(57)【要約】  従来の組み換えヒトアルファグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）と比べて多量の、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）またはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含むｒｈＧＡＡからなるより最適化されたグリカン組成物を、少量の非リン酸化高マンノースグリカンおよび複合オリゴ糖上の少量の末端ガラクトースと共に含む、ＣＨＯ細胞に由来するｒｈＧＡＡ組成物。このｒｈＧＡＡを含む組成物および使用方法が説明されている。【選択図】図１Ａ
2017537604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノ−マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）またはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含むｒｈＧＡＡを、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ；ＣＡＳ４２０７９４−０５−０）により例示される従来のｒｈＧＡＡと比べて多量に含む、ＣＨＯ細胞に由来するｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項２】
前記ｒｈＧＡＡが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項３】
前記ｒｈＧＡＡの３０％以上がカチオン非依存性マノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合するか、または前記ｒｈＧＡＡの３０％以上が、モノ−Ｍ６Ｐもしくはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項４】
前記ｒｈＧＡＡの５０％以上がカチオン非依存性マノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合するか、または前記ｒｈＧＡＡの５０％以上が、モノ−Ｍ６Ｐもしくはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項５】
前記ｒｈＧＡＡの９０％〜１００％がカチオン非依存性マノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合するか、または前記ｒｈＧＡＡの９０％〜１００％もしくはより多くが、モノ−Ｍ６Ｐもしくはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項６】
Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量が０．５〜７．０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡの範囲である、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項７】
Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量が１．０〜４．０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡの範囲である、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項８】
Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量が５．０〜６．０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡの範囲である、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項９】
平均して、前記Ｎ−グリカンが３ｍｏｌ／ｍｏｌ超のＭ６Ｐと４ｍｏｌ／ｍｏｌ超のシアル酸とを含む、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項１０】
平均して、前記ｒｈＧＡＡ上の前記Ｎ−グリカンの４０〜６０％が複合型Ｎ−グリカンであり、前記ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの６．５％以下がハイブリッド型Ｎ−グリカンであり、前記ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの１５％以下が非リン酸化型であり、前記ｒｈＧＡＡ上の前記高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも１０％がモノ−Ｍ６Ｐリン酸化型であり、および／または前記ｒｈＧＡＡ上の前記高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも２％がビス−Ｍ６Ｐリン酸化型である、請求項１に記載のｒｈＧＡＡ組成物。
【請求項１１】
前記ｒｈＧＡＡが平均して、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり２．０〜８．０個のシアル酸残基を担持する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｒｈＧＡＡがＣＨＯ細胞株ＡＴＢ２００−００１−Ｘ５−１４によりまたはその継代培養物により産生される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
シャペロンを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物を製造する方法であって、ＣＨＯ細胞株を培養することと、前記ＣＨＯ細胞の培養物から前記組成物を回収することとを含む方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を産生するＣＨＯ細胞株。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物を産生するＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００またはその継代培養物。
【請求項１７】
請求項１５に記載のＣＨＯ細胞株を製造する方法であって、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換させることと、前記ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡを前記ＣＨＯ細胞の染色体に安定的に組み込み、かつｒｈＧＡＡを安定的に発現するＣＨＯ細胞を選択することと、Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンの含有量が高いｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択することと、任意選択で、シアル酸含有量が高いＮ−グリカンを有するおよび／または非リン酸化高マンノース含有量が低いＮ−グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することとを含む方法。
【請求項１８】
不十分なリソソームｒｈＧＡＡに関連する状態、障害または疾患を処置する方法であって、請求項１に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記対象がグリコーゲン貯蔵症ＩＩ型（ポンペ病）を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物を前記対象の心筋に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物を前記対象の四頭筋、三頭筋またはその他の骨格筋に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を前記対象の横隔膜に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が薬理学的シャペロンと組み合わされるか、それと共投与されるか、またはそれと共に別々に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物がＡＴ２２２０もしくはその塩と組み合わされるか、それと共投与されるか、またはそれと共に別々に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物がＡＴ２２２１もしくはその塩と組み合わされるか、それと共投与されるか、またはそれと共に別々に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
組織、筋肉、筋繊維、筋細胞、リソソーム、オルガネラ、細胞内コンパートメントまたは細胞質中のグリコーゲンを代謝するか、分解するか、除去するか、またはその他に低減させる方法であって、任意選択でシャペロンまたはｒｈＧＡＡに対する免疫応答を低減させる薬剤と共に、請求項１に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２７】
細胞中におけるリソソームの増殖、自食作用または開口分泌を調節する方法であって、任意選択でシャペロンとの組合せにおいて、請求項１に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０５７，８４２号明細書、２０１４年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０５７，８４７号明細書、２０１５年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／１１２，４６３号明細書および２０１５年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／１３５，３４５号明細書に対する優先権の利益を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により援用される。
【０００２】
本発明は、医学、遺伝学および組み換え糖タンパク質生化学の分野を含み、具体的には、マンノース６−リン酸担持グリカンの総含有量がより高い組み換えヒトアルファグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）組成物に関し、このマンノース６−リン酸担持グリカンは筋細胞上のＣＩＭＰＲを効率的に標的にし、かつその後にｒｈＧＡＡをリソソームへ送達し、このリソソームにおいて、ｒｈＧＡＡは、異常に高レベルの蓄積グリコーゲンを分解することができる。本発明のｒｈＧＡＡは、従来のｒｈＧＡＡ製品と比較して筋細胞への優れたターゲティングおよびその後のリソソームへの送達を示し、かつポンペ病を有する対象の酵素補充療法に対して本発明のｒｈＧＡＡを特に有効とするその他の薬物動態特性を示す。
【背景技術】
【０００３】
ポンペ病用の既存の酵素補充療法では、Ｍ６Ｐ担持グリカンおよびビス−Ｍ６Ｐ担持グリカンの総含有量が低い従来のｒｈＧＡＡ製品が使用される。従来の製品は、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびアルグルコシダーゼアルファという名称で知られている。「Ｌｕｍｉｚｙｍｅ」および「Ｍｙｏｚｙｍｅ」は、Ｇｅｎｚｙｍｅにより生物製剤として製造または市販され、かつ米国食品医薬品局により承認されている従来型のｒｈＧＡＡであり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０１４）（これは参照により本明細書に援用される）を参照してまたは２０１４年１０月１日時点においてＦＤＡにより米国内での使用に承認された「Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）」または「Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）」という名称の製品で説明される。アルグルコシダーゼアルファは、化学名［１９９−アルギニン，２２３−ヒスチジン］プレプロ−α−グルコシダーゼ（ヒト）；分子式、Ｃ４７５８Ｈ７２６２Ｎ１２７４Ｏ１３６９Ｓ３５；ＣＡＳ番号４２０７９４−０５−０として同定されている。これらの製品は、グリコーゲン貯蔵症ＩＩ型（ＧＳＤ−ＩＩ）または酸性マルターゼ欠損症としても知られているポンペ病を有する対象に投与される。酵素補充療法は、ｒｈＧＡＡを投与してリソソーム中において欠損しているＧＡＡを置き換え、それによりリソソームグリコーゲンを分解する細胞の能力を回復させることにより、ポンペ病を処置しようとする。
【０００４】
ポンペ病は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性の欠乏に起因する遺伝性のリソソーム貯蔵症である。ポンペ病の罹患者は、グリコーゲンを分解する酵素である酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）と、身体がエネルギー源として使用する物質とを欠いているか、またはこれらのＧＡＡおよび物質のレベルが低下している。この酵素欠乏により、リソソーム中において過剰なグリコーゲン蓄積が起こり、このリソソームは、グリコーゲンとその他の細胞残屑または老廃物とを通常分解する酵素を含む細胞内オルガネラである。ポンペ病を有する対象のある種の組織（特に筋肉）中でのグリコーゲン蓄積により、正常に機能する細胞の能力が損なわれる。ポンペ病では、グリコーゲンは適切に代謝されず、リソソーム中に次第に蓄積し、特に骨格筋細胞中に次第に蓄積し、乳児発症型の疾患では心筋肉細胞中に次第に蓄積する。グリコーゲンの蓄積により、筋細胞および神経細胞が損傷し、その他の患部組織中の細胞も損傷する。
【０００５】
従来、発症年齢に応じて、ポンペ病は早期乳児型または後期発症型のいずれかとして臨床的に認識される。発症年齢は、ポンペ病を引き起こす遺伝子変異の重症度に対応する傾向がある。最も重症の遺伝子変異は、乳児期の早発性疾患として現れるＧＡＡ活性の完全な喪失を引き起こす。ＧＡＡ活性を低下させるが完全には排除しない遺伝子変異は、発症および進行が遅延しているポンペ病の形態と関連している。乳児発症性ポンペ病は出生直後に現れ、筋力低下、呼吸不全および心不全を特徴とする。未処置の場合、通常は２年以内に死亡する。若年発症性および成人発症性のポンペ病は後年に現れ、通常は乳児発症性疾患と比べて緩やかに進行する。この形態の疾患は概して心臓に影響を及ぼさないが、骨格筋と呼吸に関与する骨格筋との衰弱により死に到ることもある。
【０００６】
現在のポンペ病の非対症療法的処置として、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）等の組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）を使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）が挙げられる。このｒｈＧＡＡは、ポンペ病を有する対象中において欠如または欠損しているＧＡＡを置き換えるためにまたは補充するために投与される。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡ製品中のｒｈＧＡＡの大部分は筋組織を標的としないことから、ｒｈＧＡＡは投与後に非生産的に除去される。
【０００７】
これは、ｒｈＧＡＡ分子の標的を標的筋細胞上のＣＩＭＰＲに設定する（ｒｈＧＡＡ分子はその後に細胞のリソソーム中へと運ばれる）Ｍ６Ｐ担持グリカンおよびビス−Ｍ６Ｐ担持グリカンの総含有量が従来のｒｈＧＡＡでは高くないために起こる。酵素補充療法のためのｒｈＧＡＡのこの細胞取り込みは、後の外因性酵素のリソソームへの送達のために細胞表面上に存在するカチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する特定の炭水化物（マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ））によって促進される。
【０００８】
ｒｈＧＡＡ上には７種の潜在的なＮ結合グリコシル化部位が存在する。存在するＮ結合オリゴ糖（Ｎ−グリカン）のタイプでは各グリコシル化部位が不均一であることから、ｒｈＧＡＡは、タンパク質と、Ｍ６Ｐ受容体およびその他の炭水化物受容体に対する様々な結合親和性を有するＮ−グリカンとの複合混合物からなる。１個のＭ６Ｐ基（モノ−Ｍ６Ｐ）を有する高マンノースＮ−グリカンを含むｒｈＧＡＡは、低い（約６，０００ｎＭ）親和性でＣＩＭＰＲに結合するが、同一のＮ−グリカン上に２個のＭ６Ｐ基（ビス−Ｍ６Ｐ）を含むｒｈＧＡＡは、高い（約２ｎＭ）親和性で結合する。非リン酸化グリカン、モノ−Ｍ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンの代表的な構造を図１Ａに示す。マンノース−６−Ｐ基を図１Ｂに示す。リソソーム内に入ると、ｒｈＧＡＡは蓄積グリコーゲンを酵素的に分解することができる。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡはＭ６Ｐ担持グリカンおよびビス−Ｍ６Ｐ担持グリカンの総レベルが低く、そのため、標的筋細胞はリソソームへのｒｈＧＡＡの下位送達（ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を生じにくい。これらの従来の製品中のｒｈＧＡＡ分子の大部分はリン酸化Ｎ−グリカンを有しておらず、そのためＣＩＭＰＲに対する親和性を欠如している。非リン酸化高マンノースグリカンはマンノース受容体によっても除去され得、ＥＲＴの非生産的クリアランスが起こる（図２）。
【０００９】
ｒｈＧＡＡ上には、ガラクトースおよびシアル酸を含む複合炭水化物であるその他のタイプのＮ−グリカンも存在する。複合体Ｎ−グリカンはリン酸化されていないことから、この複合体Ｎ−グリカンはＣＩＭＰＲに対する親和性を有しない。しかしながら、露出しているガラクトース残基を有する複合型Ｎ−グリカンは、肝臓の肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対する中〜高の親和性を有し、ｒｈＧＡＡの迅速な非生産的クリアランスが起こる（図２）。
【００１０】
ＧＡＡまたはｒｈＧＡＡのグリコシル化は、Ｍ６Ｐ基を生成するために、Ｃａｎｆｉｅｌｄらの米国特許第６，５３４，３００号明細書で説明されているホスホトランスフェラーゼおよび露出酵素（ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に改変され得る。酵素的グリコシル化を適切に制御することはできず、望ましくない免疫学的特性および薬理学的特性を有するｒｈＧＡＡが生じる。酵素的改変ｒｈＧＡＡは、全てがホスホトランスフェラーゼ／露出酵素によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで潜在的におよび酵素的にリン酸化され得る高マンノースＮ−グリカンのみを含む場合があり、１個のＧＡＡ当たり平均５〜６個のＭ６Ｐ基を含む場合がある。ＧＡＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的処理によって生じるグリコシル化パターンは、付加的な末端マンノース残基（特に非リン酸化末端マンノース残基）が改変ｒｈＧＡＡの薬物動態に悪影響を及ぼすことから問題である。そのような酵素的改変産物がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、このマンノース基は、ＧＡＡの非生産的クリアランスを増加させ、免疫細胞による酵素的改変ＧＡＡの取り込みを増加させ、心筋または骨格筋の筋細胞等の標的組織に到達するＧＡＡの少なさに起因してｒｈＧＡＡの治療効果を低下させる。例えば、末端非リン酸化マンノース残基は、酵素的改変ｒｈＧＡＡの迅速なクリアランスおよびｒｈＧＡＡの標的組織へのターゲティングの低下をもたらす肝臓および脾臓中でのマンノース受容体用のリガンドとして知られている。更に、末端非リン酸化マンノース残基を有する高マンノースＮ−グリカンを有する酵素的改変ＧＡＡのグリコシル化パターンは、この酵素的改変ｒｈＧＡＡに対する免疫応答またはアレルギー応答（例えば、命に関わる重度のアレルギー（アナフィラキシー）反応または過敏性反応）を引き起こすリスクを増大させる酵母、カビおよび機能内で起こる糖タンパク質のグリコシル化パターンに類似している。
【００１１】
上記で説明したように、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のような従来のｒｈＧＡＡ製品は、モノリン酸化グリカンのレベルが低く、ビスリン酸化グリカンは更に低い。ポンペ病の治療が有効であるには、ｒｈＧＡＡを筋細胞中のリソソームへと送達する必要がある。従来のｒｈＧＡＡでのモノ−Ｍ６Ｐターゲティング基およびビス−Ｍ６Ｐターゲティング基の低い総量により、ＣＩＭＰＲによる細胞取り込みおよびリソソーム送達が制限され、そのため、従来の酵素補充療法が非効率になる。例えば、２０ｍｇ／ｋｇ以上の用量での従来のｒｈＧＡＡ製品はポンペ病の一部の態様を寛解させるが、多くの標的組織（特に骨格筋）中の蓄積グリコーゲンを十分に低減させて疾患の進行を逆転させることはできない。
【００１２】
従来の酵素補充療法のリソソームへの送達の非効率性に起因して、そのような療法は、ＧＡＡに対する免疫応答の発生等のその他の問題を伴うことが多い。従来のｒｈＧＡＡ中のＧＡＡの大部分は、モノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンを含まず、このグリカンはｒｈＧＡＡの標的を筋細胞に設定する。対象の免疫系は、この過剰な非リン酸化ＧＡＡに曝露されており、ＧＡＡを認識する有害な免疫応答を生じ得る。標的組織に侵入せず、かつリソソームに送達されない非リン酸化ＧＡＡに対する免疫応答の誘導により、投与されたｒｈＧＡＡの免疫学的不活性化に起因する処置失敗のリスクが増大し、患者がｒｈＧＡＡ処置に対する有害な自己免疫反応またはアレルギー反応を経験するリスクが増大する。本発明に係るｒｈＧＡＡは、この標的が設定されていない非リン酸化ｒｈＧＡＡを有意に少なく含み、そのため、この非リン酸化ｒｈＧＡＡへの患者の免疫系の曝露が低減する。
【００１３】
ロジスティック的に、より大きい用量は、対象者およびこの対象者を処置する医療専門家に更なる負担（例えば、ｒｈＧＡＡを静脈内投与するのに必要な注入時間が延びる）をかける。これは、従来のｒｈＧＡＡが、筋細胞上のＣＩＭＰＲを標的としない非リン酸化ｒｈＧＡＡをより高い含有量で含むからである。筋細胞上のＣＩＭＰＲに結合してリソソームに侵入しないｒｈＧＡＡは、リソソームでグリコーゲンを酵素的に分解しない。従来のｒｈＧＡＡおよび本発明に係るｒｈＧＡＡを同じ用量で投与する場合、本発明に係る組成物中のより多くのｒｈＧＡＡが筋細胞上のＣＩＭＰＲに結合し、次いでリソソームに送達される。本発明のｒｈＧＡＡは、より少ない量のｒｈＧＡＡを投与するが、同じまたはより多いｒｈＧＡＡをリソソームに送達する選択肢を医師に提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはアルグルコシダーゼアルファ等の従来のｒｈＧＡＡの製造に使用される現在の製造プロセスでは、細胞炭水化物の処理が当然のことながら複雑であり、操作することが極度に困難であることから、Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐの含有量は有意に増加しなかった。従来のｒｈＧＡＡ製品のこれらの欠点を考慮して、本発明者らは、効率的にｒｈＧＡＡの標的を筋細胞に設定してｒｈＧＡＡをリソソームへ送達し、投与されたｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを最小化し、その結果、より生産的にｒｈＧＡＡの標的を筋組織に設定する方法を探すことに努め、それを特定した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従来の形態のｒｈＧＡＡのターゲティングおよび投与と関連する問題ならびにそのように良好に標的設定された形態のｒｈＧＡＡの製造と関連する困難に対して、本発明者らは、従来のｒｈＧＡＡ組成物と比べてＭ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンの含有量が高いことにより、筋組織中においてより効率的にＣＩＭＰＲを標的とし、かつリソソームに送達されるｒｈＧＡＡを製造するための手段を研究および開発した。更に、本発明のｒｈＧＡＡは、非標的組織によるｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを最小化する、十分に処理された複合型Ｎ−グリカンを有する。
【００１６】
Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）等の従来のｒｈＧＡＡ製品を使用する現在の酵素補充処置と関連する問題を考慮して、熱心な研究および調査を経て、本発明者らは、筋細胞上のＣＩＭＰＲを標的とし、かつ次いでｒｈＧＡＡをリソソームに送達するモノ−Ｍ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンの総含有量が有意に高いＣＨＯ細胞中でｒｈＧＡＡを製造する方法を開発した。
【００１７】
この方法により製造されたｒｈＧＡＡはまた、ポンペ病を有する対象への投与後に標的組織取り込みを増加させ、かつ非生産的クリアランスを低減させるｒｈＧＡＡの全体的なグリコシル化パターンによる有利な薬物動態学的特性も有する。本発明者らは、ＡＴＢ−２００と表されるｒｈＧＡＡにより例示されるように、本発明のｒｈＧＡＡが、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）等の従来のｒｈＧＡＡと比べて骨格筋組織の標的化でより強力であり、より効率的であることを示す。本発明に係るｒｈＧＡＡは、ポンペ病を有する患者において筋組織を生産的に標的とし、図２に示すようにｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを低減させる優れた能力を有する。
【００１８】
本発明に係る優れたｒｈＧＡＡをシャペロンにより更に完成させることができ、またはシャペロンと組み合わせることができ、またはＩＧＦ２におけるＣＩＭＰＲに結合する部分等の筋組織中のＣＩＭＰＲを標的とするその他の基にコンジュゲートさせることができる。下記の実施例は、本発明のｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡにより例示される）が、従来のｒｈＧＡＡ製品Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）を使用する既存のレジメンと比較して骨格筋中で有意に良好なグリコーゲンクリアランスを提供することにより、酵素補充療法の既存の標準治療を超えることを示す。
【００１９】
本出願のファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、非リン酸化高マンノースグリカン、モノ−Ｍ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンを示す。図１Ｂは、Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ａは、非リン酸化高マンノースグリカン、モノ−Ｍ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンを示す。図１Ｂは、Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｍ６Ｐを担持するグリカンによるｒｈＧＡＡの標的組織（例えばポンペ病を有する対象の筋組織）への生産的ターゲティングを示す。図２Ｂは、非標的組織（例えば肝臓および脾臓）に対する非生産的薬剤クリアランスまたは非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合による非生産的薬剤クリアランスを説明する。
【図２Ｂ】図２Ａは、Ｍ６Ｐを担持するグリカンによるｒｈＧＡＡの標的組織（例えばポンペ病を有する対象の筋組織）への生産的ターゲティングを示す。図２Ｂは、非標的組織（例えば肝臓および脾臓）に対する非生産的薬剤クリアランスまたは非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合による非生産的薬剤クリアランスを説明する。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＩＭＰＲ受容体（ＩＧＦ２受容体としても知られている）およびこの受容体のドメインを図示する。図３Ｂは、ビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンおよびモノ−Ｍ６Ｐを担持するグリカンのＣＩＭＰＲに対する結合親和性（ｎモル濃度）、高マンノース型グリカンのマンノース受容体に対する結合親和性、ならびに脱シアル化複合体グリカンのアシアロ糖タンパク質受容体に対する結合親和性を示す表である。Ｍ６Ｐを担持するグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンを有するｒｈＧＡＡは、筋肉の標的細胞上のＣＩＭＰＲに生産的に結合することができる。高マンノースグリカンおよび脱シアル化グリカンを有するｒｈＧＡＡは、対応する受容体を担持する非標的細胞に非生産的に結合する可能性がある。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＣＩＭＰＲ受容体（ＩＧＦ２受容体としても知られている）およびこの受容体のドメインを図示する。図３Ｂは、ビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンおよびモノ−Ｍ６Ｐを担持するグリカンのＣＩＭＰＲに対する結合親和性（ｎモル濃度）、高マンノース型グリカンのマンノース受容体に対する結合親和性、ならびに脱シアル化複合体グリカンのアシアロ糖タンパク質受容体に対する結合親和性を示す表である。Ｍ６Ｐを担持するグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンを有するｒｈＧＡＡは、筋肉の標的細胞上のＣＩＭＰＲに生産的に結合することができる。高マンノースグリカンおよび脱シアル化グリカンを有するｒｈＧＡＡは、対応する受容体を担持する非標的細胞に非生産的に結合する可能性がある。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂはそれぞれ、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を意味する。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介してＣＩＭＰＲに結合したＧＡＡ分子が置き換えられる。図４Ａに示すように、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ではＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡ  Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＭｙｏｚｙｍｅのそれぞれにおいて、ｒｈＧＡＡのわずか２２％または２７％がＭ６Ｐにより溶出した。これらの図は、これら２種の従来のｒｈＧＡＡ製品中のｒｈＧＡＡの大部分が、標的筋組織中のＣＩＭＰＲを標的とするのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠くことを示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂはそれぞれ、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を意味する。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介してＣＩＭＰＲに結合したＧＡＡ分子が置き換えられる。図４Ａに示すように、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ではＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡ  Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＭｙｏｚｙｍｅのそれぞれにおいて、ｒｈＧＡＡのわずか２２％または２７％がＭ６Ｐにより溶出した。これらの図は、これら２種の従来のｒｈＧＡＡ製品中のｒｈＧＡＡの大部分が、標的筋組織中のＣＩＭＰＲを標的とするのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠くことを示す。
【図５】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡによるＣＨＯ細胞の形質転換用のＤＮＡ構築物である。ｒｈＧＡＡ（配列番号４）をコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞を形質転換させた。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、ＭｙｏｚｙｍｅおよびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。図６Ｂから明らかなように、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％がＭ６Ｐを含んでいた。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、ＭｙｏｚｙｍｅおよびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。図６Ｂから明らかなように、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％がＭ６Ｐを含んでいた。
【図７Ａ】ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの精製、実施形態１および２である。
【図７Ｂ】ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの精製、実施形態１および２である。
【図８】Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ−２００．ｒｈＧＡＡのＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルである。
【図９】ＢＰ−ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００−１およびＡＴＢ２００−２として識別されたＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの３種の異なる調製物と比較したＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のＮ−グリカン構造の概要である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ結合親和性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のＣＩＭＰＲ結合親和性（右側の線）とを比較する。図１０Ｂは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのビス−Ｍ６Ｐ含有量を説明する。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ結合親和性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のＣＩＭＰＲ結合親和性（右側の線）とを比較する。図１０Ｂは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのビス−Ｍ６Ｐ含有量を説明する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、様々なＧＡＡ濃度において正常な線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｂは、様々なＧＡＡ濃度においてポンペ病を有する対象からの線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｃは、正常な対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とポンペ病を有する対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とを比較する。
【図１１Ｂ】図１１Ａは、様々なＧＡＡ濃度において正常な線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｂは、様々なＧＡＡ濃度においてポンペ病を有する対象からの線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｃは、正常な対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とポンペ病を有する対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とを比較する。
【図１１Ｃ】図１１Ａは、様々なＧＡＡ濃度において正常な線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｂは、様々なＧＡＡ濃度においてポンペ病を有する対象からの線維芽細胞中でＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ活性（左側の線）とＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右側の線）とを比較する。図１１Ｃは、正常な対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とポンペ病を有する対象からの線維芽細胞の（Ｋｕｐｔａｋｅ）とを比較する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファまたは５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の心筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｂは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の四頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｃは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の三頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、陰性コントロールおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比較して四頭筋および三頭筋中で有意なグリコーゲン低減を生じた。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファまたは５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の心筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｂは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の四頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｃは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の三頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、陰性コントロールおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比較して四頭筋および三頭筋中で有意なグリコーゲン低減を生じた。
【図１２Ｃ】図１２Ａは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファまたは５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の心筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｂは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の四頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。図１２Ｃは、ビヒクル（陰性コントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの接触後の三頭筋中のタンパク質に対するグリコーゲンの量を示す。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、陰性コントロールおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比較して四頭筋および三頭筋中で有意なグリコーゲン低減を生じた。
【図１３Ａ】ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの安定性がシャペロンＡＴ２２２１の存在下で改善される。図１３Ａにおける最初の左側の線は、ｐＨ７．４（血液ｐＨ）での様々な温度における折り畳まれていないＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡタンパク質の割合を示す。最後の右側の線は、ｐＨ５．２（リソソームｐＨ）での様々な温度における折り畳まれていないＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡタンパク質の割合を示す。３本の中間の線は、１０μｇ、３０μｇまたは１００μｇのＡＴ２２２１シャペロンのタンパク質折り畳みへの効果を示す。これらのデータは、コントロールサンプルと比較して血液ｐＨでＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのアンフォールディングをＡＴ２２２１が防ぐことを示す。ＡＴ２２２１による中性ｐＨでのＴｍの改善を図１３Ｂにまとめる。
【図１３Ｂ】ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの安定性がシャペロンＡＴ２２２１の存在下で改善される。図１３Ａにおける最初の左側の線は、ｐＨ７．４（血液ｐＨ）での様々な温度における折り畳まれていないＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡタンパク質の割合を示す。最後の右側の線は、ｐＨ５．２（リソソームｐＨ）での様々な温度における折り畳まれていないＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡタンパク質の割合を示す。３本の中間の線は、１０μｇ、３０μｇまたは１００μｇのＡＴ２２２１シャペロンのタンパク質折り畳みへの効果を示す。これらのデータは、コントロールサンプルと比較して血液ｐＨでＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのアンフォールディングをＡＴ２２２１が防ぐことを示す。ＡＴ２２２１による中性ｐＨでのＴｍの改善を図１３Ｂにまとめる。
【図１４】ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとシャペロンＡＴ２２２１との組合せにより、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴ２２２１による処置、またはＡＴ２２２１シャペロンなしのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）もしくはＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのいずれかのコントロールによる処置と比べて、ＧＡＡノックアウトマウスにおいて有意に良好なグリコーゲンクリアランスが生じることを示す表である。
【図１５】Ｌｕｍｉｚｙｍｅ、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ、またはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡおよび様々な濃度のＡＴ２２２１シャペロンによる処置後の四頭筋中の残留グリコーゲンである。
【図１６Ａ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処理したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１６Ａ）およびＥＭ（図１６Ｂ）である。図１６Ｃ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。図１６Ｄは、Ｉ型筋繊維およびＩＩ型筋繊維の同定である。
【図１６Ｂ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処理したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１６Ａ）およびＥＭ（図１６Ｂ）である。図１６Ｃ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。図１６Ｄは、Ｉ型筋繊維およびＩＩ型筋繊維の同定である。
【図１６Ｃ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処理したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１６Ａ）およびＥＭ（図１６Ｂ）である。図１６Ｃ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。図１６Ｄは、Ｉ型筋繊維およびＩＩ型筋繊維の同定である。
【図１６Ｄ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処理したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１６Ａ）およびＥＭ（図１６Ｂ）である。図１６Ｃ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。図１６Ｄは、Ｉ型筋繊維およびＩＩ型筋繊維の同定である。
【図１７Ａ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処置したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１７Ａ）である。図１７Ｂ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。
【図１７Ｂ】ＡＴＢ−２００＋ミグルスタット（ＡＴ２２２１）で処置したマウスにおける骨格筋病理の、ＥＲＴのみで処置したマウスを超える改善である。従来のｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタット（ＡＴ−２２２１）とで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスからの筋組織のＰＡＳグリコーゲン染色（図１７Ａ）である。図１７Ｂ；ＬＡＭＰ−１マーカーによるリソソーム増殖の評価である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義：本明細書で使用する用語は、概して、本発明に関連しておよび各用語が使用される具体的な文脈において、当技術分野でのその用語の通常の意味を有する。本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の製造方法および使用方法の説明において当業者に更なるガイダンスを提供するために、ある特定の用語を下記でまたは本明細書の別の箇所で論じる。
【００２２】
用語「ＧＡＡ」は、リソソームグリコーゲンのα−１，４−グリコシド結合およびα−１，６−グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素であるヒト酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ならびにＧＡＡアミノ酸配列およびより長いＧＡＡ配列の酵素活性を発揮する断片の挿入多様体、関係多様体（ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）または置換多様体を意味する。用語「ｒｈＧＡＡ」を、ＧＡＡをコードするＤＮＡによるＣＨＯ細胞の形質転換により産生されるＧＡＡ等の合成ＧＡＡまたは組み換え産生ＧＡＡから内在性ＧＡＡを区別するために使用する。ＧＡＡをコードする例示的なＤＮＡ配列は、参照により援用されるＮＰ＿０００１４３．２（配列番号４）である。ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡは、様々なグリコシル化パターンを有するＧＡＡ分子の混合物（例えば、グリカン上にモノ−Ｍ６Ｐ基またはビス−Ｍ６Ｐ基を担持するｒｈＧＡＡ分子とＭ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを担持しないＧＡＡ分子との混合物）を含む組成物中に存在することができる。ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡを、シャペロン等のその他の化合物により完成させることもでき、またはＧＡＡコンジュゲートもしくはｒｈＧＡＡコンジュゲート中のその他の部分に結合させることもでき、例えば、このコンジュゲートの標的をＣＩＭＰＲに設定し、その後、このコンジュゲートをリソソームに送達するＩＧＦ２部分に結合させることもできる。
【００２３】
グリコーゲンの蓄積を伴う障害を有するその他の動物および非ヒト動物も処置することができるが、「対象」または「患者」は好ましくはヒトである。対象は、ポンペ病またはその他のグリコーゲン貯蔵障害もしくはグリコーゲン蓄積障害を有する胎児、新生児、小児、若年または成人であることができる。処置する個体の一例は、ＧＳＤ−ＩＩ（例えば、乳児型ＧＳＤ−ＩＩ、若年型ＧＳＤ−ＩＩまたは成人発症型ＧＳＤ−ＩＩ）を有する個体（胎児、新生児、小児、若年、青年または成人）である。この個体は残留ＧＡＡ活性を有する可能性がある、または測定可能な活性を有しない可能性がある。例えば、ＧＳＤ−ＩＩを有する個体は、正常なＧＡＡ活性の約１％未満であるＧＡＡ活性（乳児型ＧＳＤ−ＩＩ）、正常なＧＡＡ活性の約１〜１０％であるＧＡＡ活性（若年型ＧＳＤ−ＩＩ）、または正常なＧＡＡ活性の約１０〜４０％であるＧＡＡ活性（成人型ＧＳＤ−ＩＩ）を有する可能性がある。
【００２４】
用語「処置する」および「処置」は、本明細書で使用する場合、疾患と関連する１種もしくは複数種の症状の寛解、疾患の１種もしくは複数種の症状の発症の予防もしくは遅延、および／または疾患の１種もしくは複数種の症状の重症度もしくは頻度の緩和を意味する。例えば、処置は、心臓の状態の改善（例えば、拡張末期および／もしくは収縮末期の容積の増加、または典型的にはＧＳＤ−ＩＩで見られる進行性心筋症の低減、寛解もしくは予防）または肺機能の改善（例えば、ベースライン活量を超える啼泣時肺活量の増加および／もしくは啼泣中の酸素飽和度の正常化）；神経発達および／または運動技能の改善（例えばＡＩＭＳスコアの上昇）；疾患を患う個体の組織中のグリコーゲンレベルの低下；またはこれらの効果の任意の組合せを意味することができる。好ましい一実施形態では、処置は心臓の状態の改善を含み、特にＧＳＤ−ＩＩ関連心筋症の軽減または予防における心臓の状態の改善を含む。
【００２５】
用語「改善する」、「増加させる」または「低減させる」は、本明細書で使用する場合、本明細書で説明する処置の開始前の同じ個体での測定値または本明細書で説明する処置の非存在下でのコントロール個体（もしくは複数のコントロール個体）での測定値等のベースライン測定値と相対的な値を示す。コントロール個体とは、処置する個体と同じ形態のＧＳＤ−ＩＩ（乳児発症、若年発症または成人発症のいずれか）に罹患している個体のことであり、この個体は、（処置する個体における疾患のステージとコントロール個体における疾患のステージとが同等であることを保証するために）処置する個体とほぼ同じ年齢である。
【００２６】
用語「精製された」は、本明細書で使用する場合、単離される物質が得られる天然の物質を含む無関係な物質（即ち夾雑物）の存在を低減または除去する条件下で単離されている物質を意味する。例えば、精製されたタンパク質は、この精製されたタンパク質が細胞中で関連するその他のタンパク質または核酸を好ましくは実質的に含まず、精製された核酸分子は、この精製された核酸分子が細胞内で共に見出されるタンパク質またはその他の無関係の核酸分子を好ましくは実質的に含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」を、物質の分析試験との関係において操作的に（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ）使用する。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製物質は少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７％純粋であり、より好ましくは更に少なくとも９９％純粋である。純度を、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、酵素アッセイおよび当技術分野で既知のその他の方法により評価することができる。具体的な実施形態では、精製されたとは、夾雑物のレベルが、ヒトまたは非ヒト動物への安全な投与のために規制当局にとって許容可能なレベルを下回ることを意味する。クロマトグラフィーサイズ分離、アフィニティークロマトグラフィー、または陰イオン交換クロマトグラフィーによる等の当技術分野で既知の方法を使用して、ＣＨＯ細胞から組み換えタンパク質を単離または精製することができる。
【００２７】
用語「遺伝子改変された」または「組み換え」は、特定の遺伝子産物（例えばｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ）をコードするコード配列を、このコード配列の発現を制御する調節エレメントと一緒に含む核酸の導入後に、この特定の遺伝子産物を発現する細胞（例えばＣＨＯ細胞）を意味する。核酸の導入を、遺伝子ターゲティングおよび相同組み換え等の当技術分野で既知の任意の方法により達成することができる。本明細書で使用する場合、この用語はまた、例えば遺伝子活性化技術により、通常は発現しない内在性の遺伝子または遺伝子産物を発現または過剰発現するように操作されている細胞も含む。
【００２８】
「ポンペ病」は、リソソームグリコーゲン代謝を損なう不十分な酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性を特徴とする常染色体劣性ＬＳＤを意味する。酵素欠乏によりリソソームグリコーゲンが蓄積し、その結果、骨格筋の衰弱が進行し、心機能が低下し、呼吸不全が起こり、および／または疾患の後期ではＣＮＳ機能障害が起こる。ＧＡＡ遺伝子における遺伝子変異により、発現の低下、または最終的には疾患に到る安定性および／もしくは生物学的活性の変更を有する酵素の変異型の生成のいずれかが起こる。（一般に、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  Ｒ，１９９５，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ２４４３−２４６４を参照されたい）。ポンペ病の３種の認識された臨床形態（乳児、若年および成人）は、残留α−グルコシダーゼ活性のレベルと相関関係にある（Ｒｅｕｓｅｒ  Ａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ），Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３，Ｓ６１−Ｓ６９）。乳児型ポンペ病（Ｉ型またはＡ型）は最も一般的で最も重度であり、生後２年以内での発育不全、全身性の筋緊張低下、心肥大および心肺不全を特徴とする。若年型ポンペ病（ＩＩ型またはＢ型）は中間の重症度であり、心拡大がない優性の筋肉症状を特徴とする。若年型ポンペの個体は通常、呼吸不全により２０歳に達する前に死亡する。成人型ポンペ病（ＩＩＩ型またはＣ型）は、１０代または６０代の後半で緩徐進行性のミオパシーとして現れることが多い（Ｆｅｌｉｃｉａ  Ｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ−Ｏｎｓｅｔ  Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  Ｓｉｂｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７４，１３１−１３５）。ポンペでは、α−グルコシダーゼが、グリコシル化、リン酸化およびタンパク質分解処理により翻訳後に広範囲にわたって改変されることが分かっている。最適なグリコーゲン触媒作用には、リソソーム中におけるタンパク質分解により１１０キロダルトン（ｋｉｄｓ）の前駆体の７６および７０ｋｉｄｓの成熟型への変換が必要である。本明細書で使用する場合、用語「ポンペ病」は全てのタイプのポンペ病を意味する。本明細書で開示する製剤および投与レジメンを、例えばＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のポンペ病の処置に使用することができる。
【００２９】
本発明の非限定的実施形態
モノ−マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）またはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを含むｒｈＧＡＡを、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ；ＣＡＳ４２０７９４−０５−０）により例示される従来のｒｈＧＡＡと比べて多量に含む、ＣＨＯ細胞に由来するｒｈＧＡＡ組成物。本発明に係る例示的ｒｈＧＡＡ組成物は、実施例で説明するＡＴＢ−２００（ＡＴＢ−２００、ＡＴＢ−２００またはＣＢＰ−ｒｈＧＡＡと表される場合もある）である。本発明のｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ−２００）は、高い親和性（ＫＤ約２〜４ｎＭ）でＣＩＭＰＲに結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋筋芽細胞によって効率的に内在化される（Ｋｕｐｔａｋｅ約７〜１４ｎＭ）ことが分かっている。ＡＴＢ−２００がｉｎ  ｖｉｖｏで特性決定され、現在のｒｈＧＡＡ  ＥＲＴ（ｔ１／２約６０分）と比べて見かけ上の血漿中半減期が短い（ｔ１／２約４５分）ことが分かった。
【００３０】
ｒｈＧＡＡのアミノ酸配列は、配列番号１、３または４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％もしくは９９％同一であることができ、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはより多くの欠失、置換もしくは付加を含むことができる。本発明のＧＡＡまたはｒｈＧＡＡのいくつかの実施形態、例えばＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡでは、ＧＡＡまたはｒｈＧＡＡは、配列番号１または３の野生型ＧＡＡアミノ酸配列等の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を含むことができる。その他の非限定的実施形態では、ｒｈＧＡＡは、野生型ＧＡＡ中に存在するアミノ酸残基の一部を含み、この一部は、野生型ＧＡＡにおいて基質結合用および／または基質還元用の活性部位を形成するアミノ酸残基を含む。一実施形態では、ｒｈＧＡＡは、この遺伝子の９種の観測したハプロタイプの内の最も優性なものでコードされるグルコシダーゼアルファ（ヒト酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である）である。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ等の本発明のｒｈＧＡＡは、受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）で示され、かつ米国特許第８，５９２，３６２号明細書を参照することにより援用されるアミノ酸配列（配列番号１）等のヒトアルファグルコシダーゼのアミノ酸配列またはＮＰ＿０００１４３．２のアミノ酸配列（配列番号４）と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＧＡＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列もそれぞれ配列番号２および３で示す。このアミノ酸配列の多様体として、下記のＧＡＡアミノ酸配列に対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはより多くのアミノ酸の欠失、挿入または置換を有するものも挙げられる。ＧＡＡおよびそのような多様体ヒトＧＡＡをコードするポリヌクレオチド配列も考えられ、このポリヌクレオチド配列を、本発明に係るｒｈＧＡＡを組み換えにより発現するために使用するこができる。
【００３１】
様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはアラインメントプログラム（例えば、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定で使用することができるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴ）を使用して、２種の配列間の同一性を算出することができる。例えば、本明細書で説明する特定のポリペプチドと少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが考えられる。別途指定しない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性の割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対における総残基の数および割合を示し、ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、かつ互いに類似している残基の数および割合を示す。本開示は、本明細書で開示するアミノ酸配列に対するこれらの程度の同一性もしくは類似性または任意の中程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列を意図し、かつ包含する。類似のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は遺伝暗号を使用して推定され、このポリヌクレオチド配列を従来の手段により得ることができ、特に、遺伝暗号を使用するアミノ酸配列の逆翻訳により得ることができる。
【００３２】
好ましくは、本発明に係る組成物中の総ｒｈＧＡＡの７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５％以下が、Ｍ６Ｐもしくはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを欠いているか、またはカチオン非依存性マノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する能力を欠いている。あるいは、この組成物中のｒｈＧＡＡの３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、＜１００％またはより多くが、Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンおよび／もしくはビス−Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンを少なくとも１個含むか、またはＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。
【００３３】
本発明のｒｈＧＡＡ組成物中のｒｈＧＡＡ分子は、このｒｈＧＡＡｂ分子のグリカン上に１個、２個、３個または４個のＭ６Ｐ基を有することができる。例えば、ｒｈＧＡＡ分子上の少なくとも１個のＮ−グリカンがＭ６Ｐを担持することができる（モノ−リン酸化）か、単一のＮ−グリカンが２個のＭ６Ｐ基を担持することができる（ビス−リン酸化）か、または同じｒｈＧＡＡ分子上の２個の異なるＮ−グリカンが共通のＭ６Ｐ基を担持することができる。このｒｈＧＡＡ組成物中のｒｈＧＡＡ分子はまた、Ｍ６Ｐ基を担持していないＮ−グリカンも有することができる。別の実施形態では、平均して、Ｎ−グリカンは３ｍｏｌ／ｍｏｌ超のＭ６Ｐと４ｍｏｌ／ｍｏｌ超のシアル酸とを含む。平均してｒｈＧＡＡ上の総グリカンの少なくも約３、４、５、６、７、８、９または１０％がモノ−Ｍ６Ｐグリカンの形態であることができ、例えば総グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を担持することができ、平均してｒｈＧＡＡ上の総グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％がビス−Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して本発明の総ｒｈＧＡＡの２５％未満が、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含まない。
【００３４】
本発明に係るｒｈＧＡＡ組成物は、Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量が０．５〜７．０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡの範囲であることができ、または０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５もしくは７．０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡ等の部分範囲のあらゆる中間値を有することができる。実施例で示すように、本発明のｒｈＧＡＡを分画してｒｈＧＡＡ上のＭ６Ｐ担持グリカンまたはビス−Ｍ６Ｐ担持グリカンの平均数が異なるｒｈＧＡＡ組成物を生成し、それにより、特定の画分を選択することにより、または様々な画分を選択的に組み合わせることにより、標的組織中のリソソームへのｒｈＧＡＡターゲティングの更なるカスタマイズを可能にすることができる。
【００３５】
ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの最大６０％が完全にシアル化され得、例えば、このＮ−グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全にシアル化され得る。いくつかの実施形態では、ｒｈＧＡＡ組成物中の総Ｎ−グリカンの４〜２０％が完全にシアル化されている。
【００３６】
その他の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの５％、１０％、２０％または３０％以下が、シアル酸と末端Ｇａｌとを担持する。この範囲は全ての中間値および部分範囲を含み、例えば、本組成物中のｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの７〜３０％がシアル酸と末端Ｇａｌとを担持することができる。
【００３７】
更にその他の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９または２０％以下は末端Ｇａｌのみを有してシアル酸を含まない。この範囲は全ての中間値および部分範囲を含み、例えば、本組成物中のｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの８〜１９％が末端Ｇａｌのみを有することができてシアル酸を含まない。
【００３８】
本発明のその他の実施形態では、本組成物中のｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの４０、４５、５０〜６０％が複合型Ｎ−グリカンであり、または本組成物中のｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ−グリカンであり、本組成物中のｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの５、１０または１５％以下が非リン酸化型であり、本組成物中のｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも５％または１０％がモノ−Ｍ６Ｐリン酸化型であり、および／または本組成物中のｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも１または２％がビス−Ｍ６Ｐリン酸化型である。これらの値は全ての中間値および部分範囲を含む。本発明に係るｒｈＧＡＡ組成物は、上記で説明した含有量範囲の内の１つまたは複数を満たすことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明のｒｈＧＡＡ組成物は平均して、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり２．０〜８．０個のシアル酸残基を担持することができる。この範囲は、２．０個、２．５個、３．０個、３．５個、４．０個、４．５個、５．０個、５．５個、６．０個、６．５個、７．０個、７．５個および８．０個の残基／ｍｏｌ  ｒｈＧＡＡ等の全ての中間値および部分範囲を含む。シアル酸残基は、アシアロ糖タンパク質受容体による非生産的クリアランスを防ぐことができる。
【００４０】
好ましくは、本発明のｒｈＧＡＡ組成物は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００等のＣＨＯ細胞によりまたはそのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物もしくは派生物により産生される。ＧＡＡの対立遺伝子多様体またはその他の多様体ＧＡＡのアミノ酸配列、例えば配列番号１と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を発現するＤＮＡ構築物を構築してＣＨＯ細胞中で発現させることができる。当業者は、そのようなＤＮＡ構築物の産生用のＣＨＯ細胞の形質転換に適した別のベクターを選択することができる。
【００４１】
本発明者らは、ＣＩＭＰＲおよび細胞リソソームを標的とする優れた能力ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを低減させるグリコシル化パターンを有するｒｈＧＡＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生し得ることを発見した。この細胞は、従来のｒｈＧＡＡ製品と比べて総Ｍ６Ｐおよび総ビス−Ｍ６Ｐのレベルが有意に高いｒｈＧＡＡを発現するように誘導され得る。例えば実施例で説明するｒｈＧＡＡ  ＡＴＢ−２００により例示されるように、この細胞により産生される組み換えヒトＧＡＡは、筋細胞ターゲティングＭ６Ｐ基および筋細胞ターゲティングビス−Ｍ６Ｐ基がＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）等の従来のＧＡＡと比べて有意に多く、ＣＩＭＰＲに効率的に結合して骨格筋および心筋により効率的に取り込まれることが分かっている。この組み換えヒトＧＡＡは、有利な薬物動態プロファイルを提供し、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの非生産的クリアランスを低減させるグリコシル化パターンを有することも分かっている。
【００４２】
本発明に係るｒｈＧＡＡを医薬組成物として製剤化することができ、またはポンペ病もしくはＧＡＡの欠乏に関連するその他の状態の処置用の薬剤の製造で使用することができる。本組成物を、生理学的に許容される担体または添加剤と共に製剤化することができる。この担体および組成物は無菌であることができ、その他に投与様式に適合することができる。
【００４３】
薬学的に許容される適切な担体として、水、塩溶液（例えばＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたはデンプン、糖、例えばマンニトール、スクロース等、ブドウ糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。医薬調製物を必要に応じて補助剤と混合することができ、例えば、ポリソルベート８０のようなポリソルベート等の界面活性剤、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、香味料および／または芳香物質等と混合することができ、これらは活性化合物と有害に反応しない。好ましい実施形態では、静脈内投与に適した水溶性担体が使用される。
【００４４】
本組成物または薬剤は、必要に応じて少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。本組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または粉末であることができる。本組成物を、従来の結合剤および担体（例えばトリグリセリド）と共に坐薬として製剤化することもできる。経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。好ましい実施形態では、ＩＶ注入によりｒｈＧＡＡを投与する。
【００４５】
本組成物または薬剤を、ヒトへの投与に適した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化することができる。例えば、好ましい実施形態では、静脈内投与用の組成物は無菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、本組成物は、注射の部位での痛みを和らげるために可溶化剤および局所麻酔薬を含むこともできる。通常、成分は別々にまたは単位剤形中で一緒に混合されて供給され、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋等の密封された容器中の凍結乾燥粉末または水フリー濃縮物として供給される。本組成物を注入により投与する場合、本組成物を、無菌の医薬グレードの水、生理食塩水またはブドウ糖／水を含む注入ボトルにより分注することができる。本組成物を注射により投与する場合、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを、投与前に成分が混合され得るように提供することができる。
【００４６】
ｒｈＧＡＡを中性または塩の形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの等の遊離アミノ基により形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもの等の遊離カルボキシル基により形成される塩が挙げられる。
【００４７】
ｒｈＧＧＡ（またはＧＡＡを含む組成物もしくは薬剤）を適切な経路により投与する。一実施形態では、ＧＡＡを静脈内投与する。その他の実施形態では、ＧＡＡを、心臓または骨格筋（例えば筋肉内）等の標的組織または神経系（例えば脳中、脳室内、髄腔内への直接注射）に直接投与する。必要に応じて、複数の経路を同時に使用することができる。
【００４８】
ｒｈＧＡＡ（またはＧＡＡを含む組成物もしくは薬剤）を、治療上有効な量（例えば、規則的な間隔で投与する場合、上記で説明したように、例えば疾患に関連する症状を改善することにより、疾患の発症を予防するもしくは遅延させることにより、および／または疾患の症状の重症度もしくは頻度も低下させることにより、疾患を処置するのに十分である投薬量）で投与する。疾患の処置において治療上有効であろう量は、疾患の影響の性質および程度に依存し得、標準的な臨床技術により決定され得る。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイを任意選択で用いて、適切な投薬量範囲を容易に明らかにすることができる。用いる正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し得、当業者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。効果的な用量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系に由来する用量応答曲線から推定することができる。好ましい実施形態では、治療上有効な量は、個体の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ以下の酵素であり、好ましくは体重１ｋｇ当たり約１〜１０ｍｇの酵素の範囲であり、更により好ましくは体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの酵素または体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの酵素である。特定の個体に有効な用量を、個体の必要性に応じて経時的に変える（増加または低減させる）ことができる。例えば、身体的疾病もしくはストレスの際には、または抗ＧＡＡ抗体が存在もしくは増加するようになる場合、または疾患の症状が悪化した場合、この量を増加させることができる。
【００４９】
治療上有効な量のＧＡＡ（またはＧＡＡを含む組成物もしくは薬剤）を、疾患の影響の性質または程度に応じて規則的な間隔でかつ継続的に投与する。「規則的な間隔」での投与は、本明細書で使用する場合、治療上有効な量を（１回の用量と区別して）定期的に投与することを示す。この間隔を標準的な臨床技術により決定することができる。好ましい実施形態では、ＧＡＡを１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１週間に１回、１週間に２回、または毎日投与する。単一の個体のための投与間隔は固定された間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて経時的に変動され得る。例えば、身体的疾病もしくはストレスの際には、抗ＧＡＡ抗体が存在もしくは増加するようになる場合、または疾患の症状が悪化した場合、用量間の間隔を短縮することができる。いくつかの実施形態では、５、１０、２０、５０、１００または２００ｍｇ酵素／ｋｇ体重である治療上有効な量を、１週間に２回、１週間に１回または隔週でシャペロンと共にまたはシャペロンなしで投与する。
【００５０】
本発明のＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを後の使用のために調製することができ、例えば、単位用量のバイアルもしくはシリンジ中または静脈内投与用のボトルもしくは袋中で調製することができる。ＧＡＡまたはｒｈＧＡＡと、任意選択的な添加剤またはシャペロン等のその他の活性成分またはその他の薬剤とを含むキットを包装材中に封入することができ、ポンペ病を有する患者等の処置を必要とする対象を処置するための再構成、希釈または投薬に関する説明書を添付することができる。
【００５１】
ＧＡＡ（またはＧＡＡを含む組成物もしくは薬剤）を、単独でまたはシャペロン等のその他の薬剤と共に投与することができる。モノ−Ｍ６Ｐもしくはビス−Ｍ６Ｐによるグリコシル化の程度が異なるｒｈＧＡＡを投与することができ、またはＭ６Ｐグリコシル化もしくはビスＭ６Ｐグリコシル化の程度が異なるｒｈＧＡＡの組合せを投与することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明のｒｈＧＡＡ組成物を、ＡＴ２２００またはＡＴ−２２２１等のシャペロンと複合体化させることができ、またはこのシャペロンと混合することができる。シャペロン（「薬理学的シャペロン」と称される場合がある）とは、ｒｈＧＡＡと複合体化された場合またはｒｈＧＡＡと共投与された場合にｒｈＧＡＡの薬物動態およびその他の薬理学的特性を変更する化合物のことである。本明細書で例示する代表的なシャペロンとして、ＡＴ２２２１（ミグルスタット、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン）およびＡＴ２２２０（ドゥボグルスタット（ｄｕｖｏｇｌｕｓｔａｔ）ＨＣｌ、１−デオキシノジリマイシン）が挙げられる。そのような複合体化または混合は体外または体内で生じることができ、例えば、ｒｈＧＡＡおよびシャペロンの別々の投薬量を投与する。例えば、本発明の活性ｒｈＧＡＡ、この活性ｒｈＧＡＡの画分または誘導体のＣＩＭＰＲへのターゲティングおよびその後の細胞リソソームへのターゲティングを、この活性ｒｈＧＡＡをドゥボグルスタット−ＨＣｌ（ＡＴ２２２０、デオキシノジリマイシン、ＡＴ２２２０）またはミグルスタット（ＡＴ２２２１、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン）と組み合わせることにより改善することができる。下記の実施例は、シャペロンと組み合わせて本発明の良好に標的設定されたｒｈＧＡＡを投与したＧＡＡノックアウトマウスの重要な骨格筋中における有意なグリコーゲン基質低減を示す。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明に係るｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞またはその誘導体またはその他の均等物に関係する。そのようなＣＨＯ細胞株の一例は、本明細書で説明するｒｈＧＡＡ組成物を産生するＧＡ−ＡＴＢ−２００またはその継代培養物である。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子の複数のコピー（例えば、５、１０、１５もしくは２０またはより多くのコピー）を含むことができる。
【００５４】
ＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を形質転換させることにより、本発明の高Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡおよび高ビス−Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡ（例えばＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ）を産生することができる。ＣＨＯ細胞はｒｈＧＡＡの製造に既に使用されているが、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐグリカンおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンの含有量が高いｒｈＧＡＡを産生するように形質転換ＣＨＯ細胞を培養して選択し得ることが認識されていなかった。
【００５５】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＨＯ細胞株を形質転換させ、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンを高含有量で含むｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択し、この高Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡを安定的に発現することが可能であることを発見した。そのため、本発明の関連態様は、このＣＨＯ細胞株を製造する方法を対象とする。この方法は、ＧＡＡまたはＧＡＡ多様体をコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換させることと、ＧＡＡをコードするＤＮＡをＣＨＯ細胞の染色体に安定的に組み込み、かつＧＡＡを安定的に発現するＣＨＯ細胞を選択することと、Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンの含有量が高いＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択することと、任意選択で、シアル酸含有量が高いＮ−グリカンを有し、かつ／または非リン酸化高マンノース含有量が低いＮ−グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することとを含む。
【００５６】
このＣＨＯ細胞株を培養し、ＣＨＯ細胞の培養物から本発明に係るｒｈＧＡＡ組成物を回収することにより、このＣＨＯ細胞株を使用して本発明に係るｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ組成物を製造することができる。
【００５７】
本発明のｒｈＧＡＡ組成物またはその画分もしくは誘導体を有利に使用して、このｒｈＧＡＡ組成物を投与することにより、不十分なリソソームＧＡＡに関連する状態、障害または疾患を有する対象を処置する。処置を必要とする対象として、グリコーゲン貯蔵症ＩＩ型（ポンペ病）を有する対象、ならびにｒｈＧＡＡの投与により利益を得るであろうその他の状態、障害または疾患を有する対象が挙げられる。
【００５８】
下記の実施例は、本発明のｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ−２００）が、従来のｒｈＧＡＡ製品と比べて有意に低い投薬量で投与された場合、骨格筋細胞に取り込まれ、ＣＩＭＰＲに結合し、骨格筋細胞からグリコーゲンを効率的に除去することを示す。ＡＴＢ−２００の静脈内投与の隔週レジメンを使用するＧＡＡノックアウトマウスでは、骨格筋筋芽細胞中のグリコーゲンの最大７５％の低減が達成された。この低減は同量のＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）によりもたらされる低減を上回っており、これは、Ｍ６Ｐを担持するＮ−グリカンおよびビス−Ｍ６Ｐを担持するグリカンの含有量が増大している本発明のｒｈＧＡＡによりグリコーゲン基質の優れた低減がもたらされたことを示す。ターゲティングの改善に起因して、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）等の従来ｒｈＧＡＡ製品と比べて低い投薬量で本発明のｒｈＧＡＡ組成物の薬理および薬物動態を与えることができる。
【００５９】
本発明のｒｈＧＡＡを使用して、心筋、平滑筋または横紋筋からグリコーゲンを分解するか、低減させるか、また除去することができる。処置対象の骨格筋または横紋筋の例として、小指外転筋（足）、小指外転筋（手）、母趾外転筋（ａｂｄｕｃｔｏｒ  ｈａｌｌｕｃｅｓ）、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、肘関節筋、膝関節筋（ａｒｔｉｃｕｌａｒｉｓ  ｇｅｎｕ）、披裂喉頭蓋筋（ａｒｙｅｐｉｇｌｏｔｔｉｃｕｓ）、アリヨルダニクス（ａｒｙｊｏｒｄａｎｉｃｕｓ）、耳介筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、球海綿体筋、下咽頭の収縮筋、中咽頭の収縮筋、上咽頭の収縮筋、烏口腕筋、皺眉筋、精巣挙筋、輪状甲状筋、肉様膜、深会陰横筋（ｄｅｅｐ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｅｒｉｎｅｉ）、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、横隔膜、二腹筋、二腹筋（前面像）、脊柱起立筋−棘筋、脊柱起立筋−腸肋筋、脊柱起立筋−最長筋、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋（手）、指伸筋（手）、短指伸筋（足）、長指伸筋（足）、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、外腹斜筋（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｏｂｌｉｑｕｅ  ａｂｄｏｍｉｎｉｓ）、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（足）、短小指屈筋（手）、短指屈筋、長指屈筋（足）、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、下双子筋、上双子筋、オトガイ舌筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、舌骨舌筋、腸骨筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、外肋間筋、最内肋間筋、内肋間筋、内腹斜筋（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｏｂｌｉｑｕｅ  ａｂｄｏｍｉｎｉｓ）、手の背側骨間筋、足の背側骨間筋、手の掌側骨間筋、足の底側骨間筋、棘間筋、横突間筋、舌の内在筋、坐骨海綿体筋、外側輪状披裂筋、外側翼突筋、外側直筋、広背節、口角挙筋、肛門挙筋−尾骨、肛門挙筋−腸骨尾骨筋、肛門挙筋−恥骨尾骨筋、肛門挙筋−恥骨直腸筋、肛門挙筋−恥骨膣筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、口蓋帆挙筋、肋骨挙筋、頭長筋、頚長筋、足の中様筋（４）、手の中様筋、咬筋、内側翼突筋、内直筋、オトガイ筋、口蓋垂筋、顎舌骨筋、鼻筋、斜披裂筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋（Ａ）、内閉鎖筋（Ｂ）、肩甲舌骨筋、小指対立筋（手）、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、舌口蓋筋、口蓋咽頭筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋（Ａ）、梨状筋（Ｂ）、足底筋、広頚筋、膝窩筋、後輪状披裂筋、鼻根筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、小腰筋、錐体筋、大腿方形筋、腰方形筋、足底方形筋、腹直筋、前側頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、耳管咽頭筋、縫工筋、前斜角筋、中斜角筋、最小斜角筋、後斜角筋、半膜様筋、半腱様筋、前鋸筋、下後鋸筋、上後鋸筋、ヒラメ筋、肛門括約筋、尿道括約筋、頭板状筋、頚板状筋、アブミ骨筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌筋、茎突舌骨筋、茎突舌骨筋（前面像）、茎突咽頭筋、鎖骨下筋、肋下筋、肩甲下筋、浅会陰横筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、側頭頭頂筋、大腿筋��張筋、鼓膜張筋、口蓋帆張筋、大円筋、小円筋、甲状披裂筋および声帯筋、甲状喉頭蓋筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、横披裂筋、横突棘筋−多裂筋、横突棘筋−回旋筋、横突棘筋−半棘筋、腹横筋、胸横筋、僧帽筋、三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋からなる群からから選択される少なくとも１種の筋肉が挙げられる。
【００６０】
本発明のＧＡＡ組成物を、１型（緩徐収縮）筋繊維もしくは２型（速収縮）筋繊維もしくはそのような筋繊維中でグリコーゲンを蓄積している対象に投与することもでき、または本発明のＧＡＡ組成物を使用して、１型（緩徐収縮）筋繊維もしくは２型（速収縮）筋繊維もしくはそのような筋繊維中でグリコーゲンを蓄積している対象を処置することができる。Ｉ型（緩徐収縮）筋または赤筋は、毛細管が密集しており、ならびにミトコンドリアおよびミオグロビンに富んでおり、筋組織に特徴的な赤色が付与される。Ｉ型筋は、より多くの酸素を担持することができ、燃料として脂肪または炭水化物を使用して有酸素活動を持続することができる。緩徐収縮繊維は、長期にわたるが小さい力で収縮する。ＩＩ型（速収縮）筋は、収縮速度および生じる力の両方が異なる３種の主要なサブタイプ（ＩＩａ、ＩＩｘおおびＩＩｂ）を有する。速収縮繊維は急速かつ強力に収縮するが非常に急激に疲労し、筋収縮が有痛性になる前に無酸素性の爆発的活動を短期間だけ維持する。速収縮繊維は筋力に最も寄与し、質量の増加の可能性をより高める。ＩＩｂ型は、ミトコンドリアおよびミボグロビンがわずかに密集している無酸素性で糖分解性の「白」筋である。小動物（例えば齧歯動物）ではＩＩＢ型が主要な速筋型であり、この小動物の肉の浅色を説明する。
【００６１】
本発明のｒｈＧＡＡ組成物、その画分または誘導体を、例えば静脈内（ＩＶ）注入により全身投与することができ、または所望の部位（例えば心筋、もしくは四頭筋、三頭筋等の骨格筋、もしくは横隔膜）中に直接投与することができる。本発明のｒｈＧＡＡ組成物を筋細胞に投与することができ、特に筋組織、筋肉または筋群に投与することができる。例えば、そのような処置では、このｒｈＧＡＡ組成物を対象の四頭筋または三頭筋または横隔膜中に直接、筋肉内投与することができる。
【００６２】
上述したように、本発明のｒｈＧＡＡ組成物、その画分または誘導体を、ＡＴ−２２２０（ドゥボグルスタットＨＣｌ、１−デオキシノジリマイシン）もしくはＡＴ−２２２１（ミグルスタット、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン）またはこれらの塩等のシャペロンと複合体化させ、またはこのシャペロンと混合し、ｒｈＧＡＡ投与の薬物動態を改善することができる。ｒｈＧＡＡおよびシャペロンを一緒にまたは別々に投与することができる。同時に投与する場合、この組成物中のＧＡＡにシャペロンを予め組み込むことができる。あるいは、ＧＡＡおよびシャペロンを同時にまたは異なる時間で別々に投与することができる。
【００６３】
ＡＴ２２２１の代表的な投薬量は０．２５〜４００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは０．５〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、最も好ましくは２〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。ＡＴ２２２１の具体的な投薬量として、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５および５０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。これらの投薬量を、１５：１〜１５０：１の範囲のＡＴ２２２１対ｒｈＧＡＡのモル比でｒｈＧＡＡ（例えばＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ）と組み合わせることができる。具体的な比として、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、１００：１、１２５：１および１５０：１が挙げられる。ｒｈＧＡＡおよびＡＴ２２２１を、これらの量またはモル比で、同時に、順次にまたは別々に共投与することができる。上記の範囲は、この範囲の端点の間の全ての整数値等の全ての中間の部分範囲および値を含む。
【００６４】
ＡＴ２２２０の代表的な投薬量は０．１〜１２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは０．２５〜６０の範囲であり、最も好ましくは０．６〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。ＡＴ２２２０の具体的な投薬量として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５および３０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。これらの投薬量を、１５：１〜１５０：１の範囲のＡＴ２２２０対ｒｈＧＡＡのモル比でｒｈＧＡＡ（例えばＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ）と組み合わせることができる。具体的な比として、１５：１、２０：１２５：１、５０：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、１００：１、１２５：１および１５０：１が挙げられる。ｒｈＧＡＡおよびＡＴ２２２０を、これらの量またはモル比で、同時に、順次にまたは別々に共投与することができる。上記の範囲は、この範囲の端点の間の全ての整数値等の全ての中間の部分範囲および値を含む。
【００６５】
本発明のｒｈＧＡＡ組成物、その画分または誘導体を使用して、組織、筋肉、筋繊維、筋細胞、リソソーム、オルガネラ、細胞内コンパートメントまたは細胞質中のグリコーゲンを代謝するか、分解するか、除去するか、またはその他に低減させることもできる。任意選択で、シャペロンまたはｒｈＧＡＡに対する免疫応答を低減させる薬剤と共に、このｒｈＧＡＡ組成物を対象に投与することによる。
【００６６】
この使用方法の別の実施形態では、本発明のｒｈＧＡＡ、その画分または誘導体を、任意選択でシャペロンとの組合せにおいて、または任意選択で別のターゲティング部分とのコンジュゲートとして、細胞中におけるリソソームの増殖、自食作用または開口分泌の調節を必要とする細胞、組織または対象に投与することにより、本発明のｒｈＧＡＡを使用して細胞中におけるリソソームの増殖、自食作用または開口分泌を調節することができる。自食作用とは、細胞が、この細胞のリソソームの作用によりグリコーゲンまたはその他の不必要なもしくは機能不全の細胞成分を分解することを可能にする異化メカニズムのことである。この方法はまた、処置を必要とする対象にＧＡＡ組成物を全身投与または局所投与することも含むことができる。
【００６７】
本発明に係るｒｈＧＡＡ（Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＭｙｏｚｙｍｅと比較してモノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐが富化されており、このｒｈＧＡＡのグリコシル化パターンにより付与された有利な薬物動態特性を有する）を、複合炭水化物の分解を必要とするその他の状態の処置に使用することもでき、例えば、グリコーゲンまたはｒｈＧＡＡにより分解されるその他の炭水化物がリソソーム中にまたはｒｈＧＡＡがアクセス可能な細胞のその他の部分（例えば細胞質）中に蓄積しているその他の障害（例えばグリコーゲン貯蔵症ＩＩＩ型）の処置に使用することもできる。本発明に係るｒｈＧＡＡを非治療目的にも使用することができ、例えば、デンプンおよびグリコーゲン等の複合炭水化物のこのモノマーへの分解を必要とする食品、飲料品、化学製品および医薬品の製造に使用することもできる。
【実施例】
【００６８】
下記の非限定的な実施例は本発明の態様を例証する。
【００６９】
第Ｉ節：ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡおよびその特性
既存のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ製品およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ製品の限界
ポンペ病用に現在承認されている唯一の処置剤であるＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物をＣＩＭＰＲカラム（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）上に注入し、その後に遊離Ｍ６勾配で溶出させた。画分を９６ウェルプレート中に回収し、４ＭＵ−α−グルコース基質でＧＡＡ活性をアッセイした。結合したｒｈＧＡＡおよび結合していないｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
【００７０】
図５は、従来のＥＲＴ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））に関連する問題を説明しており、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）中のｒｈＧＡＡの７３％（図５Ｂ）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中のｒｈＧＡＡの７８％（図５Ａ）がＣＩＭＰＲに結合しなかった（各図の左端のピークを参照されたい）。わずかにＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）中のｒｈＧＡＡの２７％およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中のｒｈＧＡＡの２２％が、ｒｈＧＡＡの標的を筋細胞上のＣＩＭＰＲに生産的に設定することができるＭ６Ｐを含んだ（生産的薬剤ターゲティングおよび非生産的薬剤クリアランスを説明する図２を参照されたい）。
【００７１】
Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の有効用量は、筋細胞上のＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐを含むｒｈＧＡＡの量に対応する。しかしながら、これら２種の従来製品中のｒｈＧＡＡの大部分は、標的筋細胞上のＣＩＭＰＲ受容体を標的としない。ｒｈＧＡＡの大部分が筋細胞を標的としない従来のｒｈＧＡＡの投与により、標的が設定されていないｒｈＧＡＡに対するアレルギー反応または免疫の誘導のリスクが増大する。
【００７２】
モノ−Ｍ６Ｐ担持Ｎ−グリカンまたはビス−Ｍ６Ｐ担持Ｎ−グリカンの含有量が高いＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ｒｈ−ＧＡＡを発現するＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした後、ｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈ−ＧＡＡをコードするＤＮＡによるＣＨＯ細胞の形質転換用のＤＮＡ構築物を図５に示す。ｒｈ−ＧＡＡを発現するＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした後、ｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
【００７３】
トランスフェクション後、安定的に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含むＤＧ４４  ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をヒポキサンチン／チミジン欠乏（−ＨＴ）培地）で選択した。この細胞中でのＧＡＡ発現の増幅を、メトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）により誘発した。ＧＡＡを多量に発現する細胞プールをＧＡＡ酵素活性アッセイにより同定し、この細胞プールを使用して、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立した。個々のクローンを半固体培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムで採取し、２４ディープウェルプレートに移した。個々のクローンをＧＡＡ酵素活性に関してアッセイし、高レベルでＧＡＡを発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を測定するための条件培地は、４−ＭＵ−α−グルコシダーゼ基質を使用した。ＧＡＡ酵素アッセイで測定した場合にＧＡＡをより高いレベルで産生するクローンを、生存率、増殖能、ＧＡＡ産生力、Ｎ−グリカン構造および安定的なタンパク質発現に関して更に評価した。この手順を使用して、モノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンまたはビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンが増大しているｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株（例えばＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００）を単離した。
【００７４】
ｒｈＧＡＡ  ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの精製
ＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００を使用して、本発明に係るｒｈＧＡＡの複数のバッチを振とうフラスコ中でおよび潅流バイオリアクタ中で製造し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。様々な製造バッチからの精製されたＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡに関して、図６Ｂおよび図７に示すＣＩＭＰＲ受容体結合と同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）を観測し、これは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡが常に産生され得ることを示す。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡと比べて有意に少ないＣＩＭＰＲ結合を示した。
【００７５】
ＡＴＢ−２００とＬｕｍｉｚｙｍｅとの分析比較
弱陰イオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸塩に従ってＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡを分画した。塩の量を増加させてＥＲＴを溶出させることにより、溶出プロファイルを作成した。このプロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニタリングした。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）を商業的供給源から得た。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側で高いピークを示した。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の右側に溶出する４つの突出したピークを示した（図８）。このことから、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡがＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比べて大きい程度までリン酸化されたことが確認される。なぜなら、この評価は、ＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるからである。
【００７６】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡのオリゴ糖の特性決定
精製されたＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のグリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上で見出される個々のグリカン構造を決定した（図９）。ＡＴＢ−２００サンプルは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比べて非リン酸化高マンノース型Ｎ−グリカンをわずかに低い量で含むことが分かった。ＡＴＢ−２００中のＭ６Ｐグリカンの含有量はＬｕｍｉｚｙｍｅ中と比べて高いことから、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの標的が筋細胞により効率的に設定される。ＭＡＬＤＩにより決定したモノ−リン酸化構造およびビス−リン酸化構造の高い割合は、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ−２００の有意に高い結合を示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるＮ−グリカン分析から、平均して、各ＡＴＢ２００分子は少なくとも１個の天然ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン構造を含むことを確認した。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡに関するより高いビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイでのＣＩＭＰＲへの高親和性結合（ＫＤ約２〜４ｎＭ）（図１０Ａ）と直接相関した。
【００７７】
ＡＴＢ−２００のＣＩＭＰＲ親和性の特性決定
ＣＩＭＰＲに結合することができるｒｈＧＡＡをより高い割合で有することに加えて、この相互作用の質を理解することが重要である。ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを使用して、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの受容体結合を測定した。簡潔に言うと、ＣＩＭＰＲ被覆プレート使用してＧＡＡを捕捉した。固定した受容体に様々な濃度のｒｈＧＡＡを塗布し、結合していないｒｈＧＧＡを洗い落とした。残存するｒｈＧＡＡの量をＧＡＡ活性により測定した。図１０Ａに示すように、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅと比べて有意に多くＣＩＭＰＲに結合した。
【００７８】
図１０Ｂは、従来のｒｈＧＡＡであるＬｕｍｉｚｙｍｅ中のビス−Ｍ６Ｐグリカンおよび本発明に係るＡＴＢ−２００中のビス−Ｍ６Ｐグリカンの相対含有量を示す。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の場合、平均してわずか１０％の分子がビス−リン酸化グリカンを有する。これとは対照的に、ＡＴＢ−２００では、平均して全てのｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１個のビス−リン酸化グリカンを有する。
【００７９】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、線維芽細胞によりＬｕｍｉｚｙｍｅと比べて効率的に内在化された。
正常な線維芽細胞株およびポンペ線維芽細胞株を使用して、ＡＴＢ−２００およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを比較した。比較には、５〜１００ｎＭの本発明に係るＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡと、１０〜５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡ  Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）とを含めた。１６時間のインキュベーション後、外部のｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に回収した。内在化されたＧＡＡを４ＭＵ−α−グルコシド加水分解により測定して総細胞タンパク質に対してグラフ化し、結果を図１１に示す。
【００８０】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡはそれぞれの細胞中に効率的に内在化されることも分かり（図１１Ａおよび図１１Ｂ）、これは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡが正常な線維芽細胞およびポンペ線維芽細胞の両方に内在化されること、ならびに従来のＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のｒｈＧＡＡと比べて大きい程度まで内在化されることを示す。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは約２０ｎＭで細胞受容体を飽和させるが、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）では約２５０ｎＭが必要である。これらの結果から推定される取り込み効率定数（Ｋｕｐｔａｋｅ）は、図１１Ｃに示すように、ＡＴＢ−２００の場合には２〜３ｎｍであり、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の場合には５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡがポンペ病を目的とした良好な標的化処置であることを示唆する。
【００８１】
第ＩＩ節：前臨床研究
優れたグリコシル化を有するＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、ＧＡＡ  ＫＯマウスの骨格筋におけるグリコーゲンクリアランスに関して、標準的な治療ＥＲＴと比べ有意に良好であった
上記で説明したように、組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）を使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ポンペ病に利用可能な唯一の承認された処置である。このＥＲＴには、細胞取り込みおよびその後の細胞カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩＭＰＲ）によるリソソームへの送達のために、特殊な炭水化物マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）が必要である。しかしながら、現在のｒｈＧＡＡ  ＥＲＴが含むＭ６Ｐは少量であり、そのため薬剤ターゲティングと疾患関連組織中での有効性とが制限される。本発明者らは、薬物ターゲティングの改善のために、従来のｒｈＧＡＡと比べて（特に高親和性ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン構造と比べて）優れたグリコシル化および高いＭ６Ｐ含有量を有するｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡと表す）が得られる産生用細胞株および製造方法を開発した。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは高親和性（ＫＤ約２〜４ｎＭ）でＣＩ−ＭＰＲに結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋筋芽細胞によりに効率的に内在化された（Ｋｕｐｔａｋｅ約７〜１４ｎＭ）。
【００８２】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、骨格筋中においてＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比べて有意に良好にグリコーゲンを除去する。ＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンクリアランスに関するＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの投与の効果を評価した。動物に２回ＩＶボーラス投与し（隔週）、最後の用量から２週後に組織を摘出してＧＡＡ活性およびグリコーゲン含有量に関して分析した（図１２）。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡは、心臓中のグリコーゲンの除去に関して同等に有効であった（図１２Ａ）。図１２Ｂおよび図１２Ｃに示すように、５ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、骨格筋中のグリコーゲンの低減に関して２０ｍｇ／ｋｇでのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡと同等であり、１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与したＡＴＢ−２００は、骨格筋中のグリコーゲンの除去に関してＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比べて有意に良好であった。
【００８３】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとＡＴ２２２１との共投与の理論的根拠（ＣＨＡＲＴ技術）
シャペロンはｒｈＧＡＡ  ＥＲＴに結合して安定化させ、活性酵素の組織中への取り込みを増加させ、忍容性を改善し、免疫原性を潜在的に軽減する。上記に示すように、ＣＨＡＲＴ（商標）を使用して、好ましくない条件下でのＥＲＴのタンパク質安定性を大幅に改善した。ＣＨＡＲＴ：シャペロン改良型補充療法、参照により援用するｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ａｍｉｃｕｓｒｘ．ｃｏｍ／ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．ａｓｐｘ（最終アクセス２０１５年９月２２日）を参照されたい。図１３Ａおよび図１３Ｂに示すように、ＡＴ２２２１（ミグルスタット、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン）によりＡＴＢ−２００の安定性が有意に改善した。中性（ｐＨ７．４−血漿環境）緩衝液または酸性（ｐＨ５．２−リソソーム環境）緩衝液中での熱変性により、ｒｈＧＡＡタンパク質の折り畳みを３７℃でモニタリングした。ＡＴ２２２０は、中性ｐＨ緩衝液中において２４時間を超えてｒｈＧＡＡタンパク質を安定化させた。
【００８４】
ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとＡＴ２２２１（ミグルスタット）との共投与と比較した、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）とミグルスタットとの共投与
１２週齢のＧＡＡ  ＫＯマウスをＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの隔週での４回注射）で処置し、適応がある場合にｒｈＧＡＡの３０分前にミグルスタットを１０ｍｇ／ｋｇのＰＯで共投与した。グリコーゲン測定のために、最後の酵素用量の１４日後に組織を採取した。図１４は、四頭筋および三頭筋の骨格筋中のグリコーゲンの相対的低減を示す。
【００８５】
薬理学的シャペロンＡＴ２２２１（ミグルスタット）と共投与したＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡによる組織グリコーゲンの低減
薬理学的シャペロンとＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとの組合せがｉｎ  ｖｉｖｏでグリコーゲンクリアランスを増強することが分かった。ＧＡＡ  ＫＯマウスに、隔週で２０ｍｇ／ｋｇにおいてｒｈＧＡＡを２回ＩＶボーラス投与した。薬理学的シャペロンＡＴ２２２１を０、１、２および１０ｍｇ／ｋｇの投与量でｒｈＧＡＡの３０分前に経口投与した。ＥＲＴの最後の用量の２週後に組織を摘出し、ＧＡＡ活性、グリコーゲン含有量、細胞特異的グリコーゲンおよびリソソーム増殖に関して分析した。
【００８６】
図１５に示すように、ＡＴＢ２００＋シャペロンＡＴ２２２１を投与した動物は、四頭筋からのグリコーゲンクリアランスの増強を示した。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）は同じ用量のＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）と比べてグリコーゲンを低減させ、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡを１０ｍｇ／ｋｇのＡＴ２２２０と組み合わせた場合、筋肉中のグリコーゲンの正常付近のレベルを達成した。
【００８７】
図１６Ａおよび図１６Ｂに示すように、グリコーゲン低減の制限を示した（大量の点状のＰＡＳシグナルで示す）従来のｒｈＧＡＡとは異なり、ＡＴＢ−２００ｒｈＧＡＡ単独でＰＡＳシグナルの有意な低減を示した。１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットとの共投与により、基質の大幅な更なる低減が起きた。ＴＥＭから、膜結合した電子密度の高い物質としてリソソーム中のグリコーゲンの大部分が明らかとなり、これらは点状のＰＡＳシグナルに対応する。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとミグルスタットとの共投与により、基質含有リソソームの数、サイズおよび密度が低減し、これは、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡの筋細胞を標的とした送達およびその後のリソソームを標的とした送達を示唆する。
【００８８】
上記に示した研究（２回のＩＶボーラス隔週注射）から、組織を、ＬＡＭＰ１マーカーを使用してリソソーム増殖に関して処理し、この上方制御はポンペ病の別の特徴である。ＬＡＭＰ：リソソーム関連膜タンパク質。上記に示した研究（２回のＩＶボーラスＥＯＷ注射）から、ヒラメ筋組織を、隣接区画においてＬＡＭＰ１染色に関しておよび隣接区画においてＩ型繊維特異的抗体（ＮＯＱ７．５．４Ｄ）に関して処理し図１６Ｃおよび図１６Ｄ）、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは、従来のｒｈＧＡＡと比較して大幅なＬＡＭＰ１低減を生じ、ＷＴ動物で見られるレベルまで低減した図１６Ｃ）。
【００８９】
加えて、効果がＩ型繊維（緩徐収縮、アスタリスクで印を付けている）にほとんど限定されているｒｈＧＡＡとは異なり、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡではＩＩ型（速収縮）繊維（赤色の矢頭）の一部においてもＬＡＭＰ１シグナルが有意に低減した（図１６Ｄ）。重要なことに、ミグルスタットとの共投与により、ＩＩ型繊維の大部分において、ＬＡＭＰ１増殖のＡＴＢ−２００により媒介される低減が更に改善された（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）。結果として、ＬＡＭＰ１シグナルのレベルで繊維型に特異的で有意な差異は見られなかった。同様の結論が四頭筋および横隔膜から得られた（データを示さない）。
【００９０】
同様に設計された別の研究では、４回の隔週ＩＶボーラス注射により、より長い期間にわたりＡＴＢ−２００±ＡＴ２２２１の効果を調べた。心臓では、ｒｈＧＡＡまたはＡＴＢ−２００のいずれかの反復投与により、心筋細胞での主なグリコーゲン貯蔵が野生型（ＷＴ）動物で見られるレベルまで容易に除去された（図１７Ａ）。しかしながら、心臓の平滑筋細胞中の基質は好ましくはＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡにより除去されるように思われ、これは、ｒｈＧＡＡと比較してＡＴＢ−２００の潜在的に広域な生体内分布を示唆する（アスタリスクは心臓の血管の管腔を示す）。重要なことに、ミグルスタットとの共投与により、ＬＡＭＰ１増殖のＡＴＢ−２００により媒介される低減が更に改善された。
【００９１】
これらの結果から、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡ（このＮ−グリカン上のＭ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐのレベルがより高い）は骨格筋中のＣＩＭＰＲを効率的に標的にすることが分かる。ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの非生産的クリアランスを最小化する、十分に処理された複合型Ｎ−グリカンも有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適した薬物動態特性も有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの重要な筋組織への良好なターゲティングも示す。これらから、ＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡは筋組織中のグリコーゲンの低減に関して従来の標準的治療Ｌｕｍｉｚｙｍｅと比べて良好であること、およびＡＴＢ−２００  ｒｈＧＡＡとシャペロンＡＴ２２２１との組合せにより、標的組織からのグリコーゲンの除去が更に改善されて筋肉病理が改善されることも分かる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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