(57)【要約】  本発明は次世代シークエンシング、特にイオン半導体シークエンシングを用いて、サンプル、例えば臨床サンプルに存在する病原体の遺伝子型を決定する方法に関する。本発明は、本明細書で開示される遺伝子型決定法を実施するコンピュータユニットを備える機器と、本明細書で開示される方法の実行に適したソフトウェア製品とにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の病原体の有無及び／又は遺伝子型及び／又は亜型を決定／検出する方法であって、該方法は、
a．病原体を含有する疑いのあるサンプルを準備する工程と、
b．前記病原体の存在の指標となるコンセンサス配列を選択する工程と、
c．前記病原体の指標となる選択されたコンセンサス配列の核酸配列を決定する工程と、
d．BLAST（配列アラインメントに適したソフトウェア）を用いて、得られた核酸配列を前記病原体の指標となる既知の遺伝子配列とともにアラインする工程と、
e．前記病原体の指標となるゲノム領域の選択されたコンセンサス配列の核酸配列に基づき病原体の遺伝子型又は亜型を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記病原体の指標となる遺伝子配列の少なくとも2つの異なる遺伝子型又は亜型による同時感染を判定する工程f.を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記病原体が、HCV、HIV、HBV又はヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスがHCVである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
感染の指標となる前記コンセンサス配列が、ヌクレオチド位置8614〜9298を含むHCV NS5Bゲノム領域のHCV断片である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが臨床サンプルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記臨床サンプルが、
a）HCVに感染している疑いのある患者、
b）遺伝子型及び／又は亜型が未知のHCVに感染していることが分かっている患者、
c）これまでに抗ウイルス薬による治療を行ったことのない患者、
d）既に抗ウイルス薬による治療を行ったことのある患者、
e）抗ウイルス薬に対する応答のない患者、
f）抗ウイルス薬に対して耐性を呈するHCVに感染している患者等、
からなる群から選択される患者由来のものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記配列が、NS5Bのゲノム領域の一部を増幅し、ヌクレオチド配列を決定することにより決定される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が次世代シークエンシングにより決定される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列が、前記コンセンサス配列をシークエンシングし、シークエンシング情報をコンティグへとアセンブリすることにより決定される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ソフトウェアアルゴリズムを用いて、前記シークエンシング情報をコンティグ配列へとアセンブリする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
配列アラインメントに適したソフトウェア又はBLASTを用いて、各コンティグを前記病原体の指標となる遺伝子配列とともにアラインする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法の工程を実施するソフトウェアパスを備えるソフトウェア製品。
【請求項１４】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を実施することを含み、前記病原体の遺伝子型／亜型を決定する該方法の結果に基づき、治療を選択する工程を更に含む、治療法を選択する方法。
【請求項１５】
前記病原体がHCV、HIV、HBVからなる群から選択されるウイルスである、請求項1〜12及び14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがHCVである、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
感染の指標となるコンセンサス配列がHCVゲノム領域NS5Bの8614位〜9298位である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが臨床サンプルである、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記臨床サンプルが、
a．HCVに感染している疑いのある患者、
b．遺伝子型及び／又は亜型が未知のHCVに感染していることが分かっている患者、
c．これまでに抗ウイルス薬による治療を行ったことのない患者、
d．既に抗ウイルス薬による治療を行ったことのある患者、
e．抗ウイルス薬に対する応答のない患者、
f．抗ウイルス薬に対して耐性を呈するHCVに感染している患者、
g．抗ウイルス薬の臨床試験に参加する、HCVに感染している患者、
からなる群から選択される患者由来のものである、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記配列が次世代シークエンシングにより決定される、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記配列が、前記コンセンサス配列の断片をシークエンシングし、シークエンシング情報をコンティグへとアセンブリすることにより決定される、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ソフトウェアアルゴリズムを用いて、前記シークエンシング情報をコンティグ配列へとアセンブリする、請求項14〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
配列アラインメントに適したソフトウェア又はBLASTを用いて、各コンティグを前記病原体の指標となる既知の遺伝子配列とともにアラインする、請求項14〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
抗ウイルス薬による特異治療をHCV遺伝子型に応じて選択する、請求項14〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項14〜24のいずれか一項に記載の方法の工程を実施するソフトウェアパスを備えるソフトウェア製品。
【請求項２６】
請求項25に記載のソフトウェアにおいて規定される方法工程を読み込み、実行することの可能な機器。
【請求項２７】
請求項25に記載のソフトウェアにて与えられた方法工程を実行することが可能である、請求項26に記載の機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、次世代シークエンシング、特にイオン半導体シークエンシングを用いて、サンプル、例えば臨床サンプルにおいて同定された遺伝子型を決定する方法に関する。本発明は、本明細書で開示される遺伝子型決定法を実施するコンピュータユニットを備える機器と、本明細書で開示される方法の実行に適したソフトウェア製品とにも関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病原体が、相当な個人の苦痛及び重大な社会経済的な帰結、例えば医療費等に関連している。病原体、例えば細菌及びウイルスには異なる株、遺伝子型又は亜型が存在することが多い。個々の株、遺伝子型又は亜型は利用可能な治療、例えば抗生物質又は抗ウイルス薬の影響を多少なりとも受け得る。近年、抗生物質耐性菌の発生及び既知の抗ウイルス薬の影響を受けない又は余り受けないウイルスの発生が主な悩みの種であった。例えば、過去には十分効果のあった抗生物質では治療することができないスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus：黄色ブドウ球菌）株、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis：ヒト結核菌）株等の数の増加に合わせて、施設の数及び関連する社会経済的な帰結、例えば入院日数の増大、感染からの回復にかかる日数の全体的な増加等が起こってきた。
【０００３】
さらに、現在知られている抗ウイルス薬、例えばγインターフェロン、抗レトロウイルス薬等では十分に排除されないウイルス変異株の発生に起因して、ヒトにとって重大なウイルス病原体、例えばHIV、HCV及びHBVもより多くの注目を集めている。これらのウイルスは遺伝子突然変異率が高く、遺伝子突然変異により薬物結合部位を変えることで、既知の薬物に対する部分的又は完全な耐性をもたらし得る。この結果、罹患患者においてより高力価の耐性病原体が生じ、病に苦しむ個体及び社会の両方に帰結する。
【０００４】
社会経済的に重要であり、かついくつかの抗ウイルス薬に対する耐性を引き起こす突然変異を発現することが知られているウイルスの例はC型肝炎ウイルス（HCV）である。このウイルスは本発明を説明するための一例である。
【０００５】
HCVはフラビウイルス科のRNA含有ウイルスファミリーに関するものであり、肝硬変及び肝細胞癌といった最もよく見られる合併症を伴う感染プロセスを引き起こす（非特許文献1）。2005年時点で、地球上において推定で1億7千万を超える人々がこの疾患に苦しんでおり（非特許文献2）、罹患数は未だに増え続けている。
【０００６】
HCVへの急性感染（全ての急性肝炎感染の20 %）は慢性肝炎（全ての慢性肝炎症例の70 %）及び末期肝硬変へと至ることが多い。HCV慢性保菌者の最大で20 %が約20年の期間にわたって肝硬変を発症する可能性があり、肝硬変を発症した者の年間1 %〜4 %が肝臓癌を発症するリスクがあると推定されている（非特許文献3、非特許文献4）。
【０００７】
HCV起因性の末期肝疾患に対する生存期間を延ばすための選択肢は肝移植である（世界中の全ての肝移植の30 %がHCV感染に起因するものである）。
【０００８】
さらに、肝移植が指示されていないか又は実現不可能である場合、現在のところHCV治療において広く用いられている治療傾向は、大量のインターフェロンと、一般的な抗ウイルス製剤及び1つ又は2つのHCV複製阻害剤（特異的プロテアーゼ−ヘリカーゼ及び／又はRNAポリメラーゼ阻害剤）の両方を含むカクテルとの同時注射を含む併用療法の使用である（例えば、非特許文献5）。これらのカクテルは回復率を増大させるが、適応性の阻害剤耐性HCV突然変異株の形成が起こることは避けられない。
【０００９】
HCVは突然変異率が高く、その高い突然変異率が、ウイルスが宿主の免疫系を回避するのを助けていると考えられる。高い突然変異率は感染個体内における準種としても知られる多くの明確に異なるHCVゲノム配列の存在に反映される（非特許文献6、非特許文献7）。準種はウイルスによってコードされるNS5B RNA依存性RNAポリメラーゼの活性によって生じ、該RNAポリメラーゼは校正機能を欠いていることから、本質的に正確性が低い酵素である。可能性のある準種の生物学的帰結としては、（i）持続感染の確立に至る体液性及び細胞性の免疫に対するエスケープ突然変異株の発生；（ii）可変の細胞指向性（例えばリンパ指向性対肝臓指向性）；（iii）ワクチン不全、及び（iv）薬物耐性の急速な発現が挙げられる。
【００１０】
したがってHCV検体の遺伝子型及び亜型の同定は、治療応答の検出、抗ウイルス療法の期間及び有効性の評価、並びにウイルスの伝播経路の確立に相当重要である。亜型の遺伝子型に応じて、現在のところ、患者はインターフェロン系薬物を用いて治療されているが、インターフェロン系薬物は遺伝子型2、3、5及び6への感染の治療には使用することができる一方、遺伝子型1及び4はインターフェロンに基づく治療に対する応答性が低い。今日では、HCVが異なるHCV単離株の中で明確に異なる遺伝子型として存在し、特定の地理的位置に各遺伝子型が広がっていることが十分に確立されている。現在、HCV変異株は主にコア／El及びNS5Bサブゲノム配列、並びに全ゲノム配列の系統発生解析により規定された6つの遺伝群を表す6つの遺伝子型へと分類されている。各遺伝子型内において、HCV変異株は更に亜型へと分けることができる（非特許文献8）。HCV遺伝子型の命名法の現行の統合システムの概要は非特許文献9に与えられている。
【００１１】
リバビリンと併せたペグ化インターフェロンαの現行の標準FDA認可抗ウイルス療法を用いても、この治療に適格な遺伝子型-1のHCV感染個体のおよそ半分しか持続性ウイルス学的応答（sustainedvirologic response：ウイルス持続陰性化率）を達成することができない（非特許文献10）。重度の副作用及び他の医学的合併症のために、今日ではHCV患者の最大で75 %が治療法から除外されている。したがって、現在開発中で、初期の臨床試験にある新たな抗HCV薬はHCV内部リボソーム侵入部位（IRES）、HCV NS3セリンプロテアーゼ及びHCV NS5B RNA依存性RNAポリメラーゼ等の新たな標的を用いることを目的としている（例えば非特許文献11、非特許文献12を参照されたい）。
【００１２】
しかしながら、HCVの高い突然変異率及び変異性が薬物耐性の発生を支持し、これらの阻害剤の臨床的有用性を限定することが予測されている。実際、薬物耐性突然変異が、in vitro実験及び初期臨床試験中に既に発見されている。例えば、HCVサブゲノムレプリコンを用いて、ヌクレオシド及び非ヌクレオシドNS5B阻害剤の両方、並びにNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤に対するウイルスの耐性を研究している（非特許文献13、非特許文献14、これらは非特許文献15にてレビューされている）。HCVの耐性突然変異株の理解は効果的なHCV治療に向けて更に進んでいる。換言すると、異なる分類の抗ウイルス剤に対する既存の薬物耐性突然変異株の感受性の評価は新たな薬物の開発に最も重要である。加えて、薬物耐性に対する併用治療の効果を調べることで、今後のHCV治療戦略への洞察を得ることができる。これだけで、適切な治療法プロトコルを迅速に開発及び／又は変更することができた。このようにして、HCV感染患者の適切な、すなわち有効薬物を用いた治療がかなり実現可能なものとなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】CDC Report NO61; Younossi Z, Kallman J, Kincaid J. Theeffects of HCV infection and management on health-related quality of life;Hepatology. 2007 Mar; 45(3): 806-16
【非特許文献２】Robert-Koch-Institut: Epidemiologisches Bulletin. 46/2005
【非特許文献３】Shiffman 1999
【非特許文献４】Lauer and Walker 2001
【非特許文献５】Toniutto P, Fabris C, Bitetto D, Fomasiere E, Rapetti R, Pirisi M.Valopicitabine dihydrochloride; a specific polymerase inhibitor of Hepatitis C virus.Curr Opin Investig Drugs. 2007 Feb; 8(2): 150-8;
【非特許文献６】Bukh et al. 1995
【非特許文献７】Farci et al. 1997
【非特許文献８】Simmonds et al. 1994
【非特許文献９】Simmonds et al. (2005)
【非特許文献１０】Manns et al. 2001
【非特許文献１１】Tan et al. 2002
【非特許文献１２】De Francesco et al. 2003
【非特許文献１３】Kukolj et al. 2005
【非特許文献１４】Mo et al. 2005
【非特許文献１５】Tomei et al. 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
HCV遺伝子型にわたるこのような正確な薬物耐性プロファイリングを行うために、HCV核酸配列を効率的に解析する方法が必要である。HCVは治療的介入に応じて進化する病原体の一例であるが（While）、いくつかの薬物に対する応答性がより大きくなる他の病原体、例えばHIV、抗生物質耐性菌（例えばMRSA）等についても同様の懸念がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、病原体、例えばHCV等のウイルスの遺伝子型又は亜型を確実かつ正確に決定するというこの要求に応えるものであり、次世代シークエンシングを用いてウイルス遺伝子型を決定するための新たな方法及び機器を提供する。
【００１６】
次世代シークエンシングは、疾患、例えばウイルス感染等の感染性疾患の診断においてますます重要になってきている方法である。次世代シークエンシングによって、核酸、例えばウイルス核酸の配列の決定が可能となり、個体に対して正しい治療を選択する際の重要な情報が医師に与えられる。
【００１７】
次世代シークエンシングは、膨大な数、例えば数千又は数百万の配列の同時並行シークエンシングに基づくものである。現在、様々なタイプの次世代シークエンシング法が用いられており、Roche's 454のピロシークエンシング、Illuminaのシークエンシング、SOLiDシークエンシング及びイオン半導体シークエンシングが最先端のシークエンシング法である。いくつかの企業が、次世代シークエンシング法を自動で行うことのできる機器を市場に導入している。次世代シークエンシングは当該技術分野の技術者には既知のものであり、原理として供給源、例えば臨床サンプル等の臨床的供給源からの核酸の単離、数百塩基対から数千塩基対のサイズの短い核酸断片の作製に基づいている。これらの短い断片をライブラリへとクローニングした後、個々に配列を別々の反応容器に入れ、そこでシークエンシング反応を行う。核酸をシークエンシングするのに、異なる方法、例えばホスフェートの放出、蛍光の放出又は正に帯電した水素イオンの検出に基づく方法が存在する。
【００１８】
本発明は次世代シークエンシング法のプロセスにて得られたデータを解析する手段を提供する。大抵の場合、所望のゲノム領域の短い断片のみがシークエンシングされ、対象となるゲノム領域の本質的に全てをカバーするコンティグへとアセンブリしなければならない。
【００１９】
さらに、臨床サンプルは臨床サンプルに存在する疑いのある特定のウイルスの遺伝子型を表す異なるタイプの所望の標的ゲノム領域（例えばウイルスゲノム領域）を含有している場合があり、罹患患者に対して正しい治療を見つけるために、標的遺伝子（例えばウイルス遺伝子）の遺伝子型の正確な性質を見出すことが重要である。
【００２０】
或る特定長（例えば約1000塩基対）の遺伝子をイオン半導体シークエンシング法等の次世代シークエンシング法を用いてシークエンシングする場合、シークエンシングの後にゲノム領域全体をカバーする膨大な数の断片を再度アセンブリして、連続配列（コンティグ）を形成しなければならない。
【００２１】
本発明は、非常に高い効率にて、膨大な数の個々のシークエンシング反応にて得られた情報をアセンブリするとともに、得られた情報をこれまでに収集された情報（例えば既知のHCV遺伝子型及び亜型に対する情報を含むデータベース等の遺伝子データベースの形態）と比較するのに驚くほど効率的な方法を提供する。
【００２２】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（the singular forms of "a" and "an"）は特に明確に指定のない限り、対応する複数形も包含する。
【００２３】
本発明に関連して「約」という用語は、対象となる特徴の技術的効果が依然保証されると当業者が理解する精度間隔を指す。「通例」という用語は±10%好ましくは±5 %の指定数値からの偏差を示す。
【００２４】
「含む（comprising）」という用語は限定するものではないことを理解する必要がある。本発明の目的上、「からなる（consisting of）」という用語は「含む」という用語の好ましい実施の形態であるとみなされる。以下で或る群が少なくとも或る特定数の実施の形態を含むと規定されている場合、これは好ましくはこれらの実施の形態のみからなる群も包含することを意味する。
【００２５】
「存在の検出」という用語は、本明細書で使用される場合、「有無の検出」を意味するものとして理解される。本出願において特許請求される方法において述べられているように、分析対象のサンプルは病原体の存在の指標となるコンセンサス核酸配列（標的配列と称されることもある）を含む核酸を含むことが疑われる。
【００２６】
本発明に関連して、「病原体の存在の指標となるコンセンサス核酸配列」又は「標的配列」は該病原体に特異的な所与の病原体のゲノム領域を示す。ゲノム領域の増幅、例えば（RT-）PCRを用いたゲノム領域の増幅及び増幅産物のシークエンシングによって、増幅核酸が得られたサンプルに所与の病原体が存在するか否かを判定することが可能となる。「コンセンサス」という用語は、このゲノム領域によって、所与の病原体の核酸配列がサンプルに存在するか否かを特異的に判定することが可能になることを意味するが、2つ以上の核酸配列の変異体、すなわち上記病原体の2つ以上の遺伝子型、亜型又は株が存在することを考慮する。例えば、HCVのNS5Bゲノム領域によって、サンプル中のHCVの存在を特定することが可能となる。しかしながら、このゲノム領域にはいくつかの遺伝子型及び亜型が存在する、すなわちゲノム領域は全てのHCV遺伝子型の指標となるコンセンサス配列を含んでいるが、これらの個々の遺伝子型及び亜型は上記核酸配列の異なる核酸配列又は変異体を有している。
【００２７】
本発明に関連して、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の自然発生的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。核酸は特に、二本鎖DNA及び一本鎖RNAとすることができる。
【００２８】
「配列」という用語は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーにおける塩基の連続発生（sequential occurrence）を指し、デオキシリボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、T、G及びCからなる群から選択され、リボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、U、G及びCからなる群から選択される。そのため、デオキシリボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAGCAAGCCTであり得る一方、リボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAUCGAUであり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、標的配列を含む核酸の存在について試験することができる任意のヒト又は動物（veterinary）対象由来の任意の生物学的サンプルを指す。サンプルとしては、例えば肺組織等の任意の器官から得られる組織、並びに例えば血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、羊膜帯血、涙液、唾液及び鼻咽頭洗浄液等の任意の器官から得られる体液が挙げられ得る。上記で挙げられたように、サンプルは身体の特定の領域、例えば気道由来のものであってもよく、気道由来のサンプルとしては、咽頭ぬぐい液、咽頭洗浄液、鼻腔ぬぐい液及び下気道由来の検体が挙げられる。
【００３０】
サンプルは特に、ヒト又は動物対象由来のものとすることができる。したがって、「患者」はヒト又は動物対象とすることができる。「臨床サンプル」について言及する場合、このことはサンプルが標的配列を含む核酸を有する病原体に感染している疑いのある患者由来のものであることを示している。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「増幅」という用語は核酸標的のコピーを数十億生成することが可能な酵素媒介性の手法を指す。当該技術分野において既知の酵素媒介性の標的増幅手法の例としてはPCRが挙げられる。
【００３２】
「PCR反応」は、米国特許第4683195号においてMullis et al.によって、また米国特許第4683202号においてMullisによってDNAの増幅に対して初めて記載され、当業者に既知のものである。PCR法では、DNAのサンプルを、DNA二重鎖の各鎖の3'端に相補的に調製された、モル過剰の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー（上記参照、フォワード及びリバースプライマー）と、モル過剰のヌクレオチド塩基（すなわちdNTP）と、オリゴヌクレオチドプライマー及びdNTPからのDNAの形成を触媒する熱安定性DNAポリメラーゼ（好ましくはTaqポリメラーゼ）とが入った溶液中で混合する。プライマーの内、少なくとも1つが変性DNA分析物の1つの鎖（上記定義ではナンセンス鎖）の3'端に5'→3'方向で結合するフォワードプライマーであり、それ以外が変性DNA分析物のもう一方の鎖（上記の定義ではセンス鎖）の5'端に3'→5'方向で結合するリバースプライマーである。この溶液を約94℃〜96℃に加熱することで、二本鎖DNAを一本鎖DNAへと変性させる。溶液を冷却し、いわゆるアニーリング温度に達すると、プライマーは分離した鎖と結合し、DNAポリメラーゼが、dNTPとプライマーとを結び付けることにより分析物の新たな鎖を触媒する。このプロセスを繰り返し、プライマーから合成された伸長産物をその相補配列から分離する。各伸長産物は他のプライマーから合成される相補伸長産物の鋳型として働く。各サイクルの後に配列は二倍に増幅することから、膨大な数のコピーの理論的な増幅を、数時間、このプロセスを繰り返すことで達成することができ、このようにして極めて僅かな量のDNAを、PCRを用いて比較的短期間にて増幅することができる。
【００３３】
PCR反応の出発材料がRNAである場合、逆転写を介してRNAから相補DNA（「cDNA」）を合成する。次いで得られたcDNAを、上記のPCRプロトコルを用いて増幅する。逆転写酵素は鋳型であるmRNA配列からDNAの相補的な一本鎖を合成することができるレトロウイルスにて見られる酵素として当業者に知られている。RNA産物を増幅するのに用いられるPCRは逆転写酵素PCR、すなわち「RT-PCR」と呼ばれる。
【００３４】
「シークエンシング」という用語は、分子生物学において一般的に意味するものとして本明細書にて用いられている。これにより、核酸配列における塩基の正確な連続発生が求められる。
【００３５】
「病原体」という用語は、本明細書で使用される場合、最も広い意味で用いられる。そのため、病原体は任意のタイプの細菌、古細菌（archaeum）、原生動物（protozoum）、真菌及びウイルスとすることができる。ウイルスは本明細書で使用される「微生物」の定義に含まれることをはっきりと述べる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
一態様では、本発明は、（i）サンプル中の病原体の有無を判定又は検出するとともに、（ii）サンプル中の病原体の遺伝子型及び／又は亜型を決定する方法であって、
a．病原体を含有する疑いのあるサンプルを準備する工程と、
b．上記病原体の存在の指標となるコンセンサス配列を選択する工程と、
c．シークエンシングリードアセンブリに適したソフトウェア（例えばMIRA）を用いて、上記病原体の指標となる選択されたコンセンサス配列の核酸配列を決定する工程と、
d．広く受け入れられている複合配列アラインメントアルゴリズム（例えばMAFFT、CLUSTALW、MUSCLE）及び系統樹構築アルゴリズム（例えばMaximum-likelihood、Nearest-neighbor、Maximum-parsimony）を用いたソフトウェアにて構築された、既知の遺伝子型を含む遺伝子配列セットの系統樹を作成する工程と、
e．配列アラインメントに適したソフトウェア（例えばBLAST、TMAP、BWA）を用いて、得られたコンセンサス核酸配列を、上記病原体の指標となる既知の遺伝子型を含む遺伝子配列セットとともにアラインする工程と、
f．得られたコンセンサス核酸配列との類似性の高い遺伝子配列サブセットを決定する工程と、
g．工程d）における系統樹において、工程f）における得られたコンセンサス核酸配列との類似性の高い遺伝子配列サブセットの最小共通祖先（lowest common ancestors）を決定する工程と、
h．工程g）で得られた結果に基づき、サンプル中に存在する病原体の遺伝子型／亜型を診断する工程と、
i．上記病原体の指標となる遺伝子配列の少なくとも2つの異なる遺伝子型又は亜型への同時感染を任意に判定する工程と、
を含む、方法に関する。
【００３７】
上記方法による分析に適したサンプルは任意のタイプのサンプル、特に上記で定義された臨床サンプルとすることができる。サンプルの準備は、所与の病原体を含有する（所与の病原体に感染している）疑いのある生物からサンプルを取り出すことを意味する。さらに、本方法は概して、更なる分析工程、例えば逆転写、PCR等を行うことができるように、サンプル中の核酸を抽出及び精製する工程を含む。
【００３８】
上記方法は上記病原体の存在の指標となるコンセンサス配列を選択する工程を含む。この工程は所与の病原体の遺伝子同一性及び変異性についての情報に依存するものである。例えば、HCVが存在及び遺伝子型／亜型を決定する病原体である場合、データベースによって、HCVの特異的な検出及び該HCVの遺伝子型／亜型の決定の両方を可能にするこれらの領域についての情報が与えられる。（RT-）PCRに基づく増幅及び検出法には、特異的な増幅を可能にするHCVゲノム領域を特異的に増幅するプライマーの設計が必要となることは明らかである。そのため、本発明の方法は、HCVのゲノム領域又はその相補配列と特異的にハイブリダイズして、コンセンサスゲノム領域、すなわち対象となるゲノム領域（標的領域）の特異的な増幅を可能にするPCRプライマーを設計する工程を更に含む。増幅したゲノム領域の長さは約100ヌクレオチド〜1000ヌクレオチドの範囲であるのが好ましいが、ゲノム領域のより長い断片、例えば約1100、1200、1300、1400、1500ヌクレオチド長、又はより長い領域を所望に応じて増幅することもできる。標的とされるゲノム領域の選択は概して、該ゲノム領域が所与の病原体、例えばHCVに特異的であるか否か、また増幅産物の更なる解析によって該病原体の遺伝子型／亜型の決定が可能であるか否かという疑問に依存するものである。例えば、約800ヌクレオチド長のゲノム領域の増幅及び解析が病原体、例えばHCVを特異的に検出するのに十分である場合、この断片（コンセンサスゲノム領域）によってそれぞれの病原体の遺伝子型／亜型の決定も可能であれば、それ以上長い断片を得る必要はない。
【００３９】
上記病原体の指標となる選択されたコンセンサス配列の核酸配列を決定する工程を核酸配列の増幅に続いて行う。核酸配列は病原体の標的とされるゲノム領域のシークエンシング、好ましくは次世代シークエンシング、最も好ましくはイオン半導体シークエンシングにより決定する。本発明の方法では、対象となるゲノム領域を表すより多くの数の増幅産物がシークエンシングされる。全てのシークエンシング反応のシークエンシングリードをアセンブリすることで、連続配列（コンティグ）を得る。アセンブリ工程は、MIRAアセンブラ（すなわちヌクレオチド配列の自動アセンブリ及び編集に適したソフトウェア）として知られる自由にアクセス可能なソフトウェアを用いて行われる。Newbler、CLC Bio等の名称で知られている他のソフトウェアも、かかるソフトウェアがコンティグのこのようなアセンブリに適していれば、使用することができる。コンティグにおけるヌクレオチド配列のアセンブリ後、アセンブリしたコンティグの質を包括度（coverage）、長さについて確認し、標的核酸配列の少なくとも300倍の平均包括度を有し、250ヌクレオチドを超える、300ヌクレオチドを超える長さを有するコンティグ、好ましくは400ヌクレオチドを超えるコンティグ、又は更に長い配列を本発明の目的上、有効とみなす。
【００４０】
本発明の方法では、上記病原体の指標となる既知の遺伝子型を含む遺伝子配列セットの系統樹を、多重配列アラインメントアルゴリズム及び系統樹構築アルゴリズムを用いて作成する。続いて、配列アラインメントに適したソフトウェア、例えばIon Torrent PGMからのデータに合わせて特別に調整されたショートリードアライナであるTMAPソフトウェアを用いて、得られた核酸配列を、既知の遺伝子型を含む遺伝子配列セットとともにアラインする。病原体がHCVである場合、既知の遺伝子型を含む遺伝子配列セットは「C型肝炎ウイルス（HCV）データベースプロジェクト」（初めに国立アレルギー感染症研究所（NIAID）の微生物学及び感染症部門（Division of Microbiology and Infectious Diseases）による資金提供を受け、一般に公開されている）から収集することができる。
【００４１】
ウイルスの高い突然変異率に起因して、得られた核酸配列がデータベースにおいて既知の単一遺伝子配列に正確に適合するとは考えにくい。さらに、データベースにおいて寄託された多くの既知の遺伝子配列は互いに類似性が高い。そのため、各核酸配列について、BLASTアラインメントスコアに基づき核酸配列に最も密接に適合する既知の遺伝子型を含む遺伝子配列のサブセットSが得られる。核酸配列の遺伝子型が、系統樹上のSにおける既知の遺伝子配列の最小共通祖先である遺伝子型ASから推測される。系統樹T上のノードNのセットの最小共通祖先は子孫としてNに全てのノードを有するTにおける最小ノードとして規定される。生物学的には、ASはSにおける既知の遺伝子配列の進化論上の親を表す。このアプローチを用いると、核酸配列に密接に適合する遺伝子配列からの全ての遺伝子型の情報が用いられることから、遺伝子型決定の精度が向上する。さらに、核酸に密接に適合する遺伝子配列が異なる遺伝子型を有する場合、組換えを推測することができる。同様に、同じサンプル中の核酸配列が異なる遺伝子型を有する場合、同時感染を推測することができる。
【００４２】
本発明の方法の有利な点はBLASTの結果を見ることで組換え又は異常な配列変異を検出することができることである。さらに、トップマッチ（top matches：最大適合）が異なる遺伝子型の配列に関連している場合にもこれを検出することが可能である。本発明の方法を用いることで、コンティグ配列を用いて系統樹を直接構築することが可能であり、この配列をどちらか一方の遺伝子型に近い系統樹の或る部分に置くことができる。概してこの場合、組換えが検出され難い。
【００４３】
本発明の方法に関わる別の有利な点は、同時感染、例えば病原体の少なくとも2つの株、遺伝子型又は亜型、例えばHCVの2つの異なる遺伝子型又は亜型による同時感染を検出することができることである。
【００４４】
上記方法の下位態様は細菌又はウイルスを含む微生物の群から選択される病原体の検出に関する。本明細書で使用される場合、細菌は抗生物質等の薬物に対する耐性を発現しているヒト病原菌、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス株（MRSA）、抗生物質耐性クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiellaepneumoniae：肺炎桿菌）株、抗生物質耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシス株、又はEHEC（腸管出血性大腸菌株）等の毒素産生菌から選択することができるのが好ましい。
【００４５】
検出されるのが好ましい、又は遺伝子型若しくは亜型が決定されるウイルスの例は、HIV、HCV、HBV、ノロウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスを含むヒト病原性ウイルスの群から選択される。
【００４６】
本発明の方法は、HCV、HIV、HBV、ヒトヘルペスウイルス、例えばCMV等からなる群から選択されるウイルスの有無の検出及び遺伝子型／亜型の決定に用いるのが好ましい。
【００４７】
本発明の方法は、遺伝子型決定、又は病原性ウイルスがHCVである場合の2つ以上の遺伝子型若しくは亜型による同時感染の検出に特によく適している。
【００４８】
本発明の方法は、遺伝子型決定、又は病原性ウイルスがHCVである場合の2つ以上の遺伝子型若しくは亜型による同時感染の検出に特に適しており、感染の指標となるコンセンサス配列（標的配列）はヌクレオチド位置8614及び9298を含むHCVNS5Bゲノム領域の断片である。
【００４９】
本発明の方法は、臨床サンプルの解析に特に適しており、臨床サンプルは、
a）HCVに感染している疑いのある患者、
b）遺伝子型及び／又は亜型が未知のHCVに感染していることが分かっている患者、
c）これまでに抗ウイルス薬による治療を行ったことのない患者、
d）既に抗ウイルス薬による治療を行ったことのある患者、
e）抗ウイルス薬に対する応答のない患者、
f）抗ウイルス薬に対して耐性を呈するHCVに感染している患者、
g）HCVに感染しており、臨床試験において抗ウイルス薬による治療を行っている患者、
からなる群から選択される患者に由来するものである。
【００５０】
本発明の方法はヌクレオチド配列を次世代シークエンシングにより決定するシークエンシング工程を含むのが好ましい。
【００５１】
本発明の方法は、配列が、上記コンセンサス核酸（標的）配列の断片をシークエンシングして、シークエンシング情報をコンティグヘとアセンブリすることにより決定される場合に特に適している。
【００５２】
本発明の方法は、ソフトウェアアルゴリズム（例えばMIRAアセンブラ、http://www.chevreux.org/projects_main.htmlを参照されたい）を用いて、核酸配列リードをコンティグ配列へとアセンブルするように特に適合している。
【００５３】
本発明の方法では、配列アラインメントに適したソフトウェア、例えばBLASTを用いて、各コンティグを上記病原体の指標となる既知の遺伝子配列とともにアラインする。
【００５４】
さらに本明細書に言及される方法の工程を行うためのソフトウェアパスを含むソフトウェア製品も本発明に包含される。
【００５５】
本発明は、先の段落のいずれかの方法を行い、上記病原体の遺伝子型／亜型を決定する該方法の結果に基づき治療を選択することを含む、治療法を選択する方法にも関する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、病原体による感染を治療する治療法はHCV、HIV、HBV、ヘルペスウイルス、例えばCMVからなる群から選択されるウイルスに特異的である。本発明のこの態様の最も好ましい実施形態はHCV感染の治療に関するものである。本発明のこの態様ではHCVによる感染の指標となるコンセンサス配列はHCVゲノム領域NS5B又はその断片である。この断片はヌクレオチド位置8614及び9298を含むのが好ましい。しかしながら、好適な遺伝子型又は亜型特異的な治療処置の決定に他のHCVゲノム領域を用いることがはっきりと企図される。
【００５６】
本発明は、先の段落のいずれかの方法を行うことを含む、HCV感染対象の治療法を選択する方法にも関する。例えば患者がHCV遺伝子型1に感染している場合、例えばテラプレビル＋インターフェロン及びリバビリン又はボセプレビル（Boceprevir）＋インターフェロン及びリバビリンによる治療が適している。他の遺伝子型、例えばHCV2、3及び4については、インターフェロン＋リバビリンによる治療を選択することができる。
【００５７】
本発明は、病原体、例えばHCVの存在を検出し、遺伝子型を決定する上記方法のいずれかを行うソフトウェアを読み込むのに適した機器にも関する。この機器はソフトウェアにて与えられた方法工程を実行することが可能である。
【００５８】
本発明は本明細書に記載の実施形態に併せて記載されているが、上記の記載及び下記の実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが意図されることを理解されたい。本発明の範囲内にある他の態様、有利な点及び変更形態は本発明に係る当業者にとって明らかであろう。本明細書で述べられる全ての特許及び刊行物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００５９】
下記の実施例は当業者に本発明の組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び記載を与えるように記載される。実施例は本発明の非限定的な例であることが意図される。量、温度等の変量に関しては正確さを確保するよう努めているが、実験誤差及び偏差は考慮すべきである。特に明確に指定のない限り、部は重量部であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧付近である。特に明確に指定のない限り、全ての成分は市販のものとした。
【実施例】
【００６０】
ヒト患者から得られた血液サンプルを用いて核酸を抽出した後、該核酸を、Ion Torrent半導体シークエンシング機器を用いた次世代シークエンシングのための準備工程に供した。
【００６１】
HCVの存在の指標となるコンセンサス配列として、ヌクレオチド位置8614及び9298を含むNS5B領域を選択した。
【００６２】
NGSシークエンシングを用いて、HCVの指標となる上記で選択されたコンセンサス配列の核酸配列を決定した。シークエンシングリードアセンブリに適したMTRA（http://mira-assembler.sourceforge.net/docs/DefinitiveGuideToMIRA.html）を用いてこの工程を遂行した。
【００６３】
HCV遺伝子型が既知の遺伝子配列セットの系統樹を、広く受け入れられている複合配列アラインメントアルゴリズムMAFFT（http://mbe.oxfordjournals.org/content/30/4/772）及び系統樹構築アルゴリズム（例えばMaximum-likelihood、http://code.google.com/p/phyml/）を用いたソフトウェアにて構築した。
【００６４】
配列アラインメントに適したソフトウェア（例えばIonTorrent製のTMAP）を用いて、得られたコンセンサス核酸配列を上記病原体の指標となる遺伝子型が既知の遺伝子配列セットとともにアラインした。
【００６５】
得られたコンセンサス核酸配列との類似性が高い遺伝子配列のサブセットを決定した。
【００６６】
先の工程における得られたコンセンサス核酸配列との類似性が高い遺伝子配列のサブセットの工程d）の系統樹における最小共通祖先を決定した。
【００６７】
先の工程で得られた結果に基づき、サンプルに存在する病原体の遺伝子型／亜型を診断した。
【国際調査報告】
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