(57)【要約】本発明は、1種以上のヒトオステオポンチンの先端切断型変異体に特異的なモノクローナル抗体および少なくとも1種の単離されたオステオポンチンペプチドを含むワクチン、ならびに該抗体およびワクチンの製造方法を提供する。さらに、該抗体を使用する診断方法を提供する。該抗体およびワクチンは、治療、特に2型糖尿病および心血管疾患の治療および／または予防において用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1種以上のヒトオステオポンチン(Opn)の先端切断型変異体に特異的なモノクローナル抗体であって、
抗体が、全長Opn(flOpn；配列番号：15)に対するよりも1種以上の先端切断型変異体に対してより反応性が高く；および
抗体が、
(A)マトリックスメタロプロテイナーゼ先端切断型Opn(MmpOpn；配列番号：16)(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびトロンビン先端切断型Opn(ThrOpn；配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpnに対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(配列番号：17)(ここで、抗体は、VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)から選ばれるペプチド配列を有するThrOpnエピトープに対して特異的である)；ここで、抗体がペプチド配列SVVYGLR(配列番号：2)に対して特異的である場合、抗体の重鎖の可変領域(VH)および抗体の軽鎖の可変領域(VL)は、以下の配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む：
VH CDR1 GFSLSTYGLG(配列番号：18),
VH CDR2 IYWDDNK(配列番号：19),
VH CDR3 ARGTSPGVSFPY(配列番号：20),
VL CDR1 ENIYSY(配列番号：21),
VL CDR2 NAK(配列番号：22),
VL CDR3 QHHYGTPLT(配列番号：23),
(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもThrOpn(配列番号：17)に対する反応性が高く、好ましくはVHが配列番号：24の配列を含み、VLが配列番号：25の配列を含む)；
に対して特異的である抗体。
【請求項２】
抗体が、GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)から選ばれるペプチド配列を有するMmpOpnエピトープに対して特異的である、請求項1(A)に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、TYDGRGDSVVYG(配列番号：10)およびPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)から選ばれるペプチド配列を有するMmpOpn/ThrOpnエピトープに対して特異的である、請求項1(B)に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ペプチド配列GDSVVYGを有するエピトープに対して特異的であり、抗体のCDRが、以下の配列：
VH CDR1 GITFNTNG(配列番号：26),
VH CDR2 VRSKDYNFAT(配列番号：27),
VH CDR3 VRPDYYGSSFAY(配列番号：28),
VL CDR1 QSIVHSNGNTY(配列番号：29),
VL CDR2 KVS(配列番号：30),
VL CDR3 FQGSHVPWT(配列番号：31),
を含み、好ましくは、VHが配列番号：32の配列を含み、VLが配列番号：33の配列を含む、請求項2に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、ペプチド配列TYDGRGDSVVYGを有するエピトープに対して特異的であり、抗体のCDRが、以下の配列：
VH CDR1 GFSLSTSGLG(配列番号：34),
VH CDR2 ISWDDSK(配列番号：35),
VH CDR3 ARSGGGDSD(配列番号：36),
VL CDR1 SSVNS(配列番号：37),
VL CDR2 DTS(配列番号：38),
VL CDR3 FQGSGYPLT(配列番号：39)
を含み、好ましくは、VHが配列番号：40の配列を含み、VLが配列番号：41の配列を含む、請求項3に記載の抗体。
【請求項６】
CDRまたはVHまたはVLのアミノ酸の3つ、好ましくは2つ、より好ましくは1つが他のアミノ酸に変異されている、請求項1(C)、4または5に記載の抗体。
【請求項７】
7．抗体がMmpOpn(配列番号：16)に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対するよりもN倍以上MmpOpn(配列番号：16)に対する反応性がある；および
抗体がMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもN倍以上MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対する反応性がある；および
抗体がThrOpn(配列番号：17)に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもN倍以上ThrOpn(配列番号：17)に対する反応性がある；および
ここで、Nは1.5を超え、好ましくは2を超え、より好ましくは3を超え、さらにより好ましくは5を超え、最も好ましくは10を超える；および
ここで、以下の条件：
抗体の濃度：0.25μg/ml、
二次HRP結合抗体の濃度：0.1μg/ ml、
HRP基質：ABTSおよび0.1％過酸化水素、
読み出し：405nmにおける吸光度、
を含む1% BSAで遮断された後に、MmpOpn(配列番号：16)、ThrOpn(配列番号：17)およびflOpn(配列番号：15)に対するそれぞれの抗体の反応性が、それぞれMmpOpn(配列番号：16)、ThrOpn(配列番号：17)およびflOpn(配列番号：15)でコーティングされたプレート上のELISAによって測定されるのが好ましい；請求項1〜6のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項８】
各エピトープに関する、および/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離定数Kdが、50nM未満、好ましくは20nM未満、より好ましくは10nM未満、さらにより好ましくは5nM未満、最も好ましくは2nM未満である、および／または
各エピトープに関する、および/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離速度値が、5×10-3s-1未満、好ましくは3×10-3s-1未満、より好ましくは1×10-3s-1未満、さらにより好ましくは1×10-4s-1未満である、および／または
抗体が、ヒト化されている、請求項1〜7のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項９】
好ましくは単一ドメイン抗体であり、該断片が、
(A)MmpOpn(配列番号：16)(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpn(配列番号：16)に対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもThrOpn(配列番号：17)に対してより反応性が高い)；
に対して特異的である、請求項1〜8のいずれか１つに記載の抗体の断片。
【請求項１０】
少なくとも1種の請求項1〜8のいずれか1つに記載の抗体および／または少なくとも1種の請求項9に記載の断片および少なくとも1種の賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
以下の配列：
(A)GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)およびGRGDSVVYG(配列番号：55)から選ばれる1種以上の配列；および／または
(B)TYDGRGDSVVYG(配列番号：10)、VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)、PTVDTYDGRGDS(配列番号：14)およびDTYDGRGDSVVY(配列番号：56)およびTVDTYDGRGDSV(配列番号：57)から選ばれる1種以上の配列、ここで、ペプチド、特に配列VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)またはPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)を有するペプチドが、そのC末端にてアミド化されるのが好ましい(R-COO-NH2(ここでRは、そのC末端カルボキシル基をもたないペプチドである)をもたらす)；および／または
(C)VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)およびGDSVVYGLR(配列番号：58)から選ばれる1種以上の配列；
を有する、少なくとも1つの単離されたOpnペプチドを含むワクチンであって、
該ペプチドが医薬的に許容しうる担体、好ましくはタンパク質担体に結合し、好ましくは、ペプチドが、担体に共有的に結合し；好ましくは、担体が、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、プロテインDまたはジフテリア毒素(DT)から選ばれるタンパク質、特にKLHであり；および
特に、少なくとも1つのペプチドが、N末端および／またはC末端に付加された追加のシステイン残基を有し、少なくとも1つのペプチドが、タンパク質担体またはそれに結合したリンカーに、さらなるシステイン残基を介して共有的に結合し、ここで、リンカーが、好ましくは、ペプチドのシステインと反応するマレイミド基またはハロアセチル基を含み；および／または
好ましくは、ワクチンが、少なくとも1種の医薬的に許容しうる賦形剤および/またはアジュバントをさらに含む、ワクチン。
【請求項１２】
治療における使用、好ましくは、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防における使用のための；または
好ましくは2型糖尿病、特に肥満関連インスリン抵抗性の治療および／または予防における使用のための、請求項10に記載の組成物または請求項11に記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項1〜8のいずれか1つに記載の抗体の製造方法であって、
細胞培養物中で抗体を発現させること；
抗体を精製すること；
を含む、方法
【請求項１４】
請求項11に記載のワクチンの製造方法であって、
ペプチドを提供すること；
ペプチドを担体、好ましくはKLHタンパク質に結合すること；
任意に、医薬的に許容しうる賦形剤を加えること；
を含む、方法
【請求項１５】
患者の単離されたサンプル、好ましくは血液および／または脂肪組織、特に皮下脂肪組織からのサンプルを提供すること；
好ましくはELISAまたはウエスタンブロットによって、サンプル中のThrOpn、MmpOpnのレベルまたはThrpOpnおよびMmpOpnの凝集レベルを測定するために、請求項1〜9のいずれか1つに記載の抗体を使用すること；
これらのレベルを健康なコントロール集団のレベルおよび／またはより早い時点における患者のレベルと比較すること；
疾患もしくは状態、好ましくは心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、または2型糖尿病、特に肥満関連インスリン抵抗性の診断または予後、あるいは該疾患もしくは状態の進行の診断または予後を創出すること；
を含む、診断方法であって、
特に、請求項12に記載の治療の効率をモニターするための、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2型糖尿病(T2D)および心血管疾患(CVD)などの慢性炎症性疾患の治療および／または予防における使用に特に適しているワクチンおよびモノクローナル抗体(mAb)に関する。本発明のもう1つの態様は、mAbを用いる診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要な肥満関連疾患の社会学的および経済的影響
肥満は、医療的および経済的観点から私たちの社会に挑戦する伝染病である。心代謝リスクに関連する肥満の有病率の上昇は、T2DおよびCVDに起因する平均寿命の低下をもたらす。たとえば、英国では、この10年間で、肥満率(体重指数が≧30kg/m2)は、女性で30％、男性で40％、子供で50％まで増加しており、2007年には成人の23％が肥満となり、2050年には50％になると予測される。疾病管理センター(CDC)によると、世界中で推定1億5,000万人(米国のみで2,100万人)がT2Dの影響を受けており、この数は今後20年間に2億5,000万人に増加すると予測されている。現在、T2Dの薬物療法にかかる費用は、EU諸国の年間医療費の4％を超えている。これらの費用は、今後数年間で劇的に増加することが予想される。肥満の蔓延の根底にある原因はまだ完全には理解されていないが、たとえば、最近では子供および青年にも起こるT2Dの劇的な増加によって、その結果はすでに明らかである。
【０００３】
CVDは、世界保健機関(WHO)ヨーロッパ地域(53カ国からなる)における主要死因であり、毎年430万人を超える人々が死亡している。罹患率の重荷を数値化することは非常に困難であるが、2006年に、CVDは、欧州連合(EU)の医療システムに1,100億ユーロの負担をかけると推定された。
【０００４】
心代謝リスクを減少させるための現在の予防的および治療的方策は不十分であり、この実質的な生物医学的挑戦に対処するための新規な医療介入を開発するための研究コミュニティ(学術および産業の両方の面での)が必要である。したがって、比較的安価で患者のコンプライアンスを確実にするT2DおよびCVDの治療および予防方策には、社会学的および経済的に非常に大きな意味がある。研究は、T2DおよびCVDの基礎である肥満関連インスリン抵抗性およびアテローム性動脈硬化症の原因となる共通メカニズムとして、肥満によって誘導される慢性の軽度の炎症を同定している。このことは、免疫療法を用いて慢性炎症に関係する重要な因子を排除することによって、これらの疾患の一般的な治療方策を提供する。
【０００５】
肥満、T2Dおよび血管疾患を結びつけるメカニズムとしての炎症
肥満、特に中心性肥満は、脂質異常症および高血圧を含むメタボリックシンドロームの特徴の元にあるインスリン抵抗性に対する重要な土台である。メタボリックシンドロームは、一緒になって有意な心代謝リスク、すなわち、T2Dおよびアテローム硬化性CVDの発症につながるこれらの因子の変わりうる組合せを含む。インスリン抵抗性は、その主要標的器官、すなわち、脂肪組織、肝臓、および筋肉のインスリンに対する感受性の障害として定義される。インスリンは、グルコース取り込みおよび循環する遊離脂肪酸(FFA)濃度を調節する。脂肪組織では、インスリンは、脂肪分解を阻害することによってFFA流出を減少させながら、グルコース取り込みおよび脂質生成を刺激する；肝臓では、インスリンは重要な酵素活性を低下させることにより糖新生を阻害する；そして、骨格筋においては、インスリンはグルコース取り込みを大きく増強する。結果的に、脂肪組織のインスリン抵抗性は、肝臓および骨格筋におけるインスリン作用を妨げる、循環FFA濃度および異所性脂肪蓄積の増加をもたらす。最終的に、インスリン抵抗性によって誘発される糖および脂肪毒性は、明白なT2Dをもたらす膵β細胞によるインスリン分泌を損なう。
【０００６】
近年、肥満が、インスリン抵抗性の発症を著しく引き起こす軽度の炎症と関連しているという証拠が蓄積されている。脂肪組織および肝臓は、インスリン感受性を損なう肥満における循環性炎症マーカーの主要な供給源である。これらの臓器内では、おそらく免疫系の他の細胞によって誘発されるマクロファージが、まだ完全には理解されていないメカニズムゆえにこの炎症を引き起こす。脂肪組織マクロファージがインスリン抵抗性の発達に決定的に関与するという実験的知見は、最近の臨床データによって強く支持されている。
【０００７】
インスリン抵抗性およびT2Dの肥満関連症状の特徴は、最も顕著な血管疾患の根底にある特徴である促進されたアテローム性動脈硬化症である。この関係は、最も重要なことであり、T2Dを有する人々の80％が、15年の老化と同等の死亡のリスクの増加をもたらすアテローム性動脈硬化性CVDの合併症で死亡し、また、肥満自体は、10年の老化と同等の心筋梗塞のリスクの増加に関連する。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症は、かつて脂質貯蔵疾患として同定されたが、現在は血管壁の炎症状態として認識されており、互いに、および動脈壁の細胞と相互作用するマクロファージおよびT細胞の浸潤を特徴とする。したがって、アテローム性動脈硬化症の病理学的メカニズムは、肥満において観察される炎症過程の多くの特徴をまとめるものである。さらに、最近の実験動物研究は、肥満誘発性脂肪組織炎症を促進されたアテローム性動脈硬化症と直接結びつけ、T2DおよびCVDの共通の病原性起源を示している。
【０００９】
一般的な炎症メカニズムに基づいて、肥満関連脂肪組織炎症およびアテローム性動脈硬化症の同時標的化が近年動物モデルにおいて実証されている。たとえば、脂肪細胞およびマクロファージ脂肪酸結合タンパク質(aP2)の小分子阻害剤はT2Dおよびアテローム性動脈硬化症を効果的に治療し、炎症性サイトカインMIFの欠損は、LDL受容体ノックアウトにおけるアテローム性動脈硬化症に伴う慢性脂肪組織炎症およびインスリン抵抗性を低下させることを実証している。反対に、マクロファージにおける抗炎症性アディポネクチンおよびコレステリルエステル加水分解酵素のトランスジェニック過剰発現は同様の効果を示した。したがって、肥満の重大な合併症、すなわち、慢性炎症を介して非常に密接に相互に関連するインスリン抵抗性およびアテローム性動脈硬化症を同時に標的とする精巧なアプローチは、実行可能で非常に魅力的である。(Olefsky JM、Glass CK. Annu Rev Physiol 2010；72：219-246、PMID：20148674；Rocha VZ、Libby P. Nat Rev Cardiol 2009；6：399-409、PMID：19399028)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、まとめると、予防および治療、特にT2DおよびCVDなどの慢性炎症性疾患あるいは肥満関連インスリン抵抗性および／またはアテローム性動脈硬化症などのこれらに伴う選択された身体状態および／または症状などの予防および治療における使用に適している化合物を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
本発明のもう1つの目的は、該化合物の製造方法および該化合物を用いる診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
その結果として、本発明の一態様は、1種以上のヒトオステオポンチン(Opn)の先端切断型変異体に特異的なモノクローナル抗体(mAb)であって、
抗体が、全長Opn(flOpn；配列番号：15)に対するよりも1種以上の先端切断型変異体に対してより反応性が高く；および
抗体が、
(A)マトリックスメタロプロテイナーゼ先端切断型Opn(MmpOpn；配列番号：16)(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびトロンビン先端切断型Opn(ThrOpn；配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpnに対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpnおよびThrOpnの両方(ここで、抗体は、flOpnに対するよりもMmpOpnおよびThrOpnのそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(ここで、抗体は、VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)から選ばれるペプチド配列を有するThrOpnエピトープに対して特異的である)；ここで、抗体がペプチド配列SVVYGLR(配列番号：2)に対して特異的である場合、抗体の重鎖の可変領域(VH)および抗体の軽鎖の可変領域(VL)は、以下の配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む：
VH CDR1 GFSLSTYGLG(配列番号：18),
VH CDR2 IYWDDNK(配列番号：19),
VH CDR3 ARGTSPGVSFPY(配列番号：20),
VL CDR1 ENIYSY(配列番号：21),
VL CDR2 NAK(配列番号：22),
VL CDR3 QHHYGTPLT(配列番号：23),
(ここで、抗体は、flOpnおよびMmpOpnのそれぞれに対するよりもThrOpnに対する反応性が高く、好ましくはVHが配列番号：24の配列を含む(comprise)かまたは有し(have)、VLが配列番号：25の配列を含むかまたは有する)；
に対して特異的である抗体を提供する。
【００１３】
本発明の抗体は、以下に記載するように、特にT2D、特に肥満関連インスリン抵抗性、および/またはCVD、特にアテローム性動脈硬化症の治療および/または予防における使用に特に適している。
【００１４】
有望な分子標的としてのOpn
分泌型リンタンパク質1およびシアロタンパク質1とも呼ばれるOpnは、SPP1遺伝子によってコードされる。Opnは、活性化マクロファージおよびT細胞、破骨細胞、肝細胞、平滑筋、内皮、および上皮細胞において発現され、炎症性サイトカインとして分類される多機能性タンパク質である。Opnは、特に単球/マクロファージの細胞移動において機能する。内皮細胞の主要接着メカニズムはOpnによって変更されないので、内皮への単球の接着におけるOpnの効果は、主に単球におけるその作用によって媒介されると思われる。さらに、Opnは、さまざまな他の炎症性サイトカインおよびケモカインならびにマトリックスメタロプロテアーゼの発現を誘発して、マトリックス分解を誘導し、細胞運動を促進することができる。Opnのこれらの機能は、以下に詳述するように、インテグリンおよびCD44などの接着分子に結合するその能力に基づいている。走化性および傷害および炎症を起こした組織への侵入に不可欠な免疫細胞機能の不可欠な構成要素である接着を超えて、インテグリンおよびCD44は、免疫細胞の移動、増殖、生存、分化および炎症および適応免疫応答の活性化をもたらすシグナルを伝達する。
【００１５】
以下の段落で詳細に説明するように、Opnは、心筋代謝リスクの根底にある代謝組織および血管壁における慢性低悪性炎症に基づく肥満関連疾患の治療のための標的分子である。ポリクローナル抗体は、Opn機能をブロックし、肥満誘発性インスリン抵抗性などの炎症性疾患を治療するための受動免疫療法において首尾よく使用されている(Kiefer FW、et al. Diabetes 2010；59：935-946；PMID：20107108)。
【００１６】
Yan et al. (Yan、Xiaoxiang、et al.；Cardiovasc Diabetol 9.1(2010)：70-78.)は、トロンビン切断オステオポンチンではなく、オステオポンチンの血漿濃度が、2型糖尿病患者の腎症および冠状動脈疾患の存在および重症度に関連していることを開示している。
【００１７】
肥満関連インスリン抵抗性およびアテローム性動脈硬化症におけるOpnの役割
Opnは、ヒトおよびさまざまなマウスモデルにおける肥満において高度に上方調節されることが実証されている(Gomez-Ambrosi J et al. J Clin Endocrinol Metab 2007；92：3719-3727. PMID：17595250. Kiefer FW et al. Endocrinology 2008；149：1350-1357. PMID：18048491)。いくつかの最近の研究は、Opnが肥満誘発性脂肪組織炎症およびインスリン抵抗性に原因として関与し、そして肝臓脂肪症に密接に関連していることを示した(たとえば、Kiefer FW、et al. Diabetes 2010；59：935-946；PMID：20107108)。驚いたことに、インビボでのOpn作用の抗体介在中和がインスリンシグナル伝達を有意に改善することにより、脂肪組織および肝臓における肥満関連炎症を減少させ、それによって、肥満におけるインスリン抵抗性を低下させることがマウスの受動免疫によって実証され得た。
【００１８】
これらの結果は、マクロファージ活性化が、肥満誘発性脂肪組織炎症中の脂肪組織内でのOpn作用のメカニズムであることを示している。
【００１９】
Opnの過剰な量は、肥満脂肪組織に見られるだけではない。Opnは、アテローム硬化性プラークおよび大動脈弁瘤病変のマクロファージ、平滑筋および内皮細胞において高度に富化されている。血漿Opnは、血管疾患を有する患者における予後マーカーであり、関節リウマチ患者における動脈硬化と相関する。ノックアウト研究は、アンギオテンシンII誘発性アテローム性動脈硬化症および動脈瘤形成におけるOpnの直接的関与を示した(Bruemmer D et al. J Clin Invest 2003；112：1318-1331. PMID：14597759)。正常食においてアポリポタンパク質E(ApoE)およびOpnを同時に欠く混合遺伝的背景をもつ雌性マウスは、アテローム性動脈硬化症から有意に保護された。また、ApoE、LDLレセプター(LDLR)およびOpnについては、雌性マウスもトリプルネガティブであり、ApoEおよびLDLR二重ノックアウトと比較して、顕著に小さい病変および減少した内側肥厚を発症する。反対に、高脂肪高コレステロール摂食C57BL/6マウスにおけるOpnのトランスジェニック過剰発現は、悪化したアテローム性動脈硬化病変の形成、内膜肥厚および新内膜形成の増加をもたらした。さらに、Opnは、糖尿病性の大血管および微小血管疾患におけるその密接な関係およびOpnの欠損したストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスにおける保存された心臓機能によって、T2Dに関連する血管疾患にも関連している。(たとえば、Subramanian V、et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007；292：H673-683. PMID：16980342)。
【００２０】
他の疾患におけるOpnの役割
Opnは、全身性の炎症性または自己免疫疾患の病因にも関与している。上記の障害における役割を超えて、Opnは、とりわけ関節炎リウマチ、心筋線維症、多発性硬化症の病因において役割を果たし、実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症に寄与することが明らかにされている。さらに、また、Opnは、乳癌および前立腺癌、骨肉腫、神経膠芽細胞腫、扁平上皮癌および黒色腫などの多くの悪性腫瘍において発現され、腫瘍増殖の促進およびその転移能の決定において重要な役割を果たす。
【００２１】
Opnの構造および機能
Opnは、約314アミノ酸(ヒト、マウスでは297)から構成される大きく負に帯電した細胞外マトリックスタンパク質であり、33kDaの新生タンパク質として発現される。オステオポンチンの予測される二次構造は、8つのαヘリックスおよび6つのβシートセグメントからなる。細胞型および状態特異的変異に至る翻訳後修飾は、分子量における既知の可変性の原因となりうる。
【００２２】
インテグリンおよびCD44結合機能ドメイン
Opnは、インテグリンを結合し、連結することにより、さまざまな細胞活動を調節する。中心に位置する159RGD161配列と、マクロファージおよび破骨細胞において高度に発現されるαvβ3インテグリンとの間の相互作用は十分に実証されている。対応するリン酸化部位は、RGD領域には存在しない。RGD配列と連続して、トロンビン切断によってマスクされていない162SVVYGLR168(配列番号：2)隠れた(cryptic)インテグリン結合部位は、白血球によって発現されるα4β1およびα9β1インテグリンによって認識される。さらに、メタロプロテイナーゼMMP3、MMP7およびMMP9は、Opnを切断し、白血球によって発現されるα4β1およびα9β1インテグリンによって再び認識される隠れたインテグリン結合部位162SVVYG166のわずかに先端切断された形態をもたらす。
【００２３】
CD44は、マクロファージの走化性応答およびサイトカイン応答が制御されるOpnの受容体として同定されている。しかしながら、未発表の実験を含む他の研究は、CD44がOpnの接着受容体であるということを否定し、疑問を投げかけている。
【００２４】
タンパク質分解生成物
Opnは機能的に重要な切断部位を示す。全長Opnをトロンビンで切断して隠れたインテグリン結合配列162SVVYGLR168(配列番号：2)を露出させることができる。この隠れたドメイン(SLAYGLR(配列番号：46))のマウスホモログは、実験的関節炎の発症に必須であると考えられている(Yamamoto N、et al. J Clin Invest 2003；112：181-188. PMID：12865407)。Opn切断の調節に関するデータはまれであるが、トロンビン切断Opnは、関節リウマチの患者のリウマチ関節の滑液および尿内で富んでいることが示されている。Sharif et al. (Sharif、Shadi A.、et al.「Thrombin-activatable carboxypeptidase B cleavage of osteopontin regulates neutrophil survival and synoviocyte binding in rheumatoid arthritis.」Arthritis & Rheumatism 60.10(2009)：2902-2912.)は、リウマチ関節内のトロンビンによって切断されたOpn(文献中では「OPN-R」、本願では「ThrOpn」)およびトロンビン活性化可能なカルボキシペプチダーゼB(CPB)によって切断されたOPN-R、「OPN-L」に関する。関節リウマチにおけるOPN-RおよびOPN-Lの重要性を調査するために、これらの切断されたOpn型に対して明らかに特異的なELISAが開発された(文献のp. 2903、col 2、§2)。簡単に述べると、KLH結合Opnペプチド、その中のSVVYGLに対するウサギポリクローナル抗体が作製され(文献のp. 2903、col 2、§2)。抗体はエピトープマッピングされた(文献のp. 2904、col 1、§2およびFig. 1)。それらは、免疫吸着による交差反応性抗体の除去によってさらに精製された(文献のp. 2905、col 1、§1)。これらの精製ポリクローナル抗体を使用して、変形性関節症、乾癬性関節炎および関節リウマチを有する患者の滑液におけるOPN-R(ThrOpn)、OPN-LおよびOPNのレベル(文献の)ならびに滑液サンプルの免疫染色(文献のFig. 4)が評価された。この文献は、関節リウマチの研究ツールとして抗Opn抗体を確立するにすぎない。この文献は、抗Opn抗体または抗Opnワクチンの治療上の使用については何も言及していない。
【００２５】
非常に最近のヒトの研究の1つは、組織抽出物からの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定されたトロンビンおよびトロンビン切断Opnの両方が、石灰化されていない領域と比較して狭窄性大動脈弁の石灰化領域において濃縮されることを示す。
【００２６】
Opnは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、MMP-3、MMP-7、MMP-2およびMMP-9の基質でもある。特に、11種のMMPのプロテイナーゼ活性は、アテローム発生に関与しており、マウスおよびヒトの肥満においてMMP-7および-9などのいくつかのMMPの発現の増加が実証されている(Unal R、et al. J Clin Endocrinol Metab 2010；95：2993-3001. PMID：20392866)。これらのMMPの多くは、マクロファージの表面で分泌または発現され、MMP-9活性はOpnによって誘導されうる。注目すべきことに、MMP-9、-7および-3の166GL167切断部位は、168RS169トロンビン切断部位に最も近接して位置する。したがって、MMP切断は、トロンビンに類似した隠れたインテグリン結合部位をアンマスキングする。このことは、OpnのMMP-3またはMMP-7切断が、マウス腫瘍細胞およびマクロファージの接着および移動刺激としてOpnの機能を増強することを示す研究によって明らかにされる。さらに、組換えペプチドの効果の分析により、162SVVYG166領域は、β1インテグリンへの結合を媒介するのに十分であることが示唆された。
【００２７】
Opn機能を中和するためのエピトープ
肥満関連炎症およびインスリン抵抗性、たとえば糸球体線維症の治療におけるポリクローナル抗Opn抗体の成功した適用に加えて、Opn機能を成功裏に阻止するために、いくつかのmAbが受動免疫試験に用いられている：抗SLAYGLR(配列番号：46)(ヒト162SVVYGLR168-配列番号：2に対するマウス相同体)抗体M5は、単球の移動を阻止し、マウスの関節炎関節における滑膜の増殖、骨侵食および炎症細胞浸潤を抑制した(Yamamoto N、et al. J Clin Invest 2003；112：181-188. PMID：12865407)。キメラ抗SVVYGLR mAb(C2K1、配列番号：2)は、非ヒト霊長類関節リウマチモデルにおいて成功裏に試験された(Yamamoto N、et al. Int Immunopharmacol 2007；7：1460-1470. PMID：17761350)。
【００２８】
mAb53は、トロンビン切断の前にのみ存在するエピトープを介してOpnに対するRGD依存性細胞接着を阻害した(Bautista DS、et al. J Biol Chem 1994；269：23280-23285. PMID：8083234)。別のMAb(Opn1.2)は、Asp113-Arg128に結合し、分子内変化を誘導することによってRGD機能を阻害した(Yamaguchi Y、Hanashima S、Yagi H、et al. NMR characterization of intramolecular interaction of osteopontin、an intrinsically disordered protein with cryptic integrin-binding motifs. Biochem Biophys Res Commun 2010；393：487-491. PMID：20152802)。
【００２９】
これらの抗体のインビボでの適用はこれまでに開示されていない。
【００３０】
212NAPSD216に対するヒト化mAbは、ヒト乳癌細胞株の細胞接着、遊走、浸潤およびコロニー形成を阻害し、ヒト乳癌のマウス肺転移モデルにおいて原発腫瘍増殖および自発転移を有意に抑制することが実証されている(Dai J、et al. Cancer Immunol Immunother 2010；59：355-366。PMID：19690854)。
【００３１】
OpnのN末端41ATWLNPDPSQKQ52モチーフに特異的なmAb23C3は、炎症性サイトカインの産生を減少させ、コラーゲン誘導性関節炎における活性化T細胞のアポトーシスを促進した(Fan K、et al. Arthritis Rheum 2008；58：2041-2052. PMID：18576331)。31QLYNKYP37は、mAb(F8E11)によって標的化された別のN末端配列であり、インビトロでのOpn誘導T細胞活性化および遊走を遮断した(Dai J、et al. Biochem Biophys Res Commun 2009；380：715-720. PMID：19285028)。
【００３２】
要約すれば、これらの知見から、小さいが機能的に関連するOpnエピトープに対するmAbによる受動免疫は、慢性炎症反応を妨げるのに有効であると結論される。
【００３３】
さらに、Opnに対するmAbは、以下の文献から公知である：
Kon et al. (Kon、Shigeyuki、et al.「Mapping of functional epitopes of osteopontin by monoclonal antibodies raised against defined internal sequences.」Journal of Cellular Biochemistry 84.2(2002)：420-432.)は、チログロブリンに結合したさまざまなOpnペプチド(文献のFig. 1参照)で免疫したマウスから得た脾細胞のハイブリドーマ由来の5つのmAbを開示する(423頁、第1欄)。mAbは、選択されたOpnエピトープの存在について、健康な男性(文献のFig. 3)からの尿サンプルおよび腫瘍細胞株からの上清(文献のFig. 4)を分析するために使用された。この文献は、Opn関連の生理学的および病理学的プロセスにおける研究ツールとして抗Opn mAbを確立するにすぎない(文献内の議論セクションの最後の3文も参照されたい)。抗Opn mAb(または抗Opnワクチン)の単独での治療的使用さえも示唆されていない。
【００３４】
Opnに対する意図されたワクチン接種の安全性考察
Opn(Spp1)ノックアウトの表現型
かなりの心代謝リスクを有するが、まだ深刻に不調ではない患者において、安全性は重要な問題である。注目すべきことに、標的とされたSpp1欠失についてホモ接合である2つの独立したマウス株は、生存可能であり、繁殖力があり、正常なサイズであり、著しい身体的または行動的な異常は全く示さない(Liaw L、et al. J Clin Invest 1998；101：1468-1478. PMID：9525990. Rittling SR et al. Journal of Bone and Mineral Research 1998；13：1101-1111. PMID：9661074)。
【００３５】
免疫療法の標的としてのOpnに関する結論
T2DおよびCVDは共通の炎症を起こす根拠を有し、Opnはインビトロおよびインビボでインスリン抵抗性およびアテローム発生に機能的に関連することを示している重要な分子である。したがって、Opnは有効性および安全性に関する合理的な考慮の結果としての免疫療法の標的である。
【００３６】
予防接種方策は、人類史上最も効果的な医療介入の1つである。過去1世紀の間に感染症に対する予防的ワクチン接種の開発がこの分野を支配していたが、近年、受動免疫用と能動免疫用の両方の治療用ワクチンの開発がより注目されている。近年、臨床医学において、炎症性および腫瘍性疾患における重要な分子を標的とするために、並外れた特異性および有効性を提供する多くの抗体が、導入されている。多数の動物研究および最初の臨床試験において、治療的B細胞ワクチンは、さまざまな非感染性ヒト疾患を治療するための低価格で有効な治療選択肢としての可能性を保持することが示されているので、そのような受動免疫療法的アプローチに加えて、能動的ワクチン接種アプローチは有効であると思われる。したがって、能動的な治療的ワクチン接種の概念は、受動免疫療法アプローチが成功しているほぼすべての疾患に適用されると考えられる免疫療法の方策を表す。その原理は、ワクチンを設計することであり、そのように設計されたワクチンは、病原性であり、特定の疾患において病原性であり、過剰発現する内因性タンパク質に対する免疫応答を誘発することができる。現在利用可能な治療用ワクチンの大部分は、自己タンパク質またはそのようなタンパク質に由来する自己エピトープ、または担体に結合したエピトープの修飾型(しばしばミモトープと呼ばれる)のいずれかを使用し、両者とも、標的タンパク質に対する強力な液性免疫応答を誘導してその病原性効果を中和するように操作されている。
【００３７】
受容体結合部位、タンパク質分解切断によって誘導される推定的ネオエピトープ、およびその結合が機能的コンホメーション造変化を誘導するエピトープなどのいくつかの代替的なOpnエピトープは、Opnに対する成功しうる免疫治療方策のための標的配列である。
【００３８】
本発明の過程で、多くのOpnエピトープ(それらの中でも、表1に列挙したすべてのエピトープ)をその免疫原性、ならびにOpnの特異的先端切断型変異体についてその上に惹起された血清/抗体の選択性および血清/抗体の機能について評価した(図1〜5)。
1種以上の1種以上のヒトオステオポンチンの先端切断型変異体(Opn)に対するmAbを惹起するために使用することができるエピトープが存在することが分かり、驚いたことに、その抗体は、全長Opn(flOpn)に対するよりも、1種以上の先端切断型変異体に対して実質的により反応性が高い(そして特異的である)。(たとえば、図３を参照。)
【００３９】
したがって、本発明の1つの態様は、全長Opn(flOpn)に対するよりも1種以上の先端切断型変異体に対してより反応性が高い、1種以上のヒトオステオポンチンの先端切断型変異体(Opn)に特異的なmAbを提供する。
【００４０】
この抗体は、
(A)マトリックスメタロプロテイナーゼ先端切断型Opn(MmpOpn；配列番号：16)(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびトロンビン先端切断型Opn(ThrOpn；配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpnに対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpnおよびThrOpnの両方(ここで、抗体は、flOpnに対するよりもMmpOpnおよびThrOpnのそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(ここで、抗体は、VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)から選ばれるペプチド配列を有するThrOpnエピトープに対して特異的である)；ここで、抗体がペプチド配列SVVYGLRに対して特異的である場合、抗体の重鎖の可変領域(VH)および抗体の軽鎖の可変領域(VL)は、以下の配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む(すなわち、本発明の過程で生成されたmAb4-4-2のCDR、表2参照)：
VH CDR1 GFSLSTYGLG(配列番号：18),
VH CDR2 IYWDDNK(配列番号：19),
VH CDR3 ARGTSPGVSFPY(配列番号：20),
VL CDR1 ENIYSY(配列番号：21),
VL CDR2 NAK(配列番号：22),
VL CDR3 QHHYGTPLT(配列番号：23),
(ここで、抗体は、flOpnおよびMmpOpnのそれぞれに対するよりもThrOpnに対する反応性が高く、好ましくはVHが配列番号：24の配列を含む(comprise)かまたは有し(have)、VLが配列番号：25の配列を含むかまたは有する)；
に対して特異的である。抗体の好ましいアイソタイプは免疫グロブリンG(IgG)であり、好ましい軽鎖型はκである。
【００４１】
CDRは、抗体がその特異的エピトープに結合する抗体の可変領域を表す。重鎖の型および数は、抗体のクラス、すなわち、それぞれIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体を決定する。抗体は、2つの同一の軽鎖も含み、それらはラムダまたはカッパ型でありうる。
【００４２】
Opn(MmpOpn、ThrOpn、またはその両方)の先端切断型変異体に特異的であり、全長タンパク質(flOpn)に対する反応性が低いことは、治療において非常に標的化されたアプローチを可能にする。これは、本発明の抗体による治療を受けている患者における副作用を低減化する。本発明の抗体は、このような有益な特異性を示すように、注意深く選択される(実施例も参照)。
【００４３】
本発明の過程で研究されたエピトープについては表1を参照のこと。
【００４４】
SVVYGLR(配列番号：2)を含むペプチドに特異的な抗体は、たとえば、国際公開第2009/023411号、米国特許公開第2007/0274993号明細書、米国特許公開第2006/0002923号明細書および米国特許公開第2004/0234524号明細書から分かる。しかしながら、これらの文献のすべては、ThrOpnに対するよりもflOpnおよびMmpOpnのそれぞれに対する反応性が高い、SVVYGLR(配列番号：2)に特異的なmAbを提供するという本発明の特徴に関しては沈黙している。さらに、これらの文献のすべては、MmpOpn、またはMmpOpnおよびThrOpnの両方に特異的な抗体に関して完全に沈黙している。
【００４５】
他のモノクローナル抗Opn抗体もまた公知であるが、本明細書に記載の本発明の抗体の有益な特性(特に、MmpOpnもしくはThrOpn、またはその両方に対する強い反応性を示すが、flOpnに対する反応性は低い)を有さない：
2K1、C2K1(Yamamoto N、et al. Int Immunopharmacol 2007；7：1460-1470. PMID：17761350)：マウスmAbクローン2K1は、ヒトOpnペプチドVDTYDGRGDSVVYGLRS(配列番号：48)に対して産生された。インビトロで、クローン2K1は、全長Opnに対するRGD依存性細胞接着ならびに組換えN末端Opn(ThrOpn、aa1-168に等価)に対するRGD非依存性細胞接着を阻害することが示された。さらに、クローン2K1は、全長、トロンビン切断および組換えN末端Opnに対するα9媒介細胞移動を阻害する。したがって、クローン2K1は、ヒトOpn、SVVYGLR(配列番号：2)の隠れたエピトープを認識することができる。後に開発されたmAbC2K1は、2K1の可変領域がヒトIgG1定常領域と融合したキメラ抗体である。インビトロで、C2K1は、それぞれヒトおよびサルN末端Opnへのヒトおよびサル単球の移動を阻害することが示された。治療的インビボアプローチにおいて、C2K1は、非ヒト霊長類における既存のコラーゲン誘発性関節炎を改善しうる。2K1およびC2K1は、Opnの隠れたエピトープを認識し、機能的であるが、それらはflOpnおよびThrOpnを別個に区別しない。MmpOpnに対するそれらの反応性および機能性は、開示されていない。
【００４６】
mAb53、mAb87-B(Bautista DS、et al. J Biol Chem 1994；269：23280-23285. PMID：8083234)：モノクローナル抗体 mAb53およびmAb87-Bは、細菌産生組換えGST-ヒトOpn(GST-hOpn)に対して産生された。それらは全長のタンパク質に対して産生されたので、本発明の抗体の有益な特性を有していない。
【００４７】
34E3：マウスmAbクローン34E3は、ヒトOpnペプチドCSVVYGLR(配列番号：49)に対して産生され、C末端アミノ酸配列YGLR(配列番号：50)を特異的に認識する。34E3は、トロンビン切断マウスOpn、ウサギOpnおよびヒトOpnと交差反応するが、切断されないOpnとは交差反応しない。34E3は、マウスOpnペプチドVDVPNGRGDSLAYGLR(配列番号：47)およびSLAYGLR(配列番号：46)に対するマウスメラノーマ細胞株B16.F10の接着を阻害することができるが、GRGDSに対する接着は阻害せず、このことは、α4およびα9インテグリンに特異的な接着阻害を示す。ヒトOpn配列についての機能的データは示されなかった。どちらも、MmpOpnに対して反応性があり、機能的であった(米国特許公開第2011/312000号明細書参照)。
【００４８】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、抗体は、GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)の群から選択されるペプチド配列を有するMmpOpnエピトープ、またはTYDGRGDSVVYG(配列番号：10)およびPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)の群から選択されるペプチド配列を有するMmpOpn / ThrOpnエピトープに特異的である。
【００４９】
本発明に最も適したエピトープから生成された血清を、それらの生物学的機能についてさらに精査した(図2)。非常に適した3つのエピトープを用いて選択的mAbを作成した(図3-5で特徴付けられたもの；表2および実施例も参照のこと)。したがって、本発明のさらなる実施態様は、非常に適切な抗体、特にそのCDR配列またはそのVHまたはVL配列を開示する(SVVYGLR(配列番号：2)に特異的な抗体の本発明の配列は上記に開示されている。)。
【００５０】
これらの好ましい実施態様の1つは、ペプチド配列GDSVVYGを有するエピトープに特異的な抗体であり、抗体のCDR(すなわち、本発明の過程で生成されたmAb7-5-4およびmAb9-3-1のCDR；表2を参照；mAb7-5-4およびmAb9-3-1は同一であることが判明した)は以下の配列：
VH CDR1 GITFNTNG(配列番号：26),
VH CDR2 VRSKDYNFAT(配列番号：27),
VH CDR3 VRPDYYGSSFAY(配列番号：28),
VL CDR1 QSIVHSNGNTY(配列番号：29),
VL CDR2 KVS(配列番号：30),
VL CDR3 FQGSHVPWT(配列番号：31),
を含み、好ましくは、VHは配列番号：32の配列を含むかまたは有し、VLは配列番号：33の配列を含むかまたは有する。抗体の好ましいアイソタイプは、免疫グロブリンG(IgG)であり、好ましい軽鎖型はκである。
【００５１】
これらの好ましい実施態様のもう1つは、ペプチド配列TYDGRGDSVVYGを有するエピトープに特異的な抗体であり、抗体のCDR(すなわち、本発明の過程で生成されたmAb21-5-4のCDR；表2を参照)は以下の配列：
VH CDR1 GFSLSTSGLG(配列番号：34),
VH CDR2 ISWDDSK(配列番号：35),
VH CDR3 ARSGGGDSD(配列番号：363),
VL CDR1 SSVNS(配列番号：37),
VL CDR2 DTS(配列番号：38),
VL CDR3 FQGSGYPLT(配列番号：39),
を含み、好ましくは、VHは配列番号：40の配列を含むかまたは有し、VLは配列番号：41の配列を含むかまたは有する。抗体の好ましいアイソタイプは、免疫グロブリンG(IgG)であり、好ましい軽鎖型はκである。
【００５２】
CDRにおける突然変異は親和性または選択性の低下をもたらす可能性があるが、限られた量の突然変異は、許容されうるものであるか、または親和性または選択性に関して有利でさえありうる。したがって、本発明のもう1つの好ましい実施態様において、本発明の抗体では、CDRまたはVHまたはVLのアミノ酸の3つ、好ましくは2つ、より好ましくは1つが他のアミノ酸に変異されている。
【００５３】
本発明の抗体が低い交差反応性を有することは、特に有益であり、したがって、本発明のもう1つの好ましい実施態様は、
抗体がMmpOpnに特異的である場合、抗体は、flOpnおよびThrOpnのそれぞれに対するよりもN倍以上MmpOpnに対する反応性がある；および
抗体がMmpOpnおよびThrOpnの両方に特異的である場合、抗体は、flOpnに対するよりもN倍以上MmpOpnおよびThrOpnのそれぞれに対する反応性がある；および
抗体がThrOpnに特異的である場合、抗体は、flOpnおよびMmpOpnのそれぞれに対するよりもN倍以上ThrOpnに対する反応性がある；および
ここで、Nは1.5を超え、好ましくは2を超え、より好ましくは3を超え、さらにより好ましくは5を超え、最も好ましくは10を超える；本発明の抗体を提供する。
【００５４】
抗体(または血清)の(交差)反応性を試験するためのELISAアッセイは、当技術分野で広く使用されている。したがって、以下の条件を含む1% BSAで遮断された後に、MmpOpn、ThrOpnおよびflOpnに対するそれぞれの抗体の反応性が、それぞれMmpOpn、ThrOpnおよびflOpnでコーティングされたプレート上のELISAによって測定されるのが好ましい：
抗体の濃度：0.25μg/ml、
二次HRP結合抗体の濃度：0.1μg/ ml、
HRP基質：ABTSおよび0.1％過酸化水素、
読み出し：405nmにおける吸光度。
【００５５】
抗体は、それぞれのエピトープ(またはリガンド)についての解離定数Kd(「親和性」とも呼ばれる)およびそれぞれのエピトープ(またはリガンド)に関する解離速度(off-rate)値によって分類することができる。両方の用語(およびそれらがどのように測定されるか)は、当技術分野において周知である。他のパラメーターを考慮しない場合、親和性が高い(すなわちKdが低い)および/または抗体の解離速度値が低いほど、より適切である。
【００５６】
したがって、本発明のもう1つの好ましい実施態様において、各エピトープおよび/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離定数Kdは、50nM未満、好ましくは20nM未満、より好ましくは10nM未満、さらにより好ましくは5nM未満、最も好ましくは2nM未満である。さらに、本発明のもう1つの好ましい実施態様において、各エピトープおよび/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離速度値は、5×10-3s-1未満、好ましくは3×10-3s-1未満、より好ましくは1×10-3s-1未満、さらにより好ましくは1×10-4s-1未満である。表3は、選択された本発明の抗体の決定された解離定数値および解離速度値をリストする。
【００５７】
本発明の抗体が、ヒト化されているのが好ましい。そのような抗体を得るための方法は、当技術分野で周知である。1つの方法は、本明細書中に開示される可変領域をヒト抗体骨格に挿入することである(たとえば、Hou S、et al.、J Biochem 2008、PMID：18424812を参照)。
【００５８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基(固定領域)を含むキメラ抗体を意味する。「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域(HVR)残基以外の可変領域残基を意味する。可変領域のFRは、一般に4つのFR領域：FR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFR配列は、一般に、VH(またはVL)において以下の配列で現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、HVR(たとえば、CDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のそれらに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のそれらに対応する、少なくとも1つ、典型的には2つの可変領域の実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。1つの好ましい実施態様において、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域にマウスHVRを移植する。マウス可変領域アミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列抗体V遺伝子のコレクションに整列され、配列同一性および相同性にしたがって仕分けされる。アクセプター配列は、全体的な配列相同性の高さ、および場合によって、アクセプター配列に既に存在する適切なカノニカル残基の存在に基づいて選択される。生殖細胞系列V遺伝子は、重鎖についてはHVR3の開始までの領域のみ、および軽鎖のHVR3の中央までをコードする。したがって、生殖細胞系列V遺伝子の遺伝子は、V領域全体にわたって整列していない。ヒト化構築物は、ヒトJK4に由来するヒトフレームワーク1〜3、マウスHVR/およびヒトフレームワーク4配列、ならびに軽鎖および重鎖それぞれのJH4配列を含む。1つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆるカノニカルループ構造を決定することができる。これらのカノニカルループ構造は、いわゆるカノニカル位置に存在する残基のタイプによって決定される。これらの位置は、(部分的に)HVR領域の外側にあり、親(ドナー)抗体のHVRコンホメーションを保持するために最終構築物において機能的に同等であるべきである。国際公開第2004/006955号パンフレットには、
非ヒト成熟抗体中のHVRのカノニカルHVR構造型を同定する工程；
ヒト抗体可変領域のためのペプチド配列のライブラリーを得る工程；
ライブラリー中の可変領域のカノニカルHVR構造型を決定する工程；および
カノニカルHVR構造が、非ヒトおよびヒト可変領域内の対応する位置における非ヒト抗体カノニカルHVR構造タイプと同じであるヒト配列を選択するステップ；
を含む、抗体をヒト化する方法が記載されている。要約すると、隠れたアクセプター配列は、全体的な相同性が高く、場合によってはさらに、アクセプター配列に既に存在する適切なカノニカル残基の存在に基づいて選択される。いくつかの場合、単純なHVR移植は、非ヒト抗体の結合特異性の部分的な保持のみをもたらす。結合特異性を再構成するためには、少なくともいくつかの特定の非ヒトフレームワーク残基が必要であり、また、ヒトフレームワークに移植されなければならない、すなわち、非ヒトHVRの導入に加えて、いわゆる「復帰突然変異」を作らなければならないことが見出されている(たとえば、Queen et al.、PNAS 86(1989)、10029-10033を参照)。これらの特定のフレームワークアミノ酸残基は、FR-HVR相互作用に関与し、HVRのコンホメーション(ループ)を安定化させた。いくつかの場合、ヒト生殖細胞系列配列をより密接に採用するために、正突然変異も導入される。したがって、「本発明のヒト化抗体」(たとえば、マウス由来のものなど)は、VHおよびVLが上記の標準的技術によってヒト化されているマウス抗体配列に基づく抗体を意味する(フレームワーク領域およびHVR-H1、HVR-H2、HVR-L1またはHVR-L2中の特定のアミノ酸のHVR移植および任意の後続する突然変異誘発を含むが、HVR-H3およびHVR-L3は未修飾のままである)。
【００５９】
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、たとえば、米国特許第4,816,567号明細書；およびMorrison et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855)に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(たとえば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは非ヒト霊長類、たとえばサル由来の可変領域)およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【００６０】
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術を用いて産生され得る。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を有する完全な抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって製造されうる。そのような動物は、典型的には、内在性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかまたは動物の染色体に無作為に組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Lonberg、Nat. Biotech. 23(2005)1117-1125、XENOMOUSE(商標)技術を記載する米国特許第6,075,181号および第6,150,584号；HuMab(登録商標)技術を記載する米国特許第5,770,429号明細書；K-M MOUSE(登録商標)技術を記載する米国特許第7,041,870号明細書、およびVelociMouse(登録商標)技術を記載する米国特許公開第2007/0061900号明細書を参照。そのような動物によって産生されたインタクト抗体からのヒト可変領域を、たとえば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾することができる。
【００６１】
「ヒト抗体」は、ヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体をコードする配列を利用する、ヒトまたはヒト細胞によって産生された抗体または非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変領域配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Kabat、E.A. et al、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed.、Bethesda MD(1991)、NIH Publication 91-3242、Vols. 1-3に記載されたようなサブグループである。1つの実施態様において、VLの場合、サブグループは、上記Kabatらに記載のサブグループカッパIである。1つの実施態様において、VHの場合、サブグループは、上記Kabatらに記載のサブグループIIIである。
【００６２】
ヒト抗体を、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体産生用のヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Li et al、PNAS 103(2006)3557-3562に記載されている。さらなる方法には、たとえば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載する)に記載されているものまたはトリオーマ技術によって作成されるものが含まれる。ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変領域配列を単離することによって、ヒト抗体を生成することもできる。次いで、そのような可変領域配列を所望のヒト定常領域と組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術を以下に記載する。
【００６３】
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。たとえば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするためのさまざまな方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、さらに、たとえば、Fellouse、PNAS(2004)12467-12472に記載されている。
【００６４】
特定のファージディスプレイ法において、VHおよびVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングし、ファージライブラリー中でランダムに組み換え、次いで、それらを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして、抗体断片を提示する。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしで、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。別法として、ナイーブレパートリーをクローニングして(たとえば、ヒトから)、何らかの免疫処置をすることなく、広範な非自己および自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最終的に、幹細胞由来の再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、高度に変化しうるCDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を達成するためのランダム配列を含んでいるPCRプライマーを用いることによって、ナイーブレパートリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載しているさらなる刊行物として、たとえば、米国特許第5,750,373号明細書、米国特許公開第2005/0079574号明細書、米国特許公開第2005/0119455号明細書、米国特許公開第2005/0266000号明細書、米国特許公開第2007/0117126号明細書、米国特許公開第2007/0160598号明細書、米国特許公開第2007/0237764号明細書、米国特許公開第2007/0292936号明細書、および米国特許公開第2009/0002360号明細書が挙げられる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【００６５】
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、たとえば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様において、結合特異性の1つは、本明細書中に記載されるエピトープに対するものであり、他は、本明細書中に記載される別のエピトープまたは任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術として、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現(国際公開第93/08829号、米国特許第5,731,168号明細書)が挙げられるが、これに限定されるものではない。多重特異性抗体はまた、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するための静電気ステアリング効果を操作すること(国際公開第2009/089004号)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること(たとえば、米国特許第4,676,980号明細書)；ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を産生すること；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を用いること(たとえば、Holliger et al、PNAS 90(1993)6444-6448)；および一本鎖Fv(sFv)ダイマーを用いること；および三重特異性抗体を調製すること；によって作製されうる。「オクトパス抗体」などの3つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる(たとえば、米国特許公開第2006/0025576号明細書)。
本明細書中の抗体または断片はまた、本明細書に言及されるエピトープおよび別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Fab」または「DAF」を含む(たとえば、米国特許公開第2008/0069820号明細書を参照)。本明細書に記載の抗体または断片はまた、国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/115589号、国際公開第2010/136172号、国際公開第2010/145792号、および国際公開第2010/145793号に記載の多重特異性抗体を含む。
【００６６】
抗体の機能的断片は、それぞれのエピトープにも結合することができる断片である。それらは、化学的安定性、薬学的半減期、投薬またはより単純な製造などを考慮して、フルサイズ抗体に優る利点を提供する。このような断片は、たとえば、Fab断片、単一ドメイン抗体および抗体の定常領域に由来する結合ドメイン(Fcab(商標)など)である。
【００６７】
したがって、本発明のもう1つの好ましい実施態様は、抗体断片、好ましくは単一ドメイン抗体であり、該断片は、
(A)MmpOpn(配列番号：16)(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpnに対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpnおよびThrOpnの両方(ここで、断片は、flOpnに対するよりもMmpOpnおよびThrOpnのそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(ここで、断片は、flOpnおよびMmpOpnのそれぞれに対するよりもThrOpnに対してより反応性が高い)；
に対して特異的である。
【００６８】
本発明の断片は、以下のものも包含する：「カッパ体」(III et al.、Protein Eng. 10：949-57(1997))、「ミニボディ(Minibodies)」(Martin et al.、EMBO J. 13：5303-9(1994))、「ダイアボディ」(Holliger et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993))、または「ジャヌシン(Janusins)」(Traunecker et al.、EMBO J. 10：3655-3659(1991)およびTraunecker et al.、Int. J. Cancer(Suppl.)7：51-52(1992))。これらは、本明細書の教示にしたがって標準的な分子生物学的技術を用いて調製されうる。
【００６９】
本発明に適したこのような操作された抗体断片の概要もまた、Hollinger & Hudson(Nat Biotechnol. 2005、PMID：16151406)に示されている。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明の抗体(または抗体断片)の少なくとも1つのアミノ酸残基、N末端および/またはC末端は、当技術分野で公知の方法にしたがって化学的に修飾される。そのような修飾は、グリコシル化、ペグ化、ビオチン化、アルキル化、ヒドロキシル化、アデニル化、リン酸化、スクシニル化、酸化、またはアシル化、特にアセチル化の1種以上を含む。これは、本発明の抗体の薬学的特性(たとえば、溶解度、半減期、活性)を改善する。
【００７１】
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。たとえば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって製造されうる。そのような修飾には、たとえば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および/または残基への挿入および/または残基内での置換が含まれる。ただし、最終構築物が、たとえば、抗原結合などの所望の特性を有するならば、欠失、挿入および置換の任意の組合せを最終構築物に到達させることができる。
【００７２】
特定の実施態様において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための対象の部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、表1において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、アミノ酸側鎖クラスに関して以下に提供される。目的の抗体にアミノ酸置換を導入し、所望の活性、たとえば抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、または改善されたADCCまたはCDCについて生成物をスクリーニングすることができる。
【００７３】
元の残基      例示的置換                      好ましい置換
Ala(A)        Val、Leu、lle                          Val
Arg(R)        Lys、Gln、Asn                          Lys
Asn(N)        Gln、His、Asp、Lys、Arg                Gln
Asp(D)        Glu、Asn                               Glu
Cys(C)        Ser、Ala                               Ser
Gln(Q)        Asn、Glu                               Asn
Glu(E)        Asp、Gln                               Asp
Gly(G)        Ala                                    Ala
His(H)        Asn、Gln、Lys、Arg                     Arg
Ile(I)        Leu、Val、Met、Ala、Phe、ノルロイシン  Leu
Leu(L)        ノルロイシン、Ile、Val、Met、Ala、Phe  lle
Lys(K)        Arg、Gln、Asn                          Arg
Met(M)        Leu、Phe、Ile                          Leu
Phe(F)        Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr           Tyr
Pro(P)        Ala                                    Ala
Ser(S)        Thr                                    Thr
Thr(T)        Val、Ser                               Ser
Trp(W)        Tyr、Phe                               Tyr
Tyr(Y)        Trp、Phe、Thr、Ser                     Phe
Val(V)        Ile、Leu、Met、Phe、Ala、ノルロイシン  Leu
【００７４】
アミノ酸を、共通の側鎖特性にしたがってグループ分けすることができる：
(1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)塩基性：His、Lys、Arg；
(5)鎖の配向に影響を与える残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【００７５】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。置換変異体の1つのタイプは、親抗体(ヒト化抗体またはヒト抗体)の1種以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される、得られる変異体は、親抗体と比較してある種の生物学的特性(たとえば、親和性の増大、免疫原性の低下)における修飾(たとえば、改善)を有し、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、たとえば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて好都合に作製されうる。簡単に述べると、1種以上のHVR残基が突然変異し、変異抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性(たとえば、結合親和性)についてスクリーニングされる。HVRにおいて、たとえば、抗体親和性を改善するために、改変(たとえば、置換)を行うことができる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセスの間に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基、および/またはSDR(a-CDR)で行われ、得られる変異体VHまたはVLは、結合親和性について試験される。親和性成熟は、二次ライブラリーを構築および再選択することによって行われる。親和性成熟のいくつかの実施態様では、さまざまな方法(たとえば、エラープローンPCR、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発)のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するためのもう1つの方法は、いくつかのHVR残基(たとえば、一度に4〜6残基)がランダム化されるHVR指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、たとえば、アラニン走査変異誘発またはモデリングを用いて特異的に同定されうる。特に、CDR-H3およびCDR-L3は、しばしば標的とされる。
【００７６】
特定の実施態様において、置換、挿入または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、1つ以上のHVR内で生じ得る。たとえば、HVRにおいて、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(たとえば、本明細書で提供されるような保存的置換)がなされうる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」またはSDRの外側にありうる。上記で提供される変異体VHおよびVL配列の特定の実施態様において、各HVRは、改変されていないか、または1つ、2つもしくは3つ以下のアミノ酸置換を含む。突然変異誘発の標的にされうる抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の1つの残基または群(たとえば、Arg、Asp、His、LysおよびGluなどの荷電残基)を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸(たとえば、アラニンまたはポリアラニン)と置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されうる。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または排除されうる。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。末端挿入の例として、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる、酵素(たとえば、ADEPTのための)またはポリペプチドへの抗体のN末端またはC末端への融合を含む。
【００７７】
たとえば、保存中の抗体の安定性を高めるために、本発明の抗体を医薬組成物として提供することが有利である。したがって、もう1つの好ましい実施態様は、1種以上の賦形剤をさらに含む、本発明の抗体または断片を含む医薬組成物を提供する。
【００７８】
用語「医薬組成物」は、本明細書に記載の状態を改善、治癒または予防する、上記で定義した抗体を含む任意の組成物または製剤を意味する。特に、「医薬組成物」という表現は、本発明による抗体および医薬的に許容しうる賦形剤を含む組成物を意味する。適切な賦形剤は、当業者に知られており、たとえば、水(特に注射用水)、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンク溶液、ベシクル形成化合物(たとえば、脂質)、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の5％デキストロース、等張性および化学的安定性を高める物質、緩衝剤および保存剤である。他の適切な賦形剤は、それ自体が、患者にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意の化合物を包含する。例は、十分に許容しうるタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーである。この医薬組成物または本発明の抗体は、当業者に知られている適切な手順を介して、それを必要とする患者(すなわち、本明細書に記載の疾患または状態を有するか、または発症するリスクを有する患者)に、(薬物として)投与されうる。患者が、ヒトであるのが好ましい。
【００７９】
本発明の組成物の好ましい投与経路は、特に、静脈内または皮下投与による非経口投与である。非経口投与のために、本発明の医薬組成物は、上記の医薬的に許容しうる賦形剤と共に製剤化された、注射可能な投与単位剤形、たとえば、溶液、懸濁液またはエマルションとして提供される。しかしながら、投与量および投与方法は、治療される個々の患者に依存する。
【００８０】
本発明の抗体は、他のmAB投薬計画から公知であるか、または特定の個人について特別に評価および最適化された任意の適切な投薬量で投与することができる。たとえば、本発明のmABは、1mg〜10g、好ましくは50mg〜2g、特に100mg〜1gの量での投与剤形として提供(または投与量として適用)されうる。通常の投薬量は、また、患者の体重kgに基づいて決定することができ、たとえば、好ましい投薬量は、0.1 mg〜100 mg/体重kg、特に1〜10 mg/体重kg(投与期間当り)の範囲である。
【００８１】
本発明の組成物の好ましい投与様式は非経口投与であるので、本発明の医薬組成物は、液体であるか、または滅菌脱イオン水または蒸留水または滅菌等張リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解される準備ができているのが好ましい。好ましくは、このような組成物の1000μg(乾燥重量)は、0.1〜990μg、好ましくは1〜900μg、より好ましくは10〜200μgの本発明の抗体、および任意に1〜500μg、好ましくは1〜100μg、より好ましくは5〜15μg(緩衝)塩(最終容量において等張緩衝液を得るのが好ましい)、および任意に0.1〜999.9μg、好ましくは100〜999.9μg、より好ましくは200〜999μgの他の賦形剤を含むか、またはから成る。好ましくは、このような乾燥組成物100mgは、滅菌脱イオン/蒸留水または滅菌等張リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解されて、0.1〜100ml、好ましくは0.5〜20ml、より好ましくは1〜10mlの最終体積を得る。
【００８２】
本発明の過程で発見および/または特徴付けられたエピトープのいくつかは、(選択性および免疫原性の点で)抗体産生に非常に適していることが判明したので、本発明のもう1つの態様は、能動免疫アプローチ(すなわち、ワクチン接種)において同じエピトープを使用することに関する。
【００８３】
その結果として、本発明のこの態様は、以下の配列：
(A)GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)およびGRGDSVVYG(配列番号：55)から選ばれる1種以上の配列；および／または
(B)TYDGRGDSVVYG(配列番号：10)、VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)、PTVDTYDGRGDS(配列番号：14)およびDTYDGRGDSVVY(配列番号：56)およびTVDTYDGRGDSV(配列番号：57)から選ばれる1種以上の配列、ここで、ペプチド、特に配列VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)またはPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)を有するペプチドが、そのC末端にてアミド化されるのが好ましい(R-COO-NH2(ここでRは、そのC末端カルボキシル基をもたないペプチドである)をもたらす)；および／または
(C)VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)およびGDSVVYGLR(配列番号：58)から選ばれる1種以上の配列；
を有する、少なくとも1つの単離されたOpnペプチドを含むワクチンであって、
該ペプチドが医薬的に許容しうる担体に結合するワクチンを提供する。これらのエピトープは、患者において、ThrOpn、MmpOpn、またはその両方に対する強力かつ選択的な応答を誘発し、一方、flnOpnに対してより低い応答を誘発することが期待できるので、非常に適切である。
【００８４】
本発明以前には、Thr-またはMMP-切断のいずれか、またはその両方によってアクセス可能になるか、あるいは、隠れたドメインに関連してRGD領域に対処することによってOpnの隠れたドメインを特異的に標的とする、ワクチン接種アプローチは、当業者に知られていなかった。
【００８５】
国際公開第02/25285号は、Opnに対する抗体を含む転移の予後指標に関する。この文献は、p. 6ffにおいて、抗原ペプチドを含むワクチンが、Opnに対する抗体を生成するであろうことを教示する。この文献は、癌の治療に関連するにすぎない。さらに、この文献は、ペプチドが由来し得る配列としてN末端Opn配列を明示的に記載するだけであり、該ペプチドは、本発明のワクチンのペプチドから100アミノ酸残基以上離れている。特に、この文献は、「アミノ末端が細胞外に露出している」ので、ペプチドがN末端に由来するのが好ましいと教示しているが、Opnが分泌され、場合によりトロンビンのようなプロテアーゼによってプロセシングされるという事実を一見すると忘れているようである。
【００８６】
さらに、本発明のワクチンによって誘導された免疫血清は、全長タンパク質(flOpn)に対する反応性が低いことを示しているが、Opn(MmpOpn、ThrOpn、または両方)の先端切断型変異体に対して特異的であることが本明細書に示される(たとえば、図1および実施例1参照)。これにより、本発明のワクチンによる治療を受けている患者の副作用を低減する、治療における非常に標的化されたアプローチが可能になる。
【００８７】
したがって、本発明の「ワクチン」組成物は、「免疫原性組成物」、すなわち、その組成物が適用されるヒト個体において免疫応答を誘発する組成物であるとみなされてもよい。しかしながら、ヒト個体における免疫応答を誘発する能力は、集団内で著しく変化し得ることが知られており、したがって、本発明の目的として、もし特定の集団の個体の少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも50％において、本発明による免疫原性組成物のデリバリー後の免疫反応が検出可能であるならば、たとえば、デリバリーされたペプチドに特異的な抗体が、個体の免疫系によって形成されるならば、それは「免疫原性組成物」と呼ばれる。
【００８８】
本発明のワクチンの1種以上のペプチド、特に配列TYDGRGDSVVYGおよびPTVDTYDGRGDSを有するペプチドが、免疫付与のために使用されるペプチドのより中心部分に抗体応答を向けるために、そのC末端でアミド化されるのが好ましい。もう1つの好ましい実施態様において、本発明のワクチンの1種以上のペプチドは、当技術分野で公知の他の方法で修飾される。そのような修飾は、グリコシル化、ペグ化、ビオチン化、アルキル化、ヒドロキシル化、アデニル化、リン酸化、スクシニル化、酸化、またはアシル化、特にアセチル化の1種以上を含む。これは、本発明のワクチンの医薬的特性を改善する。
【００８９】
本発明によれば、ペプチドは、医薬的に許容される担体に結合または融合される。好ましくは、医薬的に許容しうる担体は、1種以上のKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP；Biol.Chem. 358：581)、ならびに、Singh & O'Hagan、1999(特に、この文献の表1に記載のもの)およびO'Hagan & Valiante、2003(特に、低溶解性アルミニウム組成物(たとえば、水酸化アルミニウム)、MF59、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(たとえば、QS21)、MDP誘導体、CpGオリゴ、IC31、LPS、MPL、スクワレン、D,L-α-トコフェロール(たとえば、水中油系中、リン酸緩衝化生理食塩水と混合して)、ポリホスファゼン、エマルション(たとえば、フロイント、SAF)、リポソーム、ビロソーム、イスコム、渦巻状物、PLG微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、熱不安定性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、突然変異毒素(たとえば、LTK63およびLTR72)、微粒子または重合リポソームなどのこの文献に記載の先天性免疫増強化合物およびデリバリーシステムまたはその混合物を使用してもよい)に記載のアジュバント物質である。本発明の好ましい態様において、ワクチン組成物は、水酸化アルミニウムを含有する。ペプチドが担体に共有結合または融合されるのが好ましい。
【００９０】
特に好ましい実施態様において、本発明ワクチンの少なくとも1つのペプチドは、N末端および／またはC末端に付加された追加のシステイン残基を有し、少なくとも1つのペプチドは、タンパク質担体またはそれに結合したリンカーに、さらなるシステイン残基を介して共有的に結合し、ここで、リンカーは、好ましくは、ペプチドのシステインと反応するマレイミド基またはハロアセチル基を含む。
【００９１】
たとえば、保存中の抗体の安定性を高めるために、追加の賦形剤と共に本発明のワクチンを提供することが有利である。したがって、別の好ましい実施態様は、1種以上の医薬的に許容しうる賦形剤および/またはアジュバントをさらに含む本発明のワクチンを提供する。
【００９２】
適切な賦形剤は、当業者に知られており、たとえば、水(特に注射用水)、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンク溶液、ベシクル形成化合物(たとえば、脂質)、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の5％デキストロース、等張性および化学的安定性を高める物質、緩衝剤および保存剤である。他の適切な賦形剤は、それ自体が、患者にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意の化合物を包含する。例は、十分に許容しうるタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーである。このワクチンは、当業者に知られている適切な手順を介して、それを必要とする患者(すなわち、本明細書に記載の疾患または状態を有するか、または発症するリスクを有する患者)に、(薬物として)投与されうる。患者が、ヒトであるのが好ましい。
【００９３】
本発明のワクチンは、好ましくはアジュバント、より好ましくは低溶解性アルミニウム組成物、特に水酸化アルミニウムとともに製剤される。もちろん、MF59、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(たとえば、QS21)、MDP誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、IC31、LPS、MPL、ポリホスファゼン、エマルション(たとえば、フロイント、SAF)、リポソーム、ビロソーム、イスコム、渦巻状物、PLG微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、熱不安定性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、突然変異毒素(たとえば、LTK63およびLTR72)、微粒子または重合リポソームなどのアジュバントを用いてもよい。
【００９４】
適当なアジュバントは、たとえば、AS01B、AS02A、AS15、AS-2およびその誘導体(GlaxoSmithKline、フィラデルフィア、PA)；CWS、TDM、Leif、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン的またはアニオン的に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリル脂質AおよびクイルAとして市販されている。サイトカイン、たとえば、GM-CSFまたはインターロイキン2、7または12もアジュバントとして使用することができる。
【００９５】
もう1つの好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣物または誘導体、好ましくはQS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)であり、単独または他のアジュバントと組み合わせて使用することができる。たとえば、強化された系は、国際公開第94/00153号に記載されているようなQS21と3D-MPLとの組み合わせなどのモノホスホリル脂質Aとサポニン誘導体との組み合わせ、または国際公開第96/33739号に記載されているようにQS21がコレステロールでクエンチされている反応性の低い組成物を含む。他の好ましい製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルション中のQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、国際公開第95/17210号に記載されている。本発明で用いるさらなるサポニンアジュバントは、QS7(国際公開第96/33739号および国際公開第96/11711号に記載)およびQS17(米国特許第5,057,540号明細書および欧州特許第0 362 279号明細書に記載)を包含する。
【００９６】
他の好ましいアジュバントとして、モンタニドISA 720(Seppic、フランス)、SAF(Chiron、カリフォルニア、アメリカ合衆国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBASシリーズのアジュバント(たとえば、SBAS-2、AS2'、AS2、SBAS-4またはSBAS6、GlaxoSmithKlineから市販)、デトックス(Corixa)、RC-529(Corixa、ハミルトン、MT)およびその他のアミノ-アルキルグルコサミニド 4-ホスフェート(AGP)が挙げられる。さらなる例示的なアジュバントは、合成MPLおよび志賀毒素Bサブユニットに基づくアジュバントを含む(国際公開第2005/112991号明細書を参照)。
【００９７】
本発明のワクチンは、たとえば、皮内(i.d.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、鼻内、経口、皮下(s.c.)などの任意の適切な適用様式、および任意の適切なデリバリーデバイス(O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2(9)、(2003)、727-735)で投与されうる。本発明のワクチンは、好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与用に製剤される。それぞれの製剤を得るための手段および方法は、当業者に公知である(たとえば、「Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations」、Sarfaraz Niazi、CRC Press Inc、2004を参照)。
【００９８】
本発明のワクチンは、たとえば、溶液、懸濁液またはエマルションなどの注射可能な投与単位剤形で提供され、好ましくは、上述の医薬的に許容しうる賦形剤および/またはアジュバントと共に製剤化される。しかしながら、投与量および投与方法は、治療される個々の患者に依存する。
【００９９】
典型的には、ワクチンは、1種以上の本発明のペプチドをそれぞれ、0.1 ng〜10 mg、好ましくは10 ng〜1 mg、特に100 ng〜100 μgまたは、あるいは、100 fmole〜10 μmole、好ましくは10 pmole〜1 μmole、特に100 pmole〜100 nmoleの量で含む。
【０１００】
ワクチンはまた、典型的な補助物質、たとえば、緩衝液、安定剤などを含んでもよい。
【０１０１】
単一投与剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができるペプチドの量は、治療される宿主および特定の投与様式に依存して変化する。ワクチンの用量は、病状、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子によって変化しうる。投薬計画は、最適な治療応答を提供するように調整されうる。たとえば、いくつかの分割用量は、毎日、毎週、もしくは毎月、または他の選択された間隔で投与されうるか、または治療状況の緊急性によって示されるように比例的に減少されうる。ワクチンの用量を、状況に応じて最適な予防的用量応答を提供するように変化させてもよい。たとえば、本発明のペプチドおよびワクチンは、個々の抗原に対する抗体のレベルに応じて、数日間、1週間または2週間、またはさらには数ヶ月の間隔で個体に投与されうる。
【０１０２】
好ましい投与様式は、注射による投与であるから、本発明のワクチンは、液体であるか、または滅菌脱イオン水もしくは蒸留水または滅菌等張リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの液体に溶解される準備ができているのが好ましい。好ましくは、このようなワクチンの1000μg(乾燥重量)は、0.1〜990μg、好ましくは1〜900μg、より好ましくは10〜200μgの本発明の抗体、および任意に1〜500μg、好ましくは1〜100μg、より好ましくは5〜15μg(緩衝)塩(最終容量において等張緩衝液を得るのが好ましい)、および任意に0.1〜999.9μg、好ましくは100〜999.9μg、より好ましくは200〜999μgの他の賦形剤を含むか、またはから成る。好ましくは、このような乾燥ワクチン1mgは、滅菌脱イオン/蒸留水または滅菌等張リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解されて、0.1〜100ml、好ましくは0.5〜20ml、より好ましくは1〜10mlの最終体積を得る。
【０１０３】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、ワクチンは、以下の成分/特徴の2つ以上を含み得る：
2017525670.tif 000002
【０１０４】
上記セクションで詳細に説明したように、Opn、MmpOpnおよびThrOpnは、人体における発病過程に関与する。さらに、実施例および図面は、本発明のワクチンおよび抗体が機能的であることを示す。したがって、本発明の組成物またはワクチンは、好ましくは、治療、特にCVDまたは特にアテローム性動脈硬化症の予防またはT2Dの治療、特に肥満関連インスリン抵抗性の治療において使用される。
【０１０５】
本発明のもう1つの態様において、
細胞培養物中で抗体を発現させること；
抗体を精製すること；
を含む、本発明の抗体の製造方法を提供する。
【０１０６】
mAbの発現および精製の両方は、当技術分野で周知である。大規模な抗体生産(発現および精製)の概要については、たとえば、Birch & Racher、Adv Drug Deliv Rev 2006、PMID：1682257を参照されたい。技術は、従来のmAb方法、たとえば、Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む。Bリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換といったような、mAbを産生するための他の技術を用いることもできる。
【０１０７】
本発明のもう1つの態様において、
ペプチドを提供すること；
ペプチドを担体、好ましくはKLHタンパク質に結合すること；
任意に、医薬的に許容しうる賦形剤を加えること；
を含む、本発明のワクチンの製造方法を提供する。
【０１０８】
本発明のワクチン中に存在するペプチドの化学合成のための方法は、当技術分野で周知である。もちろん、組換え法を用いてペプチドを産生することも可能である。ペプチドは、細菌、酵母または真菌、哺乳類細胞または昆虫細胞などの真核細胞、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスまたはセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターにおいて産生されうる。ペプチドを製造するのに適した細菌として、大腸菌、枯草菌またはそのようなペプチドを発現することができる任意の他の細菌が挙げられる。本発明のペプチドを発現させるのに適した酵母細胞として、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ、ピキア・パストリスまたはペプチドを発現することができる任意の他の酵母が挙げられる。対応する手段および方法は当技術分野において周知である。また、組換え的に産生されたペプチドを単離および精製する方法もまた、当技術分野において周知であり、たとえば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。システイン残基がエピトープペプチドに付加されて、担体へのカップリング、特に、N末端またはC末端におけるカップリングを促進するのが有利である。
【０１０９】
前記ペプチドの単離を容易にするために、ペプチドが、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドに翻訳的に融合(共有的に結合)した融合ポリペプチドを作製することができる。典型的な異種ポリペプチドは、Hisタグ(たとえば、His6；6ヒスチジン残基)、GSTタグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)などである。融合ポリペプチドは、ペプチドの精製を容易にするだけでなく、精製工程中のペプチドの分解を防止することもできる。精製後に異種ポリペプチドを除去することが望ましい場合、融合ポリペプチドは、ペプチドと異種ポリペプチドとの間の接合部に切断部位を含むことができる。切断部位は、該部位のアミノ酸配列に特異的な酵素(たとえば、プロテアーゼ)で切断されるアミノ酸配列から構成されてもよい。
【０１１０】
これに関連して、結合/共役化学(たとえば、GMBSなどのヘテロ二官能性化合物およびもちろん「バイオコンジュゲート技術」、Greg T. Hermansonに記載されているその他の化合物を介する)は、当業者に公知の反応から選択されうる。医薬的に許容しうる賦形剤は、上記で詳細に議論され、当技術分野でも知られている。
【０１１１】
本発明の抗体はまた、患者の体内におけるThrOpnまたはMmpOpnまたは両方のレベルの変化を伴う疾患の診断または予後にも適している(図6および実施例6に示される)。したがって、本発明のもう1つの態様において、
患者の単離されたサンプル、好ましくは血液および／または脂肪組織、特に皮下脂肪組織からのサンプルを提供すること；
好ましくはELISAまたはウエスタンブロットによって、サンプル中のThrOpn、MmpOpnのレベルまたはThrpOpnおよびMmpOpnの凝集レベルを測定するために、請求項1〜10のいずれか1つに記載の抗体を使用すること；
これらのレベルを健康なコントロール集団のレベルおよび／またはより早い時点における患者のレベルと比較すること；
疾患もしくは状態、好ましくは心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、または2型糖尿病、特に肥満関連インスリン抵抗性の診断または予後、あるいは該疾患もしくは状態の進行の診断または予後を創出すること；
を含む、診断方法を提供する。患者がヒトであるのが好ましい。
【０１１２】
ウエスタンブロットでは、前記疾患または状態(すなわち、異常なレベルの切断されたオステオポンチンに伴う疾患、特に肥満関連インスリン抵抗性および／またはアテローム性動脈硬化症)であると診断された患者からのサンプルのバンド強度は、適切なコントロールと比較して、有意に上昇する(図6および実施例6参照)。典型的には、バンド強度は、適切なコントロールと比較して、少なくとも25％高いか、特に50％高いか、または75％高い。当業者であれば、コントロールと比較しての前記疾患または状態を有すると診断される患者からのサンプルの実際の差異が、抗体結合の測定方法、サンプル処理などの多くの要因に依存することを理解し、抗体結合を測定する他の方法(たとえば、ELISAによる)などにより、前記要因に本発明の方法を容易に適合させることができる。
【０１１３】
この方法は、患者の身体の中または上では行われない。
【０１１４】
この方法がを用いて、本明細書に記載の任意の治療の効率をモニターするのが好ましい。
【０１１５】
一般に、本発明の抗体を惹起するペプチドまたは本発明のワクチンの成分としてのペプチドは、そのC末端でアミド化され得るか、または当技術分野で公知のように修飾されうる。特に、配置列TYDGRGDSVVYGおよびPTVDTYDGRGDSを有するペプチドは、免疫応答に使用されるペプチドのより中心部分に抗体応答を向けるために、そのC末端でアミド化されうる。
【０１１６】
さらに、本発明の抗体およびワクチンは、単離された形態で、すなわち動物および／またはヒトの身体の外側に提供される。
【０１１７】
本明細書においては、他に特記しない限り、それぞれオステオポンチン、Opn、flOpn、MmpOpn、およびThrOpnという表現は、それぞれヒトオスオポンチン、ヒトOpn、ヒトflOpn、ヒトMmpOpnおよびヒトThrOpnを意味する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、賦形剤という用語は、担体という用語よりも広い、すなわち、担体は賦形剤であるが、その逆はない。
【０１１９】
本明細書で使用する「治療する」という用語は、既に存在する病態または病気(disease state or condition)を治癒することを意味する。治療は、病態または病気の発症を阻害、すなわち進行を停止すること、および緩和、すなわち疾患の退行を引き起こすことも含みうる。
【０１２０】
本明細書で使用する「防止する」という用語は、特に、患者または被験者が病態または病気に罹患するリスクがある場合に、患者または被験者において病態または病気が完全にまたはほぼ完全に停止することを意味する。
【０１２１】
本明細書で使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列において超可変である(「相補性決定領域」または「CDR」)か、および／または構造的に規定されたループの形態「超可変「ループ」)をとるか、および／または抗原接着残基(「抗原接着」)を含む、抗体可変領域のそれぞれの領域を意味する。一般に、抗体は、6つのHVRを含む：VHに3つ(H1、H2、H3)、VLに3つ(L1、L2、L3)。例示的なHVRは、本明細書に開示される。
【０１２２】
ここで、「Ab」は抗体を意味し、用語「mAb」はモノクローナル抗体を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、たとえば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる可能性があり、一般的に少量で存在する変異体抗体を除き、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一であるかまたは同一のエピトープに結合する集団から得られた抗体を意味する。典型的には、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージ-，酵母-または哺乳動物-細胞ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などのさまざまな技術によって作成されうるが、これらに限定されるものではなく、このような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
【０１２４】
本発明において、「医薬品調製物」および「薬理学的組成物」という用語は互換的に用いられ、ヒト個体へのデリバリーを意図し、かつそれに適した組成物を意味する。このような調製物または組成物は、GMP(品質管理規制(good manufacturing practices))にしたがって製造され、EMAおよびFDA、特にEMAによって必要とされる前提条件を遵守するように十分に滅菌およびパッケージングされている。
【０１２５】
本発明を、以下の実施例および図面によりさらに説明するが、本発明は、それらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】全長Opn(flOpn)、トロンビン切断Opn(ThrOpn)またはメタロプロテイナーゼ切断Opn(MmpOpn)のいずれかに対するワクチン誘発血清の免疫反応性。ELISAを用いて免疫反応性を試験した。(A)配列番号：1-5のペプチドを含むワクチンは、主にThrOpnに対する血清を誘発する。(B)配列番号：6-9のペプチドを含むワクチンは、主にMmpOpnに結合する血清を誘発する。配列番号10のペプチド配列は、ペプチド配列番号6〜9と同じアミノ酸で終わるが、それらはすべてMmp切断部位を表し、配列番号10を含むワクチンは、試験されたすべてのOpn変異体を認識する免疫血清を誘導する。(C)配列番号：11〜14のペプチド配列を含むワクチンは、試験されたすべてのOpn変異体に結合する血清を誘発する。
【図２】ワクチン誘導抗体の機能的活性の評価。(A)全長Opnによって誘導される細胞接着は、flOpnを含む全てのOpn変異体への結合を示す配列番号：12または14含有ワクチンによって誘導された血清を用いて阻害することができる。他のすべての血清はこの阻害能を示さない。ThrOpn(B)またはMmpOpn(C)のいずれかによって誘導される細胞接着は、ThrOpn(配列番号：1または2によって誘導される)に特異的な血清またはMmpOpn(配列番号：7または8によって誘導される)に特異的な血清のいずれかによって、および試験されたすべてのOpn変異体に対する汎反応性(pan reactivity)を示す、配列番号：12または14を含むワクチンによって誘導される血清によって、阻害され得る。コントロール血清は、すべての場合において細胞接着に何の影響も示さない。
【図３】全長Opn(flOpn)、トロンビン切断Opn(ThrOpn)またはメタロプロテイナーゼ切断Opn(MmpOpn)のいずれかに対するmAbの免疫反応性。ELISAを用いて免疫反応性を試験した。(A)mAb4-4-2は、ThrOpnに排他的に結合することを示す。(B)および(C)mAb7-5-4および9-3-1は、ThrOpnに対してわずかな交差反応性を示すが、MmpOpnに対して高度に反応性である。(D)21-5-4 mAbはすべてのOpn型に結合するが、切断されたOpn変異体に対してより反応性が高い。
【図４】flOpn(レーン1-4)、ThrOpn(レーン5-6)、またはMmpOpn(レーン7-8)のいずれかに対するウエスタンブロット分析におけるmAbの免疫反応性。(A)mAb4-4-2はThrOpnに対する弱いが排他的な結合を示す。(B)および(C)mAb7-5-4および9-3-1は、両方の切断Opn型への結合を示すが、明らかにMmpOpnに対してより反応性が高い。(D)21-5-4 mAbは全てのOpn型に結合するが、切断されたOpn変異体に対してより反応性が高い。(E)使用したマーカーを示す。(F)ローディングスキーム。
【図５】mAbの機能的活性の評価。(A)ThrOpnによって誘導された細胞接着は、mAb21-5-4 mAb4-4-2によって阻害することができるが、ThrOpnに特異的なものは、この設定において阻害能を持たないように見える。(B)MmpOpnによって誘導される細胞接着は、mAb7-5-4および9-3-1などのMmpOpnに対してより反応性の高いmAbおよび汎反応性mAb21-5-4によって阻害されうる。
【図６】ヒト脂肪組織(AT)における切断されたOpnの測定。(A)皮下AT溶解物を、mAb9-3-1を用いてイムノブロットした。(B)調査した全ての痩せ(n＝6)および肥満(n＝6)ドナーのβ-アクチンに関連する25kDバンドの定量化。この図は、平均+/-SE **、p＜0.01(スチューデントのT検定)を示す。
【図７】mAb4-4-2のCDRループの配列決定結果のグラフ表示。(A)VH領域のCDRループ(B)VL領域のCDRループ。Lefranc et al. (Nucleic Acids Research 1999、PMID：12477501)による表示/IMGTナンバリングシステム。青で塗りつぶされた円は、抗体の大部分において疎水性である部位でのフレームワーク1-3における疎水性(非極性)残基である。黄色の斜線の付いた円はプロリン残基である。四角はCDRの始まりと終わりにおける重要な残基である。フレームワーク内の赤色アミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【図８】mAb7-5-4(および同一のクローンmAb9-3-1)のCDRループの配列決定結果のグラフ表示。(A)VH領域のCDRループ(B)VL領域のCDRループ。Lefranc et al. (Nucleic Acids Research 1999、PMID：12477501)による表示/IMGTナンバリングシステム。青で塗りつぶされた円は、抗体の大部分において疎水性である部位でのフレームワーク1-3における疎水性(非極性)残基である。黄色の斜線の付いた円はプロリン残基である。四角はCDRの始まりと終わりにおける重要な残基である。フレームワーク内の赤色アミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【図９】mAb21-5-4のCDRループの配列決定結果のグラフ表示。(A)VH領域のCDRループ(B)VL領域のCDRループ。Lefranc et al. (Nucleic Acids Research 1999、PMID：12477501)による表示/IMGTナンバリングシステム。青で塗りつぶされた円は、抗体の大部分において疎水性である部位でのフレームワーク1-3における疎水性(非極性)残基である。黄色の斜線の付いた円はプロリン残基である。四角はCDRの始まりと終わりにおける重要な残基である。フレームワーク内の赤色アミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
実施例
材料および方法
活性ワクチン接種アプローチ
雌性BALB/cマウス(6〜8週齢)をプライミングし、KLH結合ペプチドワクチンを隔週で4回ブースト免疫した(pH7.4のリン酸塩緩衝液中、皮下、200 μl)。アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いた。それぞれのKLH結合ペプチドワクチンを注射するために6匹のマウスを使用した。実験を繰り返し、その代表を以下に示す。マウス血清の抗体力価を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって分析した。力価を、半最大結合(すなわち、ODmax/2)を与える血清希釈として計算し、一群あたり5〜6匹のマウスのメジアン力価を提示する。導された抗体の機能的活性を、グルクロニダーゼ酵素放出アッセイによって評価した。
【０１２８】
モノクローナル抗体産生
免疫用抗原
マウスに、マレイミド基を含むリンカー(N-メチルピロリドン、NMP)を介して担体タンパク質KLH(MP Biomedicals)に結合したペプチドからなる結合体を注射した。我々は、3つの異なるペプチドを用いた：配列番号：2(配列 SVVYGLR-COOH)、配列番号：7(配列 GDSVVYG-COOH)および配列番号：12(配列 C-TYDGRGDSVVYG-CO-NH2)。配列C-SVVYGLR-COOHを用いて、ThrOpnを特異的に標的とする抗体を誘導し、最終的に産生し、配列C-GDSVVYG-COOHを使用して、MmpOpnに特異的に結合する抗体を産生することを目的とした。対照的に、RGDSVVYGモチーフに結合し、したがってThrOpnおよびMmpOpnの両方に特異的な抗体を誘導することを目的として、C-TYDGRGDSVVYG-CO-NH2を免疫化のために使用した。
【０１２９】
N末端システインのSH基へのリンカーの結合を介して起こるペプチドの結合は、、2段階プロセスである。まず、KLHをマレオイル化し；1 mgのリンカー(50 mg/ml NMP)を1 mlのKLH溶液(0.1 mM NaHCO3中、10 mg/ml、pH＝8.3)に添加し、室温(RT)にて1時間インキュベートした。次に、KLH-リンカー溶液を、PBSで平衡化したセファデックスG50カラム(1.5×14 cm)を用いて脱塩した。第2段階では、マレオイル化KLHをペプチドにカップリングし；100 μlのペプチド溶液(アクア・ビデスト(aqua bidest)中、10 mg/ml)を1 mlのマレオイル化KLH溶液(PBS中、2mg/ml)と混合し、室温にて2時間インキュベートした。反応しないマレイミド基をブロックするために、2-メルカプトエタノールを溶液に加え(10 nMの濃度になるまで)、4℃にて一夜インキュベートした。次いで、結合体をPBSに対して4℃にて透析した(3回の緩衝液交換、分子量カットオフを10,000に設定した)。
【０１３０】
分析用抗原
マウス血清およびハイブリドーマ上清中のNMP-およびKLH-特異的抗体を排除するために、上述のプロトコルにしたがって、それぞれのELISA分析(「免疫化」および「脾細胞と骨髄腫細胞の融合」参照)に使用されるペプチド、別個のリンカー(SMPH、スクシンイミジル-6-[(β-マレイミドプロピオアミド)ヘキサノエート]、Sigma)-担体タンパク質(BSA、Sigma))の組み合わせを使用した。
【０１３１】
免疫化
雌性8週齢のBALB/cマウス(Janvier、フランス)を、39日間の期間にわたる腹腔内注射によって結合体で免疫化した。血清サンプルを免疫化期間中に採取し、成功した抗体誘導のためのコントロールとしてELISAで試験した。
【０１３２】
脾細胞と骨髄腫細胞の融合
3つのオステオポンチンペプチドに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、以下のプロトコルにしたがって脾細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって作製した。一般的に、細胞を、抗生物質(10000 L.Eペニシリン、10,000 μg/mlストレプトマイシン、25 μg/mlアンホテリシン、100x、PAA)、2-メルカプトエタノール(Sigma)、L-グルタミン(L-グルタミン)、安定したグルタミン(100倍、PAA)、HT-サプリメント(50倍、GIBCO/BRL)、MEM非必須アミノ酸(100X、PAA)および10、15または20％FCS(PAA)を補足した完全DMEM培地中で培養した。免疫化マウスの脾臓を取り出し、ホモジナイザーおよび細胞ストレーナーを用いて単一細胞懸濁液に加工した。「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)」から骨髄腫細胞SP2/0-Ag14(SP2/0)を注文し、完全DMEM培地(10％FCS)中で培養し、マイコプラズマ汚染について定期的に試験した。脾細胞および骨髄腫細胞SP2/0をDMEMで洗浄し、ポリエチレングリコール3350(1 ml 50％w/v、Sigma)と融合させた。生成したハイブリドーマを、完全DMEM培地(20％FCS)およびアミノプテリン(50倍、Sigma)(HAT培地)に再懸濁し、96ウェル組織培養プレート(Corning Costar)中の腹腔フィーダー細胞の上に播種した。ハイブリドーマを、37℃、5％CO2にて10日間インキュベートした。
【０１３３】
マウス血清およびハイブリドーマ上清のスクリーニングのためのELISA
ELISAプレート(PAA、カタログ番号PAA38096X)を、100 mM NaHCO3、pH9.6中の4 μg/mlのペプチド-BSA結合体(以下の表を参照)でコーティングした。次いで、プレートをTBS(10 mM Tris、200 mM NaCl、pH＝7.8)および0.01％Triton X-100で洗浄し、TBS中2％FCS(v/v)でブロックした。ハイブリドーマ上清(原液)および血清(1：100)をブロッキング緩衝液で希釈し、被覆されたプレートに塗布した。ネガティブコントロールとしてSP2/0細胞の細胞上清を使用した。次いで、プレートを洗浄し、AP結合ヤギ抗マウスIgG抗体(Sigma)を用いて結合した抗体を検出した。アルカリホスファターゼ(AP)の基質として、4-ニトロフェニルホスファート(2 mM、5％ジエタノールアミン中、1 mM MgCl2、Fluka)を使用した。吸光度を、マイクロプレートリーダー(Dynex Opsys MR)を用いて405nmにて読み取った。マウス血清中の抗体力価を血清滴定により決定した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングのために、シグナルが405nmにおける平均ELISAプレート値の2倍である場合、クローンは陽性であると決定された。
【０１３４】
以下のペプチドはすべて、カップリングのためのN末端にシステイン残基を付加して合成された。
2017525670.tif 000003
【０１３５】
抗体産生クローンの選択段階
ELISAで陽性と判定された細胞を48ウェルプレートに移し、2〜3日間培養した。この期間に、上清をそれぞれの関連ペプチドとの反応性についてELISAによって再び試験した。選択段階は、非特異的なクローンの過剰増殖を避けるために短かった。
【０１３６】
クローニング
選択段階の後、抗体産生細胞を非産生細胞から分離することを主な目的として最初のクローニングを行った。2回目のクローニングにより、選択されたクローンがモノクローナルであることが確認された。両方の場合において、クローニングを限界希釈によって行い、細胞を24ウェルプレートに移した。6〜8日後、顕微鏡下でモノクローナル細胞増殖を分析した。その3日後、上清をELISAで分析した。最良の増殖およびELISAシグナルを示すサブクローンを、第2のクローニングおよびさらに凍結保存のために選択した。マイコプラズマ汚染についてサブクローニング上清を試験し(Greiner Bio-One、フリッケンハウゼン、ドイツ)、モノクローナル抗体のアイソタイプを市販のキット(Serotec)で決定した。
【０１３７】
モノクローナル抗体配列決定
モノクローナル抗体の配列決定は、Fusion Antibodies Ltd.(Springbank Industrial Estate、Pembroke Loop Road、ベルファスト、北アイルランド、BT17 0QL)によって行なわれた。10/10/13に、ハイブリドーマ細胞ペレットからmRNAを抽出した。全RNAを、Fusion Antibodies Ltd社内のRNA抽出プロトコルを用いてペレットから抽出した。
【０１３８】
RT-PCR
オリゴ(dT)プライマーを用いた逆転写によって、RNAからcDNAを作製した。cDNAを、S.N.A.P精製し、TdTによるcDNAのテーリングを、5'RACEキットを用いて行った。モノクローナル抗体DNAのVHおよびVL領域の両方を増幅するために、AAPおよび可変領域リバースプライマーを用いてPCR反応をセットアップした。
【０１３９】
VHおよびVL産物を、Invitrogen配列決定ベクターpCR2.1にクローニングし、TOP10細胞に形質転換し、陽性形質転換体についてPCRによってスクリーニングした。選択されたコロニーを採取し、ABI3130x1 Genetic AnalyzerでのDNA配列決定によって分析したが、その結果は下記の通りである。
【０１４０】
組換えヒトOpnタンパク質のクローニング、生成および産生
示されたタグ(Strep、6xHis)を含むOpnの3つの組換体を発現させ、精製した：
a)Strep-314 AA(全長Opn)-6xHis
b)6xHis-166 AA(N末端 MMP切断Opn)
c)6xHis-168 AA(N末端 トロンビン切断Opn)
【０１４１】
テンプレートとしてcDNAクローンBC017387(Thermo Scientific)を用いた。
同じフォワードプライマーr(5’-AGCGGCTCTTCAATGATACCAGTTAAACAGGCTGATTC-3’；配列番号：42)および以下のリバースプライマー：
a)Strep-314 AA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCATTGACCTCAGAAGATGCACT-3’；配列番号：43)；
b)6xHis-166 AA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCCTATCCATAAACCACACTATCACC-3’；配列番号：44)(単にN末端タグ付型のための166 AA後の停止コドンを含む)；
c)6xHis-168 AA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCCTACCTCAGTCCATAAACCACAC-3’；配列番号：45)(単にN末端タグ付型のための168 AA後の停止コドンを含む)；
を用いて、DNA配列を増幅した。
【０１４２】
製造者指示書にしたがい、StarGate Entry Cloning system(IBA、Goettingen)を用いて、pENTRY-IBA51プラスミドにアンプリコンをクローニングし、次いで、pCSG-IBA142またはpCSG-IBA144プラスミド(すべてIBA)のいずれかにサブクローニグし、それぞれN末端 6xヒスチジンタグ、N末端 OneStrep(登録商標)タグ、C末端 6xヒスチジンタグを導入した。
【０１４３】
Lipofectamine 2000(Life Technologies、カールスバッド)を用いるトランスフェクション、続いてNi-NTA樹脂(Merck、ダルムシュタット)またはStrep-Tactin(IBA、ゲッチンゲン)充填重力流カラムによる精製により、HEK293 c18細胞株(ATCC、CRL-10852)を誘導した。精製したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析し、PBSに対して透析した。
【０１４４】
組換えOpnタンパク質によるモノクローナル抗体の交差反応性についてのELISA
100mM NaHCO3、pH9.2中の1μg/mlの組換えヒトOpnタンパク質(コントロールとして、自家製またはPeproTechから入手、カタログ番号120-35)でELISAプレート(Nunc、カタログ番号439454)をコーティングし、1×PBS中、1％BSAでブロックした。結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体(BioGenes、1 μg/ml)およびポジティブコントロールとして使用したマウス血清を、HRP結合ヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Laboratory、カタログ番号115-035-068、0.2 μg/ml)を用いて検出した。ABTS(0.1 Mクエン酸中、0.68 mM ABTS、pH＝4.3)および0.1％過酸化水素を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の基質として使用した。基質反応を、1％SDS溶液をウェルに添加することによって停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー(TECAN Sunrise)を用いて405 nmにて読み取った。
【０１４５】
ゲル電気泳動およびウエスタンブロット
ゲル電気泳動のために、4〜20％のCriterion TGXプレキャストゲル(BioRad、カタログ番号567-1095)を使用した。組換えヒトOpnタンパク質(自家製またはPeproTech、カタログ番号120-35)を、還元ローディングバッファー(0.1%(v/v)β-メルカプトエタノールを補足した4×LDS-Buffer、Invitrogen、カタログ番号NP0007、0.1％(v/v)を含む)中で70℃にて10分間変性させた。1ウェル当たりのタンパク質充填量は0.6 μgであった。
プレシジョンPlusプロテインデュアル(Biorad、カタログ番号161-0374)をタンパク質ラダーとして、および1x Tris/グリシン/SDSバッファー(Biorad、カタログ番号161-0732)をランニングバッファーとして使用した。トランスファーターボブロットトランスファーパック(Biorad、カタログ番号170-4159)を用いて、タンパク質を0.2μmのニトロセルロース膜に転写した。膜を市販のブロッキング溶液(Thermo scientific、＃37515)でブロックした。抗体を1:10のブロッキング溶液で希釈した。最初に、膜をマウス抗ヒトモノクローナル抗体(BioGenes、1 μg/ml)とともに1時間インキュベートし、0.1％PBSTで洗浄した。検出のために、HRP結合IgG抗体(Southern Biotech、カタログ番号1034-05、1：40,000)を45分間インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液およびdH2Oで膜を洗浄した。最終的に、膜を基質(ECL Clarity Western、Biorad＃170-5061)とともに5分間インキュベートした。LabWorksソフトウェア4.6を用いて画像取得を行った。
【０１４６】
機能アッセイ-接着アッセイ
V型底のマイクロプレート(Greiner、カタログ番号651161)を0、10または30 nMの組換えヒトOpnタンパク質でコーティングし(1時間、37℃)、1％BSA/1x PBSでブロックした(1時間、37℃)。1x PBSで洗浄後、5 μg/mlのブロッキング抗体をウェルに添加した(37℃にて1時間)。マウス抗ヒトモノクローナル抗体(BioGenes)およびIgG1アイソタイプコントロール(Sigma、カタログ番号M9269)を使用した。次に、プレートを洗浄し、20,000個の予めCMFDA標識したHEK293細胞をウェルに加えた(30分、37℃)。ただちに、HEK293細胞を0.02％EDTA(Versene、GIBCO、カタログ番号15040)で回収し、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO、カタログ番号15140)をおよび4mM L-グルタミン(GIBCO、カタログ番号25030)補足した、フェノールレッド(Sigma、カタログ番号D5921)を添加しないDMEMに再懸濁させた。標識のために、1.5 μM CMFDA細胞トラッカー(Molecular Probes、カタログ番号C7025)をHEK293細胞に加えた(30分、37℃、500rpm)。細胞を、フェノールレッドを含まないDMEMで2回洗浄した後、ウェルに添加した。プレート上で細胞をインキュベートした後、プレートを100gで5分間遠心分離した。非接着細胞は、V型ウェルの底に移動するので、それらを、ボトムリーディング(Geniosマイクロプレートリーダー、励起485 nm、発光535nm)を介して蛍光強度を測定することによって定量化した。
【０１４７】
表面プラズモン共鳴(SPR)
Biacore 2000で結合分析を行った。異なるOpn産物を表すさまざまなビオチン化ペプチドリガンドを、30 μl/分の流速で、1つのフローセル内のストレプトアビジンチップ上にそれぞれ固定化した。第4のフローセルは、ペプチドを含まない参照細胞である。ペプチドをDMSO溶液に溶解し、さらにHBS緩衝液(0.01 M Hepes、0.1 M NaCl、0.004 M EDTA、0.05％P20、pH＝7.4)で希釈した。固定化後、各フローセル内のチップを1 μMのD-ビオチンで飽和させた。コントロールとして、非特異的血清を、全てのセルに注入した。抗体の流速は、2 μg/mlの濃度で30 μl/分であり、注入容量は100 μlであった。解離時間を500秒に設定した。チップを60 μlの50mM HClで再生させた。Off-rate値およびKD値を、Biacore SPRソフトウェアを用いて計算した。
【０１４８】
診断ツールとしての本発明のmAb-ヒトサンプル中のOPN濃度の測定(実施例6も参照)
重度の肥満(BMI≧40 kg/m2)患者、または選択的肥満手術もしくは他の腹腔鏡下腹部手術を受けた20歳から65歳の間の年齢および性別が一致した痩せ型から過体重(BMI≦30)の非糖尿病患者[空腹時血漿グルコース ＜126 mg/dLおよび75-gの経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)の2時間後の血漿グルコース ＜200 mg/dL]から、皮下脂肪組織(AT)生検を得た。過去2週間以内に急性疾患を起こしている；既知の真性糖尿病または抗糖尿病薬の使用；後天性免疫不全(HIV感染)；肝炎またはその他の重大な肝疾患；重症または未治療の心血管疾患、腎疾患または肺疾患；未治療または不適切に治療された臨床的に重要な甲状腺疾患；貧血；活動性悪性疾患；ワルファリン治療を含む先天性または後天性出血性障害；妊娠または授乳中；の場合には患者を除外した。
【０１４９】
50 mgの凍結AT、pH 7.4に調整した、210 mMトリス、140 mM NaCl、1％ Triton-X、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)およびナトリウム-オルトバナジウム酸塩(1mM)を含む210 μlの溶解緩衝液中でホモジナイズした。次いで、サンプルを95℃にて10分間、還元サンプルローディングバッファーで煮沸し、4℃にて10k U /分で遠心分離した。脂肪層の下の液相を採取し、遠心分離を繰り返し、600nmタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度を測定した。サンプル当たり10 μgのタンパク質を、12％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGE上で分離し、標準的なウエスタンブロット手順にしたがってニトロセルロース膜上にブロットした。20 kDaのmAbCMI 9-3およびHRP標識ヤギ抗マウス(BioRad＃170-6516)を用いて、25kDaのOPN断片を検出した。抗-b-アクチン(Novus Biologicals ＃AC-15)をローディングコントロールとして用いた。ブロットを視覚化し、バンド強度をFusion-FXイメージング装置(Peqlab)およびImageJソフトウェア(ImageJ、アメリカ国立衛生研究所)を用いて定量化した。
【０１５０】
能動的ワクチン接種
【実施例１】
【０１５１】
トロンビン切断またはMMP3/7/9切断形態のOpnに特異的に結合する抗体免疫応答の誘導、ならびに隠れたドメインのコンテキストにおいて159RGD161領域に結合し、すべての形態のOpn(全長、トロンビン切断およびMMP3/7/9切断Opn)に結合する抗体応答の誘導
この研究では、マウスを、表1に列挙した抗原性ペプチドの1つを含む結合型ワクチンで免疫化した。この研究の目的は、Opnの先端切断型形態であるOpnのトロンビン切断形態またはMMP3/7/9切断形態のいずれかに特異的に結合する抗体応答を誘導する能力を有する抗原性ペプチドを同定することであった。さらに、この研究は、Opnの隠れたドメインのコンテキストにおける159RGD161モチーフに結合し、したがって、Opn特異的であるがOpnの異なる形態(全長、トロンビン切断およびMMP3/7/9切断Opn)を区別しない抗体応答を誘導する抗原性ペプチドを同定することを目的とし、
【０１５２】
トロンビン切断によって生成されたネオエピトープを特異的に標的とする抗体応答を誘導することができるペプチドを同定するために、長さが異なるペプチド(配列番号：1-5)を用いて免疫化した。これらのペプチドはすべて、C末端でトロンビン切断部位を表すアルギニン(R)で終わる。これらのペプチドは、それらのC末端でアミド化されなかった。
【０１５３】
MMP3/7/9切断によって生成されたネオエピトープを特異的に標的とする抗体応答を誘導することができるペプチドを同定するために、再度、長さが異なるペプチド(配列番号：6-10)を用いて免疫化した。これらのペプチドはすべて、C末端でMMP切断部位を表すグリシン(G)で終わる。これらのペプチドは、それらのC末端でアミド化されなかった。
【０１５４】
Opnのフランキングアミノ酸(隠れたドメインを含む)のコンテキストにおけるOpnのRGD領域(159-161位に位置する)を特異的に標的とする抗体応答を誘導することができるペプチドを同定するために、配列番号：11-14のペプチドを用いて免疫化した。これらのペプチドは、免疫化に使用される抗原性ペプチドがRGDモチーフを飛び越える(walk over)ように設計されている。これらのペプチドは、抗体応答を、免疫化に使用されたペプチドの、より中心部分に向けるために、そのC末端でアミド化された。
【０１５５】
表1：Opnを標的とする抗体免疫応答を誘導するための活性ペプチドベースの結合ワクチンのための本発明で使用されるOpnのペプチド配列。配列番号：1-配列番号：10のペプチドは、遊離カルボキシ末端(COO-)を有するが、配列番号：11-配列番号：14のペプチドは、アミド化される(COO-NH2)のが好ましい(本明細書に記載の実験においてアミド化された)。
2017525670.tif 000004
【０１５６】
示されたペプチドでマウスを免疫化し、異なる組換え的に産生された形態であるOpn(全長[flOpn]、トロンビン切断部位で終わる先端切断型Opn 1-Opn-168 [ThrOpn]、MMP切断部位で終わる先端切断型Opn 1-Opn-166 [MmpOpn])に対して誘導された抗体の中央値力価を図1に示す。全ての試験したペプチドは、注入されたペプチドに結合する抗体を同じ程度で誘導することができたが(データは示さず)、これらのペプチドによって誘発された血清は、flOpn、ThrOpnおよびMmpOpnに対する反応性に関して大きく異なる。
【０１５７】
驚いたことに、配列番号：1(配列番号：2 および配列番号：3と比較して免疫応答の程度は低いが)、配列番号：2および配列番号：3のペプチドは、トロンビン切断型のOpnに対してほとんど特異的に免疫応答を誘導した。一方、配列番号：4および配列番号：5誘導抗体は、MmpOpnにも結合するように見えた。
【０１５８】
対照的に、配列番号：7、配列番号：8および配列番号：9のペプチドは、MMP切断型のOpnを標的とする免疫応答を高い特異性および高い程度で誘導する(図1B)。これは、他のタンパク質によって誘発された血清が分析された場合はそうではない。
【０１５９】
興味深いことに、配列番号：10、配列番号：12および配列番号：14のペプチドは、すべての形態のOpnに対して反応する血清を誘導した。誘発された血清がOpnに対して特異的であり、したがって、抗体の結合が、隣接するOpn特異的アミノ酸のコンテキストにおけるアミノ酸159RGD161を必要とするということが重要である。
【０１６０】
コントロールとして使用されたワクチンが、Opn形態の1つに結合する抗体応答を誘導しなかった(データは示さず)ということが重要である。
【実施例２】
【０１６１】
ワクチン誘導免疫血清の機能的評価
実施例1に記載したように、さまざま形態のOpn(全長、Thr切断またはMMP切断Opn)の活性をブロックするワクチン誘発血清の能力を評価するために、材料および方法のセクションで詳述する機能的接着アッセイを実施した。簡単に述べると、96ウェルプレートを、組換え産生された全長Opn、トロンビン切断部位で終わる先端切断型組換えOpnタンパク質(ThrOpnまたは1-Opn-168)、またはMMP3/7/9開裂部位で終わる先端切断型組換えOpnタンパク質(MmpOpnまたは1-Opn-166)のいずれかでコーティングした。続いて、実施例1に記載したように、免疫化動物由来の血清および蛍光色素で標識したHEK293細胞を、プレートに加えた。接着を、材料および方法のセクションに記載されているように測定および計算した。
【０１６２】
図2から明らかなように、Thr切断型Opnを特異的に標的とすることが示されている(図1A)配列番号：1および配列番号：2のペプチド配列によって誘発された血清は、HEK293細胞の他のOpn型への接着を妨害することなく(図2Aおよび2C)、HEK293細胞のThrOpnへの接着をブロックし(図2B)、配列番号：1および配列番号：2によって誘導された血清の特異性が確認される。配列番号：1によって誘発された血清が使用された場合のThrOpn被覆プレートへのHEK293細胞の接着の阻害が、ペプチド配列番号：2によって誘発された血清と比較して、あまり顕著ではなかったことが重要である。これは、これらのThe-Open(図1A)に対して誘導された血清の反応性と一致する。
【０１６３】
配列番号：1および配列番号：2(図1B)とは対照的に、MmpOpnを特異的に標的とすることが示された配列番号：7および配列番号：8は、MMP切断部位(MmpOpn)で終る先端切断型Opnで被覆されたプレート上のHEK293細胞の接着をブロックする(図2C)。これらのデータは、MmpOpnに対する誘導血清の特異性を再度確認する。
【０１６４】
全ての形態のOpnに結合することが示された配列番号：12および配列番号：14は(図1)、HEK293細胞の全ての異なるOpnバージョンへの接着を阻止する能力を有し(図2A〜2C)、それらの汎反応性が再度確認される。
【０１６５】
コントロールとして、無関係なペプチド配列によって誘発された血清を使用した(コントロール配列1および2)。予想されたように、これらの血清は、各OpnバージョンへのHEK293細胞の接着を妨害しなかった。
【０１６６】
モノクローナル抗体の生成およびこれらのmAbの評価
【実施例３】
【０１６７】
モノクローナル抗体の生成および精製ならびにELISAとウエスタンブロットによる異なるOpn産物に対する結合特性の測定
mAbを特異的に標的化し、したがって異なるOpn産物(全長、ThrOpnおよびMmpOpn)を区別するために、特定の抗体応答を誘導することが示されている異なるペプチド配列を用いてマウスを免疫化した(図1および図2)。
【０１６８】
表2に概略するように、Thr切断Opn産物に特異的に結合する抗体を生成するために、配列番号2を用いて免疫化した。MMP切断Opn産物に特異的に結合する抗体を生成するために、配列番号：7を用いて免疫化し、すべてのOpn産物(全長または切断されていないかどうかにかかわらず)に結合する抗体を生成するために、配列番号12を用いて免疫化した。
【０１６９】
材料および方法のセクションに記載されているように、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を生成し、選択し、次いで、精製した。多数のmAb産生ハイブリドーマ細胞株を慎重にスクリーニングし、分析し、最後に、表2に示す4つの異なる抗体産生ハイブリドーマ細胞株を選択した。モノクローナル抗体を、プロテインAカラムを用いるアフィニティー精製によって細胞培養上清から精製し、表2に記載する特徴付けを行い、分類した。
【０１７０】
表2：モノクローナル抗体の特性
2017525670.tif 000005
【０１７１】
mAbの結合能をより詳細に特徴づけるために、ELISA研究およびウエスタンブロット分析を行った。
【０１７２】
第1に、さまざまなOpn産物(全長または先端切断型Opn断片)を特異的に認識するさまざまなmAbの能力を、ELISAを用いて試験した。
【０１７３】
図3に示すように、ネイティブ全長およびプロテアーゼ切断Opnに対する個々のモノクローナル抗体の特異性を決定した。図3Aは、mAb4-4-2は、ThrOpnと特異的に相互作用するが、mAb7-5-4およびmAb9-3-1は、MmpOpnに特異的に結合することを示す(それぞれ図3Bおよび3C)。抗体の応答をRGD領域に向けることが知られている配列番号：12によって誘発されたmAb21-5-4の反応性を図3Dに示す。このmAbは全てのOpn産物に結合するように見えるが、切断されたOpn形態に対する反応性が、より顕著である。
【０１７４】
次の一連の実験において、プロテアーゼ切断Opn断片および／または全長Opnタンパク質に明確に結合する異なるmAbの能力を、ウエスタンブロット分析によって決定した(図4)。モノクローナルAb 4-4-2は、ThrOpn(図4A、レーン5および6)に対して低いシグナル強度で反応し、mAb7-5-4およびmAb9-3-1は、MmpOpnと特異的に高強度で相互作用する(それぞれ図4Bおよび4C；レーン7および8)。ELISAデータから予想されたように、mAb21-5-4は、全てのOpn形態を染色する(図4D；全長Opn−レーン1-4、タンパク質分解的に切断されたOpn−レーン5-8)。再び、ウエスタンブロットにおいて、全長Opnは、切断されたOpn型よりも低い強度で検出された。レーン1-4に適用された組換え生産された全長Opnタンパク質は、異なるタグ系を含むので、これらのタンパク質はそのサイズが異なり、したがって、ゲル上の異なる位置に現れる。図4Eは、これらの実験で使用されたマーカーM1を表し、図4Fは、異なるOpn生成物がどのようにしてゲルに適用されたかを示す。
【実施例４】
【０１７５】
接着アッセイを用いる、選択されたmAb4-4-2,7-5-4,9-3-1および21-5-4の機能的評価
次の一連の実験では、記載した細胞ベースのアッセイにおいて、Hex293細胞のそれぞれのOpn断片への接着を阻害するという観点から抗体の機能的活性を特徴付けるために、さらなる分析を行った。ThrOpnおよびMmpOpnをこの目的のために使用した。図5Aは、モノクローナル抗体の、トロンビン切断Opn(ThrOpn)に対するHEK293細胞の接着を阻害する能力を示す。mAb4-4-2は、ThrOpn(図3および4)と特異的に相互作用することが示されているが、この機能アッセイでは、ThrOpnをブロックする能力を有していない(図5A)。ELISAおよびウエスタンブロットにおけるOpnに対する抗体の結合と、細胞ベースのアッセイにおける機能的活性の欠如との間のこの不一致は、標的タンパク質に対するその低い親和性(特に高い解離速度)によって説明されうる(表3)。対照的に、mAb21-5-4は、ThrOpnへのHEK293細胞の結合を大きく減少させる。さらに、このmAbはまた、MMPOpnへのHEK細胞の結合を阻害し(図5B)、異なるOpn産物に対する汎反応性が再度確認される。ELISAおよびウエスタンブロット分析から得られたデータを確認し、その特異性を証明しているこの場合もまた、MMP切断部位特異的mAb7-5-4および9-3-1は、HEK細胞のMmpOpn誘発接着を排他的に阻害する(図5B)。
【実施例５】
【０１７６】
SPRを用いるmAb4-4-2、7-5-4、9-3-1および21-5-4の親和性決定
それらの個々の標的に対する選択されたmAbの結合強度を定義するために、異なるOpn産物を表すペプチドを用いてSPR分析を行った。モノクローナルAb4-4-2は、ThrOpnに対する親和性が13.9nMであり、解離速度値(いったん形成された抗体-標的複合体の安定性を示す)は2.79 E-3/秒であった。解離速度値は、かなり高く、標的-抗体複合体の安定性が中程度であることを示している。したがって、複数の洗浄ステップが含まれる状況(たとえば、使用された機能的細胞ベースの接着アッセイ)において、抗体はその標的から洗い流される。これが、この抗体が機能アッセイにおいてHEK293接着の阻害を示さない理由であると予想される。一方、mAb4-4-2は、中程度〜良好な親和性(KD 13.9 nM)を示し、したがって、この抗体が、その標的を同定および結合する能力および速度を表す、高い結合(on-rate)能力を示す。抗体持続性が抗体を枯渇させるステップによって影響されない、より生理学的な状況においては、mAb4-4-2もまた機能的活性を示すことが期待される。
【０１７７】
モノクローナル抗体7-5-4および9-3-1は、ほぼ同一の解離速度およびKD値を示す。両方の場合において、KD値は、高い親和性を表す、最も低いnMまたはより高いpM範囲にある。優れた解離速度値が、mAb21-5-4によって示される。この抗体はまた、標的領域に対して最も高い親和性を示す。
【０１７８】
表3：標的に対するmAbの親和性決定
2017525670.tif 000006
【０１７９】
mAbの結果の要約
モノクローナルAb 4-4-2は、その天然型(図3A)およびその変性型(図4A)の形態でThrOpnを特異的に認識する。
モノクローナルAb 7-5-4および9-3-1は、天然型(図3BおよびC)およびその変性型(図4BおよびC)の形態のMmpOpnを特異的に認識し、機能的に活性であり、HEK293細胞のMmpOpn誘発接着の明確な阻害をもたらす(図5B)。
【０１８０】
モノクローナルAb 21-5-4は、天然型(図3D)およびそれらの変性型(図4D)の形態のすべてのOpn断片を認識する。さらに、モノクローナルAb 21-5-4は、HEK293細胞のMmpOpn-およびThrOpn-誘導接着の両方の明らかな阻害をもたらすので、機能的に活性である。
【実施例６】
【０１８１】
診断のための本発明のmAbの使用
OpnおよびMMPの増加した遺伝子発現が、ヒト脂肪組織(AT)におけるOpnタンパク質およびOpn断片の存在量に反映されているかどうかを試験するために、我々は、ATタンパク質溶解物を肥満者およびコントロールからゲル電気泳動で分離し、mAb9-3-1を用いてOpnについて検査した。これらのmAbは、主としてMmp切断Opnを認識することが示された。本発明者らは、ベータアクチン発現に対して正常化されたC末端切断産物に対応する25 kDバンドの強度が有意に増加したことを見出した(図6)。
【実施例７】
【０１８２】
モノクローナル抗体配列決定
ハイブリドーマ細胞ペレットからmRNAを抽出した。全RNAをペレットから抽出した。オリゴ(dT)プライマーを用いた逆転写によって、RNAからcDNAを作製した。cDNAを、S.N.A.P精製し、TdTによるcDNAのテーリングを、5'RACEキットを用いて行った。モノクローナル抗体DNAのVHおよびVL領域の両方を増幅するために、AAPおよび可変領域リバースプライマーを用いて、PCR反応を設定した。VHおよびVL産物をInvitrogen配列決定ベクターpCR2.1にクローニングし、TOP10細胞に形質転換し、陽性形質転換体についてPCRによってスクリーニングした。選択されたコロニーを取り出し、ABI3130xl Genetic AnalyzerでのDNA配列決定により分析した結果を、図7(mAb4-4-2)、図8(mAb7-5-4および9-3-1、これは mAb7-5-4と同一であることが判明した)および図9(mAb21-5-4)に示す。
【０１８３】
本発明は、以下の実施態様によってさらに例示されるが、これらに限定されるものではない：
1．1種以上のヒトオステオポンチン(Opn)の先端切断型変異体に特異的なモノクローナル抗体であって、
抗体が、全長Opn(flOpn；配列番号：15)に対するよりも1種以上の先端切断型変異体に対してより反応性が高く；および
抗体が、
(A)マトリックスメタロプロテイナーゼ先端切断型Opn(MmpOpn；配列番号：16)(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびトロンビン先端切断型Opn(ThrOpn；配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpnに対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(配列番号：17)(ここで、抗体は、VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)から選ばれるペプチド配列を有するThrOpnエピトープに対して特異的である)；ここで、抗体がペプチド配列SVVYGLR(配列番号：2)に対して特異的である場合、抗体の重鎖の可変領域(VH)および抗体の軽鎖の可変領域(VL)は、以下の配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む：
VH CDR1 GFSLSTYGLG(配列番号：18),
VH CDR2 IYWDDNK(配列番号：19),
VH CDR3 ARGTSPGVSFPY(配列番号：20),
VL CDR1 ENIYSY(配列番号：21),
VL CDR2 NAK(配列番号：22),
VL CDR3 QHHYGTPLT(配列番号：23),
(ここで、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもThrOpn(配列番号：17)に対する反応性が高く、好ましくはVHが配列番号：24の配列を含み、VLが配列番号：25の配列を含む)；
に対して特異的である抗体。
2．抗体が、GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)から選ばれるペプチド配列を有するMmpOpnエピトープに対して特異的である、実施態様1(A)に記載の抗体。
3．抗体が、TYDGRGDSVVYG(配列番号：10)およびPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)から選ばれるペプチド配列を有するMmpOpn/ThrOpnエピトープに対して特異的である、実施態様1(B)に記載の抗体。
4．抗体が、ペプチド配列GDSVVYGを有するエピトープに対して特異的であり、抗体のCDRが、以下の配列：
VH CDR1 GITFNTNG(配列番号：26),
VH CDR2 VRSKDYNFAT(配列番号：27),
VH CDR3 VRPDYYGSSFAY(配列番号：28),
VL CDR1 QSIVHSNGNTY(配列番号：29),
VL CDR2 KVS(配列番号：30),
VL CDR3 FQGSHVPWT(配列番号：31),
を含み、好ましくは、VHは配列番号：32の配列を含み、VLは配列番号：33の配列を含む、実施態様2に記載の抗体。
5．抗体が、ペプチド配列TYDGRGDSVVYGを有するエピトープに対して特異的であり、抗体のCDRが、以下の配列：
VH CDR1 GFSLSTSGLG(配列番号：34),
VH CDR2 ISWDDSK(配列番号：35),
VH CDR3 ARSGGGDSD(配列番号：36),
VL CDR1 SSVNS(配列番号：37),
VL CDR2 DTS(配列番号：38),
VL CDR3 FQGSGYPLT(配列番号：39)
を含み、好ましくは、VHは配列番号：40の配列を含み、VLは配列番号：41の配列を含む、実施態様3に記載の抗体。
6．CDRまたはVHまたはVLのアミノ酸の3つ、好ましくは2つ、より好ましくは1つが他のアミノ酸に変異されている、実施態様1(C)、4または5に記載の抗体。
7．抗体がMmpOpn(配列番号：16)に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対するよりもN倍以上MmpOpn(配列番号：16)に対する反応性がある；および
抗体がMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもN倍以上MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対する反応性がある；および
抗体がThrOpn(配列番号：17)に特異的である場合、抗体は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもN倍以上ThrOpn(配列番号：17)に対する反応性がある；および
ここで、Nは1.5を超え、好ましくは2を超え、より好ましくは3を超え、さらにより好ましくは5を超え、最も好ましくは10を超える；および
ここで、以下の条件：
抗体の濃度：0.25μg/ml、
二次HRP結合抗体の濃度：0.1μg/ ml、
HRP基質：ABTSおよび0.1％過酸化水素、
読み出し：405nmにおける吸光度、
を含む1% BSAで遮断された後に、MmpOpn(配列番号：16)、ThrOpn(配列番号：17)およびflOpn(配列番号：15)に対するそれぞれの抗体の反応性が、それぞれMmpOpn(配列番号：16)、ThrOpn(配列番号：17)およびflOpn(配列番号：15)でコーティングされたプレート上のELISAによって測定されるのが好ましい；実施態様1〜6のいずれか１つに記載の抗体。
8．各エピトープおよび/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離定数Kdが、50nM未満、好ましくは20nM未満、より好ましくは10nM未満、さらにより好ましくは5nM未満、最も好ましくは2nM未満である、実施態様1〜7のいずれか１つに記載の抗体。
9．各エピトープおよび/または各Opnタンパク質に関する抗体の解離速度値が、5×10-3s-1未満、好ましくは3×10-3s-1未満、より好ましくは1×10-3s-1未満、さらにより好ましくは1×10-4s-1未満である、実施態様1〜8のいずれか１つに記載の抗体。
10．抗体が、ヒト化されている、実施態様1〜9のいずれか１つに記載の抗体。
11．好ましくは単一ドメイン抗体であり、該断片が、
(A)MmpOpn(配列番号：16)(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対するよりもMmpOpn(配列番号：16)に対してより反応性が高い)；または
(B)MmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)の両方(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)に対するよりもMmpOpn(配列番号：16)およびThrOpn(配列番号：17)のそれぞれに対してより反応性が高い)；または
(C)ThrOpn(ここで、断片は、flOpn(配列番号：15)およびMmpOpn(配列番号：16)のそれぞれに対するよりもThrOpn(配列番号：17)に対してより反応性が高い)；
に対して特異的である、実施態様1〜10のいずれか１つに記載の抗体の断片。
12．少なくとも1種の実施態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体および／または少なくとも1種の実施態様11に記載の断片および少なくとも1種の賦形剤を含む、医薬組成物。
13．以下の配列：
(A)GDSVVYG、RGDSVVYGおよびDGRGDSVVYG(配列番号：7-9)およびGRGDSVVYG(配列番号：55)から選ばれる1種以上の配列；および／または
(B)TYDGRGDSVVYG(配列番号：10)、VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)、PTVDTYDGRGDS(配列番号：14)およびDTYDGRGDSVVY(配列番号：56)およびTVDTYDGRGDSV(配列番号：57)から選ばれる1種以上の配列、ここで、ペプチド、特に配列VDTYDGRGDSVV(配列番号：13)またはPTVDTYDGRGDS(配列番号：14)を有するペプチドが、そのC末端にてアミド化されるのが好ましい(R-COO-NH2(ここでRは、そのC末端カルボキシル基をもたないペプチドである)をもたらす)；および／または
(C)VVYGLR、SVVYGLRおよびDSVVYGLR(配列番号：1-3)およびGDSVVYGLR(配列番号：58)から選ばれる1種以上の配列；
を有する、少なくとも1つの単離されたOpnペプチドを含むワクチンであって、
該ペプチドが医薬的に許容しうる担体、好ましくはタンパク質担体に結合し、好ましくは、ペプチドが、担体に共有的に結合する、ワクチン
14．担体が、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、プロテインDまたはジフテリア毒素(DT)から選ばれるタンパク質、特にKLHである、実施態様13に記載のワクチン。
15．少なくとも1つのペプチドが、N末端および／またはC末端に付加された追加のシステイン残基を有し、少なくとも1つのペプチドが、タンパク質担体またはそれに結合したリンカーに、さらなるシステイン残基を介して共有的に結合し、ここで、リンカーが、好ましくは、ペプチドのシステインと反応するマレイミド基またはハロアセチル基を含む、実施態様14に記載のワクチン。
16．少なくとも1種の医薬的に許容しうる賦形剤および/またはアジュバントをさらに含む、実施態様13〜15のいずれか1つに記載のワクチン。
17．治療における使用のための、実施態様12に記載の組成物または実施態様13〜16のいずれか1つに記載のワクチン。
18．心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防における使用のための、実施態様12に記載の組成物または実施態様13〜16のいずれか1つに記載のワクチン。
19．2型糖尿病、特に肥満関連インスリン抵抗性の治療および／または予防における使用のための、実施態様12に記載の組成物または実施態様13〜16のいずれか1つに記載のワクチン。
20．実施態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体の製造方法であって、
細胞培養物中で抗体を発現させること；
抗体を精製すること；
を含む、方法
21．実施態様13〜16のいずれか1つに記載のワクチンの製造方法であって、
ペプチドを提供すること；
ペプチドを担体、好ましくはKLHタンパク質に結合すること；
任意に、医薬的に許容しうる賦形剤を加えること；
を含む、方法
22．患者の単離されたサンプル、好ましくは血液および／または脂肪組織、特に皮下脂肪組織からのサンプルを提供すること；
好ましくはELISAまたはウエスタンブロットによって、サンプル中のThrOpn、MmpOpnのレベルまたはThrpOpnおよびMmpOpnの凝集レベルを測定するために、実施態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体を使用すること；
これらのレベルを健康なコントロール集団のレベルおよび／またはより早い時点における患者のレベルと比較すること；
疾患もしくは状態、好ましくは心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、または2型糖尿病、特に肥満関連インスリン抵抗性の診断または予後、あるいは該疾患もしくは状態の進行の診断または予後を創出すること；
を含む、診断方法。
23．実施態様17〜19のいずれか1つに記載の治療の効率をモニターするための、実施態様22に記載の方法の使用。
【図１】
2017525670.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2017525670.tif 000014
【図９】
2017525670.tif 000015
【配列表】
2017525670000001.app
【国際調査報告】
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2017525670.tif 000017
2017525670.tif 000018
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