しないことを確立した：１）植物がプラスミ骨格中の陰性選択可能イソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子と関連する表現型を有する場合、それらを廃棄した；２）骨格ＤＮＡの非存在を、サザンブロットハイブリダイゼーションで確認した；３）ＰＣＲを使用して、上記骨格ＤＮＡの断片が存在しないことを確認した。まとめると、サザンブロットおよびＰＣＲ分析は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｗ８事象が形質転換において使用されるいずれのプラスミドに由来する骨格をも含まないことを示した。
【０１１０】
実施例７．挿入されたＤＮＡの安定性
細菌性Ｔ−ＤＮＡは、植物への挿入後に、常に安定なわけではない。予期される不安定率（０．５〜５．９×１０−４）は、減数分裂と関連し（Ｍｕｅｌｌｅｒら  １９８７；  Ｃｏｎｎｅｒら  １９９８）、これはバレイショに関連しない。なぜならバレイショは、植物性に再生するからである。従って、ＤＮＡ挿入物は、安定であると予期される。種子よりむしろ塊茎を使用して、その後の世代を定義した。なぜなら商業的に植えられるものは塊茎であるからである。
【０１１１】
遺伝的安定性を、分子アッセイおよび表現型アッセイの両方を使用して評価した。挿入物の構造は、Ｗ８バレイショの３世代（Ｇ０〜Ｇ３）にわたって単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を使用して安定であると示されたのに対して、表現型安定性は、圃場生育塊茎の第２世代において、ポリフェノールオキシダーゼ活性を測定することによって評価した。この方法は、バレイショの切断表面にカテコールを適用した後にＰＰＯサイレンシングの視覚的証拠を示す。これら研究を実行して、Ｗ８における望ましい遺伝的変化が上記形質を維持しながら複数のクローンサイクルにわたって安定なままであることを確保した。
【０１１２】
ＤＮＡ挿入物の安定性を、サザンブロットを使用して、３連続のクローン世代（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）を元の形質転換体（Ｇ０）に対して比較することによって評価した。安定なＤＮＡ挿入物は、同じ構造を維持し、従って、上記植物の複数の世代にわたって同じ消化パターンを生じると予期される。Ｗ８事象における挿入物の安定性を試験するために、その消化パターンを、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８両方に由来する挿入物の領域にハイブリダイズする２つのプローブ（ＧＢＳ１およびＡＧＰ）、ならびにｐＳＩＭ１６７８挿入物に特異的な２つのプローブ（ＩＮＶおよびＶＮＴ１）を使用して比較した。これらプローブがハイブリダイズする上記ＤＮＡ配列は、バレイショゲノムの中に、ならびに、上記ＤＮＡ挿入物（複数可）内に含まれるので、内因性バンドおよび挿入物特異的バンドの両方がサザンブロットにおいて予期される。
【０１１３】
全てのゲノムＤＮＡサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、ＡＧＰもしくはＧＢＳ１のいずれかに特異的なプローブとハイブリダイズさせた。ＥｃｏＲＶを、これら研究のために選択した。なぜならそれは、両方の挿入物内で消化して、ｐＳＩＭ１２７８挿入物において推定されるサイズ（例えば、２．３ｋｂ）の内部バンドを伴う特有のバンド形成パターンを提供するからである。Ｗ８の全てのサンプル間のバンド形成パターンは、両方のプローブに関して互いに同一であった。Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照に存在する複数のバンドは、Ｗ８においても見出されるが、Ｗ８は、ｐＳＩＭ１２７８挿入物およびｐＳＩＭ１６７８挿入物に相当するバンドも含む。これらバンドは、分析されるＷ８の全世代の間で同様に一貫しており、このことは、両方の挿入物の遺伝的安定性を示す。
【０１１４】
第２の分析を、ｐＳＩＭ１６７８挿入物に特異的な２つのプローブを使用して行った。この分析のために、ゲノムＤＮＡサンプルを、制限酵素ＸｂａＩで消化し、ＶＮＴ１プローブおよびＩＮＶプローブとハイブリダイズさせた。ＸｂａＩを、これらの研究のための制限酵素として選択した。なぜならそれはｐＳＩＭ１６７８を内部で消化し、既知のサイズ（例えば、ＩＮＶプローブについては４．６ｋｂ）のバンドを生じるからである。繰り返すと、内因性バンドおよび挿入物特異的バンドの両方を、分析した３世代の間で一貫したバンド形成パターンとともに検出した。遺伝的分析および表現型分析は、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の両方の形質転換から生じる挿入が、３世代にわたって安定であることを示した。３世代にわたって実証された安定性を考慮すれば、安定性は、栄養繁殖のその後のサイクルの間で維持される可能性がある。
【０１１５】
実施例８．遺伝子サイレンシングの効力および組織特異性
サイレンシングを、サイレンシングのために標的化された遺伝子およびプロモーターに由来する配列を含む逆方向反復を導入することによって達成した。２本鎖ＲＮＡ媒介型サイレンシングに関与する多くの並行経路が存在するものの、これら逆方向反復の転写は、ウイルス防御に関与する細胞機構によってプロセシングされると考えられる（Ｆｕｓａｒｏら  ２００６）。Ｗ８バレイショは、３つの特有のカセットを含み、この３つのカセットは、合計５つの異なるバレイショ遺伝子に由来する配列を含む。ｐＳＩＭ１２７８構築物は、２つの遺伝子サイレンシングカセットから成る（図４、上の構築物を参照のこと）。１つのカセットは、２つの遺伝子、アスパラギンシンセターゼ−１（Ａｓｎ１）およびポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）に由来する配列の逆方向反復を含む。第２のカセットは、デンプン関連遺伝子Ｒ１（５３１ｂｐ）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）（５０８ｂｐ）のプロモーターに由来する配列を含む。最後のカセットは、ｐＳＩＭ１６７８構築物を通じて導入された。この構築物は、液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）遺伝子に由来する配列を含む逆方向反復を含む（図４、下の構築物を参照のこと）。
【０１１６】
３つ全てのサイレンシングカセットは、光合成活性組織および根と比較して、塊茎において非常に活性であるバレイショのＡｇｐ遺伝子およびＧｂｓｓ遺伝子に由来する、十分に性質決定されかつ組織特異的なプロモーターの同じセットによって調節される（Ｎａｋａｔａら  １９９４；  Ｖｉｓｓｅｒら  １９９１）。従って、発現および遺伝子サイレンシングは、塊茎において最も有効であり、塊茎に主に限定されると予期された。
【０１１７】
５つ全ての標的遺伝子の発現を、ノーザンブロット分析によって性質決定して、各カセットからの遺伝子サイレンシングの有効性を決定した。Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、およびＶＩｎｖのロバストなサイレンシングを、塊茎において観察した一方で、Ｒ１のサイレンシングは余り有効ではなかった（図５）。ＰｈＬのサイレンシングは、対照とＷ８サンプルとの間の測定可能な差異が観察されなかったので、無効と考えられた。同じｐＳＩＭ１２７８構築物での他の事象において、塊茎におけるＰｈＬおよびＲ１のプロモーターの部分的サイレンシングが観察された（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ  ２０１３）。
【０１１８】
以前の研究は、Ｐｐｏ遺伝子サイレンシングが、関連タンパク質の量をウェスタンブロット分析によって検出不能なレベルへと低下させることを示した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅら  ２０１１）。同様に、Ｒ１遺伝子のサイレンシングが、デンプン顆粒に少なくとも部分的に結合される約１６０ｋＤａタンパク質の蓄積を減少させた（Ｌｏｒｂｅｒｔｈら  １９９８）。
【０１１９】
標的遺伝子発現を、他の植物組織において評価して、遺伝子サイレンシングの特異性を決定した。Ｗ８およびＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照の葉、幹、根、および花から単離されたＲＮＡに対して同様にノーザンブロット分析を行った。図６、図７および図８に示されるように、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と比較して葉、幹、もしくは根において標的遺伝子のサイレンシングは存在しなかった。全ての転写物は、ＶＩｎｖ遺伝子（これは、全ての葉および幹のサンプル（対照を含む）において弱く発現された）に相当するものを除いて、容易に検出可能であった。
【０１２０】
いくつかの標的サイレンシングが観察される塊茎以外の唯一の組織は、花のサンプル中にあった。これらサンプルは、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と比較してＷ８においてＡｓｎ１転写物のいくらかのサイレンシングを示した。これは、その組織においていくらかの発現の漏れ（ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に起因し得る（図９）。
【０１２１】
Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋへと導入してＷ８事象を生成した３つの遺伝子サイレンシングカセットのうちの２つは、ＲＮＡｉ媒介型サイレンシングのためにそれらの標的転写物をサイレンシングするのに非常に有効であった。これら２つの構築物は、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、およびＶＩｎｖをＷ８の塊茎において効率的にサイレンシングした。塊茎へのサイレンシングの特異性は、ＲＮＡｉ機構によって生成されるｓｉＲＮＡのいくつか（あるとすれば）が他の組織に拡がったかまたはそれらのレベルがそれら組織におけるＲＮＡｉ応答を引き起こすためには不十分であったことを示す。塊茎以外でのサイレンシングの唯一の証拠は、Ａｓｎ１のより低いレベルが観察された花にあったが、変化の大きさは、塊茎におけるより遙かに低かった。ＰｈＬおよびＲ１でのプロモーターサイレンシングストラテジーは、最小限の効果を有した。このことは、同じｐＳＩＭ１２７８構築物を含む他の事象と一致した（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ  ２０１３）。
【０１２２】
予期されるように、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、およびＶＩｎｖと関連したＲＮＡ転写物の低下した発現は、さらに裏付けられた。さらに、組成データおよび農業データは、有意なオフターゲット効果もしくは意図しないサイレンシングと関連するいかなる予測外の表現型も明らかにしなかった。例えば、塊茎におけるＡｓｎ１の強いサイレンシングは、アミノ酸アスパラギンの蓄積を制限するのに対して、葉もしくは幹におけるＡｓｎ１のサイレンシングは、生育および発生に有害に作用し得るが、これはそうではなかった。従って、ＲＮＡｉ応答は、有効かつ特異的であり、これらバレイショ遺伝子のサイレンシングが雑草性もしくは他の植物病虫害特徴に影響を及ぼすという徴候はない。
【０１２３】
実施例９．バレイショ栽培品種Ｗ８性質決定のまとめ
バレイショ変種Ｗ８は、後期胴枯れ病に対する抵抗性を増大させること、黒色斑傷に関与する酵素の発現を低減させること、及び反応物、すなわちアスパラギン及び還元糖の濃度を低下させることを通してアクリルアミドを低減することによる、品質を改善する、バレイショ産業のニーズに対処する。バレイショ変種Ｗ８を、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり外来性ＤＮＡ、アグロバクテリウムＤＮＡ、ウイルスマーカー又はベクター骨格配列を含まない核酸配列によって形質転換した。加えて、農業研究を行い、本形質に関連する特徴を除いて従来対照と同じく生育した事象を確保した。
【０１２４】
農業特徴
農業試験を行って、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種Ｗ８が、米国においてバレイショ生産の主要な地域を代表する複数の場所で生育させた場合に、対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋと比較して等価な表現型を有することを確認した。２０１２年および２０１３年に生育させたＷ８および対照の農業特徴、収量および等級特徴の評価のまとめは、表４および表５に示される。全体的に、結果は、これら特徴に関して、Ｗ８と対照との間に大きな差異はないことを確認する。以下の表４および表５において、第１列は、特徴を示し、第２列は、変種を示し、第３列は、試験した植物の数を示し、第４列は、特徴に関するＬＳ平均値を示し、第５列は、ｐ値を示し（太字および下線は、統計的有意差を示す）、第６列は、標準偏差（ＳＤ）を示し、第７列は、９０％信頼区間（ＣＩ）を示し、第８列は、従来変種の平均値の範囲（ＣＶＲ）を示す。表５において、揚げた塊茎細切り片の色を、ＵＳＤＡ  Ｍｕｎｓｅｌｌカラーチャートと比較した。ハイシュガー（high  sugar）は、フレンチフライ（french  fried  potato）のＭｕｎｓｅｌｌカラーチャートと比較した場合に、最も濃い側面において、３番もしくはこれより濃い基調色（predominate  color）を有する揚げ物細切り片（fry  strip）を伴う塊茎のパーセンテージである。シュガーエンド（sugar  ends）は、３番もしくはより濃い色を試験して、揚げ物細切り片の全幅に関して該細切り片の最も濃い側面において１/４インチ長もしくはこれより長い末端を有する該細切り片を伴う塊茎のパーセンテージである（ＵＳＤＡ  ＡＭＳ  １９６９）。揚げ物０〜揚げ物４は、最も濃い側面の基調色が、フレンチフライのＭｕｎｓｅｌｌカラーチャートと比較した場合に、それぞれ、０〜４の色読み取りであると決定される揚げ物細切り片を伴う塊茎のパーセントである。従って、報告された数字は、Ｍｕｎｓｅｌｌチャートで０、１、２、３、もしくは４のスコアになる揚げ物のパーセンテージである。低くなるほど色はより良好、０が最良である。
【表４】
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【表５】
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【０１２５】
バレイショ栽培品種Ｗ８についての表４および５に提示されたデータに基づき、非形質転換Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種とバレイショ栽培品種Ｗ８との間に、早期出現％およびシュガーエンド％を除いて、農業特徴、収量及び等級、並びに生態学的相互作用において、全体として主要な相違はないと結論した。従って、複数年データに基づき、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種Ｗ８は、雑草性又は病虫害の潜在性の結果として、環境における残留性の有意な危険はない。
【０１２６】
後期胴枯れ病抵抗性
多くのバレイショ栽培品種は、後期胴枯れ病（真菌様卵菌病原体Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされる壊滅的な病気）に罹りやすい。バレイショの後期胴枯れ病は、急速に拡大し得かつ壊死し得る葉および幹上の黒色／褐色病変によって同定される。ひどい後期胴枯れ病の流行は、Ｐ．  ｉｎｆｅｓｔａｎｓが増殖し、宿主作物で急速に再生する場合に起こる。
【０１２７】
Ｒｐｉ−ｖｎｔ１として公知のバレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子を、Ｗ８に付加したところ、成功裡に後期胴枯れ病抵抗性が付与された。後期胴枯れ病抵抗性の効力を実証するために、研究を、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種Ｗ８および対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋの葉および塊茎の両方に接種することによって行った。
【０１２８】
試験期間の終わりに、各場所からの評価を取得し、以下の表６および７にまとめる。バレイショ後期胴枯れ病への葉の抵抗性の結果を、表６に示す。各株のサイトは、その地域で見出される株に依存して、ＵＳ−８、ＵＳ−２２もしくはＵＳ−２３を含む異なる株接種物を有した。表６、第１列は、変種を示し、第２列は、ＬＳ平均％葉後期胴枯れ病感染を示し、第３列は、ｐ値（ここでＷ８と対照との間の有意差は、太字および下線が付されている）を示し、第４列は、従来変種範囲（これは、従来変種の平均値の範囲である）を示す。
【表６】
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【０１２９】
表６で示されるように、％葉後期胴枯れ病感染の有意な低下は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と比較して、Ｗ８について検出された。このことは、バレイショ後期胴枯れ病抵抗性遺伝子がＷ８において後期胴枯れ病への抵抗性を付与し、葉において有効であるという結論を支持する。
【０１３０】
以下の表７は、％感染によって決定される場合、Ｗ８および対照の塊茎後期胴枯れ病感染率の結果を示す。表７、第１列は、後期胴枯れ病分離菌を示し、第２列は、変種を示し、第３列は、平均％後期胴枯れ病塊茎感染を示し、第４列は、Ｐ値（ここでＷ８と対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋとの間の有意差は、太字および下線を付している）を示す。
【表７】
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【０１３１】
表７で示されるように、塊茎における％後期胴枯れ病感染の有意な低下は、ＵＳ−２２分離菌およびＵＳ−８分離菌の両方について対照と比較して、Ｗ８について検出された。
【０１３２】
黒色斑傷耐性
黒色斑傷は、損傷した塊茎に影響を与える変色であり、バレイショ産業における最も重要な品質問題の１つを表す。この状態は、損傷したプラスチドから細胞質へのポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）の漏出の結果である。細胞質において、その酵素がポリフェノールを酸化し、次いで暗色の沈殿物を形成する。ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物の２つのサイレンシングカセットのうちの１つは、ソラナム・ベルコサム由来の２コピーのＰｐｏ５遺伝子の断片を、調節エレメントの間に逆向き反復として配置した。この逆向き反復の発現は、バレイショＰｐｏ５遺伝子のサイレンシングを誘発して、黒色斑傷の出現を有意に低減する。
【０１３３】
バレイショ栽培品種Ｗ８及び黒色斑傷に感受性である対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種の塊茎を、黒色斑傷耐性について、２つの方法でアッセイした。
【０１３４】
塊茎変色は、カテコールを含むフェノール類を酸化し、迅速に重合体化して色素を生じる化合物を生成する、ポリフェノールオキシダーゼの活性によって起こる。黒色斑傷耐性について試験する間接的な方法は、１ｍｌのカテコール（２５ｍＭ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ中、ｐＨ６．５）を塊茎の切断表面上にピペットで置き、暗褐色沈殿物のＰｐｏ依存型発生をモニタリングすることに基づく。暗褐色沈殿物のＰｐｏ依存型発生を、２０分間後に評価した。バレイショ栽培品種Ｗ８についてのカテコールアッセイの結果を、図１０に示す。図１０に示されるように、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照は、暗褐色に変色して黒色斑傷を示した。他方で、バレイショ栽培品種Ｗ８は、暗褐色に変色せず、このことは、Ｗ８が、非形質転換Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照よりも黒色斑傷に対し抵抗性であることを示し、低減した黒色斑形質の効力を支持する。
【０１３５】
傷耐性についてアッセイするための第２の方法は、ＰＰＯ活性を酵素アッセイで測定することによるものであった。ドーパクロムへのＬ−ＤＯＰＡの変換を、Α４７４ｎｍ・ΔＡ４７４ｎｍ・分−１を測定することによって経時的にモニターし、これをμｍｏｌ・分−１・ｍｇ  ｄｗ塊茎−１の単位へと変換した。表８に示されるように、酵素アッセイは、Ｗ８がＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と比較した場合に、ＰＰＯ活性において９０％減少を有することを示す（０．０２５  μｍｏｌ・分−１・ｍｇ  ｄｗ  塊茎−１）。Ｗ８塊茎において低下した活性は、Ｐｐｏ５遺伝子のサイレンシングを通じて低下した黒色斑と関連した。
【表８】
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【０１３６】
アスパラギンおよびアクリルアミドレベル
バレイショ栽培品種Ｗ８の塊茎は、より少ない遊離アスパラギンを含んだが、表９に示されるように、収穫時では、対照よりも多くのアスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸を含んだ。Ｗ８に関する遊離アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸の平均値は、全て許容区間（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）内であり、文献の範囲を併せ持ち、従って、バレイショの正常範囲内と考えられた。表９、第１列は、ｍｇ／１００ｇでアミノ酸を示し、第２列は、変種を示し、第３列は、ＬＳ平均を示し、第４列は、Ｐ値を示し（ここでＷ８と対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋとの間の有意差は、太字および下線を付している）、第５列は、試験した植物数を示し、第６列は、範囲を示し、第７列は、許容区間の範囲（ＴＩ）を示し、第８列は、Ｄａｖｉｅｓ  （１９７７）、Ｓｈｅｐｈｅｒｄら  （２０１０）およびＬｉｓｉｎｓｋａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  （１９８９）から採用された、合わされた文献範囲（ＣＬＲ）を示す。
【表９】
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【０１３７】
低下したアスパラギン、フルクトースおよびグルコースレベルは、それらがアクリルアミドの形成における反応物であることから、加工バレイショ製品中のアクリルアミドの全体的な低減をもたらす。アクリルアミドを低減するという効力を実証するために、Ｗ８および対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋの圃場生育塊茎を、収穫時に、ならびに通常貯蔵温度（４６°Ｆ）および低温貯蔵温度（３８°Ｆ）での３ヶ月間、６ヶ月間および９ヶ月間の貯蔵後に分析した。その結果を、表１０および表１１に示す。アクリルアミドについて試験する前に、Ｗ８および対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋを、フレンチフライにした。表１０は、収穫時および４６°Ｆでの貯蔵後のフレンチフライアクリルアミドレベルをパートパービリオン（ｐｐｂ）で示す。表１１は、収穫時および３８°Ｆでの貯蔵後のフレンチフライアクリルアミドレベルをパートパービリオン（ｐｐｂ）で示す。表１０および表１１、第１列は、試験を行ったときのタイミングを示し、第２列は、化合物を示し、第３列は、変種を示し、第４列は、ＬＳ平均アクリルアミドレベルをｐｐｂで示し、第５列は、Ｐ値（ここでＷ８と対照との間の有意差は、太字および下線を付される）を示し、第６列は、同じ貯蔵時間での対照と比較したアクリルアミドの％低下を示し、第７列は、試験した塊茎の数を示し、第８列は、アクリルアミドの範囲をｐｐｂで示し、第９列は、許容区間（ＴＩ）を示す。
【表１０】
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【表１１】
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【０１３８】
表１０に示されるように、収穫時点では、Ｗ８塊茎で作ったフレンチフライは、対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋより８５％低いアクリルアミドを含んだ。バレイショを４６°Ｆで９ヶ月間ずっと貯蔵した場合、Ｗ８におけるアクリルアミドレベルは、対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋより７８％〜８３．７％低かった。表１１に示されるように、３８°Ｆで６〜９ヶ月間貯蔵した後のＷ８フレンチフライにおけるアクリルアミドレベルは、一貫して対照より遙かに低かった。
【０１３９】
還元糖およびインベルターゼサイレンシング
バレイショ栽培品種Ｗ８は、複数の機構によって塊茎中の還元糖のレベルを低くし得る発現カセットを含む。ｐＳＩＭ１２７８での形質転換を通じて、デンプン関連遺伝子（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターのサイレンシングカセットを導入したのに対して、ｐＳＩＭ１６７８での形質転換は、インベルターゼ遺伝子のサイレンシングカセットを導入した（Ｙｅら  ２０１０）。一緒になると、これら形質は、デンプンおよびスクロースを還元糖（グルコースおよびフルクトース）へ変換するのを遅らせることによって機能する。Ｒ１およびＰｈＬのサイレンシングは、収穫の１ヶ月後に分析した場合に、低下した還元糖レベルを生じた（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ  ２０１３）が、還元糖の大きな低下は、インベルターゼサイレンシングに関連するようである。Ｒ１、ＰｈＬ、およびＶＩｎｖをサイレンシングすることの全体的な利益は、改善された品質（特に、色のコントロールに関する）を含み、従って、大部分のフレンチフライもしくはチップスの消費者が要求する望ましい金褐色に寄与する。また、還元糖は、アミノ酸（例えば、アスパラギン）と反応して、アクリルアミドを含むメイラード産物を生じる。
【０１４０】
ｐＳＩＭ１６７８におけるＶＩｎｖ遺伝子サイレンシングカセットは、液胞インベルターゼ（スクロースをグルコースおよびフルクトースへと変換する酵素）の低下したレベルを生じる。インベルターゼのレベルがバレイショにおいて低下される場合、還元糖であるグルコースおよびフルクトースは、スクロースが増大する間の貯蔵中に、特に、フレンチフライ用バレイショのために４６〜４８°Ｆの代表的貯蔵温度より低く保持される場合に、低レベルのままである。インベルターゼ活性について試験する前に、塊茎を、３９°Ｆで１ヶ月間貯蔵した。Ｗ８およびＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照の各々について３つの複製物を、アッセイのために使用し、活性を、ｎｍｏｌ／分／ｇｍ  塊茎の単位でグルコースの蓄積によって測定した。表１２に示されるように、Ｗ８は、対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋと比較して、低温貯蔵塊茎の液胞インベルターゼ活性において８５％低下を有した。Ｗ８塊茎におけるこの低下した液胞インベルターゼ活性は、表１３および表１４に示されるように、ＶＩｎｖ遺伝子からの低下したＲＮＡ蓄積および還元糖であるグルコースおよびフルクトースの低レベルと関連する。
【表１２】
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【０１４１】
長期の低温貯蔵は、フレンチフライおよびポテトチップスへと通年で加工するための高品質バレイショの適切な供給を維持するために必要であるが、低温誘導甘味（ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｗｅｅｔｅｎｉｎｇ）（ＣＩＳ）をもたらす。ＣＩＳは、高温で加工されるバレイショ製品において望ましくない副作用（風味の変化、望ましくない濃い色およびアクリルアミドの上昇した量が挙げられる）を引き起こす。液胞酸インベルターゼ（ＶＩｎｖ）は、非常に低温で貯蔵された塊茎においてグルコースおよびフルクトースの量を増大させるにあたって、ＣＩＳプロセスにおいて極めて重要な酵素である（Ｚｒｅｎｎｅｒら  １９９６）。Ｗ８は、ＶＩｎｖ遺伝子の抑制された発現を有し、従って、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と比較して、低温貯蔵において低下したグルコースおよびフルクトースレベルならびに低いＣＩＳを有する。低下した還元糖をもたらす形質の効力を実証するために、Ｗ８および非形質転換対照の圃場生育塊茎を、収穫時、ならびに通常貯蔵温度（４６°Ｆ）および低温貯蔵温度（３８°Ｆ）で分析した。
【０１４２】
還元糖であるグルコースとフルクトース、および非還元糖であるスクロースを、収穫時に、ならびにその後貯蔵の３ヶ月後、６ヶ月後および９ヶ月後に、Ｗ８において試験した。２つの異なる貯蔵温度を使用した（４６°Ｆ（これは、冷凍フレンチフライに予定されたＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋバレイショに代表的には使用される）、および３８°Ｆ（おそらく還元糖の高いレベルなしによりよい品質を可能にするＶＩｎｖのサイレンシングによって可能にされる低温））。収穫時、ならびに全ての貯蔵時点および温度においては、Ｗ８塊茎は、表１３および表１４に示されるように、対照と比較して、還元糖フルクトースよびグルコースの低レベルを含んだ。収穫時のＷ８の全ての糖の値は、許容区間内であった。これは、対照と組成上等しいことを示す。表１３は、収穫時ならびに４６°Ｆで３ヶ月間、６ヶ月間もしくは９ヶ月間貯蔵した後のフルクトース＋グルコースおよびスクロースに関するバレイショ糖レベルを示し、表１４は、３８°Ｆで６ヶ月間もしくは９ヶ月間貯蔵した場合のフルクトース＋グルコースおよびスクロースに関するバレイショ糖レベルを示す。表１３および表１４、第１列は、試験を行ったときのタイミングを示し、第２列は、変種を示し、第３列は、ｍｇ／１００ｇでＬＳ平均糖レベルを示し、第４列は、Ｐ値を示し（ここでＷ８と対照との間の有意差は、太字および下線で示される）、第５列は、試験した塊茎の数を示し、第６列は、ｍｇ／１００ｇで糖の範囲を示し、第７列は、許容区間（ＴＩ）を示す。
【表１３】
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【表１４】
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【０１４３】
表１３および表１４に示されるように、全てのＷ８塊茎は、収穫時、ならびに３８°Ｆおよび４６°Ｆの両方での複数の貯蔵時点後に、対照サンプルより多くのスクロースを含んだ。Ｗ８におけるＶＩｎｖ遺伝子のサイレンシングの正味の結果は、還元糖のより低いレベルおよびスクロースのより高いレベルである。これら変化は、収穫の時点で、および９ヶ月までの貯蔵期間全体を通して観察される。Ｗ８における還元糖は、貯蔵時間とともに増大するが、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照より一貫して低いままである。還元糖のより遙かに低いレベルが、３８°Ｆで貯蔵し場合に、対照と比較してＷ８において観察された。このことは、低温貯蔵が、Ｗ８に関して実現可能であることを示唆する。全ての場合において、還元糖における有意な減少は、スクロースのより高いレベルと結びつけられる。低温貯蔵が、呼吸に由来するより小さな収縮を生じるが、疾患に由来する喪失も低減することが予期される。
【０１４４】
Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋバレイショ栽培品種Ｗ８は、後期胴枯れ病への増大した抵抗性、黒色斑の原因となる酵素の低下した発現、低下したアスパラギンを介する低下したアクリルアミドおよび還元糖の低下したレベルを有することによって、品質を改善するバレイショ産業の必要性に対処する。
【０１４５】
本発明のさらなる実施形態
上記の有利な特徴を組み合わせるバレイショ変種をもたらす研究は、主に経験的である。この研究は、大きな投資時間（investment  of  time）、労力及び費用を必要とする。バレイショ栽培品種の開発は、しばしば、温室から商用利用までに、８年以上もの時間を費やす。繁殖は、最も重要な特徴を子孫に組み入れるための、優れた親の注意深い選択によって始まる。全ての所望の形質は、通常、１回の交配によって現れることはないので、繁殖は、必ず累積的になる。
【０１４６】
現在の繁殖技術は、親クローンの制御された授粉によって続けられる。代表的には、花粉をゼラチンカプセル内に集め、後に雌親の授粉に使用する。ハイブリッド種子を、温室内に撒き、数千もの個々の苗から塊茎を収穫し、保持する。翌年、各々得られた苗からの１〜４個の塊茎を、野外に植えつけ、ここでは、ウイルス及び病気の蔓延を回避するよう、細心の注意を払う。この第１年苗収穫物から、選択プロセスを生き抜いた各ハイブリッド個体からの数個の「種」塊茎を、翌年の植え付けのために保持する。第２年の後に、密度測定及び揚げ物試験のためにサンプルを採取し、商用利用のための塊茎の好適性を決定する。この時点までの選択プロセスを生き延びた植物を、次いで、より包括的な一連の揚げ物試験及び密度決定のために、第３年により大きな容量で植える。開発段階第４年に、選択を生き延びたものを幾つかの州（several  states）で野外試験に供し、異なる生育条件に対するその適合性を決定する。やがては、優れた品質を有する変種を、他の農場に移し、市場規模に種子を増やす。一般に、この時点までに、８年以上の作付、収穫及び試験を調査し、新規且つ改善されたバレイショ栽培品種を開発することを企図する。
【０１４７】
特定のタンパク質生成物をコードする遺伝子の単離及び性質決定を可能にした分子生物学技術の出現により、植物生物学分野における科学者らは、特定の様式で植物の形質を変化させるため、植物のゲノムを、外来性遺伝子又は、ネイティブもしくは内因性の遺伝子のさらなるバージョン若しくは改変されたバージョン（恐らくは、異なるプロモーターによって駆動される）を含んで発現するように操作することに、強い関心を持つようになった。このような外来性のさらなるおよび／もしくは改変された遺伝子は、本明細書中で、集合的に、「トランスジーン」と呼ばれる。ここ１５〜２０年にわたり、トランスジェニック植物を産生するための幾つかの方法が開発されてきており、本発明もまた、詳細な実施形態において、特許請求した変種又は系統の形質転換バージョンに関する。
【０１４８】
植物形質転換は、植物細胞において機能する発現ベクターの構築を含む。このようなベクターは、調節配列（例えば、プロモーター）の制御下の、又は調節配列に作用的に連結した遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つもしくはそれより多くのこのような作動可能に連結した遺伝子／調節エレメント組み合わせを含み得る。（単数又は複数の）ベクターは、プラスミドの形態であってもよく、単独で用いるか、又は他のプラスミドと組み合わせて用い、以下に記載されるような、トランスジーンをバレイショ植物（複数可）の遺伝物質内に組み入れる形質転換方法を用いて、形質転換バレイショ植物を提供することができる。
【０１４９】
従来型植物繁殖は、代表的に、新規且つ改善された特徴を有する変種を作製するための、植物染色体の無作為組換えに依存する。標準的な周知の技術に従い、遺伝子及び調節エレメントを含む遺伝子「発現カセット」を、アグロバクテリウムの単離された運搬ＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の境界内に挿入し、植物ゲノム内に組み込む。Ｔ−ＤＮＡ材料のアグロバクテリウム媒介型移入は、代表的に、以下の標準的手順を含む：（１）そのうちの少なくとも１つが外来性起源である遺伝子エレメントのインビトロ組換えにより、形質転換の選択のための発現カセットを産生すること、（２）この発現カセットを、しばしば、外来性ＤＮＡを含む少なくとも１つの他の発現カセット共に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によって隣接されるアグロバクテリウムＤＮＡの通常数百塩基対から成るバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域内に挿入すること、（３）しばしば、アグロバクテリウム由来のさらなるバイナリーベクター配列の幾つか又は全てを伴い、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に位置する配列を、植物細胞内に移入すること、並びに（４）所望の形質、例えば、収量の増加、成長力の改善、病気及び昆虫に対する抵抗性の増強、又はストレス下で生存する能力の増強を示す、安定的に形質転換した植物細胞を選択すること。
【０１５０】
従って、遺伝子操作方法は、外来性の、非固有の、プロモーター及びターミネーターなどの調節エレメントを含む核酸、並びに新規な形質の発現に関与するか又は形質転換体のウイルス、細菌及び植物からの同定及び選択のためのマーカーとしての機能する遺伝子の導入に依存する。マーカー遺伝子は、代表的に、細菌供給源に由来し、抗生物質抵抗性又は除草剤抵抗性を付与する。古典的繁殖方法は、骨が折れ、時間がかかり、新しい変種は、代表的に、比較的穏やかな改善しか示さない。
【０１５１】
「アンチセンス」技術において、ネイティブの遺伝子の配列は、逆向きにされて、トランスジェニック植物における遺伝子の発現をサイレンシングする。しかし、逆向きＤＮＡは、通常、プロモーターとターミネーターとの間に挿入された新規且つ性質決定されていないオープンリーディングフレームを含み、該フレームは、植物の発育に干渉し、かつ／又は栄養的価値を減じるので、所望されない場合がある、外来性アミノ酸配列をコードする。
【０１５２】
バレイショ形質転換のための発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つの遺伝子マーカーを含み、該マーカーは、陰性選択、すなわち、選択的マーカー遺伝子を含まない細胞の成長の阻害によって又は陽性選択、すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングによってのいずれかで、回収される。多くの、植物形質転換のために一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子は、形質転換分野において周知であり、例えば、抗生物質又は除草剤であり得る選択的化学薬剤を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である改変された標的をコードする遺伝子を含む。幾つかの陽性選択方法もまた、当該分野で公知である。
【０１５３】
植物形質転換のための、１つの一般に使用される選択可能マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これは、植物調節シグナルの制御下にある場合、カナマイシンに対する抵抗性を付与する。Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）。別の一般に使用される選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２９９（１９８５）。
【０１５４】
抗生物質に対する抵抗性を付与する細菌起源のさらなる選択可能マーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ及びブレオマイシン抵抗性決定因子であるアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｈａｙｆｏｒｄら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６：１２１６（１９８８），Ｊｏｎｅｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０：８６（１９８７），Ｓｖａｂら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１９７（１９９０）Ｈｉｌｌｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１（１９８６）。他の選択可能マーカー遺伝子は、グリホサート、グルホシネート又はブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。Ｃｏｍａｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：７４１〜７４４（１９８５），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０）及びＳｔａｌｋｅｒ  ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９〜４２３（１９８８）。
【０１５５】
細菌起源でない植物形質転換のための選択可能マーカー遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ及び植物アセトラクテートシンターゼが挙げられる。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚら，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：６７（１９８７），Ｓｈａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８（１９８６），Ｃｈａｒｅｓｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．８：６４３（１９９０）。
【０１５６】
植物形質転換のための別のクラスのマーカー遺伝子は、抗生物質などの毒性物質に対する抵抗性のための形質転換細胞の直接的な遺伝子選択よりもむしろ、推定形質転換植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子の発現を定量するか、又はその発現の空間的パターンを可視化するのに特に有用であり、常習的にレポーター遺伝子と呼ばれる。何故なら、これらは、遺伝子発現の調査のために、遺伝子又は遺伝子調節配列に融合し得るからである。推定形質転換細胞をスクリーニングするための、一般的に使用される遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７（１９８７），Ｔｅｅｒｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３４３（１９８９），Ｋｏｎｃｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１３１（１９８７），ＤｅＢｌｏｃｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６８１（１９８４）。
【０１５７】
植物組織の破壊を必要としない、ＧＵＳ活性を可視化するためのインビボ方法が、利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２９０８，ＩＭＡＧＥＮＥ  ＧＲＥＥＮ，ｐ．１〜４（１９９３）及びＮａｌｅｗａｙら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５：１５１ａ（１９９１）。しかし、ＧＵＳ活性を可視化するためのこれらのインビボ方法は、低い感度、高い蛍光バックグラウンド、及び選択可能マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限ゆえに、形質転換細胞を回収するために有用であることが証明されていない。
【０１５８】
より近年、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が、原核細胞及び真核細胞における遺伝子発現のマーカーとして、利用されている。Ｃｈａｌｆｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２（１９９４）。ＧＦＰ及びＧＦＰの変異体は、スクリーニング可能マーカーとして使用され得る。
【０１５９】
バレイショ形質転換のための発現ベクター：プロモーター
発現ベクター内に含まれる遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。幾つかの種類のプロモーターが、単独で又はプロモーターと組み合わせて使用され得る他の調節エレメントと同じく、形質転換分野で周知である。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、転写の開始から上流のＤＮＡ領域であって、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写を開始する他のタンパク質の認識及び結合に関与する領域に対する言及を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞における転写を開始可能であるプロモーターである。発生制御下のプロモーターの例としては、特定の組織、例えば、葉、根、種子、繊維、木部道管、仮道管又は厚壁組織において優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、「組織好適」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、主に、１つもしくはそれより多くの器官の特定の細胞型、例えば、根又は葉における脈管細胞において、発現を駆動する。「誘導型」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導型プロモーターによる転写に作用し得る環境条件の例としては、嫌気条件又は光の存在が挙げられる。組織特異的、組織好適、細胞型特異的及び誘導型のプロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、殆どの環境条件下で活性であるプロモーターである。
【０１６１】
Ａ．誘導型プロモーター
誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のための、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。誘導型プロモーターにより、転写の速度が、誘導剤に応答して増加する。
【０１６２】
任意の誘導型プロモーターが、本発明において使用され得る。Ｗａｒｄら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１〜３６６（１９９３）を参照されたい。誘導型プロモーターの例としては、銅に応答するＡＣＥＩ系由来のもの（Ｍｅｔｔら，ＰＮＡＳ  ９０：４５６７〜４５７１（１９９３））；ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性軽減剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１）及びＧａｔｚら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２〜３８（１９９４））、又はＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Ｇａｔｚら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１））が挙げられるがそれらに限定されない。特に好ましい誘導型プロモーターは、通常は植物が応答しない誘導剤に応答するプロモーターである。例示的な誘導型プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子からの誘導型プロモーターであり、その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモンによって誘導される。Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：０４２１（１９９１）。
【０１６３】
Ｂ．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるか、又は構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。
【０１６４】
多くの異なる構成的プロモーターが、本発明において利用され得る。例示的な構成的プロモーターとしては、植物ウイルス由来のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５））及びコメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１（１９９０））；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９〜６３２（１９８９）及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５〜６８９（１９９２））；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８（１９９１））；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３〜２７３０（１９８４））及びトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３１：２７６〜２８５（１９９２）及びＡｔａｎａｓｓｏｖａら，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２（３）：２９１〜３００（１９９２））などの遺伝子に由来するプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６５】
Brassica  napus  ＡＬＳ３構造遺伝子に対し５’側であるＡＬＳプロモーター、Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌ断片（又はこのＸｂａ１／Ｎｃｏｌ断片に類似したヌクレオチド配列）は、特に有用な構成的プロモーターを表す。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５３０を参照されたい。
【０１６６】
Ｃ．組織特異的又は組織好適プロモーター
組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のための、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子によって形質転換された植物は、特異的組織において、トランスジーンのタンパク質産物を、独占的に又は優先的に産生する。
【０１６７】
組織特異的又は組織好適プロモーターのいずれかは、本発明において利用され得る。例示的な組織特異的又は組織好適プロモーターとしては、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根好適プロモーター（Ｍｕｒａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６〜４８２（１９８３）及びＳｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３３２０〜３３２４（１９８５））；ｃａｂ又はｒｕｂｉｓｃｏ由来のものなどの葉特異的及び光誘導型プロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２７２３〜２７２９（１９８５）及びＴｉｍｋｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７９〜５８２（１９８５））；ＬＡＴ５２由来のものなどの葯特異的プロモーター（Ｔｗｅｌｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１７：２４０〜２４５（１９８９））；Ｚｍ１３由来のものなどの花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４４：１６１〜１６８（１９９３））又はａｐｇ由来のものなどの小胞子好適プロモーター（Ｔｗｅｌｌら，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．６：２１７〜２２４（１９９３））が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６８】
タンパク質を細胞内区画に標的化するためのシグナル配列
トランスジーンによって産生されたタンパク質の葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁若しくはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送、又はアポプラストへの分泌のための輸送は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’及び／又は３’領域への、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の作動可能な連結によって達成される。構造遺伝子の５’及び／又は３’末端における配列の標的化は、タンパク質合成及びプロセシングの間に、コードされたタンパク質が最終的に区画化される場所を決定し得る。
【０１６９】
シグナル配列の存在は、ポリペプチドを、細胞内小器官若しくは細胞内区画、又はアポプラストへの分泌について、方向づける。多くのシグナル配列が、当該分野で公知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４９（１９９２）；Ｃｌｏｓｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９３）；Ｋｎｏｘ，Ｃ．，ら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３〜１７（１９８７）；Ｌｅｒｎｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２４〜１２９（１９８９）；Ｆｒｏｎｔｅｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：４８３〜４９６（１９９１）；Ｍａｔｓｕｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８３４（１９９１）；Ｇｏｕｌｄら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７（１９８９）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１２９（１９９１）；Ｋａｌｄｅｒｏｎ，ら，Ｃｅｌｌ  ３９：４９９〜５０９（１９８４）；Ｓｔｅｉｆｅｌ，ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：７８５〜７９３（１９９０）を参照されたい。
【０１７０】
外来性タンパク質遺伝子及び農業用遺伝子
本発明に従うトランスジェニック植物により、外来性タンパク質が、商業的量で産生され得る。従って、形質転換植物の選択及び増殖のための、当該分野で周知の技術は、複数のトランスジェニック植物を生じ、これは、従来様式で収穫され、次いで、外来性タンパク質が、目的の組織又はバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、以下によって議論される公知の方法によって達成され得る：Ｈｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｒｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：９２〜６（１９８１）。
【０１７１】
好ましい実施形態に従い、外来性タンパク質の商業的生産のために提供されたトランスジェニック植物は、バレイショ植物である。別の好ましい実施形態において、目的のバイオマスは、種子又は塊茎である。より高いレベルの発現を示す比較的少数のトランスジェニック植物について、遺伝子マップが、まずは従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲ及びＳＳＲ分析を介して作成され得る。該遺伝子マップにより、組み込まれたＤＮＡ分子のおよその染色体位置が同定される。この点に関する例示的方法論についてはＧｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２６９：２８４（１９９３）を参照されたい。染色体位置に関するマップ情報は、主題のトランスジェニック植物の所有権保護のために有用である。認定されない増殖が行われ、他の生殖質との交配がなされた場合には、組み込み領域のマップは、疑わしい植物についての類似のマップと比較され得、後者が主題の植物と共通の素性（common  parentage）を有するかどうかを決定する。マップ比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲ及び配列決定を含み得、これらの全ては従来技術である。
【０１７２】
同様に、本発明を用いて、農業遺伝子が、形質転換植物において発現され得る。より詳細には、植物は、農業目的の種々の表現型を発現するように遺伝子操作され得る。この点に関係する例示的な遺伝子としては、いかに示すカテゴリーのものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
１．有害生物または病気に対する抵抗性を付与し、以下をコードする遺伝子：
Ａ．植物の病気に抵抗性の遺伝子。植物防御は、多くの場合、植物における病気抵抗性遺伝子の産物（Ｒ）と病原体における対応する無発病性（Ａｖｒ）遺伝子の産物との間の特異的相互作用によって活性化される。植物変種は、クローニングされた抵抗性遺伝子（複数可）によって形質転換されて、特定の病原体株に対して抵抗性であるように植物を操作し得る。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（１９９４）（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  Ｃｆ−９  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（１９９３）（ｔｏｍａｔｏ  Ｐｔｏ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）；ＭｉｎｄｒｉｎｏｓらＣｅｌｌ  ７８：１０８９（１９９４）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＳＰ２  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）を参照されたい。
【０１７４】
Ｂ．有害生物、例えばダイズシストセンチュウに対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５１７；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１９１８１を参照されたい。
【０１７５】
Ｃ．バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体又はその上にモデリングした合成ポリヌクレオチド。例えば、Ｂｔ  δ−内毒素遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を開示するＧｅｉｓｅｒら，Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（１９８６）を参照されたい。さらに、δ−内毒素遺伝子をコードするＤＮＡ分子が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５及び３１９９８の下で購入可能である。
【０１７６】
Ｄ．レクチン。例えば、幾つかのクリビア・ミニアータ（Ｃｌｉｖｉａ  ｍｉｎｉａｔａ）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＶａｎ  Ｄａｍｍｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４）を参照されたい。。
【０１７７】
Ｅ．アビジンなどのビタミン結合タンパク質。ＰＣＴ出願ＵＳ  ９３／０６４８７を参照されたい。これは、昆虫有害生物に対する殺幼虫剤としての、アビジン及びアビジンホモログの使用を教示する。
【０１７８】
Ｆ．酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒビター若しくはプロテイナーゼインヒビター又はアミラーゼインヒビター。例えば、Ａｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）（コメシステインプロテイナーゼインヒビターのヌクレオチド配列）、Ｈｕｕｂら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３）（タバコプロテイナーゼインヒビターＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、Ｓｕｍｉｔａｎｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）α−アミラーゼインヒビターのヌクレオチド配列）及び米国特許５，４９４，８１３（Ｈｅｐｈｅｒ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ｉｓｓｕｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７，１９９６）を参照されたい。
【０１７９】
Ｇ．エクジステロイド又は幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモン、それらのバリアント、それらに基づく模倣物、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８（１９９０）による、クローニングした幼若ホルモンエステラーゼ（幼若ホルモンの不活性化剤）のバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。
【０１８０】
Ｈ．発現の際に、影響を受けた有害生物の生理機構を破壊する、昆虫特異的ペプチド又はニューロペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）（発現クローニングが昆虫利尿ホルモンレセプターをコードするＤＮＡを生じる）、及びＰｒａｔｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）（アロスタチンは、ジプロテラ・プンタータ（Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａ）において同定される）の開示を参照されたい。また、Ｔｏｍａｌｓｋｉらに対する米国特許５，２６６，３１７（昆虫特異的な麻痺性ニューロトキシンをコードする遺伝子を開示する）も参照されたい。
【０１８１】
Ｉ．天然において蛇、スズメバチなどによって産生される昆虫特異的毒物。例えば、Ｐａｎｇら，Ｇｅｎｅ  １１６：１６５（１９９２）を、サソリ昆虫毒ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示について参照されたい。
【０１８２】
Ｊ．モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺昆虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰蓄積に関与する酵素。
【０１８３】
Ｋ．生物学的活性分子の翻訳後修飾を含む改変に関与する酵素、例えば、天然又は合成のいずれかである、解糖酵素、タンパク分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０２１９７（Ｓｃｏｔｔら）を参照されたい。これは、カラーゼ（callase）遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。キチナーゼコード配列を含むＤＮＡ分子が、例えば、ＡＴＣＣから、受託番号３９６３７及び６７１５２の下で得られ得る。また、Ｋｒａｍｅｒら，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）（タバコイモムシキチナーゼをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列を教示する）、並びに、Ｋａｗａｌｌｅｃｋら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供する）も参照されたい。
【０１８４】
Ｌ．シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Ｂｏｔｅｌｌａら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）による、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列の開示、及びＧｒｉｅｓｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提供する）を参照されたい。
【０１８５】
Ｍ．疎水性モーメントペプチド。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１６７７６（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体を開示する）、並びに、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１８８５５（病気抵抗性を付与する、合成抗微生物ペプチドを教示する）を参照されたい。
【０１８６】
Ｎ．膜パーミアーゼ、チャネルフォーマー又はチャネルブロッカー。例えば、Ｊａｙｎｅｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８９：４３（１９９３）の、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対して抵抗性にする、セクロピン−β溶解性ペプチドの異種発現の開示を参照されたい。
【０１８７】
Ｏ．ウイルス侵襲性タンパク質又はそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染及び／又はコードタンパク質遺伝子が由来するウイルスにより、並びに関連のウイルスによりもたらされる病気発症に対する抵抗性を付与する。Ｂｅａｃｈｙら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照されたい。コートタンパク質媒介型抵抗性は、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスに対する形質転換植物に付与されている。
【０１８８】
Ｐ．昆虫特異的抗体又はそれに由来するイムノトキシン。従って、昆虫の腸における重要な代謝機能に対し標的化された抗体は、影響を受けた酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。Ｔａｙｌｏｒら，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃４９７，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）（１９９４）（トランスジェニックタバコにおける一本鎖抗体断片の産生を介した酵素不活性化）を参照されたい。
【０１８９】
Ｑ．ウイルス特異的抗体。例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９（１９９３）（組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す）を参照されたい。
【０１９０】
Ｒ．病原体又は寄生生物により天然で産生される発生停止タンパク質。従って、真菌エンド−α−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することにより、真菌のコロニー形成及び植物栄養放出を容易にする。Ｌａｍｂら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６（１９９２）を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び性質決定は、Ｔｏｕｂａｒｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７（１９９２）によって記載される。
【０１９１】
Ｓ．植物により天然で産生される発生停止タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（１９９２）は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌の病気に対し増大した抵抗性を有することを示している。
【０１９２】
Ｔ．全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子及び／又は病因関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）（１９９５）。
【０１９３】
Ｕ．抗真菌遺伝子。Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０１：７０９〜７１２（１９９３）；Ｐａｒｉｊｓら，Ｐｌａｎｔａ  １８３：２５８〜２６４（１９９１）及びＢｕｓｈｎｅｌｌら，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７〜１４９（１９９８）を参照されたい。
【０１９４】
Ｖ．フィトフトラ・ブライト（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｂｌｉｇｈｔ）に対する抵抗性を付与する遺伝子、例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び他の抵抗性遺伝子。Ｎａｅｓｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ  ｉｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９７〜７０４及びＬｉ，Ｘ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ＡＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｔｈｅ  Ｒ２  ａｌｌｅｌｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｏｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：１１２１〜１１２８を参照されたい。
【０１９５】
２．除草剤に対する抵抗性を扶養する遺伝子、例えば：
Ａ．成長点又は分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン又はスルホニルウレア。このカテゴリーにおける例示的な遺伝子は、例えば、それぞれＬｅｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１（１９８８）及びＭｉｋｉら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）に記載されるように、変異体ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。
【０１９６】
Ｂ．グリホセート（それぞれ変異体５−エノールピルビルシキメート（enolpyruvlshikimate）−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）及びａｒｏＡ遺伝子によって、抵抗性が損なわれる）、並びにグルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＰＡＴバー遺伝子）及びピリジンオキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンなど（ＡＣＣアーゼインヒビターコード遺伝子）の他のホスホノ化合物。例えば、グリホセート抵抗性を付与し得るＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、Ｓｈａｈ，らに対する米国特許４，９４０，８３５を参照されたい。変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得られ得、変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉに対する米国特許４，７６９，０６１に開示される。Ｋｕｍａｄａらに対する欧州特許出願０  ３３３  ０３３、及びＧｏｏｄｍａｎらに対する米国特許４，９７５，３７４は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらに対する欧州出願０  ２４２  ２４６において提供される。ＤｅＧｒｅｅｆら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性についてコードするキメラバー遺伝子を発現する、トランスジェニック植物の産生を記載する。フェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソン、例えばセトキシジム及びハロキシホップに対する抵抗性を付与する遺伝子の例は、Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２及びＡｃｃ２−Ｓ３遺伝子である：Ｍａｒｓｈａｌｌら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）に記載される。
【０１９７】
Ｃ．光合成を阻害する除草剤、例えばトリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Ｐｒｚｉｂｉｌａら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（１９９１）は、変異体ｐｓｂＡをコードするプラスミドによる、クラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子についてのヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒに対する米国特許４，８１０，６４８に開示され、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２の下で利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）に記載される。
【０１９８】
Ｄ．複数の型の除草剤に抵抗性であるアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素を発現する植物を作製することが見出されており、該アセトヒドロキシ酸シンターゼが、種々の植物内に導入されている。Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９，１９９５を参照されたい。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子としては、ラットシトクロムＰ４５０７Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼとのキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７，１９９４）、グルタチオンレダクターゼ及びスーパーオキシドジスムターゼについての遺伝子（Ａｏｎｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：１６８７，１９９５）、並びに種々のホスホトランスフェラーゼについての遺伝子（Ｄａｔｔａら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６１９，１９９２）が挙げられる。
【０１９９】
Ｅ．プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）が、全ての植物の生存のために必要な葉緑素の産生のために必要である。ｐｒｏｔｏｘ酵素は、種々の除草剤化合物のための標的として働く。これらの除草剤はまた、存在する全ての異なる種の植物の成長も阻害し、それらの全体的破壊をもたらす。これらの除草剤に対して抵抗性である改変されたｐｒｏｔｏｘ活性を有する植物の開発は、米国特許６，２８８，３０６；６，２８２，８３７；５，７６７，３７３及び国際公開ＷＯ  ０１／１２８２５に記載される。
【０２００】
３．付加価値形質を付与するか又はこれに寄与する遺伝子。例えば：
Ａ．改変された脂肪酸代謝。例えば、ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子による、植物のステアリン酸含量を増大するように該植物を形質転換することによるもの。Ｋｎｕｌｔｚｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２５（１９９２）を参照されたい。
【０２０１】
Ｂ．低下したフィテート含量−１）フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィテートの分解を増強し、形質転換植物に、より多くの遊離のホスフェートを追加する。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら，Ｇｅｎｅ  １２７：８７（１９９３）を参照されたい。２）フィテート含量を低下させる遺伝子を導入することもできた。トウモロコシにおいて、例えば、これは、低レベルのフィチン酸によって特徴づけられるトウモロコシ変異体に関与する単一の対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングし、次いで再導入することによって、達成され得た。Ｒａｂｏｙら，Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３（１９９０）を参照されたい。
【０２０２】
Ｃ．例えば、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによりもたらされた、改変された炭水化物組成。Ｓｈｉｒｏｚａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（１９８８）（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ミュータンスフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（１９８５）（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（１９９２）（バチルス・リケニホニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の産生）、Ｅｌｌｉｏｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｏｇａａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（１９９３）（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的変異誘発）及びＦｉｓｈｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（１９９３）（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい。
【０２０３】
Ｄ．ＦＡＤ−２遺伝子改変を介したオレイン酸の上昇及び／又はＦＡＤ−３遺伝子改変を介したリノレン酸の低下。米国特許６，０６３，９４７；６，３２３，３９２；及び国際公開ＷＯ  ９３／１１２４５を参照されたい。
【０２０４】
４．雄性不稔を制御する遺伝子
Ａ．タペータム特異的プロモーターの制御下及び化学的Ｎ−Ａｃ−ＰＰＴの適用によるデアセチラーゼ遺伝子の導入。国際公開ＷＯ  ０１／２９２３７を参照されたい。
【０２０５】
Ｂ．種々の雄ずい特異的プロモーターの導入。国際公開ＷＯ  ９２／１３９５６及びＷＯ  ９２／１３９５７を参照されたい。
【０２０６】
Ｃ．バルナーゼ遺伝子及びバルスター遺伝子の導入。Ｐａｕｌら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６１１〜６２２，１９９２を参照されたい。
【０２０７】
バレイショ形質転換の方法
植物形質転換のための多くの方法が開発されており、それらとしては、生物学的及び物理的植物形質転換プロトコールが挙げられる。例えば、Ｍｉｋｉら，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ６７〜８８を参照されたい。加えて、発現ベクター並びに植物細胞又は組織の形質転換及び植物の再生のためのインビトロ培養方法が、利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ８９〜１１９を参照されたい。
【０２０８】
Ａ．アグロバクテリウム媒介型形質転換−発現ベクターを植物内に導入するための１つの方法は、アグロバクテリウムの天然の形質転換システムに基づく。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９（１９８５）を参照されたい。Ａ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスは、植物細胞を遺伝的に形質転換する、植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を有する。例えば、Ｋａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１０：１（１９９１）を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介型遺伝子移入のための方法の記載は、Ｇｒｕｂｅｒら，上掲，Ｍｉｋｉら，上掲  および  Ｍｏｌｏｎｅｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８（１９８９）によって提示される。また、１９９６年１０月８日に発行された米国特許５，５６３，０５５（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ）も参照されたい。
【０２０９】
Ｂ．直接遺伝子移入−集合的に直接遺伝子移入と呼ばれる植物形質転換の幾つかの方法が、アグロバクテリウム媒介型形質転換の代替法として開発されている。微小射出（microprojectile）の植物表面での一般に適用可能な方法は、１〜４μｍである。発現ベクターを、植物細壁及び細胞膜を貫くのに十分な３００〜６００ｍ／秒の速さに微小射出を加速する微粒子銃（biolistic）デバイスにより、植物組織内に導入する。Ｓａｎｆｏｒｄら，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７（１９８７）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：２９９（１９８８）；Ｋｌｅｉｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：５５９〜５６３（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：２０６（１９９０）；Ｋｌｅｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）。１９９１年５月１４日に発行された米国特許５，０１５，５８０（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ら）、及び１９９４年６月２１日に発行された米国特許５，３２２，７８３（Ｔｏｍｅｓ，ら）もまた、参照されたい。
【０２１０】
ＤＮＡの植物への物理的送達のための別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Ｚｈａｎｇ  ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９９６（１９９１）。あるいは、リポソーム及びスフェロプラスト融合が、発現ベクターを植物内に導入するために使用されている。Ｄｅｓｈａｙｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７３１（１９８５）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３９６２（１９８７）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを用いるＤＮＡのプロトプラスト中への直接取り込みもまた、報告されている。Ｈａｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１（１９８５）及びＤｒａｐｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：４５１（１９８２）。プロトプラスト及び全細胞並びに組織のエレクトロポレーションもまた、記載されている。Ｄｏｎｎら，Ｉｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＶＩＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＩＡＰＴＣ，Ａ２−３８，ｐ  ５３（１９９０）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５〜１５０５（１９９２）及びＳｐｅｎｃｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：５１〜６１（１９９４）。
【０２１１】
バレイショ標的組織の形質転換後、上記の選択可能マーカー遺伝子の発現は、当該分野で周知の再生及び選択方法を用いた形質転換細胞、組織及び／又は植物の優先的選択を可能にする。
【０２１２】
形質転換のための上述の方法が、代表的に、トランスジェニック変種を産生するために使用される。次いで、新規なトランスジェニック変種を産生するために、トランスジェニック変種を、別の（形質転換されていない又は形質転換されている）変種に交配させ得る。あるいは、特定のバレイショ系統に上述の形質転換技術を用いて操作した遺伝的形質を、植物繁殖分野で周知の従来型戻し交配技術を用いて、別の系統に移してもよい。例えば、戻し交配アプローチを使用し、操作した形質を、公の、非エリート変種からエリート変種へと移動させてもよく、又は、そのゲノム内に外来性遺伝子を含む変種からこの遺伝子を含まない単数または複数の変種へと移動させてもよい。本明細書中で使用される場合、「交配する」は、単純にＸをＹによってかけ合わせることをいっても、又は文脈に依存して、戻し交配のプロセスをいってもよい。
【０２１３】
当業者は、用語バレイショ植物が、本発明の文脈で使用される場合、これはまたＷ８の本質的に識別可能な特徴を保持する派生変種、例えば、この変種の遺伝子変換植物又はそこに組み入れられた１つもしくはそれより多くの付加価値遺伝子（例えば、除草剤又は有害生物抵抗性）を有するトランスジェニック誘導体をも含むことを理解する。戻し交配方法は、特徴を改善するか、又は特徴を変種に導入するために、本発明と共に使用され得る。用語「戻し交配」は、本明細書中で使用される場合、ハイブリッド子孫を反復親に戻す１、２、３、４、５、６、７、８、９回またはそれ超の繰り返し交配をいう。１つもしくはそれより多くの所望の特徴のために遺伝子（複数可）を与える親バレイショ植物を、非反復親又はドナー親と呼ぶ。この用語は、非反復親が、戻し交配プロトコールにおいて１回使用され、繰り返されないという事実をいう。非反復親からの単数または複数の遺伝子が移入されている親バレイショ植物は、戻し交配プロトコールにおいて、数ラウンドも使用されるので、反復親として公知である。代表的な戻し交配プロトコールにおいて、目的の元の変種（反復親）は、移入される目的の遺伝子（複数可）を有する第２の変種（非反復親）と交配される。この交配から得られた子孫を、次いで、再び反復親にかけ合わせ、このプロセスを、変換した植物において、非反復親から移入された１つもしくはそれより多くの遺伝子に加えて反復親の所望の形態学的及び生理学的特徴を本質的に全て回復したバレイショ植物が得られるまで繰り返す。
【０２１４】
好適な反復親の選択は、戻し交配手順を成功させるために重要な工程である。戻し交配プロトコールの目標は、元の変種における１つまたはそれより多くの形質又は特徴を、改変することまたは置換することである。これを達成するために、反復変種の１つもしくはそれより多くの遺伝子を、非反復親由来の所望の遺伝子（複数可）により、改変するか、置換するか、又は補充する一方で、所望の遺伝子の残りの全ては本質的に保持し、従って、元の変種の所望の生理学的及び形態学的構造（constitution）を保持する。特定の非反復親の選択は、戻し交配の目的に依存する。主要な目的の一つは、幾つかの商業的に望ましい、農業的に重要な形質を、植物に付加することである。正確な戻し交配プロトコールは、改変されるか又は加えられた特徴若しくは形質に依存して、適切な試験プロトコールを決定する。移入される特徴が優性対立遺伝子である場合は戻し交配方法は単純化されるが、劣勢対立遺伝子もまた、移入され得る。この場合、所望の特徴が首尾よく移入されたかを決定するために、子孫の試験を導入する必要がある。
【０２１５】
このように、トランスジーンは、種々の確立された、当業者に周知の組換え方法のいずれかを用いて、植物へと導入され得る。例えば、以下である：Ｇｒｅｓｓｅｌ，１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｒｏｐｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｌ．ｖａｎ  Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ，（ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｕｔｔｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ら，１９９２，Ｒｅｖｉｓｉｎｇ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｅｅ，Ｈ．，ら，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．，ら，１９８６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ＴＬ−ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  ５  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｗｓｏｎ，Ｃ．，ら，１９９０，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍｉｘｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｘ  ａｎｄ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｔｓｋｙ，Ｔ．Ａ．，ら，１９９６，Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＬＲＶ．米国特許５，５１０，２５３；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，ら，１９９１，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．Ｃｖ．Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．，ら，１９９３，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｏｔａｔｏｅｓ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｅｅｔｌｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、これらの全ては、この目的のために、本明細書中に参考として組み込まれる。
【０２１６】
新規な変種の開発のためには通常選択されないが、戻し交配及び遺伝子操作技術によって改善され得る多くの形質が、同定されている。これらの形質は、トランスジェニックであってもなくてもよい；これらの形質の例としては、除草剤抵抗性；細菌性の病気、真菌性の病気又はウイルス性の病気に対する抵抗性；昆虫抵抗性；デンプンおよび他の炭水化物の濃度における均一性若しくは増大；栄養品質の向上；塊茎が傷を負う傾向の低下；及びデンプンの糖への変換の割合の低下が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子は、核を通して遺伝的に受け継がれる。これらの形質の幾つかは、以下に記載される：米国特許５，５００，３６５、米国特許５，３８７，７５６、米国特許５，７８９，６５７、米国特許５，５０３，９９９、米国特許５，５８９，６１２、米国特許５，５１０，２５３、米国特許５，３０４，７３０、米国特許５，３８２，４２９、米国特許５，５０３，９９９、米国特許５，６４８，２４９、米国特許５，３１２，９１２、米国特許５，４９８，５３３、米国特許５，２７６，２６８、米国特許４，９００，６７６、米国特許５，６３３，４３４及び米国特許４，９７０，１６８。
【０２１７】
寄託情報
Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ所有の、上で開示し添付の特許請求の範囲で挙げたバレイショ栽培品種Ｗ８の塊茎寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０によってなされた。寄託日は、２０１４年３月１１日であった。微小塊茎の２５個のバイアルの寄託物を、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙによって維持された同じ寄託物から、本出願の提出日の前に受け取った。全ての制限は、特許の付与の際に不可逆的に取り除かれ、この寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  １．８０１〜１．８０９の全ての要件を満たすことを意図する。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２１０７９である。寄託物は、３０年間の期間にわたって、又は最後の要求から５年間にわたって、又は、より長い場合には特許の権利行使可能期間にわたって、寄託当局によって維持され、必要に応じて、その期間の間、取り換えられる。
【０２１８】
多くの例示的局面及び実施形態が上で議論されているが、当業者は、特定の改変、交換、追加及びその部分的組み合わせを、認識する。従って、以下の添付の特許請求の範囲は、以後、全てのこのような改変、交換、追加及び部分的組み合わせを、その真の精神及び範囲内であるように、含むと解釈されることが、意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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