(57)【要約】  本発明はタンパク質ペグ化の分野にある。特に、本発明は治療タンパク質をペグ化するための方法に関する。本発明は、筋疾患および障害を治療するためのそのようなペグ化治療ポリペプチドの使用にも関する。
2017502005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、
前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、
還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、前記反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施してペグ化治療タンパク質の組成物を提供することを特徴とする、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
モノペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、前記カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いてクロマトグラフィーステップを実施して、モノペグ化治療タンパク質の組成物を提供するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
前記治療タンパク質がヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質またはその変異体である、請求項１または２に記載の組成物を調製するための方法。
【請求項４】
前記ペグ化反応がα−シクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下で実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＥＧが２０〜１００ｋＤａの全体分子量を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧが約３０ｋＤａの全体分子量を有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記交換クロマトグラフィーステップが陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）であり、Ｎ末端モノペグ化治療タンパク質を含有する画分を貯留して、モノペグ化治療タンパク質の組成物を提供することを含む、請求項２〜６に記載の方法。
【請求項８】
ｂ）限外濾過（ＵＦ）／ダイアフィルトレーション（ＤＦ）濃縮およびバッファー交換、
ｃ）最終濾過
の追加のステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＩＧＦ１前駆体タンパク質がヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している、請求項３〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５からなるヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項１、３〜６、９および１０に記載の方法に従って調製される組成物。
【請求項１２】
組成物において、前記組成物に含まれる治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項２〜１０に記載の方法に従って調製されるモノペグ化治療タンパク質の組成物。
【請求項１３】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項１、３〜６、９および１０に記載の方法により入手可能なペグ化治療タンパク質の組成物。
【請求項１４】
組成物において、前記組成物に含まれるペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項２〜１０に記載の方法により入手可能なモノペグ化治療タンパク質の組成物。
【請求項１５】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項１、３〜６、９および１０に記載の方法により得られるペグ化治療タンパク質の組成物。
【請求項１６】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、請求項２〜１０に記載の方法により得られるモノペグ化治療タンパク質の組成物。
【請求項１７】
組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、請求項９および１０に記載の方法に従って調製される組成物。
【請求項１８】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、請求項９および１０に記載の方法により入手可能な組成物。
【請求項１９】
組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、請求項９および１０に記載の方法により入手可能な組成物。
【請求項２０】
組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、請求項９および１０に記載の方法により得られる組成物。
【請求項２１】
組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、請求項９および１０に記載の方法により得られる組成物。
【請求項２２】
ＩＧＦ１前駆体タンパク質がヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、前記タンパク質において、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している、請求項１７〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５のアミノ酸配列を含むヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
医薬として使用するための薬学的に許容される形態の、請求項１１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
治療において使用するための、請求項１〜１０に記載の方法により得られるペグ化治療タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２６】
それを必要とする患者における筋障害の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
徐脂肪体重の減少および／または筋消耗に罹っている火傷患者の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
慢性腎疾患患者の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記筋障害が筋委縮症である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記筋委縮症が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
それを必要とする患者において筋障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
徐脂肪体重の減少および／もしくは筋消耗に罹っている火傷患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
慢性腎疾患患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
前記筋障害が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される筋委縮症である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質ペグ化の分野にある。特に、本発明は、ペグ化ＩＧＦ−１ポリペプチドおよびその変異体のようなペグ化治療タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いたタンパク質の共有結合的修飾は、身体内でのタンパク質の循環半減期を伸ばす有益な方法であることが判明している（Hershfield, M.S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers, F.J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313; Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug）。この方法はペグ化として知られており、ペグ化は医薬的に活性なタンパク質の治療価値を改善するもっとも確立し成功裏に使用されている技法である（Roberts et al, Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476; Caliceti P. et al, 2003）。
【０００３】
ＰＥＧ鎖がタンパク質に結合するとその分子量と流体力学半径が増し、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が著しく伸びる。タンパク質の周りを包むＰＥＧ鎖はタンパク質に遮蔽効果を及ぼし、したがってタンパク質分解およびコンジュゲートの免疫原性が低下する。ペグ化は体内分布特性も変化させ、疎水性タンパク質の可溶性を著しく増加する（Caliceti,P. and Veronese,F.M. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv.Drug Deliv.Rev., 55, 1261., Roberts et al, Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476;）。
【０００４】
メトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＰＥＧ−ＮＨＳ）を使用することによって達成されるカップリング化学により、異なるリシン残基をコンジュゲートすることができ、位置アイソフォームとマルチペグ化型の複合混合物が生じる。既に治療において数年間使用されているいくつかのコンジュゲート（ＰＥＧ−ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ＭＩＲＣＥＲＡ（登録商標）、Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標））はランダムペグ化化学の成果である。
【０００５】
ランダムペグ化の主要な欠点は、最終産物の均一性に欠ける点である。したがって反応の再現が難しく最終産物の分析的特徴付けが難問となると予想される。
【０００６】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は細胞がその生理的環境と情報交換するのに使用する複雑な系の一部である。この複雑な系（インスリン様増殖因子軸と呼ばれることが多い）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質のファミリー（ＩＧＦＢＰ１〜６）、および関連ＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は正常な生理機能の調節のためだけではなく、いくつかの病理学的状態のためにも重要である（Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003）。
【０００７】
ＩＧＦ軸は細胞増殖の促進および細胞死（アポトーシス）の阻害に役割を担っていることが明らかにされている。ＩＧＦ−１はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として主に肝臓により分泌される。ヒト身体のほぼすべての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚および肺の細胞がＩＧＦ−１に影響される。インスリン様の効果に加えて、ＩＧＦ−１は細胞増殖も調節することが可能である。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はＩＧＦ結合タンパク質として知られる遺伝子産物のファミリーにより調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を妨げることによりＩＧＦ作用を阻害することと、受容体への送達を助け血流中でのＩＧＦ半減期を増やすことを通じてＩＧＦ作用を促進することの両方を伴う複雑な方法でＩＧＦ作用を調節する一助となる。少なくとも６つの特徴付けられた結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）が存在する。
【０００８】
その成熟型では、ヒトＩＧＦ−１は、ソマトメジンとも呼ばれるが、培養中の広範囲の細胞の増殖を刺激することが明らかにされている７０アミノ酸からなる小タンパク質である。ＩＧＦ−１タンパク質は３つの既知のスプライスバリアントｍＲＮＡにより最初にコードされている。それぞれのｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは、７０アミノ酸ＩＧＦ−１（配列番号１）を含有する前駆体タンパク質および特定のＩＧＦ−１  ｍＲＮＡに応じてＣ末端に特定のＥペプチドをコードしている。これらのＥペプチドはＥａ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ；配列番号２）、Ｅｂ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｙｑｐｐｓｔｎｋｎｔｋｓｑｒｒｋｇｗｐｋｔｈｐｇｇｅｑｋｅｇｔｅａｓｌｑｉｒｇｋｋｋｅｑｒｒｅｉｇｓｒｎａｅｃｒｇｋｋｇｋ；配列番号３）およびＥｃ（ｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｙｑｐｐｓｔｎｋｎｔｋｓｑｒｒｋｇｓｔｆｅｅｒｋ；配列番号４）ペプチドと名付けられており、３５から８７アミノ酸長の幅がありＮ末端に共通配列領域をＣ末端に可変配列領域を包含している。例えば、ＩＧＦ−１−Ｅａの野生型オープンリーディングフレームは、リーダー配列を含む１３５アミノ酸のポリペプチドおよびリーダー配列のない１０５アミノ酸のポリペプチドをコードしている（ｇｐｅｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｒｓｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ；配列番号５）。生理的発現では、Ｅペプチドは内在性プロテアーゼにより前駆体から切断されて、成熟７０アミノ酸ＩＧＦ−１が生じる。ヒト血清中のＩＧＦ−１の利用能および半減期は、主にプロテアーゼおよびＩＧＦ−１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）により影響を受け調節される。ＩＧＦＢＰはＩＧＦ−１活性を阻害することも増強することもできる（Oh Y, et al., Characterization of the affinities of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I, IGF-II, IGF-I/insulin hybrid, and IGF-I analogs. Endocrinology. 1993 Mar;132(3):1337-44）。ＩＧＦ−１の半減期を増加するための戦略が先行技術において記載されてきた。企図されてきた戦略は、
（ｉ）ヒト血清におけるセリンプロテアーゼによるＩＧＦ−１の切断を妨げることを、またはＩＧＦ−１の利用能もしくは血清半減期に対するＩＧＦ−１結合タンパク質のマイナス影響を軽減することを目標とする特定の突然変異を含むＩＧＦ−１変異体の調製（ＷＯ２０００４０６１３、ＷＯ０５０３３１３４、ＷＯ２００６０７４３９０、ＷＯ２００７１４６６８９）；
（ｉｉ）成熟ＩＧＦ−１タンパク質がヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合されているＩＧＦ−１融合タンパク質の調製（ＷＯ２００５０３３１３４、ＷＯ２０００４０６１３）；
（ｉｉｉ）プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥペプチドの切断が前駆体タンパク質の改変により減少されるＩＧＦ−１前駆体タンパク質の使用（ＷＯ２００７１４６６８９）；
（ｉｖ）上記戦略の組合せ（（ｉ）／（ｉｉ）ＷＯ０５０３３１３４、（ｉ）／（ｉｉ）ＷＯ２０００４０６１３、（ｉ）／（ｉｉｉ）ＷＯ２００７１４６６８９）、および
（ｖ）ペグ化ＩＧＦ−１変異体の調製（ＷＯ２００９１２１７５９、ＷＯ２００８０２５５２８およびＷＯ２００６０６６８９１）である。
【０００９】
ＩＧＦ−１は薬物動態特性が不十分（短い排出半減期）なので、ＩＧＦ変異体のペグ化バージョンを調製した。神経筋障害の治療のためのＩＧＦ変異体のペグ化バージョンの調製はＷＯ２００８０２５５２８、ＷＯ２００９１２１７５９  Ａ２およびＷＯ２００６０６６８９１に記載された。通常、ＰＥＧはタンパク質のアミノ基に結合される。しかし、このアミノペグ化アプローチの主要な限界は、タンパク質が典型的にはかなりの量のリシン残基を含有しており、したがって、ポリ（エチレングリコール）基は非特異的にタンパク質に結合していることである。生物活性に必要なアミノ残基（例えば、タンパク質の活性部位近くのまたは活性部位の残基）のペグ化により、タンパク質の特異的活性が低下したりタンパク質が不活化することがある。
【００１０】
上記の欠点の一部を回避するために、ＷＯ２００６０６６８９１は、ＩＧＦ−１変異体および１つまたは２つのポリ（エチレングリコール）基（複数可）からなり、前記ＩＧＦ−１変異体が野生型ＩＧＦ−１アミノ酸配列の２７位、３７位、６５位、６８位のうち最大３アミノ酸で突然変異していることを特徴とするコンジュゲートの使用を記載している。しかし、ランダムなペグ化を最小限に抑えるためにタンパク質に導入されているそれぞれの突然変異は、同時に免疫原性のリスクを増加させる。したがって、治療タンパク質を開発する場合には突然変異はできる限り少ないことが好ましい。
【００１１】
ＷＯ２００８０２５５２８は、２７位、６５位および／または６８位のリシンでのアミノ酸置換を含む、組換えヒトＩＧＦ−１融合タンパク質の調製を開示している。ＷＯ２００８０２５５２８に記載されている方法に従えば、Ｎ末端ペグ化を担持しない組換えヒトＩＧＦ−１変異タンパク質の調製が可能になる。ＷＯ２００６０６６８９１およびＷＯ２００８０２５５２８で使用されたペグ化試薬はメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＰＥＧ−ＮＨＳ）であり、これによりランダムにペグ化されたタンパク質が生じる。Ｎ末端ペグ化と位置異性体の創造を回避するために、１つを除くすべてのリシン残基が極性アミノ酸で置き換えられ、プロペプチドがＮ末端に結合された。第１ステップで、ＩＧＦ−１変異タンパク質をペグ化しその後プロペプチドはＩｇＡプロテアーゼでＩＧＦ−１から切断され、単一のリシン残基のみでペグ化されたＩＧＦ−１変異タンパク質が残った。
【００１２】
メトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ＰＥＧ−ＣＨＯ）試薬を使用する還元的アルキル化は一般には部位特異的ペグ化法として認識されている（Roberts et al, Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476;）。Ｎ末端ペグ化はＡｍｇｅｎｅ関連特許ファミリ（ＵＳ  ７０９０８３５  Ｂ２、ＵＳ  ６９５６０２７  Ｂ２、ＥＰ  ０８２２１９９  Ｂ１）に記載されていた。還元的アルキル化の反応は、酸性条件下、ｐＨ５．０で実施された（ＥＰ  ０８２２１９９  Ｂ１）。一般に、ＰＥＧ−ＣＨＯ試薬の鍵となる特性は、酸性条件下（ほぼｐＨ５）でアルデヒド基が、他の求核試薬と比べてαアミンのｐＫａがさらに低いためにＮ末端αアミンに対して大きく選択的であることだと考えられている（Kinstler et al., 2002, Molineux, 2004）。
【００１３】
Ｎ末端ペグ化の選択性は通常、高度に露出し反応性の高いリシンのあるタンパク質では著しく減少し、操作工程にさらに高度な複雑さをもたらすために、開発時間はさらに長くコストもさらに高くなる。
【００１４】
ＷＯ２００７１４６６８９に記載されるＩＧＦ−１成熟タンパク質（ソマトメジン）およびＥペプチドからなるＩＧＦ−１前駆変異体中の種々の突然変異により、ＩＧＦ−１変異体を調整して作って改善された治療効果を達成させることができた。突然変異により、身体によりもっとゆっくりと代謝され、したがって成熟ＩＧＦ−１ペプチドよりも長い半減期を有する安定化した分子が生じた。ＷＯ２００７１４６６８９に記載されるＩＧＦ−１変異体の身体からのクリアランスがもっと遅いために、野生型ＩＧＦ−１に比べて効力が改善された。しかし、ＷＯ２００７１４６６８９に開示されたＩＧＦ−１前駆変異体は多数の表面露出リシン残基を有しており、前記ＩＧＦ−１前駆変異体のペグ化によりモノペグ化位置アイソフォームと分子量が異なるペグ化タンパク質の混合物が形成される。クロマトグラフィー精製法を用いれば均一な産物が得られたが、ペグ化混合物の分離は、その形態の物理化学的特徴が極めて類似しているために、技術的には困難である。このために、最終工程収率は低くなる。したがって、ＩＧＦ−１前駆体タンパク質のもっと選択性のあるペグ化を可能にする改善された方法を開発する必要性が存在していた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示の第１の主題は、ペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、ペグ化反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施してペグ化治療タンパク質の組成物を提供することを特徴とする、ステップを含む、方法に関する。
【００１６】
本開示の追加の実施形態は、モノペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップと、
（ｃ）交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）の溶出画分を得るステップと、
（ｄ）モノペグ化治療タンパク質を含有する画分を貯留するステップと
を含む、方法に関する。
【００１７】
本開示の追加の主題は、ペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ヒトＩＧＦ１前駆体タンパク質の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体中でＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップを含む、方法に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、本開示はモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物が少なくとも６５パーセントのＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含み、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中でＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーステップを実施するステップと、
（ｃ）交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）の溶出画分を得るステップと、
（ｄ）モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質アイソフォームを含有する画分を貯留するステップと
を含む、方法に関する。
【００１９】
ある種の実施形態では、本開示は、ペグ化（カップリング反応）がαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下で実施されることを特徴とする上記方法に関する。
【００２０】
本開示の特定の実施形態では、上記ペグ化反応は約６．５のｐＨで実施される。本開示の特定の実施形態では、上記方法で使用されるＰＥＧは２０〜１００ｋＤａ（キロダルトン）の全体分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。したがって、本開示の一実施形態では、上記方法において使用される直鎖状ＰＥＧは約３０ｋＤａの全体分子量を有する。代わりに、上記方法で使用されるＰＥＧは分岐状であり得る。本開示の特定の実施形態では、上記方法で適用される交換クロマトグラフィーステップは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）ステップである。同様に、本開示は、
ｂ）限外濾過（ＵＦ）／ダイアフィルトレーション（ＤＦ）濃縮およびバッファー交換、
ｃ）最終濾過および充填
の追加のステップをさらに含む、上記方法に関する。
【００２１】
本開示の特定の実施形態では、上記方法に従ってペグ化されているＩＧＦ１前駆体タンパク質はヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している。
【００２２】
本開示の一実施形態では、上記方法に従ってペグ化されているＩＧＦ１前駆体タンパク質は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である。
【００２３】
したがって、本開示の追加の実施形態では、上記方法に従ってペグ化されているＩＧＦ１前駆体タンパク質は、配列番号５５のアミノ酸配列からなるヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本開示は上に開示される方法に従って調製されるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００２５】
さらに、本開示は上記方法に従って調製されるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれる治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００２６】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により得られるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００２７】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により入手可能であるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００２８】
特定の実施形態において、本開示は、上記方法により入手可能であるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００２９】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により得られるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本開示は、上に開示される方法に従って調製されるモノペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、組成物に関する。
【００３１】
さらに、本開示は、上記方法に従って調製されるペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、組成物に関する。
【００３２】
さらに、一実施形態において、本開示は、上記方法により入手可能なモノペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、組成物に関する。
【００３３】
特定の実施形態において、本開示は上記方法により入手可能なペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、組成物に関する。
【００３４】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により得られるモノペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、組成物に関する。
【００３５】
別の実施形態では、本開示は、上記方法により得られるペグ化ＩＧＦ−１組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、組成物に関する。
【００３６】
本開示の特定の実施形態では、上に開示される組成物に含まれるＩＧＦ１前駆体タンパク質はヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している。
【００３７】
さらに、本開示は、上記組成物であって、ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５のアミノ酸配列を含むヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、組成物に関する。
【００３８】
したがって、本開示は、上記組成物であって、ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５のアミノ酸配列からなるヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、組成物に関する。
【００３９】
さらに別の実施形態では、本開示は、医薬として使用するための薬学的に許容される形態の上記組成物に関する。
【００４０】
本開示は、治療において使用するための上記医薬組成物をさらに提供する。
【００４１】
本開示の別の実施形態では、上述の治療的使用は、それを必要とする患者における筋障害の治療である。本開示の特定の実施形態では、治療的使用は徐脂肪体重の減少および／もしくは筋消耗に罹っている火傷患者の治療、またはＣＯＰＤ患者の治療、または球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者の治療、または慢性腎疾患患者の治療である。したがって、本開示は、徐脂肪体重の減少および／または筋消耗と組み合わせた火傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡ、ケネディ病）ならびに慢性腎疾患からなる群から選択される疾患または状態の治療において使用するための上記の医薬組成物を提供する。
【００４２】
本開示の追加の実施形態では、上記の筋障害は筋委縮症である。本開示のいくつかの態様では、治療的使用は肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症の治療である。したがって、本開示は、筋委縮症、肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される疾患または状態の治療において使用するための上記の医薬組成物を提供する。
【００４３】
本開示は、それを必要とする患者において筋障害を治療する方法であって、治療有効量の上記組成物を投与することを含む、方法をさらに提供する。
【００４４】
したがって、一特定の実施形態では、本開示は、徐脂肪体重の減少および／もしくは筋消耗に罹っている火傷患者を治療する方法、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者を治療する方法、またはケネディ病患者を治療する方法、または慢性腎疾患患者を治療する方法であって、治療有効量の上記組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００４５】
さらに、本開示は、それを必要とする患者において筋障害を治療する方法であって、筋障害が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される筋委縮症であり、治療有効量の上記組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００４６】
本開示のある種の実施形態は以下の態様において記載される。
１．ペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、前記反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施してペグ化治療タンパク質の組成物を提供することを特徴とする、ステップを含む、方法。
２．モノペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いてクロマトグラフィーステップを実施して、モノペグ化治療タンパク質の組成物を提供するステップと
を含む、方法。
３．クロマトグラフィーステップが、Ｎ末端モノペグ化治療タンパク質を含有する画分を貯留して、モノペグ化治療タンパク質の組成物を提供することを含む陽イオン交換クロマトグラフィーステップである、実施形態２に従った方法。
４．実施形態１〜３のいずれかに従って組成物を調製するための方法であって、治療タンパク質がヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質またはその変異体である、方法。
５．ペグ化反応がα−シクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下で実施されることを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに従った方法。
６．ＰＥＧが２０〜１００ｋＤａの全体分子量を有することを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに従った方法。
７．ＰＥＧが約３０ｋＤａの全体分子量を有することを特徴とする、実施形態６に従った方法。
８．交換クロマトグラフィーステップが陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である、実施形態２および４〜７に従った方法。
９．ｂ）限外濾過（ＵＦ）／ダイアフィルトレーション（ＤＦ）濃縮およびバッファー交換、
ｃ）最終濾過
の追加のステップをさらに含む、実施形態２および４〜８に従った方法
１０．ＩＧＦ１前駆体タンパク質がヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している、実施形態３〜９のいずれかに従った方法。
１１．ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５からなるヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、実施形態１０に従った方法。
１２．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態１、５、６および７の方法に従って調製される組成物。
１３．組成物において、前記組成物に含まれる治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態２および５〜９の方法に従って調製されるモノペグ化治療タンパク質の組成物。
１４．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態１、５、６および７の方法により入手可能なペグ化治療タンパク質の組成物。
１５．組成物において、前記組成物に含まれるペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態２および５〜９の方法により入手可能なモノペグ化治療タンパク質の組成物。
１６．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態１、５、６および７の方法により得られるペグ化治療タンパク質の組成物。
１７．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、実施形態２および５〜９の方法により得られるモノペグ化治療タンパク質の組成物。
１８．組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、実施形態１０および１１の方法に従って調製される組成物。
１９．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、実施形態１０および１１の方法により入手可能な組成物。
２０．組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、実施形態１０および１１の方法により入手可能な組成物。
２１．組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質である、実施形態１０および１１の方法により得られる組成物。
２２．組成物において、前記組成物に含まれるペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも７０パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質とリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質との混合物である、実施形態１０および１１の方法により得られる組成物。
２３．ＩＧＦ１前駆体タンパク質がヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質であり、アミノ酸Ｅ３は欠失しており、アミノ酸Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、アミノ酸の番号付けは配列番号５に対応している、実施形態１８〜２２のいずれかに従った組成物。
２４．ＩＧＦ１前駆体タンパク質が配列番号５５のアミノ酸配列を含むヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質である、実施形態２３に従った組成物。
２５．医薬として使用するための薬学的に許容される形態の、実施形態１２〜２４のいずれかに従った組成物。
２６．治療において使用するための、実施形態１〜１１の方法により得られるペグ化治療タンパク質を含む医薬組成物。
２７．それを必要とする患者における筋障害の治療において使用するための、実施形態２５または２６の医薬組成物。
２８．徐脂肪体重の減少および／または筋消耗に罹っている火傷患者の治療において使用するための、実施形態２５または２６の医薬組成物。
２９．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の治療において使用するための、実施形態２５または２６の医薬組成物。
３０．球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者の治療において使用するための、実施形態２５または２６の医薬組成物。
３１．慢性腎疾患患者の治療において使用するための、実施形態２５または２６の医薬組成物。
３２．筋障害が筋委縮症である、実施形態２７の医薬組成物。
３３．筋委縮症が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される、実施形態３２の医薬組成物。
３４．それを必要とする患者において筋障害を治療する方法であって、治療有効量の実施形態２５または２６の組成物を対象に投与することを含む、方法。
３５．徐脂肪体重の減少および／または筋消耗に罹っている火傷患者を治療する方法であって、治療有効量の実施形態２５または２６の組成物を対象に投与することを含む、方法。
３６．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者を治療する方法であって、治療有効量の実施形態２５または２６の組成物を対象に投与することを含む、方法。
３７．球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者を治療する方法であって、治療有効量の実施形態２５または２６の組成物を対象に投与することを含む、方法。
３８．慢性腎疾患患者を治療する方法であって、治療有効量の実施形態２５または２６の組成物を対象に投与することを含む、方法。
３９．筋障害が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される筋委縮症である、実施形態３２に従った方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａの調製のための方法を説明する方法フロー図である。この方法は、ペグ化反応、陽イオン交換精製ステップ（ＣＥＸ）、バッファー交換および濃縮ステップ（ＵＦ／ＤＦ）ならびに最終濾過および充填ステップで構成されている。
【図２】モノＰＥＧ−ＩＧＦ１アイソフォームの部分的分離のための調製用ＣＥＸクロマトグラムである。１：Ｎ末端ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ型；２、３および４：Ｌｙｓペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ型。番号付の矢印はクロマトグラム上の貯留された画分の位置を示す。１、２、３および４と名付けられた貯留物は、クロマトグラム上で矢印が付いた時刻に溶出した画分の貯留物を用いて調製した。
【図３】モノＰＥＧ−ＩＧＦ１アイソフォームの調製用ＣＥＸ単離から貯留された物質のＣＥ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。Ｎ：Ｎ末端ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ型；リシン１、リシン２、リシン２ａおよびリシン３：Ｌｙｓ−ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ型。
【図４】Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ６５０Ｓでの分離の調製用ＣＥＸクロマトグラムである。
【図５】ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰでの分離のＣＥＸクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
一般的な定義
本発明をさらに容易に理解できるように、ある種の用語を先ず定義する。追加の定義は詳細な説明全体を通じて記載される。
【００４９】
約（about）：用語「約（about）」は本明細書では、ほぼ（approximately）、大まかに（roughly）、およそ（around）またはほぼ（in the region of）を意味するのに使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、その用語は記載されている数値を超えるおよび下回る境界域を広げることによりその範囲を変更する。一般に、用語「約」は本明細書では、５パーセント上または下（高または低）の変動で、述べられた値を超えるおよび下回る数値に変更するのに使用される。例えば、用語約６．５のｐＨならば、６．３〜６．８のｐＨ範囲を含むことになる。本明細書で使用されるように、および他の方法で明記されていなければ、語「または（or）」は特定のリストのうちのいずれか１つの数を意味する。語句約６．５〜７．５のｐＨ範囲内ならば、６．３〜７．９のｐＨ範囲を含むことになる。
【００５０】
含む（comprising）：用語「含む（comprising）」は「含む（including）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（comprising）」組成物は、もっぱらＸからなる場合もあれば、何か追加のもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含む場合もある。
【００５１】
ＩＧＦ−１タンパク質変異体とは、ＩＧＦ−１野生型配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なるタンパク質であり、用語「野生型配列」とは少なくとも１つの天然に存在する生物において入手可能であるポリペプチドもしくは遺伝子配列またはヒトにより変更されたり、突然変異されたり、他の方法で操作されていないポリペプチドもしくは遺伝子配列のことである（配列番号１のタンパク質配列により明記されている場合はヒトＩＧＦ−１野生型配列）。ＩＧＦ−１変異体はＩＧＦ−１前駆体タンパク質またはペプチドリーダー配列を含むプロＩＧＦ−１タンパク質でもある。上記のＩＧＦ−１変異体は、そのようなタンパク質は野生型ＩＧＦ−１の機能的等価物であると見なすことができるという意味でその生物活性を保持している。ＩＧＦ−１野生型タンパク質の機能的等価物はＩＧＦ−１受容体タンパク質に対して特異的な親和性を有する。
【００５２】
ＩＧＦ−１タンパク質に関して機能的等価物は天然のまたは人工的な突然変異を含むＩＧＦ−１タンパク質と理解しなければならない。突然変異は、ＩＧＦ−１タンパク質の生物活性を減少させない１つまたは複数の核酸の挿入、欠失または置換であり得る。機能的等価物は、ＩＧＦ−１野生型タンパク質、例えば、ヒトＩＧＦ−１タンパク質配列番号１に少なくとも８０％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％を超える同一性、特に好ましくは少なくとも９８％同一性、しかし１００％未満の同一性を有する。融合タンパク質の場合、１００％同一性は、そのような融合タンパク質のＩＧＦ−１部分のみに基づいて定義することにする。
【００５３】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、細胞がその生理的環境と情報交換するのに使用する複雑な系の一部である。この複雑な系（インスリン様増殖因子軸と呼ばれることが多い）は２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒ）、２つのリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質のファミリー（ＩＧＦＢＰ１〜６）、および関連ＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）からなる。この系は正常な生理機能の調節のためだけではなく、いくつかの病理学的状態のためにも重要である（Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003）。ＩＧＦ軸は細胞増殖の促進および細胞死（アポトーシス）の阻害に役割を担っていることが明らかにされている。ＩＧＦ−１は主にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として肝臓により分泌される。ヒト身体のほぼすべての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚および肺の細胞がＩＧＦ−１に影響される。インスリン様の効果に加えて、ＩＧＦ−１は細胞増殖も調節することがある。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はＩＧＦ結合タンパク質として知られる遺伝子産物のファミリーにより調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合を妨げることによりＩＧＦ作用を阻害することと、受容体への送達を助け血流中でのＩＧＦ半減期を増やすことを通じてＩＧＦ作用を促進することの両方を伴う複雑な方法でＩＧＦ作用を調節する一助となる。少なくとも６つの特徴付けられた結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）が存在する。ＩＧＦ−１は広範囲の治療用途において使用されている。メカセルミン（商標名Ｉｎｃｒｅｌｅｘ（商標））は成長阻害の治療に認可されているＩＧＦ−１の合成類似体である。いくつかの会社が、１型糖尿病、２型糖尿病、筋委縮性側索硬化症、重症熱傷および筋緊張性筋ジストロフィーを含む種々の追加の適応症について臨床試験においてＩＧＦ−１を評価した。
【００５４】
明確さと一貫性のために、本出願全体でおよび特許請求の範囲においてＩＧＦ−１前駆体または成熟タンパク質のアミノ酸残基の番号付けは、ヒトインスリン様増殖因子１（ソマトメジンＣ）、シグナルペプチドのないアイソフォームＣＲＡ＿ｃ（受託番号ＥＡＷ９７６９７）の野生型前駆体タンパク質配列番号付け（すなわち、配列番号５）に基づいている。
【００５５】
ＰＥＧは、本開示の文脈で使用される場合は、ポリエチレングリコールのことである。
【００５６】
ＰＥＧ−ＣＨＯとは、メトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド試薬（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本から購入されるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−３００ＡＬまたはＤｒ  Ｒｅｄｄｙ’ｓ（ＥＵ）Ｌｉｍｉｔｅｄから購入される３０ｋＤａ  ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド）である。
【００５７】
用語「高次ＰＥＧ型」、「高次ペグ化型」、「高次ペグ化変異体」、または「ジ−、トリ−、もしくはさらに高次のペグ化型」は２つ以上のＰＥＧ分子が結合しているタンパク質（例えば、２つ、３つまたはそれよりも多いＰＥＧ分子）ジ−、トリ−、またはさらに高次のペグ化タンパク質を記述するのに使用される。用語「モノペグ化」は、ペグ化プロセス（ペグ化方法）中所与のタンパク質にＰＥＧ分子が１個だけ結合している状況を記述するのに使用される。
【００５８】
「ペグ化反応」、「ペグ化」または「ペグ化プロセス」（「ペグ化方法」）とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖が別の分子、本発明の文脈では、ヒトＩＧＦ−１前駆体分子に共有結合をするプロセス（方法）のことである。
【００５９】
前駆体：以下では、用語「前駆体」とは、本発明の文脈で使用する場合、シグナルペプチドはないが、それぞれＥａ、ＥｂおよびＥｃペプチドを含む成熟ヒトＩＧＦ−１タンパク質の前駆体を指すことにする。
【００６０】
還元的アルキル化：用語「還元的アルキル化」とは、還元剤の存在下でカルボニル基とアミノ基がアミンに変換される反応のことである。この反応はずっと以前から知られており、アミンを作るもっとも重要な方法と考えられている。
【００６１】
ペグ化の場合、ＰＥＧ−ＣＨＯ試薬は穏やかな還元条件下でタンパク質のアミノ基と反応する。前記反応は２段階、縮合と還元で進行する。第１段階では不安定なシッフ塩基が形成され、この塩基は続いて試薬とタンパク質間の安定した二級アミン結合に還元される。
第１段階：縮合
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ＋ＮＨ２（Ｎ末端）−Ｐｒｏｔ
←→ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ（Ｎ末端）−Ｐｒｏｔ
第２段階：還元
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ（Ｎ末端）−Ｐｒｏｔ
→ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｐｒｏｔ
【００６２】
タンパク質修飾では、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの穏やかな還元剤が通常選択されて、タンパク質中の天然のジスルフィド結合の同時還元を回避する。
【００６３】
治療タンパク質：用語「治療タンパク質（複数可）」はヒトまたは獣医治療において使用するためのタンパク質（複数可）のことであり、急性または慢性投与を目的とする場合もある。特に、「治療タンパク質」は、疾患または病態を有する哺乳動物の治療において使用されるタンパク質である。
【００６４】
発明の詳細な説明
本発明はペグ化治療タンパク質の高度に再現性のある方法での調製および精製を説明する。産物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がＮ末端またはリシンアミノ基に結合しているモノペグ化タンパク質である。
【００６５】
本発明は、選択性が改善されている治療タンパク質のペグ化のための手順を提供する。ペグ化中に使用する条件は、ペグ化治療タンパク質変異体のプロファイルを改変するまたは調整し、高次ペグ化タンパク質変異体の量を減少もさせる能力を提供する。反応を所望のコンジュゲートのほうに向かわせるパラメータはペグ化混合物のｐＨである。驚くべきことに、ペグ化混合物にαシクロデキストリン（α−ＣＤ）を加えると、反応速度が著しく減少し、したがって、高次ペグ化型の形成が著しく減少する。さらに、α−ＣＤがあれば、反応を減速させることによりペグ化反応のより良好な制御が可能になる。ペグ化条件は高収率およびプロセスの高い再現性を確実にする。
【００６６】
本開示は、リシン（Ｌｙｓ）ペグ化アイソフォームとＮ末端ペグ化アイソフォームとの間の部分的分離が達成され、最終モノペグ化産物中のペグ化アイソフォームの組成に対する制御を可能にするようにクロマトグラフィーステップ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））を用いる精製／単離方法に関する。
【００６７】
一実施形態では、本開示は、ペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で前記治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応が約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施されることを特徴とする、ステップを含む、方法に関する。
【００６８】
追加の実施形態では、本開示は、モノペグ化治療タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質であり、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で前記治療タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応が約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施されることを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いて交換クロマトグラフィーステップを実施するステップと、
（ｃ）交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）の溶出画分を得るステップと、
（ｄ）モノペグ化治療タンパク質を含有する画分を貯留するステップと
を含む、方法に関する。
【００６９】
本開示は、上記方法に従って調製されるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物にも関する。
【００７０】
さらに、本開示は上記方法に従って調製されるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれる治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００７１】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により得られるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００７２】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により入手可能であるペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６１パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００７３】
特定の実施形態において、本開示は上記方法により入手可能であるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００７４】
さらに、本開示の一実施形態は、上記方法により得られるモノペグ化治療タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化治療タンパク質画分の少なくとも６５パーセントがＮ末端モノペグ化治療タンパク質である、組成物に関する。
【００７５】
上述の治療タンパク質は増殖因子であり得る。増殖因子は当技術分野では既知であり、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル経路胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）、インターロイキン２−（ＩＬ２）、ＩＬ３−、ＩＬ４−、ＩＬ５−、ＩＬ６−、ＩＬ７−増殖因子を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
したがって、本発明はペグ化インスリン様増殖因子−１またはインスリン様増殖因子−１Ｅａ変異体（ＩＧＦ−１Ｅａ）のようなその変異体の高度に再現性のある方法での調製および精製にも関する。産物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がＮ末端またはリシンアミノ基に結合しているモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質（例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ）である。
【００７７】
本発明は、選択性が改善されているＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｅａのようなその変異体のペグ化のための手順を提供する。ペグ化中に使用する条件は、ペグ化ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質のようなその変異体のプロファイルを改変するまたは調整し、高次ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質型の量を減少もさせる能力を提供する。反応を所望のコンジュゲートのほうに向かわせるパラメータはペグ化混合物のｐＨである。驚くべきことに、ペグ化混合物にαシクロデキストリン（α−ＣＤ）を加えると、反応速度が著しく減少し、したがって、高次ペグ化ＩＧＦ−１型またはＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質のようなその変異体の形成が著しく減少する。さらに、α−ＣＤがあれば、反応を減速させることによりペグ化反応のより良好な制御が可能になる。ペグ化条件は高収率およびプロセスの高い再現性を確実にする。
【００７８】
本発明は、リシン（Ｌｙｓ）ペグ化アイソフォームとＮ末端ペグ化アイソフォームとの間の部分的分離が達成され、最終モノペグ化産物中のペグ化アイソフォームの組成に対する制御を可能にするようにクロマトグラフィーステップ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））を用いる精製／単離方法も説明する。
【００７９】
したがって、一態様では、本発明は、ペグ化プロセス（ペグ化方法）から直接得られるペグ化ヒトＩＧＦ−１タンパク質またはＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質のようなその変異体の組成物であって、前記組成物において、前記組成物に含まれるモノペグ化ｈＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ｈＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質である、組成物を提供する。
【００８０】
さらに、本発明は、ペグ化プロセスから直接得られるペグ化ヒトＩＧＦ−１タンパク質またはＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質のようなその変異体の組成物であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、高次ペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質の量が全ペグ化ＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の２０％未満である、または１９％未満である、または１８％未満である、または１７％未満である、組成物を提供する。
【００８１】
ペグ化プロセスから生じる反応混合物に存在するモノペグ化および高次ペグ化ＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の量は、当業者には周知である逆相ＨＰＬＣ法により決定することが可能である（Park et al, Journal of Chromatography A, 1216, (2009), 7793-7797, Seely el al, BioPharm Int, (2005) 1-7）。
【００８２】
ペグ化プロセスから生じる反応混合物に存在するＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の量は、当業者には周知である陽イオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＣＥ−ＨＰＬＣ）法により決定することが可能である（Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 17 (2002), 547-570, Monkarsh et al, Anal Biochem, 247, (1997), 434-440）。
【００８３】
したがって、本発明は、ペグ化プロセスから直接得られるペグ化ヒトＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の組成物であって、前記組成物の前記モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分が少なくとも６６パーセントのＮ末端モノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含有する、組成物も提供する。
【００８４】
さらに、本発明は、ペグ化プロセスから直接得られるペグ化ヒトＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の組成物であって、前記組成物の前記モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分が少なくとも６６パーセントのＮ末端モノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含有し、高次ペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質の量が全ペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質の２０％未満である、組成物も提供する。
【００８５】
本開示の特定の実施形態では、上記組成物に含まれるヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質に結合しているＰＥＧは直鎖状または分岐状であり、２０〜１００ｋＤａ、または２０〜８０ｋＤａ、または２０〜７０ｋＤａ、または２０〜６０ｋＤａ、または２０〜５０ｋＤａの全体分子量を有する。したがって、本発明の一実施形態では、組成物は約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧでペグ化されたヒトＩＧＦ−１タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質を含む。
【００８６】
本発明の組成物に含まれるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体分子は、Ｅａ、Ｅｂ、Ｅｃペプチドを含む野生型ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり得る。さらに、本発明の組成物に含まれるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体分子は、Ｅａ、Ｅｂ、Ｅｃペプチドを含むヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の突然変異バージョンであり得る。したがって、本発明はペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を含む上記組成物であって、モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセント、または少なくとも６８パーセント、または少なくとも６９パーセント、または少なくとも７０パーセントまたはそれよりも多くがＮ末端でモノペグ化されており、Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｇ４２、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４および／またはＭ１０５からなる群から選択される位置の１つまたは複数のアミノ酸が突然変異しかつ／または欠失しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応している、組成物を提供する。
【００８７】
さらに、本発明はモノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質の組成物であって、前記組成物が少なくとも７０パーセント、または少なくとも８０パーセント、または少なくとも９０パーセント、または少なくとも９１パーセント、または少なくとも９２パーセント、または少なくとも９３パーセント、または少なくとも９４パーセント、または少なくとも９５パーセント、または少なくとも９６パーセント、または少なくとも９７パーセントまたはそれよりも多くのモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含み、Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｇ４２、Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１、Ｓ７２、Ｒ７４、Ｒ７７、Ｇ９６、Ｓ９７、Ａ９８、Ｇ９９、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｎ１０２、Ｙ１０３、Ｑ１０４および／またはＭ１０５からなる群から選択される位置の１つまたは複数のアミノ酸が突然変異しているおよび／または欠失しており、アミノ酸の番号付けが配列番号５に対応している、組成物を提供する。
【００８８】
そのような分子の例には、以下のポリペプチド変異体、
アミノ酸（複数可）
（１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６およびＲ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（１０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（２２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（２５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換され、Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換され、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（２９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換され、Ｒ３７はアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（３０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６およびＲ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方はグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２は欠失している、
（３８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（３９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（４９）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５０）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（５１）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５２）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５３）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（５４）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５５）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５６）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５７）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（５８）Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
別の実施形態では、本開示はポリペプチド（１）〜（５８）を含む上記タンパク質であって、前記分子において、１位〜３位で突然変異している代わりに、アミノ酸Ｅ３のみが欠失している、前記タンパク質に関する。
【００９０】
そのような分子の例には、以下のポリペプチド、
アミノ酸（複数可）
（５９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６０）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６およびＲ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６７）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（６８）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（６９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７０）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７７）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７８）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（７９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（８０）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（８３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８７）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（８８）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（８９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９０）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６およびＲ３７が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している、
（９７）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（９８）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（９９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６が置換されているまたは欠失しており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＱ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１００）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０７）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０８）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１０９）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１０）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１１）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している、
（１１２）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１３）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１４）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１５）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
（１１６）Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している、
ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
別の実施形態では、本開示は上記の通りにペグ化されたヒトＩＧＦ−１前駆体変異体（例えば、ポリペプチド変異体１〜１１６）を含む上記組成物であって、アミノ酸
ａ）ＶＱＡＱＱＨＴＤＭＰＫＴＱＫＥＶＨＬＫＮＡＳＧ（配列番号９９）、または
ｂ）ＶＱＡＱＱＨＴＤＭＰＫＴＱＫＹＱＰＰＡＴＮＫＮＴＫＳＱＲＲＫＧＳ（配列番号１００）
ｃ）ＶＱＡＱＱＨＴＤＭＰＫＴＱＫＥＶＨＬＫＮＡＳＲＧＳＡＧＮＫＮＹＱＭ（配列番号１０１）
からなる突然変異したＥペプチドを含む、前記組成物に関する。
【００９２】
一実施形態では、本発明はモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む上記組成物であって、ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドが上のヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチド変異体６３に記載される突然変異を含む、前記組成物を提供する。
【００９３】
一実施形態では、本開示はモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む上記組成物であって、ペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質が配列番号５５に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である、組成物を提供する。
【００９４】
一実施形態では、本発明はモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む上記組成物であって、ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列を含む、前記組成物を提供する。
【００９５】
したがって、本発明の一実施形態は、ペグ化プロセスから直接得られるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の上記組成物であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化画分の少なくとも６４パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列からなる、組成物にも関する。
【００９６】
ペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の上記組成物は、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、前記ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコール、例えば直鎖状ＰＥＧと反応させるステップであって、カップリング反応が約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施されることを特徴とする、ステップを含む、方法により調製することが可能である。
【００９７】
追加の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるペグ化プロセスから直接生じるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応が約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施されることを特徴とする、ステップを含む方法により得られる、組成物に関する。
【００９８】
特定の実施形態において、上記組成物は、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させる方法であって、カップリング反応をαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下、約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、方法により得られる。
【００９９】
したがって、別の特定の実施形態では、本開示は本明細書に記載されるペグ化プロセスから直接生じるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の上記組成物であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させることから入手可能であり、カップリング反応を約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、組成物に関する。本開示の追加の実施形態では、上記還元的アルキル化反応は約６．５のｐＨで実施する。
【０１００】
特定の実施形態では、上記組成物は、カップリング反応をαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下、約６．５のｐＨで実施することを特徴として、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させることから入手可能である。
【０１０１】
本開示の別の実施形態は、ペグ化プロセスから直接生じるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応を約６．５のｐＨで実施することを特徴とする、ステップを含む、方法に関する。
【０１０２】
特定の実施形態では、本開示は、ペグ化プロセスから直接生じるペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物において、前記組成物のモノペグ化画分の少なくとも６１パーセント、または少なくとも６２パーセント、または少なくとも６３パーセント、または少なくとも６４パーセント、または少なくとも６５パーセント、または少なくとも６６パーセント、または少なくとも６７パーセントがＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質であり、還元的アルキル化の条件下、水性媒体において、ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応をαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下、約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップを含む、方法に関する。
【０１０３】
αシクロデキストリン（α−ＣＤ）は１〜５％（１〜５ｇ／１００ｍｌ）の範囲の最終濃度で使用することが可能である。特定の実施形態では、固形α−ＣＤを反応混合物に３％最終濃度まで添加した。
【０１０４】
本開示の特定の実施形態では、上記方法において使用するＰＥＧは直鎖状であり、２０〜１００ｋＤａ、または２０〜８０ｋＤａ、または２０〜７０ｋＤａ、または２０〜６０ｋＤａ、または２０〜５０ｋＤａの全体分子量を有する。したがって、本発明の一実施形態では、上記方法において使用するＰＥＧは直鎖状ＰＥＧであり、約３０ｋＤａの全体分子量を有する。上記の通りに使用するＰＥＧは直鎖状でもあり得、または分岐状でもあり得る。
【０１０５】
上記方法は、上記ペグ化ステップから直接生じるタンパク質のペグ化タンパク質または所望のタンパク質画分のさらなる精製、分離、濃縮を可能にする追加のステップを含むことが可能である。当業者であれば実行可能な技術は周知である（Fee et al, Chemical Engineering ScienceChemical Engineering Science, 61 (2006) 924-939), Pabst et al, Journal of Chromatography A, 1147 (2007) 172-182, Lee et al, Pharmaceutical Research, 20 2003 818-85）。特定の実施形態では、これら追加のステップは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）であり得る（Yun et al, Journal of Biotechnology, 118 (2005) 67-74, Jevsevar et al, Biotechnol. J., 5 (2010) 113-128, Molineux, Current Pharmaceutical Design, 10 (2004) 1235-1244), Baker et al, Bioconjugate Chem. 17 (2006) 179-188）。本発明は、リシン（Ｌｙｓ）ペグ化アイソフォームとＮ末端ペグ化アイソフォームとの間の部分的分離が達成され、最終モノペグ化産物中のペグ化アイソフォームの組成に対する制御を可能にするように陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いる精製／単離方法も説明する。
【０１０６】
驚くべきことに、上記発明の方法における条件下では、ペグ化混合物にα−ＣＤを添加すると高次ペグ化型の形成が減少し、ペグ化反応の速度も遅くなる。ペグ化混合物にα−ＣＤを添加すると高次ペグ化型の量が減少し、クロマトグラフフィー精製が簡略化され、それによりクロマトグラフィー精製が簡略化されたためにより高い収率が保証される。ペグ化プロセスに添加されたα−ＣＤはロットごとの一貫性を改善し、高収率とプロセスの高い再現性を確実にする。ロットごとの一貫性は、リシンペグ化アイソフォームとＮ末端ペグ化アイソフォームの部分的分離が達成されるように実施される陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップによっても制御される。
【０１０７】
本開示の別の実施形態は、モノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質の組成物を調製するための方法であって、前記組成物が少なくとも７０パーセント、または少なくとも８０パーセント、または少なくとも９０パーセント、または少なくとも９１パーセント、または少なくとも９２パーセント、または少なくとも９３パーセント、または少なくとも９４パーセント、または少なくとも９５パーセント、または少なくとも９６パーセント、または少なくとも９７パーセント、またはそれよりも多くのモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含み、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中でＩＧＦ−１前駆体タンパク質を水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応をαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下、約６．５のｐＨで実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いて交換クロマトグラフィーステップを実施するステップと、
（ｃ）交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）の溶出画分を得るステップと、
（ｄ）モノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質アイソフォームを含有する画分を貯留するステップと
を含む、方法に関する。
【０１０８】
本開示の特定の実施形態では、上記ステップ（ｂ）は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である。
【０１０９】
同様に、上記交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）、例えば、ＣＥＸ、に加えて、以下の濃縮／精製ステップ
（ｅ）ＵＦ／ＤＦ濃縮およびバッファー交換
限外濾過およびダイアフィルトレーションステップは、濃縮し、ＣＥＸクロマトグラフィーバッファーを最終バッファーに交換することを狙いとして実施する（実施例４；ＵＦ／ＤＦステップ、無菌濾過および充填）。
（ｆ）最終濾過および充填（実施例４）
を上に開示されている方法に追加することが可能である。
【０１１０】
したがって、本発明の別の実施形態は、それぞれ上記方法ステップ（ａ）〜（ｄ）および（ａ）〜（ｆ）を実施することにより得られる９０パーセントを超えるモノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む、組成物に関する。
【０１１１】
本開示の特定の実施形態では、それぞれステップ（ａ）〜（ｄ）および（ａ）〜（ｆ）を含む上に開示されている方法は、変異体６３モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の組成物を調製するために使用される（上記の通りに）。
【０１１２】
したがって、本開示の一実施形態は、それぞれステップ（ａ）〜（ｄ）および（ａ）〜（ｆ）を含む上に開示されている方法であって、前記方法が配列番号５５のタンパク質配列からなるモノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の組成物を調製するために使用される、方法に言及する。
【０１１３】
上に開示されているペグ化方法／プロセスに従って調製されるＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質およびリシン残基モノペグ化ＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む上記組成物は、薬学的に許容される形態にさらに加工することが可能である。当業者であれば先行技術において入手可能な関連製剤技術は周知である。
【０１１４】
したがって、本開示は、配列番号５５のＮ末端モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドまたはリシン残基モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドを含む医薬組成物の調製であって、
（ａ）還元的アルキル化の条件下、水性媒体中で配列番号５５のヒトＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ポリペプチドを水溶性ポリエチレングリコールと反応させるステップであって、カップリング反応をαシクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下、約６．５〜７．５のｐＨ範囲内で実施することを特徴とする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた組成物を用いて交換クロマトグラフィーステップを実施するステップと、
（ｃ）交換クロマトグラフィーステップ（ｂ）の溶出画分を得るステップと、
（ｄ）モノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質アイソフォームを含有する画分を貯留するステップと
（ｅ）医薬組成物の調製のためにステップ（ｄ）において得られた画分を使用するステップと
を含む、調製に関する。
【０１１５】
クロマトグラフィー精製
モノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質は、強い陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーにより過剰な試薬、反応副産物および非ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質から精製される。精製は、カラム上にモノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａを保持することがまだ可能であり同時にリシンモノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質とＮ末端モノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質との間で少なくとも部分的な分離を達成するのに十分高いｐＨで実施される。６．５〜７．５のｐＨ範囲は、分離にもっとも適していると判定された。したがって、本開示はクロマトグラフィー精製ステップ（例えば、上のステップ（ｂ））を約６．５のｐＨで実施する上記方法に関する。
【０１１６】
代わりに、ＵＦ／ＤＦ濃縮、バッファー交換、および濾過のような追加のステップは、ステップ（ｅ）の医薬組成物の調製に先立って上記方法に適用することが可能である。
【０１１７】
開示されている方法に従って調製されるモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含むこうして得られた医薬組成物は、治療において使用することが可能である。
【０１１８】
したがって、一実施形態では、本開示は、治療において使用するための、特に、それを必要とする患者の筋障害の治療における治療的使用のための薬学的に許容される形態でモノペグ化ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含む上述の特定のおよび新規の組成物に関する。本開示の特定の実施形態では、治療的使用は徐脂肪体重の減少および／もしくは筋消耗に罹っている火傷患者の治療、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の治療、または球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡまたはケネディ病）患者の治療、または慢性腎疾患患者の治療である。
【０１１９】
特定の好ましい実施形態では、本開示は、少なくとも９５％、またはそれよりも多くの上記方法に従って調製される配列番号５５からなるＮ末端モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質およびリシン残基モノペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質との混合物を含む組成物を使用することにより調製された医薬組成物の治療における上に特定された薬学的使用に関する。
【０１２０】
本開示は、それを必要とする患者において筋障害を治療する方法であって、本明細書に開示される方法に従って調製される組成物を含む治療有効量のＮ末端残基ペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を投与することを含む、方法をさらに提供する。
【０１２１】
したがって、一特定の実施形態では、本開示は、徐脂肪体重の減少および／もしくは筋消耗に罹っている火傷患者を治療する方法、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者を治療する方法、またはケネディ病患者を治療する方法、または慢性腎疾患患者を治療する方法であって、本明細書に開示される方法に従って調製される組成物を含む治療有効量のＮ末端残基ペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質を投与することを含む、方法に関する。
【０１２２】
アミノ酸突然変異
上に言及する通り、種々のアミノ酸は別のアミノ酸に突然変異することがある。しかし、非天然アミノ酸または別の群（すなわち、極性、酸性、塩基性または非極性）からの天然アミノ酸などの他のアミノ酸を使用してもよい。タンパク質のアミノ酸に突然変異を導入する方法は当業者には周知である。例えば、Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。方法には、変異原性プライマーを用いて行うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ポリペプチドの機能的に活性な変異体またはその断片をコードするＤＮＡの増幅および必要であればアセンブリーＰＣＲによる断片の組立てまたは「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ．ＴＭ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販のキットを使用する突然変異の導入が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。さらに、突然変異配列は、営利会社（例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により提供されるサービスである合成的遺伝子合成により入手することが可能である。ポリペプチドの機能に影響を及ぼさないアミノ酸を置き換えることによるポリペプチドの機能的に活性な変異体またはポリペプチドに対する誘導体の作製は、当業者であれば達成することが可能である。
【０１２３】
治療タンパク質の調製
現在使用されている最先端の異種タンパク質調製系には、大腸菌（E.coli）、酵母、ウイルス、真菌および昆虫細胞のような原核および真核細胞系が含まれる。グリコシル化などの翻訳後修飾または周囲翻訳修飾を必要とする（および工業規模の調製が必要とされる場合に）組換えタンパク質を調製するためには、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、サバンナモンキー（Cercopithecus aethiops）、人類（Homo sapiens）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、マウス（Mus musculus）およびクロロセバス種（Chlorocebus species）由来の細胞を含む哺乳動物細胞系が使用されることが非常に多い。哺乳動物細胞系は治療タンパク質および抗体のための常用の調製系になっている。前記細胞は最近、広範囲にわたって特徴付けられており、極めて高い産生レベルに到達することが可能であり、感染性のまたはウイルス様粒子を含まないことが可能であり、バイオリアクターにおいて非常に高密度まで増殖することが可能であり、遺伝的に操作し形質転換することが可能である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、適切なグリコシルトランスフェラーゼのトランスフェクションによりヒトグリカンプロファイルに類似するように操作することが可能である。組換え的に調製される増殖因子は治療用途において既に広く使用されているまたは新たな治療の開発のために有望な候補である。
【０１２４】
当業者であれば、遺伝的に改変された哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１誘導体、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１誘導体またはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のようなＣＨＯ細胞を形質転換し、選択し培養する方法は既知である。選択プロトコルが常用されて、増殖因子のような所望の治療タンパク質、例えば、ＩＧＦ−１をコードする組換えＤＮＡを組み込んでいる可能性のある細胞の選択を促進する。抗生物質耐性または共組換え遺伝子により形質転換ベクターに与えられる栄養的選択培地で増殖できる能力が常用されている（Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604.参照）（Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi）。組換えタンパク質調製のための２つのもっとも一般的なＣＨＯ発現系は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ベースのメトトレキサート（ＭＴＸ）選択またはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）ベースのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択を利用する（Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production）。
【０１２５】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を用いたポリペプチドの大規模調製は、例えば、ウェーブ、ガラスまたはステンレススチールバイオリアクターにおいて実行することが可能である。その目的のために、細胞は、通常単一の凍結バイアル、例えば、マスターセルバンク由来のバイアルから開始して、拡大される。細胞は解凍されいくつかのステップを通じて拡大される。スケールが異なるバイオリアクターに適切な量の細胞を播種する。細胞密度は、バイオリアクターに供給液および添加剤を添加することにより増加することが可能である。細胞は長時間高い生存率で維持される。リットルあたり数百ミリグラムからリットルあたり数グラムまでの範囲のリアクター中の産物濃度が大規模に達成される。精製は標準クロマトグラフィー法により実行することが可能であり、前記方法は親和性、イオン交換、疎水性相互作用またはサイズ排除クロマトグラフィーステップを含むことが可能である。バイオリアクターのサイズは最終スケールで数千リットル体積までであり得る（例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398も参照）。
【０１２６】
治療タンパク質は、大腸菌（E.coli）においてＮｐｒｏ自己プロテアーゼ融合技術（ＮＡＦＴ）を使用して極めて効率的に調製することが可能である。当業者であれば、特に、特許出願／特許ＷＯ２００１１１０５６、ＷＯ２００１１１０５７、ＷＯ２００６１１３９５７、ＥＰ１２００６０４Ｂ１およびＵＳ６９３６４５５Ｂ１に極めて詳細に開示されているこの技術は周知である。
【０１２７】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の方法またはプロセスに従って調製される上記ペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物のうちの１つまたは組合せを含有し、薬学的に許容される担体と一緒に製剤される組成物、例えば、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の薬物と組み合わせて製剤することも可能である。例えば、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物は、少なくとも１つの筋肉量／筋力増強剤、例えば、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ汎性抗体ＩＧＦ−２もしくは変異体ＩＧＦ−２、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合はするが活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、グレリンアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模倣物またはフォリスタチンと組み合わせることが可能である。併用療法において使用することが可能な治療薬の例は、本発明のＩＧＦ−１変異体の使用に関する下のセクションにおいてさらに詳細に説明される。
【０１２８】
用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されているまたは米国薬局方もしくは動物において、さらに具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認められた薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」とは治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルのことである。そのような医薬担体は、水ならびに石油、動物、植物、またはピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの合成起源の油を含む、油などの無菌液体であり得る。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することが可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることが可能である。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と一緒に坐薬として製剤することが可能である。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等などの標準担体を含むことが可能である。適切な医薬担体の例はE. W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【０１２９】
好ましい実施形態では、組成物はヒトへの静脈内投与に適応させた医薬組成物として常用手順に従って製剤される。必要な場合には、組成物は、注射部位での苦痛を和らげるため可溶化剤およびリドカインなどの局所麻酔薬を含んでいてもよい。組成物が注入により投与されることになる場合、無菌医薬品等級の水または生理食塩水を含有する注入ボトルで組成物を分注することが可能である。組成物が注射により投与される場合、注射用減菌水または生理食塩水のアンプルをその成分を投与に先立って混合できるように提供することが可能である。
【０１３０】
薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入により）に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、増殖因子、免疫コンジュゲート、または二重特異性分子は、酸の作用および化合物を不活化する可能性のある他の天然の状態から化合物を保護する物質で被覆してもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物において用いることができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材の使用により、分散液の場合の必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することが可能である。
【０１３３】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有していてよい。微生物の存在は、上の殺菌手順によりと、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによりの両方で確実に防止し得る。組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望ましい場合がある。さらに、注射可能な剤型の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含むことによりもたらし得る。
【０１３４】
薬学的に許容される担体には、無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野では既知である。いかなる従来の媒体および薬剤でも活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物中でのその使用を企図している。補助的な活性化合物も組成物中に組み込むことが可能である。
【０１３５】
治療組成物は典型的には製造および貯蔵条件下では無菌で安定していなければならない。組成物は、溶液、微細乳濁液、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造体として製剤することが可能である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合の必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することが可能である。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが可能である。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらすことが可能である。
【０１３６】
無菌注射液は、上に列挙する薬剤のうちの１つまたは組合せと一緒に、活性化合物を必要とされる量で適切な溶媒に取り込み、必要に応じて、続いて殺菌マイクロ濾過により調製することが可能である。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙するものから必要とされる他の薬剤を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の方法は、活性薬剤プラス任意の追加の所望される薬剤の粉末を既に無菌濾過されているその溶液から産出する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１３７】
担体材料と組み合わせて単一剤形を作成することが可能である活性薬剤の量は、治療を受けている対象および特定の投与様式に応じて変動することになる。担体材料と組み合わせて単一剤形を作成することが可能である活性薬剤の量は、一般的には治療効果を生み出す組成物の量になる。一般的には、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性薬剤、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの活性薬剤の範囲になる。
【０１３８】
投与計画は最適の所望の応答（例えば、治療応答）を与えるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかに分けた用量を時間をかけて投与してもよく、または用量は治療状況の緊急事態により示されるのに比例して減らしたり増やしたりしてもよい。投与を容易にし用量を均一に保つために非経口組成物を単位剤形で製剤するのが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、治療を受ける対象に単位用量として適している物理的に個別の単位のことであり、それぞれの単位には、必要とされる医薬担体と共に所望の治療効果を生み出すように計算された前もって決められた量の活性化合物が含有される。本発明の単位剤形の明細は、活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個人における感応性の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の限界により規定され、こうしたことに直接依存する。
【０１３９】
本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物を投与するという文脈における治療有効量のポリペプチドは、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに通常では０．１〜１０ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、用量は約０．１ｍｇ／体重ｋｇであり得、約０．２ｍｇ／体重ｋｇであり得、約０．３ｍｇ／体重ｋｇであり得、約１ｍｇ／体重ｋｇであり得、約３ｍｇ／体重ｋｇであり得、約５ｍｇ／体重ｋｇまたは約１０ｍｇ／体重ｋｇであり得る。当業者であれば、投与経路（例えば、静脈内にまたは皮下に）に応じて変動することになる適切な有効用量を特定することを承知している。例となる治療計画は、１日１回、毎週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回または月１回の投与を必要とする。そのような投与は、静脈内にまたは皮下に実施することができる。本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物の投与計画は、静脈内投与による０．１ｍｇ／体重ｋｇまたは０．２ｍｇ／体重ｋｇまたは０．３ｍｇ／体重ｋｇまたは０．５ｍｇ／体重ｋｇまたは１ｍｇ／体重ｋｇまたは３ｍｇ／体重ｋｇまたは１０ｍｇ／体重ｋｇを含む。代わりに、組成物は徐放製剤であり得、その場合必要な投与頻度は少なくなる。用量および頻度は患者における抗体の半減期に応じて変動する。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるまたは治療的であるかどうかに応じて変動することが可能である。予防的適用では、長期間にわたり比較的低頻度間隔で比較的低用量が投与される。一部の患者はその生涯の間治療を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が遅くなるもしくは終わるまで、または患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまでは、比較的短い間隔での比較的高用量が必要となるときもある。その後、患者に予防計画を施すことが可能である。
【０１４０】
本発明の医薬組成物中の活性薬剤の実際の用量レベルは、患者に対し有毒ではなしに、特定の患者、組成物および投与様式で、所望の治療応答を達成するのに有効な量の活性薬剤を得られるように変えることができる。選択された用量レベルは、用いる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いている特定の化合物の排泄速度、治療の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、治療を受けている患者の年齢、性別、体重、状態、総合的健康および先の病歴、ならびに医術において周知である類似の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存することになる。
【０１４１】
本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物の治療的有効用量の投与により、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、あるいは疾患苦痛による機能障害または能力障害の防止、すなわち、火傷患者における筋肉量および／もしくは機能の増加または創傷域の減少／縮小をもたらすことが可能である。
【０１４２】
患者は、有効量の、すなわち、問題の疾患または障害を検出する、治療する、寛解するまたは予防するのに十分な量のポリペプチド活性成分を受けることになる。治療効果は、身体症状の減少も含むことができる。いかなる特定の対象に対しても治療タンパク質の最適有効量および濃度は、患者の年齢、大きさ、健康および／または性別、病状の性質および程度、特定の治療タンパク質の活性、身体によるクリアランス速度を含む種々の要因に、ならびに治療タンパク質と組み合わせて投与されるいかなる考え得る追加の治療薬（複数可）にも依存することになる。所与の状況に対して送達される有効量は、常用の実験により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内にある。投薬は単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールによっても可能である。
【０１４３】
本発明の組成物は、当技術分野で既知の種々の方法のうちの１つまたは複数を使用して１つまたは複数の投与経路により投与することが可能である。当業者であれば認識するように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動することになる。本発明の治療タンパク質の投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下の、脊髄または、例えば、注射または注入による他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管の、皮下の、表皮下の、関節腔内の、嚢下の、くも膜下の、脊髄内の、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、組成物を含む抗体は静脈内に投与される。別の実施形態では、抗体は皮下に投与される。
【０１４４】
代わりに、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物は、局所的、上皮的または粘膜投与経路などの非経口ではない経路により、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下にまたは局所的に投与することが可能である。
【０１４５】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む放出制御製剤などの、化合物を速放性から保護する担体と一緒に調製することが可能である。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することが可能である。そのような製剤の調製のための多くの方法は特許が取られているか、当業者には一般に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１４６】
治療組成物は、当技術分野で既知の医療装置を用いて投与することが可能である。例えば、一実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，７９０，８２４号、または米国特許第４，５９６，５５６号に示される装置などの無針皮下注射装置を用いて投与することが可能である。本発明において有用である周知のインプラントおよびモジュールの例として、米国特許第４，４８７，６０３号は薬物を制御された速度で分注するための植込み式マイクロ注入ポンプを示しており、米国特許第４，４８６，１９４号は皮膚を通じて薬物を投与するための治療装置を示しており、米国特許第４，４４７，２３３号は正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを示しており、米国特許第４，４４７，２２４号は連続薬物送達のための可変フロー植込み式注入装置を示しており、米国特許第４，４３９，１９６号は複数のチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを示しており、米国特許第４，４７５，１９６号は浸透圧薬物送達システムを示している。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは当業者には既知であり、ＭｉｃｒｏＣＨＩＰＳＴＭ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）が作製したものも含まれる。
【０１４７】
ある種の実施形態では、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物はｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な分布を保証するように製剤することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高度に親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを確実に通過するためには（所望の場合）、例えば、リポソームに製剤することが可能である。リポソームを製造する方法では、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、米国特許第５，３７４，５４８号、および米国特許第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つまたは複数の部分を含み、したがって標的薬物送達を増強することができる（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685参照）。例となるターゲティング部分には、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号参照）、マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）、サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）、ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０１４８】
標的疾患および障害
本発明は、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質の組成物または治療において使用するためのその有用な医薬組成物を提供する。本発明は、病理学的障害の治療において使用するための本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物の医薬組成物をさらに提供する。本発明は、病理学的障害の治療のための医薬の製造における本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質の組成物の使用をさらに提供する。本発明は、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質の治療有効量を患者に投与することを含む、病理学的障害に罹っている患者を治療する方法をさらに提供する。
【０１４９】
病理学的障害とは、筋委縮症などの筋骨格の疾患または障害であり得る。筋委縮症には、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾロンなどのグルココルチコイドを用いた治療の結果としてを含む、多くの原因がある。筋委縮症は、神経外傷に起因する除神経の結果または変性、代謝性、もしくは炎症性神経障害（例えば、ギランバレー症候群、末梢神経障害、または環境有害物質もしくは薬物への曝露）の結果でもあり得る。
【０１５０】
さらに、筋委縮症は、筋強直症などのミオパチー；ネマリンミオパチー、マルチ／ミニコアミオパチーおよび筋細管（中心核）ミオパチーを含む先天性ミオパチー；ミトコンドリア筋症；家族性周期性四肢麻痺；炎症性ミオパチー；グリコーゲンまたは脂質蓄積症により引き起こされるなどの代謝ミオパチー；皮膚筋炎（dermatomyositisis）；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症およびミオグロビン尿症の結果であり得る。
【０１５１】
本開示の別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ケネディ病または慢性腎臓病の治療のために使用することが可能である。ミオパチーは、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張性、顔面肩甲上腕、エメリドレフェス、眼咽頭、肩甲上腕、肢帯型、フクヤマ、先天性筋ジストロフィー、または遺伝性遠位型ミオパチーなどの筋ジストロフィー症候群によって引き起こされることがある。筋骨格系疾患は、骨粗鬆症、骨折、低身長、または低身長症もあり得る。
【０１５２】
さらに、筋委縮症は、筋委縮性側索硬化症などの成人運動ニューロン疾患；乳児脊髄性筋委縮症、若年性脊髄性筋委縮症、多病巣性コンダクターブロックを有する自己免疫運動神経障害、脳卒中または脊髄損傷に起因する麻痺；トラウマ、長期ベッド安静、自発的無活動、強制無活動、代謝ストレスまたは栄養不足に起因する骨格不動化；がん、ＡＩＤＳ、絶食、甲状腺もしくは副腎もしくは脳下垂体障害、糖尿病、良性先天性筋緊張低下、セントラルコア病、肝疾患（線維症、硬変などの例）、敗血症、腎不全、うっ血性心不全、加齢、宇宙旅行または無重力環境ですごす時間の結果であり得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、除脂肪体重の低下および／または筋消耗に罹っている、成人および小児火傷を含む火傷患者の治療のために使用することが可能である。
【０１５４】
治療することができる加齢関連疾患の例には、筋肉減少症、皮膚委縮症、筋消耗、脳委縮、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不適格、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、脳卒中、寿命減少、虚弱、記憶喪失、皺、腎臓機能障害、加齢性難聴；ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖および肥満を含む代謝障害が含まれる。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の治療のために使用することが可能である。
【０１５６】
本開示の別の実施形態では、本発明の医薬組成物は筋委縮症の治療のために使用することが可能である。特定の実施形態では、本開示は、筋委縮症の治療のための本発明の医薬組成物の使用であって、委縮症群が肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される、前記使用に関する。
【０１５７】
治療することができる他の状態には、急性および／または慢性肝疾患または不全、肝線維症または肝硬変；膵臓、胃腸（食道、胃および結腸を含む）、肺、前立腺、リンパ腫または乳がんなどのがん；パーキンソン病；ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）、脳委縮または認知症および貧血などの神経細胞死に関連する状態；結核菌により引き起こされるものでも非定型マイコバクテリアにより引き起こされるものでも結核などの慢性感染症；慢性真菌症；ならびに医原性であれＡＩＤＳに起因するものであれ免疫抑制という背景での日和見感染が含まれる。
【０１５８】
追加の状態には、悪液質、関節リウマチに関連する悪液質およびがんに関連する悪液質が含まれる。
【０１５９】
別の実施形態では、本開示は筋障害を治療する方法であって、上記の本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物の治療有効量を投与することを含む、方法に関する。筋肉量を増加するために開示されているポリペプチドまたは組成物を用いる治療の必要性は、特に筋委縮症などの筋骨格疾患または障害の結果としての上記状態のうちの１つから生じることがあり、筋障害は肥満関連筋肉減少症、筋肉減少症、および糖尿病関連筋委縮症からなる群から選択される筋委縮症である。
【０１６０】
さらに、本開示は、火傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、筋肉減少症のような加齢関連状態、ケネディ病、または慢性腎疾患を治療する方法であって、本発明の方法またはプロセスに従って調製されるペグ化ヒトＩＧＦ−１Ｅａペプチド前駆体タンパク質組成物の治療有効量を上記の通りに患者に投与することを含む、方法に関する。
【０１６１】
別の実施形態では、本開示は筋肉量を増加するための方法に関する。特定の実施形態では、本開示はそれを必要とする患者において筋肉量を増加するための方法に関する。筋肉量を増加する必要性は、特に筋委縮症などの筋骨格疾患または障害の結果としての上記状態のうちの１つから生じることがある。筋肉量を増加する必要性は、火傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、筋肉減少症のような加齢関連状態、ケネディ病、または慢性腎疾患から生じることもある。
【０１６２】
患者投与
本発明の医薬組成物は患者に投与することが可能である。投与は典型的には注射器によることになる。したがって、本発明は、本発明の医薬組成物を含む送達装置（例えば、注射器）を提供する。
【０１６３】
種々の送達装置、例えば、リポソームへのカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987参照）、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス（例えば、トリポックスウイルス、特に鶏痘ウイルス）または他のベクターの一部としての核酸の構築、等が知られており、本発明のポリペプチドを投与するのに使用することが可能である。導入方法は腸内または非経口的であり得、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻腔内、眼球内、硬膜外、および経口経路を含むがこれらに限定されない。ポリペプチドは、都合がよければいかなる経路によっても、例えば、注入またはボーラス投与により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜、等）を通じた吸収により投与することが可能であり、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身性でも局所性でも可能である。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注射を含む任意の適切な経路により中枢神経系に導入するのが好ましい場合があり、脳室内注射は、例えば、オマヤレザバーなどのレザバーに取り付けた脳室内カテーテルにより促進することができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましい場合があり、これは、例えば、および限定するためではなく、手術中の局所注入、例えば、注射による、カテーテルを用いる、またはインプラントを用いる局所適用により達成することができ、インプラントは、シラスティック膜、繊維、または市販の代用皮膚などの、膜を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質である。
【０１６４】
別の実施形態では、医薬組成物は、ベシクル、特にリポソームで送達することが可能である（Langer, Science 249:1527-1533, 1990参照）。さらに別の実施形態では、活性薬剤は徐放システムで送達することが可能である。一実施形態では、ポンプを使用することができる。
【０１６５】
患者群
提唱している治療から利益を得ることができる患者には、集中治療または長期入院（１週間を超える）を必要とする急性または重症疾患から回復中の患者；筋肉減少症に罹っている虚弱高齢患者；自動車事故、重症熱傷、戦闘傷、および他の外傷などの重度の外傷から回復中の若年成人；上に収載する悪液質を引き起こすことが知られている慢性疾患に罹った患者；ならびに上に収載する筋疾患に罹った患者が含まれる。筋肉の喪失は重症であるまたは長期にわたる大半の病気の一般的な合併症なので、筋消耗が回復すればこの喪失の根本原因とは無関係に筋喪失を経験する患者の機能の回復および復帰の速度が速くなると予想される。
【０１６６】
併用療法
この治療は筋消耗プロセスの主因を標的にするいかなる治療とも組み合わせることができる。そのような組み合わせには、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、抗サイトカイン剤、抗がん薬；エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、または他のものなどの増殖因子；糖尿病の治療のために使用される薬物（インスリンおよび経口血糖降下剤を含む）、抗結核薬、および抗生物質が含まれ得る。組み合わせには、小分子と生体分子薬剤の両方が含まれ得る。
【０１６７】
本発明の医薬組成物は、単独の活性製剤としてまたは他の薬物、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢデコイ模倣物、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ汎性特異的抗体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、グレリンアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模倣物またはフォリスタチンと組み合わせて、例えば、これらの薬物に対するアジュバントとしてまたは組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の薬物はＷＯ２０１０１２５００３に開示されているＡｃｔＲＩＩＢ抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１６８】
【表１−１】
2017502005.tif 000003
【０１６９】
【表１−２】
2017502005.tif 000004
【０１７０】
【表１−３】
2017502005.tif 000005
【０１７１】
【表１−４】
2017502005.tif 000006
【０１７２】
【表１−５】
2017502005.tif 000007
【０１７３】
【表１−６】
2017502005.tif 000008
【実施例】
【０１７４】
ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質は多数の表面露出リシン残基を有する。ペグ化パラメータを最適化しただけでは十分な収率は保証されず、特に最終産物組成物の再現性はそれほど高くはない。ペグ化反応の収率はペグ化反応をｐＨ６．５で実施することにより増加した。このｐＨでのほうが、ＰＥＧ−ＣＨＯ試薬とＩＧＦ−１Ｅａとの還元的アルキル化カップリングの選択性は高く、副産物の形成は減少する。先行技術では還元的アルキル化はｐＨが低いほうが選択性が高くなると一般に考えられているので、さらに高いｐＨで実施するペグ化反応のほうが選択性が高くなることはひどく驚きであった。
【０１７５】
パートＡ：一般的方法論
方法の説明
モノペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質の調製のための方法は、（ｉ）ｈＩＧＦ−１Ｅａ前駆体ペプチドがＰＥＧ試薬とカップリングされるペグ化反応ステップ、（ｉｉ）所望の産物が非反応ＰＥＧ試薬、非ペグ化ＩＧＦ−１Ｅａ前駆体タンパク質および反応副産物から精製されるクロマトグラフィー精製ステップ、ならびに（ｉｉｉ）バッファーが交換され対象のペグ化タンパク質が濃縮される限外／ダイアフィルトレーションステップを含む。方法フロー図は図１に提示している。
【０１７６】
Ｎ−Ｐｒｏ技術を使用するｈＩＧＦ−１Ｅａタンパク質の調製
以下の改変：Ｅ３の欠失、Ｒ３７のＡへの突然変異、およびＲ７１の欠失とＳ７２の欠失を含有するｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド（配列番号５５）をコードするＤＮＡ発現ベクターを構築した。
ｈＩＧＦ−１−Ｅａ変異体配列番号５５（ΔＥ３；Ｒ３７Ａ；ΔＲ７１，ΔＳ７２）
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５５）
【０１７７】
配列番号５５の上記ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドは、Ｎｐｒｏ自己プロテアーゼ融合技術（ＮＡＦＴ）を使用して調製した。当業者であれば、特に、特許出願／特許ＷＯ２００１１１０５６、ＷＯ２００１１１０５７、ＷＯ２００６１１３９５７、ＥＰ１２００６０４Ｂ１およびＵＳ６９３６４５５Ｂ１に開示されているこの技術は周知である。
【０１７８】
ペグ化反応
ペグ化反応中、配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドは、ＮａＣＮＢＨ３により達成される還元条件下で３０ｋＤａのＰＥＧアルデヒド試薬（ＰＥＧ−ＣＨＯ）とカップリングする。ＰＥＧ−ＣＨＯ試薬はＮ末端アミノ基と優勢に反応することは文献から既知である。配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド上の多数の表面露出リシン残基は、ＰＥＧ−ＣＨＯによるＮ末端ペグ化の選択性を減少させる。様々なｐＨ値でペグ化反応を実施することにより、前記反応はｐＨ４．０と比べてｐＨ６．５のほうがＮ末端に対する選択性が高くなることを見出した。ＰＥＧ−ＣＨＯを使用するペグ化反応はｐＨが低いほうが選択性は高くなると一般に考えられている（Kinstler et al, Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 477-485, Molineux, Current Pharmacetical Design, 10 (2004) 1235-1244）のでこの結果は驚きである。
【０１７９】
ペグ化混合物にα−ＣＤを加えると、高次ペグ化変異体（すなわち、ジ−、トリ−またはさらに高次のペグ化）の形成が抑制される条件が提供される。
【０１８０】
クロマトグラフィー精製
配列番号５５のモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドは、強い陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーにより、過剰な試薬、反応副産物および配列番号５５の非ペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドから精製される。精製は、配列番号５５のモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドをまだカラム上に保持しておくことができ、同時にリシンモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドと配列番号５５のＮ末端モノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドとの間の少なくとも部分的な分離を達成するほどには高いｐＨで実施する。ｐＨ６．５が前記分離にもっとも適していると判定した。なぜならば、ｐＨがもっと高いと配列番号５５のモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドはカラムに結合せず、ｐＨがもっと低い（例えば、５．０）とリシンペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドと配列番号５５のＮ末端ペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドとの間の保持に差がないからである。
【０１８１】
濃縮およびバッファー交換
ＵＦ／ＤＦステップは、バッファーを最終製剤バッファーに交換し、ＩＧＦ−１Ｅａを最終濃度にまで濃縮するために実施する。
【実施例１】
【０１８２】
パートＢ：実施例
本実施例は、ＰＥＧ−ＣＨＯによるペグ化反応の選択性に対するペグ化反応ｐＨの影響を実証する。驚くことに、低いｐＨと比べて、ｐＨが高いほうが、Ｎ末端コンジュゲーションに対する反応の選択性が高くなる。
【０１８３】
配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドのペグ化
ペグ化反応は、ｐＨが４．０と６．５の２つの異なるバッファーで実施した。低いほうのｐＨでは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム  ｐＨ４．０を選択し、高いほうのｐＨでは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム  ｐＨ６．５を使用した。どちらの場合でも、固形ＰＥＧ試薬（３０ｋＤａポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）、固形α−ＣＤおよび固形ＮａＣＮＢＨ３を配列番号５５のＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド溶液に添加した。ペグ化反応は、タンパク質濃度４．８ｍｇ／ｍｌで、３モル過剰のＰＥＧ試薬で、３％濃度のα−ＣＤでおよび４０ｍＭ濃度のＮａＣＮＢＨ３で、撹拌せずに、室温で実施した。分析用の試料はペグ化の３．５および７時間後に取り出した。試料は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥ−ＨＰＬＣ）を用いて分析した。
【０１８４】
ペグ化混合物の特徴付け
ＲＰ−ＨＰＬＣはモノおよび高次のペグ化型の量を決定するために使用し、ＣＥ−ＨＰＬＣはモノペグ化画分中のＮ末端ペグ化型のパーセントを決定するために使用した。それぞれの試料の組成に関しては、ペグ化反応はｐＨ４．０よりもｐＨ６．５でのほうがＮ末端コンジュゲーションに対する選択性が高くなることが結果により示されている。ｐＨ６．５では、Ｎ末端ペグ化型の量はｐＨ４．０と比べて約１０％高い。高次ペグ化型の量もｐＨが高いほうが有意に低い。ペグ化の７時間後、高次ペグ化型の量はｐＨ６．５で１６％、ｐＨ４．０では２９％であり、モノペグ化型の割合は、ペグ化反応のｐＨとは無関係に７時間後で同じである。結果は表１に示している。
【０１８５】
【表２】
2017502005.tif 000009
【実施例２】
【０１８６】
本実施例は、高次ペグ化型の量に対するα−ＣＤの影響を実証する。高次ペグ化型の量α−はＣＤの存在下では減少する。
【０１８７】
配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドのペグ化
２つのペグ化反応を実施した。どちらの場合でも、固形ＰＥＧ試薬（３０ｋＤａポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド；ＮＯＦ）および固形ＮａＣＮＢＨ３をＩＧＦ−１Ｅａ溶液に添加した。一反応では、固形α−ＣＤは３％最終濃度まで添加した。ペグ化反応は、タンパク質濃度４．４ｍｇ／ｍｌで、４モル過剰のＰＥＧ試薬で、および４０ｍＭ濃度のＮａＣＮＢＨ３で、撹拌せずに、室温で実施した。分析用の試料はペグ化の２時間および３．５時間後に取り出した。試料は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＥ−ＨＰＬＣを用いて分析した。
【０１８８】
ペグ化混合物の特徴付け
ペグ化混合物はＲＰ−ＨＰＬＣを用いて２および３．５時間後に分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣはモノおよび高次ペグ化型の量を決定するために使用した。
【０１８９】
高次ペグ化型の量は３％α−ＣＤの存在下でのほうが低いことを結果は示している。３．５時間後ペグ化混合物中の３％α−ＣＤの存在下で得られる高次ペグ化型は約２４％少なくなるが、モノペグ化型の割合は同じままである。結果は表２に示している。
【０１９０】
【表３】
2017502005.tif 000010
【実施例３】
【０１９１】
配列番号５５のモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドアイソフォームの部分的分離
固形ＰＥＧ試薬（３０ｋＤａポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド；ＮＯＦ）、５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３／１Ｍ  ＮａＯＨの中和溶液および１２％のα−ＣＤ溶液を配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド（７５ｍｇ）溶液に添加した。ペグ化反応は、タンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌ、２．２５モル過剰のＰＥＧ試薬、５０ｍＭ濃度のＮａＣＮＢＨ３、および３％濃度のα−ＣＤ、室温、ｐＨ６．５で実施した。２０時間後、ペグ化混合物は水で希釈して試料伝導率を下げ無菌濾過した。配列番号５５のモノペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドアイソフォームの精製および単離は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して実施した。反応混合物を、バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で平衡化された、４９．６ｍｌ（ＸＫ１６／４０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラム上にロードした。カラムは３カラム体積の平衡バッファーで洗浄した。ペプチド型は、３０カラム体積で、直線勾配０〜１００％の溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を使用して溶出させた。全流出の流速は２．５ｍｌ／分に維持した。分取クロマトグラムは図２に示している。
【０１９２】
溶出中、２．５ｍｌ画分を収集した。画分は分析ＣＥ−ＨＰＬＣに従って貯留した。異なる組成のモノペグ化アイソフォームを含有する４つの貯留物を調製し、１、２、３および４と名付けた。前記貯留物は濃縮し、貯蔵バッファー、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０にダイアフィルトレートした。濃縮およびダイアフィルトレーションは１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ遠心装置上で実施し、３ｋＤａは切り捨てた。
【０１９３】
それぞれの貯留物におけるアイソフォーム組成（分析ＣＥ−ＨＰＬＣを用いて決定した）およびモノペグ化物質の含有量（ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した）は表３に示している。
【０１９４】
【表４】
2017502005.tif 000011
【０１９５】
１と名付けられた貯留物は配列番号５５のＮ末端ペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドのみを含有している。モノペグ化物質の量は９７％を超えている。
【０１９６】
２、３および４と名付けられた貯留物は、一部のジ−ペグ化物質の存在のために低いＲＰ−ＨＰＬＣ純度を有する。貯留物２、３および４における残りのモノペグ化物質はリシンペグ化している。リシンペグ化アイソフォームの部分的分離のみがＣＥＸクロマトグラフィーで達成されたので、貯留物は異なるリシンペグ化アイソフォームの混合物である。分析ＣＥ−ＨＰＬＣでは、４つのピークを分解することができる。配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドにおける露出しているリシン残基の数を考慮することにより、これら４つの分析ＣＥ−ＨＰＬＣピークはまだ異なるリシンペグ化アイソフォームの混合物である。
【０１９７】
２、３および４と名付けられたＣＥＸ貯留物のＣＥ−ＨＰＬＣ分析は、図３に示している。
【実施例４】
【０１９８】
本実施例は、配列番号５５のペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドの調製のための方法を説明する。方法全体により、配列番号５５のペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドの極めて再現性の良い調製が可能になる。方法頑強性を高めるように設計されたステップはペグ化反応およびＣＥＸ精製であった。α−ＣＤは高次ペグ化型の形成を減らし、ペグ化反応の速度を遅くして、ペグ化反応終結（ＣＥＸカラム上での適用）の領域がさらに広くなり大規模工程にさらに適するようになるので、ペグ化反応に導入された。反応の特異性は、ｐＨ６．５でペグ化反応を実施することにより改善された。さらに、最終産物の組成はＣＥＸによる精製によって制御される。ＣＥＸは、リシンペグ化分子とＮ末端ペグ化分子との間の部分的分離が達成されるように設計した。最終産物の一貫性はＣＥＸ画分の適切な貯留により保証される。アイソフォームの一貫した組成を保証する貯留基準のＩＰＣ制御は、分析ＣＥ−ＨＰＬＣにより実施される。
【０１９９】
ＰＥＧ試薬および還元剤の調製
３．３５ｇの配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドを解凍し、室温に温度調節し、穏やかに混ぜることによりホモジナイズした。ＰＥＧ試薬（３０ｋＤａポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド；ＮＯＦ）は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中２００ｍｇ／ｍｌ保存液として調製した。α−ＣＤの１２％溶液は、１４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４にα−ＣＤを溶解させることにより調製した。１Ｍ  ＮａＯＨ中５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３を１２％α−ＣＤ溶液に添加して、ＮａＣＮＢＨ３の１９１ｍＭ保存液を得た。
【０２００】
ペグ化反応
溶解したＰＥＧ−ＣＨＯ試薬を配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド溶液に添加した。ペグ化反応はα−ＣＤおよびＮａＣＮＢＨ３溶液の添加により開始した。ペグ化反応は、タンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌ、２．２５モル過剰のＰＥＧ試薬、５０ｍＭ濃度のＮａＣＮＢＨ３、および３％濃度のα−ＣＤで、２２℃、ｐＨ６．４で２０．５時間行われた。
【０２０１】
クロマトグラフィー精製
ＣＥＸカラムへの結合を達成するため、ペグ化混合物は水で２倍に希釈した。希釈反応混合物は、バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で平衡化されたＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、径５ｃｍ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラム上にロードした。カラムは３カラム体積の平衡バッファーで洗浄した。ペプチド型は、５カラム体積中、直線勾配０〜４０％の溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を使用して溶出させた。全流出の流速は７５ｃｍ／時に維持した。溶出ピークは分析ＣＥ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣに従って分画し貯留した。典型的なＣＥＸクロマトグラムを図４に示している。
【０２０２】
貯留
画分の貯留はＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＥ−ＨＰＬＣ分析に従って実施する。貯留物組成は表４に示している。
【０２０３】
ＵＦ／ＤＦステップ、無菌濾過および充填
限外濾過およびダイアフィルトレーションステップは、配列番号５５のペグ化ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドを濃縮し、バッファーを交換するために実施した。バッファーは７ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０に交換した。限外濾過およびダイアフィルトレーションでは、３つのＰｅｌｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｍａｘ５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜を使用した。ダイアフィルトレーションは、６〜７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で実施し、８体積分ターンオーバーした。ＵＦ／ＤＦステップ後の濃縮された試料は、０．２μｍポアサイズのポリエーテルスルホン膜フィルターを使用して無菌濾過し、最終貯蔵容器（Ｎａｌｇｅｎｅ２５ｍｌＰＥＴＧビン）に充填した。
【０２０４】
【表５】
2017502005.tif 000012
【実施例５】
【０２０５】
本実施例は、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上での配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドペグ化混合物の精製を実証している。
【０２０６】
ペグ化反応
０．３ｇの配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドを解凍し、室温に温度調節し、穏やかに混ぜることによりホモジナイズした。固形ＰＥＧ試薬（ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド；ＮＯＦ）および固形α−ＣＤを配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド溶液に添加した。ペグ化反応はＮａＣＮＢＨ３保存液の添加により開始した。ペグ化反応は、タンパク質濃度４．７５ｍｇ／ｍｌ、３モル過剰のＰＥＧ試薬、４０ｍＭ濃度のＮａＣＮＢＨ３、および３％濃度のα−ＣＤで、２２℃、ｐＨ６．５で３時間行われた。
【０２０７】
分離
異なるＣＥＸ樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ  ６５０ＳおよびＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）上での分離の付き合わせでの比較では、数回の分離実行を可能にする比較的多量のペグ化混合物を調製した。ペグ化反応は混合液をＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷカラム（ＮａＣＮＢＨ３除去およびＰＥＧ除去）に充てることにより終結させ、元のペグ化バッファー１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５に戻した（Ａｍｉｃｏｎ限外遠心装置を使用し、５．０００ｋＤａは切り捨てた）。
【０２０８】
２２．８ｍｇの配列番号５５のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドは、バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で平衡化されたＴｒｉｃｏｒｎ１０／１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、径１ｃｍ）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上にロードした。カラムは３カラム体積の平衡バッファーで洗浄した。ペプチド型は、１５カラム体積で、直線勾配０〜８５％の溶出バッファー（４０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を使用して溶出させた。全流出の流速は０．９ｍｌ／分に維持した。溶出ピークは分析ＣＥ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣに従って分画し貯留した。ＣＥＸクロマトグラムは図５に示している。
【０２０９】
上記ｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチド変異体に加えて、以下の追加のタンパク質変異体を上記発明方法に従ってペグ化することが可能であるが、以下のタンパク質変異体に限定されない。
【実施例６】
【０２１０】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６）。
【実施例７】
【０２１１】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７）。
【実施例８】
【０２１２】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８）。
【実施例９】
【０２１３】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９）。
【実施例１０】
【０２１４】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１０）。
【実施例１１】
【０２１５】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１１）。
【実施例１２】
【０２１６】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１２）。
【実施例１３】
【０２１７】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１３）。
【実施例１４】
【０２１８】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号１４）。
【実施例１５】
【０２１９】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１５）。
【実施例１６】
【０２２０】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１６）。
【実施例１７】
【０２２１】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号１７）。
【実施例１８】
【０２２２】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１８）。
【実施例１９】
【０２２３】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号１９）。
【実施例２０】
【０２２４】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２０）。
【実施例２１】
【０２２５】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号２１）。
【実施例２２】
【０２２６】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２２）。
【実施例２３】
【０２２７】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２３）。
【実施例２４】
【０２２８】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号２４）。
【実施例２５】
【０２２９】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２５）。
【実施例２６】
【０２３０】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２６）。
【実施例２７】
【０２３１】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換され、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号２７）。
【実施例２８】
【０２３２】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換され、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号２８）。
【実施例２９】
【０２３３】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換され、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号２９）。
【実施例３０】
【０２３４】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３０）。
【実施例３１】
【０２３５】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３０）。
【実施例３２】
【０２３６】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３２）。
【実施例３３】
【０２３７】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３３）。
【実施例３４】
【０２３８】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７の両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｑｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３４）。
【実施例３５】
【０２３９】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３５）。
【実施例３６】
【０２４０】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３６）。
【実施例３７】
【０２４１】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３７）。
【実施例３８】
【０２４２】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号３８）。
【実施例３９】
【０２４３】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号３９）。
【実施例４０】
【０２４４】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４０）。
【実施例４１】
【０２４５】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号４１）。
【実施例４２】
【０２４６】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４２）。
【実施例４３】
【０２４７】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４３）。
【実施例４４】
【０２４８】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号４４）。
【実施例４５】
【０２４９】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４５）。
【実施例４６】
【０２５０】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４６）。
【実施例４７】
【０２５１】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号４７）。
【実施例４８】
【０２５２】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４８）。
【実施例４９】
【０２５３】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号４９）。
【実施例５０】
【０２５４】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５０）。
【実施例５１】
【０２５５】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号５１）。
【実施例５２】
【０２５６】
Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号５２）。
【実施例５３】
【０２５７】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５３）。
【実施例５４】
【０２５８】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５４）。
【実施例５５】
【０２５９】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５５（変異体６３））。
【実施例５６】
【０２６０】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５６）。
【実施例５７】
【０２６１】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５７）。
【実施例５８】
【０２６２】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５８）。
【実施例５９】
【０２６３】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号５９）。
【実施例６０】
【０２６４】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６０）。
【実施例６１】
【０２６５】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号６１）。
【実施例６２】
【０２６６】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｒａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６２）。
【実施例６３】
【０２６７】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６３）。
【実施例６４】
【０２６８】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号６４）。
【実施例６５】
【０２６９】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６５）。
【実施例６６】
【０２７０】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６６）。
【実施例６７】
【０２７１】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号６７）。
【実施例６８】
【０２７２】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６８）。
【実施例６９】
【０２７３】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号６９）。
【実施例７０】
【０２７４】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号７０）。
【実施例７１】
【０２７５】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７１）。
【実施例７２】
【０２７６】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７２）。
【実施例７３】
【０２７７】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７３）。
【実施例７４】
【０２７８】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号７４）。
【実施例７５】
【０２７９】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｋｓａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号７５）。
【実施例７６】
【０２８０】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７６）。
【実施例７７】
【０２８１】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７７）。
【実施例７８】
【０２８２】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７８）。
【実施例７９】
【０２８３】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号７９）。
【実施例８０】
【０２８４】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｑｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８０）。
【実施例８１】
【０２８５】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｒａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８１）。
【実施例８２】
【０２８６】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８２）。
【実施例８３】
【０２８７】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８３）。
【実施例８４】
【０２８８】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｒａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号８４）。
【実施例８５】
【０２８９】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８５）。
【実施例８６】
【０２９０】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８６）。
【実施例８７】
【０２９１】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がグルタミン酸（Ｅ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｅａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号８７）。
【実施例８８】
【０２９２】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８８）。
【実施例８９】
【０２９３】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号８９）。
【実施例９０】
【０２９４】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がアラニン（Ａ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミンに突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号９０）。
【実施例９１】
【０２９５】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９１）。
【実施例９２】
【０２９６】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９２）。
【実施例９３】
【０２９７】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３７がプロリン（Ｐ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｒｐａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号９３）。
【実施例９４】
【０２９８】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｒｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９４）。
【実施例９５】
【０２９９】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９５）。
【実施例９６】
【０３００】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４およびＲ７７がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｒｍ（配列番号９６）。
【実施例９７】
【０３０１】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６とＲ３７は両方がグルタミン（Ｑ）で置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑｑａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号９７）。
【実施例９８】
【０３０２】
Ｅ３が欠失しており、アミノ酸Ｒ３６がグルタミン（Ｑ）で置換されており、Ｒ３７がアラニンで置換されており、アミノ酸Ｋ６８、Ｓ６９、Ａ７０、Ｒ７１およびＳ７２が欠失しており、アミノ酸Ｒ７４、Ｒ７７およびＲ１０４がグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
ｇｐｔｌｃｇａｅｌｖｄａｌｑｆｖｃｇｄｒｇｆｙｆｎｋｐｔｇｙｇｓｓｓｑａａｐｑｔｇｉｖｄｅｃｃｆｒｓｃｄｌｒｒｌｅｍｙｃａｐｌｋｐａｖｑａｑｑｈｔｄｍｐｋｔｑｋｅｖｈｌｋｎａｓｒｇｓａｇｎｋｎｙｑｍ（配列番号９８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017502005.tif 000019
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