(57)【要約】  本発明は、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を発現する細胞を取得するステップ；細胞内で、１又は２以上のグリコシル基を１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼを発現させるステップ；及びグリコシル化が減少した１又は２以上のタンパク質を細胞から単離するステップを含む、タンパク質のグリコシル化を減少させる組成物及び方法を含む。
2017502694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を発現する細胞を取得するステップ；
前記細胞内で、１又は２以上のグリコシル基を前記１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼを発現させて、前記タンパク質のグリコシル化を減少させるステップ；及び
グリコシル化が減少した前記１又は２以上のタンパク質を、前記細胞から単離するステップ；
【請求項２】
１若しくは２以上のタンパク質、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つが、一時的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１又は２以上のタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記１又は２以上のグリコシダーゼを、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングの特定の細胞コンパートメントへと標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記グリコシダーゼを、小胞体へと、又は前記小胞体を通過して小胞へと標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１又は２以上のグリコシダーゼが、グルコシド、キシラナーゼ、シアリラーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１又は２以上のグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
単離した後に、インビトロ又はインビボで１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的に発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップを含む、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を、細胞内で１又は２以上のグリコシダーゼと共発現させるステップであって、前記１又は２以上のグリコシダーゼが、前記細胞内で、前記１又は２以上のタンパク質のグリコシル化を減少させる又は消失させるように作用する、ステップ；及び
前記１又は２以上のタンパク質を前記細胞から精製するステップであって、前記グリコシダーゼが、前記１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用する、ステップ；
【請求項１２】
１若しくは２以上のタンパク質、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つが、一時的に発現される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
所望のタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記１又は２以上のグリコシダーゼを、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングを行う特定の細胞コンパートメントへと標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記グリコシダーゼを、小胞体へと、又は前記小胞体を通過して小胞へと標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
１又は２以上のグリコシダーゼが、グルコシド、キシラナーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
１又は２以上のグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
精製した後に、インビトロ又はインビボで１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
精製後に、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのミュータントであり、及びグリコシンターゼ活性を有する１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的に発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
以下のステップを含む、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
細胞内で、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質と、１又は２以上のグリコシル化を前記１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼとを共発現させるステップ；
前記１又は２以上のタンパク質を前記細胞から精製するステップであって、前記グリコシダーゼが、前記１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用する、ステップ；及び
前記１又は２以上のタンパク質を、ミュータントグリコシダーゼを用いて再グリコシル化する、ステップ；
【請求項２３】
以下のステップを含む、疾患状態を治療するのに有用と考えられる候補薬物を評価する方法。
ａ）疾患状態を有することが疑われる一連の患者から得られた１又は２以上の組織から、前記疾患状態のレベルを測定するステップ；
ｂ）請求項１に従って修飾された候補タンパク質を患者の第１のサブセットに、請求項１に従って修飾されなかった比較タンパク質を前記患者の第２のサブセットに投与するステップ；
ｃ）前記候補薬物又は前記比較タンパク質の投与後にステップａ）を繰り返すステップ；及び
ｄ）前記候補薬物が、前記疾患に関する医学的転帰を改善させ、前記患者の第２のサブセットにおいて生じている任意の減少又は同等性と比較して前記患者の第１のサブセットにおいて統計的に有意である又は同等であるかどうか判定するステップであって、統計的に有意な減少又は同等性が、前記候補薬物が前記疾患状態を治療する際に有用であることを示唆する、ステップ；
【請求項２４】
１又は２以上のタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
以下のステップを含む方法により作製される糖タンパク質。
１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を発現する細胞を取得するステップ；
前記細胞内で、１又は２以上のグリコシル基を前記１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼを発現させて、前記タンパク質のグリコシル化を減少させるステップ；及び
前記１又は２以上のタンパク質を細胞から単離するステップであって、前記グリコシダーゼが、細胞内で前記１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用して、前記１又は２以上のタンパク質のグリコシル化を減少させる、ステップ；
【請求項２６】
１若しくは２以上のタンパク質、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つが、一時的に発現される、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項２７】
細胞が、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項２８】
１又は２以上のタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項２９】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記１又は２以上のグリコシダーゼを、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングの特定の細胞コンパートメントへと標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３０】
１又は２以上のグリコシダーゼが、前記グリコシダーゼを、小胞体へと、又は前記小胞体を通過して小胞へと標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３１】
１又は２以上のグリコシダーゼが、グルコシド、キシラナーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３２】
１又は２以上のグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３３】
単離後に、１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３４】
細胞が、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的に発現する、請求項２５に記載の糖タンパク質。
【請求項３５】
以下のステップを含む方法により作製される糖タンパク質。
グリコシダーゼを発現するように組換えにより修飾されている植物細胞内でタンパク質を発現させるステップ；
前記細胞内で発現及び脱グリコシル化された前記タンパク質を単離するステップ；
インビトロ又はインセルロのうちの少なくとも１つにおいて、１又は２以上の糖類の存在下で前記タンパク質を再グリコシル化するステップ；及び
前記グリコシル化されたタンパク質を単離するステップ；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この非仮特許出願は、「下流タンパク質グリコリモデリングのための基質として用いられる脱グリコシル化組換えタンパク質のインビボでの産生方法」と題する２０１３年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６１／９１７，７９３号に対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に翻訳後タンパク質修飾の分野に、より具体的には、インビボでのグリコシル化が減少したタンパク質の作製方法に関する。
【０００３】
コンパクトディスク上にファイルされた材料に関する参照による組込み
無し。
【背景技術】
【０００４】
本発明の範囲を制限することなく、その背景を、タンパク質のグリコシル化と関連付けて記載する。
【０００５】
治療用タンパク質に結合したＮ−グリコシル化の性質は、その治療活性、安定性、及び免疫誘発特性に影響を及ぼす可能性があるので、タンパク質の同一性の重要な属性である。組換えタンパク質のＮ−グリカンプロファイルは、その産生に用いられる宿主及び宿主培養条件に依存する。理想的には単一の最適なグリコフォームから構成された、均質で一貫した治療用糖タンパク質の産生を実現する製造プロセスに対する要求が高まっている。例えば、アフコシル化モノクローナル抗体では、細胞毒性活性が高まっている。また、治療薬として用いられるヒト血清タンパク質は、多くの場合ヒト特異的シアリル化を必要とし、これは、異種発現系での一様な産生を行う際の課題として存続している。
【０００６】
インビトロでの治療薬のグリコリモデリング技術が、糖鎖工学的に作製された治療薬の要求を満たすために、他者により提案されている（Huang, W., Giddens, J., Fan, S., Toonstra, C., & Wang, L. (2012). Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. Journal of the American Chemical Society, 134, 12308-12318;及びWang, L., & Lomino, J. V. (2012). Emerging technologies for making glycan-defined glycoproteins. ACS chemical biology, 7(1), 110-22）。教示されるこれらの方法は、所望の糖タンパク質の抽出及び精製、タンパク質の脱グリコシル化、但し最初のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ，N-acetylglucosamine）及びフコースが結合状態にある場合には、タンパク質のアスパラギン残基に結合した状態に留まるような脱グリコシル化、及び独自のエンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ，endoglycosidase S）ミュータントを利用した、精製後又は合成後の活性化された最適なＮ−グリカンドナーによるタンパク質の再グリコシル化を必要とする。脱グリコシル化及び再グリコシル化ステップが先行して行われ、その後に精製ステップが続くが、このグリコリモデリングプロセスには手間と費用がかかる（先行技術と表示する図１オプションＡ、及び図２Ａを参照）。
【０００７】
グリコリモデリング方法は、例えばDeFrees et al.出願の米国特許第８，３６１，９６１号明細書；同第７，９５６，０３２号明細書；同第７，６９６，１６３号明細書；及び同第７，３３８，９３３号明細書で教示されており、上記各号には、ペプチドへの１若しくは２以上のグリコシル基の付加又は欠失、及び／又はペプチドへの修飾基の付加、ペプチドのＯ結合型グリコシル化、及びタンパク質のグリコＰＥＧ化を含む、ペプチド分子をリモデリングするための方法及び組成物が含まれる。
【０００８】
別の方法が、Transglycosylation Activity Of Glycosynthase Mutants Of An Endo-Beta-N-Acetylglucosaminidase (Endo-D) From Streptococcus Pneumoniaeと題する、Wang et al.出願の米国特許出願第２０１３０１３７８５７号明細書で教示されている。要するに、該発明は、糖タンパク質を合成する際に、加水分解活性の低下及びグリコシル基転移活性の増強を示す、組換えＥｎｄｏ−Ｄ及び選択されたミュータントを含むと言われており、この場合、所望の糖鎖が、グリコシル基転移によりコアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質アクセプターに付加される。かかる組換えＥｎｄｏ−Ｄ及び選択されたミュータントは、ＩｇＧ１−Ｆｃドメインを効率的にグリコシル化リモデリングするのに役立つと言われている。
【０００９】
なおも別の方法が、Glycosylation Engineered Antibody Therapyと題する、Strome et al.出願の米国特許出願第２０１００１７３３２３号明細書で教示されている。要するに、該出願は、グリコシル化を工学的に作製した抗体を生成する方法、及び患者、特にがん患者又は免疫疾患若しくは障害の患者を治療するために、グリコシル化を工学的に作製した抗体を用いる方法について教示すると言われている。該発明は、従来型の抗体療法に反応しない多形性を有する患者の治療で用いるためにグリコシル化を工学的に作製した抗体を生成する方法、グリコシル化エンジニアリングにより抗体の生物活性を改善する方法、及びグリコシル化を工学的に作製した抗体を用いて、抗体依存性細胞媒介型細胞毒性（ＡＤＣＣ，antibody-dependent cell-mediated cytoxicity）を調節する方法も含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８，３６１，９６１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９５６，０３２号明細書
【特許文献３】米国特許第７，６９６，１６３号明細書
【特許文献４】米国特許第７，３３８，９３３号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２０１３０１３７８５７号明細書
【特許文献６】米国特許出願第２０１００１７３３２３号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Huang, W., Giddens, J., Fan, S., Toonstra, C., & Wang, L. (2012). Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. Journal of the American Chemical Society, 134, 12308-12318
【非特許文献２】Wang, L., & Lomino, J. V. (2012). Emerging technologies for making glycan-defined glycoproteins. ACS chemical biology, 7(1), 110-22
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの実施形態では、本発明は、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法であって、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を発現する細胞を取得するステップと、細胞内で、１又は２以上のグリコシル基を１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼを発現させて、タンパク質のグリコシル化を減少させるステップと、グリコシル化が減少した１又は２以上のタンパク質を細胞から単離するステップとを含む方法を含む。１つの態様では、１若しくは２以上のタンパク質、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つが、一時的に（transiently）発現される。別の態様では、細胞は、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である。別の態様では、１又は２以上のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングの特定の細胞コンパートメントへと１又は２以上のグリコシダーゼを標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、小胞体へと、又は小胞体を通過して小胞へとグリコシダーゼを標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、グルコシド、キシラナーゼ、シアリラーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼf、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、本方法は、単離した後に、インビトロ又はインビボで１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらす（adding）ステップをさらに含む。別の態様では、細胞は、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的（constitutively）に発現する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法であって、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を細胞内で１又は２以上のグリコシダーゼと共発現するステップであって、前記１又は２以上のグリコシダーゼが、細胞内で１又は２以上のタンパク質のグリコシル化を減少させる又は消失させるように作用するステップと、１又は２以上のタンパク質を細胞から精製するステップであって、該グリコシダーゼが、１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用するステップとを含む方法を含む。別の態様では、１若しくは２以上のタンパク質、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つは、一時的に発現される。別の態様では、細胞は、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である。別の態様では、所望のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングの特定の細胞コンパートメントへと１又は２以上のグリコシダーゼを標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、小胞体へと、又は小胞体を通過して小胞へとグリコシダーゼを標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、グルコシド、キシラナーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、本方法は、精製した後に、インビトロ又はインビボで１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む。別の態様では、本方法は、精製後に、ＥｎｄｏＨ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、��イロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのミュータントであり、グリコシンターゼ活性を有する１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む。別の態様では、細胞は、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的に発現する。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、タンパク質のグリコシル化を減少させる方法であって、細胞内で、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質と、１又は２以上のグリコシル化を１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼとを共発現するステップと、１又は２以上のタンパク質を細胞から精製するステップであって、該グリコシダーゼが、１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用するステップと、１又は２以上のタンパク質を、ミュータントグリコシダーゼを用いて再グリコシル化するステップとを含む方法を含む。１つの実施形態では、本発明は、疾患状態を治療するのに有用と考えられる候補薬物を評価する方法であって、ａ）疾患状態を有することが疑われる一連の患者から得られた１又は２以上の組織から、該疾患状態のレベルを測定するステップと、ｂ）本明細書の上記に記載のように修飾された候補タンパク質を患者の第１のサブセットに、修飾されなかった比較タンパク質を該患者の第２のサブセットに投与するステップと、ｃ）候補薬物又は比較タンパク質の投与後にステップａ）を繰り返すステップと、ｄ）候補薬物が、疾患に関する医学的転帰を改善させ、患者の第２のサブセットにおいて生じた何らかの減少又は同等性と比較して第１のサブセットにおいて統計的に有意である又は同等であるかどうか判定するステップであって、統計的に有意な減少又は同等性が、候補薬物が疾患状態を治療する際に有用であることを示唆するステップとを含む方法を含む。１つの態様では、１又は２以上のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインから選択される。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、１又は２以上のグリコシル化部位を含み、グリコシル化されている１又は２以上のタンパク質を発現する細胞を取得するステップと、細胞内で、１又は２以上のグリコシル基を１又は２以上のタンパク質から切断する１又は２以上のグリコシダーゼを発現させて、タンパク質のグリコシル化を減少させるステップと、１又は２以上のタンパク質を細胞から単離するステップであって、該グリコシダーゼが、細胞内で１又は２以上のタンパク質上のグリコシル化に作用して、１又は２以上のタンパク質のグリコシル化を減少させるステップとを含む方法により作製される糖タンパク質を含む。別の態様では、１若しくは２以上のタンパク質の少なくとも１つ、又は１若しくは２以上のグリコシダーゼの少なくとも１つは、一時的に発現される。別の態様では、細胞は、植物細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞である。別の態様では、１又は２以上のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、増殖因子、リンホカイン、酵素、受容体、受容体結合タンパク質、核酸結合タンパク質、構造タンパク質、細孔、チャネル、キナーゼ、ホスファターゼ、又はＧ−プロテインである。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、タンパク質のグリコシル化を引き起こすタンパク質プロセシングの特定の細胞コンパートメントへと１又は２以上のグリコシダーゼを標的化する部分をさらに含むように、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、小胞体へと、又は小胞体を通過して小胞へとグリコシダーゼを標的化する配列を用いて、組換えにより修飾される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、グルコシド、キシラナーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びリゾチームから選択される。別の態様では、１又は２以上のグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、糖タンパク質は、単離後に、１又は２以上のタンパク質に新規グリコシル化をもたらすステップをさらに含む。別の態様では、細胞は、１若しくは２以上のタンパク質、１若しくは２以上のグリコシダーゼ、又は両方を恒常的に発現する。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、グリコシダーゼを発現するように組換えにより修飾されている植物細胞内でタンパク質を発現させるステップと、細胞内で発現及び脱グリコシル化されたタンパク質を単離するステップと、インビトロ又はインセルロのうちの少なくとも１つにおいて、１又は２以上の糖類の存在下でタンパク質を再グリコシル化するステップと、グリコシル化されたタンパク質を単離するステップとを含む方法により作製される糖タンパク質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の特性及び長所をより完全に理解するために、ここで以下に示す添付の図面に沿って、本発明の詳細な説明を参照する：
【図１Ａ−１Ｂ】グリコリモデリング戦略に基づく、組換えタンパク質のインビボ及びインビトロでのＮ−グリカンプロセシングをそれぞれ示す図である。図１Ａは、他者が用いた先行技術であるオプションＡを示す。図１Ｂは、所望のタンパク質（例えば、リツキシマブ）のインビボでの脱グリコシル化が関係する、本発明のオプションＢ経路を示す。オプションＢでは、所望のタンパク質に結合した高マンノースグリカンが切断されて、インビトロでの再グリコシル化のための脱グリコシル化基質が残る。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａは、脱グリコシル化及び再グリコシル化に関してインビトロでのプロセスを利用する、先行技術のモノクローナル抗体グリコリモデリングの略図を示す。対照的に、図２Ｂは、インビボでの脱グリコシル化を用い、その後にインビトロでの再グリコシル化が続く、本発明のモノクローナル抗体グリコリモデリングの略図を示す。
【図３】ｈＩｇＧ１単独（−）で発現する、又はＥｎｄｏＨと同時（＋）に発現する植物組織由来の純粋なｈＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＥｎｄｏＨと共に発現される場合、インプランタでの脱グリコシル化に起因して抗体重鎖の分子量が変化することに留意すること。
【図４】ｈＩｇＧ１単独で発現する植物組織から得られたｈＩｇＧ１のデコンボリューション型ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。サンプルは非還元条件で分析した。大部分のタンパク質は、両方の重鎖についてグリコシル化された一方、小数のｈＩｇＧ１は半グリコシル化された（２つの重鎖のうちの１つのみがグリコシル化された）。
【図５】ＥｎｄｏＨと共にｈＩｇＧ１を発現する植物組織から得られたｈＩｇＧ１のデコンボリューション型ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。サンプルは、非還元条件で分析した。タンパク質の分子量は、グリコシル化型から脱グリコシル化型に変化することに留意すること。質量が１４３，２６８Ｄａの脱グリコシル化型ｈＩｇＧ１は、２つのＮ−アセチルヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃ，N-acetylhexosamine）が各重鎖に結合したタンパク質の理論的質量に対応する。
【図６】ｍ／ｚ４０，０００〜８０，０００の質量範囲を示す、β−メルカプトエタノールで還元した後のリツキサン（Rituxan）（登録商標）標準品について、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す図である。
【図７】ｍ／ｚ４０，０００〜８０，０００の質量範囲を示す、β−メルカプトエタノールで還元した後の植物で作製されたリツキシマブについて、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す図である。
【図８】ｍ／ｚ４０，０００〜８０，０００の質量範囲を示す、ＥｎｄｏＨと共にインプランタで脱グリコシル化し、β−メルカプトエタノールで還元した、植物で作製されたリツキシマブについて、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す図である。
【図９】インプランタでＥｎｄｏＨ脱グリコシル化し、その後にトリプシン消化したリツキシマブの拡大した（ｍ／ｚ１１００〜１５００）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す図である。
【図１０】Ｅ２単独（−）で発現する、又はＥｎｄｏＨと同時（＋）に発現する植物組織由来のＮｉ２＋−ＮＴＡにより精製されたＥ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＥｎｄｏＨと共に発現される場合、インプランタでの脱グリコシル化に起因して、タンパク質の分子量（二量体並びに単量体）が変化することに留意すること。
【図１１】ｍ／ｚ２５，０００〜１２０，０００の質量範囲を示す、インプランタで単独発現した、又はＥｎｄｏＨと共発現したＣＳＦＶ  Ｅ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルの比較を示す図である。グリコシル化されたＥ２二量体の質量は、約９２ｋＤａと予想される（単量体は４６ｋＤａと予想される）。タンパク質上に保持された６つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を考慮した場合、脱グリコシル化二量体は、８０ｋＤａと予想される（単量体は、４０ｋＤａと予想される）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の様々な実施形態の作製及び利用について、以下で詳細に議論されるが、本発明は、多種多様な具体的文脈に組み込まれ得る多くの適用可能な発明の概念を提供するものと認識すべきである。本明細書で議論される具体的な実施形態は、本発明を作製及び利用するための具体的方法を例示するにすぎず、また本発明の範囲に限界を定めるものではない。
【００１９】
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語が以下で定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」等の用語は、単数の実体のみを指すようには意図されておらず、一般的なクラスも含まれ、その場合、具体的事例が説明目的で利用され得る。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するのに用いられるが、そのように使用されても、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明に限界を定めるものではない。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「炭水化物」、「多糖類」、又は「糖」は交換可能に用いられ、単糖、二糖類、三糖類、オリゴ糖、又は多糖類を意味し、例えばマンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、グルコース、フルクトース、フコース、ソルボース、ラムノース、マンノヘプツロース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ジヒドロキシアセトン、キシロース、キシルロース、アラビノース、グリセルアルデヒド、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、又は酸化型若しくは非酸化型を問わず、Ｌ−又はＤ−異性体の任意のこれらの組み合わせを含むが、但しこれらに限定されない。用語「炭水化物」、「多糖類」、「糖」には、自然に、組換えで、合成により、及び／又は半合成により産生される分子が含まれ、直鎖状及び／又は分岐状であり得る。
【００２１】
１又は２以上の標準的技法が、当業者に周知のように、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養、及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）で用いられる。例えば、酵素反応及び精製技法が製造業者の仕様書に従い、又は当技術分野において一般的に実現されるように、又は本明細書に記載するように実施される。上記技法及び手順は、当技術分野において周知されており、本明細書全体を通じて引用及び議論される、様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されているような伝統的な方法に従い、一般的に実施される。すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)、及びHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照。関連して用いられる命名法、並びに本明細書に記載する分析化学、有機合成化学、及び医薬製薬化学の実験手順及び技法は、周知のものであり、当技術分野で一般的に用いられる。
【００２２】
本発明を用いて有用な剤形を作製するための技法及び組成物は、下記の参考資料のうちの１又は２以上に記載されている：Anderson, Philip O.; Knoben, James E.; Troutman, William G, eds., Handbook of Clinical Drug Data, Tenth Edition, McGraw-Hill, 2002; Pratt and Taylor, eds., Principles of Drug Action, Third Edition, Churchill Livingston, New York, 1990; Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Ninth Edition, McGraw Hill, 20037ybg; Goodman and Gilman, eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition, McGraw Hill, 2001; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins., 2000; Martindale, The Extra Pharmacopoeia, Thirty-Second Edition (The Pharmaceutical Press, London, 1999)；これらすべてが参照により組み込まれ、同様に関連部分が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子」とは、機能的なタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするユニットを指す。当業者が理解するように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、又はそのフラグメント若しくは組み合わせ、並びにヒトの手により改変された可能性のあるものを含め、遺伝子産物が含まれる。精製された遺伝子、核酸、タンパク質等が、通常これに関連する少なくとも１つの汚染性の核酸又はタンパク質から識別及び区別される場合、そのような実体を指すのに用いられる。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「ベクター」は、１つの細胞から別の細胞にＤＮＡセグメント（複数可）を移送する核酸分子を指す際に用いられる。ベクターは、特定の配列を伝播するように設計されたもの、又は特定の配列と作動的に結合したプロモーターを含む発現カセット、又はかかるプロモーターの導入を引き起こすように設計されたものとしてさらに定義され得る。ベクターは、宿主細胞染色体と独立した状態で存在し得る、又は宿主細胞染色体に組み込み可能である。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」とは、核酸セグメント又は改変セグメントを含むように、工学的に作製された又は操作された細胞を指し、古細菌、原核生物、又は真核生物を問わない。したがって、工学的に作製された細胞又は組換え細胞は、ヒトの手を通じて組換え導入された遺伝子を含まない天然の細胞とは区別可能である。操作の非限定的な事例として、遺伝子組換えによる安定なトランスフェクション、又は一過性トランスフェクションが挙げられる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「相同性」とは、２つの核酸が相補的である程度を指す。一部又は全部が相同性であり得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害し、また「実質的に相同」という機能的用語を用いて表される。ハイブリダイゼーションの度合い又は程度は、ハイブリダイゼーション又はその他のアッセイ法（例えば、競合的ＰＣＲアッセイ法等）を用いて試験可能であり、また当業者にとって公知なように、厳密性が低くても特異的な相互作用が含まれるように意図されている。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」とは、標的抗原への特異的結合について、インタクトな抗体と競合し得る、あらゆるアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン又はそのフラグメントを指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二重特異性抗体が含まれる。インタクトな抗体は、少なくとも２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を一般的に含むが、いくつかの事例では、組換えにより作製される、又は天然に見出される、より少数の鎖を含む場合もある。抗体は、もっぱら単一起源由来であり得る、又は「キメラ」であり得る、すなわち抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る。例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ラット、マウス、又はハムスター起源に由来し得るが、一方Ｖ領域のフレームワーク領域は、異なる動物起源、例えばヒトに由来する。抗体又は結合フラグメントは、ハイブリドーマ内で、組換えＤＮＡ技法により、フェーズディスプレイ法を用いて、又はインタクトな抗体の酵素的又は化学的切断により産生され得る。別途明示しない限り、用語「抗体」には、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体に付加して、その誘導体、バリアント、融合タンパク質、フラグメント、及びミュータントが含まれる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「軽鎖」とは、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖及びそのフラグメントを指す。完全長軽鎖として、可変領域ドメイン（本明細書ではＶＬと略す）、及び定常領域ドメイン（本明細書ではＣＬと略す）が挙げられる。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側にある。軽鎖として、κ鎖及びλ鎖が挙げられる。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「重鎖」とは、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖及びそのフラグメントを指す。完全長重鎖として、可変領域ドメイン（本明細書ではＶＨと略す）、及び３つの定常領域ドメイン（本明細書ではＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と略す）が挙げられる。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側にあり、またＣＨドメインは、カルボキシ末端側にあり、ＣＨ３が−ＣＯＯＨ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプ、又はその他の動物ではその同等物であり得る。
【００３０】
本明細書で用いる場合、用語「Ｆａｂ’」は、抗体重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン、プラス抗体軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン、プラス１又は２以上のシステイン残基を含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端側にある少なくとも１つの追加アミノ酸残基からなるヘテロ二量体を含むポリペプチドを指す。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、共有結合（複数可）により結合したＦａｂ’抗体フラグメントの対である。Ｆａｂ’重鎖は、ヒンジ領域を含み得る。これは、任意の所望のヒンジアミノ酸配列であり得る。或いは、ヒンジ部は、１つのシステイン残基を残して完全に省略され得る、又は短い（約１〜１０残基）システイン含有ポリペプチドであり得る。特定のアプリケーションでは、一般的な天然由来の抗体ヒンジ配列（システインとこれに続く２つのプロリン、次に別のシステイン）が用いられる；この配列は、ヒトＩｇＧ１分子のヒンジ部内に見出される（E. A. Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 3rd edition (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)）。その他の実施形態では、ヒンジ領域は、別の所望の抗体クラス又はアイソタイプから選択される。本発明の特定の好ましい実施形態では、Ｆａｂ’のＣＨ１のＣ末端は、配列Ｃｙｓ  Ｘ  Ｘと融合している。Ｘは、Ａｌａであり得るが、任意のその他の残基、例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、又はＰｒｏ等であってもよい。Ｘアミノ酸残基のうちの１つ又は両方は、欠失していてもよい。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「ヒンジ領域」とは、天然の免疫グロブリン又はその任意の配列バリアント内のＣＨ１及びＣＨ２の間に位置するアミノ酸配列を指す。ヒンジ領域のサイズ及び配列は幅広く変化し得るものと理解されるが、他の免疫グロブリンの類似の領域も利用される。例えば、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、約１０残基のみであり、一方ヒトＩｇＧ３の同領域は約６０残基である。
【００３２】
本明細書で用いる場合、用語「Ｆｖ」とは、共有結合的又は非共有結合的に会合した重鎖及び軽鎖ヘテロ二量体を指し、定常ドメインを含まない。
【００３３】
本明細書で用いる場合、用語「Ｆｖ−ＳＨ」又は「Ｆａｂ’−ＳＨ」は、システイニル遊離型チオールを有するＦｖ又はＦａｂ’ポリペプチドと本明細書では定義される。遊離型チオールはヒンジ領域内にあり、鎖間結合に通常関与する軽鎖及び重鎖システイン残基は、その本来の形態で存在する。本発明の最も好ましい実施形態では、Ｆａｂ’−ＳＨポリペプチド組成物は、異種性のタンパク質分解フラグメントを含まず、またＦａｂ’フラグメントを実質的に（約９０モルパーセントを上回り）含まず、この場合、重鎖及び軽鎖は還元されている、さもなければ例えば変形ジスルフィド又はスルフヒドリル付加産物の形成によりその天然の状態で存在しないように誘導体化されている。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「グリコシダーゼ」、「グリコシドヒドロラーゼ」、又は「グリコシルヒドロラーゼ」とは、複合糖、例えば多糖類におけるグリコシド結合の加水分解を支援する酵素を指す。本発明の特定の非限定的な事例では、多糖類は、糖タンパク質、すなわち、１又は２以上の多糖類の鎖が結合しているタンパク質又はポリペプチドに結合している。本発明と共に用いられるグリコシダーゼの非限定的な事例として、エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α１−２フコシダーゼ、α１−２，３マンノシダーゼ、α１−３，６ガラクトシダーゼ、α２−３ノイラミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β１−３ガラクトシダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、フェチュイン、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイロミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、及び／又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが挙げられる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「グリコシル化」とは、糖類又はグリコシル基をポリペプチドに付加することを指し、一般的にＮ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型グリコシル化は、炭化水素部分とアスパラギン残基の側鎖との結合を指す。トリペプチド配列の非限定的な事例として、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンが挙げられ、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、炭化水素部分とアスパラギン側鎖との酵素的結合に関する代表的な認識配列である。ポリペプチド内にこのようなトリペプチド配列が存在すると、グリコシル化可能部位が形成される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロース）の１つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンに付加することを指すが、但し、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも利用可能である。本発明と共に用いる場合、タンパク質の再グリコシル化は、インビトロ及び／又はインセルロであり得る。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「ヒト化抗体」とは、事前に決定された抗原に結合する能力を有する免疫グロブリンアミノ酸配列バリアント又はそのフラグメントを指し、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ領域、及び実質的にヒト以外の免疫グロブリンのアミノ酸配列、又は事前選択された抗原に結合するように工学的に作製された配列を有するＣＤＲが含まれる。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「細胞」及び「細胞培養物」は、交換可能に用いられ、すべてのかかる名称には、子孫が含まれる。したがって、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」には、初代対象細胞及びそれに由来する培養物が継代数とは無関係に含まれる。また、すべての子孫は、故意又は偶発的な突然変異のため、ＤＮＡ含有量について正確に同一でなくてもよいと理解される。当初形質転換された細胞内でスクリーニングされたものと同一の機能又は生物活性を有するミュータントの子孫も含まれる。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「プラスミド」は、小文字のｐに先行する及び／又はこれに続く大文字及び／又は番号で表される。本明細書の開始プラスミドは市販されており、無制限に公的に利用可能である、又は公表された手順に基づき、かかる利用可能なプラスミドから構築され得る。さらに、その他の同等のプラスミドは、当技術分野において公知であり、当業者にとって自明である。
【００３９】
本明細書で用いる場合、制限消化物からの所与のＤＮＡフラグメントの「回収」又は「単離」という用語は、電気泳動によりポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル上で消化物を分離すること、所望のフラグメントを、その移動度と分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度とを比較することにより同定すること、所望のフラグメントを含有するゲル切片を取り出すこと、及びＤＮＡからゲルを分離することを指す。この手順は、一般的に知られている。例えば、Lawn et al.（Nucleic Acids Res. 1981. 9:6103-6114）、及び Goeddel et al. （Nucleic Acids Res. 1980. 8:4057）を参照。
【００４０】
本明細書で用いる場合、ＤＮＡの「調製」という用語は、プラスミドＤＮＡを宿主細胞の培養物から単離することを指す。ＤＮＡの調製で一般的に用いられる方法は、Sambrook et al.、（Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）のセクション１．２５〜１．３３に記載されている大スケール及び小スケールプラスミド調製法である。ＤＮＡ調製物は、当技術分野において周知の方法により精製される（Sambrook et al.のセクション１．４０を参照、前出）。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「形質転換」とは、外因性ＤＮＡがレシピエント細胞に進入し、これを変化させるプロセスを指す。これは、自然条件又は当技術分野において周知の様々な方法を用いた人工的条件下で生ずる可能性がある。形質転換は、外来の核酸配列を原核性又は真核性の宿主細胞に挿入する任意の公知の方法に準拠し得る。該方法は、形質転換される宿主細胞に基づき選択され、また、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、及び粒子衝突を含み得るが、但しこれらに限定されない。かかる「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが自律的複製プラスミド、又は宿主染色体の一部として複製能力を有する安定的に形質転換された細胞が含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「トランスフェクション」とは、外来ＤＮＡを真核細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、例えばリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、ポリブレン媒介型トランスフェクション、アグロバクテリウム媒介型トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注射、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及び遺伝子銃（biolistics）を含む、当技術分野にとって公知の様々な方法によりを実現可能である。したがって、用語「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトされた」とは、外来ＤＮＡをトランスフェクトされる細胞のゲノムに導入し、組み込むことを指す。用語「安定なトランスフェクタント」とは、外来ＤＮＡをゲノムＤＮＡに安定的に組み込んだ細胞を指す。また、該用語は、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを限られた時間、一時的に発現する細胞も含む。したがって、用語「一時的トランスフェクション」又は「一時的にトランスフェクトされる」とは、外来ＤＮＡをトランスフェクトされる細胞のゲノムに組み込むことができなかった細胞に、外来のＤＮＡを導入することを指す。外来のＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞の核内に数日間留まる。この時間、外来のＤＮＡは、染色体内で内因性遺伝子の発現を支配する制御調整下に置かれる。用語「一時的なトランスフェクタント」とは、外来ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを一体化することができなかった細胞を指す。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「ベクター」とは、ＤＮＡセグメント（複数可）を１つの細胞から別の細胞に移送する核酸分子を指す。用語「媒体」が、時に「ベクター」と交換可能に用いられる場合もある。用語「ベクター」には、本明細書で用いる場合、所望のコーディング配列及び特定の宿主生物内で作動可能に結合したコーディング配列を発現するのに必要な該当する核酸配列を含有する組換えＤＮＡ分子に関連する発現ベクターも含まれる。原核生物内での発現に必要な核酸配列には、多くの場合、その他の配列と共に、プロモーター、オペレーター（任意選択的）、及びリボソーム結合部位が通常含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに停止及びポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。
【００４４】
本発明には、グリコシル化部位又は炭化水素結合部位の変化、欠失、及び／又は付加を引き起こすためのタンパク質配列の修飾も含まれる。例えば、親タンパク質と比較して修飾されたグリコシル化パターン、例えば特異的結合剤又は抗体に見出される１又は２以上の炭化水素部分が欠失した、及び／又は特異的結合剤又は抗体内に存在しない１又は２以上のグリコシル化部位が付加されたグリコシル化パターンを有するようなタンパク質バリアントも産生可能である。
【００４５】
タンパク質（例えば、抗体）のグリコシル化は、Ｎ結合型又はＯ結合型炭化水素基のうちの少なくとも１つを一般的に含む。本明細書で用いる場合、「Ｎ結合型」グリコシル化とは、炭化水素部分のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。例えば、Ｘａａがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列のアスパラギン−Ｘａａ−トレオニン又はアスパラギン−Ｘａａ−セリンは、炭化水素部分をアスパラギン側鎖に酵素的に結合させるための代表的な認識配列である。ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列が存在すると、グリコシル化可能部位が形成される。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列のうちの１又は２以上が含まれるようにアミノ酸配列を変化させることにより、タンパク質に付加可能である。本明細書で用いる場合、「Ｏ結合型」グリコシル化とは、炭化水素基のセリン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、又はヒドロキシリジンへの（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのヒドロキシアミノ酸への）結合を指す。
【００４６】
本発明は、プロセスを短縮し（及び産物の収率を潜在的に高め）、グリコリモデリングプロセスのコスト及び時間を最終的に削減し、大スケール製造によりなじむようにすることにより、既存のインビトロでのグリコリモデリングについて認められる問題を克服する。脱グリコシル化ステップは、特異的エンドグリコシダーゼと共に、所望のタンパク質（複数可）を共発現することによりインビボで実施される。エンドグリコシダーゼは、第１のＧｌｃＮＡｃ残基が再グリコシル化に利用可能な脱グリコシル化タンパク質を産生した後、タンパク質に結合したＮ−グリカン基質を切断する（本発明、図１、オプションＢ）。エンドグリコシダーゼの選択は、所望のタンパク質が蓄積する細胞コンパートメント及びＮ−グリカン基質を切断する性質に依存する。例えば、Ｎ−グリカンコアのフコシル化が生ずる前に、所望のタンパク質に結合した高マンノース残基を切断するように、特異的エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＨ）を、小胞体（ＥＲ，endoplasmic reticulum）へと標的化することができる（図１、オプションＢ）。所望のタンパク質を発現組織又は培養物から抽出する際には、脱グリコシル化タンパク質が精製され、インビトロでの再グリコシル化ステップの対象とされる。
【００４７】
図２Ａは、脱グリコシル化及び再グリコシル化についてインビトロでのプロセスを利用する先行技術のモノクローナル抗体グリコリモデリングに関する略図を示す。先行技術のプロセス１０は、ステップ１０において植物内でモノクローナル抗体（ｍＡｂ，monoclonal antibody）を発現させることから開始し、その後にステップ１４におけるｍＡｂの抽出が続く。次に、ステップ１６では、ｍＡｂはプロテインＡカラムに適用され、そして結合バッファーが、ステップ１８において１又は２回以上交換される。並行して、大腸菌（E.coli）が、ステップ２０において野生型（ＷＴ，wild-type）ＥｎｄｏＳを産生させるのに用いられ、その後、ステップ２２におけるＥｎｄｏＳのアフィニティー精製が続く。アフィニティー精製から得られたＥｎｄｏＳは、次にステップ２４において、ステップ１８において単離されたタンパク質に付加され、そしてｍＡｂが所定の温度で所定の時間、脱グリコシル化される。次に、ｍＡｂが第２のプロテインＡカラムを用いてステップ３０において再度精製され、再びバッファー交換ステップ３２が続く。並行して、ミュータントＥｎｄｏＳが、ステップ３４において大腸菌内で産生され、そしてステップ３６においてアフィニティー精製され、ミュータントＥｎｄｏＳが得られる。こうして産生したミュータントＥｎｄｏＳは、次にステップ３２から得られた脱グリコシル化ｍＡｂとステップ３８において組み合わされる。この段階では、再グリコシル化ｍＡｂは、次にステップ４０において第３のプロテインＡカラム上で再単離され得る、又はｍＡｂは、ステップ４２においてＣＥＸカラムを用いてアフィニティー精製可能であり、その後にステップ４４における最終産物の単離が続く。
【００４８】
対照的に、図２Ｂは、インビボでの脱グリコシル化と、これに続くインビトロでの再グリコシル化を用いた、本発明のモノクローナル抗体のグリコリモデリングの略図を示す。本発明のプロセス５０は、ステップ５２において、所望のタンパク質、例えばｍＡｂと、所望のタンパク質をインビボで脱グリコシル化する酵素との共発現から開始する。次に、ステップ５４において、所望のタンパク質が抽出され、そしてステップ５６において、例えばアフィニティーカラムを用いて単離され、次にこれはステップ５８において、バッファー交換により洗浄され得る。並行して、ステップ６０において、ミュータントグリコシダーゼ、例えばＥｎｄｏＳミュータントを発現するのに大腸菌が用いられ、その後、ステップ６２におけるＥｎｄｏＳミュータントの単離が続く。ステップ６４では、単離後の脱グリコシル化された所望のタンパク質が、所望のタンパク質を再グリコシル化するために、ミュータントグリコシダーゼと組み合わされる。再グリコシル化された所望のタンパク質は、次にステップ６６において、第２のプロテインＡカラムを用いてさらに単離され得る、又はステップ６８において、例えば異なるグリコフォームを単離するのに用いることができるＣＥＸカラムを用いてアフィニティー単離され得るが、その後、ステップ７０における最終産物の単離が続く。
【００４９】
植物ベクター系の構築。リツキシマブ重鎖及び軽鎖の遺伝子配列（GenBank: AX556949.1）、ヒトＩｇＧ１、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ，Classical Swine Fever Virus）Ｅ２外被タンパク質（GenBank: ACL98470.1）、及びエンドグリコシダーゼＨ（GenBank: AAA26738.1）を、大麦α−アミラーゼシグナルペプチド配列（GenBank: CAX51374.1）に融合させた。ＣＳＦＶ  Ｅ２タンパク質の膜貫通ドメインに対応する配列を取り出して、可溶性ＣＳＦＶ  Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子を生成した。また組換えＣＳＦＶ  Ｅ２配列についてはまた、精製しやすくするために６×ヒスチジンタグに融合させ、小胞体内へのタンパク質の蓄積を可能にするために小胞体（ＥＲ）検索ＨＤＥＬタグに融合させた。すべての遺伝子は、タバコ（Nicotiana tabaccum）コドン使用頻度を用いて、植物発現用にコドン最適化を行い、Eurofins MWG/Operon（Huntsville社、AL）により合成した。コドン使用の最適化は、例えばChristianson, M., Codon usage patterns distort phylogenies from or of DNA sequences, Am. J. Bot. August 2005, Vol. 92, No. 8, pp. 1221-1233、Puigbo, et al., OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences, Nucleic Acids Res. 2007 July; 35(Web Server issue): W126-W131が教示する表を用いる等、当技術分野において周知されており、関連する表を参照により本明細書に組み込み、また例えばｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ又はｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲから自由に入手可能である。リツキシマブ、ｈＩｇＧ１、及びＥ２遺伝子を、植物ウイルスベースの発現ベクターにクローン化した。ＥｎｄｏＨ遺伝子を、ＥＲ−検索ペプチドＳＥＫＤＥＬの配列（配列番号１）、及び３’末端の３×ペプチドフラッグタグに最初に融合させた後、バイナリーベクターpGREENIIにクローン化してpFlag-EndoHを産生させた。ＥｎｄｏＨ遺伝子の発現を、複製されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動した。すべての植物発現ベクターを、次にアグロバクテリア・ツメファシエンス（Agrobacteria tumefaciens）系統ＧＶ３１０１に動員した。
【００５０】
植物の増殖。約２５℃、相対湿度約６０％で、３週間、独自開発した赤色／青色LED光下で、ベンサミアナタバコ（N. benthamiana）種子を発芽させた。光強度は、最初の２週間は３０〜５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり、３週目には、５０〜７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓに高めた。３週間後、さらに２週間成長増殖させるために、若年の小植物を新規トレーに移した。成長増殖の最初の１週間、植物を、照光時間が１６時間明光（５０〜７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）／８時間暗光の下で、約２５℃、相対湿度約６５％に配置した。成長増殖の２週目では、植物を、一定光（７０〜１３０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）の下、約２７℃、相対湿度約４５％に配置した。
【００５１】
アグロインフィルトレーション。アグロバクテリアクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌリファンピシンが補充されたLuria-Bertani（ＬＢ，Luria-Bertani）培地を含有する培養フラスコ内、２８℃において、２２５ｒｐｍで撹拌しながら個別に増殖させた。ＯＤ６００ｎｍが約１．５に到達した培養物を収集し、２ｍＭのMESバッファー、ｐＨ５．６を含有するインフィルトレーション溶液で希釈した。アグロバクテリア誘発時間が１時間経過した後、５週齢の植物を、以下に記載するようにバキュームインフィルトレーションした。植物を、アグロバクテリアを含有するインフィルトレーション溶液に浸漬し、そして２３インチＨｇの真空度を適用し、３分間保持した。アグロインフィルトレーションした植物を、新規増殖チャンバー内、一定光（７０〜１３０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）の下、約２２℃、相対湿度約５０％でインキュベーションした。
【００５２】
タンパク質の抽出及び精製。インフィルトレーション後、６〜７日間の増殖（ＤＰＩ，days of growth post infiltration）を経た後、植物葉を採取し、総可溶性タンパク質を、３容（ｗ：ｖ）の抽出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で抽出した。リツキシマブ及びｈＩｇＧ１の回収用として、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）及びEDTA（５ｍＭ）を抽出バッファーに補充した。抽出物を１０分間スピンダウンして、植物組織をペレット化した。上清を精製及びタンパク質の特徴付けを行うために回収した。Ｆｌａｇ−ＥｎｄｏＨの発現は、抗Ｆｌａｇ抗体（Rockland Antibodies and Assays社、Gilbersville、PA）を用いて、ウェスタンブロット解析により確認した。植物で作製されたリツキシマブ及びｈＩｇＧ１を、HiTrap MabSelect SuReカラムを用いて総可溶性タンパク質から精製した（GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ）。タンパク質Ｅ２を、製造業者の説明書に従い、ニッケルがチャージされたChelating Sepharose Fast-Flow（GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ）を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー法（ＩＭＡＣ，Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography）により精製した。
【００５３】
組換えタンパク質の分子質量測定
植物で作製されたＣＳＦＶ  Ｅ２、植物で作製された及び市販のリツキシマブ（リツキサン（登録商標））を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Applied Biosystems社）により分析した。５％のβ−メルカプトエタノール中で還元したサンプルを、５７℃で２０分間インキュベーションした。完全に会合したモノクローナル抗体を還元すると、分子量直接測定用の遊離した重鎖及び軽鎖が得られた。サンプルを、シナピン酸の飽和溶液（１０．０ｍｇ／ｍＬ：７５％ACN：２５％Ｈ２Ｏ）で１：２０及び／又は１：２００に希釈し、そして１μＬのスポットを１００スポットサンプルプレートに適用した。最適化された装置パラメーターを用いて、陽イオンモードで、乾燥した液滴を分析した。
【００５４】
トリプシンペプチドのマスフィンガープリント分析。１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したサンプルを、DTTの存在下、５７℃で２０分間インキュベーションした。還元後、サンプルを、ヨードアセトアミドと共に、暗光、室温で２０分間インキュベーションすることにより、カルバミドメチル化を実施した。配列決定グレードのトリプシン（Promega社）による消化を、０．１％のProteaseMax界面活性剤（Promega社）の存在下、５７℃で２時間実施した。穏やかな窒素気流下で乾燥するまでサンプルを蒸発させ、そして６５％ACN：０．１％TFA中で再懸濁し、これを合計３回行うことにより、ペプチドを精製した。サンプルをある容積の０．１％のTFA中に再懸濁した後、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（１０．０ｍｇ／ｍＬ：７５％ACN：２５％Ｈ２Ｏ）の飽和溶液中で１：２０及び／又は１：２００に希釈し、そして１μＬのスポットを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析用として１００スポットサンプルプレートに適用した。乾燥した液滴を、最適化された装置パラメーターを用いて、陽イオンモードで分析した。
[実施例]
【実施例１】
【００５５】
モノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）のインビボでの脱グリコシル化。
実施例１では、本発明者らは、アフコシル化されたシアル酸付加型の単一グリコフォーム抗体産物を工学的に作製するという最終ゴールを目指して、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）をニコチアナ・ベンタミアーナ（Nicotiana benthamiana）植物中で産生させたが、また最初のＧｌｃＮＡｃの後のＮ結合型オリゴ糖を重鎖からインプランタで除去する。このゴールに到達するために、本発明者らは、植物バキュームアグロインフィルトレーションを用いて、ｈＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖を、小胞体検索シグナルＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）と融合したエンドグリコシダーゼＨと共に一時的に発現させた。エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）は、真核生物細胞（例えば、植物及び哺乳動物細胞）のＥＲに見出されるグリコフォームである高マンノースグリカンを特異的に切断する。植物Ｎ−グリコシル化プロセシングのこの段階（タンパク質はＥＲに局在する）では、フコース残基は、タンパク質のＮ−グリカンコアにまだ付加されていない。したがって、高マンノースグリカンが切断されると、脱グリコシル化及びアフコシル化ｈＩｇＧ１の産生が可能となる。植物が、ＥｎｄｏＨと共にｈＩｇＧ１を一時的に発現したら、総可溶性タンパク質を発現組織から抽出し、そしてｈＩｇＧ１を、プロテインＡカラムを用いて未精製の抽出物から精製した。ＥｎｄｏＨと共に又はこれとは独立に発現した精製後の産物を、還元条件のタンパク質ゲル上に負荷したが、この場合、２つの重鎖間のサイズの差異が可視化可能であり、ＥｎｄｏＨと共に共発現した際のタンパク質のインプランタでの脱グリコシル化が立証される（図３）。完全にグリコシル化されたｈＩｇＧ１（図４）及び脱グリコシル化されたｈＩｇＧ１（図５）を特徴付けるために、精製後のｈＩｇＧ１について、そのグリコシル化の性質を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ，Electrospray Ionization Mass Spectrometry）によりさらに評価した。分子質量がそれぞれ約１４５，７５６Ｄａ及び１４４，３１２Ｄａの完全及び半グリコシル化抗体として、ｈＩｇＧ１を植物内で発現させたが、半グリコシル化型では、１つの重鎖のみがグリコシル化されていることが判明した（図４）。半グリコシル化タンパク質と完全グリコシル化タンパク質との間の差異は、約１，４４４Ｄａであり、Ｎ−グリカン１つ分の平均質量である。対照的に、ｈＩｇＧ１が、植物内でＥｎｄｏＨと共に共発現した場合、会合型抗体の質量は、約１４３，０４８Ｄａ、及び約１４３，２６８Ｄａまで減少し（図５）、１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、質量２０３Ｄａ）を担持する鎖を１つ（半）又は２つ（完全）有する２つの抗体を表しているが、質量が１４２，９２８Ｄａである非グリコシル化ｈＩｇＧ１よりもなお大きい。
【実施例２】
【００５６】
モノクローナル抗体（リツキシマブ）のインビボでの脱グリコシル化。
実施例２では、本発明者らは、別のモノクローナル抗体：抗ＣＤ２０キメラ抗体リツキシマブについて、インビボでの脱グリコシル化を繰り返し行った。リツキシマブ重鎖及び軽鎖を、植物内で、単独で又はＥｎｄｏＨと共に発現させた。植物の総抽出物からの精製を終えると、ＥｎｄｏＨによるインプランタでの脱グリコシル化が、係留されたＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がタンパク質及び／又はトリプシンペプチドフラグメントのアスパラギン残基と共に残留するインビトロでの脱グリコシル化プロセスと一致するか確認するために、植物で作製されたリツキシマブサンプルをマトリックス支援式レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ，matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry）により分析した。このプロセスを確認するために、（１）イノベーター分子（リツキサン（登録商標））、（２）植物で作製されたリツキシマブ、及び（３）ＥｎｄｏＨによりインプランタで脱グリコシル化された、植物で作製されたリツキシマブを対象に、完全長及びトリプシンペプチドの両方について、そのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを取得した。
【００５７】
図６は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ，β-mercaptoethanol）で還元したリツキサン（登録商標）標準品のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示し、この場合、重鎖（ｍ／ｚ５０，９４２Ｄａ）は完全にグリコシル化されている。また、リツキシマブの重鎖及び軽鎖会合型は、ｍ／ｚ７４，１７８Ｄａ、並びに軽鎖の二量体は４６，１９６Ｄａを示す。この二量体は、３サンプルの全ＭＡＬＤＩスペクトルに認められた。図７は、単独発現させた、植物で作製されたリツキシマブのＭＡＬＤＩスペクトルを示し、グリコシル化された重鎖（ｍ／ｚ５０，６９８Ｄａ）、並びに非グリコシル化重鎖（ｍ／ｚ４９，２５３Ｄａ）を表す。また、リツキシマブの重鎖及び軽鎖会合型も認められた。図８は、ＥｎｄｏＨによるインプランタ脱グリコシル化物であった、植物で作製されたリツキシマブを示し、還元型グリコシル化重鎖（ｍ／ｚ５０，６８７Ｄａ）、並びに図７で認められた非グリコシル化重鎖の分子量よりも約２０３Ｄａ（ＧｌｃＮＡｃの分子量）上回るｍ／ｚ４９，４０６Ｄａのインプランタ脱グリコシル化重鎖を有する。この非グリコシル化及び脱グリコシル化理論を確認するために、ＥｎｄｏＨによりインプランタで脱グリコシル化されたトリプシン消化後の植物で作製されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを取得した。１１００〜１５００Ｄａの質量範囲のスペクトルを拡大して図９に示し、Ｎ−グリコシル化部位がグリカンにより占有されなかった場合、同部位を含有するペプチドの理論的なトリプシン消化から予測された通り、ピークは１１９０Ｄａに検出された。重要なこととして、１３９３Ｄａでもピークが検出されたが、この値は、タンパク質と共にＧｌｃＮＡｃが１つ残留するこのペプチドフラグメントについて予測される質量に該当し、意図した通りに、ＧｌｃＮＡｃが、インプランタで脱グリコシル化した、植物で作製されたリツキシマブに結合したまま１つ残留したことが確認された。
【実施例３】
【００５８】
多重グリコシル化サブユニットワクチン候補のインビボでの脱グリコシル化。
古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）に由来する糖タンパク質Ｅ２のインビボでの脱グリコシル化は、ＥｎｄｏＨを標的タンパク質と共に共発現することにより確認した。ＣＳＦＶ  Ｅ２タンパク質は十分にグリコシル化されており、７つのＮ−グリコシル化可能部位を保持するが、そのうちの１つのＮ−グリコシル化部位は、別のＮ−グリコシル化部位と非常に接近しているので利用されない可能性が高いものの、異なるタンパク質モデルを代表する。感染した宿主に見出される天然のＮ−グリカンを用いて、サブユニットワクチンタンパク質候補をリモデリングすれば、より高い抗原免疫原性、したがってより有効なワクチン接種を実現する可能性がある。標的タンパク質の精製をしやすくするために、Ｅ２を６×ヒスチジンタグに融合させた。Ｅ２は、植物内で発現すると二量体を形成し、グリコシル化されたＥ２二量体と脱グリコシル化された可能性のあるＥ２二量体の間のサイズの差異は、タンパク質ゲル上で容易に検出可能である。Ｅ２が植物内で発現すると、二量体グリコフォームが、予測された約９２ｋＤａの分子量で産生した。しかし、Ｅ２がＥｎｄｏＨと共に共発現すると、単一の二量体産物が、約８０ｋＤの分子質量で抽出された。質量の差異（１２ｋＤａ）は、脱離後のオリゴ糖に対応する（図１０）。グリコシル化Ｅ２及び脱グリコシル化Ｅ２のＭＭを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図１０）より、標的タンパク質のインビボでの脱グリコシル化は完全であることが示唆される。
【００５９】
Ｅ２の脱グリコシル化を確認するために、グリコシル化Ｅ２及び脱グリコシル化Ｅ２の質量を、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した（図１１）。Ｅ２タンパク質を、ニッケル−キレート化セファロースを用いて精製した。非グリコシル化Ｅ２二量体の質量は、７７，４００Ｄａとして計算される（単量体の場合３８，７００Ｄａ）。高マンノースグリカンで完全にグリコシル化されたＥ２二量体の質量は、９０〜９５ｋＤａ（単量体の場合、４５及び４７．５ｋＤａ）として計算される。各Ｎ−グリコシル化部位上のＧｌｃＮＡｃのうち、１つのみが脱グリコシル化されたタンパク質の質量は、約７９，８３６Ｄａ（単量体の場合、３９，９１８Ｄａ）として計算される。図１１は、Ｅ２の単独発現（上段パネル；二量体ｍ／ｚ９０〜９２ｋＤａ、単量体ｍ／ｚ４５〜４７ｋＤａ）と、Ｅ２のＥｎｄｏＨとの共発現（下段パネル；二量体ｍ／ｚ７９〜８２ｋＤａ、単量体ｍ／ｚ約４０ｋＤａ）の間の、二量体質量における約１２ｋＤａの変化（単量体質量では６ｋＤａ）を説明する。この差異は、６つのＭａｎ５〜Ｍａｎ７（６，０８４Ｄａ〜６，８０４Ｄａ／Ｅ２単量体）、すなわちオリジナルのタンパク質上に存在する予想される炭化水素構造の理論的な質量に対応する。
【００６０】
本発明者らは、インビボでの脱グリコシル化されたｈＩｇＧ１、リツキシマブ、及びＣＳＦＶ  Ｅ２の産生に成功したが、これは、次にインビトロでの再グリコシル化で利用可能である。一方、インプランタでの脱グリコシル化では、ｈＩｇＧ１及びリツキシマブの場合、部分的にすぎないようであるが、しかし、いくつかの戦略が、このインビボでのタンパク質脱グリコシル化ステップを最適化するのに実施可能である。例えば、異なる発現ベクターを併用したり、また恒常的プロモーター若しくは誘導的プロモーターの下で選択されたエンドグリコシダーゼを発現させたりすることにより、遺伝子組換え植物を生成すれば、選択されたエンドグリコシダーゼを、所望のタンパク質よりも多く又は／及び早期に発現させるのに役立ち、完全な脱グリコシル化を保証することが可能となる。
【００６１】
本発明は、その他の異種発現系（例えば、哺乳動物細胞、酵母、及び昆虫細胞）、並びにその他の組換えタンパク質候補のインビボでの脱グリコシル化技術で利用可能である。
【００６２】
本発明は、例えば所望のグリコシル化プロファイルを有する治療薬の製造において、様々な種類のクオリティ−バイ−デザイン（ＱｂＤ，Quality-by-Design）プロセスの開発で利用可能であり、これには下記事項が含まれるが、但しこれらに限定されない：（１）ヒトシアル酸を担持する治療用糖タンパク質の産生；（２）天然のグリコシル化パターンを担持する治療用糖タンパク質の産生；（３）抗炎症特性を有するヒトシアル酸付加型ＩｇＧの産生；（４）細胞毒性活性が高まったアフコシル化モノクローナル抗体の産生；（５）シグナルグリコフォーム治療用タンパク質を産生することによる製品の均質性及び一貫性の向上；（６）現在の異種発現系内で会合しない、稀な又は特異的グリコフォームの産生；或いは（７）望ましくない宿主特異的、免疫誘発性を有する可能性のあるグリコフォームの除去。
【００６３】
本明細書で議論される任意の実施形態は、任意の方法、キット、試薬、又は本発明の組成物について実施可能であり、またその逆も同様と考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するのに利用可能である。
【００６４】
本明細書に記載する特定の実施形態は、本発明の制限としてではなく、説明を目的として提示されるものと理解される。本発明の主要な特性は、本発明の範囲から逸脱せずに様々な実施形態で採用され得る。当業者は、ルーチン実験以上のものを用いなくても、本明細書に記載する具体的手順と同等の多くの手順を認識する、又は確認することができる。かかる同等の手順は、本発明の範囲内にあり、本特許請求の範囲に含まれると考えられる。
【００６５】
本明細書に記載するすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技能レベルを示唆する。個々の刊行物又は特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるように具体的に及び個別に提示されたかのように、すべての刊行物及び特許出願は、それと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
単語「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書の中で、用語「含む（comprising）」と組み合わせて用いられる場合、「１つ」を意味し得るが、また「１又は２以上」、「少なくとも１つ」、及び「１又は１つよりも多い」の意味にも該当する。特許請求の範囲内で用語「又は（or）」を使用する場合、それは、代替物のみを意味するように明示されない限り、又は代替物は相互に排除されない限り、「及び／又は」を意味するのに用いられるが、但し代替物のみ及び「及び／又は」を意味する定義についても本開示は支持する。本出願全体を通じて、数値には、該数値を求めるのに採用されたデバイス及び方法に関する固有の誤差変動が含まれること、又は試験対象間に存在する変動が含まれることを示唆するために、用語「約」が用いられる。
【００６７】
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）で用いる場合、単語「含む（comprising）」（並びに、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」等の、「含む（comprising）」の任意の形態）、「有する（having）」（並びに、「有する（have）」及び「有する（has）」等の、「有する（having）」の任意の形態）、「含む（including）」（並びに、「含む（includes）」及び「含む（include）」等の「含む（including）」の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに、「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」等の、「含有する（containing）」の任意の形態）は、包含的、又は非制限的であり、また追加的な、列挙されない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書に提示される組成物及び方法のいずれについても、その実施形態では、「含む（comprising）」は、「から実質的に構成される」又は「から構成される」と置換可能である。本明細書で用いる場合、慣用句「から実質的に構成される」は、所定の整数（複数可）又はステップ、並びに請求項に係る発明の特性又は機能に実質的に影響を及ぼさないものを必要とする。本明細書で用いる場合、用語「構成される（consisting）」は、列挙した整数（例えば、特性、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ、又は制限）、又は整数の群（例えば、特性（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）、特性（複数可）、いくつかの方法／プロセスステップ、又は制限（複数可））の存在を示唆するのに用いられるにすぎない。
【００６８】
用語「又はその組み合わせ」は、本明細書で用いる場合、該用語に先行して列記される項目のすべての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はその組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣのうちの少なくとも１つを含み、また特定の文脈において順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含むように意図されている。この例に続き、明確に含まれるものとして、１又は２以上の事項又は条件の繰り返し、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等を含む組み合わせが挙げられる。当業者は、文脈から別途明白でない限り、一般的には、事項又は条件の数に関して、組み合わせの如何によらず、制限は存在しないと理解する。
【００６９】
本明細書で用いる場合、非限定的に、「約」、「実質的な」、又は「実質的に」等の近似の単語は、そのように修飾された場合には、必ずしも絶対的又は完全である必要はないと理解されるが、当業者が、条件が存在するならばその通りに特定することが確実であるほどに十分近いと考えられる該条件を意味する。説明の可変範囲は、生じ得る変化の程度に依存し、また該範囲は、修飾対象の特性が、必要とされる特徴及び修飾されない特性の能力をなおも有するものと同業者になおも認識させる。一般的に、但し上記議論の対象としつつ、「約」等の近似の単語により修飾される本明細書の数値は、記載された数値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、又は１５％変化し得る。
【００７０】
本明細書で開示され、特許請求されたすべての組成物及び／又は方法は、過度の実験を行わなくても、本開示に照らし作製及び実行可能である。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態として記載されているのであって、当業者にとって、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記載する組成物及び／又は方法に対して、並びに方法のステップ又は一連のステップにおいて、変更が適用可能であることは明白である。当業者にとって明白なすべてのかかる類似した置換形態及び修正形態は、添付の特許請求の範囲の定義の通り、本発明の精神、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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