(57)【要約】本発明は、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルション中の有効量の少なくとも１つの抗原と、さらなるアジュバントとを含むワクチン、並びにそれらの調製及び使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の少なくとも１つの抗原と、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルション中のアジュバント化合物とを含む、ワクチン。
【請求項２】
アジュバント化合物が水酸化アルミニウムである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
少なくとも１つの抗原が、細菌細胞、好ましくは、生きているか、弱毒化されたか又は不活性化された細菌である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
細菌がsalmonella菌であり、好ましくは、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）、サルモネラ・ケンタッキー（Salmonella Kentucky）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）、サルモネラ・ハイデルベルグ（Salmonella Heidelberg）又はそれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ＷＯＷエマルションが、１つ又はいくつかの油及び少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
油が、植物油、動物油、鉱物油又はそれらの混合物、好ましくは鉱物油を含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
少なくとも１つの界面活性剤が、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ソルビタンからなる群より選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項８】
外水相中に分散されている油性粒子内に包埋された水小胞を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
ワクチン中の前記少なくとも１つの抗原の総量の少なくとも６０％（w/w）、好ましくは６０％〜７５％が油性粒子に含まれる、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
油性粒子が、植物油、動物油、鉱物油又はそれらの混合物、好ましくは鉱物油を含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１１】
アジュバント化合物が外水相中にある、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１２】
外水相が、前記少なくとも１つの抗原のフラクション及び前記さらなるアジュバント、好ましくは抗原−アジュバント複合体をさらに含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
ａ）油性基剤中で前記少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを形成すること、
ｂ）前記ＷＯエマルションを分散相に追加し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成し、前記ＷＯＷエマルションを乳化すること、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、前記ＷＯＷエマルションをさらなるアジュバントと混合すること
を含む方法によって得ることができる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１４】
抗原のフラクションが、油性粒子、好ましくは１〜４０μmのサイズを有する油性粒子に包埋されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１５】
動物において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用するための、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１６】
少なくとも１つの抗原とさらなるアジュバントとを含むワクチンを調製するための方法であって、
ａ）油性基剤中で前記少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、ＷＯエマルションを形成する工程、
ｂ）前記ＷＯエマルションを分散相に追加し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成し、前記ＷＯＷエマルションを乳化する工程、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、前記ＷＯＷエマルションを前記アジュバントと混合する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
有効量の請求項１に記載のワクチンを該動物に投与することを含む、非ヒト動物にワクチン接種するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン、それらの調製及び使用に関する。より具体的には、本発明は、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルション中の少なくとも１つの抗原と、さらなるアジュバントとを含む二重アジュバントワクチンに関する。本発明のワクチンは、任意の種類の抗原、好ましくは細菌抗原を含み得、ニワトリのワクチン接種などの獣医学的使用に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、通常、免疫応答を増強及び改善するために、特に抗体応答を延長するために、アジュバントと共に製剤化される。例えば、鉱物油中で乳化された抗原の溶液に相当するフロイントアジュバント（Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine, 1942, 49, 548-553）は、最初、免疫賦活剤又は免疫強化物質として使用されていた。フロイントアジュバントは、油中水型（ＷＯ）エマルションを形成し、基本的には抗原の持続放出を介してアジュバント効果を示す。
【０００３】
有効なワクチンを提供するために、様々な他のアジュバント系が評価されている。これらとしては、例えば、キトサン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、脂質、毒素、ハプテン担体又は水酸化アルミニウムが挙げられる。これに関して、Matsumotoら(Avian diseases, 1971, 15, 109-117)は、ワクチン中のアルミニウム誘導体、例えば水酸化アルミニウムゲル及びクロムアルミニウムの有効性を試験した。Blackallら(Avian Diseases, 1992, 36, 632-636)は、水酸化アルミニウムアジュバント及びＷＯエマルションを比較した。スクアレン、サポニン、クイルＡ、リポイドアミン、グリカン又はアビジンもまた、それらの有効性を改善するために、アジュバントとしてワクチンに追加されている。
【０００４】
欧州特許出願公開第０６４０３４８号は、ＷＯエマルション及び免疫刺激性グリカンを含むワクチンに関する。米国特許出願公開第２０１４／００９９３５８号は、油中水型エマルション及びアルミニウム又はアルミニウム化合物又はTiterMax（スクアレン）を含むワクチンを提案する。しかしながら、副作用の可能性により、複合エマルション−アジュバント系の設計は、安全性の問題を生み出す（Reid and Blackall, Avian Diseases, 1987, 31, 59-63）。さらに、伝統的なＷＯエマルションは、多くの場合に高粘度を有するので、製剤化又は注射が困難である。
【０００５】
鳥類胚のin ovo免疫において（米国特許第５，８１７，３２０号）、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス（Cajavec et al., Acta Veterinaria Hungarica, 1998, 46, 25-34）及び感染性コリーザ（Blackall, World’s Poultry Science Journal, 1995, 51, 17-26）などの特定のウイルスに対して、ＷＯＷエマルションベースのワクチンが試験されている。
【０００６】
ＷＯＷエマルション中のこのようなワクチンはまた、ＷＯＷエマルションを生産するために使用される界面活性剤の性質及び割合に応じて、安定性の点で改善されている。これとの関連では、Hunter及びBennetは、２未満の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）で、式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーを研究した（米国特許第５，６２２，６４９号）。彼らはまた、Ｂ型肝炎感染症のワクチン接種方法においてこのようなＷＯＷエマルションを試験し、破傷風、マラリア、ＡＩＤＳ、インフルエンザ及び肺炎球菌肺炎に対するそれらの有効性について言及している。
【０００７】
Jiao及びBurgess (AAPS Pharm. Sci., 2003, 5, 1-12)は、２つの特定の界面活性剤（Span 83及びTween 80）の濃度に関して、ＷＯＷ多重エマルションの長期安定性を評価し、２０％Span 83及び０．１％Tween 80の濃度比が、ＷＯＷエマルションの最良の長期安定性をもたらしたことを決定した。しかしながら、ＷＯＷエマルションは、十分な免疫応答を必ずしも引き起こさない。加えて、ＷＯＷは、例えば粒子のサイズ分布プロファイルにおける均一性の欠如、及び不均一製剤の粘度の可能性を含むいくつかの潜在的な欠点に関連し得る。さらに、細胞などの大きな物体を製剤化するためのこのような系の適切性は、確立されていない。
【０００８】
したがって、当技術分野では、特に動物において使用するための別の安全で改善されたワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、改善された有効性を有する新規ワクチンを提供する。本発明は特に、ＷＯＷエマルションとアジュバント化合物とを併せ持つ二重アジュバント系ワクチンを開示する。本発明は、このような二重アジュバント系が安全であり、改善された免疫応答をin vivoで引き起こすという本発明者らによる予想外の知見に端を発する。特に、本発明は、このようなワクチンが、非ヒト動物において強力な防御免疫応答を誘導し、細菌抗原（好ましくは、全細胞細菌を含む）に特に適切であることを示す。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルション中の有効量の少なくとも１つの抗原と、さらなるアジュバントとを含むワクチンに関する。
【００１１】
本発明の別の目的は、有効量の少なくとも１つの抗原と、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルション中のアジュバント化合物とを含むワクチンに関する。
【００１２】
本発明の別の目的は、非ヒト動物において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用するための、上記に定義されるワクチンである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、非ヒト動物において抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、ＷＯＷエマルション中の有効量の前記少なくとも１つの抗原と、さらなるアジュバントとを含む組成物を前記動物に投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、ワクチンを調製するための方法であって、
ａ）油性基剤中で少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、ＷＯエマルションを形成すること、
ｂ）前記ＷＯエマルションを分散相に追加し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成し、場合により、前記ＷＯＷエマルションをさらに乳化すること、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、前記ＷＯＷエマルションをさらなるアジュバントと混合すること
を含む方法である。
【００１５】
特定の実施態様では、さらなるアジュバントは、水酸化アルミニウムである。
【００１６】
別の特定の実施態様では、少なくとも１つの抗原は、細菌抗原、好ましくは生きている、弱毒化された又は不活性化された細菌である。
【００１７】
本発明の特定の態様では、上記に定義されるワクチンは、好ましくは１〜４０μmのサイズを有する油性粒子中に包埋された前記抗原を含む。
【００１８】
さらに開示されるように、本発明の組成物は、非ヒト動物、特に家禽（例えば、ニワトリ、水鳥）又は鳥類にワクチン接種するために特に適切である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面の説明
【図１】ＷＯＷエマルションの描写
【図２Ａ】皮下経路（ＳＱ、図２Ａ）によって、及び筋肉内経路（ＩＭ、図２Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Enteritidis（ＳＥ）に対する％防御。
【図２Ｂ】皮下経路（ＳＱ、図２Ａ）によって、及び筋肉内経路（ＩＭ、図２Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Enteritidis（ＳＥ）に対する％防御。
【図３Ａ】皮下経路（ＳＱ、図３Ａ）によって、及び筋肉内経路（ＩＭ、図３Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Typhimurium （ＳＴ）に対する％防御。
【図３Ｂ】皮下経路（ＳＱ、図３Ａ）によって、及び筋肉内経路（ＩＭ、図３Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Typhimurium （ＳＴ）に対する％防御。
【図４】皮下及び筋肉内経路によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Kentucky （ＳＫ）に対する％防御。
【図５Ａ】皮下（ＳＱ、図５Ａ）及び筋肉内経路（ＩＭ、図５Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Heidelberg （ＳＨ）に対する％防御。
【図５Ｂ】皮下（ＳＱ、図５Ａ）及び筋肉内経路（ＩＭ、図５Ｂ）によってワクチンＡで処置したニワトリにおけるSalmonella Heidelberg （ＳＨ）に対する％防御。
【図６】雌鶏におけるワクチンＡの筋肉内注射部位の反応。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、改善された新規ワクチン組成物、それらの調製方法及びそれらの使用を提供する。本発明は特に、ＷＯＷエマルション中の有効量の少なくとも１つの抗原を含む新規ワクチンであって、アジュバントをさらに含む新規ワクチンを開示する。本発明は、このような二重アジュバント系が容易に注射可能であり、安全であり、他のアジュバント系を使用する従来技術のワクチンよりも優れた有効性（防御免疫）を提供するという本発明者らによる予想外の知見に端を発する。特に、本発明者らは、少なくとも１つの抗原と二重アジュバント系とを含む本発明のワクチンの相乗効果を実証した。本発明者らはまた、このようなワクチンのin vivoにおけるsalmonella感染症に対する改善された防御効果、及びそれらの安全性を実証した。
【００２１】
したがって、本発明の目的は、ＷＯＷエマルション中の有効量の少なくとも１つの抗原と、さらなるアジュバントとを含むワクチン又は組成物に関する。
【００２２】
本発明の別の目的は、抗原と、ＷＯＷエマルション中のさらなるアジュバントとを含むワクチン又は免疫原性組成物であって、該抗原が、内水相及び油相を含む油性粒子に含まれ、該さらなるアジュバントが外水相に含まれ、好ましくは該抗原と複合体形成しているワクチン又は免疫原性組成物である。
【００２３】
本発明の別の目的は、ＷＯＷエマルション中の全細胞を含むワクチン又は免疫原性組成物であって、ＷＯＷエマルション中の油性粒子の少なくとも９０％が２０μm未満のサイズを有し、該組成物が４よりも高いＯＤ６００／mlを有し、該組成物中の細胞の少なくとも６０％が前記油性粒子に含まれるワクチン又は免疫原性組成物である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、非ヒト動物において少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の前記少なくとも１つの抗原と、ＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物とを含むワクチン又は組成物を該動物に投与することを含む方法である。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、病原体に対して非ヒト動物にワクチン接種するための方法であって、有効量の少なくとも１つの病原体抗原と、ＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物とを含むワクチン又は組成物を該動物に投与することを含む方法である。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、非ヒト動物において少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用するための組成物であって、有効量の少なくとも１つの抗原と、ＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物とを含む組成物である。
【００２７】
抗原
「抗原」という用語は、動物に導入されると、動物の免疫系によって認識され、免疫応答を誘発し得る作用物質を指す。動物に投与されると、抗原は、一般に、免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）と特異的に相互作用して免疫応答を誘発し、細胞性応答（例えば、記憶細胞（例えば、記憶Ｂ及びＴ細胞）又は細胞傷害性細胞）及び／又は体液性（抗体）応答を引き起こす。
【００２８】
本発明は、任意の種類の抗原、例えば限定されないが、全病原体（例えば、細胞、ウイルス）又はそのフラグメント若しくはフラクション（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、脂質など）と共に使用され得る。病原体は、動物、例えばヒト、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ハトなど）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ又はウマに感染することができる任意の作用物質であり得る。好ましくは、抗原は、鳥類病原体、より好ましくはニワトリの作用物質である。抗原は、例えば全病原体、すなわち、例えば病原体の又は感染若しくは罹患（例えば、腫瘍）細胞の表面上で天然に発現される「表面抗原」であり得る。
【００２９】
より具体的には、抗原は、任意の病原性又は非病原性微生物、例えばウイルス、細菌、任意の他の寄生虫又は抗原であり得る。これらは、生きている、弱毒化された、不活性化された、若しくは死んでいる微生物（全微生物又は微生物のサブユニット）、不活性化されたキメラ若しくはリコンビナント微生物、破壊された微生物、突然変異体微生物、不完全な微生物、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。抗原はまた、全微生物構造、例えばウイルス、細菌又は寄生虫の１つ以上のエピトープ又は抗原性部分、例えば病原体由来の抗原性タンパク質の調製物、リコンビナントタンパク質、好ましくはウイルス抗原、例えばウイルスカプシドタンパク質、細胞壁タンパク質、ペプチド、又は細菌若しくは寄生虫構造の部分、例えば多糖、リポ多糖及び糖タンパク質を含み得る。抗原はまた、ＤＮＡ又はリコンビナントＤＮＡであり得る。抗原は、精製形態又は非精製形態で提供され得る。
【００３０】
抗原が、弱毒化された微生物、例えばウイルス、細菌又は他の病原体である場合、弱毒化された病原体は免疫原性を保持し、病原性を本質的に欠く。弱毒化は、天然の又は人工的な弱毒化方法、例えば、生きている動物又は様々な天然媒体（器官、細胞、孵化卵などを含む）における継代によってなされ得る。人工的な弱毒化はまた、化学的処理、乾燥、熟成、低温又は特定の培養条件への適応、遺伝子欠失などによって達成され得る。
【００３１】
抗原はまた、死んでいる不活性化された微生物を含み得る。ワクチン接種のための不活性化ウイルスの調製は、一般に、化学的又は物理的手段によって達成される。化学的な不活性化は、例えば、酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン又はその誘導体でウイルスを処理することによって行われ得る。その後、このようにして得られた不活性化ウイルスは、中和又は安定化され得る。物理的な不活性化は、ウイルスを高エネルギー放射線、例えばＵＶ光、Ｘ線照射又はγ線照射に供することによって行われ得る。
【００３２】
胞子を含む細菌は、例えば、熱、圧力によって、及び／又は化学物質（殺菌剤と称されることが多い）の使用によって不活性化され得る。例えば、腐食性組成物、例えばホルムアルデヒド及び次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）は、細菌を不活性化するために使用されている。あるいは、細菌の不活性化は、エチレンオキシド曝露、ｇ線照射、蒸気滅菌によって、又は近臨界及び超臨界二酸化炭素処理を使用することによって達成され得る。細菌はまた、病原性に関与する１つ又は複数の遺伝子の遺伝子改変によって不活性化又は無毒化され得る。このような遺伝子改変の例は、例えば、国際公開公報第２０１２／０９２２２６号に開示されている。
【００３３】
このような弱毒化又は不活化された微生物、例えばウイルス、細菌又は他の鳥類寄生虫はまた、商業的供給源から購入され得る。
【００３４】
抗原は、相同型（例えば、ニワトリを保護するためのニワトリウイルス）又は異種型（例えば、ニワトリを保護するためのシチメンチョウウイルス）であり得る。
【００３５】
本発明のワクチン又は組成物は、生抗原、合成抗原、そのフラグメント又はフラクションの組み合わせを含み得る。前記組成物はまた、広範な免疫応答を提供するために、様々な病原体由来の抗原を含み得る。
【００３６】
本発明によれば、抗原は、G.D. Butcher, J.P. Jacob, and F.B. Mather (PS47, Veterinary Medicine-Large Animal Clinical Sciences Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida; May 1999)に記載されている一般的疾患、例えば鶏痘、ニューカッスル病、感染性気管支炎、ウズラ気管支炎、リンパ性白血病、マレック病、感染性ファブリーキウス嚢病、感染性喉頭気管炎、産卵低下症候群、レオウイルス病、感染性腱鞘炎、ニワトリ脳脊髄炎、頭部腫脹症候群、七面鳥鼻気管炎若しくは鳥インフルエンザに関与するウイルス、マイコプラズマ症、パスツレラ症、サルモネラ症、ボルデテラ症などに関与する細菌、及び／又はコクシジウム症、カンピロバクター症に関与する他の鳥類寄生虫であり得る（由来し得る）。本発明のワクチン組成物に使用される好ましいワクチンは、全弱毒化生ウイルス株を含む。
【００３７】
好ましい抗原は、細胞性病原体、特に細菌又は真菌、例えばActinobaccilus pleuropneumoniae、Pasteurella multocida、Streptococcus pneumonia、Streptococcus pyogenes、E. coli、Salmonella、Shigella、Yersinia、Campylobacter、Clostridium、Vibrio及びGiardia、Entamoeba及びCryptosporidiumであるか、又はこれらに由来する。
【００３８】
特定の実施態様では、少なくとも１つの抗原は、細菌細胞、好ましくは生きているか、弱毒化されたか、又は不活性化された細菌を含む。本発明との関連では、細菌細胞は、全細胞、細胞のサブフラクション若しくは残屑又はそれらのペレットを含み得る。
【００３９】
好ましい実施態様では、細菌細胞は、好ましくはSalmonella Enteritidis、Salmonella Kentucky、Salmonella Typhimurium、Salmonella Heidelberg又はそれらの組み合わせの株から選択されるSalmonella菌である。より具体的には、抗原は、いくつかの異なる細菌細胞の、より好ましくは、異なるSalmonella株及び／又はそのサブフラクションの組み合わせを含む。好ましい実施態様では、抗原は、Salmonella Enteritidis、Salmonella Typhimurium及びSalmonella Kentuckyから選択される少なくとも２つの異なるsalmonella細胞を含む。
【００４０】
アジュバント
示されているように、本発明は、ＷＯＷ製剤とアジュバント化合物とを組み合わせる。ＷＯＷ製剤及びアジュバントは両方ともアジュバント活性を発揮し、これらは、驚くべきことに、本発明にしたがって組み合わせると相乗効果を提供する。
【００４１】
本発明との関連では、さらなるアジュバントは、抗原に対する免疫応答を促進又は刺激し得る任意の化合物である。
【００４２】
アジュバントの例としては、限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、糖、毒素、脂質、合成分子又は塩、例えばアルミニウム塩が挙げられる。アジュバントのより具体的な例としては、抗原に対する免疫系応答を増強する化学物質及びポリペプチド免疫刺激物質が挙げられる。このようなアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、細菌毒素、キチン誘導体及びキトサンなどを含み得る。
【００４３】
アルミニウム塩は、アルミニウム沈降ワクチンとして、及びアルミニウム吸着ワクチンとして、抗原と共に現在使用されている。アルミニウム塩の例として、水酸化アルミニウムが挙げられ得る。
【００４４】
好ましい実施態様では、さらなるアジュバントは、アルミニウム塩、好ましくは水酸化アルミニウムである。
【００４５】
特定の実施態様では、アジュバントは、好ましくはさらなる量の上記に定義される少なくとも１つの抗原と組み合わせた抗原−アジュバント複合体である。より好ましくは、アジュバントは、抗原−水酸化アルミニウム複合体である。
【００４６】
ＷＯＷエマルション
「ＷＯＷ」という用語は、水中油中水型エマルションを意味する。水中油中水型（ＷＯＷ）エマルションは、小水滴又は水小胞（内水相）が油性粒子（油相）内に包埋され、連続する水相（外水相）中に分散されているエマルションである。ＷＯＷエマルションは、第１のエマルション中で水相が油相に付加され、続いて、少なくとも第２のエマルション中で前記油相が水相中に分散されて生じる。図１に示されている本発明の特定のＷＯＷエマルション又は組成物は、典型的には、第１の界面活性剤膜によって囲まれた水小胞又は小滴に対応する内水相と、第２の界面活性剤膜によって囲まれた油相と、外水相とを含む。
【００４７】
典型的なＷＯＷ組成物は、油性粒子内に包埋された水小胞を含む粒状組成物であり、前記油性粒子は、外水相中に分散されている。
【００４８】
好ましくは、抗原又はそのフラクションは、油性小胞に包埋又は封入された内水相に含まれ、さらなるアジュバント化合物は、外水相中にある。好ましい実施態様では、外水相は、好ましくは抗原−アジュバント複合体の形態で、前記少なくとも１つの抗原のフラクションと、前記さらなるアジュバントとを含む。好ましい実施態様によれば、組成物中の抗原の総量の約７５％は油性小胞中にあり、組成物中の抗原の総量の約２５％は、アジュバント化合物と場合により複合体形成した外水相中にある。
【００４９】
ＷＯＷエマルションは、様々なサイズ／分布特性を有し得る。しかしながら、好ましい実施態様では、油性粒子は、１〜４０μm、より好ましくは３〜３０μm、特により好ましくは３〜２０μm、最も好ましくは５〜２０μmに含まれるサイズを有する。粒子のサイズは、典型的には、その直径を示す。実際、本発明は、このようなサイズ範囲が、in vivo投与時に最良の免疫学的効力を提供することを示す。
【００５０】
より具体的には、本発明の好ましいＷＯＷ組成物では、油性粒子の少なくとも８０％は２０μm未満のサイズを有し、より好ましくは、油性粒子の少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％は２０μm未満のサイズを有する。さらに、好ましい実施態様では、油性粒子の少なくとも５％、好ましくは約１０％は、１０μm以下のサイズ、好ましくは５〜１０μmに含まれるサイズを有する。本発明の最も好ましい組成物は、油性粒子の少なくとも９０％が２０μm以下のサイズを有し、少なくとも１０％が１０μm未満のサイズ（例えば、Ｄ１０≦１０μm及びＤ９０≦２０μm）を有するような油性粒子の分布プロファイルを有する。本発明は、このようなサイズ及び分布プロファイルによって、特に強力な免疫応答が細菌抗原に対して引き起こされ得ることを示す。
【００５１】
油
本発明のＷＯＷエマルションに使用するための適切な油としては限定されないが、植物油、動物油及び鉱物油又はそれらの混合物が挙げられる。
【００５２】
植物油の例としては、限定されないが、ヤシ油、コーン油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、カノーラ油、ベニバナ油、ゴマ油、豆油、ヒマワリ油、マスタード油、ラノリン油扁桃油、アルガン油、ヒマシ油、マカダミア油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、モンゴンナッツ、ピーカン油、ピスタチオナッツ、クルミ油、カロフィラム油、アボカド油、大豆油、ホホバ油又はそれらの混合物が挙げられる。
【００５３】
動物油の例としては、限定されないが、魚油、タートル油、ミンク油、鶏脂油、クジラ油、マッコウクジラ油、シール油、タラ肝油、エミュー油、水素化スクアレン（又はペルヒドロスクアレン）又はそれらの混合物が挙げられる。
【００５４】
鉱物油の例としては、限定されないが、パラフィン油、例えばパラフィン及びイソパラフィン、石油ゼリー油、Drakeol又はMineral Oil Light No.5が挙げられる。
【００５５】
特定の実施態様では、本発明のＷＯＷエマルション及び油性粒子は、好ましくは植物油、動物油及び鉱物油又はそれらの混合物から選択される１つ又は複数の油を含む。好ましくは、ＷＯＷエマルション及び油性粒子は、少なくとも１つの鉱物油を含む。
【００５６】
界面活性剤
好ましい実施態様では、本発明のＷＯＷエマルションは、少なくとも１つの界面活性剤をさらに含有する。
【００５７】
界面活性剤は、典型的には、適切な親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を製剤に提供する条件下で選択され、又は組み合わされ、又は使用される。界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせのＨＬＢは、その親水性又は親油性の程度の尺度であり、Griffin (Journal of the Society of Cosmetic Chemists, 1949, 1(5), 311-26及びJournal of the Society of Cosmetic Chemists, 1954, 5(4), 249-56)に記載されているように、分子の異なる領域の値を計算することによって決定される。
【００５８】
最も好ましくは、第１のエマルションに使用される界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせは、低いＨＬＢ値（典型的には、４〜７、好ましくは約６．０）を有し、第２のエマルションに使用される界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせは、高いＨＬＢ値（典型的には、７〜１５、好ましくは約１０．５）を有する。
【００５９】
エマルションワクチンに使用される界面活性剤の例としては、限定されないが、モノオレイン酸ソルビタン（Span 80）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80）、セスキオレイン酸ソルビタン（Span 83）、レシチン及びモノオレイン酸マンニド又はそれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
好ましくは、本発明のＷＯＷエマルションは、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン及びモノオレイン酸ソルビタンから選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む。より好ましくは、第１のＷＯエマルションに使用される界面活性剤はSpan 80及びTween 80の組み合わせであり、第２のＯＷエマルションに使用される界面活性剤はTween 80である。
【００６１】
塩
本発明のワクチン及び組成物は、１つ又は複数の塩を場合によりさらに含む。塩の追加は、油性粒子への水の浸透を阻害し、油性粒子をさらに安定化し得る。
【００６２】
このような塩の例としては、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム又は硫酸マグネシウムが挙げられる。特定の実施態様では、塩は、塩化ナトリウムである。
【００６３】
保存剤
本発明の組成物は、獣医学分野で許容し得る１つ以上の保存剤をさらに含み得る。限定されないが、適切な保存剤の例としては、
−酸、例えば安息香酸、ソルビン酸及びそれらのナトリウム又はカリウム塩；
−エステル、例えばメチルパラベン、エチルパラベン及びプロピルアパラベン；
−アルコール、例えばクロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、フェノキシエタノール、フェノール、例えばクロロクレゾール及びｏ−フェニルフェノール；
−水銀化合物、例えばチメロサール、ニトロメルゾール、硝酸フェニル水銀及び酢酸フェニル水銀；
−第４級アンモニウム化合物、例えば塩化ベンザルコニウム（benalkonium chloride）及び塩化セチルピリジニウム
が挙げられる。
【００６４】
好ましい実施態様では、保存剤は、チメロサール溶液、典型的には１０％チメロサール溶液である。
【００６５】
調製方法
本発明の組成物は、それ自体が当技術分野で一般に公知の技術を使用して生産され得る。しかしながら、好ましくは、前記方法は、ＷＯＷエマルションを形成する第１の工程、及び前記ＷＯＷエマルションをさらなるアジュバント化合物と混合する第２の工程を含む。
【００６６】
より具体的には、本発明のワクチンは、
ａ）油性基剤中で前記少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを形成する工程、
ｂ）前記ＷＯエマルションを分散相に追加し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成し、前記ＷＯＷエマルションを乳化する工程、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、前記ＷＯＷエマルションをさらなるアジュバントと混合する工程
を含む方法によって得られる。
【００６７】
したがって、本発明のさらなる目的は、少なくとも１つの抗原とさらなるアジュバントとを含む組成物を調製するための方法であって、
ａ）油性基剤中で前記少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを形成する工程、
ｂ）前記ＷＯエマルションを分散相に追加し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成し、前記ＷＯＷエマルションを乳化する工程、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、前記ＷＯＷエマルションをさらなるアジュバントと混合する工程
を含む方法である。
【００６８】
特定の実施態様では、工程ａ）の油性基剤は、１つ又は複数の油と、上記に定義される少なくとも１つの界面活性剤とを含む。好ましくは、油性基剤は、鉱物油と、Span 80及びTween 80の組み合わせとを含む。より好ましくは、界面活性剤又は界面活性剤の混合物は、４〜７、好ましくは約６．０のＨＬＢを提供する。
【００６９】
さらなる特定の実施態様では、工程ｂ）の分散相は、脱イオン水と、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくはTween 80とを含む。特定の実施態様では、分散相は、上記に定義される塩及び／又は保存剤をさらに含む。好ましくは、分散相は、脱イオン水、塩化ナトリウム、Tween 80及びチメロサール溶液を含む。特に、界面活性剤（例えば、Tween 80）又は界面活性剤の混合物は、７〜１５、好ましくは約１０．５のＨＬＢを提供する。
【００７０】
別の特定の実施態様では、工程ｃ）のさらなるアジュバントは、上記に定義されるものなどである。好ましくは、さらなるアジュバントは、好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせた水酸化アルミニウムであり、又は前記水酸化アルミニウムを含む。
【００７１】
乳化工程は、所定のサイズを有する油性粒子が得られるように循環パラメータが決定された多段階乳化セットを通して行われ得る。
【００７２】
特定の実施態様では、油性基材中の前記少なくとも１つの抗原の溶液を、非常に高い毎分回転数（rpm）、好ましくは１５０００〜３００００rpm、より好ましくは２００００〜２５０００rpm、典型的には約２２０００rpm、少なくとも１回の循環、好ましくは３回の循環で乳化する。次いで、エマルションを前記分散相に追加し、低rpm、好ましくは１０００〜６０００rpm、より好ましくは２０００〜５０００rpm、典型的には約３０００rpm、少なくとも１回の循環、好ましくは２回の循環、より好ましくは３回の循環で乳化する。場合により、さらなる循環を、中rpm、好ましくは５０００〜１５０００rpm、より好ましくは８０００〜１２０００rpm、典型的には約１００００rpmで実施する。
【００７３】
このような特定のプロセス条件は、上記に定義されるサイズ分布プロファイルを有する少なくとも１つの抗原がロードされた油性粒子を得ることを可能にし、好ましくは、該粒子の約１０％（Ｄ１０）は、１０μm未満、好ましくは５〜１０μmのサイズを有し、該粒子の約９０％（Ｄ９０）は、２０μm未満のサイズを有する。
【００７４】
少なくとも１つの前記抗原がロードされた油性粒子のこのようなサイズ分布プロファイルは、従来の油中水型エマルションよりも低粘性であり、容易に注射可能であり、高免疫原性の安定なＷＯＷエマルションを提供する。
【００７５】
乳化工程ａ）及びｂ）の後、好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、１つ又は複数のさらなるアジュバント化合物をＷＯＷエマルションと混合することによって、本発明の組成物を得る。
【００７６】
したがって、本発明の組成物を調製するための好ましい方法は、
ａ）約２２０００rpm、３回の循環の多段階乳化セットによって、油性基剤中で前記少なくとも１つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを形成すること、
ｂ）約３０００rpm、３回の循環及び約１００００rpm、さらに１回の循環の多段階乳化セットによって、分散相中で前記ＷＯエマルションを乳化し、それにより、ＷＯＷエマルションを形成すること、及び
ｃ）好ましくはさらなる量の前記少なくとも１つの抗原と組み合わせて、さらなるアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを前記ＷＯＷエマルションと混合すること
を含む。
【００７７】
より好ましい実施態様では、工程ａ）は約６．０のＨＬＢで行われ、工程ｂ）は約１０．５のＨＬＢで行われる。
【００７８】
好ましい組成物
本発明の好ましい組成物及びワクチンは、以下に記載される。これらの組成物は、in vivo（内臓中を含む）で強力かつ持続的な免疫防御を誘導して、例えば、様々な疾患に対する非ヒト動物の有効な防御を可能にし得る。
【００７９】
本発明の特定の組成物は、１〜３０μmに含まれる粒径を有するＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物と組み合わせた細菌抗原を含む。
【００８０】
本発明のさらなる特定の組成物は、１〜３０μmに含まれる粒径を有するＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物と組み合わせた細菌抗原であって、全弱毒化細胞を含む細菌抗原を含む。
【００８１】
本発明のさらなる特定の組成物は、１〜３０μmに含まれる粒径を有するＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物と組み合わせたSalmonella抗原を含む。
【００８２】
本発明のさらなる特定の組成物は、１〜３０μmに含まれる粒径を有するＷＯＷエマルション中のアジュバント化合物と組み合わせたSalmonella抗原であって、場合により弱毒化された全Salmonella細胞、好ましくはＳＴ、ＳＥ及びＳＫから選択される少なくとも２種類のSalmonella細胞の混合物を含むSalmonella抗原を含む。
【００８３】
本発明の組成物は、好ましくは、有効量の抗原、例えば、（単回投与又は反復投与で）動物において免疫応答を誘導するのに十分な量の抗原を含む。当業者であれば、抗原、製剤及び目的の用途に応じて、抗原の有効量を調整し得る。組成物中の抗原の量は、重量、生物学的活性及び／又は密度などの様々な方法によって評価され得る。典型的な実施態様では、有効量は、組成物が、４よりも高い、好ましくは５よりも高い、典型的には４〜１２、好ましくは５〜８、より好ましくは５〜６．５に含まれる総ＯＤ６００／mlを有する量である。さらに、抗原は、油性粒子及び外水相に含まれ得るので、本発明の組成物中の抗原の総量の少なくとも６０％、最も好ましくは約６０〜７５％は油性粒子に含まれ、残りの４０〜２５％は外水相中にあることが好ましい。
【００８４】
これに関して、本発明のさらなる特定の目的は、ＷＯＷエマルション中の全細菌細胞を含むワクチン又は免疫原性組成物であって、該ＷＯＷエマルション中の油性粒子の少なくとも９０％が２０μm未満のサイズを有し、該組成物が４よりも高いＯＤ６００／mlを有し、該組成物中の細胞の少なくとも６０％が前記油性粒子に含まれるワクチン又は免疫原性組成物である。さらに好ましい実施態様では、本発明の組成物は、ＷＯＷエマルション中の不活化又は弱毒化された全細菌細胞を含み、該ＷＯＷエマルション中の油性粒子の少なくとも９０％は２０μm未満のサイズを有し、少なくとも５％は１０μm未満のサイズを有し、該組成物は５よりも高いＯＤ６００／mlを有し、該組成物中の細胞の少なくとも６０〜７５％は前記油性粒子に含まれる。好ましい実施態様では、これらの組成物は、さらなるアジュバント化合物（これは、典型的には外水相中にある）をさらに含有する。
【００８５】
本発明の好ましい組成物は、界面活性剤、塩及び保存剤をさらに含む。
【００８６】
用途
本発明のワクチン及び組成物は、動物において有効量の前記少なくとも１つの抗原を送達するために使用され得る。
【００８７】
より具体的には、本発明のワクチンは、動物において、上記に定義される少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００８８】
実施例に示されているように、二重アジュバント系を含む本発明のワクチンは、肝臓、脾臓及び盲腸などのいくつかの器官において、病原体感染に対する防御の改善をもたらす。さらに、示されているように、この効果は、従来技術のワクチンで観察されるものよりも非常に強力であり、ＷＯＷ及びアジュバント化合物の相乗効果を示している。
【００８９】
したがって、本発明のさらなる目的は、動物における感染症、好ましくは細菌感染症を治療及び／又は予防するための上記に定義されるワクチン又は組成物の使用に関する。
【００９０】
本発明のさらなる目的は、動物における感染症、好ましくは細菌感染症を治療及び／又は予防するための方法であって、上記に定義されるワクチン又は組成物を該動物に投与することを含む方法である。
【００９１】
特定の実施態様では、細菌感染症は、salmonella感染症、好ましくはSalmonella Enteritidis感染症、Salmonella Kentucky感染症、Salmonella Typhimurium感染症又はSalmonella Heidelberg感染症である。
【００９２】
本発明の組成物及びワクチンは、任意の通常経路によって、例えば全身投与によって、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与、経鼻適用、眼内投与によって、より好ましくは注射によって投与され得る。
【００９３】
本発明は、非ヒト動物、特に家禽（例えば、ニワトリ）、ウシ、ヒツジ又はブタを処置するために特に適切である。特に、動物は、ニワトリである。
【００９４】
特定の実施態様では、本発明のワクチンは、油中水型（ＷＯ）エマルション中の従来のワクチンに対する耐性が低い動物に投与される。
【００９５】
特許請求の範囲に記載されている本発明を例証する以下の実験セクションにおいて、本発明のさらなる態様及び利点を開示する。
【実施例】
【００９６】
Ａ．細菌抗原を含むワクチンＡの生産
細菌抗原は、最低抗原濃度で生産したSalmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン生成物の組み合わせであった。Salmonella抗原を追加しない以外は、全てのアジュバント及び他の成分を含有するワクチンと同じプロセスを利用して、プラセボを生産した。Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン及びプラセボの各０．５０ml用量の抗原性製剤を以下の表１に示す。
【表１】
2017518338.tif 000002
【００９７】
以下のように、ワクチンを生産した：
【００９８】
工程Ｉ：
水酸化アルミニウム９４２mlを、プールした抗原２０６ml（プールした抗原の２５％）と混合することによって、水酸化アルミニウム−抗原複合体を調製した。複合体を室温で少なくとも４時間混合し、次いで使用まで２〜７oＣで保存した。
【００９９】
工程ＩＩ：
油性基材３２２２mlを、約２２，０００毎分回転数（rpm）で乳化器によって循環させ、乳化器のエントリー直前に、プールした抗原６２０ml（プールした抗原の７５％）を徐々に追加した。抗原を追加した後、２２，０００回転、３回の循環で、溶液を乳化した。これにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを作成した。
【０１００】
工程ＩＩＩ：
次いで、ＷＯエマルションを分散相（０．８５％塩化ナトリウム、Tween 80及びチメロサール）５００８mlに激しく混合しながら徐々に追加し、１時間混合した。これにより、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルションを作成した。
【０１０１】
工程ＩＶ：
３，０００rpm、３回の循環で乳化し、続いて１０，０００rpm、１回の循環で乳化することによって、ＷＯＷエマルションの粒径を減少させた。Ｄ１０及びＤ９０の粒径範囲は、それぞれ８．６及び１２．２マイクロメートルであった。
【０１０２】
工程Ｖ：
次いで、水酸化アルミニウム−抗原複合体１１４８mlをＷＯＷエマルションに混合し、充填前に室温で少なくとも１時間混合した。
【０１０３】
Ｂ．細菌抗原を含むワクチンＢの生産
細菌抗原は、最低抗原濃度で生産したSalmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン生成物の組み合わせであった。Salmonella抗原を追加しない以外は、全てのアジュバント及び他の成分を含有するワクチンと同じプロセスを利用して、プラセボを生産した。Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン及びプラセボの各０．５０ml用量の抗原性製剤を以下の表２に示す。
【表２】
2017518338.tif 000003
【０１０４】
以下のように、ワクチンを生産した。
【０１０５】
工程Ｉ：
水酸化アルミニウム９４３mlを、プールした抗原３６０ml（プールした抗原の２５％）と混合することによって、水酸化アルミニウム−抗原複合体を調製した。複合体を室温で少なくとも４時間混合し、次いで使用まで２〜７oＣで保存した。
【０１０６】
工程ＩＩ：
油性基材３２２３mlを、約２２，０００毎分回転数（rpm）で乳化器によって循環し、乳化器のエントリー直前に、プールした抗原１０７９ml（プールした抗原の７５％）を徐々に追加した。抗原を追加した後、２２，０００回転、３回の循環で、溶液を乳化した。これにより、油中水型（ＷＯ）エマルションを作成した。
【０１０７】
工程ＩＩＩ：
次いで、ＷＯエマルションを分散相（０．８５％塩化ナトリウム、Tween 80及びチメロサール）４３９４mlに激しく混合しながら徐々に追加し、１時間混合した。これにより、水中油中水型（ＷＯＷ）エマルションを作成した。
【０１０８】
工程ＩＶ：
３，０００rpm、３回の循環で乳化し、続いて１０，０００rpm、１回の循環で乳化することによって、ＷＯＷエマルションの粒径を減少させた。Ｄ１０及びＤ９０の粒径範囲は、それぞれ９．３及び１２．６マイクロメートルであった。
【０１０９】
工程Ｖ：
次いで、水酸化アルミニウム−抗原複合体１３００mlをＷＯＷエマルションに混合し、充填前に室温で少なくとも２時間混合した。
【０１１０】
Ｃ．Salmonella菌に対する有効な防御
材料
比較評価のために、ワクチン１〜４を調製する。
【０１１１】
本発明のワクチン１は、二重アジュバント系を含む（ＷＯＷ＋Ａｇ−Ａｌ（ＯＨ）３）。
【０１１２】
ワクチン２は、Ａｇ−Ａｌ（ＯＨ）３アジュバントを含むがＷＯＷではない。
【０１１３】
ワクチン３は、ＷＯＷエマルションを含むが、さらなるアジュバント化合物を含まない。
【０１１４】
ワクチン４は、ＷＯＷエマルション及びＡｌ（ＯＨ）３を含むが、抗原を含まない（プラセボ）。
【０１１５】
比較試験のために、標準的な手順によって、ワクチン番号２〜４を調製した。（プラセボを除く）全てのワクチンは、同量の抗原を含有していた。
【０１１６】
方法
４週齢及び８週齢時に、ニワトリにワクチン接種し、１２週齢時にチャレンジした。チャレンジの７日後（１３週齢）に、剖検を実施した。
【０１１７】
結果
結果を以下の表３に示す。右端の欄から分かるように、ワクチン１はSalmonella感染症を予防した一方（０．００２）、ワクチン２〜４はあまり有効ではなく、細菌感染症を本質的に予防しなかった。
【表３】
2017518338.tif 000004
【０１１８】
分かるように、本発明の二重のアジュバント系を含むワクチン１は、試験したターゲット組織の全てにおいて、顕著な防御をもたらした。
【０１１９】
ワクチン２（単一ＯＷエマルション）は、特に肝臓では有効ではなく（再単離＝１００％）；アジュバント化合物を欠くワクチン３もまた、全ての組織で有効ではなかった（再単離＝１００％）。
【０１２０】
したがって、本発明者らは、驚くべきことに、細菌感染症を予防するための本発明のワクチンの改善された有効性を示した。この効果は、単一アジュバントの比較ワクチン２及び３よりも非常に強力であるので、試験した全ての組織において顕著であり、相乗的である。
【０１２１】
Ｄ：本発明のワクチンは、in vivoで細菌感染症から有効に防御する
材料及び方法
動物
本研究では、Charles Riverの特定病原体除去ニワトリを使用した。１日齢時に、雛を、South Dakota State University Brookings, South DakotaにあるRural Technologies, Inc.の施設に移した。研究期間中、全てのニワトリは、同じ部屋（混合）にいた。ニワトリの陰性salmonella状態を確認するために、１２週齢及び２４週齢時に個々のニワトリから総排泄腔スワブを採取し、salmonellaの再単離について試験した。
【０１２２】
チャレンジ生物
異種の、ＳＥ（Salmonella Enteritidis）、ＳＫ（Salmonella Kentucky）、ＳＴ（Salmonella Typhimirium）又はＳＨ（Salmonella Heidelberg）チャレンジ株を、全ての処置群のニワトリにチャレンジした。生菌数アッセイによって、チャレンジ用量を決定した。
【０１２３】
方法
１４週齢の特定病原体除去ニワトリを３つの処置群にランダムに分け、ワクチン接種した。０．５mlのＩＭ（筋肉内）用量を使用して、Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン（ワクチンＡ）を第１の群にワクチン接種した。また、ＳＱ（皮下）経路による投与によって、与ワクチンＡ ０．５mlを第２の群にワクチン接種した。０．５ml用量を使用して、プラセボを第３の群に投与した；プラセボをＳＱ経路によってこれらのニワトリの半分に投与し、ＩＭ経路によって半分に投与した。１８週齢時に、別の０．５ml用量又はプラセボを同じ経路によってニワトリに投与した。２回目のワクチン接種の８週間後（ニワトリが２６週齢であった時点）に、病原性異種ＳＥ、ＳＫ、ＳＴ又はＳＨチャレンジ株を全てのニワトリにチャレンジした。チャレンジの１週間後に、ニワトリを剖検し、各ニワトリから盲腸、肝臓／脾臓又は卵巣を採取し、ＳＥ、ＳＫ、ＳＴ又はＳＨのコロニー形成について試験した。バクテリンが、盲腸、肝臓／脾臓又は卵巣におけるＳＥ、ＳＫ、ＳＴ又はＳＨのコロニー形成の減少を支援したか否かを決定するために、再単離の結果を使用して予防分画の評価を行った。ワクチン接種、観察、チャレンジ及び再単離は、RTI (Rural Technologies, Inc)で行った。
【０１２４】
Salmonellaのスクリーニング
１．ワクチン接種前
６週齢時に、ニワトリ２０羽を安楽死させ、剖検した。以下の「組織コロニー形成の検出」のセクションに記載されているように、肝臓、脾臓及び盲腸をサンプリング及び試験した。１３週齢時に、全てのニワトリから総排泄腔スワブを採取した。ウェットタイプの綿棒を用いて、これらの各ニワトリからスワブを取り、５つの鳥スワブを、四チオン酸ブリリアントグリーン増菌培養液（ＴＴＢＧ）１０mlを含有するチューブにプールした。チューブを４２℃で４８時間インキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、各ＴＴＢＧブロス培養物の１０マイクロリットルアリコートを、タージトール４（ＸＬＴ４）を含有するキシロースリジン寒天プレート上にストリークし、３７℃で４８時間インキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー（Difco Manual, 1998））の存在について、ＸＬＴ４プレートを調査した。１回目にＸＬＴ４上にストリークした後のsalmonellaに典型的なコロニーについて陰性であったブロス培養物を、インキュベーションの４８時間後にＸＬＴ４上に再びストリークし、２４時間及び４８時間後にプレートを評価した。次いで、２４時間及び４８時間のサンプリングから陰性であったサンプルを、遅延二次増菌法（ＤＳＥ）によって試験した。簡潔に言えば、ＴＴＢＧチューブを室温（２０〜２５℃）で５〜７日間置いてから、サンプル１mlを新鮮なＴＴＢＧ ９mlに移した。次いで、これらのチューブを３７℃で２４時間インキュベーションし、ＸＬＴ４プレート上に植菌し、プレートを３７℃で４８時間インキュベーションした。４８時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー（Difco Manual, 1998））の存在について、ＸＬＴ４プレートを調査した。
【０１２５】
２．ワクチン接種後／チャレンジ前
チャレンジの２週間前（鳥が２４週齢であった時点）に、チャレンジすべき全ての鳥から総排泄腔スワブを採取し、上記のようにsalmonellaの存在についてスクリーニングした。
【０１２６】
チャレンジ方法
２回目のワクチン接種の８週間後（ニワトリが２６週齢であった時点）に、ＳＥ、ＳＫ、ＳＴ又はＳＨの新たに成長させた病原性異種培養物０．５ml（１×１０３〜１×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有するように希釈したもの）を、経口投与又は筋肉内投与によって、全ての鳥にチャレンジした。チャレンジを調製するために、凍結シードを解凍し、１mlを２５０ml大豆ペプトンブロスに移し、３７℃で６時間インキュベーションした。経口チャレンジ又は筋肉内チャレンジのために、６時間培養物１mlを所定量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に追加した。このチャレンジ調製物を連続希釈及びプレーティングして、チャレンジで生菌数を求めた。
【０１２７】
組織コロニー形成の検出
チャレンジの７日後（ｄｐｃ）に、各鳥を剖検した。肝臓、脾臓、卵巣及び内容物を伴う盲腸嚢をサンプリングし、防御応答を実証する直接的な方法として、チャレンジ株のコロニー形成について試験した。脾臓全体及び肝臓約１ｇを同じ組織粉砕機に入れ、ＴＴＢＧ ２０mlを各粉砕機に追加し、組織を細分し、次いで、３７℃で４８時間インキュベーションした。卵を含む卵巣をホワールパックバッグに入れ、手でマセレートし、計量し、１：１０w/vの組織媒体比でＴＴＢＧに移し、次いで、３７℃で４８時間インキュベーションした。内容物を伴う各盲腸嚢約１グラムを蓋付き使い捨て滅菌組織粉砕機に入れ、ＴＴＢＧブロス２０mlを追加し、組織を細分し、サンプルを含有する組織粉砕機を４２℃で４８時間インキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、各ＴＴＢＧブロス培養物のアリコートをＸＬＴ４寒天上にストリークし、３７℃で２４時間インキュベーションした。さらなる成長のために、ＴＴＢＧブロス培養物を適切な温度で再びインキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー（Difco Manual, 1998））の存在について、ＸＬＴ４プレートを調査した。１回目にＸＬＴ４上のsalmonellaに典型的なコロニーについて陰性であったブロス培養物を、インキュベーションの４８時間後の２回目に新たなＸＬＴ４プレート上に再びストリークし、３７℃で２４時間インキュベーションし、その時点で評価した。確認試験のために、ＸＬＴ４プレート上のsalmonellaに典型的であった細菌コロニーを、３つの異なる寒天（三糖鉄寒天（ＴＳＩ）、リジン鉄寒天（ＬＩＡ）及び仔牛寒天）上に植菌し、３７℃で２４時間インキュベーションした。単離株が、ＴＳＩ及びＬＩＡ上でsalmonellaの典型的反応を示した場合（Difco Manual, 1998）、Salmonella群を確認するために単一因子種特異的Salmonella O単一因子抗血清中で、及びチャレンジ生物のSalmonella血清型を確認するためにSalmonella H:g,m抗血清中で、凝集用仔牛寒天プレートからその単離株のコロニーを採取した。
【０１２８】
一次増菌について陰性であった全ての処置群の全ての組織サンプルを、遅延二次増菌法（ＤＳＥ）によって試験した。簡潔に言えば、最初の４８時間のインキュベーション期間後、ＴＴＢＧ培養物を室温（２０〜２５℃）で保存した。室温に移した６日後に、培養物１mlを新鮮なＴＴＢＧ ９mlに追加することによって、新鮮なＴＴＢＧブロス中で培養物を濃縮した。次いで、サンプルを４２oＣでインキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、各ＴＴＢＧブロス培養物のアリコートをＸＬＴ４寒天上にストリークし、３７℃で４８時間インキュベーションした。２４時間及び４８時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー（Difco Manual, 1998））の存在について、ＸＬＴ４プレートを調査した。
【０１２９】
評価法
チャレンジ後に、内臓、盲腸、肝臓／脾臓、卵巣及び生殖管におけるチャレンジ株のコロニー形成について、抗原を含有するバクテリンを投与したＩＭ及びＳＱワクチン接種群を、プラセボワクチン接種群とそれぞれ比較した。内臓、生殖管及び／又は腸管におけるＳＥ、ＳＫ、ＳＴ又はＳＨのコロニー形成の予防分画（リスク比の補数）を計算することによって、各処置群のバクテリンの有効性を統計的に評価した。
【０１３０】
統計
式ＰＦ＝１−ｐｖ／ｐｃ（式中、ｐｖ及びｐｃは、それぞれワクチン接種及びコントロールの罹患率である）にしたがって、予防分画（リスク比の補数）を計算した。プロトコールに示されているように、コントロール群は、ＩＭ又はＳＱ投与にかかわらず、プラセボを投与した全てのニワトリを含む。SAS（登録商標）System, version 9.3（コードはＡＰＨＩＳによる提供）及びR 2.13.0を使用して、全ての利用可能なデータについて、全ての分析を実施した。
【０１３１】
結果
Salmonellaのスクリーニング
６週齢のニワトリ由来の全ての組織サンプル、及び２４週齢のニワトリ由来の全ての排出サンプルは陰性であったが、これは、ワクチン接種前及びチャレンジ前に、これらのニワトリにはSalmonellaがなかったことを示している。
【０１３２】
安全性の観察結果
あらゆるワクチン関連副作用及び死亡について、ニワトリを毎日観察した。いかなるニワトリにおいても、有害なワクチン反応又は死亡の発生は観察されなかった。
【０１３３】
１．Salmonella Enteritidis（ＳＥ）感染症に対する防御
結果を以下の表４並びに図２Ａ及び２Ｂに示す。
【表４】
2017518338.tif 000005
【０１３４】
結果は、以下を示している：
ＳＱ経路によって投与したワクチンＡは、全ての試験した内蔵、例えば肝臓／脾臓、盲腸及び卵巣のＳＥコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
【０１３５】
特に、盲腸及び卵巣では、０．５超の予防分画が得られたが、これは、ワクチン処置が、このような内臓における防御ＳＥ効果を５０％超改善した（ＰＦ＝０．５６９及びＰＦ＝０．５８４）ことを意味する。これらの結果はまた、盲腸（７８％）及び卵巣（７０％）では、７０％超の防御ＳＥ効果が得られることを図２Ａで示している。
【０１３６】
ＩＭ経路によるワクチンＡの投与は、全ての内蔵、例えば肝臓／脾臓、盲腸及び卵巣のＳＥコロニー形成の軽減に一層有効であった（表３：肝臓／脾臓及び卵巣ではＰＦ＞０．７、並びに図２Ｂ：肝臓／脾臓、盲腸及び卵巣では７５％超の防御ＳＥ効果）。
【０１３７】
全ての内臓の９５％信頼水準の下限は、ＳＱ経路及びＩＭ経路の両方で０超であったが、これは、ＳＱ経路及びＩＭ経路によって投与したワクチンＡによるニワトリのワクチン接種が、内蔵のＳＥチャレンジ株のコロニー形成を軽減するのに有効であったという統計的に有意な証拠である。
【０１３８】
２．Salmonella Typhimurium（ＳＴ）感染症に対する防御
結果を以下の表５並びに図３Ａ及び３Ｂに示す。
【表５】
2017518338.tif 000006
【０１３９】
結果は、以下を示している：
ＳＱ経路又はＩＭ経路によって投与したワクチンＡは、肝臓／脾臓及び盲腸のＳＴコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
【０１４０】
特に、肝臓／脾臓では、０．５超の予防分画が得られたが、これは、このような内臓における防御効果の改善を意味する。図３Ａ及び図３Ｂはまた、ＳＱ経路及びＩＭ経路の両方について、肝臓／脾臓（７０％超の防御ＳＴ効果）及び盲腸（４０％の防御ＳＴ効果）における防御効果の改善を示している。
【０１４１】
３．Salmonella Kentucky（ＳＫ）感染症に対する防御
結果を以下の表６及び図４に示す。
【表６】
2017518338.tif 000007
【０１４２】
結果は、以下を示している：
ＳＱ経路又はＩＭ経路によって投与したワクチンＡは、盲腸におけるＳＫコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
【０１４３】
特に、ＩＭ経路によって約０．６４の予防分画が得られ、ＳＱ経路によって０．４超の予防分画が得られた。図４はまた、ＳＱ経路及びＩＭ経路によるワクチンについて、ＳＫに対する防御効果の改善を示している（８５％超の防御ＳＫ効果、図４）。
【０１４４】
４．Salmonella Heidelberg（ＳＨ）感染症に対する防御
【表７】
2017518338.tif 000008
【０１４５】
結果は、以下を示している：
ＳＱ経路によってワクチンＡをワクチン接種した群では、内臓肝臓及び脾臓からのＳＨチャレンジ株の再単離率は１３％であり、盲腸からの再単離率は４１％であり、卵巣からの再単離率は８％であり、プラセボ群では、それぞれ８２％、６９％及び５９％であった（図５Ａ）。予防分画の９５％信頼限界の下限は、これら全ての組織で０超であった。したがって、内臓、盲腸及び卵巣では、ワクチンＡは、ＳＱ経路によって投与した場合にＳＨ感染症を軽減した。ＩＭ経路によってワクチンＡをワクチン接種した群では、内臓肝臓及び脾臓からのＳＨ株の再単離率は１９％であり、盲腸からの再単離率は７０％であり、卵巣からの再単離率は１４％であった（図５Ｂ）。予防分画の９５％信頼限界の下限は、内臓及び卵巣で０超であった。したがって、内臓及び卵巣では、ワクチンＡは、ＩＭ経路によって投与した場合にＳＨ感染症を軽減した。
【０１４６】
ＩＭ経路又はＳＱ経路によって投与したＳＥ−ＳＴ−ＳＫ細菌を含むワクチンＡは、驚くべきことに、ワクチン接種動物の内臓（肝臓／脾臓）及び卵巣のＳＨ感染症を軽減及び予防するのに有効であった。
【０１４７】
Ｅ．ワクチン組成物の安全性
雌鶏における筋肉内注射部位の反応を計算することによって、ワクチンＡの安全性を分析した。スコアリング方法は、表８に定義されている。
【表８】
2017518338.tif 000009
【０１４８】
結果は図６に示され、Salmonella ＯＤ／用量に応じた単一エマルションＷＯ中の従来技術のワクチンと比較したワクチンＡ（ＳＥ−ＳＴ−ＳＨ）の平均反応スコアを示している。
【０１４９】
１．１５及び１．０３  ＳＥ  ＯＤ／用量では、単一エマルション中のワクチンは、それぞれ４．８及び１０．２の平均反応スコアを有する。
【０１５０】
ワクチンＡについて得られた平均反応スコアは３．７であるのに対して、Salmonella ＯＤ／用量は約５倍超高まっている（５．１）。
【０１５１】
驚くべきことに、これらの結果により、本発明のワクチンを筋肉内注射した場合の平均反応スコアが低いことが示され、それにより、安全性の改善が実証された。
【図１】
2017518338.tif 000010
【図２Ａ】
2017518338.tif 000011
【図２Ｂ】
2017518338.tif 000012
【図３Ａ】
2017518338.tif 000013
【図３Ｂ】
2017518338.tif 000014
【図４】
2017518338.tif 000015
【図５Ａ】
2017518338.tif 000016
【図５Ｂ】
2017518338.tif 000017
【図６】
2017518338.tif 000018
【国際調査報告】
2017518338.tif 000019
2017518338.tif 000020
2017518338.tif 000021