(57)【要約】  本発明は、実行可能な次世代シークエンシング法に対するサンプルからの核酸の抽出、PCRの調製、及びDNAライブラリのPCR後の作製工程を可能とする、改善された半自動化方法に関する。該方法及びかかる方法に関連する追加の態様は、自動化されていない類似の方法よりも、手間がかからず、安全性コストが安く、試薬が少なく、また汚染を生じにくい。【選択図】図1
2017521356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAライブラリを作製する方法であって、該方法が、
a）サンプルから核酸を抽出する工程と、
b）UDGと、DNAポリメラーゼ若しくはDNAポリメラーゼ及び逆転写酵素と、dUTPとを含む混合物に対して抽出した核酸を曝露する工程と、
c）前記混合物をインキュベートして、先の増幅反応に由来するキャリーオーバー増幅産物から前記混合物を除染する工程と、
d）dUTPの存在下で増幅反応を行う工程と、
を含み、除染反応若しくは除染反応と逆転写、及びDNAポリメラーゼによる増幅反応が同じ反応混合物において行われる、方法。
【請求項２】
前記DNAポリメラーゼがテルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ又はその機能性誘導体であり、前記Taqポリメラーゼの機能性誘導体がTaqポリメラーゼのDNA重合活性の少なくとも80 %、若しくは少なくとも90 %、若しくは少なくとも100 %を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抽出された核酸が工程b）に先立って断片化される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記DNAライブラリをその後次世代シークエンシング反応に使用する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
UDGと、DNAポリメラーゼ若しくはDNAポリメラーゼと逆転写酵素、とを含む酵素ミックスを含む、試薬組成物。
【請求項６】
dUTPを更に含む、請求項5に記載の試薬組成物。
【請求項７】
Taq DNAポリメラーゼ又はその機能性誘導体を含む、試薬組成物。
【請求項８】
逆転写及び／又はPCR用の試薬を含む、試薬組成物。
【請求項９】
核酸鋳型の増幅に対する反応混合物を除染する方法であって、該核酸鋳型と、DNAポリメラーゼと、UDG酵素若しくはUDG酵素及び逆転写酵素と、dUTPと、DNA重合若しくはDNA重合及び逆転写用の試薬とを含む、方法。
【請求項１０】
前記UDG酵素が、先の増幅反応に由来するキャリーオーバー増幅産物から前記混合物を除染するのに十分な期間の後不活性化される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記DNAポリメラーゼがテルムス・アクウァーティクス（Taq）DNAポリメラーゼ又はその機能性誘導体である、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項１２】
抽出された核酸が工程b）に先立って断片化される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
DNAライブラリをその後次世代シークエンシング反応に使用する、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
DNAライブラリを作製する方法であって、
a）サンプルから核酸を抽出する工程と、
b）DNAポリメラーゼ若しくはDNAポリメラーゼと逆転写酵素と、を含む混合物に抽出した核酸を曝露する工程と、
c）dUTPの存在下で増幅反応を行う工程と、
d）（i）アルカリ金属塩と溶媒とを含むバッファー組成物を、増幅産物を含む増幅混合物に添加する工程と、
（ii）担体粒子を、増幅産物を含む増幅混合物に添加する工程と、
（iii）DNAが担体粒子に結合するのに十分な時間に亘って前記混合物をインキュベートする工程と、
（iv）前記混合物をエタノールで洗浄する工程と、
（v）前記担体粒子から標準化したPCR産物を溶離する工程と、
を含む、得られた増幅産物を標準化する工程と、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記アルカリ金属塩がNaClである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒がポリエチレングリコールである、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルカリ金属塩が、約2.0 M〜約5.0 MのNaCl、若しくは約2.5 MのNaClの量で添加される、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒がPEG 8000である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列分析の分野に関する。特に、本発明は、次世代シークエンシング（NGS）に関する方法及び手段に関する。DNAシークエンシングは、癌の発症に関与する種々の遺伝子を含む、幾つかのヒト疾患を解読するための強力なアプローチである。
【背景技術】
【０００２】
次世代シークエンシング（NGS）技術の到来は、シークエンシングの費用を数桁分削減し、スループットを著しく増加することによって、全ゲノムシークエンスを、臨床行動がとられ得る患者に関する包括的なゲノム情報を得ることができる方法とした。DNAシークエンシングは、個々の遺伝子、より大きな遺伝領域（すなわち、遺伝子又はオペロンのクラスタ）、全染色体又は全ゲノムの配列を決定するため使用され得る。使用される方法に応じて、シークエンシングは、DNA中の又は動物、植物、細菌の細胞等、若しくは実質的に遺伝情報の任意の他の供給源から単離されたヌクレオチドの順番を提供し得る。得られた配列は、分子生物学又は遺伝学の研究者によって更なる科学の進歩に使用されてもよく、又は治療を決定するため若しくは遺伝子カウンセリングにおける補助のため医療関係者によって使用されてもよい。後の二つの用途は、個別化医療又はコンパニオン診断用途との関連でしばしば言及される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
NGS技術によって提案される利益に関わらず、NGS技術が研究手段から日常の診療に変換され得る前に、幾つかの課題に適切に対処しなければならない。診断目的のNGS技術は、できるだけ手作業の工程を少なくし、所与の時点で分析に供される臨床サンプル以外の他の供給源に起因する核酸材料による汚染を予防するための適切な機構を含まなくてはならず、また、その方法は迅速でなくてはならず、臨床検査室で働くスタッフによって容易に行われなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
物理化学の機構を含む種々のNGS技法が開発され、各核酸配列の分析に使用される他とは全く別の方法をもたらした。これらの技法は、一般的には当該技術分野で知られている。最も広く適用される技法は、イオン半導体（Ion Torrent）シークエンシング、パイロシークエンシング、及び合成によるシークエンシング（Illumina）である。
【０００５】
定義
本発明の方法を広く説明したが、この方法の各態様をより詳細に説明する。
【０００６】
本明細書で使用される、シークエンシングされる核酸は、標的核酸（又は標的）と呼ばれる。標的核酸として、限定されないが、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、cDNA等のDNAと、限定されないが、mRNA、miRNA等のRNAとが挙げられるが、これらに限定されない。標的核酸は、天然供給源又は合成供給源を含む任意の供給源に由来してもよい。核酸は、PCR産物、コスミド、プラスミド、天然若しくは合成のライブラリの成員又は種等であってもよい。本発明は、これについて限定を意図しない。核酸は、限定されないが、ヒト等の哺乳動物、並びに細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、及びマイコバクテリア等の微生物を含む動物又は病原体供給源に由来してもよい。幾つかの実施形態では、核酸はウイルス核酸ではない。標的核酸は、限定されないが、血液、唾液、脳脊髄液（「CSF」）、皮膚、毛髪、尿、糞便、及び粘液を含む任意の体液又は組織から得られてもよい。また、標的核酸は、限定されないが、環境サンプル（水サンプル等）、食品サンプル、又は法医学サンプルに由来してもよく、該サンプルは新鮮サンプル（例えば、核酸抽出に直接供される生検材料）又は保存を可能とするため処理されたサンプル、例えばホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋されたサンプル（FFPEサンプル）であってもよい。
【０００７】
標的核酸は、当該技術分野で既知の任意の方式を使用して作製される。例として、ゲノムDNAを当該技術分野で既知の技法に従ってサンプルから採取してもよい（例えば、Sambrook et al. "Maniatis"を参照されたい）。採取に続いて、DNAを断片化して、より短い長さの核酸を得てもよい。得られたフラグメントは、数百、数千、又は数万のヌクレオチド長の規模であってもよい。幾つかの実施形態では、上記フラグメントは、50〜1000のヌクレオチド長、100〜1000のヌクレオチド長、200〜1000の塩基対長、又は300〜800の塩基対長であるが、それらに限定されない。核酸は、限定されないが、機械的、酵素的、又は化学的な手段を含む任意の手段によって断片化され得る。例として、剪断、超音波処理、噴霧、及びエンドヌクレアーゼ（例えば、DNase I）消化、又は好ましくは所望の長さの核酸フラグメントを産生する当該技術分野で既知の任意の他の技法が挙げられる。断片化の後、特定の長さのフラグメントを濃縮又は単離するためサイズ選択技法を使用することができる。かかる技法もまた当該技術分野で既知であり、限定されないが、ゲル電気泳動又はSPRIが挙げられる。
【０００８】
代替的には、既に所望の長さの標的核酸を使用してもよい。かかる標的核酸は、エクソン濃縮プロセスに由来するものを含む。シークエンシングに先立つエクソン等の配列の単離及び／又は濃縮の方法について、Albert et al. Nat Meth4(ll):903-905 (2007)、Porreca et al. Nat Meth 4(11):931-936 (2007)、Okouet al. Nat Meth 4(11):907-909 (2007)を参照されたい。したがって、（無作為に又は非無作為に）より長い標的核酸を断片化するのではなく、該標的は、天然に存在する核酸であってもよく、又はmRNA、cDNA、エクソン、（上述の）PCR産物等のより短い有用な長さで単離されてもよい。
【０００９】
概して、標的核酸を配列の5'末端及び3'末端の配列の一方又は両方にライゲートする。これらのアダプター配列は、本発明のシークエンシング法に使用されるシークエンシングプライマー部位（すなわち、シークエンシングプライマーがハイブリダイズする部位）を含む。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、下記で論考するように増幅に供される標的は同じ又は同様の長さを有する（例えば標的間で5 %〜10 %の変動）。幾つかの実施の形態では、全ての鋳型が一様に適用されることを確実にするために、かかる変動を可能な限り小さく維持してもよい。
【００１１】
増幅された産物は支持体表面（例えばガラス表面）に様々な方法で固定化することができる。例えば、増幅プロセスは溶液中で行うことができ、最終産物を続いて支持体表面に付着させる。増幅産物の5'末端又は3'末端を固体支持体に付着させることができる。付着は支持体表面に固定化された核酸へのハイブリダイゼーションによるものであっても、又は増幅産物の末端の部分と支持体表面上の部分との相互作用によるものであってもよい。例としては、ストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジンでコーティングした支持体表面、DIG（ジゴキシゲニン）及び抗DIG抗体若しくは抗体フラグメント、フルオレセイン及び抗フルオレセイン抗体若しくは抗体フラグメント（Gore etal. Nature 442, 836-9 (2006)）とのビオチン若しくは二重ビオチン標識DNA（Margulieset al. Nature 437:376(2005)）の使用、又は例えばアミン官能化ガラスに結合させることができ、ストレプトアビジンサンドイッチ（すなわち、核酸ビオチンストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジン−ビオチン固体支持体の相互作用）によるビオチン標識DNAの固定化に使用されるビオチン化プロピオン酸スクシンイミジル−PEG等のヘテロ官能性架橋剤の使用が挙げられる。
【００１２】
鋳型は表面上に無作為に固定化されることが言及され得る。これは、鋳型が配列に基づいて固体支持体表面上に置かれるわけではないことを意味する。しかしながら、各々の鋳型が、ポリメラーゼ媒介組込み反応及び／又は鋳型の伸長中に別の鋳型によって占有されない領域（ひいては容量）に取り囲まれることを確実にするように鋳型が固体支持体上に置かれる。すなわち場合によっては、鋳型は鋳型間の任意の相互作用を防ぐために互いに十分に離れて表面上に位置する。
【００１３】
固体支持体は鋳型を結合又は固定化する要素を指し、ガラス又は他のシリカ系材料、プラスチック又は他のポリマー系材料を含むが、これらに限定されない任意の材料から構成され得る。しかしながら、これらの材料は鋳型、プライマー、ポリメラーゼ、dNTP、並びにシークエンシング反応及び洗浄に使用される他の成分に対して比較的不活性であるものとする。固体支持体は剛性であっても又は剛性でなくてもよい。固体支持体は多孔質であってもよい。固体支持体は連続性であっても又は連続性でなくてもよい。幾つかの実施の形態では、固体支持体はスライドガラスである。幾つかの実施の形態では、支持体はそれ自体が固体支持体上に固定化される複数のビーズ又は粒子（微小粒子等）である。かかるビーズは多孔質であってもよい。支持体はメッシュであってもよい。幾つかの実施の形態では、固体支持体自体が接触撮像装置（contact imager）等（これに限定されない）の検出器又はセンサーである。
【００１４】
複数の鋳型の各々の成員が鋳型間で重複が起こらないように十分に他の成員との間隔を空けている限りにおいて、同一であるか異なるかにかかわらず複数の鋳型が固体支持体に係留され得ることが理解される。
【００１５】
通例、鋳型は観察可能な（又は検出可能な）部分の自由端に付着させる必要がある。この部分は鋳型の自由端、ひいてはその位置を表し、その力の方向の運動が鋳型の長さを示すことが意図される。観察可能な部分は任意の数の部分であってもよく、本発明はその性質によって限定されない。観察可能な部分の性質により、鋳型の長さの変化を観察する（又は検出若しくはモニタリングする）のに好適なタイプのセンサー又は検出器が決まる。幾つかの重要な実施の形態では、観察可能な部分はマイクロビーズ、更にはより具体的に磁性ビーズ等のビーズである。
【００１６】
上記部分は様々な方法によって、またビオチン／ストレプトアビジン、DIG／抗DIG及び蛍光／抗蛍光結合対等の非共有相互作用、並びに支持体表面への鋳型（又はプライマー）の共有固定化に関して本明細書で論考されるような共有相互作用を含むが、これらに限定されない様々な相互作用を用いて鋳型に付着させることができる。
【００１７】
固体支持体はフローセルの一部であるか又はフローセルに近接する。本明細書で使用される場合、フローセルは少なくとも流体が通過する入口及び出口を有するチャンバである。鋳型が係留される固体支持体は、鋳型の観察に使用される検出システムの位置に応じてフローセルの下、上又は隣に存在し得る。固体支持体は底壁、側壁又は上壁を含むフローセルの壁面であってもよい。
【００１８】
当然のことながら、鋳型の正確かつ迅速なシークエンシングは、非組み込みヌクレオチドがシステムから除去される程度及び速度に左右される。このため、非組み込みヌクレオチドの迅速かつ完全な（又はほぼ完全な）除去が重要である。マイクロ流体システムを、洗浄能（washingpotentially）を最大化し、より小さな洗浄容量及び洗浄期間が得られるように設計する必要もある。
【００１９】
非組み込みヌクレオチドのクリアランス（Clearance：除去率）は、非組み込みdNTPを分解し、それらを更なる組込みに適さないものに変えるアピラーゼの使用によって部分的又は全体的に促すことができる。アピラーゼは自由流動性であり、洗浄バッファーに添加され、任意の所与のヌクレオチド三リン酸タイプの組込みが停止した後（鋳型の末端の検出可能な部分による任意のバックグラウンド上の（above-background）運動の停止によって示される）、フローセルへと導入され得る。代替的又は付加的には、アピラーゼはフローセル内の例えば（鋳型が同様に固定又は固定化される）固体支持体表面等に固定又は固定化してもよい。これは、酵素をよりアクセス可能とし、表面に極めて接近していることに伴う任意の立体障害を除去するためにリンカーの使用によって行うことができる。アピラーゼは、長さの異なる様々なリンカーに付着させることができる。このようにして、アピラーゼは壁面により近いフロー流、及び中央により近いフロー流又は中央のフロー流を含むフローセル内の様々なフロー流中に存在し得る。上記で論考されるように、これは低速で移動する壁面に近いフロー流であり、これらのフロー流中に存在する非組み込みdNTPは取り除かれる可能性が低い。アピラーゼがこれらのフロー流に含まれることで、これらのdNTPの除去が改善される。これにより、鋳型の長さの変化が洗浄後にフローセルに留まる残留非組み込みdNTPではなく、フローセルに新たに導入されたdNTPの組込みの結果である可能性が増大する。
【００２０】
本発明の幾つかの態様では、シークエンシング法は合成によるシークエンシング（sequencing-by-synthesis）反応と称される。これは、第1の核酸の配列の決定に第1の核酸を鋳型として使用した第2の核酸の合成が必要とされることを意味する。このようにして、組み込まれるdNTPの順序及び数から第2の核酸の配列が決定され、第1の核酸配列の相補体として第1の核酸の配列が決定される。本発明の方法では、合成される核酸へのdNTPの付加を直接観察するのではなく、鋳型の長さの変化によってdNTP組込みを検出する。結果として、dNTPは天然dNTP（すなわち、フルオロフォア等の任意の検出可能な外因性標識を含む任意の修飾を欠くdNTP）であってもよい。本開示から明らかであるように、本発明のシークエンシング法には鋳型が無傷のままである必要もある。本発明の幾つかの態様は、蛍光の非存在下で又は非蛍光的な方法で行われると記載されるシークエンシング法を含む。これらの特徴（characterizations）は蛍光の検出、特に組み込まれた各々のdNTPからの蛍光の検出なしに該方法を行うことができることを意味する。したがって、これらの方法の実施の形態では、外因性フルオロフォアの付加によって修飾されていない天然のdNTPを用いることができる。しかしながら、これらの特徴は、鋳型の自由端にコンジュゲートした観察可能な部分自体が蛍光性である可能性を排除するものではない。この後者の例では、鋳型の長さの変化を個別に組み込まれたdNTPからの任意の蛍光ではなく、観察可能な部分の蛍光によって可視化することができる。
【００２１】
同様に、本明細書で提供されるシークエンシング法では、（例えば、CMOS接触撮像装置を用いて可能であるように）観察可能な部分自体を検出することによってヌクレオチド組込みを検出することが可能であることも理解されたい。このため幾つかの実施の形態では、観察可能な部分は直接検出され、酵素媒介事象の必要はない。酵素的に検出されるヌクレオチド組込みの一例は、放出される無機ピロリン酸のスルフリラーゼ及びルシフェラーゼ媒介検出と組み合わせたパイロシークエンシングである（Leamonand Rothberg, Chemical Reviews, "CrammingMore Sequencing Reactions onto Microreactor Chips", 2006を参照されたい）。このため、本発明の態様はヌクレオチド組込みを酵素により生成されるシグナルの非存在下で検出することができることから、非酵素的方法（又は非酵素的なヌクレオチド組込みの検出）と称される。
【００２２】
様々な実施の形態において特に関心の持たれる分析物は水素イオンであり、本開示による大規模ISFETアレイは、特にpHを測定するように構成されている。他の実施の形態では、モニタリングされる化学反応はDNA合成プロセス、又は他の化学的及び／又は生物学的なプロセスに関するものであってもよく、chemFETアレイは特にpH、又は対象となる特定の化学プロセスに関する関連情報を提供する1つ若しくは複数の他の分析物を測定するように構成することができる。様々な態様において、chemFETアレイは従来のCMOS処理技術を用いて作製され、特にアレイ全体からの迅速なデータの取得（対応するピクセルアウトプットシグナルを得るためのピクセル全ての走査）を容易にするように構成されている。好ましいシークエンシングシステムはIon PGMSystemであるが、陽子検出に基づく他のシークエンシングシステムも企図される。例えば、パイロシークエンシングシステム及びIlluminaの合成によるシークエンシングも選択肢である。分析物の検出及び測定に関して、下記で更に詳細に論考される様々な実施の形態において、本開示によるchemFETアレイによって測定される1つ又は複数の分析物が、対象となる化学プロセス（単数又は複数）に関する関連情報（例えば複数の核酸鎖の結合、抗原への抗体の結合等）を提供する様々な化学物質のいずれかを含み得ることを理解すべきである。幾つかの態様では、単なる分析物の存在の検出に加えて1つ又は複数の分析物のレベル又は濃度を測定する能力により、化学プロセス（単数又は複数）に関する有益な情報が提供される。他の態様では、単なる対象となる分析物（単数又は複数）の存在の検出は有益な情報を提供し得る。本発明の最も好ましいシークエンシング法はIon TorrentのPGM Systemの使用を伴う。
【００２３】
別の態様では、本発明は、鋳型核酸を断片化して複数の断片化核酸を生成することと、複数の断片化核酸の各々に由来する1つの鎖を個別にビーズへと付着させ、各々に一本鎖断片化核酸が付着した複数のビーズを生成することと、一本鎖断片化核酸が付着した複数のビーズを、領域内の各々のセンサーに対する別個の反応チャンバを有し、1つのビーズのみが各々の反応チャンバ内に位置するchemFETアレイに供給することと、複数のチャンバにおいて同時にシークエンシング反応を行うこととを含む、核酸をシークエンシングする方法を提供する。
【００２４】
本発明は、複数の異なるシークエンシング反応を同じフローセル内又は同じ固体支持体上で同時に行うことを企図する。各々のシークエンシング反応により、固体支持体上に固定化された1つの鋳型に関する情報が得られる。単一のランでシークエンシングすることができる鋳型の数は、期待される鋳型の長さ及び固体支持体の面積に応じて異なる。したがって、実施の形態に応じて少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900又は少なくとも1000の鋳型を固体支持体上に固定化し、ひいては同時にシークエンシングすることができる。更に他の実施の形態では、100〜500、100〜750、100〜1000、500〜1000、600〜1000、700〜1000、800〜1000、900〜1000、1000〜2000、2000〜3000、3000〜4000、4000〜5000、5000〜10000又はそれ以上の鋳型を同時にシークエンシングすることができる。表1は、固体支持体が各2.8 μmビーズにつき1.6ピクセルを有するように構成され得ることを示す。
【００２５】
シークエンシング反応は、鋳型にハイブリダイズする新たに合成された核酸鎖にdNTPを組み込むことによって行われる。新たに合成された鎖は、鋳型に結合するプライマー又はポリメラーゼ媒介伸長が進行することができる他の分子に由来し得る。
【００２６】
非限定的な一例では、シークエンシング反応は、鋳型とプライマーとをそれらのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ、鋳型／プライマーハイブリッドとポリメラーゼとを接触させることによって開始することができる。かかる接触は固体支持体上への固定化の前、その最中及び／又はその後に行うことができる。重要な実施の形態では、接触は固体支持体への固定化に続いて行われる。
【００２７】
プライマー及びポリメラーゼを鋳型に結合させた後、試薬を反復サイクルでフローセルに流入させ、通過させる。試薬フローがプライマーの3'末端のすぐ下流の鋳型上のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含有する場合、ポリメラーゼによりdNTPが組み込まれる。鋳型上の隣接した下流位置が同一のヌクレオチドによって占有される場合（本明細書でホモポリマーと称される）、ポリメラーゼにより同数の相補的dNTPが組み込まれる。フロー中のdNTPが鋳型上の次に利用可能なヌクレオチドと相補的でない場合、かかる組込みは停止する。流入するdNTPの量及びかかるフローの時間は、それぞれ鋳型上の相補的な塩基の数及び予想される全てのdNTPを組み込むのに必要とされる時間を超えるものである。
【００２８】
重要なことには、相補的なdNTPの組込みは2つ以上の結合プライマーで起こる。より好ましくは、組込みは結合プライマーの少なくとも10%、少なくとも25 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも80%、少なくとも90 %又は全てで起こる。このプライマーのパーセンテージは鋳型中の標的コピー数によって異なり得る。幾つかの実施の形態については、組込みは個々の鋳型につき少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100又はそれ以上のプライマーで起こる。本発明が、生じる長さ変化の程度を（長さの増大又は減少にかかわらず）増大することによってシグナル対ノイズ比を増大するために、所与の鋳型上のハイブリダイズしたプライマーの多くでのdNTPの組込みを企図することを理解されたい。
【００２９】
シークエンシング反応の一環として、その相補的なヌクレオチドが鋳型核酸上の同じ位置に存在する場合、新たに合成された鎖の3'（又は最初に組み込まれるdNTPの場合、シークエンシングプライマーの3'末端）にdNTPをライゲートする（又は本明細書で使用されるように「組み込む」）。導入されたdNTPの組込みにより、鋳型の一本鎖領域が二本鎖領域へと変換され、この変換は続いて伸張（tension）下の鋳型の長さ変化に反映される。長さ変化は鋳型の自由端に位置する、観察可能な部分（例えばビーズ）の位置を決定及びモニタリングすることによって検出される。したがって、ビーズ位置が任意の所与のフロースルー後に変化しない場合、dNTPは組み込まれず、フロースルーdNTPが鋳型中の次に利用可能なヌクレオチドとは相補的でなかったと結論付けることができる。この部分の位置における変化が検出される場合、フロースルーdNTPは相補的であり、新たに合成された鎖に組み込まれた。順序が既知であり、好ましくはシークエンシングラン全体を通して一定に維持される限りにおいて、dNTPを任意の順序で流入させることができる。
【００３０】
本発明の幾つかの態様の典型的なシークエンシングサイクルとしては、洗浄バッファーによるフローチャンバ（及びウェル）の洗浄、鋳型核酸の末端に係留される観察可能な部分の位置の測定、ポリメラーゼの存在下でのフローチャンバへの第1のdNTP種（例えばdATP）の導入、観察可能な部分の位置の測定、任意に洗浄バッファー中のアピラーゼのフロースルー、洗浄バッファーのフロースルー、ポリメラーゼの存在下での第2のdNTP種の導入等を挙げることができる。このプロセスは4つ全てのdNTP（すなわちdATP、dCTP、dGTP及びdTTP）がチャンバを流れ、新たに合成される鎖に組み込まれるまで継続する。この4ヌクレオチドサイクルは10回、25回、50回、100回、200回、300回、400回、500回、600回、700回、800回、900回、1000回又はそれ以上の回数を含むが、これらに限定されない任意の回数で繰り返すことができる。サイクル数はシークエンシングされる標的の長さに左右され、反応試薬、特にdNTP原液及び洗浄バッファーを補充する必要がある。このため、本発明の方法を用いて決定することができる配列の長さは少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも700ヌクレオチド、少なくとも800ヌクレオチド、少なくとも900ヌクレオチド、最大で1000ヌクレオチド、1500ヌクレオチド、2000ヌクレオチドを含む、又はそれ以上のヌクレオチドであることができる。
【００３１】
好適なポリメラーゼはDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又はサブユニットが鋳型に基づき、ハイブリダイズしたプライマーから開始して新たな核酸鎖を合成することが可能である限りにおいて、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又はそのサブユニットである。好適なポリメラーゼサブユニットの一例は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く大腸菌（E. coli）DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントのエキソバージョンである。他の好適なポリメラーゼとしては、T4 exo-、Therminator及びBstポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは溶液中に遊離していても（洗浄溶液及び／又はdNTP溶液中に存在し得る）、又は固体支持体、フローセルの1つ若しくは複数の壁面、鋳型、若しくはプライマーに固定されていてもよい。
【００３２】
本明細書で提供されるシークエンシング法が、核酸の部分又は完全ヌクレオチド配列（又は哺乳動物ゲノム、より具体的にはヒトゲノムを含むゲノム中に存在するような核酸コレクション）の決定、（例えば診断法及び法医学的方法において有用であり得るような）サンプルにおける核酸の有無の決定、核酸が配列中に突然変異又は変動（例えば一塩基多型を含む対立遺伝子変動等）を含むか否かの決定、（抗生物質耐性微生物の根本原因となり得るような）既知の核酸に新たな種を生成する突然変異が起こっているか否かの決定、遺伝子改変生物又は遺伝子組み換え核酸の存在の決定、2つのサンプル（例えば正常組織及び罹患組織等）間に遺伝的差異が存在するか否か及びそれが何であるかの決定、対象の遺伝子構成によって決定することができるような特定の病態を有する対象の治療に最も効果的な治療計画の決定、及び遺伝子型決定（例えば、例えばキャリア状態を決定するための1つ又は複数の遺伝子座の分析）を含むが、これらに限定されない多数の用途を有することを理解されたい。これらの実施の形態の幾つかでは、本発明の方法を用いて決定されたヌクレオチド配列を、得られる配列を配向する及び／又は2つの差異を同定するために既知又は参照の配列と比較することができる。これは遺伝子変動及び突然変異を同定するのに役立ち得る。既知又は参照の配列は予め決定された配列（例えば、種の完全ゲノムシークエンシングによって得られる）であってもよい。
【００３３】
本明細書に記載の方法は、病態の同定及び治療に役立てるために用いることもできる。例えば、該方法は特定の病態と関連する配列を同定するため、又は特定の病態の欠如の診断に用いられる配列を同定するために用いることができる。分析されるサンプルはヒトを含む任意の対象に由来し得る。病態は癌又は感染であり得る。
【００３４】
上記方法は、作用物質に対する陽性応答と関連する配列の同定にも用いることができる。該方法は、本明細書で提供される1つ又は複数のシークエンシング法を用いて作用物質に対して陽性応答を示した複数の対象及び陰性応答を示した複数の対象に由来するDNAをシークエンシングすることと、陽性応答を示した複数の対象又は陰性応答を示した複数の対象において他方の複数の対象に存在しない共通配列を同定することとを含み得る。対象は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００３５】
本明細書に記載の方法は、ロボット工学によってシークエンシング反応が行われるように自動化することができる。加えて、検出器又はセンサーから得られるシークエンシングデータは、使用者がシークエンシング反応の進行を遠隔でモニタリングすることができるようなパーソナルコンピュータ、携帯情報端末、携帯電話、ビデオゲームシステム又はテレビへのインプットであり得る。
【００３６】
本発明は、本明細書に説明される方法に従う増幅及び／又はシークエンシング反応を行うのに必要とされる様々な試薬と使用説明書とを含むキットを更に企図する。
【００３７】
本明細書で提供される方法は、鋳型中の標的の各々のコピーでの単一ヌクレオチドの検出に基づく。限界分解能は使用される検出システムの分解能によって決まる。
【００３８】
幾つかの本発明の実施形態を本明細書で記載及び説明したが、当業者には機能を発揮するため、及び／又は結果及び／又は本明細書に記載の利点の1つ若しくは複数を得るための様々な他の手段及び／又は構造が容易に想定され、かかる変更及び／又は修飾は各々、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成は例示的であると意図され、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成が本発明の教示を用いる特定の用途（単数又は複数）に応じて異なることが当業者には容易に理解される。当業者は本明細書に記載される特定の本発明の実施形態の多くの均等物を認識するか、又は単なる日常実験を用いて確かめることができる。したがって、上述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において本発明の実施形態を具体的に記載及び特許請求される以外の形で実行することができることを理解されたい。本開示の進歩性のある実施形態は、本明細書に記載される各々個々の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法に関する。加えて、かかる特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の2つ以上の任意の組合せが、かかる特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない限りにおいて、本開示の進歩性の範囲に含まれる。
【００３９】
本明細書で規定及び使用される全ての定義は辞書の定義、引用することにより本明細書の一部をなす文献における定義、及び／又は規定の用語の通常の意味より優先されると理解されるものとする。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（the singular forms of "a," "an," and"the"）は、文脈により特に明確に指定のない限り、指示対象の複数形も包含する。 
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の実施形態
本発明は、特に、（A）及び（B）に提示される以下の工程を特徴とする、サンプルからの核酸の単離、（RT-）PCR反応のセットアップ、（RT-）PCRに基づく核酸増幅、PCR後の増幅産物の標準化及び浄化（clean up）、PCR増幅産物の断片化、アダプターとのライゲーションに対する独特な半自動化方法に関する。
【００４２】
方法（A）
（a）サンプルからの核酸の抽出、
（b）任意に、先の増幅反応に由来するクロス及びキャリーオーバーの汚染を消化するための（RT-）PCR反応を行う前のウラシル−DNA−グリコシラーゼ（UDG）の（RT-）PCR混合物への添加、
（c）単離された核酸の種類、すなわち、RNA又はDNAに応じた、A、T、C、Gを含む、また任意にウラシルを含む、ヌクレオチド三リン酸構成要素（nucleotidetriphosphate building blocks）（すなわち、個々のヌクレオチド）を使用する（RT-）PCR、
（d）RT-PCRにおいて得られる核酸の標準化（標準化に担体構造、例えば常磁性マイクロビーズ（例えば、Axygen製のAxyPrep Mag PCR Normalizer）を使用し、上記ビーズが所望の配列長のヌクレオチド配列に結合する）であって、PCRの後にRT-PCR混合物を上記ビーズに結合すること、PCR産物の結合の後に該マイクロビーズを完全に洗浄すること、マイクロビーズからのPCR増幅産物の溶離を含む、核酸の標準化、
（e）工程（d）で得られた溶離されたPCR増幅産物の断片化（剪断）、
（f）工程（e）の産物を担体構造、例えばマイクロビーズに結合した後、洗浄し、結合した核酸を溶離すること、
（g）工程（f）で得られた生成物に対するアダプター配列（特定のサンプル（例えば臨床サンプル及び患者）に核酸の属性を与えるバーコード配列を含む）のライゲーション、
（h）担体構造、例えば先の工程（d）及び／又は（f）で使用されたマイクロビーズを使用する工程（g）で得られた生成物の浄化、
（i）工程（h）で得られた生成物を（例えば、Ion PGM Systemを使用する）シークエンシング反応に供すること、並びに、
（j）工程（i）で得られたシークエンシング反応の結果の分析。
【００４３】
方法（B）
（a）サンプルからの核酸の抽出、
（b）任意に、先の増幅反応に由来するクロス及びキャリーオーバーの汚染を消化するための（RT-）PCR反応を行う前のウラシル−DNA−グリコシラーゼ（UDG）の（RT-）PCR混合物への添加、
（c）単離された核酸の種類、すなわち、RNA又はDNAに応じた、A、T、C、Gを含む、また任意にウラシルを含む、ヌクレオチド三リン酸構成要素（すなわち、個々のヌクレオチド）を使用するRT-PCR、
（d）（例えば、LifeTechnologiesのFuPa試薬を使用する）プライマーの部分消化、
（e）工程（d）で得られた生成物への（バーコードを含む）アダプター配列のライゲーション、
（f）RT-PCRにおいて得られる核酸の標準化（標準化に担体構造、例えば常磁性マイクロビーズ（例えば、Axygen製のAxyPrep Mag PCR Normalizer）を使用し、上記ビーズが所望の配列長のヌクレオチド配列に結合する）であって、PCRの後にRT-PCR混合物を上記ビーズに結合すること、PCR産物の結合の後に該マイクロビーズを完全に洗浄すること、マイクロビーズからのPCR増幅産物の溶離を含む、核酸の標準化、
（g）担体構造、例えば先の工程（d）及び／又は（f）で使用されたマイクロビーズを使用する工程（h）で得られた生成物の浄化、
（i）工程（h）で得られた生成物を（例えば、Ion PGM System; Ion Torrentを使用する）シークエンシング反応に供すること、並びに、
（j）工程（i）で得られたシークエンシング反応の結果の分析。
【００４４】
上のワークフロー方法の独自性は、その後に結果の分析が続く、分析用の核酸の抽出及び最終NGS反応から上記プロセスで必要とされる時間を短縮することを可能とする。UDGの使用は、核酸抽出、PCRセットアップ、PCR後の精製工程、ライブラリ作製及びNGSに対する自動化システムにおける汚染リスクを大幅に減少する。上の方法を使用するこれらの工程の自動化は、特に、診断用途に必要とされる時間及び費用を削減する。
【００４５】
驚いたことに、本明細書に記載される革新的で代替的な方法を次世代シークエンシングライブラリの作製に使用可能であることに気付いた。本発明の方法を、例えば、Illuminaシークエンシング又はIon Torrentシークエンシングに対する種々のNGSライブラリの作製に使用することができる。この方法を上に提示されるNGSワークフローに組み込んでもよい。
【００４６】
通常、かかる目的に適したバッファーを含む商業的に入手可能なキットを使用して、NGSライブラリを作製する。これらのバッファーは、GC含有量に関わらず、NGSライブラリの強固で適合度の高い（high-fidelity）増幅に対して特異的に最適化される。NGSライブラリの作製に対する自動化オープンシステムは、先のランに由来するPCRアンプリコンによる臨床サンプルの汚染のキャリーオーバーに対する高リスクに影響されやすい場合があることから、上記の危険性を軽減することが目的である。キャリーオーバー汚染を防止するため、dUTPを（RT-）PCRマスターミックスに添加する。PCRマスターミックスのウラシルデヒドロゲナーゼ（UDG）処理は、先のランに由来し、後の反応混合物へと偶発的にキャリーオーバーされてしまう可能性がある汚染物質アンプリコンを除去する。ウラシルデヒドロゲナーゼ（UDG）は、デオキシリボースと塩基との間のN-グリコシル結合の加水分解によってDNAからウラシルを除去し、脱プリン部位又は脱ピリミジン部位（AP部位）を残す酵素である。
【００４７】
しかしながら、NGSライブラリ作製用のバッファー（例えば、Platinum（商標）Taq High Fidelityを用いるSuperscript（商標）III One-Step RT-PCR System）は、一般的には増幅反応中のdUTPの組み込みに適していない。驚いたことに、NGSライブラリの作製に対して特別に開発された特に高い適合度の酵素を、適合度が高くない酵素である従来のTaqポリメラーゼで置き換え可能であることに気付いた。従来の（RT-）PCRバッファー（例えば、100 mM  Tris-HCl、pH 8.3、500 mM  KCl、15 mM  MgCl2を含有するバッファー）を使用することができる。NGSライブラリの作製に関するプロトコルにおけるこの変更は、増幅中のdUTPの組み込みを可能とする。
【００４８】
したがって、一態様では本発明は、特殊な高適合度のPCRバッファーを使用しないが、PCRに適した任意のDNAポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ）を必須に使用する、増幅中にdUTPを組み込むことを含む、NGSライブラリを作製する方法に関する。このバッファー及び酵素の幾分単純な交換により、dUTPの導入、及び後の汚染のキャリーオーバーを防止するためのUDGによる処理を可能とする。
【００４９】
さらに、本発明は、dUTPの組み込みに対して野生型（組換え又は天然）Taqポリメラーゼを使用する次世代シークエンシングライブラリの作製に対する核酸増幅反応におけるキャリーオーバー汚染の排除方法、すなわち、分析されるべきであり、先の（RT-）PCR反応に由来するDNAを汚染する可能性のある抽出された核酸を含む試薬混合物の除染方法であって、
a)サンプルから得られた核酸を断片化する工程と、
b）増幅反応混合物中に存在する任意の汚染核酸増幅物（contaminating nucleic acid amplificates）を分解するのに適した分解酵素を添加する工程と、
c）dUTPの存在下での第1の核酸増幅反応において第1の核酸増幅物を提供するため、核酸鋳型を増幅する工程と、
d）上記分解酵素を不活性化する工程と、
を含む、方法に関する。
【００５０】
上記のdUTPの取り込みに対して野生型（組換え又は天然）Taqポリメラーゼ又はその誘導体を使用する次世代シークエンスライブラリの作製に対する核酸増幅反応におけるキャリーオーバー汚染の排除方法の好ましい実施形態では、上記分解酵素はUDGである。UDG処理は、通常数分、例えば最大10分、好ましくは最大5分かかる。その後、上記酵素を、約5分間約50℃の温度に曝露することによって不活性化する。
【００５１】
上記のdUTPの取り込みに対して野生型Taqポリメラーゼを使用する次世代シークエンスライブラリの作製に対する核酸増幅反応におけるキャリーオーバー汚染の排除方法の別の好ましい実施形態では、上記分解酵素はUDGであり、上記Taqポリメラーゼは組換え又は天然ポリメラーゼである。
【００５２】
上記のdUTPの取り込みに対して野生型（組換え又は天然）Taqポリメラーゼを使用する次世代シークエンスライブラリの作製に対する核酸増幅反応におけるキャリーオーバー汚染の排除方法の別の好ましい実施形態では、上記分解酵素はUDGであり、UDG処理ライブラリを、次世代シークエンシング法において、
a）サンプルから得られた核酸を断片化する工程と、
b）増幅反応混合物中に存在する任意の汚染核酸増幅物を分解するのに適した分解酵素を添加する工程と、
c）dUTPの存在下で第1の核酸増幅反応において第1の核酸増幅物を提供するため、核酸鋳型を増幅する工程と、
d）上記分解酵素を不活性化する工程と、
を含む更なる工程に供する。
【００５３】
DNAライブラリの作出に対する本方法の好ましい実施形態、又は上のDNAライブラリ作製のプロセスにおける反応混合物の除染もまた特許請求の範囲に記載される。
【００５４】
上の方法（A）及び方法（B）の好ましい実施形態は、例えば、幾つかの癌遺伝子の修飾が幾つかの薬物に対する耐性を与えることから、臨床サンプルに存在する標的核酸（例えば、癌遺伝子又はHCV、HIVのような病原体に由来する核酸等）の配列に関する知識が、医師が患者にとって最も有望な治療を選択することを補助する比較診断における、in vitro診断用途に関する。
【００５５】
方法（A）の好ましい実施形態では、上記サンプルは、例えば患者、好ましくはヒト患者から得られた新鮮なサンプルである。上記サンプル材料は、例えば、血液、血漿、血液細胞の亜集団、例えばT細胞、脳脊髄液、痰、糞便等であってもよい。
【００５６】
方法（A）の好ましい実施形態では、上記サンプルは、該サンプルに見出される核酸材料、例えば、ウイルス、細菌、真菌、若しくは寄生生物に由来する核酸、又はかかる核酸を含有する材料、例えば、ウイルス粒子、細菌等を単離するための血漿である。
【００５７】
方法（A）の好ましい実施形態では、上記サンプル材料は血漿であり、核酸材料はウイルス、例えばHCV、HIV等に由来する。HCVが標的とされる場合、目的の領域は、6つの主要なHCV遺伝子型及び多数のサブタイプを同定するのによく適したNS5B遺伝子領域であることが好ましい。HCVゲノムにおける標的領域は、ヌクレオチド8616からヌクレオチド9298に及ぶことが好ましいが、該領域は6つのHCV遺伝子型の同定が可能である限り、わずかに長くてもよく、又はわずかに短くてもよい。好ましいプライマーは、HCVゲノムのヌクレオチド8616〜8638、8614〜8635、9276〜9298、及び9171〜9191に結合する。プライマーは、当該技術分野で知られる天然の又は修飾されたヌクレオチド構成要素を含んでもよい。
【００５８】
方法（B）の好ましい実施形態では、上記サンプルは、例えば患者、好ましくはヒト患者から得られた新鮮なサンプルである。上記サンプル材料は、例えば、血液、血漿、血液細胞の亜集団、例えばT細胞、脳脊髄液、痰、糞便等であってもよい。方法（B）の別の好ましい実施形態では、上記サンプルは新鮮なサンプルではないが、それを得た後に、例えばホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋を使用して処理されたサンプルである（FFPEサンプルは様々な癌遺伝子の分析に好ましいサンプルである）。
【００５９】
方法（B）の好ましい実施形態では、上記サンプルは、ヒト患者に由来するFFPE-サンプル、例えばホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋さていてもよい任意の組織に由来するサンプル、例えば皮膚、乳房組織、結腸、肺、肝臓、筋肉等に由来するサンプルであってもよい。非常に好ましい実施形態では、上記サンプルは黒色腫の形成に関与する遺伝子の分析用の皮膚サンプルである。これに関して標的化される好ましい遺伝子は、少なくとも1つ又は複数の以下の遺伝子群、すなわち、NRAS、AKT3、MAP2K1、GNA11、ERBB4、PIK3CA、FGFR3、KIT、BRAF、CDKN2A、及びGNAQを含む。これらの遺伝子は、黒色腫の発症に関与することが知られており、各遺伝子の異なる部位に異なる点突然変異を含む可能性がある。幾つかの突然変異が薬物耐性を与えるのに対して、他は薬物感受性（druggable）（薬物に対して感受性）であることが知られているため、特定の突然変異の分析は、治療を行っている医師が適した治療法を選択することを可能とする。
【００６０】
本発明の別の態様は、FFPE組織からの核酸抽出に対して対照物質としてはたらく可能性のある新たなFFPE細胞系列の供給である。これらの細胞系列は、標的化配列、例えば形質転換により、又は他の方法を使用して先に導入された遺伝物質に対応する遺伝情報を保有する場合がある。代替的には、これらの遺伝子は、例えば、細胞が既に目的の標的遺伝子（例えば、癌遺伝子）を保有する場合、又は標的遺伝子が実際のアッセイにおいて標的化された遺伝子と異なるはずである場合に、遺伝学的に修飾されていなくてもよい。例えば、上記アッセイが臨床サンプル中の1つ又は複数の癌遺伝子の突然変異を標的とする場合、FFPE細胞系列において標的化された遺伝子はハウスキーピング遺伝子、又は変異が導入されていない野生型遺伝子であってもよい。上記細胞系列は、FFPE細胞系列材料の量が個別のアッセイの要求に一致するように選択され得ることから、定量化可能な量の標的核酸源を提供する。本発明の細胞系列は、所与のアッセイに対するキットの一部として提供される場合がある。上記キットは、抽出、精製、増幅、又は他の核酸の操作に適した追加の化学試薬、例えばプライマー、バッファー、酵素等を更に含んでもよい。
【００６１】
本明細書に提供される別の態様は、DNAライブラリの標準化方法である。更なる実施形態では、これらのDNAライブラリを、磁性マイクロビーズ等の担体粒子の使用を含む後のNGSに使用する。
【００６２】
先の方法では、DNAライブラリの標準化は、アダプターのライゲーションの前に（RT-）PCR反応で得られた断片化されたDNA増幅産物の定量及び／又はサイズ選択を必要とする。驚いたことに、マイクロビーズの使用を含むライブラリの作製は、サイズ選択及び／又は先の定量を必要としないことがわかり、好ましいマイクロビーズはAxygenによって提供されるもの（AxyPrepMAG-PCR-CL-5キット）又は類似製品である。また、これらのマイクロビーズの使用は、核酸増幅及び／又は増幅産物へのアダプターのライゲーションの後になおも存在するより短いフラグメントを排除する。
【００６３】
さらに、驚いたことに、ライゲーションの後にアダプターを含むライブラリを再度増幅する従来技術の方法と異なり、そのようにして作出されたDNAライブラリのPCR増幅は必要ではないことがわかった。
【００６４】
ビーズの量及び上記ビーズとDNAライブラリとのインキュベーション時間に応じて、ビーズが経時的に核酸によって飽和されることから、結合したDNAの量を定義することができる。
【００６５】
本発明の自動化された核酸抽出、増幅及びライブラリ作製の方法（例えば、Vela DiagnosticのSentosa SX101プラットフォームを使用する）は、全体に時間、試薬の量及び費用の削減を可能とし、NGSに対するDNAライブラリの手作業による作製と関連するリスクを回避する。
【００６６】
また、本発明は、遺伝子ライブラリの作製に対するキットも企図する。
【００６７】
さらに、本発明は、単純化され、改善されたライブラリ作製のプロトコルを提供する。上述したように、後のNGSプロトコルにおいて使用されるDNAライブラリの作製に対して磁性ビーズを標準化することは、更なる分析に対して正確な量の核酸を得るため非常に重要である。そのため、増幅された核酸の標準化に対して（RT-）PCRの後に、制限された結合表面を有するDNA結合ビーズを使用することができる。
【００６８】
さらに、続く次世代シークエンシング工程に対して予め決められた量のDNAを得るため、従来技術の方法は、以下の工程：
1）（RT-）PCR
2）磁性ビーズ及び浄化バッファーを使用するPCR産物の浄化、
3）ビーズの洗浄（例えば、エタノールによる）、
4）磁性ビーズに結合したPCR産物の溶離、
5）標準化磁性ビーズ及び標準化バッファーを使用するPCR産物の標準化、
6）ビーズの洗浄（例えば、エタノールによる）、
7）標準化PCR産物の溶離、
を本質的に必要とする。
【００６９】
おそらく、ワンステップRT-PCRバッファー中のdTTが増幅されたDNA産物の標準化ビーズへの結合を阻害するため、標準化磁性ビーズ（定義）は、RT-PCRバッファーに対して非常に感受性である。増幅が行われた後にRT-PCR混合物中に存在する試薬を除去する上記工程2）〜工程4）を行うことが先の従来技術の方法では必要であった。
【００７０】
驚いたことに、本発明者らは、溶媒、例えばポリエチレングリコール及びアルカリ金属塩、例えばNaCl、MgCl等を含むNGSライブラリ作製用の標準化ビーズに対するバッファーを含む新たな本発明の組成物に（RT-）PCR産物を曝露した場合に、面倒で手間及び費用のかかる工程2）〜工程4）を省略可能であることを見出した。幾つかの実施形態では、上記組成物は、例えば約2.0 M〜約5.0 MのNaCl、例えば0.2 M〜約4.0 MのNaCl、好ましくは2.5 M〜約3.5 MのNaCl、非常に好ましくは約2.5 M〜約3.0 MのNaClを含み、最も好ましくは本発明のバッファーにおけるアルカリ金属塩の濃度は2.5 MのNaClである。NGSライブラリの作製用の標準化ビーズに対する本発明のバッファーは、約10 ％〜約30 ％の溶媒、例えば約12.5％〜約25 ％、又は15.0 ％〜約25 ％、又は17.5 ％〜約22.5 ％、好ましくは約20 ％の溶媒を更に含む。該溶媒は、ポリエチレングリコール、例えばポリエチレングリコール（PEG）8000等の高分子量のPEGであることが好ましい。また、NaClをMg、K等の他のアルカリ金属塩で置き換えることができる。非常に好ましい実施形態では、NGSライブラリ作製用の標準化ビーズに対する本発明のバッファーは、約2.5 MのNaCl及び20 ％のポリエチレングリコール（PEG）8000を含む。
【００７１】
本発明のNGSライブラリの作製方法及び改善されたNGSワークフローでは、上述のバッファーを、増幅された核酸を含有する得られたRT-PCR増幅混合物に直接添加する。本発明のバッファーは、2：1〜1：2の比率で増幅混合物に添加されることが好ましく、本発明のバッファーをおよそ等量（例えば1：1）でPCR増幅混合物に添加することが最も好ましい。非常に好ましい実施形態では、NGSライブラリ作製用の標準化ビーズに対する本発明のバッファーは約2.5 M NaClを含み、20％のポリエチレングリコール（PEG）8000を1：1の比率でPCR増幅混合物に添加する。
【００７２】
このようにして、NGSに対するライブラリを作製する時間及び工程は、非常に減少され得る。さらに、（RT-）PCR産物に添加されるバッファーは非常に安価であり、特に、浄化ビーズ及び浄化バッファーよりも更に安価である。
【００７３】
以下に提示される実施例は例としての役割を果たすにすぎず、何ら本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７４】
実施例1：Vela Diagnosticの自動化プラットフォームSentosa SX101を使用するNGSに対するHCVライブラリの作製
【００７５】
1. RT-PCR
HCVウイルスRNAをヒト血漿から単離してcDNAを合成する。ここで、この工程を、自動化プラットフォームSentosa SX 101を使用して行う。
RT-PCRを行う前に、ウラシル−DNA−グリコシラーゼ（UDG）をRT-PCRミックスに添加して、先のアッセイに由来する潜在的な汚染物質を排除する。増幅の前に25℃で4分間UDGを用いてアンプリコン−キャリーオーバー汚染の消化を行う。
【００７６】
2. RT-PCR後の標準化
図1に示される作業プラットフォームが参照される。
試薬96ウェルプレートのウェルを調製する（図1、C1の位置）
【００７７】
【表１】
2017521356.tif 000003
【００７８】
試薬96ウェルプレートの温度（図1のTEMP2）を15℃に設定する
各サンプルの全てのPCR産物25 μL（合計4個）を規定の位置にプールする。
5回混合し、195μLの標準化ビーズを1500 μLのPCR浄化バッファー（ライブラリ作製試薬）に移す。
10回混合し、86μLのPCR浄化バッファー（VelaDiagnostics）及びノーマライザビーズ（Axygen）を移す。規定の位置のプールしたPCR産物と混合し（ライブラリ作製試薬）、10回混合する。
室温で3分間インキュベートする。
図1のプラットフォームのB5の位置の磁性ホルダにPCRプレートを移動する。
2分間インキュベートする。
40 μLを3回、50 μLを1回ピペッティングすることによって上清を廃棄する。
100μLの80 ％EtOHをPCRプレート上の選択したウェルに添加する。
PCRプレートをサーモミキサ（TMX）に移動し、1000rpmで2分間振蕩する。
PCRプレートを図1のB5の位置の磁性ホルダに戻す。
TMXの温度制御をオンにし、56℃に設定する。
2分間インキュベートする。
70 μLを3回、40 μLを1回ピペッティングすることによって上清を廃棄する。
PCRプレートを予め56℃に設定したサーモミキサ（TMX）に移動する。
2分間プレートを乾燥する。
PCRプレートをC1の位置に移す。
35 μLの溶離バッファーを添加する（ライブラリ作製試薬1AからPCRプレートへ）
ピペッティングにより5回混合する。
PCRプレートをサーモミキサに移動する。
サーモミキサ上で56℃にて1400 rpmで5分間振蕩する。
プレートを磁性プレート（B5）に戻し、2分間待つ。
【００７９】
3. 剪断
63 uLの剪断バッファー（Life technologies）及び30 uLを規定の位置に移し、5回混合する。80 uLの混合物を剪断酵素（Life technologies）（C4及びD4）にそれぞれ移し、20回混合する。
15 ulを規定の位置に移す。15 uLの溶離サンプル（工程2に由来する）を同じ規定の位置に移し、混合する。
PCRプレートをサーモミキサに移動し、12分間インキュベートし、38℃で13分間インキュベートする。
【００８０】
4. PCRビーズの浄化
PCR浄化ビーズを混合し、50 μLのビーズをライブラリ作製試薬から規定のPCRプレートのウェルに移す。
PCRプレートをTMXに移動し、26℃にて1200 rpmで3分間振蕩する。
PCRプレートをB5の位置の磁性ホルダに移動し、2分間待つ。
それぞれ70 μL及び30 uLのピペッティングにより上清を廃棄する。
100 μLの80 ％EtOHを添加する（ライブラリ作製試薬からPCRプレートへ）。
PCRプレートをTMXに戻し、26℃にて1200 rpmで3分間振蕩する。
PCRプレートをB5の位置の磁性ホルダに移動する。3分間待つ。
70 μLを1回及び50 μLを1回ピペッティングすることにより上清を廃棄する。
5分間待つことによりビーズを乾燥する。
PCRプレートをC1の位置に戻す。
28 μLの溶離バッファーを添加する（ライブラリ作製試薬から選択されたPCRプレートのウェルに溶離バッファーを移す）。
PCRプレートをTMXに移動し、26℃にて1200 rpmで2分間振蕩する。
PCRプレートをB5の位置の磁性ホルダに移動し、2分間待つ。
【００８１】
5. ライゲーション
90 μLのリガーゼバッファー（Enzymatics）、18 uLのdNTP、36 uLのT4リガーゼ（Enzymatics）、18 uLのMantaポリメラーゼ（Enzymatics）、及び108 uLの水を規定の試薬プレートのウェルから別の規定されるチューブに移し、10回混合する。
更に15 μLのミックスを試薬プレートの規定のウェルから別の規定のウェルに移す。
その後、10 uLのバーコードアダプターを同じ規定のウェルに移す。
25 uLの工程4で溶離されたサンプルを同じ規定のウェルに移し、10回混合する。25 uLの鉱油でその混合物を覆う。
PCRプレートをTMXに移動し、26℃で10分間インキュベートする。
温度を65℃まで上昇させ、更に5分間インキュベートする。
【００８２】
実施例2：AmpliSeq（商標）ライブラリの自動操作
AmpliSeq（商標）試薬（Life technologies,Inc.）を使用する試薬96ウェルプレートのウェルを調製する（図1のC1の位置）。
【００８３】
【表２】
2017521356.tif 000004
自動化プラットフォームSentosa SX101（VelaDiagnostics）を使用するAmpliseqライブラリ自動操作
【００８４】
1. PCR
TEMP2の位置の温度を4℃に設定する。
4 μLのPCRマスターミックスを試薬プレートの規定のウェルから他の選択されたウェルのプライマープールに移す。
ピペッティングにより10回混合する。
7 μLのPCRミックスを選択された試薬96ウェルプレートのウェルから選択されたPCR 96ウェルプレートのウェルにそれぞれ移す。
3 μLのgDNAサンプルを規定の溶離プレートのウェルから選択されたPCR 96ウェルプレートのウェルにそれぞれ移す（PCRの総容量＝10 μL）。
PCRプレートを手作業で密閉し、以下のプログラムを使用する増幅のためPCRへと移す。
工程1：99℃で2分
工程2：99℃で15秒
工程3：60℃で4分
工程2を繰り返す（21回）
10℃で保持する
PCRの後、PCRプレートをSentosaプラットフォームSX101のC1の位置（図1）に戻す。
サーモミキサの温度を52℃に設定する。
【００８５】
2. FuPa反応
2 μLのFuPa（Life technologies）を選択した試薬96ウェルプレートのウェルから予め決められたPCR 96ウェルプレートのウェルに移す。（自動化システムを使用する非常に小容量の粘性試薬の移動）
規定のウェルからFuPa試薬を含むPCRプレートのウェルへと10 μLのPCR産物をプールし、ピペッティングにより5回混合する。
40 μLの油膜（oil overlay）を先の工程のPCRプレートウェルに添加する。（ライブラリ作製試薬→PCRプレート）
PCRプレートをTMXへと移動し、52℃にて300 rpmで10分間、57℃で10分間、及び62℃で20分間振蕩する。
PCRプレートをSX101のC1の位置に戻す。
【００８６】
3. ライゲーション反応
4 μLのSwitch溶液（Life technologies）を規定される試薬プレートのウェルから他の規定されるPCRプレートのウェルに添加する。
2 μLのリガーゼを規定される試薬プレートから別の規定されるPCRプレートのウェルに移す。
2 μLのバーコードアダプターを規定される試薬プレートのウェルから予め決められたPCRプレートのウェルに移す。
5 μLの水を、ライブラリ作製試薬を含む予め決められたウェルから別の予め決められたPCRプレートのウェルに添加する。
17 μLのサンプルを添加し、ピペッティングにより5回混合する。
選択したPCRプレートのウェルからリガーゼを既に含むウェルへと全サンプルを移し、ピペッティングにより5回混合する。
40 μLの油膜を選択したPCRプレートのウェルB5に添加する。（ライブラリ作製試薬から規定されるPCRプレートのウェルへ）
20分間待つ。
サーモミキサを72℃に設定し、更に10分間待つ。
PCRプレートをTMXに移動し、72℃にて300 rpmで10分間振蕩する。
【００８７】
4. ビーズの標準化
標準化ビーズをピペッティングによって10回混合する。
ライブラリ作製試薬中の10 μLの標準化ビーズをライブラリ作製試薬中の200 μLの結合バッファーに添加する。
PCRプレートをTMXからC1の位置に移動する。
サーモミキサの温度を25℃に設定する。
100 μLのビーズ溶液を所望のPCRプレートのウェルに移す前に、規定のウェルにおいてビーズ溶液を10回混合する。
結合のため、25 μLのサンプルを1つの選択したPCRプレートのウェルから別の規定されたウェルに移し、ピペッティングにより10回混合する。
5分間待つ。
PCRプレートをTMXに移動する。
25℃にて1200rpmで1分間振蕩する。
4分間インキュベートする。
PCRプレートを磁性プレートホルダB5に移動し、2分間インキュベートする。
50 μLを2回、20 μLを1回ピペッティングすることによって上清を廃棄する。
100 μLの80 ％EtOHを選択したPCRプレートのウェルに移す。
プレートをTMXに戻し、25℃にて1000 rpmで1分間振蕩する。
1分間インキュベートする。
PCRプレートを磁性プレートホルダB5に戻し、2分間インキュベートする。
50 μLを2回及び20 μLを1回ピペッティングすることによって上清を廃棄する。
プレートをTMXに戻し、25℃にて1000 rpmで1分間振蕩する。
1分間インキュベートする。
PCRプレートを磁性プレートホルダB5に戻し、2分間インキュベートする。
50 μLを2回及び20 μLを1回ピペッティングすることによって上清を廃棄する。
TMXを58℃に設定する。
PCRプレートをTMXに移動し、2分間EtOHを完全に乾燥する。
PCRプレートをC1の位置に戻す。
25 μLの溶離バッファーをPCRプレートの選択したウェルに添加する。
PCRプレートをTMXに移動し、1200 rpmで2分間振蕩する。
PCRプレートを磁性プレートホルダB5に移動し、2分間インキュベートする。
25 μLの溶離したサンプルを1つの規定されたPCRプレートのウェルから別の規定されたウェルにピペットで移す（Pipette）。
【００８８】
上記方法及びかかる方法に関する追加の態様は、自動化されていない又はより多くの手作業の工程を必要とする同等の方法よりも、手間がかからず、安全性コストが安く、試薬が少なく、汚染を生じにくい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】作業プラットフォームを示す。Worktable for HCVassay  HCVアッセイ用ワークテーブル
【図１】
2017521356.tif 000005
【国際調査報告】
2017521356.tif 000006
2017521356.tif 000007
2017521356.tif 000008
2017521356.tif 000009
2017521356.tif 000010
2017521356.tif 000011