(57)【要約】  本発明は、抗原ＣＳ１に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（多重鎖ＣＡＲと称される）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＣＳ１を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に多発性骨髄腫を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−細胞外ＣＳ１リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含む、ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項２】
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項３】
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチドをさらに含む、請求項２に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項４】
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＳ１リガンド結合ドメインが、ＣＳ１に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ＶＨが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９および配列番号：２１から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項４に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記ＶＬが、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０および配列番号：２２から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチドを含む、請求項１に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項７】
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、請求項１に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項９】
ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する、請求項９に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：１０と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１０に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１２に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１２に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
請求項１に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表６においてＣＳ１−Ｌｕｃ６３、ＣＳ１−Ｌｕｃ９０、ＣＳ１−Ｌｕｃ３４またはＣＳ１−Ｌｕｃ６３と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１８】
免疫細胞を操作する方法であって、
（ｃ）免疫細胞を提供すること；
（ｄ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む、方法。
【請求項１９】
（ｄ）免疫細胞を提供すること；
（ｅ）少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｆ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２０】
（ｃ）免疫細胞を提供すること；
（ｄ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２１】
（ｄ）免疫細胞を提供すること；
（ｅ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｆ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法から得られる、単離された免疫細胞。
【請求項２３】
少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
【請求項２４】
医薬として使用するための、請求項２２または２３に記載の単離された免疫細胞。
【請求項２５】
ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
【請求項２６】
それを必要とする患者を処置するための方法であって、
ａ）請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる免疫細胞を提供すること；
ｂ）前記Ｔ細胞を前記患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものである、請求項２６に記載の患者処置方法。
【請求項２８】
前記免疫細胞が、患者から回収されるものである、請求項２６に記載の患者処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原ＣＳ１に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（多重鎖ＣＡＲまたはｍｃＣＡＲと称される）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＣＳ１を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に多発性骨髄腫を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増大または遺伝子操作を通したＴ細胞の再指向のいずれかによって生成され得る（Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移入は、移植に関連するウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
【０００３】
Ｔ細胞における新規特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ＣＡＲは、１つ以上のシグナリングドメインに結合して一本鎖融合分子を形成するターゲティング部分からなる合成受容体である。
【０００４】
一本鎖ＣＡＲは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍由来の腫瘍細胞の表面において発現される抗原に対してＴ細胞を再指向させることに成功した（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０００５】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄内の形質細胞（ＰＣ）の異常なクローン増大を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍であり、２０１２年において米国では、推定２１，７００件の新たな症例および１０，７１０件のＭＭによる死亡が確認されている（Ｓｉｅｇｅｌ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２０１２  ６２：１０−２９）。２０１３年において米国では、２２，３５０人がＭＭと新たに診断され、１０，７１０人がそれにより死亡すると推定されており、これは、すべての血液悪性腫瘍による死亡の２０％を占める。プロテアソーム阻害剤および免疫調節薬の使用は全生存を改善したにもかかわらず（Ｐａｌｕｍｂｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００９  ２３：４４９−４５６）、ＭＭは、依然として不治の悪性腫瘍であり（Ｐｏｄａｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００９  ２３：１０−２４）、その新規治療アプローチが緊急に必要とされている。
【０００６】
細胞表面糖タンパク質ＣＳ１（文献では、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９またはＣＲＡＣＣとも称される−ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６７００４．３）は、骨髄腫細胞の表面上において高度かつ遍在的に発現される（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）。ＣＳ１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞の一部および正常Ｂ細胞を含むほとんどの免疫エフェクター細胞において非常に低レベルで発現され、骨髄細胞上ではほとんど検出不可能である（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）。特に、ＭＭを含む血液悪性腫瘍を処置するために幹細胞移植に使用され得るヒト造血幹細胞では、ＣＳ１は、無視可能な程度に発現される（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）。ＭＭにおけるＣＳ１の機能は依然として完全には理解されておらず、ＣＳ１は、骨髄腫細胞接着、クローン性成長および腫瘍原性において役割を果し得ることが証明されている（Ｂｅｎｓｏｎ  ＤＭ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２  ３０：２０１３−５；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：４３０９−１８）。
【０００７】
悪性細胞または感染細胞をターゲティングし得る治療グレードの人工免疫細胞を開発する状況において、本発明者らは、天然のものに近い改善されたＣＡＲアーキテクチャであって、任意の細胞外単一特異的または多重特異的リガンド結合ドメインを使用して作用する可能性が高い改善されたＣＡＲアーキテクチャを研究した。国際公開第２０１４０３９５２３号では、本発明の別個のポリペプチドサブユニットを含む新世代のＣＡＲ（多重鎖ＣＡＲと称される）が記載されている。このアーキテクチャによれば、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは、異なるポリペプチド鎖上に配置される。このような多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の高親和性ＩｇＥ結合ドメインを細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）で置換することによって、ＦｃεＲＩから生成され得る一方で、ＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖のＮ末端および／またはＣ末端尾部は、それぞれシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。細胞外リガンド結合ドメインは、Ｔ細胞の特異性を細胞標的に再指向させる役割を有し、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞応答を活性化する。ＦｃεＲＩ由来のアルファ、ベータおよびガンマポリペプチド由来の異なるポリペプチドが、膜近傍位置にある膜貫通ポリペプチドであるという事実は、ＣＡＲに対するよりフレキシブルなアーキテクチャを提供して、ＣＳ１に対する特異性を改善し、免疫細胞のバックグラウンド活性化を減少させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
課題を解決するための手段
今回、本発明者らは、マーカーとしてＣＳ１を有する悪性細胞をターゲティングするのに特に適切なｓｃＦｖ細胞外ドメイン結合ＣＳ１を有する多重鎖ＣＡＲを設計した。これを達成した一方で、白血病、特に多発性骨髄腫を処置または予防するためにＣＳ１陽性細胞に対して効率的に作用する抗体は、これまでにほとんど記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】上：本発明の多重鎖ＣＡＲアーキテクチャが由来するＦｃεＲＩの概略図。下：本発明のＣＳ１多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性構築物の一般構造。
【図２】本発明のＣＳ１特異的多重鎖ＣＡＲの異なるアーキテクチャ。左から右へ：（ＣＤ３ゼータのＩＴＡＭに融合された）ポリペプチドガンマ、（ＳｃＦｖに融合された）ポリペプチドアルファ、（ＣＤ２８または４１ＢＢのいずれか由来の共刺激ドメインに融合された）ポリペプチドベータ。ＡおよびＢ：ポリペプチドベータは、４１ＢＢ由来の共刺激ドメインに融合されており、ＶＬおよびＶＨ断片は逆の順序である。ＣおよびＤ：ポリペプチドベータは、ＣＤ２８由来の共刺激ドメインに融合されており、ＶＬおよびＶＨ断片は逆の順序である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
【表１】
2017518071.tif 000002
【００１１】
【表２】
2017518071.tif 000003
【００１２】
【表３】
2017518071.tif 000004
【００１３】
【表４】
2017518071.tif 000005
【００１４】
【表５】
2017518071.tif 000006
【００１５】
【表６】
2017518071.tif 000007
【００１６】
発明を実施するための形態
発明の詳細な説明
本発明は、
−細胞外ＣＳ１リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド；
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００１７】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＳ１リガンド結合ドメインが、ＣＳ１に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００１８】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＳ１リガンド結合ドメインが、ＣＳ１に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含むヒト化一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００１９】
本発明は、前記ＶＨが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９および配列番号：２１から選択される１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２０】
本発明は、前記ＶＬが、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０および配列番号：２２から選択される１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチドを含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２１】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２２】
本発明は、前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２３】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、ＣＳ１−Ｌ特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）であって、
−細胞外ＣＳ１−Ｓリガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド；
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＳ１−Ｌ特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００２５】
本発明は、前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では、保存的配列改変は、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、または最適化生殖細胞系列配列を用いることによって、抗体に、抗体断片に、または本発明のＣＡＲ分子の他の部分のいずれかに導入される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」または「ヒト化」という用語は、ＣＡＲの結合特性に有意に影響を与えず、もしくはＣＡＲの結合特性を有意に変化させず、ならびに／または改変アミノ酸配列を含有するＣＡＲの活性に有意に影響を与えず、およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低減もしくは抑制しないアミノ酸改変を指すことを意図する。このような保存的改変としては、前記ＣＡＲ中の前記抗体断片および／または前記ＣＡＲ分子の他の部分のいずれかにおけるアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。
【００２８】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができ、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５８４８号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載されておりＣＳ１用に適合された機能アッセイを使用して、ＣＳ１結合能力について、改変ＣＡＲを試験することができる。
【００２９】
本発明の抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲは、ＣＳ−１に特異的な抗体、特にヒトＣＳ１に特異的な抗体を操作することによって、より具体的には、ヒトＴ細胞において発現された場合にＨＡＭＡ応答を誘導しないヒトＣＳ１に特異的な抗体を操作することによって提供される。
【００３０】
本発明は、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３１】
本発明は、前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３２】
本発明は、前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３３】
本発明は、前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３４】
本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表６においてＣＳ１−Ｌｕｃ６３、ＣＳ１−Ｌｕｃ９０、ＣＳ１−Ｌｕｃ３４またはＣＳ１−Ｌｕｃ６３と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８４％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８７％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８８％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも８９％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５２】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、ＣＳ１−Ｌｕｃ６３の全長アミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５５】
本発明は、上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００５６】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法を提供する。
【００５７】
本発明は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）少なくとも１つの上記いずれか１つに記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００５８】
本発明は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００５９】
本発明は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記いずれか１つに記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００６０】
本発明は、上記いずれか１つに記載の方法から得られる単離された免疫細胞を提供する。
【００６１】
本発明は、少なくとも１つの上記いずれか１つに記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む単離された免疫細胞を提供する。
【００６２】
本発明は、医薬として使用するための上記単離された免疫細胞を提供する。
本発明は、ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する上記単離された細胞を提供する。
【００６３】
本発明は、医薬として使用するための単離された免疫細胞であって、抗ＣＳ１  ＣＡＲを持つＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する単離された免疫細胞を提供する。
【００６４】
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の領域の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００６５】
適切な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似しているかまたは等価であるすべての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
【００６６】
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）ａｎｄ  Ｖｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【００６７】
多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫療法において使用される免疫細胞に特に適合された多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【００６８】
一般に、本発明の多重鎖ＣＡＲは、少なくとも：
−少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド；および
−少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド
を、前記ポリペプチドが共にアセンブルして多重鎖キメラ抗原受容体を形成するように含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。
【００７０】
好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＳ１に特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）可変断片がフレキシブルリンカーによって連結されたものを含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、好ましくは表５において配列番号：１３〜２２として提供される抗ＣＳ１  ｓｃＦＶである。ｓｃＦｖ以外のＣＳ１特異的結合ドメイン、例えば非限定的な例として、ラクダ科動物もしくはサメ類（ＶＮＡＲ）単一ドメイン抗体断片、または受容体リガンド、例えば血管内皮成長因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンもしくはＩＬ−１３突然変異タンパク質、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループもしくはＣＤＲもまた、リンパ球の所定のターゲティングに使用され得る。
【００７１】
好ましい実施形態では、前記第１の膜貫通ポリペプチドは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにさらなる可動性および接近性を与えるために用いられる。ストーク領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、天然分子のすべてもしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は天然ストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、前記ストーク領域は、ヒトＣＤ８アルファ鎖の一部である（例えばＮＰ＿００１１３９３４５．１）（配列番号：２）。
【００７２】
免疫細胞における多重鎖ＣＡＲの発現は、限定されないが、各腫瘍関連表面抗原を有する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を有するウイルス感染細胞、または系統特異的もしくは組織特異的表面抗原を有する標的細胞を含む所定の標的を選択的に排除する改変細胞をもたらす。
【００７３】
標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異は、一般に、癌細胞において観察され、抗原喪失エスケープ変異体を作成する。したがって、腫瘍エスケープをオフセットし、免疫細胞をより標的特異的にするために、多重鎖ＣＡＲは、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含み得、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強する。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに配置され得、場合により、リンカーによって分離され得る。別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多重鎖ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置され得る。別の実施形態では、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を発現させることを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む方法に関する。特定の実施形態では、免疫細胞操作方法は、細胞の表面において、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の少なくとも一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合されたＦｃεＲＩアルファ鎖の複数の部分とを発現させることを含む。より具体的な実施形態では、前記方法は、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された複数のＦｃεＲＩアルファ鎖とをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む。多重鎖ＣＡＲの集団は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の多重鎖ＣＡＲを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強し得る。
【００７４】
本発明はまた、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む単離された免疫細胞に関する。
【００７５】
本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、多重鎖ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指令するタンパク質の部分を指す。
【００７６】
多重鎖ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するＦｃ受容体またはＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体または変異体および合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の２つの別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられ得る。好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン、またはＦｃεＲＩベータもしくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含み得る。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００７８】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ｉｇａｎｄ）（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
【００７９】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【００８０】
別の特定の実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子２（ＴＲＡＦ２）結合モチーフ（共刺激ＴＮＦＲメンバーファミリーの細胞質内尾部）である。共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの細胞質尾部は、主要な保存的モチーフ（Ｐ／Ｓ／Ａ）Ｘ（Ｑ／Ｅ）Ｅ）またはマイナーモチーフ（ＰＸＱＸＸＤ）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）からなるＴＲＡＦ２結合モチーフを含有する。ＴＲＡＦタンパク質は、受容体の三量化に応じて、多くのＴＮＦＲの細胞内尾部に動員される。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。
【００８２】
適切な膜貫通ポリペプチドの顕著な特徴は、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために一緒に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多重鎖ＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、一緒に相互作用して、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来し得るか、または合成起源に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはδなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖またはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。
【００８３】
「由来する」という用語は、Ｆｃε受容体の配列の１つ以上のアミノ酸改変を含むＦｃε受容体のものと等価であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなアミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失、付加またはそれらの改変の任意の組み合わせを含み得、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を変化させ得る。一方、特定のＦｃ受容体由来のＦｃ結合領域は、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を実質的に変化させない１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。この種のアミノ酸改変は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。
【００８４】
特定の実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩ鎖由来の膜貫通ポリペプチドを含む。より具体的な実施形態では、ＦｃεＲＩ鎖は、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメイン、好ましくはＣＳ１に対するｓｃＦＶで置換されたＦｃεＲＩα鎖である。
【００８５】
より具体的な実施形態では、前記多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するように含み、別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原受容体は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。
【００８６】
非限定的な例として、様々なバージョンの多重鎖ＣＡＲが図３に示されている。より好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲは、表６に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、このようなアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００８７】
より好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、配列番号：１５および／または配列番号：１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００８８】
「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される時、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手され得る。
【００８９】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明の上記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。本発明は、多重鎖ＣＡＲに含まれ得る本明細書に開示される膜貫通ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む）を提供する。特に、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する少なくとも１つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００９０】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス）中に存在し得る。
【００９１】
特定の実施形態では、異なる核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのポリヌクレオチドまたはベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：  １０１３−１０２５  （２００１）；  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：  １３−２１  （１９９７）；  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ａｎｄ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８（１３）：  ４２２７−４２３９  （２００８）；  Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  １３：  ８０３−８１０  （２００７）を参照のこと)。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
【００９２】
ＦｃεＲなどの膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、ＦＣεＲのものであり得るか、または別の分泌タンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ）に由来し得るか、またはデノボ合成され得る。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、２つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、ＦｃεＲＩアルファ鎖（ＮＰ＿００１９９２．１）の残基１〜２５を含み、配列番号：２０５のアミノ酸配列を有する。
【００９３】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
【００９４】
免疫細胞を操作する方法：
包含される特定の実施形態では、本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを発現させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換すること、および前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させることを含む。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成する異なるポリペプチドを前記細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、細胞において安定に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含められる。
【００９６】
送達方法
上記様々な方法は、場合によりＤＮＡ末端処理酵素または外因性核酸と共に、多重鎖ＣＡＲ、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＡＲを細胞に導入することを含む。
【００９７】
非限定的な例として、前記多重鎖ＣＡＲは、１つまたは異なるプラスミド性ベクターによってコードされる導入遺伝子として導入され得る。異なる導入遺伝子は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：１３−２１（１９９７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ａｎｄ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８（１３）：４２２７−４２３９（２００８）；Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １３：８０３−８１０（２００７）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、低頻度切断エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ末端処理酵素または多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
【００９８】
前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含有し得る。
【００９９】
ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産され、次いで、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、微量注入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。
【０１００】
−エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって細胞に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。本発明者らは、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡエレクトロポレーションの最適条件を決定した。
【０１０１】
本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を使用した。この技術は、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）エレクトロポレーション波形の使用に基づいており、パルス持続時間、強度、ならびにパルス間の間隔の正確な制御を与える（米国特許第６，０１０，６１３号および国際公開第２００４０８３３７９号）。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、これらのパラメータはすべて変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一態様では、本発明者は、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡの＞９５％トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびＴ細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、Ｔ細胞を形質転換する方法であって、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２〜１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス、；および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む方法に関する。
【０１０２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を形質転換する方法は、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧が２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２ｍｓ、０．５ｍｓ、１ｍｓ、２ｍｓ、３ｍｓ、４ｍｓ、５ｍｓ、６ｍｓ、７ｍｓ、８ｍｓ、９ｍｓ、または１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０Ｖ、２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス、および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む。
【０１０３】
上記値域に含まれる任意の値が、本出願において開示される。エレクトロポレーション培地は、当技術分野で公知の任意の適切な培地であり得る。好ましくは、エレクトロポレーション培地は、０．０１〜１．０ミリシーメンスの範囲の伝導率を有する。
【０１０４】
特定の実施形態では、非限定的な例として、前記ＲＮＡは、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、低頻度切断エンドヌクレアーゼの１つのモノマー、例えば半ＴＡＬＥヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、多重鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１つの成分、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、外因性核酸、１つさらなる触媒ドメインをコードする。
【０１０５】
改変Ｔ細胞
本発明はまた、前記細胞操作方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを含む。別の実施形態では、前記単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む。特に、前記単離された細胞は、本発明の少なくとも１つの多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
以前に記載されている方法のいずれか１つによって得られる単離された免疫細胞、好ましくはＴ細胞も、本発明の範囲内に包含される。前記免疫細胞は、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。本発明の前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。前記単離された細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択されるＴ細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して被験体から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得られ得る。本発明の特定の実施形態では、当業者に入手可能であり公知である多数のＴ細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。以前に記載されている方法による形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も、本発明の範囲内に包含される。免疫抑制処置に対して耐性であり、以前の方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。
【０１０７】
前述のように、このような細胞はまた、例えば、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＨＬＡ遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばＰＤ１およびＣＴＬＡ−４からなる群より選択される１つもしくは複数の遺伝子を不活性化するように遺伝的に操作され得るか、またはｐＴアルファの導入遺伝子を発現し得る。
【０１０８】
別の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、本発明の細胞において非機能的になる。上記戦略は、より具体的にはＧｖＨＤを避けるために使用される。本発明の特定の態様は、個体由来の改変細胞を得るための方法であって、前記細胞が、主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る方法である。前記方法は、以下の工程：
（ａ）前記個体から細胞を回収する工程；
（ｂ）ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、前記細胞をエクスビボで遺伝子改変する工程；
（ｃ）適切な条件下で、遺伝子改変Ｔ細胞をインビトロで培養して前記細胞を増幅する工程
を含む。
【０１０９】
主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る改変細胞であって、この方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
【０１１０】
より好ましい実施形態では、前記方法は、
（ａ）好ましくは細胞培養物由来のまたは血液サンプル由来のＴ細胞を提供すること；
（ｂ）ＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖切断によって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸で前記Ｔ細胞を形質転換すること；
（ｃ）前記低頻度切断エンドヌクレアーゼを前記Ｔ細胞に発現させること；
（ｄ）細胞表面上においてＴＣＲを発現しない形質転換Ｔ細胞を分類すること；
（ｅ）前記細胞を増大させること
を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。好ましい方法および関連ＴＡＬＥヌクレアーゼは、国際公開第２０１３１７６９１５号に記載されている。
【０１１２】
Ｔ細胞の活性化および増大
Ｔ細胞は、Ｔ細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、活性化させ遺伝的に増大させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。
【０１１３】
一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。
【０１１４】
例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。
【０１１５】
非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあり得るか、または表面に結合され得る。当業者であれば容易に理解し得るように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を薬剤コーティングビーズと結合させ、続いて、ビーズおよび細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。Ｔ細胞培養のために適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、−１０、−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ−、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが追加されているか、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはＴ細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、被験体へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％Ｃ０２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。
【０１１６】
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させ得る。前記細胞はまた、前記細胞を被験体に投与した後、インビボで、例えば、被験体の血液中で増大させ得る。
【０１１７】
治療用途
別の実施形態では、以前に記載されているような異なる方法によって得られる単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。
【０１１８】
本発明は、医薬として使用するための単離された免疫細胞であって、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する単離された免疫細胞を提供する。
【０１１９】
前記上記単離された細胞は、ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来し得る。
【０１２０】
本発明は、医薬として使用するための単離された免疫細胞であって、抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲを持つＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する単離された免疫細胞を提供する。
【０１２１】
組成物
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む組成物を提供する。
【０１２２】
好ましくは、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つの抗ＣＳ１  ＣＡＲ、好ましくは
細胞外ＣＳ１リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド；
シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；
共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する前記単離された免疫Ｔ細胞とを含む組成物を提供する。
【０１２３】
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つのＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む上記組成物であって、ＣＳ１リガンド結合ドメインがＦｃεＲＩのアルファ鎖に融合されており、ＣＳ１に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記組成物を提供する。
【０１２４】
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つのＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む上記組成物であって、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＳ１リガンド結合ドメインが、ＣＳ１に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含むヒト化一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記組成物を提供する。
【０１２５】
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つのＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む上記組成物であって、前記ＶＨが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９および配列番号：２１から選択される１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記組成物を提供する。
【０１２６】
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つのＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む上記組成物であって、前記ＶＬが、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０および配列番号：２２から選択される１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すポリペプチドを含む上記組成物を提供する。
【０１２７】
本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、
上記に記載の方法によって得られる免疫細胞を含む上記組成物を提供すること；
Ｔ細胞を含む前記組成物を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。
【０１２８】
本発明は、前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものであり、上記組成物の一部である上記患者処置方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、前記免疫細胞が、患者から回収されるものであり、上記組成物の一部である上記患者処置方法を提供する。
【０１３０】
一実施形態では、本発明は、疾患または前記疾患関連の合併症を処置する医薬として使用するための、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つの上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む上記組成物を提供する。
【０１３１】
好ましくは、前記疾患は、少なくとも１つの上記ＣＳ１−Ｌ特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞を含む本発明の組成物を使用して処置され得る。
【０１３２】
別の実施形態では、前記疾患は、少なくとも１つの上記ＣＳ１−Ｓ特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞を含む本発明の組成物を使用して処置され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、医薬として使用するために提供される。
別の実施形態では、前記医薬は、ＣＳ１陽性細胞に関連する病変と診断された患者における癌または感染症を処置するために使用され得る。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明の前記単離された細胞または前記単離された細胞由来の細胞株は、癌、特に多発性骨髄腫を処置するための医薬の製造において使用され得る。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、疾患または前記疾患関連の合併症を処置する医薬として使用するための、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つの上記ＣＳ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を発現する上記単離された免疫Ｔ細胞とを含む組成物を提供する。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の組成物を使用して処置され得る前記疾患は、自己免疫疾患、好ましくは自己免疫炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。
【０１３７】
一実施形態では、本発明の組成物を使用して処置され得る前記疾患は、癌、血液癌、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）以前に記載されている方法のいずれか１つによって入手可能な免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記形質転換免疫細胞を前記患者に投与すること
の少なくとも１つを含む方法に依拠する。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の前記Ｔ細胞は、頑強なインビボＴ細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。
【０１４０】
前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
【０１４１】
典型的にはドナーから得られたＴ細胞の非同種反応性細胞への形質転換を可能にする限り、本発明は、同種免疫療法に特に適切である。これは、標準的なプロトコールの下で行われ得、必要に応じて何回も再現され得る。得られた改変Ｔ細胞をプールし、１人または複数の患者に投与し得るので、「既製」治療製品として利用可能である。
【０１４２】
開示される方法と共に使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記処置は、癌、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を処置するために使用され得る。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞を含む前記処置は、自己免疫障害、好ましくはＳＬＥまたはＩＢＤと診断された患者を処置するために使用され得る。
【０１４４】
より好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞を含む前記処置は、多発性骨髄腫と診断された患者を処置するために使用され得る。
【０１４５】
処置され得る癌としては、血管新生していないかまたはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、および血管新生した腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の多重鎖ＣＡＲで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫および特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫、特に多発性骨髄腫が挙げられる。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も挙げられる。
【０１４６】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞を含む処置から利益を受け得る患者は、ＭＭ、再発もしくは難治性のＭＭ、またはＭＭ関連の合併症を患っている。
【０１４７】
ＭＭは、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）から形質細胞性白血病に及び得る。
【０１４８】
併用療法
それは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される１つ以上の抗癌療法と組み合わせた処置であり得る。
【０１４９】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞と、ＭＭのための処置のような抗癌薬との組み合わせを提供する。
【０１５０】
好ましくは、抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞であって、それと組み合わせられる抗癌薬の存在下で生存および増殖し得るＴ細胞が提供される。
【０１５１】
抗癌薬は、例えば、ＭＭ、再発性ＭＭまたは難治性ＭＭを処置するために使用される処置であり得る。
【０１５２】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞と、以下の処置：サリドマイド（単剤として、またはステロイドもしくはメルファランと組み合わせて）、レナリドマイド＋デキサメタゾン、ボルテゾミブ＋メルファラン、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン［アドリアマイシン］およびデキサメタゾン、メルファラン＋プレドニゾンの少なくとも１つとの組み合わせを提供する。
【０１５３】
移植候補者における一次導入療法の場合、以下の併用療法ボルテゾミブ／デキサメタゾン、ボルテゾミブ／ドキソルビシン／デキサメタゾン、ボルテゾミブ／サリドマイド／デキサメタゾン、レナリドミド／デキサメタゾンは、本発明の目的に関連する。
【０１５４】
本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞と併せた以下の組み合わせレナリドマイド／デキサメタゾン、メルファラン／プレドニゾン／ボルテゾミブ（ＭＰＢ）、メルファラン／プレドニゾン／レナリドマイド（ＭＰＬ）、メルファラン／プレドニゾン／サリドマイド（ＭＰＴ）は、移植候補者ではない患者における一次導入療法に好ましい。
【０１５５】
難治性疾患または再発を有する患者は、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞および以下のもので処置され得る：
以前に使用されていない薬剤のいずれか、ボルテゾミブ＋シクロホスファミドおよびデキサメタゾン、カーフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）、サリドマイド、レナリドミド＋シクロホスファミドおよびデキサメタゾン、ポマリドマイド。
【０１５６】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗ＣＳ１  ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞と、難治性ＭＭのための処置のような、抗ＣＤ３８  ＣＡＲおよび／または抗ＩＲＦ４  ＣＡＲを発現する別の人工Ｔ細胞との組み合わせを提供する。
【０１５７】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この態様では、免疫抑制処置は、患者における本発明のＴ細胞の選択および増大を支援するべきである。
【０１５８】
本発明の細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０１５９】
細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０９個の細胞、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０５〜１０６個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、単回投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。
【０１６０】
別の実施形態では、前記有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。
【０１６１】
本発明の特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）などの薬剤による処置、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含む多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去剤、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，  １  １；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎ．  ７３：３１６−３２１，  １９９１；  Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｔｒｒ．  Ｏｐｉｎ．ｍｍ  ｎ．  ５：７６３−７７３，  ９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去治療の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後、被験体は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られる前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
【０１６２】
抗化学療法薬に対する耐性
薬剤耐性Ｔ細胞
一態様によれば、本発明の抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、免疫抑制薬または化学療法処置（これらは、ＣＳ１陽性悪性細胞を処置するための標準治療として使用される）に対するそれらの耐性を改善させるようにさらに遺伝的に操作され得る。
【０１６３】
癌治療および同種Ｔ細胞の選択的生着を改善するために、薬剤耐性は、化学療法薬剤の毒性副作用からそれらを保護するために前記同種Ｔ細胞に付与される。薬剤耐性遺伝子を発現するＴ細胞は、薬物感受性細胞と比べて生存および増殖するので、Ｔ細胞の薬剤耐性はまた、それらのインビボまたはエクスビボ濃縮を可能にする。
【０１６４】
化学療法剤に対して耐性のＴ細胞を操作するための方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７５３１７号（これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる）に開示されている。
【０１６５】
特に、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子が不活性化されており、薬物耐性を付与するために１つの遺伝子が改変されている免疫療法に適切な免疫細胞を操作する方法であって、
○抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供すること；
○Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変すること；
○前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変して、薬剤耐性を前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞に付与すること；
○前記薬物の存在下で、前記人工抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を増大させること
を含む方法に関する。
【０１６６】
あるいは、本発明は、
○抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供すること；
○前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変して、薬剤耐性を前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞に付与すること；
○Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変すること；
○前記薬物の存在下で、前記人工抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を増大させること
を含む方法に関する。
【０１６７】
特に、本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子が不活性化されており、薬物耐性を付与するために１つの遺伝子が改変されている免疫療法に適切な免疫細胞を操作する方法であって、
○抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供すること；
○Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変すること；
○前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変して、薬剤耐性を前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞に付与すること；
○前記薬物の存在下で、前記人工抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を増大させること
を含む方法に関する。
【０１６８】
あるいは、本発明は、
○抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供すること；
○前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変して、薬剤耐性を前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞に付与すること；
○Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、前記抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を改変すること；
○前記薬物の存在下で、前記人工抗ＣＳ１  ｍｓＣＡＲ発現Ｔ細胞を増大させること
を含む方法に関する。
【０１６９】
抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現免疫細胞における薬剤耐性遺伝子の発現
特定の実施形態では、前記薬剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子の発現によって、Ｔ細胞に付与され得る。前記薬剤耐性遺伝子は、化学療法剤（例えば、ボルテゾミブ、Ｌｕｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，１：１３を参照のこと）などの薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列を指す。
【０１７０】
換言すれば、細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤耐性遺伝子を有しない対応する細胞の増殖よりも大きい程度に、薬剤の存在下における細胞の増殖を可能にする。細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤の存在下における細胞の増殖を可能にし、その活性に影響を与えない。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の薬剤耐性遺伝子は、薬物（または薬剤）、特に選択される抗癌薬およびそれらの組み合わせに対する耐性を付与し得る。
【０１７２】
好ましい実施形態では、薬剤耐性を付与するｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞はまた、その発現がコンディショニングされる阻害ｍＲＮＡまたは遺伝子であって、前記薬物の存在下における、または前記薬物の投与時に前記薬剤耐性細胞の選択的破壊を可能にするものを含む。
【０１７３】
−抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現免疫細胞における自殺遺伝子
−一実施形態では、薬剤耐性遺伝子または薬剤耐性を付与する改変遺伝子を有する細胞はまた、その誘導が細胞死を誘発する誘導性自殺遺伝子であって、それらの選択的破壊を可能にするものを含む。
【０１７４】
いくつかの場合では、人工Ｔ細胞は増殖し、投与後数年間にわたって持続し得るので、投与されるＴ細胞の選択的な除去を可能にする安全機構を含めることが望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、組換え自殺遺伝子による前記Ｔ細胞の形質転換を含み得る。前記組換え自殺遺伝子は、投与後の被験体における、直接的な毒性のおよび／または前記Ｔ細胞の無制限増殖のリスクを低減するために使用される（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  Ｃ，Ｖｅｒａ  Ｆ，ｂｌｏｏｄ  ２００７；Ｔｅｙ  ＳＫ，Ｄｏｔｔｉ  Ｇ．，Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，ｂｏｉｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００７）。自殺遺伝子は、インビボにおける形質転換細胞の選択的な除去を可能にする。特に、自殺遺伝子は、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換し、または毒性遺伝子の発現産物を発現する能力を有する。換言すれば、「自殺遺伝子」は、それ自体によって、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。
【０１７５】
このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘・帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼおよび細菌遺伝子のシトシンデアミナーゼ（これは、５−フルオロシトシンを高毒性の化合物５−フルオロウラシルに変換し得る）である。自殺遺伝子としてはまた、非限定的な例として、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼが挙げられる。カスパーゼ−９は、特定の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子はまた、細胞の表面において発現されるポリペプチドであり得、細胞を治療用モノクローナル抗体に対して感受性にし得る。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、本発明の方法において有用な任意の化合物であって、毒性産物に変換され得る化合物を意味する。プロドラッグは、本発明の方法において、自殺遺伝子の遺伝子産物によって毒性産物に変換される。このようなプロドラッグの代表例は、ＨＳＶチミジンキナーゼによって毒性化合物にインビボで変換されるガンシクロビルである。続いて、ガンシクロビル誘導体は、腫瘍細胞に対して毒性である。プロドラッグの他の代表例としては、アシクロビル、ＦＩＡＵ［１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル］、ＶＺＶ−ＴＫのための６−メトキシプリンアラビノシド、シトシンデアミナーゼのための５−フルオロシトシンが挙げられる。
【０１７６】
１つの好ましい自殺遺伝子システムは、抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブ、特にＱＢｅｎ１０によって認識される抗原モチーフを含む組換え抗原ポリペプチド、例えば国際公開第２０１３１５３３９１号に記載されているいわゆるＲＱＲ８ポリペプチドを用いる。次いで、必要であれば、許可された抗体医薬のリツキシマブを細胞枯渇に使用し得る。
【０１７７】
一実施形態では、本発明は、抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞であって、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子を含み、または少なくとも１つの薬物感受性遺伝子が不活性化されており、自殺遺伝子、好ましくはＲＱＲ８が前記細胞の破壊を可能にする抗ＣＳ１  ｍｓ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供する。
【０１７８】
ゲノムへの遺伝子のランダム挿入は、挿入された遺伝子または挿入部位付近の遺伝子の不適切な発現につながり得る。内因性配列を含む外因性核酸の相同組換えを使用して遺伝子をゲノム内の特定部位にターゲティングする特定の遺伝子治療は、安全なＴ細胞の操作を可能にし得る。上記のように、前記方法の遺伝子改変工程は、内因性遺伝子と外因性核酸との間で相同組換えが起こるように、少なくとも薬剤耐性遺伝子をコードする配列と、内因性遺伝子の一部とを含む外因性核酸を細胞に導入する工程を含み得る。特定の実施形態では、前記内因性遺伝子は、相同組換え後に、薬剤耐性を付与する突然変異型遺伝子によって野生型遺伝子が置換されるような野生型「薬剤耐性」遺伝子であり得る。
【０１７９】
−方法
初代Ｔ細胞培養
フィコール密度勾配媒質を使用して、例えばＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されるバフィーコートサンプルから、Ｔ細胞を精製する。ＰＢＭＣ層を回収し、市販のＴ細胞濃縮キットを使用して、Ｔ細胞を精製する。２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２、５％ヒトおよびＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、１：１のビーズ：細胞比（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、精製Ｔ細胞を活性化する。
【０１８０】
−ＣＡＲ  ｍＲＮＡのトランスフェクション
Ｔ細胞の精製および活性化後４日目または１１日目に、トランスフェクションを実施する。５百万個の細胞を、ＣＡＲ構築物の異なる部分をコードする１５μｇのｍＲＮＡでトランスフェクトする。Ｔ７  ｍＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＣＡＲ  ｍＲＮＡを生産し、最終容量２００μｌの“Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ”（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）中、０．４ｃｍギャップキュベットにおいて、Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ技術を使用して、３０００Ｖ／ｃｍで０．１ｍＳパルスを２回適用し、続いて、３２５Ｖ／ｃｍで０．２ｍＳパルスを４回適用することによって、トランスフェクションを行う。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地で直ぐに希釈し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。エレクトロポレーションの２時間後に、ＩＬ−２を２０ｎｇ／ｍＬで追加する。
【０１８１】
−脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａの動員）
９６ウェルプレート（細胞４０，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、様々なレベルの本発明のｍｓ  ＣＡＲを発現する等量の細胞と共にインキュベートする。最終容量１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、共培養物を５％ＣＯ２、３７℃で６時間維持する。細胞刺激の間、共培養の開始時に、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８および１×Ｍｏｎｅｎｓｉｎ溶液と共に、蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体を追加することによって、ＣＤ１０７ａ染色を行った。６時間のインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素および蛍光色素結合抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＤ８＋細胞間のＣＤ１０７ａ染色の平均蛍光強度シグナル（ＭＦＩ）を決定することによって、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、脱顆粒活性を決定した。ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、脱顆粒アッセイを行った。
【０１８２】
−ＩＦＮガンマ放出アッセイ
９６ウェルプレート（細胞４０，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、様々なレベルのＣＳ１タンパク質を発現する細胞株と共にインキュベートする。最終容量１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、共培養物を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間維持した。このインキュベーション期間後に、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新たなプレートに回収した。細胞培養上清中のＩＦＮガンマの検出をＥＬＩＳＡアッセイによって行った。ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、細胞共培養を開始することによって、ＩＦＮガンマ放出アッセイを行う。
【０１８３】
−細胞傷害性アッセイ
９６ウェルプレート（細胞１００，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、１０，０００個の（ＣＳ１発現）標的細胞および１０，０００個の対照（ＣＳ１  ｎｅｇ）細胞と共に同じウェルにおいてインキュベートする。ｍｓＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に共培養する前に、標的細胞および対照細胞を蛍光細胞内色素（ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ）で標識する。共培養物を５％ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートする。このインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素で標識し、フローサイトメトリーによって分析する。各細胞集団（標的細胞またはＣＳ１ｎｅｇ対照細胞）の生存を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。ｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に、細胞傷害性アッセイを行った。
【０１８４】
−Ｔ細胞の形質導入
ＣＡＲの組換えレンチウイルスベクター発現によるＴ細胞の形質導入を、Ｔ細胞の精製／活性化の３日後に行う。ヒトＣＳ１タンパク質の細胞外ドメインと、マウスＩｇＧ１  Ｆｃ断片との融合物からなる組換えタンパク質を使用して、Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲ検出を行う。ＣＡＲ分子に対するこのタンパク質の結合を、前記タンパク質のマウスＦｃ部分をターゲティングする蛍光標識二次抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１８５】
−抗腫瘍マウスモデル
ＭＭ異種移植マウスモデルとして、ＣＳ１−ルシフェラーゼを発現する細胞を免疫欠損ＮＯＧマウスに静脈内（ｉｖ）注射する。場合により、抗癌処置、例えばボルテゾミブをマウスに投与する。次いで、（腫瘍細胞株の注射の２日後または７日後のいずれかに）異なる用量の試験すべきＣＡＲ＋Ｔ細胞を、またはＣＡＲレンチウイルスベクターで形質導入しなかったＴ細胞をマウスに静脈内（ｉｖ）注射する。異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、Ｔ細胞の注射日（Ｄ０）に、Ｔ細胞の注射後７日目、１４日目、２１日目、２８日目および４０日目に、生物発光シグナルを決定する。
【０１８６】
薬剤耐性同種ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するためのＣＳ１＋／ｌｕｃ＋薬剤耐性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞
本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞に特異的な表面受容体（ＣＳ１）および耐性遺伝子の両方を発現する標的細胞株を製造するための方法を包含する。これらの標的細胞は、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するために特に有用である。これらの細胞は、ＭＭに対して使用される臨床関連用量の薬物に対して容易に耐性であり、ルシフェラーゼ活性を有する。この特徴の組み合わせは、マウスモデルにおいてそれらをインビボで追跡（ｔｒａｋｉｎｇ）することを可能にし、または必要であればそれらを破壊する。
【０１８７】
より具体的には、それらは、化学療法またはそれらの組み合わせの存在下で、マウスの薬剤耐性Ｔ細胞の細胞傷害性特性を評価するために使用され得る。ボルテゾミブ耐性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞は、薬剤耐性Ｂ細胞悪性腫瘍を有し得るＭＭ患者の生理学的状態を模倣する。したがって、薬剤耐性ＣＡＲ  Ｔ細胞の信頼性および細胞傷害性を評価するために、これらの細胞は非常に興味深い。好ましくは、これらの標的細胞は、ＣＳ１＋ルシフェラーゼ＋Ｈ９２９細胞である。ＣＳ１＋／ｌｕｃ＋薬剤耐性の他のモデルは、様々なレベルのＣＳ１を発現する細胞（ＩＭ９、ＭＭ．１ＳおよびＲＰＭＩ−８２２６）を使用して提供される。薬物耐性を調節し、それらの自殺を可能にするように、細胞を操作し得る。
【０１８８】
ＣＳ１特異的多重鎖ＣＡＲの実施例
Ａ．多重鎖ＣＡＲの設計
ＣＳ１抗原をターゲティングする多重鎖ＣＡＲを、ＩｇＥに対する高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）に基づいて設計した。肥満細胞および好塩基球上において発現されるＦｃεＲＩは、アレルギー反応をトリガーする。それは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニットおよび２つのジスルフィド結合γサブユニットから構成される四量体複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するＩＴＡＭを含有する。あらゆる多重鎖ＣＡＲにおいて、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインを削除し、それぞれ表５においてμと称される各ｓｃＦｖで置換し、ＦｃＲβ鎖および／またはＦｃＲγ鎖のＣＤ８αヒンジ（配列番号：２）およびＩＴＡＭを削除した。得られた構造は、表６に詳述されている構造を有していた。
【０１８９】
Ｂ．Ｔ細胞における一過性発現
ポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、ヒトＴ細胞において、多重鎖ＣＡＲを発現させ得る。
【０１９０】
ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥキットおよび線状化プラスミド（テンプレートとして）を使用して生産したキャップ化およびポリアデニル化ポリシストロン性ｍＲＮＡをＴ細胞にエレクトロポレーションした。テンプレートとして使用したプラスミドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、続いて、異なるＣＡＲ変異体をコードするポリシストロン性ＤＮＡ配列を含有していた。
【０１９１】
以下のプロトコールにしたがって、ＣｙｔｏＬＶＴ−Ｓデバイス（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）を使用して、ヒトＴ細胞へのポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った：抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで数日間（３〜５）予備活性化した５×１０６個のＴ細胞およびＩＬ２をＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ緩衝液Ｔに再懸濁し、０．４ｃｍキュベットにおいて、ＰＢＭＣ３  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔａｂｌｅ１４を使用して、４５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。
【０１９２】
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ−７８０およびＰＥ結合特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１９３】
ポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作した生Ｔ細胞は、それらの表面において多重鎖ＣＡＲを発現した。
【０１９４】
Ｃ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞との共培養後に脱顆粒する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に６時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞を分析して、それらの表面における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を検出した。データは、ＣＳ１多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照細胞との共培養ではなくＣＳ１発現標的細胞との共培養後に、脱顆粒することを示している。
【０１９５】
Ｄ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞との共培養後にサイトカインを分泌する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に２４時間共培養した。次いで、上清を回収し、ＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキットを使用して分析して、Ｔ細胞によって産生されたサイトカインを定量した。アッセイにより、多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、対照細胞との共培養ではなくＣＳ１発現標的細胞との共培養後に、ＩＦＮγ、ＩＬ８およびＩＬ５を産生することが示された。
【０１９６】
Ｅ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞を溶解する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に４時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによって標的細胞を分析して、それらの生存を分析したところ、ＣＳ１多重鎖ＣＡＲを発現する異なる細胞が、対照細胞ではなくＣＳ１発現標的細胞を溶解することが示された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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