(57)【要約】  血小板減少症、アレルギー、止血障害、免疫性、炎症性及び自己免疫性障害を含むＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害を治療するための方法及び使用と同様に、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体が包含される。【選択図】図３４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療する、方法。
【請求項２】
ヒト被験体におけるＣＤ３２ａを遮断するための方法及び／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げるための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げる、方法。
【請求項３】
ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療することにおけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、使用。
【請求項４】
ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、使用。
【請求項５】
ヒト被験体においてＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げることにおけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げる、使用。
【請求項６】
ヒト被験体においてＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げるための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げる、使用。
【請求項７】
エフェクター欠損抗体が、ＩｇＧ免疫複合体試験及び固定化ＩｇＧ試験の両方に適合し、ここで、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように、エフェクター欠損抗体のＦＣ領域が改変されている、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３から６の何れか一項に記載の使用。
【請求項８】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害が、ＩｇＧ媒介性止血障害である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項９】
止血障害が、血小板減少症を伴うか又は伴わない血栓症である、請求項８に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
止血障害が、ＩｇＧ媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症（ＩＴＰ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴＴ）、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択される、請求項８に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害が、ＩｇＧ媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
ＩｇＧ媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ＩｇＧ抗体誘発性貧血、及びＩｇＧ媒介性血球減少からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害が、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるＣＤ３２ａのＩｇＧ−Ｆｃ媒介性活性化によって特徴付けられる、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１４】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害が、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害である、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害が、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体（ＡＴＡ）応答である、請求項１４に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
非抗ＣＤ３２ａ抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール（抗体様）、ゴリムマブ、エタネルセプト（抗体様）、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブである、請求項１５に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体が、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与される、請求項１５又は１６に記載の方法又は使用。
【請求項１８】
ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体により治療されている患者において生じる、請求項１５に記載の方法又は使用。
【請求項１９】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害が、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するＩｇＧにより特徴付けられる、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
循環細胞型が、血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Ｂリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物の１つ以上からなる、請求項１９に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
疾患又は障害が、血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症の１つ以上から選択される、請求項１９又は２０に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、方法。
【請求項２３】
ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するためのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、使用。
【請求項２４】
ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための医薬の調製のためのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、使用。
【請求項２５】
アレルギー性疾患が、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物に対するアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法又は請求項２３又は２４に記載の使用。
【請求項２６】
エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体が、エフェクター欠損ＭＤＥ−８、ＩＶ．３又はＡＴ−１０モノクローナル抗体である、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２７】
モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項２６に記載の方法又は使用。
【請求項２８】
ＡＴ−１０抗体が、
ａ．配列ＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と同一であるか又は配列ＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と同一であるか又は配列ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と同一であるか又は配列ＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と同一であるか又は配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と同一であるか又は配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と同一であるか又は配列ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項２９】
ＡＴ−１０抗体が、配列番号８又は配列番号１２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号１０又は配列番号１４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３０】
ＡＴ−１０抗体が、
ａ．配列番号１６、配列番号１８又は配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号２２又は配列番号２４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３１】
ＩＶ．３抗体が、
ａ．配列ＮＹＧＭＮ（配列番号２５）若しくはＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号７９）と同一であるか又はその配列と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と同一であるか又は配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と同一であるか又は配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と同一であるか又は配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３、配列番号１０１）と同一であるか又は配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３、配列番号１０１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０及び配列番号８４及び配列番号１０２）と同一であるか又は配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０及び配列番号８４及び配列番号１０２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３２】
ＩＶ．３抗体が、
ａ．配列番号３２、配列番号３６又は配列番号３８に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び
ｂ．配列番号３４、配列番号４１又は配列番号８５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３３】
ＩＶ．３抗体が、
ａ．配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７又は配列番号４９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号５１、配列番号５３又は配列番号８７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３４】
ＭＤＥ−８抗体が、
ａ．配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号９４）と同一であるか又は配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号９４）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と同一であるか又は配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と同一であるか又は配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と同一であるか又は配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と同一であるか又は配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と同一であるか又は配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３５】
ＭＤＥ−８抗体が、
ａ．配列番号６１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び
ｂ．配列番号６３に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３６】
ＭＤＥ−８抗体が、
ａ．配列番号６５又は配列番号６７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号６９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法又は使用。
【請求項３７】
エフェクター欠損であるＦｃ領域の少なくとも一部を含む、ヒトＣＤ３２ａに特異的に結合するエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体であって、改変されていない対照と比較して、ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除する改変されたＦｃ領域を含む、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１１月２６日出願の米国特許出願第１４／５５５，５５６号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が全ての目的のために参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は出典明示により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年１１月２０日に作成され、０１１１９−０００８−００ＵＳ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは１１１，２８１バイトである。
【０００３】
分野
ＣＤ３２ａによって媒介される疾患及び障害を治療及び予防するための方法及び組成物が提供される。
【背景技術】
【０００４】
抗体のエフェクター領域又はＦｃ領域は、多くの異なる細胞型の様々な受容体に結合する。そのような受容体の１つは、ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ受容体（ＦｃガンマＲＩＩａとしても知られている）である。好塩基球、好酸球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞などのヒト血小板及び他のヒト細胞は、細胞表面のＣＤ３２ａ受容体を提示することが報告されている（Hogarth PM et al. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124; Bruhns P. Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models (Jun 2012) Blood 119:5640; PubMed ID: 22535666）。（抗原特異性に関わらず）ＩｇＧ抗体のＦｃ領域によるＣＤ３２ａの活性化は、多くのインビボ反応をもたらし、その多くはヒト宿主に負の影響を及ぼす。例えば、ＣＤ３２ａのＩｇＧ活性化は、ヘパリン起因性血小板減少症の死亡に寄与し得る（ＨＩＴ；Boon DM et al. Heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis: a potential fatal complication in a routine treatment (Mar 1995) Neth J Med 46:146; PubMed ID: 7731489；及びWarkentin TE et al. Sera from patients with heparin-induced thrombocytopenia generate platelet-derived microparticles with procoagulant activity: an explanation for the thrombotic complications of heparin-induced thrombocytopenia (Dec 1994) Blood 84:3691; PubMed ID: 7949124を参照）。好中球、単球、及びマクロファージ上のＣＤ３２ａのＩｇＧ媒介性活性化が気道炎症、アレルギー反応及びアナフィラキシーを促進することも報告されている。例えば、Joensson F. et al. Human Fc-gamma-RIIA induces anaphylactic and allergic reactions (2012 Mar 15) Blood 119:2533-44, PubMed ID: 22138510を参照。ＩｇＧ−ＦｃによるＣＤ３２ａの活性化はまた、ＨＩＴにおける血栓症の一因となり得る（例えば、Arepally G et al. Fc gamma RIIA H/R 131 polymorphism, subclass-specific IgG anti-heparin/platelet factor 4 antibodies and clinical course in patients with heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis (Jan 1997) Blood 89:370; PubMed ID: 9002937; Newman PM et al. Heparin-induced thrombocytopenia: new evidence for the dynamic binding of purified anti-PF4-heparin antibodies to platelets and the resultant platelet activation (Jul 2000) Blood 96:182; PubMed ID: 10891449; Jaffray B et al. Fatal venous thrombosis after heparin therapy (Mar 1991) Lancet 337:561; PubMed ID: 1671929を参照）。
【０００５】
Ｊｏｅｎｓｓｏｎらの２０１２年の報告では、著者らはＣＤ３２ａ受容体の遮断がマウスを局所及び全身性アナフィラキシーから保護すると報告し、同文献の２５４２で、ヒトにおける炎症及び自己免疫／アレルギー反応における特異的遮断分子によりＦｃガンマＲＩＩＡを標的とすることは、リウマチ性関節炎のマウスモデルにおけるマウスＦｃガンマＲＩＩＩＡについて最近報告したのと同様の阻害をもたらす可能性があると結論づけた。Ｊｏｅｎｓｓｏｎは同文献の２５４２で、ｍＡｂ  ＩＶ．３の高用量がアナフィラキシーを予防するのではなく誘導することを報告したので、ヒトにおけるアレルギー性疾患及び自己免疫性疾患を予防するために二価リガンド（例えば、ｍＡｂ  ＩＶ．３）を用いてＦｃガンマＲＩＩＡを遮断することは想定されるべきではないと続けた（強調が加えられた）。従って、ＣＤ３２ａの遮断は、炎症性、自己免疫性及びアレルギー性障害を治療するための望ましい目標であったが、当業者は、インビボ投与の既知の負の副作用のためにＣＤ３２ａ抗体による遮断を想定していなかった。発明者らは、アナフィラキシーのような負の副作用を誘発しない新規なＣＤ３２ａ抗体を提供することによってこの問題を解決した。
【０００６】
ＣＤ３２ａの活性化によって媒介される疾患及び障害に加えて、多くの疾患及び障害が、ＣＤ３２ａを直接活性化しない固定化ＩｇＧのＦｃ領域とのＣＤ３２ａ相互作用によって媒介される。「固定化ＩｇＧ」は、表面に結合するか、又は表面上に沈殿し、従って制限された移動性を有する（すなわち、「固定されている」）抗体分子を指す。あるいは、固定化ＩｇＧを有する細胞は、「ＩｇＧで被覆された」細胞として記載され得る。ＣＤ３２ａは、可溶性であろうと（Hogarth PM et al. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124）固定化されていようと（Wines BD et al. The IgG Fc contains distinct Fc receptor (FcR) binding sites: the leukocyte receptors Fc gamma RI and Fc gamma RIIa bind to a region in the Fc distinct from that recognized by neonatal FcR and protein A (May 2000) J Immunol 164:5313; PubMed ID: 10799893）、単一ＩｇＧ分子のＦｃ領域とごくわずかに相互作用することが知られている。従って、ＣＤ３２ａを直接的に活性化することができない抗体は、血小板表面に固定された場合には血小板減少症などのＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害を引き起こした（McKenzie et al. The role of the human Fc receptor FcgammaRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model (Apr 1999) J Immunol 162:4311; PubMed ID: 10201963）。
【０００７】
ＩｇＧで被覆された血小板（又は他の細胞）は、循環血液から能動的に除去される。例えば、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）において、循環する抗血小板抗体（典型的にはＩｇＧ）を有するヒト患者は、大部分が脾臓及び肝臓によって媒介される血小板クリアランスを経験することがよく知られており、ここでは食細胞上のＦｃ受容体（ＣＤ３２ａを含む）がＩｇＧで被覆された血小板に結合して保持する。脾臓の除去（脾臓切除）はこの状態を緩和することができる。しかしながら、ＨＩＴとは異なり、血栓症は、典型的には、ＩＴＰ中のＩｇＧで被覆された血小板のクリアランスと関連していない。むしろ、出血の臨床的問題がより顕著な懸念であり、この問題に対する改善された治療戦略が必要とされている（Altomare I et al. Bleeding and mortality outcomes in ITP clinical trials: a review of thrombopoietin mimetics data (Oct 2012) Am J Hematol 87:984; PubMed ID: 22729832）。
【０００８】
ＣＤ３２ａはまた、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）などのＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害においてＩｇＧで被覆された赤血球（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））のクリアランスを媒介することも知られている。従って、遮断ｍＡｂを用いてＣＤ３２ａを標的とすることは、ＡＩＨＡの治療において大きな有用性があると思われ；実際、これは、ヒトＣＤ３２ａ導入遺伝子を有するが他の点では古典的なマウスＩｇＧ受容体機能を欠いているマウスにおいてＩｇＧ抗体誘発性貧血を改善することが示されている抗ＣＤ３２ｍＡｂ、ＭＤＥ−８で報告されており、すなわち、ＭＤＥ−８を試験するために使用した動物は、Ｉ型（ＣＤ６４）及びＩＩＩ型（ＣＤ１６）の機能的マウスＩｇＧ受容体を欠いており、これらがインビボでＭＤＥ−８活性にどのように影響を及ぼすかについての問題が残されている（van Royen-Kerkhof A et al. A novel human CD32 mAb blocks experimental immune haemolytic anaemia in FcgammaRIIA transgenic mice (Jul 2005) Br J Haematol 130:130; PubMed ID: 15982355）。ＭＤＥ−８は治療用抗体として開発されていない。ＭＤＥ−８の前臨床開発の欠如の理由は公に開示されていない。しかしながら、本発明者らは、ＭＤＥ−８及び他の抗ＣＤ３２ａ抗体に関する以前には記載されていない問題を同定し解決した。すなわち、それらを改変してＩｇＧ  Ｆｃ受容体への結合を減少させることにより、それらは細胞に固定化されたときにＣＤ３２ａを介するクリアランスをもはや媒介せず、それにより臨床開発を可能にしている。
【０００９】
従って、負の副作用を引き起こさずにＩｇＧで被覆された細胞のＣＤ３２ａ媒介性クリアランスを防止し得る組成物が望まれる。本発明者らは、このような組成物を記載し、ＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害を治療及び予防するために、それらの成功した使用を詳述する。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書の記載に従って、発明者らは、インビボでの天然抗ＣＤ３２ａ抗体の投与が、血小板減少、体温の低下及びショックの症状を含む有害反応を引き起こすことを発見した。発明者らは、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を投与することがこれらの有害反応を緩和することを見出した。
【００１１】
従って、一実施態様では、本発明は、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を投与することによって抗ＣＤ３２ａ抗体の投与によって引き起こされる有害反応を予防する方法を提供する。同様に、エフェクター欠損ＣＤ３２ａ抗体を投与することを含むＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための方法が提供される。
【００１２】
ある症例では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は血小板減少症である。
【００１３】
他の実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、アナフィラキシーショックを含むショックの症状である。
【００１４】
なお更なる実施態様では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節症及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む炎症性、免疫性又は自己免疫性疾患又は障害である。
【００１５】
なお更なる実施態様では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、自己免疫又は特定の薬物（例えば、ヘパリン）及び抗体療法（例えば、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＮＦα、抗ＩｇＥ、又は抗ＣＤ４０Ｌ免疫療法）に関連するヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、血栓症又は血小板減少症、アレルギー性鼻炎、抗体仲介性貧血、アナフィラキシー、慢性特発性蕁麻疹（ＣＩＵ）、又は気道炎症である。
【００１６】
本発明者らは、エフェクター能力のある非抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ抗体を投与すると、血小板減少、体温の低下、又はショックの症状を含む有害反応を引き起こすことができることを更に発見した。エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を投与することにより、これらの有害反応を妨げる。従って、一実施態様では、本発明は、非ＣＤ３２ａ抗体を含む、ＩｇＧ抗体によって引き起こされる有害反応を治療するためのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を投与する方法を提供する。
【００１７】
エフェクター欠損キメラ及びヒト化ＡＴ−１０及びＩＶ．３ならびにエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８モノクローナルＩｇＧ抗体を含むこれらの方法で使用するための化合物が提供される。エフェクター欠損抗体は、Ｆｃ領域の少なくとも一部を含み、全長であってもよく、又は切断されていてもよい。
【００１８】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、その量は治療的に有効である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａを遮断するための方法及び／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げるための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げる方法を提供する。幾つかの実施態様では、その量は治療的に有効である。
【００１９】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療することにおけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体においてＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げることにおけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。
【００２０】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体においてＣＤ３２ａを遮断し、かつ／又はＣＤ３２ａ活性化を妨げるための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。
【００２１】
幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗体は、ＩｇＧ免疫複合体試験及び固定化ＩｇＧ試験の両方に適合し、ここで、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように、エフェクター欠損抗体のＦＣ領域が改変されている。
【００２２】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性止血障害である。幾つかの実施態様において、止血障害は、血小板減少症を伴うか又は伴わない血栓症である。幾つかの実施態様において、止血障害は、ＩｇＧ媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症（ＩＴＰ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴＴ）、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択される。
【００２３】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ＩｇＧ抗体誘発性貧血、及びＩｇＧ媒介性血球減少からなる群から選択される。
【００２４】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるＣＤ３２ａのＩｇＧ−Ｆｃ媒介性活性化によって特徴付けられる。
【００２５】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ＩｇＧ抗体誘発性貧血、及びＩｇＧ媒介性血球減少からなる群から選択される。
【００２６】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害は、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体（ＡＴＡ）応答である。幾つかの実施態様において、非抗ＣＤ３２ａ抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール（抗体様）、ゴリムマブ、エタネルセプト（抗体様）、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与される。
【００２７】
幾つかの実施態様において、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体により治療されている患者において生じる。
【００２８】
幾つかの実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するＩｇＧにより特徴付けられる。幾つかの実施態様において、循環細胞型は、以下の１つ以上からなる：血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Ｂリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物。幾つかの実施態様において、疾患又は障害は、以下の１つ以上から選択される：血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症。
【００２９】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する方法を提供する。
【００３０】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するためのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、ここで該抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、該抗体の使用を提供する。
【００３１】
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏反応を治療するための医薬の調製のためのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の使用であって、ここで該抗体はＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、該抗体の使用を提供する。
【００３２】
幾つかの実施態様において、アレルギー性疾患は、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物へのアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択される。
【００３３】
一実施態様では、本発明は、エフェクター欠損であるＦｃ領域の少なくとも一部を含む、ヒトＣＤ３２ａに特異的に結合するエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体であって、該エフェクター欠損抗体が、改変されていない対照と比較して、ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除する改変されたＦｃ領域を含む、抗体を提供する。
【００３４】
幾つかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化されている。
【００３５】
幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＭＤＥ−８、ＩＶ．３又はＡＴ−１０モノクローナル抗体である。
【００３６】
幾つかの実施態様において、ＡＴ−１０抗体は
ａ．配列ＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と同一であるか又は配列ＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と同一であるか又は配列ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と同一であるか又は配列ＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と同一であるか又は配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と同一であるか又は配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と同一であるか又は配列ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００３７】
幾つかの実施態様において、ＡＴ−１０抗体は、配列番号８又は配列番号１２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号１０又は配列番号１４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００３８】
幾つかの実施態様において、ＡＴ−１０抗体は
ａ．配列番号１６、配列番号１８又は配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号２２又は配列番号２４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００３９】
幾つかの実施態様において、ＩＶ．３抗体は
ａ．配列ＮＹＧＭＮ（配列番号２５）若しくはＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号７９）と同一であるか又はその配列と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と同一であるか又は配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と同一であるか又は配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と同一であるか又は配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３、配列番号１０１）と同一であるか又は配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３、配列番号１０１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０及び配列番号８４及び配列番号１０２）と同一であるか又は配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０及び配列番号８４及び配列番号１０２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００４０】
幾つかの実施態様において、ＩＶ．３抗体は
ａ．配列番号３２、配列番号３６又は配列番号３８に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び
ｂ．配列番号３４、配列番号４１又は配列番号８５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
【００４１】
幾つかの実施態様において、ＩＶ．３抗体は
ａ．配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７又は配列番号４９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号５１、配列番号５３又は配列番号８７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００４２】
幾つかの実施態様において、ＭＤＥ−８抗体は
ａ．配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号９４）と同一であるか又は配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号９４）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と同一であるか又は配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と同一であるか又は配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と同一であるか又は配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と同一であるか又は配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と同一であるか又は配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００４３】
幾つかの実施態様において、ＭＤＥ−８抗体は
ａ．配列番号６１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び
ｂ．配列番号６３に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
【００４４】
幾つかの実施態様において、ＭＤＥ−８抗体は
ａ．配列番号６５又は配列番号６７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号６９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、天然ヒトＭＤＥ−８抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）又は同じＭＤＥ−８抗体の２つの異なるエフェクター欠損バージョンの何れかを注射したＣＤ３２Ａマウスにおけるインフュージョンリアクションの代表的な尺度としての中核体温を示す。これらのエフェクター欠損抗体は、インフュージョンリアクションを引き起こさない。
【図２】図２は、天然ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂ（モノクローナル抗体）のＣＤ３２Ａマウスへの静脈内注射後における重度の血小板減少症を示し、２つの代表的なエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８抗体の静脈内注射後における血小板減少症は示していない。
【図３Ａ】図３Ａは、天然ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、天然ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、天然ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、天然ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後の重度の血小板減少症を示し（＃１）、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスへの免疫複合体注射後には血小板減少症はなかったことを示す（＃２−４）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後の重度の血小板減少症を示し（＃１）、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスへの免疫複合体注射後には血小板減少症はなかったことを示す（＃２−３）。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の注射後のＣＤ３２Ａマウスの肺血管における血栓の存在を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体注射後の肺血管における血栓症を示さない。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２−４）で処置したＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓の数を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の注射後のＣＤ３２Ａマウスの肺血管における血栓の存在を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体注射後の肺血管における血栓症を示さない。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２−３）で処置したＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓の数を示す。
【図８】図８は、天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂのＣＤ３２Ａマウスへの静脈内注射後における重度の血小板減少症を示し、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒの静脈内注射後における血小板減少症を示さない。
【図９Ａ】図９Ａは、天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図９Ｄ】図３Ｄは、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１ｍＡｂの注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後の重度の血小板減少症を示し（＃１）、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスへの免疫複合体注射後には血小板減少症はなかったことを示す（＃２−３）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のエフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の注射後のＣＤ３２Ａマウスの肺血管における血栓の存在を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体注射後の肺血管における血栓症を示さない。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損キメラＡＴ−１０  ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２−３）で処置したＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓の数を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒを注射したＣＤ３２Ａマウスの体温の低下を示さない（ここ及び以下、これは「ｈＡＴ−１０」ｍＡｂである）
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒの静脈内注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のビヒクルで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のエフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、ビヒクル又はエフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで処置したＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓の数を示す。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、ＩｇＧ免疫複合体の注射後のＣＤ３２Ａマウスの肺血管における閉塞性血栓の存在を示す。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体注射後の肺血管における血栓症を示さない。
【図１４Ａ】図１４Ａは、天然ＡＴ−１０ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂのＣＤ３２Ａマウスへの静脈内注射後における用量依存的な重度の血小板減少症を示し、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂの静脈内注射後における血小板減少症を示さない。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２又はエフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａを注射したＣＤ３２Ａマウスの体温の低下を示さない。
【図１５Ａ】図１５Ａは、天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂの静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後のエフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１７】図１７は、ＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体の静脈内注射後の重度の血小板減少症を示し（＃１）、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２Ａマウスへの免疫複合体注射後には血小板減少症はなかったことを示す（＃２−＃４）。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＩｇＧ免疫複合体の注射後のＣＤ３２Ａマウスの肺血管における閉塞性血栓の存在を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩｇＧ免疫複合体注射後の肺血管における血栓症を示さない。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損キメラＩＶ．３  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２−＃４）で処置したＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓の数を示す。
【図１９】図１９は、ビヒクル（＃１）又は天然マウスＩＶ．３  ＩｇＧ２ｂ（＃２）又は天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ１（＃３）ｍＡｂの存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２０】図２０は、ビヒクル（＃１）又は脱グリコシル化天然マウスＩＶ．３  ＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２１】図２１は、ビヒクル（＃１）又は天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂ（＃２−４）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２２】図２２は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２−３）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２３】図２３は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２４】図２４は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。血小板の凝集能力を証明するために標準的な血小板アゴニストコラーゲン（＊）を陽性対照として＃２に加えた。
【図２５】図２５は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（ここ及び以下、これは「ｈＩＶ．３．１」である）（＃２）又は天然マウスＩＶ．３  ＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（３ｎＭ）（＃３）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図２６】図２６は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（＃２）又は天然マウスＩＶ．３  ＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（２ｎＭ）（＃３）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。血小板の凝集能力を証明するために標準的な血小板アゴニストコラーゲン（＊）を陽性対照として＃３に加えた。
【図２７】図２７は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（６ｎＭ）（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。血小板の凝集能力を証明するために標準的な血小板アゴニストコラーゲン（＊）を陽性対照として＃２に加えた。
【図２８】図２８は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（＃２）又は天然マウスＩＶ．３  ＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（２５ｎＭ）（＃３）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。緩衝液（ＰＢＳ）を単独で陰性対照として添加した（＃４）。
【図２９】図２９は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（４０ｎＭ）（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。血小板の凝集能力を証明するために標準的な血小板アゴニストコラーゲン（＊）を陽性対照として＃２に加えた。
【図３０】図３０は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＭＤ３−ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（３３ｎＭ）（＃２）又はエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（５０ｎＭ）（＃３）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。
【図３１】図３１は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（「ｈＡＴ−１０」；１５ｎＭ）（＃２）の存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。Ｆｃドメインを欠くヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（＃）のＦ（ａｂ’）２断片を＃２に加えて凝集能力を実証した。
【図３２】図３２は、ビヒクル（＃１）又はエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、及びエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせの存在下でのＩｇＧ免疫複合体に対する血小板凝集反応を示す。血小板の凝集能力を証明するために標準的な血小板アゴニストコラーゲン（＊）を陽性対照として＃２に加えた。
【図３３】図３３は、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ、及びエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせに対する血小板凝集反応の欠如を示す。
【図３４】図３４は、ＩｇＧ抗体に応答する血小板脱顆粒を示す。
【図３５】図３５は、インフリキシマブ免疫複合体に応答する血小板脱顆粒（棒１）及び本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の保護効果（棒２−４）を示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、３つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、３つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせの注射後の（キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ、及びヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ；５０μｇの各ｍＡｂを注射した）ＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、３つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせの注射前のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３６Ｄ】図３６Ｄは、３つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせの注射後の（キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ、及びヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ；１００μｇの各ｍＡｂを注射した）ＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３６Ｅ】図３６Ｅは、３つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ、キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ、及びヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ）の組み合せ（この図では「ｅｄ−ｍＡｂｓ」と表示される）の注射後のＣＤ３２Ａマウスの中核体温の低下を示さない。
【図３７】図３７は、ＩＶ．３  ｍＡｂ調製物が多量体を含まないことを示す結果を示す。マウス注射のために使用されるＩＶ．３調製物を、多量体の潜在的な存在を評価するために動的光散乱分析に供した。多量体を欠く参照試薬として、注射用医薬品グレードのモノクローナルＩｇＧ１抗体、セツキシマブ、及びラットＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を用いた。３つ全てのピークは、モノマーＩｇＧの正常範囲内に入る（Ahrer et al.Journal of Chromatography A; 2003, 89-96）。熱凝集したＩＶ３を、多量体ＩＶ３構造を同定するための陽性対照として用いた。
【図３８Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ及び３８Ｄは、エフェクター欠損組換えＣＤ３２ａ  ｍＡｂがインビボでＦＣＧＲ２Ａマウス血小板の表面に局在することを示す結果を示す。パネルＡ−Ｄに示されるように、ＦＣＧＲ２Ａマウスに種々のエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを注射した（３５μｇ／マウス）。血小板表面結合抗ＣＤ３２ａは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いてエクスビボで（全血で）検出された。ＰＢＳ（未処置）を注射したＦＣＧＲ２Ａマウス由来の血小板は、陰性対照として機能を果たした。Ｅ２６９Ｒ標識（図３８Ａ、３８Ｃ）はＩｇＧ１サブクラスを示す。Ｎ２９７Ａ標識（図３８Ｂ、３８Ｄ）は、ＩｇＧ２サブクラスを示す。
【図３９Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｈ】図３９Ａ、３９Ｂ、３９Ｃ、３９Ｄ、３９Ｅ、３９Ｆ、３９Ｇ及び３９Ｈは、ＩＶ．３ならびに組換えエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂがエクスビボでＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を直接活性化しないことを示す結果を示す。ＦＣＧＲ２Ａマウスからの多血小板血漿（ＰＲＰ）を希釈してＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（３５μｇ／ｍｌ）で処理し、表面上にＣＤ６２Ｐの存在について試験した。ＣＤ６２Ｐは、活性化血小板上にのみ存在する。対照ＩｇＧ及びアラキドン酸で処置した血小板は、それぞれ活性化の陰性及び陽性対照として機能を果たした。更に、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧを用いて表面結合ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ、ＭＤＥ８−Ｅ２６９Ｒをクラスター化し、それによって血小板を活性化した。Ｅ２６９Ｒ標識はＩｇＧ１サブクラスを示す。Ｎ２９７Ａ標識はＩｇＧ２サブクラスを示す。
【図４０Ａ−Ｂ】図４０Ａ及び４０Ｂは、ＩＶ．３ならびに組換えエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂがＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を直接凝集しないが、それらはエクスビボでＩＣ媒介性凝集を遮断し、血小板表面に特異的に結合することを示す結果を示す。ＦＣＧＲ２Ａマウスの洗浄した血小板をＣＤ３２ａ  ｍＡｂで処置した（５−６０μｇ／ｍｌ）。ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの潜在的な血小板凝集活性を検出するために、血小板凝集トレースを１０−１５分間モニターした。この間隔の後、予め形成されたＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣを血小板に導入し、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの阻害能力を評価するためにトレースを更に１０分間モニターした。実験の終わりに、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（組換えｍＡｂ及びセツキシマブについて）又はヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（ＩＶ．３について）の添加によって、平坦なトレースについて血小板の凝集能力を確認した。
【図４１】図４１は、ＦＣＧＲ２ＡマウスへのＩＶ．３の腹腔内注射が血小板減少症を誘発することを示す結果を示す。ＦＣＧＲ２Ａマウス（ｎ＝６、平均±ｓｄ）に、７０μｇのＩＶ．３を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＩＶ．３注射の前及び３０分後、ならびに３時間、２４時間、及び４８時間後に、（実施例５の方法の項に記載のように、眼窩後出血により回収した全血のフローサイトメトリー分析により）血小板数を決定した。最初の３０分間の期間中に、ｉ．ｐ注射されたマウスはショックの兆候を示さず、低体温にならなかった。
【図４２Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ及び４２Ｆは、ＦＣＧＲ２ＡマウスへのＩＶ．３の静脈内注射が肺血管において血栓塞栓症を引き起こさなかったことを実証する結果を示す。ＩＶ．３（７０μｇ）をＦＣＧＲ２Ａマウスに静脈内注射した。３０分後、肺を採取し、少なくとも４８時間ホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅ切片を調製し、血栓塞栓症の証拠について分析した。（Ａ−Ｃ）ＩＶ．３を注射された代表的なマウスの肺血管（赤血球で満たされた）における閉塞性血栓の欠如。（Ｄ−Ｆ）肺血栓症の基準として、血栓性ＩＣ（５００ｎＭ  Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ）を注射された代表的なマウスからの肺切片の画像が含まれ、ここでは広汎性血栓（例えば、パネルＦの矢印によって示される領域）が多数の血管で観察された。
【図４３Ａ−Ｂ】図４３Ａ及び４３Ｂは、７０μｇのａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の注射後３０分（Ａ）又は２４時間（Ｂ）のＦＣＧＲ２Ａマウスから収集した血小板の表面上のａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の共焦点顕微鏡画像（１０００ｘ）を示す。びまん性灰色は、血小板アクチンを表し；焦点黒色染色は、ａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８を示す（図４３Ａに矢印で示される例）。ａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８シグナルは、４９８ｎｍでの励起と５０６ｎｍから５７９ｎｍへの発光により得られた。ファロイジンＡ５５５シグナル（拡散した灰色として表示）は、５５４ｎｍでの励起と５５９ｎｍから６３１ｎｍへの発光により得られた。５９２ｎｍレーザーを用いて誘導抑制が実施された。共焦点画像は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘシステム（１００ｘ／１．４０油性対物レンズ、ＰＬＡＰＯ）上で単一の切片として取得され、デコンボリューションされなかった。スライドは、７０μｇのａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の注射の３０分後又は２４時間後に収集した心臓穿刺血液から調製したＰＲＰからの洗浄したＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を用いて調製し、メタノールを含まない２％のホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に固定し、洗浄し、透過性にし、ファロイジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で対比染色し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に包埋し、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｄ  ２２ｍｍ２＃１．５Ｈ−０．１７０ｍｍ（±５μｍ）カバーガラス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｔｅｍｐｅ、ＡＺ）にマウントした。
【００４６】
配列の記述
表１−５は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
2017537103.tif 000003
2017537103.tif 000004
2017537103.tif 000005
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2017537103.tif 000019
2017537103.tif 000020
【００４７】
実施態様の記述
一実施態様では、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療する方法が包含され、本明細書に記載の１つ以上のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与し、それによりＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療する。
【００４８】
一実施態様では、抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、１）ＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができ；２）ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦｃ領域を有する。
【００４９】
一実施態様では、抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、１）ＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができ；２）ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦｃ領域を有する。
【００５０】
一実施態様では、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４に対するＦｃ結合の減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して完全な減少である。他の態様では、減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％である。
抗体
【００５１】
任意のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を本方法の実施態様において使用することができる。組成物及び方法の実施態様の抗体は、Ｆｃ領域の少なくとも一部を含む。
【００５２】
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表１−５のように、それぞれ、各抗体について記載された１つ以上のＣＤＲを含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、エフェクター欠損である。他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表１−５のように、それぞれ、各抗体について記載された可変重鎖及び軽鎖を含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、エフェクター欠損である。他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表１−５のように、それぞれ、各抗体について記載された全長重鎖及び全長軽鎖を含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、エフェクター欠損である。
【００５３】
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、その抗体の１つ以上のＣＤＲを含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、ここで、ＣＤＲは、表１−５にそれぞれ各抗体について記載されたＣＤＲ配列と同一であり、表１のように各抗体について記載された配列と比較して、ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つが１つ又は２つの変異を有し、エフェクター欠損である。
【００５４】
他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、それぞれ各抗体について表１−５に記載された可変重鎖及び軽鎖を含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、可変重鎖及び軽鎖は、それぞれ各抗体について表１−５に記載された可変重鎖及び可変軽鎖と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり、抗体はエフェクター欠損である。
【００５５】
他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、それぞれ各抗体について表１−５に記載された全長重鎖及び軽鎖を含むＡＴ−１０、ＩＶ．３又はＭＤＥ−８抗体であり、又は可変重鎖及び軽鎖は、それぞれ各抗体について表１−５に記載された重鎖及び軽鎖と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり、エフェクター欠損である。
【００５６】
本発明の抗体組成物、並びに本明細書に記載の方法及び使用において使用される抗体は、ＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができる。抗体がＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができるかどうかは、当技術分野で周知の方法によって、すなわち、以下に記載される「ＩｇＧ免疫複合体試験」に従って、ＩｇＧ免疫複合体に対する凝集又は脱顆粒反応のために洗浄した血小板を試験することによって試験することができる。例えば、Meyer T et al.Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice (Jan 2009) J Thromb Haemost 7:171; PubMed ID: 18983497を参照。
【００５７】
「ＩｇＧ免疫複合体試験」：以下の工程は、抗体がＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができるかどうかを決定することができる。第１に、例えば、ヒト血小板は、「洗浄」方法によって他の血液細胞から単離することができる（例えば、Meyer T et al.(Jan 2009) J Thromb Haemost 7:171; PubMed ID: 18983497）。あるいは、ＦＣＧＲ２Ａトランスジェニックマウス由来の血小板を、同様の方法を用いて単離することができる（例えば、Robles-Carrillo L et al.Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice (Aug 2010) J Immunol 185:1577; PubMed ID: 20585032を参照）。次に、このように洗浄した血小板を用いて、ヒトＣＤ３２ａを活性化することが知られているＩｇＧ抗体、例えば抗ＣＤ９  ｍＡｂ（例えば、PubMed ID:18983497、op citに記載のように）又は抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ、Ｍ９０（例えば、PubMed ID:20585032、op citに記載のように）によってＣＤ３２ａ媒介性活性化を試験することができる。洗浄した血小板上のＣＤ３２ａを活性化するために、洗浄した血小板に曝露する前にＣＤ４０Ｌと組み合わせたＭ９０の場合のように、免疫複合体（ＩＣ）を形成するように抗原によってクラスター化する必要がある抗体もある。ＣＤ３２ａ活性化抗体は、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇモデル４９０シリーズ凝集計のような血小板凝集計を用いて同定することができる。抗体が凝集計キュベットに導入された後に血小板凝集を引き起こし、そのような凝集が抗ＣＤ３２ａブロッキング抗体（例えば、ＩＶ．３、ＡＴ−１０、又はＭＤＥ−８など；他に多くのものが市販されており、当業者に知られている）によって妨げられる場合、次いで抗体は血小板ＣＤ３２ａを特異的に活性化し、従って「ＩｇＧ免疫複合体試験」において必要な試薬として使用するのに十分である。洗浄された血小板凝集試験の代替法は、血小板脱顆粒を測定するセロトニン放出アッセイ（又は「ＳＲＡ」）である（例えば、PubMed ID 18983497及び20585032 citを参照）。ＣＤ３２ａはヒト血小板上の唯一のＩｇＧ受容体である；従って、これらの試験はＣＤ３２ａ活性化抗体を特異的に同定することができる。「ＩｇＧ免疫複合体試験」の第３工程では、ＣＤ３２ａ活性化ＩｇＧ抗体の導入の前に、洗浄した血小板を候補抗ＣＤ３２ａ抗体に曝露する必要がある。例えば、アッセイ緩衝液（典型的には２５０／ナノリットル）中に懸濁した洗浄ヒト血小板を凝集計キュベットに入れる。機器の設定は、アッセイシグナル範囲及びベースラインを確立するように調整される。次に、候補の抗ＣＤ３２ａ遮断抗体（例えば、ＩＶ．３、ＡＴ−１０又はＭＤＥ−８）をキュベットに導入する（典型的には、ミリリットルあたり１０マイクログラムかその近くで）。次に、キュベット中の血小板懸濁液に、血小板活性化ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ免疫複合体（例えば、Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ、典型的には５０−５００ｎＭの最終アッセイ濃度で）を添加する。最後に、抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂがＩｇＧ抗体／免疫複合体誘発性血小板凝集を妨げるかどうかを評価するために、少なくとも１分間（又は、典型的には５分以上）血小板凝集をモニターする。これらの工程を使用して、抗ＣＤ３２ａ抗体が、凝集（又はＳＲＡが使用される場合は脱顆粒）の阻害によって証明されるように、���ｇＧ抗体又はＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を防ぐことができる場合、次いで抗ＣＤ３２ａ抗体は「ＩｇＧ免疫複合体試験」に適合する。同様に、抗ＣＤ３２ａ抗体が血小板凝集及び脱顆粒を妨げる能力を欠いている場合、前記抗ＣＤ３２ａ抗体は「ＩｇＧ免疫複合体試験」に適合しない。
【００５８】
本明細書に含まれる実施例において、図１９−３３は、洗浄された血小板凝集（すなわち、「ＩｇＧ免疫複合体試験」を使用）によって、マウスＩＶ．３、キメラＩＶ．３、及びヒト化ＩＶ．３、キメラＡＴ−１０及びヒト化ＡＴ−１０、及びヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは全て、そのような抗ＣＤ３２ａ抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプのサブクラスであるかどうかにかかわらず、かつそのような抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが天然又はエフェクター欠損Ｆｃ領域を有するかどうかにかかわらず、「ＩｇＧ免疫複合体試験」に適合することを実証する。「ＩｇＧ免疫複合体試験」としての血小板凝集の使用の代替として、図３４及び３５は、血小板凝集の代わりにＳＲＡを用いたＩＶ．３、ＡＴ−１０、及びＭＤＥ−８抗体変異体について同様の結果を示しており；ここでもまた、全ての試験された抗体は、ＩＣ誘発性血小板活性化を妨げ、従って、「ＩｇＧ免疫複合試験」に適合する。
【００５９】
ａ．エフェクター欠損
本発明の抗体組成物、並びに本明細書に記載の方法及び使用において使用される抗体は、「エフェクター欠損」である。本明細書中で使用される場合、「エフェクター欠損」抗体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦｃ領域を有する抗体として定義される。
【００６０】
一実施態様では、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４に対するＦｃ結合の減少は、エフェクター能力のある対照と比較して完全な減少である。他の態様では、減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％である。抗体がＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４に対するＦｃ結合の減少を有するかどうかを決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許出願公開第２０１１０２１２０８７（Ａ１）号、国際公開第２０１３１６５６９０号、及びVafa O.et al.An engineered Fc variant of an IgG eliminates all immune effector functions via structural perturbations (Jan 2014) Methods 65:114; PubMed ID: 23872058を参照。
【００６１】
更なる実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、１）ＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２ａの活性化を妨げることができる抗体であり；２）ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦｃ領域を有し；３）投与後にＦｃ媒介性有害宿主反応を誘導しない。
【００６２】
本発明の抗ＣＤ３２ａエフェクター欠損抗体が投与後に有害宿主反応を誘導することができるか否かは、以下に記載する「固定化ＩｇＧ試験」によって試験することができる。
【００６３】
「固定化ＩｇＧ試験」：以下の工程は、抗ＣＤ３２ａ抗体が、宿主動物への静脈内投与後にＩｇＧ媒介性有害反応を誘導することができるかどうかを決定することができる。宿主動物は哺乳類でなければならず、試験されるべき抗ＣＤ３２ａ抗体が抗原として結合することが知られている少なくとも１つのエピトープを有するＣＤ３２  ＩｇＧ受容体を提示しなければならない。例えば、ＩＶ．３はＣＤ３２ａ抗原に結合することが知られているＩｇＧ  ｍＡｂである（例えば、配列番号７０に記載、及び配列番号７１に記載；例えばRosenfeld SI et al.Human platelet Fc receptor for immunoglobulin G.Identification as a 40,000-molecular-weight membrane protein shared by monocytes (Dec 1985) J Clin Invest 76:2317; PubMed ID: 2934409)；ＡＴ−１０は、ＣＤ３２抗原に結合することが知られているＩｇＧ  ｍＡｂである（例えば、配列番号７０−７２に記載される；例えば、Greenman J et al.Characterization of a new monoclonal anti-Fc gamma RII antibody, AT10, and its incorporation into a bispecific F(ab')2 derivative for recruitment of cytotoxic effectors (Nov 1991) Mol Immunol 28:1243; PubMed ID: 1835758を参照のこと）；ＭＤＥ−８は、ＣＤ３２抗原に結合することが知られているＩｇＧ  ｍＡｂである（例えば、配列番号７０−７２に記載される；例えば、van Royen-Kerkhof A et al.A novel human CD32 mAb blocks experimental immune haemolytic anaemia in FcgammaRIIA transgenic mice (Jul 2005) Br J Haematol 130:130; PubMed ID: 15982355を参照）。抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂについての「固定化ＩｇＧ試験」で使用するための１つの適切な宿主動物は、ＦＣＧＲ２Ａマウスである（「Ｂ６；ＳＪＬ−Ｔｇ（ＦＣＧＲ２Ａ）１１Ｍｋｚ／Ｊ」マウス、＃００３５４２、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）。他の適切なＣＤ３２陽性宿主動物は、当業者に周知である。次いで、「固定化ＩｇＧ試験」を、例えば、精製した抗ＣＤ３２ａ試験抗体（好ましくは生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、又は他の適切な不活性ビヒクル中で）を（この場合は）ＦＣＧＲ２Ａ（すなわちＣＤ３２Ａ）マウスの尾静脈に注射することにより実施する。典型的には、５０−１００マイクログラムが注射される；しかしながら、反応の欠如は、より多くの量の抗体が注射されるべきであることを示唆し得る：例えば、１２０マイクログラム又は１４０マイクログラムが反応を誘発するために必要とされ得る。１５０マイクログラムを超える量は、通常、ＦＣＧＲ２Ａマウスには必要とされない。試験抗体（この例では、抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ）の注射直後に、注射後少なくとも２０分間、１０分間ごとに動物を中核体温について（典型的には、直腸温度計を使用して）モニターする（ベースライン温度は、試験ｍＡｂ注射の前に確立される）。摂氏２度を超える温度低下（すなわち、低体温）が５分を超えて持続することは、抗ＣＤ３２ａ試験ｍＡｂが「固定化ＩｇＧ試験」に適合しなかったことを示す有害反応を示す。更に、抗ＣＤ３２ａ試験ｍＡｂの注射の少なくとも２０分後、好ましくは抗ＣＤ３２ａ試験ｍＡｂの注射の３０分後に、全血を宿主動物から採取し（後眼窩、又は静脈穿刺により）、分析して循環する標的細胞の数の変化を評価する。細胞数は、フローサイトメトリー、自動セルカウンター、又は血球計の使用によって得ることがで��る。ＦＣＧＲ２Ａマウスにおいて抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを試験する場合、試験前日、又は抗ＣＤ３２ａ試験ｍＡｂの注射の少なくとも１−３時間前にベースライン血小板数が得られる。ここで留意すべきは、血液採取のプロセス、特に連続的な血液採取のプロセスは、見かけの細胞数を減少させることができることである。典型的には、ＦＣＧＲ２Ａマウスのベースライン血小板数は、１ナノリットルあたり７００を超えるであろうし、より典型的には１ナノリットル当たり８００より大きく、１ナノリットル当たり１２００，１５００，１８００又は２０００にも達する可能性がある。ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２Ａ）マウスにおいて抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを試験する場合、５０％を超える循環血小板数の減少は、抗ＣＤ３２ａ試験ｍＡｂが「固定化ＩｇＧ試験」に適合しなかったことを示す有害反応を示す。対照的に、５０μｇ以上の抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂをＣＤ３２Ａマウスに静脈注射すると、中核体温は５分以上で２℃以上低下せず、循環血小板数が３０分以内に５０％以上減少しない場合、抗ＣＤ３２ａ抗体は「固定化ＩｇＧ試験」に適合する。
【００６４】
本明細書に含まれる実施例において、図１−１７及び図３６は（すなわち、「固定化ＩｇＧ試験」を使用して）、エフェクター欠損であるが天然フォーマットではないキメラＩＶ．３、キメラＡＴ−１０、ヒト化ＡＴ−１０、及びヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは、そのような抗ＣＤ３２ａ抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプのサブクラスのものであるかどうかにかかわらず、「固定化ＩｇＧ試験」に適合することを実証する。とりわけ、「固定化ＩｇＧ試験」によって試験した全ての天然抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ  ｍＡｂは、これらの実施例では「固定化ＩｇＧ試験」に適合しなかったが、「固定化ＩｇＧ試験」によって試験した全てのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ  ｍＡｂは「固定化ＩｇＧ試験」に適合した。
【００６５】
ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４に対するＦｃ依存性結合の能力が低下したエフェクター欠損抗体を操作する方法は、当技術分野で周知である。例えば、この結果を達成するために、エフェクター欠損抗体は、以下の変異のうちの一又は複数を有し得る：Ｅ２３３Ｐ、Ｇ２３７Ｍ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｅ２６９Ｒ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｒ、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ（番号はＫａｂａｔのＥＵインデックスである）。
【００６６】
特定の実施形態において、Ｆｃ領域の変異は、治療用抗体の循環半減期を延長させることが知られている変異であるＭ２５２Ｙ＋Ｓ２５４Ｔ＋Ｔ２５６Ｅ、Ｇ３８５Ｄ＋Ｑ３８６Ｐ＋Ｎ３８９Ｓ、及びＨ４３３Ｋ＋Ｎ４３４Ｆ＋Ｙ４３６Ｈから選択される（例えば、米国特許第８３２３９６２号）。
【００６７】
特定の実施態様では、免疫原性を促進することが当該分野で周知であるＴ細胞エピトープを除去するために、本発明の抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが修飾される。
【００６８】
１．エフェクター欠損ＡＴ−１０モノクローナル抗体
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＡＴ−１０抗体である。一態様において、ＡＴ−１０抗体は、
ａ．配列ＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と同一であるか又はＹＹＷＭＮ（配列番号１）若しくはＧＦＴＦＳＹＹＷ（配列番号７３及び配列番号８８）と比較して１個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と同一であるか又はＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）若しくはＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７４及び配列番号８９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と同一であるか又はＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）若しくはＮＲＲＤＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号７５及び配列番号９０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と同一であるか又はＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦＭＮ（配列番号４）若しくはＥＳＶＤＮＦＧＩＳＦ（配列番号７６及び配列番号９１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と同一であるか又はＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号５）若しくはＧＡＳ（配列番号７７及び配列番号９２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と同一であるか若しくはＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号６）又はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７８及び配列番号９３）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００６９】
他の態様において、エフェクター欠損ＡＴ−１０抗体は、配列番号８に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号１０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００７０】
一態様において、エフェクター欠損ＡＴ−１０抗体は、
ａ．配列番号１６又は配列番号１８に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号２２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００７１】
別の実施態様において、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０抗体は、配列番号１２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び配列番号１４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００７２】
別の態様において、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０抗体は、
配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
配列番号２４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００７３】
２．エフェクター欠損ＩＶ．３モノクローナル抗体
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＩＶ．３抗体である。一態様において、ＩＶ．３抗体は、
ａ．配列ＮＹＧＭＮ（配列番号２５）若しくはＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号７９）と同一であるか又は配列ＮＹＧＭＮ（配列番号２５）若しくはＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号７９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と同一であるか又は配列ＷＬＮＴＹＴＧＥＳＩＹＰＤＤＦＫＧ（配列番号２６）若しくはＬＮＴＹＴＧＥＳ（配列番号８０）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と同一であるか又は配列ＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号２７）若しくはＡＲＧＤＹＧＹＤＤＰＬＤＹ（配列番号８１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と同一であるか又は配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２８）若しくはＫＳＬＬＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号８２及び配列番号１００）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３及び配列番号１０１）と同一であるか又は配列ＲＭＳＶＬＡＳ（配列番号２９）若しくはＲＭＳ（配列番号８３及び配列番号１０１）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０）若しくはＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号８４及び配列番号１０２）と同一であるか又は配列ＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号３０）若しくはＭＱＨＬＥＹＰＬＴ（配列番号８４及び配列番号１０２）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００７４】
他の態様において、エフェクター欠損ＩＶ．３抗体は、配列番号３２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び配列番号３４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００７５】
一態様において、エフェクター欠損ＩＶ．３抗体は、
ａ．配列番号４３又は配列番号４５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む重鎖配列；及び
ｂ．配列番号５１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む軽鎖配列
を含む。
【００７６】
一実施態様では、エフェクター欠損ＩＶ．３抗体は、配列番号３６又は配列番号３８に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び配列番号４１又は配列番号８５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含むヒト化抗体である。
【００７７】
特定の実施態様において、エフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３抗体は、
ａ．配列番号４７又は配列番号４９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号５３又は配列番号８７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００７８】
３．エフェクター欠損ＭＤＥ−８モノクローナル抗体
幾つかの態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体である。幾つかの態様において、エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体は、
ａ．配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号９４の残基１−７）と同一であるか又は配列ＳＹＧＭＨ（配列番号５４）若しくはＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号９４の残基１−７）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｂ．配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と同一であるか又は配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＹＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号５５）若しくはＩＷＹＤＧＳＮＹ（配列番号９５）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列；
ｃ．配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と同一であるか又は配列ＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号５６）若しくはＡＲＤＬＧＡＡＡＳＤＹ（配列番号９６）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列；
ｄ．配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と同一であるか又は配列ＲＡＳＱＧＩＮＳＡＬＡ（配列番号５７）若しくはＱＧＩＮＳＡ（配列番号９７）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列；
ｅ．配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と同一であるか又は配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５８）若しくはＤＡＳ（配列番号９８）と比較して１個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列；及び
ｆ．配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と同一であるか又は配列ＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号５９）若しくはＱＱＦＮＳＹＰＨＴ（配列番号９９）と比較して１若しくは２個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列
を含む。
【００７９】
他の態様において、エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体は、配列番号６１に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変重鎖配列；及び配列番号６３に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００８０】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、
ａ．配列番号６５又は配列番号６７に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である重鎖配列；及び
ｂ．配列番号６９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である軽鎖配列
を含む。
【００８１】
組成物及び方法の実施態様の抗体は、完全ヒト、ヒト化、キメラ、組換え、又は合成であってもよい。
【００８２】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に開示されるエフェクター欠損抗体とＣＤ３２ａとの結合について競合する単離された抗体を含む。
【００８３】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を含む薬学的組成物を含む。
【００８４】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＭＤＥ−８、ＩＶ．３又はＡＴ−１０モノクローナル抗体である。一実施態様では、エフェクター欠損ＭＤＥ−８、ＩＶ．３、又はＡＴ−１０モノクローナル抗体がヒト化される。
【００８５】
１つ以上のアミノ酸で変異したＦｃドメインの少なくとも一部を含むＣＤ３２ａに特異的に結合するエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体であって、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４  ＩｇＧ受容体へのＦｃ媒介性結合を妨げる変異が包含される。
【００８６】
ｂ．更なる抗体の実施態様
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の機能的特徴の何れか又は全てを示し得る：
ａ．抗体の抗原結合部分は、水溶液中で１０−８Ｍよりも強い（未満の）平衡親和定数値（「ＫＤ」）でヒトＣＤ３２ａに結合する；
ｂ．抗体の抗原結合部分は、ヒトＣＤ３２に結合し、ここでこのような結合は、そのような結合したＣＤ３２と任意のヒト又は治療用ＩｇＧ分子のＦｃ領域との間の安定な相互作用を阻害し、ここでこのようなヒト又は治療用ＩｇＧ分子は、（１）少なくとも１つの抗原分子にＦａｂ依存的に結合しているか、又は（２）少なくとも２つのそのようなヒト又は治療用ＩｇＧ分子の集合体にクラスター化されているか、又は（３）ヒト又は治療用ＩｇＧ分子の水性拡散を制限する；
ｃ．抗体は、Ｆｃ領域の少なくとも一部を含み、古典的なＩ型（ＣＤ６４）、ＩＩ型（ＣＤ３２）、又はＩＩＩ型（ＣＤ１６）のヒトＩｇＧ受容体（ＦｃガンマＲ）へのＦｃ領域結合の能力を欠くか又は能力を減少させており、そのような結合の減少又は欠如は、対応する天然に存在する古典的なＩｇＧ−Ｆｃ領域（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の何れか）の結合よりも、２０％、３０％、４０％、４５％、又は５０％以上比較的弱く、任意のそのような古典的なＩｇＧ−Ｆｃ領域は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４への結合を示す。
【００８７】
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の構造的特徴の何れか又は全てを示し得る：
ａ．抗体は、単一ＩｇＧ分子当たり合計４つのポリペプチドの以下の配置（アミノ酸組成に関して）を含む、該配置からなる又は本質的に該配置からなる：
ｉ．少なくとも２つのシステイン−システインジスルフィド結合によって共有結合された２つの重鎖ポリペプチド、ここでこのような鎖間ジスルフィド結合は、ヒンジ領域内又はヒンジ領域付近に位置し、そのような重鎖ポリペプチドは、重鎖免疫グロブリン分子のＩｇＧアイソタイプ（クラス１、２、３又は４、又はそれらのセグメントを含む任意のハイブリッドバージョン）のものであり、そのような重鎖ポリペプチドの各々は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）の少なくとも一部及び１つ、２つ又は３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）又はその一部を含む。ハイブリッド定常領域ＩｇＧ重鎖分子の例は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域を有するＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ２重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのものに由来するポリペプチドの残りのカルボキシ末端部分とを有するものであろう；
ｉｉ．（上記の項目［ｉ］の）単一の重鎖ポリペプチドに各々（個々に）共有結合した２つの軽鎖ポリペプチドであって、そのような共有結合は、単一の前記軽鎖と単一の前記重鎖ポリペプチドとの間の少なくとも１つのシステイン−システイン鎖間ジスルフィド結合からなり、そのような軽鎖ポリペプチドは、κ型又はλ型の軽鎖免疫グロブリン分子であり、それらの各々が少なくとも１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び少なくとも１つの軽鎖定常ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる；
ｂ．抗体は、見かけの分子量で、約１００，０００ダルトンより大きく約２５０，０００ダルトン未満、約１２０，０００ダルトンより大きく約１８０，０００ダルトン未満、又は約１４０，０００から約１６５，０００ダルトンの見かけの分子量（非還元条件下で８％−１２％ポリアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定される）を有し得る；
ｃ．抗体は、クラス１（ＩｇＧ１）、２（ＩｇＧ２）、３（ＩｇＧ３）又は４（ＩｇＧ４）の天然に存在するヒトＩｇＧアイソタイプ分子の重鎖定常領域に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸組成を有する重鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用ＩｇＧ抗体に見出されるように、任意のアイソタイプのヒトＩｇＧ重鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全てのアロタイプ変異体を含む；（例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照）；
ｄ．抗体は、天然に存在するヒトカッパ又はラムダ型分子の軽鎖定常領域に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸組成を有する軽鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用抗体に見出されるように、ヒト軽鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全ての可能なアロタイプ変異体を含む（例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照）；
ｅ．抗体は、哺乳類供給源（例えば、ヒト、霊長類、ウサギ、反芻動物、マウス又は他のげっ歯類）に由来する重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。ＶＨ又はＶＬをコードする供給源がヒトではない場合、抗体はキメラ（ヒト定常領域の存在による）又はヒト化（ヒトフレームワーク可変領域への非ヒトアミノ酸配列の移植による）の何れかであり得る；
ｆ．一実施態様では、抗体は以下の何れに対してもコンジュゲートしていない：（１）細胞毒素（例えば、ビンクリスチン）、（２）放射性物質（例えば、１１１インジウム）、（３）造影剤（例えば、フルオレセイン）、（４）小分子治療薬（例えば、ブレオマイシン）、（５）治療用非抗体ポリペプチド（例えば、インターフェロン−γ）、（６）酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、（７）ワクチン物質（例えば、ウイルスポリペプチド）、又は（８）ポリエチレングリコール分子（例えば、ＰＥＧ）。
ｇ．一実施態様では、抗体は以下の何れかに対してコンジュゲートしている：（１）細胞毒素（例えば、ビンクリスチン）、（２）放射性物質（例えば、１１１インジウム）、（３）造影剤（例えば、フルオレセイン）、（４）小分子治療薬（例えば、ブレオマイシン）、（５）治療用非抗体ポリペプチド（例えば、インターフェロン−γ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、（７）ワクチン物質（例えば、ウイルスポリペプチド）、又は（８）ポリエチレングリコール分子（例えば、ＰＥＧ）。
【００８８】
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の機能機能相関の何れか又は全てを示し得る：
ａ．抗体は、２つの重鎖−軽鎖対のそれぞれによって形成される可変（Ｆａｂ）領域に由来する２つのＣＤ３２結合ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になり得、この二価構造のために、１つ又は２つの抗原エピトープの何れかに結合する能力を有する。
ｂ．抗体のＦｃ領域は、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４  ＩｇＧ受容体に結合する能力が減少させるか、又は完全に能力を欠くかの何れかであり、ここでこのようなＩｇＧ受容体結合活性の減少は、（１）２つ以上のＩｇＧ−Ｆｃ領域ポリペプチド配列の融合（例えば、ハイブリダイゼーション）、（２）Ｆｃ領域の糖分子の酵素的修飾（例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにおける位置２９７に位置するアスパラギン残基からの糖分子の修飾又は除去）、又は（３）ＩｇＧ重鎖の定常領域中の１つ以上の位置で操作されたアミノ酸変異の何れかの結果であり、ここでそのような操作された変異は、以下の型の古典的なヒトＩｇＧ受容体：ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４へのＦｃ依存性の結合を減少させるか又は排除する：
ｃ．抗体は、ヒトＣＤ３２に結合すると、他のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の能力を阻害して前記ＣＤ３２分子が炎症性細胞反応を直接誘導するようにする安定な免疫複合体を形成し、このような他のＩｇＧ抗体は、（１）少なくとも１つの抗原分子にＦａｂ依存的に結合するか、又は（２）少なくとも２つのそのようなＩｇＧ分子の集合体にクラスター化されるか、又は（３）前記ＩｇＧ分子の水性拡散を制限するような様式で表面へ局在化される。
【００８９】
核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体の何れかをコードする合成又は組換え核酸配列を提供する。そのような核酸は、例えば、本明細書に記載の抗体を産生することができるＢ細胞から単離される。そのような核酸は、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖の配列をコードする。あるいは、そのような核酸は、それぞれ、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖の配列をコードする。幾つかの実施態様において、核酸は、本明細書に記載の抗体の機能的部分をコードするであろう。核酸コードの縮重により、複数の核酸が同じアミノ酸をコードし、全てが本明細書に包含される。包含される特定の核酸は、表１−５に記載されている。
【００９０】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む。幾つかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を含む。
【００９１】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に開示される少なくとも１つの抗体をコードする核酸分子を含む。
【００９２】
抗体を作製する方法
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を作製する方法が提供される。一態様では、本方法は、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、分泌された抗体を単離することを含む。エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体をコードする核酸は、表１−５に記載の任意の核酸又はその断片又は変異体であり得る。
【００９３】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を発現する宿主細胞が包含される。宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。非限定的な例には、ヒト個体、げっ歯類、ウサギ、ラマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、アペ、又はゴリラに由来する宿主細胞が含まれる。一実施態様では、前記宿主細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ウサギ細胞及び／又はラマ細胞を含む。
【００９４】
一実施態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、２９３（Ｔ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞及び当技術分野で周知の他の細胞株を含み、本明細書に記載の抗体をコードする核酸配列を含む。宿主細胞は、商業的抗体産生（「産生細胞」）に適応させることができる。前記産生細胞の増殖は、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体を産生することができる産生細胞株をもたらす。産生細胞株は、ヒトで使用するための化合物を産生するのに適している可能性がある。従って、前記産生細胞株は、病原性微生物などの病原体を含まなくてもよい。
【００９５】
更に提供されるのは、ＣＤ３２ａに特異的に結合することができる抗体を産生するための方法であり、該抗体は、固定化ＩｇＧによるＣＤ３２ａの活性化を妨げるか、又はＩｇＧ免疫複合体によるＣＤ３２の活性化を妨げ、該方法は前記エフェクター欠損抗体を産生することができる抗体産生細胞を産生し、前記抗体産生細胞により産生された抗体を得ることを含む。
【００９６】
本明細書で提供される方法の１つによって得ることができる、単離された又は組換え抗体、並びに単離された又は組換え宿主細胞、又はその機能的等価物もまた提供される。
【００９７】
一実施態様では、抗体は、抗ＣＤ３２ａ抗体（ＩＶ．３、ＡＴ−１０、及びＭＤＥ−８）の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸分子を得ることによって産生された。例えば、抗体は、これらの細胞株から単離されたリボ核酸（ＲＮＡ）及び５’リーダーコード配列及び５’定常鎖コード配列に向けられたオリゴプライマーを用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ハイブリドーマ細胞株から、又は２）抗ＣＤ３２ａ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の既知の核酸配列を含む合成分子を産生することによって得ることができる。
【００９８】
一実施態様では、抗ＣＤ３２ａ抗体の軽鎖及び重鎖のヒト化可変領域をコードする核酸分子は、本明細書に記載の修飾を有する既知の核酸配列を含む合成分子を（商業的に利用可能な手段により）産生することによって得られた。
【００９９】
一実施態様では、抗ＣＤ３２ａ抗体（ＩＶ．３、ＡＴ−１０、及びＭＤＥ−８）の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸分子を、軽鎖定常領域（免疫グロブリンカッパ）及び重鎖定常領域（ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２）をコードするそれぞれの核酸配列を含有する市販のプラスミドベクターｐＦＵＳＥにクローニングした。
【０１００】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、ｐＦＵＳＥプラスミドの重鎖定常領域コード配列上の部位特異的突然変異誘発によって核酸変異を作製することによって産生された。
【０１０１】
一実施態様では、抗ＣＤ３２ａ抗体は、抗体軽鎖及び重鎖の可変領域並びに定常領域をコードする核酸分子を含むｐＦＵＳＥプラスミドベクターでヒト胚性腎臓細胞（例えばＥｘｐｉ２９３細胞）をトランスフェクトすることによって産生された。幾つかの態様において、核酸分子は、天然型（エフェクター能力のある）又は変異型（エフェクター欠損）フォーマットでのＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプの、キメラ、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂをコードした。
【０１０２】
一実施態様では、トランスフェクトされた細胞によって分泌された抗ＣＤ３２ａ抗体を、プロテインＧカラム精製によって培養培地から精製し、使用前に緩衝食塩水で透析した。
【０１０３】
薬学的組成物
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を含む。幾つかの実施態様において、薬学的組成物は、付加的活性薬剤を更に含む。
【０１０４】
特定の実施態様において、薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態及び所望される投与量に依存して、当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R.Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)を参照。特定の実施態様において、そのような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０１０５】
特定の実施態様において、薬学的組成物中の賦形剤は、本質的に水性又は非水性とすることができる。例えば、特定の実施態様では、適切な賦形剤は、注射用水、生理食塩水又は人工脳脊髄液とすることができ、場合によっては非経口投与のための組成物に一般的な他の材料を補充してもよい。幾つかの実施態様において、生理食塩水は等張リン酸緩衝食塩水を含む。特定の実施態様において、血清アルブミンと混合した中性緩衝食塩水又は生理食塩水は、更なる例示的な賦形剤である。特定の実施態様において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトール又はそれに適した代用物質を更に含むことができる。特定の実施態様において、少なくとも１つの付加的治療剤を含むか又は含まない、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態の任意の製剤（ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することによって貯蔵のために調製することができる。更に、特定の実施態様では、少なくとも１つの付加的治療剤を含むか又は含まない、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方することができる。
【０１０６】
本発明の抗体／組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸性に、経鼻的に、口腔的に、経膣的に又は移植されたリザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。
【０１０７】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害
ＣＤ３２ａ媒介性疾患及び障害には、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫又は特定の薬物（例えば、ヘパリン）に関連する血栓症、及び抗体療法（例えば、抗ＶＥＧＦ又は抗ＣＤ４０Ｌ免疫療法）、輸血又は臓器移植の反応、特定のウイルス感染、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、アレルギー性鼻炎、ループス腎炎、抗体媒介性貧血、アナフィラキシー及び気道炎症が含まれる。例えば、Gillis C et al.Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies (2014 May 30) Front Immunol 5:254; PubMed ID: 24910634; Bruhns P.Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models (2012 Jun 14) Blood, 119(24):5640-9, PubMed ID: 22535666; and Hogarth PM and Pietersz GA, Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (2012 Mar 30) Nat Rev Drug Discov 11(4):311-31, PubMed ID: 22460124を参照。
【０１０８】
特定の実施態様では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は血小板減少症である。血小板減少症は循環血小板の減少によって特徴付けられる。一実施態様では、血小板減少症は、正常値の下限値（通常は１５０ｘ１０９／Ｌとする）より小さい血小板数として定義される。他の実施態様では、血小板減少症は、循環血小板の数の減少として定義される。例えば、血小板数が１５０ｘ１０９／Ｌを下回っていなくても、ヘパリン投与後の血小板数の３０−５０％以上の減少は、ヘパリン誘発性血小板減少症の症状である可能性がある。（Warkentin TE.Clinical presentation of heparin-induced thrombocytopenia (Oct 1998) Semin Hematol 35(4 Suppl 5):9-16; discussion 35-6; PubMed ID: 9855179）。血小板数は、典型的には電子計数法によって、通常は完全血球数（ＣＢＣ）の一部として測定される。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより血小板減少症を治療するための方法が包含される。
【０１０９】
別の実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性血栓症である。一実施態様において、ＩｇＧ媒介性血栓症は、ＩｇＧ免疫複合体によって又は固定化ＩｇＧによって引き起こされる血栓症である（例えば、Reilly MP et al.Heparin-induced thrombocytopenia/thrombosis in a transgenic mouse model requires human platelet factor 4 and platelet activation through FcgammaRIIA.Blood.2001 Oct 15;98(8):2442-7.PubMed ID: 11588041;また、Taylor SM et al.Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human FcgammaRIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor.Blood.2000 Dec 15;96(13):4254-60.PubMed ID: 11110699をそれぞれ参照）．本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせによりＩｇＧ媒介性血栓症を治療するための方法が包含される。ＩｇＧ媒介性血栓症の治療のための方法であって、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の単独又は組み合わせを、単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含む方法であって、ここでＩｇＧ血栓症はＩｇＧ免疫複合体によって引き起こされる任意の血栓症である。
【０１１０】
幾つかの態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、少なくとも部分的に、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞（Boruchov AM et al.Activating and inhibitory IgG Fc receptors on human DCs mediate opposing functions (Oct 2005) J Clin Invest 115:2914; PubMed ID: 16167082）、肥満細胞、真皮微小血管内皮細胞（Groeger M et al.Dermal microvascular endothelial cells express CD32 receptors in vivo and in vitro (15 Feb 1996) J Immunol 156:1549; PubMed ID: 8568259)を含む細胞上又は細胞内でのＣＤ３２ａの活性化によって引き起こされる（Hogarth PM et al.Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (30 Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124）。幾つかの他の態様では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小裂開細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、濾胞性リンパ腫、Ｂ系統のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫、胎児性癌腫、鼻咽頭の未分化癌腫、キャッスルマン病、カポジ肉腫及び他のＢ細胞リンパ腫は悪性細胞上のＣＤ３２ａの活性化によって少なくとも部分的に引き起こされる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることによりＣＤ３２ａの活性化によって特徴付けられる疾患又は障害を治療するための方法が包含される。
【０１１１】
一実施態様において、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、免疫性、自己免疫性、アレルギー性又は炎症性の疾患又は障害である。免疫性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性肺疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、全身性紅斑、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、急性感染性単核球症、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス関連疾患、多発性硬化症、溶血性貧血、甲状腺炎、スティフマン症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、抗体介在性関節炎、又は抗体誘発性貧血若しくは血球減少症を挙げることができる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせにより免疫性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性の疾患又は障害を治療するための方法が包含される。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性肺疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、抗体介在性関節炎、又は抗体誘発性貧血若しくは血球減少症を治療するための方法が包含される。
【０１１２】
ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、免疫複合体媒介性疾患又は障害であって良い。免疫複合体介在性疾患又は障害は、この場合、例えば、ＲＡにおける単球からの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、炎症性サイトカイン）のＩｇＧ誘発性放出によって引き起こされる炎症（Mathsson L et al.Immune complexes from rheumatoid arthritis synovial fluid induce FcgammaRIIa dependent and rheumatoid factor correlated production of tumour necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells (2006) Arthritis Res Ther 8:R64; PubMed ID: 16569263）、又はＳＬＥ及び糸球体腎炎における多形核細胞（好中球、好塩基球、好酸球）によって引き起こされる腎臓損傷（Suzuki Y et al.Pre-existing glomerular immune complexes induce polymorphonuclear cell recruitment through an Fc receptor-dependent respiratory burst: potential role in the perpetuation of immune nephritis (2003 Mar 15) J Immunol 170:3243; PubMed ID: 12626583; Rovin BH.The chemokine network in systemic lupus erythematous nephritis (2008 Jan 1) Front Biosci 13:904; PubMed ID: 17981599）の細胞及び組織に損傷を与える局在性又は全身性の炎症過程により特徴付けられる。免疫複合体媒介性疾患又は障害には、多数の他の急性及び慢性状態が含まれる（Gillis C et al.Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies (2014 May 30) Front Immunol 5:254; PubMed ID: 24910634）。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより免疫複合体媒介性疾患又は障害を治療するための方法が包含される。免疫複合体形成に関連することが知られている疾患又は障害には、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、ループス腎炎、及びＡＰＳが挙げられる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、ループス腎炎、及びＡＰＳを治療するための方法が包含される。
【０１１３】
そのような疾患又は障害と関連する免疫複合体の型には、循環ＩｇＧ免疫複合体、沈着ＩｇＧ免疫複合体、及び固定化ＩｇＧ免疫複合体が含まれる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより循環ＩｇＧ免疫複合体、沈着ＩｇＧ免疫複合体、及び固定化ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害を治療するための方法が包含される。
【０１１４】
一実施態様では、循環ＩｇＧ免疫複合体、沈着ＩｇＧ免疫複合体、又は固定化ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害には、循環ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられるＲＡ及びＳＬＥが含まれる。例えば、Zhao X et al.Circulating immune complexes contain citrullinated fibrinogen in rheumatoid arthritis (2008) Arthritis Res Ther 10:R94; PubMed ID: 18710572; Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Soares NM et al.An improved anti-C3/IgG ELISA for quantification of soluble immune complexes (1 Mar 2001) J Immunol Methods 249:199; PubMed ID: 11226477；及びHuber C et al.C3-containing serum immune complexes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation to disease activity and comparison with other rheumatic diseases (1989) Rheumatol Int 9:59; PubMed ID: 2814209)を参照。ＲＡ又はＳＬＥが循環ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられるＲＡ及びＳＥＬを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
【０１１５】
一実施態様では、循環ＩｇＧ免疫複合体、沈着ＩｇＧ免疫複合体、又は固定化ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害には、循環細胞又は粒子に、又は組織中に沈着したＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられるＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＰＳが含まれる。例えば、Zhao X et al.Circulating immune complexes contain citrullinated fibrinogen in rheumatoid arthritis (2008) Arthritis Res Ther 10:R94; PubMed ID: 18710572; Nielsen CT et al.Increased IgG on cell-derived plasma microparticles in systemic lupus erythematosus is associated with autoantibodies and complement activation (Apr 2012) Arthritis Rheum 64:1227; PubMed ID: 22238051；及びde Groot PG et al.The significance of autoantibodies against beta-2 glycoprotein I (Jul 12, 2012) Blood 120:266; PubMed ID: 22553312)を参照。ＲＡ、ＳＬＥ又はＡＰＳが循環細胞又は粒子に沈着したＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられるＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＰＳを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
【０１１６】
一実施態様では、循環ＩｇＧ免疫複合体、沈着ＩｇＧ免疫複合体、又は固定化ＩｇＧ免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害にはＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、及びＡＰＳが含まれ、ここではＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、又はＡＰＳは可溶性又は固定化免疫複合体によって特徴付けられる。例えば、Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Roennelid J et al.Immune complexes from SLE sera induce IL10 production from normal peripheral blood mononuclear cells by an FcgammaRII dependent mechanism: implications for a possible vicious cycle maintaining B cell hyperactivity in SLE (Jan 2003) Ann Rheum Dis 62:37; PubMed ID: 12480667; Cines DB et al.Heparin-induced thrombocytopenia: an autoimmune disorder regulated through dynamic autoantigen assembly/disassembly (Feb 2007) J Clin Apher 22:31; PubMed ID: 17285619;及びde Groot PG et al.The significance of autoantibodies against beta-2 glycoprotein I (Jul 12, 2012) Blood 120:266; PubMed ID: 22553312を参照。ＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、又はＡＰＳが可溶性又は固定化免疫複合体によって特徴付けられるＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、又はＡＰＳを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
【０１１７】
重要なことに、上記免疫複合体の２つ以上の型が、これら及び他の免疫複合体の疾患及び障害において同時に又は異なる時点で存在し得る。このシナリオにおいてさえ、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体は、疾患及び障害の１つ又は全てを治療するために投与され得る。
【０１１８】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを投与することを含む、ＰＦ４に結合する抗体によって特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法が包含される。ヒト血小板因子４（ＰＦ４）に対する抗体は、ＲＡ、ＡＰＳ、ＳＬＥ及びＨＩＴにおいて同定されている。例えば、Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Sikara MP et al.Beta 2 Glycoprotein I binds platelet factor 4 (PF4): implications for the pathogenesis of antiphospholipid syndrome (Jan 21 2010) Blood 115:713; PubMed ID: 19805618; Satoh T et al.Heparin-dependent and -independent anti-platelet factor 4 autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus (2012 Sep) Rheumatology (Oxford) 51:1721 PubMed ID: 22718864；及びWarkentin TE et al.HITlights: a career perspective on heparin-induced thrombocytopenia (2012 May) Am J Hematol 87:S92; PubMed ID: 22367928を参照。従って、一実施態様において、ＲＡ、ＡＰＳ、ＳＬＥ、又はＨＩＴが、ＰＦ４に結合する抗体によって特徴付けられるＲＡ、ＡＰＳ、ＳＬＥ及びＨＩＴを治療する方法であって、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを、単独又は既存の療法と組み合わせて投与することを含む方法が包含される。
【０１１９】
ＨＩＴでは、抗ＰＦ４  ＩｇＧ抗体は血小板ＣＤ３２ａを介して血小板減少症及び血栓症を媒介することが知られており、ここではヘパリンの治療量（ヘパリンはＰＦ４抗原に結合する）がＨＩＴ免疫複合体を血小板表面に局在させる重要な役割を果たす。例えば、Newman PM et al.Heparin-induced thrombocytopenia: new evidence for the dynamic binding of purified anti-PF4-heparin antibodies to platelets and the resultant platelet activation (1 Jul 2000) Blood 96:182; PubMed ID: 10891449を参照。
【０１２０】
一実施態様において、免疫複合体媒介性疾患は、非抗ＣＤ３２ａ抗体又はその抗原結合断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体（ＡＴＡ）応答である。非抗ＣＤ３２ａ抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＩｇＧ−Ｆｃ融合治療剤、エタネルセプト、セソリズマブペゴール、ゴリムマブ、エタネルセプト、ウステキヌマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、ベリムマブ、又はタブルマブであり得る。これらの方法の実施態様において、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与され得る。
【０１２１】
一実施態様では、免疫複合体媒介性疾患又は障害は、ＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、ループス腎炎又は抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）の治療のための非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体で治療される患者において生じる。患者が非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体を投与されているか又は投与された、ＲＡ、ＳＬＥ、ＨＩＴ、ループス腎炎、又は抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
【０１２２】
他の実施態様において、疾患又は障害は止血障害である。止血障害は、抗体媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症（ＩＴＰ）、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、及び血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴＴ）からなる群から選択され得る。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを投与することを含む、止血障害を治療するための方法が包含される。また、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の単独又は組み合わせを、単独又は他の療法（例えば、抗凝固剤）と組み合わせて投与することを含む、抗体媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症（ＩＴＰ）、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、及び血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴＴ）を治療するための方法も包含される。
【０１２３】
また、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを投与することを含む、ＩＶ−Ｉｇを有する患者の治療によって引き起こされる止血障害を治療する方法であって、このようなエフェクター欠損抗体が、ＩＶ−Ｉｇの前、ＩＶ−Ｉｇの同時、又はＩＶ−Ｉｇ処理の後に投与される方法も包含される。ＩＶ−Ｉｇは、自己免疫及び移植患者の治療に有用であるが、血小板減少症及び急性動脈血栓症及び静脈血栓症、アナフィラキシーショック、一過性腎不全、感染リスクの増大、及び白血球減少症などの副作用を伴う。血栓症はＩＶ−Ｉｇによる治療においてますます認められている（Paran D et al.Venous and arterial thrombosis following administration of intravenous immunoglobulins (Jul (2005) Blood Coagul Fibrinolysis 16:313; PubMed ID: 15970713; Woodruff RK et al.Fatal thrombotic events during treatment of autoimmune thrombocytopenia with intravenous immunoglobulin in elderly patients (Jul 1986) Lancet 2:217; PubMed ID: 2873457）。ＩＶ−Ｉｇの使用において観察される重篤な血栓塞栓事象には、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、心筋梗塞（ＭＩ）、肺塞栓症（ＰＥ）、網膜中心静脈閉塞、脳血管障害（ＣＶＡ）が含まれる。Ｐｏｌｌｒｅｉｓｚと同僚は、ＩＶＩｇは、ＣＤ３２依存的に血小板の活性化、凝集、脱顆粒、及び血小板からの炎症性サイトカイン放出を誘導することができ、そしてこのＩＶＩｇ誘導性ＣＤ３２依存性血小板活性化はＡＴ−１０によって完全に遮断されることを示し、血小板ＣＤ３２がＩＶＩｇ誘発性血栓形成促進性活性に必要かつ十分であることが実証された（Pollreisz A et al.Intravenous immunoglobulins induce CD32-mediated platelet aggregation in vitro (Sep 2008) Br J Dermatol 159:578; PubMed PMID: 18565176）。
【０１２４】
更に他の実施態様では、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害はアレルギー性疾患である。アレルギー性障害は、喘息、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー、及びアレルギー反応からなる群から選択され得る。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを投与することを含む、アレルギー性障害を治療するための方法が包含される。同様に、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含む、喘息、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー及びアレルギー反応を治療するための方法が包含される。
【０１２５】
ヒト血小板の表面上のＣＤ３２  ＩｇＧ受容体及びＣＤ２３  ＩｇＥ受容体の両方の存在は（Hasegawa S et al.Functional expression of the high affinity receptor for IgE (FcepsilonRI) in human platelets and its' [sic] intracellular expression in human megakaryocytes (Apr 1999) Blood 93:2543; PubMed ID: 10194433）、喘息及び慢性肺疾患において起こるように、特に肺炎症において明らかである、血小板とアレルギーとの間の不可欠な関連を示す（Page C et al.Platelets and allergic inflammation (Jul 2014) Clin Exp Allergy 44:901; PubMed ID: 24708345）。ヒト扁桃腺Ｂ細胞上のＣＤ３２のＩＶ．３又はＡＴ−１０遮断が、誘導性ＩｇＧ及び誘導性ＩｇＥ合成の両方を抑制することが示されている未成熟Ｂリンパ球についても、ＣＤ３２とＣＤ２３の間の関連が認められている（Horejs-Hoeck J et al.Inhibition of immunoglobulin E synthesis through Fc gammaRII (CD32) by a mechanism independent of B-cell receptor co-cross-linking (Jul 2005) Immunology 115:407; PubMed ID: 15946258）。ＣＤ３２／ＣＤ２３相乗作用の機構的説明は、ＣＤ３２ａを有する細胞において抗炎症状態を誘導するためのＩＶ．３及びＡＴ−１０の能力において最近同定された（Ben Mkaddem S et al.Shifting Fc[gamma]RIIA- ITAM from activation to inhibitory configuration ameliorates arthritis (Sep 2014) J Clin Invest 124:3945; PubMed PMID: 25061875）。アレルギーにおけるＣＤ３２ａの役割は、止血の障害にも関連する可能性がある（Potaczek DP.Links between allergy and cardiovascular or hemostatic system (Jan 2014) Int J Cardiol 170:278; PubMed ID: 24315352）。
【０１２６】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、ＣＤ３２ａを提示する細胞における反応によって駆動される炎症を抑制するために使用され、そのようなＣＤ３２ａは、血小板又は赤血球の表面などの表面に固定化されたＩｇＧ分子に結合する。例えば、固定化ＩｇＧは、血小板ＣＤ３２ａに結合して活性化し、接着及び顆粒分泌をもたらし、このプロセスはＩＶ．３によって遮断されることが示されている（Haimovich B et al.The FcgammaRII receptor triggers pp125FAK phosphorylation in platelets (July 1996) J Biol Chem 271:16332; PubMed ID: 8663117）。更に、ＩｇＧＩｇＧで被覆された赤血球はＣＤ３２ａを介して貪食され、この活性はＩＶ．３によって阻害される（Wiener E et al.Role of Fc gamma RIIa (CD32) in IgG anti-RhD-mediated red cell phagocytosis in vitro (Sep 1996) Transfus Med 6:235; PubMed ID: 8885153）。更に、ＩｇＧで被覆された細胞は、ＳＬＥ患者ではＣＤ３２ａ依存的に排除され、このクリアランスはＩＶ．３によって阻害されることが知られている（Seres T et al.Correlation of Fc gamma receptor expression of monocytes with clearance function by macrophages in systemic lupus erythematosus (Sep 1998) Scand J Immunol 48:307; PubMed ID: 9743218）。
【０１２７】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、ＣＤ３２ａを提示する細胞における反応によって駆動される炎症を抑制するために使用され、ここではそのようなＣＤ３２ａは、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの自己抗原に結合したＩｇＧ分子と相互作用し、ＣＤ３２ａ陽性細胞に局在化し、ＩＶ．３によって阻害されることが知られている炎症性活性化を導く（例えば、Hoylaerts MF et al.Recurrent arterial thrombosis linked to autoimmune antibodies enhancing von Willebrand factor binding to platelets and inducing Fc gamma RII receptor-mediated platelet activation (Apr 1998) Blood 91:2810; PubMed ID: 9531591を参照）。従って、１つ又は複数のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
【０１２８】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、感染性ウイルスによって引き起こされる炎症を抑制するために使用される。例えば、ＩＶ．３は、ヒト肥満細胞のデングウイルス感染を阻害することが知られている（Brown MG et al.A dominant role for FcgammaRII in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells and associated CCL5 release (Dec 2006) J Leukoc Biol 80:1242; PubMed ID: 16940332）。従って、炎症が感染性ウイルスによって媒介される場合、１つ又は複数のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
【０１２９】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、感染性微生物によって引き起こされる炎症を抑制するために使用される。例えば、黄色ブドウ球菌は感染性心内膜炎を引き起こし、ＩＶ．３によって阻害される血小板駆動型ＣＤ３２ａ炎症反応性を誘導する（Fitzgerald JR et al.Fibronectin-binding proteins of Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis, and Streptococcus pneumoniae mediate activation of human platelets via fibrinogen and fibronectin bridges to integrin GPIIb/IIIa and IgG binding to the FcgammaRIIa receptor (Jan 2006) Mol Microbiol 59:212; PubMed ID: 16359330; Arman M et al.Amplification of bacteria-induced platelet activation is triggered by Fc[gamma]RIIA, integrin [alpha]IIb[beta]3, and platelet factor 4 (May 2014) Blood 123:3166; PubMed ID: 24642751）。同様に、グラム陽性敗血症における全身性炎症、敗血症関連血管漏出、血小板活性化及び凝固機能不全はＣＤ３２ａ媒介性であり、これらの炎症過程はＩＶ．３によって遮断される（Sun D et al.Bacillus anthracis peptidoglycan activates human platelets through Fc[gamma]RII and complement (Jul 2013) Blood 122:571; PubMed ID: 23733338）。従って、炎症が感染性微生物によって媒介される場合、１つ又は複数のエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
【０１３０】
一実施態様では、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、ＩＶ−Ｉｇとともに、又はＩＶ−Ｉｇの代わりに患者に対して治療として投与される。静脈内免疫グロブリン（ＩｇＧ）又は「ＩＶ−Ｉｇ」は、原発性液性免疫不全、多巣性運動ニューロパシー、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、免疫性血小板減少性紫斑病、川崎病候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーを含む様々な自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療のためにＦＤＡによって承認されている。また、ＩＶＩｇは、新生児の同種免疫性血小板減少症、ＨＩＶ関連血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、骨髄移植患者における間質性肺炎又はサイトメガロウイルス感染、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、粘膜類天疱瘡、壊死性筋膜炎、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、中毒性表皮壊死症又はスティーブンス・ジョンソン症候群、バードショット網膜症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋萎縮症候群、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、多発神経根障害、難治性皮膚筋炎、難治性多発性筋炎、再発寛解型多発性硬化症を治療するために使用される。エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体は、これらの状態を治療するために使用され得る。
【０１３１】
方法の実施態様のそれぞれにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ショックの症状によって特徴付けられ得る。本明細書中で使用される場合、用語「ショック」とは、限定するものではないが、Ｉ型の過敏性反応（すなわち、ＩｇＥによって媒介される）、ＩＩ型の過敏性反応（すなわち、固定化ＩｇＧによって媒介される）、又はＩＩＩ型の過敏性反応（すなわち、ＩｇＧ複合体によって媒介される）、ＩｇＧ媒介性血栓性反応、及びＩｇＧ媒介性神経学的反応を含む。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか１つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含むショックの症状を緩和するための方法が包含される。
【０１３２】
例示的な実施態様
一実施態様では、ヒト被験体におけるＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を治療する方法が提供される。
【０１３３】
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、ＩｇＧ免疫複合体試験及び固定化ＩｇＧ試験の両方に適合し、かつＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦＣ領域を有する。
【０１３４】
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性止血障害であり得る。止血障害は、血小板減少症の有無にかかわらず、血栓症であり得る。止血障害は、ＩｇＧ媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症（ＩＴＰ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴＴ）、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択され得る。
【０１３５】
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるＣＤ３２ａのＩｇＧ−Ｆｃ媒介性活性化によって特徴付けられ得る。
【０１３６】
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害であり得る。ＩｇＧ媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ＩｇＧ抗体誘発性貧血、及びＩｇＧ媒介性血球減少からなる群から選択され得る。
【０１３７】
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害であり得る。ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患は、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体（ＡＴＡ）応答であり得る。本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、非抗ＣＤ３２ａ抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール（抗体様）、ゴリムマブ、エタネルセプト（抗体様）、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブであり得る。本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与され得る。単独で又は他の方法と組み合わせた方法の実施態様の何れかにおいて、ＩｇＧ免疫複合体媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために、非抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体により治療されている患者において生じ得る。
【０１３８】
方法の実施態様の何れかにおいて、ＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害は、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するＩｇＧにより特徴付けられ得る。循環細胞型は、以下の１つ以上であり得る：血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Ｂリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物。方法の実施態様の何れかにおいて、細胞表面に局在化するＩｇＧによって特徴付けられる疾患又は障害は、以下の１つ以上であり得る：血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症。
【０１３９】
幾つかの実施態様では、ヒト被験体におけるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がＦｃ領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する方法が提供される。この実施態様及び方法の実施態様の何れかにおいて、又は方法の実施態様の任意の組み合わせにおいて、エフェクター欠損抗体は、ＩｇＧ免疫複合体試験及び固定化ＩｇＧ試験の両方に適合し、かつＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦＣ領域を有する。方法の実施態様の何れかにおいて、アレルギー性疾患は、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物に対するアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択され得る。
【０１４０】
様々な実施態様の任意の組み合わせを含む、本明細書に記載の方法の実施態様のそれぞれにおいて、エフェクター欠損抗ＣＤ３２ａ抗体は、エフェクター欠損ＭＤＥ−８、ＩＶ．３又はＡＴ−１０モノクローナル抗体であり得、かつモノクローナル抗体はヒト又はヒト化されていてもよい。
【０１４１】
様々な方法の実施態様の任意の組み合わせを含む、本明細書に記載の方法の実施態様のそれぞれにおいて、ＭＤＥ−８、ＩＶ．３及びＡＴ−１０モノクローナル抗体は、本明細書及び配列表に記載されるように、各抗体について６つのＣＤＲを含み得、又は本明細書及び配列表に記載されるＣＤＲの間に１又は２個のアミノ酸の相違を有する配列を含み得る。
【０１４２】
エフェクター欠損であるＦｃ領域の少なくとも一部を含む、ヒトＣＤ３２ａに特異的に結合するエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａモノクローナル抗体であって、該エフェクター欠損抗体が、改変されていない対照と比較して、ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除する改変されたＦｃ領域を含む、抗体が提供される。
【０１４３】
定義
本明細書で使用される場合、用語「ヒトＣＤ３２Ａマウス」、「ＣＤ３２Ａマウス」、「トランスジェニックＣＤ３２Ａマウス」及び「トランスジェニックヒトＣＤ３２Ａマウス」は互換的に使用される。ＣＤ３２Ａマウスは以前に記載されている（McKenzie et al., The role of the human Fc receptor FcgammaRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model.J Immunol.1999 Apr 1;162(7):4311-8.PubMed ID: 10201963）。
【０１４４】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体のＦｃ部分に特異的に結合する白血球表面糖タンパク質である。ＩｇＧの受容体、すなわちＦｃガンマＲＩＩＩは、最も広範でかつ多種多様であり、その主な型は、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３２ａ」は、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩの活性化型及び「ガンマ」の代わりにギリシャのガンマ記号を使用する反復などその反復と同義である。
【０１４５】
用語「抗体」は、標的抗原への特異的結合のためにインタクトな抗体と競合することができる任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン又はその断片を指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト及び二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むことができるが、幾つかの例では、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物において天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源から単独で得ることができるか、又は「キメラ」であることができ、すなわち、抗体の異なる部分は、２つの異なる抗体に由来し得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的又は化学的切断によって産生され得る。他に示されない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片及び変異体を含む。更に、明示的に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）及びその断片を含む。
【０１４６】
本明細書中で使用される場合、「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は１０Ｅ７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、アルブミン、カゼイン）への結合について、そのＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤで所定の抗原に結合する。
【０１４７】
本明細書で使用される用語「Ｋａｓｓ」又は「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しているが、一方、本明細書で使用される用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図している。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「結合を阻害する」及び「結合を遮断する」（例えば、ＣＤ３２リガンド、例えばＩｇＧのＣＤ３２への結合の阻害／遮断を指す）は互換的に使用され、部分的及び完全な阻害／遮断の両方を包含する。ＣＤ３２に対するＩｇＧの阻害／遮断は、好ましくは、ＩｇＧが阻害又は遮断なしにＣＤ３２に結合するときに生じるエフェクター細胞機能の正常なレベル又は型を減少させるか又は変化させる。阻害及び遮断はまた、抗ＣＤ３２抗体と接触していないリガンドと比較して、抗ＣＤ３２抗体と接触した場合のＩｇＧのＣＤ３２への結合親和性の任意の測定可能な減少、例えば、ＣＤ３２へのＣＤ３２リガンドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％又は１００％の遮断を含むことが意図される。
【０１５０】
「Ｆｃ」領域は、抗体の定常「ＣＨ」ドメインの一部又は全てを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって一緒に保持される。Ｆｃ領域は、重鎖定常領域からの付加的アミノ酸を有するか又は有しないかのどちらかであって、ヒンジ領域の全て又は一部を含み得る。換言すれば、Ｆｃ領域は、任意でＣＨ２及びＣＨ３の一方又は両方を含み得る。
【０１５１】
「Ｆａｂ’断片」は、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖並びにＶＨドメイン及びＣ−Ｈ１ドメイン及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインと間の領域をも含む１つの重鎖の一部を含む。
【０１５２】
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【０１５３】
本明細書で使用する用語「血小板減少症」とは、循環血液中の血小板の異常な数を指す（Wintrobe MM et al.Disorders of Platelets and Hemostasis.In: Clinical Hematology, Seventh Edition, Lea & Febiger, Philadelphia, 1974）。これは典型的には、血小板減少症は、正常値の下限値（通常は１５０ｘ１０９／Ｌとする）より小さい血小板数として定義される。また、循環血小板の数の減少として特徴付けることもできる。例えば、血小板数が１５０ｘ１０９／Ｌを下回っていなくても、ヘパリン投与後の血小板数の３０−５０％以上の減少は、ヘパリン誘発性血小板減少症の症状である可能性がある。（Warkentin TE.Clinical presentation of heparin-induced thrombocytopenia (Oct 1998) Semin Hematol 35(4 Suppl 5):9-16; discussion 35-6; PubMed ID: 9855179）。血小板数は電子計数法によって通常は完全血球数（ＣＢＣ）の一部として測定される。
【０１５４】
本明細書で使用される用語「血栓症」は、血管（静脈又は動脈）の内部の血餅の形成を指す。典型的には、血餅又は血栓は、様々な割合で活性化血小板を含むフィブリン及び血液細胞からなるであろう。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ媒介性血栓症」という語句は、ＩｇＧ抗体分子が血栓の形成に寄与する血栓症を指す。
【０１５６】
用語「患者」及び「被験体」は、本明細書において互換的に使用され、治療の実施を必要とする哺乳動物を指す。
【０１５７】
本明細書で使用する用語「疾患」及び「障害」は、医学的疾患又は障害の存在を示唆する兆候、症状、又は検査室ベースの診断によって正常な健康とは区別される機能障害の異常又は徴候とみなされる病状及び症候群を含むことも意図される。
【０１５８】
「治療する」には、治療及び予防の両方が含まれる。
【０１５９】
用語「同一性」は、配列を整列させて比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アライメント（もしあれば）におけるギャップは、好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。整列された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M.and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M.Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J.Applied Math.48:1073に記載されているものが挙げられる。
【０１６０】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体として記載され得る。
【０１６１】
用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの様々な哺乳動物種由来の抗体に由来するＣＤＲ配列がヒト生殖系列可変フレームワーク配列上に移植された抗体を指すことを意図している。更なるフレームワーク領域のアミノ酸修飾を導入することができる。
【０１６２】
用語「エフェクター機能」は、免疫系のタンパク質及び／又は細胞及び血小板に結合する抗体のＦｃ領域又は定常領域の機能的能力を指す。ＩｇＧ抗体の典型的なエフェクター機能には、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）、新生児受容体（ＦｃＲｎ）、又はＩｇＧ  Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲ）（例えば、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩ）に結合する能力を含む。前述の分子の１つ以上に結合することができるという効果には、限定されないが、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、食作用、オプソニン作用、及びエフェクター細胞調節が含まれる。エフェクター機能の抑止又は減少は、抗体の可変領域の抗原結合活性を維持しつつ、Ｆｃのその受容体又は補体タンパク質又はエフェクター細胞への結合によって少なくとも部分的に誘導される生化学的又は細胞性活性の１つ又は複数における抑止又は減少を指し得る。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「エフェクター欠損」抗体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２及び／又はＣＤ６４型ＩｇＧ受容体へのＦｃ結合を減少させるか又は排除するように改変されたＦｃ領域を有する抗体として定義される。
【０１６４】
用語「抗原」は、抗体に特異的に結合することができる任意の天然又は合成物質を指す。
【０１６５】
用語「特異的結合」とは、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は、１０−７Ｍより強い親和性平衡定数で結合し、非特異的抗原に対する少なくとも２倍強い結合で所定の抗原に結合する。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫複合体」は、１つ以上の抗原分子に特異的に結合した１つ以上の抗体分子からなる分子構造を指す。
【０１６７】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合するか、又は抗体による特異的結合が可能なタンパク質決定基を指す。
【実施例】
【０１６８】
実施例１
エフェクター欠損モノクローナル抗体ＭＤＥ−８
本発明者らは、天然ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂが、そのヒト抗原（すなわち、ＣＤ３２Ａ）のトランスジェニックマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こすことを実証した。これらのマウスは、本明細書では「ＣＤ３２Ａマウス」と呼ばれる。ＣＤ３２ＡマウスにおけるＩｇＧ媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる；重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動抑制、痙攣、意識の明らかな喪失、（まれに）死亡も含まれる。
【０１６９】
ＭＤＥ−８  ｍＡｂのエフェクタードメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）をエフェクター欠損ＩｇＧフォーマットに変えることにより、ＣＤ３２Ａマウスに投与したときのインフュージョンリアクションが排除された。
【０１７０】
更に、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂが免疫複合体による曝露前に提供された場合、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症、血栓症及びショックを予防した。
【０１７１】
従って、エフェクター欠損モノクローナルＭＤＥ−８抗体は、任意のＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を処置するための天然ＭＤＥ−８抗体の代わりに使用され得る。理由は、エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体が天然ＭＤＥ−８で観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、予防的又は治療的に投与される場合、エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体は、ＩｇＧ免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び／又は予防するために使用され得る。
【０１７２】
材料及び方法
ＭＤＥ−８  ｍＡｂのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２フォーマットの両方で）をＣＤ３２Ａマウスに静脈内（尾静脈）注射した。この研究では、ＭＤＥ−８の２つのエフェクター欠損変異体を評価した。Ｅ２６９Ｒ及びＮ２９７Ａ。ＣＤ３２Ａマウスは以前にMcKenzie et al., 1999 Apr 1, J Immunol, 162(7):4311-8, PubMed ID: 10201963に記載されている。．ＭＤＥ−８  ｍＡｂ注射（１００マイクログラム）の後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために３０分間モニターした。ＭＤＥ−８  ｍＡｂ注射の前及び３０分後に、血液を後眼窩から採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。３時間後、幾つかの動物に、抗原であるＣＤ４０Ｌ三量体（５０マイクログラム）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃３１０−０２）と平衡化学量論の１５０マイクログラムのマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体（クローンＭ９０、ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２０５５ハイブリドーマ馴化培地からプロテインＧクロマトグラフィーにより精製したマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ）からなる免疫複合体（ＩＣ）の２００マイクロリットルボーラスを静脈内注射した。ＩＣ注射の３０分後、血小板を再び計数した。次いで、動物を直ちに屠殺し（すなわち、Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ注射の３０分後）、肺を採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
【０１７３】
結果
エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂは、エフェクター能力のあるＭＤＥ−８抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
ＣＤ３２Ａマウスに静脈内注射されると、天然ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１抗体は、中核体温によって測定される場合、低体温を特徴とするインフュージョンリアクションを引き起こす（図１；菱形）。天然ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１抗体を注射したマウスも、明らかな意識消失を含む重度のインフュージョンリアクションの徴候を示した（データ非表示）。マウスＩｇＧ受容体は、ヒトＩｇＧ２への結合が減少しており（例えば、Overdijk et al., Crosstalk between human IgG isotypes and murine effector cells, 2012 Oct 1, J Immunol, 189(7): 3430-8, PubMed ID: 22956577を参照）、これは低体温を引き起こすＩｇＧ２フォーマットの天然抗ヒトＭＤＥ−８抗体の不全と一致する（図１；四角）。重要なことに、２つの代表的なエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂ（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２フォーマットの両方で）（配列番号６９のアミノ酸を配列番号６５又は配列番号６７のアミノ酸とともに含む抗体）は天然ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１抗体で観察されるようなインフュージョンリアクションを引き起こさなかった（図１；三角形及びＸ）。血小板減少症を引き起こしたとしても、低体温（予想されるように）を引き起こすＩｇＧ２ののエフェクター能力のあるｍＡｂの不全は当業者には驚くことかもしれない。この驚くべき発見はまた、体温上昇の欠如が、ｍＡｂが安全であることを示さないことも明らかにする。この実験で提供されるエフェクター欠損の結果は、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体が以前に認識されていなかった血小板減少症の安全問題を解決することを実証する。
【０１７４】
次に、重篤な血小板減少症が、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の両方のフォーマットにおいて、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスへの天然ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂの静脈内注射に続いたことが観察された（図２、カラム１及びカラム２）。対照的に、２つの代表的なエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂ（配列番号６９のアミノ酸を配列番号６５又は配列番号６７のアミノ酸とともに含む抗体）は、ＣＤ３２Ａマウスに注射したときに血小板減少症を誘導しなかった（図２、カラム３及び４）。図２のカラム３及び４に見られる循環血小板数のわずかな減少は典型的なものであり、繰り返される採血から生じる。
【０１７５】
これらの実験は、ＩｇＧ２フォーマットのＭＤＥ−８は低体温を引き起こすことができなかったが（図１参照）、しかし循環血小板を大きく枯渇させた（図２）ので、血小板減少症は低体温とは無関係であり、血小板数の減少は温度の低下よりも敏感な指標であることを実証している。
【０１７６】
ヒトＩｇＧ１フォーマットにおける天然ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂの静脈内注射の前（図３Ａ）及び後（図３Ｂ）のＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した（図３Ｂ）。（蛍光ビーズ［１マイクロメートルは、血液量を制御するために含められ［ゲートＰ５］；右上の象限は赤血球及び白血球を含む［ゲートＰ４］）。
【０１７７】
重要なことに、天然ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  ｍＡｂがエフェクター欠損にされたとき（配列番号６９のアミノ酸を配列番号６５のアミノ酸とともに含む抗体）、それらは循環血小板を除去することができなかった（図３Ｃ［注射前］及び図３Ｄ［エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂの注射後］を図３Ａ及び図３Ｂと比較）。従って、エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂは血小板を枯渇させなかった（図３Ｄ）。更に、エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂ（ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ及びＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ）を注射したマウスは、インフュージョンリアクションの観察可能な徴候を示さなかった（データ非表示）。
【０１７８】
エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂの異なるＩｇＧサブクラスであるＭＤＥ−８（配列番号６９のアミノ酸を配列番号６７のアミノ酸とともに含む抗体）を用いた場合も同様の結果が得られた。天然ＭＤＥ−８  ｍＡｂ  ＩｇＧ２の静脈内注射の前（図３Ｅ）及び後（図３Ｆ）のＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した（図３Ｆ）。重要なことに、天然ＭＤＥ−８  ｍＡｂ  ＩｇＧ２がエフェクター欠損にされたとき、それはもはや循環血小板を除去しなかった（図３Ｇ［注射前］及び図３Ｈ［エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂの注射後］を図３Ｅ及び図３Ｆと比較）。
【０１７９】
これらの結果は、２つの代表的なＩｇＧサブクラス型のエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂは、循環血小板を枯渇させなかったことを示す（図３Ｄ及び３Ｈ）。
【０１８０】
図３に示す結果は、天然ＭＤＥ−８  ＩｇＧ  ｍＡｂのエフェクタードメインがＣＤ３２Ａマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こし、そのようなインフュージョンリアクションがＩｇＧ−Ｆｃドメインを改変することによって排除されることを実証する。従って、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に効率的に結合する抗ＣＤ３２ａ抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。ＭＤＥ−８  ｍＡｂをエフェクター欠損にすることはまた、循環血液から血小板を除去する抗体の能力を抑止し、そのようなクリアランスが、ＭＤＥ−８の場合、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウス血小板の表面上に固定化されているＩｇＧ−Ｆｃドメインによっても媒介されていることを示している。
【０１８１】
エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂは、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂは、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症（循環血小板数の減少）から保護することが決定された。免疫複合体曝露の３時間前に、ビヒクルリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）又は２つの代表的なエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ｍＡｂ（１００μｇ）：１）エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６５）；又は２）エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（配列番号６９とともに配列番号６７）のうちの１つでＣＤ３２Ａマウスを処置した。マウスに免疫複合体（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ、合計２００μｇ）を曝露し、曝露の３０分後に全血を採取した。図４は結果を示す。ビヒクル対照で前処置したマウスでは、ＩＣ注射により、重篤なショックの徴候（データ非表示）及び重篤な血小板枯渇を有するマウスが得られた。エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置された動物は、ＩＣ依存性のインフュージョンリアクション又はショックの徴候を示さなかった（データ非表示）。また、図４Ｂに示すように、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置されたマウスは、ＩＣ誘発性血小板減少症を経験しなかった（すなわち、血小板はＩＣにより除去されなかった；図４Ｂ）。インフュージョンリアクションのために、天然ＩｇＧ１フォーマットのエフェクター能力のあるＭＤＥ−８  ｍＡｂを同様に試験することはできなかった。
【０１８２】
同様の結果はエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａについても得られた。図４Ｃは、ビヒクル対照で前処置され、ＩＣ注射後のＣＤ３２Ａマウスからの血小板数を示す。図４Ｄは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７で前処置されたＣＤ３２ＡマウスのＩＣ後の血小板数を示す。図４のデータは、試験した全ての動物の代表例である。
【０１８３】
図５は、ビヒクル又はエフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体の何れかで前処置した（ＩＣ曝露の３時間前に前処置）ＣＤ３２ＡマウスへのＩＣ注射後の循環血小板の減少（％）を示す棒グラフを示す。ビヒクル（ＰＢＳ）で前処置したＣＤ３２Ａマウスは、著しく血小板減少性になったが（図５Ａ及び５Ｂ、棒＃１）、一方エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（図５Ａ）又はエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（図５Ｂ）で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。図５Ａ及び図５Ｂの動物＃１をビヒクル（ＰＢＳ）で前処置した。Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ免疫複合体を全ての動物に静脈内注射した。３０分後、血液を採取し、血小板を計数した。図５Ａは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒがマウスを免疫複合体媒介性血小板減少症から保護することを示す（図５Ａ、カラム２，３及び４を参照）。図５Ｂは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａがマウスを免疫複合体媒介性血小板減少症から保護することを示す（図５Ｂ、カラム２及び３を参照）。従って、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ｍＡｂの２つの代表的なＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）は、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護した。
【０１８４】
エフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体は、免疫複合体（ＩＣ）によって引き起こされる肺血栓症からＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを保護する。
ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスをビヒクル（ＰＢＳ）又は１００マイクログラムの代表的なエフェクター欠損ＭＤＥ−８ｍＡｂ（配列番号６５又は配列番号６７とともに配列番号６９）で前処置した。３時間後、マウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ（２００マイクログラム）を曝露した。３０分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に採取した。図６Ａは、ＩＣ曝露の３時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのＨ＆Ｅ染色された肺切片を示す。ビヒクルで前処置したマウスでは、広汎性閉塞性肺血栓（＊）が観察された。驚くべきことに、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した（図６Ｂ）。血管が異常であり、血管内で観察された赤血球の数がより少なく、炎症を起こした肺胞組織の証拠があるビヒクル処置マウス（図６Ａ）と比較して、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ前処置マウスもまた正常（健康な）肺胞組織に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した（図６Ｂ）。
【０１８５】
ＩＣ曝露後のマウス肺のＨ＆Ｅ顕微鏡検査によって、視野あたりの肺血栓を計数した。４匹のマウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣを注射した。動物＃１（図６Ｃ、棒１；ビヒクル対照）は、広汎性肺血栓症（視野あたり平均２０）を示したが、ＩＣ曝露の前にエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置された動物＃２−４（図６Ｃ、棒２−４）は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。図１に示す結果は、また、図６Ｃは、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒが肺血栓症を引き起こさなかったことも実証している。
【０１８６】
同様の結果はエフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａについても得られた。図７Ａは、ＩＣ曝露の３時間前にビヒクルで前処置されていたマウスからのＨ＆Ｅ染色された肺切片を示す。図７Ａには、広汎性閉塞性肺血栓（＊）が観察された。対照的に、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した（図７Ｂ）。ビヒクル（ＰＢＳ）前処置マウス（図７Ａ）の異常な（血管内で観察された赤血球の数が少なくいだけでなく炎症の証拠もある）肺胞組織とは対照的に、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ前処置マウスは健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管も示した（図７Ｂ）。図６及び７データは、試験した全ての動物の代表例である。
【０１８７】
図７Ｃは、ビヒクル又はエフェクター欠損ＭＤＥ−８抗体で前処置したマウスにおけるＩＣ曝露後のマウス肺のＨ＆Ｅ顕微鏡写真を示す。視野あたりの肺血栓を計数した。４匹のマウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣを注射した。動物＃１（図７Ｃ、棒１；対照）は、広汎性肺血栓症（視野あたり平均１８．６）を示したが、エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａで前処置された動物＃２及び＃３（図７Ｃ、棒２及び３）は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。これらの知見は、ＭＡＤＥ−８  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂ自体が肺血栓症を引き起こさなかったことも実証している。
【０１８８】
まとめると、実施例１に示すデータは、（１）天然の（エフェクター能力のある）抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ  ｍＡｂが、インフュージョンリアクションを引き起こし、血小板減少症を誘導する；（２）ＭＤＥ−８  ｍＡｂをエフェクター欠損フォーマットに改変することにより、最適なＩｇＧの注入を安全にしかつ止血的に安全にする（それは血小板減少症を誘導しない）；（３）天然ＭＤＥ−８  ｍＡｂ媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、ＩｇＧ−Ｆｃ（エフェクター）ドメインの機能に依存する；（４）エフェクター欠損ＭＤＥ−８  ＩｇＧ１及びＩｇＧ２  ｍＡｂが、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、ショック、血小板減少症及び血栓症から保護する；（５）ＣＤ３２Ａ  ＩｇＧ受容体が、これらの免疫学的にインタクトな（例えば、マウスＩｇＧ受容体の完全配列を有する）ＣＤ３２ＡトランスジェニックマウスにおけるＩＣによって媒介されるようなインフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症、及びショックを主に制御することを実証する。血栓性ＩＣに応答した、他の全てのマウスＩｇＧ−Ｆｃ受容体（マウスＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩｂ、及びＦｃガンマＲＩＩＩ）よりもヒトＣＤ３２Ａ導入遺伝子産物の支配的な効果は予期せぬ発見である。
【０１８９】
実施例２
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体ＡＴ−１０
本発明者らは、天然キメラ（マウス−ヒト）ＡＴ−１０  ＩｇＧ  ｍＡｂが、ＣＤ３２ａについてトランスジェニックマウスにおいて（例えば、ＣＤ３２Ａマウスにおいて）、インフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。ＣＤ３２ＡマウスにおけるＩｇＧ媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる。重篤なインフュージョンリアクションの観察可能な兆候は、運動抑制、痙攣、そして（まれに）死亡が含まれる。
【０１９０】
我々は本明細書において、天然ＡＴ−１０  ｍＡｂのエフェクタードメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）をエフェクター欠損ＩｇＧフォーマットに変えることにより、ＣＤ３２Ａマウスに投与したときのインフュージョンリアクションが排除されたことを示す。
【０１９１】
更に、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂが免疫複合体による曝露前に投与された場合、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症及び血栓ショックを予防した。
【０１９２】
従って、エフェクター欠損モノクローナルＡＴ−１０抗体は、任意のＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を処置するための天然ＡＴ−１０抗体の代わりに使用され得る。理由は、エフェクター欠損ＡＴ−１０抗体が天然ＡＴ−１０  ｍＡｂで観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂは、予防的又は治療的に与えられた場合に、免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び／又は予防するために使用され得る。
【０１９３】
材料及び方法
ＡＴ−１０  ｍＡｂのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体（それぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ）を（実施例１のように）ＣＤ３２Ａマウスに静脈内（尾静脈）注射した。注射（１００マイクログラム）後、マウスをインフュージョンリアクションの評価のために３０分間モニターした。ＡＴ−１０  ｍＡｂ注射の前及び３０分後に、血液を（後眼窩から）採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。３時間後、幾つかの動物に免疫複合体（ＩＣ１、実施例１のように、２００マイクログラム）を注射し、注射の３０分後に血液を採取した。この採取した血液から血小板を再び計数した。ＩＣの注射から３０分後に肺を採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
【０１９４】
結果
エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂは、エフェクター能力のあるＡＴ−１０抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、天然キメラＡＴ−１０ｍＡｂは、血小板減少症によって特徴付けられるインフュージョンリアクションを引き起こす（図８、棒１）。特に、これらのマウスは低体温を有していなかった（データ非表示）。エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（図８、カラム２）（配列番号２２のアミノ酸を配列番号１６のアミノ酸とともに含む抗体）を天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１の代わりに投与したときに血小板減少症が取り除かれた。
【０１９５】
天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１の静脈内注射の前（図９Ａ）及び後（図９Ｂ）のＣＤ３２Ａマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、低体温を有しないにもかかわらず。重篤な血小板枯渇を示した（図９Ｂ）。重要なことに、天然キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂがエフェクター欠損にされたとき、それらはもはや循環血小板を減少させなかった（図９Ｃ［注射前］及び図９Ｄ［エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂの注射後］を比較）。従って、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂは血小板を枯渇させなかった。このデータは、ＩｇＧエフェクタードメインがＡＴ−１０  ＩｇＧ誘発性血小板減少症の原因であることを実証している。
【０１９６】
これらの実験は、ＩｇＧ１フォーマットの天然ＡＴ−１０  ｍＡｂは低体温症を引き起こすことができなかったが（データ非表示）、重篤な血小板枯渇を引き起こしたため、血小板減少症では血小板数の減少は温度低下とは無関係であり、この場合温度低下よりもインフュージョンリアクションのより敏感な指標であることを実証している。重要なことに、エフェクター欠損ＡＴ−１０ｍＡｂは、エフェクター能力のあるカウンターパートと同様に、血小板を枯渇させなかった（すなわち、血小板減少症を引き起こす）。
【０１９７】
図８及び９に示す結果は、天然ＡＴ−１０  ＩｇＧ  ｍＡｂのエフェクター領域がＣＤ３２Ａマウスにおいてインフュージョンリアクションを媒介し、そのようなインフュージョンリアクションがＩｇＧ−Ｆｃ領域を改変することによって排除されることを実証する。従って、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に効率的に結合する抗ＣＤ３２ａ抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。
【０１９８】
エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂは、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂがＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することができることが実証された（図１０）。免疫複合体曝露の３時間前に、マウスをＰＢＳビヒクル又はエフェクター欠損ＡＴ−１０ｍＡｂ（ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ）（配列番号２２のアミノ酸を配列番号１６のアミノ酸とともに含む抗体）で処置した。免疫複合体（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ（実施例１のように）；２００マイクログラム）を静脈内注射し、ＩＣ曝露の３０分後に全血を採取した。この採取した血液から血小板を計数した。
【０１９９】
図１０は、ビヒクル又はエフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ抗体の何れかで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩＣ注射後の循環血小板の減少（％）を示す棒グラフを示す。ビヒクル（ＰＢＳ）で前処理したＣＤ３２Ａマウスは、著しく血小板減少性になったが（図１０のカラム１）、一方エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（図１０のカラム２及び３）で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒは、免疫複合体誘発性血小板減少症からマウスを保護した（図１０、対照のカラム１と比較してカラム２及び３）。
【０２００】
図１１は、上記のようにビヒクル又はエフェクター欠損ＡＴ−１０抗体の何れかで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩＣ注射後の循環血小板のフローサイトメトリー分析を示す。図１１Ａは、ビヒクルを投与されたマウスからの血小板枯渇を示す。図１１Ｂは、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置された動物は、ＩＣ注射に応答して血小板減少症を経験しなかったことを示す。更に、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒの前処置は、媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候からＣＤ３２Ａマウスを完全に保護した（キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ処置動物は、ＩＣ注射による影響を受けなかったようにみえたが、一方ビヒクル処置対照は、ショックと一致して、運動障害、猫背の姿勢、浅い急速な呼吸の徴候を示した。
【０２０１】
エフェクター欠損ＡＴ−１０抗体は、免疫複合体（ＩＣ）によって引き起こされる肺血栓症からＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを保護する。
マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）又はエフェクター欠損ＡＴ−１０ｍＡｂ（配列番号１６のアミノ酸とともに配列番号２２のアミノ酸を含む抗体）で前処理した。３時間後、マウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ（実施例１と同様；２００マイクログラム）を曝露した。３０分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図１２Ａは、ＩＣ曝露の３時間前にビヒクルで前処置されたマウスからの代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓（＊）がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置されたマウスは、これらのマウスが免疫学的にインタクトである（すなわち、ヒトＣＤ３２Ａに加えて正常なマウスＩｇＧ受容体の完全なレパートリーを有する）にもかかわらず、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した（図１２Ｂ）。エフェクター欠損ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ前処置マウスはまた、対照（ビヒクル処置）マウス（図１２Ａ）と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した（図１２Ｂ）。これらの結果は、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂがＩＣ誘発性血栓症から保護することができることを示している。
【０２０２】
図１２Ｃは、上記のようにビヒクル（対照）又はエフェクター欠損キメラＡＴ−１０抗体で前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩＣ注射後のマウス肺のＨ＆Ｅ顕微鏡写真を示す（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）。動物＃１（図１２Ｃ、棒１；対照）は、広汎性肺血栓症（視野あたり平均１７．６の血餅）を示したが、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０ヒトＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒで前処置された動物＃２及び＃３（図１２Ｃ、棒２及び３）は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。
【０２０３】
ヒト化エフェクター欠損ＡＴ−１０  ｍＡｂ。
エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（「ｈＡＴ−１０」）を作製し、試験した（配列番号２４のアミノ酸を配列番号２０のアミノ酸とともに含む抗体）。図１３Ａに示すように、ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（１１６μｇ）をＣＤ３２Ａマウスに投与し、マウスの中核体温を経時的に評価した。ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂは、低体温（インフュージョンリアクションの指標）を引き起こさなかった。低体温を示さないことに加えて、これらの動物は、インフュージョンリアクションを有する他の徴候を示さなかった。図１３Ｂは、ＣＤ３２Ａマウス由来の血小板をｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ注射（１１６マイクログラム）の前後で評価した研究の結果を示す。ｈＡＴ−１０は循環血小板数に影響を及ぼさなかった（図１３Ｂの右側のパネルを参照）。
【０２０４】
更に、ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒは、Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ誘発性血小板減少症からマウスを完全に保護する。ビヒクル（ＰＢＳ対照）で前処置を受けた対照動物は、ＩＣ曝露を受けてから１０分以内に無意識になり、続いて重篤なショックと一致する徴候を示した。対照的に、ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒで前処置されたマウスは、ＩＣ曝露によって影響を受けなかったようであった（データ非表示）。ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ前処置はまた、ＣＤ３２Ａマウスを血小板減少症から保護した（図１３Ｃ左パネル（ビヒクル処置群における血小板喪失を示す）及び図１３Ｃ右パネル（ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ処置動物における血小板喪失を示さない）を比較されたい）。
【０２０５】
最後に、ヒト化エフェクター欠損ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ）抗体は、マウスを免疫複合体誘導性肺血栓症から保護した。ＡＴ−１０キメラ抗体で観察されるように（図１２）、ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒでの前処置は、ＩＣ曝露後のＣＤ３２Ａマウスにおける肺血栓症を完全に予防した（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ；実施例１と同様、２００マイクログラム）。図１３Ｄは、対照処置マウスの肺における有意な血栓及びｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒ処置マウスにおける血栓のほぼ完全な欠如を示す。ｈＡＴ−１０  Ｅ２６９Ｒで前処置したマウスにおける血栓の欠如と比較して、対照処置マウスにおける広汎性肺血栓症（視野あたり平均２４．４の血餅を示す）（図１３Ｆ）図１３Ｅも参照。
【０２０６】
まとめると、実施例２に示すデータは、（１）天然の（エフェクター能力のある）抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ  ｍＡｂが、血小板減少症によって特徴付けられるインフュージョンリアクションを引き起こす；（２）ＡＴ−１０  ｍＡｂをエフェクター欠損に改変することにより、ＡＴ−１０の注入を安全にしかつ止血的に安全にする（それは血小板減少症を誘導しない）；（３）天然（エフェクター能力のある）ＡＴ−１０抗体媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、ＩｇＧ−Ｆｃ（エフェクター）ドメインの機能に依存する；（４）エフェクター欠損ＡＴ−１０  ＩｇＧ  ｍＡｂがＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、血小板減少症及び血栓症から保護する；（５）ＣＤ３２Ａ  ＩｇＧ受容体が、これらの免疫学的にインタクトなＣＤ３２ＡマウスにおけるＩＣによって媒介されるようなインフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症、及びショックを主に制御することを実証する。
【０２０７】
実施例３
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体ＩＶ．３
本発明者らは、天然キメラＩＶ．３  ｍＡｂが、その抗原のトランスジェニックマウス（すなわち、ＣＤ３２Ａマウス）においてインフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。ＣＤ３２ＡマウスにおけるＩｇＧ媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる；重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動障害、痙攣、意識の明らかな喪失、（まれに）死亡も含まれる。
【０２０８】
我々は本明細書において、キメラＩＶ．３のエフェクタードメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）をエフェクター欠損ＩｇＧフォーマットに変えることにより、ＣＤ３２Ａマウスに投与後のインフュージョンリアクションが排除されたことを示す。
【０２０９】
更に、エフェクター欠損ＩＶ．３  ｍＡｂが免疫複合体による曝露前に被験体に提供された場合、エフェクター欠損ＩＶ．３  ｍＡｂは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症及び血栓ショックを予防した。
【０２１０】
従って、エフェクター欠損モノクローナルＩＶ．３抗体は、任意のＣＤ３２ａ媒介性疾患又は障害を処置するための天然ＩＶ．３抗体の代わりに使用されるべきである。理由は、エフェクター欠損ＩＶ．３抗体が天然ＩＶ．３  ｍＡｂで観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、エフェクター欠損ＩＶ．３は、予防的又は治療的に与えられた場合に、免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び／又は予防するために使用され得る。
【０２１１】
材料及び方法
この一連の実験において、キメラＩＶ．３  ｍＡｂのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体（それぞれヒトＩｇＧ２及びヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ）を（実施例１のように）ヒトＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスに静脈内（尾静脈）注射した。注射（１００マイクログラム）後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために３０分間モニターした。ＩＶ．３  ｍＡｂ注射の前及び３０分後に、血液を（後眼窩から）採血した。次いでこの採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。３時間後、幾つかの動物に免疫複合体（ＩＣ１、実施例１のように、２００マイクログラム）を注射し、その後（３０分）血小板を再び計数した。次いで肺を採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
【０２１２】
結果
エフェクター欠損ＩＶ．３  ｍＡｂは、エフェクター能力のあるＩＶ．３抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
我々は、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、エフェクター能力のあるキメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  ｍＡｂが、低体温を伴わない血小板減少症を特徴とする用量依存的なインフュージョンリアクションを引き起こすことを発見した。図１４は、天然ヒトＩｇＧ２フォーマットにおけるキメラＩＶ．３の静脈内注射後、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスが著しく血小板減少性になったことを示す（図１４Ａ、黒の棒）。この血小板減少症は、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂ（配列番号５１のアミノ酸を配列番号４５のアミノ酸とともに含む抗体）を天然キメラＩＶ．３の代わりに投与した場合に、大部分が取り除かれた（図１４Ａ、白の棒）。図１４Ｂは、天然キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２もそのエフェクター欠損（ＩＶ．３  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ）フォーマットもＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスにおいて低体温を引き起こさなかったことを示す。
【０２１３】
これらの結果は、血小板数の減少は、インビボで血小板と相互作用する抗体へのインフュージョンリアクションの指標として、中核体温低下とは無関係であり、この場合、中核体温低下よりも敏感であることを再び示唆している。
【０２１４】
ヒトＩｇＧ２における天然キメラＩＶ．３の静脈内注射の前（図１５Ａ）及び後（図１５Ｂ）のＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した（図１５Ｂ）。重要なことに、天然キメラＩＶ．３  ＩｇＧ２  ｍＡｂがエフェクター欠損にされたとき、それはもはや循環血小板を減少させなかった（図１５Ｃ［注射前］及び図１５Ｄ［エフェクター欠損キメラＩＶ．３  ｍＡｂの注射後］を比較）。従って、エフェクター欠損ＩＶ．３  ｍＡｂは血小板を枯渇させなかった（図１５Ｄ）。このデータは、ＩｇＧエフェクタードメインがＩＶ．３  ＩｇＧ誘発性血小板減少症の原因であることを実証している。
【０２１５】
図１４及び１５に示す結果は、天然ＩＶ．３  ＩｇＧ  ｍＡｂのエフェクタードメインがＣＤ３２Ａマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こし、そのようなインフュージョンリアクションがＩｇＧ−Ｆｃドメインを改変することによって排除されることを実証する。従って、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に効率的に結合する抗ＣＤ３２ａ抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。ＩＶ．３  ｍＡｂをエフェクター欠損にすることはまた、循環血液から血小板を除去する抗体の能力を抑止し、そのようなクリアランスが、ＩＶ．３の場合、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウス血小板の表面上に固定化されているＩｇＧ−Ｆｃドメインによっても媒介されていることを示している。
【０２１６】
エフェクター欠損ＩＶ．３  ｍＡｂは、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損キメラＩＶ．３  ｍＡｂは、ＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することが決定された。免疫複合体曝露の３時間前に、ＣＤ３２ＡトランスジェニックマウスをＰＢＳビヒクル又は１００マイクログラムの代表的なエフェクター欠損キメラＩＶ．３  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（配列番号５１のアミノ酸を配列番号４５のアミノ酸とともに含む抗体）で前処置した。免疫複合体（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ、実施例１のように、２００マイクログラム）をマウスに曝露した３０分後に全血を採取した。図１６Ａは、ビヒクルを投与されたマウスからの全血試料中の血小板枯渇を示す。図１６Ｂは、キメラＩＶ．３  ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａで前処置された動物は、ＩＣに応答して血小板減少症を経験しなかったことを示す。
【０２１７】
図１７は、上記のようにビヒクル又はエフェクター欠損キメラＩＶ．３抗体の何れかで前処置したＣＤ３２ＡマウスへのＩＣ注射後（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ、実施例１のように、２００マイクログラム）の循環血小板の減少（％）を示す棒グラフを示す。ビヒクル（ＰＢＳ）で前処理したＣＤ３２Ａマウスは、著しく血小板減少性になったが（図１７、棒１）、一方エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（図１７、棒２、３及び４）で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。従って、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａは、マウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護した（図１７）。
【０２１８】
エフェクターキメラ欠損ＩＶ．３抗体は、免疫複合体（ＩＣ）によって引き起こされる肺血栓症からＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを保護する。
この実験では、ＣＤ３２Ａマウスをビヒクル又は１００マイクログラムのエフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂ（配列番号４５とともに配列番号５１）で前処置した。３時間後、前処置したマウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ（実施例１と同様；２００マイクログラム）を曝露した。３０分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図１８Ａは、ＩＣ曝露の３時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのＨ＆Ｅ染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓（＊）がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した（図１８Ｂ）。キメラＩＶ．３  ＩｇＧ２ヒトＮ２９７Ａ前処置マウスはまた、異常でかつ閉塞した血管を呈したビヒクル処置マウス（図１８Ａ）と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した（図１８Ｂ）。特に、これらのマウスは免疫学的にインタクトであり（天然に存在するマウスＩｇＧ−Ｆｃ受容体の完全な配列を有する）、ＩＣ誘発性血小板減少症、血栓症及びショックにおけるＣＤ３２ａの優位性を実証した。
【０２１９】
図１８Ｃにおいて、ＩＣ曝露後のマウス肺のＨ＆Ｅ顕微鏡検査によって、１０の視野当たりの平均肺血栓数を決定した。上記のように４匹のマウスにＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣを注射した。動物＃１（ＰＢＳ前処理対照）は、広汎性肺血栓症（視野あたり平均１７．６の血餅）を示したが、エフェクター欠損キメラＩＶ．３ヒトＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａで前処置された動物＃２、＃３、及び＃４は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。
【０２２０】
まとめると、実施例３に示すデータは、（１）天然キメラＩＶ．３抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧ２  ｍＡｂが、インフュージョンリアクションを引き起こし、血小板減少症を誘導する；（２）キメラＡＴ−１０  ｍＡｂをエフェクター欠損フォーマットに改変することにより、キメラＩＶ．３の注入を安全にしかつ止血的に安全にする（それは血小板減少症を誘導しない）；（３）ＩＶ．３媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、ＩｇＧ−Ｆｃ（エフェクター）ドメインの機能に依存する；（４）エフェクター欠損キメラＩＶ．３  ＩｇＧ  ｍＡｂがＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症及びショックから保護することを実証する。
【０２２１】
実施例４
抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは、ＣＤ３２ａ媒介性免疫複合体誘発ヒト血小板凝集及び脱顆粒を強力に阻害する。
【０２２２】
この実施例では、インビトロでの免疫複合体誘発性ヒト血小板凝集及び脱顆粒を分析して、抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの効力及び有効性を評価した。
方法
【０２２３】
血小板活性化免疫複合体（ＩＣ）を、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４とも呼ばれる）、ヒト血小板因子４（ｈＰＦ４）、ヒトβ２−糖タンパク質Ｉ（β２−ＧＰＩ）、又はＴＮＦα抗体とそれらのそれぞれのリガンドと典型的には平衡化学量論（１００−１０００ｎＭ）で組み合わせることにより調製した。以下の型の免疫複合体を試験した：（１）Ｍ９０抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋ＣＤ４０Ｌ；（２）Ｍ９１抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋ＣＤ４０Ｌ；（３）Ｍ９０抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋Ｍ９１抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋ＣＤ４０Ｌ（ポリクローナル免疫複合体）；（４）抗ｈＰＦ４  ｍＡｂ＋ｈＰＦ４＋０．１Ｕ／ｍｌヘパリン（ＨＩＴ様ＩＣ）；（５）ポリクローナル抗ベータ２−ＧＰＩ＋ベータ２−ＧＰＩ（ＡＰＳ様ＩＣ）；（６）インフリキシマブ＋ＴＮＦアルファ（治療用ｍＡｂ様ＩＣ）；（７）アダリムマブ＋ＴＮＦアルファ（治療用ｍＡｂ様ＩＣ）；（８）ヤギＦ（ａｂ’）２−抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２＋インフリキシマブ（抗治療用抗体ＩＣ活性を模倣するため）。
【０２２４】
単離された血小板は、以下のように光透過凝集測定法を介して評価された。インフォームド・コンセントに従って健康なヒトドナー（ｎ＝１０）から血小板を得て、洗浄し、アッセイ緩衝液に懸濁させた。血小板を凝集計のキュベットに入れ、安定したベースラインが達成されるまで３７℃でインキュベートした。
【０２２５】
抗ＣＤ３２ａ抗体又は生理食塩水を、血小板活性化免疫複合体の添加の５−１０分前にキュベットに添加した。免疫複合体の添加後、凝集痕跡を少なくとも５分間モニターした。ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが免疫複合体誘発性凝集を防止した場合、血小板の凝集能力は、標準アゴニストコラーゲンの添加（７マイクログラム／ミリリットル最終濃度）によって確認された。
結果
【０２２６】
図１９において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣは、洗浄されたヒト血小板上のＣＤ３２ａを活性化し、凝集をもたらし、対照ｍＡｂ（組換えウサギＩｇＧ）によって遮断されなかった。図１９（ライン１）。血小板凝集は、マウスＩＶ．３ｍＩｇＧ２ｂ（図１９、ライン２）及び天然キメラＩＶ．３ｈＩｇＧ１（図１９、ライン３）によって完全にブロックされ、それらは同様の効力（＜５ｎＭが必要）を呈する。このデータは、クローン化天然キメラＩＶ．３  ｈＩｇＧ１が、親マウスモノクローナル抗体のものに匹敵するＣＤ３２ａ遮断活性を有することを実証する。
【０２２７】
図２０において、２５０ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣは、７ｎＭアグリコシル化マウスＩＶ．３ｍＩｇＧ２ｂによって遮断された（図２０、ライン２）ＣＤ３２ａ依存性凝集を強力に誘導した（図２０、ライン１）。これらの結果は、抗体エフェクター欠損をもたらすマウスＩＶ．３ｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂの「Ｆｃ」エフェクタードメインの脱グリコシル化は、血小板ＣＤ３２ａの遮断における効力（すなわち、そのＦａｂ依存活性）を有意に変化させないことを示唆する。
【０２２８】
図２１において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  Ｉｃは、天然キメラＩＶ．３  ｈＩｇＧ２によって遮断された（図２１、ライン２、３、４）凝集を誘導した（図２１、ライン１）。５００ｎＭのＭ９１＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣで試験した第２のドナー由来の血小板の凝集もまた、天然キメラＩＶ．３  ｈＩｇＧ２によって完全に阻害された（データ非表示）。
【０２２９】
図２２において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ誘発性凝集（図２２、ライン１）は３．３ｎＭ（図２２、ライン２）及び１．７ｎＭ（図２２、ライン３）のエフェクター欠損キメラＩＶ．３  ｈＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ  ｍＡｂ（配列番号４５とともに配列番号５１）によって遮断される。１９分で添加したコラーゲン（ここと以下で＊で示す）は、抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂで処置した血小板が凝集能力を保持していることを実証した。
【０２３０】
図２３において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ誘発性凝集（図２３、ライン１）は１３ｎＭのエフェクター欠損キメラＡＴ−１０ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（図２３、ライン２）ｍＡｂ（配列番号１６とともに配列番号２２）によって遮断される。また、天然キメラＡＴ−１０  ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、及びエフェクター欠損キメラｈＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａフォーマット（配列番号１８とともに配列番号２２）は、他のドナーからの血小板で同様の結果を示した（データ非表示）。
【０２３１】
図２４において、Ｍ９０＋Ｍ９１及びＣＤ４０Ｌの７００ｎＭ混合物からなるＩＣは、血小板凝集を引き起こした（図２４、ライン１）。このＩＣの活性は、３ｎＭ未満のエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６９）によって完全に遮断された（図２４、ライン２）。１５分で添加されたコラーゲンは、凝集能力を示した（図２４、ライン２＊）。天然ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びエフェクター欠損ＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（配列番号６７とともに配列番号６９）は同様にＩＣ誘発性凝集を遮断した（データ非表示）。
【０２３２】
図２５において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ誘発性凝集（図２５、ライン１）は、３ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図２５、ライン２）によって及び３ｎＭのマウスＩＶ．３  ｍＩｇＧ２ｂ（図２５、ライン３）ｍＡｂによって同様に阻害された。エフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．２  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（配列番号４９とともに配列番号５３）の同一濃度（３ｎＭ）もこのＩＣの活性を阻害した（データ非表示）。このデータは、ヒト化ＩＶ．３  ｍＡｂとマウスＩＶ．３  ｍＡｂとの間の同様の効力を示す。
【０２３３】
図２６において、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣ誘発性凝集（図２６、ライン１）は、２ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図２６、ライン２）によって阻害されなかったが、２ｎＭのマウスＩＶ．３  ｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（図２６、ライン３）によって阻害された。１０．５分で添加されたコラーゲンは、血小板凝集能力を実証した。
【０２３４】
図２７において、Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ（５００ｎＭ）ＩＣ誘発性凝集（図２７、ライン１）は、６ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図２７、ライン２）によって遮断された。コラーゲン（＊）が１１分で添加され（図２７、ライン２）、血小板凝集能力を実証した。
【０２３５】
図２８において、Ｍ９０＋Ｍ９１及びＣＤ４０Ｌの１０００ｎＭ混合物からなるＩＣは、血小板凝集を引き起こした（図２８、ライン１）。このＩＣの活性は、２５ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図２８、ライン２）によって及び２５ｎＭのマウスＩＶ．３  ｍＩｇＧ２ｂ（図２８、ライン３）ｍＡｂによって同様に阻害された。陰性対照（ＩＣを添加しなかった；図２８、ライン４）は凝集しなかった。
【０２３６】
図２９において、２５０ｎＭのｈＰＦ４＋抗ｈＰＦ４＋ヘパリン（０．１単位／ミリリットル）、ＨＩＴ様ＩＣ（図２９、ライン１）は、４０ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図２９、ライン２）によって完全に遮断された。コラーゲンを１０．５分で添加した（図２９、ライン２）。エフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．２  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（配列番号４９とともに配列番号５３）の同一濃度（３ｎＭ）もこのＩＣの活性を阻害した（データ非表示）。
【０２３７】
図３０において、５００ｎＭの抗ヒトベータ２ＧＰＩポリクローナル抗体＋１２５ｎＭのヒトベータ２ＧＰＩＩＣ（ＡＰＳ様ＩＣ）は、強い血小板凝集を誘導し（図３０、ライン１）、それは３３ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ  ｍＡｂ（配列番号４７とともに配列番号５３、図３０、ライン２）及び５０ｎＭのエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６９、図３０、ライン３）の両方によって遮断された。
【０２３８】
図３１において、Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ（５００ｎＭ）ＩＣ誘発性凝集（図３１、ライン１）は、１５ｎＭのエフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号２０とともに配列番号２４、図３１、ライン２）によって阻害された。Ｆｃドメインを欠いているヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のＦ（ａｂ’）２断片３７５ｎＭの添加（＃で示される；１６分で添加された）は、血小板凝集を引き起こし、従って、エフェクター欠損ヒト化ＡＴ−１０  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒの血小板表面局在ならびに凝集能力を実証する。
【０２３９】
まとめると、図１９−３１に示す結果は、幾つかの異なる型の免疫複合体（ＩＣ）がＣＤ３２ａ依存的に血小板凝集を誘導することができることを示している。これらのＩＣは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソタイプサブクラスを含む、エフェクター能力のあるフォーマット及びエフェクター欠損フォーマットの両方において、キメラ又はヒト化ＩＶ．３によって、キメラ又はヒト化ＡＴ−１０によって、及びＭＤＥ−８によって強力に遮断される。ヒト化ＡＴ−１０及びヒト化ＩＶ．３  ｍＡｂは、それらの親マウスｍＡｂに匹敵するＣＤ３２ａ遮断活性を示したので、これらの以前に記載されていない新規なｍＡｂは、免疫複合体がＣＤ３２ａを介して病理学的役割を果たすヒト疾患の治療に有用であり得る。
【０２４０】
まとめて考えた場合、インビボ（マウス）及びインビトロ（凝集、脱顆粒）データはまた、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２フォーマットのいずれであろうと、キメラ、ヒト化、又は完全ヒトであるかどうかに関わらず、ＩＶ．３、ＡＴ−１０、及びＭＤＥ−８のエフェクター欠損フォーマットは、ＣＤ３２ａの強力な遮断を提供しながら安全なインビボ投与プロファイルを有し、従ってＩＣ又は固定化ＩｇＧによって誘導されるＣＤ３２ａの活性化を妨げることが期待できる。
【０２４１】
組み合わせたＡＴ−１０、ＩＶ．３及びＭＤＥ−８  ｍＡｂはＣＤ３２ａを活性化しない。
我々は次に、本明細書に記載のエフェクター欠損キメラ、ヒト化及びヒト抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが、組み合わせた場合に、ＣＤ３２ａを活性化することができるかどうかを検討した（すなわち、受容体を直接多量体化又はクラスター化することにより）。この目的のために、我々は、全てがエフェクター欠損ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒフォーマットである、２ｎＭのヒト化ＡＴ−１０（配列番号２０とともに配列番号２４）、１５０ｎＭのヒト化ＩＶ．３．１（配列番号４７ととも配列番号５３）、及び１５０ｎＭのヒトＭＤＥ−８（配列番号６５とともに配列番号６９）を組み合わせ、これらの抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせを洗浄したヒト血小板に暴露した。図３２は、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣは強力な血小板凝集を誘導したが（図３２、ライン１）、組み合わせた抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは凝集を生じなかった（図３２、ライン２）ことを示す。１８分で添加されたコラーゲンは凝集能力を実証した。図３３は、３００ｎＭのエフェクター欠損キメラＡＴ−１０ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号１６とともに配列番号２２）、３００ｎＭエフェクター欠損キメラＩＶ．３ｈＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（配列番号４５とともに配列番号５１）及び３００ｎＭのエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６５）の組み合わせもまた、血小板凝集を誘導することができなかったが、コラーゲン（＊）は成功したことを示す。
【０２４２】
次に、ＩＣ３２ａがＩＣによってクラスター化される場合に起こる、血小板脱顆粒を誘導するための組み合わせたＣＤ３２ａ  ｍＡｂの能力を調べた。我々はまた、ＴＮＦアルファと複合体を形成した治療用ＴＮＦアルファ抗体（１００ｎＭ）によって引き起こされる血小板脱顆粒を防止するためのこれらの抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの能力を評価した。この目的のために、我々は、マウスＩＶ．３ｍＩｇＧ２ｂ、エフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３）、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０  ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号１６とともに配列番号２２）、及びエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６９）、並びにこれらの４つのｍＡｂの組み合わせ（全て１００ｎＭで）を、セロトニン放出アッセイ（図３４）における脱顆粒によって測定される、洗浄されたヒト血小板を活性化するそれらの能力について試験した。結果は、試験した全ての抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂがＴＮＦアルファ−免疫複合体誘発性血小板脱顆粒を防止し、全てのｍＡｂの組み合わせが血小板の脱顆粒に失敗したことを示した。図３４。
【０２４３】
更に、全てがエフェクター欠損ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒフォーマットである、２５ｎＭのヒト化ＩＶ．３．１（配列番号４７とともに配列番号５３）、９０ｎＭのヒト化ＡＴ−１０（配列番号２０ととも配列番号２４）、及び７５ｎＭのヒトＭＤＥ−８（配列番号６５とともに配列番号６９）の組み合わせをもまた同様に試験し、同じ結果であった（すなわち、ＣＤ３２ａの活性化なし、データ非表示）。
【０２４４】
試験したｍＡｂの各々は、インフリキシマブ及びアダリムマブ抗ＴＮＦアルファＩＣ誘発性血小板活性化を遮断した。４つの抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（マウスＩＶ．３、ヒト化ＩＶ．３、キメラＡＴ−１０及びヒトＭＤＥ−８）は、血小板活性化を引き起こすことができなかった（図３４）。
【０２４５】
まとめると、図３２−３４に示す結果は、試験されたｍＡｂが相乗的にＣＤ３２ａを活性化点にクラスター化しない点で適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であり、これらのｍＡｂが相乗的活性化なしに患者に潜在的に送達され得ることを示唆している。更に、これらのｍＡｂの適合性は、抗ＣＤ３２ａ療法のための進行性の治療経過を提供し、ここでは第１の治療用抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂに対する免疫反応性を発症する患者には、慢性免疫複合体媒介性疾患の長期治療に適合する追跡治療薬が提供される。
【０２４６】
免疫複合体媒介性障害を有する患者における治療に使用されるヒト化抗体及びヒト抗体は、免疫原性が低いと予想されるが、その証拠は、それにもかかわらず、多くのそのような患者は、治療用抗体（例えば、抗治療用抗体抗体又はＡＴＡ）に対する免疫反応を発症することを示唆する。これらの宿主応答抗体は、ＣＤ３２ａを活性化する免疫複合体を形成し得る；しかしながら、本明細書に記載のエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは、これらのＡＴＡ免疫複合体から患者を保護する際に使用する候補である。
【０２４７】
この根拠に従って、我々は、抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが、インフルキシマブ及びヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２抗体のＦ（ａｂ’）２断片から形成されたＩＣによって誘導される血小板脱顆粒を防止する能力を試験し、ここでこのようなＩＣの唯一の機能的Ｆｃドメインは、治療用ｍＡｂであるインフリキシマブのものである。図３５は、インフリキシマブ＋ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＩＣが血小板脱顆粒を誘導することを示す（図３５、第１カラム）。このＩＣの活性は、マウスＩＶ．３ｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（図３５、第２カラム）によって、エフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６９、図３５、第３カラム）によって、エフェクター欠損キメラＡＴ−１０  ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号１６とともに配列番号２２、図３５、第４カラム）によって、及びエフェクター欠損ヒト化ＩＶ．３．１  ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号４７とともに配列番号５３、図３５、第５カラム）によって遮断された。これらの結果は、ＣＤ３２ａの遮断は、治療用ｍＡｂ、インフリキシマブをクラスター化する抗体から形成されるＩＣによって血小板の活性化を防止することができ、本発明のエフェクター欠損ＣＤ３２ａ抗体は、ＩＣによる、特に治療用非ＣＤ３２ａモノクローナル抗体のクラスターから形成されたＩＣによる血小板の活性化を防止する方法において有用であることを実証する。
【０２４８】
更に、そのような治療用非ＣＤ３２ａ  ｍＡｂに免疫学的に反応性である患者は、典型的には、抗ＴＮＦα療法の場合のように、同じ抗原標的を有する別の治療用ｍＡｂへと移行されるか、又は「切り替えられ」、ここで反応性患者は、例えばインフリキシマブからアダリムマブに切り替えることができる。この懸念は、残留する以前の治療用抗体がもはや存在しないことを保証するために、長い治療間隙を必要とする可能性がある。しかし、我々のデータは、免疫反応性レシピエント（すなわち、投与された非抗ＣＤ３２ａ抗体に対する免疫反応を有する患者）は、治療間隙のない本明細書に記載のエフェクター欠損ＣＤ３２ａ抗体に安全に切り替えることができ、相乗的な血小板活性化の心配なしに、本明細書に記載されているように、複数のエフェクター欠損ＣＤ３２ａ抗体で患者を治療することもできることを示している。
【０２４９】
この根拠に従って、３種の抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの組み合わせをＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスに注射し、可能な相乗的インフュージョンリアクションの尺度として中核体温及び血小板数を調べた。エフェクター欠損キメラＡＴ−１０  ｈＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号１６とともに配列番号２２）、エフェクター欠損キメラＩＶ．３  ｈＩｇＧ２  Ｎ２９７Ａ（配列番号５１とともに配列番号４５）、及びエフェクター欠損ヒトＭＤＥ−８  ＩｇＧ１  Ｅ２６９Ｒ（配列番号６５とともに配列番号６９）を予め混合し、２回のＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスに単回ボーラスとして静脈内注射した。第１の動物には５０マイクログラムの各ｍＡｂを投与した（合計１５０マイクログラムの抗ＣＤ３２ａ  ＩｇＧを注射した）。第２の動物には１００マイクログラムの各ｍＡｂを投与した（３００マイクログラムの全ＩｇＧを注射した）。各動物の血小板数（全血中）をｍＡｂ注射の前（図３６Ａ及び３６Ｃ）及び３０分後に測定した（図３６Ｂ＝５０マイクログラム×３、図３６Ｄ＝１００マイクログラム×３）。ゲートＰ１は血小板を同定する（ゲートＰ４は他の血液細胞である）。図３６Ｅは、エフェクター欠損ｍＡｂの注射後３０分間モニターしたＣＤ３２Ａトランスジェニックマウスの中核体温を示す。これらの結果は、これらのエフェクター欠損抗ＣＤ３２ａクローン（すなわち、ＩＶ．３、ＡＴ−１０、ＭＤＥ−８）を組み合わせると、ＣＤ３２ＡマウスにおいてＣＤ３２ａをクラスター化するか又は血小板減少症を誘発する能力を付与しないことを示す。
【０２５０】
まとめると、図３２−３６に示される結果は、ＩＶ．３、ＡＴ−１０、及びＭＤＥ−８の驚くべき機能的適合性を示し、組み合わされた場合、これらの抗体はインビトロ及びインビボの両方でそれらの非活性化プロファイルを保持し、例えば抗薬物抗体（ＡＴＡ）の存在下での継続的な抗ＣＤ３２ａ免疫療法のための治療戦略を提供する。
【０２５１】
実施例５
抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの更なる特徴付け。
この実施例において、我々は、明らかな内在性ＣＤ３２ａ活性化活性の欠如及び予想されるＣＤ３２ａ遮断能について、エクスビボで機能的に抗ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを確認した。我々はまた、ＩＶ．３溶液が動的光散乱にれば凝集体を含まないことを確認した。
【０２５２】
方法
インビトロヒト血小板研究のための血小板活性化免疫複合体。追加の（Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ以外の）血小板活性化ＩＣを、Ｍ９１（別のＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ、ＡＴＣＣ）、ＴＮＦ−α抗体（インフリキシマブ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、及びアダリムマブ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、それぞれのリガンドと平衡化学量論（１００−１０００ｎＭ）で組み合わせることによって調製した。全てにおいて、以下の型の免疫複合体を試験した：（１）Ｍ９０抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋ＣＤ４０Ｌ；（２）Ｍ９１抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ＋ＣＤ４０Ｌ；（３）インフリキシマブ＋ＴＮＦ−α（治療用ｍＡｂ様ＩＣ）；（４）アダリムマブ＋ＴＮＦ−α（治療用ｍＡｂ様ＩＣ）。ＴＮＦ−αは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０２５３】
抗体の動的光散乱分析。ＩＶ．３調製物及び参照抗体溶液を動的光散乱分析に供した。熱凝集したＩＶ．３は、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ．３溶液を６３℃で２０分間インキュベートすることによって調製した。抗体分子の流体力学的直径は、緑色レーザー（５３２ｎｍ）を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０  ＤＬＳシステム、及びアバランシェフォトダイオード検出器（５３２ｎｍで５０％を超える量子効率；Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で測定した。３ｍｍのＨｅｌｌｍａ  ＱＳキュベットを試料容器として使用した。ＤＴＳ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５．１０ソフトウェアを使用してデータを分析した。報告された平均分子サイズは、非負最小二乗分析法で得られた強度平均に基づくものであった。体積分布は１．４５の屈折率を有する強度分布から計算した。各試料について、３回の測定を２０秒の実行時間で行った。サイズ測定には９０°の検出角を用いた。
【０２５４】
マウス血小板表面上のＣＤ３２ａ  ｍＡｂ局在のフローサイトメトリー分析。選択ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（３５μｇ）又はＰＢＳをＦＣＧＲ２Ａマウスに静脈内注射した。
血液を注射の１０分後に後眼窩から採取し、５μｌをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と１００μｌの反応容量でインキュベート（２０分）した。次に、試料をＰＢＳで１：５に希釈し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析した。血小板をＦＳＣ対ＳＳＣプロットに基づいて同定し、５０，０００事象の蛍光を分析した。ビヒクル（ＰＢＳ）を注射した動物からの血液を対照として使用した。
【０２５５】
フローサイトメトリー及び凝集測定のためのマウス多血小板血漿及び洗浄血小板の調製。複数のＦＣＧＲ２Ａマウスから血液（１ｍｌ／マウス）を酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ、１：６比）に収集し、プールした。０．５Ｘ容量のＴｙｒｏｄｅｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて血液を希釈した［１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５．６ｍＭのデキストロース、３．３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４］。フローサイトメトリーには、プールされた血液の遠心分離（室温で血液を２３００×ｇで１０秒／ｍｌ）で得られた多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた。洗浄した血小板の調製のために、ＰＲＰをＢＳＡ被覆チューブに入れた。プロスタグランジン−Ｉ２（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終濃度３００ｎｇ／ｍｌで添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＰＲＰを遠心分離した（７４０×ｇ）。血漿除去後、ペレット化血小板を０．１％ＢＳＡ−Ｔｙｒｏｄｅｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中に３００×１０６／ｍｌの濃度で懸濁させ、光透過性血小板凝集測定法（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ；Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）を用いた血小板凝集研究に使用した。
【０２５６】
マウス血小板活性化のフローサイトメトリー分析。マウスＰＲＰをＰＢＳで希釈し、２．５×１０６個の血小板（１００μｌ中）をＩＶ．３及び組換えＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（全て３５μｇ／ｍｌで）とともにインキュベートした。対照ＩｇＧ（セツキシマブ、３５μｇ／ｍｌ）及びアラキドン酸（０．５ｍＭ）をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ及び／又は対照の添加直後に、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６２Ｐ又はアイソタイプ対照抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を血小板に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで１：５に希釈し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）で分析した。血小板をＦＳＣ対ＳＳＣプロットに基づいて同定し、５０，０００事象の蛍光を分析した。
【０２５７】
マウス血小板凝集測定。２７０μｌの洗浄したマウス血小板（３００×１０６／ｍｌ）を含む反応物（最終体積３２０μｌ）をＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（５−６０μｇ／ｍｌ）とともに１０−１５分間インキュベートした。ＰＢＳ及び無関係のＩｇＧ（セツキシマブ、６０μｇ／ｍｌ）を陰性対照として使用した。次いで、５００ｎＭのＭ９０＋ｈＣＤ４０Ｌからなる予め形成された（室温で５分間）免疫複合体の３０マイクロリットルを反応物に添加し、１０−１５分間インキュベートした。次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを含有する反応物に添加し、ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をマウスＩＶ．３を含む反応液に添加した。光伝達血小板凝集測定は、４チャンネル血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ）において３７℃で攪拌することによって行った。
【０２５８】
ヒト血小板凝集測定。健康なヒト被験者からのインフォームドコンセントに従って、ＡＣＤチューブ（１：９比）に収集した全血から血小板を得た。血液を１２０×ｇで１５分間遠心分離して、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。ＰＲＰをＢＳＡコ被覆ｙチューブに収集し、２Ｕ／ｍｌアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに室温で５分間インキュベートし、１０分間遠心分離した（７４０×ｇ）。血漿除去後、ペレット化した血小板を０．１％のＢＳＡ−Ｔｙｒｏｄｅｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、血小板凝集に使用した。２７０μｌの洗浄したヒト血小板（２５０×１０６／ｍｌ）を含む反応物（最終容量３００μｌ）をＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（０．２−２μｇ／ｍｌ）とともに１０−１５分間インキュベートした。次いで、５００ｎＭのＭ９０＋ＣＤ４０Ｌからなる予め形成された（室温で５分間）免疫複合体の３０マイクロリットルを反応物に添加し、１０−１５分間インキュベートした。幾つかの場合、６μｇ／ｍｌコラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ）を実行の最後に加えて血小板凝集性を確認した。光伝達血小板凝集測定は、４チャンネル血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ）において３７℃で攪拌することによって行った。
【０２５９】
セロトニン放出アッセイ。血小板脱顆粒を測定するためにセロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）を使用した。健康なヒト被験者からのインフォームドコンセントに従って、ＡＣＤチューブ（１：９比）に収集した全血から血小板を得た。血液を１２０×ｇで１５分間遠心分離して、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。ＰＲＰを３７℃で４５分間、［１４Ｃ］セロトニン（０．１ｍＣｉ／ｍｌ、［１４Ｃ］−５ＨＴ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートした。血小板をカルシウム及びアルブミンを含まないＴｙｒｏｄｅの緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．４２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５．６ｍＭのデキストロース、１．５Ｕ／ｍｌのアピラーゼ、ｐＨ６．２）で洗浄した。洗浄した血小板を、２ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．３）を含むアルブミン−及びアピラーゼフリー（ＡＦＴ）Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（３０μｇ／ｍｌ）及び予め形成された抗ＴＮＦ  ＩＣをＰＢＳ中で調製し、血小板に添加した。混合物を使用前に室温で５分間インキュベートした。マイクロタイタープレート中の３つの反応（１００μｌの最終容量）は、７０μｌの洗浄した血小板（３００−５００×１０６／ｍｌ）及び３０μｌのアゴニスト（すなわち、予め形成されたＩＣ）からなっていた。「バックグラウンド」反応は、ＡＦＴ緩衝液で処理した血小板からなっていたのに対して、「全取り込み」反応では、血小板が３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に可溶化された。反応は、４００ｒｐｍで振動振盪しながら室温で６０分間行った。等容積の４％ＥＤＴＡを加えることによって反応を停止させ、血小板を２１００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。放出されたセロトニンを含む上清をＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  ＬＳＣ  Ｃｏｃｋｔａｉｌシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で１：５０に希釈し、β−放射能の放出をＴｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で１分間測定した。３回の反応の平均を計算した。パーセントセロトニン放出は、（試験の平均ｃｐｍ−バックグラウンドの平均ｃｐｍ）／（全取り込みの平均ｃｐｍ−バックグラウンドの平均ｃｐｍ／１００）として計算した。
【０２６０】
結果
ＩＶ．３  ｍＡｂ調製物は多量体を含まない。マウス注射のために使用されるＩＶ．３調製物を、多量体の潜在的な存在を評価するために動的光散乱分析に供した。多量体を欠く参照試薬として、注射用医薬品グレードのモノクローナルＩｇＧ１抗体、セツキシマブ、及びラットＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を用いた。３つ全てのピークは、モノマーＩｇＧの正常範囲内に入る（Ahrer et al.Journal of Chromatography A; 2003, 89-96）。熱凝集したＩＶ３を、多量体ＩＶ３構造の陽性対照として用いた。結果を図１７に示す。
【０２６１】
エフェクター欠損組換えＣＤ３２ａ  ｍＡｂは、インビボでＦＣＧＲ２Ａマウス血小板の表面に局在する。ＦＣＧＲ２Ａマウスに、様々なエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂを注射した（３５μｇ／マウス）。血小板表面結合抗ＣＤ３２ａを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いてエクスビボで（全血で）検出した。ＰＢＳ（未処置）を注射したＦＣＧＲ２Ａマウス由来の血小板は、陰性対照として機能を果たした。図２に示す結果は、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（ｃＡＴ１０−Ｅ２６９Ｒ、ｃＡＴ１０−Ｎ２９７Ａ、ＭＤＥ８−Ｅ２６９Ｒ、及びＭＤＥ８−Ｎ２９７Ａ）が血小板に特異的に局在することを示していた。Ｅ２６９Ｒ標識はＩｇＧ１サブクラスを示す。Ｎ２９７Ａ標識はＩｇＧ２サブクラスを示す。
【０２６２】
ＩＶ．３ならびに組換えエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂは、エクスビボでＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を直接活性化しない。ＦＣＧＲ２ＡマウスからのＰＲＰを希釈してＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（３５μｇ／ｍｌ）で処理し、表面上にＣＤ６２Ｐの存在について試験した。対照ＩｇＧ及びアラキドン酸で処置した血小板は、それぞれ活性化の陰性及び陽性対照として機能を果たした。更に、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧを用いて表面結合ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ、ＭＤＥ８−Ｅ２６９Ｒをクラスター化し、それによって血小板を活性化した。図３９Ａ−Ｈに示す結果は、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂ（ＭＤＥ８−Ｅ２６９Ｒ、ＭＤＥ８−Ｎ２９７Ａ、ｃＡＴ１０−Ｅ２６９Ｒ、及びｃＡＴ１０−Ｎ２９７Ａ）は、エクスビボで明らかな内因性ＣＤ３２ａ活性化活性を欠いていたことを示していた。Ｅ２６９Ｒ標識はＩｇＧ１サブクラスを示す。Ｎ２９７Ａ標識はＩｇＧ２サブクラスを示す。
【０２６３】
ＩＶ．３ならびに組換えエフェクター欠損ＣＤ３２ａ  ｍＡｂがＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を直接凝集しないが、それらはエクスビボでＩＣ媒介性凝集を遮断し、血小板表面に特異的に結合する。ＦＣＧＲ２Ａマウスの洗浄した血小板をＣＤ３２ａ  ｍＡｂで処置した（５−６０μｇ／ｍｌ）。ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの潜在的な血小板凝集活性を検出するために、血小板凝集トレースを１０−１５分間モニターした。この間隔の後、予め形成されたＭ９０＋ＣＤ４０Ｌ  ＩＣを血小板に導入し、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂの阻害能力を評価するためにトレースを更に１０分間モニターした。実験の終わりに、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（組換えｍＡｂ及びセツキシマブについて）又はヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（ＩＶ．３について）の添加によって、平坦なトレースについて血小板の凝集能力を確認した。図４０Ａ−Ｂに示す結果は、ＣＤ３２ａ  ｍＡｂが免疫複合体による血小板ＣＤ３２ａ活性化を妨げるという結論を支持する。
【０２６４】
ＦＣＧＲ２ＡマウスへのＩＶ．３の腹腔内注射は、血小板減少症を誘導する。ＦＣＧＲ２Ａマウス（ｎ＝６、平均±ｓｄ）に、７０μｇのＩＶ．３を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＩＶ．３注射の前及び３０分後、ならびに３時間、２４時間、及び４８時間後に、（本実施例の方法の項に記載のように、眼窩後出血により回収した全血のフローサイトメトリー分析により）血小板数を決定した。最初の３０分間の期間中に、ｉ．ｐ注射されたマウスはショックの兆候を示さず、低体温にならなかった。図４１に示す結果は、ＩＶ．３（７０μｇ／マウス；ｎ＝６）の腹腔内注射は、血小板を著しく枯渇させたＦＣＧＲ２Ａマウスにおいてアナフィラキシーを誘導することができなかったことを示した。
【０２６５】
ＦＣＧＲ２ＡマウスへのＩＶ．３の静脈内注射は、肺血管において血栓塞栓症を引き起こさなかった。ＩＶ．３（７０μｇ）をＦＣＧＲ２Ａマウスに静脈内注射した。３０分後、肺を採取し、少なくとも４８時間ホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅ切片を調製し、血栓塞栓症の証拠について分析した。閉塞性血栓の欠如は、ＩＶ．３を注射された代表的なマウスの肺血管（赤血球で満たされた）において観察された（図４２Ａ−Ｃ）。肺血栓症の基準として、血栓性ＩＣ（５００ｎＭ  Ｍ９０＋ＣＤ４０Ｌ）を注射された代表的なマウスからの肺切片の画像が提供され、ここでは広汎性血栓（例えば、図４２Ｆの矢印によって示される領域）が多数の血管で観察された（図４２Ｄ−Ｆ）。従って、血栓塞栓症は、ＩＶ．３注射マウス由来のＨ＆Ｅ染色ＦＣＧＲ２Ａマウス肺切片では明らかではなかった。
【０２６６】
血小板の表面上のａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の共焦点顕微鏡画像。７０μｇのａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の注射後３０分（図４３Ａ）又は２４時間（図４３Ｂ）のＦＣＧＲ２Ａマウスから収集した血小板の表面上のａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の共焦点顕微鏡画像（１０００ｘ）。びまん性灰色染色は、血小板アクチンを表し；焦点黒色染色は、ａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８を示す（例えば、図４３Ａに矢印で示されるフォーカス）。ａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８シグナルは、４９８ｎｍでの励起と５０６ｎｍから５７９ｎｍへの発光により得られた。ファロイジンＡ５５５シグナル（拡散した灰色として表示）は、５５４ｎｍでの励起と５５９ｎｍから６３１ｎｍへの発光により得られた。５９２ｎｍレーザーを用いて誘導抑制が実施された。共焦点画像は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘシステム（１００ｘ／１．４０油性対物レンズ、ＰＬＡＰＯ）上で単一の切片として取得され、デコンボリューションされなかった。スライドは、７０μｇのａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８の注射の３０分後又は２４時間後に収集した心臓穿刺血液から調製したＰＲＰからの洗浄したＦＣＧＲ２Ａマウス血小板を用いて調製し、メタノールを含まない２％のホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に固定し、洗浄し、透過性にし、ファロイジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で対比染色し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に包埋し、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｄ  ２２ｍｍ２＃１．５Ｈ−０．１７０ｍｍ（±５μｍ）カバーガラス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｔｅｍｐｅ、ＡＺ）にマウントした。図４３Ａ−Ｂに示すように、ａｇｌｙ−ＩＶ．３Ａ４８８のＩＶ注射の３０分後及び２４時間後に収集されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８陽性血小板の共焦点画像化の結果は、血小板は循環中に残り、注射後３０分と２４時間の両方で蛍光ａｇｌｙ−ＩＶ．３を獲得し、保持したことを示した。
【０２６７】
以下の科学刊行物が全目的のためにその全体が参考として援用される：Meyer T, Robles-Carrillo L, Davila M, Brodie M, Desai H, Rivera-Amaya M, Francis JL, Amirkhosravi A., “CD32a antibodies induce thrombocytopenia and type II hypersensitivity reactions in FCGR2A mice," Blood, 2015 Nov 5;126(19):2230-8; doi:10.1182/blood-2015-04-638684; Epub 2015 Sep 22; PubMed PMID: 26396093; PubMed Central PMCID: PMC4644267。
【０２６８】
等価物
前述の明細書は、当業者が本実施態様を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施態様を詳述し、本発明者らによって考えられる最良の形態を記述する。しかしながら、上記のことがどれほど詳細に記載されていても、実施態様は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【０２６９】
本明細書で使用される「約」という用語は、明示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は、一般に、当業者が列挙された値と同等であると考えるであろう（例えば、同じ機能又は結果を有する）ある数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。幾つかの例では、「約」という用語は最も近い有効数字に四捨五入された数値を含むことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｈ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｆ】
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【図１３Ｇ−Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３６Ｅ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図３９Ｇ】
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【図３９Ｈ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017537103.tif 000083
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