(57)【要約】  本発明は、短い倍加時間を有する改良されたex vivoのB細胞培養物を生成するための手段及び方法を提供する。
2017500052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るためのウサギB細胞の使用。
【請求項２】
20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るための方法であって、
-  B細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
前記B細胞が、ウサギB細胞であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
ウサギB細胞の複製寿命を増加するための方法であって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子並びに/或いは少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする、方法。
【請求項４】
対象の核酸分子をウサギB細胞に導入するための、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質の使用。
【請求項５】
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
-  前記B細胞により7〜14日で、好ましくは9〜12日で生成される抗体を採集する工程と
を含む、抗体を得るための方法。
【請求項６】
* 非ウサギBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子、及び/又は
* 少なくとも1つの非ウサギ抗アポトーシス核酸分子
を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする、請求項2、3又は5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記非ウサギ核酸分子が、ヒト核酸分子である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子が、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10及びそのウサギ相同体並びにその機能性部分及び機能性誘導体からなる群から好ましくは選択されるBcl2ファミリーの遺伝子を含む、請求項2〜3又は5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウサギB細胞におけるBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程も含む、請求項2〜3又は5〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
IL21及びCD40Lを前記ウサギB細胞に与える工程を更に含む、請求項2〜3又は5〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記IL21が、マウス若しくはヒトIL21であり、且つ/又は前記CD40Lが、マウス若しくはヒトCD40Lである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
-  Bcl-6の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
-  Bcl-6の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、請求項2〜3又は5〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
-  Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10及び/又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる少なくとも1つの化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、並びに/或いは
-  Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10及び/又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる少なくとも1つの化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、請求項2〜3又は5〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
-  Blimp-1の発現又はBlimp-1のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる少なくとも1つの化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
-  Blimp-1の発現又はBlimp-1のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる少なくとも1つの化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を更に含む、請求項2〜3又は5〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質と結合している単離又は組換えウサギB細胞。
【請求項１６】
GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を介して又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を介して、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列及び/又は抗アポトーシス核酸配列を含む遺伝子送達媒体と結合している、請求項15に記載のウサギB細胞。
【請求項１７】
前記抗アポトーシス核酸配列が、Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、そのウサギ相同体、その機能性部分、その機能性誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列である、請求項16に記載のウサギB細胞。
【請求項１８】
-  Bcl-xL若しくはMcl-1若しくはBcl-2若しくはA1若しくはBcl-w若しくはBcl2L10又はその機能性部分若しくは機能性誘導体を好ましくはコードする非ウサギ抗アポトーシス核酸分子、及び
-  Bcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする非ウサギ核酸分子
を含む単離又は組換えウサギB細胞。
【請求項１９】
前記非ウサギ核酸配列が、ヒト核酸配列である、請求項18に記載のウサギB細胞。
【請求項２０】
20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのウサギB細胞培養物。
【請求項２１】
請求項18又は19に記載のウサギB細胞を含むex vivoのウサギB細胞培養物。
【請求項２２】
請求項2〜3又は5〜14のいずれか一項に記載の方法により得られる場合のex vivoのウサギB細胞培養物。
【請求項２３】
請求項2〜3又は5〜14のいずれか一項に記載の方法により得られる場合の抗体。
【請求項２４】
請求項18若しくは19に記載のウサギB細胞又は請求項20〜22のいずれか一項に記載のex vivoのウサギB細胞培養物により生成される抗体。
【請求項２５】
ウサギB細胞の複製寿命を増加するための、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質と、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列及び/又は少なくとも1つの抗アポトーシス核酸配列とを含む遺伝子送達媒体の使用。
【請求項２６】
前記細胞外ドメインが、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである、請求項3に記載の方法、又は請求項4に記載の使用、又は請求項15若しくは16に記載のウサギB細胞、又は請求項25に記載の使用。
【請求項２７】
前記遺伝子送達媒体が、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項3に記載の方法、又は請求項16に記載のウサギB細胞、又は請求項25に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、分子生物学及び免疫学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ex vivoのB細胞培養物は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を生成するための重要なツールである。モノクローナル抗体(mAb)は、単一抗体分子の複数の同一コピーであり、これらのコピーは、同じ親和性で抗原と結合し、同じエフェクター機能を促進する。mAbの利点の中でも、抗原上の同じエピトープに対するそれらの特異性がある。この特異性は、概して低い副作用の、効果的で耐容性が良好な治療の選択肢を患者に提供しつつ、より慣習的な処置を超えるある種の臨床的利点をmAbに対して与える。更に、mAbは、生物学的及び医学的研究のために有用である。
【０００３】
mAbを得るための慣習的なアプローチは、ハイブリドーマ技術であり、この技術では、B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリッド抗体生成株化細胞(ハイブリドーマ)を形成する。しかし、ヒトB細胞を用いるハイブリドーマ技術は、得られるハイブリドーマが不安定なので、あまり成功していない。一方、複製寿命が延長されたex vivoのB細胞培養物を生成する改善された技術が開発されている(WO 2007/067046)。この技術は、Blimp-1及び/又は抗アポトーシス核酸と一緒にBcl-6がB細胞において発現されるヒトex vivoの培養物を含む。このことは、これらのB細胞の複製寿命を改善する。典型的に、ヒトB細胞を培養してヒトmAbを得る。ヒトmAbは、他の種の抗体と比較して免疫原性がより低いので、ヒトにおける治療用途のために好ましい。WO 2007/067046の技術を用いて、約25〜36時間の平均倍加時間を有するex vivoのヒトB細胞培養物が得られる。
【０００４】
治療用mAbのような対象のmAbを商業的に生成するために、B細胞が短い倍加時間を有するB細胞培養物を用いることが有利である。短い倍加時間は、がん治療のような治療アプローチ、例えば非ヒト哺乳動物を患者のがん細胞で免疫化し、その後、がん特異的B細胞を動物から採集してex vivoの抗体生成のために用いる場合においても非常に重要である。このような抗体は個別の患者のためのテーラーメイド医薬であるので、患者がAb治療をできるだけ速く始めることができるように、これらの抗体はできるだけ速く生成されるべきである。個体の腫瘍に特異的なこのような抗体は、前もって生成できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2007/067046
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Christopherson, K.S.ら、PNAS 89、6314〜8 (1992)
【非特許文献２】Guzman, L. M.ら、Bacteriol 177、4121〜4130 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的の一つは、より短い倍加時間を有する改良されたex vivoのB細胞培養物を生成するための手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、WO 2007/067046に開示されるB細胞培養物と比較してより短い倍加時間を有するB細胞培養物がウサギB細胞を用いる場合に得られるという見識を提供する。ヒトB細胞、マウスB細胞及びラマB細胞のような一般的に用いられるB細胞は25〜36時間の倍加時間を典型的に有するのに対して、本発明者らは、20時間以下の倍加時間を有するウサギB細胞培養物を得ることができることを驚くべきことに見出した。この見識により、対象の抗体の生成が著しくより速くなり、所定の時間枠内でのより高い収率をもたらすことが可能になり、このことは、商業的な抗体生成及び治療用途のために特に価値がある。
【０００９】
したがって、本発明は、20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るためのウサギB細胞の使用を提供する。本発明によるex vivoのウサギB細胞培養物は、ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体と、抗アポトーシス核酸分子との発現により典型的に得られる。よって、20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るための方法であって、
-  B細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、前記B細胞が、ウサギB細胞であることを特徴とする方法が更に提供される。
【００１０】
好ましくは、20時間未満の平均倍加時間を有するex vivoのウサギB細胞培養物が生成される。より好ましくは、前記平均倍加時間は、19時間未満又は18時間未満でさえある。より短い倍加時間は、より速く且つより高い抗体生成を可能にし、このことは、所望の抗体の試験及びスクリーニング並びに対象の抗体の単離及び/又は同定のための時間並びに有効性を増強する。更に、個別の患者のためのmAbを開発する必要があるならば、ウサギB細胞のより短い倍加時間により、患者の特異的mAb治療の開始をより速くすることができる。
【００１１】
ウサギB細胞を用いる本発明による方法は、よって、現在既知のヒト、マウス又はラマB細胞培養物と比較してより短い時間枠内で抗体をex vivoで得て、試験し、同定し、単離し、且つ/又は生成することができるという利点を提供する。
【００１２】
短い倍加時間を有するB細胞培養物を本発明が提供するという事実は、現存する方法と比較してより短い期間内で十分な量の抗体を得ることができるという利点を提供する。例えば、WO 2007/067046に開示される方法では、ヒト個体から得られるB細胞の収集物を、Bcl-6及び抗アポトーシス核酸(又はこのような核酸の発現を増加する化合物)を用いて安定化した後に培養する。このことにより、安定化されたヒトB細胞が得られ、該細胞は、増殖及び抗体生成をともに行うことができる。培養中に、安定化されたB細胞は抗体を生成し、該抗体は、培養培地中に分泌される。その後、これらの抗体は、好ましくは、所望の特異性(及び/又は親和性)について試験される。現在の試験手順のために、少なくとも100ng/ml培養培地の抗体濃度が典型的に要求される。安定化されたヒトB細胞を15〜20日間培養した後に、このような最小限の抗体濃度が得られる。よって、ヒトB細胞培養物を用いて、培養開始の少なくとも15〜20日後、典型的には第20日付近に抗体が採集される。ラマB細胞は、ヒトB細胞と同様の成長速度を有するので、ラマB細胞培養物を用いても、典型的には培養開始の少なくとも15〜20日後に抗体が採集される。より長い倍加時間を有するマウスB細胞を用いると、100ng/mlの最小限の濃度を有する抗体は、典型的には20日を超えた後に得られる。
【００１３】
抗体を試験した後に、対象の対応するB細胞は、さらなる使用のために選択され、単離されることが多い。抗体試験が通常約3日間かかるという事実に鑑みて、対象のヒト又はラマB細胞は、B細胞培養開始の18〜23日後に典型的に選択及び単離される一方、対象のマウスB細胞は、23日を超えた後に典型的に選択及び単離される。単離B細胞は、次いで、更に培養される。対象のヒト、ラマ又はマウスB細胞を含むB細胞培養物は、よって、B細胞培養開始から約3週間後に典型的に得られる。しかし、本発明による方法を用いると、少なくとも100ng/mlの抗体濃度は11〜12日後に既に得られる。よって、抗体は、B細胞培養開始の11〜12日後に既に採集できるが、抗体を採集する前にヒト(又はラマ)B細胞培養物は少なくとも15〜20日間維持しなければならない。試験手順に3日間かかるならば、対象のウサギB細胞は、よって、B細胞培養開始から14〜15日で選択及び単離され、これは、ヒト又はマウスB細胞を培養する状況と比較して著しく速い。結論として、十分な抗体濃度を有するヒト、ラマ又はマウスB細胞培養物を得るために典型的に約3週間かかるが、本発明の見識を用いれば、十分なAb濃度を有するウサギB細胞を含むB細胞培養物が早くも2週間後には得られる。このことは、現存する方法を超える主要な利点である。よって、本発明の一態様は、少なくとも100ng/mlの最小限の抗体濃度が要求される1又は複数の試験アッセイにおいて好ましくは用いるための抗体を得るための方法であって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
-  前記B細胞により10〜14日で、好ましくは11〜12日で生成される抗体を採集する工程と
を含む方法を提供する。前記採集される抗体は、好ましくは、少なくとも100ng/mlの最小限の抗体濃度が要求される1又は複数のアッセイを用いて試験される。
【００１４】
上記のように、得られる抗体は、所望の特異性及び/又は親和性についての試験のために典型的に用いられる。現在の試験方法では、100ng/mlの最小限の抗体濃度がしばしば要求されるが、より感度が高い方法を用いるならば、抗体は、より早期に採集できる。試験方法の感度にも関わらず、本発明による方法とともにウサギB細胞を用いると、要求される最小限の抗体濃度は、ウサギB細胞の倍加時間が著しくより速いことから、現在既知のヒト、ラマ又はマウスB細胞の使用と比較してより早期に得られる。例えば、100ng/mlの代わりにわずか30ng/mlの最小限の抗体濃度が要求されるならば、ヒトB細胞を用いて、典型的にはB細胞培養の開始から13〜18日後にこの濃度に達するが、ウサギB細胞培養物は、この最小限の抗体濃度を得るために9〜10日だけが必要である。よって、ここでもまた、対象のB細胞の抗体試験及び単離をより早期に行うことができる。実際に、本発明者らは、B細胞培養の開始から7〜14日でウサギ抗体を得て試験している。本発明以前には、ex vivoのヒトB細胞培養物と比較して著しくより早期の段階にて抗体試験を可能にするex vivoのB細胞培養物は入手可能でなかった。よって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記ウサギB細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
-  前記B細胞により7〜14日で、好ましくは9〜12又は9〜10日で生成される抗体を採集する工程と
を含む、抗体を得るための方法が更に提供される。前記採集される抗体は、好ましくは、約30ng/mlの最小限の抗体濃度が要求される1又は複数のアッセイを用いて試験される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウサギメモリーB細胞の形質導入。ウサギB細胞をIg発現に基づいてPBMCから単離した。rm-IL-21とともにCD40L L細胞上で36〜40時間、細胞を活性化した。細胞に、BCL6及びBcl-xLを含むレトロウイルスベクターを形質導入した。GALV及び両種指向型レトロウイルスをともに試験した。形質導入された細胞を、次いで、組換えマウスIL-21の存在下でCD40L-L細胞上で培養する。培養4日後に、形質導入効率をGFP発現に基づいて決定した。GALV型レトロウイルスは、両種指向型(0.8%)レトロウイルスと比較して、優れた(80%)形質導入効率を示した。
【図２】BCL6及びBcl-xLを含むレトロウイルスベクター又はBCL6及びMcl-1を含むレトロウイルスベクターが形質導入されたウサギB細胞について成長曲線を分析した。比較のために、並行して、BCL6及びBcl-xLを含む同一のレトロウイルスベクターが形質導入されたラマ細胞及び2名の異なるドナーからのヒト細胞からのB細胞について成長曲線を分析した。
【図３】IgG、IgM及びIgA表面免疫グロブリン発現を、FACSを用いて、3つの異なるBcl-6 Bcl-xL形質導入ウサギB細胞クローン上で検出した。
【図４】異なる特異性を有するウサギB細胞のプール内での抗原特異的ウサギB細胞の同定。
【図５】15μgのH1N1、15μgのH3N2及び15μgのinfl Bを含むヒトインフルエンザワクチンの異なる成分に対して、抗原特異的ウサギ抗体を得た。ヒトインフルエンザワクチンでウサギを免疫及び追加免疫した。B細胞を不死化し、組換えマウスIL-21の存在下でCD40L-L細胞上に384ウェルプレート中、異なる密度で播種した。ウサギB細胞培養上清中に存在する抗体を、インフルエンザ特異性についてELISAでスクリーニングした。抗原特異的抗体は、ワクチンの全ての成分について観察された。
【図６】15μgのH1N1、15μgのH3N2及び15μgのinfl Bを含むヒトインフルエンザワクチンで免疫したウサギからの不死化B細胞を、蛍光標識インフルエンザタンパク質で染色した。インフルエンザタンパク質との結合を示すB細胞を、ウェルあたり1細胞で、組換えマウスIL-21の存在下でCD40L-L細胞上、384ウェルプレート中でFACSAriaソーターを用いて選別した。ELISAでインフルエンザ特異的抗体について上清をスクリーニングした。抗原特異的抗体は、抗原特異的選別のために用いたワクチンの成分について高い頻度で観察された。
【図７】異なる時点でのクローンB細胞の上清中の抗体濃度。ヒト、ラマ及びウサギ形質導入B細胞を、ウェルあたり1細胞で、マウスIL-21を補った照射CD40L-L細胞の存在下で播種した。3〜4日ごとにCD40L-L細胞及びIL-21を補給した。IgG濃度を、培養中の異なる時点にて個別のウェルについてELISAで分析した。各測定は、異なるウェルで行った。ウサギB細胞には、BCL6及びBcl-xLを含むレトロウイルスベクター又はBCL6及びMcl-1を含むレトロウイルスベクターのいずれかを形質導入した。他の全ての細胞(ヒト及びラマ)には、BCL6及びBcl-xLを形質導入した。
【図８】ウサギ及びヒトB細胞を形質導入するために用いたベクターの模式図。
【図９】アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメイン(斜体+点線の下線)と融合したGALV SEATOエンベロープタンパク質の細胞外ドメイン(太字)及びGALV SEATOエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン(下線)の配列。
【図１０】ウサギメモリーB細胞の形質導入及び両種指向型レトロウイルスが形質導入されたウサギB細胞の成長。ウサギB細胞をIg発現に基づいてPBMCから単離した。rm-IL-21とともにCD40L L細胞上で36〜40時間、細胞を活性化した。細胞に、BCL6及びBcl-xLを含むレトロウイルスベクターを形質導入した。GALV及び両種指向型レトロウイルスをともに試験した。形質導入された細胞を、次いで、組換えマウスIL-21の存在下でCD40L-L細胞上で培養した。培養4日後に、形質導入効率をGFP発現に基づいて決定した。GALV型レトロウイルスは、両種指向型(0.8%)レトロウイルスと比較して、優れた(80%)形質導入効率を示した。10日後に、両種指向型レトロウイルスが形質導入されたウサギB細胞の94%は、GFP発現に基づいて不死化されており、非形質導入細胞を超える形質導入された細胞の成長を示した。
【図１１】BCL6及びBcl-xLを含む両種指向型レトロウイルスベクターが形質導入されたウサギB細胞について、成長曲線を分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で用いる場合、「ウサギB細胞」との用語は、ウサギから得られたB細胞、又はウサギB細胞を起源とするB細胞を意味する。ウサギB細胞を起源とするB細胞の例は、1又は複数の細胞分裂周期の後に形成されるウサギB細胞の子孫である。このような子孫は、例えば、ウサギB細胞のex vivoの培養物を含む。
【００１７】
ex vivoのウサギB細胞培養物は、ウサギB細胞及び/又はその子孫を含む培養物である。他の種類の細胞も、該培養物中に存在することができる。例えば、CD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞のようなB細胞刺激細胞も、本発明によるB細胞培養物中に典型的に存在する。更に、B細胞含有試料中に存在していた他の種類の細胞も、B細胞培養物中にまだ存在できる。B細胞培養条件において存在する場合、このような非B細胞はB細胞と比較して増殖できる能力が典型的により低いので、このような混入細胞の数は、経時的に典型的に減少する。好ましくは、ウサギB細胞培養物の細胞の少なくとも70%は、ウサギB細胞である。より好ましくは、前記ウサギB細胞培養物の細胞の少なくとも75%、80%、85%、90%又は95%は、ウサギB細胞である。特に好ましい実施形態では、ウサギB細胞並びにCD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞のようなB細胞刺激細胞だけが、本質的に、ウサギB細胞培養物中に存在する細胞の種類である。
【００１８】
好ましくは、本発明によるウサギB細胞培養物のB細胞は、1つの元のウサギB細胞の子孫であり、よって、モノクローナル抗体が、B細胞培養物により生成される。
【００１９】
「平均倍加時間」との用語は、本明細書において、ある元の量のB細胞を用いる培養物から開始して、前記の元のB細胞の数の2倍のB細胞の数を有する培養物を得るまでに要求される平均時間と定義される。全てのB細胞が全く同じ速度で増殖するわけではないので、全体としてB細胞培養物について平均の値を典型的に用いる。
【００２０】
Bcl-6は、正常なB細胞及びT細胞の発達及び成熟のために要求され、胚中心の形成のために要求される転写リプレッサーをコードする。Bcl-6は、胚中心B細胞において高度に発現されるが、形質細胞においてはほとんど発現されない。Bcl-6は、活性化B細胞から形質細胞への分化を阻害する。本発明による方法では、Bcl-6発現生成物又はそのウサギ相同体の発現生成物は、ex vivoの培養物のウサギB細胞に存在したままである。抗アポトーシス核酸の存在と一緒にBcl-6又はそのウサギ相同体の存在は、B細胞の複製寿命を延長する。Bcl-6又はそのウサギ相同体の発現は、好ましくは、Bcl-6発現促進化合物、若しくはBcl-6のウサギ相同体の発現を促進する化合物を、培養に用いるウサギB細胞に投与すること、又はそのような化合物の存在下でウサギB細胞を培養することにより誘導、増強又は維持される。
【００２１】
よって、
-  Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
-  Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、本発明による方法が更に提供される。
【００２２】
Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる様々な化合物が当業界において公知である。このような化合物は、例えば、シグナル伝達性転写因子5(STAT5)タンパク質又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/或いはそれをコードする核酸配列を含む。STAT5は、Bcl-6発現を増強できるシグナル伝達性因子である。STAT5の2つの形、すなわちSTAT5a及びSTAT5bが知られ、これらは、2つの異なる直列に連結された遺伝子によりコードされている。STAT5又はそのウサギ相同体の投与及び/又は活性化により、Bcl-6のレベルの増強又はBcl-6のウサギ相同体のレベルの増強がもたらされる。よって、STAT5又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体は、Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的に増加できる。よって、STAT5又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体を前記ウサギB細胞に与える工程、或いはSTAT5又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を前記ウサギB細胞に与える工程、或いはSTAT5の存在下、或いはそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程を含む、本発明による方法が提供される。
【００２３】
STAT5又はそのウサギ相同体の存在は、Bcl-6の量又はBcl-6のウサギ相同体の量を直接的に増加する。Bcl-6の発現又はそのウサギ相同体の発現を間接的に増加することも可能である。このことは、例えば、STAT5又はそのウサギ相同体を直接的又は間接的に次いで増加し、且つ/又はSTAT5の発現又はそのウサギ相同体の発現を増加するある化合物の量を調節することにより行われる。よって、一実施形態では、内因性及び/若しくは外因性STAT5の発現及び/若しくは活性又はそのウサギ相同体の発現が増加する。例えば、STAT5を活性化するか若しくはSTAT5のウサギ相同体を活性化し、Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を次いで増加することができるインターロイキン(IL)2及び/又はIL4の存在下でウサギB細胞を培養することにより、Bcl-6の発現又はそのウサギ相同体の発現を間接的に増強することが可能である。
【００２４】
本明細書で用いる場合、例えばBcl-6又はSTAT5の「ウサギ相同体」との用語は、Bcl-6又はSTAT5に対応するウサギタンパク質を意味し、これは、該タンパク質が、ヒトB細胞におけるBcl-6又はSTAT5の機能と比較してウサギB細胞における対応する同様の機能を有することを意味する。
【００２５】
しかし、Bcl-6をコードするか、或いはそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子をウサギB細胞に与えることが好ましい。このようにして、前記ウサギB細胞におけるBcl-6の濃度又はそのウサギ相同体の濃度を直接的に調節することが可能である。よって、Bcl-6をコードするか、或いはBcl-6のウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を前記ウサギB細胞に与える工程を含む本発明による方法も提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、このことは、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体が調節因子の存在とは独立して恒常的に発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、このことは、その発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。このようにして、前記核酸分子の発現が自由自在に調節される。例えば、Tet-On及びTet-Off発現系(例えばTet-On(登録商標)及びTet-Off(登録商標) Advanced Inducible Gene Expression Systems、Clontech社)を、対象の核酸配列の誘導性発現のために用いることができる。これらの系では、転写活性化因子(tTA)の発現が、テトラサイクリン(TC)若しくはドキシサイクリン(dox)のような誘導体の存在(Tet-On)又は非存在(Tet-Off)により調節される。原理上、tTAは、大腸菌(Escherichia coli)Tetリプレッサータンパク質(TetR)と単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルストランス活性化ドメインVP16とで構成される。tTAは、対象の核酸配列の転写を、Tetオペレーター(TetO)DNA配列とプロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーターとを含むテトラサイクリン応答性エレメント(TRE)の制御下で調節する。例えばBcl6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列は、このプロモーターの下流に配置できる。
【００２６】
Tet-off系では、tTAは、TC又はdoxの非存在下でTREと結合し、対象の核酸の転写が活性化されるが、TC又はdoxの存在下では、tTAは、TREと結合できず、対象の核酸の発現が阻害される。対照的に、Tet-on系は、doxの存在下でTREとだけ結合できるリバースtTA(rtTA)を用いる。対象の核酸配列の転写は、doxの非存在下で阻害され、doxの存在下で活性化される。
【００２７】
別の実施形態では、誘導性発現は、例えばエクジソン誘導性遺伝子発現系(例えばRheoSwitch(登録商標)、New England Biolabs社)(Christopherson, K.S.ら、PNAS 89、6314〜8 (1992))のようなホルモン誘導性遺伝子発現系を用いて実行する。エクジソンは、例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)からの昆虫ステロイドホルモンである。エクジソン受容体をトランスフェクトした細胞では、エクジソン、ムリステロンA及びポナステロンAのようなその類似体の1つ、及び非ステロイドエクジソンアゴニストから選択されるエクジソンアゴニストの存在下で、エクジソン受容体(Ecr)とレチノイドX受容体(RXR)とからなるヘテロ二量体が形成される。アゴニストの存在下では、Ecr及びRXRが相互作用し、発現カセット上に存在するエクジソン応答エレメントと結合する。エクジソン応答エレメントの下流に発現カセット中に配置された対象の核酸配列の発現は、よって、ウサギB細胞をエクジソンアゴニストに曝露することにより誘導される。
【００２８】
本発明の更に別の実施形態では、誘導性発現は、アラビノース誘導性遺伝子発現系(例えばpBAD/gIIIキット、Invitrogen社)(Guzman, L. M.ら、Bacteriol 177、4121〜4130 (1995))を用いて実行する。アラビノースは、5つの炭素原子を含む単糖である。アラビノース誘導性プロモーターPBADをトランスフェクトした細胞では、PBADの下流に配置された対象の核酸配列の発現は、よって、アラビノースの存在下で誘導できる。
【００２９】
Bcl-6若しくはウサギ相同体又は機能性部分若しくは機能性誘導体の活性が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節される、Bcl-6タンパク質、又はそのウサギ相同体、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体(をコードする核酸分子)を用いることも可能である。非限定的な例は、調節エレメントがBcl-6又はそのウサギ相同体の少なくとも一部分をコードする配列と融合している融合タンパク質である。例えば、エストロゲン受容体(ER)をBcl-6と融合して、融合タンパク質ER-Bcl-6を得る。この融合タンパク質は、サイトゾル中で熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。外因性誘導因子4ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与の際に、融合タンパク質ER-Bcl-6は熱ショックタンパク質から解離して、融合タンパク質のBcl-6部分が活性になる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「抗アポトーシス核酸分子」との用語は、ウサギB細胞におけるアポトーシスを遅延及び/又は妨げることができる核酸分子のことをいう。好ましくは、前記抗アポトーシス核酸分子は、抗体を増やし且つ生成できる形質芽細胞様ウサギB細胞におけるアポトーシスを遅延及び/又は妨げることができる。好ましくは、外因性核酸分子を含む抗アポトーシス核酸分子を用いる。このことは、ウサギB細胞において自然に発現されない核酸配列を用いること、又は自然に存在する核酸配列のさらなるコピーを用いることにより、得られるウサギB細胞における発現が、自然のウサギB細胞と比較して増強されることを意味する。様々な抗アポトーシス核酸分子が当業界において公知であることから、様々な実施形態が利用可能である。好ましくは、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバーである抗アポトーシス核酸分子を用いる。なぜなら、抗アポトーシスBcl-2タンパク質は、B細胞における良好なアポトーシス阻害物質であるからである。Bcl-2ファミリー(このファミリーは、アポトーシス促進性タンパク質及び抗アポトーシスタンパク質の両方を含む)により制御される多くのプロセスは、アポトーシスのミトコンドリア経路に関する。抗アポトーシスBcl-2ファミリーメンバーBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-2関連タンパク質A1(Bcl2-A1又はA1とも命名される)、Bcl-2様10(Bcl2L10)及びMcl-1又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の使用が好ましい。なぜなら、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1、Bcl2L10及びMcl-1は、ミトコンドリア外膜と一般的に一体化しているからである。これらは、Bcl-2ファミリーに属するアポトーシス促進性タンパク質と直接結合し阻害して、ミトコンドリア膜の完全性を守る。
【００３１】
好ましい実施形態は、よって、前記抗アポトーシス核酸分子が、Bcl2ファミリー、好ましくはBcl-xL若しくはMcl-1若しくはBcl-2若しくはA1若しくはBcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の抗アポトーシス遺伝子を含む、本発明による方法を提供する。
【００３２】
一実施形態では、Bcl-xL若しくはMcl-1若しくはBcl-2若しくはA1若しくはBcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の発現は、これらの抗アポトーシス遺伝子のいずれかの発現を促進できる少なくとも1つの化合物をウサギB細胞に投与することにより、又はそのような化合物の存在下でウサギB細胞を培養することにより、誘導、増強又は維持される。よって、
-  Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、並びに/或いは
-  Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、本発明による方法が更に提供される。
【００３３】
しかし、好ましくは、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10及びそのウサギ相同体並びにその機能性部分及び機能性誘導体からなる群から好ましくは選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子をウサギB細胞に与える。このようにして、前記ウサギB細胞における発現生成物の量を直接的に増強することが可能である。よって、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10及びそのウサギ相同体並びにその機能性部分及び機能性誘導体からなる群から好ましくは選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を前記ウサギB細胞に与える工程を含む、本発明による方法も提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、このことは、前記核酸分子が、恒常的に発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、このことは、その発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。当業界において公知の誘導性核酸発現系の非限定的な例は、本明細書において上に記載している。
【００３４】
特に好ましい実施形態では、前記抗アポトーシス核酸分子は、Bcl-xL若しくはMcl-1又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。本発明によると、Bcl-6とBcl-xLとの組合せは、ウサギB細胞の複製寿命を特によく増加することができ、このことにより、得られる形質芽細胞様B細胞の長期培養物が形成される。Bcl-6とMcl-1との組合せについても同様である。最も好ましくは、前記抗アポトーシス核酸は、Bcl-xL又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。
【００３５】
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の機能性部分は、自然のBcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体のそれぞれと比較してウサギB細胞の複製寿命を増加する同じ能力(本質的に必ずしも量ではない)を有するタンパク質性分子である。このような機能性部分は、例えば、前記能力に関与しないか又はわずかだけ関与するアミノ酸を含まない。
【００３６】
例えば、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10又はそのウサギ相同体の機能性部分は、本明細書において、それぞれ全長Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10又はそのウサギ相同体と同じ種類(本質的に必ずしも量ではない)の抗アポトーシス特徴を保持しているそれぞれBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10又はそのウサギ相同体の断片として定義される。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10又はそのウサギ相同体の機能性部分は、典型的に、ウサギB細胞におけるアポトーシスを遅延及び/又は妨げることができるそれぞれBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10又はそのウサギ相同体のより短い断片である。このような機能性部分は、例えば、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の抗アポトーシス活性に著しく貢献しない配列を含まない。Bcl-6又はそのウサギ相同体の機能性部分は、典型的に、ウサギB細胞の複製寿命を増加できるBcl-6のより短い断片、又はそのウサギ相同体のより短い断片である。
【００３７】
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の機能性誘導体は、変更されているが、ウサギB細胞の複製寿命を増加するその能力(本質的に必ずしも量ではない)を維持しているそれぞれBcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w若しくはBcl2L10タンパク質又はそのウサギ相同体として定義される。機能性誘導体は、多くの方法、例えば、1つのアミノ酸が、全体的な機能が著しく影響を受けないように、全般的に同様の特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される保存的アミノ酸置換により得られる。或いは、機能性誘導体は、例えば、検出可能な標識又は誘導性化合物との融合タンパク質を含む。
【００３８】
本発明の別の態様は、ウサギB細胞に対象の核酸分子を効率的に導入するという問題を解決する。予想に反して、本発明者らは、マウス細胞のようなげっ歯類細胞に感染するのに適切であり、よってウサギB細胞も形質導入できると予想された、一般的に用いられるアンホレトロウイルスベクターが、ウサギB細胞に効率的に形質導入されないことが明らかになり、形質導入4日後のアンホベクターの形質導入効率は、ウサギB細胞において1%未満であることが明らかになったことを見出した。よって、本発明者らは、他の遺伝子送達媒体(gene delivery vehicles)を探索する必要があった。驚くべきことに、本発明者らは、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインを含む遺伝子送達媒体が、典型的に形質導入の3〜5日後に80〜90%の高い効率でウサギB細胞に形質導入できることを発見した。この特性は、かなり予期されなかった。なぜなら、テナガザル白血病ウイルスは、自然にはウサギに感染しないからである。ウサギ細胞は、よって、GALVエンベロープタンパク質に対する受容体を含まないと予想されていた。今回の発見は、全く偶然の一致である。注目すべきことには、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインを含むベクターでのヒトB細胞の形質導入効率は、典型的に、形質導入の4日後に60〜70%であり、これは、ヒトB細胞が霊長類細胞であるという事実にも関わらず、このベクターでのウサギB細胞の形質導入効率より低いことが多い。このことは、驚くべきことである。なぜなら、サルも霊長類であるので、GALVベースのエンベロープタンパク質を含むベクターは、ウサギ細胞と比較して、霊長類細胞により良好に感染できることが予想されたからである。注目すべきことには、マウスB細胞は、テナガザル白血病ウイルスがマウスに感染しない事実に一致して、実際に、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインを含むベクターを用いて効率的に形質導入されない。
【００３９】
GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を用いてウサギB細胞を効率的に形質導入することが可能であり、形質導入効率はヒトB細胞の形質導入効率よりも高くさえあるという本発明の見識が今やあるので、新しい用途が利用可能になる。今では、対象の核酸分子をウサギB細胞に高い効率で導入することが可能になり、このことは、本発明に従ってex vivoのウサギB細胞培養物を生成するために特に有利である。本発明の好ましい実施形態は、よって、ウサギB細胞の複製寿命を増加するための方法であって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメイン若しくは前記細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードするか又はそのウサギ相同体をコードするか又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子並びに/或いは少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法を提供する。好ましい一実施形態では、前記細胞外ドメインは、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである。前記細胞外ドメインは、好ましくは、配列
【化１】
2017500052.tif 000003
を含む。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも81%、より好ましくは少なくとも82%、より好ましくは少なくとも83%、より好ましくは少なくとも84%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも87%、より好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも89%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは100%である。
【００４０】
当業者により理解されるように、野生型テナガザル白血病ウイルスの表面(エンベロープ)に位置するので宿主細胞と結合できる前記細胞外ドメインは、好ましくは、ウサギB細胞を形質導入するための遺伝子送達媒体の表面(エンベロープ)にも位置する。特に好ましい一実施形態では、アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメインと融合したGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン又はその機能性部分を含むエンベロープタンパク質を含むベクター又は他の遺伝子送達媒体を用いる。このことにより、実施例に示すように、ウサギB細胞の特に効率的な形質導入が可能になる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの機能性部分」との用語は、ウサギB細胞となおも結合することができるためにウサギB細胞の感染及び/又は形質導入を媒介できる前記細胞外ドメインの一部分を意味する。このような機能性部分は、ウサギB細胞の結合、感染及び/又は形質導入に必須でない1つ又は複数のアミノ酸残基を欠失していることがある。
【００４２】
もちろん、今や本発明の見識があるので、ウサギB細胞は、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を用いて、任意の対象の核酸分子を形質導入できる。よって、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインと結合しているか、又は前記細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と結合しているか、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質と結合している単離又は組換えウサギB細胞が更に提供される。GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を介して、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を介して遺伝子送達媒体と結合している単離又は組換えウサギB細胞も、本発明で提供される。好ましい一実施形態では、前記細胞外ドメインは、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである。前記細胞外ドメインは、好ましくは、配列
【化２】
2017500052.tif 000004
を含む。ここでもまた、前記配列同一性は、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも81%、より好ましくは少なくとも82%、より好ましくは少なくとも83%、より好ましくは少なくとも84%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも87%、より好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも89%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは100%である。前記遺伝子送達媒体は、好ましくは、対象の核酸分子、好ましくはBcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列、及び/或いは抗アポトーシス核酸配列を含む。このような遺伝子送達媒体を用いて、本発明による安定なウサギB細胞培養物が生成できる。前記抗アポトーシス核酸配列は、好ましくは、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10及びそのウサギ相同体並びにその機能性部分及び機能性誘導体からなる群から最も好ましくは選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子である。
【００４３】
対象の核酸分子をウサギB細胞に導入するためのGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメイン又はウサギB細胞と結合できるその少なくとも機能性部分の使用も、対象の核酸分子をウサギB細胞に導入するためのGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質の使用とともに、本発明で提供される。ウサギB細胞の複製寿命を増加するための、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体の使用であって、前記遺伝子送達媒体が、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列と、少なくとも1つの抗アポトーシス核酸配列とを含む使用が更に提供される。好ましい一実施形態では、前記細胞外ドメインは、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである。前記細胞外ドメインは、好ましくは、配列
【化３】
2017500052.tif 000005
を含む。
【００４４】
実施例においても用いる好ましいキメラエンベロープタンパク質を図9に示す。このキメラエンベロープタンパク質は、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメイン(図9に太字で示す配列
【化４】
2017500052.tif 000006
を有する)、及びGALVエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン(図9に下線で示す配列
【化５】
2017500052.tif 000007
を有する)であって、アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメイン(図9に斜体及び点線の下線で示す配列
【化６】
2017500052.tif 000008
を有する)と融合したものを含む。この好ましいキメラエンベロープタンパク質を含むベクター又は他の遺伝子送達媒体は、ウサギB細胞に対象の核酸分子を特によく導入できる。
【００４５】
よって、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質と結合している単離又は組換えウサギB細胞が更に提供される。図9に示すキメラエンベロープタンパク質を介して、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質を介して、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を介してベクター又は他の遺伝子送達媒体と結合している単離又は組換えウサギB細胞も本発明で提供される。
【００４６】
このようなベクター又は他の遺伝子送達媒体は、対象の核酸分子をウサギB細胞に形質導入するために特に適切である。よって、ウサギB細胞に対象の核酸分子を導入するための、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質の使用が更に提供される。
【００４７】
このようなベクター又は他の遺伝子送達媒体は、ウサギB細胞の複製寿命を増加するために特に適切である。よって、ウサギB細胞の複製寿命を増加するための方法であって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含むベクター又は他の遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードするか、又はそのウサギ相同体をコードするか、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子、及び/或いは少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法が更に提供される。
【００４８】
ウサギB細胞の複製寿命を増加するための、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体の使用であって、前記遺伝子送達媒体が、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列と、少なくとも1つの抗アポトーシス核酸とを含む使用も提供される。
【００４９】
GALVベースの遺伝子送達媒体は、Bcl-6及び抗アポトーシス核酸分子のような1又は複数の対象の核酸分子でのウサギB細胞の効率的な形質導入のために非常に適切であるが、GALVベースの遺伝子送達媒体の使用は、20時間以下の短い倍加時間を有するウサギB細胞を得るために必須ではないことが強調される。20時間以下の倍加時間を有するウサギB細胞を生成するために、他の遺伝子送達媒体も、(効率はより低いことが多いが)ウサギB細胞にBcl-6及び抗アポトーシス核酸分子を導入するために用いることができる。より低い量の元々形質導入されたウサギB細胞が成長するためにはより長い時間がかかることがあるが、Bcl-6及び抗アポトーシス核酸分子がウサギB細胞に導入される限り、急速成長B細胞培養物を得ることができる。本明細書に記載するGALVベースの遺伝子送達媒体のような効率的にウサギB細胞を形質導入できる遺伝子送達媒体を用いる利点は、より高い割合の元々単離されたB細胞が形質導入されるので、そこから得られるB細胞が、得られるB細胞培養物に存在することである。このことにより、より低い形質導入効率の遺伝子送達媒体を用いる状況と比較して、B細胞培養物内のB細胞の多様性がより高くなる。なぜなら、前者の場合ではより低い割合の元のB細胞が形質導入されるからである。得られるB細胞培養物内により高い多様性のB細胞が存在することは、所望の特性を有する1又は複数のB細胞を単離する機会を改善する。よって、原則として、遺伝子送達媒体の形質導入効率が高いほど、得られるB細胞培養物内のB細胞の多様性がより高い。
【００５０】
ウサギB細胞における発現を誘導するために、対象の核酸分子は、好ましくは、プロモーターに作動可能に連結している。非限定的な例としては、CMVプロモーター及びCAGプロモーターが挙げられる。一態様では、このようなプロモーターは、誘導性であり、このことは、その活性が、例えば転写因子のような少なくとも1つの化合物により影響されることを意味する。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「遺伝子送達媒体」との用語は、核酸分子を宿主細胞に移すことができる任意の化合物を意味する。遺伝子送達媒体の非限定的な例としては、(ウイルス)ベクター及びプラスミドが挙げられる。「GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体」との用語は、GALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む遺伝子送達媒体であって、前記細胞外ドメイン又はその前記一部分が、ウサギB細胞と結合でき、そのことにより核酸を前記ウサギB細胞に導入できる遺伝子送達媒体を意味する。本明細書において以前に記載したように、前記細胞外ドメイン又はその一部分は、好ましくは、遺伝子送達媒体の表面に位置し、そのことにより、前記細胞外ドメイン又はその一部分は、ウサギB細胞上の受容体と結合できる。同様に、本発明による遺伝子送達媒体がGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含むならば、前記タンパク質は、好ましくは、遺伝子送達媒体の表面に位置し、そのことにより、前記タンパク質は、ウサギB細胞上の受容体と結合できる。
【００５２】
アミノ酸又は核酸配列の同一性のパーセンテージ、又は「%配列同一性」との用語は、本明細書において、最大限のパーセント同一性を達成するために2つの配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後に、参照配列中の残基と同一である候補アミノ酸又は核酸配列中の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは当業界において公知であり、例えば「Align 2」である。
【００５３】
GALVエンベロープタンパク質は、テナガザル白血病ウイルスのウイルスエンベロープ中に自然に存在し、宿主細胞の感染に関与するタンパク質である。標的特異性は、典型的に、エンベロープタンパク質により決定される。一実施形態では、前記エンベロープタンパク質は、GALV SEATO株のものである。GALVエンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクターは当業界において公知であり、分子生物学の技術において一般的に用いられる手順を用いて生成でき、例えばLamら、1996を参照されたい。
【００５４】
「プロモーターに作動可能に連結した」との用語は、対象の核酸配列がプロモーターに十分に近く位置するので、プロモーターがその発現に影響できることを意味する。典型的に、そのようなプロモーターは、前記対象の核酸の発現を誘導又は増加する。「発現活性」との用語は、このような発現の誘導又は増強のことをいう。
【００５５】
本明細書において以前に言及したように、本発明は、現在知られているヒト又はマウスB細胞培養物と比較してより短い平均倍加時間を有するex vivoのウサギB細胞培養物を得ることができるという見識を提供する。ヒトBcl-6核酸配列、マウスIL21及びヒトCD40Lのような非ウサギ化合物を今回の実施例において用いたので、このことはよりいっそう驚くべきことである。実施例に示すように、本発明者らは、ヒトBcl-6配列及びヒトBcl-xL又はMcl-1配列を含む核酸分子をウサギB細胞に形質導入した。ヒト配列を用い、ウサギ細胞をマウスIL21及びヒトCD40Lの存在下で培養しさえしたが、ウサギB細胞は、驚くべきことに、ヒト及びマウスB細胞と比較してより速く増殖し、より多くの抗体を生成することが明らかになった。
【００５６】
よって、本発明によると、ウサギB細胞は、ヒト及びマウス化合物を用いて非常に良好に増殖する。これらの反応条件下で、ウサギB細胞は、ヒト及びマウスB細胞よりも良好に増殖しさえする。このことは、なかでも、ヒトB細胞について現在用いている反応条件をウサギB細胞のために調整しなくてよいという利点がある。ウサギIL21、ウサギCD40又はBcl-6をコードするウサギ核酸配列又は抗アポトーシス遺伝子を得る必要はない。代わりに、現在利用可能なヒト又はマウス化合物を用いることができる。本発明の一態様は、よって、ウサギB細胞の複製寿命を増加する方法であって、
-  ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
-  前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
* 非ウサギBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子、及び
* 非ウサギ抗アポトーシス核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法を提供する。ヒトBcl-6及びヒト抗アポトーシス配列がウサギB細胞において特に良好な結果を与えるようであることから、前記非ウサギ核酸分子は、好ましくはヒト核酸分子である。特に好ましい実施形態では、ヒトBcl-6をコードする核酸分子と、ヒト抗アポトーシス核酸分子、好ましくはヒトBcl-xL又はヒトMcl-1又はヒトBcl-2又はヒトA1又はヒトBcl-w又はヒトBcl2L10をウサギB細胞に与える。
【００５７】
更に、IL21及びCD40Lを前記ウサギB細胞に与える工程を更に含む、本発明による方法が提供される。好ましくは、非ウサギIL21及び/又は非ウサギCD40Lを用いる。好ましくは、前記IL21は、マウス又はヒトIL21、最も好ましくはマウスIL21である。好ましい別の実施形態では、前記CD40Lは、マウス又はヒトCD40L、最も好ましくはヒトCD40Lである。
【００５８】
Bcl-6発現及び抗アポトーシス核酸分子の発現を増加することのほかに、ウサギB細胞におけるBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持することも有利である。このことは、前記B細胞の抗体生成を増強する。一態様は、よって、前記ウサギB細胞におけるBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程を更に含む、本発明による方法を提供する。
【００５９】
ウサギB細胞におけるBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現の程度は、様々な方法で調節される。一実施形態では、Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物をウサギB細胞に与える。更に又は或いは、Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物の存在下でウサギB細胞を培養する。よって、
-  Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
-  Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を更に含む、本発明の方法が更に提供される。
【００６０】
Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を増加できる前記化合物は、最も好ましくはIL21を含む。よって、本発明の好ましい一実施形態では、ウサギB細胞は、培養時間の少なくとも一部分の間は、IL21の存在下で培養する。
【００６１】
別の実施形態では、Blimp-1発現を増加できる前記化合物は、シグナル伝達性転写因子3(STAT3)タンパク質又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/或いはそれをコードする核酸分子を含む。STAT3は、シグナル伝達因子であり、これは、B細胞の発達及び分化に関与する。STAT3は、Blimp-1発現を上方制御できる。好ましい一実施形態では、STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子をウサギB細胞に与え、ここで、前記核酸分子の発現は、リプレッサーの外因性誘導因子により調節されるので、STAT3発現の程度は、自由自在に調節される。例えば、以前に言及した誘導性発現系の1つを用いる。一実施形態では、STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体とERとを含む融合生成物を用いる。例えば、エストロゲン受容体(ER)及びSTAT3を融合タンパク質ER-STAT3としてコードする核酸分子をウサギB細胞に与える。この融合タンパク質は、サイトゾル中で熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。このようにして、STAT3は核に達することができず、Blimp-1発現は増強されない。外因性誘導因子4ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与の際に、融合タンパク質ER-STAT3は熱ショックタンパク質から解離するので、STAT3が核に侵入してBlimp-1発現を活性化できる。
【００６２】
本明細書で用いる場合、STAT3の機能性部分は、自然のSTAT3と比較してBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を増加する同じ能力(本質的に必ずしも量ではない)を有するSTAT3の断片として定義される。このような機能性部分は、例えば、前記能力に関与しないか又はわずかだけ関与するアミノ酸を含まない。
【００６３】
STAT3の機能性誘導体は、変更されているが、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を増加するその能力(本質的に必ずしも量ではない)を維持しているSTAT3タンパク質として定義される。機能性誘導体は、多くの方法で、例えば、1つのアミノ酸が、全体的な機能が著しく影響を受けないように、全般的に同様の特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される保存的アミノ酸置換により得られる。或いは、機能性誘導体は、例えば、検出可能な標識又は誘導性化合物との融合タンパク質を含む。
【００６４】
STAT3は、Blimp-1の発現を増加又はそのウサギ相同体の発現を増加できるので、STAT3の活性及び/又は発現を増加できる化合物を投与することにより、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を間接的に増加することも可能である。一実施形態では、よって、STAT3の活性を増強できる化合物をウサギB細胞に与え、そのことにより、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を間接的に増強する。
【００６５】
STAT3は、様々な方法で活性化される。好ましくは、STAT3は、サイトカインをウサギB細胞に与えることにより活性化される。B細胞分化に自然に関与するサイトカインは、STATタンパク質の調節において非常に効果的である。STAT3の非常に効果的な活性因子は、IL21及びIL6であるが、IL2、IL7、IL10、IL15及びIL27もSTAT3を活性化することが知られている。更に、自然免疫に関与するToll様受容体(TLR)もSTAT3を活性化できる。一実施形態は、よって、前記ウサギB細胞が、IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15及び/又はIL27の存在下で培養される、本発明の方法を提供する。最も好ましくは、IL21が用いられる。なぜなら、IL21は、本発明によるウサギB細胞培養物の抗体生成を増強するために特に適切であるからである。IL21は、Blimp-1発現がBCL6により打ち消される場合でさえ、Blimp-1発現を上方制御できる。
【００６６】
更に又は或いは、STAT3を活性化するために、変異ヤヌスキナーゼ(JAK)又はJAKの変異ウサギ相同体を用いる。自然では、JAKは、少なくとも1つのサイトカインによりそれ自体が活性化された後にSTAT3をリン酸化できる。サイトカインの存在とは独立してSTAT3を活性化できる変異ヤヌスキナーゼ又はJAKの変異ウサギ相同体は、本発明による方法において特に適切である。
【００６７】
更に別の実施形態では、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現は、サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)タンパク質又はそのウサギ相同体をウサギB細胞に与えることにより、且つ/又は前記細胞内のSOCSタンパク質又はそのウサギ相同体を活性化することにより増加する。或いは又は更に、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を増加するために、E-タンパク質E47、E12、E2-2及びHEBの少なくとも1つを用いる。E47は、E-タンパク質と命名されるヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質のファミリーに属する転写因子である。4つのE-タンパク質、E12、E47、E2-2及びHEBが存在し、これらは、リンパ球発達に関与する。E12及びE47は、E2Aと命名される1つの遺伝子によりコードされ、これは、異なってスプライシングされる。Eタンパク質は、腫瘍抑制因子として記載されている。E47の特異的標的の1つは、Socs1及びSocs3遺伝子である。
【００６８】
一態様は、よって、Blimp-1又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物を前記B細胞に与えることにより、且つ/又はBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物の存在下で前記B細胞を培養することにより、ウサギB細胞におけるBlimp-1又はそのウサギ相同体の発現を更に増加する本発明による方法であって、前記化合物が、
-  STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/或いは
-  STAT3を活性化できる化合物、及び/或いは
-  STAT3の発現を増強できる化合物、及び/或いは
-  IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCSタンパク質、E-タンパク質E47、E12、E2-2若しくはHEBの1つ、変異ヤヌスキナーゼ及び/或いはSTAT3又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列
を含む方法を提供する。
【００６９】
最も好ましくは、前記化合物は、IL21である。
【００７０】
本発明は、本発明による方法を用いて得ることができる単離又は組換えウサギB細胞を更に提供する。このような単離又は組換えウサギB細胞は、好ましくは、外因性抗アポトーシス核酸配列と、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする外因性核酸配列とを含む。よって、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする外因性核酸配列と、外因性抗アポトーシス核酸配列とを含む単離又は組換えウサギB細胞が更に提供される。以前に説明したように、前記外因性核酸分子は、ウサギB細胞に自然に存在しない核酸配列又は自然のウサギB細胞核酸配列のさらなるコピーのいずれかを含む。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10並びにそのウサギ相同体は、好ましい抗アポトーシス核酸分子である。好ましい一態様は、よって、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする外因性核酸配列と、Bcl-xL若しくはMcl-1若しくはBcl-2若しくはA1若しくはBcl-w若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする外因性核酸配列とを含む単離又は組換えウサギB細胞を提供する。
【００７１】
Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする前記核酸配列及び前記外因性抗アポトーシス核酸配列は、1つの核酸分子上に存在することが可能である。或いは、これらの配列は、少なくとも2つの異なる核酸分子上に存在する。
【００７２】
好ましくは、以前に説明したように、非ウサギ配列を用いる。好ましい実施形態は、よって、非ウサギ抗アポトーシス核酸配列と、Bcl-6又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする非ウサギ核酸配列とを含む単離又は組換えウサギB細胞を提供する。前記非ウサギ核酸配列は、好ましくは、ヒト配列を含む。
【００７３】
特に好ましい実施形態では、
-  ヒトBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列と、
-  好ましくはヒトBcl-xL若しくはヒトMcl-1若しくはヒトBcl-2若しくはヒトA1若しくはヒトBcl-w若しくはヒトBcl2L10、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードするヒト抗アポトーシス核酸配列と
を含む単離又は組換えウサギB細胞が提供される。ここでもまた、Bcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする前記核酸配列及び前記抗アポトーシス核酸配列は、1つの核酸分子上に存在することが可能であるか、或いは、これらの配列は、少なくとも2つの異なる核酸分子上に存在することが可能である。
【００７４】
本発明は、本発明の方法により得ることができるex vivoのウサギB細胞培養物も提供する。重要な利点は、短い平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物が今では得られるという事実である。よって、20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのウサギB細胞培養物が提供される。更に好ましい実施形態は、本発明によるウサギB細胞を含むex vivoのウサギB細胞培養物を提供する。前記ウサギB細胞は、好ましくは、ヒトBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列と、抗アポトーシス核酸配列とを含む。非ウサギIL21及び/又は非ウサギCD40Lの存在下にウサギB細胞を含むex vivoのウサギB細胞培養物も提供される。好ましくは、前記IL21は、マウス又はヒトIL21、最も好ましくはマウスIL21である。別の好ましい実施形態では、前記CD40Lは、マウス又はヒトCD40L、最も好ましくはヒトCD40Lである。
【００７５】
本発明の方法により得られる場合の抗体も、本発明によるウサギB細胞又は本発明によるex vivoのウサギB細胞培養物により生成される抗体とともに本発明で提供される。このような抗体は、治療又は診断用途のために特に有用である。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００７６】
本発明を以下の実施例において更に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定しないが、本発明を明確にするだけの役割を果たす。
【実施例】
【００７７】
(実施例1)
B細胞の形質導入
リン酸カルシウム沈殿、リポソーム形成又はエレクトロポレーションのような伝統的な方法によるリンパ球への遺伝子導入は、非効率であるが、より重要なことには、安定な遺伝子組み込みが全般的に存在しない。しかし、ウイルス形質導入は、標的細胞のゲノムへの安定な遺伝子組み込みを直接的に導き、正しいウイルスエンベロープが選択されるならば、非常に効率的であり得る。レトロウイルス及びレンチウイルス形質導入はともに、効率的な遺伝子導入のために適切である。レトロウイルス組み込みは細胞分裂に依存するが、レンチウイルス形質導入は、形質B細胞のような非分裂細胞にも用いることができる。組換えレトロウイルスの大規模調製は、Phoenix発現プラットフォーム(Kinsella及びNolan、1996)のような安定生成株化細胞を用いることにより容易に達成できる。高力価レンチウイルスの生成は、主に、発現されるウイルスタンパク質及びエンベロープの毒性のために、より煩わしい。
【００７８】
今回の実施例のために、本発明者らは、両種指向性又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープ発現生成細胞(Wilsonら、1995)のいずれかを用いるモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)ベースのプラットフォームを用いた。本発明者らのGALVベースのベクターでは、GALV SEATO株エンベロープタンパク質の膜貫通ドメインを、アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメインに融合した(図9)。導入ベクターは、Bcl-6、Bcl-xL及び緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカータンパク質が同じウイルスRNAから同時に翻訳されるように構成する(図8)。この多重シストロンアプローチは、「自己切断」2Aペプチド配列(Szymczakら、2004)を、BCL-6及びBCL-xLコード領域とGFPレポーター遺伝子の上流の配列内リボソーム侵入配列(IRES)との間に配置することにより達成する。ウイルス形質導入効率は、高く、偏っていない。
【００７９】
不死化ウサギB細胞の作製
Kwakkenbosら、2010及び特許出願WO 2007/067046に記載されるBCL-6/Bcl-xL技術を用いて、ヒトメモリーB細胞を不死化した。簡単に述べると、フィコール密度勾配を用いてウサギ血液からのPBMCを単離し、IgM特異的抗体と時には組み合わせて、Ig(IgG H+L:IgG重鎖並びにカッパ及びラムダ軽鎖)を認識する抗体を用いてIg発現について染色した。FACSソーターを用いてB細胞を単離し(Ig陽性、又はIg陽性+IgM陰性)、組換えマウスインターロイキン(IL)-21と一緒にCD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)上で36〜48時間刺激した。細胞を採集し、FCSを含まない培地で洗浄し、細胞を、次いで、Retronectin(登録商標)(タカラバイオ株式会社、日本国滋賀県)でコートした組織培養プレートに移して、ここで、BCL-6、Bcl-xL及びレポータータンパク質としてGFPを含むレトロウイルスベクターを細胞に形質導入した。或いは、BCL-6、Mcl-1及びGFPを含むレトロウイルスベクターを細胞に形質導入した。形質導入されたB細胞を、CD40リガンド発現L細胞及びIL-21とともに培養で維持した。図1では、GALV及び両種指向型レトロウイルスについて、形質導入の4日後の形質導入効率を比較する。両種指向型レトロウイルスでの形質導入の4日後に、0.8%の細胞が形質導入されたのに対して、GALV型レトロウイルスを用いる形質導入の後では80%の細胞が形質導入された。明らかに、GALV型レトロウイルスは、ウサギB細胞の形質導入について、両種指向型レトロウイルスより優れている。
【００８０】
(実施例2)
細胞培養。
本発明者らは、B細胞(2×105細胞ml-1)を、組換えマウスインターロイキン21(IL-21)(50ng ml-1)を補った8%FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)を含むイスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco社)で維持し、CD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)上で細胞を培養した。細胞倍加時間を決定するために、CD40L-L細胞及びIL-21と一緒に50〜100,000細胞/ウェルにて24ウェルプレート中で細胞を培養した。3〜4日ごとに細胞を計数し、50〜100,000細胞を新しいウェルに移した。図2では、2つのヒトドナーからのB細胞(89及び93)、1つのラマB細胞試料(ラマ)及びヒトBcl-6配列及びヒトBcl-xLを含む核酸分子を有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギB細胞試料(Rb 6XL)について成長曲線を示す。ヒトBcl-6配列及びヒトMcl-1を含む核酸分子を有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギ試料(Rb 6M)についても成長曲線を示す。形質導入されたウサギB細胞は、19時間の平均倍加時間を有し、よって、26から32時間の間の倍加時間を有するヒト又はラマB細胞よりも速く成長する。これらの平均倍加時間は、3〜4日のいくつかの時間間隔中のB細胞の増加を決定し、得られた結果を平均することにより元々算出した。その後、培養期間全体の間の全体的な平均倍加時間を算出した。このことにより、形質導入されたウサギB細胞の平均倍加時間は18時間、形質導入されたヒトB細胞の平均倍加時間は25〜29時間、及び形質導入されたラマB細胞平均倍加時間は27時間となった。このことにより、本発明者らの方法により20時間以下の平均倍加時間を有するウサギB細胞培養物が得られるが、ヒト、マウス及びラマB細胞は、典型的に、25から36時間の間の倍加時間を有することが確認される。
【００８１】
(実施例3)
B細胞受容体発現及び抗原特異的染色
不死化ヒトB細胞は、B細胞受容体を発現する。この特質により、抗原特異的染色及びB細胞の選別が可能になる。形質導入されたウサギB細胞上でB細胞受容体も発現されるかを決定するために、B細胞クローンを、ウサギIgG、ウサギIgM又はウサギIgAのいずれかと特異的に反応する蛍光標識抗体で染色する。B細胞を冷(4℃)細胞培養培地で洗浄し、ウサギIgG、IgM、IgA又は標識抗原のいずれかに特異的な免疫蛍光標識抗体を含む細胞培養培地と氷上で暗所にてインキュベートした。その後、過剰の標識抗体又は抗原を洗浄して除き、B細胞受容体発現をFACS分析器、Guava easycyte(Millipore社)又はFACS Aria3(BD社)で分析した。
【００８２】
図3では、異なるアイソタイプの3つの異なるB細胞クローンを、ウサギ抗体アイソタイプIgG、IgA又はIgMを特異的に認識する蛍光標識抗体で染色した。明らかに、B細胞受容体は、異なるウサギ抗体アイソタイプについて効率的に染色できる。本発明者らは、よって、不死化ウサギB細胞もB細胞受容体を発現すると結論付ける。
【００８３】
更に、これもまた蛍光標識されたインフルエンザタンパク質を用いて、ヒトインフルエンザワクチンで免疫したウサギ又は未処理の対象ウサギからのインフルエンザ特異的B細胞について染色した(図4)。ウサギB細胞を、蛍光標識H1、H3又はインフルエンザBで染色し、ウェルあたり1細胞でFACSソーターを用いて選別した。
【００８４】
(実施例4)
単細胞由来クローンウサギB細胞培養物の発展。
形質導入されたB細胞を、ウェルあたり1細胞でFACSソーターを用いて選別し、組換えマウスIL-21と一緒に、CD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)の存在下で培養した。3〜4日ごとに新しいCD40L-L細胞及びIL-21を加えた。細胞を播種した(ウェルあたり1細胞)9日後に開始して、ウサギ免疫グロブリンG(IgG)の生成についてELISAで上清を分析した。比較のために、ヒトB細胞クローンの上清中のヒトIgGも並行して分析した。
【００８５】
図7では、単細胞培養の開始9日後に開始して経時的な上清中の抗体濃度を示す。抗体濃度は、2つのヒトドナー、並びにヒトBcl-6配列を含む核酸分子及びヒトBcl-xLを有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギB細胞試料、並びにヒトBcl-6配列を含む核酸分子及びヒトMcl-1を有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギB細胞試料について決定した。ウサギからのB細胞クローンは、ヒトB細胞クローン(それぞれ13〜18日及び15〜20日)よりも短い時間の間(それぞれ9〜10日及び11〜12日)に30ng/ml及び100ng/mlのIgG濃度を生じる。このことは、ヒトB細胞クローンと比較してウサギB細胞クローンの対象の抗体についてより早期のスクリーニングを可能にするという重要な利点を提供する。
【００８６】
(実施例5)
ウサギの免疫。
2匹のニュージーランドホワイトウサギを、完全フロイントアジュバント中に15μgのH1N1、15μgのH3N2及び15μgのinfl Bを含むヒトインフルエンザワクチンで免疫した。3週間後に、不完全フロイントアジュバント中の同じワクチンでウサギを追加免疫した。追加免疫の5日後に、ウサギから出血させ、血液からB細胞を単離し、ヒトBcl-6配列を含む核酸分子及びヒトBcl-xLを有するGALV型レトロウイルス(アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメインと融合したGALV SEATO株エンベロープタンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む)を形質導入した。形質導入されたB細胞を、異なる密度で培養プレートに播種し、実施例4に記載するようにして培養した。また、形質導入したB細胞を、ワクチンの蛍光標識成分、H1、H3又はインフルエンザBで標識し、ウェルあたり1細胞でFACSソーターを用いて選別し、実施例4に記載するようにして培養した。培養した細胞の上清を、完全ワクチン又はその個別の成分との結合について分析した。結果を図4〜図6に示し、結果は、細胞を異なる密度で播種することにより(図5)、また、標識抗原を用いて細胞を選別することにより非常に効率的に(図4及び図6)、ワクチン接種したウサギからB細胞プール中の抗原特異的B細胞を同定できることを示す。
【００８７】
(実施例6)
ウサギB細胞は、両種指向型レトロウイルスを用いる遺伝子Bcl-6及びBcl-xlの導入により不死化される。
遺伝子Bcl-6及びBcl-xlの導入によるウサギB細胞の不死化は、実施例1に示すとおり、例えばGALV及び両種指向型レトロウイルスのような異なる型のベクターを用いることにより達成できる。両種指向型レトロウイルスが形質導入されたB細胞の成長を更に追跡して、両種指向性レトロウイルスによるBcl-6及びBcl-xlの導入がウサギB細胞の不死化も導くことを確認した。GALV型レトロウイルスの形質導入後に80%の細胞が形質導入されたのに比較して、両種指向型レトロウイルスの形質導入の4日後に、0.8%の細胞が形質導入された(図1及び図10)。形質導入の10日後に、両種指向性レトロウイルスが形質導入された細胞集団の94%がGFP陽性であり、このことは、形質導入された細胞が、非形質導入細胞よりもよく成長することを証明した(図10)。
【００８８】
細胞倍加時間を決定するために、実施例2と同様にして、CD40L-L細胞及びIL-21と一緒に50〜100,000細胞/ウェルにて24ウェルプレート中で細胞を培養した。3〜4日ごとに細胞を計数し、50〜100,000細胞を新しいウェルに移した。図11では、両種指向性ウイルスが形質導入されたウサギB細胞について成長曲線を示す。算出された倍加時間は、19時間であり、これは、GALV型レトロウイルスが形質導入されたウサギB細胞(18時間)と同等である。結論として、両種指向性レトロウイルスによるウサギB細胞へのBcl-6及びBcl-xlの導入も、ウサギB細胞の不死化をもたらすが、形質導入効率は、GALVベースのベクターと比較してかなりより低い。
【００８９】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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