(57)【要約】本発明は、ワクチン抗原を製造する方法であって、少なくとも１つの式（ＩＩ）のカリックスアレーン（式中、Ｘは、−（ＣＨ２）−ＣＯ２Ｙ基であり、Ｙは、アルカリ金属である）またはその薬学的に許容される塩で前記ワクチン抗原に会合している生体膜を処理することにより前記生体膜を断片化するステップを含み、前記得られたワクチン抗原が、前記抗原に会合している生体膜の断片を更に含む、方法に関する。本発明は更に、ワクチンの総重量の０．１〜１０００μｇの量のキャリア形態で式（ＩＩ）のカリックスアレーンを含む、方法を実行することによって生産することができるワクチンに関する。本発明は更に、ワクチンまたはワクチン抗原を製造するための上記カリックスアレーンの使用および感染症の処置または防止における薬物として使用するためのワクチンに関する。
2017531032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン抗原を製造するためのプロセスであって、前記ワクチン抗原に会合している生体膜を少なくとも１つの式（ＩＩ）
【化１】
2017531032.tif 000014
（式中、
・Ｘは、−（ＣＨ２）−ＣＯ２Ｙ基であり、
・Ｙは、アルカリ金属である）
のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩と接触させることにより前記生体膜を断片化するステップを含み、
得られる前記ワクチン抗原が、前記生体膜の断片を更に含み、前記断片が前記抗原に会合している、プロセス。
【請求項２】
Ｙがナトリウムである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記生体膜が、原核もしくは真核生物にまたはウイルスに由来する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記生体膜が、単離された植物もしくは動物細胞にまたは孵化卵に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ワクチン抗原が、ウイルス起源または微生物起源の膜タンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ウイルス起源が、以下を含む群から選択される、請求項５に記載のプロセス：オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびレトロウイルス科。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢから選択される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ワクチン抗原を透析するステップを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
ワクチンの総重量中に０．１〜１０００μｇの量の補形剤の形態で式（ＩＩ）のカリックスアレーンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセスを行うことにより生産することができるワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチン抗原が、ウイルス起源または微生物起源の膜タンパク質を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ワクチンまたはワクチン抗原を製造するための、請求項１または２に記載のカリックスアレーンの使用。
【請求項１２】
感染症の処置または防止における医薬として応用するための、請求項９または１０に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質を含むワクチン抗原を製造するためのプロセスに関し、更にワクチン抗原およびワクチンならびにその使用に関する。
【０００２】
本発明は、医学分野、特にワクチン製造分野における産業的用途を有する。
【０００３】
以下の説明中、角括弧（［］）の中の参考文献は、本文の最後に記載の参考文献一覧を参照するものである。
【背景技術】
【０００４】
ワクチン接種は、一般的に人または動物にワクチンを投与することにより、感染症に対して人または動物を免疫化することにある。ワクチンは、免疫系を刺激し、人または動物を感染症または疾患から保護する。
【０００５】
ヒトのワクチン接種はこうして致命的となり得る感染症を抑制（combat）してこれを排除できることが証明されており、このようにして１年当たり２〜３百万件を超える死亡が防止されていると推定される。これは健康分野にける最も有益な投資の１つである。
【０００６】
ワクチンとは、ワクチン接種した人または動物において、自然感染から人または動物を保護できるまたはその結果を弱めることができる病原体特異的免疫応答の誘導を可能にする抗原性調製物である。
【０００７】
インフルエンザは、一般的なウイルス性呼吸器感染症であり、世界中で見られ、インフルエンザウイルスが原因で、調節された地域（tempered region）において冬期流行発生（epidemic winter episode）へと発達する。世界保健機関（ＷＨＯ）は、インフルエンザウイルスが全世界で１年当たり３〜５百万件の重篤例および２５００００〜５０００００件の死亡を引き起こしていると見なしている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｆｒ／ｉｎｓｔｉｔｕｔ−ｐａｓｔｅｕｒ／ｐｒｅｓｓｅ／ｆｉｃｈｅｓ−ｉｎｆｏ／ｇｒｉｐｐｅ＃ｓｔｈａｓｈ．ＰｗＵＮｍＪ１０．ｄｐｕｆ）。ヒトにおいて病態の原因となるインフルエンザウイルスはＡおよびＢ型インフルエンザウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスはその系統型の中で流行するが、Ａ型インフルエンザウイルスは、主要な２つの表面糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原特性に従ってウイルス亜型に分類される。インフルエンザウイルスは、１〜１０に渡り得るＮＡ／ＨＡ比でその表面に３００〜８００個の糖タンパク質を有する。
【０００８】
ヒトにおいて流行する、季節性感染症の原因となるウイルスは、ウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＡ（Ｈ３Ｎ２）である。インフルエンザウイルスの主なリザーバーは動物リザーバー（トリおよびブタ）であるので、動物ウイルスが種の壁を越えてヒトに感染することがある。鳥ウイルスＡ（Ｈ５Ｎ１）およびパンデミックウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）等のウイルスは重大な公衆衛生問題を引き起こし得る。
【０００９】
実際の所、ワクチン接種が、現在の所、インフルエンザウイルスから集団を保護するための唯一の有効な手段である。「季節性」ワクチンは、（Ｈ１Ｎ１）および（Ｈ３Ｎ２）等の季節性流行ウイルスＡならびに種々の系統のウイルスＢに対する免疫を獲得することを可能にする。これは、前年の原型株に基づいて毎年決定され、Ａ型およびＢ型の季節性ウイルスの抗原を含む。宿主の免疫応答は主に、ウイルスのＨＡおよびＮＡタンパク質に対する中和抗体を発現する体液性免疫である。
【００１０】
これら２つのタンパク質におけるかなりの抗原シフトのため、ワクチン組成物は毎年再評価する必要がある。
【００１１】
ワクチンを生産するための従来のプロセスは、第１に、ＷＨＯによって決定される毎年の原型Ａ株の各々について、Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）株と季節性ウイルス株の間の遺伝的再集合（genetic reassortment）により卵上でのワクチンシードを得ることに基づく。ほとんどのワクチンメーカーは通常、親Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに主に由来するこれらの再集合ウイルスを用いる。したがって、各ワクチンシードは、卵中での最適な複製能を有するＡ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスと原型Ａ株の間の遺伝的再集合のプロセスに由来する。このＢ型ウイルスの生産は、卵上でＰＲ８との再集合なしに直接行われる。
【００１２】
核タンパク質に結合し且つポリメラーゼ複合体に会合した単一ＲＮＡ鎖からなる８個の別個の遺伝子セグメントをウイルス粒子は含み、各遺伝子は１〜３個の所与のウイルスタンパク質：ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＢ１、ＰＢ１Ｆ２、ＰＢ１Ｎ４０、ＰＢ２、およびＰＡをコードする。その結果、長い選択プロセスにより、ＰＲ８ウイルスの遺伝的背景上に原型株のＨＡおよびＮＡをコードする遺伝子セグメントを少なくとも含むワクチン再集合体を得ることができる（「６＋２」組成）。その後、２つの原型株と親Ａ／ＰＲ／８／３４株との間の遺伝的再集合により生じる２つのワクチン再集合体を卵上で増幅させる。ＨＡおよびＮＡ抗原は、尿膜生成物（allantoic production）から抽出され、必要に応じて、ワクチン用量（dose）を生産するためにアジュバントと組み合わされる。
【００１３】
ワクチン用量を生産するためのこの産業的プロセスは長い（４〜６ヶ月）。しかし、特にヒトインフルエンザに対する、プレパンデミックワクチンの生産の場合、インフルエンザのパンデミックを抑制（combat）するためのプランを実施する場合、約１０億人がワクチン接種する必要があるとＷＨＯは評価している。実際、そのような抑制プランは、大量および迅速なワクチンの生産の効率に一部依存する。
【００１４】
季節性流行株に対するワクチンの需要増大、更には１つ（または複数）の潜在的パンデミック新興株に対するワクチンの需要−これは予測が困難である−に立ち向かう上で、卵の利用能が限定要因となることが示され得、家畜中での鳥パンデミックのリスクは持続的であるため、尚更である。しかし、卵中で良好な収率でＢ株、更に、６＋２ではなく５＋３または４＋４である一部のＡ型再集合体を生産することには一定の困難がある。
【００１５】
したがって、流行原型株の選択とワクチン用量の生産の間の時間を短縮するために、代替的な戦略が開発されてきた。インフルエンザウイルスは細胞系の中でも生産することができる（Barrett PN, Portsmouth D, Ehrlich HJ. Developing cell culture-derived pandemic vaccines. Curr Opin Mol Ther. 2010 Feb;12(1):21-30 ([1]); Le Ru A, Jacob D, Transfiguracion J, Ansorge S, Henry O, Kamen AA. Scalable production of influenza virus in HEK-293 cells for efficient vaccine manufacturing. Vaccine. 2010 May 7;28(21):3661-71 ([2])）。ワクチン株の生産および更にその増幅は、産業用バイオリアクターを用いて細胞上で行うことができる。実際、ワクチン株の増幅に細胞株を用いることにより、とりわけ、「卵」系（卵の量および生産収率がパンデミックを扱うには不十分）に依存しなくすることができ、尿膜生成物で通常観察される表面抗原修飾が低減され、アレルギーが生じなくなる。この戦略は、パンデミックインフルエンザウイルス（例えば、Ａ  Ｈ１Ｎ１）出現中のワクチンの需要をより容易に満たすことができる。
【００１６】
それにも関わらず、これらの系および特に登録されている細胞株（ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ
、ＰＥＲＣ６、ＥＢ６６等）はインフルエンザウイルスの最適な複製が可能ではないため、ワクチンシード生産の点における主な限定要因となっている。細胞株中での生産収率は現在、依然として、尿膜系中より低い。したがって、現在の所、この産業用プロセスは卵での効率にはるかに及ばないので、現時点でこの新しい生産方法を選択したメーカーはほとんどない。
【００１７】
ワクチン用量生産時間をできるだけ短縮するためにおよび用量の数の点で同等な収率レベルを得るために、ワクチンシードの獲得はリバースジェネティクスの技術を用いて行うことができ、これにより、「６＋２」組成のワクチン再集合体をより迅速に得ることができ、したがって、全ての選択ステップを除くことができる。リバースジェネティクスによる組換えウイルスの生産は、ワクチン需要を効率的に満たすための最も現実的な選択肢である。第２に、リバースジェネティクスによる組換えウイルスの生産は、原型株との遺伝的再集合のプロセスを用いて用いられた時、卵中または細胞中でのワクチン用量生産のために最適化されたウイルスの特徴を有するワクチン再集合体の生産を可能にする「最適化された」ＰＲ８ウイルスの生産の可能性を提供する。この種の方法は、細胞内生産にも適用することができる。
【００１８】
尿膜系および細胞系におけるワクチン生産を最適化するためのもう１つの戦略は、宿主細胞をターゲティングする関心のある小さな化学分子の利用および／またはワクチンシードの遺伝的修飾に基づくウイルス生産の収率の増大を目的とする。そのようなプロセスは評価中である（仏国特許出願公開第１０／５５７１６号（［３］）、国際公開第２０１２００７３８０号（［４］）、仏国特許出願公開第１０／５９１３２号（［５］）、国際公開第２０１２０５９６９６号（［６］））。
【００１９】
もう１つの戦略は、アジュバントを加えることによりワクチン抗原の有効性を高めることにより、同じ限定された数の卵および同じ量の生産される糖タンパク質に対してより多くのワクチン用量の生産を可能にすることにある（Ellebedy AH, Webby RJ. Influenza vaccines. Vaccine. 2009 Nov 5; 27 Suppl 4:D65-8 ([7])）。このプロセスは、免疫系が欠損した人に、より強く推奨される。更に、世論はアジュバントの使用に対してどちらかというと抵抗的（refractory）である。
【００２０】
最後に、ある戦略は、生産プロセスの下流でワクチン抗原（「ｓｐｌｉｔ」）を抽出するステップを最適化することにあり、その目的は、その立体構造を、したがってワクチンの保護力が直接的に依存するその抗原特性をより効果的に保存しながら、より良く且つより多くワクチン抗原を抽出することである。
【００２１】
より具体的には、感染した孵化鶏卵（embryonic hen egg）を用いて（尿膜腔液の回収）またはバイオリアクター中の感染細胞株の培養物を用いて（培養培地の回収）得られたウイルス生成物を、ショ糖勾配で精製した後、化学的処理（好ましくはホルマリンを用いて、規定に従ってウイルス力価を１５ｌｏｇ低下させるために、）により不活化する。プロセスはその後、ウイルス（「スプリットビリオン（split virion）」）を破壊（disrupt）／断片化（fragment）（「破壊（disrupting）／断片化（fragmenting）」）する洗剤の使用およびダイアフィルトレーションによるワクチン抗原の精製を含む。
【００２２】
得られた、スプリットまたは断片化されたウイルスを、ウイルスタンパク質の部分的または完全な可溶化と組み合わせることにより、ウイルスの（感染性の）完全性（integrity）および機能を修飾する。スプリットは更に、化学的方法を補う不活化方法を構成し、その場合、直交的不活化（orthogonal inactivation）という用語が用いられる。
【００２３】
スプリットは、種々の洗剤、特に非イオン性およびイオン性（例えば、陽イオン）界面
活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（acyl sugar）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシメチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスファート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴ−ＭＡ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎｌ  ０１）、ポリオキシメチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）  ＮＰ９等で精製ウイルスを処理することにより得ることができる。
【００２４】
この点において、インフルエンザウイルスをスプリット（断片化）する多くの方法が知られている。文献国際公開第０２／２８４２２号（［８］）は、例えば、ラウレス９、ＮａＤＯＣ、サルコシル基、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商標）、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００から選択されるスプリット剤（splitting agent）を用いたスプリット方法を記載している。文献国際公開第０２／０６７９８３号（［９］）は、その一部に、デオキシコール酸ナトリウムを用いたスプリット方法を記載している。
【００２５】
界面活性剤（または洗剤）は、顕著な水溶性を有する明確に別個な極性および非極性ドメインで構成される両親媒性分子である。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と呼ばれる正確な濃度を超えると、疎水効果によりミセル化現象が誘導される（M. Rosen, "Surfactants and
Interfacial Phenomena", 3rd Ed., Hoboken: John Wiley & Sons, Inc., 2004 ([10])）。
【００２６】
疎水性尾部の性質、その長さ、その不飽和および分岐の程度、芳香核の有無、ならびに鎖の数は、界面活性剤モノマーの化学的特性および水溶液中での自己組織化に影響する（凝集体の幾何学的形状の性質、サイズ、凝集数、およびＣＭＣ）。親水性基の性質（中性または荷電、小さいまたは粗大）は界面活性剤の特性およびその生物学的応用に強い影響を与える。
【００２７】
界面活性剤は、親水性部分の性質に応じて３つの主要なファミリー、すなわちイオン性（陽イオンまたは陰イオン）界面活性剤、双性イオン性（または両性）界面活性剤、および中性界面活性剤に分類される（A.M. Schwartz, J.W. Perry, J. Berch, "Surface Active Agents and Detergents", vol II, R. Krieger Pub. Co., New York, 1977 ([11])）。これらはしばしばソフトまたはハード（ｈａｒｓｈ）であると言われる。この意味で最もハードなクラスから最もソフトなクラスへと洗剤の分類の順番を作成することができる：イオン性＞両性＞中性。ＣＴＡＢ等のイオン性界面活性剤は一般的に変性性である。これらは、タンパク質の分子内クーロン力相互作用を破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）し、したがって、その３次元立体構造を破壊（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅ）する。
【００２８】
双性イオン性界面活性剤（スルホベタイン、ベタイン）は、その親水性部分に正電荷および負電荷の両方を含み、電気的に中性である。
【００２９】
中性界面活性剤、例えば特にアルキルグルコシドおよびポリオキシメチレンアルキルエーテルは、非荷電親水性頭部を特徴とする。これらはソフトで非変性性の界面活性剤であるが、タンパク質−脂質および脂質−脂質相互作用を破壊し、タンパク質の分子内クーロン力相互作用に影響を与えない。
【００３０】
ポリエチレングリコールタイプの親水性部分を含む洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｂ
ｒｉｊ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ等）は生化学で一般的に使用される。これらの欠点は、そのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）基上に可変的な重合インデックスｎを有する化学的に不均一な分子であると見なされることである。したがって、市販の洗剤のこれらのバッチは溶液中で化学的によく定義された種の形態ではなく、このことはそれらの物理化学的特性のばらつきにつながり得る。
【００３１】
パンデミックな病原性ウイルスの出現という現在の文脈において、感染、例えばインフルエンザ感染は、先進国のみで１３０〜２００万件の入院および２８００００〜６５００００件の死亡につながり得る（ＷＨＯデータ）。
【００３２】
したがって、主要な経済的課題の１つは、ワクチン用量の製造コストを下げることができることである（１回の生産当たりの用量の増大および／または同じ量の用量を得るための時間の短縮）。
【００３３】
この状況においておよび経済的観点から、ワクチンシードを生産するための新しい最適化されたプロセスの探索および開発は、特に（ｉ）生産収率の向上、（ｉｉ）時間および／またはコストの低減、（ｉｉｉ）より免疫原性の高い抗原の生産の点から道理にかなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明の目的は、産業的生産プロセスにおいて、特に細胞系または尿膜系においてワクチン抗原、例えばインフルエンザワクチン抗原の抽出ステップを定性的および定量的に最適化できるワクチン抗原製造プロセスを提供することによりこれらのニーズを正確に満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本出願人は、実際、驚くべきことにおよび予期されなかったことに、式（Ｉ）のカリックスアレーンおよび有利には式（ＩＩ）のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩を、特に膜の断片化に従来用いられていた洗剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００またはＴｗｅｅｎ８０を置き換えることにより、ウイルスを断片化（スプリット）するために用いることができることを示した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明のプロセスは特に、表面ワクチン抗原等の膜糖タンパク質の立体構造をより良く保存するという利点を有する。本発明は、驚くべきことに、公知の技術と比べて、ウイルスを断片化、特に（「スプリット」）、するステップ中の抗原の立体構造のより良い保存を可能にする。
【００３７】
この点において、このプロセスを用いることで、免疫原性の点ではるかに効果的なワクチン抗原を作製することが可能になり、したがって、同じまたは同等な保護のためのワクチンバッチに必要な抗原の量を低減することが可能になる。
【００３８】
更に、これらのより効果的な抗原は、より良く保存されており、有利には、公知のアジュバントの完全なまたは部分的な代替物とすることができる。あるいは、カリックスアレーンは、ワクチン抗原の特性を改善するためのワクチン組成物中のアジュバントおよび／または補形剤として用いることができる。
【００３９】
本発明は、特に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００洗剤分子の従来の使用と比べて、生産されるワクチン抗原の質および／または量を上げることができる。
【００４０】
本発明の使用は、存在する種々の生産様式（卵、すなわち尿膜系および細胞）に適合させることができるだけでなく、他の補助的な生産最適化方法（前述）にも適合させることができ、更に、タバコの葉、原生動物を含む方法等の開発中の生産様式にも適合させることができ、このリストは限定するものではない。
【００４１】
したがって、本発明の文脈中に、ワクチン抗原の製造プロセスであって、前記ワクチン抗原に会合している生体膜（biological membrane）を少なくとも１つの式（Ｉ）：
【００４２】
【化１】
2017531032.tif 000003
（式中、
・ｎは、１、３、５、または６に等しい整数であり；
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素原子；Ｏ、Ｓ、Ｎ、およびＰ原子の群から選択される１または複数の異種原子で置換されていてもよい直鎖または分岐鎖（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル基；−ＣＯＯＲ基（式中、Ｒは、直鎖または分岐鎖（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である）で置換されていてもよい直鎖または分岐鎖（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル基；６〜２０個の炭素原子を含むアリール基を表し；
・Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、互いに独立して、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ’または−ＳＯ３または−（ＣＨ２）ｍＰＯ（ＯＨ）Ｏまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ’３基
（式中、
・ｍは、０〜２０の整数であり、
・Ｒ’は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を表す）
を表す）
のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩と接触させることにより前記生体膜を断片化するステップを含み、
ワクチン抗原が、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抗原またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）抗原ではない、プロセスが記載される。
【００４３】
本発明の目的のために、用語「ワクチン抗原」は、ウイルスによって発現され得る少なくとも１つの膜タンパク質を含む任意の調製物を意味することが意図される。ワクチン抗原は更に生体膜の断片を含んでよい。この点において、膜タンパク質は生体膜に会合していてよい。ワクチン抗原は更に、ワクチン抗原が例えば生体膜の内面および／または外面に密集する、生体膜断片であると理解される。
【００４４】
ワクチン抗原は、有利には、この抗原を発現するウイルスに対するおよび特に膜タンパク質に対する、それが投与されたヒトまたは動物個体の免疫応答を刺激することができる。ワクチン抗原は、有利には、抗原および特に膜タンパク質に対する個体の完全または部分的な免疫化を可能にすることができる。
【００４５】
本発明の目的のために、用語「膜タンパク質」は、生体膜に会合しているタンパク質、すなわちアンカーされているかまたは組み込まれており、水性媒体中で自由に拡散せず、これらの媒体中で不安定であるタンパク質を意味することが意図される。膜タンパク質として、例えば、形質膜タンパク質および細胞内の膜タンパク質（例えば、ミトコンドリア膜タンパク質、細網（reticulum）タンパク質、ゴルジタンパク質、リソソームタンパク質。このリストは限定するものではない）を挙げることができる。膜タンパク質は、ポリトピックタンパク質（polytopic protein）またはモノトピックタンパク質（monotopic protein）であり得る。用語「ポリトピックタンパク質」は、１または複数回膜を貫通するタンパク質を意味することが意図される。用語「モノトピックタンパク質」は、膜の片側とだけ相互作用するタンパク質を意味することが意図される。膜タンパク質は更に、細胞膜内（integral）または周辺（peripheral）タンパク質であり得る。用語「細胞膜内タンパク質（integral protein）」は、特に疎水性相互作用により、膜と強く相互作用するモノトピックまたはポリトピックタンパク質を意味することが意図される。これらのタンパク質は「内在性タンパク質（intrinsic protein）」とも呼ばれる。用語「周辺タンパク質」は、膜と弱く、すなわち静電結合によりまたは他の膜タンパク質を介して相互作用するモノトピックタンパク質を意味することが意図される。これらのタンパク質は「外在性タンパク質（extrinsic protein）」とも呼ばれる。
【００４６】
膜タンパク質は、それに対するワクチン接種が望まれる感染病原体（infectious agent）によって発現される抗原性タンパク質であり得る。これはウイルス起源または微生物起源のタンパク質であり得る。言い換えると、膜タンパク質は、感染病原体のゲノムによってコードされるタンパク質であり得る。この点において、感染病原体はウイルス、特にエンベロープウイルスであり得る。ウイルスである場合、これは、以下を含む群から選択される、任意の種類の株の、野生型または組換えウイルスであり得る：
・オルトミクソウイルス科、例えば特にインフルエンザウイルス、例えば哺乳動物インフルエンザウイルス、より具体的にはヒトインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、例えばハクチョウインフルエンザウイルス、
・パラミクソウイルス科、例えばレスピロウイルス（センダイ、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒトパラインフルエンザ１および３）、ルブラウイルス（ヒトパラインフルエンザ２、４、４ａ、４ｂ、ヒトムンプスウイルス、パラインフルエンザ５型）、アブラウイルス（ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ））、ニューモウイルス（ヒトおよびウシ呼吸器多核体ウイルス）、メタニューモウイルス（動物およびヒトメタニューモウイルス）、モルビリウイルス（麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、および牛疫ウイルス）、およびヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパーウイルス等）、
・コロナウイルス科、例えば特にヒトコロナウイルス（特にＮＬ６３、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）および動物コロナウイルス（イヌ、ブタ、ウシコロナウイルスおよびトリ伝染性気管支炎コロナウイルス）、
・フラビウイルス科、例えば特にアルボウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス）、フラビウイルス（デングウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、例えばＫｕｎｊｉｎ亜型、マレー渓谷ウイルス、ロシオウイルス（Rocio virus）、イルヘウスウイルス、ダニ媒介性髄膜脳炎ウイルス）、ヘパシウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、およびペスチウイルス（ボーダー病ウイルス、ウシ下痢ウイルス、ハクチョウ熱ウイルス（swan fever virus））、
・ラブドウイルス科のウイルス、例えば特にベジクロウイルス（水疱性口内炎ウイルス）、リッサウイルス（オーストラリア、ヨーロッパラゴスコウモリウイルス（European Lagos bat virus）、狂犬病ウイルス）、エフェメロウイルス（ウシ一日熱ウイルス）、ノビラブドウイルス（スネークヘッドウイルス（snakehead virus）、出血性敗血症ウイル
ス、および造血壊死ウイルス（hematopoietic necrosis virus））、
・トガウイルス科、例えば特にルビウイルス（風疹ウイルス）、アルファウイルス（特にシンビスウイルス（Sinbis virus）、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、
・ヘルペスウイルス科、例えば特にヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、ＨＨＶ−７、およびＫＳＨＶ）、
・ポックスウイルス科、例えば特にオルソポックスウイルス（例えば特にカモエポックス（camoepox）、牛痘、天然痘、ワクシニア）、カルピポックス（carpipox）ウイルス（例えば、特に羊痘）、アビポックスウイルス（例えば特に鶏痘）、パラポックスウイルス（例えば特にウシ丘疹性口内炎ウイルス（Bovine papular stomatitis virus））、およびレポリポックスウイルス（例えば特に粘液腫症ウイルス）、
・レトロウイルス科、例えば特にレンチウイルス（例えば特にヒト、ネコ、およびサル免疫不全ウイルス１および２、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、またはＭａｅｄｉ−Ｖｉｓｎａ疾患ウイルス）、およびレトロウイルス（例えば特にラウス肉腫ウイルス、ヒトリンパ球向性ウイルス１、２、および３）；
このリストは限定するものではない。これは更に、リバースジェネティクスにより細胞系で生産された、修飾された再集合体なまたは原型のウイルスであり得る。
【００４７】
これは特に、ウイルス糖タンパク質、例えばノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素、またはＭ１およびＭ２膜タンパク質、核タンパク質、インフルエンザウイルス非構造タンパク質（ＮＳ１）、または例えばパラミクソウイルス科ウイルスＦ融合タンパク質、または任意の他のウイルスタンパク質、特に前述のウイルスの膜に会合している任意のタンパク質であり得る。これは更に、修飾ウイルスタンパク質、例えば国際公開第２０１０／０５８１００号（［２６］）または国際公開第２０１０／０５８０９９号（［２７］）に記載されている融合タンパク質Ｆの変異体であり得る。
【００４８】
膜タンパク質が原核生物の感染病原体に由来する場合、これは、例えばサルモネラおよび百日咳菌のパータクチン抗原（このリストは限定するものではない）に由来するパータクチン外表面膜（outer surface membrane）抗原から選択される抗原であり得る。
【００４９】
本発明の目的のために、用語「生体膜」は、両親媒性脂質、特にリン脂質の二重層で構成され、各膜脂質が、膜の外側を向いた親水性極性頭部および内側を向いた疎水性尾部からなる、細胞をその環境から隔てる二重シートへの分子の任意の集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を意味することが意図される。これは、原核細胞、真核細胞、動物もしくは植物細胞、またはウイルスの膜であり得る。
【００５０】
これは、例えば、小胞膜、例えば、文献国際公開第２００７／１３２７９０号（［２９］）、同第１９９９／０３６０８５号（［３０］）等、同第２００５／０５８３５７号（［３１］）、または同第２００８／０９２１５３号（［３２］）に記載されているようなＶＬＰ（ウイルス様粒子）の膜、リソソームの膜、エキソソームの膜、プロテオリポソームの膜、小胞体膜、またはゴルジ体膜であり得、このリストは限定するものではない。
【００５１】
真核細胞膜の場合、これは、小胞膜、粗面小胞体膜、ゴルジ体膜、滑面小胞体膜、または原形質膜であり得、このリストは限定するものではない。これは、例えば組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ遺伝子操作技術によりまたは１もしくは複数の目的のワクチン抗原を発現するウイルスベクターを用いた細胞の感染により１または複数のワクチン抗原を発現する細胞系に由来する単離されたトランスジェニック宿主細胞であり得る。細胞中での導入遺伝子の発現を可能にする当業者に公知の任意の遺伝子操作技術が用いられ得る。これは、
形質導入により、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、超音波、感染、またはトランスフェクションにより細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば合成コードｍＲＮＡの発現を含む技術を含み得る。発現は、例えば一過性および／または誘導性であり得且つ／または例えば文献国際公開第０２０９０５３３号（［３３］）に記載の少なくとも１つの目的の抗原を構成し得る。細胞は、特にヒト胚性幹細胞を除く、任意の細胞、例えば単離されたヒト細胞−例えばヒト胚性幹細胞は除く−または単離された非ヒト動物もしくは植物細胞であり得る。単離された細胞は、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＣＬ−８１）、例えばＶｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１５８７）、ＣＨＯ、例えばＣＨＯ−Ｋｌ（ＣＣＬ  ６１、ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ、例えばＢＨＫ−２１
［Ｃ−１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１０（商標））、ＨＥＬＡ、ｐｅｒＣ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ社）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−１５７３（商標））、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７１１）、ＥＢｘ（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ／Ｖｉｖａｌｉｓ、文献国際公開第２００８／１２９０５８号（［１２］）に記載）、ＭＤＣＫ、例えばＭＤＣＫ（ＮＢＬ−２）（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−３４（商標））から選択される細胞系に由来し得、このリストは限定するものではない。細胞系から単離された細胞の場合、プロセスは以下のステップを含み得る：
・単離された細胞に、ウイルスを含む流体を接種するステップ、
・ウイルスを細胞中で増殖させるステップ、
・こうして増殖させたウイルスを細胞培養上清中に回収するステップ、
・必要に応じて、こうして回収されたウイルスを不活化するステップ、
・ウイルス膜を断片化するステップ。
【００５２】
細胞系から単離された細胞の場合、本発明のプロセスは代わりに以下を含んでもよい：
・単離された細胞に、ウイルスを含む流体を接種するステップ、
・ウイルスを細胞中で増殖させるステップ、
・表面に抗原を発現する細胞を回収するステップ、
・膜分画法を用いて、例えば細胞の破壊（breaking）およびその後の遠心により、細胞から膜、例えば原形質膜を単離するステップ、
・膜を断片化するステップ。
【００５３】
あるいは、
・遺伝子操作法を用いて、単離された細胞中で抗原を発現させるステップ、
・抗原を発現する細胞を増幅するステップ、
・表面に抗原を発現する細胞を回収するステップ、
・膜分画法を用いて、例えば細胞の破壊およびその後の遠心により、細胞から膜、例えば原形質膜を単離するステップ、
・膜を断片化するステップ。
【００５４】
あるいは、細胞は、胚形成尿膜系（embryonated allantoic system）に由来し得る。この点において、この胚形成系（embryonated system）は、任意の動物種の種類のもの、例えば鶏卵、またはウイルスに許容性である任意の他の動物の、特にトリの、尿膜系であり得る。例えば、前述の膜タンパク質を生産する孵化鶏卵（embryonated hen's egg）を得るためには、ステップは以下であり得る：
・ウイルス、例えば１０−３ｐｆｕ／ｍｌの濃度で２００μｌを、無菌室で飼育した雌鳥に由来する１１日齢の孵化卵の尿膜腔液に接種するステップ、
・これらの卵を、その後、２〜３日間、約３３℃でインキュベートし、その間に、ウイルスが尿膜腔液中に蓄積するステップ、
・卵をカットし、感染病原体の濃度が上昇した尿膜腔液を吸引するステップ。
【００５５】
ウイルス膜の場合、これは、ウイルスおよび／または発現されるワクチン抗原のウイル
ス起源に応じて、感染宿主細胞の細胞質膜または原形質膜の出芽に由来するエンベロープであり得る。この場合、エンベロープは、ウイルス出芽中にその膜に会合しているウイルス糖タンパク質の発現により修飾された、感染細胞の細胞質起源または原形質起源の膜であり、エンベロープの脂質自体は細胞起源である。この場合、これは、ワクチン接種および／または免疫化が望まれるウイルスの膜であり得る。
【００５６】
本発明の目的のために、用語「カリックスアレーン」は、カリックスアレーンファミリーの超分子界面活性剤を意味することが意図される。この点において、本発明で用いられるカリックスアレーンは当業者に公知の任意の技術によって合成することができる。これは、例えば文献国際公開第２００９／１４４４１９号（［２８］）に記載されているプロセスを含み得る。
【００５７】
本発明の目的のために、用語「アルキル」は、飽和または不飽和の、直鎖、分岐鎖、または環状の、置換されていてもよい、１〜１２個の炭素原子を含む炭素系ラジカルを意味することが意図される。例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、およびドデカニルラジカルならびにその分岐異性体を挙げることができる。アルキル基は、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、Ｎ、およびＰの群から選択される１または複数の異種原子で置換されていてよい。
【００５８】
用語「アリール」は、一般的に、６〜２０個の炭素原子を含む環状芳香族置換基を意味する。本発明の文脈において、アリール基は、単環式または多環式であり得、これは置換されていてもよい。この点において、ベンジルまたはフェニルを挙げることができる。
【００５９】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される塩」は、化合物上に存在する置換基に応じて非毒性の酸または塩基で製造された塩を含む。本発明の化合物が酸性官能基を含む場合、対応する塩は、必要に応じて好ましくは不活性である溶媒の存在下で、中和された形態の化合物に有機または無機塩基を加えることにより得ることができる。塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、アミノ（有機）、またはマグネシウム塩であり得る。本発明の化合物が塩基性官能基を含む場合、対応する塩は、必要に応じて好ましくは不活性である溶媒中で、有機または無機酸を加えることにより得ることができる。無機酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（monohydrogencarbonic acid）、リン酸、一水素リン酸（monohydrogenphosphoric acid）、二水素リン酸（dihydrogenphosphoric acid）、硫酸、一水素硫酸（monohydrogensulfuric acid）、またはヨウ化水素酸の塩であり得る。有機酸付加塩の例は、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、またはメタンスルホン酸の塩であり得る。
【００６０】
特定の一実施形態では、断片化ステップは、少なくとも１つの式（Ｉ）：
（式中、
・ｎは、１に等しい整数であり；
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素原子；または直鎖もしくは分岐鎖（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル基を表し；
・Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、互いに独立して、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ’または−ＳＯ３Ｙまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＰＯ（ＯＨ）ＯＹまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ’３基
（式中、
・ｍは、０〜２０の整数であり、
・Ｒ’は、水素原子を表す）
を表す）
のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩を用いて行われ得る。
【００６１】
ワクチン抗原を製造するプロセスは、前記ワクチン抗原に会合している生体膜を少なくとも１つの式（ＩＩＩ）
【００６２】
【化２】
2017531032.tif 000004
（式中、
・Ｘは、−（ＣＨ２）ｏ−ＣＯ２Ｙ基であり、
・ｏは、１〜３の整数であり、
・Ｒ４は、直鎖または分岐鎖（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であり、
・Ｙは、アルカリ金属である）
のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩と接触させることにより前記生体膜を断片化するステップを含み、
得られた前記ワクチン抗原は生体膜の断片を更に含み、前記断片はこの抗原に会合している。
【００６３】
本発明の主題は、ワクチン抗原を製造するプロセスであって、前記ワクチン抗原に会合している生体膜を少なくとも１つの式（ＩＩ）
【００６４】
【化３】
2017531032.tif 000005
（式中、
・Ｘは、−（ＣＨ２）ｏ−ＣＯ２Ｙ基であり、
・ｏは、１〜３の整数であり、
・Ｙは、アルカリ金属である）
のカリックスアレーンまたはその薬学的に許容される塩と接触させることにより前記生体膜を断片化するステップを含み、
得られた前記ワクチン抗原が、生体膜の断片を更に含み、前記断片が、断片化ステップが行われるこの抗原に会合している、プロセスに関する。
【００６５】
本発明の特定の一実施形態では、ｏは１である。本発明のこの主題では、カリックスアレーンはＣＡＬＸ１３３ＡＣＥと呼ばれる。カリックスアレーンがＣＡＬＸ１３３ＡＣＥであるこの特定のケースでは、本発明のプロセスおよびその使用は、前述のワクチン抗原の断片化に加えて、ＣＭＶおよびＨＩＶの断片化を含み得る。別の一実施形態では、ワクチン抗原は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抗原またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）抗原ではない。
【００６６】
有利には、プロセス中でのカリックスアレーン、特に式（ＩＩＩ）のカリックスアレーン、特にＣＡＬＸ１３３ＡＣＥの使用は、例えば断片化されるウイルス膜内にワクチン抗原をその立体構造で保存することにより、ワクチン抗原の立体構造の最適な保存を可能にする。有利には、本発明のプロセスを行うことにより得られるワクチン抗原が生体膜の断片を含み、前記断片がワクチン抗原に会合していることは、ワクチン抗原の立体構造の最適な保存を可能にする。有利には、特に洗剤を用いて断片化される先行技術のプロセスと比べて、本発明に係るウイルス抗原の立体構造の保存は、本発明のプロセスに従って断片化されたウイルス抗原のより高い有効性、特にワクチン有効性を可能にする。
【００６７】
本発明の目的のために、用語「アルカリ金属」は、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、（有機）アミノ塩、またはマグネシウム塩から選択される、任意のアルカリ金属を意味することが意図される。
【００６８】
特定の一実施形態では、ｏは１であり且つ／またはＹはナトリウムである。
【００６９】
有利には、本発明で使用されるカリックスアレーンは、他の界面活性剤、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００およびデオキシコレートと比べて、表面ワクチン抗原等の膜糖タンパク質の立体構造の改善された保存を提供する。この文脈において、その使用は、免疫原性の点ではるかに効果的なワクチン抗原を特に有利に作製することを可能にし、したがって、同じ保護のためのワクチンバッチに必要な抗原の量を少なくすることができる。更に、これらの抗原は、より良く保存されているのでより効果的であり、本発明の特定の一実施形態では、アジュバントの完全なまたは部分的な代替物となることができる。
【００７０】
本発明の目的のために、用語「生体膜の断片化」は、膜全体の、膜断片へのあらゆる非複合体化（decomplexification）を意味することが意図される。有利には、生体膜の断片化（スプリットともいう）により、膜タンパク質を含む生体膜の断片を得ることができる。有利には、本発明のプロセスによる、生体膜断片内での、言い換えると膜環境中での膜タンパク質の維持は、膜タンパク質の立体構造の保存を可能にし、先行技術の方法より免疫原性の点ではるかに効果的なワクチン抗原の作製を可能にする。
【００７１】
接触ステップは、５．５〜１０、好ましくは６〜９、例えば約７．９５のｐＨで行われ得る。断片化ステップは、０〜１００℃、好ましくは４〜２５℃、特に４℃の温度で行われ得る。断片化ステップでは、濃度１０−６〜１０−２Ｍのカリックスアレーン、例えばＣＡＬＸ１３３ＡＣＥが用いられ得る。
【００７２】
断片化ステップは、溶液中のカリックスアレーンまたはその界面活性特性のためコロイド凝集体の形態であるカリックスアレーンを用いて行われ得る。本発明の目的のために、用語「コロイド凝集体」は、溶媒に関する反発力に従って組織化される数十〜数百のカリックスアレーン分子の集合体を意味することが意図される。その性質を考えると、カリックスアレーン、例えばＣＡＬＸ１３３ＡＣＥは、適切な媒体中、例えば水中、水溶液中、等張性の媒体中、または生物学的媒体中で凝集体を形成することができる。
【００７３】
凝集体は、好ましくはミセルの形態であり得る。用語「ミセル」は、使用される溶媒に応じて組織化される式（Ｉ）のカリックスアレーン分子の球状凝集体を意味する。例えば、水または水性溶媒中では、親油性末端はミセル中を向き、親水性末端はミセルと溶媒の界面を形成する。有機溶媒、例えば油中では、この配置は逆になる。用語「リポソーム」は、特に水性区画によって互いに隔てられた帯状の（strips of）リン脂質からなる、小さい人工的に生産された小胞を意味する。これらは、細胞膜に非常に近い構造を有し得る。本発明の文脈において、用語「ナノ粒子」は、寸法の少なくとも１つがナノメートルサイズ、例えば１〜３００ｎｍである物体を生じる、数百〜数千の式（Ｉ）のカリックスアレーン分子の集合体を意味する。本発明のプロセス中、抽出する膜タンパク質を含む水性懸濁液を、式（Ｉ）のカリックスアレーンと接触させるステップは、必要に応じて以下を含む群から選択される少なくとも１つの共溶質の存在下で行ってもよい：
（ｉ）薬学的に許容される塩を含む群から選択される有機および無機塩；
（ｉｉ）アミノ酸、ビタミン、脂質、ステロイド、炭水化物、または代謝物質の群から選択される生理活性小分子；
（ｉｉｉ）ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴ糖の群から選択されるオリゴマー生理活性分子；
（ｉｖ）タンパク質、ポリヌクレオチド、および多糖の群から選択されるポリマー生体分子。
【００７４】
本発明の一実施形態では、接触ステップに以下のステップが先行してよい：
・抽出する膜タンパク質またはそれを含む膜画分をバッファー溶液に溶解するステップ、および
・上記の温度、ｐＨ、および濃度条件に応じて式（Ｉ）のカリックスアレーンを加えるステップ。
【００７５】
本発明の一実施形態では、接触ステップの後に遠心ステップが続いてよく、これにより、式（Ｉ）のカリックスアレーンと複合体化した膜タンパク質を非複合体化膜タンパク質から分離することが可能になる。
【００７６】
式（Ｉ）のカリックスアレーンと複合体化した膜タンパク質および非複合体膜タンパク質は、遠心、例えば速度１０００００ｇ、４℃で１時間の遠心により分離することができる。遠心条件はタンパク質の性質に依存する。当業者であれば、例えばLenoir, G., Menguy, T., Corre, F., Montigny, C., Pedersen, P. A., Thines, D., le Maire, M., and Falson, P. (2002) Overproduction in yeast and rapid and efficient purification of the rabbit SERCAIa Ca2+-ATPaSe, Biochim. Biophys. Acta 1560, 67-83 ([13])に記載されている最適な遠心条件をどのように選択するかが分かるであろう。
【００７７】
有利には、断片化ステップに、当業者に公知の任意の方法による不活化ステップ、例えばホルムアルデヒドを用いた不活化、ベータ−プロピオノラクトンを用いた不活化、紫外線照射による不活化、またはホルマリンを用いた不活化のステップが先行および／または後続してよく、必要に応じて、文献米国特許出願公開第２００９／００６０９５０号（［１４］）および米国特許第６０４８５３７号（［１５］）に記載されているように例えば超遠心による、部分的精製ステップが後続または先行してよい。
【００７８】
本発明のプロセスは、断片化（スプリット）に用いられる化合物を式（Ｉ）のカリックスアレーンまたはその塩と置き換えることで、任意の従来の産業的ワクチン抗原生産プロセス、例えば文献国際公開第２０１１／０５１２３５号（［１６］）、米国特許出願公開第２０１１／００１４２３０号（［１７］）、国際公開第２００２／０２８４２６号（［１８］）、米国特許出願公開第２００９／００６０９５０号（［１４］）、国際公開第０２／０６７９８３号（［９］）、米国特許第４２０６０１４号（［１９］）、国際公開第
２００９／１１５９１７号（［２０］）、または国際公開第２００５／１１３７５６号（［２１］）に記載のプロセスに含まれ得る。
【００７９】
一実施形態では、ダイアフィルトレーションステップが行われ得る。有利には、これは、界面活性剤または他の不純物を除去することを可能にする。このステップは、当業者に公知の任意の方法で行うことができる。これは、例えば透析、希釈、カラム上でのバッファー交換、酵素作用、ポリマー、例えばＢｉｏｂｅａｄｓ、特にＳＭ２またはＤｏｗｅｘの使用、沈殿、またはＯｌｌｉｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ollivon M1, Lesieur S, Grabielle-Madelmont C, Paternostre M.: "Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles" Biochim Biophys Acta. 2000 Nov 23;1508(1-2):34-50 ([25])）に記載の技術から選択される技術であり得、このリストは網羅的ではない。
【００８０】
有利には、滅菌濾過ステップが行われ得る。有利には、このステップは、更により多くの不純物の除去を可能にする。このステップは、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。これは、例えば、濾過、例えば多孔度（porosity）が０．２２μｍ未満の濾過膜を用いた濾過であり得る。
【００８１】
一実施形態では、本発明のプロセスは更に、前記ワクチン抗原を透析するステップを含み得る。有利には、このステップは、更により多くの不純物の除去を可能にする。このステップは、当業社に公知の任意の方法によって行うことができる。これは、例えば、多孔度が１４０００ダルトン未満の膜を用いた透析であり得る。
【００８２】
一実施形態では、プロセスは更に、膜タンパク質を濃縮するステップを含み得る。このステップは、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。これは、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）または硫酸アンモニウム等を用いた沈殿、蒸発、濃縮器、例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）タイプ、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）またはＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）（メルクミリポア社）の使用であり得る。
【００８３】
本発明のプロセスは更に、例えば文献国際公開第２０１１／０５１２３５号（［１６］）、米国特許出願公開第２０１１／００１４２３０号（［１７］）、国際公開第２００２／０２８４２６号（［１８］）、米国特許出願公開第２００９／００６０９５０号（［１４］）、国際公開第０２／０６７９８３号（［９］）、米国特許第４２０６０１４号（［１９］）、国際公開第２００９／１１５９１７号（［２０］）、または国際公開第２００５／１１３７５６号（［２１］）のプロセスに記載されている、ワクチンの製造において当業者に公知の任意のステップを含み得る。
【００８４】
上記プロセスを行うことにより生産できるワクチン抗原（例えばワクチン抗原はＨＩＶ抗原またはＣＭＶ抗原ではない）も記載される。
【００８５】
前述のワクチン抗原を含むワクチン（例えばワクチン抗原はＨＩＶ抗原またはＣＭＶ抗原ではない）も記載される。
【００８６】
ワクチンは、所望のワクチン接種に好適な任意の公知の経路、例えば、注射により、特に皮下、皮内、筋肉内、経口、鼻腔内、経上皮、経皮的に、パッチにより、粘膜付着性錠剤により、直腸的に、例えば坐剤により、投与可能であり得る。
【００８７】
ワクチンは、パンデムリックス（登録商標）タイプ（ＧＳＫ社）、フォセトリア（登録商標）（ノバルティス社）、またはＨｕｍｅｎｚａ（登録商標）（サノフィパスツール社（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ））タイプのアジュバントを含むワクチンまたは３価Ｆｌｕｖｉｒａｌ（ＧＳＫ社）もしくは４価Ｆｌｕａｒｉｘ（ＧＳＫ社）、Ｃｅｌｖａｐａ
ｎ（登録商標）（バクスター社（Ｂａｘｔｅｒ））もしくはＶａｘｉｇｒｉｐ（登録商標）（サノフィパスツール社）タイプのアジュバントを含まないワクチンであり得、このリストは限定するものではない。これらの例において、ウイルスは、本発明に係るワクチン抗原で置き換えられる。アジュバントを含むワクチンの場合、前記アジュバントは、免疫応答を増大させることができる当業者に公知の任意のアジュバント、例えばアルミニウム塩、リゾレシチン、ミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、水酸化アルミニウム、マイクロエマルション、脂質粒子、またはオリゴヌクレオチドであり得る。
【００８８】
ワクチンは、任意の薬学的に許容されるキャリア、例えば前述のワクチンに含まれるもの、または安定化塩、溶解剤、浸透圧調節剤（osmoregulator）、増粘剤、生理的酸化還元電位を維持するための酸化還元化合物を含み得、このリストは限定するものではない。
【００８９】
ヒト用の１用量のワクチンは、例えば、注射される０．５ｍｌの体積に相当し得る。
【００９０】
ワクチンは更に、特に補形剤形態で、式（Ｉ）のカリックスアレーンを含み得る。本発明に関して、用語「補形剤」は、認められた効果を有することが意図される物質を意味することが意図される。これは、有利には、所与の形状または他の特定の物理的特徴を最終製品に付与することができ、同時に、活性成分とのあらゆる望まれない相互作用、特に化学的相互作用を防ぐことができる。これに関して、ワクチン中に存在し得るカリックスアレーンの量は０．１〜１０００μｇ、例えば０．５〜７００μｇ、１〜６００μｇ、または５〜５００μｇであり得る。
【００９１】
本発明のもう１つの主題は、前述のワクチンまたはワクチン抗原を製造するためのカリックスアレーンのまたは式（ＩＩ）の使用に関し、例えば、ワクチン抗原は前述したように、ウイルス抗原ではない（ＨＩＶのものを除く）またはＣＭＶの抗原ではない。式（Ｉ）のカリックスアレーンの使用も記載される。
【００９２】
本発明のもう１つの主題は、例えばワクチン抗原がＨＩＶ抗原またはＣＭＶ抗原ではない、感染症の処理または防止における医薬としての応用のための前述のワクチン抗原またはワクチンに関する。感染症は、例えば以下から選択されるウイルスの１または複数によって生じる疾患であり得る：
【００９３】
・オルトミクソウイルス科、例えば特にインフルエンザウイルス、例えば哺乳動物インフルエンザウイルス、より具体的にはヒトインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、例えばハクチョウインフルエンザウイルス、
・パラミクソウイルス科、例えばレスピロウイルス（センダイ、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒトパラインフルエンザ１および３）、ルブラウイルス（ヒトパラインフルエンザ２、４、４ａ、４ｂ、ヒトムンプスウイルス、パラインフルエンザ５型）、アブラウイルス（ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ））、ニューモウイルス（ヒトおよびウシ呼吸器多核体ウイルス）、メタニューモウイルス（動物およびヒトメタニューモウイルス）、モルビリウイルス（麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、および牛疫ウイルス）、およびヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパーウイルス等）、
・コロナウイルス科、例えば特にヒトコロナウイルス（特にＮＬ６３、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）および動物コロナウイルス（イヌ、ブタ、ウシコロナウイルスおよびトリ伝染性気管支炎コロナウイルス）、
・フラビウイルス科、例えば特にアルボウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス）、フラビウイルス（デングウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、例えばＫｕｎｊｉｎ亜型、マレー渓谷ウイルス、ロシオウイルス、イルヘウスウイルス、ダニ媒介性髄膜脳炎ウイルス）、ヘパシウイルス（Ｃ型肝
炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、およびペスチウイルス（ボーダー病ウイルス、ウシ下痢ウイルス、ハクチョウ熱ウイルス）、
・ラブドウイルス科、例えば特にベジクロウイルス（水疱性口内炎ウイルス）、リッサウイルス（オーストラリア、ヨーロッパラゴスコウモリウイルス、狂犬病ウイル）、エフェメロウイルス（ウシ一日熱ウイルス）、ノビラブドウイルス（スネークヘッドウイルス、出血性敗血症ウイルス、および造血壊死ウイルス）、
・トガウイルス科、例えば特にルビウイルス（風疹ウイルス）、アルファウイルス（特にシンビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、
・ヘルペスウイルス科、例えば特にヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、ＨＨＶ−７、およびＫＳＨＶ）、
・ポックスウイルス科、例えば特にオルソポックスウイルス（例えば特にカモエポックス、牛痘、天然痘、ワクシニア）、カルピポックスウイルス（例えば特に羊痘）、アビポックスウイルス（例えば特に鶏痘）、パラポックスウイルス（例えば特にウシ丘疹性口内炎ウイルス）、およびレポリポックスウイルス（例えば特に粘液腫症ウイルス）、
・レトロウイルス科、例えば特にレンチウイルス（例えば特にヒト、ネコ、およびサル免疫不全ウイルス１および２、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、またはＭａｅｄｉ−Ｖｉｓｎａ疾患ウイルス）、およびレトロウイルス（例えば特にラウス肉腫ウイルス、ヒトリンパ球向性ウイルス１、２、および３）；
このリストは限定するものではない。
【００９４】
例えば、インフルエンザウイルスの場合、ワクチンは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７ヒト亜型、ブタインフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、およびＨ３Ｎ２亜型、イヌインフルエンザおよびウマインフルエンザのＨ７Ｎ７およびＨ３Ｎ８亜型、またはトリインフルエンザのＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ５Ｎ９、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ４Ｎ８、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ８Ｎ４、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ６Ｎ５、およびＨ１２Ｎ５亜型から選択されるインフルエンザウイルスＡの１または複数の亜型または任意の他のヒトおよび／もしくは動物の再集合体ウイルスを含み得る。あるいは、インフルエンザウイルスの場合、ワクチンは、インフルエンザウイルスＢのヒト亜型から選択される１または複数、例えばビクトリア系統および山形系統から選択される系統を含み得る。インフルエンザウイルスＢの場合、これは、特にＢ／マサチューセッツ／２／２０１２またはＢ／ブリスベン／３３／２００８ワクチン株の問題である。
【００９５】
本発明のもう１つの主題は、ワクチン中のアジュバントとしての前述のカリックスアレーンの使用に関する。
【００９６】
上記のカリックスアレーンは、その免疫学的活性、より具体的には免疫調節活性のために用いることができる。これらは、対象、用量、抗原、およびそれが投与される時間に応じて、免疫刺激を引き起こし得る。
【００９７】
本発明の目的のために、用語「アジュバント」は、抗原と一緒にそれが投与された（飲み込まれた、吸入された、注射された等）時に免疫系を刺激する、活性化する、長引かせる、強化する、または調節するが、この物質自体は如何なる抗原特性も有さない物質を意味することが意図される。
【００９８】
これに関して、ワクチン中に存在し得るカリックスアレーンの量は、ワクチンの総重量
に対して０．１〜１０００μｇ、例えば０．５〜７００μｇ、１〜６００μｇ、または５〜５００μｇであり得る。
【００９９】
特定の一実施形態では、アジュバントは、用いられる生産プロセスに関係なく、任意のワクチン、例えば不活化もしくは減弱されたワクチンまたはスプリットワクチンに加えられ得る。
【０１００】
例として記載する、添付の図面に図解されている以下の例を読むことで他の利点が更に当業者に明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】Ｄ−４２（感染の４２日前）、Ｄ−２１（感染の２１日前）、Ｄ０（感染日および採血日）、Ｄ４（感染の４日後）、およびＤ１４（感染の１４日後）における、マウス中で曝露するＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ免疫化プロトコールを示す図である。
【図２】必要に応じて（左から右へ）Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）１／５ワクチン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００陰性対照、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ陰性対照、３μｇの抗原Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、３μｇの抗原−１用量Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、３μｇの抗原ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ、および０．５μｇの抗原ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで免疫化した、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０ｅ３）を感染させたマウスのＤ−４２（「予備（preliminary）」）、Ｄ−２１（「試料２」）、およびＤ０（「試料３」）でのＨＡＩ（赤血球凝集抑制）力価の測定を示す図である。
【図３】必要に応じて（左から右へ）Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）１／５ワクチン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００陰性対照、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ陰性対照、３μｇの抗原Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、３μｇの抗原−１用量Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、３μｇの抗原ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ、および０．５μｇの抗原ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで免疫化した、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０ｅ３）を感染させたマウスのＤ−４２（「予備」）、Ｄ−２１（「試料２」）、およびＤ０（「試料３」）でのＭＮ（マイクロ中和試験）力価の測定を示す図である。
【図４】免疫化して、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０ｅ３ＩＵ）を感染させたＤ０〜Ｄ１４のマウスの体重の測定（ｇ）を示す図であり、マウスには以下が投与された：Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン、用量１／５（◆）、陰性対照Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  Ｎｅｇ．  Ｃ．（□）、陰性対照ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ  Ｎｅｇ．  Ｃ（△）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で抽出した３μｇの抗原（×）、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出した３μｇの抗原（＊）、およびＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出した０．５μｇの抗原（●）。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥおよびＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥ分子を用いてインフルエンザワクチン抗原を抽出するためのプロトコール
ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥおよびＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥ分子（ＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥは、Ｒ４がＣ１０アルキル基であるカリックスアレーンである）を、インフルエンザワクチン抗原（ワクチンシードＸ−１７９ａ、Ｈ１Ｎ１パンデミック２００９の製品から生産）を抽出する能力について評価し、ワクチン製造業者に使用される洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）および２つの市販の洗剤（ＦＣ１２およびＣ１２Ｅ８）と比較した。複数の濃度、ｐＨ、および抽出温度条件を評価した。
【０１０３】
ワクチン抗原抽出の定量的および定性的評価は、抽出された抗原の赤血球凝集能を測定するため（赤血球凝集試験：Hirst, G.K. 1942. The quantitative determination of influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination. J. Exp. Med. 75:47-64 ([22])およびSalk, J.E. 1944. Simplified procedure for titrating hemagglutinating capacity of influenza virus and the corresponding antibody. J. Immunol. 
49:87-98 ([23])）および定量化するため（ＳＲＩＤ：インフルエンザウイルスを用いた免疫学的研究のための定量的一元放射拡散テスト。Schild GC, Henry-Aymard M, Pereira
HG. J Gen Virol. 1972 Aug;16(2):231-6 ([24])）の産業的対比試験（industrial reference test）を用いて行った。
試験した条件は表Ｉに記載のものである：
表Ｉ：
【０１０４】
【表１】
2017531032.tif 000006
【０１０５】
抽出後、抽出産物の塩および洗剤濃度を下げるために従来の産業的生産プロセス（例えば［９］、［１８］）で１×ＰＢＳに対する断片化抗原（上清ＳＮおよび抽出ペレット）の透析を行った。こうして各バッチを透析した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００は透析中に完全に除去されないことが確認された。しかし、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子は透析できたようであり、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子は市販可能なワクチン製品中に微量しか存在し得ないことが示唆された。
透析後、抽出産物を分注し、赤血球凝集能（ＨＡ）について滴定した。データを以下の表ＩＩに示す。  
【０１０６】
【表２】
2017531032.tif 000007
【０１０７】
この結果は、４℃およびｐＨ＝７．９５の条件下で濃度１％のＣＡＬＸ１３３ＡＣＥおよびＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥ分子を用いた抽出後に得られた断片化抗原（ＳＮ）の顕著な赤血球凝集（ＨＡ）力価（それぞれ５１２および１０２４）を示している。これらの力価は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて従来のプロトコールに従って抽出された抗原（ＳＮ）で得られたものより有意に高い。
【０１０８】
これらの結果は、（ｉ）得られた赤血球凝集力価が、使用されたＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子濃度に依存しており（０．１％対１％）、（ｉｉ）非抽出抗原残渣（ペレット）のＨＡ力価が、逆比例しており、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で得られたものより低いので、更に重要である。抽出温度は重要なパラメーターであるようであり、４℃の温度がＣＡＬＸ１
３３ＡＣＥおよびＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥ分子を用いたワクチン抗原の抽出に最適な温度であるようである。
【０１０９】
これらの最初の結果により、ワクチンメーカーにより使用される尿膜生産系において生産されるウイルスのバッチからのインフルエンザワクチン抗原の抽出にＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子が好適であることが明らかに示された。これらのＣＡＬＸ１３３ＡＣＥおよびＣＡＬＸ１１０３ＡＣＥ分子は、定性的な点から、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いた従来のものより効率的な抽出を可能にする（より多くの抗原の抽出、より高い赤血球凝集能、抗原オリゴマー化の天然プロファイル）。
【０１１０】
実施例２：ワクチン抗原の断片化の最適化およびマウスモデルにおいて有効性試験を行うためのその定量化
１１日齢の孵化鶏卵にウイルス接種材料（ワクチンシード）を接種し、その後、濃縮および精製することにより、ウイルス生産を行った。断片化を、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子の使用との比較で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（４％）を用いる従来の産業的方法に従って行った。
【０１１１】
抽出したワクチン抗原の定性的評価は、前記ワクチン抗原の赤血球凝集能（主要抗原赤血球凝集素の活性。力価をＵＨＡ／５０ｍｌで表す）を測定する産業的対比試験を用いて行う。定量的評価は、産業的対比技術を用いて行い、これは、薬物当局（drug authorities）によるワクチンバッチの確認および販売承認にも使用されている：一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ、ｍｇ／ｍｌで表したＨＡの量）。最後に、ｉＴＲＡＱ質量分析法によるＨＡの定量化により、動物試験で比較する種々の試料間の相対的量を得ることができる（ｍｇ／ｍｌで表したＨＡの量）。
【０１１２】
断片化に選択した分子および条件は以下の通りである。
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、４％、１時間、３７℃
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子、１％、２時間、４℃
【０１１３】
ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子は、赤血球凝集試験中、インフルエンザ抗原の非存在下で赤血球溶血を全く生じさせない。更に、この分子は透析可能であり、したがって、試料中のＣＡＬＸ１３３ＡＣＥを微量に限定できることが示唆される。
【０１１４】
実施例３：動物実験
第１の実験中、スプリット剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００またはＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子を用いて前述の最適な生産条件下で複数のバッチの抗原を生産した。以下の表ＩＩＩは、動物試験に用いた断片化材料の要約である。
【０１１５】
【表３】
2017531032.tif 000008
【０１１６】
この第１の実験中、スプリットについて２種類の量のＨＡ抗原（０．５および２．５μｇ）およびスプリットの超遠心により得られる上清について１種類だけを試験するように計画した。各条件について、１２匹のＢａｌｂ．ｃマウスを２回（Ｄ０およびその後Ｄ２１に）筋肉内免疫化した（合計１００μｌ）。Ｄ０、Ｄ２１、Ｄ４２、およびＤ６３に動物から複数の血液試料を採取した（心臓穿刺および安楽死）。各一連の採血後、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験およびマイクロ中和試験をｄｕｐｌｉｃａｔｅで行うのに充分な材料を得るために１つの同じグループから血清を回収して混合した。
【０１１７】
得られた結果を以下の表ＩＶに示す：
【０１１８】
【表４】
2017531032.tif 000009
【０１１９】
ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ断片化により作製された抗原を用いた実験を確認した（マウスの良好な耐性、採取された血清の質および量、確認済（＋）および対照（−）を用いたＨＡＩ結果の強度）。
【０１２０】
ＨＡＩおよびマイクロ中和試験の結果は、整合性がとれており、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ断片化により作製された抗原スプリット（試料３および心臓穿刺）は有意な抗体応答を誘導し、スプリットの超遠心により精製された抗原（表ＩＩＩおよびＩＶで「上清」と表記）は、これらの精製抗原がもはや膜中にないため、有意に抗体反応を誘導しないことを示しており、これにより、定性的および定量的な点からＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子を用いた
ワクチン抗原の生産および断片化のプロセスが確認された。
【０１２１】
更に、０．５μｇの注射用量に関して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００プロセスと比べてＣＡＬＸ１３３ＡＣＥプロセスで好ましい有意な差が現れている（試料３および心臓穿刺）。同じ傾向は２．５μｇの用量でも見られるが、ＨＡＩの差は有意ではない（試料３および心臓穿刺）。
【０１２２】
更に、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥプロセスによって作製された０．５μｇの用量の抗原によって誘導される抗体応答は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００プロセスによって作製された２．５μｇの抗原で誘導されるものと同様であるようである（試料３および心臓穿刺）。後者の結果は、ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子を用いて抗原を作製した時に５分の１の抗原で抗体応答が得られる可能性を示しているので、本発明にとって重要である。
【０１２３】
実施例４：ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥを用いたマウスの免疫化：作製されたワクチン抗原の保護能力のマウスにおける評価
第２の実験では、スプリット剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００またはＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ分子を用いて前述の最適な生産条件下で複数のバッチの抗原を生産した。以下の表Ｖは、この第２の動物実験で用いた断片化された材料の要約である。ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００抗原製剤でＢａｌｂ／ｃマウスを２回免疫化し、その後、動物における保護を検証するためにそれらのマウスにＡ／Ｈ１Ｎ１カリフォルニア／７／２００９株（Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ０９）を感染させるように計画した。
【０１２４】
グループ１：１用量の１／５のＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）（抗原当たり３μｇのＨＡに相当）でｉ．ｍ．（筋肉内）免疫化した１２匹のマウス（陽性対照）。
【０１２５】
グループ２：抗原を用いないＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の方法（６マウス）または抗原を用いないＣＡＬＸ１３３ＡＣＥの方法（６マウス）でｉ．ｍ．免疫化した１２匹の陰性対照マウス（「Ｃｔｒｌ」）。
【０１２６】
グループ３：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いた３μｇのＨＡ製剤でｉ．ｍ．免疫化した１２匹のマウス。
【０１２７】
グループ４：ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥを用いた３μｇのＨＡ製剤でｉ．ｍ．免疫化した１２匹のマウス。
【０１２８】
グループ５：ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥを用いた０．５μｇのＨＡ製剤でｉ．ｍ．免疫化した１２匹のマウス。
【０１２９】
免疫化プロトコールを図１に示す。
【０１３０】
以下の表Ｖは、この試験に用いた断片化された材料の要約である。
【０１３１】
【表５】
2017531032.tif 000010
【０１３２】
Ｄ＋４（ウイルス複製ピーク）でマウスを屠殺し、その肺のウイルス力価を測定した。
【０１３３】
免疫化してＨ１Ｎ１  ｐｄｍ０９（１０ｅ３ＩＵ）を感染させたマウスのＤ＋４での肺ウイルス力価を安楽死後に測定した。以下の表ＶＩに示す。
【０１３４】
【表６】
2017531032.tif 000011
【０１３５】
１０ｅ３ＩＵ／マウスのインフルエンザウイルスＡ  Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ０９（ｐａｎｄｅｍｉｃ）を鼻腔内感染させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体重をモニタリングした。これを図４に示す。
【０１３６】
ＨＡＩによる保護の測定
以下のマウスのグループを試験した。
・Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン１／５で免疫化したマウス
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００のみで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで免疫化したマウス
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて調製されたウイルス抗原３μｇで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出したワクチン抗原３μｇで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出したワクチン抗原０．５μｇで免疫化したマウス
【０１３７】
これらのマウスにＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０ｅ３）を感染させる。
【０１３８】
免疫化してＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０ｅ３）を感染させたマウスの血清のＨＡＩ試験の結
果を表ＶＩに示す。
【０１３９】
【表７】
2017531032.tif 000012
【０１４０】
ＨＡＩによる保護の測定を図２に示す。
【０１４１】
ＭＮ（マイクロ中和試験）による保護の測定
以下のマウスのグループを試験する。
・Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン１／５で免疫化したマウス
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００のみで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで免疫化したマウス
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて調製したウイルス抗原３μｇで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出したワクチン抗原３μｇで免疫化したマウス
・ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで抽出したワクチン抗原０．５μｇで免疫化したマウス
【０１４２】
これらのマウスにＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０３）を感染させる。
【０１４３】
免疫化してＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０３）を感染させたマウスの血清のＭＮ試験を以下の表ＶＩＩＩに要約する。
【０１４４】
【表８】
2017531032.tif 000013
【０１４５】
ＭＮによる保護の測定を図３に示す。
【０１４６】
マウスの保護
図５は、免疫化してＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（１０３ＩＵ）を感染させたマウスの体重のモニタリングを示す図である。
【０１４７】
全ての免疫化されたグループ（Ｆｌｕｖｉｒａｌ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、およびＣＡＬＸ１３３ＡＣＥ）において、体重の減少または死亡は見られない。
【０１４８】
２つの陰性対照グループのマウスのみ死亡した。
【０１４９】
結論
ＨＡＩおよびＭＮ試験：
免疫化は、０．５μｇの抗原スプリット／ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで、３μｇのＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）と同じように効果的である。
【０１５０】
免疫化は、３μｇの抗原スプリット／ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで、３μｇの抗原スプリット／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００より効果的である。
【０１５１】
保護：
保護は、０．５μｇの抗原スプリット／ＣＡＬＸ１３３ＡＣＥで、３μｇのＦｌｕｖｉｒａｌまたは３μｇの抗原スプリット／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００と同じように効果的である。
【０１５２】
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33. WO 02090533.
【図１】
2017531032.tif 000015
【図２】
2017531032.tif 000016
【図３】
2017531032.tif 000017
【図４】
2017531032.tif 000018
【国際調査報告】
2017531032.tif 000019
2017531032.tif 000020
2017531032.tif 000021
2017531032.tif 000022
2017531032.tif 000023
2017531032.tif 000024