(57)【要約】  本発明はＶＥＧＦＲ−２に結合する抗体に関する。該抗体は、腫瘍性疾患、過剰増殖性疾患、及び血管新生疾患の治療に用いられる。単独で用いても、他の剤との組合せで用いてもよい。【選択図】なし
2017531434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＥＧＦＲ２に結合する単離された抗体又はその断片であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインを含み、
（i）ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧ（配列番号２３７）であり、
（ii）ＣＤＲ２配列が、
ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３８）、
ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３９）、及び
ＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４０）
からなる群より選択され、
（ii）ＣＤＲ３配列が、
ＧＮＹＦＤＹ（配列番号２４１）、
ＧＮＹＬＤＹ（配列番号２４２）、
ＧＰＹＬＤＹ（配列番号２４３）、及び
ＧＳＹＬＤＹ（配列番号２４４）
からなる群より選択され、
但し重鎖可変ドメインは、配列番号２４０のＣＤＲ２配列及び配列番号２４１のＣＤＲ３配列の両方を含むことはない、抗体又はその断片。
【請求項２】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
（i）ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧ（配列番号２４５）であり、
（ii）ＣＤＲ２配列がＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２４６）であり、
（iii）ＣＤＲ３配列が、
ＱＱＦＤＳＬＰＬＴ（配列番号２４７）、
ＱＱＨＤＳＳＰＬＳ（配列番号２４８）、
ＱＱＦＤＳＳＰＬＳ（配列番号２４９）、及び
ＱＱＦＤＳＳＰＬＴ（配列番号２５０）
からなる群より選択される、請求項１の抗体又は断片。
【請求項３】
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、配列ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３８）を有し、重鎖可変ドメインのＣＤＲ３が、配列ＧＮＹＦＤＹ（配列番号２４１）を有する、請求項１の抗体又は断片。
【請求項４】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３が、配列ＱＱＦＤＳＬＰＬＴ（配列番号２４７）を有する、請求項２の抗体又は断片。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが、配列番号２００、配列番号２０８、配列番号２１６、配列番号２２４、及び配列番号２３２からなる群より選択される配列を有する、請求項１の抗体又は断片。
【請求項６】
軽鎖可変ドメインが、配列番号２０４、配列番号２１２、配列番号２２０、配列番号２２８、及び配列番号２３６からなる群より選択される配列を有する、請求項２の抗体又は断片。
【請求項７】
重鎖可変ドメインが配列番号２００の配列を有し、軽鎖可変ドメインが配列番号２０４の配列を有する、請求項２の抗体又は断片。
【請求項８】
アイソタイプＩｇＧである、請求項１〜７の何れか一項の抗体又は断片。
【請求項９】
ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又は二重特異性抗体である、請求項１〜７の何れか一項の抗体又は断片。
【請求項１０】
前記抗体又は断片がヒトＶＥＧＦＲ２及びマウスｈＶＥＧＦＲ２に結合する、請求項１〜９の何れか一項の抗体又は断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片をコードする単離された核酸。
【請求項１２】
請求項１１に係る単離された核酸を含む核酸ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に係る単離された核酸を含む原核又は真核宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片と、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項１５】
ヒトＶＥＧＦＲ２又はマウスＶＥＧＦＲ２の活性化を中和する方法であって、有効量の請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片を細胞と接触させることを含む方法。
【請求項１６】
血管新生を阻害する方法であって、有効量の請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片を対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
腫瘍の成長を低減する方法であって、有効量の請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片を対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
対象の腫瘍性疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１０の何れか一項の抗体又は断片を対象に投与することを含み、ここで腫瘍性疾患が、肺癌、大腸癌、腎細胞癌、膠芽腫、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、及び膵臓癌から選択される、方法。
【請求項１９】
有効量の上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor ：ＥＧＦＲ）アンタゴニストを対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２０】
有効量のｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（fms-like tyrosine kinase receptor：ｆｌｔ−１）アンタゴニストを対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２１】
有効量のｒｈｏ関連キナーゼ２（rho associated kinase 2：ＲＯＣＫ２）アンタゴニストを対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２２】
有効量のマトリックスメタロプロテイナーゼアンタゴニストを対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２３】
有効量のＰＤＧＦＲβ抗体を対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２４】
有効量のＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを更に含む、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【請求項２５】
患者がヒトである、請求項１６〜１８の何れか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−２に結合する抗体に関する。本抗体は、腫瘍性疾患及び過剰増殖性障害を治療するのに用いられ、単独でも他の剤と組み合わせても用いることができる。
【０００２】
本願は、米国特許出願第６２／０６１,０９７号（２０１４年１０月７日出願）に基づく優先権を主張する。当該出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本願は、国際特許出願第PCT／US２０１３／０６３７５４号（２０１３年１０月７日出願）及び米国特許出願第６１／７１０,４２０号（２０１２年１０月５日出願）に基づく優先権を主張する。当該出願もその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、新たな血管を形成する極めて複雑なプロセスであり、毛細管内皮細胞の増殖及び遊走、並びに既存の血管からの毛細管内皮細胞の組織浸潤、細胞集合体の細管構造への分化、新たに形成された細管集合体の閉鎖型（closed-circuit）血管系への連結、更には新たに形成された毛細血管の成熟等を伴う。
【０００４】
血管新生は、胚発生、卵胞成長、創傷治癒等の正常な生理学的過程にとって重要である。また、過度の血管新生は、腫瘍性疾患や、加齢性黄斑変性症（age-related macular degeneration：ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障等の非腫瘍性疾患において、新血管形成を招く。ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標＠））を用いた血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）を標的とする抗血管新生治療が、ＡＭＤの進行を遅延させるのに有効であると報告されている。しかし、新血管形成は複雑な過程であり、複数の血管新生機構が関与している可能性が高い。よって、新血管形成に関連する疾病を治療するための治療剤及び治療法の開発が依然として要請されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に結合するヒト抗体及びその断片を提供する。ある態様によれば、当該抗体はＶＥＧＦＲ−２へのリガンド結合（例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、又はＶＥＧＦ−Ｅのうち１又は２以上）を阻害する。ある態様によれば、当該抗体はＶＥＧＦＲ−２の活性化を中和する。当該抗体は、腫瘍性疾患、例えば固形又は非固形腫瘍や、過剰増殖性障害等を治療するのに用いられる。従って、本発明は、ＫＤＲの活性化を中和する方法、血管新生関連腫瘍の阻害を含む、腫瘍成長を阻害する方法、及び、血管新生関連障害を治療する方法を提供する。本発明は、ＶＥＧＲ受容体に結合するヒト抗体又は抗体断片を有するキットを提供する。
【０００６】
一態様によれば、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合する単離された抗体又はその断片であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインを含み、
（i）ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧ（配列番号２３７）であり、
（ii）ＣＤＲ２配列が、
ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３８）、
ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３９）、及び
ＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４０）
からなる群より選択され、
（ii）ＣＤＲ３配列が、
ＧＮＹＦＤＹ（配列番号２４１）、
ＧＮＹＬＤＹ（配列番号２４２）、
ＧＰＹＬＤＹ（配列番号２４３）、及び
ＧＳＹＬＤＹ（配列番号２４４）
からなる群より選択され、
但し重鎖可変ドメインは、配列番号２４０のＣＤＲ２配列及び配列番号２４１のＣＤＲ３配列の両方を含むことはない、抗体又はその断片を提供する。
【０００７】
一態様によれば、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合する単離された抗体又はその断片であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
（i）ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧ（配列番号２４５）であり、
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列がＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２４６）であり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列が、
ＱＱＦＤＳＬＰＬＴ（配列番号２４７）、
ＱＱＨＤＳＳＰＬＳ（配列番号２４８）、
ＱＱＦＤＳＳＰＬＳ（配列番号２４９）、及び
ＱＱＦＤＳＳＰＬＴ（配列番号２５０）
からなる群より選択される、抗体又はその断片を提供する。
【０００８】
本発明の一態様によれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、配列ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３８）を有し、重鎖可変ドメインのＣＤＲ３は、配列ＧＮＹＦＤＹ（配列番号２４１）を有する。
【０００９】
本発明の一態様によれば、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３は、配列ＱＱＦＤＳＬＰＬＴ（配列番号２４７）を有する。
【００１０】
本発明の一態様によれば、重鎖可変ドメインは、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２００）、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＱＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０８）、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＮＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１６）、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＰＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２４）、及び
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２３２）
からなる群より選択される配列を有する。
【００１１】
本発明の一態様によれば、軽鎖可変ドメインは、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＤＳＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２０４）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＨＤＳＳＰＬＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１２）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＤＳＳＰＬＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２２０）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＤＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２２８）、及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＤＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２３６）
からなる群より選択される配列を有する。
【００１２】
本発明の一態様によれば、重鎖可変ドメインは、配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２００）
を有し、軽鎖可変ドメインは、配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＧＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＤＳＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２０４）
を有する。
【００１３】
本発明の一態様によれば、前記抗体又は断片は、アイソタイプＩｇＧを有する。
【００１４】
本発明の一態様によれば、前記抗体又は断片は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又は二重特異性抗体である。
【００１５】
本発明の一態様によれば、前記抗体又は断片は、ヒトＶＥＧＦＲ２及びマウスｈＶＥＧＦＲ２に結合する。
【００１６】
本発明は、本発明の抗体又は断片をコードする単離された核酸を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の抗体又は断片をコードする単離された核酸を含む、核酸ベクターを提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体又は断片をコードする単離された核酸を含む、原核又は真核宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明は、本発明の抗体又は断片と、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ２又はマウスＶＥＧＦＲ２の活性化を中和する方法であって、細胞を有効量の本発明の抗体又は断片に接触させることを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明は、血管新生を阻害する方法であって、有効量の本発明の抗体又は断片を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、腫瘍成長を減少させる方法であって、有効量の本発明の抗体又は断片を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明は、対象の腫瘍性疾患を治療する方法であって、有効量の本発明の抗体又は断片を対象に投与することを含み、ここで前記腫瘍性疾患が、肺癌、大腸癌 腎細胞癌、膠芽腫、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、及び膵臓癌からなる群より選択される方法を提供する。
【００２４】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量の上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor ：ＥＧＦＲ）アンタゴニストを、対象に投与することを含む。
【００２５】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量のfms様チロシンキナーゼ受容体（fms-like tyrosine kinase receptor：ｆｌｔ−１）アンタゴニストを、対象に投与することを含む。
【００２６】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量のｒｈｏ関連キナーゼ２（rho associated kinase 2：ＲＯＣＫ２）アンタゴニストを、対象に投与することを含む。
【００２７】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量のマトリックスメタロプロテイナーゼアンタゴニストを、対象に投与することを含む。
【００２８】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量のＰＤＧＦＲβ抗体を、対象に投与することを含む。
【００２９】
本発明の一態様によれば、前記方法は更に、有効量のＰＤ−Ｌ１抗体を、対象に投与することを含む。
【００３０】
本発明の一態様によれば、前記患者はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、ファージ提示法により確認された、本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体のヒトの重鎖、λ軽鎖、及びκ軽鎖の可変領域の配列をそれぞれ示す。
【図１Ｂ１】同上。
【図１Ｂ２】同上。
【図１Ｂ３】同上。
【図１Ｃ１】同上。
【図１Ｃ２】同上。
【図１Ｃ３】同上。
【００３２】
【図２】図２は、本発明の抗体のｈＶＥＧＦＲ２との結合（上）ならびにｈＶＥＧＦＲ２のドメイン２及びドメイン３を含む構築物との結合（中央）を示す。下図はリガンド（ＶＥＧＦ１６５）の遮断を示す。
【００３３】
【図３】図３は、ＫＤＲ（ヒトＶＥＧＦＲ２）を過剰発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞内で、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫのリン酸化を本発明のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）１０１及び１０２が阻害することを示す。
【００３４】
【図４】図４は、Ｍａｂ１０４、１０５、１０６、及び１０８によるｈＶＥＧＦＲ２への結合とＶＥＧＦ１６５リガンドの遮断を示す。別々の実験で、Ｍａｂ１０３、１０７、１０９、及び１１０についても同様の結果を得た。これらのＭａｂは、異なる軽鎖可変ドメインと組換えたＭａｂ１０１の重鎖可変ドメインを含む。
【００３５】
【図５】図５は、ＫＤＲ（ヒトＶＥＧＦＲ２）を過剰発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞で、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫのリン酸化を本発明のＭａｂ１０５及び１０６が阻害することを示す。
【００３６】
【図６Ａ】図６Ａは、配列番号４（図にも示す配列）を有するＶＨドメインを含む、Ｍａｂ１３８に由来する５個の親和性成熟抗体の重鎖アミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ａは、配列番号４（図にも示す配列）を有するＶＨドメインを含む、Ｍａｂ１３８に由来する５個の親和性成熟抗体の重鎖アミノ酸配列を示す。
【００３７】
【図７】図７Ａは、本発明の抗体のヒト及びマウスの可溶性ＶＥＧＦＲ２に対する結合を、ＤＣ１０１（マウスＶＥＧＦＲ２に結合するマウスモノクローナルＡｂ）及び対照（ヒトＶＥＧＦＲ２のみに結合する抗体）との比較で示す。Ｍａｂ１４７は、ヒトとマウス両方のＶＥＧＦＲ２に結合する。Ｍａｂ１０６は、ヒトＶＥＧＦＲ２には結合するが、マウスＶＥＧＦＲ２には結合しない。図７Ｂは、リガンド遮断実験で得たデータを示す。Ｍａｂ１４７は、ヒトＶＥＧＦのヒトＶＥＧＦＲ２との結合及びマウスＶＥＧＦとマウスＶＥＧＦＲ２との結合を遮断する。Ｍａｂ１０６は、ヒトＶＥＧＦのヒトＶＥＧＦＲ２との結合を遮断するが、マウスＶＥＧＦのマウスＶＥＧＦＲ２との結合は遮断しない。
【００３８】
【図８】図８Ａは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＫＤＲを過剰発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞（ＫＤＲ−ＰＡＥ）内でのＭａｂ１０６及びＭａｂ１４７のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合を示す。図８Ｂは、Ｍａｂ１４７はＭＳ１マウス内皮細胞でＶＥＧＦＲ２に結合するがＭａｂ１０６は結合しないことを示す。図８Ａ及び図８Ｂで、対照はｈＶＥＧＦＲ２に結合するがｍＶＥＧＦＲ２には結合しない抗体である。
【００３９】
【図９】図９は、ＶＥＧＦＲ２が関与するシグナル伝達のＭａｂ１０６及びＭａｂ１４７による阻害を示す。Ｍａｂ１０６及びＭａｂ１４７は、ＫＤＲ−ＰＡＥ細胞（図９Ａ）内及びＨＵＶＥＣ（図９Ｂ）内でＫＤＲ及びｐ４４／４２のリン酸化を投与量に依存して阻害する。
【００４０】
【図１０】図１０Ａは、Ｍａｂ１０６、Ｍａｂ１４７、及びｈＶＥＧＦＲ２に結合する対照抗体によるＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の増殖の阻害を示す。図１０Ｂは、誘導された細胞移動の阻害を示す。ＶＥＧＦの勾配（ＶＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌ（上）、ＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ（下））でＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の移動を誘導した。図は、０．６μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、又は１５μｇ／ｍｌのＭａｂ１０６抗体又はＭａｂ１４７抗体が存在する場合の細胞数を示す。
【００４１】
【図１１】図１１は、ＶＥＧＦに誘導されるＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の移動のＭａｂ１４７による阻害を示す。
【００４２】
【図１２】図１２Ａは、マウスＥＯＭＡ細胞内でのＶＥＧＦＲ２が関与するシグナル伝達のＭａｂ１４７による阻害を示す。図１２Ｂは、Ｍａｂ１４７がＥＯＭＡ細胞とより高い結合性を有することを対照抗体との比較で実証する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
一側面では、本発明は、ＶＥＧＦＲ２に依存するシグナル伝達を阻害するのに有効な新規のＶＥＧＦＲ２抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本明細書で使用する場合、「受容体を阻害する」は、シグナルを伝達する受容体固有のキナーゼ活性を低減又は不活性化することを意味する。ＶＥＧＦＲ２阻害に関する信頼性のある試験は、受容体のリン酸化の減少である。
【００４４】
本発明は、何れかの特定のＶＥＧＦＲ２阻害の機序によって限定されるものではない。１つの抗体の機序は別の抗体の機序と必ずしも同じではない。可能性のある一部の機序としては、ＶＥＧＦＲ２の細胞外結合ドメインとのＶＥＧＦリガンドの結合の防止や、受容体の二量体化又は多量体化の防止が挙げられる。ただし、他の機序を除外することはできない。
【００４５】
抗体は、特定の抗原又は物質を認識しそれに結合するタンパク質である。好ましい態様では、本発明の抗体は、少なくとも天然リガンドと同程度の強さでＫＤＲに結合する。抗原と抗体の解離に関する平衡定数で表される親和性（Ｋｄ）は抗原決定基と抗体結合部位との結合の強度の尺度である。結合活性は、抗体とその抗原との結合の強度の尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗体の抗原結合性部位との親和性、及び抗体あたりの結合部位の数（価数）の両方に関連する。たとえば、一価抗体（たとえばＦａｂ）は特定のエピトープについて１個の結合部位を有する。ＩｇＧ抗体は２個の抗原結合部位を有する。Ｋ値（解離定数Ｋｄの逆数）の一般的な値は１０５〜１０１１リットル／モルである。１０４リットル／モル未満の任意のＫ値は非特異的な結合を示すと考えられる。
本発明の抗体はＶＥＧＦＲ２の活性化を阻害する。ＶＥＧＦＲ２阻害の１つの尺度は受容体のチロシンキナーゼ活性の低下である。チロシンキナーゼの阻害は、受容体の自己リン酸化レベルの測定などの周知の方法で決定できる。ＶＥＧＦＲ２の阻害は、天然又は合成のＶＥＧＦＲ２基質やＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路のその他の成分のリン酸化事象の阻害又は調節によっても観察できる。リン酸化は、たとえば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロットでリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いて検出できる。Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997)及びBatley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998)には、チロシンキナーゼ活性に関するいくつかの試験が記載されている。
【００４６】
生体内での試験も利用できる。たとえば、受容体チロシンキナーゼの阻害は、阻害剤が存在する場合と存在しない場合の、受容体リガンドで刺激した細胞株を用いた細胞分裂促進試験によっても観察できる。たとえば、ＶＥＧＦで刺激したＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ）を用いてＶＥＧＦＲ阻害を試験できる。別の方法は、たとえばマウスに注入したヒト腫瘍細胞を用いてＶＥＧＦ発現腫瘍細胞の成長の阻害を試験することを含む。米国特許第６，３６５，１５７号明細書（Rockwellら）を参照のこと。
【００４７】
本発明は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体（この抗体をコードする核酸、この抗体を含有する組成物を含む）を提供する。一態様では、本発明は、ＣＤＲ−１Ｈ、ＣＤＲ−２Ｈ、及びＣＤＲ−３Ｈ配列を含む単離された抗体重鎖可変領域であって、
（ｉ）前記ＣＤＲ−１Ｈ配列はＧＦＴＦＳＷＹＸ１ＭＸ２（配列番号１８５）（ここで、Ｘ１はＶ又はＩであり、Ｘ２はＧ又はＬである）であり、
（ｉｉ）前記ＣＤＲ−２Ｈ配列はＳＩＸ１Ｘ２ＳＧＧＸ３ＴＸ４ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８６）（ここで、Ｘ１はＹ又はＧであり、Ｘ２はＰ又はＳであり、Ｘ３はＡ又はＦであり、Ｘ４はＮ又はＤである）であり、
（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ−３Ｈ配列はＧＮＹＦＤＹ（配列番号３）又はＧＬＡＡＰＲＳ（配列番号１１）である、
重鎖可変領域を提供する。
【００４８】
一態様では、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３配列を含む単離された軽鎖可変領域であって、
（ｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ１配列がＸ１ＧＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｓ（配列番号１８７）（ここで、Ｘ１はＳ、Ｑ、又はＴであり、Ｘ２はＤ、Ｅ、又はＱであり、Ｘ３はＫ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、又はＡであり、Ｘ４はＧ又はＲであり、Ｘ５はＤ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、又はＮであり、Ｘ６はＥ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、又はＮであり、Ｘ７はＹ、Ｆ、又はＳであり、Ｘ８はＡ又はＳである）であるか、ＳＧＳＸ１ＳＮＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８８）（ここで、Ｘ１はＳ又はＴであり、Ｘ２はＩ又はＬであり、Ｘ３はＥ又はＧであり、Ｘ４はＴ、Ｓ、又はＮであり、Ｘ５はＮ又はＹであり、Ｘ６はＴ、Ｐ、Ａ、又はＹであり、Ｘ７はＶ又はＬであり、Ｘ８はＮ、Ｉ、又はＹである）であるか、Ｘ１ＧＸ２ＳＸ３ＤＸ４ＧＸ５ＹＤＹＶＳ（配列番号１８９）（ここで、Ｘ１はＡ又はＴであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＨ、Ｓ、又はＮであり、Ｘ４はＩ又はＶであり、Ｘ５はＳ又はＡである）であり、
（ｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ２配列がＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＳ（配列番号１９０）（ここで、Ｘ１はＱ、Ｄ、Ｔ、Ｙ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ２はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ３はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、又はＹであり、Ｘ４はＱ、Ｋ、Ｎ、又はＬであり、Ｘ５はＲ又はＬである）であり、
（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ３配列がＱＸ１ＷＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１９１）（ここで、Ｘ１はＡ又はＴであり、Ｘ２はＤ又はＧであり、Ｘ３はＲ又はアミノ酸不在であり、Ｘ４はＳ、Ｆ、又はＮであり、Ｘ５はＳ、Ｔ、又はＮであり、Ｘ６はＳ、Ｔ、又はＰであり、Ｘ７はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、又はＹであり、Ｘ８はＶ又はＬである）であるか、ＡＸ１ＷＤＤＸ２ＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号１９２）（ここで、Ｘ１はＡ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ２はＮ又はＳであり、Ｘ３はＮ、Ｉ、又はＧであり、Ｘ４はＧ又はＳであり、Ｘ５はＰ、Ｗ、又はＶであり、Ｘ６はＶ又はＬである）であるか、ＭＹＳＴＩＴＸ１ＬＬ（配列番号１９３）（ここで、Ｘ１はＡ又はＴである）である、
軽鎖可変領域を提供する。
【００４９】
一態様では、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３配列を含む単離された軽鎖可変領域であって、
（ｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ１配列がＲＡＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＹＸ８Ｘ９（配列番号１９４）（ここで、Ｘ１はＱ、Ｅ、又はＨであり、Ｘ２はＳ、Ｒ、又はＮであり、Ｘ３はＶ、Ｉ、又はＬであり、Ｘ４はＳ、Ｒ、Ｇ、又はＮであり、Ｘ５はＳ又はＮであり、Ｘ６はＳ、Ｎ、Ｗ、又はＤであり、Ｘ７はＧ又はアミノ酸不在であり、Ｘ８はＬ又はＦであり、Ｘ９はＡ、Ｇ、Ｍ、又はＳであり、
（ｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ２配列がＧＡＳＸ１ＲＡＴ（配列番号１９５）（ここで、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｉ、又はＮである）であり、
（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ３配列がＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１９６）（ここで、Ｘ１はＦ又はＹであり、Ｘ２はＤ、Ｇ、又はＹであり、Ｘ３はＳ、Ｔ、又はＮであり、Ｘ４はＳ、Ｌ、又はＷであり、Ｘ５はＰ又はアミノ酸不在であり、Ｘ６はＰ又はＴであり、Ｘ７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｗ、又はＹであり、Ｘ８はＴ又はＳである）である、
軽鎖可変領域を提供する。
【００５０】
本発明の一態様では、上記の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列のうち１個、２個、３個、４個、５個、又は６個を含む重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。
【００５１】
ＶＥＧＦＲ２結合性抗体の配列の例（ただし、これらに限定されるものではない）を記載する。本明細書に記載のとおり、ヒトＦａｂファージ提示ライブラリーから、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合し、リガンドＶＥＧＦ−ＡのｈＶＥＧＦＲ２との結合を遮断し、かつＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２のリン酸化及び下流のシグナル伝達を阻害する２個の中和抗体を確認した。表１は、それらの抗体のＣＤＲ及び可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Ｍａｂ１０１及びＭａｂ１０２のＫｄ値は、それぞれ約６．６ｍＭ及び１．７ｎＭである。
【００５２】
【表１】
2017531434.tif 000003
【００５３】
Ｍａｂ１０１の重鎖をκ軽鎖遺伝子（κライブラリー）及びλ軽鎖遺伝子（λライブラリー）で再組換えした。ヒトＶＥＧＦＲ２とマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してλライブラリーをパニングすることにより、２０個の固有のλ軽鎖変異体を見出した。ヒトＶＥＧＦＲ２とマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してκライブラリーをパニングすることにより、２２個の固有のκ軽鎖変異体を見出した。表２は軽鎖のＣＤＲ及び可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Ｍａｂ１０５、１０６、及び１０７のＫｄ値は約１０倍増加した（それぞれ０．２４ｎＭ、０．２２ｎＭ、０．１２ｎＭ）。親抗体と同様、これらの抗体はＶＥＧＦＲ２に結合してＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦＲ２との結合を遮断し、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫのリン酸化を阻害する（図４）。
【００５４】
抗体のうちいくつか（Ｍａｂ１３８、１３９、１４０、１４６など）は、マウスＶＥＧＦＲ２とも交差反応する。これらの抗体も、ＶＥＧＦＲ２及び下流シグナル伝達分子（ＭＡＰＫなど）のＶＥＧＦ−Ａが刺激するリン酸化を阻害した。
【００５５】
【表２】
2017531434.tif 000004
【００５６】
本発明は、表１及び表２に記載の配列から選択される１個、２個、又は３個の重鎖ＣＤＲと１個、２個、又は３個の軽鎖ＣＤＲとを含む、単離されたＶＥＧＦＲ２抗体とそのＶＥＧＦＲ２結合性断片を提供する。本発明の抗体では、２個以上のＣＤＲが表１及び表２に示す配列から選択される場合、それらの別々のＣＤＲはこれらの表に示す同じモノクローナル抗体から選択される必要はなく、表に示す２個以上の抗体可変ドメインから選択されてもよい。特定の態様には以下が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の一態様では、単離されたＶＥＧＦＲ２抗体は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１個、２個、又は３個の重鎖ＣＤＲを含む。本発明の一態様では、抗体は、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７を有する１個、２個、又は３個の軽鎖ＣＤＲを含む。別の態様では、抗体は、表１又は表２に示す配列を有する１個、２個、又は３個の軽鎖ＣＤＲを含む。抗体の例としては、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７のうちの１個以上、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１のうちの１個以上、又は配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５のうちの１個以上を含む軽鎖可変領域が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の態様では、ＶＥＧＦＲ２抗体は、配列番号４又は配列番号１２を含む重鎖可変ドメインを含む。特定の態様では、ＶＥＧＦＲ２抗体は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号３５を含む軽鎖可変ドメインを含む。特定の態様では、抗体は、上記の重鎖可変ドメインのうちの１個と上記の軽鎖可変ドメインのうちの１個を含む。特定の態様では、ＶＥＧＦＲ２抗体又はその結合性断片は、表１又は表２に示すＣＤＲ及び可変ドメインの配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、１個以上のＣＤＲ又は１個以上の可変ドメインを含む。特定の態様では、本発明の抗体は、本明細書に開示するものと同一のＣＤＲアミノ酸を有し、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一のフレームワークを有する。
【００５７】
「同一性」は、２つの配列を最適に整列するために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮した、２つのアミノ酸配列又は核酸配列が共有する同一の位置の数又は割合を指す。「実質的に同一」は、保存的アミノ酸置換（たとえば１個のアミノ酸を同じ分類の別のアミノ酸で置換すること（たとえば、バリンをグリシンで置換、アルギニンをリシンで置換、など））、あるいはタンパク質の機能を損なわない、アミノ酸配列の位置での１個以上の非保存的置換、欠失、又は挿入のみが異なるアミノ酸配列を意味する。アミノ酸配列は別のアミノ酸配列と少なくとも８０％類似しているのが好ましく、少なくとも８５％類似しているのがより好ましく、少なくとも９０％類似しているのが最も好ましい。配列の類似性を決定するための方法やコンピュータプログラムは公開されており、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）、及びＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。周知のSmith Watermanアルゴリズムも類似性の決定に使用できる。ＢＬＡＳＴプログラムはＮＣＢＩやその他の情報源から一般に利用できる（BLAST Manual, Altschul, et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894；BLAST 2.0（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/））。配列を比較する際、これらの方法は様々な置換、欠失、及び他の改変を考慮する。保存的置換には一般に以下の各群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン。
【００５８】
本発明の抗体は、直接変異、親和性成熟法、ファージ提示法、または鎖の組換えによって結合特性が改善された抗体も含む。親和性及び特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原性結合部位について選別することによって変更又は改善できる。ＣＤＲの変異は様々な方法で行われる。１つの方法は、同一の抗原結合部位の集合において、特定の位置に２０種類すべてのアミノ酸が見いだせるように、個々の残基又は残基の組み合わせをランダム化することである。あるいは、ある範囲のＣＤＲ残基に対してエラープローンＰＣＲ法（複製エラーを利用した遺伝子変異導入法）で変異を誘導する（たとえば、Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)を参照のこと）。たとえば、重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージ提示ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株で増殖させてもよい（たとえば、Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)を参照のこと）。これらの変異誘発法は当業者に公知の多くの方法の例である。
【００５９】
ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体の免疫原性を最小にするため、本発明はヒトの可変ドメイン及び定常ドメイン配列を含む抗体を提供する。この抗体は免疫グロブリンの任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥなど）及びそのサブクラスの抗体であってもよいし、それらの組み合わせでもよい。抗体のクラスは、天然抗体のエフェクター機能（たとえば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を最適化するように選択してよい。
【００６０】
本発明の特定の態様は、ＶＥＧＦＲ２結合性抗体断片の使用を含む。Ｆｖは、６個の超可変ループ（ＣＤＲ）をすべて含む完全な重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む最小の断片である。定常ドメインがない場合、可変ドメインは非共有結合で会合する。ＶＨドメインとＶＬドメインが会合して抗原結合部位を形成するのを可能にするリンカーを用いて重鎖と軽鎖を連結して単鎖ののポリペプチド鎖（「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」）としてもよい。本発明の一態様では、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３である。ｓｃＦｖ断片は全抗体のうち定常ドメインがないため、全抗体よりもかなり小さい。また、ｓｃＦｖ断片には通常の重鎖定常ドメインと他の生体分子との相互作用（特定の態様では望ましくない場合がある）がない。
【００６１】
ＶＨ、ＶＬ（及び必要に応じてＣＬ、ＣＨ１、又は他の定常ドメイン）を含む抗体断片も使用できる。パパイン消化により生成される一価の抗体断片はＦａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を持たない。ペプシン消化により生成される断片はＦ（ａｂ’）２と呼ばれ、重鎖ヒンジを保持し、二価である。このような断片を組換えにより作製してもよい。他に多くの有用な抗原結合性抗体断片が当技術分野で公知であり、二量体型抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三量体型抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、その他の一価及び多価の形態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明は、抗体、その抗原結合性断片、抗体の抗原結合部分の全体又は一部を含むタンパク質の形態であってよい（ただし、これらに限定されるものではない）多価の抗原結合性タンパク質をさらに提供する。多価の抗原結合性タンパク質は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってよい。特異性という用語は、特定の分子が結合できる異なる型の抗原決定基の数を指す。免疫グロブリン分子が１つの型の抗原決定基にのみ結合する場合、その免疫グロブリン分子は単一特異性であり、異なる型の抗原決定基に結合する場合は多重特異性である。
【００６３】
たとえば、二重特異性の多価単鎖抗体は、２つの異なる型のエピトープを認識できる。両方のエピトープが同じ抗原（たとえばＶＥＧＦＲ２）に存在してもよいし、一方はある抗原（たとえばＶＥＧＦＲ２）に、第２のエピトープは別の抗原に存在してもよい。
【００６４】
一態様では、多価単鎖抗体は、可変重鎖断片に連結し（ｓｃＦｖと同様）、可変重鎖断片はさらに別のペプチドリンカーで少なくとも１つの抗原結合ドメインと連結した可変軽鎖断片含む。一般に、このペプチドリンカーは約１５個のアミノ酸残基で構成される。好ましい態様では、ＶＬドメインとＶＨドメインの数は同じである。たとえば、二価単鎖抗体は、ＶＬ−Ｌ１−ＶＨ−Ｌ２−ＶＬ−Ｌ３−ＶＨ、ＶＬ−Ｌ１−ＶＨ−Ｌ２−ＶＨ−Ｌ３−ＶＬ、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ２−ＶＨ−Ｌ３−ＶＬ、又はＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ２−ＶＬ−Ｌ３−ＶＨと表すことができる。三価以上の多価単鎖抗体は、１つ以上の抗体断片が追加のペプチドリンカーによって二価単鎖抗体に連結されている。三価単鎖抗体の一例はＶＬ−Ｌ１−ＶＨ−Ｌ２−ＶＬ−ＬＩ−ＶＨ−Ｌ２−ＶＬ−ＬＩ−ＶＨである。
【００６５】
２つの単鎖抗体を結合して二量体型抗体（二価二量体ともいう）を形成することもできる。二量体型抗体は２本の鎖を有する。二量体型抗体の各鎖は、ＶＨドメインが約５〜１０アミノ酸残基の短いリンカー（たとえば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２）によりＶＬドメインと連結されている。このようなリンカーは、同一鎖上のドメイン間の鎖内対形成を防止するのに十分に短く、そのことにより、異なる鎖上の相補ドメイン間の鎖間対形成を引き起こし、２個の抗原結合部位を再形成する。二量体型抗体の構造は強固で小さく、抗原結合部位は分子の互いに反対側の末端にある。二量体型抗体は単一特異性でも二重特異性でもよい。
【００６６】
３つの単鎖抗体を結合して三量体型抗体（三価三量体）を形成することもできる。態様によっては、ＶＬ又はＶＨドメインのカルボキシ末端をＶＨ又はＶＬドメインのアミノ末端に直接（すなわちリンカー配列なしで）融合した三量体型抗体を構築する。三量体型抗体にはＦｖの頭部が３個あり、それらのポリペプチドは環状に、互いに頭−尾形式で配置されている。三量体型抗体分子の可能な立体配座は平面状で、３つの結合部位が互いに１２０度の角度で平面内に位置する。三量体型抗体は、単一特異性でも二重特異性でも三重特異性でもよい。
【００６７】
なお、本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、予防又は治療の目的で哺乳動物に使用される場合、医薬的に許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されることは自明である。医薬的に許容される適切な担体としては、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びそれらの組み合わせのうち１種以上が挙げられる。医薬的に許容される担体は、抗体の有効期間を延長、又は有効性を増強する微量の補助物質（たとえば、湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝剤）をさらに含んでもよい。
【００６８】
本発明の方法では、治療に有効な量の本発明の抗体を、それを必要とする哺乳動物に投与する。本明細書で使用する「投与」という用語は、所望の結果を達成し得る任意の方法で本発明の抗体を哺乳動物に送達することを意味する。本発明の抗体は、たとえば静脈内又は筋肉内に投与されてもよい。本発明のヒト抗体は、ヒトへの投与に特に有用であるが、他の哺乳動物にも投与されてもよい。本明細書で使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト、実験動物、愛玩動物、及び家畜を包含するものとする（ただし、これらに限定されるものではない）。「治療に有効な量」は、哺乳動物に投与されたときにキナーゼ活性の阻害などの所望の治療効果をもたらすのに有効な本発明の抗体の量を意味する。たとえば、疾患に応じて、抗体の場合、それには０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０．０ｍｇ／ｋｇが必要となる可能性がある。分子質量が１５０，０００ｇ／モルのＩｇＧ（２つの結合部位）の場合、これらの用量は、５Ｌの血液量に対して約１８ｎＭ、１８０ｎＭ、５４０ｎＭ、１．０８μＭ、１．８μＭの結合部位に相当する。
【００６９】
本発明の抗体は、腫瘍成長、腫瘍成長に関連する血管新生、又は血管新生に関連する他の病的状態を阻害するのに有用である。治療できる腫瘍には、原発性腫瘍、転移性腫瘍、及び難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍としては、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独、又はそれらの組み合わせによる治療に反応がないか耐性がある腫瘍が含まれる。難治性腫瘍はさらに、そのような作用因子によって阻害されると思われるが治療を中断してから５年、場合によっては１０年以上までの間に再発する腫瘍を包含する。この抗体は、血管形成した腫瘍にも血管形成していないか実質的に血管形成していない腫瘍の治療にも有効である。
【００７０】
したがって、治療できる固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、神経膠腫及びリンパ腫が挙げられる。このような腫瘍の例としては、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍（頭頚部腫瘍など）、大腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍（小細胞肺腫瘍と非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍が挙げられる。他の例としては、カポジ肉腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸・腎臓の癌及び肉腫、横紋筋肉腫、膠芽腫（多形膠芽腫が好ましい）、及び平滑筋肉腫が挙げられる。本発明のアンタゴニストが有効な血管形成した皮膚癌の例としては、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び悪性角化細胞（ヒトの悪性角化細胞など）の増殖を抑制することにより治療できる皮膚癌が挙げられる。
非固形腫瘍の例としては、白血病、多発性骨髄腫、及びリンパ腫が挙げられる。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤芽球性白血病、単球性白血病が挙げられる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【００７１】
本発明の抗体は、たとえば血管新生及び／又は炎症を含む過剰な血管新生を特徴とする病的状態（アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、血管腫、血管線維腫、及び乾癬など）の治療又は予防にも使用できる。非腫瘍性の血管新生疾患のその他の例は、未熟児網膜症（後水晶体線維増殖症）、角膜移植片拒絶反応、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、クローン病、自己免疫性腎炎、原発性胆汁性肝硬変、急性膵炎、同種移植片拒絶反応、アレルギー性炎症、接触皮膚炎及び遅延型過敏反応、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、骨粗鬆症、変形性関節症、神経細胞の炎症による認知欠陥（cognition defect）、オスラー・ウェーバー症候群、再狭窄、ならびに真菌、寄生虫、及びウイルス感染症（サイトメガロウイルス感染症など）であるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
過剰な血管新生を特徴とする眼疾患としては、新生血管緑内障、増殖性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、及び黄斑変性が挙げられる。本発明は、眼の疾患及び障害を治療するための方法及び化合物を提供する。一態様では、本発明は、「乾性」及び「湿性」の形態で起こる加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の治療を提供する。ＡＭＤの「湿性」形態は、異常な血管成長（新生血管）による失明を引き起こす。これらの網膜血管からの出血、漏出、及び瘢痕により、最終的には光受容体への不可逆的な損傷が起こる。乾性形態は網膜色素上皮層の萎縮から始まり、眼の中心部にある光受容体（杆体と錐体）の喪失を経て、失明を引き起こす。別の態様では、本発明は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を治療する方法を提供する。脈絡膜新生血管は、新しい血管が脈絡膜でブルッフ膜を貫通して成長し、網膜下腔に侵入する過程であり、他にも原因はあるが特に加齢性の黄斑変性、近視、及び眼球外傷の症状である。別の態様では、本発明は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）又は網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫を治療する方法を提供する。本発明に従って治療可能な他の疾患としては、虹彩新生血管、ブドウ膜炎、新生血管緑内障、および未熟児網膜炎（ＲＯＰ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。治療方法は予防的なもの（たとえば、角膜移植後に角膜血管新生を回避するため、又は線維柱帯切除術での創傷治癒過程を調節するため）であってもよい。
【００７３】
本発明の抗体及び抗原結合性断片は、それを必要とする患者に第２の作用因子と共に投与でき、有利である。たとえば、態様によっては、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体を抗腫瘍剤と共に対象に投与する。態様によっては、ＶＥＧＦＲ２抗体を第２の血管新生阻害剤と共に対象に投与する。態様によっては、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体を抗炎症剤又は免疫抑制剤と共に投与する。
【００７４】
抗腫瘍剤としては、細胞傷害性化学療法剤、標的小分子及び生体分子、ならびに放射線が挙げられる。化学療法剤の例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、インターフェロンα、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、タキソール、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
標的小分子及び生体分子としては、シグナル伝達経路の成分の阻害剤（チロシンキナーゼの調節剤及び受容体チロシンキナーゼの阻害剤など）、及び腫瘍特異的抗原に結合する作用物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腫瘍形成に関与する成長因子受容体の例としては、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、及び上皮成長因子受容体ファミリーの受容体（ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲリガンドに結合してリガンド結合及び／又は受容体活性化を阻害する抗体を含む。たとえば、この作用物質は、受容体二量体又は他のＥＧＦＲファミリーメンバーとのヘテロ二量体の形成を阻止できる。ＥＧＦＲのリガンドとしては、たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、及びベータセルリンが挙げられる。ＥＧＦＲアンタゴニストは外部でＥＧＦＲの細胞外部分に結合するか（それによってリガンドの結合が阻害されてもよいし阻害されなくてもよい）、内部でチロシンキナーゼドメインに結合することができる。ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、たとえばＥＧＦＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することによって、ＥＧＦＲに依存するシグナル伝達を阻害する作用物質がさらに挙げられる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的同等物）などの生体分子や、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤などの小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
小分子阻害剤及び生体由来の阻害剤としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤（ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びセツキシマブなど）、ＨＥＲ２の阻害剤（たとえば、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ−ＤＭ１；Ｔ−ＤＭ１）、及びペルツズマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体及び断片（たとえばベバシズマブ）、ＣＤ２０を阻害する抗体（たとえば、リツキシマブ、イブリツモマブ）、抗ＶＥＧＦＲ抗体（たとえば、ラムシルマブ（ＩＭＣ−１１２１Ｂ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、及びＣＤＰ７９１）、抗ＰＤＧＦＲ抗体、ならびにイマチニブが挙げられる。小分子キナーゼ阻害剤は特定のチロシンキナーゼに特異的であってもよいし、２種以上のキナーゼの阻害剤であってもよい。たとえば、化合物Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン（ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ−７６４７、ＫＤ−０１９としても知られる）は、いくつかの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３）、及びＥｒｂＢ２などが挙げられる）の生体外阻害剤であり、さらに、特定のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する腫瘍の非応答性を引き起こす経路に関与するＳＲＣキナーゼの阻害剤でもある。本発明の一態様では、必要のある対象の治療は、式ＩのＲｈｏ−キナーゼ阻害剤の投与とＫＤ−０１９の投与を含む。
【００７８】
ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５；Bristol-Myers Squibb, New York）は、経口的に生体利用できＡＴＰ部位と競合する別のＳｒｃ阻害剤である。ダサチニブは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）又はフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の患者への使用がＦＤＡに認可されている）、さらにはｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＦＭＳ、ＥｐｈＡ２、及びＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）も標的とする。Ｓｒｃ及びＢｃｒ−Ａｂｌの別の２種類の経口チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）及びサラカチニブ（ＡＺＤ０５３０）である。
【００７９】
ＶＥＧＦＲ２は、血管新生でのＶＥＧＦの下流効果の大部分に関与するが、第２の血管新生阻害剤の投与が好都合な場合がある。本発明の抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、腫瘍成長又は血管新生に関与する他の受容体を中和する抗体と共に投与されてもよい。
【００８０】
ＶＥＧＦ結合性作用物質の例としては、ＶＥＧＦ抗体及びＶＥＧＦトラップ（すなわちＶＥＧＦ受容体のリガンド結合ドメイン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体（ＶＥＧＦ結合性抗体断片を含む）を２つ例示すると、ＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体であるベバシズマブ（アバスチン）とベバシズマブ由来のＦａｂであるラニビズマブ（ルセンティス）が挙げられる。一般に、ＶＥＧＦトラップは１種以上のＶＥＧＦ受容体タンパク質のＶＥＧＦ結合ドメインを含むタンパク質である。ＶＥＧＦトラップとしては、可溶性ＶＥＧＦＲ１、可溶性ニューロピリン１（ＮＲＰ１）、可溶性ＶＥＧＦＲ３（ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに結合する）、及びアフリベルセプト（Zaltrap；Eylea；VEGF Trap R1R2）（ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に融合したヒト血管内皮成長因子受容体ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインのセグメントで構成される）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Conbercept（ＫＨ９０２）は、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１）の細胞外ドメイン２とＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）の細胞外ドメイン３、４をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した融合タンパク質である。ＫＤＲやＦＬＴ１のＩｇ様ドメインを様々な組み合わせで含むいくつかのＶＥＧＦトラップが米国特許第８，２１６，５７５号明細書に開示されている。DARPin（設計されたアンキリン反復タンパク質（designed ankyrin repeat protein）の頭字語）は、一般に高特異性かつ高親和性の標的タンパク質結合を示す、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。DARPin（登録商標）MP0112は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤であり、湿性黄斑変性及び糖尿病性黄斑浮腫の治療に関する臨床試験に入っている。
【００８１】
本発明によれば、ＶＥＧＦの発現を標的とすることができる。たとえば、ＶＥＧＦ阻害剤ＰＴＣ２９９は、ＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’−非翻訳領域に選択的に結合することによって転写後にＶＥＧＦを標的とし、それによってＶＥＧＦの翻訳を防止する。ペガプタニブ（マクジェン）はＶＥＧＦ−１６５に対するＲＮＡアプタマーである。
【００８２】
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は病的血管新生と関連があるとされている。ＰｌＧＦは構造的にはＶＥＧＦに関連し、ＶＥＧＦＲ１のリガンドでもある。したがって、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインを含むＶＥＧＦトラップ（上記参照）はＰｌＧＦを標的とするのに有用である。抗血管新生剤は、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１受容体に結合するものをさらに含む。特定の態様では、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインに結合する抗原結合性タンパク質は、そのリガンドであるＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの一方又は両方による結合を遮断し、かつ／あるいはＶＥＧＦ又はＰｌＧＦに誘導されるＶＥＧＦＲ１の活性化を中和する。
【００８３】
ＰＤＧＦは、ホモ二量体ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、及びヘテロ二量体ＰＤＧＦ−ＡＢを形成する４本のポリペプチド鎖から構成される。ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）α及びβはＰＤＧＦ機能に関与する。特に、ＰＤＧＦＲαはＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＰＤＧＦ−ＣＣに結合し、ＰＤＧＦＲβはＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤと相互作用する。ＰＤＧＦに結合する作用物質の例としては、抗ＰＤＧＦ抗体及びＰＤＧＦトラップが挙げられる。ＰＤＧＦを標的とする作用物質としては、ＰＤＧＦ−Ｂを標的とするペグ化アプタマーであるFovista（商標）（E10030、Ophthotech）、及びＰＤＧＦ−Ｂに結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマーであるＡＸ１０２（Sennino et al., 2007, Cancer Res. 75(15):7359-67）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
本発明の特定の態様では、抗体又はその抗原結合性断片を有効量のＰＤＧＦＲβ抗体と共に対象に投与する。
【００８５】
ＰＤＧＦ受容体を標的とする作用物質としては、抗ＰＤＧＦＲα抗体であるラムシルマブ（ＩＭＣ−３Ｇ３、ヒトＩｇＧ１）、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβの選択的阻害剤（それぞれに対しＩＣ５０＝０．９ｎＭ、ＩＣ５０＝１．８ｎＭ）であるクレノラニブ（ＣＰ−８６８５９６）、ならびにＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβと他のチロシンキナーゼの阻害剤であるニロチニブ（Tasigna（登録商標））が挙げられる。
【００８６】
血管新生阻害剤としては、たとえばＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ受容体又はＰＤＧＦ受容体のリガンド、又は補体が関与するシグナル伝達を遮断する細胞内作用因子が挙げられる。血管新生阻害剤を阻害する細胞内作用因子としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない。スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）は、ＶＥＧＦＲ１〜ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ、幹細胞因子受容体（ｃ−Ｋｉｔ）、ＦＬＴ３、及びコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）の汎特異的な小分子阻害剤である。アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６；Inlyta）は、ＶＥＧＦＲ１〜ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲ、及びｃ−Ｋｉｔを阻害する別の小分子チロシンキナーゼ阻害剤である。セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）は、ＶＥＧＦＲ１〜ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲβ、及びｃ−Ｋｉｔの阻害剤である。ソラフェニブ（ネクサバール）は、いくつかのチロシンタンパク質キナーゼ（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、及びＲａｆキナーゼなど）に対する別の小分子阻害剤である。パゾパニブ（ヴォトリエント；ＧＷ７８６０３４）は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｃ−Ｋｉｔ、及びＰＤＧＦＲを阻害する。フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９；ＸＬ８８０）はカボザンチニブ（Cometriq；ＸＬ１８４）と同様、ＶＥＧＦＲ２及びＭＥＴを阻害する。ポナチニブ（アイクルシグ；ＡＰ２４５３４）は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、及びｃ−Ｋｉｔを阻害する。チボザニブ（ＡＶ−９５１）は、ピコモル濃度でＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３を阻害する。ＣＰ−５４７６３２はＶＥＧＦＲ２及び塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のキナーゼの強力な阻害剤である。Ｅ−３８１０（（６−（７−（（１−アミノシクロプロピル）メトキシ）−６−メトキシキノリン−４−イルオキシ）−Ｎ−メチル−１−ナフトアミド）は、ナノモルの範囲でキナーゼＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、及びＦＧＦＲ２を阻害する。ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）は、ＦＧＦ受容体のシグナル伝達も阻害するＶＥＧＦＲ２阻害剤である。ＣＴ−３２２（アドネクチン）は、ヒトフィブロネクチンドメインに基づく小さなタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ２に結合してその活性化を阻害する。バンデタニブ（カプレルサ；ザクティマ；ＺＤ６４７４）は、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、及びＲＥＴのチロシンキナーゼの阻害剤である。Ｘ−８２（Xcovery）は、成長因子受容体ＶＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲによるシグナル伝達の小分子インドリノン阻害剤である。
【００８７】
特定の態様では、本発明の抗ＶＥＧＦＲ抗体をマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤と共投与する。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）（ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−２４など）は、細胞外基質（ＥＣＭ）と基底膜の成分を切断し、それにより、下位にある間質基質に癌細胞が貫通し浸潤するのを可能にする。さらに、多くの成長因子受容体、細胞接着分子、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシスリガンド、及び血管新生因子がＭＭＰの基質である。したがって、ＭＭＰ活性は、成長因子の活性化、腫瘍細胞のアポトーシスの抑制、宿主の免疫反応によって生じるケモカイン勾配の崩壊、又は血管新生因子の放出を引き起こすことができる。ＭＭＰは、特異的結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合するインスリン様成長因子などの細胞増殖因子の放出を促すことによって腫瘍成長を促進できる（Manes et al., 1997 J. Biol. Chem. 272: 25706-25712）。
【００８８】
黒色腫や大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、及び膀胱癌ではＭＭＰ−２などのコラゲナーゼがより高い濃度で見つかっている。通常、このように濃度がより高いことは、腫瘍の悪性度と侵襲性がより高いことと相関性がある。ＭＭＰ−２濃度は、転移性肺癌の患者の血清中では有意に上昇し、濃度の高い患者では化学療法に対する反応が低くなる。ｐｒｏＭＭＰ−２を切断して活性ＭＭＰ−２を放出するＭＭＰ−１４は多くの癌で上昇し、腫瘍の成長、腫瘍塞栓症、癌（たとえば、ＣＮＳ腫瘍（たとえば神経膠腫）、頭頚部癌、口腔癌、喉頭癌、軟骨肉腫、乳癌）の移動性、浸潤性、及び転移に寄与する可能性がある。ＭＭＰ−１６及びＭＭＰ−２４も多くの癌で上昇し、腫瘍の成長にも癌（たとえば、乳癌、喉頭癌、卵巣癌、精巣癌、黒色腫、脳腫瘍（たとえば、星細胞腫、膠芽腫、神経膠腫））の浸潤性及び転移にも寄与する可能性がある。
【００８９】
特定の態様では、本発明の抗ＶＥＧＦＲ抗体をＭＭＰ−１４アンタゴニスト（米国特許第７，７４５，５８７号及び第８，１０６，１６８号明細書に開示されている抗ＭＭＰ−１４抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない）と共投与する。一態様では、抗体はヒトモノクローナル抗体ＤＸ−２４００（Dyax Corp）である。このような抗体との共投与は、ヒトの癌（子宮頚癌、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、頭頚部癌、悪性脳腫瘍、及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の治療に適している。
【００９０】
別の態様では、本発明のＶＥＧＦＲ２抗体を１種以上の適切な補助剤（たとえば、サイトカイン（たとえばＩＬ−１０及びＩＬ−１３）又はその他の免疫刺激物質など）と組み合わせて投与できる。しかし、当然であるが、抗ＫＤＲ抗体のみの投与は、治療に有効な形で腫瘍の進行を予防、阻害又は低減するのに十分である。
【００９１】
抗炎症剤及び免疫抑制剤としては、グルココルチコイド（たとえばデキサメタゾン）などのステロイド系薬物、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリン、フィンゴリモド、インターフェロン（ＩＦＮβ又はＩＦＮγなど）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）結合性タンパク質（インフリキシマブ（レミケード）、エタネルセプト（エンブレル）、又はアダリムマブ（ヒュミラ）など）、及びミコフェノール酸が挙げられる。
【００９２】
特定の態様は、本発明の抗体と以下のような第２の作用物質を投与することを含む：ドセタキセル（乳癌、尿路癌、腎臓癌などの固形腫瘍）；パクリタキセル（固形腫瘍、胃腺腫）；ＦＯＬＦＲＩ（すなわち、イリノテカン、フォリン酸、５−フルオロウラシル）（大腸癌）；カペシタビン（乳癌）；ＦＯＬＦＯＸ（すなわち、オキサリプラチン、ロイコボリン、５−フルオロウラシル）（胃癌、食道癌、胃食道癌）；エリブリン（乳癌）；ＦＯＬＦＩＲＩ（すなわち、イリノテカン、レボホリナート、５−フルオロウラシル）（大腸癌）；カルボプラチン（ＮＳＣＬＣ）、ミトキサントロン、及びプレドニゾン（前立腺癌）；ＯＦＦ（オキサリプラチン、フォリン酸、５−フルオロウラシル）（大腸癌）；イリノテカン及びセツキシマブ（大腸癌）；ならびにダカルバジン（悪性黒色腫）。
【００９３】
本発明の抗体と抗原結合性断片を、たとえば、細胞傷害性薬物、細胞毒素、酵素、又は放射性同位体などの作用物質に結合させてもよい。この方法は、結合性タンパク質を単独で、又は作用物質（たとえば細胞傷害性薬物）と結合させて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。たとえば、ＶＥＧＦＲ２抗体又はその断片を用いて、ＶＥＧＦＲ２に関連する細胞又は組織（たとえば腫瘍）に毒素などの作用物質を含有するナノ粒子を送達してもよい。
【００９４】
ＶＥＧＦＲ２結合性タンパク質を生体内で直接使用して天然の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって抗原発現細胞を除去することができる。本明細書に記載の結合性タンパク質は、補体結合性エフェクタードメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３由来のＦｃ部分、あるいは補体に結合するＩｇＭの相当部分など）を含んでもよい。
【００９５】
本発明のＶＥＧＦＲ２抗体を第２の作用物質と共に投与する場合、第１の作用物質と第２の作用物質は、逐次的に投与されても同時に投与されてもよい。各作用物質は１回の投与量でも複数回の投与量でも投与でき、その投与量を任意の計画（１日２回、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回などが挙げられるが、これらに限定されるものではない）で投与できる。
【００９６】
本発明は補助的投与も含む。補助的投与は、疾患又はその症状を治療するために既に投与されている第１の作用物質に加えて第２の作用物質を患者に投与することを意味する。態様によっては、補助的投与は、第１の作用物質の投与によってその疾患又はその症状が治療されなかったか十分に治療されなかった患者に第２の作用物質を投与することを含む。他の態様では、補助的投与は、第１の作用物質の投与によって疾患が有効に治療された患者に第２の作用物質を投与することを含む。
【００９７】
本発明の一態様では、抗体又はその抗原結合性断片を注射によって投与し、小分子を経口投与する。そのような一態様では、抗体は１週間に１回、又は１ヶ月に１〜２回投与され、小分子は毎日投与される。
【００９８】
本発明の一態様では、抗体又はその抗原結合性断片を注射によって投与し、ＲＯＣＫ２阻害剤を経口投与する。好ましい態様では、作用物質を１日に１回投与する。本発明によれば、眼の疾患の治療のためにＲＯＣＫ阻害剤又はＶＥＧＦＲ２抗体を対象に投与する場合、瘢痕を低減又は予防するためにＴＧＦ−βアンタゴニストをその対象に投与してもよい。たとえば、本発明の一態様では、眼の障害の治療のためにＲＯＣＫ阻害剤を投与する場合、ＴＧＦ−βも投与する。別の態様では、目の障害の治療のためにＶＥＧＦアンタゴニストを対象に投与する場合、ＴＧＦ−βアンタゴニストも投与する。本発明の別の態様では、目の障害の治療のためにＲＯＣＫ阻害剤とＶＥＧＦアンタゴニストを対象に投与する場合、ＴＧＦ−βアンタゴニストも投与する。新生血管を伴う眼の疾患では、新たな血管の漏出に続いて瘢痕（たとえば円板状の瘢痕）が形成される。本発明は、眼の疾患での新生血管を治療するためにＶＥＧＦアンタゴニスト及びＲＯＣＫ２阻害剤と共にＴＧＦ−βアンタゴニストを対象に投与することを含む。
【００９９】
有用なＴＧＦ−βアンタゴニストとしては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されるものではない）：（ｉ）抗ＴＧＦ−β抗体とその抗原結合性断片（汎ＴＧＦ−β抗体ＧＣ−１００８（Genzyme）、抗ＴＧＦ−β１抗体メテリムマブ（ＣＡＴ−１９２）（Cambridge Antibody Technology）、及びこれらの抗体の抗原結合性断片など）；（ｉｉ）可溶性ＴＧＦ−β受容体又はそのリガンド結合性断片（ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩの膜近位のリガンド結合性ドメインのアミノ酸７３０位〜７４３位を含む合成ペプチドであるＰ１４４（Esparza-Lopez et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(18):14588-96）、及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合物（Smith, J. et al., 1999, Circulation Res. 84:1212-22）など）；（ｉｉｉ）ＴＧＦ−βの１つ以上のアイソフォームを遮断するＴＧＦ−β受容体結合性ペプチド（Huang et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:27155-59に開示されている、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３に由来する２５個のアミノ酸からなるＴＧＦ−β受容体結合性ペプチドなど）；ならびに（ｉｖ）ＴＧＦ−βの合成を阻害するアンチセンス剤（ＴＧＦ−β２の合成を阻害するオリゴヌクレオチドであるトラベデルセン（Antisense Pharma GmbH）など）。国際公開第２００６／０５２５６８号、第０２／０９４８３３号、第０４／０４８３８２号、第０４／０４８３８１号、第０４／０５０６５９号、第０４／０２１９８９号、第０４／０２６８７１号、及び第０４／０２６３０７号パンフレットにはさらにアンタゴニストが開示されている。
【０１００】
本発明の特定の態様では、抗体又はその抗原結合性断片を有効量のＰＤ−Ｌ１抗体（米国特許仮出願第６１／９２７，９０７号及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／１１６５７号明細書を参照のこと；これらの内容全体を参照により本明細書に援用する）と共に対象に投与する。
【０１０１】
特定の態様では、化合物又は組成物の１回分の投与量を、毎日、１日おき、２日毎、３日毎、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、又は２週間に１回、対象に投与する。他の態様では、化合物又は組成物の２回分、３回分、又は４回分の投与量を、毎日、２日毎、３日毎、１週間に１回、又は２週間に１回、対象に投与する。態様によっては、１回分または複数回分の投与量の化合物又は組成物を、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、又は２１日間投与する。特定の態様では、１回分の投与量の化合物又は組成物を、１ヶ月間、１．５ヶ月間、２ヶ月間、２．５ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、又はそれ以上、投与する。
【０１０２】
投与方法としては、非経口投与、皮内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻内投与、硬膜外投与、経口投与、舌下投与、鼻内投与、脳内投与、膣内投与、経皮投与、経粘膜投与、直腸投与、吸入投与、又は局所投与（特に、耳、鼻、目、又は皮膚への）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。投与の様式は投与を行う者の判断に委ねられる。ほとんどの場合、投与によって血流中に化合物が放出される。眼の疾患の治療の場合、生物由来物質の硝子体内投与が好ましい。
【０１０３】
特定の態様では、化合物の局所投与が望ましい場合がある。これは、たとえば、局所点滴、局所使用、注射、カテーテル手段、又は留置剤によって達成できるが、これらに限定されるものではない。前記留置剤は、多孔性、非多孔性、又はゼラチン状の物質であり、膜（シラスティック膜など）や繊維を含む。このような場合、投与は、化合物を血流中に実質的に放出することなく、局所組織を選択的に標的とすることができる。
【０１０４】
肺投与（たとえば、吸入器か噴霧器とエアロゾル化剤を含む製剤を使用するか、フルオロカーボン又は合成肺胞界面活性剤での灌流による）も採用できる。特定の態様では、化合物をの従来の結合剤及び溶媒（トリグリセリドなど）と共に坐剤として製剤化する。
【０１０５】
別の態様では、小胞、特にリポソーム中に化合物を送達する（以下を参照のこと：Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)；Lopez Berestein（同書）、pp.317-327（同書全体を参照のこと））。
【０１０６】
別の態様では、徐放システムで化合物を送達する（たとえば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release（上記文献）, vol. 2, pp. 115 - 138 (1984)を参照のこと）。Langer, 1990, Science 249:1527-1533による概説に記載されている徐放システムの例を用いてもよい。一態様では、ポンプを使用してもよい（Langerの上記文献；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照のこと）。別の態様では、ポリマー材料を用いてもよい（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照のこと；また、Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照のこと）。
【０１０７】
上記の投与計画は、例示のためにのみ示すものであり、限定として解釈されるべきではない。当業者は容易に理解することであるが、あらゆる投与が本発明の範囲に含まれる。
【０１０８】
本明細書に開示された発明の原理の変形が当業者によってなされてもよいことが理解かつ期待されるべきであり、そのような変更も本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１０９】
本願全体で様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物は、本発明が属する技術水準をより完全に説明するために、参照によりその全体が本願に援用される。以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
ＶＥＧＦＲのドメイン２及び３に結合してリガンド結合を遮断する抗体の確認
【０１１１】
表１で確認した、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合してこれを中和する２個の抗体をヒトＦａｂファージ提示ライブラリーから単離した。これらの抗体は、リガンドＶＥＧＦ−ＡのｈＶＥＧＦＲ２との結合を遮断する（図２）。これらの抗体はさらに、ＫＤＲを発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞と結合し、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫのリン酸化を阻害する（図３）。表１は、それらの抗体のＣＤＲ及び可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Ｍａｂ１０１及びＭａｂ１０２のＫｄ値は、それぞれ約６．６ｍＭ及び１．７ｎＭである。
【０１１２】
Ｍａｂ１０１の重鎖をκ軽鎖遺伝子（κライブラリー）及びλ軽鎖遺伝子（λライブラリー）で再組換えした。ヒトＶＥＧＦＲ２とマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してλライブラリーをパニングすることにより、２０個の固有のλ軽鎖変異体を見出した。ヒトＶＥＧＦＲ２とマウスＶＥＧＦＲ２の両方に対してκライブラリーをパニングすることにより、２２個の固有のκ軽鎖変異体を見出した。表２は軽鎖のＣＤＲ及び可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Ｍａｂ１０５、１０６、及び１０７のＫｄ値は約１０倍増加した（それぞれ０．２４ｎＭ、０．２２ｎＭ、０．１２ｎＭ）（表３）。これらの抗体と、その由来である抗体Ｍａｂ１０１は、ＶＥＧＦＲのドメイン２及び３に結合し、これらのドメインを含む構築物にも結合する。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
親抗体と同様、これらの抗体はＶＥＧＦＲ２に結合してＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦＲ２との結合を遮断し（図４）、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫのリン酸化を阻害する（図５）。
【０１１５】
抗体のうちいくつか（Ｍａｂ１３８、１３９、１４０、１４６など）はマウスＶＥＧＦＲ２とも交差反応した。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
Ｍａｂ１３８、１３９、及び１４０は、ＶＥＧＦ−Ａに刺激されるＶＥＧＦＲ２及び下流シグナル伝達分子（ＭＡＰＫなど）のリン酸化を阻害した。
【０１１８】
（実施例２）
生体内での腫瘍成長の阻害
【０１１９】
６〜８週齢の性別を一致させた（雌）ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、１３７Ｃｓガンマ線源から約０．９Ｇｙ／分の線量率で３．５Ｇｙを照射し、２×１０７個のＨＬ６０細胞を静脈内接種する。腫瘍接種の３日後、マウスの群を様々な投与量のＭａｂ１０６で週に２回治療し、生存期間について記録する。
治療しなかったマウスは約２週間以内にすべて死亡した。腫瘍量が多くても、１０ｍｇ／ｋｇのＭａｂ１０６でマウスを治療した場合の生存時間は２８日まで延長される。
【０１２０】
（実施例３）
ヒト患者の大腸癌の治療
【０１２１】
大腸癌と診断されたヒト対象を処置群に分け、標準の化学療法計画を行う。２つの患者群を、週に１回、５ｍｇ／ｋｇ／週又は１５ｍｇ／ｋｇ／週で４ヶ月間治療する。対照群には、標準の化学療法計画のみを行う。腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で定期的に評価する。対照群と比較すると、週に１回の抗体治療を受けた患者は、抗体治療を受けない患者に比べて腫瘍成長又は腫瘍サイズの有意な低減、より高い進行遅延性又は生存期間の延長を示すと予想される。
【０１２２】
Ｍａｂ１０１の重鎖を含むＭａｂ１３８（表２）（配列番号４；図６Ａを参照のこと）を親和性成熟のために選択した。軽鎖のＣＤＲ３と重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に変異を導入した。得られたライブラリーをヒト及びマウスのＶＥＧＦＲ２に対してパニングした。表５は、得られた抗体のうちの５個の抗体の重鎖と軽鎖のＣＤＲ及び可変ドメインのアミノ酸配列を示す。図６は、Ｍａｂ１３８の重鎖（配列番号４）及びκ軽鎖（すなわち配列番号１６０）との配列の比較を示す。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
ヒト、マウス、及びラットのＶＥＧＦＲ２に対するＭａｂ１４７及びＭａｂ１４９と親であるＭａｂ１３８の結合定数をBiacore分析により決定した（表６）。
【表６】
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【０１２５】
Ｍａｂ１４７の受容体結合特性とリガンド遮断特性についてＥＬＩＳＡで試験した。Ｍａｂ１４７は、可溶性ｈＶＥＧＦＲ２と可溶性ｍＶＥＧＦＲ２の両方に同様の親和性で結合する（図７Ａ）。Ｍａｂ１４７は、ｈＶＥＧＦＲ特異的対照抗体と同様にｈＶＥＧＦＲ２とのリガンド結合を遮断し、さらにｍＶＥＧＦＲ２特異的対照抗体と同様にｍＶＥＧＦＲ２とのリガンド結合を遮断する（図７Ｂ）。
【０１２６】
細胞膜で発現されたｈＶＥＧＦＲ２及びｍＶＥＧＦＲ２とのＭａｂ１４７の結合も確認した。図８Ａは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＫＤＲ（すなわちヒトＶＥＧＦＲ２）を過剰発現するブタ動脈内皮（ＰＡＥ）細胞によって発現されるｈＶＥＧＦＲ２との結合を示す。Ｍａｂ１４７は、ＭＳ１マウス内皮細胞によって発現されるｍＶＥＧＦＲにも結合した（図８Ｂ）。
【０１２７】
Ｍａｂ１４７は、ＫＤＲ及びｐ４２／４４のリン酸化の減少が示すように、ＫＤＲ−ＰＡＥ細胞（図９Ａ）及びＨＵＶＥＣ（図９Ｂ）内で、ＶＥＧＦＲ２が関与するシグナル伝達を阻害する。Ｍａｂ１０６及びＭａｂ１４７は、ＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の増殖を阻害し（図１０Ａ）、さらにはＶＥＧＦに誘導されるＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の移動を阻害する（図１０Ｂ）。ＶＥＧＦに誘導されるＫＤＲ−ＰＡＥ細胞の移動の阻害に対するＭａｂ１４７の効果も図１１に示す。
【０１２８】
Ｍａｂ１４７は、ｍＶＥＧＦＲ２のリン酸化の減少が示すように（図１２Ａ）、ＶＥＧＦＲ２が関与するシグナル伝達をマウスＥＯＭＡ細胞内でも阻害する。ＦＡＣＳ試験により、Ｍａｂ１４７がＥＯＭＡ細胞とより高い結合性を有することが対照抗体との比較で実証された（図１２Ｂ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ１】
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【図１Ｂ２】
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【図１Ｂ３】
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【図１Ｃ１】
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【図１Ｃ２】
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【図１Ｃ３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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