(57)【要約】本発明は、細胞にＲＮＡを送達するための多層ナノ粒子、並びにそれを製造及び使用するための方法に関する。多層ナノ粒子は、正電荷ポリマー層及び負電荷ポリマー層を交互にコーティングしたコアナノ粒子を含み、負電荷ポリマー層の少なくとも１つは、ＲＮＡである。
2017500312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを細胞に送達するための多層ナノ粒子であって、正電荷ポリマー層及び負電荷ポリマー層を交互にコーティングしたコアナノ粒子を含み、層の数が２以上であり、前記負電荷ポリマー層の少なくとも１つが、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる多層ナノ粒子。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、リボザイム、ＲＮＡｉ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の多層ナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子コアが、生体適合性又は生分解性である、請求項１又は２に記載の多層ナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子コアが、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、炭酸カルシウム、金、ポリスチレンラテックスからなる群から選択される物質、好ましくはヒドロキシアパタイトを含むか又は前記物質からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項５】
前記ナノ粒子コアが、リポソームを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項６】
前記ナノ粒子コアが、負に荷電されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項７】
前記多層ナノ粒子が、３〜１０層を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項８】
前記ポリマー層の最外側層が、正荷電ポリマー層である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項９】
前記ポリマー層の最内側層が、正荷電ポリマー層である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１０】
前記多層が、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる少なくとも２つの負荷電ポリマー層を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１１】
全ての負荷電ポリマー層がＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる、請求項１０に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１２】
前記ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる負荷電ポリマー層、又は前記ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる負荷電ポリマー層の各々が、２つの正荷電ポリマー層の間に挟まれている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１３】
前記正荷電ポリマーが、ポリカチオンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１４】
前記負荷電ポリマーが、ポリアニオンである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１５】
前記正荷電ポリマーが、ポリ（Ｌ−アルギニン）を含むか又はポリ（Ｌ−アルギニン）からなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１６】
前記負荷電ポリマーが、硫酸デキストランを含むか又は硫酸デキストランからなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１７】
最外側層として標的指向性ペプチド又は標的指向性タンパク質を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１８】
前記標的指向性ペプチド又は標的指向性タンパク質が、ＴＡＴペプチド、エンドサイトーシス媒介性両親媒性ペプチド、及び葉酸受容体指向性部分から選択される、請求項１７に記載の多層ナノ粒子。
【請求項１９】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡであり、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）遺伝子を標的とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項２０】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１に示されているヌクレオチドセンス配列及び配列番号２に示されているヌクレオチドアンチセンス配列を有する、請求項１９に記載の多層ナノ粒子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ．ナノ粒子コアを準備するステップ、
ｂ．前記ナノ粒子コアを正荷電ポリマー又は負荷電ポリマーと接触させて、前記ナノ粒子コア上に第１のポリマー層を形成させるステップ、
ｃ．ステップｂ）のコーティングされたナノ粒子を、ステップｂ）で使用したものと反対に荷電されているポリマーと接触させて、前記ナノ粒子上に第２のポリマー層を形成させるステップ、
ｄ．任意選択で、ステップｂ）及びｃ）を繰り返すステップを含み、
前記負荷電ポリマーの層の少なくとも１つがＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる方法。
【請求項２２】
ＲＮＡ、好ましくはｓｉＲＮＡを細胞又は生物に送達するための方法であって、前記細胞又は生物を、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の有効量の多層ナノ粒子と接触させることを含む方法。
【請求項２３】
対象体のＲＮＡ治療可能な疾患又は障害を治療するための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の有効量の多層ナノ粒子を前記対象体に投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡが、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）発現を阻害するｓｉＲＮＡであり、前記ＲＮＡ治療可能な疾患又は傷害が瘢痕であり、前記治療が、前記対象体の瘢痕を低減させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記多層ナノ粒子が、眼の手術、好ましくは緑内障手術後に結膜に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象体が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡ治療可能な疾患又は障害の治療に使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子。
【請求項２８】
前記ＲＮＡが、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）発現を阻害するｓｉＲＮＡであり、前記ＲＮＡ治療可能な疾患又は傷害が瘢痕であり、前記治療が、対象体の瘢痕を低減させる、請求項２７に記載の使用のための多層ナノ粒子。
【請求項２９】
対象体が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項２７又は２８に記載の使用のための多層ナノ粒子。
【請求項３０】
ＲＮＡを細胞又は生物に送達するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の多層ナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び生物にＲＮＡを送達するためのナノ粒子、並びにそれを製造及び使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボースを含む二本鎖ＤＮＡとは異なり、ほとんどが一本鎖の、リボースを含む核酸分子である。ＲＮＡは、加水分解され易いため、本質的にＤＮＡよりも不安定である。そのため容易に分解されてしまい、生物学的に不活性になるため、細胞又は生物にＲＮＡを送達するのは非常に困難である。
【０００３】
リボヌクレアーゼは、ＲＮＡの分解を触媒する酵素である。リボヌクレアーゼは、全ての細胞で極めて一般的であり、保護環境にないあらゆるＲＮＡの寿命は非常に短いものになる。５’末端キャッピング、３’末端ポリアデニル化、ＲＮＡタンパク質複合体内での折り畳み、及びリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）を含む、リボヌクレアーゼからＲＮＡを保護するための天然機序が生み出されている。しかしながら、細胞又は生物へのＲＮＡの送達は、ＲＮＡを分解する遍在性で堅牢なリボヌクレアーゼが存在するため非常に複雑なものになり、細胞にＲＮＡを送達することは非常に困難である。現在、ＲＮＡは、ほとんどの場合、ＲＮＡが細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕ合成されるように、そのＲＮＡをコードするＤＮＡを介して、例えばベクターの形態で細胞に送達される。しかしながら、この手法では、同様に細胞へと導入する必要のある分子をさまざまに制御、選択、及び検出する必要がある。そのような追加分子は、産生を複雑にし、細胞毒性の懸念があるため必ずしも望ましいものとは限らない。
【０００４】
ＲＮＡ送達に関連する問題は、「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）により拡大する。これは、１９９０年代後期に、Ｆｉｒｅ、Ｍｅｌｌｏ、及び彼らの同僚により最初に発見された遺伝子発現制御機構である。ＲＮＡｉは、標的細胞又は臓器のタンパク質を特異的に下方制御することを指す。そのようなＲＮＡｉを遺伝子治療に使用するためには、ＲＮＡｉを細胞に送達する必要がある。
【０００５】
同様に、細胞中の多くの望ましくないタンパク質の遺伝子発現は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を細胞の細胞質へと導入することにより達成される転写後の遺伝子サイレンシングにより変更することができる。
【０００６】
標的ｍＲＮＡに対して相補性を有する二本鎖の２１〜２３個ヌクレオチドＲＮＡ二本鎖であるｓｉＲＮＡは、一本鎖、いわゆるパッセンジャー鎖およびガイド鎖に分離する。パッセンジャー鎖は分解されるが、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、それを相補性ｍＲＮＡと結合させ、ＲＮＡｓｅ（アルゴノート）活性化によりその翻訳を防止する。ＲＮＡｉは、単純であり低用量で効果があるため、広範な疾患の洗練された治療処置の有望なツールと見なすことができる。
【０００７】
ポリマー性ナノ粒子（ＮＰ）、リポソーム、及び葉酸塩、コレステロール、ビオチン、又は蛍光性分子による表面修飾等の、ｓｉＲＮＡを細胞質へと送達するため種々の手法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３）。
【０００８】
遺伝子サイレンシング効率を向上させるために、ウイルスベクターも、ｓｉＲＮＡ送達に使用されている。しかしながら、ウイルスベクターの腫瘍形成性及び免疫原性の克服は、依然としてウイルスに基づくｓｉＲＮＡ送達の重要な課題である（非特許文献４）。ネイキッドｓｉＲＮＡの細胞の取込みが不良であること、ＲＮＡｓｅにより迅速に分解されること、及び全身性疾患部位へのｓｉＲＮＡ標的化が困難であることにより、現在、ｓｉＲＮＡ療法の広範の使用が制限されている（非特許文献１）。そうした課題を克服するため、特に、眼、皮内、肝臓、神経、肺を標的とするための局所的ｓｉＲＮＡ送達に、脂質又はポリマーに基づくｓｉＲＮＡ送達系の使用が成功している。ＲＮＡｉが療法として機能するには、効果的な細胞取込みに加えて、担体の非毒性／非免疫原性、及びｓｉＲＮＡの効果的な細胞内送達が不可欠である。したがって、現在の研究は、こうした困難を克服するポリマーに基づくナノ粒子等の、非ウイルスベクターに着目している。しかしながら、ほとんどの非ウイルス担体は、容認できる効力を欠如しており、高レベルの細胞毒性を有する（非特許文献３）。
【０００９】
結果的に、ｓｉＲＮＡ療法の効率的で安全な送達系は、依然として課題である。
ポリカチオン及びポリアニオンのコロイド交互積層法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ（ＬｂＬ）ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）が、非特許文献５により最初に記載されている。この正荷電ポリマー及び負電荷ポリマー間の静電相互作用に基づく穏やかな積層法は、高度な応用可能性を有する単純で汎用性のある方法である。以前の研究では、ポリスチレンラテックス、シリカ、及びメラミンホルムアルデヒド等のマイクロ／ナノ粒子、及び生物学的細胞だけでなく、炭酸カルシウム、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）フラットテンプレート等のより生体適合性のテンプレートが注目されている。
【００１０】
酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ；オステオネクチンとも呼ばれる）は、細胞と細胞外マトリックスとの相互作用、及び細胞遊走を調節するカルシウム結合細胞外マトリックス糖タンパク質である。ＳＰＡＲＣの発現上昇と組織瘢痕及び線維症との間には強い関連性がある。ＳＰＡＲＣの発現増加は線維性障害で観察されており、ＳＰＡＲＣ発現を標的として線維症を調節することは、将来性のある治療手法であると評価されている。
【００１１】
線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分泌及び沈着であり、高血圧、糖尿病、肝硬変、及び炎症過程等の種々の疾患の結果であることが多い。線維症では、ＳＰＡＲＣ発現が上昇し、ＥＣＭ相互作用の調節にＳＰＡＲＣタンパク質が関与することを示す。ＳＰＡＲＣ発現及び上方制御は、ヒト組織及び動物モデルの両方で複数のタイプの線維症において報告されている。研究者によると、ＳＰＡＲＣ発現の阻害が、皮膚、肝臓、腎臓、肺、腸の線維症を含む線維症及び緑内障を減少させることが示されている。非特許文献６には、ＳＰＡＲＣの低減が、眼瘢痕の外科マウスモデルにおける外科手術の成功を向上させることが報告されている。したがって、ＳＰＡＲＣ下方制御は、細胞遊走の遅延、コラーゲン収縮性の低減、並びに線維症促進性及び炎症促進性遺伝子の発現低下も引き起こすため、ＳＰＡＲＣ発現を標的とすることは、外傷を調節し、瘢痕を低減するための将来性のある治療戦略であることが特定されている（非特許文献７）。
【００１２】
酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）タンパク質発現の上昇は、組織瘢痕および線維症に関連している一方で、ＳＰＡＲＣの阻害は、瘢痕を低減することができる。したがって、ＳＰＡＲＣ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、ＳＰＡＲＣを阻害し、瘢痕を低減する有望な方法である。課題は、生物活性ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡを傷害部位に送達することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｕｏら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２０１０年、６２巻、６５０頁
【非特許文献２】Ｋａｐｏｏｒら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ、２０１２年、４２７巻、３５頁
【非特許文献３】Ｔａｎら、Ｓｍａｌｌ  ２０１１年、７巻、８４１頁
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９年、８巻、１２９頁
【非特許文献５】Ｄｏｎａｔｈら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９８年、３７巻、２２０１頁
【非特許文献６】Ｓｅｅｔら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１０年、５巻、９４１５頁
【非特許文献７】Ｓｅｅｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１２年、１６巻、１２４５頁
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、本発明の第１の態様では、ＲＮＡを細胞に送達するための多層ナノ粒子であって、正電荷ポリマー層及び負電荷ポリマー層を交互にコーティングしたコアナノ粒子を含み、層の数が２以上であり、負電荷ポリマー層の少なくとも１つが、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる多層ナノ粒子を提供することにより、無傷のＲＮＡを標的部位に送達するための方法に対する必要性を満たす。
【００１５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の多層ナノ粒子を製造するための方法であって、ａ）ナノ粒子コアを準備するステップ、ｂ）上記ナノ粒子コアを正荷電ポリマー又は負荷電ポリマーと接触させて、上記ナノ粒子コアに第１のポリマー層を形成するステップ、ｃ）ステップｂ）のコーティングされたナノ粒子を、ステップ（ｂ）で使用したものと反対に荷電されたポリマーと接触させて、上記ナノ粒子に第２のポリマー層を形成するステップ、ｄ）任意選択でステップｂ）およびｃ）を繰り返すステップを含み、上記負荷電ポリマー層の少なくとも１つがＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる方法に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞又は生物に送達するための方法であって、上記細胞又は生物を、本明細書に記載されている有効量の多層ナノ粒子と接触させることを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の更なる態様は、対象体のＲＮＡ治療可能な疾患又は障害を治療するための方法であって、本明細書に記載されている有効量の多層ナノ粒子を上記対象体に投与することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明のなお更なる態様は、細胞又は生物にＲＮＡを送達するための、本明細書に記載の多層ナノ粒子の使用に関する。
また、ＲＮＡ治療可能な疾患又は障害の治療に使用される本明細書に記載の多層ナノ粒子も本発明に包含される。
【００１９】
本発明の他の態様は、当業者であれば、種々の非限定的な実施形態に関する以下の図面及び記載を参照すると明白であろう。
図面は、必ずしも縮尺通りに示されておらず、むしろ概して種々の実施形態の原理を図示する際に強調がなされている。以下の記載では、本発明の種々の実施形態が、以下の図面を参照して説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａ．本発明の１つの実施形態による多層ナノ粒子の製造、及びＢ．細胞中で多層ナノ粒子が剥離することによりＲＮＡが細胞に送達されることを示す概略図である。
【図２】交互積層（ＬｂＬ）コーティングＰＥＭナノ粒子の多層内への、ｓｉＧＬＯ（ｓｉＧＬＯ緑色形質移入指示剤、核に局在化する蛍光性オリゴヌクレオチド二本鎖）の挿入。ＰＥＭナノ粒子へのｓｉＧＬＯコーティングは、ゼータ電位により決定した：正荷電ポリ−Ｌ−アルギニン及び負荷電硫酸デキストラン高分子電解質並びにｓｉＧＬＯ層を交互にコーティングすることに起因して、ＰＥＭナノ粒子のゼータ電位が交互することが示されている。負荷電ｓｉＲＮＡを層４及び層６に負荷すると、著しく負のゼータ電位がもたらされる。３回の独立測定の平均及び標準偏差が示されている。
【図３】表には、漸増数の層を有する多層ナノ粒子のサイズ、分散性、及びゼータ電位が要約されている（ＨＡ＝ヒドロキシアパタイト；ＡＲＧ＝ポリ−Ｌ−アルギニン、ＤＸＳ＝硫酸デキストラン、ＳＰＡＲＣ＝ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡ）。
【図４】ｓｉＧＬＯ含有ＰＥＭナノ粒子の細胞による取込み。ｓｉＧＬＯ負荷ＰＥＭナノ粒子と共にインキュベーションした１日後のＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞の共焦点レーザ走査顕微鏡画像が示されている。細胞体内部のドット様緑色蛍光は、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）によるｓｉＧＬＯ負荷ＰＥＭナノ粒子の取込みを示し、特に透過光及び両者のオーバーレイにより示されている。
【図５】ｓｉＧＬＯ含有ＬｂＬ  ＮＰの細胞相互作用。ｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬナノ粒子と共にインキュベーションした１日後の（ａ〜ｃ）ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞の共焦点レーザ走査顕微鏡画像が示されている。（a）細胞体内部のドット様緑色蛍光は、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）によるｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬナノ粒子の取込みを示し、特に（ｂ）透過光及び（ｃ）両者のオーバーレイにより示されている。未標識対照（未標識ｓｉＲＮＡを含むＬｂＬ  ＮＰと共にインキュベートしたＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞）は、トレース（ｄ〜ｆ）に示されている。透過は、トレース（ｅ）に示されており、オーバーレイは、トレース（ｆ）に見ることができる。核は、細胞質と明白に区別するためにＤＡＰＩにより染色されている。３回の独立測定の代表的な共焦点画像が示されている。
【図６】細胞ナノ粒子取込みのフローサイトメトリー検出。ＡＲＧ、ＤＸＳ、及びｓｉＧＬＯでコーティングしたＨＡナノ粒子を、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞と共に１日間インキュベートした。トリパンブルークエンチングの前（黒色グラフ）及び後（薄灰色グラフ）の、ｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬ  ＮＰで処理したＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞のヒストグラムが示されている。未標識ｓｉＲＮＡを含むＬｂＬ  ＮＰで処理したＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞（灰色グラフ）は、対照としての役目を果たす。３回の独立測定の代表的なデータが示されている。
【図７】ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞内でのｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬ  ＮＰの局在化。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞によるナノ粒子取込みのＣＬＳＭ研究及び同時に行ったリソソーム染色が示されている。ライソトラッカーレッド（ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄ）による染色を、様々な時点：（ａ）４時間、（ｂ）２４時間、及び（ｃ）７２時間で実施した。図３ｂ及び図３ｃの矢印は、ＮＰ及びエンドソームの共局在化領域（オレンジ色）を指している。図３ｃの７２時間での緑色領域の拡散は、ＮＰから「放出」されたｓｉＲＮＡ分子の凝集による。縮尺バーは、５０μｍである。３回の独立測定の代表的な共焦点画像が示されている。
【図８】ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡでコーティングした５層のＬｂＬナノ粒子のＴＥＭ画像。スケールバー（ａ）２００ｎｍ、（ｂ）５０ｎｍ。
【図９】Ｂｉｏｒａｄ社製Ｃｈｅｍｉｄｏｃシステムを使用したタンパク質分離及び抗体処理。（Ａ）無染色ゲルでのタンパク質分離。（Ｂ）Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標）システムを使用したＰＶＤＦ膜へのタンパク質移動。（Ｃ）Ｃｈｅｍｉｄｏｃ撮像装置で観察された基質処理後のＳＰＡＲＣ（４３ｋＤａ）に対応するバンド。試料の順序は、以下の通りである：（１）ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ層を有するＬｂＬ  ＮＰ、（２）ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ層を有するＬｂＬ  ＮＰ、（３）ブランク細胞、（４）ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン、（５）スクランブル−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン。
【図１０Ａ】ナノ粒子で処理した９６時間後の、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞におけるＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬナノ粒子のノックダウン効率パーセント。ＬｂＬナノ粒子は、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ、ブランク細胞、及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン（ＬＦ）、スクランブル−ｓｉＲＮＡを有するＬＦの１つの層で構成されていた。＊ｐ＜０．００１。結果は、３回の独立実験から得た。
【図１０Ｂ】ナノ粒子で処理した２日後の、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞におけるＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬナノ粒子のノックダウン効率パーセント。ＬｂＬナノ粒子は、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ、ブランク細胞、及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン（ＬＦ）、スクランブル−ｓｉＲＮＡを有するＬＦの１つの層で構成されていた。＊ｐ＜０．００１。結果は、３回の独立実験から得た。
【図１０Ｃ】ナノ粒子で処理した７日後の、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞におけるＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬナノ粒子のノックダウン効率パーセント。ＬｂＬナノ粒子は、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ、ブランク細胞、及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン（ＬＦ）、スクランブル−ｓｉＲＮＡを有するＬＦの１つの層で構成されていた。＊ｐ＜０．００１。結果は、３回の独立実験から得た。
【図１０Ｄ】ナノ粒子で処理した１４日後の、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞におけるＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬナノ粒子のノックダウン効率パーセント。ＬｂＬナノ粒子は、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ、ブランク細胞、及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミン（ＬＦ）、スクランブル−ｓｉＲＮＡを有するＬＦの１つの層で構成されていた。＊ｐ＜０．００１。結果は、３回の独立実験から得た。
【図１１】ＳＰＡＲＣ及びＲＰＬ１３の相対的ｍＲＮＡレベルを示し、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞では、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬ  ＮＰを使用した効率的な遺伝子サイレンシングが示されている。ＬｂＬ−ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡ、リポフェクタミン−ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡでＬｂＬ処理した９６時間後の、対照に対する値が示されている。未処理細胞及びリポフェクタミン−スクランブルｓｉＲＮＡは、対照として使用されている。＊ｐ＜０．０１。結果は、３回の独立実験（ｎ＝３）から得た。平均±ＳＤ。
【図１２】ＬｂＬでコーティングしたＬｂＬ  ＮＰでインキュベーションした後のＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞の増殖パターン。（ａ）種々の量のＬｂＬ  ＮＰと共にインキュベートしたＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞のリアルタイム細胞増殖アッセイが示されている。ブランク（黒色）は、細胞培養培地のみを有するウェルを指す。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）（ａ、赤色）の陽性対照は、ＬｂＬナノ粒子が付加されていない細胞を指す。（ｂ）様々な量のＬｂＬナノ粒子と共に７日間インキュベートしたＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞のＭＴＴ細胞増殖アッセイ。１ウェル当たり２、５、１０、１５、及び２０μｇの種々の量のＬｂＬ  ＮＰを、上記細胞と共に最大７日間インキュベートし、細胞増殖をモニタリングした。３回の測定の平均及び標準偏差が示されている。
【図１３】ナノ粒子による結膜へのｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達。表示されているｓｉＲＮＡを負荷した５ｕｌのＬｂＬナノ粒子を、実験的手術直後にマウス結膜に注射した。外科手術後の７日目Ａ及び１４日目Ｂに組織を採取し、Ｓｐａｒｃ（左）及びＣｏｌ１ａ１（右）のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで分析した。各記号は、３匹のマウスに由来する組織の貯留を表し、右眼に由来する対の未手術組織に対する、左眼に由来するナノ粒子を注射した手術組織での発現比として算出されている。黒色バーは、各条件の平均倍数変化を示す。矢印は、ｓｉＳｃｒａｍ負荷ナノ粒子と比べた、ｓｉＳｐａｒｃ負荷ナノ粒子による変化の方向を示す。矢印の左側にある数字は、ｓｉＳｐａｒｃによる平均倍数変化に対するｓｉＳｃｒａｍによる平均倍数変化の比率を示す。矢印の右側にある数字は、ｓｉＳｃｒａｍナノ粒子注射とｓｉＳｐａｒｃナノ粒子注射との倍数変化を比較するｐ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは、ＲＮＡ担体として著しい利点を有する多層ナノ粒子を開発した。多層ナノ粒子は、高度にカスタマイズ可能な搬送系として、高い取込み効率、並びに図１に示されているような局所的ＲＮＡ放出を提供する能力を有する。粒子表面の高分子電解質は、細胞質の幾つかの巨大分子と相互作用し、それにより多層分解を促進することができる。バイオポリマー層の分解が細胞内で徐々に生じることにより、多層組込み積荷の放出が可能になる。
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様は、ＲＮＡを細胞に送達するための多層ナノ粒子であって、正電荷ポリマー層及び負電荷ポリマー層を交互にコーティングしたコアナノ粒子を含み、層の数が２以上であり、負電荷ポリマー層の少なくとも１つが、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなるナノ粒子に関する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「多層ナノ粒子」は、２つ以上の層がナノ粒子コアにコーティングされていることを指す。層は、好ましくは交互積層プロセスを使用してコーティングされているため、多層ナノ粒子は、交互積層ナノ粒子（ＬｂＬ  ＮＰ）とも呼ばれる場合がある。ナノ粒子コアを直接コーティングしている、つまりコア表面と直接接触している、少なくとも２つの層の第１の層は、最内側層と呼ばれる。多層ナノ粒子の外側表面を形成する最上層コーティング、つまりコア表面から最も遠方にあるポリマー層は、最外側層と呼ばれる。この最外側ポリマー層は、以下で詳述されているように、標的指向性化合物により更にコーティングされていてもよいことが理解される。
【００２４】
最内側層と最外側層との間には、一般的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の層を有することが可能である。しかしながら、種々の実施形態では、多層ナノ粒子は、３〜１０個の層を含む。
【００２５】
多層ナノ粒子は、約１００から約５０００ｎｍまでのサイズを有し、形態は本質的に球状であることが好ましい。本明細書に記載の多層ナノ粒子の直径は、約１００ｎｍから約５００ｎｍまで、約１２０ｎｍから約４５０ｎｍまで、約２００ｎｍから約３００ｎｍまでの範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、多層ナノ粒子の直径は、約２００ｎｍから約５００ｎｍまでの範囲にある。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」は、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ＲＮＡは、生物由来のものでも合成物でもよく、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。そのようなＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボザイム、又はマイクロＲＮＡ若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のＲＮＡ干渉で使用されるＲＮＡであってもよい。種々の実施形態では、ＲＮＡは、リボザイム、ＲＮＡｉ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選択される。本明細書に記載の幾つかの実施形態では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」は、低分子干渉ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、短い、典型的には１８〜２５ｎｔの二本鎖ＲＮＡ分子であり、一方の鎖（ガイド鎖）は、細胞の標的ｍＲＮＡ、つまり「サイレンシング」のために標的とされている遺伝子から転写されるｍＲＮＡに相補的である。ｓｉＲＮＡを送達するための１つの選択肢は、本明細書に記載のようなコーティングされたナノ粒子の使用を含む。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子コア」は、約１から約２５０ｎｍまでサイズを有する任意の粒子を指す。本明細書に記載のナノ粒子コアの直径は、約１ｎｍから約２５０ｎｍまで、約１ｎｍから約２００ｎｍまで、約１ｎｍから約１６０ｎｍまで、約１ｎｍから約１４０ｎｍまで、約１ｎｍから約１２０ｎｍまで、約１ｎｍから約８０ｎｍまで、約１ｎｍから約６０ｎｍまで、約１ｎｍから約５０ｎｍまで、約５ｎｍから約２５０ｎｍまで、約８ｎｍから約２５０ｎｍまで、約１０ｎｍから約２５０ｎｍまで、約２０ｎｍから約２５０ｎｍまで、約３０ｎｍから約２５０ｎｍまで、約４０ｎｍから約２５０ｎｍまで、約８５ｎｍから約２５０ｎｍまで、約１００ｎｍから約２５０ｎｍまで、又は約１５０ｎｍから約２５０ｎｍまでの範囲であることができる。幾つかの実施形態では、ナノ粒子コアの直径は、約１ｎｍから約１００ｎｍまでの範囲にある。
【００２９】
種々の実施形態では、ナノ粒子コアは、本質的に球状である。
ある実施形態では、コアは、第１の正荷電ポリマー層によるコーティングを容易にするために、負に荷電されていてもよい。他の実施形態では、コアは、負に荷電されている第１の層によるコーティングを容易にするために、正に荷電されていてもよい。
【００３０】
幾つかの実施形態では、多層は、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる少なくとも２つの負荷電ポリマー層を含む。この実施形態では、好ましくは、層の総数は少なくとも５層であり、負荷電ポリマー層の少なくとも２つは、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる。これには、細胞においてＲＮＡの持続放出が提供されるという利点があり、多層ナノ粒子が細胞と接触した少なくとも２週間後にＲＮＡの活性を測定することができる。無論、粒子の層の数を更に増加させて、３つ以上のＲＮＡ（含有）層を収容することができる。
【００３１】
種々の実施形態では、ナノ粒子コアは、生体適合性又は生分解性である。
用語「生体吸収性」、「生分解性」、及び「生体再吸収性」は、本明細書では同義的に使用されており、体内の化学的及び／又は生物学的な作用により、ある期間にわたって物質が劣化するか又は分解し、安全に排泄されるか又は排出系等の天然系により身体から除去される能力を指す。本発明の状況では、用語「生体吸収性」は、再吸収等の生理学的な代謝プロセスにより局所的な区域から完全に除去されることができる１つ又は複数の成分を指す。例えば、生分解性ナノ粒子コアは、細胞により取り込まれると、リソソーム等の細胞機構により、又は加水分解により、より小さなサブユニットに分解される場合がある。その後、細胞は、残部を再使用しても又は破棄してもいずれでもよく、細胞に著しい毒性効果を及ぼさない。生分解プロセスの例には、酵素性及び非酵素性の加水分解、酸化、及び還元が挙げられる。非酵素性加水分解の好適な条件には、例えば、生分解性物質をリソソーム（つまり、細胞内小器官）の温度及びｐＨの水に接触させることが挙げられる。分解断片は、典型的には、器官若しくは細胞の過負荷、又はそのような過負荷若しくは他の有害効果によりｉｎ  ｖｉｖｏで引き起こされる病理学的プロセスを誘導しないか又はほとんど誘導しない。
【００３２】
生物分解性物質の種々の例は、当技術分野で公知であり、それらはいずれも、本発明での使用に概して好適であり、生物に対して毒性を示さす、本発明で使用することができる。生分解性であり、本発明による使用に好適であると考えられる物質の例には、限定ではないが、以下のものが挙げられる：脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレンオキサラート、ポリアミド、ポリ（イミノカルボナート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミド基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、ポリカルボナート、キトサン、コラーゲン、デンプン等の天然生分解性ポリマー、及びそれらの混合物。ポリオルトエステルの例には、以下のものが挙げられる：ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、生分解性ポリアミド、生分解性脂肪族ポリエステル、及び／又はそれらのコポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「生体適合性」は、生物学的プロセスに干渉しない合成又は天然物質を指し、生物学的に又は化学的に不活性な物質とみなすことができる。生物分解性物質の種々の例は、当技術分野で公知であり、それらはいずれも、本発明での使用に概して好適であり、生物に対して毒性を示さず、本発明で使用することができる。生体適合性であり、本発明による使用に好適であると考えられる物質の例には、限定ではないが、ヒドロキシアパタイト、シリカ、炭酸カルシウム、金、ポリスチレンラテックスが挙げられる。
【００３４】
種々の実施形態では、ナノ粒子コアは、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、炭酸カルシウム、金、ポリスチレンラテックスからなる群から選択される物質、好ましくはヒドロキシアパタイトを含むか又はその物質からなる。
【００３５】
ヒドロキシアパタイト等の生体適合性及び生分解性ナノ粒子の使用は、ＲＮＡを送達したと記載されている以前のあらゆる候補よりもずっと細胞毒性が低い。
種々の他の実施形態では、ナノ粒子コアは、リポソーム、好ましくはナノリポソームを含む。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」は、脂質及び／又は脂質誘導体及び／又はリン脂質を含む脂質様分子で構成されているあらゆる脂質二重層小胞構造を指す。
種々の実施形態では、リポソームは、少なくとも１つのＲＮＡ層を含む２つ以上の交互積層されている正荷電ポリマー層及び負荷電ポリマー層でコーティングする前に、ＲＮＡがリポソーム内に封入されるように、ＲＮＡを負荷することができる。最外側層は、下記に記載されている細胞指向性ペプチドで構築されていてもよい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ナノリポソーム」は、ナノスケールの脂質小胞を指す。リポソーム及びナノリポソームを形成するための根底にある機序は、基本的には両親媒性脂質と水分子との親水性−疎水性相互作用である。その後、ナノメートルのサイズ範囲に調製された小胞は、本明細書に記載のような少なくとも１つのＲＮＡ層を含む交互積層されている正荷電ポリマー層及び負荷電ポリマー層で引き続きコーティングされるナノ粒子コアとしての役目を果たす。また、標的療法は、本明細書に記載のように、ナノ粒子コアとしてのリポソーム又はナノリポソームを使用し、及び細胞指向性ペプチド等の受動的又は能動的標的指向性機序を使用する多層ナノ粒子により効率的に達成することができる。
【００３８】
用語「層」は、本明細書で使用される場合、ナノ粒子コア及び／又は下記の層の少なくとも一部を覆うコーティング膜を指す。層は、好ましくは連続的であり、コア又は直下の層の表面を実質的に完全に覆っている。層の厚さは、製造条件により制御することができるが、典型的には１から１１０ｎｍまでの範囲である。
【００３９】
上述の多層粒子の種々の実施形態では、最外側層は、正荷電ポリマーである。他の送達方法と比較すると、多層ナノ粒子手法は、最外側層がＲＮＡではなく正荷電高分子電解質であるため、細胞質への輸送中及び恐らくは細胞質に滞在している間も、ＲＮＡ分子により大きな保護を付与することが可能である。
【００４０】
種々の実施形態では、最内側層は、正荷電ポリマーである。
種々の実施形態では、ＲＮＡ層は、２つの正荷電ポリマー層に挟まれている。これには、最外側層がＲＮＡでなく、ＲＮＡの細胞内への放出を遅延させることが可能であるため、ＲＮＡが保護されるという利点がある。
【００４１】
種々の実施形態では、正荷電ポリマーは、ポリカチオンである。
種々の実施形態では、負荷電ポリマーは、ポリアニオンである。
本明細書で使用される場合、用語「ポリカチオン」又は「ポリアニオン」は、その反復単位が、荷電されているか又は潜在的に荷電されている基を有する高分子電解質又はポリマーを指す。後者の場合、こうした基は、水溶液（水）中で解離して、ポリマーを荷電させる。ポリカチオンは、正の正味電荷を有するポリマーである。ポリアニオンは、負の正味電荷を有するポリマーである。
【００４２】
交互に積層されている正荷電ポリマー層及び負荷電ポリマー層でコアナノ粒子をコーティングすることにより、組み込まれているＲＮＡ層は、その機能を効果的に実施することができる細胞質内に放出されるまで保護される。多層は、ＲＮＡの保護及び徐放の両方を提供する。
【００４３】
種々の実施形態では、正荷電ポリマーは、ポリ（Ｌ−アルギニン）を含むか又はポリ（Ｌ−アルギニン）からなる。
種々の実施形態では、負荷電ポリマーは、硫酸デキストランを含むか又は硫酸デキストランからなる。
【００４４】
種々の実施形態では、多層ナノ粒子は、最外側層として標的指向性ペプチド又はタンパク質を更に含む。
本明細書で使用される場合、用語「（標的）指向性ペプチド」又は「タンパク質」は、多層ナノ粒子の輸送を目的細胞へと誘導するタンパク質またはペプチドを指す。また、この用語は、シグナルペプチドと呼ばれる場合がある。これらとしては、抗体、又は特定の細胞受容体若しくはチャネルを認識する短鎖ペプチド（３〜７０アミノ酸長）を挙げることができる。種々の実施形態では、標的指向性ペプチド又はタンパク質は、ＴＡＴペプチド、エンドサイトーシス媒介性両親媒性ペプチド、及び葉酸受容体指向性部分から選択される。
【００４５】
また、多層手法により、標的指向性ペプチドを最外側層として使用することが容易に可能になり、その後、それにより粒子及びｓｉＲＮＡの標的特異的送達が可能になるであろう。そのような標的指向性ペプチドとしては、ＴＡＴペプチド、Ｅｎｄｏｐｏｒｔｅｒ（商標）ペプチド及び葉酸受容体指向性部分等のエンドサイトーシス媒介性両親媒性ペプチドが挙げられる。
【００４６】
種々の実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡであり、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）遺伝子を標的とする。
種々の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１（ＡＡＣＡＡＧＡＣＣＵＵＣＧＡＣＵＣＵＵＵＣ）に示されているヌクレオチドセンス配列、及び配列番号２（ＧＧＡＡＧＡＧＵＣＧＡＡＧＧＵＣＵＵＧＵＵ）に示されているヌクレオチドアンチセンス配列を有する。
【００４７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の多層ナノ粒子を製造するための方法であって、ａ）ナノ粒子コアを準備するステップ、ｂ）上記ナノ粒子コアを正荷電ポリマー又は負荷電ポリマーと接触させて、上記ナノ粒子コアに第１のポリマー層を形成するステップ、ｃ）ステップｂ）のコーティングされたナノ粒子を、ステップｂ）で使用したものと反対に荷電されたポリマーと接触させて、上記ナノ粒子に第２のポリマー層を形成するステップ、ｄ）任意選択でステップｂ）およびｃ）を繰り返すステップを含み、上記負荷電ポリマーの層の少なくとも１つがＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる方法に関する。
【００４８】
本発明の別の態様は、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞又は生物に送達するための方法であって、上記細胞又は生物を、本明細書に記載されている有効量の多層ナノ粒子と接触させることを含む方法に関する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養細胞に送達してもよく、又はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達してもよい。細胞は、ＲＮＡを送達しようとするあらゆる生物の原核細胞又は真核細胞を含む任意の細胞であってもよい。
【００５０】
種々の実施形態では、生物は、細菌、真菌、植物、又は動物を指し、生物は、ラット、マウス、ウマ、又はヒト等の哺乳動物であることが好ましい。
本発明の別の態様は、対象体のＲＮＡ治療可能な疾患又は障害を治療するための方法であって、本明細書に記載されている有効量の多層ナノ粒子を上記対象体に投与することを含む方法に関する。
【００５１】
用語「ＲＮＡ治療可能な疾患又は障害」は、ＲＮＡによる治療に応答性のあらゆる状態に関する。例示的な疾患には、限定ではないが、癌を含む過剰増殖性疾患だけでなく、高血圧、糖尿病、肝硬変、及び炎症性疾患も挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「対象体」は、細菌、真菌、植物、又は動物を指し、生物は、ラット、マウス、ウマ、又はヒト等の哺乳動物であることが好ましい。
種々の実施形態では、ＲＮＡは、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）発現を阻害して、対象体の瘢痕を低減するｓｉＲＮＡである。
【００５３】
種々の実施形態では、有効量の多層ナノ粒子は、手術後の結膜に投与され、ＲＮＡは、好ましくは酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
【００５４】
本発明の別の態様は、細胞又は生物にＲＮＡを送達するための、本明細書に記載の多層ナノ粒子の使用に関する。
本発明の別の態様は、ＲＮＡ治療可能な疾患又は障害の治療に使用するための、本明細書に記載の多層ナノ粒子に関する。
【００５５】
種々の実施形態では、ＲＮＡは、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）発現を阻害して、ラット、マウス、ウマ、又はヒト等の哺乳動物の瘢痕を低減するｓｉＲＮＡである。
【００５６】
種々の実施形態では、生体適合性ヒドロキシアパタイトナノ粒子コアが、ポリ−アルギニン層及び硫酸デキストラン（ＤＸＳ）層、並びにＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡが組み込まれている又はＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡからなる層でコーティングされている。そのようなＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡ負荷多層ナノ粒子を、マウス線維芽細胞に取り込ませて、ｓｉＲＮＡを送達することに成功したことを示すことができた。これは、これらの細胞でＳＰＡＲＣタンパク質をノックダウンすることができることを示す。細胞取込みにとって非常に重要である初期細胞結合が、正荷電されている表面層（ＡＲＧ）により促進され、ナノ粒子がエンドソームと共局在化することにより示されるように、エンドサイトーシスによる取込みに結び付く。その後、エンドソーム内で細孔形成を促進する荷電外側層を有する（ほとんど）完全なナノ粒子が、エンドソームから脱出する。最大６０％のｓｐａｒｃタンパク質ノックダウンが、単回の多層ナノ粒子処理で達成された。相対的なＳＰＡＲＣ及びＲＰＬ１３  ｍＲＮＡレベルは、０．４±０．０４倍へと著しく低減され、多層ナノ粒子手法により効率的なＳＰＡＲＣ遺伝子サイレンシングを達成できることが示された。加えて、線維芽細胞での多層ナノ粒子処理に伴う細胞毒性は観察されず、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ送達用の将来性のある非ウイルスベクターとしての多層ナノ粒子の安全性が支持された。結論として、こうした知見は、交互積層ナノ粒子を、ｍＲＮＡをノックダウンするための非ウイルス治療法として開発することが有望であること支持する。
【００５７】
したがって、ポリカチオンとしてのＡＲＧ及びポリアニオンとしてのＤＸＳで構成されるＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷多層ナノ粒子は、遙かに低い細胞毒性で、ｓｉＲＮＡを線維芽細胞へと効果的に送達することができたことが示された。また、多層ナノ粒子により送達されたＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡは、線維芽細胞の標的タンパク質発現レベルを特異的に低減させることができた。コアとしてＨＡ（ヒドロキシアパタイト）を有するこれらの多層ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡに基づく送達ベクターの化学的結合体に対して幾つかの利点を有する。第１に、製剤ステップが非常に単純であり、ｓｉＲＮＡ送達系を調製するための時間が低減される。細胞毒性研究により示されたように、多層ナノ粒子ＲＮＡ送達媒体の毒性は低いと考えられる。
【００５８】
他の非ウイルス粒子を使用する遺伝子送達用の制限要因は毒性であったため、この知見は、多層ナノ粒子系の重要な利点である。
「含む」とは、「含む」という語に続くものを全て含むが、それらに限定されないことを意味する。したがって、用語「含む」の使用は、列挙されている要素は必要であるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、存在してもよく又は存在しなくともよいことを示す。
【００５９】
「からなる」とは、「からなる」の後に続くものを全て含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、用語「からなる」の使用は、列挙されている要素は必要であるか又は必須であり、他の要素は存在してはならないことを示す。
【００６０】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の１つ又は複数の要素、１つ又は複数の限定が存在しなくとも適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含する」、及び「含有する」等は、包括的に解釈され、限定的に解釈されないものとする。加えて、本明細書に使用されている用語及び表現は、説明のための用語として使用されており、限定するための用語ではなく、そのような用語及び表現を、表示又は記載されている特徴又はそれらの部分の任意の均等物を除外するために使用することは意図されていない。しかしながら、特許請求されている発明の範囲から逸脱せずに、種々の改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択の特徴により具体的に開示されているが、本明細書で開示され、そこに例示されている本発明の改変、及び変更は、当業者であればなすことができ、そのような改変及び変更は、本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【００６１】
本発明は、本明細書では広い意味で一般的に記載されている。属の開示内に入るより狭義の種及び亜属分類の各々も、本発明の部分を形成する。これは、本発明の属に関する記載を条件付で含むか、又は除外される物質が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関わらず、属から任意の主題を除外する否定的限定を含む。
【００６２】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲及び非限定的な例の内にある。
実施例
ｓｉＲＮＡ多層ナノ粒子の製造
任意の物質、例えばヒドロキシルアパタイト（ＨＡ）で作製されているナノ粒子コアから開始して、交互積層されている正層及び負層でコアをコーティングする。典型的なスキームでは、１００ｎｍのＨＡ粒子を、まず、Ｌ−アルギニン（＋ｖｅ電荷）等の陽イオン性ポリマーで、その後硫酸デキストラン（−ｖｅ電荷）でコーティングし、引き続き、ｓｉＲＮＡ分子（負に荷電されている）で−ｖｅ層を作製することができる。このようにして、６層系を、図１に示されているように作製することができる。
【００６３】
使用した１つのｓｉＲＮＡ分子は、蛍光タグを有するためｓｉＧＬＯと呼ばれた。反対に荷電されているバイオポリマー層であるＡＲＧ、ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡを有するＤＸＳの二重層でコーティングされているコアとして市販のＨＡ  ＮＰを使用し、多層又は交互積層（ＬｂＬ）ナノ粒子（ＮＰ）を製造した。二重層のＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡコーティング、及び高分子電解質の濃度は、相当程度のｓｉＲＮＡを負荷した多層ＮＰを構築し、凝集形成を防止するように最適化した。ＮＰ多層へのｓｉＲＮＡコーティングは、層が剥離し、その後ｓｉＲＮＡの細胞質への放出が起こる場合にのみ意味があるため、ＬｂＬ多層に組み込まれているｓｉＲＮＡリポーター分子により剥離を研究した。ＬｂＬ  ＮＰの細胞の取込みを評価するために、ｓｉＧＬＯ−ｓｉＲＮＡ緑色形質移入指示剤を、負荷電層としてＬｂＬ  ＮＰの二重層にコーティングした。ｓｉＧＬＯ−ＬｂＬ  ＮＰの粒径は４８５ｎｍであり、ゼータ電位は＋４３ｍＶである。二重層にコーティングしたｓｉＧＬＯの実際の量は、０．４ｐモル／μｇ  ＬｂＬナノ粒子であり、コーティング効率は９８％±０．２である。ここで報告した量は、遺伝子サイレンシングに十分であると考えられる。
【００６４】
材料
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ナノ粒子（＜２００ｎｍ）、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（ＡＲＧ）（ＭＷ＞７０，０００）、及び硫酸デキストランナトリウム塩（ＤＸＳ）（ＭＷ＞３６００００）は、Ｓｉｇｍａ社（シンガポール）及びＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＬＬＣ社（シンガポール）から調達した。ｓｉＧＬＯ緑色形質移入指示剤は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（シンガポール）から得た。ライソトラッカーレッドＤＮＤ−９９及びＯｐｔｉ−ＭｅＭ低減血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（シンガポール）であった。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）ヒト包皮線維芽細胞は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製（シンガポール）であった。ダルベッコ変法イーグル培地（高グルコース及びＬ−グルタミンを有するＤＭＥＭ）、カルシウム及びマグネシウム非含有ダルベッコＰＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製（シンガポール）であった。トリパンブルーストック溶液（０．４％）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（シンガポール）から購入した。ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ  Ｍｗ−１３３６９ｇ／モル及びスクランブルは、Ｂｉｏ−Ｒｅｖ社、韓国から調達した。
【００６５】
ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ：
センス−ＡＡＣＡＡＧＡＣＣＵＵＣＧＡＣＵＣＵＵＵＣ（配列番号１）
アンチセンス−ＧＧＡＡＧＡＧＵＣＧＡＡＧＧＵＣＵＵＧＵＵ（配列番号２）
スクランブルｓｉＲＮＡ
センス−ＧＣＵＣＡＣＡＧＣＵＣＡＡＵＣＣＵＡＡＵＣ（配列番号３）
アンチセンス−ＧＡＵＵＡＧＧＡＵＵＧＡＧＣＵＧＵＧＡＧＣ（配列番号４）
プロセス
ヒドロキシアパタイトナノ粒子（ＮＰ）を、０．２μｍろ過精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に懸濁し、５分間ボルテックスし、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集した（ＳＴ１６Ｒ、Ｓｏｒｖａｌｌ社）。この手順を繰り返してＨＡナノ粒子を洗浄する。ナノ粒子懸濁系を、等量の０．５ｍｇ／ｍＬポリ（Ｌ−アルギニン、ＡＲＧ）に添加し、その後ボルテックスし、１０分間超音波処理する。ＡＲＧでコーティングされたＮＰを回収し、塩化ナトリウムを使用して洗浄した。ＡＲＧでコーティングされたＮＰを、塩化ナトリウムに再懸濁し、陰イオン層として０．５ｍｇ／ｍＬ硫酸デキストリン（ＤＸＳ）に添加した。ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡの場合には、４μＬの２０ｎＭ溶液を、３０分間のインキュベーション時間でｓｉＲＮＡコーティングに使用する。ＬｂＬコーティングの最終層は、ｓｉＲＮＡをコーティングしたＬｂＬ  ＮＰをＡＲＧに添加し、その後１０分間インキュベーションすることにより達成した。サイズ及びゼータ電位を測定するための試料を、各層毎に収集した。ｓｉＲＮＡ層の場合、測定は、２３０ｎｍにてナノドロップ（Ｖ３．７、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で実施し、ＬｂＬ  ＮＰのｓｉＲＮＡコーティングを評価した。本発明者らは、ｓｉＧＬＯ、リポーターｓｉＲＮＡ、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを、別々にＬｂＬ  ＮＰに組み込んだ。ＬｂＬ  ＮＰは、以下のように名付けた：ＨＡ｜ＡＲＧ｜ＤＸＳ｜ＡＲＧ｜ｓｉＲＮＡ｜ＡＲＧ。
【００６６】
唯一の負荷電ポリマーがＲＮＡである１つのナノ粒子を作製した。ヒドロキシアパタイトナノ粒子（ＮＰ）を、０．２μｍろ過精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に懸濁し、５分間ボルテックスし、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集した（ＳＴ１６Ｒ、Ｓｏｒｖａｌｌ社）。この手順を繰り返してＨＡナノ粒子を洗浄する。ナノ粒子懸濁系を、０．５ｍｇ／ｍＬの量のポリ（Ｌ−アルギニン、ＡＲＧ）に添加し、その後ボルテックスし、１０分間超音波処理する。ＡＲＧでコーティングされたＮＰを回収し、塩化ナトリウムを使用して洗浄した。ＡＲＧでコーティングしたＮＰを、塩化ナトリウムに再懸濁し、１２μＬの１２００ｐモル溶液に添加した。それを、３０分間のインキュベーション時間でＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡコーティングに使用する。ＬｂＬコーティングの最終層は、ｓｉＲＮＡをコーティングしたＬｂＬ  ＮＰをＡＲＧに添加し、その後１０分間インキュベーションすることにより達成した。［ＨＡ│ＡＲＧ│ｓｉＲＮＡ│ＡＲＧ］の多層ナノ粒子構造がもたらされた。
【００６７】
唯一の負荷電ポリマーがＲＮＡであり、２層のＲＮＡが存在する別のナノ粒子を作製した。ヒドロキシアパタイトナノ粒子（ＮＰ）を、０．２μｍろ過精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に懸濁し、５分間ボルテックスし、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集した（ＳＴ１６Ｒ、Ｓｏｒｖａｌｌ社）。この手順を繰り返してＨＡナノ粒子を洗浄する。ナノ粒子懸濁系を、０．５ｍｇ／ｍＬの量のポリ（Ｌ−アルギニン、ＡＲＧ）に添加し、その後ボルテックスし、１０分間超音波処理する。ＡＲＧでコーティングされたＮＰを回収し、塩化ナトリウムを使用して洗浄した。ＡＲＧでコーティングしたＮＰを、塩化ナトリウムに再懸濁し、１２μＬの１２００ｐモル溶液に添加した。これを、３０分間のインキュベーション時間でＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡコーティングに使用する。ＬｂＬコーティングの最終層は、ｓｉＲＮＡをコーティングしたＬｂＬ  ＮＰをＡＲＧに添加し、その後１０分間インキュベーションすることにより達成した。ＡＲＧコーティング及びＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡコーティングを、別々に各々同じ方法で繰り返し、［ＨＡ│ＡＲＧ│ｓｉＲＮＡ│ＡＲＧ│ｓｉＲＮＡ│ＡＲＧ］の多層ナノ粒子構造を得た。
【００６８】
多層ナノ粒子の特徴解析
層化は、図２に示されているように、各層を施してから粒子のゼータ電位を測定して確認することができる。
【００６９】
また、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬ  ＮＰを用いて、サイズ及び表面電荷に対するＬｂＬナノ粒子の影響を調査した。結果は図３に示されている。ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡでコーティングしたＬｂＬ  ＮＰは、３５０ｎｍのサイズ、＋４３ｍＶのゼータ電位をもたらす。ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡのコーティング効率は、０．４ｐモルＳＰＡＲＣ／μｇのＬｂＬナノ粒子で９７％である。遺伝子サイレンシング研究では、この濃度（０．４ｐモル／μｇのＬｂＬナノ粒子）を使用して、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞を処理した。
【００７０】
電気泳動度
各層のコーティング後、ＬｂＬ  ＮＰの電気泳動度を、室温にて０．２μｍろ過０．１Ｍ  Ｎａｃｌ中で、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して測定した。ゼータ電位（ζ−電位）は、η及びεがそれぞれ溶媒の粘度及び誘電率であるスモルコフスキー関数ζ＝μη／εを使用して、電気泳動度（μ）から算出した。
【００７１】
細胞へのＲＮＡの送達
多層ナノ粒子を細胞に送達することができるか否かを決定するために、上述のように製造したｓｉＧＬＯ粒子を細胞と共にインキュベートして、細胞質への粒子の進入を評価した。これは、「ｓｉＧＬＯ」と呼ばれる、タグ付きｓｉＲＮＡ粒子を使用することにより行われる。ｓｉＧＬＯコーティングを有する粒子が細胞に進入した場合、図４に示されているように、所望の波長レーザを使用した共焦点顕微鏡により可視化される。
【００７２】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に基づくＬｂＬ系は、線維芽細胞において効率的な遺伝子ノックダウンを提供する。ノックダウン効率は、細胞透過及び剥離が最適化された、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＡＲＧ）、硫酸デキストラン（ＤＸＳ）を使用した交互積層構築体を用いて試験した。
【００７３】
この担体には、線維芽細胞（ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標））での細胞内輸送及びＳＰＡＲＣ−ｍＲＮＡ標的化のために、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡが組み込まれている。ＬｂＬ  ＮＰにコーティングしたＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡの細胞結合、取込み、細胞内プロセシングを研究するために、ｓｉＧＬＯ−緑色形質移入指示剤（ｓｉＧＬＯ）を、ＬｂＬ  ＮＰの多層成分として使用した。ナノ粒子取込み及び細胞形質移入を、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーにより、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞で調査した。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞における標的タンパク質発現レベルは、ＣｈｅｍｉＤＯＣ（登録商標）ウエスタンブロット技法により評価し、ｍＲＮＡレベル（ＬｂＬ処理後）を、ＲＴ−ＰＣＲを使用することにより定量した。
【００７４】
ｓｉＧＬＯを有する多層ナノ粒子
細胞結合は、正荷電ＬｂＬ  ＮＰと細胞膜との間の静電的相互作用により促進される。結果的に、最外側ＬｂＬ  ＮＰ層の電荷は、ＬｂＬ  ＮＰ／細胞相互作用の第１段階に重要な役割を果たす。したがって、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）による細胞取込みを、最外側多層成分としてＡＲＧを含有するＬｂＬ  ＮＰを用いて研究した。電荷とは別に、サイズは、細胞の取込み速度に影響を及ぼす重要なパラメータである。多層ナノ粒子は、微粒子と比較して、容易に細胞に取り込まれる。ＬｂＬ  ＮＰ結合及び取込みは、ＣＬＳＭを使用して定性的に、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）（２．５ｎｇ  ＬｂＬ  ＮＰ／細胞）を使用することにより定量的に、その両方で分析した。図５には、１日インキュベーションした後でＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）（ａ〜ｃ）細胞内部にある、及び細胞に付着している相当数のＬｂＬ  ＮＰの典型的なＣＬＳＭ画像が示されている。未標識ｓｉＲＮＡを有するＬｂＬ  ＮＰを含有する対照は、トレースｄ〜ｆに示されている。透過（ｂ、ｅ）画像及びオーバーレイ（ｃ、ｆ）画像によると、蛍光性粒子は、細胞膜及び細胞質にのみ存在し、核内部には存在しなかった。ＤＡＰＩによる核染色により、核内には粒子を見出すことができないというこの知見が支持される。これは、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞が、ｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬナノ粒子を内在化することができたが、粒子は大き過ぎて核に進入することができなかったことを示す。この結果は、キトサン／アルギン酸塩多層を有する４００ｎｍのＰＬＧＡナノ粒子は、肝細胞に組み込まれるが、共焦点画像では、核局在化を見出すことができなかったという、Ｚｈｏｕら（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００９年、９巻、３２６頁）の知見と一致する。
【００７５】
ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞へのＬｂＬナノ粒子取込みは、ナノ粒子の細胞表面結合を回避するためにトリパンブルークエンチングを使用して、フローサイトメーター測定で研究した。（図６）。生細胞はトリパンブルーを透過させないため、細胞に内在化されたナノ粒子は、トリパンブルークエンチングから保護される。しかしながら、細胞膜の外側表面に向けて結合した粒子は、トリパンブルーと接触し、その後クエンチされる。
【００７６】
平均ｇ値−８±０．１を有する、未標識ｓｉＲＮＡを含有する対照ＬｂＬ  ＮＰ、及び平均ｇ値−１００±０．７を有する、クエンチ後のｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬ  ＮＰで処理したＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞の蛍光強度の比較は、ＬｂＬナノ粒子の細胞取込みを明白に示している。ＬｂＬ  ＮＰをＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞へと処理した後の、クエンチング前後の蛍光強度変化は、細胞取込みプロセスとして、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞との強力なＬｂＬ  ＮＰ相互作用を示す。ＬｂＬ  ＮＰを含有するｓｉＧＬＯで処理したＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞へのトリパンブルー付加は、非常にわずかな蛍光強度変化をもたらした。トリパンブルークエンチング後の細胞の蛍光強度は、対照細胞群の蛍光強度よりも高いため、これは、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞によるＬｂＬ  ＮＰの内部移行が成功したことを示す。
【００７７】
ＲＮＡ負荷ＬｂＬ  ＮＰの内部移行及び細胞内局在化に関する情報を得るために、ＬｂＬ  ＮＰ取込み中に、ライソトラッカーによる染色を実施した。遺伝子サイレンシングは、ｍＲＮＡの段階でサイトゾルにて起こるため、細胞内部でのＮＰの運命及び細胞内局在化は、この区画でのｓｉＲＮＡの利用能を保証するはずである。エンドソームからの脱出は、サイトゾルへのｓｉＲＮＡの効果的な送達に重要である。
【００７８】
図７には、種々の粒子インキュベーション時間で撮影された生細胞共焦点画像が示されている。ＬｂＬインキュベーションの４時間後に（図７ａ）、本発明者らは、細胞がＬｂＬ  ＮＰにより囲まれており、また、幾つかの斑点状の緑色蛍光が細胞内にあることを観察した。これは、ＮＰ内にｓｉＧＬＯが存在することを示す。蛍光が斑点状であることは、ｓｉＧＬＯが依然としてＮＰ内に組み込まれていることに起因する（恐らくは凝集している）。インキュベーション時間を２４時間に増加させると、緑色ｓｉＧＬＯ蛍光及び赤色ライソトラッカーの共局在化が視認でき（オレンジ色又は黄色、図７ｂではオーバーレイされている）、ＬｂＬ粒子がエンドソーム内部に局在化されていることが示された。７２時間後の図７ｃには、細胞内の斑点状蛍光（緑色）領域並びに拡散領域が示されている。これは、ｓｉＧＬＯ組込みＮＰのエンドソームからの脱出が成功し、遊離ｓｉＧＬＯ分子が同時に又は連続してある程度放出され、その後凝集して拡散緑色領域を形成することに起因する。
【００７９】
ＬｂＬ  ＮＰに結合しているｓｉＧＬＯが放出されたことは、斑点が拡大及び凝集し、その後蛍光が細胞全体に拡散分布することから推論される。ｓｉＲＮＡに関連する蛍光は、未処理細胞（ブランク）では観察されなかった。緑色ｓｉＧＬＯ及びエンドソームが共局在化し、その後ｓｉＧＬＯが放出されたことは、ＬｂＬ  ＮＰのＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞への取込みが成功したこと、及びｓｉＧＬＯ放出がゆっくりであることを示す。透過型電子顕微鏡（図８ａ及び８ｂ）で決定した平均ＬｂＬ平均粒度が２００ｎｍであることに加えて、ｓｉＲＮＡでコーティングしたＬｂＬ  ＮＰが球形であり、形態が滑らかであることも、効果的な細胞取込みを促進すると考えられる。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞は、ポリ（Ｌ−アルギニン）でコーティングしたＬｂＬ  ＮＰをエンドサイトーシスにより取り込む。これは、エンドソームに共局在化し［３９］、更にｓｉＧＬＯ−ＬｂＬ  ＮＰが、エンドソーム脂質二重膜に細孔を形成することによりエンドソームから脱出するという観察の通りである。正荷電ＮＰ及び表面修飾ＰＬＧＡ  ＮＰ等の非ウイルスベクターの場合、細胞取込みの主要機序は、エンドサイトーシスによる。
【００８０】
エンドソーム酸性化は、その管腔が周囲細胞内媒体ともはや連通しなくなるため、ナノ粒子が原形質膜から分離するとほとんど同時に始まる。ＡＲＧペプチド（ｐＫａは約１１．５）は、１１よりもかなり低いｐＨでプロトン化されると予想され、したがって、それらがエンドソームに進入する時点で、既に完全に正に荷電される（陽子スポンジ効果はない）。その後、正荷電ＬｂＬ  ＮＰは、リン脂質膜と相互作用して、ＮＰがなんとか通り抜けられる程度の大きさの細孔を形成する。この脱出は、斑点状の緑色領域（単一粒子ではなく、凝集体であると考えられる）により確認される。その後、層が剥離して、ｓｉＧＬＯ分子をサイトゾルに放出する。これら分子は、凝集して、インキュベーション時間にわたって拡大する拡散緑色領域を形成するであろう。Ｈｅｒｃｅら（Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｌｅｔｔ、２００４年、９２巻、１９頁）及びＨｕａｎｇら（Ｂｉｏｐｈｙ  Ｊ．２００９年、９７巻、１９１７頁）は、陽イオン性ペプチドが脂質二重膜と結合すると、エンドソーム脂質膜に細孔を形成するのに十分な強さであり得る内部応力がもたらされることを報告している。
【００８１】
細胞培養及びＬｂＬ  ＮＰの細胞取込み
ヒト包皮に由来するＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）で培養し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して分離し、１：２〜１：４の比で継代した。
【００８２】
４×１０３細胞を、８ウェルガラス底チャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ネイパービル、イリノイ州、アメリカ合衆国；１ウェルのサイズ：０．７ｃｍ×０．７ｃｍ、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中）で一晩接種した。１０μｇのｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬ  ＮＰを添加する前に、培地をＯｐｔｉ−Ｍｅｍに変更した。更に４時間インキュベーションした後、培地をＰＢＳに置換することによりＣＬＳＭ測定を実施した。３００μＬの３００ｎＭ  ＤＡＰＩデレクタート（ｄｅｌｅｃｔａｔｅ）を細胞に５分間添加し、ＰＢＳですすぐことにより、細胞核対比染色のためのＤＡＰＩ染色を実施した。細胞内の酸性細胞小器官を追跡するために、製造業者の説明書に従ってライソトラッカーレッドを添加した。共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）、Ｚｅｉｓｓ社、ＬＳＭ  ５１０を使用して、共焦点顕微鏡画像を撮影した。
【００８３】
細胞−粒子相互作用をフローサイトメトリーで分析するために、１ウェル当たり２×１０５個のＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞を６ウェルプレートに接種し、一晩培養した。ｓｉＧＬＯ負荷ＬｂＬ  ＮＰを添加する前に、培地をｏｐｔｉ−ｍｅｍに変更した。４時間インキュベーションした後、トリプシン−ＥＤＴＡ中で５分間３７℃にてインキュベーションすることにより細胞を分離し、穏やかに混合して単離細胞を達成した後、２倍容積の完全培地を添加した。培地の完全除去は、３００ｒｃｆで遠心分離し、その後ＰＢＳで洗浄することにより達成した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー測定まで常に暗所氷上にて保管した。クエンチングの場合、１０μＬの０．４％トリパンブルーを細胞に添加して、膜に結合したＬｂＬ  ＮＰを除去した。細胞のフローサイトメトリーを直ちに実施した。各実験を３回繰り返した。１つの代表的なデータが示されている。
【００８４】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）
標識粒子の蛍光強度、並びに粒子との細胞インキュベーションを、ＦＣＭ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ合衆国）で調査した。４８８ｎｍでレーザ励起した後、ＦＬ−１チャネル（バンドパス：５３０±１５ｎｍ）でｓｉＧＬＯ  Ｇｒｅｅｎを検出した。１０４回の事象を、担体／細胞相互作用の関連領域で検出し、ＷｉｎＭＤＩ２．９ソフトウエアを使用して分析した。
【００８５】
共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）
ＮＰ／細胞相互作用及び取込みの視覚化は、ＣＬＳＭ（Ｚｅｉｓｓ社、ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ、イェーナ、ドイツ）で実施した。ｓｉＧＬＯ緑色蛍光強度を検出するために、Ａｒ／Ｋｒレーザ（励起波長：４８８ｎｍ）を使用し、Ｈｅ／Ｎｅレーザ（励起波長：５４３ｎｍ）で赤色蛍光（ライソトラッカーレッド）を検出した。ｓｉＧＬＯ及びライソトラッカーレッドの発光は、バンドパスフィルター（５０５〜５３０ｎｍ及び５６０〜６１５ｎｍ）で検出した。
【００８６】
ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有する多層ナノ粒子
高分子電解質としてポリ（Ｌ−アルギニン）（ＡＲＧ）及びデキストラン（ＤＸＳ）を有する交互積層（ＬｂＬ）ナノ粒子（ＮＰ）の二重層にＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを含有する多層ナノ粒子を、線維芽細胞の細胞培養に送達した。ＬｂＬ  ＮＰの細胞結合及び取込み並びにｓｉＲＮＡ送達を、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞で研究した。ｓｉＧＬＯ−ｓｉＲＮＡ及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡは、ヒドロキシアパタイトナノ粒子に効率的にコーティングされていた。動的光散乱及び透過型電子顕微鏡を使用して、多層ＮＰを、粒径、ゼータ電位、及び表面形態に関して特徴付けた。ＳＰＡＲＣ−遺伝子サイレンシング及びｍＲＮＡレベルを、ＣｈｅｍｉＤＯＣ（登録商標）ウエスタンブロット技法及びＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。多層ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ組込みナノ粒子は、直径が約２００ｎｍであり、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞内に効率的に内在化される。また、好適なリポーターｓｉＲＮＡ並びにライソトラッカー染料でタグ化することにより、それらの細胞内運命を追跡した。共焦点顕微鏡観察により、粒子がエンドソームから脱出することが明白に示されている。ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞において、未処理細胞に対し有意な（６０％）ＳＰＡＲＣ−遺伝子ノックダウンが０．４ｐモルｓｉＲＮＡ／μｇのＬｂＬ  ＮＰを使用することにより達成され、ＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡの相対発現が有意に（６０％）低減された。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞増殖及びＭＴＴ細胞アッセイにより評価した細胞毒性は、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬ  ＮＰが無毒性であることを示した。結論として、記載されているＬｂＬ  ＮＰ系は、バイオポリマーを使用するｓｉＲＮＡ送達用の非ウイルスベクターとして、有望で安全な効率的送達プラットフォームを提供し、ｓｉＲＮＡ療法を開発するための遺伝子ノックダウン効率を増強する。
【００８７】
標的タンパク質レベルを、無染色技術により評価した。図９には、無染色ゲルに負荷した全溶解タンパク質試料からのタンパク質分離が示されており、ゲル並びに膜におけるＳＰＡＲＣタンパク質（４３ｋＤａ）に対応するバンドは、無染色（ＳＦ）技法によるタンパク質分離及び膜への移動を明白に示唆する。基質処理した後のＳＰＡＲＣ（４３ｋＤａ）に対応するバンドは、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを含有するＬｂＬ  ＮＰ及びＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡを有するリポフェクタミンによりタンパク質発現レベルが低減されたことを示す。しかしながら、ブランク細胞及びリポフェクタミン−スクランブルｓｉＲＮＡの場合、バンド強度の低下はなく、タンパク質発現レベルの低減は示されなかった。
【００８８】
Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（商標）ソフトウェアを使用して全タンパク質に対するバンド強度の正規化を実施した。データは、対照細胞に対するノックダウン％として図１０に報告されている。ＳＰＡＲＣ負荷ＬｂＬ  ＮＰのノックダウンパーセントは６０％であり、陽性対照としてのリポフェクタミンを有するＳＰＡＲＣは、８９％である。ブランク細胞並びにスクランブル−ｓｉＲＮＡと比較したＬｂＬ  ＮＰのノックダウン効率に関する統計分析は、有意差を示している（ｐ＜０．００１）。したがって、このデータは、ＬｂＬ  ＮＰにより送達されたＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡによって、標的タンパク質発現が低減されたことを示す。非特異的なｓｉＲＮＡによるノックダウンはなく、非ウイルス送達ベクターとしてのＬｂＬ  ＮＰの有効性が示された。
【００８９】
ウエスタンブロットによる遺伝子ノックダウン評価
線維芽細胞（１．２×１０５個、２ｍＬ）を、６ウェルチャンバの完全ＤＭＥＭ培地に接種し、２４時間培養した。ＳＰＡＲＣ  ｓｉＲＮＡ官能化ＬｂＬ  ＮＰ、ＳＰＡＲＣを有するリポフェクタミン、及び４００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含有するスクランブル−ｓｉＲＮＡ試料で細胞を処理した。いかなる処理も施していない細胞を、ブランク細胞として使用した。ＮＰインキュベーションの２４時間後にｏｐｔｉｍｅｍを完全ＤＭＥＭ培地に変更した。４日間インキュベーションした後、細胞を回収し、溶解した。
【００９０】
９６時間の所定のインキュベーション時間後、細胞溶解緩衝液を使用してタンパク質抽出を実施した。各ウェルの抽出タンパク質を、クマシーブルーを使用して５９５ｎｍで分析した。様々な試料に由来する当量（３０μｇ）のタンパク質及びラダー（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ（商標））を、ゲルに負荷した。タンパク質を分離した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して画像化を実施して、タンパク質分離ステップを検証し、更にＰＶＤＦ膜へのタンパク質移動を、Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）システムを２００Ｖで約４０分間使用することにより実施した。タンパク質移動後の膜を、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ撮像装置で視覚化して、膜へのタンパク質移動を検証し、更に膜を２０℃にて１時間５％スキムミルクでブロックした。
【００９１】
抗体処理は、２．５％スキムミルクで１：１０００希釈して一次抗体（マウスモノクローナルＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いて膜をプローブすることより達成し、２０℃で１時間、インキュベートした。更に膜をＴＢＳＴで３回、１０分間断続的に洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダイゼ結合抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｌａｂｓ社）を２．５％スキムミルクで１：１００００に希釈した。二次抗体を有する膜を、２０℃で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴを用いて、５分間断続的に６回洗浄した。バンドは、化学発光基質を使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置でデジタル化して視覚化した。画像は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して撮影した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後、全タンパク質画像を取得し、ブロットを全て、対照細胞に対して正規化した。ＳＰＡＲＣタンパク質レベルを相対的に定量するために、４３ｋＤのＳＰＡＲＣに対応するバンドを、三重重複試験で選択した。平均値及び標準偏差が報告されている。
【００９２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究
ＳＰＡＲＣ−タンパク質ノックダウンが、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞のｍＲＮＡ発現減少により媒介されることを確認するため、本発明者らは、ＬｂＬ−ＳＰＡＲＣ及びリポフェクタミン−ＳＰＡＲＣ処理の９６時間後に、相対的なＳＰＡＲＣ及びＲＰＬ１３  ｍＲＮＡレベルを測定した（図１０）。ｍＲＮＡレベルは、ＬｂＬ−ＳＰＡＲＣ  ＮＰ処理細胞では０．４±０．０４倍に低減された（対照細胞又は未処理細胞に対して）。これは、リポフェクタミン−ＳＰＡＲＣ処理細胞によるｍＲＮＡレベルと同等である。スクランブル−ｓｉＲＮＡ及び未処理細胞に関してはｍＲＮＡレベルの低減はなかった。同様の結果は、ヒトテノン嚢線維芽細胞（ＨＴＦ）におけるＳＰＡＲＣタンパク質ノックダウンに関して、Ｗｏｎｇら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２０１２年、１６巻、１２４５頁）により以前に報告されている。ＬｂＬ  ＮＰ処理時のｍＲＮＡレベルの有意な低減（ｐ＜０．０１）は、ＳＰＡＲＣ遺伝子の発現サイレンシングのために、ＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡが効率的に細胞に送達されることを明白に示す。更に、ＬｂＬ  ＮＰは、線維芽細胞のｍＲＮＡレベル並びにＳＰＡＲＣタンパク質発現の減少に有効であることが示されている。
【００９３】
ＳＰＡＲＣタンパク質を標的とし、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞のｍＲＮＡレベルを低減させるＬｂＬナノ粒子は、線維症を最小限に抑えるための治療戦略としてｓｉＲＮＡを使用するための有望な手法であることが明白に確認された。
【００９４】
２、７、及び１４日目のマウス線維芽細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＰＡＲＣサイレンシング
複数のＬｂＬ濃度による細胞処理：１ウェル当たり３０，０００個の細胞。処理ＬｂＬ  ＮＰ：２００ｕｇ  ＬｂＬ（２０ｕＬ  ＬｂＬ懸濁系）ＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現は、上述のように唯一の負荷電ポリマーがＲＮＡであったナノ粒子を使用してｑＰＣＲにより測定した。結果は、図１０Ｂ〜Ｄに示されている。
【００９５】
ＲＮＡ調製、ｃＤＮＡ合成、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＬｂＬ−ＳＰＡＲＣ  ＮＰ処理後のｍＲＮＡレベルを、６ウェル組織培養プレートに１２０，０００細胞／ウェルの密度で、２４時間ＤＭＥＭ培地に細胞を播種することにより調査した。各々４００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡに対応するＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ負荷ＬｂＬ  ＮＰ、リポフェクタミン−ＳＰＡＲＣ、及びリポフェクタミン−スクランブルｓｉＲＮＡで細胞を処理し、処理の４日後にｍＲＮＡ発現を評価した。
【００９６】
製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社、シンガポール）を使用し、全ＲＮＡを抽出した。ファーストストランドｃＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、シンガポール）を用いて、２５０ｎｇの全ＲＮＡ抽出物、及び１ｕＬの５０ｎｇ／μＬランダム六量体プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、シンガポール）で合成した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、３８４ウェルマイクロタイタープレートにて、１０ｕＬの全容積で実施した。各反応は、０．５μＬのファーストストランド反応生成物、各０．２５μＬの上流プライマー及び下流プライマー（各１０μＭ）、５μＬのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）、及び４μＬの無ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅ蒸留水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、アメリカ合衆国）からなっていた。ｃＤＮＡ断片の増幅及び分析は、Ｒｏｃｈｅ社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、インディアナポリス、アメリカ合衆国）を使用することにより実施した。ＰＣＲ反応は全て、三重重複で実施した。ｍＲＮＡレベルは全て、ＣＴ閾値レベルとして測定し、対応する６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３’（ＲＰＬ１３）ＣＴ値で正規化した。値は、２−ΔΔＣＴ法により、未処理ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）対照細胞の対応する値に対する倍数増／減として表されている。以下のプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲに使用した：
ＲＰＬ１３遺伝子：順方向プライマー  ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧ（配列番号５）
逆方向プライマー  ＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣ（配列番号６）
ＳＰＡＲＣ遺伝子  順方向プライマー  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＧ（配列番号７）
逆方向プライマー  ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧ（配列番号８）
多層ナノ粒子の細胞毒性試験
ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞増殖アッセイ
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Ｒｏｃｈｅ社）は、組織培養プレートの底部に組み込まれている微小電極間の電気インピーダンスを測定することにより、細胞のリアルタイムモニタリングを提供する。適用した９６ウェル電極プレートを、まず完全培地でブランク取りし、続いて１ウェル当たり４×１０３細胞を接種した。種々の量のＬｂＬ  ＮＰを細胞に添加し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ機器に設置する前に、プレートを３０分間室温でインキュベートした。細胞増殖を、５分間隔で２５回スイープし、その後１５分間隔で２４回スイープし、その後は１時間間隔で測定して、約７日間連続モニタリングした。試料は、三重重複で実験し、３回繰り返した。全測定のうち代表的な１つのグラフが示されている。
【００９７】
ＭＴＴ細胞増殖アッセイ
１ウェル当たり４×１０３細胞を、９６ウェルプレート（ＴＰＰ）の完全培地に接種し、一晩培養した。種々の量のＬｂＬ  ＮＰ（０．０４〜０．４μｇ／μＬ）を、三重重複で細胞に添加し、１〜７日間インキュベータに注意深く入れておいた。全培養容積の１０％にあたるＭＴＴ（ＰＢＳ中、５ｍｇ  ｍｌ−１）を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。続いて、溶液をウェルから注意深く除去し、１００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。プレートを１時間以上穏やかに振とうして結晶を溶解させ、その間常にカバーをかけて直射日光から遠ざけておいた。その後、各ウェルの吸光度を、５９５ｎｍの波長で測定した。
【００９８】
生体適合性及び低細胞毒性は、許容されるｓｉＲＮＡ送達系の重要な要件である。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ及びＭＴＴアッセイという２つの細胞増殖法により、ＬｂＬ  ＮＰを、７日間にわたって濃度依存性研究で調査した（図１２）。図１２ａは、ＬｂＬ  ＮＰを一切含まないＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞並びに漸増量のナノ粒子を含むＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞の生物学的状態を表している。より少量の粒子量（２μｇ、５μｇ、及び１０μｇ）は、未処理対照細胞よりもわずかに低いだけの、同様の細胞指標値を示した。より高いＬｂＬ  ＮＰ量（１５μｇ及び２０μｇ）の場合、細胞は、ナノ粒子の量が増加するほど有意に低い細胞指標値を示した。
【００９９】
ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞に対するＬｂＬ  ＮＰの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイで交差研究した。図１２ｃで観察されるように、ＦｉｂｒｏＧＲＯ（登録商標）細胞は、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイで既に示されているように粒子量に依存せずに同様の細胞増殖を示した。細胞生存能に対する粒子の有意な影響は、全ての粒子濃度で７日間は観察することができない。これらの結果は、ＬｂＬ  ＮＰに基づくＳＰＡＲＣ−ｓｉＲＮＡ送達系が線維芽細胞において高い生体適合性を有することを示す。
【０１００】
生物へのＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ送達
１層のｓｉＲＮＡ  ＳＰＡＲＣ層のｑＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において２日目にのみ見られたｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンは、２日目にのみＳＰＡＲＣ及びコラーゲンがサイレンシングされたことを示した。７日目には、ＳＰＡＲＣの著しいサイレンシングが示されたが、コラーゲンのサイレンシングが示されなかった。１０日目には、ＳＰＡＲＣ又はコラーゲンのノックダウンは示されなかった。
【０１０１】
ノックダウンの持続には、単層ではなく、複数（２）層のｓｉＲＮＡが必要である。ナノ粒子による結膜へのｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ送達。表示されているｓｉＲＮＡを負荷した５ｕｌのＬｂＬナノ粒子を、実験的手術直後にマウス結膜に注射した。外科手術後の７日目及び１４日目に組織を採取し、Ｓｐａｒｃ（左）及びコラーゲンＣｏｌ１ａ１（右）のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで分析した。各記号は、３匹のマウスに由来する組織の貯留を表し、右眼に由来する対の未手術組織に対する、対となる左眼に由来するナノ粒子を注射した手術組織中の発現比として算出されている。黒色バーは、各条件での平均倍数変化を示す。矢印は、ｓｉＳｃｒａｍ負荷ナノ粒子と比べた、ｓｉＳｐａｒｃ負荷ナノ粒子による変化の方向を示す。矢印の左側にある数字は、ｓｉＳｐａｒｃによる平均倍数変化に対するｓｉＳｃｒａｍによる平均倍数変化の比率を示す。矢印の右側にある数字は、ｓｉＳｃｒａｍナノ粒子注射とｓｉＳｐａｒｃナノ粒子注射との倍数変化を比較するｐ値を示す。
【０１０２】
データは、複数層のｓｉＲＮＡを有するＬｂＬが、ノックダウン持続をｉｎ  ｖｉｖｏで達成することができることを示す。
そのような系（ＬｂＬ）の応用は、ｓｉＲＮＡを標的系及び疾患に持続送達する際の有用な調査用研究開発ツールとして使用することができ、また、持続的ｓｉＲＮＡ療法へと発展させることができる可能性がある。
【０１０３】
統計
各実験は、少なくとも３回繰り返した。データは全て、平均±標準偏差（ＳＤ）として表されている。値は全て、三重重複測定の平均として示されている。統計的有意差（Ｐ＜０．００１）は、両側ｔ検定を使用して決定した。
【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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