(57)【要約】本明細書において、多量体インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチン、ならびに特にインフルエンザの検出、予防および／または治療におけるそれらの使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、少なくとも第１および第２のインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体を含み、前記第１および第２の単量体は、それぞれ、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインに結合しており、前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘ、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜Ｃ末端アミノ酸を含み、
（ｃ）ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まず、
（ｄ）前記第１の単量体は、前記第１の単量体の４１１位上のアミノ酸および前記第２の単量体の４１９位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋により前記第２の単量体に結合しているポリペプチド。
【請求項２】
三量体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが、系統発生グループ１に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ｘ＝配列番号１の５２位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番号１の３２１位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが、系統発生グループ２に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
それぞれのインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体の前記ＨＡ２ドメインが、トランケートされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
５１９位からＣ末端アミノ酸までの前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
５３０位からＣ末端アミノ酸までの前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が、場合によりリンカーを介して連結しているアミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）により置き換えられている、請求項８、９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
それぞれのインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体の前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントの前記Ｃ末端アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
それぞれのインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体について、アミノ酸配列ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１９３）が４１９〜４３３位において導入されており、または配列ＲＭＣＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号１９４）が４１７〜４３３位において導入されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＨＡ１ドメインおよび／または前記ＨＡ２ドメイン中の１つ以上のさらなる突然変異を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する、請求項１〜５、８〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
抗体ＣＲ８０２０および／またはＣＲ８０５７に結合しない、請求項１〜５、８〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
抗体ＣＲ８０２０に選択的に結合する、請求項６〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび／または請求項１８に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項２１】
医薬品として使用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載の核酸分子、および／または請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導において使用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載の核酸分子、および／または請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
ワクチンとして使用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載の核酸分子、および／または請求項１９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンならびに特にインフルエンザの検出、予防および／または治療におけるそれらの使用方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、無症状感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」または「インフルエンザ（ｔｈｅ  ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす。感染の臨床効果は、インフルエンザ株の病原性ならびに宿主の曝露、既往歴、年齢、および免疫状態により変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスによる感染を受け、３〜５百万症例の重病および推定３００，０００から５００，０００のインフルエンザ関連死をもたらすことが推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１またはＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、３つ全ての代表物は季節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種実施は、有効な季節性インフルエンザワクチンの適時産生を可能とするための循環インフルエンザウイルスの早期同定に依存する。次の季節の間に優性となる株の予測の固有の困難性とは別に、抗ウイルス耐性および免疫回避も、現在のワクチンが罹患および死亡を予防することができない一因である。これに加え、病原体保有動物から生じ、ヒトからヒトへの拡散を増加させるようにリアソートされた高度に病原性のウイルス株により引き起こされる流行病の可能性は、グローバルヘルスにとって顕著で現実的な脅威となる。
【０００３】
インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類および哺乳動物に感染し得る。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。これらのゲノムは、１１の異なるタンパク質、１つの核タンパク質（ＮＰ）、３つのポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、３つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、およびＰＢ１−Ｆ２）、および２つの外部糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ウイルスは、ＨＡおよびＮＡタンパク質の抗原構造の差に基づき分類され、それらの異なる組合せは、規定のインフルエンザウイルス株にさらに分類されるユニークなウイルス亜型を表す。全ての公知の亜型は鳥類において見出すことができるが、現在循環するヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２である。系統発生分析は、ヘマグルチニンの２つの主群への下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４およびＨ７亜型。
【０００４】
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密にはヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的および抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統により表わされるとおり、ヒトにおいて循環している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患のスペクトルは、インフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも一般に軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻繁に観察される。
【０００５】
インフルエンザを中和する抗体が主としてヘマグルチニン（ＨＡ）に対して指向されることは公知である。ヘマグルチニンまたはＨＡは、ウイルスコートにアンカリングされ、二重の機能を有する三量体糖タンパク質であり：それは細胞表面受容体シアル酸への結合を担い、取り込み後、それはウイルスおよびエンドソーム膜の融合を媒介し、細胞の細胞質ゾル中でのウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大型の頭部ドメインおよびより小型のステムドメインを含む。ウイルス膜への付着は、ステムドメインに連結されたＣ末端アンカリング配列により媒介される。タンパク質は、特定のループで翻訳後開裂されて２つのポリペプチドＨＡ１およびＨＡ２を生じさせる（全配列は、ＨＡ０と称される）。膜遠位頭部領域は、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステム領域は、主としてＨＡ２に由来する（図１）。
【０００６】
季節性インフルエンザワクチンを毎年アップデートしなければならない理由は、ウイルスの大きい変異性である。ヘマグルチニン分子において、この変異は、抗原ドリフトおよびシフトが多数の異なるバリアントをもたらした頭部ドメイン中で特に顕在化される。これは、免疫優性の区域でもあるため、ほとんどの中和抗体はこのドメインに対して指向され、受容体結合を妨げることにより作用する。頭部ドメインの免疫優性および大きい変異の組合せは、なぜ特定の株による感染が他の株に対する免疫をもたらさないかも説明し：第１の感染により誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連する限定数の株を認識するにすぎない。
【０００７】
近年、全てまたは実質的に全てのインフルエンザヘマグルチニン球状頭部ドメインを欠くインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドが記載されており、ステムドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使用されている。ステムドメインポリペプチドのエピトープは、球状頭部ドメインの高度に免疫原性の領域よりも免疫原性でなく、したがってステムドメインポリペプチド中の球状頭部ドメインの不存在がステムドメインポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免疫応答の発現を許容し得ると考えられている（Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１のアミノ酸残基５３から２７６をＨＡ一次配列から欠失させ、これを短いフレキシブル結合配列ＧＧＧＧにより置き換えることにより新規分子を作出した。Ｈ３ＨＫ６８構築物によるマウスのワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６において示されるとおり、ステムドメインポリペプチドは高度に不安定であり、ステム領域中の保存エピトープに結合することが示された抗体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造を採用しなかった。
【０００８】
さらに、Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、ＨＡ２のアミノ酸残基１〜１７２、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基７〜４６、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡに続くＨＡ１の残基２９０〜３２１を、ＨＡ１中の突然変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２ＴおよびＣ３０５Ｔとともに含むＨＡ２ベースポリペプチドを記載した。設計は、Ｈ３ＨＡ（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８）の配列をベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対する交差保護を提供したにすぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）によるより近年の論文において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４からのＨＡをベースとするステムドメイン配列（Ｈ１ＨＡ０ＨＡ６）が記載されている。このポリペプチドにおいて、残基５５から３０２の相当物が欠失しており、突然変異Ｉ３１１Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｎ、Ｃ３１９Ｓ、Ｆ４０６Ｄ、Ｆ４０９Ｔ、およびＬ４１６Ｄが作製されている。Ｈ３およびＨＡベースポリペプチドの両方が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、したがって、天然ＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、ポリペプチドは、主として高分子量凝集物および微量単量体分画として回収される。ポリペプチドは、９および０．２μＭの２つの見かけの解離定数でＣＲ６２６１に結合する。著者らは、マウスが、１００μｇのＣｐＧ７９０９がアジュバント添加された２０μｇのタンパク質による免疫化（２回、４週間の間隔）後、１ＬＤ９０の同種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４ウイルスによるチャレンジを生存し得ることを示す。著者らは、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来ポリペプチドについて上記のものと同等の環状に並べ替えられたポリペプチドも記載する。これらのポリペプチドは、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／２０／９９またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨＡに由来し、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（すなわち、同一亜型内）のマウスにおける軽度チャレンジ（１ＬＤ９０）モデルの部分的保護を提供し得る。これらのポリペプチドにより免疫化されたモルモットからの血清は、中和アッセイにおいて試験された場合に検出可能レベルの中和を示さなかった。
【０００９】
より近年、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）も、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９のＨＡに由来する可溶性ステムドメインポリペプチドを記載した。最終設計において、残基５４〜３０３（配列番号１による番号付与）の相当物が欠失しており（リーダー配列、残基１〜１７も存在しない）、２つの突然変異がタンパク質のＢループ、すなわち、Ｆ４０７Ｄ、およびＬ４１３Ｄ中に導入されている。さらに、ポリペプチドは、Ｃ末端三量体化ドメイン（ｆｏｌｄｏｎ）を含有した。さらに、２つの単量体間ジスルフィド架橋が、三量体ｆｏｌｄｏｎドメインの区域中に１つ、ならびに４３０および４３１位に１つ導入された。ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベース無細胞系中で産生され（したがって、天然ＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く）、使用前にリフォールドさせる必要がある変性形態で回収される。インフルエンザチャレンジデータから免疫学的または保護は示されなかったので、このポリペプチドの免疫原性および効果は不明である。
【００１０】
近年の論文において、Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）も、ステムドメインポリペプチドを報告している。この設計において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４からのＨＡをベースとして、ＨＡ１配列の大部分が欠失しているだけでなく（残基４２から２８９、配列番号１による番号付与）、ＨＡ２のＮおよびＣ末端配列の大部分も欠失している（それぞれ、残基３４４から３８３、および４５７から５６５）。Ｈ３ＨＡタンパク質において、欠失部分が広域中和エピトープ、例えば、ＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３のものを含有することは、特筆すべきである。ポリペプチドは、Ｃ末端におけるｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメインも含有し、さらに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されるため、ウイルスＨＡ上の天然グリカンを欠く。ポリペプチドは広域中和抗体に結合し、それはＣＲ６２６１、Ｆ１０およびＦＩ６ｖ３である。ポリペプチドは、インフルエンザチャレンジモデル（１ＬＤ９０のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４）においても試験し、マウスを死亡から保護し得た。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のＨＡに由来する相当ポリペプチドも、部分的に保護し得た。Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４に由来する相当ポリペプチドは、このチャレンジモデルにおいて限定された保護のみを与えた。さらに、１つのみのインフルエンザ株を使用して比較的低い投与用量（１〜２ＬＤ９０）で動物をチャレンジしたため、ユニバーサルワクチンの前提条件である複数のインフルエンザ株に対する保護は確立されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在および将来のインフルエンザウイルス株（季節性および流行性の両方）に対する保護を提供する、特にインフルエンザの有効な予防および治療のために系統発生グループ１および／またはグループ２内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供する安全で有効なユニバーサルワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンおよびそれらの使用方法が提供される。
【００１３】
第１の態様において、本発明は、インフルエンザ（ＨＡ）ステムドメインポリペプチドと称される、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインを含み、球状頭部を欠く新規免疫原性多量体ポリペプチドを提供する。多量体ポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場合に免疫応答を誘導し得る。本発明のポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示する。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、残留アミノ酸配列を直接的にまたは、一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてアミノ酸鎖の連続性を回復させる。得られた配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの全長ＨＡ１および／またはＨＡ２を含まない。
【００１４】
本発明は、新規多量体インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、少なくとも第１および第２のインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体を含み、前記第１および第２の単量体は、それぞれ、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインに結合しており、前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘ、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜Ｃ末端アミノ酸を含み、
（ｃ）ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まず、
（ｄ）第１の単量体は、第１の単量体の４１１位上のアミノ酸および第２の単量体の４１９位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋により前記第２の単量体に結合しているポリペプチドを提供する。
【００１５】
したがって、本発明によれば、ジスルフィド架橋は、多量体中の個々の単量体間の共有結合架橋を形成する。
【００１６】
ある実施形態において、多量体ポリペプチドは、三量体であり、すなわち、３つの単量体を含む。本発明によれば、それぞれの単量体は、ある単量体の４１１位上のアミノ酸と別の単量体の４１９位上のアミノ酸との間のジスルフィド架橋により別の単量体に結合している。使用される番号付与は、配列番号１に関することが留意される。当業者は、他のＨＡ配列中の相当位置を決定することができる。
【００１７】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、系統発生グループ１に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００１８】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００１９】
ある実施形態において、ｘ＝配列番号１の５２位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番号１の３２１位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸である。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸３２１〜末端（すなわち、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸）を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、５３位におけるアミノ酸から３２０位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１８〜５２を含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。
【００２０】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、系統発生グループ２に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００２１】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００２２】
したがって、本発明の多量体ポリペプチドは、少なくとも２つの単量体を含み、それぞれの単量体は、ＨＡ１ドメイン（前記ＨＡ１ドメインは、ＨＡ１Ｃ末端セグメントに直接または結合配列を介して結合しているＨＡ１Ｎ末端セグメントを含む）およびＨＡ２ドメインを含む。ある実施形態において、ＨＡ２ドメインのＮ末端アミノ酸は、ＨＡ１Ｃ末端セグメントのＣ末端アミノ酸に直接結合している。
【００２３】
ある実施形態において、ポリペプチドは、完全ＨＡ２ドメイン、すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞内配列を含むＨＡ２ドメインを含む。ある実施形態において、モノマーのＨＡ２ドメインは、トランケートされている。したがって、ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有しない。ある実施形態において、ＨＡ２ドメインの５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されている。
【００２４】
本発明によれば、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸は、ＨＡ２ドメインのＮ末端アミノ酸に結合しており、したがって、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部を形成する。本発明のポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まない。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸３４３）は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。
【００２５】
本発明の免疫原性ポリペプチド中のインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体は、ＨＡ０よりも実質的に小さく、好ましくは、ＨＡの球状頭部の全てまたは実質的に全てを欠く。好ましくは、免疫原性単量体は、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０である。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。
【００２７】
ある実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化されている。
【００２８】
本発明によれば、ポリペプチドは、野生型ＨＡ、特にＨＡ１およびＨＡ２ドメインがベースとするＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。
【００２９】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、グループ１交差中和抗体ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに開示）および／または抗体ＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットに記載）、グループ１およびグループ２インフルエンザＡウイルスの両方、ならびにインフルエンザＢウイルスに結合し、中和し得る抗体の保存ステムドメインエピトープを含む。したがって、ＨＡステムドメインポリペプチドであって、前記ポリペプチドへの前記１つまたは複数の抗体の結合により示されるとおり、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示するポリペプチドを提供することが本発明の別の態様である。
【００３０】
ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ３インフルエンザウイルスのみに結合するモノクローナル抗体であるＣＲ８０２０およびＣＲ８０５７（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）に結合しない。本明細書に提供されるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルスＡおよび／またはＢ株に対する免疫応答を生成し得る免疫原性組成物（例えば、ワクチン）における使用に好適である。
【００３１】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドはグループ２交差中和抗体ＣＲ８０２０（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）の保存ステムドメインエピトープを含む。
【００３２】
ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、系統発生グループ１および／またはグループ２のインフルエンザＡウイルス株に対する、特に系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同一およびまたは異なる亜型の異種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株ならびにインフルエンザＢウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。
【００３３】
本発明によるポリペプチドは、例えば、インフルエンザウイルス、特に系統発生グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態のスタンドアロン療法および／もしくは予防および／もしくは診断において、または他の予防および／もしくは治療処置、例えば、（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／もしくはモノクローナル抗体との組合せで使用することができる。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を含む免疫原性組成物を提供する。本明細書に提供される免疫原性組成物は、対象、例えば、マウス、フェレットまたはヒトへの組成物の投与を可能とする任意の形態であり得る。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、ヒト投与に好適である。ポリペプチド、核酸分子および組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防および／もしくは治療する方法において、ならびに／または診断目的に使用することができる。組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含み、またはアジュバントとの組合せで投与される。
【００３７】
別の態様において、本発明は、ワクチンとして使用されるポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を提供する。本発明は、特に、系統発生グループ１および／もしくは２のインフルエンザウイルスＡ亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される免疫原性ポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。
【００３８】
本発明によるポリペプチドの種々の実施形態および使用は、以下の本発明の詳細な説明から明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】天然三量体中に存在する融合前状態のＨＡ単量体のモデルを示す。ＨＡ１を淡灰色で示し、ＨＡ２を暗灰色で示す。へリックスＡ（ＣＲ６２６１のエピトープの重要部分）およびへリックスＣＤ（三量体界面の部分）を示し、ループがそれらの二次構造エレメントを連結する。ＨＡ１のＣ末端およびＨＡ２のＮ末端も示される。融合ペプチドは、ＨＡ２のＮ末端において局在する。
【図２】以下についてのＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡ結果：（Ａ）三量体および単量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの精製可溶性ＨＡ。（Ｂ）ｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号９１）を発現する培養物から得られた培地；ＦＬ  ＨＡ三量体および単量体についてのデータも比較のために示す。（Ｃ）５５Ｇ７−ｔ２の二重システイン突然変異バリアント（配列番号１６６から１７６）。（Ｄ）１２７Ｈ１−ｔ２の二重システインバリアント（配列番号１７７から１８７）。
【図３】還元（Ａ、Ｃ）および非還元条件（Ｂ、Ｄ）下の５５Ｇ７（Ａ、Ｂ）および１２７Ｈ１−ｔ２（Ｃ、Ｄ）の二重システインバリアントを発現する培養物の培地のウエスタンブロット。それぞれのレーン上方の数字は、表１０に列記されるシステイン突然変異のクラスターを指す。
【図４】１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８中のシステインに突然変異している残基４１１および４１９の位置を示す本発明のポリペプチドの構造モデル。モデルは、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９の全長ＨＡの構造（ＰＤＢ  ３ＬＺＧ）からの残基５３から３２０の欠失により作出される。
【図５】（Ａ）追加のＣ末端ｈｉｓタグを有するｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８１）の精製間の分取サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）からの溶出プロファイル。分画を図面下方に示す。（Ｂ）非還元（左）および還元条件（右）下のサイズ排除カラムから回収された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン上方の数字は図５Ａに対応し、Ｍは分子量マーカーを示す。（Ｃ）分画１〜４のネイティブＰＡＧＥ。レーン上方の数字は図５Ａに対応し、Ｍは分子量マーカーを示す。（Ｄ）検出のためのポリクローナル抗ｈｉｓタグ抗体を使用する分画１〜４のウエスタンブロット。レーン上方の数字は図５Ａに対応し、Ｍは分子量マーカーを示す。
【図６】図５に示される分画１から４中のポリペプチドへの広域中和抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の結合についてのＥｌｉｓａ結果。ポリクローナル抗Ｈ１ＨＡ血清およびグループ２特異的モノクローナル抗体ＣＲ８０２０への結合も含める。比較のため、単量体および三量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの可溶性ＨＡについての結果も示す。
【図７】図５に示される分画１から４についてのＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡ結果。比較のため、単量体および三量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの可溶性ＨＡについての結果も示す。
【図８】ＣＲ８０２０（上段パネル）、ＣＲ６２６１またはＣＲ９１１４（両方とも下段パネル）のＦａｂ断片の不存在および存在下の分画３のポリペプチドについてのＳＥＣ−ＭＡＬＳ結果。ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１のＦａｂ断片との複合体形成は、分子質量の増加およびピークのシフトをもたらす。
【図９】バイオレイヤー干渉法により決定されたｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇへの広域中和抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の結合。ＡおよびＣは、変動濃度のｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇに曝露された固定化モノクローナル抗体についての個々の結合曲線を示し；ＢおよびＤは、Ｋｄを推定するために使用された定常状態分析を示す。
【図１０】陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率（Ａ）、相対体重損失（Ｂ）および臨床スコア（Ｃ）。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｂ）または四分位範囲（Ｃ）を示す。
【図１１】１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回（Ｃ）免疫化された群についての生存率。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。
【図１２】１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回免疫化された群についての相対体重変化。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。
【図１３】１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより１回（Ａ）、２回（Ｂ）または３回免疫化された群についての臨床スコア。マウスを致死用量（２５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４により最後の免疫化から４週間後にチャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）も示す。エラーバーは四分位範囲を示す。
【図１４】ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（Ａ）または全長ＨＡの可溶性形態（Ｂ）を抗原として使用する陰性対照および実験群のプレチャレンジ血清（最後の免疫化から４週間後）についてのＥＬＩＳＡ結果。バーは中央値を表す。
【図１５】本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇによる免疫化後に最後の免疫化から４週間後（プレチャレンジ時点）に誘導された抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡへの結合についてＣＲ９１１４と競合し得る（トップ）。比較のため、非標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方とも、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）による競合レベルを別個のグラフに示す（ボトム）。バーは中央値を表す。
【図１６】（Ａ）陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７により最後の免疫化後４週間チャレンジした。１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより３回免疫化された群についての（Ｂ）生存率、（Ｃ）相対体重変化および（Ｄ）臨床スコア中央値。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｃ）または四分位範囲（Ｄ）を示す。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７により最後の免疫化後４週間チャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）もＢ、Ｃ、Ｄにおいて示す。
【図１７】いくつかのグループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループＩＩ（Ｈ３およびＨ７）インフルエンザ株の全長ＨＡを抗原として使用する実施例７に記載の本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより３回免疫化されたマウスからの血清についてのＥｌｉｓａ結果。誘導された抗体は、グループ１からの試験された全てのＦＬ  ＨＡを認識する。
【図１８】（Ａ）陰性（ＰＢＳ、３週間の間隔における３回の免疫化）および陽性対照（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）群についての生存率。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７により最後の免疫化から４週間後にチャレンジした。１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの存在下で３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより３回免疫化された群についての（Ｂ）生存率、（Ｃ）相対体重変化および（Ｄ）臨床スコア中央値。エラーバーは、９５％信頼区間（Ｃ）または四分位範囲（Ｄ）を示す。マウスを致死用量（１２．５×ＬＤ５０）のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７により最後の免疫化後４週間チャレンジし、２１日間モニタリングした。比較のため、陰性対照群（ＰＢＳ）もＢ、Ｃ、Ｄにおいて示す。
【図１９】本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇまたはＰＢＳにより免疫化されたマウスからの血清を使用する偽粒子中和アッセイ。中和は、本発明のポリペプチドにより免疫化された動物からの血清について高い血清濃度において観察される。
【図２０】抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）代理アッセイ。本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより免疫化されたマウスからの血清は、抗原資源としてのＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ａ）またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（Ｂ）からのＦＬ  ＨＡが形質移入された標的細胞を使用して最大血清濃度においてＦｃγＲＩＶシグナリング活性の３０〜４０倍の誘導を示す。
【図２１】Ａ：本発明のポリペプチド（その配列番号により示される）の多量体形態を検出するためのＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡ。培養培地を３倍段階で希釈し、分析した。Ｂ：ＥＬＩＳＡによる本発明のポリペプチド（その配列番号により示される）へのＣＲ９１１４結合。培養培地を３倍段階で希釈し、分析した。Ｃ：ＥＬＩＳＡによる本発明のポリペプチド（その配列番号により示す）へのＣＲ６２６１結合。培養培地を３倍段階で希釈し、分析した。Ｄ：ＥＬＩＳＡによる本発明のポリペプチド（その配列番号により示される）へのＣＲ８０２０結合。培養培地を３倍段階で希釈し、分析した。精製タンパク質（配列番号１８６ならびに三量体および単量体形態の全長ＨＡ）については、５μｇ／ｍｌの出発濃度を使用した。全てのポリペプチドは、Ｃ末端第Ｘ因子開裂ｈｉｓタグ配列を含有する。
【図２２】本発明のポリペプチド（その配列番号により示される）を発現する培養物の上清のウエスタンブロット。還元条件下、単量体間ジスルフィド架橋は還元され、本発明のポリペプチドは、ゲル上で単量体である（左パネル）。酸化条件下、単量体間ジスルフィド架橋はインタクトのままであり、本発明のポリペプチドは、ゲル上で三量体として出現する。配列番号１８６について、精製三量体をこの実験に使用した。
【図２３】実施例１６に記載のＮＨＰの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価（抗原全長ＨＡ）。パネルＡ〜ＦのＨＡはグループ１インフルエンザ株（パネル中に識別される）に由来し、パネルＧ〜ＪのＨＡはグループ２インフルエンザ株に由来する。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。
【図２４】実施例１６に記載のＮＨＰの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＣＲ９１１４競合結合。３つの異なる株からのＦＬ  ＨＡをパネルＡ〜Ｃに識別されるとおり使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。
【図２５】実施例１６に記載のＮＨＰの免疫化後に得られた血清中のＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞を使用して決定された代理ＡＤＣＣ活性。３つの異なる株からのＦＬ  ＨＡを発現するＤＮＡが形質移入された細胞を使用した（パネルＡ〜Ｃに識別）。データを誘導倍率として表現し、それは血清の不存在下のバックグラウンドシグナルと比較したそれぞれの計測値のシグナルである。線は個々の動物を示し、記号は血清濃度ごとの２つ組の平均を示す。
【図２６】実施例１６に記載のＮＨＰの免疫化後に得られた血清を使用するマイクロ中和アッセイ。リードアウトは、段階希釈血清の存在下の１ウェル当たり１００ＴＣＩＤ５０のＨ５Ｎ１Ａ／ＨＫ／１５６／９７とのインキュベーションから１６時間後の固定細胞中のＮＰのＥＬＩＳＡベースの定量であった。線は個々の動物を示し、記号は血清濃度ごとの２つ組の平均を示す。
【図２７】実施例１６に記載の実験に含まれる非ヒト霊長類の曲線下面積温度増加。動物ごとに、免疫化開始前に２１日間のウインドウを使用して参照２４時間体温周期を再構築した。チャレンジ後２１日間のフォローアップ期間の間の体温の正味の増加は、チャレンジ後フォローアップ期間の間に計測された体温から９５％ＣＩの上限値が付加された参照体温を引くことにより計算した。続いて、正味の温度増加のＡＵＣを０〜３日目、０〜８日目および０〜２１日目の間隔において計算した。処理間の統計分析は、複数の比較のためにテューキー・クレーマー調整によるペアワイズｔ検定を使用して実施した。バーは中央値を示す。データロガー故障に起因して、動物Ｊ１００１４（配列番号１８６＋Ｍａｔｒｉｘ−Ｍ群）のデータはない。動物Ｊｉ０４０３０６１（Ｉｎｆｌｅｘａｌ群）は８日目の終了時に死亡し、０〜２１日目の間隔計算から除外した。
【図２８】実施例１７に記載の血清移入およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。
【図２９】７０日目におけるドナーマウス（Ｄ）、および血清移入前（−４日目）またはチャレンジ前（０日目）のレシピエントマウス（Ｒ）の全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。
【図３０】実施例１８に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。
【図３１】Ａ：実施例１８に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。Ｂ：実施例１８に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ  ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。
【図３２】実施例１９に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／６０２／０９によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。
【図３３】Ａ：実施例１９に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。Ｂ：実施例１９に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ  ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。
【図３４】実施例２０に記載の免疫化およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。
【図３５】Ａ：実施例２０に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。Ｂ：実施例２０に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ  ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。
【図３６】実施例２１に記載の免疫化およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４によるチャレンジ後のマウスの生存率（Ａ）および％体重変化（Ｂ）。
【図３７】Ａ：実施例２１に記載の免疫化されたマウスの全長ＨＡ（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）ＥＬＩＳＡ力価。傾きに基づく加重平均アプローチを使用してデータを分析した。白丸記号は、ＬＯＤにおける計測値を示す。バーは中央値を示す。Ｂ：実施例２１に記載のマウスの免疫化後に得られた血清ＩｇＧ  ＣＲ９１１４競合結合。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＦＬ  ＨＡを抗原として使用した。示されるデータは群中央値であり、エラーバーは四分位範囲を示す。
【図３８】本発明のポリペプチドによる一過的形質移入後のＨｅｋ２９３Ｆ細胞培養上清のウエスタンブロット（ポリクローナル抗Ｈ１）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
本発明において使用される用語の定義を以下に挙げる。
【００４１】
本発明によるアミノ酸は、２０の天然（または「標準」アミノ酸）またはそのバリアント、例えば、Ｄ−プロリン（プロリンのＤ−エナンチオマー）など、またはタンパク質に天然に見出されない任意のバリアント、例えば、ノルロイシンなどのいずれかであり得る。標準アミノ酸は、それらの特性に基づきいくつかのグループに分割することができる。重要な因子は、電荷、親水性または疎水性、サイズおよび官能基である。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質相互作用にとって重要である。一部のアミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基への共有ジスルフィド結合（またはジスルフィド架橋）を形成し得、プロリンは、ポリペプチド骨格への周期性を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。表１は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００４２】
用語「アミノ酸配列同一性」は、通常、割合として表現される一対のアラインされたアミノ酸配列間の同一性または類似性の程度を指す。同一性パーセントは、同一（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸残基は、同一残基である）または類似（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸置換は、以下に論じる保存的置換である）の候補配列中のアミノ酸残基と、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後のペプチド中の対応するアミノ酸残基との割合である。配列相同性、例として配列同一性および類似性の割合は、当分野において周知の配列アラインメント技術を使用して、例えば、目視調査および数学的計算により決定され、またはより好ましくは、比較は、コンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することにより行われる。例示的な好ましいコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４））である。
【００４３】
「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による置換を指す。特定の実施形態において、保存的置換は、本発明のポリペプチドの構造もしくは機能、またはその両方を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎水性（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ）、中性親水性（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、酸性（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、立体構造破壊物質（例えば、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）および芳香族（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）が含まれる。
【００４４】
本明細書において使用される用語「疾患」および「障害」は、対象における病態を指すために互換的に使用される。一部の実施形態において、病態は、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染である。具体的な実施形態において、用語「疾患」は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理的状態を指す。ある実施形態において、病態は、免疫原性組成物の投与を介して対象において免疫応答を誘導することにより重症度が減少される対象における疾患である。
【００４５】
治療物を対象に投与する文脈における本明細書において使用される用語「有効量」は、予防および／または治療効果を有する治療物の量を指す。ある実施形態において、治療物を対象に投与する文脈における「有効量」は、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の重症度の低減もしくは改善、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の持続時間の低減、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の進行の予防、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の発現もしくは発症もしくは再発の予防、ある対象から別の対象へのインフルエンザウイルスの拡散の予防もしくは低減、対象の入院および／もしくは入院期間の低減、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患を有する対象の生存率の増加、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患の排除、インフルエンザウイルス複製の阻害もしくは低減、インフルエンザウイルス力価の低減；および／または別の治療物の予防もしくは治療効果の向上および／もしくは改善を達成するために十分な治療物の量を指す。ある実施形態において、有効量は、インフルエンザウイルス疾患からの完全な保護をもたらさないが、未治療対象と比較してより低い力価または低減数のインフルエンザウイルスをもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数または総負荷の低減の利益には、限定されるものではないが、より軽度の感染症状、より少ない感染症状および感染に伴う疾患の期間の低減が含まれる。
【００４６】
本明細書において使用される用語「宿主」は、ベクター、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターが導入された生物または細胞を指すものとする。生物または細胞は、原核または真核であり得る。好ましくは、宿主は、単離宿主細胞、例えば、培養物中の宿主細胞を含む。用語「宿主細胞」は、細胞が本発明のポリペプチドの（過剰）発現のために改変されていることを単に意味するにすぎない。宿主という用語は、特定の対象生物または細胞を指すだけでなく、そのような生物または細胞の子孫も同様に指すものとすることを理解すべきである。ある改変が突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親生物または細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語「宿主」の範囲内に含まれる。
【００４７】
本明細書において使用される用語「含まれる」または「例として」の後には、語「限定されるものではないが」が続くものとみなされる。
【００４８】
本明細書において使用される用語「感染」は、細胞または対象におけるウイルスの繁殖および／または存在による侵襲を意味する。一実施形態において、感染は、「活性」感染、すなわち、ウイルスが細胞または対象において複製しているものである。このような感染は、ウイルスにより最初に感染された細胞、組織、および／または器官から他の細胞、組織、および／または器官へのウイルスの拡散を特徴とする。感染は、潜伏感染、すなわち、ウイルスが複製していないものでもあり得る。ある実施形態において、感染は、細胞もしくは対象中のウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理学的状態を指す。
【００４９】
インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス型：Ａ、ＢおよびＣ属に分類される。本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の組合せを特徴とするインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜型は、それらのＨ番号、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」または「Ｈ３インフルエンザ」など、またはＨ番号およびＮ番号の組合せ、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」もしくは「Ｈ３Ｎ２」などにより称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、突然変異から生し、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例として、天然分離株および人工突然変異体またはリアソータントなどが含まれる。このような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称することもできる。したがって、本明細書において使用される用語「株」および「分離株」は、互換的に使用することができる。ヒトインフルエンザウイルス株または分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型（属）、すなわち、Ａ、ＢまたはＣ、最初の分離の地理的場所、株番号および分離年度に通常括弧内に挙げられるＨＡおよびＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒト株には、命名法において起源の宿主も含まれる。インフルエンザＡウイルス亜型は、それらの系統発生グループを参照することによりさらに分類することができる。系統分析は、ヘマグルチニンの２つの主要グループへの下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型（「グループ１」インフルエンザウイルス）およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）。
【００５０】
本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス疾患」は、細胞もしくは対象中のインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡもしくはＢウイルスの存在またはインフルエンザウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲から生じる病理学的状態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる呼吸器疾病を指す。
【００５１】
本明細書において使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、化学的もしくは生化学的に改変することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得、それは当業者により容易に認識される。このような改変には、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、未荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、および改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列への言及は、特に記載のない限り、その相補物を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解すべきである。相補鎖も、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーに有用である。
【００５２】
ある実施形態において、本明細書において使用されるＨＡ中のアミノ酸の番号付与は、野生型インフルエンザウイルスのＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づく。したがって、本発明において使用される語「ＨＡ中の「ｘ」位におけるアミノ酸」は、特定の野生型インフルエンザウイルス、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１；ＨＡ２ドメインのアミノ酸をイタリックで示した）のＨＡ０中のｘ位におけるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。他のインフルエンザウイルス株および／または亜型中の相当アミノ酸を多重配列アラインメントにより決定することができることが当業者により理解される。本出願全体にわたり使用される番号付与系において、１は、未成熟ＨＡ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。成熟配列は、例えば、配列番号１の１８位上で開始する。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含み、すなわち、アミノ酸配列は、シグナル配列を有さないＨＡ０のアミノ酸配列をベースとする。
【００５３】
「ポリペプチド」は、当業者により公知のアミド結合により結合しているアミノ酸の重合体を指す。本明細書において使用されるこの用語は、共有アミド結合により結合している単一ポリペプチド鎖を指し得る。この用語は、非共有相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファン・デル・ワールス接触および疎水性接触により会合している複数のポリペプチド鎖も指し得る。当業者は、この用語には、例えば、翻訳後プロセシング、例えば、シグナルペプチド開裂、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化）、プロテアーゼ開裂および脂質改変（例えば、Ｓ−パルミトイル化）により改変されたポリペプチドが含まれることを認識する。
【００５４】
「ステムドメインポリペプチド」は、天然（または野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）のステムドメインを構成する１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドを指す。典型的には、ステムドメインポリペプチドは、単一ポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ０ポリペプチドのステムドメインに対応）または２つのポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ２ポリペプチドと会合しているヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチドのステムドメインに対応）である。本発明によれば、ステムドメインポリペプチドは、野生型ＨＡ分子と比較して１つ以上の突然変異を含み、特に野生型ＨＡの１つ以上のアミノ酸残基が特定の野生型ＨＡ中の対応位置上で天然に生じない他のアミノ酸により置換されていてよい。本発明によるステムドメインポリペプチドは、下記の１つ以上の結合配列をさらに含み得る。
【００５５】
用語「ベクター」は、複製され、一部の場合に発現される、宿主中への導入のために第２の核酸分子を挿入することができる核酸分子を示す。換言すると、ベクターは、それが結合した核酸分子を輸送し得る。クローニングおよび発現ベクターは、本明細書において使用される用語「ベクター」により企図される。ベクターには、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）ならびにバクテリオファージまたは植物または動物（例として、ヒト）ウイルスに由来するベクターが含まれる。ベクターは、提示される宿主により認識される複製起源および発現ベクターの場合、宿主により認識されるプロモーターおよび他の調節領域を含む。あるベクターは、それらが導入された宿主中で自律複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有するベクターは、細菌中で複製し得る）。他のベクターは宿主中への導入時に宿主のゲノム中に組み込むことができ、それによりベクターは宿主ゲノムに沿って複製される。
【００５６】
本明細書において使用される、ウイルスの文脈における用語「野生型」は、高頻度であり、天然に循環し、典型的な疾患の蔓延を発生させているインフルエンザウイルスを指す。
【００５７】
詳細な説明
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万の重病の症例、数千人の死亡、およびかなりの経済的損失を引き起こす。現在の三価インフルエンザワクチンは、ワクチン株および密接に関連する分離株に対する強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株または他の亜型に及ぶことはほとんどない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にもたらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型の予測は、それがいつどこで生じるかを含め、現在では不可能である。
【００５８】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザＡウイルスからの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、流入プロセスの間の２つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用を介して標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトーシス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルスおよびエンドソーム膜の融合を生んでそのゲノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来酵素により開裂されてジスルフィド結合により結合したままの２つのポリペプチドを生成する約５００アミノ酸の大型エクトドメインを含む。大多数のＮ末端断片（ＨＡ１、３２０〜３３０アミノ酸）は、受容体結合部位およびウイルス中和抗体により認識されるほとんどの抗原決定基を含有する膜遠位球状ドメインを形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞またはウイルス膜にアンカリングするステム様構造を形成する。亜型間の配列相同性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％〜５９％の亜型間相同性）がＨＡ２ポリペプチド（５１〜８０％の相同性）よりも小さい。ほとんどの保存領域は、開裂部位周囲の配列、特にＨＡ２Ｎ末端２３アミノ酸であり、それは全てのインフルエンザＡウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０がＨＡ１およびＨＡ２に開裂された場合に接近不可能になる。
【００５９】
ほとんどの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、受容体結合および付着を妨げる。これらのループは高度に変異性であるため、それらの領域を標的化するほとんどの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的免疫を誘発するかを説明する。しかしながら、近年、広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された。機能および構造分析は、それらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中の高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかにした（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレット、国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレット）。
【００６０】
これらの抗体のエピトープを安定的に提示するステムドメインポリペプチドは、同時係属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書に記載されている。本明細書に記載のステムドメインポリペプチドの少なくとも一部は、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示し、マウスにおいて免疫原性である。ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示するさらなる免疫原性ステムドメインポリペプチドは、同時係属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に記載されている。
【００６１】
本発明によれば、これらのエピトープを提示する新たな多量体ＨＡステムドメインポリペプチドが設計された。これらのポリペプチドを使用して広範囲のインフルエンザ株に対する保護を誘導するユニバーサルエピトープベースワクチンを作出することができる。既に記載されたステムドメインポリペプチドにおいて同様、高度に変異性の免疫優性部分、すなわち、頭部ドメインを最初に全長ＨＡ分子から除去してｍｉｎｉ−ＨＡとも称されるステムドメインポリペプチドを作出して免疫応答を広域中和抗体についてのエピトープが局在するステムドメインに再指向する。上記の広域中和抗体は、中和エピトープの存在を確認するために使用される。
【００６２】
ある実施形態において、本発明の新たなＨＡステムポリペプチドは、溶液中で安定な三量体を形成する一方、中和抗体のＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４および／またはＣＲ８０２０のエピトープを曝露させる。個々の単量体間の追加の相互作用はタンパク質およびエピトープをさらに安定化させ、ポリペプチドがワクチン中で使用される場合にそれらのエピトープのより良好な提示をもたらす。
【００６３】
本発明のステムドメインポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示し得る。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、直接的に、または一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてポリペプチド鎖の連続性を回復させる。得られたポリペプチド配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。
【００６４】
本発明は、新規多量体インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、少なくとも第１および第２のインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体を含み、前記第１および第２の単量体は、それぞれ、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含み、前記ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインに結合しており、前記ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘ、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜Ｃ末端アミノ酸を含み、
（ｃ）ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まず、
（ｄ）第１の単量体は、第１の単量体の４１１位上のアミノ酸および第２の単量体の４１９位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋により前記第２の単量体に結合しているポリペプチドを提供する。
【００６５】
したがって、本発明によれば、ジスルフィド架橋は、多量体中の個々の単量体間の共有結合架橋を形成する。
【００６６】
ある実施形態において、多量体ポリペプチドは、三量体であり、すなわち、３つのインフルエンザステムドメイン単量体を含む。本発明によれば、それぞれの単量体は、ある単量体の４１１位上のアミノ酸と別の単量体の４１９位上のアミノ酸との間のジスルフィド架橋により別の単量体に結合している。
【００６７】
驚くべきことに、本発明によれば、少なくとも２つの異なる単量体の４１１および４１９位（配列番号１による番号付与または他のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン中の相当残基）アミノ酸間の新規ジスルフィド架橋の導入が、二量体、または好ましくは、三量体ポリペプチドをもたらすことが見出された。他の公開されている三量体ＨＡステム構造とは対照的に、この単量体間ジスルフィド結合三量体は、十分に発現し、自然にフォールドする。したがって、これは記載（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）されたその三次元構造を得るためのリフォールディング手順を要求しない。
【００６８】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、系統発生グループ１に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００６９】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。
【００７０】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、系統発生グループ２に由来するインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００７１】
ある実施形態において、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。
【００７２】
ある実施形態において、本発明の免疫原性ポリペプチド中のインフルエンザヘマグルチニンステムドメイン単量体は、ＨＡ０よりも実質的に小さく、好ましくは、ＨＡの球状頭部の全てまたは実質的に全てを欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。
【００７３】
本発明によれば、「ＨＡ１Ｎ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）分子のＨＡ１ドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含み、ｘ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。用語「ＨＡ１Ｃ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。本発明によれば、ｙは、ｘよりも大きく、したがって、ＨＡ１Ｎ末端セグメントおよびＨＡ１Ｃ末端セグメント間、すなわち、ＨＡ１のｘ位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントが欠失しており、一部の実施形態において、結合配列により置き換えられている。
【００７４】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ−１位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７）を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製することができる。
【００７６】
ここでも、本明細書において使用されるアミノ酸位置の番号付与は、配列番号１を指すことが留意される。当業者は、他のヘマグルチニン配列中の相当位置を決定することができる。
【００７７】
ある実施形態において、ポリペプチドは、完全ＨＡ２ドメインを含み、したがって、膜貫通および細胞内配列を含む。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。したがって、ある実施形態において、ポリペプチドは、トランケートＨＡ２ドメインを含む。ある実施形態において、細胞中での発現後に可溶性ポリペプチドが産生されるように、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されている。
【００７８】
本発明によれば、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、すなわち、ＨＡ１およびＨＡ２間のこの連結部におけるプロテアーゼ開裂部位を含まない。ＨＡ１およびＨＡ２に及ぶＡｒｇ（Ｒ）〜Ｇｌｙ（Ｇ）配列がトリプシンおよびトリプシン様プロテアーゼのための認識部位であり、典型的には、ヘマグルチニン活性化のために開裂されることは当業者に公知である。本明細書に記載のＨＡステムドメインポリペプチドは活性化されるべきでないため、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、プロテアーゼ開裂に耐性である。したがって、本発明によれば、プロテアーゼ開裂部位は除去されており、またはＨＡ１およびＨＡ２に及ぶプロテアーゼ部位がプロテアーゼ開裂に耐性である配列に突然変異している。本発明によれば、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位の除去は、Ｐ１位におけるＲ（わずかな場合においてＫ）からＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１の３４３位）の命名法の説明についてはＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０参照。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端アミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）である。
【００７９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化されている。
【００８０】
ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、Ｈ１亜型のインフルエンザウイルスのＨＡをベースとする。「をベースとする」は、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメインのＮ末端セグメント、および／またはＣ末端セグメントが当業者に公知の、または後に発見されるＨ１亜型の任意の天然インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインの対応Ｎ末端および／またはＣ末端セグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。
【００８１】
ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡ、すなわち、Ｈ１亜型のインフルエンザウイルスからの、特に下記のインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号１）からのアミノ酸配列を含むＨＡをベースとする。Ｈ１亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスを本発明により使用することもできることが当業者により理解される。ある実施形態において、ポリペプチドは、表２から選択されるインフルエンザＡＨ１ウイルスのＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。
【００８２】
ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡ１ドメインの１位からｘ位までのアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントを含み、ｘは、４６位上のアミノ酸および６０位上のアミノ酸間の任意のアミノ酸、例えば、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９位上のアミノ酸であり、好ましくは、ｘは、５２、５３、５５または５９である。好ましくは、ポリペプチドは、シグナル配列を有さないＨＡ１Ｎ末端セグメント、すなわち、ＨＡ１ドメインの１８位（例えば、Ｈ１ＨＡについて、例えば、配列番号１）、または他のインフルエンザウイルス株（例えば、表２参照）中の相当位置からｘ位までのアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端セグメントを含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインのｐ位（配列番号１のＨ１ＨＡについてｐ＝１８または他のＨ１ＨＡ上の相当位置）からｘ位までのアミノ酸を含む。
【００８３】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、Ｈ１ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）までのアミノ酸を含み、ｙは、Ｈ１ＨＡ１の２９０位上のアミノ酸および３２５位上のアミノ酸間の任意のアミノ酸であり、好ましくは、ｙは、２９１、３０３、３１８、または３２１である。
【００８４】
ある実施形態において、ｘ＝配列番号１の５２位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｐ＝配列番号１の１８位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸であり、ｙ＝配列番号１の３２１位（または別のヘマグルチニン中の相当位置）上のアミノ酸である。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸３２１〜末端（すなわち、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸）を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、５３位におけるアミノ酸から３２０位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）までのアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１８〜５２を含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。
【００８５】
したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３を含む。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３からなる。
【００８６】
本発明によれば、ステムポリペプチドは、対応する野生型インフルエンザウイルスＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン、すなわち、ステムポリペプチドがベースとするインフルエンザウイルスのアミノ酸配列と比較して個々の単量体のＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の突然変異、すなわち、アミノ酸置換を含む。
【００８７】
ある実施形態において、ＨＡ２ドメインは、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む（図１）。ヘリックスＡのＣ末端残基およびヘリックスＣＤのＮ末端残基を連結するＨ１ＨＡ２アミノ酸配列は、インフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８を含むアミノ酸配列を含み（配列番号１による番号付与）、アミノ酸配列ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号７）を含む。
【００８８】
ある実施形態において、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列、すなわち、血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡのアミノ酸残基４０２〜４１８（配列番号１による番号付与）を含む領域は、アミノ酸配列Ｘ１ＮＴＱＸ２ＴＡＸ３ＧＫＥＸ４Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ５Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）を含む。
【００８９】
ある実施形態において、４０２、４０６、４０９、４１３および４１６位（番号付与は、配列番号１を指す）上のアミノ酸の１つ以上、すなわち、アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の１つ以上は突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドがベースとする野生型インフルエンザウイルス中のそれらの位置において生じないアミノ酸を含む。
【００９０】
ある実施形態において、４０２位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ１は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９１】
ある実施形態において、４０６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹ、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９２】
ある実施形態において、４０９位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ３は、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳ、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９３】
ある実施形態において、４１３位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ４は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶ、好ましくは、Ｉ、Ｙ、ＭまたはＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９４】
ある実施形態において、４１６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ５は、Ｌ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、好ましくは、Ｉからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９５】
これらの１つ以上の突然変異の組合せも可能である。
【００９６】
ある実施形態において、Ｘ１はＭであり、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＩであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＳである。
【００９７】
本発明によれば、ステムポリペプチドは、対応する野生型インフルエンザウイルスＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン、すなわち、ステムポリペプチドがベースとするインフルエンザウイルスのアミノ酸配列と比較してＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異、すなわち、アミノ酸置換を含む。
【００９８】
ある実施形態において、ＨＡ０開裂部位（配列番号１の残基３４３）に近い１つ以上のアミノ酸残基が突然変異している。ある実施形態において、配列番号１の３３７、３４０、３５２、もしくは３５３位または他のインフルエンザウイルス中の相当位置上のアミノ酸残基の１つ以上が突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドがベースとする野生型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列中の対応する位置において生じないアミノ酸により置換されている。表６は、天然アミノ酸変異を示す。
【００９９】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５２位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１００】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５３位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１０１】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１０２】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３４０位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１０３】
ある実施形態において、３３７位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択される。
【０１０４】
ある実施形態において、３４０位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択される。
【０１０５】
ある実施形態において、３５２位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される。
【０１０６】
ある実施形態において、３５３位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからなる群から選択される。
【０１０７】
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、例えば、配列番号６のＩ３４０Ｎの場合のように配列中のコンセンサスＮ−グリコシル化、例えば、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ（Ｘは、Ｐを除く任意の天然アミノ酸である）を導入する。
【０１０８】
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、同一亜型の配列中で天然で生じないアミノ酸である。
【０１０９】
ある実施形態において、３３７位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋである。
【０１１０】
ある実施形態において、３４０位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋである。
【０１１１】
ある実施形態において、３５２位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｆである。
【０１１２】
ある実施形態において、３５３位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｔである。
【０１１３】
本出願全体にわたり、アミノ酸の番号付与はＨ１ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与をベースとすることがここでも留意される。当業者は、他のインフルエンザウイルスのＨＡ中の相当アミノ酸を決定することができ、したがって、相当の突然変異を決定することができ、例えば、異なるＨ１インフルエンザウイルスの配列アラインメントについては表２参照。
【０１１４】
本発明によれば、ポリペプチドは、３２４位上のアミノ酸および４３６位上のアミノ酸間の追加のジスルフィド架橋をさらに含み得る。したがって、本発明によれば、少なくとも１つの追加のジスルフィド架橋がステムドメインポリペプチド中で、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の３２４および４３６位（またはその相当物）のアミノ酸間に導入されている。したがって、ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン中の突然変異Ｒ３２４ＣおよびＨＡ２ドメイン中のＴ４３６Ｃをさらに含む。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。
【０１１５】
ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスのＨＡをベースとする。「をベースとする」は、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメインのＮ末端セグメント、および／またはＣ末端セグメントが当業者に公知の、または後に発見されるＨ３亜型の任意の天然インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインの対応Ｎ末端および／またはＣ末端セグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。
【０１１６】
ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ３ＨＡ、すなわち、下記のＨ３Ｎ２ウイルスＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８（配列番号２３７）のインフルエンザウイルスからのアミノ酸配列を含むＨＡをベースとする。Ｈ３亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスを本発明により使用することもできることが当業者により理解される。
【０１１７】
ある実施形態において、アミノ酸配列ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１９３）が配列番号１の４１９〜４３３位（または異なるＨＡ中の相当位置）において導入されており、またはアミノ酸配列ＲＭＣＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号１９４）が配列番号１の４１７〜４３３位（または異なるＨＡ中の相当位置）において導入されている。
【０１１８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが由来するＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。したがって、ステムポリペプチドの安定性がさらに増加する。
【０１１９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０２０および／またはＣＲ８０５７に結合しない。一実施形態において、ＣＲ６２６１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＲ８０５７は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ＣＲ８０２０は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２０】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０２０に選択的に結合する。
【０１２１】
したがって、本発明によれば、ある実施形態において、ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、および／またはＣＲ８０２０の特異的エピトープを模倣し、例えば、単独で、または他の予防および／もしくは治療的治療との組合せでインビボで投与される場合、交差中和抗体を誘発するための免疫原性ポリペプチドとして使用することができる多量体ポリペプチドが提供される。「交差中和抗体」は、系統発生グループ１のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの異なる亜型、および／または系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの異なる亜型、および／またはインフルエンザＢウイルスの少なくとも２つの異なる亜型、特に、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４により中和される少なくとも全てのウイルス株を中和し得る抗体を意味する。
【０１２２】
上記のとおり、ポリペプチドは、少なくとも２つのモノマーを含み、各モノマーは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインをそれぞれ含む。結合配列は、天然ＨＡにおいても野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択される配列である。
【０１２３】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１Ｃ末端セグメントに直接結合しており、すなわち、ポリペプチドは、結合配列を含まない。
【０１２４】
天然形態のインフルエンザＨＡは、細胞またはウイルス膜上で三量体として存在する。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に産生されるように除去されている。ＨＡの分泌エクトドメインを発現させ、精製する方法は記載されている（例えば、Ｄｏｐｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００９；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，２０１１；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００４，２００６；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８１参照）。当業者は、これらの方法を本発明のステムドメインポリペプチドに直接適用して分泌（可溶性）ポリペプチドの発現を達成することもできることを理解する。したがって、これらのポリペプチドも本発明に包含される。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、細胞中での発現後に可溶性ポリペプチドが産生されるように、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列（配列番号１による番号付与）が除去されている。
【０１２６】
ある実施形態において、５１９位からＣ末端アミノ酸のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている。さらなる実施形態において、５３０位からＣ末端アミノ酸のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている。
【０１２７】
場合により、ｈｉｓタグ配列（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）またはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６））を、精製目的のために（場合により、トランケートされた）ＨＡ２ドメインに場合によりリンカーを介して連結させて結合させることができる。場合により、リンカーは、精製後にｈｉｓタグを酵素的に除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有し得る。
【０１２８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）をＨＡ２のＣ末端において場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化される。したがって、ある実施形態において、ＨＡ２ドメインのＣ末端部分は、場合によりリンカーを介して連結しているアミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）により置き換えられている。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、タグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）またはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６））またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介して連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）を含有し得る。プロセシングされたタンパク質も本発明に包含される。
【０１２９】
ある実施形態において、５１９〜５６５位のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されており（配列番号１による番号付与）、ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ(配列番号４)により置き換えられている。
【０１３０】
ある実施形態において、５３０〜５６５位のＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されており（配列番号１による番号付与）、ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ(配列番号４)により置き換えられている。
【０１３１】
天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する一方、ステムドメインにおいて、三量体化は三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、タンパク質安定化を増加させるための改変が必要とされる。ヘリックスＣＤのヘリカル傾向を強化することにより、より安定なタンパク質を作出することができる。
【０１３２】
同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に記載のポリペプチドにおいて、酵母転写アクチベータータンパク質ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号５）が４１９〜４３３位（の相当物）におけるＣＤヘリックス中で導入された。この配列は、ヘリカル二次構造を形成する高い傾向を有し、こうして本発明のポリペプチドの全安定性を向上させ得る。
【０１３３】
ポリペプチドの安定性および多量体化状態が本発明のポリペプチドの一次配列中のＧＣＮ４由来配列の正確な局在および配列に依存的であることがさらに示された。
【０１３４】
好ましい実施形態において、アミノ酸配列ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１９３）が４１９〜４３３位において導入されており、または配列ＲＭＣＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号１９４）が４１７〜４３３位において導入されている。
【０１３５】
本発明をもたらす研究において、当業者に周知の分子生物学の技術を使用して、ｓ７４Ｈ９（配列番号６５）、ｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）、ｓ７１Ｈ２（配列番号７１）、ｓ８６Ｂ４（配列番号６７）、ｓ１１５Ａ１（配列番号７０）、ｓ２２０１Ｃ９（配列番号７７）、ｓ５５Ｇ７（配列番号６８）、ｓ１１３Ｅ７（配列番号７８）、ｓ６Ｅ１２（配列番号６９）、ｓ１８１Ｈ９（配列番号７６）のポリペプチドを改変して４１９〜４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）を含有する配列ｓ７４Ｈ９−ｔ２（配列番号９３）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号９１）、ｓ７１Ｈ２−ｔ２（配列番号９７）、ｓ８６Ｂ４−ｔ２（配列番号９２）、ｓ１１５Ａ１−ｔ２（配列番号９６）、ｓ２２０Ｃ９−ｔ２（配列番号９９）、ｓ５５Ｇ７−ｔ２（配列番号９５）、ｓ１１３Ｅ７−ｔ２（配列番号１００）、ｓ６Ｅ１２−ｔ２（配列番号９４）、ｓ１８１Ｈ９−ｔ２（配列番号９８）を作出した。
【０１３６】
類似の様式において、４１７〜４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）を含有するポリペプチドｓ７４Ｈ９−ｔ３（配列番号１２３）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ３（配列番号１２１）、ｓ７１Ｈ２−ｔ３（配列番号１２７）、ｓ８６Ｂ４−ｔ３（配列番号１２２）、ｓ１１５Ａ１−ｔ３（配列番号１２６）、ｓ２２０１Ｃ９−ｔ３（配列番号１２９）、ｓ５５Ｇ７−ｔ３（配列番号１２５）、ｓ１１３Ｅ７−ｔ３（配列番号１３０）、ｓ６Ｅ１２−ｔ３（配列番号１２４）、ｓ１８１Ｈ９−ｔ３（配列番号１２８）を作出した。
【０１３７】
本発明によれば、第１の単量体の４１１位上のアミノ酸および第２の単量体の４１９位上のアミノ酸間のジスルフィド架橋が、４１１および４１９位上のアミノ酸をシステインに突然変異させることにより導入されている。したがって、ある実施形態において、アミノ酸配列ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１９３）が４１９〜４３３位において導入されており、またはアミノ酸配列ＲＭＣＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号１９４）が４１７〜４３３位において導入されている。
【０１３８】
上記のとおり、本出願人らは、ワクチン接種個体からの一次ヒトＢ細胞から単離された広域中和抗体を既に同定しており、その一部はグループ１に特異的であり（例えば、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載のＣＲ６２６１）、その一部はグループ２インフルエンザウイルスに特異的であった（例えば、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載のＣＲ８０２０）。これらのモノクローナル抗体のエピトープの詳細な分析は、それらの特異的抗体の交差反応性の欠落についての理由を明らかにした。両方の場合において、異なる位置上のグループ１またはグループ２ＨＡ分子中のグリカンの存在は、抗体がグループ特異的であるという事実を少なくとも部分的に説明した。下記の多くのグループ１および２ＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体の同定により、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン摂取スキームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１および／またはＨ３の（季節性）インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン摂取後にも明らかに誘発されず、または極めて低い程度で誘発されるにすぎない。
【０１３９】
本発明によれば、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４、および／またはＣＲ８０２０の特異的エピトープを模倣し、例えば、単独で、または他の予防および／もしくは治療的治療との組合せでインビボで投与される場合、交差中和抗体を誘発するために免疫原性ポリペプチドとして使用することができる多量体ポリペプチドが提供される。「交差中和抗体」は、系統発生グループ１のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの異なる亜型、および／または系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの異なる亜型、および／またはインフルエンザＢウイルスの少なくとも２つの異なる亜型、特に、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４、および／またはＣＲ８０２０により中和される少なくとも全てのウイルス株を中和し得る抗体を意味する。
【０１４０】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０５７に結合しない。ＣＲ６２６１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ８０２０は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ＣＲ８０５７は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４１】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、三量体である。
【０１４２】
ある実施形態において、ポリペプチド単量体は、アミノ酸配列：
【化１】
2017521073.tif 000002
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ，およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４３】
ある実施形態において、ポリペプチド単量体は、アミノ酸配列：
【化２】
2017521073.tif 000003
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４４】
ある実施形態において、ポリペプチド単量体は、アミノ酸配列：
【化３】
2017521073.tif 000004
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４５】
ある実施形態において、ポリペプチド単量体は、アミノ酸配列：
【化４】
2017521073.tif 000005
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４６】
ある実施形態において、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＹであり、Ｘ７はＩであり；Ｘ８はＹであり、Ｘ９はＳである。
【０１４７】
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適と考えられる任意の技術、例として、下記の技術に従って調製することができる。
【０１４８】
したがって、本発明の免疫原性ポリペプチドは、当分野において公知の標準的方法によりＤＮＡ配列として合成し、当分野において公知の好適な制限酵素および方法を使用してクローニングし、続いてインビトロまたはインビボで発現させることができる。したがって、本発明はまた、上記のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。ある実施形態において、本発明による核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このようなベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核および／または真核細胞中で複製し得るように設計することができる。さらに、多くのベクターは、直接的に、またはそれから単離された所望の断片の形態で真核細胞の形質転換に使用することができ、全部または一部としてそのような細胞のゲノム中に組み込まれ、所望の核酸をゲノム中に含む安定な宿主細胞をもたらす。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適であり、関心対象の核酸の転写に使用することができる任意のベクターであり得る。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい。あるいは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。
【０１４９】
当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質またはポリペプチドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは当業者に周知である。一般に、プロモーター配列が、発現させるべき配列の上流に配置される。多くの発現ベクターが当分野において利用可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどであり、それらを使用して好適なプロモーターおよび／または転写終結配列、ポリＡ配列などを得ることができる。関心対象のポリペプチドをコードする配列が、コードされるポリペプチドの転写および翻訳を支配する配列に関して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、関心対象のポリペプチドを産生するために有用であり、それは発現と称される。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、およびそれらの組合せが含まれ得る。これらは、宿主細胞中で機能し得、それによりそれらに機能的に結合している核酸配列の発現を駆動し得るべきである。当業者は、宿主細胞中での遺伝子の発現を得るために種々のプロモーターを使用することができることを把握する。プロモーターは、構成的または調節的であり得、種々の資源、例として、ウイルス、原核、もしくは真核資源から得ることができ、または人工的に設計することができる。関心対象の核酸の発現は、天然プロモーターもしくはその誘導体から、または完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）からのものであり得る。一部の周知で、真核細胞中での発現にかなり使用されるプロモーターは、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来するプロモーター、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本発明においてＣＭＶプロモーターと称される）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）などを含む。好適なプロモーターは、真核細胞からも由来し得、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ユビキチンＣまたはＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどである。プロモーター機能およびプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、および試験遺伝子の発現試験を包含し得る。無論、プロモーターは、その配列の欠失、付加、突然変異により変え、機能性について試験して新たな、減衰した、または改善されたプロモーター配列を見出すことができる。本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好ましい。
【０１５０】
当業者に周知の方法を使用して構築物を真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母または動物細胞）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核発現系中に形質移入することができる。一部の場合、好適な「タグ」配列（例えば、限定されるものではないが、ｈｉｓ、ｍｙｃ、ｓｔｒｅｐ、またはｆｌａｇタグなど）または完全タンパク質（例えば、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質またはグルタチオンＳトランスフェラーゼなど）を本発明の配列に付加して細胞または上清からのポリペプチドの精製および／または同定を可能とすることができる。場合により、特異的タンパク質分解部位を含有する配列を含めて後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。
【０１５１】
精製ポリペプチドは、当分野において公知の分光法（例えば、円偏光二色分光法、フーリエ変換赤外分光法およびＮＭＲ分光法またはＸ線結晶分析法）により分析してへリックスおよびベータシートなどの所望の構造の存在を調査することができる。以前に記載された広域中和抗体（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０５７）への本発明のポリペプチドの結合を調査するためにＥＬＩＳＡ、ＯｃｔｅｔおよびＦＡＣＳなどを使用することができる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択することができる。
【０１５２】
本発明は、さらに、治療有効量の本発明のポリペプチドおよび／または核酸の少なくとも１つを含む組成物に関する。組成物は好ましくは、免疫原性組成物である。組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容可能な」は、担体が用いられる投与量および濃度において、それが投与される対象中で不所望な効果も有害効果も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容可能な担体および賦形剤は、当分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。用語「担体」は、組成物がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩溶液および水性デキストローズおよびグリセロール溶液は、例えば、特に注射溶液のための液体担体として用いることができる。正確な配合は、投与の様式に適合すべきである。ポリペプチドおよび／または核酸分子は、好ましくは、滅菌溶液として配合および投与される。滅菌溶液は、滅菌濾過により、または当分野において自体公知の他の方法により調製される。次いで、溶液は、凍結乾燥または医薬投与容器中に充填することができる。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０から９．５、例えば、ｐＨ５．０から７．５の範囲である。
【０１５３】
本発明はまた、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に上記のポリペプチド、核酸分子および／または免疫原性組成物を投与することを含む方法に関する。本発明による対象は、好ましくは、感染性疾患惹起作用物質、特にインフルエンザウイルスにより感染され得、またはそうでなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であり、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、または家庭もしくは農場動物、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。したがって、本発明は、特にグループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７および／もしくはＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を利用する対象において誘導する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を利用して対象においてＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０１５４】
一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、グループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。一部の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物により誘導される免疫応答は、インフルエンザＡウイルスの２、３、４、５もしくは６つの亜型および／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザＡおよび／またはＢウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。
【０１５５】
小型タンパク質および／または核酸分子は強力な免疫応答を常に有効に誘導するわけではないことが周知であるため、アジュバントを添加することによりポリペプチドおよび／または核酸分子の免疫原性を増加させることが必要であり得る。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントを含み、またはそれとの組合せで投与される。本明細書に記載の組成物との組合せ投与のためのアジュバントは、前記組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。好適なアジュバントの例には、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム；油−エマルション組成物（または水中油型組成物）、例として、スクアレン−水エマルション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット参照）；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレット参照）；細菌または微生物誘導体が含まれ、その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、または破傷風トキソイドＴＴ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｍ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）である。さらに、公知の免疫強化技術、例えば、免疫応答を向上させることが当分野において公知のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＣＴＢ、細菌性フラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合またはビロソーム中へのポリペプチドの包含、またはそれらの組合せを使用することができる。使用することができる他の非限定的な例は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）により開示されている。
【０１５６】
一実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター中に取り込まれる。ＶＬＰは、一般に、典型的には、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＬＰは、複製し得ない。ある実施形態において、ＶＬＰは、ウイルスの全ゲノムを欠き得、またはウイルスのゲノムの一部を含み得る。一部の実施形態において、ＶＬＰは、細胞に感染し得ない。一部の実施形態において、ＶＬＰは、それらの表面上で当業者に公知のウイルス（例えば、ウイルス表面糖タンパク質）または非ウイルス（例えば、抗体またはタンパク質）標的化部分の１つ以上を発現させる。
【０１５７】
具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、ビロソーム中に取り込まれる。本発明によるポリペプチドを含有するビロソームは、当業者に公知の技術を使用して産生することができる。例えば、ビロソームは、精製ウイルスを破壊し、ゲノムを抽出し、粒子をウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド）および脂質とリアソートさせてウイルスタンパク質を含有する脂質粒子を形成することにより産生することができる。
【０１５８】
本発明はまた、特にワクチンとして使用される、インフルエンザＨＡに対する対象における免疫応答を誘導するための上記のポリペプチド、核酸、ベクターおよび／または免疫原性組成物に関する。したがって、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターまたは本明細書に記載のポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのステム領域に対する中和抗体を誘発させるために使用することができる。本発明は特に、系統発生グループ１および／もしくは系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される上記のポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。一実施形態において、ワクチンは、系統発生グループ１および／または２の２、３、４、５、６もしくはそれより多い異なる亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療において使用することができる。一実施形態において、ワクチンは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスにより引き起こされるインフルエンザ感染の予防および／または治療において使用することができる。
【０１５９】
本発明のポリペプチドは、合成後にインビトロで、または好適な細胞発現系、例として、細菌および真核細胞中で使用することができ、またはインビボでそれが必要とされる対象中で、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させることにより発現させることができる。このような核酸ワクチンは、任意の形態、例として、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクター、例として、アデノウイルスベクターを取り得る。
【０１６０】
本発明によるポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または免疫原性組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例には、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口などが含まれる。当業者は、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物を投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができる。ある実施形態において、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物（またはワクチン）は、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物が２回以上投与されるある実施形態において、第２の用量の投与は、例えば、第１の用量の投与後１週間以上の時間間隔後、第１の用量の投与後２週間以上、第１の用量の投与後３週間以上、第１の用量の投与後１ヵ月以上、第１の用量の投与後６週間以上、第１の用量の投与後２ヵ月以上、第１の用量の投与後３ヵ月以上、第１の用量の投与後４ヵ月以上など、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の第１の用量の投与後数年まで実施することができる。ワクチンを第１のプライミング投与後に２回以上のブースト投与が続くように３回以上、例えば、３回、４回など投与することも可能である。他の実施形態において、本発明によるポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物は、１回のみ投与される。
【０１６１】
ポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物は、プライムまたはブーストのいずれかとして、異種プライム−ブーストレジメンで投与することもできる。
【０１６２】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または組成物を利用して対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法をさらに提供する。具体的な実施形態において、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法は、それが必要とされる対象に有効量の上記のポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物を投与することを含む。治療有効量は、グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルス、および／またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じる疾患または病態、特にＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、および／またはＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスの感染により引き起こされる疾患の予防、改善および／または治療に有効な本明細書に定義のポリペプチド、核酸、および／または組成物の量を指す。予防は、インフルエンザウイルスの拡散の阻害もしくは低減またはインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上の発症、発現もしくは進行の阻害もしくは低減を包含する。本明細書において使用される改善は、可視もしくは知覚疾患症状、ウイルス血症、または任意の他の計測可能なインフルエンザ感染の症候の低減を指し得る。
【０１６３】
治療が必要とされる者には、グループ１もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じた病態により既に苦痛を受ける者、およびインフルエンザウイルスによる感染を予防すべき者が含まれる。したがって、本発明のポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物は、未投薬の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、もしくはインフルエンザウイルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、またはインフルエンザウイルスにより既に感染され、および／または感染されたことのある対象に投与することができる。
【０１６４】
一実施形態において、予防および／または治療は、インフルエンザウイルス感染を受けやすい患者群において標的化することができる。このような患者群には、限定されるものではないが、例えば、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者および抗ウイルス化合物により治療されたが、不適切な抗ウイルス応答を示した患者が含まれる。
【０１６５】
別の実施形態において、ポリペプチド、核酸分子および／またはベクターは、対象に１つ以上の他の活性剤、例えば、既存または将来のインフルエンザワクチン、モノクローナル抗体および／または抗ウイルス剤、および／または抗菌剤、および／または免疫調節剤との組合せで投与することができる。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイルス疾患の治療および／または予防において有益であり得、またはインフルエンザウイルス疾患に伴う症状または病態を改善し得る。一部の実施形態において、１つ以上の他の活性剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、または呼吸を緩和もしくは補助する治療物である。
【０１６６】
本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子の投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。好適な投与量範囲は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。用いるべきポリペプチドおよび／または核酸分子の正確な投与量は、例えば、投与経路、および感染またはそれにより引き起こされる疾患の重症度に依存し、医師の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。例えば、有効用量は、患者の標的部位、生理学的状態（例として、年齢、体重、健康）に応じて変動し、治療が予防的または治療的であるかを問わない。通常、患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量は、安全性および効力を最適化するように最適に力価測定される。
【０１６７】
本発明のポリペプチドは、潜在的な治療候補物として同定されたモノクローナル抗体の結合を確認するために使用することもできる。さらに、本発明のポリペプチドは、診断ツールとして、例えば、本発明のポリペプチドに結合し得るそのような個体の血清中の抗体が存在するか否かを確認することにより個体の免疫状態を試験するために使用することができる。したがって、本発明はまた、患者におけるインフルエンザ感染の存在を検出するインビトロ診断法であって、ａ）前記患者から得られた生物学的試料を本発明によるポリペプチドと接触させるステップ；およびｂ）抗体−抗原複合体の存在を検出するステップを含む方法に関する。
【０１６８】
本発明のポリペプチドは、新たな結合分子を同定するため、または既存の結合分子、例えば、モノクローナル抗体および抗ウイルス剤を改善するために使用することもできる。
【０１６９】
本発明を以下の実施例および図面においてさらに説明する。実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書に開示されるステムベースポリペプチド
ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書は、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、組成物およびワクチンならびにインフルエンザの予防および／または治療の分野におけるそれらの使用方法を開示している。ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６０９９７号明細書は、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）の部位特異的突然変異により得られ、ＣＲ６２６１（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）および／またはＣＲ９１１４の広域中和エピトープをさらに安定的に提示したＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡに由来するステムドメインポリペプチドのさらなる配列を開示している。
【０１７１】
Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡから以下のステップを利用することにより導いた：
１．ＨＡ０の開裂部位を除去すること。この部位における野生型ＨＡの開裂は、ＨＡ１およびＨＡ２をもたらす。除去は、Ｐ１位におけるＲからＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０参照）。
２．配列番号１からアミノ酸５３から３２０を欠失させることにより頭部ドメインを除去すること。配列の残りのＮおよびＣ末端部分は、４残基フレキシブルリンカーＧＧＧＧにより結合させた。
３．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１８（の相当物）により形成されるループ（ＡへリックスおよびＣＤへリックス間）の溶解度を増加させて融合前立体構造の安定性を増加させ、改変ＨＡの融合後立体構造を脱安定化させること。Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）において、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３ＧおよびＬ４１６Ｓ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入した。
４．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４および４３６位におけるアミノ酸間のジスルフィド架橋を導入すること；これは、突然変異Ｒ３２４ＣおよびＹ４３６Ｃ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入することにより達成される。
５．三量体化することが公知のＧＣＮ４由来配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号５）を４１９〜４３３位（番号付与は配列番号１を指す）において導入すること。
【０１７２】
ある実施形態において、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に産生されるように、膜貫通および細胞内ドメインの配列は、ＨＡ２の５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（または配列アラインメントから決定してその相当物）からＨＡ２のＣ末端（配列番号１による番号付与）まで欠失されている。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ｆｏｌｄｏｎ配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）を、場合により上記の短いリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させた。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製および検出を容易にするため、タグ配列、例えば、ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）またはＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１）またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介して連結させて場合により付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）またはＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）を含有し得る。プロセシングされたタンパク質も本発明に包含される。
【０１７３】
ＦＬＡＧタグ、トロンビン開裂部位、ｆｏｌｄｏｎ、およびＨｉｓ配列を組み合わせるこのようなＣ末端配列の一例は、配列番号４のＦＬＡＧ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｆｏｌｄｏｎ−Ｈｉｓである。この配列をＨ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）配列の可溶性形態と組み合わせて親配列（配列番号６）を作出し、それを使用して突然変異導入により本発明の新規ポリペプチドを作出した。この配列は、配列番号１および２のアミノ酸１〜１７に対応するリーダー配列を含有しない。
【０１７４】
したがって、ステムドメインポリペプチドは、ＰＣＴ／２０１２／０７３７０６号明細書および上記に記載のとおり分子の頭部ドメインをコードするヘマグルチニン配列の一部を欠失させ、配列のＮおよびＣ末端部分を欠失の両側でリンカーを介して再連結させることにより作出した。頭部ドメインの除去は、水性溶媒から既に保護された分子の一部を曝露されたままとし、本発明のポリペプチドの構造を潜在的に脱安定化させる。この理由のため、Ｂループ中の残基（特にアミノ酸残基４０６（配列番号１および２のそれぞれＦおよびＳ）、４０９（ＶおよびＴ）４１３（ＦおよびＧ）および４１６（ＬおよびＳ）を、親配列の配列番号６を出発点として使用して種々の組合せにおいて突然変異させた。配列番号６は、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）から、リーダー配列を除去し、残基５２０〜５６５をＦｌａｇ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｆｏｌｄｏｎ−−ｈｉｓ配列（配列番号４）により置き換えることにより作出した。
【０１７５】
同様に、融合ペプチド周辺の区域において、多数の疎水性残基が溶媒に曝露され、このことは、天然全長ＨＡとは異なり、ポリペプチドが開裂され得ず、タンパク質内部に疎水性融合ペプチドを埋め込む関連立体構造変化を受ける事実により引き起こされる。この問題に対処するため、配列番号２の残基Ｉ３３７、Ｉ３４０、Ｆ３５２およびＩ３５３の一部または全部も突然変異させた。
【０１７６】
このように、ＨＡステムポリペプチドの可溶性形態７４Ｈ９（配列番号５７）、１２７Ｈ１（配列番号５５）、７１Ｈ２（配列番号６１）、８６Ｂ４（配列番号５６）、１１５Ａ１（配列番号６０）、２２０１Ｃ９（配列番号６３）、５５Ｇ７（配列番号５９）、１１３Ｅ７（配列番号６４）、６Ｅ１２（配列番号５８）、１８１Ｈ９（配列番号６２）をライブラリの一部として作出した。
【０１７７】
当業者に周知のプロトコルを使用して上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中に形質転換させ、またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞中に形質移入した。哺乳動物細胞中の発現に使用される構築物は、ＨＡリーダー配列（配列番号１および２の残基１〜１７）を含有した一方、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中の発現に使用される構築物において、ＨＡリーダー配列を酵母アルファ因子リーダー配列（配列番号７）により置き換えた。このように発現タンパク質を細胞培養培地に指向させ、したがって、本発明のポリペプチドのさらなる精製なしで結合および発現の決定を可能とした。全ての配列は、ＦＬＡＧ−ｆｏｌｄｏｎ−ＨＩＳ  Ｃ末端配列（配列番号４）を含有した。
【０１７８】
本発明のポリペプチドへのモノクローナル抗体結合（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２０）は、ＥＬＩＳＡにより決定した。この目的のため、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体溶液（２０μｌ／ウェル）により４℃において一晩処理した。抗体溶液の除去後、残留表面を脱脂粉乳のＰＢＳ中４％溶液により室温において少なくとも１時間ブロッキングした。プレートを洗浄した後、２０μｌの細胞培養培地（無希釈または希釈）をそれぞれのウェルに添加し、室温において少なくとも１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、２０μｌの抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａ８９５２、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中４％の脱脂粉乳中２０００倍希釈）を添加した。インキュベーション（室温において１時間）後、プレートを再度１回洗浄し、２０μｌの発光基質（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ＃３４０７８）を添加してシグナルを発現させた。あるいは、比色検出法を使用してシグナルを発現させることができる。
【０１７９】
本発明のポリペプチドの発現は、均一性時間分解蛍光アッセイ（一般的記載について、例えば、Ｄｅｇｏｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００９  ３：２２−３２参照）から決定することができる。この目的のため、テルル（Ｔｂ）標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ドナー）およびＡｌｅｘａ４８８標識抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（アクセプター）の混合物（ＨＴＲＦ溶液）は、２１０．５μｌの抗ＦＬＡＧ−ＴＢ（原液２６μｇ／ｍｌ）および１．６８ｍｌの抗ＨＩＳ−４８８（原液５０μｇ／ｍｌ）を培養培地および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋０．１％のＢＳＡの８０ｍｌの１対１混合物に添加することにより調製した。１９μｌのＨＴＲＦ溶液をＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに添加し、１μｌの培養培地を添加した。励起時および他の化合物（タンパク質、培地構成要素など）から生じる短期寿命バックグラウンドシグナルの減衰を可能にするための遅延後、５２０および６６５ｎｍにおける蛍光発光の比を決定した。これは、試料中の総タンパク質含有率の尺度であり、異なる実験間のｍＡｂ結合シグナルを正規化するために使用する。
【０１８０】
当業者に周知のプロトコルに従って表３および４に列記されるポリペプチドをピキア・パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させた。培養培地を回収し、ステムドメインポリペプチドのＣＲ６２６１結合への結合および発現を上記のとおり決定した。結合アッセイにおける応答は発現タンパク質の濃度に対応するため、それぞれの発現配列についてのＨＴＲＦアッセイにおけるシグナルに対する結合シグナルの比を比較することによりＥＬＩＳＡ結合シグナルをタンパク質発現について正規化した。全ての発現タンパク質は、配列番号６の親配列と比較して高いＨＴＲＦシグナルとＣＲ６２６結合との比を示す。
【０１８１】
さらに、ＣＲ６２６１結合とＨＴＲＦシグナルとの比を計算し、親配列の配列番号６について計算された比と比較した。結果を表３および４の第５列に列記し；全ての発現タンパク質は、より高い比を示し、上記ステムポリペプチドがＣＲ６２６１の結合の増加を示すことを示す。
【０１８２】
実施例２：さらなるポリペプチドの設計および特性決定
上記ポリペプチドは、ＣＤヘリックス中で酵母転写因子アクチベータータンパク質ＧＣＮ４に由来する配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱを含有する。この配列は、ヘリカル二次構造を形成する高い傾向を有し、こうして本発明のポリペプチドの全安定性を向上させ得る。驚くべきことに、ヘマグルチニンステムポリペプチドの安定性および凝集状態は、ポリペプチドの一次配列中のＧＣＮ４由来配列の正確な局在および配列に依存的であることが見出された。
【０１８３】
本実施例において、本発明者らは、配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）が４１９〜４３３位（配列番号１による番号付与；例えば、配列番号８１から１１０）において導入されており、または配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）が４１７〜４３３位（例えば、配列番号１１１から１４０）において導入されている新規のポリペプチドのセットを記載する。
【０１８４】
この目的のため、当業者に周知の分子生物学の技術を使用して実施例１に記載のポリペプチド、すなわち、７４Ｈ９（配列番号５７）、１２７Ｈ１（配列番号５５）、７１Ｈ２（配列番号６１）、８６Ｂ４（配列番号５６）、１１５Ａ１（配列番号６０）、２２０１Ｃ９（配列番号６３）、５５Ｇ７（配列番号５９）、１１３Ｅ７（配列番号６４）、６Ｅ１２（配列番号５８）、１８１Ｈ９（配列番号６２）を改変して４１９〜４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２０）を含有する配列７４Ｈ９−ｔ２（配列番号８３）、１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号８１）、７１Ｈ２−ｔ２（配列番号８７）、８６Ｂ４−ｔ２（配列番号８２）、１１５Ａ１−ｔ２（配列番号８６）、２２０Ｃ９−ｔ２（配列番号８９）、５５Ｇ７−ｔ２（配列番号８５）、１１３Ｅ７−ｔ２（配列番号９０）、６Ｅ１２−ｔ２（配列番号８４）、１８１Ｈ９−ｔ２（配列番号８８）を作出した。
【０１８５】
類似の様式において、４１７〜４３３位における配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号２１）を含有する配列７４Ｈ９−ｔ３（配列番号１１３）、１２７Ｈ１−ｔ３（配列番号１１１）、７１Ｈ２−ｔ３（配列番号１１７）、８６Ｂ４−ｔ３（配列番号１１２）、１１５Ａ１−ｔ３（配列番号１１６）、２２０１Ｃ９−ｔ３（配列番号１１９）、５５Ｇ７−ｔ３（配列番号１１５）、１１３Ｅ７−ｔ３（配列番号１２０）、６Ｅ１２−ｔ３（配列番号１１４）、１８１Ｈ９−ｔ３（配列番号１１８）を作出した。
【０１８６】
ポリペプチドは、異なるウイルス株からのＨＡ分子の配列に基づき作出することもできる。例えば、配列番号１９５〜２０１は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株のＨＡ配列をベースとするポリペプチドを記載する。
【０１８７】
上記のとおり、可溶性ポリペプチドは、例えば、ＨＡ２ドメインの残基５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０からＨＡ２ドメインのＣ末端（配列番号１による番号付与）のＨＡベース配列のＣ末端部分を除去することにより作出することができる。
【０１８８】
ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、タグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６））またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介して連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルに従って後でプロセシングするためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）を含有し得る。
【０１８９】
配列番号５５〜６４および８１〜９０のポリペプチドの可溶性形態は、残基５１９〜５６５（番号付与は配列番号１を指す）の相当物を、改変トロンビン開裂部位および６ヒスチジンタグ（配列番号２１）の両方を含有する配列ＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＨＨＨＨＨＨにより置き換えることにより作出し、当業者に周知のプロトコルに従ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させた。
【０１９０】
比較のため、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書に記載のＨ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５２）およびＨ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ３（配列番号５３））の可溶性形態も実験に含めた。培養培地を回収し、ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４への結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、培養培地から直接ポリペプチドを捕捉するためのコートｍＡｂのＣＲ６２６１またはＣＲ９１１４および検出目的のためのＣ末端ｈｉｓタグに対して指向されるセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を使用して検出した。あるいは、ビオチン化ＣＲ９１１４をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとの組合せで、サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＣＲ９１１４により捕捉されたポリペプチドの検出に使用した。このフォーマットは、ポリペプチドの多量体形態の存在の検出を可能とする。試験された全てのポリペプチドは、ＥＬＩＳＡにより決定されたとおり、ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１に結合し得た。ＣＲ９１１４捕捉−ビオチン化ＣＲ９１１４検出サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出された多量体のレベルの増加が、ｓ５５Ｇ７−ｔ２（配列番号９５）、ｓ８６Ｂ４−ｔ２（配列番号９２）、ｓ１１５Ａ１−ｔ２（配列番号９６）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号９１）、ｓ１１３Ｅ７−ｔ２（配列番号１００）、ｓ２２０Ｃ９−ｔ２（配列番号９９）、ｓ７１Ｈ２−ｔ３（配列番号１２７）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ３（配列番号１２１）、ｓ７４Ｈ９−ｔ３（配列番号１２３）について観察された。
【０１９１】
さらなる特性決定のためにポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号８１）、８６Ｂ４−ｔ２（配列番号８２）および５５Ｇ７−ｔ２（配列番号８５）の可溶性形態をコードする遺伝子を含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４を形質移入した。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）が分泌最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。
【０１９２】
ポリペプチドの生成のため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００ｇにおいて５分間スピンダウンさせ、ＳＦ１０００フラスコを介して３００ｍＬの予備加温Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁することにより１．０＊１０６ｖｃ／ｍＬを播種した。この培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２、１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤＮＡを９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で３００ｍＬの培養容量中１．０μｇ／ｍＬの濃度にピペッティングした。並行して、４４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に添加し、室温において２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）混合物を細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２および１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目、細胞を培養培地から遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により分離した一方、可溶性ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター上で濾過した。
【０１９３】
精製目的のため、１５００ｍｌ（ｓ１２７Ｈ１＿ｔ２）、１８００ｍｌ（ｓ８６Ｂ４＿ｔ２）、および２４００ｍｌ（ｓ５５Ｇ７＿ｔ２）の培養上清を、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で予備平衡化された２４ｍｌのＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムにアプライした。洗浄緩衝液中１０ｍＭのイミダゾールによる洗浄ステップ後、結合したポリペプチドを、洗浄緩衝液中３００ｍＭのイミダゾールの段階的勾配により溶出させた。溶出ピークを回収し、濃縮し、さらなる精製のためにサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００にアプライした。５５Ｇ７−ｔ２および１２７Ｈ１−ｔ２について、分画を回収し、プールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＥＬＩＳＡおよび分析サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱との組合せ（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により分析して分子質量を推定した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４へのポリペプチドの結合を裏付けたが、ＣＲ８０２０への結合は裏付けなかった。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ結果を表９にまとめる。
【０１９４】
表８は、ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２が５５Ｇ７−ｔ２および８６Ｂ４−ｔ２と比較して高い収量（１ｌの培養上清当たり約３０ｍｇのタンパク質）を有することを示す。タンパク質の大多数は、単量体または二量体について予測されるものの間である６２ｋＤａの分子量を示す。タンパク質の凝集状態を裏付けるため、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験を、ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０に由来するＦａｂ断片の存在下で繰り返した。結果を表８にまとめる。
【０１９５】
結果は、ポリペプチドの可溶性形態ｓ１２７Ｈ１−ｔ２が、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４からのＦａｂ断片の存在下で複合体（ＳＥＣクロマトグラム中のピークのシフトにより証明）を形成することを示すが、ＣＲ８０２０からのＦａｂ断片の存在下では示さない。これは、Ｆａｂ断片の結合反応の特異性と一致する。それというのも、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４はグループ１に由来するＨＡに結合する一方、ＣＲ８０２０は結合しないためである。複合体のサイズを表ｓに列記し、これは、ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２が１から２つのＦａｂ断片に結合することを示し、精製ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２の集団の少なくとも一部が二量体形態であることを示す。
【０１９６】
ポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２とｍＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４との間の結合反応をさらに分析するため、ならびにＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の立体構造エピトープの存在を裏付けるため、精製タンパク質とのそれらの抗体の複合体化をバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４，Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）により試験した。この目的のため、ビオチン化ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０をストレプトアビジンコートセンサ上に固定化し、続いてそれを最初に精製されたポリペプチドの溶液に曝露させて会合速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離速度を計測した。
【０１９７】
固定化ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は、両方とも、１２７Ｈ１−ｔ２の可溶性形態への曝露後の明らかな応答により証明されるとおり、認識する。まとめると、ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２は多量に産生され、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に高い親和性で結合し得、このステムドメインポリペプチド中の対応中和エピトープの存在を裏付ける。ポリペプチドは、二量体構造を形成する傾向を有する。
【０１９８】
実施例３：本発明のジスルフィド安定化三量体
ワクチン中の免疫原上の中和エピトープの提示を改善するための１つの手法は、単量体免疫原間の追加の相互作用を遺伝子操作して単量体と比較して増加した溶解度を有する多量体種を作出することである。この方法の欠点は、単量体免疫原を一緒にすることにより、重要なエピトープが次のプロモーターにより潜在的にカバーされ得ることである。したがって、これを回避するように留意すべきである。
【０１９９】
本明細書に記載の本発明のポリペプチドは、インフルエンザのヘマグルチニン分子に由来する。この分子は、ウイルス膜上の天然状態の三量体である。ここで、本発明者らは、溶液中で安定な三量体を形成する一方、中和ｍＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４のエピトープを曝露させる本発明の改変ポリペプチドを記載する。
【０２００】
本発明の三量体ポリペプチドを生成するため、ＨＡステムベースポリペプチドの単量体種の三量体化を促進する安定化相互作用を設計し、特に、三量体中の個々の単量体間の共有結合ジスルフィド架橋の作出にフォーカスした。この目的のため、未開裂状態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１．／１８（ＰＤＢ  １ＲＤ８）およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（ＰＤＢ：３ＬＺＧ）からのＦＬ  ＨＡの三次元構造を分析して別の単量体の近接性およびタンパク質の立体構造特徴部が単量体間ジスルフィド架橋の形成を潜在的に可能とし得る区域を同定した。残基間距離が３．５Å未満である残基の１１のペアを同定した（表９）。それぞれのペアについて、残基を三量体構造中の異なるプロモーター（単量体）上で局在させることを確保するように留意した。ジスルフィド架橋の形成を介して共有結合している三量体ポリペプチドを形成する意図で、ポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号１６０から１７０および５５Ｇ７−ｔ２（配列番号１４９〜１５９）中のそれらの残基の相当物（配列アラインメントから決定）をシステインに突然変異させた。三量体ＨＡ分子の３回対称性を考慮して、良好な設計が、三量体中の単量体のそれぞれを２つの他の単量体に共有結合する３つのプロモーター間ジスルフィド架橋の形成をもたらす。
【０２０１】
設計されたジスルフィド架橋ならびにＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１の中和エピトープの存在を試験するため、設計されたポリペプチドの可溶性形態をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させた。可溶性形態は、配列番号１４９から１７０から残基５３０〜５６５（番号付与は、配列番号１を指す）の相当物を欠失させてポリペプチド配列番号１７１から１９２を作出することにより作出した。追加の配列ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）をＣ末端において付加し、事実上、精製および／または検出を支援するために第Ｘ因子タンパク質分解開裂部位を先にして７ヒスチジン精製タグを導入した。
【０２０２】
ポリペプチドを産生するため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００ｇにおいて５分間スピンダウンし、ＳＦ２５０フラスコ当たり３０ｍＬの予備加温Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁させることにより、１．０＊１０６ｖｃ／ｍＬを播種した。この培地をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２、１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤＮＡを１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で、３０ｍＬの培養容量で１．０μｇ／ｍＬの濃度にピペッティングした。並行して、４４μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍミックスを２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍミックスに添加し、室温において２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）ミックスを細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２および１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目において、細胞を遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により培養培地から分離した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清を、さらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター上で濾過した。
【０２０３】
培養培地を回収し、広域中和抗体ＣＲ９１１４の２つ以上のエピトープを提示するポリペプチドの多量体形態の存在についてサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて分析した。最初に、ＣＲ９１１４コートプレートを使用して培養培地から発現ポリペプチドを直接捕捉した。第２に、ビオチン化ＣＲ９１１４をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとの組合せで本発明のＣＲ９１１４捕捉ポリペプチドの検出に使用した。対照として、三量体および単量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの可溶性精製全長ＨＡを、アッセイに含めた（図２Ａ）。結果を図２に示す。
【０２０４】
三量体全長ＨＡは、低希釈率において明らかなシグナルを示すが、約０．０００１μｇ／ｍｌ以下の濃度においてこのシグナルはもはや検出可能でない（図２Ａ）。単量体全長ＨＡについて、シグナルは低希釈率においても観察されるが、強度はかなり低く、シグナルは約０．０２μｇ／ｍｌ以下においてもはや検出可能でない。シグナルは、精製の間に単量体から分離することができず、または経時的に単量体から形成した一部の残留三量体により引き起こされる可能性が最も高い。Ｈ１ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号５２）（図２Ａ）および１２７Ｈ１（配列番号５５）図２Ｂの可溶性形態のみが、低い強度シグナルを示し、溶液中でＣＲ９１１４のエピトープを示す多量体ポリペプチドの低濃度または不存在を示す。１２７Ｈ１−ｔ２（配列番号８１）の可溶性形態、図２Ｂは、このアッセイにおいて明らかな応答を示し、一部の多量体種の存在を示すが、観察されたシグナルの強度は、全長ＨＡ三量体と比較して低い。
【０２０５】
追加の導入システインを有する５５Ｇ７−ｔ２をベースとする可溶性ポリペプチドについての結果を図２Ｃに示す。ほとんどのペプチドについて、シグナルが観察されず、または極めて低いシグナルが観察されるにすぎず、ＣＲ９１１４のエピトープを提示する多量体種が培養培地中に存在しないことを示す。明らかな例外は、ポリペプチドｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１７５；追加のシステインを４１１および４１９位において導入；番号付与は配列番号１を指す）である。検出可能な応答を示す唯一の他のポリペプチドはｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ１４ｌｏｎｇ（配列番号１７１；追加のシステインを４２３および４２４位において導入）であるが、シグナルはより低く、より低い希釈率において消失する。
【０２０６】
１２７Ｈ１−ｔ２をベースとするポリペプチドについての結果を図２Ｄに示す。この場合において、明らかな応答は、ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１４ｌｏｎｇ（配列番号１８２；４２３および４２４位における追加のシステイン）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１５ｌｏｎｇ（配列番号１８３；４３０および４３１における追加のシステイン）、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１７ｌｏｎｇ（配列番号１８５；４０５および４２９における追加のシステイン）、およびｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ２４ｌｏｎｇ（配列番号１９１；３４４および４６７における追加のシステイン）について、ならびにより小程度でｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１９ｌｏｎｇ（配列番号１８７；３８および３９０における追加のシステイン）およびｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ２３ｌｏｎｇ（配列番号１９０；３４２および４６０における追加のシステイン）について観察される。低いが、検出可能な応答は、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１６ｌｏｎｇ（配列番号１８４；４０４および４３３における追加のシステイン）について観察される。しかしながら、５５Ｇ７−ｔ２の場合と同様、最良の結果は、４１１および４１９位において導入された追加のシステインを有するバリアントｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）について得られる。
【０２０７】
追加のシステインを有する本発明のポリペプチドをさらに特性決定するため、当分野において十分確立されたプロトコルを使用して培養上清をウエスタンブロットにより分析した。検出目的のため、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）のＨＡタンパク質に対して指向されるポリペプチド抗体を使用した。非還元条件下の三量体について、すなわち、ジスルフィド架橋がインタクトである場合、約９０ｋＤａ以上におけるタンパク質バンド（グリコシル化の程度に依存する）が予測される一方、還元条件下では３５ｋＤ（本発明のグリコシル化単量体ポリペプチドに対応する）に近いバンドが予測される。結果を図３ＡおよびＢに示す。還元条件下の追加のシステインを含有する５５Ｇ７−ｔ２のバリアントについて、強力なシグナルが、ｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇおよびｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ２２ｌｏｎｇ、およびより小程度でｓ５５Ｇ７−ｃｌ１４ｌｏｎｇについて観察される。非還元条件下、１００ｋＤａを超える異なるサイズのタンパク質のスメアがｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇおよびｓ５５Ｇ７−ｔ２−ｃｌ２２ｌｏｎｇについて観察され、共有結合架橋ステムドメインポリペプチドがそれらの試料中で存在することを示す。スメアは、ｓ５５Ｇ７−ｃｌ１４ｌｏｎｇについても観察されるが、強度は、ｓ５５Ｇ７−ｃｌ１８およびｓ５５Ｇ７−ｃｌ２２について観察されるものよりも低い。
【０２０８】
還元条件下の１２７Ｈ１−ｔ２に由来する追加のシステイン含有ポリペプチドのウエスタンブロットについての結果（図３Ｃ）は、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１４ｌｏｎｇ、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１５ｌｏｎｇ、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１６ｌｏｎｇ、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１７ｌｏｎｇ、およびｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇについての強力なシグナルを示す。ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１７ｌｏｎｇおよびｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇについて、１００ｋＤａに近い規定タンパク質バンドが非還元条件下で観察され（図３Ｄ）、共有結合架橋ステムドメインポリペプチドの存在を示す。ポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１４ｌｏｎｇおよびｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１５ｌｏｎｇもウエスタンブロット上でほぼ１００ｋＤａのいくぶんの強度を示すが、シグナルはｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１７ｌｏｎｇ、および特にｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇほど強力でない。この構築物中のジスルフィド架橋（ｃｌ１８）は、図４に示されるとおりある単量体のＢループを別の単量体のＣＤヘリックスの上部に連結し、５５Ｇ７−ｔ２および１２７Ｈ１−ｔ２のバックグラウンドにおいて両方で最も強力な結果を与える。
【０２０９】
Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ（ＰＮＡＳ  ２０１３）は、複数の単量体間ジスルフィド架橋を含有するＨＡステムドメインポリペプチドを記載する。これらの構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベース無細胞系中で産生され、本明細書に記載のタンパク質と対照的に、未フォールドタンパク質であり、リフォールドする必要がある。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌによるステムベースポリペプチドは、Ｃ末端におけるｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメインを含有し、単量体は複数のジスルフィド結合を介して共有結合している。記載のジスルフィド結合は、ｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメイン中またはＨＡステムポリペプチドのＨＡ由来部分中のいずれかに局在する。４２３および４２４位（クラスター１４）ならびに４３０および４３１位（クラスター１５）におけるシステインを含むポリペプチドのＨＡ由来部分中の４つの潜在的なジスルフィド結合が記載される。記載のステムドメインポリペプチドにおいて、４３０および４３１位（クラスター１５）におけるシステインで最良の結果が得られたが、４２３および４２４位（クラスター１４）におけるシステインについて三量体化を観察することもできた。両方の場合において、追加のジスルフィド架橋がＣ末端ｆｏｌｄｏｎドメイン中に存在した。驚くべきことに、ここの結果は、ジスルフィド結合Ｃ末端三量体化ドメインの不存在下で、４１１および４１９位におけるシステインを介して２つの異なる単量体を共有結合する遺伝子操作されたジスルフィドが、より多量の三量体ステムドメインポリペプチドをもたらすことを示す。まとめると、本発明者らは、戦略的に配置されたジスルフィドペアの導入がＨＡステムベースポリペプチドの多量体化をもたらし得ることを示した。特に、４１１および４１９位（クラスター１８）におけるシステインの同時導入は、ウエスタンブロットおよびサンドイッチＥｌｉｓａ結果から証明されるとおり溶液中の多量体種の形成をもたらす。
【０２１０】
実施例４：本発明の三量体ポリペプチドの精製および特性決定
本発明のポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８をさらに特性決定するため、タンパク質を精製した。精製を容易にするため、タンパク質のＣ末端における膜貫通および細胞質ドメインを上記のとおり除去してタンパク質の可溶性形を作出することができる。産生の間のタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）が分泌最終ポリペプチド中で存在しないことが当業者により理解される。本発明の可溶性ポリペプチドの非限定的な例は、ｓ１２７Ｈ−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）である。
【０２１１】
本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、当分野において十分に確立されたプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に追加のＣ末端ｈｉｓタグ配列（ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ）を含有する本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４を形質移入し、７日間培養した。精製目的のため、３００ｍｌの培養上清を、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で予備平衡化された５ｍｌのＨｉｓ捕捉カラムにアプライした。洗浄緩衝液中１０ｍＭのＩｍｉｄａｚｅによる洗浄ステップ後、本発明の結合ポリペプチドを洗浄緩衝液中３００ｍＭのイミダゾールの段階勾配により溶出させた。溶出ピークを回収し、緩衝液交換し、濃縮し、さらなる精製のためにサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）にアプライした。溶出プロファイルを図５Ａに示し、図に示されるとおり分画１〜４を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５Ｂ）、ネイティブＰＡＧＥ（図５Ｃ）およびウエスタンブロット（図５Ｄ）により分析した。
【０２１２】
非還元条件下、ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、本発明の共有結合三量体ポリペプチドについて予測される１００および１５０ｋＤ間の分画２および３についての明らかなバンドを示す一方、分画４は、本発明の単量体ポリペプチドについて予測されるサイズに近いほぼ３７ｋＤに集中する拡散バンドを示す。サイズ変動は、ポリペプチドのグリコシル化の程度の変動からの結果であり、ＨＡに由来する他のステムドメインポリペプチドについて観察された。ジスルフィド架橋の還元時、分画３中の主要バンドは、分画４について観察されたバンドに極めて類似する約３７ｋＤにシフトし、還元が単量体化をもたらすことを示す。分画２について、シフトを明確に識別することができない。分画１は、明らかな主要バンドを有さない一連のサイズのタンパク質を示す。
【０２１３】
ネイティブＰＡＧＥ（非還元条件）は、分画３および４中のタンパク質間の明らかなサイズ差を示し、主要バンドはそれぞれ１４６〜２４０ｋＤおよび６６ｋＤ未満である。分画２について、１４６および２４０ｋＤ間の弱いシグナルが観察される一方、分画１について、おそらく大きな凝集物の形成に起因してタンパク質を検出することができない。
【０２１４】
検出のためのポリクローナル抗Ｈｉｓを使用するウエスタンブロットデータ（非還元条件）は、分画３中の主要バンドがヒスチジンタグ化材料であることを裏付ける。それというのも、明らかなバンドが１００および１５０ｋＤ間に観察されるためである。分画２について、弱いシグナルが三量体のほぼ予測サイズで観察されるが、より高次のオリゴマーも検出される一方、分画４について、弱く拡散したシグナルがほぼ３７ｋＤで観察される。これらのデータは、分画２、３および４中の主要バンドがＨ１ＨＡに由来することを裏付ける。分画１中のタンパク質については、シグナルが観察されなかった。
【０２１５】
ＥＬＩＳＡにより、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体のコーティングを使用して本発明のｈｉｓタグ化ポリペプチドを捕捉してＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０の中和エピトープの存在を決定した。試験下のｍＡｂの結合後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしている二次抗体を検出に使用した。対照として、単量体および三量体全長Ｈ１ＨＡ（抗原）ならびにＨ１ＨＡに対して指向されるポリクローナル血清（検出用）を含めた。結果を図６に示す。ｍＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４への結合は、分画２、３および４について、ならびに単量体および三量体ＦＬ  ＨＡについて明らかに観察される。分画１について、弱いシグナルのみがＣＲ９１１４結合について検出され、ＣＲ６２６１への結合についてはほとんどシグナルが検出されない。どの分画においても、ＣＲ８０２０（グループ２からのＨＡに特異的なｍＡｂ）への結合は観察されない。単量体ＦＬ  ＨＡはポリクローナル抗Ｈ１ＨＡにより認識されるが、三量体ＦＬ  ＨＡへの応答はかなり少なく、おそらく単量体に対する三量体中のエピトープの一部の閉塞に起因する。類似のパターンが分画３（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の三量体）および分画４（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の単量体）の結果間で観察され、溶液中の本発明のポリペプチドの十分にフォールドされた三量体形態の分画３中の存在と一致する。
【０２１６】
分画１〜４をＣＲ９１１４サンドイッチＥＬＩＳＡにおいても試験して上記の本発明の多量体ポリペプチドを検出した（図７参照）。比較のため、単量体および三量体ＦＬ  ＨＡをここでもこの実験に含めた。分画３は、三量体ＦＬ  ＨＡと極めて類似する応答を示し、本発明のポリペプチドの三量体形態と一致する一方、分画２および４についての応答は単量体および三量体ＦＬ  ＨＡ間の中間である。
【０２１７】
ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０のＦａｂ断片とｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇとの間の複合体形成を、分析サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱との組合せにより試験して分画３中のタンパク質についての分子質量（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を推定した（図８）。結果は、分画３中に存在するポリペプチドが約１１０ｋＤの分子量を有することを示し、三量体の形成と一致する（グリコシル化を除くアミノ酸配列に基づき計算された単量体分子量は、２９．２ｋＤである）。本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇは、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４からのＦａｂ断片の存在下で複合体を形成するが（ＳＥＣクロマトグラム中のピークのシフトにより証明されるとおり）、ＣＲ８０２０からのＦａｂ断片の存在下では形成しない。これは、Ｆａｂ断片の結合反応の特異性と一致する。それというのも、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４はグループ１に由来するＨＡに結合する一方、ＣＲ８０２０は結合しないためである。形成された複合体のサイズは、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４のＦａｂ断片でそれぞれ約２１５および２４８ｋＤであり、ポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８が３つのＦａｂ断片に結合し得ることを示す（３つのＦａｂ断片との複合体中の三量体について予測される分子量は約２５０ｋＤであり；ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験から導かれた分子質量を表１０にまとめる）。
【０２１８】
実施例５：本発明のポリペプチドの特性決定
本発明のポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８と、ｍＡｂのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４との間の結合反応をさらに分析するため、ならびにＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の立体構造エピトープの存在を再確認するため、それらの抗体と精製タンパク質との複合体化をバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）により試験した。この目的のため、ビオチン化ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０をストレプトアビジンコートセンサ上で固定化し、続いてそれを最初に本発明の精製ポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８の溶液に曝露させて会合の速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離の速度を計測した。結果を図９に示す。
【０２１９】
固定化ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は、両方とも、１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８の可溶性形態への曝露後の明らかな応答により証明されるとおり本発明のポリペプチドを認識する（図９ＡおよびＢ）。結合相互作用についての解離定数を推定するため、２倍希釈系列を使用して力価測定を実施した。固定化ＣＲ６２６１またはＣＲ９１１４を含有するセンサを、それぞれ１０、５、２．５、１．３および０．６３、０．３１および０．１６ｎＭにおける可溶性ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ溶液に曝露させ、６６００秒後の最終応答を記録した。応答をステムドメインポリペプチド濃度の関数としてプロットし、定常状態結合モデルへのフィットを実施し、ＣＲ６２６１／ステムドメインポリペプチド複合体について０．７ｎＭ、ＣＲ９１１４複合体について０．５ｎＭの解離定数Ｋｄを生じさせた（図９ＣおよびＤ）。
【０２２０】
まとめると、本発明のポリペプチド１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８は、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に高いアビディティーで結合し得る共有結合三量体を形成し、このステムドメインポリペプチド中の対応する中和エピトープの存在を裏付ける。溶液中の結合反応の化学量論は１：３であり、中和エピトープが三量体のそれぞれの個々の単量体中で存在することを示す。
【０２２１】
実施例６：致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力の評価
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の保護効力をさらに評価するため、８〜１４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより３週間の間隔において１、２および３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰性対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０の異種チャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。最後の免疫化から４週間後に得られたプレチャレンジ血清を、免疫化に使用された本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇへの結合（正確な免疫化を確認するため）、可溶性Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７全長ＨＡへの結合（全長ＨＡの認識を確認するため）および全長ＨＡへの結合についての広域中和モノクローナル抗体ＣＲ９１１４との競合（誘導された抗体が広域中和抗体ＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため）についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。結果を図１０〜１５に示す。
【０２２２】
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群中の全てのマウスはチャレンジ後７日目において感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図１０Ａ）。ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により１回免疫化された１０匹のマウスのうち９匹は致死チャレンジを生存し、全てのマウスは２または３回の免疫化後に生存した（図１１）。さらに、体重損失は、２または３回免疫化された動物について無視可能であり（図１２）、臨床徴候が観察されず（２または３回）、または最小（１回）の臨床徴候が観察された（図１３）。ＰＢＳ対照群と比較して、統計的に有意な生存比率の増加、生存時間の増加、体重損失の減少および臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより免疫化された全ての群について観察された。
【０２２３】
ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（図１４Ａ）または可溶性全長ＨＡ（図１４Ｂ）を抗原として使用する最後の免疫化から４週間後のプレチャレンジ時点からのＥＬＩＳＡデータは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇが免疫原性であり、１回の免疫化後でさえ全長ＨＡを認識し得る抗体を誘導することを示すが、レベルは、２および３回の免疫化後に実質的に高い。
【０２２４】
免疫化に対する免疫学的応答をさらに理解するため、競合結合ＥＬＩＳＡを実施した。この目的のため、プレート結合全長ＨＡを段階希釈血清試料とインキュベートし、その後に所定の力価測定濃度におけるＣＲ９１１４−ビオチンを添加した。さらなるインキュベーション後、当分野において周知のプロトコルに従ってストレプトアビジンコンジュゲートセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して結合ＣＲ９１１４−ビオチンの量を定量した。「傾きＯＤ」（ΔＯＤ／１０倍希釈率）として表現される対数希釈率に対するＯＤのロバスト線形回帰を使用してデータを分析した。データは、広域中和抗体ＣＲ９１１４と結合について競合し得る抗体レベルが、本発明のアジュバント添加ポリペプチドによる免疫化により誘導されることを示す。２回の免疫化後、レベルは明らかにバックグラウンドを超え、それらは３回目の免疫化後に上昇し続ける（図１５、上段）。比較として、非標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方とも５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）により誘導されるレベルを、別個のグラフに示す（図１５、下段）。
【０２２５】
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）による免疫化が、たとえ単一の免疫化ラウンド後でも、インフルエンザによる致死感染に対してマウスを保護し得ることを示した。ポリペプチドは、免疫原性であり、全長ＨＡに結合し得る抗体を誘導する。誘導される抗体の少なくとも一部が、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の広域中和エピトープのエピトープに結合し、またはその近くで結合する。
【０２２６】
実施例７：致死異種亜型Ｈ５Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力の評価
致死Ｈ５Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の保護効力をさらに評価するため、８〜１２匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰性対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０の異種亜型チャレンジウイルス（Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。結果を図１６に示す。
【０２２７】
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群中の全てのマウスはチャレンジ後８〜１０日目の間において感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図１６Ａ）。ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により免疫化された１０匹のマウスのうち１０匹は致死チャレンジを生存する（図１６Ｂ）。さらに、体重損失はそれらの動物について無視可能であり（図１６Ｃ）、フォローアップ期間の間に臨床徴候は観察されなかった（図１６Ｄ）。ＰＢＳ対照群と比較して、統計的に有意な生存比率の増加、生存時間の増加、体重損失の減少および臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇにより免疫化された群について観察される。
【０２２８】
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２ｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）による免疫化が、異種亜型Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株による致死感染に対してマウスを保護し得ることを示した。
【０２２９】
実施例８：本発明のポリペプチドによる免疫化を介して誘発された血清の結合域の評価
実施例６に記載の結果は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）が免疫原性であり、本発明のポリペプチドの設計のための基礎として使用される株からのＦＬ  ＨＡを認識し得る抗体を誘発し得ることを示す。実施例７に記載の３回免疫化されたマウスからの血清を、いくつかの他のグループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループＩＩ（Ｈ３およびＨ７）インフルエンザ株からの全長ＨＡに対する結合についてもＥＬＩＳＡにより当分野において周知のプロトコルに従って試験した（図１７）。結果は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により誘導された抗体がＦＬ  ＨＡの天然配列中に存在するエピトープを効率的に認識すること、ならびに抗体が結合するエピトープが異なるグループ１（特に、Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびさらには一部のグループ２インフルエンザ株（例えば、Ｈ７）間で保存されることを実証する。
【０２３０】
実施例９：致死Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力の評価
致死Ｈ１Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の保護効力をさらに評価するため、８〜１８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に静脈内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化が陰性対照として機能した。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２３１】
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群における全てのマウスはチャレンジ後７〜１０日目の間に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護されるためである（図１８Ａ）。ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により免疫化された１０匹のうち１０匹のマウスが、致死チャレンジを生存する（図１８Ｂ）。さらに、体重損失は平均して感染後４日で約１０％であるが（図１８Ｃ）、動物は１０日以内に完全に回復する。臨床徴候も感染後４日でピークであるが、感染後９日目以降は不存在である（図１８Ｄ）。ＰＢＳ対照群と比較して、統計的有意な生存比率の増加、生存時間の増加、体重損失の減少および臨床スコアの低減が、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇにより免疫化された群について観察される。
【０２３２】
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）による免疫化が、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７による致死感染に対してマウスを保護し得ることを示した。
【０２３３】
実施例１０：本発明のポリペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のインフルエンザ中和抗体の存在の評価
インフルエンザに対する保護における役割を担う抗体媒介エフェクター機序をさらに調査するため、プレチャレンジ血清を、下記のＨ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４に由来する偽粒子を使用する偽粒子中和アッセイ（Ａｌｂｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）において試験した。
【０２３４】
偽粒子中和アッセイ
ＦＬ  ＨＡを発現する偽粒子を既に記載のとおり生成した（Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。既に記載のとおり（Ａｌｂｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）（わずかに改変）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＨ５Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４偽粒子によるＨＥＫ２９３細胞の単一形質導入ラウンドを使用して中和抗体を決定した。手短に述べると、熱不活性化（５６℃において３０分間）プレチャレンジ血清試料を成長培地（２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）、１％の非必須アミノ酸溶液（Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）および１０％のＦＢＳ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ，Ｐｅｒｏ，Ｉｔａｌｙ）が補給されたＥＢＳＳを有するＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｓｅｒｌａｎｄ））中で、９６ウェル平底培養プレート中で３つ組で３倍段階希釈し、力価測定数のＨ５Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４偽粒子（感染後に１０６の相対発光単位（ＲＬＵ）を生じさせる）を添加した。３７℃、５％のＣＯ２における１時間のインキュベーション後、ウェル当たり１０４個のＨＥＫ２９３細胞を添加した。３７℃、５％のＣＯ２における４８時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ基質（Ｂｒｉｔｅｌｉｅ  Ｐｌｕｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加し、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用して発光を計測した。
【０２３５】
実施例６、７、および８に記載の本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により免疫化された動物から得られたプレチャレンジ血清は、偽粒子中和アッセイを使用して高い血清濃度において検出可能な中和を示した（図１９）。これは、免疫原として使用される場合に広域中和抗体を誘発する本発明のポリペプチドの能力を実証する。
【０２３６】
直接ウイルス中和の他、Ｆｃ媒介エフェクター機序、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が、インフルエンザに対する保護に実質的に寄与し、ステム指向ｂｎＡｂはそれらの機序において特に有効である（ＤｉＬｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２ｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）による免疫化後に誘発された抗体がＡＤＣＣを誘導し得るか否かを試験するため、本発明者らは、下記のとおりマウスについて適合させたＡＤＣＣ代理アッセイ（Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｃｈｎｅｕｒｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用してプレチャレンジ血清を試験した。
【０２３７】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）代理アッセイ
ヒト肺癌由来Ａ５４９上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清が補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地中で３７℃、１０％のＣＯ２において維持した。実験２日前、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡ５４９細胞にＨ５Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７  ＨＡまたはＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７  ＨＡをコードするプラスミドＤＮＡを形質移入した。アッセイ１日前、形質移入細胞をハーベストし、ＡＤＣＣのために白色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で、およびイメージングのために黒色透明底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中で播種した。２４時間後、試料をアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中４％の超微量ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ））中で希釈し、５６℃において３０分間熱不活性化し、次いでアッセイ緩衝液中で段階希釈した。ＡＤＣＣバイオアッセイのため、Ａ５４９細胞に新たなアッセイ緩衝液を補充し、抗体希釈物およびマウスＦｃガンマ受容体ＩＶを発現するＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞（ＦｃγＲＩＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加し、１：４．５の標的−エフェクター比において３７℃において６時間インキュベートした。細胞を室温に１５分間平衡化してからＢｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。発光をＳｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ（Ｂｉｏｔｅｋ）上で１０分後にリードアウトした。データを血清の不存在下のシグナルの誘導倍率として表現する。
【０２３８】
このアッセイを使用して、実施例６、７および８に記載の本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により免疫化された動物から得られたプレチャレンジ血清を、抗原の資源としてのＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡが形質移入された標的細胞を使用してＦｃγＲＩＶシグナリング活性について試験した（図２０）。両方の場合において、試験された最大血清濃度において３０〜４０倍の誘導が観察され、マウスにおいてＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を示すＦｃγＲＩＶシグナリングを活性化させる抗体を誘発する本発明のポリペプチドの能力を実証する。
【０２３９】
実施例６〜９において示されるこれらの結果は、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１−ｔ２１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の能力がステム標的化、中和およびＡＤＣＣ媒介抗体を誘発し、同種、異種および異種亜型グループＩインフルエンザ株による致死チャレンジに対してマウスを保護し得ることを示す。
【０２４０】
実施例１１：Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９からのＨＡをベースとする本発明のポリペプチドの設計
実施例１から１０は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＨＡをベースとする本発明のポリペプチドを記載する。類似のポリペプチドを、他のインフルエンザ株、例えば、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９からの他のＨＡをベースとして設計することもできる。したがって、上記概略された手順に従って、配列番号２０２および２０３に記載の本発明のポリペプチドを作出した。
【０２４１】
実施例１２：Ｈ１株からのＨＡをベースとする本発明のさらなるポリペプチドの設計
実施例１から１１は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（配列番号２５２）からのＨＡをベースとする本発明のポリペプチドを記載する。類似のポリペプチドを、他のＨ１インフルエンザ株からのＨＡをベースとして設計することもでき、それらも本発明に含まれる。非限定的な例は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｔｅｘａｓ／ＵＲ０６−０５２６／０７（配列番号２０５）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／６２９／９５（配列番号２０６）およびＨ１Ｎ１Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／４３（配列番号２０４）のＨＡである。したがって、上記概略された手順に従って、配列番号２０７から２１６に記載の４１１および４１９位（クラスター１８）におけるシステイン間の遺伝子操作されたジスルフィド架橋を含有する本発明のステムドメインポリペプチドを作出した。配列番号２０２、２０３、２１３および２１４は、配列番号８によるＢループ配列を作出するための４１５位（番号付与は、配列番号１を指す）において導入された追加のリジン突然変異を含有し；それらの配列も本発明に含まれる。
【０２４２】
実施例１３：本発明のポリペプチドの発現および特性決定
設計ジスルフィド架橋ならびにＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１の中和エピトープの存在について試験するため、設計ポリペプチドの可溶性形態をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させた。可溶性形態は、配列番号２０２、２０７、２０９、２１３からアミノ酸残基５３０〜５６５（番号付与は配列番号１を指す）の相当物を欠失させてそれぞれ本発明のポリペプチド配列番号２０３、２０８、２１０および２１４を作出することにより作出した。これらの配列はポリペプチドのプロセシング形態、すなわち、リーダー配列の除去後の形態を記載することが留意される。追加の配列ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）または配列番号２０８においてＥＧＲＨＨＨＨＨＨをＣ末端において付加し、事実上、精製および／または検出を支援するために第Ｘ因子タンパク質分解開裂部位を先にして７または６ヒスチジン精製タグを導入した。
【０２４３】
ポリペプチドを産生するため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００ｇにおいて５分間スピンダウンし、ＳＦ２５０フラスコ当たり３０ｍＬの予備加温Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁させることにより、１．０＊１０６ｖｃ／ｍＬを播種した。この培地をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２、１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤＮＡを１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で、３０ｍＬの培養容量で１．０μｇ／ｍＬの濃度にピペッティングした。並行して、４４μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍミックスを２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍミックスに添加し、室温において２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）ミックスを細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２および１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目において、細胞を遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により培養培地から分離した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清を、さらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター上で濾過した。
【０２４４】
培養培地を回収し、広域中和抗体ＣＲ９１１４の２つ以上のエピトープを提示するポリペプチドの多量体形態の存在についてサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて分析した。最初に、ＣＲ９１１４コートプレートを使用して培養培地から発現ポリペプチドを直接捕捉した。第２に、ビオチン化ＣＲ９１１４をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとの組合せで本発明のＣＲ９１１４捕捉ポリペプチドの検出に使用した。比較のため、三量体および単量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの可溶性精製全長ＨＡならびに精製三量体ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）を、アッセイに含めた（出発濃度５μｇ／ｍｌ）。結果を図２１Ａに示す。
【０２４５】
三量体全長ＨＡは、低希釈率において明らかなシグナルを示すが、１対６５６１以上の希釈率（すなわち、より低濃度）においてこのシグナルはもはや検出可能でない（図２１Ａ）。単量体全長ＨＡについて、シグナルは低希釈率においても観察されるが、強度はかなり低く、シグナルは１対７２９の希釈率においてもはや検出可能でない。シグナルは、精製の間に単量体から分離することができず、または経時的に単量体から形成した一部の残留三量体により引き起こされる可能性が最も高い。追加のＣ末端ｈｉｓタグ配列（ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ）を含有する精製三量体ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）（出発濃度５μｇ／ｍｌ）も、１対１９６８３の濃度において検出不能になるこのアッセイにおける明らかなシグナルをもたらす。本発明のポリペプチド配列番号２０３、２０８、２１０および２１４を含有する培養培地も、このアッセイにおいて明らかなシグナルを示し、本発明の多量体ポリペプチドの存在を示す。最も強力な応答は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するポリペプチド（配列番号２０３）について観察される。Ｈ１Ｎ１Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３に由来する本発明のポリペプチド（配列番号２１４）について観察されたアッセイにおけるより弱い応答は、下記の培養培地のウエスタンブロットからの結果から証明されるとおりこの特定の本発明のポリペプチドのより低い発現からの結果である。
【０２４６】
追加のシステインを含有する本発明のポリペプチドをさらに特性決定するため、当分野において十分確立されたプロトコルを使用して培養上清をウエスタンブロットにより分析した。検出目的のため、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）のＨＡタンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体を使用した。非還元条件下のジスルフィド結合三量体について、すなわち、ジスルフィド架橋がインタクトである場合、約９０ｋＤａ以上におけるタンパク質バンド（グリコシル化の程度に依存する）が予測される一方、還元条件下では３５ｋＤ（本発明のグリコシル化単量体ポリペプチドに対応する）に近いバンドが予測される。図２２は、株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｔｅｘａｓ／（配列番号２０８）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／６２９／９５（配列番号２１０）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（配列番号２０３）およびＨ１Ｎ１Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３（配列番号２１４）からのＨＡに由来する本発明のポリペプチドについての結果を示す。還元条件下のウエスタンブロットは、異なるレベルではあるが本発明の４つ全てのポリペプチドが発現することを示し、最大発現は本発明のＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来ポリペプチド（配列番号２０３）について観察され、最小発現はＨ１Ｎ１Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３由来ポリペプチド（配列番号２１４）について観察される。これらの条件下、ポリペプチドは、追加のＣ末端ｈｉｓタグ配列（ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ）を含有する精製三量体ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）と同様に単量体としてゲル中でランする。非還元条件下、本発明の三量体ポリペプチドの存在を示す１００および１５０ｋＤ間のバンドが、本発明の全てのポリペプチド（ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）を含む）について観察される。Ｈ１Ｎ１Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３に由来するポリペプチド（配列番号２１４）について、単量体バンドはもはや可視的でなく、三量体について予測される高さにおけるバンドが、このポリペプチドのより低い発現に起因する低い強度ではあるが出現する。さらに、約７５ｋＤにおいてランする二量体形態を観察することもできる。本発明のポリペプチドは、本発明の個々のポリペプチドのグリコシル化の程度の変動に起因していくぶんサイズが不均一である。
【０２４７】
ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の中和エピトープの存在をさらに確認するため、培養上清をＥＬＩＳＡにより分析した。第一に、本発明の可溶性ポリペプチド上のｈｉｓタグに指向される抗体によりコートされたプレートを使用して培養培地から発現ポリペプチドを直接捕捉した。第二に、ＣＲ９１１４またはＣＲ６２６１を添加し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体を、本発明のポリペプチドへのＣＲ９１１４またはＣＲ６２６１結合の検出に使用した。陽性対照として、三量体および単量体形態のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの可溶性精製全長ＨＡをアッセイに含めた（図２１Ｂ、Ｃ）。陰性対照として、グループ２からのＨＡに特異的なｍＡｂのＣＲ８０２０を使用するＥＬＩＳＡも実施した。結果を図２１Ｄに示す。本発明のポリペプチドは、ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１を用いるＥＬＩＳＡにおける明らかな応答を示し、最大応答はＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するポリペプチド（配列番号２０３）について観察される。精製可溶性全長ＨＡ（単量体および三量体の両方）も、強力な応答を示す。予測されるとおり、ＣＲ８０２０を用いるＥＬＩＳＡにおいて応答は観察されず、本発明のポリペプチドへのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の結合の特異性を裏付けた。
【０２４８】
まとめると、上記結果は、上記のＨ１ＨＡ配列に由来する本発明のポリペプチドが三量体種を形成し、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の中和エピトープを含有し得ることを示す。
【０２４９】
実施例１４：インフルエンザグループ１株からのＨＡをベースとする本発明のさらなるポリペプチドの設計
実施例１から１３は、Ｈ１Ｎ１からのＨＡをベースとする本発明のポリペプチドを記載する。類似のポリペプチドを、他のグループ１インフルエンザ株、例えば、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９ＨＡを含有するものからのＨＡをベースとして設計することもできる。これらのポリペプチドも本発明に含まれる。このような株の非限定的な例は、例えば、Ｈ２Ｎ２Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／１９５７、Ｈ２Ｎ２Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＨ９Ｎ２Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／６９９５５／２００８である。したがって、上記概略の手順に従って、配列番号２１８から２２１、配列番号２２３から２２６、配列番号２２８から２３１、および配列番号２３３から２３６に記載の４１１および４１９位（クラスター１８）におけるシステイン間の遺伝子操作されたジスルフィド架橋を含有する本発明のポリペプチドを作出した。
【０２５０】
Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からの全長ＨＡ（配列番号２２７）が、多塩基開裂部位、すなわち、融合ペプチド配列に直接先行する配列番号２２７の３４１〜３４６位における配列ＲＲＲＫＴＲを含有することに留意すべきである。本発明のポリペプチド２２８〜２３１において、多塩基性開裂部位を除去し、単一グルタミン（Ｑ）残基により置き換えて完全開裂部位を除去した。これらの配列も本発明に包含される。
【０２５１】
配列番号２１９、２２１、２２４および２２６は、システインである残基４１８を除く配列番号８によるＢループ配列を作出するための４０７および４１４〜４１６位（配列番号１による番号付与；Ｈ２配列において、配列番号１と比較して９、１０および１３９位における残基が欠失していることに留意されたい）におけるさらなる突然変異を含有する。
【０２５２】
配列番号２３０および２３１は、４０７位（Ｅ４０７Ｔ）および４１５位（Ｎ４１５Ｓ）（配列番号１による番号付与）における追加の突然変異を含有する。これらの突然変異は、システインである残基４１８を除く配列番号８によるＢループを作出する。配列番号２３６および２３６は、配列ＭＮＴＱＹＴＡＩＧＣＥＹＮＫＳＥ（すなわち、システインである残基４１８を除く配列番号８による配列）を含有するようにさらに改変されている。
【０２５３】
実施例１５：インフルエンザグループ２株からのＨＡをベースとする本発明のジスルフィド安定化三量体の設計
実施例１から１４は、グループ１株からのＨＡをベースとする本発明のポリペプチドを記載する。ジスルフィド架橋ポリペプチドは、グループ２からのＨＡ配列、例えば、Ｈ３およびＨ７などに基づき設計することもできる。これらのポリペプチドも本発明に含まれる。このような株の非限定的な例は、例えば、Ｈ３Ｎ２Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８およびＨ７である。
【０２５４】
ワクチン中の免疫原上の中和エピトープの提示を改善するための１つの手法は、単量体免疫原間の追加の相互作用を遺伝子操作して単量体と比較して増加した溶解度を有する多量体種を作出することである。この方法の欠点は、単量体免疫原を一緒にすることにより、重要なエピトープが次のプロモーターにより潜在的にカバーされ得ることである。したがって、これを回避するように留意すべきである。
【０２５５】
本明細書において、本発明者らは、溶液中で安定な三量体を形成する一方、中和ｍＡｂのＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３のエピトープを曝露させる本発明の改変ポリペプチドを記載する。
【０２５６】
本発明の三量体ポリペプチドを生成するため、ＨＡステムベースポリペプチドの単量体種の三量体化を促進する安定化相互作用を設計し、特に、三量体中の個々の単量体間の共有結合ジスルフィド架橋の作出にフォーカスした。この目的のため、Ｈ３Ｎ２Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／／１／１９６８からのＦＬ  ＨＡの三次元構造（ＰＤＢ：３ＳＤＹ）を分析して別の単量体の近接性およびタンパク質の立体構造特徴部が単量体間ジスルフィド架橋の形成を潜在的に可能とし得る区域を同定した。残基の６つのペアを同定した（表１１）。それぞれのペアについて、残基を三量体構造中の異なるプロモーター（単量体）上で局在させることを確保することを留意した。次いで、ジスルフィド架橋の形成を介して共有結合しているポリペプチドを形成することができるように、グループ２をベースとするステムドメインポリペプチド中のそれらの残基の相当物（配列アラインメントから決定）をシステインに突然変異させて本発明のポリペプチドを作出する。三量体ＨＡ分子の３回対称性を考慮して、良好な設計が、三量体中の単量体のそれぞれを２つの他の単量体に共有結合する３つのプロモーター間ジスルフィド架橋の形成をもたらす。
【０２５７】
国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットは、広域中和抗体ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３に結合し得るグループ２株からのＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドを記載する。表１１からのジスルフィドペアをＨ３Ｎ２Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８のＨＡ（配列番号２３７）に由来するポリペプチドＨ３ＨＫｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋ＧＣＮ４Ｔ（本明細書では配列番号２３８；国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットの配列番号１３０）およびＨ３ＨＫｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋ＧＣＮ４Ｔ−ＣＧ７−１（本明細書では配列番号２３９；国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットの配列番号１７４）中で導入して本発明のポリペプチド２４０から２５１を得た。
【０２５８】
配列番号２４０から２５１の配列は、ＨＡリーダー配列を含有する。当業者は、成熟タンパク質において、リーダー配列が開裂されており、もはや存在しないことを理解する。プロセシングされた配列も本発明に含まれる。
【０２５９】
本発明のポリペプチドの可溶性形態は、Ｃ末端膜貫通領域および細胞質ドメインの欠失により作出することができる。例えば、欠失は、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６または５３７からＣ末端の残基を含み得る。これらのポリペプチドも本発明に含まれる。一部の場合において、場合により、短いリンカーを介して結合しており、場合により、タンパク質分解開裂部位を含有するＣ末端三量体化配列を付加することができる。三量体ドメイン化の一例は、配列番号３のｆｏｌｄｏｎ配列である。プロセシングされた配列も本発明に含まれる。
【０２６０】
実施例１６：インフルエンザワクチン保護効力評価における使用のためのＮＨＰｐＨ１Ｎ１チャレンジモデルのバリデーション、ならびにＮＨＰにおけるＨ１ｍｉｎｉ−ＨＡ＃４９００の免疫原性および保護効力
代替モデルにおけるＵＦＶワクチン候補を免疫原性および保護効力を試験することができるように、流行性Ｈ１Ｎ１株（Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９）を使用するカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）における非ヒト霊長類（ＮＨＰ）チャレンジモデルが、ＢＰＲＣ（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において既に確立されている。このモデルは、Ｓａｆｒｏｎｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８５：１２１４による文献に公開されたモデルをベースとする。しかしながら、このモデルをインフルエンザワクチンの保護効力の評価に使用することができるか否かを確立する必要がある。
【０２６１】
この試験の主目的は、以下であった。
ａ）使用チャレンジ株と同種のＨ１Ｎ１株の１５μｇのＦＬ  ＨＡを含有する季節性ワクチン（Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ、季節２０１３／２０１４；Ｉｎｆｌｅｘａｌ１３／１４）を使用して、既に確立されたカニクイザルにおけるｐＨ１Ｎ１チャレンジモデルを使用してワクチン媒介保護効力を計測することができるか否かを評価すること。
ｂ）非ヒト霊長類におけるｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の免疫原性を評価すること。
【０２６２】
二次的な目的は、このｐＨ１Ｎ１ＮＨＰチャレンジモデルにおけるｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）の保護効力を評価することであった。
【０２６３】
雄カニクイザルのコホートを、アルファヘルペスウイルス、ＳＴＬＶ、ＳＩＶ、ＳＲＶおよびインフルエンザＡ  ＮＰに対する血清抗体の存在、チャレンジウイルスに対するＨＡＩ力価（１／１０の最大力価を許容）に対してプレスクリーニングし、Ｍａｎｔｏｕｘおよび血液試験により結核について試験した。スクリーニングされた一部の動物は、予備ＣＲ８０２０ＰＫ試験の一部であった。スクリーニング後、好適な動物を、週齢、体重、ＨＡＩ力価およびＰＫ試験の包含を考慮する乱塊法計画をそれぞれ使用する６つの動物の３つの群にランダムに割り当てた。１５分間隔で体温を計測するデータロガーを腹部移植し、次いで１ヵ月の回復期間を設け、その後に免疫化レジメンを開始した。１つの群は、保険医療当局（ＣＤＣ，ＲＩＶＭ）により提唱されるワクチン未接種小児についての公式ガイドライン免疫化レジメンであるＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９の１５μｇのＦＬ  ＨＡを含有するヒト用量（０．５ｍＬ）のＩｎｆｌｅｘａｌ  Ｖ  １３／１４による２回の筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化を受けた。第２の群は、０．５ｍＬ容量の５０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された１５０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６；追加のＨｉｓタグを含有）タンパク質による３回の筋肉内免疫化を受けた。第３の群は、０．５ｍＬのＰＢＳが３回筋肉内投与された陰性対照群であった。全ての免疫化は、４週間の免疫化間隔で実施した。最後の免疫化から４週間後、動物をモデルのセットアップの間に確立された用量である４×１０６ＴＣＩＤ５０のＨ１Ｎ１Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９により気管支内チャレンジした。２１日間のフォローアップ期間の間、臨床徴候を毎日記録した。動物を１、２、４、６、８、１０、１４および２１日目に麻酔し、その間に体重を計測し、気管スワブを採取してｑＰＣＲによりウイルス負荷を決定した。試験終了時、データロガーを取り出し、データを分析した。
【０２６４】
投与されたワクチンの免疫原性を確認するため、血清を免疫化日、およびチャレンジ５日前に単離した。両方のワクチン摂取処理について、インフルエンザＡグループ１および２ＦＬ  ＨＡのパネルへの結合域、ＣＲ９１１４エピトープに近接して結合する抗体を誘導するワクチンの能力（応答を％競合として表現するＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを使用）、ワクチン誘導抗体の代理ＡＤＣＣ活性（下記参照）ならびにワクチン誘導抗体の中和活性（異種亜型Ｈ５Ｎ１Ａ／ＨＫ／１５６／９７に対するマイクロ中和アッセイおよびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９を使用してＦＬ  ＨＡ頭部エピトープにより媒介されるウイルス中和を検出するＨＡＩアッセイの両方を使用する）についてプレチャレンジ血清応答を分析した。最後の株は、ワクチンおよびチャレンジ株と同種である。
【０２６５】
代理ＡＤＣＣ活性は、ＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞（ヒトＦｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ヒトＣＤ３γ、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を調節するＮＦＡＴ応答エレメントを発現する安定なＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１株のＦＬ  ＨＡをコードするＤＮＡが一過的に形質移入されたＡ５４９標的細胞を使用して決定した。
【０２６６】
結果
−  気管ウイルス負荷ＡＵＣにおける処理群間の有意差は見られなかった（図示せず）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６およびＰＢＳ群間で、０〜３日目（ｐ＝０．０１０）および０〜８日目（ｐ＝０．０４７）の間隔の間のチャレンジ後の体温増加（発熱）において有意差が見られた（図２７）。
−  Ｉｎｆｌｅｘａｌ１３／１４群およびＰＢＳ群で、０〜３日目（ｐ＝０．０３３）の間隔の間のチャレンジ後の体温増加において有意差が見られた（図２７）。
−  主として反復麻酔により決定される可能性が高い軽度症状に起因して体重および臨床徴候は有益でなく、したがって図示しない。
−  動物Ｊｉ０４０３０６１（Ｉｎｆｌｅｘａｌ１３／１４群）は、チャレンジ後８日目に死亡した。獣医病理学者による解剖は死因としてウイルス肺炎を究明し、死亡時間までの高い気管ウイルス負荷と一致した。
−  ３×１５０μｇの本発明のポリペプチド配列番号１８６＋５０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍの免疫化レジメンは、免疫原性であった：
・グループ１ＨＡ結合抗体の誘導（図２３）
・３つの異なるグループ１ＨＡタンパク質に対するＣＲ９１１４競合抗体の誘導（図２４）
・マイクロ中和アッセイを使用する異種亜型Ｈ５Ｎ１株を中和する抗体の誘導（図２６）
・３つの異なるグループ１ＨＡタンパク質を標的ＨＡとして使用するＡＤＣＣエフェクターとして機能し得る抗体の誘導（図２５）。
【０２６７】
結論：カニクイザルにおけるＨ１Ｎ１インフルエンザチャレンジモデルにおける疾患のワクチン媒介介入の実証は、部分的に良好であるにすぎなかった。それというのも、チャレンジ後の最初の３日間において発熱のみが有意に低減したためであった。３×１５０μｇのＨ１ｍｉｎｉ−ＨＡ＃４９００＋５０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍによる３回の免疫化は、非ヒト霊長類において免疫原性である。誘導抗体は、ＨＡに結合し得、試験された全てのグループ１全長ＨＡについてＡＤＣＣエフェクターとして機能し得、異種亜型Ｈ５株も中和する。
【０２６８】
実施例１７：本発明のポリペプチドにより免疫化されたマウスからの血清の受身伝達によるＨ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジからの保護
観察された保護に対する本発明のポリペプチドにより誘導された抗体の寄与を決定するため、血清移植試験を実施した。
【０２６９】
この試験の目的は、Ｍａｔｒｉｘ−Ｍの存在下でｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により３回免疫化されたマウスからの血清の受身伝達（複数回投与）が、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジに対する保護を付与するか否かを評価することであった。
【０２７０】
雌ＢＡＬＢ／ｃドナーマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加されたＣ末端Ｈｉｓタグを含有する３０μｇのｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃ１１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）、またはＰＢＳにより３週間の間隔において３回免疫化した。最後の免疫化から４週間後（７０日目）、血清を単離し、群ごとにプールし、レシピエントマウス（雌ＢＡＬＢ／ｃ、６−８週齢、１群当たりｎ＝１０）中に移植した。それぞれのマウスは、４００μｌの血清を、チャレンジ前に３日間連続（−３、−２および−１日目）で腹腔内で受けた。チャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝８）。０日目において、マウスを１２．５×ＬＤ５０Ｈ５Ｎ１  Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７によりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２７１】
ドナーマウスにおけるＨ１ｍｉｎｉ−ＨＡバリアントの免疫原性を確認し、レシピエントマウス中への血清の移植後にＨＡ特異的抗体レベルを評価するため、ドナーマウスの末梢血のプール血清試料（７０日目）、血清移入前のナイーブレシピエントマウスのプール血清試料（−４日目）およびチャレンジ直前の３回血清移入後のレシピエントマウスの個々の血清試料（０日目）を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【０２７２】
結果
−  実験群についての生存割合を表１２に報告する。
−  実験は有効であった；ＰＢＳ対照群における全てのマウスはチャレンジ後１３日目以前（中央値９．５日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
−  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加のｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８６）により免疫化されたマウスからの血清の、ナイーブレシピエントマウス中への３回の血清移入は、ＰＢＳ血清移入対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）（図２８Ａ）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）（図２８Ａ）、体重損失の減少（ｐ＜０．００１）（図２８Ｂ）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）（図示せず）をもたらす。
−  ３回の血清移入後のＦＬ  ＨＡ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７特異的抗体力価は、活性免疫化後に得られたレベルと類似する（図２９）。
【０２７３】
結論：Ｍａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加のＨ１ｍｉｎｉ−ＨＡ＃４９００による３回の免疫化により誘導された血清構成要素（抗体である可能性が最も高い）は、異種亜型Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジに対してマウスを保護するために十分である。
【０２７４】
実施例１８：致死Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７マウスモデルにおける保護効力の評価
ワクチンとしての本発明のポリペプチドの使用のためのさらなる証拠を提供するため、インフルエンザによる致死チャレンジに対する３つの追加のポリペプチドの保護効力を評価した。この目的のため、本発明のポリペプチド配列番号２０３および２５４（両方とも、Ｃ末端ｈｉｓタグを含有）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で一過的に発現させ、上記のとおり精製した。さらに、本発明のポリペプチド配列番号１８６（同様に追加のＣ末端ｈｉｓタグを含有）を、当業者に周知の手順（例えば、Ｍ．Ｃｏｘ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、博士論文、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｃ  ２００９参照）に従ってＳＦ９昆虫細胞中で発現させ、上記のとおり精製した。
【０２７５】
この試験の目的は、ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７チャレンジモデルにおけるＭａｔｒｉｘ−Ｍを有する本発明のポリペプチドの保護効力を決定することであった。
【０２７６】
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチドにより３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２７７】
本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（−１日目）をＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。本発明のポリペプチドにより誘導された抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」として可視化し、（Ａ−Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈における血清存在下のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現した。
【０２７８】
結果
−  実験群についての生存割合を表１２に報告する。
−  結果は、実験が有効であることを示す；ＰＢＳ対照群（ｎ＝１６）中の全てのマウスはチャレンジ後１０日目以前（中央値８日）において感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
−  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）（図３０Ａ）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）（図３０Ａ）、体重損失の減少（ｐ＜０．００１）（図３０Ｂ）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）（図示せず）をもたらす。
−  本発明のポリペプチドにより誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡに対するプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、試験された全ての本発明のポリペプチドについてＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ≦０．００１）（図３１Ａ）。
−  Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡに対するＩｇＧ抗体力価は、試験された全ての本発明のポリペプチドについて２回の免疫化後にプラトーである（図示せず）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３１Ｂ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号２０３（バックグラウンドＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡを標的抗原として使用した場合、試験された他の本発明のポリペプチドと比較して有意に低いＣＲ９１１４競合抗体を誘導する（ｐ≦０．０１３）（図３１Ｂ）。
【０２７９】
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加された追加のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７による致死チャレンジに対する保護を付与する。
【０２８０】
実施例１９：致死Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９マウスモデルにおける保護効力の評価
ワクチンとしての本発明のポリペプチドの使用のためのさらなる証拠を提供するため、インフルエンザによる致死チャレンジに対する３つの追加のポリペプチドの保護効力を評価した。この目的のため、本発明のポリペプチド配列番号２０３および２５４（両方とも、Ｃ末端ｈｉｓタグを含有）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で一過的に発現させ、上記のとおり精製した。さらに、本発明のポリペプチド配列番号１８６（同様に追加のＣ末端ｈｉｓタグを含有）を当業者に周知の手順（前掲）に従ってＳＦ９昆虫細胞中で発現させ、上記のとおり精製した。
【０２８１】
この試験の目的は、ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９チャレンジモデルにおけるＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された追加の三量体Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡバリアントの保護効力を決定することであった。
【０２８２】
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチドにより３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２８３】
本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（−１日目）をＨ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験する。ｍｉｎｉ−ＨＡにより誘導される抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」として可視化し、（Ａ−Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈における血清存在下のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０（出発濃度５ｍｇ／ｍｌ）溶液を含めた。
【０２８４】
結果
−  実験群についての生存割合を表１２に報告する。
−  実験は有効であった；ＰＢＳ対照群（ｎ＝１６）における全てのマウスはチャレンジ後８日目以前（中央値６日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
−  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ≦０．００４）（図３２Ａ）、生存時間の増加（ｐ≦０．００１）（図３２Ａ）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）（図示せず）をもたらす。本発明のポリペプチド配列番号２０３について、有意な体重ＡＵＣの低減も観察される（ｐ＜０．００１）（図３２Ｂ）。
−  本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４により誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡに対するプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、ＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ≦０．００１）（図３３Ａ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３３Ｂ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加三量体ポリペプチド配列番号２０３（バックグラウンドＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡを標的抗原として使用した場合、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するバリアントと比較して有意に低いＣＲ９１１４競合抗体を誘導する（ｐ≦０．００２）（図３３Ｂ）。
【０２８５】
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＮＬ／６０２／０９による致死チャレンジに対する保護を付与する。
【０２８６】
実施例２０：Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７マウスモデルにおけるＨ１  ｍＨＡ三量体候補評価ＩＩ
ワクチンとしての本発明のポリペプチドの使用のためのさらなる証拠を提供するため、インフルエンザによる致死チャレンジに対する３つの追加のポリペプチドの保護効力を評価した。この目的のため、本発明のポリペプチド２０３および２５４（両方とも、Ｃ末端ｈｉｓタグを含有）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で一過的に発現させ、上記のとおり精製した。さらに、本発明のポリペプチド配列番号１８６（同様に追加のＣ末端ｈｉｓタグを含有）を当業者に周知の手順に従ってＳＦ９昆虫細胞中で発現させ、上記のとおり精製した。
【０２８７】
この試験の目的は、ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７チャレンジモデルにおけるＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４の保護効力を決定することであった。
【０２８８】
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチドにより３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる注射が陰性対照として機能した（ｎ＝１６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを１２．５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２８９】
本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４の免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（−１日目）を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。ｍｉｎｉ−ＨＡ誘導抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」として可視化し、（Ａ−Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈における血清存在下のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０（出発濃度５μｇ／ｍｌ）溶液を含めた。
【０２９０】
結果：
−  実験群についての生存割合を表１２に報告する。
−  実験は有効であった；ＰＢＳ対照群における１６匹のうち１５匹のマウスはチャレンジ後９日目以前（中央値９日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
−  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）（図３４Ａ）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）（図３４Ａ）、体重損失の減少（ｐ＜０．００１）（図３４Ｂ）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）（図示せず）をもたらす。
−  本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４により誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡに対するプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、ＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ≦０．００１）（図３５Ａ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３５Ｂ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号２０３（バックグラウンドＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡを標的抗原として使用した場合、本発明のポリペプチド配列番号１８６および２５４（バックグラウンドＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）と比較して有意に低いＣＲ９１１４競合抗体を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３５Ｂ）。
【０２９１】
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、異種亜型Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７による致死チャレンジに対する保護を付与する。
【０２９２】
実施例２１：Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４マウスモデルにおけるＨ１ｍＨＡ三量体候補評価ＩＩ
ワクチンとしての本発明のポリペプチドの使用のためのさらなる証拠を提供するため、インフルエンザによる致死チャレンジに対する３つの追加のポリペプチドの保護効力を評価した。この目的のため、本発明のポリペプチド２０３および２５４（両方とも、Ｃ末端ｈｉｓタグを含有）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で一過的に発現させ、上記のとおり精製した。さらに、本発明のポリペプチド配列番号１８６（同様に追加のＣ末端ｈｉｓタグを含有）を当業者に周知の手順に従ってＳＦ９昆虫細胞中で発現させ、上記のとおり精製した。
【０２９３】
この試験の目的は、ＰＢＳ対照群と比較した、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４チャレンジモデルにおけるＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４の保護効力を決定することであった。
【０２９４】
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍがアジュバント添加された３０μｇの本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４により３週間の間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルのための陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に投与した一方（ｎ＝８）、ＰＢＳによる３回の免疫化が陰性対照として機能した（ｎ＝１６）。最後の免疫化から４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスによりチャレンジし、３週間モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。
【０２９５】
本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するため、プレチャレンジ血清（−１日目）をＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からのＦＬ  ＨＡへの結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。ｍｉｎｉ−ＨＡ誘導抗体がＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため、ＣＲ９１１４競合ＥＬＩＳＡを実施した。競合データを「％競合」として可視化し、（Ａ−Ｐ）／Ａ×１００）として定義し、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、所与の希釈における血清存在下のＦＬ  ＨＡへのＣＲ９１１４結合のＯＤシグナルであり、または応答を定量し得る傾きＯＤ計量値を使用して表現し；参照のためにＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０（出発濃度５μｇ／ｍｌ）溶液を含めた。
【０２９６】
結果
−  実験群についての生存割合を表１２に報告する。
−  実験は有効である；ＰＢＳ対照群（ｎ＝１６）における全てのマウスはチャレンジ後９日目以前（中央値８日）に感染により死亡する一方、陽性対照群（ｎ＝８、１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は完全に保護される（ｐ＜０．００１）。
−  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍが添加された本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４による３回の免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して有意な生存比率の増加（ｐ＜０．００１）（図３６Ａ）、生存時間の増加（ｐ＜０．００１）（図３６Ａ）、体重損失の減少（ｐ＜０．００１）（図３７Ｂ）および臨床スコアの低減（ｐ＜０．００１）（図示せず）をもたらす。
−  Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡバリアントにより誘導されたＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡに対するプレチャレンジＩｇＧ抗体力価は、本発明のポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４についてＰＢＳと比較して有意に高い（ｐ＜０．００１）（図３７Ａ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、ＰＢＳと比較して有意に高いＣＲ９１１４競合力価を誘導する（ｐ＜０．００１）（図３７Ｂ）。
−  本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号２０３（バックグラウンドＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７ＦＬ  ＨＡを標的抗原として使用した場合、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７をベースとするバリアントと比較して有意に低いＣＲ９１１４競合抗体を誘導する（ｐ≦０．００１）（図３７Ｂ）。
【０２９７】
結論：本発明のＭａｔｒｉｘ−Ｍアジュバント添加ポリペプチド配列番号１８６、２０３および２５４は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４による致死チャレンジに対する保護を付与する。
【０２９８】
実施例２２：異なるＨ１配列バックグラウンドにおける本発明のポリペプチド
ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８１）に次いで、同一設計特徴を共有するが、株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｔｅｘａｓ／ＵＲ０６−０５２６／０７（配列番号２０５）およびＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／６２９／９５（配列番号２０６）から生じるＨＡをベースとする２つのバリアントＴｅｘ＿ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇおよびＮＹ＿ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇを産生させた（配列番号２０８および２１０）。この実験において、Ｃ末端第第Ｘ因子開裂部位および６ヒスチジンタグが、両方のタンパク質中に存在する。発現および精製については、実施例２に記載のものと同様のプロトコルを使用し、例外としてこの手順は０．６ｌの培養上清から出発した。
【０２９９】
精製ポリペプチドを、広域中和抗体ＣＲ９１１４の２つ以上のエピトープを提示するポリペプチドの多量体形態の存在についてサンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例３に記載）においてさらに分析した。手短に述べると、コートｍＡｂのＣＲ９１１４を使用して精製タンパク質を捕捉し、続いてそれをビオチン化ＣＲ９１４またはＣＲ６２６１とインキュベートし、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより評価した。産生収量および多量体サンドイッチＥＬＩＳＡ結果を表１３に示す。
【０３００】
表１３に示される結果は、全てのバリアントが所望の結合特徴を有する多量体タンパク質をもたらすことを示す。ポリペプチドＴｅｘ＿ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８（配列番号２０８）はｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇと比較して類似の収量を有する一方、ポリペプチドＮＹ＿ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８（配列番号２１０）は、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇ（配列番号１８１）と比較して約４倍低い収量を有する。試験された全てのポリペプチドは、多量体化の存在を示すＥＬＩＳＡにより決定されたとおり、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇと同様にＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１に結合し得た。まとめると、ここに示される結果は、異なる系統発生起源のＨ１配列を使用するＨＡステムベースポリペプチドの良好な生成を実証する。
【０３０１】
実施例２３：追加のｃ末端三量体化ドメインを有する本発明のポリペプチド
種々のｃ末端を有する本発明のポリペプチドを発現させることができる。異なる長さ（ＨＡの膜貫通ドメインの択一的トランケーションから生じる）の他、検出および精製のためのタグならびに機能ドメインも、抗原構造に影響を与えずに付加することができる。以下の構築物は、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）またはＨ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（配列番号２５２）からのＦＬ  ＨＡに由来する本発明のポリペプチドの短鎖（残基５２０からＣ末端まで欠失；配列番号１による番号付与）または長鎖（残基５２０からＣ末端まで欠失）形へのｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメインの付加（ＦｌａｇおよびＨｉｓタグによりフランキング）を実証する。
【０３０２】
構築物をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で一過的に発現させ（実施例２に記載）、濾過された培養上清中に存在する本発明のポリペプチドを調査した。最初に発現および三量体化のレベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（実施例２に記載、図３８参照）により評価した。培養培地を、広域中和抗体ＣＲ９１１４の２つ以上のエピトープを提示するポリペプチドの多量体形態の存在についてサンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例３に記載）においてさらに分析した。手短に述べると、コートｍＡｂのＣＲ９１１４を使用して精製タンパク質を捕捉し、続いてそれをビオチン化ＣＲ９１４とインキュベートし、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより評価した（表１４参照）。最後に、ホモジニアス結合試験を実施して本発明のポリペプチドの発現レベルを確認し、ＨＡのステム上の公知のエピトープを有する十分に特性決定されたモノクローナル抗体（ＩｇＧ）へのそれらの結合強度を決定した。ここで、ｃ末端ＦｌａｇおよびＨｉｓタグならびにヒトモノクローナルＩｇＧのＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１に依存するＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を確立した。ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、および０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する緩衝液中で全ての試薬を希釈した。
【０３０３】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップを使用して発現レベルを決定するため、本発明のポリペプチドを含有する濾過された細胞培養上清を、（２５μＬの最終容量中１０μｇ／ｍＬにおける両方ともＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製の抗Ｈｉｓドナービーズおよび抗Ｆｌａｇアクセプタービーズの存在下で、４０倍希釈した。ホモジニアス混合物を室温において１時間インキュベートした。励起されたドナービーズ（６８０ｎｍ）およびアクセプタービーズが両方ともそれぞれのｃ末端タグに結合し、近接（約１００ｎｍ）する場合、エネルギー移動（一重項酸素）をアクセプタービーズ（６１５ｎｍ）の発光シグナルとして計測することができる。このホモジニアスアッセイフォーマットにおけるシグナル強度は、溶液中のタンパク質の量に正比例する。発現された本発明のポリペプチドについてのＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル強度の平均を表１４に示す。
【０３０４】
本発明のポリペプチドおよびＩｇＧ間の相互作用は、室温におけるＣＲ９１１４またはＣＲ６２６１（それぞれ、２５μＬ中１または２ｎＭの最終濃度）のいずれかとの１時間のインキュベーション後に検出し、２つのビーズ、ＨＡを認識する抗Ｈｉｓドナービーズ（１０μｇ／ｍＬ）およびＩｇＧを認識する抗Ｆｃアクセプタービーズ（１０μｇ／ｍＬ）を使用した。１時間の追加のインキュベーション後、アクセプタービーズのＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを計測した。このホモジニアスアッセイフォーマットにおけるシグナル強度は、両方の結合パートナー間の結合強度（親和性／アビディチィー）に正比例し、それによりｍｉｎｉ−ＨＡエピトープの完全性および質についての尺度となる。ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１の結合についてのＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル強度の平均を表１４に示す。
【０３０５】
親構築物配列番号１６４（Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７バックグラウンド）および配列番号２１１（Ｈ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９バックグラウンド）は、Ｃ−ヘリックス中に埋め込まれたＧＣＮ４三量体化ドメインを既に含有する。これらのポリペプチドの可溶性形（これも本発明に含まれる）のｃ末端における追加のｆｏｌｄｏｎ三量体化ドメインの挿入が考えられ、類似またはより良好な発現レベルをもたらす。追加の三量体化ドメインは、ウエスタンブロットおよび多量体ＥＬＩＳＡ結果により証明されるとおり三量体化のレベルに関して本発明のポリペプチドをさらに改善し得る。広域中和ＩｇＧのＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１の結合は、１つのみの三量体化ドメインを有する本発明のポリペプチドと比較して同等またはより良好である。
【０３０６】
【表１】
2017521073.tif 000006
【０３０７】
【表２】
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【０３０８】
【表３】
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【０３０９】
【表４】
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【０３１０】
【表５】
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【０３１１】
【表６】
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【０３１２】
【表７】
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【０３１３】
【表８】
2017521073.tif 000013
【０３１４】
【表９】
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【０３１５】
【表１０】
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【０３１６】
【表１１】
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【０３１７】
【表１２】
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【０３１８】
【表１３】
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【０３１９】
【表１４】
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【０３２０】
【表１５】
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【０３２１】
【表１６】
2017521073.tif 000021
【０３２２】
【表１７】
2017521073.tif 000022
【０３２３】
【表１８】
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【０３２４】
【表１９】
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【０３２５】
【表２０】
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【０３２６】
【表２１】
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【０３２７】
【表２２】
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【０３２８】
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【０３２９】
配列表
【化５】
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配列番号３：ｆｏｌｄｏｎ
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
【化６】
2017521073.tif 000029
配列番号５：
ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ
【化７】
2017521073.tif 000030
【化８】
2017521073.tif 000031
【化９】
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【化１０】
2017521073.tif 000033
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
2017521073.tif 000058
【化３６】
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【化３７】
2017521073.tif 000060
【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
2017521073.tif 000070
【図５−２】
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【図６−１】
2017521073.tif 000072
【図６−２】
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【図６−３】
2017521073.tif 000074
【図７】
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【図８】
2017521073.tif 000076
【図９−１】
2017521073.tif 000077
【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
2017521073.tif 000090
【図１６−１】
2017521073.tif 000091
【図１６−２】
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【図１７】
2017521073.tif 000093
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
2017521073.tif 000097
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017521073.tif 000163
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