(57)【要約】  本発明は一般に、多系列能を示す細胞を生成する方法、及びそれによって生成された細胞に関する。より詳細には、本発明は、CD4+単核細胞、CD8+単核細胞、CD25+単核細胞、CD19+単核細胞、又はCD20+単核細胞から哺乳類幹細胞を生成するインビトロ方法、及びそれによって生成された細胞を対象とする。本発見は今や、多種多様な臨床及び研究の状況で使用される、多系列能細胞、例えば幹細胞の集団を確実且つ効率的に生成する手段の設計を容易にした。この使用として、とりわけ、対象の多系列能細胞の、インビトロ若しくはインビボでの指向性分化、及び本発明の多系列能細胞又はそれに由来するより完全に分化した細胞集団の投与を介した広範な状態の治療的又は予防的処置が挙げられる。また、容易にしたのは、これらの細胞が曝され得る潜在的処置又は培養レジームの治療的影響及び/又は毒性を試験する、インビトロベースのスクリーニング系の設計である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD20、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法。
【請求項２】
前記単核細胞懸濁液が、20〜40v/v%、例えば15v/v%、又はその機能的に等価な割合である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アルブミンが、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合、例えば15v/v%又はその機能的に等価な割合である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養培地が、30〜80v/v%、例えば70v/v%、又はその機能的に等価な割合である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記単核細胞が、リンパ球である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記CD4+及び/又はCD8+単核細胞が、胸腺細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、マクロファージ、又は樹状細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記CD4+又はCD8+単核細胞懸濁液が、30v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液が、40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地が、30v/v%又はその機能的に等価な割合である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記CD25+細胞が、調節T細胞又は記憶T細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記CD25+単核細胞懸濁液が、20v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液が、40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地が、40v/v%又はその機能的に等価な割合である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記CD19+又はCD20+細胞が、任意の分化段階にあるB細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記CD19+又はCD20+単核細胞懸濁液が、40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液が、20v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地が、40v/v%又はその機能的に等価な割合である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記胸腺細胞が、二重陽性CD4+/CD8+胸腺細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球が、単独陽性CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞、又はCD8+NK細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンパ球が、CD25+T調節細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンパ球が、CD19+B細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項１６】
前記単核細胞が、CD20+細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項１７】
前記単核細胞が、末梢血又は脾臓に由来する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記多系列能細胞が、造血分化能又は間葉系分化能を示す、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記CD4+由来多系列能細胞が、CD44+及びCD45+を発現する、請求項1から7及び13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記CD8+由来多系列能細胞が、CD45+及びCD47+を発現する、請求項1から7及び13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記CD25+由来多系列能細胞が、CD23+を発現する、請求項1から4、10、11及び14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記CD19+由来多系列能細胞が、CD44+及びCD45+を発現する、請求項1から4、10、11及び15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記造血分化能が、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、又は血小板に分化する能力である、請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
前記間葉系分化能が、骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、又は脂肪の細胞に分化する能力である、請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルブミン濃度が、5〜20%又は5〜15%である、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルブミン濃度が、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞培養物が、10mg/Lインシュリン、又はその機能的フラグメント若しくは等価物を更に含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、4〜7日間培養される、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、4〜5日間又は3〜6日間培養される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
多系列分化能を示す細胞(MLPC)を刺激と接触させて、前記MLPCの分化をMLPC由来表現型に導く付加的な工程を含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記MLPC由来表現型が、造血表現型又は間葉系表現型である、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
造血幹細胞由来細胞が、赤血球、血小板、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、又は好酸球である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
間葉系幹細胞由来細胞が、結合組織細胞、例えば骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、又は脂肪の細胞である、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類の状態を治療的且つ/又は予防的に処置する方法であって、前記哺乳類に、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法に従って生成された有効数のMLPC、又は部分的に若しくは完全に分化したMLPC由来細胞を投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
哺乳類の状態の処置のための医薬の製造における、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞の集団の使用。
【請求項３７】
前記状態が、異常な造血機能又は間葉系機能によって特徴付けられる、請求項35又は36に記載の方法又は使用。
【請求項３８】
前記状態が、造血障害、循環障害、卒中、心筋梗塞、高血圧骨障害、II型糖尿病、不妊症、損傷を受けた、若しくは形態学的に異常な軟骨又は他の組織、ヘルニア修復、支持メッシュ及び生体スキャフォールドを用いる骨盤底脱外科手術、他の筋骨格障害のための細胞療法、並びに加齢、外科手術又は外傷の状況での欠陥のある支持組織の置換である、請求項37に記載の方法又は使用。
【請求項３９】
請求項1から34のいずれか一項に記載の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞の集団。
【請求項４０】
MLPC又はMLPC由来細胞の表現型状況又は機能状況に対する、処置又は培養レジメンの効果を評価する方法であって、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法に従って生成された前記MLPC又はMLPC由来細胞を前記処置レジメンにかける工程、及び変更された機能状況又は表現型状況についてスクリーニングする工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、多系列能を示す細胞を生成する方法、及びそれによって生成された細胞に関する。より詳細には、本発明は、CD4+単核細胞、CD8+単核細胞、CD25+単核細胞、CD19+単核細胞、又はCD20+単核細胞から哺乳類幹細胞を生成するインビトロ方法、及びそれによって生成された細胞を対象とする。本発見は今や、多種多様な臨床及び研究の状況で使用される、多系列能細胞、例えば幹細胞の集団を確実且つ効率的に生成する手段の設計を容易にした。この使用として、とりわけ、対象の多系列能細胞の、インビトロ若しくはインビボでの指向性分化、及び本発明の多系列能細胞又はそれに由来するより完全に分化した細胞集団の投与を介した広範な状態の治療的又は予防的処置が挙げられる。また、容易にしたのは、これらの細胞が曝され得る潜在的処置又は培養レジームの治療的影響及び/又は毒性を試験する、インビトロベースのスクリーニング系の設計である。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で出願人によって参照される刊行物の文献詳細が、本明細書の最後にアルファベット順に集められている。
【０００３】
本明細書中でのあらゆる先行刊行物(又はこれに由来する情報)、又は知られているあらゆる事項への言及は、当該先行刊行物(又はこれに由来する情報)、又は知られている事項が、本明細書が関係する努力傾注分野における通常の一般的知識の一部を形成するという容認でも承認でもなければ、いかなる形態の示唆でもないし、そのようなものとして解釈されるべきでもない。
【０００４】
哺乳類の幹細胞及びプロジェニター細胞の同定、単離、及び生成における関心は相当なものである。「幹細胞」及び「プロジェニター細胞」への言及は通常、あらゆる細胞型(生殖細胞を含む)を生成することができる全能性細胞、及びより限られた種類の成熟細胞系列を生成することができる多能性前駆細胞の双方を含む、多種多様な細胞型を包含するものと理解される。一部の前駆細胞型は、更にもっと分化性であり、特定の細胞系列の細胞を生成することができる前駆体に相当する。これらの能力は、完全な臓器及び組織の発達に必須の全ての細胞分化及び専門化の基礎として役立つ。
【０００５】
この発生経路の選択された態様をインビトロで再現することに関して、幹細胞の単離及び培養に多くの関心が寄せられてきた。例えば、胚盤胞内部細胞塊に由来する細胞を培養して、頻繁に分離及び継代培養を繰り返すことによって、胚性幹細胞が確立され得る。適切な条件下で、インビトロ培養が維持され得る一方で、幹細胞の正常な核型及び全能性の双方が維持され得る。特定の系列に沿う幹細胞の分化を促進することに関して、かなりの進展もあった。ヒトからES細胞が単離されたが、これを研究及び治療に用いるのは倫理的配慮によって妨げられている。
【０００６】
成体組織もまた、自己複製し、不可逆性の最終分化を経る娘細胞を生成し得る幹細胞の集団を含有する(Science、287、1442〜1446頁、2000)。最もよく特徴付けられているのは、造血幹細胞及びその後代であるが、幹細胞は、間葉系細胞、ニューロン細胞、及び造血細胞(Science、284、143〜147頁、1999;Science、287、1433〜1438頁、2000;J. Hepatol.、29、676〜682頁、1998)を含む殆どの組織において同定されている。間葉系幹細胞が、骨、軟骨、脂肪、筋肉、及び骨髄間質を含む間葉系組織への分化能を有する骨髄における接着性の線維芽細胞様細胞として同定されている(Science、284、143〜147頁、1999)。間葉系幹細胞に類似する形態学的特徴及び表現型特徴、並びに分化能を有する間葉系プロジェニターが、臍帯血(Br. J. Haematol.、109、235〜242頁、2000)、胎児末梢血(Blood、98、2396〜2402頁、2001)、及び成体末梢血(Arthritis Res.、2、477〜488頁、2000)において、非常に低い頻度で報告されている。
【０００７】
このため、分化は常に、機能が明らかに定義され、寿命が限られている最終分化体細胞の表現型を最終的に達成するように、多くの遺伝子の制御による幹細胞の直線的な進行(linear progression)の形態をとると想定されてきた。そのような細胞の例として、赤血球、破骨細胞、島細胞、及び血小板が挙げられる。幹細胞は、分裂し、自己再生し、特定の体細胞系列に拘束される娘細胞をもたらす(非対称分裂)と考えられている。また、適切な環境条件下で、幹細胞は、2倍の幹細胞プールをもたらすように対称分裂し得るとも考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,763,194号
【特許文献２】米国特許第5,985,653号
【特許文献３】米国特許第6,238,908号
【特許文献４】米国特許第5,512,480号
【特許文献５】米国特許第5,459,069号
【特許文献６】米国特許第5,763,266号
【特許文献７】米国特許第5,888,807号
【特許文献８】米国特許第5,688,687号
【特許文献９】米国特許第6,387,369号
【特許文献１０】米国特許出願公開第20020094573A1号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science、287、1442〜1446頁、2000
【非特許文献２】Science、284、143〜147頁、1999
【非特許文献３】Science、287、1433〜1438頁、2000
【非特許文献４】J. Hepatol.、29、676〜682頁、1998
【非特許文献５】Br. J. Haematol.、109、235〜242頁、2000
【非特許文献６】Blood、98、2396〜2402頁、2001
【非特許文献７】Arthritis Res.、2、477〜488頁、2000
【非特許文献８】Kim S.S.及びVacanti J.P.、1999、Semin Pediatr Surg. 8:119
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それでもやはり、幹細胞の効率的且つ確実な単離、維持、特に増殖は、依然として実現が難しいままである。したがって、幹細胞の単離、維持、及び分化を効率的に再現性よく促進する新しい手段を開発することがいまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に至るまでの研究において、幹細胞増殖は必ずしも、幹細胞の再生と、特定の系列から最終分化までに沿う関連娘細胞の直線的分化の双方を実現する非対称幹細胞分裂によって生じる必要はないと判断した。むしろ、増殖は、成熟細胞から多系列能を有する細胞への逆行によって達成され得る。本発見は今や、多系列能を示す細胞を確実且つ効率的に生成する手段の開発を容易にし、これによって、幹細胞集団及び/又はそこから分化した体細胞が臨床用途及び研究用途に利用可能となり得る、価値ある機構が実現される。
【００１２】
後に続く本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、文言「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」等の変形は、明示される整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の排除を意味しないと理解される。
【００１３】
本明細書中で用いられる用語「に由来する」は、特定の完全体又は完全体の群が、特定された種から生じたものの、特定された源から必ずしも直接的に得られたわけではないことを示すととられるものとする。更に、本明細書中で用いられる単数形の「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明白に別の意味に解釈すべき場合を除き、複数の語の指示対象を含む。
【００１４】
定義される場合を除き、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
本発明の一態様は、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法を対象とする。
【００１６】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００１７】
別の態様において、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合のリンパ球懸濁液であって、リンパ球がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、リンパ球懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単球細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００１８】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００１９】
更に別の態様において、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の末梢血由来単球懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、末梢血由来単球懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００２０】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００２１】
更に別の態様において、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持され、多系列能細胞が、造血分化能及び/又は間葉系分化能を示す、方法が提供される。
【００２２】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００２３】
更に別の態様において、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜20%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００２４】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００２５】
更なる態様において、ヒト多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合のヒト末梢血単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、ヒト末梢血単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００２６】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００２７】
本発明の別の更なる態様において、哺乳類MLPC由来細胞の生成を促進する方法であって、
(i)
(a)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(b)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(c)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程であって、
前記細胞培養物が、前記単核細胞からMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、工程、並びに場合によっては
(ii)工程(i)のMLPCを刺激と接触させて、前記MLPCの分化を、MLPC由来表現型に導く工程
を含む、方法が提供される。
【００２８】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００２９】
別の更なる態様において、哺乳類MLPC由来細胞の生成を促進する方法であって、
(i)
(a)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、及びCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(b)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、並びに
(c)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程であって、
前記細胞培養物が、前記単核細胞からMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、工程、並びに場合によっては
(ii)工程(i)のMLPCを刺激と接触させて、前記MLPCの分化を造血表現型又は間葉系表現型に導く工程
を含む、方法が提供される。
【００３０】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００３１】
本発明の別の態様は、哺乳類の状態を治療的且つ/又は予防的に処置する方法であって、前記哺乳類に、本発明の方法に従って生成された有効数のMLPC、又は部分的に若しくは完全に分化したMLPC由来細胞を投与する工程を含む、方法を対象とする。
【００３２】
更に別の態様において、哺乳類における異常な造血機能又は間葉系機能によって特徴付けられる状態を治療的且つ/又は予防的に処置する方法であって、前記哺乳類に、
(i)本発明の方法に従って生成された有効数の造血幹細胞、又は部分的に若しくは完全に分化した造血幹細胞由来細胞、或いは
(ii)本発明の方法に従って生成された有効数の間葉系幹細胞、又は部分的に若しくは完全に分化した間葉系幹細胞由来細胞
を投与する工程を含む、方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様は、哺乳類の状態の処置のための医薬の製造における、本発明の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞の集団の使用を対象とする。
【００３４】
本発明の更に別の態様は、本発明の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】培養後、(A)1日目、及び(B)4日目の、CD4+PBMCの形態の写真表示である。
【図２】培養後、(A)1日目、及び(B)4日目の、CD8+PBMCの形態の写真表示である。
【図３】培養後、(A)1日目、及び(B)4日目の、CD19+PBMCの形態の写真表示である。
【図４】培養後、(A)1日目、及び(B)4日目の、CD25+PBMCの形態の写真表示である。
【図５】培養後、(A)1日目、及び(B)4日目の、CD20+PBMCの形態の写真表示である。
【図６】CD4+、CD8+、CD19+、CD20+、及びCD25+リンパ球における、(A)ネスチン、GATA結合因子-4(GATA-4)、及び顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、(B)カベオリンのタンパク質発現の写真表示である。
【図７】CD4+、CD8+、CD19+、CD20+、及びCD25+リンパ球における、(A)アクチン(コントロール)、シナプトフィジン(SYP)、及びニューロゲニン3、(B)βエノラーゼ(ENO-3)、グランザイムB(GZMB)、及び神経成長因子(NGF)のタンパク質発現の写真表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、成体幹細胞の増殖が、幹細胞の再生と、特定の体細胞系列に沿う分化の双方をもたらすために非対称幹細胞分裂を起こすことに必ずしも基づくわけではないという判断に一部は基づくものである。特に、多能性幹細胞は、Tリンパ球から供給され得、Tリンパ球は、多系列能の状態に移行するように誘導されてから、適切な刺激下で、対称分裂及び分化に至る。幹細胞の再生及び増殖をインビトロで効率的に誘導する方法が実現されていないことが、当該技術分野における特定の困難であったため、この発見はかなり重要である。したがって、本発明は、多系列能を示す幹細胞表現型への成熟哺乳類細胞の脱分化の誘導に基づく、哺乳類幹細胞のルーチン的インビトロ生成の手段を提供する。したがって、これらの発見の潜在的なインビボ適用及びインビトロ適用は、極めて広範であり、幹細胞集団のインビトロ生成、対象の幹細胞のインビトロ又はインビボでの指向性分化、これに基づく治療的又は予防的処置レジーム、並びに本発明の細胞が曝され得る潜在的処置若しくは培養レジームの有効性及び/又は毒性のインビトロ評価を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
したがって、本発明の一態様は、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法を対象とする。
【００３８】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００３９】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００４０】
「単核細胞」への言及は、単一の核を有する細胞への言及として理解されるべきである。白血球の関連において、これは主に、単球及びリンパ球を説明する。本発明は、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する単核細胞が、本発明の方法に従って培養された場合に、多系列能の状態に移行するように誘導され得るという判断を対象とする。CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する細胞への言及は、CD4抗原とCD8抗原のいずれか若しくは双方を発現する、又はCD25、CD19、若しくはCD20を発現する単核細胞への言及として理解されるべきである。これらの細胞表面分子の発現、例えば、T細胞分化中の、胸腺細胞上でのCD4及びCD8の二重陽性発現は、一時的であっても継続的であってもよい。しかしながら、CD4/CD8発現が一時的であるか継続的であるかにかかわらず、本発明の方法は、最初の培養の時点でCD4及び/又はCD8を発現している細胞の使用を対象とすると理解されるべきである。対応する意味が、CD25、CD19、又はCD20を発現する細胞に当てはまると理解されるべきである。即ち、CD25、CD19、又はCD20を一時的に、又は継続的に発現する単核細胞への言及である。但し、最初の培養の時点で、これらの細胞が、これらの細胞表面マーカーの1つを発現しているものとする。
【００４１】
本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、CD4は、ヘルパーT細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞の表面上に見出される糖タンパク質である。これは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、4つの免疫グロブリンドメイン、D1からD4を含む。CD4は代わりに、leu-3及びT4としても知られている。CD8は主に、細胞障害性T細胞の表面上に発現されるが、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、皮質胸腺細胞、及び樹状細胞上でも見出され得る。CD8は、一対のCD8鎖、最も一般的にはCD8-α鎖及びCD8-β鎖からなるダイマーの形態をとる。これらの鎖もまた双方とも、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CD8は最も一般的にはヘテロダイマーとして発現されるが、CD8-αホモダイマー等のホモダイマーもまた、一部の細胞上に発現される。CD25は、IL-2受容体のアルファ鎖である。これは、CD122と結合して、IL-2に対する高親和性受容体として作用し得るヘテロダイマーを形成する、活性化T細胞、活性化B細胞、一部の胸腺細胞、脊髄前駆体、及び乏突起膠細胞上に存在するI型膜貫通タンパク質である。CD25は、調節T細胞を同定するマーカーとして用いられてきたが、一部の休止状態の記憶T細胞が、ヒトにおいて、CD25を構成的に発現することが見出された。CD19遺伝子は、Bリンパ球の抗原受容体とアセンブルして、抗原受容体依存性の刺激についての閾値を低下させる細胞表面分子をコードする。これは、ろ胞樹状細胞及びB細胞上に発現される。実際、これは、発達中に、最も初期の認識可能なB系列細胞からB細胞ブラストまで、B細胞上に存在する。しかしながらこれは、形質細胞への成熟の際に失われる。これは主に、CD21及びCD81と併せて、B細胞共受容体として作用する。活性化と同時に、CD19の細胞質尾部はリン酸化されて、Src-ファミリーキナーゼ、及びPK-3キナーゼの補充によって、結合に至る。本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、CD20は、全てのB細胞の表面上に発現される活性化-グリコシル化リンタンパク質であり、プロBフェーズから始まって、成熟まで濃度が次第に増大する。
【００４２】
したがって、一実施形態において、前記CD4+及び/又はCD8+単核細胞は、胸腺細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、マクロファージ、又は樹状細胞である。
【００４３】
別の実施形態において、前記CD25+細胞は、調節T細胞又は記憶T細胞である。
【００４４】
更に別の実施形態において、前記CD19+細胞は、任意の分化段階のB細胞である。
【００４５】
この目的で、「CD4」、「CD8」、「CD25」、「CD19」、及び「CD20」への言及は、CD4、CD8、CD25、CD19、及びCD20の全ての形態への、及び、これらの分子のmRNAの択一的スプライシングから生じ得る異性体の形態を含む、これらの分子の機能的突然変異体又は多型の形態への言及として理解されるべきである。「CD4」、「CD8」、「CD25」、「CD19」、及び「CD20」への言及はまた、細胞表面上に発現され得る全ての前駆体、プロタンパク質、又は中間体の形態を含む、これらの分子の全ての形態への言及を含むと理解されるべきである。ダイマー、マルチマー、又は融合タンパク質として存在するかにかかわらず、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20のあらゆる細胞表面分子にまで拡張されることも理解されるべきである。
【００４６】
本明細書中で詳述されるように、CD4、CD8、CD25、CD19、及びCD20分子は圧倒的に、リンパ球及びNK細胞上で大規模に発現される。「リンパ球」への言及は、関連するCD分子の分化の発達段階、又は発現レベルにかかわらず、あらゆるリンパ球又はNK細胞への言及として理解されるべきである。
【００４７】
本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、胸腺細胞は、胸腺中に存在する造血プロジェニター細胞である。これは、細胞表面マーカーの発現に基づいて、いくつかの異なる成熟段階に分類される。最も初期の胸腺細胞段階は、「二重陰性」段階(即ち、CD4及びCD8の双方が陰性)であり、これはまた、系列陰性(lineage-negative)とも記載され、4つの亜段階に分割され得る。次の主要段階は、「二重陽性」段階(即ち、CD4及びCD8の双方が陽性)である。成熟の最終段階は、単独陽性段階(CD8又はCD8のいずれかが陽性)である。
【００４８】
胸腺細胞は、骨髄造血プロジェニター細胞に由来する。胸腺に入った後、プロジェニターは初期のリンパプロジェニター集団を生成するように増殖する。この工程は、皮髄境界部から胸腺嚢(thymus capsule)に向けて移動するCD4-/CD8-胸腺細胞の生成が後に続く。増殖に加えて、分化及びT系列拘束が、CD4-/CD8-胸腺細胞集団内で生じる。拘束、又は代替系列能(脊髄、B及びNKの系列能等)の損失もまた、この段階にて生じる。T系列拘束の後、胸腺細胞はβ-選択を受ける[6]。外来抗原を認識するT細胞の能力は、T細胞受容体によって媒介され、これは、MHCによって提示される短いタンパク質ペプチドを認識することが可能な表面タンパク質である。
【００４９】
殆どの遺伝子は、これらを発現する、各細胞中の安定した配列を有するが、それらとは異なり、T細胞受容体は、一連の代替遺伝子フラグメントで構成される。機能的T細胞受容体を創出するために、二重陰性の胸腺細胞は、TCR遺伝子再編成を受ける。TCR再編成は、2工程で起こる。第一に、TCRβ鎖が、T細胞発達のCD4-/CD8-段階にて再編成される。TCRβ鎖は、プレTαと対形成されて、プレTCRが生じる。再編成プロセスにおける細胞の不利点は、T細胞受容体遺伝子フラグメントの多くの組合せが機能しないということである。機能しないT細胞受容体を構成した胸腺細胞を除外するために、機能的プレTCRをもたらすようにベータ鎖を首尾よく再編成した細胞のみが、CD4-/CD8-段階を越えて発達することが許される。機能的プレTCRをもたらすことができない細胞は、アポトーシスによって除外される。
【００５０】
以下のβ選択胸腺細胞は、CD4+CD8+二重陽性細胞に分化してから、TCRα再編成を受けて、完全にアセンブルされたTCRとなる。しかしながら、これらのT細胞受容体の多くは依然として、MHCと結合することができないために、機能しない。したがって、胸腺細胞発達の次の主要段階は陽性選択であり、そこで、MHCと結合することができるT細胞受容体を発現する胸腺細胞のみが維持される。
【００５１】
陽性選択された二重陽性胸腺細胞はその後、系列拘束を受けて、CD8+T細胞又はCD4+T細胞に成熟する。その後、陰性選択があって、自己反応性胸腺細胞が除外される。成熟プロセスが完了すると、T細胞は胸腺を出て、末梢血流に入る。
【００５２】
T調節細胞に関して、これは、胸腺内での細胞との相互作用による二重陽性段階にて選択されて、Foxp3の転写を開始して、Treg細胞になるが、機能的Tregになる単独陽性段階まで、Foxp3を発現し始めることはできない。Tregは、NKT又はγδT細胞のTCR発現の制限を示さず、エフェクターT細胞よりも大きなTCR多様性を示し、自己ペプチドに偏る。Treg選択のプロセスは、自己ペプチドMHC複合体との相互作用の親和性によって判定される。Tregになるための選択は、「ゴルディロックス」プロセスである。具体的には、非常に強いシグナルを受けるT細胞がアポトーシス死を受ける一方、弱いシグナルを受ける細胞が生存して、エフェクター細胞になるように選択される。T細胞が中間シグナルを受ける場合、調節細胞になる。T細胞活性化のプロセスの確率的性質のために、所与のTCRを有するT細胞集団は全て、Teff及びTregの混合物が得られて終わり、つまり、相対的割合が、T細胞の、自己ペプチド-MHCに対する親和性によって判定される。
【００５３】
ナチュラルキラー(NK)細胞は、T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞双方の特性を共有するT細胞の異質群である。これらの細胞の多くは、自己及び外来の脂質及び糖脂質と結合する抗原提示分子である非多型CD1d分子を認識する。これらは、全末梢血T細胞のおおよそ0.1%しか構成しない。NK細胞は、αβT細胞受容体(TCR)を共発現するが、NK細胞、例えばNK1.1と典型的に関連する種々の分子マーカーも発現する。最もよく知られているNK細胞は、TCRが多様性についてよりはるかに限定されるという点で、従来のαβT細胞と異なる(「インバリアント」又は「1型」NK)。これら及び他のCD1d制限T細胞(「2型」NK)は、ペプチド-MHC複合体ではなく、抗原提示分子のCD1ファミリーのメンバーであるCD1d分子によって提示される脂質及び糖脂質を認識する。そのようなものとして、NK細胞は、結核を引き起こすマイコバクテリウム等の生物由来の糖脂質を認識する際に重要であることが知られている。
【００５４】
B細胞発達は、いくつかの段階を通して起こり、各段階は、抗体遺伝子座にて、ゲノム含有量の変化を表す。抗体は、2つの同じ軽鎖及び2つの同じ重鎖で構成され、これらを規定する遺伝子が、「V」(可変)領域及び「C」(定常)領域において見出される。重鎖「V」領域では、3つのセグメント;V、D、及びJがあり、これらは、VDJ組換えと呼ばれるプロセスにおいてランダムに組み換えられて、個々のB細胞において免疫グロブリン中に固有の可変ドメインをもたらす。2つのセグメント:V及びJしか含まれないこと以外、同様の再編成が、軽鎖「V」領域について起こる。以下の表は、B細胞発達の様々な段階での、免疫グロブリン形成のプロセスを記載する。
【００５５】
【表１】
2017518055.tif 000002
【００５６】
B細胞は、成熟プロセスのいずれかの工程において失敗があると、クローン消失によって死ぬ。B細胞は、骨髄中で連続的にもたらされる。T細胞のように、未熟B細胞が、骨髄を出る前に、免疫系による自己反応性について試験される。骨髄において、中枢性トレランスがもたらされる。B細胞受容体が自己抗原にあまりに強く結合する未熟B細胞は、成熟できない。B細胞が自己に対して高度に反応性であることが見出されれば、3つの機構が起こり得る。
・クローン消失:特定の自己抗原特異性を持ったB細胞の、通常はアポトーシスによる、除去。
・受容体編集:自己反応性B細胞の受容体は、その配座を再編成する機会が与えられる。このプロセスは、組換え活性化遺伝子の継続的な発現を介して起こる。RAGの助力により、受容体編集は、B細胞受容体の軽鎖遺伝子再編成に関わる。受容体編集が、あまり自己反応性でない受容体をもたらすことに失敗すれば、アポトーシスが起こる。
・アネルギー:B細胞は、小さくて可溶性である、弱く架橋結合する自己抗原と結合する場合、永久無応答性の状態に入る。
B細胞型は、以下を含む:
・形質B細胞(形質細胞(plasma cell)、形質細胞(plasmocyte)、及びエフェクターB細胞としても知られる)は、抗原に曝されてきた大細胞型B細胞であり、大量の抗体を産生且つ分泌する。これは、短命な細胞であり、免疫応答を誘導した惹起剤が除去されると、アポトーシスを受ける。これは、生存のために必要とされる、種々のコロニー刺激因子への継続的な曝露の停止のために起こる。
・記憶B細胞は、一次免疫応答中に直面した抗原に特異的な活性化B細胞から形成される。この細胞は、長期間生きることが可能であり、同抗原への第2の曝露後に素早く応答することができる。
・B-1細胞は、IgMをIgGよりも大量に発現し、その受容体は、多特異性を示し、このことは、多くの異なる抗原に対する親和性が低いことを意味する。多特異的免疫グロブリンは多くの場合、他の免疫グロブリン、自己抗原、及び一般的な細菌多糖類に対する選好性を示す。
・B2細胞
・辺縁帯B細胞
・ろ胞B細胞
・調節B細胞は、免疫調節に関与するB細胞である。Bregsのサブセットが、B-1及びB-2双方の細胞集団内に見出される。最もよく記載される2つの表現型は、ヒトにおけるB10(CD5+CD1d+)サブセット及びCD24+CD38+サブセットである。
【００５７】
CD4+及び/若しくはCD8+又はCD25+「リンパ球」への言及は、発達の任意の分化段階にあるリンパ球への言及として理解されるべきであり、二重陽性及び単独陽性の胸腺細胞、並びに成熟T細胞(ナイーブ、記憶、及び活性化T細胞、並びにNK細胞を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。やはり本発明をいかなる形であれ限定するものではないが、殆どのT細胞がαβT細胞受容体を発現するが、γδT細胞受容体細胞の亜集団が、CD4又はCD8をも発現すると判断した。したがって、あらゆるリンパ球は、γδ又はαβにかかわらず、CD4又はCD8の一方又は双方を発現するならば、本発明の方法の範囲内に入ると理解されるべきである。同様に、CD19+リンパ球への言及は、分化のあらゆる段階にあるB細胞に言及すると理解されるべきである。
【００５８】
別の実施形態において、前記単核細胞は、リンパ球である。
【００５９】
本実施形態に従えば、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合のリンパ球懸濁液であって、リンパ球がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、リンパ球懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単球細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００６０】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００６１】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００６２】
一実施形態において、前記リンパ球は、二重陽性のCD4+/CD8+胸腺細胞である。
【００６３】
別の実施形態において、前記リンパ球は、単独陽性のCD4+T細胞又はCD8+T細胞である。
【００６４】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD8+NK細胞である。
【００６５】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD25+T調節細胞である。
【００６６】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD19+B細胞である。
【００６７】
更に別の実施形態において、前記単核細胞は、CD20+細胞である。
【００６８】
本発明の単核細胞は、末梢血及び脾臓を含む任意の適切な組織から供給され得ることが理解されるべきである。
【００６９】
更に別の実施形態において、前記単核細胞は、末梢血に由来する。
【００７０】
本実施形態に従えば、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の末梢血由来単球懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、末梢血由来単球懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００７１】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００７２】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００７３】
一実施形態において、前記単核細胞は、リンパ球である。
【００７４】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、単独陽性のCD4+T細胞若しくはCD8+T細胞、CD8+NK細胞、CD25+T細胞、CD19+B細胞、又はCD20+B細胞である。
【００７５】
先に詳述されるように、成熟体細胞、具体的にはリンパ球等の単核細胞が、多系列分化能の状態に移行するように誘導され得ると判断した。したがって、「多系列分化能」又は「多系列能」を示す細胞への言及は、1つ超の体細胞分化経路に沿って発達する能力を示す細胞への言及として理解されるべきである。例えば、細胞は、広範な体細胞型を生成することができ、そのような細胞は通常、多能性又は多分化能性であると呼ばれる。これらの細胞は、全能性細胞よりも限られた範囲の系列への拘束を示し、後者は、全ての体細胞系列及び配偶子を含む、本来的に可能性があるあらゆる分化方向に発達し得る細胞である。本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、幹細胞は、生後組織に由来する限り、多くの場合「成体幹細胞」とも呼ばれる。「プロジェニター(progenitor)」細胞又は「前駆(precursor)」細胞と古典的に呼ばれる多くの細胞もまた、適切な刺激条件下で、1つ超の体細胞系列の細胞を生成し得るということに基づいて、「多系列分化能」の定義の範囲内に入り得る。本発明の方法によって生成される細胞に関して本明細書中で「幹細胞」に言及する限り、これは、本明細書中に定義される多系列分化能を示す細胞への言及として理解されるべきである。
【００７６】
本発明の一実施形態において、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞が、複数の異なる系列、例えば造血系列又は間葉系列に沿って分化する能力を示す多系列分化能の表現型に移行するように誘導され得ると判断した。例えば、適切な刺激下で、対象の多分化能性細胞が、単核造血細胞(リンパ球又は単球等)、多形核造血細胞(好中球、好塩基球、又は好酸球等)、赤血球、若しくは血小板を含む造血系列に分化するように、又は間葉系列に沿って、例えば結合組織、例えば骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、及び脂肪に分化するように導かれ得る。適切な刺激の存在下で、これらの細胞はまた、他の系列、例えばニューロン系列に沿って分化するように誘導され得る。本発明の方法に従って生成される多系列能細胞の全てが、いくつかの異なる出発集団の1つに由来し得るが、これら全てが、複数の系列に沿って分化する能力を示すことも理解されるべきである。本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、本発明のCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20の出発細胞から生成される多系列細胞は、固有の表現型プロファイルを示す。これらの細胞の全てが多分化能を示すが、これらの細胞は、もしあれば、特定の細胞外刺激がない場合に、特定の系列に沿って分化し易いそれらの素因に関して、機能的な差異を示し得る。しかしながら、特定の刺激が提供される場合、分化はあらゆる所望の系列に沿って導かれ得る。
【００７７】
したがって、本発明の一実施形態は、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持され、多系列能細胞は、造血分化能及び/又は間葉系分化能を示す、方法を対象とする。
【００７８】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００７９】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００８０】
別の実施形態において、前記CD4+由来多系列能細胞は、CD44+及びCD45+を発現する。
【００８１】
更に別の実施形態において、前記CD8+由来多系列能細胞は、CD45+及びCD47+を発現する。
【００８２】
更に別の実施形態において、前記CD25+由来多系列能細胞は、CD23+を発現する。
【００８３】
更に別の実施形態において、前記CD19+由来多系列能細胞は、CD44+及びCD45+を発現する。
【００８４】
より好ましくは、前記造血分化能は、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、又は血小板に分化する能力であり、前記間葉分化能は、骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、又は脂肪の細胞に分化する能力である。
【００８５】
本明細書中で用いられる用語「哺乳類」及び「哺乳類の」は、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ペット(例えば、イヌ、ネコ)、及び捕えられた野生動物(例えば、カンガルー、シカ、キツネ)を含む。好ましくは、哺乳類はヒト又は実験動物である。更により好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００８６】
CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞、例えば単球の、多系列能表現型への「移行」の誘導への言及は、体細胞表現型を、本明細書中で定義される型の多系列能表現型に変えるのに必要とされる遺伝的変化、形態的変化、及び/又は機能的変化の誘導への言及として理解されるべきである。
【００８７】
CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の、多系列能細胞へのインビトロ脱分化を誘導することに関して、これは、小規模インビトロ組織培養の関連においても、大規模バイオリアクター生産の関連においても、達成され得る。
【００８８】
先に詳述されるように、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の、多系列能細胞への移行は、前記細胞を固有の細胞培養レジームにインビトロでかけることによって、達成され得ると判断した。具体的には、単核細胞の出発試料が、特定の割合で、アルブミン及び細胞培養培地と共に培養される。これは、本方法の特定の利点である。というのも、殆どの細胞培養系とは異なり、本培養物の確立は、細胞数の決定及び細胞濃度の適切な調整を伴うような特定の濃度の細胞培養に基づかずに、容量内の細胞の実際の数に拘らないおおよその容量割合での培養物の設計に基づくからである。このことは、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の出発容量がどのようなものであれ、利用可能であるのか、又は機能させるのに都合が良いのかに基づいて、本方法を実行するのに非常に単純且つルーチン的にする。
【００８９】
したがって、本発明のインビトロ細胞培養系は、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞懸濁液のおおよその出発容量で確立される。「懸濁液」への言及は、非接着細胞の試料への言及として理解されるべきである。これらの細胞は、生存能力のある状態で細胞を維持する任意の適切な媒体、例えば等張液(例えば、PBS、生理食塩水、ハンクスの平衝塩溶液、又は他の平衝塩溶液の変形)、細胞培養培地、又は体液(例えば血清)等中に含有されてよい。対象の細胞は、他の方法、例えば陽性磁気ビーズ分離又は陰性磁気ビーズ分離による富化又は処理を受けていてよく、これは、種々の異なる等張液のいずれか1つに含有されるCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の最終懸濁液もたらすであろうが、利用される方法の性質次第である。得られる細胞の実際の濃度にかかわらず、この懸濁液の任意の適切な容量が用いられて、本発明の培養物が確立され得る。この容量は、用いようとする培養系のタイプに基づいて選択される。例えば、フラスコベース系、バッグベース系、又はローラーボトルベース系で培養するならば、最大約1リットルの小容量が、細胞培養物全体を形成する可能性がある。しかしながら、バイオリアクターの関連において、かなり大容量の細胞培養物が収容され得、これによって、より多くの出発容量が用いられ得る。利用される特定の細胞培養系の関連で用いるのに適切な最終の細胞培養物容量を決定することは、十分、当業者の技術範囲内である。
【００９０】
本発明の細胞培養物を初めに確立する工程に関して、培養を受ける細胞培養物の最終容量は、約15v/v%の5%〜85%のアルブミン溶液及び約70v/v%の細胞培養培地と共に、約15v/v%のCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞懸濁液から構成される。本明細書中で詳述されるように、これらのパーセンテージ値への言及は、これらの特定のパーセンテージからの幾分のずれが許容可能であり、且つ機能的に等価の割合を実現する限り、概算である。上記のパーセンテージ値からの幾分のずれがどの程度可能か決定することは、例示される培養系の非常に単純且つルーチン的な性質に基づいて、十分、当業者の技術範囲内である。例えば、約20v/v%から40v/v%の単核細胞懸濁液、及び5〜40%、特に10%〜40%、15%〜40%、20%〜40%、又は約15%の5%〜85%のアルブミン溶液が有効であり得ると予想され得る。対象のアルブミン溶液に関して、約4%から90%、又は5%〜86%、好ましくは5%〜7%の溶液が等しく有効であり得る。30%〜60%、例えば30%〜40%の細胞培養培地が用いられ得る。
【００９１】
本発明をいかなる形であれ限定するものではないが、非常に広い範囲にわたるアルブミン濃度が、本発明の方法に有効であると判断した。したがって、5%〜85%、5%〜80%、5%〜75%、5%〜70%、5%〜65%、5%〜60%、5%〜50%、5%〜45%、5%〜40%、5%〜35%、5%〜30%、5%〜25%、5%〜20%、5%〜15%、5%〜10%の濃度範囲を用いることができる。一実施形態において、前記濃度は5%〜20%である。
【００９２】
したがって、本発明の一実施形態は、哺乳類多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(ii)20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜20%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜50v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法を対象とする。
【００９３】
一実施形態において、前記CD4+又はCD8+単核細胞懸濁液は、30v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００９４】
別の実施形態において、前記CD19+単核細胞懸濁液は、40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、20v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、40v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００９５】
更に別の実施形態において、前記CD25+単核細胞懸濁液は、20v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、40v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００９６】
更に別の実施形態において、前記CD20+単核細胞懸濁液は、20v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、40v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００９７】
更に別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【００９８】
別の実施形態において、前記アルブミン溶液濃度は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。
【００９９】
本発明は、特に先の実施形態に関して、本明細書中で詳述されるパーセンテージ値を厳守することによって限定されるべきではなく、本発明の機能性を保持し、当業者によってルーチン的且つ容易に評価され得るこれらのパーセンテージの変動をその範囲内に含む。
【０１００】
先に詳述されるように、出発細胞懸濁液内のCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の濃度は、任意の細胞数であってよい。当該細胞数が相対的に低いか相対的に高いかにかかわらず、本発明の重要な態様は、出発細胞懸濁液が、当該懸濁液内の細胞濃度にかかわらず、出発細胞培養物の総容量の15〜40v/v%であることである。それでもやはり、好ましい実施形態において、出発細胞濃度に下限も上限もないけれども、細胞数は、培養コンテナにおいてこれらの単核細胞が培養中に接着する表面積が不十分とならないように、多くあるべきでないことが示唆される。本方法は、それでもやはり、これらの細胞が接着するための表面積が不十分であり得るような出発細胞濃度の高さである限り、多系列分化能を示す細胞を首尾よくもたらすけれども、接着することができない当該細胞は幹細胞に脱分化せず、これによって、本方法は有効であるけれども、最適に効率的ではないことを簡単に観察することができる。したがって、この点に関しては、効率を最大にする観点から、存在する全細胞が、用いるのに選択される特定の組織培養コンテナに接着することが可能である環境内で、出発細胞培養物の一部を形成する細胞濃度が培養されることを確実にすることが期待できる。例えば、培養バッグコンテナを用いる場合、106細胞/ml以下の細胞濃度が適切である。
【０１０１】
用いられるアルブミン溶液に関して、6%のアルブミン溶液が一般的に市販されているが、それ以外の方法で、任意の適切な等張液、例えば生理食塩水中に構成されてもよい。「アルブミン」への言及は、蒸留水及び半飽和硫酸アンモニウム溶液中に可溶性であるが、完全飽和硫酸アンモニウム溶液中に不溶性である球状タンパク質の群への言及として意図されることが理解されるべきである。例えば、血清の主要タンパク質である血清アルブミンは、本発明の方法の関連で用いられ得る。しかしながら、ラクトアルブミン又はオバルブミン等の任意のアルブミン分子が利用され得ることが理解されるべきである。アルブミンの任意の合成組換え体又は誘導体の形態もまた、本発明の方法において用いられ得ることも理解されるべきである。6%のアルブミン溶液を、例えば本発明の出発培養物容量の15v/v%の割合で用いることによって、0.9%のアルブミン有効濃度が達成されることが当業者によって理解される。
【０１０２】
出発培養物容量の残りは細胞培養培地で構成され、これは、出発細胞培養物容量の好ましくは30〜80v/v%を形成する。「細胞培養培地」への言及は、哺乳類細胞の成長を支援するように設計されている液体又はゲル、特に幹細胞培養を支援する培地への言及として理解されるべきである。この目的で、任意の適切な細胞培養培地が用いられてよく、細胞成長に必要とされる最小の栄養分を提供する最小培地、又は哺乳類細胞の生存度及び成長の維持を促進するための付加的な栄養分を含有してよい富化培地が挙げられる。使用に適した培地の例として、DMEM及びRPMIが挙げられる。細胞の生存度及び成長の維持を促進するアミノ酸又は糖等の付加的な選択された作用物質を含有する補完最小培地を用いてもよい。培地は、任意の他の適切な作用物質、例えば抗生物質が更に補われてもよい。別の例において、細胞培養培地は、細胞生存度及び成長を更に支援するために、インシュリンが補われる。30〜80v/v%の細胞培養培地への言及は、出発CD4、CD8、CD25、CD19若しくはCD20単核細胞、又はアルブミンが懸濁している等張液にかかわらず、例えば生理食塩水であろうと最小培養培地であろうと、溶液の性質によって影響を与えられない独立した要件であると理解されるべきである。実際、本発明の培養系への導入に先立って単核細胞が初めに懸濁する、又はアルブミンが溶解する溶液の性質にかかわらず、出発細胞培養集団の総容量のパーセンテージとして30〜80v/v%の細胞培養培地の要件が変化しないままであることが、本発明の特定の利点である。
【０１０３】
一実施形態において、前記細胞培養物は、10mg/Lインシュリンを更に含む。
【０１０４】
先に詳述されるように、本発明の方法は、単核細胞の、間葉系/造血幹細胞表現型への脱分化を誘導するために、細胞培養培地及び5%〜85%のアルブミン溶液と共に、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の集団を特定の割合で培養することに基づく。前記CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞は、対象の幹細胞表現型が達成される時点まで、インビトロで培養される。一実施形態において、3〜8日、特に4〜7日の培養期間が、対象の幹細胞を生成するのに適していると判断した。インビトロ培養された細胞をサンプリングして、必要な程度の脱分化が起こったか否かを判定するのは、十分、当業者の技術範囲内であると理解される。温度及びCO2パーセンテージの双方に関して、細胞を培養する最も適切な条件の決定もまた、十分、当業者の技術範囲内である。本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、ヒトCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞を培養する場合、4〜5日のインキュベーションが特に適していると判断した。培養は、数日の培養期間にわたって良好な細胞の生存度及び成長を維持するのに適切であると考えられる条件下で進行してよい。この目的で、適切な細胞培養条件を確立することは、当業者にとってルーチン的な手順の事項であることが理解される。
【０１０５】
したがって、一実施形態において、ヒト多系列能細胞を生成する方法であって、
(i)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合のヒト末梢血単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、ヒト末梢血単核細胞懸濁液、
(ii)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(iii)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程を含み、
前記細胞培養物が、前記単核細胞から多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【０１０６】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【０１０７】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【０１０８】
一実施形態において、前記アルブミン溶液は、5%〜20%、好ましくは5%〜15%である。
【０１０９】
一実施形態において、前記細胞培養物は、10mg/Lヒトインシュリン、又はその機能的フラグメント若しくは等価物を更に含む。
【０１１０】
別の実施形態において、前記細胞は、4から7日間、特に4から5日間、又は3から6日間培養される。
【０１１１】
先に詳述されるように、本発明は、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞の単離集団にインビトロで実行される。この目的で、対象の細胞が、個体(処置の対象であってよい個体等)から新たに単離されていてもよいし、新鮮でない源から、例えば(例えば、細胞数が増大され、且つ/又は細胞が、分化シグナルを受け入れるように培養された)培養物から、又は、個体から、若しくは別の源から幾分早い時点にて単離された細胞(例えば、確立されたT細胞系統)の凍結ストックから供給されていてもよいことが理解されるべきである。また、対象の細胞が、一部の他の形態の処理又は操作、例えば、これらに限定されないが、富化若しくは精製、細胞周期の状態の修正、又は細胞系統の形成を受けていてもよいことが理解されるべきである。したがって、対象の細胞は、一次細胞であっても二次細胞であってもよい。一次細胞は、個体から単離されたものである。二次細胞は、単離の後に、本発明の方法の適用に先立って、一部の形態のインビトロ操作、例えば細胞系統の調製を経たものである。また、出発CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20単核細胞集団は、比較的純粋であってもよいし、異質の細胞集団、例えば末梢血球集団の一部であってもよいことが理解されるべきである。これについては以降で更に議論される。
【０１１２】
関連する態様において、本発明の方法はまた、本発明の方法によってもたらされる多系列能細胞(MLPC)の、より成熟した表現型への分化を誘導するように適合されてもよいことが理解されるべきである。例えば、本発明の一実施形態の関連で、造血幹細胞は、全ての血球(例えば赤血球、血小板、リンパ球、単球、及び顆粒球)を生成する一方、間葉系幹細胞は、骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、及び脂肪を含む多種多様な結合組織を生成する。本発明の方法が、間葉能及び造血能の双方を備えるMLPCをもたらす限り、本発明の方法は、目的の系列に沿う部分的な、又は完全な分化をもたらすのに必要とされる特定の刺激に対象のMLPC集団を導入する更なる工程を含むように、インビトロ又はインビボで適合されてよい。
【０１１３】
また、この付加的な指向性分化イベントは、インビトロで好都合に実行されるが、インビボでも達成され得ることも理解されるべきである。これについては以降でより詳細に議論される。しかしながら、特定のインサイチュ環境もまた、特定の系列に沿うMLPCの分化を導くのに必要とされるシグナルの範囲を好都合に提供し得る。
【０１１４】
したがって、「MLPC由来細胞」への言及は、MLPCよりも分化性であり、前記MLPCから生成された細胞型への言及として理解されるべきである。これらの細胞は、MLPCが、例えば造血幹細胞の関連において血球、及び間葉系幹細胞の関連において結合組織を生成することが知られている系列の細胞に相当する。対象のMLPC由来細胞は、造血幹細胞又は間葉系幹細胞等の細胞系列の特定のサブグループに沿う分化に不可逆的に拘束される、より分化性の前駆細胞であってもよいし、例えば赤血球又はリンパ球等の特定の細胞系列の、部分的に、又は最終的に分化した形態に相当してもよいことが理解されるべきである。したがって、本発明の本態様の範囲内に入る細胞は、発達の任意のポストMLPC分化段階にあり得ることが理解されるべきである。先に詳述されるように、この更なる分化は、構成的に生じてもよいし、1つ又は複数の更なるシグナルを必要としてもよい。これらのシグナルは、例えば小規模インビトロ組織培養若しくは大規模バイオリアクター生産の関連において、インビトロで、又は、例えば前駆細胞が、更なる分化を可能にするために適切な組織微環境中に移植されるならば、インビボ微環境で提供されてもよい。
【０１１５】
したがって、本発明の関連する態様において、哺乳類MLPC由来細胞の生成を促進する方法であって、
(i)
(a)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(b)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、及び
(c)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程であって、
前記細胞培養物が、前記単核細胞からMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間及び条件下で維持される、工程、並びに場合によっては
(ii)工程(i)のMLPCを刺激と接触させて、前記MLPCの分化を、MLPC由来表現型に導く工程
を含む方法が提供される。
【０１１６】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%、又はその機能的に等価な割合である。
【０１１７】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【０１１８】
一実施形態において、前記CD4+及び/又はCD8+単核細胞は、リンパ球、より好ましくは、末梢血由来のCD4又はCD8単独陽性T細胞である。
【０１１９】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD8+NK細胞である。
【０１２０】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD25+T調節細胞である。
【０１２１】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD19+B細胞である。
【０１２２】
更に別の実施形態において、前記リンパ球は、CD20+B細胞である。
【０１２３】
別の実施形態において、前記アルブミンは、5%〜20%である。
【０１２４】
更に別の実施形態において、前記MLPCは、造血能及び間葉能の双方を示す。
【０１２５】
したがって、本実施形態に従えば、哺乳類MLPC由来細胞の生成を促進する方法であって、
(i)
(a)10〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の単核細胞懸濁液であって、単核細胞がCD4、CD8、CD25、CD19、及びCD20を発現する、単核細胞懸濁液、
(b)5〜40v/v%又はその機能的に等価な割合の、おおよそ5%〜85%のアルブミン溶液、並びに
(c)30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合の細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養物を確立する工程であって、
前記細胞培養物が、前記単核細胞からMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間、及び条件下で維持される、工程、並びに場合によっては
(ii)工程(i)のMLPCを刺激と接触させて、前記MLPCの分化を、造血表現型又は間葉系表現型に導く工程
を含む、方法が好ましくは提供される。
【０１２６】
一実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、20〜40v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15〜40v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、30〜80v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【０１２７】
別の実施形態において、前記単核細胞懸濁液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合であり、前記5〜85%のアルブミン溶液は、15v/v%又はその機能的に等価な割合で用いられ、前記培養培地は、70v/v%又はその機能的に等価な割合である。
【０１２８】
更により好ましくは、前記造血幹細胞由来細胞は、赤血球、血小板、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、又は好酸球である。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、前記間葉系幹細胞由来細胞は、結合組織細胞、例えば骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、又は脂肪の細胞である。
【０１３０】
本発明の本態様の関連において、双方の細胞の凝集体、例えば組織(例えば、筋肉又は真皮組織)、又は細胞懸濁液(例えば、造血細胞懸濁液)がもたらされ得ることが理解されるべきである。
【０１３１】
先に詳述されるように、本発明は、幹細胞が、CD4、CD18、CD25、CD19、又はCD20単核細胞から生成され得るという判断に基づく。この目的で、これが、出発集団の全てのCD4、CD8、CD25、CD19、及びCD20細胞の移行を導くことに関連して、又はこれらの体細胞の出発集団の亜集団の移行を導くことに関連して、達成され得ることが理解されるべきである。これは、例えば、出発細胞集団の純度及び/又は異質性に依存する可能性がある。また更に、本発明の培養系は、細胞の異質集団の生成をもたらし得る。これは、例えば、出発集団の全ての細胞がMLPC表現型に移行するわけでなければ、又は全てのMLPC細胞がその後、より成熟した均質の表現型に分化するように誘導されるわけでなければ、起こり得る。出発集団の全ての細胞が必ずしも、MLPC表現型又はMLPC由来の表現型に分化し得ないため、また、得られるMLPC由来細胞アウトプットはそれ自体異質であり得るため、このことから、本発明の方法は、所望の表現型を示す細胞を同定且つ単離するスクリーニング及び選択工程の適用を必要としてよい。同定方法は、当業者に周知であり、同定方法は、これらに限定されないが、以下を含む:
(i)細胞系列に特異的な構造の検出。
細胞系列に特異的な構造の検出は、同定されるべき構造のタイプに応じて、例えば、光学顕微鏡検査、蛍光親和性標識化、蛍光顕微鏡検査、又は電子顕微鏡検査を介して実行され得る。光学顕微鏡検査は、形態的特徴、例えばリンパ球対多形核球対赤血球の核の特徴、又は多核骨格筋細胞を検出するのに用いられ得る。別の例において、未熟な心筋細胞の、直径が約10〜30μmであり、丸型の、又はロッド形状の形態的特徴を有する単核細胞が同定され得る。電子顕微鏡検査は、筋節、X帯、Z体(Z-body)、介在板、ギャップ結合、又は接着斑等の構造を検出するのに用いられ得る。蛍光親和性標識化及び蛍光顕微鏡検査は、問題の構造に特異的に結合し、且つフルオロフォアに直接的に、又は間接的にコンジュゲートする分子、一般的には抗体を蛍光標識化することによって、細胞系列に特異的な構造を検出するのに用いられ得る。そのような構造のオートメーション化された定量が、適切な検出及び計算系を用いて実行されてよい。
(ii)細胞系列に特異的なタンパク質の検出。
細胞系列に特異的なタンパク質、例えば細胞表面タンパク質又は細胞内タンパク質の検出は、例えば、蛍光親和性標識化及び蛍光顕微鏡検査を介して好都合に達成され得る。特異的なタンパク質は、全細胞及び全組織の双方において検出され得る。簡潔に、蛍光標識化された抗体が、固定された細胞上でインキュベートされて、特異的な心臓マーカーが検出される。代わりに、ウエスタンイムノブロッティング又はハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「タンパク質チップ」)等の技術も用いられ得る。この方法を介して検出され得るタンパク質は、細胞の特定の集団に特有である任意のタンパク質であってよい。例えば、前駆/プロジェニター細胞型のクラスが、1つ又は複数の細胞表面分子の発現の有無を介して区別され得る。これに関して、この方法は、いずれか1つ又は複数の分子の発現に基づく陽性選択工程又は陰性選択工程のいずれかを介して細胞型を同定するために利用され得る。より成熟した細胞は通常、文献に明確に定義される、広範な特定細胞表面タンパク質又は細胞内タンパク質の発現によって特徴付けられ得る。例えば、全ての造血細胞型の分化段階は、細胞表面分子発現パターンに関して、明確に定義されている。同様に、筋細胞及び他の間葉系由来細胞型もまた、タンパク質発現プロファイルの関連で、発達の種々の分化段階を通して明確に記録されている。この目的で、本発明のMLPCは典型的に、本明細書中に例示される広範な細胞表面マーカーを発現し、これらは、通常、単球幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、多系列能細胞、及びニューロン幹細胞に特有の細胞表面マーカーである。
(iii)細胞系列に特異的なRNA又はDNAの検出。
この方法は好ましくは、RT-PCR又はリアルタイム(qRT-PCR)を用いて達成される。代わりに、用いられ得る他の方法として、ハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「RNAチップ」)又はノーザンブロッティング若しくはサザンブロッティングが挙げられる。RT-PCRは、本質的にあらゆるタンパク質、例えば先のポイント(ii)に詳述されるタンパク質、又は分泌される、若しくはそうでなければ、ポイント(ii)に詳述される方法論を介して好都合に検出可能でないタンパク質をコードする特異的RNAを検出するのに用いられ得る。例えば、初期のB細胞分化の関連では、免疫グロブリン遺伝子の再編成が、再編成された免疫グロブリン分子の細胞表面発現に先立って、DNAレベルで検出可能である。
(iv)細胞系列に特異的な機能的活性の検出。
その機能に関して、細胞集団の分析は通常、ポイント(i)〜(iii)のスクリーニング法よりも都合の良くない方法とされているが、一部の例において、これは事実でないかもしれない。例えば、心細胞を生成しようとする限りでは、心臓に特異的な機械的収縮について、光学顕微鏡検査下で簡単にスクリーニングすることができる。
【０１３２】
本発明の方法を適用して得られる細胞の集団の特徴付けに関連して、先に詳述される技術のいずれか1つ又は複数が利用されてよいことが理解されるべきである。
【０１３３】
本発明の方法に従う培養に先立つ、CD4、CD8、CD25、CD19、若しくはCD20リンパ球の成熟体細胞集団の富化、又はそれに由来するMLPC細胞集団の単離若しくは富化の観点から、ここでも、実行され得る種々の周知の技術がある。先に詳述されるように、抗体及び他の細胞表面結合分子、例えばレクチンは、特定の細胞系列及び/又は分化段階と関連したマーカーを同定するのに特に有用である。抗体は、分離を可能にするために、固体支持体に付着してよい。しかしながら、他の細胞分離技術として、物理的特徴(密度勾配遠心分離、及び対流遠心エルトリエーション)及び生体染色特性(ミトコンドリア結合色素ローダミン123及びDNA結合色素Hoechst 33342)の差異に基づくものが挙げられる。
【０１３４】
分離の手順として、抗体又はレクチンがコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、親和性クロマトグラフィー、固体マトリックスに付着した抗体による「パニング」、又は他の都合の良い任意の技術が挙げられ得る。特に正確な分離を実現する他の技術として、蛍光活性化細胞ソーティングが挙げられ、この技術もまた、前方光散乱対側方光散乱によって識別可能な形態的特徴に基づいて、細胞の分離に適用可能である。これらの技術が、陽性選択又は陰性選択の関連で適用され得るが、付加的な陰性選択技術として、これに限定されないが、細胞溶解性、アポトーシス性、又はそうでなければ毒性の作用物質の部位指向性投与が挙げられる。これは、最も好都合には、その指向性送達を促進するための、モノクローナル抗体へのそのような作用物質のカップリングを介して達成され得る。別の例において、抗体に続く相補体投与によるオプソニン化が、同じ結果を達成し得る。
【０１３５】
これらの技術は、所望のレベルの精製又は富化を達成するように、単一ステップ又はマルチステップのプロトコルとして実行されてよい。
【０１３６】
本発明の細胞及び組織の増殖能は、例えば損傷を受けた組織を修復するための、又は治療的処置レジームの効果を試験するための所与の使用にとって必須であり得るので、十分なレベルの増殖能を示している細胞をスクリーニングすることが望ましい場合がある。細胞の増殖能の判定は、標準的な多数の技術によって実行され得る。好ましくは、増殖の判定は、3[H]-チミジン又は125I-ヨードデオキシウリジンの吸収アッセイを介して達成される。代わりに、XTT等の代謝色素を用いる比色アッセイ、又は直接細胞カウンティングも、増殖能を確かめるのに用いられ得る。増殖能はまた、細胞周期マーカー、例えばKi-67の発現を介して評価され得る。
【０１３７】
先に詳述されるように、本発明の方法は、インビトロで実行される。したがって、インビトロ技術に関して、MLPC又はMLPC由来細胞を小規模又は大規模でルーチン的且つ確実に生産する手段が今や提供される。例えば組織培養フラスコ又はバッグ内で達成され得る小規模生産に関して、これは、所与の個体に関して、及び特定の条件に関連して、細胞集団の生産に特に適し得る。大規模生産に関して、本発明の方法は、大規模ニーズを満たす実行可能な手段を提供する。本発明の方法に従って大規模生産を達成する一手段は、バイオリアクターの使用を介するものである。
【０１３８】
バイオリアクターは、培地を送達し得る培養プロセス、並びにインビボでの栄養分の濃度及び速度を模倣して制御された濃度及び速度での酸素化を実現するように設計されている。バイオリアクターは、長年にわたって市販されており、種々のタイプの培養技術を用いている。哺乳類細胞培養に用いられる様々なバイオリアクターの殆どは、単細胞型の高密度培養物の生産を可能にするように設計されているので、本発明での使用が見出される。これらの高密度系の典型的な用途は、最終産物として、細胞によってもたらされる調整培地を生産することである。これは、例えば、モノクローナル抗体のハイブリドーマ産生、及びウィルスベクター産生用のパッケージング細胞系統について、事実である。しかしながら、これらの用途は、本発明におけるような、治療の最終産物が採取細胞それ自体である用途と異なる。
【０１３９】
一旦操作可能となると、バイオリアクターは、培地フロー、酸素送達、並びに温度及びpHの制御を自動的に調節して、多数の細胞の生産を通常可能にする。ゆえに、バイオリアクターは、労力を節約し、且つプロセス途中の汚染の可能性を最小にし、最も精巧なバイオリアクターは、最小のマニュアル労力要件及びオープンプロセシング工程に関与するセットアップ、成長、選択、並びに採取の手順を許容する。そのようなバイオリアクターは、本発明によって考察される均質の細胞混合物又は凝集細胞集団に用いられるように、最適に設計される。本発明に用いるのに適したバイオリアクターとして、米国特許第5,763,194号、米国特許第5,985,653号及び同第6,238,908号、米国特許第5,512,480号、米国特許第5,459,069号、同第5,763,266号、同第5,888,807号及び同第5,688,687号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
例えばMLPCのインビトロ指向性分化が所望される場合ような、任意の大容量の、長期の細胞培養では、いくつかの基本的なパラメーターが制御を必要とする。培養には、細胞生存度の維持、増殖、及び(おそらくいくつかの別個の分化培養及び分化条件の関連での)分化、並びに最終の細胞培養物の保存を可能にする培地が提供されなければならない。典型的には、バイオリアクター内のポンプ輸送機構によって種々の培地が細胞に送達されて、培地が規則的に供給且つ交換される。交換プロセスにより、副産物が培養物から除去され得る。細胞又は組織の成長はまた、酸素源を必要とする。異なる細胞型は異なる酸素要件を有し得る。したがって、細胞に酸素を提供する柔軟且つ調整可能な手段が、所望の構成要素である。
【０１４１】
特定の培養に応じて、培養チャンバー内の細胞集団の分布及び培地供給ですら、重要なプロセス制御となり得る。そのような制御は多くの場合、懸濁培養設計の使用によって達成され、これは、細胞間相互作用が重要でない場合に有効であり得る。懸濁培養系の例として、種々のタンクリアクター設計及び気体透過性プラスチックバッグが挙げられる。三次元構造中へのアセンブリも必要としないし、間質層又はフィーダー層への近接も必要としない細胞(殆どの血球前駆体又は成熟血球等)に、そのような懸濁設計が用いられ得る。
【０１４２】
培養プロセスの完了時での細胞の効率的な収集が、有効な細胞培養系の重要な特徴である。産物として細胞を生産する一アプローチが、回収のための物理的バリアのない定義された空間内で細胞を培養して、細胞産物の単純な溶出により、最終洗浄のために設計された市販の、閉鎖系細胞ワッシャー中でのその目的に従う管理可能な、濃縮容量の細胞を生成するものである。最適には、当該系は、防腐剤又は細胞貯蔵化合物があってもなくても、薬学的に許容されるキャリアの添加を可能にし、且つ適切な滅菌パッケージング中への効率的な採取を実現する。最適には、採取及びパッケージングプロセスは、培養チャンバーの流体経路の滅菌バリアを壊すことなく完了してよい。
【０１４３】
あらゆる細胞培養手順での主な懸念は、滅菌状態である。産物細胞が患者に(多くの場合、患者が不健康又は免疫不全である時点で)移植されることになる場合、微生物が存在しないことが要求される。
【０１４４】
本発明の開発は今や、対象を治療的又は予防的に処置する手段の開発を容易にした。特に、本発明の好ましい実施形態の関連で、不適当な、不十分な、若しくは異常な造血細胞又は間葉系細胞の機能を示す患者を処置する手段が、これらの対象に、本発明の方法に従って生成されたMLPC、又は部分的に若しくは完全に分化したMLPC由来細胞(造血由来細胞又は間葉系由来細胞等)を投与することに基づいて、提供される。
【０１４５】
本方法は、造血障害、循環障害、卒中、心筋梗塞、高血圧骨障害、II型糖尿病、不妊症、損傷を受けた、若しくは形態学的に異常な軟骨又は他の組織、ヘルニア修復、支持メッシュ及び生体スキャフォールドを用いる骨盤底脱外科手術、他の筋骨格障害のための細胞療法、並びに加齢、外科手術又は外傷の状況での欠陥のある支持組織の置換を含むがこれらに限定されない、広範囲の状態に適用され得る。
【０１４６】
「異常な造血細胞機能又は間葉系細胞機能」によって特徴付けられる状態への言及は、少なくとも部分的に、造血系列又は間葉系列の細胞の機能又は発達に関する欠陥、又は不必要若しくは不所望の結果による任意の状態への言及として理解されるべきである。これは、細胞の均質の、又は異質の集団に相当し得る。「造血幹細胞」、「造血幹細胞由来細胞」、「間葉系幹細胞」、又は「間葉系幹細胞由来細胞」への言及は、先に定義されたのと同じ意味を有することが理解されるべきである。対象の欠陥は、不十分な数のこれらの細胞の生産を含む、正常でない、又はそうでなければ不所望の細胞の任意の構造的又は機能的特徴への言及として理解されるべきである。
【０１４７】
したがって、本発明の別の態様は、哺乳類の状態を治療的且つ/又は予防的に処置する方法であって、前記哺乳類に、本発明の方法に従って生成された有効数のMLPC、又は部分的に若しくは完全に分化したMLPC由来細胞を投与する工程を含む方法を対象とする。
【０１４８】
より詳細には、哺乳類における異常な造血機能若しくは間葉系機能によって特徴付けられる状態を治療的且つ/又は予防的に処置する方法であって、前記哺乳類に
(i)本発明の方法に従って生成された有効数の造血幹細胞、又は部分的に若しくは完全に分化した造血幹細胞由来細胞、或いは
(ii)本発明の方法に従って生成された有効数の間葉系幹細胞、又は部分的に若しくは完全に分化した間葉系幹細胞由来細胞
を投与する工程を含む方法が提供される。
【０１４９】
個体への、有効数の本発明の細胞の「投与」への言及は、哺乳類への、本発明の方法に従って生成された細胞のエキソビボ集団の導入への言及として理解されるべきである。「作用物質」の「投与」への言及は、哺乳類への、MLPC由来細胞を生成するためにインビボ導入された、MLPCに作用する1つ又は複数の有効量の刺激の導入への言及として理解されるべきである。
【０１５０】
本発明に従えば、対象のMLPC又はMLPC由来細胞は好ましくは、同定され、単離され、且つ/又は必要な表現型にエキソビボ分化し、且つそれらが当初採取された個体に再び移植される自己由来細胞である。しかしながら、本発明はそれでもやはり、対象の細胞が、処置の対象である個体と同じ主要組織適合性プロファイルを示す任意の他の適切な源に由来する細胞の使用にまで拡張されることが理解されるべきである。したがって、そのような細胞は効果的には、外来のMHCプロファイルを示す細胞の移植と通常関連した組織適合性問題を生じさせないという点で、自己由来である。そのような細胞は、「自己由来」の定義に入ると理解されるべきである。例えば、ある特定の状況下で、対象の細胞は、遺伝的に同じ双子から単離されることが望ましい、必須である、又は実際的に重要である場合がある。細胞はまた、所望の主要組織適合性プロファイルを示すように操作されていてもよい。そのような細胞の使用は、組織移植及び臓器移植の関連で本来的に直面する困難を克服する。しかしながら、自己由来細胞を単離する、又は生成することが可能でもなければ、実行可能でもない場合、同種異系の幹細胞を利用することが必須である場合がある。「同種異系」細胞は、処置されている対象と同じ種から単離されるが、異なるMHCプロファイルを示すものである。治療法の関連でのそのような細胞の使用は、免疫抑制処置の使用を必要とする可能性があるが、この問題はそれでもやはり、処置されている対象のMHCプロファイルと類似性を示すMHCプロファイルを示す細胞、例えば、きょうだい、親又は子供等の親族から単離/生成された細胞集団の使用によって、最小にされ得る。本発明はまた、異種間移植にまで拡張されることも理解されるべきである。即ち、本発明の方法に従って生成され、患者に導入される細胞は、処置されている対象の種以外の哺乳類種から単離される。
【０１５１】
本発明をいずれか1つの理論又は作用機序に限定するものではないが、異常な細胞集団によって実現されることのない機能の部分的な回復でさえ、多くの状態の徴候を改善するように作用する。したがって、「有効数」への言及は、所望の効果を少なくとも部分的に達成するのに、或いは処置されている特定の状態の開始を遅延させて、進行を妨げ、又は開始若しくは進行を全体として停止させるのに必須の細胞数を意味する。そのような量は、勿論、処置されている特定の状態、状態の重症度、並びに、年齢、身体状態、サイズ、体重、生理学的状態、併用処置、既往歴、及び問題の障害に関係するパラメーターを含む、個々の患者のパラメーターによって決まる。当業者であれば、有効用量を構成する本発明の細胞及び組織の数、並びにその投与の最適モードを、過度の実験を実施せずとも決定することが可能であろう。この後者の問題は、以降で更に議論される。これらの因子は、当業者に周知であり、ルーチン的な実験だけで対処され得る。通常、最大細胞数、即ち、適切な医学的判断に従う安全な最高数が用いられることが好ましい。しかしながら、当業者によって、医学的な理由、心理的な理由、又は他の任意の理由のために、より少ない細胞数が投与されてよいことが理解される。
【０１５２】
先に議論されるように、本発明の方法は、その範囲内に、本明細書中で定義されるような状態を患う個体への、移行した、又は完全に、若しくは部分的に分化した細胞の導入を包含するが、個体に導入された集団の細胞全てが、目的のMLPC又はMLPC由来表現型を獲得することが必ずしも事実というわけではないことも理解されるべきである。例えば、CD4、CD8、CD25、CD19、又はCD20リンパ球集団が、MLPCへの移行を経て、全て投与される場合、必要な表現型を示す細胞への移行を経なかった細胞の一部が存在し得る。同じ問題が、MLPC由来細胞の集団、例えば特定の造血集団又は間葉系集団を投与する関連で生じ得る。したがって、本発明は、これによって導入される関連する細胞の一部が、先に定義される「有効数」を構成すれば、達成される。しかしながら、特に好ましい実施形態において、分化を経た細胞の集団は、首尾よく分化した細胞の同定、その単離、及び対象個体への導入にかけられる。これは、MLPC由来細胞の異質集団を選択する(例えば、間葉系由来結合組織が発達するように誘導される場合に起こり得る)、又は投与のための特定の細胞亜集団、例えば赤血球を選び出す手段を提供する。用途について選択される方法のタイプは、処置されている状態の性質によって決まる。しかしながら、一般に、起こり得る副作用、例えば奇形腫形成を回避するために、純粋な細胞集団を投与することが望ましいと予想される。代わりに、一部の例において、MLPCの集団を分化にかけることも実行可能であり得るが、但し、この集団が、全体として、必要な機能的活性を示すことが見られ、この集団が全体として対象の個体に、無関係な細胞型が事前に除去されることなく導入されてよい場合に限る。したがって、この場合における「有効数」への言及は、分化細胞数が、本発明の目的を達成する活性レベルをもたらすのに十分であるように導入されることが必要とされる、対象の状態の処置となる細胞の総数への言及として理解されるべきである。
【０１５３】
先に詳述されるように、MLPC移行は、インビトロで実行される。この状況において、対象の細胞はその後、個体への導入を必要とする。例えば、細胞懸濁液が、直接注射によって、又は血塊(blood clot)内部に導入されてもよく、これによって細胞は、塊中に固定されることによって、移植が容易になる。細胞は、移植前に封入されてもよい。封入は、増殖し続ける(即ち、不死の特徴を示す)ことができる細胞の転移を予防するのに、又は組織不適合性の拒絶問題を最小にするのに有用な技術である。しかしながら、封入の有用性は、移植細胞によってもたらされる必要がある機能によって決まる。例えば、移植細胞が可溶性の因子を分泌する目的で主に必要とされるならば、封入細胞集団はこの目的を達成する可能性がある。しかしながら、例えば、移植細胞がその収縮特性について必要とされるならば、細胞は、筋肉の既存の組織スキャフォールドと統合することが必要とされる可能性がある。封入細胞はこれを効率的に行うことができない。
【０１５４】
患者に投与される細胞は、任意の適切な経路によって、単回用量又は複数回用量として投与されてよい。好ましくは、そして可能であれば、単回投与が利用される。必要とされる修復のタイプに応じて、注射を介した投与が、組織又は臓器の種々の領域に向けられてよい。
【０１５５】
本発明のこれらの態様に従えば、患者に投与される細胞は、任意の適切な形態、例えば細胞懸濁液(例えば血球)中、又は組織移植片(例えば結合組織)の形態をとり得ることが理解されるであろう。単細胞懸濁液を生成する観点から、分化プロトコルは、細胞懸濁液の維持を支持するように設計されてよい。代わりに、細胞凝集体又は組織が形成されるならば、これらが細胞懸濁液中に分散されてもよい。細胞懸濁液を利用する観点から、患者への投与用の、特定の単核造血細胞等の特定の細胞亜集団を選び出すことが望ましい場合もある。組織が患者に移植されることが所望される限り、これは通常、(ニードル又はカテーテルを介した投与とは対照的に)外科的移植を必要とする。代わりに、この組織の一部のみが移植され得る。別の例において、操作された組織が、標準的な組織操作技術を介して、例えば、本発明の細胞及び組織で設計された形態を有する組織操作スキャフォールドを播種して、播種されたスキャフォールドを、播種された細胞及び組織によるスキャフォールドのコロニー形成を可能にする条件下で培養することによって生じ得、これによって、形成された組織を生成することが可能となる。形成された組織はその後、例えば標準的な外科的移植技術を用いて、レシピエントに投与される。適切なスキャフォールドが、例えば、細胞外マトリックス成分、例えばラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンその他を含む、生体適合性の生物分解性ポリマー繊維又はフォームを用いて、生成し得る。適切なスキャフォールドを生成し、又は得、そのようなスキャフォールドを培養し、且つそのようなスキャフォールドを治療的に移植することに関する詳細なガイドラインが、文献で入手可能である(例えば、Kim S.S.及びVacanti J.P.、1999、Semin Pediatr Surg. 8:119、米国特許第6,387,369号(Osiris, Therapeutics社);米国特許出願公開第20020094573A1号(Bell E.)参照)。
【０１５６】
本発明の方法に従えば、他のタンパク性又は非タンパク性分子が、対象の細胞の導入と共に、これに先立って、又はこれに続いて共投与されてもよい。「共投与される」は、同じ若しくは異なる経路を介した同じ配合若しくは異なる配合での同時投与、又は同じ若しくは異なる経路を介した逐次投与を意味する。「逐次」投与は、これらの細胞の導入と、タンパク性若しくは非タンパク性分子の投与との間の、又はこれらの細胞の機能的活性の開始と、タンパク性若しくは非タンパク性分子の投与との間の、秒、分、時間、或いは日の時間差異を意味する。そのような共投与が必要とされる場合がある状況の例として、以下が挙げられるが、それらに限定されない:
(i)対象に非同系細胞又は組織を投与する場合、通常、対象によるそのような細胞又は組織の免疫拒絶が起こる。この状況では、患者を免疫抑制レジメンで処置することも必須であり、好ましくは、これは、そのような拒絶を最小にするために、そのような投与に先立って始められる。同種異系移植片の拒絶を、例えばシクロスポリンA、免疫抑制抗体等の投与を介して妨げる免疫抑制プロトコルが、普及しており、標準的な技法である。
(ii)処置されている状態の性質に応じて、例えば移植細胞が統合されて完全に機能的になる時点まで、状態の徴候を軽減するように医薬品を与えながら患者を維持することが必須である場合がある。代わりに、状態が処置される時点で、損傷の再発を予防するための医薬品の長期使用を始めることが必須である場合もある。例えば、対象の損傷が自己免疫状態によって引き起こされた(例えば、慢性関節リウマチの関連で起こる)場合、軟骨を置き換える、又は修復するために同系幹細胞が用いられている場合ですら、免疫抑制薬の継続使用が必要とされる場合がある。
【０１５７】
また、本発明の方法は、問題の状態を処置するために、対象の処置を促進又は強化するように設計された1つ若しくは複数の付加的な技術と切り離されて実行されてもよいし、一緒に実行されてもよいことも理解されるべきである。これらの付加的な技術は、先に詳述されるような、他のタンパク性又は非タンパク性分子の共投与の形態をとってよい。
【０１５８】
本発明の別の態様は、哺乳類の状態の処置のための医薬の製造における、本発明の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞の集団の使用を対象とする。
【０１５９】
本発明の更に別の態様は、本発明の方法に従って生成されたMLPC又はMLPC由来細胞を対象とする。
【０１６０】
好ましくは、前記MLPCは、造血幹細胞又は間葉系幹細胞である。
【０１６１】
本発明の関連する態様において、処置又は予防を受ける対象は、治療的処置又は予防的処置が必要な、任意のヒト又は動物であり得る。これに関して、本明細書中での「処置」及び「予防」への言及は、その最も広い関連で考えられるべきである。用語「処置」は、哺乳類が完全回復まで処置されることを必ずしも意味するわけではない。同様に、「予防」は、対象が最終的に疾患状態にかからないことを必ずしも意味するわけではない。したがって、処置及び予防は、特定の状態の徴候を改善すること、又は特定の状態を発生させるリスクを予防する、若しくはそうでなければ引き下げることを含む。用語「予防」は、特定の状態の発生の重症度を引き下げると考えられてよい。「処置」はまた、既存の状態の重症度を引き下げ得る。
【０１６２】
MLPC及びMLPC由来細胞をインビトロで生成する方法の開発は今や、既存の、又は可能性がある処置又は培養レジームの有効性及び毒性を試験するためのインビトロベースのスクリーニング系の開発を容易にした。
【０１６３】
ゆえに、本発明の更に別の態様に従えば、MLPC又はMLPC由来細胞の表現型状況又は機能状況に対する、処置又は培養レジメンの効果を評価する方法であって、先に定義される方法に従って生成された前記MLPC又はMLPC由来細胞を前記処置レジメンにかける工程、及び変更された機能状況又は表現型状況についてスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【０１６４】
好ましくは、前記MLPCは、造血幹細胞又は間葉系幹細胞である。
【０１６５】
「変更される」は、分析の対象である機能パラメーター又は表現型パラメーターの1つ又は複数が、未処置の細胞に対して変わることを意味する。これは、問題の処置レジームが、細胞機能を向上させるように設計されている望ましい結果であり得る。しかしながら、処置レジームが有害な結果を伴う場合、これは、毒性を、従って処置レジームの使用が不適当であることを示し得る。特定の薬物に対する個体の応答性に関して観察される差異は多くの場合、その個体の固有の遺伝的構成に関係があることは、今や周知である。したがって、本発明の方法は、問題の個体に由来する核材料を利用して生成される細胞に、既存の、又は新しい処置レジームを試験する価値ある手段を提供する。これは、薬物のインビボ投与に先立って、個体の細胞系に対する薬物の有望な有効性を評価するための固有の手段を提供する。患者が非常に気分が優れない場合に、不所望の結果を引き起こす処置レジームによって引き起こされる虞がある生理学的ストレスは、回避、又は少なくとも最小にされ得る。
【０１６６】
したがって、本発明の本態様は、細胞機能を標準化するように設計される処置を最適化する手段を提供する。しかしながら、当該方法はまた、処置、特に化合物による処置の毒性を評価するのに用いられ得る。ゆえに、例えば、化合物による処置に応じて本発明の細胞及び組織において、造血表現型又は間葉系表現型と関連した特徴を生じさせることができないことが、そのような化合物の毒性を評価するのに用いられ得る。
【０１６７】
それゆえに、本発明の方法は、薬物、他の処置レジーム、又は培養条件をスクリーニング且つ/又は試験するのに用いられ得る。表現型変化を評価する関連において、本発明の本態様は、対象の細胞及び組織の遺伝子発現プロファイルの変化を監視するために利用されてよい。ゆえに、本発明の本態様に従う方法は、例えば、処置に応じた遺伝子発現パターンの変化を判定するのに用いられてよい。
【０１６８】
好ましくは、本発明の細胞又は組織がかけられる処理は、化合物への曝露である。好ましくは、化合物は、薬物又は生理的イオンである。代わりに、化合物は、成長因子であっても分化因子であってもよい。この目的で、薬物の投与に先立って、細胞集団に対するそのような副作用を予測することができる方法が利用可能であることが、非常に望ましい。
【０１６９】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、更に説明される。
【実施例１】
【０１７０】
CD4+-、CD8+-、CD19+-、CD20+-、及びCD25+-PBMC細胞培養物におけるCDマーカー及びタンパク質の発現
末梢血単核細胞(PBMC)を、20〜40歳の健康なボランティアから収集し、GE Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare社、説明書71-7167-00 AG)によって、製品取扱説明書に従って分画した。
CD4+、CD8+、CD19+、CD20+、及びCD25+白血球を、選択した接着法を用いて、PBMCから生成した。簡潔にいうと、リンパ球のこれらの5集団を、マイクロビーズ(MACS社)によってPBMCから個々に精製し、純度はルーチン的に、フローサイトメトリーによって確認して、>90%であった。
これらのリンパ球の各集団を、滅菌FEP培養バッグにおいて個々に培養した。これらの最終培養培地を、30%のCD4+及びCD8+-PBMC、40%の6%ヒトアルブミン(CSL Behring社)溶液及び30%の細胞培養培地、並びに2%インシュリン(Invitrogen社、米国)で再構成した。40%のCD19+-PBMC細胞を、20%の6%ヒトアルブミン(CSL Behring社)溶液及び40%の細胞培養培地で再構成した。20%のCD20+及びCD25+細胞を、40%の6%ヒトアルブミン(CSL Behring社)溶液及び40%の細胞培養培地、並びに2%インシュリン(Invitrogen社、米国)で再構成した。細胞を、加湿インキュベーター内で5%CO2により37℃にて3〜6日間、これらの混合物内で成長させた。
このインキュベーション期間中に、5つのリンパ球集団(CD4+、CD8+、CD19+、CD20+、及びCD25+)を、フローサイトメトリーによってCDマーカー及び表面タンパク質発現について調査した。更に、CD4+集団において、総細胞タンパク質発現を、ウエスタンブロッティングによって調査した。
【０１７１】
PBMCの形態学的観察
37℃のCO2インキュベーター内でのインキュベーションの1日後、及び4日後の細胞培養物試料でスライドを作製した。PBMCの生物学的特徴を研究するために、接着細胞表現型を、細胞培養期間中に、倒立顕微鏡によって分析した(図1から図5)。
【０１７２】
フローサイトメトリー分析による、CD4+、CD8+、CD19+、CD20+-、及びCD25+のCDマーカー発現
FEP培養バッグからCD4+-、CD8+-、CD19+-、CD20+-、及びCD25+-PBMCをそれぞれ採取し、PBS(2%胎児ウシ血清;FBSを含有する)で洗浄し、640×gにて4℃で5分間遠心分離し、細胞ペレットを維持した。フローサイトメトリーアッセイのために、細胞密度を、チューブあたり3×105細胞に調整した。これらの5つの白血球集団を、蛍光標識化抗体で標識化した。最終的に、100マイクロリットルの固定バッファー(BD)を各チューブに加えてから、4℃で20分間インキュベートし、最終的に、フローサイトメトリー分析(Bacton Dickinson社)まで4℃で暗所に保存した。生存細胞を、CellQuestソフトウェアを用いて同定した。結果として生じたデータをTable 1(表2)〜Table 10(表11)に示す。
【０１７３】
ウエスタンブロッティング分析による、CD4+、CD8+、CD19+、CD20+、及びCD25+リンパ球のタンパク質発現
細胞抽出物の調製
細胞タンパク質を、40人の健康なボランティア由来のCD4+-PBMC細胞から、3〜6日間の培養後に、個々に抽出した。簡潔に、細胞タンパク質抽出物を、RIPA溶解バッファー(Millipore社、Temecula. CA 92590)によって得た。抽出した懸濁液を、氷上で20分間インキュベートしてから、13000×gにて5分間遠心分離した。上澄み(可溶性の画分)を、タンパク質発現のために収集した。
【０１７４】
ウエスタンブロット分析
種々のタンパク質に対する抗体を、市販の製品から購入した。これらとして、コラーゲンI型、HLAクラス-1、TAZ、インシュリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)、アルカリホスファターゼ、神経成長因子(NGF)、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー18(TNFSF18)、幹細胞抗原-1(Sca-1)、カベオリン-2、及びパーフォリン(Abcam社);CDX2、フィブロネクチン、マクロファージ-1抗原(MAC-1)、Mカドヘリン、MyoD(MYOD1)、核転写因子Yサブユニットアルファ(NF-YA)、ノッチ1、ペアードボックス-5(PAX-5)、P-糖タンパク質、ウィスコット-アルドリッチ症候群タンパク質(WASP)(Epitomic社);α-アクチニン、Ca2+/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ(CaMキナーゼIV)、細胞レチノイン酸結合タンパク質(CRABP II)、GATA結合因子-4(GATA4)、低酸素誘導性因子-1a(HIF-1a)、ミオゲニン、Achaete-scute相同体1(ASCL1)、シナプトフィジン(SYP)、ネスチン及びRunt関連転写因子3(Runx3)(Merck Millipore社のHeadquarters)、アネキシンVI(G-10)、ニューロゲニン3(E-8)、グランザイムB、グルタメートデカルボキシラーゼ(GAD2、D5G2)、ニューロピリン-2、βエノラーゼ(ENO-3)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及びグラニュリシン(F-9)(Santa Cruz Biotechnology社)、Fms関連チロシンキナーゼ1(FLT-1)及び多剤耐性関連タンパク質1(MRP1)(CHEMICON international社、SerlogicalR社の分社)、並びにPU.1(Cell Signaling Technology社)が挙げられる。
これらの細胞溶解物の上澄みを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に用いた。100マイクログラムの各細胞溶解物試料を、Pierceの4〜20%トリス-グリシンゲル(Thermo SCIENTIFIC社、米国Rockford)上にロードした。電気泳動後、ゲルをPVDFメンブレン(Millpore社、CA、Temecula、92590)上にブロッティングした。PVDFメンブレンを、トリス緩衝生理食塩水Tween-20バッファー(10mMトリス、pH8.0、150mM NaCl)中5%スキムミルクによるブロッキングにかけてから、メンブレンを、新鮮な5%スキムミルクトリス緩衝生理食塩水Tween-20バッファー中の種々の一次抗体と18〜20時間、2〜5℃にてインキュベートした。メンブレンを洗浄してから、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とインキュベートした。バンドの視覚化を、Amersham社の増強化学発光系により実行した。応答性のバンドをCCDカメラによって記録して、Multi Gaugeソフトウェアによって分析した。ベータ-アクチン正規化内部標準を用いた半定量分析により、発現の増大パーセンテージを判定した。結果を図6〜図7及びTable 11(表12)に提示する。
【０１７５】
【表２】
2017518055.tif 000003
【０１７６】
【表３Ａ】
2017518055.tif 000004
【０１７７】
【表３Ｂ】
2017518055.tif 000005
【０１７８】
【表３Ｃ】
2017518055.tif 000006
【０１７９】
【表３Ｄ】
2017518055.tif 000007
【０１８０】
【表３Ｅ】
2017518055.tif 000008
【０１８１】
【表３Ｆ】
2017518055.tif 000009
【０１８２】
【表３Ｇ】
2017518055.tif 000010
【０１８３】
【表３Ｈ】
2017518055.tif 000011
【０１８４】
【表３Ｉ】
2017518055.tif 000012
【０１８５】
【表３Ｊ】
2017518055.tif 000013
【０１８６】
【表３Ｋ】
2017518055.tif 000014
【０１８７】
【表３Ｌ】
2017518055.tif 000015
【０１８８】
【表３Ｍ】
2017518055.tif 000016
【０１８９】
【表３Ｎ】
2017518055.tif 000017
【０１９０】
【表３Ｏ】
2017518055.tif 000018
【０１９１】
【表３Ｐ】
2017518055.tif 000019
【０１９２】
【表４】
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【０１９３】
【表５Ａ】
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【０１９４】
【表５Ｂ】
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【０１９５】
【表５Ｃ】
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【０１９６】
【表５Ｄ】
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【０１９７】
【表５Ｅ】
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【０１９８】
【表５Ｆ】
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【０１９９】
【表５Ｇ】
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【０２００】
【表５Ｈ】
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【０２０１】
【表５Ｉ】
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【０２０２】
【表５Ｊ】
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【０２０３】
【表５Ｋ】
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【０２０４】
【表５Ｌ】
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【０２０５】
【表５Ｍ】
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【０２０６】
【表５Ｎ】
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【０２０７】
【表５Ｏ】
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【０２０８】
【表６】
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【０２０９】
【表７Ａ】
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【０２１０】
【表７Ｂ】
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【０２１１】
【表７Ｃ】
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【０２１２】
【表７Ｄ】
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【０２１３】
【表７Ｅ】
2017518055.tif 000041
【０２１４】
【表７Ｆ】
2017518055.tif 000042
【０２１５】
【表７Ｇ】
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【０２１６】
【表７Ｈ】
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【０２１７】
【表７Ｉ】
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【０２１８】
【表７Ｊ】
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【０２１９】
【表７Ｋ】
2017518055.tif 000047
【０２２０】
【表７Ｌ】
2017518055.tif 000048
【０２２１】
【表７Ｍ】
2017518055.tif 000049
【０２２２】
【表７Ｎ】
2017518055.tif 000050
【０２２３】
【表７Ｏ】
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【０２２４】
【表８】
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【０２２５】
【表９Ａ】
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【０２２６】
【表９Ｂ】
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【０２２７】
【表９Ｃ】
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【０２２８】
【表９Ｄ】
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【０２２９】
【表１０】
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【０２３０】
【表１１Ａ】
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【０２３１】
【表１１Ｂ】
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【０２３２】
【表１１Ｃ】
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【０２３３】
【表１１Ｄ】
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【０２３４】
【表１２Ａ】
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【０２３５】
【表１２Ｂ】
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【０２３６】
当業者は、本明細書中に記載される本発明が、具体的に記載されるもの以外の変形及び変更に影響を受け易いことを理解する。本発明がそのような変形及び変更の全てを含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で言及され、又は示される工程、特徴、組成、及び化合物の全てを個々に、又は併せて、並びに前記工程又は特徴の任意の2つ以上のあらゆる全ての組合せを含む。
【０２３７】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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