(57)【要約】  本方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析法に供される、全血サンプル、ピンプリックおよび血液スポットカードの迅速なスクリーニングを特徴とする。スペクトルを生成し、健常な対照からのスペクトルと比較する。特徴的なスペクトルを異常ヘモグロビン症の存在の指標とし、本方法は、全ての鎌状赤血球病、アルファおよびベータサラセミアをスクリーニング／診断するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られた血液サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む、異常ヘモグロビン症を検出する方法。
【請求項２】
前記血液サンプルを直接質量スペクトル解析の前に溶解剤と混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解剤がホルマリンを含む、請求項２に記載の方法
【請求項４】
前記サンプルを直接質量スペクトル解析の前に希釈する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球性貧血、α−サラセミア、β−サラセミア、ＨｂＡＧ、ＨｂＡ／エンフィールド、ＨｂＨ、ＨｂＡＦ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ−パンジャブ、ＨｂＯ−アラブ、ＨｂＧ−フィラデルフィア、Ｈｂ  コンスタントスプリング、Ｈｂ  ハシャロン、Ｈｂ  コルレ−ブ、Ｈｂ  レポール、ＨｂＭ、およびＨｂ  カンザスから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルを正規化する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルを７，０００〜７００，０００ｍ／ｚの範囲で分析する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルの前記直接質量スペクトル解析から得られたパターンと健常な対照からの血液サンプルの直接質量スペクトル解析から得られた質量スペクトルパターンとを比較して、前記サンプルからの前記パターンが異常ヘモグロビン症を示すかどうかを決定することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルの前記直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルを健常な対照からの採血サンプルの統計分析から決定された約６，０００〜３００，０００ｍ／ｚの間の期待質量の参照スペクトルモデルと比較する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルの前記直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルを異常ヘモグロビン症の患者からの採血サンプルの統計分析から決定された約６，０００〜３００，０００ｍ／ｚの間の期待質量の疾患モデルと比較する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
実施された前記質量スペクトル解析がマトリックス支援レーザー脱離／イオン化分析法（ＭＡＬＤＩ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＡＬＤＩ分析法が飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本方法は、以下：
１）脱イオン蒸留水への溶解（または凍結）および脱イオン蒸留水または０．１％ＴＦＡ脱イオン蒸留水のいずれかでの１／１０から１／８０００の範囲での大量の希釈。結果として得られるスペクトルは、１５０００ｍ／ｚから１６，２００ｍ／ｚの質量／荷電範囲で単一荷電イオンとして、好ましくは７５００から８２００ｍ／ｚで二重荷電イオンとして分析される。
２）クエン酸塩緩衝ホルマリンでのインキュベーション、その後脱イオン蒸留水への溶解（または凍結）および脱イオン蒸留水または０．１％ＴＦＡ脱イオン蒸留水のいずれかでの１／１０から１／８０００の範囲での大量の希釈。結果として得られるスペクトルは、１５０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚの質量／荷電範囲で単一荷電イオンとして分析される。
のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析法に供される、全血サンプル、ピンプリック（ｐｉｎ  ｐｒｉｃｋ）および血液スポットカード（ｂｌｏｏｄ  ｓｐｏｔ  ｃａｒｄｓ）の迅速なスクリーニングを特徴とする。
【０００２】
前記スペクトルは、好ましくはマトリクスとしてシナピン酸を用いて生成され、特徴的なスペクトルは、異常ヘモグロビンの存在の指標であり、すべての鎌状赤血球病、アルファおよびベータサラセミアをスクリーニング／診断できる。
【背景技術】
【０００３】
異常ヘモグロビン症は、世界的に遺伝性のヒト単一遺伝子病の最も大きなグループであり、赤血球において酸素に結合するα２β２ヘテロ四量体コンプレックス、ヘモグロビンを形成するグロビンタンパク質をコードする１以上の遺伝子における変異によるものである。患者において結果として起こる構造変化（Ｈｂ）は、軽症で、潜在的であるが、重篤な慢性の病的状態および新生児死亡の原因でありうる。
【０００４】
アラビア諸国では、異常ヘモグロビン症が最も一般的な遺伝病である；報告されたキャリア率は、１〜１１％のβ−サラセミア、１〜５８％のα−サラセミアおよび０．３〜３０％の鎌状赤血球形質である。
【０００５】
インドでは、最も一般的な異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球形質、Ｈｂ  ＤおよびＨｂ  Ｅである。２０００年において、１０億の人口および１０００人あたり２５の出生率で、インドでは毎年異常ヘモグロビン症である約４５００万人のキャリアおよび約１５，０００の新生児がいるであろうと推定された。
【０００６】
ヘモグロビン自体は、２つのベータ遺伝子グロビンタンパク質を伴う２つのアルファ遺伝子グロビンタンパク質産物を含むヘテロ四量体コンプレックスである。構成グロビンタンパク質の遺伝的特徴およびタンパク質生化学は、複雑である：ヒトβ−グロビン遺伝子座は、第１１染色体の小領域に位置する５つの遺伝子で構成され、ヘモグロビンのベータ部分の形成に関与している。この遺伝子は、ベータ（β）グロビン遺伝子を発現するクラシックの遺伝子だけではなく、デルタ（δ）、ガンマ−Ａ（Ａγ）、ガンマ−Ｇ（Ｇγ）、およびイプシロングロビン（ε）も含む。ヒトα−グロビン遺伝子クラスターは、第１６染色体に見つかっており、グロビン発現遺伝子アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）ならびにゼータ（ζ）（図１参照）を含むが、新たなα−グロビン遺伝子が最近同定され、Ｈｂ  Ｍｕ（μ）と呼ばれる。ヒトの生命が初期の胎児から後期の妊娠、誕生および幼児／成人期へ移動するにつれて、ペアであるアルファおよびベータ遺伝子は、ｉｎ  ｕｔｅｒｏおよびｅｘｔｒａ  ｕｒｅｔｏ生活の環境に適応するように変化する。
【０００７】
例えば、最初期の胚は、Ｈｂ組み合わせξ２ε２（ガウアー）；α２ε２（ガウアーＩＩ）およびξ２γ２（ポートランド）を妊娠初期の間、卵黄嚢において形成された赤血球幹細胞（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）により生成する。これは急速にα２γ２（ＨｂＦ）に取って代わられ、妊娠中期および妊娠後期の間、胎児肝臓の赤血球幹細胞により生成される。誕生後これは、大部分α２β２（ＨｂＡ）、少しのα２δ２（ＨｂＡ２）および微量のＨｂＦに変化する（図１参照）。
【０００８】
驚くことではないが、同定された様々な異常ヘモグロビン症は、単離されたグロビンタンパク質の特徴よりむしろヘテロ四量体ヘモグロビンコンプレックスの特徴として命名された。鎌状赤血球病において、ヘモグロビンＨｂ  Ｓでは、グロビン遺伝子βがβグロビンタンパク質の６位で特定のアミノ酸変化突然変異β６Ｇｌｕ−Ｖａｌを有し、Ｓβと名付けられる；およびヘテロ四量体Ｈｂがα２Ｓβ２である。赤血球での通常のβおよびＳβのコンプレックスである鎌状赤血球形質は、ヘテロ接合性の結果としてヘモグロビン分子を構成し、多くの場合気づかれない。ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）は、β−グロビン鎖の６位でアミノ酸置換（β６Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）により生じる通常ヘモグロビン（ＨｂＡ）の構造変異体である。それは、同じ位置（ＨｂＳ；β６Ｇｌｕ−Ｖａｌ）で起こる、ヘモグロビンＳ、およびヘモグロビンＥ（ＨｂＥ，β２６Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）と一緒に世界的に最も広がった異常ヘモグロビン変異の一つである。ＨｂＣヘテロ接合体個体（ＡＣ）において、この形質は、無症状である。同型接合性（ＣＣ）は、結晶形成につながるであろう赤血球の溶解性低下によって軽症の溶血性貧血を引き起こす。ＨｂＣは、ＨｂＳとの組み合わせで遺伝する場合、臨床的に重要である。サラセミアは、β−グロビン遺伝子（β−サラセミア）またはα−グロビン遺伝子（α−サラセミア）のいずれかの発現を阻害する変異のために生じる。結果として、異常なヘテロおよびホモ四量体のＨｂの組み合わせが生じる。
【０００９】
β−サラセミアにおいて、βグロビンの合成の減少（β＋−サラセミア）またはβグロビンの合成の欠如（β０−サラセミア）がある。β−サラセミアの軽症形態は、中間型サラセミアと呼ばれる。遺伝子融合から生じるδβ−サラセミアもあり、β鎖およびδ鎖両方の生成が消失する。ベータ鎖よりもα−グロビンでのグロビン鎖合成におけるアンバランスは、赤血球におけるα−グロビンの沈降を引き起こし、骨髄または末梢血での細胞の早期破壊を引き起こす。過剰なα−グロビンは、細胞に大きなダメージを与える；赤血球前駆体において細胞タンパク質、脂肪および核酸を破壊する活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。また、四量体−αヘモグロビンは、酸化で変性する傾向により、構造的に不安定であり、ＲＯＳ生成をさらに増やす、沈降したα−グロビン鎖、遊離ヘム、ポルフィリンおよび鉄で細胞質および細胞膜を満たす。赤血球系細胞は、過剰な遊離α−グロビンを分解するためにタンパク質分解経路を有するが、これらの経路は、圧倒されるであろう。
【００１０】
α−サラセミアでは、αグロビン遺伝子の発現が欠失している；しかし、ヒトは、４つの遺伝子コピーを有するため（各親染色体に２つ、図１参照）、より大きな耐性がある。しかし、このことは、その一方で大きなキャリア能力およびこれが起こった際の結果として限定された集団でのα−サラセミアのより高い発生率を意味する。したがって、この状況は、インドから中国、東南アジアを含む、アジアでたびたび発生し、また中東およびアフリカでも発生する。
【００１１】
３つの機能的なアルファ遺伝子−患者は、症状または兆候のないサイレントキャリアである（α−サラセミア  ミニマ  α−／α  α）。
【００１２】
２つだけの機能的なアルファ遺伝子−患者は、サイレントキャリア、α−サラセミア  マイナーまたはサラセミア形質であるが、しばしば小赤血球症である。２つの遺伝子は、同じ染色体（シス型）またはペアのそれぞれ（トランス型）のいずれかに存在しうる。αα／−−（α０サラセミア）またはα−／α−（α＋サラセミア）。シス型のα０サラセミア形質は、アジア系の個体で発見される傾向があり、一方トランス型のα＋サラセミアは、アフリカ系の個体で伝わる傾向にある。母親がα０サラセミアのキャリアである場合、妊娠は、バート胎児水腫症候群のリスクがあり、一方α＋サラセミアである母親の妊娠での最悪の結果は、もっと穏やかな状態、Ｈｂ−Ｈ病である。
【００１３】
１つだけの機能的なアルファ遺伝子（α−／−−）。過剰なβ−グロビンを生じさせ、過剰βグロビンが四量体を形成し、β４（ＨｂＨ）として蓄積される。ＨｂＨは、安定ではなく、熱で変化しやすく、患者は、貧血となり、脾腫がある。
【００１４】
機能的な遺伝子がないと、早期の胎児死亡を引き起こす：過剰のγ−グロビン鎖は、４つのガンマ鎖：γ４（Ｈｂバート）からなる四量体の蓄積の原因となる。α−グロビン鎖なしでは、ＨｂＦまたは成人ヘモグロビン（ＨｂＡ、ＨｂＡ２）が存在し得ず、死産を伴う胎児水腫という結果になる。α０サラセミアのキャリアの母親において妊娠中毒症および分娩後出血のリスクが増加する。
【００１５】
ヘモグロビンコンスタントスプリング変異（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）。サイレントキャリア状態の珍しいケースは、ヘモグロビンコンスタントスプリング変異を持っている個体である。これは、終止コドン突然変異による異常に伸長したα−グロビンである。この突然変異を有する個体は、正常な赤血球指数を示すが、もう一方の親がα−サラセミア形質を有する場合、ＨｂＨ−コンスタントスプリング病を有する子供ができうる。
【００１６】
したがって、特定のグロビンタンパク質／遺伝子の物理化学的特徴および分子遺伝学は、異常ヘモグロビン症の分子検査の基礎となる。
【００１７】
分子量は、αグロビンが１５，１２８であり、βグロビンが１５，８６８である：約７４０ｄａの差。したがって、Ｈｂのホモ四量体コンプレックスおよびそれらのヘム（６０，０００から６８，０００Ｄａ）ならびにαまたはβグロビンの、誘導三量体（約４７，５００Ｄａ）および二量体（３０，０００から３５，０００Ｄａ）は、それぞれ２９６０、２２００および１４８０Ｄａで質量が変化する。これらの質量分解能は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析の範囲内である。通常、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析のプロセスは、このようなヘモグロビンコンプレックスを遊離モノマーに解離させる。ホルマリン処理は、通常、隣接するアミド結合の自由水素とメチル架橋を形成するリジン残基側鎖を介して内部架橋を形成することによってタンパク質を「固定」する。しかし、ホルマリンは、タンパク質が当然互いに非常に接近しており、正しいアミノ酸側基が近くに整列する場合、タンパク質を架橋するであろう。これは、ヘモグロビンの四量体コンプレックスの場合である。したがって、クエン酸緩衝ホルマリン生理食塩水（ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）のような、ホルマリン溶液での全血の前処理は、もはや解離されず、四、三および二量体コンプレックスの特徴的なｍ／ｚとしてＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより決定されるようにＨｂコンプレックスを「固定」するであろう。したがって、特定のサラセミアの質量パターン特性は、その結果、マップ化でき、本明細書で記載するようにサラセミアの診断／スクリーニングツールとして使用できる。
【００１８】
本出願は、患者から得られた血液サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む異常ヘモグロビン症を検出する方法を提供する。 
【００１９】
「直接質量スペクトル解析」とは、質量スペクトル解析から生成されたデータが前記方法で用いられること、およびサンプルに存在する成分の推定質量ではないことを意味する。本明細書において、異常ヘモグロビン症とは、ヘモグロビン分子におけるグロビン分子の一つの異常発現または構造をもたらす遺伝子突然変異により生じたいかなる状態をいう。異常ヘモグロビン症の例は、特に制限されないが、鎌状赤血球性貧血、α−サラセミア、β−サラセミア、ＨｂＡＧ、ＨｂＡ／エンフィールド、ＨｂＨ、ＨｂＡＦ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ−パンジャブ、ＨｂＯ−アラブ、ＨｂＧ−フィラデルフィア、Ｈｂ  コンスタントスプリング、Ｈｂ  ハシャロン、Ｈｂ  コルレ−ブ、Ｈｂ  レポール、ＨｂＭ、およびＨｂ  カンザスを含む。好ましい異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球性貧血、α−サラセミア、β−サラセミア、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＡＧ、ＨｂＡ／エンフィールド、ＨｂＨ、およびＨｂＡＦである。
【００２０】
血液サンプルは、従来の瀉血法を用いて収集された全血サンプルでありうる。例えば、前記サンプルは、静脈穿刺によりまたはフィンガースティックもしくはヒールプリックなどのピンプリックサンプルとして得ることができる。血液サンプルは、ろ紙上またはその他の適切なプラッドスポット捕捉材料に留めた乾燥したブラッドスポットであってもよい。
【００２１】
血液サンプルは、被処理サンプルでありうる。または、血液サンプルは、希釈または処理（濃縮、ろ過など）されてもよい。
【００２２】
血液サンプルは、好ましくは赤血球を溶解する溶解剤、または溶解の前に２４時間までにクエン酸ホルマリン（ｃｉｔｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎ）のような架橋剤のいずれかと最初に混合される。その他の適切な溶解剤は、当業者に知られている。溶解剤は、例えば１／１（すなわち１部の溶解剤に対して１部の血液）、１／５、１／１０もしくは１／２０またはそれ以上の適切な濃度でサンプルと混合することができる。血液サンプルが乾燥したブラッドスポットである場合、サンプルを乾燥したブラッドサンプル捕捉材料は、サンプルを再構成するために溶解剤またはクエン酸ホルマリンのいずれかの中に置くことができる。または、ブラッドスポットは、ホルマリン固定の前に適切なバッファー中で再構成して、その後溶解または直接溶解することができる。適切なバッファーおよびその他のタンパク質架橋剤は、当業者に知られている。好ましい溶解剤は、脱イオン蒸留水である。または、サンプルは、細胞を溶解するために凍結することができる。
【００２３】
好ましい架橋剤は、クエン酸緩衝ホルマリン生理食塩水である。サンプルは、好ましくは１／５の濃度（すなわち、５部のクエン酸ホルマリン生理食塩水に対して１部の血液）でホルマリン含有剤と混合される。サンプルは、赤血球のグロビン分子が固定されるように適切な期間反応させることができる。例えば、混合は、４、５、６、７、８、１０、１２、１６、２０、２４時間以上そのままにすることができる。サンプルは、好ましくは最低６時間そのままにされる。
【００２４】
好ましくは、血液サンプルは、好ましくは溶解後、希釈される。希釈工程は、Ｈｂが最も豊富なタンパク質であるように質量スペクトル解析のために血液の他の成分からＨｂを効果的に精製する。血液サンプルは、１／１０（すなわち、１０部の希釈剤中に１部のサンプル）、１／１６６、１／３３３、１／５００、１／１０００、１／２０００、１／２５００、１／８０００またはそれ以上希釈されてもよい。最も好ましくは、サンプルは、１／２０００希釈され、すなわち２０００部の希釈剤中に１部の血液サンプルである。好ましくは、希釈剤は、０．１％トリフルオロ酢酸を含む脱イオン蒸留水、または脱イオン蒸留水である。
【００２５】
好ましくは、血液サンプルは、固定、溶解および希釈の相互間で処理されない。言い換えると、血液サンプルは、溶解および希釈されるのみ；または固定、溶解および希釈されるのみである。かかる処理は、興味のあるタンパク質、例えばＨｂを濃縮すること；例えばＨＰＬＣによりＨｂを単離することもしくは分子内結合を引き裂くまたは破壊するために化学薬品で処理することを含む。特に、サンプルは、好ましくは還元剤で処理されない。より好ましくは、サンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理されない。
【００２６】
好ましくは、本方法は、サンプルの前記直接質量スペクトル解析によるスペクトルパターンと健常な対照からの血液サンプルの直接質量スペクトル解析から得られた質量スペクトルパターンとを比較して前記サンプルからの前記パターンが異常ヘモグロビン症を示すかどうかを決定することを含むことができる。本明細書中、「健常な対照」とは、異常ヘモグロビン症ではない患者である。
【００２７】
好ましくは、質量スペクトルのパターンにおける違いは、健常な対照からの血液サンプルの質量スペクトルと異常ヘモグロビン症である患者からの血液サンプルの質量スペクトルパターンとを区別できる自動化された定量的な方法により決定される。
【００２８】
本明細書中、「自動化された定量的な方法」とは、サンプルがコンピュータソフトウェアプログラムにより処理された質量分析計からの直接出力データの処理をいう。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳなどの質量スペクトルを生成する方法は、通常、定量的な技術ではない。例えば、これらのスペクトルのＹ軸は、スペクトル内の質量ピークの「相対強度」の指標であるが、一つのサンプルともう一つのサンプルとの質量ピーク間のものではない。これを克服するために、正規化は、Ｙ軸の値をサンプルスペクトル間で比較可能にする必要がある。したがって、直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルは、好ましくは正規化される。スペクトルは、データ処理をされ、質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標（ｎｏｒｍａｌｉｓｅｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｉｎｄｅｘ）となる。これは、定性的な質量スペクトルを定量的な値に変換する。正規化は、データの繰り返しおよび不一致を減少するためのデータ構造を生成する処理である。いくつかの正規化技術が可能である。典型的な正規化方法は、与点での総面積のパーセンテージ、二乗差および差の比を含む。パーセンテージ差は、以下のように計算される。
【００３０】
【数１】
2017525971.tif 000002
【００３１】
この際、Ｙｒｅｆは、スペクトルの最小のＹ値であり、Ｙ１は、各点のＹ値である。
【００３２】
二乗差は、以下のように計算される。
【００３３】
【数２】
2017525971.tif 000003
【００３４】
比の差は、以下のように計算される。
【００３５】
【数３】
2017525971.tif 000004
【００３６】
したがって、質量スペクトルからのデータは、スペクトルに示される定性的変化の定量的尺度を提供するために操作される。
【００３７】
好ましくは、スペクトルモデルは、データ処理の方法により作製され、設定された範囲内での質量スペクトルの相対的割合の正規化された統計的に決定された指標となる。このことは、任意の与えられた質量値での中央値および百分率の変動がモデル化されうるように、全てのスペクトルを比較可能にする。好ましくは、前記範囲は、約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚの間である。
【００３８】
一価の形態のグロビンのために、分析された範囲は、６，０００〜１７０００ｍ／ｚであり、より好ましくは７，５００〜１６，２００ｍ／ｚである。赤血球グロビンの単一荷電および／または二重荷電分子を測定できる。単一荷電イオンのために、１５０００ｍ／ｚから１６２００ｍ／ｚの質量／荷電範囲でのスペクトルを分析する。二重荷電イオンのために、５０００ｍ／ｚ〜８２００ｍ／ｚ、好ましくは６０００から８１００ｍ／ｚ、より好ましくは７５００ｍ／ｚから８２００ｍ／ｚまたは７５５０ｍ／ｚから８１００ｍ／ｚの質量／荷電範囲でのスペクトルを分析する。下記表は、二重荷電イオンに対応する様々なグロビンに対応するピークの位置を示す。
【００３９】
【表１】
2017525971.tif 000005
【００４０】
グロビンの多価の形態のために、分析された範囲は、３０，０００〜７００，０００ｍ／ｚである。
【００４１】
所与の範囲での質量スペクトルの相対的割合の正規化された統計的に決定された指標は、質量スペクトルの曲線下の総面積を用いて計算できる。その結果、これを相対強度を計算するために使用できる。
【００４２】
質量スペクトルの曲線下の面積は、質量スペクトルをｍ／ｚの所与の値の多くの瓶に分割することにより計算される。本明細書中、「瓶」は、通常の統計的意味を有し、例えば統計分析においてデータがソートされた一連の数値範囲の一つである。例えば、瓶は、１００ｍ／ｚ、５０ｍ／ｚ、２５ｍ／ｚ、１０ｍ／ｚまたは５ｍ／ｚのサイズでありうる。使用される瓶のサイズが小さいほど、方法がより洗練される。
【００４３】
相対強度（Ｙ軸値）は、「二乗差（ｓｑｕａｒｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」法により計算することができ、よって比較可能なＹ値が全ての瓶に与えられる。この方法において、スペクトルの最小のＹ値（Ｙｒｅｆ）をすべての瓶でのＹ値から減算して、差を二乗した。二乗差を計算するのに使用される式＝（ｙ１−ｙｒｅｆ）２および計算された二乗差を「相対強度」と名付けた。
【００４４】
サンプルにおける各質量瓶での相対強度は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）、Ｓｔａｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標）およびＯｒｉｇｉｎ  ８（登録商標）などの市販の統計的検定を用いて捕捉できる。
【００４５】
スペクトルがデータ処理の方法を経て質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標になると、存在するグロビンのレベルは、様々なグロビンに対応するピークの相対的な高さを測定することによって決定できる。好ましくは、範囲は約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚの間である。一価の形態のグロビンのために、分析された範囲は、５，０００〜８，２００ｍ／ｚであり、好ましくは６，０００〜１７０００ｍ／ｚであり、より好ましくは７，５００〜１６，２００ｍ／ｚである。二重荷電イオンのために、５，０００〜８，２００ｍ／ｚまたは６０００から８１００ｍ／ｚ、より好ましくは７５５０から８１００ｍ／ｚまたは７，５５０から８，２００ｍ／ｚの質量／荷電範囲でのスペクトルを分析する。
【００４６】
好ましくは、サンプルの直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルは、健常な対照からの血液サンプルのコレクションの統計分析から決定された約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚまたは６，０００〜１００，０００ｍ／ｚの間で期待質量の標準スペクトルモデルと比較される。「標準スペクトルモデル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｍｏｄｅｌ）は、健常な対照からの血液サンプルの回収物の統計分析から決定された設定範囲内での期待質量である。好ましくは、範囲は、約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚの間である。一価の形態のグロビンのために、分析される範囲は、６，０００〜１７０００ｍ／ｚであり、好ましくは７，５００〜１６，２００ｍ／ｚであり、より好ましくは５，０００〜８，２００ｍ／ｚである。二重荷電イオンのために、５，０００〜８，２００ｍ／ｚまたは６０００から８１００ｍ／ｚ、より好ましくは７５５０から８１００ｍ／ｚまたは７，５５０から８，２００ｍ／ｚの質量／荷電範囲でのスペクトルを分析する。好ましくは、約５，０００〜８，２００ｍ／ｚまたは６，０００〜８，１００ｍ／ｚの間での期待質量のスペクトルモデルを健常な対照からの血液サンプルの収集物の統計分析から決定する。
【００４７】
好ましくは、スペクトルモデルは、データ処理の方法により作製され、設定範囲内での質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標となる。このことは、任意の与えられた質量値での中央値および百分率の変動がモデル化されうるように、全てのスペクトルを比較可能にする。好ましくは、前記範囲は、約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚの間である。より好ましくは、前記範囲は、５，０００〜８，２００ｍ／ｚまたは６０００から８１００ｍ／ｚであり、より好ましくは７５５０から８１００ｍ／ｚまたは７，５５０から８，２００ｍ／ｚである。
【００４８】
好ましくは、サンプルの直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルは、異常ヘモグロビン症である患者からの血液サンプル収集物の統計分析から決定された約６，０００〜３００，０００ｍ／ｚの間での期待質量の疾患のモデルと比較される。パラレルの「疾患」モデルは、設定範囲内での質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標から作り出され、異常ヘモグロビン症を有すると分かっている患者から得られた血液サンプルから作製される。好ましくは、前記範囲は、約６，０００〜７００，０００ｍ／ｚの間である。より好ましくは、前記範囲は、５，０００〜８，２００ｍ／ｚまたは６０００から８１００ｍ／ｚであり、より好ましくは７５５０から８１００ｍ／ｚまたは７，５５０から８，２００ｍ／ｚである。
【００４９】
正規化技術の適用後、健常な対照から得られたサンプルおよび異常ヘモグロビン症を患う患者からのサンプルのスペクトル値を比較する。異常ヘモグロビン症の存在は、グロビンタンパク質内での突然変異よって引き起こされた質量のシフトにより、正規化されたスペクトルのピークのパターンにおける変化を引き起こす。
【００５０】
鎌状赤血球症の患者は、７９３４ｍ／ｚのβ−グロビンおよび約７９３３ｍ／ｚのＣβからはっきりと分解された７９２０ｍ／ｚにＳβのピークを有する。したがって、７９２０ｍ／ｚのＳβのピークの存在は、鎌状赤血球症の指標である。
【００５１】
遺伝性高胎児ヘモグロビン症（Ｈｅｒｉｄｉｔａｒｙ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）血液サンプル、ＨｂＡＦを有する患者において、７９３４ｍ／ｚのβ−グロビンの強度は、著しく減少し、Ａγに対応する８００５ｍ／ｚのピークは、著しく上昇した。７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースラインの上昇もまた見ることができる。したがって、Ａγに対応する８００５ｍ／ｚのピークの存在は、ＨｂＡＦの指標である。
【００５２】
ＨｂＡＧにおいて、α６８Ａｓｎ−Ｌｙｓでの突然変異がある。これは、胎児のアルファ−グロビンξおよび新たに発見されたμを示すであろう７６１２および７６４５ｍ／ｚでの追加のピークを生じる。７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇もまたありうる。したがって、７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇を伴ってもよい、７６１２および７６４５ｍ／ｚでのピークの存在は、ＨｂＡＧの指標でありうる。
【００５３】
ＨｂＡ／エンフィールドは、α８９Ｈｉｓ−Ｇｌｕの突然変異である。この状態の患者は、胎児のアルファ−グロビンξおよび新たに発見されたμ−グロビンを示すであろう７６１２および７６４５ｍ／ｚでの追加のピークを有する。７９６３ｍ／ｚでのδおよび７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇もまたありうる。したがって、７９６３ｍ／ｚでのδおよび７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇を伴ってもよい、７６１２および７６４５ｍ／ｚでのピークの存在は、ＨｂＡ／エンフィールドの指標でありうる。
【００５４】
特に、健常な対照から得られたサンプルの正規化されたスペクトル値と異常ヘモグロビン症を患う患者からのスペクトル値との比率を比較することができ、様々な測定、例えば平均、標準偏差、歪度、上位および下位の四分位数、中央値、尖度、ならびに９５および５パーセンタイル値を算出できるように、統計分析を行うことができる。
【００５５】
健常な対照から得られたサンプルと異常ヘモグロビン症を患う患者からのサンプルとの間の各質量瓶での相対強度の差は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）、Ｓｔａｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標）およびＯｒｉｇｉｎ  ８（登録商標）などの市販の統計的検定を用いて捕捉できる。
【００５６】
参照スペクトルモデルおよび疾患モデルは、その後「ホットスポット」、すなわち２つのモデルの相違点を確認するためにプロットすることにより比較される。これは、ピークのサイズにおける減少もしくは増加、またはピークの出現でありうる。そして相違点は、異常ヘモグロビン症の存在を決定するために用いることができる。好ましくは、これは、適切なアルゴリズムを用いて行われる。
【００５７】
質量スペクトルの解析は、適切なコンピュータプログラムソフトウェアを用いて簡単に算出できる。コンピュータはまた、異常ヘモグロビン症の存在の指標を提供するために、適切なアルゴリズムでプログラムすることができる。
【００５８】
好ましくは、実行される質量スペクトル解析は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）である。
【００５９】
架橋剤が使用される場合、二量体と比較して、存在する四量体、五量体および三量体の相対的割合量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）は、異常ヘモグロビン症の存在を診断するために利用することができる。存在する四量体の二つの形態−グロビンタンパク質のみを含むＳ−四量体およびグロビンとヘムとを含むＬ−四量体がある。固定された二量体と比較して固定されたＳ−四量体の平均相対量が≧１０、好ましくは≧１５および／または固定された二量体と比較して固定されたＬ−四量体の平均相対量が≧６、好ましくは≧１０であることは、異常ヘモグロビン症の存在の指標である。この結果が得られた時点で、患者は、存在する特定の異常ヘモグロビン症を特定するためにさらなる調査を受けることができる。
【００６０】
また、
ａ）患者から血液サンプルを得ること
ｂ）前記サンプルの希釈および溶解；または固定、希釈および溶解
ｃ）前記サンプルを直接質量スペクトル解析にかけること
ｄ）患者からの前記サンプルからのパターンが異常ヘモグロビン症の指標であるかどうかを決定するために前記分析によるパターンを分析すること
を含む、異常ヘモグロビン症を検出する方法を示す。
【００６１】
好ましくは、分析によるスペクトルパターンは、健常な対照からの血液サンプルから得られた質量スペクトルパターンと比較される。
【００６２】
本明細書中、動詞「含む」は、通常の辞書の意味であり、非排他的な包含を意味する。すなわち、１以上の特徴を含むための「含む」（または派生語のいずれか）の使用は、さらなる特徴をも含むことの可能性を排除しない。「望ましい」（または派生語のいずれか）は、好ましいが必須ではない１つ以上の特徴を示す。
【００６３】
本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された特徴のすべてまたは特徴のいずれか、および／または開示されたあらゆる方法またはプロセスの工程のすべてまたはいずれかは、少なくとも特徴および／または工程のいくつかが互いに排反する組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
【００６４】
本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された各特徴は、特に明記しない限り、同じ、同等または同様の目的を果たす別の特徴により、置換することができる。したがって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、同等または同様の特徴の一般的な系の単なる一例である。
【００６５】
本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された特徴からなる、いかなる新規の発明、またはいかなる新規の組み合わせ、またはそのように開示されたいかなる方法またはプロセスからなる、いかなる新規の発明、またはいかなる新規の組み合わせにまで及ぶ。
【００６６】
本願は、以下の図面を参照する下記実施例で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ヒトにみられる機能的に発現したベータおよびアルファ−グロビン遺伝子（遺伝子クラスター内での公知の偽遺伝子を省略した）簡略化された図表示を示す。
【図２】図２は、ＨｂＡ全血のスペクトルを示す。
【図３】図３は、ＨｂＡＳのスペクトルを示す。
【図４】図４は、ＨｂＡＣのスペクトルを示す。
【図５】図５は、ＨｂＡＣのスペクトルを示す。
【図６】図６は、ＨｂＡＥのスペクトルを示す。
【図７】図７は、ＨｂＦのスペクトルを示す。
【図８】図８は、ＨｂＨのスペクトルを示す。
【図９】図９は、ＨｂＡＧのスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、ＨｂＡ／ケニヤのスペクトルを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、表現型正常サンプルでのスペクトルの表形式の比較を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、表現型異常サンプルでのスペクトルの表形式の比較を示す。
【図１２】図１２は、ホルマリン固定精製ＨｂＡおよびホルマリン固定全血ＨｂＡの３０，０００から７００，０００ｍ／ｚの間での質量スペクトルパターンを示す。
【図１３】図１３は、ホルマリン固定鎌状赤血球病（ＳＳＤ）血液サンプルのスペクトルを示す。
【図１４】図１４は、表現型正常および異常サンプルでのホルマリン固定スペクトルの表形式の比較を示す。
【実施例】
【００６８】
実施例１
方法
サンプル処理
全血の最適希釈は、ｄｄＨ２Ｏ（１：１  ｖ／ｖ）でのサンプルの最初の溶解後、ｄｄＨ２Ｏまたは０．１％ＴＦＡｄｄＨ２Ｏのいずれかにおける１／１０００および１／２０００の間である。この希釈工程は、Ｈｂが最も豊富なタンパク質であるように、質量スペクトル解析のために血液の他の成分からＨｂを効果的に精製する。また、ｄｄＨ２Ｏ（または０．１％ＴＦＡ／ｄｄＨ２Ｏ）での希釈は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析による分離分析のために構成グロビンタンパク質を解離する。１／８０００よりも高い希釈では、質量スペクトルシグナルが次第に弱くなる。
【００６９】
ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ質量スペクトル解析
最適なマトリックスは、シナピン酸（ＳＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）およびアルファ４−シアノヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）である。好ましいマトリックスである、シナピン酸は、１／１０００から１／８０００希釈サンプル（最適１／２０００）の混合液滴へのプレコーティング層として混合または使用される。鋼ＭＡＬＤＩプレート（３８４ウェル）は、０．５μｌのマトリックス溶液（５０／５０  ｖ／ｖ  アセトニトリル（ＡＣＮ）／ｄｄＨ２Ｏおよび０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解したシナピン酸−２０ｍｇ／ｍｌ）をピペッティングすることにより調製し、乾燥させた。０．５μｌのサンプルをＳＡと混合し、乾燥マトリックス上にスポットした。これをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析の前に室温で１時間乾燥させた。
【００７０】
質量スペクトル解析は、島津Ａｘｉｍａ  ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行われた；パルス窒素レーザー（λｍａｘ＝３３７ｎｍ）を７５から８０％の任意の単位パワーで発射した。イオンは、１．２ｍ線形管の下の２０ｋＶの電場により加速され、５００ＭＨｚのサンプリングレートでマイクロチャンネルプレート検出器により検出された。スペクトルは２０〜３０回のレーザーショットを積算することにより生成された。ディレイドエクストラクションでの正の線形モードは、スペクトルを得るために使用された。
【００７１】
装置は、内部でキャリブレーションされ、それにより１／１０００希釈の血液サンプルを１０ｐモル／μｌシトクロムＣ（１：２、ｖ／ｖ）でスパイクした。生成された２つのポイントのキャリブレーションは、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２３６１ｍ／ｚおよび［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝６１８１ｍ／ｚであった。
【００７２】
６，０００から１７，０００ｍ／ｚの間の質量スペクトル領域を収集して分析し、特に６０００から８１００ｍ／ｚまたは６０００から８２００ｍ／ｚの範囲を二重荷電グロビンタンパク質のために分析した。
【００７３】
分析されたスペクトルレンジにおいて、比較の正規化ピーク高さまたは正規化ピーク面積のいずれかとして、重心質量割当（ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｍａｓｓ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）および相対ピーク強度の両方に関して特徴づけられる。
【００７４】
結果
グロビンの同定
最良の分解能は、［Ｍ＝２Ｈ］２＋イオンに対応する６０００〜８２００ｍ／ｚの範囲で得られた。
【００７５】
【表２】
2017525971.tif 000006
【００７６】
病理学的サンプルスペクトルパターン
異常ヘモグロビン症が存在するすべてのサンプルにおける一般的な知見として、突然変異のまたは胎児のグロビン遺伝子のいずれかに対応するピークが見られる。これは、発症していない血液サンプルの場合にはなかった。
【００７７】
通常の成人Ｈｂサンプルは、ＨｂＡ２およびＨｂＦ（δ、ＧγおよびＡγ）で見られる他のグロビンとα−グロビンおよびβグロビンとのピークがほとんど検出されなかったことを明らかにする（図２）。
【００７８】
ＨｂＳ−鎌状赤血球病（図３および４）
鎌状赤血球形質（ＨｂＡＳ）を有する患者からの血液サンプルは、通常およびＳＡ付加α−グロビンのピークならびに７９３４ｍ／ｚでのβ−グロビンおよび約７９３３ｍ／ｚでのＣβから明確に分解された７９２０ｍ／ｚでのＳβのピークを明らかにした。７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースライン上昇は、８０２３ｍ／ｚでの新たなピークと同様に、明らかであった。
【００７９】
ＨｂＡＣ（図５）
ＨｂＣ形質を有する患者からのからの血液サンプルは、通常およびＳＡ付加α−グロビンピークを示した。７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースライン上昇は、明らかであったが、７９３４ｍ／ｚでのβ−グロビンは、約７９３３ｍ／ｚでのＣβから分解されなかった。
【００８０】
ＨｂＡＥ（図６）
ＨｂＥ形質を有する患者からのからの血液サンプルは、単独の通常およびＳＡ付加α−グロビンピークを示した。７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースライン上昇は、明らかであったが、７９３４ｍ／ｚでのβ−グロビンは、約７９３３ｍ／ｚでのβＥから分解されなかった。
【００８１】
ＨｂＡＦ（図７）
遺伝性高胎児ヘモグロビン症血液サンプル、ＨｂＡＦは、単独の通常およびＳＡ付加α−グロビンピークを示した。７９３４ｍ／ｚでのβ−グロビンの強度は、著しく減少し、８００５ｍ／ｚでのＡγは、著しく上昇した。７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースライン上昇も見られた。
【００８２】
ＨｂＨ病（α−／−−）α−サラセミア（図８）
ＨｂＨからの血液サンプルは、ピークが７５６４および７６６７ｍ／ｚでの単独の通常およびＳＡ付加グロビンピークを示したことを明らかにした。β−グロビンは、７９３４ｍ／ｚで明らかであり、７９６５および７９９６ｍ／ｚでのδおよびＧγグロビンのベースライン上昇は、明らかであった。
【００８３】
発現したα−およびβグロビン突然変異（図９および１０）
ＨｂＡＧは、α６８Ａｓｎ−Ｌｙｓでのαグロビンにおける突然変異により引き起こされる。α−グロビンは、７５６４ｍ／ｚ、ＳＡ付加αは、７６６７ｍ／ｚで見られるが、７６１２（不明）および７６４５ｍ／ｚ（糖化されたα−グロビン）での追加のピークが見られた。７９３３ｍ／ｚでのβグロビンは、７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇を伴った。ＨｂＡ／ケニヤ表現型は、同様に示されたＧγおよびβの融合である。αグロビンは、７５６４ｍ／ｚであり、ＳＡ付加αは、７６６７ｍ／ｚであるが、７９６３ｍ／ｚでのδのピークと一致する、７９６１ｍ／ｚでの追加のピークが、おそらく融合βグロビンを示す。７９３３ｍ／ｚでのβグロビンは、７９９３ｍ／ｚでのＧγの上昇を伴った。
【００８４】
表現型の正常および異常サンプルの比較（図１１）
さらに９つの表現型の通常な血液サンプルと９つの表現型の異常な血液サンプル（ホモ接合体ＨＢＳ鎌状赤血球症、ヘテロ接合体ＨＢＳＣ鎌状赤血球症、２つの表現型のアルファサラセミア形質、ベータ−サラセミアおよびベータ−サラセミア形質、ならびにＨｂＥ病）とが分析された。
【００８５】
全てのヘモグロビン異常症およびキャリアの特徴は、発症していない個体と比較して、δ−グロビン、γ−（ＧおよびＡ）グロビンならびにマーカー８０８８ｍ／ｚ（ε−グロビンと思われる）の上昇した割合である。加えて、β−グロビンのα−グロビンに対する比は、発症していないものである表現型通常血液サンプル（表３参照）と比較して発症およびキャリアにおいてより低い。これは、実証したように、δおよび胎児グロビンをさらに発現するためにベータ−グロビン遺伝子クラスターから生じる転写における変化をおそらく反映している。
【００８６】
典型的なｓβｓβホモ接合体は、一般的なベータ−グロビンピークにおける７９２１ｍ／ｚへの質量シフトにより検出でき、一方ｓβｃβ鎌状赤血球症は、７９２１ｍ／ｚピークの顕著な低下を示すが、鎌状キャリアと同じくβ（ｃβ）グロビンの７９３６ｍ／ｚでの一般的なピークを示す。しかし、ｓβｃβ鎌状赤血球症は、上昇したδおよびγ−グロビンならびにマーカー質量（すなわち、ε−グロビンと思われる８０８８ｍ／ｚ）を有する。
【００８７】
表現型ベータ−サラセミアおよびベータ−サラセミア形質両方のサンプルは、８０８８ｍ／ｚ（ε−グロビンと思われる）での上昇した異常なピーク、わずかに上昇したδ−グロビンおよび減少したβ／αグロビン比率により特徴づけられた。このパターンは、ＨｂＥ病と類似していたが、δ−グロビンのより著しい上昇が見られた。
【００８８】
アルファサラセミア形質の表現型サンプルの両方は、８０８８ｍ／ｚ（ε−グロビンと思われる）での上昇した異常なピーク、上昇したδ及びγグロビンを明らかにした。
【００８９】
実施例２−ホルマリン固定サンプル
方法
サンプル処理
全血サンプルを１部から５部、クエン酸緩衝ホルマリン生理食塩水で最低６時間混合する。その後これをｄｄＨ２Ｏまたは０．１％ＴＦＡｄｄＨ２Ｏのいずれかに１／１６６および１／３３３の間で希釈する。この希釈工程は、Ｈｂが最も豊富なタンパク質であるように質量スペクトル解析のために血液の他の成分からＨｂを効果的に精製する。
【００９０】
１／８０００よりも高い希釈では、質量スペクトルシグナルが次第に弱くなる。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ質量スペクトル解析
最適なマトリックスは、シナピン酸（ＳＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）およびアルファ４−シアノヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）である。好ましいマトリックスである、シナピン酸は、１／１０００から１／８０００希釈サンプル（最適１／２０００）の混合液滴へのプレコーティング層として混合または使用される。鋼ＭＡＬＤＩプレート（３８４ウェル）は、０．５μｌのマトリックス溶液（５０／５０  ｖ／ｖ  アセトニトリル（ＡＣＮ）／ｄｄＨ２Ｏおよび０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解したシナピン酸−２０ｍｇ／ｍｌ）をピペッティングすることにより調製し、乾燥させた。０．５μｌのサンプルをＳＡと混合し、乾燥マトリックス上にスポットした。これをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析の前に室温で１時間乾燥させた。質量スペクトル解析は、島津Ａｘｉｍａ  ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行われた；パルス窒素レーザー（λｍａｘ＝３３７ｎｍ）を７５から８０％の任意の単位パワーで発射した。イオンは、１．２ｍ線形管の下の２０ｋＶの電場により加速され、５００ＭＨｚのサンプリングレートでマイクロチャンネルプレート検出器により検出された。スペクトルは２０〜３０回のレーザーショットを積算することにより生成された。ディレイドエクストラクションでの正の線形モードは、スペクトルを得るために使用された。
【００９２】
３０，０００から７０，０００ｍ／ｚの間の質量スペクトル領域を収集して分析した。
【００９３】
分析されたスペクトルレンジにおいて、比較の正規化ピーク高さまたは正規化ピーク面積のいずれかとして、重心質量割当（ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｍａｓｓ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）および相対ピーク強度の両方に関して特徴づけられる。
【００９４】
サンプルスペクトルパターン
一般的な成果として、分離された単量体のグロビン、二量体、三量体および四量体ならびに五量体などの複合体に対応するピークがある。個々のピークまたは合成の二量体、三量体、四量体およびより大きい複合体に対応する幅広いピークの質量分布は、様々なグロビンペア（ｇｌｏｂｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ）の相対質量代表物、すなわち二量体、αβ、αα、ββ、αδ、αＡγ、αＧγなどに対応する。同様に、幅広いピークでの大きな複合体質量分布は、個々のグロビンの三量体、四量体、五量体およびその他の複合体の組み合わせの相対組成を表す。
【００９５】
ホルマリン固定ＨｂＡおよび全血サンプル（図１２）
通常の精製成人ＨｂＡサンプルは、検出されていないＨｂＡ２およびＨｂＦ（δ、ＧγおよびＡγ）で見られる他のグロビンと共にα−グロビンおよびβ−グロビンのピークを明らかにする。グロビンの特定のオリゴマーペアを検出した。α−βグロビンに対応する二量体、中央の最大値３１３９６ｍ／ｚ；三量体、ααβおよびαββに対応する４７３０８ｍ／ｚの中央の最大値；四量体、αβββに対応する中央の最大値６２８５８ｍ／ｚ；ならびにαααααに対応する７７７３２ｍ／ｚでの中心を外れた質量最大値を含む五量体の複合体。
【００９６】
ホルマリンで固定後溶解された全血は、単量体のグロビン（１５０００から１７０００ｍ／ｚ）、Ｈｂ二量体（３１０００〜３３０００ｍ／ｚ）、Ｈｂ三量体（４５，０００〜４５８００ｍ／ｚ）、Ｈｂ四量体（６１０００〜６４０００ｍ／ｚ）および五量体プラス４つのヘム人工ユニット（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｕｎｉｔｓ）（６６，０００〜６８０００ｍ／ｚ）を同様に明らかにした。
【００９７】
表現型通常および異常サンプルの比較（図１３および１４）
さらに９つの表現型通常血液サンプルおよび９つの表現型異常血液サンプル（ホモ接合体ＨＢＳ鎌状赤血球症、ヘテロ接合体ＨＢＳＣ鎌状赤血球症、２つの表現型αサラセミア形質、β−サラセミアおよびβ−サラセミア形質ならびにＨｂＥ病）を分析した。
【００９８】
全ての異常ヘモグロビン症の特徴は、ホルマリン固定二量体グロビンから四量体／オリゴマーの相対強度比における変化したプロファイルである（図１３）。これが鎌状赤血球症で最も劇的である（図１４参照）が、発症していないものと比べて四量体／オリゴマーの割合が二倍である形質を含むベータ−およびアルファ−サラセミアでも見られる。
【００９９】
考察
異常ヘモグロビン症の同定における臨床検査室が直面する主要な問題は、結果が多くの場合決定的であるよりむしろ推定的であり、そのためある試験からの陽性結果を別の試験で確認または区別のいずれかをする必要がある。集団を完全にスクリーニングするまたは特定の診断を確認するために、鎌状化試験、血液塗抹標本の顕微鏡検査、Ｈｂ電気泳動、キャピラリー電気泳動および高速液体クロマトグラフィーからのいくつかの方法の寄せ集めを使用する。これは、サンプル量、所要時間およびリソースにおいて、すべてで非常にコストがかかる。特にナショナルスクリーニングポリシーを導入する場合、より迅速で費用効果の高い試験が必要である。
【０１００】
結論
ピンプリックおよび血液スポットは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析によって鎌状赤血球およびその他の潜在的な異常ヘモグロビン症を迅速にスクリーニングすることができる。サンプルを溶解し、水中で１０００倍以上希釈する。構成グロビンの二重荷電イオンは、Ｓβの特徴的なｍ／ｚを明らかにするためにＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより十分かつ再現性良く分解される。さらに、その他の異常ヘモグロビン症は、胎児グロビンからの上昇したｍ／ｚシグナルの検出により特徴づけられる。これらの胎児グロビンは、欠陥があるαおよびβグロビン遺伝子発現を補おうとするためにストレス状態で発現されるであろうし、異常ヘモグロビン症のバイオマーカーとして作用できる。しかし、ホルマリンまたはその他の架橋剤により固定化され、その後溶解された場合、グロビンの構成四量体、二量体ペアおよびその他のオリゴマーグループ（例えば、三量体および五量体）は、明らかにされ、αおよびβサラセミアの特徴である過剰および異常なαまたはβグロビンオリゴマーペアを示すことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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2017525971.tif 000023
2017525971.tif 000024