(57)【要約】  改変された合成メッセンジャーＲＮＡおよび送達剤を含む製剤。改変された合成メッセンジャーＲＮＡは、レプチンタンパク質をコードし、複製せず、翻訳が直ちに可能である。製剤は、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象に送達することができる。
2017500865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レプチンタンパク質をコードし、
（ｉｉ）プソイドウリジンヌクレオチドを含む
リボ核酸ポリヌクレオチド；および
（ｂ）送達剤
を含む製剤。
【請求項２】
コードされる前記レプチンタンパク質がヒトレプチンタンパク質である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記リボ核酸ポリヌクレオチドがウリジンヌクレオチドを含まない、請求項１〜２のいずれかに記載の製剤。
【請求項４】
前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号１７〜２０からなる群から選択される配列と少なくとも７８％の配列同一性を有するコード領域を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号１７〜２０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するコード領域を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号１７〜２０からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１〜７のいずれかに記載の製剤。
【請求項９】
前記送達剤が、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質およびステルス脂質を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
カチオン性脂質対リボ核酸ポリヌクレオチドのモル比が３：１から８：１の間である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記カチオン性脂質が、カチオン性リピドＡ、カチオン性リピドＢ、カチオン性リピドＣおよびカチオン性リピドＤからなる群から選択される、請求項９〜１０のいずれかに記載の製剤。
【請求項１２】
前記中性脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項９〜１１のいずれかに記載の製剤。
【請求項１３】
前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項９〜１２のいずれかに記載の製剤。
【請求項１４】
前記ステルス脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質である、請求項９〜１３のいずれかに記載の製剤。
【請求項１５】
前記ステルス脂質がＳ０２４である、請求項９〜１４のいずれかに記載の製剤。
【請求項１６】
前記送達剤が、カチオン性脂質、コレステロール、中性脂質およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の製剤。
【請求項１７】
医薬として使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤。
【請求項１８】
レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態の処置で使用するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１９】
対象においてレプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を処置する方法であって、
（ａ）レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象を選択するステップと；
（ｂ）前記対象に請求項１に記載の製剤を投与するステップと
を含み、前記製剤の前記投与は、前記対象のレプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態の症状を緩和する、方法。
【請求項２０】
前記製剤が反復用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤が静脈内投与される、請求項１９〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記製剤が皮下投与される、請求項１９〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記製剤が静脈内投与され、その後皮下投与される、請求項１９〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記製剤が前記対象の体重１ｋｇにつき少なくとも０．２ｍｇのリボ核酸ポリヌクレオチドの投薬量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記製剤が前記対象の体重１ｋｇにつき少なくとも０．６ｍｇのリボ核酸ポリヌクレオチドの投薬量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記製剤が少なくとも１．４ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記製剤が少なくとも２．８ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記製剤が、前記製剤の前記投与の前の前記対象の血漿中レプチンタンパク質濃度より少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ超の血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記製剤が少なくとも１９ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記製剤が少なくとも２５ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記製剤が少なくとも１８５ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記製剤が少なくとも１３００ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記投与がグルコースの血漿中濃度の少なくとも３０％の低下をもたらす、請求項１９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記投与がトリグリセリドの血漿中濃度の少なくとも４０％の低下をもたらす、請求項１９〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記投与が安定した体重をもたらす、請求項１９〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記投与が持続した体重減少をもたらす、請求項１９〜３４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ポリヌクレオチドの生体影響（bio-affecting）組成物または体侵食（body eating）組成物に関し、特に、対象にヒトレプチンタンパク質をコードする改変された合成非複製メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することによる、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
レプチンは、白色脂肪組織によって生成され、個体の循環系の中に分泌されるホルモンである。循環レプチンは個体の脳に入り、そこでそれはレプチン受容体に結合し、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化させることによって食欲（満腹感）、エネルギー代謝および神経内分泌機能を調節する。
【０００３】
先天性レプチン欠乏症は、レプチン遺伝子での突然変異によって引き起こされる。先天性レプチン欠乏症をもつ個体は貪欲に食べ、病的肥満になり、性腺機能低下症および糖尿病を含む肥満の結果を患う。全身性リポジストロフィー（脂肪組織のほとんど完全な不在）を引き起こすレプチン突然変異または単一遺伝子突然変異をもつ個体も、不十分なレプチンレベルを有する。リポジストロフィーおよび低いレプチンレベルをもつこれらの個体は痩せているが、過食、重度の脂質異常および糖尿病を起こす。
【０００４】
組換えレプチンタンパク質による処置は、これらの影響を逆戻りさせる。Licinio J et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(13):4531-6は、レプチンタンパク質療法の後にレプチン欠乏肥満成人での体重減少を示した。患者を皮下メトレレプチン（組換えレプチンタンパク質）で１８カ月間処置し、それは、身体活動の増加、２型糖尿病および性腺機能低下症の解消、ならびに肥満度指数の低減をもたらした。全身性リポジストロフィーを有する患者で、Ebihara K et al. (2007) J. Clin. Endocrinol. Metab. 92 532-541は、１日２回の注射によるメトレレプチンによる４０カ月間の処置が、１週間以内に開始して空腹時グルコースおよびトリグリセリドレベルを改善したことを示した。レプチン補充療法は、インスリン抵抗性を低減し、インスリン分泌を増強した。メトレレプチン療法は、糖尿病とリポジストロフィーの両方の合併症に有益であった。Chan JL et al. (2011) Endocr. Pract. 17(6):922-932は、メトレレプチン療法がリポジストロフィー患者の代謝異常を正常化することを示した。特に、Chan et al. (2011)は、３年の処置期間にわたってメトレレプチン療法がヘモグロビンＡ１ｃおよびトリグリセリドレベルを低減したことを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、レプチンタンパク質は生成するのが困難であり、半減期が短く、１日に１〜２回の皮下（ＳＣ）投薬を必要とする。したがって、当技術分野では、レプチン投薬レジメンを１日２回から数日おきに１回に、またはさらにはより低い頻度に低減させることによって、患者標準治療を改善する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対象においてレプチン欠乏症を治すのに有用である製剤を提供する。製剤は、有利には、ｉｎ  ｖｉｖｏで最小限の免疫賦活化およびレプチンタンパク質の制御された発現で、数日おきに１回対象に投与することができる。
【０００７】
製剤の１つの構成要素は、改変された合成レプチンメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ｍＲＮＡの改変は、改善されたｍＲＮＡ安定性および減少した免疫原性をもたらす。改変された合成レプチンｍＲＮＡの合成は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を含むいくつかの方法のいずれかによるものであってもよい。一実施形態では、レプチンｍＲＮＡは、レプチンｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の間のプソイドウリジン（Ψ）によるレプチンｍＲＮＡ中のウリジンの置換によって、その合成の間に改変される。具体的な実施形態では、レプチンｍＲＮＡ中のウリジンの全てがプソイドウリジンで置換される。
【０００８】
一実施形態では、改変された合成レプチンは、天然に見出されるコード配列を有する。代わりの実施形態では、改変された合成レプチンは、コドン最適化されたコード配列を有する。一実施形態では、改変された合成レプチンは、天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であるタンパク質をコードするコード配列を有する。
【０００９】
製剤の別の構成要素は、送達剤である。一実施形態では、送達剤は脂質ナノ粒子である。一実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、（ｉ）封入およびエンドソームエスケープのためのカチオン性脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）同じく安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）凝集を阻止するステルス脂質を含む。より具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性リピドＡ、カチオン性リピドＢ、カチオン性リピドＣまたはカチオン性リピドＤであってもよく；ヘルパー脂質はコレステロールであり；ステルス脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質（「リピド化ＰＥＧ」）である。別の実施形態では、改善された脂質ナノ粒子は、個体の細胞でのレプチンタンパク質の改善された発現および個体の循環でのレプチンの増加を提供するための送達剤として用いられる。別の実施形態では、ヘルパー脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。さらに別の実施形態では、ステルス脂質はＳ０２４（本明細書でさらに記載される）である。別の実施形態では、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は３：１から８：１の間である。
【００１０】
本発明は、レプチン欠乏症を有する対象に改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤を投与する方法も提供する。対象は、先天性および後天性の全身性リポジストロフィー（非常に低いレプチンレベルがある）、後天性ＨＩＶリポジストロフィー（低いレプチンレベルがある）、視床下部無月経または肥満（特に、レプチンレベルが低下した者）などの状態を有してもよい。器官または脂肪組織でレプチンタンパク質の外因性発現を誘導するために、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤を対象にｉｎ  ｖｉｖｏで、または器官もしくは組織にｅｘ  ｖｉｖｏで投与することができる。したがって、ｍＲＮＡは染色体挿入リスクをもたらすかもしれないＤＮＡコピーを生み出すために哺乳動物細胞で逆転写することができないので、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、最小限のがんのリスクで遺伝子療法に類似の目的のために用いることができる。
【００１１】
一実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、個体に静脈内投与される。別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、皮下投与される。さらに別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、先ず静脈内投与され、次に皮下投与される。改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、反復投薬で投与することができる。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、対象の体重１ｋｇにつき少なくとも０．２ｍｇのレプチンｍＲＮＡの投薬量で送達される。別の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、対象の体重１ｋｇにつき少なくとも０．６ｍｇのレプチンｍＲＮＡの投薬量で送達される。
【００１２】
本発明は、いくつかの利点を有する。利点の１つは、１日１〜２回の皮下投与であるレプチンタンパク質の投与に必要とされる投与より低い頻度で製剤を個体に投与することができることである。一実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の投与は、３日おきに１回であってもよい。別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の投与は、１週に１回であってもよい。一実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡは、個体への免疫原性レベルが低い脂質ナノ粒子複合体にパッケージされる。別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡは、有利には、生分解性である送達剤にパッケージされる。
【００１３】
利点の１つは、対象への製剤の投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏでレプチンの薬学的に活性なレベルをもたらすのに十分な改変された合成レプチンｍＲＮＡを送達することである。本明細書に記載されるように、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡのＥＣ５０濃度値は、食物摂取の抑制のために血漿中で１．４ｎｇ／ｍＬ（８５ｐＭ）と決定された。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスで体重を減少させるためのヒトレプチンタンパク質濃度のＥＣ５０の２倍の値である、少なくとも２．８ｎｇ／ｍＬのレプチンタンパク質の血漿中濃度を投与がもたらすように対象に投与される。別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の送達は、１．４ｎｇ／ｍＬレプチンタンパク質の血漿中濃度をもたらす。さらに別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の送達は、１８５ｎｇ／ｍＬの血漿中濃度をもたらす。別の実施形態では、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の送達は、１３００ｎｇ／ｍＬのレプチンタンパク質の血漿中濃度をもたらす。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、投与前の対象のベースラインレプチンタンパク質濃度を少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ上回る血漿レプチンタンパク質濃度のために十分な量で対象に投与される。
【００１４】
本発明は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤が投与される対象にいくつかの測定可能な利益を提供する。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の送達は、食物摂取および体重における用量依存的減少を誘導する。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の送達は、肥満および糖尿病を改善する。一実施形態では、投与は、グルコースの血漿中濃度の少なくとも３０％の低下をもたらす。一実施形態では、本発明のレプチンｍＲＮＡの投与は、トリグリセリドの血漿中濃度の少なくとも４０％の低下をもたらす。
【００１５】
痩せた対象への本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与は、循環中で、肥満対象への本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与より低いレベルのレプチンタンパク質をもたらす。これらの結果は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤が肥満対象の処置のために利点を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】改変された合成ヒトレプチンｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を処方するために用いられるカチオン性脂質（カチオン性リピドＡおよびカチオン性リピドＢ）の化学構造を示す図である。
【図１−２】改変された合成ヒトレプチンｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を処方するために用いられるカチオン性脂質（カチオン性リピドＣおよびカチオン性リピドＤ）の化学構造を示す図である。
【図２−１】カチオン性リピドＡによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはカチオン性リピドＡで製剤化したヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎまたはｈＬｅｐ）（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）のいずれかをコードするｍＲＮＡを、マウス体重１キログラムにつき０．２ｍｇのｍＲＮＡ（ｍｇ／ｋｇ、ｍｐｋ）でレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。まとめると、図２Ａ〜Ｃは、ＰＢＳおよびｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ対照と比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図２Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図２Ｃ）と相関する体重減少（図２Ａ）を引き起こしたことを示す。図２Ａは、カチオン性リピドＡでパッケージされ、静脈内投与されたヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐｔｉｎ）の体重に及ぼす特異的効果を示す折れ線グラフのセットである。詳しくは実施例９を参照されたい。図２Ｂは、カチオン性リピドＡでパッケージされ、静脈内投与されたヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐ）の食物摂取に及ぼす特異的効果を示す棒グラフのセットである。詳しくは実施例９を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に５４，５８２ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図２−２】カチオン性リピドＡによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはカチオン性リピドＡで製剤化したヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎまたはｈＬｅｐ）（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）のいずれかをコードするｍＲＮＡを、マウス体重１キログラムにつき０．２ｍｇのｍＲＮＡ（ｍｇ／ｋｇ、ｍｐｋ）でレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。まとめると、図２Ａ〜Ｃは、ＰＢＳおよびｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ対照と比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図２Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図２Ｃ）と相関する体重減少（図２Ａ）を引き起こしたことを示す。図２Ｃは、カチオン性リピドＡでパッケージされ、静脈内投与されたヒトレプチンｍＲＮＡの投与の後のヒトレプチンタンパク質（レプチン）の発現レベルを示す折れ線グラフである。詳しくは実施例１０を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に５４，５８２ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図３−１】カチオン性リピドＢによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはカチオン性リピドＢで製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐｔｉｎ）（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）を、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。ヒトレプチンｍＲＮＡは、体重１キログラムにつき０．０２、０．０６および０．２ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ；ｍｐｋ）で投与した。並行試験では、マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡは、０．２ｍｐｋで投与した。結果は、ＰＢＳと比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図３Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図３Ｃ）と相関する体重減少（図３Ａ）を引き起こしたことを示す。図３Ａは、カチオン性リピドＢでパッケージされ、静脈内投与されたヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐｔｉｎ）の異なる量の体重に及ぼす特異的効果を示す折れ線グラフのセットである。詳しくは実施例１１を参照されたい。図３Ｂは、カチオン性リピドＢでパッケージされ、静脈内投与されたヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐｔｉｎ）の異なる量の食物摂取（図３Ｂ）に及ぼす特異的効果を示す棒グラフのセットである。詳しくは実施例１１を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に８９２，６３３ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図３−２】カチオン性リピドＢによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはカチオン性リピドＢで製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡ（ｈＬｅｐｔｉｎ）（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）を、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。ヒトレプチンｍＲＮＡは、体重１キログラムにつき０．０２、０．０６および０．２ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ；ｍｐｋ）で投与した。並行試験では、マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡは、０．２ｍｐｋで投与した。結果は、ＰＢＳと比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図３Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図３Ｃ）と相関する体重減少（図３Ａ）を引き起こしたことを示す。図３Ｃは、カチオン性リピドＢでパッケージされ、静脈内投与された０．６ｍｐｋのヒトレプチンｍＲＮＡの投与の後のヒトレプチンタンパク質（レプチン）の発現レベルを示す棒グラフである。詳しくは実施例１２を参照されたい。図３Ｄは、マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡ（ｍＥＰＯ）の投与がマウスで体重減少を引き起こさないことを示す折れ線グラフである。体重減少に及ぼすヒトレプチンｍＲＮＡの投与の効能は、特異的である。詳しくは実施例１５を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に８９２，６３３ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図４−１】カチオン性リピドＣで製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。ＰＢＳまたはカチオン性リピドＣによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）を、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。ヒトレプチンｍＲＮＡは、０．０２、０．０６および０．２ｍｐｋで投与した。並行試験では、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡは０．２ｍｐｋで投与した。結果は、ＰＢＳと比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図４Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図４Ｃ）と相関する体重減少（図４Ａ）を引き起こしたことを示す。図４Ａは、カチオン性リピドＣでパッケージされたヒトレプチンｍＲＮＡの体重に及ぼす特異的効果を示す折れ線グラフのセットである。詳しくは実施例１３を参照されたい。図４Ｂは、カチオン性リピドＣでパッケージされたヒトレプチンｍＲＮＡの食物摂取に及ぼす特異的効果を示す棒グラフのセットである。詳しくは実施例１３を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に１５８，８６５ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図４−２】カチオン性リピドＣで製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡの投与は、レプチンタンパク質発現の一時的回復のためにレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの肥満および摂食亢進性表現型を特異的および一時的に逆戻りさせることを示すグラフのセットである。ＰＢＳまたはカチオン性リピドＣによる脂質ナノ粒子で製剤化したヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）もしくはマウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）（配列番号１２）を、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに静脈内投与した。ヒトレプチンｍＲＮＡは、０．０２、０．０６および０．２ｍｐｋで投与した。並行試験では、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡは０．２ｍｐｋで投与した。結果は、ＰＢＳと比較して、ヒトレプチンｍＲＮＡは、食物摂取の低下（図４Ｂ）およびヒトレプチンタンパク質の発現（図４Ｃ）と相関する体重減少（図４Ａ）を引き起こしたことを示す。図４Ｃは、カチオン性リピドＣでパッケージされたヒトレプチンｍＲＮＡの投与の後のヒトレプチンタンパク質の発現レベルを示す棒グラフである。詳しくは実施例１４を参照されたい。図４Ｄは、マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡ（ｍＥＰＯ）の投与がマウスで体重減少を引き起こさないことを示す折れ線グラフである。体重減少に及ぼすヒトレプチンｍＲＮＡの投与の効能は、特異的である。詳しくは実施例１５を参照されたい。ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（６時間時に１５８，８６５ｐｇ／ｍＬ）を投与されたマウスではｍＥＰＯタンパク質発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を確認した。
【図５】痩せたマウスへのカチオン性リピドＡで製剤化したレプチンｍＲＮＡの静脈内（ＩＶ）対皮下（ＳＣ）送達の後の血漿中レプチンタンパク質レベルを示す折れ線グラフである。詳しくは実施例７（ＩＶ）および実施例８（ＳＣ）を参照されたい。実施例１に示すように、有効濃度は、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取の抑制のためのＥＣ５０に同等である。
【図６】改善プロセスＡのための封入セットアップを示す図のセットである。詳しくは実施例３４を参照されたい。改善プロセスＡに関する追加の情報については、実施例５も参照されたい。
【図７−１】改善プロセスＢのための封入セットアップを示す図のセットである。図７Ａは、改善プロセスＢのための封入セットアップを示す。詳しくは実施例３５を参照されたい。
【図７−２】改善プロセスＢのための封入セットアップを示す図のセットである。図７Ｂは、プロセスＢのための２つのシリンジポンプ上のシリンジのセットアップを示す。図７Ｃは、改善プロセスＢのための第２の希釈セットアップを示す。詳しくは実施例３５を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
序論
本明細書において、改変された合成レプチンｍＲＮＡの生成のための組成物および方法が開示される。本発明の組成物および方法は、レプチンタンパク質の発現のために外因性ＤＮＡまたはウイルスベクターをベースとした方法を含まず、したがってゲノムの恒久的な改変を引き起こさず、予想外の変異原性作用の可能性もない。本発明の組成物、製剤および方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡの細胞への直接導入に基づき、それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳されたときに所望のレプチンタンパク質を提供する。
【００１８】
本発明の合成レプチンｍＲＮＡを改変する目的の１つは、免疫原性を低減することである。より高等の真核細胞は、外来の「非自己」ＲＮＡに対する細胞性防御手段を有する。これらの防御手段は細胞性タンパク質合成の広域的阻害を引き起こし、細胞毒性をもたらす。細胞性防御手段はｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡを通常は外来であると認識し、この細胞性先天性免疫応答を誘導する。本明細書に記載される方法では、応答を回避または低減する様式で改変される合成ＲＮＡを用いることによって、細胞性先天性免疫応答の効果は軽減される。先天性免疫応答の回避または低減は、外因的に導入されたＲＮＡからの持続性の発現を可能にする。一態様では、持続性の発現は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの反復導入によって達成される。
【００１９】
Ｋａｒｉｋｏらへの米国特許第８，２７８，０３６号は、ウリジンがプソイドウリジン（Ψ）で置き換えられたｍＲＮＡ分子、それを合成する方法および治療的タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための方法を開示する。この特許は、開示の方法によって作製することができる多くのｍＲＮＡを開示する。Kariko K et al. (2007) Current Opinion in Drug Discovery and Development 10(5): 523-532；Kariko K et al. (2008) Molecular Therapy 16(11), 1833-1840およびAnderson BR et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38(17): 5884-5892も参照されたい。
【００２０】
本発明は、新規脂質ナノ粒子複合体にパッケージされたレプチンｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効力データならびに静脈内および皮下送達の後のレプチンタンパク質発現に関するｉｎ  ｖｉｖｏ試験データを提供する。
【００２１】
定義
「同時転写で加えられた」は、ＲＮＡ分子の転写の間の、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡへの特徴、例えば５’ジグアノシンキャップまたは他の改変ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの付加を意味する（すなわち、改変ＲＮＡは５’キャップの付加の前に完全には転写されない）。
【００２２】
「生分解性」は、材料が対象の体内で分解し、その化学的同一性を失うことを意味する。生分解性脂質は、ほとんどの脂質と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで速やかに消去される脂質である。生分解性脂質部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の組織曝露のピークを過ぎてから速やかに消滅する。消去は、肝臓半減時間として薬物動態学的に測定することができる。国際特許出願番号ＷＯ２０１１／１５３４９３を参照されたい。生分解性ポリマーは、それらを除去するための２回目の手術を回避するために、または薬物を徐々に放出するために医療器具で用いられるタイプのポリマーであってもよい。
【００２３】
「コード領域（ＣＤＳ）」または「コード配列」は、タンパク質などのポリペプチドをコードする、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の部分である。コード領域は、一般的にＡＵＧコドンで開始し、１つまたは複数のストップコドンで終わる。いくつかの例示的なコドン領域が本明細書に記載される。他のコード領域を決定する方法も、本明細書に記載される。真核生物のメッセンジャーＲＮＡは、コード領域中の情報のポリペプチドへの翻訳のために有用であるがそれら自身はコード領域でない、他の部分を含む。メッセンジャーＲＮＡのこのような他の部分は、本明細書にさらに記載される。本明細書で用いるように、用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」も、コード領域またはコード配列を記載するために用いられる。
【００２４】
細胞を「接触させる」とは、細胞を本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡまたはその製剤とｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを意味する。そのような細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである場合は、細胞を本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡと接触させることは、化合物がｉｎ  ｖｉｖｏで細胞と接触するように、製剤中の本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを適当な投与経路によって対象に投与することを含む。
【００２５】
「保存された」ヌクレオチドまたはアミノ酸は、比較される２つ以上の配列の同じ位置に変更なしに出現する、それぞれポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の残基である。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関係している配列の間で保存されているものである。それらがお互いと１００％同一であるならば、２つ以上の配列は「完全に保存されている」。一部の実施形態では、それらがお互いと少なくとも９０％同一であるならば、２つ以上の配列は「高度に保存されている」。一部の実施形態では、それらがお互いと同一であるならば、２つ以上の塩基は「保存されている」。配列の保存は、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用することができるか、またはその部分、領域もしくは特徴に適用することができる。
【００２６】
「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する行為または様式を意味する。「送達剤」は、細胞への核酸分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達を少なくとも一部促進する任意の物質である。
【００２７】
「欠失」は、ＤＮＡのある部位を欠くまたは欠失する突然変異である。
【００２８】
「検出可能な標識」は、Ｘ線撮影法、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で公知の方法によって容易に検出される、別の実体（ＲＮＡまたはタンパク質など）に付着しているか、組み込まれるかまたはそれと関連する、１つまたは複数のマーカー、シグナルまたは部分を意味する。検出可能な標識には、放射性同位体、蛍光体、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどが含まれる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるＲＮＡまたはタンパク質の任意の位置に置かれてもよい。
【００２９】
「投薬レジメン」は、処置、予防または待期的医療の投与スケジュールまたは医師が決定したレジメンである。
【００３０】
「外因性」核酸は、それが通常は見出されないかまたはそれがより低い量で見出される細胞または生物体などの生体系に、ヒト介入を含むプロセスによって導入された核酸（例えば、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ）である。その物質を継承する直属の前駆体細胞または子孫細胞にそれが導入されるならば、因子（例えば、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ）は外因性である。対照的に、「内因性」は、生体系または細胞にとって天然である因子または発現生成物である（例えば、遺伝子の内因性発現）。
【００３１】
「発現」は、ＲＮＡおよびタンパク質の生成、ならびに適宜、転写、翻訳、折畳み、修飾およびプロセシングを含むタンパク質の分泌に関与する細胞過程である。核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つまたは複数を指す：（ｉ）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（ｉｉ）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成または３’末端プロセシングによる）；（ｉｉｉ）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；および（ｉｖ）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。「発現生成物」または「遺伝子生成物」には、遺伝子から転写されるＲＮＡおよび遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳によって得られるポリペプチドが含まれる。
【００３２】
「フレームシフト」は、ＤＮＡ配列の３で均等に分割できないいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失によって引き起こされる突然変異である。コドンによる遺伝子質発現のトリプレット性のために、挿入または欠失はリーディングフレーム（コドンの組分け）を変えることができ、元のものと完全に異なる翻訳をもたらす。これは、機能の喪失をもたらすトランケーションされたタンパク質をしばしば生み出す。
【００３３】
「相同性」は、核酸分子（例えばＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）の間またはポリペプチド分子の間の全体的関連性を意味する。用語「相同的」は、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較を必然的に指す。
【００３４】
「同一性」は、ポリマー分子の間、例えばオリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）の間またはポリペプチド分子の間の全体的関連性を意味する。例えば２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列を並べることによって実行することができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非同一配列は比較目的のために無視することができる）。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが次に比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合は、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって記載されるものなどの方法を用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを判定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．０多重配列アラインメントプログラムを用いて判定することができる。Larkin MA et al. (2007) "Clustal @ and Clustal X version 2.0." Bioinformatics 23(21): 2947-2948。
【００３５】
「先天性免疫応答」または「インターフェロン応答」は、外来生物体、例えばウイルスまたは細菌、またはそのような生物体の生成物、例えば対象細胞で生成されるＲＮＡに特徴的な改変を欠くＲＮＡによる感染の認識に応答して細胞によって開始される、細胞防御応答を意味する。先天性免疫応答は、外因性核酸を検出する細胞の死を誘導することによって、ウイルスおよび細菌感染から保護する。「先天性免疫応答」または「インターフェロン応答」の記載は、Ｋａｒｉｋｏらへの米国特許第８，２７８，０３６号によって提供される。
【００３６】
「単離細胞」は、それが本来見出される生物体から取り出された細胞またはそのような細胞の後代である。任意選択で、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意選択で、細胞は後に第２の生物体に導入されるか、またはそれが単離された生物体（またはそれが由来する細胞または細胞の集団）に再導入される。
【００３７】
「挿入」は、ＤＮＡのある場所に余分の塩基対が挿入される突然変異である。
【００３８】
「レプチン」は、対象における、食欲および飢え、代謝ならびに行動を含む、エネルギーの摂取および消費の調節に関与する約１６ｋＤａのタンパク質である。本明細書で用いるように、用語「レプチン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能、例えばヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ、ＣＤ２９５）への機能的結合によって測定される通り、レプチンタンパク質として機能することができる任意のタンパク質を含む。用語「ヒトレプチン」には、タンパク質受託番号ＮＰ＿０００２２１の配列（配列番号３）を有する天然のヒトレプチン（ＬＥＰ）、およびヒトレプチンタンパク質として機能するヒトレプチンの任意の変異体が含まれる。ヒト以外の哺乳動物のレプチンポリペプチドは、ヒトレプチンと６７％以上の同一性を一般に有する。Doyon C et al. (2001) "Molecular Evolution of Leptin." Gen. and Comp. Endocrinol. 124:188-198；Denver RJ et al. (2011) "Evolution of Leptin Structure and Function." Neuroendocrinol. 94:21-38。用語「レプチン」には、ヒトレプチンの合成類似体であるメトレレプチンも含まれ、その使用はLicinio et al. (2004)、Ebihara K et al. (2007)およびChan et al. (2011)によって記載される。用語「レプチン」には、ヒトレプチンの機能的特性を有する、任意の硬骨魚または両生類のレプチンオルソログも含まれる。例えば、アフリカツメガエル（Xenopus）のレプチンは、細胞上で発現されるヒトレプチン受容体を活性化する。Hen G et al. (2008) "Monitoring leptin activity using the chicken leptin receptor." J. Endocrinol. 197:325-333。
【００３９】
「改変された」は、本発明の分子の変化した状態または構造を意味する。「改変された」ｍＲＮＡは、標準のグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シチジン（Ｃ）およびウリジン（Ｕ）ヌクレオシドに対して改変形を含むリボヌクレオシドを含有する。非標準ヌクレオシドは、天然に存在するもの、または天然に存在しないものであってもよい。ＲＮＡは、当業者に公知である方法によって、化学的、構造的および機能的を含む多くの形で改変することができる。そのようなＲＮＡ改変は、例えば、哺乳動物細胞ｍＲＮＡに転写後に通常導入される改変を含むことができる。さらに、Ｋａｒｉｋｏらへの米国特許第８，２７８，０３６号、およびＳｃｈｒｕｍへの米国特許出願公開第２０１３／０１０２０３４号、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓらへの米国特許出願公開第２０１３／０１１５２７２号およびｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓらへの米国特許出願公開第２０１３／０１２３４８１号に記載されるように、ｍＲＮＡ分子は、天然および非天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドの転写の間に導入によって改変することができる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡに関するときの改変されたは、野生型ヒトレプチンコード配列と異なる任意の変更を意味することもできる。
【００４０】
「患者」は、処置を求めるかもしくはその必要性がある対象、処置を要求する対象、処置を受けている対象、処置を受けようとする対象、または特定の疾患もしくは状態のために訓練された専門家によって治療中の対象である。
【００４１】
語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なしでヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適し、理にかなった利益／リスク比と釣り合っている、化合物、材料、組成物または剤形を指す。
【００４２】
「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形に変換することによって親化合物が改変される、本発明の化合物の誘導体である。薬学的に許容される塩の例には、限定されずに、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば無毒の無機または有機の酸から形成される親化合物の従来の無毒の塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形を、水または有機溶媒中、または２つの混合液中の適当な塩基または酸の化学量と反応させることによって調製することができる。適する塩のリストは、Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Press and Journal of Pharmaceutical Science (1977) 66, 2、に見出される。
【００４３】
「プライマー」は、短い核酸配列である。一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるかなり短い長さ（例えば、８〜３０ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、標的配列からの配列情報を用いて、当業者が容易に開発、生成することができる。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
【００４４】
「プローブ」（オリゴヌクレオチドプローブ）は、サイズが約５０〜１００ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、さらに数千ヌクレオチドの長さまで一般的に変動する核酸分子である。したがって、プローブは、整数増分で５０から数千ヌクレオチドの範囲内の任意の長さを含む、本明細書に記載されるアッセイで用いるための任意の適する長さであってもよい。そのような分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的核酸配列とハイブリダイズさせることによって、試料中の特異的核酸配列を特定するために一般的に用いられる。ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知である。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
【００４５】
「低減された細胞傷害性」は、例えば同じ配列を有するがＲＮＡへの改変を欠くＲＮＡ分子との接触と比較して、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡと繰り返し接触させた細胞培養中の細胞の５０％未満の死を意味する。低減された細胞傷害性は、例えばＴＵＮＥＬアッセイを用いてアポトーシスを測定することによって評価することができる。「低減された細胞傷害性」を判定するための他の有用な測定手段には、例えば、フローサイトメトリーおよびビーズをベースとした生存率の測定、細胞増殖または細胞性（例えば顕微鏡で測定して、血球計で定量化する）が含まれる。
【００４６】
「反復投与」は、対象への複数回（例えば、２回以上または少なくとも２回）の投与である。一部の実施形態では、投与頻度は、所与の時間の間に２４〜４８時間以上おきに起こる。頻度は、各投与の間の間隔が異なるように異なってもよい（例えば、第１の間隔３６時間、第２の間隔４８時間、第３の間隔７２時間など）。
【００４７】
生物学および化学の当業者に公知であるように、「リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド」はリボヌクレオチドのポリマーである。ＲＮＡ分子の各ヌクレオチドはリボース糖を含有し、炭素は１’から５’まで番号付けされる。塩基が、１’位に結合する。一般に、塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）であるが、多くの改変形が当業者に公知である。例えば、本明細書に記載されるように、プソイドウリジンヌクレオチドがウリジンヌクレオチドに代えて置換されるように、ＲＮＡは１つまたは複数のプソイドウラシル（Ψ）塩基を含有することができる。本明細書に記載される通り、多くの他のＲＮＡ改変が当業者に公知である。ＲＮＡの種類の１つは、ＤＮＡからリボソームに遺伝情報を伝達する働きを本来する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」であり、それらは、転写として知られるプロセスによって遺伝子発現のタンパク質生成物のアミノ酸配列を規定する。生物学の当業者に公知であるように、構造的および情報的に、メッセンジャーＲＮＡはコード領域中のタンパク質の情報をコードする。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
【００４８】
「試料」は、その組織、細胞または構成部分（例えば、体液）のサブセットである。試料は、全生物体またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその画分または部分、例えば、限定されずに、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部、呼吸、腸および尿生殖器の管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、から調製されるホモジネート、溶解物または抽出物をさらに含むことができる。試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地をさらに指す。「試験試料」または「患者試料」は、限定されずに、単離細胞の試料、組織試料または体液試料を含む、本発明の方法によって評価されるべき細胞または細胞から分泌された生成物を含有する任意のタイプの試料を意味する。「組織試料」は、単離細胞の試料に類似しているが、任意選択で細胞を保持する細胞骨格構造と一緒の、いくつかの細胞型を一般的に含む体の器官または組織の部位である。「細胞試料」は「組織試料」の一タイプであるが、用語「組織試料」は、細胞試料より複雑な構造を指すために用いられることの方が多いかもしれない。組織試料は、例えば切断、スライシングまたはパンチによることを含む、生検によって得ることができる。「体液試料」は、組織試料と同様に、評価される細胞を含有し、特定の体液から試料を採取するのに適する任意の方法によって得られる流体である。試料採取に適する体液には、中でも、血液、血漿および血清が含まれる。
【００４９】
「選択的に結合する」は、１つの化合物の別のものとの（例えば、本発明の製剤の細胞との）特異的結合を意味し、そこで、任意の標準のアッセイによって測定される結合レベルは、そのアッセイのバックグラウンド対照より統計学的に有意に高い。
【００５０】
「対象」は、本明細書で用いるように、実験、診断、予防または治療目的であれ、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤を投与することができる任意の生物体である。一般的な対象には、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類およびヒトなどの哺乳動物が含まれる。
【００５１】
「置換」は、１つの塩基を別のものと交換する突然変異である（すなわち、ＡからＧへの交換などの単一の「化学的文字」の変化）。そのような置換は、（ｉ）異なるアミノ酸をコードして生成されるタンパク質に小さい変化を引き起こすものにコドンを変更すること；（ｉｉ）同じアミノ酸をコードして生成されるタンパク質に変化を引き起こさないものにコドンを変更すること（「サイレント突然変異」）；または（ｉｉｉ）アミノ酸コードコドンを単一の「終止」コドンに変更して不完全タンパク質を生じさせることができるかもしれない。
【００５２】
疾患、障害または状態を「患っている」個体は、疾患、障害または状態を診断されているか、またはその１つまたは複数の症状を示す。
【００５３】
疾患、障害または状態に「感受性である」個体は、その疾患、障害または状態を診断されていないか、またはその症状を示さないが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。一部の実施形態では、疾患、障害または状態（例えば、肥満）に感受性である個体は、以下の１つまたは複数で特徴付けることができる：（ｉ）疾患、障害または状態の発症と関連する遺伝子突然変異；（ｉｉ）疾患、障害または状態の発症と関連する遺伝子多型；（ｉｉｉ）疾患、障害または状態と関連するタンパク質または核酸の発現または活性の増加または減少；（ｉｖ）疾患、障害または状態の発症と関連する習慣またはライフスタイル；（ｖ）疾患、障害または状態の家族歴；および（ｖｉ）疾患、障害または状態の発症と関連する微生物への曝露またはそれによる感染。一部の実施形態では、疾患、障害または状態に感受性である個体は、その疾患、障害または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害または状態に感受性である個体は、その疾患、障害または状態を発症しない。
【００５４】
「合成」は、ヒトの介入によって生成、調製または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的であるかまたは酵素的であってもよい。
【００５５】
「ターゲティング部分」は、特定の組織、細胞型、受容体、感染因子または他の対象領域に向かうか、優先的に関連するかまたは結合する薬剤である。ｍＲＮＡ送達組成物へのターゲティング部分の付加は、所望の細胞型または位置へのｍＲＮＡの送達を増大させる。細胞におけるターゲティング部分の付加または発現は、動物または対象の中の所望の位置へのその細胞の限局化を強化する。
【００５６】
「治療有効量」または「有効量」は、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の、疾患、障害または状態を患っているかまたはそれに感受性の対象に投与したときに、疾患、障害または状態を処置するか、その症状を改善するか、診断するか、予防するか、その発症を遅らせるのに十分である量、あるいは、研究者、獣医、医師または他の臨床医が望む、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を導き出す量である。
【００５７】
「処置すること」は、特定の疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的または完全に緩和、寛解、改善、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻止すること、その重症度を低減することまたはその発生頻度を低減することである。例えば、「処置すること」は、レプチン欠乏症またはリポジストロフィーを後退させるかまたは緩和する手段を指すことができる。「処置」は、例えば、レプチン欠乏症またはリポジストロフィーを処置する行為を意味する。処置は、疾患の徴候を示さない対象に、または疾患の初期徴候だけを示す対象に、疾患と関連する病状を発症するリスクを低下させる目的で投与されてもよい。
【００５８】
レプチン欠乏症
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、レプチン欠乏症の対象への投与のために有用である。原則的に、レプチン欠乏症（低い循環レプチンレベル）につながるいかなる状態も、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与によって処置することができる。レプチン欠乏症を有する対象には、以下の状態を有する者が含まれてもよい：（ｉ）レプチン遺伝子の突然変異による先天性レプチン欠乏症、（ｉｉ）先天性および後天性全身性リポジストロフィー；（ｉｉｉ）患者は低いレプチンレベルを有する後天性ＨＩＶリポジストロフィー；（ｉｖ）運動誘導形または非競技形（食事誘導性）であれ、視床下部無月経；（ｖ）１０％の体重減少の後の重量維持（すなわち、代謝適応）。これらの状態のいずれかを有する対象は、低い循環レプチンレベルの状態にあり、代謝疾患（糖尿病、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症および過食）、月経周期および重量維持を正常化するために本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与が有益である。Kelesidis T et al. (2010) Annals of Internal Medicine 152(2):93-101およびDardeno TA et al. (2010) Frontiers in Neuroendocrinology 31:377-393を参照されたい。
【００５９】
先天性レプチン欠乏症は、レプチン遺伝子の突然変異によって引き起こされる。先天性レプチン欠乏症をもつ対象は貪欲に食べ、病的肥満になり、性腺機能低下症および糖尿病を含む肥満の結果を患う。
【００６０】
リポジストロフィー症候群は遺伝性または後天性のいずれであってもよく、脂肪組織の全身性または部分的な喪失および結果としての循環中の不十分なレプチンレベルを伴う。リポジストロフィー症候群患者は、体の脂肪組織の縮退または再分布（低脂肪症）または両方を有する。リポジストロフィー症候群患者は、インスリン抵抗性、糖尿病、高トリグリセリド血症および過食などの、病的肥満としばしば関連した重度の代謝表現型を示す。重度のリポジストロフィーを有する患者は、心筋症、急性すい炎、肝硬変、失明および腎移植が必要な末期糖尿病性腎疾患を発症する素因も有する。
【００６１】
後天性ＨＩＶリポジストロフィーは、ＨＩＶ感染対象の１５〜３５％を侵す。後天性ＨＩＶリポジストロフィーを有する患者は、インスリン抵抗性、高脂血症および中心肥満を含む、メタボリックシンドロームを示す。
【００６２】
視床下部無月経は、対象の視床下部−下垂体−性腺軸の調節不全からもたらされる月経周期の停止である。視床下部無月経は、ストレス、運動または体重減少によって誘導されることがある。
【００６３】
肥満の患者は、一般にレプチン抵抗性である。中等度体重減少により、レプチン感受性は部分的に回復される。したがって、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与は、患者が体重を維持することを可能にする。
【００６４】
改変された合成レプチンｍＲＮＡ
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、レプチンポリペプチドをコードし、少なくとも１つの改変されたヌクレオシドを含み、少なくとも以下の特徴を有する：（ｉ）それはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、細胞から単離されていない；（ｉｉ）それは、細胞（例えば、ヒト細胞）においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで翻訳可能である；および（ｉｉｉ）それは、同じ配列の改変されていないＲＮＡと比較して、それが導入されるか接触する対象において有意に低減された先天性免疫応答またはインターフェロン応答を引き起こす。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ機能（例えば、食欲、エネルギー代謝または神経内分泌機能を調節することによる）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能（例えば、ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ、ＣＤ２９５）に機能的に結合することによる）または両方によって測定される通り、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、天然のヒトレプチンタンパク質（配列番号３）に機能的に同等であるレプチンポリペプチドをコードすることができる。天然のヒトタンパク質への相同性によって判定される通り、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、天然のヒトレプチンタンパク質に構造的に類似しているレプチンポリペプチドをコードすることができる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であり、かつ構造的に類似しているレプチンポリペプチドをコードすることができる。具体例では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、配列番号１７〜２０から選択されるコード配列を含有する。実施例３１を参照されたい。これらの４つのヒトレプチンオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、互いと７８％〜９１％同一である。したがって、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、配列番号１７〜２０から選択されるコード配列と少なくとも７８％同一である機能的コード領域を含有することができる。
【００６６】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡのコード領域は、天然のヒトレプチンコード配列を含む任意の天然のレプチンコード配列のコドン最適化によって構築することができる。コドン最適化は、市販サービス、例えばＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＵＳＡから入手できる）、ＧＥＮＥＷＨＩＺ（ＧＥＮＥＷＨＩＺ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ  ＵＳＡから入手できる）およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ  ＵＳＡから入手できる）によって実行することができる。
【００６７】
【表１−１】
2017500865.tif 000003
【００６８】
【表１−２】
2017500865.tif 000004
【００６９】
【表１−３】
2017500865.tif 000005
【００７０】
【表１−４】
2017500865.tif 000006
【００７１】
【表１−５】
2017500865.tif 000007
【００７２】
【表１−６】
2017500865.tif 000008
【００７３】
【表１−７】
2017500865.tif 000009
【００７４】
【表１−８】
2017500865.tif 000010
【００７５】
【表１−９】
2017500865.tif 000011
【００７６】
【表１−１０】
2017500865.tif 000012
【００７７】
【表１−１１】
2017500865.tif 000013
【００７８】
【表１−１２】
2017500865.tif 000014
【００７９】
【表１−１３】
2017500865.tif 000015
【００８０】
【表１−１４】
2017500865.tif 000016
【００８１】
【表１−１５】
2017500865.tif 000017
【００８２】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、翻訳を開始、増進する、脱アデニル化およびＲＮＡ鎖分解に拮抗する、かつ炎症性応答の誘導を阻止する複数のエレメントを含有することができる。
【００８３】
改変された合成レプチンｍＲＮＡは、５’末端において、ｍＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡポリメラーゼによって転写された後に酵素的に合成されるｍＲＮＡキャップで開始することができる。ｍＲＮＡキャップは、外来としてのｍＲＮＡの認識を回避しつつ翻訳開始を促進し、５’エキソヌクレアーゼによって媒介される分解からｍＲＮＡを保護する。５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を用いてＲＮＡ分子の５’末端に連結されている、改変されたグアニンヌクレオチドを含むことができる。５’キャップは、５’キャップ類似体、例えば５’ジグアノシンキャップ、メチレンビス（ホスホネート）部分を有する四リン酸キャップ類似体（例えば、Rydzik AM et al. (2009) Org. Biomol. Chem. 7(22):4763-76を参照）、ホスホロチオエート改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Kowalska J et al. (2008) RNA 14(6):1119-1131を参照）、非架橋酸素の代わりに硫黄置換を有するキャップ類似体（例えば、Grudzien-Nogalska E et al. (2007) RNA 13(10): 1745-1755を参照）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（例えば、Grudzien E et al. (2004) RNA 10(9):1479-1487を参照）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、Jemielity J et al., (2003) RNA 9(9): 1108-1122およびStepinski J et al. (2001) RNA 7(10):1486-1495を参照されたい）であってもよい。そのような一実施形態では、５’キャップ類似体は５’ジグアノシンキャップである。実施例２に示すＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ  ＵＳＡ）によるキャップ形成の方法も参照されたい。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、５’三リン酸を含まない。
【００８４】
次は、最小限の二次構造を有し、かつリボソーム補充を増強するかまたはキャップからコザック配列および開始コドンまでのリボソーム走査の効率を向上させることによってキャップ依存性翻訳効率を増進する、真核生物またはウイルス起源の合成５’非翻訳領域（ＵＴＲ）であってもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、コザック配列を含む。「コザック配列」は、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号１）を有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指し、そこで、Ｒは、別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の上流のプリン（アデニンまたはグアニン）の３つの塩基である。コザックコンセンサス配列はリボソームによって認識されて、ポリペプチドの翻訳を開始する。一般的に、開始は、転写産物の５’末端に近位の翻訳機構が遭遇する最初のＡＵＧコドンにおいて起こる。ＡＵＧコドンの近くのコザック配列の存在は、正しいポリペプチドの翻訳が起こるように、翻訳の開始部位としてのそのコドンを強化する。一部のそのような実施形態では、コザック配列は、１つまたは複数の改変されたヌクレオシドを含む。
【００８６】
天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームが、この後に続く。例示的なオープンリーディングフレームが本明細書に開示されるが、機能的レプチンタンパク質を生成する他のオープンリーディングフレームを用いてもよい。
【００８７】
オープンリーディングフレームの後に、真核生物またはウイルス起源の合成３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列が続いてもよい。３’ＵＴＲは、細胞中で高い安定性を有することが公知であるｍＲＮＡから選択することができる。例えば、合成３’ＵＴＲ配列は、Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍａｉｎｚへの国際特許出願番号ＷＯ２００７／０３６３６６に記載される、マウスα−グロビン３’ＵＴＲまたはマウスβ−グロビン３’ＵＴＲであってもよい。この３’ＵＴＲの後に、細胞中で一緒にｍＲＮＡの分解に拮抗してその翻訳を増強するポリアデノシンテールをコードする別の合成３’ＵＴＲ配列が続いてもよい。
【００８８】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる急速な分解を阻止し、ＲＮＡへの細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を回避または低減するための改変を含むことができる。改変には、例えば、（ｉ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化脱リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｉｉ）塩基改変、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対を形成する塩基、またはコンジュゲート塩基による置き換え、（ｉｉｉ）糖改変（例えば、２’位または４’位での）または糖の置き換え、ならびに（ｉｖ）ホスホジエステル結合の改変または置き換えを含む、ヌクレオシド間の結合の改変、を含めることができる。これらの改変の多くは、ｓｉＲＮＡ分子を改変するために用いられている。一部の塩基改変は、投与されたｍＲＮＡへの免疫応答の低減のために有用である。Kariko K et al. (2005) Immunity 23: 165-175を参照されたい。
【００８９】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、任意の利用可能な技術、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による酵素的合成、より長い前駆体の酵素的または化学的切断などによって調製することができる。ＲＮＡの合成方法は当技術分野で公知である。例えば、組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた、プラスミド鋳型からの長いＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための初期参考文献、例えば、Chapman KA and Wells RD (1982) "Bacteriophage T7 late promoters; construction and in vitro transcription properties of deletion mutants." Nucleic Acids Research 10(20): 6331-6340およびSchenborn ET and Mierendorf RC (1985) "A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure." Nucleic Acids Research 13(17): 6223-6236を参照されたい。転写方法は、本明細書において実施例２でさらに記載される。
【００９０】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、レプチンＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成することができる。鋳型生成のための方法は、標準の分子クローニング技術を用いる当業者に周知である。ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳および安定性を増強して、炎症性応答の誘導を回避する効果を有する改変（例えば、プソイドウリジンによるウリジンの置換）を含むリボヌクレオチドによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される。転写された改変合成レプチンｍＲＮＡは、転写後に、例えばキャップまたは他の官能基を加えることによってさらに改変することができる。
【００９１】
転写のために、改変されたヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ酵素が基質として認識することができる。一般に、ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、一定範囲のヌクレオシド塩基の改変を許容することができる。ＲＮＡポリメラーゼによる転写を可能にする、リボースおよびリン酸改変ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体が当技術分野で公知である。改変されたヌクレオシドを受容するポリメラーゼは、当業者に公知である。Ｋａｒｉｋｏらへの米国特許第８，２７８，０３６号を参照されたい。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼであってもよい。ＲＮＡポリメラーゼによって受け入れられる改変ヌクレオチドには、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、６−メチルアデニン（ｍ６Ａ）が含まれ、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）はファージＲＮＡポリメラーゼを用いる転写に適合するが、Ｎ１−メチルグアノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ７−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルシチジンはそうでないことが知られている。
【００９２】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを生成するために、改変されたポリメラーゼを用いることができる。２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチド５’−三リン酸を効率的に組み込む、改変された（突然変異体、Ｒ４２５Ｃ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、Ibach J et al. (2013) "Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2'-O-methyl-modified mRNA." J. Biotechnology 167:287-295によって近年記載された。
【００９３】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの転写または他の合成は、当技術分野で公知の任意の適する方法によって監視することができる。例えば、生成物形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴スペクトル法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）赤外分光分析、吸光分光分析（例えば、紫外可視）、もしくは質量分析によって、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって監視することができる。
【００９４】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、真核細胞の翻訳機構によって翻訳することができる。プソイドウリジン（Ψ）以外のヌクレオシド改変は、翻訳に干渉することができる。当業者は、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイ（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイ、リポーター活性アッセイまたは翻訳されたタンパク質中の放射性標識の測定）を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫化学アッセイなどを用いて生成されたポリペプチドの量を検出して、翻訳および翻訳効率を受けるその能力について、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを試験することができる。候補改変を有する本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの翻訳が同じままであるかまたは増加するならば、本明細書に記載される組成物および方法での候補改変の使用が企図されるように、候補改変を含む本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの翻訳は、候補改変を欠くＲＮＡの翻訳と比較される。
【００９５】
製剤
改変された合成レプチンｍＲＮＡは、いくつかの有利な特徴を有する送達剤で製剤化される。送達剤は、改変された合成レプチンｍＲＮＡを分解から保護する。送達剤は、改変された合成レプチンｍＲＮＡを意図された組織または細胞型に送達することを助けることもでき、そのことは対象の循環系でレプチンタンパク質の翻訳の増加およびレプチンタンパク質のレベルの増加をもたらす。
【００９６】
ｍＲＮＡは単独で細胞の細胞質に効率的に送達されず、リボヌクレアーゼによる分解に対して脆弱である。ｍＲＮＡは負に強く荷電し、親水性であるが、それは細胞外空間またはエンドサイトーシス小胞から細胞の細胞質へのｍＲＮＡの侵入の可能性を非常に低くする。したがって、治療目的のための細胞へのｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達は製剤の使用を必要とし、そこで、製剤中の送達剤はリボヌクレアーゼからｍＲＮＡを保護し、かつ細胞の細胞質へのｍＲＮＡの送達を促進する。
【００９７】
改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、エマルジョン、リポソーム、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、アニオン性脂質、荷電脂質または浸透エンハンサーなどの送達剤を含むことができる。正に荷電したカチオン性送達系は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（負荷電したポリヌクレオチド）の結合を促進し、負荷電した細胞膜で相互作用を増強して効率的な細胞取り込みも可能にする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーは、改変された合成ＲＮＡに結合することができるか、または小胞もしくはミセルを形成するように誘導することができる。例えば、改変されたＲＮＡが入っているKim SH et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい。カチオン性改変ＲＮＡ複合体を作製して用いるための方法は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Sorensen DR et al. (2003) J. Mol. Biol. 327:761-766；Verma UN et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300；Arnold AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい）。核酸送達のための脂質およびポリマー担体を評価する方法の指針は、Nguyen J and Szoka FC (2012) Accounts of Chemical Research 45(7): 1153-1162によって提供される。
【００９８】
トランスフェクションまたはリポフェクションのための送達剤。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、トランスフェクションまたはリポフェクションによって細胞または組織に導入することができる。トランスフェクションまたはリポフェクションのための適する送達剤には、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＩＭＲＩＥ  Ｃ（商標）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）およびＥｆｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（商標））、Ｕｎｉｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｍａｘｉｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（商標）（トランスフェクタム；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などが含まれる。例えば、Banerjee et al. (1999) Med. Chem. 42:4292-99；Godbey et al. (1999) Gene Ther. 6:1380-88；Kichler et al. (1998) Gene Ther. 5:855-60；Birchaa et al. (1999) J. Pharm. 183:195-207を参照されたい。
【００９９】
細胞透過エンハンサー。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、１つまたは複数の透過エンハンサー、界面活性剤またはキレーターと共に製剤化される。適する界面活性剤には、脂肪酸ならびにまたはそのエステルおよび塩、胆汁酸およびその塩が含まれる。適する胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが含まれる。適する脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。一部の実施形態では、透過エンハンサーの組合せ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が用いられる。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。他の透過エンハンサーには、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。
【０１００】
リポソーム。核酸を含有するいくつかのリポソームが、当技術分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらへの国際特許出願番号ＷＯ９６／４００６２は、高分子量核酸をリポソームに封入する方法を開示する。Ｔａｇａｗａらへの米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容はＲＮＡ分子を含むことができると主張する。Ｒａｈｍａｎらへの米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらへの国際特許出願番号ＷＯ９７／０４７８７は、ＲＮＡｉ分子を含むリポソームを開示する。核酸を含むリポソーム製剤を調製する方法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号；第６，０７４，６６７号；第６，１１０，４９０号；第６，１４７，２０４号；第６、２７１、２０６号；第６，３１２，９５６号；第６，４６５，１８８号；第６，５０６，５６４号；第６，７５０，０１６号；および第７，１１２，３３７号に見出すこともできる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの細胞への送達を提供するために、これらのアプローチの各々を用いることができる。
【０１０１】
ポリマー。国際特許出願番号ＷＯ２０１３／０９０１８６Ａ１に示すように、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、天然または合成のポリマーを用いて製剤化することができる。送達のために用いることができるポリマーの例には、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ＵＳＡ）およびＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ＵＳＡ）からのＤｙｎａｍｉｃ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（商標）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えばＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰｈａｓｅＲｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ  ＵＳＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ  ＵＳＡ）からのＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ  ＣＡ  ＵＳＡ）からのシクロデキストリン、デンドリマーおよび乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ  ＣＡ  ＷＡ）およびＰＨＡＳＥＲＸ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ  ＵＳＡ）などのｐＨ応答性ブロックコポリマーが含まれる。米国特許第６，８３５，３９３号、第７，３７４，７７８号、第７，７３７，１０８号、第７，７１８，１９３号および第８，００３，１２９号を参照されたい。欧州特許ＥＰ１０４４０２１Ｂ１も参照されたい。
【０１０２】
乳酸−グリコリドコポリマー（ＰＬＧＡ）製剤の例には、ＰＬＧＡ注射用デポ、例えばＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）が含まれる。
【０１０３】
これらのポリマーアプローチの多くは、細胞質へのオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ送達において有効性を実証した。これらのアプローチは、deFougerolles (2008) Hum Gene Ther. 19: 125-132によってレビューされている。核酸、特に小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達を与えた２つのポリマーアプローチは、動的ポリコンジュゲートおよびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチの第１のものは、動的ポリコンジュゲートを用い、ｓｉＲＮＡを効果的に送達することがマウスでｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887。このアプローチは、その特徴が、ジスルフィド結合によって核酸に共有結合することができる膜活性ポリマーを含み、ＰＥＧ（電荷マスキングのため）とＮ−アセチルガラクトサミン（肝細胞ターゲティングのためのターゲティング部分）基の両方がｐＨ感受性結合によって連結する、多成分ポリマー系である。Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887。
【０１０４】
別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞で、ＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子生成物の標的サイレンシングを実証した。Hu-Lieskovan et al. (2005) Cancer Res. 65: 8984-8982を参照されたい。これらのナノ粒子で製剤化されたｓｉＲＮＡは、ヒト以外の霊長類で耐容性が良好であった。Heidel et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:5715-21を参照されたい。ポリマー製剤は、異なるリガンド、例えば葉酸塩、トランスフェリンおよびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の発現を通して選択的ターゲティングが可能である。Benoit et al. (2011) Biomacromolecules 12:2708-2714；Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887；Davis (2009) Mol. Pharm. 6: 659-668；Davis (2010) Nature 464: 1067- 1070を参照されたい。
【０１０５】
送達剤は、少なくとも１つのポリマー、例えば、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬに移植されたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、改変ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［ａ−（４−アミノブチル）−Ｌグリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、Ｌ−ラクチド−Ｌ−リシンコポリマー、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはその組合せを含むことができる。
【０１０６】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、科学文献、特許および公開された特許出願で提供される指針を用いて、製剤技術の当業者がポリマーで製剤化することができる。例えば、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載の通りＰＬＬで移植されたＰＥＧのポリマー化合物で製剤化し、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために用いることができる。別の例として、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２００９／００４２８２９号および第２００９／００４２８２５号に記載の通り、カチオン性ポリマーを有する溶液もしくは媒体に、乾燥した医薬組成物中に、または乾燥させることが可能な溶液に懸濁させることができる。
【０１０７】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１２／０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号によって記載される通り、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーで製剤化することもできる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許第８，２４６，９６８号に記載される通り、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーで製剤化することができる。本明細書に記載されるポリマーは、脂質末端ＰＥＧにコンジュゲートすることができる。例えば、ＰＬＧＡは、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成する脂質末端ＰＥＧにコンジュゲートすることができる。ＰＥＧコンジュゲートは、国際特許出願番号ＷＯ２００８／１０３２７６に記載される。
【０１０８】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１０／０２６０８１７号に記載される通り、植込み型のまたは注射可能な器具に含まれるポリアミン誘導体送達剤で製剤化することができる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１０／０２６０８１７号に記載されるポリアミン誘導体で製剤化することができる。
【０１０９】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートおよびその組合せで製剤化することができる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの製剤は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えばポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマーまたはその組合せを含むことができる。
【０１１０】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、国際特許出願番号ＷＯ２０１１／１５８６２、ＷＯ２０１２／０８２５７４およびＷＯ２０１２／０６８１８７に記載される少なくとも１つのポリマーで製剤化することができる。さらに、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマーまたは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマーまたはその組合せを含む送達剤で製剤化することができる。生分解性カチオン性リポポリマーは、米国特許第６，６９６，０３８号または米国特許出願公開第２００３／００７３６１９号および第２００４／０１４２４７４号に記載される方法によって作製することができる。ポリ（アルキレンイミン）は、米国特許出願公開第２０１０／０００４３１５号に記載される方法を用いて作製することができる。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマーまたは生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、米国特許第６，５１７，８６９号または第６，２６７，９８７号に記載される方法を用いて作製することができる。線状生分解性コポリマーは、例えば米国特許第６，６５２，８８６号に記載される通り、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。ＰＡＧＡポリマーは、米国特許第６，２１７，９１２号に記載される方法を用いて作製することができる。ＰＡＧＡポリマーを共重合させて、ポリマーと、例えば、限定されずに、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチドおよびラクチド−グリコリドコポリマーとコポリマーまたはブロックコポリマーを形成することができる。生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマーは、米国特許第８，０５７，８２１号または米国特許出願公開第２０１２／００９１４５号に記載される方法によって作製することができる。例えば、分枝状ポリエチレンイミンと比較して異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて、多ブロックコポリマーを合成することができる。さらに、米国特許出願公開第２０１０／０００４３１５号または米国特許第６，２６７，９８７号もしくは第６，２１７，９１２号に記載される方法によって、組成物または医薬組成物を作製することができる。
【０１１１】
米国特許出願公開第２０１０／０００４３１３号は、製剤がヌクレオチド配列およびポロキサマーをどのように含むことができるかについて記載する。したがって、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、遺伝子送達組成物でポロキサマーと一緒に用いることができる。
【０１１２】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、ポリカチオン性側鎖を含有することができる少なくとも１つの分解可能なポリエステルで製剤化することができる。分解可能なポリエステルには、限定されずに、ポリ（セリンエステル）、Ｌ−ラクチド−Ｌ−リシンコポリマー、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）およびその組合せが含まれる。別の実施形態では、分解可能なポリエステルは、ペグ化されたポリマーを形成するＰＥＧコンジュゲーションを含むことができる。
【０１１３】
カチオン性脂質ナノ粒子。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、ナノ粒子に封入することができる。ナノ粒子パッケージングの方法は当技術分野で周知であり、例えば、Bose S et al. (2004) J. Virol. 78:8146；Dong Y et al. (2005) Biomaterials 26:6068；Lobenberg R et al. (1998) J Drug Target 5:171；Sakuma SR et al. (1999) Int. J. Pharm. 177:161；Virovic L et al. (2005) Expert Opin. Drug Deliv. 2:707およびZimmermann E et al, (2001) Eur. J. Pharm. Biopharm. 52:203に記載される。
【０１１４】
核酸の細胞送達のためのカチオン性脂質の使用は、いくつかの利点を有する。カチオン性脂質を用いるアニオン性化合物の封入は、静電的相互作用のために本質的に定量的である。カチオン性脂質は、細胞膜輸送を開始する負荷電した細胞膜と相互作用することができる。Akhtar et al. (1992) Trends Cell Biol. 2, 139；Xu et al. (1996) Biochemistry 35, 5616。さらに、カチオン性脂質の分子形状、立体配置および特性は、エンドソームコンパートメントからサイトゾルへの送達効率の増大をもたらすことができる。Semple SC et al. (2010) Nature Biotechnol. 28(2):172-176。カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子は、小さい抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を十分に封入し、動物の細胞に効率的にｓｉＲＮＡを送達することが示された。Jayaraman M et al (2012) Angew. Chemie Int. Ed. 51:1-6。
【０１１５】
一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入するための組成物は、（ｉ）封入およびエンドソームエスケープのためのカチオン性脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質、および（ｉｖ）凝集を阻止するステルス脂質を含む。
【０１１６】
「カチオン性脂質」は、正に荷電した脂質である。核酸送達のためのカチオン性リポソームまたはカチオン性リポプレックスを作製するためのカチオン性脂質の使用のレビューについては、Gallas A et al. (2013) Chem. Soc. Rev. 42:7983-7997；Falsini et al. (2013) J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q；および本明細書で提供される他の参考文献を参照されたい。具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性リピドＡ、カチオン性リピドＢ、カチオン性リピドＣおよびカチオン性リピドＤから選択することができ、その各々は本明細書で記載される。
【０１１７】
「中性脂質」は、非常に低い極性の溶媒だけで可溶性である任意の脂質のための運用上の用語である。本発明の送達剤での使用に適する中性脂質には、様々な中性、非荷電または双性イオン性の脂質、例えば以下のものが含まれる：５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レソルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ３ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１ミリストイル２パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１パルミトイル２ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎグリセロール−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびその組合せ。一実施形態では、中性リン脂質は、ＤＳＰＣおよびＤＭＰＥからなる群から選択される。
【０１１８】
「ヘルパー脂質」は、トランスフェクション（例えば生物学的に活性な薬剤を含むナノ粒子のトランスフェクション）を増強する脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強する機構は、例えば、粒子安定性を増強するかまたは膜融合誘導を増強することを含むことができる。ヘルパー脂質には、ステロイドおよびアルキルレソルシノールが含まれる。本発明の送達剤での使用に適するヘルパー脂質には、コレステロール、５−ヘプタデシルレソルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートが含まれる。
【０１１９】
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏに、例えば血液中に存在することができる時間の長さを増加させる脂質である。本発明の送達剤での使用に適するステルス脂質には、限定されずに、脂質部分に連結した親水性の頭基を有するステルス脂質が含まれる。そのようなステルス脂質の例には、国際特許出願番号ＷＯ２０１１／０７６８０７に記載される化合物が含まれる。本発明の送達剤での使用に適する他のステルス脂質、およびそのようなステルス脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al. (2008) Pharmaceutical Research 25(1): 55 71 and Hoekstra et al. (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1660: 41-52に見出すことができる。適するステルス脂質は、ポリ（エチレンオキシド）ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ［Ｎ（２ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］に基づくポリマーを含む、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に類似の分子の中から選択することができる。追加の適するＰＥＧ脂質は、国際特許出願番号２００６／００７７１２に開示される。ＰＥＧ脂質には、約Ｃ４から約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコールジアシルグリカミド（ＰＥＧＤＡＧ）コンジュゲートが含まれる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含むことができる。本明細書に記載される例のいずれでも、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧジラウリルグリセロール、ＰＥＧジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（ＮＯＦ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎからのカタログ番号ＧＭ０２０）、ＰＥＧジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧジステリルグリセロール、ＰＥＧジラウリルグリカミド、ＰＥＧジミリスチルグリカミド、ＰＥＧジパルミトイルグリカミドおよびＰＥＧジステリルグリカミド、ＰＥＧコレステロール（１［８’（コレスタ５エン３［ベータ］オキシ）カルボキシアミド３’，６’ジオキサオクタニル］カルバモイル［オメガ］メチルポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ  ＤＭＢ（３，４ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチルポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミンＮ［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ  ＡＬ  ＵＳＡからのカタログ番号８８０１５０Ｐ）から選択することができる。
【０１２０】
一実施形態では、ステルス脂質は化合物Ｓ０２４であり、それは国際特許出願番号ＷＯ２０１１／０７６８０７に記載される。化合物Ｓ０２４の化学構造は、以下の通りである：
【０１２１】
【化１】
2017500865.tif 000018
【０１２２】
Ｓ０２４の化学名は、ノナコサン−１５−イル２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，６２，６５，６８，７０，７２，７５，７８，８１，８４，８７，９０，９３，９６，９９，１０２，１０５，１０８，１１１，１１４，１１７，１２０，１２３，１２６，１２９，１３２，１３５−ヘキサテトラコンタオキサテトラコンタヘクタン−１４０−イルカルバメートであり、ｎ＝４５である。
【０１２３】
一実施形態では、送達剤は、ヘルパー脂質としてコレステロールを、ステルス脂質として中性脂質およびＰＥＧ脂質を含む。より具体的な実施形態では、送達剤は、カチオン性リピドＡ、カチオン性リピドＢ、カチオン性リピドＣまたはカチオン性リピドＤから選択される３０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１０％のヘルパー脂質、３０〜６０％の中性脂質および１〜５％のＰＥＧ脂質を含む。さらにより具体的な実施形態では、送達剤は、カチオン性リピドＡ、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣから選択される３０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１０％のヘルパー脂質、４８％のコレステロールおよび２％のＰＥＧ脂質を含む。
【０１２４】
一実施形態では、送達剤のｐＨは、改変された合成レプチンｍＲＮＡの封入または製剤化の時点で４〜６である。より具体的な実施形態では、送達剤のｐＨは、封入または製剤化の時点で５〜６である。さらにより具体的な実施形態では、送達剤のｐＨは、封入または製剤化の時点で５．６〜６．０である。カチオン性リピドＣによる脂質ナノ粒子の製剤化のための、必要とは限らないが提案されたｐＨはｐＨ５．６である。カチオン性リピドＢによる脂質ナノ粒子の製剤化のための、必要とは限らないが提案されたｐＨはｐＨ６．０である。
【０１２５】
選択されるカチオン性脂質によって、ｍＲＮＡ封入パーセントは、異なるｐＨ値でこの範囲内でより高くてもまたはより低くてもよい。特定のカチオン性脂質製剤のための最適な封入ｐＨは、この範囲内で経験的に決定することができる。送達剤中の４つの脂質構成成分のモル比およびカチオン性脂質アミン対ｍＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比は一般に有用な指針であるが、３：１のＮ：Ｐ比から８：１のＮ：Ｐ比まで変更することができる。Ｎ：Ｐ比の変動は、ｍＲＮＡ封入効率、粒子分析性およびｉｎ  ｖｉｖｏのｍＲＮＡ送達性能に影響を及ぼすことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏのｍＲＮＡ送達要件のための理想的な脂質製剤は、経験的に決定することができる。
【０１２６】
本発明の送達剤は、これらの各種の脂質の間の脂質モル比を調整することによって、当業者がさらに最適化することができる。一実施形態では、さらなる最適化は、所望の粒径、Ｎ：Ｐ比、製剤方法の１つまたは複数を調整して得られる。
【０１２７】
本明細書に、特に実施例３４および実施例３５に記載される改善されたプロセスでは、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、カチオン性脂質および急速混合を用いてカチオン性脂質ナノ粒子に製剤化される。封入は効率的であり、製剤化された粒子は生細胞への封入ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達に適合することができる。表２は、実施例３４および実施例３５に記載される２つの改善プロセスによる、脂質ナノ粒子へのレプチンｍＲＮＡ封入の分析結果を示す。
【０１２８】
【表２】
2017500865.tif 000019
【０１２９】
医薬組成物。本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、公知であるかまたは今後薬学分野で開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、有効成分を賦形剤および任意選択で１つまたは複数の他の副成分と関連させるステップと、次に、任意選択で生成物を所望の単一用量または複数用量単位に成形またはパッケージするステップを含む。
【０１３０】
本明細書で提供される医薬組成物の記載は主にヒトへの投与に適する医薬組成物を対象とするが、そのような組成物があらゆる種類の動物への投与に一般に適することは当業者が理解する。
【０１３１】
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量としてまたは複数の単一単位用量として調製、パッケージまたは販売することができる。「単位用量」は、有効成分の所定量を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、対象に投与されるだろう有効成分の投薬量に一般に等しい。
【０１３２】
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含有することができ、それらには、所望の特定の剤形に適するものとして、あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Pressは、医薬組成物の製剤化で用いられる様々な賦形剤およびそれらの調製のための公知の技術を開示する。
【０１３３】
一部の実施形態では、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認される。一部の実施形態では、賦形剤は医薬用グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方または国際薬局方の規格を満たす。
【０１３４】
医薬品の製剤化または製造での一般的な考慮事項は、例えばRemington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Pressに見出すことができる。
【０１３５】
本明細書に記載される医薬組成物は、以下の特性の１つまたは複数によって特徴付けることができる：
【０１３６】
生物学的利用能。本明細書に記載される送達剤で組成物に製剤化されるとき、ｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載される送達剤のない組成物と比較して増大した生物学的利用能を示すことができる。用語「生物学的利用能」は、哺乳動物に投与されるｍＲＮＡ分子の所与の量の全身の利用度を指す。生物学的利用能は、哺乳動物への化合物の投与の後に、未変形化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清中もしくは血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を測定することによって評価することができる。ＡＵＣは、横軸（Ｘ軸）に沿った時間に対して縦軸（Ｙ軸）に沿って化合物の血清中または血漿中濃度をプロットした曲線の下の面積の判定である。一般に、特定の化合物のためのＡＵＣは、当業者に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるG. S. Banker (1996) Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc.に記載されているような方法を用いて計算することができる。
【０１３７】
Ｃｍａｘ値は、哺乳動物への化合物の投与の後に哺乳動物の血清または血漿で達成される、化合物の最高濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に公知である方法を用いて測定することができる。本明細書で用いる語句「生物学的利用能を増加させる」または「薬物動態を改善する」は、哺乳動物においてＡＵＣ、ＣｍａｘまたはＣｍｉｎで測定される第１のｍＲＮＡ分子の全身利用度が、本明細書に記載される送達剤と同時投与されるときに、そのような同時投与がないときより大きいことを意味する。
【０１３８】
治療ウィンドウ。本明細書に記載される組成物に製剤化されるとき、ｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載される送達剤を欠く投与されたｍＲＮＡ分子組成物の治療ウィンドウと比較して、投与されたｍＲＮＡ分子組成物の治療ウィンドウの増加を示すことができる。本明細書で用いるように、「治療ウィンドウ」は、治療効果を導き出す確率の高い、血漿中濃度の範囲または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を指す。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の投与のための治療ウィンドウは、ベースラインより１０ｎｇ／ｍＬ上の増加した血漿レプチンタンパク質であり、ベースラインは、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の投与前の対象の血漿レプチンであるかまたは同等の試験患者の血漿レプチンタンパク質であってもよい。
【０１３９】
分布容積。本明細書に記載される組成物に製剤化されるとき、本発明の改変された合成ｍＲＮＡは、改善された分布容積（Ｖｄｉｓｔ）を示すことができる。Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物量を血液または血漿中の薬物濃度に関連させる。用語「分布容積」は、血液または血漿におけるのと同じ濃度で体内の全薬物量を含有するために必要とされる流体容積を指す：Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物量／血液または血漿中の薬物濃度に等しい。例えば、１０ｍｇの用量および１０ｍｇ／Ｌの血漿中濃度の場合、分布容積は１リットルであるだろう。分布容積は、薬物が脈管外組織に存在する程度を反映する。大きな分布容積は、血漿タンパク結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床場面では、定常状態濃度を達成する負荷用量を決定するために、Ｖｄｉｓｔを用いることができる。実施例で示す薬物動態学的研究に基づくと、Ｖｄｉｓｔは非常に低く、化合物が循環を離れるとき、化合物は循環に再入しないことを意味する。
【０１４０】
投薬量
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤の投薬量および投与は、処置すべき状態および所与の場合にとられる治療アプローチによって異なる。投薬量は、改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤が治療量で投与されるかまたは予防量で投与されるかによって異なってもよい。
【０１４１】
投薬量は、とられるアプローチ、送達様式および処置すべき疾患によっても変化する。一実施形態では、投薬量は１ｋｇ体重につき０．２ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ、ｍｐｋ）の範囲のリボ核酸ポリヌクレオチドであってもよい。別の実施形態では、投薬量は１ｋｇ体重につき０．６ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ、ｍｐｋ）の範囲のリボ核酸ポリヌクレオチドであってもよい。実施例２０および実施例２３を参照されたい。他の実施形態では、投薬量は最高２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１４２】
本発明の少なくとも１つの改変された合成レプチンｍＲＮＡを含有する治療組成物は、単位用量で従来通りに投与することができる。治療組成物に関して用いるとき、用語「単位用量」は、対象のための単一投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる生理的に許容される希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共同して所望の治療効果を生むように計算された活性物質の所定量を含有する。
【０１４３】
組成物は、投薬製剤に適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与される。投与する量およびタイミングは、処置対象、有効成分を利用する対象の系の能力および所望の治療効果の程度に依存する。
【０１４４】
投与
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、局所または全身処置が所望かどうか、および処置領域によって様々な経路によって対象に送達または投与することができる。例示的な経路には、静脈内および皮下送達経路がある。
【０１４５】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与は、対象によって、または別の人、例えば介護者によって提供されてもよい。介護者は、ヒトへの医療の提供に関与する任意の実体、例えば病院、ホスピス、診療室、外来診療所；医療従事者、例えば医師、看護士もしくは他の開業医；または配偶者、親もしくは保護者であってよい。
【０１４６】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、改変された合成レプチンｍＲＮＡによってコードされるレプチンポリペプチドの翻訳および発現が細胞で起こるように、改変された合成レプチンｍＲＮＡの細胞内送達を達成する任意の様式によって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に導入することができる。細胞による本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの吸収または取り込みは、補助なしの拡散性もしくは活性細胞性プロセスによって、または本明細書で下に記載されるかもしくは当技術分野で公知である補助的薬剤もしくは器具によって起こすことができる。
【０１４７】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤または本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤を含む医薬組成物は、１つまたは複数の他の治療、予防、診断または画像化の薬剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」という語句は、薬剤を同時に投与しなければならないか、送達のために一緒に製剤化しなければならないことを意味しないが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、１つまたは複数の他の所望の治療または医療手順と同時に、その前または後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でまたは時間スケジュールで投与される。一部の実施形態では、本発明は、医薬、予防、診断または画像化の組成物を、それらの生物学的利用能を改善するか、それらの代謝を低減もしくは改変するか、それらの排出を抑制するか、または体内でそれらの分布を改変することができる薬剤と組み合わせて送達することを含む。
【０１４８】
対象、器官、組織または細胞への投与のための当技術分野で公知の器具および方法は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤と一緒の使用が企図される。これらには、例えば内腔またはカテーテルを採用する、針、ハイブリッド器具を有する方法および器具が例えば含まれる。
【０１４９】
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（例えば、Wong and Neumann (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87を参照されたい）、微粒子銃（すなわち、粒子衝撃）、細胞融合などによって標的細胞に導入される。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ製剤は、単一用量または２つ以上の用量で投与される。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望ならば、非植込み型送達器具、例えば針、シリンジ、ペン器具、または植込み型送達器具、例えばポンプ、半恒久的なステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内または包内）もしくはレザバーを推奨できる。一部のそのような実施形態では、送達器具は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを含む医薬組成物の単位用量を小出しする機構を含むことができる。他の実施形態では、器具は、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを含む医薬組成物を、例えば拡散によって連続的に放出する。一部の実施形態では、器具は、対象の中でパラメータを監視するセンサーを含むことができる。例えば、器具は、例えば、および任意選択でエレクトロニクスと関連付けられたポンプを含むことができる。例示的な器具には、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官または器官構成要素（例えば、人工心臓、心臓弁など）および縫合が含まれる。
【０１５１】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを含有する流体の少量を局部組織に直接的に注入する手段を提供する、植え込まれた留置カテーテルを用いることにより送達することもできる。これらのカテーテルの近位端は、対象の体に外科的に固定された植え込まれたアクセスポートに、または、例えば対象の胴に位置する植え込まれた薬ポンプに接続することができる。
【０１５２】
あるいは、植込み型送達器具、例えば植込み型ポンプを採用することができる。本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを含む組成物用としての送達器具の例には、ＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓＭＮ、ＵＳＡのＭｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．によるモデル８５０６治験器具が含まれ、それは、体の皮下にまたは頭蓋の上に植え込むことができ、治療剤を送達することができるアクセスポートを提供する。あるいは、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、米国特許第５，７３５，８１４号、第５，８１４，０１４号および第６，０４２，５７９号に記載されるものなどの、種々の器具によって送達することができる。本明細書に記載される教示を用いて、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの送達のために、これらおよび他の器具および系が適する可能性があることを当業者は認める。
【０１５３】
一部のそのような実施形態では、送達系は、カテーテルの近位端に接続されたポンプを体の外に植え込むこと、およびポンプを作動させて本発明の改変された合成ｍＲＮＡの所定投薬量をカテーテルの排出部を通して送達することをさらに含む。さらなる実施形態は、体の外のポンプへの本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの供給を周期的に更新することを含む。
【０１５４】
固体組織へ治療剤を送達する方法が、Ｂａｈａｍｉらによって米国特許出願公開第２０１１／０２３０８３９号に記載されている。各針に沿って固体組織の任意の位置で実質的に等しい量の流体を送達する器具に、列状の針が組み込まれる。
【０１５５】
生体組織全体に生物物質を送達する器具が、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって米国特許出願公開第２０１１／０１７２６１０号に記載されている。ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質および他の薬学的に活性な成分またはそれらの組合せを送達する器具に、１つまたは複数の金属で作製され、約２００ミクロンから約３５０ミクロンの外径および少なくとも１００ミクロンの長さを有する多穴極微針が組み込まれる。
【０１５６】
組織へ治療剤を送達する送達プローブが、Ｇｕｎｄａｙらによって米国特許出願公開第２０１１／０２７０１８４号に記載されている。針を通してカプセルから薬剤を排出するために、取り付けられたカプセルを活性化位置と不活性化位置の間で移動させる器具に、複数の針が組み込まれる。
【０１５７】
多注入医療装置が、Ａｓｓａｆによって米国特許出願公開第２０１１／０２１８４９７号に記載されている。針の１つまたは複数に接続されたチャンバー、および各注入の後に医療流体をチャンバーに連続的に補充する手段を有する器具に、複数の針が組み込まれる。
【０１５８】
鉄の治療有効量の経皮送達のための方法が、Ｂｅｒｅｎｓｏｎによって米国特許出願公開第２０１０／０１３０９１０号に記載されている。イオン導入パッチ上のイオン性鉄の経皮送達を増強するために、角質層に複数のマイクロチャネルを形成するために、複数の針を用いることができる。
【０１５９】
生体組織全体に生物物質を送達する方法が、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって米国特許出願公開第２０１１／０１９６３０８号に記載されている。タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質および他の薬学的に活性な成分またはそれらの組合せを送達する器具に、治療有効成分を含有する複数の生分解性極微針が組み込まれる。
【０１６０】
組織細胞へ遺伝子、酵素および生物学的薬剤を送達する方法が、Ｄｅｓａｉによって米国特許出願公開第２００３／００７３９０８号に記載されている。体に挿入され、針を通して医薬流体を送達する器具に、複数の針が組み込まれる。
【０１６１】
極微針経皮運搬器具が、Ａｎｇｅｌらによって米国特許第７，３６４，５６８号に記載されている。異なる方向から表面に挿入される針を通して体表面に物質を運搬する器具に、複数の針が組み込まれる。
【０１６２】
皮下注入用器具が、Ｄａｌｔｏｎらによって米国特許第７，１５０，７２６号に記載されている。針を通して皮下組織に流体を送達する器具に、複数の針が組み込まれる。
【０１６３】
マイクロカニューレを通したワクチンおよび遺伝子治療剤の皮内送達のための器具および方法が、Ｍｉｋｓｚｔａらによって米国特許第７，４７３，２４７号に記載されている。対象の皮膚に０．０２５ｍｍから２ｍｍの間の深さまでワクチンを送達する器具に、少なくとも１つの穴の極微針が組み込まれる。
【０１６４】
皮膚を通して物質を引き抜くかまたは送達する器具が、Ｄｏｗｎらによって米国特許第６，６０７，５１３号に記載されている。器具に組み込まれる複数の皮膚透過メンバーは、約１００ミクロンから約２０００ミクロンの長さを有し、約３０〜５０ゲージである。
【０１６５】
極微針とヒト皮膚の間の相互作用を改善することによる、組織全体への薬物および生物学的分子の運搬の増強のための方法が、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚらによって米国特許第６，７４３，２１１号に記載されている。極微針が適用される、より強固でより変形しにくい表面を提供することができる器具に、複数の極微針が組み込まれる。
【０１６６】
多針ホルダーおよび皮下の多チャネル注入ポートが、Ｂｒｏｗｎによって米国特許第４，６９５，２７３号に記載されている。針ホルダー上の複数の針は、注入ポートの隔壁を通して挿入され、注入ポート内の隔離されたチャンバーに通じる。
【０１６７】
二重の皮下注射器が、Ｈｏｒｎによって米国特許第３，５５２，３９４号に記載されている。器具に組み込まれる２つの針は間隔が６８ｍｍ未満であり、異なる型および長さであってもよく、このように異なる深度への注入を可能にする。
【０１６８】
全身吸収および改善された薬物動態のための皮膚の少なくとも２つのコンパートメントへの物質の投与のための方法および器具が、Ｐｅｔｔｉｓらによって国際特許出願番号ＷＯ２００３／０９４９９５に記載されている。皮内および皮下組織コンパートメントに同時に送達する器具に、約３００μｍから約５ｍｍの間の長さを有する複数の針が組み込まれる。
【０１６９】
針およびローラーを有する薬物送達器具が、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらによって国際特許出願番号ＷＯ２０１２／００６２５９に記載されている。ローラーが回転する間に針を通してレザバー中の内容物を送達する器具に、ローラーに配置される多穴針が組み込まれる。
【０１７０】
多成分療法を投与するための方法が、Ｎａｙａｋによって米国特許第７，６９９，８０３号に記載されている。組織の中に治療物質が送達される深度を制御するための深度スロットを含むことができる器具に、複数の注入カニューレを組み込むことができる。
【０１７１】
柔軟な生体障壁に流体を送達するための器具および方法が、Ｙｅｓｈｕｒｕｎらによって米国特許第７，９９８，１１９号および第８，００７，４６６号にそれぞれ記載されている。器具の上の極微針は柔軟な生体障壁を貫通して伸展し、流体は中空極微針の孔を通して注入される。
【０１７２】
所望の場合は、哺乳動物または対象を薬剤（例えば、ホーミング因子）で前処置することができる。例えば、ホーミング因子は、組織への細胞ターゲティングを増強するために投与することができ、細胞が所望の組織を標的にすることを助長する部位に置くことができる。組織へのホーミング因子の直接注入は、リガンド標的細胞の全身送達の前に実行することができる。
【０１７３】
効能の評価
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与の奏効は、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態などの状態を含む、処置する状態の１つまたは複数の症状またはマーカーを監視することによって、通常の熟練臨床医が評価することができる。効能の評価は、状態の１つまたは複数の徴候の任意の統計的に有意な改善を含む。適切な場合には、所与の状態のための臨床的に容認されたグレードまたは評価系を適用することができ、尺度またはグレードの改善は有効な処置の指標となる。
【０１７４】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの投与の効能を評価するための指針は、他のレプチン療法の投与からの結果が提供することができる。
【０１７５】
Ｌｉｃｉｎｉｏ  Ｊら（２００４）は、メトレレプチンによる皮下処置の後に、レプチン欠乏肥満成人でいくつかの治療指数の改善を報告した。Ｌｉｃｉｎｉｏ  Ｊら（２００４）は、身体活動の増加、２型糖尿病および性腺機能低下症の解消、ならびに肥満度指数の低減を報告した。患者の平均肥満度指数は、６カ月間の処置の後に約３６．５ｋｇ／ｍ２に低下した。患者の平均肥満度指数は、１２カ月間の処置の後に約２８．９ｋｇ／ｍ２に低下した。患者の平均肥満度指数は、１８カ月間の処置の後に約２６．９ｋｇ／ｍ２に低下した。さらに、患者の１日の平均カロリー摂取は、２週間の処置の後に４９％減少した。患者の血清中レプチンレベルは、６カ月間の処置の後に約１２．６７ｎｇ／ｍＬに増加した。患者の血漿中黄体形成ホルモン（ＬＨ）レベルは、６カ月間の処置の後に約２．７５ミリ単位／ｍＬに増加した。１８カ月の処置クール中、トリグリセリドレベルは少なくとも４９％低下した。
【０１７６】
Ｅｂｉｈａｒａ  Ｋ．ら（２００７）は、全身性リポジストロフィーを有する患者を、１日２回のメトレレプチンにより、メトレレプチンで皮下処置した。全身性リポジストロフィーを有する患者は、１週間の処置期間内に空腹時血漿グルコースおよび血清トリグリセリドの有意な改善を示した。全身性または部分的リポジストロフィーを有する患者では、４カ月間のメトレレプチン処置は、空腹時グルコースを１８４±９１ｍｇ／ｄＬから１４６±１４ｍｇ／ｄＬに、ヘモグロビンＡ１ｃを８．５％±２．１％から７．３％±０．３％に、トリグリセリドを４７９±８０ｍｇ／ｄＬから２５４±４０ｍｇ／ｄＬに有意に改善した。Ｅｂｉｈａｒａら（２００７）は、１週間の処置期間内に空腹時グルコースレベルが約１７２から約１２０ｍｇ／ｄＬに低減し、トリグリセリドレベルが約７００から約２６０ｍｇ／ｄＬに低減したことも示した。
【０１７７】
Ｃｈａｎ  ＪＬら（２０１１）は、３年のメトレレプチン処置期間中のいくつかの治療指数の低を報告した。ヘモグロビンＡ１ｃの血漿中レベル（当初、約８．５％に上昇していた）は、約２．１％低下した。ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は糖化されたヘモグロビンであり、総ヘモグロビンの百分率で表され、より高い百分率は循環中の経時的なより高いグルコースレベルを反映する。トリグリセリドの血漿中レベル（当初、約４７９ｍｇ／ｄＬに上昇していた）は、約３５．４％低下した。３年間のメトレレプチン処置の後、空腹時グルコースレベルは約１８４ｍｇ／ｄＬから約１２４ｍｇ／ｄＬになり、ヘモグロビンＡ１ｃレベルは約８．５％から約６．０％になり、トリグリセリドは約７４３ｍｇ／ｄＬから約１６４ｍｇ／ｄＬになった。Ｃｈａｎら（２０１１）は、リポジストロフィーのためのレプチン補充療法の後の、レプチン、グルコース、トリグリセリドおよびグリコシル化ヘモグロビンの試験結果方法を記載する、Oral EA et al. (2002) N. Engl. J. Med. 346(8):570-8を参照した。Ｏｒａｌら（２００２）および他によって記載された試験法は、血液、血漿または血清の関連する試験のための指針を提供する。
【０１７８】
本発明のレプチンｍＲＮＡ製剤の投与のための指針は、Ｌｉｃｉｎｉｏら（２００４）、Ｅｂｉｈａｒａら（２００７）、Ｃｈａｎら（２０１１）およびＯｒａｌら（２００２）によって提供される結果が提供することができる。本発明のレプチンｍＲＮＡの投与は少なくともメトレレプチンの投与と同じくらい効果的にレプチンタンパク質を送達するので、７日間のレプチン処置の後と同等の、血漿中グルコースレベルまたはトリグリセリドレベルの低減がある。７日間メトレレプチンを皮下投与する患者の投与はグルコースおよびトリグリセリドレベルの低減をもたらしたので、本発明のレプチンｍＲＮＡ製剤の投与は、血漿中グルコースレベルの少なくとも３０％の低下および血漿中トリグリセリドレベルの少なくとも４０％の低下をもたらす。
【０１７９】
血漿中グルコースレベルおよび血漿中トリグリセリドレベルの低減のための追加の指針は、実施例３７および実施例３８に見出される。
【０１８０】
全ての特許、遺伝子識別番号によって特定されるオリゴヌクレオチド配列、および本明細書で特定される他の刊行物は、記載および開示のために参照により明示的に組み込まれる。これには、本発明に関連して用いることができる特許および刊行物に記載される方法論が含まれる。これらの文書の内容に関する日付または表示に関する全ての表明は、入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認も構成しない。引用元と本明細書の開示の間の矛盾する表明の場合には、本明細書の開示中の表明が支配するものとする。
【０１８１】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、それとは反対に指示されないか、さもなければ文脈から明白でない限り、１つまたは複数を意味することができる。本明細書および特許請求の範囲で用いるように、文脈が明らかに別に指示しない限り単数形は複数形を含み、その逆も真である。操作例以外では、または特記されている場合以外は、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解すべきである。
【０１８２】
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、文脈が明らかに他を指示しない限り、範囲で表される値は、本発明の異なる実施形態において、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、明記される範囲内の任意の特異の値またはサブレンジをとることができる。
【０１８３】
以下の実施例は、本発明およびその様々な使用の具体的な実施形態を例示する。それらは説明目的のためにだけ示されており、本発明を限定するものととるべきでない。
【実施例１】
【０１８４】
レプチンＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態および効能試験
この実施例の目的は、レプチンをコードするポリヌクレオチド構築物からの発現がヒトレプチンタンパク質を送達することができることを確認することであった。ヒトレプチンＤＮＡからのレプチンタンパク質発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ効能を判定するために、流体力学的遺伝子送達方法（ＨＤＩ）を開発し、採用した。裸のＤＮＡで誘導されたレプチンタンパク質の発現の送達を、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ効能で追跡した。以下の材料を用いた：
【０１８５】
【表３】
2017500865.tif 000020
【０１８６】
ＨＤＩの前に、マウス体重および食物重量を記録した。マウスをそれらの体重によってグループ分けした。
【０１８７】
マウスを加熱灯から約１２インチ離し、加熱灯の下でそれらを約２分の間暖めることによって、マウスを注射のために準備した。
【０１８８】
流体力学的な注入手順については、マウスを拘束装置に置き、それらの尾を７０％アルコールで洗浄した。ベベルすり合せにより３ｍｌシリンジに接続された２７ゲージのバタフライ針を尾静脈に挿入し、血液が確実にシリンジに抜かれるようにシリンジプランジャーを後方に引いた。ＤＮＡ構築物の所望の容量（体重の７％、３．２ｍｌでふたをした）を手動により短時間（５〜１０秒）で注入した。次に針を抜き取り、注射部位にガーゼで圧を加えることによって止血した。
【０１８９】
注射後のケアのために、完全な回復（約１５分）のためにマウスを観察下、加熱パッドの上に置き、その後それらのハウジング部屋に戻した。その後、最初の４８時間に１日２回、マウスを監視した。
【０１９０】
独居房内の８〜９週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウスをｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために用いた。表１に記載されるヒトレプチンＤＮＡ構築物を、平均群体重につき３０μｇ、３μｇ、０．３μｇおよび０．０３μｇの用量で注射用食塩水に希釈した。
【０１９１】
０日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。体重に従って、マウスに対して上のＤＮＡ用量で尾静脈に注射し、それは注射用食塩水に次に希釈した。最終投与量はマウス体重の７％であり、３．０ｍｌのキャップであった。マウスに投薬した。次に、体重、健康状態および食物摂取（ＦＩ）を１、２、４、７、１４および２１日目にそれぞれ記録した。さらに、レプチンタンパク質の発現レベルを評価するために、４および７日目に１５μｌの血漿を収集した。
【０１９２】
レプチンＤＮＡの流体力学的注入の後、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、この実施例の手順により投与されたヒトレプチンは体重を減少させ（表４）、食物摂取（表５）を低減した。体脂肪分析は、体重減少が完全に体脂肪の減少によることを確認した。
【０１９３】
【表４】
2017500865.tif 000021
【０１９４】
【表５】
2017500865.tif 000022
【０１９５】
ヒトレプチンタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ。マウス血漿中のヒトレプチンを、ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｄｕｏｓｅｔから購入した抗体（Ｃａｔ＃ＤＹ３９８Ｅ、捕捉抗体についてはｐａｒｔ＃８４０２７９、検出抗体についてはｐａｒｔ＃８４０２８０）をＰＢＳで再構成し、再びＰＢＳを用いて滴定した。ｗｈｉｔｅ  Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（Ｃａｔ＃４６０３７２）の上に、捕捉抗体を３０μｌ／ウェルで４μｇ／ｍＬでコーティングした。室温で終夜のインキュベーションの後、捕捉抗体を吸引し、プレートを９０μＬ／ウェルのＫＰＬミルクブロッカー（Ｃａｔ＃５０−８２−００）により室温で２時間ブロックした。インキュベーションが完了したならば、プレートを吸引し、６００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で２時間、組換え標準および試料を３０μＬ／ウェルでプレートに加えた。カゼイン試料希釈剤を用いて試料／標準希釈溶液を作製した。Ｔｅｋｎｏｖａプレート洗浄溶液（Ｃａｔ＃Ｐ１１９２）を用いて、１００μｌ／ウェルによる洗浄／吸引が３回続いた。次に、カゼイン検出抗体希釈剤を用いて検出抗体を１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈し、室温で２時間、３０μｌ／ウェルで加えた。このインキュベーションの後、プレートを再び洗浄し、ＨＲＰ希釈緩衝液中の１：１２５０希釈のポリ−ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｃａｔ＃２１１４０）の溶液を各ウェルに加え（３０μＬ／ウェル）、室温で３０分間インキュベートした。最終洗浄／吸引はＨＲＰ溶液を除去し、化学発光基質を３０μＬ／ウェル（Ｃａｔ＃１８５９６７８および１８５９６７９）で加えた。ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ５プレートリーダーを用いて５０ミリ秒の集積時間でプレートを速やかに読み取った。ＥＬＩＳＡのダイナミックレンジは、１００〜２，０００ｐｇ／ｍｌのヒトレプチンである。アッセイは、マウス、ラットおよびカニクイザルから血漿に適用できる。血漿中ヒトレプチンレベルを、表６に示す。
【０１９６】
【表６】
2017500865.tif 000023
【０１９７】
薬物動態学的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）分析は、食物摂取の抑制について１．４ｎｇ／ｍＬ（８５ｐＭ）のレプチンＥＣ５０を確立した。
【実施例２】
【０１９８】
改変された合成レプチンｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ形成
この実施例の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって生成し、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）精製によって精製し、その後Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ  ＵＳＡ）からの市販キットを用いてキャップを形成した。
【０１９９】
材料および試薬は、表７に示す。
【０２００】
【表７】
2017500865.tif 000024
【０２０１】
表８に掲載したように転写反応を組み立て、無ＲＮアーゼチューブ、チップおよび操作の使用に注意を払った。
【０２０２】
【表８】
2017500865.tif 000025
【０２０３】
改変された合成レプチンｍＲＮＡを作製するためのこの実施例での手順は、以下の通りである：
１．温度を監視しながら、３０℃で２時間超材料をインキュベートする。０．０４Ｕ／μＬのＤＮアーゼを加えることによってＤＮＡ鋳型を消化し、次に３７℃で３０分の間インキュベートする。
２．２．８１Ｍの最終濃度までＬｉＣｌを加え、よく混合し、−２０℃で１時間超インキュベートする。およそ２０，０００×ｇ（最高速度）の最高速度で、混合物を４℃で１５分の間遠心分離する。上清を除去し、１ｍＬの７０％エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように１０分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び１分未満上記の通り遠心分離する。
３．残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。
ペレットの溶解を観察し、ペレットの溶解を助けるためにピペットで吸引排出を繰り返し、３７℃でインキュベートする。濃度を測定し、約１μｇ／μＬに調整する。
４．１０％容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５を加え、よく混合する。１容量の室温イソプロパノールを加え、よく混合する。−２０℃で終夜インキュベートする。およそ２０，０００×ｇ（最高速度）の最高速度で、混合物を４℃で１５分の間遠心分離する。上清を除去し、１ｍＬの７０％エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように１０分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び１分未満上記の通り遠心分離する。
５．残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。ペレットの溶解を注意深く観察し、ペレットが溶解するのを助けるためにピペットによる吸引排出を繰り返し、３７℃でインキュベートする。濃度を測定し、約４μｇ／μＬに調整する。
【０２０４】
改変された合成レプチンｍＲＮＡは、その後キャップ形成まで−８０℃で保存することができ、解凍後に濃度を再び測定する。
【０２０５】
キャップ形成については、用いた手順は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓのそれであった。合成レプチンｍＲＮＡおよび水の混合液を６５℃で１０分の間熱変性させ、次に冷たいブロックに移して５分の間クエンチする。使用直前にＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（３２ｍＭ）の保存溶液を水で４ｍＭに１：８に希釈し、次に残りの反応成分を表９に指定の順序で加える。
【０２０６】
【表９】
2017500865.tif 000026
【０２０７】
次に、混合液を３７℃で１時間インキュベートする。試料を上記の通りＬｉＣｌ沈殿によって精製し、次に−８０℃で保存する。
【実施例３】
【０２０８】
改変された合成レプチンｍＲＮＡのＦＰＬＣ精製
本発明の改変された合成ｍＲＮＡは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム（Ｓｅｍｉ−Ｐｒｅｐ  ＲＮＡＳｅｐ２１×１００ｍｍカラム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ．カタログ番号ＲＰＣ−９９−２１１０））で精製した。カラムは、温度を５０℃に設定したカラムヒーター（Ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（カタログ番号ＴＬ−１０５））に入れ、５カラム容量の６２％のウェーブ最適化緩衝液Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０）（ＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃＩｎｃ．カタログ番号５５３４０１）および３８％のウェーブ最適化緩衝液Ｂ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、２５％アセトニトリル）（ＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃＩｎｃ．カタログ番号５５３４０２）によって前平衡化させた。１カラム容量は、３５ｍＬに等しい。
【０２０９】
各改変された合成ｍＲＮＡ溶液の１．５ｍＬを、２ｍＬの試料ループに注入した。次に、表１０に記載した勾配に従ってＦＰＬＣ操作を開始した。流量は、５ｍＬ／分にセットした。
【０２１０】
【表１０】
2017500865.tif 000027
【０２１１】
画分をプールし、イソプロパノールおよび酢酸ナトリウム沈殿によって改変された合成ｍＲＮＡを単離した。第１のｍＲＮＡピークに関連する画分（注入後約２３分に溶出する）をプールした。
【０２１２】
４７５０ｒｐｍで１５分の間、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルターユニット、３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）で試料を２２℃で濃縮し、濃縮液を水で希釈することによって緩衝液を水に交換し、混合液を遠心機に２回通した。
【０２１３】
濃縮したｍＲＮＡ試料をエッペンドルフチューブに移し、ｍＲＮＡを１／１０容量３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５（Ａｍｂｉｏｎ＃ＡＭ９７４０）および２×容量２−プロポノールおよび１／１００容量ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ９５１５）で沈殿させ、終夜−２０℃に保った。
【０２１４】
混合液を４℃で１５分の間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを１ｍＬの７０％冷エタノール（Ｓｉｇｍａカタログ番号４５９８４４）で洗浄した。混合液を３分の間遠心分離し、上清を除去した。
【０２１５】
ペレットを無ヌクレアーゼ水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１０９７７−０１５）に再懸濁させた。３７℃でおよそ５〜１０分間のピペット操作およびインキュベーションで、ペレットが溶解するのを助けた。濃度を測定し、約１．５ｍｇ／ｍＬに調整した。その後、キャップ形成までｍＲＮＡを−８０℃で保存し、解凍後に濃度を再び測定した。
【実施例４】
【０２１６】
ＨＰＬＣによるｍＲＮＡ精製
本発明の改変された合成ｍＲＮＡは、高速液体クロマトグラフィーで精製した。ＳＩＬ−１０ＡＰオートサンプラー、ＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフ、ＳＰＤ−２０Ａ  ＵＶ／可視光検出器およびＦＲＣ−１０Ａ画分コレクターへの分離を同期させるために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＣＬ−１０Ａ  ＶＰシステムコントローラを用いた。ｈＬｅｐｔｉｎ  ｍＲＮＡのクロマトグラフ分離のために、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）３０×１００ｍｍ  ５μ  １００Å反転相ＨＰＬＣカラムを用いた。カラムを、Ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＴ１０５デュアルカラムおよび移動相加熱ユニットに入れた。試薬は、表１１に掲載する。
【０２１７】
【表１１】
2017500865.tif 000028
【０２１８】
０．１Ｍ  ＴＥＡＡおよび４．５％アセトニトリル中の４ｍｇ／ｍＬの濃度の１００ｍｇのｍＲＮＡを、５ｍｌループを用いて６〜８回の注入によってカラムに詰めた。移動相Ａは水に０．１ＭのＴＥＡＡであり、移動相Ｂは９０：１０のアセトニトリル：水に０．１ＭのＴＥＡＡであった。流量は完全勾配のために１０ｍｌ／分の一定に保ち、ＨＰＬＣカラムおよび移動相は常に６５℃に維持した。ＨＰＬＣ操作のための時間プログラムを、表１２に示す。２６０ｎｍ波長の読取が２０ｍＶに到達したならば、ヒトレプチンｍＲＮＡを１２ｍｌ画分に収集した。ＨＰＬＣピークのテールエンドが２０ｍＶ未満になるまで、試料収集を続けた。
【０２１９】
【表１２】
2017500865.tif 000029
【０２２０】
下流の任意の試験および適用の前に、ＨＰＬＣ画分を水に緩衝液交換した。緩衝液交換は、３つのＰｅｌｌｉｃｏｎ３  ８８ｃｍ２カセットを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｇｅｎｔ  μＳｃａｌｅ  ＴＦＦで実施した。個々のＬＣ画分または合同画分をユニットの試料チャンバーに注ぎ、少なくとも１００×交換して発熱物質およびＲＮアーゼを含まない水にした。ヒトレプチンｍＲＮＡの最終濃度が確実に少なくとも１ｍｇ／ｍＬであるように、水中の試料の最終容量を最適化した。キャップ形成まで水中のヒトレプチンｍＲＮＡ試料を−８０℃で保存し、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために必要なときには解凍後に濃度を再び測定した。
【実施例５】
【０２２１】
送達ビヒクルへの改変された合成レプチンｍＲＮＡのパッケージング
この実施例で用いた材料は、以下の通りだった：
【０２２２】
【表１３】
2017500865.tif 000030
【０２２３】
カチオン性脂質アミン基対ｍＲＮＡリン酸基（Ｎ：Ｐ）モル比が４：１で本発明の改変された合成ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子にパッケージし、透析し、濃縮した。一例として、＞０．４ｍｇ／ｍＬｍＲＮＡの濃度の約２ｍｇのパッケージされた改変された合成ｍＲＮＡをもたらしたプロトコールについて、量を示す。
【０２２４】
無ＲＮアーゼ試薬、チューブ、チップおよび操作を用いて、表１４に記載の通り脂質ナノ粒子混合物試薬を計量し、バイアル中に混合した。
【０２２５】
【表１４】
2017500865.tif 000031
【０２２６】
処理の容易さのために、必要量の１．１×比に相当するエタノール（８．８ｍＬ）を脂質に加えた。混合液を短時間超音波処理して、３７℃で５分の間静かに撹拌した。その後、使用の準備ができるまで、混合液をかき混ぜずに３７℃でインキュベートした。
【０２２７】
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離装置にｍＲＮＡ溶液を詰め、４℃で４，０００ｒｐｍで１５分の間遠心分離することによって、改変された合成ｍＲＮＡを水からｐＨ６．０緩衝液に交換した。濃縮したｍＲＮＡをｐＨ６．０クエン酸緩衝液に再懸濁し、ｍＲＮＡ濃度を測定した。
【０２２８】
ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液に０．５ｍｇ／ｍＬの最終改変合成ｍＲＮＡ濃度を水洗シンチレーションバイアルに調製し（８ｍＬに４ｍｇのｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ溶液の最終濃度を測定した。使用の準備ができるまで、ｍＲＮＡ希釈溶液を３７℃でインキュベートした。
【０２２９】
以下の各８ｍＬで、３つの１０ｍｌシリンジを調製した：（ａ）脂質混合物；（ｂ）ｍＲＮＡ溶液；（ｃ）クエン酸緩衝液。シリンジ（ａ）および（ｂ）は、Ｔ字型接合部のＬｅｕｒフィッティングに取り付けた。簡潔には、０．５ｍｍ内径のＰ７２７  Ｔ−混合機が、Ｐ６５２アダプタ（ＩＤＥＸ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ  ＷＡ  ＵＳＡ）に取り付けられた。シリンジ（ａ）および（ｂ）は、Ｐ６５８  Ｌｕｅｒフィッティング（ＩＤＥＸ）に取り付けた。シリンジ（ａ）および（ｂ）は、ＰＴＦＥ０．８ｍｍ内径チュービング（＃３２０００６８、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ、Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ）によって、Ｐ９３８ｘナットおよびフェルール（ＩＤＥＸ）でＴ−混合機に接続した。シリンジ（Ｃ）は、Ｐ９３８ｘナットおよびフェルールによって最終単一チュービングに接続されたＬｕｅｒフィッティングに取り付けた。チュービングの末端は、撹拌棒入りの前水洗ビーカーの上に一緒に固定し、静かに撹拌した。
【０２３０】
シリンジポンプ設定は、適当なシリンジ製造業者およびサイズにセットし、容量（８ｍＬ）および１．０ｍＬ／分の流量を入れた。ポンプを開始し、生じた材料は撹拌棒入りの無ＲＮアーゼ５０ｍＬプラスチックビーカーに収集した。ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の懸濁液を、１バッグにつき２〜３ｍＬで透析チュービングに移し、４℃で終夜、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に透析した。
【０２３１】
分割した材料を、１つの１５ｍＬ円錐形チューブにプールした。接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）懸濁液を濃縮した。新鮮な５００Ｋの分子量カットオフカプセルをＭｉｎｉｍａｔｅシステムに接続するために新鮮なチュービングを用いて、１５０ｒｐｍの流速で５００ｍＬの無ＲＮＡ水で水洗することによってＴＦＦシステムを準備した。
【０２３２】
脂質ナノ粒子／改変された合成ｍＲＮＡ懸濁液をＴＦＦユニットレザバーに詰め、７５ｍＬ／分の流量で２〜３ｍｌの最終容量に濃縮した。
【０２３３】
改変された合成ｍＲＮＡの封入パーセントは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ  ＵＳＡ）からのＱｕａｎｔ−ｉＴ  Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイキットを用いて判定した。脂質ナノ粒子／改変された合成ｍＲＮＡ懸濁液は、緩衝液（粒子外のｍＲＮＡ）および緩衝液プラス洗浄剤（全ｍＲＮＡ）での蛍光測定によって分析した。提供されたリボソームＲＮＡからの１０００ｎｇ／ｍＬ保存液を調製し、保存液は表１５に示すＴＥおよびＴＥ＋０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の比に従ってＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのための標準曲線を作成するために用いた。アッセイのために、ＴＥ緩衝液またはＴＥプラスＴｒｉｔｏｎで試料を調製し、蛍光試薬を各々に加える。計算される差は、粒子中のｍＲＮＡである。
【０２３４】
【表１５】
2017500865.tif 000032
【０２３５】
読取りが標準曲線内（４００〜６００倍）にあるように、試料はＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で適当な希釈で調製した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの標準／試料を加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬をＴＥ緩衝液で１：２００に希釈し、１００μＬを各ウェルに加えた。
【０２３６】
試料蛍光は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、４８０ｎｍの励起、５２０ｎｍの放射で測定した。蛍光対ＲＮＡ濃度の標準曲線を作成するために、各ＲＮＡ試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を差し引いた。各試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を差し引き、標準曲線からの試料のＲＮＡ濃度を判定した。試料の封入パーセントは、試料プラスＴｒｉｔｏｎと試料だけの間の濃度の差を、試料プラスＴｒｉｔｏｎの濃度によって割り算することによって判定した。脂質ナノ粒子／改変された合成懸濁液の６倍希釈溶液を作製し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて直径および多分散指数を判定した。
【実施例６】
【０２３７】
カチオン性リピドＡにパッケージしたレプチンｍＲＮＡ；ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの静脈内および皮下送達に続いて、レプチンタンパク質発現を誘導した。レプチンタンパク質の発現（実施例１に記載されるＥＬＩＳＡによって測定された）は、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスでｉｎ  ｖｉｖｏ効能につながった。
【０２３８】
マウスへのカチオン性リピドＡ中の改変された合成ｍＲＮＡの投与のために用いた材料は、表１６に詳述する。
【０２３９】
【表１６】
2017500865.tif 000033
【実施例７】
【０２４０】
改変された合成レプチンｍＲＮＡのマウス静脈内尾静脈注射
尾静脈注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを加熱灯から約１２インチ離し、加熱灯の下でそれらを約２分の間暖めることによって、マウスを準備した。
【０２４１】
尾静脈注射手順については、マウスを拘束装置に置き、それらの尾を７０％アルコールで洗浄した。ベベルすり合せにより１ｍｌシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３０９６５９）に接続した２７ゲージの針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３０５１０９）を尾静脈に挿入し、血液が確実にシリンジに抜かれるようにシリンジプランジャーを後方に引いた。改変された合成レプチンｍＲＮＡの所望の容量を中程度の圧および速度により、手で注射した。次に針を抜き取り、注射部位をガーゼで圧迫することによって止血した。
【０２４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、独居房の８〜９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＦＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）をカチオン性リピドＡにパッケージし（Ｎ：Ｐモル比＝８：１）、次に、平均群体重につき１０μｇの用量で注射用食塩水に希釈した。
【０２４３】
０日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。マウスに投薬し、食物摂取（ＦＩ）を１〜７日目の各日と９、１１および１６日目に記録した。
【０２４４】
実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドＡ中のレプチンｍＲＮＡの静脈内投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表１７および図５に詳述する。
【０２４５】
【表１７】
2017500865.tif 000034
【０２４６】
この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンｍＲＮＡの静脈内送達は、１９ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンレベルをもたらし、そのレベルは、実施例１で判定されたように、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取の抑制のための１．４ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０の１０倍以上高い。
【実施例８】
【０２４７】
改変された合成レプチンｍＲＮＡのマウス皮下注射
皮下注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを手動で拘束し、作業台に置いた。それらの襟首をつまんで下の筋肉から持ち上げ、その空間に１ｍＬシリンジと接続した２５ゲージ針を挿入した。流体が決してシリンジ内に引き抜かれないようにシリンジプランジャーを後方に引き、次にレプチンｍＲＮＡの所望の容量を中程度の圧および速度により手で注射した。針を次に抜き取り、マウスはそれらのケージに戻した。
【０２４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、８〜９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。カチオン性リピドＡにパッケージした、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている（Ｎ：Ｐモル比＝８：１）、ＦＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、平均群体重につき１０μｇの用量で注射用食塩水に希釈した。
【０２４９】
０日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。午前９時にマウスに投薬し、０日目の午前９時に血液をとった。１日目および２日目にも午前９時にそれぞれ血液をとり、レプチンタンパク質レベルについて評価した。体重および食物摂取も記録した。
【０２５０】
実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドＡ中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表１８および図５に詳述する。
【０２５１】
【表１８】
2017500865.tif 000035
【０２５２】
この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンｍＲＮＡの皮下送達は、１．４ｎｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質レベルをもたらし、これは、実施例１で判定されたように、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取の抑制のためのＥＣ５０に同等である。
【実施例９】
【０２５３】
カチオン性リピドＡでパッケージされ、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの特異的効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているＦＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与によって送達され、レプチンｍＲＮＡはカチオン性リピドＡにパッケージされて静脈内投与された。
【０２５４】
用いたマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの９週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、ＨＰＬＣ精製され、カチオン性リピドＡにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）または対照の改変された合成マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡ（配列番号１２）を与えた。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２５５】
３匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。３匹のマウスに、改変された合成マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。
【０２５６】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４、５、６、７および８日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０２５７】
図２Ａおよび図２Ｂは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
【実施例１０】
【０２５８】
カチオン性リピドＡでパッケージされ、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているＦＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、ｍＲＮＡはカチオン性リピドＡにパッケージされて静脈内投与された。
【０２５９】
用いたマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの９週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、ＨＰＬＣ精製され、カチオン性リピドＡにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）または対照の改変された合成マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡ（配列番号１２）を与えた。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２６０】
３匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。３匹のマウスに、改変された合成マウスエリスロポイエチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。
【０２６１】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０２６２】
０日目の午後３時００分（投薬後６時間）に、次に１、２および４日目の午前９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、ヒトレプチンまたはマウスエリスロポイエチンレベルを測定した。
【０２６３】
図２Ｃは、実施例１のプロトコールによって測定された、この試験の血漿中ヒトレプチンレベルの結果を表す。図２Ｃの裏づけとなる研究については、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡを投与された（６時間後に５４，５８２ｐｇ／ｍＬ）マウスでｍＥＰＯタンパク質の発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達を確認した。
【実施例１１】
【０２６４】
カチオン性リピドＢにパッケージされてレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与によって送達され、レプチンｍＲＮＡはカチオン性リピドＢにパッケージされて静脈内投与された。
【０２６５】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１２週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらは、ＨＰＬＣ精製され、カチオン性リピドＢにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与された。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２６６】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。
【０２６７】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４、５、６および７日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０２６８】
図３Ａおよび図３Ｂは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
【実施例１２】
【０２６９】
カチオン性リピドＢでパッケージされてレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、レプチンｍＲＮＡはカチオン性リピドＢにパッケージされて静脈内投与された。
【０２７０】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１６週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらは、ＨＰＬＣ精製され、カチオン性リピドＢにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与された。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２７１】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。
【０２７２】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０２７３】
０日目の午後３時００分（投薬後６時間）に、次に１、２、３、４、５、６および７日目の午前９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。
【０２７４】
図３Ｃは、この試験の血漿中ヒトレプチンタンパク質の結果を表す。
【実施例１３】
【０２７５】
カチオン性リピドＣでパッケージされてレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の効果を実証することであった。ヒトレプチンは、カチオン性リピドＣにパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与によって送達された。
【０２７６】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらは、ＨＰＬＣ精製され、カチオン性リピドＣにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与された。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２７７】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。５匹の動物に、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。
【０２７８】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４、５、６および７日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０２７９】
図４Ａおよび図４Ｂは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
【実施例１４】
【０２８０】
カチオン性リピドＣでパッケージされてレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたレプチンｍＲＮＡの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）が、カチオン性リピドＣにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに静脈内投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
【０２８１】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらは、ＨＰＬＣ精製され、４：１のＮ：Ｐモル比でカチオン性リピドＣにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与された。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２８２】
３匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。３匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。
【０２８３】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０２８４】
０日目の午後３時００分（投薬後６時間）に、次に１、２、３、４、５、６および７日目の午前９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。
【０２８５】
図４Ｃは、この試験の血漿中ヒトレプチンタンパク質の結果を表す。
【実施例１５】
【０２８６】
カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣでパッケージされてレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたマウスエリスロポイエチンｍＲＮＡの薬物動態
この実施例の目的は、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣでパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたマウスエリスロポイエチンｍＲＮＡ（配列番号１２）の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取への効果がないことを実証することであった。
【０２８７】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの８週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらは、ＨＰＬＣ精製され、４：１のＮ：Ｐモル比でカチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、改変された合成マウスエリスロポイエチン（ｍＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号１２）を投与された。マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０２８８】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＢ中の改変された合成ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡを０．０２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＣ中の改変された合成ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。
【０２８９】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４および７日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０２９０】
図３Ｄおよび図４Ｄは、この試験の結果を表す。図３Ｄの裏づけとなる研究については、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡを投与された（６時間後に８９２，６３３ｐｇ／ｍＬ）マウスでｍＥＰＯタンパク質の発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達を確認した。図４Ｄの裏づけとなる研究については、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡを投与された（６時間後に１５８，８６５ｐｇ／ｍＬ）マウスでｍＥＰＯタンパク質の発現が高く、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達を確認した。
【実施例１６】
【０２９１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるカチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡの毒性および耐容性試験
この実施例は、カチオン性リピドＣでパッケージされて静脈内（４ｍｐｋ）および皮下（２ｍｐｋ）投与された、ＨＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）がどのようにマウスで一般に安全だったかを記載する。
【０２９２】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（３匹の動物／群）は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を皮下もしくは静脈内のいずれかで投与されて対照の役目をしたか、または、カチオン性脂質としてカチオン性リピドＣで脂質ナノ粒子に製剤化された改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投薬された。表１９は、試験計画を概説する。表２０は、製剤特性を概説する。試験の静脈内アームのマウスは、およそ１０ｍＬ／ｋｇの投薬量を投与した。皮下に投薬したマウスは、投薬前に剃った。試験の終了時（投薬のおよそ２４および７２時間後）、適当な試験セグメントに割り当てられた全てのマウスを検死にかけ、それらの最終体重を記録し、臨床化学のために血液試料を収集した。
【０２９３】
【表１９】
2017500865.tif 000036
【０２９４】
【表２０】
2017500865.tif 000037
【０２９５】
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Ｃｏｂａｓ（登録商標）６０００アナライザー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、以下のパラメータを判定した：アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；総ビリルビン；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）；総タンパク；アルカリ性ホスファターゼ；アルブミン；尿素；グロブリン；クレアチニン；クレアチンキナーゼ（ＣＫ）；グルコース；アルブミン／グロブリン比。
【０２９６】
臨床化学的変化が投薬の７２時間後に起こり、それを表２１に概説する。
【０２９７】
【表２１】
2017500865.tif 000038
【０２９８】
カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を静脈内に投薬されたマウスは、対応する顕微鏡的変化なしでタンパク価が減少した。さらに、静脈内投薬されたマウスにおけるＢＵＮの低下は、減少した食物摂取を示唆した。
【０２９９】
これらの変化は、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の皮下投与による最小限の炎症を反映していた（アルブミンの減少、グロブリンの増加およびアルブミングロブリン比の低下を伴う総タンパクの減少）。これらの変化は、顕微鏡的好中球性脾臓浸潤物および皮膚の血清細胞性痂皮に対応した。
【０３００】
検死時に、脾臓、肝臓および腎臓重を記録し、全ての動物からのこれらの組織を肺と一緒に１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、通常通り処理して顕微鏡評価に適する染色組織切片を生成した。
【０３０１】
改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の器官重量の変化は検出されなかった。改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の肉眼的変化は観察されなかった。カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を皮下に投薬されたマウスの中で、試験品関連の皮膚変化は投薬から７２時間後に１匹の動物だけに明らかに存在した（皮下および皮膚の炎症性細胞浸潤）。脾臓での顕微鏡観察（増加した赤色脾髄の細胞性または好中球性浸潤物または両方）は、任意の皮膚刺激に反応性および二次性であると考えられた。
【０３０２】
カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）で静脈内投薬されたマウスは、肝臓での異常な血管内細胞、赤脾髄での細胞性の増加、ならびに肺脈管障害および血栓症を呈した（１／３の動物）。
【０３０３】
カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を静脈内に投薬された１匹のマウスは、投薬から７２時間後に肺脈管障害を呈した。
【実施例１７】
【０３０４】
カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ；ｉｎ  ｖｉｖｏ予備的前臨床安全性試験
この実施例の目的は、カチオン性リピドＣにパッケージされ、マウスに製剤の静脈内（ＩＶ）注射によって送達された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の投与からのタンパク質の発現を判定することであった。ＥＬＩＳＡアッセイによって測定された通り、改変された合成レプチンｍＲＮＡの送達は、レプチンタンパク質の発現を誘導した。毒性および耐容性も分析した。
【０３０５】
マウスは、上で実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０３０６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を、独居房の８〜９週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスで実施した。それらに、カチオン性リピドＣにパッケージされ、この実施例のために４ｍｐｋの用量で注射用食塩水に希釈された、ＨＰＬＣで精製された改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）を投与した。食塩水対照を用いた。
【０３０７】
３匹のマウスは、食塩水対照を投与した。３匹のマウスの１つの群は、カチオン性リピドＣにパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、４ｍｐｋの用量で各々投与する。０日目に、マウスを計量し、それらの体重によって群に選別し、それらのグループ分けに基づいて次に投薬した。食物重量を記録した。
【０３０８】
１日目に（投薬の２４時間後）、全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。
【０３０９】
心臓穿刺により血液を収集する：ＡＬＴ／ＡＳＴ／ＡＬＰ／ビリルビン（総および活性）のための血清（１５０〜２５０μｌ）；ＥＬＩＳＡのための血漿（１５μｌ）。
【０３１０】
肝臓、脾臓および腎臓を収集した。全組織重量を記録した。
【０３１１】
試験でレプチンタンパク質の用量比例曝露が観察された。カチオン性リピドＣにパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、ｏｂ／ｏｂマウスでの０．２ｍｐｋ用量より２０倍高い４ｍｐｋの用量で、痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスに投薬した。循環中の１８５ｎｇ／ｍＬのレプチンタンパク質レベルが観察された。
【実施例１８】
【０３１２】
カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ；反復用量によるｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態および効能試験
カチオン性リピドＣにパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡのタンパク質発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ効能を判定するために、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）をマウスに送達するために、実施例７のプロトコールによる反復静脈内（ＩＶ）注射を用いた。改変された合成レプチンｍＲＮＡの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ｏｂ／ｏｂマウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ効能が続いた。
【０３１３】
マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０３１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を、独居房の１２週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドＣでパッケージされ、この試験のために０．２ｍｐｋの用量で注射用食塩水に希釈された、ＨＰＬＣで精製された改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与した。食塩水対照を用いた。
【０３１５】
薬物動態。５匹のマウスの１つの群に食塩水対照を投与し、５匹のマウスの１つの群には、カチオン性リピドＣでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を０．２ｍｐｋ（１０μｇ）の用量で投与した。反復血液試料採取の行為自体のストレスがマウスの体重減少を引き起こすので、レプチンタンパク質発現の動態を測定するためのおよびレプチンｍＲＮＡの効能を測定するための別々の群のマウスが必要である。群あたりの平均体重が同じであるように、５日間の各日にマウスを計量し、選別した。食物を、同様に計量した。
【０３１６】
０日目に、午前９時（午前）にマウスに投薬し、午後３時（午後）にレプチン分析のために尾ニックによって放血させた（１５μｌの血漿）。３、７、１０、１４、１４および１７日目に、午前９時にマウスに投薬した。１、２、４、８、１１、１５および１８日目に、午前９時にマウスを計量し、レプチン分析のために尾ニックによって放血させた（１５μｌの血漿）。実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従って、血漿中のヒトレプチンタンパク質レベルを測定する。この実施例で測定されたレプチンタンパク質レベルは、表２２にある。第１の投薬の後のレプチンタンパク質レベルを６、２４および４８時間の時点に分析し、以降のタンパク質レベルは最後の投薬から２４時間後であった。
【０３１７】
【表２２】
2017500865.tif 000039
【０３１８】
薬力学。６匹の動物に、食塩水対照を投与した。６匹のマウスの１つの群の各々に、カチオン性リピドＣでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を０．２ｍｐｋ（１０μｇ）の用量で投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、動物を計量し、選別した。
【０３１９】
１日目に、午前９時（午前）にマウスに投薬した。１、２、４、８、９、１１〜１３、１５、１６、１８〜２０、２２および２３日目に、体重および食物摂取だけを記録した。３、７、１０、１４、１７および２１日目に、体重および食物摂取を朝一番に記録し、午前９時にマウスに投薬した。
【０３２０】
カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの反復処置は、持続した体重減少およびレプチンタンパク質発現をもたらした。カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、３週間にわたって１週あたり２回投薬し（矢印によって表される合計６回の投薬）、各投薬の後、表２３に詳述される通り、体重減少およびレプチンタンパク質レベルの維持が観察された。
【０３２１】
【表２３】
2017500865.tif 000040
【実施例１９】
【０３２２】
カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ；ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性試験
カチオン性リピドＣにパッケージされた（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の安定性を判定するために、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを様々な時点でマウスに送達するために、静脈内（ＩＶ）注射を用いた。レプチンｍＲＮＡの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、発現レベルを全ての時点で比較した。
【０３２３】
マウスは、実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０３２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、独居房の１０週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドＣにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、この試験のために０．４ｍｐｋの用量で注射用食塩水に希釈された、ＨＰＬＣで精製された改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与する。食塩水対照を用いた。
【０３２５】
４匹のマウスに、食塩水対照を投与した。４匹のマウスの１つの群に、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、０．４ｍｐｋ（１０μｇ）の用量で各々投与した。
【０３２６】
群あたりの平均体重が同じであるように、１日目と１、２、４および８週目に動物を計量し、選別した。午前９時にマウスに投薬し、次に計量し、レプチンレベルのために２４時間時に放血させた（３つのアリコート）。
【０３２７】
静脈内送達の後に、実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールによってレプチンタンパク質発現を測定することによって、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の安定性を判定する。初期製剤日から１、７、１４、２８および５６日後に、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを用いてマウスに投薬し、各投薬の２４時間後にレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを調製してから５６日後に、投与後のレプチンタンパク質レベルは約６０％低下した。
【実施例２０】
【０３２８】
カニクイザルにおけるカチオン性リピドＣでパッケージされたレプチンｍＲＮＡの薬物動態および薬力学
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドＣでパックされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の、０．６ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）を検討することであった。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
【０３２９】
表２４は、この実施例のための試験計画を概説する。表２５は、製剤特性を概説する。表２６で概説される通りに、血液試料を収集した。伏在静脈または大腿静脈で血液試料を収集してシリンジに入れた。血液化学のために全血を分析した。血清化学のために血清を収集し、レプチンＥＬＩＳＡおよびリピド代謝のために血漿を収集した。
【０３３０】
３匹のサルに、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、０．６ｍｐｋの用量で静脈内に投薬した。１２９ｎｇ／ｍＬのピークのレプチン発現が、医薬品処置の４時間後に観察された。これにより、げっ歯動物からカニクイザルへのレプチン発現の翻訳が確認された。
【０３３１】
実施例の条件下で、カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、雄カニクイザルに０．６ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカインＩＬ−１ＲＡの増加もあった。これらの変化の全ては初期の時点で最も目立ち、２４時間（サイトカインの場合）または７２時間（臨床病理）後までにはほとんど正常だった。
【０３３２】
下記のように、カチオン性リピドＣでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の０．６ｍｇ／ｋｇでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示し、肝臓および筋肉の傷害を示唆する炎症性変化、大部分は最小限の変化をもたらした。
【０３３３】
【表２４】
2017500865.tif 000041
【０３３４】
【表２５】
2017500865.tif 000042
【０３３５】
【表２６】
2017500865.tif 000043
【０３３６】
血液学のための血液試料は、ＥＤＴＡ抗凝固剤の中に収集した。ＡＤＶＩＡ２１２０（登録商標）アナライザーを用いて以下のパラメータを判定した：赤血球数、白血球数、ヘモグロビン、好中球数、ヘマトクリット、リンパ球数、平均血球体積、単球数、平均赤血球ヘモグロビン量、好酸球数、平均赤血球ヘモグロビン濃度、好塩基球数、網状赤血球数、大きな未染色細胞数および血小板数。
【０３３７】
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Ｃｏｂａｓ６０００アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した：アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；総ビリルビン；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）；総タンパク；アルカリ性ホスファターゼ；アルブミン；尿素；グロブリン；クレアチニン；クレアチンキナーゼ（ＣＫ）；グルコース；アルブミン／グロブリン比；ナトリウム；リン；カリウム；コレステロール；塩化物；トリグリセリド；カルシウム；およびマグネシウム。
【０３３８】
表２７に掲載した分析物の判定のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ２８−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ（キットカタログ番号：ＬＰＣ０００３Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いた。定量下限未満の値は、１：２の希釈比に基づいて定量下限（ＬＬＯＱ）としてデータ表に入れた。一部の場合には、その計算のために異なる希釈が用いられたので、ＬＬＯＱは異なった。Ｂｉｏｐｌｅｘ  ２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を分析のために用い（ソフトウェアバージョン：Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）５．０セキュリティ版、ビルド５３１）、データ処理を促進するためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１０が用いられ、生データに含まれた。
【０３３９】
【表２７】
2017500865.tif 000044
【０３４０】
結果。有意な血液学的変化は起こらなかった。表２８で、臨床化学的変化を概説する。カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの０．６ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与は、両時点で臨床化学的変化を引き起こし、投薬から２４時間後の最小限の肝細胞変化（ＡＳＴ、ＡＬＴの増加、アルブミンの低下）および潜在的な筋肉変化（ＡＳＴおよびＣＫの増加）を反映していた。アルブミンの減少（下で詳述する炎症誘発性サイトカインの増加に加えて）によって、かすかな炎症性変化が示された。主に投薬後２４時間のトリグリセリドの減少は、脂質代謝への影響、食物摂取の減少を反映していたかもしれず、または生物学的変動によるかもしれない。
【０３４１】
【表２８】
2017500865.tif 000045
【０３４２】
投薬前の値と比較したときに、カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡによる０．６ｍｇ／ｋｇ  ｉｖの用量での投薬の後に、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子濃度の上昇が記された。分析物の投薬前の値が定量下限（ＬＬＯＱ）未満であったならば、ＬＬＯＱを用いて変化倍率を計算した。血清中分析物レベルがＵＬＯＱより上にあったとき、定量上限（ＵＬＯＱ）を用いて増加倍率を計算した（動物＃３の６時間後のＭＣＰ−１）。
【０３４３】
投薬後２時間という早い時期に全３匹の動物で試験品関連の変化のいくつかが記され、これらの変化のほとんどは投薬後２４時間までに投薬前レベルに復帰した。１匹の動物だけで上昇した少数の分析物もあった。これらの後者の変化と処置との関係は除外することができないが、その理由は、それらが投薬前の値を上回っていたからであり、および他のサイトカインが同じサルで増加していたからである。
【０３４４】
両端を含めて投薬の２時間後から投薬の６時間後まで、血清ＩＬ１ＲＡレベルの上昇は全３匹のサルで起こり、投薬の２４時間後までにレベルは正常に戻った；最大上昇量は、少なくとも１時点の１匹の動物でおよそ１２倍であった。同時並行的に、血清中のＩＬ６レベルは投薬の２時間後から投薬の６時間後まで全ての動物で上昇し（少なくとも１時点の１匹のサルで１００倍以上）、２４時間後までに投薬前の値に回帰した。血清中のＭＣＰ−１レベルは、投薬の６時間後の最高１００倍以上の上昇を含めて投薬の２時間後に上昇し、投薬の２４時間後におよそ２倍の上昇であったが、投薬の７２時間後に投薬前の値に回帰した。Ｉ−ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１ケモカイン）の血清中レベルは、投薬の４時間後に全３匹の動物で上昇し、６時間後には上昇したままであった（１匹の動物で最高７８倍）。２４時間後までに、Ｉ−ＴＡＣレベルは最高８倍上昇し、投薬の７２時間後までに投薬前レベルに回帰した。さらに、動物＃２以外の動物＃１および＃３で、血清中ＶＥＧＦレベルのおよそ３倍の上昇が起こった。これらの上昇は、投薬の２、４または６時間後に見られた。表２９では、最も一貫した上昇を示した４つの分析物の経時変化を概説する。
【０３４５】
【表２９】
2017500865.tif 000046
【０３４６】
表２９は、投薬前の値と比較したカチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変合成レプチンｍＲＮＡの雄カニクイザルへの投与と関連した血清中サイトカインおよびケモカインレベルで顕著な変化が観察されたことを示す。
【０３４７】
実施例の条件下で、雄カニクイザルに０．６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与された、カチオン性リピドＣ構築物でパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、ＩＬー１ＲＡの増加もあった。これらの変化の全ては初期の時点で最も目立ち、２４時間（サイトカインの場合）または７２時間（臨床病理）後までにはほとんど正常だった。
【０３４８】
レプチンは、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの増加を通してそれ自体免疫調節効果を有する（末梢血単核細胞でＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＦＮγならびにＩＬ−１ＲＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する。Juge-Aubry CE and Meier CA (2002) Mol. Cell Endocrinol. 194(1-2): 1-7を参照されたい）。
【０３４９】
結論として、カニクイザルへのカチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの静脈内単回投与は、７２時間後に解消した炎症性変化、大部分は肝臓および筋肉の傷害を示唆した最小限の変化をもたらした。この実施例の結果に基づいて、０．６ｍｇ／ｋｇの用量は、カニクイザルで良好な耐容性を示した。
【実施例２１】
【０３５０】
カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ；ｉｎ  ｖｉｖｏ予備的前臨床安全性試験
この実施例のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、独居房の８〜９週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドＢにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、この試験用に７ｍｐｋの用量で注射用食塩水に希釈された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製された改変合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与した。食塩水対照を用いた。
【０３５１】
０日目に、マウスは、実施例７に記載の通りに尾静脈内注射を受けた。
【０３５２】
表３０に詳述されるように、３匹のマウスに食塩水対照を投与し（Ａ群）、３匹のマウスの１つの群に、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを７ｍｐｋの用量で各々投与する（Ｂ群）。Ａ群およびＢ群のマウスは、１日目に屠殺した。３匹のマウスに食塩水対照を投与し（Ｃ群）、３匹のマウスの１つの群に、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを７ｍｐｋの用量で各々投与する（Ｄ群）。Ｃ群およびＤ群のマウスは、３日目に屠殺した。表３１は、製剤特性を概説する。
【０３５３】
【表３０】
2017500865.tif 000047
【０３５４】
【表３１】
2017500865.tif 000048
【０３５５】
０日目に、マウスを計量し、それらの体重によって群に選別し、それらのグループ分けに基づいて次に投薬した。食物重量を記録した。
【０３５６】
１日目に、Ａ群およびＢ群の全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。３日目に、Ｃ群およびＤ群の全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。
【０３５７】
心臓穿刺により血液を収集した：ＡＬＴ／ＡＳＴ／ＡＬＰ／ビリルビン（総および活性）（１５０〜２５０μＬ）のために血清；レプチンタンパク質測定（１５μＬ）およびカチオン性リピド測定（２０μＬ）のために血漿。
【０３５８】
肝臓、脾臓および腎臓を収集する：全組織重量を記録した。
【０３５９】
耐容性試験でレプチンタンパク質の用量比例曝露が観察された。カチオン性リピドＢにパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を、７ｍｐｋの用量で痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスに投薬した。実施例１のＥＬＩＳＡアッセイプロトコールにより測定したときに１３００ｎｇ／ｍＬのレプチンタンパク質レベルが循環中で観察されたが、それはＣ５７ＢＬ／６マウスで０．６ｍｐｋ用量で観察されたレベルより１７倍高い。
【０３６０】
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Ｃｏｂａｓ  ６０００アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した：アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；総ビリルビン；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）；総タンパク；アルカリ性ホスファターゼ；アルブミン；尿素；グロブリン；クレアチニン；クレアチンキナーゼ（ＣＫ）；グルコース；アルブミン／グロブリン比。
【０３６１】
検死時に、脾臓、肝臓および腎臓重を記録し、全ての動物からのこれらの組織を肺と一緒に１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、通常通り処理して顕微鏡評価に適する組織切片にした。
【０３６２】
表３２で、臨床化学的変化を概説する。
【０３６３】
【表３２】
2017500865.tif 000049
【０３６４】
両時点で変化は最小限の炎症を反映した（アルブミンの減少、グロブリンの増加およびアルブミングロブリン比の低下を伴う総タンパクの減少）。これらの変化は、顕微鏡により好中球の脾臓浸潤、肝血管系における異常な血管内細胞、または肺脈管障害および血栓症に対応した。さらに、ＢＵＮの低下は食物摂取の減少を示唆した。
【０３６５】
器官重量を、表３３に示す。改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の増加は投薬のおよそ７２時間後に脾臓重量で発生し、最小限であり（３匹のマウスで正味８％の差）、赤色脾髄および好塩基球の顕微鏡的に増加した細胞性に対応した。
【０３６６】
【表３３】
2017500865.tif 000050
【０３６７】
投薬したマウスにおいて投薬の２４時間後に、改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の脾臓および肝臓の変化が存在したが、投薬の７２時間後には、肝臓および脾臓での変化に加えて肺にも形態学的変化が存在した。投薬の２４時間後の改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の脾臓変化には、白色および赤色脾髄の細胞細片／単細胞壊死、赤色脾髄、好中球浸潤物および好塩基球の細胞性の減少が含まれた。脾臓の好塩基球は、初期の骨髄巨核球に対応した可能性が高い。これらの変化は、臨床病理学で観察された炎症性プロファイルと一致した。
【０３６８】
肝臓では、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡを投薬された動物において異常な血管内細胞が存在し、炎症性応答をさらに示した。
【０３６９】
投薬の７２時間後、異常な血管内細胞が肝臓になお存在した。細胞性細片および赤色脾髄または好塩基球の細胞性の増加（全て骨髄外造血を示す）で特徴付けられる脾臓の変化もあった。
【０３７０】
７２時間後の肺では、中間のおよび小さい径の血管系に脈管障害および血栓が存在した。
【０３７１】
さらに、検査した両時点で、全動物において赤色脾髄は若干膨張し、薄くなった（しかし、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡで処置した動物で余計そうであった）。
【０３７２】
実施例の条件下で、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、２４時間後に炎症性臨床病理学プロファイルと一貫した脾臓変化、細胞性細片／単細胞壊死、好中球浸潤物および好塩基球（初期の骨髄巨核球）ならびに肝臓での異常な血管内細胞をもたらした。これらの変化に加えて、それは、７２時間後までに肺脈管障害ももたらした。
【実施例２２】
【０３７３】
カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ；反復投与によるｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態および効能試験
カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）のタンパク質発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ効能を判定するために、改変された合成レプチンｍＲＮＡをマウスに送達するために反復静脈内（ＩＶ）注射を用いた。レプチンｍＲＮＡの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ｏｂ／ｏｂマウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ効能が続いた。
【０３７４】
マウスは、上の実施例７に記載の通りに尾注射を受けた。
【０３７５】
この実施例のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、独居房の１６週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドＢにパッケージされ、この試験のために０．２ｍｐｋの用量で注射用食塩水に希釈された、ＨＰＬＣで精製された改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）を投与した。食塩水対照を用いた。
【０３７６】
薬物動態。５匹の動物に、食塩水対照を投与した。５匹のマウスの１つの群に、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を０．２ｍｐｋ（１０μｇ）の用量で各々投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、５日間の各日に動物を計量し、選別した。食物を、同様に計量する。
【０３７７】
０日目に、午前９時にマウスに投薬し、午後３時にレプチンのために尾ニックによって放血させた（１５μｌの血漿）。１、２、４、８、１１、１５および１８日目に、午前９時に動物を計量し、レプチンのために尾ニックによって放血させる（１５μｌの血漿）。体重および食物摂取を記録する。３、７、１０、１４および１７日目に、午前９時にマウスに投薬し、体重および食物摂取を記録する。９および２１日目に、体重および食物摂取だけを記録した。
【０３７８】
最初の投与の後に６、２４および４８時間の時点でレプチンタンパク質レベルを測定した。以降の投与の２４時間後に、レプチンタンパク質レベルを測定した。表３４の結果は、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの反復処置は、類似したレベルのレプチンタンパク質発現をもたらすことを実証する。
【０３７９】
【表３４】
2017500865.tif 000051
【０３８０】
薬力学。６匹の動物に、食塩水対照を投与した。６匹のマウスの１つの群に、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を０．２ｍｐｋ（１０μｇ）の用量で各々投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、マウスを計量し、選別した。
【０３８１】
０、３および７日目に、午前９時にマウスに投薬し、体重および食物摂取を記録した。１、２、５、６および８〜２１日目に、体重および食物摂取だけを記録した。
【０３８２】
カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの反復処置は、持続した体重減少およびレプチンタンパク質発現をもたらす。ｏｂ／ｏｂマウスを、１、３および７日目に３回、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）で処置した。各投与の後、マウスは有意な量の体重減少を続けた。
【０３８３】
【表３５】
2017500865.tif 000052
【０３８４】
レプチンタンパク質発現は、２５ｎｇ／ｍＬのままであった。最初の投与の後のレプチンタンパク質レベルは６、２４および４８時間の時点、以降のタンパク質レベルは最後の投与から２４時間後である。
【実施例２３】
【０３８５】
カニクイザルにおけるカチオン性リピドＢでパッケージされたレプチンｍＲＮＡの薬物動態および薬力学
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドＢでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、０．６ｍｇ／ｋｇのＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態および薬力学（ＰＤ）を検討することである。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
【０３８６】
伏在静脈または大腿静脈で血液試料を収集してシリンジに入れた。表３６は、試験計画を概説する。表３７は、製剤特性を概説する。表３８で概説される通りに、血液試料を収集した。表３８に掲載される時点に基づいて、全血、血漿および血清を収集した。全血は、血液化学のために分析した。血清化学のために血清を収集し、レプチンＥＬＩＳＡおよびリピド代謝のために血漿を収集した。３匹のサルに、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡを静脈内に０．６ｍｐｋで投薬した。医薬品処置の６時間後に、９５ｍｇ／ｍＬのピークのレプチンタンパク質発現が観察されたが、レプチンタンパク質レベルは実施例１に記載のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。これにより、げっ歯動物からカニクイザルへのレプチン発現の翻訳が確認された。実施例の条件下で、雄カニクイザルに０．６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与された、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）は、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、ＩＬ−１ＲＡの増加もあった。サイトカイン変化の全ては、投薬の６時間後に最も著しく、２４時間後にほとんど正常であった。臨床病理学変化は投薬の２４時間後に顕著であったが、一部の変化は試験中ずっと持続した。
【０３８７】
下記のように、カチオン性リピドＢでパッケージされた改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の０．６ｍｇ／ｋｇでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示した。
【０３８８】
【表３６】
2017500865.tif 000053
【０３８９】
【表３７】
2017500865.tif 000054
【０３９０】
【表３８】
2017500865.tif 000055
【０３９１】
血液学のための血液試料は、ＥＤＴＡ抗凝固剤の中に収集した。ＡＤＶＩＡ２１２０（登録商標）アナライザーを用いて以下のパラメータを判定した：赤血球数、白血球数、ヘモグロビン、好中球数、ヘマトクリット、リンパ球数、平均血球体積、単球数、平均赤血球ヘモグロビン量、好酸球数、平均赤血球ヘモグロビン濃度、好塩基球数、網状赤血球数、大きな未染色細胞数および血小板数。
【０３９２】
凝固試験のための血液試料は、凝血薬としてクエン酸三ナトリウムを含有するチューブに収集した。Ｓｔａｇｏ  ＳＴＡ−Ｒ機器を用いて以下のパラメータを判定した：プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間。
【０３９３】
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Ｃｏｂａｓ  ６０００アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した：アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；総ビリルビン；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）；総タンパク；アルカリ性ホスファターゼ；アルブミン；尿素；グロブリン；クレアチニン；クレアチンキナーゼ（ＣＫ）；グルコース；アルブミン／グロブリン比；ナトリウム；リン；カリウム；コレステロール；塩化物；トリグリセリド；カルシウム；およびマグネシウム。
【０３９４】
実施例２０の表２５に掲載した分析物の判定のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ２８−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ（キットカタログ番号：ＬＰＣ０００３Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ  ＵＳＡ）を用いた。Ｂｉｏｐｌｅｘ  ２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ  ＵＳＡ）を分析のために用い（ソフトウェアバージョン：Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）５．０セキュリティ版、ビルド５３１）、データ処理を促進するためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１０が用いられ、生データに含まれた。定量下限未満の値は、１：２の希釈比に基づいてＬＬＯＱとしてデータ表に入れた。
【０３９５】
有意な血液学的変化は起こらなかった。表３９で、臨床化学的変化を概説する。カチオン性リピドＣでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの０．６ｍｇ／ｋｇでの静脈内投与は、両時点で臨床化学的変化を引き起こし、投薬から２４時間後の最小限の肝細胞変化（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の増加、アルブミンの低下）および潜在的な筋肉変化（ＡＳＴおよびＣＫの増加）を反映していた。アルブミンの減少（下で詳述する炎症誘発性サイトカインの増加に加えて）によって、かすかな炎症性変化が示された。主に投薬後２４時間のトリグリセリドの減少は、脂質代謝への影響、食物摂取の減少を反映していたかもしれず、または生物学的変動によるかもしれない。
【０３９６】
【表３９】
2017500865.tif 000056
【０３９７】
投薬前の値と比較したときに、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡによる０．６ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投薬の後に、サイトカインおよびケモカインの上昇が記された。分析物の投薬前の値がＬＬＯＱ未満であったならば、ＬＬＯＱを用いて変化倍率を計算した。
【０３９８】
大部分は投薬の６時間後に全３匹のサルで改変された合成レプチンｍＲＮＡ関連の変化のいくつかが記され、これらの変化のほとんどは投薬の２４時間後までに投薬前のレベルに復帰した。１匹のサルだけで上昇した少数の分析物もあった。これらの後者の変化と処置との関係は除外することができないが、その理由は、それらが投薬前の値を上回っていたからであり、および他のサイトカインが同じサルで増加していたからである。
【０３９９】
投薬の６時間後に、血清中のＩＬ１ＲＡレベルの上昇が全３匹のサルで起こり、投薬の２４時間後までにレベルは正常に戻った（上昇はおよそ２倍からおよそ１１倍まで変動した）。血清中のＩＬ６レベルは３匹のサルのうちの２匹で投薬の３時間後におよそ５倍上昇し、投薬６時間後に全てのサルでおよそ４倍から８倍までさらに上昇したが、２４時間後までに投薬前の値に戻った。血清中のＭＣＰ−１レベルは３匹のサルのうちの２匹で投薬の１時間後におよそ１倍上昇し、レベルは投薬の３時間後に全ての動物で１倍から４倍上昇したが、投薬の６時間後にＭＣＰ−１レベルは３匹のサルのうちの２匹で１４倍から３０倍、１匹のサルでは４倍上昇し、上昇は投薬の２４時間後に全てのサルで１倍から３倍のままであった。Ｉ−ＴＡＣの血清中レベルは投薬の６時間後に全３匹の動物で４倍から３７倍上昇し、投薬の２４時間後にも上昇したままであった。表４０は、最も一貫した上昇を示した４つの分析物の経時変化を概説する。
【０４００】
【表４０】
2017500865.tif 000057
【０４０１】
表４０は、投薬前の値と比較したカチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変合成レプチンｍＲＮＡの雄カニクイザルへの投与と関連した血清中サイトカインおよびケモカインレベルの変化を示す。
【０４０２】
実施例の条件下で、雄カニクイザルに０．６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与された、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、ＩＬ−１ＲＡの増加もあった。サイトカイン変化の全ては、投薬の６時間後に最も著しく、２４時間後までにほとんど正常であった。臨床病理学的変化は投薬の２４時間後に顕著であったが、一部の変化は試験中ずっと持続した。
【０４０３】
レプチンは、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの増加を通してそれ自体免疫調節効果を有する（末梢血単核細胞でＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＦＮγならびにＩＬ−１ＲＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する。Juge-Aubry CE and Meier CA (2002) Mol. Cell Endocrinol. 194(1-2): 1-7を参照されたい）。
【０４０４】
結論として、カチオン性リピドＢでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡの０．６ｍｇ／ｋｇでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示し、肝臓および筋肉の傷害を示唆する炎症性変化、大部分は最小限の変化をもたらした。
【実施例２４】
【０４０５】
ｏｂ／ｏｂマウスへの皮下投与後のカチオン性リピドＢにパッケージされたヒトレプチンｍＲＮＡの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の特異的効果を実証することであった。レプチンタンパク質は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）によって送達され、ｍＲＮＡはカチオン性リピドＢにパッケージされて皮下投与された。
【０４０６】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。マウスは、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）、または、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、翻訳不能になるように突然変異させられた、ＨＰＬＣで精製された対照ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号１６）を投与した。ｍＲＮＡを、カチオン性リピドＣ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。実施例８に記載されるように、マウスに皮下注射した。
【０４０７】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを２ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを６ｍｐｋの用量で投与した（Ｅ群）。５匹のマウスに、改変された合成翻訳不能レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｆ群）。５匹のマウスに、改変された合成翻訳不能レプチンｍＲＮＡを２ｍｐｋの用量で投与した（Ｇ群）。５匹のマウスに、改変された合成レプチンｍＲＮＡを６ｍｐｋの用量で投与した（Ｈ群）。
【０４０８】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４、５、６、７、１０、１４および２４日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０４０９】
表４１は体重を表し、表４２はこの実施例の食物摂取の結果を表す。レプチンｍＲＮＡの最低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、体重および食物摂取に関して効果的だった。体重および食物摂取に及ぼすレプチンｍＲＮＡの効果は、最高のｋｇあたり６ｍｇ用量まで用量依存的に増加した。ｋｇにつき２ｍｇの用量で、対照の翻訳不能レプチンｍＲＮＡにはマイナー効果しかなかった。翻訳不能なレプチンｍＲＮＡの効果は最も高いｋｇにつき６ｍｇ用量でより大きかったが、この効果は翻訳可能なレプチンｍＲＮＡの最も低い用量で見られたものよりなお低かった。これらの結果は、レプチン欠損マウスに皮下投与されたレプチンｍＲＮＡが食物摂取および体重を強力に低減し、この影響はヒトレプチンタンパク質の特異的発現に主によることを実証する。
【０４１０】
【表４１】
2017500865.tif 000058
【０４１１】
【表４２】
2017500865.tif 000059
【実施例２５】
【０４１２】
ｏｂ／ｏｂマウスへの皮下投与後のカチオン性リピドＣにパッケージされたヒトレプチンｍＲＮＡの薬力学
この実施例の目的は、カチオン性リピドＣにパッケージされて皮下投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼす特異的効果を実証することであった。
【０４１３】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの８週齢雄レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスを、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）、または、ＨＰＬＣで精製された翻訳不能ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号２１）を投与した。実施例３５の製剤化プロセスに従って、ｍＲＮＡをカチオン性リピドＣ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。実施例８に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
【０４１４】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。５匹のマウスの各群に、リン酸緩衝食塩水または１キログラムにつき０．６ミリグラム（ｍｐｋ）の、カチオン性リピドＣで製剤化した、レプチンｍＲＮＡもしくは翻訳不能レプチンｍＲＮＡを投与した。試験の初めに、それらの食物も計量した。１、２、３、４、５、６、７、１０および１５日目の午前９時００分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
【０４１５】
カチオン性リピドＣ中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後の体重変化は、表４３に詳述する。食物摂取は、表４４に詳述する。カチオン性リピドＣによる結果は、レプチンタンパク質発現をもたらすことができる０．６ｍｐｋレプチンｍＲＮＡの皮下投与は、ｏｂ／ｏｂマウスで体重および食物摂取を減少させることを実証する。対照的に、翻訳不能レプチンｍＲＮＡの０．６ｍｐｋの投与は、体重および食物摂取に最小限の影響しか及ぼさない。
【０４１６】
【表４３】
2017500865.tif 000060
【０４１７】
【表４４】
2017500865.tif 000061
【実施例２６】
【０４１８】
レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスへの皮下投与の後のカチオン性リピドＣでパッケージされたレプチンｍＲＮＡの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）が、カチオン性リピドＣにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
【０４１９】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、カチオン性リピドＣにパッケージされ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）、または、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、翻訳不能になるように突然変異させられた、ＨＰＬＣで精製された対照ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号２１）を投与した。実施例８に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
【０４２０】
４匹の動物に、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。４匹の動物に、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。４匹の動物に、改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。４匹の動物に、改変された合成レプチンｍＲＮＡを２ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。４匹の動物に、改変された合成レプチンｍＲＮＡを６ｍｐｋの用量で投与した（Ｅ群）。４匹の動物に、改変された合成翻訳不能レプチンｍＲＮＡを６ｍｐｋの用量で投与した（Ｆ群）。
【０４２１】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０４２２】
０日目の午後３時００分（投薬６時間後）に、次に１および２日目の午前９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、ヒトレプチンまたはマウスエリスロポイエチンレベルを測定した。
【０４２３】
表４３は、実施例１のプロトコールによって測定された、この試験の血漿中ヒトレプチンレベルの結果を表す。
【０４２４】
【表４５】
2017500865.tif 000062
【実施例２７】
【０４２５】
カチオン性リピドＡの合成
中間体Ａ１の調製：（６Ｚ，９Ｚ）−１８−ブロモオクタデカ−６，９−ジエン。
【０４２６】
【化２】
2017500865.tif 000063
【０４２７】
撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコ内で、リノレイルメシレート（５０ｇ、１４５ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（２００ｍＬ）に溶解した。臭化マグネシウムジエチルエーテル化合物（１０１ｇ、３９２ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応物は、室温で終夜撹拌した。分液漏斗中で、ブラインおよびエーテルを混合液に加えた。次に有機物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、圧の下で濃縮して粗生成混合物を得た。次に１００％ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、４５ｇの生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.26 - 5.46 (m, 4 H) 3.42 (t, J=6.90 Hz, 2 H) 2.78 (t, J=6.65 Hz, 2 H) 2.06 (q, J=6.78 Hz, 4 H) 1.86 (dt, J=14.43, 7.09 Hz, 2 H) 1.21 - 1.49 (m, 16 H) 0.82 - 0.95 (m, 3 H) ppm.
【０４２８】
中間体Ａ２の調製：（１３Ｚ，１６Ｚ）−１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−４−オール。
【０４２９】
【化３】
2017500865.tif 000064
【０４３０】
撹拌棒を備えた５００ｍＬの三つ口丸底フラスコ内で、Ｍｇ旋削（０．４４３ｇ、１８．２２ｍｍｏｌ）を計量し、ヒートガンで加熱しながら５分の間真空下に保った。５〜１０分間、フラスコを真空下に放置した。次にフラスコをＮ２で充填し、セプタムで密封した。反応容器中にＴＨＦ（７５ｍＬ）を速やかに注ぎ、続いてＩ２（０．０３９ｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）および中間体Ａ１（５ｇ、１５．１８ｍｍｏｌ）を注ぎ、還流凝縮器をフラスコに取り付けた。システム全体をＮ２で３回交換し、混合液を２時間加熱還流（９０℃）した。次に、Ｎ２の下で透明な混合液を室温まで冷却させた。
【０４３１】
第２の２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ブタナール（２．７６ｇ、１３．６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、氷水浴で冷却させた。次に調製したリノレイルグリニャール試薬をシリンジによって１０分間にわたってアルデヒドに滴下添加し、周囲温度で３０分の間反応物を撹拌した。反応フラスコを氷浴で再び冷却させた。飽和ＮＨ４Ｃｌ（水性）溶液をゆっくり加えてｐＨを７に調整し、反応物を撹拌し、１時間かけて室温まで温めた。分液漏斗中で、ブラインおよび酢酸エチルを混合液に加えた。有機物を収集してブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成混合物を得た。次にヘプタン中の０〜２０％酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、４．９１ｇの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.26 - 5.46 (m, 4 H) 3.51 - 3.80 (m, 3 H) 2.71 - 2.84 (m, 2 H) 1.99 - 2.13 (m, 4 H) 1.56 - 1.75 (m, 4 H) 1.21 - 1.52 (m, 20 H) 0.82 - 0.98 (m, 12 H) 0.01 - 0.14 (m, 6 H) ppm.
【０４３２】
中間体Ａ３の調製：（１３Ｚ，１６Ｚ）−１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−４−イル（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カーボネート。
【０４３３】
【化４】
2017500865.tif 000065
【０４３４】
撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコ内で、４−ニトロフェニルクロロホルメート（３．４９ｇ、１７．３１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。Ｐｙ（１．４ｍＬ、１７．３１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３９７ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を加え、続いて中間体Ａ２（４．９ｇ、１０．８２ｍｍｏｌ）を加え、混合液を終夜室温で撹拌した。３−ジメチルアミノ−１−プロパノール（６．７ｇ、６４．９ｍｍｏｌ）を次に加え、混合液を次に密封チューブに移し、５０℃で終夜加熱した。ＤＣＭを加えて、反応混合液を希釈した。飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）（５０ｍＬ×４）を用いて、反応物を洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。ヘプタン中の０〜６０％酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、残渣を精製した。単離した材料をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  ＮＨ２カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に通して、４ｇの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.27 - 5.47 (m, 4 H) 4.62 - 4.79 (m, 1 H) 4.19 (t, J=6.40 Hz, 2 H) 3.61 (d, J=3.01 Hz, 2 H) 2.72 - 2.83 (m, 2 H) 2.42 - 2.59 (m, 2 H) 2.31 (br. s., 6 H) 2.05 (d, J=6.78 Hz, 4 H) 1.83 - 2.00 (m, 2 H) 1.47 - 1.74 (m, 6 H) 1.17 - 1.43 (m, 18 H) 0.80 - 0.97 (m, 12 H) -0.05 - 0.10 (m, 6 H) ppm.
【０４３５】
中間体Ａ４の調製：３−（ジメチルアミノ）プロピル（（１３Ｚ，１６Ｚ）−１−ヒドロキシドコサ−１３，１６−ジエン−４−イル）カーボネート。
【０４３６】
【化５】
2017500865.tif 000066
【０４３７】
プラスチックチューブ内で、中間体Ａ３（２ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＴＨＦに溶解し、氷浴で冷却した。ＨＦ−Ｐｙ（１．５１ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。次に混合液を周囲温度まで温め、１時間撹拌した。反応混合液を分液漏斗に移し、ＤＣＭで希釈した。反応混合液がバブリングを停止するまで、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）をゆっくり加え、酢酸エチルで水性相を３回分離、抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物質を、さらなる精製なしで用いた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.28 - 5.47 (m, 4 H) 4.67 - 4.80 (m, 1 H) 4.13 - 4.28 (m, 2 H) 3.66 (t, J=5.77 Hz, 2 H) 2.78 (t, J=6.53 Hz, 2 H) 2.44 - 2.65 (m, 2 H) 2.26 - 2.44 (m, 6 H) 2.01 - 2.14 (m, 4 H) 1.88 - 2.01 (m, 2 H) 1.50 - 1.80 (m, 6 H) 1.19 - 1.44 (m, 18 H) 0.80 - 0.97 (m, 3 H) ppm.
【０４３８】
中間体Ａ５の調製：（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン酸。
【０４３９】
【化６】
2017500865.tif 000067
【０４４０】
アセトン（２０ｍＬ）中の中間体Ａ４（１．５ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）の溶液にジョーンズ試薬（１．６ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中の２Ｍ溶液）を滴下添加により加え、反応混合液が５分間を超えてオレンジ色のままであるまで、氷水浴で冷却させた。それを次に３０分間撹拌し、その後冷却浴を除去し、さらなる４５分の間撹拌を継続した。ｉＰｒＯＨ（１ｍＬ）を加え、混合液を濾過した。ｐＨが６に調整されるまで、アセトンおよび５ＭのＮａＯＨ水溶液を加えた。混合液を、ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨで４回抽出した。合わせたＤＣＭ抽出物を減圧下で乾燥、濃縮し、２８８ｍｇの生成物を得、それをさらなる精製なしで用いた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.25 - 5.48 (m, 4 H) 4.84 (dt, J=7.72, 3.80 Hz, 1 H) 4.38 (ddd, J=10.85, 6.84, 3.39 Hz, 1 H) 3.98 (ddd, J=11.04, 8.28, 3.01 Hz, 1 H) 2.99 - 3.10 (m, 1 H) 2.78 (t, J=6.53 Hz, 2 H) 2.62 - 2.74 (m, 2 H) 2.47 - 2.59 (m, 6 H) 2.24 - 2.42 (m, 2 H) 2.18 (br. s., 1 H) 1.89 - 2.11 (m, 6 H) 1.58 - 1.78 (m, 2 H) 1.47 - 1.58 (m, 1 H) 1.19 - 1.42 (m, 18 H) 0.89 (t, J=6.65 Hz, 3 H) ppm.
【０４４１】
リピドＡの合成：２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート。
【０４４２】
【化７】
2017500865.tif 000068
【０４４３】
丸底フラスコ内で、中間体Ａ５（２８０ｍｇ、０．５８１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２８．４ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（２２３ｍｇ、１．１６３ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジイルジオクタノエート（３００ｍｇ、０．８７２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）にとった。ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、１．１６３ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間後に、反応物を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０％〜５０％酢酸エチル）によって、残渣を精製した。画分を収集し、溶媒を減圧下で除去して、１８８ｍｇの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.45 - 5.21 (m, 5H), 4.73 (d, J=4.3 Hz, 1H), 4.30 (dd, J=4.3, 11.8 Hz, 2H), 4.23 - 4.07 (m, 4H), 2.77 (t, J=6.3 Hz, 2H), 2.49 - 2.36 (m, 4H), 2.36 - 2.21 (m, 9H), 2.12 - 1.80 (m, 7H), 1.70 - 1.48 (m, 6H), 1.40 - 1.20 (m, 36H), 0.94 - 0.81 (m, 9H) ppm.
【０４４４】
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ  ｍ／ｚ）＝８０８．５（Ｍ＋１）。
【実施例２８】
【０４４５】
カチオン性リピドＢの合成
中間体１ａの調製：５−（ベンジルオキシ）ペンチルメタンスルホネート。
【０４４６】
【化８】
2017500865.tif 000069
【０４４７】
磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、Ｎ２下の０℃において、ＤＣＭ（７５ｍＬ）中の５−ベンジルオキシ−１−ペンタノール（１０．０８ｇ、５１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１０．７９ｍＬ、７８ｍｍｏｌ）をシリンジで一度に加えた。次に、内部温度が１５℃を超えないような速度で、ＭｓＣｌ（４．８５ｍＬ、６２．３ｍｍｏｌ）を４回に分けてシリンジで滴下添加した。反応物を１時間撹拌し続けさせ、その後それをＨ２Ｏ（２００ｍＬ）およびＤＣＭ（１５０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水性層をＤＣＭ（２２５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して標記化合物を未精製のオレンジ色の油状物（１４．４６ｇ、９９％）として得た。
【０４４８】
質量分析（「ＭＳ」）（ｍ＋１）＝２７２．９。
【０４４９】
中間体１ｂの調製：ジエチル２−（５−（ベンジルオキシ）ペンチル）マロネート。
【０４５０】
【化９】
2017500865.tif 000070
【０４５１】
Ｎ２雰囲気下の無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のマロン酸ジエチルの冷たい０℃の溶液（７．５ｇ、４６．８ｍｍｏｌ）に、６０％ＮａＨ（２．２３ｇ、５６．２ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって少しずつ加えた。気体の発生が観察された。混合液を０℃で３０分間撹拌し、次に、無水ＤＭＦ（４１ｍＬ）中の中間体１ａ（１４．４６ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって滴下添加し、続いてヨウ化テトラブチルアンモニウム（１．７３ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）を加えた。次に、混合液を１００℃で１．５時間加熱した。混合液を室温で冷却させ、終夜放置した。混合液を次に飽和ＮＨ４Ｃｌ（５０ｍＬ）でクエンチし、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈した。混合液を、ＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮した。０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製し、化合物を油状物（１１．７ｇ、７４％）として得た。
【０４５２】
（ＭＳ）（ｍ＋１）＝３３６．６。
【０４５３】
中間体１ｃの調製：２−（５−（ベンジルオキシ）ペンチル）プロパン−１，３−ジオール。
【０４５４】
【化１０】
2017500865.tif 000071
【０４５５】
Ｎ２下の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の中間体１ｂの冷たい０℃溶液（５．５ｇ、１６．３５ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ（２４．５２ｍＬ、４９．０ｍｍｏｌ）中の２．０ＭのＬｉＡｌＨ４を１５分間にわたって滴下添加した。混合液を室温に温め、終夜撹拌した。混合液を０℃に冷却させ、ＴＨＦ（１６．３５ｍＬ、３２．７ｍｍｏｌ）中の２．０ＭのＬｉＡｌＨ４で再び処理し、室温に温め、週末の間撹拌した。反応物を０℃に冷却させ、１０分間にわたるＥｔＯＡｃ（９．３０ｍＬ）の滴下でクエンチした。次に、Ｈ２Ｏ（３．１０ｍＬ）の滴下、１５％ＮａＯＨ溶液（３．１０ｍＬ）の滴下、次に追加のＨ２Ｏ（９．３０）の滴下で混合液を処理した。混合液を室温で３０分の間撹拌した。セライトのパッドを通して、混合液を濾過した。セライトをＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、標記化合物を半ワックス固体（１．５２ｇ、３７％）として得た。
【０４５６】
ＭＳ（ｍ＋１）＝２５３．０。
【０４５７】
中間体１ｄの調製：２−（５−（ベンジルオキシ）ペンチル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート。
【０４５８】
【化１１】
2017500865.tif 000072
【０４５９】
磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、Ｎ２下の０℃において、ＤＣＭ（２０ｍｌ）中の中間体１ｃ（１．５１ｇ、５．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１．２１ｍＬ、１４．９６ｍｍｏｌ）をシリンジで約３０秒間にわたって滴下添加した。次に、塩化オクタノイル（２．１４５ｍＬ、１２．５７ｍｍｏｌ）を数分間にわたってシリンジで滴下添加し、反応物を室温に温め、終夜撹拌した。混合液を飽和ＮＨ４Ｃｌ（１００ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈した。有機物を分離した。水性相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。０〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、標記化合物を無色油状物（２．８８ｇ、９５％）として得た。
【０４６０】
ＭＳ（ｍ＋１）＝５０５．６。
【０４６１】
中間体１ｅの調製：２−（５−ヒドロキシペンチル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート。
【０４６２】
【化１２】
2017500865.tif 000073
【０４６３】
室温のＭｅＯＨ（２５ｍｌ）中の中間体１ｄの溶液（２．５ｇ、４．９５ｍｍｏｌ）に、１０％Ｐｄ／Ｃ、ｗｅｔ  ｄｅｇｕｓｓａ型（２６４ｍｇ）を加えた。混合液を、Ｈ２バルーンの下で終夜撹拌した。粗反応混合液をセライトのパッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮して標記化合物を無色油状物（２．０ｇ、９７％）として得た。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ4.11 - 3.96 (m, 4H), 3.59 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.04 - 1.91 (m, 1H), 1.66 - 1.48 (m, 7H), 1.41 - 1.34 (m, 6H), 1.34 - 1.20 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
【０４６４】
中間体１ｆの調製：７−（オクタノイルオキシ）−６−（（オクタノイルオキシ）メチル）ヘプタン酸。
【０４６５】
【化１３】
2017500865.tif 000074
【０４６６】
室温において、磁気撹拌棒を入れたバイアル中で、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（４６．８４ｍＬ、１：１の比）中の中間体１ｅ（２．０ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）に、ＴＥＭＰＯ（０．１５１ｇ、０．９６５ｍｍｏｌ）を一度に加えた。次に、二酢酸ヨードベンゼン（３．４２ｇ、１０．６１ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を室温で終夜撹拌し続けさせ、その後、１５％水性チオ硫酸ナトリウム（５０ｍＬ）で反応をクエンチした。反応物をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して薄黄色油状物を得た。油状物をトルエン（１５ｍＬ）に溶解し、減圧下で濃縮して（×６）薄黄色油状物を得、それをＤＣＭに溶解し、減圧下で濃縮して（×３）標記化合物（さらに、残留トルエンまたはヨードベンゼンのいずれかに相当するかもしれないマイナーな芳香族不純物）を薄黄色油状物（２．０ｇ、９７％）として得た。
【０４６７】
ＭＳ（ｍ−１）＝４２７．２。
【０４６８】
中間体１ｇの調製：３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパナール。
【０４６９】
【化１４】
2017500865.tif 000075
【０４７０】
撹拌棒を備えた１Ｌ丸底フラスコ内で、ｔｅｒｔブチルジメチルシリルオキシプロパノール（２０ｇ、１０５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（４３．９ｍＬ、３１５ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌棒を備えた第２の５００ｍＬフラスコ内で、ＳＯ３．Ｐｙ（２５．０８ｇ、１５８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ、１４０９ｍｍｏｌ）に溶解した。生じた溶液を、０℃（氷水浴中の）のアルコール溶液に滴下添加した。週末にわたって、室温に温まる間、反応物を撹拌した。分液漏斗中で、水およびＤＣＭを混合液に加えた。次に有機物を水で洗浄し、ＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮（冷）して粗生成混合物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３３０ｇカラム、１００％ＤＣＭ）による精製により、標記化合物（１７．７ｇ、８９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 9.81 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.61 (td, J = 6.0, 2.3 Hz, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.07 (s, 6H). 
【０４７１】
中間体１ｈの調製：１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ペンタデカン−３−オール。
【０４７２】
【化１５】
2017500865.tif 000076
【０４７３】
５００ｍＬ丸底フラスコ内で、中間体１ｇ（１７．７ｇ、９４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、氷水浴で０℃に冷却した。ジエチルエーテル中に１Ｍのドデシル臭化マグネシウム（１３２ｍＬ、１３２ｍｍｏｌ）をピペットで１０分間にわたってアルデヒドに滴下添加し、氷浴を除去し、室温で３０分の間反応物を撹拌した。反応フラスコを氷浴で再び０℃に冷却した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液をゆっくり加えて（６００ｍＬ）ｐＨを約７に調整し、混合液を１Ｌ分液漏斗に注いだ。次に有機物を飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成混合物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３３０ｇカラム、２カラム体積のために１００％ヘプタン、１カラム体積のために０％〜２％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、３カラム体積のために２％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１カラム体積のために２％〜５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、次に１０カラム体積のために５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）による精製により、標記化合物（２４．９ｇ、７４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.97 - 3.87 (m, 1H), 3.87 - 3.77 (m, 2H), 1.69 - 1.60 (m, 2H), 1.57 - 1.36 (m, 3H), 1.36 - 1.19 (br, 19H), 0.93 - 0.84 (m, 12H), 0.09 (s, 6H). 
【０４７４】
中間体１ｉの調製：１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ペンタデカン−３−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート。
【０４７５】
【化１６】
2017500865.tif 000077
【０４７６】
室温において、磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、ＤＣＭ（２８ｍＬ）中の中間体１ｈ（２．９６６０ｇ、８．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロフェニルカルボノクロリデート（２．０８４ｇ、９．９２ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物にセプタムを取り付けてＮ２の下に置き、その後、ピリジン（１．００３ｍＬ、１２．４０ｍｍｏｌ）を数分間にわたってシリンジで滴下添加した。反応物を、室温で終夜撹拌させた。２４時間の反応時間の後、反応物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）およびＤＣＭ（１２５ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水性層をＤＣＭ（１２５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオフホワイトの残渣を得た。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８０ｇカラム、液体投入、０〜２．５％ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）で精製して、３．１４４ｇ（７３％）の標記化合物（さらに、マイナーな未確認不純物のピーク）を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ8.29 - 8.24 (m, 2H), 7.41 - 7.35 (m, 2H), 5.03 - 4.95 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 6.6, 5.7 Hz, 2H), 1.95 - 1.80 (m, 2H), 1.80 - 1.63 (m, 2H), 1.45 - 1.19 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 12H), 0.06 (s, 6H).
【０４７７】
中間体１ｊの調製：１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ペンタデカン−３−イル（３−（ジエチルアミノ）プロピル）カーボネート。
【０４７８】
【化１７】
2017500865.tif 000078
【０４７９】
Ｎ２の下で、磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の中間体１ｉ（２．９１５３ｇ、５．５７ｍｍｏｌ）に、３−（ジエチルアミノ）プロパン−１−オール（３．４８ｍＬ、２２．２６ｍｍｏｌ）を数分間にわたってシリンジで滴下添加した。次に、ピリジン（２．２５１ｍＬ、２７．８ｍｍｏｌ）を約３０秒間にわたってシリンジで滴下添加し、続いてＤＭＡＰ（０．１３６ｇ、１．１１３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物を、室温で終夜撹拌し続けさせた。２２時間の反応時間の後、反応物をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）およびＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水性層をＤＣＭ（２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して黄色−オレンジ色の粗油状物を得、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１２０ｇカラム、液体投入（ＤＣＭ中）、０〜８％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって精製して黄色の油状物を得た。黄色の油状物はｂｏｎｄ  ｅｌｕｔ  ＮＨ２カラム（１０ｇ）を通して、ＤＣＭで溶出した。濾液を減圧下で濃縮して、薄黄色の油状物を得た。ｂｏｎｄ  ｅｌｕｔ手順を再び繰り返して、標記化合物を無色油状物（２．０８８７ｇ、７３％）として得た。
【０４８０】
ＭＳ（ｍ＋１）＝５１６．４。
【０４８１】
中間体１ｋの調製：３−（ジエチルアミノ）プロピル（１−ヒドロキシペンタデカン−３−イル）カーボネート。
【０４８２】
【化１８】
2017500865.tif 000079
【０４８３】
室温のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の中間体１ｊの溶液（２．２ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）に、ＣＡＮ（５．１４ｇ、９．３８ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合液を室温で撹拌し、その後ＴＬＣ（７０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、ＫＭｎＯ４染色）が続いた。出発材料の消費が観察された後、混合液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）で洗浄した。水性層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して標記化合物（多少のマイナーな不純物と一緒に）を油状物として得た。
【０４８４】
ＭＳ（ｍ＋１）＝４０２．２。
【０４８５】
最終化合物、カチオン性リピドＢの調製：２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ−３−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート。
【０４８６】
【化１９】
2017500865.tif 000080
【０４８７】
丸底フラスコ内で、中間体１ｆ（１．９９ｇ、４．６６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．２０７ｇ、１．６９３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．４８ｍＬ、８．４７ｍｍｏｌ）および中間体１ｋ（１．７ｇ、１３．０７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）にとった。ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．６２ｇ、８．４７ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間の後、反応物を減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２に０％〜５％のＭｅＯＨ）によって、残渣を精製した。画分を収集し、溶媒を減圧下で除去して、黄色の油状物（３．８ｇ）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜７５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって油状物を精製し、標記化合物をオフホワイトの油状物（２．６ｇ、７１．８％）として得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ= 4.80 (t, J=6.1 Hz, 1H), 4.25 - 3.96 (m, 8H), 2.62 (br. s., 4H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 6H), 2.05 - 1.85 (m, 5H), 1.71 - 1.53 (m, 8H), 1.43 - 1.21 (m, 42H), 1.21 - 0.98 (m, 6H), 0.96 - 0.79 (m, 9H).  13C NMR (101MHz, CDCl3) δ= 174.15 (s, 2C), 173.71, 155.20, 75.90, 66.41, 64.14 (s, 2C), 60.85, 49.32, 47.10 (s, 2C), 37.46, 34.56 (s, 3C), 34.52, 34.29, 33.28, 32.22, 31.97 (s, 2C), 29.95 (s, 2C), 29.88, 29.80, 29.76, 29.66, 29.41 (s, 2C), 29.23 (s, 2C), 28.20, 26.64, 25.36, 25.25 (s, 4C), 23.00, 22.90 (s, 2C), 14.44, 14.38 (s, 2C), 11.37 (s, 2C).
【実施例２９】
【０４８８】
カチオン性リピドＣの合成
中間体１ａの調製：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）
【０４８９】
【化２０】
2017500865.tif 000081
【０４９０】
丸底フラスコ内で、リノール酸（９５．０ｇ、３３９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．１４ｇ、３３．９０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（７４．１ｍＬ、４２４ｍｍｏｌ）および２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（１８．０ｇ、１７０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（４３５ｍｌ）にとった。ＥＤＣ（８１．０ｇ、４２４ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間後に、乾燥投入のためにシリカゲル粉末により反応物を減圧下で濃縮し、溶離剤として酢酸エチル／ヘプタン（０％〜４０％）を用いてシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ）で残渣を精製し、４７ｇ（４４％収率）の所望の生成物を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.19-5.50 (m, 8H), 4.19 (tt, J = 11.83, 5.87 Hz, 4H), 3.51-3.69 (m, 2H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.53 Hz, 4H), 2.20 (五重線, J = 5.83 Hz, 2H), 2.06 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.49-1.72 (m, 5H), 1.20-1.46 (m, 26H), 0.79-0.98 (m, 6H) ppm.
【０４９１】
最終化合物、カチオン性リピドＣの調製：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）。
【０４９２】
【化２１】
2017500865.tif 000082
【０４９３】
丸底フラスコ内で、中間体１ａ（１５．０ｇ、２３．７７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．５８１ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８．３０ｍＬ、４７．５ｍｍｏｌ）および１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボン酸（５．１１ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（７８ｍＬ）にとった。ＥＤＣ（９．１１ｍｇ、４７．５ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間後に、乾燥投入のために乾燥シリカゲルにより反応物を減圧下で濃縮し、溶離剤として酢酸エチル／ヘプタン（０％〜８０％）を用いてシリカゲル（Ｂｉｏｔａｇｅ）で残渣を精製し、１５ｇ（８２％収率）の所望の生成物を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.26-5.47 (m, 8H), 4.08-4.21 (m, 6H), 2.97 (d, J = 9.29 Hz, 1H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.56-2.69 (m, 2H), 2.24-2.49 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.54-1.76 (m, 5H), 1.22-1.42 (m, 31H), 0.89 (t, J = 6.78 Hz, 6H) ppm.ＭＳ（ｍ＋１）＝７５６．７。
【実施例３０】
【０４９４】
カチオン性リピドＤの合成
中間体１３ａの調製：４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタンニトリル。
【０４９５】
【化２２】
2017500865.tif 000083
【０４９６】
４，４−ジエトキシブタンニトリル（１５ｇ、９５ｍｍｏｌ）とオクタノール（３７．３ｇ、２８６ｍｍｏｌ）の混合液に、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（１．２ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を加え、混合液を１０５℃に加熱した。７２時間後に、反応混合液を冷却し、溶離剤として酢酸エチル／ヘプタンを用いてシリカゲルで精製して、９．３４ｇの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.56 (t, J = 5.40 Hz, 1H), 3.61 (dt, J = 9.16, 6.59 Hz, 2H), 3.44 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.28 Hz, 2H), 1.95 (td, J = 7.34, 5.40 Hz, 2H), 1.50-1.66 (m, 4H), 1.17-1.44 (m, 20H), 0.80-0.95 (m, 6H) ppm.
【０４９７】
中間体１３ｂの調製：４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタン酸
【０４９８】
【化２３】
2017500865.tif 000084
【０４９９】
高圧反応容器内で、中間体１３ａ（９．３４ｇ、２８．７ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＥｔＯＨに溶解する。ＫＯＨ（４．８３ｇ）を３０ｍＬの水に溶解し、ＫＯＨ溶液をＥｔＯＨ溶液に加えた。チューブを密封して、終夜１１０℃に加熱した。混合液を冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した。１Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ５に調整し、水性相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して１０．９ｇの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.46 (t, J = 5.52 Hz, 1H), 3.46-3.59 (m, 2H), 3.08-3.46 (m, 3H), 2.18 (t, J = 7.28 Hz, 2H), 1.72-1.89 (m, 2H), 1.46-1.63 (m, 4H), 1.28 (d, J = 3.76 Hz, 20H), 0.79-0.96 (m, 6H) ppm.
【０５００】
中間体１３ｃの調製：（９Ｚ，１２Ｚ）−３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート。
【０５０１】
【化２４】
2017500865.tif 000085
【０５０２】
丸底フラスコ内で、リノール酸（２３．７８ｇ、８５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２．０７２ｇ、１６．９６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２２．２２ｍＬ、１２７ｍｍｏｌ）および２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（９ｇ、８５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２００ｍＬ）にとった。ＥＤＣ（２４．３９ｇ、１２７ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間の後、反応物を減圧下で濃縮し、酢酸エチル／ヘプタンを溶離剤とするシリカゲルで濃縮液を精製して、１２．４ｇの予想生成物を得る。９．５ｇの中間体１ａも単離された。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.27 (d, J = 6.27 Hz, 2H), 3.77 (qd, J = 11.25, 5.14 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 6.40 Hz, 2H), 2.23-2.48 (m, 4H), 1.90-2.15 (m, 6H), 1.53-1.76 (m, 3H), 1.15-1.45 (m, 14H), 0.77-0.98 (m, 3H) ppm.
【０５０３】
中間体１３ｄの調製：（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（ヒドロキシメチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート
【０５０４】
【化２５】
2017500865.tif 000086
【０５０５】
丸底フラスコ内で、中間体１３ｃ（１０．９ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７７３ｍｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１．０５ｍＬ、６３．３ｍｍｏｌ）および中間体１３ｂ（１３．９９ｇ、３８ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）にとった。ＥＤＣ（１２．１３ｇ、６３．３ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。２４時間の後、反応物を減圧下で濃縮した。０〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを溶離剤とするシリカゲルで濃縮液を精製して、１１．２ｇの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.27-5.45 (m, 4H), 4.50 (t, J = 5.52 Hz, 1H), 4.08-4.25 (m, 4H), 3.50-3.69 (m, 4H), 3.41 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.53 Hz, 2H), 2.33 (t, J = 7.53 Hz, 2H), 2.13-2.29 (m, 2H), 2.00-2.13 (m, 4H), 1.88-2.00 (m, 2H), 1.49-1.69 (m, 7H), 1.20-1.44 (m, 32H), 0.83-0.95 (m, 9H) ppm.
【０５０６】
最終化合物、カチオン性リピドＤの調製：（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（（１−エチルピペリジン−３−イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート。
【０５０７】
【化２６】
2017500865.tif 000087
丸底フラスコ内で、４−ニトロフェニルクロロホルメート（２９０ｍｇ、１．４３９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解した。ピリジン（０．１１６ｍｌ、１．４３９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２６．４ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、続いて中間体１３ｄ（５００ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）を加え、混合液を周囲温度で１時間撹拌した。（１−エチルピペリジン−３−イル）メタノール（６１８ｍｇ、４．３２ｍｍｏｌ）を加え、反応を終夜継続させた。反応物を減圧下で濃縮し、酢酸エチル／ヘプタンを溶離剤とするシリカゲルで濃縮液を精製して、５３０ｍｇの予想化合物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 5.25-5.46 (m, 4H), 4.49 (t, J = 5.52 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 19.32, 5.77 Hz, 6H), 4.02-4.09 (m, 1H), 3.91-4.00 (m, 1H), 3.57 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 2.82-2.99 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.40 Hz, 2H), 2.36-2.48 (m, 5H), 2.31 (t, J = 7.53 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.78 Hz, 5H), 1.84-1.97 (m, 3H), 1.50-1.81 (m, 12 H), 1.21-1.41 (m, 31H), 0.94-1.14 (m, 5H), 0.80-0.94 (m, 9H) ppm.ＭＳ（ｍ＋１）＝８６５．１。
【実施例３１】
【０５０８】
異なるレプチンｍＲＮＡ配列からのレプチンタンパク質の発現
この実施例の目的は、レプチンタンパク質発現の効率に及ぼすレプチンｍＲＮＡヌクレオチド配列の影響を実証することであった。
【０５０９】
実施例で用いたレプチンｍＲＮＡ構築物の各々は、異なるヒトレプチンコード領域配列を含有した。配列番号４、配列番号６および配列番号８のヒトレプチンｍＲＮＡは、コドン最適化配列（それぞれ、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９）を含有した。配列番号１０のヒトレプチンｍＲＮＡは、天然のヒトコード配列（配列番号２０）を含有する。これらの４つのヒトレプチンコドン配列のヌクレオチド配列は相同配列であり、互いと７８％〜９１％同一である。
【０５１０】
レプチンｍＲＮＡは、実施例２のように転写された。５％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃のインキュベーター内で、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地でＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞を増殖させた。１．５マイクログラムのレプチンｍＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と複合体化させ、製造業者のプロトコールに従ってＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞にトランスフェクトさせた。
【０５１１】
細胞を２４時間インキュベートし、ならし培地を除去した。細胞をリン酸緩衝食塩水で一度洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含む新鮮なダルベッコの改変イーグル培地を細胞に加えた。細胞をさらに２４時間インキュベートし、ならし培地をその後除去した。
【０５１２】
ならし培地中のレプチンタンパク質レベルを、実施例１に記載の通りに測定した。表４６に結果を示す。配列番号４のレプチンｍＲＮＡは、レプチンタンパク質の最高の発現を裏づけた。
【０５１３】
【表４６】
2017500865.tif 000088
【実施例３２】
【０５１４】
カチオン性リピドＣにパッケージされたレプチンｍＲＮＡ；皮下送達された異なる製剤のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドＣにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の皮下送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。
【０５１５】
実施例２に記載の通りにレプチンｍＲＮＡを合成し、実施例５の通りにカチオン性リピドナノ粒子に封入したが、ただし、カチオン性リピドＣと、中性脂質（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびリピド化ＰＥＧとの比が表４７の通り異なっていた。
【０５１６】
【表４７】
2017500865.tif 000089
【０５１７】
９週齢雄Ｃ５７ＢＩ／６マウス（群につきｎ＝４）に、実施例８のように脂質ナノ粒子中のレプチンｍＲＮＡを皮下投与した。０日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。午前９時にマウスに投薬し、６時間後に採血した。体重および食物摂取も記録した。
【０５１８】
実施例１のプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。異なる製剤化条件下のカチオン性リピドＣ中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルを、表４７に詳述する。
【０５１９】
したがって、より高い血漿中ヒトレプチンタンパク質レベルから証明される通り、この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンｍＲＮＡの皮下送達は、皮下投与の後にｍＲＮＡ送達の効力を増強することができる。
【実施例３３】
【０５２０】
カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣにパッケージされたレプチンｍＲＮＡ、静脈内反復送達のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドＣにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）の静脈内送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。実施例２に記載の通りにレプチンｍＲＮＡを合成し、実施例５の通りにカチオン性脂質ナノ粒子に封入した。
【０５２１】
１５週齢雌１２９Ｓｖマウス（群につきｎ＝４）に、実施例８のように脂質ナノ粒子中のレプチンｍＲＮＡを静脈内投与した。０日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。表４８に示す日の午前９時にマウスに投薬し、６時間後に採血した。体重も記録した。
【０５２２】
実施例１のプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣ中のレプチンｍＲＮＡの各静脈内投与の後のレプチンタンパク質レベルを、表４８に詳述する。
【０５２３】
【表４８】
2017500865.tif 000090
【０５２４】
この実施例の手順による１２９ＳｖマウスへのヒトレプチンｍＲＮＡの反復静脈内送達は、ｍＲＮＡ送達の６時間後にほとんど再現性レベルの血漿中レプチンタンパク質をもたらす。カチオン性リピドＢの場合、反復投与マウス群がそれらの１７日目の投与を受けたのと同時の、マウスのさらなる群へのレプチンｍＲＮＡの単一の２ｍｇ／ｋｇ用量の投与は、２５２，６２２ｐｇ／ｍＬの血漿中レプチンタンパク質レベルをもたらした。これは、カチオン性リピドＢ中のレプチンｍＲＮＡの反復投与の後の血漿中レプチンタンパク質レベルの変動が、単一投与の正常な変動の範囲内であることを示す。試験期間中にマウス群の間に体重の一貫した差はなく、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣ中のレプチンｍＲＮＡの反復投与が一般に耐容性であったことを示す。
【実施例３４】
【０５２５】
改善プロセスＡ
改善プロセスＡによる脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの封入。以下の改善は、０．３ｍｇのｍＲＮＡの封入操作のための、最高０．４ｍｇ／ｍＬの濃度での、０．７５ｍｌ容量の脂質および０．７５ｍｌ容量のｍＲＮＡを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか４０μｇのｍＲＮＡまで規模を縮小することができる。撹拌プレートの上で撹拌棒入りの回収容器内でクエン酸緩衝液と混合することによって、５０％エタノール中の初期ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を直ちに希釈する。
【０５２６】
【表４９】
2017500865.tif 000091
【０５２７】
任意選択で、装置および使い捨て式備品は、ＲＮアーゼ活性がないことを製造業者が証明してもよく、またはＲＮａｓｅＺａｐ試薬の使用によってＲＮアーゼフリーにされてもよい。
【０５２８】
本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡは、ｐＨ６．０であってもよいが、所望によりｐＨ５．６まで多少下げてもよいクエン酸緩衝液で調製される。
【０５２９】
エタノールでの脂質混合液の調製。以下は、４：１のカチオン性脂質アミン対ｍＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）のモル比で封入されたｍＲＮＡの一例である。脂質（カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびリピド化ＰＥＧ）を別々に計量し、エタノール中の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液（５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を除いて）として調製する。これらの保存溶液は、脂質混合液を調製するために用いる。モル比は、それぞれ４０：１０：４８：２である。例えば、エタノール中の１．５ｍＬ容量の脂質のための全ての構成成分の量および最終濃度が表５０にある。１．５ｍＬ容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の２倍に相当する。混合液をシンチレーションバイアルで調製し、使用時まで３７℃に維持する。
【０５３０】
【表５０】
2017500865.tif 000092
【０５３１】
クエン酸緩衝液でのｍＲＮＡの調製。クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ６．０であることを先ず確認する。そうでないならば、進行する前にｐＨを調整する。
【０５３２】
封入のための水中の十分なｍＲＮＡを−８０℃保存から解凍し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器の使用によって水からクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に交換する。１０〜１２ｍｇのｍＲＮＡを各濃縮器に投入することができ、それは４℃で４，０００ｒｐｍで８分の間遠心分離される。クエン酸緩衝液ｐＨ６．０の添加によって、容量を増加させる。所望の緩衝条件を達成するために、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０による≧１０容量の交換が推奨される。ＵＶ分光計で２６０ｎｍの光学濃度によって、ｍＲＮＡの濃度を測定する。水洗したシンチレーションバイアル内で、ｍＲＮＡの最終濃度を０．８２５ｍＬのクエン酸緩衝液で０．４ｍｇ／ｍＬに調整し、使用時まで室温に保つ。０．８２５ｍＬ容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の１．１倍に相当する。
【０５３３】
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの封入。投入および排出ラインを有するＴ字型接合部を、図６に示すように準備する。滅菌１ｍＬシリンジに、等量（０．７５ｍＬ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡ（シリンジ（ｂ））およびクエン酸緩衝液だけ（シリンジ（ｃ））を詰める。脂質およびｍＲＮＡをそれぞれ含有するシリンジ（ａ）および（ｂ）のＬｕｅｒフィッティングからつながるチュービングをＴ字型接合部に取り付け、クエン酸緩衝液だけを含有するシリンジ（ｃ）のＬｕｅｒフィッティングからつながるチュービングを、活性撹拌プレートの上の撹拌棒入りの回収容器の上のＴ字型接合部を出るチュービングと対にする。シリンジをシリンジポンプの上に設置する。シリンジポンプを、適当なシリンジ（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐｌａｓｔｉｐａｋ、１ｍＬ）および１分につき１ｍＬの流量にセットする。
【０５３４】
こうして脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを、透析チュービング（例えば、スネークスキン１０ｋＤａ分子量カットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直ちに移す。４℃で終夜、ＲＮアーゼおよび発熱物質フリーの１×リン酸緩衝食塩水に対して材料を透析する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を取り出し、滅菌チューブに入れ、分析まで４℃で保存する。
【０５３５】
改善プロセスＡに関する追加の情報については、実施例５を参照されたい。
【実施例３５】
【０５３６】
改善プロセスＢ
改善プロセスＢによる脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡ封入。以下の改善は、最高０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の、または３０ｍｇのｍＲＮＡの封入操作のための、６０ｍｌ容量の脂質および６０ｍｌ容量のｍＲＮＡを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか２ｍｇのｍＲＮＡまで規模を縮小することができる。
【０５３７】
改善プロセスＡと対照的に、改善プロセスＢにおいては、容器への回収の前に第２のＴ字型接合部でクエン酸緩衝液と混合することによって、５０％エタノール中の初期ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を直ちに希釈する。生じたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液は、次に別のＴ字型接合部を通してクエン酸緩衝液と混合することによってもう一度希釈する。プロセスＢは、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の濃縮のための接線流濾過法（ＴＦＦ）および透析の代わりのＴＦＦユニットでの緩衝液交換の使用も含む。任意選択で、ＴＦＦカートリッジ（例えば、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０）を先ず発熱物質フリーにしてもよい。
【０５３８】
エタノールでの脂質混合物の調製。以下は、４：１のカチオン性脂質アミン対ｍＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）のモル比で封入されたｍＲＮＡの例である。脂質（カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびリピド化ＰＥＧ）を、エタノールに溶解する。モル比は、それぞれ４０：１０：４８：２である。表５１は、エタノール中の６３ｍｌ容量の脂質のための全ての構成成分の量および最終濃度を示す。６３ｍＬ容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の１．０５倍に相当する。混合液を計量し、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール改変（ＰＥＴＧ）１２５ｍＬボトルに入れ、エタノールを加える。混合液を短時間超音波処理し、次に５分の間静かにかき混ぜ、次に使用時まで３７℃に維持する。
【０５３９】
【表５１】
2017500865.tif 000093
【０５４０】
クエン酸緩衝液でのｍＲＮＡの調製。クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ６．０であることを先ず確認する。そうでないならば、進行する前にｐＨを調整する。封入のための水中の十分なｍＲＮＡを−８０℃保存から解凍し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器の使用によって水からクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に交換する。１０〜１２ｍｇのｍＲＮＡを各濃縮器に投入することができ、それは４℃で４，０００ｒｐｍで５分の間遠心分離される。クエン酸緩衝液ｐＨ６．０の添加によって、容量を増加させる。所望の緩衝条件を達成するために、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０による≧１０容量の交換が推奨される。ＵＶ分光計で２６０ｎｍの光学濃度によって、ｍＲＮＡの濃度を測定する。滅菌１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル内で、ｍＲＮＡの最終濃度を６３ｍＬのクエン酸緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、使用時まで室温に保つ。６３ｍＬ容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の１．０５倍に相当する。
【０５４１】
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの封入。投入および排出ラインを有するＴ字型接合部を、図７Ａに示すように準備する。滅菌６０ｍＬシリンジに、等量（６０ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡ（シリンジ（ｂ））およびクエン酸緩衝液だけ（シリンジ（ｃ））を詰める。脂質およびｍＲＮＡをそれぞれ含有するシリンジ（ａ）および（ｂ）のＬｕｅｒフィッティングからつながるチュービングをＴ字型接合部に取り付け、シリンジポンプＡに設置する。図７Ｂを参照されたい。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にするために、クエン酸緩衝液だけを含有するシリンジ（ｃ）のＬｕｅｒフィッティングからつながるチュービングを、第２のＴ字型接合部に取り付け、シリンジ（ｃ）をシリンジポンプＢに設置する。第２のＴ字型接合部からの排出ラインを、希釈されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の回収のための滅菌２５０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルの上に配置する。全てのフィッティングは、シリンジとタイトである。シリンジポンプを、適当なシリンジ製造業者およびサイズ（ＢＤ、Ｐｌａｓｔｉｐａｋ、６０ｍｌ）ならびに１分につき４０ｍｌまでの流量にセットする。両方のポンプを同時に開始し、およそ０．５秒後に材料回収を開始する。およそ１６０〜１７０ｍｌのｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を回収することができる。
【０５４２】
１３５ｍＬのｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を吸引するために、１４０ｍＬシリンジを用いることができる。残りの３５〜４５ｍＬを６０ｍＬシリンジに移す。同量のクエン酸緩衝液で、１４０ｍＬおよび６０ｍＬシリンジを準備する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液の別の希釈のために、図７Ｃに示す通りに別のＴ字型接合部をセットする。この希釈ステップは、ただ１つのシリンジポンプの上の両方のシリンジで実行する。１４０ｍＬシリンジ（１つは脂質ナノ粒子を含有し、他はクエン酸緩衝液を含有する）を先に実行し、２番目に６０ｍＬシリンジを実行する。全てのフィッティングは、シリンジとタイトである。最初の実行のために、シリンジポンプの上で設定を正しいサイズおよび製造業者（１４０ｍＬ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−ｍｏｎｏｊｅｃｔ）に変更する。流量は、１分につき２５ｍｌに設定する。希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌５００ｍｌ  ＰＥＴＧボトルに回収する。第２の実行のために、シリンジポンプの上で設定を正しいサイズおよび製造業者（６０ｍｌ、ＢＤ  Ｐｌａｓｔｉｐａｋ）に変更する。流量は、１分につき２５ｍｌに設定する。希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、同じ滅菌５００ｍＬ  ＰＥＴＧボトルに回収する。最終容量は、およそ３７０〜３８０ｍＬである。
【０５４３】
接線流濾過によるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の透析および濃縮。封入操作での１５ｍｇのｍＲＮＡのために、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０カートリッジを用いることができる。３０ｍｇのｍＲＮＡの封入操作のために、２つのＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０カートリッジを直列に取り付けることができる。任意選択で、再生セルロースカートリッジを先ず発熱物質フリーにすることができる。任意選択で、この手順は、封入前日に開始することができる。
【０５４４】
Ｍｉｎｉｍａｔｅ  ＴＦＦシステムを用いて、２つのＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０カートリッジを直列にセットし、チュービングを取り付ける。５００ｍＬの発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水をレザバーに詰め、２０ｐｓｉの圧でカートリッジに流す。１００ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨ／１．０Ｍ  ＮａＣｌをレザバーに詰め、５０ｍＬをカートリッジに流す。残りの５０ｍＬは、カートリッジ内に終夜静置する。翌朝、残りの５０ｍＬを２０ｐｓｉでカートリッジに流す。さらなる発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水をレザバーに詰め、５０ｍＬをカートリッジに流す。この水洗をさらに２回繰り返す。それが検出可能な量未満であることを確実にするために、最後の水洗のアリコートをエンドトキシンについて試験する。
【０５４５】
Ｍｉｎｉｍａｔｅ  ＴＦＦレザバーにｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を詰める。２０〜２５ｐｓｉの全体圧を維持しながら、混合液を濃縮する。濾液は１分につきおよそ４ｍｌで溶出を開始するかもしれないが、その後遅くなるかもしれない。レザバー中の液位が４０ｍｌの目盛にくるまで濃縮する。濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、３００ｍｌの発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの１×ＰＢＳに対して限外濾過する。２０〜２５ｐｓｉの圧を保つ。限外濾過の後、レザバーの１０ｍｌ目盛線直下まで材料の濃縮を再開する。レザバーから、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を回収する。さらなる５ｍｌの１×ＰＢＳでＴＦＦシステムを水洗して、希釈されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を回収することが可能であるが、この洗浄液は濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液から別個に回収することができる。分析まで４℃で材料を保存する。ＴＦＦシステムを発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水で、続いて７０％エタノール／水で洗浄する。
【実施例３６】
【０５４６】
痩せたＣ５７ＢＩ／６、食事誘発性肥満（ＤＩＯ）またはレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスへのカチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣの中のレプチンｍＲＮＡの皮下投薬の後のレプチンタンパク質発現の薬物動態
レプチンｍＲＮＡの皮下送達の後に発現されるレプチンタンパク質の量に皮下脂肪の量が影響するかどうか判定するために、３匹の異なるマウスモデルを評価した。
【０５４７】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの８週齢雄の痩せたＣ５７ＢＩ／６マウス、Ｔａｃｏｎｉｃからの１３週齢雄の食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスおよびＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１６週齢雄のレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスを、通常の明周期（６：００〜１８：００）により１ケージ４匹で収容した。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与した。実施例３５の製剤化プロセスに従って、ｍＲＮＡをカチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣ（Ｎ：Ｐモル比＝４：１）にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。実施例８に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
【０５４８】
４匹のマウスの各群に、１キログラムにつき０．２、０．６または２．０ミリグラム（ｍｐｋ）のカチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣで製剤化したレプチンｍＲＮＡを午前９時に投与し、６時間後の午後３時に採血した。レプチンタンパク質レベルの評価のために、投与の２４、４８、７２および９６時間後（４日間の各翌日の午前９時）にも採血した。
【０５４９】
実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従って、血漿中のヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドＢ中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表５２に詳述する。カチオン性リピドＣ中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表５３に詳述する。
【０５５０】
両方のカチオン性脂質製剤による結果は、痩せたＣ５７Ｂｌ／６マウスモデルと比較して、やや肥満のＤＩＯマウスモデルでより高いレプチンタンパク質レベルを実証する。レプチンタンパク質レベルは、やや肥満のＤＩＯマウスモデルと比較して、重度肥満のｏｂ／ｏｂマウスモデルでさらにより高かった。したがって、皮下脂肪のより大きな量は、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣの中のレプチンｍＲＮＡの皮下投与の後のより大きなレプチンタンパク質発現と相関する。
【０５５１】
【表５２】
2017500865.tif 000094
【０５５２】
【表５３】
2017500865.tif 000095
【実施例３７】
【０５５３】
レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたカチオン性リピドＢおよびカチオン性リピドＣでパッケージされたレプチンｍＲＮＡの反復ＳＣ処置の薬物動態
この実施例の目的は、レプチンｍＲＮＡの反復（毎週の）処置が各連続投与の後に一貫した（安定した）レプチンレベルをもたらすこと、およびｉｎ  ｖｉｖｏ効能が全投薬期間を通して維持されることを実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）をカチオン性リピドＢおよびＣにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
【０５５４】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、ＨＰＬＣ精製され、４：１のＮ：Ｐモル比でカチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈された、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与した。通常の様式でマウスを拘束した。実施例８に示すように、レプチンｍＲＮＡを皮下投与した。
【０５５５】
５匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＣにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＣにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＣにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＢにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｅ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＢにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｆ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＢにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｇ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＢにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０２ｍｐｋの用量で投与した（Ｈ群）。
【０５５６】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０５５７】
０日目の午後３時００分（投薬の６時間後）に、次に１、７、１０、１５、２１、２２、２８および３１日目の午前９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ  ＵＳＡによって製造されたＣａｒｄｉｏＣｈｅｋ（登録商標）ＰＡ（カタログ番号７３０）およびトリグリセリド（ＴＧ）試験ストリップ（参照番号１７１６）を用いて、トリグリセリドを測定した。マウス尾静脈によって新たに収集されたＥＤＴＡ−血液の１５μＬをメーターにかけ、約２分以内にＴＧ値を記録した。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ  ＵＳＡによって製造されたＡｌｐｈａＴＲＡｋ（登録商標）メーター（カタログ番号３２１２５０４０１）およびグルコース試験ストリップ（参照３２１０９−４６−５０）を用いて、マウスグルコースレベルを測定した。約２０秒以内にこのメーターからグルコースを読み取るのに、尾静脈からの全血の１滴だけが必要である。
【０５５８】
下の表は、ウリジンがプソイドウリジンで置換され、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣのいずれかを含有する脂質ナノ粒子で製剤化された、本発明のＨＰＬＣ精製ヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）による毎週の（４回投与）処置からの、体重、グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルを示す。
【０５５９】
【表５４】
2017500865.tif 000096
【０５６０】
【表５５】
2017500865.tif 000097
【０５６１】
【表５６】
2017500865.tif 000098
【０５６２】
【表５７】
2017500865.tif 000099
【０５６３】
【表５８】
2017500865.tif 000100
【実施例３８】
【０５６４】
レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに投与されたカチオン性リピドＤでパッケージされたレプチンｍＲＮＡの皮下処置の後のグルコースおよびトリグリセリドデータ
この実施例の目的は、単一の皮下処置の後のグルコースおよびトリグリセリド（ＴＧ）の動態（減少率およびベースラインへの戻り）に及ぼす、レプチンｍＲＮＡの効果を実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ＨＰＬＣで精製されたヒトレプチンｍＲＮＡ（配列番号４）をカチオン性リピドＤにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
【０５６５】
図１に、カチオン性リピドＤの構造を示す。
【０５６６】
用いた動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１０週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスであった。動物は、通常の明周期（６：００〜１８：００）の独居房に入れた。それらに、実施例８に示すようにＨＰＬＣ精製され、４：１のＮ：Ｐモル比でカチオン性リピドＤにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈され、皮下注射された、本発明の改変された合成レプチンｍＲＮＡ（配列番号４）を投与した。
【０５６７】
４匹のマウスに、ＰＢＳを投与した（Ａ群）。４匹のマウスに、カチオン性リピドＤにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．６ｍｐｋの用量で投与した（Ｂ群）。４匹のマウスに、カチオン性リピドＤにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．２ｍｐｋの用量で投与した（Ｃ群）。５匹のマウスに、カチオン性リピドＤにパッケージした改変された合成レプチンｍＲＮＡを０．０６ｍｐｋの用量で投与した（Ｄ群）。
【０５６８】
０日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるようにそれらの摂取グルコースおよびグリセリドレベルによって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前９時００分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前９時００分にも、全てのマウスを計量した。
【０５６９】
０日目の午後３時００分（投薬の６時間後）に、次に１、２、３、５、６、７および１４日目の午後９時００分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。実施例３７に記載のように、ＣａｒｄｉｏＣｈｅｋ（登録商標）ＰＡ（カタログ番号７３０）およびトリグリセリド試験ストリップ（参照番号１７１６）を用いて、トリグリセリドを測定した。同じく実施例３７に記載のように、ＡｌｐｈａＴＲＡｋ（登録商標）メーター（カタログ番号３２１２５０４０１）およびグルコース試験ストリップ（参照３２１０９−４６−５０）を用いて、マウスグルコースレベルを測定した。
【０５７０】
【表５９】
2017500865.tif 000101
【０５７１】
【表６０】
2017500865.tif 000102
【実施例３９】
【０５７２】
カニクイザルにおけるカチオン性リピドＢおよびカチオン性リピドＣにパッケージされたレプチンｍＲＮＡの静脈内投与の投与後のカニクイザルの毒性結果
実施例２０に記載のように、カニクイザルは、カチオン性リピドＢまたはカチオン性リピドＣのいずれかを含有する脂質ナノ粒子にパッケージされたレプチンｍＲＮＡの静脈内投与を受けた。投薬の２４時間後または投薬の７２時間後のいずれかに、サルの脳を毒性結果について検査した。
【０５７３】
静脈内投与の２４時間後の一部のサルの脾臓の組織学的分析は、それらの動脈周囲リンパ鞘の細胞性の増加を示し、対照動物での成熟したリンパ集団と比較してリンパ組織球集団へのシフトがあった。
【０５７４】
より高い用量（例えば、カチオン性リピドＢ製剤では１．５ｍｐｋまたはカチオン性リピドＣ製剤では１．２５ｍｐｋ）の脂質ナノ粒子のいずれかの静脈内投与から７２時間後の一部のサルの組織学的分析は、脳出血の病変および散乱した病巣を示した。病変は大部分はサルの脳白質に限定され、周囲神経網への混合型ないし支配的好中球性炎症細胞浸潤と関連した。散乱病巣出血は、白質に限定された。
【０５７５】
２４時間後、動物の大脳皮質の灰白質および白質の両方でグリア細胞賦活化が観察された。グリア細胞賦活化は、ＧＦＡＰ発現の増加（星状神経膠細胞の賦活化を示す）およびＩｂａ１発現の増加（小グリア細胞の賦活化を示す）によって、免疫組織化学的に測定された。星状神経膠細胞賦活化は、投薬の２４時間後から観察された。星状神経膠細胞賦活化は、組織病理学的病変を示す動物で投薬の７２時間後により顕著であることが観察された。
【０５７６】
他のマーカーも試験した。免疫組織化学的に測定されたＫｉ６７は、２４および７２時間の時点で全ての高用量動物で増加した。ＩＬ−１βはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによっておよび免疫組織化学的に全ての高用量動物で観察され、脳病変を起こしたサルで最も増加した。ＩＬ−１βのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は２４時間後に観察され、７２時間後に増加する；２４時間後に、灰白質および白質の星状神経膠細胞にｍＲＮＡの発現が存在するようである。７２時間後に、炎症性細胞浸潤および内皮細胞連続性の喪失と一緒に血管周囲ＧＦＡ陽性星状神経膠細胞の減少が起こるのが観察された。切断されたカスパーゼ３の存在は、投薬の７２時間後の一部の罹患動物の白質内のアポトーシスを実証する。ヒトレプチンＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果は、全ての用量で２４時間後までの灰白質および白質のグリア細胞および内皮の中のレプチンｍＲＮＡの存在を実証する。７２時間後に、罹患動物の出血領域において内皮およびグリア細胞で広範な限局化が観察された。正常な白質の内皮細胞は低レベルのＬＤＬＲを発現し（組織化学的に測定された）、それは、脂質ナノ粒子の投与の後に再分布し、観察した罹患動物で上方制御された。Ｃ５ｂ−９（ＭＡＣ）の免疫組織化学結果は、７２時間後に高投薬量静脈内投与を受けた動物の内皮への補体沈着を実証した。この補体沈着は罹患動物でより顕著であることが観察され、神経網で広範囲にわたったレプチンシグナル（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出された）に先行した。
【０５７７】
本発明の範囲は、上の記載に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に示される通りである。
【図１−１】
2017500865.tif 000103
【図１−２】
2017500865.tif 000104
【図２−１】
2017500865.tif 000105
【図２−２】
2017500865.tif 000106
【図３−１】
2017500865.tif 000107
【図３−２】
2017500865.tif 000108
【図４−１】
2017500865.tif 000109
【図４−２】
2017500865.tif 000110
【図５】
2017500865.tif 000111
【図６】
2017500865.tif 000112
【図７−１】
2017500865.tif 000113
【図７−２】
2017500865.tif 000114
【配列表】
2017500865000001.app
【国際調査報告】
2017500865.tif 000115
2017500865.tif 000116
2017500865.tif 000117
2017500865.tif 000118