(57)【要約】本発明は、ＳｉｐＡを含む組成物を投与することにより疾患の１つまたは複数の症状を低減させる組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、Ｐ−ｇｐおよび／またはｐ５３の過剰発現に関連する疾患の症状の低減において特に有益である。本発明の組成物および方法は、癌の症状および／または癌の多剤耐性（ＭＤＲ）の低減において有用である。本発明は、その必要のある哺乳類の対象における癌の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、精製ＳｉｐＡを含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、上記ＳｉＰＡは、ナノ粒子に機能的に結合する。別の実施形態では、上記癌は、少なくとも１つの細胞毒に耐性のある癌細胞を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある哺乳類の対象の癌の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、精製ＳｉｐＡを含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＳｉｐＡが、ナノ粒子に機能的に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が、少なくとも１つの細胞毒に耐性のある癌細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、対照細胞と比較してＰ−ｇｐおよびｐ５３のうちの１つまたは複数を過剰発現する癌細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つまたは複数の細胞毒を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳｉｐＡを、
ａ）前記癌の細胞におけるＰ−ｇｐの発現レベルを低減させること、
ｂ）前記癌の細胞における非切断型のＰ−ｇｐのレベルを低減させること、および
ｃ）前記癌の細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増加させること
のうちの１つまたは複数において有効な量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記癌の細胞におけるＰ−ｇｐの発現レベルを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳｉｐＡが、細胞毒に機能的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳｉｐＡが、前記癌の細胞に特異的に結合する標的化剤に機能的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的化剤が、抗体、またはその抗原結合部分を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的化剤が、環状−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）ペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的化剤が葉酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
その必要のある哺乳類の対象の疾患の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、前記疾患が、Ｐ−ｇｐおよびｐ５３のうちの１つまたは複数を過剰発現する細胞に関連しており、前記方法が、精製ＳｉｐＡを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＳｉｐＡが、
ａ）前記細胞のＰ−ｇｐの発現のレベルを低減させることと、
ｂ）前記細胞の非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低減させることと、
ｃ）前記細胞のＰＥＲＰの発現のレベルを増加させることと
のうちの１つまたは複数に有効である量である、
方法。
【請求項１４】
前記疾患が、癌、多発性硬化症、自己免疫疾患、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
精製ＳｉｐＡを含む組成物を哺乳類の細胞に投与することを含む方法であって、
前記ＳｉＰＡが、
ａ）前記細胞のＰ−ｇｐの発現のレベルを低減させること、
ｂ）前記細胞の非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低減させること、および
ｃ）前記細胞のＰＥＲＰの発現のレベルを増加させること
のうちの１つまたは複数において有効である量である、
方法。
【請求項１６】
前記細胞が、対照細胞と比較して前記Ｐ−ｇｐおよびｐ５３の１つまたは複数を過剰発現する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｐ−ｇｐを過剰発現する前記細胞が、癌細胞および非癌性細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記非癌性細胞が、リンパ球細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記非癌性細胞が腸上皮細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
１つまたは複数の精製ＳｉｐＡを含むナノ粒子。
【請求項２２】
請求項２１に記載のナノ粒子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１２月１１日に出願の同時係属中の米国仮特許出願第６１／９１４，６００号に対する優先権を米国特許法１１９条（ｅ）の下で主張するものであり、この文献全体は本明細書中参照として援用されている。
【０００２】
政府の所有権
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金（ＤＫ５６７５４）の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、ＳｉｐＡを含む組成物を投与することにより、疾患の１つまたは複数の症状を低減させる組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、Ｐ−ｇｐおよび／またはｐ５３の過剰発現と関連する疾患の症状の低減に特に有益である。本発明の組成物および方法は、癌の症状および／または癌の多剤耐性（ＭＤＲ）の低減において有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
疾患（たとえば癌、微生物による感染症など）を治療するために使用される現在の治療は、相当な制限を有する。たとえば、多くの癌患者を治療するために使用される現在の化学療法薬は、高い毒性、不十分な腫瘍の標的化、および多剤耐性（ＭＤＲ）を有し、それと共に多くの場合腫瘍の破壊が不完全である。これらの欠点は、有効な治療を阻み、罹患率および死亡率の上昇に関連している。
【０００５】
癌細胞が、多剤耐性などの構造上かつ機能上関連しない複数の細胞障害剤に対して耐性を発達させることができることは、有効な化学療法に対する大きな障害であり、いまだ対処されていないきわめて重要なニーズである。過去２０年間にわたり、多くの分野の研究者らが、ヒト癌におけるＭＤＲを元に戻す方法として新規Ｐ−ｇｐ調節剤を開発することを最終目的として多剤耐性を研究してきた。Ｐ−ｇｐの機能を調節する薬剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＭＤＲ細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験的腫瘍中のＭＤＲ細胞に対する化学療法剤の細胞障害性を回復することができることを報告したいくつかの研究（６）により、この分野での薬剤開発の関心が高まっている。ＭＤＲ調節剤を用いた臨床試験はまた、それ以外は化学療法に非応答性である腫瘍においても何らかの応答を示している。
【０００６】
正常で健康な組織におけるＰ−ｇｐの構成的発現は、癌などの疾患状態の際の毒性の可能性がある生体異物に対する重要な保護機構であると考えられており、Ｐ−ｇｐは、投与された薬物が生物学的に利用される際の主な障壁であると認識されており、よって、化学療法に対する耐性は、依然として特定の癌の治療成功に対する障害である（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。近年の化学療法の戦略では、ＭＤＲ１遺伝子（Ｐ−ｇｐをコード）に対するハンマーヘッド型リボザイムとＭＤＲ１標的抗アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｆｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）の使用を組み合わせている。さらに、これらの進歩にもかかわらず、臨床試験段階に進んだ開発中のすべてのＭＤＲ阻害剤は、一般的に無効であるか、または毒性が高い用量でのみ有効である（Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。さらに、これらの調節剤の多くは、同時投与した化学療法剤の薬物動態および体内分布に有害な影響を及ぼす。さらに、Ｐ−ｇｐのｓｉＲＮＡによるサイレンシングは見込みのある手法ではあるが、この方法は、細胞の運命を遺伝的に変化させて、繊細に構築された送達システムを必要とし得ることから、これまで臨床で使用されていない。
【０００７】
この分野の進歩にも関わらず、臨床試験段階に進んだ開発中のすべてのＭＤＲ阻害剤は、広く無効であるか、または毒性が高い用量でのみ有効であった（８）。さらに、従来技術の調節剤の大部分は、同時投与した化学療法剤の薬物動態および体内分布に有害な影響を及ぼすため、望ましくない副作用のない、新規で有効なＭＤＲおよび／またはＰ−ｇｐ調節剤がなおも必要とされている（４）。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）エフェクタータンパク質ＳｉｐＡは、細胞外作用によりＰ−ｇｐの発現を調節する。（Ａ）ＨＣＴ８腸上皮細胞の単層を、無処置（−）のままにするか、または野生型（ＷＴ）のネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ１３４４もしくはＳＬ１３４４ＩＩＩ型分泌装置トランスロコン変異体株（ΔｓｉｐＢもしくはΔｓｉｐＣ）に５時間感染させた。全細胞のライセートを、タンパク質レベルに関して標準化し、Ｐ−ｇｐに関してプロービングした。ＧＡＰＤＨのプロービングを、ローディングの対照とした。（Ｂ）ＨＣＴ８細胞を、５時間、野生型のＳＬ１３４４もしくはＳＬ１３４４  ＳＰＩ−１欠損変異体株に感染させるか、または野生型ＳＬ１３４４由来分泌型タンパク質抽出物に曝露し、次に（Ａ）のようにプロービングした。（Ｃ）ＨＣＴ８細胞を、野生型ＳＬ１３４４、ＳＬ１３４４ΔｓｏｐＡもしくはΔｓｉｐＡ、またはＳｉｐＡを発現するベクターで補完したＳＬ１３４４ΔｓｉｐＡ（ΔＳｉｐＡ／ｐＳｉｐＡ）に５時間感染させ、次に（Ａ）のようにプロービングした。デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪにより分析し、無処置細胞と比較して提示した。
【図２】ＳｉｐＡは、用量依存的にＰ−ｇｐの発現をダウンレギュレートする。（Ａ）ＨＣＴ−８細胞の単層を、無処置のままにするか（−）、または、野生型ＳＬ１３４４に３時間感染させるか、または８０μｌ／ｍｌもしくは１６０μｌ／ｍｌ精製ＳｉｐＡに３時間曝露した。次に標準化した全細胞のライセートを、Ｐ−ｇｐおよびＧＡＰＤＨに関してプロービングした。（Ｂ）ＨＣＴ８細胞の単層を３時間、野生型のＳＬ１３４４に感染させるか、またはネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）から精製したリポ多糖（ＬＰＳ）に曝露し、次に（Ａ）のようにプロービングした。（Ｃ）ＨＣＴ８細胞の単層を、ＳＬ１３４４野生型、ΔｓｉｐＡまたはΔＳｉｐＡ／ｐＳｉｐＡ由来の分泌型タンパク質抽出物に３時間曝露し、次に（Ａ）のようにプロービングした。
【図３】ＳｉｐＡ誘導型の用量依存性のＰ−ｇｐのダウンレギュレーションは、他の癌細胞タイプにおいて保存される。（Ａ）ＭＣＦ−７乳腺癌細胞を、無処置のままにするか（−）、または８０μｇ／ｍｌもしくは１６０μｇ／ｍｌ精製ＳｉｐＡに３時間曝露した。次に、標準化した全細胞のライセートを、Ｐ−ｇｐおよびＧＡＰＤＨに関してプロービングした。デンシトメトリーを、Ｉｍａｇｅｊにより分析し、無処置細胞と比較して提示した。（Ｂ）ＵＭ−ＵＣ−３ヒト膀胱癌細胞を、無処置のままにするか、または８０μｇ／ｍｌもしくは１６０μｇ／ｍｌ精製ＳｉｐＡに３時間曝露し、次に（Ａ）のようにプロービングし、分析した。
【図４】ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、カスパーゼ―３−依存性の機構を介してＰ−ｇｐ発現を調節する。（Ａ）ＨＣＴ８細胞の単層を、無処置のままにするか（−）、またはＣＡＳＰ−３もしくはＣＡＳＰ−１の薬理学的阻害剤（陰性対照）の存在下もしくは非存在下で野生型ＳＬ１３４４に５時間感染させた。次に標準化した全細胞のライセートをＰ−ｇｐおよびＧＡＰＤＨに関してプロービングした。（Ｂ）非特異的ｓｉＲＮＡベクター対照またはＣＡＳＰ−３発現を減少させることをねらいとしたｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ８細胞の単層を、無処置のままにするか、または野生型ＳＬ１３４４に感染させた。次に全細胞ライセートを（Ａ）のようにプロービングした。（Ｃ）イラストおよび透明な表面で表したマウスＰ−ｇｐ（ＰＤＢ  ＩＤ、３Ｇ５Ｕ）の３次元構造。細胞質カスパーゼ―３切断部位（４５４ＤＧＱＤ４５７）を赤色で示す。推定のＣＡＳＰ３部位１６４ＤＶＨＤ１６７は示されていない。数字はタンパク質の配列中のアミノ酸の位置を指す。（Ｄ）ＨＣＴ８細胞の単層を、野生型ＳＬ１３４４に１、３、または５時間感染させ、次に、Ｐ−ｇｐ切断産物を検出できるＰ−ｇｐ抗体を使用してプロービングした。Ｐ−ｇｐの調節の進行は、９０および６０ｋｄａの切断産物の出現を伴った。
【図５】ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰは、遊離ＳｉｐＡよりもほぼ５００倍低い用量のＳｉｐＡでＰ−ｇｐの発現を低下させる。（Ａ）ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰを介したＰ−ｇｐのノックダウン機構の略図。（Ｂ）ＨＣＴ８細胞の単層を、無処置のままにするか（−）、３２０μｇ／ｍｌ１６０μｇ／ｍｌ精製ＳｉｐＡ、ＡｕＮＰ、単独またはＡｕＮＰ−ＳｉｐＡ（０．７２μｇ／ｍｌのＳｉｐＡ）に曝露した。
【図６】ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰおよび外来性ドキソルビシンの併用効果は、腫瘍の増殖を防止する。（Ａ）皮下ＣＴ２６腫瘍（約０．５ｍｍ３の平均腫瘍体積）を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、材料および方法の節に記載されるように１５日間ＩＰ処置を行った。（■）無処置、（●）ＡｕＮＰ単独、（▲）ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ、（◆）ドキソルビシン、または（□）ＳｉｐＡ−ＡｕＫＰ＋ドキソルビシン（ＤＯＸ）。ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、ドキソルビシンの効能を改善する（＊Ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）（Ａ）に示される腫瘍中の金ナノ粒子の蓄積を、ＳＥＭおよびＸ線微量分析により評価した。色の強度は、腫瘍の浸透を表す。腫瘍の区画を、材料および方法の節に記載されるようにＸ線分析およびＸ線のマッピングのためにイメージングした。（Ｃ）（Ａ）に示される腫瘍のＰ−ｇｐ発現をウェスタンブロットにより評価した。腫瘍をホモジナイズし、溶解した。全細胞ライセートを、タンパク質レベルに関して標準化し、Ｐ−ｇｐに関してプロービングした。Ｐ−ｇｐのレベルをデンシトメトリーにより定量化し、棒グラフに表した。デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪを使用して実施し、結果を、無処置対照と比較して表した。（Ｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＳｉｐＡ（ΔＳｉｐＡ／ｐＳｉｐＡ）で補完したＳＬ１３４４  ΔＳｉｐＡまたはＳＬ１３４４  ΔＳｉｐＡ  １０７ＣＦＵに４８時間感染させ、その後近位の結腸を解剖し、ホモジナイズし、溶解した。全細胞ライセートをタンパク質レベルに関して標準化し、Ｐ−ｇｐに関してプロービングした。Ｐ−ｇｐのレベルをデンシトメトリーにより定量化し、棒グラフで提示した。デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪを使用して実施し、結果を無処置細胞と比較して表した。＊  Ｐ＜０．０００１（ｎ＝６）。
【図７】完全なゲノム配列（ＮＣＢＩの参照配列：ＮＣ＿０１６８１０．１）であるサルモネラエンテリカ亜種エンテリカ血清型ネズミチフス菌  ＳＬ１３４４のＤＮＡ配列（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｑ）ＳＬ１３４４＿２８６１によりコードされるサルモネラエンテリカ亜種エンテリカ血清型ネズミチフス菌  ＳＬ１３４４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６６１８．１）の配列番号１のＳｉｐＡの例示的なアミノ酸配列（配列番号１）。
【図８】ジチオレート化テトラ（エチレングリコール）カルボン酸の合成のスキーム。
【図９】ＳｉｐＡおよびＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの試料由来のペプチドＩＰＥＰＡＡＧＰＶＰＤＧＧＫに関して抽出したイオンクロマトグラフ（ＥＩＣ）のピーク。
【図１０】ヌクレオチド配列（配列番号３）（Ｂ）よりコードされる例示的なホモサピエンスのＰＥＲＰアミノ酸配列（配列番号２）（Ａ）（ＮＣＢＩの参照配列：ＮＭ＿０２２１２１．４）
【０００９】
定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。
【００１０】
「ＰＥＲＰ」、「ＰＭＰ−２２に関連するｐ−５３アポトーシスエフェクター」、および「Ｔｐ５３アポトーシスエフェクター」は、互換可能に、ｐ５３腫瘍サプレッサーの転写の標的として当初同定されたテトラスパン膜タンパク質を指す（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＥＲＰ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｐ５３  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３−ＭＤＭ２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２，  ｅ１３６  （２０１１））。ヒトＰＥＲＰは、ヌクレオチド配列（配列番号３）（図１０Ｂ）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２２１２１．４）によりコードされるホモサピエンスＰＥＲＰアミノ酸配列（配列番号０２）（図１０Ａ）により例示される。
【００１１】
「Ｐ−糖タンパク質」、「Ｐ−ｇｐ」、「ＭＤＲ１タンパク質」は、１７０ｋＤａのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存性多剤排出トランスポーターである、生体異物の駆除を促進する膜輸送タンパク質を指す。Ｐ−ｇｐは、ＭＤＲ１によりコードされており、癌細胞における多剤耐性（ＭＤＲ）表現型の１態様の原因となる多剤耐性ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）膜トランスポーターである（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  １，  １６３  （Ａｕｇ，  ２００１））。Ｐ−ｇｐは、ホモサピエンス（ヒト）ＡＢＣＢ１  ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１、遺伝子ＩＤ：５２４３により例示されている。いくつかの報告により、Ｐ−ｇｐの過剰発現が多くの癌における有害な治療転帰と関連づけられ、このＭＤＲの表現型は薬理学的調節に重要な生物学的な標的として同定された（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  １，  １６３  （Ａｕｇ，  ２００１）；  Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  ４５５，  １５２  （Ｎｏｖ  １１，  １９７６））。正常で健康な組織は、Ｐ−ｇｐのベースライン発現を示し、毒性の可能性がある生体異物に対する重要な保護機構であり、ホメオスタシスを維持すると考えられている。Ｐ−糖タンパク質は、胎盤、腸細胞の刷子縁膜、肝細胞の毛細胆管膜、腎近位尿細管の管腔膜、および血液脳関門に寄与する上皮などの、重要な薬理学的な障壁で高く発現される（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００２  Ｊａｎ；２（１）：４８−５８）。さらに、Ｐ−ｇｐは異なる血液細胞に広く発現される（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００９  Ｎｏｖ；８６（５）：  １０７５−８７）。
【００１２】
「非切断型Ｐ−ｇｐ」は、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物および／または約６０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物を含む切断産物を産生するカスパーゼ―３（ＣＡＳＰ３）により切断されていないＰ−ｇｐを指す。実施例４は、非切断型ｐ−ｇｐのレベルを決定するための例示的な方法を示す。
【００１３】
「タンパク質５３」、「ｐ５３」、「腫瘍タンパク質５３」、および「ＴＰ５３」は、ヒトにおいてＴＰ５３遺伝子によりコードされる腫瘍サプレッサータンパク質を指すために互換可能に使用される。
【００１４】
関心対象のポリペプチド配列、または関心対象のヌクレオチド配列の「変異体」、または「相同体」は、それぞれ、関心対象のポリペプチド配列、または関心対象のヌクレオチド配列との８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％同一性を含む、少なくとも８０％同一性を有する配列を指す。
【００１５】
１つの好ましい実施形態では、変異体は、関心対象の配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％同一性を含む、関心対象の配列に対する少なくとも９５％の同一性を有する。
【００１６】
２つ以上の配列に関する場合（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の配列）、「同一性」は、２つ以上の配列の間の類似性の度合いを指し、一般的にパーセンテージで表される。アミノ酸またはヌクレオチドの配列の同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９０，  ８７，  ２２６４−２２６８；  Ｋａｒｌｉｎ，  Ｓ．  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０，  ５８７３）を使用して決定できる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムをベースとして使用して開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９０，  ２１５，  ４０３）。ヌクレオチド配列を分析するためにＢＬＡＳＴＮを使用する場合、パラメータは、たとえば、スコア＝１００およびワード長＝１２に設定することができる。さらにアミノ酸配列を分析するためにＢＬＡＳＴＸを使用する場合、パラメータをたとえばスコア＝５０およびワード長＝３に設定することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧＡＰＰＥＤ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータを使用する。これら分析方法のための特定の技術は、たとえば、国立生物工学情報センターのウェブサイト上で良く知られている。
【００１７】
「精製する」およびその文法上の等価物は、望ましい成分（たとえば細胞、タンパク質、核酸配列、炭水化物など）に関する場合、少なくとも１つの望ましくない成分（たとえば細胞、タンパク質、核酸配列、炭水化物、シアル酸‐糖タンパク質など）を試料から低減させることを指し、限定するものではないが、１０％から１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、および９０％〜１００％などの５％〜１００％のうちいずれかの数学的なパーセンテージ分の減少を含む。このように精製は、１つまたは複数の望ましくない成分と比較して望ましい成分の量の「濃縮」（すなわち増加）をもたらし、望ましい成分の（細胞のライセートおよび／または細胞外溶液などの開始物質と比較して）より濃縮した形態をもたらす。
【００１８】
「細胞障害性」分子は、標的細胞の増殖および／または生存率を減少させ、必ずしも必要ではないが好ましくは標的細胞を死滅させるいずれかの分子を指す。好ましい実施形態では、細胞障害性分子は、抗癌性毒素である。
【００１９】
「抗癌性毒素」および「抗癌性細胞毒」は、癌細胞の増殖を低減し、および／または癌細胞の生存率を低減させ、および／または腫瘍の大きさを低減させ、および／または腫瘍の数を低減させ、および／または転移を低減させ、および／または癌細胞のアポトーシスを増加させる分子である。好ましい実施形態では、抗癌性毒素は、腫瘍の発生を遅らせ、および／または腫瘍の数、重量、体積、および／もしくは増殖速度を低減させる。細胞毒は、限定するものではないが、ｃＡＭＰなどの二次伝達物質；例示的な百日咳毒素、コレラ毒素、およびＣ３細胞外酵素などの細菌性毒素；リシンＡなどのレクチンにより例示される（Ｅｎｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７  Ｊａｎ  １５；８９（２）：４０３−１０）。同様に、エトポシド、カンプトテシン（Ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、イリノテカン、トポテカン、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン）などのトポイソメラーゼ阻害剤；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどの微小管阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン（ｏｘａｌｏｐｌａｔｉｎ）などの白金含有化合物；シクロホスファミド、およびイホスファミドなどのアルキル化剤；メトトレキサートおよびメルカプトプリンなどの代謝拮抗剤；タモキシフェンおよびトレミフェンなどの抗エストロゲン薬；オールトランスレチノイン酸などのレチノイド類；ならびにアドリアマイシン、ゲムシタビン、および５−フルオロウラシルなどの他の毒素により例示される毒素をも含む。
【００２０】
上述の多くの毒素は、同様に、広範囲の様々な類似体および誘導体を有し、限定するものではないが、シスプラチン、シクロホスファミド、ミソニダゾール、チラパザミン（ｔｉｒｉｐａｚａｍｉｎｅ）、ニトロソウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、フルオロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンデシンおよびエトポシドを含む。類似体および誘導体は、（ＣＰＡ）．ｓｕｂ．２Ｐｔ（ＤＯＬＹＭ）および（ＤＡＣＨ）Ｐｔ（ＤＯＬＹＭ）シスプラチン、シス−（ＰｔＣｌ．ｓｕｂ．２（４，７−Ｈ−５−メチル−７−オキソ−）１，２，４（トリアゾロ（１，５−ａ）ピリミジン）．ｓｕｂ．２）、（Ｐｔ（シス−１，４−ＤＡＣＨ）（トランス−Ｃｌ．ｓｕｂ．２）（ＣＢＤＣＡ））．ｍｕｌｔｉｄｏｔ．−１／２ＭｅＯＨ  シスプラチン、４−ピリドキシン酸ジアンミンヒドロキシ白金、Ｐｔ（ＩＩ）．Ｐｔ（ＩＩ）（Ｐｔ．ｓｕｂ．２（ＮＨＣＨＮ（Ｃ（ＣＨ．ｓｕｂ．２）（ＣＨ．ｓ−ｕｂ．３）））．ｓｕｂ．４）、２５４−Ｓ  シスプラチン類似体、シスプラチン類似体を有するＯ−フェニレンジアミンのリガンド、トランス、シス−（Ｐｔ（ＯＡｃ）．ｓｕｂ．２Ｉ．ｓｕｂ．２（エン））、シスプラチン類似体を有するエストロゲン様  １，２−ジアリールエチレンジアミンリガンド（硫黄含有アミノ酸およびグルタチオンを含む）、シス−１，４−ジアミノシクロヘキサンシスプラチン類似体、シス−（Ｐｔ（ＮＨ．ｓｕｂ．３）（４−アミノＴＥＭＰ−Ｏ）｛ｄ（ＧｐＧ）｝）の５’配向異性体、キレート性ジアミン含有シスプラチン類似体、１，２−ジアリールエチレンアミンリガンド含有シスプラチン類似体、（エチレンジアミン）白金−（ＩＩ）錯体、ＣＩ−９７３シスプラチン類似体、シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）およびその類似体  シス−１，１−シクロブタンジカルボキシラート（ｄｉｃａｒｂｏｓｙｌａｔｏ）（２Ｒ）−２−メチル−１，４−ブタンジアンミン白金−（ＩＩ）およびシス−ジアンミン（グリコラート）白金、シス−アミン−シクロヘキシルアミン−ジクロロ白金（ＩＩ）、ジェム−ジホスホナートシスプラチン類似体（仏国特許第２６８３５２９号）、（メソ−１，２−ビス（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシプレニル）エチレンジアミン）ジクロロ白金（ＩＩ）、テザーダンシル基を含むシスプラチン類似体、白金（ＩＩ）ポリアミン、シス−（３Ｈ）ジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）、トランス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）およびシス−（Ｐｔ（ＮＨ．ｓｕｂ．３）．ｓｕｂ．２（Ｎ．ｓｕｂ．３−シトシン）Ｃｌ）、３Ｈ−シス−１，２−ジアミノシクロヘキサンジクロロ白金（ＩＩ）および３Ｈ−シス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−マロナト白金（ＩＩ）、ジアミノカルボキシラト白金（ＥＰＡ  ２９６３２１）、トランス−（Ｄ，１）−１，２−ジアミノシクロヘキサンキャリアーリガンド含有白金類似体，アミノアルキルアミノアントラキノン−由来のシスプラチン類似体、スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）およびＪＭ４０白金類似体、二座３級ジアミン含有シスプラチン誘導体、白金（ＩＩ）、白金��ＩＶ）、シス−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト−）白金（ＩＩ）（カルボプラチン、ＪＭ８）およびエチレンジアンミン−マロナト白金（ＩＩ）（ＪＭ４０）、ＪＭ８およびＪＭ９シスプラチン類似体、（ＮＰｒ４）２（（ＰｔＣ１，４）．シス−（ＰｔＣ１２−（ＮＨ２Ｍｅ）２））、脂肪族トリカルボン酸白金錯体（ＥＰＡ  １８５２２５）、シス−ジクロロ（アミノ酸）（ｔｅｒｔ−ブチルアミン）白金−（ＩＩ）錯体；４−ヒドロペルオキシシクロ（ｃｙｌｃｏ）ホスファミド、アシクロウリジンシクロホスファミド誘導体、１，３，２−ジオキサ−および−オキサザホスホリナンシクロホスファミド類似体、Ｃ５−置換シクロホスファミド類似体、テトラヒドロオキサジン  シクロホスファミド類似体、フェニルケトンシクロホスファミド類似体、フェニルケトホスファミド  シクロホスファミド類似体、ＡＳＴＡ  Ｚ−７５５７  シクロホスファミド類似体、３−（１−オキシ−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）シクロホスファミド、２−オキソビス（２−β−クロロエチルアミノ）−４−，６−ジメチル−１，３，２−オキサアザホスホリナンシクロホスファミド、５−フルオロ−および５−クロロシクロホスファミド、シス−およびトランス−４−フェニルシクロホスファミド、５−ブロモシクロホスファミド、３，５−デヒドロシクロホスファミド、４−エトキシカルボニルシクロホスファミド類似体、アリールアミノテトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサアザホスホリン  ２−オキシド  シクロホスファミド類似体、ＮＳＣ−２６２７１  シクロホスファミド類似体、ベンゾアンヌレート化シクロホスファミド類似体、６−トリフルオロメチルシクロホスファミド、４−メチルシクロホスファミドおよび６−メチル（ｍｅｔｈｙ）シクロホスファミド類似体；ＦＣＥ  ２３７６２  ドキソルビシン誘導体、アンナマイシン、ルボキシル、アントラサイクリン二糖ドキソルビシン類似体、Ｎ−（トリフルオロアセチル）ドキソルビシンおよび４’−Ｏ−アセチル−Ｎ−（トリフルオロアセチル）−ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、二糖ドキソルビシン類似体、４−デメトキシ−７−Ｏ−（２，６−ジデオキシ−４−Ｏ−（２，３，６−トリデオキシ−３−アミノ−α−Ｌ−リキソ−ｈ−エキソピラノシル）−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）アドリアマイシンドキソルビシン二糖類似体、２−ピロリノドキソルビシン、モルフォリニルドキソルビシン類似体、エナミノマロニル−β−アラニン  ドキソルビシン誘導体、セファロスポリン  ドキソルビシン誘導体、ヒドロキシルビシン、メトキシモルフォリノ  ドキソルビシン誘導体、（６−マレイミドカプロイル）ヒドラゾン  ドキソルビシン誘導体、Ｎ−（５，５−ジアセトキシペント−１−イル）ドキソルビシン、ＦＣＥ  ２３７６２  メトキシモルフォリニル  ドキソルビシン誘導体、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル  ドキソルビシン誘導体、ポリデオキシヌクレオチド  ドキソルビシン誘導体、モルフォリニル  ドキソルビシン誘導体  （ＥＰＡ  ４３４９６０）、ミトキサントロン  ドキソルビシン類似体、ＡＤ  １９８  ドキソルビシン類似体、４−デメトキシ−３’−Ｎ−トリフルオロアセチ���ドキソルビシン、４’−エピドキソルビシン，アルキル化シアノモルフォリノ  ドキソルビシン誘導体、デオキシジヒドロヨードオキソルビシン（ＥＰＡ  ２７５９６６）、アドリブラスチン、４’−デオキシドキソルビシン、４−デメトキシー４’−ｏ−メチルドキソルビシン、３’−デアミノ‐３’−ヒドロキシドキソルビシン、４−デメトキシ  ドキソルビシン類似体、Ｎ−Ｌ−ロイシル  ドキソルビシン誘導体、３’−デアミノ‐３’−（４−メトキシ‐１−ピペリジニル）ドキソルビシン誘導体（４，３１４，０５４）、３’−デアミノ‐３’−（４−モルホリニル）ドキソルビシン誘導体（４，３０１，２７７）、４’−デオキシドキソルビシンおよび４’−ｏ−メチルドキソルビシン、アグリコン  ドキソルビシン誘導体、ＳＭ  ５８８７、ＭＸ−２，４’−デオキシ−１３（Ｓ）−ジヒドロ−４’−ヨードドキソルビシン（ＥＰ  ２７５９６６）、モルフォリニルドキソルビシン誘導体（ＥＰＡ  ４３４９６０）、３’−デアミノ‐３’−（４−メトキシ‐１−ピペリジニル）ドキソルビシン誘導体（４，３１４，０５４）、ドキソルビシン−１４−吉草酸塩、モルフォリノドキソルビシン（５，００４，６０６）、３’−デアミノ−３’−（３’−シアノ−４”−モルフォリニルドキソルビシン；３’−デアミノ−３’−（３”−シアノ−４”−モルフォリニル）−１３−ジヒドドキソルビシン；（３’−デアミノ‐３’−（３”−シアノ−４”−モルフォリニル）ダウノルビシン；３’−デアミノ‐３’−（３”−シアノ−４”−モルフォリニル）−３−ジヒドロダウノルビシン；および３’−デアミノ３’−（４”−モルフォリニル−５−イミノドキソルビシンおよび誘導体（４，５８５，８５９）、３’−デアミノ‐３’−（４−メトキシ−１−ピペリジニル）ドキソルビシン誘導体（４，３１４，０５４）および３−デアミノ−３−（４−モルフォリニル）ドキソルビシン誘導体（４，３０１，２７７）；４，５−ジメチルミソニダゾール、アゾおよびアゾキシミソニダゾール誘導体；ＲＢ９０７４０；６−ブロモおよび６−クロロ−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾチアジン  ニトロソウレア誘導体、ジアミノ酸ニトロソウレア誘導体、アミノ酸ニトロソウレア誘導体，３’，４’−ジデメトキシ−３’，４’−ジオキソ−４−デオキシポドフィロトキシン  ニトロソウレア誘導体、ＡＣＮＵ、三級ホスフィンオキシド  ニトロソウレア誘導体、スルファメラジン（ｓｕｌｆａｍｅｒｉｚｉｎｅ）および  スルファメチゾール  ニトロソウレア誘導体、チミジン  ニトロソウレア類似体、１，３−ビス（２−クロロエチル）‐‐１−ニトロソウレア、２，２，６，６−テトラメチル−１−オキソピペリジニウム（ｐｉｐｅｒｉｄｉｕｎｉｕｍ）  ニトロソウレア誘導体（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｒ．  １２６１２５３）、２−および４−デオキシ糖  ニトロソウレア誘導体（４，９０２，７９１）、ニトロキシル  ニトロソウレア誘導体  （Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｒ．  １３３６４８９）、フォテムスチン、ピリミジン（ＩＩ）ニトロソウレア誘導体、ＣＧＰ  ６８０９、Ｂ−３８３９、５−ハロゲン化シトシン  ニトロソウレア誘導体、１−（２−クロロエチル）−３−イソブチルー３−（β−マルトシル）−ｌ−ニトロソウレア、硫黄含有ニトロソウレア、スクロース、６−（（（（２−クロロエチル）ニトロソアミノ−）カルボニル）アミノ）−６−デオキシスクロース（ＮＳ−１Ｃ）および６’−（（（（２−クロロエチル）ニトロソアミノ）カルボニル）アミノ）−６’−デオキシスクロース（ＮＳ−１Ｄ）ニトロソウレア誘導体、ＣＮＣＣ、ＲＦＣＮＵおよびクロロゾトシン、ＣＮＵＡ、１−（２−クロロエチル）−３−イソブチル３‐‐（β−マルトシル）−１−ニトロソウレア、コリン様ニトロソアルキルウレア、スクロース  ニトロソウレア誘導体（ＪＰ  ８４２１９３００）、サルファ剤  ニトロソウレア類似体、ＤＯＮＵ、Ν，Ν’−ビス（Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソカルバモイル）シスタミン（ＣＮＣＣ）、ジメチルニトロソウレア、ＧＡＮＵ、ＣＣＮＵ、５−アミノメチル−２’−デオキシウリジン  ニトロソウレア類似体、ＴＡ−０７７、ゲンチアノース  ニトロソウレア誘導体  （ＪＰ  ８２  ８０３９６）、ＣＮＣＣ、ＲＦＣＮＵ、ＲＰＣＮＵおよびクロロゾトシン（ＣＺＴ）、チオコルヒチン  ニトロソウレア類似体、２−クロロエチル−ニトロソウレア、ＡＣＮＵ、（１−（４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジニル）メチル−３−（２−−クロロエチル）−３−ニトロソウレアハイドロクロライド）、Ｎ−デアセチルメチル  チオコルヒチン  ニトロソウレア類似体、ピリジンおよびピペリジン  ニトロソウレア誘導体、メチル−ＣＣＮＵ、フェンスジミド（ｐｈｅｎｓｕｚｉｍｉｄｅ）ニトロソウレア誘導体、エルゴリン  ニトロソウレア誘導体、グルコピラノースニトロソウレア誘導体（ＪＰ７８９５９１７）、１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレア、４−（３−（２−クロロエチル）−３−ニトロソウレイド）−−シス−シクロヘキサンカルボン酸、ＲＰＣＮＵ（ＩＣＩＧ  １１６３）、ＩＯＢ−２５２、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、１−テトラヒドロキシシクロペンチル−−３−ニトロソ−３−（２−クロロエチル）−ウレア（４，０３９，５７８）、ｄ−１−１−（β−クロロエチル）−３−−（２−オキソ−３−ヘキサヒドロアゼピニル）−１−ニトロソウレア（３，８５９，２７７）およびゲンチアノース  ニトロソウレア誘導体（ＪＰ  ５７０８０３９６）；６−Ｓ−アミノアシルオキシメチル  メルカプトプリン誘
導体、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、７，８−ポリメチレンイミダゾ−１，３，２−ジアザホスフォリン、アザチオプリン、メチル−Ｄ−グルコピラノシド  メルカプトプリン誘導体およびｓ−アルキニルメルカプトプリン誘導体；  インドリン環および修飾型オルニチンまたはグルタミン酸含有メトトレキサート誘導体、アルキル置換ベンゼン環Ｃ含有メトトレキサート誘導体、ベンゾキサジンまたはベンゾチアジン  部分含有メトトレキサート誘導体、１０−デアザアミノプテリン  類似体、５−デアザアミノプテリンおよび５，１０−ジデアザアミノプテリン  メトトレキサート類似体、インドリン部分含有メトトレキサート誘導体、親油性アミド  メトトレキサート誘導体、Ｌ−スレオ−（２Ｓ，４Ｓ）−４−フルオロ−グルタミン酸およびＤＬ−３，３−ジフルオログルタミン酸含有メトトレキサート類似体、メトトレキサート  テトラヒドロキナゾリン  類似体、Ｎ−（ａｃ−アミノアシル）メトトレキサート誘導体、ビオチン  メトトレキサート誘導体、Ｄ−グルタミン酸またはＤ−エリトロ、スレオ−４−フルオログルタミン酸  メトトレキサート類似体、β，γ‐メタノメトトレキサート類似体、１０−デアザアミノプテリン（１０−ＥＤＡＭ）類似体、γ−テトラゾール  メトトレキサート類似体、Ｎ−（Ｌ−α−アミノアシル）メトトレキサート誘導体、アミノプテリンのメタおよびオルト異性体、ヒドロキシメチルメトトレキサート（ＤＥ  ２６７４９５）、γ−フルオロメトトレキサート、ポリグルタミル  メトトレキサート誘導体、ジェム−ジホスホン酸塩  メトトレキサート類似体（ＷＯ  ８８／０６１５８）、α−およびγ−置換メトトレキサート類似体、５−メチル−５−デアザメトトレキサート類似体（４，７２５，６８７）、Ｎ．デルタ．−アシル−Ｎ  α−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｌ−オルニチン誘導体、８−デアザメトトレキサート類似体、アシビシン  メトトレキサート類似体、プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌ）重合体  メトトレキサート誘導体、メトトレキサート−γ−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、メトトレキサート  ポリグルタメート類似体、ポリ−γ−グルタミル  メトトレキサート誘導体、デオキシウリジル酸塩  メトトレキサート誘導体、ヨードアセチルリジン  メトトレキサート類似体、２，．ω−ジアミノアルカノイド酸（ａｌｋａｎｏｉｄ  ａｃｉｄ）含有メトトレキサート類似体、ポリグルタメート  メトトレキサート誘導体、５−メチル−５−デアザ類似体、キナゾリンメトトレキサート類似体、ピラジン  メトトレキサート類似体、システイン酸およびホモシステイン酸メトトレキサート類似体（４，４９０，５２９）、γ−ｔｅｒｔ−ブチル  メトトレキサート  エステル、フッ化メトトレキサート類似体、葉酸塩  メトトレキサート類似体、ホスホノグルタミン酸類似体、ポリ（Ｌ−リジン）メトトレキサートコンジュゲート、ジリジンおよびトリリジン  メトトレキサート誘導体、７−ヒドロキシメトトレキサート、ポリ−γ−グルタミル  メトトレキサート類似体、３’，５’−ジクロロメトトレキサート、ジアゾケトンおよびクロロメチルケトン  メトトレキサート類似体、１０−プロパルギルアミノプテリンおよびアルキルメト��レキサート  相同体、メトトレキサートのレクチン  誘導体、ポリグルタメート  メトトレキサート誘導体、ハロゲン化メトトレキサート誘導体、８−アルキル−７，８−ジヒドロ  類似体、７−メチル  メトトレキサート誘導体  および  ジクロロメトトレキサート、親油性  メトトレキサート誘導体および３’，５’−ジクロロメトトレキサート、デアザ  アメトプテリン  類似体、ＭＸ０６８およびシステイン酸およびホモシステイン酸  メトトレキサート類似体（ＥＰＡ  ０１４２２２０）；５−フルオロウラシルのＮ３−アルキル化類似体、１，４−オキサヘテロエパン部分を含む５−フルオロウラシル  誘導体、５−フルオロウラシルおよびヌクレオシド類似体、シス−およびトランス−５−フルオロ−５，６−ジヒドロ‐‐６−アルコキシウラシル、シクロペンタン  ５−フルオロウラシル類似体、Ａ−ＯＴ−フルオロウラシル、Ｎ４−トリメトキシベンゾイル−５’−デオキシ−５−フルオロ−シチジンおよび５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、１−ヘキシルカルバモイル−５−フルオロウラシル、Ｂ−３８３９、ウラシル−１−（２−テトラヒドロフリル）−５−フルオロウラシル、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−フルオロウラシル、ドキシフリジン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、１−アセチル−３−Ｏ−トルイル−５−フルオロウラシル、５−フルオロウラシル−ｍ−ホルミルベンゼン−スルホネート（ＪＰ  ５５０５９１７３）、Ｎ’−（２−フラニジル（ｆｕｒａｎｉｄｙｌ））−５−フルオロウラシル（ＪＰ  ５３１４９９８５）および１−（２−テトラヒドロフリル）−５−フルオロウラシル（ＪＰ  ５２０８９６８０）；４’−エピドキソルビシン；Ｎ−置換デアセチルビンブラスチン  アミド（ビンデシン）硫酸塩；およびＣｕ（ＩＩ）−ＶＰ−１６（エトポシド）錯体、ピロールカルボキサミジノ（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｏ）含有エトポシド類似体、４０−アミノ  エトポシド類似体、γ−ラクトン環−修飾アリールアミノ  エトポシド類似体、Ｎ−グルコシル  エトポシド類似体、エトポシド  Ａ−環類似体、４’−デスヒドロキシ−４’−メチル  エトポシド、振子環エトポシド類似体およびＥ−環デスオキシ  エトポシド類似体を含む。
【００２１】
「ナノ粒子」は、約１００ｎｍ以下の１つまたは複数の次元を有する固体（金属、ポリマー、酸化物など）の粒子を指す。実施可能要件：組織（癌組織など）に薬剤を送達するために、金ナノ粒子（たとえば米国特許第８，３２３，６９４号）を含むナノ粒子に分子（化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、ＳｉｐＡなど）を「連結（ｌｉｎｋ）」（すなわち結合）するための一般的な方法は、当技術分野で知られており（たとえば米国特許第８，３１８，２０８号、第８，３１８，２１１号、第８，２４６，９６８号、第８，１９３，３３４号、第８，０６３，１３１号、第７，７２７，５５４号、第７，５６３，４５７号、第７，５５０，４４１号、第７，５５０，２８２号、第７，３８７，７９０号、第７，３４８，０３０号、第５，７１８，９１９号、第５，５０３，７２３号、第５，４２９，８２４；米国特許公開公報第２０１２／０３０２５１６号、国際特許公開公報第２００８／１５１０４９号）。金ナノ粒子とＳｉｐＡを結合するための例示的な方法は、実施例１、５、および７に記載されている。
【００２２】
ナノ粒子と別の分子（ＳｉｐＡ、細胞毒、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤など）の間の結合などの、２つの分子の間の結合に関する場合、「機能的に結合した」および「機能的に連結した」は、各分子が、その意図するかつ／または生物学的機能（たとえばＳｉｐＡは、細胞のＰ−ｇｐの発現レベルを低下させ、かつ／または細胞における機能的な非切断型のＰ−ｇｐのレベルを低減させ、かつ／またはＰＥＲＰの発現レベルを増加させるなど）を行うように結合していることを意味する。結合は、直接的な結合、間接的な結合、非共有結合、共有結合などであり得る。好ましい実施形態では、ナノ粒子とタンパク質の間の結合は、タンパク質の解離または凝集を低減させるような共有結合である。
【００２３】
用語「特異的に結合する」および「特異的結合」は、２つの分子の結合（たとえば抗原に対する抗体）に関連する場合などでは、１つまたは両方の分子の特定の構造の存在に依存する２つの分子の相互作用を指す。たとえば、抗体が、分子上のエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識した「Ａ」と抗体とを含む反応中にエピトープＡ（または遊離、非標識のＡ）を含むタンパク質が存在すれば、抗体に結合する標識Ａの量を低減させる。
【００２４】
「抗体」は、免疫グロブリン（たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）を指す。
【００２５】
抗体の「抗原結合部」は、抗原に特異的に結合する抗体のフラグメントを指す。「抗原結合部」は、抗原に結合するための「可変ドメイン」（「Ｆｖ領域」とも呼ばれる）を含む。より具体的には、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）鎖上の３つの可変ループは、抗原への結合に関与する。これらのループは、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）および「イディオタイプ」とも呼ばれる。「抗原結合部」は、Ｆａｂ領域、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｐＦｃ’フラグメント、およびＦａｂ’フラグメントを含む。「Ｆａｂ領域」および「フラグメント、抗原結合領域」は、互換可能に、抗原の結合において機能するイムノグロブリン「Ｙ」の抗体のアームの一部を指す。Ｆａｂ領域は、抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖由来の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。Ｆａｂ発現ライブラリーの構築する方法は当業者に知られており（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））、これにより望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡易な同定が可能となる。別の実施形態では、ＦｃおよびＦａｂのフラグメントは、イムノグロブリンモノマーを２つのＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメンチに切断するために酵素パパインを使用することにより作製できる。酵素ペプシンは、ヒンジ領域の下を切断し、よって、「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」および「ｐＦｃ’フラグメント」が形成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、穏やかな還元により２つの「Ｆａｂ’フラグメント」に分割することができる。
【００２６】
「Ｆｃ」および「フラグメント結晶化可能」領域は、互換可能に、免疫細胞の活性を調節する役割において機能する免疫グロブリン「Ｙ」の基部の部分を指す。Ｆｃ領域は、抗体のクラスに応じて２つまたは３つの定常ドメインに寄与する２つの重鎖から構成されている。特異的タンパク質を結合することにより、Ｆｃ領域は、各抗体が所定の抗原に対して適切な免疫応答を生じることを保証する。またＦｃ領域は、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、および補体タンパク質などの他の免疫分子に結合する。これを行うことにより、Ｆｃは、マスト細胞、好塩基球、および好酸球のオプソニン化、細胞の溶解、および脱顆粒を含む異なる生理学的作用を媒介する。実験の状況で、ＦｃおよびＦａｂフラグメントは、酵素のパパインで免疫グロブリンモノマーを２つのＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントに切断することにより研究室で生成することができる。
【００２７】
「環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸」、「ｃＲＧＤ」、「ｃＧＲＧＤｄｖｃ」、および「ＬＸＷ７」は、互換可能に、ジスルフィド結合により環化し、カルボキシル末端でビルトインハンドルを含むアルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸ペプチドを指す。
【００２８】
「癌細胞」は、これまでに記述されているように（Ｐｉｔｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  １５−２８（１９７８））、多段階の新生物進行の初期、中期、または進行期を経た細胞を指す。これは、「前腫瘍細胞」（すなわち「過形成細胞および異形成細胞」を含む新生物進行の初期、中期、および進行期の細胞、ならびに異形成細胞の新生物進行の進行期の新生物細胞を含む。「癌」は、転移性であっても転移性でなくてもよく、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌（たとえばメラノーマ、基底細胞癌、カポジ肉腫など）、筋肉癌、心臓癌、肝臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、精巣癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳癌、神経細胞癌、中皮腫、胆嚢癌、眼性癌（たとえば、角膜の癌、ぶどう膜の癌、脈絡膜の癌、黄斑の癌、硝子体液癌など）、関節癌（滑膜癌など）、神経膠芽腫、リンパ腫、および白血病により例示される。特定の好ましい実施形態では、癌は、結腸癌（実施例２参照）、結腸直腸癌、胃腸癌、乳癌（実施例３参照）、膀胱癌（実施例３参照）、腎臓癌、白血病、脳癌、肉腫、星状細胞腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫を含む。
【００２９】
「症状」は、疾患の兆候である。癌の症状として、限定するものではないが、体重の減少、発熱、疲労、出血、または分泌物（肺癌、結腸癌、直腸癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、膀胱癌、腎臓癌、および／または乳癌）、治癒しない痛み（皮膚および／または口腔癌）、口腔内の白い斑点、または舌の上の白い斑点（口腔癌の白斑症）、肥厚または塊（乳癌、精巣癌、および／またはリンパ節癌）、腫瘍の大きさ、腫瘍の増殖速度、消化不良、または嚥下困難（食道癌、胃癌、および／または咽頭癌）、ほくろの大きさまたは色の変化（メラノーマ）、咳または嗄声（肺癌、喉頭癌、および／または甲状腺癌）が挙げられる。多発性硬化症の症状は、限定するものではないが、１つまたは複数の肢におけるしびれもしくは脱力、または通常１つの目で起こり、多くの場合眼の動きの間疼痛（視神経炎）を伴う部分的もしくは完全な中心視野の喪失、複視もしくは視覚のぼやけ、身体の一部の刺痛もしくは疼痛、特定の頭の動きに伴い起こる電気ショックの感覚、振戦、協調の欠如もしくは不安定歩行、不明瞭な発話、疲労、および／またはめまいを含む。自己免疫疾患の症状は、限定するものではないが、極度の疲労、筋肉および関節の疼痛、筋肉の脱力、腫大した腺、炎症、感染症への易罹患性、睡眠の障害、体重の減少または増加、低血糖、血圧の変化、カンジダ酵母感染症、アレルギー、異常性疼痛などの消化器系の問題、腹部膨満、圧痛、胸やけ、筋痙攣、便秘、下痢、および過剰なガス（「腸管壁浸漏症候群」）、不安および抑うつ、記憶の問題、低体温および過剰な脱毛として現れ得る甲状腺の問題（甲状腺機能低下症および／または甲状腺機能亢進症）、再発性の頭痛、軽度の発熱、および／または再発性の流産などが挙げられる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の症状は、限定するものではないが、損傷した免疫系を有する患者で起こる、疲労、下痢、悪心、嘔吐、熱、悪寒、寝汗、筋痛、咽頭炎、腫大したリンパ節、口腔の潰瘍、後期の消耗性疾患、および／または日和見性感染症が挙げられる。
【００３０】
「非癌性細胞」は、多段階新生物進行の、初期、中期、または進行期を経ていない細胞などの、癌細胞ではない細胞を指す。
【００３１】
「細胞毒に耐性のある」細胞は、細胞毒が存在しない場合と比較して細胞毒の存在下で増殖速度が実質的に低減しない細胞を指す。
【００３２】
「対照」の試料または細胞は、ある現象に関して変動する１つまたは複数の変数の因果関係のの有意性を推測するための１つまたは複数の特定の変数を除き、対照および他の試料または細胞で同じ条件を維持することにより、別の試料または細胞と比較するために使用する試料または細胞を指す。たとえば、非癌性細胞は、癌細胞に対する対照細胞である。別の例では、ウイルスに感染していない細胞は、ウイルスに感染している細胞に対する対照細胞である。同様に、たとえば、「陽性対照試料」は、現象が起こると予測される対照の試料である。たとえば、「陰性対照試料」は、現象が起こらないと予測される対照の試料である。
【００３３】
タンパク質および／またはヌクレオチドの配列を「過剰発現する」細胞は、対照の細胞と比較して高いレベルのタンパク質および／またはヌクレオチドの配列を産生する細胞を指す。
【００３４】
「対象」は、任意の多細胞性の動物、好ましくは「哺乳類」を含む。哺乳類の対象は、ヒト、非ヒトの霊長類、マウス、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ類、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などを含む。哺乳類の対象は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、およびチンチラにより例示される。
【００３５】
疾患の１つまたは複数の症状を低減させる「必要のある」対象は、疾患の１つまたは症状を呈する、および／または呈するリスクのある対象を含む。たとえば、対象は、家族の病歴、遺伝的要因、環境要因などに基づきリスクを有し得る。この用語は、疾患の動物モデルを含む。よって、（疾患を低減、かつ／または疾患の１つまたは複数の症状を低減する）組成物を、疾患を低減、および／または疾患の１つまたは複数の症状を低減させる必要のある対象に投与することは、組成物の予防的投与（すなわち疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出可能となる前に投与）、ならびに／または組成物の治療的投与（すなわち疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出可能となった後に投与）を含む。
【００３６】
疾患に関して「リスクのある」対象は、疾患の１つまたは複数の症状を有するおよび／または発現する素因を有する対象を指す。この素因は、遺伝的（たとえば遺伝的障害などの疾患の１つまたは複数の症状を発現する特定の遺伝的傾向）であり得るか、または他の要因（たとえば環境上の条件、環境に存在する発癌物質を含む有害な化合物への曝露など）によるものであり得る。用語「リスクのある」対象は、「疾患を罹患している」対象、すなわち、疾患の１つまたは複数の症状を経験している対象を含む。本発明は、特定の兆候または症状に限定されないと意図される。よって、本発明は、疾患に関連する指標（たとえば兆候および症状）の少なくとも１つを呈する、無症状性の症状から末期の疾患までの任意の範囲の疾患を経験している対象を含む。
【００３７】
用語「低減する」、「阻害する」「減少する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「抑制する」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、および文法上等価物（「より少ない」、「小さい」などを含む）は、第１の試料（または第１の対象）における任意の分子（たとえばＰ−ｇｐまたはＰＥＲＰなどのアミノ酸配列、Ｐ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする配列などの核酸配列、抗体など）、細胞、および／または現象（たとえばＰ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする遺伝子などの遺伝子の発現レベル、疾患症状、細胞増殖、細胞の生存率、腫瘍の大きさ、腫瘍の数、２つの分子の結合レベル、酵素活性、生物活性など）のレベルを、第２の試料（または第２の対象）と比較して参照する場合、第１の試料（または第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料（または第２の対象）よりも、当技術分野で容認される任意の統計学的分析方法を使用して統計的に有意である任意の量だけ少ないことを意味する。一実施形態では、第１の試料（または第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量は、第２の試料（または第２の対象）における同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも少なくとも１０％少なく、少なくとも２５％少なく、少なくとも５０％少なく、少なくとも７５％少なく、かつ／または少なくとも９０％少ない。別の実施形態では、第１の試料（第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量は、第２の試料（または第２の対象）における同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも、限定するものではないが、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、および９０％〜１００％などの、５〜１００％のいずれかの数学的なパーセントだけ少ない。一実施形態では、第１の試料（または第１の対象）は、限定するものではないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されている試料（または対象）により例示される。さらなる実施形態では、第２の試料（または第２の対象）は、限定するものではないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されていない試料（または対象）により例示されている。代替的な実施形態では、第２の試料（または第２の対象）は、限定するものではないが、第１の対象と比較して異なる用量および／または異なる持続期間、および／または異なる投与経路を介して、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されている試料（または対象）である。一実施形態では、第１および第２の試料（または対象）は、たとえば本発明の組成物および／または方法の異なる投与計画（例えば用量、持続期間、投与経路など）の効果を、１つの試料（または対象）で決定することが求められる場合では、同じであり得る。別の実施形態では、第１および第２の試料（または対象）は、たとえば臨床試験に参加している患者および入院中の別の個体などの１つの試料（または対象）において本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合では異なり得る。
【００３８】
用語「増加する」、「上昇する」、「上がる」、および文法上の等価物（「より高い」、「より多い」などを含む）は、第１の試料（または第２の対象）における任意の分子（たとえばＰ−ｇｐまたはＰＥＲＰなどのアミノ酸配列、Ｐ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする配列などの核酸配列、抗体など）、細胞、および／または現象（たとえば、Ｐ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする遺伝子などの遺伝子の発現レベル、疾患の症状、細胞の増殖、細胞の生存率、腫瘍の大きさ、腫瘍の数、２つの分子の結合レベル、酵素活性、生物活性など）のレベルを、第２の試料（または第２の対象）と比較して参照する場合、第１の試料（または第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料（または第２の対象）よりも、当技術分野で容認される任意の統計学的分析方法を使用して統計学的に有意である量だけ高いことを意味する。一実施形態では、第１の試料（または第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量は、第２の試料（または第２の対象）における同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも少なくとも１０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも７５％多く、かつ／または少なくとも９０％多い。これは、限定するものではないが、第２の試料（または第２の対象）における同じ分子、細胞、および／または現象の量よりも少なくとも１０％多い、少なくとも１５％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも２５％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも３５％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも４５％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも５５％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも６５％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも７５％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも８５％多い、少なくとも９０％多い、かつ／または少なくとも９５％多い量である第１の試料（または第１の対象）中の分子、細胞、および／または現象の量を含む。一実施形態では、第１の試料（または第１の対象）は、限定するものではないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されている試料（または対象）により例示される。さらなる実施形態では、第２の試料（または第２の対象）は、限定するものではないが、本発明の組成物および／または方法を使用して操作されていない試料（または対象）により例示される。代替的な実施形態では、第２の試料（または第２の対象）は、限定するものではないが、第１の対象と比較して異なる用量および／または異なる持続期間、および／または異なる投与経路を介した本発明の組成物および／または方法を使用して操作されている試料（または対象）により例示される。一実施形態では、第１および第２の試料（または対象）は、たとえば本発明の組成物および／または方法の異なる投与計画（たとえば用量、持続期間、投与経路などが異なる）の効果が、１つの試料（または対象）で決定されることが求められる場合には、同じであり得る。別の実施形態では、第１および第２の試料（または対象）は、たとえば臨床試験に参加している患者および入院中の別の個体などの１つの試料（または対象）において本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合では異なり得る。
【００３９】
用語「実質的に低減していない」は、第１の試料（または第１の対象）における任意の分子（たとえばＰ−ｇｐまたはＰＥＲＰなどのアミノ酸配列、Ｐ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする配列などの核酸配列、抗体など）、細胞、および／または現象（たとえばＰ−ｇｐまたはＰＥＲＰをコードする遺伝子などの遺伝子の発現レベル、疾患の症状、細胞の増殖、細胞の生存率、腫瘍の大きさ、腫瘍の数、２つの分子の結合レベル、酵素活性、生物活性など）を、第２の試料（第２の対象）と比較して参照する場合、第１の試料（または第１の対象）における分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料（または第２の対象）の９１％〜１００％の量であることを意味する。
【００４０】
用語「変化する」および「修飾する」は、任意の分子および／または現象のレベルを参照する場合、増加および／または減少を指す。
発明の概要
【００４１】
本発明は、その必要のある哺乳類の対象の癌の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、精製ＳｉｐＡを含む組成物を上記対象に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、上記ＳｉｐＡは、ナノ粒子と機能的に結合している。別の実施形態では、上記癌は、少なくとも１つの細胞毒に耐性である癌細胞を含む。さらなる別の実施形態では、上記癌は、対照細胞と比較してＰ−ｇｐおよびｐ５３のうち１つまたは複数を過剰発現する癌細胞を含む。さらなる実施形態では、本方法は、任意に、１つまたは複数の細胞毒を上記対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、上記ＳｉｐＡは、ａ）上記癌の細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、ｂ）上記癌の細胞における非切断型Ｐ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、およびｃ）上記癌の細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増大させることのうち１つまたは複数に有効である量で投与されている。さらなる別の実施形態では、上記方法は、上記癌の細胞におけるＰ―ｇｐの発現のレベルを決定することをさらに含む。特定の実施形態では、上記ＳｉｐＡは、細胞毒と機能的に結合している。別の実施形態では、上記ＳｉｐＡは、上記癌の細胞に特異的に結合する標的化剤に機能的に結合している。代替的な実施形態では、上記標的化剤は、抗体、またはその抗原結合部分を含む。１つの好ましい実施形態では、上記標的化剤は、環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）ペプチドを含む。代替的な実施形態では、上記標的化剤は葉酸を含む。
【００４２】
さらに本発明は、その必要のある哺乳類の対象の疾患の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、上記疾患が、Ｐ−ｇｐおよびｐ５３のうち１つまたは複数を過剰発現する細胞と関連しており、上記方法が、精製ＳｉｐＡを含む組成物を上記対象に投与することを含み、上記ＳｉｐＡは、ａ）上記細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、ｂ）上記細胞における非切断型Ｐ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、およびｃ）上記細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増大させることのうち１つまたは複数において有効である量である、方法を提供する。一実施形態では、上記疾患は、癌、多発性硬化症、自己免疫疾患、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症からなる群から選択される。
【００４３】
また、本発明により、精製ＳｉｐＡを含む組成物を哺乳類の細胞に投与することを含む方法であって、上記ＳｉｐＡが、ａ）上記細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、ｂ）上記細胞における非切断型Ｐ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、およびｃ）上記細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増大させることの１つまたは複数に有効である量である、方法を提供する。一実施形態では、上記細胞は、対照細胞と比較して上記Ｐ−ｇｐおよびｐ５３のうちの１つまたは複数を過剰発現する。別の実施形態では、上記Ｐ−ｇｐを過剰発現する細胞は、癌細胞および非癌性細胞からなる群から選択される。一実施形態では、上記細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにある。さらなる別の実施形態では、上記非癌性細胞はリンパ球細胞を含む。さらなる実施形態では、上記非癌性細胞は腸上皮細胞を含む。
【００４４】
さらに本発明は、１つまたは複数の精製ＳｉｐＡを含むナノ粒子を提供する。
【００４５】
さらに本発明は、本明細書において記載される１つまたは複数の任意のナノ粒子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００４６】
また本発明は、その必要のある哺乳類の対象の癌細胞のアポトーシスを増加させる方法であって、精製ＳｉｐＡを含む組成物を上記対象に投与することを含む、方法を提供する。
【発明の詳細な形態】
【００４７】
本発明は、腸の病原体サルモネラ・エンテリカ血清型ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から単離したＩＩＩ型の分泌エフェクタータンパク質であるＳｉｐＡ（サルモネラ浸潤タンパク質Ａ）が、ＭＤＲ１（またはＰ−糖タンパク質）を機能的にダウンレギュレートし、活性ｐ５３を安定化させる経路の引き金となり、最終的にアポトーシスの応答を駆動する複合的な役割を有するという独創性に富む発見を提供する。
【００４８】
また本発明は、腫瘍に特異的に標的化される微生物と、多剤耐性のトランスポーターの調節との関連の驚くべき発見も提供する。本明細書中のデータは野生型のネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）によるヒト結腸癌細胞株（Ｐ−ｇｐを過剰発現する）の定着が、多剤耐性タンパク質のトランスポーターＰ−ｇｐにおけるタンパク質発現の重大な機能的な減少および喪失をもたらしたことを示す（５）。
【００４９】
特に本発明は、ＳｉｐＡが上皮細胞に生物学的に結合するように進化的にプログラムされた病原性微生物由来の分子であり、同様に癌などの不適な微小環境でも安定であるため、ＭＤＲおよび／またはｐ５３薬剤に基づく戦略を標的とする従来より開発された低分子実体と比較して大きな前進を示すという発見を提供する。
【００５０】
また本発明は、Ｐ−ｇｐの発現とアポトーシス（プログラム細胞死）の活性化とは反比例関係を有するとの発見も提供する。Ｐ−ｇｐタンパク質の発現は、細胞の生存の促進において主要な役割を果たしており、Ｐ−ｇｐはアポトーシスカスケードを触媒するために重要な酵素をおそらく押し出すことにより抗アポトーシス分子として主に機能する。よって、Ｐ−ｇｐを機能的にダウンレギュレートすることにより、本発明のナノ粒子は、腫瘍をアポトーシスに対してより感受性にするというさらなる利点を有する。アポトーシスを標的とする改善された治療は、２つの鍵となる知見に基づく：１）癌の発症に寄与する変化の多くはアポトーシスを受ける細胞の能力をも減少させる（９）。この死のプロセスが阻害される場合、通常は除去される損傷または欠損した細胞がその代わりに蓄積し、重大な病的問題を引き起こす；ｉｉ）様々な研究から、アポトーシスが、しばしば有効な治療の転帰であることが証明されている（９）。結果的に、本発明の利点のうちの１つは、新生物細胞におけるアポトーシスを促進することである。
【００５１】
さらに本発明は、ネズミチフス菌のエフェクターであるＳｉｐＡが、上皮細胞におけるＰＥＲＰ（ＰＭＰ−２２に関連するｐ５３アポトーシスエフェクター）の産生を促進すること、およびＳｉｐＡがｐ５３活性を増強して、安定させるといった、驚くべき偶然の発見を提供する。
【００５２】
本明細書中のデータは、ＳｉｐＡが、シグナル伝達経路を刺激するために上皮細胞のサイトゾルへ入る必要はなく、むしろ細胞外の上皮細胞表面で機能し、特異的受容体に結合することを示す。この知見は、ＩＩＩ型分泌装置エフェクタータンパク質が、シグナル伝達経路に結合するためには、細菌細胞から宿主細胞へと直接送達されなければならないという長年の考え方に対する挑戦であるため、パラダイムを変える驚くべき発見である。
【００５３】
また本発明は、従来の化学療法の治療の欠点に対処し、腫瘍サプレッサータンパク質である活性ｐ５３を同時に安定化させつつ、多剤耐性腫瘍を標的とする薬剤のナノキャリアーを提供する。新規の化学療法剤とＳｉｐＡとの同時結合型薬剤送達システムの設計は、ナノ粒子固有の物理化学的特性、ＳｉｐＡの生化学的機能的活性、および化学療法剤（ＦＤＡに認可されたドキソルビシンなど）の薬学的有効性を利用する。このナノキャリアーを使用した治療方法は、薬剤に関連する副作用を最小限にしつつ効能を顕著に改善することにより前例のない将来性のある治療を提供することから、本発明のナノ粒子組成物は、化学療法剤送達における新規のパラダイムを確立する。
【発明の詳細な説明】
【００５４】
本発明は、ＳｉｐＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む組成物を投与することにより疾患の１つまたは複数の症状を低減する組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、具体的に、Ｐ−ｇｐおよび／またはｐ５３の過剰発現に関連する疾患の症状の低減に有益である。本発明の組成物および方法は、癌の症状および／または癌の多剤耐性（ＭＤＲ）の低減に有益である。さらに本発明を、（１）宿主細胞とネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の相互作用、（２）サルモネラＴ３３エフェクタータンパク質（ＳｉｐＡ）、（３）疾患の症状を低減させる方法、および（４）ナノ粒子に結合したＳｉｐＡについてさらに説明する。
【００５５】
１．宿主細胞とネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の相互作用
１５０年にわたり細菌性病原体は、腫瘍の治療薬として研究されてきた（１）。例として、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、ヒトで食中毒を引き起こし、胃腸炎をもたらす通性腸内病原体である。またこの病原体は、全身投与の後腫瘍で選択的に増殖し、幅広いスペクトラムの細胞タイプ（すなわち腸、腎臓、肺、マクロファージ）にわたり多くの生化学的な経路を調節することができる（２、３）。（４）よって、これらの特徴を利用する本発明の組成物および方法は、従来の化学療法剤を妨害する多くの送達障壁を克服する固有の機会を提供する。
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、遠位の回腸内に主に位置する腸細胞に侵入することにより感染を開始し、宿主細胞の運命を制御し、その発病を誘導するためにＩＩＩ型分泌構造として知られている針状構造の利用を発達させている（５）。この洗練された分泌構造により、多くのサルモネラのエフェクタータンパク質は細菌から分泌された後、標的細胞のサイトゾルの中へと移動する。このような分泌型エフェクターは、宿主と共に発達しており、炎症性疾患および癌の治療薬の開発において根本的な共通の標的である多くのシグナリング伝達経路の調節に関与する宿主細胞タンパク質ときわめて巧妙に相互作用することから、治療薬として高い潜在性を有する（４、５）。
【００５６】
本発明者らは、サルモネラ‐宿主細胞の相互作用をＰ−ｇｐの発現および機能性に関して研究した。近年の報告は、Ｐ−ｇｐの過剰発現を多くの癌の有害な治療転帰に結び付けており、それによってこのＭＤＲ表現型を、薬理学的調節にとって重要な生物学的標的として同定した（６、７）。本発明者らのこれまでの研究は、Ｐ−ｇｐを過剰発現するヒト結腸癌細胞株を用いたネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の定着が、Ｐ−ｇｐにおける重大な機能の減少およびタンパク質発現の喪失をもたらすことを明らかにした（８）。同様に、ネズミチフス菌が、腫瘍を標的としてかつ腫瘍において選択的に増殖する（他の健康な臓器よりも腫瘍に２０００倍蓄積する）ことができることを証明する報告もある。
【００５７】
２．サルモネラＴ３ＳＳエフェクタータンパク質（ＳｉｐＡ）
本明細書中のデータは、サルモネラＩＩＩ型分泌エフェクターであるＳｉｐＡが、Ｐ−ｇｐのダウンレギュレーション作用に関与することを同定し、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）分泌型エフェクタータンパク質であるＳｉｐＡが、Ｐ−ｇｐを選択的かつ強力にダウンレギュレートできることを示す。本明細書中のデータは、ＳｉｐＡが、結腸癌、腎臓癌、および乳癌などのＰ−ｇｐを過剰発現すると知られているいくつかの癌においてＰ−ｇｐの発現を調節することを示す。本発明は、腫瘍における多剤耐性を低減（反転することを含む）することを目的とする新規戦略の開発にこのビルレンス決定因子を利用する。ＳｉｐＡは、ヒト宿主と共に共進化してきた安定な分子であるため、このビルレンス因子は、ＭＤＲを標的とする従来開発された低分子実体と比較して大きな前進を表すものである。
【００５８】
これらの知見を利用することにより、さらに本発明は、本発明者らが多剤耐性の逆転能を模倣する人工的なＳｉｐＡ結合型金ナノ粒子（ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ）系を作製した治療用途を提供する。この系を使用して、本発明者らは、ＳｉｐＡと結合したＡｕＮＰは、遊離の非結合型ＳｉｐＡよりもほぼ５００倍低い用量のＳｉｐＡで癌細胞におけるＰ−ｇｐ発現を低減できることを発見した。また本発明者らは、例示的な強力な癌化学治療剤であるドキソルビシンと併用して使用する場合、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰが腫瘍の増殖を抑制することを証明する。
【００５９】
「ＳｉｐＡ」および「サルモネラＴ３ＳＳエフェクタータンパク質」は、サルモネラエンテリカ亜種エンテリカ血清型ネズミチフス菌  ＳＬ１３４４の完全なゲノム配列（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１６８１０．１）のＤＮＡ配列（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｑ）ＳＬ１３４４＿２８６１によりコードされるサルモネラエンテリカ亜種エンテリカ血清型ネズミチフス菌  ＳＬ１３４４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６６１８．１）（図７）の配列番号１のアミノ酸配列により例示されるように、サルモネラにより産生されるタンパク質を指すよう互換可能に使用される。
【００６０】
いくつかの生物活性が、ＳｉｐＡに関して同定されている。たとえば、ＳｉｐＡは、アクチンの重合および細菌の浸潤に関与することが示されている（Ｚｈｏｕ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９９  Ｍａｒ  ２６；２８３（５４１０）：２０９２−５；  Ｓｃｈｕｍｂｅｒｇｅｒ  ＭＣ．  Ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ａｕｇ；６５（３）：７４１−６０）。ＳｉｐＡは、好中球の動員（Ｗａｌｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ｓｅｐ；９（９）：２２９９−３１３；  Ｓｉｌｖａ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００４  Ｊｕｎ；２８６（６）：Ｇ１０２４−３１  ；  Ｃｒｉｓｓ  ＡＫ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ｄｅｃ  ２１；２７６（５１）：４８４３１−９；  ａｎｄ  Ｌｅｅ  ＣＡ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０００  Ｏｃｔ  ２４；９７（２２）：１２２８３−８）、ＮＯＤ１／ＮＯＤ２シグナリング経路の活性化（Ｋｅｅｓｔｒａ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＢｉｏ．  ２０１１  Ｄｅｃ  ２０；２（６））、ならびにｐ３８ＭＡＲＫおよびＪＵＮ経路を介したＣＸＣケモカイン発現（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＪＦ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ２００９  Ｆｅｂ；１１（２）：３０２−１０）などの炎症促進性の応答に関与することが示されている。またＳｉｐＡは、Ｍｒｐ２のアップレギュレーショおよびＨＸＡ３系において活性であることも示されている（Ｐａｚｏｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８  Ｄｅｃ  １  ；１８１（１１）：８０４４−５２；  Ａｇｂｏｒ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｄｅｃ；１３（１２）：２００７−２１；  ａｎｄ  Ｍｒｓｎｙ  ＲＪ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４  Ｍａｙ  １１；１０１（１９）：７４２１−６）。
【００６１】
ＳｉｐＡのいくつかの生物機能に関連するＳｉｐＡの活性部位もまた、マップされている。たとえば、ＳｉｐＡのアクチン重合および細菌浸潤活性に関する活性部位は、カルボキシ末端に位置する（配列番号１のＡＢＤドメインの４４６〜６８５番目のアミノ酸）（Ｇａｌｋｉｎ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，  ５１８  −  ５２１  （２００２））。ＳｉｐＡのアクチン重合および細菌浸潤の活性部位はまた、ＳｉｐＡの中心領域に位置している（配列番号１の１０５〜４６番目のアミノ酸）に位置しており、これには、ＳｉｐＡの病巣形成の開始に必要で、ＡＢＤドメインと協調するＦ１（配列番号１の１７０〜２７１番目のアミノ酸）と、おそらくは分子間ＳｉｐＡ−ＳｉｐＡ相互作用を介したＳｉｐＡの病巣蓄積を増強するＦ２（配列番号１のアミノ酸位置２８０〜３９４）とが含まれる（Ｓｃｈｕｍｂｅｒｇｅｒ  ＭＣ．  Ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ａｕｇ；６５（３）：７４１−６０）。ＳｉｐＡのアクチン重合および細菌浸潤の活性部位はまた、ＴＴＳＳ−１輸送を媒介するＮ末端のＳｉｐＡ領域（配列番号１のアミノ酸位置１〜１０５）にも位置する（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｃｔｅｒｉｄ．  ２０００  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；  １８２（２３）：  ６６３８−６６４４）。
【００６２】
ＳｉｐＡの好中球動員活性に関する活性部位は、アミノ酸１３１個の領域であるＳｉｐＡａ３（配列番号１の２９４〜４２４番目のアミノ酸）に位置する（Ｗａｌｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ｓｅｐ；９（９）：２２９９−３１３）。
【００６３】
３．疾患の症状を低減させる方法
一実施形態では、本発明は、その必要のある哺乳類の対象（疾患のリスクのある対象を含む）の疾患の１つまたは複数の症状を低減する方法であって、前記疾患が、Ｐ−ｇｐおよびｐ５３の１つまたは複数を過剰発現する細胞と関連しており、上記方法が、
ＳｉｐＡ、および／またはＳｉｐＡ（配列番号１）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む組成物を上記対象に投与することであって、ＳｉｐＡ（および／またはポリペプチド配列）が、ａ）細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、ｂ）細胞における機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低下させること、およびｃ）細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増大させることのうちの１つまたは複数に有効な量であることを含む、方法を提供する。一実施形態では、ＳｉｐＡおよび／またはＳｉｐＡに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列は精製されている。
【００６４】
よって一実施形態では、実施例２および３のデータは、ＳｉｐＡが、細胞におけるＰ−ｇｐの発現レベルの低減に有効であることを証明した。
【００６５】
別の実施形態では、実施例４は、ＳｉｐＡが、カスパーゼ―３（ＣＡＳＰ３）によるＰ−ｇｐの切断のレベルを増加させ、よって、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐ切断産物および／または約６０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物を含むＰ−ｇｐの切断産物のレベルを増加させることにより、機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低減させることを示す。
【００６６】
さらなる実施形態では、ＳｉｐＡは、細胞におけるＰＥＲＰの発現レベルを増加させる。ＰＥＲＰは、ｐ５３腫瘍サプレッサーの転写標的として当初同定されたテトラスパン膜タンパク質である（１０）。ｐ５３は、細胞周期を調節し、それにより癌の予防に関与する腫瘍のサプレッサーとして機能する。そのため、ｐ５３は、ゲノムの変異を防止することによる安定性の保存におけるその役割を指して「ゲノムの守護者」と記述されている。ｐ５３の腫瘍のサプレッサーの役割の根本は、アポトーシスに関与する能力である。この考え方は、ヒトの癌の半分超におけるｐ５３の変異の存在（１１、１２）、および他の癌の大部分においてｐ５３の活性（他の機構による）が損なわれていることを明らかにした試験により強力に裏付けられている（１２）。表面の上皮細胞とＳｉｐＡの相互作用を調べる試験が行われている（１３、１４）。本発明者らは、ＰＥＲＰである、ｐ５３誘導型アポトーシス性エフェクターを、ＳｉｐＡと相互作用するパートナーとして同定するために、ベイトとして完全長のＳｉｐＡおよびプレイとしてヒト癌の結腸ｍＲＮＲベースのライブラリーを用いてスプリット‐ユビキチン法に基づく酵母ツーハイブリッド分析を使用した。ＳｉｐＡは、上皮表面でＰＥＲＰに結合するだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトの結腸癌においてＰＥＲＰのタンパク質発現をアップレギュレートする。機構を理解することは必ずしも必要ではなく、本発明はいかなる特定の機構にも限定されるものでもなく、アポトーシス応答の誘発におけるＰＥＲＰの正確な機能は知られていないままであるが、最初の報告は、ＰＥＲＰの発現が、ｐ５３の核局在化を引き起こし、転写的に活性のｐ５３タンパク質のレベルを増加させることを示している。さらに、他の研究から、ＰＥＲＰ発現の増加が、タンパク質の安定性の増加、翻訳後修飾、および核蓄積の増強を含むｐ５３の調節のいくつかの態様に影響を及ぼすことが見出された。これらの知見は、ＰＥＲＰがｐ５３の活性化の経路に影響を及ぼすことにより重要なシグナリング回路に位置し、ならびに機能的ｐ５３レベルの増強およびｐ５３の安定性の増加におけるこのタンパク質固有の役割を強調する。ＰＥＲＰ発現の喪失は、腫瘍発生を促進する（１５）。ＳｉｐＡはＰＥＲＰの産生を促進することから、本発明者らは、ｐ５３（アポトーシス）活性を高める手段としてのこの天然の応答を利用することができる。ｐ５３ベースの薬剤は、様々な生存指標を調節し、それによって腫瘍細胞における細胞増殖の阻害、選択的アポトーシス、および完全な腫瘍の増殖阻害をもたらすことが示されている。
【００６７】
一実施形態では、本発明の方法のいずれか１つを使用する治療に適している疾患として、限定するものではないが、癌、神経炎症（多発性硬化症など）（Ｋｏｏｉｊ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２００９；  ４（１２）：  ｅ８２１２）、自己免疫疾患（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００９  Ｎｏｖ；８６（５）：  １０７５−８７）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症（Ｊｏｎｅｓ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ．  ２００１  Ｊｕｌ  ２７；１５（１１）：  １３５３−８）が挙げられる。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明は、その必要のある哺乳類対象の癌の１つまたは複数の症状を低減させる方法であって、ＳｉｐＡおよび／またはＳｉｐＡと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列（配列番号１）を含む組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。実施例６の本明細書中のデータは、金ナノ粒子に結合したＳｉｐＡ（ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ）が例示的なマウスの結腸癌動物モデルにおいてドキソルビシンの効能を改善したことを示す。
【００６９】
一実施形態では、ＳｉｐＡおよび／またはＳｉｐＡと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列は精製されている。
【００７０】
本発明の方法は、少なくとも１つの細胞毒に耐性である癌細胞を含む癌に応用可能であることが好ましい。
【００７１】
一実施形態では、癌は、対照細胞と比較してＰ−ｇｐおよび／またはｐ５３を過剰発現する癌細胞を含む。
【００７２】
１つの好ましい実施形態では、癌細胞はＰ−ｇｐを過剰発現する。これは、結腸直腸癌（Ｈｏｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  １９９９  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４６（２５）：３１６−２１）、乳癌（Ｂｒｕｃｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＮＣＩ  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  （１９９７）  ８９  （１３）：  ９１７−９３）、膀胱癌（Ｔａｄａ，  Ｙ．ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００２  Ａｐｒ  １  ；９８（４）：６３０−５）、肉腫（骨肉腫を含む）（Ｃｈａｎ，  ＨＳ．  Ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  １９９７  Ｎｏｖ  １９；８９（２２）：  １７０６−１５）、星状細胞腫（血液脳関門）（Ｓａｄａｎａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２００３  Ｊｕｌ  ３０；１９８（１）：２１−７）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｌｅｉｔｈ，  ＣＰ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９９  Ａｕｇ  １；９４（３）：１０８６−９９）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｙａｇｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ２０１３  Ｆｅｂ；６２（３）：４１４−２０）などの血液系腫瘍により例証されている。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、癌細胞は、ＴＰ５３変異を含む。ＴＰ５３は、ヒトの癌で最も高頻度に変化した遺伝子であり、ヒトの癌の約５０％で不活性化されている（Ｔ．  Ｓｏｕｓｓｉ，  Ｃ．  Ｂｅｒｏｕｄ，  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ＴＰ５３  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １  （２００１），  ｐｐ．  ２３３−２４０）。
【００７４】
本発明の組成物は、好ましくは、治療量で投与される。用語「治療量」、「薬学的に有効な量」、「治療上有効量」、「生物学的有効量」、および「保護的な量」は、定量的および／または定性的であるかにかかわらず、望ましい結果を得るために十分な量を指すために本明細書において互換可能に使用される。特に、治療量は、関心対象組成物の非存在下と比較して疾患の１つまたは複数の症状を遅らせ、低減し、緩和し、軽減し、安定化し、防止し、かつ／または反転させる量である。例として、限定するものではないが、癌の疾患における腫瘍の大きさおよび／または腫瘍の数が挙げられる。
【００７５】
たとえば、特異的な「治療量」の「用量」は、投与経路、治療する対象のタイプ、および検討中の特定の対象の身体特徴に依存する。この量を決定するためのこれら要因およびこれらの関係は、医学、獣医学、および他の関連する分野の当業者によく知られている。この量および投与方法は、最適な効果を達成するために調節できるが、体重、食事、併用薬物治療、および当業者によって認識される他の要因などの要因に依存する。用量および投与回数は、有害な作用が実質的にない状態で化合物の有効レベルを作製するように選択される。
【００７６】
用量は、疾患のタイプおよび重症度、およびたとえば投与が１回もしくは複数回の個別投与であるかまたは持続投与であるかに応じて調節される。数日間またはそれ以上にわたる反復投与では、条件に応じて、治療は、疾患の症状の望ましい抑制が起こるまで繰り返される。
【００７７】
本発明の組成物は、予防的に（すなわち疾患の症状が観察される前）かつ／または治療的に（すなわち疾患の症状が観察された後）投与することができる。対象に「投与する」との用語は、対象に分子を提供することを意味する。これは、当技術分野で知られた方法を使用して行ってもよい（たとえばＥｒｉｃｋｓｏｎ  らの米国特許第６，６３２，９７９号；Ｆｕｒｕｔａ  らの米国特許第  ６，９０５，８３９号；  Ｊａｃｋｏｂｓｅｎ  らの米国特許第６，２３８，８７８号；Ｓｉｍｏｎ  らの米国特許第５，８５１，７８９号）。
【００７８】
投与は、１つまたは複数の疾患の症状の出現と同時であってもよい（すなわち症状の出現と同時または最中に投与してもよい）。同様に、本発明の組成物は、別のタイプの薬剤の投与または治療上の手法（たとえば外科手術）の前、同時、かつ／または後に投与してもよい。本発明の組成物の投与方法は、限定するものではないが、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所、および舌下の投与方法を含む。非経口投与経路は、たとえば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射、および点滴注入経路を含む。特定の実施形態では、投与は腹腔内投与である（実施例６参照）。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、リポソームとして送達するための脂質を含んでもよい。当該組成物を作製する方法は、当技術分野でよく知られている（Ｂｏｒｇｈｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １１，  ７１３−７２６；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  ｅ４１７１  ；  Ｆａｉｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７，  ６５３７−６５４５；  Ｈｕｗｙｌｅｒｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３，  ２１−２９；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３６３，  １５５−１６１；  Ｖｏｉｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６，  ４６５−４７４），  ＵＳ  ２０１１／０１２９５２６  Ａ１）。
【００８０】
一実施形態では、本発明の組成物は、当技術分野で知られた方法を使用して、送達用のナノ粒子、マイクロスフェア、マイクロ粒子、およびマイクロカプセルを含み得る（ＵＳ  ２０１１／０１２９５２６  Ａ１）。好ましい実施形態では、本発明の組成物はナノ粒子を含み得る。
【００８１】
本発明の方法は、１つまたは複数の細胞毒を対象に投与することをさらに含み得る。ＳｉｐＡ−ＡｕＮｐの治療のみを受けた腫瘍のＰ−ｇｐ発現レベルは控えめに低減されたのに対し（約１０％）、細胞毒のドキソルビシンとＳｉｐ−ＡｕＮＰの併用は、腫瘍におけるＰ―ｇｐの発現レベルの有意な低減をもたらした（約４０％）ことから、実施例６の本明細書中のデータは、細胞毒のドキソルビシンとＳｉｐＡ−ＡｕＮＰとの間の驚くべき相乗効果を示す。
【００８２】
細胞毒は、ＳｉｐＡの投与の前、および／または同時、および／または後に投与してもよい。実施例６は、金ナノ粒子に結合したＳｉｐＡが、マウスの結腸癌の動物モデルにおいてドキソルビシンの効能を改善したことを示す。
【００８３】
一部の実施形態では、ＳｉｐＡは、ａ）癌の細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低下させること、ｂ）癌の細胞における機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低減させること、およびｃ）癌の細胞のＰＥＲＰの発現のレベルを増加させることのうちの１つまたは複数において有効である治療量で投与される。
【００８４】
たとえば、ＳｉｐＡは、癌の細胞のＰ−ｇｐの発現レベルの低減に有効である治療量で投与され得る（実施例２および３参照）。
【００８５】
同様に、ＳｉｐＡは、癌の細胞における機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルの低減に有効である治療量で投与され得る。よって実施例４は、カスパーゼ―３（ＣＡＳＰ３）によるＰ−ｇｐの切断のレベルを増加させることにより、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物および／または約６０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物を含むＰ−ｇｐの切断産物のレベルを増加させることにより、ＳｉｐＡが機能的なＰ−ｇｐのレベルを低減させることを示す。
【００８６】
一部の実施形態では、Ｐ−ｇｐの発現レベルの低減は、ＳｉｐＡを投与しない場合と比較して哺乳類の細胞における１０％〜１００％の低減を含む。１０％〜１００％の低減は、たとえば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％の低減を含む。実施例３の本明細書中のデータは、精製ＳｉｐＡの投与の後の乳癌の細胞および膀胱癌の細胞においてそれぞれ、４０％および９５％のＰ−ｇｐの発現の低減を示す。
【００８７】
一部の実施形態では、本方法は、実施例２および３に記載される例示的な方法を使用して、哺乳類の細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、哺乳類の細胞における機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを決定することをさらに含む。これは、たとえば、カスパーゼ３によるＰ−ｇｐの切断により産生されるＰ−ｇｐフラグメントを含む、Ｐ−ｇｐの１つまたは複数の部分のレベルを決定することを含んでもよい。一部の実施形態では、Ｐ−ｇｐフラグメントは、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐ切断産物および約６０ｋＤａのＰ−ｇｐ切断産物のうち１つまたは複数を含む。実施例４の本明細書中のデータは、ＳｉｐＡが、カスパーゼ―３（ＣＡＳＰ３）によるＰ−ｇｐの切断のレベルを増加させ、よって、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐ切断産物および／または約６０ｋＤａのＰ−ｇｐ切断産物を含むＰ−ｇｐの切断産物のレベルを増加させることにより、機能的なＰ−ｇｐのレベルを低減させることを示す。
【００８８】
別の実施形態では、本方法は、哺乳類の細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを決定することをさらに含む。
【００８９】
特定の好ましい実施形態では、ＳｉｐＡは、細胞毒（たとえばドキソルビシン）に機能的に結合する。
【００９０】
さらなる実施形態では、ＳｉｐＡは、細胞に特異的に結合する標的化剤と機能的に結合する。本明細書中で使用されるように、用語「標的化剤」は、複合体の別の部分（治療分子など）と会合（すなわち、共有結合またはそうでなければ安定的に会合）する場合、後に複合体をイメージングできる、および／または複合体がその会合分子を送達する特異的部位に複合体を配向する化学分子を指す。適切な標的化剤は当技術分野でよく知られている。代表的な標的化剤は、１つの結合対である。たとえば、一実施形態では、標的化剤は抗体、抗体の抗原結合部、またはその抗原である。抗原は低分子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または多糖であり得る。一実施形態では、標的化剤は核酸またはその相補体である。核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。一実施形態では、標的化剤は酵素またはその基質である。一実施形態では、標的化剤は受容体またはそのリガンドである。一実施形態では、標的化剤は核酸またはそのパートナーのタンパク質である。一実施形態では、標的化剤は細胞、細胞膜、またはオルガネラのリガンドである。
【００９１】
一実施形態では、癌細胞と特異的に結合する標的化剤は、葉酸および「環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸」（「ｃＲＧＤ」）ペプチドを含む。ＲＧＤ−４Ｃ−ペプチドは、ヒト乳癌細胞および癌の内皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に結合することが示されている（Ｚｉｔｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，  ２００２  ６２；  ５１３９）。
【００９２】
癌細胞と特異的に結合する抗体は、当技術分野でよく知られており、乳癌（米国特許公開公報第２００４／０１５１７２４号）に特異的な抗体、前立腺癌に特異的な前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）抗体（国際特許公開公報第２０１１／０５７１４６号）、神経膠芽腫に特異的なＥＧＦＲ抗体（国際特許公開公報第２０１１／０５７１４６号）、肺癌に特異的なＡＦＡＩ抗体（米国特許公開公報第２００９／０２２６９４２号および米国特許公開公報第２００６／０１５９６８７号および国際特許公開公報第２００４／０７８０９７号）、ＴＡ９０特異的抗体などの泌尿器腫瘍関連抗原（ＵＴＡＡ）特異的抗体（米国特許第５，７００，６４９号および第５，９９３，８２８号、米国特許公開公報第２０１０／０２４７４４０号）を含む。
【００９３】
腫瘍のイメージングまたは治療などの特定の実施形態では、有用な抗体は、腫瘍関連抗原を標的とし得る。これらの抗原性マーカーは、腫瘍により産生される物質であってもよく、または腫瘍部位もしくは腫瘍細胞表面上もしくは腫瘍細胞内に蓄積する物質であってもよい。このうち、腫瘍関連マーカーは、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，  ”Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，  ｉｎ  Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｄ．，  ”Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，  ｐａｇｅ  ３４７  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １９７９）および米国特許第４，１５０，１４９号、第４，３６１，５４４号、および第４，４４４，７４４号に開示されるものである。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に関する報告は、Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １１  ：９９２−９７）；  Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：２２９−４８）；  Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２３：３５３６−４４）；  ａｎｄ  Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５，  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  ２４２：５５−６３）を含む。
【００９４】
関心対象の別のマーカーは、膜貫通型アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １  ：２５２−２５６（２０００）を参照されたい。
【００９５】
疾患がリンパ、リンパ腫、白血病、または自己免疫障害を含む場合、標的とされる抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子（たとえばｃ−ｍｅｔまたはＰＬＡＧＬ２）、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ−ｄ、ネクローシス抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択され得る。
【００９６】
特に好ましい実施形態では、標的化剤は、抗体、抗体の抗原結合部、環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）ペプチド、および葉酸により例示される。
【００９７】
さらに本発明は、ＳｉｐＡ、および／またはＳｉｐＡと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列（配列番号１）を含む組成物を哺乳類の細胞に投与することを含む方法であって、ＳｉｐＡ（および／またはポリペプチド配列）が、ａ）細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルを低減させること（実施例２および３参照）、ｂ）細胞における機能的な非切断型Ｐ−ｇｐのレベルを低減させること（カスパーゼ―３（ＣＡＳＰ３）によるＰ−ｇｐの切断のレベルを増加させることにより、約９０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物および／または約６０ｋＤａのＰ−ｇｐの切断産物を含むＰ−ｇｐの切断産物のレベルを増加させることにより、ＳｉｐＡが機能的なＰ−ｇｐのレベルを低減させることを示す、実施例４を参照）、およびｃ）細胞におけるＰＥＲＰの発現のレベルを増加させることの１つまたは複数において有効である量である、方法を提供する。
【００９８】
一実施形態では、ＳｉｐＡおよび／またはＳｉｐＡと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列は精製されている。
【００９９】
本発明の方法の一部の実施形態では、対照細胞と比較して、細胞はＰ−ｇｐおよびｐ５３の１つまたは複数を過剰発現する。
【０１００】
特に好ましい実施形態では、ｐ５３を過剰発現する細胞は癌細胞である。
【０１０１】
別の特に好ましい実施形態では、Ｐ−ｇｐを過剰発現する細胞は癌細胞および／または非癌性細胞である。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにある。
【０１０３】
Ｐ−ｇｐを過剰発現する例示的な非癌性細胞は、ＨＩＶに感染したリンパ球などのリンパ系細胞を含む。
【０１０４】
別の実施形態では、Ｐ−ｇｐを過剰発現する非癌性細胞は、腸上皮細胞を含む。実施例６の本明細書中のデータは、ＳｉｐＡは、アイソジェニックなネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）変異体株と比較して、ＳｉｐＡを過剰発現したネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株に感染させたマウスにおけるＰ−ｇｐの発現を有意に減少させたことを示す。
【０１０５】
一部の実施形態では、Ｐ−ｇｐを過剰発現する癌細胞は、結腸癌細胞（実施例２）、結腸直腸癌細胞、胃腸癌細胞、乳癌細胞（実施例３参照）、膀胱癌細胞（実施例３参照）、腎臓癌細胞、白血病の細胞、脳癌細胞、肉腫の細胞、星状細胞腫の細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の細胞の１つまたは複数を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、癌細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにあり、ＳｉｐＡの投与は、経口、経皮、静脈内、腹腔内（実施例６参照）、および／または局所注射であり得る。
【０１０７】
代替的な実施形態では、癌細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにあり、ＳｉｐＡの投与は、細胞毒の投与の前、および／または投与と同時、および／または投与の後である。
【０１０８】
４．ナノ粒子に結合したＳｉｐＡ
本発明は、１つまたは複数の精製ＳｉｐＡおよび／またはＳｉｐＡと少なくとも９５％の同一性を有する１つまたは複数のポリペプチド配列（配列番号１）を含むナノ粒子をさらに提供する。
【０１０９】
本発明のナノキャリアー粒子の機能的な設計は、サルモネラエフェクタータンパク質ＳｉｐＡが、化学療法の効能を改善するために重要な２つの経路：多剤耐性と腫瘍のサプレッサータンパク質であるｐ５３の安定化とを標的とするといった本発明者らの発見に基づくものであった。この技術の革新および従来にない性質のアプローチの中心は、ＳｉｐＡが、ドキソルビシンなどの既知の化学療法薬剤と併用して作用する薬剤ナノキャリアーの一部として作製される新規ＡｕＮＰ（金ナノ粒子）スキャフォールドの開発であった。本質的に、本発明者らは、多剤耐性を低減（反転を含む）するための細菌の模倣体として作用するナノ粒子を作製した。
【０１１０】
ナノ粒子に結合したＳｉｐＡ（ＳｉｐＡ−結合型ＡｕＮＰ細菌模倣体など）を使用する本発明の方法は、Ａｕ−ＮＰの固有の物理化学特性、ＳｉｐＡの生化学的な機能的活性を利用し、単独の治療として使用でき、かつ／またはドキソルビシンなどのＦＤＡに認可された多くの異なる化学療法剤と併用して使用することができる。必要に応じて、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ系を、さらに、たとえば抗体、環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸（ｃＲＧＤ）ペプチドおよび葉酸といった標的腫瘍細胞の表面上のその同族の受容体を認識するアクセプター分子に結合させることができる。このような結合は、望ましくないオフターゲットのｐ−ｇｐ作用を最小限にするためのＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ系の腫瘍標的化能をさらに改善する。まとめると、そのような細菌模倣体は、結腸癌、乳癌、および白血病を含む様々な癌を標的とするために異なる抗癌剤と併用することができる腫瘍の化学療法において多剤耐性を克服するための容易かつ強力なシステムを提示する。
【０１１１】
本発明の組成物は、本発明の方法のいずれか１つにおいて有益である。特定の実施形態では、ＳｉｐＡは、ナノ粒子に機能的に結合する。別の実施形態では、任意に、ナノ粒子は、細胞毒および／または細胞に特異的に結合する標的化剤にさらに機能的に結合する。一部の実施形態では、細胞に特異的に結合する標的化剤は、抗体、抗体の抗原結合部、環状‐アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸ペプチド（ｃＲＧＤ）の１つまたは複数を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、１ｎｍ〜１００ｎｍのナノ粒子などの金ナノ粒子を含む。特に好ましい実施形態では、ナノ粒子は１５ｎｍである。実施例５の本明細書中のデータは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）表面リガンドスペーサーを介してＳｉｐＡに結合した例示的な１５ｎｍの金ナノ粒子の構築および使用を記載している。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＳｉｐＡは、ナノ粒子：ＳｉｐＡの比率が少なくとも１：１でナノ粒子に機能的に結合している。一実施形態では、ナノ粒子：ＳｉｐＡの比率は、１：５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０などを含む、１：１〜１：１００の任意の比率である。好ましい実施形態では、ナノ粒子：ＳｉｐＡの比率は１：６である。実施例５の本明細書中のデータは、ナノ粒子：ＳｉｐＡの１：６の比率で金粒子に結合したＳｉｐＡの構築に成功したこと、およびこれら粒子の使用により、遊離の非結合型ＳｉｐＡよりもほぼ５００倍低いＳｉｐＡの用量で癌細胞におけるＰ−ｇｐの発現のレベルの低減に成功したことを示す（図５Ｂ）。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書中に記載されるナノ粒子のいずれか１つまたは複数と、希釈剤および／または賦形剤などの少なくとも１つの薬学的に許容可能な分子とを含む。
【０１１５】
例示的な「希釈剤」（「キャリアー」）は、水、生理食塩水溶液、ヒト血清アルブミン、油、ポリエチレングルコール、水性デキストロース、グリセリン、プロピレン、グリコール、または他の合成溶媒を含む。希釈剤は、液体（水、生理食塩水、培養培地、生理食塩水、水性デキストロース、およびグリコール）、または固体のキャリアー（デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、およびデキストランを例とする炭水化物、アスコルビン酸およびグルタチオンを例とする抗酸化剤、ならびに加水分解したタンパク質）であってもよい。
【０１１６】
「賦形剤」は、本発明の組成物の簡便かつ正確な投与を可能にするために、送達、吸収、増量にとって有用であり得る本発明の組成物用のキャリアーとして使用される不活性の物質である。賦形剤は、限定するものではないが、抗粘着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔ）、結合剤（たとえばデンプン、糖、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびメチルセルロースなどの改質セルロース、ラクトース、キシリトール、ソルビトール、およびマルチトールなどの糖アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール）、コーティング剤（たとえばセラック、トウモロコシタンパク質のゼイン、多糖）、崩壊剤（たとえばデンプン、セルロース、架橋したポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、充填剤（たとえばセルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、植物性の脂肪および油、およびラクトースなどの糖類）、希釈剤、芳香剤、着色剤、滑剤（たとえば二酸化ケイ素、タルク）、潤滑剤（たとえばタルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸）保存剤（たとえばビタミンＡ、Ｅ、Ｃ、セレニウム、システイン、メチオニン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベンなどの抗酸化剤）、吸着剤、甘味剤（たとえばシロップ）を含む。一実施形態では、賦形剤は、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）を含み、これは、増粘する、懸濁する、結合する、乳化する、フィルムを形成する、安定化する、分散する、水を保持する、および保護コロイド作用を提供することができる非イオン性の水溶性ポリマーである。ＨＥＣは非炎症性であり、膣の殺菌剤用の送達ビヒクルとして使用されている（Ｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，  （２００５）．  ２１  ：８４５）。
【０１１７】
実験
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示すために使用され、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０１１８】
実施例１
材料および方法
以下は、以下の実施例で使用される例示的な材料および方法の簡単な説明である。
【０１１９】
化学物質：抗Ｐ−ｇｐマウスｍＡｂ  Ｃ２１９およびＣ４９４を、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から購入した。ＣＡＳＰ３阻害剤（ＳＣ−３０７５）およびＣＡＳＰ１阻害剤（ＳＣ−３０７１）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）から購入した。抗ＨＡ親和性マトリックスおよびＨＡペプチドを、Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１２０】
細胞培養：ヒト腸管腺癌細胞株ＨＣＴ８を、（８）に従い維持した。ヒトの乳腺癌細胞株ＭＣＦ−７、ヒトの膀胱移行上皮癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３、およびＣＴ２６マウス結腸癌細胞株を、ＡＴＣＣから購入し、すべてを１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭＦ−１２中で、９０％の相対湿度および５％のＣＯ２、３７℃で維持した。
【０１２１】
細菌株、プラスミド、および増殖条件：すべてのネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は、ＳＬ１３４４由来であった。ＡＫＪ６３菌株は、既に記載されている（２２）。さらにΔＳｉｐＣ、ΔＳｉｐＢ、およびΔＳｏｐＡはすべて、既に記載されている（９、１１）。
【０１２２】
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）分泌型タンパク質の単離：野生型のネズミチフス菌ＳＬ１３４４または変異体を、（２２）に従ってＬＢ培地中で一晩増殖させた。この培養上清由来のタンパク質を、既に記載されているように、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリクロロ酢酸で沈殿させた（９）。
【０１２３】
ＳｉｐＡ−ＨＡ融合タンパク質の精製：ＳｉｐＡの精製を、Ｌｅｅらの研究に従って実施した（２２）。
【０１２４】
細胞のライセートおよびウェスタンブロット分析：細胞のライセートを、既に記載されているようにネズミチフス菌に感染したＨＣＴ８細胞から収集した（８）。タンパク質を３０μｇに標準化し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（４〜１２％の勾配；Ｂｉｏｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）により分離し、ニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；０．４５μｍのメンブレン）に転写した。１：１００に希釈したマウスモノクローナルＰ−ｇｐＣ２１９抗体を使用して、イムノブロットを行った。１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）を使用してバンドを検出して、ｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を使用して増強化学発光によりバンドを可視化した。
【０１２５】
ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ結合の化学
１．ジチオレート化テトラ（エチレングリコール）カルボン酸の合成
【化１】
2017502950.tif 000003
ウンデカ−１−エン−１１−イルテトラ（エチレングリコール）の合成。５０％水酸化ナトリウム水溶液０．３４ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）およびテトラ（エチレングリコール）４．０８ｇ（２１ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下、１００℃の油浴で約０．５時間攪拌し、次に１１−ブロモウンデカ−１−エン１．０ｇ（４．３ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間後、反応混合物を冷却し、ヘキサンで６回抽出した。減圧でのロータリーエバポレーションにより混合したヘキサン部の濃縮により、１ＨＮＭＲ分光法による分析に従って、モノエーテルとジエーテルの混合物を含む黄色の油を得た。シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル）による油の精製により、モノエーテル０．９８ｇを得た：収率７６％；  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣ１，）  １．２２−１．２７  （ｍ，  １０Ｈ），  １．２９−１．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４９−１．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９６−２．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７３−２．７６  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３８−３．４２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５２−３．６９  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．８６−４．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．７１−５．８２  （ｍ，  １Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）  Ｃ１９Ｈ３８Ｏ５  計算値３４６．５０、実測値３４７．２  ［Ｍ＋Ｈ］  ＋．
【０１２６】
０℃のウンデカ−１−エン−１１−イルテトラ（エチレングリコール）（１．０ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）を含む無水ＤＣＭ（６ｍｌ）の溶液に、ジアゾ酢酸エチル（０．７ｍＬ、５．７８ｍｍｏｌ）およびΒΡ３Εｔ２Ｏ（０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で３０分間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム（３ｍＬ）を添加し、反応混合物を分液漏斗に入れた。有機相を回収し、水相をＤＣＭ（５×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮すると、黄色の油が得られ、これをヘキサン：酢酸エチル（１：１）の勾配の溶離液を使用したクロマトグラフィーにより精製してエステルを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣＬ）  １．１９−１．２２  （ｍ，  １３Ｈ），  １．２６−１．３１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４６−１．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９３−１．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３５−３．３８  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５２−３．６９  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．１１−４．１６  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．８２−４．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．６９−５．７７  （ｍ，  １Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）  Ｃ２３Ｈ４４Ｏ７  計算値４３２．３１、実測値４５０．２  ［Ｍ＋Ｈ３Ｏ］＋
【０１２７】
エステル（０．１０ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を含む無水ＤＣＭ（１０ｍｌ）の溶液に、臭素（０．２８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を暗所で、０℃で４時間攪拌した。その後反応混合物を、ロータリーエバポレーターにおいて軽い減圧および温度３０℃の水浴を使用して溶媒を除去し、ならびに真空中の生成物の最終的な乾燥により単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣ１，）  １．２２−１．３８  （ｍ，  １３Ｈ），  １．４９−１．６１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．７１  −１．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４２−３．４７  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５８−３．７７  （ｍ，  １７Ｈ），  ３．８１−４．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１９−４．２２  （ｍ，  ３Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）  Ｃ２３Ｈ４４Ｂｒ２Ｏ７  計算値５９２．４０、実測値６１５．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【０１２８】
二臭素（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１１７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を含むアセトン（１０ｍｌ）の溶液に、チオ酢酸（１２９ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣ１，）  １．０９−１．３５  （ｍ，  １３Ｈ），  １．４８−１．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９３−２．０１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３２  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．０８−３．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．３９−３．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．５５−３．７８  （ｍ，  １７Ｈ），  ４．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８−４．２４  （ｍ，  ２Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）  Ｃ２７Ｈ５０Ｏ９Ｓ２  計算値５８２．８１、実測値６２１．３  ［Ｍ＋Ｋ］＋．
【０１２９】
次に、ジアクチル−ＯＥｔを含むエチル溶液に濃塩酸を添加し、一晩攪拌し、遊離チオール化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ，）  １．１８−１．３８  （ｍ，  １０Ｈ），  １．４９−１．６１  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．７２−２．９８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．３６−３．４２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５５−３．７７  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ２１Ｈ４２Ｏ７Ｓ２  計算値４７０．６８、実測値４７１．３  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０１３０】
２．Ａｕ−ＣＯＯＨの合成
１５ｎｍのＡｕＮｐを、還元剤としてのクエン酸塩および安定剤を使用して最初に合成した。ＨＡｕＣｌ４（１０ｍｇ）を水９０ｍｌに溶解し、溶液を沸点まで加熱した。クエン酸ナトリウム水溶液（５００μｌ、２５０ｎＭ）を煮沸溶液に添加し、色がワインレッドに変わるまで３０分間攪拌した。次に、得られたＡｕＮＰを３回洗浄した。その後ジチオレート化テトラ（エチレングリコール）カルボン酸５ｍｇを、水５ｍｌ中１０ピコモル濃度のＡｕＮＰと混合し、リガンド交換反応を一晩行った。得られたＡｕ−ＣＯＯＨナノ粒子を、Ｓｌｉｄｅ−  Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析ユニット（ＭＷ＝１０，０００）を使用してＤＩ水で２日間透析した。
【０１３１】
３．ＳｉｐＡ結合ＡｕＮＰの結合および特徴
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１０ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１０ｍｇを、Ａｕ−ＣＯＯＨの溶液２８ｍｌ（７．２０ｐｍｏｌ）に添加した。得られた溶液を室温で攪拌した。１時間後、溶液を遠心し、ＤＩ水で３回洗浄した。最終的に溶液を、ＤＩ水２ｍｌに濃縮した。ＳｉｐＡ溶液２００μｌ（５４０．７μｇ／ｍｌ）をこの溶液に添加した。この混合溶液を４℃の冷却室で攪拌した。１２時間後、溶液を遠心し、ＤＩ水で３回洗浄した。最終的に、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの原液を、ＤＩ水０．５ｍｌに濃縮し、次にＤＩ水において、Ｓｌｉｄｅ−  Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析ユニット（ＭＷ＝１００，０００）を用いて一晩透析した。
【０１３２】
皮下腫瘍モデル：８〜１０週齢の雌性Ｂａｌｂ／ＣマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から購入し、４日間馴化させた。ＣＴ２６細胞をトリプシン処理により収集し、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ＣＴ２６細胞（５×１０５）１００μｌを、右脇腹皮下に接種した（１６）。マウスを、対照群（ｎ＝６）または処置群（ｎ＝６）／群へとランダムに割り当てた。数日後、マウスは０．５ｍｍ３以下の体積の腫瘍を有し、２日間ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ（２００μｌ）を１．１μｇ／日でＩＰ注射した。翌日、マウスに、ＩＰ注射により送達するドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の１回薬剤処置を行った後、１．１μｇ／日のＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ（ＩＰ）を１５日間４８時間ごとに投与した。薬剤送達から２週間後に、マウスを屠殺し、腫瘍の大きさおよびＰ−ｇｐの発現に関して分析するため腫瘍を摘出した。ノギスを使用して腫瘍の大きさを測定し、式０．５×長さ×（幅）２を使用して体積を推定した。これら動物の管理は、プロトコル番号：  ２０４６−１２の下Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ施設内ガイドラインに従った。統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して行った。
【０１３３】
マウスの感染：マウスの感染は、既に記述されているように行った（９）。
【０１３４】
実施例２
ＳｉｐＡは、腸上皮細胞においてＰ−ｇｐの発現を調節する。
本発明者のこれまでの研究により、ネズミチフス菌ＳＰＩ−１がＰ−ｇｐの発現をダウンレギュレートするために必要であることが判明したため（８）、本発明者らは、ネズミチフス菌ＩＩＩ型分泌装置エフェクターをスクリーニングすることから始めて、どれがＰ−ｇｐの調節能が変化したかを決定した。本発明者らは、ＨＣＴ８ヒト腸癌細胞の単層を、サルモネラＩＩＩ型分泌装置トランスコロン変異体ΔＳｉｐＢまたはΔＳｉｐＣに曝露すると、これら変異体が、Ｐ―ｇｐの調節能を維持することを見出した（図１Ａ）。表現型の上では、これらの変異体は、エフェクターを分泌することができるものの、それらを宿主細胞に転位させることができない（９）。よって本発明者らの知見は、分泌されたエフェクターが、上皮細胞に直接送達されるのではなく、細胞外相互作用の結果としてＰ−ｇｐを調節することができることを示唆している。この可能性を調べるために、ＨＣＴ８上皮単層を、ネズミチフス菌から単離した分泌型タンパク質の抽出物に曝露した（実施例１）。このタンパク質抽出物単独の処置で、Ｐ−ｇｐの調節を誘発するには十分であることから（図１Ｂ）、次に本発明者らは、どれがＰ−ｇｐを調節できないのかを確立するために個々のネズミチフス菌ＩＩＩ型分泌装置エフェクター変異体を試験した。図１Ｃに示されるように、ネズミチフス菌ΔＳｉｐＡ変異体株（ＥＥ６３３）は、Ｐ−ｇｐの調節能が顕著に低減している。ΔｓｉｐＡ欠損変異体の特異性を、ｓｉｐＡ遺伝子を発現するプラスミドが、野生型株により誘発されるおおよそのレベルまでΔＳｉｐＡ変異体がＰ−ｇｐを調節する能力を回復することを証明することにより確認した（図１Ｃ）。
【０１３５】
ＳｉｐＡ単独が他のサルモネラまたはＩＩＩ型エフェクターの補助を用いることなくＰ−ｇｐの調節を誘導できるかどうかを試験するために、精製ＳｉｐＡ−ＨＡを、洗浄したＨＣＴ８細胞の上部のバッファーに添加した。８０μｇ／ｍｌまたは１６０μｇ／ｍｌＳｉｐＡ−ＨＡに細胞単層を３時間曝露すると、野生型のネズミチフス菌と同程度の用量依存的なＰ−ｇｐ調節能が得られた。この作用は、微量のリポ多糖によるものではなかった（図２ＡおよびＢ）。さらに、ＳｉｐＡがＰ−ｇｐの調節の原因であることをさらにバリデートするために、ネズミチフス菌ΔＳｉｐＡ変異体から単離した分泌型タンパク質の抽出物に、細胞単層を曝露した（実施例１）。この抽出物は、ＳｉｐＡを除くネズミチフス菌分泌型エフェクターをすべて含むものであり、図２Ｃに示されるように、Ｐ−ｇｐを調節しなかった。同様に単層を、再生した変異体であるネズミチフス菌ΔＳｉｐＡ／ｐＳｉｐＡからの分泌型タンパク質抽出物に曝露したところ、Ｐ−ｇｐの調節能を回復させた（図２Ｃ）。
【０１３６】
実施例３
ＳｉｐＡは、ヒト乳癌および膀胱癌細胞株におけるＰ−ｇｐの発現を調節する。
Ｐ―ｇｐの発現は、いくつかのタイプの悪性腫瘍においてアップレギュレートされることが報告されており、その予後不良に寄与するため（６、７）、本発明者らは、Ｐ−ｇｐをダウンレギュレートするＳｉｐＡの能力が幅広いスペクトラムであるかどうかを評価した。結腸癌細胞株と同様に、精製ＳｉｐＡ−ＨＡを、ＭＣＦ−７（乳腺癌）、およびＵＭ−ＵＣ−３（ヒト膀胱癌）などのＰ−ｇｐを過剰発現することが同様に知られている異なるタイプの癌細胞の細胞単層に曝露した。バッファーの対照と比較して、ＭＣＦ−７細胞に対する精製ＳｉｐＡの曝露は、用量依存的にＰ−ｇｐの発現を低減させ、４０％の低減を示した。同様に、本発明者らは、ＳｉｐＡ−ＨＡが、ＵＭ−ＵＣ−３細胞に関するＰ―ｇｐの発現を調節し、９５％の低減を示すことを見出した。ＨＣＴ８細胞へのＳｉｐＡ−ＨＡの曝露を、陽性対照とした（図３ＡおよびＢ）。これらの結果から、ＳｉｐＡのＰ−ｇｐ調節能は、腸上皮細胞に限定されないことが確認される。
【０１３７】
実施例４：Ｐ−ｇｐに関するＳｉｐＡの機構
本出願人の以前の研究により、Ｐ−ｇｐのタンパク質発現は、Ｐ−ｇｐのｍＲＮＡが対応して減少しないにもかかわらずサルモネラ感染上皮細胞においてダウンレギュレートされることが明らかとなった。この知見は、遺伝子発現の制御というよりも、細胞膜からのＰ−ｇｐの切断および／または再配置の機構と一致する。ヒトＴリンパ芽球様ＣＥＭ細胞を使用した近年の研究から、Ｐ−ｇｐがアポトーシスの最中にカスパーゼ‐３−依存性切断を受けることが示されており（１０）、タンパク質の切断／分解を伴う機構を介して、細胞がＰ−ｇｐを機能的にダウンレギュレートすることができるという証拠を与えている。以前に本発明者らは、ＳｉｐＡエフェクタータンパク質が、カスパーゼ‐３（ＣＡＳＰ３）の活性化を促進するために必要かつ十分であることを示したため（１１）、次に本発明者らは、ＣＡＳＰ３の薬理学的阻害剤の存在下および非存在下での、ネズミチフス菌感染後のＨＣＴ８細胞におけるＰ−ｇｐのタンパク質発現を試験した。図４Ａに示されるように、ウェスタンブロット解析から、カスパーゼ‐３の阻害は、ネズミチフス菌がＰ―ｇｐをダウンレギュレートするのを防止したが、ＣＡＳＰ１の阻害（陰性対照として使用）は防止しなかったことを示している。また同様の転帰が、ＣＡＳＰ３の発現に関してノックダウンしたＨＣＴ８細胞（低分子干渉（ｓｉＲＮＡ；（ｉｉ））を使用して観察され、Ｐ−ｇｐがこのトランスポーターを機能的にダウンレギュレートする手段としてＣＡＳＰ３−依存性切断を受けるという主張をさらに裏付けた。さらに、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのマウスＰ−ｇｐ（ヒトのＰ−ｇｐと８９％同一）モデリングにより、表面に曝露された２つのＣＡＳＰ３切断モチーフ（ＤＱＧＤおよびＤＶＨＤ；図４Ｃ）が明らかとなった。この知見と一致して、本発明者らは、ネズミチフス菌に感染したＨＣＴ８細胞が、Ｐ−ｇｐの発現に進行性の低減を示し、これが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのモデルから計算されるように、Ｐ−ｇｐの予測されるＣＡＳＰ３の切断産物の出現（９０ｋＤａ、および約６０ｋＤａ）と相関することをも見出した（図４ＣおよびＤ）。より小さな２５ｋＤａのバンドは分解されなかった。まとめると、これらの知見は、ネズミチフス菌がＳｉｐＡを介してＰ−ｇｐを調節する能力が、そのＣＡＳＰ３活性化能に依存しており、ＳｉｐＡがＣＡＳＰ３を活性化することを示す本発明者らの従来の知見と一致することを示唆する。
【０１３８】
実施例５
ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの構築
ＳｉｐＡがＰ−ｇｐを広くダウンレギュレートする能力を利用して、次に本発明者らは、有効な化学療法アジュバントとしてＳｉｐＡ結合型ナノ粒子を作製することを求めた。本発明者らは、金ナノ粒子が不活性であり毒性がなく（１２、１３）、簡単に合成かつ修飾され、結合した製剤（たとえばタンパク質（１４）および低分子薬（１２））を安定化させることから、金ナノ粒子をスキャフォールドとして選択した。本発明者らは、１００ｎｍ未満のナノ粒子が固有のＥＰＲ効果を有し、よって、効率よく細胞外に遊出して間質腔内に滞留することができ、その結果腫瘍部位でより高濃度のＳｉｐＡをもたらすことから（１５）、本研究に関して１５ｎｍの金ナノ粒子を作製した。
【０１３９】
遺伝子材料のため、および低分子薬物送達系としてのＡｕＮＰの使用の促進実質的に進んでいるが、滞留するまたは活性の高い機能的なタンパク質の送達は、タンパク質認識の維持および構造保持が不適切であるために難題である。これらの制限を克服するために、本発明者らは、生体適合性のテトラ（エチレングリコール（ＴＥＧ）スペーサーを挿入することにより、ＡｕＮＰにＳｉｐＡを直接結合するための表面リガンドを設計した（実施例１および図５Ａ）。このように適合させることにより、非特異的な相互作用および吸収を低減させ、かつ、結合したタンパク質の活性を高めるためのさらなる自由度および多価性を提供する。さらに、カルボン酸の末端は、その後のタンパク質のカップリングのためのプラットフォームを作製する。最後に、本発明者らは、タンパク質の解離または凝集を回避するために、ＳｉｐＡタンパク質をカルボキシル修飾ＡｕＮＰに共有結合させた（実施例１および図５Ａ）。
【０１４０】
表面に結合したＳｉｐＡタンパク質に対するＡｕＮＰの比率を決定するために、次に本発明者らは、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰを、金粒子のコアを分解するシアン化ナトリウムに曝露した。次に、この混合物を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析ユニット（ＭＷ＝１０，０００）を使用して２日間透析し、その後、質量分析での特徴づけのために４５μｌに濃縮した。質量分析の解析に基づき、ＳｉｐＡタンパク質の総量は、４２．２ピコモルであると決定され、ＡｕＮＰ：ＳｉｐＡの結合比率を１：６に確立した（実施例７）。その後のＳｉｐＡ−結合型ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験から、この新規のナノ粒子の設計が、表面に結合したＳｉｐＡタンパク質の安定性を大いに増加させ、遊離の非結合ＳｉｐＡよりもほぼ５００倍少ないＳｉｐＡの用量で癌細胞におけるＰ−ｇｐの発現を低減させることが判明した（図５Ｂ）。そのようなＳｉｐＡの機能性の亢進は、ほとんどが大きな表面（ＡｕＮＰの容積比）によるものであり、結合したタンパク質の分解を防止することにより、ＳｉｐＡタンパク質を劇的に安定化させる。さらに、単一のＡｕＮＰの表面上のＳｉｐＡタンパク質の多価性は、遊離の結合型ＳｉｐＡには存在しない相乗的な共同作用を提供し得る。
【０１４１】
実施例６
ＳｉｐＡは、マウスの結腸癌モデルにおけるドキソルビシンの効能を改善する。
次に、本発明者らは、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの結合体が、既知の化学療法剤であるドキソルビシンの効能を改善するかどうかを決定することを求めた。本発明者らは、Ｐ―ｇｐを過剰発現することが知られている癌を試験するためのプロトタイプのモデルとして、良好に確立されているマウスの皮下結腸癌モデルを使用した（１６）（１７）。このモデルの疾患は、８週齢以下のＢａｌｂ／ＣマウスのＣＴ２６結腸癌細胞の皮下注射により誘導される。触診可能な腫瘍が形成された日（約０．５ｍｍ３の大きさ）を、実験１日目とする。次にマウスに、２日間１．１μｇ／日のＳｉｐＡ−ＡｕＮＰをＩＰ注射した後、１回用量のドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ処置を行った。重要な目的は、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ自体がドキソルビシンの効能を改善することができるかどうかを評価することであるため、１０ｍｇ／ｋｇは、本発明者らが腫瘍の大きさに関して最小限の効果を示すと決定した薬物濃度である。この処置の後に、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰのＩＰ注射を、１５日間４８時間ごとに行い、その後ドキソルビシンの効能を、ｍｍ３での腫瘍の大きさにより評価した。
【０１４２】
図６Ａに示されるように、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ「ナノバグ」−ドキソルビシンの併用処置の後の腫瘍体積は、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ処置単独またはドキソルビシン処置単独を実施した後の腫瘍体積よりも有意に小さかった（Ｐ＜０．０００１）。
【０１４３】
本発明者らは、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰとドキソルビシンの併用療法で処置した腫瘍におけるＡｕＮＰの高濃度が、腫瘍の中心に選択的に局在していることを発見した（図６Ｂ）。一方、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰまたはＡｕＮｐ単独で処置した腫瘍では、粒子が拡散して分散していることが示された。これは、Ｐ−ｇｐ発現が、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰとＤＯＸの併用投与計画を投与した腫瘍において多いに減少したとの本発明者らの知見と一致するものである（図６Ｃ）。ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ処置のみを投与した腫瘍のＰ−ｇｐの発現の低減はわずか（〜１０％）であったことに注目されたい。安定した用量のＳｉｐＡ−ＡｕＮＰが直面する微小環境が異なることが、これらの知見の原因である可能性がある。たとえば、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰとＤＯＸの併用処置群では、化学療法剤と組み合わせたＰ−ｇｐ阻害の相乗効果は、腫瘍の大きさおよび細胞数の両方の顕著な減少を特徴とし、これによりＳｉｐＡ−ＡｕＮＰは、腫瘍にさらに浸透して、有効濃度で細胞に作用することができた。対照的に、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ投与計画のみを投与した群は、高い細胞増殖率の腫瘍に直面し、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの作用を効率的に薄めた。結果的に、これらの腫瘍は、Ｐ−ｐｇレベルの調節を示さなかった。
【０１４４】
この結果と一致して、ＳｉｐＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで健康なマウスの腸上皮におけるＰ−ｇｐの発現を調節することができる。正常で健康な腸上皮は、Ｐ−ｇｐのベースライン発現を示すことから、本発明者らは、アイソジェニックなＳｉｐＡの変異体株（ＥＥ６３３）の同等量を定着させたマウスと比較して、ＳｉｐＡ（Ａｊｋ６３）を過剰発現するネズミチフス菌株を定着させたマウスのＰ−ｇｐの結腸での発現を評価した。これらの条件下で、本発明者らは、Ｐ−ｇｐの発現を調節しなかったＳｉｐＡ変異体株と比較してＳｉｐＡを過剰発現する株を感染させたマウスにおいてＰ−ｇｐ発現の有意な減少を観察した（図６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＳｉｐＡタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰ−ｇｐのダウンレギュレーションの原因である証拠を提供する。同様に本発明者らは、ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰの細菌模倣体が、強力な癌化学療法剤であるドキソルビシンと併用して使用する場合に、腫瘍で蓄積し、腫瘍の退縮／阻害を促進し、同時にＰ−ｇｐ発現の減少を促進するという概念の最初の論証を確立する。
【０１４５】
実施例７
ＳｉｐＡに結合したナノ粒子
Ａ．ジチオレート化テトラ（エチレングリコール）カルボン酸の合成
ジチオレート化テトラ（エチレングリコール）カルボン酸の合成スキームを図８に示す。
【０１４６】
簡潔に記載すると、５０％の水酸化ナトリウム水溶液０．３４ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）およびテトラ（エチレングリコール４．０８ｇ（２１ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下、１００℃の油浴中で約０．５時間攪拌し、次に、１１−ブロモウンデカ−１−エン１．０ｇ（４．３ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間後、反応混合物を冷却し、ヘキサンで６回抽出した。減圧でのロータリーエバポレーションによる混合したヘキサン部分の濃縮により黄色の油が得られ、これは１ＨＮＭＲ分光法による分析によりモノエステルおよびジエステルの混合物を含んだ。シリカゲル（溶離液：酢酸エチル）でのクロマトグラフィーによる油の精製から、モノエステル（化合物１）０．９８ｇを得た：収率７６％；  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣＬ）  １．２２−１．２７  （ｍ，  １０Ｈ），  １．２９−１．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４９−１．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９６−２．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７３−２．７６  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３８−３．４２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５２−３．６９  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．８６−４．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．７１−５．８２  （ｍ，  １Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ１９Ｈ３８Ｏ５  ３４６．５０、実測値３４７．２  ［Ｍ＋Ｈ］  ＋．
【０１４７】
ウンデカ−１−エン−１１−イルテトラ（エチレングリコール）（化合物１）（１．０ｇ  ２．８９ｍｍｏｌ）を含む無水ＤＣＭ（６ｍｌ）の溶液にジアゾ酢酸エチル（０．７ｍＬ、５．７８ｍｍｏｌ）およびＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（０．２９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を０℃で３０分間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム（３ｍｌ）を添加し、反応混合物を分液漏斗に入れた。有機相を回収し、水相をＤＣＭ（５×１５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、黄色の油に濃縮し、ヘキサン対酢酸エチル（１：１）の勾配溶出を使用したクロマトグラフィーにより精製して、エステル（化合物２）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣ１，）  １．１９−１．２２  （ｍ，  １３Ｈ），  １．２６−１．３１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４６−１．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９３−１．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３５−３．３８  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５２−３．６９  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．１  １  −４．１６  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．８２−４．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．６９−５．７７  （ｍ，  １Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ２３Ｈ４４Ｏ７  計算値４３２．３１、実測値４５０．２  ［Ｍ＋Ｈ３Ｏ］＋．
【０１４８】
エステル（化合物２（０．１０ｇ、０．２３ｍｍｍｏｌ）を含む無水ＤＣＭ（１０ｍｌ）の溶液に、臭素（０．２８ｍｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を、暗所で、０℃で４時間攪拌した。その後、反応混合物を、ロータリーエバポレーターにおいてわずかな減圧および３０℃の水浴を使用した溶媒の除去、ならびに真空での生成物の最終的な乾燥により単離した（化合物３）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣＬ）  １．２２−１．３８  （ｍ，  １３Ｈ），  １．４９−１．６１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．７１−１．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４２−３．４７  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５８−３．７７  （ｍ，  １７Ｈ），  ３．８１−４．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１９−４．２２  （ｍ，  ３Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ２３Ｈ４４Ｂｒ２Ｏ７  計算値５９２．４０、実測値６１５．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【０１４９】
二臭素（化合物３（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１１７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を含むアセトン（１０ｍｌ）の溶液に、チオ酢酸（１２９ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌した（化合物４）１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣ１，）  １．０９−１．３５  （ｍ，  １３Ｈ），  １．４８−１．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９３−２．０１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３２  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．０８−３．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．３９−３．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．５５−３．７８  （ｍ，  １７Ｈ），  ４．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８−４．２４  （ｍ，  ２Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ２７Ｈ５０Ｏ９Ｓ２  計算値５８２．８１、実測値６２１．３  ［Ｍ＋Ｋ］＋．。
【０１５０】
ジアクチル‐ＯＥｔ（化合物４）を含むエチルアルコールの溶液に、濃塩酸を添加し、一晩攪拌して遊離チオール化合物（化合物５）を提供した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣＬ）  １．１８−１．３８  （ｍ，  １０Ｈ），  １．４９−１．６１  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．７２−２．９８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．３６−３．４２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７  Ｈｚ），  ３．５５−３．７７  （ｍ，  １６Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ）．  ＭＳ  （ＥＳＩ−ＭＳ）Ｃ２１Ｈ４２Ｏ７Ｓ２  計算値４７０．６８、実測値４７１．３  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５１】
Ｂ．表面結合型ＳｉｐＡタンパク質に対するＡｕＮＰの比率の決定
コロナＳｉｐＡタンパク質に対するＡｕＮＰの比率を決定するために、本発明者らは、金粒子のコアを分解するシアン化ナトリウムにＳｉｐＡ−ＡｕＮＰ（７．２ピコモル濃度）の試料を曝露した。次に、これにより得た溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ΜＩＮＩ透析ユニット（ＭＷ＝１０，０００）を使用して１日間透析し、その後４５μｌに濃縮した。この試料および同じ容量のＳｉｐＡのみ（４５μｌ、５４０．７μｇ／ｍｌ）の試料をトリプシン消化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００にカップリングさせたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｑ−ＴＯＦ  ６５３８質量分析計で測定した。ＳｉｐＡタンパク質由来のペプチドＩＰＥＰＡＡＧＰＶＰＤＧＧＫ（［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ  ６５２．８５０５）を、ＭＳ／ＭＳのスペクトルの一致を介して同定し、タンパク質の定量化の代理として選択した。上述した２つの試料由来のこのペプチドに関して抽出したイオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）のピークを積分し、比較した（図９）。タンパク質のみ／ＳｉｐＡ―ＡｕＮＰ由来のタンパク質の比率は、積分面積に基づき７．５である。ＳｉｐＡ−ＡｕＮＰからのＳｉｐＡの総量は、以下の式により決定できる。
（数１）
（４５μｌ×５４０．７μｇ／ｍｏｌ）／７．５＝３．２４μｇまたは
３．２４μｇ／７４，０００ｇ／ｍｏｌ（ＳｉｐＡのＭＷ）＝４３．８ピコモル濃度
よってＡｕＮＰおよび結合したＳｉｐＡの比率は、１：６（７．２ピコモル対４３．８ピコモル）と推定された。
【０１５２】
「背景技術」および「発明の詳細な説明」で上述された参照文献
【表１】
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【０１５３】
「発明の詳細な説明」および「実施例」で上述された参照文献
【表２】
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【０１５４】
上記明細書で言及したそれぞれおよびすべての刊行物および特許は、その全体が参照として本明細書中に援用される。本発明に記載される方法およびシステムの様々な修正および変更は、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく当業者にとって明らかなものである。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されているが、請求される本発明は、当該特定の実施形態に不当に限定されるものではない。実際に、当分野およびこれに関連する分野の当業者に明らかである本発明を実行するための記載される形式の様々な修正が、以下の特許請求の範囲内にあるものとして意図されている。
【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【国際調査報告】
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