(57)【要約】  窒素固定細菌を例えば最近刈られた草などの成長植物の傷に投与するステップを含んでなる、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）などの窒素固定細菌を植物に接種する方法。この様式の接種は、草の緑色増大を含む増殖促進特性をもたらす。本方法で使用するのに適した新規組成物もまた、これらを製造するためのキットと合わせて記載され、特許請求される。
2017525688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素固定細菌を成長植物の傷に投与するステップを含んでなる、窒素固定細菌を植物に接種する方法。
【請求項２】
前記窒素固定細菌が、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記窒素固定細菌が、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と組み合わされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記傷が、芝刈り、草刈り、株出し栽培、剪定、家畜による摂取または収穫の結果である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
予備段階において、前記植物が、芝刈り、草刈り、株出し栽培、剪定または収穫の対象である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記窒素固定細菌が、前記予備段階の１〜２時間以内に適切に塗布される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記窒素固定細菌が、組成物の形態で前記植物の傷に塗布される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、１ミリリットルあたり１〜１×１０７個の窒素固定細菌を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、１ミリリットルの組成物あたり５０〜２００個の窒素固定細菌を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、農業上許容される界面活性剤をさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、非イオン性合成洗剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤の７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残部がリノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、多糖類をさらに含んでなる、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、多糖類および農業上許容される界面活性剤の双方を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖類が、滲出ガム多糖類である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記滲出ガム多糖類が、アラビアガムである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が、多年生、二年生または永続的一年生植物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物が、果樹または低木、つる植物、飼料作物、観賞用芝、生垣、森林、園芸植物またはハーブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物が、刈草である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）と、多糖類または界面活性剤またはそれらの組み合わせから選択されるさらなる成分とを含んでなる、農業上許容される組成物。
【請求項２１】
１ミリリットルあたり１〜１００個の細菌を含んでなる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記多糖類が、滲出ガム多糖類である、請求項２０または請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記滲出ガム多糖類が、アラビアガムである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記界面活性剤が、非イオン性合成洗剤である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記界面活性剤の７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残部がリノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
０．０００５〜１０％ｖ／ｖの界面活性剤を含んでなる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記窒素固定細菌のための栄養素をさらに含んでなる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株をさらに含んでなる、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
（ｉ）窒素固定細菌、および（ｉｉ）農業上許容される界面活性剤、または多糖類またはそれらの組み合わせを含んでなるさらなる成分を含んでなる、農業上許容される組成物を形成するためのキット。
【請求項３０】
前記窒素固定細菌が、凍結乾燥形態である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記さらなる成分が、希釈されて前記窒素固定細菌と混合されて、農業上許容される組成物を生成してもよい濃縮物である、請求項２９または請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
植物のクロロフィルレベルを増大させることで、植物の緑色を増大させるために実施される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＭＩ５０４９９８（以前のＩＭＩ５０１９８６）またはＩＭＩ５０４９５８（以前のＩＭＩ５０４８５３）から選択される、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素固定細菌を植物に接種する方法と、方法で使用するのに適した組成物およびキットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
以前、アセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）として知られていた、窒素固定細菌であるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｉｌｌｉｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：３６１−３６４；１９８９）は、最初にサトウキビの根と茎の中から単離された（Ｃａｖａｌｃａｎｔｅ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ  Ｖｏｌ．１０８，ｐ．２３−３１）。１５Ｎ２取り込みによって、ジアゾトロフィクス（Ｇ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）は、サトウキビ植物内で窒素を固定すること（Ｓｅｖｉｌｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１４：３５８−３６６；２００１；Ｂｏｄｄｅｙ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ  ２５２：１３９−１４９；２００３）、そして固定窒素のほぼ半量を植物が潜在的に利用できる形態で排出する能力を有すること（Ｃｏｊｈｏ，Ｅ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０６：３４１−３４６；１９９３）が実証されている。細菌は、根粒着生なしに、サトウキビ根分裂組織細胞間および側根出現点に侵入し、細胞間に、そしてまた木部内に、コロニー形成する（Ｊａｍｅｓ，Ｅ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５２：７４７−７６０；２００１）。その下で、Ｇｄの細胞内コロニー形成が起こり、非結節性内共生窒素固定を可能にし得る条件が、実証されている（ＥＰ−Ｂ−１４２２９９７  ａｎｄ  Ｃｏｃｋｉｎｇ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１，ｐ７４−８２）。具体的には、細菌は、植物の発芽時成長時、またはその７日以内に、植物の成長培地に投与される。
【０００３】
国際公開第２０１１／１４４７４１号パンフレットは、サトウキビ茎内に注入されて、窒素固定を向上させてもよい、Ｇｄなどの細菌を提案する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
明らかにこのような技術は、いかなる大規模農業操作にも応用し得るものではない。
【０００５】
出願人らは、成長植物に、窒素固定細菌を成功裏に接種し得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に従って、窒素固定細菌を成長植物の傷に投与するステップを含んでなる、窒素固定細菌を植物に接種する方法が提供される。
【０００７】
植物組織中の傷、特に傷表面に塗布された場合、引き続く植物成長を促進させることが分かった。例えば、バイオマスまたは収率が向上されてもよく、および／または開花数が増大してもよい。これは、例えば、欧州特許Ｂ−１４２２９９７第号明細書に記載されるのと同様の窒素固定細菌による植物組織のコロニー形成に起因してもよいが、このようにして塗布された時に、これが起こってもよいという事実は、驚くべきである。植物組織内にコロニー形成した窒素固定細菌は、植物成長を促進する細胞内窒素源を提供してもよい。したがって本発明の方法は、成長植物に植物成長促進処理を投与する、有用な手段を提供する。
【０００８】
窒素固定細菌は、適切には、植物細胞内に位置するようになってもよいものであるべきである。特定の実施形態では、これは、例えば、どちらもそれぞれ２０１２年９月２１日、および２０１５年５月２２日にＣＡＢＩ（ＵＫ）に寄託された、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＩＭＩ株５０４９９８（以前のＩＭＩ５０１９８６）またはＩＭＩ５０４９５８（以前のＩＭＩ５０４８５３）などのグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）などの細胞内コロニー形成共生窒素固定細菌である。このような株は新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。代案としては、窒素固定細菌は、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属の種であってもよい。その他の窒素固定細菌としては、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ベイジェリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびスピリルム・リポフェルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）が挙げられる。
【０００９】
特定の実施形態では、窒素固定細菌は、英国特許出願第１４００８４０．３号明細書の優先権を主張する、出願人らの同時係属国際特許出願に記載されるように、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と一緒にまたは組み合わせて投与される。出願人らは、このような株が、窒素固定細菌の活性を増大させてもよいことを見出した。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の適切な株としては、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、特にテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株である。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、別々にまたは窒素固定細菌との混和材料中のどちらかで。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、窒素固定細菌との密接混和材料中にあってもよく（そして確かに、ＩＭＩ５０１９８６（現在のＩＭＩ５０４９９８）は、Ｇｄとテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の共同体に分類されている）、またはそれは、共培養形態または混合培養形態で投与されてもよい。
【００１０】
傷は、偶発的または自然損傷の結果であってもよく、その上で、追加的な窒素可用性が修復成長を促進してもよい。しかし、特定の実施形態では、傷は、芝刈り（観賞用芝）、草刈り（サイレージおよび乾草作物）、株出し栽培（バナナ、パイナップル、サトウキビ、ソルガム、イネ、キマメ、綿、アバカ、ラミー）、剪定（果樹、ブドウの木）、家畜による摂取または収穫などの処理によって引き起こされる、損傷の結果である。その中で植物が不注意にまたは不完全に損傷を受けることもある、砕土などのその他の処理は、場合によっては適切でないこともある。特に、傷は、葉または茎などの植物の「地上」部分に見られる。
【００１１】
そのため、本発明の方法は、特に、芝刈り、草刈り、株出し栽培（ｒａｔｉｏｎｉｎｇ）、剪定によって、または収穫によって、植物に「損傷」を与える予備段階をさらに含んでなってもよい。窒素固定細菌は、適切には、植物に損傷が与えられてから、例えば４８時間以内、例えば２４時間以内、１０時間以内など、適切には１〜２時間以内など、このような処理の実施から比較的短い時間内に塗布される。
【００１２】
細菌の送達は、傷領域、特に表傷面に、組成物の形態の適切な調合物を塗布することで得られる。組成物、液体、ゲル、ペーストの形態であってもよく、それは直接、または希釈形態で塗布されてもよく、またはそれは使用前に水などの液体に溶解される、粉末または顆粒組成物などの固体組成物の形態であってもよい。固体組成物中では、細菌は、通常、水の添加によって戻せる乾燥形態で、例えば、凍結乾燥形態で使用される。所望ならば、細菌の高い生存率および安定性を維持するために、細菌は、当該技術分野で公知の方法を使用してマイクロカプセル化されてもよい。
【００１３】
特定の実施形態では、組成物は、植物上に噴霧するに適した形態であり、したがって液体または固体形態、特に液体形態であってもよい、希釈用濃縮物を含んでなり、またはそれは、直接噴霧されてもよい希釈水性組成物を含んでなってもよい。代案としては、組成物は、例えば、その中で植物創面が液浸によって浸漬されてもよいものであってもよい。
【００１４】
任意の特定の例で投与される窒素固定細菌の量は、処理される種子タイプ、使用される窒素固定細菌の特定の株、要求される発芽増大のレベルおよび投与方法、ならびに要求される効果などの要素次第で、変動する。しかし典型的に、１ミリリットルの組成物あたり１〜１×１０７個の細菌を含有する溶液が塗布され、例えば１ミリリットルの組成物あたり１０〜１０３個の細菌、例えば１ミリリットルの組成物あたり５０〜２００個の細菌、１ミリリットルの組成物あたり１００個の細菌などが、植物の傷に投与される。このような溶液は、例えば、光学濃度を調べることで容易に検出可能なレベルに細菌を培養し、次に溶液をそれ相応に希釈することで得られてもよい。
【００１５】
出願人らは、例えば、特定の細菌では、バイオマスなどの特性に対する効果が、塗布された細菌量によって用量依存様式で影響を受けることを発見した。これは、処理の目的次第で、異なる用量が投与されてもよいことを意味する。例えば、草の場合、牧草地ではバイオマスが最大化することが要求されてもよいのに対し、観賞用芝または芝草では、緩慢な成長が好ましくあってもよい。このような場合、投与される細菌量は、以下で例示されるように、標的草種に最適なバイオマス生産量を提供するように選択される。
【００１６】
特定の実施形態では、組成物は、窒素固定細菌のための栄養素をさらに含んでなり、例えば、組成物は、欧州特許第Ｂ−１４２２９９７号明細書に記載されるように、３％ｗ／ｖスクロースを含んでなってもよい。
【００１７】
窒素固定細菌は、組成物の唯一の活性成分であってもよく、またはそれは必要に応じて、殺虫剤、殺真菌剤または植物成長調節物質などの追加的な農芸化学的活性成分と組み合わされてもよい。
【００１８】
組成物は、増粘剤、分散剤、希釈剤、湿潤剤、固体担体などの当該技術分野で公知の添加剤または賦形剤をさらに含んでなってもよい。
【００１９】
特定の実施形態では、組成物は、多糖類または農業上許容される界面活性剤またはこれらの組み合わせをさらに含んでなる。
【００２０】
特定の実施形態では、組成物は、農業上許容される界面活性剤をさらに含んでなる。界面活性剤の存在は、組成物が、傷表面の全体にわたって比較的自由に流動して、窒素固定細菌の侵入を促進できることを確実にする。
【００２１】
適切な界面活性剤または洗剤としては、例えば「ツイーン」（登録商標）のようなツイーン８０の商品名の下に販売されるものなどの非イオン性洗剤が挙げられる。
【００２２】
ツイーン８０は非イオン性合成洗剤であり；７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残部は、リノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである。１％溶液のｐＨは、５．５〜７．２の範囲である。それは、物質を医療用および食品中で乳化して分散するために、広く利用されている。それは因子抗菌剤としての活性が、わずかまたは皆無である（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：１９８６），ｐ．２８９）。
【００２３】
植物の傷に投与される界面活性剤の量は、窒素固定細菌（および下でさらに詳しく説明されるように、任意選択的に多糖類）と組み合わせると、植物成長促進効果を生じるのに十分であるべきである。これは、特定の界面活性剤、処理理される植物のタイプ、傷の性質、用いられる窒素固定細菌の特定の株、および投与方法などの様々な要素次第で変動する。しかし、典型的に、組成物は、０．０００５〜１０％ｖ／ｖ、０．０００５〜０．５％ｖ／ｖなど、例えば、０．０００５〜０．２％ｖ／ｖをはじめとして０．０００５〜１％ｖ／ｖ、例えば０．０００５〜０．１５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖなどを含んでなる。
【００２４】
さらなる実施形態では、組成物は多糖類を含んでなる。組成物で利用される適切な多糖類としては、植物、動物または微生物源に由来する、親水コロイド多糖類が挙げられる。
【００２５】
特に、これらとしては、多糖類アラビアガム、ガティガム、カラヤガム、およびトラガカントガムなどの滲出ガム；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは微結晶セルロースなどのセルロース誘導体；例えば、コーンスターチ、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、米デンプン、小麦デンプンをはじめとするデンプンおよび誘導体と、α化デンプン、酸化デンプン、エチル化デンプン、デンプンデキストリンまたはマルトデキストリンなどのそれらの修飾バージョン；ペクチン；寒天などの海藻に由来する多糖類；アルギン酸塩；カラゲナン；およびファーセレラン（ｆｕｃｅｌｌａｒａｎ）；グアーガムおよびローカストビーンガムなどの種子ガム；キサンタンガムおよびジェランガムなどの微生物発酵に由来する多糖類；およびキトサンなどの窒素含有多糖類；またはこれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
特定の実施形態では、多糖類は、アラビアガム、ガティガム、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの滲出ガム多糖類である。多糖類の特定の例は、アラビアガムである。
【００２７】
アラビアガムは、アカシア樹の異なる種から得られる滲出液から採取される天然ガムであり、（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（２０１０）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：１１，１３９８−１４０５）；それは複合多糖であって、塗料、糊、医薬品、繊維製品、および食品をはじめとする、幅広い工業部門で広範に使用されている。アカシア樹木からのアラビアガムは、カルシウム、マグネシウム、およびカリウム塩としてのガラクトース、ラムノース、アラビノース、およびグルクロン酸の分枝ポリマーと考えられ、分子量はおよそ２５０，０００である。それは、特定の植物種子が、発芽に先だって２４時間にわたり１％アラビアガム溶液に浸漬された場合に、種子発芽に対する効果を有することが示されている（Ｂａｄａｒ，Ｋ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（５）６−７）。さらに（Ｆｕｔｈｅｒｍｏｒｅ）国際公開第０２／０５８４６６号パンフレットは、多糖類およびペプチドの組み合わせを含んでなる特定の組成物が、作物収量を増大させてもよいことを報告する。
【００２８】
植物の傷に投与される多糖類の量は、窒素固定細菌と、そして任意選択的に界面活性剤とも組み合わせると、窒素固定効果の向上を生じるのに十分であるべきである。これは、使用される特定の多糖類、処理理される植物のタイプ、傷の性質、用いられる窒素固定細菌の特定の株、および投与方法などの様々な要素次第で変動する。しかし、典型的に、０．１〜１％ｗ／ｗ、例えば、０．１〜０．５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗなどの多糖類を含んでなる組成物が使用される。
【００２９】
一実施形態では、組成物は、多糖類および農業上許容される界面活性剤の双方を含んでなる。いくつかの状況では、これらの成分は、窒素固定細菌の効果を高め、共に相乗的に機能して、より顕著な増大を生じるようであることが分かった。これらの成分を含んでなる組成物で処理された植物は、処理植物の乾燥重量増大によって証明されるように、成長増大を示してもよい。
【００３０】
上述の成分を含んでなる新規組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。したがってさらなる態様では、本発明は、窒素固定細菌、特にグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、および多糖類、界面活性剤またはそれらの組み合わせを含んでなる、農業上許容される組成物を提供する。
【００３１】
上述されるような窒素固定細菌は、特にグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）は、適切には上に記載される量で存在する。同様に、多糖類は、例えばアラビアガムなどの滲出ガム多糖類などの上述されるような多糖類であり、それは、上述されるような量で、例えば０．１〜１％ｗ／ｗ多糖類の濃度で、組成物に包含される。さらに界面活性剤適切には、非イオン性洗剤、例えば、７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残部がリノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである界面活性剤などの上述されるような界面活性剤である。特定の実施形態では、組成物は、０．０００５〜１０％ｖ／ｖの界面活性剤、例えば０．０００５〜０．２％ｖ／ｖの界面活性剤を含んでなる。
【００３２】
なおもさらなる態様では、本発明は、窒素固定細菌を含んでなる農業上許容される組成物を調製するためのキットを提供する。このようなキット中では、窒素固定細菌、特にグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）は、例えば、別個の容器内で、または二部パックまたは容器内で、組成物のその他の成分と別々に保持されてもよい。窒素固定細菌は、凍結乾燥されてもよい。別の成分は、保存または輸送を容易にするために、例えば、使用場所で直ぐに水で希釈できる濃縮物の形態であってもよい。この性質の濃縮物は、上に列挙される組成物と同一成分を含有するが、通常、より高レベルで含有する。したがって、例えば濃縮物は、１〜１０％ｗ／ｗ、例えば１〜５％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗなどの多糖類を含有してもよく、１０倍希釈は、例えば本発明の方法で使用するのに適した組成物をもたらす。同様に、界面活性剤は、濃縮物中に０．００５〜２％ｖ／ｖの量で存在してもよい。例えば、窒素固定細菌のための栄養素などのその他の成分は、適切には、必要な濃度の濃縮物を含む。
【００３３】
このタイプのキットを使用して本発明の組成物が製造されてもよく、それは直接使用されてもよい。特に任意の濃縮物は、適切な容積に水で希釈されてから、窒素固定細菌がそれに添加される。
【００３４】
本発明は、細胞内窒素固定細菌を幅広い作物に塗布して送達できるようにする。具体的には、これらは、果樹および低木（例えば、ブルーベリー、キイチゴ、および茶樹）、ブドウの木、茎葉飼料作物（サイレージ、乾草または家畜による直接摂取用のアルファルファおよび草）観賞用芝および生垣、森林、園芸およびハーブ（例えば、シブレット、アスパラガス、ナス）をはじめとするが、これに限定されるものではない多年生、二年生または永続的一年生植物であってもよい。
【００３５】
Ｇｄが、甜菜またはサトウキビなどの高スクロース作物の生産を改善してもよいことが、以前報告されている（国際公開第２０１０／０２２５１７号パンフレット）。しかし、出願人らは、本発明の処理を使用して非高スクロース作物に改善が見られることを発見し、これらは、本発明の特定の実施形態を形成する。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、観賞用、芝生または牧草などの草に、芝刈りの直後にまたは程なくして塗布される。この処理は、未接種草との対比で接種草の乾燥重量の増大から明らかなように、草に成長促進をもたらす。窒素固定細菌は、芝刈り処理から生じる傷を通じて草に入り、草本植物細胞内にコロニー形成できるようであり、成長促進特性をもたらす。
【００３７】
さらにＧｄによるコロニー形成は、植物中で、特に牧草地、観賞用または芝草などの草種中で、クロロフィルレベルを増大し得ることが分かった。クロロフィルの増大は、植物の窒素含量だけでなく緑色のレベルにも関連するので、この特性は、高レベルの緑色加減が有益である観賞用芝などの用途において非常に望ましい。
【００３８】
本発明をここで、一例として添付の概略図を参照して、具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】未接種および接種刈草の平均乾燥重量（ｇ）を示すグラフである。
【図２】Ｇｄおよびスクロース、ツイーンおよび／またはアラビアガムまたはそれらの組み合わせによって処理された、接種刈草の地上乾燥重量を示すグラフである。
【図３】チャノキの栄養繁殖調製の一例を図示し、（Ａ）は、挿し枝の除去を図示し、（Ｂ）は、ＤＮＡ単離のために採取された各挿し枝の小区分の図式表現である。
【図４】Ｇｄで接種された茶樹サンプルから得られた、ＰＣＲ産物ゲルの画像を示す。対照植物中の全てのバンドは配列決定され、非特異的結合であることが確認された。接種植物からの配列決定バンドは、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）であることが確認された。
【図５】刈草のバイオマスに対する、様々な処理の効果を示すグラフである。
【図６】草の頭状花数に対するＧｄの効果を判定する試験の結果を示す。
【図７】刈草のバイオマスに対する、様々な組成物による処理の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
しかし、本発明を実施するために、特定の詳細が必要でないことが、当業者には明らかであろう。以下の本発明の特定の実施形態の説明は、例証および説明の目的で提示される。それらは、網羅的であることや、開示される精密な形態に本発明を制限することは、意図されない。明らかに、上記の教示を鑑みて、多数の修正および変更が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実用的応用を最適に説明するために提示されて説明され、それによって他の当業者らが、検討される特定用途に適するように様々な修正を加えて、本発明および様々な実施形態を最適に利用できるようにする。
【実施例】
【００４１】
実施例１
刈草への散布
手順
Ｇ．ジアゾトロフィクス（Ｇ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の培養：
ｐＲＧＳ５６１プラスミド発現ＧＵＳがあるＧ．ジアゾトロフィクス（Ｇ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＩＭＩ５０１９８６株（現在のＩＭＩ５０９９８）は、必要に応じて、ＡＴＧＵＳ培地［０．８％（ｗ／ｖ）寒天、酵母抽出物（２．７ｇｌ−１）、グルコース（２．７ｇｌ−１）、マンニトール（１．８ｇｌ−１）、ＭＥＳ緩衝液（４．４ｇｌ−１）、Ｋ２ＨＰＯ４（４．８ｇｌ−１）、およびＫＨ２ＰＯ４（０．６５ｇｌ−１）、ｐＨ６．５］上で培養された。ｂ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓＡ）遺伝子の発現は、５０ｍｇｌ−１のＸ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩）を含有するＡＴＧＵＳ培地上に播種することで試験され；暗青色コロニーの形成は、ｇｕｓＡ遺伝子発現を示唆した。
【００４２】
接種手順：
Ｇ．ジアゾトロフィクス（Ｇ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の水性懸濁液が調製されて、６００ｎｍで１．１の光学濃度の１ミリリットルあたり約１０９個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）が得られた。ＣＦＵ数は、連続希釈してＡＴＧＵＳ培地（必要に応じて抗生物質添加）上に播種し、ペトリ皿内で４日間の培養（２８°Ｃ、遮光）後に細菌コロニーを数えることで判定された。懸濁液は１０−４に希釈されて、１ｍｌあたりおよそ１００個の細菌を含有する溶液が生成され、それは下述するように直ぐに噴霧できる。
【００４３】
標準重量０．５ｇの草、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）カシオペア（Ｃａｓｓｉｏｐｅｉａ）変種の種子が、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  １号堆肥の苗トレー内に播種され、堆肥で軽く覆われた。
【００４４】
個々のトレーはより大型のトレーに入れられて、２１°Ｃ／１５°Ｃの昼／夜１６／８時間周期の成長室内で、２０日間にわたり十分な水が供給された。その後、はさみを使用して地表面から２ｃｍの高さで草を切断し（切落しは除去された）、家庭用ハンドヘルドミスト噴霧器を使用して、以下の処理剤が散布された。
【００４５】
実験１．処理
水＋３％スクロースの対照
Ｇｄ＋水＋３％スクロース
【００４６】
実験２．処理
Ｇｄ＋水
Ｇｄ＋水＋３％スクロース
Ｇｄ＋水＋０．１％ツイーン
Ｇｄ＋水＋０．３％アラビアガム
Ｇｄ＋水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン
Ｇｄ＋水＋３％スクロース＋０．３％アラビアガム
Ｇｄ＋水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム
【００４７】
発芽苗の乾燥重量
苗はピンセットを用いて寒天から除去され、あらゆる残留寒天が根から洗浄された。各苗は紙バッグに入れて、８０°Ｃのオーブンに４８時間入れられ、次に秤量された。
【００４８】
実験１および実験２からの結果は、それぞれ図面１および２に示される。
【００４９】
図１の結果は、草の平均乾燥重量の有意な増大を示す（未接種では０．０９６７６ｇ、接種グラフでは０．１２７６ｇ）。これらの乾燥重量は、Ｐ＜０．０１で有意差があった。したがって、この様式での接種は、明らかに成長に有意な増大をもたらす。
【００５０】
図２に示される結果は、Ｇｄ／Ｓ／Ｔ／ＧＡと、次の最大乾燥重量（Ｇｄ／Ｔ）およびＧｄ／Ｓ／Ｔとの間の有意差（Ｐ＜０．００１）を示し、３成分の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｎ）の相乗効果が実証される。ＧｄおよびＧｄ／Ｓは、Ｐ＝０．０５で有意差がない。
【００５１】
実施例２
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ａｚｏｔｉｃｕｓ）によるチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のコロニー形成
挿し枝からの栄養生殖
チャノキのクローンの栄養繁殖の標準手段は、単葉挿し枝である。およそ４〜６個の節および茎頂を含んでなるより大型の茎から、組織の健康状態（すなわち昆虫および疾患を含まない）に基づいて、茎および葉の切片が選択された。挿し枝のために選択された部分は、Ｙａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｉｌ  ａｎｄ  Ｃｒｏｐ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，（２００８）ＳＣＭ−２３）によって推奨されるように、赤枝と緑枝の間であった。最近、腋芽を積極的に破壊した、成熟葉に隣接するわずかに赤くなった樹皮を含有する成熟苗条が、最良の発根成功をもたらすことが発見されている。
【００５２】
好ましい部分から、３〜５ｃｍの茎部分と１枚の健康な葉とを含んでなるサンプルが選択された。各茎部分は、（１）葉の上のおよそ０．５ｃｍの斜め切り、（２）節間葉の下のもう１つの斜め切りを使用して、（３）傷部位の圧迫または挫傷を避けて切除された（図３Ａを参照されたい）。
各チャノキ挿し枝の下部は、１％インドール酪酸溶液に浸されて個々のポットに入れられた；挿し枝は、葉が土壌に接触しないように、茎をまっすぐからわずかに傾けて栽植された。各ポットは、砂とＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  １号挿し木ミックスを比率４：１で含有し、水で飽和された。各挿し枝の切断面には、２０μｌの水、または２０μｌの水中の２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌのＧｄのどちらかが塗布されて、各サンプルの湿度は、各ポットをプラスチックシートで覆い、軽く水を噴霧することで保たれた。
【００５３】
３ヶ月間の栽培に続いて、挿し枝のＧｄによる成功裏のコロニー形成を確認するために、未接種および接種挿し枝がポットから取り出された。各挿し枝は、（ａ）接種部位を含めた苗条先端部分（４）（図３Ｂ）、（ｂ）図３Ｂの節部分（５）、および（Ｃ）図３Ｂの任意の根組織（６）を含めた下枝部分に細区画された。次に、これらの部分は、液体窒素中で急速凍結された。
【００５４】
製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して、挿し枝の各部分（すなわち、図３Ｂの４、５、および６）からのＤＮＡ単離が実施され、ＰＣＲが実施された。実施されたＰＣＲ反応は、Ｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．，（２００９）によって記載されるような二段階反応であり；最初のステップは、ＧＤＩ−２５Ｆ（５’−ＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＧ−３’）およびＧＤＩ−９２３Ｒ（５’−ＣＣＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣ−３’）を使用して、それはプライマーＧＤＩ１３９Ｆ（５’ＴＧＡＧＴＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧ−３’）およびＧＤＩ９１６Ｒ（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＧ−３’）のアンプリコンを含有する８９９ｂｐ産物を増幅し、後者は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用可能な１６ＳｒＤＮＡ配列情報に基づいて設計された。９５°Ｃで３分間の初期変性ステップ後、以下の温度プロファイルが３２回実行された；９５°Ｃで２０秒間の変性、５５°Ｃで４５秒間のアニーリング、および７２°Ｃで２０秒間の伸長、７２°Ｃで５分間の最終伸長ステップ。次に、このＰＣＲ産物の１マイクロリットルが取り出されて、ＧＤＩ３９ＦおよびＧＤＩ９１６Ｒを使用したＰＣＲの第２ステップのテンプレートとして使用された。第２ラウンドのパラメータ修正は、１５秒間で６２°Ｃへのアニーリング温度の増大と、３９へのサイクル数の増大を含んだ。ＰＣＲ増幅産物は、１％アガロースゲル上で分析されて臭化エチジウムで染色され、ならびに配列決定されて、生成物の同一性が確認された（図４）。
【００５５】
興味深いことに、ＡｚＧｄは、チャノキ挿し枝の部分４から検出されず、ＡｚＧｄが、接種に続いて傷部位から基部に向かって移動したことが示唆され、それぞれ部分５および６で検出された。
【００５６】
配列決定および引き続くＢＬＡＳＴ結果は、対照植物の部分１に見られるバンドが、使用されたプライマーセットの非特異的結合の結果であることの確認を提供し、接種組織中の部分２および３で観察された４本のバンドは、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）Ｐａｌ５（１００％同定、８６％クエリーカバーおよび７ｅ−０４のＥ値）と同定された。結果は、接種組織中で低コピー数ではあるが、ＡｚＧｄが、傷部位の接種に続いて、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）中で成功裏にコロニー形成したことを示唆する。これは、おそらく、Ｇｄによる多年生植物のコロニー形成の最初の例である。
【００５７】
実施例３
草バイオマスに対する処理効果の研究
草は、植物グロースチャンバー（Ｆｉｔｏｔｒｏｎ（登録商標））（２３°Ｃ／１５°Ｃａｔ６５％湿度）内において、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  １号堆肥を使用して、種子トレー内で２週間栽培された。それは、次に８ｃｍの高さで切断され、家庭用噴霧器を使用して、下に記載される１０ｍｌの処理剤が即座に噴霧された。
【００５８】
処理
１．  水
２．  ３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム
３．  水＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
４．  水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）
５．  水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）
６．  水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
７．  水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）
８．  水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）
草は、同様の成長条件下で、Ｆｉｔｏｔｒｏｎにさらに２週間戻された。無作為に選択された５本の植物が、地表面で切断されて１個のサンプルが作成され秤量された。これはさらに５回反復されて、各処理のために全部で６個のサンプルが得られた。
【００５９】
これらのサンプルは、オーブン内で４８時間乾燥されて秤量された。
【００６０】
結果は、図５に示される。これらの結果は、いくらかのスクロースが存在してＧｄの増殖を支持するならば、草のバイオマスが、調合物次第でＧｄの添加によって増大することを示す。さらに、増大は用量依存的であり、最適成長は、２．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌで観察された。したがってこのような用量は、処理される草がバイオマスの最大化が有益である牧草であれば、有益であってもよい。しかし処理される草が、観賞用または芝草であれば、緑色が増大した、より低いバイオマスが有益であってもよく、それは、さらなる草刈りまたは芝刈りに対する必要性を増大させずに、外観を改善してもよい。この場合、２．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ未満の用量またはそれを超える用量のどちらかが、使用されてもよい。
【００６１】
実施例４
野外実験
水のみで処理された１ｍ２の未接種刈草試験区（対照）との比較で、水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を含んでなる調合物が、１ｍ２の刈草試験区（確立されたホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）芝生）に散布された。
【００６２】
調合物および水は、家庭用ミスト噴霧器を使用して、草が新鮮に刈られた３０分間以内に、流れ落ちるまで散布された。対照試験区は、プラスチックスクリーンによって処理試験区から保護された。散布は、静止空気中で、夕方近くに実施された。
【００６３】
２０ｃｍ平方のワイヤ四分区間を使用して、完全に伸長して完全に形成された開花頭状花の数を計えることで、１ｍ２の試験区を副次標本採取した。
【００６４】
各試験区内の各２０ｃｍ平方からの結果は平均化され、結果は図６に示される。このようにして散布されたＧｄ処理は、花の成長に実質的に影響を与えることが明らかである。
【００６５】
実施例５
組成物の成分比較
実験で使用された組成物の個々の成分を含む、様々な組成物を使用して、実施例３の方法が繰り返された。具体的には、この実験で使用された組成物は、次のとおりであった。
【００６６】
処理
１．水
２．水＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
３．水＋３％スクロース＋０．１％ツイーン＋０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
４．０．３％アラビアガム＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
５．３％スクロース＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
６．０．１％ツイーン＋Ｇｄ（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）
【００６７】
ＡｂｅｒＧｌｙｎ草は、２３／１５°Ｃ、８０％湿度の植物グロースチャンバー（Ｆｉｔｏｔｒｏｎ（登録商標））内において、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  １号土壌中で２週間にわたり栽培された。草ははさみで８ｃｍの高さで切断されて、切落しは除去され、家庭用噴霧器を使用して、１０ｍｌ処理剤が草に即座に噴霧された。草は、植物グロースチャンバーに、さらに２週間戻された。
【００６８】
５本の植物がトレーから無作為に選択され、合わせて貯留されて、１個のサンプルが作成されて秤量された。これは、処理あたり合計６個のサンプルが採取されるように、さらに５回反復される。草は、８０°Ｃで４８時間乾燥され、次に秤量された。
【００６９】
結果は、図７に示される。この実験は、使用された成分が、草の成長に対する効果を有しないことを示す。本実施例では、界面活性剤が乾燥重量に最大の増大を与えた。アラビアガムは、おそらくは、植物上のＧｄ拡散を助け、液体が草の傷に侵入するのを助けるために、界面活性剤が必要であってもよいという事実のために、対照との比較でのみわずかな改善を示した（この場合、組み合わせは期待された改善を示さなかったが）。ここでも、水＋Ｇｄ処理は対照と同様であり、傷にコロニー形成するためには、これらの成分の少なくとも一部の添加が、Ｇｄに必要であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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