(57)【要約】  本発明は、直接マススペクトル分析法を用いて、血液サンプル中の非−グリコシル化およびグリコシル化ヘモグロビンのレベルを測定する方法に関する。グリコシル化されたヘモグロビン分子の割合は、糖尿病前症または糖尿病を診断するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から得られた血液サンプルを直接マススペクトル分析し、前記サンプル中に存在するグリコシル化ヘモグロビン（Ｈｂ）の割合を決定することを含む、前糖尿病または糖尿病を検出する方法。
【請求項２】
前記存在するグリコシル化ヘモグロビンの割合の決定は、（ｉ）グリコシル化αグロビンおよび非グリコシル化αグロビンのレベル、および／または（ｉｉ）グリコシル化βグロビンおよび非グリコシル化βグロビンのレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記直接マススペクトル分析の前に、前記血液サンプルを溶解する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記直接マススペクトル分析の前に、前記血液サンプルを希釈する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記直接マススペクトル分析に供されたサンプルは、溶解および／または希釈以外の処理はされていない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記直接マススペクトル分析から得られたスペクトルが正規化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
グルコシル化ヘモグロビンの割合が、グリコシル化されたヘモグロビンの百分率として計算される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記直接マススペクトル分析から得られたスペクトルが、７，０００〜１６，５００ｍ／ｚの範囲で測定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
グルコシル化ヘモグロビンの割合を決定することが、一つ荷電されたヘモグロビンまたはグロビン分子のレベルを測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記直接マススペクトル分析から得られたスペクトルが、１５，０００〜１６，２００ｍ／ｚの範囲で測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
グルコシル化ヘモグロビンの割合を決定することが、二つ荷電されたヘモグロビンまたはグロビン分子のレベルを測定することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記直接マススペクトル分析から得られたスペクトルが、６，０００〜８，１００ｍ／ｚの範囲で測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルコシル化Ｈｂおよび非グルコシル化Ｈｂの総量が、直接マススペクトル分析から得られたマススペクトルの曲線下の総面積を用いて測定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記グルコシル化Ｈｂおよび非グルコシル化Ｈｂの総量が、直接マススペクトル分析から得られたマススペクトルの相対ピーク高さを用いて測定される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
３〜４％の前記グルコシル化α−グロビン百分率および／または３〜６％の前記グルコシル化β−グロビン百分率が、前糖尿病の指標である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
４％以上の前記グルコシル化αグロビン百分率および／または６％以上の前記グルコシル化βグロビン百分率が、糖尿病の指標である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記実施されたマススペクトル分析が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化分光法（ＭＡＬＤＩ）である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＡＬＤＩ分光法が、飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤ−ＴｏＦ  ＭＳ）である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接マススペクトル分析を用いて血液サンプル中の非グルコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃａｔｅｄ）およびグルコシル化ヘモグロビン（糖化ヘモグロビン）のレベルを測定するための方法に関する。グリコシル化されたヘモグロビン分子の割合は、前糖尿病（ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｅｓ）または糖尿病の診断に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
糖尿病、特に２型糖尿病は現在、先進国および発展途上国の公衆衛生問題である。高価な糖尿病合併症には、心血管疾患、網膜症、神経障害および腎症が含まれる。このため、患者を検出および検出することと、早期発症糖尿病に対する国民の高齢者のスクリーニングとの両方にかなりの満足されていない医療ニーズが存在する。例えば、２０１１年には、米国における２５．８百万人の小児および成人（人口の８．３％）が糖尿病であると推定されている。推定１８．８百万人が２型糖尿病と診断されたが、約７００万人がそれらの病気に気づいていない。米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、２００５年〜２００８年の血糖測定に基づき、米国成人人口の３５％が前糖尿病を罹患していると報告し、これは、２型糖尿病の発症リスクを有する国成人７９百万人と推定されている。同様に、英国では、２０１４年に前糖尿病患者数は２００３年の１１．６％から２０１３年には３５．３％に増加したと言われている。１７．３百万人の英国成人が前糖尿病を羅患していると推定されている。米国だけでも、糖尿病治療に関連する２００７年の年間総費用は１，７４０億ドル（＄１７４  ｂｉｌｌｉｏｎ）だった。したがって、糖尿病およびその合併症を予防および管理することは、世界的な公衆衛生上の課題であり、多くの国の医療制度の優先事項である。
【０００３】
糖尿病の検出は、従来、血液および尿中のグルコースレベルの測定を介して行われてきた。前糖尿病について、グルコース耐性試験を行い、経口グルコース負荷試験（ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後、時間をかけて血糖値（血中グルコースレベル）を測定し、レベルが正常に戻る前の最大値おおよび大きさをモニターする。加えて、インスリンレベルを並行して測定することができるが、耐糖能試験では、１日の患者としてアドミタンスを必要とする。
【０００４】
グリコシル化ヘモグロビン（Ｈｂ）は、赤血球内に含まれていても、ヘモグロビン（Ｈｂ）が血漿グルコースと自由に反応する非酵素的な糖化経路で形成される。赤血球が体内で約１００〜１２０日間循環すると、その成分が脾臓および肝臓によって再循環される前に、グリコシル化Ｈｂの測定は、グルコースへの累積暴露を反映する：正常レベルのグルコースは正常な量のグルコシル化ヘモグロビンを産生する；血漿グルコースの平均量が増加するにつれて、グルコシル化ヘモグロビンの割合が増加する。したがって、それは、測定数ヶ月前にわかる平均血糖値のマーカーである。１回限りのテストではなく、前糖尿病などの代謝の問題が増えているという確かな証拠が提供される。実際に、グルコシル化Ｈｂの測定は、患者が食事および血糖日記よりも糖尿病をどれくらいうまくコントロールしているかについて、はるかに信頼できる尺度を提供する。
【０００５】
このため、グルコシル化Ｈｂの最近の好ましい試験は、ＨｂＡレベルと比較して、ＨｂＡ１Ｃレベルの測定である。ＨｂＡ１Ｃは、Ｈｂが通常分析され、逆相高圧液体クロマトグラフィーからの溶出によって測定されるため、そのように命名される。全Ｈｂのクロマトグラフィーは、ヘモグロビンの異なるタイプ、主にＡおよびＡ２を、胎児Ｈｂおよびこれらの２つタイプの疾患変異体から決定する。マイナー溶出ピーク（ｍｉｎｏｒ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｅａｋ）は、ＨｂＡ１Ｃと呼ばれたグルコシル化Ｈｂである。ＨｂＡ１Ｃの測定は糖尿病のための好ましい試験であり、グルコシル化Ｈｂは累積および非患者コンプライアンス依存試験であるため代謝疾患の発症である。ＨｂＡ１Ｃのポイント・オブ・ケア検査は、米国糖尿病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって推奨されており、それは、迅速であり、臨床医が患者の状態にすぐに対応し、患者のコンプライアンスを改善できるからである。ヘモグロビンＡ１Ｃは、最近、診断ツールとしての使用が承認され、６．５％以上のＨｂＡ１Ｃが診断のためのカットオフポイントである。前糖尿病状態は、ＨｂＡ１Ｃ＞５．７〜６．４％であると言及されていた。ＨｂＡ１Ｃと平均グルコース濃度との相関は、最近２型糖尿病を有する患者で検証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、１つ目の診断上の問題は、ＨｂＡ１Ｃが、鎌状赤血球形質（ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｉｔ）のような変異型Ｈｂまたはヘモグロビン症の患者には適していないことである。これは、グルコシル化Ｈｂの溶出プロフィールが、変異Ｈｂの溶出プロフィールによって不明瞭にされ得るか、またはＨｂＡ１Ｃ免疫アッセイの特異的特異性を妨げるためであり得る。
【０００７】
２つ目の問題は、ＷＨＯ２０１１レポートＷＨＯ／ＮＭＨ／ＣＨＰ／ＣＰＭ／１１．１に報告されたように、糖尿病の診断におけるグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の使用、現在のＨｂＡ１ｃアッセイは、「低所得国および中所得国のほとんどの国では手が届かない」ということである。
【０００８】
そこで本発明は、血液サンプルを分析することにより、糖尿病および前糖尿病代謝症候群の集団を〕スクリーニングするための迅速で頑丈で、かつ手頃な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、溶解され、任意的に水中で１００〜１０００倍希釈されうる血液サンプルの直接マススペクトル分析（直接質量分光分析）を開示する。サンプル中に存在するＨｂ種は、例えば飛行時間質量分析法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化分光法などの直接マススペクトル分析によって、分析することができる。グルコシル化種−Ｈｂα−グロビンＧｌｃ由来のＨｂα−グロビン鎖、および／またはＨｂβ−グロビンＧｌｃ由来のＨｂβ−グロビン鎖は、例えば曲線またはピーク高さの下の正規化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）面積によって測定できる。Ｈｂの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）または異常ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）は、グルコシル化Ｈｂの百分率の測定に影響を与えずに決定され、Ｈｂα−鎖および／またはＨｂβ−鎖ならびにそれぞれのグルコシル化された（Ｇｌｃ）オルソログが糖尿病グルコシル化の異なるマーカーとして使用できるからである。
【００１０】
本発明は、早期の検出およびモニタリングによって、国家に対する社会経済的負担の原因を管理および低減する方法を開示する。本発明の方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦマス分析などの直接マススペクトル分析に供されたピンプリック（ｐｉｎ  ｐｒｉｃｋ）サンプルおよび血液スポットカードなどの全血試料の迅速なスクリーニングを開示する。分析は、溶解（ｌｙｓｉｓ）後行うことができ、例えば蒸留した脱イオン水中に溶解された後、または凍結により行うことができ、および任意に例えば蒸留した脱イオンＨ２Ｏまたは０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の蒸留した脱イオンＨ２Ｏで１／１０〜１／８０００（好ましくは１／２０００）の範囲で大量希釈後に行うことができる。得られたスペクトルは、１，５０００ｍ／ｚ〜１６，２００ｍ／ｚの質量／電荷範囲で一価イオン（一つ荷電されたイオン）として；および／または７，５５０〜８，１００ｍ／ｚもしくは７，５５０〜８，２００ｍ／ｚで二価イオン（二つ荷電されたイオン）として検出される。
【００１１】
・非グルコシル化α−グロビンが好ましくは７，５６４ｍ／ｚで測定される。
【００１２】
・グルコシル化αグロビンが好ましくは７，６４５ｍ／ｚで測定される。
【００１３】
・非グルコシル化β−グロビンが好ましくは７，９３４ｍ／ｚで測定される。
【００１４】
・グルコシル化β−グロビンが好ましくは８，０１７ｍ／ｚで測定される。
【００１５】
スペクトルは、マトリックス、好ましくはシナピン酸を用いて得られ、α−グロビンおよびグルコシル化α−グロビン、および／またはβ−グロビンおよびグルコシル化β−グロビンの特徴的に分解された質量ビークの強度が測定され、比率はグルコシル化グロビンの相対的な百分率を決定する。決定された相対的な百分率は、全糖尿病、糖尿病、および糖尿病患者の過去２〜３ヶ月に亘る累積平均血糖値のコントロールを示す。
【００１６】
このため、本発明は、被検体から得られた血液サンプルを直接マススペクトル分析に供し、サンプルに存在するグルコシル化ヘモグロビン（Ｈｂ）、例えばグルコシル化α−グロビンおよび／またはグルコシル化β−グロビンの割合を決定すること含む、全糖尿病または糖尿病を検出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】１２歳男性の正常血液のスペクトルを示す図である。
【図２】肥満の５２歳男性の正常血液のスペクトルを示す図である。
【図３】鎌状赤血球症ＨｂＳＣ患者の血液のスペクトルを示す図である。
【図４】１２歳少年と５２歳男性との血液スペクトルのオーバーレイを示す図である。
【図５Ａ】大人９人および様々なヘモグロビン異常症の患者７人におけるグルコシル化α−グロビンおよびβ−グロビンおよびその他のグロビン分子の計算された相対量の表を示す図である。
【図５Ｂ】大人９人および様々なヘモグロビン異常症の患者７人におけるグルコシル化α−グロビンおよびβ−グロビンおよびその他のグロビン分子の計算された相対量の表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「直接マススペクトル分析」は、当該方法において、マススペクトル分析から生成されたデータが使用されることを意味し、サンプル中に存在する成分の推定された質量（マス）ではない。
【００１９】
境界前糖尿病（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）とも呼ばれる前糖尿病は、通常、糖尿病の前駆体である。これは、血糖値が通常よりも高いときに発生するが、患者が糖尿病であると考えられるほど高くない。それは、しばしば、正常血糖と糖尿病のレベルとの間の「灰色領域（ｇｒｅｙ  ａｒｅａ）」と記載される。前糖尿病は、患者が一定期間の断食後に正常な糖レベルよりも高い場合、空腹時血糖異常（ＩＦＴ）とも称し、または患者が食事後に正常な糖レベルよりも高い場合、耐糖能障害（ＩＧＴ）とも称する。
【００２０】
血液サンプルは、未処理サンプルであり得る。あるいは、血液サンプルを希釈または処理（濃縮、ろ過など）してもよい。
【００２１】
血液サンプルは、従来の採血法を用いて、採取した全血サンプルであってもよい。例えば、係るサンプルは、静脈穿刺によって、またはピンチックまたはヒールプリックのようなピンチックサンプルとして得ることができる。血液サンプルは、濾紙または他の適切な血液スポット捕捉材料上に捕捉された乾燥血液スポットであってもよい。
【００２２】
血液サンプルは、好ましくは、赤血球を溶解するように処理される。これは、血液サンプルを、例えば蒸留された脱イオン水などの溶解剤中に、好ましくは１／１の濃度（すなわち、１部の血液に対して１部の溶解剤または蒸留された脱イオン水）で、希釈することによって行うことができる。または、サンプルを凍結させて細胞を溶解することができる。血液サンプルが乾燥した血液スポットである場合、サンプルが乾燥された血液スポット捕捉材料を溶解剤（例えばサンプルを再構築するための蒸留された脱イオン水）に入れることができる。または、血液スポットは、溶解前に適切な緩衝液中で再構成することができる。
【００２３】
好ましくは係る血液サンプルは、好ましくは溶解後に希釈される。血液サンプルは、１／１０（すなわち、１０部の希釈剤中に１部のサンプル）、１／５００、１／１０００、１／２００、１／２５００、１／８０００またはそれ以上に希釈されることができる。より好ましくは、血液サンプルは１／２０００（すなわち、２０００部の希釈剤中に１部の血液サンプル）に希釈される。希釈剤は、好ましくは、蒸留された脱イオン水中０．１％のトリフルオロ酢酸であり、より好ましくは蒸留された脱イオン水である。
【００２４】
好ましくは、血液サンプルは、溶解と希釈との間に処理されないことである。換言すると、血液サンプルは溶解および希釈されるだけである。かような処理には、目的のタンパク質、例えば、Ｈｂ、α−グロビンおよび／またはβ−グロビン；例えばＨＰＬＣによってまたは化学試薬で処理し、粉砕するもしくは分子内結合を破壊することによって、単離されたＨｂ、α−グロビン、および／またはβ−グロビン、を濃縮すること含む。特に、サンプルは、還元剤で処理されていないことが好ましい。サンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理されていないことがより好ましい。
【００２５】
グルコシル化α−グロビンおよび／またはβ−グロビンの割合を計算することができ、すなわち、グルコシル化されたα−グロビンおよび／またはβ−グロビンの百分率を計算することができる。係る百分率は、下記数式によって計算される。
【００２６】
【数１】
2017525972.tif 000002
【００２７】
４％以上のグルコシル化α−グロビンおよび６％以上のβ−グロビンのレベルは、糖尿病の指標である。３〜４％のグルコシル化α−グロビンおよび４〜６％のグルコシル化β−グロビンのレベルは、前糖尿病の指標である。好ましくはグルコシル化α−グロビンの割合は、異常ヘモグロビン症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ）または異常ヘモグロビン症形質（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ  ｔｒａｉｔ）の患者において計算される。
【００２８】
ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳなどのマススペクトルを生成する方法は、一般的に定量的な手法ではない。例えば、これらのスペクトルにおけるＹ軸は、スペクトル内の質量ピークの「相対強度」の指標であり、別のサンプルに対する一つのサンプルにおける質量ピークではない。これを克服するために、正規化はサンプルスペクトルの間でＹ軸の値を同等にする必要がある。このため、直接マススペクトル分析から得られたスペクトルは正規化されていることが好ましい。スペクトルは、データ処理を受け、結果的に統計的に決定された正規化されたマススペクトルの相対比の指標となる。これは、定性的なマススペクトルを定量的な値に変換する。正規化は、データの重複と不一致を減らすためのデータ構造を生成するプロセスである。いくつかの正規化技術が可能である。典型的な正規化の方法には、所与の点における総面積の百分率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）、平方差（ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）および差の比（ｒａｔｉｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）が含まれる。当該百分率の差は、以下のように計算される。
【００２９】
【数２】
2017525972.tif 000003
【００３０】
式中、Ｙｒｅｆはスペクトルの最小Ｙ値であり、Ｙ１は、それぞれの点（ポイント）のＹ値である。
【００３１】
平方差は、以下のように計算される。
【００３２】
【数３】
2017525972.tif 000004
【００３３】
差の比は、以下のように計算される。
【００３４】
【数４】
2017525972.tif 000005
【００３５】
したがって、スペクトル上に示される質の変化の定量的な尺度を提供するために、マススペクトルからのデータが操作される。
【００３６】
好ましくは、スペクトルモデルは、設定された範囲内の質量スペクトルの相対的割合の正規化された統計的に決定された指標をもたらすデータ処理の方法によって生成される。これは、任意に与えられた質量値における中央値および中心変動がモデル化され得るように、すべてのスペクトルを比較可能にする。係る範囲は、約７，０００〜１６，５００ｍ／ｚの間であることが好ましく、７，５００〜１６，２００ｍ／ｚであることがより好ましく、７，５００〜８，２００ｍ／ｚであることが特に好ましい。グロビンの単一荷電および／または二重荷電された分子を測定することができる。一価イオンについては、１５０００ｍ／ｚ〜１６２００ｍ／ｚの質量／電荷の範囲でスペクトルが測定される。二価イオンについては、６０００〜８１００ｍ／ｚの質量／電荷の範囲、より好ましくは７５５０〜８１００ｍ／ｚまたは７５５０〜８２００ｍ／ｚでスペクトルが測定される。
【００３７】
・α−グロビンが好ましくは７５６４ｍ／ｚ±５ｍ／ｚで測定される。
【００３８】
・グルコシル化αグロビンが好ましくは７６４５ｍ／ｚ±５ｍ／ｚで測定される。
【００３９】
・β−グロビンが好ましくは７９３４ｍ／ｚ±５ｍ／ｚで測定される。
【００４０】
・グルコシル化β−グロビンが好ましくは８０１７ｍ／ｚ±５ｍ／ｚで測定される。
【００４１】
所与の範囲内のマススペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標は、マススペクトルの曲線下の総面積を用いて計算することができる。そして、これを使用して相対強度を計算することができる。
【００４２】
マススペクトルの曲線下の面積は、マススペクトルを所与の数のｍ／ｚの複数のビンに分割することによって計算される。ここでいう「ビン」は、例えば、統計分析において、データが分類される一連の数値範囲の１つであるという通常の統計的な意味を有する。例えば、ビンは、１００ｍ／ｚ、５０ｍ／ｚ、２５ｍ／ｚ、１０ｍ／ｚまたは５ｍ／ｚのサイズであってもよい。使用されるビンのサイズが小さければ小さいほど、本発明の方法がより精密化にできる。好ましいビンのサイズは５ｍ／ｚである。
【００４３】
相対強度（Ｙ軸の値）は、「差の平方（ｓｑｕａｒｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」法によって計算されてもよく、したがって各ビンに相当のＹ値が与えられる。この方法において、スペクトルの最小Ｙ値（Ｙｒｅｆ）が各ビンのＹ値から差し引かれ、その差を二乗した。差の平方を計算するための式は（ｙ１−ｙｒｅｆ）２であり、そして計算された差の平方は、「相対強度」と名付けられた。
【００４４】
サンプル中のそれぞれの質量ビンにおける相対強度は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）、Ｓｔａｔｓ  ＤｉｒｅｃｔＴＭおよびＯｒｉｇｉｎ  ８ＴＭなどの市販の統計学的テストを用いて、得ることができる。（ｉ）α−グロビンおよびグルコシル化α−グロビンおよび／または（ｉｉ）β−グロビンおよびグルコシル化βグロビンの質量ビンの相対強度を用いて、存在するグルコシル化グロビンの割合を計算することができる。
【００４５】
スペクトルが、マススペクトルの相対的な割合の統計的に決定された正規化された指標となるデータ処理の方法を受けたら、グルコシル化グロビンの割合は、グルコシル化および非グルコシル化グロビンに対応するピークの相対的な高さを測定することによって決定できる。一価イオンについては、１５０００ｍ／ｚ〜１６２００ｍ／ｚの質量／電荷範囲におけるスペクトルを測定する。二価イオンについては、６０００〜８１００ｍ／ｚ、好ましくは７５５０〜８２００ｍ／ｚの質量／電荷範囲におけるスペクトルを測定する。
【００４６】
・α−グロビンが好ましくは７５６４ｍ／ｚ±１０ｍ／ｚで測定される。
【００４７】
・グルコシル化αグロビンが好ましくは７６４５ｍ／ｚ±１０ｍ／ｚで測定される。
【００４８】
・β−グロビンが好ましくは７９３４ｍ／ｚ±１０ｍ／ｚで測定される。
【００４９】
・グルコシル化β−グロビンが好ましくは８０３８ｍ／ｚ±１０ｍ／ｚで測定される。
【００５０】
マススペクトルの分析は、適切なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて容易に計算できる。
【００５１】
好ましくは、実施されたマススペクトル分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤ−ＴｏＦ  ＭＳ）である。
【００５２】
また、前糖尿病または糖尿病を検出する方法も提供され、以下の工程：
ａ）被検体から血液サンプルを得ること；
ｂ）サンプルを直接マススペクトル分析に供すること；
ｃ）存在するグルコシル化グロビンの割合を計算すること；
を含み、この際、グルコシル化αグロビンが４％以上であり、およびグルコシル化β−グロビンが６％以上である百分率は、糖尿病の指標であり、ならびに、α−グロビンが３〜４％であり、およびβ−グロビンが３〜６％であるグルコシル化グロビンの百分率は、前糖尿病の指標である。グルコシル化グロビンの百分率は、特に、異常ヘモグロビン症を有する被検体におけるグルコシル化α−グロビンの百分率であることが好ましい。
【００５３】
本明細書において、動詞「含む」は、通常の辞書における意味を有し、非排他的な包含を示す。これは、一つ以上の特徴を含むために、単語「含む」（またはその任意の派生語）の使用は、さらなる特徴を含む可能性を排除するものではない。単語「好ましい」（またはその任意の派生語）は、望ましいが必須ではない１つ以上の特徴を指す。
【００５４】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示されている特徴の全てまたはいずれか、および／または開示された全てもしくはいずれかの、任意の方法もしくはプロセスの工程は、少なくともいくつの特徴および／または工程が互いに排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合せで組み合わせることができる。
【００５５】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、他に明示的に記載されていない限り、同じ、等価または類似の目的を果たす代替の特徴に置き換えることができる。したがって、明示的に別段の定めがない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的な一連の一例に過ぎない。
【００５６】
本発明は、上述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規性のあるもの、もしくは任意の新規性のある組み合せ、または開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の、任意の新規性のあるもの、もしくは任意の新規性のある組み合せまで及んでいる。
【００５７】
この出願は、以下の図を参照しながら、以下の例を説明する：
図１は、１２歳男性の正常血液のスペクトルを示す図である。
【００５８】
図２は、肥満の５２歳男性の正常血液のスペクトルを示す。
【００５９】
図３は、鎌状赤血球症ＨｂＳＣ患者の血液のスペクトルを示す。
【００６０】
図４は、１２歳少年と５２歳男性との血液スペクトルのオーバーレイを示す。
【００６１】
図５は、大人９人および様々なヘモグロビン異常症の患者７人におけるグルコシル化α−グロビンおよびβ−グロビンおよびその他のグロビン分子の計算された相対量の表を示す。
【実施例】
【００６２】
実施例１
方法
サンプル処理
全血または乾燥された血液スポットの最適の希釈度は、ｄｄＨ２Ｏ（１：１ｖ／ｖ）によるサンプルの最初の溶解（ｌｙｓｉｓ）の後に、ｄｄＨ２Ｏ中または０．１％ＴＦＡのｄｄＨ２Ｏ中において、１／１０００から１／２０００の間である。この希釈工程は、Ｈｂが最も豊富タンパク質であるため、マススペクトル分析のために血液の他の成分からＨｂを効果的に精製する。加えて、ｄｄＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ／ｄｄＨ２Ｏの）中での希釈は、ＭＡＬＤ−ＴｏＦ質量分析法による分析のために、構成グロビンタンパク質を解離させる。希釈度が１／８０００よりも高い場合は、マススペクトルのシグナルが次第に弱くなることをもたらす。
【００６３】
ＭＡＬＤ  ＴｏＦマススペクトル分析
最適マトリックスは、シナピン酸（ＳＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）およびアルファ４−シアノヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）である。シナピン酸は、１／１０００〜１／８０００に希釈されたサンプル（最適１／２０００）の混合液滴に混合されるか、または予備コーティング層として好ましいマトリックスである。
【００６４】
スチールＭＡＬＤＩプレート（３８４ウェル）は、０．５μｌのマトリックス溶液（シナピン酸−２０ｍｇ／ｍｌを５０／５０  ｖ／ｖのアセトニトリル（ＡＣＮ）／ｄｄＨ２Ｏおよび０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶かした）をピペットで取り、その後乾燥することによって準備された。０．５μｌのサンプルをＳＡと混合させ、乾燥マトリックス上にスポットした。これを、室温で１時間乾燥させてから、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析を行った。
【００６５】
質量分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ａｘｉｍａ  ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行った：パルス窒素レーザ（λｍａｘ＝３３７ｎｍ）は、７５〜８０％の任意の単位電力で発射された。イオンは、２０ｋＶの電場によって加速され、１．２ｍの線形管の下を流れ、５００ＭＨｚのサンプリング速度でマイクロチャネルプレート検出器によって検出された。スペクトルは、２０〜３０回のレーザーショットを合計することによって生成された。スペクトルを取得するために、遅延抽出を用いた正の線形モードを使用した。
【００６６】
１／１０００希釈した血液サンプルに１０ｐｍｏｌ／μシトクロムＣ（１：２、ｖ／ｖ）でスパイクすることによって、装置を内部校正した。生成された２点の較正は、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２３６１ｍ／ｚおよび［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝６１８１ｍ／ｚにある。６，０００〜１７，０００ｍ／ｚのマススペクトル領域を収集し、分析した。特に、７５００〜８２００ｍ／ｚの範囲で、二つ荷電されたグロビンタンパク質について調べた。
【００６７】
これらは、調べたスペクトル範囲における比較正規化ピーク高さまたは正規化ピーク面積のいずれかとして、重心質量割り当ておよび相対ピーク強度の両方に関して特徴付けられる。
【００６８】
結果
図１  １２歳の少年の血液グロビンのスペクトル。
【００６９】
１２歳の正常な男性の血液サンプルは、αおよびβグロビンおよび対応するマトリックス（シナナピン酸−ＳＡ）付加物に対応する明らかに明白なピークを有するスペクトルを示した（図１および表１参照）。他のグロビン付加物および他のグロビン（δ、Ｇγ、Ａγおよびε）はほとんど検出されていない（表１参照）。さらに、グルコシル化されたαおよびβグロビンオーソログは、親グロビンの１％未満では、ほとんど見られなかった（図１に示す）。
【００７０】
図２  ５２歳男性の血液グロビンのスペクトル。
【００７１】
正常ではあるが肥満の成人の血液サンプルは、α−グロビンおよびβ−グロビンのピークを、それらの関連するＳＡ付加物とともに示す。さらに、他のグロビン（Ｇγ、Ａγおよびε）はほとんど検出されないが、他のαおよびβ−グロビン付加物と共に上昇したδ−グロビンが注目される（図２および表１参照）。血液サンプルは、親グロビンの３％および５％に相当するグリコシル化α−グロビンおよびβ−グロビンのピークを示した。
【００７２】
図３  鎌状赤血球症ＨｂＳＣ患者由来の血液のスペクトル。
【００７３】
鎌状赤血球症（ＨｂＳＣ）患者の血液サンプル図３は、正常およびグリコシル化α−グロビンのピークを示し、７９２０ｍ／ｚでのＳβのピークが、７９３４ｍ／ｚでのβ−グロビンおよび約７９３４ｍ／ｚでのＣβから明らかに分解されたことを示した。７９６５および７９９６ｍ／ｚにおけるδおよびＧγグロビンのベースライン上昇は、８０２３ｍ／ｚにおける新しいピークであることが明らかであった。血液サンプルは、正常およびグリコシル化α−グロビンのピークを示し、強度の％比は１．８％であった、一方でグリコシル化β−グロビンは親β−グロビンの６．３％であった。
【００７４】
図４  ５２歳の男性と１２歳の少年の血液グロビンの比較。
【００７５】
１２歳の少年の血液スペクトルに５２歳の成人男性の血液スペクトルを重ねると、成人のサンプルの循環するグリコシル化αおよびβグロビンの上昇が示される（図４）。
【００７６】
図５  ９種類の成人のスペクトルピーク強度と、７種類のヘモグロビン異常症の患者のピーク強度と、の比較表。
【００７７】
グリコシル化α−鎖はすべてのサンプルで検出され、表現型的に正常なサンプルおよび鎌状赤血球病を含むヘモグロビン異常症を有するサンプルではっきりと解消された。グリコシル化β−グロビンはすべての正常サンプルではっきりと区別できたが、すべてのヘモグロビン異常症で一般的に上昇した胎児グロビン発現によって損なわれました（図５）。α−グロビン強度の百分率として表し、表現型正常成人では、オルグリコシル化オルソログが０．５〜３％（平均１．７８％、ＳＤ０．７９％）であり；キャリアを含むヘモグロビン異常症患者では１〜２．７％（平均２．１、ＳＤ０．５７％）であった。β−グロビン強度の百分率として表し、表現型正常成人では、オルグリコシル化オルソログが２〜５．２％（平均３．１５％、ＳＤ１．０７％）であり、キャリアを含むヘモグロビン異常症患者では０〜９．１％（平均５．１％、ＳＤ２．７８％）であった（図５参照）。
【００７８】
討論
ヘモグロビンの高められたグリコシル化は、血糖値の乏しい調節に関連する。ＨｂＡ１ｃは、１９７１年にヘモグロビンのクロマトグラフィー画分として最初に同定され、ヘモグロビンのβ−Ｎ−１−デオキシフルクトシル成分の尺度として特徴づけられた。正常レベルのグルコースは正常な量のグリコシル化ヘモグロビンを産生する。血漿グルコースの平均量が増加すると、グリコシル化ヘモグロビンの割合が予測可能な形で増加する。これは、赤血球の半減期である測定前の３ヶ月間の平均血糖値のマーカーとして機能する。
【００７９】
糖尿病では、血糖値の制御がより困難であることを示す、より多量のグリコシル化ヘモグロビンが、心血管疾患、腎症および網膜症に関連している。１型糖尿病患者のＨｂＡ１ｃのモニタリングは結果の改善策として採用されている。ＨＰＬＣ、イムノアッセイおよびキャピラリー電気泳動を含む「ＨｂＡ１ｃ」を測定するためのいくつかの方法が臨床的に使用されている。多くはβ−グロビン糖化の尺度とみなされ、その測定は、胎児β−様グロビン発現、鎌状赤血球疾患およびベータ・サラセミアなどのβ−グロビン遺伝子変異、ならびにそのような変異のキャリアによって影響される。しかしながら、グリコシル化の上昇は、最近、そのようなヘモグロビン異常症と関連することが示されており、そのような影響を受けた血液細胞において、グリコシル化に対する化学的感受性の増加を反映している可能性がある。
【００８０】
本発明の方法は、α−およびβ−グロビンのグリコシル化形態を、お互いおよびそれらのそれぞれの非グリコシル化親から明確に分離する。これは、ヘモグロビンのグリコシル化をより細かく識別し、Ｈｂグリコシル化を測定する他の方法に悪影響を与える突然変異または異常なグロビン遺伝子発現の存在によって損なわれない。
【００８１】
結論
ｄｄＨ２Ｏで１／２０００希釈した後の滴または乾燥スポット全血のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳスペクトル分析は、分解されたグロビンタンパク質およびαおよびβグロビンのグリコシル化オルソログの明確な分解を明らかにする。グリコシル化α−グロビンピークのシグナル強度と親α−グロビンピークとの比較は、糖尿病および前糖尿病の迅速かつ経済的なスクリーニングおよびモニタリングの試験方法を表す。
【００８２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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