(57)【要約】本発明は、抗ウイルス治療薬のための送達方法および組成物を提供する。方法および組成物は、例えば、アデノウイルス、AAV、および複製不全HSVのようなウイルスベクターを使用した、関心対象の細胞中への抗ウイルス治療薬のターゲティングされた送達のために提供される。これらおよびその他の送達系は、ヌクレアーゼまたは細胞殺傷遺伝子をコードするDNAベクターを送達するための媒体として使用され得る。これらの送達方法は、裸のDNAもしくはRNA、タンパク質産物、潜伏ウイルス状態においてのみ活性を有し細胞殺傷遺伝子を駆動するプロモーターを含有するプラスミド、またはその他の治療剤を送達するためにも使用され得る。2017518372.tif 000004
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬のための遺伝子と、ウイルスに感染した細胞内で該治療薬の発現を引き起こす配列とを含むベクター
を含む、ウイルス感染を処置するための組成物。
【請求項２】
前記治療薬が、ウイルス感染細胞の死を選択的に引き起こす機序を提供する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記治療薬が、ウイルス感染細胞の死を選択的に引き起こすタンパク質を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が、細胞における欠陥アポトーシス経路を回復させる、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
前記治療薬がターゲティング可能なヌクレアーゼを含み、前記配列がウイルスのゲノムに由来する、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
ターゲティング可能なヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼであり、前記ベクターが複数種類のガイドRNAをさらにコードする、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
ガイドRNAのうちの1種類または複数種類が、ウイルスに感染した細胞のゲノムを標的とするよう設計されている、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
前記配列が、ウイルスのゲノムに由来する調節エレメントである、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
前記調節エレメントが、プロモーターおよび複製開始点からなる群より選択されるものである、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記治療薬が、ウイルス感染細胞の死を引き起こすタンパク質を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
前記遺伝子が、BAX、BAK、BCL-2、およびα溶血素からなる群より選択される、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
前記配列が、ウイルスのゲノムに由来するプロモーターである、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
前記配列が、ウイルスの複製開始点を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１４】
前記治療薬が、ウイルスに感染した細胞においてアポトーシスを誘導し、非感染細胞においてはアポトーシスを誘導しない、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
プロモーターが、ウイルスによる潜伏感染の状態にある細胞内でのみ治療薬の発現を引き起こす、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、請求項14記載の組成物。
【請求項１８】
前記ベクターが、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアからなる群より選択されるものを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
抗ウイルス治療薬と、ウイルスに感染した細胞内で該治療薬の活性化を引き起こす調節エレメントとを含むベクター
を含む、ウイルス感染を処置するための組成物。
【請求項２０】
前記抗ウイルス治療薬がターゲティング可能なヌクレアーゼのための遺伝子を含み、前記調節エレメントがウイルスのゲノムに由来する、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
前記調節エレメントが、プロモーターおよび複製開始点からなる群より選択されるものである、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項20記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項２４】
前記ベクターが、ウイルスのゲノムに由来する核酸へヌクレアーゼをターゲティングするガイドRNAをさらにコードする、請求項20記載の組成物。
【請求項２５】
前記ガイドRNAが、ヒトゲノムの中にパーフェクトマッチを有しないよう設計されている、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗ウイルス治療薬が、ターゲティング可能なヌクレアーゼのための遺伝子を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
前記ベクターが、ウイルスのゲノムに由来する核酸へヌクレアーゼをターゲティングする1種類または複数種類のガイドRNAをさらにコードする、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、ヒトゲノムの中にパーフェクトマッチを有しないよう設計されている、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、ウイルスのゲノムの中の調節エレメントを標的とするよう設計されている、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペス1型、単純ヘルペス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒトパピローマウイルス、BKウイルス、JCウイルス、天然痘、B型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスB19、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、A型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、C型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、E型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、グアナリト（Guanarito）ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、D型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、およびバンナ（Banna）ウイルスからなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３２】
ヌクレアーゼのための遺伝子と、ウイルスのゲノムへ該ヌクレアーゼをターゲティングする配列と、特定の種類の細胞内でベクターからの転写を促進するプロモーターとを含むベクター
を含む、ウイルス感染を処置するための組成物。
【請求項３３】
前記細胞が神経細胞であり、前記プロモーターが該神経細胞内で選択的に前記遺伝子の発現をさらに引き起こす、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、または血小板由来増殖因子（PGDF）プロモーターを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
ウイルスが水痘帯状疱疹ウイルスである、請求項33記載の組成物。
【請求項３６】
前記配列が、ウイルスのゲノムの中の調節エレメントを標的とするよう設計されており、かつヒトゲノムの中のいかなる正確なマッチも欠いている、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
前記ヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
前記配列が、ベクター内のクラスター化した規則的に間隔を空けた短い回文配列の繰り返し（CRISPR）領域内にあり、該CRISPR領域が、ウイルスのゲノムの中の複数種類の標的にマッチする複数種類のガイドRNAをコードする、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
前記プロモーターが末梢神経系において転写を促進する、請求項32記載の組成物。
【請求項４０】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターまたはrAAVベースのベクターを含む、請求項39記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2014年5月30日出願の米国仮特許出願第62/005,395号および2014年7月25日出願の米国仮特許出願第62/029,072号（これらの内容は参照によって組み入れられる）の両方に基づく優先権および恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染細胞への治療薬の送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウイルス感染は、重大な医学的問題である。例えば、ヘルペスは、広範なヒト病原体であり、90％を超える成人が感染したことがある。潜伏のため、感染後、宿主は、症状を発現していなくても、ヘルペスウイルスを無限に保有する。同様に、ヒトパピローマウイルスまたはHPVは、ヒト集団における一般的なウイルスであり、75％を超える人々が感染するであろう。特に問題であるのは、ウイルス感染が癌をもたらし得ることである。例えば、HPVの宿主DNAへの組み込みは、癌、具体的には、子宮頸癌をもたらすことが公知である。エプスタインバーウイルス（EBV）は、伝染性単核症（腺熱）を引き起こすのみならず、ホジキンリンパ腫およびバーキットリンパ腫のような癌にも関連している。
【０００４】
ウイルスタンパク質を標的とする薬物を開発する努力がなされているが、それらの努力は完全には成功していない。例えば、ウイルスが潜伏状態にあり、そのタンパク質を活発に発現していない場合、標的とするものが存在しない。さらに、ウイルス感染を根絶する努力は、それが宿主細胞の機能に干渉する場合、有用でない。例えば、ウイルス複製を防止する酵素は、それが宿主全体の細胞内のゲノム複製に干渉する場合、役立たない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、ウイルスに感染した宿主細胞において選択的にウイルス感染を処置するための方法および治療薬を提供する。処置は、感染した宿主細胞の死のみを引き起こすことを含み得る。例えば、処置は、感染ウイルスのゲノムに由来するプロモーターのようなウイルス調節エレメントの制御下にあるか、またはウイルス複製開始点を含むベクターにコードされている、細胞死を引き起こすタンパク質のための遺伝子を送達することを含み得る。ウイルスが存在する場合、遺伝子が発現され、遺伝子産物が、細胞の死を引き起こすであろう。遺伝子は、アポトーシスにおいて重要なタンパク質をコードするものであってもよいし、または、遺伝子は、宿主ゲノムを消化するヌクレアーゼをコードするものであってもよい。
【０００６】
あるいは、処置剤は、宿主細胞機能に干渉することなく、ウイルス感染を除去する、抗ウイルス治療薬を含み得る。例えば、処置剤は、ウイルス核酸にターゲティングされるターゲティング可能なヌクレアーゼを含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼは、ウイルスのプロモーターまたは複製開始点のようなウイルス調節エレメントの制御下にある遺伝子として提供され得る。本発明は、例えば、アデノウイルス、AAV、および複製不全HSVのようなウイルスベクターを使用した、関心対象の細胞への抗ウイルス治療薬の標的特異的な送達を提供する。これらおよびその他の送達系は、ヌクレアーゼまたは細胞傷害性遺伝子カセットをコードする核酸（DNA、RNA、PNAおよびLNAのような合成核酸等）ベクターを送達するための媒体として使用され得る。本発明の送達方法は、抗ウイルス遺伝子編集配列を含有しているベクターを送達するのに有用である。本発明は、裸のDNAまたはRNA、タンパク質産物、潜伏ウイルス状態においてのみ活性を有し細胞殺傷遺伝子構築物もしくは治療剤（例えば、細胞傷害性タンパク質）発現を制御するプロモーターもしくはその他の制御配列を含有するプラスミドの送達も企図する。
【０００７】
ある特定の局面において、本発明は、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、治療薬のための遺伝子と、ウイルスに感染した細胞内で該治療薬の発現を引き起こす配列とを含むベクターを含む。配列は、ウイルスのゲノムに由来する調節エレメント（例えば、プロモーターおよび複製開始点）であり得る。
【０００８】
治療薬は、ウイルス感染細胞の死を選択的に引き起こす機序を提供するものであり得る。ある特定の態様において、治療薬は、ウイルス感染細胞の死を引き起こすタンパク質を含む。治療薬は、ウイルス感染細胞の死を選択的に引き起こすタンパク質であり得る。例えば、細胞における欠陥アポトーシス経路を回復させるタンパク質が使用され得る。遺伝子は、例えば、BAX、BAK、BCL-2、またはα溶血素であり得る。好ましくは、治療薬は、ウイルスに感染した細胞においてアポトーシスを誘導し、非感染細胞においてはアポトーシスを誘導しない。
【０００９】
いくつかの態様において、治療薬はターゲティング可能なヌクレアーゼであり、配列はウイルスのゲノムに由来する。例えば、ターゲティング可能なヌクレアーゼはcas9エンドヌクレアーゼであってよく、ベクターはさらに複数種類のガイドRNAをコードし得る。ガイドRNAは、ウイルスに感染した細胞のゲノムを標的とするよう設計され得る。
【００１０】
ある特定の態様において、プロモーターは、ウイルスによる潜伏感染の状態にある細胞内でのみ治療薬の発現を引き起こす。
【００１１】
ベクターは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルスのようなウイルスベクターであり得る。ベクターには、プラスミドが含まれ得る。ベクターには、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアが含まれ得る。
【００１２】
いくつかの局面において、本発明は、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、抗ウイルス治療薬と、ウイルスに感染した細胞において該治療薬の活性化を引き起こす調節エレメントとを含むベクターを含む。抗ウイルス治療薬は、任意で、ターゲティング可能なヌクレアーゼ（例えば、cas9、ZFN、TALENS、メガヌクレアーゼ）のための遺伝子であってよく、調節エレメントは、ウイルスのゲノムに由来するもの（例えば、プロモーターまたは複製開始点）であってよい。ベクターは、ウイルスのゲノムに由来する核酸へヌクレアーゼをターゲティングするガイドRNAをコードし得る。ある特定の態様において、ガイドRNAは、ヒトゲノムの中にパーフェクトマッチを有しないよう設計されている。ガイドRNAは、ウイルスのゲノムの中の調節エレメントへヌクレアーゼをターゲティングすることができる。アデノウイルス、単純ヘルペス1型、単純ヘルペス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒトパピローマウイルス、BKウイルス、JCウイルス、天然痘、B型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスB19、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、A型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、C型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、E型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、グアナリト（Guanarito）ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、D型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、またはバンナ（Banna）ウイルスのような任意の適当なウイルスを処置することができる。
【００１３】
本発明のある特定の態様は、共に、ウイルスゲノム材料を標的とし、選択的に編集するかまたは破壊する、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼおよびガイドRNA（gRNA）を使用する。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）は、ファージ感染から細菌を保護する細菌の免疫系の天然に存在する要素である。ガイドRNAは、ウイルス標的配列へCRISPR/Cas9複合体を局在させる。複合体の結合は、ウイルスゲノム標的配列へCas9エンドヌクレアーゼを局在させ、ウイルスゲノムにおいて破壊を引き起こす。好ましい態様において、ガイドRNAは、ウイルス核酸を崩壊させ、それが機能的に組み換えられる機会を低下させるために、ウイルスゲノム上の複数の部位を標的とするよう設計される。
【００１４】
本発明は、ウイルスに感染した（完全組織を含む）細胞へのCRISPR/gRNA/Cas9複合体またはその他の治療剤の標的特異的な送達の方法を提供する。本発明のCRISPR/gRNA/Cas9複合体は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはその他のベクターによって送達され得る。ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルスが含まれる。送達は、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフェアのような非ウイルスベクターによっても達成され得る。いくつかの非ウイルスベクターは、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝集を低下させ、細網内皮系による除去を最小化して、静脈内投与後の循環寿命の延長をもたらすため、ポリエチレングリコール（PEG）によってコーティングされ得る。本発明の局面は、組織を透過性化する効果の増加のための、送達ベクターへのエネルギー（超音波）の適用を提供する。本発明は、全身送達および局所送達の両方を企図する。
【００１５】
本発明の局面は、CRISPR/gRNA/Cas9複合体が、ウイルスゲノム材料を標的とし、宿主のゲノム材料は標的としないよう設計されることを可能にする。潜伏ウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス6型および7型、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹ウイルス、またはヒトパポーバウイルスであり得る。本発明の局面は、CRISPR/gRNA/Cas9複合体が、潜伏性または活性型である任意のウイルスを標的とするよう設計されることを可能にする。
【００１６】
提示された方法は、ウイルスゲノムの編集または破壊を可能にし、ウイルスの増殖能の欠如をもたらしかつ／または感染細胞のアポトーシスを誘導するが、非感染細胞に対する細胞傷害は観察されない。本発明の局面は、ウイルスゲノム材料（DNAまたはRNA）を選択的に標的とするCRISPR/gRNA/Cas9複合体を提供し、ウイルスゲノムを含有している細胞へCRISPR/gRNA/Cas9複合体を送達し、ウイルスを無能力化するためにウイルスゲノムを切断することを含む。提示された方法は、ウイルスゲノム内の複数個のエンドヌクレアーゼ作用部位を標的とすることによって引き起こされる複数個の破壊を介した、ウイルスゲノム機能の標的特異的な崩壊、または、好ましい態様において、ウイルス核酸の消化によって、処置を可能にする。本発明の局面は、細胞増殖を完全に抑制しかつ／または感染細胞のアポトーシスを誘導するため、CRISPR/gRNA/Cas9複合体カクテルのトランスフェクションを提供する。本発明の付加的な局面および利点は、以下の詳細な説明を考慮することによって明白になるであろう。
【００１７】
本発明の局面は、ウイルス感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、ヌクレアーゼのための遺伝子と、ウイルスのゲノムへ該ヌクレアーゼをターゲティングする配列と、特定の種類の細胞においてベクターからの転写を促進するプロモーターとを含むベクターを含む。組成物は、水痘帯状疱疹ウイルスによる感染を処置するために使用され得、即ち、帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を処置するかまたは防止するために使用され得る。いくつかの態様において、細胞は神経細胞であり、プロモーターは、神経細胞において選択的に前記遺伝子の発現を引き起こす。プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、または血小板由来増殖因子（PGDF）プロモーターであり得る。ある特定の態様において、ウイルスは水痘帯状疱疹ウイルスである。配列は、ウイルスのゲノムの中の調節エレメントを標的とするよう設計されていてよく、好ましくは、ヒトゲノムの中のいかなる正確なマッチも欠いている。ヌクレアーゼはcas9エンドヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、配列は、ベクター内のクラスター化した規則的に間隔を空けた短い回文配列の繰り返し（CRISPR）領域内にあり、CRISPR領域は、ウイルスのゲノムの中の複数種類の標的にマッチする複数種類のガイドRNAをコードする。末梢神経系における転写を促進するプロモーターが使用され得る。アデノウイルスベクター、rAAVベースのベクター、またはプラスミドのような任意の適当なベクターが使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】EBVを標的とするCRISPR/Cas9の設計を表す。（図1A）Cong L et al.(2013)CRISPR/Casシステムを使用した多重ゲノム操作（Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.）Science 339:819-823から改作されたCRISPR/Casプラスミドのスキーム。
【図１Ｂ】EBVを標的とするCRISPR/Cas9の設計を表す。（図1B）Raji細胞におけるトランスフェクション効率に対するoriPの効果。Cas9プラスミドおよびCas9-oriPプラスミドの両方がスクランブルガイドRNAを有する。
【図１Ｃ】EBVを標的とするCRISPR/Cas9の設計を表す。（図1C）EBV参照ゲノム上のCRISPRガイドRNAの標的。緑色、赤色、および青色は、3種類の異なる標的配列カテゴリを表す。
【図２Ａ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。（図2A）ガイドRNA sgEBV2の周辺のゲノム状況およびPCRプライマーの位置。
【図２Ｂ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。（図2B）sgEBV2によって誘導された大きい欠失。レーン1〜3は、それぞれ、sgEBV2処理の前、5日後、および7日後である。
【図２Ｃ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。（図2C）ガイドRNA sgEBV3/4/5の周辺のゲノム状況およびPCRプライマーの位置。
【図２Ｄ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。（図2D）sgEBV3/5およびsgEBV4/5によって誘導された大きい欠失。レーン1および2は、sgEBV3/5処理の前および8日後の3F/5R PCRアンプリコンである。レーン3および4は、sgEBV4/5処理の前および8日後の4F/5R PCRアンプリコンである。
【図２Ｅ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。sgEBV3/5（図2E）による処理の8日後のサンガー配列決定によって確認されたゲノム切断および修復ライゲーション。青色および白色の背景は、修復ライゲーション前の2個の末端を強調している。
【図２Ｆ】CRISPR/Cas9によって誘導された大きい欠失を表す。sgEBV4/5（図2F）による処理の8日後のサンガー配列決定によって確認されたゲノム切断および修復ライゲーション。青色および白色の背景は、修復ライゲーション前の2個の末端を強調している。
【図３Ａ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。（図3A）異なるCRISPR処理の後の細胞増殖曲線。5種類の独立したsgEBV1〜7処理がここに示される。
【図３Ｂ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の前（図3B）のフローサイトメトリー散乱光シグナル。青色および赤色は、亜集団P3およびP4に相当する。
【図３Ｃ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の5日後（図3C）のフローサイトメトリー散乱光シグナル。青色および赤色は、亜集団P3およびP4に相当する。
【図３Ｄ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の8日後（図3D）のフローサイトメトリー散乱光シグナル。青色および赤色は、亜集団P3およびP4に相当する。
【図３Ｅ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の前（図3E）のアネキシンV Alexa647およびDAPIによる染色の結果。
【図３Ｆ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の5日後（図3F）のアネキシンV Alexa647およびDAPIによる染色の結果。
【図３Ｇ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の8日後（図3G）のアネキシンV Alexa647およびDAPIによる染色の結果。
【図３Ｈ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理後の顕微鏡法によって明らかにされたアポトーシス細胞形態学。
【図３Ｉ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理後の顕微鏡法によって明らかにされたアポトーシス細胞形態学。
【図３Ｊ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の前（図3J）の核形態学。
【図３Ｋ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の後（図3K）の核形態学。
【図３Ｌ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の後（図3L）の核形態学。
【図３Ｍ】EBVゲノム破壊による細胞増殖停止を表す。sgEBV1〜7処理の後（図3M）の核形態学。
【図４Ａ】CRISPR処理後のEBV負荷定量を表す。（図4A）ディジタルPCRによる異なるCRISPR処理の後のEBV負荷。Cas9およびCas9-oriPは2反復を有し、sgEBV1〜7は5反復を有していた。
【図４Ｂ】CRISPR処理後のEBV負荷定量を表す。（図4B）全ゲノム増幅のための捕獲された単一細胞の顕微鏡法。
【図４Ｃ】CRISPR処理後のEBV負荷定量を表す。（図4C）全ゲノム増幅のための捕獲された単一細胞の顕微鏡法。
【図４Ｄ】CRISPR処理後のEBV負荷定量を表す。（図4D）処理前の単一細胞からのEBV定量的PCR Ct値のヒストグラム。（図4D）における赤色の点線は、各細胞の1個のEBVゲノムのCt値を表す。
【図４Ｅ】CRISPR処理後のEBV負荷定量を表す。（図4E）sgEBV1〜7処理の7日後の単一生細胞からのEBV定量的PCR Ct値のヒストグラム。（図4E）における赤色の点線は、各細胞の1個のEBVゲノムのCt値を表す。
【図５】図5は、EBV CRISPRのSURVEYORアッセイを表す。レーン1：NEB 100bpラダー；レーン2：sgEBV1対照；レーン3：sgEBV1；レーン4：sgEBV5対照；レーン5：sgEBV5；レーン6：sgEBV7対照；レーン7：sgEBV7；レーン8：sgEBV4。
【図６】図6は、EBV陰性バーキットリンパ腫DG-75によるCRISPR細胞傷害性試験を示す。
【図７】図7は、初代ヒト肺繊維芽細胞IMR-90によるCRISPR細胞傷害性試験を表す。
【図８】図8は、ZFNの使用を示す。
【図９】図9は、本発明の方法を図示する。
【図１０】図10は、HBVゲノムのマップである。
【図１１】図11は、ウイルス処置の送達の結果を示す。
【図１２】図12は、ある特定の態様による組成物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、一般に、ウイルス感染を標的とする治療の送達のための組成物および方法に関する。図9は、本発明の方法を図示する。図12は、ある特定の態様による組成物を示す。いくつかの態様において、組成物は、図12に示されるような、治療薬（例えば、ヌクレアーゼまたはアポトーシス関連遺伝子）のための遺伝子と、ウイルスによって駆動されるプロモーターとを少なくとも含むプラスミドのようなベクターを含む。組成物は、任意で、ガイドRNA、他のプロモーター、複製開始点、その他、またはそれらの組み合わせのうちの1種類または複数種類を含んでいてもよい。本発明は、ヌクレアーゼまたはその他の細胞傷害性要素の、関心対象の細胞への効果的な送達を可能にする方法および組成物を提供する。例えば、アデノウイルス、AAV、および複製不全HSVのようなウイルスベクターを使用した、関心対象の細胞への抗ウイルス治療薬の標的特異的な送達のための方法および組成物が提供される。これらおよびその他の送達系は、ヌクレアーゼまたは細胞殺傷遺伝子をコードするDNAベクターを送達するための媒体として使用され得る。これらの送達方法は、裸のDNAもしくはRNA、タンパク質産物、潜伏ウイルス状態においてのみ活性を有し細胞殺傷遺伝子を駆動するプロモーターを含有するプラスミド、またはその他の治療剤を送達するためにも使用され得る。本発明の方法および組成物は、ウイルスおよびウイルス感染細胞を特異的に標的とするよう設計される。
【００２０】
本発明によって企図される処置のうちの一つは、ウイルスゲノムを標的とするためのヌクレアーゼの使用である。いくつかの態様において、本発明は、関心対象の細胞へのヌクレアーゼの送達を含む。ヌクレアーゼは、ウイルスゲノムにおいて系統的に欠失を引き起こし、それによって、ウイルスゲノムの自己複製能を低下させることによって、細胞内の潜伏ウイルスを無能力化するかまたは崩壊させる能力を有する。態様において、処置剤は、ウイルスを無能力化するかまたは破壊するため、ウイルスゲノムにおける挿入、欠失、または再配置を引き起こす、CRISPR/CasとガイドRNAとの複合体を含む。
【００２１】
本発明は、一般に、ガイドされたヌクレアーゼシステムを使用してウイルス感染を選択的に処置するための組成物および方法に関する。本発明の方法は、一本鎖または二本鎖の破壊、切断、消化、または編集のようなヌクレアーゼ活性を通して、細胞内のウイルス核酸を無能力化するかまたは崩壊させるために使用される。本発明の方法は、ゲノムにおける大きい欠失または反復的な欠失を系統的に引き起こし、完全ゲノムの再構築の確率を低下させるために使用され得る。
【００２２】
i. 感染細胞の処置
図9は、ウイルスに感染した細胞を処置する方法を図示する。本発明の方法は、患者のインビボ処置に適用可能であり、例えば感染細胞においてアポトーシスを起こすことによって、または潜伏性ウイルス感染に関連したウイルスの遺伝子を消化することによって、ウイルスに感染した任意の細胞を処置するために使用され得る。方法は、例えば、細胞培養物または細胞試料を調製するかまたは処置するため、インビトロで使用され得る。インビボで使用される時、細胞は、任意の適当な生殖系列細胞または体細胞であり得、本発明の組成物は、患者の身体の特定の部分に送達されてもよいし、または全身送達されてもよい。全身送達される場合には、組織特異的プロモーターを本発明の組成物に含めることが好ましいことがある。例えば、患者が肝臓に限局性の潜伏性ウイルス感染を有する場合、ターゲティングされるヌクレアーゼをコードするプラスミドまたはウイルスベクターに、肝組織特異的プロモーターを含めることができる。  
【００２３】
ii. 治療薬
本発明の方法および組成物は、感染細胞に干渉することなく、感染した細胞の死を選択的に引き起こすか、またはウイルスを選択的に標的とするために使用され得る。
【００２４】
1. アポトーシス
いくつかの態様において、本発明は、感染している宿主細胞のみの死を引き起こすために使用され得る方法および治療薬を提供する。例えば、処置は、感染ウイルスのゲノムに由来するプロモーターのようなウイルス調節エレメントの制御下にあるか、またはウイルス複製開始点を含むベクターにコードされている、細胞死を引き起こすタンパク質のための遺伝子の送達を含み得る。ウイルスが存在する場合、遺伝子が発現され、遺伝子産物が細胞の死を引き起こすであろう。遺伝子は、アポトーシスにおいて重要なタンパク質をコードするものであってもよいし、または、遺伝子は、宿主ゲノムを消化するヌクレアーゼをコードするものであってもよい。
【００２５】
治療薬は、ウイルスに感染した細胞内で治療薬の発現を引き起こす配列もコードするベクターの中にコードされて提供され得る。配列は、ウイルスのゲノムに由来する調節エレメント（例えば、プロモーターおよび複製開始点）であり得る。治療薬は、ウイルス感染細胞の死を選択的に引き起こす機序を提供するものであってよい。例えば、細胞内の欠陥アポトーシス経路を回復させるタンパク質が使用され得る。遺伝子は、例えば、BAX、BAK、BCL-2、またはα溶血素であり得る。好ましくは、治療薬は、ウイルスに感染した細胞においてアポトーシスを誘導し、非感染細胞においてはアポトーシスを誘導しない。
【００２６】
少数の細胞が感染しており、（潜伏ウイルスゲノムのみならず）細胞全体を除去することが十分であるケースにおいて、本発明の局面は、潜伏ウイルス状態において活性を有する、細胞殺傷遺伝子を駆動するプロモーターを含有しているベクターの投与を企図する。HSVは、数千〜数万のニューロンのみが潜伏感染すると推定されているため、このアプローチの特に興味深い標的である。参照によって組み入れられる、Hoshino et al.,2008,単純ヘルペスウイルス感染ニューロンの数および1ニューロン当たりのウイルスゲノムの数は神経節内の潜伏ウイルス負荷に相関する（The number of herpes simplex virus-infected neurons and the number of viral genome copies per neuron correlate with latent viral load in ganglia）,Virology 372(1):56-63を参照すること。細胞殺傷遺伝子の例には、BAXおよびBAKのようなアポトーシスエフェクター、ならびにα溶血素のような細胞またはミトコンドリア膜の完全性を破壊するタンパク質が含まれる。（Bayles,「細菌プログラム細胞死：逆説の道理（Bacterial programmed cell death:making sense of a paradox）」Nature Reviews Microbiology 12pp.63-69(2014)）。潜伏感染細胞内でのみ活性化されるプロモーターは、この状況において使用され得るのみならず、活性を感染細胞に対して特異的にすることによって、ヌクレアーゼ治療の選択性を増加させるためにも使用される；そのようなプロモーターの一例は、潜伏関連プロモーター1または「LAP1」である（Preston and Efstathiou,「HSVの潜伏および再活性化の分子的基礎（Molecular Basis of HSV Latency and Reactivation）」,in Human Herpesviruses: Biology,Therapy and Immunoprophylaxis 2007.）。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、アポトーシスを促進する少なくとも1種類の遺伝子と、少なくとも1種類のウイルスゲノム関連プロモーターとをコードする、ウイルスベクター、プラスミド、またはその他のコード核酸を含む組成物を提供する。アポトーシス制御因子Bcl-2は、ミトコンドリア外膜透過性（MOMP）を支配する、Bax、BAD、Bak、Bok、Bcl-rambo、Bcl-xs、およびBOK/Mtdのようなアポトーシス促進タンパク質を含むタンパク質のファミリーである。
【００２８】
bcl-2様タンパク質4としても公知のアポトーシス制御因子BAXは、ヒトにおいてBAX遺伝子によってコードされるタンパク質である。BAXは、Bcl-2遺伝子ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、BCL2とのヘテロ二量体を形成し、アポトーシス活性化因子として機能する。このタンパク質は、ミトコンドリア電位依存性アニオンチャネル（VDAC）と相互作用し、その開口を増加させ、膜電位の喪失およびシトクロムcの放出をもたらすことが報告されている。
【００２９】
Bcl-2相同アンタゴニスト／キラーは、ヒトにおいて6番染色体上のBAK1遺伝子によってコードされるタンパク質である。このタンパク質はミトコンドリアに局在し、アポトーシスを誘導するよう機能する。それは、電位依存性アニオンチャネルと相互作用し、その開口を加速させ、膜電位の喪失およびシトクロムcの放出をもたらす。
【００３０】
このファミリーに属するタンパク質をコードするヒト遺伝子には、BAK1、BAX、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL2L10、BCL2L13、BCL2L14、BOK、およびMCL1が含まれる。
【００３１】
2. 抗ウイルス剤
本発明の方法は、ウイルス核酸を特異的に破壊の標的とするための、プログラム可能またはターゲティング可能なヌクレアーゼの使用を含む。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、任意の適当なターゲティングヌクレアーゼが使用され得る。参照によって組み入れられる、Schiffer,2012,慢性ウイルス感染の治療のための標的特異的なDNA変異誘発（Targeted DNA mutagenesis for the cure of chronic viral infections）,J Virol 88(17):8920-8936を参照すること。
【００３２】
CRISPR方法論は、任意のゲノム位置においてプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の上流で配列特異的にDNAを切断するため、ガイドとしての小さいRNA（gRNA）と複合体化するヌクレアーゼ、CRISPR関連（Cas9）を利用する。CRISPRは、crRNAおよびtracrRNAとして公知の別々のガイドRNAを使用し得る。短いガイドRNAの設計を通して、部位特異的な哺乳動物ゲノム切断を可能にするため、これらの2種類の別々のRNAは単一のRNAへ組み合わせられた。Cas9およびガイドRNA（gRNA）は、公知の方法によって合成され得る。Cas9/ガイドRNA（gRNA）は、非特異的なDNA切断タンパク質Cas9と、標的にハイブリダイズしかつCas9/gRNA複合体をリクルートするためのRNAオリゴとを使用する。Chang et al.,2013,ゼブラフィッシュ胚におけるRNAガイドCas9ヌクレアーゼによるゲノム編集（Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos）,Cell Res 23:465-472；Hwang et al.,2013,CRISPR-Casシステムを使用したゼブラフィッシュにおける効率的なゲノム編集（Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system）,Nat.Biotechnol 31:227-229；Xiao et al.,2013,ゼブラフィッシュにおけるTALENおよびCRISPR/Casによって媒介される染色体の欠失および逆位（Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENS and CRISPR/Cas in zebrafish）,Nucl Acids Res 1-11を参照すること。
【００３３】
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）は、細菌に見出され、ファージ感染から細菌を保護すると考えられている。それは、最近、真核生物DNAにおける遺伝子発現を変える手段として使用されているが、抗ウイルス治療として、または、より広く、ゲノム材料を崩壊させるための方式としては提唱されていない。むしろ、それは、標的とされた細胞または細胞の集団のDNAの転写を増加させるかまたは減少させる方式として、挿入または欠失を導入するために使用されている。例えば、Horvath et al.,Science(2010)327:167-170；Terns et al.,Current Opinion in Microbiology(2011)14:321-327；Bhaya et al.Annu Rev Genet(2011)45:273-297；Wiedenheft et al.Nature(2012)482:331-338)；Jinek M et al.Science(2012)337:816-821；Cong L et al.Science(2013)339:819-823；Jinek M et al.(2013)eLife 2:e00471；Mali P et al.(2013)Science 339:823-826；Qi LS et al.(2013)Cell 152:1173-1183；Gilbert LA et al.(2013)Cell 154:442-451；Yang H et al.(2013)Cell 154:1370-1379；およびWang H et al.(2013)Cell 153:910-918を参照すること。さらに、同時係属中の米国特許仮出願第62/005,395においては、CRISPRは、抗ウイルス治療として、または、より広く、ゲノム材料を崩壊させるための方式として提唱されている。
【００３４】
本発明の一局面において、Cas9エンドヌクレアーゼは、ゲノム内の少なくとも2箇所において二本鎖破壊を引き起こす。これらの2個の二本鎖破壊は、ゲノムの断片の欠失を引き起こす。ウイルス修復経路が2個の末端をアニールしたとしても、ゲノムにはまだ欠失が存在するであろう。この機序を使用した1個または複数個の欠失は、ウイルスゲノムを無能力化するであろう。その結果、宿主細胞からウイルス感染が取り除かれるであろう。
【００３５】
本発明の態様において、ヌクレアーゼは、標的ウイルスのゲノムを切断する。ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素である。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼIのように、比較的非特異的に（配列に関係なく）DNAを切断するものもあるが、典型的には、制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素と呼ばれる多くのものが、極めて特異的なヌクレオチド配列においてのみ切断する。本発明の好ましい態様において、Cas9ヌクレアーゼが、本発明の組成物および方法へ組み入れられるが、任意のヌクレアーゼが利用され得ることが認識されるべきである。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、Cas9ヌクレアーゼが、ゲノムを切断するために使用される。Cas9ヌクレアーゼは、ゲノムにおいて二本鎖破壊を作製することができる。Cas9ヌクレアーゼは、各々異なる鎖を切断する2個の機能ドメイン：RuvCおよびHNHを有する。これらのドメインの両方が活性型である時、Cas9はゲノムにおいて二本鎖破壊を引き起こす。
【００３７】
本発明のいくつかの態様において、ゲノムへの挿入が、無能力化またはゲノム発現の変化を引き起こすよう設計され得る。さらに、二本鎖破壊部に終止コドンを作製することによって、または二本鎖破壊部の下流に終止コドンが作製されるようリーディングフレームをシフトさせることによって、早熟終止コドンを導入するためにも、挿入／欠失が使用される。標的遺伝子を崩壊させるため、NHEJ修復経路のこれらの転帰のいずれかに影響を及ぼすことができる。CRISPR/gRNA/Cas9システムの使用によって導入された変化は、ゲノムに永続する。
【００３８】
本発明のいくつかの態様において、少なくとも1個の挿入が、CRISPR/gRNA/Cas9複合体によって引き起こされる。好ましい態様において、多数の挿入がゲノムにおいて引き起こされ、それによって、ウイルスを無能力化する。本発明の一局面において、多数の挿入は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。
【００３９】
本発明のいくつかの態様において、少なくとも1個の欠失が、CRISPR/gRNA/Cas9複合体によって引き起こされる。好ましい態様において、多数の欠失がゲノムにおいて引き起こされ、それによって、ウイルスを無能力化する。本発明の一局面において、多数の挿入は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。高度に好ましい態様において、本発明のCRISPR/Cas9/gRNAシステムは、宿主ゲノムを完全なままにしながら、有意なゲノム崩壊を引き起こし、ウイルスゲノムの効果的な破壊をもたらす。
【００４０】
TALENは、本質的に任意の配列を標的とすることができるDNA結合ドメインに融合した非特異的なDNA切断ヌクレアーゼを使用する。TALENテクノロジーについては、標的部位が同定され、発現ベクターが作製される。（例えば、Notlによって）直鎖化された発現ベクターが、mRNA合成のための鋳型として使用され得る。Life Technologies（Carlsbad,CA）のmMESSAGE mMACHINE SP6転写キットのような市販のキットが使用され得る。Joung & Sander,2013,TALEN：標的特異的なゲノム編集のための広く適用可能なテクノロジー（TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing）,Nat Rev Mol Cell Bio 14:49-55を参照すること。
【００４１】
TALEN法およびCRISPR法は、標的部位との1対1の関係を提供する、即ち、TALEドメイン内のタンデムリピートの1単位は、標的部位の1ヌクレオチドを認識し、CRISPR/CasシステムのcrRNA、gRNA、またはsgRNAは、DNA標的内の相補的な配列にハイブリダイズする。方法は、標的において二本鎖破壊を生成するための、TALENペアまたはCas9タンパク質と1個のgRNAとのペアの使用を含み得る。次いで、破壊は、非相同末端結合または相同組換え（HR）を介して修復される。
【００４２】
図8は、ウイルス核酸を切断するために使用されているZFNを示す。簡単に説明すると、ZFN法は、ターゲティングされるZFN 305および任意で少なくとも1種類の付属のポリヌクレオチドをコードする少なくとも1種類のベクター（例えば、RNA分子）を、感染した宿主細胞中に導入する工程を含む。例えば、参照によって組み入れられる、Weinsteinの米国公開第2011/0023144号を参照すること。細胞は標的配列311を含む。細胞がZFN 305の発現を可能にするためにインキュベートされ、標的とされた染色体配列311へ、ZFN 305によって、二本鎖破壊317が導入される。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドまたは交換ポリヌクレオチド321が導入される。ウイルス核酸の一部分の、無関係の配列への取り替えは、ウイルス核酸の転写または複製に完全に干渉し得る。標的DNA 311は、交換ポリヌクレオチド321と共に、エラープローン非相同末端結合DNA修復過程または相同組換えDNA修復過程によって修復され得る。
【００４３】
典型的には、ZFNは、DNA結合ドメイン（即ち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（即ち、ヌクレアーゼ）を含み、この遺伝子は（例えば、5'キャップ、ポリアデニル、またはその両方を有する）mRNAとして導入され得る。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の選択の核酸配列を認識しそれに結合するよう操作され得る。例えば、参照によって組み入れられる、Qu et al.,2013,ジンクフィンガーヌクレアーゼは感染ヒトT細胞および潜伏感染ヒトT細胞からのHIV-1プロウイルスDANの特異的かつ効率的な切り出しを媒介する（Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DAN from infected and latently infected human T cells）,Nucl Ac Res 41(16):7771-7782を参照すること。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作法には、合理的設計および様々な型の選択が含まれるが、これらに限定されない。ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガー認識領域（即ち、ジンクフィンガー）を介して標的DNA配列を認識するよう設計され得る。例えば、参照によって組み入れられる、米国特許第6,607,882号；第6,534,261号、および第6,453,242号を参照すること。ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法は、ファージディスプレイ系およびツーハイブリッド系を含み得、各々参照によって組み入れられる、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,410,248号；米国特許第6,140,466号；米国特許第6,200,759号；および米国特許第6,242,568号に開示されている。
【００４４】
ZFNは切断ドメインも含む。ZFNの切断ドメイン部分は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼのような、任意の適当なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから入手され得る。例えば、Belfort & Roberts,1997,ホーミングエンドヌクレアーゼ：適切なハウスキーピング（Homing endonucleases:keeping the house in order）,Nucleic Acids Res 25(17):3379-3388を参照すること。切断ドメインは、切断活性のために二量化を必要とする酵素に由来し得る。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体のモノマーを構成するため、2個のZFNが切断のために必要とされ得る。あるいは、単一のZFNが、活性酵素二量体を作製するための両方のモノマーを含んでいてもよい。存在する制限エンドヌクレアーゼは、DNAに配列特異的に結合し、結合の部位またはその近くでそれを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、IIS型）は、認識部位から離れた部位でDNAを切断し、かつ分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、二量体として活性型であるIIS型酵素FokIは、一方の鎖の認識部位から9ヌクレオチド、他方の鎖の認識部位から13ヌクレオチドで、DNAの二本鎖切断を触媒する。ZFNにおいて使用されるFokI酵素は、切断モノマーと見なされ得る。従って、FokI切断ドメインを使用した標的特異的な二本鎖切断のため、各々がFokI切断モノマーを含む2個のZFNが、活性酵素二量体を再構成するために使用されてもよい。各々参照によって組み入れられる、Wah,et al.,1998,FokIの構造はDNA切断に関係している（Structure of FokI has implications for DNA cleavage）,PNAS 95:10564-10569；米国特許第5,356,802号；米国特許第5,436,150号；米国特許第5,487,994号；米国公開第2005/0064474号；米国公開第2006/0188987号；および米国公開第2008/0131962号を参照すること。
【００４５】
ZFNを使用してウイルスを標的とすることは、配列を含む少なくとも1種類のドナーポリヌクレオチドの細胞内への導入を含み得る。ドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、染色体内の組み込み部位のいずれかの側との配列類似性を共有する上流配列および下流配列が隣接している、導入される配列を含む。ドナーポリヌクレオチド内の上流配列および下流配列は、関心対象の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するよう選択される。典型的には、ドナーポリヌクレオチドは、DNAであろう。ドナーポリヌクレオチドは、DNAプラスミド、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、ウイルスベクター、DNAの直鎖状の小片、PCR断片、裸の核酸であってもよく、リポソームのような送達媒体を利用してもよい。ドナーポリヌクレオチドの配列には、エクソン、イントロン、制御配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。二本鎖破壊は、所望の配列が染色体へ組み込まれるような、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを介して修復される。染色体配列を変化させるためのZFNによって媒介される過程において、ZFNによって染色体配列へ導入された二本鎖破壊は、交換ポリヌクレオチド内の配列が染色体配列の一部分に交換され得るような、交換ポリヌクレオチドとの相同組換えを介して修復される。二本鎖破壊の存在は、相同組換えおよび破壊の修復を容易にする。交換ポリヌクレオチドは、物理的に組み込まれてもよいし、あるいは、交換ポリヌクレオチドは、交換ポリヌクレオチドの配列情報の、染色体配列のその部分の配列情報との交換をもたらす、破壊の修復のための鋳型として使用されてもよい。従って、ウイルス核酸の一部分は、交換ポリヌクレオチドの配列に変換され得る。ZFN法は、ZFNをコードする核酸分子、および、任意で、少なくとも1種類の交換ポリヌクレオチドまたは少なくとも1種類のドナーポリヌクレオチドを、感染細胞へ送達するための、ベクターの使用を含み得る。
【００４６】
メガヌクレアーゼは、大きい認識部位（12〜40塩基対の二本鎖DNA配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり；結果として、この部位は、一般に、所定のゲノムに一度だけ存在する。例えば、（単一ミスマッチを含む配列はヒトサイズのゲノムに約3回存在するが）I-SceIメガヌクレアーゼによって認識される18塩基対配列は、偶然に1回見出されるために、平均して、ヒトゲノムのサイズの20倍のゲノムを必要とするであろう。従って、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると見なされる。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づき、五つのファミリー：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cysボックス、およびPD-(D/E)XKへ分類され得る。独立しているメンバーも存在するが、最も十分に研究されているファミリーは、生物の全ての界に見出され、一般に、イントロンまたはインテインにコードされているLAGLIDADGタンパク質のファミリーである。配列モチーフLAGLIDADGは、酵素活性のための必須の要素を表す。いくつかのタンパク質は、そのようなモチーフを1個しか含有していなかったが、他のものは2個含有していた；いずれのケースにおいても、他のファミリーメンバーとの配列類似性をほとんど〜全く有していないおよそ75〜200アミノ酸残基が、モチーフに後続していた。結晶構造は、LAGLIDADGファミリーについての配列特異性のモードおよび切断機序を例示する：（i）特異性接触は、延長されたβ鎖のDNAの主溝への埋め込みから発生し、DNA結合サドルは、DNAのヘリカルツイストを模倣するピッチおよび輪郭を有する；（ii）タンパク質とDNAとの間の完全な水素結合能は完全には実現されない；（iii）中央の「4塩基」領域におけるDNAの歪みによって、解離しやすいリン酸結合がタンパク質触媒コアにより近くなる、副溝を横切って、特徴的な4ntの3'-OH突出を生成するための切断が起こる；（iv）切断は、独特の「金属共有」パラダイムを時に含む、提唱された2金属機序を介して起こる；（v）そして、最後に、付加的な親和性および／または特異性の接触が、コアα/β折り畳みの外部の領域において、「適合した」足場から発生し得る。参照によって組み入れられる、Silva et al.,2011,標的特異的なゲノム操作のためのメガヌクレアーゼおよびその他のツール（Meganucleases and other tools for targeted genome engineering）,Curr Gene Ther 11(1):11-27を参照すること。
【００４７】
本発明のいくつかの態様において、鋳型配列がゲノムへ挿入される。ゲノムDNAへヌクレオチド改変を導入するためには、所望の配列を含有しているDNA修復鋳型が、HDRの間に存在しなければならない。DNA鋳型は、通常、gRNA/Cas9と共に細胞へトランスフェクトされる。各ホモロジーアームの長さおよび結合位置は、導入される変化のサイズに依存する。適当な鋳型の存在下で、HDRは、Cas9によって誘導された二本鎖破壊部に特異的なヌクレオチドの変化を導入することができる。
【００４８】
本発明のいくつかの態様は、ヌクレアーゼの改変バージョンを利用してもよい。単一の不活性触媒ドメインRuvC-またはHNH-を含有しているCas9酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ（nickases）」と呼ばれる。1個の活性ヌクレアーゼドメインのみを有するCas9ニッカーゼは、標的DNAの一方の鎖のみを切断して、一本鎖破壊または「ニック」を作製する。不活性dCas9（RuvC-かつHNH-）に類似して、Cas9ニッカーゼは、やはりgRNA特異性に基づきDNAに結合することができるが、ニッカーゼはDNA鎖の一方のみを切断する。CRISPRプラスミドの大半は、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）に由来し、RuvCドメインはD10A変異によって不活化され得、HNHドメインはH840A変異によって不活化され得る。
【００４９】
一本鎖破壊またはニックは、通常、完全な相補DNA鎖を鋳型として使用して、HDR経路を通して迅速に修復される。しかしながら、Cas9ニッカーゼによって導入された2個の近位の反対鎖ニックは、「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」CRISPRシステムとしばしば呼ばれるものにおいて、二本鎖破壊として処理される。ダブルニックによって誘導された二本鎖破壊は、遺伝子標的に対する所望の効果に依って、NHEJまたはHDRのいずれかによって修復され得る。これらの二本鎖破壊部において、CRISPR/Cas9複合体によって、挿入および欠失が引き起こされる。本発明の一局面において、欠失は、2個の二本鎖破壊を相互に近く位置付けることによって引き起こされ、それによって、ゲノムの断片の欠失を引き起こす。
【００５０】
iii.ターゲティング部分
ヌクレアーゼは、作用するためにgRNAのターゲティング特異性を使用することができる。下記のように、ガイドRNAまたはシングルガイドRNAは、ウイルスゲノムを標的とするよう特異的に設計される。
【００５１】
本発明のCRISPR/Cas9遺伝子編集複合体は、ウイルスゲノムを標的とするガイドRNAによって最適に作用する。ガイドRNA（gRNA）またはシングルガイドRNA（sgRNA）は、ウイルスゲノム崩壊を引き起こすため、CRISPR/Cas9複合体をウイルスゲノムへ導く。本発明の一局面において、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、細胞内の特定のウイルスを標的とするよう設計される。本発明の組成物を使用して、任意のウイルスを標的とし得ることが認識されるべきである。ウイルスゲノムの特異的な領域の同定は、CRISPR/Cas9/gRNA複合体の開発および設計を助ける。
【００５２】
本発明の一局面において、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、細胞内の潜伏ウイルスを標的とするよう設計される。細胞内にトランスフェクトされた後、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、ゲノムを無能力化するため、反復的な挿入もしくは欠失を引き起こすか、または多数の挿入もしくは欠失によって、修復の確率が有意に低下する。
【００５３】
一例として、ヒトヘルペスウイルス4型（HHV-4）とも呼ばれるエプスタインバーウイルス（EBV）は、本発明のCRISPR/Cas9/gRNA複合体によって細胞において不活化される。EBVはヘルペス科のウイルスであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスのうちの一つである。ウイルスは、直径およそ122nm〜180nmであり、タンパク質カプシドに包囲されたDNAの二重らせんから構成されている。この例において、Raji細胞株が適切なインビトロモデルとして用いられる。Raji細胞株は、造血起源からの最初の連続ヒト細胞株であり、細胞株は、エプスタインバーウイルスの異常な株を産生し、最も広範囲に研究されているEBVモデルのうちの一つである。Raji細胞においてEBVゲノムを標的とするためには、EBVに対する特異性を有するCRISPR/Cas9複合体が必要である。Addgene,Incから入手された、U6プロモーターによって駆動されるキメラガイドRNA（sgRNA）および遍在性プロモーターによって駆動されるCas9からなるEBVを標的とするCRISPR/Cas9プラスミドの設計。市販のガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼが、本発明によって使用されてもよい。Cas9タンパク質の後に融合したEGFPマーカーは、Cas9陽性細胞の選択を可能にした（図1A）。
【００５４】
本発明の一局面において、ガイドRNAは、商業的に購入されるか否かに関わらず、特異的なウイルスゲノムを標的とするよう設計される。ウイルスゲノムを同定し、ウイルスゲノムの選択された部分を標的とするためのガイドRNAを開発し、本発明の組成物へ組み入れる。本発明の一局面において、ウイルスの特定の株の参照ゲノムを、ガイドRNA設計のために選択する。
【００５５】
例えば、EBVゲノムを標的とするガイドRNAは、本発明の実施例におけるシステムの成分である。例えば、EBVに関して、株B95-8からの参照ゲノムを、設計ガイドとして使用した。EBVのような関心対象のゲノム内で、選択された領域または遺伝子が標的とされる。例えば、異なるゲノム編集目的のための7種類のガイドRNAの設計によって、6個の領域を標的とすることができる（図1Cおよび表S1）。
【００５６】
（表Ｓ１）ガイドRNA標的配列
ガイドRNA配列
2017518372.tif 000003
【００５７】
EBVに関して、EBNA1は、感染の潜伏モードおよび溶解モードの両方において発現される唯一の核エプスタインバーウイルス（EBV）タンパク質である。EBNA1は、潜伏感染においていくつかの重要な役割を果たすことが公知であり、EBNA1は、遺伝子制御および潜伏ゲノム複製を含む多くのEBV機能にとって重要である。従って、EBNA1コード領域全体を切り出すため、ゲノムのこの領域の両端を標的とするよう、ガイドRNA sgEBV4およびsgEBV5を選択した。これらの「構造」標的は、EBVゲノムのより小さい小片への系統的な消化を可能にする。EBNA3CおよびLMP1は、宿主細胞形質転換のために必須であり、これらの2種類のタンパク質の5'エクソンを標的とするよう、それぞれ、ガイドRNA sgEBV3およびsgEBV7を設計した。
【００５８】
iv. 細胞への導入
本発明の方法は、ヌクレアーゼおよび配列特異的ターゲティング部分を細胞中に導入する工程を含む。ヌクレアーゼは該配列特異的ターゲティング部分によってウイルス核酸へターゲティングされ、次いで、そこで、宿主ゲノムに干渉することなく、ウイルス核酸を切断する。感染した細胞または組織へヌクレアーゼを送達するため、任意の適当な方法を使用することができる。例えば、注射によって、経口的に、または水力学的送達によって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子を送達することができる。ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、全身循環へ送達されてもよいし、または特定の組織型へ送達されるか、もしくはその他の方法で局在させられてもよい。
【００５９】
いくつかのウイルス感染は、少数の細胞のみに影響を与え、標的特異的な送達アプローチを利用することが好ましい場合がある。例えば、HSVは、およそ20,000個のニューロンのみを潜伏感染させると推測されている。これおよびその他のウイルス感染について、関心対象の細胞へのみターゲティングされる処置を有することは重要であり得る。細胞の親和性および特異性を増加させることによって、治療薬送達効率を大いに改善することができる。
【００６０】
ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、コードされたヌクレアーゼが、ある特定の組織型において、優先的にまたは唯一、転写されるよう、組織特異的プロモーターを使用することによって、ある特定の条件の下でのみ活性型であるよう改変されるかまたはプログラムされてもよい。
【００６１】
いくつかの態様において、特異的なCRISPR/Cas9/gRNA複合体が細胞中に導入される。ガイドRNAは、ウイルスゲノムの配列の少なくとも1種類のカテゴリを標的とするよう設計される。潜伏感染に加えて、本発明は、パッケージングされる前または放出された後のウイルスゲノムを標的とすることによって、活発に複製するウイルスをコントロールするために使用されてもよい。
【００６２】
予めパッケージングされたGFP-Cas9アデノウイルスは、Vector Biolabs（Philadelphia,PA）から入手可能である。EBVを標的とする配列のような、様々なターゲティングgRNA配列が、アデノウイルス株にパッケージングされ得る。gRNA配列は、CRISPR/Cas9複合体と共に収容されてもよいし、または別々に収容されてもよい。
【００６３】
いくつかの態様において、ガイドRNAのカクテルを細胞中に導入することができる。ガイドRNAは、ウイルスゲノムの配列の多数のカテゴリを標的とするよう設計される。ゲノム上のいくつかの区域を標的とすることによって、複数の位置における二本鎖破壊は、ゲノムを断片化し、修復の可能性を低下させる。修復機序によってすら、大きい欠失はウイルスを無能力化する。
【００６４】
いくつかの態様において、配列の異なるカテゴリを標的とするためのカクテルを作製するため、数種類のガイドRNAが添加される。例えば、2種類、5種類、7種類、または11種類のガイドRNAが、3種類の異なる配列のカテゴリを標的とするCRISPRカクテルの中に存在し得る。しかしながら、任意の数のgRNAを、配列のカテゴリを標的とするためのカクテルへ導入することができる。好ましい態様において、配列のカテゴリは、それぞれ、ゲノム構造、宿主細胞形質転換、および感染潜伏にとって重要である。
【００６５】
本発明のいくつかの局面において、インビトロ実験が、ウイルスゲノム内の最も必須の標的の決定を可能にする。例えば、ゲノムの効果的な無能力化のための最も必須の標的を理解するため、ガイドRNAのサブセットをモデル細胞へトランスフェクトする。配列の必須のカテゴリを標的とするために最も効果的であるガイドRNAまたはカクテルを、アッセイによって決定することができる。
【００６６】
これらの作用物質は、ウイルスベクターの一部として送達されてもよいし（例はさらに後述される）、または裸のDNAもしくはRNAとして送達されてもよい。裸の核酸は、分解を回避するために改変されてもよい。
【００６７】
もう一つの可能性は、シグナリング分子に融合しているか、または表面上にシグナリング分子を有する小胞へパッケージングされているか、またはナノ粒子、小胞へ充填されているか、またはコロイドに付着しているタンパク質産物自体を送達することである。この送達方法の例は、以前に癌において調査されたが、潜伏性ウイルス感染に対する局所送達には適用されていない（Alexis et al,「癌治療のためのナノ粒子テクノロジー（Nanoparticle Technologies for Cancer Therapy）」in Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology 197,2010を参照すること）。他の送達方法は、以下に詳細に記載される。感染させる細胞および組織に関して高度に限局性であるHSVおよびその他のウイルスについて、これらの治療は、局所注射またはクリームとして送達され得る。
【００６８】
本発明の他の態様において、HSVのような疾患において、潜伏感染を有する細胞が限局性であるという事実を活用して、それらの細胞を除去するために物理的アプローチを使用することができる。一つのアプローチは、（例えば、ウイルスタンパク質もしくはウイルスゲノムに対する蛍光マーカー、またはウイルス潜伏プロモーターによって誘導された蛍光タンパク質を使用して）感染細胞を画像化し、次いで、熱、光、または高周波照射を使用してそれらの細胞を除去することである。直接、造影剤を感染細胞に対して使用することもできる。蛍光分子の代わりに、光または高周波と強く相互作用する半導体もしくは金属ナノ粒子、コロイド、またはその他の構造を使用してもよい。これらは、クリームまたは注射によって局所適用され得る。これらの物質は、感染細胞が複数個の粒子を誘引し、それによって、最も高い効果を有するよう、協同効果を活用することができる可能性がある。類似したアプローチは、癌処置において使用されている（例えば、Jain et al 「癌治療のための新規薬剤としての金ナノ粒子（Gold nanoparticles as novel agents for cancer therapy）」Br J Radiol Feb 2012 85(1010):101-113を参照すること）。本発明は、潜伏性ウイルス感染の処置にこれらの技術を適用する。
【００６９】
もう一つの態様において、単一細胞解像度で、高度に局所的な画像化および放射線送達を可能にする光ファイバー内視鏡のような顕微鏡下手術ツールを使用して、標識された感染細胞を切り出すことができる（Barretto RP and Schnitzer MJ.「生組織内の深部の溶解中の細胞の画像化のためのインビボ光学顕微内視鏡（In Vivo Optical Microendoscopy for Imaging Cells Lying Deep in Live Tissue.）」Cold Spring Harb Protoc.2012(10)およびLlewellyn ME,Barretto RPJ,Delp SL & Schnitzer MJ.(2008)マウスおよびヒトにおける筋節収縮動力学の低侵襲高速画像化（Minimally invasive high-speed imaging of sarcomere contractile dynamics in mice and humans.）Nature.454 784-788を参照すること）。
【００７０】
例えば、EBVゲノムを標的とするケースにおいて、CRISPRカクテル中の7種類のガイドRNAが、それぞれ、EBVゲノム構造、宿主細胞形質転換、および感染潜伏にとって重要であることが同定されている3種類の異なる配列のカテゴリを標的とした。効果的なEBV処置のために最も必須の標的を理解するため、Raji細胞をガイドRNAのサブセットによってトランスフェクトした。sgEBV4/5は、EBVゲノムを85％低下させたが、完全なカクテルほど効果的には細胞増殖を抑制することができなかった（図3A）。構造配列を標的とするガイドRNA（sgEBV1/2/6）は、完全なEBV負荷を排除しなかった（26％減少）にも関わらず、細胞増殖を完全に停止させることができた。ゲノム編集の高い効率および増殖停止から（図2）、sgEBV1/2/6における残存EBVゲノムサインは、完全ゲノムによるのではなく、EBVゲノムから消化された遊離したDNAによるもの、即ち、偽陽性であると推測された。
【００７１】
CRISPR/Cas9/gRNA複合体を構築した後、複合体を細胞中に導入する。インビトロモデルまたはインビボモデルにおいて、複合体を細胞中に導入し得ることが認識されるべきである。本発明の一局面において、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、トランスフェクション後にウイルスの完全なゲノムを残さないよう設計されるのではなく、複合体は、効率的なトランスフェクションのために設計される。
【００７２】
本発明の局面は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む様々な方法によって、CRISPR/Cas9/gRNAが細胞へトランスフェクトされることを可能にする。ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが含まれ得る。細胞へのCRISPR/Cas9/gRNA複合体の送達を実行するため、任意のウイルスベクターが本発明へ組み入れられ得ることが認識されるべきである。CRISPR/Cas9/gRNA複合体が消化のために設計されるか、それとも無能力化のために設計されるかに依って、いくつかのウイルスベクターが、他のものより効果的であり得る。本発明の一局面において、ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製および維持のために必要である、複製開始点のような必須の成分を含有している。
【００７３】
本発明の一局面において、複合体を細胞へ送達するための送達ベクターとして、ウイルスベクターが使用される。送達ベクターとしてのウイルスベクターの使用は、当技術分野において公知である。例えば、Wilkesらの米国公開第2009/0017543号（その内容は参照によって組み入れられる）を参照すること。
【００７４】
レトロウイルスは、その核酸を（5'キャップおよび3'ポリAテールを含む）mRNAゲノムの形態で貯蔵し、絶対寄生体として宿主細胞を標的とする一本鎖RNAウイルスである。当技術分野におけるいくつかの方法において、レトロウイルスは、細胞へ核酸を導入するために使用されている。宿主細胞の細胞質内で、ウイルスは、通常のパターンの逆向き、従って逆（後方）に、そのRNAゲノムからDNAを産生するため、自己の逆転写酵素を使用する。次いで、この新たなDNAは、インテグラーゼ酵素によって宿主細胞ゲノム中に組み入れられ、その時点で、レトロウイルスDNAはプロウイルスと呼ばれる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルスのような組換えレトロウイルスは、安定的に宿主ゲノム中に組み込まれる能力を有する。それらは、宿主ゲノム中への組み込みを可能にする逆転写酵素を含有している。レトロウイルスベクターは、複製能を有する場合もあるし、または複製欠陥である場合もある。本発明のいくつかの態様において、レトロウイルスが、細胞へのトランスフェクションを実行するために組み入れられるが、CRISPR/Cas9/gRNA複合体が、ウイルスゲノムを標的とするよう設計される。
【００７５】
本発明のいくつかの態様において、レトロウイルスのサブクラスであるレンチウイルスが、ウイルスベクターとして使用される。レンチウイルスは、分裂細胞のみを感染させることができる他のレトロウイルスと比べてレンチウイルスの独特の特色である、非分裂細胞のゲノム中に組み込まれる能力のため、送達媒体（ベクター）として適合し得る。RNAの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入した時に、DNAを産生するために逆転写され、次いで、DNAが、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置においてゲノムへ挿入される。プロウイルスと呼ばれるようになったベクターは、ゲノム内に留まり、分裂時に細胞の子孫に受け継がれる。
【００７６】
レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、ゲノム中に組み込まれず、細胞分裂中に複製されない。アデノウイルスおよび関連するAAVは、宿主のゲノム中に組み込まれないため、送達ベクターとして可能性のあるアプローチであろう。本発明のいくつかの局面において、標的とされるウイルスゲノムのみが、CRISPR/Cas9/gRNA複合体によって影響を受け、宿主の細胞は影響を受けない。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ヒトおよびその他のいくつかの霊長類種を感染させる小さいウイルスである。AAVは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノム中に組み入れることができる。例えば、遺伝子治療ベクターとしてのその可能性のある使用のため、研究者は、自己相補的なアデノ随伴ウイルス（scAAV）と呼ばれる変化型AAVを作製した。AAVはDNAの一本鎖をパッケージングし、第2鎖合成の過程を必要とするが、scAAVは、二本鎖DNAを形成するために共にアニールしている両方の鎖をパッケージングする。第2鎖合成のスキップによって、scAAVは、細胞における迅速な発現を可能にする。他の点では、scAAVは、そのAAVカウンターパートの多くの特徴を保持している。本発明の方法は、送達ベクターの手段として、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、またはワクシニアウイルスを組み入れることができる。
【００７７】
本発明のある特定の態様において、非ウイルスベクターが、トランスフェクションを実行するために使用されてもよい。核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注入、バイオリスティクス（biolistics）、ビロソーム、リポソーム、ミセル、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、および薬剤によって増強されたDNAの取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号；および第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、TransfectamおよびLipofectin）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションのために適当なカチオン性および中性の脂質には、Jesseeの米国特許第7,166,298号またはJesseの米国特許第6,890,554号（これらの各々の内容は参照によって組み入れられる）に記載されたものが含まれる。送達は、細胞へなされてもよいし（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）、または標的組織へなされてもよい（例えば、インビボ投与）。
【００７８】
合成ベクターは、典型的には、およそ100nmの直径を有する粒子を形成するため、負の電荷を有する核酸と複合体化することができるカチオン性の脂質またはポリマーに基づく。複合体は、ヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。さらに、細胞送達戦略および局所送達戦略は、適切な細胞内コンパートメントにおける内部移行、放出、および分布の必要性に対処しなければならない。全身送達戦略は、付加的な困難、例えば、カチオン性送達媒体の血液成分との強い相互作用、細網内皮系による取り込み、腎臓ろ過、毒性、および関心対象の細胞への担体のターゲティング能力に遭遇する。カチオン性非ウイルスの表面の修飾は、血液成分との相互作用を最小化し、細網内皮系取り込みを低下させ、毒性を減少させ、標的細胞との結合親和性を増加させることができる。（オプソニン化とも呼ばれる）血漿タンパク質の結合は、RESが循環ナノ粒子を認識する主要な機序である。例えば、肝臓のクッパー細胞のようなマクロファージは、スカベンジャー受容体を介して、オプソニン化されたナノ粒子を認識する。
【００７９】
本発明のいくつかの態様において、非ウイルスベクターは、標的特異的な送達およびトランスフェクションを実行するために改変される。PEG化（即ち、ポリエチレングリコールによる表面の修飾）は、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝集を低下させ、細網内皮系による除去を最小化して、静脈内（i.v.）投与後の循環寿命の延長をもたらすために使用される主な方法である。従って、PEG化ナノ粒子は、しばしば「ステルス」ナノ粒子と呼ばれる。循環から迅速に除去されないナノ粒子は、感染細胞に遭遇する機会を有するであろう。
【００８０】
しかしながら、表面上のPEGは、標的細胞による取り込みを減少させ、生物学的活性を低下させる場合がある。従って、PEG化成分の遠位末端にターゲティングリガンドを付着させることが必要であり；標的細胞表面上の受容体との結合を可能にするため、リガンドは、PEG「シールド」を越えて突出する。カチオン性リポソームが遺伝子担体として使用される時、中性ヘルパー脂質の適用は、エンドソームエスケープを可能にするための六方相形成の促進に加えて、核酸の放出を助ける。本発明のいくつかの態様において、中性またはアニオン性のリポソームが、核酸の全身送達および実験動物モデルにおける治療効果の入手のために開発される。新規のカチオン性の脂質およびポリマーの設計および合成、ならびにペプチド、ターゲティングリガンド、ポリマー、または環境感受性部分との遺伝子の共有結合性もしくは非共有結合性の結合も、非ウイルスベクターが遭遇する問題の解決のために多くの注目を集めている。送達ベクターにおける無機ナノ粒子（例えば、金属ナノ粒子、酸化鉄、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸マンガン、二重水酸化物、カーボンナノチューブ、および量子ドット）の適用は、種々の方式で調製され表面官能化され得る。
【００８１】
本発明のいくつかの態様において、組織の独特の環境および外部刺激に応答する標的特異的な徐放系が利用される。金ナノロッドは、近赤外域に強力な吸収帯を有し、吸収された光エネルギーは、次いで、金ナノロッドによって熱に変換される（いわゆる「光熱効果」）。近赤外光は組織へ深く浸透することができるため、徐放のため、核酸によって金ナノロッドの表面を修飾することができる。修飾された金ナノロッドが近赤外光によって照射される時、光熱効果によって誘導された熱変性によって、核酸が放出される。放出される核酸の量は、光照射の力および曝露時間に依存する。
【００８２】
本発明のいくつかの態様において、細胞または組織へのトランスフェクションを実行するため、リポソームが使用される。「リポソーム」とは、本明細書において使用されるように、疎水性部分が二重層膜の内部の疎水性領域に接しており、ヘッド部分が膜の外側の極性の表面に向いている脂質二重層構造へ水中で自然に配置され得る脂質、具体的には、小胞を形成する脂質から構成された小さい球状の小胞をさす。小胞を形成する脂質は、典型的には、2本の炭化水素鎖、具体的には、アシル鎖と、極性または無極性のいずれかであるヘッド基とを有する。小胞を形成する脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンのようなリン脂質を含む、天然に存在する脂質または合成起源の脂質のいずれかから構成され、2本の炭化水素鎖は、典型的には、約14〜22炭素原子長であり、変動する不飽和度を有する。アシル鎖が変動する飽和度を有する前記の脂質およびリン脂質は、商業的に入手されてもよいし、または発表された方法に従って調製されてもよい。本発明の組成物において使用するためのその他の適当な脂質には、糖脂質、およびコレステロールのようなステロール、ならびにリポソームにおいて使用され得る様々な類似体が含まれる。
【００８３】
リポソームに類似して、ミセルは、脂質から構成された小さい球状の小胞であるが、脂質単層として配置され、脂質分子の親水性ヘッド領域が周囲の溶媒に接しており、疎水性のシングルテール領域をミセルの中心に隔離している。この相は、二重層内のシングルテール脂質のパッキング挙動（packing behavior）によって引き起こされる。
【００８４】
核酸のリポソーム製剤の薬理学は、核酸がリポソーム二重層の内部に封入される程度によって概して決定される。封入された核酸は、ヌクレアーゼ分解から保護されるが、リポソームの表面に結合しただけのものは保護されない。封入された核酸は、完全リポソームの延長された循環寿命および体内分布を共有するが、表面に結合したものは、リポソームから分離すると、裸の核酸の薬理学に従う。
【００８５】
いくつかの態様において、本発明の複合体は、リポソームに封入される。主に、核酸の大きいサイズおよび親水性の性質のため、核酸は、低分子薬物と異なり、完全な脂質二重層を横切ることができない。従って、核酸は、（SALPのような）エタノール液滴法、逆相蒸発法、および（SNALPのような）エタノール希釈法のような従来の受動負荷テクノロジーによってリポソーム内に捕捉され得る。
【００８６】
いくつかの態様において、直鎖状ポリエチレンイミン（L-PEI）が、その多用途性および比較的高いトランスフェクション効率のため、非ウイルスベクターとして使用される。L-PEIは、肺、脳、膵臓、網膜、膀胱、さらには腫瘍のような広範囲の器官へインビボの遺伝子を効率的に送達するために使用されている。L-PEIは、インビトロおよびインビボで核酸を効率的に圧縮し、安定化し、送達することができる。
【００８７】
マイクロバブルと組み合わされた低強度超音波は、遺伝子送達の安全な方法として最近多くの注目を集めている。超音波は、組織を透過性化する効果を示す。それは非侵襲的であり、部位特異的であり、標的とされていない器官には影響を与えないまま、全身送達後に腫瘍細胞を破壊することを可能にする。超音波によって媒介されるマイクロバブル破壊は、異なる組織への薬物および核酸の非侵入性の送達のための革新的な方法として提唱されている。特定の関心対象の区域に到達するまで、薬物または遺伝子を保持するため、マイクロバブルが使用され、次いで、マイクロバブルを破裂させ、生理活性材料の部位特異的な送達を引き起こすため、超音波が使用される。さらに、アルブミンによってコーティングされたマイクロバブルの、多糖外被損傷または内皮機能障害を有する血管領域に付着する能力は、超音波の非存在下ですら薬物を送達するもう一つの可能な機序である。Tsutsui et al.,2004,薬物送達をターゲティングするためのマイクロバブルの使用（The use of microbubbles to target drug delivery）,Cardiovasc Ultrasound 2:23（その内容は参照によって組み入れられる）を参照すること。超音波によって誘発される薬物送達において、組織を透過性化する効果は、超音波造影剤、ガス充填マイクロバブルを使用して強化され得る。核酸の送達のためのマイクロバブルの使用は、標的区域への微小血管通過中の集中超音波ビームによる、DNAが負荷されたマイクロバブルの破壊が、標的とされていない区域には影響せずに、マイクロバブルシェルの崩壊によって、限局性の形質導入をもたらすであろうという仮説に基づく。
【００８８】
超音波によって媒介される送達に加えて、磁気ターゲティング送達を、送達のために使用することができる。磁気ナノ粒子は、一般的には、核酸の送達を画像化するため、遺伝子ベクターに捕捉される。核酸担体は、超音波および磁場の両方に対して応答性、即ち、磁気超音波活性リポスフェア（MAAL）であり得る。基本的な前提は、治療剤が、磁性のマイクロ粒子またはナノ粒子に付着しているかまたは封入されていることである。これらの粒子は、官能化されていてもよいポリマーもしくは金属のコーティングを有する磁性コアを有していてもよいし、または孔内に沈殿した磁性ナノ粒子を含有している多孔性ポリマーからなっていてもよい。ポリマーまたは金属のコーティングを官能化することによって、例えば、標的特異的な化学療法のための細胞傷害性薬物または遺伝子欠陥を補正するための治療用DNAを付着させることが可能である。付着後、粒子／治療剤複合体は、しばしば、標的の近くに注射部位を位置付けるため、カテーテルを使用して、血流へ注射される。一般には、高磁場、高勾配の希土類磁石からの磁場が、標的部位に集中させられ、磁場に入る時の粒子に対する力が、標的における粒子の捕獲および排出を可能にする。
【００８９】
伝統的なリポソームと比較して低下した細胞傷害性と組み合わせて、増強されたトランスフェクション効率を提示する、合成カチオン性ポリマーに基づくナノ粒子（直径およそ100nm）が開発されている。変動する物理的および化学的な特徴を有する脂質分子から構成された異なる層のポリマーナノ粒子製剤への組み入れは、より良好な細胞膜との融合および細胞への進入、細胞内での分子の増強された放出、ならびにナノ粒子複合体の低下した細胞内分解を通して、改善された効率をもたらした。
【００９０】
いくつかの態様において、複合体は、とりわけ、リポソーム、アルブミンに基づく粒子、PEG化タンパク質、生分解性高分子-薬物複合物、ポリマーミセル、デンドリマーのような全身治療のためのナノシステムにコンジュゲートされる。参照によって組み入れられる、Davis et al.,2008,ナノ治療用粒子：癌のための新興治療モダリティ（Nanotherapeutic particles:an emerging treatment modality for cancer）,Nat Rev Drug Discov.7(9):771-782を参照すること。リポソームのような長時間循環高分子担体は、腫瘍血管からの優先的な血管外漏出のため、増強された透過性および保持効果を活用することができる。ある特定の態様において、本発明の複合体は、細胞への送達のため、リポソームまたはポリマーソームへコンジュゲートされるかまたは封入される。例えば、リポソームアントラサイクリンは、高度に効率的な封入を達成しており、リポソームダウノルビシンおよびPEG化リポソームドキソルビシンのような大いに延長された循環を有するバージョンを含む。Krishna et al.,プロプラノロールのためのカルボキシメチルセルロースナトリウムに基づく経皮薬物送達系（Carboxymethylcellulose-sodium based transdermal drug delivery system for propranolol）,J Pharm Pharmacol.1996 Apr;48(4):367-70を参照すること。
【００９１】
リポソーム送達系は、安定製剤を提供し、改善された薬物動態、およびある程度の「受動的」または「生理学的」な組織へのターゲティングを提供する。可能性のある化学療法剤のような親水性材料および疎水性材料の封入が公知である。例えば、合成脂質を含む非経口投与可能なリポソーム製剤を開示している、Schneiderの米国特許第5,466,468号；リン脂質にコンジュゲートされたヌクレオシド類似体を開示している、Hostetlerらの米国特許第5,580,571号；薬学的活性を有する化合物が、少なくとも1種類の両親媒性極性脂質成分および少なくとも1種類の非極性脂質成分を含む規定された脂質系に含有されているヘパリンまたはその断片である薬学的組成物を開示している、Nyqvistの米国特許第5,626,869号を参照すること。
【００９２】
リポソームおよびポリマーソームは、複数の溶液および化合物を含有し得る。ある特定の態様において、本発明の複合体は、ポリマーソームにカップリングされるかまたは封入される。人工小胞のクラスとして、ポリマーソームは、小胞膜を形成するため、両親媒性合成ブロックコポリマーを使用して作製された、溶液を包囲する小さな中空の球である。一般的なポリマーソームは、コアに水性溶液を含有しており、薬物、酵素、その他のタンパク質およびペプチド、ならびにDNAおよびRNAの断片のような感受性分子を封入し保護するために有用である。ポリマーソーム膜は、生物系において見出されるもののような外部材料から、封入された材料を隔離する物理的障壁を提供する。ポリマーソームは、公知の技術によってダブルエマルションから生成され得る。参照によって組み入れられる、Lorenceau et al.,2005,ダブルエマルションからのポリマーソームの生成（Generation of Polymerosomes from Double-Emulsions）,Langmuir 21(20):9183-6を参照すること。
【００９３】
本発明のいくつかの態様は、遺伝子銃またはバイオリスティック（biolistic）粒子送達系を提供する。遺伝子銃は、ペイロードがプラスミドDNAによってコーティングされた重金属の基本粒子であり得る、遺伝情報を細胞へ注射するための装置である。この技術は、バイオバリスティクス（bioballistics）またはバイオリスティクスとも呼ばれ得る。遺伝子銃はDNAワクチンを送達するためにも使用されている。遺伝子銃は、DNAプラスミド、蛍光タンパク質、色素等のような多様な有機種および非有機種によって、細胞をトランスフェクトすることができる。
【００９４】
本発明の局面は、送達ベクターの多数の使用を提供する。送達ベクターの選択は、標的とされた細胞または組織、およびCRISPR/Cas9/gRNAの具体的な構成に基づく。例えば、上述のEBVの例において、リンパ球はリポフェクションに対して抵抗性であることが公知であるため、ヌクレオフェクション（細胞核および細胞質へ基質を直接移動させるための、Nucleofectorと呼ばれる装置によって生成される電気パラメータの細胞型特異的試薬との組み合わせ）が、Raji細胞へのDNA送達のために必要とされた。Lonza pmaxプロモーターは、Raji細胞において強力な発現を提示したため、Cas9発現を駆動する。ヌクレオフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡法を通して、少ない割合の細胞から、明瞭なEGFPシグナルが観察された。しかしながら、EGFP陽性細胞集団は劇的に減少し、ヌクレオフェクションの48時間後には＜10％のトランスフェクション効率が測定された（図1B）。EBV複製開始点配列oriPを含むCRISPRプラスミドは、＞60％のトランスフェクション効率を与えた（図1B）。
【００９５】
本発明の局面は、標的特異的な送達のため、CRISPR/Cas9/gRNA複合体を利用する。一般的な公知の経路には、経皮、経粘膜、鼻、眼、および肺の経路が含まれる。薬物送達系には、リポソーム、プロリポソーム、マイクロスフェア、ゲル、プロドラッグ、シクロデキストリン等が含まれ得る。本発明の局面は、予定された様式での薬物の放出および許容される期間での分解を提供する、肺内の特定の部位または細胞集団を標的とするためのエアロゾルへ移される、生分解性ポリマーから構成されたナノ粒子を利用する。経皮および経粘膜の徐放送達系、鼻および頬のエアロゾルスプレー、薬物浸含ロゼンジ、封入された細胞、経口軟ゲル、皮膚を通して薬物を投与するためのイオン泳動装置、ならびに多様なプログラム可能な埋め込み薬物送達装置のような徐放テクノロジー（CRT）が、標的特異的な制御された送達を達成する本発明の複合体と共に使用される。
【００９６】
v. 核酸の消化
細胞内に入ると、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、核酸を標的とする。本発明の一局面において、複合体はウイルスゲノムへターゲティングされる。潜伏感染に加えて、本発明は、パッケージングされる前または放出された後のウイルスゲノムを標的とすることによって、活発に複製するウイルスをコントロールするためにも使用され得る。いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、潜伏ウイルスゲノムを標的とし、それによって、増殖の機会を低下させるため、Cas9のようなヌクレアーゼを使用する。ヌクレアーゼは、gRNA（例えば、crRNA＋tracrRNAまたはsgRNA）と共に複合体を形成していてよい。複合体は、ウイルスゲノムを無能力化するため、標的特異的にウイルス核酸を切断する。上述のように、Cas9エンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムにおいて二本鎖破壊を引き起こす。ウイルスゲノム上の数箇所を標的とし、一本鎖破壊ではなく二本鎖破壊を引き起こすことによって、ゲノムはゲノム上の数箇所において効果的に切断される。好ましい態様において、二本鎖破壊は、天然修復機序がゲノムを接合したとしても、ゲノムが無能力化するよう、小さい欠失が引き起こされるかまたは小さい断片がゲノムから除去されるよう設計される。
【００９７】
細胞中への導入の後、CRISPR/Cas9/gRNA複合体は、ウイルスゲノム、遺伝子、転写物、またはその他のウイルス核酸に作用する。CRISPRによって生成された二本鎖DNA破壊は、小さい欠失を含んで修復される。これらの欠失は、タンパク質コーディングを崩壊させ、従って、ノックアウト効果をもたらすであろう。
【００９８】
ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、トランスフェクションによって感染細胞へ送達され得る。例えば、（単一の小片または別々の小片に）Cas9およびgRNAをコードするDNAによって、感染細胞をトランスフェクトすることができる。gRNAは、ウイルスゲノム上の一箇所または数箇所にCas9エンドヌクレアーゼを局在させるよう設計される。Cas9エンドヌクレアーゼは、ゲノムにおいて二本鎖破壊を引き起こし、ウイルスゲノムからの小さい断片の欠失を引き起こす。修復機序によってすら、欠失はウイルスゲノムを無能力化する。
【００９９】
より高い細胞親和性（例えば、RGDノブ）および特異性を有する操作されたウイルス粒子は、送達効率を大いに改善することができる。環状DNAは、複製開始点によってエピソームとして複製することができるため、直鎖状DNAではなく環状DNAを送達することも有益であり得る。
【０１００】
本発明の局面は、標的特異的な送達のため、CRISPR/Cas9/gRNA複合体を利用する。一般的な公知の経路には、経皮、経粘膜、鼻、眼、および肺の経路が含まれる。薬物送達系には、リポソーム、プロリポソーム、ミセル、マイクロスフェア、ゲル、プロドラッグ、シクロデキストリン等が含まれ得る。本発明の局面は、予定された様式での薬物の放出および許容される期間での分解を提供する、肺内の特定の部位または細胞集団を標的とするためのエアロゾルへ移される、生分解性ポリマーから構成されたナノ粒子を利用する。経皮および経粘膜の徐放送達系、鼻および頬のエアロゾルスプレー、薬物浸含ロゼンジ、封入された細胞、経口軟ゲル、皮膚を通して薬物を投与するためのイオン泳動装置、ならびに多様なプログラム可能な埋め込み薬物送達装置のような徐放テクノロジー（CRT）が、標的特異的な制御された送達を達成する本発明の複合体と共に使用される。
【０１０１】
参照による組み入れ
本開示の全体にわたって、特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツのような他の文書が参照され引用されている。全てのそのような文書は、参照によって実際にその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
同等物
本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な改変およびその多くのさらなる態様が、本明細書中に引用された科学文献および特許文献の参照を含む、本文書の完全な内容から、当業者に明白になるであろう。本明細書における主題は、様々な態様およびそれらの同等物における本発明の実施に適合し得る、重要な情報、例証、および案内を含有している。
【実施例】
【０１０３】
実施例1：EBVに対するターゲティング
バーキットリンパ腫細胞株Raji、Namalwa、およびDG-75を、ATCCから入手し、ATCCの推奨に従って、10％FBSおよびPSAが補足されたRPMI 1640において培養した。ヒト初代肺繊維芽細胞IMR-90を、Coriellから入手し、10％FBSおよびPSAが補足されたAdvanced DMEM/F-12において培養した。
【０１０４】
Cong L et al.(2013)CRISPR/Casシステムを使用した多重ゲノム操作 Science 339:819-823に記載されたような、U6プロモーターによって駆動されるキメラガイドRNA（sgRNA）および遍在性プロモーターによって駆動されるCas9からなるプラスミドを、addgeneから入手した。Cas9タンパク質の後に融合したEGFPマーカーは、Cas9陽性細胞の選択を可能にした（図1A）。本発明者らは、より効率的なPol-III転写およびより安定的なステムループ構造のため、改変されたキメラガイドRNA設計を改作した（Chen B et al.(2013)最適化されたCRISPR/Casシステムによる生存ヒト細胞における遺伝子座の動的画像化（Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.）Cell 155:1479-1491）。
【０１０５】
本発明者らは、Addgene,IncからpX458を入手した。合成イントロンを含む改変されたCMVプロモーター（pmax）を、Lonza対照プラスミドpmax-GFPからPCR増幅した。改変されたガイドRNA sgRNA（F+E）を、IDTに注文した。EBV複製開始点oriPを、B95-8によって形質転換されたリンパ芽球様細胞株GM12891からPCR増幅した。本発明者らは、最初のCAGプロモーター、sgRNA、およびf1開始点を置換するため、pmax、sgRNA（F+E）、およびoriPをpX458へクローニングするため、標準的なクローニングプロトコルを使用した。本発明者らは、B95-8参照に基づき、EBV sgRNAを設計し、IDTにDNAオリゴを注文した。pX458における最初のsgRNAプレースホルダーは陰性対照として用いられる。
【０１０６】
リンパ球はリポフェクションに対して抵抗性であることが公知であり、従って、本発明者らは、Raji細胞へのDNA送達のためにヌクレオフェクションを使用した。Lonza pmaxプロモーターはRaji細胞における強力な発現を提示するため、本発明者らは、Cas9発現を駆動するためにLonza pmaxプロモーターを選択した。本発明者らは、DNA送達のためにLonza Nucleofector IIを使用した。500万個のRaji細胞またはDG-75細胞を、各100ulの反応において5ugのプラスミドによってトランスフェクトした。Cell line Kit VおよびプログラムM-013を、Lonzaの推奨に従って使用した。IMR-90については、100万個の細胞を、プログラムT-030またはX-005によって、100ulのSolution Vにおいて5ugプラスミドによってトランスフェクトした。ヌクレオフェクションの24時間後、本発明者らは、蛍光顕微鏡法を通して少ない割合の細胞から明瞭なEGFPシグナルを観察した。しかしながら、EGFP陽性細胞集団は、その後に劇的に減少し、ヌクレオフェクションの48時間後には＜10％のトランスフェクション効率が測定された（図1B）。本発明者らは、このトランスフェクション効率減少は、細胞分裂によるプラスミド希釈に起因すると考えた。宿主細胞内のプラスミドレベルを活発に維持するため、本発明者らは、EBV複製開始点配列oriPを含むようCRISPRプラスミドを再設計した。細胞内での活発なプラスミド複製によって、トランスフェクション効率は＞60％に上昇した（図1B）。
【０１０７】
EBVゲノムを標的とするガイドRNAを設計するため、本発明者らは、株B95-8由来のEBV参照ゲノムに頼った。本発明者らは、異なるゲノム編集目的のための7種類のガイドRNA設計によって6個の領域を標的とした（図1Cおよび表S1）。EBNA1は、遺伝子制御および潜伏ゲノム複製を含む多くのEBV機能のために重要である。本発明者らは、EBNA1コード領域全体を切り出すため、ゲノムのこの領域の両端へ、ガイドRNA sgEBV4およびsgEBV5をターゲティングした。ガイドRNA sgEBV1、sgEBV2、およびsgEBV6は、リピート領域に含まれ、その結果、少なくとも1個のCRISPR切断の成功率は増加する。これらの「構造」標的は、EBVゲノムのより小さい小片への系統的な消化を可能にする。EBNA3CおよびLMP1は、宿主細胞形質転換にとって必須であり、本発明者らは、これらの2種類のタンパク質の5'エクソンをそれぞれ標的とするため、ガイドRNA sgEBV3およびsgEBV7を設計した。
【０１０８】
EBVゲノム編集。CRISPRによって生成された二本鎖DNA破壊は、小さい欠失を含んで修復される。これらの欠失は、タンパク質コーディングを崩壊させ、従って、ノックアウト効果をもたらすであろう。SURVEYORアッセイは、個々の部位の効率的な編集を確認した（図5）。各ガイドRNAによって誘導された独立の小さい欠失の他に、ターゲティング部位間の大きい欠失が、EBVゲノムを系統的に破壊し得る。ガイドRNA sgEBV2は、12個の125bpリピート単位を含む領域を標的とする（図2A）。リピート領域全体のPCRアンプリコンは、およそ1.8kbのバンドを与えた（図2B）。5日間または7日間のsgEBV2トランスフェクションの後、本発明者らは、同一のPCR増幅からおよそ0.4kbのバンドを得た（図2B）。およそ1.4kbの欠失は、最初のリピート単位における切断と最後のリピート単位における切断との間の修復ライゲーションの予想された産物である（図2A）。
【０１０９】
sgRNA標的に隣接するDNA配列を、Phusion DNAポリメラーゼによってPCR増幅した。SURVEYORアッセイを、製造業者の説明に従い、実施した。大きい欠失を含むDNAアンプリコンをTOPOクローニングし、単一コロニーをサンガー配列決定のために使用した。EBV負荷を、Fluidigm BioMarkにおけるTaqmanディジタルPCRによって測定した。保存されたヒト遺伝子座を標的とするTaqmanアッセイを、ヒトDNA標準化のために使用した。Fluidigm C1からの単一細胞全ゲノム増幅産物1ngを、EBVの定量的PCRのために使用した。
【０１１０】
本発明者らは、独特の標的間の領域を欠失させることが可能であることをさらに証明した（図2C）。sgEBV4〜5トランスフェクションの6日後、（プライマーEBV4Fおよび5Rによる）隣接領域全体のPCR増幅は、予想された2kbのはるかに弱いバンドと共に、より短いアンプリコンを復帰させた（図2D）。アンプリコンクローンのサンガー配列決定は、2個の予想された切断部位の直接接続を確認した（図2F）。sgEBV3〜5による類似した実験も、EBNA3CからEBNA1へ、さらに大きい欠失を復帰させた（図2D〜E）。
【０１１１】
EBVゲノム破壊による細胞増殖停止。CRISPRトランスフェクションの2日後に、本発明者らは、さらなる培養のためにEGFP陽性細胞を流動選別し、生細胞を毎日計数した。予想通り、oriPもsgEBVも欠くCas9プラスミドによって処理された細胞は、数日以内にEGFP発現を失い、かつ未処理対照群に類似した速度で増殖した（図3A）。Cas9-oriPおよびスクランブルガイドRNAを含むプラスミドは、8日後にEGFP発現を維持したが、細胞増殖速度は低下させなかった。混合カクテルsgEBV1〜7による処理は、測定可能な細胞増殖をもたらさず、全細胞数は一定のままであるかまたは減少した（図3A）。大半の細胞のサイズが縮小し、顆粒化が増加したため、フローサイトメトリー散乱光シグナルは、sgEBV1〜7処理後の細胞形態学の変化を明白に明らかにした（図3B〜D、集団P4からP3へのシフト）。集団P3の細胞は、DAPI染色によって、損なわれた膜透過性も示した（図3E〜G）。特に、多重ガイドRNAによる、CRISPRの細胞傷害性の可能性を除外するため、本発明者らは、2種類の他の試料：EBV陰性バーキットリンパ腫細胞株DG-75（図6）および初代ヒト肺繊維芽細胞IMR90（図7）に対して同一の処理を実施した。トランスフェクションの8日後および9日後に、細胞増殖速度は、未処理対照群から変化せず、細胞傷害性が無視し得る程度であることが示唆された。
【０１１２】
従来の研究によって、EBVの腫瘍形成能力は、宿主細胞アポトーシスの妨害に起因すると考えられている（Ruf IK et al.(1999)エプスタインバーウイルスはバーキットリンパ腫においてc-MYC、アポトーシス、および腫瘍形成を制御する（Epstein-Barr Virus Regulates c-MYC,Apoptosis,and Tumorigenicity in Burkitt Lymphoma.）Molecular and Cellular Biology 19:1651-1660）。従って、EBV活性の抑制は、アポトーシス過程を回復させることができ、それは、本発明者らの実験において観察された細胞死を説明することができる。アネキシンV染色は、細胞膜は完全であるが、ホスファチジルセリンが露出している細胞の異なる亜集団を明らかにし、それは、アポトーシスを通した細胞死を示唆した（図3E〜G）。明視野顕微鏡法は、明瞭なアポトーシス細胞形態学を示し（図3H〜I）、蛍光染色は、激しいDNA断片化を証明した（図3J〜M）。総合すると、この証拠は、EBVゲノム破壊後の正常な宿主細胞アポトーシス経路の回復を示唆している。
【０１１３】
亜集団におけるEBVの完全な除去。細胞増殖停止とEBVゲノム編集との間の可能性のある関係を研究するため、本発明者らは、EBNA1を標的とするディジタルPCRによって異なる試料中のEBV負荷を定量化した。保存されたヒト体細胞遺伝子座を標的とするもう一つのTaqmanアッセイを、ヒトDNA標準化のための内部対照として用いた。平均して、未処理のRaji細胞は、各々、42コピーのEBVゲノムを有する（図4A）。oriPもsgEBVも欠くCas9プラスミドによって処理された細胞は、未処理の対照とのEBV負荷の明瞭な差を有していなかった。oriPを含むがsgEBVを含まないCas9プラスミドによって処理された細胞は、およそ50％低下したEBV負荷を有していた。この実験からの細胞が増殖速度の差を示さなかったという先の観察と合わせて、本発明者らは、これを、プラスミド複製中のEBNA1結合についての競合によるものである可能性が高いと解釈する。トランスフェクションへのガイドRNAカクテルsgEBV1〜7の添加は、EBV負荷を劇的に低下させた。生細胞および死細胞の両方が、未処理の対照と比較して、＞60％のEBV減少を有する。
【０１１４】
本発明者らは、同一のモル濃度比で7種類のガイドRNAを提供したが、プラスミドのトランスフェクションおよび複製の過程は、極めて確率論的である可能性が高い。いくつかの細胞は、必然的に、ガイドRNAカクテルの異なるサブセットまたは混合物を受容するであろう。それは、処理効率に影響を与える可能性がある。そのような効果を制御するため、本発明者らは、自動マイクロ流体系による単一細胞全ゲノム増幅を使用することによって、単一細胞レベルでEBV負荷を測定した。本発明者らは、新鮮に培養されたRaji細胞をマイクロ流体チップに負荷し、81個の単一細胞を捕獲した（図4B）。sgEBV1〜7によって処理された細胞について、本発明者らは、トランスフェクションの8日後に生細胞を流動選別し、91個の単一細胞を捕獲した（図4C）。製造業者の説明に従って、本発明者らは、各単一細胞反応チャンバからおよそ150ngの増幅されたDNAを入手した。品質管理のため、本発明者らは、各単一細胞増幅産物に対して4遺伝子座ヒト体細胞DNA定量的PCRを実施し（Wang J,Fan HC,Behr B,Quake SR(2012)ヒト精子における組換え活性および新規変異率の全ゲノム単一細胞分析（Genome-wide single-cell analysis of recombination activity and de novo mutation rates in human sperm.）Cell 150:402-412）、少なくとも1個の遺伝子座からの陽性増幅を必要とした。69個の未処理の単一細胞産物が品質管理をパスし、EBV負荷の正規対数分布を示し（図4D）、ほぼ全ての細胞が有意な量のEBVゲノムDNAを示した。本発明者らは、単一の組み込まれたEBVゲノムを含有しているNamalwaバーキットリンパ腫細胞のサブクローンによって、定量的PCRアッセイを較正した。1コピーEBV測定は、29.8のCtを与え、そのため、バルクディジタルPCR測定と一致して、69個のRaji単一細胞試料の平均Ctが、1細胞当たり42 EBVコピーに相当することを決定することができた。sgEBV1〜7によって処理された試料については、71個の単一細胞産物が品質管理をパスし、EBV負荷分布は劇的に広くなった（図4E）。22個の細胞は未処理の細胞と同一のEBV負荷を有し、19個の細胞は検出可能なEBVを有しておらず、残りの30個の細胞は、未処理の試料からの劇的なEBV負荷減少を示した。
【０１１５】
EBV処置のための必須の標的。CRISPRカクテル中の7種類のガイドRNAは、それぞれ、EBVゲノム構造、宿主細胞形質転換、および感染潜伏にとって重要な3種類の異なる配列のカテゴリを標的とする。効果的なEBV処置のための最も必須の標的を理解するため、本発明者らは、ガイドRNAのサブセットによってRaji細胞をトランスフェクトした。sgEBV4/5は、EBVゲノムを85％低下させたが、完全カクテルほど効果的に細胞増殖を抑制することはできなかった（図3A）。構造配列を標的とするガイドRNA（sgEBV1/2/6）は、完全なEBV負荷を排除しなかった（26％減少）にも関わらず、細胞増殖を完全に停止させることができた。ゲノム編集の高い効率および増殖停止から（図2）、本発明者らは、sgEBV1/2/6における残存EBVゲノムサインは、完全ゲノムによるのではなく、EBVゲノムから消化された遊離したDNAによるもの、即ち、偽陽性であったと推測する。本発明者らは、EBVゲノム構造の系統的な破壊は、特定の重要タンパク質を標的とするより、EBV処置のために効果的であると考えられるとの結論を下す。
【０１１６】
プライマー設計のような付加的な情報は、Wang and Quake,2014,RNAガイドエンドヌクレアーゼは潜伏ヘルペスウイルス科感染を治療するための治療戦略を提供する（RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection）,PNAS 111(36):13157-13162、およびPNASウェブサイトにオンラインで公開されているその文献の支持情報に示されており、これらの文書の両方の内容があらゆる目的のために参照により組み入れられる。
【０１１７】
実施例2：B型肝炎ウイルス（HBV）に対するターゲティング
本発明の方法および材料は、ターゲティングされたエンドヌクレアーゼを、B型肝炎ウイルス（HBV）のような潜伏ウイルスゲノムのような特定の遺伝材料へ適用するために使用され得る。本発明は、さらに、標的細胞（例えば、肝細胞）への（DNAプラスミドのような）核酸の効率的で安全な送達を提供する。一つの態様において、本発明の方法は、HBVを標的とするために水力学的な遺伝子送達を使用する。
【０１１８】
図10はHBVゲノムを図示する。HBVゲノムについてのアノテーションを受け（即ち、それはゲノムの重要なフィーチャーを明らかにする）、ウイルス複製開始点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、および反復領域のようなそれらのフィーチャーのうちの一つに存在する、酵素分解による標的とするための候補を選ぶことが、好ましい場合がある。
【０１１９】
ヘルペスウイルス科のプロトタイプメンバーであるHBVは、表面抗原（HBsAg）を含有している（エンベロープとも呼ばれる）外側のリポタンパク質外被によって囲まれた、27nmのヌクレオカプシドコア（HBcAg）から構成された、42nmの部分二本鎖DNAウイルスである。ウイルスは、3〜3.3kbの不完全環状（relaxed circular）部分二重鎖DNAを含有しているエンベロープによって囲まれたビリオン、およびビリオンDNA鋳型におけるギャップを修復することができ、逆転写酵素活性を有する、ビリオンに結合したDNA依存性ポリメラーゼを含む。HBVは、ポリメラーゼタンパク質（P）、コアタンパク質（C）、表面タンパク質（S）、およびXタンパク質をコードする4個のオーバーラップするORFを含むおよそ3200bpの環状の部分二本鎖DNAウイルスである。感染においては、ウイルスのヌクレオカプシドが細胞に侵入し、核に到達し、そこでウイルスゲノムが送達される。核において、第2鎖DNA合成が完了し、両方の鎖のギャップが修復され、3.5kb、2.4kb、2.1kb、および0.7kbの長さである4種類のウイルスRNAの転写のための鋳型として用いられる共有結合で閉環した環状DNA分子を与える。これらの転写物は、ポリアデニル化され、細胞質へ輸送され、そこで、ウイルスのヌクレオカプシド抗原およびプレコア抗原（C、プレC）、ポリメラーゼ（P）、エンベロープL（ラージ）、M（ミディアム）、S（スモール）、ならびに転写トランス活性化タンパク質（X）へ翻訳される。エンベロープタンパク質は、不可欠の膜タンパク質として、小胞体（ER）の脂質膜へ挿入される。ゲノム全体に及び、プレゲノムRNA（pgRNA）と呼ばれる3.5kbの種が、HBVポリメラーゼおよびプロテインキナーゼと共にコア粒子へパッケージングされ、そこで、マイナス鎖DNAの逆転写のための鋳型として用いられる。RNAからDNAへの変換が、粒子内で起こる。
【０１２０】
HBVゲノム上の塩基対のナンバリングは、制限酵素EcoR1のための切断部位、またはEcoR1部位が存在しない場合には、相同部位に基づく。しかしながら、コアタンパク質の開始コドンまたはRNAプレゲノムの最初の塩基に基づく、ナンバリングの他の方法も、使用される。HBVゲノム内の全ての塩基対が、HBVタンパク質のうちの少なくとも1種類のコーディングに関与する。しかしながら、ゲノムは、転写のレベルを制御する遺伝要素、ポリアデニル化の部位を決定する遺伝要素、およびヌクレオカプシドへのキャプシド形成のため特異的な転写物をマークする遺伝要素も含有している。4個のORFは、変動するインフレーム開始コドンの使用を通して、7種類の異なるHBVタンパク質の転写および翻訳をもたらす。例えば、リボソームが、adwゲノムの155位のATGにおいて翻訳を開始する時、スモールB型肝炎表面タンパク質が生成される。リボソームが3211位の上流ATGで開始し、タンパク質の5'末端への55アミノ酸の付加をもたらす時、ミドルB型肝炎表面タンパク質が生成される。
【０１２１】
ORF Pは、ゲノムの大半を占有し、B型肝炎ポリメラーゼタンパク質をコードする。ORF Sは、3種類の表面タンパク質をコードする。ORF Cは、肝炎eタンパク質およびコアタンパク質の両方をコードする。ORF Xは、B型肝炎Xタンパク質をコードする。HBVゲノムは、ウイルスの複製が起こるために必要な多くの重要なプロモーター領域およびシグナル領域を含有している。4個のORFの転写は、4種類のプロモーター要素（プレS1、プレS2、コア、およびX）ならびに2種類のエンハンサー要素（Enh IおよびEnh II）によって調節される。全てのHBV転写物が、ゲノム内の1916〜1921に及ぶ領域に位置している共通のアデニル化シグナルを共有している。得られる転写物の長さは、3.5ヌクレオチドから0.9ヌクレオチドまでの範囲である。コア／プレゲノムプロモーターの位置のため、ポリアデニル化部位は示差的に利用される。ポリアデニル化部位は、基準の真核生物ポリアデニル化シグナル配列（AATAAA）とは対照的に、6ヌクレオチド配列（TATAAA）である。TATAAAは、非効率的に作用することが公知であり（9）、HBVによる示差的な使用のために適当である。
【０１２２】
C、X、P、およびSと呼ばれる、ゲノムによってコードされた4種類の公知の遺伝子が存在する。コアタンパク質は、遺伝子C（HBcAg）によってコードされ、その開始コドンの前には、プレコアタンパク質が産生される上流インフレームAUG開始コドンが先行する。HBeAgは、プレコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングによって産生される。DNAポリメラーゼは、遺伝子Pによってコードされる。遺伝子Sは、表面抗原（HBsAg）をコードする遺伝子である。HBsAg遺伝子は、1個の長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を三つのセクション、プレS1、プレS2、およびSへ分割する3種類のインフレーム開始（ATG）コドンを含有している。複数の開始コドンのため、ラージ、ミドル、およびスモールと呼ばれる三つの異なるサイズのポリペプチド（プレS1＋プレS2＋S、プレS2＋S、またはS）が産生される。遺伝子Xによってコードされたタンパク質の機能は、完全には理解されていないが、それは、肝臓癌の発症に関連している。それは、細胞増殖を促進する遺伝子を刺激し、増殖を制御する分子を不活化する。
【０１２３】
図10に関して、HBVは、プレS1によって宿主細胞に結合することによってその感染サイクルを開始する。プレS1に対するガイドRNAは、コード配列の5'末端に位置する。エンドヌクレアーゼ消化は、プレS1翻訳のフレームシフトをもたらす挿入／欠失を導入するであろう。HBVは、両端に同一のリピートDR1およびDR2を有し、5'末端にRNAキャプシド形成シグナルεを有する長いRNAの型を通してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（RT）は、RNAをDNAに変換する。Hbxタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。RTに対するRNAによってガイドされた消化は、RT翻訳のフレームシフトをもたらす挿入／欠失を導入するであろう。ガイドRNA sgHbxおよびsgコアは、HbxおよびHBVコアタンパク質のコーディングにおいてフレームシフトをもたらすのみならず、DR2-DR1εを含有している領域全体の欠失ももたらす。組み合わせられた4種類のsgRNAも、HBVゲノムの小さい小片への系統的な破壊をもたらすことができる。
【０１２４】
HBVは、RNA中間体の逆転写によってそのゲノムを複製する。RNA鋳型が、まず、一本鎖DNA種（マイナス鎖DNA）に変換され、それが、その後、プラス鎖DNA合成のための鋳型として使用される。HBVにおけるDNA合成は、一本鎖DNA上の内部の位置において主に開始するプラス鎖DNA合成のため、RNAプライマーを使用する。プライマーは、RNA鋳型の5'末端から配列非依存性の測定であるRNase H切断を介して生成される。この18nt RNAプライマーは、マイナス鎖DNAの3'末端にアニールされ、プライマーの3'末端が12ntのダイレクトリピートDR1の内部に位置付けられる。プラス鎖DNA合成の大半は、プライマー転座の結果としてマイナス鎖DNAの他方の末端の近くに位置する12ntのダイレクトリピートDR2から開始する。プラス鎖プライミングの部位は重要である。元の場所でのプライミングは、二重鎖直鎖状（duplex linear/DL）DNAゲノムをもたらし、DR2からのプライミングは、環状化と呼ばれる第2鋳型スイッチの完了後に不完全環状（RC）DNAゲノムの合成をもたらし得る。ヘパドナウイルスが、プラス鎖DNA合成のプライミングのためにこの付加的な複雑性を有する理由は不明なままであるが、プライマー転座の機序は可能性のある治療的な標的である。ウイルス複製は、（ヒト病原体、B型肝炎ウイルスを含む）ヘパドナウイルスの慢性保有状態の維持のために必要であるため、複製を理解し、治療的な標的を解明することは、保有者における疾患を制限するために重要である。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明のシステムおよび方法は、プレS1のようなフィーチャー内のヌクレオチドストリングを見出すことによって、HBVゲノムを標的とする。プレS1に対するガイドRNAは、コード配列の5'末端に位置する。従って、それは、コード配列内の最も5'の標的のうちの一つを表すため、標的とするためのよい候補である。エンドヌクレアーゼ消化は、プレS1翻訳のフレームシフトをもたらす挿入／欠失を導入するであろう。HBVは、両端に同一のリピートDR1およびDR2を有し、5'末端にRNAキャプシド形成シグナルεを有する長いRNAの型を通してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（RT）は、RNAをDNAに変換する。Hbxタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。RTに対するRNAによってガイドされた消化は、RT翻訳のフレームシフトをもたらす挿入／欠失を導入するであろう。ガイドRNA sgHbxおよびsgコアは、Hbxタンパク質およびHBVコアタンパク質のコーディングにおいてフレームシフトをもたらすのみならず、DR2-DR1-εを含有している領域全体の欠失ももたらすことができる。組み合わせられた4種類のsgRNAは、HBVゲノムの小さい小片への系統的な破壊ももたらすことができる。いくつかの態様において、本発明の方法は、図10に示されるHBVゲノムのようなゲノム内の重要なフィーチャーに対する1種類または数種類のガイドRNAを作製することを含む。
【０１２６】
図10は、CRISPRガイドRNAによって標的とされるHBVゲノム内の重要な部分を示す。細胞内でCRISPR活性を達成するため、cas9およびガイドRNAをコードする発現プラスミドが、関心対象の細胞（例えば、HBV DNAを保持する細胞）へ送達される。インビトロアッセイにおいて証明するため、細胞の増殖、成長、および形態学のモニタリング、ならびに細胞内のDNA完全性およびHBV DNA負荷の分析によって、抗HBV効果を評価することができる。記載された方法は、インビトロアッセイを使用してバリデートされ得る。証明するため、cas9タンパク質および標的部位に隣接するDNAアンプリコンによって、インビトロアッセイが実施される。ここで、標的が増幅され、アンプリコンが、cas9、およびターゲティングのための選択されたヌクレオチド配列を有するgRNAと共にインキュベートされる。図11に示されるように、DNA電気泳動は、標的部位における強力な消化を示す。
【０１２７】
図11は、HBVに対するインビトロCRISPRアッセイから得られたゲルを示す。レーン1、3、および6：RT、Hbx-コア、およびプレS1に隣接するHBVゲノムのPCRアンプリコン。レーン2、4、5、および7：sgHBV-RT、sgHBV-Hbx、sgHBV-コア、sgHBV-プレS1によって処理されたPCRアンプリコン。レーン5および7において特に可視の複数の断片の存在は、sgHBV-コアおよびsgHBV-プレS1が、HBVに関する特に魅力的な標的を提供することを示し、インビトロバリデーションアッセイによって、本発明のシステムおよび方法の使用が有効であることが示され得ることを示している。
【０１２８】
実施例3：水痘帯状疱疹治療
時に、帯状疱疹（herpes zoster）、帯状疱疹（zoster）、水痘ウイルス、ヒトヘルペスウイルス3型（HHV-3）、または帯状疱疹（zona）としても公知の帯状疱疹（Shingles）は、4〜6週間も続く患者の大きな疼痛を伴う疱疹および紅斑を特徴とするウイルス性疾患である。紅斑は、しばしば、身体の片側に特徴的な帯として出現する。数ヶ月または数年にわたり持続し得る進行中の神経痛を発症する人々もおり、その状態は、帯状疱疹後神経痛と呼ばれる。
【０１２９】
帯状疱疹および帯状疱疹後神経痛は、体内の水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）の再活性化に関連している。VZVは、ヒトにのみ影響を与え、若い人々における水痘の原因である。VZVは神経を感染させ、多様な症状を引き起こす。初感染（水痘）の後、ウイルスは、脳神経節、後根神経節、および自律神経節を含む神経に潜伏するようになる。患者が水痘から回復した何年も後に、VZVは、再活性化されて、多数の神経学的状態を引き起こすことができる。
【０１３０】
ヌクレアーゼのための遺伝子と、ウイルスのゲノムへ該ヌクレアーゼをターゲティングする配列と、特定の種類の細胞においてベクターからの転写を促進するプロモーターとを含むベクターを含む組成物を、帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛のような状態を処置するかまたは防止するために使用することができる。水痘帯状疱疹ウイルス感染のような感染を処置するための本発明の方法および組成物の使用は、ニューロンのような特定の細胞型へのヌクレアーゼの送達を含み得る。
【０１３１】
本発明の方法は、ニューロンおよびその他の細胞型へベクターをターゲティングする工程を含む。任意の適当なターゲティング方法を使用することができる。例えば、ターゲティングには、顕微鏡下手術、またはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（11）、もしくは、参照によって組み入れられる、Glatzel et al.,2000,アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスによる末梢神経系への遺伝子の移入（Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system）PNAS 97(1):442-447に記載されたようなラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー／プロモーター（pRcRSV、Invitrogen）の使用が含まれ得る。プロモーターについては、参照によって組み入れられる、Liu et al.,2004,ニューロン特異的なトランスジーン発現のためのCMVエンハンサー／ヒトPDGFβプロモーター（CMV enhancer/human PDGF-beta promoter for neuron specific transgene expression）,Gene Ther 11(1):52-60も参照すること。ニューロンを標的とすることの付加的な考察については、参照によって組み入れられる、Sapunar et al.,2012,後根神経節−神経障害性疼痛のための可能性のある新たな治療標的（Dorsal root ganglion-a potential new therapeutic drug target for neuropathic pain）,J Pain Res 5:31-38を参照すること。ターゲティング可能な活性ヌクレアーゼのニューロン（好ましくは、DRG）への特異的な送達は、帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を処置するかまたは防止するために使用され得る。神経細胞において、プロモーターは、神経細胞内で選択的に遺伝子の発現を引き起こす。プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、または血小板由来増殖因子（PGDF）プロモーターであり得る。
【０１３２】
ターゲティング配列は、ウイルスのゲノムの中の調節エレメントを標的とするよう設計され得、好ましくは、ヒトゲノムの中のいかなる正確なマッチも欠いている。ターゲティング配列は、gRNAをコードするベクターの一部分であり得る。ヌクレアーゼは、cas9エンドヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、配列は、ベクター内のクラスター化した規則的に間隔を空けた短い回文配列の繰り返し（CRISPR）領域内にあり、CRISPR領域は、ウイルスのゲノムの中の複数種類の標的にマッチする複数種類のガイドRNAをコードする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月2日(2017.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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