(57)【要約】本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号１５３１２９）の活性を調節することにより細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性を調節する化合物を特定する方法、および、ｍＴＯＲＣ１の調節におけるかかる特定された化合物の使用およびｍＴＯＲＣ１の異常活性によって特徴づけられる病気および疾患の治療に関する。本発明は、ｍＴＯＲＣ１の調節経路の重要な成分として、および薬理学的に操作できる経路中の推定的なアミノ酸センサーとして、ＳＬＣ３８Ａ９のタンパク質イソ型を特定し、ｍＴＯＲＣ１の活性化の選択的な調節をもたらすことによってこの問題を解決する。
2017525936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、ｍＴＯＲＣ１の活性の調節剤を特定する方法：
（ａ）試験化合物をＳＬＣ３８Ａ９．１、またはＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を有する、その断片または変異体に接触させるステップ；
（ｂ）前記試験化合物の存在下において、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を測定するステップ；および
（ｃ）前記測定された活性または特性を、前記試験化合物の不存在下における同じ活性または特性と比較し、それによって前記試験化合物がＳＬＣ３８Ａ９の調節剤であるかどうかを決定するステップ。
【請求項２】
前記試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０、または配列番号１のアミノ酸１〜１１９、またはＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む融合タンパク質、および異種融合パートナーと接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種融合パートナーは、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、Ｎ末端ポリＨｉｓタグ、エピトープタグ、リガンドタグ、ＮまたはＣ末端原形質膜シグナル配列、蛍光ポリペプチド、または発光ポリペプチドから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、アミノ酸を、膜を透過して移動させる能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、一つまたはそれ以上のＲａｇｕｌａｔｏｒまたはＲａｇＧＴＰａｓｅの成分と結合する能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞を、ＳＬＣ３８Ａ９のレベルまたは活性を調節する薬剤または組成物と接触させることを含む、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節する方法。
【請求項７】
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を増加させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を減少させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする患者においてｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤を前記患者に投与し、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるステップを含む前記方法。
【請求項１０】
ｍＴＯＲＣ１の活性の減少を必要とする患者ににおいてｍＴＯＲＣ１の活性を減少させる方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤を前記患者に投与し、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるステップを含む前記方法。
【請求項１１】
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を増加させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤の有効量を対象に対して投与し、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを含む前記方法。
【請求項１２】
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を減少させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤の有効量を前記対象に対して投与し、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／０９５，５１２号、および２０１４年５月２日出願の米国仮特許出願第６１／９８７，７６９号の利益を請求し、その全体の教示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｒ０１ＣＡ１２９１０５、Ｒ０１ＣＡ１０３８６６、およびＲ０１ＡＩ０４７３８９の下において、米国国立衛生研究所によって授与された政府の支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。    
【０００３】
本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号１５３１２９）の活性を調節することにより細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性を調節する化合物を特定する方法、および、ｍＴＯＲＣ１の調節におけるかかる特定された化合物の使用およびｍＴＯＲＣ１の異常活性によって特徴づけられる病気および疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳類（機構的）ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）は、栄養素、成長因子およびストレス因子に応答する細胞、器官および生命体の成長の主要な調節機構である。ｍＴＯＲは、セリンまたはスレオニンキナーゼであり、少なくとも二つの明確に区別できる複合体であるｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）の核となる。ｍＴＯＲＣ１の活性は、部分的にアミノ酸によって調節される。活性化された場合、ｍＴＯＲＣ１は、ｍＲＮＡ翻訳のような同化作用を促進し、およびその下流の基質の活性を通じた自食作用のような異化作用を阻害して細胞の成長を刺激できる。しかし、ｍＴＯＲＣ１の異常活性化は、癌、代謝機能障害（例えば、２型糖尿病、病的肥満）、自己免疫疾患（例えば、乾癬）、および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、およびパーキンソン病）、神経精神病学的症候群（例えば、自閉症および大きなうつ病性障害）、骨格筋機能障害（例えば、サルコペニア、病気によって誘発された悪液質および非活動性萎縮）、さらには、（遺伝性および後天性ミトコンドリア機能障害（例えば、リー脳症）およびある種の遺伝性成長異常から生じる病気を含むいくつかの稀な病気の複数のタイプを含む広範な病気において観察されている。
【０００５】
アミノ酸がｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達を調節するメカニズムは複雑であり、リソソームが中心的役割を果たしている。アミノ酸が豊富にある条件下では、アミノ酸は原形質膜を透過して、リソソーム内腔内に蓄積する。さらに、リソソームのプロテアーゼおよびペプチダーゼによるリソソーム内腔のタンパク質の分解も、リソソーム内のアミノ酸の蓄積に寄与し、ｍＴＯＲＣ１の活性化をもたらすことができる。ｍＴＯＲＣ１は、リソソーム膜に動員され、そこでＲａｇＡまたはＲａｇＢとＲａｇＣまたはＲａｇＤの偏性ヘテロ二量体であるＲａｇＧＴＰａｓｅと相互に作用する。このＲａｇＧＴＰａｓｅヘテロ二量体は、この複合体をこのリソソームに繋ぐ脂質アンカーを含んでいない。その代わり、このＲａｇＧＴＰａｓｅヘテロ二量体は、リソソーム膜にリソソーム局在化のためのＲａｇｕｌａｔｏｒ成分ＬＡＭＴＯＲＩ（ｐ１８）の脂質付加によって繋がれた、五量体Ｒａｇｕｌａｔｏｒ複合体に依存する。さらに、ＬＡＭＴＯＲ１とともに組み立てられているこのＲａｇｕｌａｔｏｒ成分ＬＡＭＴＯＲ  ２−５（それぞれ、ｐ１４、ＭＰ１、Ｃ７またはｆ５９およびＨＢＸＩＰ）は、ＧＴＰの充填を助長して、ＲａｇＡおよびＲａｇＢのためのグアニンヌクレオチド交換因子としての機能を果たす。その結果、Ｒａｇｕｌａｔｏｒは、ＲａｇＧＴＰａｓｅヘテロ二量体をリソソームの表面に局在化させるのに必要なだけでなく、このＲａｇＡまたはＢの活性化されたヌクレオチド結合状態に触媒作用を及ぼすのにも必要である。アミノ酸の有効性に敏感な追加のタンパク質複合体は、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇ複合体の活性を調節するものと特定されたが、個々のアミノ酸がｍＴＯＲＣ１の経路によって物理的に感知される正確なメカニズムは解明されていない。
【０００６】
ロイシンおよびアルギニンが、ｍＴＯＲＣ１を活性化するのに果たす知られた役割を考慮すると、我々は、ロイシンおよびアルギニンをリソソームにおいて特に感知し、それに応じてｍＴＯＲＣ１の上流においてリソソーム機構を活性化することができるタンパク質が存在するという仮説を立てた。我々は、プロテオミクスおよび生化学的手法によって、このようなタンパク質を特定しようとした。
【０００７】
同化作用およびある種の病状の両者におけるｍＴＯＲＣ１の調節の重要性を考えると、調節の潜在的標的としてｍＴＯＲＣ１の活性化経路の他のメンバーを特定する必要性があり、このことは、次にｍＴＯＲＣ１の活性を調節できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ｍＴＯＲＣ１の調節経路の重要な成分として、および薬理学的に操作できる経路中の推定的なアミノ酸センサーとして、ＳＬＣ３８Ａ９のタンパク質イソ型を特定し、ｍＴＯＲＣ１の活性化の選択的な調節をもたらすことによってこの問題を解決する。
【０００９】
本明細書におけるある特定の実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性の調節物質を特定する方法が開示され、そのような方法は、（ａ）試験化合物をＳＬＣ３８Ａ９．１、またはＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を有する、その断片または変異体に接触させるステップと、（ｂ）前記試験化合物の存在下において、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を測定するステップと、（ｃ）測定された活性または特性を、試験化合物の不存在下における同じ活性または特性と比較し、それによって前記試験化合物がＳＬＣ３８Ａ９の調節物質であるかどうかを決定するステップを含む  。
【００１０】
ある特定の態様においては、前記試験化合物を、ＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０、または配列番号１のアミノ酸１〜１１９またはＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１−１１９を含む融合タンパク質、および異種融合パートナーと接触させる。ある特定の実施形態においては、当該異種融合パートナーは、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、Ｎ末端ポリＨｉｓタグ、エピトープタグ、リガンドタグ、ＮまたはＣ末端原形質膜シグナル配列、蛍光ポリペプチド、または発光ポリペプチドから選択される。
【００１１】
ある特定の実施形態においては、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性とは、アミノ酸を、膜を透過して移動させる能力である。  ある特定の実施形態においては、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性とは、一つまたはそれ以上のＲａｇｕｌａｔｏｒまたはＲａｇＧＴＰａｓｅの成分と結合する能力である。
【００１２】
本明細書においては、細胞を、ＳＬＣ３８Ａ９のレベルまたは活性を調節する薬剤または組成物と接触させることを含む、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節する方法も開示する。ある特定の態様においては、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を増加させることを含む。ある特定の実施形態においては、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を減少させることを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする患者においてｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法も開示し、かかる方法は、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤を、その患者に投与し、よってその患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるステップを含む。
【００１４】
さらに他の実施形態においては、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤を、ｍＴＯＲＣ１の活性の減少を必要とする患者に投与し、よってその患者のｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるステップを含む、その患者のｍＴＯＲＣ１の活性を減少させる方法を開示する。
【００１５】
本明細書では、患者におけるｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を増加させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法を開示し、かかる方法は、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤の有効量をその対象に対して投与し、よってその病気、疾患、または障害を治療することを含む。
【００１６】
ある特定の態様においては、患者のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を減少させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法を開示し、当該方法は、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤の有効量をその対象に対して投与し、よってその病気、疾患、または障害を治療することを含む。
【００１７】
上で論じられた特長、および本発明の多くの他の特長および付随的な利点は、以下の発明の詳細な説明を参照することによってより理解が深まるであろう。
【００１８】
本特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラーの図面を含むこの特許公報または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いがあれば本庁が交付する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、種々のＦＬＡＧタグ付きタンパク質で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物の免疫ブロットを描いている。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、発現ベクター中の指示されたｃＤＮＡで形質移入され、溶解物が調製された。この溶解物の一部は、ＦＬＡＧ免疫沈降を受けた。この細胞溶解物およびこの細胞溶解物からのＦＬＡＧ免疫沈降されたタンパク質の両者は、指示されたタンパク質のために免疫ブロットされた。図１Ａは、完全長ＳＬＣ３８Ａ９.１またはそのＮ末端領域と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからのＳＬＣ３８Ａ９.１相同体Ｆ１３Ｈ１０．３を有するＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅとの相互作用に必要な、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域の一部の列、さらには、かかる相互作用（下向き矢印）に必要な、主要アミノ酸残基、さらには、ＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９.１の種々のＮ末端変異体と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１とｖ−ＡＴＰａｓｅ成分であるＶ０ｄ１およびＶ１Ｂ２の相互作用を描いている。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、種々のＦＬＡＧタグ付きタンパク質で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物の免疫ブロットを描いている。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、発現ベクター中の指示されたｃＤＮＡで形質移入され、溶解物が調製された。この溶解物の一部は、ＦＬＡＧ免疫沈降を受けた。この細胞溶解物およびこの細胞溶解物からのＦＬＡＧ免疫沈降されたタンパク質の両者は、指示されたタンパク質のために免疫ブロットされた。図１Ａは、完全長ＳＬＣ３８Ａ９.１またはそのＮ末端領域と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからのＳＬＣ３８Ａ９.１相同体Ｆ１３Ｈ１０．３を有するＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅとの相互作用に必要な、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域の一部の列、さらには、かかる相互作用（下向き矢印）に必要な、主要アミノ酸残基、さらには、ＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９.１の種々のＮ末端変異体と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１とｖ−ＡＴＰａｓｅ成分であるＶ０ｄ１およびＶ１Ｂ２の相互作用を描いている。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、種々のＦＬＡＧタグ付きタンパク質で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物の免疫ブロットを描いている。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、発現ベクター中の指示されたｃＤＮＡで形質移入され、溶解物が調製された。この溶解物の一部は、ＦＬＡＧ免疫沈降を受けた。この細胞溶解物およびこの細胞溶解物からのＦＬＡＧ免疫沈降されたタンパク質の両者は、指示されたタンパク質のために免疫ブロットされた。図１Ａは、完全長ＳＬＣ３８Ａ９.１またはそのＮ末端領域と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからのＳＬＣ３８Ａ９.１相同体Ｆ１３Ｈ１０．３を有するＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅとの相互作用に必要な、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域の一部の列、さらには、かかる相互作用（下向き矢印）に必要な、主要アミノ酸残基、さらには、ＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９.１の種々のＮ末端変異体と、内因性Ｒａｇｕｌａｔｏｒ（ｐ１８およびｐ１４）およびＲａｇＡおよびＲａｇＣＧＴＰａｓｅとの相互作用を描いている。図１Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１とｖ−ＡＴＰａｓｅ成分であるＶ０ｄ１およびＶ１Ｂ２の相互作用を描いている。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９.１およびリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−２の局在化に対するアミノ酸の効果、さらにはｍＴＯＲＣ１およびＳＬＣ３８Ａ９の生産に対するアミノ酸の効果を描いている。図２Ａは、安定的にＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９.１を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１およびリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−２の局在化に対するアミノ酸の効果を示す免疫染色を描いている。図２Ｂは、指示された短ヘアピンＲＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１およびＳＬＣ３８Ａ９の生産に対するアミノ酸の効果を描く免疫ブロットを描いている。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９.１およびリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−２の局在化に対するアミノ酸の効果、さらにはｍＴＯＲＣ１およびＳＬＣ３８Ａ９の生産に対するアミノ酸の効果を描いている。図２Ａは、安定的にＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９.１を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１およびリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−２の局在化に対するアミノ酸の効果を示す免疫染色を描いている。図２Ｂは、指示された短ヘアピンＲＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１およびＳＬＣ３８Ａ９の生産に対するアミノ酸の効果を描く免疫ブロットを描いている。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質をコードするレンチウイルスで形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のｍＴＯＲＣ１の成分に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図３Ａは、（対照としての）ｍｅｔａｐ２またはＳＬＣ３８Ａ９.１を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図３Ｂは、ｍｅｔａｐ２、リソソームマーカータンパク質ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  Ｉ６８Ａを発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｄは、ｍｅｔａｐ２、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質をコードするレンチウイルスで形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のｍＴＯＲＣ１の成分に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図３Ａは、（対照としての）ｍｅｔａｐ２またはＳＬＣ３８Ａ９.１を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図３Ｂは、ｍｅｔａｐ２、リソソームマーカータンパク質ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  Ｉ６８Ａを発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｄは、ｍｅｔａｐ２、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質をコードするレンチウイルスで形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のｍＴＯＲＣ１の成分に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図３Ａは、（対照としての）ｍｅｔａｐ２またはＳＬＣ３８Ａ９.１を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図３Ｂは、ｍｅｔａｐ２、リソソームマーカータンパク質ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  Ｉ６８Ａを発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｄは、ｍｅｔａｐ２、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質をコードするレンチウイルスで形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のｍＴＯＲＣ１の成分に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図３Ａは、（対照としての）ｍｅｔａｐ２またはＳＬＣ３８Ａ９.１を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図３Ｂは、ｍｅｔａｐ２、リソソームマーカータンパク質ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  Ｉ６８Ａを発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図３Ｄは、ｍｅｔａｐ２、またはＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９．１とＲａｇｕｌａｔｏｒとＲａｇＧＴＰａｓｅ間の相互作用に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図４Ａは、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分ｐ１４またはｐ１８を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図４Ｂは、ｍｅｔａｐ２、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、ＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図４Ｃは、指示されたＲａｇＢおよび／またはＲａｇＣ変異体で形質移入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の内因性ＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒの成分との結合に対する、ＲａｇＢおよびＲａｇＣの種々の変異体の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９．１とＲａｇｕｌａｔｏｒとＲａｇＧＴＰａｓｅ間の相互作用に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図４Ａは、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分ｐ１４またはｐ１８を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図４Ｂは、ｍｅｔａｐ２、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、ＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図４Ｃは、指示されたＲａｇＢおよび／またはＲａｇＣ変異体で形質移入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の内因性ＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒの成分との結合に対する、ＲａｇＢおよびＲａｇＣの種々の変異体の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｂは、指示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９．１とＲａｇｕｌａｔｏｒとＲａｇＧＴＰａｓｅ間の相互作用に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。図４Ａは、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分ｐ１４またはｐ１８を発現している細胞中のアミノ酸、さらにはロイシンおよびアルギニンの効果を描いている。図４Ｂは、ｍｅｔａｐ２、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、ＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９またはＳＬＣ３８Ａ９.２を発現している細胞中のアミノ酸の効果を描いている。図４Ｃは、指示されたＲａｇＢおよび／またはＲａｇＣ変異体で形質移入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の内因性ＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒの成分との結合に対する、ＲａｇＢおよびＲａｇＣの種々の変異体の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、ｍＴＯＲＣ１の経路の誘発活性化の障害を描く、アルギニンおよび関連する免疫ブロットの実験結果を描いている。図５Ａは、ＳＬＣ３８Ａ９.１を含むプロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの継時的摂取を描いている。図５Ｂ、左図は、固定［３Ｈ］アルギニン濃度（０．５μＭ）および増加された非標識アルギニン濃度の下における［３Ｈ］アルギニン摂取の時間経過を描いている。図５Ｂ、右図は、合計アルギニン濃度の関数として、左図から計算された速度を描いている。データは、マイケリス-メントン方程式に当てはめられた。図５Ｃは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンを１．５時間与えた後の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームの継時的流出を描いている。図５Ｄは、１００ｍＭの指示された非標識アミノ酸を使って、ＳＬＣ３８Ａ９.１による、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンの輸送の競合を描いている。図５Ａ〜５Ｄのエラーバーは、最低３回の測定から得られた標準偏差を表している。図５Ｅは、ＳＬＣ３８Ａ９を含まないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および陰性対象細胞（ｓｇＡＡＶＳ１＿１）におけるｍＴＯＲＣ１経路のロイシンまたはアルギニン誘発活性化の障害を描いた一連の免疫ブロットである。細胞は、指示されたアミノ酸を５０分間与えられず、その後、この指示されたアミノ酸濃度を用いて１０分間刺激された。ＲＰＭＩのロイシンおよびアルギニン濃度は、それぞれ３８１μＭおよび１．１４ｍＭである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、ｍＴＯＲＣ１の経路の誘発活性化の障害を描く、アルギニンおよび関連する免疫ブロットの実験結果を描いている。図５Ａは、ＳＬＣ３８Ａ９.１を含むプロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの継時的摂取を描いている。図５Ｂ、左図は、固定［３Ｈ］アルギニン濃度（０．５μＭ）および増加された非標識アルギニン濃度の下における［３Ｈ］アルギニン摂取の時間経過を描いている。図５Ｂ、右図は、合計アルギニン濃度の関数として、左図から計算された速度を描いている。データは、マイケリス-メントン方程式に当てはめられた。図５Ｃは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンを１．５時間与えた後の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームの継時的流出を描いている。図５Ｄは、１００ｍＭの指示された非標識アミノ酸を使って、ＳＬＣ３８Ａ９.１による、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンの輸送の競合を描いている。図５Ａ〜５Ｄのエラーバーは、最低３回の測定から得られた標準偏差を表している。図５Ｅは、ＳＬＣ３８Ａ９を含まないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および陰性対象細胞（ｓｇＡＡＶＳ１＿１）におけるｍＴＯＲＣ１経路のロイシンまたはアルギニン誘発活性化の障害を描いた一連の免疫ブロットである。細胞は、指示されたアミノ酸を５０分間与えられず、その後、この指示されたアミノ酸濃度を用いて１０分間刺激された。ＲＰＭＩのロイシンおよびアルギニン濃度は、それぞれ３８１μＭおよび１．１４ｍＭである。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは、ｍＴＯＲＣ１の経路の誘発活性化の障害を描く、アルギニンおよび関連する免疫ブロットの実験結果を描いている。図５Ａは、ＳＬＣ３８Ａ９.１を含むプロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの継時的摂取を描いている。図５Ｂ、左図は、固定［３Ｈ］アルギニン濃度（０．５μＭ）および増加された非標識アルギニン濃度の下における［３Ｈ］アルギニン摂取の時間経過を描いている。図５Ｂ、右図は、合計アルギニン濃度の関数として、左図から計算された速度を描いている。データは、マイケリス-メントン方程式に当てはめられた。図５Ｃは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンを１．５時間与えた後の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームの継時的流出を描いている。図５Ｄは、１００ｍＭの指示された非標識アミノ酸を使って、ＳＬＣ３８Ａ９.１による、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンの輸送の競合を描いている。図５Ａ〜５Ｄのエラーバーは、最低３回の測定から得られた標準偏差を表している。図５Ｅは、ＳＬＣ３８Ａ９を含まないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および陰性対象細胞（ｓｇＡＡＶＳ１＿１）におけるｍＴＯＲＣ１経路のロイシンまたはアルギニン誘発活性化の障害を描いた一連の免疫ブロットである。細胞は、指示されたアミノ酸を５０分間与えられず、その後、この指示されたアミノ酸濃度を用いて１０分間刺激された。ＲＰＭＩのロイシンおよびアルギニン濃度は、それぞれ３８１μＭおよび１．１４ｍＭである。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、ｍＴＯＲＣ１の経路の誘発活性化の障害を描く、アルギニンおよび関連する免疫ブロットの実験結果を描いている。図５Ａは、ＳＬＣ３８Ａ９.１を含むプロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの継時的摂取を描いている。図５Ｂ、左図は、固定［３Ｈ］アルギニン濃度（０．５μＭ）および増加された非標識アルギニン濃度の下における［３Ｈ］アルギニン摂取の時間経過を描いている。図５Ｂ、右図は、合計アルギニン濃度の関数として、左図から計算された速度を描いている。データは、マイケリス-メントン方程式に当てはめられた。図５Ｃは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンを１．５時間与えた後の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームの継時的流出を描いている。図５Ｄは、１００ｍＭの指示された非標識アミノ酸を使って、ＳＬＣ３８Ａ９.１による、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンの輸送の競合を描いている。図５Ａ〜５Ｄのエラーバーは、最低３回の測定から得られた標準偏差を表している。図５Ｅは、ＳＬＣ３８Ａ９を含まないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および陰性対象細胞（ｓｇＡＡＶＳ１＿１）におけるｍＴＯＲＣ１経路のロイシンまたはアルギニン誘発活性化の障害を描いた一連の免疫ブロットである。細胞は、指示されたアミノ酸を５０分間与えられず、その後、この指示されたアミノ酸濃度を用いて１０分間刺激された。ＲＰＭＩのロイシンおよびアルギニン濃度は、それぞれ３８１μＭおよび１．１４ｍＭである。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、ｍＴＯＲＣ１の経路の誘発活性化の障害を描く、アルギニンおよび関連する免疫ブロットの実験結果を描いている。図５Ａは、ＳＬＣ３８Ａ９.１を含むプロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの継時的摂取を描いている。図５Ｂ、左図は、固定［３Ｈ］アルギニン濃度（０．５μＭ）および増加された非標識アルギニン濃度の下における［３Ｈ］アルギニン摂取の時間経過を描いている。図５Ｂ、右図は、合計アルギニン濃度の関数として、左図から計算された速度を描いている。データは、マイケリス-メントン方程式に当てはめられた。図５Ｃは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンを１．５時間与えた後の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームの継時的流出を描いている。図５Ｄは、１００ｍＭの指示された非標識アミノ酸を使って、ＳＬＣ３８Ａ９.１による、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンの輸送の競合を描いている。図５Ａ〜５Ｄのエラーバーは、最低３回の測定から得られた標準偏差を表している。図５Ｅは、ＳＬＣ３８Ａ９を含まないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および陰性対象細胞（ｓｇＡＡＶＳ１＿１）におけるｍＴＯＲＣ１経路のロイシンまたはアルギニン誘発活性化の障害を描いた一連の免疫ブロットである。細胞は、指示されたアミノ酸を５０分間与えられず、その後、この指示されたアミノ酸濃度を用いて１０分間刺激された。ＲＰＭＩのロイシンおよびアルギニン濃度は、それぞれ３８１μＭおよび１．１４ｍＭである。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅが、種々のＦＬＡＧタグ付きのタンパク質を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域に特異的に結合することを示す免疫ブロットを描いている。図６Ａは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ７（ＳＬＣ３８Ａ９と同じファミリーからの、既知のリソソーム輸送体）およびＳＬＣ３６Ａ１（ｍＴＯＲＣ１の調節に関係していると考えられる、既知のリソソーム膜タンパク質）との相互作用を描いている。図６Ｂは、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、およびＳＬＣ３８Ａ９.２との相互作用を描いている。図６Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０、ＳＬＣ３８Ａ９.４、およびＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９との相互作用を描いている。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅが、種々のＦＬＡＧタグ付きのタンパク質を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域に特異的に結合することを示す免疫ブロットを描いている。図６Ａは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ７（ＳＬＣ３８Ａ９と同じファミリーからの、既知のリソソーム輸送体）およびＳＬＣ３６Ａ１（ｍＴＯＲＣ１の調節に関係していると考えられる、既知のリソソーム膜タンパク質）との相互作用を描いている。図６Ｂは、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、およびＳＬＣ３８Ａ９.２との相互作用を描いている。図６Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０、ＳＬＣ３８Ａ９.４、およびＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９との相互作用を描いている。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅが、種々のＦＬＡＧタグ付きのタンパク質を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域に特異的に結合することを示す免疫ブロットを描いている。図６Ａは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ７（ＳＬＣ３８Ａ９と同じファミリーからの、既知のリソソーム輸送体）およびＳＬＣ３６Ａ１（ｍＴＯＲＣ１の調節に関係していると考えられる、既知のリソソーム膜タンパク質）との相互作用を描いている。図６Ｂは、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、およびＳＬＣ３８Ａ９.２との相互作用を描いている。図６Ｃは、ｍｅｔａｐ２、ＬＡＭＰ１、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０、ＳＬＣ３８Ａ９.４、およびＳＬＣ３８Ａ９.１  １〜１１９との相互作用を描いている。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、実施された免疫染色および免疫ブロット実験の結果を描いている。図７Ａおよび７Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型のＦＬＡＧタグ付きのものを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.２およびＳＬＣ３８Ａ９.４、さらにはＬＡＭＰの局在化を示す免疫染色を描いている。図７Ｃは、指示されたイソ型および変異体を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９の種々のイソ型とＲａｇｕｌａｔｏｒの成分の種々の変異体との間の相互作用を示す免疫ブロットを描いている。図７Ｄは、（ｍＴＯＲＣ１基質Ｓ６Ｋ１のリン酸化によって分析した）短鎖干渉ＲＮＡを用いてＳＬＣ３８Ａ９についてノックダウンされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１に対する、アミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、実施された免疫染色および免疫ブロット実験の結果を描いている。図７Ａおよび７Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型のＦＬＡＧタグ付きのものを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.２およびＳＬＣ３８Ａ９.４、さらにはＬＡＭＰの局在化を示す免疫染色を描いている。図７Ｃは、指示されたイソ型および変異体を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９の種々のイソ型とＲａｇｕｌａｔｏｒの成分の種々の変異体との間の相互作用を示す免疫ブロットを描いている。図７Ｄは、（ｍＴＯＲＣ１基質Ｓ６Ｋ１のリン酸化によって分析した）短鎖干渉ＲＮＡを用いてＳＬＣ３８Ａ９についてノックダウンされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１に対する、アミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、実施された免疫染色および免疫ブロット実験の結果を描いている。図７Ａおよび７Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型のＦＬＡＧタグ付きのものを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.２およびＳＬＣ３８Ａ９.４、さらにはＬＡＭＰの局在化を示す免疫染色を描いている。図７Ｃは、指示されたイソ型および変異体を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９の種々のイソ型とＲａｇｕｌａｔｏｒの成分の種々の変異体との間の相互作用を示す免疫ブロットを描いている。図７Ｄは、（ｍＴＯＲＣ１基質Ｓ６Ｋ１のリン酸化によって分析した）短鎖干渉ＲＮＡを用いてＳＬＣ３８Ａ９についてノックダウンされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１に対する、アミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、実施された免疫染色および免疫ブロット実験の結果を描いている。図７Ａおよび７Ｂは、ＳＬＣ３８Ａ９イソ型のＦＬＡＧタグ付きのものを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.２およびＳＬＣ３８Ａ９.４、さらにはＬＡＭＰの局在化を示す免疫染色を描いている。図７Ｃは、指示されたイソ型および変異体を発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９の種々のイソ型とＲａｇｕｌａｔｏｒの成分の種々の変異体との間の相互作用を示す免疫ブロットを描いている。図７Ｄは、（ｍＴＯＲＣ１基質Ｓ６Ｋ１のリン酸化によって分析した）短鎖干渉ＲＮＡを用いてＳＬＣ３８Ａ９についてノックダウンされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のｍＴＯＲＣ１に対する、アミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、および／またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ａは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のアミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の一時的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｂは、アミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、種々の細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｃは、自食ｐ６２およびＬＣ３レベルのマーカーで測定したアルギニン飢餓およびクロロキン誘発性の自食に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、および／またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ａは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のアミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の一時的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｂは、アミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、種々の細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｃは、自食ｐ６２およびＬＣ３レベルのマーカーで測定したアルギニン飢餓およびクロロキン誘発性の自食に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、および／またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ａは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のアミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１、ＳＬＣ３８Ａ９.４、またはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０の一時的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｂは、アミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１の感度に対する、種々の細胞中のＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。図８Ｃは、自食ｐ６２およびＬＣ３レベルのマーカーで測定したアルギニン飢餓およびクロロキン誘発性の自食に対する、ＳＬＣ３８Ａ９.１の安定的な過剰発現の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図９】ＳＬＣ３８Ａ９のＲａｇおよびＲａｇｕｌａｔｏｒの成分との内因性の結合に対するアミノ酸の効果を示す免疫ブロットを描いている。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜１０Ｆは、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について行われた研究結果を描いている。図１０Ａは、原形質膜に対する流失をもたらすレベルで、ＳＬＣ３８Ａ９.１を一時的に過剰発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の免疫染色を描いている。図１０Ｂ−１０Ｄは、標識アミノ酸（図１０Ｂ：［１４Ｃ］アルギニン、図１０Ｃ：［１４Ｃ］アミノ酸混合物、図１０Ｄ：［１４Ｃ］ロイシン）の摂取に対するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中の種々のタンパク質の一時的な発現の効果を描いている。図１０Ｅ、左図は、-８０ｍＶで、指示されたｃＤＮＡを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの全細胞の記録を描いている。２．４ｍＭのアルギニン、１．６ｍＭのロイシン、および４ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ濃度の４倍）を局所的に適用した後の定常電流の変化を定量する。図１０Ｅ，右図は、個々の記録の代表例を描いている。グレーのバーはアミノ酸の適用を示している。図１０Ｆは、０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンと共に６０分間培養し、その後、遊離アミノ酸を捕集するカラムでクロマトグラフィーを行った場合の、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはＬＡＭＰ１プロテオリポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取を描いている。このプロテオリポソームは、カラムを通って通過し、ＦＬＡＧ免疫ブロット（上図）およびシンチレーション計数（下図）を行った。
【図１１】１００ｍＭの非標識アルギニンの存在または不存在下において、固定濃度０．５μＭの［３Ｈ］アルギニンで、ＳＬＣ３８Ａ９.１（「３８Ａ９］）リポソームまたはＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０（「３８Ａ９デルタ１１０」）リポソームによる［３Ｈ］アルギニンの摂取の時間経過を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において用いられる場合、「調節すること」（および、「調節する」のようなその動詞形）とは、関心の対象である分子、プロセス、経路、または現象の質的または量的な変化、変更、または修正をもたらし、または促進することを意味する。このような変化は、結合特性の増加、減少、変化、またはプロセス、経路または現象の異なる成分または枝の相対的強度または活性の変化でありうるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、「阻害剤」（および、「阻害する」のようなその動詞形）とは、（ａ）阻害されるタンパク質に通常ともなう一つまたはそれ以上の活性を減少させること、（ｂ）阻害されるタンパク質が、別のタンパク質、リガンドまたは核酸と、例えば、結合するなどして関与する能力を減少その他妨害すること、または（ｃ）阻害されるタンパク質をコードする遺伝子からの転写または発現を減少させることの少なくとも一つを行う薬剤を意味する。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、「活性剤」および「作動薬」（および、「活性化する」および「作動する」のようなそれらの動詞形）とは、（ａ）活性化されるタンパク質に通常ともなう一つまたはそれ以上の活性を増加させること、（ｂ）活性化されるタンパク質が、別のタンパク質、リガンドまたは核酸と、例えば、結合するなどして関与する能力を増加その他強化すること、または（ｃ）活性化されるタンパク質をコードする遺伝子からの転写または発現を増加させることの少なくとも一つを行う薬剤を意味する。本明細書におけるある特定の実施形態においては、本明細書において記載される活性化、作動、または阻害系、方法または薬剤のいずれを使用する調節、阻害、活性化または作動の少なくとも一つは、インビトロまたはエクスビボ、例えば、細胞を活性化、作動、または阻害系、方法または薬剤に接触または暴露させることによって行うことができる。本明細書におけるある特定の実施形態においては、本明細書において記載される活性化、作動、または阻害系、方法または薬剤のいずれを使用する調節、阻害、活性化または作動の少なくとも一つは、インビボによって行うことができる。
【００２３】
「ＳＬＣ３８Ａ９」、「完全長ＳＬＣ３８Ａ９」、「ＳＬＣ３８Ａ９イソ型１」および「ＳＬＣ３８Ａ９.１」の用語は同じ意味で使われており、これらのいずれもが、配列番号１に記載の完全なアミノ酸配列を意味する。
【００２４】
「ＳＬＣ３８Ａ９.２」および「ＳＬＣ３８Ａ９イソ型２」の用語は同じ意味で使われており、配列番号１のアミノ酸６４〜５６１を意味する。
【００２５】
「ＳＬＣ３８Ａ９.４」および「ＳＬＣ３８Ａ９イソ型４」の用語は同じ意味で使われており、配列番号１のアミノ酸１２０〜５６１を意味する。
【００２６】
「ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０」の用語は、配列番号１のアミノ酸１１１〜５６４を意味する。
【００２７】
本明細書におけるある特定の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９の一部に対応するペプチドおよびポリペプチド、または、アミノ酸レベルにおいて、ＳＬＣ３８Ａ９アミノ酸配列（配列番号１）の一部に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドまたはペプチドを提供する。これらの実施形態の一つの特定の態様においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む。このＳＬＣ３８Ａ９のアミノ末端領域は、Ｒａｇｕｌａｔｏｒに結合する原因であるように思われる。これらの実施形態のさらに特定の態様においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、少なくとも配列番号１のアミノ酸５９〜９０に対応する。別の態様においては、このペプチドまたはポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜１１９またはアミノ酸５９〜９０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性があるアミノ酸配列を含む。さらに別の特定の態様においては、この少なくとも７０％の相同性があるポリペプチドは、Ｄ５９，Ｈ６０，Ｓ６２，Ｓ７２，Ｒ７３，Ｐ７７，Ｄ８６，およびＶ８８の少なくとも一つまたはそれ以上を別のアミノ酸で置換することによって配列番号１のアミノ酸配列と異なっている。ある特定の態様においては、Ｄ５９，Ｈ６０，Ｓ６２，Ｓ７２，Ｒ７３，Ｐ７７，Ｄ８６，およびＶ８８の少なくとも一つまたはそれ以上は、アラニンで置換される。さらに別の特定の態様においては、この少なくとも７０％の相同性があるポリペプチドは、少なくとも、配列番号１のＩ６８，Ｙ７１，Ｌ７４，Ｐ８５，Ｖ８９、およびＰ９０に対応するアミノ酸を含む。これらの実施形態のさらに別の態様においては、このペプチド、ポリペプチド、またはこれらの相同体は、例えば、配列番号１のアミノ酸１２０〜５６１のいずれでもないＳＬＣ３８Ａ９の膜透過領域のいずれにも対応する、またはそれを定義するアミノ酸配列を有しない。ある特定の実施形態においては、このペプチド、ポリペプチド、またはこれらの相同体は、細胞の中に入ることができる。このことは、このペプチドまたはポリペプチドにアルギニン−グリシン−アスパラギン酸のような細胞接着性アミノ酸配列を加える方法、立体配座的に安定化された「一括りにされた」ポリペプチドを使用する方法、およびこのペプチド、ポリペプチド、またはこれらの相同体の融合パートナーが細胞浸透性ポリペプチド配列である融合タンパク質を使用する方法を含む、本技術分野において知られた方法によって達成することができる。代替の実施形態においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、配列番号１のアミノ酸１１１〜５６１から成る。この代替の実施形態の関連する態様においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、本質的に、上記のいずれのペプチドまたはポリペプチドの断片のＮまたはＣ末端に直接的に、またはリンカーを介して融合した原形質膜標的配列から成る。より具体的な態様においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、本質的に、配列番号１のアミノ酸１１１〜５６１、または配列番号１のアミノ酸１〜５６１のいずれかのＮまたはＣ末端に直接的に、またはリンカ−を介して融合した原形質膜標的配列から成る。原形質膜標的配列は、本技術分野においてはよく知られている（例えば、Ｂｈａｒｄｗａｊ，  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３１１０−３１１２  （２００７）参照）。より具体的な態様において、この原形質膜標的配列は、Ｈ−ＲａｓのＣ末端２５アミノ酸である（ＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号５））。関連するより具体的な態様においては、このペプチドまたはポリペプチドの断片は、配列番号１の任意の変異体、または上記の任意ののペプチドまたはポリペプチドの断片の変異体から成り、そこでは、リソソーム標的配列は、アミノ酸の置換、挿入または付加の少なくとも一つによって除去されている。
【００２８】
ある特定の実施形態においては、本発明のこのペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、およびこれらの相同体は、ＳＬＣ３８Ａ９のＲａｇｕｌａｔｏｒへの結合に対する競合的な阻害剤として有用である。別の実施形態においては、本発明のこのペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、およびこれらの相同体は、ＳＬＣ３８Ａ９の調節剤を特定するための分析試料として有用である。そのような調節剤は、一つまたはそれ以上のアミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンに対するＳＬＣ３８Ａ９の親和性を変更し、またはＳＬＣ３８Ａ９とＲａｇｕｌａｔｏｒ間の相互作用を変更しうる。
【００２９】
関連する実施形態においては、本発明は、上記のペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、およびこれらの相同体の一つまたはそれ以上をコードする核酸配列、このような核酸配列を含むベクター、およびそのようなベクターによって転換された、および／またはそのような核酸配列の生成物を発現する細胞を提供する。
【００３０】
別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９のタンパク質足場調節剤を提供する。タンパク質足場調節剤は、細胞内に入り標的タンパク質と結合することができる小さなタンパク質であり、標的タンパク質の活性を変更でき得る。タンパク質足場調節剤は、アフィボディ、二らせんの抗体、ノッチン、（アドネクチンとしても知られる）モノボディ、アンチカリン、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アルファボディ（商標），アビマー、免疫グロブリン誘導結合フラグメント、単鎖抗体およびその断片、さらにはＶＥＧＦ，ＥＧＦおよびアネキシンＶのような自然リガンドの誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明のタンパク質足場調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化するか、またはＳＬＣ３８Ａ９を阻害しうる。適切なタンパク質足場調節剤は、ファージ、細胞、またはリボソームディスプレイライブラリースクリーニングによって特定でき、それらは市販されているか当業者が作成できる。このＳＬＣ３８Ａ９のタンパク質足場調節剤の活性は、例えば、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ、または、例えば、ＴＭＥＭ１９２（ＮＣＢＩ遺伝子番号：２０１９３１、配列番号２）、ＳＬＣ１２Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：５６９９６、配列番号３）、またはＣＬＣＮ７（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１１８６、配列番号４）のような、ＳＬＣ３８Ａ９と結合すると考えられる一つまたはそれ以上の他のタンパク質に対するＳＬＣ３８Ａ９の親和性の変化をもたらすその能力によって決定することができる。別の方法として、このＳＬＣ３８Ａ９のタンパク質足場調節剤の活性は、ＳＬＣ３８Ａ９の一つまたはそれ以上の活性の変化をもたらすその能力によって決定することができる。この実施形態一つの態様においては、このタンパク質足場調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤である。別の実施形態においては、このタンパク質足場調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の活性剤または作動薬である。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９の小分子調節剤を提供する。この実施形態の一つの態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤であり、細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性の減少をもたらす。この実施形態の別の態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の活性剤または作動薬であり、細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性の増加をもたらす。より具体的な実施形態においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の活性剤または作動薬であり、アルギニン、リジン、またはロイシン以外のものである。別の実施形態においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９の活性剤または作動薬であり、アルギニン、リジン、またはロイシンの機能的模倣剤である。本明細書において用いられる場合、「模倣剤」とは、この薬剤に応答したｍＴＯＲＣ１の基質（例えば、Ｓ６Ｋ）のｍＴＯＲＣ１のリン酸化によって測定される、細胞におけるｍＴＯＲＣ１の活性化に対するアルギニン、リジン、またはロイシンの生物学的効果を模倣する薬剤、または細胞中のアルギニン、リジン、またはロイシンのレベルを増加させる薬剤を意味する。これらの実施形態のある特定の態様においては、この小分子調節剤は、少なくとも１０％のアルギニン、リジン、またはロイシン含有量（例えば、このペプチド中のアミノ酸の少なくとも１０％は、アルギニン、リジン、またはロイシンの一つである）を有するペプチドまたはペプチド相同体ではない。ＳＬＣ３８Ａ９の小分子調節剤は、市販されている小分子および自然生成物ライブラリーをスクリーニングすることによって特定でき、周知の医薬的化学操作および調節によって、ＳＬＣ３８Ａ９の調節活性のためにさらに最適化することができる。
【００３２】
本明細書における別の実施形態においては、本発明は、ＴＭＥＭ１９２（ＮＣＢＩ遺伝子番号：２０１９３１、配列番号２）、ＳＬＣ１２Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：５６９９６、配列番号３）、またはＣＬＣＮ７（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１１８６、配列番号４）の一つまたはそれ以上の小分子調節剤を提供する。この実施形態のある一つの態様においては、この小分子調節剤は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の阻害剤であり、細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性の減少をもたらす。この実施形態の代替の態様においては、この小分子調節剤は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の活性剤または作動薬であり、細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性の増加をもたらす。より具体的な本明細書の実施形態においては、この小分子調節剤は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の活性剤または作動薬であり、アルギニン、リジン、またはロイシン以外のものである。さらに別の実施形態においては、この小分子調節剤は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の活性剤または作動薬であり、アルギニン、リジン、またはロイシンの模倣剤である。これらの実施形態のある特定の態様においては、この小分子調節剤は、少なくとも１０％のアルギニン、リジン、またはロイシン含有量（例えば、このペプチド中のアミノ酸の少なくとも１０％は、アルギニン、リジン、またはロイシンの一つである）を有するペプチドまたはペプチド相同体ではない。ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の小分子調節剤は、市販されている小分子ライブラリーをスクリーニングすることによって特定でき、周知の医薬的化学操作および調節によって、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の調節活性のためにさらに最適化することができる。
【００３３】
さらに別の実施形態においては、本発明は、例えば、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のこのオリゴヌクレオチドは、対応するタンパク質の転写または翻訳の少なくとも一つを減少させることができるにちがいない。
【００３４】
別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上の発現を調節するＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系および手段を提供する。これらの調製および使用のためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系および手段は、本技術分野において知られており、特定の遺伝子の発現を増加または減少するために使用することができる。したがって、この実施形態の一つの態様においては、このＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上の発現の阻害をもたらす。この実施形態の別の態様においては、このＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上の発現の増加をもたらす。
【００３５】
さらに別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７のゲノムオープンリーディングフレームの一つまたはそれ以上の転写の小分子調節剤を提供する。そのような小分子は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上のプロモーターにおいて、活性化転写因子、転写活性化補助因子、および転写抑制因子の一つまたはそれ以上、または引き続いて発生する転写機構の動員の少なくとも一つの存在および活性を調節する分子を含む。この実施形態の一つの態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７のゲノムオープンリーディングフレームの一つまたはそれ以上の転写を増加させる。この実施形態の別の態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７のゲノムオープンリーディングフレームの一つまたはそれ以上の転写を減少させる。
【００３６】
さらに別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７ｍＲＮＡの一つまたはそれ以上の翻訳の小分子調節剤を提供する。この実施形態の一つの態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７ｍＲＮＡの一つまたはそれ以上の翻訳を増加させる。この実施形態の代替の態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７ｍＲＮＡの一つまたはそれ以上の翻訳を減少させる。
【００３７】
さらに別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７タンパク質レベルの一つまたはそれ以上のタンパク質の分解の小分子調節剤を提供する。この実施形態の一つの態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７タンパク質の一つまたはそれ以上の分解を増加させる。この実施形態の別の態様においては、この小分子調節剤は、ＳＬＣ３８Ａ９、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７タンパク質の一つまたはそれ以上の分解を減少させる。
【００３８】
さらに別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９のグリコシル化を減少または排除する薬剤を提供する。この実施形態の一つの態様においては、この薬剤は、ＳＬＣ３８Ａ９のアミノ酸残基１１７、２３９、２４８、２６６または２７４の一つまたはそれ以上において部分的または完全な脱グリコシル化をもたらす。
【００３９】
関連する実施形態においては、本発明は、部分的または完全に脱グリコシル化された形態のＳＬＣ３８Ａ９、ＳＬＣ３８Ａ９のポリペプチドまたはペプチド断片、またはＳＬＣ３８Ａ９のポリペプチドまたはペプチド断片の相同体を提供する。この実施形態においては、このＳＬＣ３８Ａ９、またはポリペプチドまたはペプチド断片は、ＳＬＣ３８Ａ９のアミノ酸残基１１７，２３９、２４８、２６６または２７４の少なくとも一つを含む。この実施形態において有用な相同体は、ＳＬＣ３８Ａ９残基のグリコシル化シグナルに対応するアミノ酸の一つまたはそれ以上において変異されうる。これらの変異は、三つのアミノ酸Ｎグリコシル化シグナルが取り除かれるように、Ｎグリコシル化された（つまり、ＳＬＣ３８Ａ９のアミノ酸１１７、２３９、２４８、２６６または２７４に対応するアミノ酸）と推定されるＳＬＣ３８Ａ９中のいずれのアスパラギン、または、これらのＮーグリコシル化が推定されるサイトの直ぐＣ末端側の二つのアミノ酸のいずれかの少なくとも一つにおいて起こりうる。
【００４０】
別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動する薬剤を患者に投与するステップを含む、患者のｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法を提供する。上記のＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動するシステム、方法または薬剤のいずれもが、この目的のために用いられうる。
【００４１】
関連する実施形態においては、本発明は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上を活性化または作動する薬剤を患者に投与するステップを含む、患者のｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法を提供する。上記のＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７を活性化または作動するシステム、方法または薬剤のいずれもが、この目的のために用いられうる。
【００４２】
いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１を増加させるこの方法は、筋肉同化作用の促進、筋肉機能の改善、筋肉量の増加、筋肉退化の反転または筋肉退化の防止のために使用される。いくつかの実施形態においては、この方法は、対象のライフスタイルによる不活動、整形外科手術、運動抑制または年齢、または対象が有するまたは罹患している病気または疾患を原因とする筋肉退化を反転させ、または筋肉退化の防止のために使用される。いくつかの実施形態においては、この方法は、骨折、重症のやけど、脊椎損傷、手足の切断、変性疾患、対象が回復するのに臥床を必要とする疾患、集中治療室での滞在、または長期入院を原因とする筋肉退化を反転させ、または筋肉退化の防止のために使用される。いくつかの実施形態においては、この方法は、サルコペニア、筋肉除神経および筋ジストロフィーのような骨格筋の萎縮によって生じる病気、疾患または障害を治療するために使用される。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする対象は、例えば、悪液質または食欲不振による減退した満腹感を有する。いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする対象は、悪液質と関連し、そして癌、ＡＩＤＳ，ＳＡＲＳ，慢性心臓疾患、ＣＯＰＤ，慢性関節リウマチ、肝疾患、腎臓病および外傷から選択される病気または疾患にかかり、または罹患している。いくつかの実施形態においては、対象は、吸収障害に関係すると知られている病気または疾患にかかり、または罹患している。いくつかの実施形態においては、病気または疾患は、クローン病、過敏性大腸症候群、セリアック病、および嚢胞性線維症から選択される。いくつかの実施形態においては、対象は、栄養失調、サルコペニア、筋肉除神経、筋ジストロフィー、炎症性筋疾患、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または重症筋無力症にかかり、または罹患している。いくつかの実施形態においては、対象は、宇宙旅行の準備をし、参加し、または最近、そこから帰還した者である。いくつかの実施形態においては、対象は、戦闘または軍事訓練の準備をし、参加し、または最近、そこから帰還した者である。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、この方法は、リボソーム病を治療するために使用される。いくつかの実施形態においては、リボソーム病は、ダイヤモンド−ブラックファン貧血症、５ｑ−症候群、シュバッハマン−ダイアモンド症候群、Ｘ−関連異常角化症、軟骨髪発育不全、およびトリーチャー・コリンズ症候群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、この方法は、コヒーシン病（例えば、ロバーツ症候群およびコーネリア・デ・ラング症候群）を治療するために使用される。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法は、患者の自食作用を防止するために使用される。いくつかの実施形態においては、対象は、自食作用の誘導に依存する方法で抗治療性癌にかかり、または罹患している。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、この方法は、うつ病を治療または防止するために使用される。いくつかの実施形態においては、この方法は、枯渇したアミノ酸レベルによって特徴づけられる形態の自閉症を治療または防止するために使用される。いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるこの方法は、時差ボケを治療または防止するために使用される。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、この方法は、対象の心臓筋収縮症を防止または反転させるために使用される。いくつか実施形態においては、対象は、心臓発作、鬱血性心不全、心臓移植、心臓弁修復、アテローム性動脈硬化症、その他の主要な血管病、および心臓バイパス手術から選択される病気または疾患にかかり、またはかかっていた。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、ｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるこの方法は、運動後の筋肉の強度または筋肉量の少なくとも一方を増加させるために使用される。本明細書のある特定の実施形態においては、この方法は、理学療法と合わせて、全経静脈栄養の一部として、または機能的電気刺激を促進するために実行される。
【００５０】
別の実施形態においては、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ９を阻害する薬剤を患者に投与するステップを含む、患者のｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるための方法を提供する。上記の、ＳＬＣ３８Ａ９阻害する系、方法または薬剤のいずれもがこの目的のために用いられうる。この実施形態の一つの態様においては、患者は、臓器移植の受領者であるか、免疫抑制が必要であるか、ステントの受領者であるか、動脈の狭窄にかかり、または罹患し、またはそのリスクを有するか、または癌、特にラパマイシンによる治療が監督機関から推薦または承認された癌にかかり、または罹患している。この実施形態の別の態様においては、患者は、代謝性疾患（例えば、２型糖尿病、病的肥満、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、および高脂血症）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、および筋萎縮性側索硬化症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、痛風、アレルギー性鼻炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎）、稀なミトコンドリア病（例えば、リー症候群、フリードライヒ運動失調症、心筋症、リーバーの遺伝性視神経萎縮症、リンパ管平滑筋腫、結節状硬化、ポンプ病（ＩＩ型糖原病）、およびリソソーム蓄積症）、心血管疾患（例えば、心筋症、心臓麻痺、虚血性心疾患（アテローム硬化性疾患）、虚血性脳卒中、および肺動脈高血圧）、腎臓病（例えば、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎、および急性腎臓損傷）、神経精神病学的疾患（例えば、癲癇、自閉症スペクトル障害、およびうつ病性障害）、および腫瘍学的疾患（例えば、腎細胞癌、固形腫瘍、血液学的癌）から選択される病気または疾患に罹患している。
【００５１】
関連する実施形態においては、本発明は、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７の一つまたはそれ以上を阻害する薬剤を患者に投与するステップを含む、患者のｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるための方法を提供する。上記の、ＴＭＥＭ１９２、ＳＬＣ１２Ａ９またはＣＬＣＮ７を阻害する系、方法または薬剤のいずれもがこの目的のために用いられうる。この実施形態の一つの態様においては、患者は、臓器移植の受領者であるか、免疫抑制が必要であるか、ステントの受領者であるか、動脈の狭窄にかかり、または罹患し、またはそのリスクを負っているか、または癌、特にラパマイシンによる治療が監督機関から推薦または承認された癌、ｍＴＯＲＣ１に作用し、またはそれによって調節されるシグナル伝達経路を通じた増加した活性をもたらす遺伝子の混乱によって特徴づけられる癌の亜型、または自食作用が発言上昇した癌の亜型にかかり、または罹患している。この実施形態の別の関連する態様においては、患者は、代謝機能障害（例えば、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、ベータ細胞機能障害）によってもたらされる病気である肥満、心筋症、自己免疫疾患（例えば、乾癬、ルーパス）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病）、ｍＴＯＲＣ１の異常活性にともなう神経性障害（例えば、結節性硬化症複合体、神経線維腫症、脆弱性エックス症候群、ＰＴＥＮ関連疾患、自閉症および自閉症スペクトル障害、癲癇および発作）、ミトコンドリア機能障害をもたらす遺伝性疾患（例えば、リー症候群、フリードライヒ運動失調症）、または、過剰活性ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達をもたらす遺伝性疾患（例えば、結節性硬化症、リンパ脈管筋腫症）にかかり、または罹患している。この実施形態の代替の態様においては、患者は、代謝性疾患（例えば、２型糖尿病、病的肥満、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、および高脂血症）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、および筋萎縮性側索硬化症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、痛風、アレルギー性鼻炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎）、稀なミトコンドリア病（例えば、リー症候群、フリードライヒ運動失調症、心筋症、リーバーの遺伝性視神経萎縮症、リンパ管平滑筋腫、結節状硬化、ポンプ病（ＩＩ型糖原病）、およびリソソーム蓄積症）、心血管疾患（例えば、心筋症、心臓麻痺、虚血性心疾患（アテローム硬化性疾患）、虚血性脳卒中、および肺動脈高血圧）、腎臓病（例えば、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎、および急性腎臓損傷）、神経精神病学的疾患（例えば、癲癇、自閉症スペクトル障害、およびうつ病性障害）、および腫瘍学的疾患（例えば、腎細胞癌、固形腫瘍、血液学的癌）から選択される病気または疾患に罹患している。
【００５２】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）試験化合物をＳＬＣ３８Ａ９．１、またはＳＬＣ３８Ａ９．１の断片または変異体を含み、ＳＬＣ３８Ａ９.１の活性または特性を有するポリペプチドに接触させるステップと、（ｂ）前記試験化合物の存在下において、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を測定するステップと、（ｃ）前記測定された活性または特性を、前記試験化合物の不存在下における同じ活性または特性と比較し、それによって前記試験化合物がＳＬＣ３８Ａ９の調節剤であるかどうかを決定するステップを含む  ＳＬＣ３８Ａ９の調節剤を特定する方法を提供する。
【００５３】
これらの方法は、ＳＬＣ３８Ａ９またはその断片または変異体が原形質膜に存在するように操作された（例えば、Ｎ末端を原形質膜シグナル配列、例えば、Ｈ−Ｒａｓの最後の２５個のアミノ酸（ＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ、配列番号５）に融合させることによって操作された）細胞系、原形質膜においてＳＬＣ３８Ａ９またはその断片または変異体を発現させるように操作された非哺乳動物細胞系（例えば、ゼノパス卵母細胞）、ＳＬＣ３８Ａ９またはその断片または変異体が固体の支持物に付着されたインビトロ系、およびＳＬＣ３８Ａ９またはその断片または変異体が溶液中で遊離しているインビトロ系を用いることができる。
【００５４】
これらの方法において測定されるべき活性または特性は、標識された（例えば、放射性標識、蛍光標識された）アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、またはリジン）の摂取、細胞系におけるナトリウムの摂取、細胞系における膜の膜電位の変化、インビトロ系におけるアミノ酸の、ＳＬＣ３８Ａ９、またはその断片または変異体に対する結合、インビトロシステムにおける試験化合物の、ＳＬＣ３８Ａ９、またはその断片または変異体に対する結合、インビボおよびインビトロ系の両者における、ＳＬＣ３８Ａ９、またはその断片または変異体がＲａｇｕｌａｔｏｒに結合する能力の変化、およびｍＴＯＲＣ１の一つまたはそれ以上の活性の変化（例えば、Ｓ６Ｋ１のリン酸化状態の変化）を含む。
【００５５】
これらの活性の測定は、放射性標識されたアミノ酸については、シンチレーション計数によって、蛍光アミノ酸についておよび膜電位の変化を測定するためには、流動細胞計測法、蛍光マイクロプレートまたはスペクトロ蛍光光度計によって（例えば、膜電位の変化に反応して蛍光発光が変化する染料、例えば、ＦＬＩＰＲ染料（分子装置）によって）、膜の膜電位を測定するにはパッチクランプ法によって、アミノ酸の結合または試験化合物の直接結合の変化を測定するには、固相面プラスモン共鳴法によって、およびアミノ酸の結合または試験化合物の直接結合の変化を測定するには、質量分析法によってそれぞれ達成できる。
【００５６】
このような方法において使用するＳＬＣ３８Ａ９.１の断片または変異体の選択は、測定される活性に依存する。アミノ酸１〜１１０を欠く断片、ならびにＳＬＣ３８Ａ９イソ型２および４は、Ｒａｇｕｌａｔｏｒと相互作用せず、したがって測定する活性がＲａｇｕｌａｔｏｒの相互作用に依存する場合にはそれは避けるべきである。しかし、アミノ酸１〜１１０を欠く断片は、それでもアミノ酸と結合し、それを輸送するので、アミノ酸の結合および輸送を直接的にまたは間接的に測定する分析において用いられうる。一実施形態においては、完全な形のＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０は、アミノ酸の結合および輸送を直接的にまたは間接的に測定する分析において用いられる。
【００５７】
ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはＳＬＣ３８Ａ９の断片または変異体を含むポリペプチドは、これらの方法において有用なポリペプチドに望ましい付加的物性を与える他のアミノ酸配列をも含みうる。いくつかの実施形態においては、このポリペプチドは、ＮまたはＣ末端に、さらにこのポリペプチドの組み換え生産、またはこのポリペプチドの分離の少なくとも一方を助け得るタグを含む。そのようなタグは、ＳＬＣ３８Ａ９.１、またはその断片または変異体に直接的に共有結合し、またはリンカーを介して結合する、ヒスチジンまたはポリヒスチジンタグ、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧまたはＨＡポリペプチド融合）、またはリガンドタグ（例えば、ビオチン）を含む。いくつかの実施形態においては、このポリペプチドは、さらにこのポリペプチドを原形質膜に対して標的にするシグナル配列（例えば、Ｈ−Ｒａｓの最後の２５個のアミノ酸（ＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ、配列番号５））を含む。いくつかの実施形態においては、このポリペプチドは、さらに蛍光または生物発光のタグまたはポリペプチド配列（例えば、緑の蛍光タンパク質、黄色の蛍光タンパク質、赤い蛍光タンパク質、または発光酵素との融合）を含む。
【００５８】
これらの方法の具体的な例が、下記、実施例において記載される。
【００５９】
本明細書において開示される発明は、この説明に記載された詳細、または例示において示された適用に限定されないものと解されるものである。本発明は、他の実施形態を包含し、種々の方法によって実施または実行することができる。さらには、本明細書が用いる表現および用語は、説明のためのものであって、限定するものとみなされてはならない。
【００６０】
本明細書および請求項で用いられる冠詞「ａ」および「ａｎ」は、特に明記しない限り、複数の対象を含むものと解される。群の一つまたはそれ以上の要素間の「または」を含む請求項または説明は、特に明記されその他文脈上明らかでない限り、そのグループの要素の一つ、二つ以上、またはすべてが対象の物または方法において存在し、用いられ、その他関連する場合には、要件を満たしているものと解される。本発明は、群のまさに一つの要素が所与の産生物またはプロセスにおいて存在し、用いられ、その他関連する実施形態を含む。本発明は、さらに、群の二つ以上、またはすべての要素が所与の産生物またはプロセスにおいて存在し、用いられ、その他関連する実施形態を含む。さらには、本発明は、特に明記され、または当業者にとって矛盾または不一致が生じることが明らかである場合を除き、一つまたはそれ以上の記載された請求項からの、一つまたはそれ以上の限定、要素、節、説明的記述等が、同じ基本の請求項（または、関連する他のいずれの請求項）に依存する他の請求項に導入されるすべての変形、組合せ、および順列を含む。要素がリストとして提示されている場合（例えば、マーカッシュ群、または同様の形式）、それらの要素のそれぞれの部分群も開示され、そして、いずれの要素もその群から除去することができるものと解される。一般的に、発明または発明の態様が、特定の要素、特長等を含むものとして言及される場合、この発明または発明の態様のある特定の実施形態は、そのような要素、特長等からなり、またはそれらから本質的になる。簡略化のために、本明細書の実施形態は、すべての場合に十分な語数をもって特に記載されているわけではない。本発明のいずれの実施形態または態様は、明細書にその旨が記載されているか否かに関わらず、請求項から明確に除外することができるものと解される。本発明の背景を説明し、本発明の実施に関する追加的な詳細を提供するために本明細書で参照される公報およびその他の参考資料は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６１】
実施例１  ＳＬＣ３８Ａ９はＲａｇｕｌａｔｏｒと相互作用する。
アミノ酸の存否がどのようにしてｍＴＯＲＣ１の転座および活性化を媒介するリソソームタンパク質の複雑なネットワークを始動させるのかは依然として不明である。一つの仮説は、推定上のアミノ酸センサーが、ｍＴＯＲＣ１に対するシグナル伝達に関係するリソソーム複合体の一つと直接的に相互作用するというものである。この仮説を試験するために、我々は、最初に、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ複合体に注目し、タンパク質とタンパク質の相互作用を維持する条件下で種々のＦＬＡＧタグ付きタンパク質を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの免疫沈降を行った。
【００６２】
天然およびコドン最適化された両方の、すべてのヒトＳＬＣ３８Ａ９イソ型のためのｃＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって遺伝子合成した。このｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、生成物をＨＡ−ｐＲＫ５およびＦＬＡＧ−ｐＲＫ５のＳａｌＩおよびＮｏｔＩサイトにサブクローンした。このｃＤＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から調達したオリゴヌクレオチドを用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して変異誘発した。
【００６３】
ＦＬＡＧタグ付きＳＬＣ３８Ａ９イソ型およびＳＬＣ３８Ａ９Ｎ末端１〜１１９をＰＣＲによって増幅し、ｐＬＪＭ６０のＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩサイトまたはｐＭＸのＰａｃＩおよびＥｃｏＲＩサイトへクローンした。配列を検証した後、以下に述べるように、ｃＤＮＡ形質移入、またはこれらのたんぱく質を安定的に発現している細胞株を発生させるのに必要なレンチウイルスを生成するために、これらのプラスミドを使用した。
【００６４】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％の不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭ中で培養し、３７℃および５％ＣＯ２に維持した。２００万個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの培養皿に播いた。２４時間後、これらの細胞に図面で示すｐＲＫ５ベースのｃＤＮＡ発現プラスミドを、以下に示す量で、形質移入した。５００ｎｇＦＬＡＧ−ｍｅｔａｐ２、５０ｎｇ  ＦＬＡＧ−ＬＡＭＰ１、１００ｎｇ  ＦＬＡＧ−ＲａｇＢおよび１００ｎｇ ＨＡ−ＲａｇＣ、３００ｎｇ  ＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９．１、６００ｎｇ  ＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９．１Δ１１０、２００ｎｇＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９．４、４００ｎｇＦＬＡＧ−Ｎ末端１１９  ＳＬＣ３８Ａ９．１の断片、２００ｎｇＦＬＡＧ−ＲａｇＣ、２００ｎｇＦＬＡＧ−ＲａｇＣ  Ｓ７５Ｎ、２００ｎｇＦＬＡＧ−ＲａｇＣ  Ｑ１２０Ｌ、４００ｎｇ  ＨＡＧＳＴ−ＲａｇＢ、４００ｎｇ  ＨＡＧＳＴ−ＲａｇＢ  Ｔ５４Ｎ、４００ｎｇ  ＨＡＧＳＴ−ＲａｇＢ  Ｑ９９Ｌ。
【００６５】
形質移入混合物を、空ｐＲＫ５を使用して、合計５μｇのＤＮＡまで取り上げた。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、氷冷溶解バッファー（４０ｍＭのへぺス  ｐＨ７．４，１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍＭのベータグリセロールリン酸、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、およびＥＤＴＡ無添加プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社）１錠／２５ｍｌのバッファー）で溶解した。細胞溶解物からの可溶性画分を微量遠心機を用いて、１３，０００回転／分で１０分間、遠心分離によって分離した。免疫沈降物を得るために、３０μＬの、５０％抗ＦＬＡＧ親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ社）のスラーリーをそれぞれの溶解物に添加し、４℃で２〜３時間回転しながら培養した。免疫沈降物を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む溶解バッファーで３回洗浄した。免疫沈降したタンパク質に５０μＬのサンプルバッファーを添加し、３０分間、室温で培養して変性した。ＳＬＣ３８Ａ９を含む試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶解および免疫ブロットによる分析の前に沸騰も冷凍もしないことが重要である。質量分析のための試料を調製する際には、同様の手順を用いた。
【００６６】
以下で説明するように、ＦＬＡＧ−ｍｅｔａｐ２，ＦＬＡＧ−ｐ１８，ＦＬＡＧ−ｐ１４，ＦＬＡＧ−ＨＢＸＩＰ，ＦＬＡＧ−ｃ７またはｆ５９，およびＦＬＡＧ−ＲａｇＢを安定的に発現する３，０００万個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から免疫沈降物を調製した。タンパク質を、ＦＬＡＧペプチド（配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を用いて、４〜１２％のＮｕＰａｇｅ(R)ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、およびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した抗ＦＬＡＧ親和性ビーズから、溶出した。それぞれのゲルレーンを、１０〜１２個に薄切りにし、それぞれのゲルスライス中のタンパク質をトリプシンを用いて一晩消化させた。得られた消化物を、液体クロマトグラフィーに付し、次いでタンパク質の特定のためにタンデム質量分析（液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法）に付した。共輸送体のアミノ酸・ナトリウムファミリーの一員であるＳＬＣ３８Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１５３１２９）は、すべてのＲａｇｕｌａｔｏｒ成分固有の免疫沈降物中に存在し、さらにＲａｇＢの免疫沈降物中にもある程度存在したが、対照タンパク質Ｍｅｔａｐ２の免疫沈降物中には存在しなかった。
【００６７】
液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法のデータを確認するために、上記の手順を用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＳＬＣ３８Ａ９.１のＦＬＡＧタグ付きの構成物で形質移入し、（そのｐ１４およびｐ１８成分によって検出した）内因性のＲａｇｕｌａｔｏｒタンパク質、さらにはＲａｇＡおよびＲａｇＣを免疫沈降することができた。他のＦＬＡＧタグ付きリソソーム膜タンパク質であるＬＡＭＰ１，ＳＣ３６Ａ１およびＳＬＣ３８Ａ７は、ｐ１４、ｐ１８、ＲａｇＡまたはＲａｇＣ（図１Ｄおよび図６Ａ）のいずれも免疫沈降しなかった。さらに、組み換えエピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９および共発現エピトープタグ付きＲａｇｕｌａｔｏｒタンパク質間の結合を示すことができた。
【００６８】
ＳＬＣ３８Ａ９がＲａｇｕｌａｔｏｒと相互作用することを示す質量分析のデータを確認した後、ＳＬＣ３８Ａ９のどの領域がＲａｇｕｌａｔｏｒとの相互作用を担っているのかを決定し始めた。ＳＬＣ３８Ａ９に対してＮＣＢＩが注釈を添えた明確に区別できる４個のイソ型がある。イソ型１（配列番号１）は完全な長さのタンパク質であり、イソ型２は配列番号１のＮ末端から最初の６３個のアミノ酸が欠落しており、イソ型３はより短い修飾されたＮ末端および途切れたＣ末端を有し、そしてイソ４型は最初の膜貫通領域（ＡＡ１〜１１９）に先立つＮ末端の全領域が欠落している。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中に、イソ型１，２および４を、さらに最初の１１０個のアミノ酸（ＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０）を欠くＳＬＣ３８Ａ９.１の変異体を発現させ、イソ型１はＲａｇｕｌａｔｏｒに強く結合するが、イソ型２，４およびＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０のいずれも内因性または共形質移入されたＲａｇｕｌａｔｏｒタンパク質を免疫沈降させることはできなかったことを見出した（図６、ＢおよびＣ）。
【００６９】
イソ４型がＲａｇｕｌａｔｏｒ成分を沈降させることができなかったことを考慮して、ＳＬＣ３８Ａ９とＲａｇｕｌａｔｏｒ間の相互作用を媒介することを担う可能性の高いＮ末端（ＡＡ１〜１１９）に着目した。ＳＬＣ３８Ａ９のＮ末端、アミノ酸残基１〜１１９のみを含むＮ末端ＦＬＡＧタグ付き構成物を開発し、それがＲａｇｕｌａｔｏｒを免疫沈降させるのに必要かつ十分であることを見出した（図１Ａおよび図６Ｃ）。ヒト、ゼブラフィッシュおよび線虫間に保存された残留物を観察し、アミノ酸５９〜９０が強く保存されることを見出した。ＡＡ１〜１９９中の構造物において、それぞれの残留物をアラニンで置換したところ、ＳＬＣ３８Ａ９のＮ−末端領域とＲａｇｕｌａｔｏｒとの結合を攪乱する以下の変異を特定した：Ｉ６８Ａ，Ｙ７１Ａ、Ｌ７４Ａ、Ｐ８５Ａ、Ｖ８９Ａ、およびＰ９０Ａ。相互作用を攪乱しなかったこの領域内のアラニン置換は、Ｄ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６２Ａ、Ｓ７２Ａ、Ｒ７３Ａ、Ｐ７７Ａ、Ｄ８６Ａ、およびＶ８８Ａを含む。我々は、Ｉ６８、Ｙ７１、Ｌ７４、Ｐ８５、およびＰ９０が、ＲａｇｕｌａｔｏｒとＳＬＣ３８Ａ９.１間の相互作用に必要であるとの結論に達した（図１Ｅ）．    
【００７０】
他のアミノ酸輸送体との相同性を考慮して、アミノ酸が豊富な培養条件およびアミノ酸が不足した培養条件の両条件下で、完全長のＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒタンパク質間の免疫沈降分析を行った。ＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒタンパク質間の相互作用が、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇタンパク質間で観察されたものと同様なアミノ酸条件によって調節されることを発見した。このアッセイを、ＳＬＣ３８Ａ９のＮ末端のみ（配列番号１のアミノ酸１〜１１９）で繰り返したとき、アミノ酸レベルに対する反応の変化をまったく観察しなかった。その結果、ＳＬＣ３８Ａ９およびＲａｇｕｌａｔｏｒ間の相互作用はアミノ酸によって調節され、またこの調節は、アミノ酸に反応するｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達のレギュレーターとしての機能を果たすので重要であると考えられる。ＳＬＣ３８Ａ９のこの膜貫通領域は、アミノ酸に対する反応を媒介するために必要である可能性が高い。
【００７１】
ｖ−ＡＴＰａｓｅおよびその活性は、ｍＴＯＲＣ１の経路によるアミノ酸の検知に必要であり、ＳＬＣ３８Ａ９.１のように、それは安定的に発現されたＦＬＡＧタグ付きＲａｇｕｌａｔｏｒと共免疫沈降した。このことは、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅに加えてｖ−ＡＴＰａｓｅの内因性成分と結びつく安定的に発現されたＳＬＣ３８Ａ９.１の超複合体の存在を示したが、ＬＡＭＰ１の存在は示さなかった（図１Ｃ）。ＳＬＣ３８Ａ９.２は、Ｒａｇｕｌａｔｏｒと相互作用しないが、それは、ＳＬＣ３８Ａ９.１よりも少ない量ではあるが、ｖ−ＡＴＰａｓｅと共免疫沈降した（図１Ｃ）。このことは、ＳＬＣ３８Ａ９.１およびｖ−ＡＴＰａｓｅ間の相互作用は、Ｒａｇｕｌａｔｏｒによってではなく、その膜貫通領域を含むＳＬＣ３８Ａ９.１の領域によって直接的または間接的に媒介されることを示唆する。この解釈と調和して、Ｒａｇｕｌａｔｏｒと強く相互作用するＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ末端領域は、ｖ−ＡＴＰａｓｅと免疫沈降しなかった（図１Ｃ）。
【００７２】
実施例２  ＳＬＣ３８Ａ９はリソソーム膜に局在化する。
ＳＬＣ３８Ａ９のＲａｇｕｌａｔｏｒとの強い相互作用、およびその標準的な５+５の膜貫通構造を含む他のＳＬＣ３８ファミリーメンバーとの相同性を考慮して、ＳＬＣ３８Ａ９は、リソソーム膜に局在するものと予測した。
【００７３】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、６ウエル組織培養皿中のフィブロネクチンを上塗りしたカバーガラス上に、３００，０００細胞／ウエルで播いた。１２〜１６時間後、スライドをＰＢＳで１回洗浄し、氷冷１００％メタノール（ＳＬＣ３８Ａ９の検出用）で、−２０℃、１５分間の１回のステップで固定および透過処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、スライドを、５％の正常ロバ血清中の一次抗体（ＦＬＡＧ  ＣＳＴ  １：３００、ＬＡＭＰ２  １：４００）と共に１時間、室温で培養し、次いでＰＢＳで４回洗浄した後、ロバで生成した二次血清（５％の正常ロバ血清中で希釈１：４００）で４５分間、室温、暗闇中で培養し、そしてＰＢＳで４回洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用してカバーガラス上に載せ、回転ディスク共焦点システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）上に結像させた。
【００７４】
免疫蛍光イメージングによって、ＳＬＣ３８Ａ９のすべてのエピトープタグ付きイソ型はＬＡＭＰ２と共局在されたことが決定され、ＳＬＣ３８Ａ９はリソソーム膜タンパク質であることを示す（図２Ａおよび図７、ＡおよびＢ）。さらに、Ｒａｇｕｌａｔｏｒ成分が不足した二つの異なるマウスの胎仔線維芽細胞中でＳＬＣ３８Ａ９およびｌａｍｐ２を染色したが、ＳＬＣ３８Ａ９は依然としてリソソームに局在化し、そのリソソーム局在化にＲａｇｕｌａｔｏｒを必要としないことを示す。この知見と一致して、その脂質アンカーを取り除くことによってＲａｇｕｌａｔｏｒを細胞質に局在させることは、ＳＬＣ３８Ａ９のリソソーム局在化を変更しないし、また変異ＲａｇｕｌａｔｏｒはＳＬＣ３８Ａ９.１と相互作用することはない（図７Ｃ）。これらのデータは、ＳＬＣ３８Ａ９が、そのリソソームへの局在化にＮ−末端またはＲａｇｕｌａｔｏｒを必要としないリソソーム膜タンパク質であることを示す。
【００７５】
ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを調製し、以下に説明するように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質導入した。ＶＳＶ−ＧエンベロープおよびＣＭＶΔＶＰＲパッケージングプラスミドと共にｐＬＪＭ１／ｐＬＪＭ６０レンチウイルス転送ベクターを、ＸＴｒｅｍｅＧｅｎｅ９形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して、ウイルスＨＥＫ−２９３Ｔ細胞４に共形質移入してレンチウイルスを生成した。ＨｅＬａ細胞、ＬＮ２２９細胞，およびＭＥＦの感染のために、ＶＳＶ−ＧエンベロープおよびＧａｇ／Ｐｏｌパッケージングプラスミドと共にｐＭＸレトロウイルス転送ベクターを、ウイルスＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に共形質移入してレトロウイルスを生成した。形質移入後２４時間後に、培地を３０％のＩＦＣで補完したＤＭＥに交換した。形質移入後４８時間後に、ウイルスを含む上澄みを収集し、細胞を取り除くために０．４５μｍのフィルターを通した。６ウエル組織培養皿中の標的細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレンを含む培地で感染させ、２，２００回転／分で、１時間、遠心分離によってスピン感染させた。感染後２４時間後に、ウイルスを除去し、細胞を適切な抗生物質で選択した。
【００７６】
ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ３（ＴＲＣ３）から取得した、対照ｓｈＲＮＡ、およびヒトＳＬＣ３８Ａ９を標的にしたものの配列は以下（５’から３’）のとおりである：
ＳＬＣ３８Ａ９＃１：ＧＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＡ
（ＴＲＣＮ００００１５１２３８）（配列番号６）、
ＳＬＣ３８Ａ９＃２：ＣＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＡ
（ＴＲＣＮ００００１５６４７４）（配列番号７）、
ＧＦＰ：ＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣ
（ＴＲＣＮ０００００７２１８６）（配列番号８）。
【００７７】
ｓｉＲＮＡに基づく実験のために、２００，０００個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を６ウエルのプレートに播いた。２４時間後に、細胞に、ＳＬＣ３８Ａ９を標的にした、２５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）のプール、または非標のプールを有するＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を使用して、形質移入を行った。形質移入後４８時間後に、細胞に再度形質移入を行ったが、今度は、ｓｉＲＮＡを２倍の量で行った。２回目の形質移入後２４時間後に、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、上記のように、溶解して免疫ブロットを行った。以下のｓｉＲＮＡを使用した。非標的、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的プール（Ｄ−００１８１０−１０−０５）ＳＬＣ３８Ａ９：ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＬＣ３８Ａ９（Ｌ−００７３３７−０２−０００５）。
【００７８】
ＳｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによって媒介されるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９の枯渇は、その確立された基質であるリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ１）のリン酸化によって検知して、アミノ酸によるｍＴＯＲＣ１の活性化を抑制した（図２Ｂおよび７Ｄ）。したがって、Ｒａｇｕｌａｔｏｒの知られている５つのサブユニットのように、ＳＬＣ３８Ａ９.１は、エムトア複合体１の経路の正の構成要素である。理論に拘束されるわけではないが、我々は、ＳＬＣ３８Ａ９.１が、そのＮ−末端の１１９アミノ酸（「Ｒａｇｕｌａｔｏｒ結合ドメイン」）を通じて、ＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅと相互作用するリソソーム膜タンパク質であり、ｍＴＯＲＣ１の活性化に必要であると考える。
【００７９】
実施例３  ＳＬＣ３８Ａ９の過剰発現がｍＴＯＲＣ１を活性化する。
ＳＬＣ３８Ａ９がリソソームにおいてＲａｇｕｌａｔｏｒと強く相互作用することを確立したので、ｍＴＯＲＣ１の活性を制御するＳＬＣ３８Ａ９の作用を理解することを望んだ。ＳＬＣ３８ファミリーがアミノ酸の輸送に関わっていることを考慮して、ＳＬＣ３８Ａ９の過剰発現がアミノ酸に応答してｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達を調節するか否かを試験した。培地中の野生型細胞では、アミノ酸の撤去はｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達の抑制をもたらす。
【００８０】
１００万個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの培養皿に播いた。２４時間後に、細胞に、図面で示した、以下の量のｐＲＫ５ベースのｃＤＮＡ発現プラスミドで形質移入を行った：５００ｎｇのＨＡ−ｍｅｔａｐ２、５０ｎｇのＨＡ−ＬＡＭＰ１、２００ｎｇのＨＡ−ＳＬＣ３８９.１、５００ｎｇのＨＡ−ＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０、２００ｎｇのＨＡＳＬＣ３８Ａ９.４、１００ｎｇのＨＡ−ＲａgＢ Ｔ５４Ｎ  および１００ｎｇのＨＡ−ＲａgＣ  Ｑ１２０Ｌ、および２ｎｇのＦＬＡＧ−Ｓ６Ｋ１。形質移入後７２時間後に、細胞を１回洗浄し、その後５０分間、アミノ酸を含まないＲＰＭＩで培養した。細胞を、媒体またはアミノ酸で刺激し（ＲＰＭＩに相当する最終濃度まで）、その後収穫した。
【００８１】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９イソ型１の一時的または安定的な過剰発現は、細胞中のｍＴＯＲＣ１の活性の確立したレポーターである外因性Ｓ６Ｋ１のスレオニン３８９（Ｔ３９８）のリン酸化によって測定して、ｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達を完全なアミノ酸飢餓またはロイシンまたはアルギニンのみの飢餓に対して抵抗できるようにした（図３Ａおよび８Ａ）。ｍＴＯＲＣ１に対するその効果に応じて、ＳＬＣ３８Ａ９.１の過剰発現はアミノ酸飢餓によってももたらされる自食の誘発を抑制した（図８Ｃ）。
【００８２】
ＳＬＣ３８Ａ９.２、ＳＬＣ３８Ａ９.４、およびＳＬＣ３８Ａ９.１Δ１１０およびＳＬＣ３８Ａ９.１Ｉ６８Ａ変異体を含むＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇＧＴＰａｓｅと相互作用しないＳＬＣ３８Ａ９の変異体の一時的な過剰発現は、アミノ酸撤収後のｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達を維持することができなかった（図３、ＢおよびＣ，および図８Ａ）。
【００８３】
ＳＬＣ３８Ａ９.１の過剰発現は、さらに、アミノ酸の不存在下で、ＨＥＫ−２９３Ｅ，ＨｅＬａ，およびＬＮ２２９細胞中、さらにはマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）中で、発現したＳＬＣ３８Ａ９.１の量に比例する活性化の程度でｍＴＯＲＣ１を活性化した（図８Ｂ）。興味深いことに、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＲａｇｕｌａｔｏｒ結合領域だけの過剰発現は、ｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達に対する完全長タンパク質の効果を模倣し（図３Ｄ）、このことは、ＳＬＣ３８Ａ９.１の膜貫通部分から分離されたときに、活性状態を採用できるということを示す。
【００８４】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を使用してＳＬＣ３８Ａ９.１のノックアウトを調製した。以下に開示されるＳＬＣ３８Ａ９またはＡＡＶＳ１遺伝子座のＮ末端（アミノ酸１〜１１９）に設計された、このＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ガイド配列を、ｐＸ４５９にクローンした。
ＡＡＶＳ１：ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号９）
ＳＬＣ３８Ａ９＿１：ＧＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴ
（配列番号１０）
ＳＬＣ３８Ａ９＿２：ＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＣ
（配列番号１１）
【００８５】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、６ウエルのプレートに播き（７５０，０００細胞／ウエル）、１６時間後に、ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ９を使用して、上記のガイドを発現している１μｇのｐＸ４５９で形質移入を行った。４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、７２時間の間、１ｍｇ／ｍＬのピューロマイシンを適用し、数日間回復させた。細胞が集密状態に近づいたとき、３０％の血清および馴化培地を含む９６穴皿に単一細胞選別した。ＳＬＣ３８Ａ９について、クローンを拡張し、ウエスタン解析法によってそのノックアウト状態を評価した。これらのクローンは、上で説明したように、アミノ酸応答について評価した。
【００８６】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ゲノム編集技術を使用してＳＬＣ３８Ａ９を枯渇させたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、アミノ酸の刺激に反応してｍＴＯＲＣ１の活性化の部分的抑制を示した。これらのデータに基づいて、我々は、ＳＬＣ３８Ａ９がアミノ酸に応答するｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達の正の調節因子であるとの仮説を立てた。
【００８７】
実施例４  可能性のあるＳＬＣ３８Ａ９の結合パートナーの液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法による特定。
液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法によって、ＴＭＥＭ１９２（ＮＣＢＩ遺伝子番号：２０１９３１）、ＳＬＣ１２Ａ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：５６９９６）、およびＣＬＣＮ７（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１１８６）を、ＳＬＣ３８Ａ９がホモ・オリゴマー形成またはヘテロ・オリゴマー形成の少なくとも一方を行いうる潜在的タンパク質結合パートナーとして特定した。我々はＳＬＣ３８Ａ９がｍＴＯＲＣ１の上流にあるアミノ酸センサーとしてのその作用の一部として、これらの他のタンパク質の一つまたはそれ以上と結合しうるものと考える。
【００８８】
実施例５  ＳＬＣ３８Ａ９のグリコシル化分析。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＬＣ３８Ａ９の発現を解明する際に、予想したよりも高い分子量のタンパク質バンドを観察した。これは、グリコシル化した膜タンパク質について観察したパターンと似ている。したがって、ＳＬＣ３８Ａ９の配列の生物情報学的分析を行い、残基１１７、２３９、２４８、２６６および２７４がＮグリコシル化された可能性があることを見出した。理論に拘束されるわけではないが、グリコシル化が、ｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達のアミノ酸センサーおよび調節因子として、ＳＬＣ３８Ａ９の局在化および作用の役割を果たしうると考える。グリコシル化は、さらに、リソソームプロテアーゼによる裂開からＳＬＣ３８Ａ９タンパク質を保護しうる。
【００８９】
実施例６  アミノ酸によるＳＬＣ３８Ａ９とＲａｇとＲａｇｕｌａｔｏｒ間の相互作用の調節。
アミノ酸は、アミノ酸検知経路の多くの確立された成分間の相互作用を調節するので、このことがＳＬＣ３８Ａ９.１とＲａｇｕｌａｔｏｒとＲａｇ複合体についても妥当するかを試験した。
【００９０】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、フィブロネクチンで上塗りした１２ウエルプレートに播き（１５０，０００細胞／ウエル）、１２時間後に、ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ９を使用して、図面に示したように、以下の量で、ｐＲＫ５に基づいたｃＤＮＡ発現プラスミドで形質移入した：４００ｎｇのＬＡＭＰ１−ＦＬＡＧ，４００ｎｇのＦＬＡＧＳＬＣ３８Ａ９.１，４００ｎｇｎｏＳＬＣ３８Ａ２−ＦＬＡＧ，１５０ｎｇのＰＱＬＣ２−ＦＬＡＧ，および５０ｎｇのＧＦＰ。形質移入用混合試薬を空ｐＲＫ５を使用して、最大合計２μｇのＤＮＡまで取り上げた。４８時間後に、細胞を２回トランスポートバッファー（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、３０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．４、５ｍＭのグルコース）で洗浄し、３７℃で５分間トランスポートバッファーで培養し、次にアミノ酸（非標識で、合計濃度３８０μＭの０．１μＣｉの［１４Ｃ］ロイシン、または、非標識で、ＲＰＭＩで見出しうる合計濃度の０．１μＣｉの［１４Ｃ］アミノ酸混合物、または、非標識で、合計濃度３ｍＭの０．２μＣｉの［１４Ｃ］アルギニン）で補完した指定のｐＨ（ＭＥＳでバッファーされたｐＨ５，トリスでバッファーされたｐＨ８）の新鮮なバッファーと交換し、３７℃で１０分間培養して分析した。摂取後、細胞を２回、氷冷トランスポートバッファーで洗浄し、シンチレーション計数のために０．５ｍＬの１％のＳＤＳ中で収穫した。
【００９１】
実際、アミノ酸飢餓は、安定的に発現した、または内因性のＲａｇｕｌａｔｏｒと内因性のＳＬＣ３８Ａ９間（図４Ａ、図９）、および安定的に発現したＳＬＣ３８Ａ９.１と内因性のＲａｇｕｌａｔｏｒおよびＲａｇ間（図４Ｂ）の相互作用を強化した。細胞がロイシンまたはアルギニンのみを枯渇、またはそれで刺激されたときにも同様の結果を得た。奇妙にも、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＮ−末端領域は簡単にＲａｇｕｌａｔｏｒと結合するが、相互作用はアミノ酸に対して敏感ではなかった（図４Ｂ）。このことは、膜貫通領域がアミノ酸応答性を与えるために必要であることを示唆する。
【００９２】
アミノ酸飢餓は、ＲａｇＧＴＰａｓｅのヌクレオチド状態を変化させるので、ＳＬＣ３８Ａ９が、そのヌクレオチド状態をロックするＲａｇの変異体と差次的に相互作用するか否かを試験した。ＧＤＰと結合した状態を模倣するＲａｇＢＴ５４Ｎを含むエピトープタグ付きＲａｇＢ−ＲａｇＣのヘテロ二量体は、野生型ＲａｇＢを含むヘテロ二量体よりも、より多くの内因性ＳＬＣ３８Ａ９と結合した（図４Ｃ）。対照的に、ＧＴＰａｓｅを欠き、したがってＧＴＰと結合するＲａｇＢＱ９９Ｌを含むヘテロ二量体は、ＳＬＣ３８Ａ９と非常に弱く相互作用した（図４Ｃ）。したがって、Ｒａｇｕｌａｔｏｒと同様に、ＳＬＣ３８Ａ９は、ＲａｇＡ／BがＧＤＰを含むＲａｇヘテロ二量体と最もよく相互作用し、このことはＳＬＣ３８Ａ９がＲａｇｕｌａｔｏｒと結合し、およびＲａｇｕｌａｔｏｒがＲａｇＡ／BのＧＥＦであることと一貫している。これらの結果は、ＳＬＣ３８Ａ９.１のＲａｇおよびＲａｇｕｌａｔｏｒとの相互作用のアミノ酸による調節が、ＲａｇＧＴＰａｓｅのヌクレオチド状態のアミノ酸によって誘発された変化を主に反映することを示唆する。ＲａｇＢ変異は、Ｒａｇｕｌａｔｏｒよりも、ＲａｇＧＴＰａｓｅのＳＬＣ３８Ａ９との相互作用に対してより大きな効果を有するので（図４Ｃで、ＳＬＣ３８Ａ９ブロットとｐ１４およびｐ１８のそれらと比較すること）、Ｒａｇヘテロ二量体が、ＲａｇとＳＬＣ３８Ａ９との相互作用の安定性に影響するＳＬＣ３８Ａ９との、Ｒａｇｕｌａｔｏｒから独立した接触をする可能性が非常に高い。
【００９３】
実施例６  ＳＬＣ３８Ａ９.１はアミノ酸輸送体である。
ＳＬＣ３８Ａ９.１があまりにも高く発現したためにその一部が原形質膜に到達した生きた細胞中で、ＳＬＣ３８Ａ９.１によって媒介されたアミノ酸輸送、またはアミノ酸によって誘発されたナトリウムの流れを検出することはできなかった（図１０、Ａ〜Ｅ）。これらの実験は、それぞれ、内因性の輸送体の存在によって混乱させられ、または輸送の間接的な測定に依存したので、放射性標識されたアミノ酸の輸送を直接分析するために、ＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９−Δ１１０をリポソームに再構成した。
【００９４】
ＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９.１を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、上で説明したように、免疫沈降のために収穫した。ただし、細胞は、４０ｍＭの  へぺス，ｐＨ７．４，０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ，およびプロテアーゼ阻害剤中で溶解した。３時間の免疫沈降後に、ＦＬＡＧ親和性ビーズを２回、各５分間、５００ｍＭのＮａＣｌで補完した溶解バッファーで洗浄した。ビーズを、１０％のグリセロールで補完した内部バッファー（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５、９０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ）で、５回洗浄して平衡させた。ＦＬＡＧ親和性精製済みＳＬＣ３８Ａ９.１タンパク質を、１ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドを含むグリセロールで補完した内部バッファーで、３０分間、回転して溶出した。タンパク質を、アミコン遠心分離フィルターを使用して約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【００９５】
ＳＬＣ３８Ａ９−Δ１１０の精製は以下のように行った。一時的にＨｉｓ−ＳＬＣ３８Ａ９−Δ１１０で形質移入した２９３Ｆ細胞の２リットルの懸濁液をペレットにし、生成した細胞ペーストに対して、２５ｍＭのトリス，１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５中で、ダウンス型ホモジナイザーを使用して３ラウンドの均質化を行い、次に超遠心分離を行った。この３ラウンドの後に、生成した細胞ペレットに対して、２５ｍＭのトリス，１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５中で、ダウンス型ホモジナイザーを使用してさらに３ラウンドの均質化を行い、次に超遠心分離を行った。次に、生成したペレットを、２５ｍＭのへぺス，１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２％のＤＤＭ，ｐＨ７．５（および、プロテアーゼ阻害錠）中に懸濁させて一晩培養し、そして超遠心分離を行い、生成した上澄みを収集した。生成した上澄みから、コバルト親和カラムによってＨｉｓ−ＳＬＣ３８Ａ９−Δ１１０を精製し、２５０ｍＭのイミダゾール、２５ｍＭのへぺス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．０５％のＤＤＭ，ｐＨ７．５中に溶出した。
【００９６】
リポソームを形成させるために、クロロホルムに溶解したホスファチジルコリン（ＰＣ、５０ｍｇ）を、丸底フラスコに脂質膜を作り出すために乾燥窒素を使用して蒸発させ、一晩、真空で乾燥させた。脂質を、水浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｍ２８００Ｈ）中の光超音波処理によって５０ｍｇ／ｍＬの内部バッファー中で水和させ、エッペンチューブ中に１００μＬのアリコートごとに分割した。アリコートした脂質を水浴超音波処理によって清澄化し、組み換え、そして１５のパスを有する１００ｎｍの膜（Ａｖａｎｔｉ  ６１０００）を通して押し出した。再構成反応（７００μＬまでの内部バッファー中の、１５μｇのＦＬＡＧ−ＳＬＣ３８Ａ９.１タンパク質、または１５μｇのＨｉｓ−ＳＬＣ３８Ａ９−Δ１１０、７．５ｍｇ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍｇの押し出されたＰＣ、１ｍＭのＤＴＴ）を、４℃で３０分間、回転して開始した。リポソームだけの対照中のＳＬＣ３８Ａ９.１タンパク質の代わりに、グリセロールで補完した内部バッファーを使用した。バイオビーズ（２００ｍｇ／反応）を、メタノール中で１回、水中で５回、そして内部バッファー中で２回洗浄して調製した。再構成反応をバイオビーズに１時間行い、一晩で新鮮なバイオビーズに転換し、そして再度新鮮なバイオビーズに１時間、転換した。
【００９７】
アミノ酸輸送を分析するために、すべてのバッファーは冷やされ、分析は４℃の低温の部屋で行われた。経時変化実験のために、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはリポソーム対照を、外部バッファー（２０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４，１００ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化したＰＤ１０カラムに適用し、製造者の指示にしたがい溶出した。アミノ酸の摂取は、０．５μＭ［３Ｈ］アルギニンを添加して開始し、３０℃の水浴で培養した。時点を、分析反応の一部を取り上げて、それを外部バッファーで事前に平衡化したＰＤ１０カラムに適用して収集した。カラムを少量ずつ、または１．７５ｍＬの単一溶出で溶出し、５ｍＬのシンチレーション液に加えた。アミノ酸濃度の正確な測定値を得るために、等しい体積の外部バッファーを標準器中のシンチレーション液に加えた。
【００９８】
非標識のアミノ酸との競合実験のために、ＳＬＣ３８Ａ９.１のインポート活性の高いＫｍ（約３９ｍＭ）のために高濃度のアミノ酸が必要であった。ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはリポソーム対照を、１００，０００ｇで、３０分間、ＴＬＡ−１００．３ローターで遠心分離し、それらを外部バッファー成分で補完した１００ｍＭの非標識のアミノ酸（最終濃度）のより大きい体積に加えることができるように、外部バッファーのより小さい体積中に再懸濁した。約１３０ｍＭというロイシンの溶解度の限界のためにこの手順を用いなければならなかった。このような高い濃度では、すべてのアミノ酸溶液のｐＨを７．４に調節することが重要である。アッセイを、０．５μＭ［３Ｈ］アルギニンをアミノ酸バッファー溶液に添加して開始し、次に、ＳＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはリポソーム対照を添加した。
【００９９】
定常反応速度実験のために、時点を上で説明したように収集し、基質特異性を評価するために、７５分時点で競合実験を収集した。流出実験のために、上で説明したように、重要な分析には、ＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームまたはリポソーム対照に、１．５時間、［３Ｈ］アルギニンを含ませた。外部アミノ酸を除去するためには、この反応を、外部バッファーで事前に平衡化したＰＤ１０カラムに適用し、上で説明したように、時点を収集した。リポソーム対照からのシンチレーション計数を、ＬＣ３８Ａ９.１プロテオリポソームからのそれから差し引いた。
【０１００】
リポソームの中に、一方向的に挿入されたアフィニティー精製したＳＬＣ３８Ａ９.１またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０は、それぞれ放射性標識されたアルギニンの経時的な摂取を示した一方、ＬＡＭＰ１を含むものは、リポソームとして同様の量のアルギニンと相互作用した（図５Ａ、図１１、図１０Ｆ）。定常動態実験は、ＳＬＣ３８Ａ９.１が約３９ｍＭのミカエリス定数（Ｋｍ）および約１．８分−１の触媒率定数（ｋｃａｔ）を有することを明らかにし、（図５Ｂ）ＳＬＣ３８Ａ９.１が、低親和性アミノ酸輸送体であることを示す。ＳＬＣ３８Ａ９.１は、さらに、プロテオリポソームからアルギニンを流出させることができる（図５Ｃ）が、そのリポソームにおける方向のために、この活性のための正確なＫｍおよびｋｃａｔの測定値を得ることは不可能である。輸送体を「後ろ向き」の方向で分析しなければならないことによって、リポソームからのアミノ酸のエキスポートの間、輸送体のアミノ酸に対する親和性を過小評価しているものと思われる。
【０１０１】
ＳＬＣ３８Ａ９.１の基質特異性を評価するために、非標識アミノ酸を使用して競合実験を行った（図５Ｄ）．正に荷電したアミノ酸ヒスチジンおよびリジンは、アルギニンと同じ程度、放射性標識されたアルギニン輸送体と競合したが、ロイシンはあまり大きくない効果を示し、グリシンは最も効果的ではない競合体であった。したがって、ＳＬＣ３８Ａ９.１は、極性アミノ酸に対する選好について、比較的、特異性のない基質の特徴を有しているように思われる。
【０１０２】
ＳＬＣ３８Ａ９.１のアルギニン輸送に対する選好、およびアルギニンがネズミの肝臓リソソームおよびイースト液胞中で濃度が高いということを考慮して、我々は、ＳＬＣ３８Ａ９.１がｍＴＯＲＣ１に対してアルギニンレベルを伝送するのに重要な役割を果たしているか否かを疑問として持った。この目標に向けて、上の実施例４で説明したように、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９のゲノム編集を使ってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のＳＬＣ３８Ａ９をノックアウトした、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中のアルギニンまたはロイシンの様々な濃度にｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達がどのように応答するかを調査した。興味深いことに、アルギニンによるｍＴＯＲＣ１の活性化は、ＳＬＣ３８Ａ９ノックアウト中のすべてのアルギニン濃度で強く抑制されたが、一方、ロイシンに対する応答は、単に鈍くなっただけだったので、ロイシンの高い濃度はヌル細胞および対照細胞中でｍＴＯＲＣ１を等しくよく活性化した（図５Ｆ）。
【０１０３】
上で説明した知見に基づいて、また理論に拘束されるわけではないが、ＳＬＣ３８Ａ９がナトリウムおよび特定のアミノ酸と結合し、それに応答して、ｍＴＯＲＣ１のＲａｇｕｌａｔｏｒとの相互作用を通じてｍＴＯＲＣ１の活性化をもたらす形態の変化を受けるのではないかと考える。アミノ酸の基質特異性に関しては、ＳＬＣ３８Ａ９がロイシン、アルギニン、リジン、またはこれらの天然および／または合成の誘導体の少なくとも一つのようなｍＴＯＲＣ１にとって重要なアミノ酸と結合すると考える。しかし、ＳＬＣ３８Ａ９.１が、ｍＴＯＲＣ１の経路のためのリソソームベースのアルギニンセンサーとしての有力な候補者であると考える。ＳＬＣ３８Ａ９によるアミノ酸の結合は、アミノ酸がリソソーム膜を透過して輸送されることをもたらしうる。他のＳＬＣ３８ファミリーメンバーのｐＨに対する感度、さらにはｍＴＯＲＣ１によるアミノ酸検知のｐＨに対する感度を考慮すると、リソソーム内ｐＨを増加させると、ｍＴＯＲＣ１に対するＳＬＣ３８Ａ９のシグナル伝達を阻害する可能性があり、一方、リソソームのｐＨの変動は、ｍＴＯＲＣ１に対するＳＬＣ３８Ａ９の活性を調節するのに重要でありうると考える。さらには、ＳＬＣ３８ファミリーの特徴であるナトリウムの結合部位が、ＳＬＣ３８Ａ９に存在する。したがって、このナトリウムの結合部位が、リソソーム膜においてナトリウム電流を伝導し、かかる電流がアミノ酸によって調節され、ｍＴＯＲＣ１の作用にとって重要でありうると推測する。
【０１０４】
実施例７  ＳＬＣ３８Ａ９または配列番号１のアミノ酸１〜１１９とＲａｇＣ／Ｂヘテロ二量体またはＲａｇｕｌａｔｏｒとの相互作用を測定するアッセイ。
ｍＴＯＲＣ１の活性を調節する試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９.１（または配列番号１のアミノ酸１〜１１９）およびＲａｇヘテロ二量体間の相互作用に対するｍＴＯＲＣ１の活性の効果を決定するアッセイによって特定できる。試験化合物は、以下のいずれかを安定的に発現している培養された細胞株で、一定期間培養させる：
（ｉ）内因性ＳＬＣ３８Ａ９.１、およびＲａｇヘテロ二量体もしくはＲａｇｕｌａｔｏｒ成分のいずれか一方、または
（ｉｉ）エピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９.１（または配列番号１のアミノ酸１〜１１９）および／またはエピトープタグ付きＲａｇＡもしくはＲａｇＢもしくはＲａｇＣもしくはＲａｇＤの少なくとも一つ、またはエピトープタグ付きＲａｇｕｌａｔｏｒ成分（ｐ１８、ＭＰ１，ｐ１４、ＨＢＸＩＰ，Ｃ７またはｆ５９）の少なくとも一つの組合せであり、当該タグは、外因性アミノ酸がｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達を調節することを妨げることはない。
【０１０５】
当該技術分野で説明されているように（Ｓａｎａｋ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １４１，  ２９０−３０３，  Ａｐｒｉｌ  １６，  ２０１０）、化合物を処理した後に、細胞を溶解し、内因性またはエピトープタグ付きＲａｇまたはＲａｇｕｌａｔｏｒ成分を免疫沈降する。その後、上で説明したように、試料を脱グリコシルし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理し、そして内因性またはエピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９.１またはエピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９.１または配列番号１のエピトープタグ付きアミノ酸１〜１１９について免疫ブロットする。
【０１０６】
本アッセイの別の実施形態においては、当該技術分野で記載れているように（Ｄａｎｉｅｌｅ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４，  ＡＲｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  ４７４９，  ２０１４）、内因性またはエピトープタグ付きＲａｇまたはＲａｇｕｌａｔｏｒは、適切な抗体によって固定された表面上に捕捉し、次いで内因性またはエピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９.１または配列番号１のアミノ酸１〜１１９について、サンドイッチＥＬＩＳＡを行う。
【０１０７】
本アッセイのさらなる別のバージョンにおいては、当該技術分野で記載されているように（  ｈｔｔｐ：／／ｃｓｍｅｄｉａ２．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ／ｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ｅｌｉｓａ５．ｐｄｆ参照）、このＥＬＩＳＡは、蛍光または発光基質のいずれかで行われる。
【０１０８】
本実施例７に記載されるこのアッセイは、すべてのアミノ酸に対して飢餓している細胞、アルギニンに対して飢餓している細胞、すべてのアミノ酸に対して飢餓し、かつすべてのアミノ酸に刺激された細胞、アルギニンに対して飢餓し、かつアルギニンに刺激された細胞、および／またはすべてのアミノ酸に対して飢餓し、かつアルギニンに刺激された細胞の少なくとも一つで行われる。
【０１０９】
実施例８  ＳＬＣ３８Ａ９の活性の調節剤を特定するためのアッセイ
Ａ．ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０の原形質膜への局在化。
生きた細胞に対して行うある特定の分析は、ＳＬＣ３８Ａ９の原形質膜への発現および局在化を必要とする。ＳＬＣ３８Ａ９を原形質膜へ局在化するためには、ＳＬＣ３８Ａ９のＮまたはＣ末端が、Ｈ−Ｒａｓの最後の２５個のアミノ酸（ＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ）に融合される。
あるいは、Ｈ−Ｒａｓのこの２５個のアミノ酸部分は、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０のような、アミノ酸に結合し、アミノ酸を膜を透過して輸送できる、いずれのペプチドまたはポリペプチド断片またはＳＬＣ３８Ａ９の変異体のＮまたはＣ末端に融合できる。そのような融合タンパク質は、原形質膜を標的にし、そこで発現する。      
【０１１０】
あるいは、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０のような、アミノ酸に結合し、アミノ酸を膜を透過して輸送できる、ＳＬＣ３８Ａ９のリソソーム局在配列またはいずれのＳＬＣ３８Ａ９のペプチドまたはポリペプチド断片または変異体も、変異誘発される。当該技術分野で示されるように（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．４３４（２）、２１９−３１，２０１１）、これは生成したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を原形質膜を標的とするものでもある。
【０１１１】
上で説明したいずれの構成物も、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のような最適な細胞株中で一時的に形質移入され、または安定的に発現されたもので
【０１１２】
Ｂ．放射性標識された基質摂取アッセイ
当該技術分野で説明されるように（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４、５５５９−５５６９，１９９４）、放射性標識された基質摂取分析を、ＳＬＣ３８Ａ９、またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０のような、アミノ酸に結合し、アミノ酸を膜を透過して輸送できる、ＳＬＣ３８Ａ９の任意のペプチドまたはポリペプチド断片またはの変異体を発現している接着細胞または懸濁細胞において行う。簡潔に述べると、試験化合物の存在または不存在下、室温で、放射性標識されたアミノ酸基質を添加する前、またはそれと同時に、ある期間、細胞をダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で培養する。ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０の輸送の試験のために、トリチウム標識された（３Ｈ）−アルギニン、（３Ｈ）−ヒスチジンおよび（３Ｈ）−リジンに対して、異なる濃度で、異なる期間、輸送を評価する。分析の終了時に、接着細胞を、氷冷Ｄ−ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％のＳＤＳ中で可溶化し、シンチレーション計数のために適切なシンチレーション液中で処理する（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ）。懸濁細胞については、分析の終了時に、懸濁液をＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆマイクロファイバー・フィルタ(または同様の型のフィルター）に通し、洗浄し、標準的な方法でシンチレーション計数のための処理をする。これらの実験の値は、基質の親和定数を計算するために使用することができる。より低いシンチレーション計数をもたらす化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤とみなされ、一方、シンチレーション計数を増加させた化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９作動薬とみなす。
【０１１３】
Ｃ．蛍光基質摂取アッセイ
ＳＬＣ３８Ａ９のために蛍光的に標識されたアミノ酸基質の輸送も、完全細胞で測定する。分析は、３Ｈ基質摂取について説明したところと同じであり、試験化合物は、蛍光アミノ酸基質の前、またはそれと同時に添加される。当該技術分野において行われているように（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９、１６８−１７６，２００８）、分析の終了時、細胞が取り込んだ蛍光基質の量を、蛍光マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって測定する。化合物に応答した基質摂取の変化は、細胞内蛍光強度の変化によって測定する。
【０１１４】
Ｄ．完全細胞に基づくシンチレーション近接アッセイ
最新の当該技術に従って（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６６（２）、１１７−２５，２００７）、原形質膜に局所化したＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を発現する細胞による３Ｈ基質摂取の実時間解析は、シンチラントを上塗りした９６ウエルまたは３８４ウエルの組織培養処理済みマイクロウエルプレート（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔプレート）を使用して達成する。簡潔に述べると、接着細胞または懸濁細胞をシンチレーティングマイクロウエルプレート中に密集するまで成長させ、異なる濃度の３Ｈ−アミノ酸基質を含むハンクの平衡塩類溶液またはＤ−ＰＢＳで洗浄および培養する。試験化合物を、３Ｈ基質の前、またはそれと同時に細胞を含むウエルに種々の濃度で添加する。放射性標識された基質の実時間摂取を、９６ウエルまたは３８４ウエルのプレートからのシグナルを読むことができる光電子増倍管に基づく放射性測定検知器中にを置くことで所与の時間量で測定する。
【０１１５】
Ｅ．ナトリウム輸送を探知するための蛍光に基づく輸送体分析試料
ＳＬＣ３８Ａ９はナトリウム依存性のアミノ酸輸送体のファミリーに属し、ナトリウムに配位結合し輸送をするために必要なアミノ酸を含む。ナトリウムの摂取を検知する輸送体分析は、ナトリウム結合ベンゾフラン・イソフタル酸塩（ＳＢＦＩ）のようなナトリウム感知蛍光染料を使用して行う（Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４（３２）、１９４４９−５７，１９８９）、ＣｏｒｏＮａ  Ｇｒｅｅｎ  （Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４９８、２９５−３０７，１９９７）、またはＡｓａｎｔｅ  ＮａＴｒＩＵＭ  Ｇｒｅｅｎ  １（ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５８：２、５７２−５７８，２０１１）。簡潔に述べると、原形質膜においてＳＬＣ３８Ａ９、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０、または対照タンパク質を発現している細胞は、当該技術分野において決定されているように（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｃｚｙｍｏｌ、１９２、３８−８１，１９９０）、ナトリウム感知蛍光染料の細胞膜浸透性のアセトキシメチル・エステルを事前に含めており、洗浄し、種々の濃度の試験化合物と共に、そして基質アミノ酸および塩化ナトリウムの前、またはそれと同時に培養する。原形質膜に局在されるＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を過剰発現している細胞を、陰性対照タンパク質を発現している細胞と比較するとき、アミノ酸基質と塩化ナトリウムと共に培養時の蛍光シグナルの増加は、ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を通じた輸送のためにナトリウム摂取の増加を示す。蛍光強度の変化は、フローサイトメトリー、蛍光マイクロプレートまたはスペクトロ蛍光光度計によって測定することができる。
【０１１６】
Ｆ．膜電位アッセイ
ＳＬＣ３８Ａ９による膜を透過するナトリウムの輸送は、膜電位の変化をももたらしうる。細胞と共に前培養するとき、膜タンパク質の変化を蛍光の変化によって測定することを可能にする複数の染料（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＦＬＩＰＲ膜電位染料）が入手可能である。簡潔に述べると、接着細胞を、黒い不透明のマイクロウエルプレート中で増殖させ、洗浄し、ハンクの平衡塩類溶液および膜電位染料中で、細胞に染料が入ることができるように十分な期間培養する。次いで細胞は試験化合物と共に培養される。試験化合物と共に培養した後に、染料が入った細胞プレートは、ＦＬＩＰＲワークステーションに装着され、これによって、アミノ酸基質と塩化ナトリウムの添加時の原形質膜の電位の変化を実時間で探知できる（Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６：２、２００８）。基質と塩化ナトリウムと共に培養時の膜電位の変化を防ぐ試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤とみなされ、一方、より大きな膜の脱分極をもたらす化合物はＳＬＣ３８Ａ９の作動薬とみなされる。
【０１１７】
Ｇ．全細胞パッチクランプ
ＳＬＣ３８Ａ９によるアミノ酸とナトリウムの輸送は、全細胞パッチクランプによって探知できる電流を発生しうる。原形質膜においてＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を過剰発現しているニューロンまたは細胞を、最初アミノ酸飢餓させたのちホウケイ酸ガラス製記録ピペット（３〜５μＭ）を用いて全細胞パッチクランプを受ける。外部および内部の溶液は、当該技術分野に記載されているように（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，  ２８４，１１２２４−１１２３６，２００９）、ＳＬＣ３８ファミリーのナトリウム依存性、アミノ酸輸送体からの記録電流に適合できるように製剤される。微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の周波数および振幅は、（-７０ｍＶの保持電位の）電位固定下、試験化合物の存在または不存在下、および外部溶液中のアミノ酸基質の存在または不存在下で記録される。興奮性電流の振動数および振幅をその後減少させる化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤とみなされ、一方、興奮性電流の振動数および振幅を増加させる化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の作動薬とみなされる。
【０１１８】
Ｈ．リソソーム内パッチクランプ
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質と融合する野生型ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を発現している細胞から分離したリソソーム内の直接パッチングを、当該技術技術分野に記載されるように用いる（Ｃｅｌｌ１５２（４）：７７８−７９０，２０１３）。簡潔に述べると、蛍光タンパク質に融合したＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を発現している細胞を、原形質膜で切断し、ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０の蛍光染色によって特定されるリソソームは、パッチクランプ記録のために押し出される。サイトゾルおよび管腔バッファーが、他のＳＬＣ３８ファミリーメンバーの活性を測定するための、当該技術に従って製剤され（Ｃｅｌｌ  １５２（４）：７７８−７９０，２０１３）、興奮性記録は、ＳＬＣ３８Ａ９基質の存在または不存在で、および試験化合物の存在または不存在下で取られる。クランプからの興奮性シグナルを調節する試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の調節剤とみなされる。
【０１１９】
Ｉ．卵母細胞に基づく輸送体アッセイ
ゼノパス卵母細胞を、当該技術に従って（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：２０５００−２０５１１，２０１１）単離し、ＳＬＣ３８Ａ９、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０または対照タンパク質の原形質膜に指令された形に対応するインビトロで転写されたｍＲＮＡを微量注入する。生成される卵母細胞は、９６ウエルプレート中に置かれ、クレブス・リンガーへぺス（ＫＲＨ）バッファーと共に培養される。この卵母細胞は、非標識および３Ｈ標識のアミノ酸基質および塩化ナトリウムの組合せの前に、またはそれと同時に試験化合物とともに、３０℃で１時間培養され、その後、冷ＫＲＨバッファーの添加によってアッセイを終了する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：２０５００−２０５１１，２０１１）。終了後、細胞を１０％のＳＤＳ中に溶解し、放射性標識されたアミノ酸の摂取の定量化のためにシンチレーションチューブに移される。３Ｈ基質の摂取を阻害した化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤とみなされ、一方、３Ｈ基質の摂取を増加させた化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の作動薬とみなされる。
【０１２０】
Ｊ．シンチレーション近接アッセイ
放射性標識されたアミノ酸基質のＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０への結合は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して測定される。簡潔に述べると、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＳＬＣ３８Ａ９またはＮ末端Ｈｉｓタグ付きＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０が、発光物質を含む銅キレートフルオロ微小球体ビーズ上に固定される。次いで、放射性標識された基質結合分析を、当該技術分野で記載されているように（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、７：９、１５６９−１５７８、２０１２）、このたんぱく質とビーズの複合体と適切な対照とで行なう。試験化合物は、放射性基質の前またはそれと同時に添加される。シンチレーション計数を減少させる化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９の阻害剤とみなされ、一方、放射性標識された基質の結合を増加させた化合物はＳＬＣ３８Ａ９の作動薬とみなされる。
【０１２１】
Ｋ．ナノディスクに基づく直接結合アッセイ
ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０は、当該技術で記載されているように（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８４（９）：１７２１−７、２０１０）、ナノディスクに組み立てられる。一旦、ナノディスクに組み立てられると、このポリペプチドは、以下のものを含む、小分子およびアミノ酸基質の直接結合を評価する広範な生物物理学的分析法に適するようになる。
１．固体相表面プラズモン共鳴法
ＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を含むナノディスクが、直接的なアミンカップリングによるか、またはナノディスクまたはＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０のＮ末端に融合した結合タグを通じて、マトリックスプレート上に固定される。一旦固定されると、小分子の結合は、前に以前に記載されたように評価される（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０８，４６−５２，２０１１）。
２．小分子の結合の溶液相測定
Ｎ末端エピトープタグ付きＳＬＣ３８Ａ９またはＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０を含むナノディスクが、一定期間、試験化合物と培養される。タンパク質を含むナノディスクは免疫沈降され、溶液中に残存している小分子は質量分析法による分析を受ける。これは、ＳＬＣ３８Ａ９を含むナノディスクとの培養の際に枯渇されるが、陰性の対照タンパク質を含むものとでは枯渇されない小分子の検出および特定を可能にする。溶液からの化合物の枯渇の程度は、タンパク質に対する試験化合物の親和性と相関する。
配列
配列番号１
>ｇi│２２２４１８６２９│ref│ＮＰ＿７７５７８５．２│  推定ナトリウム結合中性アミノ酸輸送体９イソ型１［ホモ・ピエンス］
ＭＡＮＭＮＳＤＳＲＨＬＧＴＳＥＶＤＨＥＲＤＰＧＰＭＮＩＱＦＥＰＳＤＬＲＳＫＲＰＦＣＩＥＰＴＮＩＶＮＶＮＨＶＩＱＲＶＳＤＨＡＳＡＭＮＫＲＩＨＹ
ＹＳＲＬＴＴＰＡＤＫＡＬＩＡＰＤＨＶＶＰＡＰＥＥＣＹＶＹＳＰＬＧＳＡＹＫＬＱＳＹＴＥＧＹＧＫＮＴＳＬＶＴＩＦＭＩＷＮＴＭＭＧＴＳＩＬＳＩＰＷ
ＧＩＫＱＡＧＦＴＴＧＭＣＶＩＩＬＭＧＬＬＴＬＹＣＣＹＲＶＶＫＳＲＴＭＭＦＳＬＤＴＴＳＷＥＹＰＤＶＣＲＨＹＦＧＳＦＧＱＷＳＳＬＬＦＳＬＶＳＬＩ
ＧＡＭＩＶＹＷＶＬＭＳＮＦＬＦＮＴＧＫＦＩＦＮＦＩＨＨＩＮＤＴＤＴＩＬＳＴＮＮＳＮＰＶＩＣＰＳＡＧＳＧＧＨＰＤＮＳＳＭＩＦＹＡＮＤＴＧＡＱＱ
ＦＥＫＷＷＤＫＳＲＴＶＰＦＹＬＶＧＬＬＬＰＬＬＮＦＫＳＰＳＦＦＳＫＦＮＩＬＧＴＶＳＶＬＹＬＩＦＬＶＴＦＫＡＶＲＬＧＦＨＬＥＦＨＷＦＩＰＴＥＦ
ＦＶＰＥＩＲＦＱＦＰＱＬＴＧＶＬＴＬＡＦＦＩＨＮＣＩＩＴＬＬＫＮＮＫＫＱＥＮＮＶＲＤＬＣＩＡＹＭＬＶＴＬＴＹＬＹＩＧＶＬＶＦＡＳＦＰＳＰＰＬ
ＳＫＤＣＩＥＱＮＦＬＤＮＦＰＳＳＤＴＬＳＦＩＡＲＩＦＬＬＦＱＭＭＴＶＹＰＬＬＧＹＬＡＲＶＱＬＬＧＨＩＦＧＤＩＹＰＳＩＦＨＶＬＩＬＮＬＩＩＶＧ
ＡＧＶＩＭＡＣＦＹＰＮＩＧＧＩＩＲＹＳＧＡＡＣＧＬＡＦＶＦＩＹＰＳＬＩＹＩＩＳＬＨＱＥＥＲＬＴＷＰＫＬＩＦＨＶＦＩＩＩＬＧＶＡＮＬＩＶＱＦＦＭ
配列番号２
>ｇi │２３２７３８１３│ｇｂ│ＡＡＨ３６３０１．１│ＴＭＥＭ１９２タンパク質［ホモ・ピエンス］
ＭＡＡＧＧＲＭＥＤＧＳＬＤＩＴＱＳＩＥＤＤＰＬＬＤＡＱＬＬＰＨＨＳＬＱＡＨＦＲＰＲＦＨＰＬＰＴＶＩＩＶＮＬＬＷＦＩＨＬＶＦＶＶＬＡＦＬＴＧＶ
ＬＣＳＹＰＮＰＮＥＤＫＣＰＧＮＹＴＮＰＬＫＶＱＴＶＩＩＬＧＫＶＩＬＷＩＬＨＬＬＬＥＣＹＩＱＹＨＨＳＫＩＲＮＲＧＹＮＬＩＹＲＳＴＲＨＬＫＲＬＡ
ＬＭＩＱＳＳＧＮＴＶＬＬＬＩＬＣＭＱＨＳＦＰＥＰＧＲＬＹＬＤＬＩＬＡＩＬＡＬＥＬＩＣＳＬＩＣＬＬＩＹＴＶＫＩＲＲＦＮＫＡＫＰＥＰＤＩＬＥＥＥ
ＫＩＹＡＹＰＳＮＩＴＳＥＴＧＦＲＴＩＳＳＬＥＥＩＶＥＫＱＧＤＴＩＥＹＬＫＲＨＮＡＬＬＳＫＲＬＬＡＬＴＳＳＤＬＧＣＱＰＳＲＴ
配列番号３
>ｇi │７４７５２４３５│ｓｐ│Ｑ９ＢＸＰ２．１│Ｓ１２Ａ９＿ＨＵＭＡＮ  溶質輸送体ファミリー１２メンバー９
ＭＡＳＥＳＳＰＬＬＡＹＲＬＬＧＥＥＧＶＡＬＰＡＮＧＡＧＧＰＧＧＡＳＡＲＫＬＳＴＦＬＧＶＶＶＰＴＶＬＳＭＦＳＩＶＶＦＬＲＩＧＦＶＶＧＨＡＧＬＬ
ＱＡＬＡＭＬＬＶＡＹＦＩＬＡＬＴＶＬＳＶＣＡＩＡＴＮＧＡＶＱＧＧＧＡＹＦＭＩＳＲＴＬＧＰＥＶＧＧＳＩＧＬＭＦＹＬＡＮＶＣＧＣＡＶＳＬＬＧＬＶ
ＥＳＶＬＤＶＦＧＡＤＡＴＧＰＳＧＬＲＶＬＰＱＧＹＧＷＮＬＬＹＧＳＬＬＬＧＬＶＧＧＶＣＴＬＧＡＧＬＹＡＲＡＳＦＬＴＦＬＬＶＳＧＳＬＡＳＶＬＩＳ
ＦＶＡＶＧＰＲＤＩＲＬＴＰＲＰＧＰＮＧＳＳＬＰＰＲＦＧＨＦＴＧＦＮＳＳＴＬＫＤＮＬＧＡＧＹＡＥＤＹＴＴＧＡＶＭＮＦＡＳＶＦＡＶＬＦＮＧＣＴＧ
ＩＭＡＧＡＮＭＳＧＥＬＫＤＰＳＲＡＩＰＬＧＴＩＶＡＶＡＹＴＦＦＶＹＶＬＬＦＦＬＳＳＦＴＣＤＲＴＬＬＱＥＤＹＧＦＦＲＡＩＳＬＷＰＰＬＶＬＩＧＩ
ＹＡＴＡＬＳＡＳＭＳＳＬＩＧＡＳＲＩＬＨＡＬＡＲＤＤＬＦＧＶＩＬＡＰＡＫＶＶＳＲＧＧＮＰＷＡＡＶＬＹＳＷＧＬＶＱＬＶＬＬＡＧＫＬＮＴＬＡＡＶ
ＶＴＶＦＹＬＶＡＹＡＡＶＤＬＳＣＬＳＬＥＷＡＳＡＰＮＦＲＰＴＦＳＬＦＳＷＨＴＣＬＬＧＶＡＳＣＬＬＭＭＦＬＩＳＰＧＡＡＧＧＳＬＬＬＭＧＬＬＡＡ
ＬＬＴＡＲＧＧＰＳＳＷＧＹＶＳＱＡＬＬＦＨＱＶＲＫＹＬＬＲＬＤＶＲＫＤＨＶＫＦＷＲＰＱＬＬＬＬＶＧＮＰＲＧＡＬＰＬＬＲＬＡＮＱＬＫＫＧＧＬＹ
ＶＬＧＨＶＴＬＧＤＬＤＳＬＰＳＤＰＶＱＰＱＹＧＡＷＬＳＬＶＤＲＡＱＶＫＡＦＶＤＬＴＬＳＰＳＶＲＱＧＡＱＨＬＬＲＩＳＧＬＧＧＭＫＰＮＴＬＶＬＧ
ＦＹＤＤＡＰＰＱＤＨＦＬＴＤＰＡＦＳＥＰＡＤＳＴＲＥＧＳＳＰＡＬＳＴＬＦＰＰＰＲＡＰＧＳＰＲＡＬＮＰＱＤＹＶＡＴＶＡＤＡＬＫＭＮＫＮＶＶＬＡ
ＲＡＳＧＡＬＰＰＥＲＬＳＲＧＳＧＧＴＳＱＬＨＨＶＤＶＷＰＬＮＬＬＲＰＲＧＧＰＧＹＶＤＶＣＧＬＦＬＬＱＭＡＴＩＬＧＭＶＰＡＷＨＳＡＲＬＲＩＦＬ
ＣＬＧＰＲＥＡＰＧＡＡＥＧＲＬＲＡＬＬＳＱＬＲＩＲＡＥＶＱＥＶＶＷＧＥＧＡＧＡＧＥＰＥＡＥＥＥＧＤＦＶＮＳＧＲＧＤＡＥＡＥＡＬＡＲＳＡＮＡＬ
ＶＲＡＱＱＧＲＧＴＧＧＧＰＧＧＰＥＧＧＤＡＥＧＰＩＴＡＬＴＦＬＹＬＰＲＰＰＡＤＰＡＲＹＰＲＹＬＡＬＬＥＴＬＴＲＤＬＧＰＴＬＬＶＨＧＶＴＰＶＴ
ＣＴＤＬ
配列番号４
>ｇi │１２６４４３０１│ｓｐ│Ｐ５１７９８．２│ＣＬＣＮ７＿ＨＵＭＡＮ  Ｆｕｌｌ＝Ｈ（+）／Ｃｌ（−）交換輸送体７、ＡｌｔＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝塩化物チャネル７  アルファ  サブユニット、ＡｌｔＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝塩化物チャネル  タンパク質７、Ｓｈｏｒｔ＝ＣｌＣ−７  
ＭＡＮＶＳＫＫＶＳＷＳＧＲＤＲＤＤＥＥＡＡＰＬＬＲＲＴＡＲＰＧＧＧＴＰＬＬＮＧＡＧＰＧＡＡＲＱＳＰＲＳＡＬＦＲＶＧＨＭＳＳＶＥＬＤＤＥＬＬＤ
ＰＤＭＤＰＰＨＰＦＰＫＥＩＰＨＮＥＫＬＬＳＬＫＹＥＳＬＤＹＤＮＳＥＮＱＬＦＬＥＥＥＲＲＩＮＨＴＡＦＲＴＶＥＩＫＲＷＶＩＣＡＬＩＧＩＬＴＧＬＶ
ＡＣＦＩＤＩＶＶＥＮＬＡＧＬＫＹＲＶＩＫＧＮＩＤＫＦＴＥＫＧＧＬＳＦＳＬＬＬＷＡＴＬＮＡＡＦＶＬＶＧＳＶＩＶＡＦＩＥＰＶＡＡＧＳＧＩＰＱＩＫ
ＣＦＬＮＧＶＫＩＰＨＶＶＲＬＫＴＬＶＩＫＶＳＧＶＩＬＳＶＶＧＧＬＡＶＧＫＥＧＰＭＩＨＳＧＳＶＩＡＡＧＩＳＱＧＲＳＴＳＬＫＲＤＦＫＩＦＥＹＦＲ
ＲＤＴＥＫＲＤＦＶＳＡＧＡＡＡＧＶＳＡＡＦＧＡＰＶＧＧＶＬＦＳＬＥＥＧＡＳＦＷＮＱＦＬＴＷＲＩＦＦＡＳＭＩＳＴＦＴＬＮＦＶＬＳＩＹＨＧＮＭＷ
ＤＬＳＳＰＧＬＩＮＦＧＲＦＤＳＥＫＭＡＹＴＩＨＥＩＰＶＦＩＡＭＧＶＶＧＧＶＬＧＡＶＦＮＡＬＮＹＷＬＴＭＦＲＩＲＹＩＨＲＰＣＬＱＶＩＥＡＶＬＶ
ＡＡＶＴＡＴＶＡＦＶＬＩＹＳＳＲＤＣＱＰＬＱＧＧＳＭＳＹＰＬＱＬＦＣＡＤＧＥＹＮＳＭＡＡＡＦＦＮＴＰＥＫＳＶＶＳＬＦＨＤＰＰＧＳＹＮＰＬＴＬ
ＧＬＦＴＬＶＹＦＦＬＡＣＷＴＹＧＬＴＶＳＡＧＶＦＩＰＳＬＬＩＧＡＡＷＧＲＬＦＧＩＳＬＳＹＬＴＧＡＡＩＷＡＤＰＧＫＹＡＬＭＧＡＡＡＱＬＧＧＩＶ
ＲＭＴＬＳＬＴＶＩＭＭＥＡＴＳＮＶＴＹＧＦＰＩＭＬＶＬＭＴＡＫＩＶＧＤＶＦＩＥＧＬＹＤＭＨＩＱＬＱＳＶＰＦＬＨＷＥＡＰＶＴＳＨＳＬＴＡＲＥＶ
ＭＳＴＰＶＴＣＬＲＲＲＥＫＶＧＶＩＶＤＶＬＳＤＴＡＳＮＨＮＧＦＰＶＶＥＨＡＤＤＴＱＰＡＲＬＱＧＬＩＬＲＳＱＬＩＶＬＬＫＨＫＶＦＶＥＲＳＮＬＧ
ＬＶＱＲＲＬＲＬＫＤＦＲＤＡＹＰＲＦＰＰＩＱＳＩＨＶＳＱＤＥＲＥＣＴＭＤＬＳＥＦＭＮＰＳＰＹＴＶＰＱＥＡＳＬＰＲＶＦＫＬＦＲＡＬＧＬＲＨＬＶ
ＶＶＤＮＲＮＱＶＶＧＬＶＴＲＫＤＬＡＲＹＲＬＧＫＲＧＬＥＥＬＳＬＡＱＴ
配列番号５
ＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ 
配列番号６
ＧＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＡＴＡＴ 
配列番号７
ＣＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡ 
配列番号８
ＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡ 
配列番号９
ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ
配列番号１０
ＧＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧＧ  
配列番号１１
ＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧ 
配列番号１２
ＥＨＮＮＡＬＲＹＲＬ−−ＹＮＲＬＤ−ＰＧＧＥＨＬＴＭＰＤＨＶＬＰＰＮ
【図１Ａ】
2017525936.tif 000003
【図１Ｂ】
2017525936.tif 000004
【図１Ｃ】
2017525936.tif 000005
【図２Ａ】
2017525936.tif 000006
【図２Ｂ】
2017525936.tif 000007
【図３Ａ】
2017525936.tif 000008
【図３Ｂ】
2017525936.tif 000009
【図３Ｃ】
2017525936.tif 000010
【図３Ｄ】
2017525936.tif 000011
【図４Ａ】
2017525936.tif 000012
【図４Ｂ】
2017525936.tif 000013
【図４Ｃ】
2017525936.tif 000014
【図５Ａ】
2017525936.tif 000015
【図５Ｂ】
2017525936.tif 000016
【図５Ｃ】
2017525936.tif 000017
【図５Ｄ】
2017525936.tif 000018
【図５Ｅ】
2017525936.tif 000019
【図６Ａ】
2017525936.tif 000020
【図６Ｂ】
2017525936.tif 000021
【図６Ｃ】
2017525936.tif 000022
【図７Ａ】
2017525936.tif 000023
【図７Ｂ】
2017525936.tif 000024
【図７Ｃ】
2017525936.tif 000025
【図７Ｄ】
2017525936.tif 000026
【図８Ａ】
2017525936.tif 000027
【図８Ｂ】
2017525936.tif 000028
【図８Ｃ】
2017525936.tif 000029
【図９】
2017525936.tif 000030
【図１０Ａ】
2017525936.tif 000031
【図１０Ｂ】
2017525936.tif 000032
【図１０Ｃ】
2017525936.tif 000033
【図１０Ｄ】
2017525936.tif 000034
【図１０Ｅ】
2017525936.tif 000035
【図１０Ｆ】
2017525936.tif 000036
【図１１】
2017525936.tif 000037
【配列表】
2017525936000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月22日(2016.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、ｍＴＯＲＣ１の活性の調節剤を特定する方法：
（ａ）試験化合物をＳＬＣ３８Ａ９．１、またはＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を有する、その断片または変異体に接触させるステップ；
（ｂ）前記試験化合物の存在下において、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を測定するステップ；および
（ｃ）前記測定された活性または特性を、前記試験化合物の不存在下における同じ活性または特性と比較し、それによって前記試験化合物がＳＬＣ３８Ａ９の調節剤であるかどうかを決定するステップ。
【請求項２】
前記試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０、または配列番号１のアミノ酸１〜１１９、またはＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む融合タンパク質、および異種融合パートナーと接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種融合パートナーは、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、Ｎ末端ポリＨｉｓタグ、エピトープタグ、リガンドタグ、ＮまたはＣ末端原形質膜シグナル配列、蛍光ポリペプチド、または発光ポリペプチドから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、アミノ酸を、膜を透過して移動させる能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、一つまたはそれ以上のＲａｇｕｌａｔｏｒまたはＲａｇＧＴＰａｓｅの成分と結合する能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＳＬＣ３８Ａ９のレベルまたは活性を調節する薬剤を含む、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節するための組成物であって、前記細胞と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を増加させることを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を減少させることを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする患者においてｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるための組成物であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤を含み、前記組成物は、前記患者に投与され、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を増加させることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
ｍＴＯＲＣ１の活性の減少を必要とする患者においてｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるための組成物であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤を含み、前記組成物は前記患者に投与され、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を減少させることを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を増加させることが有益な病気、疾患、または障害を治療するための組成物であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤の有効量を含み、前記組成物は前記患者に投与され、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を減少させることが有益な病気、疾患、または障害を治療するための組成物であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤の有効量を含み、前記組成物は前記患者に投与され、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを特徴とする、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラーの図面を含むこの特許公報または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いがあれば本庁が交付する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
以下のステップを含む、ｍＴＯＲＣ１の活性の調節剤を特定する方法：
（ａ）試験化合物をＳＬＣ３８Ａ９．１、またはＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を有する、その断片または変異体に接触させるステップ；
（ｂ）前記試験化合物の存在下において、ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性を測定するステップ；および
（ｃ）前記測定された活性または特性を、前記試験化合物の不存在下における同じ活性または特性と比較し、それによって前記試験化合物がＳＬＣ３８Ａ９の調節剤であるかどうかを決定するステップ。
（項目２）
前記試験化合物は、ＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０、または配列番号１のアミノ酸１〜１１９、またはＳＬＣ３８Ａ９．１、ＳＬＣ３８Ａ９Δ１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む融合タンパク質、および異種融合パートナーと接触される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記異種融合パートナーは、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、Ｎ末端ポリＨｉｓタグ、エピトープタグ、リガンドタグ、ＮまたはＣ末端原形質膜シグナル配列、蛍光ポリペプチド、または発光ポリペプチドから選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、アミノ酸を、膜を透過して移動させる能力である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＳＬＣ３８Ａ９．１の活性または特性は、一つまたはそれ以上のＲａｇｕｌａｔｏｒまたはＲａｇＧＴＰａｓｅの成分と結合する能力である、項目１に記載の方法。
（項目６）
細胞を、ＳＬＣ３８Ａ９のレベルまたは活性を調節する薬剤または組成物と接触させることを含む、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節する方法。
（項目７）
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を増加させることを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を調節することは、細胞中のｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性を減少させることを含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
ｍＴＯＲＣ１の活性の増加を必要とする患者においてｍＴＯＲＣ１の活性を増加させる方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤を前記患者に投与し、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を増加させるステップを含む前記方法。
（項目１０）
ｍＴＯＲＣ１の活性の減少を必要とする患者ににおいてｍＴＯＲＣ１の活性を減少させる方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤を前記患者に投与し、よって前記患者におけるｍＴＯＲＣ１の活性を減少させるステップを含む前記方法。
（項目１１）
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を増加させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９を活性化または作動させる薬剤の有効量を対象に対して投与し、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを含む前記方法。
（項目１２）
患者においてｍＴＯＲＣ１のレベルまたは活性化を減少させることが有益な病気、疾患、または障害を治療する方法であって、ＳＬＣ３８Ａ９の活性を阻害する薬剤の有効量を前記対象に対して投与し、よって前記病気、疾患、または障害を治療することを含む前記方法。
【国際調査報告】
2017525936.tif 000038
2017525936.tif 000039