(57)【要約】  ＤＩＧ−６５７植物殺虫性毒素、このような毒素をコードするポリヌクレオチド、有害生物を防除するためのこのような毒素の使用、およびこのような毒素を生産するトランスジェニック植物が開示される。本発明は、ＤＩＧ−６５７改変体、断片および類似体を含む。
2017521055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−６５７改変体、ＤＩＧ−６５７断片およびＤＩＧ−６５７改変体断片からなる群から選択される殺虫タンパク質をコードする核酸配列の発現を駆動する１つ以上の異種調節配列を含む核酸構築物。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１に対して少なくとも９０パーセントの同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−６５７改変体、ＤＩＧ−６５７断片および配列番号２の残基２０６〜８０３を含む殺虫タンパク質からなる群から選択される、単離された殺虫タンパク質。
【請求項４】
配列番号２、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された殺虫タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸配列を含む植物、種子または植物の一部。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸配列を含む植物、種子または植物の一部。
【請求項７】
請求項３に記載の殺虫タンパク質を含む植物、種子または植物の一部。
【請求項８】
請求項４に記載の殺虫タンパク質を含む植物、種子または植物の一部。
【請求項９】
ポリペプチドが、ヨーロッパアワノメイガ、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ヨーロッパアワノメイガ、ダイズルーパ、ベルベットビーンキャタピラー、タバコバッドワーム、コットンボールワーム、コーンイアワーム、およびコナガからなる群から選択される昆虫に対する殺虫活性を有する、請求項５に記載の植物または植物の一部。
【請求項１０】
ポリペプチドが、ヨーロッパアワノメイガ、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ヨーロッパアワノメイガ、ダイズルーパ、ベルベットビーンキャタピラー、タバコバッドワーム、コットンボールワーム、コーンイアワーム、およびコナガからなる群から選択される昆虫に対する殺虫活性を有する、請求項７に記載の植物または植物の一部。
【請求項１１】
影響されやすい（susceptible）昆虫を防除する方法であって、前記昆虫と請求項３に記載のタンパク質の有効量を接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
タンパク質が、配列番号２、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
影響されやすい昆虫が、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ヨーロッパアワノメイガである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、配列番号２の残基２０６〜８０３を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
昆虫集団が、ヨーロッパアワノメイガ、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ヨーロッパアワノメイガ、ダイズルーパ、ベルベットビーンキャタピラー、タバコバッドワーム、コットンボールワーム、コーンイアワーム、およびコナガからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
耐虫性植物種を生産する方法であって、非トランスジェニック植物と、前記耐虫性植物種のゲノムに安定に組み込まれたＤＩＧ−６５７毒素の発現を駆動する外来ＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物を交配させことと、前記耐虫性植物由来の外来ＤＮＡ構築物の少なくとも一部を分析することにより子孫を選択することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／０１４，９１６号の優先権およびその利益を主張する。この出願の全内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に見出された新規な植物性殺虫タンパク質毒素から開発された新規な殺虫タンパク質毒素および昆虫を防除するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
昆虫および他の有害生物により、作物の損失およびこれらの有害生物を防除下に置くための費用において、農業従事者には毎年数十億ドルの費用がかかる。畑作物の損失に加えて、害虫はまた、野菜および果物の栽培者、装飾花の生産者、ならびに家庭の園芸家にとっても負担になる。農業生産環境における害虫による損失には、作物収量の減少、作物品質の低下、および収穫コストの増加が含まれる。
【０００４】
害虫は、主に、昆虫の成長の阻害、昆虫の摂食もしくは繁殖の防止を通じて活性である、または死を引き起こす化学農薬の集中的な施用によって防除される。したがって、良好な昆虫防除が達成され得るが、これらの化学物質はまた、時には他の有益な昆虫に影響を及ぼし得る。化学農薬の広範な使用に起因する別の問題は、耐性昆虫集団の出現である。これは、様々な耐性管理慣行によって部分的に緩和されているが、代替の有害生物防除剤の必要性が高まっている。デルタエンドトキシンのような農薬毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）株などの生物学的有害生物防除剤もまた、満足のいく結果で作物植物に施用され、化学農薬に代わるものまたは補うものを提供する。これらのデルタエンドトキシンのいくつかをコードする遺伝子は単離されており、異種宿主におけるそれらの発現は、経済的に重要な害虫を防除するための別のツールを提供することが示されている。特に、トランスジェニック植物における殺虫性毒素、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のデルタエンドトキシンの発現は、選択された害虫に対して有効な保護を提供し、このような毒素を発現するトランスジェニック植物は商業化され、農業従事者に化学昆虫防除剤の施用を減少させることができる。
【０００５】
土壌微生物のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は、パラスポラル結晶性タンパク質封入体を特徴とするグラム陽性胞子形成細菌である。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は、植物の組み込み農薬を開発するための新規な殺虫タンパク質の主要な供給源であり続けている。細菌単離株の様々な株を用いて、本発明者らは、商業的に重要な害虫に対して活性である新規なＢｔ毒素を発明した。北アメリカのトウモロコシの昆虫耐性市場において、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（ヨトウガ「ＦＡＷ」）、アワノメイガ（Ostrinia nubialis）ヒューブナー（Hubner）（ヨーロッパアワノメイガ「ＥＣＢ」）、およびアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）ボディー（Boddie）（コーンイアワーム「ＣＥＷ」）は主要な駆動有害生物であるが、他の地域の他の重要な害虫（例えば、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）（コットンボールワーム「ＣＢＷ」またはコーンイアワーム「ＣＥＷ」））および追加の二次的であるが、重要な害虫種である。Ｂｔ毒素は、バイオ殺虫剤市場の９０％超を占め、本質的には、昆虫摂食に耐性を示すように開発されたトランスジェニック作物の遺伝子の全供給源である。Ｂｔ細菌は、クリスタル（Ｃｒｙ）、サイトトキシン（Ｃｙｔ）および植物性殺虫タンパク質（ＶＩＰ）毒素を含む殺虫性デルタエンドトキシンをそれらの遺伝子およびタンパク質構造に依存して産生する。Ｃｒｙ毒素は、胞子形成中に不溶性結晶タンパク質として産生される。一方、ＶＩＰ毒素は、Ｂｔ細菌増殖の生長期中に可溶性タンパク質として産生される。ＶＩＰタンパク質は、それらの構造においてＣｒｙタンパク質と区別されるが、昆虫中腸に位置する細胞に作用する細孔形成因子であるＣｒｙ毒素と特性を共有する（Yu, C.-G., et al., 1997 Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536、Lee, M.K., et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 4648-4657、Shotkoski, F., et al., 2003, Proc. Beltwide Cotton Conf, 89-93）。本発明者らは、現在知られているＶＩＰタンパク質と比較して固有である、ＥＣＢに対する殺虫活性を含む広範囲の殺虫活性を有する新規なＶＩＰ毒素の本発明を本明細書において記載する（Yu, C.-G., et al., 1997 Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536）。
【０００６】
特許文献の国際公開第２０１３／１３４５２３号パンフレット、同第９４／２１７９５号パンフレット、同第９６／１００８３号パンフレット、同第５，８７７，０１２号パンフレット、同第６，１０７，２７９号パンフレット、同第６，１３７，０３３号パンフレットおよび同第６，２９１，１５６号パンフレット、ならびにＥｓｔｒｕｃｈら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-5394）およびＹｕら（1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536）は、ＶＩＰ３と呼ばれる殺虫タンパク質の一種を記載する。ＶＩＰ３遺伝子は、成長の生長期中にバチルス（Bacillus）によって生産および分泌される約８８ｋＤａのタンパク質をコードする。これらの毒素は、結晶形成デルタエンドトキシンと区別されることが報告された。これらの書面は、ＶＩＰ１Ａ（ａ）、ＶＩＰ１Ａ（ｂ）、ＶＩＰ２Ａ（ａ）、ＶＩＰ２Ａ（ｂ）、ＶＩＰ３Ａ（ａ）およびＶＩＰ３Ａ（ｂ）と称される毒素を具体的に参照している。また、ＶＩＰタンパク質の作用および切断のメカニズムの検討については、Lee et al., AEM vol. 69, no. 8 (August 2003), pages 4648-4657を参照されたい。
【０００７】
ＶＩＰ３Ａタンパク質は、ＦＡＷ、ＣＥＷ、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）ハフナゲル（Hufnagel）（ブラックカットワーム「ＢＣＷ」）、およびニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）ファブリシウス（Fabricius）（タバコバッドワーム「ＴＢＷ」）を含む幅広い鱗翅類有害生物に対して殺虫活性を有する。より最近になって、ＶＩＰタンパク質は、ある種の半翅虫害虫に対して有毒であることが判明した（Nanasaheb, P. et al, Toxins (Basel) vol. 4, no.6 (Jun 2012), pages 405-429、Sattar S. and Maiti M.K., J. Microbiol. Biotechnol. 2011, 21:937-946）。したがって、ＶＩＰクラスのタンパク質は、独特の殺虫活性スペクトルを示す。他の開示の国際公開第９８／１８９３２号パンフレット、同第９８／３３９９１号パンフレット、同第９８／００５４６号パンフレット、および同第９９／５７２８２号パンフレットもまた、ここでは、ＶＩＰ３クラスのタンパク質の相同体を同定した。
【０００８】
害虫を防除するための化学薬剤および生物薬剤の継続的な使用は、昆虫がこのような防除対策に対する耐性を生じさせる機会を高める。また、生物学的防除剤の高い選択性は、多くの場合、ほんのわずかな特定の害虫だけが各薬剤によって防除される結果となる。ＥＣＢ耐性のトランスジェニックトウモロコシの成功にもかかわらず、耐性昆虫集団の発生の可能性は、ＥＣＢ防除におけるＣｒｙタンパク質の長期耐久性を脅かし、ＥＣＢおよび他の有害生物を防除するために、新規なＣｒｙまたは他の種類の生物学的防除剤を発見または開発する必要性を生み出す。Ｂｔ  Ｃｒｙタンパク質に対する昆虫の耐性は、いくつかの機序によって生じる可能性がある（Heckel et al., 2007、Pigott and Ellar, 2007）。Ｃｒｙタンパク質の複数の受容体タンパク質クラスが昆虫で同定されており、複数の例が各受容体クラス内に存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する耐性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリンドメインの毒素結合部分内の突然変異を用いて生じさせ得る。耐性のさらなる手段は、プロトキシン処理プロテアーゼによって媒介され得る。したがって、鱗翅目の種におけるＣｒｙ毒素に対する耐性は、少なくとも４つの異なる主要な耐性遺伝子を有する複雑な遺伝的基盤を有する。Ｃｒｙタンパク質に耐性である鱗翅目昆虫は、ＤＢＭ種（コナガ（diamondback moth））（Tabashnik, 1994）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）ヒューブナー（Hubner）（キャベッジ・ルーパー「ＣＬ」；Janmaat and Myers 2003, 2005）、およびＣＥＷ種（Tabashnik et al., 2008）内で畑において発生している。したがって、本明細書に開示されているような新規な高い効力のある植物に組み込まれた農薬タンパク質の開発および展開は有用であり、必要とされる。
【０００９】
したがって、農業従事者に経済的利益をもたらし、環境的に許容可能である新規であり、有効な有害生物防除剤を発見する必要性が依然としてある。既存の昆虫防除剤および現在の防除剤と同等の効力またはそれと比較して増加した効力を有する昆虫防除剤に耐性であるまたは耐性となり得た昆虫集団を効率的に防除する、広範囲の経済的に重要な害虫に標的化された防除剤が特に必要とされる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、本明細書においてＤＩＧ−６５７と称されるタンパク質毒素およびＤＩＧ−６５７の改変体、これらの毒素をコードする核酸、毒素を用いて有害生物を防除する方法、トランスジェニック宿主細胞中に毒素を産生する方法、ならびに毒素を発現するトランスジェニック植物を含む、殺虫性ＶＩＰ毒素を提供する。本発明はさらに、ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−６５７改変体およびＤＩＧ−６５７断片からなる群から選択される殺虫タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−６５７改変体、ＤＩＧ−６５７断片、および配列番号２の残基２０６〜８０３を含む殺虫タンパク質からなる群から選択される、単離された殺虫タンパク質が開示される。また、ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−６５７改変体およびＤＩＧ−６５７断片からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む植物、植物部分および種子が開示される。昆虫の害虫集団における個体と、農薬的に有効な量の配列番号２の残基２０６〜８０３を含むポリペプチドを接触させることを含む、上記害虫集団を防除するための方法もまた開示される。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２の残基２０６〜８０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号２の残基２０６〜８０３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素またはその殺虫活性な断片の発現および活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸置換、欠失もしくは修飾を有する、配列番号２の残基２０６〜８０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、からなる群から選択されるコア毒素セグメントを含む、単離されたＤＩＧ−６５７昆虫毒素ポリペプチドを提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２の残基１〜８０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号２の残基１〜８０３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％または９６％または９７％または９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）配列番号１によりコードされる毒素またはその殺虫活性な断片の発現および活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸置換、欠失もしくは修飾を有する、配列番号２の残基１〜８０３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｄ）発現および毒素活性に悪影響を及ぼさない配列番号２の残基２０６から８０３のアミノ酸配列に対して少なくとも９３％または９４％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、からなる群から選択されるＤＩＧ−６５７コア毒素セグメントを含む、単離されたＤＩＧ−６５７昆虫毒素ポリペプチドを提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−６５７昆虫毒素を含む稔性植物を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸分子をトランスジェニック植物に導入することを含む、昆虫耐性または昆虫寛容性トランスジェニック植物を生成する方法を提供し、ここで、核酸分子は、昆虫を防除するのに有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、有害生物集団を農薬的に有効な量のＤＩＧ−６５７昆虫毒素と接触させることを含む、前記集団を防除するための方法を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、本発明のＤＩＧ−６５７毒素をコードする、単離された核酸分子を提供する。ＤＩＧ−６５７毒素のアミノ酸配列が与えられると、コード配列は、意図された宿主植物により好まれるコドンを用いてアミノ酸配列を逆翻訳し、次に、問題を引き起こし、断続的な終止コドンを与え得る配列を除去するために代替のコドンを用いて配列を純化して、非コードリーディングフレームにおいて長いオープンコード配列を除去することにより設計することができる。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、Ｂｔに由来せず、植物において発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結されたＤＩＧ−６５７昆虫毒素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明はまた、ゲノムに安定に組み込まれたＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物、および前記植物に構築物を導入することを含む、有害生物から植物を保護する方法を提供する。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明は、非トランスジェニック植物と、ＤＩＧ−６５７毒素を発現することができ、植物のゲノムに安定に導入された外来ＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物を交配し、トランスジェニック植物から生じる外来ＤＮＡ構築物の少なくとも一部について分析することにより子孫を選択することを含む、昆虫耐性植物または昆虫寛容性植物を生成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】精製されたＤＩＧ−６５７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像である。レーン１、分子量マーカー；レーン２、３μｇの精製された全長ＤＩＧ−６５７；レーン３、精製された全長タンパク質をトリプシン（１：１０のＤＩＧ−６５７ｗｔ／トリプシンｗｔ）で１時間処理した後のＤＩＧ−６５７の反応生成物。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列の説明
配列番号１は、全長ＤＩＧ−６５７昆虫毒素をコードするＤＮＡ配列である。
【００２０】
配列番号２は、推定されるＤＩＧ−６５７タンパク質配列である。
【００２１】
配列番号３は、ＤＩＧ−６５７改変体１をコードするトウモロコシ最適化されたＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号４は、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）において発現させるために最適化されたコドンを有するＤＩＧ−６５７改変体２である。
【００２３】
配列番号５は、ＤＩＧ−６５７  ｖ４、トウモロコシ最適化された高ＧＣ含量である。
【００２４】
配列番号６は、Ｎ末端から２０５ＡＡが切断された、ＤＩＧ−６５７  ｖ５  トウモロコシ最適化された高ＧＣ含量のＤＩＧ−６５７である。
【００２５】
配列番号７は、配列番号６の推定されるタンパク質配列である。
【００２６】
配列番号８は、全長ＤＩＧ−６５７ダイズの最も好ましいコドン最適化されたバージョンである。
【００２７】
配列番号９は、切断型ＤＩＧ−６５７のダイズの最も好ましいコドン最適化されたバージョンである。
【００２８】
配列番号１０は、全長ＤＩＧ−６５７のダイズの最も好ましいコドン最適化されたバージョンに融合された葉緑体輸送ペプチド４（Ｔｒａｐ４）をコードするＤＮＡである。
【００２９】
配列番号１１は、ＴｒａＰ４  ＤＩＧ−６５７の全長ダイズの最も好ましいコドンの推定されるタンパク質配列である。
【００３０】
配列番号１２は、切断型ＤＩＧ−６５７のダイズの最も好ましいコドン最適化されたバージョンに融合されたＴｒａｐ４である。
【００３１】
配列番号１３は、Ｔｒａｐ４  ＤＩＧ−６５７の切断型バージョンの推定されるタンパク質配列である。
【００３２】
本発明は、殺虫タンパク質毒素、および昆虫の多数の目、好ましくは鱗翅目昆虫に対して機能的に活性および有効である毒素を送達するための方法を提供する。「機能的に活性」（または「に対する活性」）とは、タンパク質が経口的に活性な毒素または昆虫防除剤として機能し、タンパク質が毒性効果を有するまたは昆虫の成長もしくは摂食を妨害または阻止することができることを意味する。昆虫を、トランスジェニック植物発現、製剤化されたタンパク質組成物（単数もしくは複数）、噴霧可能なタンパク質組成物（単数もしくは複数）、餌マトリックスまたは他の送達システムを介して送達される、有効量の本発明の毒素と接触させると、結果は、典型的には、昆虫の死、昆虫の成長もしくは増殖の阻害、または昆虫に毒素を利用可能にする供給源、好ましくはトランスジェニック植物に関して昆虫の摂食から防ぐことである。また、本発明の機能性タンパク質は、１つ以上の他の毒素タンパク質の活性を増強または改善するために、一緒にまたは単独で作用することができる。「毒性の」、「毒性」または「毒素」なる用語は、該毒素が、本明細書において定義されるような機能的活性を有することを伝えることを意味する。
【００３３】
摂食している昆虫に対して完全な致死率が好ましいが、機能的活性を達成するために必要ではない。昆虫が毒素を回避するかまたは摂食を止めた場合、効果が致死量以下であるまたは致死が遅延しもしくは間接的であるとしても、その回避はいくつかの施用において有用である。例えば、昆虫耐性のトランスジェニック植物が望まれる場合、最終目的が昆虫誘発による植物損傷を避けることであるため、昆虫が植物に対する摂食することを拒否することは、昆虫に対する致死毒性と同様に有用である。
【００３４】
ＤＩＧ−６５７をコードする核酸が発見され、Ｂｔ株ＰＳ４６Ｌから単離された。「単離された」とは、出願人らは、核酸分子が本来の環境から取り出され、ヒトの手によって異なる環境に置かれたことを意味する。遺伝コードの重複のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。一度アミノ酸配列が判明すると、同じであるまたは本質的に同じである毒素をコードするこれらの代替のＤＮＡ配列を作製することは、当業者の技術の範囲内に十分にある。ＤＩＧ−６５７（配列番号１）の全長コード領域の核酸配列を決定し、その核酸配列からＤＩＧ−６５７の全長タンパク質配列（配列番号２）を推定した。ＤＩＧ−６５７タンパク質配列は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔデータベースである「ＧＱ−Ｐａｔ  Ｐｌａｔｉｎｕｍタンパク質」および「ＧＱ−Ｐａｔ  ＧｏｌｄＰｌｕｓタンパク質」、ならびにＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースに対して照会された。最も近い公知の相同体は、ＸＭＩ３３５（９４％同一性、国際公開第２０１３１３４５２３−００２号パンフレット）およびＶｉｐ３Ｂａ（７４％同一性、受託番号ＡＡＶ７０６５３、Ｒａｎｇら）である。
【００３５】
また、ＤＩＧ−６５７毒素の昆虫活性改変体は本明細書に記載され、集合的にＤＩＧ−６５７昆虫毒素または改変体と称し、断片形態および切断形態を含む。ＤＩＧ−６５７の個々の改変体は、特定のＤＩＧ命名法によって特定することができる。ＤＩＧ−６５７毒素は、鱗翅目有害生物の防除に使用するための理想的な候補である。
【００３６】
ＤＩＧ−６５７およびその改変体毒素の驚くべき特性は、それらがＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａ毒素に耐性のあるＥＣＢおよびＤＢＭの集団に対して活性であることが判明したことである。したがって、ＤＩＧ−６５７毒素は、耐性の鱗翅目有害生物集団の防除および予防に理想的な候補である。
【００３７】
本発明のＤＩＧ−６５７毒素は、鱗翅目昆虫に対して、好ましくはＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＣＥＷ、ＣＢＷおよびＴＢＷに対して活性である。また、殺虫活性は、ＢＣＷ、ＣＬ、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム「ＢＡＷ」）、ワタキバガ（Pectinophora gossypiella）（ピンクボールワーム）、ホソハマキガ（Cochyles hospes）ウォルシンガム（Walsingham）（バンディドサンフラワーモス）、およびホモエオソマ・エレクテルム（Homeosoma electellum）（サンフラワーヘッドモス）に対して期待される。
【００３８】
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）において産生されるＤＩＧ−６５７の殺虫活性は、ＥＣＢを含む鱗翅目種；ｃｒｙ１Ｆ耐性ＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、ＤＢＭ、ｃｒｙ１Ａ耐性ＤＢＭ（ｒＤＢＭ）、ＣＥＷ、ＢＣＷおよびＴＢＷに対して活性であることが実証された。ＤＩＧ−６５７タンパク質はまた、ＣＢＷ、ＦＡＷおよびＣｒｙ１Ｆ耐性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）における活性について試験された。
【００３９】
トウモロコシの害虫とダイズ害虫の両方に対する生物学的活性のこのスペクトルは非常に有利である。トリプシン切断型毒素（配列番号７）は、バイオアッセイにおいてＥＣＢに対して試験され、全長ＤＩＧ−６５７と活性がほぼ等しいことが示され、これは、タンパク質のＮ末端上の最初の２０５個のアミノ酸は、生物学的活性に必要ないことを示す。
【００４０】
全長ＤＩＧ−６５７はインタクトなＮ末端を有し、トリプシン（１：１０のトリプシン／ＤＩＧ−６５７）で処理した場合、タンパク質は、２つのバンドである約６５ｋＤａのバンドと約１８ｋＤａの別のバンドに切断される（図１）。加えて、小さな残存する全長ＤＩＧ−６５７もまた存在した。ＤＩＧ−６５７の６５ｋＤａ切断産物のＮ末端アミノ酸分析は、トリプシン切断部位が（２０５Ｋ／Ｓ２０６）であることを示した。
【００４１】
ＤＩＧ−６５７をコードするヌクレオチド配列、その改変体、切断型および断片を合成し、従来の手段によって標準的なプラスミドベクターにクローニングすることができ、またはヌクレオチド配列を含有する他の構築物の標準的な分子生物学的操作によって得ることができる。ＤＩＧ−６５７コード領域の内部の固有の制限部位を同定することができ、ＤＩＧ−６５７コード領域の制限部位間の配列を含むＤＮＡ断片を合成することができ、このような断片の各々は、特異的な欠失、挿入または他のＤＩＧ−６５７改変をコードする。修飾されたＤＩＧ−６５７断片をコードするＤＮＡ断片は、適切な制限部位で他のＤＩＧ−６５７コード領域断片または他のＣｒｙもしくはＶＩＰコード領域断片に連結され、所望の全長ＤＩＧ−６５７タンパク質、欠失または改変ＤＩＧ−６５７タンパク質をコードするコード領域を得ることができる。例えば、第１のＤＩＧ−６５７コード領域の開始部での適切な制限認識部位、およびＤＩＧ−６５７コード領域内部の第２の制限部位を同定することができる。これらの制限部位でのこの第１のＤＩＧ−６５７コード領域の切断は、第１のＤＩＧ−６５７コード領域の一部を含むＤＮＡ断片を生じさせる。別のＤＩＧ−６５７コード領域または他のＶＩＰ３コード領域に特異的な、類似して位置する適合性のある制限部位が隣接する第２のＤＮＡ断片を第１のＤＮＡ制限断片と組み合わせて使用し、改変体を構築することができる。
【００４２】
抗毒素抗体。本明細書に開示される毒素またはこれらの毒素の断片に対する抗体は、当該技術分野において周知の標準的な手順を用いて調製することができる。このような抗体は、植物組織におけるＤＩＧ−６５７毒素および種々の他の物質の存在を検出するために有用である。このような抗体および抗血清は、本発明の請求されるＤＩＧ−６５７毒素およびその改変体または断片を検出する様々な方法において有用である。レポート基で標識された抗体を用いて、様々な環境における抗原の存在を同定することができることはよく知られている。放射性同位元素で標識された抗体は、ラジオイムノアッセイに使用され、様々な生体液中の抗原の存在を非常に高い正確性および感受性で同定されている。より最近では、酵素標識された抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて放射線標識された抗体の代替物として使用されている。さらに、本発明のＢｔ殺虫性毒素に免疫反応性のある抗体は、ポリスチレンウェルまたは粒子などの固定化物質に結合され、イムノアッセイに用いられ、Ｂｔ毒素が試験サンプル中に存在するか否かを決定することができる。抗ＤＩＧ−６５７抗体はまた、組換え生成システムまたは天然供給源からある量のＤＩＧ−６５７毒素を単離するために使用することができる。
【００４３】
ＤＩＧ−６５７のトランスジェニック発現。対象のタンパク質毒素は、様々な方法で標的昆虫と接触するように「施用され」または提供され得る。例えば、ＤＩＧ−６５７毒素は、トランスジェニック植物における植物組み込み保護剤（植物によって生産され、植物中に存在する）として使用することができ、当該技術分野において周知である。毒素遺伝子の発現はまた、植物の特定の組織、例えば、根、葉などにおいて選択性を達成することができる。これは、当該技術分野において周知の組織特異的プロモーターの使用によって達成することができる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、対象の殺虫タンパク質またはその改変体をコードする遺伝子による植物の形質転換である。形質転換された植物は、形質転換された植物の細胞における、調節量の対象の殺虫タンパク質またはその改変体の存在により、昆虫標的有害生物による攻撃に対して抵抗性である。特定の害虫によって摂食された植物のゲノムにＤＩＧ−６５７毒素をコードする遺伝物質を組み込み、発現させることにより、成虫または幼虫は食用植物を摂取した後に死ぬ。単子葉および双子葉の分類の多数のメンバーが形質転換されている。トランスジェニック農作物ならびに果物および野菜は商業的に重要である。このような作物には、限定されないが、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、ソルガム、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモなどが含まれる。単子葉植物または双子葉植物細胞に外来遺伝物質を導入するため、および導入された遺伝子を安定に維持および発現する稔性植物を得るための多数の周知技術が存在する。
【００４５】
１つの好ましい実施形態において、ＤＩＧ−６５７または改変体は、本発明の毒素を発現する核酸配列を含むトランスジェニック植物を介して経口的に送達される。本発明は、本発明の核酸分子を植物に導入することを含む、昆虫耐性トランスジェニック植物を製造する方法を提供し、ここで、毒素は、昆虫を防除するのに有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である。非限定的な例において、基本的なクローニング戦略は、全長のまたは修飾されたＤＩＧ−６５７コード配列を、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ制限部位で植物発現プラスミドにサブクローニングすることであり得る。植物発現エレメント（例えば、植物発現可能プロモーター、３’末端の転写終結およびポリアデニル酸付加決定基など）の制御下で適切なＤＩＧ−６５７コード領域を含有する得られた植物発現カセットを、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術または標準的な制限酵素断片クローニング手順を利用して、バイナリーベクタープラスミドにサブクローニングする。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を利用する場合、例えば、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、全長のおよび修飾された遺伝子植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミドに組み換えてもよい。プラスミドが大腸菌（E. Coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞中に存在する場合、抗生物質であるスペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子を有するバイナリー植物形質転換ベクターを用いることが好都合である。また、所望の宿主植物において機能的である植物発現可能な選択マーカー遺伝子を含有するバイナリーベクタープラスミドを用いることも好都合である。植物発現可能な選択マーカー遺伝子の例としては、限定されないが、抗生物質のカナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈＩＩ）をコードするもの、ならびにグリホサート；ハイグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノトリシン（ビアラホス）、イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えば、クロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対して耐性または寛容性であるものをコードする遺伝子が挙げられる。
【００４６】
あるいは、ＤＩＧ−６５７遺伝子挿入物を含有するバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構造は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）操作の当業者に周知である標準的な分子生物学的方法によって候補アグロバクテリウム（Agrobacterium）単離体から調製されたプラスミドＤＮＡの制限消化フィンガープリントマッピングによって行われる。
【００４７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換法を介して形質転換植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外の他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用することができ、株の選択は形質転換される宿主植物種の同一性に依存し得ることを理解する。
【００４８】
トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）の昆虫バイオアッセイ。修飾されたＤＩＧ−６５７タンパク質を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統は、人工的な食餌オーバーレイアッセイにおいて感受性の昆虫種に対する活性を実証するために使用することができる。トランスジェニックおよび非トランスジェニックのシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統から抽出されたタンパク質は、適切な方法によって定量化され得、試料体積は、タンパク質濃度を正規化するように調整され得る。次に、以下に記載するように、人工的な食餌についてバイオアッセイを行う。非トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）ならびに／または緩衝液および水は、バックグラウンドチェック処理としてアッセイに含めるべきである。
【００４９】
トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ。また、植物細胞で産生されるＤＩＧ−６５７毒素および改変体の生物活性は、従来のバイオアッセイ法（例えば、Huang et al., 2006を参照）によって実証され得る。効力は、ＤＩＧ−６５７毒素を産生する植物由来の様々な植物組織または組織片を、制御された摂食環境において標的昆虫に与えることによって試験することができる。あるいは、タンパク質抽出物は、ＤＩＧ−６５７毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織から調製され得、人工的な食餌バイオアッセイに抽出されたタンパク質を組み込む。このような摂食アッセイの結果は、ＤＩＧ−６５７タンパク質もしくは改変体を産生しない宿主植物からの適切な対照組織を用いる、同様に行われるバイオアッセイ、または他の対照サンプルと比較されるべきであることは理解しなければならない。
【００５０】
ＤＩＧ−６５７毒素および殺虫活性な改変体。配列番号２の全長ＤＩＧ−６５７毒素に加えて、本発明は、配列番号２、配列番号１１または配列番号１３の殺虫活性な改変体を包含する。改変体という用語では、出願人らは、特定の欠失、置換および挿入の突然変異体を含むことを意図する。ＤＩＧ−６５７断片は、全長ＤＩＧ−６５７アミノ酸配列よりも小さく、殺虫特性を有する配列番号２に見出される任意のタンパク質配列である。ＤＩＧ−６５７改変体断片もまた本発明の一部として意図され、本明細書に記載され、殺虫活性を有する特定の欠失、置換および挿入の突然変異体を含有するＤＩＧ−６５７の断片として定義される。本発明に含まれるＤＩＧ−６５７毒素の改変体を記載するための前書きとして、ＤＩＧ−６５７タンパク質毒素の構造を簡単に概説することは有用である。
【００５１】
限定された数のアミノ酸の欠失、置換または付加を行うことによって作製されたＤＩＧ−６５７改変体。配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、置換および付加は容易に逐次的に行うことができ、殺虫活性におけるこのような改変の効果をバイオアッセイによって試験することができる。変更の数に制限がある場合、このような試験には不合理な実験は含まれない。本発明はまた、コア毒素セグメントの殺虫活性な改変体（配列番号２のアミノ酸２０６〜８０３、あるいは最大１０個、最大１５個もしくは最大２０個の独立したアミノ酸の付加、欠失または置換がなされている）を含む。
【００５２】
改変体は、ランダム変異を行うことによって作製されてもよく、または改変体を設計してもよい。設計された突然変異体の場合において、アミノ酸同一性が、生物学的活性の主要因であり、または最終的には生物活性の原因となる三次元立体構造の決定に関与する、毒素の重要な領域において維持される場合、天然毒素と類似した活性を有する改変体を生成する可能性が高い。置換が保存的である場合、活性を保持する高い可能性もまた生じる。アミノ酸は、以下のクラス：非極性、非荷電極性、塩基性および酸性に分類することができる。１つのクラスのアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸で置換された保存的置換は、改変体の生物学的活性を実質的に変化させる可能性が最も低い。表１は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストを提供する。
【００５３】
【表１】
2017521055.tif 000003
【００５４】
本発明の農薬タンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列と十分に同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、または農薬タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と十分に同一である。「十分に同一である」とは、標準的なパラメータを使用する、本明細書に記載されるアライメントプログラムの１つを使用して、参照配列と比較して少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれらを超える配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が意図される。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置などを考慮に入れて、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認識する。
【００５５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列を最適比較目的のために整列させる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）である。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。別の実施形態において、同一性パーセントは、参照配列の全体にわたって計算される。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容するかどうかにかかわらず、以下に記載するものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントの計算において、典型的には正確な一致がカウントされる。ギャップ（１つの配列中に残基が存在するが、他の配列には存在しないアライメントにおける位置）は、同一でない残基を有する位置とみなされる。
【００５６】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるように修飾された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Bioi. 215:403のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる。本発明の農薬様核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明の農薬タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）をAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Altschul et al. (1997)上述を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アライメントは、検査によって手動で行うこともできる。
【００５７】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸配列またはＤＮＡ配列の全体を整列させ、したがって、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、ベクターＮＴＩプログラムスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどのいくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージで使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷとのアミノ酸配列の整列後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および同一性の評価を可能にする。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4(1):11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、４のギャップペナルティを用いることができる。別段の記載がない限り、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453のアルゴリズムを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して、配列同一性または類似性を以下のパラメーターを用いて決定する：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いるヌクレオチド配列のための同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いるアミノ酸配列のための同一性％または類似性％。同様のプログラムもまた使用することができる。「同等のプログラム」は、対象とする任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じる対応するアライメントと比較した場合、同一のヌクレオチド残基の一致および同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生じる任意の配列比較プログラムを意図する。
【００５８】
プロテアーゼ感受性改変体。ＤＩＧ−６５７を含むＶＩＰ３タンパク質は、約８８ｋＤａの大きさから約６６ｋＤａの大きさの産物にタンパク質分解的に切断され得る。６６ｋＤａのタンパク質は、アミノ酸残基２０６から８０３個を含む。昆虫腸プロテアーゼは、典型的に、食餌タンパク質から必要なアミノ酸を得る際に昆虫を助ける役割を果たす。最も良く理解されている昆虫消化プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、これは最も一般的なタイプ（Englemann and Geraerts (1980)）であり、特に鱗翅目種であると考えられる。鞘翅目昆虫は、鱗翅目の腸よりも中性から酸性である腸を有する。大部分の鞘翅目の幼虫および成虫、例えば、コロラドハムシ（ＣＰＢ）は、わずかに酸性の中腸を有し、システインプロテアーゼは主要なタンパク質分解活性を提供する（Wolfson and Murdock, 1990）。より正確には、Thie and Houseman (1990)は、ＣＰＢにおいて、カテプシンＢ様およびカテプシンＨ様のシステインプロテアーゼ、ならびにカテプシンＤ様のアスパルチルプロテアーゼを同定し、特徴付けた。Gillikin et al. (1992)は、、ＷＣＲ幼虫の腸においてタンパク質分解活性を特徴付け、主としてシステインプロテアーゼを見出した。米国特許第７，２３０，１６７号明細書は、カテプシンＧに起因するプロテアーゼ活性がＷＣＲに存在することを開示した。昆虫腸プロテアーゼの多様性および様々な活性レベルは、特定のＢｔ毒素に対する昆虫の感受性に影響し得る。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、特定の害虫の感受性幼虫の中腸内でのタンパク質プロセッシングに影響を与えるために、所望の位置で操作され得る。これらのプロテアーゼ切断部位は、化学的遺伝子合成またはスプライスオーバーラップＰＣＲ（Horton et al., 1989）などの方法によって導入することができる。セリンプロテアーゼ認識配列は、例えば、場合により、Ｃｒｙタンパク質構造の特定の部位に挿入され、感受性幼虫の中腸内の所望の欠失点でのタンパク質プロセッシングに影響を与えることができる。このような方法に利用され得るセリンプロテアーゼには、トリプシンまたはトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼなどの鱗翅目中腸セリンプロテアーゼが含まれる（Christeller et al., 1992）。さらに、未分画の幼虫中腸プロテアーゼ調製物を用いて生成したＣｒｙタンパク質消化産物を配列決定することにより、または刷子縁膜小胞に結合させることにより、経験的に同定される欠失部位を遺伝子操作して、タンパク質活性化を行うことができる。修飾されたＣｒｙまたはＶＩＰ３タンパク質は、遺伝子欠失によって、またはＥＣＢ、ＣＥＷ、ＣＢＷ、ＢＣＷ、ＦＡＷ、ＢＡＷ、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、ロキサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）および他の標的有害生物を含む鱗翅目有害生物に対する改善された活性を有するプロテアーゼ切断部位の導入のいずれかによって生じさせた。
【００６０】
トリプシン、キモトリプシンおよびカテプシンＧ様プロテアーゼなどの鱗翅目および鞘翅目セリンプロテアーゼ、カテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様およびＫ様プロテアーゼ）などの鱗翅目および鞘翅目システインプロテアーゼ（Koiwa et al., (2000)およびBown et al., (2004)）、ＡＤＡＭ１０などの鱗翅目および鞘翅目メタロプロテアーゼ（Ochoa-Campuzano et al., (2007)）、ならびにカテプシンＤ様およびＥ様、ペプシン、プラスメプシンおよびキモシンなどの鱗翅目および鞘翅目アスパラギン酸プロテアーゼは、特定の害虫の感受性幼虫の中腸内でのＣｒｙタンパク質プロセッシングに影響を与えるために所望のプロセッシング部位で適切な認識配列を遺伝子操作することによってさらに利用され、また、恐らく非感受性害虫に対して活性を提供するように機能する。
【００６１】
昆虫、植物または微生物のプロテアーゼによるより大きな改変体タンパク質のタンパク質分解切断を可能にするまたは排除するためのコード配列の適切な位置にプロテアーゼプロセッシング部位を導入または排除することによって産生されるＤＩＧ−６５７改変体は、本発明の範囲内である。このような操作の最終結果は、インタクトな（全長の）毒素タンパク質と同じまたはより良好な活性を有する毒素断片分子の生成であると理解される。
【００６２】
スプレー式施用は別の例であり、当該技術分野においても公知である。本タンパク質は、所望の最終用途のために適切に製剤化され、次に、侵入が発見される前に、標的昆虫が発見された後に、前と後の両方などで保護されるべき植物に、および／または植物周囲に、および／または植物周辺に噴霧（または他には施用）され得る。例えば、餌顆粒もまた使用することができ、当該技術分野において公知である。
【００６３】
昆虫を、トランスジェニック植物発現、製剤化されたタンパク質組成物（単数もしくは複数）、噴霧可能なタンパク質組成物（単数もしくは複数）、餌マトリックスまたは他の送達システムを介して送達される、有効量の毒素と接触させた場合、結果は、典型的には、昆虫の死であり、または昆虫は、昆虫が毒素を利用できるようにする供給源を餌にしない。
【００６４】
適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス属（Pseudomonas）に関して、微生物を増殖させて摂取する、有害生物の環境に施用することができる。結果は有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を宿す微生物は、毒素の活性を延長し、細胞を安定化させる条件下で処理することができる。次に、毒性活性を保持する処理細胞を標的有害生物の環境に施用することができる。
【００６５】
オリゴヌクレオチドプローブの開発。本発明の毒素および遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な放射性標識によって検出可能とすることができ、または、例えば、米国特許第６，２６８，１３２号明細書に記載されているように本質的に蛍光性にすることができる。当該技術分野において周知であるように、プローブ分子および核酸サンプルが２つの分子間に強い塩基対形成結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブおよびサンプルは、実質的な配列相同性を有すると合理的に想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller and Manak (1993)に記載されているように、当該技術分野において周知である技術によって、ストリンジェントな条件下で行われる。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを公知の手法で決定するための手段を提供する。このようなプローブ分析は、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザーおよび標準的な手順を用いて合成することができる。また、これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００６６】
核酸ハイブリダイゼーション。分子生物学の当業者に周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらがハイブリダイズする傾向によって特徴付けることができる。本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列と、他の配列よりも大きい検出可能な程度に（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）ハイブリダイズする（アニーリングする）条件を指すことが意図される。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を調節することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同的プロービング）。あるいは、より低い度合いの類似性が検出されるように、配列におけるいくらかのミスマッチを可能にするためにストリンジェンシー条件を調整することができる（異種プロービング）。一般的に、プローブは、長さが約１０００ヌクレオチド未満、好ましくは長さが５００ヌクレオチド未満である。
【００６７】
典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃での３０％〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０℃〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃での４０％〜４５％ホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および５５℃〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃での５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および６０℃〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般的には約２４時間未満、通常は約４〜１２時間である。
【００６８】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドについて、熱融点（Ｔｍ）は、相補的な標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下）である。Ｔｍは、ミスマッチの１％ごとに約１℃低下する；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列のアニーリングを容易にするように調整することができる。例えば、９０％超の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃低下させることができる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体についてのＴｍよりも約５℃低いように選択される。しかしながら、高ストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１℃、２℃、３℃または４℃低いところでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；中程度のストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃低いところでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃低いところでハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００６９】
Ｔｍ（℃）は、実験的に決定されてもよく、または計算によって近似されてもよい。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Meinkoth and Wahl (1984)の式：Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（ホルムアミド％）−５００／Ｌから近似することができる；式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、ＧＣ％はＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、ホルムアミド％はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。あるいは、Ｔｍは、以下の式（Beltz et al., 1983）：Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（ホルムアミド％）−６００／Ｌによって記載され、式中、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度であり、ＧＣ％はＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、ホルムアミド％はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【００７０】
方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液の変更が本質的に記載されることを理解する。所望の程度のミスマッチが４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍをもたらす場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Hybridization with Nucleic Acid Probes Vol.1 by P. Tijssen(1993, ISBN-10: 0444898840, ISBN-13: 9780444898845 Hardcover)およびAusubel et al. (1995)に見出される。また、Sambrook et al. (1989)を参照されたい。
【実施例１】
【００７１】
ＤＩＧ−６５７殺虫性毒素をコードする発現プラスミドの構築および細菌宿主における発現。標準的なクローニング方法を用いて、植物最適化されたコード領域によりコードされる全長ＤＩＧ−６５７タンパク質を生産するように遺伝子操作されたシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現プラスミドを構築した。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼを、それぞれ制限消化およびＤＮＡライゲーションのために、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得た。プラスミド調製は、低コピーのプラスミド精製のために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を用いて、その供給業者の指示に従って行われた。ＤＮＡ断片は、アガロースＴｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｉｏ、Ｌｉｍｂｕｒｇ）を用いて精製された。
【００７２】
ＤＩＧ−６５７をコードする遺伝子を、クローニング用の特定の制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いて、親のＢｔ株ＰＳ４６Ｌ／ＤＢｔ１１８８９から増幅した。次に、得られたＤＩＧ−６５７ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物は、伝統的なライゲーションクローニング法を用いて、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）発現ベクターｐＤＯＷ１１６９にクローニングされた。
【００７３】
基本クローニング戦略は、ＳｐｅＩとＳａｌＩ制限部位でｐＤＯＷ１１６９にＤＩＧ−６５７毒素コード配列（ＣＤＳ）（配列番号１）をサブクローニングすることを必要とし、それにより、プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）由来のＰｔａｃプロモーターとｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現調節下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０複製起点、ｐｙｒＦ遺伝子、およびＤＮＡ断片を含有するタンパク質コード領域を導入することができる制限酵素認識部位の前にリボソーム結合部位を有する中コピー数プラスミドである（米国特許出願第２００８０１９３９７４号明細書）。ｐＤＯＷ１１６９と称する発現プラスミドをエレクトロポレーションによって、ＤＣ４５４（ｄｅｌｔａｐｙｒＦとｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩの突然変異を有するほぼ野生型Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）株）またはその誘導体に形質転換させ、ＳＯＣ−Ｓｏｙ加水分解物培地に回収し、選択培地（ウラシルを欠損したＭ９グルコース寒天、Sambrook et al.、上述）上にプレーティングした。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Squires et al., (2004)、米国特許出願第２００６０００８８７７号明細書、米国特許出願第２００８０１９３９７４号明細書および米国特許出願第２００８００５８２６２号明細書から入手することができる。ミニプレップのプラスミドＤＮＡの制限消化によって、コロニーを最初にスクリーニングした。ＤＩＧ−６５７毒素を含有する選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、４つの制限酵素を用いて消化され、挿入物の存在をさらに有効にするために配列を検証した。
【実施例２】
【００７４】
振とうフラスコにおける増殖および発現分析。特徴付けおよび昆虫バイオアッセイのためのＤＩＧ−６５７毒素の生産は、発現構築物を有する振とうフラスコ増殖Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）株（ｐＤＯＷ１１６９）によって遂行された。ＤＩＧ−６５７培養物のグリセロールストック（０．５ｍＬ）は、９．５％グリセロール（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号３Ｄ７４２６、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を含む、５０ｍＬの規定の生成培地に接種された。Ｐｔａｃプロモーターを介したＤＩＧ−６５７毒素遺伝子の発現は、２４時間、３０℃で振とうしながらの最初のインキュベーション後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導された。誘導時におよび誘導後の様々な時点で培養物をサンプリングした。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）により、細胞密度を測定した。また、例えば、Huang et al. (2007)および米国特許出願第２００６０００８８７７号明細書に記載されるようなシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適した他の培地を利用することができる。
【実施例３】
【００７５】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換。標準的なクローニング方法を用いて、バイナリー植物形質転換および発現プラスミドを構築した。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼをＮＥＢから得た。プラスミド調製は、製造業者の指示書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミド調製キットまたはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキット（ともにＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手）を用いて行われた。ＤＮＡ断片は、ゲル単離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットまたはＱＩＡＥＸ  ＩＩ（登録商標）ゲル抽出キット（ともにＱｉａｇｅｎ  Ｖｅｎｉｏ、Ｌｉｍｂｕｒｇから入手）を用いて精製された。
【００７６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｚ７０７Ｓ（Ｚ７０７のストレプトマイシン耐性誘導体；Hepburn et al., 1985)のエレクトロ−コンピテント細胞を調製し、エレクトロポレーションを用いて形質転換した（Weigel and Glazebrook, 2002）。エレクトロポレーション後、１ｍＬの酵母抽出ペプトン（ＹＥＰ）ブロス（１０ｇｍ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇｍ／Ｌペプトンおよび５ｇｍ／Ｌ  ＮａＣｌ）をキュベットに添加し、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養チューブに移し、４時間、一定に撹拌しながら、水浴中で２８℃にてインキュベートした。スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）とストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰプラス寒天（２５ｇｍ／Ｌ）上に細胞を播種し、プレートを２８℃で２から４日間、インキュベートした。十分に分離された単一のコロニーを選択し、上記のようにスペクチノマイシンとストレプトマイシンを含む新鮮なＹＥＰ＋寒天プレート上に線状に付着させ、２８℃で１から３日間インキュベートした。
【００７７】
バイナリー植物形質転換ベクター中のＤＩＧ−６５７遺伝子挿入物の存在は、選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーから調製された鋳型プラスミドＤＮＡを含むベクター特異的プライマーを用いたＰＣＲ分析により実施された。上記のようにスペクチノマイシンとストレプトマイシンを含むＹＥＰ中で増殖させた１５ｍＬ一晩培養物の４ｍＬアリコートからの細胞ペレットをＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ、Ｌｉｍｂｕｒｇ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）Ｓｐｉｎ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐｓを用いて製造者の指示に従って抽出した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）エレクトロポレーション形質転換において使用されたバイナリーベクターからのプラスミドＤＮＡを対照として含めた。製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを０．５×濃度で使用してＰＣＲ反応を完了させた。ＰＣＲ反応は、以下の条件でプログラムされたＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中で行われた：ステップ１）９４℃で３分間；ステップ２）９４℃で４５秒間；ステップ３）５５℃で３０秒間；ステップ４）７２℃で、期待される産物の長さのｋｂあたり１分間；ステップ５）ステップ２まで２９回；ステップ６）７２℃で１０分間。サイクル後、反応物を４℃に維持した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％から１％アガロース、ｗ／ｖ）により分析し、臭化エチジウム染色で可視化した。ＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーを選択した。
【実施例４】
【００７８】
ＤＩＧ−６５７の生成。発現構築物（ｐＤＯＷ１１６９）を有する振とうフラスコ培養したＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）株の細胞を遠心分離により単離し、得られた細胞ペレットを−８０℃で凍結した。凍結した振とうフラスコ細胞ペレットサンプルからの可溶性および不溶性画分を、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）バクテリアタンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて生成させた。各細胞ペレットを１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に懸濁させ、さらに、溶解緩衝液で１：４に希釈し、室温で３０分間、振とうしながらインキュベートした。溶解物を１４，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次に、ペレット（不溶性画分）を等容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁させた。
【００７９】
試料を、β−メルカプトエタノール（Sambrook et al.、上述）を含有する２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と１：１で混合し、５分間煮沸させ、その後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に充填した。推奨されるＸＴ  ＭＯＰＳ緩衝液中で電気泳動を行った。製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）でゲルを染色し、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて画像化した。
【実施例５】
【００８０】
封入体の調製。ＤＩＧ−６５７は、一般的に、ＤＩＧ−６５７の遺伝子を含有するＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）細胞の可溶性画分に位置していた。いくつかの場合において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析）によって示されるように、ＤＩＧ−６５７タンパク質の可変パーセンテージが、タンパク質封入体（ＩＢ）調製物に位置することが見出された。この画分からこのタンパク質を単離するために、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）発酵ペレットを３７℃の水浴中で解凍した。細胞を２５％ｗ／ｖの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に再懸濁させた；５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ８４６５  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用直前に添加した。最小設定（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）で手持ち式ホモジナイザーを用いて細胞を懸濁させた。細胞懸濁液にリゾチーム（ニワトリ卵白由来の２５ｍｇのＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｌ７６５１）を金属スパチュラで混合して添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を氷上で１５分間冷却し、次に、Ｂｒａｎｓｏｎ（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（５０％デューティサイクル、３０％出力で２回の１分間のセッション）を用いて超音波処理した。細胞溶解を顕微鏡検査により調べた。さらに２５ｍｇのリゾチームを必要に応じて加え、インキュベーションおよび超音波処理ステップを繰り返した。細胞溶解が顕微鏡検査で確認された場合、溶解物を１１，５００×ｇで２５分間（４℃）遠心分離して、ＩＢペレットを形成させ、上清を捨てた。ＩＢペレットを１００ｍＬの溶解緩衝液で再懸濁し、手持ち式ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。ＩＢペレットを（５０ｍＬの溶解緩衝液中で）再懸濁し、ホモジナイゼーションし、超音波処理し、および遠心分離によって上清が無色になり、ＩＢペレットがしっかりとして色がオフホワイトになるまで繰り返し洗浄した。最後の洗浄では、ＩＢペレットを、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過した（０．２２μｍ）蒸留水に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過した蒸留水に再懸濁し、−８０℃にて１ｍＬアリコートで保存した。
【００８１】
ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および定量は、ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍し、滅菌濾過した蒸留水で１：２０に希釈することによって行われた。次に、希釈したサンプルを、４×還元サンプル緩衝液［２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８，４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］とともに煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に充填し、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）とともに泳動した。ゲルを６０分間、２００ボルトで泳動し、次に、クーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留した水中の７％酢酸、５％メタノールを用いて脱染色した。標的バンドの定量化は、標準曲線を生成するために同じゲル上で実行されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルに対するバンドのデンシトメトリー値を比較することによって行った。
【実施例６】
【００８２】
封入体の可溶化。６ｍＬの封入体懸濁液（３２ｍｇ／ｍＬのＤＩＧ−６５７タンパク質を含有する）をエッペンドルフモデル５４１５Ｃマイクロフュージの最高設定（約１４，０００×ｇ）で遠心分離して、封入体をペレット化した。貯蔵緩衝液上清を除去し、５０ｍＬコニカルチューブ中で２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１１と置き換えた。封入物をピペットを用いて再懸濁し、完全に混合するようにボルテックスした。チューブを穏やかに揺動するプラットフォーム上に４℃で一晩置き、標的タンパク質を抽出した。抽出物を４℃にて、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心フィルター装置（３０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて５倍に濃縮した。次に、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、サンプル緩衝液を１０ｍＭ  ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサアミノ）１−プロパンスルホン酸］ｐＨ１０に変更した。
【実施例７】
【００８３】
ゲル電気泳動。濃縮抽出物は、還元剤として５ｍＭのジチオスレイトールを含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で１：５０希釈することによって電気泳動用に調製し、９５℃で４分間加熱した。サンプルは、０．２から２μｇ／レーンの範囲（標準曲線生成用）の５つのＢＳＡ標準を並べて、４から１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの二連のレーンに装填された。ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、追跡色素がゲルの底部に達するまで電圧を２００Ｖで印加した。ゲルを４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０で染色し、最初に簡単に４５％メタノール、１０％酢酸で脱染色し、次に、最終的にはバックグラウンドが透明になるまで７％酢酸、５％メタノールで脱染色した。脱染色後、ゲルをＢｉｏｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒでスキャンした。装置のＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ｖ．４．５．２ソフトウェアを用いて、バックグラウンドを減じた容積の染色されたタンパク質バンドを取得し、ストック溶液中のＤＩＧ−６５７タンパク質の濃度を計算するために使用されるＢＳＡ標準曲線を作成した。
【実施例８】
【００８４】
ＤＩＧ−６５７精製。ＤＩＧ−６５７の精製は、Lee, M.K., et al (2003)によって報告されるように、ＶＩＰ３に類似して行われ、この場合、ＤＩＧ−６５７遺伝子で形質転換されたＰｆ由来の細胞を解凍し、０．５ｍｌのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、抽出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁させ、それぞれ、１分間、５回超音波処理し、各超音波処理サイクル間に１分間、氷上に静置した。溶液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収し、ＭｏｎｏＱイオン交換カラム（１ｃｍ径×１０ｃｍ長）に提供した。イオン交換（ＭｏｎｏＱ  １０１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上の連続クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質精製を達成させた。最終的な調製は、約９０ｋＤａの見かけの分子量で移動する単一バンドのタンパク質を示した。
【実施例９】
【００８５】
サンプル調製およびバイオアッセイ。ＤＩＧ−６５７の精製された調製物を１０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０で適切に希釈し、全てのバイオアッセイに、この緩衝液からなる対照処理を含有させ、これを死亡率および／または増殖阻害のバックグラウンドチェックとして役立てた。バイオアッセイ緩衝液中のタンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）画像化システム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアバージョン４．５．２を装備するＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ）を用いて測定される、ゲルデンシトメトリーの標準曲線を作成するためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるゲル電気泳動によって推定された。ゲルマトリックス中のタンパク質は、クーマシーブルーベースの染色で染色され、読み取り前に脱染色された。
【００８６】
人工的な昆虫飼料で１から２日齢の新生鱗翅目幼虫を用いて行ったバイオアッセイにおいて、精製されたタンパク質を殺虫活性について試験した。市販の昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）により維持されたコロニーから得られた卵から、ＣＥＷ、ＳＢＬ、ＤＢＭ、ＶＢＣ、ＥＣＢ、ＦＡＷおよびＴＢＷの幼虫を孵化させた。ｒＥＣＢおよびｒＦＡＷの幼虫を独自のコロニー（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から採取した卵から孵化させた。
【００８７】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレイ中で行われた。各ウェルは、２．０ｍＬの多種鱗翅目食餌（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）を含有した。タンパク質サンプルの４０μＬアリコートをピペットにより、各ウェルの２．０ｃｍ２食餌表面（２０μＬ／ｃｍ２）に供給した。食餌濃度は、ウェル中の表面積の平方センチメートル（ｃｍ２）あたりのＤＩＧ−６５７タンパク質の量（ｎｇ）として計算された。９，０００から３ｎｇ／ｃｍ２の９個の投薬濃度範囲を用い、投薬あたり１６匹の幼虫を試験した。処理されたトレイは、食餌表面上の液体が蒸発するまでまたは食餌に吸収されるまで、ヒュームフード内に保持された。
【００８８】
２４〜４８時間の羽化において、個々の幼虫を湿ったラクダ毛ブラシで拾い、処理された食餌上に、１ウェルあたり１匹の幼虫を配置させた。次に、滲出したウェルを透明なプラスチックの接着シートで密閉し、ガス交換を可能にするように通気した（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）。バイオアッセイトレイは、５日間、制御された環境条件（２８℃、約６０％相対湿度、１６：８［明：暗］）下で保持され、その後、各タンパク質サンプルに曝露された昆虫の総数、死んだ昆虫の数、および生き残った昆虫の体重を記録した。パーセント死亡率およびパーセント増殖阻害を各処置について計算した。増殖阻害（ＧＩ）を以下の式を用いて計算した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
式中、ＴＷＩＴは処置における昆虫の総体重であり、ＴＮＩＴは処置における昆虫の総数であり、ＴＷＩＢＣはバックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総体重であり、ＴＮＩＢＣはバックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【００８９】
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％である食餌中のＤＩＧ−６５７タンパク質の濃度であると決定された。５０％致死濃度（ＬＣ５０）は、試験昆虫の５０％が死んだ食餌中のＤＩＧ−６５７タンパク質の濃度として記録された。増殖阻害濃度−応答曲線は、ＪＭＰ  Ｐｒｏ、バージョン９．０．３ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）による非線形ロジスティック３パラメータを使用することによって決定された。致死濃度−応答曲線は、プールされた死亡率データのＰｒｏｂｉｔ分析（Finney, 1971）によって分析され、ＰＯＬＯ−ＰＣ（ＬｅＯｒａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行われた。
【００９０】
表２は、ＥＣＢ、ｒＥＣＢ、ＴＢＷ、シュードモナス・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ウォーカー（Walker））（ダイズルーパ、「ＳＢＬ」）、アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ヒューブナー（Hubner））（ベルベットビーンキャタピラー、「ＶＢＣ」）、ＣＥＷ、ＦＡＷ、ｒＦＡＷ、およびＤＢＭのＤＩＧ−６５７タンパク質のバイオアッセイ試験の結果を示す。予期しない、驚くべき発見は、ＥＣＢ昆虫の感受性株と同様に、ｒＥＣＢ試験昆虫がＤＩＧ−６５７タンパク質の作用にそれほど影響しなかった場合に感受性であったことである。
【００９１】
【表２】
2017521055.tif 000004
【００９２】
オオタバコガ（Helicoverpa armigera）バイオアッセイは、新生の幼虫を用いて、表面汚染によって行われた。毒性試験は、それぞれ細胞２ｃｍ２で１２８細胞トレイにおいて行われた。２５および２５００ｎｇ／ｃｍ２の濃度を用いて、パーセント死亡率を決定し、緩衝液のみを対照とした（表３）。ＬＣ５０値を決定するための試験は、７種類の異なる濃度の精製されたプロトキシンを用いて行われ、緩衝液のみを対照とした（表４）。死亡率および停止は、２５℃で７日後に評価され、１６：８の明暗条件とした。死亡およびＬ１停止の幼虫を採点して、「機能的死亡率」を得た。結果は、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）に対するＤＩＧ−６５７活性を示した。
【００９３】
【表３】
2017521055.tif 000005
【００９４】
【表４】
2017521055.tif 000006
【実施例１０】
【００９５】
双子葉植物におけるＤＩＧ−６５７  Ｂｔ殺虫タンパク質および改変体の生成。
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の形質転換。アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１は、フローラルディップ法（Weigel and Glazebrook, 2002）を用いて形質転換される。選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーを使用して、選択に適した抗生物質を含有するＹＥＰブロスの１ｍＬから１５ｍＬの培養物を接種する。培養物を２２０ｒｐｍで一定に撹拌しながら、２８℃で一晩インキュベートする。各培養物を用いて、選択に適した抗生物質を含有するＹＥＰブロスの５００ｍＬ培養物を２回接種し、新しい培養物を一定に撹拌しながら、２８℃で一晩インキュベートする。細胞を室温で約８７００×ｇで１０分間ペレット化し、得られた上清を捨てる。細胞ペレットを、１／２×ムラシゲスクーグ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍＬストックの１０μＬ／Ｌ）および３００μＬ／ＬのＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する５００ｍＬの浸潤培地中に静かに再懸濁される。約１カ月齢の植物を１５秒間培地に浸し、最新の花序の浸漬を確実にするために注意深く行った。次に、植物を横に置き、２４時間覆い（光透過または不透過）、水で洗浄し、直立させる。植物を２２℃で生育させ、光周期を１６：８の明暗とする。浸漬の約４週間後、種子を収穫する。
【００９６】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の成長と選択。新たに採取したＴ１種子を、乾燥剤の存在下、室温で少なくとも７日間乾燥させる。種子を０．１％寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中に懸濁させ、次に、４℃で２日間、層別化する。植え付けの準備として、１０．５インチ×２１インチの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）のＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）を微細なバーミキュライトで覆い、ホーグランドの溶液（(Hoagland and Arnon, 1950）で湿るまで亜灌漑し、次に、２４時間排水させた。層別化された種子をバーミキュライト上に播種し、湿度ドーム（ＫＯＲＤ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で７日間覆う。種子を発芽させ、長日条件（１６：８の明暗期間）下、１２０から１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度で、一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）にて、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（ＣＭＰ４０３０またはＣＭＰ３２４４モデル；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）において植物を生育した。植物を最初にホーグランドの溶液で湿らせ、その後、脱イオン水で湿らせ、土壌を湿った状態に保つが、濡れない状態にする。
【００９７】
ドームを播種の５から６日後に除去し、形質転換していない種子からの発芽した植物を死滅させるために、化学選択剤を植物に噴霧する。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターによって提供される植物発現可能な選択マーカー遺伝子がｐａｔまたはｂａｒ遺伝子（Wehrmann et al., 1996）である場合、形質転換植物は、１０００倍のＦｉｎａｌｅ溶液（５．７８％グルホシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）の噴霧により選択され得る。その後の２回の噴霧を５〜７日の間隔で行う。生存体（活発に成長する植物）は、最終噴霧の７〜１０日後に特定され、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５で調製されたポットに移植される。移植された植物を湿性ドームで３から４日間覆い、上記の生育条件下、Ｃｏｎｖｉｒｏｎに置かれる。
【００９８】
双子葉植物形質転換の当業者は、他の植物発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が使用される場合、形質転換された植物を選択する他の方法が利用可能であることを理解する。
【実施例１１】
【００９９】
ＤＩＧ−６５７を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）。ＤＩＧ−６５７を含む核酸のための発現ベクターを有する１０から２０個のトランスジェニックＴ０ダイズ（Glycine max）植物は、当該技術分野において公知のように生成され、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を媒介した形質転換による。成熟したダイズ（ダイズ（Glycine max））種子を１６時間、塩素ガスを用いて一晩滅菌する。塩素ガスによる滅菌後、塩素ガスを払拭するために、種子をＬＡＭＩＮＡＲ（商標）層流フードの開放容器内に配置する。次に、滅菌した種子を２４℃でブラックボックスを使用して、暗所で１６時間、滅菌Ｈ２Ｏを吸収させる。
【０１００】
分割された種子ダイズの調製。胚軸プロトコールの一部を含む、割ったダイズ種子は、種皮を分離および除去し、２つの子葉部分に種子を分割するために種子のへそに沿って、メスに固定した＃１０の刃を用いて、縦方向に切断されるダイズ種子材料の調製を必要とする。胚軸を部分的に除去するために注意深く行われ、この場合、約１／２〜１／３の胚軸を子葉の節点端部に付着させたままにする。
【０１０１】
接種。次に、胚軸の一部分を含む分割されたダイズ種子は、ＤＩＧ−６５７を含むバイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えば、株ＥＨＡ１０１またはＥＨＡ１０５）の溶液中に約３０分間、浸漬される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液は、胚軸を含む子葉を浸漬する前に、λの最終濃度＝０．６ＯＤ６５０に希釈される。
【０１０２】
共栽培。接種後、分割されたダイズ種子は、一片のろ紙で覆われたペトリ皿において、共栽培培地（Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.）上で５日間、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株と共に共培養される。
【０１０３】
シュート誘導。共栽培の５日後に、分割されたダイズ種子は、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌの鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、１．１１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、１００ｍｇ／ＬのＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシン（ｐＨ５．７）からなる液体シュート誘導（ＳＩ）培地中で洗浄される。次に、分割されたダイズ種子は、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天、２８ｍｇ／Ｌの鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、１．１１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５０ｍｇ／ＬのＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシン（ｐＨ５．７）からなるシュート誘導Ｉ（ＳＩ  Ｉ）培地で培養され、子葉の平らな面を上に向け、子葉の結節端部を培地中に埋める。培養２週間後、形質転換された、分割されたダイズ種子由来の外植片は、６ｍｇ／Ｌグルホシネート（ＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標））が補充されたＳＩ  Ｉ培地を含有するシュート誘導ＩＩ（ＳＩ  ＩＩ）培地に移される。
【０１０４】
シュート伸長。ＳＩ  ＩＩ培地上で培養２週間後、子葉を外植片から除き、胚軸を含有するフラッシュシュートパッドを子葉の基部で切り込みを作ることによって切除する。子葉から単離されたシュートパッドをシュート伸長（ＳＥ）培地に移す。ＳＥ培地は、ＭＳ塩、２８ｍｇ／Ｌの鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロースおよび０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１００ｍｇ／ＬのＬ−ピログルタミン酸、０．１ｍｇミ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＧＡ３、１ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、５０ｍｇ／ＬのＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、６ｍｇ／Ｌのグルホシネート、７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天（ｐＨ５．７）からなる。培養物を２週間ごとに新鮮なＳＥ培地に移す。培養物は、２４℃にてＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー内で生育され、８０から９０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度で１８時間の光周期でとする。
【０１０５】
根付。子葉のシュートパッドから発生した、伸長したシュートは、子葉のシュートパッドの基部で伸長したシュートを切断し、１から３分間、１ｍｇ／ＬのＩＢＡ（インドール３−酪酸）中に伸長したシュートを浸漬することによって単離し、根付を促進する。次に、伸長したシュートをｐｈｙｔａトレイ中の根付培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌの鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、２０ｇ／Ｌのスクロースおよび０：５９ｇ／ＬのＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１００ｍｇ／ＬのＬ−ピログルタミン酸、７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．６）に移す。
【０１０６】
栽培。２４℃、１８時間光周期で１から２週間、ＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー内で培養後、根が発達したシュートを被覆されたサンデーカップ中の土壌ミックスに移し、植物体の順化のために、長日条件（１６時間の明／８時間の暗）下、１２０から１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度で、一定温度（２２℃）および湿度（４０から５０％）下にて、ＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー（ＣＭＰ４０３０またはＣＭＰ３２４４モデル；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）に置いた。根付された植物体を数週間、サンデーカップ中で順化させ、その後、さらなる順化と堅牢なトランスジェニックダイズ植物の確立のために温室に移す。
【０１０７】
トランスジェニック系統の発生および形態学的特徴を形質転換していない植物と比較する。植物根、シュート、茎葉および再生特性を比較する。トランスジェニック植物および形質転換していない植物の根の長さおよび成長パターンにおいて観察可能な相違はない。高さ、葉の数および大きさ、開花時期、花の大きさおよび外観などの植物シュートの特徴は類似している。一般的に、インビトロおよび温室内の土壌で培養した場合、トランスジェニック系統とＤＩＧタンパク質を発現しない系統の間に観察可能な形態学的な相違はない。
【実施例１２】
【０１０８】
単子葉植物におけるＤＩＧ−６５７  Ｂｔ殺虫タンパク質および改変体の生成。
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換。Ｈｉｇｈ  ＩＩまたはＢ−１０４  Ｆ１交配（Armstrong et al., 1991）由来の種子は、９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ  ３６０無土壌生育培地（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）および５％粘土／ローム土壌をの混合物を含有する５ガロンの鉢に植え付けた。植物は、１６：８時間の明：暗の光周期を有する高圧ナトリウムおよびメタルハライドランプの組み合わせを用いて温室内で生育された。形質転換のための未熟なＦ２胚を得るために、調節された親類受粉を行った。未成熟胚は、胚が約１．０から２．０ｍｍの大きさである、受粉後の８から１０日目に単離された。
【０１０９】
感染および共栽培。トウモロコシ雌穂を液体石鹸で洗い、７０％エタノールに２分間浸漬し、次に、２０％の市販漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）に３０分間浸漬することにより表面殺菌し、その後、滅菌水で濯いだ。スーパーバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の懸濁液は、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンおよび２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含有するＹＥＰ固体培地上で２８℃にて２から３日間生育させた１から２ループの細菌を、１００μＭのアセトシリンゴンを含有する５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基礎培地（Linsmaier and Skoog, 1965）、Ｎ６ビタミン（Chu et al., 1975）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇｍ／Ｌのスクロース、３６．０ｇｍ／Ｌのグルコース、６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）に移すことにより調製された。均一な懸濁液が得られるまで溶液をボルテックスし、紫色フィルターを備えたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を用いて、約２００Ｋｌｅｔｔ単位の最終濃度に、または５５０ｎｍで約０．４の光学濃度に調整した。未成熟胚を２ｍＬの感染培地を含有するマイクロ遠心管に直接単離した。培地を除去し、密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位である１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で置き換え、アグロバクテリウム（Agrobacterium）と胚の溶液を室温で５分間インキュベートし、次に、共栽培培地（ＬＳ基礎培地（Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００μＭのアセトシリンゴン、および３．０ｇｍ／ＬのＧｅｌｌａｎガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳを含有する）、ｐＨ５．８）に、暗条件下で５日間、２５℃で移した。
【０１１０】
共栽培後、胚を選択培地に移し、その後、形質転換された単離体を約８週間にわたって得た。植物発現可能なｐａｔまたはｂａｒ選択マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織を選択するために、ＬＳベース培地（ＬＳ基礎培地、１×Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／ＬのＧｅｌｌａｎガム、ｐＨ５．７）をＢｉａｌａｐｈｏｓ（Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに使用した。胚発生の単離体が得られるまで、胚を３ｍｇ／ＬのＢｉａｌａｐｈｏｓを含有する選択培地に移した。回収された単離体は、再生およびさらなる分析のために、２週間の間隔で新鮮な選択培地に移すことによって嵩張らせた。トウモロコシ形質転換の当業者は、他の植物発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合、形質転換植物を選択する他の方法が利用可能であることを理解する。
【０１１１】
プラスミドｐＤＡＢ１１４５３４およびｐＤＡＢ１１４５３５に含有されるＤＩＧ−６５７の２つの異なる構築物（配列番号５および配列番号６）（表５）をトウモロコシに形質転換した。Ｔ０植物を再生し、標的害虫を防除するそれらの能力について試験した。構築物ｐＤＡＢ１１５７８２は、非殺虫性遺伝子で形質転換された植物の陰性対照として使用されるＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）の遺伝子を含有するプラスミドである。
【０１１２】
【表５】
2017521055.tif 000007
【０１１３】
Ｖ５  Ｔ０トランスジェニック植物のＶ３またはＶ４葉から１．０×０．５インチの正方形の葉カットを二連で採取した。各試験について、野生型植物の葉組織を最初にサンプリングして、葉の縁部でＢｔ毒素の交配汚染を防ぎ、続いて、形質転換植物をサンプリングした。各バイオアッセイトレイウェル（３２ウェルのトレイおよび蓋、ＣＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）において、１枚の葉カットを２％水−寒天（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）上に置き、これを昆虫種ごと、事象ごと、および構築物ごとに２回複製した。各ウェルに１０個の新生のＥＣＢまたはサトウキビ・メイガ（Diatraea saccharalis）（ファブリキュウス（Fabricius））（サトウキビ・ボーラー「ＳＣＢ」）（２４から４８時間齢）を用いて罹患させ、プラスチック製の穿孔した蓋で密閉して、空気交換を可能にした。トレイを２８℃（１６：８時間の明：暗、４０％ＲＨ）に置き、３日後、それらを葉の損傷率について評価した。ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ  ９．０．１（２０１０年、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、分散が均質である場合に、葉の損傷率データをＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験による平均分離で分析した。トランスジェニック植物材料に対する、各昆虫種によって観察された葉の損傷レベルを表６に示す。
【０１１４】
【表６】
2017521055.tif 000008
【０１１５】
構築物１１４５３４と１１４５３５の両方は、ＹＦＰ陰性対照構築物（１１５７８２）と比較してより小さな平均損傷を生じさせた。完全長ＤＩＧ−６５７タンパク質を発現する構築物１１４５３４は、切断型ＤＩＧ−６５７タンパク質を発現する構築物１１４５３５と比較してより大きな昆虫活性を示した。
【実施例１３】
【０１１６】
再生および種子生成。再生に関して、培養物は、低い光条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、次に、高い光条件（約８９μＥｍ−２ｓ−１）で１週間、「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３ｍｇ／ＬのＢｉａｌａｐｈｏｓ、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのジェランガム、ｐＨ５．７）に移された。その後、組織を「３６」再生培地（植物成長調節因子の欠如を除いて誘導培地と同じ）に移した。３〜５ｃｍ長の植物体は、ＳＨＧＡ培地（シェンク・ヒルデブランド塩ならびにビタミン（１９７２）；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロースおよび２．０ｇｍ／Ｌのジェランガム、ｐＨ５．８）を含有するガラス製培養管に移され、シュートおよび根のさらなる成長および発育を可能にする。植物を本明細書の前に記載したのと同じ土壌混合物に移植し、温室内で開花まで生育させた。種子生成のために調節された受粉を行った。
【実施例１４】
【０１１７】
ＤＩＧ−６５７  Ｂｔ殺虫タンパク質のコード配列の植物最適化バージョンの設計。トランスジェニック単子葉植物および双子葉植物においてＤＩＧ−６５７タンパク質を生成するために、植物コドンバイアスを有するＤＮＡ配列を設計および合成した。ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列から得られる７０６個のタンパク質コード配列（ＣＤ）からトウモロコシ（Zea mays L.）のコドン使用頻度表を計算した。タバコ（タバコ（Nicotiana tabacum）、１２６８個のＣＤ）、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Brassica napus）、５３０個のＣＤ）、コットン（ワタ（Gossypium hirsutum）、１９７個のＣＤ）およびダイズ（ダイズ（Glycine max）、約１０００個のＣＤ）についてのコドン使用頻度表をウェブサイトhttp://www.kazusa.or.jp/codon/のデータからダウンロードした。適切な加重平均相対量で、トウモロコシと双子葉植物のデータセットの両方に共通する、高度に使用されるコドンを含むバイアスコドンセットは、いずれかの植物タイプにおいてそのアミノ酸の全コドン使用の約１０％未満が使用された任意の冗長コドンを省略した後に計算された。ＤＩＧ−６５７タンパク質をコードする植物最適化配列を誘導するために、実験的に決定されたＤＩＧ−６５７のＤＮＡ配列に対するコドン置換を、得られたＤＮＡ配列が植物最適化コドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するように行った。望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物のイントロンスプライシング部位、Ａ／ＴまたはＣ／Ｇ残基の長い部分、および植物細胞における、コード領域のＲＮＡ安定性、転写または翻訳を妨害し得る他のモチーフを排除するために、配列のさらなる改善がなされた。所望の制限酵素認識部位を導入し、長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するために、他の変更が行われた。これらの変化は全て、植物に偏ったコドン組成を保持するという制約の中でなされた。設計された配列の合成は、市販の業者（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって実施された。合成遺伝子の生成に関するさらなるガイダンスは、例えば、国際公開番号第９７／１３４０２号パンフレットおよび米国特許第５，３８０，８３１号明細書に見出すことができる。ＤＩＧ−６５７改変体１をコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列を配列番号３に示す。ＤＩＧ−６５７改変体２をコードするシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）最適化ＤＮＡ配列を配列番号４に示す。ＤＩＧ−６５７をコードするトウモロコシ最適化された高ＧＣのＤＮＡ配列を配列番号５に示す。Ｎ末端から２０４ａａを切断したＤＩＧ−６５７遺伝子をコードするトウモロコシ最適化された高ＧＣのＤＮＡ配列を配列番号６に示す。完全長ＤＩＧ−６５７をコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列を配列番号８として開示する。切断型ＤＩＧ−６５７をコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列を配列番号９として開示する。
【０１１８】
サザンブロット上の固定化ＤＮＡと放射性標識された遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、標準的な方法（Sambrook et al.、上述）によって行われる。ポリヌクレオチドプローブを標識するために使用される放射性同位体には、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃまたは３Ｈが含まれる。ポリヌクレオチドプローブ分子への放射性同位体の組み込みは、分子生物学分野の当業者に周知ないくつかの方法のいずれかによって行われる。（例えば、Sambrook et al.、上述を参照されたい。）一般的に、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄は、請求された毒素のコード遺伝子に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にするストリンジェントな条件下で行われる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ［２０×ＳＳＰＥは、３ＭのＮａＣｌ、０．２ＭのＮａＨＰＯ４、および０．０２ＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩）；１００×デンハルト溶液（２０ｇｍ／Ｌのポリビニルピロリドン、２０ｇｍ／ＬのＦｉｃｏｌｌタイプ４００および２０ｇｍ／ＬのＢＳＡ−フラクションＶ）中で、ＤＮＡハイブリッドのＴｍ未満の２０℃から２５℃で一晩を行われる。
【０１１９】
洗浄は、典型的には、以下のように行われる：
ａ．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温にて１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）。
ｂ．０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、Ｔｍ温度未満の２０℃で１５分間を１回（中程度ストリンジェンシー洗浄）。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ中で、ハイブリッドのＴｍ未満の１０℃から２０℃で一晩行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブについてのＴｍは、以下の式（Suggs et al., 1981）によって決定することができる。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【０１２１】
洗浄は、典型的には、以下のように行われる：
ａ．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温にて１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）。
ｂ．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度にて１５分間を１回（中程度ストリンジェンシー洗浄）。
【０１２２】
ハイブリダイゼーションのためのプローブ分子、およびプローブと標的分子の間に形成されたハイブリッド分子は、放射性標識以外の手段によって検出可能にすることができる。このような代替方法は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１２３】
本開示は、様々な修正および代替形態を受け入れることができるが、具体的な実施形態は、例として本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本開示は、開示される特定の形態に限定されることを意図しないことを理解されたい。むしろ、本開示は、以下の添付の特許請求の範囲およびその法的均等物によって定義される本開示の範囲内にある全ての修飾、均等物および代替物を網羅するものである。
【図１】
2017521055.tif 000009
【配列表】
2017521055000001.app
【国際調査報告】
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2017521055.tif 000011
2017521055.tif 000012