(57)【要約】本発明は、糖尿病性腎症ならびに他の慢性腎障害および他の糖尿病性合併症の処置に特に有用な１，２−ベンゾチアゾール化合物を提供する。2017531684.tif 000030
2017531684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2017531684.tif 000021
（式中、
Ａは、
【化２】
2017531684.tif 000022
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、フルオロ、クロロ、メチルまたはシアノであり、Ｒ１またはＲ２の内の少なくとも一方が水素ではなく、
Ｚは、
【化３】
2017531684.tif 000023
であり、
Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはメチルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の内の少なくとも一つは、水素ではない）
またはその塩。
【請求項２】
Ａが、
【化４】
2017531684.tif 000024
である、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項３】
Ｒ２が、フルオロである、請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項４】
Ａが、
【化５】
2017531684.tif 000025
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項５】
Ｚが、
【化６】
2017531684.tif 000026
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項６】
Ｚが、
【化７】
2017531684.tif 000027
である、請求項５に記載の化合物または塩。
【請求項７】
Ｚが、
【化８】
2017531684.tif 000028
である、請求項６に記載の化合物または塩。
【請求項８】
【化９】
2017531684.tif 000029
である、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物の塩酸塩、メタンスルホン酸塩またはヘミエタン−１，２−ジスルホン酸塩。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
１つ以上の更なる治療剤を更に含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩を投与する工程を含む、それを必要とする患者における腎障害を処置する方法。
【請求項１３】
前記腎障害が、慢性腎疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腎障害が、糖尿病性腎症である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、ヒトである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者が、ネコ科動物である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩を投与する工程を含む、それを必要とする患者における糖尿病性合併症を処置する方法。
【請求項１８】
前記糖尿病性合併症が、アテローム硬化症、心筋症、網膜症、腎症および神経障害からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項２０】
腎障害の処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項２１】
前記腎障害が、慢性腎疾患である、請求項２０に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項２２】
前記腎障害が、糖尿病性腎症である、請求項２０に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項２３】
糖尿病性合併症の処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項２４】
前記糖尿病性合併症が、アテローム硬化症、心筋症、網膜症、腎症および神経障害からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のための化合物または塩。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトおよび動物における腎臓部または腎臓の障害は、腎臓の正常な生理および機能における変化を含む。腎臓部障害は、広い範囲の急性および慢性の状態およびイベントから生じ得る。同状態およびイベントとしては、物理的、化学的または生物学的な傷害、損傷または外傷、疾患ならびに種々の炎症性疾患および自己免疫疾患が挙げられる。腎臓障害は、生活の質および期間を重篤に損なう、低下した腎機能をもたらし得る。最初の損傷または原因に関わらず、腎臓障害は、腎実質の進行性崩壊および機能的なネフロンの損失により特徴付けられる。この進行は、多くの場合、慢性腎疾患（ＣＫＤ）ならびに末期の腎疾患および腎不全（ＥＳＲＤ／ＥＳＲＦ）をもたらす。
【０００２】
ＣＫＤは、腎機能における進行性の損失により特徴付けられる。増大したアルブミン尿および段階的で進行性の腎機能の損失は、ＣＫＤの主な兆候である。低下した腎機能は、増大した血中クレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）をもたらす。ＣＫＤ患者は、経時的に、アルブミン尿、タンパク尿、血清クレアチニンおよび腎臓部の病理組織学的病変の増大を経験する。
【０００３】
ヒトにおいて、ＣＫＤは、全ての先進国において、相当な社会的および経済的問題であったし、そして、あり続けている。米国において、１０２，５６７名の患者が、２００３年に透析を開始し（１００万人当たりに、３４１名の患者／年）、同様の割合で、発展途上国、および特に、民族集団において見出された（非特許文献１および２）。ただし、これらの数字は、ある程度の腎障害を有すると考えられる何百万という患者のごく一部でしかない。米国において、慢性的に低下した腎機能の有病率は、成人の約１０％であると推定される（非特許文献３）。ＣＫＤの悪化は、多くの患者についてＥＳＲＤに進行し、透析または腎臓移植が必要となる。患者のＣＫＤの重症度を分類するのに、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）が使用されている。ここで、ＧＦＲの低下は、より重症のＣＫＤに対応する。患者におけるＧＦＲが低下する速度を遅らせることは、ＥＳＲＤの進行を遅延させ、または、予防することが予測される。アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリル；またはアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストもしくはブロッカー（ＡＲＢ）、例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ロサルタンおよびオルメサルタン；またはそれらの組み合わせが、ＣＫＤからＥＲＳＤへの進行を遅延させるための、現在の標準的なケアとして使用されているが、これらは、透析への最終的な進行を停止させるには不十分であることが示されている。
【０００４】
腎臓部障害の有病率は、ネコにおいても高い。一方、慢性腎不全は、最も重要なものであると考えられる。ネコ科動物のＣＫＤの有病率は、最大２０％に達することが報告されている。ここで、それらのネコの５３％が、７歳以上である（非特許文献４および５）。軽度〜中程度の高窒素血症および腎外の臨床サイン（国際獣医腎臓病研究グループ（ＩＲＩＳ）のステージ２および３）を有するネコの生存は、１〜３年の範囲である。現在の治療は、腎機能を改善することにより、ネコにおける疾患の進行を遅延させるのが目的である。この治療には、食餌によるタンパク質制限、食餌による脂質摂取の改善、リン酸の制限およびＡＣＥ阻害剤による処置が挙げられる（非特許文献６）。
【０００５】
当技術分野において、ヒトおよび動物における腎障害を処置するための代替的な治療を提供する必要性が残っている。特に、ヒトおよびネコ科動物のＣＫＤを処置するための代替的な治療は、喫緊の必要性である。
【０００６】
ＣＫＤについての特に高リスク群としては、糖尿病を有する群が挙げられる。糖尿病性腎症は、糖尿病性合併症としての結果である慢性の腎疾患または腎臓傷害であり、ＥＲＳＤの主因である。このため、糖尿病性腎症は、慢性腎疾患および糖尿病性合併症の両方の部分集合である。進行性の糖尿病性腎症の全体的なリスクは、ＩＩ型糖尿病（遅発性糖尿病）の約１０％〜Ｉ型糖尿病（早発性糖尿病）の約３０％の間で変動する。高血糖（制御できない高血糖）により、特に、高血圧も存在する場合、腎臓傷害の進行がもたらされると考えられる。
【０００７】
複数の生化学的経路が、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）−プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路の活性化を含めて、高血糖の有害作用を説明するのに提唱されてきた。ＰＫＣは、１２個のアイソフォーム：Ｃａ２＋およびＤＡＧの両方に結合する従来型ＰＫＣ（α、β１、β２およびγ）、ＤＡＧには結合するが、Ｃａ２＋には結合しない新規型ＰＫＣ（δ、ε、η、θおよびμ）および、いずれにも結合しない異常型ＰＫＣ（ζ、λおよびτ）からなるセリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。従来型および新規型のＰＫＣアイソフォームの活性化には、これらのアイソフォームの正しいリン酸化と、Ｃａ２＋およびＤＡＧなどの補助因子の存在が必要である。正しくリン酸化された場合、Ｃａ２＋またはＤＡＧの急速または慢性的な増大により、細胞の膜画分へのそれらの移行が誘引され、生物学的作用が引き起こされるであろう。ＤＡＧおよびＣａ２＋レベルの急速で短期間の増大は、通常、ホスホリパーゼＣの活性化を介したサイトカインにより誘引される。ＰＫＣの慢性的な活性化は、ＤＡＧの持続性の増大を必要とする。同増大は、ホスホリパーゼＤ／Ｃの活性化または新たなＤＡＧ合成による。ＰＫＣの活性化は、内皮細胞により形成された障壁を通した、アルブミンおよび他の巨大分子の透過性を直接増大させる。高血糖および糖尿病の状態において、おそらく、これらの全ての経路が、ＤＡＧ−ＰＫＣカスケードの活性化に関与しているであろう。
【０００８】
特定の糖尿病性合併症を処置するためのＰＫＣ阻害剤は、当技術分野において既知である。例えば、特許文献１および２を参照のこと。
【０００９】
現在、糖尿病性腎症のための治療は存在しない。ＣＫＤを伴うような糖尿病性腎症は、最初に、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢまたはそれらの組み合わせなどの、血圧を下げる医薬により処置される。これらの分類の化合物は、抗炎症作用を示すとも考えられる。残念ながら、このような処置では、疾患の進行を遅らせるのみであり、腎臓に起こった進行を停止させまたは傷害を修復することはできない。最終的に、処置は、腎臓が機能不全に向かって悪化するのに伴って、より侵襲的（透析および／または腎臓移植）になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，５５２，３８６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１０，１４５号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】２００６，ＵＳＲＤＳ  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ４７：１−２８６
【非特許文献２】Ｍｅｇｕｉｄ  Ｅｌ  Ｎａｈａｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｌｏ，Ａ．Ｋ．２００５．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：３３１−３４０
【非特許文献３】ｈｔｔｐ：／／ｋｉｄｎｅｙ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｋｕｄｉｓｅａｓｅｓ／ｐｕｂｓ／ｋｕｓｔａｔｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ，ｐａｇｅｓ１−４
【非特許文献４】Ｌｅｆｅｂｒｅ，Ｔｏｕｔａｉｎ  ２００４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐ．２７，２６５−２８１
【非特許文献５】Ｗｏｌｆ，Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．Ｖｅｔ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２００６
【非特許文献６】Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｂｅｒ（２００４）Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，ｉｎ：Ｃｈａｎｄｌｅｒ  Ｅ  Ａ，Ｇａｓｋｅｌｌ  Ｃ  Ｊ，Ｇａｓｋｅｌｌ  Ｒ  Ｍ，（ｅｄｓ．）Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、糖尿病性腎症のための代替的な化合物についての必要性が存在する。好ましくは、このような化合物は、より有効であろうし、場合により、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢまたはそれらの組み合わせと組み合わせられ得る。好ましくは、このような化合物は、インスリンシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子であるＡｋｔを阻害しないものとし、従来型および新規型のＰＫＣアイソフォームの活性化を阻害するであろう。この阻害は、アテローム硬化症、心筋症、網膜症、腎症および神経障害などの糖尿病性合併症についての処置を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の式の化合物：
【化１】
2017531684.tif 000003
（式中、
Ａは、
【化２】
2017531684.tif 000004
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、フルオロ、クロロ、メチルまたはシアノであり、Ｒ１またはＲ２の内の少なくとも一方が水素ではなく、
Ｚは、
【化３】
2017531684.tif 000005
であり、
Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはメチルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の内の少なくとも一つは、水素ではない）
またはその塩を提供する。式Ｉの化合物は、腎障害の処置における臨床的使用を有してもよい。同腎障害としては、慢性腎疾患、およびとりわけ、糖尿病性腎症が挙げられる。さらに、式Ｉの化合物は、アテローム硬化症、心筋症、網膜症および腎症などの糖尿病性腎症以外またはこれらに加えて、糖尿病性合併症の処置における臨床的使用を有してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、フルオロ、クロロまたはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、フルオロ、クロロ、メチルまたはシアノである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、フルオロ、クロロまたはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、フルオロまたはクロロである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、フルオロまたはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、クロロまたはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、フルオロである。本発明の実施形態において、Ｒ１は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ６は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ６は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、水素またはメチルである。本発明の実施形態において、Ｒ３は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ３は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ４は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ４は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ５は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ５は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ７は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ７は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ８は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ８は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ９は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ９は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ１０は、水素である。本発明の実施形態において、Ｒ１０は、メチルである。本発明の実施形態において、Ｒ４およびＲ５が、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成する場合には、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しない。本発明の実施形態において、Ｒ７およびＲ８が、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成する場合には、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しない。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、Ａは、
【化４】
2017531684.tif 000006
である。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、Ｒ２は、フルオロである。本発明の好ましい実施形態では、Ａは、
【化５】
2017531684.tif 000007
である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｚは、
【化６】
2017531684.tif 000008
である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、Ｚは、
【化７】
2017531684.tif 000009
である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｚは、
【化８】
2017531684.tif 000010
である。
【００２０】
また、本発明は、患者における腎障害（ＣＫＤまたは糖尿病性腎症など）および／または糖尿病性合併症を処置する方法であって、このような処置を必要とする患者に、有効量の本発明の化合物またはその塩を投与する工程を含む、方法も提供する。また、本発明は、同時、別々または連続的な組み合わせにおいて、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリルからなる群から選択されるＡＣＥ阻害剤；カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ロサルタンおよびオルメサルタンからなる群から選択されるＡＲＢ；またはそれらの組み合わせなどの更なる活性成分を投与する工程を更に含む上記方法も提供する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の化合物または塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、本医薬組成物は、１つ以上の他の治療剤、例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリルからなる群から選択されるＡＣＥ阻害剤；カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ロサルタンおよびオルメサルタンからなる群から選択されるＡＲＢ；またはそれらの組み合わせを更に含む。
【００２２】
また、本発明は、治療に使用するための、本発明の化合物または塩も提供する。また、本発明は、腎障害（ＣＫＤまたは糖尿病性腎症など）および／または糖尿病性合併症の処置に使用するための、本発明の化合物または塩も提供する。加えて、本発明は、腎障害（ＣＫＤまたは糖尿病性腎症など）および／または糖尿病性合併症を処置するための医薬の製造における、本発明の化合物または塩の使用を提供する。本発明の実施形態において、本発明の化合物または塩は、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリルからなる群から選択されるＡＣＥ阻害剤；カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ロサルタンおよびオルメサルタンからなる群から選択されるＡＲＢ；またはそれらの組み合わせの、同時、別々または連続的な使用における使用のためのものである。
【００２３】
本発明の実施形態において、患者におけるタンパク尿を減少させる方法であって、このような処置を必要とする患者に、有効量の本発明の化合物またはその塩を投与する工程を含む、方法が提供される。本発明の実施形態において、タンパク尿を減少させるのに使用するための、本発明の化合物またはその塩が提供される。本発明の実施形態において、タンパク尿を減少させるための医薬を製造するための、本発明の化合物またはその塩の使用が提供される。
【００２４】
本発明の実施形態において、患者におけるアルブミン尿を減少させる方法であって、このような処置を必要とする患者に、有効量の本発明の化合物またはその塩を投与する工程を含む、方法が提供される。本発明の実施形態において、アルブミン尿を減少させるのに使用するための、本発明の化合物またはその塩が提供される。本発明の実施形態において、アルブミン尿を減少させるための医薬を製造するための、本発明の化合物またはその塩の使用が提供される。
【００２５】
本発明の実施形態において、患者におけるＥＳＲＤへの進行速度を遅延させる方法であって、このような処置を必要とする患者に、有効量の本発明の化合物またはその塩を投与する工程を含む、方法が提供される。本発明の実施形態において、患者におけるＥＳＲＤへの進行速度を遅延させるのに使用するための、本発明の化合物またはその塩が提供される。本発明の実施形態において、ＥＳＲＤへの進行速度を遅延させるための医薬を製造するための、本発明の化合物またはその塩の使用が提供される。
【００２６】
「腎障害」という用語は、任意の腎臓部障害、腎臓部疾患または、腎臓の正常な生理および機能における何等かの変化が存在する腎臓疾患を意味する。腎障害は、広い範囲の急性および慢性の状態およびイベントから生じ得る。同状態およびイベントとしては、物理的、化学的または生物学的な傷害、損傷、外傷または疾患、例えば、高血圧、糖尿病、うっ血性心不全、ループス、鎌状赤血球貧血、ならびに、種々の炎症性、感染性および自己免疫疾患、ＨＩＶ（または関連疾患）関連腎症などが挙げられる。この用語は、腎臓移植、腎症、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、糸球体腎炎、多嚢胞性腎疾患などの遺伝病、腎肥大症（一方または両方の腎臓の極端な肥大）、ネフローゼ症候群、末期腎臓部疾患（ＥＳＲＤ）、急性および慢性腎臓部不全、間質性疾患、腎炎、例えば、疾患または傷害による炎症を含む原因により生じる組織および／または血管の硬結または硬化である硬化症、腎臓部の線維症および瘢痕、腎臓部関連増殖性障害ならびに他の原発性または続発性の腎原性状態などの疾患および状態を含むが、これらに限定されない。腎不全による透析およびカテーテル配置に関連する線維症、例えば、腹膜および血管アクセス線維症も含まれる。
【００２７】
一部の実施形態では、腎臓障害は、一般的には、「腎症」と定義される場合がある。この「腎症」という用語は、腎線維症および／または糸球体疾患（例えば、糸球体硬化症、糸球体腎炎）ならびに／または慢性腎臓部不全をもたらすおそれがあり、末期腎臓部疾患および／または腎臓部不全を引き起こし得る、腎臓における全ての臨床病理学的変化を包含する。一部の実施形態では、この「腎症」という用語は、具体的には、対象の尿中のタンパク質（すなわち、タンパク尿）および／または腎臓部不全のいずれかが存在する、障害または疾患を意味する。
【００２８】
「線維症」という用語は、線維性組織の異常な進行または類線維腫もしくは線維性変性を意味する。線維症は、種々の傷害または疾患により生じるおそれがあり、多くの場合、種々の臓器の移植に関する慢性移植拒絶により生じ得る。線維症は、典型的には、例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチンの過剰生成および増大した沈着を含む、細胞外マトリクスコンポーネントの異常な生成、蓄積または沈着による。本明細書で使用する場合、「腎線維症」または「腎臓部線維症」または「腎臓の線維症」という用語は、細胞外マトリクスコンポーネント、特にコラーゲンの過剰生成または異常な沈着に関連し、腎機能の崩壊または損失をもたらす疾患または障害を意味する。
【００２９】
「糖尿病性合併症」としては、アテローム硬化症、心筋症、網膜症、腎症および神経障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「患者」という用語は、腎障害（慢性腎疾患または糖尿病性腎症など）および／または糖尿病性合併症を発症しているおそれがあるか、または、このような病理に感受性である、生きた生物を含む。この用語には、動物（例えば、哺乳類、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット、ウサギ、リス、クマ、霊長類（例えば、チンパンジー、サル、ゴリラおよびヒト）およびニワトリ、アヒル、北京ダック、ガチョウならびにそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、患者は、哺乳類である。より好ましくは、患者は、ヒトまたはネコ科動物である。
【００３１】
「処置（治療）」、「処置（治療）する」、「処置（治療）すること」などの用語は、障害の進行を遅延させ、または、反転させることを含むのを意味する。また、これらの用語は、障害または状態が実際に除去されない場合、および、障害または状態の進行自体が遅延されまたは反転されない場合であっても、障害または状態の１つ以上の兆候を緩和し、改善し、減弱させ、除去し、または、減少させることも含む。
【００３２】
本願において、例えば、塩および担体などの配合化合物に関して使用する場合、「薬学的に許容可能な」は、「獣医学的に許容可能な」を含むため、ヒトおよび非ヒト動物用途の両方を、独立して含む。
【００３３】
本発明の化合物および塩は、好ましくは、医薬組成物として配合される。同医薬組成物は、獣医学的組成物を含む。本医薬組成物は、各種の経路により投与され得る。最も好ましくは、このような組成物は、経口または静脈内投与用のものであり、錠剤、カプセル剤、液剤および懸濁剤が挙げられる。「担体」は、本明細書において、配合中の活性成分以外の任意の成分を説明するのに使用される。担体の選択は、投与または適用の特定の方式、溶解性および安定性における担体の効果ならびに剤形の性質などの要因により概ね決まるであろう。このような医薬組成物およびそれを調製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ｄ．Ｔｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照のこと。
【００３４】
本発明の化合物は、一般的には、広い用量範囲にわたって有効である。「有効量」は、研究者、臨床医、獣医もしくは他の医師により求められる組織、系もしくは患者の生物学的または医療的応答、または、これらにおける所望の治療効果を引き出すであろう、本発明の方法および使用のための化合物量を意味する。化合物の有効量は、関与する具体的な疾患、疾患の状態、患者の年齢、性別および体重、患者における所望の応答を引き出す化合物の能力、患者の応答、投与される特定の化合物、投与方式、投与された調製物に固有の生物学的利用能、選択された投与計画ならびに任意の付随的な医薬の使用などの要因に従って変動し得る。また、有効量は、化合物の任意の毒性または有害作用より、治療的に有益な効果が勝る量でもある。また、投与頻度は、複数の要因に基づいて決定されるであろうし、１回または複数回の投与であり得る。
【００３５】
本発明の化合物は、薬学的に許容可能な塩を含む塩を形成可能でもよいことが、当業者により理解されるであろう。例えば、実施例１の化合物は、塩基性アミンを含有するため、数多くの無機酸および有機酸のいずれかと反応して、薬学的に許容可能な酸付加塩を形成する。このような薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７を参照のこと。
【００３６】
本発明の化合物は、少なくとも１つのキラル中心を含有してもよいことを、当業者であれば理解するであろう。本発明は、全ての個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーおよびラセミ体を含む前記化合物のエナンチオマーとジアステレオマーとの混合物に想到される。少なくとも１つのキラル中心を含有する本発明の化合物は、単独のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在するのが好ましい。単独のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬で開始して、または、立体選択もしくは立体特異的合成技術により調製されてもよい。あるいは、単独のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、混合物から、標準的なキラルクロマトグラフまたは結晶化技術により単離されてもよい。以下の実施例１０および３１について、異性体１がカラムからまず溶出し、異性体２が２番目に溶出する。
【実施例】
【００３７】
下記調製および実施例は、本発明を更に例示し、本発明の化合物の典型的な合成を表わす。試薬および開始材料は、容易に入手できるか、または、当業者であれば容易に合成することができる。調製および実施例は、例示として説明されるものであり、限定するものではなく、種々の改変が当業者によりなされ得ることを理解されたい。本明細書で例示された化合物は、ＩＵＰＡＣＮＡＭＥ  ＡＣＤＬＡＢＳを使用して命名される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、下記用語は、示された意味を有する。「ＡＴＣＣ」は、アメリカンタイプカルチャーコレクションを意味する。「ＡＴＰ」は、アデノシン−５’−三リン酸を意味する。「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味する。「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味する。「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。「ＥＧＴＡ」は、エチレングリコール四酢酸を意味する。「ｈ」は、時間を意味する。「ＨＡＴＵ」は、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートリン酸を意味する。「ＨＴＲＦ」は、均一時間分解蛍光を意味する。「ＩＣＲ」は、インプリンティング制御領域を意味する。「ＩｇＧ」は、免疫グロブリンＧを意味する。「ｍｉｎ」は、分を意味する。「ＯＧＴＴ」は、経口グルコース負荷試験を意味する。「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核球を意味する。「Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２」は、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン錯体を意味する。「ＰＫＣ」は、プロテインキナーゼＣを意味する。「ＰＭＡ」は、ホルボールミリスチン酸酢酸を意味する。「Ｐ−プレクストリン」は、リン酸化プレクストリンを意味する。「ＲＰＭＩ」は、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを意味する。「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。「ＳＴＫ」は、セリン／スレオニンキナーゼを意味する。「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを意味する。
【００３９】
調製１
５−ブロモ−２−フルオロ−３−メチル−ベンズアルデヒド
ＴＨＦ（１．４Ｌ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−メチル−ベンゼン（３００ｇ、１．５９ｍｏｌ）の溶液を、窒素下で−６５〜−７０℃に冷却する。ついで、内部温度を−６５〜−７０℃の間で維持しながら、ＴＨＦ中の２．０Ｍ  ジイソプロピルアミドリチウム（１Ｌ、２．０ｍｏｌ、１．２６当量）を、２．５時間にわたって加える。反応温度を、添加の完了後更に１時間維持する。ＤＭＦ（２４０ｍＬ）およびＴＨＦ（１００ｍＬ）の溶液を加える。混合物を、−７８℃にて２時間攪拌し、ついで、−１０℃に１６時間にわたって温める。飽和塩化アンモニウム（５Ｌ）を加え、混合物を、酢酸エチル（２×３Ｌ）で抽出する。組み合わせた抽出物を、水（５Ｌ）で洗浄し、塩化ナトリウムの飽和水溶液（ブライン）（５Ｌ）で洗浄し、濃縮して、粗製の表題化合物（３００ｇ）を得る。同化合物を、更なる精製をすることなく使用する。
【００４０】
調製２
５−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−３−メチル−ベンズアルデヒド
ＤＭＦ（２．５Ｌ）中の５−ブロモ−２−フルオロ−３−メチル−ベンズアルデヒド（４８０ｇ、２．５３４ｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（６００ｇ、４．３ｍｏｌ）、続けて、２−メチルプロパン−２−チオール（３００ｍＬ、２．７ｍｏｌ）を加える。得られた混合物を、６０℃に１６時間加熱する。水（１．５Ｌ）を、この温度にて加え、ついで、混合物を、６０℃にて更に８時間攪拌する。反応混合物を、約２５℃に冷却し、水（１０Ｌ）に注ぎ、ついで、酢酸エチル（７Ｌ）で抽出する。有機層を、水（７Ｌ）、５％のブライン（５Ｌ）で洗浄し、濃縮して、粗製の表題化合物（６００ｇ）を得る。同化合物を、更なる精製をすることなく使用する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２３０．９／２３２．９［Ｍ−イソブテン＋Ｈ］＋。
【００４１】
調製３
５−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−３−メチル−ベンズアルデヒドオキシム
９５％のエタノール（３Ｌ）中の５−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−３−メチル−ベンズアルデヒド（６００ｇ、１．９８５ｍｏｌ）の溶液に、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２１８ｇ、３．１ｍｏｌ）を加える。ついで、重炭酸ナトリウム（２８０ｇ、３．３４ｍｏｌ）を、少量ずつ１０分にわたって加える。添加が完了した後に、反応混合物を、室温にて３時間攪拌する。反応混合物を、水（３Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（３Ｌ）で抽出する。有機層を、５％のブラインで洗浄し、濃縮する。得られた残留物を、石油エーテル（５Ｌ）中で粉砕し、濾過し、石油エーテル（２×１Ｌ）で洗浄する。ケーキを風乾して、黄色の固体として表題化合物を得た（４６０ｇ、３工程で収率６３％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３０４．０／３０６．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４２】
調製４
５−ブロモ−７−メチル−１，２−ベンゾチアゾール
トルエン（３Ｌ）中の５−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチルスルファニル−３−メチル−ベンズアルデヒドオキシム（４６０ｇ、１．５ｍｏｌ）の懸濁液に、４−メチルベンゼンスルホン酸（５０ｇ、０．２６ｍｏｌ）を加える。反応混合物を、８０℃にて２時間加熱し、ついで、２時間還流する。反応を冷却し、酢酸エチル（３Ｌ）で希釈する。有機部分を、水（３Ｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（３Ｌ）およびブライン（３Ｌ）で洗浄する。有機部分を濃縮する。得られた残留物を、石油エーテル（３Ｌ）中でスラリー化し、濾過する。濾過ケーキを、石油エーテル（２×１Ｌ）で洗浄して、褐色の固体として表題化合物を得る（２５０ｇ、７２％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２２７．９／２２９．９［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ９．０８（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｓ，１Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ）。
【００４３】
調製５
５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−カルボン酸
四塩化炭素（１．５Ｌ）中の５−ブロモ−７−メチル−１，２−ベンゾチアゾール（５０ｇ、０．２２ｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２３４．１ｇ、１．３ｍｏｌ）および過酸化ベンゾイル（１０．６ｇ、４４ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、還流で１６時間加熱し、２５℃に冷却し、濾過する。濾過ケーキを、水（２．５Ｌ）および酢酸エチル（２Ｌ）中に溶解させる。有機層および濾液を互いに組み合わせ、濃縮して、固体を得る。残留した固体を風乾して、固体（８０ｇ）として、５−ブロモ−７−（ジブロモメチル）−１，２−ベンゾチアゾール（２１４ｎｍでのＵＶ吸光により検出された純度３８％、ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３８４／３８６／３８８／３９０［Ｍ＋Ｈ］＋）および５−ブロモ−７−（トリブロモメチル）−１，２−ベンゾチアゾール（２１４ｎｍでのＵＶ吸光により検出された純度２８％、ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４６２／４６４／４６６／４６８／４７０［Ｍ＋Ｈ］＋）の粗製の混合物を得る。粗製の混合物（８０ｇ）を、水（８００ｍＬ）およびジオキサン（８００ｍＬ）中の水酸化リチウム（１７．４ｇ、０．４１５ｍｏｌ）の溶液に加え、還流で１６時間加熱する。溶液を、２５℃に冷却し、２ＮのＨＣｌで、ｐＨ＝２〜３に酸性化する。混合物を、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出する。組み合わせた有機部分を濃縮して、５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−カルバルデヒド（２１４ｎｍでのＵＶ吸光により検出された純度５０％、ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２４２／２４４［Ｍ＋Ｈ］＋）および５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−カルボン酸（２１４ｎｍでのＵＶ吸光により検出された純度８％、ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２５８／２６０［Ｍ＋Ｈ］＋）の粗製の混合物（１００ｇ）を得る。粗製の混合物（１００ｇ）を、ＴＨＦ（９６０ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（３２０ｍＬ）および水（３２０ｍＬ）中に溶解させる。亜塩素酸ナトリウム（３２．２ｇ、０．３１１ｍｏｌ）、リン酸二水素ナトリウム・一水和物（９８．３ｇ、０．６２ｍｏｌ）およびスルファミン酸（３２．２ｇ、０．３３ｍｏｌ）を加える。混合物を、２５℃にて１６時間攪拌し、ついで、濃縮する。得られた残留物を、ジクロロメタンおよび水（１：１、４００ｍＬ）による粉砕により精製する。スラリーを濾過し、ケーキを、風乾して、固体として表題化合物を得る（２６ｇ、３工程収率４６％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２５８／２６０［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ９．１８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７１４−６．７１９（ｍ，１Ｈ）。
【００４４】
調製６
（５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル）−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン
【化９】
2017531684.tif 000011
５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−カルボン酸（１０ｇ、０．０３９ｍｏｌ）とＤＭＦ（１００ｍＬ）との混合物に、ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペラジン（６．６４ｇ、０．０５８ｍｏｌ）を、２８℃にて加える。得られた混合物を、０℃に冷却し、ＨＡＴＵ（２２．１ｇ、０．０５８ｍｏｌ）を、少量ずつ加える（内部温度は、０〜２℃とする）。混合物を、２５℃に温め、この温度にて１６時間攪拌する。混合物を、真空下で濃縮し、水（３０ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出する。組み合わせた有機部分を、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄する。有機部分を濃縮し、得られた残留物を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）との混合物中に溶解させる。６ＮのＨＣｌを、大部分の固体が現れるまで滴下する。固体を、濾過により収集する。濾液の水相を分離し、固体ケーキと組み合わせ、重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ８に塩基性化し、ついで、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出する。有機相を濃縮して、表題化合物を得る（１０．１ｇ、７４％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３５４／３５６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４５】
調製７
［５−（２，６−ジフルオロ−４−メトキシ−フェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン
【化１０】
2017531684.tif 000012
（５−ブロモ−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル）−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン（２．０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）、２，６−ジフルオロ−４−メトキシフェニルボロン酸（１．６ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２）（４１５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１．８３ｇ、１６９ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（１８ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合物を、８５℃にて窒素雰囲気下で１６時間攪拌する。混合物を、２５℃に冷却し、濾過する。濾液を、真空下で濃縮する。残留物を、シリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィー（メタノール中のジクロロメタン＝１５０：１〜１００：１で溶出）により精製する。残留した粗製の生成物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解させ、１，４−ジオキサン中の４Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）および少量の水を滴下する。得られた固体を濾過し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で洗浄する。ついで、固体を、水（１０ｍＬ）中に懸濁させ、炭酸ナトリウムの飽和溶液で塩基性化し、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。組み合わせた有機部分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。濾液を濃縮して、表題化合物（１．１ｇ、４７％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４１８．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４６】
実施例１
４−（７−｛［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］カルボニル｝−１，２−ベンゾチアゾール−５−イル）−３，５−ジフルオロフェノール
【化１１】
2017531684.tif 000013
５−（２，６−ジフルオロ−４−メトキシ−フェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン（１．０ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（３０ｍＬ）との混合物に、三臭化ホウ素（２．７ｍＬ、１０．５４ｍｍｏｌ）を、−７８℃にて窒素雰囲気下で滴下する。混合物を、２５℃に温め、２１時間攪拌する。反応を、メタノールで−４０℃にて停止させ、アンモニアでｐＨ＝８に塩基性化する。混合物を、ジクロロメタンとイソプロピルアルコールとの溶液（３×１６０ｍＬ、３／１  ｖ／ｖ）で抽出する。組み合わせた有機部分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮する。得られた残留物を、メタノール（５ｍＬ）でスラリー化し、濾過する。濾過ケーキを、ジクロロメタンで洗浄して、表題化合物（０．５ｇ、５１％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４７】
実施例２
４−（７−｛［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］カルボニル｝−１，２−ベンゾチアゾール−５−イル）−３，５−ジフルオロフェノール塩酸塩
【化１２】
2017531684.tif 000014
メタノール（３００ｍＬ）中の［５−（２，６−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン（９．０ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（３００ｍＬ）との混合物に、１，４−ジオキサン中の４Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、２５℃にて１６時間攪拌する。反応混合物を、真空下で濃縮する。残留物を、メタノール（３×５０ｍＬ）で洗浄して、白色の固体として表題化合物を得る（８．６６ｇ、８８％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １０．７５（ｓ，１Ｈ），９．７２（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），９．２２（ｓ，２Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，２Ｈ），４．３２−４．２５（ｍ，２Ｈ），３．４６−３．５５（ｍ，３Ｈ），３．１３−３．１７（ｍ，１Ｈ），１．２７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）。
【００４８】
実施例３
［５−（２，６−ジフルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノンメタンスルホン酸塩
【化１３】
2017531684.tif 000015
ジクロロメタン（８ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）中の［５−（２，６−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン（９６７．２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２Ｎのメタンスルホン酸の水溶液（１２ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、２５℃にて３０分間攪拌し、減圧下で４０℃にて濃縮して、淡い黄色の固体として表題化合物を得る（１．１８ｇ、９８％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ９．１３（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５５−４．６０（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．６２（ｍ，２Ｈ），３．１４−３．３４（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）。
【００４９】
実施例４
エタン−１，２−ジスルホン酸−［５−（２，６−ジフルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン
【化１４】
2017531684.tif 000016
ジクロロメタン（８ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）中の［５−（２，６−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−１，２−ベンゾチアゾール−７−イル］−［ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］メタノン（９６７．２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に、０．０５Ｎのエタン−１，２−ジスルホン酸の水溶液（２４ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、２５℃にて３０分間攪拌し、減圧下で４０℃にて濃縮して、白色の固体として表題化合物を得る（１．１８ｇ、９９％）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １０．７１（ｓ，１Ｈ），９．３１（ｓ，２Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３３−４．３７（ｍ，２Ｈ），３．３６−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．０２−３．１４（ｍ，２Ｈ），２．５０−２．５２（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）。
【００５０】
下記化合物を、調製１〜７および実施例１〜４で説明されたのと類似する方法において調製することができる。
【００５１】
【表１−１】
2017531684.tif 000017
【表１−２】
2017531684.tif 000018
【表１−３】
2017531684.tif 000019
【表１−４】
2017531684.tif 000020
【００５２】
生物学的アッセイ
相当数の文献による証拠から、腎臓内レニン−アンジオテンシン系が、糖尿病性腎症において重要な役割を果たしていることが示唆されている。ＰＫＣがアンジオテンシンＩＩにより活性化され、糖尿病性腎症のための初期の処置が、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカー（ＡＲＢ）またはそれらの組み合わせによるものであるため、おそらく、ＰＫＣ阻害剤とＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢまたは両方との組み合わせは、糖尿病性腎症を有する患者についての、より効果的な処置の選択肢を提示することができるであろう。
【００５３】
さらに、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢまたは両方との組み合わせにおいて投与された選択的ＰＫＣ−β阻害剤として報告されたルボキシスタウリンの効果が、文献に記載されている。Ｔｕｔｔｌｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｒｕｂｏｘｉｓｔａｕｒｉｎ  ｏｎ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｎｏ．１１：２６８６−２６９０（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５）。同文献では、ルボキシスタウリンが、２型糖尿病および腎症を有するヒトにおけるアルブミン尿および腎機能に望ましい効果を有することが報告された。
【００５４】
したがって、複数のＰＫＣアイソフォーム、すなわち、従来型（ＰＫＣ−βを含む）および／または新規型アイソフォームを阻害する化合物は、特に、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢまたは両方と組み合わせて使用された場合、糖尿病性腎症に有効な処置を提供することができると考えられる。
【００５５】
糖尿病性腎症の罹患は、進行性の腎疾患のための新たな治療剤を発見するための試みの念頭にある。ただし、原理的に種々の形態の糸球体症による非糖尿病性の腎疾患または障害は、透析および移植を必要とする患者数に対する主な寄与要因である。腎疾患のこれらの２つの主な分類の病因は明確に異なるが、それらは、高血圧、タンパク尿（アルブミン）および糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の減退ならびに糸球体硬化症、尿細管間質線維症およびマクロファージ浸潤を含む、主な病因組織学的特徴などの共通する臨床的兆候を共有する。また、数多くの知見から、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）および線維症進行性成長因子の詳細などの糖尿病性および非糖尿病性腎疾患に関連する、共通の病原性メカニズムが示唆されている。まとめると、これらの知見から、糖尿病性の腎臓を標的にするように設計された処置が、非糖尿病環境においても有効である場合がある可能性が浮かび上がってくる。Ｋｅｌｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ−β  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｖｏｌ．２４，１７８２−１７９０（２００９）。したがって、本発明の化合物は、慢性腎疾患を含む腎障害に有効な処置を提供することができると考えられる。
【００５６】
下記アッセイは、本発明の例示された化合物が、アルブミン尿を減少させることによる有効性を証明するＰＫＣの強力な阻害剤であり、複数の糖尿病性合併症を同時に標的とすることにより、糖尿病性腎症により有効な処置を提供する可能性があるＰＫＣの従来型および新規型のアイソフォームの阻害剤であり、好ましくは、Ａｋｔの強力な阻害剤でないことを証明する。
【００５７】
アッセイ１：ＰＫＣアイソフォーム系ＨＴＲＦ  ＫＩＮＥＡＳＥ（商標）−ＳＴＫ  ｊｕｍｂｏアッセイプロトコル
このアッセイの目的は、種々のＰＫＣアイソフォームにおける化合物の阻害活性を評価することである。種々のＰＫＣアイソフォーム（ＰＫＣ−α、−β１／２およびＰＫＣ−δ）により引き起こされる血管細胞のホメオスタシスにおける攪乱が、大きな血管（アテローム硬化症、心筋症）および小さな血管（網膜症、腎症および神経症）の合併症に影響を及ぼす病理の進行に関連することが報告されてきた。Ｇｅｒａｌｄｅｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，Ｇ．Ｌ．，「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，１０６：１３１９−１３３１（２０１０）。このため、複数の従来型および新規型ＰＫＣアイソフォームを阻害する化合物は、複数の糖尿病性合併症を同時に標的にすることにより、糖尿病性腎症により有効な処置の選択肢を提供する可能性がある。
【００５８】
ＰＫＣα、β２、δ、ε、τおよびζのキナーゼ活性における試験化合物の効果は、ＨＴＲＦ  ＫＩＮＥＡＳＥ（商標）−ＳＴＫアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用し、供給元により提供されたプロトコルに従って決定される。この方法は、キナーゼ基質および一般的な検出システムを使用するセリン／スレオニンキナーゼ活性を測定するための一般的な方法である。本プロトコルにおいて、アッセイキット中に提供されたビオチン化ＳＴＫ１は、任意のＰＫＣアイソフォームによりリン酸化され得る基質として使用される。ＨＴＲＦ  ＫＩＮＥＡＳＥ（商標）−ＳＴＫアッセイキットのフォーマットは、以下に記載された２つの工程（酵素工程および検出工程）を含む。まず、キナーゼが、ＡＴＰの存在下において、基質をリン酸化する。第二に、このアッセイキット中に提供された検出試薬が、リン酸化された基質を認識する。検出試薬は、Ｅｕ３＋−クリプテートで標識されたＳＴＫ−抗体と、ストレプトアビジン−ＸＬ６６５とを含む。この抗体は、リン酸化された形態のＳＴＫ基質のみを認識する。ストレプトアビジンは、キナーゼ基質に結合したビオチンに結合する。クリプテートは、エネルギードナーとして機能し、一方、ストレプトアビジンと会合しているＸＬ６６５蛍光体は、アクセプターとして機能する。これらのドナーとアクセプターとの間の物理的接近により、蛍光共鳴エネルギー移動および会合蛍光シグナルがもたらされる。シグナルの強度は、基質のリン酸化レベルに比例する。
【００５９】
スタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ）を、陽性コントロールとして使用することができる。スタウロスポリンを、１０ｍＭのストック溶液になるようにＤＭＳＯ中で調製し、ついで、系列希釈（１０μＭ〜０．００５μＭ）して、１０点希釈曲線を得る。試験化合物を、同様の方法において、最高用量１００μＭで調製する。各化合物を系列希釈して、１０点希釈曲線を得る。
【００６０】
酵素工程に使用される反応系は、反応バッファー、基質および酵素からなる。２種類の反応バッファーを、種々のＰＫＣアイソフォーム用のキナーゼバッファーから調製する。５×キナーゼバッファーが、キットの一部として提供されており、ＨＥＰＥＳ  ２５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、ＮａＮ３  ０．１％、ＢＳＡ  ０．０５％およびオルトバナジウム酸０．５ｍＭからなる。
【００６１】
ＰＫＣαおよびＰＫＣεについては、１．２５×反応バッファーは、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１．２５×キナーゼバッファーからなる。ＰＫＣβ２、ＰＫＣδ、ＰＫＣτおよびＰＫＣζについては、１．３５×反応バッファーは、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＤＴＴ、１．２５ｍＭ  脂質アクチベータ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）および１．２５×キナーゼバッファーを含む。これらのバッファーを、基質混合物および酵素混合物の調製に使用する。基質混合物および酵素混合物は、種々のＰＫＣアイソフォームについて異なる。ＰＫＣαについては、基質混合物は、５０μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素混合物は、３ｎＭ  ＰＫＣαにより表される。ＰＫＣβ２については、基質混合物は、２５μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素は、３．７５ｎＭ  ＰＫＣβ２により表される。ＰＫＣδについては、基質混合物は、６２．５μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素は、３．７５ｎＭ  ＰＫＣδにより表される。ＰＫＣεについては、基質混合物は、２５μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素混合物は、３ｎＭ  ＰＫＣεにより表される。ＰＫＣτについては、基質混合物は、８７．５μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素は、７．５ｎＭ  ＰＫＣτにより表される。ＰＫＣζについては、基質混合物は、１０μＭ  ＡＴＰおよび２．５μＭ  ＳＴＫ１からなる。一方、酵素は、７．５ｎＭ  ＰＫＣζにより表される。
【００６２】
各ＰＫＣアイソフォームについて、５０μＬの反応系を生成するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃマトリクスを使用して、１０μＬの希釈化合物を、希釈プレートからアッセイプレートに移す。ついで、２０μＬの基質混合物を、アッセイプレートに加え（ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ（登録商標）Ｃｏｍｂｉ分注器、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃを使用）、５００ｒｐｍで１分間遠心分離する。最後に、２０μＬの酵素混合物を、アッセイプレートに加えて（ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ（登録商標）を使用）、反応を開始する。このプレートを、プラットフォーム振とう機において、６０秒間振とうし、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。反応系を、室温にて、個々のＰＫＣアイソフォームに固有の種々の期間：ＰＫＣα、ＰＫＣβ２およびＰＫＣεについては３０分間、ＰＫＣδについては４０分間、ＰＫＣτおよびＰＫＣζについては７０分間インキュベートする。
【００６３】
検出工程において、検出混合物には、０．５６２５μＭ  Ｅｕ３＋−クリプテートで標識されたＳＫＴ抗体、０．１５６３μＭ  ストレプトアビジン−ＸＬ６６５およびＥＤＴＡが含まれる。反応系とのインキュベーション後、４０μＬの検出混合物を加える（ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ（登録商標）を使用）ことにより、酵素反応を停止させる。検出混合物は、ＥＤＴＡの存在により、酵素反応を停止させることができる。溶質を、１分間混合し（プラットフォーム振とう機を使用）、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。プレートを、室温にて１時間インキュベートする（光から保護）。ついで、Ｖｉｃｔｏｒ−３を使用して、蛍光を、６２０ｎｍ（クリプレテート）および６６５ｎｍ（ＸＬ６６５）において測定する。各ウェルについて、比を計算する（６６５／６２０）。固有シグナルを、比（サンプル）−比（陰性コントロール）として計算する。ＸＬＦＩＴ（登録商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、データを処理する。
【００６４】
ヒトＰＫＣα、β２、δ、ε、τおよびζ酵素阻害剤アッセイについて基本的に上記されたプロトコルに従って、結果から、本発明の例示された化合物が、異常型ＰＫＣアイソフォームτおよびζと比較して、所望の従来型および新規型のＰＫＣアイソフォームα、β２、δ、εの選択的な阻害を示すことが証明される。例えば、実施例２の化合物はそれぞれ、約１６．６ｎＭ、５１．０ｎＭ、６８．０ｎＭ、２１．９ｎＭ、２０，０００ｎＭ超および１５，５００ｎＭのＩＣ５０を有する。このアッセイにおいて実施例２の化合物と同時に試験したスタウロスポリンは、ＰＫＣα、β２、δ、ε、τおよびζそれぞれについて、約３０．５ｎＭ、７６．１ｎＭ、２７．９ｎＭ、０．８ｎＭ、６９．４ｎＭ、および１４１．９ｎＭのＩＣ５０を有する。
【００６５】
アッセイ２：ＰＫＣ阻害の細胞系アッセイ
このアッセイの目的は、ＰＫＣ基質のリン酸化レベルを測定することにより、細胞系システムでのＰＫＣにおける試験化合物の阻害効果を試験することである。
【００６６】
スタウロスポリンを、陽性コントロールとして使用することができる。スタウロスポリンを、１０ｍＭのストック溶液になるようにＤＭＳＯ中で調製し、ついで、プレーンなＲＰＭＩ１６４０培養培地中で系列希釈（１０μＭ〜０．０００５μＭ）して、１０点希釈曲線を得る。試験化合物を、同様の方法において調製する。
【００６７】
ＴＨＰ−１細胞（ヒトマクロファージ細胞株）を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−２０２  ｌｏｔ４０２８５４２）から得る。細胞を、ポリ−ｄ−リジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートした９６ウェルプレートにおいて、播種密度４０００個の細胞／ウェルで、１％  ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養する。細胞を、１０μＭ〜０．０００５μＭの範囲にわたって、１０点の１：３希釈で投与する試験化合物、および、終濃度０．２％のＤＭＳＯにより、ＰＫＣ刺激前に、３７℃にて１．５時間処理する。「刺激」は、外因性刺激によるＰＫＣ活性化を意味する。ＰＫＣを、２０ｎＭのホルボール−１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ１５８５）で、３７℃にて３０分間刺激する。
【００６８】
インキュベーション後、まず、細胞を、Ｐｒｅｆｅｒ固定剤（ＡＮＡＴＥＣＨ  ＬＴＤ）中に室温にて３０分間固定する。ついで、固定剤を吸引する。Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＰＢＳ中の０．１％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を、５０μＬ／ウェルで加えて、細胞を透過性にする。細胞を、室温にて１５分間透過性処理する。プレートを、ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で２回洗浄する。一次抗体溶液を、５０μＬ／ウェルで加える。細胞を、一次抗体と、４℃にて一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ついで、標識された二次抗体と共に、室温にて１時間インキュベートする。一次抗体は、抗ホスホ（セリン）ＰＫＣ基質ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であり、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：１０００希釈されている。二次抗体は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８  ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であり、ＰＢＳ中に１：１０００希釈されている。プレートを、ＰＢＳで洗浄する。核を、５０μＬの１５μＭ  ヨウ化プロピジウム溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）および５０μｇ／ｍＬ  リボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で、室温にて１時間対比染色する。プレートを、ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザスキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ）により、４８８ｎｍのレーザ励起でスキャンし、６５５ｎｍ〜７０５ｎｍにおいて、細胞数／ウェルのための蛍光発光（ＤＮＡに結合したヨウ化プロピジウムの発光）、および、細胞中のリン酸化ＰＫＣ基質に結合している抗体の５０５ｎｍ〜５３０ｎｍにおける蛍光の発光を検出する。主なアッセイ出力は、リン酸化ＰＫＣ基質の総蛍光と総細胞数との比（比＝総強度／総細胞数）である。この比を使用して、用量応答およびＩＣ５０を計算する。
【００６９】
ヒトＴＨＰ−１細胞中でのＰＫＣ基質のリン酸化を決定することについて基本的に上記されたプロトコルに従って、本発明の例示された化合物は、この細胞中でのＰＫＣ阻害効果を証明している。ここで、大部分は、１以下の絶対ＩＣ５０（μＭ）を有する。例えば、実施例２の化合物は、約０．８０μＭのＩＣ５０を有する。このアッセイにおいて試験したスタウロスポリンは、約０．０１１μＭのＩＣ５０を有する（実施例２の化合物と共に行った）。
【００７０】
アッセイ３：ＰＫＣのｉｎ  ｖｉｖｏ標的阻害アッセイ
このアッセイの目的は、血球中でのＰＫＣ基質のリン酸化における試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の効果を評価することである。
【００７１】
プレクストリンは、ＰＫＣタンパク質基質の１つであり、主に血小板および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において発現される。プレクストリンのリン酸化は、ＰＫＣ活性に比例する。マウス血液から精製された血小板およびＰＢＭＣにおけるプレクストリンタンパク質のリン酸化状態を、リン酸化ＰＫＣ基質に特異的な一次抗体を使用するウェスタンブロットにより分析する。この抗体は、複数のリン酸化ＰＫＣ基質を認識する。同基質としては、ｐ−プレクストリンが挙げられるが、これに限定されない。ｐ−プレクストリンのバンドは、その分子量に基づいて特定される。
【００７２】
オスのＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、１％  ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０中に均一化された、０．３〜３ｍｇ／ｍＬの濃度範囲における試験化合物を経口強制摂取により投与した。用量に応じて、投与量は、１０ｍｌ／ｋｇ体重とする。同じ媒体に溶解させたスタウロスポリンを、アッセイが機能していることを実証するために、陽性コントロールとして使用することができる。マウスを、処置後２時間で、ＣＯ２窒息により犠牲にし、血液を、心臓穿孔により収集する。血液を、ＥＤＴＡ抗凝集剤ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤であるＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、＃１８３６１７０）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ２８５０）およびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６）で処理する。
【００７３】
血小板を、マウス血液から、２００×ｇで４分間の低速度スピンにより調製する。血小板リッチ血漿を取り出し、エッペンドルフチューブに移す。ついで、同チューブを、１，４００×ｇで５分間スピンする。血小板ペレットを、少量の溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、＃１８３６１７０）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ２８５０）およびＰｈｏｓｐｈａｔａｚｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６））中に懸濁させ、更なる分析まで凍結させる。残りの血液を混合し、ＢＤ  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にアプライして、１，６００〜１，８００×ｇで２０〜２５分間での遠心分離により、ＰＢＭＣを精製する。ＰＢＭＣのバンドを、ピペットで回収し、ｐＨ７．５のバッファーで希釈し、１，４００×ｇで５分間スピンダウンし、少量の溶解バッファー中に懸濁させ、更なる分析まで凍結させる。タンパク質を、細胞と溶解バッファーとのインキュベーションにより得る。
【００７４】
１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、細胞溶解物（３０μｇのタンパク質をレーン当たりにロードする）について、１３０Ｖで９０分間行う。トランスファー後、ニトロセルロースメンブランを、ウサギポリクローナル抗ホスホ−ＰＫＣ基質抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）と共にインキュベートする。このメンブランを洗浄し、二次コンジュゲート蛍光抗ウサギ抗体（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートする。このメンブランを、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）赤外画像化システム（ＬＩ−ＣＯＲ）によりスキャンする。ゲル中のホスホ−プレクストリンのバンドを、分子量マーカータンパク質に対するゲル中でのその相対的な移動により、および、（選択された場合には）ホスホプロテオミクス解析により特定する。近赤外蛍光の強度は、ＰＫＣ基質のリン酸化レベルに比例する。この蛍光強度を、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ソフトウェアにより定量する。用量応答実験について、光学密度値（ｙ）を平均化し、用量値（ｘ）に対してプロットして、ＩＤ５０を生成する。
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＫＣによりプレクストリンのリン酸化を決定することについて基本的に上記されたプロトコルに従って、実施例２の化合物は、血小板について、約１１．８５ｍｇ／ｋｇのＩＤ５０を有し、ＰＢＭＣについて、約１８．０３ｍｇ／ｋｇのＩＤ５０を有する。この結果から、実施例２がｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＫＣ基質のリン酸化における阻害効果を有することが証明される。
【００７６】
アッセイ４：糖尿病性腎症の動物モデルにおける有効性
このアッセイの目的は、糖尿病性腎症のマウスモデルにおける化合物の有効性を分析することである。糖尿病性腎症の最初期の臨床的兆候は、尿中へのアルブミンの漏出であるアルブミン尿である。糖尿病性腎症は何らの兆候も無しに起こり得るため、初期の診断は、処置を開始し得るのに重要である。糖尿病性腎症の初期診断に重要な試験は、アルブミン尿の存在をチェックすることを含む。このため、化合物が糖尿病患者における尿中のアルブミンレベルを低下させた場合、おそらく、糖尿病性腎症の処置における化合物の有効性を示すであろう。
【００７７】
糖尿病性腎症をモデル化するために、遺伝的に生じる２型糖尿病および一側腎摘出の組み合わせを利用する。６週齢のｄｂ／ｄｂマウス（遺伝的系統：Ｃ５７  ＢＬ  ＫｓＪ、ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）に、標準的なげっ歯類用の食餌および水を自由に取らせる。左側の腎臓を、０．６％  ペントバルビタールナトリウムによる、６０ｍｇ／ｋｇ体重（１０μＬ／ｇ  ｉ．ｐ．）での麻酔下において摘出する。手術後７日で、アルブミン尿レベルを測定するために、尿を、代謝ケージ中において２４時間収集する。グルコースレベルを決定するために、血液を、尾の切断により収集する。化合物処置について、動物を、２４時間でのアルブミン尿、血中グルコースおよび体重に基づいてランダム化する。試験化合物を、４％  ＤＭＳＯ（水溶液）中に溶解させ、経口強制摂取により、１日二回投与する。コントロール群および処置群はそれぞれ、１０匹のマウスからなる。コントロール群を、同様の方法において、媒体（４％  ＤＭＳＯ）により処置する。処置期間中、アルブミン尿を、月１回分析する。処置後２か月で、血液を、イソフルオラン麻酔下において、心臓穿孔により収集する。心臓を摘出することにより、マウスを安楽死させる。
【００７８】
ｄｂ／ｄｂマウスにおけるアルブミン尿の減少を決定することについて基本的に上記されたプロトコルに従って、実施例２の化合物は、約２５．３３ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有する。具体的には、３０ｍｇ／ｋｇの用量において、（２４時間の間収集した）尿中のアルブミンの実平均レベルは、８５．０±６．９μｇ（ｎ＝１２）であった。一方、媒体処置マウスの尿中では、同平均レベルは、１３５．９±１４．３μｇ（ｎ＝１２）であった。この結果から、実施例２の化合物は、糖尿病性腎症の動物モデルにおいて、マウスの尿中のアルブミンレベルを低下させることが証明される。
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月24日(2017.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2017531684.tif 000031
（式中、
Ａは、
【化２】
2017531684.tif 000032
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、フルオロ、クロロ、メチル、またはシアノであり、Ｒ１またはＲ２の内の少なくとも一方は水素ではなく、
Ｚは、
【化３】
2017531684.tif 000033
であり、
Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはメチルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、水素またはメチルであるか、あるいは、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している炭素と一緒になって、シクロプロピルを形成しており、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、またはＲ１０の内の少なくとも一つは、水素ではない）
またはその塩。
【請求項２】
Ａが、
【化４】
2017531684.tif 000034
である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
Ｒ２がフルオロである、請求項１または２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
Ａが、
【化５】
2017531684.tif 000035
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
Ｚが、
【化６】
2017531684.tif 000036
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
Ｚが、
【化７】
2017531684.tif 000037
である、請求項５に記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
Ｚが、
【化８】
2017531684.tif 000038
である、請求項６に記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
【化９】
2017531684.tif 000039
である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物の塩酸塩、メタンスルホン酸塩、またはヘミエタン−１，２−ジスルホン酸塩。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物またはその塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
１つ以上の更なる治療剤を更に含む、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腎障害の治療に使用するための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記腎障害が慢性腎疾患である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記腎障害が糖尿病性腎症である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
糖尿病性合併症の治療に使用するための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記糖尿病性合併症が、アテローム硬化症、心筋症、網膜症、腎症、および神経障害からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2017531684.tif 000040
2017531684.tif 000041
2017531684.tif 000042