(57)【要約】本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが付加したＶＬＰを唯一の活性成分として含有し、かつ非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤を含有するワクチンと、その使用とを提供する。本発明はさらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを有したＶＬＰと、１つまたは複数の非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤とからなるワクチンを含有する医薬組成物、およびそれとの治療剤混和物ならびにその使用を提供する。【選択図】図１
2017500313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加したＶＬＰと、（２）１つまたは複数の非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤とを含み、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加したＶＬＰは、ワクチン中の唯一の活性成分である、ワクチン。
【請求項２】
請求項１に規定のワクチンと、それに混和された治療剤とを含む、がんを治療する医薬組成物。
【請求項３】
前記ＶＬＰは、目的の部位に少なくとも１つの第１の非天然アミノ酸を含むように修飾されたウイルス被覆ポリペプチドを含み、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、第１の非天然アミノ酸との化学反応に関与して共有結合を形成する反応性官能基を含むように修飾される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
ＶＬＰタンパク質モノマーに結合するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＶＬＰモノマーとの比率が、１：２４から１：１２、１：１２から１：６、１：６から１：３、１：３から２：３または１：２から１：１に相当するような量（モル）である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、平均でＶＬＰ当たり１０から５０コピー、ＶＬＰ当たり４０から８０コピー、ＶＬＰ当たり７０から１７０コピー、ＶＬＰ当たり１６０から２４０コピーに相当する量でＶＬＰに結合する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記配列は、５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’に示されるようなホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合との混合物を有し、記号「＊」は、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換することを示す、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記配列は、５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’に示されるようなホスホロチオエート結合を有し、記号「＊」は、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換することを示す、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列の３’端に５−オクタジニルデオキシウリジンまたは改変デオキシウリジンまたはリンカーをさらに含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ＶＬＰは、図１もしくは図５に示される配列またはその一部を含むＢ型肝炎コアタンパク質によって形成される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ＶＬＰは、バクテリオファージ、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多角体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトボカウイルスまたはパルボウイルス、およびノロウイルスからなる群から選択されるウイルス被覆タンパク質またはその一部を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、ＰＤＬ２阻害剤、Ｂ７−Ｈ３阻害剤、Ｂ７−Ｈ４阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＣＤ１６０阻害剤、Ａ２ａＲ阻害剤およびＶＩＳＴＡ阻害剤からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の活性を遮断する抗体もしくはその断片またはそれらの誘導体である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療剤は、レナリドマイド、イピリムマブ、リツキシマブ、アレムツマブ、オファツムマブ、フラボピリドール、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、ＡＢＴ−１９９、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ヅアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エゾルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロックスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イデラリシブ、塩酸イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オビヌツズマブ、オルマプラチン、オキシスラン、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、パーホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサトロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、リツキシマブ、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、および塩酸ゾルビシンからなる群から選択される抗がん剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に規定のワクチンのＶＬＰをコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に規定のｃＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１６に規定の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
適切な宿主細胞に請求項１８に規定のベクターを含む宿主ベクター系。
【請求項２０】
前記適切な宿主細胞は、細菌細胞である、請求項１９に記載の宿主ベクター系。
【請求項２１】
前記適切な宿主細胞は、真核細胞である、請求項１９に記載の宿主ベクター系。
【請求項２２】
適切な培養条件下で請求項１９に規定の宿主ベクター系を培養して、宿主中でウイルスゲノム不含のＶＬＰを生産することと、そうして生産されたウイルスゲノム不含のＶＬＰを回収することとを含む、ワクチン中でウイルスゲノムタンパク質を含まないＶＬＰを生産する方法。
【請求項２３】
請求項２２に規定の方法によって生産された、ウイルスゲノム不含のＶＬＰ。
【請求項２４】
請求項１または２に規定の組成物と、任意選択で試薬および／または使用説明書とを含む、がんを阻害するキット。
【請求項２５】
有効量の請求項１に規定のワクチンを対象に投与して、がんを阻害し、それによって対象を治療することを含む、がんに罹患した対象を治療する方法。
【請求項２６】
有効量の請求項２に規定の医薬組成物を対象に投与して、がんを阻害し、それによって対象を治療することを含む、がんに罹患した対象を治療する方法。
【請求項２７】
腫瘍細胞を有効量の請求項１に規定のワクチンに接触させて、腫瘍細胞を阻害して対象を治療することを含む、がんに罹患した対象を治療する方法。
【請求項２８】
腫瘍細胞を有効量の請求項２に規定の医薬組成物に接触させて、腫瘍細胞を阻害して対象を治療することを含む、がんに罹患した対象を治療する方法。
【請求項２９】
前記がんは、固形腫瘍であり、投与は、腫瘍内である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
対象は、哺乳動物である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物は、ヒト、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスまたはラットである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんは、乳がん、大腸がん、膵臓がん、前立腺がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ））、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、頭頸部がん、メラノーマまたは濾胞性リンパ腫を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３３】
固形腫瘍の成長を阻害するのに有効な量で、請求項１に規定のワクチンを対象に腫瘍内投与することを含む、対象で固形腫瘍の成長を阻害する方法。
【請求項３４】
固形腫瘍の成長を阻害するのに有効な量で、請求項２に規定の組成物を対象に腫瘍内投与することを含む、対象で固形腫瘍の成長を阻害する方法。
【請求項３５】
前記腫瘍は、乳がん腫瘍である、請求項３３または３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願を通じて様々な刊行物が参照される。本発明が関連する技術分野での態様をさらに充分に記載するために、これらの刊行物の開示は、その全体において、ここに参照により本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、より良い治療レジメンを必要とする健康上の主要な問題である。アメリカがん学会では、２０１２年に１，６３８，９１０人超が新たにがんを診断され、５７７，１９０人ががんで死亡したものと推定している。トリプルネガティブ乳がん、脳がんや膵臓がんなど、多くのがんは、依然として、治療法のない致命的な疾患である。患者は、耐え難くそして多くの有害事象をはらんだ何年にもわたる治療に向き合う可能性がある。ステージＩＶの乳がん患者の５年生存率は約２２％であり、神経膠芽腫患者は４％から１７％の範囲であり、膵臓がん患者は１％から１４％の範囲である。
【０００３】
治療ワクチンは、がんにおいて非常に良い潜在性を実証し始めている。例えば、シプロイセルＴは、現在、前立腺がんに認可された樹状細胞ワクチンであり、歴史あるイディオタイプ（Ｉｄ）ワクチンのプログラムでは、特異的な抗Ｉｄ免疫応答が、無増悪生存期間および全生存期間に強く関連することが実証された。残念ながら、以前のワクチンは、一貫して強い免疫応答を生じず、また、例えば、シプロイセルＴを用いる治療は、多くの患者に有効ではない煩雑なプロセスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、がん、例えば固形がん腫瘍などの疾患に対する治療剤として使用するのに充分な免疫応答を誘導する、ＣｐＧが付加または接続した新規の特異的ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供することによって、本技術分野の課題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが接続されたＶＬＰを唯一の活性成分として含み、かつ非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤を含むワクチンと、その使用とを提供する。さらに提供されるのは、そのようなワクチンと治療剤とを共に混和して含む組成物、およびその使用である。
【０００６】
本発明はさらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを有したＶＬＰを唯一の活性成分として含み、かつ１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤と１つまたは複数の非毒性の医薬的に許容されうる担体、結合剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤および／またはビヒクルを含むワクチン、ならびにその使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢＣ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す図である。
【図２】ＣｐＧ−Ｘの核酸配列の例を示す図である。
【図３】メチオニン置換を使用したＨｅｐＢコアの発現の分析を示す図である。ＨｅｐＢコアプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、撹拌フラスコ中、最小培地で拡大培養した後、継続して２リットルのバイオリアクター中、最小限のメチオニン共存下で拡大培養し、続いて、ＩＰＴＧを用いた誘導および１：２０の比率のメチオニンとアジドホモアラニンの添加を行った。精製されたＨｅｐＢコアモノマー、分子量標品、および発現誘導前後の試料を示す。
【図４】ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＶＬＰへのコンジュゲーションの分析を示す図である。大腸菌およびＣｐＧ−Ｘによって生産されたＶＬＰの３つのコンジュゲーション反応の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。端的に述べれば、６０μＭ当量モノマーの１．２５ｍｇのＶＬＰ、８０μＭのＣｐＧ−Ｘ、２００μＭのアスコルビン酸塩、２５０μＭのＴＴＭＡ増強剤、５００μＭのＣｕ（Ｉ）を調製し、アルゴン分散させた１０ｍＭリン酸カリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８中、１２５０マイクロリットルの総反応体積で混合した。反応は、３０度で一晩進ませた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図５−１】１４９アミノ酸のＨｅｐＢコアタンパク質を発現させて本発明のＶＬＰを生産するために使用した、ＤＮＡ構築物を示す。妥当な生物学的シグナル、コード配列および制限酵素切断部位を有したｐＥＴ２１−ＨｅｐＢコアプラスミドＤＮＡの線図を示す。
【図５−２】１４９アミノ酸のＨｅｐＢコアタンパク質を発現させて本発明のＶＬＰを生産するために使用した、ＤＮＡ構築物を示す。ＨｅｐＢコアタンパク質コード配列（太字の下線部）およびＴ７プロモーター（下線部）の場所と併せて、ｐＥＴ２１−ＨｅｐＢコアプラスミド構築物の完全長の核酸配列を示す。
【図５−３】１４９アミノ酸のＨｅｐＢコアタンパク質を発現させて本発明のＶＬＰを生産するために使用した、ＤＮＡ構築物を示す。ＨｅｐＢコアタンパク質コード配列（太字の下線部）およびＴ７プロモーター（下線部）の場所と併せて、ｐＥＴ２１−ＨｅｐＢコアプラスミド構築物の完全長の核酸配列を示す。
【図５−４】１４９アミノ酸のＨｅｐＢコアタンパク質を発現させて本発明のＶＬＰを生産するために使用した、ＤＮＡ構築物を示す。ＨｅｐＢコアタンパク質コード配列（太字の下線部）およびＴ７プロモーター（下線部）の場所と併せて、ｐＥＴ２１−ＨｅｐＢコアプラスミド構築物の完全長の核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン」は、がんに罹患した哺乳動物に投与された際に免疫応答を刺激する、本発明のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む調合剤である。治療ワクチンは、がんの発症中または発症後に投与されてもよい。予防治療ワクチンは、がんなどの疾患の発症前に投与されてもよく、その疾患の発症を予防、阻害または遅延させることが意図される。
【０００９】
本明細書で使用される場合、用語「ＶＬＰ」は、ウイルスの非感染性のサブユニットから作製されるウイルス様粒子であり、該サブユニットは、構造を、一般には正二十面体の形態で形成する。ＶＬＰは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび／または免疫チェックポイント阻害剤の多価の提示に対し許容性がある。ＶＬＰは、カプシドタンパク質のモノマー／サブユニットの、例えば、約６０の倍数個の被覆またはカプシドタンパク質のモノマー／サブユニットの集合体を含有しうる。ＶＬＰは、正二十面体構造に基づいて、被覆タンパク質サブユニットによって形成されるが、このサブユニットは、様々な数の被覆タンパク質を含む他の二十面体の中でも、例えば６０個（Ｔ＝ｌ）、１２０個（Ｔ＝２）、１８０個（Ｔ＝３）、２４０個（Ｔ＝４）、３６０個（Ｔ＝７ｄ）、４２０個（Ｔ＝７）、７８０個（Ｔ＝１３）、９６０個（Ｔ＝１６）、１２６０個（Ｔ＝２１）、１５００個（Ｔ＝２５）または１６２０個（Ｔ＝２７）のカプシドタンパク質を含む。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に基づくＶＬＰの場合、一態様では、１８０個または２４０個のＨＢＶ被覆タンパク質モノマー（本明細書ではまた、ウイルス被覆ポリペプチドとも参照される）は、２つの異なるタイプのＶＬＰを形成することができるが、これらのタイプは、例えば、それぞれＴ＝３またはＴ＝４の正二十面体の対称性を用いて配列される。ＨＢＶコアタンパク質（本明細書ではまた、ＨｅｐＢコアタンパク質とも参照される）から形成されるＶＬＰに用いるために、本発明は、一態様では、Ｃ末端で切断されかつＮ末端では最初の１４９アミノ酸が無傷のままである（アミノ酸１〜１４９）ＨＢＶ被覆タンパク質を提供し、該ＨｅｐＢコアＶＬＰは、例えば１８０個または２４０個のＨｅｐＢコアモノマータンパク質のアセンブリによって形成される。
【００１０】
例えば、ＶＬＰ−アジドとは、少なくとも１つのアジド官能基がＶＬＰに存在することを指し、その存在は、アジド官能基を具える非天然アミノ酸を組み込むことなどを介しており、例えば、アジドホモアラニンがある。アジドホモアラニンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチド鎖中のメチオニンと置換するのに使用してもよく、この置換は、メチオニン欠損培地中で成長させたメチオニン要求株にアジドホモアラニンを提供することに依る。あるいは、アジドホモアラニンは、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）系を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成に導入されてもよい。アジド官能基の存在によって、アルキン官能基を用いた銅触媒性［３＋２］付加環化または「クリックケミストリー」に関与することが可能になる。アジド官能基を有する他の非天然アミノ酸は、利用可能であり、ＶＬＰモノマーまたはカプシドタンパク質を含むポリペプチド中に導入されうる。アジド官能基を有するそのような非天然アミノ酸としては、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００１１】
例えば、ＶＬＰ−アルキンとは、少なくとも１つのアルキン官能基がＶＬＰに存在することを指し、その存在は、アルキン官能基を有する非天然アミノ酸を組み込むことなどを介している。この組み込みは、例えば、メチオニン要求株でＶＬＰを発現させる間に、部分的にまたは完全にメチオニンと置換するものとしてホモプロパギルグリシンを供給し、それゆえメチオニンがアルキン含有非天然のアミノ酸に置き換えられることに依る。あるいは、非天然アミノ酸はまた、終止コドン、例えばアンバー終止コドンＵＡＧの導入と、所望の非天然アミノ酸で荷電されたサプレッサーｔ−ＲＮＡの使用とを介して、所望の部位でポリペプチド内に組み込まれることがある。このことは、特異的なポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物中の工学的に作製された終止コドンを抑制することを通じて、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むことを可能にする（ＢｕｎｄｙおよびＳｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、第２１巻、２５５〜２６３頁（２０１０年））。いずれの場合も、アルキン官能基の存在によって、アジド官能基を用いた銅触媒性［３＋２］付加環化または「クリックケミストリー」が可能になる。
【００１２】
本明細書で使用されるときの「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格によって接続された１つまたは複数のシトシン−グアニンジヌクレオチドを含む非メチル化オリゴヌクレオチドを指す。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホジエステル−ホスホロチオエート骨格を有していてもよい。これらのモチーフは、哺乳動物では、Ｔｏｌｌ様受容体によって「病原体関連分子パターン」として認識される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの例としては、図２に示されるような配列が挙げられるが、これらに限定されない（本発明の組成物の節も参照されたい）。
【００１３】
図２はまた、５−オクタジニルｄＵなどのリンカーに連結されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを示すが、該オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧ−Ｘ」と称され、ここで、「Ｘ」は、架橋剤（二機能性の架橋剤）またはリンカーを表す。「リンカー」は、オリゴヌクレオチドに付加された化学物質を意味し、アルキン基、アジド基、カルボニル基、アミン基またはスルフヒドリル基など、化学官能性を含む。リンカーの追加の例としては、マレイミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、二機能性架橋剤、ポリエチレングリコール誘導体、例えばスクシンイミド−マレイミドＰＥＧや、一方の端にＮＨＳエステル、他方にマレイミド基を有するＳＭ（ＰＥＧ）ｎなど、ペプチドリンカー、ペプチド核酸リンカー（ＰＮＡ）、および修飾型核酸リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイントを遮断する薬剤を指す。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、免疫応答の程度を制御するために重要な免疫細胞に存在する阻害経路である。これらの経路の遮断は、免疫細胞の調節の低減と、免疫細胞の活性の増加につながりうる。
【００１５】
「ベクター」、「構築物」または「プラスミド」という用語は、所望のコード配列と、具体的な宿主生物中でのそのコード配列の発現に必要な適切な核酸配列とを含む組換え核酸分子を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列としては、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらくは他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。「ベクター」、「構築物」または「プラスミド」はまた、ＲＮＡ転写物の産生に続く無細胞タンパク質合成系で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳系でなど、具体的な宿主生物の状況の外で使用されてもよい。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「活性成分」は、生物（人または動物対象）に投与された際に、局所および／または全身に作用することによって、所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する物質である、任意の化合物または組成物を含む。
【００１７】
したがって、本発明の実施形態の文脈で「唯一の活性成分」という句は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加したＶＬＰが、ワクチン中のただ１つの、または排他的な活性成分であることを意味する。しかし、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加したＶＬＰは、ワクチン中でただ１つの、または排他的な活性成分ではなく、なぜなら、該ＶＬＰが、賦形剤および他の非活性剤、例えば、保存もしくは対象への適正な投与に用いるワクチンを製剤化するために必要なものを含有するためである。さらに、本発明は、該ワクチンおよび１つまたは複数の治療剤、例えばそれらの混和物を含む医薬組成物または製剤を提供する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、哺乳動物を意味する。哺乳動物は、ヒト、または非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿、ウサギやウシなどの動物とすることができるが、これらの例に限定されない。哺乳動物でヒト以外を、障害、例えばがんに関連する障害の動物モデルを表す対象として、好都合に使用することができる。さらに、本明細書に記載の方法および組成物は、家畜化された動物および／またはペットを治療するために使用することができる。「患者」および「対象」という用語は、互換的に使用される。対象は、雄とすることも雌とすることもできる。
【００１９】
本発明のＶＬＰワクチンは、医薬的に許容されうる剤形で、活性成分を含む医薬組成物の形態で投与されうる。疾患および治療される患者のタイプ、ならびに投与経路に応じて、組成物は、様々な用量で投与されうる。投与は、腫瘍内デリバリ、腫瘍周囲デリバリ、腹腔内デリバリ、鞘内デリバリ、筋肉内注射、皮下注射、静脈内デリバリ、経鼻噴霧および粘膜デリバリ（例えば経粘膜デリバリ）、動脈内デリバリ、脳室内デリバリ、胸骨内デリバリ、頭蓋内デリバリ、皮内注射、エレクトロインコーポレーション（例えばエレクトロポレーションを用いて）、超音波、ジェット注入器、および局所パッチを含めた方法に拠るが、これらに限定されない。
【００２０】
投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および該製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有しうる、水性または非水性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含みうる、水性または非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで存在し得、凍結乾燥（真空下での凍結乾燥）状態で、例えば注射用の水など、滅菌液体担体を使用直前に添加することのみを要する状態で保存されうる。即席の注射溶液および懸濁液は、既に記載された類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されうる。
【００２１】
本明細書に記載の本発明のＶＬＰワクチンが、対象に供されている際に、当業者は、その投与量は、以下に限定されないが、対象の体重、疾患およびその進行、または腫瘍のサイズ、または腫瘍の進行を含む、いくつかの要因に依存することを理解する。治療の継続期間および頻度については、該治療が治療上の利点を提供しているか否かを決定するために、また、投与量を増加するかまたは低減するか、投与頻度を増加するかまたは低減するか、治療を中断するか、再開するか、または治療レジメンに他の変更を加えるかを決定するために、熟練の医療者が対象をモニターすることが一般的である。
【００２２】
一実施形態では、本発明に有用な投与プロトコールの非制限的な例は、最初の期間の間に、本発明の多価ＶＬＰワクチンを複数回投与することを含む（例えば２週間毎の投与を例えば６週間など）。さらに、投与プロトコールはまた、最初の投与時に、本発明の多価ＶＬＰワクチンを複数回投与することを含む（多価ＶＬＰワクチンの最初の投与時に腫瘍内の複数部位になど）。
【００２３】
本発明のＶＬＰワクチンについて本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、対象に投与される多価ＶＬＰの量を意味し、その量は、がんなどの疾患を阻害するよう哺乳動物による免疫応答をもたらす。さらに、有効量とは、そのような量を受けていない対応の対象に比較して、疾患、障害もしくは副作用の治療、治癒、予防もしくは寛解の向上、または疾患もしくは障害の進展の低下をもたらす任意の量を含む。この用語はまた、正常な整理機能を増強するのに有効な量をその範囲に含む。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍を阻害すること」は、当技術分野に公知であり受け入れられているような任意の方法で測定されうるが、そのような方法としては、腫瘍の完全な退化（完全な応答）；、腫瘍のサイズもしく体積の低減か、あるいは既に観察されている腫瘍の成長を遅延させること、例えば、ベースラインの最長径（ＬＤ）の和を参照とした際の腫瘍のＬＤの和の少なくとも約１０〜３０％の低下（部分的な応答）；混在応答（ある種の腫瘍にあって他にはない退化もしくは安定化）；または、治療開始以来の最小のＬＤの和を参照とした際に、腫瘍の成長もしくは進行がなく、部分的な応答に適する充分な退縮も、疾患の進行に適する充分な増加もないことが挙げられる。
【００２５】
腫瘍またはがんの状態はまた、腫瘍もしくはがん細胞の数、濃度または密度を、単独でまたは参照についてサンプリングすることによって、評価されうる。腫瘍またはがんの状態はまた、乳がんでのＨｅｒ−２や前立腺がんでのＰＳＡなど、代替マーカーを使用することを通じて評価されうる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」とは、療法を使用して、疾患、障害、または疾患もしくは障害の１つもしくは複数の生物学的な症状を寛解すること、直接的もしくは間接的に（ａ）疾患もしくは障害につながる、もしくはそれらを担う生物学的カスケードの１つもしくは複数の点で、または（ｂ）疾患もしくは障害の生物学的な症状のうち１つもしくは複数に、干渉すること、疾患、障害、または１つもしくは複数のそれらの徴候もしくは障害もしくは治療に関連付けられた、１つもしくは複数の徴候、影響もしくは副作用、を寛解させること、あるいは、疾患、障害、または疾患もしくは障害の１つまたは複数の生物学的な症状の進行を遅延させることである。治療はまた、疾患または障害に悩む対象のために人生の質を向上させることを含みうる（例えば、がんに悩む対象は、本明細書に記載の本発明の組成物を用いて免疫されている際に、さらに低い用量の抗がん剤を受けうる）。本明細書を通じて、本発明の組成物およびその使用のため方法が提供され、それを必要とする対象に適切な治療を提供するために選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の組成物を用いた治療は、対象に免疫応答を誘発および／または持続させる。免疫応答としては、自然免疫応答、適応免疫応答、またはその両方が挙げられる。自然免疫応答は、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、および／または樹状細胞によって媒介されうる。獲得免疫応答としては、液性応答（すなわち、抗体の生産）、細胞性応答（すなわち、Ｔリンパ球の増殖および刺激）、またはその両方が挙げられる。細胞性応答の活性化および持続の測定は、任意の公知の方法によってなされうるが、そのような方法としては、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイが挙げられる。液性応答もまた、公知の方法によって測定されうるが、そのような方法としては、ＩｇＧやＩｇＭの抗体画分など、本発明の組成物（例えばワクチン）に特異的な抗体の力価の単離および定量が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療（例えば免疫療法）は、スタンドアロン療法として、他の任意の療法と組み合わされることなく使用される。
【００２９】
他の実施形態では、本明細書に記載の治療（例えば免疫療法）は、対象に規定される他の療法、例えばがん療法に対する、補助療法を提供する。例えば、本明細書に記載の治療（例えば免疫療法）の方法は、放射線療法、化学療法、遺伝子療法または外科手術と組み合わせて投与することができる。組み合わせは、本明細書に記載の治療（例えば免疫療法）が、補助療法の前に、それと共に、またはそれに続いて、投与されうるようになされる。
【００３０】
本発明に従って、抗疾患または障害治療（例えばがん治療）の効果は、対象をモニタリングすることによって、例えば、生存期間または疾患無増悪期間（無病生存期間）を測定および比較することによって、評価されうる。任意の応答の評価は、治療を受けなかったかもしくはプラセボを処置された個人と、または代替治療を受けた個人と比較されうる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」とは、それらの状況または生物学的な症状の可能性および重症度を実質的に減少させるために、またはそのような状況または生物学的な症状の発生を遅延させるために、薬剤を予防的に投与することを参照するものと理解される。当業者は、予防が絶対的な用語ではないことを認識するであろう。予防療法は、例えば、対象が具体的な疾患または障害（例えばがん）を発症する高い危険性があると考えられる際に、対象が疾患または障害の強力な家族歴を有する際や、対象が例えば疾患の原因薬剤、例えば発癌物質に曝露されている際などに、適正である。
【００３２】
実施する実施例中以外、または別段に指示される箇所以外で、本明細書に使用される、成分の量または反応条件を表現するあらゆる数は、あらゆる場合で「約」という用語によって、修正されるものと理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用される際の「約」という用語は、±１〜１０％の範囲を意味しうる。
【００３３】
単数の使用は、具体的に別段の記述がない限り、複数を含む。「ａ」または「ａｎ」という言葉は、具体的に別段の記述がない限り、「少なくとも１つ」を意味する。「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／または」を意味する。「少なくとも１つ」という節の意味は、「１つまたは複数」という節の意味と等価である。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は制限されていない。「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」や「含有される（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」などの他の形態の使用は制限されていない。また、「要素」や「構成要素」などの用語は、要素または構成要素の両方を包含し、それらは、具体的に別段の記述がない限り、１を超える単位を含む一単位および要素または構成要素を含む。
【００３４】
本発明の組成物
本発明は、（１）ＣｐＧオリゴヌクレオチドが付加したＶＬＰと、（２）１つまたは複数の非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤とを含むかまたは含有する、ワクチンを提供する。１コピーまたは複数コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＶＬＰの表面に付加または接続されうる。一実施形態では、ワクチン中の唯一の活性成分は、付加された１コピーまたは複数コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有するＶＬＰである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９分子のアゴニストでありうる。
【００３５】
本発明はさらに、（１）１つまたは複数のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫チェックポイント阻害剤が付加したＶＬＰと、（２）１つまたは複数の非毒性の医薬的に許容されうる担体または希釈剤とを含有するかまたはそれらからなる、ワクチンを提供する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドと免疫チェックポイント阻害剤がそれぞれ、ＶＬＰの表面に付加または接続されうる。一実施形態では、ワクチン中の唯一の活性成分は、１コピーまたは複数コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび免疫チェックポイント阻害剤を付加されて含有するＶＬＰである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９分子のアゴニストでありうる。
【００３６】
さらに、ウイルスゲノム不含のＶＬＰは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）またはパルボウイルス（Ｐａｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のうちいずれか由来のウイルス被覆ポリペプチドを含んでいてもよい。好ましくは、ＶＬＰは、ウイルスゲノム不含の安定な正二十面体のＶＬＰである。
【００３７】
具体的には、ウイルス被覆タンパク質が由来としうるウイルスの例としては、バクテリオファージ、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多角体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトボカウイルスまたはパルボウイルス、およびノロウイルスが挙げられる。一実施形態では、バクテリオファージは、ＭＳ２バクテリオファージ、Ｐ１様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、Ｔ４様ウイルス、Ｐ２２様ウイルスおよびラムダ様ウイルスとしうる。Ｂ型肝炎ウイルス由来のＶＬＰが好適である。
【００３８】
本発明の一実施形態では、ＶＬＰに付加するＣｐＧオリゴヌクレオチドの平均量は、ＶＬＰ当たり１から１０コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＶＬＰ当たり１０から５０コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＶＬＰ当たり４０から８０コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＶＬＰ当たり７０から１７０コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはＶＬＰ当たり１６０から２４０コピーのＣｐＧオリゴヌクレオチドに相当しうる。別の実施形態では、ＶＬＰタンパク質モノマーに付加するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド：ＶＬＰの重量比が、１：１０００から１：１００、１：１００から１：１０、１：１０から１：４、１：４から１：２、または１：２から１：１に相当するような量としうる。さらに別の実施形態では、ＶＬＰタンパク質モノマーに付加するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド：ＶＬＰの比が、１：２４から１：１２、１：１２から１：６、１：６から１：３、１：３から２：３、または１：２から１：１に相当するような量（モル）である。
【００３９】
本発明の一実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含む。核酸分子、オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＡＡＣＧＴＴ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’または５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊ＡＣＧＴ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’または５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’または５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’におけるホスホジエステル結合体とホスホロチオエート結合体との混合物である修飾オリゴヌクレオチドとし得、＊は、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置き換えることを示す。本ＣｐＧオリゴヌクレオチドのさらに他の実施形態は、リンカーを分子（ＣｐＧ−Ｘ）に導入するが、例えば、アルキン基、アジド基、カルボニル基、アミン基やスルフヒドリル基など、特有の化学官能基を含有する化学物質を、配列の５’端または３’端にカップリングすることによってそれを行い、例えば、それぞれ（リンカー）−５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ  ３’または５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ−（リンカー）３’である。好適なＣｐＧ−Ｘ実施形態では、アルキン官能基が、ＣｐＧ分子に導入されるが、例えば、５−オクタジニルｄＵ（５）を、配列の３’端にカップリングすることによってそれは行われ、例えば、５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＧ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ−（５−Ｏｃｔ−ｄＵ）３’または５’  Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ−（５−Ｏｃｔ−ｄＵ）  ３’である。アルキン官能基は、ＶＬＰのカプシドタンパク質内に組み込まれたアジド官能基と共に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、その結果、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに架橋されたＶＬＰを生じうる。
【００４０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの追加の例としては、（１）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５３と称する）、（２）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５５と称する）、（３）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴ  ３’（Ｍ３５４と称する）；（４）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５２と称する）、（５）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ５９３と称する）、（６）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ５９４と称する）、（７）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ５９５と称する）、（８）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ５４６と称する）、（９）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ６４０と称する）、（１０）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ６４２と称する）、（１１）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’  （Ｃ６４４と称する）、（１２）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５６と称する）、（１３）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５７と称する）、（１４）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’（Ｍ３６１と称する）、（１５）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’（Ｍ３６２と称する）、（１６）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｍ３５８と称する）、（１７）５’  ＴＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ３’（１０１８と称する）、（１８）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ３’（Ｃ２７４と称する）、（１９）５’  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  Ｔ  ３’（Ｃ５８３と称する）、（２０）５’  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＴ  ３’（Ｃ５８２と称する）、（２１）５’  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ３’（Ｃ６３７と称する）、（２２）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ３’（２００６と称する）、（２３）５’  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ３’（Ｃ６３０と称する）、（２４）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ３’（Ｃ６３１と称する）、（２５）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  Ｔ  ３’（Ｃ６３３と称する）、（２６）５’ＧＧｇ  ｇｇａ  ｃｇａ  ｔｅｇ  ｔｅｇ  ＧＧＧ  Ｇｇ  ３’（２２１６と称する［１２］）、（２７）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ３’（２００６と称する［５］）、（２８）５’  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’  （Ｍ３８３と称する）、（２９）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ��ＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’（Ｍ３８４と称する）、（３０）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’（Ｍ３８５と称する）、（３１）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  Ｔ  ３’（Ｍ３８６と称する）、（３２）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧ  ３’（Ｍ３８７と称する）および（３３）５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ  ３’（Ｍ３８８と称する）（Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、第７３巻、７８１〜７９２頁；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、第３３巻、１６３３〜４１頁）が挙げられるが、これらに限定されない。上記のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格、ホスホロチオエート骨格、または混合ホスホジエステル−ホスホロチオエート骨格を有していてもよい。
【００４１】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドをＶＬＰに付加するために、ＶＬＰのウイルス被覆ポリペプチドは、ウイルス被覆ポリペプチドの合成の間のメチオニンの位置でのアジドホモアラニンの組み込みなど、目的の部位に少なくとも１つの第１の非天然のアミノ酸（非自然なアミノ酸または非正規アミノ酸（ｎｎＡＡ）とも参照される）と、ＣｐＧ−Ｘを生成するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドの３’端の５−オクタジニルｄＵなど、アルキン官能基に付加されたＣｐＧオリゴヌクレオチドとを含むように修飾されうる。ＶＬＰのカプシドタンパク質内に組み込まれたアジドホモアラニンのアジド官能基は、ＣｐＧ−Ｘのアルキン官能基と共に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、その結果、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに架橋されたＶＬＰを生じうる。同じＶＬＰ内にある他の非天然アミノ酸含有カプシドタンパク質は、同様に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加または接続されたＶＬＰを生成し、２つまたはそれ以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドを具えるＶＬＰを生じうる。
【００４２】
同様に、免疫チェックポイント阻害剤をも付加されて有するＶＬＰをワクチンが含有する実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤が、少なくとも１つの第２の非天然アミノ酸を含むように修飾され得、ここで、第１の非天然アミノ酸は、第２の非天然アミノ酸とは異なっており、第２の非天然アミノ酸に反応性がある。第１の非天然アミノ酸の一例は、アジドホモアラニンである。第２の非天然アミノ酸の一例は、プロパルギルオキシフェニルアラニンである。ＶＬＰのカプシドタンパク質内に組み込まれたアジドホモアラニンのアジド官能基は、ポリペプチドに基づく免疫チェックポイント阻害剤などのポリペプチド剤に組み込まれた、プロパルギルオキシフェニルアラニンのアルキル官能基と共に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、その結果、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに架橋されたＶＬＰを生じうる。同じＶＬＰ内にある他の非天然のアミノ酸含有カプシドタンパク質は、同様に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、免疫チェックポイント阻害剤に付加または接続されたＶＬＰを生成し、２つまたはそれ以上の免疫チェックポイント阻害剤を具えるＶＬＰを生じうる。
【００４３】
同様の戦略を使用して、反応性のあるアジド官能基を有したＶＬＰは、タンパク質または核酸ではない、免疫チェックポイントタンパク質の拮抗リガンドや低分子阻害剤を含めた阻害剤など、他の非タンパク質性または非核酸ベースの治療剤とカップリングすることができ。これは、アルキン官能基を用いてこれらの薬剤を官能基化することを介して行われる。そのような非タンパク質性または非核酸ベースの治療剤は、（３＋２）環化付加クリック反応を介してＶＬＰに付加され、非タンパク質性または非核酸ベースの治療剤が付加または接続されたＶＬＰを生成しうる。
【００４４】
本発明の一実施形態では、ＶＬＰは、カプシドモノマーサブユニット当たり少なくとも１つのまたは少なくとも２つの天然アミノ酸を含有する。例えば、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の少なくとも５０分の１が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の１２分の１が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の１０分の１が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約４分の１が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。さらに別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約３分の１が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。いっそう別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約半分が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを付加するために使用されうる。例えば、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約３分の２が、ＣｐＧ−Ｘオリゴヌクレオチドに付加するために使用されうる。別の例では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約５分の４が、ＣｐＧ−Ｘオリゴヌクレオチドに付加するために使用されうる。
【００４５】
また、本発明の一実施形態では、ＶＬＰにて、少なくとも２５分の１のウイルス被覆タンパク質が、そこに付加されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。別の実施形態では、少なくとも１０分の１のウイルス被覆タンパク質が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。別の実施形態では、少なくとも５分の１のウイルス被覆タンパク質が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。いっそう別の実施形態では、約半分のウイルス被覆タンパク質が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。さらに別の実施形態では、約３分の２のウイルス被覆タンパク質が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。さらなる実施形態では、ほぼ全てのウイルス被覆タンパク質が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提示しうる。
【００４６】
別の実施形態では、本発明のウイルスゲノム不含のＶＬＰは、初期反応性リンカーを３’端または５’端に具えたＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含み、該リンカーは、ＶＬＰまたはＶＬＰカプシドタンパク質にカップリングする（例えば、共有結合的に付加される）ために使用され、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをＶＬＰまたはＶＬＰカプシドタンパク質に架橋するように化学反応に加わるリンカーである。リンカー（反応性リンカーなど）の例としては、アルキン基、アジド基、カルボニル基、アミン基またはスルフヒドリル基などの化学官能基が挙げられる。本発明の好適な実施形態では、反応性リンカーは、５−オクタジニルデオキシウリジンであり、これは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの３’端に位置する修飾デオキシウリジンである（例えば、図２に示されるように）。ＶＬＰとのカップリングに続いて、結果として得られる生成物は、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドにリンカーを介して共有結合的に付加されるが、共有結合形成反応に加わる反応性官能基をもはや持たないＶＬＰである。
【００４７】
さらに、本発明は、固形腫瘍がんを治療するための医薬組成物について追加的に提供し、該組成物は、本発明の任意のＶＬＰワクチンと、該ワクチンに混和される１つまたは複数の治療剤とを含む。第２の治療剤が添加される一実施形態では、該第２の治療剤は、ワクチンと混和される治療剤と同じであっても異なる治療剤であってもよい。
【００４８】
そのように混和される治療剤としては、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する薬剤（本明細書では免疫チェックポイント阻害剤とも参照される）が挙げられるが、それらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤の例としては、ＰＤ−１（例えばＰＤ−１阻害剤または抗ＰＤ−１剤）、ＣＴＬＡ−４（例えばＣＴＬＡ−４阻害剤または抗ＣＴＬＡ−４剤）、ＬＡＧ３（例えばＬＡＧ３阻害剤または抗ＬＡＧ３剤）、ＫＩＲ（例えばＫＩＲ阻害剤または抗ＫＩＲ剤）、ＴＩＭ３（例えばＴＩＭ３阻害剤または抗ＴＩＭ３剤）、ＴＩＧＩＴ（例えばＴＩＧＩＴ阻害剤または抗ＴＩＧＩＴ剤）、ＢＴＬＡ（例えばＢＴＬＡ阻害剤または抗ＢＴＬＡ剤）、ＣＤ１６０（例えばＣＤ１６０阻害剤または抗ＣＤ１６０剤）、ＶＩＳＴＡ（例えばＶＩＳＴＡ阻害剤または抗ＶＩＳＴＡ剤）およびＡ２ａＲ（例えばＡ２ａＲ阻害剤または抗Ａ２ａＲ剤）を阻害する薬剤が挙げられる。あるいは、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント受容体のリガンドを阻害し得、そのような受容体の例としては、ＰＤＬ１（例えばＰＤＬ１阻害剤または抗ＰＤＬｌ剤）、ＰＤＬ２（例えばＰＤＬ２阻害剤または抗ＰＤＬ２剤）、Ｂ７−Ｈ３（例えばＢ７−Ｈ３阻害剤または抗Ｂ７Ｈ３剤）、Ｂ７−Ｈ４（例えばＢ７−Ｈ４阻害剤または抗Ｂ７−Ｈ４剤）が挙げられよう。薬剤は、標的受容体（例えばＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０またはＡ２ａＲ）またはリガンドを遮断する、単離された抗体または断片またはその誘導体である。さらに、該薬剤は、免疫チェックポイントタンパク質またはリガンドの活性を遮断する低分子であってもよい。リガンドは、免疫チェックポイント経路内の標的受容体などの免疫チェックポイントタンパク質の拮抗物質または選択的モジュレーターであってもよい。
【００４９】
本発明に従って、単離された抗体は、単離され精製されたモノクローナル抗体としてもよい。さらに別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、標識化抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、または親和性成熟抗体である。他の実施形態では、抗原結合断片は、ラクダ化単ドメイン抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ｄｓＦｖ、（ｄｓｆｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓ抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２またはドメイン抗体である。他の実施形態では、抗原結合断片は、定常領域に動作可能に付加し、ここで、該定常領域は、カッパ軽鎖、ガンマ−１重鎖、ガンマ−２重鎖、ガンマ−３重鎖、またはガンマ−４重鎖である。
【００５０】
さらに別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、治療剤（例えば、化学療法剤）、毒素、放射性同位体、または検出可能な標識にコンジュゲートされてもよい。
【００５１】
そのように混和される治療剤の追加の例としては、共刺激分子である薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。共刺激剤の例としては、ＨＶＥＭ；ＩＣＯＳＬ；４−１ＢＢＬ；ＯＸ４０Ｌ；ＧＩＴＲＬ；ＣＤ４０Ｌ；およびＣＤ２８（例えばＣＤ２８作動薬）、ＩＣＯＳ（例えばＩＣＯＳ作動薬）、ＣＤ１３７（例えばＣＤ１３７作動薬）、ＯＸ４０（例えばＯＸ４０作動薬）、ＣＤ２７（例えばＣＤ２７作動薬）、ＣＤ４０（例えばＣＤ４０作動薬）、ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ−３９としても知られる）（例えばＣＤ４０Ｌ作動薬）、ＬＩＧＨＴ（例えばＬＩＧＨＴ作動薬）、ＬＴ−アルファ（例えばＬＴ−アルファ作動薬）、ＧＩＴＲ（例えばＧＩＴＲ作動薬）を刺激する薬剤；および上述のリガンドの模倣物が挙げられる。薬剤は、標的受容体（例えばＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファおよび／またはＴＮＦＲＳＦ１８としても知られるＧＩＴＲ）を刺激する、単離された抗体または断片またはその誘導体、例えば抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＬＩＧＨＴ抗体、抗ＬＴ−アルファ抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体などとしうる。さらに、該薬剤は、標的受容体を刺激する低分子であってもよい。
【００５２】
治療剤のさらに別の例としては、Ｔｒｅｇ活性を抑制する薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。Ｔｒｅｇ抑制剤の例としては、ＧＩＴＲを刺激する薬剤（例えばＧＩＴＲ作動薬）、またはリガンド、またはそのリガンドの模倣物が挙げられる。該薬剤は、標的受容体（例えばＧＩＴＲ）を刺激する、単離された抗体または断片またはその誘導体としうる。抗体の一例は、ＴＲＸ−５１８である。タンパク質の別の例は、ＧＩＴＲ−Ｌである。さらに、該薬剤は、標的受容体を刺激する低分子であってもよい。
【００５３】
治療剤のさらに別の例としては、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。Ｔｒｅｇ涸渇剤の例としては、ＡＤＣＣ細胞傷害活性（例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害活性）を媒介する抗体）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害活性）に起因する細胞死をＴｒｅｇ細胞に誘導するか、または他のエフェクター機能を介して細胞死を媒介する薬剤（例えば、Ｔｒｅｇ細胞の表面抗原（例えば、ＦＲ４、ＣＤ４、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）、ＣＤ１２７（ＩＬ７Ｒａ）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＣＤ１０１、ＧＡＲＰ）に結合する）が挙げられる。あるいは、Ｔｒｅｇ涸渇剤の例としては、ＰＣＤ（プログラム細胞死）を誘導する薬剤が挙げられる。該薬剤は、細胞死を誘導する、単離された抗体または断片またはその誘導体としうる。さらに、該薬剤は、細胞死を誘導する低分子であってもよい。
【００５４】
治療剤のさらに別の例としては、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体（ＴＮＦＲＳＦＲ）またはリガンド（ＴＮＦＲＳＦＲＬ）に結合する薬剤（抗体や低分子など）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、ＴＮＦＲＳＦＲまたはリガンドを刺激する薬剤（抗体や断片やそれらの誘導体や低分子など）（例えば、ＣＤ１３７作動薬、ＮＧＦＲ作動薬、ＢＡＦＦＲ作動薬、オステオプロテゲリン作動薬、ＢＣＭＡ作動薬、ＯＸ４０作動薬、ＣＤ２７作動薬、ＲＡＮＫ作動薬、ＣＤ３０作動薬、ＲＥＬＴ作動薬、ＣＤ４０作動薬、ＴＡＣＩ作動薬、ＤｃＲ３作動薬、ＴＮＦ  ＲＩ作動薬、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒｌ作動薬、ＴＮＦ作動薬、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２作動薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒｌ作動薬、ＤＲ３作動薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２作動薬、ＤＲ６作動薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３  作動薬、ＥＤＡＲ作動薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４作動薬、Ｆａｓ作動薬、ＴＲＯＹ作動薬、ＧＩＴＲ作動薬、ＴＷＥＡＫ  Ｒ作動薬、ＨＶＥＭ作動薬、ＸＥＤＡＲ作動薬、リンフォトキシンベータ受容体作動薬、４−ＩＢＢ作動薬、ＡＰＲＩＬ作動薬、ＢＡＦＦ作動薬、ＴＬＩＡ作動薬、ＴＷＥＡＫ作動薬、およびＬＩＧＨＴ作動薬）が挙げられる。
【００５５】
例としてはまた、ＴＮＦＲＳＦＲまたはそのリガンドを阻害する薬剤（例えば、ＣＤ１３７拮抗薬、ＮＧＦＲ拮抗薬、ＢＡＦＦＲ拮抗薬、オステオプロテゲリン拮抗薬、ＢＣＭＡ拮抗薬、ＯＸ４０拮抗薬、ＣＤ２７拮抗薬、ＲＡＮＫ拮抗薬、ＣＤ３０拮抗薬、ＲＥＬＴ拮抗薬、ＣＤ４０拮抗薬、ＴＡＣＩ拮抗薬、ＤｃＲ３拮抗薬、ＴＮＦ  ＲＩ拮抗薬、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒｌ拮抗薬、ＴＮＦ拮抗薬、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２拮抗薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒｌ拮抗薬、ＤＲ３拮抗薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２拮抗薬、ＤＲ６拮抗薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３  拮抗薬、ＥＤＡＲ拮抗薬、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４拮抗薬、Ｆａｓ拮抗薬、ＴＲＯＹ拮抗薬、ＧＩＴＲ拮抗薬、ＴＷＥＡＫ  Ｒ拮抗薬、ＨＶＥＭ拮抗薬、ＸＥＤＡＲ拮抗薬、リンフォトキシンベータ受容体拮抗薬、４−ＩＢＢ拮抗薬、ＡＰＲＩＬ拮抗薬、ＢＡＦＦ拮抗薬、ＴＬＩＡ拮抗薬、ＴＷＥＡＫ拮抗薬、およびＬＩＧＨＴ拮抗薬）が挙げられる。例示的のみのものであるが、これらの阻害剤は、ＴＮＦＲＳＦＲまたはそのリガンドに対する抗体または断片またはその誘導体または低分子としうる。
【００５６】
治療剤は、細胞増殖を阻害するかまたはアポトーシスを誘導する抗がん剤としうる。治療剤の例としては、レナリドマイド、イピリムマブ、リツキシマブ、アレムツマブ、オファツムマブ、フラボピリドール、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、ＡＢＴ−１９９、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ヅアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エゾルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロックスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イデラリシブ、塩酸イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オビヌツズマブ、オルマプラチン、オキシスラン、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、パーホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサトロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、リツキシマブ、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、および塩酸ゾルビシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
別の実施形態では、治療剤は、アルキル化剤とし得、そのようなアルキル剤は、ナイトロジェンマスタード、メチルメラミン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアまたはトリアゼンとしうる。
【００５８】
本発明は、例えば、図１または図５に示されるような、本発明のＶＬＰをコードする核酸分子をさらに提供する。
【００５９】
本発明の核酸は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較された際に、本願の発明の参照の核酸およびアミノ酸配列（すなわち、例えば図１および図２の配列など、本発明の実施例を参照されたい）と少なくとも約７０％同一の、好ましくは少なくとも約８０％同一の、さらに好ましくは少なくとも約９０％同一の、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一の核酸配列を含み、かつポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得、ここで、アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間に最大の合致を与えるように選択される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて比較された際に、本願の発明の参照のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一の、好ましくは少なくとも約８０％同一の、さらに好ましくは少なくとも約９０％同一の、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本願の発明に含まれ、ここで、アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間に最大の合致を与えるように選択される。
【００６０】
核酸分子は、本発明のＶＬＰをコードするＤＮＡ分子（例えば、単離されたｃＤＮＡ）としてもよい。さらに、核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、単離されたｍＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ）としてもよい。あるいは、核酸分子は、ｃＤＮＡとｍＲＮＡとのハイブリッドとしてもよい。例えば、本発明は、本発明のウイルスゲノム不含のＶＬＰを発現するベクターを含むＤＮＡ構築物を提供する（図５を参照されたい）。
【００６１】
本発明の核酸分子はまた、ＤＮＡ分子ともＲＮＡ分子とも異なる核酸誘導体分子を含む。誘導体分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非核酸分子を含み、非核酸分子は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、およびメチルホスホネートが挙げられ、塩基対依存的な方式で一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第７５巻、２８０２８４頁；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｐ．Ｃら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８３巻、４１４３〜４１４６頁）。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの類縁体は、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、１９９１年、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓニューヨーク；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、イングランドに見ることができる。
【００６２】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。用語ベクターは、プラスミド、コスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。宿主ベクター系は、適切な宿主細胞に本発明のベクターを含む。適切な宿主細胞の例としては、細菌細胞および真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、培養培地からもしくは培養細胞から本発明のＶＬＰおよび／またはＶＬＰモノマーを回収することを含む、プロセスを提供する。培養培地もしくは培養細胞由来のＶＬＰモノマーである場合、そのようなモノマーは、まず単離され、次いでＶＬＰを形成するようにされる。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、遺伝子コードの縮重は、本発明のＶＬＰをコードする核酸配列の予測されうる数を提供し、該配列のコドンは、単離された核酸を宿主生物（細菌、酵母、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳類細胞、哺乳類動物（ヒトを含む）の細胞）が限定なく挙げられる）で最適に発現するように選択される。そのような発現は、核酸またはポリペプチドを生産する上で、それに続く本発明による単離および使用のため宿主生物において、または無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／または翻訳系において、有用である。
【００６５】
用語「医薬製剤」、「医薬組成物」および「剤形」は、本明細書では互換的に使用され、対象への投与に適した形態の本発明の活性成分を含有する組成物を指す。
【００６６】
本願の発明の医薬組成物は、投与様式および剤形の性質に応じて、１つまたは複数の医薬的に許容されうる担体、結合剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクル、例えば、保存剤、充填剤、ポリマー、崩壊剤、流動促進剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、潤滑剤、酸性化剤、染料、防腐剤、分散剤や、同様の性質を有する化合物などと混合されてもよい。そのような成分は、剤形を製剤化するために使用されることがある医薬的に許容うる担体または賦形剤を含めて、参照により本明細書にその全体を組み込まれるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載されている。
【００６７】
医薬的に許容されうる担体は、概して、採用された剤形および濃度でレシピエントに非毒性であり、製剤の他の成分に適合性がある。医薬的に許容されうる担体の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、エタノール、ポリオール、植物油、脂肪、オレイン酸エチル、リポソーム、蜜蝋、ゲル形成ポリマーおよび非ゲル形成ポリマーを含めたポリマー、またはそれらの適切な混合物が挙げられる。担体は、等張性および化学安定性を高める物質など、微量の添加物を含有していてもよい。そのような材料は、採用された剤形および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸、またはそれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸やアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーやＰＥＧなどの非イオン性の界面活性剤が挙げられる。担体は、非経口の担体、さらに好ましくはレシピエントの血液に等張な溶液としてもよい。
【００６８】
結合剤の例としては、微結晶性セルロースおよびセルロース誘導体、トラガカントゴム、グルコース溶液、アカシアゴム、ゼラチン溶液、糖蜜、ポリビニルピロリドン、ポビドン、クロスポビドン、ショ糖およびデンプンペーストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
希釈剤の例としては、塩が挙げられる。
【００７０】
賦形剤の例としては、界面活性剤、親油性ビヒクル、疎水性ビヒクル、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびリン酸二カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
湿潤剤の例としては、プロピレングリコールモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ジエチレングリコールモノラウレート、およびポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本技術分野の当業者は、多数の異なる成分が、がんの治療で製剤の有効性を維持しつつ、活性薬剤に加えて、本発明による製剤に使用することができることを認識しよう。本明細書に提供される一覧は、網羅的ではない。
【００７３】
非経口投与について、一実施形態では、本発明の薬剤は、上記に記載された医薬的に許容されうる担体と、単位剤形で注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で、所望の純度で混合することによって、概ね製剤化することができる。
【００７４】
治療投与に使用される任意の単位剤形は、滅菌されるべきである。滅菌性は、滅菌ろ過膜を通じる濾過によって容易に達成することができる。治療物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器に、例えば、静脈注射溶液バッグ、または皮下注射針による穿刺が可能なストッパーを具えるバイアル内に置かれる。
【００７５】
本発明のキット
本発明の別の態様によれば、キットが提供される。本発明によるキットは、本発明の組成物を含むパッケージを含む。
【００７６】
語句「パッケージ」は、本明細書に提示された組成物を含有する任意のベッセルを意味する。好適な実施形態では、パッケージは、箱または包装とすることができる。パッケージされた医薬製品に使用するためにパッケージ材は、本技術分野の当業者に公知である。医薬パッケージ材の例としては、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ（プレフィルドシリンジを含む）、ボトル、および選択された製剤と意図された投与方式および治療に適する任意のパッケージ材が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
キットはまた、パッケージ内に含有されないが、パッケージ外に添付された品目、例えばピペットを含む。
【００７８】
キットは、任意選択で、本願の発明の組成物を、それを必要とする状態にある対象に投与するための取扱説明書を含んでいてもよい。キットはまた、本明細書の組成物の構成要素の、米国食品医薬品局などの規制当局によって認可された使用についての取扱説明書を含んでいてもよい。キットは、任意選択で、本願の組成物についての標示文書または製品添付文書を含んでいてもよい。パッケージおよび／または任意の製品添付文書は、それ自体で規制当局に認可されていることがある。キットは、組成物を、パッケージ内で固相または液相（提供された緩衝液など）に含むことができる。キットはまた、方法を実行するための溶液の調製に用いる緩衝液と、ある容器から別へ液体を移し入れるためのピペットとを含むことができる。
【００７９】
キットはまた、任意選択で、本明細書に記載されるような併用療法に使用するための１つまたは複数の他の組成物を含んでいてもよい。ある実施形態では、パッケージは、静脈内投与のための容器である。他の実施形態では、組成物は、吸入器に提供される。さらに他の実施形態では、組成物は、ポリマーマトリックスまたはリポソームの形態で提供される。
【００８０】
本発明の方法
本発明は、対象で固形腫瘍がんの進行を治療、阻害または予防するための方法を提供する。本法は、腫瘍の成長または転移を阻害し、腫瘍細胞を死滅させるか腫瘍量を低減するように、有効量の本発明のＶＬＰワクチンまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、固形腫瘍について腫瘍細胞を阻害する方法を提供し、本法は、有効量の本発明のワクチンまたは組成物を、腫瘍細胞に接触させることを含む。
【００８１】
ＶＬＰワクチンまたは組成物は、例えば、がんに用いる場合、固形腫瘍の内部または近くに直接的に注射されてもよい。好適な実施形態では、投与は、腫瘍内としうる。あるいは、腫瘍部位を容易に識別できないがんの場合、投与は、リンパ節、脾臓、甲状腺、骨髄、または高濃度の腫瘍細胞を含む身体の他の器官の内部または周囲に、直接行われてもよい。さらに、がんの部位に応じて、投与は、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、または経粘膜としうる。
【００８２】
本発明の実践に従って、ＶＬＰワクチンは、組成物を対象に投与する直前に、治療剤と混和されてもよい。あるいは、該組成物は、ＶＬＰワクチンと治療剤との両方が含有されるように、プレミックスで利用可能としうる。
【００８３】
剤形は、様々でありうるが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの総量が、用量当たり０．００１〜０．０５、０．０１〜０．５、０．１〜５．０、１〜３０、２０〜６０、５０〜１００、９０〜３００、または２５０〜１，０００の領域にあるような用量を含む。
【００８４】
固形腫瘍がんは、副腎がん、肛門がん、再生不良がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、乳がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頚がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性繊毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭および下咽頭のがん、肝がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ），多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、脾臓辺縁体リンパ腫、辺縁体リンパ腫（節外性および結節性）、成人の混合細胞型びまん性中悪性度リンパ腫、成人の大細胞型びまん性中悪性度リンパ腫、成人の大細胞型免疫芽球性びまん性中悪性度リンパ腫、成人の小型非きれこみ核細胞型びまん性中悪性度リンパ腫、または濾胞性リンパ腫としうる。
【００８５】
さらに別の実施形態では、がんは、頭頸部がん、乳房、唾液腺、甲状腺、膵臓、胃、膀胱、子宮内膜または子宮の癌、子宮頚がん、卵巣、外陰部がん、前立腺、結腸、直腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺がん、骨肉腫、神経膠芽腫、腎臓、肝臓、メラノーマまたは転移性がんのうちいずれかとしうる。
【００８６】
本発明の一実施形態では、ワクチンは、整列化されて提示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを有することによって、対象で受容体シグナリングを増強しうる。別の実施形態では、ワクチンは、によって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させることによって、対象で受容体シグナリングを（例えば、ＴＬＲ９受容体）を増強しうる。細胞は、抗原提示細胞、リンパ球、単球、またはＮＫ細胞としうる。
【００８７】
本発明はまた、ウイルスゲノムタンパク質不含のＶＬＰを生産するための方法を提供し、本法は、宿主中でウイルスゲノム不含のＶＬＰを生産するように、適切な培養条件下で本発明の宿主ベクター系を培養することと、そうして生産されたウイルスゲノム不含のＶＬＰを回収することとを含む。あるいは、本法は、宿主中でウイルスゲノム不含のＶＬＰ被覆タンパク質を生産するように、適切な培養条件下で本発明の宿主ベクター系を培養することと、ウイルスゲノム不在下で宿主から単離されたＶＬＰ被覆タンパク質から、ＶＬＰをアセンブリすることと、そうして生産されたウイルスゲノム不含のＶＬＰを回収することとを含む。ＶＬＰはまた、宿主細胞からの単離に続いて、ＶＬＰモノマーのアセンブリから生産されてもよい。例えば、ＶＬＰは、宿主細胞の外側のカプシドタンパク質からアセンブリされてもよい。あるいは、本発明のＶＬＰは、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／または翻訳系で生産されてもよい（Ｂｕｎｄｙ、２００８年ｂ；Ｂｕｎｄｙ、２０１１年）。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応でウイルスゲノム不含のＶＬＰを生産するための方法を提供する。好ましくは、ＶＬＰは、ウイルスゲノム不含の正二十面体のウイルス様粒子の集団である。この方法は、原核生物の細胞不含のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応（例えば、実質的にポリエチレングリコール不の）で、ウイルス被覆タンパク質を合成することを含んでいてもよい。原核生物の細胞不含のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応は、細菌細胞抽出物、ポリペプチドおよび／またはｍＲＮＡの合成機構の構成要素；ポリペプチドの翻訳のための転写に用いる鋳型；ポリペプチドの合成のためのモノマー；および補因子、酵素と他の試薬とを含有しうるが、他の試薬とは、ウイルス被覆タンパク質が、少なくとも６０個の別々のタンパク質を含むウイルスゲノム不含の安定な正二十面体のウイルス様粒子に、自己アセンブリすることが許容される条件下で、ウイルス被覆タンパク質（例えば、少なくとも約２５０μｇ／ｍＬのウイルス被覆タンパク質）を生産するための翻訳に必要なものである。
【００８９】
一実施形態では、本発明の方法によって、ウイルスゲノム不含のＶＬＰが生産され、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（前掲）にコンジュゲートするのに利用される少なくとも１つの非天然アミノ酸（本明細書では非自然なアミノ酸またはｎｎＡＡとも参照される）が含有されうる。
【００９０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドをＶＬＰに付加（本明細書ではコンジュゲーションとも参照される）するために、ＶＬＰのウイルス被覆ポリペプチドは、目的の部位に少なくとも１つの第１の非天然アミノ酸（本明細書では非自然なアミノ酸または非正規アミノ酸（ｎｎＡＡ）とも参照される）を含むように修飾されてもよく、例えば、ウイルス被覆ポリペプチドを合成する間にメチオニンの位置へアジドホモアラニンを組み込むなどであり、また、アルキン官能基に付加されるＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むように修飾されてもよく、例えば、ＣｐＧ−Ｘを生産するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドの３’端の５−オクタジニルｄＵなどである。ＶＬＰのカプシドタンパク質に組み込まれたアジドホモアラニンのアジド官能基は、ＣｐＧ−Ｘのアルキン官能基と共に（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、その結果、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに架橋されたＶＬＰを生じる。同じＶＬＰ内にある他の非天然アミノ酸含有カプシドタンパク質は、同様に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに付加または接続されたＶＬＰを生産するための（３＋２）環化付加クリック反応に加わって、２つまたはそれ以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドを具えたＶＬＰを生産する。アジド−アルキン官能基対に基づく同様の戦略が、治療剤または免疫チェックポイント阻害剤をＶＬＰに付加するために使用されうる。ＶＬＰの形成に続いて、アジドとアルキン含有反応物質との（３＋２）環化付加クリック反応を実施することが好ましい一方で、ＶＬＰ内にアセンブリされる前に、そのような環化付加クリック反応が、ＶＬＰカプシドタンパク質またはモノマーを用いて実施されてもよい。
【００９１】
以下の実施例は、本発明の態様をさらに説明するために提供される。これらの実施例は、非限定的であり、本発明の任意の態様を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９２】
【実施例１】
【００９３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏのメチオニン置換としてのアジドホモアラニンを用いたＨｅｐＢコアタンパク質の合成、およびアセンブリされたアジドホモアラニン含有ＨｅｐＢコア（ＨＢＣ）ＶＬＰの精製
Ｔ７ＲＮＡプロモーターの制御下で、ＨｅｐＢコアコード配列を有したメチオニン（ｍｅｔＢ１）要求性のＩＰＴＧ誘導可能なＴ7ＲＮＡポリメラーゼ大腸菌株をｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、メチオニン置換としてアジドホモアラニンを有するＨｅｐＢコア（ＨＢＣ）タンパク質を合成する。細菌宿主株は、メチオニン要求性の大腸菌変異（ｍｅｔＢ１）を有し、遺伝子型ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−Ｔｅｔｓ）２［ｄｃｍｊ］Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−Ｔｅｔｓ）ｅｎｄＡｌ  ｍｅｔＢ１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０を有する、Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（高効率、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である。この細菌株は、クロラムフェニコール耐性マーカー遺伝子（ＣＡＭＲ）を有するｐＬｙｓＳプラスミド、アンピシリン耐性マーカー遺伝子（ＡｍｐＲ）を有し、かつＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にＨｅｐＢコアタンパク質コード配列を担持するｐＥＴ２１−ＨｅｐＢ  Ｃｏｒｅプラスミドを用いて、形質転換される。図１（下方）に示されるようなＨｅｐＢコアタンパク質コード配列は、ｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニング配列（ＭＣＳ）のＮｄｅＩ部位とＳａｌＩ部位との間に挿入されて、１４９アミノ酸のＨｅｐＢコアタンパク質（図１、上方）の発現を可能にする。図５は、ｐＥＴ２１−ＨｅｐＢ  ＣｏｒｅプラスミドＤＮＡの線図（上方）およびその配列（下方）を示す。同じ細菌細胞中でｐＬｙｓＳプラスミドとｐＥＴ２１−ＨｅｐＢ  Ｃｏｒｅプラスミドの両方を維持するための選抜条件は、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールである。
【００９４】
材料
Ｍ９培地（１００ｍＬ）は、Ｍ９塩（５×、Ｓｉｇｍａ）２０ｍＬ、グルコース（２０％、Ｓｉｇｍａ）＊２ｍＬ、ＭｇＳ０４（１Ｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＊＊２００μＬ、ＣａＣｌ２（１Ｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＊＊１０μＬ、アミノ酸混合物（５０×）＊２ｍＬ、ビタミンＢ複合体（１００×）＊１ｍＬ、クエン酸鉄アンモニウム（１ｇ／Ｌ）２００μＬ、１００μｇ／ｍｌとするアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ９５１８）の添加、３５μｇ／ｍｌとするクロラムフェニコール（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、品番２２０５５１）の添加、および総量１００ｍＬとするＨ２Ｏの添加（＊４℃で保存された濾過滅菌ストックおよび＊＊室温で保存ざれたオートクレーブストック）を含む。
【００９５】
アミノ酸混合物（５０×）は、１ｇのＡｒｇ（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ３７８４）、１ｇのＧｌｕ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｇ５７６３）、１ｇのＬｙｓ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｌ５６２６）、１ｇのＨｉｓ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｈ８０００）、１ｇのＧｌｙ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｇ７１２６）；１ｇのＩｌｅ（Ｓｉｇｍａ、品番ＩＩ２７５２）、１ｇのＰｈｅ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｐ２１２６）、１ｇのＬｅｕ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｌ８０００）、１ｇのＣｙｓ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｃ８１５２）、１ｇのＡｓｐ（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ４５３４）、１．５ｇのＬ−Ｖａｌ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｖ０５００）、４ｇのＬ−Ｓｅｒ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｓ５５１１）、４ｇのＬ−Ｔｈｒ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ８６２５）および２００ｍＬとするＨ２Ｏの添加を含む。
【００９６】
ビタミンＢ複合体（１００×）は、１００ｍｇのリボフラビン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｒ７６４９）、１００ｍｇのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ、品番Ｎ５５３５）、１００ｍｇのピリドキシンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｐ４７２２）、１００ｍｇのチアミン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ１２７０）、１００ｍｇのビオチン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｂ３０１０）および１００ｍＬとするＨ２Ｏの添加を含む。
【００９７】
アジドホモアラニン（ＡＨＡ）ストック（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＬＬＰまたはＡＣＭＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．由来）は、４ｍｇ／ｍＬを含む（露光せずに−８０°Ｃで保存）。
【００９８】
ＶＬＰ再懸濁緩衝液（１×）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５および５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【００９９】
以下の試薬、すなわち、ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ、品番Ｌ３０２２）、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ、品番１６７５８）、ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、品番２１−０４０−ＣＶ）、および飽和硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ４４１８）も使用した。
【０１００】
アジドホモアラニンを含有するＨｅｐＢコアタンパク質の誘導
ｐＬｙｓＳプラスミドとｐＥＴ２１−ＨｅｐＢ  Ｃｏｒｅプラスミドの両方を用いて形質転換されたＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、高効率）を、２ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含む）中、３７℃で一晩成長させる。翌日、細胞を１０ｍＬの新鮮ＬＢ培地（アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補充）中に１００倍に希釈し、対数期に３７℃でＯＤ６００が０．５になるまで成長させ、この時点で、１，０００×ｇで１５分間旋回することによって、細胞を採取する。上清を除去し、細胞ペレットを１ｍＬのＭ９培地に再懸濁する。細胞を３７℃で３時間、Ｍ９培地中で成長させ、その後、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＬ）とアジドホモアラニン（ＡＨＡ、終濃度２００μｇ／ｍＬ）の両方を添加して、ＨｅｐＢコアタンパク質の発現を誘導し、メチオニンの位置にＡＨＡを取り込ませる。培養培地中へＡＨＡを導入した上で、細胞を暗所で、遮光のため培養フラスコを覆うことによって成長させる。３７℃での一晩の培養後、１，０００×ｇで１５分間旋回することによって、細胞を採取した。上清を捨て、細胞ペレットを−８０℃で保存する。
【０１０１】
ＨｅｐＢコアタンパク質の発現に用いる誘導細胞の分析
細胞ペレットを１ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞を１５秒間、超音波で３回処理する。各々から破砕細胞の溶解成分および不溶成分を、１５，０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって分離する。溶解成分（上清）を採集し、さらなる精製に付して、単離されたＨｅｐＢコアタンパク質を得る（下記）。また、上清を、全ジスルフィド結合の還元の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析する。ＨｅｐＢコアモノマーは、１６ｋＤａに別個のバンドとして現れる。
【０１０２】
破砕された細胞からのアジドホモアラニン含有ＨｅｐＢコアタンパク質（ＨＢＣ−アジド）の単離
上清（上記由来の、超音波処理および遠心分離後の）中のＨｅｐＢコアタンパク質を、硫酸アンモニウムで沈殿させるが、これは、上清が最終飽和度３０％となるまで飽和硫酸アンモニウムを滴下で添加し、さらに１時間混合し、遠心分離して沈殿をペレットとすることによって行う。上清を除去した後、ＨｅｐＢコアタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿物を１ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁する。
【０１０３】
ＨＢＣ  ＶＬＰ−アジドの形成および硫酸アンモニウム沈殿による精製
アジドホモアラニンを有するＨｅｐＢコアタンパク質からＶＬＰを形成するために、ＰＢＳ中のＨｅｐＢコアタンパク質を、５０〜２００容の０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５に対し透析する。ＡＨＡ含有ＨｅｐＢコアタンパク質の自己アセンブリに続いて、結果として得られたＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子を、２周回の硫酸アンモニウム沈殿によって精製する。端的に述べれば、透析されたＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子を、３０％硫酸アンモニウムを用いて沈殿させるが、これは、透析されたＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子を含有する１．４ｍＬの溶液に、０．６ｍＬの飽和硫酸アンモニウムと追加のＰＢＳを所望の体積になるまで滴下で添加し、続いて、室温で１時間インキュベートする。硫酸アンモニウム沈殿を１４Ｋで１０分間旋回し、次いで、ペレットを８ｍＬのＰＢＳに再懸濁して、さらに室温で１時間インキュベートする。２周回目の硫酸アンモニウム沈殿は、飽和硫酸アンモニウムを３０％になるまで滴下で添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、１４Ｋで１０分間遠心分離することによって、実施する。沈殿物を１．４ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。再懸濁されたＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子を、室温で１時間インキュベートする。任意の不溶物質を、１４Ｋで１０分間の遠心分離によって除去する。得られた上清を、新しい１５ｍＬ円錐チューブに移し、硫酸アンモニウム沈殿によってＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子を精製する。
【０１０４】
ＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド粒子の濃度を、１ｍｇ／ｍＬ＝１．７７ＯＤ２６０を用いてＯＤ２８０での吸収によって決定する。ＨＢＣ  ＶＬＰ−アジド調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析する。
【０１０５】
エンドトキシン除去
ＰＢＳ中、硫酸アンモニウム精製されたＨＢＣ  ＶＬＰアジド粒子（上記由来）を４℃に冷却し、１／１０容の冷却１０％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４を添加する。溶液を、頻繁に混合しながら室温で１時間インキュベートし、続いて、３，０００×ｇで遠心分離して境界を形成させる。水層（上層）を入念に取り出す。境界に近い追加の水層を、０．５ｍＬのチューブに取り出して、１４Ｋで５分間旋回させて境界を形成させる。上層を取り出して、さらに多い水系試料（１回目の抽出から取り出した１回目の水層）に添加する。Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４抽出の手順を追加の３回繰り返して、エンドトキシンをさらに除去する。
【０１０６】
不溶性の凝集物を除去するために、該水溶液を室温で１時間インキュベートし、次いで、１５，０００×ｇで１５分間、遠心分離する。ペレットを乱さないよう注意しながら、上清を採集する。上清を使用してタンパク質濃度を決定し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０１０７】
ＨＢＣ  ＶＬＰアジドのさらなる精製
硫酸アンモニウム沈殿およびエンドトキシン除去のプロトコールに続いて、精製されたＨＢＣ  ＶＬＰアジド調製物を、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降速度法、沈降平衡法、免疫沈降法、透析、濾過、電気泳動による方法、および／または示差沈殿を用いて、さらに精製してもよい。
【０１０８】
一般に、緩衝液をＰＢＳに交換する際に、遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、品番ＵＦＣ５１００２４）を試料体積＜１ｍＬに対して使用し、一方、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番１７−０８５１−０１）を試料体積２〜１０ｍＬに対して使用する。
【０１０９】
ＨＢＣ  ＶＬＰアジドは、−８０℃、−２０℃または４℃で保存する。
【０１１０】
ＶＬＰへのＣｐＧオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
架橋可能な官能基を具えたＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−Ｘ）を、Ｓｉｇｍａカスタムオリゴ部門（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−  ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｕｓｔｏｍ−ｏｌｉｇｏｓ．ｈｔｍｌ）で合成し精製した。使用した配列は、５’ＴｓＧｓＡｓＣｓＴｓＧｓＴｓＧｓＡｓＡｓＣＧｓＴｓＴｓＣｓＧｓＡｓＧｓＡｓＴｓＧｓＡ−（５−Ｏｃｔ−ｄＵ）３’であり、ここで、「ｓ」は、配列中のホスホロチオエート結合を意味し、５−Ｏｃｔ−ｄＵは、オリゴヌクレオチドの３’端の５−オクタジニルｄＵである。５−Ｏｃｔ−ｄＵの存在によって、アルキン官能基がＣｐＧオリゴヌクレオチドに導入され、結果として得られるＣｐＧ−Ｘオリゴヌクレオチドはまた、ＣｐＧ−アルキンとも参照される。オリゴの３’端に付加された５オクタジニルｄＵは、ＶＬＰへのアルキン−アジドのコンジュゲーションを形成した。
【０１１１】
ＨＢＣ  ＶＬＰアジドを、不透明な反応槽内で、ＣｐＧ−アルキン、アスコルビン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０およびリン酸緩衝整理食塩水と混合した。混合物をアルゴンガスで覆う。触媒のヘキサフルオロリン酸テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）（テトラキスＣｕ（Ｉ）、Ｓｉｇｍａ）および促進剤のトリス（トリアゾイルメチル）アミン（ＴＴＭＡ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）を次いで添加し、反応を室温で一晩、緩やかに撹拌させながら進行させた。最後の反応条件は、ＶＬＰをＣｐＧオリゴヌクレオチドで完全に飽和させることが望ましい際には、以下のように、すなわちＨＢＣ  ＶＬＰ−アジドを６０μΜ、ＣｐＧ−アルキンを８０μΜ、アスコルビン酸Ｎａを２００μΜ、Ｔｗｅｅｎを．０１％、１０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ８、ＴＴＭＡを０．２５ｍＭ、テトラキスＣｕ（Ｉ）を５００μΜ、３０℃、一晩、暗所とした。
【０１１２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図４に示すように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＨＢＣモノマーのゲル移動度シフトを観察することによって、ＶＬＰ−ＣｐＧオリゴヌクレオチドコンジュゲーションを評価した。
【実施例２】
【０１１３】
マウスでにおけるトリプルネガティブ乳腫瘍の治療のためのＣｐＧオリゴヌクレオチド担持ウイルス様粒子の腫瘍内注射
以下のＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用した。すなわち、（１）対照として配列５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’（小文字はホスホロチオエート結合を示す）を有するＣｐＧ、（２）ＣｐＧ−アルキン（５’−ｔｇａｃｔｇｔｇａａＣＧｔｔｃｇａｇａｔｇａ−５オクタジニルｄＵ−３’）、および（３）ＣｐＧ−ＶＬＰである。マウスに由来しかつステージＩＶのヒト乳がんの動物モデルに使用される４Ｔ１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９）を、動物に注射する。
【０１１４】
動物のケア
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから入手する。認可されたＩＡＣＵＣプロトコールの下、動物施設にて、動物を収容する。腫瘍細胞の注射、測径器による腫瘍の測定、治療剤の注入、動物の安楽死および腫瘍組織の採取を実施した。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルおよび治療
進行性のトリプルネガティブ乳腺癌腫である４Ｔ１を、同系のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、左右対称に移植した。左右対称の腫瘍の一方の治療は、腫瘍が約８０〜１００ｍｍ３（約９〜１１日目）である際に開始する。マウス各１２頭５つの群を、以下に記載されるように治療する。
【０１１６】
【表１】
2017500313.tif 000003
2017500313.tif 000004
【０１１７】
それぞれの場合では、５日を超える間隔を置いた別の日に、治療剤を３回腫瘍内注射する。腫瘍が潰瘍化するかまたは径＞２ｃｍに到達した際に、マウスを屠殺する。腫瘍内の白血球浸潤に及ぼす処置の効果を試験するために、治療剤の最後の注射から３〜４日後に各群から３頭のマウスを安楽死させ、腫瘍を分析用に採取する。試験は、処置の開始から３０〜３５日後に終了し、生存している全ての動物を安楽死させ、組織／腫瘍を分析用に採取する。
【０１１８】
分析
治療剤の最終注射から３週間から４週間後に、各群から３頭ずつのマウスを免疫学的分析用に安楽死させた。血清または血漿を採集し、のちのアッセイ用（例えば、血清サイトカインアッセイ用、抗体反応性の免疫フィンガープリンティング用）に、−８０℃で凍結保存した。腫瘍を採取して、続いて行う浸潤細胞［Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）］の分析に用いるために、ホルマリン中で固定した。
【０１１９】
１群当たり残りの９頭の動物では、処置された腫瘍の成長と無処置の対側の腫瘍とを、１週当たり２回評価する。腫瘍体積を［（腫瘍長）×（腫瘍幅）２×（π／６）］として算出する。動物の全身の健康状態、例えば、活動、体重、外被の外観もまたモニターする。
【０１２０】
試験の終わりに、マウスを安楽死させて、腫瘍を採取し秤量する。肺も取り出して秤量し、転移性がん結節を観察する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１２１】
【非特許文献１】Siano, M., et al., A phase I-II study to determine the maximum tolerated infusion rate of rituximab with special emphasis on monitoring the effect of rituximab on cardiac function. Clin Cancer Res, 2008. 14(23): p.7935-9.
【非特許文献２】Witzig, T.E., et al., Rituximab therapy for patients with newly diagnosed, advanced- stage, follicular grade I non-Hodgkin's lymphoma: a phase II trial in the North Central Cancer Treatment Group. J Clin Oncol, 2005. 23(6): p.1 103-8.
【非特許文献３】Spina, M, et al., Rituximab plus infusional cyclophosphamide, doxorubicin, and etoposide in HIV-associated non-Hodgkin lymphoma: pooled results from 3 phase 2 trials. Blood, 2005. 105(5): p.1891-7.
【非特許文献４】Hainsworth, J.D., et al, Rituximab plus short-duration chemotherapy as first-line treatment for follicular non-Hodgkin's lymphoma: a phase II trial of the minnie pearl cancer research network. J Clin Oncol, 2005. 23(7): p.1500-6.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【国際調査報告】
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