(57)【要約】【課題】分岐ポリマーの有用性をさらに拡大して好適な特性を示す新しい構造を有する分岐ポリマーを開発すること。【解決手段】本発明は、支持部分と、それぞれ該支持部分に共有結合しており、且つ該支持部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含む分岐ポリマーに関するものであり、少なくとも３つのホモポリマー鎖はカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持部分と、それぞれ前記支持部分に共有結合しており、且つ前記支持部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含むミクトアーム分岐ポリマーであって、
前記少なくとも３つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、分岐ポリマー。
【請求項２】
少なくとも３つのホモポリマー鎖の１以上が分解性官能基を介して支持部分に共有結合している、請求項１に記載の分岐ポリマー。
【請求項３】
支持部分に共有結合している１より多くのカチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖又は疎水性ホモポリマー鎖を有する、請求項１又は２に記載の分岐ポリマー。
【請求項４】
星型ポリマーの形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分岐ポリマー。
【請求項５】
支持部分が架橋されたポリマーの支持部分の形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分岐ポリマー。
【請求項６】
架橋されたポリマーの支持部分が、ジスルフィドジメタクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールエトキシ化ジアクリレート（ＨＥＤＡ）、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアリルオキシジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパントリ（メタ）アクリレート、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリルフタレート、ジアリルテレフタレート、ジビニルベンゼン、メチロール（メタ）アクリルアミド、トリアリルアミン、オレイルマレエート、グリセリルプロポキシトリアクリレート、アリルメタクリレート、無水メタクリル酸、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタ−２−エン−１，４−ジアクリレート、ビスフェノールＡエトキシ化ジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタニミン、アジピン酸ジビニル、４，４’−ジビニルビフェニル及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドから選択される１以上の多官能性モノマーの重合残基を含む、請求項５に記載の分岐ポリマー。
【請求項７】
カチオン性ホモポリマー鎖が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルフォリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルフォリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化アリルジメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、及び４−ビニルピリジンから選択される１以上のモノマーの重合残基を含み；
親水性ホモポリマー鎖が、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリロイルモルフォリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート及びＮ−ビニルピロリドンから選択される１以上のモノマーの重合残基を含み；並びに
疎水性ホモポリマー鎖が、スチレン、α−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート及びビニルラウレートから選択される１以上のモノマーの重合残基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分岐ポリマー。
【請求項８】
支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含むミクトアーム分岐ポリマーを調製する方法であって、
前記少なくとも３つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含み、前記方法が、
（ｉ）各ホモポリマー鎖がそれに共有結合されたリビング重合部分を有する、カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖及び疎水性ホモポリマー鎖を提供することと、
（ｉｉ）前記カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖及び疎水性ホモポリマー鎖のそれぞれが共有結合される架橋ポリマー支持部分を形成するように、リビング重合部分の制御下で１以上の多エチレン性不飽和モノマーを重合させることとを含む方法。
【請求項９】
ミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体であって、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも３つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、複合体。
【請求項１０】
少なくとも３つのホモポリマー鎖が、約１０〜約２００のモノマー残基単位を含むカチオン性ホモポリマー鎖を含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
少なくとも３つのホモポリマー鎖が、約１０〜約１５０のモノマー残基単位を含む親水性ホモポリマー鎖を含む、請求項９又は１０に記載の複合体。
【請求項１２】
少なくとも３つのホモポリマー鎖が、約１５〜約１５０のモノマー残基単位を含む疎水性ホモポリマー鎖を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
約１０ｍＶ〜約４０ｍＶの範囲に及ぶゼータ電位を有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
核酸分子が、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小分子／短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡｓ）、核内小分子（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的推移に介在するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答性ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
細胞に核酸分子を送達する方法であって、前記方法が
（ａ）ミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体を提供することと、
（ｂ）前記細胞に前記複合体を送達することとを含み、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも３つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子発現をサイレンシングする方法であって、前記方法がミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体で細胞に形質移入することを含み、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも３つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、方法。
【請求項１７】
インビボで実施される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
分岐ポリマーが星型ポリマーの形態である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも３つのホモポリマー鎖の少なくとも１つが標的化リガンド、イメージング剤、生物活性剤、又はそれらの組み合わせを抱合している、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
複合体が被験体に投与される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にミクトアーム（ｍｉｋｔｏ−ａｒｍ）分岐ポリマーに関する。言い換えれば、本発明は少なくとも３つの異なるポリマーアームを有する分岐ポリマーに関する。ミクトアーム分岐ポリマーは核酸分子との複合体を形成することに使用するのに特に適しているので、この適用を強調しながら本発明を記載することは好都合であろう。しかしながら、ミクトアーム分岐ポリマーは種々の他の適用で使用され得ることが理解されるべきである。従って、本発明はまた、核酸分子とミクトアーム分岐ポリマーの複合体、核酸分子を細胞に送達する方法におけるそのような複合体の使用、及び遺伝子発現をサイレンシングする方法にも関する。本発明はさらに、核酸分子を酵素分解から保護する方法におけるミクトアーム分岐ポリマーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分岐ポリマーは、少なくとも３つのポリマー鎖が結合する原子又は分子のような支持部分を含むことが当該技術で知られるポリマーの一種である。少なくとも３つのポリマー鎖は分岐ポリマーの「アーム」と呼ばれることがある。分岐ポリマーの具体的な種類には、星型ポリマー、櫛型ポリマー、ブラシ型ポリマー及びデンドリマーが挙げられる。
【０００３】
分岐ポリマーは種々の独特の特性を示すことが見いだされており、たとえば、エラストマー、界面活性剤、潤滑剤、及び生物活性剤のための送達剤として機能する多様な応用で採用されている。
【０００４】
生物活性剤の送達は、たとえば、生物活性の安定性、放出速度、放出の誘因及び生体適合性のような、結果に影響を与える多数の変動要因があるので、難題のままである。
【０００５】
従って、このクラスのポリマーの有用性をさらに拡大するのに好適な特性を示す新しい分岐ポリマーの構造を開発する機会が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１３０７１号
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、支持部分と、それぞれ該支持部分に共有結合しており、且つそれから伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含む分岐ポリマーを提供し、ここで、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【０００８】
本発明に係る分岐ポリマーは、驚くべきことに核酸分子との複合体を効率的に形成するのを可能にするだけでなく、得られる複合体の血清安定性及び細胞への取り込みを向上させることも可能にする、少なくともカチオン性、親水性及び疎水性のホモポリマーの特徴の独特の組み合わせを提供することがここで見出された。
【０００９】
支持部分に連結された少なくとも３つのホモポリマーのアームのそれぞれが異なるので、分岐ポリマーはミクトアーム分岐ポリマーとも呼ばれてもよい。
【００１０】
国際公開第２０１３／１１３０７１号は、支持部分と、支持部分に共有結合しており、且つそれから伸びる少なくとも３つのブロックコポリマー鎖とを含む分岐ポリマーを開示している。ブロックコポリマー鎖はそれぞれ、親水性ポリマーブロックと、カチオン性ポリマーブロックと、任意で疎水性ポリマーブロックとを含む。驚くべきことに、国際公開第２０１３／１１３０７１号にて開示された分岐ポリマーに類似するポリマー成分を有するにもかかわらず、本発明に係る分岐ポリマーのミクトアームホモポリマー構造は国際公開第２０１３／１１３０７１号にて開示された分岐ブロックコポリマー構造に比べて改善された特性を明らかにしている。
【００１１】
たとえば、本発明に係る分岐ポリマーのミクトアームホモポリマー構造は改善された遺伝子サイレンシング特性を示す。そのような改善された特性には低投与量での遺伝子サイレンシングが含まれる。たとえば、効果的な遺伝子サイレンシングは、国際公開第２０１３／１１３０７１号にて開示された分岐ブロックコポリマー構造を用いた少なくとも２５０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度に比べて５０ｎＭという低いｓｉＲＮＡ濃度にて得られている。複数の細胞株での使用も実証されているということは、多用途性を示している。本発明に係る分岐ポリマーのミクトアームホモポリマー構造は、国際公開第２０１３／１１３０７１号にて開示された分岐ブロックコポリマー構造によって同じ目標を達成するのに必要とされる多工程アプローチに比べてアームの末端でさらに容易に官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅ）することもできる。
【００１２】
一実施形態では、分岐ポリマーはミクトアーム星型ポリマーである。
【００１３】
別の実施形態では、少なくとも３つのホモポリマー鎖の１以上が分解性の官能基を介して支持部分に共有結合している。
【００１４】
分解性の官能基の分解によって、共有結合が切断され、ホモポリマー鎖は支持部分から切り離されてしまう。
【００１５】
少なくとも３つのホモポリマー鎖のそれぞれが分解性の官能基を介して支持部分に共有結合していてもよい。
【００１６】
別の実施形態では、支持部分は、分解を受ける際、その分子構造における１以上の共有結合の切断と、支持部分からの少なくとも３つのホモポリマー鎖の少なくとも１つの放出とを生じる１以上の分解性の官能基を含む分子構造を有する。
【００１７】
１以上のホモポリマー鎖の分岐ポリマーからの喪失は、たとえば、親水性、疎水性及び／又はカチオン性の特徴のようなポリマーの特性における変化を有利に促進することができる。分岐ポリマーの分子量も当然低下するであろう。
【００１８】
分解性官能基の適当な選択及び位置を介して、特定の分解環境にて特定の構造的な変換を受けるように分岐ポリマーを設計することができる。
【００１９】
一実施形態では、分解性官能基は生分解性官能基である。
【００２０】
たとえば、核酸分子との複合体を形成するように分岐ポリマーを設計してもよく、複合体の投与とその後の形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の際、好適に位置する生分解性官能基が生分解を受け、その結果、分岐ポリマー構造からの１以上のホモポリマー鎖の分離を生じる。細胞内での分岐ポリマーのこの構造変換は、核酸分子の向上した利用性を提供し、且つ分岐ポリマー（及び／又はその残基）の代謝及びクリアランスを促進し得る。
【００２１】
従って、本発明はまた、分岐ポリマー及び核酸分子を含む複合体も提供し、該分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【００２２】
この文脈では、複合体自体は分岐ポリマーと核酸分子との間で形成されることが十分に理解されるであろう。
【００２３】
分岐ポリマーは種々の核酸分子と安定な複合体を形成することができ、得られる複合体は種々の細胞型への核酸分子の改善された形質移入を提供する。分岐ポリマーは、複合体の形態であるとき、酵素分解からの核酸分子の良好な保護を提供することも見いだされている。
【００２４】
分岐ポリマーの少なくとも３つのホモポリマーアームのそれぞれは、所与の核酸分子との効率的な複合体化及び／又は所与の細胞型による核酸分子の効率的な形質移入を提供するように有利にオーダーメイドで設計され得る。選択された標的細胞型に複合体を指向する標的化リガンドを組み込むように分岐ポリマー及び／又は核酸分子を有利にオーダーメイドで設計することもできる。
【００２５】
一実施形態では、分岐ポリマー及び／又は核酸分子は標的化リガンドを抱合している。
【００２６】
別の実施形態では、分岐ポリマーは、支持部分に共有結合している１よりも多いカチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖、又は疎水性ホモポリマー鎖を有する。
【００２７】
本発明はまた、核酸分子を細胞に送達する方法も提供し、該方法は、
（ａ）分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体を提供することと、
（ｂ）該複合体を細胞に送達することとを含み、
分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖、及び疎水性ホモポリマー鎖が含まれる。
【００２８】
一実施形態では、核酸分子は遺伝子発現をサイレンシングする目的で細胞に送達される。
【００２９】
従って、本発明はまた、遺伝子発現をサイレンシングする方法も提供し、該方法は、分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体で細胞に形質移入することを含み、分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖、及び疎水性ホモポリマー鎖が含まれる。
【００３０】
本発明のこの態様及び他の態様の一実施形態では、核酸分子はＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【００３１】
さらなる実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小分子／短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体小分子（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ）ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内小分子（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ）（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的推移（ｓｐａｔｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に介在（ｍｅｄｉａｔｅ）するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答性ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３２】
本発明に係る分岐ポリマーは酵素分解に対して核酸分子を保護することも見いだされている。
【００３３】
従って、本発明はまた、酵素分解から核酸分子を保護する方法も提供し、該方法は、支持部分、およびそれぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖を含む分岐ポリマーと、核酸分子を複合体化することを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【００３４】
核酸分子を細胞に送達するための複合体の使用も提供され、該複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【００３５】
本発明はさらに、遺伝子発現をサイレンシングするための複合体の使用を提供し、複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【００３６】
本発明はその上さらに、酵素分解から核酸を保護することにおける分岐ポリマーの使用を提供し、分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖とが含まれる。
【００３７】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、発明の詳細な説明にて以下で明らかにする。
【００３８】
本発明は、以下の非限定的な図面を参照しつつ本明細書にて記載される。
【００３９】
一部の図は、着色の表示又は実体を含む。図の着色版は要請に応じて入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明に係る分岐ポリマーの模式図である。
【図２】図２は、本発明に係る分岐ポリマーを調製する方法の模式図である。
【図３】図３は、９０℃でＤＭＦにて［ＲＡＦＴ］：［ＡＣＣＮ］＝１．０：０．３の相対モル比で鎖（ｃｈａｉｎ）移動剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸を用いたＲＡＦＴを介したポリ［（オリゴ（エチレングリコールメタアクリレートエチレングリコールメタアクリレート）］、ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタアクリレート２−（ジメチルアミノ）エチルメタアクリレート］、ポリ（ｎ−ブチルメタアクリレートｎ−ブチルメタアクリレート）の線形重合のためのモノマー変換による数平均分子量及び分散度の（Ａ）片対数プロット及び（Ｂ）発生を示す図である。
【図４】図４は、（Ｉ）それぞれＰ（ＯＥＧＭＡ８−９）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）及びＰ（ｎ−ＢＭＡ）による３つのマクロＲＡＦＴ剤（図４（Ｉ）ではＭ−ＲＡＦＴ１、２、３として示す）について得られたＧＰＣトレース、（ＩＩ）異なる［架橋剤／マクロＲＡＦＴ］の比＝８、１２、１６で合成されたミクトアーム星型ポリマーのＧＰＣトレース、（ＩＩＩ）異なるＰ（ｎ−ＢＭＡ）モル比：Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９）／Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）／Ｐ（ｎ−ＢＭＡ）＝３／３／ｘにてｘ＝３，２，１，０で合成されたミクトアーム星型ポリマーのＧＰＣトレース、並びに（ＩＶ）粗精製の星型ポリマー、精製星型ポリマー、混合アームポリマー及び切断された星型ポリマーのＧＰＣトレースを示す図である。
【図５】図５は、精製ミクトアームポリマーＳ３−６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である（詳細は表２を参照のこと）。
【図６】図６は、ミクトアーム星型ポリマー及び四級化ミクトアーム星型ポリマーＳ３−６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である（詳細は表２を参照のこと）。
【図７】図７は、実施例１の実験結果で調製された一連のポリマーについてのポリマー：ｓｉＲＮＡの比（ｗ／ｗ）の関数としてのミクトアームポリマーのｓｉＲＮＡとの関連を示す図である：（Ｉ）ポリマー単独、（ＩＩ）Ｎ：Ｐ比＝２、（ＩＩＩ）Ｎ：Ｐ比＝５及び（ＩＶ）Ｎ：Ｐ比＝１０.
【図８】図８は、還元条件下（ＴＣＥＰ）でのｓｉＲＮＡの解放を示す図である。
【図９】図９は、異なるポリマー濃度での細胞株Ｈｕｈ７、Ａ５４９及びＣＨＯ−ＧＦＰにおいて、実施例１で調製されたミクトアーム星型ポリマーによる細胞生存率を示す図である。
【図１０】図１０は、細胞株ＣＨＯ−ＧＦＰ、Ａ５４９及びＨｕｈ７におけるサイレンシング実験に用いた異なる濃度でのミクトアーム星型ポリマーによる細胞生存率を示す図である。
【図１１】図１１は、２及び１のＮ：Ｐの比で実施例１にて記載されるように調製されたミクトアームポリマーの％ＧＦＰ平均蛍光によって測定された、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞における遺伝子サイレンシングを示す図である。
【図１２】図１２は、１２５ｎＭ及び５０ｎＭの濃度でのミクトアームポリマーＳ４−１及びＳ４−５によるＡ５４９細胞及びＨｕｈ７細胞におけるＣＯＰＡのサイレンシングを示す図である。
【図１３】図１３は、ミクトアームポリマーＳ４−４を用いたＨｕｈ７細胞への抗癌剤ＳＮ３８の送達を示す図である。
【図１４】図１４は、内部移行を実証する共焦点顕微鏡像を用いた、ＣＨＯ細胞の細胞質におけるｓｉＲＮＡ（緑色）及び標識（赤色）粒子の内部移行を示す図である。
【図１５】図１５は、国際公開第２０１３／１１３０７１号にて記載された方法に従って調製された４アームの星型ブロックコポリマーによるＣＨＯ−ＧＦＰ細胞における遺伝子サイレンシングを示す図である：ＴＬ３８−５０（５０％四級化）、ＴＬ３８−１００（１００％四級化）、ＴＬ−８４（ＰｏｌｙＦｌｕｏｒなしで１００％四級化）、及びＴＬ−８５（ＰｏｌｙＦｌｕｏｒで１００％四級化）。
【図１６】図１６は、ｑＲＴ＿ＰＣＲ分析によるｓｓＢ  ｍＲＮＡ発現における倍数変化を示す図である：（Ａ）脾臓、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）肺、（Ｄ）肝臓。データはＰＢＳ対照と比較したＴｕｋｅｙ事後分析と共に反復測定ＡＮＯＶＡによって解析した。＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０５、ＮＳ＝有意差なし
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び、たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなその変形は、言及される整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除することを意味しないように理解される。
【００４２】
本明細書における先行刊行物（又はそれに由来する情報）又は既知である事柄に対する参照は、その先行刊行物（又はそれに由来する情報）又は既知の事柄が、本明細書が関係する試みの分野における技術的常識の一部を形成するという認知若しくは承認、又は任意の形態の示唆として解釈されず、また、解釈されるべきではない。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の態様を含むように意図される。従って、たとえば、「細胞」に対する参照は単一の細胞と同様に２以上の細胞を含み、「剤」に対する参照は単一の剤と同様に２以上の剤を含む、等である。
【００４４】
本発明の文脈で使用されるとき、表現「分岐ポリマー」は少なくとも３つのホモポリマー鎖が結合される支持部分を含むポリマーを意味するように意図される。分岐ポリマーはそのような支持部分を１よりも多く含んでもよい。
【００４５】
支持部分に結合される少なくとも３つのホモポリマー鎖のそれぞれは異なるので、分岐ポリマーはミクトアーム分岐ポリマーとも呼ばれてもよい。
【００４６】
具体的な種類の分岐ポリマーには、星型ポリマー、櫛型ポリマー、ブラシ型ポリマー及びデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明に係る分岐ポリマーは、それぞれ支持部分に共有結合している少なくとも１つのカチオン性ホモポリマー鎖と、少なくとも１つの親水性ホモポリマー鎖と、少なくとも１つの疎水性ホモポリマー鎖とを有する。便宜上、支持部分に共有結合している少なくとも３つのホモポリマー鎖は分岐ポリマーの「アーム」と呼ばれてもよい。
【００４８】
一実施形態では、分岐ポリマーはミクトアーム星型ポリマーである。
【００４９】
分岐ポリマーは３を超えるアームを有してもよい。たとえば、分岐ポリマーは、支持部分に結合された４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのホモポリマー鎖を有してもよい。
【００５０】
一実施形態では、分岐ポリマーは、支持部分に共有結合している（ｉ）カチオン性ホモポリマー鎖、（ｉｉ）親水性ホモポリマー鎖、及び／又は疎水性ホモポリマー鎖を１よりも多く有する。
【００５１】
別の実施形態では、カチオン性ホモポリマー鎖と、親水性ホモポリマー鎖と、疎水性ホモポリマー鎖との比は約１：１：１である。
【００５２】
少なくとも３つのホモポリマー鎖がそれぞれ支持部分に共有結合している場合、分岐ポリマーは支持部分に共有結合している１以上のコポリマー鎖も有してもよい。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「ホモポリマー」鎖は同一モノマーの重合残基に由来する分子構造を有するポリマー鎖を意味するように意図される。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「コポリマー」鎖は少なくとも２つの異なるモノマーの重合残基に由来する分子構造を有するポリマー鎖を意味するように意図される。
【００５５】
支持部分に結合された少なくとも３つのホモポリマー鎖はそれぞれ独立して分岐ホモポリマー鎖又は線状ホモポリマー鎖であってもよい。
【００５６】
本発明に係る分岐ポリマーは分岐ホモポリマー鎖と線状ホモポリマー鎖の組み合わせを有してもよい。
【００５７】
支持部分に結合されたホモポリマー鎖の「分岐」とは、ホモポリマー鎖が分岐構造を有する主なポリマー主鎖からの付属基を提示することを意味する。たとえば、分岐ホモポリマー鎖は、分岐したオリゴエチレンオキシド部分（たとえば、オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート）を含むモノマーに由来してもよく、それによって主なポリマー主鎖に付属する、分岐したオリゴエチレンオキシド基を提示する。
【００５８】
一実施形態では、支持部分に結合された少なくとも３つのホモポリマー鎖は線状ホモポリマー鎖である。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明に係る分岐ポリマーは星型ポリマーである。
【００６０】
「星型ポリマー」とは、少なくとも３つの共有結合したポリマーの鎖又はアームを生じる単一の枝部分を含む高分子を意味する。本発明によれば、（ｉ）その枝部分は支持部分を表し、支持部分は本明細書で記載されるような好適な原子、分子又は分子構造の形態であってもよく、且つ（ｉｉ）少なくとも３つの共有結合ポリマーの鎖又はアームは少なくとも３つのホモポリマー鎖である。
【００６１】
本発明に係る分岐ポリマーが星型ポリマーである場合、少なくとも３つのホモポリマー鎖はそれぞれ独立して線状又は分岐状であってもよい。
【００６２】
本発明に係る分岐ポリマーの星型ポリマーの形成は優れた特性を提供することが見いだされている。
【００６３】
「支持部分」とは、分岐ポリマーのアームが共有結合する、たとえば、原子、分子又はコアの構造のような部分を意味する。従って、支持部分は共有結合したアームを支えるように機能する。
【００６４】
分岐ポリマー、及び特に、表現「分岐ポリマー」及び「支持部分」によって意図されるものを記載するのを手助けするために、以下の一般式（Ａ）を参照してもよい。
【００６５】
【化１】
2017500390.tif 000002
式中、ＳＭは支持部分を表し、ＨＰ１はカチオン性ホモポリマー鎖を表し、ＨＰ２は親水性ホモポリマー鎖を表し、ＨＰ３は疎水性ホモポリマー鎖を表し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１以上の整数であり、たとえば、それぞれ独立して１〜１０の範囲の整数である。ａ、ｂ又はｃが１より大きい場合、これは１を超える関連するホモポリマー鎖が支持部分に共有結合している状況を表すことが理解される。少なくとも３つのホモポリマーアーム（ＨＰ１、ＨＰ２及びＨＰ３）の１以上が連結部分を介してＳＭに共有結合していてもよい。
【００６６】
一般式（Ａ）を参照すると、支持部分（ＳＭ）は、それに共有結合している少なくとも３つのホモポリマー鎖（ＨＰ１、ＨＰ２及びＨＰ３）のそれぞれを有し、そのようなものとして、ＳＭは、分岐が生じる構造的特徴として単純化して見られてもよい。
【００６７】
一般式（Ａ）の特徴は種々の分岐構造を提供してもよい。
【００６８】
本発明に係る分岐ポリマーは分岐が生じるそのような構造的特徴を一層多く有してもよい。たとえば、支持部分は、ポリマーのブラシ型構造を形成するように複数のカチオン性ホモポリマー鎖、複数の親水性ホモポリマー鎖、及び複数の疎水性ホモポリマー鎖が付属形態で共有結合している線状高分子であってもよい。
【００６９】
従って、本発明に係る分岐ポリマーは一般式（Ａ）の構造的特徴を含むものとして記載されてもよい。
【００７０】
支持部分が原子である場合、それは一般にＣ、Ｓｉ又はＮであるだろう。原子がＣ又はＳｉである場合、各原子に共有結合している第４のポリマー鎖があってもよい。
【００７１】
支持部分が分子である場合、それがそれに共有結合した少なくとも３つのホモポリマーアームを有することができるという条件であれば、その部分の性質に関する特定の制限はない。言い換えれば、分子は少なくとも三価でなければならない（すなわち、共有結合が生じる少なくとも３点を有する）。たとえば、分子は、置換されていてもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルオキシアシルアルキル、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリールオキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリールオキシ、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、配位錯体及びポリマー鎖の少なくとも三価の形態から選択することができ、ここで、存在すれば、アルキル鎖における−ＣＨ２−基又は各−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＳｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｓｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−ＯＢ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａ−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−から独立して選択される二価の基によって置換されてもよく、ここで、Ｒａ又は各Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、及びアシルから独立して選択されてもよい。Ｒａ又は各Ｒａはまた、水素、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ１−１８アルケニル、Ｃ１−１８アルキニル、Ｃ６−１８アリール、Ｃ３−１８カルボシクリル、Ｃ３−１８ヘテロアリール、Ｃ３−１８ヘテロシクリル、及びＣ７−１８アリールアルキルから独立して選択されてもよい。
【００７２】
支持部分がコア構造である場合、それがそれに共有結合した少なくとも３つのホモポリマーアームを有することができるという条件であれば、その部分の性質に関する特定の制限はない。言い換えれば、コア構造は共有結合が生じる少なくとも３点を有さなければならない。たとえば、コア構造は、たとえば、ナノ粒子状材料、又は架橋ポリマー粒子のようなポリマー粒子のような固形粒子状材料の形態であってもよい。その場合、コア構造のサイズは一般に約５Å〜約５００ｎｍ、たとえば、約１０Å〜約１００ｎｍ、又は約２０Å〜約１０ｎｍの範囲である。
【００７３】
架橋ポリマーの支持部分の例には、ジスルフィドジメタクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールエトキシ化ジアクリレート（ＨＥＤＡ）、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアリルオキシジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパントリ（メタ）アクリレート、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリルフタレート、ジアリルテレフタレート、ジビニルベンゼン、メチロール（メタ）アクリルアミド、トリアリルアミン、オレイルマレエート、グリセリルプロポキシトリアクリレート、アリルメタクリレート、無水メタクリル酸、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタ−２−エン−１，４−ジアクリレート（ＢＤＡ）、ビスフェノールＡエトキシ化ジアクリレート（ＢＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタニミン（ＤＳＢＡｍ）、アジピン酸ジビニル（ＤＶＡ）、４，４’−ジビニルビフェニル（ＤＶＰＢ）及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）から選択される１以上の多官能性モノマーの重合残基を含有するもの、又はそれらの重合を介して形成されるものが挙げられる。
【００７４】
分岐ポリマーがたった１つの支持部分を含み、且つ少なくとも３つのホモポリマーアームが線状である場合、分岐ポリマーは都合良く、星型ポリマー又はミクトアーム星型ポリマーと呼ばれてもよい。
【００７５】
支持部分を定義する場合、部分が由来する化合物又はコア構造を参照することも好都合であり得る。たとえば、支持部分は、それを介して少なくとも３つのホモポリマーアームが共有結合されるべきである反応性部位を提供する３以上の官能基を有する化合物又はコア構造に由来してもよい。その場合、支持部分は、たとえば、アルコール、ハロゲン、チオール、カルボン酸、アミン、エポキシド、イソシアネート及び酸塩化物から選択される３以上の官能基を有する化合物又はコア構造に由来してもよい。
【００７６】
支持部分が由来してもよい３以上のアルコール官能基を有する化合物の例には、グリセロール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール、１，２，３−トリヒドロキシヘキサン、トリメチロールプロパン、ｍｙｏ−イニシトール、グルコース及びその異性体（たとえば、ｄ−ガラクトース、ｄ−マノース、ｄ−フルクトース）、マルトース、スクロース、及びマニトールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
支持部分が由来してもよい３以上の官能（カルボン酸、メルカプト、ハロゲン又はイソシアネート）基を有する化合物の例には、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、シス，シス，−１，３，５−トリメチルシクロヘキサン−１，３，５−トリカルボン酸、１，２，４−ベンゼントリカルボン酸、アルギン酸、ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸、トリエチル１，１，２−エタントリカルボン酸、シクロヘキサン−１，２４，５−テトラカルボン酸、シクロペンタン−１，２，３，４−テトラカルボン酸、ビシクロ［２．２．２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプリオピオネート）、１，２，３−トリクロロプロパン、１，３，３−トリクロロブタン、１，２，３−トリクロロブタン、リジントリイソシアネート、及びトリフェニルメタン−４，４’，４’−トリイソシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
支持部分が由来してもよい３以上のアミン官能基を有する化合物の例には、ポリ（エチレンイミン）、１，２，３−トリアミノ−２−（アミノメチル）プロパン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ブタン−１，２，３，４−テトラアミン、及びペンタン−１，２，３，３−テトラアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
少なくとも３つのホモポリマー鎖はそれぞれ（すなわち、別々に）支持部分に共有結合される。各ホモポリマー鎖は直接又は間接的に支持部分に共有結合されてもよい。
【００８０】
「直接的」な共有結合とは、ホモポリマー鎖と支持部分との間にたった１つの共有結合があることを意味する。
【００８１】
「間接的」な共有結合とは、ホモポリマー鎖と支持部分との間に１以上の共有結合原子又は分子が位置することを意味する。
【００８２】
ホモポリマー鎖が支持部分に間接的に共有結合される場合、連結部分を介して支持部分に共有結合されるようなホモポリマー鎖を指すことが好都合であってもよい。
【００８３】
一実施形態では、少なくとも３つのホモポリマー鎖の少なくとも１つが連結部分を介して支持部分に共有結合される。
【００８４】
別の実施形態では、少なくとも３つのホモポリマー鎖のそれぞれが連結部分を介してそれぞれ支持部分に共有結合される。
【００８５】
連結部分が支持部分にホモポリマー鎖を結合するように機能することができるという条件であれば、そのような連結部分の性質に関して特別の制限はない。連結部分は、これが支持部分に結合されるコポリマー鎖全体の形成を生じるので、当然に別のポリマー鎖ではないであろう。
【００８６】
好適な連結部分の例には、置換されていてもよい、オキシ（−Ｏ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル（−Ｃ（Ｏ）−を含む）、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルオキシアシルアルキル、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリールオキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリールオキシ、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、及びアリールヘテロアリールチオの二価の形態が挙げられ、存在する場合、−ＣＨ２−基又は任意のアルキル鎖における各−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＳｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｓｉ（ＯＲａ）２Ｏ−、−ＯＢ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａ−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−から独立して選択される二価の基によって置換されてもよく、ここで、Ｒａ又は各Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、及びアシルから独立して選択されてもよい。Ｒａ又は各Ｒａはまた、水素、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ１−１８アルケニル、Ｃ１−１８アルキニル、Ｃ６−１８アリール、Ｃ３−１８カルボシクリル、Ｃ３−１８ヘテロアリール、Ｃ３−１８ヘテロシクリル、及びＣ７−１８アリールアルキルから独立して選択されてもよい。
【００８７】
２以上の亜基（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）（たとえば、［Ａ基］［Ｂ基］）を含有する基に対する本明細書での参照は、亜基が提示される順序に限定されるようには意図されない。従って、［Ａ基］［Ｂ基］（たとえば、アルキルアリール）と定義される２つの亜基は［Ｂ基］［Ａ基］（たとえば、アリールアルキル）と定義される２つの亜群への参照であるようにも意図される。
【００８８】
連結部分は分解性の官能基であってもよいし、又はそれを含んでもよい。
【００８９】
一実施形態では、少なくとも３つのホモポリマー鎖の１以上は、分解性の官能基が分解を受ける際、共有結合が切断され、ホモポリマー鎖が支持部分から切り離されるように、分解性の官能基を介して支持部分に共有結合される。
【００９０】
少なくとも３つのホモポリマー鎖のそれぞれが分解性の官能基を介して支持部分に共有結合されてもよい。
【００９１】
別の実施形態では、分解性の官能基が分解を受ける際、分子構造における１以上の共有結合が切断され、少なくとも３つのホモポリマー鎖の少なくとも１つが支持部分から放出される（すなわち、遊離になる）ように、支持部分は１以上の分解性の官能基を含むその分子構造を有する。
【００９２】
「分解性」である官能基とは、それが、分解環境にさらされた際、化学反応を介して分解を生じ易い（すなわち、結合の切断を受ける）分子構造を有することを意味する。
【００９３】
一実施形態では、分解性の官能基は生分解性の官能基である。
【００９４】
「生分解性」である官能基とは、それが、生物学的環境にさらされた際（たとえば、被験体の内部で又は、たとえば、血液、組織等のような生体材料に接触して）、化学反応を介して分解を生じ易い（すなわち、結合の切断を受ける）分子構造を有することを意味する。生分解はインビトロ又はインビボで生じ得る。そのような化学的分解又は生分解は加水分解、酸化又は還元を介してもよい。従って、生分解性の官能基は一般に、加水分解による、酸化による又は還元による切断を受け易いであろう。生分解の速度は、多数の外部又は内部の要因（たとえば、光、熱、放射線、ｐＨ、酵素的な又は非酵素的な介在等）に応じて変化し得る。
【００９５】
分解性の官能基は、それらが分解を受ける際、少なくとも３つのホモポリマー鎖の１以上が支持部分から放出される（すなわち、もはや共有結合しない）ように位置づけられる。
【００９６】
支持部分が分解性の官能基を含む分子構造を有する場合、それら分解性の官能基の分解は支持部分構造の破壊を生じ、それは次に支持部分からのホモポリマー鎖の放出（すなわち、もはや共有結合しない）を生じる。
【００９７】
当業者は、分解及び生分解を受け易い官能基の種類を十分に理解するであろう。そのような官能基には、たとえば、エステル、無水物、カーボネート、ペルオキシド、ペルオキシエステル、ホスフェート、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、ジスルフィド、カルバメート（ウレタン）及びボロネートエステルが挙げられてもよい。
【００９８】
一実施形態では、生分解性の官能基は、エステル、無水物、カーボネート、ペルオキシド、ペルオキシエステル、ホスフェート、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、ジスルフィド、カルバメート（ウレタン）及びボロネートエステルから選択される。
【００９９】
別の実施形態では、連結部分は、エステル、無水物、カーボネート、ペルオキシド、ペルオキシエステル、ホスフェート、チオエステル、尿素、チオウレタン、エーテル、ジスルフィド、カルバメート（ウレタン）及びボロネートエステルから選択される１以上の官能基を介した生分解性である。
【０１００】
生分解性の官能基の分解は、結合の切断過程を触媒することができる又は少なくともそれに役立つ酸、塩基、酵素及び／又は別の内在性の生体化合物の存在下で促進されてもよい。たとえば、エステルは加水分解により切断されてカルボン酸基とアルコール基を生じてもよく、アミドは加水分解により切断されてカルボン酸基とアミン基を生じてもよく、ジスルフィドは還元により切断されてチオール基を生じてもよい。
【０１０１】
分解は、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、膣液、滑膜液、リンパ液、羊水、汗、及び涙液等の生体液、並びに、たとえば、滲出液、排水液、木部、師部、樹脂及び花蜜を始めとする、植物によって産生される水溶液にて生じてもよい。
【０１０２】
分解はまた、細胞内で、又は、たとえば、エンドソーム及び細胞質のような細胞成分にて生じてもよい。
【０１０３】
生分解性の官能基は、特定の生体環境にさらされた際、それらが分解を受けることができるように選択されてもよい。たとえば、正常な状態及び病態生理学的な状態において細胞外環境と細胞内環境との間には酸化還元電位勾配が存在する。生分解性の官能基としてのジスルフィド結合は細胞内還元環境では容易に還元され得る一方で、細胞外酸化空間ではインタクトなままである。ジスルフィド結合の細胞内還元は通常、たとえば、グルタチオン（ＧＳＨ）及びチオレドキシンのような酸化還元小分子によって単独で、又は酵素機構に助けを借りて実行される。
【０１０４】
２以上の分解性の官能基が使用される場合、これら官能基の性質及び分解環境に応じて、官能基の一方だけが所望の結合切断を実際に促進するかもしれない。たとえば、分解性の官能基はエステル官能基とジスルフィド官能基の双方を含んでもよい。還元環境では、ジスルフィド官能基だけが分解を受けるかもしれない。加水分解環境では、エステル官能基だけが分解を受けるかもしれない。還元及び加水分解環境では、ジスルフィド官能基及びエステル官能基の双方が分解を受けるかもしれない。
【０１０５】
「カチオン性」ホモポリマー鎖とは、正の正味電荷を提示する又は提示することが可能であるホモポリマー鎖を意味する。一実施形態では、カチオン性ホモポリマー鎖は正の正味電荷を提示する。
【０１０６】
「親水性」のホモポリマー鎖とは、正味の親水性特性を提示するホモポリマー鎖を意味する。親水性ホモポリマー鎖は一般に負又は正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない。従って、親水性ホモポリマー鎖は、負又は正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない親水性ホモポリマー鎖として記載されてもよい。言い換えれば、親水性ホモポリマー鎖は、本明細書で記載されるようなカチオン性ホモポリマー鎖であることを意図されない（すなわち、それは、正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない）。従って、親水性ホモポリマー鎖は非カチオン性の親水性ホモポリマー鎖としても記載されてもよい。
【０１０７】
一実施形態では、親水性ホモポリマー鎖は中性の親水性ホモポリマー鎖である（すなわち、それは電荷を提示しない又は電荷を提示することが可能ではない）。その場合、親水性ホモポリマー鎖は非イオン性の親水性ホモポリマー鎖としても記載されてもよい。
【０１０８】
「疎水性」ホモポリマー鎖とは、正味の疎水性特性を提示するホモポリマー鎖を意味する。疎水性ホモポリマー鎖は一般に負又は正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない。従って、疎水性ホモポリマー鎖は、負又は正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない疎水性ホモポリマー鎖として記載されてもよい。言い換えれば、疎水性ホモポリマー鎖は本明細書で定義されるようなカチオン性ホモポリマー鎖であるようには意図されない（すなわち、それは正の正味電荷を提示しない又は提示することが可能ではない）。従って、疎水性ホモポリマー鎖は非カチオン性の疎水性ホモポリマー鎖としても記載されてもよい。
【０１０９】
一実施形態では、疎水性ホモポリマー鎖は中性の疎水性ホモポリマー鎖である（すなわち、それは電荷を提示しない又は電荷を提示することが可能ではない）。その場合、疎水性ホモポリマー鎖は非イオン性の疎水性ホモポリマー鎖としても記載されてもよい。
【０１１０】
表現「カチオン性」、「親水性」及び「疎水性」ホモポリマー鎖によって意味されるものに関するさらなる詳細は以下で提示される。
【０１１１】
カチオン性、親水性及び疎水性ホモポリマー鎖はそれぞれ、複数のモノマー単位の重合残基を含むであろう。これらのホモポリマー鎖を形成するのに使用されてもよいモノマーに関するさらなる詳細は以下に提示される。
【０１１２】
本発明に係るカチオン性ホモポリマー鎖は一般に約５〜約２５０、又は約１０〜約２００、又は約３０〜約１５０のモノマー残基の単位を含むであろう。
【０１１３】
カチオン性ホモポリマー鎖は、それが水性媒体に可溶性である又は混和性であるという意味で親水性の特性を示してもよい。
【０１１４】
一実施形態では、分岐ポリマーは負の電荷を持つ又は負の電荷を持つことが可能である重合モノマー残基の単位を含まない。言い換えれば、一実施形態では、分岐ポリマーは両性の分岐ポリマーではない。
【０１１５】
たとえば、それぞれカチオン性ホモポリマー鎖又は核酸分子に関連する「正」又は「負」の電荷に対する本明細書での参照は、カチオン性ホモポリマー鎖又は核酸分子がそれぞれ、正又は負の電荷を提示する、又は提示するように意図される、且つ提示することが可能である１以上の官能基又は官能部分を有することを意味するように意図される。
【０１１６】
従って、そのような官能基又は官能部分は、その電荷を固有に持ってもよいし、又は、たとえば、求電子試薬の添加若しくは除去を介して荷電した状態に変換されることが可能であってもよい。言い換えれば、正の荷電の場合、官能基又は官能部分は、たとえば、四級アンモニウムの官能基又は部分のような固有の電荷を有してもよいし、又は官能基又は官能部分はそれ自体、中性であってもよいし、さらに、荷電可能であって、たとえば、三級アンモニウムカチオンのｐＨ依存性の形成若しくは三級アミン基の四級化を介してカチオンを形成してもよい。負の荷電の場合、官能基若しくは官能部分は、たとえば、負の電荷を提供する有機酸塩を含んでもよく、又は官能基若しくは官能部分は、中性であってもよい有機酸を含み、さらに、荷電可能であって、たとえば、酸性プロトンのｐＨ依存性の除去を介してアニオンを形成してもよい。
【０１１７】
一実施形態では、分岐ポリマーのカチオン性ホモポリマー鎖は重合の時点で中性状態である官能基又は官能部分を含有するモノマーを用いて調製されてもよく、そのような形態のポリマー鎖はその後、正に荷電した状態に変換することができる。たとえば、モノマーは三級アミン官能基を含んでもよく、それは重合されてカチオン性ホモポリマー鎖を形成する際、その後、正に荷電した状態に四級化される。
【０１１８】
別の実施形態では、分岐ポリマーのカチオン性ホモポリマー鎖は正に荷電した状態である。言い換えれば、カチオン性ホモポリマー鎖は正に荷電したカチオン性ホモポリマー鎖である。
【０１１９】
当業者は、荷電状態では、カチオン性ホモポリマー鎖に会合するカチオン自体、又は、たとえば、核酸分子に会合するアニオン自体が、それに会合する好適な対イオンを有することを十分に理解されるであろう。
【０１２０】
本発明に係る分岐ポリマーが核酸分子との複合体形成に使用される場合、カチオン性ホモポリマー鎖は個々に又はまとめて（１を超えて存在するならば）、十分な正の荷電部位を含んで核酸分子との複合体化を促進することが十分に理解されるであろう。
【０１２１】
一実施形態では、本発明に係るカチオン性ホモポリマー鎖は、約５〜約２５０、又は約１０〜約２００、又は約３０〜約１５０の、それぞれ正の電荷を含むモノマー残基単位を含んでもよい。
【０１２２】
本発明に係る親水性ホモポリマー鎖は一般に約５〜約２００、又は約１０〜約１５０、又は約２０〜約１００のモノマー残基単位を含むであろう。
【０１２３】
本発明に係る疎水性ホモポリマー鎖は一般に約１０〜約２００、又は約１５〜約１５０、又は約３０〜約１００のモノマー残基単位を含むであろう。
【０１２４】
親水性及び疎水性のような用語は一般に、他方に比べた一方の成分間の相互作用（たとえば、誘引若しくは反発の相互作用、又は溶解性特性）を伝えるのに当該技術で使用され、且つ、他方に比べた一方の特定の成分の特性を量的に定義しないように使用される。
【０１２５】
たとえば、親水性成分は水のような水性媒体による湿潤又は溶媒和の可能性が高いのに対して、疎水性成分は水のような水性媒体による湿潤又は溶媒和の可能性が低い。
【０１２６】
本発明の文脈では、親水性ホモポリマー鎖は、水性媒体にて可溶性又は混和性を示すホモポリマー鎖を意味するように意図される。水性媒体としては、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、膣液、滑膜液、リンパ液、羊水、汗、及び涙液等の生体液、並びに、たとえば、滲出液、排水液、木部、師部、樹脂に及び花蜜を始めとする、植物により産生される水溶液が挙げられる。
【０１２７】
それに反して、疎水性ホモポリマー鎖は、水性媒体にて可溶性又は混和性をほとんど示さない又は示さないホモポリマー鎖を意味するように意図される。水性媒体としては、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液、膣液、滑膜液、リンパ液、羊水、汗、及び涙液等の生体液、並びに、たとえば、滲出液、排水液、木部、師部、樹脂に及び花蜜を始めとする、植物により産生される水溶液が挙げられる。
【０１２８】
所与のホモポリマー鎖のカチオン性、親水性又は疎水性の特徴は、（ａ）ホモポリマー鎖の分子組成及び／又は（ｂ）水性媒体におけるホモポリマー鎖の可溶性又は混和性（又はその欠如）を介した単純な評価によって、当該分野における当業者により容易に決定することができる。
【０１２９】
親水性ホモポリマー鎖は一般に、分岐ポリマーを水性媒体にて可溶性又は混和性にするように選択されるであろう。
【０１３０】
一実施形態では、親水性ホモポリマー鎖は約５〜約２００、又は約１０〜約１５０、又は約２０〜約１００の親水性のモノマー残基単位を含んでもよい。
【０１３１】
一実施形態では、疎水性ホモポリマー鎖は約１０〜約２００、又は約１５〜約１５０、又は約３０〜約１００の疎水性のモノマー残基単位を含んでもよい。
【０１３２】
ホモポリマー鎖のそれぞれは分岐構造を有する基を含むモノマーに由来してもよい（又はその重合した残基を含んでもよい）。
【０１３３】
カチオン性ホモポリマー鎖は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルフォリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルフォリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化アリルジメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、及び４−ビニルピリジンから選択される１以上のモノマーに由来してもよい（又はその重合した残基を含んでもよい）。
【０１３４】
親水性ホモポリマー鎖は、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、オリゴ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート（ＯＥＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリロイルモルフォリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート及びＮ−ビニルピロリドンから選択される１以上のモノマーに由来してもよい（又はその重合した残基を含んでもよい）。
【０１３５】
疎水性ホモポリマー鎖は、スチレン、α−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート及びビニルラウレートから選択される１以上のモノマーに由来してもよい（又はその重合した残基を含んでもよい）。
【０１３６】
本発明に係る分岐ポリマーの例は、以下の一般式（Ａ）を参照して示されてもよい。
【０１３７】
【化２】
2017500390.tif 000003
式中、ＳＭは支持部分であり；ＨＰ１は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルフォリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルフォリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化アリルジメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、又は４−ビニルピリジンに由来するカチオン性ホモポリマー鎖を表し（すなわち、その重合された形態であり）、ＨＰ２は、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、オリゴ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート（ＯＥＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリルオキシモルフォリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート又はＮ−ビニルピロリドンに由来する親水性ホモポリマー鎖を表し（すなわち、その重合された形態であり）、ＨＰ３は、スチレン、α−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート又はビニルラウレートに由来する疎水性ホモポリマー鎖を表し（すなわち、その重合された形態であり）、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１〜５０、又は１〜３０、又は１〜２０、又は１〜１５、又は１〜１０、又は１〜５の範囲に及ぶ整数である。ａ、ｂ又はｃが１より大きい場合、これは、１を超える関連するホモポリマー鎖が支持部分に共有結合する状況を表すことが十分に理解されるであろう。少なくとも３つのホモポリマーアーム（ＨＰ１、ＨＰ２及びＨＰ３）の１以上が連結部分を介してＳＭに共有結合されてもよい。
【０１３８】
一実施形態では、分岐ポリマーはさらに、標的化リガンド、生物活性剤及び／又はイメージング剤を含む。その場合、標的化リガンド、生物活性剤又はイメージング剤は一般に分岐ポリマーに共有結合されるであろう。標的化リガンド、生物活性剤又はイメージング剤は、支持部分、分岐ポリマーの少なくとも３つのホモポリマー鎖の１以上、又はそれらの組み合わせに共有結合されてもよい。標的化リガンド、生物活性剤及び／又はイメージング剤の２以上の組み合わせも意図される。
【０１３９】
分岐ポリマーに結合されてもよい好適な標的化リガンドの例には、糖類及びこれら糖類に由来するオリゴ糖、ペプチド、タンパク質、アプタマー及びコレステロールが挙げられる。好適な糖類の例には、ガラクトース、マンノース及びグルコサミンが挙げられる。好適なペプチドの例には、ボベシン、黄体形成ホルモン放出ペプチド、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）、ＧＡＬＡペプチド、インフルエンザ由来の膜融合ペプチド、ＲＧＤペプチド、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ペネトラチン、ｔａｔ−ペプチド、及びトランスポータンが挙げられる。癌細胞を標的とすることができる葉酸のような他のリガンドも分岐ポリマーに結合されてもよい。分岐ポリマーに結合されてもよい生物活性剤の例には、活性有機化合物、タンパク質又は抗体（又はその断片）及びペプチドが挙げられる。好適なタンパク質の例には、移行プロタミン、及び、たとえば、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗Ｋ−ｒａｓ抗体のような抗体が挙げられる。好適な有機化合物の例には、ドキソルビシン、パクリタキセル、カンプトテシン及びパラチネートのような化学療法剤が挙げられる。
【０１４０】
分岐ポリマーに結合されてもよい好適なイメージング剤の例には、Ｐｏｌｙｆｌｕｏｒ（商標）（メタクリルオキシエチルチオカルバモイルローダミンＢ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、及びＢＯＰＩＤＹ色素が挙げられる。
【０１４１】
【化３】
2017500390.tif 000004
【０１４２】
本発明に係る分岐ポリマーは好適な手段によって調製されてもよい。
【０１４３】
一実施形態では、分岐ポリマーを調製する方法はエチレン性不飽和モノマーの重合を含む。エチレン性不飽和モノマーの重合は好ましくは、リビング重合法を用いて実施される。
【０１４４】
リビング重合は一般に、不可逆的な鎖停止が実質的に存在しない鎖重合の形態であると当該技術で見なされる。リビング重合の重要な特徴は、重合を支えるモノマーと反応条件が提供されながら、ポリマー鎖が成長し続けるということである。リビング重合によって調製されたポリマー鎖は、明確に定義された分子構造、所定の分子量及び狭い分子量分布又は低い多分散度を有利に示すことができる。
【０１４５】
リビング重合の例には、イオン重合及び制御されたラジカル重合（ＣＲＰ）が挙げられる。ＣＲＰの例には、イニファータ重合、安定遊離ラジカル介在重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
リビング重合を行うための機器、条件及び試薬は当業者に周知である。
【０１４７】
エチレン性不飽和モノマーがリビング重合法によって重合されるべきである場合、いわゆるリビング重合剤を使用することが一般に必要であろう。「リビング重合剤」とは、リビングポリマー鎖（すなわち、リビング重合法に従って形成されているポリマー鎖）を形成するように１以上のエチレン性不飽和モノマーのリビング重合に関与する、それを制御する又はそれに介在することができる化合物を意味する。
【０１４８】
リビング重合剤には、イオン重合及びＣＲＰから選択されるリビング重合法を促進するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明の一実施形態では、分岐ポリマーはイオン重合を用いて調製される。
【０１５０】
本発明の一実施形態では、分岐ポリマーはＣＲＰを用いて調製される。
【０１５１】
本発明のさらなる実施形態では、分岐ポリマーはイニファータ重合を用いて調製される。
【０１５２】
本発明の別の実施形態では、分岐ポリマーはＳＦＲＰを用いて調製される。
【０１５３】
本発明のさらなる実施形態では、分岐ポリマーはＡＴＲＰを用いて調製される。
【０１５４】
本発明のさらなる実施形態では、分岐ポリマーはＲＡＦＴ重合を用いて調製される。
【０１５５】
ＲＡＦＴ重合によって形成されたポリマーは好都合にＲＡＦＴポリマーと呼ばれてもよい。重合のメカニズムのお蔭で、そのようなポリマーはモノマーの重合を円滑にするＲＡＦＴ剤の残留物を含むであろう。
【０１５６】
本発明に係る使用に好適なＲＡＦＴ剤は、チオカルボニルチオ基（−Ｃ（Ｓ）Ｓ−によって表される二価の部分である）を含む。ＲＡＦＴ重合及びＲＡＦＴ剤は、たとえば、国際公開第９８／０１４７８号、Ｍｏａｄ，Ｇ．；Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｅ；Ｔｈａｎｇ，Ｓ，Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，２００８，４９，１０７９−１１３１及びＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００５，５８，３７９−４１０；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００６，５９，６６９−６９２；及びＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００９，６２，１４０２−１４７２（その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる）のような多数の刊行物にて記載されている。分岐ポリマーを調製するのに使用するために好適なＲＡＦＴ剤には、キサンテート、ジチオエステル、ジチオカルバメート及びトリチオカーボネートの化合物が挙げられる。
【０１５７】
本発明に係る使用に好適なＲＡＦＴ剤には、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）によって表されるものも挙げられる。
【０１５８】
【化４】
2017500390.tif 000005
式中、Ｚ及びＲは基であり、Ｒ*及びＺ*はそれぞれ、ｘ価の基及びｙ価の基であり、それらは、１以上のエチレン性不飽和モノマーの重合にてその剤がＲＡＦＴ剤として機能することができるように独立して選択され；ｘは≧１の整数であり、ｙは≧２の整数である。
【０１５９】
一実施形態では、ｘは≧３の整数であり、ｙは≧３の整数である。その場合、Ｒ*及びＺ*は支持部分（ＳＭ）を表してもよい。
【０１６０】
１以上のエチレン性不飽和モノマーの重合にてＲＡＦＴ剤として機能させるために、当業者は、Ｒ及びＲ*が通常、採用される重合条件下で遊離ラジカル脱離基として機能し、尚且つ、遊離ラジカル脱離基として、重合を再開する能力を保持する、置換されていてもよい有機基であることを十分に理解するであろう。当業者はまた、Ｚ及びＺ*が通常、重合が過度に遅くなる程度にＲＡＦＴ付加体ラジカルの開裂の速度を遅くすることなく、遊離ラジカルの付加に対するＲＡＦＴ剤におけるＣ＝Ｓ部分の好適に高い反応性を与えるように機能する、置換されていてもよい有機基であることも十分に理解するであろう。
【０１６１】
式（Ｉ）では、Ｒ*はｘ価の基であり、ｘは≧１の整数である。従って、Ｒ*は一価、二価、三価又はそれ以上の価数であってもよい。たとえば、Ｒ*はＣ２０アルキル鎖であってもよく、式（Ｉ）で示されるＲＡＦＴ剤の残りは鎖に付属する複数の置換基として提示される。一般に、ｘは１〜約２０、たとえば、約２〜約１０、又は１〜約５の範囲での整数であろう。一実施形態では、ｘ＝２。
【０１６２】
同様に、式（ＩＩ）では、Ｚ*はｙ価の基であり、ｙは≧２の整数である。従って、Ｚ*は、二価、三価又はそれ以上の価数であってもよい。一般に、ｙは２〜約２０、たとえば、約２〜約１０、又は２〜約５の範囲での整数であろう。
【０１６３】
本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＲの例には、置換されていてもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリールオキシアリール、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、及びポリマー鎖が挙げられ、且つ、本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＲ*の場合では、置換されていてもよいそれらのｘ価の形態が挙げられる。
【０１６４】
「置換されていてもよい」に対する本明細書での疑義がある如何なる参照も回避するために、アルキル、アルケニル等々は、アルキル及びアルケニルのような各基が任意で置換されることを意味するように意図される。
【０１６５】
本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＲの例には、置換されていてもよい、アルキル；飽和、不飽和又は芳香族の炭素環又は複素環の環；アルキルチオ；ジアルキルアミノ；有機金属種；及びポリマー鎖が挙げられ、本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＲ*の場合では、置換されていてもよいそれらのｘ価の形態が挙げられる。
【０１６６】
ポリマー鎖を含むリビング重合剤は一般に当該技術では「マクロ」リビング重合剤と呼ばれる。そのような「マクロ」リビング重合剤は、所与のリビング重合剤の制御下でエチレン性不飽和モノマーを重合することによって好都合に調製されてもよい。
【０１６７】
一実施形態では、少なくとも３つのホモポリマー鎖は、リビング重合剤、たとえば、ＲＡＦＴ剤の制御下でエチレン性不飽和モノマーを重合することによって形成される。
【０１６８】
本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＺの例には、置換されていてもよい、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、アシル、アミノ、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アリールオキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリールオキシ、アルキルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、ジアルキルオキシ−、ジヘテロシクリルオキシ−又はジアリールオキシ−ホスフィニル、ジアルキル−、ジヘテロシクリル−又はジアリール−ホスフィニル、シアノ（すなわち、−ＣＮ）、及びＲが式（ＩＩ）について定義されるような−Ｓ−Ｒが挙げられ、本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤におけるＺ*の場合では、置換されていてもよいそれらのｙ価の形態が挙げられる。
【０１６９】
一実施形態では、本発明に従って使用することができるＲＡＦＴ剤はトリチオカーボネートＲＡＦＴ剤であり、Ｚ又はＺ*は置換されていてもよいアルキルチオ基である。
【０１７０】
本発明に係る使用に好適なマクロＲＡＦＴ剤は商業的に入手してもよく、たとえば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈのカタログ（ｗｗｗ.ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ.ｃｏｍ）で記載されたものを参照のこと。
【０１７１】
本発明に従って使用することができる他のＲＡＦＴ剤には、国際公開第２０１０／０８３５６９号及びＢｅｎａｇｌｉａら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．（４２），９３８４−９３８６，２００９（その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる）にて記載されたものが挙げられる。
【０１７２】
そこからＺ、Ｚ*、Ｒ及びＲ*が選択されてもよい基を定義する本明細書でのリストでは、それぞれ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びポリマー鎖部分が置換されていてもよい。
【０１７３】
そこからＺ、Ｚ*、Ｒ及びＲ*が選択されてもよい基を定義する本明細書でのリストでは、所与のＺ、Ｚ*、Ｒ又はＲ*が２以上の亜基（たとえば、［Ａ基］［Ｂ基］）を含有する場合、亜基の順序は、それらが提示される順序に限定するようには意図されない（たとえば、アルキルアリールはアリールアルキルに対する参照とも見なされてもよい）。
【０１７４】
Ｚ、Ｚ*、Ｒ又はＲ*は分岐状であってもよいし、及び／又は置換されていてもよい。Ｚ、Ｚ*、Ｒ又はＲ*が置換されていてもよいアルキル部分を含む場合、任意の置換基には、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（すなわち、エステル）、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（すなわち、アミド）から選択される基によってアルキル鎖における−ＣＨ２−が置換される場合（ここで、Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル及びアシルから選択されてもよい）が挙げられる。
【０１７５】
ｘ価、ｙ価、多価、又は二価「形態」に対する本明細書での参照は、特定された基がそれぞれｘ価、ｙ価、多価、又は二価ラジカルであることを意味するように意図される。たとえば、ｘ又はｙが２である場合、特定された基が二価のラジカルであるように意図される。当業者は、さらに高い価数の形態を提供することにおいてこの理論的根拠をどのように適用するかを十分に理解するであろう。
【０１７６】
分岐ポリマーの調製には一般にエチレン性不飽和モノマーの重合が関与する。
【０１７７】
分岐ポリマーを調製するのに使用されてもよいエチレン性不飽和モノマーの好適な例には、式（ＩＩＩ）のものが挙げられる。
【０１７８】
【化５】
2017500390.tif 000006
式中、
Ｕ及びＷは独立して−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、水素、ハロゲン及び置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、又はＵ及びＷは一緒に、それ自体置換されていてもよいラクトン、無水物若しくはイミドの環を形成し、ここで、任意の置換基はヒドロキシ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、及び−ＯＣＳＲ１から独立して選択され；
Ｖは、水素、Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、及び−ＯＣＳＲ１から選択され；
Ｒ１又は各Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、置換されていてもよいアルキルアリール、置換されていてもよいアルキルヘテロアリール、及び置換されていてもよいポリマー鎖から独立して選択される。
【０１７９】
式（ＩＩＩ）のモノマーの具体例には、国際公開第２０１０／０８３５６９号，国際公開第９８／０１４７８号，Ｍｏａｄ，Ｇ．；Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｅ；Ｔｈａｎｇ，Ｓ，Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，２００８，４９，１０７９−１１３１及びＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００５，５８，３７９−４１０；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００６，５９，６６９−６９２；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００９，６２，１４０２−１４７２，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，Ｒ．Ｚ．，ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｄｕｐ，Ｊ，及びＩｍｍｅｒｇｕｔ．Ｅ．Ｈ．Ｅｄｓ）Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐＩＩ／５３及びＢｅｎａｇｌｉａら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．（４２），９３８４−９３８６，２００９（その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる）の１以上にて概要が説明されたものが挙げられる。
【０１８０】
分岐ポリマーを調製するのに使用されるモノマーの種類を議論する場合、性質上、親水性、疎水性又はカチオン性であるモノマーを参照することが好都合である。この文脈で「性質上」、親水性、疎水性又はカチオン性とは、重合の際、そのようなモノマーがそれぞれ親水性、疎水性又はカチオン性のホモポリマー鎖を生じさせることを意味する。たとえば、親水性ホモポリマー鎖は親水性モノマーを重合することによって調製されるであろう。
【０１８１】
指針としてのみであるが、親水性のエチレン性不飽和モノマーの例には、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、オリゴ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート（ＯＥＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリロイルモルフォリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート及びＮ−ビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
使用されたモノマーがカチオン性ホモポリマー鎖を生じる場合、前に概要が説明されたように、そのように形成されたホモポリマー鎖は本質的に、荷電されたカチオン状態になくてもよい。言い換えれば、ホモポリマー鎖は、荷電されたカチオン状態に変換される１以上の他の化合物と反応させる必要があってもよい。たとえば、カチオン性ホモポリマー鎖を形成するように選択されたモノマーは三級アミン官能基を含んでもよい。カチオン性ホモポリマー鎖を形成するためにモノマーを重合する際、三級アミン官能基はその後、正に荷電された状態に四級化されることができる。
【０１８３】
指針としてのみであるが、カチオン性のエチレン性不飽和モノマーの例には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルフォリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルフォリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、塩化アリルジメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、及び４−ビニルピリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
指針としてのみであるが、疎水性のエチレン性不飽和モノマーの例には、スチレン、α−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート及びビニルラウレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
親水性のエチレン性不飽和モノマーであるＯＡＧ（Ｍ）Ａの場合、アルキレン部分は一般にＣ２−Ｃ６であり、たとえば、Ｃ２又はＣ３アルキレン部分であるだろう。当業者は、「（アルキレングリコール）」に関連した「オリゴ」の名称は複数のアルキレングリコール単位の存在を指すことを十分に理解するであろう。一般に、ＯＡＧ（Ｍ）Ａのオリゴ成分は約２〜約２００、たとえば、約２〜約１００、又は約２〜約５０又は約２〜約２０のアルキレングリコール反復単位を含むであろう。
【０１８６】
従って、親水性ホモポリマー鎖は親水性のエチレン性不飽和モノマーの重合残基を含むものとして記載されてもよい。
【０１８７】
従って、カチオン性ホモポリマー鎖はカチオン性のエチレン性不飽和モノマーの重合残基を含むものとして記載されてもよい。
【０１８８】
従って、疎水性ホモポリマー鎖は疎水性のエチレン性不飽和モノマーの重合残基を含むものとして記載されてもよい。
【０１８９】
分岐ポリマーの少なくとも一部を形成するようにエチレン性不飽和モノマーを重合するのに遊離ラジカル重合法が使用されるべきである場合、重合は普通、遊離ラジカルの供給源からの開始を必要とするであろう。
【０１９０】
開始ラジカルの供給源は、たとえば、好適な化合物（ペルオキシド、ペルオキシエステル又はアゾ化合物のような熱開始剤）の熱誘導の均一開裂、モノマー（たとえば、スチレン）からの自然発生的な生成、酸化還元開始系、光化学開始系又は、たとえば、電子ビーム、Ｘ線放射若しくはγ線放射のような高エネルギー放射のような遊離ラジカルを生成する好適な手段によって提供することができる。そのような開始剤の例は、たとえば、国際公開第２０１０／０８３５６９号並びにＭｏａｄ及びＳｏｌｏｍｏｎ，’’Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ’’，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５，ｐｐ５３−９５（その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる）にて見いだされ得る。
【０１９１】
分岐ポリマーは当該技術で既知の技法を用いて構築されてもよい。たとえば、適当な重合反応を用いてポリマーのホモポリマーアームを先ず形成し、次いでその後、好適な支持部分に結合させてもよい。この技法は「カップリング・オントゥ（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｎｔｏ）」法として知られる。そのようなカップリング・オントゥ法には事前に形成された支持部分への事前に形成されたホモポリマー鎖の結合が関与する。或いは、事前に形成されたホモポリマー鎖は支持部分の同時形成の間に結合されてもよい。たとえば、それに共有結合したリビング重合剤（又は部分）を有する事前に形成されたホモポリマー鎖を用いて、ホモポリマー鎖が共有結合する架橋ポリマーの支持部分を形成するように多エチレン性不飽和モノマーの重合を制御してもよい。
【０１９２】
【化６】
2017500390.tif 000007
【０１９３】
【化７】
2017500390.tif 000008
【０１９４】
従って、本発明は、支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、その部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含む分岐ポリマーを調製する方法も提供し、ここで、該少なくとも３つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とが含まれ、該方法は、
（ｉ）各ホモポリマー鎖がそれに共有結合しているリビング重合部分を有するカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを提供することと、
（ｉｉ）カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖のそれぞれが共有結合される架橋ポリマーの支持部分を形成するようにリビング重合部分の制御下で１以上の多エチレン性不飽和モノマーを重合することとを含む。
【０１９５】
方法の一実施形態では、工程（ｉ）で提供される各ホモポリマー鎖はそれに共有結合されたＲＡＦＴ部分を有する。
【０１９６】
本明細書で使用されるとき、「リビング重合部分」は、リビングポリマー鎖を形成するように１以上のエチレン性不飽和モノマーのリビング重合に関与でき、且つそれを制御することができる部分を意味するように意図される。
【０１９７】
本発明に係る使用に好適なリビング重合部分には、イオン重合及び制御されたラジカル重合（ＣＲＰ）から選択されるリビング重合法を促進するものが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＰの例には、本明細書で記載されるようなイニファータ重合、安定遊離ラジカル介在重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
本発明に従って使用されてもよい多エチレン性不飽和モノマー（又は多官能性モノマー）の例には、ジスルフィドジメタクリレート、ジスルフィドジメタクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアリルオキシジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパントリ（メタ）アクリレート、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリルフタレート、ジアリルテレフタレート、ジビニルベンゼン、ジビニルアジペート、４，４’−ジビニルビフェニル、メチロール（メタ）アクリルアミド、トリアリルアミン、オレイルマレエート、グリセリルプロポキシトリアクリレート、アリルメタクリレート、無水メタクリル酸及びメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ビス（２−メタクリロイル）オキシエチルジスルフィド、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが挙げられる。
【０１９９】
分岐ポリマーは、好適な支持部分から直接モノマーを重合することによっても形成されてもよい。この技法は「コアファースト」法として知られる。
【０２００】
カップリングオントゥ法とコアファースト法の組み合わせを使用することも可能であり得る。たとえば、モノマーを好適な支持部分から直接重合してカチオン性ホモポリマー鎖を形成してもよい（コアファースト）。事前に形成された親水性及び疎水性のホモポリマー鎖を次いで支持部分に結合させてもよい（カップリングオントゥ）。
【０２０１】
本発明はまた、分岐ポリマーと核酸分子を含む複合体も提供する。用語「複合体」は本明細書で使用されるとき、分岐ポリマーと核酸分子のイオン結合による会合を指す。イオン結合は、分岐ポリマーのカチオン性ホモポリマー鎖と核酸分子に関連する反対に荷電したイオン間での静電気引力を介して導き出される。必要とされる静電気引力と複合体の形成を増進するように、カチオン性ホモポリマー鎖は正の電荷を提供し、それに応じて、核酸分子は負の電荷を提供することが十分に理解されるであろう。
【０２０２】
核酸分子における負の正味電荷は一般に、負に荷電した核酸自体（たとえば、リン酸基）に由来するであろう。核酸分子に対して行われる任意の修飾は、イオン結合を介した分岐ポリマーとの複合体の形成を可能にする程度に負の正味電荷を保持するべきである。
【０２０３】
理論によって限定されることを望まないが、分岐ポリマーと核酸分子は、核酸分子の負に荷電した主鎖と分岐ポリマーのカチオン性ホモポリマー鎖との間でのイオン性相互作用を介してナノ粒子を形成すると考えられる。所与の分岐ポリマーにおけるカチオン性電荷の数に応じて、１以上の核酸分子がポリマーと会合して複合体を形成してもよく、複合体化した核酸分子の数はポリマーにおけるアーム／分岐の数を増やすことに伴って増加してもよい。従って、分岐ポリマーは、その線状対応物に比べて、さらに多くの核酸分子が分岐ポリマー分子当たりで複合体化することができるという点で利点を有してもよい。
【０２０４】
分岐ポリマーと核酸分子を含む複合体は、カチオン性ポリマー／核酸分子の複合体を調製する既知の技法を用いて調製されてもよい。たとえば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）のような低濃度血清培地を含む容器に水に懸濁した必要量のポリマーを導入してもよい。次いで必要量の核酸分子をこの溶液に導入し、複合体を形成するように、得られた混合物を適当な時間ボルテックスで撹拌してもよい。
【０２０５】
核酸分子は商業的に入手されてもよく、又は当該技術で周知の技法を用いて調製されてもよいし、又は単離されてもよい。
【０２０６】
複合体を形成するのに使用されてもよい核酸分子の分岐ポリマーに対する比に関して特定の限定はない。当業者は、分岐ポリマーと核酸分子の電荷密度（ゼータ電位によって示されるような）が分岐ポリマーと核酸分子の比と一緒に、得られる複合体の全体的な電荷／中性の状態に影響を与えることを十分に理解するであろう。
【０２０７】
一実施形態では、複合体は正のゼータ電位を有する。さらなる実施形態では、複合体は、０ｍＶより大きく約１００ｍＶまで、又は０ｍＶより大きく約５０ｍＶまで、たとえば、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、又は約１５ｍＶ〜約３０ｍＶ、又は約２０ｍＶ〜約２５ｍＶの範囲に及ぶ正のゼータ電位を有する。
【０２０８】
本発明に係る複合体のゼータ電位はＭａｌｖｅｒｎゼータサイザーによって測定されるようなものである。ゼータ電位は、電場における粒子の移動度（電気泳動移動度）及び試料における粒度分布の測定から算出される。
【０２０９】
本明細書で使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、オリゴヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）、ＲＮＡ（センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内小分子（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体及び本明細書で記載されるような他のそのような分子を含む核酸分子を指す。疑念を回避するために、用語「核酸分子」には、天然に存在する形態と同様に天然に存在しない修飾された形態も含まれる。
【０２１０】
一部の実施形態では、核酸分子は約８〜約８０の核酸塩基（すなわち、約８〜約８０の連続して連結される核酸）を含む。当業者は、本発明が長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０の核酸塩基の核酸分子を具体化することを十分に理解するであろう。
【０２１１】
用語「核酸分子」にはまた、オリゴヌクレオチドの類似体、キメラ、ハイブリッド及び模倣体の形態のような化合物の他のファミリーも含まれる。
【０２１２】
オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド模倣体を含むが、これらに限定されないキメラのオリゴマー化合物も２以上の核酸分子の複合構造として形成されてもよい。日常的に使用されるキメラ化合物には、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、伸長ギャップマー、反転ギャップマー、及びブロックマーが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、種々の点修飾及び／又は領域は、ネイティブの又は修飾されたＤＮＡ型及びＲＮＡ型のユニット及び／又は、たとえば、ロック型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリン及びその他のような模倣体型のサブユニットから選択される。そのようなハイブリッド構造の調製は、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；及び同第５，７００，９２２号にて記載されている。
【０２１３】
ＲＮＡ及びＤＮＡのアプタマーも意図される。アプタマーは、従来のワトソン／クリック塩基対合以外の相互作用を介して非核酸分子又は核酸分子に対する特定の結合親和性を有する核酸分子である。アプタマーは、たとえば、米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，２７０，１６３号；同第５，５８９，３３２号；同第５，５８９，３３２号及び同第５，７４１，６７９号にて記載されている。その非核酸標的を認識するますます多くのＤＮＡ及びＲＮＡのアプタマーが開発されており、性状分析されている（たとえば、Ｇｏｌｄら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：７６３−７９７．１９９５；Ｂａｃｈｅｒら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，３（６）：２６５−２７３，１９９８を参照のこと）。
【０２１４】
核酸分子に対するさらなる修飾を行うことができ、それには末端の一方、選択された核酸塩基の位置、糖の位置、又はヌクレオシド間結合の１つに結合される抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）基が含まれてもよい。
【０２１５】
本発明はまた、核酸分子を細胞に送達する方法も提供し、該方法は
（ａ）分岐ポリマーと核酸分子を含む複合体を提供することと、
（ｂ）該複合体を細胞に送達することとを含み、
分岐ポリマーは支持部分と、その部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも３つのホモポリマー鎖はカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
【０２１６】
この方法は、インビボ、エキソビボ又はインビトロで実施されてもよい。
【０２１７】
本発明はさらに、本明細書で記載されるように、それを必要とする被験体に治療上有効な量の本発明に係る核酸分子複合体を投与することを含む遺伝子治療の方法を提供する。
【０２１８】
遺伝子治療としてのＤＮＡ修復と介在する組換えの関連性は、たとえば、嚢胞性線維症、血友病、及び鎌状赤血球貧血やβ−サラセミアのようなグロビン異常症のような遺伝性疾患の背景で研究される場合、明らかである。たとえば、標的遺伝子が遺伝性障害の原因である突然変異を含有するのであれば、核酸分子を被験体の細胞内に送達することは、変異修復を促進して異常な標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常に復元するのに有用であり得る。或いは、被験体の細胞に導入された核酸分子は、病的状態でさもなければ抑制される又はサイレントにされる遺伝子の発現をもたらしてもよい。そのような核酸分子はそれ自体サイレントな遺伝子又は抑制される遺伝子をコードしてもよいし、又はそれらは、さもなければ抑制された又はサイレントな標的遺伝子の転写及び／又は翻訳を活性化してもよい。
【０２１９】
本発明の方法を用いて治療される疾患又は状態は、遺伝子治療による治療が可能である疾患又は状態であってもよく、使用される遺伝材料（すなわち、核酸分子）の選択は特定の疾患又は状態に明らかに左右されることが当業者によって理解される。治療され得る疾患又は状態には、癌（たとえば、骨髄疾患）、サラセミア、嚢胞性線維症、難聴、視覚障害（たとえば、レーバー先天性黒内障）、糖尿病、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合性免疫不全症及び心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、遺伝子治療を用いて非内在性の遺伝子、たとえば、生物発光の遺伝子を導入してもよいし、又は内在性の遺伝子をノックアウトする遺伝子（たとえば、ＲＮＡ干渉）を導入してもよい。
【０２２０】
核酸分子の性質は治療される又は予防される疾患又は状態に必ず左右されるであろうことも当業者によって理解される。たとえば、線維性の細胞外マトリクス材料（たとえば、ＩＩ型コラーゲン）の蓄積に少なくとも部分的に起因する疾患又は状態は、本発明の核酸分子複合体を被験体に送達することのよって治療する又は予防することができ（標的化又は非標的化のアプローチ）、ここで、核酸分子（たとえば、ｓｉＲＮＡ）は、細胞外マトリクス材料をコードする遺伝子をサイレンシングすることが可能である。一部の実施形態では、疾患又は状態は、感染性疾患、炎症性疾患、又は癌である。
【０２２１】
本発明に係る細胞への核酸分子複合体の送達がインビボで実施される場合、状況下で適している投与の経路によって核酸分子複合体を細胞に導入することができる。たとえば、全身性の送達が意図される場合、複合体は静脈内、皮下、筋肉内、経口等で投与されてもよい。或いは、当業者に既知の手段によって特定の細胞又は細胞型に対して複合体を標的化してもよい。核酸分子が非癌性細胞に対して許容し難く毒性であるならば、又はそれが高すぎる投与量を必要とするならば、たとえば、癌細胞を標的とするためにのような種々の理由で標的化することが望ましくてもよい。
【０２２２】
標的化送達はインビボ、エキソビボ又はインビトロで実施されてもよく、当業者に既知の手段によって達成されてもよい。たとえば、これは、受容体が介在する標的化を介して、又は標的細胞を含む組織に核酸分子複合体を直接投与することによって達成されてもよい。
【０２２３】
受容体が介在する標的化は、分岐ポリマー及び／又は核酸分子を本明細書で記載されるような好適な標的化リガンドに結合させる又は抱合させることによって達成されてもよい。
【０２２４】
たとえば、受容体が介在する標的化は、たとえば、ポリリジンを介して核酸分子をタンパク質リガンドに抱合させることによって達成されてもよい。
【０２２５】
標的化リガンドは通常、標的細胞／組織型の表面上での相当するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。
【０２２６】
リガンド／核酸分子の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は本発明に係る分岐ポリマーと複合体化することができ、所望であれば全身投与することができ（たとえば静脈内）、ここで、それらは受容体結合が生じる標的細胞／組織に向けられるであろう。
【０２２７】
一実施形態では、分岐ポリマー及び／又は核酸分子は標的化リガンドに抱合されて細胞の受容体が介在する標的化を促進する。
【０２２８】
別の実施形態では、核酸分子はタンパク質リガンドに抱合されて細胞の受容体が介在する標的化を促進する。
【０２２９】
用語「結合される」、「結合する」及び「抱合される」、「抱合する」は本明細書では相互交換可能に使用され、少なくとも２つの実体が単一の実体を形成するように通常、共有結合によって連結されることを意味するように意図される。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明に係る細胞に核酸分子を送達する方法はエキソビボで実施される。たとえば、細胞は被験体から単離され、本発明の核酸分子複合体でエキソビボにて導入されて外来性の核酸分子を含む細胞を生じる。細胞は治療される被験体から又は同種の宿主から単離されてもよい。次いで細胞は、治療又は予防の目的で被験体（又は同種のレシピエント）に再導入し戻される。一部の実施形態では、細胞は造血系前駆細胞又は幹細胞であることができる。
【０２３１】
一実施形態では、遺伝子の発現をサイレンシングする（又は抑制する）目的で核酸分子を細胞に送達する。一部の実施形態では、翻訳効率を低下させること又はメッセージの安定性を低下させること又はこれらの効果の組み合わせによって遺伝子の発現をサイレンシングする。一部の実施形態では、プロセシングされていないＲＮＡのスプライシングは機能的ではない又は活性の低いタンパク質をもたらす標的の目標である。
【０２３２】
一部の実施形態では、遺伝子発現は、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）を含むが、これらに限定されないＤＮＡ分子を細胞に送達することによってサイレンシングされる。
【０２３３】
一部の実施形態では、遺伝子発現はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってサイレンシングされる。本発明を特定の理論又は作用機序に限定するものではないが、「ＲＮＡ干渉」は通常、たとえば、配列特異的な方法でｍＲＮＡを分解すること又はさもなければその翻訳を妨害することに基づく遺伝子の発現をサイレンシングするメカニズムを記載する。外来性の干渉ＲＮＡ分子がｍＲＮＡの分解又はｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらし得ることが当業者によって理解される。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、読み取りフレームを変更してナンセンス介在性の崩壊をもたらす１以上の早発性の停止コドンを導入することによって達成される。
【０２３４】
ＲＮＡｉには、標的ｍＲＮＡの分解を介して遺伝子発現での配列特異的な低下をもたらす二本鎖（センス及びアンチセンス）ＲＮＡが関与する遺伝子サイレンシングの過程が含まれる。ＲＮＡｉには通常、小分子二本鎖ｓｉＲＮＡ又は一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が介在する。
【０２３５】
ＲＮＡ様の特性を有する他のオリゴヌクレオチドも記載されており、多数のさらに異なる種類のＲＮＡｉが開発され得る。たとえば、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを用いてエクソンの使用を変更し、プレＲＮＡスプライシングを調節している（たとえば、Ｍａｄｏｃｓａｉら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：１０１３−１０２２，２００５及びＡａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，８：４３，２００７を参照のこと）。アンチセンス及びｉＲＮＡ化合物は、当該標的遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡと特異的にハイブリダイズするＲＮＡ又はＲＮＡ様又はＤＮＡ又はＤＮＡ様の分子である二本鎖又は一本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０２３６】
本発明の文脈で使用するのに好適なＲＮＡ分子の例には、長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）；小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡマイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）；空間的推移に介在するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡｓ）、ストレス応答（ｓｒＲＮＡ）又は細胞周期（ｃｃＲＮＡ）；及びハイブリダイズし、内在性に発現されるｍｉＲＮＡ若しくはｓｔＲＮＡ又は外来性に導入されるｓｉＲＮＡの機能を妨げるように設計されたＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
他の実施形態では、核酸分子は翻訳の開始、スプライスドナー部位又はスプライスアクセプター部位でのスプライシングを抑制する。他の実施形態では、スプライシングの修飾は読み取りフレームを変更し、転写物のナンセンスが介在する分解を開始する。
【０２３８】
本発明に係る使用に好適な核酸分子の設計に関する別の例では、分子の特定の構造及び長さを決定すること、たとえば、分子が、ｄｓＲＮＡ、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ、プリ−ｍｉＲＮＡの形態又は本明細書で記載されるような他の好適な形態を取るかどうかを決定することは当業者の技量の範囲内である。
【０２３９】
用語「遺伝子」は最も広い意味で使用され、遺伝子のエクソンに相当するｃＤＮＡを含む。本明細書での「遺伝子」への参照は、転写及び／又は翻訳の調節配列及び／又はコーディング領域及び／又は非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’及び３’の非翻訳配列）；、又はコーディング配列（すなわち、エクソン）に相当するｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ分子、プレｍＲＮＡ並びに遺伝子の５’及び３’の非翻訳配列から成る従来のゲノム遺伝子を含むようにも解釈される。
【０２４０】
「発現」への参照は遺伝子発現に対する広い参照であり、転写前から転写及び翻訳を経て翻訳後までの遺伝子又は核酸分子に由来するタンパク質又はＲＮＡを生じる過程における任意の段階を含む。
【０２４１】
「細胞」には、本明細書で使用されるとき、真核細胞（たとえば、動物細胞、植物細胞、及び真菌又は原生生物の細胞）及び原核細胞（たとえば、細菌）が含まれる。一実施形態では、細胞はヒトの細胞である。
【０２４２】
用語「被験体」は本明細書で使用されるとき、動物又はヒトの被験体を意味する。「動物」とは、霊長類、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギを含む）、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、及びモルモットを含む）、捕獲野生動物（動物園環境で一般に見られるものを含む）、及び水性動物（魚類及び甲殻類のような淡水及び海水の動物を含む）を意味する。たとえば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びハムスターのような実験動物も、彼らが好都合な試験系を提供し得るので意図される。一部の実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【０２４３】
複合体又は組成物の被験体への「投与」とは、剤又は組成物が、それを被験体に移すことができる又はそれが被験体に移されるように提示されることを意味する。投与の方法には特定の限定はないが、これは一般に、経口の方法、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、クモ膜下及び髄腔内を含む）の方法、吸入の方法（噴霧を含む）、直腸及び膣への方法によるであろう。
【０２４４】
理論によって束縛又は限定するものではないが、本発明の複合体は、たとえば、ＲＮＡ分解酵素及び／又はＤＮＡ分解酵素のような酵素による分解から核酸分子を保護することが見いだされている。
【０２４５】
従って、本発明はまた、核酸分子を酵素分解から保護する方法も提供し、該方法は、支持部分、及びその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖を含む分岐ポリマーと核酸分子とを複合体化することを含み、ここで、少なくとも３つのホモポリマー鎖は、カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
【０２４６】
核酸分子を細胞に送達するための複合体の使用も提供され、該複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、該分岐ポリマーは支持部分と、その部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、ここで、少なくとも３つのホモポリマー鎖は、カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
【０２４７】
本発明はさらに、遺伝子発現をサイレンシングするための複合体の使用を提供し、該複合体は分岐ポリマーと核酸分子とを含み、該分岐ポリマーは支持部分と、その部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、ここで、少なくとも３つのホモポリマー鎖は、カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
【０２４８】
一実施形態では、核酸分子はＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。さらなる実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子／小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡｓ）、核内小分子（ＳｎＲＮＡｓ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的推移に介在するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答性ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【０２４９】
本発明はその上さらに、酵素分解から核酸分子を保護することにおける分岐ポリマーの使用を提供し、該分岐ポリマーは支持部分と、その部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも３つのホモポリマー鎖とを含み、ここで、少なくとも３つのホモポリマー鎖は、カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
【０２５０】
本発明はまた、本発明の核酸分子複合体を含む医薬組成物のような組成物に関する。一部の実施形態では、組成物は本発明の核酸分子複合体と、１以上の薬学上許容可能なキャリア、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。
【０２５１】
本発明の組成物では、核酸分子複合体は通常、有効量での投与のために製剤化される。核酸複合体の用語、「有効量」及び「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき通常、少なくとも統計的に有意な数の被験体において経過中、所望の治療効果又は予防効果を提供する複合体の十分量を意味する。
【０２５２】
一部の実施形態では、ヒト被験体にとっての有効量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重／用量〜１ｇ／ｋｇ体重／用量の範囲にある。一部の実施形態では、範囲は、約１μｇ〜１ｇ、約１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、又は１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重／用量である。投薬計画は状況の緊急性に合うように調整されるが、最適な治療用量又は予防用量を生じるように調整されてもよい。
【０２５３】
「薬学上許容可能な」キャリア、賦形剤又は希釈剤とは、生物学的に又は別の点で望ましくないものではない材料で構成される医薬ビヒクルを意味し；すなわち、該材料は、どんな又は実質的な有害反応を生じることなく、本発明の複合体と共に被験体に投与されてもよい。
【０２５４】
本発明の態様には、感染性疾患、炎症性疾患、又は癌のために被験体を治療する方法が含まれ、該方法は、本発明に係る複合体を被験体に投与すること、又は本発明に係る医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【０２５５】
本発明に係る分岐ポリマーは、農業部門、化粧品部門にて生物活性剤のための送達ビヒクルとして、たとえば、塗料及び化粧品の製造において粘度調節剤、界面活性剤、分散剤又は添加剤として使用されてもよい。
【０２５６】
本明細書で使用されるとき、単独で又は複合語で使用される用語「アルキル」は直鎖、分岐鎖、又は環状のアルキル、好ましくはＣ１−２０アルキル、たとえば、Ｃ１−１０又はＣ１−６のアルキルを示す。直鎖及び分岐鎖のアルキルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチル−プロピル、及びヘキシルが挙げられる。環状アルキルの例には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル等のような単環式又は多環式のアルキル基が挙げられる。アルキル基が一般に「プロピル」、「ブチル」等と呼ばれる場合、これは適宜、直鎖、分岐鎖及び環状の異性体のいずれかを指すことができることが理解されるであろう。アルキル基は、本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。
【０２５７】
用語「アルケニル」は本明細書で使用されるとき、以前定義されたようなエチレン性不飽和のモノ−、ジ−、又はポリ不飽和アルキル基又はシクロアルキル基を含む、少なくとも１つの炭素と炭素の二重結合を含有する直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素残基から形成される基、好ましくはＣ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−１０又はＣ２−６）を示す。アルケニルの例には、ビニル、アリル、１−メチルビニル及びブテニルが挙げられる。アルケニル基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。
【０２５８】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、以前定義されたようなエチレン性不飽和のモノ−、ジ−、又はポリ不飽和アルキル基又はシクロアルキル基を含む、少なくとも１つの炭素と炭素の三重結合を含有する直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素残基から形成される基を示す。炭素原子の数が特定されない限り、その用語は好ましくはＣ２−２０アルキニル（たとえば、Ｃ２−１０又はＣ２−６）を指す。例には、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル及びブチニル異性体及びペンチニル異性体が挙げられる。アルキニル基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。
【０２５９】
用語「ハロゲン」（「ハロ」）はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）を示す。
【０２６０】
用語「アリール」（又は「カルボアリール」）は、芳香族炭化水素環系（たとえば、Ｃ６−２４又はＣ6−１８）の単一の、多核の、抱合された及び融合された残基のいずれかを示す。アリールの例には、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、クオーターフェニル及びナフチルが挙げられる。アリール基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよいし、置換されなくてもよい。用語「アリーレン」はアリールの二価の形態を示すように意図される。
【０２６１】
用語「カルボシクリル」には、非芳香族の単環式、多環式、融合された又は抱合された炭化水素残基、好ましくはＣ３−２０（たとえば、Ｃ３−１０又はＣ３−８）のいずれかが含まれる。環は飽和されてもよいし、たとえば、シクロアルキル、又は１以上の二重結合を持ってもよいし（シクロアルケニル）及び／又は１以上の三重結合を持ってもよい（シクロアルキニル）。カルボシクリル基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。用語「カルボシクリレン」はカルボシクリルの二価の形態を示すように意図される。
【０２６２】
用語「ヘテロ原子」又は「ヘテロ」は最も広い意味で本明細書で使用されるとき、環状有機基のメンバーであってもよい炭素原子以外の任意の原子を指す。ヘテロ原子の特定の例には、窒素、酸素、イオウ、リン、ホウ素、ケイ素、セレニウム及びテルリウムが挙げられ、さらに特に、窒素、酸素及びイオウが挙げられる。
【０２６３】
用語「ヘテロシクリル」には、単独で又は複合語にて使用される場合、単環式、多環式、融合された又は抱合された炭化水素残基、好ましくはＣ３−２０（たとえば、Ｃ３−１０又はＣ３−８）のいずれかが含まれ、ここで、１以上の炭素原子が非芳香族残基を提供するようにヘテロ原子によって置換される。好適なヘテロ原子には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｅ、特にＯ、Ｎ及びＳが挙げられる。２以上の炭素原子が置換される場合、これは同一ヘテロ原子の２以上によってもよいし、異なるヘテロ原子によってもよい。ヘテロシクリル基は飽和されてもよく、又は部分不飽和であってもよく、すなわち、１以上の二重結合を持ってもよい。ヘテロシクリル基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。用語「ヘテロシクリレン」はヘテロシクリルの二価の形態を示すように意図される。
【０２６４】
用語「ヘテロアリール」には、単環式、多環式、融合された又は抱合された炭化水素残基のいずれかが含まれ、ここで、１以上の炭素原子が芳香族残基を提供するようにヘテロ原子によって置換される。好まれるヘテロアリールは３〜２０、たとえば、３〜１０の環原子を有する。好ましくは好まれるヘテロアリールは５〜６及び９〜１０員環の二環式環系である。好適なヘテロ原子には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｅ、特にＯ、Ｎ及びＳが挙げられる。２以上の炭素原子が置換される場合、これは同一ヘテロ原子の２以上によってもよいし、異なるヘテロ原子によってもよい。ヘテロアリール基は本明細書で定義されるような１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。用語「ヘテロアリーレン」はヘテロアリールの二価の形態を示すように意図される。
【０２６５】
用語「アシル」は単独で又は複合語にてＣ＝Ｏ部分を含有する（及びカルボン酸、エステル又はアミドではない）基を示す。好まれるアシルにはＣ（Ｏ）−Ｒｅが含まれ、Ｒｅは水素又はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリルの残基である。
【０２６６】
用語「スルホキシド」は単独で又は複合語にて基−Ｓ（Ｏ）Ｒｆを指し、Ｒｆは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル及びアラルキルから選択される。好まれるＲｆの例には、Ｃ１−２０アルキル、フェニル及びベンジルが挙げられる。
【０２６７】
用語「スルホニル」は単独で又は複合語にて基Ｓ（Ｏ）２−Ｒｆを指し、Ｒｆは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル及びアラルキルから選択される。
【０２６８】
用語「スルホンアミド」は単独で又は複合語にて基Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｆを指し、各Ｒｆは独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル及びアラルキルから選択される。
【０２６９】
用語「アミノ」は当該技術で理解されるように最も広い意味でここでは使用され、それには式ＮＲａＲｂの基が含まれ、式中Ｒａ及びＲｂは独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル及びアシルから選択されてもよい。Ｒａ及びＲｂはそれらが連結される窒素と一緒に単環式又は多環式の環系、たとえば、３〜１０員環の環、好ましくは５〜６及び９〜１０員環の系を形成してもよい。
【０２７０】
用語「アミド」は当該技術で理解されるように最も広い意味でここでは使用され、それには式Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂを有する基が含まれ、式中Ｒａ及びＲｂは上記で定義されたとおりである。
【０２７１】
用語「カルボキシエステル」は当該技術で理解されるように最も広い意味でここでは使用され、それには式ＣＯ２Ｒｇを有する基が含まれ、式中Ｒｇはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル及びアシルを含む基から選択されてもよい。
【０２７２】
本明細書で使用されるとき、用語「アリールオキシ」は酸素架橋を介して結合された「アリール」基を指す。アリールオキシ置換基の例には、フェノキシ、ビフェニルオキシ、ナフチルオキシ等が挙げられる。
【０２７３】
本明細書で使用されるとき、用語「アシルオキシ」は、「アシル」基が次に酸素原子を介して結合される「アシル」基を指す。
【０２７４】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルオキシカルボニル」はカルボニル基を介して結合された「アルキルオキシ」基を指す。「アルキルオキシカルボニル」基の例には、ブチルホルメート、ｓｅｃ−ブチルホルメート、ヘキシルホルメート、オクチルホルメート、デシルホルメート、シクロペンチルホルメート等が挙げられる。
【０２７５】
本明細書で使用されるとき、用語「アリールアルキル」は芳香環で置換された直鎖又は分岐鎖のアルカンから形成される基を指す。アリールアルキルの例には、フェニルメチル（ベンジル）、フェニルエチル及びフェニルプロピルが挙げられる。
【０２７６】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルアリール」は直鎖又は分岐鎖のアルカンで置換されたアリール基から形成される基を指す。アルキルアリールの例には、メチルフェニル及びイソプロピルフェニルが挙げられる。
【０２７７】
本明細書では、「置換されていてもよい」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アラルキル、アルカリル、アルクヘテロシクリル、アルクヘテロアリール、アルクカルボシクリル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ハロカルボシクリル、ハロヘテロシクリル、ハロヘテロアリール、ハロアシル、ハロアリアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシカルボシクリル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシヘテロシクリル、ヒドロキシヘテロアリール、ヒドロキシアシル、ヒドロキシアラルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルケニル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボシクリル、アルコキシアリール、アルコキシヘテロシクリル、アルコキシヘテロアリール、アルコキシアシル、アルコキシアラルキル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、カルボシクリルオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アシルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアルキニルオキシ、ハロアリールオキシ、ハロカルボシクリルオキシ、ハロアラルキルオキシ、ハロヘテロアリールオキシ、ハロヘテロシクリルオキシ、ハロアシルオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアイル、ニトロカルボシクリル、ニトロアシル、ニトロアラルキル、アミノ（ＮＨ２）、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アラルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、アシルアミノ、ジアシルアミノ、ヘテロシクルアミノ、ヘテロアリールアミノ、カルボキシ、カルボキシエステル、アミド、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アシルチオ、スルホキシド、スルホニル、スルホンアミド、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノカルボシクリル、アミノアリール、アミノヘテロシクリル、アミノヘテロアリール、アミノアシル、アミノアラルキル、チオアルキル、チオアルケニル、チオアルキニル、チオカルボシクリル、チオアリール、チオヘテロシクリル、チオヘテロアリール、チオアシル、チオアラルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、カルボキシアルキニル、カルボキシカルボシクリル、カルボキシアリール、カルボキシヘテロシクリル、カルボキシヘテロアリール、カルボキシアシル、カルボキシアラルキル、カルボキシエステルアルキル、カルボキシエステルアルケニル、カルボキシエステルアルキニル、カルボキシエステルカルボシクリル、カルボキシエステルアリール、カルボキシエステルヘテロシクリル、カルボキシエステルヘテロアリール、カルボキシエステルアシル、カルボキシエステルアラルキル、アミドアルキル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、アミドカルボシクリル、アミドアリール、アミドヘテロシクリル、アミドヘテロアリール、アミドアシル、アミドアラルキル、ホルミルアルキル、ホルミルアルケニル、ホルミルアルキニル、ホルミルカルボシクリル、ホルミルアリール、ホルミルヘテロシクリル、ホルミルヘテロアリール、ホルミルアシル、ホルミルアラルキル、アシルアルキル、アシルアルケニル、アシルアルキニル、アシルカルボシクリル、アシルアリール、アシルヘテロシクリル、アシルヘテロアリール、アシルアシル、アシルアラルキル、スルホキシドアルキル、スルホキシドアルケニル、スルホキシドアルキニル、スルホキシドカルボシクリル、スルホキシドアリール、スルホキシドヘテロシクリル、スルホキシドヘテロアリール、スルホキシドアシル、スルホキシドアラルキル、スルホニルアルキル、スルホニルアルケニル、スルホニルアルキニル、スルホニルカルボシクリル、スルホニルアリール、スルホニルヘテロシクリル、スルホニルヘテロアリール、スルホニルアシル、スルホニルアラルキル、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアルケニル、スルホンアミドアルキニル、スルホンアミドカルボシクリル、スルホンアミドアリール、スルホンアミドヘテロシクリル、スルホンアミドヘテロアリール、スルホンアミドアシル、スルホンアミドアラルキル、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロカルボシクリル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロアシル、ニトロアラルキル、シアノ、サルフェート、ホスフェート、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、及びカルバゾールの基から選択されるものを含む、有機基及び無機基の１、２、３以上で基が置換又は融合（縮合多環基を形成するように）されてもよいし、又は置換又は縮合されなくてもよいことを意味するように解釈される。任意の置換は、鎖又は環における−ＣＨ２−基が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（すなわち、エステル）、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（すなわち、アミド）から選択される基によって置換される場合を指すように解釈されてもよく、ここで、Ｒａは本明細書で定義されたとおりである。
【０２７８】
本発明は今や、以下の非限定的な実施例を参照して記載される。
【実施例】
【０２７９】
実施例１
材料
オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート（ＯＥＧＭＡ８−９、Ｍｎ〜４７５ｇ．ｍｏｌ−１）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ｎ−ＢＭＡ）のモノマー及びエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）架橋剤はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、使用前３０分間、ヒドロキノン又はヒドロキノンモノメチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）のための阻害剤／除去剤の存在下で撹拌することによって精製した。４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸（ＤＴＴＣＰ）ＲＡＦＴ剤（Ｇ．Ｍｏａｄ，Ｙ．Ｋ．Ｃｈｏｎｇ，Ａ．Ｐｏｓｔｍａ，Ｅ．Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｓ．Ｈ．Ｔｈａｎｇ，Ｐｏｌｙｍｅｒ２００５，４６，８４５８）［１］、ジスルフィドジメタクリレート（ＤＳＤＭＡ）架橋剤（Ｊ．Ｒｏｓｓｅｌｇｏｎｇ，Ｓ．Ｐ．Ａｒｍｅｓ，Ｗ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｄ．Ｐｒｉｃｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，４２，５９１９）［２］は公開された文献に従って調製した。１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＣＮ又はＶＡＺＯ−８８，ＤｕＰｏｎｔ）開始剤、トリブチルホスフィン（Ｂｕ３Ｐ，Ａｌｄｒｉｃｈ）還元剤は受け取ったとおりに使用した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジイソプロピルエーテル、メタノール及び他の化学物質は市販の試薬であり、さらに精製することなく使用した。
【０２８０】
性状分析
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ４００ＭＨｚ分光光度計（１Ｈ−４００ＭＨｚ）によって得た。ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）測定は、ＣＭＢ−２０Ａコントローラシステム、ＳＩＬ−２０Ａ  ＨＴ自動試料採取器、ＬＣ−２０ＡＴ直列ポンプシステム、ＤＧＵ−２０Ａ脱気ユニット、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、ＲＤＩ−１０Ａ屈折率検出器を備え、４×Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｔｙｒａｇｅｌカラム（１００〜４００００００の有効なモル質量範囲を提供する各３００ｍｍ×７．８ｍｍのＨＴ２，ＨＴ３，ＨＴ４，ＨＴ５）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕシステムにて行ったが、８０℃にて１ｍＬ／分の流速で溶出液としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）（２．１ｇ／Ｌの塩化リチウム（ＬｉＣｌ）と共に）を使用する。試料のモル質量は、低い多分散指数値のポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）標品（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって構築された較正曲線から得た。三次多項式を用いてｌｏｇＭｐ対時間の較正曲線を当て嵌めたが、それはモル質量の範囲を横切る線形だった。動的光散乱（ＤＬＳ）実験は、６３３ｎｍで作動する４ｍＷのＨｅＮｅレーザー、高量子効率のアバランシェ光ダイオード検出器及びＡＬＶ／ＬＳＥ−５００３多重τデジタル相関器電子システムを備えたＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのゼータサイザーナノシリーズ機器を用いて実施した。水性光散乱試験は、１０ｍＭのＮａＣｌのバックグランド電解質と共に１ｍｇ／ｍＬの星型ポリマー水溶液で実施した。
【０２８１】
ダンシルＲＡＦＴ剤（３）の合成
Ｓｃｈｒａｄｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００７，１３，７７０１−７７０７による公開された文献に従ってジクロロメタン：ｎ−ヘキサン（１：１）溶媒混合物における再結晶化の後、８４．８％の収率で、表題のダンシルＲＡＦＴ剤を作製するための前駆体、ダンシルエチレンジアミン（又は２−ダンシルアミノエチルアミン）（１）を調製した。
【０２８２】
【化８】
2017500390.tif 000009
【０２８３】
ダンシルエチレンジアミン（２９３ｍｇ，１．０ミリモル）と４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸（２）（４０３ｍｇ，１．０ミリモル）と触媒Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液にジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１４０ｍｇ，１．１ミリモル）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。ＤＩＣ／尿素副生成物を濾別し、揮発物を真空で取り除き、粗精製の反応混合物（７９０ｍｇ）をカラムクロマトグラフィ（溶出液として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝３：２、ｖ／ｖ）によって精製して、黄色の液体として表題の生成物、ダンシルＲＡＦＴ剤（２）（４６０ｍｇ、６７．８％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）０．８８（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３），１．２１−１．４０（ｂｒ．ｓ，１８Ｈ，９ｘＣＨ２），１．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．８５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３０−２．４２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２），２．８９（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），３．０５（ｍ，２Ｈ，Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２），３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｓ（Ｏ）２ＮＨＣＨ２），３．３３（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ），５．４９（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），５．９９（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．２１（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【０２８４】
ＳＮ３８  ＲＡＦＴ剤の合成
【０２８５】
【化９】
2017500390.tif 000010
【０２８６】
Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２０１２，７，２８１−２９１による公開された文献に従って２工程合成によってＳＮ３８−ＲＡＦＴ剤を調製した。先ず、Ｚｈａｏら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，８４９−５９）の手順に従ってＳＮ３８（ＳＮ３８は抗癌剤である）から１０−Ｂｏｃ−ＳＮ３８（ＳＮ３８のＢｏｃ保護した１０−ＯＨ基）を調製し、次いで第２の工程において、ジクロロメタン溶媒にてＤＩＣカップリング試薬の存在下で４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸と得られた１０−Ｂｏｃ−ＳＮ３８を反応させた。
【０２８７】
１０−Ｂｏｃ−ＳＮ−３８（５１０ｍｇ，１．０３５ミリモル）と４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸（４２６ｍｇ，１．０５ミリモル）と触媒Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンのＤＣＭ（１５ｍＬ）溶液にジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１９５ｍｇ，１．５６ミリモル，１．５当量）のＤＣＭ溶液を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＤＩＣ／尿素副生成物を濾別し、揮発物を真空で取り除き、粗精製の反応混合物をカラムクロマトグラフィ（溶出液として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１、ｖ／ｖ）によって精製して黄色の固形物としてＳＮ３８−ＲＡＦＴ剤（４９８ｍｇ、５５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）０．８４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３），１．２１−１．３６（ｂｒ．ｍ，１８Ｈ，９ｘＣＨ２），１．３５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３），１．５８（ｓ，９Ｈ，３ｘＣＨ３），１．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．８１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．１４（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），２．５０（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），３．１０（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ），３．２１（ｄｔ，１Ｈ），３．２７（ｔ，１Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ，），５．３７（ｄ，１Ｈ，），５．６４（ｄ，１Ｈ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．８４（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【０２８８】
アームファースト法によるミクトアーム星型ポリマーの合成
［重合の動的プロトコール］別々の重合実験を行うことによってＯＥＧＭＡ８−９とＤＭＡＥＭＡとＢＭＡとの重合比率を確定したが、使用した基本手順を以下に要約する：
ＶＡＺＯ−８８（２５ｍｇ）のＤＭＦ（２．５ｇ）ストック溶液Ｉをフラスコで調製した。ＤＴＴＣＰ（１０６ｍｇ）とＯＥＧＭＡ８−９（５．０ｇ）とストック溶液Ｉ（６４３ｍｇ）とＤＭＦ（４．５ｇ）の混合物を第２のフラスコで調製した。凍結／排気／融解の３回のサイクルによって脱気し、真空下で密封した５つのアンプルにこのストック溶液のアリコート（１．０ｇ）を移した。アンプルを特定の時間９０℃に加熱し、次いでＧＰＣ及び１Ｈ−ＮＭＲの解析に供した。図３は、時間及びモノマーの変換、並びにポリマーの分散に関する３つのモノマーについてのポリマー分子量の成長を説明する。調製された３つのポリマーのＧＰＣトレースを図３（Ｉ）に示し、ＧＰＣからの分子量の結果及びポリマーの多分散度Ｄを表１に示す。
【０２８９】
【表１】
2017500390.tif 000011
【０２９０】
［ミクトアームポリマーの合成］アンプルを用いたミクトアームポリマーの合成のための典型的な手順は以下のとおりである；
ＡＣＣＮ（１．０重量％）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９）（３０．０重量％）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）（３０．１重量％）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ）（２７．３重量％）、ＤＳＤＭＡ（２０．０  重量％）のＤＭＦストック溶液をフラスコにて調製した。特定の量の各モノマー（［モノマー］：［ポリマー］＝６：１）をそれぞれポリマー溶液に加えた。ＡＣＣＮ溶液（７３ｍｇ）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９）溶液（１２９ｍｇ）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）溶液（１２７ｍｇ）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ）溶液（１２０ｍｇ）、ＤＳＤＭＡ溶液（１４６ｍｇ）及びＤＭＦ（１２７ｍｇ）の混合物をフラスコにて調製した。３回の凍結／排気／融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにストック溶液を移した。アンプルを９０℃で２０時間加熱した。
【０２９１】
この手順に従って７つの星型ポリマーを調製したが、表２は、使用した各ホモポリマーのマクロＲＡＦＴ剤及び他の試薬の相対量、並びにＧＰＣ解析に基づいたミクトアームポリマーの分子量を要約する。選択したミクトアームポリマーのＧＰＣトレースを図４（ＩＩＩ）に示す。図４（ＩＶ）は重合前、重合後（粗ポリマー）、精製ポリマー及び分解ポリマーの混合アームのＧＰＣトレースを示す。図５は、精製ミクトアームポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを説明する。
【０２９２】
ミクトアーム星型ポリマーの四級化
ミクトアーム星型ポリマーのＰ（ＤＭＡＥＭＡ）アームの三級アミノ基を四級化するために、上述の星型のストック溶液をＤＭＦで希釈し、次いで過剰なＭｅＩを溶液に加え、室温で１６時間撹拌した。最終的に過剰のＭｅＩを回転エバポレータで取り除き；水に対する星型ポリマーの４日間の透析（分子量膜カットオフ２５，０００Ｄａ）によってＤＭＦを取り除いた。凍結乾燥の後、四級化Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）を含有する星型ポリマーを得た。図６は四級化ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【０２９３】
【表２】
2017500390.tif 000012
【０２９４】
実施例２
トリブチルホスフィンを用いたミクトアーム星型ポリマーの還元的切断
２０ｍｇのトリブチルホスフィンを含有する１ｍＬのＤＭＡｃに、そのコアにジスルフィド結合を含有するミクトアームポリマー（５ｍｇ）を溶解した。ＧＰＣ解析に先立って、窒素雰囲気下で３０分間、室温にて溶液を撹拌した。図３（ＩＶ）は、星型ポリマーと、アームのそれに匹敵する分子量を持つ低分子量ポリマーを生じる架橋コアの切断を示す分解ポリマーのＧＰＣトレースを示す。
【０２９５】
実施例３
蛍光色素であるローダミンメタクリレートを取り込んでいるＳ４−１（表２を参照）に類似するミクトアーム星型ポリマーの合成
アームファースト法を用いてＰｏｌｙＦｌｏｕｒを有するミクトアーム星型ポリマーを合成した。
【０２９６】
第１の工程については、ＰｏｌｙＦｌｏｕｒを有する線状ポリマーの合成のための典型的な手順は以下のとおりである。ＶＡＺＯ−８８（２５ｍｇ）のＤＭＦ（２．５ｇ）ストック溶液Ｉをフラスコで調製した。ＤＴＴＣＰ（３２ｍｇ）、ＰｏｌｙＦｌｏｕｒ（ローダミンメタクリレート  ＭＡ）（１１ｍｇ）、ＯＥＧＭＡ８−９（１．５ｇ）、ストック溶液Ｉ（１９０ｍｇ）及びＤＭＦ（１．３ｇ）の混合物を第２のフラスコで調製した。３回の凍結／排気／融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにこのストック溶液を移した。アンプルを９０℃で特定の時間加熱し、次いでＧＰＣ及び１Ｈ−ＮＭＲの解析に供した。
【０２９７】
【表３】
2017500390.tif 000013
【０２９８】
次いで第２の工程では、ＡＣＣＮ（１．０重量％）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９−ＲｈＭＡ）（３０．０重量％）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ＲｈＭＡ）（３０．０重量％）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ−ＲｈＭＡ）（３０．０重量％）、ＤＳＤＭＡ（２０．６重量％）のＤＭＦストック溶液をフラスコで調製した。特定の量の各モノマー（［モノマー］：［ポリマー］＝６：１）をそれぞれポリマー溶液に加えた。ＡＣＣＮ溶液（８６ｍｇ）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９−ＲｈＭＡ）溶液（１１１ｍｇ）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ＲｈＭＡ）溶液（１０９ｍｇ）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ−ＲｈＭＡ）溶液（１０７ｍｇ）、ＤＳＤＭＡ溶液（１７８ｍｇ）及びＤＭＦ（２８４ｍｇ）の混合物をフラスコで調製した。３回の凍結／排気／融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにストック溶液を移した。アンプルを９０℃で２０時間加熱した。
【０２９９】
【表４】
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【０３００】
実施例４
材料及び方法
細胞
緑色蛍光タンパク質を構成的に発現しているチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−ＧＦＰ）（ＣＳＩＲＯ，オーストラリア）を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０１％のペニシリン及び０．０１％のストレプトマイシンで補完された改変ＭＥＭαにて５％ＣＯ２と共に３７℃で増殖させ、週に２回継代した。
【０３０１】
ヒト腺癌性肺胞基底上皮細胞（Ａ５４９、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１８５）、ヒト肝癌細胞（ＶＩＤＲＬ，オーストラリアから快く譲渡されたＨｕＨ７）を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、０．０１％のペニシリン及び０．０１％のストレプトマイシンで補完されたＤＭＥＭにて５％ＣＯ２と共に３７℃で増殖させ、週に２回継代した。
【０３０２】
ｓｉＲＮＡ
抗ＧＦＰ及び陰性対照のｓｉＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ（ＵＳＡ）から得た。抗ＧＦＰのｓｉＲＮＡの配列は、センス５’ｇｃａａｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａａｇｕｕｃａｕ３’及びアンチセンス５’ｇａａｃｕｕｃａｇｇｇｕｃａｇｃｕｕｇｃｃｇ３’である。ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして同等の配列を非サイレンシング対照として用いる。
【０３０３】
ｓｉＦＡｍはセンス鎖上で５’ＦＡＭ標識した抗ＧＦＰのｓｉＲＮＡで同じ配列である。
【０３０４】
抗コートマータンパク質複合体、サブユニットα（ＣＯＰＡ）のｓｉＲＮＡプールはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。４つのｓｉＲＮＡの配列は、１；５’−ＡＣＵＣＡＧＡＵＣＵＧＧＵＧＵＡＡＵＡ［ｄＴ］［ｄＴ］−３’、２；５’−ＧＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＣＡＣＵＡＵＧＵ［ｄＴ］［ｄＴ］−３’、３；５’−ＧＡＵＣＡＧＡＣＣＡＵＣＣＧＡＧＵＧＵ［ｄＴ］［ｄＴ］−３’、４；５’−ＧＡＧＵＵＧＡＵＣＣＵＣＡＧＣＡＡＵＵ［ｄＴ］［ｄＴ］−３’である。
【０３０５】
結合
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の形成
ポリマーの５０ピコモルのｓｉＲＮＡ又はｓｉＤＮＡに対する窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比を算出した。エッペンドルフチューブへのＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の添加によって複合体を形成した。水に再懸濁した必要な量のポリマーをチューブに加え、混合物をボルテックスで撹拌した。次いで５０ピコモルのｓｉ２２又はｄｉ２２をチューブに加え、試料をボルテックスで撹拌した。室温で１時間、複合体化を継続させた。
【０３０６】
アガロースゲル
５０ピコモルのｓｉＲＮＡを含有する試料をＴＢＥでの２％アガロースゲル上で１００Ｖにて４０分間、電気泳動した。カメラ付きＵＶトランスイルミネータでゲルレッド（Ｊｏｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってｓｉＲＮＡを視覚化し、ＧｅｎｅＳｎａｐプログラム（Ｓｙｎｇｅｎｅ，ＵＳＡ）によって画像を記録した。
【０３０７】
実施例１における手順に従って調製したミクトアームポリマーをｓｉＲＮＡの結合、毒性及びサイレンシングの評価に用いた。実施例１で調製したミクトアームポリマーとのｓｉＲＮＡの結合の結果を図７で説明する。図７（Ｉ）はポリマー単独を説明するのに対して図７（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）はそれぞれ、２、５及び１０のポリマー：ｓｉＲＮＡの（Ｎ：Ｐ）比についての結合を説明する。図７における結果は、低いＮ：Ｐ比であっても良好なｓｉＲＮＡ結合が観察されることを説明する。このことは、少ない量のポリマーを用いてポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を製造して、良好なサイレンシングを達成できることを示す。
【０３０８】
ジスルフィド結合の切断によるｓｉＲＮＡの放出
脱酸素水を用いてＴＣＥＰ溶液（５０ｍＭ）を調製し、−２０℃で保存した。ポリマー／ｓｉ２２複合体（５０ピコモル）を上述のように構築した。これらのポリプレックスをｐＨ５の酢酸ナトリウム緩衝液中で０．３ＭのＮａＣｌの存在下にて５０ｍＭのＴＣＥＰ還元に供した。反応物を３７℃で２時間インキュベートし、上述のような２％アガロースゲル上の電気泳動によってｓｉ２２の放出について解析した。図８はミクトアーム星型ポリマーＳ４−１及びＳ４−５におけるジスルフィド結合の切断を説明する。
【０３０９】
実施例５
毒性ポリマー単独
毒性アッセイ
９６穴組織培養プレートにて３つ組でＣＨＯ−ＧＦＰ細胞及びＡ５４９細胞を１×１０４個で播いた一方でＨｕｈ７細胞を２×１０４個で播き、５％ＣＯ２と共に３７℃で増殖させた。
【０３１０】
連続希釈したポリマー材料を各試料について９６穴培養プレートにおける３ウェルに加え、２００μＬの標準培地にて３７℃で７２時間インキュベートした。製造元の指示書に従ってＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）を用いて毒性を測定した。手短には、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬を含有する１００μＬの標準培地で置き換え、次いで細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。ＥＬ８０８吸光度マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ、ＵＳＡ）にて５４０ｎｍ及び６２０ｎｍでアッセイを読み取った。細胞の生存率は５４０ｎｍでの測定から６２０ｎｍでの測定を差し引くことによって決定した。得られたデータはマイクロソフトのエクセルで解析した。結果は、未処理の細胞の比率として提示され、提示されたデータは３つ組での３回の別々の実験の代表的なものである。
【０３１１】
９６穴組織培養プレートにて３つ組でＣＨＯ−ＧＦＰ細胞及びＡ５４９細胞を１×１０４細胞／ウェルで播き、Ｈｕｈ７細胞を２×１０４細胞／ウェルで播いて、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。陽性対照及び陰性対照については、製造元の指示書通りにＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてｓｉＲＮＡを細胞に形質移入した。手短には、双方とも５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で希釈して、１０ピコモルの関連するｓｉＲＮＡを０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００と混合し、室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ混合物を細胞に加え、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、７２時間インキュベートした。
【０３１２】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体については、細胞培地を取り出し、２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭで置き換えた。上述のように作製したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に加え、４時間インキュベートし、培地を標準の増殖培地に置き換え、さらに７２時間インキュベートした。上述のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて毒性を測定した。得られたデータをマイクロソフトのエクセルで解析した。結果は未処理の細胞の比率として提示し、提示されたデータは３つ組での３回の別々の実験の代表的なものである。
【０３１３】
ポリマー濃度（ポリマー単独）の関数としての細胞生存率を細胞株Ｈｕｈ７、Ａ５４９及びＣＨＯ−ＧＦＰについて図９で説明する一方で、図１０は同じ３つの細胞株でのポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞生存率を示す。
【０３１４】
実施例６
ＣＨＯ−ＧＦＰをサイレンシングするｓｉＲＮＡ
３つ組にて９６穴組織培養プレートに１×１０４個でＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を播き、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。陽性対照及び陰性対照については、製造元の指示書通りにＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｌ２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてｓｉＲＮＡを細胞に形質移入した。手短には、双方とも５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で希釈して、１０ピコモルの関連するｓｉＲＮＡを０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００と混合し、室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ混合物を細胞に加え、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、７２時間インキュベートした。
【０３１５】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体については、細胞培地を取り出し、２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭで置き換えた。上述のように作製したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に加え、４時間インキュベートし、培地を標準の増殖培地に置き換え、さらに７２時間インキュベートした。
【０３１６】
７２時間のインキュベートの後、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を含有する９６穴プレートをＰＢＳＡで洗浄し、Ｓｙｎｅｒｇｙ，ＨＴ（ＵＳＡ）にて５１６ｎｍでＧＦＰの蛍光を解析した。得られたデータをマイクロソフトのエクセルで解析した。結果をポリマー／非特異的なサイレンシングＤＮＡ複合体の百分率として提示し、提示されたデータは３つ組での３回の別々の実験の代表的なものである。
【０３１７】
図１１は、実施例１で調製されたミクトアームポリマー（表２）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生じるのに関与する遺伝子のサイレンシングを説明する。
【０３１８】
他の細胞株でのサイレンシング
９６穴組織培養プレートにて３つ組でＡ５４９細胞を１×１０４細胞／ウェルで播き、Ｈｕｈ７細胞を２×１０４細胞／ウェルで播いて、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。陽性対照及び陰性対照については、製造元の指示書通りにＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｌ２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてｓｉＲＮＡを細胞に形質移入した。手短には、双方とも５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で希釈して、１０ピコモルの関連するｓｉＲＮＡを０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００と混合し、室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ混合物を細胞に加え、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、７２時間インキュベートした。
【０３１９】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体については、細胞培地を取り出し、２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭで置き換えた。上述のように作製したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に加え、４時間インキュベートし、培地を標準の増殖培地に置き換え、さらに７２時間インキュベートした。ＣＯＰＡは必須の遺伝子であるので、上述のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いた毒性によってサイレンシングを測定する。得られたデータをマイクロソフトのエクセルで解析した。結果を未処理の細胞の比率として提示し、提示されたデータは３つ組での３回の別々の実験の代表的なものである。
図１２はＨｕｈ７細胞及びＡ５４９細胞におけるＣＯＰＡのサイレンシングを説明する。
【０３２０】
実施例７
抗癌剤ＳＮ３８の送達
ＲＡＦＴ剤を介して共有結合したＳＮ３８を有するポリマーを、ＳＮ３８を送達する能力について調べた。９６穴組織培養プレートにて３つ組でＡ５４９細胞を１×１０４個で播き、Ｈｕｈ７細胞を２×１０４個で播いて、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。１０、１、０．１、又は０．０１μＭのＳＮ３８を送達するようにポリマーの濃度を算出した。各試料についてこれらを９６穴組織培養プレートの３ウェルに加え、２００μＬの標準培地にて３７℃で７２時間インキュベートした。製造元の指示書に従ってＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）を用いて毒性を測定した。手短には、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬を含有する１００μＬの標準培地で置き換え、次いで細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。ＥＬ８０８吸光度マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ、ＵＳＡ）にて５４０ｎｍ及び６２０ｎｍでアッセイを読み取った。細胞の生存率は５４０ｎｍでの測定から６２０ｎｍでの測定を差し引くことによって決定した。得られたデータはマイクロソフトのエクセルで解析した。結果は、未処理の細胞の比率として提示され、提示されたデータは３つ組での３つの別々の実験の代表的なものである。結果を図１３にて要約する。
【０３２１】
実施例８
［６ＦＡＭ］標識したｓｉ２２を用いて上述のようにポリマー／ｓｉ２２−ＦＡＭ複合体（５０ピコモル）を構築し、共焦点顕微鏡下での実験に用いた。
【０３２２】
［共焦点顕微鏡］２４穴プレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳＡ）における１３ｍｍの丸型カバーグラス（Ｍｅｎｚｅｌ，ドイツ）上に１×１０５個でＨｕｈ７細胞を播き、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。陽性対照については、以下に記載されるように、製造元の指示書通りにＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて［６ＦＡＭ］標識したｓｉ２２を細胞に形質移入した。ポリマーと標識したｓｉＲＮＡの複合体を上述のように作製し、細胞に５時間加えた。共焦点顕微鏡用に細胞を処理するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で１時間固定した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）におけるスライド上に細胞を伴ったカバーグラスを載せた。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ドイツ）にて画像を取得した。図１４は、共焦点顕微鏡によって調べたように標識ポリマー及びＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの取り込みを説明している。
【０３２３】
実施例９
ブロックコポリマーのアームを有する４アーム星型の調製（国際公開第２０１３／１１３０７１号に係る比較例）
方法
国際公開第２０１３／１１３０７１号で要点が述べられた方法に従って、ＲＦＡＴ重合を介してＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及びオリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ４７５）モノマーを重合して、ブロックコポリマーで構成される様々な４アーム星型を達成した。
【０３２４】
【表５】
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【０３２５】
実施例４と同じ方法によってＣＨＯ細胞におけるＧＦＰのサイレンシングを行った
サイレンシングのデータは、試料ＴＬ３８−５０（５０％四級化）、ＴＬ３８−１００（１００％四級化）、ＴＬ−８４（ＰｏｌｙＦｌｕｏｒを有しない１００％四級化）、及びＴＬ−８５（ＰｏｌｙＦｌｕｏｒを有する１００％四級化）についてのＣＨＯ−ＧＦＰのサイレンシングを説明する図１５にて提示される。ＴＬ−３８ポリマーは国際公開第２０１３／１１３０７１号にて記載されたものに類似する方法を用いて調製された４アーム星型を表す。ＴＬ−８４は、４アーム星型におけるアームがカチオン性、親水性及び疎水性のセグメントを含有することを除いて類似して調製された。図１５における結果は、本発明に係る３つのホモポリマーアームを表すセグメントを有するにもかかわらず、星型のアームが構造的に同等である場合、サイレンシングの成績はミクトアームポリマーで見られたものに劣ることを明らかにしている（比較には図１１におけるＳ４−１を参照のこと）。
【０３２６】
実施例１０
この動物試験で使用されるミクトアームポリマーＳ４−１及びＳ４−１０はそれぞれ実施例１及び実施例３で開示されたものだった。
６３２．８ｎｍで作動する２２ｍＷのＨｅ−Ｎｅレーザー、高量子効率のアバランシェ光ダイオード検出器及びＡＬＶ／ＬＳＥ−５００３多重デジタル相関器電子システムを備えるＭａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａｓｉｚｅｒナノシリーズＤＬＳ検出器にて、２、４及び６のＮ／Ｐ比でｓｉＲＮＡを用いたＳ４−１のゼータ電位を３７℃で測定した。２４．２μＬのミクトアームポリマーＳ４−１（４μｇ／μＬ）を４２μＬの水と５μＬのＧＦＰｓｉＲＮＡ（１０μｇ／μＬ）に加えた。この混合物をボルテックスで撹拌したところ、ナノ粒子が自然発生的に形成した。溶液を室温で２時間平衡化させ、測定の直前に１０ｍＭのＮａＣｌで１ｍＬに希釈した。２、４及び６のＮ／Ｐ比を持つナノ粒子のゼータ電位はそれぞれ、−１１．６、２９．７及び３０．８だった。
【０３２７】
Ｃ５７／ＢＬＫ６マウスは動物倫理委員会（ＡＥＣ）の認可に従ってオーストラリア動物衛生研究所（ＡＡＨＬ）の小動物施設から入手した。
【０３２８】
１００μＬのＰＢＳ又は１００μＬのＰＢＳ中の処理剤を尾静脈で静脈内注射するのに先立って２日間、マウスの体重を測定した。
【０３２９】
処理群は、
グループ１  対照：６匹のＰＢＳ対照動物；
グループ２  ポリマー１−３：ＰＢＳ中での蛍光ミクト星型（Ｓ４−１０）／ｓｓＢのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのマウスの体重ｇ当たり３μｇで処理した６匹の動物；
グループ３  ポリマー２−３：ＰＢＳ中でのミクト星型（Ｓ４−１）／ｓｓＢのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのマウスの体重ｇ当たり３μｇで処理した６匹の動物；
グループ４  ポリマー３−９：ＰＢＳ中での蛍光ミクト星型（Ｓ４−１０）／ｓｓＢのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのマウスの体重ｇ当たり９μｇで処理した６匹の動物；
グループ５  ポリマー１−９：ＰＢＳ中でのミクト星型（Ｓ４−１）／ｓｓＢのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのマウスの体重ｇ当たり９μｇで処理した６匹の動物；
から成った。
【０３３０】
４８時間後、マウスを安楽死させ、ＲＮＡ抽出のために肺、脾臓、肝臓及び腎臓の組織を採取した。製造元の指示書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳｉｍｐｌｙＲＮＡ組織キットを用いて１０ｍｇの組織からＲＮＡを抽出した。製造元の指示書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて、標的遺伝子シェーグレン症候群Ｂ型抗原（ｓｓＢ）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ、ＳＭカタログ＃：４３３１１８２、アッセイＩＤ：Ｍｍ００４４７３７４＿ｍ１、遺伝子記号：Ｓｓｂ，ｍＣＧ１２９７６）及びハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ、ＳＭカタログ＃：４３３１１８２、アッセイＩＤ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、遺伝子記号：Ｇａｐｄｈ）について定量的リアルタイムＰＣＲを行った。データは、ＰＢＳ対照動物と比べたｓｓＢ発現における倍数変化として解析した。結果を図１６に示す。
【０３３１】
実施例１１
モノマーの供給業者、この実施例で記載されるミクトアームポリマーの合成で使用されるモノマー及びポリマー及び他の材料を記載する略記は実施例１にて記載されている。
【０３３２】
ｐ（ＢＭＡ）含量（ＴＬ８−１、２、３、４）の効果、分子量（ＴＬ８−５、６）、及びミクトアームのコアを調製するのに使用されるモノマーの種類（ＴＬ８−７、８、９）を検討するためのミクトアームポリマーの合成。
アームファースト法によるミクトアームポリマーの合成
（１）（ＯＥＧＭＡ８−９）、ＤＭＡＥＭＡ及びｎ−ＢＭＡの両端二官能性マクロＲＡＦＴ剤のホモポリマーの合成及び性状分析
【０３３３】
典型的な重合実験では、６ｇのＯＥＧＭＡ８−９モノマー（１．２６４×１０−２モル）と、７．７１６×１０−３ｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（３．１５９×１０−５モル）と、０．１２７４８ｇのＤＴＴＣＰ剤（５）（３．１５４×１０−４モル）と５．１０６３ｇのＤＭＦをＳｃｈｌｅｎｋフラスコに量り採った。溶液混合物を４回の凍結／排気／融解サイクルによって脱気し、９０℃で４時間重合した。
【０３３４】
モノマーからポリマーへの変換は１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３にて）によって測定されたように８４％だった。変換は、未処理のモノマーのＣＯＯＣＨ２の積分（４．３ｐｐｍ）と形成されたポリマーのＣＯＯＣＨ２の積分（４．１ｐｐｍ）を比べることによって算出した。１Ｈ−ＮＭＲに基づいて算出されたポリマーの分子量は１６．４ｋＤａであり、３３．６の重合度に相当する。線形ポリスチレン標品に対してゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって測定されたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は１５．８ｋＤａ（１．２７の分散度）だった。結果を表４に要約する。
【０３３５】
得られたポリマーを濃縮し、ヨウ化メチルで四級化し、透析した。回収したポリマーを凍結乾燥した。
【０３３６】
【表６】
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【０３３７】
（２）ミクトアームポリマーの合成及び性状分析
ミクトアームポリマーの合成のための典型的な手順は以下のとおりである；
Ｖａｚｏ８８（１．０重量％）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９）（３０．０重量％）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）（３０．０重量％）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ）（３０．０重量％）、ＤＳＤＭＡ（２０．０重量％）のＤＭＦストック溶液を調製した。特定の量の各モノマー（［モノマー］：［ポリマー］＝６：１）をそれぞれポリマー溶液に加えた。Ｖａｚｏ８８溶液（２４７．３ｍｇ）、Ｐ（ＯＥＧＭＡ８−９）溶液（５３９ｍｇ）、Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）溶液（５１７ｍｇ）、Ｐ（ｎ−ＢＭＡ）溶液（４９２ｍｇ）、ＤＳＤＭＡ溶液（５２８．９ｍｇ）及びＤＭＦ（１８ｍｇ）の混合物をフラスコで調製した。３回の凍結／排気／融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにストック溶液を移した。アンプルを９０℃で２０時間加熱した。
【０３３８】
この手順に従って６つの星型ポリマーを調製したが、表５は、使用した各ホモポリマーマクロＲＡＦＴ剤及び他の試薬の相対量、並びにミクトアームポリマー及び切断されたミクトアームポリマーの分子量を要約する。
【０３３９】
【表７】
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【０３４０】
ミクトアーム星型ポリマーの四級化
ミクトアーム星型ポリマーのＰ（ＤＭＡＥＭＡ）アームの三級アミノ基を四級化するために、上述の星型のストック溶液をＤＭＦで希釈し、次いで過剰のＭｅＩを溶液に加え、室温で１６時間撹拌した。最終的に、過剰のＭｅＩを回転エバポレータで取り除き；水に対する星型ポリマーの４日間の透析（分子量膜カットオフ２５，０００Ｄａ）によってＤＭＦを取り除いた。凍結乾燥の後、四級化Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ）を含有する星型ポリマーを得た。図６は四級化ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【０３４１】
トリブチルホスフィンを用いたミクトアーム星型ポリマーの還元的切断
２０ｍｇのトリブチルホスフィンを含有する１ｍＬのＤＭＡｃに、そのコアにジスルフィド結合を含有するミクトアームポリマー（５ｍｇ）を溶解した。ＧＰＣ解析に先立って、窒素雰囲気下で３０分間、室温にて溶液を撹拌した。図３（ＩＶ）は、星型ポリマーと分解ポリマーのＧＰＣトレースを示す。これは、アームのそれに匹敵する分子量を持つ低分子量ポリマーを生じる架橋コアの切断を示している。
【０３４２】
本明細書及び後に続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈が特に必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びたとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、言及される整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味し、他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除することを意味しないように理解されるであろう。
【０３４３】
従来の刊行物（又はそれに由来する情報）又は既知である事柄に対する本明細書における参照は、その従来の刊行物（又はそれに由来する情報）又は既知の事柄が、本明細書が関係する試みの分野における技術的常識の一部を形成するという認知若しくは承認又は何らかの形態の示唆として解釈されることはなく、且つ解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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