(57)【要約】  眼疾患の治療、機能性ニューロンのシナプス発達の促進、並びに分娩後由来細胞などの前駆細胞、及びこの細胞由来の馴化培地を用いたニューロン成長の改善のための方法及び組成物が開示される。シナプス形成及びニューロン成長を促進する細胞によって分泌された栄養因子及びその他の剤も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分娩後由来細胞の集団を網膜変性した被験体の眼球に投与する方法であって、前記細胞集団はヒト臍帯組織由来細胞の均質な集団であり、前記ヒト臍帯組織由来細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記細胞の集団は少なくとも１つのシナプス形成因子を分泌し、前記シナプス形成因子はＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４から選択される、方法。
【請求項２】
ヒト臍帯組織由来細胞の均質集団を被験体の眼球に投与する工程を含む、網膜ニューロン内でシナプス形成又は神経突起成長を誘導する方法であって、前記細胞集団は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記ヒト臍帯組織由来細胞の集団は少なくとも１つのシナプス形成因子を分泌し、前記シナプス形成因子はＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４から選択される、方法。
【請求項３】
被験体の眼球に、ヒト臍帯組織由来細胞の均質集団を含む組成物を投与する工程を含む、網膜変性した被験体の網膜ニューロン内に機能性シナプスを発達させる方法であって、前記細胞集団は実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離され、前記ヒト臍帯組織由来細胞の集団は少なくとも１つのシナプス形成因子を分泌し、前記シナプス形成因子はＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４から選択される、方法。
【請求項４】
ヒト臍帯組織由来細胞の集団を網膜変性した被験体の眼球に投与する方法であって、前記細胞集団は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記ヒト臍帯組織由来細胞の集団は少なくとも１つのシナプス形成因子を分泌し、前記シナプス形成因子はＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４から選択される、方法。
【請求項５】
前記血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞集団は、培養中に増殖することができ、少なくとも神経表現型の細胞に分化する潜在能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
ａ）培養中に４０回集団倍加する潜在能力、
ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、
ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、及びＣＤ１４１の産生の欠如、並びに
ｄ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子をより多く発現すること、の特徴を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関して陰性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記網膜ニューロンは、網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アマクリン細胞、水平細胞、又は双極細胞からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記眼球への投与は、眼球内部への投与、又は前記眼球の背後への投与から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は医薬組成物である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物は薬学的に許容できる担体を含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、それぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１２月５日出願の米国特許仮出願第６２／０８８，４２９号、２０１５年２月２７日出願の米国特許仮出願第６２／１２６，３７０号、及び２０１５年９月１８日出願の米国特許仮出願第６２／２２０，８７３号の利益を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、眼科的疾患及び障害、特に、網膜変性症などの眼球症状に対する細胞ベースの療法又は再生療法の分野に関する。本発明は、臍帯組織由来細胞、胎盤組織由来細胞、及びこれらの細胞から調製された馴化培地などの前駆細胞を用いた、眼球細胞及び組織の再生又は修復のための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
身体の複雑かつ繊細な器官として、眼球は多数の疾患、及び身体が正常に機能する能力に影響を及ぼすその他の有害な状態を経験し得る。これらの状態の多くが、特定の眼球細胞、及びこれらの細胞から構成される組織の損傷又は変性を伴う。一例として、視神経及び網膜の疾患及び変性的状態は、全世界における失明の主な原因である。角膜、水晶体、及び付随する眼球組織の損傷又は変性は、全世界における失明のもう一つの大きな原因を占める。
【０００４】
網膜は、光信号を神経信号に変換する、７層の交互になる細胞及び突起を含む。網膜視細胞及び隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、多くの障害において、遺伝変種又は環境条件（加齢を含む）のために不均衡となる機能単位を形成している。これは、アポトーシス又は二次的変性による視細胞の喪失をもたらし、これは、進行性の視力悪化、及び、一部の場合では、失明をもたらす（参考として、例えば、Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．らのＰｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１；２０：４１５〜４４９）を参照されたい）。このパターンに該当する眼球障害の２つの部類は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び網膜色素変性症（ＲＰ）である。
【０００５】
ＡＭＤは、米国の５０歳以上の人口で最も大きな視力喪失の原因であり、その有病率は年齢とともに増加する。ＡＭＤの一次的障害は、ＲＰＥの機能障害及びブルッフ膜内の変化が原因であると考えられ、とりわけ、脂質沈着、タンパク質架橋、及び養分透過性の減少によって特徴付けられる（上記のＬｕｎｄら（２００１）を参照されたい）。黄斑変性症には、遺伝子構造、加齢、栄養、喫煙、及び太陽光への暴露を含む様々な要素が寄与する場合がある。ＡＭＤの非滲出性、即ち「乾燥」形態はＡＭＤの事例の９０％を占め、その他の１０％は滲出性新生血管形態（「湿潤型」ＡＭＤ）である。乾燥型ＡＭＤの患者においては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の段階的な消失が起こり、限局性の萎縮領域をもたらす。ＲＰＥの消失に続いて視細胞の喪失が起こるため、影響を受けた網膜領域は視覚機能をほとんど又は全く有さない。
【０００６】
ＡＭＤの現行の療法は、例えばレーザー療法及び薬学的インターベンションなどの処置を伴う。熱エネルギーを移送することによって、レーザービームは、黄斑下の漏孔のある血管を破壊して、視力喪失の速度を低下させる。レーザー療法の欠点は、ビームによって送達される高い熱エネルギーが、隣接する健康な組織も破壊してしまうことである。Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ第４版（Ｐｕｒｖｅｓ，Ｄら（２００８））には、「現在、乾燥型ＡＭＤに対する治療法は存在しない」と記載されている。
【０００７】
ＲＰＥ移植は、ヒトにおいては失敗している。例えば、Ｚａｒｂｉｎ，Ｍ（２００３）には「通常の加齢下では、ヒトのブルッフ膜の、特に黄斑下区域は、（例えば、厚さの増大、ＥＣＭ及び脂質の堆積、タンパク質の架橋、糖化最終産物の非酵素的形成を含む）様々な変化を経験する。これらの変化及びＡＭＤが原因の更なる変化は、ＥＣＭリガンド（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩＶ）の生物学的利用性を低下させて、ＡＭＤを患う眼球内におけるＲＰＥ細胞の極めて低い生存率の原因となり得る。そのため、ヒトＲＰＥ細胞が、これらのＥＣＭ分子と結合するために必要なインテグリンを発現するものの、加齢した黄班下のヒトブルッフ膜上で生存するＲＰＥ細胞は、障害を生じる」と記載されている。（Ｚａｒｂｉｎ，ＭＡ，Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｏｃ，２００３；１０１：４９３〜５１４）。
【０００８】
網膜色素変性症は、主に遺伝性疾患であり、１００を超える突然変異が視細胞の喪失に関係していると考えられている（上述のＬｕｎｄら（２００１）を参照されたい）。突然変異の大部分は視細胞を標的にしているが、いくつかはＲＰＥ細胞に直接影響を与える。これらの突然変異は、視細胞とＲＰＥ細胞との間における分子の輸送及び光伝達としてのこうしたプロセスに、協働して影響を及ぼす。
【０００９】
それほど一般的ではないが、なおかつ消耗性のその他の網膜症は、視力喪失及び失明をもたらす進行性の細胞変性を更に伴い得る。これらとしては、例えば、糖尿病性網膜症、及び脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）が挙げられる。
【００１０】
細胞及び組織の修復及び再生のための幹細胞に基づく療法の出現は、上記の数多くの細胞変性病態及びその他の網膜状態に対する有望な治療を提供する。幹細胞は、自己複製及び分化して多種多様な成熟細胞系統を発生させる能力を有する。こうした細胞の移植は、標的組織を再構成することによって、生理学的及び解剖学的機能を修復するための臨床的手段として用いられ得る。幹細胞技術の適用は広範にわたり、組織工学、遺伝子治療の送達、及び細胞治療（即ち、生物学的薬剤を生成するか、又はそれらの薬剤を含む、生細胞又は細胞成分を体外から供給することによって、標的部位にそのような生物学的薬剤を送達すること）を含む。（参考として、例えば、Ｔｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．らのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）４２：２〜３７を参照されたい）。
【００１１】
細胞療法は神経性障害の治療に対する優れた可能性を示している。移植された細胞は、損傷した細胞を置き換えることにより、又は神経の健康状態及び再生を増強する栄養因子を提供することにより、回復及び神経保護作用を促進するものと考えられている。（Ｄｏｅｐｐｎｅｒ  ＴＲ，Ｈｅｒｍａｎｎ  ＤＭ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）；８：３５７、Ａｔａｌａ  Ａ，Ｌａｎｃｅｔ（２０１４／２０１５）；３８５（９９６７）：４８７〜４８８、Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＰＧ，Ｃｅｌｌ（２０１２）；１５０：１１０５〜１１０６、Ｌｉｎｄｖａｌｌ  ＯらのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１０）；１２０：２９〜４０、Ｒａｏ  ＭＳ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００１）；１２２：７１３〜７３４）。ニューロン突起の萎縮は、多くの神経性障害で普遍的な事象であり、そのため、神経突起成長のトリガとなり得る要因を提供することで、これらの疾患における治療効果がもたらされ得る。特に、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）は、ニューロンの喪失に対する有望な治療法となり得る。ヒト臍帯は、倫理的な問題なしに分娩後臍帯から採取可能であり、インビトロ培養中に核型安定性を有することが示されており、また、増殖が可能である（ＬｕｎｄらのＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００７）；２５（３）：６０２〜６１）。ｈＵＴＣ投与の治療的可能性は、様々な動物疾患モデルで実証されてきた。例えば、卒中動物モデルへのｈＵＴＣの送達（ＭｏｏｒｅらのＳｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）；３０：１８５〜１９６、Ｚｈａｎｇ  ＬらのＢｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）；１４８９：１０４〜１１２、Ｚｈａｎｇ  ＬらのＣｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０１３）；２２：１５６９〜１５７６、Ｊｉａｎｇ  ＱらのＰｌｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）；７（８）：ｅ４２８４５、Ｚｈａｎｇ  ＬらのＳｔｒｏｋｅ（２０１１）；４２：１４３７〜１４４４）、及び網膜変性動物モデルへのｈＵＴＣの送達（上記のＬｕｎｄらのＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００７）は、これらの細胞が機能回復を強化し、ニューロンを進行性の変性及び細胞死から保護することを示している。
【００１２】
近年では、分娩後由来細胞が網膜変性を改善することが示されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットは、チロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｔｋ）が欠損して、外節食作用に影響を及ぼし、視細胞の細胞死をもたらすことを示す。（Ｆｅｎｇ  ＷらのＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：２７７（１９）：１７０１６〜１７０２２）。ＲＣＳラットの網膜下腔に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を移植することで、視細胞の喪失の進行を制限して、視覚機能を維持することが判明した。分娩後由来細胞を用いて、ＲＣＳモデルの視細胞のレスキューを促進して、視細胞を保存し得ることも実証されている。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）をＲＣＳラットの眼球に網膜下注入することで、視力が向上し、網膜変性が改善された。更に、ｈＵＴＣ由来の馴化培地（ＣＭ）を用いた治療によって、インビトロでジストロフィＲＰＥ細胞におけるＲＯＳの食作用が回復した。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。視力を改善するｈＵＴＣの機構を本明細書で更に究明する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、眼疾患及び障害に対する細胞に基づく療法又は再生療法に適用可能な組成物又は方法を提供する。詳細には、本発明は、分娩後由来細胞などの前駆細胞及びこれらの細胞から生成された馴化培地を用いた、眼球細胞及び組織の再生又は修復を含む、眼疾患又は状態を治療するための方法並びに医薬組成物を含む組成物を特徴とする。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞、又は胎盤組織由来細胞であり得る。
【００１４】
本発明の一態様は、前駆細胞の集団又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含む、ニューロン細胞内でシナプス形成を誘導することによって眼疾患を治療する方法である。本発明の一実施形態では、ニューロン細胞又はニューロンは、網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アミクリン（amicrine）細胞、水平細胞、又は双極細胞などの網膜ニューロンである。本発明の特定の実施形態では、前駆細胞は分娩後由来細胞である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。更なる一実施形態では、前駆細胞は栄養因子を分泌する。一実施形態では、馴化培地は、前駆細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。実施形態では、分娩後由来細胞などの前駆細胞によって分泌された栄養因子は、シナプス形成を誘導する。実施形態では、栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００１５】
本発明の一態様では、前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含む、ニューロン細胞内で神経突起成長を誘導することにより眼疾患を治療する方法。本発明の一実施形態では、ニューロン細胞又はニューロンは、網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アミクリン細胞、水平細胞、又は双極細胞などの網膜ニューロンである。本発明の特定の実施形態では、前駆細胞は分娩後由来細胞である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。更なる一実施形態では、前駆細胞は栄養因子を分泌する。一実施形態では、馴化培地は、前駆細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。実施形態では、分娩後由来細胞などの前駆細胞によって分泌された栄養因子は、シナプス形成を誘導する。実施形態では、栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００１６】
本発明の更なる一態様は、前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含む、神経突起成長を誘導する方法である。本発明の一実施形態では、ニューロン細胞（ニューロン）は、例えば、網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アミクリン細胞、水平細胞、又は双極細胞などの網膜ニューロンである。本発明の実施形態では、前駆細胞は分娩後由来細胞である。実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。更なる実施形態では、前駆細胞は栄養因子を分泌する。一実施形態では、馴化培地は、前駆細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。実施形態では、分娩後由来細胞などの前駆細胞によって分泌された栄養因子は、神経突起成長を誘導する。更なる一実施形態では、前駆細胞によって分泌された栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００１７】
本発明の別の一実施形態は、前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含む、網膜ニューロン内で機能性シナプスを発達させる方法である。本発明の実施形態では、網膜ニューロンは網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アミクリン細胞、水平細胞、又は双極細胞であり、前駆細胞は分娩後由来細胞である。実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。更なる一実施形態では、前駆細胞は栄養因子を分泌する。一実施形態では、馴化培地は、前駆細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。実施形態では、分娩後由来細胞などの前駆細胞によって分泌された栄養因子は、神経突起成長を誘導する。更なる一実施形態では、前駆細胞によって分泌された栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００１８】
本明細書における本発明の実施形態では、例えば分娩後由来細胞などの前駆細胞の集団から調製された馴化培地は、細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。細胞によって分泌されたこうした栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）、又は胎盤組織由来細胞（ＰＤＣ）である。
【００１９】
一実施形態では、前駆細胞は、網膜ニューロン内における機能性シナプスの発達を促進する。別の実施形態では、前駆細胞によって分泌された栄養因子は、ニューロン内における機能性シナプスの発達を促進する。特定の一実施形態では、栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。更に別の実施形態では、前駆細胞の集団は、ニューロン細胞の増殖を支援する。
【００２０】
更なる一実施形態では、前駆細胞の集団から調製された馴化培地は、ニューロン細胞の増殖を支援する。本発明の実施形態では、上記の前駆細胞の集団から調製された馴化培地は、細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。特定の一実施形態では、栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００２１】
本発明の別の一態様は、網膜変性においてシナプスの発達を促進するための方法を特徴とし、方法は、被験体にシナプスの発達を促進するのに有効な量の馴化培地を投与することを含む。本発明の一実施形態では、馴化培地は、分娩後由来細胞の集団から調製される。特定の一実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。その他の実施形態では、馴化培地は、細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。細胞によって分泌されたこうした栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。
【００２２】
本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から誘導される。実施形態では、細胞は培養中に増殖可能であり、また、神経表現型の細胞に分化する潜在能力を有し、細胞は、増殖するためにＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で増殖することが可能である。細胞は、（ａ）培養中に少なくとも約４０回倍加する潜在能力、ｂ）コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器上での付着及び増殖（ここでコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオミチン（polyomithine）、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）、（ｃ）組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生、（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうちの少なくとも１つの産生、（ｅ）フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちの少なくとも１つの産生の欠如、（ｆ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫（melonoma）増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウイルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ホモサピエンスクローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ、仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ１；及びクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のホモサピエンス遺伝子、をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つが増大されている遺伝子発現、（ｇ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、低身長感受性（short stature）ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、αＢ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２（disheveled associated activator of morphogenesis 2）；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体、α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチ���ーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α  １；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；ヘファエスチン；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期増殖応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮想タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン１の類似体；Ｂ細胞転座遺伝子１；仮想タンパク質ＦＬＪ２３１９１；並びにＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１、をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つが低減されている遺伝子発現、並びに（ｈ）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼ発現の欠如、の特徴のうちの１つ又は２つ以上を更に備える。一実施形態では、臍帯組織由来細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出される、（ｉ）ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌、（ｊ）ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如、の特徴を更に有する。別の一実施形態では、胎盤組織由来細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出される、（ｉ）ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌、（ｊ）ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如、の特徴を更に有する。
【００２３】
特定の実施形態では、分娩後由来細胞は、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６８）、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７５）、又は細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７９）の全ての識別特徴を有する。一実施形態では、臍組織由来の分娩後由来細胞は、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、又は細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６８）の全ての識別特徴を有する。別の一実施形態では、胎盤組織由来の分娩後由来細胞は、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７４）；細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７５）；又は細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７９）の全ての識別特徴を有する。
【００２４】
特定の実施形態では、分娩後由来細胞は、メタロプロテアーゼ活性、粘液溶解活性、及び中性プロテアーゼ活性を含む、１つ又は２つ以上の酵素活性の存在下で単離される。好ましくは、これらの細胞は、培養中に継代される際に維持される、正常核型を有する。好ましい実施形態では、分娩後由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０をそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ含む。好ましい実施形態では、分娩後由来細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７のいずれも含まない。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞は、フローサイトメトリーで検出した場合に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも含まない。実施形態では、細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
【００２５】
本発明の実施形態では、細胞集団は分娩後由来細胞の実質的に均質な集団である。特定の一実施形態では、集団は分娩後由来細胞の均質な集団である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から誘導される。
【００２６】
特定の実施形態では、上述した分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から生成された馴化培地は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、又は他の複能性若しくは多能性の幹細胞などの、少なくとも１つのその他の細胞型と共に投与される。これらの実施形態では、他の細胞型は、細胞集団又は馴化培地と同時に、これらの前に、又はこれらの後に投与することができる。
【００２７】
同様に、これら及びその他の実施形態では、上述した分娩後由来細胞の集団、又は細胞集団から調製された馴化培地は、眼球治療用の薬剤などの少なくとも１つのその他の薬剤、又は抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、若しくは増殖因子などの別の有益な補助剤と共に投与される。これらの実施形態では、他の剤は、細胞集団又は馴化培地と同時に、これらの前に、又はこれらの後に投与することができる。
【００２８】
様々な実施形態では、分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞（臍又は胎盤）から生成された馴化培地は、眼球の表面に投与するか、あるいは眼球の内部又は眼球に近接する位置（例えば、眼球の背後）に投与する。分娩後由来細胞の集団又は馴化培地は、カニューレを介して、又は患者の身体の眼球内若しくは眼球に近接した位置に移植された装置から、投与してもよく、あるいは、分娩後由来細胞集団又は馴化培地を備えるマトリックス又はスカフォールドを移植することによって投与してもよい。
【００２９】
本発明の別の一態様は、分娩後由来細胞の集団、又は細胞の集団から調製された馴化培地を、機能性シナプスの発達を促進するのに有効な量で含む、網膜変性症における機能性シナプスの発達を促進するための組成物を特徴とする。好ましくは、馴化培地は、上述した分娩後由来細胞から調製される。より好ましくは、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まない分娩後臍帯又は胎盤から単離される。変性症は、急性、慢性、又は進行性の症状であり得る。
【００３０】
特定の実施形態では、本組成物は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、又は他の複能性若しくは多能性の幹細胞などの、少なくとも１種の他の細胞型を含む。これらの実施形態又は他の実施形態では、本組成物は、眼球変性障害を治療するための薬などの少なくとも１つの他の薬剤、又は、例えば、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、若しくは増殖因子などの別の有益な補助剤を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組成物は薬学的に許容できる担体を更に含む医薬組成物である。
【００３２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、眼球表面に投与するように配合される。あるいは、これらは、眼球の内部、又は眼球に近接する位置（例えば、眼球の背後）に投与するように配合してもよい。本組成物は、更に、分娩後由来細胞又は馴化培地を含有するマトリックス又はスカフォールドとして配合してもよい。
【００３３】
本発明の更に別の一態様によれば、眼球変性症を有する患者を治療するためのキットが提供される。本キットは、薬学的に許容できる担体、分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞、好ましくは上述した分娩後由来細胞の集団から生成された馴化培地、及び患者の治療法におけるキットの使用説明書を含む。本キットは、馴化培地を生成するための試薬及び説明書、又は少なくとも１つのその他の細胞型の集団、又は眼球変性症の治療に有用な１つ又は２つ以上の薬剤などの、１つ又は２つ以上の追加的な構成要素を更に含み得る。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、網膜変性におけるシナプス形成を誘導するための方法であり、方法は、分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地を、シナプス形成を誘導するのに効果的な量で被験体に投与することを含み、ここで分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から誘導され、また、ここで細胞集団は、培養中に増殖可能であり、少なくとも神経表現型の細胞に分化する潜在能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
ａ）培養中に４０回集団倍加する潜在能力、
ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、並びに
ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、及びＣＤ１４１の産生の欠如、の特徴を有し、また、
分娩後由来細胞の集団が栄養因子を分泌するか、あるいは分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地が細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。一実施形態では、細胞集団によって分泌された栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞、又は胎盤組織由来細胞である。実施形態では、臍帯組織由来細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。更に、臍帯組織由来細胞集団は、ＥＬＩＳＡで検出した場合に、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。別の一実施形態では、胎盤組織由来細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。実施形態では、胎盤組織由来細胞集団は、ＥＬＩＳＡで検出した場合に、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。更に、細胞集団は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。実施形態では、臍帯組織由来細胞集団は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子をより多く発現する。実施形態では、細胞集団は、ビメンチン及びα−平滑筋アクチンを産生する。
【００３５】
別の一実施形態では、本発明は、網膜変性におけるシナプス形成を誘導するための方法であり、方法は、臍帯組織由来細胞の集団、又はヒト臍帯組織由来細胞の集団から調製された馴化培地を、シナプス形成を誘導するのに効果的な量で被験体に投与することを含み、細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から誘導され、また、細胞集団は培養中に増殖可能であり、少なくとも神経表現型の細胞へと分化する潜在能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
ａ）培養中に４０回集団倍加する潜在能力、
ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、並びに
ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、及びＣＤ１４１の産生の欠如、の特徴を有し、また、
臍帯組織由来細胞の集団が栄養因子を分泌するか、あるいはヒト臍帯組織由来細胞の集団から調製された馴化培地が細胞集団によって分泌された栄養因子を含む。一実施形態では、細胞集団によって分泌された栄養因子は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される。一実施形態では、細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。実施形態では、細胞集団は、ＥＬＩＳＡで検出した場合に、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。更に、細胞集団は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。実施形態では、細胞集団は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子をより多く発現する。実施形態では、細胞集団は、ビメンチン及びα−平滑筋アクチンを産生する。
【００３６】
上記の実施形態では、臍由来細胞又は胎盤由来細胞は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して陽性である；ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０に関して陽性である；ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関して陰性である；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、及びＣＤ１４１の産生を欠如しているか、又はこれらに関して陰性である；の特徴のうちの１つ又は２つ以上を有する。実施形態では、細胞は、ビメンチン及びα−平滑筋アクチンを産生する。
【００３７】
上述した更なる実施形態では、臍由来細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子をより多く発現する。実施形態では、臍由来細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
【００３８】
上述した本発明の一実施形態では、網膜変性症、網膜症、又は網膜／黄斑疾患は、加齢性黄斑変性症である。代替的な一実施形態では、網膜変性症、網膜症、又は網膜／黄斑疾患は、萎縮型（dry）加齢性黄斑変性である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】ｈＵＴＣは培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。（図１Ａ）実験計画の概略図である。精製ＲＧＣを、トランスウェルインサート内で６日間、単体で培養するか、あるいはｈＵＴＣ、ＮＨＤＦ、又はラットＡＳＣと共培養した。免疫細胞化学、及び電気生理学系アッセイによってシナプスの数及び機能をそれぞれ判定した。（図１Ｂ）シナプス前部（Ｂａｓｓｏｏｎ、レッド）及びシナプス後部（Ｈｏｍｅｒ、グリーン）タンパク質に対して特異的な抗体で染色したＲＧＣの例示的な画像である。底部：インレット（inlets）（白いボックス）が高倍率で示され、共局在化されたシナプス斑点（マージ、イエロー）が白色の矢印で示されている。スケールバー：２０μｍ。
【図１−２】ｈＵＴＣは培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。（図１Ｃ）共局在化されたシナプス斑点数の倍増（ｎ＝５９〜１６１細胞／条件）、及び（図１Ｄ）シナプス密度（樹状突起長さ当りのシナプス数、ｎ＝３０細胞／条件）を定量化することによって、ｈＵＴＣが、ＡＳＣと同様に、培養ＲＧＣ間で興奮性シナプス形成を誘導することが明らかとなる。（倍増は、細胞あたりのシナプス数を、ＲＧＣ単体条件における細胞あたりのシナプス数で正規化することにより算出した）。
【図１−３】ｈＵＴＣは培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。図１Ｅ〜１Ｉは、誘導されたシナプスが電気生理学的に機能的であることを示す。（図１Ｅ）ｍＥＰＳＣを示す、ホールセルパッチクランプ記録からの例示的なトレースである。（図１Ｆ）事象間の間隔の累積確率プロット、及び（図１Ｇ）ｍＥＰＳＣの中心周波数の定量化によって、ｈＵＴＣ又はＡＳＣとの共培養が、シナプス事象数の増加を誘導したことが明らかとなった。（図１Ｈ）ｍＥＰＳＣ振幅の累積確率プロットは、ｈＵＴＣ又はＡＳＣと共培養されたＲＧＣにおける大振幅事象が、単体で培養されたＲＧＣと比較して増加したことを実証した。（図１Ｉ）ｍＥＰＳＣ振幅の平均値は、条件間で変わらなかった。（電気生理学実験では、ｎ＝１５細胞／条件。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。ｎ．ｓは非有意である）。
【図１−４】ｈＵＴＣは培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。図１Ｊ〜１Ｍは、ｈＵＴＣ及びＡＳＣの共培養により誘導されたシナプスの電気生理学的波形特性を示す。ＡＳＣ又はｈＵＴＣと共培養されたＲＧＣから記録されたｍＥＰＳＣは、ＣＴＲ（ＲＧＣ単体）と比較して、（図１Ｊ、１Ｋ）立ち上がりタウ（rising tau）、及び（図１Ｌ、１Ｍ）減衰タウ（decay tau）の両方の増加を示した。ｎ＝１５細胞／条件。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図２−１】ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）は、培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。（図２Ａ）実験計画の概略図である。精製ＲＧＣを（様々な濃度の）ＵＣＭ、又はＡＣＭで６日間処理した。免疫細胞化学、及び電気生理学系アッセイによってシナプスの数及び機能をそれぞれ判定した。（図２Ｂ）シナプス前部（Ｂａｓｓｏｏｎ、レッド）及びシナプス後部（Ｈｏｍｅｒ、グリーン）タンパク質に対して特異的な抗体で染色したＲＧＣの例示的な画像。底部：インレット（白いボックス）が高倍率で示され、共局在化されたシナプス斑点（マージ、イエロー）が白色の矢印で示されている。スケールバー：２０μｍ。
【図２−２】ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）は、培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。（図２Ｃ）シナプス数の倍増（ｎ＝６５〜１５７細胞／条件）及び（図２Ｄ）シナプス密度（樹状突起長さ当りのシナプス数、ｎ＝３０細胞／状態）の定量化によって、ＵＣＭは、ＡＣＭと同様に、培養ＲＧＣ間で興奮性シナプス形成を誘導することが明らかにされた。（シナプス数の倍増は、細胞あたりの共局在化されたシナプス斑点数を、ＲＧＣ単体条件におけるシナプス数で正規化することにより算出した）。（図２Ｅ）単体で培養された、又はＡＣＭ（８０μｇ／ｍＬ）若しくはＵＣＭ（８０μｇ／ｍＬ）で処理されたＲＧＣからのｍＥＰＳＣを示すホールセルパッチクランプ記録からの例示的なトレースである。
【図２−３】ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）は、培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。（図２Ｆ）事象間の間隔の累積確率プロット、及び（図２Ｇ）ｍＥＰＳＣの中心周波数の定量化によって、ＵＣＭ又はＡＣＭを用いた処理が、シナプス事象数の増加を誘導したことが明らかとなった。（図２Ｈ）ｍＥＰＳＣ振幅の累積確率プロットは、ＲＧＣがＵＣＭ又はＡＣＭで処理されたとき、大振幅事象が、単体で培養されたＲＧＣと比較して増加したことを実証した。（図２Ｉ）ｍＥＰＳＣ振幅の平均値は、条件間で有意には変わらなかった。（電気生理学実験では、ｎ＝１５細胞／条件。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。）
【図２−４】ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）は、培養ＲＧＣ間で機能性シナプスの形成を誘導する。図２Ｊ〜２Ｎ  ＵＣＭに誘導されたシナプス数及び電気生理学的性質の変化。（図２Ｊ）様々な濃度のＡＣＭ及びＵＣＭで処理されたＲＧＣにおけるシナプス数の定量化。結果は、シナプス数の倍増（ＲＧＣ単体条件（ｎ＝２９〜１５７細胞／条件）における共局在化されたシナプス斑点数の数に正規化した）として示される。ＡＣＭ又はＵＣＭで処理されたＲＧＣから記録されたｍＥＰＳＣは、単体で培養されたＲＧＣ（ｎ＝１５細胞／条件）と比較して、（図２Ｋ、２Ｌ）立ち上がりタウ及び（図２Ｍ、２Ｎ）減衰タウの両方での増加を実証した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図３−１】ｈＵＴＣ分泌因子がＲＧＣの生存及び神経突起成長を促進する。（図３Ａ）生存アッセイ試薬（生細胞（グリーン）にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、及び死細胞（レッド）にＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）で処理したＲＧＣの例示的な画像。スケールバー：１００μｍ。（図３Ｂ）最少培地（ＣＴＲ）で培養したＲＧＣと比較した、様々な濃度のＡＣＭ及びＵＣＭの存在下におけるＲＧＣ生存の定量化。（ｎ＝９−１０顕微鏡視野／条件）。
【図３−２】ｈＵＴＣ分泌因子がＲＧＣの生存及び神経突起成長を促進する。（図３Ｃ）ＵＣＭによって媒介される生存効果は、試験された全てのＵＣＭ濃度でフォルスコリン依存性である（ｎ＝９−１８顕微鏡視野／条件）。ＵＣＭ（４０μｇ／ｍＬ）の生存効果は、（図３Ｄ）ＢＤＮＦ、及び（図３Ｅ）ＣＮＴＦの生存効果に付加的である。（ｎ＝１８−２０顕微鏡視野／条件）。
【図３−３】ｈＵＴＣ分泌因子がＲＧＣの生存及び神経突起成長を促進する。（図３Ｆ）単体で培養されたか、又はＡＣＭ若しくはＵＣＭで処理されたかいずれかのＲＧＣの例示的な形態骨格トレース（skeletonized traces）である。スケールバー：１００μｍ。（図３Ｇ）神経突起の複雑度のショール分析（Sholl analysis）は、馴化培地で処理したＲＧＣは、単体で培養されたＲＧＣ（ｎ＝２０〜２４細胞／条件）と比較してより高い複雑さを有することを実証した。
【図３−４】ｈＵＴＣ分泌因子がＲＧＣの生存及び神経突起成長を促進する。（図３Ｈ）合計神経突起成長数、（図３Ｉ）突起数、及び（図３Ｊ）分岐数の定量化は、ＲＧＣがＵＣＭ又はＡＣＭで処理されたとき、単体で培養されたＲＧＣ（ｎ＝２５〜３６細胞／条件）と比較して、増加を示した。グラフは、ＲＧＣ単体条件の値に正規化された倍増として示される。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。ｎ．ｓは非有意である。
【図４−１】ＵＣＭにおけるシナプス形成因子の特性評価。（図４Ａ）実験計画の概略図である。異なる分画分子量を有する遠心濃縮器を用いて分画したＵＣＭで、精製ＲＧＣを６日間処理した。続いて、シナプス数を上述した通りに定量化した。（図４Ｂ）共局在化されたシナプス斑点を示す例示的なＲＧＣ画像（シナプス前部：Ｂａｓｓｏｏｎ（レッド）、シナプス後部：Ｈｏｍｅｒ（グリーン））。底部：白いボックスが高倍率で示されている。白い矢印は共局在化されたシナプス斑点を示す。スケールバー：２０μｍ。（図４Ｃ）シナプス数の倍増の定量化。倍増は、共局在化されたシナプス斑点／細胞の数を、ＲＧＣ単体条件（ｎ＝３０〜４４細胞／条件）で得られた値に正規化することにより算出した。
【図４−２】（図４Ｄ）ガバペンチン（ＧＢＰ、３２μＭ）の存在下又は不在下で、ＵＣＭで処理したＲＧＣ中の共局在化されたシナプス斑点（白い矢印、シナプス前部：Ｂａｓｓｏｏｎ（レッド）、及びシナプス後部：Ｈｏｍｅｒ（グリーン）を示す例示的なＲＧＣ画像。スケールバー：２０μｍ。（図４Ｅ）ＲＧＣ単体条件（ｎ＝２４〜２５細胞／条件）に正規化したシナプス数の倍増の定量化。ＵＣＭ誘導シナプス形成は、ＧＢＰによって阻害された。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図５−１】ｈＵＴＣ誘導シナプス形成にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。（図５Ａ）ＴＳＰノックダウン実験（図５〜７）用の実験計画の概略表現である。ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４の発現を、ｈＵＴＣのレンチウイルスによるｓｈＲＮＡ形質導入によってサイレンシングして、ノックダウン（ＫＤ）ＵＣＭを採取した。ＲＧＣをＫＤ  ＵＣＭで６日間処理した。ＵＣＭのシナプス形成（シナプスアッセイ）、シナプス機能（電気生理学）、ニューロン生存（生存アッセイ）、及び神経突起成長（成長アッセイ）に対する効果を判定した。（図５Ｂ）レンチウイルスによるｓｈＲＮＡ形質導入を用いたＴＳＰ−１、ＴＳ２Ｐ、及びＴＳＰ−４ノックダウンのウエスタンブロット確認。ヘビン（HEVIN）と称される無関係ｈＵＴＣ分泌タンパク質をローディング対照として用いた。（図５Ｃ）ＲＧＣ単体条件（ｎ＝３０細胞／条件）に正規化した、ＲＧＣ処理したスクランブル対照ＵＣＭ（ＳＣＲ−ＣＴＲ）及びＴＳＰ−ＫＤ  ＵＣＭにおけるシナプス数の倍増。
【図５−２】ｈＵＴＣ誘導シナプス形成にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。（図５Ｄ）ＲＧＣ単体条件（ｎ＝７６〜８１細胞／条件）に正規化した様々なＴＳＰ−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣにおけるシナプス数の倍増。（図５Ｅ）ＲＧＣ単体条件（ｎ＝３０細胞／条件）に正規化した、精製ＴＳＰの存在下での、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣのシナプス数の倍増。３種類全てのＴＳＰ（ＴＳＰ−１、２、及び４）を添加することで、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭのシナプス形成作用がレスキューされた。それぞれの異なる処理からのＲＧＣの例示的な画像を、図５Ｈ〜５Ｊで見ることができる。
【図５−３】ｈＵＴＣ誘導シナプス形成にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。図５Ｆ及び５Ｇは、レンチウイルスに感染したｈＵＴＣのピューロマイシン選択を示す。（図５Ｆ）３日目及び５日目における、様々なピューロマイシン濃度の存在下での、レンチウイルスによる形質導入なしでのｈＵＴＣの死滅曲線（Kill curve）（ｎ＝３顕微鏡視野／条件）。（図５Ｇ）３日目及び５日目における、ピューロマイシン（０．９μｇ／ｍＬ）の存在下での、レンチウイルス感染あり及びなしのｈＵＴＣの例示的な画像。スケールバー：５０μｍ。
【図５−４】ｈＵＴＣ誘導シナプス形成にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ｈＵＴＣによって分泌されたＴＳＰがＲＧＣ間でシナプス形成を誘導することを示す。（図５Ｈ〜５Ｊ）共局在化されたシナプス斑点（シナプス前部：Ｂａｓｓｏｏｎ（レッド）、シナプス後部：Ｈｏｍｅｒ（グリーン））が、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭを用いたときにＵＣＭのシナプス形成活性が損失されたことを示した、ＲＧＣの例示的な画像。この喪失は、精製ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、又はＴＳＰ−４（１５０ｎｇ／ｍＬ）をＫＤ  ＵＣＭに添加することによって部分的にレスキューされ得る。３種類のＴＳＰを全て添加することで、ＵＣＭの完全なシナプス形成作用がレスキューされた。底部：白いボックスが高倍率で示されている。白い矢印は共局在化されたシナプス斑点を示す。スケールバー：２０μｍ。
【図５−５】ｈＵＴＣ誘導シナプス形成にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ｈＵＴＣによって分泌されたＴＳＰがＲＧＣ間でシナプス形成を誘導することを示す。（図５Ｋ）様々なＴＳＰ−ＫＤ  ＵＣＭで処理した後の、シナプス密度（共局在化されたシナプス斑点の数／神経突起長さ）の変化の定量化。
【図５−６】ｈＵＴＣによって分泌されたＴＳＰがＲＧＣ間でシナプス形成を誘導することを示す。（図５Ｌ）単体で培養されたＲＧＣ（陰性対照）、又は精製ＴＳＰ（ｎ＝３０細胞／条件）の存在下でＫＤ  ＣＴＲ  ＵＣＭで処理されたＲＧＣの間で形成されたシナプスの定量化。精製ＴＳＰをＫＤ  ＣＴＲ  ＵＣＭに添加することでは、シナプス数の更なる増加は起こらなかった。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。ｎ．ｓは非有意である）。
【図６−１】ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。（図６Ａ）ＡＭＣ（陽性対照）、ＳＣＲ−ＣＴＲ、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理されたＲＧＣ、又は単体で培養されたＲＧＣ（陰性対照）からのｍＥＰＳＣを示すホールセルパッチクランプ記録の例示的なトレース。
【図６−２】ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ＵＣＭ（ＴＳＰ−１＋２＋４−ＫＤ）でのＴＳＰのサイレンシングによって、ＳＣＲ−ＣＴＲによって達成された（図６Ｂ、６Ｃ）周波数の増加が停止した。定量化データは、累積確率プロット（図６Ｂ）、及び平均値の棒グラフ（図６Ｃ）として示される（ｎ＝１５細胞／条件）。
【図６−３】ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ＵＣＭ（ＴＳＰ−１＋２＋４−ＫＤ）でのＴＳＰのサイレンシングによって、ＳＣＲ−ＣＴＲによって達成された（図６Ｄ、６Ｅ）振幅の増加が停止した。定量化データは、累積確率プロット（図６Ｄ）、及び平均値の棒グラフ（図６Ｅ）として示される（ｎ＝１５細胞／条件）。
【図６−４】ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。（図６Ｆ）  ＡＣＭ（陽性対照）、ＳＣＲ−ＣＴＲ、若しくはＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理されたＲＧＣ、又は単体で培養されたＲＧＣ（陰性対照）からのｍＥＰＳＣを示すホールセルパッチクランプ記録の例示的なトレース。
【図６−５】ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ＵＣＭ（ＴＳＰ−１＋２＋４−ＫＤ）でのＴＳＰのサイレンシングによって、ＳＣＲ−ＣＴＲによって達成された周波数（図６Ｇ〜６Ｈ）の増加が停止した。定量化データは、累積確率プロット（図６Ｇ）、及び平均値の棒グラフ（図６Ｈ）として示される（ｎ＝１５細胞／条件）。
【図６−６】図６Ｉは、ｈＵＴＣによって誘導されるシナプス機能の増加にはＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４が必要である。ＵＣＭ（ＴＳＰ−１＋２＋４−ＫＤ）でのＴＳＰのサイレンシングによって、ＳＣＲ−ＣＴＲによって達成された振幅（図６Ｉ〜６Ｊ）の増加が停止した。定量化データは、累積確率プロット（図６Ｉ）、及び平均値の棒グラフ（図６Ｊ）として示される（ｎ＝１５細胞／条件）。
【図６−７】ＵＣＭで処理されたＲＧＣの波形特性上でのＴＳＰのノックダウンの作用を示す。ＫＤ−ＣＴＲ及びＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣ記録（ｎ＝１５細胞／条件）間における値が同様であることによって示されるように、（図６Ｋ、６Ｌ）立ち上がりタウは、ｈＵＴＣでのＴＳＰ発現のサイレンシングによる顕著な影響は受けなかった。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図６−８】ＵＣＭで処理されたＲＧＣの波形特性上でのＴＳＰのノックダウンの作用を示す。ＫＤ−ＣＴＲ及びＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣ記録（ｎ＝１５細胞／条件）間における値が同様であることによって示されるように、（図６Ｍ、６Ｎ）減衰タウは、ｈＵＴＣでのＴＳＰ発現のサイレンシングによる顕著な影響は受けなかった。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図７−１】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。（図７Ａ）ＲＧＣ単体（陰性対照）と比較した、ＳＣＲ−ＣＴＲ、ＫＤ−ＣＴＲ、又はＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣの例示的な形態骨格トレース。スケールバー：１００μｍ。
【図７−２】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。ＴＳＰをサイレンシングしたｈＵＴＣ  ＵＣＭ（ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭ）は、対照ＳＣＲ−ＣＴＲ及びＫＤ−ＣＴＲの両方と比較して合計神経突起成長の（図７Ｂ）長さ、（図７Ｃ）突起、及び（図７Ｄ）分岐数が減少した（ｎ＝４０〜４８細胞／条件）。
【図７−３】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。ｈＵＴＣ内でのＴＳＰのサイレンシングで、（図７Ｅ）合計神経突起成長の長さ（ｎ＝１２０〜１６９細胞／条件）及び（図７Ｆ）ショール分析によって示される複雑度（ｎ＝２５細胞／条件）が減少したＵＣＭが得られた。＃は、ＲＧＣ単体条件（ｐ＜０．０５）と比較しての合計成長の顕著な減少を示す。
【図７−４】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。（図７Ｇ）精製ＴＳＰの存在下における、ＫＤ−ＣＴＲ又はＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣの例示的な形態骨格トレースである。スケールバー：１００μｍ。
【図７−５】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。精製ＴＳＰをＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに添加することで、（図７Ｈ）合計神経突起成長（ｎ＝２９〜３３細胞／条件）、及び（図７Ｉ）複雑度（ｎ＝３０細胞／条件）を高めるＵＣＭの機能が回復した。＃は、ＲＧＣ単体条件（ｐ＜０．０５）と比較しての合計成長の顕著な減少を示す。
【図７−６】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。（図７Ｊ）生存アッセイ試薬（生細胞（グリーン）にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、及び死細胞（レッド）にＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）で処理したＲＧＣの例示的な画像。スケールバー：１００μｍ。（図７Ｋ）様々なＴＳＰ−ＫＤ  ＵＣＭ条件で処理したＲＧＣの生存率の定量化（ｎ＝３０顕微鏡視野／条件）。ＴＳＰ−２若しくはＴＳＰ−４又は３種類のＴＳＰ全てのサイレンシングによって、ＵＣＭの生存促進作用が減少した。
【図７−７】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。（図７Ｌ）ＴＳＰをＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに添加しても、ＫＤ−ＵＣＭの完全な生存作用は回復しなかった（ｎ＝２０顕微鏡視野／条件）。
【図７−８】ＴＳＰは、ＵＣＭ誘導神経突起成長に必要であるが、細胞の生存には必要でない。図７Ｍ〜７Ｏは、ＲＧＣにおけるＵＣＭ誘導神経突起成長におけるＴＳＰの関与を示す。（図７Ｍ）ＲＧＣ単体（陰性対照）と比較した、ＳＣＲ−ＣＴＲ、ＫＤ−ＣＴＲ、及びＴＳＰ−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣの例示的な形態骨格トレース。スケールバー：１００μｍ。ｈＵＴＣにおけるＴＳＰのノックダウンは、（図７Ｎ）突起及び（図７Ｏ）分岐数の減少をもたらした（ｎ＝１２０〜１６９細胞／条件）。突起及び分岐数の倍数変化を、ＲＧＣ単体の対照に正規化した。
【図７−９】図７Ｐ〜７Ｒは、精製ＴＳＰを添加することによって、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭの神経突起成長機能がレスキューされたことを示す。（図７Ｐ）精製ＴＳＰの存在下における、ＫＤ−ＣＴＲ又はＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理したＲＧＣの例示的な形態骨格トレースである。スケールバー：１００μｍ。精製ＴＳＰをＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭ（図７Ｑ）に戻して添加しても、突起数に僅かな影響しか与えなかったが、（図７Ｒ）分岐数の倍数変化を回復させた（ｎ＝２９〜３３細胞／条件）。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、ＲＧＣ単体に正規化され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【図８−１】ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰは、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で、神経突起成長を誘導する。（図８Ａ）増大する濃度のＣＳＰＧ（ｎ＝４５〜７９細胞／条件）、又は（図８Ｂ）Ｎｏｇｏ−Ａ（ｎ＝３０〜３７細胞／条件）でコーティングされたカバースリップ上での合計神経突起成長の定量化。グラフは、ＣＳＰＧ、又はＮｏｇｏ−Ａを含まない、カバースリップ上にプレーティングしたＲＧＣの増殖値に正規化された倍増として示される。
【図８−２】ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰは、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で、神経突起成長を誘導する。（図８Ｃ）ＣＳＰＧ（０．０５ｕｇ／ｃｍ2）、又は（図８Ｄ）Ｎｏｇｏ−Ａ（１ｕｇ／ｃｍ2）でコーティングされたカバースリップ上にプレーティングされた、ＳＣＲ−ＣＴＲ、ＴＳＰ  ＫＤ  ＵＣＭ、及び精製ＴＳＰで処理されたＲＧＣの例示的な形態骨格トレース。スケールバー：１００μｍ。
【図８−３】ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰは、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で、神経突起成長を誘導する。（図８Ｅ）ＣＳＰＧ（０．０５ｕｇ／ｃｍ2、ｎ＝６２〜１０３細胞／条件）、又は（図８Ｆ）Ｎｏｇｏ−Ａ（１ｕｇ／ｃｍ2、ｎ＝２５〜２９細胞／条件）でコーティングされたカバースリップ上にプレーティングされたＲＧＣの合計神経突起成長の定量化。グラフは、各培養条件下で、増殖培地のみで培養されたＲＧＣ（ＲＧＣ単体）の値に正規化された倍増として示される。
【図８−４】ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰは、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で、神経突起成長を誘導する。（図８Ｇ）ＭＢＰ（１０ｕｇ／ｍＬ）の存在下で、ＳＣＲ−ＣＴＲ、又はＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭを単体で、若しくは精製ＴＳＰを添加して処理されたＲＧＣの例示的な形態骨格トレース。スケールバー：１００μｍ。（図８Ｈ）増殖阻害物質の存在下で、精製ＴＳＰで処理されたＲＧＣの例示的な形態骨格トレース。スケールバー：１００μｍ。
【図８−５】ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰは、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で、神経突起成長を誘導する。（図８Ｉ）合計神経突起成長の定量化によって、ＭＢＰの存在下で、ＵＣＭ分泌ＴＳＰ−２の神経突起成長活性が増大することが示された。（ｎ＝４０〜５４細胞／条件）。グラフは、ＲＧＣ単体条件の値に正規化された倍増として示される。（図８Ｊ）精製ＴＳＰを用いたＲＧＣの処理は、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下で有意な増殖を誘導することができる（ｎ＝４１〜５４細胞／条件）。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。ｎ．ｓは非有意である）。＃は、ＲＧＣ単体条件（ｐ＜０．０５）と比較しての合計成長の顕著な減少を示す。
【００４０】
本発明の他の特徴及び有利点は、以下の「発明を実施するための形態」及び実施例から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
様々な特許及び他の刊行物が、本明細書の全体を通して参照される。これらの刊行物のそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。以下の例示的実施形態の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付図面が参照されている。これらの実施形態は、当業者が本発明を実践できるように十分に詳細に説明されおり、本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく、他の実施形態を用いることができること、及び論理構造的、機械的、電気的、及び化学的変更がなされ得ることが理解されよう。当業者が本明細書に記載される実施形態を実践することを可能にするために必要でない詳細な説明を避けるために、当業者に周知の特定の情報の説明が省略されている場合がある。したがって、以下の詳細な説明は限定的な意味で解釈されるべきではなく、例示される実施形態の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００４２】
定義
本明細書及び特許請求の範囲の全体で用いられる様々な用語は、以下で定める通りに定義され、これらは本発明を明確にすることを目的とする。
【００４３】
幹細胞は、単一細胞の、自己複製する能力、並びに自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能細胞に分化する能力によって、並びに、移植後に複数の胚葉組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注入後に、全部ではないが実質的に殆どの組織に寄与する能力によっても、特徴付けられる。
【００４４】
幹細胞は、その発生能に応じて、（１）全能性、（２）多能性、（３）複能性、（４）少能性、及び（５）単能性に分類される。全能細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。複能性細胞は、細胞系統のサブセットを生じさせることが可能であるが、全てが、特定の組織、器官、又は生理系の範囲内であるものを含む（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣを含む子孫（自己複製）、血球に制限された少能性前駆細胞、並びに血液の正常成分である全ての細胞型及び要素（例えば、血小板）を産生することができる）。少能性の細胞は、複能性幹細胞よりも制限された、細胞系統のサブセットを生じさせることができ、単能性の細胞は、単一の細胞系統を生じさせることができる（例えば、精原幹細胞）。
【００４５】
幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいても分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、複能性の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己複製することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、多能性幹細胞に変換された成熟細胞である。（ＴａｋａｈａｓｈｉらのＣｅｌｌ（２００６）；１２６（４）：６６３〜６７６、ＴａｋａｈａｓｈｉらのＣｅｌｌ（２００７）１３１：１〜１２）。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。分娩後幹細胞は、出産後に入手可能な胚体外組織、即ち、胎盤及び臍帯を実質的に起源とする、複能性若しくは多能性の細胞である。これらの細胞は、迅速な増殖、及び多くの細胞系統への分化に関する潜在能力を含めた、多能性幹細胞に固有の特徴を保有することが見出されている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られる幹細胞のような）又は非血液由来（例えば、臍帯及び胎盤の非血液組織から得られるような）のものとすることができる。
【００４６】
胚組織は、典型的には、胚（ヒトの場合、受精から、約６週間の発達までの期間を指す）を起源とする組織として定義される。胎児組織は、ヒトでは約６週間の発達から分娩までの期間を指す、胎児に由来する組織を指す。胚体外組織は、胚又は胎児に関連するが、胚又は胎児を起源とはしない組織である。胚体外組織としては、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、及び尿膜）、臍帯、及び胎盤（それ自体は、絨毛膜及び母体基底脱落膜から形成される）が挙げられる。
【００４７】
分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）細胞、又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの、特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「コミットされた」）状態を呈している細胞である。コミットされた、という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、特定の細胞型又は細胞型のサブセットへと分化を継続して、通常の状況下では、異なる細胞型へと分化することも、又はより未分化の細胞型に復帰することもできない地点まで、分化経路が進行している細胞を指す。脱分化とは、細胞が、細胞の系統の範囲内で、比較的特殊化されて（又はコミットされて）いない状態に復帰するプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、即ち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。
【００４８】
広義には、前駆細胞は、それ自体よりも分化した子孫を作り出す能力を有し、かつ前駆細胞のプールを補充する能力を更に保持する細胞である。その定義によれば、幹細胞自体もまた、より直接的な、最終分化細胞への前駆体であるため、前駆細胞である。以下でより詳細に説明されるように、本発明の細胞に言及する場合、この広い意味での前駆細胞の定義を使用することができる。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、即ち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型のサブセットを産生する際の中間体である。このタイプの前駆細胞は、全般的には、自己複製が不可能である。したがって、このタイプの細胞が本明細書で言及される場合には、その細胞は、非複製前駆細胞、又は中間的前駆細胞若しくは中間的前駆細胞と称される。
【００４９】
本明細書で使用するとき、語句「眼系統又は眼表現型への分化」とは、網膜及び角膜幹細胞、網膜及び虹彩の色素上皮細胞、視細胞、網膜神経節及びその他の視神経系統（例えば、網膜グリア、小神経膠、星状細胞、ミュラー細胞）、水晶体形成細胞、並びに強膜、角膜、縁、及び結膜の上皮細胞が挙げられるがこれらに限定されない、特定の眼表現型に部分的又は完全にコミットされるようになった細胞を指す。語句「神経系統又は神経表現型への分化」、という語句は、ＣＮＳ又はＰＮＳの特定の神経表現型へ、即ち、ニューロン又はグリア細胞（後者の分類としては、星状細胞、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、及び小神経膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない）に、部分的又は完全にコミットされるようになった細胞を指す。
【００５０】
本明細書で例示され、かつ本発明での使用に好ましい細胞は、一般に分娩後由来細胞（又はＰＰＤＣ）と称される。これらは、時には、より具体的に、臍由来細胞又は胎盤由来細胞（ＵＤＣ又はＰＤＣ）と称される場合もある。更には、この細胞は、幹細胞又は前駆細胞として説明することができ、後者の用語は広義で使用される。由来する、という用語は、その細胞が、それらの生物学的起源から得られ、インビトロで、増殖されるか又は他の方法で操作されている（例えば、増殖培地中で培養されて、その集団を増殖させ、かつ／又は細胞株を産生する）ことを示すために使用される。臍幹細胞及び胎盤幹細胞のインビトロ操作、及び本発明の臍由来細胞及び胎盤由来細胞の独自の特徴が、以下で詳細に説明される。その他の手段によって分娩後胎盤及び臍から単離された細胞も、本発明での使用に好適であると考えられる。本明細書では、こうしたその他の細胞は、分娩後細胞と称される（分娩後由来細胞ではなく）。
【００５１】
様々な用語が、培養中の細胞を説明するために使用される。細胞培養物とは、一般に、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養中」又は「培養される」）細胞を指す。初代細胞培養物は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養物である。細胞は、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で、増殖培地内に定置される場合に、培養増殖して、細胞の大集団を生じさせる。細胞を培養中に増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって測定される場合がある。この時間は、倍加時間と称される。
【００５２】
細胞株は、初代細胞培養物の１回又は複数回の継代培養によって形成される、細胞の集団である。継代培養の各一巡は、１継代と称される。細胞が継代培養される場合、それらの細胞は、継代されているとして言及される。特定の細胞集団、又は細胞株は、継代された回数によって言及されるか、又は特徴付けられる場合がある。例えば、１０回継代されている培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と称することができる。初代培養物、即ち、組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と表される。最初の継代培養後には、それらの細胞は、二次培養物（Ｐ１又は継代数１）として説明される。２回目の継代培養後には、それらの細胞は、三次培養物（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者には、継代期間中には多くの集団倍加が存在し得、したがって、培養物の集団倍加の数は継代の数よりも大きいということが理解されるであろう。継代の合間の期間中の細胞の増殖（即ち、集団倍加の数）は、多くの因子に応じて変化するものであり、それらの因子としては、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代の合間の時間が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
用語「増殖培地」は、一般に、ＰＰＤＣの培養に十分な培地を指す。具体的には、本発明の細胞の培養に関して、現時点で好ましい１つの培地は、ダルベッコ変法必須培地（本明細書ではまた、ＤＭＥＭとも略される）を含む。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（本明細書では、ＤＭＥＭ−ＬＧとも称される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））である。ＤＭＥＭ−低グルコースには、好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（例えば、規定ウシ胎児血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ））、抗生物質／抗真菌剤（好ましくは、５０〜１００単位／ミリリットルのペニシリン、５０〜１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、及び０〜０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）））、及び０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ））が添加される。以下の実施例で使用するとき、増殖培地とは、１５％のウシ胎児血清及び抗生物質／抗真菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれる場合、好ましくは、それぞれ５０Ｕ／ｍＬ及び５０マイクログラム／ｍＬであり、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンが使用される場合、好ましくは、それぞれ１００Ｕ／ｍＬ、１００マイクログラム／ｍＬ、及び０．２５マイクログラム／ｍＬである）を有する、ＤＭＥＭ−低グルコースを指す。一部の場合には、異なる増殖培地が使用されるか、又は異なる補助剤が提供され、これらは、通常は、増殖培地に対する補助剤として、本テキスト内に示される。
【００５４】
馴化培地は、特定の細胞又は細胞の集団が、その中で培養されて、その後取り出された、培地である。細胞が培地中で培養される場合、それらの細胞は、他の細胞に栄養的支援を提供することができる細胞因子を分泌する場合がある。そのような栄養因子としては、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、及び顆粒が挙げられるが、これらに限定されない。それらの細胞因子を含む培地が、馴化培地である。
【００５５】
一般に、栄養因子は、細胞の生存、成長、分化、増殖、及び／又は成熟を促進するか、あるいは細胞の活性の増大を刺激する物質として定義される。栄養因子を介した細胞間の相互作用は、異なる型の細胞間で発生し得る。栄養因子による細胞相互作用は、本質的に全ての細胞型で見出され、神経細胞型間の、特に重要な情報伝達の手段である。栄養因子はまた、自己分泌方式でも機能することができ、即ち、細胞は、その細胞自体の生存、成長、分化、増殖、及び／又は成熟に影響を及ぼす栄養因子を、産生することができる。
【００５６】
培養した脊椎動物細胞に言及する場合、用語「老化」（複製老化、又は細胞老化とも称される）は、有限細胞培養物に起因する特性、即ち、有限数の集団倍加を超えて成長できないことを指す（ヘイフリックの限界と呼ばれる場合もある）。細胞老化は、最初に、線維芽細胞様細胞を使用して説明されたが、培養中に成功裏に増殖させることができる、殆どの正常ヒト細胞型が、細胞老化を経る。種々の細胞型のインビトロでの寿命は、様々であるが、最大寿命は、典型的には、１００回の集団倍加より少ない（１００は、培養中の全細胞が老化することにより、培養物が分裂不能になる倍化数である）。老化は、経時的な時間に応じて決定されるものではなく、むしろ、その培養物が経験している、細胞分裂又は集団倍加の数によって測定される。
【００５７】
本明細書では、用語「眼球、眼球の、及び眼の」は、「眼の、眼に関する、又は眼に関連する」を定義する同じ意味で用いられる。
【００５８】
用語「眼球変性症（又は障害）」は、細胞の損傷、変性、又は欠失を伴う、眼と脳との神経連絡を含む、眼の急性及び慢性症状、障害、又は疾患を包含する、包括的用語である。眼球変性症は、加齢性である場合もあり、損傷若しくは外傷から生じる場合もあり、又は特定の疾患若しくは障害に関連する場合もある。急性の眼球変性症としては、脳血管機能不全に起因する症状を含む、眼に影響を及ぼす細胞死若しくは細胞の損失を伴う症状、局所性若しくはびまん性脳外傷、びまん性脳損傷、眼の感染若しくは炎症性疾患、網膜の裂傷若しくは剥離、眼球内損傷（挫傷、穿通、圧迫、裂傷）、又はその他の物理的損傷（例えば物理的又は化学的火傷）が挙げられるが、これらに限定されない。慢性の眼球変性症（進行性症状を含む）としては、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）などの網膜症及びその他の網膜／黄斑変性症；糖尿病性網膜症、閉塞性網膜症、鎌状赤血球網膜症及び高血圧性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、頚動脈狭窄症、緑内障及び関連する症候群などの視神経症などの網膜症；例えば、化学的傷害又は熱傷などにおいて起きる輪部幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）（輪部上皮細胞欠損（ＬＥＣＤ）とも称される）、スティーブンス・ジョンソン症候群、コンタクトレンズ由来角膜症、眼部瘢痕性類天疱瘡、無虹彩症又は外胚葉異形成症の先天性疾患、及び複数の内分泌欠乏関連角膜炎などの水晶体及び外眼の障害；が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
「眼球変性症を治療する（又は眼球変性症の治療）」という用語は、本明細書で定義される眼球変性症の影響を改善すること、眼球変性症の進行を遅延、中断、若しくは逆行させること、又は眼球変性症の発症を遅延若しくは予防することを指す。
【００６０】
用語「有効量」は、本明細書で説明されるような、インビトロ若しくはインビボでの細胞の増殖及び／又は分化、あるいは眼球変性症の治療を含む意図された結果を生じさせるために有効な、増殖因子、分化剤、栄養因子、細胞集団、若しくは他の薬剤などの試薬又は医薬組成物の濃度又は量を指す。増殖因子に関しては、有効量は、約１ナノグラム／ミリリットル〜約１マイクログラム／ミリリットルの範囲とすることができる。インビボで患者に投与されるＰＰＤＣに関しては、有効量は、数百以下の少量から、数百万以上の大量までの範囲であり得る。特定の実施形態では、有効量は、１０3〜１１11の範囲の細胞数、より具体的には、少なくとも約１０4の細胞数であり得る。投与される細胞の数は、治療される障害の詳細に応じて決定され、それらの詳細としては、医薬生物学者には周知の他の要因の中でも特に、治療されるサイズ又は総容積／表面積、並びに治療される領域の場所に対する、投与部位の近接性が挙げられるが、これらに限定されないことが理解されるであろう。
【００６１】
有効期間（又は時間）及び有効条件という用語は、薬剤又は医薬組成物が、その意図された結果を達成するために必要であるか、若しくは好ましい期間又はその他の制御可能な条件（例えば、インビトロ法の場合は、温度、湿度）を指す。
【００６２】
患者又は被験体という用語は、その医薬組成物を使用して、又は本明細書で説明される方法に従って治療される、哺乳類、好ましくはヒトを含めた、動物を指す。
【００６３】
薬学的に許容できる担体（又は培地）という用語は、生物学的に適合可能な担体又は培地という用語と、互換的に使用することができ、治療的に投与される細胞及び他の薬剤と適合可能であるばかりではなく、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスクの比率に見合った、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、若しくは他の合併症を伴わない、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に関しても好適である、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、並びに／あるいは剤形を指す。
【００６４】
細胞置換療法に関して、幾つかの用語が使用される。自家移入、自家移植、自己移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントでもある、治療を指す。同種異系移入、同種異系移植、同種移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントと同じ種のものであるが、同じ個体ではない、治療を指す。ドナーの細胞が、レシピエントと組織適合的に一致している細胞移入は、同系移入と称される場合がある。異種移入、異種移植、異種移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントとは異なる種のものである、治療を指す。本明細書で使用するとき、移植とは、自家又は同種異系ドナー細胞置換療法をレシピエントに導入することを指す。
【００６５】
本明細書で使用するとき、量、時間の長さなどの測定可能な値に関して使用する用語「約」は、指定値から±２０％〜±０．１％、好ましくは±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、これらの変動は開示される方法を実施する上で適切である。
【００６６】
説明
様々な原因を有する、急性、慢性、及び進行性の障害並びに疾患を包含する眼球変性症は、眼球細胞の特定の群又は易損性の群の機能障害又は喪失を、共通の特徴として有する。この共通性のために、易損性の損傷した又は喪失した眼球組織又は細胞の修復及び再生のための類似した治療的手法の開発が可能となり、それらの手法のうちの１つが、細胞療法である。眼球変性症のための細胞療法の開発は、眼球由来幹細胞自体（例えば、網膜及び角膜幹細胞）、胚幹細胞、及び数種類の成熟幹細胞又は前駆細胞（例えば、神経、粘膜、上皮、及び骨髄幹細胞）を含む、比較的少ない種類の幹細胞又は前駆細胞に限定されてきた。分娩後臍帯及び胎盤から単離された細胞は、この目的のための前駆細胞の重要な新供給源であることが特定されている。（米国特許出願第２００５−００３７４９１号、及び同第２０１０−０２７２８０３号）。更に、分娩後胎盤及び臍帯組織から単離した細胞から生成した馴化培地は、眼球変性症を治療するための別の新たな供給源を提供する。したがって、本明細書で説明するその様々な実施形態では、本発明は、分娩後臍帯又は胎盤から単離した細胞などの前駆細胞由来の馴化培地を用いる（眼球組織の修復及び再生）のための方法及び医薬組成物を特徴とする。本発明は、眼球変性症に適用可能であるが、従来は治療又は治癒が困難又は不可能であった、数多くの眼球障害に対しても特に好適であることが期待される。そうした眼球障害としては、非限定的であるが、加齢性黄斑変性、網膜色素変性症、糖尿病、及びその他の網膜症が挙げられる。
【００６７】
当該技術分野において既知の任意の方法に従って分娩後臍帯又は胎盤から単離した細胞などの前駆細胞由来の馴化培地は、本発明での使用に好適であると期待される。しかしながら、一実施形態では、本発明は、好ましくは下記で説明する方法に従って血液を実質的に含まないようにした臍帯組織又は胎盤に由来する、上記で定義した臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）又は胎盤組織由来細胞（ＰＤＣ）に由来する馴化培地を用いる。ｈＵＴＣ又はＰＤＣは、培養中に増殖することが可能であり、他の表現型の細胞に分化する潜在能力を有する。特定の実施形態は、こうした前駆細胞から調製された馴化培地、本馴化培地を含む医薬組成物、及び急性又は慢性の眼球変性症を患う患者を治療するための本医薬組成物の使用方法を特徴とする。本発明の分娩後由来細胞は、それらの培養中の増殖特性によって、それらの細胞表面マーカーによって、それらの遺伝子発現によって、それらの、特定の生化学的栄養因子を産生する能力によって、及びそれらの免疫学的特性によって、特徴付けられる。分娩後由来細胞から誘導された馴化培地は、細胞によって分泌される栄養因子によって特性決定されている。
【００６８】
細胞の調製
本発明の組成物及び方法に使用される、細胞、細胞集団、及び細胞溶解物、馴化培地などを含む調製物は本明細書で説明され、米国特許第７，５２４，４８９号、及び同第７，５１０，８７３号、並びに米国特許出願公開第２００５／００５８６３４号で詳細に説明され、これらは参照により本明細書にそれぞれ援用される。分娩後細胞を使用する方法によれば、哺乳類の臍帯及び胎盤は、満期妊娠又は早期妊娠のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の圧出の後で回収される。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの滅菌容器に入れて移送することができる。この容器は、溶液又は培地を含み得、これらとしては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの、食塩水、又はウィスコンシン大学液若しくはペルフルオロ化合物溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を、培地若しくは緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。この組織は、ＰＰＤＣの抽出の前に、約４〜１０℃に保つことが好ましい。この組織は、ＰＰＤＣの抽出の前に凍結させないことが、更により好ましい。
【００６９】
ＰＰＤＣの単離は、無菌環境下で実施することが好ましい。臍帯は、当該技術分野において既知の手段によって、胎盤から分離することができる。あるいは、臍帯及び胎盤は、分離することなく使用される。血液及び残渣は、ＰＰＤＣの単離前に、分娩後組織から除去することが好ましい。例えば、分娩後組織は、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液で洗浄してもよい。この洗浄緩衝液はまた、限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１種又は２種以上の抗真菌剤及び／又は抗生物質も含み得る。
【００７０】
胎盤の全体、臍帯、又はそれらの断片若しくは切片を含む分娩後組織は、機械的な力（細断力又は剪断力）によって脱凝集させる。現時点で好ましい実施形態では、この単離手順はまた、酵素消化プロセスも利用する。多くの酵素が、培養中の増殖を促進するための、複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に関して有用であることは、当該技術分野において既知である。弱い消化性（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、及び中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から、強い消化性（例えば、パパイン及びトリプシン）の範囲にわたって、そのような酵素が市販されている。本明細書に適合する酵素の非網羅的なリストとしては、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解活性から選択される酵素活性が、現時点で好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用であることが既知である。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集を最小限に抑えることができる。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼ及びディスパーゼ、あるいはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを使用する、酵素処理を伴い、そのような方法が提供される場合、特定の好ましい実施形態では、コラゲナーゼと中性プロテアーゼのディスパーゼとの混合物が、この解離工程で使用される。ヒストリチクス菌由来の少なくとも１種のコラゲナーゼ、並びにプロテアーゼ活性のディスパーゼ、及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する方法が、より好ましい。コラゲナーゼ酵素活性及びディスパーゼ酵素活性の双方での消化を採用する方法が、更により好ましい。また、コラゲナーゼ活性及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法も好ましい。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（登録商標）Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ３（Ｒｏｃｈｅ）シリーズの酵素の組み合わせが、本方法での使用に対して好適である。その他の酵素源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然源から直接取得することもできる。当業者は、更に、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組み合わせを評価するための設備を十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。他の好ましい実施形態では、組織は、解離工程の酵素処理の間、３７℃でインキュベートされる。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態において、分娩後組織は、例えば、胎盤の新生児、新生児／母体、及び母体の態様などの、様々な組織の態様を含む切片へと分離される。次いで、分離された切片は、本明細書で説明される方法に従って、機械的解離及び／又は酵素的解離によって解離される。新生児又は母体系統の細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段によって、例えば、Ｙ染色体の核型分析又はインサイチュハイブリダイゼーションによって、同定することができる。
【００７２】
それからＰＰＤＣが増殖する、単離された細胞又は分娩後組織を使用して、細胞培養を開始、即ち播種することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（天然、変性、又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質によりコーティングされていない又はコーティングされた組織培養用滅菌容器に、単離細胞を移す。ＰＰＤＣを、例えば、限定するものではないが、ＤＭＥＭ（高又は低グルコース）、改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、スコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０及びｃｅｌｌｇｒｏ  ＦＲＥＥ（商標）などといった、細胞の生育を維持することのできる任意の培養培地で培養する。培養培地は、例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ又は２−ＭＥ）；１つ又は２つ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、及びエリスロポエチン；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；並びに、例えば、単独又は組み合わせのいずれかでの、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を制御するための１種又は２種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を含む１種又は２種以上の成分を添加してもよい。この培養培地は、好ましくは、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、血清、ＢＭＥ、及び抗生物質）を含む。
【００７３】
細胞は、細胞増殖を可能にする密度で、培養容器中に播種される。好ましい実施形態では、細胞は、空気中約０〜約５容量％のＣＯ2で培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は、空気中約２〜約２５％のＯ2、好ましくは、空気中約５〜約２０％のＯ2で培養される。細胞は、好ましくは約２５〜４０℃で培養され、更に好ましくは３７℃で培養される。好ましくは、細胞は、インキュベーター内で培養される。培養容器内の培地は、静的状態とすることができ、又は例えば、バイオリアクターを使用して攪拌することもできる。ＰＰＤＣは、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）増殖される。「低酸化ストレス」とは、本明細書で使用するとき、フリーラジカルが培養細胞に損傷を与えないか、又は損傷が最低限に抑えられる条件を指す。
【００７４】
最も適切な培養培地、培地調製、及び細胞培養技術の選択法は、当該技術分野において周知であり、Ｄｏｙｌｅら（編）「ＣＥＬＬ＆ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）（１９９５）、並びにＨｏ及びＷａｎｇ（編）「ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ」，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｂｏｓｔｏｎ）（１９９１）を含む様々な出典に説明されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
単離された細胞又は組織断片を、十分な期間にわたって培養すると、分娩後組織からの遊走、若しくは細胞分裂のいずれか、又はその両方の結果として、ＰＰＤＣが増殖する。本発明の一部の実施形態では、ＰＰＤＣは、継代され、即ち、取り出されて最初に使用されたものと同じ又は異なる種類の新鮮培地を収容する別個の培養容器に移され、ここで細胞の集団は有糸分裂的に増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０と老化との間の任意の時点で使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。
【００７６】
本発明のいくつかの態様において、分娩後組織内に存在する種々の細胞型は、そこからＰＰＤＣを単離することができる下位集団に分画される。これは、分娩後組織をその構成細胞へと解離する酵素処理が挙げられるがこれに限定されない細胞分離のための標準的技術を使用し、それに続いて、例えば、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択；所望される細胞の選択的増殖（正の選択）、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば大豆凝集素を使用するような、混合集団中での示差的な細胞凝集能（differential cell agglutinability）に基づく分離；凍結−解凍処理法；混合集団における細胞の示差的な接着特性；濾過；従来型及びゾーン遠心分離；遠心エルトリエーション（対向流（counter-streaming）遠心分離）；単位重力分離；向流分布；電気泳動；及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられるがこれらに限定されない、特定の細胞型をクローニング及び選択することによって達成することができる。クローン選択及び細胞分離技術の概説に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，３ｒｄ  Ｅｄ．」，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９４）を参照されたい。
【００７７】
培養培地は、例えば、必要に応じて、例えばピペットで、皿から培地を慎重に吸引して、新鮮培地を補充することによって変更される。インキュベーションは、十分な数又は密度の細胞が皿内に蓄積するまで継続される。標準的技術を使用して、又はセルスクレーパーを使用して、元の外移植組織の切片を取り出し、残余の細胞をトリプシン処理することができる。トリプシン処理の後、細胞を収集して、新鮮培地に取り出し、上記のようにインキュベートする。いくつかの実施形態において、培地は、トリプシン処理の約２４時間後に、少なくとも１回交換して、あらゆる浮遊細胞を除去する。培養中に残存する細胞が、ＰＰＤＣであると考えられる。
【００７８】
ＰＰＤＣは、凍結保存することができる。したがって、以下でより詳細に説明される好ましい実施形態では、自家移入に関する（母又は子のいずれかに関する）ＰＰＤＣは、子の誕生後に適切な分娩後組織から誘導して、続いて、これらが後に移植に必要とされる事象で利用可能となるように、凍結保存することができる。
【００７９】
細胞の特徴
ＰＰＤＣなどの本発明の前駆細胞は、例えば、増殖特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／若しくは免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出に関する）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来型ＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の指標として）、並びに／又は当該技術分野において既知の他の方法によって特徴付けることができる。
【００８０】
臍組織由来のＰＰＤＣの例は、２００４年６月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０）に寄託され、以下のＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている。（１）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）には受託番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ、（２）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）には受託番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。胎盤組織由来のＰＰＤＣの例は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）に寄託され、以下のＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている。（１）菌株表示ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられ、（２）菌株表示ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられ、（３）菌株表示ＰＬＡ  ０７１００３（Ｐ１６）は２００４年６月１６日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられている。
【００８１】
様々な実施形態では、ＰＰＤＣは以下の増殖特性のうちの１つ又は２つ以上を有する。（１）培養中に増殖するためにＬ−バリンを必要とすること、（２）約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含む大気下での増殖が可能であること、（３）老化に達する前に培養中に少なくとも約４０回の倍加を行う潜在能力を有すること、及び、（４）コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器上で付着及び増殖すること（ここでコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオミチン（polyomithine）、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）。
【００８２】
特定の実施形態では、ＰＰＤＣは、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析は、胎盤由来の母体細胞から、新生児細胞を同定して識別するために、特に有用である。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。
【００８３】
他の実施形態では、ＰＰＤＣは、（１）ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生、並びに（２）フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生を含む、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態では、ＰＰＤＣは、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生の欠如によって、特徴付けることができる。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンを産生する細胞が特に好ましい。
【００８４】
その他の実施形態では、ＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫（melonoma）増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウイルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ホモサピエンスクローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ１；及びクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のホモサピエンス遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。一実施形態では、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；又はケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。別の一実施形態では、胎盤組織由来のＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、レニン、又は酸化低密度リポタンパク質受容体１のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。
【００８５】
更にその他の実施形態では、ＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、低身長感受性ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、αＢ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２（disheveled associated activator of morphogenesis 2）；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体、α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α  １；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；ヘファエスチン；インテグリン、β８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期増殖応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮想タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；及びシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して低減した遺伝子発現によって特徴付けることができる。
【００８６】
その他の実施形態では、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４から選択される栄養因子の分泌によって特徴付けることができる。実施形態では、ＰＰＤＣは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＤＣ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠損によって特徴付けることができる。代替的な実施形態では、胎盤組織由来のＰＰＤＣは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって、並びにＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付けることができる。更なる実施形態では、ＰＰＤＣは、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
【００８７】
好ましい実施形態では、それらの細胞は、上記の増殖特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ以上を含む。それらの特性のうちの３つ、４つ、又は５つ以上を含むような細胞が、より好ましい。それらの特性のうちの６つ、７つ、又は８つ以上を含むＰＰＤＣが、更により好ましい。上記の特性の全てを含むような細胞が、現時点では更により好ましい。
【００８８】
特に好ましい実施形態では、培養中に増殖が可能な、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞は、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生を欠如し、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。一実施形態において、この細胞にはＣＤ１１７及びＣＤ４５の産生がなく、任意で、ｈＴＥＲＴ及びテロメラーゼを発現しない。別の実施形態において、この細胞は、ｈＴＥＲＴ及びテロメラーゼを発現しない。更に別の実施形態では、培養中に増殖が可能な、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞は、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生を欠如し、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現せず、また、以下の特性のうちの１つ又は２つ以上を有する：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること；ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと；ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること；並びに分化する可能性を有していること。
【００８９】
その態様のうちのいくつかで本発明と共に使用するのに現時点で好ましい細胞は、とりわけ、上述の特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、細胞が正常核型を有し、継代で正常核型を維持する分娩後細胞であり、更には、細胞がマーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する分娩後細胞であり、細胞が列記されたマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する分娩後細胞である。前述に加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかに対応するタンパク質も産生しないような細胞が、更により好ましい。更なる好適な実施形態では、細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
【００９０】
各種表現型に向かう系列に従い分化する可能性があるある種の株は、不安定であり、したがって自発的に分化する場合がある。例えば、神経株に沿って、自然発生的に分化することのない細胞が、本発明と共に使用するために、現時点で好ましい。好ましい細胞は、増殖培地中で増殖させる場合、それらの細胞の表面上に産生される細胞マーカーに関して、また、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて判定される様々な遺伝子の発現パターンに関して、実質的に安定である。それらの細胞は、例えば、複数回の集団倍加を経る継代にわたって、それらの表面マーカー特性を、実質的に一定なまま保持する。
【００９１】
しかしながら、ＰＰＤＣの１つの特徴は、分化を誘導する細胞培養条件にそれらを曝露することによって様々な系統の表現型へと分化するように、それらの細胞を意図的に誘導することができる点である。特定の眼球変性症の治療における用途では、当該技術分野において既知の１つ以上の方法を用いて、ＰＰＤＣを神経表現型に分化するように誘導することができる。例えば、本明細書で例示されるように、ＰＰＤＣは、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中、ラミニンでコーティングされたフラスコ上にプレーティングすることができ、この培地の組み合わせは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される。ＮＰＥ培地には、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを更に添加することができる。あるいは、ＰＰＤＣは、（１）神経前駆細胞と共にＰＰＤＣを共培養すること、又は（２）神経前駆細胞馴化培地中でＰＰＤＣを増殖させること、によってインビトロで分化するように誘導することもできる。
【００９２】
ＰＰＤＣの神経表現型への分化は、伸長した突起を有する双極細胞形態によって証明され得る。誘導された細胞集団は、ネスチンの存在に関して、陽性に染色することができる。分化したＰＰＤＣは、ネスチン（nest in）、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、Ｏ４、及び／又はＭＢＰの検出によって、評価することができる。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣは、ニューロスフェアのニューロン幹細胞形成に固有の、３次元体を形成する能力を呈している。
【００９３】
細胞集団
本発明の別の一態様は、分娩後由来細胞、又はその他の前駆細胞などの前駆細胞の集団を特徴とする。分娩後由来細胞は、胎盤又は臍帯組織から単離することができる。好ましい一実施形態では、細胞集団は上記のＰＰＤＣを含むが、この細胞集団については下記の項で説明する。
【００９４】
一部の実施形態では、この細胞集団は不均質である。本発明の不均質な細胞集団は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の細胞を含み得る。本発明の不均質な細胞集団は、前駆細胞（分娩後由来細胞）、又は上皮若しくは神経前駆細胞などの他の前駆細胞を更に含み得るか、あるいは完全に分化した細胞を更に含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、この集団は、実質的に均質であり、即ち、実質的にＰＰＤＣのみ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上の細胞）を含む。一部の実施形態では、この細胞集団は均質である。実施形態では、本発明の均質な細胞集団は、臍又は胎盤由来細胞を含み得る。臍由来細胞の均質な集団は、好ましくは、母体系統の細胞を含まない。胎盤由来細胞の均質な集団は、新生児又は母体系統であり得る。細胞集団の均質性は、当該技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、又は既知の方法によるクローン増殖によって、達成することができる。したがって、好ましい均質なＰＰＤＣ集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞株を含み得る。そのような集団は、極めて望ましい機能性を有する細胞クローンが単離されている場合、特に有用である。
【００９６】
また、所望の形成経路（例えば神経、上皮）に沿った幹細胞分化を刺激する、１種又は２種以上の因子の存在下、又はそのような条件下でインキュベートされた細胞の集団も本明細書で提供される。そのような因子は、当該技術分野において既知であり、当業者には、分化に好適な条件の決定は、慣用の実験方法を使用して達成することができる点が、理解されるであろう。そのような条件の最適化は、統計的実験計画及び分析によって達成することができ、例えば、応答曲面法により、例えば生物学的培養での、複数の変数の同時最適化が可能となる。現時点で好適な因子としては、増殖因子若しくは栄養因子などの因子、脱メチル化剤、神経若しくは上皮性系統細胞との共培養、又は神経若しくは上皮性系統細胞馴化培地での培養、及びこれらの経路に沿って幹細胞分化を刺激する技術分野で既知のその他の条件が挙げられるが、これらに限定されない（神経分化に有用な因子については、例えばＬａｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ｄ．らのＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７６：１８４〜１９２（２００４）、Ｊｏｈｅ，Ｋ．Ｋ．らのＧｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．１０：３１２９〜３１４０（１９９６）、Ｇｏｔｔｌｅｉｂ，Ｄ．のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３８１〜４０７（２００２）を参照されたい）。
【００９７】
本発明の実施形態では、ＲＧＣと共培養されたｈＵＴＣは、ＲＧＣ内でのシナプス形成、並びにニューロンの生存及び成長にプラスの効果を有していた。ｈＵＴＣとＲＧＣとの共培養は、シナプス斑点数の増加を示し、星状細胞（陽性対照）のそれと匹敵するものであった。（図１Ｂ〜１Ｄ）。
【００９８】
微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の測定では、ｈＵＴＣがシナプス形成に影響を及ぼすことが示される。ＲＧＣは、単体で培養されたか、又は、ｈＵＴＣ若しくはＡＳＣの存在下で培養された（図１Ａ）。星状細胞と同様に、ＲＧＣとｈＵＴＣとの共培養によって、観察されたシナプス数の増加（図１Ｂ〜１Ｄ）に沿ってシナプス事象の頻度が増加した（図１Ｅ〜１Ｇ、図１Ｆ、クラスカル−ウォリス検定、ｐ＜．０００１、図１Ｇ、一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）ｐ＜．０００１）。ｈＵＴＣは、更に、シナプス後電流の振幅も増大させた。星状細胞と同様に、ｈＵＴＣもシナプス活性を強化する（図１Ｈ、１Ｉ）。ｍＥＰＳＣのピーク波形は、ｈＵＴＣ処理（図１Ｊ〜１Ｍ）によって立ち上がりタウ及び減衰タウの両方が増加したことを示した。ｈＵＴＣは、興奮性シナプス形成を誘導して、培養ＲＧＣにおけるシナプス機能を強化する。
【００９９】
馴化培地
一態様では、本発明は、後述するように、インビトロ及びインビボで用いるための、分娩後由来細胞又はその他の前駆細胞などの培養した前駆細胞由来の馴化培地を提供する。こうした馴化培地の使用により、拒絶反応又は他の有害な免疫応答を誘発する恐れがある無傷細胞を導入することなく、細胞によって分泌された有益な栄養因子を、患者内で同種異系的に（allogeneically）使用することが可能となる。馴化培地は、培養培地中で細胞（細胞の集団など）を培養し、続いて、その培地から細胞を除去することによって調製される。特定の実施形態では、分娩後細胞は、ＵＴＣ又はＰＤＣであり、より好ましくはｈＵＴＣである。
【０１００】
上記細胞の集団から調製される馴化培地は、そのまま使用するか、例えば限外濾過若しくは凍結乾燥によって更に濃縮するか、更には乾燥させるか、部分的に精製するか、当該技術分野において既知の、薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と組み合わせるか、又は生物学的製剤、例えば薬学的に有用なタンパク質組成物などの他の化合物と組み合わせることができる。馴化培地は、インビトロ又はインビボで、単独、又は例えば自家若しくは同系の生細胞と共に使用することができる。この馴化培地は、インビボで導入される場合は、治療部位で局所的に、又は遠隔で導入して、例えば必要な細胞増殖因子若しくは栄養因子を、患者に提供することができる。
【０１０１】
これまでに、ヒト臍帯組織由来細胞が視覚機能を改善し、網膜変性症を改善したことが実証されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。更に、分娩後由来細胞を用いて、ＲＣＳモデルにおける視細胞のレスキューを促進して、視細胞を保存し得ることも実証されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。ｈＵＴＣをＲＣＳラットの眼に網膜下注入することで、視力が改善し、網膜変性症が改善している。更に、ｈＵＴＣ由来の馴化培地（ＣＭ）を用いた治療によって、インビトロでジストロフィＲＰＥ細胞におけるＲＯＳの食作用が回復している（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。本明細書における本発明の実施形態は、特に、網膜神経節細胞、視細胞（桿体及び錐体）、網膜アミクリン細胞、水平細胞、及び双極細胞を含む網膜ニューロンに対する神経突起成長及びシナプス形成を促進する従来未知のｈＵＴＣのプラス効果を開示する。
【０１０２】
本明細書で説明する通りに、ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）を調製して、網膜神経節細胞のシナプシス形成、ニューロン生存、及び神経突起成長に対する作用を評価した。ＲＧＣを様々な濃度のｈＵＣＭと共に培養した。シナプス分析により、ｈＵＣＭが、星状細胞馴化培地（ＡＣＭ）と同様の濃度依存的様式でＲＧＣのシナプス形成を誘導したことが示された（図２Ｂ）。ＵＣＭはＨｏｍｅｒ及びＢａｓｓｏｏｎの両方の斑点数にプラスの作用を有していた（図２Ｂ〜２Ｄ、２Ｊ）。
【０１０３】
星状細胞は、シナプス形成を調節することが示された。シナプス形成の誘導は、トロンボスポンジン、ヘビン（hevin）、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、グリピカン、ＢＤＮＦ、ＴＧＦβ−１、コレステロール、及びエフリンなどの分泌されたシナプス形成分子によるものだと考えられる（ＣｌａｒｋｅのＮａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）；１４：３１１〜３２１、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＥｒｏｇｌｕのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）；１９：４９１〜４９７）。本発明のｈＵＣＭを特徴付ける際に、星状細胞及び星状細胞から調製された馴化培地を陽性対照として用いる場合もあった。
【０１０４】
ｍＥＰＳＣの増加した振幅及び周波数によって示されるように、ｈＵＣＭも機能性シナプスを強化した（図２Ｅ〜２Ｎ）。ｈＵＴＣの移植後に観察された機能回復に加えて、動物の疾患モデルにおける従来の研究で、神経構造の保存に効果を有するこれらの細胞が明らかとなった（上記のＬｕｎｄら（２００７）、ＭｏｏｒｅらのＳｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）；３０：１８５〜１９６、Ｚｈａｎｇ  ＬらのＢｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）；１４８９：１０４〜１１２、Ｊｉａｎｇ  ＱらのＰｌｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）；７：ｅ４２８４５、Ｚｈａｎｇ  ＬらのＳｔｒｏｋｅ（２０１１）；４２：１４３７〜１４４４）。ＲＧＣ培養系を用いて、シナプス形成及び神経突起成長に対するＵＣＭの効果を示す。シナプス形成に対するその効果の他にも、ｈＵＣＭは、例えばＢＤＮＦ及びＣＴＮＦなどのいかなるその他の増殖因子も存在しない環境でＲＧＣの生存を促進した。（図３Ａ〜３Ｅ）。
【０１０５】
ｈＵＣＭは、更に、合計突起長さ、突起数、及び分岐数の増加によって示されるように、ＲＧＣの神経突起成長を増進させた（図３Ｆ〜３Ｊ）。
【０１０６】
本発明の実施形態では、ｈＵＴＣは、インビトロで精製ＲＧＣ間における機能性シナプスの発達を促進する因子を分泌する。更に（Moreoever）、ｈＵＴＣはニューロンの成長及び機能も支援する。
【０１０７】
細胞の改変、構成成分、及び産物
分娩後細胞、好ましくはＰＰＤＣなどの前駆細胞は、更に、治療的に有用な遺伝子産物を産生するため、又は腫瘍治療のための抗腫瘍薬を産生するために遺伝子操作されてもよい。遺伝子操作は、例えばレトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの組み込みウイルスベクター；例えばパピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組み込み複製ベクター；又は複製欠陥ウイルスベクター、が挙げられるがこれらに限定されない様々なベクターのうちのいずれかを用いて達成され得る。細胞内にＤＮＡを導入する他の方法としては、リポソーム、電気穿孔法、粒子ガンの使用、又は直接的ＤＮＡ注入によるものが挙げられる。
【０１０８】
宿主細胞に、好ましくは、とりわけ、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの、１つ又は２つ以上の適切な発現制御要素によって制御されるか、あるいは有効に関連するＤＮＡ、及び選択マーカーを、形質転換又は形質移入する。任意のプロモーターを使用して、挿入遺伝子の発現を駆動することができる。例えば、ウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン−バールウイルス、又はエラスチン遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、インビボで必要とされる場合にのみ、その産物が合成されるように、目的の遺伝子の発現を制御するために使用される制御要素によって、調節された遺伝子発現が可能となる。一過性発現が所望される場合には、構成的プロモーターが、好ましくは、非組み込みベクター及び／又は複製欠陥ベクター内で使用される。あるいは、誘導性プロモーターを使用して、必要とされる際に、挿入遺伝子の発現を駆動することが可能である。誘導性プロモーターとしては、メタロチオネイン及び熱ショックタンパク質を伴うものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を、富栄養培地中で増殖させ、次いで、選択培地に切り替えることができる。外来ＤＮＡ中の選択マーカーは、選択に耐性を付与し、細胞が、例えば、プラスミド上に、その染色体中に外来ＤＮＡを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にこの増殖巣は、クローン化して細胞株へと増殖することができる。この方法は、有利には、遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために、使用することができる。
【０１１０】
細胞は、移植部位での炎症若しくは拒絶反応を促進する因子の発現を、「ノックアウト」又は「ノックダウン」するように、遺伝子組み換えすることができる。標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルの低減のための、負調節技術を、以下で説明する。「負調節」とは、本明細書で使用するとき、調節処理の非存在下での標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性に対する、標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性の低減を指す。ニューロン又はグリア細胞に本来ある遺伝子発現は、例えば、相同組み換え技術を使用して遺伝子を不活性化させることによる、発現の阻害を含めた、数多くの技術を使用して、低減若しくはノックアウトすることができる。典型的には、タンパク質の重要領域をコードするエクソン（即ち、その領域に対して５'側のエクソン）が、陽性選択マーカー、例えばｎｅｏによって干渉されることで標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生が妨げられて、その遺伝子の不活性化をもたらす。遺伝子はまた、遺伝子の一部に欠失を作り出すことによって、又は遺伝子全体を欠失させることによって、不活性化させることもできる。ゲノム中で離間した２つの相同な領域を備える構築物を標的遺伝子に対して使用することによって、その２つの領域に介在する配列を、欠失させることができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４〜３０８７）。アンチセンス、ＤＮＡザイム、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び標的遺伝子の発現を阻害する他のそのような分子もまた、標的遺伝子活性のレベルを低減するために使用することができる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害する、アンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に関して、最も汎用的であることが示されている。また更には、標的遺伝子活性のレベルを低減する際に、３重らせん分子を利用することもできる。これらの技術は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら（編）、「ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ  ｅｄ．」（１９９４）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で詳細に説明されている。
【０１１１】
他の態様では、本発明は、分娩後幹細胞、好ましくはＰＰＤＣから調製される細胞溶解物及び細胞可溶性画分、又はＰＰＤＣを含む不均質若しくは均質な細胞集団、並びに遺伝子操作されているか、又は神経形成経路に沿って分化するように刺激されている、ＰＰＤＣ若しくはその集団を提供する。こうした溶解物及びその画分は、多くの有用性を有する。インビボでの細胞溶解物の可溶性画分（即ち、実質的に膜を含まない）の使用により、例えば、拒絶反応、又は他の有害な免疫学的応答を誘発する可能性が最も高い、相当量の細胞表面タンパク質を導入することなく、有益な細胞内環境を、患者内で同種異系的に使用することが可能となる。細胞を溶解する方法は、当該技術分野において周知であり、機械的破壊、酵素破壊、若しくは化学的破壊、又はこれらの組み合わせの様々な手段が挙げられる。そのような細胞溶解物は、増殖培地中の細胞から、直接調製することができ、それゆえ、分泌された増殖因子などを含有するか、又は例えば、ＰＢＳ若しくは他の溶液中で洗浄された、培地を含まない細胞から調製することができる。洗浄細胞は、好ましい場合には、元の集団密度よりも高い濃度で、再懸濁させることができる。
【０１１２】
一実施形態では、例えば、細胞を破壊し、その後に細胞画分を分離しないことによって、細胞溶解物の全体が調製される。別の実施形態では、当該技術分野において既知の慣用的方法、例えば、遠心分離、濾過、又は同様の方法によって、細胞の可溶性画分から、細胞膜画分が分離される。
【０１１３】
分娩後由来細胞などの前駆細胞の集団から調製される、細胞溶解物又は細胞可溶性画分は、そのまま使用するか、例えば限外濾過若しくは凍結乾燥によって更に濃縮するか、更に乾燥させるか、部分的に精製するか、当該技術分野において既知の、薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と組み合わせるか、又は生物学的製剤、例えば薬学的に有用なタンパク質組成物などの他の化合物と組み合わせることができる。細胞溶解物又はその画分は、インビトロ若しくはインビボで、単独で、又は、例えば自家若しくは同系の生細胞と共に、使用することができる。細胞溶解物は、インビボに導入される場合には、治療部位で局所的に、又は遠隔で導入して、例えば、必要な細胞増殖因子を患者に提供することができる。
【０１１４】
更なる一実施形態では、分娩後細胞、好ましくはＰＰＤＣは、インビトロで培養することにより、生物学的産物を高収率で産生することができる。例えば、そのような細胞は、目的とする具体的な生物学的産物（例えば、栄養因子）を天然に産生するか、又は生物学的産物を産生するように遺伝子操作されており、本明細書で説明される培養技術を使用して、クローン増殖させることができる。あるいは、所望の系統への分化を誘導する培地中で、細胞を増殖させることができる。いずれの場合でも、その細胞によって産生され、培地中に分泌された生物学的産物は、例えば、幾つか例を挙げると、示差的タンパク質沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、及びＨＰＬＣなどの、標準的な分離技術を使用して、馴化培地から容易に単離することができる。「バイオリアクター」を使用して、例えば、インビトロで３次元培養物に栄養を与えるための、フロー法を活用することができる。本質的には、新鮮培地が３次元培養物を通過する際、生物学的産物は、培養物から洗い出され、次いで、上記のように、その流出物から単離されることができる。
【０１１５】
あるいは、目的の生物学的産物は、細胞内部に留まる場合があり、それゆえ、その収集には、上述のように、細胞を溶解させることが必要となる場合がある。続いて、上記の技術のうちの任意の１つ以上を使用して、その生物学的産物を精製することができる。
【０１１６】
別の実施形態では、液体、固体、又は半固体の基質上に分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）を培養することによって産生される、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が調製、収集され、組織の修復又は置換を必要とする被験体内への生細胞の移植の代替案として利用される。細胞は、インビトロで、本明細書の他の箇所で説明される３次元フレームワーク上に、所望の量のＥＣＭがそのフレームワーク上に分泌されるような条件下で培養される。細胞及びフレームワークが取り出され、例えば注入可能製剤としての更なる使用のために、ＥＣＭが処理される。このことを達成するために、フレームワーク上の細胞を死滅させ、そのフレームワークから、あらゆる細胞残渣を除去する。このプロセスは、多種多様な方法で実施することができる。例えば、凍結保存剤を使用することなく、その生組織を液体窒素中で急速冷凍することができ、又は細胞が浸透圧に反応して破裂するように、滅菌蒸留水中に組織を浸漬させることができる。
【０１１７】
細胞を死滅させた後、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、又は双極性イオン性洗剤などの弱い洗剤ですすぎ処理することによって、細胞膜を破壊し、細胞残渣を除去することができる。あるいは、細胞膜を分解し、細胞内容物の除去を可能とする試薬で、その組織を酵素消化させ、かつ／又は抽出することができる。そのような酵素の例としては、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。洗剤の例としては、例えばアルキルアリールポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．））、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０）、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）などの非イオン性洗剤、並びに、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、分岐又は非分岐鎖中に７〜２２個の炭素原子を含有するスルホン化アルカン及びスルホン化アルキルアレーンなどのイオン性洗剤が挙げられる。
【０１１８】
ＥＣＭの収集は、例えば、新たな組織が、生分解性又は非生分解性である３次元フレームワーク上で形成されているかどうかによって、様々な方法で達成することができる。例えば、そのフレームワークが、非生分解性である場合には、音波処理、高圧水ジェット、機械的掻き取り、又は洗剤若しくは酵素での穏和な処理、あるいは上記の任意の組み合わせを、そのフレームワークに施すことによって、ＥＣＭを取り出すことができる。
【０１１９】
フレームワークが、生分解性である場合には、例えば、そのフレームワークを溶液中で分解させるか、又は溶解させることによって、ＥＣＭを収集することができる。あるいは、生分解性フレームワークが、それ自体をＥＣＭと併せて注入することが可能な材料からなる場合には、そのフレームワーク及びＥＣＭは、その後の注入のために、まとめて処理することができる。あるいは、ＥＣＭは、非生分解性フレームワークからのＥＣＭの収集に関して上述された方法のうちのいずれかによって、生分解性フレームワークから取り出すことができる。全ての収集プロセスは、好ましくは、ＥＣＭを変性させないように設計される。
【０１２０】
ＥＣＭを収集した後、更にＥＣＭを処理することができる。例えば、ＥＣＭは、音波処理などによる、当該技術分野において周知の技術を使用して、微粒子へと均質化することができるため、そのＥＣＭは、外科用ニードルの中を通過することができる。ＥＣＭの成分は、必要に応じて、γ線照射によって架橋することができる。好ましくは、ＥＣＭは、０．２５〜２メガラドで照射することにより、ＥＣＭを滅菌及び架橋することができる。グルタルアルデヒドなどの、毒性の薬剤を使用する化学架橋も可能であるが、一般的には好ましくない。
【０１２１】
ＥＣＭ中に存在する様々なタイプのコラーゲンなどの、タンパク質の量及び／又は比率は、本発明の細胞によって産生されるＥＣＭと、１種又は２種以上の他の細胞型のＥＣＭとを混合することによって、調整することができる。更には、タンパク質、増殖因子、及び／又は薬物などの、生物学的に活性な物質を、ＥＣＭ中に組み込むことができる。例示的な生物学的に活性な物質としては、注入部位での治癒及び組織修復を促進する、ＴＧＦ−βなどのような、組織増殖因子が挙げられる。そのような追加的薬剤は、例えば、全細胞溶解物、可溶性細胞分画、あるいは細胞によって産生される更なる精製成分及び産物と共に、本明細書で上述された実施形態のいずれかで利用することができる。
【０１２２】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）などの非胚（non-embryronic）幹細胞、その細胞集団、こうした細胞によって産生される馴化培地、並びに、眼球変性症治療のための様々な方法においてこうした細胞によって産生される細胞成分及び産物を用いる医薬組成物を提供する。特定の実施形態は、生細胞（例えば、ＰＰＤＣ単独、又は他の細胞型との混合）を含む医薬組成物を包含する。その他の実施形態は、ＰＰＤＣ馴化培地を含む医薬組成物を包含する。更なる実施形態は、ＰＰＤＣの細胞成分（例えば、細胞溶解物、可溶性細胞分画、ＥＣＭ、又は前述のうちのいずれかの構成成分）、又は産物（例えば、細胞によって天然に又は遺伝子操作を通じて産生される、栄養及びその他の生物学的因子、細胞を培養することから得られる馴化培地）を用い得る。いずれの場合でも、この医薬組成物は、当該技術分野において既知の、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、増殖因子、神経栄養因子、又は神経再生薬、神経保護薬、若しくは点眼薬などの、他の活性剤を更に含み得る。
【０１２３】
医薬組成物に添加できるその他の成分の例としては、（１）他の神経保護薬又は神経有効薬、（２）当該技術分野において既知の１つ又は２つ以上のタイプのコラーゲンなどの、選択された細胞外マトリックス成分、並びに／又は増殖因子、多血小板血漿、及び薬剤（あるいは、増殖因子を発現及び産生するように、ＰＰＤＣを遺伝子組み換えしてもよい）、（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなど）、（５）カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、及び様々な抗体などの、免疫抑制剤あるいは免疫調節剤、（６）プロブコール、ビタミンＣ及びビタミンＥ、補酵素（conenzyme）Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、並びにＮ−アセチルシステインなどの、抗酸化剤、及び（６）局所麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体又は媒質と共に配合された、分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）などの前駆細胞、これらの細胞から生成された馴化培地、又はこれらの構成成分若しくは産物を含む。好適な薬学的に許容できる担体としては、水、食塩水（リンガー液など）、アルコール、油、ゼラチン、及び炭水化物（ラクトース、アミロース、又はデンプンなど）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、並びにポリビニルピロリドンが挙げられる。そのような調製物は、滅菌することができ、また必要に応じて、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、及び着色剤などの、補助剤と混合することができる。典型的であるが非限定的に、細胞成分又は産物を含むが生細胞を含まない医薬組成物は、液状で配合される。ＰＰＤＣ生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、液体、半固体（例えば、ゲル）、又は固体（例えば、眼組織工学に関して適切なマトリックス、スカフォールドなど）として配合される。
【０１２５】
医薬組成物は、医薬品化学者又は生物学者に周知されるような補助成分を含んでもよい。例えば、医薬組成物は、用いられる抗酸化剤の種類に応じて変化する範囲の抗酸化剤を含んでもよい。一般に用いられる抗酸化剤の妥当な範囲は、約０．０１〜約０．１５ｗ／ｖ％のＥＤＴＡ、約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％の亜硫酸ナトリウム、及び約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のそれぞれに対して約０．１ｗ／ｖ％の濃度を用い得る。その他の例示的な化合物としては、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β−メルカプトエチルアミン、グルタチオン、及び類似の種が挙げられるが、眼投与に好適なその他の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びその塩、又は亜硫酸塩若しくはメタ重亜硫酸ナトリウムを用いてもよい。
【０１２６】
緩衝剤を使用して、点眼薬配合物のｐＨを約４．０〜約８．０の範囲に維持して、その結果、眼刺激を最小化することができる。硝子体内又は眼球内直接注入のためには、配合物はｐＨ７．２〜７．５、好ましくはｐＨ７．３〜７．４であるべきである。眼科組成物は、眼への投与に好適な等張化剤を更に含んでもよい。中でも、配合物を０．９％生理的食塩水溶液とほぼ等張にするのには、塩化ナトリウムがとりわけ好適である。
【０１２７】
特定の実施形態では、医薬組成物は増粘剤と共に配合される。例示的な剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、及びポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要であれば共溶媒を有してもよい。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、及びポリビニルアルコールが挙げられ得る。更に、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀若しくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、又はメチル若しくはプロピルパラベンなどの防腐剤を添加してもよい。
【０１２８】
注入用配合物は、単用投与用に設計して、防腐剤を含まないことが好ましい。注入剤は、０．９％の塩化ナトリウム溶液と等価の等張性を有するべきである（２９０〜３００ミリオスモルのオスモル濃度）。これは、塩化ナトリウム、若しくは上記のその他の共溶媒、又は上記の緩衝剤及び抗酸化剤などの賦形剤を添加することによって達成され得る。
【０１２９】
眼の前房組織は房水に浸されており、一方で、網膜は硝子体に連続的に曝露されている。これらの流体／ゲルは、抗酸化化合物及び酵素を含むため、高還元性の酸化還元状態で存在する。したがって、眼科組成物に還元剤を含めることは有利となり得る。好適な還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸、又は塩形態、及び亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられ、アスコルビン酸、及び／又はＮ−アセチルシステイン若しくはグルタチオンは注入剤に特に好適である。
【０１３０】
細胞若しくは馴化培地、又は細胞成分若しくは細胞産物を含む医薬組成物は、当該技術分野において既知のいくつかの送達モードのうちの１つ又は２つ以上で患者の眼に送達することができる。いくつかの場合で使用に好適であり得る一実施形態では、組成物は点眼液又は洗眼剤形態で眼に局所送達される。別の一実施形態では、組成物は、周期的な眼内注入によって、又は、ＢＳＳ若しくはＢＳＳ  ＰＬＵＳ（Ａｌｃｏｎ  ＵＳＡ（Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘ））などの潅注溶液形態での注入によって眼内の様々な位置に送達することができる。あるいは、組成物は、例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｖａｎｒｅｌｌに対する米国特許第５，７１８，９２２号で開示されるような、予形成又はインサイチュ形成されるゲル又はリポソームなどの、当業者に既知の他の眼科剤形で適用されてもよい。別の実施形態では、組成物は、コンタクトレンズ（例えば、Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ  Ｂ．Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ  ＣＷ７９、又はＤＥＬＴＡＣＯＮ（Ｄｅｌｔａｆｉｌｃｏｎ  Ａ））、又は眼の表面に一時的に置かれる他の物体を介して、処置の必要な眼の水晶体に対して又はそれを通して送達されてもよい。他の実施形態では、コラーゲン角膜シールド（例えば、ＢＩＯ−ＣＯＲ可溶性角膜シールド、Ｓｕｍｍｉｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ））のような支持体を用いてもよい。また、組成物は、浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ，Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））からカニューレを通して、又は徐放カプセル（ＯＣＣＵＳＥＮＴ）若しくは生分解性ディスク（ＯＣＵＬＥＸ，ＯＣＵＳＥＲＴ）を移植することによって、眼球中に注入することで投与されてもよい。これらの投与経路は、眼への医薬組成物の連続的な供給を提供するという利点を有する。これは例えば、角膜への局所送達のために有利であろう。
【０１３１】
半固形又は固形の担体中に生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、眼の損傷又は苦痛部位における外科的移植のために配合される。更に、例えば馴化培地などの液体組成物も、外科的処置によって投与可能であることが理解されるであろう。具体的な実施形態では、半固体又は固体の医薬組成物は、非生分解性若しくは生分解性とすることができる、半透性ゲル、格子、細胞スカフォールドなどを含み得る。例えば、特定の実施形態では、外来性の細胞を、それらの周囲から隔離するが、それらの細胞が、周囲の細胞に生体分子を分泌及び送達できるようにすることが、望ましいか、又は適切である場合がある。これらの実施形態では、細胞は、移植細胞を宿主組織から物理的に隔離する、非生分解性の選択的透過性障壁によって包囲された、生きているＰＰＤＣ、又はＰＰＤＣを含む細胞集団を含む、自律的移植片として配合されてもよい。こうした移植片は、薬理学的に誘導された免疫抑制の不在下で、免疫細胞及び巨大分子が移植細胞を殺傷することを防ぐ能力を有するため、「免疫防御性」と呼ばれる場合がある（こうした装置及び方法については、例えば、Ｐ．Ａ．ＴｒｅｓｃｏらのＡｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４２：３〜２７（２０００）を参照されたい）。
【０１３２】
他の実施形態では、本発明の医薬組成物に関して、多種多様な分解性ゲル及び分解性ネットワークが利用される。例えば、持続放出性製剤に関して特に好適な、分解性材料としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの、生体適合性ポリマーが挙げられる。薬物送達ビヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択、及び使用については、Ａ．ＤｏｍｂらのＰｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ３：２７９〜２９１（１９９２）を含むいくつかの刊行物で概説されている。米国特許第５，８６９，０７９号（Ｗｏｎｇら）は、生分解性持続放出性眼移植片における親水性物質と疎水性物質との組み合わせを開示している。加えて、米国特許第６，３７５，９７２号（Ｇｕｏら）、同第５，９０２，５９８号（Ｃｈｅｎら）、同第６，３３１，３１３号（Ｗｏｎｇら）、同第５，７０７，６４３号（Ｏｇｕｒａら）、同第５，４６６，２３３号（Ｗｅｉｎｅｒら）、及び同第６，２５１，０９０号（Ａｖｅｒｙら）が、それぞれ医薬組成物の送達に用いられ得る眼球内移植装置及びシステムについて説明している。
【０１３３】
他の実施形態では、例えば、損傷若しくは断裂した視神経などの、神経損傷部位の修復に関しては、生分解性、好ましくは生体再吸収性又は生体吸収性のスカフォールド若しくはマトリックス上に、又はそれらの内部に細胞を送達することが望ましいか、又は適切な場合がある。これらの典型的な３次元生体材料は、スカフォールドに付着されるか、スカフォールド内部に分散されるか、又はスカフォールド内に封入された細胞外マトリックス内に組み込まれる、生細胞を含む。身体の標的領域内に移植されると、これらの移植片は、宿主組織と一体化され、ここで、移植細胞が徐々に確立されていく（例えば、上記のＰ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら（２０００）を参照されたい。更に、Ｄ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．１２：１０７〜１７４（２００１）も参照されたい）。
【０１３４】
本発明で使用できるスカフォールド又はマトリックス（「フレームワーク」と総称される場合がある）材料としては、不織布マット、多孔質発泡体、又は自己集合性ペプチドが挙げられる。不織性マットは、例えば、商標名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ））で市販されているグリコール酸と乳酸との吸収性合成コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）からなる繊維を用いて形成することができる。更に、例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に記載されているような、冷凍乾燥法又は凍結乾燥法などのプロセスにより形成されたポリ（エプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体を用いてもよい。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルもまた、使用することができる。インサイチュで形成される分解性ネットワークもまた、本発明での使用に関して好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．らのＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８：１９９〜２０９（２００２）、Ｗａｎｇ，Ｄ．らのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：３９６９〜３９８０（２００３）、Ｈｅらの米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号を参照されたい）。これらの材料は、注入に好適な流体として配合し、続いて、インサイチュ又はインビボで、分解性ヒドロゲルネットワークを形成するように、様々な手段（例えば、温度、ｐＨ、露光の変更）によって誘導することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、このフレームワークは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬのコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸から作製されたマルチフィラメント糸で構成することができる、フェルトである。この糸は、圧着、切断、カーディング、及びニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を使用して、フェルトにされる。別の実施形態では、細胞は、複合材料構造体とすることができる発泡体スカフォールド上に播種される。
【０１３６】
上記の実施形態の多くで、フレームワークを有用な形状に成形することができる。更には、ＰＰＤＣは、例えば、線維芽細胞含有ＧＤＣ血管内コイルを調製するために使用される方式に対応する方法によって、予備形成された非分解性の外科用装置又は移植可能装置上で培養できる点が理解されるであろう（Ｍａｒｘ，Ｗ．Ｆ．らのＡｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．２２：３２３〜３３３（２００１））。
【０１３７】
これらのマトリックス、スカフォールド、又は装置は、細胞付着を増強するために、細胞の接種の前に処理することができる。例えば、接種の前に、ナイロンマトリックスを０．１モルの酢酸で処理し、かつポリリシン、ＰＢＳ、及び／又はコラーゲン中でインキュベートすることにより、そのナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンは、硫酸を使用して、同様に処理することができる。フレームワークの外側表面もまた、そのフレームワークの血漿コーティング、あるいは１種又は２種以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、並びに／又は、限定するものではないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどの他の材料の添加などによって、細胞の付着若しくは増殖、及び組織の分化を改善するように、改変することができる。
【０１３８】
生細胞含有フレームワークは、当該技術分野で既知の方法に従って調製される。例えば、細胞は、準集密又は集密まで、培養容器内で自由に増殖させて、その培養物から取り上げ、フレームワーク上に接種することができる。必要に応じて、細胞の接種前、接種中、若しくは接種後に、培養培地に増殖因子を添加することにより、分化及び組織形成を誘発させることができる。あるいは、フレームワーク上での細胞の増殖が増強されるように、又は移植片の拒絶のリスクが低減されるように、フレームワーク自体を改変することができる。したがって、抗炎症剤、免疫抑制剤、又は増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない１種又は２種以上の生物学的に活性な化合物を、局所放出のためにフレームワークに添加することができる。
【０１３９】
使用方法
分娩後細胞（好ましくはｈＵＴＣ又はＰＤＣ）などの前駆細胞、若しくはその細胞集団、又はこうした細胞の馴化培地若しくはその他の成分、あるいはこうした細胞によって産生される産物を、眼球細胞及び組織の修復及び再生を支援及び促進するために様々な方法で用いてもよい。そのような有用性は、インビトロ法、エクスビボ法、及びインビボ法を包含する。以下に記載する方法は、ＰＰＤＣを目的としているが、その他の前駆細胞も、これらの方法で用いるのに好適であり得る。
【０１４０】
インビトロ法及びエクスビボ法
一実施形態では、分娩後細胞（好ましくはｈＵＴＣ又はＰＤＣ）などの前駆細胞、及びそれから生成された馴化培地を、インビトロで用いて、医薬品、増殖因子、調節因子などの有効性及び細胞毒性に関して、多種多様な化合物をスクリーニングすることができる。例えば、こうしたスクリーニングを、実質的に均質なＰＰＤＣの集団に対して実行して、眼球症状の治療のためにそのＰＰＤＣと共に配合されるかあるいは同時投与される候補化合物の有効性又は毒性を評価することができる。あるいは、こうしたスクリーニングは、新規の医薬品候補の有効性を評価する目的で、眼内で見出される細胞型、又はその前駆細胞へと分化するよう刺激されているＰＰＤＣに対して実行してもよい。この実施形態では、ＰＰＤＣは、インビトロで維持され、試験される化合物に曝される。細胞毒性の可能性がある化合物の活性は、培養細胞に損傷を与えるか又は死滅させる、その能力によって測定することができる。このことは、生体染色技術によって、容易に評価することができる。
【０１４１】
上述のように、ＰＰＤＣは、これらの細胞によって天然に産生されるか、その他の系統に分化するように誘導される際にこれらの細胞によって産生されるか、又は遺伝子操作を介してこれらの細胞によって産生されるか、のいずれかである生物学的産物を産生するようにインビトロ培養することができる。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、増殖培地中で増殖させた臍由来細胞から分泌されることが判明した。臍由来細胞は、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、及びトロンボスポンジン−４を更に分泌する。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、及びＩＬ−８は、増殖培地中で培養した胎盤由来ＰＰＤＣから分泌されることが判明した（実施例を参照）。
【０１４２】
この点に関し、本発明の実施形態は、馴化培地を産生するためのＰＰＤＣの使用を特徴とする。ＰＰＤＣ由来馴化培地の産生は、未分化のＰＰＤＣから、又は分化を刺激する条件下でインキュベートされたＰＰＤＣから、のいずれかであってよい。こうした馴化培地は、例えば、上皮又は神経前駆細胞のインビトロ又はエクスビボ培養、あるいは、ＰＰＤＣの均質集団、又はＰＰＤＣとその他の前駆細胞とを含む不均質集団を含む移植細胞を支援するためのインビボにおける使用が想到される。
【０１４３】
ＰＰＤＣの細胞溶解物、可溶性細胞画分若しくはその成分、又はＥＣＭ若しくはその成分が、様々な目的のために用いられ得る。上述のように、これらの成分の一部は、医薬組成物中で使用することができる。他の実施形態では、細胞溶解物又はＥＣＭを使用して、外科的な使用のための、若しくは移植のための、又はエクスビボ目的のための物質又は装置を、コーティングするか、あるいは他の方法で処理することにより、こうした処理の過程で接触する細胞又は組織の治癒又は生存が促進される。
【０１４４】
実施例１２及び１４で説明する通り、ＰＰＤＣは、これらの細胞との共培養で増殖させた場合に、成体神経前駆細胞の生存、増殖、及び分化を支援する能力を実証している。同様に、従来の研究で、ＰＰＤＣが栄養機構を介して網膜細胞を支援するように機能し得ることが指摘されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。したがって、ＰＰＤＣは、その他の細胞、特に神経細胞、並びに神経及び眼前駆細胞（例えば、神経幹細胞、及び網膜又は角膜上皮幹細胞）に栄養的支援を提供するために、インビトロ共培養で有利に用いられる。共培養の場合、ＰＰＤＣ及び所望の他の細胞が、この２つの細胞型が接触する条件下で共培養されることが望ましい場合がある。このような接触は、例えば、培養培地中、又は好適な培養基質上に、不均質な細胞集団として、それらの細胞を播種することによって行うことができる。あるいは、ＰＰＤＣは、最初にコンフルエンスまで増殖されてもよく、続いて、培養中の第２の所望の細胞型のための基質としての機能を果たす。この後者の実施形態では、それらの細胞は、例えば、膜又は同様の装置によって、更に物理的に分離させることができ、これにより、共培養の期間の後に、他の細胞型を取り出して、個別に使用することができる。神経又は眼球細胞型の増殖及び分化を促進するための、共培養中のＰＰＤＣの使用は、研究分野及び臨床／治療分野での応用性を見出し得る。例えば、ＰＰＤＣの共培養を利用して、例えば、基礎研究目的のために、又は薬剤スクリーニングアッセイでの使用のために、培養下細胞の増殖及び分化を促進することができる。ＰＰＤＣの共培養は、更に、治療目的で後に投与するための神経又は眼前駆細胞のエクスビボ増殖のために利用することもできる。例えば、神経又は眼前駆細胞を個体から採取して、ＰＰＤＣとの共培養中にエクスビボ増殖させ、続いて、その個体に戻す（自家移入）か、又は別の個体に戻す（同系移入又は同種異系移入）ことができる。これらの実施形態では、エクスビボ増殖の後に、ＰＰＤＣ及び前駆細胞を含む混合細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することが可能である点が、理解されるであろう。あるいは、自家移入が適切であるか、又は望ましい状況では、共培養された細胞集団を培養中に物理的に分離して、患者に投与するための自家前駆細胞の取り出しを実現することができる。
【０１４５】
インビボ法
実施例で記載する通り、前駆細胞（ＰＰＤＣ）、又はこうした細胞から生成された馴化培地は、眼球変性症の治療のために効果的に用いられ得る。眼内の標的部位内に移植されると、ＰＰＤＣなどの前駆細胞、又は前駆細胞由来の馴化培地は、ニューロン細胞を含む眼球細胞にインサイチュで栄養的支援を提供する。
【０１４６】
前駆細胞（ＰＰＤＣ）、前駆細胞由来の馴化培地は、当該技術分野において既知の、その他の有用な薬剤、増殖因子、栄養因子などの生体分子、馴化培地（前駆細胞又は分化細胞培養由来の）、又は抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、増殖因子、神経栄養因子、若しくは神経再生薬若しくは神経保護薬などのその他の活性剤、と共に投与することができる。馴化培地が他の薬剤と共に投与される場合、それらは、単一の医薬組成物として一緒に、あるいは別個の医薬組成物として、他の薬剤と同時に、若しくは逐次的に（他の薬剤の投与より前又は後のいずれかで）、投与することができる。
【０１４７】
ＰＰＤＣなどの前駆細胞、及び馴化培地産物と共に投与できるその他の成分の例としては、（１）他の神経保護薬又は神経有効薬、（２）当該技術分野において既知の１つ又は２つ以上のタイプのコラーゲンなどの、選択された細胞外マトリックス成分、並びに／又は増殖因子、多血小板血漿、及び薬剤（あるいは、細胞は、増殖因子を発現及び産生するように、遺伝子組み換えすることもできる）、（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなど）、（５）カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、及び様々な抗体などの、免疫抑制剤あるいは免疫調節剤、（６）プロブコール、ビタミンＣ及びビタミンＥ、補酵素（conenzyme）Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、並びにＮ−アセチルシステインなどの、抗酸化剤、及び（６）局所麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
液体又は流体医薬組成物は、眼内のより一般的な位置に（例えば、局所又は眼内に）投与してもよい。
【０１４９】
その他の実施形態は、ＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地、又はこれらの細胞により天然に産生されたか、若しくは細胞の遺伝子操作によって産生された、栄養及びその他の生物学的因子を含む医薬組成物を投与することにより、眼球変性症を治療する方法を包含する。この場合も、これらの方法は、当該技術分野において既知のような増殖因子、神経栄養因子、又は神経再生薬若しくは神経保護薬などの、他の活性剤を投与することを更に含み得る。
【０１５０】
本明細書で説明されるＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地、又は他の医薬組成物のうちのいずれかを投与するための、剤形及び投与計画は、個々の患者の状態、例えば、眼球変性症の性質及び程度、年齢、性別、体重及び全般的な医学的状態、並びに医師には既知の他の因子を考慮して、適正な臨床に従って開発される。それゆえ、患者に投与される医薬組成物の有効量は、当該技術分野において既知のこれらの考慮事項によって決定される。
【０１５１】
細胞療法を開始する前に、患者を薬理学的に免疫抑制することが、望ましいか、又は適切な場合がある。このことは、全身性若しくは局所性の免疫抑制剤の使用を通じて達成することができ、又は上述のように、封入装置内の細胞を送達することによって達成することができる。移植細胞に対する免疫反応を低減若しくは排除するための、これらの手段及び他の手段は、当該技術分野において既知である。別の方法として、上述のように、遺伝子操作したＰＰＤＣから馴化培地を調製して、それらの免疫原性を低減することができる。
【０１５２】
生きている患者内での移植細胞の生存は、様々な走査技術、例えば、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴ又はＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）スキャン、又は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを使用することによって判定することができる。移植片の生存の判定は、組織を摘出し、目視、又は顕微鏡を介して、それを検査することによって、死後に実施することもできる。あるいは、神経若しくは眼球細胞、又はその産物、例えば、神経伝達物質に対して特異的な染色剤で、細胞を処理してもよい。移植細胞は、更に、ローダミン標識マイクロスフェア若しくはフルオレセイン標識マイクロスフェア、ファーストブルー、第２鉄微小粒子、ビスベンズアミドなどの追跡用染料、又はβ−ガラクトシダーゼ若しくはβ−グルクロニダーゼなどの、遺伝子導入されたレポーター遺伝子産物を予め組み込むことによっても同定できる。
【０１５３】
移植細胞又は馴化培地の被験体の眼球組織内への機能的組み込みは、損傷又は罹患した眼機能の回復を検査することによって、評価することができる。例えば、黄斑変性症、又はその他の網膜症の治療における有効性は、視力の改善、並びにステレオカラー眼底写真の異常評価及び等級付けによって判定することができる（Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，ＮＥＩ，ＮＩＨ，ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．８（２００１），Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１９：１４１７〜１４３６）。
【０１５４】
キット及びバンク
別の態様では、本発明は、上述した眼球の再生及び修復のための様々な方法における、ＰＰＤＣなどの前駆細胞、並びに細胞集団、細胞（好ましくはＰＰＤＣ）から調製された馴化培地、並びにその成分及び産物を利用するキットを提供する。眼球変性症の治療、又はその他の計画的治療のために使用する場合、キットは、少なくとも分娩後細胞又は分娩後細胞から誘導された馴化培地を含む、１つ又は２つ以上の細胞集団又は馴化培地、及び薬学的に許容できる担体（液体、半固体、又は固体）を含み得る。このキットは、更に、例えば注射によって細胞及び馴化培地を投与する手段も、任意選択的に含み得る。このキットは、細胞及び馴化培地の使用に関する使用説明書を、更に含み得る。軍事利用のためなどに野戦病院で使用するために準備されたキットは、組織スカフォールド、外科用縫合糸などを含む、完全処置のための供給品を含んでもよく、細胞又は馴化培地は、急性損傷の修復に関して用いられる。本明細書で説明するアッセイ及びインビトロ法のためのキットは、例えば、（１）ＰＰＤＣ若しくはその成分、又はＰＰＤＣの馴化培地若しくはその他の産物、（２）インビトロ法を実施するための試薬、（３）必要に応じて、その他の細胞又は細胞集団、及び（４）インビトロ法を実施するための説明書、のうちの１つ又は２つ以上を含み得る。
【０１５５】
更に別の態様では、本発明は、更に、本発明の組織、細胞、細胞集団、馴化培地、及び細胞成分のバンキングも提供する。上述のように、細胞及び馴化培地は、容易に凍結保存され得る。それゆえ、本発明は、バンク内に細胞を凍結保存する方法を提供し、細胞は、冷凍保存されて、その細胞の免疫学的特性、生化学的特性、及び遺伝的特性に基づいて、それらの細胞の完全な特性評価と関連付けられる。凍結細胞は、手順の要件、及び患者の必要性に応じて、自家療法、同系療法、若しくは同種異系療法のために、解凍して増殖させるか又は直接使用することができる。好ましくは、凍結保存された各サンプルについての情報は、コンピュータ内に保存され、その情報は、外科医、手順、及び患者の要件に基づいて検索可能であり、好適な照合が、それらの細胞又は集団の特性評価に基づいて行われる。好ましくは、本発明の細胞は、所望の細胞の量まで、増殖及び拡大培養され、治療用細胞組成物が、マトリックス若しくは支持体の存在下又は非存在下で、別個に、あるいは共培養物として、調製される。一部の用途に関しては、新たに調製された細胞を使用することが好ましい場合があるが、残余の細胞は、それらの細胞を凍結して、コンピュータに情報を入力し、そのコンピュータ入力とサンプルとを関連付けることによって、凍結保存及びバンクすることができる。そのような細胞の供給源又はドナーとレシピエントとを照合することが必要とされない場合であっても、このバンクシステムは、免疫学的目的のために、例えば、バンク細胞の望ましい生化学的特性又は遺伝的特性と、治療的必要性とを照合することを容易にする。所望の特性とバンクのサンプルとを照合した後、そのサンプルを回収して、治療使用のために調製する。本明細書で説明されるように調製された、細胞溶解物、ＥＣＭ、又は細胞成分もまた、凍結保存若しくは他の方法で保存して（例えば、凍結乾燥によって）、本発明に従ってバンクすることができる。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供される。それらの実施例は、本発明を限定することではなく、例示することを意図するものである。
【０１５７】
以下の略語は、本明細書の実施例及びその他、並びに特許請求の範囲に出現する場合がある。ＡＮＧ２（又はＡｎｇ２）はアンジオポエチン−２を表し、ＡＰＣは抗原提示細胞を表し、ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子を表し、ｂＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子を表し、ｂｉｄ（ＢＩＤ）は「ビス・イン・ディエイ」（１日２回）を表し、ＣＫ１８はサイトケラチン１８を表し、ＣＮＳは中枢神経系を表し、ＣＮＴＦは毛様体神経栄養因子を表し、ＣＸＣリガンド３はケモカイン受容体リガンド３を表し、ＤＭＥＭはダルベッコの最少必須培地を表し、ＤＭＥＭ：ｌｇ（又はＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は低グルコースのＤＭＥＭを表し、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を表し、ＥＧＦ（又はＥ）は上皮成長因子を表し、ＦＡＣＳは蛍光活性化細胞選別法を表し、ＦＢＳはウシ胎児血清を表し、ＦＧＦ（又はＦ）は線維芽細胞増殖因子を表し、ＧＢＰはガバペンチンを表し、ＧＣＰ−２は顆粒球走化性タンパク質−２を表し、ＧＤＮＦはグリア細胞由来神経栄養因子を表し、ＧＦ  ＡＰはグリア筋原線維酸性タンパク質を表し、ＨＢ−ＥＧＦはヘパリン結合上皮成長因子を表し、ＨＣＡＥＣはヒト冠動脈内皮細胞を表し、ＨＧＦは肝細胞増殖因子を表し、ｈＭＳＣはヒト間葉系幹細胞を表し、ＨＮＦ−１αは肝細胞特異的転写因子を表し、ＨＶＶＥＣはヒト臍静脈内皮細胞を表し、Ｉ３０９はケモカイン及びＣＣＲ８受容体のためのリガンドを表し、ＩＧＦ−１はインスリン様増殖因子１を表し、ＩＬ−６はインターロイキン−６を表し、ＩＬ−８はインターロイキン８を表し、Ｋ１９はケラチン１９を表し、Ｋ８はケラチン８を表し、ＫＧＦはケラチノサイト増殖因子を表し、ＬＩＦは白血病阻害因子を表し、ＭＢＰはミエリン塩基性タンパク質を表し、ＭＣＰ−１は単球走化性タンパク質１を表し、ＭＤＣはマクロファージ由来ケモカインを表し、ＭＩＰ１αはマクロファージ炎症性タンパク質１αを表し、ＭＩＰ１βはマクロファージ炎症性タンパク質１βを表し、ＭＭＰはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を表し、ＭＳＣは間葉系幹細胞を表し、ＮＨＤＦは正常ヒト皮膚線維芽細胞を表し、ＮＰＥは神経前駆細胞増殖培地を表し、ＮＴ３はニューロトロフィン３を表し、Ｏ４は乏突起神経膠細胞又はグリア分化マーカーＯ４を表し、ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を表し、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を表し、ＰＤＧＦ−ＣＣは血小板由来増殖因子−Ｃを表し、ＰＤＧＦ−ＤＤは血小板由来増殖因子−Ｄを表し、ＰＤＧＦｂｂは血小板由来増殖因子ｂｂを表し、ＰＯは「ｐｅｒ  ｏｓ」（経口）を表し、ＰＮＳは末梢神経系を表し、Ｒａｎｔｅｓ（又はＲＡＮＴＥＳ）は活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌物を表し、ｒｈＧＤＦ−５はリコンビナントヒト増殖及び分化因子５を表し、ＳＣは皮下を表し、ＳＤＦ−１αは間質由来因子１αを表し、ＳＨＨはソニックヘッジホッグを表し、ＳＯＰは標準的操作手順を表し、ＴＡＲＣは胸腺及び活性化調節ケモカインを表し、ＴＣＰは組織培養プラスチックを表し、ＴＣＰＳは組織培養ポリスチレンを表し、ＴＧＦβ１はトランスフォーミング増殖因子β１を表し、ＴＧＦβ２はトランスフォーミング増殖因子β２を表し、ＴＧＦβ−３はトランスフォーミング増��因子β−３を表し、ＴＩＭＰ１はマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害物質１を表し、ＴＰＯはトロンボポエチンを表し、ＴＳＰはトロンボスポンジンを表し、ＴｕＪ１はＢＩＩＩチューブリンを表し、ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子を表し、ｖＷＦはヴォン・ヴィレブランド因子を表し、αＦＰはα−胎児性タンパク質を表す。
【０１５８】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１５９】
（実施例１）
神経突起成長及びシナプス形成における前駆細胞の効果
シナプス形成は、ニューロン間、特にシナプス前部ニューロン（Ｂａｓｓｏｏｎ）とナプス後部ニューロン（Ｈｏｍｅｒ）との間のシナプスの形成である。このシナプス形成のプロセスは、星状細胞によって制御され、星状細胞は、シナプス形成の促進の他に、網膜神経節細胞を含むニューロンの生存及び成長のための支援も提供する。エクスビボでのヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の網膜変性モデルへの網膜下投与によって、視細胞及び視覚機能が維持されたことが示されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。本明細書では、ｈＵＴＣの治療面が試験され、機能性シナプス形成（シナプス生成）、ニューロン生存、及び成長に対する、誘導されたｈＵＴＣの効果を特性化する。
【０１６０】
材料及び方法
ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）を、以下の実施例４〜１６に記載され、かつ、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５２４，４８９号、及び同第７，５１０，８７３号、並びに米国特許出願第２００５／００５８６３４号に詳述されている方法で得た。要約すると、ヒト臍帯は、出産後のドナーの同意を得て入手した。組織は細切れにしてから酵素消化した。０．５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｒｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、５Ｕ／ｍＬの中性プロテアーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｒｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（Ｇｅｒｍａｎｙ））、及び２Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（Ｃｕｍｕｌａｓｅ；Ｏｒｉｇｉｏ  ａ／ｓ（Ｍａｌｏｖ（Ｄｅｎｍａｒｋ）））の混合物を含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコース（Ｌｇ）（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ））を用いた消化がほぼ完了した後で、細胞懸濁液を７０μｍの濾紙で濾過して、上清を２５０×ｇで遠心分離した。単離した細胞をＤＭＥＭ−Ｌｇ中で数回洗浄して、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、（５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）二酸化炭素、３７℃）を含むＤＭＥＭ−Ｌｇ中に５，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。細胞が約７０％コンフルエンス（約３〜４日）に達したとき、これらをＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用いて継代した。細胞を数回増殖させてからバンクした。凍結保存ｈＵＴＣ（１６〜２０回の集団倍加）を用いた。
【０１６１】
網膜神経節細胞：網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を、上述したいずれかの性別の、Ｐ７（生後７日目）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの網膜（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））から、逐次的免疫パニング（sequential immune-panning）によって精製した（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  Ａ，Ｗａｎｇ  ＪＴ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）；６４３〜６５２）。要約すると、網膜を切開してから、パパイン（６Ｕ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ））によって解離した。解離させた細胞を、最初にＢａｎｄｅｉｒａｅａ  Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｉ（ＢＳＬ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ））でコーティングされたペトリ皿でパニングして、免疫細胞、細胞残屑、及び線維芽細胞を取り除いた。ＲＧＣの特異的な単離のために、非結合細胞を、抗Ｔｈｙ１（クローンＴ１１Ｄ７）抗体でコーティングしたペトリ皿に移した。精製ＲＧＣをゆっくりとトリプシン処理し、２４ウェルプレート中のポリＤ−リジン（ＰＤＬ）及びラミニンでコーティングされたガラスカバースリップ上に再プレーティングした（３５，０００細胞／カバースリップ）。ＲＧＣを、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン、及びフォルスコリンを含む無血清増殖培地内で培養した（培地の完全なレシピは、上記のＷｉｎｚｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに見出すことができる）。
【０１６２】
ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＫＤ，ｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ  Ｊ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８０）８５：８９０〜９０２で説明される標準法を用いて、皮質星状細胞（ＡＳＣ）をいずれかの性別のＰ１のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ子ラットから単離した。星状細胞を共培養するため、星状細胞増殖培地（ＡＧＭ、ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＫＤ，ｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ  Ｊ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８０）８５：８９０〜９０２で説明される）中で１インサートあたり１２５，０００の皮質星状細胞を播種することにより、トランスウェルインサート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））を調製した。翌日、ＡＧＭをＲＧＣ増殖培地と交換し、トランスウェルインサートを、カバースリップ上に４ＤＩＶ（インビトロ日数）のＲＧＣを含む２４ウェルプレートに移した。
【０１６３】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。製造者の実験計画書に従い、細胞を増殖させて、継代４で凍結保存した。
【０１６４】
ＲＧＣを、ｈＵＴＣ、陽性対照としてのＡＳＣ、又は陰性対照としてのＮＨＤＦ細胞株と６日間共培養した。ＤＩＶ３のｈＵＴＣ、及びＮＨＤＦを１０Ｋ、２０Ｋ、３０Ｋ、１００Ｋ、及び２００Ｋで播種した。星状細胞を１３０Ｋで播種した。シナプス形成に対する効果を算出するために、２５Ｋ、５０Ｋ、及び１００ＫでのｈＵＴＣ、１３０Ｋでの星状細胞、及び１００Ｋ、１５０Ｋ、及び２００ＫでのＮＨＤＦを用いた。
【０１６５】
共培養実験のため、２５，０００のｈＵＴＣを、ＲＧＣと共培養する前日に、ｈＵＴＣ増殖培地中のトランスウェルインサート内に播種した。共培養する当日に、ｈＵＴＣ増殖培地をＲＧＣ増殖培地と交換して、トランスウェルインサートを、ガラスカバースリップ上で増殖させた４ＤＩＶのＲＧＣを有する２４ウェルプレートに移した。
【０１６６】
ＮＨＤＦを、線維芽細胞基礎培地（ＦＢＭ，Ｌｏｎｚａ）内で、製造者の指示を用いて培養した。ＲＧＣとの共培養のため、１５０，０００のＮＨＤＦを、ＲＧＣと共培養する前日に、ＦＢＭ培地中のトランスウェルインサート内に播種した。翌日、ＦＢＭをＲＧＣ増殖培地と交換し、トランスウェルインサートを、カバースリップ上に４ＤＩＶのＲＧＣを含む２４ウェルプレートに移した。
【０１６７】
免疫細胞化学によるシナプス数の定量化（シナプスアッセイ）：シナプス前部（Ｂａｓｓｏｏｎ）及びシナプス後部（Ｈｏｍｅｒ）マーカーの共局在化の免疫細胞学的分析、並びに電気生理学によりシナプス形成を評価した。ガラスカバースリップ上で、３５，０００のＲＧＣを単体で４ＤＩＶの間培養し、４ＤＩＶでトランスウェルインサート又は馴化培地を添加した。ＴＳＰ由来シナプス形成をブロックするために、Ｅｒｏｇｌｕ  ＣらのＣｅｌｌ（２００９）１３９：３８０〜３９２に説明される通りに、３２μμＭのガバペンチン（ＧＢＰ）を馴化培地と共に添加した。共培養細胞は、７ＤＩＶで新鮮増殖培地を与えられた。馴化培地を用いた場合、７ＤＩＶで馴化培地が添加された増殖培地がもたらされた。１０ＤＩＶで、ＲＧＣを４％のＰＦＡ（ｗ／ｖ）を使用して固定し、シナプス前部及びシナプス後部マーカーのＢａｓｓｏｏｎ（マウス抗Ｂａｓｓｏｏｎ、１：１０００，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０３８８５７，Ｅｎｚｏ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ））、及びＨｏｍｅｒ−１（ウサギ抗Ｈｏｍｅｒ、１：５００，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１９６６４３８，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｏｅｔｔｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に関して染色した。Ａｌｅｘａ−結合型二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ヤギ抗ウサギＡＦ−４８８（１：１０００，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０５６３７４８）、及びヤギ抗マウスＡＦ−５９４（１：５００，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０５６１５０７））を、検出のために用いた。カバースリップを、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をガラススライド（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ））上に備えたＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤に封入した。ＲＧＣを、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ  Ｍ１落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ））上で６３倍対物レンズを用いて画像化した。最近接した隣接細胞から少なくとも２細胞直径だけ離れた形態学的に健康な単一の細胞を、ＤＡＰＩ蛍光によってランダムに同定した。１回の実験につき、１条件あたり少なくとも１５〜２０の細胞を画像化して分析し、示される結果は２〜３回の独立した実験の平均である。取り込まれた画像を、ＮＩＨ画像処理パッケージＩｍａｇｅＪ用カスタムプラグイン（Ｂａｒｒｙ  Ｗａｒｋによって書かれ、Ｄｕｋｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣａｇｌａ  Ｅｒｏｇｌｕに要請することで入手可能）を用いて共局在化されたシナプス斑点に関して分析した。染色の実験計画書及び定量化法の詳細は、Ｉｐｐｏｌｉｔｏ  ＤＭ，Ｅｒｏｇｌｕ  Ｃ，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（２０１０）１６（４５）：２２７０で詳細に説明されている。１００μｍの樹状突起あたりの共局在化シナプス斑点数を集計することによりシナプス密度（神経突起長さあたりのシナプス数）を判定した。本分析では、１つの近位樹状突起／細胞は、画像ごとにランダムに選択した。示されたシナプス密度の結果は、３０細胞／条件の１回の実験からのものである。
【０１６８】
ＲＧＣからの電気生理学的記録：微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を、保持電位−７０ｍＶのホールセルパッチクランプにより記録した。細胞は、２３〜２４℃で流速０．２ｍＬ／分の細胞外溶液の連続的灌流下に保たれた。細胞外溶液は、１２４ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、２６ｍＭのＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのＤ−グルコース（ｐＨ７．４）を含んでいた。テトロドトキシン（ＴＴＸ、Ａｂｃａｍ、１μＭ、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））を、記録中に細胞外溶液に添加した。パッチピペット（２．５〜５ＭΩ）中の内部溶液は、１２０ｍＭのセシウムメタンスルホネート、５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのテトラエチルアンモニウムクロライド、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４ｍＭのリドカインＮ−エチルブロマイド、１．１ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭのマグネシウムＡＴＰ、及び０．３ｍＭのナトリウムＧＴＰを含んでおり、ｐＨはＣｓＯＨを用いて７．２に調整し、オスモル濃度はスクロースを用いて３００ｍＯｓｍに設定された。信号はＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））で記録し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａディジタイザ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて１０ｋＨｚでフィルター処理して、２０ｋＨｚでデジタル化した。ホールセル構成（whole-cell configuration）では、直列抵抗が＜２０ＭΩの時のみ記録は受理された。全てのデータは、ｐＣＬＡＭＰ１０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、ピーク検出ソフトウェアを用いて分析された。示されるデータは、３回の独立した実験で記録された１５細胞／条件から得られる。
【０１６９】
神経突起成長アッセイ：ＲＧＣを、低密度（１，５００細胞／カバースリップ）で、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、及びマウスラミニン（２０ｎｇ／ｍＬ）でコーティングしたガラスカバースリップ上に２４時間播種し、続いて４％のＰＦＡ（ｗ／ｖ）を使用して固定し、ウサギ抗ββチューブリン抗体（ＬＩ−ＣＯＲ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１８５００２９（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ））で、続いてヤギ抗ウサギＡＦ−４８８で免疫染色して、神経突起を可視化した。２４時間後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ染料（Ｉｎｉｖｔｉｒｏｇｅｎ）と共に１５分間インキュベートして、続いて４％のＰＦＡ（ｗ／ｖ）と共に固定化することにより、神経突起を可視化した。その神経突起を含む単一ＲＧＣの画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ  Ｍ１落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）上で２０倍対物レンズを用いて取り込んだ。１回の実験につき、１条件あたり少なくとも３０の細胞を画像化して分析し、示される結果は２〜３回の独立した実験の平均である。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の神経突起成長アプリケーションモジュールを用いてニューロン形態を分析した。Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＴＡらのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）１１：９８２〜９８４で説明されている、Ｆｉｊｉ用のプラグインを使用してショール分析を実施した。
【０１７０】
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、続いて各ペアのスチューデントのｔ（ＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ）事後検定（Each Pair, Student's t （Fisher's LSD）post−test）を実施して、定量化データの統計的分析を実施した。神経突起成長アッセイのショール分析では、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を実施した。ｍＥＰＳＣの累積確率の分析には、クラスカル−ウォリス検定、それに続いてダンの多重比較ポストホック試験（Dunn's multiple comparison post-hoc test）を用いた。全てのデータの統計分析には、ＳＡＳ９．２ソフトウェア（ＳＡＳ）が組み込まれたＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５を用いた。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表され、有意性は***ｐ＜０．０００１、**ｐ＜０．００１、及び*ｐ＜０．０５として示した。
【０１７１】
結果
トランスウェルインサート中でｈＵＴＣと共培養された場合の、精製ＲＧＣ間で作られたシナプスの数及び機能における変化が判明した。星状細胞が、シナプス数を激しく増加させ、シナプス活性を増大させることを示すため、ラット星状細胞初代培養（ＡＳＣ）と共培養されたＲＧＣは、陽性対照を提供する（Ｐｆｒｉｅｇｅｒ  ＦＷ，Ｂａｒｒｅｓ  ＢＡ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：１６８４〜１６８７、Ｕｌｌｉａｎ  ＥＭらのＳｃｉｅｎｃｅ（２００１）；２９１：６５７〜６６１）。ＮＨＤＦで処理したＲＧＣは、網膜変性モデルにおいて有意な機能的又は構造的回復を誘導しなかったため、陰性対照を提供した（上記のＬｕｎｄら（２００７））。ｈＵＴＣとＲＧＣとの共培養は、シナプス斑点数の増加を示し、星状細胞（陽性対照）のそれと匹敵するものであった（図１Ｂ〜１Ｄ）。４ＤＩＶ後、ＲＧＣをｈＵＴＣ、ＡＳＣ、又はＮＨＤＦと更に６日間共培養して、一対のシナプス前部及び後部タンパク質のＢａｓｓｏｏｎ及びＨｏｍｅｒでそれぞれ免疫染色することによってシナプス数を評価した（図１Ａ）。上述の方法を用いて、シナプスを、シナプス前部及び後マーカーの共局在化として判定した（上記のＩｐｐｏｌｉｔｏ  ＤＭ，Ｅｒｏｇｌｕ  Ｃ，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（２０１０））（図１Ｂ、矢印）。ｈＵＴＣは、単体で培養されたＲＧＣと比較して、ＲＧＣ間で興奮性シナプスの形成を誘導した（図１Ｂ、１Ｃ）。これに対して、ＮＨＤＦとの共培養は、シナプス数の有意な増加を誘導しなかった（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ）。単位神経突起長さ当りのシナプス数の定量化は、ｈＵＴＣが、シナプス密度を増加させることによって主にシナプス数を増大させたことを明らかにした（図１Ｄ、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜．０００１）。
【０１７２】
ホールセルパッチクランプ記録は、微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を測定した。ＲＧＣは、単体で培養されるか、又は、ｈＵＴＣ若しくはＡＳＣの存在下で培養された（図１Ａ）。星状細胞と同様に、ＲＧＣとｈＵＴＣとの共培養によって、観察されたシナプス数の活発な増加（図１Ｂ〜１Ｄ）に沿ってシナプス事象の頻度が増加した（図１Ｅ〜１Ｇ、図１Ｆ、クラスカル−ウォリス検定、ｐ＜．０００１、図１Ｇ、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜．０００１）。また、ｈＵＴＣもシナプス後電流の振幅を増大させた。星状細胞と同様に、ｈＵＴＣはシナプス活性を強化させた（図１Ｈ、１Ｉ、クラスカル−ウォリス検定、ｐ＜．０００１）。ｍＥＰＳＣのピーク波形は、ｈＵＴＣ処理（図１Ｊ〜１Ｍ）によって立ち上がりタウ及び減衰タウの両方が増加したことを示した。ｈＵＴＣは、ＡＳＣと同様に、興奮性シナプス形成を誘導して、培養ＲＧＣにおけるシナプス機能を強化する。
【０１７３】
（実施例２）
神経突起成長及びシナプス形成における馴化培地の効果
ｈＵＴＣ馴化培地を、ＲＧＣとの培養における効果について評価した。
【０１７４】
ｈＵＴＣ、ＲＧＣ、及び星状細胞を、上記の実施例１で説明した通りに得た。
【０１７５】
馴化培地の調製：純粋な星状細胞培養物又はｈＵＴＣを、１０ｃｍの組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））内の、それ自体の増殖培地で、７０％コンフルエントに達するまで増殖させた。続いて、細胞を温かいＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄して、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）からなる１０ｍＬの状態調節培地（conditioning media）をそれぞれの皿に添加した。培地を、細胞によって５日間馴化した。細胞を含まない馴化培地を回収して、分画分子量５ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ２０遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ））を用いることによって１０回濃縮した。各馴化培地のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））によって、製造者の指示に従い測定した。タンパク質低吸着チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））中の星状細胞順化培地（ＡＣＭ）とｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）とのアリコートを液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。ＵＣＭを様々な分画分子量で分画するために、３０ｋＤａ及び１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ２０遠心濃縮器を用いた。５〜１００ｋＤａのＵＣＭ画分を回収するために、１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ２０のフロースルーを、５ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器で濃縮した。５〜１００ｋＤａのＵＣＭ画分を回収するために、１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ２０のフロースルーを、５ｋＤａのＶｉｖａｓｐａｎ濃縮器で濃縮した。処理のために、冷凍したアリコートを氷上でゆっくりと融解させ、馴化培地を氷冷のＲＧＣ増殖培地（シナプス及び成長アッセイ）又は最少培地（生存アッセイ）に所望の濃度で添加した。
【０１７６】
馴化培地のウエスタンブロット分析：ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）のために、５％のβ−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）を含む５倍のＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１０〜２０μｇの馴化培地を調製した。タンパク質を９５℃で１５分間変性させた。タンパク質を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））中で分離させ、続いてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。ＴＳＰを検出するために、ヤギ抗ヒトＴＳＰ−１（１：２５０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２０１９５８）、ＴＳＰ−２（１：２５０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２０２６８）、ＴＳＰ−４（１：２００、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２０２０８７）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ローディング対照の場合、ヤギ抗体ヘビン抗体（１：２５０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２１９５１０３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いてヘビン／ＳＰＡＲＣＬ１と称される別のｈＵＴＣ分泌タンパク質を検出した。西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）結合抗ヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ、１：５０００）を二次抗体として用いた。検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標）ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｗｉｎｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＣ））、又はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造者の指示に従って実施した。
【０１７７】
シナプスアッセイ、電気生理学的記録、及び神経突起成長アッセイについては実施例１で説明する。
【０１７８】
細胞生存アッセイ：ＲＧＣを２４ウェルの組織培養プレート（７，５００細胞／ウェル）上に直接プレーティングした。ウェルをＰＤＬ及びラミニンでコーティングした。細胞を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＡＴＯサプリメント（SATO supplement）（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、６０ｎｇ／ｍＬのプロゲステロン、１６μｇ／ｍＬのプトレッシン、４０ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム）、Ｎ−アセチルシステイン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨードチロニン（４μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、及びフォルスコリン（５μＭ）を含む最少培地で培養した。ＵＣＭ及びＡＣＭの生存に対する効果を試験するために、フォルスコリン、ＢＤＮＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）、又はＣＮＴＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）の不在下／存在下で、最少培地に、様々な濃度の馴化培地を添加した。細胞の生存度は、哺乳類細胞用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、３ＤＩＶで評価した。生存度の集計は、このキットの剤を適用した１５分後に実施し、例示的な画像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で２０倍対物レンズを用いて取り込んだ。各実験で、１処理あたりに少なくとも１０フィールドを集計し、示された結果は２〜３回の実験平均である。生細胞の数を死滅細胞と生細胞との数の合計で割り、それを１００倍して、生存の割合を計算した。
【０１７９】
定量化データの統計的分析を、実施例１で説明される通りに実施した。
【０１８０】
結果
ＲＧＣに様々な濃度のｈＵＴＣ馴化培地（ｈＵＣＭ）を与えた。ｈＵＴＣを単体で培養し、ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）を回収した（図２Ａ）。ＲＧＣをＵＣＭで処理して、実施例１と同じアッセイを用いて、馴化培地のシナプス数及び機能に対する効果を評価した。シナプス分析は、ｈＵＣＭは、星状細胞馴化培地（ＡＣＭ）と同様の濃度依存的な方法で、トランスウェルインサート中のｈＵＴＣ（図２Ｂ〜２Ｎ）と同様のＲＧＣのシナプス形成を誘導し、シナプス機能を強化するのに十分であったことを示した（図２Ｂ〜２Ｄ、及び２Ｊ）。ＵＣＭは、２０〜８０μｇ合計タンパク質／ｍＬ培養培地の濃度で、完全なシナプス形成活性を示した。ＵＣＭは、ｈＵＴＣ共培養物と置き換えてもよい。ｍＥＰＳＣの振幅及び周波数の上昇によって示されるように、ｈＵＣＭも機能性シナプスを強化した（図２Ｅ〜２Ｉ）。
【０１８１】
これらの結果は、ｈＵＴＣがシナプス形成を誘導し、シナプス機能を強化したことを示す。ｈＵＴＣのシナプス形成作用は、これらの細胞を動物の疾患モデルに送達することによって起きる機能回復に貢献する。
【０１８２】
シナプス形成に対するその効果の他にも、ｈＵＣＭは、例えばＢＤＮＦ及びＣＴＮＦなどのいかなるその他の増殖因子も存在しない環境でＲＧＣの生存を促進した（図３Ａ、３Ｄ、及び３Ｅ）。ＲＧＣを、培地補充物Ｂ２７及び増殖因子ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、及びインスリンは含まないが、フォルスコリンを含む最少培地（最少培地の対照条件の意味でＣＴＲと称される）中で３ＤＩＶの間培養した。これらの最少培地条件下で、３ＤＩＶの終了時点で生存したＲＧＣは５％未満であった（図３Ａの左パネル、及び図３Ｂ）。フォルスコリンの存在下でのみ、ＢＤＮＦ又はＣＮＴＦなどの増殖因子を添加することでＲＧＣ生存が増加した（Ｍｅｙｅｒ−Ｆｒａｎｋｅ  ＡらのＮｅｕｒｏｎ，（１９９５）；１５：８０５〜８１９）。培地中のフォルスコリンは、ＣＮＳニューロンの生存にとって重要な進行中のニューロン活動を模倣するニューロン中のｃＡＭＰレベルを上昇させる（Ｍｅｙｅｒ−Ｆｒａｎｋｅら（１９９５））。ＵＣＭを最少培地に添加することで、濃度依存的な方法でのＲＧＣの生存が刺激され（図３Ａの右パネル、及び図３Ｂ）、一方で、同濃度のＡＣＭはＲＧＣの生存を促進しなかった（図３Ｂ）。
【０１８３】
ＵＣＭの生存促進活性は、最少培地中におけるフォルスコリンの存在下では機能的であった（図３Ｃ）。これらの結果は、ＵＣＭで刺激されたＲＧＣの生存を実証する。低濃度（４０μｇ／ｍＬ）では、ＵＣＭの生存作用は、ＢＤＮＦ又はＣＮＴＦの生存作用に付加的であるように見える（図３Ｄ、３Ｅ）。
【０１８４】
ＵＣＭは、更に、合計突起長さ、突起数、及び分岐数の増加によって示されるように、ＲＧＣの神経突起成長を増進させた（図３Ｆ〜３Ｊ）。プレーティングの時点でＵＣＭを有するＲＧＣ増殖培地は、ＵＣＭが神経突起の成長及び複雑化を促進する因子を含んでいることを示した（図３Ｆ〜３Ｊ）。ＡＣＭもまた、神経突起の成長を促進し（図３Ｆ〜３Ｊ）、ＵＣＭは全体的な複雑化及び分岐の誘導に概してより効果的であった（図３Ｆ及び３Ｊ）。ショール分析は、単体で培養されたＲＧＣと比較して、ＵＣＭがニューロンの複雑度を増加させることを示した（図３Ｇ）。
【０１８５】
要約すると、ｈＵＴＣは、インビトロで精製ＲＧＣ間における機能性シナプスの発達を促進する因子を分泌する。更に（Moreoever）、ｈＵＴＣはニューロンの生存及び成長も支援する。
【０１８６】
実施例３
前駆細胞によるシナプス形成因子の分泌
ｈＵＴＣ由来のセクレトームが、機能性シナプスの発達、並びにニューロンの生存及び成長にプラスの作用をもたらすことが示された。この実施例では、ｈＵＴＣによって分泌されたシナプス形成因子を同定する。
【０１８７】
免疫細胞化学アッセイ：ｈＵＴＣ及びＲＧＣを、実施例１で上述した通りに得た。ｈＵＴＣ馴化培地（ＵＣＭ）を、実施例２と同様に調製した。
【０１８８】
約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲内の分子量分画（ＭＷＣＯ）によってＵＣＭ中のタンパク質を単離した。８０ｕｇ／ｍＬのＵＣＭを、ＲＧＣの培養に用い、免疫細胞化学シナプスアッセイによって分析した。単離されたタンパク質＞５ｋＤａ、＞３０ｋＤＡ、及び＞１００ｋＤａを、ＲＧＣ単体及び５〜１００ｋＤａのＵＣＭと比較した。（図４Ａ）。
【０１８９】
ｈＵＴＣによって分泌されたシナプス形成因子を更に同定するためにシナプス形成遮断剤のガバペンチン（ＧＢＰ）を用いた。
【０１９０】
神経突起成長アッセイ：異常（即ち成長阻害的）培養条件下の神経突起成長を試験するために、ＲＧＣ（１，５００細胞／カバースリップ）を、様々な濃度のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））、Ｎｏｇｏ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））でコーティングされたか、あるいは可溶性ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、１０ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））の存在下のカバースリップ上に播種した。２４時間後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ染料（Ｉｎｉｖｔｉｒｏｇｅｎ）と共に１５分間インキュベートして、続いて４％のＰＦＡ（ｗ／ｖ）と共に固定化することにより、神経突起を可視化した。その神経突起を含む単一ＲＧＣの画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ  Ｍ１落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）上で２０倍対物レンズを用いて取り込んだ。１回の実験につき、１条件あたり少なくとも３０の細胞を画像化して分析し、示される結果は２〜３回の独立した実験の平均である。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の神経突起成長アプリケーションモジュールを用いてニューロン形態を分析した。Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＴＡらのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）１１：９８２〜９８４で説明されている、Ｆｉｊｉ用のプラグインを使用してショール分析を実施した。
【０１９１】
ノックダウンアッセイ：ｈＵＴＣをレンチウイルスｓｈＲＮＡと共に培養して、ノックダウン（ＫＤ）ＵＣＭを調製した。続いて、ＲＧＣをＫＤ  ＵＣＭ中で培養して、シナプス形成、電気生理学、並びにニューロンの生存及び成長に関してアッセイした。（図５Ａ）。ヒトＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、又はＴＨＢＳ４ｍＲＮＡ（それぞれＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４に翻訳される）を標的にするｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏベクターにクローニングされたｓｈＲＮＡ構成物プール（shRNA construct pools）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。空のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏベクターをＡｄｄｇｅｎｅから購入して（プラスミド８４５３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））、ノックダウン対照として用いた。個々の構造体のノックダウン効率を、ｈＵＴＣにトランスフェクションすることにより判定した。最も効果的なノックダウンを示した各ＴＳＰのｓｈＲＮＡ構成物を、続くレンチウイルス産生のために選択した。
【０１９２】
レンチウイルスを製造するために、トランスフェクションの前日に、２９３Ｔレンチウイルスパッケージング細胞を、Ｔ７５フラスコあたり８×１０6細胞で播種した。翌日、Ｔｈｂｓ１（クローン番号ＴＲＣＮ００２２４）、Ｔｈｂｓ２（クローン番号ＴＲＣＮ５３９７２）、Ｔｈｂｓ４（クローン番号ＴＲＣＮ５４０４８）用のｓｈＲＮＡ、又はノックダウン対照（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド８４５３）を含むｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏレンチウイルスプラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。スクランブルｓｈＲＮＡ対照の場合、Ｔｈｂｓ１（５'−ＡＴＡＡＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＴＡＴ−３'）、Ｔｈｂｓ２（５'−ＧＴＴＡＣＡＴＣＴＣＧＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡ−３'）、及びＴｈｂｓ４（５'−ＡＴＡＴＡＡＧＡＣＧＣＴＡＧＡＴＣＣＡＣＡ−３'）ｓｈＲＮＡに対する同じセンス及びアンチセンススクランブル配列を含むオリゴを用いた。スクランブルｓｈＲＮＡオリゴをアニールして、ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏにクローニングし、レンチウイルスの産生に用いた。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を用いて、製造者の指示に従いパッケージングプラスミド、δＲ８．２、及びＶＳＶ−Ｇを共トランスフェクトした。レンチウイルスの上清をトランスフェクション後４８時間後及び７２時間後の２回回収し、０．４５μｍの濾紙（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ＧｏＳｔｉｘ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））を用いてウイルス粒子を検出した。濾過された上清を用いて、ポリブレン（２μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を添加した後のｈＵＴＣに感染させた。培地をＲＧＣ実験のために馴化させる前の５日間、ピューロマイシン（９００ｎｇ／ｍＬ）をｈＵＴＣ培地に添加することにより、形質導入されたｈＵＴＣを更に選択した。
【０１９３】
リコンビナントＴＳＰの産生及び精製：精製したリコンビナントヒトＴＳＰ−１をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＴＳＰ−２の精製のため、ＣＨＯ細胞株発現マウスＴＳＰ−２を用いて馴化培地を製造した。分泌されたリコンビナントＴＳＰ−２を、ＨｉＴＲＡＰヘパリンＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使った親和性クロマトグラフィー法を用いて、従来説明されている通りに（Ｏｇａｎｅｓｉａｎ  ＡらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ（２００８）；１９：５６３〜５７１）、培地から精製した。ＴＳＰ−４に対しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、６−ヒスチジンタグ付きのラットのＴＳＰ−４構造体（Ｋｉｍ  ＤＳらのＪ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２０１２）；３２：８９７７〜８９８７で説明されるｐｃＤＮＡ３−ＴＳＰ−４）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。分泌されたリコンビナントＴＳＰ−４を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を用いて、製造者の指示に従い、Ｎｉキレート化クロマトグラフィーによって培地から精製した。精製されたリコンビナントＴＳＰを、３０ｋＤａ分画のＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて最高で１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、アリコートを液体窒素中で急速冷凍して、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１９４】
シナプスアッセイ、電気生理学的記録、及び神経突起成長アッセイについては実施例１で説明する。定量化データの統計的分析を、実施例１で説明される通りに実施した。馴化培地のウエスタンブロット分析に関しては実施例２で説明する。
【０１９５】
結果
様々な分画分子量サイズ排除カラム（図４Ａ）を用いたｈＵＴＣ分画ＵＣＭによって分泌されたシナプス形成因子のために、ＵＣＭのシナプス形成作用は１００ｋＤａ超の分画内に集中する（図４Ｂ、４Ｃ）。ＵＣＭとＲＧＣとの培養物の免疫細胞化学は、５〜１００ｋＤａの範囲のシナプス形成因子は最小であり、１００ｋＤａより大きな因子からの作用が最高であることを示した（図４Ｂ、４Ｃ）。ＵＣＭ誘導シナプス形成におけるＴＳＰの役割と一致したことに、ＧＢＰの添加によってシナプス形成因子が遮断された（図４Ｄ、４Ｅ）。ガバペンチンは、既知のシナプス形成トロンボスポンジンファミリーの遮断剤であり、これは、ＴＳＰファミリータンパク質が、ｈＵＴＣによって分泌される主なシナプス形成因子であることを示す。
【０１９６】
イソ型特異的ｓｈＲＮＡを用いて、ＴＳＰ−１、２、及び４を、個別に、又はレンチウイルス媒介アプローチを用いて協同でノックダウンし（図５Ａ）、ｈＵＴＣ  ＣＭ中のシナプス形成因子としてＴＳＰを確認した。対応するｓｈＲＮＡによる各ＴＳＰの特異的なノックダウンを、ウエスタンブロットによって確認した（図５Ｂ）。ｓｈＲＮＡｓ（ＫＤ−ＣＴＲ）を含まない、又はスクランブルＴＳＰ−１、２、若しくは４のｓｈＲＮＡ（ＳＣＲ−ＣＴＲ）を含むレンチウイルスで３重感染した、同親のプラスミドベクターのレンチウイルス形質導入物から産生されたＵＣＭを対照として用いた。ＵＣＭをレンチウイルスに感染したｈＵＴＣから産生して、ＴＳＰノックダウンの作用を同定するためにＲＧＣに適用した（図５Ａ）。ｈＵＴＣに送達されたＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４のｓｈＲＮＡ構成物は、各ＴＳＰの発現のノックダウンをもたらした（図５Ｂ及び５Ｄ）。ＲＧＣにおけるシナプス数及びシナプス密度の定量化によって、３種類全てのＴＳＰ（ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４）が、ＵＣＭのシナプス形成機能に貢献していたことが判明した（図５Ｃ、５Ｄ、５Ｈ〜５Ｊ）。個々のＴＳＰのノックダウンによって、ＫＤ−ＣＴＲ  ＵＣＭと比較してシナプス数が減少した（図５Ｃ、５Ｄ、５Ｈ〜５Ｊ）。３種類全てのＴＳＰをノックダウンすることで（ＴＳＰ−１＋２＋４−ＫＤ）、ＵＣＭのシナプス形成作用が消滅した（図５Ｃ、５Ｄ、５Ｊ）。
【０１９７】
ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに純粋なＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４を添加することで（それぞれ１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭのシナプス形成作用が回復した（図５Ｃ、５Ｅ、５Ｉ）。ＫＤ−ＣＴＲ  ＵＣＭに純粋なＴＳＰを添加することでは、シナプス数の更なる増加は見られなかった（図５Ｋ）。
【０１９８】
ｍＥＰＳＣの電気生理学的記録は、ＴＳＰの発現をサイレンシングすることで、ｈＵＴＣのシナプス形成作用が減少し、ｍＥＰＳＣの振幅及び周波数が減少したことを示す。ＡＣＭ（陽性対照）、ＳＣＲ−ＣＴＲ、又はＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭで処理されたＲＧＣは、ＴＳＰ発現のサイレンシングによって、ＵＣＭによって誘導されたシナプス事象の頻度の増加が減少したことを示した（図６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ）。これは、ＵＣＭがシナプス形成を誘導するのにＴＳＰ−１、２、及び４が不可欠であるという発見と一致している（図５）。ＴＳＰのノックダウンは、振幅（図６Ｉ、６Ｊ）及び立ち上がりタウ（図６Ｋ、６Ｌ）などのｍＥＰＳＣのピーク特性に対してより穏やかな影響を有していた。更に、ＴＳＰのノックダウンは、減衰タウを増加させるＵＣＭの能力に影響を及ぼさなかった（図６Ｍ、６Ｎ）。ｈＵＴＣにおけるＴＳＰ−１、２、及び４のサイレンシングは、シナプス数の増加を誘導するこれらの細胞の能力を排除する。ＴＳＰの喪失は、シナプス電流の振幅及びｍＥＰＳＣピークの波形に対するＵＣＭの作用を完全には低減させない。
【０１９９】
更に、ＴＳＰの発現をサイレンシングすることで、ＵＣＭの神経突起成長作用が消滅した（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ）。ＴＳＰ−１、２、又は４の単一ノックダウンは、突起数及び分岐数に対する作用（図７Ｎ〜７Ｏ）を含む、ＵＣＭの神経突起成長促進作用を消滅させた（図７Ｅ）。ＴＳＰ−２若しくはＴＳＰ−４のノックダウン、又は３種類全てのＴＳＰのノックダウンは、ＵＣＭの生存促進活性を減少させたが、ＴＳＰ−１のみのノックダウンではＵＣＭの生存促進活性は減少されなかった（図７Ｋ）。ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに純粋なＴＳＰを、個別に、又は全てを一度にのいずれかで添加することによっては、ＵＣＭの生存促進機能はレスキューされなかった（図７Ｌ）。ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに純粋なＴＳＰ（ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＴＳＰ−４）（それぞれ１５０ｎｇ／ｍＬ）を添加することで、ＵＣＭの神経突起成長刺激機能が回復した（図７Ｈ、７ｉ、７Ｑ、７Ｒ）。
【０２００】
ＣＮＳが損傷した場合、反応性グリア、及びＮｏｇｏ  Ａなどのミエリンタンパク質によって産生されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）が、変性ニューロンから放出される。これらのタンパク質は軸索再生を阻害し（Ｎｉｅｄｅｒｏｓｔら（２００２）；Ｓｉｌｖｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（２００４）、Ｕｓｈｅｒら（２０１０）、Ｗａｌｋｅｒら（２０１２））、ニューロンの修復及び損傷を妨害する。変性ＲＧＣ神経突起成長アッセイは、成長を阻害する条件下でｈＵＴＣが神経突起成長を促進することを示す。ＣＳＰＧ又はＮｏｇｏ−Ａを用いる変性ＲＧＣ神経突起成長アッセイ（図８Ａ及び８Ｂ）では、ＣＳＰＧは、０．０５μｇ／ｃｍ2で神経突起成長の妨害を開始し、０．２μｇ／ｃｍ2以上の濃度で成長を完全に遮断した（図８Ａ）。Ｎｏｇｏ−ＡはＲＧＣ内の神経突起成長の遮断を１μｇ／ｃｍ2で開始し、２μｇ／ｃｍ2で５０％超の神経突起成長を阻害した（図８Ｂ）。スクランブルｓｈＲＮＡ（ＳＣＲ−ＣＴＲ  ＵＣＭ）をコードするレンチウイルスで形質導入したＵＣＭは、０．０５μｇ／ｃｍ2のＣＳＰＧ、又は１μｇ／ｃｍ2のＮｏｇｏ−Ａと共にカバースリップ上にプレーティングされたＲＧＣ中で神経突起成長を誘導した（図８Ａ及び８Ｂ）。ｈＵＣＭは、成長阻害条件下にあってもなお神経突起成長を誘導した。ＳＣＲ−ＣＴＲ  ＵＣＭは、高いＣＳＰＧ（＞０．２μｇ／ｃｍ2）及びＮｏｇｏ−Ａ（２μｇ／ｃｍ2）濃度下では、神経突起成長をトリガできなかった（図８Ａ及び８Ｂ）。
【０２０１】
ＳＣＲ−ＣＴＲ  ＵＣＭとは異なり、０．０５μｇ／ｃｍ2のＣＳＰＧ（図８Ｃ及び８Ｅ）又は１μｇ／ｃｍ2のＮｏｇｏ−Ａ（図８Ｄ及び８Ｆ）が存在する場合、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭは、神経突起成長をトリガしなかったが、これは、成長阻害条件下でのｈＵＣＭの神経突起成長促進作用にＴＳＰが重要であることを示唆している。精製したＴＳＰ−２又はＴＳＰ−４を単体で添加するか、あるいは３種類全てのＴＳＰを一緒に添加することで、ＣＳＰＧ又はＮｏｇｏ−Ａの存在下で、ＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭが神経突起成長を誘導する能力がレスキューされた（図８Ｃ〜８Ｆ）。これらの結果は、ＴＳＰ、特にＴＳＰ−２及び４が、ＣＳＰＧ又はＮｏｇｏ−Ａの存在下におけるｈＵＣＭの増殖刺激作用を担っていることを示す。
【０２０２】
ＣＮＳの損傷によって生成されたミエリン残渣は、高レベルのミエリンタンパク質ＭＢＰを更に発生させる（Ｌｉｕら（２００６）、Ｓｔａｐｕｌｉｏｎｉｓら（２００８））。１０μｇ／ｍＬの可溶性ＭＢＰの存在下でのＲＧＣ増殖アッセイは、ＭＢＰがＣＮＳニューロンに対する神経突起成長阻害作用を有することを示した。従来の研究は、１０μｇ／ｍＬを超える濃度のＭＢＰが神経毒性を誘導することを示している（Ｚｈａｎｇら（２０１４））。本明細書では、１０μｇ／ｍＬのＭＢＰは、ＲＧＣ中の神経突起成長の喪失をもたらす（図８Ｊ、正常増殖培地条件下のＲＧＣ培養物と比較して１４±０．０７％の成長の減少）。ＳＣＲ−ＣＴＲ  ＵＣＭは、ＭＢＰの存在下で神経突起成長を誘導し、ＴＳＰをサイレンシングすると（即ちＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭ、図８Ｇ及び８Ｉ）、ＵＣＭのこの作用は喪失された。純粋なＴＳＰ−２をＴＳＰ１＋２＋４−ＫＤ  ＵＣＭに添加して戻すことだけが、成長促進作用をレスキューした。これらの結果は、ＭＢＰの存在下で、ＴＳＰ−２は神経突起成長を媒介することができ、成長阻害条件下では、ｈＵＴＣ分泌ＴＳＰ、ＴＳＰ−２及びＴＳＰ−４は神経突起成長を媒介することを示す。純粋なＴＳＰを増殖培地に添加することでも、ＣＳＰＧ、Ｎｏｇｏ−Ａ、又はＭＢＰの存在下でのＲＧＣ神経突起成長が誘導された（図８Ｈ及び８Ｊ）。
【０２０３】
（実施例４）
分娩後組織からの細胞の誘導
この実施例では、胎盤組織及び臍帯組織由来の分娩後由来細胞の調製について説明する。分娩後臍帯及び胎盤を、満期妊娠又は早期妊娠のいずれかの出産時に得た。細胞は、臍及び胎盤組織の、５つの別個のドナーから採取した。細胞単離の様々な方法を、これらが、１）幹細胞に共通の特性である、異なる表現型を有する細胞へと分化する潜在能力、又は２）他の細胞及び組織に有用な栄養因子を提供する潜在能力、を有する細胞をもたらす能力に関して試験した。
【０２０４】
方法及び材料
臍細胞の単離：臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た。それらの組織は、正常分娩後に得られたものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残渣を除去するために、臍帯を、抗真菌剤及び抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）））中で洗浄した。次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート内で、５０ミリリットルの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の存在下、組織が微細なパルプ状へと細断されるまで、機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬの円錐管に移した（チューブ１本当り組織約５グラム）。
【０２０５】
次いで、それぞれ上述の通りに抗真菌剤及び抗生物質を含有させた、ＤＭＥＭ−低グルコース培地若しくはＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれか中で、この組織を消化させた。一部の実験では、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、５００単位／ミリリットル、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ミリリットル）を使用した。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）（ＤＭＥＭ−低グルコース中、コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）５単位／ミリリットル）を使用した。これらの組織、培地、及び消化酵素を収容する円錐管を、２２５ｒｐｍの軌道振とう器（Ｅｎｖｉｒｏｎ（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．））内で２時間、３７℃でインキュベートした。
【０２０６】
消化の後、１５０×ｇで５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。ペレットを、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；規定ウシ血清；ロット番号ＡＮＤ１８４７５（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ミリリットル／１００ミリリットルの上述の通りの抗生物質／抗真菌剤を添加した、２０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に、再懸濁させた。この細胞懸濁液を、孔径７０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過した。増殖培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、濾過器に通過させた。次いで、その細胞懸濁液を、孔径４０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させ、続いて、増殖培地の洗液を追加で５ｍＬ通過させた。
【０２０７】
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍＬの新鮮増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。
【０２０８】
最終的な遠心分離の後、上清を吸引して、５ｍＬの新鮮な増殖培地に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生存細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。
【０２０９】
臍帯から単離した細胞を、上述の抗生物質／抗真菌剤を含む増殖培地中で、ゼラチンコーティングされたＴ−７５ｃｍ2フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））上に、５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。２日後に（各種実験で、細胞は、２〜４日間インキュベートした）、フラスコから、培養に使用された培地を吸引した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、増殖培地を補充して、コンフルエンスまで増殖させ（継代数０から約１０日）、継代数１とした。その後の継代（継代数１から継代数２へ、など）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を５０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は、５％の二酸化炭素及び大気酸素に設定した加湿インキュベーター内で、３７℃で増殖させた。
【０２１０】
胎盤細胞の単離：胎盤組織は、ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ））から得た。それらの組織は、妊婦由来のものであり、通常の外科的分娩時に得たものであった。胎盤細胞を、臍細胞の単離に関して説明されたように、単離した。
【０２１１】
以下の実施例は、胎盤組織からの、母体由来細胞及び新生児由来細胞の別個の集団の単離に適用される。
【０２１２】
細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。胎盤組織を、抗真菌剤及び抗生物質（上記）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中で洗浄して、血液及び残渣を除去した。次いで、その胎盤組織を、３つの切片：上層（新生児側又は新生児態様）、中間層（新生児と母体との混合細胞単離）、及び下層（母体側又は母体態様）へと切り分けた。
【０２１３】
分離した切片を、個別に、抗生物質／抗真菌剤を有するＰＢＳ中で数回洗浄して、血液及び残渣を更に除去した。次いで、各切片を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート内で、５０ミリリットルのＤＭＥＭ−低グルコースの存在下、微細なパルプへと機械的に解離させた。このパルプを、５０ミリリットル円錐管に移した。各管は、約５グラムの組織を収容するものとした。抗真菌剤及び抗生物質（１００Ｕ／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）及び消化酵素を含有する、ＤＭＥＭ−低グルコース培地若しくはＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれか中で、この組織を消化させた。一部の実験では、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中に、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を５００単位／ミリリットル、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０単位／ミリリットルで含有する、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）を使用した。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース中、コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）５単位／ミリリットル）。これらの組織、培地、及び消化酵素を収容する円錐管を、２２５ｒｐｍの軌道振とう器（Ｅｎｖｉｒｏｎ（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．））内で、３７℃で２時間インキュベートした。
【０２１４】
消化の後、１５０×ｇで５分間、組織を遠心分離して、得られた上清を吸引除去した。ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを有する２０ミリリットルの増殖培地中に、再懸濁させた。この細胞懸濁液を、７０マイクロメートルのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過し、追加的な５ミリリットルの増殖培地を含む洗液を、続けて通過させた。細胞懸濁液の全体を、４０マイクロメートルのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させ、追加的な５ミリリットルの増殖培地を、洗液として、続けて通過させた。
【０２１５】
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ミリリットルの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。最終的な遠心分離の後に、上清を吸引して、５ミリリットルの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー排除試験を使用して、細胞計数を判定した。次いで、標準条件で、細胞を培養した。
【０２１６】
ＬＩＢＥＲＡＳＥ細胞単離：ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ））（２．５ミリグラム／ミリリットルのＢｌｅｎｄｚｙｍｅ３（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ）））及びヒアルロニダーゼ（５単位／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））を有する、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中で、臍組織から細胞を単離した。組織の消化、及び細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に関する説明と同様であるが、Ｃ：Ｄ又はＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを使用する組織の消化は、分娩後組織から、容易に増殖する細胞集団の単離をもたらした。
【０２１７】
他の酵素の組み合わせを使用する細胞単離：様々な酵素の組み合わせを使用して、臍帯から細胞を単離するための手順を比較した。消化に関して比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（ＤＨ）、及び、ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれた。これらの種々の酵素消化条件を用いて、細胞単離の差異を観察した（表４−１）。
【０２１８】
臍帯内残留血液からの細胞の単離：様々なアプローチによって臍帯から細胞のプールを単離するためのその他の試みを実施した。一例では、臍帯を薄切りにして、増殖培地で洗浄し、血餅及びゼラチン状物質を取り除いた。血液、ゼラチン状物質、及び増殖培地の混合物を回収して１５０×ｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、ゼラチンコーティングフラスコ上の増殖培地中に播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。
【０２１９】
臍帯血からの細胞の単離：細胞は、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離された。ここで用いた単離プロトコルは、Ｈｏらによる国際特許出願第ＷＯ２００３／０２５１４９号（Ｈｏ，Ｔ．Ｗ．らの「Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｗｈｉｃｈ  Ｃｏ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＣＤ４９Ｃ  ａｎｄ  ＣＤ９０，」、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１号）のプロトコルとした。臍帯血（ＮＤＲｌ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．））のサンプル（それぞれ、５０ミリリットル及び１０．５ミリリットル）を、溶解緩衝液（濾過除菌された１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ミリモルの重炭酸カリウム、ｐＨ７．２に緩衝させた０．１ミリモルのＥＤＴＡ（全成分ともＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）より入手））と混合した。１：２０の、臍帯血と溶解緩衝液との比率で、細胞を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、５秒間ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を遠心分離した（２００×ｇで１０分間）。細胞ペレットを、１０パーセントのウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ））、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ））、１００単位／１００ミリリットルのペニシリン、及び１００マイクログラム／１００ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を含有する、完全最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を、遠心分離して（２００×ｇで１０分間）、上清を吸引し、完全培地中で細胞ペレットを洗浄した。Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｎ．Ｙ．））、Ｔ７５ラミニンコーティングフラスコ、又はＴ１７５フィブロネクチンコーティングフラスコ（双方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））内に、細胞を直接播種した。
【０２２０】
様々な酵素の組み合わせ及び増殖条件を用いた細胞の単離：細胞集団を様々な条件下で単離し、単離直後に様々な条件下で増殖することが可能か否かを判定するために、上記の手順に従って、０．００１パーセント（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を含む又は含まない増殖培地中で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合わせを使用して、細胞を消化させた。そのように単離した胎盤由来細胞を、様々な条件下で播種した。全ての細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させた（表４−２）。
【０２２１】
種々の酵素の組み合わせ及び増殖条件を用いた細胞の単離：全ての条件で、細胞は、継代数０〜１の間に、良好に付着かつ増殖した（表４−２）。条件５〜８及び条件１３〜１６の細胞は、播種の後に継代数４まで良好に増殖することが実証され、その時点で、それらの細胞を凍結保存し、バンクした。
【０２２２】
結果
様々な酵素の組み合わせを使用する細胞単離：Ｃ：Ｄ：Ｈの組合せが、単離の後に最良の細胞収量をもたらし、他の条件と比較して、より多くの世代にわたって培養中に増殖する細胞を生成した（表４−１）。コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼを単独で使用しても、増殖可能な細胞集団は得られなかった。この結果が、試験したコラーゲンに特異的なものであるか否かを判定する試みは、行わなかった。
【０２２３】
【表１】
2017537702.tif 000002
略語：＋＝良好、＋＋＝非常に良好、＋＋＋＝優良、Ｘ＝成功せず
【０２２４】
種々の酵素の組み合わせ及び増殖条件を用いた細胞の単離：細胞は、酵素消化及び増殖に関して試験した全ての条件下で、継代数０〜１の間に、良好に付着して増殖した（表４−２）。実験条件５〜８及び実験条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖し、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。更なる検討のために、全ての細胞を凍結保存した。
【０２２５】
【表２】
2017537702.tif 000003
【０２２６】
臍帯内の残留血液からの細胞の単離：有核細胞が急速に付着及び増殖した。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって得られた細胞と同様であった。
【０２２７】
臍帯血からの細胞の単離：これらの調製物は、赤血球及び血小板を含有していた。最初の３週間は、有核細胞が付着及び分裂することはなかった。播種の３週間後に、培地を交換したが、細胞の付着及び増殖は観察されなかった。
【０２２８】
要約：細胞集団は、酵素の組み合わせ、即ちコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、及びヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用いて、臍帯及び胎盤組織から、効率的に誘導することができる。ＢｌｅｎｄｚｙｍｅであるＬＩＢＥＲＡＳＥもまた、使用することができる。具体的には、コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック上の増殖培地中で培養した場合、多数の継代にわたって、容易に増殖した。
【０２２９】
細胞はまた、臍帯内の残留血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着及び増殖する、組織から洗い流された血餅中の細胞の存在は、解剖プロセス中に細胞が遊離することによるものである可能性がある。
【０２３０】
（実施例５）
分娩後由来細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いずれの汚染細胞型も含まない。細胞療法に使用される細胞は、正常な染色体数（４６）及び構造を有するべきである。均質であり、かつ、非分娩後組織起源の細胞を含まない、胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株を同定するために、細胞サンプルの核型を分析した。
【０２３１】
方法及び材料
新生男児の分娩後組織由来のＰＰＤＣを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する増殖培地中で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）との識別が可能となるように、新生男児由来の分娩後組織（Ｘ，Ｙ）が選択された。細胞を、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．））内の増殖培地中に、５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞を収容するＴ２５フラスコは、首部分まで増殖培地で充填した。臨床細胞遺伝学研究所に、急送便でサンプルを配送した（研究所間の推定輸送時間は、１時間である）。細胞は、染色体が最も良好に可視化される、分裂中期の間に分析された。計数した分裂中期の２０個の細胞のうち、５個の細胞を、正常な同種核型数（２）に関して分析した。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が同定されると、更なる分裂中期細胞を計数して、分析した。
【０２３２】
結果
染色体分析のために送られた全ての細胞サンプルは、正常な様相を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうちの３つは、新生児起源及び母体起源の双方に由来する細胞の存在を示す、不均質な表現型（ＸＸ及びＸＹ）を呈した（表５−１）。胎盤−Ｎの組織由来の細胞は、胎盤の新生児態様から単離された。継代数０では、この細胞株は、均質なＸＹを表した。しかしながら、継代数９では、この細胞株は、従前には検出されなかった母体起源の細胞の存在を示す、不均質（ＸＸ／ＸＹ）なものであった。
【０２３３】
【表３】
2017537702.tif 000004
【０２３４】
凡例：Ｎ−新生児側、Ｖ−絨毛領域、Ｍ−母体側、Ｃ−クローン
【０２３５】
要約：染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究所によって解釈されるように、核型が正常を表す胎盤由来細胞及び臍由来細胞を同定した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母体細胞を含まない細胞株も同定した。
【０２３６】
（実施例６）
ヒト分娩後に誘導される細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる評価
フローサイトメトリーによる、細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を使用して、細胞株の同一性を判定できる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞において、判定することができる。胎盤及び臍から単離された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）株を、（フローサイトメトリーによって）特徴付けして、これらの細胞株の同定に関するプロファイルを提供した。
【０２３７】
方法及び材料
培地及び培養容器：ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中で、細胞を培養した。血漿処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））内で、細胞をコンフルエントまで培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの増殖表面をゼラチンでコーティングした。
【０２３８】
抗体染色及びフローサイトメトリー分析：フラスコ内の付着細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ中に、１×１０7／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。製造元の仕様書に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳ中に、細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）計器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して実施した。表６−１は、使用された細胞表面マーカーに対する抗体を一覧で示す。
【０２３９】
【表４】
2017537702.tif 000005
【０２４０】
胎盤と臍との比較：胎盤由来細胞を、継代数８で、臍由来細胞と比較した。
【０２４１】
継代間の比較：胎盤由来細胞及び臍由来細胞を、継代数８、１５、及び２０で分析した。
【０２４２】
ドナー間の比較：ドナー間の差異を比較するために、様々なドナーからの胎盤由来細胞を互いに比較し、また、様々なドナーからの臍由来細胞を互いに比較した。
【０２４３】
表面コーティングの比較：ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した胎盤由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した胎盤由来細胞と比較した。ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。
【０２４４】
消化酵素の比較：細胞の単離及び調製に関して使用される、４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、及び４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを用いる処理によって胎盤から単離された細胞を比較した。
【０２４５】
胎盤の層の比較：胎盤組織の母体態様由来の細胞を、胎盤組織の絨毛領域由来の細胞、及び胎盤の新生胎児態様由来の細胞と比較した。
【０２４６】
結果
胎盤と臍との比較：フローサイトメトリーによって分析された、胎盤由来細胞及び臍由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較して高い蛍光値によって示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現に関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と同等の蛍光値によって示された。陽性曲線の蛍光値の変動を考慮した。陽性曲線の平均（即ち、ＣＤ１３）及び範囲（即ち、ＣＤ９０）は、ある程度の変動を示したが、これらの曲線は、正常であると考えられ、均質な集団であることが確認された。双方の曲線が、それぞれＩｇＧ対照よりも高い値を示した。
【０２４７】
継代間の比較−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０での胎盤由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値に反映されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して、全て陽性であった。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有した。
【０２４８】
継代間の比較−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０での臍由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
【０２４９】
ドナー間の比較−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された胎盤由来細胞は、それぞれＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値を有した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
【０２５０】
ドナー間の比較−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された臍由来細胞は、それぞれＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値に反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０２５１】
胎盤由来細胞に対する、ゼラチンによる表面コーティングの効果：フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンコーティングフラスコ又は非コーティングフラスコ上のいずれかで増殖させた胎盤由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これは、ＩｇＧ対照と比較して高い蛍光値に反映された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
【０２５２】
臍由来細胞に対する、ゼラチンによる表面コーティングの効果：フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンフラスコ及び非コーティングフラスコ上で増殖させた臍由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して陽性であり、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値を有した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０２５３】
細胞表面マーカープロファイルに対する、細胞の調製に使用される酵素消化手順の効果：フローサイトメトリーによって分析された、様々な消化酵素を使用して単離した胎盤由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって示されるように、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
【０２５４】
胎盤の層の比較：フローサイトメトリーによって分析された、それぞれ、胎盤の母体層、絨毛層、及び新生児層から単離した細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって示されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
【０２５５】
要約：フローサイトメトリーによる、胎盤由来細胞及び臍由来細胞の分析により、これらの細胞株の同一性が確立された。胎盤由来細胞及び臍由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性である。この同一性は、ドナー、継代数、培養容器の表面コーティング、消化酵素、及び胎盤の層を含む変数が変動しても、一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での、全ての陽性曲線は正常であり、発現した蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
【０２５６】
（実施例７）
分娩後組織表現型の免疫組織化学的な特性評価
ヒト分娩後組織、即ち臍帯及び胎盤内に見いだされる細胞の表現型を、免疫組織化学によって分析した。
【０２５７】
方法及び材料
組織の調製：ヒト臍帯組織及びヒト胎盤組織を採取して、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に、４℃で一晩、浸漬固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した：ビメンチン（１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））、デスミン（１：１５０、ウサギに対して産生（Ｓｉｇｍａ））、又は１：３００、マウスに対して産生（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００（Ｓｉｇｍａ））、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００（ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）））。更に、以下のマーカーを試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ）））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））、及び抗ヒトＮｏｇｏ−Ａ（１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））。固定標本を外科用メスを使用してトリミングし、エタノールを含有するドライアイス浴上の、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆ．）））内に定置した。次いで、凍結ブロックを、一般的クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
【０２５８】
免疫組織化学：免疫組織化学は、従来の研究（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら（２００３）、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６〜８２９）と同様に実行した。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃ  ｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、１時間曝した。目的のエピトープが細胞表面上に局在している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの減少を防ぐため、この手順の全ての工程でＴｒｉｔｏｎを省いた。更に、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、Ｎｏｇｏ−Ａ）に対して産生された場合には、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））及び／若しくはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、又はロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））と共にブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭ  ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間用い、細胞核を可視化した。
【０２５９】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０２６０】
結果
臍帯の特性評価：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内部に見出される細胞のサブセット内で発現した。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は、最内層（内腔側）に存在した。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見られた。ＳＭＡは、動脈及び静脈の、マトリックス及び外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。
【０２６１】
胎盤の特性評価：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４は全て、胎盤内部で観察され、かつ領域特異的であった。
【０２６２】
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、及びＮｏｇｏ−Ａの組織発現：これらのマーカーのいずれも、臍帯組織又は胎盤組織内部では観察されなかった。
【０２６３】
要約：ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、ヴォン・ヴィレブランド因子、及びＣＤ３４は、ヒト臍帯及びヒト胎盤内部の細胞内で発現する。
【０２６４】
（実施例８）
オリゴヌクレオチドアレイを使用する分娩後組織由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、分娩後に誘導された細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが同定された。
【０２６５】
方法及び材料
細胞の単離及び培養：ヒト臍帯及びヒト胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ））より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。これらの組織を受け取り、実施例６で説明されるように、細胞を単離した。細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ−ＬＧを使用）により、組織培養用ゼラチンコートプラスチックフラスコ上で培養した。この培養物を、５％のＣＯ2を使用して、３７℃でインキュベートした。
【０２６６】
ヒト皮膚線維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ；ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）より購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）中で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチック上で増殖させた。
【０２６７】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）より購入し、製造元の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。これらの細胞は、５％のＣＯ2を使用して、３７℃で、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。
【０２６８】
ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより提供された。この骨髄を、Ｈｏらによって概説される方法（国際公開第ＷＯ０３／０２５１４９号）に従って処理した。この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で混合した。この細胞懸濁液を、ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートし、５００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を廃棄して、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを添加した最少必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、細胞ペレットを再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を使用して、生存単核細胞を計数した。これらの単核細胞を、組織培養プラスチックフラスコ内に、５×１０4細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、標準大気Ｏ2又は５％  Ｏ2のいずれかで、５％  ＣＯ2を使用して、３７℃でインキュベートした。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非接着細胞を除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。
【０２６９】
ｍＲＮＡの単離、及びＧＥＮＥＣＨＩＰ分析：活発に増殖する細胞の培養物を、冷ＰＢＳ中で、セルスクレーパーを使用してフラスコから取り出した。これらの細胞を、３００×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去して、新鮮なＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを直ちに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させ、次いで、このｃＤＮＡをｃＲＮＡへと転写させ、ビオチンで標識した。このビオチン標識ｃＲＮＡを、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  Ｃａｌｉｆ．））とハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造元の仕様書に従って実行した。分析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピュータソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：５１１６〜５１２１）を使用して実施した。
【０２７０】
結果
１４の異なる細胞の集団を分析した。これらの細胞を、継代情報、培養基質、及び培養培地と共に、表８−１に列記する。
【０２７１】
【表５】
2017537702.tif 000006
【０２７２】
データは、これらの細胞で示差的に発現した２９０の遺伝子を分析する、主成分分析によって評価した。この分析により、集団間の類似性に関する、相対的な比較が可能となる。
【０２７３】
表８−２は、細胞対の比較のために計算された、ユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものである。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間の類似性に反比例する（即ち、距離が大きくなるほど、存在する類似性が少なくなる）。
【０２７４】
【表６】
2017537702.tif 000007
【０２７５】
表８−３、８−４、及び８−５は、胎盤由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表８−３）、臍由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表８−４）、並びに臍由来細胞及び胎盤由来細胞内で低減した遺伝子の発現（表８−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と題される縦列は、チップ上の特定の部位上に配置される、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに関する製造元の識別コードを指し、これらのプローブのセットは、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内の指定の受託番号（縦列「ＮＣＢＩ受託番号」）で見出され得る配列を含む、命名された遺伝子（縦列「遺伝子名」）とハイブリダイズする。
【０２７６】
【表７】
2017537702.tif 000008
【０２７７】
【表８】
2017537702.tif 000009
【０２７８】
【表９−１】
2017537702.tif 000010
【０２７９】
【表９−２】
2017537702.tif 000011
【０２８０】
表８−６、表８−７、及び表８−８は、ヒト線維芽細胞（表８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表８−７）、及びＭＳＣ（表８−８）内で増大した、遺伝子の発現を示す。
【０２８１】
【表１０】
2017537702.tif 000012
【０２８２】
【表１１】
2017537702.tif 000013
【０２８３】
【表１２】
2017537702.tif 000014
【０２８４】
要約：本検査は、臍帯及び胎盤由来の分娩後細胞の分子特性評価を提供するために実施された。この解析は、３つの異なる臍帯及び３つの異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この検査にはまた、皮膚線維芽細胞の２つの異なる株、間葉系幹細胞の３つの株、及び腸骨稜の骨髄細胞の３つの株も含めた。これらの細胞が発現したｍＲＮＡを、２２，０００の遺伝子プローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用して解析した。結果、これら５つの異なる細胞型において、２９０の遺伝子が示差的に発現することが示された。これらの遺伝子には、胎盤由来細胞内で特異的に増加した１０の遺伝子、及び臍帯由来細胞内で特異的に増加した７の遺伝子が含まれる。他の細胞型と比較して、胎盤及び臍帯内では、５４の遺伝子が、特異的に低い発現レベルを有することが判明した。選択された遺伝子の発現が、ＰＣＲによって確認されている（以下の実施例を参照）。これらの結果は、これらの分娩後由来細胞が、例えば、骨髄由来細胞及び線維芽細胞と比較して、明確に識別可能な遺伝子発現プロファイルを有することを実証している。
【０２８５】
（実施例９）
分娩後由来細胞中の細胞マーカー
前述の実施例では、ヒト胎盤由来細胞とヒト臍由来細胞との類似性及び相違を、それらの遺伝子発現プロファイルを、他の供給源由来の細胞の遺伝子発現プロファイルと比較することによって（オリゴヌクレオチドアレイを使用して）評価した。６つの「シグネチャー」遺伝子である、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８、レンニン、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、及び顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）が同定された。これらの「特徴的な」遺伝子は、分娩後由来細胞において比較的高レベルに発現していた。
【０２８６】
この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを検証して、遺伝子とタンパク質発現との間の一致／不一致を見出すと共に、胎盤由来細胞及び臍由来細胞に関する一意的識別子を検出するための、信頼性の高い一連のアッセイを確立するために実施された。
【０２８７】
方法及び材料
細胞：ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ内で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地中で増殖された胎盤由来細胞（３つの単離株、１つの単離株は核型分析によって主に新生児であると同定された）、臍由来細胞（４つの単離株）、及び正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児及び成人）。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、間葉系幹細胞増殖培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）））中で増殖させた。
【０２８８】
ＩＬ−８プロトコルに関しては、細胞を液体窒素から解凍して、ゼラチンコーティングフラスコ内に、５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングして、増殖培地中で４８時間増殖させ、続いて、更に８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））］中で増殖させた。この処理の後、ＲＮＡを抽出して、１５０×ｇで５分間、上清を遠心分離することにより、細胞残渣を除去した。続いて、ＥＬＩＳＡ分析のために、上清を−８０℃で冷凍した。
【０２８９】
ＥＬＩＳＡアッセイのための細胞培養：胎盤及び臍由来の分娩後細胞、並びにヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ内の増殖培地中で培養した。継代数１１で、液体窒素中で細胞を凍結させた。細胞を解凍して、１５ｍＬ遠心管に移した。１５０×ｇで５分間の遠心分離後、上清を廃棄した。４ｍＬの培養培地中に、細胞を再懸濁させ、計数した。１５ｍＬの増殖培地を収容する７５ｃｍ2フラスコ内で、３７５，０００細胞／フラスコで、細胞を２４時間生育させた。この培地を、８時間かけて血清飢餓培地に交換した。インキュベーション終了時に、血清飢餓培地を回収し、１４，０００×ｇで５分間、遠心分離した（続いて−２０℃で保存した）。
【０２９０】
各フラスコ内の細胞の数を概算するために、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を、各フラスコに添加した。フラスコから細胞を剥離した後、８ｍＬの増殖培地によりトリプシン活性を中和した。細胞を１５ｍＬ遠心管に移し、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、各管に１ｍＬの増殖培地を添加して、細胞を再懸濁した。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
【０２９１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞によって血清飢餓培地中へ分泌されたＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ）を使用して分析した。全てのアッセイは、製造元によって提供される使用説明書に従って試験した。
【０２９２】
合計ＲＮＡ単離：コンフルエントな分娩後由来細胞及び線維芽細胞から、あるいはＩＬ−８の発現のために上記のように処理した細胞から、ＲＮＡを抽出した。製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）））に従って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を含有する３５０μＬの緩衝液ＲＬＴを使用して、細胞を溶解した。製造者の指示に従って（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）））ＲＮＡを抽出して、ＤＮアーゼ処理（２．７Ｕ／サンプル）（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））に供した。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。
【０２９３】
逆転写：ヒト胎盤及びヒト臍からもＲＮＡを抽出した。２−メルカプトエタノールを添加した７００μＬの緩衝ＲＬＴ中に、組織（３０ｍｇ）を懸濁させた。サンプルを機械的に均質化し、製造元の仕様書に従って、ＲＮＡの抽出を進めた。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを抽出し、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーをＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））と共に使用し、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。サンプルを、−２０℃で保存した。
【０２９４】
ｃＤＮＡマイクロアレイによって分娩後細胞内で特異的に調節されていると同定された遺伝子（酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レンニン、及びレチクロンを含むシグネチャー遺伝子）を、リアルタイムＰＣＲ及び従来のＰＣＲを使用して、更に検討した。
【０２９５】
リアルタイムＰＣＲ：Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）遺伝子発現製品を使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レンニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチクロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）、及びＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））を備えた７０００配列検出システムを使用して、製造元の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））に従って、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造元の仕様書（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システムに関する、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）に従って分析した。
【０２９６】
従来のＰＣＲ：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ，ＵＳＡ））を使用して、従来のＰＣＲを実行することにより、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認した。ＰＣＲは、２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））、及び９４℃で５分間の初期変性を用いて実行した。各プライマーセットに関して、増幅を最適化させた。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、及びレチクロンの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レンニンの場合（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体及びＧＡＰＤＨの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを、表９−１に掲載する。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、１μＭとしたが、ただし、ＧＡＰＤＨに関しては、０．５μＭとした。ＧＡＰＤＨプライマーは、リアルタイムＰＣＲと同じものとしたが、ただし、製造元のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、最終ＰＣＲ反応に加えなかった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上に各試料を流し、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））で染色した。画像を、６６７  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋフィルム（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．））を用いる焦点距離ポラロイド（登録商標）カメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．））を用いて取り込んだ。
【０２９７】
【表１３】
2017537702.tif 000015
【０２９８】
免疫蛍光：ＰＰＤＣを室温にて１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を使用して固定した。継代数０（Ｐ０）（単離直後）及び継代数１１（Ｐ１１）の、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の単離株をそれぞれ１つづつ（胎盤由来細胞の単離株が２つ、臍由来細胞の単離株が２つ）と、線維芽細胞（Ｐ１１）と、を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて行った：ビメンチン（１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））、デスミン（１：１５０（Ｓｉｇｍａ）、ウサギに対して産生；又は１：３００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、マウスに対して産生）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００（Ｓｉｇｍａ））、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；（ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ））。更に、次のマーカーも１１代目の分娩後細胞に対して試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））、及び抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））。
【０２９９】
培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝した。目的のエピトープが、細胞表面（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）上に位置している場合には、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての工程で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を省略した。更には、一次抗体がヤギに対して産生された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、Ｎｏｇｏ−Ａ）、全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））及び／若しくはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、又はロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））と共にブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
【０３００】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。続いて、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ））を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０３０１】
ＦＡＣＳ分析のための細胞の調製：フラスコ内の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を用いて剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０  ７／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。１００μＬのアリコートを、円錐管に移した。細胞内抗原が染色された細胞に対して、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ））によって透過処理した。製造者の使用説明書に従い、アリコートに抗体を加え、これらの細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して過剰の抗体を除去した。二次抗体試験用の細胞を、１００μＬの３％  ＦＢＳ中に再懸濁させた。二次抗体を製造業者の使用説明書に従って添加し、細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、過剰な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））、ＧＲＯａ（５５５０４２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５及びＭ−５２８４（Ｓｉｇｍａ））、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して実行した。
【０３０２】
結果
ヒト胎盤、成体及び新生児線維芽細胞、並びに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の細胞からのｃＤＮＡに対して実行した、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、胎盤由来細胞内では、酸化ＬＤＬ受容体及びレンニンの両方が、他の細胞と比較してより高レベルで発現したことを示す。このリアルタイムＰＣＲから得られたデータを、ＡＡＣＴ法によって分析し、対数目盛上に表した。レチクロン及び酸化ＬＤＬ受容体の発現のレベルは、他の細胞と比較して、臍由来細胞内で高かった。分娩後由来細胞と、対照との間で、ＣＸＣリガンド３及びＧＣＰ−２の発現レベルに有意差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果を、従来のＰＣＲによって確認した。ＰＣＲ産物の配列決定により、これらの観察結果が更に立証された。分娩後由来細胞と、上記の表９−１で示す従来のＰＣＲのＣＸＣリガンド３プライマーを使用した対照と、の間には、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は存在しなかった。
【０３０３】
分娩後のサイトカイン、ＩＬ−８の産生は、増殖培地で培養した細胞、及び血清飢餓分娩後由来細胞の双方で増加した。リアルタイムＰＣＲの全データは、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって立証された。
【０３０４】
血清フリー培地中で増殖させた細胞の上清を、ＩＬ−８の存在に関して検査したところ、臍細胞由来の培地、及び一部の胎盤細胞の単離株由来の培地中で、最高量が検出された（表９−２）。ヒト皮膚線維芽細胞由来の培地からはＩＬ−８は検出されなかった。
【０３０５】
【表１４】
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ＮＤ：検出されず
【０３０６】
胎盤由来細胞はまた、ＦＡＣＳ分析によって、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、及びＧＲＯαの産生に関しても検査された。細胞の検査結果は、ＧＣＰ−２陽性を示した。酸化ＬＤＬ受容体及びＧＲＯは、この方法によっては検出されなかった。
【０３０７】
胎盤由来細胞はまた、免疫細胞化学分析によって、選択されたタンパク質の産生に関しても試験された。単離の直後（継代数０）に、ヒト胎盤由来細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、６つのタンパク質：ヴォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンに関する抗体に曝した。細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンは、継代数１１まで保持された。継代数０での少数の細胞（＜５％）のみが、サイトケラチン１８に関して陽性染色された。
【０３０８】
継代０でのヒト臍由来細胞を、選択されたタンパク質の産生に関して、免疫細胞化学分析によって調べた。単離の直後（継代数０）に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、６つのタンパク質、即ち、ヴォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンに関する抗体に曝した。臍由来細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンに関して陽性であり、この染色パターンは、継代数１１まで一貫していた。
【０３０９】
要約：マイクロアレイ及びＰＣＲ（リアルタイム及び従来の両方）によって測定される遺伝子発現レベル間の一致が、酸化ＬＤＬ受容体１、レンニン、レチクロン、及びＩＬ−８の４遺伝子に関して立証された。これらの遺伝子の発現は、ＰＰＤＣにおいてｍＲＮＡレベルで異なる調節をなされ、ＩＬ−８はまた、タンパク質レベルでも異なる調節をされていた。酸化ＬＤＬ受容体の存在は、胎盤由来細胞内では、ＦＡＣＳ分析によって、タンパク質レベルでは検出されなかった。ＧＣＰ−２と及びＣＸＣリガンド３の示差的発現は、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかったが、しかしながら、ＧＣＰ−２は、胎盤由来細胞内で、ＦＡＣＳ分析によって、タンパク質レベルで検出された。この結果は、マイクロアレイ実験から最初に得られたデータには反映されていないが、これは、それらの方法の感度の差異が原因であった可能性がある。
【０３１０】
単離の直後（継代数０）に、ヒト胎盤由来細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンはまた、継代数１１の細胞内でも観察された。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンの発現は、増殖培地中、これらの手順で用いられる条件下で継代する細胞内で保持され得る。継代数０でのヒト臍由来細胞を、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの発現に関して調べたところ、双方に関して陽性であった。この染色パターンは、継代数１１まで保持された。
【０３１１】
（実施例１０）
分娩後由来細胞のインビトロでの免疫学的評価
存在する場合には、インビボ移植時に分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）が誘導する免疫応答を予測する目的で、ＰＰＤＣ細胞をそれらの免疫学的特性に関してインビトロで評価した。ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の存在に関して、ＰＰＤＣを、フローサイトメトリーによってアッセイした。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰｅ）によって発現され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の直接刺激のために必要とされる（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）。これらの細胞株を、更に、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２００３）、上記参照）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２４，１８５〜１９６）、及びＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２００３）、上記参照、Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７０、１２５７〜１２６６）の発現に関しても、フローサイトメトリーによって分析した。胎盤組織内に存在する細胞による、これらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態を媒介すると考えられる。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株が、インビボで免疫反応を誘発する程度を予測するために、それらの細胞株を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験した。
【０３１２】
方法及び材料
細胞培養：細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン含有増殖培地中で、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））でコンフルエンスまで培養した。
【０３１３】
抗体染色：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））で細胞を洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｍｏ））を使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。製造業者の仕様書に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に抗体（表１０−１）を添加して、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳに細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）計器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【０３１４】
【表１５】
2017537702.tif 000017
【０３１５】
混合リンパ球反応：細胞株Ａとして標識される継代数１０の臍由来細胞、及び細胞株Ｂとして標識される継代数１１の胎盤由来細胞の凍結保存バイアルを、ドライアイス梱包してＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ（Ｑｕｅｂｅｃ））に送付し、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いて混合リンパ球反応を実施した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、複数の男性及び女性のボランティアドナーから収集した。刺激者（ドナー）同種異系ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、及び分娩後細胞株を、マイトマイシンＣで処理した。自家のものであり、マイトマイシンＣ処理した刺激細胞を、応答者（レシピエント）ＰＢＭＣに添加して、４日間培養した。インキュベーション後、各サンプルに［3Ｈ］チミジンを添加して、１８時間培養した。これらの細胞を採取した後に、放射標識ＤＮＡを抽出し、シンチレーション計数器を使用して、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。
【０３１６】
同種異系ドナーに関する刺激指数（ＳＩＡＤ）は、受容者＋マイトマイシンＣ処理同種異系ドナーの平均増殖を、受容者のベースライン増殖によって除算したものとして、計算した。ＰＰＤＣの刺激指数は、受容者＋マイトマイシンＣ処理分娩後細胞株の平均増殖を、受容者のベースライン増殖によって除算したものとして算出した。
【０３１７】
結果
混合リンパ球反応−胎盤由来細胞：７人のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングして、他の６人の血液ドナーとの混合リンパ球反応で旺盛な増殖反応を呈する、１人の同種異系ドナーを同定した。このドナーを、同種異系陽性対照ドナーとして選択した。残りの６人の血液ドナーを、レシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナー及び胎盤由来細胞株を、マイトマイシンＣで処理し、６人の個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応下で培養した。反応は、プレート当り３人の受容者を入れた細胞培養プレートを２つ使用して、３回実施した（表１０−２）。平均刺激指数は、１．３（プレート２）〜３（プレート１）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は、４６．２５（プレート２）〜２７９（プレート１）の範囲であった（表１０−３）。
【０３１８】
【表１６】
2017537702.tif 000018
【０３１９】
【表１７】
2017537702.tif 000019
【０３２０】
【表１８】
2017537702.tif 000020
【０３２１】
混合リンパ球反応−臍由来細胞：６人のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングして、他の５人の血液ドナーとの混合リンパ球反応で旺盛な増殖反応を呈する、１人の同種異系ドナーを同定した。このドナーを、同種異系陽性対照ドナーとして選択した。残りの５人の血液ドナーを、レシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナー及び胎盤細胞株を、マイトマイシンＣ処理して、５人の個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応下で培養した。反応は、プレート当り３人の受容者を入れた細胞培養プレートを２つ使用して、３回実施した（表１０−４）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１０−５）。
【０３２２】
【表１９】
2017537702.tif 000021
【０３２３】
【表２０】
2017537702.tif 000022
【０３２４】
【表２１】
2017537702.tif 000023
【０３２５】
抗原提示細胞マーカー−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、これは、胎盤細胞株が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
【０３２６】
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値により示されるＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＣＤ１７８及びＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
【０３２７】
抗原提示細胞マーカー−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、これは、臍細胞株が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
【０３２８】
免疫調節細胞マーカー−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって認められるＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、また、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＣＤ１７８及びＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
【０３２９】
要約：胎盤由来細胞系統で行った混合リンパ球反応では、平均刺激指数は１．３〜３の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。臍由来細胞株を使用して実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は、４２．７５〜７０の範囲であった。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定されたように、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の発現に関しては陰性であった。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定されたように、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−Ｇ及びＣＤ１７８の発現に関しては陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現に関しては陽性であった。同種異系ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含むことにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激が可能となる。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる、胎盤由来細胞及び臍由来細胞上の抗原提示細胞表面分子の不在、並びに免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在は、ＭＬＲにおいてこれらの細胞が示す、同種異系対照と比較してより低い刺激指数の原因となり得る。
【０３３０】
（実施例１１）
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤由来細胞及び臍由来細胞由来の選択された栄養因子の分泌を測定した。検出のために選択された因子としては、（１）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）などの脈管形成活性を有することが知られている因子、（２）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）などの神経栄養／神経保護活性を有することが知られている因子、及び（３）マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化時調節正常Ｔ細胞発現及び分泌物）、Ｉ３０９、胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲｅ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）などのケモカイン活性を有することが知られている因子、が含まれた。
【０３３１】
方法及び材料
細胞培養：胎盤及び臍由来のＰＰＤＣ、並びにヒト新生児包皮由来線維芽細胞を、ゼラチンコーティングＴ７５フラスコ上の、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地で培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に増殖培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠沈管に移して、１５０×ｇで５分間、それらの細胞を遠心分離した。上清を廃棄した。４ｍＬの増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。１５ミリリットルの増殖培地を収容する、７５ｃｍ2のフラスコあたり３７５，０００細胞で細胞を播種し、２４時間培養した。この培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に替え、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１４，０００×ｇで５分間の遠心分離によって、無血清馴化培地を収集し、−２０℃で保存した。
【０３３２】
各フラスコ内の細胞の数を概算するために、ＰＢＳで細胞を洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。８ｍＬの増殖培地を添加し、トリプシン活性を抑制した。１５０×ｇで５分間、細胞を遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
【０３３３】
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞を３７℃、５％二酸化炭素及び大気酸素下で増殖させた。胎盤由来細胞（バッチ１０１５０３）は、５％酸素又はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）下でも増殖させた。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量をＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ））により測定した。全てのアッセイは、製造元の使用説明書に従って実行した。
【０３３４】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ：ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、及び血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦを、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）プロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて測定した。このプロテオームアレイは、１ウェル当り２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェルに、２×２、３×３、又は４×４パターンの４〜１６の異なる捕捉抗体をスポットすることにより作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポット内で生成されるシグナルの量は、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。
【０３３５】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＭＣＰ−１及びＩＬ−６は、胎盤由来細胞及び臍由来細胞、並びに皮膚線維芽細胞により分泌された（表１１−１）。ＳＤＦ−１αは、５％Ｏ２中で培養された胎盤由来細胞、及び線維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２及びＩＬ−８は、臍由来細胞により、及びＢＭＥ又は５％Ｏ2の存在下で培養された胎盤由来細胞により分泌された。ＧＣＰ−２はまた、ヒト線維芽細胞によっても分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡアッセイでは検出されなかった。
【０３３６】
【表２２】
2017537702.tif 000024
略語：ＮＤ：検出なし、＝／−ｓｅｍ
【０３３７】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ：ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、臍由来細胞から分泌された（表１１−２及び表１１−３）。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、及びＩＬ−８は、胎盤由来細胞から分泌された（表１１−２及び表１１−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、又はＰＤＧＦ−ｂｂは、検出されなかった。
【０３３８】
【表２３】
2017537702.tif 000025
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｐ１（胎盤由来細胞（０４２３０３））、Ｕ１（臍由来細胞（０２２８０３））、Ｐ３（胎盤由来細胞（０７１００３））、Ｕ３（臍由来細胞（０７１００３））。ＮＤ：検出されず。
【０３３９】
【表２４】
2017537702.tif 000026
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｐ１（胎盤由来ＰＰＤＣ（０４２３０３））、Ｕ１（臍由来ＰＰＤＣ（０２２８０３））、Ｐ３（胎盤由来ＰＰＤＣ（０７１００３））、Ｕ３（臍由来ＰＰＤＣ（０７１００３））。ＮＤ：検出されず。
【０３４０】
（実施例１２）
分娩後由来細胞の短期的神経分化
胎盤由来細胞及び臍由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと呼ぶ）の神経系統細胞に分化する能力を調べた。
【０３４１】
方法及び材料
分娩後細胞の単離及び増殖：実施例４に記載されるように、胎盤組織及び臍組織からＰＰＤＣを単離して増殖させた。
【０３４２】
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ａ）：このアッセイは、元は骨髄ストロマ細胞（１）の神経誘導能を試験するために実施されたアッセイから採用したものであった。臍由来細胞（０２２８０３）Ｐ４、及び胎盤由来細胞（０４２２０３）Ｐ３を解凍して、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中に、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドガラス（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｃｏｎｎ））の１ウェル当り、６，０００細胞で播種した。対照として、間葉系幹細胞（Ｐ３；１Ｆ２１５５（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）））、骨芽細胞（Ｐ５；ＣＣ２５３８（Ｃａｍｂｒｅｘ））、脂肪由来細胞（Ａｒｔｅｃｅｌ、米国特許第６，５５５，３７４（Ｂ１）号）（Ｐ６、ドナー２）、及び新生児ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９（Ｃａｍｂｒｅｘ））も同条件下で播種した。
【０３４３】
全ての細胞を、最初に、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））、上皮成長因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）で４日間増殖させた。４日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ですすぎ、続いて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で２４時間培養した。２４時間後に、細胞をＰＢＳですすいだ。続いて、２００ｍＭのブチル化ヒドロキシアニソール、１０μＭの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０μＭのフォルスコリン、４μＭのバルプロ酸、及び２μＭのヒドロコルチゾン（全ての化学薬品はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）より入手）を含有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）からなる誘導培地中で、１〜６時間、細胞を培養した。次いで、１００％氷冷メタノール中で、細胞を固定し、免疫細胞化学を実行して（下記の方法を参照）、ヒトネスチンタンパク質の発現を査定した。
【０３４４】
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ｂ）：ＰＰＤＣ（臍（０２２８０３）Ｐ１１；胎盤（０４２２０３）Ｐ１１）、及び成体ヒト皮膚線維芽細胞（１Ｆ１８５３，Ｐ１１）を解凍し、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、（Ａ）と同様の密度で、ただし、（１）２４ウェル組織培養処理プレート（ＴＣＰ、Ｆａｌｃｏｎブランド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））、（２）ＴＣＰウェル＋室温で１時間吸着させた２％（ｗ／ｖ）ゼラチン、又は（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ミリリットルの吸着マウスラミニン（３７℃で最低２時間吸着（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上に播種した。
【０３４５】
厳密に（Ａ）と同様に、細胞を最初に増殖させ、培地を前述の時間枠で切り替えた。前述のように、培養物の１セットを、５日と６時間の時点で、この場合は、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、室温で１０分間固定した。培養物の第２のセットでは、培地を除去して、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる、神経前駆細胞増殖培地（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培地に、レチノイン酸（ＲＡ；１μＭ（Ｓｉｇｍａ））を更に添加した。４日後に、この培地を除去して、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養物を、室温で１０分間にわたって固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、及びＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した（表１２−１を参照）。
【０３４６】
【表２５】
2017537702.tif 000027
【０３４７】
二段階分化プロトコル：ＰＰＤＣ（臍（０４２２０３）Ｐ１１、胎盤（０２２８０３）Ｐ１１）、成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１；１Ｆ１８５３（Ｃａｍｂｒｅｘ））を解凍し、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞／ｃｍ2で、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））及びＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を添加したＮＰＥ培地の存在下で、ラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）でコーティングした２４ウェルプレートに播種した［全培地組成物はＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅとも呼ばれる］。同時に、海馬から単離された成体ラット神経前駆細胞（Ｐ４；（０６２６０３）もまた、２４ウェリアミニンコーティングプレート（24 welliaminin-coated plates）のＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地にプレーティングした。全ての培養物を、こうした条件下で６日間維持し（その期間中、細胞に１回栄養補給した）、その時点で、更に７日間にわたって、表１２−２に列記される分化条件に培地を切り替えた。培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、ヒト又はラットネスチン、ＧＦＡＰ、及びＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した。
【０３４８】
【表２６】
2017537702.tif 000028
【０３４９】
複数の増殖因子プロトコル：臍由来細胞（Ｐ１１；（０４２２０３））を解凍して、サブコンフルエンス（７５％）に到達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、２４ウェリアミニンコーティングプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、２，０００細胞／ｃｍ2で播種した。更に、いくつかのウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％  ＦＢＳ、又は１０％  ＦＢＳを含んだ。「予備分化」条件の４日後に、全ての培地を除去して、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ；２００ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））、ＦＧＦ８（１００ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、ＢＤＮＦ（４０ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））、ＧＤＮＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））、及びレチノイン酸（１μＭ（Ｓｉｇｍａ））を添加したＮＰＥ培地に、サンプルを切り替えた。培地交換から７日後に、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養物を、室温で１０分間固定し、ヒトネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１，デスミン、及びα−平滑筋アクチンの発現に関して染色した。
【０３５０】
神経前駆細胞共培養プロトコル：成体ラット海馬前駆細胞（０６２６０３）を、ラミニンコーティング２４ウェルディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）中に、ニューロスフェア又は単一細胞としてプレーティング（１０，０００細胞／ウェル）した。
【０３５１】
別に、臍由来細胞（０４２２０３）Ｐ１１、及び胎盤由来細胞（０２２８０３）Ｐ１１を解凍して、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）中に、５，０００細胞／ｃｍ2で、４８時間にわたって培養増殖させた。次いで、細胞をトリプシン処理して、既存の神経前駆細胞の培養物上に、２，５００細胞／ウェルで播種した。その時点で、既存の培地を、新鮮培地に交換した。４日後、培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、ＰＰＤＣを同定するため、ヒト核タンパク質（ｈＮｕｃ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））に関して染色した（前記の表１２−１）。
【０３５２】
免疫細胞化学：免疫細胞化学法を、表１２−１に列挙した抗体を用いて行った。培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））と共にブロッキング溶液を含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
【０３５３】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。続いて、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ））を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０３５４】
結果
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ａ）：この神経誘導組成物中でのインキュベーションでは、全ての細胞型が、双極性形態及び伸長した突起を有する細胞へと形質転換した。他の、より大きい非双極性形態もまた、観察された。更には、これらの誘導細胞集団は、複能性の神経幹細胞及び前駆細胞のマーカーである、ネスチンに関して、陽性染色された。
【０３５５】
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ｂ）：組織培養プラスチック（ＴＣＰ）ディッシュ上で繰り返しても、培養表面に予めラミニンを吸着させない限り、ネスチンの発現は観察されなかった。ネスチン発現細胞が続いて成熟ニューロンの生成へ進むことができるか否かを更に評価するため、ＰＰＤＣ及び線維芽細胞を、神経幹細胞及び前駆細胞からこうした細胞への分化を誘導することが知られている培地組成であるＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝露した（２、３、４）。未熟ニューロン及び成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、並びにネスチンに関して、細胞を染色した。ＴｕＪ１が検出された条件はなく、ニューロン形態を有する細胞も観察されなかった。更に、免疫細胞化学により判定されたように、ネスチン及びＧＦＡＰは、ＰＰＤＣによってこれ以上発現されなかった。
【０３５６】
２段階分化：臍及び胎盤ＰＰＤＣ単離株（並びにそれぞれ陰性対照細胞型及び陽性対照細胞型としてのヒト線維芽細胞及びげっ歯類神経前駆細胞）をラミニン（神経促進）コーティングディッシュにプレーティングし、神経前駆細胞からニューロン及び星状細胞への分化を促進することが知られている１３の異なる増殖条件（及び２つの対照条件）に曝露した。更に、ＰＰＤＣ分化に対する、ＧＤＦ５及びＢＭＰ７の影響を検査するために、２つの条件を追加した。全般的には、２段階分化アプローチを採択して、細胞を、最初に６日間、神経前駆細胞増殖条件に置き、その後に７日間、完全分化条件に置いた。形態学的には、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、この手順の時間経過の全体を通して、細胞形態の根本的変化を呈した。しかしながら、対照の神経前駆細胞プレーティング条件を除き、神経細胞又は星状細胞は観察されなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、及びＧＦＡＰに関して陰性の、免疫細胞化学により、これらの形態学的観察結果が確認された。
【０３５７】
複数の増殖因子：様々な神経分化剤に１週間曝露した後、神経前駆細胞（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪ１）、及び星状細胞（ＧＦＡＰ）の指標となるマーカーに関して、細胞を染色した。第一段階で非血清含有培地中に増殖させた細胞は、血清含有（２％又は１０％）培地中の細胞とは異なる、潜在的な神経分化を示す形態を有していた。具体的には、臍由来細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、及びレチノイン酸に曝す２段階手順の後に、細胞は、培養星状細胞の形態と同様の、長く伸長した突起を示した。第１段階の分化で、２％ＦＢＳ又は１０％ＦＢＳを含んでいた場合、細胞数が増大し、細胞形態は、高密度の対照培養から変化しなかった。潜在的な神経分化は、ヒトネスチン、ＴｕＪ１、又はＧＦＡＰに関する免疫細胞化学分析によっては、証明されなかった。
【０３５８】
神経前駆細胞とＰＰＤＣの共培養：２日前に、神経伸長条件（neural expansion conditions）（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に播種したラット神経前駆細胞培養物上にＰＰＤＣをプレーティングした。プレーティングしたＰＰＤＣの視覚的検査によって、これらの細胞が単一細胞としてプレーティングされたことが明らかとなったが、プレーティング４日後（全体で６日目）のヒト特異的核染色（ｈＮｕｃ）によって、これらは球状に固まり、神経前駆細胞との接触を回避する傾向があることを示した。更に、ＰＰＤＣが付着する場合に、これらの細胞は散開し、ラット起源のものであった分化ニューロンによって神経支配されたように思われたが、これは、ＰＰＤＣが、筋細胞へと分化した可能性があることを示唆する。この観察結果は、位相差顕微鏡下での形態に基づくものであった。もう一つの観察結果は、典型的に大型の細胞体（神経前駆細胞よりも大きい）は、複数の方向に広がる薄い突起を有する、神経前駆細胞に類似する形態を有していたことである。ｈＮｕｃ染色（細胞核の２分の１で見出される）は、これらのヒト細胞が、一部の場合には、ラットの前駆細胞と融合して、それらの表現型を呈し得ることを示した。神経前駆細胞のみを収容する対照ウェルは、臍又は胎盤ＰＰＤＣを収容する共培養ウェルよりも、前駆細胞及び明白な分化細胞の総数が少なかったが、これは、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、ケモカイン及びサイトカインの放出によって、又は接触が媒介する効果によってのいずれかで、神経前駆細胞の分化及び挙動に影響を及ぼしたことを更に示す。
【０３５９】
要約：ＰＰＤＣが神経系統細胞へ分化する短期的能力を判定するため、複数のプロトコルを実施した。これらのプロトコルには、それぞれ、複能性の神経幹細胞及び前駆細胞、未熟ニューロン及び成熟ニューロン、並びに星状細胞に関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、及びＧＦＡＰに関する、免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相コントラスト画像法を含めた。
【０３６０】
（実施例１３）
分娩後由来細胞の長期的神経分化
臍由来及び胎盤由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと呼ぶ）の、神経系統細胞へと長期的に分化を受ける能力を評価した。
【０３６１】
方法及び材料
ＰＰＤＣの単離及び増殖：上述した実施例に記載される通りに、ＰＰＤＣを単離して増殖させた。
【０３６２】
ＰＰＤＣ細胞の解凍及びプレーティング：予め増殖培地中で増殖させたＰＰＤＣの冷凍アリコート（臍（０２２８０３）Ｐ１１；（０４２２０３）Ｐ１１；（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（１０１５０３）Ｐ７）を解凍して、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（１０ミリリットル）（この組み合わせは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中の、ラミニン（ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））でコーティングしたＴ−７５フラスコ内に、５，０００細胞／ｃｍ２でプレーティングした。ＮＰＥ培地に、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））、及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと称する）を更に添加した。
【０３６３】
対照細胞のプレーティング：更に、成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）））、及び間葉系幹細胞（Ｐ５（Ｃａｍｂｒｅｘ））を解凍して、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中の、ラミニンコーティングＴ−７５フラスコ上に、同じ細胞播種密度でプレーティングした。更なる対照として、線維芽細胞、臍及び胎盤ＰＰＤＣを、増殖培地中で、全ての培養物に関して指定された期間にわたって増殖させた。
【０３６４】
細胞の増殖：全ての培養物からの培地は、１週間に１回、新鮮培地に置き換えて、細胞の増殖を観察した。一般的には、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中での増殖の限界のため、各培養物は、１か月の期間で１回継代した。
【０３６５】
免疫細胞化学：１か月の期間の後に、全てのフラスコを、室温で１０分間、冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定した。免疫細胞化学法は、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン；１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））、及びＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質；１：２０００（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．））に対する抗体を用いて行った。要約すると、培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））と共にブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
【０３６６】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０３６７】
【表２７】
2017537702.tif 000029
【０３６８】
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣの増殖を遅くし、形態を変化させる。プレーティングの直後に、ＰＰＤＣのサブセットが、ラミニンでコーティングした培養フラスコに付着した。このことは、凍結／解凍プロセスの機能としての細胞死によるものか、又は新たな増殖条件が原因であった可能性がある。付着した細胞は、増殖培地中で観察されるものとは異なる形態を取っていた。
【０３６９】
臍由来細胞のクローンはニューロンタンパク質を発現する：解凍／プレーティングの１か月後に、培養物を固定し、ニューロンタンパク質ＴｕＪ１、及び星状細胞内に見出される中間径フィラメントであるＧＦＡＰに関して、染色した。増殖培地中で増殖させた全ての対照培養物、並びにＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で増殖させたヒト線維芽細胞及びＭＳＣは、ＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが判明したが、臍由来細胞及び胎盤ＰＰＤＣでは、ＴｕＪ１が検出された。神経様形態を有する細胞、及び有さない細胞内で、発現が観察された。いずれの培養物内にも、ＧＦＡＰの発現は観察されなかった。神経様形態を有する、ＴｕＪ１を発現する細胞の百分率は、全集団の１％以下であった（試験した臍由来細胞単離株ｎ＝３）。定量化されていないが、神経形態を有さないＴｕＪ１＋細胞の百分率は、胎盤由来細胞培養物よりも、臍由来細胞培養物内で高かった。これらの結果は、増殖培地中の同齢の対照がＴｕＪ１を発現しなかったため、特異的であると考えられた。
【０３７０】
要約：臍由来細胞から、分化ニューロンを生成するための方法（ＴｕＪ１の発現及び神経形態学に基づく）が開発された。ＴｕＪ１に関する発現は、インビトロでは、１か月よりも早い時点では検査しなかったが、臍由来細胞の少なくとも小集団は、既定の分化を通じてか、あるいはＬ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、及びＥＧＦを添加した最少培地に１か月曝露した後の長期誘導を通じてかのいずれかで、ニューロンを生じさせ得ることは明らかである。
【０３７１】
（実施例１４）
神経前駆細胞支援のためのＰＰＤＣ栄養因子
非接触依存性（栄養性）機構による、成体神経幹細胞及び前駆細胞の生存及び分化に対する臍由来細胞及び胎盤由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと称する）の影響を調べた。
【０３７２】
方法及び材料
成体神経幹細胞及び前駆細胞の単離：Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４成体ラットをＣＯ2窒息とその後の頸脱臼により犠牲にした。骨鉗子を使用して、脳全体を無傷な状態で摘出し、脳の運動領域及び体性感覚領域の後方の冠状切開に基づいて、海馬組織を解剖した（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．＆  Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．（１９９７）「Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」）。Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））（この組み合わせは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される）中で、組織を洗浄した。ＮＰＥ培地に、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．））、及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．））を更に添加し、これを本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ。
【０３７３】
洗浄の後に、上を覆う髄膜を除去して、外科用メスで組織を細断した。細断した組織を収集し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、総容積の７５％として添加した。更に、ＤＮアーゼ（１００マイクロリットル／総容積８ミリリットル（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））を添加した。次に、この組織／培地を、１８ゲージのニードル、２０ゲージのニードル、及び最終的に２５ゲージのニードルに各１回、連続的に通過させた（全てのニードルは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）より）。この混合物を２５０ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを添加して、ペレットを再懸濁させた。得られた細胞懸濁液を、４０マイクロメートル細胞濾過器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通し、ラミニンコーティングＴ−７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又は低クラスター２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上にプレーティングし、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で、概説される研究のために十分な細胞数が得られるまで増殖させた。
【０３７４】
ＰＰＤＣプレーティング：予め増殖培地中で増殖させた分娩後由来細胞（臍（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（０４２２０３）Ｐ１２）を、５，０００細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレート用のサイズ）でプレーティングし、インサート内の増殖培地中で、１週間にわたって増殖させ、コンフルエンスに到達させた。
【０３７５】
成体神経前駆細胞のプレーティング：ニューロスフェアとして、又は単細胞として増殖させた神経前駆細胞を、細胞接着を促進するために、１日間、ラミニンコート２４ウェルプレート上のＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、およそ密度２，０００細胞／ウェルで播種した。１日後、分娩後細胞を含むトランスウェルインサートを次のスキームに従って加えた。
ａ．トランスウェル（増殖培地中の臍由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｂ．トランスウェル（増殖培地中の胎盤由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｃ．トランスウェル（成体ヒト皮膚線維芽細胞［増殖培地２００μＬ中の１Ｆ１８５３（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）］Ｐ１２）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｄ．対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｅ．対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥ単独、１ミリリットル）
【０３７６】
免疫細胞化学：共培養７日後、全ての条件を、室温で１０分間にわたって、４％（ｗ／ｖ）冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定した。表１４−１に列記されるエピトープに対する抗体を使用して、免疫細胞化学を実行した。要約すると、培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））と共にブロッキング溶液を含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
【０３７７】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０３７８】
【表２８】
2017537702.tif 000030
【０３７９】
神経前駆細胞分化の定量分析：海馬神経前駆細胞分化の定量化を検討した。各条件当り、最低１０００細胞を計数し、少ない場合には、その条件内で観察された細胞の総数とした。所定の染色に関して陽性の細胞の百分率を、ＤＡＰＩ（核）染色によって判定されるように、陽性細胞の数を細胞の総数で除算することによって、評価した。
【０３８０】
質量分析及び２Ｄゲル電気泳動：共培養の結果としての固有の分泌因子を同定するため、培養物の固定の前に採取した馴化培地サンプルを、−８０℃で一晩凍結させた。次いで、限外濾過スピン装置（分画分子量３０ｋＤ）に、サンプルを適用した。リテンテートをイムノアフィニティークロマトグラフィー（抗Ｈｕ−アルブミン；ＩｇＹ）に適用した（イムノアフィニティーはこれらのサンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液を、ＭＡＬＤＩによって分析した。この透過物を、Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅアフィニティークロマトグラフィーに適用した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び２Ｄゲル電気泳動によって分析した。
【０３８１】
結果
ＰＰＤＣ共培養は成体神経前駆細胞分化を刺激する：臍由来細胞又は胎盤由来細胞と共に培養した後、成体ラット海馬由来の共培養神経前駆細胞は、中枢神経系の主要な３つの系統全てに有意な分化を示した。この効果は、共培養５日後に、明確に観察され、数多くの細胞が、複雑な突起を作り出し、分裂中の前駆細胞に固有の、相の明るい特徴を喪失していた。反対に、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの非存在下で、単独で増殖させた神経前駆細胞は、健常性が見られず、生存に限界があった。
【０３８２】
この手順の完了後、未分化幹細胞及び前駆細胞（ネスチン）、未熟ニューロン及び成熟ニューロン（ＴｕＪ１）、星状細胞（ＧＦＡＰ）、並びに成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の指標となるマーカーに関して、培養物を染色した。３つの全ての系統に沿った分化が確認されたが、対照条件は、大多数の細胞中でのネスチン陽性染色の保持によって証明されるように、有意な分化を呈さなかった。臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、細胞の分化を誘導したが、３つ全ての系統に関する分化の度合いは、臍由来細胞との共培養の場合よりも、胎盤由来細胞との共培養の場合のほうが少なかった。
【０３８３】
臍由来細胞との共培養の後に、分化した神経前駆細胞の百分率を定量化した（表１４−２）。臍由来細胞は、成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の数を、有意に増加させた（両方の対照条件での２４．０％対０％）。更に、共培養は、培養中にＧＦＡＰ＋星状細胞、及びＴｕＪ１＋ニューロンの数を増加させた（それぞれ、４７．２％、及び８．７％）。これらの結果は、共培養後に前駆細胞状態が喪失したことを示す、ネスチン染色（対照条件４で１３．４％対７１．４％）によって確認された。
【０３８４】
分化はまた、成体ヒト線維芽細胞によっても影響を受けるものと考えられたが、そのような細胞は、成熟乏突起神経膠細胞の分化を促進することは不可能であり、感知し得る量のニューロンを生成することも不可能であった。しかしながら、定量化されなかったものの、線維芽細胞は、神経前駆細胞の生存を増進させるものと思われた。
【０３８５】
【表２９】
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【０３８６】
固有な化合物の同定：臍由来共培養物及び胎盤由来共培養物由来の馴化培地を、適切な対照（ＮＰＥ培地±１．７％血清、線維芽細胞との共培養由来の培地）と併せて、差異に関し検査した。潜在的に固有な化合物を同定して、それらの対応する２Ｄゲルから切除した。
【０３８７】
要約：臍又は胎盤ＰＰＤＣとの、成体神経前駆細胞の共培養は、それらの細胞の分化を生じさせる。この実施例で提示される結果により、臍由来細胞との共培養後の成体神経前駆細胞の分化が、特に顕著であることが示される。具体的には、有意な百分率の成熟乏突起神経膠細胞が、臍由来細胞の共培養物内に生成された。
【０３８８】
（実施例１５）
分娩後由来細胞の移植
分娩後の臍及び胎盤由来細胞は、再生療法に有用である。ＳＣＩＤマウスに生分解性材料と共に移植された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）によって産生された組織を評価した。評価する材料は、バイクリル不織布、３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、及びＲＡＤ１６自己集合性ペプチドヒドロゲルとした。
【０３８９】
方法及び材料
細胞培養：胎盤由来細胞及び臍由来細胞を、ゼラチンコーティングフラスコ中の増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．））、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中で増殖させた。
【０３９０】
サンプルの調製。１００万個の生細胞を、１５マイクロリットルの増殖培地中、直径５ｍｍ、厚さ２．２５ｍｍのバイクリル不織布スカフォールド（６４．３３ミリグラム／ｃｃ；ロット番号３５４７−４７−１）又は直径５ｍｍの３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体（ロット番号３４１５−５３）上に播種した。２時間にわたって細胞を付着させた後、更なる増殖培地を追加して、これらのスカフォールドを覆った。スカフォールド上で一晩、細胞を増殖させた。細胞を有さないスカフォールドもまた、培地中でインキュベートした。
【０３９１】
ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を水中１％（ｗ／ｖ）の無菌溶液として得、これを使用直前にダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１×１０6個の細胞と１：１で混合した。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中の細胞の最終濃度は、１×１０6細胞／１００マイクロリットルとした。
【０３９２】
試験材料（Ｎ＝４／Ｒｘ）
ａ．バイクリル不織布＋１×１０6個の臍由来細胞
ｂ．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０6個の臍由来細胞
ｃ．ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチド＋１×１０6個の臍由来細胞
ｄ．バイクリル不織布＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｅ．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｆ．ＲＡＤ  １６自己集合性ペプチド＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｇ．３５／６５  ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
ｈ．バイクリル不織布
【０３９３】
動物の準備：動物福祉法の現行の要件に従って、動物を取扱い及び維持した。上記公法との準拠性は、動物福祉規則（９ＣＦＲ）を遵守し、「ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（第７版）」で公布された現行標準に従うことによって達成した。
【０３９４】
マウス（Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ／雄（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．））、５週齢：ＳＣＩＤマウスの取扱いは全てフード内で行った。マウスを個々に秤量して、６０ミリグラム／ｋｇのＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン（Ａｖｅｃｏ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，Ｉｏｗａ）））及び１０ミリグラム／ｋｇのＲＯＭＰＵＮ（キシラジン（Ｍｏｂａｙ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｈａｗｎｅｅ，Ｋａｎｓ）））と生理食塩水との混合物の腹腔内注射を使用して麻酔した。麻酔導入の後、動物用電気バリカンを使用して、背側頸部区域から背側腰仙区域までの、動物の背部全体の毛を刈り取った。次いで、その区域を、二酢酸クロルヘキシジンを使用して擦り洗いし、アルコールですすぎ、乾燥させ、有効ヨウ素１％のヨードフォア水溶液を塗布した。眼用軟膏を眼に塗布して、麻酔期間中の組織の乾燥を防止した。
【０３９５】
皮下移植技術：マウスの背に、各約１．０ｃｍ長の４つの皮膚切開部を作った。２つの頭蓋部位を、背外側胸部領域の上に、触診した肩胛骨の下縁の５ｍｍ尾側で、一方は脊柱の左に、もう一方は右に、横方向で配置した。別の２つは、尾の仙腰レベルの臀筋区域の上に、触診した腸骨稜の約５ｍｍ尾側で、正中線の各側上に１つずつ、横方向で配置した。実験計画に従って、これらの部位内に、移植片を無作為に定置した。下層の結合組織から皮膚を分離して、小さいポケットを作製し、その切開部の約１ｃｍ尾側に、移植片を定置した（あるいはＲＡＤ１６の場合は、注射した）。適切な試験材料を、皮下空間内に移植した。皮膚の切開部は、金属クリップで閉鎖した。
【０３９６】
動物の飼育：マウスは実験過程の全体を通して個々に小型隔離ケージで、温度範囲１８℃〜２６℃（６４°Ｆ〜７９°Ｆ）、相対湿度３０％〜７０％で飼育し、約１２時間明期／１２時間暗期の周期に維持した。温度及び相対湿度は、可能な限り、記載の範囲内に維持した。食餌は、Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｐｉｃｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ  ５０５８（Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｏ．）からなるものとし、水は自由に摂取させた。
【０３９７】
指定の時間間隔で、二酸化炭素吸入によってマウスを安楽死させた。皮下移植部位を、それらの部位を覆う皮膚と共に切除して、組織学のために凍結した。
【０３９８】
組織学：移植片と共に切り取った皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈ））で固定した。サンプルを、上を覆う隣接組織と共に、中央で２等分して、パラフィン処理を施し、慣用の方法を使用して割面上に埋め込んだ。ミクロトームによって５マイクロメートルの組織切片を得て、常法を用いて、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ，Ｎ．Ｙ））で染色した。
【０３９９】
結果
３０日後の、ＳＣＩＤマウス内に皮下移植された発泡体（細胞を有さず）内への組織の内植は、最小限のものであった。対照的に、臍由来細胞又は胎盤由来細胞と共に移植された発泡体内には、広範囲の組織充填が存在した。バイクリル不織布スカフォールド内には、ある程度の組織の内植が観察された。臍由来細胞又は胎盤由来細胞が播種された不織布スカフォールドは、マトリックス沈着及び成熟血管の増大を示した。
【０４００】
要約：合成吸収性不織／発泡体ディスク（直径５．０ｍｍ×厚さ１．０ｍｍ）又は自己集合性ペプチドヒドロゲルにヒト臍又は胎盤のいずれかに由来する細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背棘領域の両側に皮下移植した。それらの結果は、分娩後由来細胞が、生分解性スカフォールド内の良質の組織形成を、劇的に増大させることが可能である点を実証した。
【０４０１】
（実施例１６）
臍帯組織由来細胞におけるテロメラーゼ発現
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋら、ＰＮＡＳ（１９９９）９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。ｈＴＥＲＴｍＲＮＡに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための容認された方法である。
【０４０２】
細胞単離。リアルタイムＰＣＲ実験を実施して、ヒト臍由来細胞のテロメラーゼ産生を評価した。ヒト臍由来細胞を、上述の実施例に従って調製した。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。続いて、組織を、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃の培養培地中でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞を、上記の実施例に記載される方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び正常真皮線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）をＣａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から得た。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２  ｃｌ．Ｄｌ）（ＰｌａｉａらのＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００６）、２４（３）：５３１〜５４６を参照）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から購入し、上記で説明した方法に従って培養した。
【０４０３】
全ＲＮＡの単離。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．））と共に、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間使用して、ＲＮＡを逆転写した。サンプルを、−２０℃で保存した。
【０４０４】
リアルタイムＰＣＲ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼに関してアッセイするために、広く使用される。簡潔には、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータを、製造業者の仕様書に従って分析した。
【０４０５】
ヒト臍由来細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴＥＲＴ及び１８Ｓ  ＲＮＡに関してアッセイした。表１６−１に示すように、ｈＴＥＲＴ、よってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞内では検出されなかった。
【０４０６】
【表３０】
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【０４０７】
ヒト臍帯組織由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞をアッセイしたところ、それらの結果は、ヒト臍帯組織由来細胞の２つのロットでは、テロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルで発現することが明らかとなった（表１６−２）。
【０４０８】
【表３１】
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【０４０９】
したがって、本発明のヒト臍由来細胞は、テロメラーゼを発現しないということを、結論付けることができる。
【０４１０】
様々な特許及び他の刊行物が、本明細書の全体を通して参照される。これらの刊行物のそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１１】
以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【配列表】
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