(57)【要約】  本発明は、１週間またはより長期、（限定されるわけではないが）１０日またはより長期、例えば２週間、３週間、またはさらに毎月を含む投与間隔の長時間作用性第ＩＸ因子（ＦＩＸ）による予防的投与レジメンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が毎週約１回の投与間隔で約２５〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質。
【請求項２】
前記用量が約３５〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３】
前記用量が約３５〜５５ＩＵ／ｋｇである、請求項１または請求項２に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４】
前記用量が約３５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５】
前記用量が約２５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項６】
前記用量が約２５〜４０ＩＵ／ｋｇである、請求項１または請求項５に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項７】
前記用量が約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１〜５のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項８】
前記用量が約４５ＩＵ／ｋｇである、請求項１〜５のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項９】
前記用量が約４０ＩＵ／ｋｇである、請求項１〜６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１０】
前記用量が約３５ＩＵ／ｋｇである、請求項１〜６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１１】
前記用量が約２５ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１２】
前記投与間隔が６〜８日毎に約１回である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１３】
前記投与間隔が７日毎に約１回である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上のトラフを維持する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２％上のトラフを維持する、請求項１４に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの５〜１５％上のトラフを維持する、請求項１４に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１７】
対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が８〜１１日毎に約１回の投与間隔で、約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与される融合タンパク質。
【請求項１８】
前記用量が約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項１７に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項１９】
前記用量が約７５ＩＵ／ｋｇである、請求項１７または請求項１８に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２０】
前記用量が約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１７または請求項１８に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２１】
前記投与間隔が１０日毎に約１回である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のように使用するための融合タンパク質。
【請求項２２】
対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が２週間毎に約１回の投与間隔で約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質。
【請求項２３】
前記用量が約６５〜８５ＩＵ／ｋｇである、請求項２２に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２４】
前記用量が約６０〜８０ＩＵ／ｋｇである、請求項２２または請求項２３に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２５】
前記用量が約７０〜８０ＩＵ／ｋｇである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２６】
前記用量が約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項２２に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２７】
前記用量が約７５ＩＵ／ｋｇである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２８】
前記用量が約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項２９】
前記投与間隔が１２〜１６日毎に約１回である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３０】
前記投与間隔が１４日毎に約１回である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３１】
対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が３週間毎に約１回またはより長期の投与間隔で少なくとも約９０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質。
【請求項３２】
前記用量が約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇである、請求項３１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３３】
前記用量が約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇである、請求項３１または請求項３２に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３４】
前記用量が約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３５】
前記用量が約１００ＩＵ／ｋｇである、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３６】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２〜４％上のトラフを維持する、請求項３５に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３７】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約４％上のトラフを維持する、請求項３５または３６に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３８】
前記投与間隔が１９〜２３日毎に約１回である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項３９】
前記投与間隔が２１日毎に約１回である、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４０】
前記投与間隔が毎月約１回ある、請求項３１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４１】
前記用量が約１４０〜２００ＩＵ／ｋｇである、請求項４０に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４２】
前記用量が約１４０〜１６０ＩＵ／ｋｇである、請求項４０または請求項４１に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４３】
前記用量が約１５０ＩＵ／ｋｇである、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４４】
前記投与間隔が２８日毎に約１回である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４５】
前記半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミン（ＦＰ）または抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）のない免疫グロブリンである、上記請求項１〜４４のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４６】
前記半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミン（ＦＰ）である、上記請求項１〜４５のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４７】
前記第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分がペプチドリンカーを介して半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合される、上記請求項１〜４６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４８】
前記ペプチドリンカーが切断可能である、請求項４７に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項４９】
前記ペプチドリンカーが、凝固に関与するか、または凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項４８に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５０】
前記リンカーがＦＩＸａによって、および／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である、請求項４８または請求項４９に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５１】
前記リンカーが配列番号：２および配列番号：３から選択される配列を含む、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５２】
前記融合タンパク質の配列が、配列番号：１に記載された配列を有する、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５３】
前記融合タンパク質の配列が配列番号：１に記載された配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５４】
前記対象がヒトである、上記請求項１〜５３のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ヒトが血友病Ｂを患っている、請求項５４に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５６】
前記方法が予防的投与レジメンを含む、上記請求項１〜５５のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５７】
前記用量が静脈内に投与されることになっている、上記請求項１〜５６のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質。
【請求項５８】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
含む融合タンパク質の約２５〜７５ＩＵ／ｋｇの用量を毎週約１回またはより長期の投与間隔で該対象に投与することを含む方法。
【請求項５９】
前記用量が約３５〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記用量が約３５〜５５ＩＵ／ｋｇである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記用量が約３５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記用量が約２５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記用量が約２５〜４０ＩＵ／ｋｇである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記用量が約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記用量が約４５ＩＵ／ｋｇである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記用量が約４０ＩＵ／ｋｇである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記用量が約３５ＩＵ／ｋｇである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記用量が約２５ＩＵ／ｋｇである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６９】
前記投与間隔が６〜８日毎に約１回である、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記投与間隔が７日毎に約１回である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上のトラフを維持する、請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの約２％上のトラフを維持する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの５〜１５％上にトラフを維持する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質を８〜１１日毎に約１回の投与間隔で該対象に投与することを含む方法。
【請求項７５】
前記用量が約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記用量が約７５ＩＵ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記投与間隔が１０日毎に約１回である、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量を２週間毎に約１回またはより長期の投与間隔で該対象に投与することを含む方法。
【請求項７９】
前記用量が６５〜８５ＩＵ／ｋｇである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記用量が６０〜８０ＩＵ／ｋｇである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記用量が約７０〜８０ＩＵ／ｋｇである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記用量が約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記用量が約７５ＩＵ／ｋｇである、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記用量が約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記投与間隔が１２〜１６日毎に約１回である、請求項７８〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記投与間隔が１４日毎に約１回である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の９０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量を３週間毎に約１回またはより長期の投与間隔で該対象に投与することを含む方法。
【請求項８８】
前記用量が約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記用量が約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記用量が約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記用量が約１００ＩＵ／ｋｇである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２〜４％上のトラフを維持する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約４％上のトラフを維持する、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記投与間隔が１９〜２３日毎に約１回である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記投与間隔が２１日毎に約１回である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記投与間隔が毎月約１回である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９７】
前記用量が約１４０〜２００ＩＵ／ｋｇである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記用量が約１４０〜１６０ＩＵ／ｋｇである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記用量が約１５０ＩＵ／ｋｇである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記投与間隔が２８日毎に約１回である、請求項９６〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミン（ＦＰ）または抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）のない免疫グロブリンである、請求項５８〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミン（ＦＰ）である、請求項５８〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分が、ペプチドリンカーを介して半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合される、請求項５８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ペプチドリンカーが切断可能である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ペプチドリンカーが、凝固に関与するか、または凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記リンカーがＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記リンカーが配列番号：２および配列番号：３から選択される配列を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記融合タンパク質の配列が配列番号：１に記載された配列を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記融合タンパク質の配列が、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記対象がヒトである、請求項５８〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ヒトが血友病Ｂを患っている、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記処置が予防的投与レジメンを含む、請求項５８〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記用量が静脈内に投与されることになっている、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
請求項１〜５７のいずれか１項に記載されたように使用するための融合タンパク質、または請求項５８〜１１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記融合タンパク質が、約１００〜４００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与するために提供される融合タンパク質または方法。
【請求項１１５】
前記融合タンパク質が約１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与するために提供される、請求項１１４に記載の融合タンパク質または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の詳細
本願は、２０１３年１２月２３日に出願された「血友病の予防的処置のための第ＩＸ因子を含む融合タンパク質およびその方法」と題する米国仮特許出願第ＵＳ６１／９１９８８４号からの優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、１週間またはより長期、１０日またはより長期、例えば２週間、３週間またはさらに毎月を含む（しかし、それらに限定されるわけではない）投与間隔での長時間作用性第ＩＸ因子（ＦＩＸ）による予防的投与レジメンに関する。
【背景技術】
【０００３】
血友病Ｂは、血液凝固の過程にとって中心となる凝固因子凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠損から生じるＸ連鎖劣性遺伝性出血障害である。血友病Ｂの徴候および症状は、ＦＩＸ欠損の重症度および出血の位置に応じて変わりうる。ほとんどの場合、出血は、関節、筋肉および軟部組織への特発性出血または外傷により誘発された出血を特徴とする。同じ位置での再発性の出血は、関節の永続的な損傷に至ることがある。また、まれであるが、生命にかかわる出血が中枢神経系、咽喉または消化管で起こりうる。
【０００４】
血友病Ｂの治療目標は、出血を処置または予防することであり、それによって障害を引き起こす関節および組織の損傷を軽減し、生活の質（ＱｏＬ）を改善することである。ＦＩＸによる補充療法は、その因子欠損の一時的な補正をもたらし、出血傾向を軽減する。現在、血漿由来および組換えＦＩＸ製剤が血友病Ｂの予防的およびオンデマンド処置に用いられている。しかし、血漿由来製剤は、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスのような感染性ウイルスの伝播に関連したリスクを伴う。血漿由来および組換えＦＩＸ製剤は短い半減期を有し、そのため出血エピソードの有意な減少を達成するには１週間に２〜３回の投薬を必要とする。さらに、投与後の無出血期間が比較的短い出血エピソードをコントロールするには繰り返しの投薬が必要となりうる。血漿由来または組換えＦＩＸ製剤ではいずれも高頻度の静脈内（ＩＶ）注射を必要とし、患者およびそれらの障害を処置する医師にとってかなりの負担となる。低年齢の小児におけるこのようなレジメンは、しばしば（常にでないが）、感染性合併症を回避するために極めて清潔に保たなければならず、かつライン中でクロットの発生を予防しなければならない静脈アクセスデバイスの挿入を必要とする。このようなデバイスに関連するリスクおよび罹患率のため、血友病の一部の非常に幼い子どもが妥当な医療を受けられなくなることがある。延長された半減期およびより良好な回復速度を有するＦＩＸ製剤により、患者はより少ない注射で妥当な止血を達成することが可能となりうる。
【０００５】
ＦＩＸのペグ化形態が生成されており、これはミニブタおよびイヌにおいてＦＩＸの５〜７倍の延長された半減期を示す（非特許文献１）。類似の結果が患者において観察された（非特許文献２）。
【０００６】
組換えＦＩＸおよびアルブミンを含む融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）は、ラット、ウサギおよびＦＩＸ欠損マウスにおいてそれがＰＫパラメータを改善していること（すなわち、現在市販の組換えＦＩＸ製剤（例えば、ｒＦＩＸ）の公開された結果と比較して高められた回復、終末相半減期および濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣ］）を示している（非特許文献３）。ヒトでの研究は、以前のＦＩＸ製剤と比較してｒＩＸ−ＦＰの毎週の予防によってより少ない注入でＦＩＸの消費が減少することを示した（非特許文献４）。
【０００７】
ＦＩＸを含むこのような融合タンパク質の別の例は、ｒＦＩＸ−Ｆｃである。特許文献１には、ＦＩＸを含む治療用キメラポリペプチドが記載されており、それはＦｃまたはアルブミンのようなＦｃＲｎ結合パートナーに融合させることができる。ｒＦＩＸ−Ｆｃは、インビボで増加した半減期を示した。この文献は、予防的治療のため毎週２０ＩＵ／ｋｇ、１０日毎に４０ＩＵ／ｋｇまたは２週間毎に１２０ＩＵ／ｋｇでｒＦＩＸＦｃを投与することを提案している。また、Lukら（非特許文献５）は、ＢｅｎｅＦＩＸ(R)（すなわち、ｒＦＩＸ）と比較してｒＦＩＸ−Ｆｃが、半減期だけでなく他のＰＫパラメータにおいても増加を示したことを記載している。ｒＦＩＸ−Ｆｃの第３相研究が最近公開され、それは、５０ＩＵ／ｋｇで開始して週１回の間隔で、または１０日の投与間隔で開始して１００ＩＵ／ｋｇで投与したときに、血友病Ｂの患者において年間出血率が低かったことを示している（非特許文献６）。
【０００８】
本発明は、１週間またはより長期、例えば１０日またはより長期の投与間隔で長時間作用性第ＩＸ因子による予防的投与レジメンを提供する。本明細書に記載された発明によれば、以前に想定された、例えば２週間、３週間またはさらに毎月よりもさらにより長期間の予防的投与を達成することができる。
【０００９】
好ましい実施態様において、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分が切断可能なペプチドリンカーを介して半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合されている、ＦＩＸおよびＨＬＥＰを含む融合タンパク質の予防的投与レジメンを提供する。ＨＬＥＰ（例えば、アルブミン）は、ＦＩＸの半減期を増加するが、切断可能なリンカーなしでは、ＦＩＸは一般に低減されたまたは低い活性を有する。このようなリンカーの切断により、ＨＬＥＰによって生じるなんらかの活性が損われる立体障害からポリペプチドが解放され、それによって融合タンパク質の生成が可能となり、それはＦＩＸの高いモル比活性（molar specific activity）を保持している。このような融合タンパク質は、それらの切断されてない対応物との比較において改善された半減期および高められたモル比活性を示す。好ましくは、切断は、凝固に関与するタンパク質によって起こる。これにより、非活性化ＦＩＸは、出血性イベントが起こり、同時にＦＩＸが活性化され、ＨＬＥＰ（例えば、アルブミン）から切断されるまで、半減期の増加が可能となる。そのＨＬＥＰへの融合物から遊離された活性化ＦＩＸは、両方の高い活性を有し、ＨＬＥＰ（例えば、アルブミン）の喪失のため、血液から急速に除去される。活性化ＦＩＸの延長された時間により血栓性合併症に至ることがありうるため、この迅速なクリアランスは望ましい。
【００１０】
先行技術は、切断不可能なリンカーを有するＦＩＸおよびアルブミンを含む融合タンパク質を記載している。例えば、特許文献２は、ヒト血清アルブミンに融合されたとき、インビボで増加した機能性半減期および延長された有効期間を有することが予測される、多数の異なる治療用ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載している。実施例として挙げられた治療用ポリペプチドのリストの中に第ＩＸ因子がある。また、ペプチドリンカーが、アルブミンとＦＩＸとの間にあるが、リンカーが切断可能であると明記されてないＦＩＸの融合物が記載されている。Sheffieldら（非特許文献７）は、ネズミＦＩＸ、８個のアミノ酸のリンカー（ＧＰＧ４ＴＭ）、マウスアルブミンおよび２２個のアミノ酸のペプチドタグで構成されるマウス第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質、ならびにまたヒト第ＩＸ因子、７個のアミノ酸のリンカー（Ｇ６Ｖ）およびヒトアルブミンで構成されるヒト第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質を示した。Sheffieldは、ＦＩＸとアルブミンとの間に切断可能なリンカーを使用しておらず、使用することを示唆してもいない。これらの融合タンパク質は、ＦＩＸを活性化させることが可能であるが、アルブミンの存在のため、低い活性を有する。
【００１１】
酵素前駆体（ＦＩＸのような）のタンパク質分解切断によるか、またはすでにタンパク分解性「プレ」活性化因子の第２のポリペプチドへの接触による（組織因子に結合するＦＶＩＩａのような）いずれかで凝固因子が凝固中に活性化されたら、ここで活性化された凝固因子の長い半減期が維持されることはもはや望ましくなく、その理由は、活性化因子が増加した半減期を有する場合、これにより血栓性合併症に至ることがあり、さらにいっそう関連があるにちがいないからである。したがって、本発明の１つの目的は、１週間またはより長期、ならびにさらに２週間、３週間およびさらに毎月のような長期の処置期間で予防的治療に適した長寿命ＦＩＸを提供する。
【００１２】
先行技術に記載されたような半減期増強ポリペプチドへの凝固因子の融合は、一般に融合した凝固因子のモル比活性の低下を招く。増強された半減期を有する凝固因子を提供する本発明の別の態様は、切断可能なリンカーのない対応する治療用融合タンパク質と比較して増加したモル比活性を示す。
【００１３】
特許文献３は、凝固に関与するプロテアーゼによって切断されうる切断可能なペプチドリンカーによって結合された、凝固因子（例えばＦＩＸ）および半減期増強ポリペプチドを含む融合タンパク質を記載している。これらの融合タンパク質は、増加した半減期およびモル比活性を有する。この出願は、その全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明の融合タンパク質の例は、切断可能なリンカーが凝固に関与するプロテアーゼによって切断可能である、ＦＩＸおよびアルブミンを含む融合タンパク質である。凝固関連の機序におけるタンパク質分解切断は、本発明の意味において、少なくとも１つの凝固因子または凝固補因子の活性化の結果として起こるなんらかのタンパク質分解切断である。凝固因子は、リンカーペプチドのタンパク質分解切断とほぼ並行して活性化される。活性化は、例えば凝固因子のタンパク質分解切断または補因子への結合によって起こってもよい。これにより長い半減期および高い活性を有するＦＩＸの活性化が起こる（図１参照）。アルブミンは、出血性イベントが起こるまでの血液中のＦＩＸの半減期を増加させ、出血性イベントは、ＦＩＸを活性化すると同時にアルブミンからそれを切断し、そこで切断されたＦＩＸは、いずれも高い活性を有し、アルブミンの喪失のため、血液から急速に除去される。配列番号：１（図２参照）に記載された配列セットを有するｒＩＸ−ＦＰ（ｒＦＩＸ−アルブミン融合タンパク質）は、改善されたＰＫパラメータを示した。具体的には、それは、ｒＦＩＸ（例えば、Ｂｅｎｅｆｉｘ(R)）（非特許文献８）と比較して、５．３倍長い半減期（ｔ１／２）、７倍低減されたＣＬ、および７倍大きいＡＵＣによって示されるような血漿中の延長された循環を有する。驚くべきことに、これによりｒＦＩＸに関して先行技術で示唆されたよりもかなり長い投与間隔で血友病の予防処置が可能となる。
【００１５】
本発明の技術的利点は、融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦＰ）が、他の知られているＦＩＸ製剤よりも長い半減期および３０％を超えるより高いインクリメンタルリカバリー（incremental recovery）の両方を有することである。融合タンパク質のより高いインクリメンタルリカバリーは、標準投薬式に基づいて必要なＦＩＸ活性レベルを達成するために、より低い用量（すなわち、より少ないタンパク質）が投与されることを意味する：
【数１】
2017502036.tif 000002
【００１６】
したがって、注射部位での局所反応のより低いリスクに加えて、より少ない宿主細胞タンパク質が投与されるため、融合タンパク質（例えば、ｒＩＸ−ＦＰ）は、免疫原性になりにくい。使用する製剤がより少なく（用量当たりのＩＵ／ｋｇおよび週当たりのＩＵ／ｋｇ）、かつ患者において同じＦＩＸピークおよびトラフ活性レベルを達成するために必要となる投与頻度がより少ないため、より長い半減期、より低いクリアランス、より大きなＡＵＣ（増強された曝露）およびより高いインクリメンタルリカバリーは、患者に有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／００６６２４
【特許文献２】ＷＯ０１／７９２７１
【特許文献３】ＵＳ２００８／０２６０７５５
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ostergaard, H, et al., 2011. Blood. 118(8):2333-2341
【非特許文献２】Negrier C et al. Blood. 2011 Sep 8;118(10):2695-701
【非特許文献３】Metzner HJ, et al., 2009. Thromb Haemost. 102:634-644
【非特許文献４】Martinowitz et al., ISTH, Amsterdam, The Netherlands, June 29-July 4, 2013 abstract
【非特許文献５】Luk A, et al., 2011. Haemophilia. 17:352-380
【非特許文献６】Powell JS, et al., Dec 12, 2013. NEJM. 369:2313-23
【非特許文献７】Sheffield W.P. et al. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573
【非特許文献８】Santagostino E, et al. Blood. 2012 Sep 20;120(12):2405-11
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、対象の出血を予防する方法に使用するための
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質が、毎週約１回の投与間隔で約２５〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質に関する。好ましい実施態様において、用量は約３５〜７５ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施態様において、用量は約３５〜５５ＩＵ／ｋｇである。さらに別のより好ましい実施態様において、用量は約３５〜５０ＩＵ／ｋｇである。さらに別のより好ましい実施態様において、用量は約２５〜５０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は３０〜４０ＩＵ／ｋｇである。好ましい実施態様において、用量は約５０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約４５ＩＵ／ｋｇである。さらに別の非常に好ましい実施態様において、用量は約４０ＩＵ／ｋｇである。別の高度に好ましい実施態様において、週用量は約３５ＩＵ／ｋｇである。さらに別の高度に好ましい実施態様において、週用量は約２５ＩＵ／ｋｇである。最も好ましい実施態様において、週用量は約２５〜４０ＩＵ／ｋｇである。
【００２０】
これらの実施態様のいずれか１つにおいて、投与間隔は、６〜８日毎に約１回、好ましくは７日毎に約１回であってもよい。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、ＨＬＥＰは、ＦｃではないＨＬＥＰであってもよい。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、ＨＬＥＰは好ましくはアルブミンである。好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔の間、ベースラインの少なくとも約１％上、好ましくは少なくとも２％上、好ましくは少なくとも３％上、好ましくは少なくとも４％上、または好ましくは少なくとも５％上、より好ましくは、全投与間隔の間、ベースラインより４％〜１５％上、またはさらにより好ましくは５％〜１５％上のトラフに維持される。
【００２１】
また、本発明は、対象において出血を予防する方法に使用するための
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が、８〜１１日毎に約１回の投与間隔で約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質に関する。好ましい実施態様において、用量は５０〜７５ＩＵ／ｋｇである。この好ましい実施態様において、用量は約７５ＩＵ／ｋｇであることができる。この好ましい実施態様において、用量は約５０ＩＵ／ｋｇであることができる。好ましくは、投与間隔は１０日毎に約１回である。別の実施態様において、用量は月当たり３回投与される。
【００２２】
さらに、本発明は、対象において出血を予防する方法に使用するための
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が２週間毎に約１回の投与間隔で、約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与されることになっている融合タンパク質に関する。好ましい実施態様において、用量は６５〜８５ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約６０〜８０ＩＵ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施態様において、用量は約７０〜８０ＩＵ／ｋｇである。最も好ましい実施態様において、用量は約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである。この最も好ましい実施態様において、用量は約７５ＩＵ／ｋｇであることができるか、または用量は約５０ＩＵ／ｋｇであることができる。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、投与間隔は、１２〜１６日毎に約１回、好ましくは１３〜１５日毎に約１回、より好ましくは１４日毎に約１回であってもよい。
【００２３】
さらに、本発明は、対象における出血の予防に使用するための
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が少なくとも約９０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量で３週間毎に約１回、またはより長期の投与間隔で対象に投与されることになっている融合タンパク質に関する。好ましい実施態様において、用量は約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施態様において、用量は約１００ＩＵ／ｋｇである。これらの実施態様のいずれかにおいて、投与間隔は、１９〜２３日毎に約１回、好ましくは２０〜２２日毎に約１回、より好ましくは２１日毎に約１回であってもよい。あるいは、投与間隔は毎月約１回であってもよい。好ましい実施態様において、用量は約１４０〜２００ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。より好ましい実施態様において、用量は約１４０〜１６０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。非常に好ましい実施態様において、用量は約１５０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。これらの実施態様のいずれかにおいて、投与間隔は、２８日毎に約１回であってもよい。
【００２４】
本発明の実施態様のいずれか１つにおいて、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、アルブミン（ＦＰ）または抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）のない免疫グロブリンであってもよい。好ましい実施態様において、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、アルブミン（ＦＰ）である。特定の一実施態様において、ＨＬＥＰはＦｃではない。
【００２５】
好ましい実施態様において、融合タンパク質の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分は、ペプチドリンカーを介して半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合される。別の非常に好ましい実施態様において、ペプチドリンカーは切断可能である。なおより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーは、凝固に関与するか、または凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能である。一旦、凝固カスケードが活性化されたら、凝固に関与するプロテアーゼが活性化され、それにより、最終的にフィブリノーゲンからフィブリンが生成される。
【００２６】
本発明の最も好ましい実施態様において、リンカーは、凝固因子を活性化するプロテアーゼによって切断可能であり、それによってリンカーの切断が、凝固が起こる部位で凝固因子の活性化につながることが保証される。他の好ましい融合タンパク質は、本発明によれば、一旦、活性化されたら、融合タンパク質の一部である凝固因子によってリンカーが切断可能であり、またこうして融合タンパク質の切断が、凝固イベントにつながることが保証されるものである。本発明の他の好ましい融合タンパク質は、リンカーがプロテアーゼによって切断可能であり、それ自体は、融合タンパク質の一部である凝固因子の活性によって直接的または間接的に活性化され、またこうして融合タンパク質の切断が凝固イベントにつながることが保証されるものである。
【００２７】
好ましい実施態様において、リンカーはＦＩＸａおよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。特に好ましい実施態様において、リンカーは、配列番号：２および配列番号：３：
配列番号：２
Pro Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1               5                   10                  15
配列番号：３
Pro Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1               5                   10                  15
から選択される配列として含む。
【００２８】
別の実施態様において、リンカーは配列番号：２および配列番号：３の１つと９０％同一である。別の実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと８０％同一である。さらに別の実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと７０％同一である。さらに別の実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと６０％同一である。さらなる実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと５０％同一である。
【００２９】
好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号：１に記載された配列を有する（図２参照）。あるいは、融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７０％の同一性を有する。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７５％の同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも８０％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも８５％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９０％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９５％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９８％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９９％のパーセント同一性を有してもよい。
【００３０】
本発明の実施態様のいずれかに関して、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上のトラフで維持される。好ましくは、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２〜５％上、より好ましくは、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２、３、４または５％上のトラフで維持される。他のより好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの４〜１５％上または５％〜１５％上に維持される。
【００３１】
本発明の目的では、融合タンパク質を投与する好ましい対象は、ヒトである。特に好ましいのは、血友病Ｂを患っているヒトである。
【００３２】
本発明の融合タンパク質は、予防的投与レジメンを含む処置での使用であってもよい。特に好ましい実施態様において、用量は静脈内に投与されることになっている。
【００３３】
また、本発明によって包含されるのは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の約２５〜７５ＩＵ／ｋｇの用量を、毎週約１回またはより長期の投与間隔で対象に投与することを含む方法である。好ましい実施態様において、用量は約３５〜７５ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施態様において、用量は約３５〜５５ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施態様において、用量は約３５〜５０ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施態様において、用量は約２５〜５０ＩＵ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施態様において、用量は３０〜４０ＩＵ／ｋｇである。好ましい実施態様において、用量は約５０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約４５ＩＵ／ｋｇである。別の非常に好ましい実施態様において、用量は約４０ＩＵ／ｋｇである。別の非常に好ましい実施態様において、用量は約３５ＩＵ／ｋｇである。別の非常に好ましい実施態様において、用量は約２５ＩＵ／ｋｇである。最も好ましい実施態様において、週用量は、約２５〜４０ＩＵ／ｋｇである。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、投与間隔は、６〜８日毎に約１回、好ましくは７日毎に約１回であってもよい。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、ＨＬＥＰは、ＦｃではないＨＬＥＰであってもよい。これらの実施態様のいずれか１つにおいて、ＨＬＥＰは、好ましくはアルブミンである。
【００３４】
好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上、好ましくは少なくとも約２〜５％上、より好ましくは全投与間隔中、ベースラインの少なくとも２、３、４または５％上のトラフで維持される。他のより好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの４〜１５％上、より好ましくは５〜１５％上に維持される。
【００３５】
また、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量を８〜１１日毎に約１回の投与間隔で対象に投与することを含む。好ましい実施態様において、用量は約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである。このより好ましい実施態様において、用量は約７５ＩＵ／ｋｇであるか、または、別の場合、この好ましい実施態様において、用量は５０ＩＵ／ｋｇであってもよい。好ましくは、投与間隔は１０日毎に約１回である。別の実施態様において、用量は１ヵ月当たり３回投与される。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の約５０〜９５ＩＵ／ｋｇの用量を２週間毎に約１回またはより長期の投与間隔で対象に投与することを含む方法に関する。好ましい実施態様において、用量は５０〜７５ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は６５〜８５ＩＵ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施態様において、用量は６０〜８０ＩＵ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施態様において、用量は約７０〜８０ＩＵ／ｋｇである。最も好ましい実施態様において、用量は約５０〜７５ＩＵ／ｋｇである。この最も好ましい実施態様において、用量は約５０ＩＵ／ｋｇであってもよく、または最も好ましい実施態様において、用量は約７５ＩＵ／ｋｇである。これらの実施態様のいずれかにおいて、投与間隔は、１２〜１６日毎に約１回、好ましくは１３〜１５日毎に約１回、より好ましくは１４日毎に約１回であってもよい。
【００３７】
また、本発明によって包含されるのは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む融合タンパク質の９０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量を３週間毎に約１回またはより長期の投与間隔で対象に投与することを含む方法である。好ましい実施態様において、用量は約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施態様において、用量は約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇである。最も好ましい実施態様において、用量は約１００ＩＵ／ｋｇである。これらの実施態様のいずれかにおいて、投与間隔は、約１９〜２３日毎に約１回、好ましくは２０〜２２日毎に約１回、より好ましくは２１日毎に約１回であってもよい。あるいは、投与間隔は毎月約１回であってもよい。好ましい実施態様において、用量は約１４０〜２００ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。より好ましい実施態様において、用量は約１４０〜１６０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。非常に好ましい実施態様において、用量は約１５０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は毎月約１回である。これらの実施態様のいずれかにおいて、投与間隔は２８日毎に約１回であってもよい。
【００３８】
上の実施態様のいずれかにおいて、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上、好ましくは少なくとも約２〜５％上、より好ましくは２〜４％上、さらにより好ましくは全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２、３、４％または５％上のトラフで維持される。他の好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインより５〜１５％上に維持されうる。最も好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、最大２１日間、ベースラインの少なくとも４％上のトラフで維持される。例えば、血友病患者における１００ＩＵ／ｋｇの予防投与レジメンを用いて、ＦＩＸ活性は、本発明の好ましい融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）による注射２１日後にベースラインより上に示された（表２、図８および９参照）。
【００３９】
本発明の方法のいずれかに関して、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、アルブミン（ＦＰ）または抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）のない免疫グロブリンであってもよい。好ましい実施態様において、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）はアルブミン（ＦＰ）である。特定の一実施態様において、ＨＬＥＰはＦｃではない。
【００４０】
非常に好ましい実施態様において、融合タンパク質の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分は、ペプチドリンカーを介して半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合される。別の非常に好ましい実施態様において、ペプチドリンカーは切断可能である。なおより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーは、凝固に関与するか、または凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能である。一旦、凝固カスケードが活性化されたら、凝固に関与するプロテアーゼが活性化され、それにより最終的にフィブリノーゲンからフィブリンが生成される。
【００４１】
本発明で最も好ましい実施態様において、リンカーは、凝固因子を活性化するプロテアーゼによって切断可能であり、それによってリンカーの切断は、凝固が起こる部位での凝固因子の活性化につながることが保証される。本発明による他の好ましい融合タンパク質は、一旦、活性化されたら、融合タンパク質の一部である凝固因子によってリンカーが切断可能であり、またこうして融合タンパク質の切断が凝固イベントにつながることが保証されるものである。本発明による他の好ましい融合タンパク質は、それ自体が、融合タンパク質の一部である凝固因子の活性によって直接的または間接的に活性化されるプロテアーゼによってリンカーが切断可能であり、またこうして融合タンパク質の切断が凝固イベントにつながることが保証されるものである。
【００４２】
好ましい実施態様において、リンカーはＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。
【００４３】
特に本発明の好ましい方法において、リンカーは、配列番号：２および３から選択される配列を含む：
配列番号：２
Pro Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1               5                   10                  15
配列番号：３
Pro Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1               5                   10                  15
【００４４】
別の実施態様において、リンカーは配列番号：２および配列番号：３の１つと９０％同一である。別の実施態様では、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと８０％同一である。さらに別の実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと７０％同一である。さらに別の実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと６０％同一である。さらなる実施態様において、それは配列番号：２および配列番号：３の１つと５０％同一である。
【００４５】
好ましくは、本発明の方法は、配列番号：１（図２参照）に記載された配列を有する融合タンパク質を投与する。別法として、融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７０％の同一性を有する。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７５％の同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも８０％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも８５％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９０％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９５％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９８％のパーセント同一性を有してもよい。融合タンパク質の配列は、配列番号：１に記載された配列と少なくとも９９％のパーセント同一性を有してもよい。
【００４６】
本発明の方法のいずれかに関して、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインよりも少なくとも１％上のトラフで維持される。好ましくは、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースラインよりも少なくとも約１％上のトラフで維持される。
【００４７】
本発明の方法に関して、好ましい対象はヒトである。特に好ましいのは、血友病Ｂを患っているヒトである。本発明の方法は、予防的投与レジメンを含む処置のためであってもよい。本発明の特に好ましい方法において、用量は静脈内に投与される。
【００４８】
本発明の実施態様のいずれかに関して、融合タンパク質は、約１００〜４００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与するために提供されることが好ましい。融合タンパク質は、６００ＩＵ／ｍｌまたは１２００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与するために提供されてもよい。
【００４９】
本発明の詳述
本明細書に用いられる「予防的処置」は、対象の血漿中の第ＩＸ因子活性のレベルを高めるため、時間の経過にわたって対象に多回投与で第ＩＸ因子融合タンパク質を投与することを意味する。好ましくは、増加したレベルは、特発性出血の発生率を低下させるか、または不測の損傷の場合の出血を予防するのに十分である。予防的処置は、出血エピソード、例えば、オンデマンド処置下に記載されたものを低下させるまたは予防する。予防的処置は、固定されてもよいし、または「投与間隔」下で議論するように、例えば、患者間の変動性を補うために、個別に合わせてもよい。
【００５０】
本明細書に用いられる「投与間隔」は、対象に投与される多回投与間に経過する時間の量を意味する。キメラＦＩＸ−ＨＬＥＰ（例えば、ＦＩＸ−ＦＰ）を用いる本発明の方法における投与間隔は、等量（ＩＵ／ｋｇで）のＨＬＥＰ、例えばアルブミン（すなわち、上記ＦＩＸからなるポリペプチド）なしの上記第ＩＸ因子に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍から８倍長い。例えば、本発明の第ＩＸ因子−ＨＬＥＰ融合タンパク質を投与するときの投与間隔は、等量のＨＬＥＰ、例えばアルブミンなしの上記第ＩＸ因子に必要な投与間隔よりも少なくとも約１．５倍から８倍長くてもよい。投与間隔は、等量の、例えばアルブミンなしの上記第ＩＸ因子（または、上記第ＩＸ因子からなるポリペプチド）に必要な投与間隔よりも少なくとも約１．５倍から８倍長くてもよい。
【００５１】
本明細書に用いられる「用量中央値」は、研究対象の半分がその用量よりも高い用量を用い、かつ研究対象の半分がその用量よりも低い用量を用いることを意味する。「平均用量」は、用量平均値（すべての用量を加算し、全投与回数で割って計算される）を意味する。記載された用量に関して、「約」は、示された用量プラスまたはマイナス示された用量の１、２、５、１０、１５または２０％を意味する。６〜８日毎に約１回または７日毎に約１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス１２時間を意味する。８〜１１日毎に約１回、または１０日毎に約１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス１８時間を意味する。月に約３回、２週間毎に約１回、１３〜１５日毎に約１回、１４日毎に約１回、または月に約２回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス１日を意味する。３週間またはより長期に約１回、２０〜２２日毎に約１回、２１日毎に約１回、または毎月約１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス２日を意味する。
【００５２】
「少なくとも約」特定のパーセンテージ「のトラフでＦＩＸの血漿レベルを維持すること」は、血漿中のＦＩＸ生物活性が、ＦＩＸを必要とする患者の特定の投与レジメンの間、上記パーセンテージレベルより下に低下しないことを意味し、その際、上記ＦＩＸ生物活性の１００％は、正常ヒト血漿のＦＩＸ活性濃度である１Ｕ／ｍｌに相当し、ＦＩＸ生物活性は、好ましくは実施例に記載された検証された１段階凝固法を用いて決定される。
【００５３】
「トラフ」は、ＦＩＸを必要とする患者の処置中の投与レジメンを通じて上記ＦＩＸ生物活性の最も低いレベルである。患者間の変動性のため、トラフレベルは、一般に中央値のことをいい、それは、研究対象の半分がより高いトラフレベルを有し、かつ研究対象の半分がより低いトラフレベルを有したことを意味する、例えば図７および１２参照。中央値を用いることがより一般的であるが、ＰＫデータからのトラフレベルは、平均値としても算出することができ、それは、すべての患者の値を加算し、患者数で割ることによって決定されている、例えば表８参照。
【００５４】
「ベースライン」は、ある特定の患者におけるＦＩＸ活性レベルを意味しており、主にＩＵ／ｄＬまたはＦＩＸ活性の％で表され、これは健康人では１００ＩＵ／ｄＬまたは１００％であると定義される。重度の血友病Ｂでは、所定の患者のベースラインレベルは、ゼロまたはほとんどゼロと非常に低いが、軽度の血友病では、患者のベースラインは、健康な人におけるＦＩＸ活性濃度の１％上、２％上または３％上または４％上または５％上といったようにより高くてもよい。ｉ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、およびｉｉ)半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）を含む融合タンパク質を本発明により投与するとき、最初にＦＩＸ活性濃度が急激に上昇し、ゆっくり消失する、すなわち、個々のベースラインレベルに戻る。特に重度の血友病Ｂでは、出血を予防するため、ＦＩＸ活性濃度が最小限のレベルより下に低下しないように注意しなければならない。この最小限のレベルをトラフレベルと称する。重度の血友病Ｂ患者では、ベースラインが実質的にゼロであるとき、ベースラインの１％上のトラフレベルとは、健康人におけるＦＩＸ活性濃度の約１％のＦＩＸ活性濃度を意味する。健康人におけるＦＩＸ活性濃度の３％ＦＩＸ活性のベースラインレベルを有する軽度の血友病Ｂ患者では、ベースラインの１％上のトラフレベルとは、健康人におけるＦＩＸ活性濃度の約４％のＦＩＸ活性濃度を意味する。
【００５５】
本発明において、投与間隔は、毎週約１回、６〜８日毎に約１回、７日毎に約１回、８〜１１日毎に約１回、１０日毎に約１回、月に約３回、２週間毎に約１回、１３〜１５日毎に約１回、１４日毎に約１回、月に約２回、３週間またはより長期毎に約１回、２０〜２２日毎に約１回、２１日毎に約１回、または毎月約１回であってもよい。特に、１週間、２週間、３週間およびさらに１ヵ月の投与間隔が企図される。最も好ましい投与間隔は、１週間（７日）、２週間（１４日）または３週間（２１日）である。
【００５６】
あるいは、投与間隔は、対象に関する薬物動態データまたはその他の情報に基づいて各対象について決定される個別に合わせた間隔であってもよい。個別に合わせた用量／投与間隔の組合せは、上記の段落中の固定された間隔のレジメンのものと同じであってもよいし、または異なってもよい。レジメンは、最初に固定された投与間隔でもよく、次いで個別に合わせた投与間隔に変更してもよい。レジメンは、最初に固定された用量（ＩＵ／ｋｇ）および投与間隔であってもよく、次いで、固定された用量で個別に合わせた投与間隔に変更してもよい。レジメンは、最初に固定された投与間隔および用量（ＩＵ／ｋｇ）であってもよく、次いで、同じ固定された投与間隔で個別に合わせた用量に変更してもよい。
【００５７】
本発明の方法で用いてもよい治療用量は、週１回の投与に関して約２５〜７５ＩＵ／ｋｇ、約３５〜７５ＩＵ／ｋｇ、約３０〜５０ＩＵ／ｋｇ、約３５〜５５ＩＵ／ｋｇ、約３５〜５０ＩＵ／ｋｇ、約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇである。進行中の研究では、約４０ＩＵ／ｋｇの用量中央値／平均値が観察されている。週１回の投与レジメンでは３５ＩＵ／ｋｇの用量が企図される。２週間毎に１回の投与スケジュールでは、５０〜７５ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇ、約６０〜９０ＩＵ／ｋｇ、約６５〜８５ＩＵ／ｋｇ、約７０〜８０ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇの用量が想定される。進行中の研究では、７５ＩＵ／ｋｇの固定された用量で優れた有効性が観察されている。特に、先行技術は、５０〜７５ＩＵ／ｋｇほどの低い用量が２週間の投与間隔で用いることができることを開示していない。
【００５８】
３週間の投与間隔では、本発明は、約９０〜２５０ＩＵ／ｋｇ、約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇ、約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇおよび約１００ＩＵ／ｋｇの用量が企図される。月１回の投与間隔では、本発明は１４０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量を企図する。先行技術は、３週間または毎月の投与間隔が達成できることを開示していない。
【００５９】
したがって、好ましい治療用量は、約３５〜７５ＩＵ／ｋｇ、約３５〜５５ＩＵ／ｋｇ、約３５〜５０ＩＵ／ｋｇ、約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜６０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜５０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇ、約７０〜８０ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇ、約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇ、約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、および約１４０〜２５０ＩＵ／ｋｇである。予防用量は、毎月２５０ＩＵ／ｋｇを超えてはならない。
【００６０】
好ましい用量および投与間隔は、以下の通りである：毎週約１回約２５〜７５ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約３５〜７５ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約３５〜５５ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約３５〜５０ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約５０ＩＵ／ｋｇ、毎週約１回約４５ＩＵ／ｋｇ、および毎週約１回約３５ＩＵ／ｋｇ。「毎週約１回」は、６〜８日毎に約１回および７日毎に約１回を含む。
【００６１】
他の好ましい用量および投与間隔は、以下の通りである：８〜１１日毎に約１回約５０〜７５ＩＵ／ｋｇ、８〜１１日毎に約１回約５０ＩＵ／ｋｇ、および８〜１１日毎に約１回約７５ＩＵ／ｋｇ。「８〜１１日毎に約１回」とは、１０日毎に約１回毎を含む。
【００６２】
さらに別の好ましい用量および投与間隔は、以下の通りである：２週間毎に約１回約５０〜９０ＩＵ／ｋｇ、２週間毎に約１回約５０〜７５ＩＵ／ｋｇ、２週間毎に約１回約６５〜８５ＩＵ／ｋｇ、約６０〜８０ＩＵ／ｋｇ、２週間毎に約１回約７０〜８０ＩＵ／ｋｇ、２週間毎に約１回約５０ＩＵ／ｋｇ、および最も好ましくは２週間毎に約１回約７５ＩＵ／ｋｇ。「２週間毎に約１回」は、１２〜１６日毎に約１回または１３〜１５日毎に約１回、好ましくは１４日毎に約１回を含む。
【００６３】
さらに別の好ましい用量および投与間隔は、以下の通りである：３週間またはより長期毎に約１回約９０〜２５０ＩＵ／ｋｇ、約９０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、約８０〜１２０ＩＵ／ｋｇ、３週またはより長期毎に約１回約９５〜１１０ＩＵ／ｋｇ、３週間またはより長期毎に約１回約９５〜１０５ＩＵ／ｋｇ、および３週間またはより長期毎に約１回約１００ＩＵ／ｋｇ。「３週間またはより長期毎に約１回」は、１９〜２３日毎に約１回、２０〜２２日毎に約１回、好ましくは２１日毎に約１回、および毎月約１回を含む。
【００６４】
本発明では、毎月１回の用量を投与できることが企図される。従って、別の好ましい用量および投与間隔は、毎月約１回約１４０〜２５０ＩＵ／ｋｇである。
【００６５】
２５〜４０ＩＵ／ｋｇの用量は、１週間（７日）投与レジメンで推奨されることになり、１週間レジメンでは最も好ましい。５０〜７５ＩＵ／ｋｇの用量は、２間週（１４日）投与レジメンで推奨されることになり、２週間レジメンでは最も好ましい。１００ＩＵ／ｋｇの用量は、３週間（２１日）投与レジメンで最も好ましい。
【００６６】
驚くべきことに、これまでのところ、本発明の好ましい融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）は、７日またはより長期毎に１回５０ＩＵ／ｋｇで投与して、小児を含むすべての患者において３％またはそれより高いトラフを維持する唯一の製剤となっている。さらに、２１日の予防レジメンは、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ注射後２１日目に少なくとも４％のＦＩＸ活性を示した。結果を表８にまとめる。先行技術のＦＩＸ製剤により、このような長期間、このような高いＦＩＸレベルを達成することは以前には可能でなかった。
【００６７】
本発明に包含されるのは、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量の投与後、７日の全投与間隔中、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値がベースラインの少なくとも約５％上のトラフを維持する実施態様である。別の実施態様では、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量の適用後、１０日の投与間隔中、ベースラインの少なくとも約５％上のトラフを維持する。さらに別の実施態様において、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、７５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量の適用後、１４日の投与間隔中、ベースラインの少なくとも約５％上のトラフを維持する。
【００６８】
また、本発明に包含されるのは、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を７日毎に適用する場合、１週間の全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約７％上のＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値が維持される実施態様である。別の実施態様において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を１０日毎に適用する場合、１週間の全投与間隔中、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値がベースラインの少なくとも約９％上のトラフを維持する。別の実施態様において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を１４日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約４％上のトラフを維持する。別の実施態様において、７５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を１４日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約７％上のトラフを維持する（例えば、表９ｂ参照）。別の実施態様において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を１４日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約４％上のトラフを維持する。別の実施態様において、７５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を１４日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約７％上のトラフを維持する。別の実施態様において、７５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を２１日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２％上のトラフを維持する（例えば、表９ｂ参照）。別の実施態様において、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量を２１日毎に適用する場合、ＦＩＸ活性の血漿レベルの中央値は、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約４％上のトラフを維持する。
【００６９】
別法として、これらの実施態様では、ＦＩＸ活性の血漿レベルは、平均値として算出することができる（例えば、表８参照）。
【００７０】
特に、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分が切断可能なペプチドリンカーを介して半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に結合されている、ＦＩＸおよびＨＬＥＰアルブミンを含む融合タンパク質の予防的投与レジメンを提供する。投与間隔は、１週間またはより長期、例えば１０日またはより長期であることができるが、しかし、以前に想定されたよりもさらにより長い期間、例えば２週間、３週間またはさらに毎月の予防的投与の達成することができる。
【００７１】
リンカーなしの、または切断不可能なリンカーを有するｒＩＸ−ＦＰ融合タンパク質は、アルブミンの存在のため、ＦＩＸの半減期を増加させる。しかし、活性化ＦＩＸがアルブミンになお融合しているため、低減された活性を有する欠点がある。さらに、活性化ＦＩＸがアルブミンになお融合しているため、出血性イベントが解消された後でさえ長い半減期を有し続ける。ＦＩＸの活性化前に切断が可能なリンカーを有するｒＩＸ−ＦＰ融合タンパク質は、アルブミンのためＦＩＸの増加された半減期を示すが、しかし、出血性イベントの前に切断が起こるため、活性化ＦＩＸの半減期は、活性化前に低減される。一方で、切断がＦＩＸの活性化の後に起こる場合、アルブミンはＦＩＸの半減期を増加させるが、しかし、活性化ＦＩＸはアルブミンになお融合しており、そのため低い活性を有する。
【００７２】
本発明は、好ましくは切断可能なリンカーが凝固に関与するプロテアーゼによって切断可能である、ＦＩＸおよびアルブミンを含む融合タンパク質に関する。凝固関連機序のタンパク質分解切断とは、本発明の意味において、少なくとも１つの凝固因子または凝固補因子の活性化の結果として起こるなんらかのタンパク質分解性切断である。凝固因子は、リンカーペプチドのタンパク質分解切断とほぼ並行して活性化される（図１参照）。活性化は、例えば凝固因子のタンパク質分解切断によって、または補因子への結合によって起こってもよい。出血性イベントが起こるまで、アルブミンは血液中のＦＩＸの半減期を増加させ、出血性イベントは、ＦＩＸを活性化し、かつ同時にアルブミンからそれを切断する。切断により、ポリペプチドは、ＨＬＥＰによって生じるなんらかの活性を損なわれる立体障害から解放され、それによって融合タンパク質の生成が可能となり、それはＦＩＸの高いモル比活性を保持している。次いで切断されたＦＩＸは、アルブミンの喪失により血液から急速に除去される。このような融合タンパク質は、改善された半減期およびそれらの切断不可能な対応物と比較して高められたモル比活性を示す。したがって、ｒＩＸを含む切断不可能な融合タンパク質と比較して、治療効果を得るために必要となるｒＩＸ−ＦＰがより少ない。
【００７３】
本発明による好ましい融合タンパク質は、モル比活性、特に、少なくとも１つの凝固関連アッセイにおいてアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号：４）を有する切断不可能なリンカーによって結合された治療用融合タンパク質のそれと比較して、少なくとも２５％高められた、治療用融合タンパク質の凝固関連モル比活性（molar specific coagulation-related activity）を有するものである。より好ましいのは、入手可能な異なる凝固関連アッセイの少なくとも１つにおいて、モル特異的活性が少なくとも５０％高められた融合タンパク質、なおより好ましいのは、モル特異的活性が少なくとも１００％高められたものである。
【００７４】
さらなる実施態様において、リンカーペプチドは、複数のプロテアーゼに対する切断部位を含む。これは、異なるプロテアーゼによって同じ位置で切断することができるリンカーペプチド、または２つもしくはそれ以上の異なる切断部位を提供するリンカーペプチドのいずれかによって達成することができる。酵素的活性を達成するために、治療用融合タンパク質がタンパク質分解切断によって活性化されなければならず、かつ異なるプロテアーゼがこの活性化ステップに関与しうる好都合な状況がありうる。ＦＩＸの活性化は、ＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）のいずれかによって達成することができる。好ましい実施態様において、リンカーは、ＦＩＸａおよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。
【００７５】
配列番号：１に記載された配列を有するｒＩＸ−ＦＰ（ｒＦＩＸアルブミン融合タンパク質）は、ｒＦＩＸ（例えば、Ｂｅｎｅｆｉｘ(R)）と比較して５．３倍長い半減期（ｔ１／２）、７倍短縮されたＣＬ、および７倍大きなＡＵＣによって示されるような血漿中の持続性循環を有する。  さらに、ｒＩＸ−ＦＰの薬物動態パラメータをＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭ  ＦＤＡ処方情報のＦＩＸ−Ｆｃの対応する薬物動態データと比較したとき、ｒＩＸ−ＦＰは、ｒＩＸ−Ｆｃ（ＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭ）と比較して約３．８倍高いＡＵＣ０−ｉｎｆ、約３．７倍短縮されたＣＬ／ＢＷ、約２６％高いインクリメンタルリカバリー、約３．２倍低い分布容積、および約１９％増加した薬物の平均滞留時間を有する。
【００７６】
予防は、予想される出血を予防するための因子濃縮物の静脈注射による処置である。凝固因子レベル＞１ＩＵ／ｄｌ（＞１％）の中等度の血友病患者は、特発性出血をめったに経験することがなく、関節機能がかなり良好に保たれているという観察から予防を考えた。したがって、出血および関節破壊を予防するために１％上に維持されたＦＩＸ活性による予防は、正常な筋骨格機能を保つことが治療の目標となるべきである（血友病管理のガイドライン、第２版、世界血友病連合（ＷＦＨ）に代わって治療ガイドライン作業部会により作成された（GUIDELINES FOR THE MANAGEMENT OF HEMOPHILIA, 2nd edition, Prepared by the Treatment Guidelines Working Group, on behalf of the World Federation of Hemophilia (WFH)））。ｒＩＸ−ＦＰの単回投与により、１４日およびそれを超える間、１％を上回るＦＩＸ活性の維持が可能である。
【００７７】
また、下の表１ａおよび１ｂから明らかなように、ｒＩＸ−ＦＰは、知られているｒＦＩＸ−Ｆｃ製剤と比較して好都合なＰＫ性質を有する。
【００７８】
【表１】
2017502036.tif 000003
【００７９】
【表２】
2017502036.tif 000004
【００８０】
７日目でのこのような高いＦＩＸ活性レベルならびに１４日目およびそれを超えて持続するＦＩＸ活性をもたらすＦＩＸ−ＦＰの能力は、予想外であった。上記のように、驚くべきことに、これまでｒＩＸ−ＦＰは、７日またはより長期に１回５０ＩＵ／ｋｇ投与して小児を含むすべての患者において３％またはそれより高いトラフを維持する唯一の製剤となっている。
【００８１】
さらに、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ投与レジメンによる研究を重度および中等度から重度の血友病Ｂの５患者で実施した。ＦＩＸ活性（％でのＩＵ／ｄＬ）を、０時間、０．５時間、７２時間（３日）、１６８時間（７日）、３３６時間（１４日）および５０４時間（２１日）後に測定した。予防レジメンは、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ注射後２１日目で少なくとも４．１％のＦＩＸ活性を示した。結果を表８にまとめる。
【００８２】
驚くべきことに、他の知られているＦＩＸ製剤と比較してｒＩＸ−ＦＰのより長い半減期およびより高い比活性により、ｒＦＩＸ（例えば、Ｂｅｎｅｆｉｘ(R)）およびｒＦＩＸ−Ｆｃに関して先行技術によって提案されたよりもかなり長い投与間隔で血友病の予防的処置が可能となる。従って、ｒＩＸ−ＦＰはｒＦＩＸ−Ｆｃと比較して改善されたＰＫパラメータを有するため、ｒＩＸ−ＦＰはｒＦＩＸ−Ｆｃを超える利点を有する。
【００８３】
融合タンパク質のより高い活性とは、投与されるタンパク質がより少なく、それにより投与される宿主細胞タンパク質がより少ないため、免疫原性となりそうにないことを意味し、注射部位で局所反応のリスクがより低いことを意味する。注射頻度が減ることで、感染リスク、患者の不快感、および医療専門家への必要な来院回数が減る。これらの利点は、患者のコンプライアンス、さらには血友病の予防的治療の有効性に良い影響を及ぼす。
【００８４】
ｒＩＸ−ＦＰは、その好都合な性質のため、本明細書に開示された投与レジメンのように、ＦＩＸ製剤の消費がより低い。好ましい実施態様において、ＦＩＸの血漿レベルは、全投与間隔中、ベースライン少なくとも約０．５％上、または少なくとも約１％上、または少なくとも約２％上、または少なくとも約３％上、少なくとも約４％または少なくとも約５％上、好ましくは全投与間隔の間、ベースラインの５〜１５％上のトラフで維持される。
【００８５】
ヒトＦＩＸ
ビタミンＫ依存性ポリペプチドのグループの一メンバーであるヒトＦＩＸは、５７ｋＤａの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、それは肝細胞によって４１５個のアミノ酸の不活性な酵素前駆体として血流中に分泌される。それは、ポリペプチドのＮ末端Ｇｌａ−ドメインに局在化された１２−カルボキシ−グルタミン酸残基を含有する。Ｇｌａ残基は、その生合成にビタミンＫを必要とする。Ｇｌａドメインに続いて、２つの上皮増殖因子ドメイン、活性化ペプチドおよびトリプシン型セリンプロテアーゼドメインがある。ＦＩＸのさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６４）、Ｎ−（Ａｓｎ１５７およびＡｓｎ１６７）ならびにＯ−タイプグリコシル化（Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９およびＴｈｒ１７２）、硫酸化（Ｔｙｒ１５５）、およびリン酸化（Ｓｅｒ１５８）を包含する。
【００８６】
ＦＩＸは、Ａｒｇ１４５−Ａｌａ１４６およびＡｒｇ１８０−Ｖａｌ１８１で活性化ペプチドのタンパク質分解によってその活性形態、第ＩＸａ因子に変換され、２つのポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（１８ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）が形成され、それらは１つのジスルフィド架橋によって一体となって保持されている。第ＩＸ因子の活性化切断は、例えば、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子／ＴＦによってインビトロで達成することができる。第ＩＸ因子は、ヒト血漿中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。ヒトの第ＩＸ因子の終末相血漿半減期は、約１５〜１８時間であることが見いだされた（White GC et al. 1997. Recombinant Factor IX. Thromb Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM et al. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197）。
【００８７】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）の例としてアルブミン、アルブミンファミリーメンバーおよび免疫グロブリンならびにそれらのフラグメントまたは誘導体が記載されている。用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）は、本願において同じ意味で用いられる。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は、より広く、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）ならびに他の種からのアルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）を包含する。
【００８８】
本明細書に用いるとき、「アルブミン」は、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンの１つもしくはそれ以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有するアルブミンフラグメントもしくは変異体のことをひとまとめにしていう。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント、特にヒトアルブミンの成熟形態のことをいう。例えば、ＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に記載されたように、アルブミンは、配列またはその変異体を有することができ、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、完全長のＨＡ配列を含んでもよいし、または治療活性を安定化もしくは延長が可能であるその１つもしくはそれ以上のフラグメントを含んでもよい。このようなフラグメントは、１０もしくはそれ以上の長さのアミノ酸であってもよいし、またはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、５０もしくはそれ以上の近接アミノ酸を含んでもよいし、またはＨＡの特定ドメインの一部もしくは全部を含んでもよい。
【００８９】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡ（天然または人工）の変異体であってもよい。また、本発明の融合タンパク質の治療用ポリペプチド部分は、本明細書に記載されたような対応する治療用ポリペプチドの変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的または非保存的のいずれか、天然または人工のいずれかの挿入、欠失および置換を含み、その際、このような変化が、治療用ポリペプチドの治療活性を与える活性部位または活性ドメインを実質的に変えることはなく、このことはＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に記載されており、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ＨＬＥＰフラグメントが非融合凝固因子と比較して少なくとも２５％の半減期延長をもたらす限り、ＨＬＥＰとしてＩｇＧおよびＩｇＧ−フラグメントを用いてもよい。治療用ポリペプチド部分は、リンカー、好ましくは融合タンパク質の高いモル比活性を可能にする切断可能なリンカー、好ましくは凝固が活性化された時に融合タンパク質の高いモル特異的活性が可能となる、凝固に関与するプロテアーゼによって切断可能である切断可能なリンカーを介してＩｇＧまたはＩｇＧフラグメントに結合されてもよい。ＷＯ２００４／１０１７４０は、ＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質を開示しており、全体として参照により本明細書に組み込まれる。これらのＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質が切断可能なリンカーを有する場合、それは本発明の融合タンパク質と類似している。
【００９１】
本発明は、特に、入手可能な異なる凝固関連アッセイの少なくとも１つにおいて、形成された融合タンパク質が、ＨＬＥＰに結合していない凝固因子と比較して増加したインビボでの半減期を有し、かつ融合タンパク質が、切断不可能なリンカーを有する対応する融合タンパク質と比較して少なくとも２５％高いモル比活性を有するように、間に入る切断可能なペプチドリンカーが治療用ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に導入されるような、凝固因子またはそのフラグメントもしくは変異体を、ＨＬＥＰまたはそのフラグメントもしくは変異体のＮ末端またはＣ末端に結合させることを含む融合タンパク質に関する。ｒＩＸは、ＨＬＥＰフラグメントまたはその変異体のＮ末端にあることが好ましい。
【００９２】
上の定義中の「第ＩＸ因子」は、あらゆる天然多型を含む天然アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。また、それは、それらのポリペプチドがそれぞれの治療用ポリペプチドの活性を実質的に保持する限り、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、末端アミノ酸欠失または付加を含む修飾されたＮ末端またはＣ末端を含む。含まれる変異体は、野生型配列とは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基において異なる。このような違いの例としては、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、好ましくは１〜３０個のアミノ酸残基）によるＮ末端および／もしくはＣ末端のトランケーション、またはＮ末端および／もしくはＣ末端での１つもしくはそれ以上の余分な残基の付加、ならびに保存的アミノ酸置換、すなわち、類似した特性を有するアミノ酸のグループ、例えば（１）小さなアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および（６）芳香族アミノ酸の中で実施された置換を含んでもよい。このような保存的置換の例は、以下の表に示す。
【００９３】
【表３】
2017502036.tif 000005
【００９４】
一般に、終末相半減期またはβ半減期として決定される本発明の融合タンパク質のインビボ半減期は、非融合ポリペプチドのインビボ半減期よりも通常、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは１００％を超えて高い。
【００９５】
本発明の融合タンパク質は、切断可能なリンカーのない対応する融合タンパク質と比較して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％増加したモル比活性を有する。
【００９６】
これに関するモル比活性（または、特にここで考えられる凝固関連のモル比活性）は、興味の治療用ポリペプチドまたは治療用融合タンパク質のモル（または、例えばナノモル）当たり発現される活性として定義される。モル比活性の算出により、調べたポリペプチドの分子量または光学濃度の違いによって影響を受けることなく異なる構築物の活性の直接比較が可能となる。ＦＩＸおよびＦＩＸ−ＦＰ融合タンパク質に関して下の表３に例示したようにモル比活性を算出してもよい。
【００９７】
【表４】
2017502036.tif 000006
【００９８】
凝固関連のモル比活性を決定するために、凝固過程に関連する酵素活性または補因子活性を決定するなんらかのアッセイを用いてもよい。
【００９９】
したがって、本発明の意味における「凝固関連のアッセイ」とは、凝固過程に関連性のある酵素活性もしくは補因子活性を決定するか、または内因性もしくは外因性のいずれかの凝固カスケードが活性化されていることを決定できるなんらかのアッセイである。従って、「凝固関連の」アッセイは、ａＰＴＴ、ＰＴのような直接凝固アッセイまたはトロンビン生成アッセイであってもよい。しかし、例えば、特定の凝固因子に関して適用される発色性アッセイのような他のアッセイも含まれる。このようなアッセイまたは対応する試薬の例は、対応する凝固因子欠損血漿（デイドベーリング（Dade Behring））を用いる、パスロムチンＳＬ（ａＰＴＴアッセイ、デイドベーリング（Dade Behring））もしくはトロンボレルＳ（プロトロンビン時間アッセイ、デイドベーリング（Dade Behring））、例えば凝固因子欠損血漿を用いるトロンビン生成アッセイキット（テクノクローン（Technoclone）、トロンビンスコープ（Thrombinoscope））、バイオフェン（Biophen）第ＩＸ因子（ハイフェンバイオメド（Hyphen BioMed））、スタクロット（Staclot）ＦＶＩＩａｒＴＦ（Roche Diagnostics GmbH）、コアテスト第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／４（クロモゲニックス（Chromogenix））のような発色性アッセイ、またはその他である。
【０１００】
本発明の目的では、上のアッセイのいずれかの１つまたは同等の凝固関連アッセイにおける増加は、モル比活性の増加を示すと考えられる。例えば、２５％の増加は、上記のまたは同等のアッセイのいずれかにおける２５％の増加に相当する。
【０１０１】
治療用融合タンパク質が本発明の範囲内にあるかどうかを決定するため、
これらのタンパク質のモル比活性を比較する基準は、それぞれの凝固因子およびそれぞれのＨＬＥＰが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号：４）を有する切断不可能なリンカーによって結合された構築物である。
【０１０２】
ＦＩＸに関して、ａＰＴＴアッセイは、凝固活性の決定のためにしばしば用いられる。このような凝固アッセイ（ａＰＴＴアッセイ）を、さらに詳細に実施例４に記載する。しかし、他の凝固関連のアッセイまたはアッセイ原理を適用してＦＩＸに関するモル比活性を決定してもよい。
【０１０３】
非活性化凝固因子に関しては高いインビボリカバリーおよび長い半減期を有することが望ましいが、プロトロンビンリスクを回避するためには、凝固因子の活性化またはその補因子の活性化後、凝固因子の半減期を制限することが好都合である。したがって、凝固過程が開始された後、活性凝固因子の半減期が、再び短縮されなければならない。これは、凝固関連機序における不活性化の増強または凝固因子の除去のいずれかによって達成することができる。
【０１０４】
本発明による不活性化は、例えば凝固因子と対応する凝固因子の阻害物質との複合体形成よって、または例えばＦＶＩＩＩおよびＦｖの場合に知られているようなさらなるタンパク質分解切断によって起こりうる治療用ポリペプチドの活性の低下を意味する。
【０１０５】
活性化された治療用融合タンパク質の不活性化速度は、例えば、阻害物質との反応によって、またはタンパク質分解不活性化によって活性が低下する速度として定義される。不活性化速度は、この凝固因子の阻害物質の生理学的量の存在下で時間をかけて活性化凝固因子のモル比活性を追跡調査することによって測定してもよい。
【０１０６】
別法として、不活性化速度は、動物に活性化製剤を投与した後、続いて活性アッセイおよび抗原アッセイを用いて適当な時間枠で血漿サンプルを試験することによって決定してもよい。
【０１０７】
治療用融合タンパク質に関して、これらのタンパク質が本発明の範囲内にあるかどうか決定する必要であるとき、これらの治療用タンパク質の不活性化速度を比較する基準は、それぞれの凝固因子およびそれぞれのＨＬＥＰが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号：４）を有する切断不可能なリンカーによって結合された構築物である。
【０１０８】
活性化された治療用融合タンパク質の排出速度は、ポリペプチドがヒトまたは動物の循環から排出される速度として定義される。排出速度は、静脈内投与後、活性化された治療用融合タンパク質の薬物動態を測定することによって決定してもよい。抗原アッセイを用いて、循環からの直接除去による排出を決定することができる。さらに活性アッセイを用いて、固有の除去および不活性化速度を決定してもよい。
【０１０９】
治療用融合タンパク質に関して、これらのタンパク質が本発明の範囲内にあるかどうか決定する必要であるとき、これらのタンパク質の排出速度を比較する基準は、それぞれの凝固因子およびそれぞれのＨＬＥＰが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号：４）を有する切断不可能なリンカーによって結合された構築物である。
【０１１０】
本発明によれば、治療用ポリペプチド部分は、切断可能なペプチドリンカーによってＨＬＥＰ部分に結合される。リンカーは非免疫原性でなければならず、かつプロテアーゼによって切断可能となるように十分柔軟性でなければならない。
【０１１１】
切断可能なリンカーは、好ましくは
ａ）治療用ポリペプチドの活性化中にタンパク質分解により切断されるタンパク質分解切断部位を含有する場合、それ自体で投与される治療用ポリペプチド
ｂ）この治療用ポリペプチドの基質ポリペプチド、または
ｃ）治療用ポリペプチドの直接もしくは間接的な関与によって活性化もしくは形成されるプロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド
から誘導された配列を含む。
【０１１２】
より好ましい実施態様のリンカー領域は、適用される治療用ポリペプチドの配列を含み、それは、発現された融合タンパク質の新抗原性のリスクを低下させることになるはずである。
【０１１３】
好ましい実施態様において、ＨＬＥＰはアルブミンである。この場合、リンカー配列は、ＦＩＸの活性化領域の配列から、ＦＸもしくはＦＶＩＩのようなＦＩＸの任意の基質の切断領域から、またはＦＩＸａが活性化に関与するプロテアーゼによって切断される任意の基質ポリペプチドの切断領域からのいずれかで誘導される。
【０１１４】
非常に好ましい実施態様において、リンカーペプチドは、ＦＩＸそれ自体から誘導される。別の好ましい実施態様において、リンカーペプチドは、ＦＸまたはＦＶＩＩから誘導される。別の好ましい実施態様において、リンカー配列は、ＦＩＸの２つの生理学的に関連した活性化物質、ＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／ＴＦによって切断することができる２つの切断配列を含む。
【０１１５】
リンカーがプロテアーゼまたはリンカーを切断するプロテアーゼによってなお切断されることができる限り、記載されたリンカーの変異体およびフラグメントもまた、本発明に包含される。用語「変異体」は、挿入、欠失および置換（保存的または非保存的）を含む。
【０１１６】
医薬組成物および投与方法
本発明の融合タンパク質は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的にタンパク質および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に用いるとき、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合しうるなんらかのおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、および同様のものを含むものとする。適した担体は、当分野の標準参照テキスト、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）の最新版に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれている。このような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、リポソームおよび固定油のような非水性ビヒクルを用いてもよい。薬学的に活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野でよく知られている。任意の慣用の媒体または薬剤は、活性化合物と不適合でなければ、組成物中のその使用が企図される。補助活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、内皮、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）；経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌賦形剤、例えば注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基；例えば水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整することができる。非経口製剤は、プラスチックのガラスでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは多回投与バイアル中に封入することができる。静脈注射としての投与が、好ましい投与経路である。
【０１１８】
注射可能な使用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のため、適した担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモホールＥＬ（ＢＡＳＦ、パルシッパニー（Parsippany）、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合、組成物は無菌でなければならず、かつシリンジが容易に移動できる程度の液体でなければならない。医薬組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムが含まれていることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによって達成することができる。
【０１１９】
滅菌注射溶液は、適当な溶媒中で必要な量の活性化合物（例えば、ｒＩＸ−ＦＰ）を上に列挙された成分の１つまたは組合せと共に配合し、必要に応じて、続いてフィルタ処理した滅菌によって調製することができる。一般に、分散液は、ベースとなる分散媒体および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、任意のさらなる所望の成分を加えた活性成分の粉末が、その予め滅菌濾過された溶液から得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２０】
注射用製剤は、治療有効量で第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦＰ）を含有することができ、その量は当業者によって決定されうる。特に、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦＰ）は、約１００〜４００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与してもよい。例えば、融合タンパク質は、約１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度での投与に提供してもよい。融合タンパク質は、より高い濃度、例えば６００ＩＵ／ｍｌおよび１２００ＩＵ／ｍｌでの投与に提供してもよい。
【０１２１】
投与の容易さおよび投与量の均一性のため、医薬組成物、例えば注射用組成物を投薬単位形中に処方することは、特に好都合である。本明細書に用いられる投薬単位形とは、処置される対象にとって単位投与量として適した物理的に離散性の単位のことであり、各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含有する。投薬単位形に関する仕様は、活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果によって決まり、それらに直接左右される。
【０１２２】
医薬組成物は、投与の説明書と共に容器、パックまたはディスペンサー中に含まれうる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】ｒＩＸ−ＦＰの好都合な性質の概略図。
【図２】成熟ｒＩＸ−ＦＰのアミノ酸配列（配列番号：１）。ＦＩＸはａａ１〜４１６に示され、リンカー配列は太字体で下線を引かれており（ａａ４１６〜４３３）、アルブミン配列はａａ４３４〜１０１８で示される。
【図３】期間、持続時間および対象の流れを含む実施例１の試験デザインの模式図。ＰＫ、薬物動態。
【図４】実施例１の試験における患者の流れおよび素因を示す模式図。
【図５】（Ａ）処置したすべての出血に関する止血を達成するためのｒＩＸ−ＦＰ注入の回数。（Ｂ）処置したすべての出血に関する出血開始からｒＩＸ−ＦＰの初回注入までの時間。
【図６】特発性出血に関する平均年間出血率を（Ａ）に示し、すべての出血に関しては（Ｂ）に示す。各患者に関する年間出血率は、研究処置期間の間の出血日数を３６５．２５で割ったものとして計算した。各患者に関する出血率の既往は、研究参加前１２ヵ月の期間中の出血回数であった。ＰＴ、予防処置；ＯＤＴ、オンデマンド処置。
【図７】２１日毎に１回、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰに関するＰＫの結果（ＦＩＸ活性シミュレーション値対時間）。
【図８】１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰを注射した後の経時的なｒＩＸ−ＦＰ活性の平均値。
【図９】１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰで注射、または５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰで注射した後、経時的なｒＩＸ−ＦＰ活性の平均値、および５０ＩＵ／ｋｇのＦＩＸで注射した後の以前のＦＩＸ（例えばＢｅｎｅｆｉｘ(R)）の平均値。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｅは、毎週２５ＩＵ／ｋｇ、１０日および１４日毎に５０ＩＵ／ｋｇならびに１４日および２１日毎に７５ＩＵ／ｋｇのような投与レジメンのＦＩＸ活性値のＦＩＸ活性レベルの中央値または平均値（実線）ならびに最低５％および最高５％を特徴とする境界線。中央値ならびに最低および最高５％のトラフレベルを表９ｂに示す。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１０−３】図１０−２の続き。
【図１０−４】図１０−３の続き。
【図１０−５】図１０−４の続き。
【図１１】ｒＩＸ−ＦＰの有効性、薬物動態および安全性を評価するための第ＩＩ／ＩＩＩ相研究の研究処置群１および２のフローチャート。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｃは、それぞれ７、１０および１４日毎に１回の３３．３３、５０および７５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰに関するＰＫ結果（シミュレーションされたＦＩＸ活性対時間）、ならびにそれぞれ７、１０および１４日毎に１回、５０、１００および１００ＩＵ／ｋｇのＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭに関するＰＫ結果との比較（シミュレーションされたＦＩＸ活性対時間）。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１２−３】図１２−２の続き。
【０１２４】
さて、本発明を詳細に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されることになり、これによりそれらは、説明のためにのみ含まれるわけではなく、本発明が限定されるものではない。本明細書に引用されたすべての特許および刊行物は、参照により明確に組み込まれる。
【実施例】
【０１２５】
〔実施例１〕血友病Ｂ患者における第ＩＸ凝固因子をアルブミンと結合している新規な組換え融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）の安全性および有効性の第Ｉ／ＩＩ相非盲検試験
本試験は、ｒＩＸ−ＦＰの安全性および薬物動態（ＰＫ）を評価することに加えて、毎週１回の予防中の出血エピソードの予防に関するｒＩＸ−ＦＰの有効性を評価すること、および出血処置に対する止血有効性を評価することを目的とする。
【０１２６】
患者および方法
患者
対象選択の基準は、ヒト用医薬品委員会（Committee for medicinal products for human use）による組換えおよびヒト血漿由来の第ＩＸ因子製剤の臨床検査におけるガイドラインの草案（draft Guideline on the clinical investigation of recombinant and human plasma-derived factor IX products）（欧州医薬品庁（European Medicines Agency）、ヒト用医薬品委員会（Committee for medicinal products for human use）（ＣＨＭＰ）、組換えおよびヒト血漿由来の第ＩＸ因子製剤の臨床検査のガイドライン（Guideline in the Clinical Investigation of Recombinant and Human Plasma-Derived Factor IX Products）２００９．
ＣＨＭＰ／ＢＰＷＰ／１４４５５２／２００９．以下で入手可能：
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003634.pdf)に基づいた。患者は、血友病Ｂ（ＦＩＸ活性≦２％）を有し、かつ年齢が１２〜６５歳であり、以前に処置された（ＦＩＸ製剤に対する≧１５０曝露日数）男性である。ＦＩＸに対する中和抗体（阻害物質）の既往歴、ＣＤ４＋リンパ球数＜２００／ｍｍ３（ＨＩＶ陽性である場合）または血友病Ｂ以外の凝固障害を有する患者を参加から除外した。患者は、２カ国（イスラエルおよびブルガリア）の２施設から集めた。すべての患者（または患者の親もしくは法的に許容される代理人）は、あらゆる試験関連の活動前に書面でインフォームドコンセントを提出した。本研究は、独立した倫理委員会によって承認され、ＧＣＰおよびヘルシンキ宣言に従って実施された。本試験は、識別子ＮＣＴ０１３６１１２６の下でwww.clinicaltrials.govに登録された。
【０１２７】
試験デザイン
本研究は、ｒＩＸ−ＦＰの安全性、薬物動態および有効性を評価するための前向き非盲検研究であり、これは先天性第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損（血友病Ｂ）患者における出血エピソードの予防および処置のために開発されている。本研究は、ｒＩＸ−ＦＰ  ＰＫの１０〜１４日の評価、ならびに予防処置を毎週受ける対象による１１ヵ月の安全性および有効性評価期間ならびにオンデマンド処置を受ける対象による３〜５ヵ月の安全性および有効性評価期間からなる（図３参照）。予防処置を毎週受ける対象は、３０±５ＩＵ／ｋｇで最初に処置した。７日の処置間隔を維持し、かつトラフＦＩＸ活性レベルを個別に合わせながら、出血表現型、物理的活性レベルおよび臨床結果に基づいて用量を調整することができた。本研究の積極的処置期間中に起こったすべての出血性イベントはｒＩＸ−ＦＰで処置し；スクリーニング中、または薬物動態評価期間中に起こった出血性イベントは、研究者の裁量で対象の以前の製剤で処置することができた。出血性イベントのオンデマンド処置に関して、用量は、対象のＰＫプロファイル、ＷＦＨガイドラインおよび当該施設の標準治療に基づき、最小用量は２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰであった。すべての対象は、日常的な予防および出血性イベントの処置の両方でｒＩＸ−ＦＰ処置を自己管理し、処置および出血性イベントは、対象が電子日誌に記録した。
【０１２８】
試験目的およびエンドポイント
本研究の主要目的は、ｒＩＸ−ＦＰの静脈注射の長期安全性を評価することであった。安全性は、有害事象の性質および発生率、実験室値の変化、ならびにｒＩＸ−ＦＰに対する阻害物質または非中和性抗体の発生によって評価した。
【０１２９】
本研究の副次的目的は、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回ＩＶ投与後のＰＫパラメータ、出血エピソードの予防に関してｒＩＸ−ＦＰによる毎週の日常的な予防の臨床反応およびｒＩＸ−ＦＰで処置した出血エピソードの臨床反応を評価することであった。
【０１３０】
分析方法
ＦＩＸ活性は、検証された一段階凝固方法を用いて測定した。簡潔には、試験サンプルを等量のＦＩＸ除去血漿と混合し、活性化試薬としてパスロムチン（Pathromtin）ＳＬ（シーメンスヘルスケアダイアグノスティックス（Siemens Healthcare Diagnostics）、マールブルク）を用いてインビトロでの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を決定することによって試験し、ｒＩＸ−ＦＰ活性の決定は、ベーリング凝固システム（Behring Coagulation System）（ＢＣＳ）を用いて実施した。結果は基準曲線を用いて解釈し、それはＦＩＸに対するＷＨＯ標準（国際血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ヒト、血漿）に関して製造元によって較正された標準ヒト血漿（ＳＨＰＬ）から作成し、結果は標準値のパーセントまたは国際単位で報告する。
【０１３１】
ヒトクエン酸血漿中のａＰＴＴのインビトロ測定に基づく凝固アッセイ、ナイメーヘン改変（Nijmegen modification）によるベセスダ（Bethesda）法によって阻害物質を滴定した。結果は、０．６のベセスダ単位（ＢＵ）を陽性結果として定義した。
【０１３２】
本研究中、ｒＩＸ−ＦＰに関する免疫原性試験の段階的アプローチを用いた。ｒＩＸ−ＦＰ曝露前におよび曝露４週間後にすべての患者でｒＩＸ−ＦＰに対する抗体を試験した。ｒＩＸ−ＦＰに対する抗体を検出するために直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いた；陽性シグナルが得られた場合、別の直接結合ＥＬＩＳＡアッセイで血漿サンプルを再試験して特異抗体シグナルを確認し、血漿由来のＦＩＸ、組換えＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ）に対する抗体とアルブミンとを識別した。
【０１３３】
ＦＩＸ活性、ＦＩＸ抗原、ｒＩＸ−ＦＰに対する阻害物質および抗体の分析を、ドイツ、マールブルクのＣＳＬベーリングの中央検査室で実施した。
【０１３４】
薬物動態解析および統計的方法
４日の休薬期間に続いて、ｒＩＸ−ＦＰの投与前ならびに注入の３０分、３、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０および３３６時間後にＰＫ分析のためＦＩＸ活性の測定用の血液サンプルを集めた。ＩＳＴＨ推奨に従って実際の採取回数を用いてすべてのＰＫパラメータを計算した。ＰＫサンプリング期間中に出血の処置に対してＦＩＸ製剤を受けた患者または十分な数の分析可能なＰＫサンプルを有しなかった患者は、ＰＫ分析から除外した。ＰＫ分析は、WinNonlin(R)ソフトウェア（ファーサイト（Pharsight））を用いて標準ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）によって実施した。ＰＫパラメータには以下が含まれる：定量化可能な薬物濃度による最終サンプルまでの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）；最後に観察されたＦＩＸ濃度に基づいて無限まで推定された投与時間からの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）；式Ｃ３０ｍｉｎ（ＩＵ／ｄＬ）／用量（ＩＵ／ｋｇ）によるインクリメンタルリカバリー（ＩＲ０−３０ｍｉｎ）；終末相半減期（ｔ１／２）；体重に対して標準化された全身クリアランス（ＣＬ）。安全性エンドポイントは、ｒＩＸ−ＦＰに曝露されたすべての患者（安全性集団）を含む記述統計を用いてをまとめた。
【０１３５】
有効性
出血性イベントの処置に対するｒＩＸ−ＦＰの有効性を決定するため、止血を達成するための注入回数を表にした。さらに、研究者らは、４点スケールにおいて出血性イベントの処置の有効性を評価し、対象によって摂取された注入回数および処置後に対象が報告した疼痛緩和の両方を考慮した。
【０１３６】
日常的な予防の有効性は、ｒＩＸ−ＦＰの消費によっておよび予防中に起こった特発性出血性イベントの回数によって測定したが、それは年間出血率として示される。
【０１３７】
薬剤
ｒＩＸ−ＦＰは、ＣＨＯ細胞で合成された約１２５，０００Ｄａの分子量を有する単鎖糖タンパク質である。製造および製剤は、動物またはヒト由来の賦形剤の添加を含まない（Metzner HJ, Weimer T, Kronthaler U, et al. Genetic fusion to albumin improves the pharmacokinetic properties of Factor IX. Thrombosis and Haemostasis 2009; 102: 634-44）。ｒＩＸ−ＦＰは、ＦＩＸ活性化に関与する内在性ＦＩＸ配列から誘導された短い切断可能なリンカーによって組換えヒト凝固ＦＩＸを組換えヒトアルブミンと結合している高度に精製された組換え融合タンパク質である。リンカーは、同じ酵素、例えば、第ＸＩａ凝固因子または第ＶＩＩａ凝固因子／組織因子によって融合タンパク質から切断され、それらは、血液凝固過程の間にＦＩＸを活性化して、アルブミン部分を除去する。ｒＩＸ−ＦＰは、５００および１０００ＩＵ／バイアルの使い捨てバイアル中のＩＶ注射のための凍結乾燥された滅菌製剤として供給され、滅菌注射用水２．５ｍＬで再構成された。
【０１３８】
結果
患者の特性
イスラエルおよびブルガリアの血友病処置センターから１７名の研究対象をスクリーニングし、全員を本研究に登録した。すべての対象は白人および非ヒスパニック系であり、年齢は１３歳から４６歳（平均年齢２６歳）の範囲であった。イスラエルで登録された全１３名の対象は、本研究の期間（３７〜４８週の範囲）中、ｒＩＸ−ＦＰの予防処置を毎週受け、ブルガリアで登録された全４名の対象は、本研究の期間（１５〜２２週の範囲）中、ｒＩＸ−ＦＰにより出血エピソードに対するオンデマンド処置を受けた。対象の素因を図４に説明する。
【０１３９】
スクリーニング時に、５名（２９％）の対象は、Ｃ型肝炎陽性であり、１名（６％）の対象は、Ｂ型肝炎陽性であり、ＨＩＶ陽性の対象はいなかった。ほぼ半分（８／１７）の対象では、血友病性関節症および慢性滑膜炎を含む筋骨格障害が報告された。５名の対象は、以前に報告されたギルバート症候群の既往歴を有しており、それはベースラインでの高いビリルビンレベルによって示された。全体として、予防対象はオンデマンド対象より若く、１８歳未満の対象が３名含まれていた。予防対象は、オンデマンド対象よりも慢性肝炎感染がより少なく、報告された関節障害が少なかった（表４）。
【０１４０】
【表５】
2017502036.tif 000007
【０１４１】
安全性集団の対象は、研究参加前のＦＩＸ製剤への曝露日数８１５（ＥＤ）の推定平均値を有した（４１５〜１４５０の範囲）。研究予防処置群において、３名の対象は、研究参加前にオンデマンド処置を受けていたところであり、１０名の対象は、ＦＩＸ製剤による予防処置を受けていた（対象の８０％では週に２〜３回）。以前にオンデマンドの処置を受けていたそれらの３名の対象では、以前の予防対象よりも研究参加前１２ヵ月間の非常に高い全出血回数平均値が報告された（４３．３対５．２）。本研究のオンデマンド群の対象は、研究参加前の１２ヵ月間に２７出血の平均値を有した。
【０１４２】
薬物動態
ｒＩＸ−ＦＰを以前に受けなかった１５名の対象において研究の開始時に２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回投与の薬物動態（ＰＫ）を評価した。ＰＫパラメータは、第Ｉ相研究から以前に報告されたものと類似しており（Santagostino E, Negrier C, Klamroth R, Tiede A, Pabinger-Fasching I, Voigt C, et al. Safety and pharmacokinetics of a novel recombinant fusion protein linking coagulation factor IX with albumin (rIX-FP) in hemophilia B patients. Blood 2012; 120: 2405-11）、平均単回投与薬物動態プロファイルは、以前に公開された（Martinowitz U, Lubetsky A. Phase I/II, open-label, multicenter, safety, efficacy and PK study of a recombinant coagulation factor IX albumin fusion protein (rIX-FP) in subjects with hemophilia B. Thrombosis Research 2013; 131S2: S11-S14）。２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの用量は、ＩＵ／ｋｇ当たり１．５２ＩＵ／ｄＬの平均インクリメンタルリカバリーおよび９４．８時間の平均半減期を有した。７、１０および１４日での平均ベースライン未補正ＦＩＸ活性は、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回投与後に５．６、３．９および２．９ＩＵ／ｄＬであった。
【０１４３】
用量
プロトコールによって定められたとおり、すべての予防対象に２５〜３５ＩＵ／ｋｇ（３０ＩＵ／ｋｇの平均値）ｒＩＸ−ＦＰの毎週の予防用量を最初に割り当てた。本研究の経過にわたって、医師の判断（６９．７％）、出血（１８．２％）または他の（１２．１％）理由のため、研究者によって用量が調整された。毎週予防の平均用量は、本研究の最後の１２週間中５８．６ＩＵ／ｋｇ（範囲４７．６〜７５ＩＵ／ｋｇ）であり、特発性出血だけでなく、高いトラフＦＩＸ活性レベルを有する外傷誘発性出血もまた予防することを目的とする。これらの用量のトラフレベルは、投与５日（１２２時間）後に３６．２％のＦＩＸ活性の平均値で高かった。
【０１４４】
出血エピソードのオンデマンド処置のため、プロトコールによって定められたとおり、すべての対象を、最初に３０〜３５ＩＵ／ｋｇ（３３ＩＵ／ｋｇの平均値）のｒＩＸ−ＦＰの用量を割り当てた。本研究の経過にわたって、医師の判断（６７．６％）、出血（２１．６％）または他の（１０．８％）理由のため、研究者によって用量が調整された。すべての出血エピソードの処置に対する平均用量は４６ＩＵ／ｋｇであり、予防対象にはオンデマンドの対象より高い用量を割り当てた（平均用量６２ＩＵ／ｋｇ対２８ＩＵ／ｋｇ）。オンデマンド用量の割当ては、対象の便宜のため、予防用量と同時に同じ用量に調整し、予防群では結果としてより高い用量になった。
【０１４５】
安全性
ｒＩＸ−ＦＰは、すべての対象において忍容性が良好であった。処置期間は、予防対象では２５９日から３３５日まで、オンデマンド対象では１０５日から１５５日までの範囲であり、本研究に参加して予防を受ける対象は、オンデマンド対象より長かった（平均値３１５日対１３１日）。ｒＩＸ−ＦＰに対して合計７１８ＥＤがあり、予防対象ではｒＩＸ−ＦＰに対して５１．５ＥＤおよびオンデマンド対象ではｒＩＸ−ＦＰに対して１２ＥＤの平均値であった。９名の予防対象は、本研究中に少なくとも５０ＥＤを達成した。
【０１４６】
ｒＩＸ−ＦＰ投与後、ＦＩＸに対する阻害物質またはｒＩＸ−ＦＰに対する抗体を生じた対象はいなかった。１名の対象は、ｒＩＸ−ＦＰの初回投与前に血漿由来のＦＩＸおよびＢｅｎｅＦＩＸに対する一過性陽性抗体を示し、それは１２週目までに消失し、この時、対象は、試験したすべての抗原に対する抗体について陰性であった。過敏性反応はなかった。本研究中に任意の安全性パラメータにおける処置中に発生した重大な所見はなかった。
【０１４７】
合計１４名（８２．４％）対象が、４６例の処置中に発生した有害事象を報告し、その中で研究者によってｒＩＸ−ＦＰと関連があると考えられたものはなかった（表５）。
【０１４８】
【表６】
2017502036.tif 000008
【０１４９】
すべてのＡＥは、軽度または中等度の重症度であった。報告された重篤な有害事象はなく、ＡＥによる中止はなかった。最も頻度の高い分類のＡＥは、筋骨格障害（７名（４１．２％）の対象、１７例のイベント）および損傷（７名（４１．２％）の対象、９例のイベント）であった。
【０１５０】
有効性
出血の処置。７名（５３．８％）の予防対象および４名（１００％）のオンデマンド対象では、特発性出血エピソードが処置された。本研究中、ｒＩＸ−ＦＰによる処置が必要である合計８５例の出血エピソードが報告され、そのうちの約半数（５４．１％）が特発性であった。予防対象の中で、予防処置期間中に起こった全１４例の特発性出血は、足首または肘関節であった。
【０１５１】
本研究中に出血エピソードを経験したすべての対象において出血の管理を評価し；処置を必要とするすべての出血エピソードは、本研究中、ｒＩＸ−ＦＰの１（９５．３％）または２（４．７％）回の投与で良好に処置された（図５Ａ）。オンデマンド対象では、２８ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの平均用量で出血が処置され、出血の９７．３％（３８例のうちの３７例）は、ｒＩＸ−ＦＰの単回投与で処置された。予防対象では、６２ＩＵ／ｋｇの平均用量で出血が処置され、出血の９３．６％（４７例のうちの４４例）では、ｒＩＸ−ＦＰの単回投与で処置された。止血を達成するためにｒＩＸ−ＦＰの２回の投与を必要とする出血が４例あった。さらなる５例の出血は、ｒＩＸ−ＦＰの単回投与、続いて処置投与３０時間以内にｒＩＸ−ＦＰの予定された予防投与で処置された。
【０１５２】
大多数の注入は、研究者によってｒＩＸ−ＦＰ処置に対して優秀または良好（９６．５％）の評価を受けた。中等度の評価を受けた３例の投与があった；これらの出血はすべて１または２回の注入で回復し、初回ｒＩＸ−ＦＰ処置までの時間は、出血開始後８時間を超えて遅くなった。対象には直ちに出血を処置することが奨励されるが、出血の１６．４％は、出血開始後８時間を超えて処置され、５．９％は出血開始後１６時間を超えて処置された（図５Ｂ）。
【０１５３】
日常的な予防
全１３名の予防対象は、１１ヵ月の研究を通してｒＩＸ−ＦＰによる毎週の日常的な予防を維持した。予防対象の約半分（４６％、６名の対象）は、本研究期間中になんら特発性出血性イベントを有しなかった。７名の予防対象では、本研究の予防区分中に１４例の特発性出血が報告され、２例の特発性出血は薬物動態期間の終わりに起こった。特発性出血が報告された７名の対象のうちの４名には、血友病性関節症または関節の滑膜炎の既往歴があった；残りの３名の対象はすべて１０代であり、そのうちの２名は研究参加前にオンデマンド処置しか受けていなかった。
【０１５４】
研究参加前にＦＩＸ製剤で予防を受けた１０名の対象の中で、毎週１回から１週間に３回までのさまざまな処置レジメンにおいて５名はｐｄＦＩＸを受け、５名はｒＦＩＸを受けた。対象は、本研究に参加する前に、８７．７ＩＵ／ｋｇのＦＩＸの平均毎週消費量を有し、本研究終了時に５８．６ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの平均週用量を有した。ｒＩＸ−ＦＰの平均毎週消費量は、研究参加前に用いたＦＩＸ製剤の平均毎週消費量よりも３３％少なかった。
【０１５５】
年間出血率
全体的に、予防対象では、オンデマンド処置のみを受けている対象より少ない特発性出血エピソードが報告された。オンデマンド対象は、本研究中に年当たり２１．７４例の特発性出血の年間出血率（ＡＢＲ）となる８．０例の特発性出血エピソードの平均値を有した。予防対象は、本研究中に年当たり１．２６例の特発性出血の年率となる１．１例の出血エピソードの平均値を有した。予防対象およびオンデマンド対象では、年当たりの外傷性出血性イベントの年率が類似していた。本研究中の全出血（特発性および外傷性）に関する平均ＡＢＲは、予防およびオンデマンドの対象について、それぞれ４．３５および２８．８であった。予防処置群では、１０名の対象が、研究参加前に予防レジメンを受けた。これらの１０名の対象では、本研究中のｒＩＸ−ＦＰの毎週予防によるＡＢＲよりも、研究参加前の１２ヵ月間でそれぞれ約５０％または３０％高い平均特発性出血率または全出血率が報告された。
【０１５６】
予防処置群では、３名の対象が研究参加前にオンデマンド処置を受けた。これらの３名の対象では、研究参加前に予防処置を受けた予防対象よりも、研究参加前の１２ヵ月間でよりはるかに高い既往の平均特発性出血率（３１．７）および全出血率（４３．３）が報告された（図６）。ｒＩＸ−ＦＰによる毎週の予防を開始した後、平均年間特発性出血率および全出血率は、それぞれ年当たり１．５６および７．３であった。この対象のサブセットでは、既往データと比較したとき、平均年間特発性出血率または全出血率における９５％または８３％の低下があった。
【０１５７】
議論
重度の血友病Ｂの１３名の患者は、ｒＩＸ−ＦＰによる毎週の予防処置を１１ヵ月間受け、９名は少なくとも５０日の曝露を達成した。さらに、出血性イベントを３〜５ヵ月間経験したときのみ、４名の患者はｒＩＸ−ＦＰを受けた。
【０１５８】
ヒトアルブミンは豊富な血漿タンパク質であり、免疫系に対するトリガーとして作用することがないため、アルブミン融合技術は、凝固因子の半減期を延長する非常に魅力的な技術であることがわかっている。本研究において、１７名の研究対象の中では、ｒＩＸ−ＦＰに７００回を超える反復曝露の後、過敏性反応またはＦＩＸに対する阻害物質もしくはｒＩＸ−ＦＰに対する抗体の発生がなかった。
【０１５９】
ｒＩＸ−ＦＰは、出血性イベントの処置において非常に有効であり、単回投与後９５％の確率で止血が達成され、すべての出血は１または２回の投与で効果的に処置された。これは、好都合なことにＢｅｎｅＦＩＸ(R)による処置に匹敵し、ＢｅｎｅＦＩＸ(R)では、以前に処置された患者の臨床試験では単回投与で出血の８１％が効果的に処置されたことが報告されている（BeneFIX(R) Package Insert. 2011 November Available at: http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=492）。出血を処置するために用いられるｒＩＸ−ＦＰ用量の範囲は広いが、用いたｒＩＸ−ＦＰの用量との間に止血を達成するのに必要であった処置の回数との間に明白な相関性はない。予防対象のすべてを、任意の出血性イベントの処置に対して高用量のｒＩＸ−ＦＰに割り当てた。選択された用量は、患者の便宜のため、すべての予防患者に関して、予防用量および処置用量が、処置する医師によって決定されたものと同じとなるようにした。オンデマンド対象では、２８ＩＵ／ｋｇ（予防対象で用いた用量より５０％少ないｒＩＸ−ＦＰ）の平均用量で出血が処置され、同様の成功率を有しており、オンデマンドの対象では出血の９７．３％がｒＩＸ−ＦＰの単回投与で処置された。予防対象では、６２ＩＵ／ｋｇの平均用量で出血が処置され、出血の９３．６％はｒＩＸ−ＦＰの単回投与で処置された。出血の処置に関して割り当てられたｒＩＸ−ＦＰ用量の違いは、予防処置ステータス、患者の出血表現型および施設の標準治療を含む複数の要因の結果でありうるが、出血性イベントの処置に関しては、より低い用量のｒＩＸ−ＦＰが同様に有効であった。
【０１６０】
全１３名の予防対象は、本研究中、ｒＩＸ−ＦＰによる予防のため毎週の処置間隔を１１ヵ月間維持した。優れた処置コンプライアンスがあって、多くの対象が予定されている処方された用量を摂取した。毎週の予防におけるこれらの対象の年間出血率は、血漿由来または組換えＦＩＸによる毎週１、２または３回の予防を受けたときのこれらの対象の以前の出血率より少なかった。本研究中、６名の対象では、特発性出血エピソードが報告されず、そのうちの５名は、研究参加前の１２ヵ月間に特発性出血エピソードを有しなかった。研究参加前に予防処置を受けていなかった３名の対象があり；これらの対象では、オンデマンド処置においてこれらの対象の報告された年間出血率と比較して、年間出血率で８３％の低下があった。注目すべきことに、これらの３名の対象のうちの１名は、本研究中、特発性出血エピソードを有しなかった。これは極めて小さなサンプルサイズであるが、オンデマンドからｒＩＸ−ＦＰの毎週の予防処置に転換すると、これらの対象の出血率が劇的に低下した。
【０１６１】
この概念研究の証明は、凝固ＦＩＸをアルブミン（ｒＩＸ−ＦＰ）と結合している組換え融合タンパク質によって提供される延長された半減期によってより少ない頻度の予防処置レジメンが可能かつ有効であることを示した。さらに、ｒＩＸ−ＦＰは、この生涯にわたって衰弱をもたらす出血障害の患者に有効なオンデマンド処置を提供した。ｒＩＸ−ＦＰは、その安全性プロファイルにより、血友病Ｂ患者の長期的予防の優れた選択肢となりうる。
【０１６２】
〔実施例２〕血友病Ｂの対象における組換え凝固第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）の第３ｂ相非盲検多施設安全性および有効性延長研究
１．研究概要
血友病Ｂの対象における出血エピソードの予防処置のための、ｒＩＸ−ＦＰの長期安全性および有効性を評価するための前向き非盲検研究が開発されている。本研究は、本発明者らの以前の臨床第ＩＩ／ＩＩＩ相および第ＩＩＩ相試験に登録された研究対象を含むが、これに限定されるわけではない。さらに、非救急の大手術を必要とする、ＣＳＬが支援するｒＩＸ−ＦＰ導入（lead-in）研究を以前に完了しなかった対象を登録してもよい。本研究終了後、導入研究からの対象は、ＣＳＬが支援するすべてのｒＩＸ−ＦＰ研究において登録中、少なくとも１００ｒＩＸ−ＦＰ曝露日数が蓄積されることが予想される。
【０１６３】
この延長研究は、対象が日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与されることになる約３年の予防処置期間からなる。最初の６ヵ月の期間中、対象は、以下の処置間隔を用いて投与されるｒＩＸ−ＦＰにより予防的処置を受ける：
・処置群１：７、１０または１４日毎に１回
・処置群２：７日毎に１回
・処置群３：７日毎に１回
【０１６４】
この最初の６ヵ月の期間の後、すべての対象は、さらなる約３０ヵ月間、７、１０、１４または２１日毎に１回投与されるｒＩＸ−ＦＰによる予防的治療を受けることになる。２１日の処置間隔に移る対象は、＞１８歳でなければならない。初めて２１日の処置間隔に移る任意の対象は、１４日の処置間隔による少なくとも６ヵ月の予防処置を完了しなければならず、かつ１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ単回投与による初回ＰＫ評価期間を受けなければならない。本研究中、対象は、研究者の裁量またはＣＳＬの要求でさらなるｒＩＸ−ＦＰ  ＰＫ評価を受けてもよい。
【０１６５】
非救急の大手術を必要とする処置群３の対象は、インクリメンタルリカバリーおよびＦＩＸ活性を決定するために最初のＰＫ評価（１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ）を受けることになる。次いで、これらの対象は、手術サブスタディを完了することになり、その後に予防処置期間を始めてもよい。２１日の処置間隔を用いる予防処置は、＞１８歳の年齢であり、かつ１４日の処置間隔で少なくとも６ヵ月の予防処置を完了した対象にのみ可能となる。対象が２１日の処置間隔から利益を受けてない場合、研究者の裁量で、任意の時に対象を７、１０または１４日の処置間隔に移すことができる。
【０１６６】
本研究は、意図する治療集団における免疫原性、血栓形成性、過敏症、および他のＡＥを含むすべての鍵となる安全性因子を報告することになる。
【０１６７】
したがって、本研究の付随するベネフィット・リスク評価は、本研究に登録された対象に対して許容されうる。
【０１６８】
２．研究目的およびエンドポイント
２．１  主要目的およびエンドポイント
２．１．１  主要目的
本研究の主要目的は、重度の血友病Ｂの対象においてＦＩＸに対する阻害物質の新たな症例によって測定されるようなｒＩＸ−ＦＰの安全性を評価することである。
２．１．２  主要エンドポイント
この延長研究に約３年参加した後、ＦＩＸに対する阻害物質を生じた対象の総数。
２．２  副次的目的およびエンドポイント
２.２.１  副次的目的
本研究の副次的目的は、以下の通りである：
・さまざまな処置間隔で投与したときのｒＩＸ−ＦＰ日常的な予防の有効性を評価すること。
・２つの異なる処置間隔でのｒＩＸ−ＦＰの日常的な予防の有効性およびオンデマンド処置に対するｒＩＸ−ＦＰの日常的な予防の有効性を比較すること。
・さらにｒＩＸ−ＦＰの安全性を評価すること。
２．２．２  副次的エンドポイント
・特発性処置出血および全処置出血に関する処置間隔による年間出血率（ＡＢＲ）。
・導入第ＩＩ／ＩＩＩ相研究の処置群２の対象に関して、本延長研究における１４日の日常的な予防処置間隔の間の特発性処置された出血のＡＢＲの比較。
・導入研究中のオンデマンドのみの処置。
・導入研究および本延長研究中の７日の処置間隔による以前の日常的な予防処置。
・対象につき月当たりのＩＵ／ｋｇとして表される日常的な予防中のｒＩＸ−ＦＰの消費。
２．３  探索的目的およびエンドポイント
２．３．１  探索的目的
本研究の他の探索的目的は、以下を含む：
・最大３年の期間にわたってさまざまな処置間隔で日常的な予防に用いたときにｒＩＸ−ＦＰの有効性をさらに評価すること。
・１００ＩＵ／ｋｇの用量でｒＩＸ−ＦＰのＰＫプロファイルを評価すること。
・１年のフォローアップ後、導入第ＩＩＩ相研究から小児対象のＱｏＬを記述すること。
【０１６９】
３．研究デザイン
３．１  研究デザインおよび理論的根拠
この多施設非盲検第３ｂ相研究は、血友病Ｂの対象における出血エピソードの日常的な予防およびオンデマンドの処置に対するｒＩＸ−ＦＰの長期的な安全性および有効性を調べることになる。対象は、第ＩＩ／ＩＩＩ相もしくは第ＩＩＩ相研究、または他のいずれかのＣＳＬが支援するｒＩＸ−ＦＰ研究を完了しており、かつすべての他の適格基準を満たした場合に本研究に参加する資格がある。さらに、ＣＳＬが支援するｒＩＸ−ＦＰ導入研究を以前に完了しなかった対象は、非救急の大手術を必要とし、かつ他の全ての適格基準を満たす場合、本研究に参加する資格があってもよい。
【０１７０】
３．１．１  日常的な予防：最初の６ヵ月
処置群１：すべての導入研究からの対象
最初の６ヵ月の間、処置群１の対象には、導入研究中と同じ処置間隔を用いるか、または研究者の決定に従って７、１０もしくは１４日の異なる処置間隔を用いるかのいずれかで日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与する。投与されるｒＩＸ−ＦＰの用量（３５〜７５ＩＵ／ｋｇ）は、ｒＩＸ−ＦＰ治療および／またはＦＩＸトラフ活性に対する対象の以前の反応（第４．１．１節参照）ならびに第３．２．１．３の用量ガイドラインに基づく。
処置群２
７日の処置間隔でｒＩＸ−ＦＰ予防治療による≧２６週間の経験を有する、導入第ＩＩ／ＩＩＩ相研究の処置群２からの対象。
最初の６ヵ月の間、この処置群の対象には、１４日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰ（７５ＩＵ／ｋｇ）を投与する。
処置群３
手術サブスタディ（surgery substudy）の完了後、処置群３の対象は、主要研究で予防処置期間を開始してもよい。最初の６ヵ月の間、対象には、７日の処置間隔を用いて予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与する。投与されるｒＩＸ−ＦＰの用量（３５〜５０ＩＵ／ｋｇ）は、対象のＦＩＸトラフ活性（第４．１．１参照）に基づく。
【０１７１】
３．１．２  日常的な予防：６〜３６ヵ月
最初の６ヵ月の処置期間の完了後、すべての対象（すなわち、処置群１、２および３）には、本研究の残りの間、７、１０または１４日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与することになる。以前の６ヵ月間に７日の処置間隔を用いていた、導入第ＩＩ／ＩＩＩ相研究処置群２からの対象は、少なくとも６ヵ月間、１４日の処置間隔へ切り替えることになる。
対象は、６〜３６ヵ月の研究と同じ処置間隔を用いてもよいし、またはその後の６ヵ月のフォローアップ来院のいずれかで研究者と相談して処置間隔を変えてもよい（第３．２．１．２参照）。投与されるｒＩＸ−ＦＰの用量は、３５〜７５ＩＵ／ｋｇとなる（第４．１．１参照）。
≧１８歳の対象には、１００ＩＵ／ｋｇの用量で２１日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与してもよい。＜１８歳の対象は、２１日の処置間隔を用いることは認められない。
初めて間隔を２１日の処置に移す対象は、１４日の処置間隔で少なくとも６ヵ月の予防処置を完了し、かつ１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰでＰＫ評価を受けなければならない（第３．１．３節参照）。
【０１７２】
３．１．３  ｒＩＸ−ＦＰ（１００ＩＵ／ｋｇ）の薬物動態評価
１）対象が処置群３である、または２）対象が、初めて２１日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰの投与を開始しようとしている、いずれかの場合、対象は、ｒＩＸ−ＦＰ（１００ＩＵ／ｋｇ）の単回投与によるＰＫ評価を受けなければならない。ＰＫ評価は、現在市販のＦＩＸ製剤（処置群３）に関して少なくとも４日またはｒＩＸ−ＦＰに関して少なくとも１４日のいずれかのウオッシュアウト期間の後に実施しなければならない。ＰＫ評価のためのサンプルは、ｒＩＸ−ＦＰの投与前、注射終了３０分後（ピークＦＩＸ活性レベルおよびインクリメンタルリカバリーを評価するため）、および注射後の指定された時点で集めることになる。
研究者は、研究者の裁量またはＣＳＬの要求で、ｒＩＸ−ＦＰ（導入研究からの対象に関して）による外科的予防を開始する前の選択された時点で、または（限定されるわけではないが）劣った有効性もしくは阻害物質発生の疑いが生じた場合、５０、７５または１００ＩＵ／ｋｇ（必要に応じて）のｒＩＸ−ＦＰのＰＫ評価を完了することを選択してもよい。
【０１７３】
３．２  用量および投与レジメン
３．２．１  日常的な予防処置
３．２．１．１  ｒＩＸ−ＦＰ処置間隔
本研究の最初の６ヵ月の間、対象またはその介護者は、以下の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与することになる：
・処置群１：７、１０または１４日
・処置群２：７または１４日
・処置群３：７日
【０１７４】
処置群１の対象に関して、処置間隔は、対象の以前の経験（すなわち、導入研究中）および対象の好みに基づいて研究の開始時に研究者によって選択される。処置群２の対象に関して、処置間隔は、導入研究中の対象の予防処置の持続時間に基づく；導入研究中、少なくとも２６週間の予防処置を完了した対象には１４日の処置間隔が割り付けられることになり、導入研究中、少なくとも２６週間の予防処置を完了しなかった対象には７日の処置間隔が割り付けられることになる。少なくとも２６週間の予防処置の全体（すなわち、導入研究および本研究中）を７日の処置間隔で開始および完了した処置群２の対象は、次いで、少なくとも６ヵ月間１４日の処置間隔へ切り替えなければならない。
【０１７５】
外科サブスタディの終了後、処置群３の対象は、主要研究で予防処置期間を開始してもよい。最初の６ヵ月の間、この処置群の対象には、７日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与することになる。投与されるｒＩＸ−ＦＰの用量（３５〜５０ＩＵ／ｋｇ）は、対象のＦＩＸトラフ活性（第４．１．１参照）に基づく。最初の６ヵ月の期間の終わりに、対象は、現在の処置を用いたままであってもよいし、または７、１０もしくは１４日の処置間隔に切り替えてもよい。≧１８歳の対象は、１４日の予防レジメンおよび１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ  ＰＫ評価期間の少なくとも６ヵ月を完了した後、２１日の処置間隔に切り替えてもよい（第３．１．３節参照）。
【０１７６】
３．２．１．２  ｒＩＸ−ＦＰ処置間隔の変更
処置期間の各６ヵ月の間、対象の安全性に関して研究者が必要とみなさなければ、処置間隔は変えるべきではない。各６ヵ月の期間の終わりに（すなわち、６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月および３０ヵ月のフォローアップ来院時に）、研究者は、有効性／安全性の評価、対象処置のコンプライアンス、および／または対象の好みに基づいて処置間隔の変更を選択してもよい。
【０１７７】
３．２．１．３  ｒＩＸ−ＦＰ用量
日常的な予防のために投与されるｒＩＸ−ＦＰの用量は、対象の以前の経験（すなわち、導入研究中）および／または目標となるＦＩＸ活性トラフレベル（目標ＦＩＸ活性レベル＞２％、しかし、最適には５〜１５％の間）に基づく。日常的な予防のためのｒＩＸ−ＦＰの最大用量は、特定の対象に関してより高い用量がＣＳＬによって承認されなければ、７日の処置間隔を用いる対象に関しては注射当たり５０ＩＵ／ｋｇ、１０または１４日の処置間隔を用いる対象に関しては注射当たり７５ＩＵ／ｋｇとなる（表６）。ｒＩＸ−ＦＰの用量は、２１日の処置間隔を用いる対象に関しては注射当たり１００ＩＵ／ｋｇとなる（表６）。すべての処置間隔に関して、２８日の期間にわたって日常的な予防のために投与されるｒＩＸ−ＦＰの全用量は、ＣＳＬからの承認がなければ２５０ＩＵ／ｋｇを超えないことになっている。
【０１７８】
【表７】
2017502036.tif 000009
【０１７９】
４．投与および管理
４．１  投与および管理
研究者（または代行者）は、本研究プロトコールで提示された手順に従って本研究に含まれる対象またはその介護者にのみｒＩＸ−ＦＰを与薬または施与する。対象もしくはその介護者または資格を与えられた研究要員がボーラスＩＶ注射としてｒＩＸ−ＦＰを管理することになる。
用量計算を行うとき、実際の全単位（すなわち、処方された用量当たりとして）を、可能ならば、目標の十分なバイアル（実際のＩＵとして）に四捨五入してもよいが、しかし、最終的な用量は、処方された用量の１０％以内である必要がある。ｒＩＸ−ＦＰの用量は、ｅＣＲＦに記録された対象の最近の体重に基づく。
【０１８０】
４．１．１  予防処置の用量の調整
予防に必要なｒＩＸ−ＦＰの用量は、対象の以前の経験および／または目標ＦＩＸ活性に基づく。以下の式は、ピークで必要なＦＩＸ活性に基づいて用量を算出するために用いることになる：
【数２】
2017502036.tif 000010
【０１８１】
日常的な予防の目標トラフＦＩＸ活性は、２％を超えるが、しかし、最適には、ベースラインの５〜１５％上である。
【０１８２】
５．薬物動態および薬力学
５．１  薬物動態分析
５．１．１  トラフ第ＩＸ因子活性レベル
本研究中、トラフＦＩＸ活性レベルの評価のため、各主要な出血エピソード（実行可能である場合）および明記されたフォローアップ来院時に血液サンプルを採取することになる。
５．１．２  ｒＩＸ−ＦＰの薬物動態評価
さらに、初めて２１日の処置間隔を用いて日常的な予防処置を開始する対象および処置群３の対象は、ｒＩＸ−ＦＰ（１００ＩＵ／ｋｇ）の単回注射によりＰＫ評価を受ける。このＰＫ評価では、ＦＩＸ活性レベルの測定のため、注射後の（必要なまたは場合による）以下の時点で血液サンプルを採取することになる：
・３０±５分
・７２±２４時間（すなわち、３±１日）
・１６８±２４時間（すなわち、７±１日）
・３３６±２４時間（すなわち、１４±１日）
・５０４±２４時間（すなわち、２１±１日）
ＰＫ評価期間中、対象が出血エピソードを経験した場合、出血エピソードを処置するかどうかにかかわらず、ＰＫ評価の一部として、さらなる血液サンプルを採取しないことにする。ＰＫは、繰り返す必要があってもよいし、または必要がなくてもよい。
また、（限定されるわけではないが）劣った有効性、阻害物質発生の疑いが生じた場合、または大手術の前に、５０、７５または１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのＰＫ評価（選択時点で）を、研究者の裁量またはＣＳＬの要求で評価してもよい。
インクリメンタルリカバリーおよびＦＩＸ活性を報告することになる。適当であるとみなされる場合、さらなるＰＫパラメータ（例えば、ＡＵＣ、ｔ１／２）を算出してもよい。
【０１８３】
〔実施例３〕血友病Ｂの対象における２１日の投与間隔による組換え凝固第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）の第３ｂ相研究
≧１８歳の対象には、１００ＩＵ／ｋｇまでの用量で２１日の処置間隔を用いて日常的な予防としてｒＩＸ−ＦＰを投与してもよい。最初に、対象は、少なくとも１４日のｒＩＸ−ＦＰウオッシュアウト期間後、ｒＩＸ−ＦＰ（１００ＩＵ／ｋｇ）の単回注射によるＰＫ評価期間を受けなければならない。２１日の処置レジメンに参加するためには、以下の基準は満たされなければならない：
１．少なくとも１８歳の対象
２．第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相研究の１４日の処置間隔レジメンにおいて少なくとも６ヵ月のｒＩＸ−ＦＰによる日常的な予防の完了
３．１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの２１日の薬物動態評価の完了
さらに、研究者は、間隔処置を変更する前に、以下を評価しなければならない：
１．有効性および安全性
２．対象処置コンプライアンス
３．対象の好み
【０１８４】
したがって、２１日の処置レジメンに適格な対象は、少なくとも１年間の日常的な予防をしていることになる（導入研究の少なくとも６ヵ月に対する７日の処置間隔、および導入研究または３００１研究の１４日の処置間隔）。１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのＰＫが完了したのちに、対象はより長い処置間隔へ切り替えることができるようになり、その用量で予防を開始する２１日前に対象のトラフレベルの評価が可能となる。
【０１８５】
凝固因子レベル＞１ＩＵ／ｄｌ（＞１％）の中等度の血友病患者はめったに特発性出血を経験することがなく、関節機能をかなりより良好に保っているという観察から予防を考えた。したがって、ＦＩＸ補充療法の代替有効性評価として１％上のＦＩＸ活性レベルを維持する予防レジメンを再検討する。２件の完了したｒＩＸ−ＦＰ臨床研究からのＰＫデータに基づくＰＫモデリングは、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの投与後２１日目に、研究対象の６８％は、ベースラインの２％上のＦＩＸ活性を有してもよく、対象の９５％は、ベースラインの１％上のＦＩＸ活性を有してもよいことを示す、また図７参照。
【０１８６】
【表８】
2017502036.tif 000011
【０１８７】
完了した第ＩＩ相／ＩＩＩ研究の１つでは、ＰＫモデリングと一致して、２名の研究対象が１４日目を越えて５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ  ＰＫ評価に参加している：５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ注射の２１日後に、１名の対象は、１９日目でベースラインの２．１％上のＦＩＸ活性レベル（ｒＩＸ−ＦＰより前のＦＩＸ活性）を有し、もう１名の対象は、ベースラインの１．７％上のＦＩＸ活性レベルを有した。
【０１８８】
血友病の多くの患者が１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ注射２１日後に１％上のトラフレベルを有することになり、２１日の予防レジメンの候補となりうることは望ましい。それにもかかわらず、最適な処置レジメンは、処置間隔を選択するときに重要な判定因子となりうる臨床結果（例えば臨床反応、対象の身体活動、出血頻度、関節の状態、クオリティオブライフまたはより高いトラフを有することが望まれる）を組み込まなければならない。
【０１８９】
１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ投与レジメンによる研究を血友病を有する５名の患者で実施した。ＦＩＸ活性（％でのＩＵ／ｄＬ）は、０時間、０，５時間、７２時間（３日）、１６８時間（７日）、３３６時間（１４日）および５０４時間（２１日）後に測定した。予防レジメンは、１００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ注射２１日目に少なくとも４．１％のＦＩＸ活性を示す。結果を下の表８にまとめる。
【０１９０】
【表９】
2017502036.tif 000012
【０１９１】
経時的なＦＩＸ活性値（％でのＩＵ／ｄＬ）のプロットを図８に示す。５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ投与レジメンを適用したとき、および５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ(R)）を適用したとき、対応する値によるこれらの値の比較を図９に示す。
【０１９２】
この第３ｂ相研究は、２つの第ＩＩＩ相登録研究、または他のいずれかのＣＳＬが支援するｒＩＸ−ＦＰ導入研究に参加した対象における日常的な予防のためのｒＩＸ−ＦＰの長期的な安全性および有効性を評価することを目的とする。本研究終了後、対象は、すべてのＣＳＬが支援するｒＩＸ−ＦＰ研究に登録中に少なくとも１００ＦＩＸ−ＦＰ曝露日数（ＥＤ）が蓄積されていることが予想される。本発明者らは、患者およびその医師が選択しうるレジメンを含むより柔軟性な予防レジメンを可能にしようとしている。
【０１９３】
〔実施例４〕集団ＰＫモデリング
血友病Ｂの対象における集団ＰＫを特徴づけるため、変動性およびＰＫ変動性の潜在的決定因子（人口統計学的および臨床的共変量）を確定するため、かつさまざまな投与シナリオの単回および定常状態ＦＩＸ活性−時間プロファイルをシミュレーションするため、以前の臨床試験からＰＫデータに基づいて、血友病Ｂの対象の組換え第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質の集団薬物動態分析を実施した。
【０１９４】
２５ＩＵ／ｋｇ、５０ＩＵ／ｋｇまたは７５ＩＵ／ｋｇの単回投与後、ＦＩＸ活性が１％、３％および５％上のトラフレベルでどれくらい維持されるかを決定するためシミュレーションを実施した。結果を表９ａにまとめる。
【０１９５】
【表１０】
2017502036.tif 000013
【０１９６】
シミュレーションされた定常状態トラフ外因性ＦＩＸ活性レベルを、多くの投与レジメンに関して表９ｂにまとめる。
【０１９７】
【表１１】
2017502036.tif 000014
【０１９８】
【表１２】
2017502036.tif 000015
【０１９９】
〔実施例５〕血友病Ｂの対象において組換え凝固第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）の第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床研究で観察されたＦＩＸ活性レベル
この第ＩＩ／ＩＩＩ相研究は、ｒＩＸ−ＦＰの有効性、薬物動態および安全性を評価するための非盲検研究であり、これは先天性第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損（血友病Ｂ）を有する患者における出血エピソードの予防（本研究の処置群１）および処置（本研究の処置群２）のために開発された。本研究は、１ヵ月未満のスクリーニング期間、１４日の薬物動態（ＰＫ）評価期間、続いてｒＩＸ−ＦＰによる約１４ヵ月の安全性および有効性の評価期間からなる。
【０２００】
本研究の開始時にｒＩＸ−ＦＰの十分なＰＫを評価した。さらに、本研究の開始時に、対象のサブセットにおいて、以前のＦＩＸ製剤（血漿由来または組換え）の薬物動態（ＰＫ）を評価した。両研究処置群、予防処置群およびオンデマンド処置群を含む本研究のフローチャートを図１１に示す。
【０２０１】
予防対象（処置群１）：
約４０名の対象は、１４ヵ月の予防処置期間を開始したが、それは２つの部分からなり、対象はｒＩＸ−ＦＰの１つまたは２つの処置レジメンを受けた。最初に、３５〜５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの予防的用量で対象を処置し、投与間で１％上のトラフＦＩＸ活性レベルを維持することを目標として、プロトコールに定められた通り、用量を最大７５ＩＵ／ｋｇまで調整した。７日の処置間隔は、本研究の第１の区分（２６〜３０週）の間、維持された。本研究の第２の半分の間、対象の一部は、ｒＩＸ−ＦＰの７５ＩＵ／ｋｇの用量で少なくとも３０週間、１０または１４日の処置間隔による予防的治療レジメンに切り替えられた。
【０２０２】
第ＩＩ相／第ＩＩＩ相研究の結果は、ｒＩＸ−ＦＰに関する優れた安全性プロファイルを示した。ＦＩＸ阻害物質、ｒＩＸ−ＦＰ抗体またはＣＨＯ宿主細胞タンパク質抗体を生じた対象はいなかった。有害反応は対象の７．９％でしか報告されず、アナフィラキシーは観察されなかった。結論として、ｒＩＸ−ＦＰは、出血エピソードの管理および予防、日常的な予防ならびに周術期の予防に有効である。
【０２０３】
本発明のｒＩＸ−ＦＰを用いることにより、以前のＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ(R)）の毎月の用量を比較したとき、月当たりＦＩＸ消費が低減される、表１０参照。５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの１０または１４日の投与間隔を適用するとき、毎月の消費はさらにいっそう低減され、これは本発明のｒＩＸ−ＦＰの高い安定性を示す。
【０２０４】
【表１３】
2017502036.tif 000016
【０２０５】
オンデマンド対象（処置群２）：
約２５名のオンデマンド対象が本研究に登録し、それは、１ヵ月のスクリーニング期間、約２６週間のオンデマンド処置（出血エピソードの後、ｒＩＸ−ＦＰを受けるだけ）、続いてｒＩＸ−ＦＰによる毎週の予防的治療からなる。オンデマンド処置の年間出血率を予防的処置と比較した。
【０２０６】
本研究中、対象は、ＦＩＸ活性レベル試験を含む評価のため、研究施設を４±１週間毎に訪れた。したがって、本発明者らは本研究の全体を通してＦＩＸ活性レベルを集めることができる。
【０２０７】
オンデマンド対象の大多数は、1ヵ月につき１回を超える処置（出血のため）を必要とした。しかし、オンデマンドの対象の２名は、処置間が１ヵ月より長く、以前のｒＩＸ−ＦＰ処置から２８日でＦＩＸ活性の試験が可能であった（表１１）。
【０２０８】
【表１４】
2017502036.tif 000017
【０２０９】
凝固因子レベル＞１ＩＵ／ｄｌ（＞１％）の中等度の血友病患者はめったに特発性出血を経験することがなく、関節機能をかなりより良好に保っているという観察から予防を考えた。したがって、１％上のＦＩＸ活性レベル（血漿レベル）を維持する予防レジメンは、ＦＩＸ補充療法を目標としている。この予備データは、ｒＩＸ−ＦＰの５０または１００ＩＵ／ｋｇより高い用量が、血友病の対象においてｒＩＸ−ＦＰ注射後２８日目にベースラインの１％上のＦＩＸ活性を立証するのに十分でありうることを示しており、それは、毎月の投与間隔が実行可能でありうることを意味している。
【０２１０】
完了したｒＩＸ−ＦＰ第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床研究からのＰＫデータに基づくＰＫモデリングを実施し、入手可能なＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭに基づくデータを対応するＰＫモデル化データと比較した。
【０２１１】
完了したｒＩＸ−ＦＰ第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床研究からのＰＫデータに基づくＰＫモデリングは、３３．３３ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰによる毎週の投与間隔で、研究対象の５０％がベースラインの１０％上のＦＩＸ活性のトラフを有したことを示した、図１２Ａ（左）参照。ＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭのＰＫ動的データに基づいて類似のＰＫモデリングを実施した。５０ＩＵ／ｋｇのＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭの毎週の投与間隔を適用したとき、研究対象の５０％は、ベースラインの２％上のＦＩＸ活性のトラフを有した、図１２Ａ（右）参照。
【０２１２】
完了したｒＩＸ−ＦＰ第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床研究からのＰＫデータに基づく別のＰＫモデリングは、５０．０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰによる１０日の投与間隔で研究対象の５０％がベースラインの７．５％上のＦＩＸ活性のトラフを有したことを示した、図１２Ｂ（左）参照。ＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭのＰＫ速度データに基づいて類似のＰＫモデリングを実施した。１００ＩＵ／ｋｇのＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭにより１０日毎の投与間隔を適用したとき、研究対象の５０％は、ベースラインの２％上のＦＩＸ活性のトラフを有した、図１２Ｂ（右）参照。
【０２１３】
完了したｒＩＸ−ＦＰ第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床研究からのＰＫデータに基づくさらに別のＰＫモデリングは、７５．０ＩＵ／ｋｇによる１４日の投与間隔で研究対象の５０％がベースラインの５％上のＦＩＸ活性のトラフを有したことを示した、図１２Ｃ（左）参照。ＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭのＰＫ速度データに基づいて類似のＰＫモデリングを実施した。１００ＩＵ／ｋｇのＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭによる１０日毎の投与間隔を適用したとき、研究対象の５０％は、ベースラインの２％上のＦＩＸ活性のトラフを有した、図１２Ｃ（右）参照。
【０２１４】
〔実施例６〕５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰまたはｒＩＸ−Ｆｃ（ＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭ）をヒト対象に投与した後、ヒト血漿から得たｒＩＸ−ＦＰまたはｒＩＸ−Ｆｃ（ＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭ）の濃度減衰データから誘導されたＰＫパラメータ
約２８名の対象に、５０ＩＵ／ｋｇの用量のｒＩＸ−ＦＰを注射した。ヒト血漿中のｒＩＸ−ＦＰの活性を経時的に測定した。ｒＩＸ−ＦＰの減衰動態を分析し、そこから表１２に示した薬物動態パラメータを決定した。特に、表１２は、相加平均値および薬物動態パラメータの対応する変動係数（ＣＶ）を示す。
【０２１５】
表１２に示すｒＩＸ−Ｆｃ（ＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭ）の薬物動態パラメータは、ＡｌｐｒｏｌｉｘＴＭのＦＤＡ処方情報に開示されたように２２名の患者による研究から誘導される。
【０２１６】
【表１５】
2017502036.tif 000018
【０２１７】
上のデータによれば、ｒＩＸ−Ｆｃ（ＡＬＰＲＯＬＩＸＴＭ）と比較したときに、ｒＩＸ−ＦＰは、約３．８倍高いＡＵＣ０−ｉｎｆ、約３．７倍低減されたＣｌ／ＢＷ、約２６％高いインクリメンタルリカバリー、約３．２倍少ない分布容積、および約１９％増加した薬物平均滞留時間を有する。これらのＰＫ値は、本発明の第ＩＸ因子融合タンパク質（ｒＩＸ−ＦＰ）の改善された活性および安定性を示す。
【図１】
2017502036.tif 000019
【図２】
2017502036.tif 000020
【図３】
2017502036.tif 000021
【図４】
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【図５】
2017502036.tif 000023
【図６】
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【図７】
2017502036.tif 000025
【図８】
2017502036.tif 000026
【図９】
2017502036.tif 000027
【図１０−１】
2017502036.tif 000028
【図１０−２】
2017502036.tif 000029
【図１０−３】
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【図１０−４】
2017502036.tif 000031
【図１０−５】
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【図１１】
2017502036.tif 000033
【図１２−１】
2017502036.tif 000034
【図１２−２】
2017502036.tif 000035
【図１２−３】
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【配列表】
2017502036000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月15日(2016.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予防的投与レジメンで対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質であって、該ＦＩＸが、凝固に関与するかまたは凝固酵素によって活性化される、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端に結合され、そして該融合タンパク質が毎週約１回の投与間隔で約２５〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で対象に静脈内投与される、上記融合タンパク質。
【請求項２】
前記用量が約３５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記用量が約２５〜４０ＩＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記用量が約４０、４５または５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記投与間隔が７日毎に約１回である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約１％上、少なくとも約２％上、または５〜１５％上のトラフを維持する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
予防的投与レジメンで対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質であって、該ＦＩＸが、凝固に関与するかまたは凝固酵素によって活性化される、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端に結合され、そして該融合タンパク質が１０〜１４日毎に約１回の投与間隔
で約５０〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で対象に静脈内投与される、上記融合タンパク質。
【請求項８】
前記投与間隔が１４日毎に約１回である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記用量が約７５ＩＵ／ｋｇ、および前記投与間隔が１４日毎に約１回である、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
予防的投与レジメンで対象において出血を予防する方法に使用するための、
ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質であって、該ＦＩＸが、凝固に関与するかまたは凝固酵素によって活性化される、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端に結合され、そして該融合タンパク質が３週間毎に約１回またはより長期投与間隔で約９０〜２５０ＩＵ／ｋｇの用量で対象に静脈内投与される、上記融合タンパク質。
【請求項１１】
前記用量が約１００ＩＵ／ｋｇである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＦＩＸの血漿レベルが、全投与間隔中、ベースラインの少なくとも約２〜４％上のトラフを維持する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記投与間隔が２１日毎に約１回である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＦＩＸがヒトＦＩＸである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーがＦＩＸａによって、および／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記リンカーが、配列番号：２および配列番号：３から選択される配列を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質の配列が、配列番号：１に記載された配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質の配列が、配列番号：１の配列を有する、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記対象がヒトである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ヒトが血友病Ｂを患っている、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、約１００〜４００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与するために提供される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【国際調査報告】
2017502036.tif 000037
2017502036.tif 000038
2017502036.tif 000039
2017502036.tif 000040