(57)【要約】グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)模倣化合物と抗精神病薬とを含む新規の薬物組み合わせ、1つまたは複数のそのような組み合わせを含む薬学的組成物、1つまたは複数のそのような組み合わせを含む薬学的組成物を調製する方法、およびそのような組み合わせまたは薬学的組成物を使用して、GPx媒介障害と関連する1つまたは複数の疾患、精神病性障害、または高用量でもしくは長期間抗精神病薬を投与することによる合併症を治療、予防、抑制、または改善する方法が本明細書において開示される。さらに、治療有効量のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣化合物を同時投与する工程を含む、該抗精神病薬の投与量を減らすための方法も開示される。2017534673.tif 000033
2017534673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のグルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物を同時投与する工程を含む、精神病性障害を治療するための投与される抗精神病薬の用量を減らす方法であって、同時投与される該グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物の存在下での抗精神病化合物の有効投与量が、該グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物の非存在下での該抗精神病化合物の有効用量よりも少ない、方法。
【請求項２】
前記グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物が、エブセレン、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリン、6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリン、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗精神病薬が、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記精神病性障害がGPx媒介障害である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記精神病性障害が、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症、関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、それらの随伴症状または合併症を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
治療有効量のグルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物と抗精神病薬とを含む薬物組み合わせを投与する、精神病性障害を治療する方法。
【請求項７】
前記グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物が、エブセレン、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリン、6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリン、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記抗精神病薬が、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記精神病性障害がGPx媒介障害である、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記精神病性障害が、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症、関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、それらの随伴症状または合併症を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
治療有効量のグルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物を同時投与する工程を含む、精神病性障害を治療するための抗精神病薬を投与することによる副作用を軽減する方法。
【請求項１２】
前記グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物が、エブセレン、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリン、6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリン、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗精神病薬が、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記副作用が遅発性ジスキネジアである、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
治療剤の組み合わせを含み、該組み合わせが、
(i)グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物またはその薬学的に許容される塩；および
(ii)抗精神病薬またはその薬学的に許容される塩
からなる、薬学的組成物。
【請求項１６】
前記グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物が、エブセレン、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリン、6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリン、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記抗精神病薬が、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記グルタチオンプロドラッグが、式：
2017534673.tif 000029
の化合物を含み、
式中、
R1は、H、メチル、エチル、またはイソプロピルであり；
R2は、H、またはエチルであり；かつ
R3は、H、アセチル、フェニルアセチル、
2017534673.tif 000030
である、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記システインプロドラッグが、N-アセチルシステイン、N,N’-ジアセチルシステイン、N-アセチルシステインアミド、N-アセチルシステイン、S-アリルシステイン、S-メチルシステイン、S-エチルシステイン、S-プロピルシステイン、および式：
2017534673.tif 000031
の化合物からなる群より選択される化合物を含み、
式中、
R1は、H、オキソ、メチル、エチル、n-プロピル、n-ペンチル、フェニル、-(CHOH)nCH2OH、ここでnは1〜5である、または
2017534673.tif 000032
であり；かつ
R2は、Hまたは-COOHである、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記システインプロドラッグが2置換チアゾリジン-4-カルボン酸を含み、チアゾリジン-4-カルボン酸の2置換がアルドース単糖類である、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記アルドース単糖類が、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、およびマンノースからなる群より選択される、請求項20に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年9月15日に出願された米国特許仮出願第62/050,635号の恩典を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、GPx媒介障害を治療する組成物および方法に関する。特に、組成物は、グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーターと抗精神病薬との組み合わせを含む。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
数十年間にわたって、ドーパミンは、統合失調症(SZ)についての病態生理学的視点および療法の中心であり、GABAおよびグルタミン酸神経伝達理論が続いた。最近になって、SZの病態生理は酸化ストレスと強く関連付けられた(Do et al., 2009; Kano et al., 2013)。中枢神経系のニューロンなどの活性細胞において、自然抗酸化防御は、グルタチオンの還元形態、即ち単量体グルタチオン(GSH)の、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)による、グルタチオンの酸化形態、即ちグルタチオンジスルフィド(GSSG)への変換を介しての、グルタチオンによるフリーラジカルの隔離を含む。GPxの主な機能および酸化還元機構のGSH→GPx→GSSG方向は、フリーラジカル、例えば、過酸化水素(H2O2)、ペルオキシ亜硝酸(ONOO-)、および脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)をそれらの対応の酸化還元不活性相当物、例えば水およびアルコールへ還元し、細胞膜、タンパク質および他の構造体を酸化的損傷から保護することである。
【０００４】
GPx媒介変化を含めて、抗酸化システムにおける多くの基質および酵素が、SZにおいて調べられた。研究は、代償機構が酸化ストレスに依然として対抗することができる最初のエピソードの間にGPxの変化を示した。全体的にみて、GPx酸化還元機構を直接ターゲットとする薬物は現在存在しないが、GPx活性とSZとの間に強い相関性が存在することが示された。
【０００５】
本発明は、以下に記載するように、先行技術のこれらおよび他の欠点に取り組む。
【発明の概要】
【０００６】
概要
その多くの態様において、本開示は、例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)モジュレーターとして有用な化合物の新規の組み合わせ、そのような組み合わせを調製する方法、1つまたは複数のそのような組み合わせを含む薬学的組成物、1つまたは複数のそのような組み合わせを含む薬学的組成物を調製する方法、およびそのような組み合わせまたは薬学的組成物を使用して、GPx媒介障害と関連する1つまたは複数の疾患を治療、予防、抑制、または改善する方法を提供する。
【０００７】
新規の組み合わせのいくつかの態様は、少なくとも2つの化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含み、第1の化合物はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣化合物であり、第2の化合物は抗精神病薬である。
【０００８】
いくつかの態様において、グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物は、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣化合物、グルタチオン(GSH)、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される。
【０００９】
いくつかの態様において、抗精神病薬は、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１０】
いくつかの態様において、グルチオン（gluthione）ペルオキシダーゼ模倣化合物の代表的な化合物は、実験式C13H9NOSe、分子量274.2、および
2017534673.tif 000003
の式を有する(2-フェニル-1,2-ベンゾイソセレナゾール-3(2H)-オン)である、エブセレンを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、グルチオンペルオキシダーゼ模倣物は、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリンおよび6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリンを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、代表的なグルタチオンプロドラッグは、式：
2017534673.tif 000004
の化合物を含み、
式中、
R1は、H、メチル、エチル、またはイソプロピルであり；
R2は、H、またはエチルであり；かつ
R3は、H、アセチル、フェニルアセチル、
2017534673.tif 000005
である。
【００１３】
いくつかの態様において、代表的なシステインプロドラッグは、
2017534673.tif 000006
の式を有するN-アセチルシステイン(NAC)を含む。
【００１４】
システインプロドラッグのいくつかの態様は、N,N’-ジアセチルシステイン、N-アセチルシステインアミド、NACエステル(アルキルエステル、グリコールアミドエステルおよびアシクロキシメチルエステル)、S-アリルシステイン、S-メチルシステイン、S-エチルシステイン、S-プロピルシステイン、または式：
2017534673.tif 000007
の化合物を含み、
式中、
R1は、H、オキソ、メチル、エチル、n-プロピル、n-ペンチル、フェニル、-(CHOH)nCH2OH、ここでnは1〜5である、または
2017534673.tif 000008
であり；かつ
R2は、Hまたは-COOHである。
【００１５】
システインプロドラッグのいくつかの態様は、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、およびマンノースなどの、アルドース単糖類での2置換チアゾリジン-4-カルボン酸を含む。
【００１６】
本開示の別の局面は、新規の組み合わせおよび少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００１７】
本開示のさらに別の局面は、治療有効量の新規の組み合わせを対象へ投与する工程を含む、GPx活性によって媒介される疾患、障害、もしくは状態に罹患しているかまたはそれらと診断された対象を治療する方法を特徴とする。そのような疾患、障害、または状態としては、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症または関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症が挙げられ得るが、これらに限定されない。新規の組み合わせ中に含まれる各化合物の治療有効量はそれぞれ約0.1 mg/日〜約5000 mg/日であり得る。
【００１８】
本開示の別の局面は、グルチオンペルオキシダーゼモジュレーター化合物を抗精神病薬と同時投与する段階によって、抗精神病薬を投与することによる副作用を軽減するための方法を特徴とする。特に、エブセレンを抗精神病薬と同時投与する段階によって、抗精神病薬を投与することによる副作用を軽減すること。さらにより特には、エブセレンを同時投与する段階によって、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、またはそれらの組み合わせを投与することによる副作用を軽減すること。いくつかの態様において、抗精神病薬を投与することによる副作用は、抗精神病薬を患者へ高用量でまたは長期間にわたって投与することによる遅発性ジスキネジアおよび他の合併症を含む。
【００１９】
本開示はさらに、新規の組み合わせの化合物のいずれかおよび薬学的に許容される担体を混合する工程を含む、薬学的組成物を製造するための方法を特徴とする。
【００２０】
追加の態様およびそれらの利点は、以下の詳細な議論、スキーム、実施例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明のこれらおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明、および添付の図面に関してよりよく理解されるだろう。
本発明のこれらおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明、および添付の図面に関してよりよく理解されるだろう。
【図１】図1Aおよび1Bは、ある態様に従って、NC(黒色バー)と比較したSZ(灰色バー)における(A)減少した血中GSHおよび(B)増大したGSSGを示す(Ballesteros et al. 2013a)。
【図２】図2Aおよび2Bは、ある態様に従って、(A)ACCでのMRS GSHスペクトル(灰色)および(B)GSH測定における正確度を示す。
【図３】図3A〜3Cは、ある態様に従って、(A)正常対照(NC)(n＝25)と比較した統合失調症(SZ)(n＝29)における減少したミスマッチ陰性電位(MMN)振幅(*p＝0.015)、(B)NCにおけるMMNとGSHとの有意な相関性(r＝-0.46、p＝0.03)、および(C)そのような関係がSZにおいては観察されないこと(r＝0.04、p＝0.85)を示す(Ballesteros et al 2013a)。
【図４】ある態様に従って、神経振動応答がGSHおよびGSSGと社会機能尺度UPSA-2(カリフォルニア日常生活技能簡易評価尺度タイプ2)とのメディエーターであった、多変量媒介モデルを示す。灰色実線は、UPSA-2に対するGSHおよびGSSGの直接的かつ有意な効果を示す。灰色点線は、21〜40 Hz振動応答が、GSHを機能的転帰(UPSA-2)へリンクする有意な中間バイオマーカーであったという有意な間接的な効果を示す。
【図５】図5A〜5Dは、ある態様に従って、エブセレンの提唱された抗酸化作用機構を示す(Kil et al., 2007; およびAntony et al, 2011より採用)。(A)活性酸素種(ROS、例えば、H2O2)はGSHおよびGPxによって還元され；エブセレンは、GPx模倣物として作用することによってこのプロセスを支援する。(B)活性窒素種(RNS、例えば、ペルオキシ亜硝酸ONOO-)も同じGSHシステムによって還元される。(C)脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)は、GPxによって二電子還元を受け、酸化還元不活性アルコール(LOH)を形成する；この脂質過酸化レドックスにおけるエブセレンの効果が十分に支持される、重要な膜／ミエリン細胞保護／修復機構。(D)エブセレンは、別の重要な酸化防御である、テオレドキシン(Trx)システムについての基質であり、エブセレンはTrxおよびトレドキシンレダクターゼ（thoredoxin reductase）(TrxR)によってエブセレンセレノール(Ebs-H)へ還元され；Ebs-Hは、次いで、効率的なH2O2レダクターゼとして働く。
【図６】図6Aおよび6Bは、ある態様に従って、基底ニューロンGSHレベルの増加に対するエブセレンの効果を示す。(A)エブセレン処置は、ストレス状態下で見られたGSHに対するそれと同様に、基底ニューロンGSHレベルを増加させた。(B)グルタメート誘導GSH消耗に対するエブセレンの神経保護効果；グルタメートによる神経毒性（neurotoxity）は細胞内GSHレベルを減少させ(三角形)、エブセレンは基底GSHレベルを増加させる(正方形)；ならびに、エブセレンおよびグルタメートの効果(菱形)。
【図７】図7A〜7Cは、ある態様に従って、NVHLが、PFC中におけるPV介在ニューロン標識の青年期増加をブロッキングすることを示す。(A)幼若(P21)および成体(P61)シャム(プラセボ)、NVHL、およびNAC処置NVHLラットにおける前前頭PV染色の代表的な顕微鏡写真。スケールバーは80μmである。(B)全ての4つの処置群におけるP21(左)およびP61(右)において不偏立体解析を使用したPV細胞カウントを示す棒グラフ。PV細胞カウントは、シャムにおいてP21およびP61の間で増加したが、NVHLラットにおいては増加しなかった。幼若NAC処置は、NVHLラットにおけるPV細胞数の進行をレスキューした。ANOVA F(5,36)＝4.7、p＝0.002。歳: F(1,36)＝10.2、p＝0.003、傷害: F(1,36)＝1.36、p＝0.11、傷害×歳: F(1,36)＝6.7、p＝0.014、処置: F(1,36)＝3.9、p＝0.057、処置×歳: n.s.。(C)NAC処置ならびに幼若(P21)および成体(P61)評価の時間的経過を示すダイヤグラム。この図および全ての他の図において、データを平均値±SEM、*p＜0.05として表す。
【図８】図8A〜8Dは、ある態様に従って、NVHLラットのPFC中における酸化ストレスを8-オキソ-dGで示す。(A)P21での4つの群におけるPFC中のPV(赤色)および8-オキソ-dG(緑色)についての二重標識を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバーは10μmである。(B)NVHLがP21でのPFC中における8-オキソ-dG標識の大量の増加を引き起こし、これは幼若NAC処置によって予防されることを示すデータの要約。上のグラフは8-オキソ-dG蛍光強度を示し、下のグラフは、各群における標識されたボクセルの数を定量化する。8-オキソ-dG強度についてのANOVA: F(3,14)＝13.7、p＝0.00002、傷害 F(1,14)＝18.4、p＝0.008、処置 F(1,14)＝9.6、p＝0.008、傷害×処置 F(1,14)＝13.0、p＝0.003。(C)P61でのPFC中におけるPV(赤色)および8-オキソ-dG(緑色)についての二重標識を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバーは10μmである。(D)NVHLがP61でのPFC中における8-オキソ-dGを増加させ、これは幼若NAC処置によって予防されることを示すデータの要約。8-オキソ-dG強度についてのANOVA: F(3,18)＝7.8、p＝0.001、傷害 F(1,18)＝12.5、p＝0.002、処置 F(1,18)＝0.13、p＝n.s.、傷害×処置 F(1,18)＝10.8、p＝0.004。
【図９】図9Aおよび9Bは、ある態様に従って、成体NVHLラットのPFC中における酸化ストレスを3-NTで示す。(A)3つの群における3-NT(緑色)、WFA(青色)およびPV(赤色)についての三重標識を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバーは100μmである。(B)NVHLがP61でのPFC中における3-NT標識の有意な増加を引き起こし、これは幼若NAC処置によって予防されることを示すデータの要約。グラフは各群における3-NT蛍光強度を示す。3-NT強度についての一元配置分散分析は、処置の非常に有意な効果を明らかにした(F(2,53)＝85.2、p＜0.0001)。Tukey-Kramerを使用した各対間の比較もまた、シャム対NVHLおよびNVHL対NACについて有意差を示した(p＜0.0001)。
【図１０】図10A〜10Cは、ある態様に従うNVHL傷害を示す。(A)海馬のレベルでの、シャム(左)、未処置NVHL(中央)、およびNAC処置NVHL(右)脳からの代表的な切片の顕微鏡写真。矢印は腹側海馬中の細胞消失を示し、星印は拡大した脳室を示す。(B)腹側海馬の全体にわたる異なる吻側尾側レベルでの未処置NVHLラット(水)における最小(黒色)および最大の傷害の程度を示す図。(C)NAC処置NVHLラットにおける傷害の程度を示す同様の図。
【図１１】図11Aおよび11Bは、ある態様に従って、NVHLが、PV中において増加した酸化ストレスを引き起こし得るが、CRおよびCB介在ニューロン中においては引き起こさず、これは発達段階でのNAC処置によって予防されることを示す。(A)シャム、NVHLおよびNAC処置NVHLラットのPFC中におけるパルブアルブミン(PV)-、カルレチニン(CR)-およびカルビンジン(CB)-陽性介在ニューロン(赤色)の8-オキソ-dG標識(緑色)を示す顕微鏡写真。スケールバーは10μmである。(B)データの要約。PV介在ニューロンにおいて、8-オキソ-dG標識はNVHL傷害後に増加し、これはNAC処置で予防された(処置: F(2,65)＝212.97、p＜0.0001)。***p＜0.001。
【図１２】図12Aおよび12Bは、ある態様に従って、ニューロン周囲網(PNN)が、成体NVHLラットのPFC中において減少し得るが、幼若NAC処置によってレスキューされたことを示す。(A)PNNを標識する、PV(赤色)およびウィステリア・フロリブンダ凝集素(WFA；緑色)の二重標識を示す、代表的な顕微鏡写真。スケールバーは10μmである。(B)PV介在ニューロン(PVI)カウント(上部)ならびにPVおよびWFAで同時標識された細胞の数(下部)を示すプロット。PVIカウントはNVHL傷害後に減少し、この減少は幼若NAC処置によって予防される。(全体的効果: F(8,16)＝3.8、p＝0.01、PVIカウント: F(2,11)＝15.3、p＜0.0007)。WFA PVIの数は、対照と比較してNVHLラットにおいて減少し、この減少は幼若NAC処置で予防される(PNNカウント: F(2,11)＝28.5、p＜0.0001)。**p＜0.01、***p＜0.001。
【図１３】図13A〜13Eは、ある態様に従って、電気生理学的欠陥が、NVHLラットにおいてN-アセチルシステイン(NAC)処置によってレスキューされ得ることを示す。(A)D2-アゴニストであるキンピロール(5μM)のバス適用前(黒色トレース)および後(緑色トレース)の、成体PFC中における浅層電気刺激によって誘発された興奮性シナプス後電位(EPSP)の代表的なトレース。(B)PFC中におけるニューロビオチン充填第V層錐体細胞；双極刺激電極および記録電極の相対的位置を図によって示す。(C)シャム、NVHL、およびNAC処置NVHLラットからのスライス中におけるキンピロールによるEPSP減衰の大きさを示す棒グラフ。シャムラットにおいて、キンピロールはシナプス反応のサイズを減少させ、一方、NVHLラットにおいて、この減衰はない。発達段階でのNAC処置は、NVHL動物においてこの欠陥を逆転する(ANOVA: F(2,39)＝3.328、p＝0.046)。(D)麻酔されたシャム(上部)、NVHL(中央)、およびNAC処置NVHL(下部)ラットにおける20 Hzでの5つのパルスのパルス列での腹側被蓋野(VTA)の電気刺激に対する応答を示すPFC錐体ニューロン中におけるインビボ細胞内記録からのトレース。各パネルは、各群において観察された応答の代表的なタイプを示す5つのトレースのオーバーレイであり、NVHLはVTA刺激後に増強された発火を示し、一方、シャムおよびNAC処置NVHLラットにおいて発火は僅かである。(E)全ての3つの群におけるVTA刺激後の500 msエポックにおける活動電位発火についての群データを示す棒グラフ。ANOVA: F(2,37)＝4.5、p＜0.05；NVHL発火は、シャムにおけるものよりも高く(事後Tukey q＝3.9、p＜0.05)、NAC処置NVHLラットにおけるものよりも高かった(事後Tukey q＝3.6、p＜0.05)。全ての電気生理学実験において、シャムおよびNAC処置シャムラットからのデータを、それらが差異を示さなかったために合わせた。
【図１４】図14Aおよび14Bは、ある態様に従って、ミスマッチ陰性電位(MMN)不足がNAC処置によってレスキューされ得ることを示す。(A)シャム(n＝6; 上部)、NVHL(n＝3; 中央)、およびNAC処置NVHLラット(n＝3; 下部)における標準(青色)および逸脱(赤色)刺激からの聴覚誘発電位の代表的なトレース。緑色ボックスは、陰性電位が測定されたエポック(刺激後35〜100 ms)を強調している。全てのトレースは少なくとも80回の繰り返しの平均である。(B)強調された領域中の曲線下面積として測定されたMMNを比較する群データは、群間での有意差を明らかにする(ANOVA: F(2,11)＝9.742; p＝0.006)。示されるデータは、各ラットにおける3つの異なるセッションからの平均である。NVHLおよびNVHL+NACの間の事後比較は有意差を明らかにした(Bonferroni検定; p＝0.005)。
【図１５】図15A〜15Dは、ある態様に従って、プレパルス抑制不足は抗酸化処置でレスキューされ得ることを示す。(A)プレパルス抑制不足が、アポモルフィンを負荷した(0.1 mg/kg、i.p.)場合にNVHLラットにおいて観察された。この不足は幼若NAC処置によって完全に逆転された(傷害: F(1,42)＝3.529 p＝0.067、処置: F(1,42)＝1 .644、p＝0.207、傷害×処置: F(1,42)＝5.730、p＝0.021)。NVHLと比較した、n＝12〜16、* p＜0.05。(B)ラットの別の群において、NACを、P35で開始して投与し、P50で停止し、P61でPPIについてラットを試験した。棒グラフは、青年期NAC処置を用いてのこの群における3つの異なるプレパルス強度でのPPIを示す。ANOVA: 群効果 F(2,28)＝3.364、p＜0.045；事後検定は、シャムと比較したNVHLにおけるPPIの差異についての傾向のみ(LSD、p＝0.069)、およびNVHLとNAC処置NVHLとの間の有意差(LSD、p＝0.016)を明らかにした。(C)一部の動物はP35からエブセレンを受け、P61においてPPIについて試験された。有意な傷害効果(F(1,28)＝7.11; p＝0.013)および処置相互作用による有意な傷害状態(F(1,28)＝7.09; p＝0.013)があった。(D)動物の別のセットはアポシニンを受け、PPIについて試験された。本発明者らは、処置相互作用による有意な傷害を観察した(F(1,25)＝4.8; p＝0.038)。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本開示における態様は、GPx媒介障害、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症または関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症を含むがこれらに限定されない、多数の状態の治療、改善、予防、または抑制のための、少なくとも2つの化合物の新規の組み合わせに関し、第1の化合物はグルタチオンペルオキシダーゼモジュレーターを含み、第2の化合物は抗精神病薬である。
【００２３】
新規の組み合わせの代表的な化合物を本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって記載する。
【００２４】
いくつかの態様において、抗精神病薬は、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、システインプロドラッグ、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２５】
いくつかの態様において、グルタチオンペルオキシダーゼモジュレーターは、グルチオンペルオキシダーゼ模倣化合物、グルタチオン、グルタチオンプロドラッグ、およびシステインプロドラッグからなる群より選択される化合物を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、グルチオンペルオキシダーゼ模倣化合物の代表的な化合物は、実験式C13H9NOSe、分子量274.2、および
2017534673.tif 000009
の式を有する(2-フェニル-1,2-ベンゾイソセレナゾール-3(2H)-オン)である、エブセレンを含む。
【００２７】
いくつかの態様において、グルチオンペルオキシダーゼ模倣化合物は、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリンおよび6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリンを含む。
【００２８】
グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物は、グルタチオンペルオキシダーゼのように、そのSe部分へのフリーラジカルの結合によって活性酸素種を還元する。グルタチオンと反応することによって、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物はフリーラジカル毒性を制限し、従って、ペルオキシ亜硝酸に対して強い活性を示す。グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物である、エブセレンは、ミトコンドリアからのシトクロムC放出および脂質過酸化の間の核損傷を減少させ、従って、酸化ストレスと関連するニューロンのアポトーシスを減じる。活性酸素種の活性を低下させる作用物質は、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症または関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症を含むが、これらに限定されない、酸化ストレス亢進およびそのようなストレスによって引き起こされる疾患の有害効果を改善することができる。
【００２９】
統合失調症患者における酸化ストレスはグルタチオン(GSH)欠乏と関連している。図1Aおよび1Bは、SZ(n＝29)および正常対照患者(n＝25)における空腹時血中GSHおよびグルタチオンジスルフィド(GSSG)を示している。SZにおいてGSHはより低く(p＜0.001)かつGSSGはより高かった(p＝0.023)が、食事、喫煙、または医薬における外因的な原因が、SZにおける異常なGSH酸化還元状態を引き起こすとは分からず、このことは固有の酸化還元異常を示唆している。GSHの減少はクロザピン(p＝0.005)または他の抗精神病治療薬(p＜0.001)を受けている患者においても見られた(Ballesteros et al., 2013a)。
【００３０】
いくつかの態様において、代表的なグルタチオンプロドラッグは、式：
2017534673.tif 000010
の化合物を含み、
式中、
R1は、H、メチル、エチル、またはイソプロピルであり；
R2は、H、またはエチルであり；かつ
R3は、H、アセチル、フェニルアセチル、
2017534673.tif 000011
である。
【００３１】
いくつかの態様において、代表的なシステインプロドラッグは、
2017534673.tif 000012
の式を有するN-アセチルシステイン(NAC)を含む。
【００３２】
システインプロドラッグのいくつかの態様は、N,N’-ジアセチルシステイン、N-アセチルシステインアミド、NACエステル(アルキルエステル、グリコールアミドエステルおよびアシクロキシメチルエステル)、S-アリルシステイン、S-メチルシステイン、S-エチルシステイン、S-プロピルシステイン、または式：
2017534673.tif 000013
の化合物を含み、
式中、
R1は、H、オキソ、メチル、エチル、n-プロピル、n-ペンチル、フェニル、-(CHOH)nCH2OH、ここでnは1〜5である、または
2017534673.tif 000014
であり；かつ
R2は、Hまたは-COOHである。
【００３３】
システインプロドラッグのいくつかの態様は、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、およびマンノースなどの、アルドース単糖類での2置換チアゾリジン-4-カルボン酸を含む。
【００３４】
本開示の別の局面は、新規の組み合わせおよび少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００３５】
本開示はさらに、新規の組み合わせの化合物のいずれかおよび薬学的に許容される担体を混合する工程を含む、薬学的組成物を製造するための方法を特徴とする。
【００３６】
本開示のさらに別の局面は、治療有効量の新規の組み合わせを対象へ投与する工程を含む、GPx活性によって媒介される疾患、障害、もしくは状態に罹患しているかまたはそれらと診断された対象を治療する方法を特徴とする。そのような疾患、障害、または状態としては、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症または関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３７】
本開示の別の局面は、グルチオンペルオキシダーゼ模倣化合物を抗精神病薬と同時投与する段階によって、抗精神病薬を投与することによる副作用を軽減するための方法を特徴とする。特に、エブセレンを抗精神病薬と同時投与することによって、抗精神病薬を投与することによる副作用を軽減すること。さらにより特には、エブセレンを同時投与することによって、クロルプロマジン(トラジン)、ハロペリドール(ハルドール)、ペルフェナジン、フルフェナジン、リスペリドン(リスパダール)、オランザピン(ジプレキサ)、クエチアピン(セロクエル)、ジプラシドン(ゲオドン)、アリピプラゾール(エビリファイ)、パリペリドン(インヴェガ)、ルラシドン(ラツーダ)、またはそれらの組み合わせを投与することによる副作用を軽減すること。いくつかの態様において、抗精神病薬を投与することによる副作用は、抗精神病薬を患者へ高用量でまたは長期間にわたって投与することによる遅発性ジスキネジアおよび他の合併症を含む。
【００３８】
さらなる態様において、それを必要とする対象におけるGPx媒介状態を治療するかまたは改善するための方法は、治療有効量の新規の組み合わせを対象へ投与する工程を含み、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.1 mg/用量〜約5 g/用量である。特に、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.5 mg/用量〜約1000 mg/用量である。より特には、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約1 mg/用量〜約100 mg/用量である。さらなる態様において、組み合わせの1日当たりの用量数は、1〜3用量である。さらなる態様において、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.001 mg/kg/日〜約30 mg/kg/日である。より特には、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.01 mg/kg/日〜約2 mg/kg/日である。
【００３９】
さらなる態様において、それを必要とする対象におけるGPx媒介状態を予防するかまたはその進行を抑制するための方法は、治療有効量の新規の組み合わせを対象へ投与する工程を含み、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.1 mg/用量〜約5 g/用量である。特に、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約1 mg/用量〜約100 mg/用量である。さらなる態様において、組み合わせの1日当たりの用量数は、1〜3用量である。さらなる態様において、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.001 mg/kg/日〜約30 mg/kg/日である。より特には、組み合わせ中の各化合物の治療有効量は、約0.01 mg/kg/日〜約2 mg/kg/日である。
【００４０】
定義／用語
一般に、特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、当業者によって理解される普通の意味を有すると解釈されるように意図される。追加の明確さを提供するために、ある用語を下記に定義する。普通の意味と提供される定義との間に矛盾がある場合、提供される定義が使用される。特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、特に指定のない限り以下に記載されるとおりに、または本開示の全体にわたるそれらの使用によって、定義される。
【００４１】
特に断りのない限り、本明細書において使用される場合の「アルキル」は、単独で使用されるかまたは置換基の部分として使用されるかどうかにかかわらず、親アルカンの単一の炭素原子から1つの水素原子の除去によって誘導される飽和、分岐鎖、または直鎖の一価炭化水素基を指す。典型的なアルキル基としては、メチル；エチル、例えばエタニル；プロピル、例えば、プロパン-1-イル、プロパン-2-イル、シクロプロパン-1-イル；ブチル、例えば、ブタン-1イル、ブタン-2-イル、2-メチル-プロパン-1-イル、2-メチル-プロパン-2-イル、シクロブタン-1-イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、アルキル基は、C1〜6アルキルであり、C1〜3が特に好ましい。「アルコキシ」基は、前述の直鎖または分岐鎖アルキル基から形成される酸素エーテルである。いくつかの態様において、アルキルまたはアルコキシは、独立して、オキソ、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、およびハロ(F、Cl、Br、またはI)を含むがこれらに限定されない、1〜5個、好ましくは1〜3個の基で置換される。
【００４２】
本明細書において使用される場合の用語「アリール」は、炭素原子からなる安定した6員の単環式、または10員の二環式または14員の三環式芳香族環系を含む芳香族基を指す。アリール基の例としては、フェニルまたはナフタレニルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、「アリール」は置換されている。例えば、「アリール」は、例えば、置換されてもよいC1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、ハロ、ヒドロキシル、-CN、-C(O)OH、-C(O)O-C1〜4アルキル、-C(O)NR’R”、-SR’、-OR’、-C(O)R’、-N(R’)(R”)、-S(O)2-R’、および-S(O)2-N(R’)(R”)で置換され得、ここで、R’およびR”は独立して、H、C1〜6-アルキル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルより選択される。
【００４３】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環」は、炭素原子ならびにN、OおよびSより選択される1〜6個のヘテロ原子からなる3〜8員の飽和、または部分的飽和の単環系または縮合環系である。ヘテロシクリル基は、安定した構造の生成をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子で結合され得る。ヘテロシクリル基の例としては、2-イミダゾリン、イミダゾリジン；モルホリン、オキサゾリン、2-ピロリン、3-ピロリン、ピロリジン、ピリドン、ピリミドン、ピペラジン、ピペリジン、インドリン、テトラヒドロフラン、2-ピロリン、3-ピロリン、2-イミダゾリン、2-ピラゾリン、インドリノンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、「ヘテロシクリル」または「複素環」は独立して置換される。例えば、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、例えば、置換されてもよいC1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、ハロ、ヒドロキシル、-CN、-C(O)OH、-C(O)O-C1〜4アルキル、-C(O)NR’R”-OR’、-SR’-C(O)R’、-N(R’)(R”)、-S(O)2-R’、および-S(O)2-N(R’)(R”)で置換され得、ここで、R’およびR”は、独立して、H、C1〜6-アルキル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルより選択される。
【００４４】
用語「オキソ」は、単独でまたは置換基の部分として使用されるかどうかにかかわらず、炭素または硫黄原子のいずれかへのO=を指す。例えば、フタルイミドおよびサッカリンは、オキソ置換基を有する化合物の例である。
【００４５】
用語「シス-トランス異性体」は、基準面に対する原子（または基）の位置が異なる立体異性オレフィンまたはシクロアルカン（またはヘテロ類似体）を指し、シス異性体において原子は同じ側にあり；トランス異性体においてそれらは反対側にある。
【００４６】
用語「置換された」は、1つまたは複数の水素原子が、各々独立して、同じまたは異なる置換基で置き換えられている基を指す。
【００４７】
置換基に関して、用語「独立して」は、2つ以上のそのような置換基が可能である場合、そのような置換基は、互いに同じであってもまたは異なってもよいことを意味する。
【００４８】
分子中の特定の位置での任意の置換基または変数の定義は、その分子中の他のところにおけるその定義と独立していることが意図される。本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定しており、かつ、当技術分野において公知の技術ならびに本明細書に記載される方法によって容易に合成され得る化合物を提供するように、当業者によって選択され得ることが理解される。
【００４９】
同じ組成物中に製剤化されるかどうかにかかわらず、開示される薬学的組成物または開示される薬物組み合わせについての治療目的および予防目的のための有効用量を決定するための方法は、当技術分野において公知である。治療目的について、本明細書において使用される場合の用語「治療有効量」は、治療される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって探求される、組織系、動物またはヒトにおいて、単独でまたは組み合わせて、生物学的または薬効的応答を誘発する、それぞれの活性化合物または薬剤の量を意味する。予防目的（即ち、障害の発症または進行の抑制）について、用語「治療有効量」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって探求される場合の、対象において、単独でまたは組み合わせて、障害を治療するかまたはその発症もしくは進行を抑制する、それぞれの活性化合物または薬剤の量を指す。従って、本発明は2つまたはそれ以上の薬物の組み合わせを提供し、例えば、(a)それぞれの薬物が、独立して治療的にまたは予防的に有効な量で投与されるか；(b)組み合わせのうちの少なくとも1つの薬物が、単独で投与される場合には治療量以下または予防量以下であるが、本発明による第2のまたは追加の薬物と組み合わせて投与される場合には治療的または予防的である量で投与されるか；あるいは(c)両方（またはそれ以上）の薬物が、単独で投与される場合には治療量以下または予防量以下であるが、一緒に投与される場合には治療的または予防的である量で投与される。
【００５０】
用語「薬学的に許容される塩」は、非毒性の薬学的に許容される塩を指す(International J. Pharm., 1986, 33, 201-217; J. Pharm. Sci., 1997 (January), 66, 1, 1を参照)。しかしながら、当業者に周知の他の塩が、本発明による化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の調製において有用であり得る。代表的な有機酸または無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、2-ナフタレンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸またはトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な有機塩基または無機塩基としては、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛などの塩基性またはカチオン性塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、ならびに特定の量の特定の成分の組み合わせから直接または間接的に得られる任意の生成物を包含するように意図される。
【００５２】
用語「対象」は、治療、観察、臨床試験または実験の対象である、生物、動物、例えば哺乳動物、ヒトまたは非ヒト、雄または雌を包含する。対象はヒト患者であり得る。用語「ヒト」は、一般にホモ・サピエンス（Homo sapiens）を指す。本明細書において使用される場合の用語「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、モルモット、チンチラ、およびサルを含むが、これらに限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、難聴、統合失調症、双極性障害、および／または任意の他の精神病性障害の動物モデルを示す対象として有利に使用することができる。
【００５３】
用語「同一性パーセント」または「配列同一性パーセント」は、2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載する配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTPおよびBLASTNまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム)の1つを使用してまたは目視検査によって測定されるように、比較されそして最大の対応についてアライメントされる場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。適用に依存して、「同一性」パーセントは、比較される配列のある領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在し得るか、あるいは、比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。
【００５４】
配列比較について、典型的に、1つの配列は、試験配列が比較される参照配列の役目をする。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００５５】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)によって、または目視検査(一般にAusubel et al.,下記を参照のこと)によって行うことができる。
【００５６】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適しているアルゴリズムの一例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通して公的に利用可能である。
【００５７】
精神病性障害、精神疾患、または精神病性前駆状態としては、酸化ストレス亢進、統合失調症、双極性障害、うつ病、躁病、不安症または関連精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
用語「統計的に有意な」は、結果が偶然によって引き起こされない確率と定義される。
【００５９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、特に文脈が明確に指示しない限り、複数指示物を含むことが注意されるべきである。
【００６０】
本明細書の全体にわたって使用される略語または頭字語は以下を含む。
・ACC：前帯状皮質
・AEC：有害事象チェックリスト
・BPRS：簡便精神医学的評価尺度
・CAT：カタラーゼ
・CDSS：統合失調症に関するカルガリーうつ病尺度
・C-SSRS：コロンビア自殺重症度評価尺度
・EOS：試験終了
・GSH：グルタチオンの還元形態
・GSSG：グルタチオンの酸化形態
・GPx：グルタチオンペルオキシダーゼ
・GR：グルタチオンレダクターゼ
・MCCB：MATRICSコンセンサス認知機能評価バッテリー
・MMN：ミスマッチ陰性電位
・MRS：磁気共鳴分光法
・NAC：N-アセチル-システイン
・NC：正常対照
・NMDAR：N-メチル-D-アスパラギン酸受容体
・POC：概念実証
・Redox：還元／酸化
・RNS：活性窒素種
・ROS：活性酸素種
・SOD：スーパーオキシドジスムターゼ
・SPI：サウンド・ファーマシューティカル・インコーポレイテッド
・SZ：統合失調症患者または統合失調症
・UPSA：カリフォルニア日常生活技能簡易評価尺度
・hまたはhr (時間)
・LCMS (高圧液体クロマトグラフィー質量分析計)
・Me (メチル)
・Mg (ミリグラム)
・rtまたはRT (室温)
・TLC (薄層クロマトグラフィー)
【００６１】
参照文献
2017534673.tif 000015
2017534673.tif 000016
2017534673.tif 000017
2017534673.tif 000018
2017534673.tif 000019
2017534673.tif 000020
2017534673.tif 000021
2017534673.tif 000022
2017534673.tif 000023
【００６２】
化合物
本発明の代表的な化合物を本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって記載する。
【００６３】
グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)模倣物の代表的な化合物は、実験式C13H9NOSe、分子量274.2、および式：
2017534673.tif 000024
を有する(2-フェニル-1,2-ベンゾイソセレナゾール-3(2H)-オン)である、エブセレンを含む。
【００６４】
エブセレンは、製剤で投与される唯一の有効成分である。エブセレンは、25℃で水溶液中に僅かに可溶である。エブセレンは触媒として作用し、解毒反応の間消費されない(Muller et. al, 1988)。エブセレン製剤のある態様は、HPLCによって確認した場合、＞99%純粋である。この製剤の合成は、Rhodia Pharma Solutionsによって提供され、ブリスターパック中に密封されているカプセル剤を含む。各カプセル剤は、200 mgのエブセレン製剤またはSPI-1000(プラセボ)を含有する。
【００６５】
グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)模倣物の他の代表的な化合物は、2,2’-ジセレノ-ビス-β-シクロデキストリンおよび6A,6B-ジセレニン酸-6A’,6B’-セレン架橋β-シクロデキストリンを含む。
【００６６】
組み合わせ中の第2の化合物の代表的な化合物は、グルタチオン(GSH)、表1に列挙されるグルタチオンプロドラッグ、および表2に列挙されるシステインプロドラッグを含む。
【００６７】
（表１）グルタチオンプロドラッグ
2017534673.tif 000025
【００６８】
（表２）システインプロドラッグ
2017534673.tif 000026
2017534673.tif 000027
2017534673.tif 000028
【００６９】
システインプロドラッグのいくつかの他の態様は、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、およびマンノースなどの、アルドース単糖類での2置換チアゾリジン-4-カルボン酸を含む。
【００７０】
本発明による化合物が少なくとも1つのキラル中心を有する場合、それらは従ってエナンチオマーとして存在し得る。化合物が2つまたはそれ以上のキラル中心を有する場合、それらはさらにジアステレオマーとして存在し得る。本発明による化合物の調製のためのプロセスにより立体異性体の混合物が生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィーなどの従来の技術により分離することができる。化合物は、ラセミ体で、または立体特異的合成かもしくは分割かのいずれかによる個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして、調製することができる。化合物は、例えば、光学活性塩基を用いた塩形成、その後の分別結晶化および遊離酸の再生成による、立体異性体対の形成などの、標準技術によって、それらの構成成分のエナンチオマーまたはジアステレオマーへ分割することができる。化合物は、立体異性エステルまたはアミドの形成、その後のクロマトグラフィー分離およびキラル補助基の除去により分割することもできる。あるいは、化合物は、キラルHPLCカラムを使用して分割されてもよい。その全ての立体異性体、ラセミ混合物、ジアステレオマー、幾何異性体、およびエナンチオマーが、本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【００７１】
さらに、化合物の結晶形の一部は、多形体として存在してよく、従って、本発明に含まれるように意図される。加えて、化合物の一部は、水（即ち、水和物）または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してよく、そのような溶媒和物も本発明の範囲内に包含されるように意図される。
【００７２】
一般的な投与、製剤、および投与量
本化合物はGPxモジュレーターであり、従って、統合失調症、双極性障害、精神病性障害、およびそれに関連する他の障害、疾患または状態を含むがこれらに限定されないGPx媒介状態の治療、予防、または進行抑制に有用である。
【００７３】
態様は、GPx媒介疾患を有する対象を治療するための方法を特徴とし、該方法は、本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物の治療有効量を対象へ投与する工程を含む。特に、態様はまた、対象における統合失調症、双極性障害、精神病性障害、遅発性ジスキネジア、およびそれらの随伴症状または合併症を治療するまたはその進行を抑制するための方法を提供し、該方法は、本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物の治療有効量を対象へ投与する工程を含む。
【００７４】
態様はまた、本明細書に開示される化合物のプロドラッグを含む。一般に、そのようなプロドラッグは、必要な化合物へインビボで容易に変換可能である化合物の機能的誘導体である。従って、本発明の治療方法において、用語「投与する」は、具体的に開示される化合物を用いた、または具体的に開示されなくてもよいが、対象への投与後にインビボで特定の化合物へ変換する化合物を用いた、記載される様々な障害の治療を包含する。好適なプロドラッグ誘導体の選択および調製の従来手法は、例えば、“Design of Prodrugs”, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されている。
【００７５】
化合物の結晶形の一部は、多形体として存在してよく、従って、本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物の一部は、水（即ち、水和物）または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してよく、そのような溶媒和物はいくつかの態様によって包含されるように意図される。
【００７６】
本明細書に開示される化合物の調製のためのプロセスにより立体異性体の混合物が生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィーなどの従来の技術により分離することができる。化合物は、ラセミ体で、または立体特異的合成かもしくは分割かのいずれかによる個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして、調製することができる。化合物は、例えば、光学活性塩基を用いた塩形成、その後の分別結晶化および遊離酸の再生成による、立体異性体対の形成などの、標準技術によって、それらの構成成分のエナンチオマーまたはジアステレオマーへ分割することができる。化合物は、立体異性エステルまたはアミドの形成、その後のクロマトグラフィー分離およびキラル補助基の除去により分割することもできる。あるいは、化合物は、キラルHPLCカラムを使用して分割されてもよい。その全ての立体異性体、ラセミ混合物、ジアステレオマー、シス-トランス異性体、およびエナンチオマーが、いくつかの態様によって包含されることが理解される。
【００７７】
投与量
GPxによって媒介される障害、疾患、または状態の治療における当業者は、本明細書以下に提示される試験結果および他の情報から、有効な一日量を決定することができる。厳密な投与量および投与頻度は、当業者には周知であるように、使用される本発明の特定の化合物、治療される特定の状態、治療される状態の重症度、特定の患者の年齢、体重、および全身的な健康状態、ならびに患者が服用中であってもよい他の医薬に依存する。さらに、前記有効な一日量が、治療される患者の応答に応じて、および／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて、減少または増加されてもよいことは明白である。本明細書に記載される有効な一日量の範囲は、従って、本発明の実施における、単なるガイドラインである。
【００７８】
本明細書に開示される化合物のいずれかを使用する本明細書に記載されるGPx媒介障害の治療のための方法について、剤形は、約0.1 mg〜約5000 mg；特に、約0.5 mg〜約1000 mg；より特には、約1 mg〜約100 mgの化合物を含有して、薬学的に許容される担体を含有し、選択される投与様式に適している任意の形態へ構成され得る。しかしながら、投与量は、対象の必要量、治療される状態の重症度、および採用される化合物に応じて変化してもよい。連日投与またはポスト定期的投与（post-periodic dosing）の使用のいずれかを用いることができる。
【００７９】
本明細書における薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、注射剤、坐剤、茶さじなどの、単位投与単位当たり、約0.001 mg/kg/日〜約10 mg/kg/日(特に約0.01 mg/kg/日〜約1 mg/kg/日；より特には約0.1 mg/kg/日〜約0.5 mg/kg/日)を含有し、約0.001 mg/kg/日〜約30 mg/kg/日(特に約0.01 mg/kg/日〜約2 mg/kg/日、より特には約0.1 mg/kg/日〜約1 mg/kg/日、さらにより特には約0.5 mg/kg/日〜約1 mg/kg/日)の投与量で与えられ得る。
【００８０】
これらの組成物は、経口、鼻腔内、舌下、眼内、経皮的、非経口、直腸、膣内、ドライパウダー吸入器、または他の吸入もしくは吸送手段による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、再構成または吸入用の乾燥散剤、顆粒剤、トローチ剤、滅菌非経口液剤または懸濁剤、定量エアゾールまたは液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注入装置または坐剤などからの単位剤形である。あるいは、組成物は、週1回または月1回投与に適している形態で提示することができ；例えば、活性化合物の不溶性塩、例えばデカン酸塩は、筋内注入のためのデポー製剤を提供するように適合されてもよい。
【００８１】
錠剤などの固体薬学的組成物の調製について、主要な有効成分は、薬学的担体、例えば、希釈剤、結合剤、接着剤、崩壊剤、滑沢剤、粘着防止剤、および滑剤（gildant）などの従来の錠剤化成分と混合される。好適な希釈剤としては、デンプン（即ち、加水分解されてもよいトウモロコシ、小麦、またはジャガイモデンプン）、乳糖（顆粒、噴霧乾燥、または無水）、ショ糖、ショ糖系希釈剤（粉砂糖；ショ糖に加えて約7〜10重量パーセントの転化糖；ショ糖に加えて約3重量パーセントの修飾デキストリン；ショ糖に加えて転化糖、約4重量パーセントの転化糖、約0.1〜0.2重量パーセントのコーンスターチおよびステアリン酸マグネシウム）、ブドウ糖、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、微結晶セルロース（即ち、FMC Corp.から入手可能なAVICEL（商標）微結晶セルロース）、リン酸ニカルシウム、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な結合剤および接着剤としては、アカシアガム、グアーガム、トラガカントガム、ショ糖、ゼラチン、グルコース、デンプン、およびセルロース系（即ち、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、水溶性または分散性結合剤（即ち、アルギン酸およびその塩、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ヒドロキシエチルセルロース［即ち、Hoechst Celaneseから入手可能なTYLOSE（商標）］、ポリエチレングリコール、多糖類酸、ベントナイト、ポリビニルピロリドン、ポリメタクリレート、およびアルファ化デンプン）などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な崩壊剤としては、デンプン（トウモロコシ、ジャガイモなど）、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、粘土（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）、セルロース（例えば、架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび微結晶セルロース）、アルギネート、アルファ化デンプン（即ち、コーンスターチなど）、ガム（即ち、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、およびトラガカントガム）、架橋されたポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な滑沢剤および粘着防止剤としては、ステアリン酸塩（マグネシウム、カルシウム、およびナトリウム）、ステアリン酸、タルクワックス、ステアロウェット（stearowet）、ホウ酸、塩化ナトリウム、DL-ロイシン、カーボワックス4000、カーボワックス6000、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な滑剤としては、タルク、コーンスターチ、シリカ（即ち、Cabotから入手可能なCAB-O-SIL（商標）シリカ、W. R. Grace/Davisonから入手可能なSYLOID（商標）シリカ、およびDegussaから入手可能なAEROSIL（商標）シリカ）などが挙げられるが、これらに限定されない。甘味剤および風味剤が、経口剤形の嗜好性を改善するために、チュアブルの固形剤形に添加されてもよい。さらに、着色剤およびコーティングが、薬物の識別を容易にするためまたは美的目的で、固形剤形に添加または適用されてもよい。これらの担体は、薬���的活性物質と共に製剤化され、治療的放出プロファイルを有する薬学的活性物質の正確で適切な用量を提供する。
【００８２】
一般に、これらの担体は、薬学的活性物質と混合されて、本発明の薬学的活性形態またはその薬学的に許容される塩の均質な混合物を含有する、固体プレ製剤組成物を形成する。一般的に、プレ製剤は、(a)湿式造粒、(b)乾式造粒、および(c)乾式混合の、3つの一般的な方法のうちの1つによって形成される。これらのプレ製剤組成物を均質と言う場合、これは、有効成分が組成物全体にむらなく分散し、それゆえに、組成物は同等に効果的な、錠剤、丸剤、およびカプセル剤などの剤形に容易に細分できることを意味する。この固体プレ製剤組成物は、次に約0.1 mg〜約500 mgの本発明の有効成分を含む、上述の種類の単位剤形に細分される。新規組成物を含有する錠剤または丸剤はまた、持続性放出生成物または二重放出生成物を提供するように多層の錠剤または丸剤に製剤化されてもよい。例えば、二重放出の錠剤または丸剤は、内側投与成分および外側投与成分を含むことができ、後者は前者上の包みの形態である。2つの成分は腸溶性の層により分離され得、これは、胃での崩壊に耐えるのに役立ち、また内側成分を無傷で十二指腸内まで通過させ、または放出を遅延させることを可能にする。様々な材料が、このような腸溶性の層またはコーティングに使用され得、このような材料には、セラック、酢酸セルロース（即ち、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートトリメトリテート（trimetllitate））、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、メタクリレートおよびエチルアクリレートコポリマー、メタクリレートおよびメチルメタクリレートコポリマーなどの、多数のポリマー材料が挙げられる。持続放出性錠剤もまた、溶液中のわずかに可溶性のもしくは不溶性の物質（湿式造粒について結合剤として作用する）、または低融点固形物溶融形態（湿式造粒において有効成分を組み込み得る）を使用したフィルムコーティングまたは湿式造粒によって、作製されてもよい。これらの材料は、天然および合成ポリマーワックス、硬化油、脂肪酸およびアルコール（即ち、蜜蝋、カルナバワックス、セチルアルコール、セチルステアリルアルコールなど）、脂肪酸のエステル金属石鹸、ならびに、長期または持続放出性の生成物を達成するための有効成分を粒状にするため、コーティングするため、封入するため、あるいはそうでなければ有効成分の溶解度を制限するために使用され得る、他の許容される材料を含む。
【００８３】
本明細書に開示される新規な組成物が投与経口または注射投与用に組み込まれ得る液体形態としては、水性液剤、好適に香味付けされたシロップ剤、水性または油性懸濁剤、および綿実油、ゴマ油、ヤシ油またはピーナッツ油のような食用油を含む香味付けされたエマルション、ならびにエリキシル剤および同様の薬学的ビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液のための好適な懸濁化剤としては、合成および天然ガム、例えば、アカシア、寒天、アルギネート（即ち、アルギン酸プロピレン、アルギン酸ナトリウムなど）、グアー、カラヤ、イナゴマメ、ペクチン、トラガカント、およびキサンタンガム；セルロース系、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの組み合わせ；合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、カルボマー（即ち、カルボキシポリメチレン）、およびポリエチレングリコール；粘土、例えば、ベントナイト、ヘクトライト、アタパルジャイト、またはセピオライト；ならびにレシチンまたはゼラチンなどの他の薬学的に許容される懸濁化剤などが挙げられる。好適な界面活性剤としては、ドクサートナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、オクトキシノール-9、ノノキシノール-10、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ポリオキサマー（polyoxamer）188、ポリオキサマー235、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好適な解膠剤または分散剤は、医薬品等級のレシチンを含む。好適な凝集剤としては、単純な中性電解液（即ち、塩化ナトリウム、カリウム、および塩化物など）、高電荷の不溶性ポリマーおよび高分子電解質種、水溶性二価または三価イオン（即ち、カルシウム塩、ミョウバンまたは硫酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩（連帯してpH緩衝剤および凝集剤として製剤において使用されてもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な保存剤としては、パラベン（即ち、メチル、エチル、n-プロピル、およびn-ブチル）、ソルビン酸、チメロサール、四級アンモニウム塩、ベンジルアルコール、安息香酸、グルコン酸クロルヘキシジン、フェニルエタノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。液体の薬学的剤形において使用されてもよい多数の液体ビヒクルが存在するが、しかしながら、特定の剤形において使用される液体ビヒクルは、懸濁化剤と相溶性がなければならない。例えば、無極性の液体ビヒクル、例えば、脂肪酸エステルおよび油性の液体ビヒクルは、低HLB（親水性-親油性バランス）の界面活性剤、ステアラルコニウムヘクトライト、不水溶性樹脂、ならびにポリマーを形成する不水溶性フィルムなどの、懸濁化剤と共に使用するのが最適である。逆に、水、アルコール、ポリオールおよびグリコールなどの極性液体は、高HLBの界面活性剤、粘土、ケイ酸塩、ガム、水溶性セルロース、水溶性ポリマーなどの、懸濁化剤と共に使用するのが最適である。非経口投与のためには、無菌懸濁剤および液剤が望まれる。非経口投与用に有用な液体形態としては、滅菌液剤、エマルションおよび懸濁剤が挙げられる。静脈内投与が所望される場合、好適な保存剤を一般に含有する等張調製物を用いる。
【００８４】
さらに、本明細書に開示される化合物は、その組成物が当業者に周知である、好適な鼻腔内ビヒクルの局所使用を介して、または経皮的皮膚用パッチを介して、鼻腔内剤形で投与され得る。経皮送達システム形態で投与するために、治療的用量の投与は、当然ながら、投与レジメン全体にわたって断続的ではなく連続的である。
【００８５】
本明細書に開示される化合物は、小単層ベシクル、大単層ベシクル、多層ベシクルなどの、リポソーム送達システムの形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンなどの、様々なリン脂質から形成されてもよい。
【００８６】
本明細書に開示される薬学的組成物の一日用量は、約0.1 mg〜約5000 mgの広い範囲にわたって変化してもよく；好ましくは、用量は、平均的なヒトについて1日当たり、約1 mg〜約100 mgの範囲内である。経口投与について、組成物は、治療される対象に対する投与量の、症状による調整のために、好ましくは、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250または500ミリグラムの有効成分を含有する錠剤形態で提供される。有利なことに、本発明の化合物は、単一の一日用量で投与してもよいか、または全一日用量を1日2回、3回または4回の分割された用量で投与してもよい。
【００８７】
本明細書に開示される活性化合物またはその薬学的組成物についての治療有効用量は、所望の効果によって変化し得る。従って、投与される最適な投与量は、当業者によって容易に決定することができ、かつ使用される特定の化合物、投与様式、調製物の強度、および病状の進行によって変化し得る。さらに、対象の年齢、体重、食事、および投与時間を含む、治療される特定の対象と関連する因子は、適切な治療レベルへ用量を調節する必要性を生じさせる。上記投与量は、従って、平均的な場合の代表例である。当然ながら、より多いまたはより少ない投与量範囲が正当である個々の例が存在し得、このようなものは本発明の範囲内である。
【００８８】
本明細書に開示される化合物は、GPxモジュレーターとしての本明細書に開示される化合物の使用が、それを必要とする対象に求められる場合にはいつでも、前述の組成物および投与レジメンのいずれかによって、あるいは当技術分野において確立された組成物および投与レジメンによって、投与することができる。
【００８９】
製剤
本明細書に開示される薬学的組成物を調製するために、有効成分としての本明細書に開示される1つまたは複数の化合物またはその塩を、従来の薬学的配合技術に従って、薬学的担体と完全に混合し、この担体は、投与（例えば、経口または非経口）に望ましい調製物の形態に応じて様々な形態をとることができる。好適な薬学的に許容される担体は、当技術分野において周知である。これらの薬学的に許容される担体のいくつかの説明は、American Pharmaceutical AssociationおよびPharmaceutical Society of Great Britain出版のThe Handbook of Pharmaceutical Excipientsに見出すことができる。
【００９０】
本発明の化合物は、投与目的で様々な薬学的形態に製剤化されてもよい。薬学的組成物を製剤化する方法は、Marcel Dekker, Inc.によって出版された、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Second Edition, Revised and Expanded, Volumes 1-3, Liebermanら編；Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Volumes 1-2, Avisら編；およびPharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Volumes 1-2, Liebermanら編などの多数の刊行物に記載されている。
【００９１】
カプセル剤の形態のエブセレン製剤を、エブセレンをGPxモジュレーターとして調べた下記の実施例のために調製し、統合失調症(SZ)患者において調節不全の酵素であるGPxは、新規の治療的SZ標的である。エブセレンは、触媒として作用し、解毒反応の間消費されない、その製剤中の唯一の有効成分である。製剤は、HPLCによって測定した場合、＞99%純粋である。カプセル剤はブリスターパック中に密封されている。各カプセル剤は、その独特の構造安定性に起因して低毒性を有するエブセレンを200 mg含有する。そのセレン(Se)部分は、生体内変化の間に遊離されず、従ってセレン代謝に入らない。製造プロセスにおいて、未結合セレンが存在したままであり得る。製造基準は、各カプセル剤が1マイクログラム未満の無機セレンを含有することである。ヒトにおいて、セレン毒性、またはセレン中毒は、高量のセレンの慢性摂取後に生じ得る。成人についてのセレンの一日所要量(RDA)は1日当たり55マイクログラムである。投与量は、合計のセレン曝露がRDAよりも著しく少なくなるように調節され、これは試験の間モニタリングされる。
【００９２】
使用方法
さらに、新生仔期腹側海馬傷害（neonatal ventral hippocampal lesion）(NVHL)ラットを使用する方法、ならびに、酸化ストレス、統合失調症、双極性障害、および他の精神病性障害を含むがこれらに限定されない、GPx媒介障害を代表する動物モデルの分析／診断に関する方法を本明細書に開示する。本明細書に開示されるこれらの方法の用途は、研究適用、治療的目的、医学的診断、および／または1人または複数の患者もしくは対象の階層化を含み得る。GPx媒介障害の予防または治療に有用である組成物を同定する方法を開示する。
【００９３】
これらの方法のいくつかの態様は、本明細書に開示されるエブセレン作用機構の初期評価および統合失調症患者における脳バイオマーカーエンゲージメントを強調している。一態様は、例えば臨床試験における、主要転帰としてのGSHおよびGSHの他の末梢血バイオマーカーの確証的な脳磁気共鳴分光法を使用する。
【００９４】
酸化ストレス、統合失調症、および他の精神疾患を治療する方法
幼若NVHLラットのPFC中の酸化ストレス免疫標識のレベルの増加が、PV細胞カウントの減少、PPI不足、局所PFC回路の変更されたドーパミン調節、および成体NVHLラットのEEGにおける誘発関連電位の不足と共に観察された。これらの不足の全てが、P5からP50までのN-アセチルシステイン(NAC)処置で予防された。NAC処置が青年期の間(P35)にかつ2つの他の酸化還元モジュレーター(エブセレン、アポシニン)によって開始された場合、PPI不足はまた予防された。データは、前前頭皮質における酸化ストレスが、NVHLによって誘導された変更を媒介するコアな特徴であり、抗酸化処置がこれらの変更を予防することを示した。従って、PVI中に高度に存在しかつ錐体ニューロン中にも観察される発症前酸化ストレスは、酸化還元経路の直接操作を伴わない神経発達モデルにおける多様な統合失調症関連現象を担う。
【００９５】
酸化ストレスは、いくつかの機構を介してPFC機能に影響を与え得る。高レベルの酸化ストレスで、細胞損傷または死が、膜脂質過酸化、DNA突然変異誘発、クロマチン構造の変化、重要な酵素の不活性化、またはキナーゼおよびカスパーゼカスケードの活性化を介して生じ得る(Bitanihirwe and Woo, 2011)。酸化還元不均衡はまた、転写因子のDNA結合部位での酸化還元感受性システイン残基に影響を与えることによって(Haddad, 2002)、および酸化に非常に敏感なミトコンドリアDNAに影響を与えることによって(Jones and Go, 2010)、脳の発達妨害をもたらし得る。
【００９６】
さらに、多くのシナプスタンパク質が調節性酸化還元部位を含み；例えば、NMDA受容体は、酸化後に機能低下となる(Steullet et al., 2006)。酸化ストレスおよびニトロソ化ストレスが、電気生理学的および行動的欠陥の発症前に、NVHLを有する幼若ラットにおけるPFC錐体ニューロンおよびPVIにおいて検出された。これは、PVIが依然としていくぶん機能的であり得ること、および、それらの青年期頃の成熟時に、酸化ストレスの有害効果が、PVおよびPNN標識の減少によって明らかにされたように、それらを疾患状態にすることを示している。本発明者らのデータは、NVHLモデルにおける酸化還元変更が酸化ストレスおよびニトロソ化ストレスの両方を包含すること、ならびに、GHSを増加させる(NACおよびエブセレン)または活性酸素種(ROS)発生を減少させる(アポシニン)処置が、成人発症型行動的欠陥を予防することを示している。従って、NVHLモデルは、GSHおよびNADPHオキシダーゼなどの異なるモジュレーターを標的化することによって逆転され得る、酸化還元経路における広範囲の変更を提示する。
【００９７】
酸化ストレスは、統合失調症の別の動物モデル：ドミナントネガティブDISC1(DN-DISC1)マウスにおいても見られる(Johnson et al., 2013)。DN-DISC1マウスは、いくつかの行動的欠陥と関連するPFC中の8-オキソ-dG染色の増大を有する。データは、PFC中の酸化ストレス亢進と、統合失調症と関連する電気生理学的および行動的欠陥との因果関係を示しており、何故ならば、抗酸化NACが、NVHLラットにおける酸化ストレスの増大ならびに電気生理学的および行動的欠陥の両方を予防するためである。
【００９８】
PFC生理は成体NVHLラットにおいて機能不全であり、この欠陥はNAC処置によって予防された。スライス中の錐体ニューロンにおけるシナプス反応のドーパミン調節、VTA刺激に対する応答のインビボ細胞内記録、および聴覚誘発電位を含む、いくつかのエンドポイントを使用して、PFC機能を評価した。錐体ニューロンからの記録は、スライス中における皮質間EPSPのD2媒介減衰の低下を示し、成体NVHLラットにおいてインビボでVTA刺激によって誘発された発火を強め、このことはO'Donnell et al., 2002; Tseng et al., 2008によっても報告された。錐体細胞シナプス反応のスライスD2減衰およびVTA刺激による錐体ニューロンのインビボサイレンシングは両方とも、ナイーブラットにおいてはドーパミンによるFSIの活性化に依存する(Tseng and O'Donnell, 2007)。NAC処置NVHLラットにおけるこれらの応答の変更の欠如は、生後発達の間の酸化ストレスがドーパミン調節FSI-錐体細胞相互作用に対して有害効果を有することを示している。これらの相互作用は、PFC中における適切な興奮-抑制バランスおよび情報処理のために重要である。現在、介在ニューロンまたは錐体ニューロンが統合失調症における機能不全の主要な部位であるかどうかについての論争がある。本発明者らのデータは、どの細胞タイプが主として影響され、錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンとの間の変更された相互作用の原因として酸化ストレスを強調しているかについては不明である。
【００９９】
ミスマッチ陰性電位は、高トランスレーショナル関連性の指標である。MMNは、逸脱聴覚刺激に対する突出の帰着を試験し、それは統合失調症患者において中断される(Javitt et al., 1993)。MMNはNMDA受容体活性に依存するため(Ehrlichman et al., 2009)、酸化ストレスが、突出シグナル対通常シグナルの処理に関与するNMDA依存的シナプス皮質機構を害する可能性が高い。
【０１００】
NVHLラットにおけるMMN不足が観察され、これはNAC処置によって予防された。抗酸化処置の影響の機能的評価を、PPIでの感覚運動統合の試験によって補完した。幼若および青年期のみのNAC処置は両方とも、NVHLラットにおいて成体PPI不足を予防した。NACまたはエブセレンでの青年期処置がPPI不足を予防するために十分であるという観察は、統合失調症治療についての可能性のある標的としての酸化還元機構についての重要な潜在的重要性となる。たとえ抗酸化処置が酸化ストレスの発生後に開始されたとしても、不足は恐らく予防される。統合失調症について極めて高いリスクの対象を青年期まで同定することができないため、高いリスクがいったん同定された後でたとえ開始されたとしても、酸化還元調節は有利であり得る。
【０１０１】
発症前酸化ストレスは、NVHLラットにおいて異常な成体PFC機能を恐らく引き起こすことが示された。この発達操作は、変更された皮質興奮-抑制バランスの確立したモデルである。このモデルは統合失調症において観察されない傷害を伴うが、NVHLおよび他の発達モデルは、この疾患と関連する電気生理学的および行動的現象の発達的軌跡についての特定の仮説を試験するために有用であった(O'Donnell, 2013)。NVHLモデルの主な強みは、欠陥の青年期発症、およびトランスレーショナルな指標が評価される場合に統合失調症において観察される現象を再現する能力を含む(O'Donnell, 2012a)。注目すべきことに、NVHLモデルは、PVI免疫標識の減少および変更された興奮-抑制バランスをもたらすことにおいて、統合失調症の動物モデルとして見なされたいくつかの他の操作と収束する(O'Donnell, 2011)。
【０１０２】
それらの制限にもかかわらず、開示される実験において使用される行動的および生理学的エンドポイントは、皮質抑制ネットワークの完全性および錐体細胞活性に対するそれらの影響を評価するために広く使用されている。傷害時およびそれ以降に発達する抑制ネットワークは、青年期に広がる神経ネットワークの経験依存的洗練において重大な役割を果たす(Hensch, 2005)。この役割は、成体NVHLラットにおいて認知機能障害を予防する青年期の間の認知訓練(Lee et al., 2012)、および、母体免疫活性化を有するマウスにおける潜在性神経病理を暴く青年期のストレス(Giovanoli et al., 2013)において反映され得る。従って、青年期は、酸化ストレスを伴う病態生理学的状態が、依然として発達中であるPFCに影響を与え得る重要な発達段階であるが、それは治療的介入についての絶好の機会をなお一層提供する。これは、重篤な副作用を有さない抗酸化剤または酸化還元レギュレーターが、皮質PVI機能の低下と関連する病態生理学的変更を予防することによって、精神障害の危険性がある対象における転換を減らすために有効であると分かり得ることを示唆している。
【実施例】
【０１０３】
下記は本発明を行うための特定の態様の実施例である。実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確度を保証する努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が、当然ながら許容されるべきである。
【０１０４】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の技能内の、タンパク質化学、生化学、組み換えDNA技術および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技術は文献中に完全に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照のこと。
【０１０５】
実施例1：脳GSH、末梢GSH、および脂質過酸化マーカー
この実施例は、エブセレン単独でまたは別の抗精神病剤と組み合わせて治療された患者に対する生理学的効果を記載する。前臨床試験におけるエブセレンの主要転帰の一つは、統合失調症(SZ)患者について減少することが以前に示された(Do et al., 2000; Wood et al. 2009)、神経GSHレベルの増大を示した。磁気共鳴分光法(MRS)を改良し、エブセレンによる脳ターゲットエンゲージメントの間、GSHをモニタリングした。磁気共鳴断層撮影装置を使用して効果の大きさを評価するために、非常に短いエコー時間1H-MRSシーケンスを使用して、11人の統合失調症患者および11人の正常対照患者におけるGSHレベルを評価した。図2Aおよび2Bに示されるように前帯状皮質(ACC)でのGSHは、正常対照患者と比較してSZ患者において減少した(平均値±sd＝2.4±0.3 vs. 2.6±0.4、F＝2.0、p＝0.17; d＝0.65)。この方法を使用して、スペクトル定量化は、GSHおよび他の成分について素晴らしいフィッティングをもたらし、クラメール・ラオの下限(CRLB)は10未満であった。
【０１０６】
分光ボクセルについてのMRS GSH試験-再試験再現性を、5人の参加者において1週間空けて評価した。再現性は素晴らしく(CV範囲: 1.0〜2.3; GSH＝1.0; 差異パーセント範囲: 1.5〜4.2%; GSH＝1.5%)、クラス内相関ICC＝0.967であった。GSHの定量化における正確度を決定するために、漸増濃度のGSHを有する5つのファントム(0 mM、1.0 mM、2.5 mM、5 mM、および10 mM)を作製した。他の代謝産物からGSHを分離する特異性を試験するために、各ファントムをさらにmyo-イノシトール、クレアチン、グルコース、グルタメート、グルタミン、およびy-アミノ酪酸（y-aminobuytric acid）と混合した。線形回帰を計算し、標準曲線へのフィッティングを決定し、これはグルタチオン濃度の検出において素晴らしい精度および正確度をもたらし、LC Model定量化ファントムGSH濃度はr2＝0.994で既知のGSH濃度に対応した(Wijtenburg et al., 2013)。高分子バックグラウンドに取り組むために、代謝産物ヌル（nulled）(即ち、高分子スペクトル)が各参加者について取得され、各参加者のスペクトルフィッテイングのために使用される。プラセボとの群比較に加えて、エブセレンによるエブセレン用量依存的および血漿中レベル依存的脳GSH変化を試験することができる。
【０１０７】
末梢GSH、GSSG、およびGPxは、エルセレン（elselen）が酸化還元経路をエンゲージする(engage)機構をモニタリングするための別の方法を提供する。血液対脳組織GSH/GSSG/GPxの直接比較はされなかったが、末梢グルタチオン投与は脳GSHレベルを増加させる(Nehru et al., 2007)。エブセレン効果は、GSHまたはさらにはGSSGおよびGPx変化を通して伝達され得る。エブセレンが脂質過酸化を減少させることを通してその効果を発揮するかどうかを調べるために、膜リン脂質の過酸化によって形成される脂質過酸化のマーカーであるイソプロスタンを測定することができる。尿イソプロスタンは、いくつかの白質疾患において(Miller et al., 2011)およびSZ患者において(Dietrich-Muszalska et al., 2009)増大する。イソプロスタンを使用して、エルセレンによる脂質過酸化の減少に対する可能性のある効果に指標を付けることができる。
【０１０８】
実施例2：電気生理学バイオマーカーのミスマッチ陰性電位およびγ振動
この実施例は、酸化還元調節部位中に含有される酸化還元感受性タンパク質であるN-メチル-D-アスパラギン酸受容体についてのミスマッチ陰性電位(MMN)を記載する(Do et al., 2009, Gonzalez-Burgos et al., 2012, Choi et al., 2012, Kohr, et al., 1994, Nakazawa, et al., 2012)。エブセレンは、この酸化還元調節部位を調節し、ニューロン生存可能性を増大させる(Herin, et al., 2001)。統合失調症(SZ)は、ミスマッチ陰性電位によって指標を付けられると考えられる、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体機能不全と関連する(Javitt, et al., 1993, Javitt, et al., 1998, Javitt, et al., 1996)。n-アセチルシステインの投与は、SZにおけるミスマッチ陰性電位を改善した(Berk, et al., 2008, Lavoie, et al., 2008)。MMNおよび末梢GSHは、図3に示されるように対照において有意に相関した。もっともらしくは調節不全関係に起因して、相関性はSZにおいて有意ではなく、何故ならば、図3A〜3Cに示されるように、MMNおよびGSHの両方がSZにおいて減少するためである。MMNは、エブセレン効果が、存在する場合、NMDAR関連機構を通して媒介されるかどうかを試験するためのバイオマーカーとして役立ち得る。
【０１０９】
γ周波数神経振動：γ振動の発生についての重要な細胞である、パルブアルブミン(PV)介在ニューロン(Carlen, et al., 2012)は、酸化ストレスに感受性の別の細胞成分である(Do, et al., 2009, Gonzalez-Burgos et al., 2012, Choi et al., 2012, Kohr, et al., 1994, Nakazawa, et al., 2012)。γバンドおよびPV-介在ニューロン異常は、SZにおいて頻繁に報告されている(Spencer, et al., 2004, Light, et al., 2006, Cho, et al., 2006, Uhlhaas, et al., 2010, Hong, et al., 2004)。GPx突然変異マウスは、PV-陽性介在ニューロンの特定の減少を示した(Wirth, 2010)。低GSHを有する動物は、損なわれたPV介在ニューロン機能に起因して、著しいβおよびγ振動不足を示した(Steullet, et al., 2010)。21〜40および41〜85 Hzでのγバンドは、正常対照患者と比較してSZにおいて減少し(全てp＜0.001)、GSHと相関した(r＝0.40〜0.59、p＝0.042〜0.001)。多変量媒介モデリングは、図4に示されるように、20〜40 Hzでのγ応答が、UPSA-2によって測定される機能能力に対するGSH効果についての有意なメディエーターであることを示した(Ballesteros, et al., 2013b)。γ振動は、エブセレンが、存在する場合、PV介在ニューロン機能を改善することによって臨床転帰を改善するかどうかについての表示のための代替のバイオマーカーとして使用され得る。
【０１１０】
診断方法のいくつかの態様は、エブセレンによるターゲットエンゲージメントに指標を付けるバイオマーカーを同定することを目標とし、後のトライアルのためのバイオマーカー選択についての実証的証拠を提供するか、または有意でないトライアルの場合、ターゲットエンゲージメントが失敗した可能性のある箇所を示す。
【０１１１】
実施例3：グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)模倣物-作用機構
エブセレンはGPxの小分子模倣物であり、これは、ヒトにおいて、同様のペルオキシダーゼ機能を有する8個のアイソザイムのファミリーを伴う。大部分のGPxアイソザイムは、そのセレン(Se)部分へのフリーラジカルの結合によって活性酸素／窒素種(ROS/RNS)を還元する。GSHと反応することによって、GPxは、過酸化水素(H2O2)(図5A、Wendel, et al., 1984, Reiter, et al., 1984, Muller, et al., 1984)、2つのフリーラジカルであるスーパーオキシドアニオンおよび一酸化窒素によって形成されるRNSラジカルである、ペルオキシ亜硝酸(ONOO-)(図5B、Noguchi, et al., 1992, Daiber, et al., 2000)、および酸化還元不活性アルコールへ脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)(図5C、Sies, 1994)を還元することを通して、フリーラジカル毒性を制限することにより細胞保護的である。エブセレンはまた、図5Dに示されるようにテオレドキシン（theoredoxin）(Trx)の基質である(Zhao, et al., 2002)。しかしながら、GPx酵素自体の投与は、その大きなサイズおよび不安定性に起因して実用的ではない。
【０１１２】
図5に示されるように、GPx模倣物であるエブセレンは、GSH→GSSG→GSHの酸化還元サイクルを増強し、従ってGSHを再利用する。この触媒機構はNACの作用機構とは異なる。NACは、抗酸化剤として作用するスルフヒドリル基を有するシステインを含有する。しかしながら、NACは、エブセレンほど効率的にGSHレベルを維持せず、GSHの再利用を助けるGPx活性を誘導しない。NACはアミノ酸：システインを供給する。任意のアミノ酸と同様に、システインは多様な機能を提供する。明らかに、NACおよび／またはエブセレンがSZについてのよりよい選択であるかどうかについて支持または反論するためにより多くの研究が必要である。比較において、エブセレンは明確に定義された作用機構を有する。
【０１１３】
動物実験は、図6に示されるように、エブセレンがGSHを増加させ、神経毒性機構によって消耗されたGSHを補充することを示す点で、一致している。この増強されたGPx活性はまた、酸化ストレスが増大し(Do, et al., 2009, Kano, et al., 2013)かつGSH合成が減少する(Gysin, et al., 2007)疾患において、内因的に生成されるGSHを節約し、GSHのより高い利用可能性をもたらし得る。GSHに対するエブセレンの効率的な効果は、エブセレンでの治療がニューロン、星状細胞および他の細胞タイプにおけるGSHレベルを用量依存的に増加させることを一貫して示す多数の前臨床試験によって明白である。
【０１１４】
図6は、エブセレンによるGSHの用量依存的上昇がニューロンにおいて基底状態およびストレス状態の両方で観察されたことをさらに示している(Pawlas, et al., 2007)。増加したグルタメートは、神経毒性であり得、GSHを消耗し得；エブセレン自体はGSHを増加させ、グルタメートをエブセレンと組み合わせることは、グルタメートによるGSH消耗を中和した(Satoh, et al., 2004)。提唱された酸化還元機構(図5)をサポートすることによって、GSH消費は減少し、利用可能なGSHは再利用され、増加する(Pawlas, et al., 2007)。従って、SZの大部分のサンプルにおけるように、GPx活性およびGSHレベルが両方とも不足している状態において、エブセレンは、損なわれたGPx/GSHシステムに起因するGPx媒介障害についての治療を提供し得る。
【０１１５】
実施例4：エブセレンの薬物代謝および薬物動態
エブセレンは、素晴らしい経口利用可能性を有する(Fisher et al., 1988)。脳レベルは血漿中レベルの約20%であった(Imai, et al., 2001, Ullrich, et al., 1996)。その神経保護効果は10 uMの血漿中レベルで観察される(Zhao, et al., 2002)。Ph-1試験が、プラセボ対照、無作為化、単一漸増用量設計で、32人のヒトにおいて行われた。エブセレンは製剤中200 mg〜1600 mgの範囲であった。(1)薬物動態：エブセレンおよびその3つの代謝産物のPKパラメータが公表された(Lynch, et al., 2009)。簡潔には、平均エブセレンCmaxは30.3 ng/mL〜83.4 ng/mLの範囲であり；平均AUC0-tは117.4 ng*hr/mL〜880.6 ng*hr/mLの範囲であり；Tmax中央値は1.5〜2.3時間の範囲であり；平均t1/2は6.4〜16.7時間の範囲であった。2-グルクロニルセレノベンズアニリドが主要な代謝産物であった。(2)安全性：重篤な有害事象(AE)またはAEに起因する中止はなかった。全てのAEは、軽度または中程度であり、後遺症なしに消散した。いかなる臨床検査およびECG所見においても治療または用量関連傾向は観察されなかった。表にされた副作用がLynch, et al., 2009において公表された。1600 mgまでの単回経口用量でのエブセレンカプセル剤が、安全であり、健康な男性および女性によって十分に許容されるようであった。
【０１１６】
7つの急性および反復投与毒物学試験が、Sprague-Dawleyラット、Sinclairミニブタ、およびカニクイザルにおいて行われた；ならびに3つのゲノトキシコロジー（genotoxicology）試験。2000 mg/kgまでの急性投与は、これらの種において急性または遅延毒性の証拠と関連しなかった。カニクイザルにおける28日間反復投与試験は、2000 mg/kgである無毒性量(NOAEL)を確立し；ミニブタにおいては2000 mg/kg超であり、ラットについてNOAELは同定されなかった。エブセレンを26および52週間投与する慢性毒性試験は、エブセレンの非毒性効果レベルがラットにおいて31.6 mg/kg、ミニブタにおいて178 mg/kgであることを示した。
【０１１７】
実施例5：精神病／統合失調症のラットモデルにおけるN-アセチルシステイン処置
この実施例は、エブセレンの処置によるプレパルス抑制の逆転を記載する。統合失調症研究における最も反復された実験による知見の一つは、皮質抑制性介在ニューロンと関連するマーカーの減少である(Lewis et al., 2012)。成体の新生仔期腹側海馬傷害(NVHL)ラットは、ドーパミンによる異常な調節を特徴とする、変更された皮質介在ニューロン成熟によって引き起こされる電気生理学的異常を示す(Tseng et al., 2008)。背側縁前方および前帯状皮質(ACC)を含む、PFC中のパルブアルブミン(PV)陽性介在ニューロンがNVHLラットにおいて変更されるかどうかを、不偏立体解析学的カウンティング（unbiased stereological counting）技術を使用して、評価した。出生後日数(P)21およびP61の間に、PV免疫反応性介在ニューロン(PVI)の数は、図7Aおよび1Bに示されるように、シャム手術ラットにおいて増加したが、NVHLラットにおいては増加しなかった。幼若ラット(P21)において、NVHLラットとシャムラットとの間でPVIカウントの有意差はなかったが、成体(P61)NVHLラットは、シャムラットと比較して前前頭皮質(PFC)における有意により少ないPVIを示した。PVI減少は、P5(即ち、海馬傷害の2日前)で始まりかつ青年期まで継続する(P50；図7A〜Cに示される)、N-アセチルシステイン(NAC)処置で予防され、このことは、新生仔期傷害によって誘導された幼若酸化ストレスはPVI成熟を損なうことを示唆している。カスパーゼ3標識は、NVHLラットのPFCにおけるアポトーシス活性化を明らかにせず（データを示さず）、このことは、PVI免疫反応性の減少が細胞消失よりも介在ニューロン活性の減少を反映している可能性が高いことを示唆している。
【０１１８】
酸化ストレスを評価するために、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-20-デオキシグアニン(8-オキソ-dG)標識でDNA酸化を定量化した。P21において、NVHLラットは、錐体ニューロンおよび介在ニューロンに両方における、シャムラットと比較したPFC中の8-オキソ-dG染色のかなりの増大を示し、これはNAC処置によって完全に予防された(図8Aおよび9Bに示される通り)。NVHLラットが成年期(P61)に達すると、それらは、P21におけるよりも少ないとはいえ、増加した8-オキソ-dGを依然として示した(図8Cおよび8Dに示される通り)。3-ニトロチロシン(3-NT)レベルの増加がNVHLラットの成体PFCにおいて観察された。3-NTは、酸化およびニトロソ化ストレスに起因するタンパク質のニトロ化を示し(Radi, 2004)、NVHLラットにおけるその増大は、発達段階でのNAC処置によって予防された(図9Aおよび9Bに示される通り)。従って、幼若NAC処置は、傷害の程度に影響を与えることなしに、成体NVHLラットにおける酸化ストレスの複数のマーカーを、対照ラットと匹敵するレベルへ減少させた(図10A〜10Cに示される通り)。NVHL後に成体PFCにおいて検出された酸化ストレスのレベルについての可能性のある説明は、NMDA受容体のブロッキングがPVIにおいて酸化ストレスを誘導するように(Behrens et al., 2007)、発達段階での腹側海馬からの減少したグルタミン酸作動性インプットである。データは、重要な発達期間の間にPFCへの海馬インプットを損なうことは、幼若ラットにおいてPFC酸化ストレスを誘発し、これはPVIの青年期成熟に対して有害効果を有することを示した。
【０１１９】
NVHLラットにおいて酸化ストレスを示す介在ニューロンのタイプを決定するために、8-オキソ-dGと、PV、カルビンジン(CB)およびカルレチニン(CR)とを同時標識した。錐体ニューロンに加えて、増大した8-オキソ-dG染色が、PVIにおいて観察されたが、CBまたはCR介在ニューロンにおいては観察されなかった(図11Aおよび11Bに示される通り)。PVIの約50%が8-オキソ-dGで同時標識され、このことは、酸化ストレスがこの細胞集団において広がっていることを示している。PVI成熟のマーカーは、成熟皮質PVIを包むニューロン周囲網(PNN)を認識するレクチンである、ウィステリア・フロリブンダ凝集素（Wisteria Floribunda agglutinin）(WFA)である。NVHL傷害はWFA染色を減少させ(図12A〜12Bに示される通り)、このことは、NVHLラットの成体PFCにおけるPVIは未熟表現型を示すことを示唆している。これらの細胞外基質変更は、幼若NAC処置で回復された(図12A〜12Bに示される通り)。PVIは、増大した酸化ストレスへ大いに曝露され得、何故ならば、それらは急速発火（fast-spiking）介在ニューロンの大多数を構成し得、それらの高いエネルギー代謝は、非急速発火ニューロンと比べてより多くの活性酸素種を発生させ得るためである。幼若PVIが、酸化ストレスを示しながら機能的であることが可能であり、酸化ストレスの有害効果は青年期頃のPVI成熟時に明白となる。
【０１２０】
幼若酸化ストレスが成体NVHLラットにおいて観察される生理学的異常の原因である場合、NAC処置はこれらの変更をレスキューすることができる。ホールセル記録を、シャム(n＝12)、NVHL(n＝16)、およびNAC処置NVHLラット(n＝14)の中央PFCを含有する成体脳スライス中の錐体ニューロンから行った。成体NVHLラットおよび統合失調症の他の齧歯動物モデルにおいて以前に示されたように(Niwa et al., 2010; Tseng et al., 2008)、第V層錐体細胞における興奮性シナプス後電位(EPSP)のドーパミンD2-依存的調節は、NVHLラットにおいて喪失した(図13A〜Cに示される通り)。この喪失は、PFC介在ニューロンの異常な成熟に恐らく起因し、何故ならば、正常な成体D2調節はGABA-A受容体成分を含むためであり(Tseng and O'Donnell, 2007)、しかし錐体ニューロンにおける酸化ストレスも役割を果たし得る。変更されたPVI-依存的PFCシナプス反応が酸化ストレスに起因するかどうかを決定するために、ラットを、発達段階の間NACで処置し、次いでPFC生理のD2調節について試験した。NAC処置は、NVHLラットにおけるシナプス反応のD2調節をレスキューし(図13A〜13Cに示される通り)、このことは、NVHLラットにおける幼若および青年期酸化ストレスが成体PFCにおける興奮-抑制バランスを変更することを示している。
【０１２１】
NVHLラットにおけるPFC機能の異常なドーパミン調節はインビボでも観察される。インビボ細胞内記録を、成体ラット(n＝9 シャム (プラセボ)、n＝5 NVHL、およびn＝7 NAC処置NVHL)由来の38個の錐体ニューロンにおいて行った。ベースライン活性は、PFC錐体ニューロンについて以前に報告されたものと一致し(Lewis and O'Donnell, 2000)、傷害状態またはNAC処置によって有意に影響されなかった。全ての記録された細胞が、静止膜電位(ダウン状態；-76.2±1.1 mV)とアップ状態(-67.6±0.7 mV)との間の自発的な推移を示した。アップ状態は、523.6±24.7 msの継続時間で0.6±0.1 Hzの周波数で生じた。細胞(n＝21)の大多数は、2.1±0.7 Hzの頻度で自然に発火した。以前に報告されたように(O'Donnell et al., 2002)、麻酔された成体NVHLラットからのインビボ細胞内記録は、シャムラットと比較して、腹側被蓋野(VTA)のバースト刺激に応答しての錐体細胞発火の異常な増大を明らかにした(図13Dおよび13Eに示される通り)。この発火の異常な増大は、幼若NAC処置によって予防された(図13Dおよび13Eに示される通り)。これらのデータは、NVHLラットのPFC中における異常なドーパミン機能は、幼若期および青年期の間の酸化ストレスに依存することを示している。
【０１２２】
成体NVHLラットにおける異常な興奮-抑制バランスは、変更された情報処理をもたらし得、これは、それが酸化ストレスに依存した場合は、NAC処置によって予防されるだろう。シャム(n＝6)、NVHL(n＝3)、およびNAC処置NVHLラット(n＝3)においてオッドボールパラダイムで聴覚誘発電位を使用して、ミスマッチ陰性電位(MMN)を試験した。MMNは、統合失調症患者(Javitt et al., 1993)においておよび動物モデル(Ehrlichman et al., 2009)において弱められるために、高トランスレーショナル関連性を有する。脳波測定(EEG)電極をNVHL、NAC処置NVHL、およびシャムラットに埋め込んだ。MMNは群間で有意に異なり、NAC処置はNVHLラットにおけるMMNを改善した(図14Aおよび14Bに示される通り)。この観察は、患者におけるMMNに対するNACの効果と一致しており(Lavoie et al., 2008)、NVHLモデルが、幼若抗酸化処置によって予防され得る重要な疾患マーカーを再現することを示している。MMNはNMDA受容体機能に依存し(Umbricht et al., 2000)、PVIにおけるNMDA機能低下が統合失調症において疑われるため、NACでのMMN改善は回復されたPVI活性に起因する可能性がある。
【０１２３】
幼若酸化ストレスが行動的欠陥をもたらすかどうかを評価するために、行動的パラダイムを、動物モデルおよび統合失調症患者の両方における試験について使用した。聴覚驚愕反応のプレパルス抑制(PPI)は、患者(Geyer and Braff, 1987)およびNVHLラット(Lipska et al., 1995)において減少している感覚運動ゲーティングの指標である。PPIを、成体シャム(n＝11)、NAC処置シャム(n＝12)、NVHL(n＝9)、およびNAC処置NVHLラット(n＝17)において試験した。幼若NAC処置は、未処置NVHLラットにおいて観察されたPPIの減少を予防した(図15Aに示される通り)。PVI成熟の減少および電気生理学的異常に加えて、幼若NVHLラットにおける発達上の酸化ストレスは、統合失調症関連成体行動的欠陥を引き起こし得る。
【０１２４】
NAC処置の有利な効果は、傷害より前に開始しかついったんラットが若年成体となったら停止する大規模な出生後処置を含む。フル・トランスレーショナル・バリュー(full translational value)について、前駆期がヒトにおいて同定され得る時期に対応する年齢で開始した場合に、NACが効果的であるかどうかを決定する。ラットの別のセットにおいて、ラットにおいては青年期初期に相当する歳であるP35で開始して、NACを飲料水中に投与した。PPI不足について、成体シャム(n＝15)、未処置NVHL(n＝12)、およびNAC処置NVHLラット(n＝14)において試験した。この群におけるシャムと比較しての未処置NVHLラットにおける不足についての傾向を示し、未処置および処置NVHLとの間には有意差があった(図15Bに示される通り)。データは、NACなどのGSH前駆体が、酸化ストレスが始まった後にたとえ開始されたとしても、依然として有効であり得ることを示している。
【０１２５】
NACの一つの重要な警告は、それはまた、システイン-グルタメート輸送体に対するその作用によってグルタメートレベルを変更することである(Moussawi et al., 2009)。グルタメートレベル変化ではなく酸化還元調節がNVHLラットにおけるNAC効果を担ったかどうかを試験するために、グルタメートを変更しない2つの他の抗酸化剤の効果を評価した。
【０１２６】
実施例6：精神病／統合失調症のラットモデルにおけるエブセレン／アポシニン処置
エブセレンは、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)模倣物(Muller et al., 1984)であり、これは、GPx発現を誘導し(Kil et al., 2007)、ニューロンにおいてGSHレベルを高め、神経毒性機構によって消耗されたGSHを補充する(Pawlas and Malecki, 2007)。成体ビヒクル処置シャム(n＝10)、エブセレン処置シャム(n＝7)、ビヒクル処置NVHL(n＝8)、およびエブセレン処置NVHLラット(n＝9)においてPPIを試験し、青年期の間のエブセレン処置は、NVHLラットにおけるPPI不足を逆転した(図15Dに示される通り)。
【０１２７】
ラットの別の群において、NADPHオキシダーゼ阻害剤であるアポシニンの効果を、幼若期および青年期を通して送達しながら評価した。成体ビヒクル処置シャム(n＝10)、アポシニン処置シャム(n＝11)、ビヒクル処置NHVL(n＝7)、およびアポシニン処置NVHL(n＝5)において、PPIを試験した。図15Cに示されるように、PPI不足の逆転が観察された。データは、青年期の間のグルタメートではなくGSHの増大がNVHLラットにおけるPPI不足をレスキューすることを示した。
【０１２８】
実験手法
動物：時期調節して妊娠させたSprague-Dawleyラットを、Charles River (Wilmington, MA)から妊娠日齢13〜15日で得、12:12時間の明／暗サイクル（7:00 AMに点灯）で温度および湿度制御環境において食物および水を自由に与えながら個々に収容した。仔がP5に達すると、雌親の半分は飲料水中のNACを受けた。健康な子孫が無作為に分離されかつNVHLまたはシャム手術のいずれかを受けたP7〜9まで仔を平静にしておいた。P21において、雄性および雌性の仔は、免疫細胞化学のために4%パラホルムアルデヒドを経心腔的に灌流されたか、または、離乳され、かつ傷害状態全体にわたって釣り合いを取った2〜3匹の群で収容された。P50までの青年期の間中NAC処置を継続した。成年期(＞P60)に達した後、動物は、免疫細胞化学のために4%パラホルムアルデヒドで灌流されたか、スライス電気生理学のために人工脳脊髄液(aCSF)で灌流されたか、インビボ細胞内記録のために用いられたか、またはPPIもしくはMMNについて試験された。
【０１２９】
新生仔期腹側海馬傷害手術：P7〜P9の間に、以前に記載されたように(Chambers and Lipska, 2011)、仔(15〜20 g)に腹側海馬の興奮毒性傷害(NVHL)またはシャム処置のいずれかを受けさせた。仔を低体温で麻酔し、定位固定フレームへ取り付けられたStyrofoamプラットフォームへ固定した(David Kopf Instruments, Tujunga, CA)。NVHLラットは、0.15μl/分の速度で腹側海馬(ブレグマに対して3 mm吻側、正中に対して3.5 mm外側、かつ表面から5 mm)中へのイボテン酸(aCSF中10μg/μl、0.3μl/片側；Tocris, Minneapolis, MN)の両側注入を受けた。ガイドカニューレを3 mmだけ下げ、かつ海馬の損傷を回避しながら外科的処置のために対照へ液体注入をしなかったこと以外、全く同じ方法でシャム手術を行った。手術後、創傷をクリッピングし、仔の活動レベルが正常に戻ったら、それらは雌親へ戻され、創傷クリップを取り外すまで平静のままにされ、ラットはP21で離乳させた。
【０１３０】
全てのラットにおいて、凍結ミクロトームを使用して背側および腹側海馬を切断する(40μm)ことによって、傷害を確認した。切片をスライドガラス上に載せ、ニッスル染色した。海馬を両側損傷の証拠について顕微鏡で検査し、両側損傷は典型的に、細胞消失、薄層化、グリオーシス、細胞崩壊、および拡大した脳室を含んでいだ(Chambers and Lipska, 2011)。
【０１３１】
抗酸化剤前処置レジメン：NAC(BioAdvantexPharma, Mississauga, Ontario, Canada)を飲料水中に900 mg/lで投与した。NAC処置をP5でまたはP35で開始し、マウスにおける以前の研究は、雌親によって消費されたNACは母乳を通して仔へ伝達されることを示した(das Neves Duarte et al., 2012)。NAC処置をP50において終了した。新鮮な溶液を2〜3日毎に調製した。エブセレン(Sound Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)を、P35で開始してPPI試験日(P60)まで1週間当たり5日i.p.投与した。エブセレンストック溶液(20 mg/ml DMSO, 凍結アリコート)を滅菌水中に1:5で希釈し、10 mg/kgの用量で投与した。対照動物は、水中に1:5で希釈された等しい濃度のDMSOを受けた。アポシニン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を飲料水中に100 mg/kgの標的用量で投与した(Nwokocha et al., 2013)。P21での離乳前に、飲料水は、水0.5 l当たりアポシニン2 gの用量を含有し、雌親の母乳を通した送達を確実にした。アポシニン濃度を、離乳後に750 mg/lへ低下させて、標的用量へ最も接近させた。一日おきに調製した新鮮な溶液を用いてP5からP50まで処置を継続した。
【０１３２】
免疫組織化学および立体解析学的定量化：合計18匹(P21)および25匹(P61)の雄性ラットを、以前に記載されたように(Cabungcal et al., 2006)、麻酔し、灌流し、それらの脳を固定した。冠状切片(40μm)を使用し、前帯状皮質(ACC)の抑制性回路を調べた。脳切片を、以前に記載されたように(Steullet et al., 2010)、パルブアルブミン(PV)について免疫標識した。PV免疫反応性細胞(細胞体)カウントを、StereoInvestigator 7.5ソフトウェア(MBF Bioscience Inc, Williston, VT, USA)を使用してACC中において定量化した。簡潔には、立体解析学的カウンティングを低倍率(×2.5対物レンズ（objective）)で開始し、各動物由来の2〜4個の連続する切片上の関心領域(ROI)の境界を同定および視覚的に示した。ACC(ブレグマでおよそ0.70〜1.70 mm)を、PaxinosおよびWatson (Paxinos and Watson, 1998)によって与えられた解剖学的細胞構築領域に従う二次運動野(M2)皮質領域から視覚的に示した。選択された関心領域(ROI)は、帯状皮質領域1(cg1)の大半および帯状皮質領域2(cg2)の一部を含んだ。小さな中間の許容をACC領域とM2領域との間に設定し、ACC中のROIが二次運動野皮質と重複しないことを確実にした。ACCに適した切片厚みおよびサンプリングフレーム内のカウンティングボックス(オプティカルディセクター)を使用して、ニューロンを分析およびカウントした(Schmitz and Hof, 2005)。カウンティングボックス(深さ15μmを有する40×40μm)は、ACCのROI内の無作為の位置から開始して各サンプリングフレーム内にソフトウェアによって配置された。より高い倍率(×40対物レンズ)を使用してカウンティングを行った。カウンティングボックスの15μm深さで焦点外となるまでボックスの表面で焦点が合っていた場合、PV細胞をカウントした。5μm警報区域を使用し、免疫調製物プロセッシングに起因する組織収縮によって影響され得るアーチファクトから距離を置いた。25個のカウンティングフレームをP21およびP61ラットについてのACCのROI体積において使用した。
【０１３３】
免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡法、および画像解析：OH基とDNAグアニン塩基との反応によって形成されるDNA付加物である、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-20-デオキシグアニン(8-オキソ-dG)に対する抗体を使用して、酸化ストレスを可視化した(Kasai, 1997)。電子伝達系が接近しているため、ミトコンドリアDNAは酸化的損傷を受けやすく、DNA中の酸化された塩基のレベルおよび8-オキソ-dGのレベルは、核におけるよりもミトコンドリアにおいてより高い。介在ニューロンの様々なタイプにおける8-オキソ-dGおよび3-ニトロチロシン(3NT)標識を評価するために、ブレグマ0.70〜1.70 mmの間の冠状切片を、マウスモノクローナル抗-8-オキソ-dG(1:350; AMS Biotechnology, Bioggio-Lugano, Switzerland)一次抗体またはマウスモノクローナル抗-ニトロチロシン(1:1000; Chemicon International, Temecula, USA)一次抗体と一緒に、ウサギポリクローナル抗-PV、抗-カルビンジン-28k(抗-CB)、または抗-カルレチニン(抗-CR) (1:2500; Swant, Bellinzona, Switzerland)一次抗体と共に、約36時間インキュベートした。PV細胞を囲むPNNの可視化を可能にするために、切片を、ビオチン結合レクチン、ウィステリア・フロリブンダ凝集素(WFA)(Hartig et al., 1994)を含有する溶液中においてインキュベートした。切片を、先ず、2%正常ウマ血清を含有するPBS + Triton 0.3% +アジ化ナトリウム(1 g/l)と共にインキュベートし、続いて、ウサギポリクローナル抗-PV(1:2500)およびビオチン結合WFA(1:2000; Sigma)と共に36時間インキュベーションした。切片を洗浄し、適切な蛍光二次抗体（ヤギ抗-マウス免疫グロブリンG(1:300; Alexa Fluor 488; Molecular Probes, Eugene, Oregon)、抗-ウサギ免疫グロブリンG(1:300; CY3; Chemicon International, Temecula, California)、CY2-ストレプトアビジンコンジュゲート(1:300; Chemicon)と共にインキュベートし、100 ng/ml DAPI(4’-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール; Vector Laboratories, California, USA)で対比染色した。切片を、×10、×20、×40および×63 Plan-NEOFLUAR対物レンズを備えたZeiss共焦点顕微鏡で可視化した。全ての周辺機器をLSM 510ソフトウェア(Carl Zeiss AG, Switzerland)で制御した。9個の画像のZスタック(2.13μm間隔を有する)を、IMARIS 7.3ソフトウェア(Bitplane AG, Switzerland)における解析のためにスキャンした(1024×1024ピクセル)。Zスタックの全ての画像をGaussianフィルターツールでフィルタリングし、望ましくないバックグラウンドノイズを除去し、細胞体輪郭を鮮明化した。立体解析学的手法において定義されたROIをACC中に作った。ROIをZスタックの全体にわたってマスクし、PV、CB、およびCR発現性介在ニューロンが解析された局所サブ体積（subvolume）のACCを単離した。8-オキソ-dGを定量化するために、ROI内の標識されたボクセルの染色強度および数を測定した。PV、CB、およびCR細胞中の8-オキソ-dGを定量化するために、本発明者らは、IMARISソフトウェアのColocモジュールを使用し、8-オキソ-dG免疫標識もされた全てのPV免疫標識されたボクセル(それぞれ、CBおよびCR免疫標識されたボクセル)の割合を計算した。Colocは、関心対象の免疫標識されたプロファイル間の共局在化されたボクセルのカウントを与える。PNNによって囲まれたPV免疫反応性ニューロンの数を定量化するために、本発明者らは、スポットモジュールを使用し、所定のサイズに入るプロファイル標識されたボクセル上のスポットマーキングを割り当てた。PVおよびWFA免疫標識についてのチャネルを選択し、��ロファイルサイズ基準(それぞれ＞9および4μm)を定義し、これらのサイズを超える標識されたプロファイルを定量化した。WFAについて生じたスポットと接触および／または重複したPVについて生じたスポットを、PNNによって囲まれたPVI(WFA陽性PVI)と見なした。
【０１３４】
スライス電気生理学：P60で開始して、断頭する15分前に、雄性ラットを抱水クロラール(400 mg/kg、i.p.)で麻酔した。頭蓋から、95% O2〜5% CO2で酸素添加されかつ以下(mM単位で)を含有する氷冷人工CSF(aSCF)中へと、脳を迅速に取り出した：125 NaCl、25 NaHCO3、10 グルコース、3.5 KCl、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2および3 MgCl2、pH 7.45 (295〜300 mOsm)。中央PFCを含有する冠状スライス(厚さ300μm)は、氷冷aCSF中においてビブラトームを用いて得られ、記録前の少なくとも45分間、95% O2〜5% CO2によって絶えず酸素添加された温かい(約35℃)aCSF溶液中でインキュベートされた。記録aCSF(1 CaCl2および2 MgCl2を有する)を、2 ml/分の速度でポンプによって記録チャンバへ送達した。
【０１３５】
パッチ電極(7〜10 MΩ)を、Flaming-Brown水平プラー(P97; Sutter Instruments)によって1.5 mmホウケイ酸ガラス毛管(World Precision Instruments)から得て、0.125%ニューロビオチンおよび以下(mM単位で)を含有する溶液で満たした：115 K-グルコネート、10 HEPES、2 MgCl2、20 KCl、2 MgATP、2 Na2-ATP、および0.3 GTP、pH 7.25〜7.30 (280〜285 mOsm)。キンピロール(5μM、Tocris)を、酸素添加された記録aCSF中へ、実験前に毎日新たに混合した。対照および薬物含有aCSFの両方を、実験の間中継続的に酸素添加した。
【０１３６】
全ての実験を33〜35℃で行い、第V層由来の縁前方またはACC PFC錐体細胞を、40×水浸型対物レンズを有する赤外線(IR)微分干渉コントラストビデオ顕微鏡(Olympus BX-51WI)を使用した視覚誘導の下で同定した。画像をIR感受性CCDカメラで検出しかつモニター上に表示した。ホールセル電流クランプ記録を、コンピュータ制御増幅器(Multiclamp 700A; Molecular Devices)で行い、デジタル化し(Digidata 1322; Molecular Devices)、10 kHzのサンプリング速度でAxoscope 9 (Molecular Devices)によって得た。電極電位を、液間電位を修正せずに、記録前にゼロへ調節した。各ニューロン中におけるベースライン活性を、10分間モニタリングし、この間の膜電位および入力抵抗(500ms継続時間の脱分極パルスおよび過分極パルスで得られた電流-電圧(I/V)プロットの傾きによって測定した)を測定した。
【０１３７】
一対のねじられたテフロンコーティングされたタングステン線(先端が約200μm離れている)から作製されたかつ記録されるニューロンの先端樹状突起の垂直軸に対して約500μm外側に置かれた双極電極を用いた、浅層の電気刺激によって、シナプス反応を錐体ニューロン中において試験した。刺激パルス(20〜400μA; 0.5 ms)を15秒毎に送達した。強度を調節し、最大振幅の約半分でEPSPを誘発した。実験の間中、過分極ステップを繰り返して入力抵抗の変化をモニタリングし、実験の過程の間に入力抵抗が20%超変化した場合、細胞を廃棄した。誘発されたEPSPの振幅をClampfit 9.0で測定し、キンピロールの適用の前および7分後の10個のスイープにわたって平均した。統合失調症の齧歯動物モデルにおけるPFC活性のD2調節の以前の研究によって明らかにされた差異との、一貫性のために、この期間を選択した(Niwa et al., 2010; Tseng et al., 2008)。各実験の終了時に、スライスを4%パラホルムアルデヒド中に置き、標準組織化学技術を使用してDAB染色について処理し、ニューロンの形態および位置を確認した。
【０１３８】
インビボ細胞内記録：雌性ラットを抱水クロラール（choral hydrate）(400 mg/kg、i.p)で麻酔し、定位固定装置(Kopf Instruments)上に置いた。腹腔内カテーテルによる連続的抱水クロラール(24〜30 mg/kg/h)を用いた記録中、麻酔を維持した。サーマルプローブ制御ヒートパッド(Fine Science Tools)を使用して、体温をおよそ37℃で維持した。同心双極刺激電極(直径0.5 mm、0.5 mm極分離; Rhodes Medical Instruments Inc.)を、刺激のためにVTA(ブレグマに対して5.8 mm尾側；正中に対して0.5〜0.8 mm外側；表面から7〜8 mm)中へ下げた。記録シャープ微小電極を、水平Flaming-Brownプラー(Sutter Instruments)上でホウケイ酸ガラス(1 mm O.D.; World Precision Instruments)から引いた。シャープ電極(50〜110 MΩ)に2M酢酸カリウム中の2%ニューロビオチン(Vector Laboratories)を充填した。油圧式マニピュレーター(Trent Wells, Coulterville, CA)を使用して、微小電極を中央PFC中へ下げた。記録を電流クランプにおいて行い、Neurodata増幅器(Cygnus)を使用してシグナルを得て、Digidata A/D変換器(Molecular Devices)およびオフライン解析用のAxoscope 9ソフトウェア(Molecular Devices)を使用して10 kHzでデジタル化した。
【０１３９】
ニューロンに突き刺さるまで、中央PFCを通って微小電極を進めた。この試験に含まれたニューロンは、- 60 mVよりも陰性の静止膜電位、および閾値から≧40 mVの振幅を有する活動電位を有した。内因性ドーパミンに対する応答を測定するために、VTAを、10秒毎に送達される20 Hzでの5つのパルスのパルス列で刺激した。8〜10個のスイープを使用し、VTA刺激に応答しての細胞発火を測定した。発火を、全てのスイープ中の最後のVTAパルス後の500 msエポックにおいて測定し、実験群で比較した。実験の終了時に、動物を麻酔の過剰投与によって屠殺し、傷害状態および電極配置の組織学的確認のためにそれらの脳を取り出した。
【０１４０】
ミスマッチ陰性電位：NVHL、NAC処置NVHL、およびシャム雌性ラットに、イソフルラン麻酔下で慢性EEG電極を埋め込んだ。電極は、塩化銀がコーティングされた直径2 mmの銀のディスクで構築され、ヒトの頭頂に等しい場所のブレグマの頂点に密着させられ、接触子は頭頂のOmneticsコネクターにつながった。4週間回復させると、ラットを、ステンレス鋼ボックス内に囲まれた30×50 cmプレキシガラスボックスの記録チャンバに先ず慣れさせた。NNMセッションは、400 msで区切られ95%が一方の周波数での繰り返し（標準）および5%が他方の周波数（逸脱）である異なる2つの周波数(7または9 kHz; 30 ms継続時間)のおよそ2,000種の音へラットを曝露することからなった。音は、TDT RZ6システム(Tucker Davis)を使用して、囲いの内部に取り付けられたスピーカーによって送達され、時間の半分で逸脱がいずれかの周波数であるように釣り合いを取られた。EEGシグナルを、1 kHzサンプリング速度で32チャネルOmniplexシステム(Plexon Instruments)を使用して得た。解析のために、音も基づいた300 msエポックを選択し、1〜30 Hzでフィルタリングし、刺激前の100 msへベースライン修正し、標準音および逸脱音について別々に平均した。逸脱波から標準波を引くことによって差異波を構築し、刺激後35〜100 msの間の期間における曲線下面積を測定することによってMMNを定量化した。全てのラットを、3つの異なる日において3つのセッションへ曝露し、値を各動物についてセッションにわたって平均した。
【０１４１】
プレパルス抑制：P60で開始して、以前に記載されたように(Feleder et al., 2010)、雄性および雌性ラットの両方をPPIについて試験した。ラットにアポモルフィンを負荷した場合に、NVHLラットにおけるPPI不足は最も明白であったため(Lipska et al., 1995)、本発明者らは、PPI試験セッションの直前にアポモルフィン(0.1 mg/kg、i.p.)を注射した。ラットを、バックグラウンドホワイトノイズが70 dBである防音驚愕チャンバ(San Diego Instruments, San Diego, CA)中に置いた。5分間の適応期間後、15〜25秒毎の擬似ランダムトライアルでPPI試験を開始した。パルス(120 dB)、プレパルス(75 dB、80 dB、もしくは85 dB)、パルス無し、またはプレパルス＋パルスのいずれかを送達した。トライアルが23分間継続し、パルスまたはプレパルス＋パルストライアルの8〜10回の繰り返しがもたらされ、一方で、ヌルまたはプレパルスのみトライアルが各プレパルス振幅について5回繰り返された。加速感受性トランスデューサーを使用して驚愕規模を測定し、PPIを、プレパルス＋パルスとパルス単独との驚愕の比率として計算し、減少パーセントとして表す。最初のトライアル(全てパルスのみ)を慣れのために使用し、解析に含めなかった。動物がチャンバ内で移動していた場合、トライアルを解析から除外し、驚愕振幅が低かった場合、セッションを解析から除外したか、またはトライアルの50%超を任意のプレパルス＋パルス組み合わせについて除外した。PPIセッションを放棄した場合、ラットを1週間後に再び試験した。
【０１４２】
統計：一元配置分散分析、続いて事後Dunnett多重比較を使用して、ACC中の組織体積当たりのPV免疫反応性細胞の平均数を処置群間で比較した。多変量ANOVA (WilksのΛ)、続いて多重比較のための事後Dunnett検定を使用して、PV細胞の平均数、PV細胞強度、WFA陽性PVおよびWFA陽性強度、全体的な8-オキソ-dG、およびWFA標識を群間で比較した。対象間変数としての群を用いて一元配置分散分析を使用して、電気生理学データを比較した。対象間変数としての傷害状態および処置、ならびに対象内変数としてのプレパルス強度を用いて反復測定二元配置分散分析を使用して、PPIデータを比較した。
【０１４３】
好ましい態様および様々な代替の態様を参照して本発明を特に表示および記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者によって理解されるだろう。
【０１４４】
本明細書の本文内で引用された全ての参照文献、発行された特許、および特許出願は、全ての目的について、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【図１】
2017534673.tif 000034
【図２】
2017534673.tif 000035
【図３】
2017534673.tif 000036
【図４】
2017534673.tif 000037
【図５】
2017534673.tif 000038
【図６】
2017534673.tif 000039
【図７】
2017534673.tif 000040
【図８】
2017534673.tif 000041
【図９】
2017534673.tif 000042
【図１０】
2017534673.tif 000043
【図１１】
2017534673.tif 000044
【図１２】
2017534673.tif 000045
【図１３】
2017534673.tif 000046
【図１４】
2017534673.tif 000047
【図１５】
2017534673.tif 000048
【国際調査報告】
2017534673.tif 000049
2017534673.tif 000050
2017534673.tif 000051
2017534673.tif 000052