(57)【要約】  本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ＡＡＶベクターの産生のための産生細胞株、及びそのようなベクターを産生する方法に関する。より詳細には、本発明は、前記ベクターの力価を増加するよう適合された産生細胞株、及び前記産生細胞株を用いてＡＡＶベクターを産生する方法に関する。
2017506885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が、対照産生細胞株と比較して調節されている、トランスジェニック産生細胞株。
【請求項２】
（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＹＢ１及びＮＰＭ１、（iii）ＹＢ１及びＮＣＬ、又は（iv）ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現が、対照産生細胞株と比較して調節されている、請求項１に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項３】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が、対照産生細胞株と比較して低下している、請求項１又は２に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項４】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを用いて低下している、請求項３に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項５】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ｓｈＲＮＡを用いて低下しており、好ましくは、
（ａ）ＹＢ１発現が、配列番号１４〜１８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（Ｙ１〜Ｙ５）を用いて低下しており；
（ｂ）ＮＰＭ１発現が、配列番号４〜８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）を用いて低下しており；及び／又は
（ｃ）ＮＣＬ発現が、配列番号９〜１３のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）を用いて低下している、
請求項４に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項６】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いて低下している、請求項４に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項７】
ＹＢ１の発現が、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び／又は配列番号３９と４０から選択されるｇＲＮＡペアを用いて低下している、請求項６に記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項８】
表２に列挙された１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現が、対照産生細胞株と比較して調節されている、請求項１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項９】
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞株である、請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック産生細胞株。
【請求項１０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生するための方法であって、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が調節されている産生細胞株においてアデノ随伴ウイルスを培養するステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
産生細胞株における（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＹＢ１及びＮＰＭ１、（iii）ＹＢ１及びＮＣＬ、又は（iv）ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現が調節されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現の調節が、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現の低下である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを用いて低下している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ｓｈＲＮＡを用いて低下しており、好ましくは、
（ａ）ＹＢ１発現が、配列番号１４〜１８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（Ｙ１〜Ｙ５）を用いて低下しており；
（ｂ）ＮＰＭ１発現が、配列番号４〜８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）を用いて低下しており；及び／又は
（ｃ）ＮＣＬ発現が、配列番号９〜１３のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）を用いて低下している、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いて低下している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＹＢ１の発現が、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び／又は配列番号３９と４０から選択されるｇＲＮＡペアを用いて低下している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表２に列挙された１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現が、産生細胞株において調節されている、請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＡＡＶベクターの力価が、対照方法によって産生されたＡＡＶベクターの力価と比較して、少なくとも２倍増加している、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比が、対照方法によって産生された完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比と比較して、少なくとも２０％増加している、請求項１０〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
産生細胞株がヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞株である、請求項１０〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＡＡＶベクターの血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８である、請求項１０〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれかに記載の産生細胞株から得られる、又は請求項１０〜２１のいずれかに記載の方法によって得られる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの集団。
【請求項２３】
集団における完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比が、対照方法により産生された集団における完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比と比較して、少なくとも２０％増加している、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８血清型ベクターである、請求項２２又は２３に記載の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ，adeno-associated viral）ベクター、ＡＡＶベクターの産生のための産生細胞株、及びそのようなベクターを産生する方法に関する。より詳細には、本発明は、前記ベクターの力価を増加するように適合された産生細胞株、及び前記産生細胞株を用いてＡＡＶベクターを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、野生型ＡＡＶがいかなるヒト疾患にも関連したことがないため、優れた安全性プロフィールを有する。したがって、ＡＡＶは、遺伝子治療にとってポピュラーで、かつ成果を挙げたベクターである。ＡＡＶベクターは、血友病Ｂ、心臓疾患、及び先天性盲を含む多くの種々の状態についての臨床試験において幅広く研究されている。加えて、最初のＥＵ認可された遺伝子治療薬である、Glyberaは、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ，familial lipoprotein lipase deficiency）の処置のためのＡＡＶベクターに基づいており、遺伝子治療におけるＡＡＶベクターの潜在能力を例示している。
【０００３】
ＡＡＶベクター設計において多くの進歩があったが、既存の免疫応答などの障壁により、臨床効果を達成するために、高力価ＡＡＶの投与、及び、多くの場合、免疫抑制の併用投与が必要とされている。これは、ＡＡＶ産生においてかなりの難題を提示し、かつＡＡＶベクターの臨床的使用における考慮すべき安全性の意味合いを含む。
【０００４】
ＡＡＶベクターは、最も一般的には、ＡＡＶプラスミド、及びアデノウイルスなどの別のウイルスに由来したヘルパープラスミドの一過性同時トランスフェクションにより産生される。臨床開発を支援するためにＡＡＶのラージスケール生産及び頑強な精製において最近、かなりの進展があった。しかしながら、高力価ＡＡＶの産生はまだかなりの難題であり、所望の用量を達成するのに患者がベクターの反復投与を受けることを必要とする。例えば、Glyberaについて、ベクターを３×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で、４０回又は６０回の複数回の注射を通して投与することが必要とされる。
【０００５】
さらに、現在の精製方法の結果として、ＡＡＶ産物は、典型的には、高レベルのタンパク質凝集物、又はベクターＤＮＡを欠く不完全にパッケージングされた空カプシドを含有する。最終産物における空カプシドは、しばしば、完全粒子のレベルの４０倍ほどもあり得る。これらの不純物は、患者において望ましくない免疫応答を引き起こし得る。例えば、最近の研究により、高用量のベクター投与後、インビボで、マウス及びヒトにおける細胞性免疫応答がＡＡＶ２カプシド内のエピトープに対して向けられ、かつ空カプシドの存在が肝細胞形質導入を阻害することが示されている。空カプシドの望ましくない免疫原性の潜在的な有害作用は、製造物の安全性及び効力を損なう。
【０００６】
治療機能をもたない空カプシドの既知方法による除去は、ベクターＤＮＡを含有する完全粒子とのそれらの粒子サイズ、親和性、及びタンパク質組成の生来の類似性により困難である。完全粒子を含有するゲノムから空ＡＡＶカプシドを分離するために継続的な努力がなされてきた。空粒子を含まないＡＡＶ２が、示差的ＣＨＣｌ３により達成されている。しかしながら、スケールアップ生産及びＧＭＰ製造においてこの方法を用いることは問題があり得る。イオン交換クロマトグラフィーもまた、ＡＡＶ２、４、５、及び８における空カプシドの分離について報告されている。しかしながら、２０％から最高３０倍までの空カプシドが、最終産物に残っていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、最終産物において空カプシドの存在を減少させ、又は排除するＡＡＶベクター産生の新しい方法を開発する必要性がある。これは、ＡＡＶ産物の安全性及び効力を向上させるだろう。空粒子の低減はまた、高力価産生におけるハードルを乗り越えさせるだろう。
【０００８】
ＡＡＶベクター産生における２つの型の粒子の形成に寄与する細胞の因子及びウイルスの因子はまだほとんど知られていない。一般的に、ウイルスは、それらのゲノムをタンパク質カプシド内へ、構造タンパク質のウイルスゲノムとの会合によるか、又はウイルスゲノムの、あらかじめ構築されたカプシド内への挿入によるかのいずれかでパッケージングする。ＡＡＶは、あらかじめ構築されたカプシド内へそれらのゲノムをパッケージングすることが知られている。ウイルスＤＮＡの効率的な挿入に特定のアミノ酸相互作用が必要とされることが報告されており、ＡＡＶカプシドタンパク質の単一アミノ酸変異及び全体の立体構造変化が、結果として、ＡＡＶゲノムのパッケージングの欠損を生じることが示されている。産生細胞タンパク質全体とＤＮＡヘリカーゼがＡＡＶ構築に必要とされることを示す、ＡＡＶ構築における細胞タンパク質の関与に関する研究もまた非常に限定されている。しかしながら、ＡＡＶ  ＤＮＡがカプシド内へ挿入される実際の機構は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＡＡＶ構築における細胞タンパク質の役割をより良く理解し、最終的には、ＡＡＶ産物の安全性及び品質を向上させるために、本発明者らは、ＡＡＶベクターにおいて同時産生され、かつ同時精製される宿主細胞タンパク質を分析している。特に、本発明者らは、３つのＡＡＶ血清型：ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８において、空カプシドと完全ベクターとの間でのタンパク質組成の最初の系統的分析及び比較を行っている。本発明者らは、異なる血清型間にいくつかの著しい違いがあるが、３つのＡＡＶ血清型の間に内因性類似性を実証している。重要なことには、本発明者らは、空カプシドと完全ベクターとの間に有意な違いがあることを初めて実証した。最後に、本発明者らは、ＡＡＶ産物に本質的に会合しているいくつかの宿主細胞タンパク質を同定している。特に、本発明者らは、宿主細胞タンパク質ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬがＡＡＶ産物中に見出されること、並びにこれらの宿主細胞タンパク質の発現の調節がＡＡＶベクター粒子の産生に影響することを実証している。
【００１０】
したがって、本発明は、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が、対照産生細胞株と比較して調節されているトランスジェニック産生細胞株を提供する。典型的には、（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＹＢ１及びＮＰＭ１、（iii）ＹＢ１及びＮＣＬ、又は（iv）ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現が、対照産生細胞株と比較して本発明の産生細胞株において調節されている。
【００１１】
好ましい実施形態において、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が、対照産生細胞株と比較して低下しており、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，double stranded RNA）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small interfering RNA）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ，small hairpin RNA）、ミクロＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを用いて低下し得る。典型的には、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現は、ｓｈＲＮＡを用いて低下しており、好ましくは、ＹＢ１発現が、配列番号１４〜１８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（Ｙ１〜Ｙ５）を用いて低下しており、ＮＰＭ１発現が、配列番号４〜８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）を用いて低下しており、及び／又はＮＣＬ発現が、配列番号９〜１３のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）を用いて低下している。ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いて低下し得る。一実施形態において、ＹＢ１の発現は、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び／又は配列番号３９と４０から選択されるｇＲＮＡペアを用いて低下している。
【００１２】
本明細書における表２に列挙された１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現もまた、対照産生細胞株と比較して、本発明の産生細胞株において調節され得る。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック産生細胞株は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞株である。
【００１４】
本発明はまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生するための方法であって、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つの発現が調節されている産生細胞株においてアデノ随伴ウイルスを培養するステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
典型的には、産生細胞株における（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＹＢ１及びＮＰＭ１、（iii）ＹＢ１及びＮＣＬ、又は（iv）ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現が、本発明の方法により調節されている。好ましくは、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬ発現の調節は、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬ発現の低下であり、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬ発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを用いて低下している。典型的には、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬ発現は、ｓｈＲＮＡを用いて低下しており、好ましくは、ＹＢ１発現が、配列番号１４〜１８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（Ｙ１〜Ｙ５）を用いて低下しており、ＮＰＭ１発現が、配列番号４〜８のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）を用いて低下しており、及び／又はＮＣＬ発現が、配列番号９〜１３のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）を用いて低下している。ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いて低下し得る。一実施形態において、ＹＢ１の発現は、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び／又は配列番号３９と４０から選択されるｇＲＮＡペアを用いて低下している。
【００１６】
表２に列挙された１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現もまた、本発明の方法に用いられる産生細胞株において調節され得る。
【００１７】
本発明の方法は、対照方法により産生されるＡＡＶベクターの力価と比較して少なくとも２倍、ＡＡＶベクターの力価を増加し得、及び／又は本発明の方法は、対照方法により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比と比較して、少なくとも２０％、完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を増加させ得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明の方法に用いられるトランスジェニック産生細胞株は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞株である。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及び／又はＡＡＶ８血清型ＡＡＶベクターを産生する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の産生細胞株及び／又は本発明の方法から得られるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの集団を提供する。好ましくは、本発明の集団における完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比は、対照方法により産生される集団における完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比と比較して、少なくとも２０％増加している。好ましくは、本発明のＡＡＶベクター集団は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及び／又はＡＡＶ８血清型ベクターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】AVB Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーの前及び後の３つの血清型のＡＡＶベクターのタンパク質プロフィールを示す図である。（ａ）典型的なクロマトグラフィープロフィールであり、結合していない細胞タンパク質からのＡＡＶの分離を示す；（ｂ）銀染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥのタンパク質プロフィールであり、クロマトグラフィーの前（粗製）及び後（精製）のＡＡベクターの純度を示す。Ｅ：空カプシド、Ｇ：レポーター遺伝子ＧＦＰ、並びにＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を保有する完全ベクター。
【図２】アフィニティークロマトグラフィーの前（粗製）及び後（精製）のＡＡＶベクターとの（ａ）アネキシンＡ５、（ｂ）ＣｙｐＡ及びＲｕｖＢ２、（ｃ）ＹＢ１の会合を示す細胞タンパク質のイムノブロッティング分析を示す図である。Ｅ：空カプシド、Ｇ：ＧＦＰを保有する完全ＡＡＶ及び対照２９３Ｔ細胞可溶化物。（ｄ）プロテイナーゼＫを用いて、精製ベクター内に残存し、かつベクターカプシドによって保護されなかった微量の組み入れられていない細胞タンパク質を除去した、ＹＢ１のＡＡＶベクターとの会合。
【図３】産生細胞におけるタンパク質発現の経時的分析を示す図である。（ａ）ＡＡＶタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）はトランスフェクション後２４時間目に検出可能であり、トランスフェクション後２４時間目から７２時間目までにわずかな増加があった；（ｂ）Ｒｅｐタンパク質は、トランスフェクション後２４時間目に検出可能であった；（ｃ）ＹＢ１及びＣｙｐＡの発現は、完全な産生サイクルを通じて変化しないままである；（ｄ）アネキシンＡ５発現の時間外の増加が、全ての３つの血清型のＡＡＶにおいて観察された。対照：いかなるプラスミドのトランスフェクションもない２９３Ｔ細胞可溶化物（２９３Ｔ）、pcDNA3プラスミドのトランスフェクションを有する２９３Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）、及び負荷対照としてのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ。
【図４】アネキシンＡ５及びＹＢ１を標的にするｓｈＲＮＡ配列のイムノブロッティング分析を示す図である。（ａ）アネキシンＡ５及び（ｂ）ＹＢ１、それぞれを標的にするｓｈＲＮＡ  Ａ２又はＡ５、及びｓｈＲＮＡ  Ｙ３、Ｙ４、又はＹ５配列を有する産生細胞において有意な遺伝子ノックダウンが観察された。非哺乳類遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ配列を有する２９３Ｔ細胞（スクランブル）、及びいかなるｓｈＲＮＡ配列も含まない２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用いた。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図５】対照ｓｈＲＮＡスクランブルに対する、ＹＢ１遺伝子ノックダウン細胞において産生されたＡＡＶのベクターゲノム力価を示すグラフである。このグラフは、８０日間を超える培養下の遺伝子ノックダウン産生細胞の７つのバッチから、（ａ）ＡＡＶ２の最高５０倍の増加、及び（ｂ）ＡＡＶ８の１０倍の増加を示している。
【図６】凍結保存後、かつ最長８０日間の培養下の遺伝子ノックダウン細胞の６バッチにおけるＹＢ１の下方制御の持続を示す図である。非哺乳類遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ配列を有する２９３Ｔ細胞（スクランブル）、及びいかなるｓｈＲＮＡ配列も含まない２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用いた。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図７】ＹＢ１下方制御及びＡＡＶ産生の、用いられるＹＢ１＿ｓｈＲＮＡウイルスの量に対する相関を示す図である。この図は、（ａ）ｓｈＲＮＡウイルスを増加させた場合の、ＹＢ１調節解除におけるわずかな増加を示し、（ｂ）対照スクランブル及び天然２９３Ｔ細胞と比較しての相対的ＡＡＶ２ゲノム力価を示し、５０ｍｌ  ＹＢ１−ｓｈＲＮＡウイルスで処理された産生細胞におけるベクターゲノム力価への最大効果を示している。対照試料には、非哺乳類遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ配列を含む２９３Ｔ細胞（スクランブル）、ＬＶ空粒子を含むが、ｓｈＲＮＡ配列を含まない２９３Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）、及びいかなるＬＶもｓｈＲＮＡ配列も含まない天然２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）が挙げられる。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図８】ＮＰＭ１を標的にするｓｈＲＮＡ配列のイムノブロッティング分析を示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  Ｎ６及びＮ９を有する産生細胞における有意な遺伝子ノックダウン、（Ｂ）８０日間を超えて持続したＮＰＭ１の下方制御、並びに（Ｃ）凍結保存から回復した後のＮＰＭ１の下方制御が、観察された。非哺乳類遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ配列を有する２９３Ｔ細胞（スクランブル）、及びいかなるｓｈＲＮＡ配列も含まない２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用いた。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図９】ＮＣＬを標的にするｓｈＲＮＡ配列のイムノブロッティング分析を示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  Ｎ４を有する産生細胞における有意な遺伝子ノックダウン、（Ｂ）培養後８０日間を超えて持続したＮＣＬの下方制御が、観察された。非哺乳類遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ配列を有する２９３Ｔ細胞（スクランブル）、及びいかなるｓｈＲＮＡ配列も含まない２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用いた。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図１０】対照ｓｈＲＮＡスクランブルと比較した、ＮＰＭ１遺伝子ノックダウン細胞において産生されたＡＡＶのベクターゲノム力価を示すグラフである。このグラフは、（ａ）ＡＡＶ２における最高３５倍の増加、及び（ｂ）ＡＡＶ８における３０倍の増加を示している。
【図１１】対照ｓｈＲＮＡスクランブルと比較した、ＮＣＬ遺伝子ノックダウン細胞において産生されたＡＡＶのベクターゲノム力価を示すグラフである。このグラフは、ＡＡＶ２ゲノム力価における２〜４０倍増加の範囲である有意な変動（Ａ）、及びベクター力価へのより少ない上方制御効果（ＡＡＶ５（Ｂ）及びＡＡＶ８（Ｃ）ゲノム力価における最高１０倍の増加）を示している。
【図１２】ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列を用いた、ＹＢ１遺伝子ノックアウトのイムノブロッティング分析を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡノックアウト細胞の２つのバッチ（Ｂ１及びＢ２）を、４つのＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤのそれぞれについて作製した。さらに、親Ｂ１及びＢ２  ｇＲＮＡ産生細胞から単細胞クローンを導き出した。合計１０の単細胞クローンにおいて、ＹＢ１遺伝子ノックアウトが観察された。いかなるｇＲＮＡ配列も含まない親２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用い、さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。
【図１３】ｒｅｐ及びｃａｐ発現、並びにベクターＤＮＡ産生についてのＹＢ１ノックダウン細胞の分子分析を示す図である：（Ａ）一過性トランスフェクション後２４時間目（Ｈ）及び７２時間目（Ｈ）、それぞれでのＹＢ１ノックダウン細胞におけるＡＡＶ２−Ｒｅｐ発現の１２倍増加、及び４倍増加を示すイムノブロッティング；（Ｂ）スクランブル細胞と比較してＹＢ１ノックダウン細胞可溶化物におけるｃａｐ発現の７分の１の減少、及びＹＢ１細胞及びスクランブル細胞から採取されたベクターにおいて検出された同等量のＣａｐタンパク質を示すＥＬＩＳＡ；並びに（Ｃ）スクランブル細胞におけるのと比較しての、ＹＢ１ノックダウン細胞における、総ベクターＤＮＡの１３倍の増加、パッケージングされていないベクターＤＮＡの８倍の増加、及びパッケージングされたベクターＤＮＡの４倍の増加を示す、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ，quantitative polymerase chain reaction）。Ｙ：Ｓ  イムノブロッティングについてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨにより標準化された後のＹＢ１とスクランブルとの間の比、又はｑＰＣＲ分析について、ハウスキーピング遺伝子アクチンにより標準化された後の細胞数によるＹＢ１とスクランブルとの間の比。＋ＰＫ、プロテイナーゼＫ処理あり；−ＰＫ、プロテイナーゼＫ処理なし；＋ＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩ処理あり；Ｓ、対照スクランブル；Ｙ、ＹＢ１ノックダウン細胞。
【図１４】ヒトＹボックス結合タンパク質１（ＹＢ１／ＹＢＸ１）ｍＲＮＡ（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号２９）を示す図である。
【図１５】ヒトヌクレオフォスミン（nucleophosmin）（核小体リン酸化タンパク質Ｂ２３（nucleolar phosphoprotein B23）、ヌマトリン（numatrin）、ＮＰＭ１）（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：２２７２４  ＩＭＡＧＥ：４０８１３６４）、完全コーディング領域、ｍＲＮＡ（配列番号１）、及びアミノ酸配列（配列番号２７）を示す図である。
【図１６】ヒトヌクレオリン遺伝子、完全コーディング領域、ｍＲＮＡ（配列番号２）、及びアミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染する小型ウイルスのファミリーである。ＡＡＶは、パルボウイルス（Parvoviridae）科のディペンドウイルス（Dependovirus）属に属する。ＡＡＶは小型（およそ２０ｎｍ）で、無エンベロープの、複製欠損性ウイルスである。ＡＡＶは、プラスセンス又はマイナスセンスのいずれでもあり得る、長さがおよそ４．７キロベース（ｋｂ，kilobase）の一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する。
【００２３】
ＡＡＶゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端配列（ＩＴＲ，inverted terminal repeat）、並びに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ，open reading frame）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。前者は、ＡＡＶ生活環に必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子で構成され、後者は、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含有し、それらのカプシドタンパク質は共に相互作用して、正二十面体対称のカプシドを形成する。
【００２４】
ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の遺伝子は、一般的に、ｐ４０と名付けられた単一のプロモーターによって制御され、３つ全ては、単一のｍＲＮＡから翻訳される。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の分子量は、典型的には、それぞれ、約８７、７２、及び６２キロダルトン（ｋＤａ，kiloDalton）である。ＡＡＶカプシドタンパク質は、典型的には、ＡＡＶ  ＤＮＡゲノムにコードされている。
【００２５】
ヒト集団におけるＡＡＶの高い血清有病率（ヒトのおよそ８０％がＡＡＶ２について血清陽性である）にも関わらず、そのウイルスは、いかなるヒト病気にも結びつけられたことがない。ＡＡＶベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができる。そのウイルスは、宿主細胞のゲノムへ組み込まれることなく、染色体外状態で持続され得る。あるいは、そのウイルスは、ヒト１９番染色体の特定の部位（ＡＡＶＳ１）で宿主細胞ゲノムへ安定的に組み込まれ得る。アデノウイルスとは対照的に、ＡＡＶは、通常、それに感染した細胞に免疫応答を引き起こさず、したがって、筋肉及び眼の疾患についての遺伝子治療の関連において脳を含む関心対象となる部位へ遺伝子を送達することができる。これらの特徴により、ＡＡＶは、遺伝子治療のため、及び疾患モデルを開発するためのウイルスベクターの作製の非常に魅力的な候補となっている。
【００２６】
ＡＡＶ構築及び産生の過程の間、ＡＡＶベクターは、本質的かつ服従的に、様々な細胞タンパク質を必要とするが、これらのタンパク質のアイデンティティは、以前には、あまり特徴づけられていなかった。本発明者らは、遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの産生を向上させることを目的として、ＡＡＶベクターと本質的に会合した宿主タンパク質を初めて、同定し、かつ特徴づけている。特に、本発明者らは、３つの血清型の組換えＡＡＶ、すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８を調べ、ＡＡＶベクター産生においてＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１についての重要な役割を実証している。液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ，liquid chromatography-mass spectrometry）を用いて、本発明者らは、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１を含む６６のＡＡＶ会合性ヒト細胞タンパク質を同定している。ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及び／又はＹＢ１についてのｓｈＲＮＡ配列を導入することにより、それぞれの遺伝子を標的として、下方制御し、ＡＡＶ力価を増加させる。
【００２７】
本明細書で記載されているように、本発明は、産生されるウイルス力価を増加させる、ＡＡＶベクターの産生のための新しい産生系を提供する。本発明の産生系はまた、産生される完全ウイルスベクター粒子：空ウイルスベクター粒子の比を増加させ得る。本発明の産生系は、ＡＡＶベクターの産生に適する産生細胞株、及び前記産生細胞株を用いてＡＡＶベクターを産生する方法を含む。
【００２８】
本発明はまた、前記産生系、産生細胞株、及び方法により産生されるＡＡＶベクターを提供する。典型的には、本発明のＡＡＶベクターは、当技術分野において知られた標準方法により産生されるＡＡＶベクターとは異なり、本発明のＡＡＶベクターが、より高い力価を生じ、完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比が向上し、及び／又はＡＡＶベクターにおける細胞タンパク質、特に産生細胞株由来のタンパク質のレベルが調節されているということからである。
【００２９】
本発明によれば、完全ウイルスベクター粒子は、個体への送達用のペイロードを含むウイルスベクター粒子である。典型的には、ペイロードは、本明細書に記載されているようなヌクレオチド配列である。本発明によれば、空ウイルスベクター粒子は、前記ペイロードを欠くウイルスベクター粒子である。典型的には、本発明の空ウイルスベクター粒子は、空のＡＡＶカプシド又はタンパク質コートである。
【００３０】
本発明のＡＡＶベクターは、多くの学問分野において、遺伝子治療並びに遺伝子操作及び改変の方法に有用であり得る。ベクターは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ，single stranded DNA）又は自己相補性ＤＮＡを含む任意の適切な形をとり得る、１又は２以上の治療用ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、疾患又は障害の治療又は予防に有用な治療用ＤＮＡ配列を含み得る。本発明のＡＡＶベクターはまた、その他にも、例えば、薬物開発及び研究において有用であり得る。そのような非治療的適用には、例えば、誘導多能性幹細胞（ＩＰＳ，induced pluripotent stem）を作製するためにｓｈＲＮＡ、がん遺伝子などを送達するための、遺伝子操作及び送達用が挙げられる。
【００３１】
ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型であり得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１のいずれか１つであり得る。好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８から選択される。任意の２つ又は３つ以上のＡＡＶ血清型の組み合わせもまた、本発明によって提供される。ＡＡＶ血清型の組み合わせには、ＡＡＶ２とＡＡＶ５、ＡＡＶ５とＡＡＶ８、ＡＡＶ２とＡＡＶ８、又はＡＡＶ２とＡＡＶ５とＡＡＶ８が挙げられ得る。
【００３２】
本発明はまた、本発明のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの集団を提供する。特に、本発明は、本明細書に開示されているような本発明の方法により得られるＡＡＶベクターの集団を提供する。本発明によれば、ＡＡＶベクターの集団は、本発明のＡＡＶの複数のコピーとして定義され得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターの集団は、少なくとも１０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも１０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも２０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも３０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも４０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも５０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも１０１０ｖｇ／ｍｌ、又はそれ以上のＡＡＶベクター粒子を含み得る。本発明のＡＡＶ集団は、本発明の単一の型のＡＡＶベクターで構成され得る。例えば、本発明のＡＡＶ集団は、単一の血清型のＡＡＶベクターを含み得、単一のペイロード（例えば、１つの薬剤）を含み得る。ＡＡＶ集団は、１つ若しくは２つ以上のバッチ、又は１回若しくは２回以上の産生サイクルで、産生され得る。
【００３３】
本発明のＡＡＶベクターのカプシドは、本明細書における表２に列挙されたタンパク質の任意の組み合わせを含み得る。典型的には、本発明のＡＡＶベクターのカプシドは、本明細書に開示されているようなＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの任意の組み合わせを含む。前記カプシドはまた、調べられたＡＡＶ血清型のうちの４つ又は５つ以上により共有される、表２に列挙された１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質を含み得る。１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、ＡＡＶにおいて機能することがすでに知られている場合もあるし、本明細書で初めて、ＡＡＶと関連づけられた場合もある。典型的には、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの少なくとも１つに加えて、調節される１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰＫ，heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１、新生ポリペプチド結合複合体αサブユニット（ＣｙｐＡ）、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ、α−エノラーゼ、アネキシンＡ５、ＲｕＶＢ  ｌｉｋｅ  １及びｌｉｋｅ  ２から選択される。
【００３４】
本発明のＡＡＶベクターに関しての本明細書における開示のいずれも、本発明のＡＡＶベクター集団にも適用され得る。例えば、本発明の一実施形態において、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター集団における完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれ以上、増加させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、本発明のＡＡＶベクター集団における完全ＡＡＶベクター粒子：空ＡＡＶベクター粒子の比を少なくとも５０％増加させる。１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節に起因するウイルス力価の任意の増加は、本明細書に記載されているように、対照方法から得られたウイルス力価と比較され得る。対照方法は、ＡＡＶベクターを産生するための、当技術分野において知られた任意の標準方法であり得る。例えば、対照方法は、本発明に従って適合されていない産生細胞株を用い得る。そのような対照／標準方法により産生されたＡＡＶベクター及びＡＡＶベクター集団は、本明細書に記載されているように、対照ベクター及び対照集団として用いられ得る。
【００３５】
当技術分野において知られた標準方法は、産生されるＡＡＶベクターの最高１００％が空であり、又は完全ＡＡＶベクターより１００倍多い空ＡＡＶベクターを有する、ＡＡＶベクター集団を産生し得る。さらに処理したとしても、標準方法は、ＡＡＶベクターの少なくとも２０％が空であるＡＡＶベクター集団を産生する。本発明の方法は、ＡＡＶベクターの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、最高１００％までが完全である（すなわち、産生されたＡＡＶベクターの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、最低０％が空である）、ＡＡＶベクター集団を産生し得る。本発明の方法は、完全ＡＡＶベクターの数と比較して、５０倍未満、４０倍未満、３０倍未満、２０倍未満、１０倍未満、又はそれ未満の空ＡＡＶベクターがある、ＡＡＶベクター集団を産生し得る。
【００３６】
本発明のＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクター粒子の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、全部を含むそれ以下が、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つを含むカプシドを有し得る。典型的には、本発明のＡＡＶベクター集団において、ＡＡＶベクター粒子の少なくとも５０％が、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つを含むカプシドを有する。好ましくは、その少なくとも１つのタンパク質は、本明細書に記載されているようなＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬのうちの１又は２以上のタンパク質であり、より好ましくは、ＡＡＶベクター粒子の少なくとも５０％が、ＹＢ１を含むカプシドを有し、さらにより好ましくは、ＡＡＶベクター粒子の少なくとも５０％が、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬを含むカプシドを有する。
【００３７】
本発明のＡＡＶベクター又はＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクターのカプシド中の、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つの量が、対照ＡＡＶベクターのカプシド中、又は対照ＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクターのカプシド中の前記少なくとも１つのタンパク質の量と比較して、改変され得る。例えば、その少なくとも１つのタンパク質の量は、対照ＡＡＶベクターのカプシド中、又は対照ＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクターのカプシド中の前記少なくとも１つのタンパク質の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれ以上、異なり得る。この改変は、その少なくとも１つのタンパク質における増加又は減少であり得る。複数のタンパク質が対照に対して改変されている場合、対照に対して、全部が減少していてもよいし、減少しているものもあれば増加しているものもあってもよいし、又は全部が増加していてもよい。
【００３８】
本発明のＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクターのカプシド中の、表２に列挙されたタンパク質のいずれかの存在及び／又は量は、任意の標準技術を用いて、決定及び／又は定量化され得る。本発明による産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節に起因する、表２に列挙されたタンパク質のいずれかの存在及び／又は量の任意の増加は、本明細書に記載されているような対照方法から得られたＡＡＶベクター集団におけるＡＡＶベクターのカプシド中の、表２に列挙されたタンパク質のいずれかの存在及び／又は量と比較され得る。
【００３９】
本発明のＡＡＶベクター又はＡＡＶベクター集団は、対照ＡＡＶベクター又はＡＡＶベクター集団と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、又はそれ以上、増加している力価を有し得る。好ましくは、ＡＡＶベクター又はＡＡＶベクター集団の力価は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、増加している。ＡＡＶベクター又はＡＡＶベクター集団力価は、対照ＡＡＶベクター若しくはＡＡＶベクター集団の力価と、又は本明細書に記載されているような対照方法から得られたウイルス力価と比較され得る。
【００４０】
アデノ随伴ウイルスベクターを産生するための方法
本発明者らは、ＡＡＶベクターを産生するために用いられる産生細胞株におけるある特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を調節することが、前記産生細胞株から産生されるウイルスベクターの力価に効果を生じ得ることを初めて示している。ＡＡＶベクターを産生するために用いられる産生細胞株におけるある特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現の調節はまた、前記産生細胞株から産生される完全ウイルスベクター粒子：空ウイルスベクター粒子の比を増加させ得る。ＡＡＶベクターを産生するために用いられる産生細胞株におけるある特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現の調節はまた、ＡＡＶベクターカプシド中のタンパク質、特に、産生細胞株に由来したタンパク質の存在及び／又は量を改変し得る。
【００４１】
１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節
本明細書に記載されているように、本発明は、産生されるウイルス力価を増加させる、ＡＡＶベクターの産生のための新しい産生系を提供する。本発明の産生系はまた、産生される完全ウイルスベクター粒子：空ウイルスベクター粒子の比を増加させ得る。本発明の産生系はまた、ＡＡＶベクターカプシド中のタンパク質、特に、産生細胞株に由来したタンパク質の存在及び／又は量を改変し得る。本発明の産生系は、ＡＡＶベクターの産生に適する産生細胞株、及び前記産生細胞株を用いてＡＡＶベクターを産生する方法を含む。本発明はまた、前記の産生系、産生細胞株、及び方法により産生されるＡＡＶベクターを提供する。
【００４２】
したがって、本発明は、産生細胞株において１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を調節するステップを含む、ＡＡＶベクターを産生する方法を提供する。
【００４３】
調節は、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を増加させること、又は低下させる（減少させる）ことであり得る。複数の遺伝子及び／又はタンパク質が調節される場合、その遺伝子／タンパク質の全てが増加する場合もあるし、又はその遺伝子／タンパク質の全てが減少する場合もあるし、又は１若しくは２以上の遺伝子／タンパク質が増加し、かつその他の遺伝子／タンパク質が減少する場合もある。好ましい実施形態において、調節は、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を減少させることである。
【００４４】
調節は、産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現の増加であろうと低下であろうと、対照に対して測定され得る。したがって、本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、対照における前記１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現と比較され得る。本発明及び対照の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の質量、モル量、濃度又はモル濃度などの１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の実際の量が、評価され、対照からの対応する値と比較され得る。あるいは、本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の質量、モル量、濃度又はモル濃度を定量化することなく、対照の発現と比較されてもよい。
【００４５】
典型的には、対照は、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節がもたらされていない等価の産生細胞株である。例えば、本発明の産生細胞株が、ＹＢ１発現が低下しているトランスジェニック細胞株である場合、適切な対照は、ＹＢ１発現が変化していない同じ細胞株である。そのような対照細胞株は、野生型細胞株であり得る。本発明による対照方法は、典型的には、本明細書に記載されているような対照産生細胞株を用いる。既知の方法を含むＡＶＶの産生のための通常の方法は、本発明による対照方法とみなされ得る。
【００４６】
本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれ以上、異なり得る。
【００４７】
例えば、本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現が対照と比較して低下している場合には、その発現は、対照と比較して部分的に、又は全体的に、低下し得る。典型的には、その発現は、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、完全な除去（ノックアウト）まで、低下する。
【００４８】
本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現が、対照と比較して増加している場合には、その発現は、対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％増加し得る。
【００４９】
本発明の産生細胞株における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、定量的及び／又は定性的分析により決定され得る。典型的には、遺伝子発現は、ｍＲＮＡレベルによって表され得る。
【００５０】
本発明の産生細胞株における１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、その１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の質量、その１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質のモル量、その１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の濃度、並びにその１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質のモル濃度を包含する。この発現レベルは、任意の適切な単位で示され得る。例えば、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の濃度は、ｐｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ、又はμｇ／ｍｌで示され得る。
【００５１】
本発明の産生細胞株における１／又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、直接的に、又は間接的に測定され得る。
【００５２】
対照に対する、本発明の産生細胞株における１又は２以上の調節された遺伝子及び／又はタンパク質の相対的発現は、任意の適切な技術を用いて決定され得る。適切な標準技術は当技術分野において知られており、例えば、ウエスタンブロッティング及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）である。
【００５３】
調節され得る１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも１３週間、少なくとも１４週間、少なくとも１５週間、又はそれ以上の間、対照と比較して変化し得る。
【００５４】
調節され得る１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、培養下の産生細胞株の少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、又はそれ以上の継代の間、対照と比較して変化し得る。調節され得る１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、無制限に変化し得る。
【００５５】
調節される遺伝子及び／又はタンパク質
本発明者らは、ＡＡＶのカプシドに含有される非ウイルス性タンパク質の初めての系統的分析を実行し、ＡＡＶ血清型２、５、８の１つ又は２つ以上のカプシド中に見出される６６のタンパク質を同定している。これらのタンパク質は本明細書の表２で同定されている。典型的には、これらの非ウイルス性タンパク質は、ＡＡＶベクター粒子が生成される産生細胞株に由来している。
【００５６】
産生細胞株においてこれらの６６のタンパク質の１又は２以上の発現を調節することは、前記産生細胞株から産生されるＡＡＶベクターの力価を増加させるのに有用であり得る。したがって、本発明は、ＡＡＶベクターを産生するための方法であって、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つの発現を調節するステップを含む、方法を提供する。
【００５７】
本発明の方法は、ＤＮＡ結合タンパク質である、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つの発現を調節するステップを含み得る。代替として、又は追加として、本発明の方法は、ＤＮＡ結合タンパク質ではない、表２に列挙されたタンパク質の少なくとも１つの発現を調節するステップを含み得る。
【００５８】
本発明の方法は、表２に列挙された遺伝子及び／又はタンパク質の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、全部までの発現を調節するステップを含み得る。
【００５９】
表２に列挙されたタンパク質のうち、複数はＤＮＡと結合することが知られている。例えば、ＮＰＭ１（別名、ヌクレオフォスミン、核小体リン酸化タンパク質Ｂ２３、及びヌマトリン）、ＮＣＬ、及びＹＢ１は全て、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡと結合する。
【００６０】
ＮＰＭ１は、核小体リボヌクレオタンパク質構造に関連しており、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの両方と結合する。ヒトＮＰＭ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１６７６８、バージョンＢＣ０１６７６８．１  ＧＩ：１６８７６９９１）に示されている。ＮＰＭ１は一般的に、核小体に位置するが、状況次第で、核細胞質へ転位置され得る。
【００６１】
ＮＣＬ遺伝子は、核小体リン酸化タンパク質ヌクレオリンをコードする。ヌクレオリンは、リボソームの合成及び成熟に関与するＤＮＡ結合タンパク質である。ＮＣＬタンパク質への本明細書におけるいかなる言及も、ヌクレオリンへの言及として理解され得る。ヒトＮＣＬ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ６０８５８、バージョンＭ６０８５８．１  ＧＩ：１８９３０５）に示されている。
【００６２】
ＹＢ１遺伝子は、Ｙボックス結合タンパク質１（別名、Ｙボックス転写因子及びヌクレアーゼ感受性配列結合タンパク質１（nuclease sensitive element binding protein 1））をコードする。ヒトＹＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５５９．３、バージョンＮＭ＿００４５５９．３  ＧＩ：１０９１３４３５９）に示されている。ＹＢ１タンパク質への本明細書におけるいかなる言及も、Ｙボックス結合タンパク質１への言及として理解され得る。ＹＢ１は、多くのＤＮＡ及びｍＲＮＡ依存性過程に関与するＤＮＡ及びＲＮＡ結合タンパク質である。ＹＢ１はｍＲＮＡをパックして、安定させ、異なるレベルでの遺伝子制御に関与している。
【００６３】
アデノプロテイン（Adenoprotein）Ｅ１Ｂは、ＹＢ１と相互作用することが知られており、結果として、ＹＢ１の細胞核内での蓄積、及びアデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａの活性化を生じることが示されている。ＹＢ１の過剰発現が、アデノウイルスＥ２プロモーターをＥ１非依存性様式で制御し、アデノウイルスＤＮＡ複製を増加させること、及びＥ１欠損アデノウイルスベクターからの感染性ウイルス粒子の産生を増加させることが示されている。結果として、ＹＢ１の過剰発現は、アデノウイルスに基づいたベクターの開発及びウイルス療法に利用されている。
【００６４】
しかしながら、本明細書の実施例に実証されているように、本発明者らは、ＹＢ１のノックダウンが、ＡＡＶベクター力価の増加を生じることを見出している。さらに、本発明者らは、産生細胞におけるＹＢ１発現の下方制御が、結果として、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現の増加、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生の増加、及びＡＡＶ  ｃａｐ発現の減少を生じることを実証した。理論に縛られることを望まないが、産生細胞株由来のＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬなどのＤＮＡ結合タンパク質が、ＤＮＡ、特に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）との結合についてアデノウイルス構成要素と競合すると考えられる。そのようなアデノウイルス構成要素には、ウイルス複製に必要とされる早期機能タンパク質であるアデノプロテインＥ２及びＥ４、翻訳されない低分子ＲＮＡ分子をコードするアデノウイルスゲノムの領域であり、そのことによりＤＮＡとの結合についてのウイルスｍＲＮＡの翻訳を制御する、ＶＡが挙げられる。Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム６は、一本鎖ＡＡＶゲノムの二本鎖型（ＤＮＡ複製における次のステップのための基質）への変換に重要である。プロテインＥ２Ａは、ＡＡＶウイルスＤＮＡとの結合、ＤＮＡ伸長の促進、及び伸長した鎖のそれの鋳型からの移動により、ウイルスＤＮＡ複製において鍵となる役割を果たす。
【００６５】
Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡなどのアデノウイルス構成要素は、ＡＡＶベクター粒子産生に必要とされ、ＤＮＡとの結合についてこれらのアデノウイルス構成要素と競合することにより、産生細胞株ＤＮＡ結合タンパク質は、ＡＡＶベクター粒子産生を減少させることができる。したがって、理論に縛られるつもりはないが、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１などの産生細胞株ＤＮＡ結合タンパク質の発現の減少は、これらの産生細胞株ＤＮＡ結合タンパク質の、Ｅ２ＡのＡＡＶ  ＤＮＡとの結合に関する競合を低下させ、その結果として、Ｅ２Ａ−ＡＡＶ  ＤＮＡ相互作用の増強、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製の効率、及び最終的に、ＡＡＶベクターゲノム力価の増加を生じる。
【００６６】
プロモーターのｓｓＤＮＡ領域とのＹＢ１の結合は、ｓｓＤＮＡの安定化を生じることが示されており、そのことがまた、遺伝子転写及び翻訳を抑制した。したがって、（本発明者らによって観察されているように）ＹＢ１（又は、ＮＰＭ１若しくはＮＣＬなどの別の産生細胞ＤＮＡ結合タンパク質）の下方制御が、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８力価の増加に相乗的に寄与する、Ｅ２ＡのＡＡＶ２ｐ５プロモーターへの結合を促進することが考えられる。
【００６７】
したがって、典型的には、本発明の方法は、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の少なくとも１つの発現を調節するステップを含む。典型的には、本発明の方法は、ＹＢ１の発現を調節するステップを含む。ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の組み合わせが調節される方法もまた包含される。例えば、本発明の方法は、（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＮＰＭ１及びＹＢ１、（iii）ＮＣＬ及びＹＢ１、又は（iv）ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の発現を調節するステップを含み得る。好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現を調節するステップを含む。
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の少なくとも１つの発現を低下させるステップを含む。典型的には、本発明の方法は、ＹＢ１の発現を低下させるステップを含む。ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の組み合わせが低下する方法もまた包含される。例えば、本発明の方法は、（ｉ）ＮＰＭ１及びＮＣＬ、（ii）ＮＰＭ１及びＹＢ１、（iii）ＮＣＬ及びＹＢ１、又は（iv）ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の発現を低下させるステップを含み得る。好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及びＮＣＬの発現を低下させるステップを含む。
【００６９】
本発明の方法は、産生細胞株において１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を調節するステップをさらに含み得る。例えば、方法は、産生細胞株において、表２に列挙された１又は２以上の追加のタンパク質の発現を調節するステップをさらに含み得る。本発明に従って調節される追加のタンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。本発明に従って調節される追加のタンパク質は、ＤＮＡ結合性以外の機能を有し得る。したがって、本発明の方法は、産生細胞株において異なる機能を有し、少なくとも１つがＤＮＡ結合タンパク質であり得る、２又は３以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節を含み得る。本発明の方法は、産生細胞株において、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の少なくとも１つの発現を調節すること、並びにまた、１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の調節を含み得、その１又は２以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質が表２に列挙されていてもよい。
【００７０】
本発明の方法は、本明細書に開示されているようにＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の任意の組み合わせの発現を調節するステップ、並びにまた、表２に列挙された１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を調節するステップを含み得る。好ましい実施形態において、表２における１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、調べられたＡＡＶ血清型の４つ又は５つ以上によって共有される。その１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、ＡＡＶにおいて機能することがすでに知られていてもよいし、又は本明細書で初めて、ＡＡＶと関連づけられていてもよい。典型的には、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１の少なくとも１つに加えて、調節される１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰＫ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１、新生ポリペプチド結合複合体αサブユニット（ＣｙｐＡ）、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ、α−エノラーゼ、アネキシンＡ５、ＲｕＶＢ  ｌｉｋｅ  １及びｌｉｋｅ  ２から選択される。
【００７１】
本発明に従って調節され得る１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、任意の適切な手段によって調節され得る。適切な標準技術は当技術分野において知られている。調節は、例えば、用いられるモジュレータの性質（下記参照）に依存して、任意の適切な機構、例えば、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の任意の直接的又は間接的相互作用又は調節における立体的干渉を介して起こり得る。
【００７２】
本発明のモジュレータは、調節され得る遺伝子又はタンパク質に特異的であり得る。特異性により、モジュレータが、ＹＢ１、ＮＰＭ１、又はＮＣＬ遺伝子などの調節され得る遺伝子又はタンパク質と、任意の他の分子、特に任意の他のタンパク質との有意な交差反応なしに、結合すると理解される。例えば、ＮＰＭ１に特異的であるモジュレータは、ヒト好中球エラスターゼとの有意な交差反応性を示さない。交差反応性は、任意の適切な方法によって評価され得る。調節され得る遺伝子又はタンパク質についてのモジュレータの、その遺伝子又はタンパク質以外の分子との交差反応性は、そのモジュレータが、それが、調節され得る遺伝子又はタンパク質と結合するのと少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は１００％強く、その他の分子と結合する場合には、有意とみなされ得る。調節され得る遺伝子又はタンパク質に特異的であるモジュレータは、それが、調節され得る遺伝子又はタンパク質と結合する強さの９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、又は２０％未満で、ヒト好中球エラスターゼなどの別の分子と結合し得る。好ましくは、モジュレータは、それが、調節され得る遺伝子又はタンパク質と結合する強さの２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満、２％未満、又は１％未満で、他の分子と結合する。
【００７３】
任意の適切なモジュレータ、例えば、ペプチド及びペプチド模倣体、抗体、低分子阻害剤、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス（一本鎖）ＲＮＡ、アプタマー、並びにリボザイムが、本発明に従って用いられ得る。転写及び転写後の遺伝子サイレンシングテクノロジーは、本発明の１又は２以上の遺伝子を調節するために用いられ得る。転写後の遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ，RNA interference）としても知られている。好ましい実施形態において、調節は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）ゲノム編集により実行され、そのゲノム編集は、典型的には、本発明の１又は２以上の遺伝子の発現を減少させるために用いられる。好ましいアンタゴニストには、二本鎖ＲＮＡ及びキメラのガイドＲＮＡ転写物（ｇＲＮＡ，guide RNA）が挙げられる。ｇＲＮＡは、細菌ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ，trans-activating crRNA）を組み合わせており、それらは、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集中、エンドヌクレアーゼ（典型的には、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ，CRISPR associated）ヌクレアーゼ）と共に、関心対象となる遺伝子にリクルートされる。本発明の１又は２以上の遺伝子は、同じカテゴリーのモジュレータを用いて、又は異なるモジュレータにより、調節され得る。非限定的例として、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／若しくはＮＣＬが全て、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いて調節されてもよいし、又はＹＢ１がＣＲＩＳＰＲゲノム編集により調節され、かつＮＰＭ１及び／若しくはＮＣＬがｓｈＲＮＡを用いて調節されてもよい。
【００７４】
二本鎖ＲＮＡ
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、産生細胞株において１又は２以上の遺伝子の発現を調節するために用いられ得る。典型的には、ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載されているような１又は２以上の遺伝子の発現を低下させるために用いられる。ｄｓＲＮＡ分子は、本発明の１又は２以上の遺伝子を調節するためにＲＮＡｉにおいて用いられ得る。
【００７５】
既知の技術を用い、かつ調節され得る１又は２以上の遺伝子の配列の知識に基づいて、ｄｓＲＮＡ分子は、その１又は２以上の遺伝子を、対応するＲＮＡ配列の配列相同性に基づいたターゲティングによりアンタゴナイズするように設計することができる。そのようなｄｓＲＮＡは、典型的には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。そのようなｄｓＲＮＡの配列は、調節され得る１又は２以上の遺伝子をコードするｍＲＮＡの一部の配列と対応する部分を含む。この部分は、通常、その１又は２以上の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ内の標的部分と１００％相補性であるが、相補性のより低いレベル（例えば、９０％若しくはそれ以上、又は９５％若しくはそれ以上）もまた用いられ得る。典型的には、％相補性は、連続した核酸残基の長さに関して決定される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又はそれ以上の核酸残基（最長の核酸残基の場合、ｄｓＲＮＡ分子が、そのｄｓＲＮＡ分子の全長に関して、本発明の１又は２以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡと少なくとも８０％相補性を有することになる）に関して測定された場合、１又は２以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ内の標的部分と少なくとも８０％相補性を有し得る。
【００７６】
好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡはｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、任意の適切な手段によって本発明の産生細胞株に送達され得る。適切な技術は当技術分野において知られており、それらには、ｓｈＲＮＡを産生細胞株に送達するためのプラスミド、ウイルス、及び細菌のベクターの使用が挙げられる。典型的には、ｓｈＲＮＡは、ウイルスベクター送達系を用いて送達される。好ましい実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００７７】
一般的に、いったんｓｈＲＮＡが産生細胞に送達されたならば、それは、その後、核内で転写され、プロセシングされる。生じたプレｓｈＲＮＡは核から搬出され、その後、ダイサーによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ，RNA-induced silencing complex）へ負荷される。センス（パッセンジャー）鎖は分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補配列を有するｍＲＮＡへＲＩＳＣを方向づける。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を抑圧する。これらの場合のどちらにおいても、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００７８】
ｓｈＲＮＡは、表２に列挙された遺伝子の１又は２以上の発現を調節するために用いられる。表２に列挙された遺伝子の任意の１つの発現を調節するために複数のｓｈＲＮＡが用いられてもよい。典型的には、ｓｈＲＮＡは、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／若しくはＮＣＬの少なくとも１つ、並びに／又はＹＢ１の発現を調節するために用いられる。ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現を調節するために複数のｓｈＲＮＡが用いられてもよい。
【００７９】
ＹＢ１発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号１４〜１８（ＹＢ１−Ｙ１〜ＹＢ１−Ｙ５）又はそれらのバリアントから選択されるヌクレオチド配列を含み得る。配列番号１４〜１８又はそれらのバリアントから選択される複数のｓｈＲＮＡが、ＹＢ１発現を調節するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、ＹＢ１発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号１７及び／若しくは１８（ＹＢ１−Ｙ４及びＹ５）又はそれらのバリアントである。
【００８０】
ＮＰＭ１発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号４〜８（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）又はそれらのバリアントから選択されるヌクレオチド配列を含み得る。配列番号４〜８又はそれらのバリアントから選択される複数のｓｈＲＮＡが、ＮＰＭ１発現を調節するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、ＮＰＭ１発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号４及び／若しくは７（ＮＰＭ−Ｎ６及びＮ９）又はそれらのバリアントである。
【００８１】
ＮＣＬ発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号９〜１３（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）又はそれらのバリアントから選択されるヌクレオチド配列を含み得る。配列番号９〜１３又はそれらのバリアントから選択される複数のｓｈＲＮＡが、ＮＣＬ発現を調節するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、ＮＣＬ発現を調節するために用いられるｓｈＲＮＡは、配列番号９及び／若しくは１２（ＮＣＬ−Ｎ１及びＮ４）又はそれらのバリアントである。
【００８２】
ＮＰＭ−Ｎ６〜Ｎ１０、ＮＣＬ−Ｎ１〜Ｎ５、及びＹＢ１−Ｙ１〜Ｙ５（配列番号４〜１８）の配列は、下記の表１に示されている。
【００８３】
配列番号１４〜１８（ＹＢ１−Ｙ１〜ＹＢ１−Ｙ５）、配列番号４〜８（ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０）、及び配列番号９〜１３（ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ５）のｓｈＲＮＡ、又はそれらのバリアントの任意の組み合わせが用いられ得る。
【００８４】
バリアント配列は、任意の適切な長さの配列に関して測定された場合、本発明の配列と少なくとも８０％配列同一性を有し得る。典型的には、％配列同一性は、連続した核酸又はアミノ酸残基の長さに関して決定される。本発明のバリアント配列は、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又はそれ以上の核酸又はアミノ酸残基に関して測定される、本発明の配列と少なくとも８０％配列同一性を有し得る。
【００８５】
例えば、本発明のバリアントｓｈＲＮＡ分子は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、又はそれ以上の核酸残基（最長の場合、バリアントｓｈＲＮＡ分子が、そのバリアントｓｈＲＮＡ分子の全長に関して、本発明のｓｈＲＮＡ分子と少なくとも８０％配列同一性を有することになる）に関して測定される場合、本発明のｓｈＲＮＡ分子と少なくとも８０％配列同一性を有し得る。典型的には、本発明のバリアントｓｈＲＮＡ分子は、配列番号４〜１８のｓｈＲＮＡ分子の１又は２以上のバリアントである。
【００８６】
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集
ゲノム編集についてのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、典型的には、以下の２つの異なる構成要素を含む：（１）ガイドＲＮＡ、及び（２）エンドヌクレアーゼ、具体的には、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ。ガイドＲＮＡは、単一のキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写物への内因性細菌ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせである。ｇＲＮＡ及びＣａｓが、細胞において発現する場合、ゲノム標的配列は、改変され得、又は永久に破壊され得る。
【００８７】
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、ｇＲＮＡ配列と、ゲノムＤＮＡにおける本発明の１又は２以上の遺伝子内の標的配列の相補体との間での塩基対形成によって標的配列にリクルートされる。Ｃａｓの結合が成功するために、ゲノム標的配列もまた、標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ，Protospacer Adjacent Motiff）配列を含有しなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体の結合は、Ｃａｓを、本発明の１又は２以上の遺伝子におけるゲノム標的配列へ局在化させ、その結果、野生型Ｃａｓは、ＤＮＡの両方の鎖を切断して、二本鎖切断を引き起こすことができる。これは、以下の２つの一般的な修復経路の１つを通して修復することができる：（１）非相同性末端結合ＤＮＡ修復経路、又は（２）相同組換え修復経路（homology directed repair pathway）。非相同性修復経路は、フレームシフト及び／又は中途終止コドンをもたらし得る二本鎖切断部における挿入／欠失を生じ、本発明の１又は２以上の遺伝子のオープンリーディングフレームを効果的に破壊する場合が多い。相同組換え修復経路は、二本鎖切断を修復するために用いられる修復鋳型の存在を必要とする。
【００８８】
【表１】
2017506885.tif 000003
【００８９】
任意の適切なｇＲＮＡペアは、それが、本明細書に記載されているような本発明の１又は２以上の遺伝子を調節するとの条件で、本発明によるＣＲＩＳＰＲゲノム編集に用いられ得る。典型的には、ｇＲＮＡペアは、本明細書に記載されているような本発明の１又は２以上の遺伝子の発現を低下させるために用いられる。好ましくは、任意の適切なｇＲＮＡペアは、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬ、より好ましくはＹＢ１の発現を調節する（典型的には、低下させ、好ましくは、除去／ノックアウトする）ために用いられる。
【００９０】
ｇＲＮＡペアは、既知の技術を用い、かつ調節され得る１又は２以上の遺伝子の配列の知識に基づいて、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プログラム（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）などの適切なコンピュータプログラムを用いて、設計することができる。例えば、ＹＢ１を調節するためのｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プログラム（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）を用いて設計され、ＹＢ１遺伝子配列を含む全ヒト１番染色体配列（受託番号ＮＣ＿０００００１．１１）を標的にし得る。ノックアウト産生細胞は、任意の適切な技術を用いて作製され得、標準技術は当技術分野において知られており、かつ適切なキットは市販されている。
【００９１】
ｇＲＮＡペアは、任意の適切な手段により、本発明の産生細胞株に送達することができる。適切な技術は、当技術分野において知られており、それらには、ｇＲＮＡペアを産生細胞株に送達するためのプラスミド、ウイルス、及び細菌のベクターの使用が挙げられる。典型的には、ｇＲＮＡペアは、プラスミドＤＮＡを用いて送達される。
【００９２】
ｇＲＮＡペアは、表２に列挙された１又は２以上の遺伝子の発現を調節するために用いられ得る。表２に列挙された任意の１つの遺伝子の発現を調節するために複数のｇＲＮＡペアが用いられてもよい。典型的には、ｇＲＮＡペアは、ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／若しくはＮＣＬ、並びに／又はＹＢ１の少なくとも１つの発現を調節するために用いられる。ＹＢ１、ＮＰＭ１、及び／又はＮＣＬの発現を調節するために複数のｇＲＮＡペアが用いられてもよい。
【００９３】
ＹＢ１発現を調節するために用いられるｇＲＮＡペアは、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び／若しくは配列番号３９と４０、又はそれらのバリアントから選択されるヌクレオチド配列ペアを含み得る。配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、及び配列番号３９と４０、又はそれらのバリアントから選択される複数のｇＲＮＡペアが、ＹＢ１発現を調節するために用いられてもよい。
【００９４】
バリアント配列は、任意の適切な長さの配列に関して測定される場合、本発明の配列と少なくとも８０％配列同一性を有し得る。典型的には、％配列同一性は、連続した核酸又はアミノ酸残基の長さに関して決定される。本発明のバリアントｇＲＮＡ配列は、例えば、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又はそれ以上の核酸残基（最長の場合、バリアントｇＲＮＡ分子が、そのバリアントｇＲＮＡ分子の全長に関して、本発明のｓｈＲＮＡ分子と少なくとも８０％配列同一性を有することになる）に関して測定される場合、本発明の配列と少なくとも８０％配列同一性を有し得る。典型的には、本発明のバリアントｇＲＮＡ分子は、配列番号３３〜４０のｇＲＮＡ分子の１又は２以上のバリアントである。本発明のｇＲＮＡペアは、本明細書に開示されたｇＲＮＡ配列の１つ又は両方のバリアントを含み得る。例えば、配列番号３３と３４のｇＲＮＡペアのバリアントは、配列番号３３のバリアント、配列番号３４のバリアント、又は配列番号３３及び３４のバリアントを含み得る。この原則は、本明細書に開示された全てのｇＲＮＡペアに適用される。
【００９５】
アンチセンスＲＮＡ
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子、別名アンチセンスＲＮＡは、産生細胞株において１又は２以上の遺伝子の発現を調節するために用いられ得る。典型的には、アンチセンスＲＮＡは、本明細書に記載されているような１又は２以上の遺伝子の発現を低下させるために用いられる。
【００９６】
既知の技術を用い、かつ調節され得る１又は２以上の遺伝子の配列の知識に基づいて、アンチセンスＲＮＡ分子は、対応するＲＮＡの配列相同性に基づいたターゲティングによりその１又は２以上の遺伝子をアンタゴナイズするように設計することができる。そのようなアンチセンスの配列は、その１又は２以上の遺伝子から転写されたｍＲＮＡの一部の配列と一致する部分を含む。この部分は、通常、転写されたｍＲＮＡ内の標的部分と１００％相補性であるが、相補性のより低いレベル（例えば、９０％若しくはそれ以上、又は９５％若しくはそれ以上）もまた用いられ得る。
【００９７】
アプタマー
アプタマーは、一般的に、特定の標的分子に結合する核酸分子である。アプタマーは、完全にインビトロで操作することができ、化学合成によって容易に作製され、望ましい保存性を有し、治療的適用において免疫原性をほとんど、又は全く誘発しない。これらの特性により、それらは薬学的及び治療的実用性において特に有用である。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、「アプタマー」は、一般的に、標的と特異的に結合する能力がある、一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチド、又はそのようなオリゴヌクレオチドの混合物を指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、本明細書で論じられるが、ペプチドアプタマーなどの等価の結合特性を有する他のアプタマーもまた用いることができることを、当業者は理解しているだろう。
【００９９】
一般的に、アプタマーは、長さが少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも１５のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含み得る。アプタマーは、長さが４０まで、６０まで、若しくは１００まで、又はそれ以上のヌクレオチドである配列を含み得る。例えば、アプタマーは、長さが、５から１００までのヌクレオチド、１０から４０までのヌクレオチド、又は１５から４０までのヌクレオチドであり得る。可能ならば、より短い長さのアプタマーが好ましく、これらが、他の分子又は材料による干渉の減少につながる場合が多いからである。
【０１００】
アプタマーは、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ，Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）手順などの日常的方法を用いて作製され得る。ＳＥＬＥＸは、標的分子との高特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法である。それは、例えば、米国特許第５，６５４，１５１号明細書、米国特許第５，５０３，９７８号明細書、米国特許第５，５６７，５８８号明細書、及び国際公開第９６／３８５７９号パンフレットに記載されている。
【０１０１】
ＳＥＬＥＸ方法は、オリゴヌクレオチドのコレクションからの、所望の標的と結合する能力がある核酸アプタマー、特に一本鎖核酸の選択を含む。一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのバリアント）のコレクションを、標的と、結合に好都合な条件下で接触させ、混合物中の標的と結合している核酸を、結合していない核酸から分離し、核酸−標的複合体を解離させ、標的と結合していたそれらの核酸を増幅して、所望の結合活性を有する核酸に富むコレクション又はライブラリーを生じさせ、その後、関連標的に対する特異的結合親和性を有する核酸（アプタマー）のライブラリーを生じるのに必要ならば、この一連のステップを繰り返す。
【０１０２】
バリアント核酸配列
少なくとも８０％の配列同一性には、（本明細書に提示された１つ１つの核酸配列との、及び／又は本明細書に提示された１つ１つの配列番号との）少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及び１００％配列同一性が挙げられる。
【０１０３】
様々な配列アラインメント方法のいずれも、パーセント同一性を決定するために用いることができ、それらには、非限定的に、包括的方法、局所的方法、及び、例えば、セグメントアプローチ方法などの混成的方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するためのプロトコールは、当業者の想定範囲内の日常的な手順である。包括的方法は、分子の始まりから終わりまで配列を整列させ、個々の残基対のスコアを合計し、かつギャップペナルティを課することにより、最良のアラインメントを決定する。非限定的方法には、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照）、及び反復改良（例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)参照）が挙げられる。局所的方法は、入力配列の全部により共有される１つ又は２つ以上の保存的モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的方法には、例えば、マッチボックス（例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)参照）、ギブスサンプリング（例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993)参照）、アライン−Ｍ（例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)参照）が挙げられる。このように、パーセント配列同一性は、通常の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。
【０１０４】
あるいは、上記で提供された特定の配列のバリアントは、バリアント配列と、上記で提供された特定の参照配列との間で異なるヌクレオチドの数を読み上げることにより決定され得る。したがって、一実施形態において、配列は、５以内、４以内、３以内、２以内のヌクレオチド位置で、例えば、１以内のヌクレオチド位置で、上記で提供された特定の配列と異なるヌクレオチド配列を含み得る（又は、からなり得る）。保存的置換が好ましい。
【０１０５】
本発明のバリアントｓｈＲＮＡ分子及び／又はバリアントｇＲＮＡ分子及び／又はバリアントｇＲＮＡペアなどの本発明のバリアント核酸分子は、典型的には、本発明の対応する分子の活性をまだなお保持する。したがって、例えば、本発明のバリアントｓｈＲＮＡ分子は、本発明の１又は２以上の遺伝子の発現を調節する、対応するｓｈＲＮＡ分子の能力を保持する。バリアントｓｈＲＮＡ分子は、本発明のｓｈＲＮＡ分子の調節活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％まで（１００％を含む）を保持し得る。これは、本発明のｇＲＮＡ分子及び／又はｇＲＮＡペアに同じように適用される。
【０１０６】
本発明のｓｈＲＮＡ分子、ｇＲＮＡ分子、及び／又はｇＲＮＡペアなどの本発明の核酸分子は、そのｓｈＲＮＡ分子、ｇＲＮＡ分子、及び／又はｇＲＮＡペアを欠く産生細胞の除去を容易にするために標識（又はタグ付け）され得る。ピューロマイシンは適切なタグの例である。本発明のｇＲＮＡペアを構成する２つのｇＲＮＡ分子は、同じタグで標識されてもよい。あるいは、本発明のｇＲＮＡペアを構成する２つのｇＲＮＡ分子は、２つのｇＲＮＡ分子が識別されることを可能にするように異なるタグで標識されてもよい。
【０１０７】
調節の効果
本発明のモジュレータは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を増加又は低下させることができる。典型的には、本明細書に開示されているように、その１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質は、表２に列挙されている。典型的には、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、本発明による産生細胞株によるＡＡＶベクター産生の力価の増加を生じる。
【０１０８】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、又はそれ以上、増加させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、増加させる。１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節に起因するウイルス力価の任意の増加は、本明細書に記載されているような対照方法から得られるウイルス力価と比較され得る。
【０１０９】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、又はそれ以上の間、増加させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を少なくとも４０日間、増加させる。この場合もやはり、増加したウイルス力価の持続期間は、本明細書に記載されているような対照と比較され得る。
【０１１０】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を、培養下の産生細胞株の少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、又はそれ以上の継代の間、増加させ得る。
【０１１１】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター産生の力価を無制限に増加させ得る。
【０１１２】
１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節のウイルス力価への時間及び用量依存があり得る。典型的には、低用量及び初期時点においてさえも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍のＡＡＶベクター力価の有意な倍増加を達成することが可能であり得る（例えば、図６Ｂ参照）。
【０１１３】
ＡＡＶベクター力価の増加は、任意の適切な技術を用いて測定され得る。ウイルス力価を測定するための標準技術は、当技術分野において知られており、例えば、細胞に基づいたアッセイ、例えば、プラークアッセイを用いること、及び／又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。
【０１１４】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、本発明による産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を増加させ得る。ＡＡＶベクター力価の増加及び／又は完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比の増加は、本明細書に記載されているような対照と比較され得る。
【０１１５】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれ以上、増加させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を少なくとも５０％増加させる。
【０１１６】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ＡＡＶベクター集団が完全ＡＡＶベクターの数と比較して５０倍未満、４０倍未満、３０倍未満、２０倍未満、１０倍未満、又はそれ未満の空ＡＡＶベクターを含むように、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を増加させ得る。
【０１１７】
１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節に起因するウイルス力価の任意の増加は、本明細書に記載されているような対照方法から得られるウイルス力価と比較され得る。
【０１１８】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、又はそれ以上の間、増加させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を少なくとも４０日間、増加させる。この場合もやはり、増加したウイルス力価の持続期間は、本明細書に記載されているような対照と比較され得る。
【０１１９】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を、培養下の産生細胞株の少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、又はそれ以上の継代の間、増加させ得る。
【０１２０】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を無制限に増加させ得る。
【０１２１】
産生細胞株により産生される完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比は、任意の適切な技術を用いて測定され得る。ウイルス力価を測定するための標準技術は、当技術分野において知られている。例えば、ｑＰＣＲとＥＬＩＳＡの組み合わせが、完全ＡＡＶベクター：空ＡＡＶベクターの比を定量化するために用いられ得る。
【０１２２】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、非依存的に、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させ得る。典型的には、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現の変化、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生の増加、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現の減少は、本明細書に定義されているような対照細胞株又は方法と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、又はそれ以上である。
【０１２３】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、又はそれ以上の間、非依存的に、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、少なくとも４０日間、非依存的に、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させる。この場合もやはり、効果の持続期間は、本明細書に記載されているような対照と比較され得る。
【０１２４】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、培養下の産生細胞株の少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、又はそれ以上の継代の間、非依存的に、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させ得る。
【０１２５】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、非依存的に、無制限に、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させ得る。
【０１２６】
１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節の、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現への時間及び用量依存があり得る。典型的には、低用量及び初期時点においてさえも、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現への有意な倍効果を達成することが可能であり得る。
【０１２７】
ＡＡＶ  ｒｅｐ発現の増加、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生の増加、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現の減少は、任意の適切な技術を用いて測定され得る。ウイルス力価を測定するための標準技術は、当技術分野において知られている。
【０１２８】
産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、非依存的に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれ以上、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させ得る。好ましくは、産生細胞株の１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、非依存的に、少なくとも５０％、ＡＡＶ  ｒｅｐ発現を増加させ、ＡＡＶベクターＤＮＡ産生を増加させ、及び／又はＡＡＶ  ｃａｐ発現を減少させる。
【０１２９】
ＡＡＶベクターの産生
本明細書に記載されているように、本発明は、表２に列挙された１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現が対照と比較して調節されている産生細胞株を提供する。
【０１３０】
好ましい実施形態において、１又は２以上の遺伝子及び／又はタンパク質の調節は、ｓｈＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲゲノム編集により達成される。ｓｈＲＮＡが用いられる場合には、ｓｈＲＮＡは典型的に、ｓｈＲＮＡを欠く産生細胞の除去を容易にするためにタグ付けされる。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集が用いられる場合には、非切断／非ｇＲＮＡ編集対照細胞における単一のＰＣＲ産物／バンドと比較して、陽性ノックアウト細胞においてｇＤＮＡの切断により２つの産物（バンド）を生じることができるＰＣＲプライマーを設計することができる。この場合もやはり、これは、本発明の１又は２以上の遺伝子が調節されていない産生細胞の除去を容易にする。
【０１３１】
いったん本発明のそのような産生細胞株が樹立されたならば、それは、本発明によるＡＡＶベクターを産生するために用いられ得る。本発明によるＡＡＶベクターを作製するために任意の適切な技術が用いられ得る。標準技術は当技術分野において知られている。
【０１３２】
本発明のＡＡＶベクターは、標的細胞への送達及び発現のための任意の治療用ポリヌクレオチドを保有するように操作され得る。治療用ポリヌクレオチドは、当業者によく知られている技術（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., Wiley and Sons, New York, 1995）を用いて、ＡＡＶベクター内の様々な部位へ操作され得、その部位には、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域が挙げられるが、それらに限定されない。ＡＡＶベクターへクローニングされる治療用ポリヌクレオチドは、適切なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む完全な転写単位として操作され得る。
【０１３３】
したがって、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ由来末端反復のペアの間に治療用ポリヌクレオチド遺伝子及びプロモーターを含み得る。プロモーターと治療用ポリヌクレオチドの組み合わせはまた、本明細書ではカセットと呼ばれる。
【０１３４】
プロモーター配列は、治療用ポリヌクレオチドに、その遺伝子の発現をもたらす様式で操作可能に連結される。このゆえに、プロモーター配列は、治療用ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端にあり得る。さらに、１つより多いプロモーター及び治療用ポリヌクレオチドが、１つのＡＡＶベクター内に存在し得、すなわち、末端反復の間に２つ又は３つ以上のカセットがあり得る。したがって、１つより多い異種性遺伝子が１つのベクターによって発現することができる。
【０１３５】
プロモーターが、治療用ポリヌクレオチドの発現を、それらが操作可能に連結されている場合に作動させる能力があるという条件で、本発明のＡＡＶベクターに任意のプロモーターが用いられ得る。そのようなプロモーターは当技術分野において知られており、それらには、例えば、ＡＡＶ  Ｅ１プロモーター又はＥ４プロモーター、加えて、非限定的に、ＣＭＶプロモーター及びＰＧＫプロモーターを含む他のものが挙げられる。プロモーターは、組織又は細胞優先的又は特異的であり得、つまり、それが、関心対象となる特定の組織型か又は細胞型のいずれかにおいて治療用ポリヌクレオチドの発現を作動させることを意味する。この場合もやはり、そのようなプロモーターは当技術分野において知られている。
【０１３６】
治療用ポリペプチドの３’末端における適切なポリアデニル化シグナルには、ＡＡＶポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。ＡＡＶゲノムのＥ３領域は、ベクターのクローニング能力を増加させるために欠失していてもよいし、又はそれはベクター構築物内に残っていてもよい。
【０１３７】
本発明のＡＡＶベクターは典型的には以下を含む：１）末端反復は、処置され得る個体の細胞ゲノムへの安定的な部位特異的組込みを媒介する；及び２）プロモーターは、治療用ポリヌクレオチドの発現を媒介し、又はプロモーターは、関心対象となるポリペプチドをコードするアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡの転写を媒介する。
【０１３８】
本発明のＡＡＶベクターは、当技術分野において知られた様々な標準方法により構築することができ、エレメントのライゲーションの順序は様々であり得る。プロモーター及び治療用ポリヌクレオチドを一緒にライゲーションして、２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ，inverted terminal repeat）の間に挿入することができるカセットを提供し得る。本発明のＡＡＶベクターの構築のための標準技術は当技術分野において知られており、Sambrook et al. (1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)などの参考文献、又はいろいろな場所で入手できる、組換えＤＮＡテクノロジーに関する無数の実験マニュアルのいずれかに見出すことができる。ＤＮＡの断片をライゲーションするために様々なストラテジーが利用可能であり、その選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、容易に決定することができる。
【０１３９】
例えば、本発明によるＡＡＶベクターを産生するための標準技術には、ＡＡＶカプシド及びＲｅｐタンパク質を発現するための産生細胞へのＤＮＡプラスミドのトランスフェクション；一本鎖ＤＮＡ又は自己相補的ＤＮＡの形をとり、かつレシピエント細胞又は患者において生物学的又は治療的機能を発揮し得る治療用及び／又はレポーター遺伝子に隣接する、任意のＡＡＶ血清型由来の２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶベクターゲノムを発現するためのＤＮＡプラスミドの同時トランスフェクション；並びに、導入するかしないか（すなわち、ヘルパーを含まない系において）は別にして、ＡＡＶヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス由来のＡＡＶヘルパーエレメントのプラスミドＤＮＡを介した同時トランスフェクション又はウイルス感染が挙げられる。
【０１４０】
ＤＮＡの染色体への組込み、ＤＮＡの発現、及びベクターのクローニングを促進する他のヌクレオチド配列エレメントが、本発明のＡＡＶベクターに含まれてもよい。例えば、プロモーターの上流のエンハンサー、又は治療用ポリヌクレオチドの下流のターミネーターの存在が発現を促進することができる。
【０１４１】
本明細書に開示されているように、本発明のＡＡＶベクターはまた、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。典型的には、これらのＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３と名付けられている。これらのＡＡＶカプシドタンパク質は、典型的には、ＡＡＶ  ＤＮＡゲノム上にコードされて、構築されるＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にする。
【０１４２】
産生細胞株
本発明によれば、産生細胞株は、ＡＡＶベクターを複製し、かつパッケージングする能力がある細胞株として定義され得る。任意の適切な産生細胞株が、本発明に従って、改変されて、用いられ得る。本発明の産生細胞株は真核細胞株、典型的には、哺乳類細胞株である。本発明により産生されたＡＡＶベクターは、通常、ヒトにおける治療用である。したがって、好ましくは、本発明の産生細胞株はヒト細胞株である。本発明の産生細胞株は、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、ＨｅＬａ細胞、及びＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株から選択され得る。本発明の産生細胞株は、接着又は浮遊の形をとり得る。
【０１４３】
好ましい実施形態において、産生細胞株は、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ，human embryonic kidney）２９３Ｔ細胞株である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列プロモーターの転写制御下でＳＶ４０初期領域を発現する。
【０１４４】
本明細書で言及される場合、対照産生細胞株は、本発明に従って改変も適合もされていないものである。
【０１４５】
治療的適用
本発明のＡＡＶベクターは、遺伝子治療ベクターとして用いられ得る。遺伝子治療は、新しい遺伝情報の細胞への移入及び挿入を含む。遺伝情報は、細胞へ一過性に、又は安定的に挿入され得る。本発明のＡＡＶベクターは、遺伝子治療にとって安全である。したがって、本発明のＡＡＶベクターは、実質的な細胞毒なしに、哺乳類染色体へ部位特異的に組み込む能力があり得、かつ治療用ポリヌクレオチドの宿主細胞特異的発現を指示する。好ましくは、本発明のＡＡＶベクターは、哺乳類、より好ましくはヒトにおける遺伝子治療に用いられる。
【０１４６】
本発明のＡＡＶベクターは、疾患又は状態を処置又は予防するために用いることができる任意のポリヌクレオチドを含み得る。治療用ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。典型的には、治療用ポリヌクレオチドはＤＮＡである。治療用ポリヌクレオチドは、好ましくは、処置され得る個体において機能しない、及び／又は変異した遺伝子を標的にする（それに取って代わる）生物学的機能性遺伝子である。好ましい実施形態において、処置され得る個体がヒトである場合、治療用ポリヌクレオチドもまたヒトである。
【０１４７】
治療用ポリヌクレオチドは、生物学的機能性タンパク質、すなわち、生物学的機能性タンパク質が発現する細胞の細胞機構に影響するポリペプチド又はタンパク質をコードし得る。例えば、生物学的機能性タンパク質は、細胞の正常な増殖に、又は個体の健康を維持するのに必須であるタンパク質であり得る。生物学的機能性タンパク質はまた、欠損したタンパク質を供給することによるか、個体において産生が不足しているタンパク質の量の増加を提供することによるか、又は個体に存在している可能性がある望まれない分子を阻害若しくは相殺するタンパク質を供給することによるかのいずれかで、個体の健康を向上させるタンパク質であり得る。生物学的機能性タンパク質はまた、新しい遺伝子治療を開発するための調査研究のために、又は細胞機構を研究するために有用なタンパク質であるタンパク質であり得る。
【０１４８】
生物学的機能性タンパク質は、身体の正常な成長又は修復に必須であるタンパク質であり得る。生物学的機能性タンパク質はまた、がんなどの疾患と闘うことにおいて有用であるものであり得る。生物学的機能性タンパク質はまた、真核生物におけるネオマイシン抵抗性についての選択マーカーなどの抗生物質抵抗性についての選択マーカーであり得る。選択マーカーの他の型もまた用いられ得る。これらのタンパク質をコードする治療用ポリヌクレオチドは、日常的なクローニング手順（Sambrook et al.）、関心対象となる遺伝子を含有するベクターからの切り出し、又は公開された配列情報に基づいた化学的若しくは酵素的合成などの様々な方法のいずれかにより提供することができる。多くの場合、関心対象となるタンパク質をコードするＤＮＡは市販されている。
【０１４９】
生物学的機能性タンパク質は、新しい又は変化した機能を細胞に与えることにより細胞機構に影響を及ぼすことができる。例えば、治療用ポリヌクレオチドは、Ｐ−糖タンパク質をコードする多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ，multidrug resistance）であり得る。Ｐ−糖タンパク質は、細胞内薬物蓄積に影響する細胞膜糖タンパク質であり、多剤耐性の現象に関与する。
【０１５０】
治療用ポリヌクレオチドは、非生物学的機能性タンパク質をコードし得る。例えば、様々な供給源由来の様々なドメイン及び機能を含むハイブリッド遺伝子が、組換えテクノロジー又は酵素的若しくは化学的合成により設計され、かつ作製され得る。
【０１５１】
治療用ポリヌクレオチドは、関心対象となるｍＲＮＡ又はＤＮＡにハイブリダイズするのに十分相補的であるＲＮＡ分子、すなわち、センス又はアンチセンスＲＮＡへ転写される能力があり得る。そのようなＲＮＡ分子は、過剰産生された、欠損した、又は別なふうに望ましくない分子の発現を防止又は制限することにおいて有用であり得る。本発明のＡＡＶベクターは、治療用ポリヌクレオチドとして、標的配列と結合するように標的配列と十分相補的であるアンチセンスＲＮＡをコードする配列を含み得る。例えば、標的配列は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分であり得、その結果として、それが、そのポリペプチドをコードするｍＲＮＡと結合して、そのｍＲＮＡの翻訳を阻止する。標的配列は、転写に必須である遺伝子のセグメントであり得、その結果、アンチセンスＲＮＡがそのセグメント（例えば、プロモーター又はコード領域）に結合し、転写を阻止又は制限する。このゆえに、アンチセンスＲＮＡは、それの標的ｍＲＮＡの翻訳、又はそれの標的ＤＮＡの転写を阻止するのに十分な長さ及び相補性をもたなければならない。アンチセンスＲＮＡが、標的と結合し、それにより翻訳又は転写を阻害する能力があるように、標的配列との十分な相補性を有するアンチセンスＲＮＡは、標準技術を用いて決定することができる。治療用ポリヌクレオチドは、例えば、化学的若しくは酵素的合成により、又は市販の供給源から提供することができる。
【０１５２】
本発明のＡＡＶベクターの機能、すなわち、治療用ポリヌクレオチドの移入及び発現を媒介する能力は、形質導入された細胞において治療用ポリヌクレオチドの発現をモニターすることにより評価することができる。例えば、細胞に本発明のＡＡＶベクターをトランスフェクトし得、又は細胞を、前記ＡＡＶベクターを含有する様々な濃度のビリオンに感染させ得、その後、治療用ポリヌクレオチドの発現を評価し得る。
【０１５３】
発現についてのアッセイは、治療用ポリヌクレオチドの性質に依存する。発現は、免疫学的アッセイ、組織化学的アッセイ、又は活性アッセイを含む様々な方法によってモニターすることができる。例えば、適切なＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いて、転写を評価するのにノーザン分析を用いることができる。治療用ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対する抗体が入手できる場合には、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学法、又は他の免疫学的技術を、そのポリペプチドの産生を評価するために用いることができる。治療用ポリヌクレオチドが酵素である場合には、適切な生化学的アッセイもまた用いることができる。例えば、治療用ポリヌクレオチドが抗生物質抵抗性をコードする場合には、抗生物質抵抗性遺伝子の発現を評価するために、感染細胞のその抗生物質に対する抵抗性の決定を用いることができる。
【０１５４】
異種性遺伝子が適切な細胞において発現していることを評価することに加えて、ＡＡＶベクターの正しいプロモーター特異性を、治療用ポリヌクレオチドの発現、又はそのプロモーターが活性であるとは予想されない細胞においては発現の欠如をモニターすることにより評価することができる。
【０１５５】
本発明の治療用ポリヌクレオチドは、ＣＦについてのＣＦＴＲ、肺気腫についてのα１−アンチトリプシン、ＡＩＤＳについての可溶性ＣＤ４、アデノシンデアミナーゼ欠損症についてのＡＤＡ、及び遺伝子治療に有用である可能性があると認識された任意の他の遺伝子から選択される遺伝子であり得る。
【０１５６】
本発明のＡＡＶベクターは、エクスビボ及びインビトロの遺伝子治療適用に適合され得る。
【０１５７】
本発明のＡＡＶベクターはまた、他の治療用物質を送達するために用いられ得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、小分子、ペプチド、及び／又はタンパク質の治療用物質を送達するために用いられ得る。
【０１５８】
本発明のＡＡＶベクターは、他の治療剤及び／又は治療方法と併用して用いられ得る。特に、本発明のＡＡＶベクターは、非限定的に、がんを含む疾患の処置において、標準治療剤及び／又は方法と併用して用いられ得る。ＡＡＶ誘導性免疫は、抗体機能を増強することができる。したがって、本発明による治療的使用の一例は、治療用抗体を送達するための本発明のＡＡＶベクターの使用、又は治療用抗体と併用した本発明のＡＡＶベクターの使用である。
【０１５９】
したがって、本発明は、治療の方法における使用のための、本明細書に記載されているようなＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、遺伝子治療のための薬物の製造における、本明細書に記載されているようなＡＡＶベクターの使用を提供する。
【０１６０】
以下の実施例は本発明を例証する。
［実施例］
【実施例１】
【０１６１】
ベクター産生
２つの型のベクター粒子、すなわち、３つのＡＡＶ血清型、すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８のそれぞれ由来の完全粒子及び空（いかなる導入遺伝子配列も含まない）粒子を産生し、調べた。完全ベクター粒子は、ＧＦＰをコードするベクター配列を含有し、空ベクター粒子は、ベクター配列を含まないカプシドであった。
【０１６２】
完全ＡＡＶ粒子は、３つのプラスミドpHelper（Stratagene社、ＵＳＡ）、ＡＡＶ  Ｒｅｐ−ＣａｐをコードするpAAV-RC、及びpAAV-hrGFP（Stratagene社、ＵＳＡ）から発現し、空ＡＡＶカプシドは、pHelper及びpAAV-RCのみから発現した。プラスミドpAAV2/2 Rep-CapをStratagene社（ＵＳＡ）から購入し、プラスミドpAAV-2/5-RC及びAAV-2/8-RCはJames Wilson教授（NIDCR/Pennsylvania、ＵＳＡ）により親切にも提供していただいた。
【０１６３】
全てのベクターを、リン酸カルシウム−ＢＢＳ方法（Chen et al., (1988) Biotechniques 6: 632-638）を用いて、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞（Stratagene社、ＵＳＡ）の一過性トランスフェクションにより産生させた。ベクター産生細胞を収集し、５サイクルの凍結融解に供して、ベクター粒子を遊離させ、細胞残屑を、遠心分離（２０００ｇ）により除去した。
【０１６４】
その後、ベクター粒子を含有する上清を、０．４５μｍフィルター（Millipore社、ＵＫ）に通して濾過し、クロマトグラフィーの前に、２０ｍＭ  Bis-Trisプロパン緩衝液で希釈した。クロマトグラフィーのためにGilson  ＨＰＬＣシステム（Anachem社、ＵＫ）を用い、それは、UV-Detector（Gilson社、１１９）、ポンプ（Gilson社  ３０６）、オートサンプラー（Gilson社  ２３１ＸＬ）、及び画分収集装置（Gilson FC203B）を搭載し、どれも冷却再循環ウォーターバス（Grant社、ＳＬＳ）（これはまた、ウォータージャケットカラムも冷却する）に接続した温度制御されたラックを取り付けられている。そのシステムは、Gilson Unipointソフトウェアを用いて制御した。XK 16/26カラム（Amersham社、ＵＫ）を、５ｍｌの総容積のAVB Sepharose High Performance媒体（GE Healthcare社、Ｓｗｅｄｅｎ）を含有するように充填し、製造会社のプロトコールに従って実施した。
【０１６５】
この研究に用いられたAVB Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーは、アデノ随伴ウイルスの精製のために設計された。図１Ａは、ＡＡＶ抗体を連結したAVB Sepharoseを含有する５ｍｌカラムを用いた、典型的なタンパク質分離を示しており、大部分のタンパク質がＡＡＶ抗体に結合しておらず、したがって、溶出緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．７）をアプライする前に、カラムを通過したことを示している（図１Ａ）。空カプシドと完全ベクターのどちらも、２５〜３５分間の移動時間で溶出した（図１Ａ）。その後、溶出した試料のタンパク質プロフィールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色を用いて可視化し（図１Ｂ）、クロマトグラフィー後のＡＡＶ試料の有意な純度が示された。予想された通り、３つの優勢なＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１（８１ｋＤａ）、ＶＰ２（７２ｋＤａ）、及びＶＰ３（６２ｋＤａ）が明らかであった。粗製の精製されていないＡＡＶ試料は、多数のタンパク質バンドを示した。
【実施例２】
【０１６６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる、ＡＡＶベクターからのタンパク質の同定
実施例１からの精製ベクター粒子をプールし、10K MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo scientific社、ＵＳＡ）中のＰＢＳへ平衡化するよう透析し、ベクター定量化に供する前に、Ultra 5K MWCO遠心濾過装置（Millipore社、ＵＫ）を用いて最初の体積の１／２０に濃縮した。
【０１６７】
精製ベクターのベクター定量化ゲノム力価を、ＡＡＶ２  ＩＴＲプライマーGGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号２４）及びCGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号２５）並びにプローブCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG（配列番号２６）でのSYBR緑色色素リアルタイムｑＰＣＲを用いて決定し、プローブを５’末端に６−カルボキシフルオセイン（６−ＦＡＭ）で、３’末端にカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。プラスミドpAAV2-hr-GFPを用いて標準曲線を作成した。総タンパク質を、Pierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermo scientific社、ＵＳＡ）を用い、製造会社のプロトコールに従って測定した。カプシドタンパク質のアイデンティティ及び推定量を、SilverXpress染色キット（Invitrogen社、ＵＳＡ）を用い、製造会社のプロトコールに従って可視化した。
【０１６８】
精製及び濃縮されたベクター試料を、１％Rapigest及び５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ABC社）、ｐＨ８．５の存在下、トリプシンで、３７℃で３時間、消化した。その後、試料をＭＳ分析に供する前に、ＨＣｌを加えることにより消化を終了させた。
【０１６９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを、溶媒脱気装置、ローディングポンプ、ナノポンプ、及び恒温オートサンプラーを含むUltimate 3000ナノ−ＬＣシステムと連動した、ナノエレクトロスプレーイオン源及び２つの質量検出器、すなわち、リニアトラップ（LTQ）とorbitrapを搭載した質量分析システム（Thermo Fisher社、ＵＫ）を用いて、実行した。自動注入後、各消化からの抽出ペプチドを、トラッピングカートリッジ（PepMap逆相Ｃ１８、５μｍ  １００Å、３００μ  ｉｄ×５ｍｍ長さ）（Thermo社）において脱塩し、Ｃ１８逆相ナノカラム（３μｍ、１００Å、５ｃｍ長さ）（Thermo社）において溶出し、続いて、５〜７０％のアセトニトリルの直線濃度勾配及び０．１％ギ酸を用いて、０．３μＬ／分のカラム流速下で６０分間、分離を行った。LTQにおける１回目のサーベイＭＳスキャン（ｍ／ｚ  ４００〜２０００）後、５つの最も強いイオンを連続して単離し、３０，０００ｐｐｍの解像度での正確な質量測定のためにOrbi-trapに移した。その後、これらを、リニアイオントラップにおいて３５％の衝突誘起エネルギーで断片化した。総サイクル時間は、およそ３０ミリ秒間であった。動的排除（dynamic exclusion）を２カウントに設定したデータ依存性ＭＳ／ＭＳモードで、データを収集した。
【０１７０】
質量スペクトル処理及びデータベース検索を含むデータ解析を、内蔵型Sequestを有するThermo Proteome Discoverer 1.2.を用いて行った。ＭＳによるタンパク質同定についての最初の質量許容差を１０ｐｐｍ（百万分率）に設定した。最高２つのトリプシン切断の欠如が認められ、メチオニン酸化を動的改変（dynamic modification）として設定した。荷電状態１、２、３について、それぞれ、Ｘ相関スコアが１．５より大きい、２より大きい、又は２．２より大きい場合、ＭＳ／ＭＳによるペプチド配列のみが含まれた。少なくとも２つのペプチドがそのタンパク質に一致している場合、明白な同定が認められた。タンパク質ＦＡＳＴＡデータベースをwww.uniprot.orgからダウンロードした（リリース２０１２−０３、ヒト（Homo sapiens）（分類群識別名９６０６）、ウシ（Bos taurus）（９９１３）、緑色蛍光タンパク質（Ｐ４２２１２）、並びにＡＡＶ２（６４８２４２）、ＡＡＶ５（８２３００）、及びＡＡＶ８（２０２８１３）からの完全なエントリーを含む）。
【０１７１】
６つの異なる型の精製ＡＡＶベクター試料、すなわち、ＡＡＶ２−ＧＦＰ、ＡＡＶ２−空、ＡＡＶ５−ＧＦＰ、ＡＡＶ５−空、ＡＡＶ８−ＧＦＰ、及びＡＡＶ８−空由来の等量の総タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。データ変動を最小限にするために、各型のベクターについて、３つのバッチの試料を調製し、各バッチを、４０の組織培養プレート（１５０ｍｍ直径）からプールした。各バッチの試料について３回のＭＳ実行を実施した。結果により、３つのバッチの試料の少なくとも２／３回の実行において６６のタンパク質が検出され、したがって、有意であるとみなされ、さらに研究され得ることが示された。これらのタンパク質は表２に列挙されている。
【０１７２】
有意なタンパク質の中で：
・４つのタンパク質、すなわち、ＧａｐＤＨ、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ／１Ｂ、ヒストンＨ２Ａ型１Ｈ、及びヒストンＨ２Ｂは、血清型及び粒子の型に関わらず、全ての６つの型のＡＡＶベクターに共通していた；
・６つのタンパク質が、５つの型のベクターに共有された；
・４つの型の試料によって共有された１０のタンパク質のうち、６つのタンパク質がＡＡＶ２及びＡＡＶ５の空型と完全型の両方により共有され、ＡＡＶ２ベクターとＡＡＶ５ベクターとの間での相対的類似性を示した；
・２０のタンパク質が２つの型のベクターに共通しており、それらのタンパク質の大部分は、同じ血清型の空型及び完全型に共通した；
・２１のタンパク質は、ベクターの個々の型に固有であった。
【０１７３】
【表２】
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【実施例３】
【０１７４】
ＭＳデータの確証
実施例２で得られた質量分析データを確証するために、ＭＳを用いて同定された、以下の２つのカテゴリーのタンパク質を、イムノブロッティングのために選択した：（ｉ）ＡＡＶライフサイクルにおいて確認された役割を有するタンパク質ＮＰＭ１、ＮＣＬ１、及びＡＴＰ５Ａ、並びに（ii）ＡＡＶとの関連についての報告はないが、ＭＳ分析において相対的に高いスコア及び信頼度を有するタンパク質アネキシンＶ、ＲｕｖＢ、ＣｙｐＡ、ｈｎＲＮＰＫ、及びＹＢ１。
【０１７５】
１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、タンパク質試料を分離し、その後、ゲルをイムノブロッティングに供した。イムノブロッティングのための試料を電気泳動し、Hybond ECL膜（Amersham社、ＵＫ）にエレクトロブロットした。以下の一次抗体を用いた；マウス抗ＡＡＶ２、マウス抗アネキシンＶ（Abcam社、ＵＫ）、抗ヌクレオリン（Abcam社、ＵＫ）、抗ヌクレオフォスミン（Abcam社、ＵＫ）、抗ＥＦ１β２（Abcam社、ＵＫ）、抗ＣｙｐＡ（Abnova社、ＵＫ）、抗ＲｕＢＶ２（Abcam社、ＵＫ）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ（Abcam社、ＵＫ）、抗ＡＴＰ５Ａ（Abcam社、ＵＫ）、及び抗ＹＢ１（Abcam社、ＵＫ）。イムノブロットをさらに、ヤギ抗マウス、抗ウサギ、又はウサギ抗ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma社、ＵＫ）とインキュベートした。免疫反応性タンパク質を、ECL化学発光試薬（Amersham社、ＵＫ）を用いて検出した。
【０１７６】
各試料について、ＭＳ／ＭＳのために用いた同じ試料由来の１０μｇの総タンパク質を、イムノブロッティングに供する前に、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いて分離した。総タンパク質を、ＳＤ／ＰＡＧＥ及び銀染色を用いて可視化し（図１Ｂ）、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の試料純度及び同等の量を確認した。
【０１７７】
イムノブロッティングにより、ＲｕｖＢ２、ＣｙｐＡ、及びアネキシンＡ５が、試験された全ての試料において検出されたことが示された（図２Ａ及びＢ）。ＹＢ１は、ＡＡＶ８空カプシドを除く全ての試料において、それらが粗製であるか、又は精製されているかに関わらず、検出された（図２Ｃ）。ＡＡＶベクターにおいて、組み入れられた細胞タンパク質と、同時精製されたが組み入れられていない細胞タンパク質とを識別するために、プロテイナーゼＫ（ＰＫ，proteinase K）を用いて、精製ベクターに残存し、かつベクターカプシドによって保護されなかった微量の組み入れられていない細胞タンパク質を除去した。図２Ｄより、ＰＫ処理の前及び後での、精製ＡＡＶベクターにおけるＹＢ１タンパク質の同等の検出が示され、ＡＡＶベクターにおけるＹＢ１の組み入れが示された。さらに、ＡＡＶベクターと並行して、処理され、かつＨＰＬＣ精製された、精製対照２９３Ｔ細胞において（未精製レーン、図２Ｄ）、ＹＢ１タンパク質の検出はなく、ＡＡＶベクター精製のために採用されたAVBカラムの特異性が浮き彫りにされ、かつＡＡＶベクターにおけるＹＢ１タンパク質の組み入れがさらに実証された。ｈｎＲＮＰＫは、試験された試料のいずれにおいても検出されなかった（データ未呈示）。
【０１７８】
イムノブロッティング及びＭＳ研究からの結果をさらに表３において、要約して、比較し、これらの２つの異なる方法の間でタンパク質検出において２２．９％（１１／４８の試験された試料、丸印で強調されている）の差異、及び７７．１％の一致が示された。
【実施例４】
【０１７９】
産生細胞における、ＡＡＶ産生のタンパク質発現への影響
産生細胞における、ウイルスタンパク質と細胞タンパク質の両方の発現へのＡＡＶ産生の潜在的影響を調べるために、ＡＡＶカプシドタンパク質、アネキシンＡ５、ＣｙｐＡ、及びＹＢ１の発現の変化を、ＡＡＶ産生の１回の完全サイクルを通して、すなわち、ＡＡＶ及びヘルパープラスミドのトランスフェクション前の０時間目から、ベクター産生過程が終了し、ＡＡＶベクターを採取する時点の、トランスフェクション後４時間目、６時間目、２４時間目、３０時間目、４８時間目、及び７２時間目まで、分析した。ＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２産生細胞においてトランスフェクション後２４時間目に検出することができた（図３Ａ及び３Ｂ）。産生細胞におけるカプシドタンパク質のわずかな増加が、トランスフェクション後２４時間目から７２時間目の間に観察された。ＡＡＶ産生の完全サイクルを通して、ＹＢ１及びＣｙｐＡ発現において有意な変化は観察されず（図３Ｃ）、ゆっくり時間をかけて、アネキシンＡ５発現の増加が全ての３つの血清型において観察された（図３Ｄ）。
【０１８０】
【表３】
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【実施例５】
【０１８１】
ＮＰＭ１、ＮＣＬ、及びＹＢ１のｓｈＲＮＡノックダウン
標的遺伝子を特異的に認識する機能性ｓｈＲＮＡは、結果として、その遺伝子の発現の下方制御を生じる。ＮＣＬ及びＮＰＭ１を過剰発現させるように培養下で細胞を樹立することはできなかったため（データ未呈示）、このストラテジーを、ＡＡＶ構築において細胞タンパク質の役割を研究するための代替方法として選択した。
【０１８２】
産生細胞におけるＮＰＭ１、ＮＣＬ、アネキシンＶ、及び／又はＹＢ１のｓｈＲＮＡノックダウンは、ＮＰＭ１、ＮＣＬ、アネキシンＶ、及び／又はＹＢ１のＡＡＶウイルスとの（ＭＳ／ＭＳ及びイムノブロットで同定される）会合を損ない、その後、遺伝子ノックダウン細胞においてＡＡＶ産生に影響し得るという仮定の下に、レンチウイルスベクター送達系を用いて、ｓｈＲＮＡ配列をスクリーニングした。
【０１８３】
標的遺伝子を特異的に認識する機能性ｓｈＲＮＡは、標的にされた遺伝子発現の下方制御を引き起こす。ＡＡＶ産生におけるＹＢ１及びアネキシンＡ５の役割及び重要性を同定するために、ｓｈＲＮＡを用いて産生細胞においてＹＢ１又はアネキシンＡ５をノックダウンする実験を設計し、仮説は、このノックダウンが、（研究されたＭＳ／ＭＳ及びイムノブロッティングから同定されているような）ＹＢ１又はアネキシンＡ５のＡＡＶウイルスとの会合を損ない、その後、遺伝子ノックダウン細胞においてＡＡＶ構築に影響するだろうということであった。
【０１８４】
レンチウイルスベクター送達系を用いて、アネキシンＡ５及びＹＢ１を標的にする１０のｓｈＲＮＡ配列（Ａ１〜Ａ５、配列番号１９〜２３、及びＹ１〜Ｙ５、配列番号１４〜１８）を、アネキシンＡ５及びＹＢ１を、それぞれ、調節解除するそれらの能力についてスクリーニングした。
【０１８５】
より詳細には、レンチウイルス発現系を用いてプラスミドpLKO.1-puro（Sigma社、ＵＳＡ）からｓｈＲＮＡを発現させた。ｓｈＲＮＡ及びレンチウイルスベクターパッケージングプラスミドを、ＣａＣｌ２トランスフェクション方法を用いて２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。対照細胞に、ｓｈＲＮＡ配列を含まない空カプシド（Ｍｏｃｋ）、又は非哺乳類遺伝子配列を標的にするスクランブルｓｈＲＮＡ配列（スクランブル）をトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞に、ＬＶ−ｓｈＲＮＡベクターを形質導入し、形質導入から４８時間後、ピューロマイシン選択に供した。
【０１８６】
ＡＡＶベクターゲノム力価を、ＣＭＶプロモーター又はＡＡＶ２  ＩＴＲ配列を標的にするプライマー及びプローブを用いるｑ−ＰＣＲにより決定した。ＣＭＶプライマー：TTC CTA CTT GGC AGT ACA TCT ACG（配列番号３０）及びGTC AAT GGG GTG GAG ACT TGG（配列番号３１）、並びにＣＭＶプローブ：TGA GTC AAA CCG CTA TCC ACG CCC A （配列番号３２）。ＡＡＶ２  ＩＴＲプライマー：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号２４）及びCGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号２５）並びにプローブ：CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG（配列番号２６）。この場合もやはり、５’６−ＦＡＭ及び３’ＴＡＭＲＡ標識を用いた。プラスミドDNA pAAV-hrGFP（Stratagene社、ＵＳＡ）を、１０２コピーから１０８コピーまでの範囲の１０倍段階希釈で、参照標準として用いた。ｑＰＣＲを、LightCycler480（Roche社、ＵＳＡ）を用いて、９５０Ｃで１０分間の１サイクル、続いて、９５０Ｃで１５秒間、６００Ｃで３０秒間、及び７２０Ｃで５秒間の４５サイクルという条件下で実行した。遺伝子ノックダウンのレベルを、前に記載されているようなイムノブロッティング方法に従って、ｓｈＲＮＡウイルスを形質導入された細胞由来の１０ｕｇの総タンパク質に関して評価した。
【０１８７】
ｓｈＲＮＡウイルスの力価を測定する通常の方法を実施するためのレポーター遺伝子がＬＶ  ｓｈＲＮＡ系において存在しないため、遺伝子ノックダウン研究は、全試料及び対照ｓｈＲＮＡウイルスを同一の条件下で同時に産生し、その後、同数の細胞を処理するのに同体積のｓｈＲＮＡウイルスを用いることによる直接的比較を用いて、管理及び確証されなければならなかった。図４は、ｓｈＲＮＡ配列Ａ２及びＡ５がアネキシンＡ５発現を有意に下方制御したことを示している（図４Ａ）。同様に、Ｙ３、Ｙ４、又はＹ５の細胞への導入は、結果として、非哺乳類遺伝子を標的にする配列を有する対照（スクランブル）又はｓｈＲＮＡ配列を含まない対照（２９３Ｔ）と比較して、ＹＢ１の有意な下方制御を生じた（図４Ｂ）。したがって、これらの４つのｓｈＲＮＡ配列、すなわち、Ａ２、Ａ５、Ｙ４、及びＹ５を、その後の研究に用いた。
【０１８８】
ｓｈＲＮＡ配列、すなわち、Ａ２、Ａ５、Ｙ４、Ｙ５、又はスクランブルを保有する産生細胞を、ピューロマイシンタグ付けｓｈＲＮＡを含まない細胞を除去するために少なくとも１０日間のピューロマイシンの存在下での培養により、ＡＡＶ産生のために樹立した。最高７つの独立したノックダウン細胞株を、各ｓｈＲＮＡ配列について作製し、ＡＡＶベクターを産生するために用いた。変動を最小限にするために、ＡＡＶベクターを、５千万個を超える細胞を含有する１５ｃｍ直径プレートから産生させ、かつノックダウン細胞株と対照細胞株から同時に、同一の条件下で産生させ、その後、リアルタイムＰＣＲを用いてＡＡＶゲノム力価について定量化した。
【０１８９】
図５に示されているように、ｓｈＲＮＡ配列ＹＢ１＿Ｙ４の産生細胞への導入は、結果として、対照ｓｈＲＮＡスクランブルに対して、ＡＡＶ２ベクターゲノム力価の最高５０倍の増加（図５Ａ）、及びＡＡＶ８ベクターゲノム力価の１０倍の増加（図５Ｂ）を生じ、しかも、その同じＹ４  ｓｈＲＮＡ配列はＡＡＶ５産生に有意な影響を生じなかった（データ未呈示）。これは、３つの血清型のＡＡＶの間での内因的差異を示している。ノックダウン細胞におけるＹＢ１発現の低下は８０日間を超える間、継続したが、Ｙ４の最大の効果は、２０〜４０日間培養下にあった産生細胞においてのみ得られた（図５Ａ）。類似した時間依存性パターンはまた、ＡＡＶ８産生細胞においても観察された（図５Ｂ）。
【０１９０】
図６は、凍結保存から回復し、かつ２０〜８０日間培養下にあったノックダウン細胞の７バッチにおけるＹＢ１の有意な下方制御を示しており、バッチ間での比較性、及びＹＢ１ノックダウン細胞の持続可能性を実証している。
【０１９１】
図７は、１０５個の細胞あたり５ｍｌから１００ｍｌまでｓｈＲＮＡウイルスを増加させた場合、ＹＢ１調節解除のわずかな増加があったこと（図７Ａ）、及びｓｈＲＮＡを含有する５０ｍｌウイルスが用いられた場合、ベクターゲノム力価への最大効果が観察されたこと（図７Ｂ）を示しており、ｓｈＲＮＡを含有するウイルスの量を増加させた場合の、ベクター産生への飽和的及び潜在的毒性効果を示している。
【０１９２】
レンチウイルスベクター送達系を用いてまた、ＮＣＬ及びＮＰＭ１遺伝子を標的にする１０のｓｈＲＮＡ配列、すなわち、Ｎ１〜Ｎ５、及びＮ６〜Ｎ１０を、ＮＣＬ及びＮＰＭ１発現、それぞれへのそれらの効果についてスクリーニングした。
【０１９３】
図８Ａは、ｓｈＲＮＡ配列ＮＰＭ−Ｎ６〜ＮＰＭ−Ｎ１０（配列番号４〜８）の細胞への導入が、非哺乳類遺伝子を標的にするスクランブルｓｈＲＮＡを含む（スクランブル）、又はいずれのｓｈＲＮＡ配列をも含まない（２９３Ｔ）のいずれかである２つの対照細胞と比較しても、ＮＰＭ１発現の有意な下方制御を達成したことを示した。ｓｈＲＮＡ  ＮＰＭ−Ｎ６及びＮＰＭ−Ｎ９（図８Ａ、丸で囲まれている）は、試験された５つの配列の間で最も高い遺伝子ノックダウンを示し、したがって、次の調査のために選択された。ＮＰＭ１−Ｎ９及びＮＰＭ１−Ｎ６ノックダウン細胞におけるＮＰＭ１発現の低下は、ピューロマイシン選択培地中での培養後８０日間を超える間、持続し（図８Ｂ）、凍結保存から回復したノックダウン細胞においても持続した（図８Ｃ）。
【０１９４】
ＮＣＬ遺伝子を標的にする４つのｓｈＲＮＡ配列、ＮＣＬ−Ｎ１〜ＮＣＬ−Ｎ４（配列番号９〜１２）は、ＮＣＬ発現の部分的低下を示し、それらの中で、ＮＣＬ−Ｎ１及びＮＣＬ−Ｎ４が、より高い効果を生じ（図９Ａ、丸で囲まれている）、したがって、さらなる研究のために選択された。ＮＣＬ−Ｎ１及びＮＣＬ−Ｎ４のＮＣＬ発現へのノックダウン効果もまた、ピューロマイシン選択培地での培養後８０日間を超える間、持続し（図９Ｂ）、凍結保存後、持続した（データ未呈示）。
【０１９５】
図１０は、ｓｈＲＮＡ  ＮＰＭ１−Ｎ９でのＮＰＭ１の下方制御が、ＡＡＶ２／ＧＦＰのベクターゲノム力価の最高３５倍の増加（図１０Ａ）、及びＡＡＶ８／ＧＦＰの最高３０倍の増加（図１０Ｂ）をもたらしたことを示し、ＡＡＶ産生におけるＮＰＭ１タンパク質の重要な役割を示している。ベクターゲノム力価へのＮＰＭ１の上方制御効果は、ＡＡＶ２／ＧＦＰ（図１０Ａ）とＡＡＶ８／ＧＦＰ（図１０Ｂ）のどちらについても経時的変化を示し、約４０日間の培養下でのノックダウン産生細胞において、最高３０倍の増加という最大効果が観察され、遺伝子ノックダウン後最長９０日間、産生細胞において持続した。
【０１９６】
ＮＣＬの下方制御は、ＡＡＶ２ベクター産生への類似した上方制御効果を示し、ＡＡＶ２ゲノム力価の最高４０倍の増加があった。しかしながら、産生細胞の異なるバッチの間で２倍〜４０倍の範囲である有意な変動が存在した（図１１Ａ）。ＮＣＬの遺伝子ノックダウンは、ＡＡＶ２と比較して、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８ゲノム力価（それぞれ、図１１Ｂ及び１１Ｃ）へより低い上方制御効果（最高１０倍の増加）を生じた。ＮＣＬノックダウン産生細胞から有意な経時的変化は観察されなかった（データ未呈示）。
【実施例６】
【０１９７】
ＹＢ１のＣＲＩＳＰＲノックダウン
ｓｈＲＮＡの代替として、ＹＢ１発現をノックアウト又はノックダウンするためにＣＲＩＳＰＲゲノム編集を用いた。この研究に用いられるｇＲＮＡ配列を、ＹＢ１遺伝子配列を含むヒト１番染色体配列全体（受託番号ＮＣ＿０００００１．１１）を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プログラム（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）を用いて設計した。ｇＲＮＡ配列の４つのペア（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）（表４）を選択し、GeneArt CRISPRヌクレアーゼベクターキット（Life technology社、カタログ番号Ａ２１１７４）を用いて、ＹＢ１  ｇＲＮＡノックアウト産生細胞を作製した。
【０１９８】
４つのＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤのそれぞれについて、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡノックアウト細胞の２つのバッチ（Ｂ１及びＢ２）を作製した。各ｇＲＮＡペアについての親Ｂ１及びＢ２  ｇＲＮＡ産生細胞から、単細胞クローン（Ｃ１〜Ｃ５）をさらに導き出した。いずれのｇＲＮＡ配列も含まない親２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）を対照として用いた。さらに、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを試料負荷標準化のために用いた。
【０１９９】
【表４】
2017506885.tif 000010
【０２００】
ＹＢ１遺伝子ノックアウトは、合計１０の単細胞クローンにおいて観察された。図１２は、これらの３つのｇＲＮＡペアを用いた、ＹＢ１発現への効果を示している。２９３とラベルされたレーンは、２９３親細胞株を指す。Ｂ１及びＢ２は、単細胞クローニング前に作製されたバルクノックアウト細胞である。Ｃ１〜Ｃ５は、バルクノックアウト細胞から作製された単細胞クローンである。
【０２０１】
図１２から明らかであるように、ｇＲＮＡペアＡは、クローン細胞株Ｃ１においてＹＢ１発現を有意に阻害し、ｇＲＮＡペアＢは、バルクノックアウト細胞Ｂ２及びクローン細胞株Ｃ１〜Ｃ４においてＹＢ１発現を有意に阻害し、加えて、バルクノックアウト細胞Ｂ１においてＹＢ１発現を観察可能なほどに阻害し、ｇＲＮＡペアＣは、バルクノックアウト細胞Ｂ２及びクローン細胞株Ｃ２〜Ｃ４においてＹＢ１発現を有意に阻害し、加えて、クローン細胞株Ｃ１及びＣ５においてＹＢ１発現を観察可能なほどに阻害した。
【実施例７】
【０２０２】
ＹＢ１ノックダウン産生細胞の分子分析
ＡＡＶ産生へのＹＢ１の影響の分子機構を理解するために、ＹＢ１ノックダウン細胞におけるＡＡＶ２タンパク質（Ｒｅｐ及びＣａｐ）発現及びベクターＤＮＡ産生を系統的に分析した。図１３Ａは、一過性トランスフェクション後２４時間目及び７２時間目、それぞれにおける、ＹＢ１ノックダウン細胞におけるｒｅｐ遺伝子発現の、スクランブル細胞におけるそれと比較しての１２倍増加及び４倍増加を示し、天然ＹＢ１のｒｅｐ遺伝子発現へのマイナス効果を示している。対照的に、ＹＢ１ノックダウン細胞における総ＡＡＶ２カプシドタンパク質の産生（１．２９±０．２×１０１４カプシド／１０８細胞）は、スクランブル細胞におけるそれ（８．８７±０．１×１０１４カプシド／１０８細胞）の約７分の１であり（図１３Ｂ）、天然ＹＢ１の存在がｃａｐ遺伝子発現に有益であることを示している。さらに、採取されたベクター試料におけるカプシドタンパク質の量は、ＹＢ１ノックダウン細胞（６．２７±０．３×１０１３カプシド／１０８細胞）とスクランブル（６．７７±０．２×１０１３カプシド／１０８細胞）との間で同等であり（図１３Ｂ）、ベクターカプシド粒子形成が、細胞において産生されるカプシドタンパク質の量に依存しない可能性があること、及び細胞において形成され得る粒子の数に制限があったことを示している。
【０２０３】
ＤＮＡ組込みを、ＹＢ１  ｓｈＲＮＡ組込みについてＵ６配列を標的にするリアルタイムｑＰＣＲ、ＡＡＶ２パッケージングプラスミドpRep/Cap及びphrGFP組込みについて、それぞれ、ｒｅｐ及びＣＭＶプロモーター配列を標的にするリアルタイムｑＰＣＲを用いて、系統的に分析した。プールされたＹＢ１ノックダウン細胞における細胞あたり平均１コピーのＹＢ１  ｓｈＲＮＡと等価の、ＹＢ１ノックダウン細胞において１．３±０．１７×１０８コピー／１０８細胞のＹＢ１  ｓｈＲＮＡ配列が検出された。ＡＡＶパッケージングプラスミドpRep/Cap及びphrGFPの組込みは、スクランブル細胞とＹＢ１ノックダウン細胞との間で同等であり、１０８細胞あたり、約２×１０７コピーのRep/Cap及び約３×１０７コピーのphrGFPであった。
【０２０４】
ＹＢ１遺伝子ノックダウンのＡＡＶ２ベクターＤＮＡの産生への影響を分析するために、ＡＡＶパッケージングプラスミドの一過性トランスフェクション後７２時間目のＹＢ１ノックダウン細胞における、（１）パッケージングされたベクターＤＮＡとパッケージングされていないベクターＤＮＡの両方を含有する総ベクターＤＮＡのコピー、（２）パッケージングされていないベクターＤＮＡのコピー、及び（３）パッケージングされたベクターＤＮＡのコピーを、ベクター特異的ＣＭＶ配列を標的にするｑＰＣＲを用いて系統的に定量化した。総ベクターＤＮＡを、プラスミドＤＮＡをベンゼナーゼ（benzenase）で除去し、細胞膜及び核を試料の凍結融解後に除去し、ＡＡＶカプシドをプロテイナーゼＫで解体して、パッケージングされたベクターＤＮＡをカプシドから遊離させることにより調製した。組み込まれていないベクタープラスミドＤＮＡもまた、細胞質における総ベクターＤＮＡコピーに寄与する可能性があるが、ＹＢ１細胞とスクランブル細胞の両方について、トランスフェクション及び産生手順が並行して実施され、かつ同一であったことを考慮すると、細胞質におけるプラスミドＤＮＡの量は、同様に同等であるはずであり、相対的な総ベクターＤＮＡ産生の計算を有意に変化させることはないだろう。図１３Ｃは、総ベクターＤＮＡ（＋ＰＫ）のコピーが、ＹＢ１ノックダウン産生細胞において（１．９３±０．０８×１０１３コピー／１０８細胞）、スクランブル細胞におけるそれ（１．４６±０．５×１０１２コピー／１０８細胞）の約１３倍であったことを示し、ＹＢ１遺伝子ノックダウンがベクターＤＮＡ産生を促進したことを示している。
【０２０５】
パッケージングされていないＡＡＶ２ベクターＤＮＡを、パッケージングされたベクターＤＮＡをＡＡＶカプシドから遊離させるためのプロテイナーゼＫ処理がない（−ＰＫ）点を除いて、総ＤＮＡ試料についての調製と類似した方法で調製した。パッケージングされていないベクターＤＮＡのコピーは、ＹＢ１ノックダウン細胞において（２．０２±０．５×１０１２コピー／１０８細胞）、スクランブル細胞におけるそれ（２．６１±０．８×１０１１コピー／１０８細胞）の約８倍であった（パッケージングされていないＤＮＡ、図１３Ｃ）。物理的なベクターゲノム力価を表す、パッケージングされたＡＡＶ２ベクターＤＮＡは、細胞質におけるパッケージングされていないベクターＤＮＡを除去するためのＤＮアーゼＩ処理（＋ＤＮアーゼＩ）の添加、続いて、パッケージングされたベクターＤＮＡをカプシドから遊離させるためのプロテイナーゼＫ処理（＋ＰＫ）により調製した。パッケージングされたベクターＤＮＡ（＋ＤＮアーゼＩ／＋ＰＫ、図１３Ｃ）のコピーは、ＹＢ１ノックダウン細胞（７．９７±０．５×１０１０コピー／１０８細胞）において、スクランブル細胞におけるそれ（２．１６±０．３×１０１０コピー／１０８細胞）の４倍であった（図１３Ｃ）。この特定のセットの分子研究において、本発明者らが、ＹＢ１ノックダウン細胞におけるＡＡＶ２ベクターゲノム力価の、スクランブル細胞におけるそれと比較して、４倍の（有意な）増加を観察したことは注目されるべきである。
【０２０６】
要約すれば、総ベクターＤＮＡ（１３倍増加）、パッケージングされていないベクターＤＮＡ（８倍増加）、及びパッケージングされたベクターＤＮＡ（４倍増加）における倍変化の間で観察された有意な差は、ＹＢ１産生系におけるＡＡＶベクターＤＮＡパッケージングの改善の可能性を明確に示している。さらに、ＹＢ１ノックダウン細胞由来の採取されたベクター試料の同じバッチにおいて、スクランブル細胞由来と比較して、カプシドタンパク質の量が同等であるが（図１３Ｂ）、パッケージングされたＤＮＡのコピー（図１３Ｃ）が４倍であったことを考慮すれば、その結果は、ＡＡＶ産物における空粒子の数を低下させることにおける、ＹＢ１遺伝子ノックダウンの注目に値する優位性を明らかにした。
【０２０７】
考察
本発明者らは、ＡＡＶベクター産生におけるＹＢ１の重要な役割を初めて実証している。ＹＢ１遺伝子を標的にして下方制御するｓｈＲＮＡ配列Ｙ４をＡＡＶ産生細胞へ導入することにより、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８、それぞれのベクターゲノム力価の最高５０倍及び１０倍の増加が生じた。ＹＢ１ノックダウン細胞の分子特性は、スクランブル細胞と比較して、ＹＢ１ノックダウン細胞において、ｒｅｐ発現の約１２倍の増加、ベクターＤＮＡ産生の約１３倍の増加、及びｃａｐ発現の約７分の１の減少を示し、ＡＡＶ生態におけるＹＢ１遺伝子の意義深い役割を明らかにした。
【０２０８】
ＹＢ１は、ほとんど全てのＤＮＡ及びｍＲＮＡ依存性過程に関与するＤＮＡ及びＲＮＡ結合性タンパク質である。ＹＢ１はｍＲＮＡをパッキングして安定化させ、遺伝子制御を異なるレベルで媒介する。ＹＢ１は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の両方と結合するが、ｓｓＤＮＡに対してはるかに高い結合親和性を有する。ＹＢ１が、プロモーターの領域におけるｓｓＤＮＡを安定化させることにより活性化タンパク質の結合を阻止し、又は配列特異的様式で増強することが示唆されている。特に、ＹＢ１は、ｓｓＤＮＡモチーフGGGG(TT)に対して最も高い結合親和性を有する。ＡＡＶ２  ｓｓＤＮＡゲノムの分析により、そのような一本鎖GGGG(TT)モチーフが、ＡＡＶ２ゲノム（ＮＣＢＩ配列  ＮＣ＿００１４０１．２）のヌクレオチド１３７〜１４２のＡＡＶ２  ＩＴＲ領域内に提示されていることが示され、ＹＢ１タンパク質に対する可能性のあるＡＡＶ  ＤＮＡ結合部位を示している。ＩＴＲ欠失変異誘発により、一本鎖GGGG(TT)モチーフを網羅し、かつそのすぐ後に１２５ヌクレオチド長のヘアピンが続く２０ヌクレオチドのＤ配列（ヌクレオチド１２６〜１４６）が、ＡＡＶ  ＤＮＡゲノムのカプシド封入に必要とされることが示され、したがって、ＡＡＶについてのパッケージングシグナルとして提案されており、特に、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端領域が、Ｄ配列と結合し、その結果として、ＡＡＶ  ｓｓＤＮＡの、あらかじめ構築されたＡＡＶカプシドへのカプシド封入を生じる。したがって、ＹＢ１とＡＡＶカプシドの両方の、ＩＴＲ  Ｄ配列領域との結合に関する能力は、ＹＢ１とＡＡＶカプシドの競合を余儀なくし得、ＡＡＶゲノムのカプシド封入を損ない得る。
【０２０９】
本発明者らによるＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）のゲノムの分析により、このGGGG(TT)モチーフが、ＡＡＶ２ゲノム（ＮＣＢＩ配列  ＮＣ＿００１４０１、バージョンＮＣ＿００１４０１．２  ＧＩ：１１０６４５９１６）の位置１３７〜１４２の逆位末端配列（ＩＴＲ）領域内に存在することが示されている。これは、ＹＢ１に関するＡＡＶ２ゲノムへの可能性のある結合部位を示す。本発明者らは、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含むＡＡＶ５及びＡＡＶ８の血清型のキメラ型（しかし、それぞれ、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８のカプシドタンパク質を含む）を作製している。したがって、GGGG(TT)モチーフがＹＢ１に関する唯一の結合部位であるとすれば、ＹＢ１は、ＡＡＶ２、並びにＡＡＶ５及びＡＡＶ８のキメラ型についてのウイルス粒子産生への類似した効果を生じるだろうことが予想される。しかしながら、本発明者らは、ＹＢ１ノックダウン細胞において産生されるＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８ベクターの間で、スクランブル対照に対してのＡＡＶベクター力価において有意な差があることを実証している。特に、本発明者らは、ＹＢ１ノックダウンを有する産生細胞において、ＡＡＶ８力価の１０倍の増加、及びＡＡＶ５力価の有意な増加なしと比較して、ＡＡＶ２ベクター力価の５０倍増加があることを見出した。これは、ＹＢ１ノックダウンのＡＡＶベクター産生への効果に関するいくつかのＡＡＶカプシドタンパク質特異性エレメント、加えてＤＮＡ配列特異的効果もまた存在する可能性があることを示唆している。
【０２１０】
タンパク質−タンパク質相互作用に関与する３つのＹＢ１ドメイン、すなわち、Ａ／Ｐ、ＣＳＤ、及びＣＴＤがある。特に、ＹＢ１タンパク質は、ｐ５３、Ａｋｔキナーゼ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、及びＴＡＴＡ結合性タンパク質などの重要な制御タンパク質と相互作用することが知られている。ＹＢ１はまた、ＨＩＶ  ＴＡＴ、ポリオーマウイルスのラージＴ抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，Hepatitis C Virus）タンパク質ＮＳ３／４Ａ、及びインフルエンザのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ，ribonucleoprotein）などのウイルスタンパク質と結合することによりいくつかのウイルスの複製において重要な役割を果たすことが知られている。実際、ＹＢ１のｓｈＲＮＡノックダウンは、最高８０％のＨＣＶ力価の低下を生じることが示されている。その研究において、ＹＢ１のノックダウンは、ウイルスタンパク質の発現にも、ウイルスＲＮＡの産生と安定性にも影響しないことが見出され、ＹＢ１のノックダウンが、ウイルス構築のためにコアタンパク質をリクルートするために必要とされるＹＢ１−ＮＳ３／４Ａ  ｖＲＮＡ相互作用の形成を破壊したことを示している。
【０２１１】
アデノウイルス複製におけるＹＢ１の役割は、ＹＢ１の下方制御が、ＡＡＶ産生を多くも５０倍、有意に向上させたという本発明者らの所見の理解に特に関係している。アデノウイルス感染細胞におけるアデノウイルスタンパク質Ｅ１ＢのＹＢ１との相互作用は、結果として、核におけるＹＢ１の蓄積、ＹＢ１のＥ２Ａ遺伝子の活性化、及びその後、アデノウイルスＤＮＡ複製の開始を生じることが示されている。Ｅ１非依存性様式でのＹＢ１制御性アデノウイルスＥ２プロモーターの過剰発現は、アデノウイルスＤＮＡ複製だけでなく、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター由来の感染性粒子の産生の２〜３ｌｏｇ増加もまた、もたらした。結果として、ＹＢ１の過剰発現は、アデノウイルスに基づいたベクター開発及びウイルス療法にさらに利用されている。
【０２１２】
これまで、ＡＡＶウイルスに関してＹＢ１の直接的関連は報告されていない。しかしながら、ＡＡＶ生活環におけるアデノウイルスの役割は十分、立証されており、これは、ＹＢ１ノックダウンのＡＡＶベクター産生への増強の背後の機構を理解するのを促す可能性がある。本実施例に用いられたＡＡＶ産生系は、産生細胞において安定的に、又はＡＡＶのためのヘルパー機能を有するプラスミドから一過性にのいずれかで発現した４つのアデノウイルスエレメント、すなわち、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を提供する。Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム６は、一本鎖ＡＡＶゲノムの、ＤＮＡ複製における次のステップについての基質である二本鎖型への変換にとって重要である。タンパク質Ｅ２Ａは、ウイルスＤＮＡ複製において、ＡＡＶウイルスＤＮＡと結合し、ＤＮＡ伸長を促進し、伸長した鎖をそれの鋳型から移動させることにより、鍵となる役割を果たす。ＹＢ１とＥ２Ａのどちらも、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ，DNA binding protein）であるが、それぞれ、細胞起源及びウイルス起源という点で、お互いに異なる。ＹＢ１及びＥ２Ａは、一本鎖ＤＮＡに対する同等の結合優先を共有する。アデノウイルスＥ２Ａは、ＡＡＶ生活環において細胞性ＤＢＰを超える最高の制御性を有し、したがって、ＹＢ１の下方制御は、ＹＢ１のＡＡＶ  ＤＮＡへの結合の競合を低下させ、その結果として、Ｅ２Ａ−ＡＡＶ  ＤＮＡ相互作用の増強、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製の効率、及び最終的には、ＡＡＶベクターゲノム力価の増加を生じることが考えられる。この推測は、Ｅ２Ａを含むＡＡＶヘルパー構成要素を欠く細胞が、まだなお少量のＡＡＶ粒子を産生することができ、ＡＡＶ生活環における、豊富であるがあまり効率的ではない細胞性ＤＢＰ、例えば、ＹＢ１からの低レベルの細胞性ヘルパー機能を示している観察によって、裏付けられ得る。
【０２１３】
他方、アデノウイルスタンパク質Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂ及びＥ２Ａは、ＡＡＶ２  ｐ５プロモーターを活性化させ、その結果ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子の転写及び発現を生じることにおいて重要な役割を果たす。ＹＢ１の血管内皮増殖因子プロモーターとの結合が、他の転写因子の結合を阻止し、転写及び翻訳の阻害を生じたことが、以前に実証されている。プロモーターのｓｓＤＮＡ領域とのＹＢ１の結合が、ｓｓＤＮＡの安定化を生じ、それがまた、遺伝子転写及び翻訳を阻害したことも示されている。したがって、ＹＢ１の下方制御は、Ｅ２ＡのＡＡＶ２ｐ５プロモーターとの結合を促進し、そのことが、本明細書に報告されているこの実験において観察された、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子発現及びベクター力価の有意な増加に相乗的に寄与したことは考えられる。
【０２１４】
本実施例は、ＡＡＶ産生におけるＹＢ１の血清型特異的役割を示し、特に、ＹＢ１のノックダウンが、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８産生をそれぞれ、５０倍及び１０倍、向上させたが、ＡＡＶ５産生に有意な効果を生じなかった。調べられた３つの血清型のＡＡＶベクター、すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８は、可能性のあるＹＢ１結合性モチーフGGGG(TT)を共有する同一のＩＴＲ配列を有し、かつアデノウイルス由来の同じヘルパーエレメントの存在下で産生された。ＡＡＶ２及びキメラＡＡＶ８ベクターはさらに、Rep/Capパッケージングプラスミド内に同じＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子配列を共有する。ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８ベクターの３つの血清型の間での差異に関して、血清型特異的ｃａｐ遺伝子配列は、それらの中の１つに寄与する。ＡＡＶ２及びＡＡＶ８カプシドタンパク質は、それらの一次配列において８２％より高い相同性、及びカプシドタンパク質の構造において非常に類似した全体的位相幾何学を共有する。ＡＡＶ２カプシドタンパク質とＡＡＶ８カプシドタンパク質との間での顕著な構造的差異は、カプシド表面に位置し、カプシド構築及びゲノムパッケージングに関与するというよりむしろ、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８の標的細胞との結合性に関連していることが知られており、さらに、カプシド構築に関してＡＡＶ２とＡＡＶ８との間での類似性が実証されている。対照的に、ＡＡＶ５は、最も多岐にわたるＡＡＶ血清型の１つであり、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８を含む他の血清型とたった約５５％の配列相同性を共有するのみである。小さい方のＨＩ及びＶＲ−ＩＶループ、並びに大きい方のＶＲ−ＶＩＩを含むＡＡＶ５カプシドタンパク質の独特な構造的特徴は、カプシド構築、ゲノムパッケージング、及び抗原決定基の特異性を支配するＶＰ領域に位置し、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクター産生において観察された差異を説明し得る。本明細書で開示された結果はまた、ＹＢ１遺伝子ノックダウンが、結果として、ＹＢ１のＡＡＶベクター産生への影響の分子機構の根底にある、ｒｅｐ遺伝子発現及びベクターＤＮＡ産生の、それぞれ、最高１２倍及び１３倍の増加、並びに、ｃａｐ遺伝子発現の約７分の１の減少を生じたことを示している。
【０２１５】
別の著しい違いは、ｒｅｐ遺伝子を有するＡＡＶ５が、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターにおけるＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子とたった５８％の相同性を共有するのみであることである。さらなる配列分析により、ＡＡＶ２とＡＡＶ５は、異なるプロモーター、すなわち、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５のｒｅｐ転写及び翻訳について、それぞれ、ｐ５及びｐ７を用いることが示された。ｒｅｐ遺伝子発現におけるｐ７の効率のために、ＡＡＶ５  ｐ７プロモーターは、ＡＡＶ２  ｐ５と比較して、２９３細胞においてＡｄ５エレメントへの依存性が低いことが示された。他方、アデノウイルスタンパク質Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂ及びＥ２Ａは、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子の転写及び発現を生じるＡＡＶ２  ｐ５プロモーターを活性化することにおいて重要な役割を果たす。ＹＢ１の細胞プロモーター及びウイルスプロモーターへの制御の機構に関してかなりの数の報告がある。例えば、ＹＢ１のＶＥＧＦプロモーターとの結合は、他の転写因子の結合を阻止し、その結果として、転写及び翻訳の阻害を生じる。プロモーターのｓｓＤＮＡ領域とのＹＢ１の結合が、結果として、ｓｓＤＮＡの安定化を生じ、そのことがまた遺伝子転写及び翻訳を阻害したことも示されている。したがって、ＹＢ１の下方制御が、Ｅ２ＡのＡＡＶ２ｐ５プロモーターとの結合を促進し、そのことが、本発明者らが観察したＡＡＶ２及びＡＡＶ８力価の有意な増加に相乗的に寄与したことが考えられる。
【０２１６】
ＤＮＡ複製、ＡＡＶ転写及び翻訳におけるＹＢ１の可能性のある役割を考慮すれば、ＹＢ１の調節解除が、結果として、ＡＡＶ２  ｓｓＤＮＡ、例えば、ＩＴＲ配列についてのＹＢ１のＥ２Ａとの競合を低下させることによるＡＡＶ  ＤＮＡ複製の増加だけでなく、ＡＡＶ２ｐ５プロモーターの制御下のＲｅｐ及びＣａｐ発現の増加も生じたことは考えられる。加えて、ＡＡＶ２／２ベクターにおける天然ＡＡＶ２ｐ５プロモーターが、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質の発現において、キメラＡＡＶ２／８  Ｒｅｐ／Ｃａｐと比較して、より効果的に実施し得、ＡＡＶ２産生及びＡＡＶ８産生において、それぞれ、観察された５０倍の増加、及び１０倍の増加の原因となり得る。ＡＡＶ５ベクターの場合、ベクターＤＮＡ複製は、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８についてと類似した競合に基づいた機構によって、同様に増加する可能性がある。しかしながら、ＹＢ１とアデノウイルスヘルパー機能の組み合わせにあまり依存しないＡＡＶ５ｐ７プロモーターの制御下での低レベルのＡＡＶ５  Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現は、過剰なＡＡＶベクターゲノムが完全ＡＡＶ５ベクターへとパッケージングされることを制限している可能性があり、その結果として、産生細胞におけるＡＡＶベクター  ＤＮＡの蓄積を生じ得る。
【０２１７】
要約すれば、本発明者らは、ＹＢ１のＡＡＶベクターとの会合を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同定し、イムノブロッティングを用いて確証しており、ＹＢ１遺伝子ノックダウンのＡＡＶベクター産生への有意な増強を初めて、明らかにした。ＡＡＶ２ベクター力価の有意な増加は、スクランブル細胞と比較して、ＹＢ１ノックダウン細胞におけるｒｅｐ遺伝子発現及びベクターＤＮＡ産生の有意な増加により得る。ＡＡＶ生活環におけるＹＢ１の直接的関与は報告されていないが、ＹＢ１が、ＡＡＶベクターＤＮＡ複製の妨害を含む、ＡＡＶ産生にマイナス効果を発揮することが推測される。これは、ＩＴＲ配列及びＡＡＶ２ｐ５プロモーターとの結合についてＥ２Ａとの競合により媒介され得、ＡＡＶ２ｐ５プロモーターとの結合により、及び活性化タンパク質、例えば、Ｅ２Ａの結合を阻止することにより、（ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質などの）ＡＡＶウイルスタンパク質の転写及び発現を阻害する。ＹＢ１のＡＡＶへの効果は、アデノウイルスのヘルパーウイルス依存性であることが考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017506885.tif 000032
2017506885.tif 000033
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