(57)【要約】本開示は、核酸のインビトロ工学の方法に関する。本開示は、更に、ウイルスゲノムのインビトロ工学、及びウイルスゲノムのインビトロゲノム工学によるウイルス特性の改善に関する。具体的には、本開示は、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９を使用したインビトロウイルスゲノム消化、消化されたウイルスゲノムへのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入による組換えゲノムのアセンブリ、及び組換えゲノムでの宿主細胞の形質転換に関する。本方法はまた、核酸のエラー修正のためのインビトロ工学に関する。【選択図】図１
2017537643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して２つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルス。
【請求項２】
産生された前記ウイルス粒子が、少なくとも３つの改善されたウイルス特性を有する、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項３】
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項４】
前記操作されたウイルス核酸が、操作されたウイルスゲノムである、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項５】
前記操作されたウイルスゲノムが、操作されたバクテリオファージゲノムである、請求項４に記載の操作されたウイルス。
【請求項６】
前記改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つが宿主域である、請求項５に記載の操作されたウイルス。
【請求項７】
改善されたウイルス特性のそれぞれが、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変の結果である、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項８】
少なくとも１つの改善されたウイルス特性が、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも２つの改変の結果である、請求項７に記載の操作されたウイルス。
【請求項９】
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも１つの改変が、１回の工学的ステップの結果である、請求項７に記載の操作されたウイルス。
【請求項１０】
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも１つの改変が、反復的な工学的ステップの結果である、請求項７に記載の操作されたウイルス。
【請求項１１】
前記改変の少なくとも１つが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５、配列番号４８または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある、請求項７に記載の操作されたウイルス。
【請求項１２】
前記操作されたウイルスゲノムが、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項４に記載の操作されたウイルス。
【請求項１３】
異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部を更に含む、請求項１２に記載の操作されたウイルス。
【請求項１４】
前記異種ｇｐ１８遺伝子が、配列番号３８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１３に記載の操作されたウイルス。
【請求項１５】
操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部を更に含む、請求項１２に記載の操作されたウイルス。
【請求項１６】
前記操作されたｇｐ３４遺伝子が、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸をコードする、請求項１５に記載の操作されたウイルス。
【請求項１７】
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変を更に含む、請求項１２に記載の操作されたウイルス。
【請求項１８】
前記操作されたウイルスゲノムが、配列番号３４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号４８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む、請求項１７に記載の操作されたウイルス。
【請求項１９】
前記改変が、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む、請求項１８に記載の操作されたウイルス。
【請求項２０】
配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む、請求項１２に記載の操作されたウイルス。
【請求項２１】
前記改変が、配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子による置換である、請求項２０に記載の操作されたウイルス。
【請求項２２】
前記異種核酸分子が、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む、請求項２１に記載の操作されたウイルス。
【請求項２３】
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２１に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項２４】
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２２に含まれる核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたウイルス。
【請求項２５】
（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、
（ｂ）前記第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子と結合して、前記第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含む第２のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することとを含み、
前記第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる、
所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法。
【請求項２６】
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すこと
を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）の操作されたウイルスゲノムを作製することが、
（１）エンドヌクレアーゼを使用した前記第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、
（２）前記消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることと
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のウイルスゲノムがウイルス粒子から単離される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、デノボ合成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記デノボ合成が、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅された核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、インビトロ消化の前に増幅される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のウイルスゲノムが、少なくとも３ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも２５ｋｂまたは少なくとも３０ｋｂである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記アセンブリがインビトロまたはインビボで実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記アセンブリが、
（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｃ）単離されたリガーゼと、
（ｄ）ｄＮＴＰの混合物と
を含む混合物を使用して、
前記操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、前記消化されたウイルス核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのガイドＲＮＡを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素であり、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、（１）キメラｇＲＮＡ、または（２）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記エンドヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記インビトロ消化がスペルミジンを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法によって作製された、操作されたウイルス。
【請求項４４】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の操作されたウイルスである、請求項４７に記載の操作されたウイルス。
【請求項４５】
（ａ）精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｄ）単離されたリガーゼと
を含む、ウイルス核酸分子を操作するためのキット。
【請求項４６】
（１）クラウディング剤、
（２）ｄＮＴＰの混合物、及び
（３）好適な緩衝液
のうちの１つ以上を更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
個別化されたガイドＲＮＡを更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
形質転換のためのコンピテント宿主細胞を更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項５０】
単離されたウイルスゲノム核酸を更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項５１】
（ａ）核酸を準備することと、
（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した前記核酸の領域のインビトロ消化と、
（ｃ）前記消化された核酸へのＤＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリと
を含み、前記アセンブリは、
（ｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｉｉｉ）単離されたリガーゼと、
（ｉｖ）ｄＮＴＰの混合物と
を含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、前記消化された核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、核酸配列を操作する方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
（ｄ）前記組換え核酸による宿主細胞の形質転換を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸が、宿主細胞から単離されたプラスミドである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記プラスミドが少なくとも６ｋｂである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記プラスミドが少なくとも１０ｋｂである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記プラスミドが少なくとも１５ｋｂである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記プラスミドが少なくとも２０ｋｂである、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づき、２０１４年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／０９２，７０７号、２０１５年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／１０２，３６２号及び２０１５年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２４２，８１１号の優先権を主張するものであり、各出願の全内容を参考として本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、米国特許法施行規則１．５２（ｅ）（ｉｉｉ）（５）に従って、２０１５年１２月１５日に作成されたキロバイトファイルサイズ（１３９ｋｂ）の配列表テキストファイル「ＳＧＩ１８４０＿３ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本出願とともに提出された核酸配列に関する参照を含み、当該ファイルの全体を参考として本明細書に援用する。
【０００３】
開示の分野
本開示は、全般的に、ゲノムの迅速な操作、より具体的には、ウイルスゲノムをインビトロで操作することに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
ウイルスは、多くの化学的用途、特に、予防法、治療法及び診療法の開発に使用されている。これらの目的のために、ウイルスは、遺伝子操作を受けることが多い。インビボ工学は、扱いやすい宿主生物を必要とし、多くの場合、改変されたウイルス及びウイルスベクターを作製するのに数週間から数ヶ月かかることがある（Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ1．２００４  Ｆｅｂ；２（２）：１６６−７３（非特許文献1）、参考として本明細書に援用する）。更に、細胞中で多数のウイルスゲノムを操作することに本質的に付随する毒性への懸念がある。大きなウイルスゲノムに対するインビトロ遺伝子工学の方法を開発する努力は、固有の制限酵素標的配列の利用可能性と、ゲノム消化及びそれに続く組換えアセンブリにて得られる効率の低さにより、これまでのところ制限されている。更に、ウイルスゲノム末端の不正確な予想により、遺伝子工学の多くの努力が妨げられている。例えば、一般に入手可能なＰＢ１様ウイルスゲノムは、末端配列がゲノムの中央部に誤って配置されており、これは、現在のシーケンシング及びインシリコゲノムアセンブリ方法を使用する際によく生じるエラーである（Ｃｅｙｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｂｒｏｂｉｏｌ．２００９  Ｎｏｖ；１１（１１）：２８７４−８３（非特許文献2））。
【０００５】
ウイルスゲノム、特に、遺伝子的に扱いにくい宿主に感染するウイルスの迅速な遺伝子工学が依然として求められている。本開示は、インビトロでのＣａｓ９による消化及びアセンブリを活用して、全ウイルスゲノムを部位特異的に操作する。本方法は、ウイルスゲノムを遺伝子的に改変できる正確さ、単純さ及び速さを劇的に向上させる。更に、この技術は、これまでに定着した、往々にして毒性であるビルレントウイルスゲノムを天然及び異種宿主細胞内で操作することの難しさを克服する。また、開示されるインビトロ工学的方法の利用により、正しいウイルスゲノム末端の特定も可能となり、本開示による後続の操作が容易になる。
【０００６】
インビトロでのエラー修正は、クローニングまたはアセンブリ技術後に所望の配列を生成するために、極めて貴重な技術である。標準的なエラー修正方法はＰＣＲに基づくものであるが、１）ＰＣＲは、付加的な望ましくない変異を核酸に導入する可能性があること、また、２）ＰＣＲは、この文脈において、エラーが一層生じやすくなる以前に、約５ｋｂのサイズ制限があることの２つの本質的な問題がある（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異導入キットマニュアル、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）。したがって、標準的なＰＣＲに基づくエラー修正方法は、ＰＣＲにより生成される付加的な変異または完全な鋳型の増幅の失敗のいずれかの結果として、５ｋｂよりも大きいプラスミドに対して、確実に実施することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ1．２００４  Ｆｅｂ；２（２）：１６６−７３
【非特許文献２】Ｃｅｙｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｂｒｏｂｉｏｌ．２００９  Ｎｏｖ；１１（１１）：２８７４−８３
【発明の概要】
【０００８】
本開示の種々の態様の１つは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した核酸配列のインビトロ工学のための組成物及びその方法である。一態様において、本開示は、ウイルス核酸配列のインビトロ遺伝子工学による特定のウイルス特性の改善及び改善されたウイルス組成物または粒子に関する。別の態様において、本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を使用したウイルス核酸配列のインビトロ消化、続いて、消化されたウイルス核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片（複数可）の挿入による組換え核酸配列のアセンブリに関する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は、宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して２つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルスを提供する。
【００１０】
いくつかの態様において、産生されるウイルス粒子は、少なくとも３つの改善されたウイルス特性を有する。
【００１１】
いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、操作されたウイルスゲノムである。
【００１３】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、操作されたバクテリオファージゲノムである。いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つは、宿主域である。
【００１４】
いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変の結果である。
【００１５】
いくつかの態様において、少なくとも１つの改善されたウイルス特性は、操作されたウイルス核酸中における少なくとも２つの改変の結果である。
【００１６】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変は、１回の工学的ステップの結果である。
【００１７】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変は、反復的な工学的ステップの結果である。
【００１８】
いくつかの態様において、改変の少なくとも１つは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５０または配列番号２５に対して少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列中にある。
【００１９】
いくつかの態様において、改変の少なくとも１つは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５、配列番号４８または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある。
【００２０】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部を更に含む。いくつかの態様において、異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号２６に対して少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの態様において、異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号３８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【００２１】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部を更に含む。いくつかの態様において、操作されたｇｐ３４遺伝子は、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸配列をコードする。
【００２２】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号５０からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する１つ以上の配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列及び配列番号５０に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列中のそれぞれにおける改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号１の核酸位置５０に対応する位置でのＧからＡへの置換、配列番号５０の核酸位置１６０に対応する位置でのＧからＴへの置換、配列番号２の核酸位置２４５に対応する位置でのＡからＧへの置換、配列番号２の核酸位置２４７〜２４８に対応する位置でのＡＴからＴＣへの置換、及び配列番号３の核酸位置７５７に対応する位置でのＡからＧへの置換を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号３４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号４８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号２５に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号２５に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号２５に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列中に含まれる配列の異種核酸分子による置換である。いくつかの態様において、異種核酸分子は、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する異種核酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子による置換である。いくつかの態様において、異種核酸分子は、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、配列番号２１に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、配列番号２２の核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本開示は、２つ以上の所望のウイルス特性を有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、（ｂ）第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子と結合して、第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含む第２のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することを含み、第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる。
【００２９】
いくつかの態様において、方法は、（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すことを更に含む。
【００３０】
いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの態様において、改善された１つの特性または改善された複数の特性及び改善された１つのウイルス特性または改善された複数のウイルス特性は、区別なく使用される。
【００３２】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）における操作されたウイルスゲノムを作製することは、（１）エンドヌクレアーゼを使用した第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、（２）消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることとを含む。
【００３３】
いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、ウイルス粒子から単離される。
【００３４】
いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムまたは少なくとも１つの修復核酸分子は、デノボ合成される。
【００３５】
いくつかの態様において、デノボ合成は、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む。
【００３６】
いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムまたは少なくとも１つの修復核酸分子は、インビトロ消化の前に増幅される。
【００３７】
いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、少なくとも３ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ，少なくとも２５ｋｂまたは少なくとも３０ｋｂである。
【００３８】
いくつかの態様において、アセンブリは、インビトロまたはインビボで実施される。
【００３９】
いくつかの態様において、アセンブリは、（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｃ）単離されたリガーゼと、（ｄ）ｄＮＴＰの混合物とを含む混合物を使用して、操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、消化されたウイルス核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される。
【００４０】
いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。
【００４１】
いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡを更に含む。
【００４２】
いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素であり、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、（１）キメラｇＲＮＡ、または（２）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
【００４３】
いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される。
【００４４】
いくつかの態様において、インビトロ消化は、スペルミジンを更に含む。
【００４５】
いくつかの態様において、方法は、操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む。
【００４６】
いくつかの態様において、方法は、操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれかによって作製される操作されたウイルスを提供する。いくつかの態様において、操作されたウイルスは、本明細書で開示される操作されたウイルスのいずれかである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたウイルス核酸分子のためのキットを提供し、このキットは、（ａ）精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）単離した耐熱性リガーゼとを含む。
【００４９】
いくつかの態様において、キットは、（１）クラウディング剤、（２）ｄＮＴＰの混合物、及び（３）好適な緩衝液のうちの１つ以上を更に含む。
【００５０】
いくつかの態様において、キットは、個別化されたガイドＲＮＡを更に含む。
【００５１】
いくつかの態様において、キットは、アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む。
【００５２】
いくつかの態様において、キットは、形質転換のためのコンピテント宿主細胞を更に含む。
【００５３】
いくつかの態様において、キットは、単離されたウイルスゲノム核酸を更に含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示は、単離されたウイルス核酸と、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、少なくとも１つのガイドＲＮＡと、単離された核酸の消化部位に挿入される核酸断片とを含む、インビトロ操作されたウイルス核酸システムを提供する。
【００５５】
いくつかの態様において、システムは、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的指向ＲＮＡとが、単離されたウイルス核酸を消化できる複合体を形成するものである。
【００５６】
いくつかの態様において、システムは、スペルミジンを更に含む。
【００５７】
いくつかの態様において、システムは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、単離されたリガーゼと、ｄＮＴＰの混合物とを更に含み、該システムは、組換えウイルス核酸を形成するための、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの消化部位での単離されたウイルス核酸への核酸断片の挿入に効果的である条件下にある。
【００５８】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムは、組換えウイルス核酸が、操作されていないウイルス核酸から生じるウイルス粒子と比較して少なくとも２つの改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができるようなものである。いくつかの例において、改善された１つのウイルス特性または複数の特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムにおいて、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アセンブリの前に不活性化されるか、または除去される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本開示は、核酸配列を操作する方法を提供し、この方法は、（ａ）核酸を準備することと、（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した核酸の領域のインビトロ消化と、（ｃ）消化された核酸へのＤＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含み、アセンブリは、（ｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｉｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｉｉｉ）単離されたリガーゼと、（ｉｖ）ｄＮＴＰの混合物とを含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、消化された核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される。
【００６１】
いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アセンブリ前に、熱にさらすことにより不活性化されるか、または除去される。
【００６２】
いくつかの態様において、方法は、（ｄ）組換え核酸による宿主細胞の形質転換を更に含む。
【００６３】
いくつかの態様において、本開示は、核酸を操作する方法を提供し、当該核酸は、宿主細胞から単離されたプラスミドである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも５ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも６ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも１０ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも１５ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも２０ｋｂである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａ〜１Ｆはウイルスゲノムを直接操作するためのインビトロプロセスの概略図を示す。Ａ）当業者に知られている方法を利用して、精製されたウイルス粒子からゲノムを抽出する。灰色の線は、例示的なｄｓＤＮＡウイルスゲノムを示す。ゲノム末端の薄い灰色の線は、多くのウイルスゲノムに共通して認められる定方向末端反復配列を表す。Ｂ）次いで、キメラｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ単独などの精製された標的指向ＲＮＡに連結されたＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用して、１つ以上の位置でウイルスゲノムを部位特異的に消化する。図は、所定のＲＮＡによって指定される、定められたウイルスゲノム位置を標的とするＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを示す。Ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを、当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、熱への曝露を使用して不活性化し、及び／または古典的なフェノールクロロホルム抽出を使用して除去する。Ｄ）当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、インビトロ合成、増幅（ＰＣＲ）、またはプラスミド、ウイルスもしくは細菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの酵素による分離を使用してＤＮＡまたはＲＮＡインサートを得る。図は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ消化部位（複数可）（灰色の末端領域）を両端に有するウイルス配列に対応する相同領域を有する、新しく作製されたインサート（濃い灰色の線）を示す。Ｅ）当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ及び／またはゴールデンゲートアセンブリを使用して、消化されたウイルスゲノムと精製されたインサートとをインビトロでアセンブルする。図は、所望の位置に新しい挿入配列（濃い灰色の線）を有する、アセンブルされた組換えゲノムを表す。Ｆ）当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、エレクトロポレーションまたは化学的形質転換を使用して、組換えウイルスゲノムによる宿主細胞の形質転換を直接行う。図像は、感染性ウイルスゲノムによる感受性宿主細胞の形質転換後の機能性ウイルス粒子の回収を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆはウイルスゲノムのインビトロ工学を示す。Ａ）ウイルス粒子からの約４３ｋｂのｄｓＤＮＡ  ＬＵＺ１９ウイルスゲノムの直接精製。Ｂ）ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼＣａｓ９とインビトロ転写されたｇＲＮＡとを使用した、ｇｐ７遺伝子断片を除去するための２つの別々の位置における精製ウイルスゲノムの部位特異的消化。Ｃ）ＰＣＲを使用してウイルスΦＫＦ７７由来のｇｐ７遺伝子を増幅した。Ｄ）インビトロでのギブソンアセンブリを使用して、消化したＬＵＺ１９ゲノムにＰＣＲ増幅したΦＫＦ７７  ｇｐ７遺伝子断片をシームレスに配列特異的に組み込んだ。Ｅ）インビトロでアセンブルした感染性ゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、プラーク形成によって明白に示される機能性ウイルス粒子を回収した。Ｆ）内側及び外側プライマーを使用して、ウイルスが正しいゲノム位置に新規ＤＮＡ断片を含有していることをＰＣＲ検証した。試験したウイルスクローンの全てが、新しいインサートΦＫＦ７７  ｇｐ７断片についてＰＣＲ陽性であった（右側の７レーン）。
【図３】図３Ａ〜３Ｂはインビトロウイルスゲノム工学後に改善されたウイルス特性を有するウイルスの作製を示す。Ａ）天然ＬＵＺ１９ウイルス、及び天然ＬＵＺ１９  ｇｐ１８配列の代わりにＬＫＤ１６ウイルスｇｐ１８遺伝子を有する操作された誘導体の各ゲノムを示す図。黒色の矢印は天然ＬＵＺ１９オープンリーディングフレームを示すのに対し、灰色の矢印は新しく組み込まれたＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子を示す。Ｂ）左：ＬＵＺ１９及びＬＫＤ１６ウイルスに感染した共通の宿主細菌及び独立の宿主細菌を示すベン図。２８２の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床単離物の種々のコレクションを試験した。右：ＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子を有する操作されたＬＵＺ１９ウイルスが、先にはＬＫＤ１６にしか感染しなかった６株のうち３株を含む、拡大した宿主域を有することを示すベン図。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは遺伝因子の特定及び選択に使用したプロセス、ならびに宿主域拡大に必要な点変異、ならびにウイルス属の完全な宿主域に感染できる幅広い宿主域ウイルスの操作を示す概略図である。Ａ）宿主域の特異性に関与する変異を特定するために使用したプロセスの概略図。Ｂ）幅広い宿主域のＬＵＺ１９（ＷＨＲ  ＬＵＺ１９）ウイルスを作製するために必要なゲノム改変を示す概略図。アスタリスク（＊）は、宿主域に関連するそれぞれの点変異の位置を特定する。ｇｐ１３  Ｃ１７Ｙ、ｇｐ１８  Ｄ３６Ｙ、ｇｐ３８  Ｄ８２Ｇ及びＩ８３Ｓならびにｇｐ４０  Ｎ２５３Ｄの表示は、ＬＵＺ１９の宿主域拡大に関連した遺伝子産物及びアミノ酸点変異を表す。ＰＡ７２４５、ＰＡ７２５５、ＰＡ７４１０、ＰＡ７４２７、ＰＡ７５０３及びＰＡ７６８６は、ＬＫＤ１６及びＷＨＲ  ＬＵＺ１９にのみ感受性のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ臨床単離物であり、ＰＡ７６４９は、ΦＫＭＶ及びＷＨＲ  ＬＵＺ１９にのみ感受性のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ臨床単離物である。所定の変異を付加した後に感染した臨床単離物は、その所定の変異の上に記載している。Ｃ）左：ＬＵＺ１９、ＬＫＤ１６及びΦＫＭＶウイルスに感染した共通の宿主細菌及び独立の宿主細菌を示すベン図。右：上記の点変異を有する操作されたＷＨＲ  ＬＵＺ１９ウイルスが、ΦＫＭＶ属のウイルスに感受性である６７株全てに感染できることを示すベン図。
【図５】図５Ａ〜５ＥはＬＵＺ１９  Ｇｐ３４タンパク質の変異が溶菌活性を改善することを示す。Ａ）ＬＵＺ１９  Ｇｐ３４タンパク質は、ウイルス尾部管状複合体の１つである（はめ込み図参照）。Ｂ）野生型ＬＵＺ１９  Ｇｐ３４またはＧｐ３４デルタロイシン５５（Ｌ５５Δ）変異（ファージ＊）のいずれかを発現する２つの関連ファージのための軟寒天プラークアッセイ。２日間にわたって画像を撮った。Ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異を発現するファージが溶解領域を増加したことを示している。Ｃ）クリスタルバイオレットの取り込みを尺度としてバイオフィルム生物量を外挿したクリスタルバイオレットバイオフィルムアッセイ。Ｇｐ３４  Ｌ５５Δを発現するＬＵＺ１９＊ファージは、野生型ＬＵＺ１９と比較して、前もって８時間形成されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを良好に破壊することができた。バイオフィルムを完全に除去するために、ゲンタマイシンを最少阻害濃度（ＭＩＣ）の１０倍で使用した。Ｄ）ｇｐ３４変異の位置を野生型ＬＵＺ１９ゲノムと比較して示す図。Ｅ）ＬＵＺ１９とＧｐ３４  Ｌ５５Δを発現するＬＵＺ１９との間の吸着及び放出数の差を示す表。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは２つの個別の特性改善を有するウイルスの反復的な工学を示す概略図である。Ａ）野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ１８遺伝子をＬＫＤ１６ホモログに置き換えたＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスｇＤＮＡの概略図。黒色は野生型ＬＵＺ１９ゲノム配列、灰色はＬＫＤ１６由来ｇｐ１８。Ｂ）宿主域の統合を示す、精製された親ウイルス（ＬＫＤ１６及びＬＵＺ１９）及び操作されたウイルスＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８に対する実験室及びＭＤＲ臨床単離物の感受性。Ｃ）Ｇｐ３４の位置５５にコードされたロイシンを欠失させ、ＬＵＺ１９  ｇｐ１８をウイルスＬＫＤ１６由来ｇｐ１８に置換した、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスｇＤＮＡの概略図。黒色は野生型ＬＵＺ１９ゲノム配列、灰色はＬＫＤ１６由来ｇｐ１８、灰色の星印はｇｐ３４ΔＬｅｕ５５を表す。Ｄ）ＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８及びＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスにおける宿主域の統合を示す、精製された親ウイルス（ＬＫＤ１６、ＬＵＺ１９及びウイルスＬＫＤ１６由来ｇｐ１８を有するＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８）及び操作されたウイルス（ＧＰ３４の位置５５にコードされたロイシンの欠失を有するＬＵＺ１９＊及びＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８）に対する実験室及びＭＤＲ臨床単離物の感受性。Ｅ）ケラチノサイト単層に付着した細菌に対する野生型及び操作されたファージの溶菌活性の評価。細胞に付着しているＰＡ０１Ｋ及びＰＡ７２４５細菌の数は、ケラチノサイト単層とともにインキュベートした全細菌のうちのパーセンテージとして報告した。データは、ＬＵＺ１９＊及びＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスの溶菌活性が改善したことを示している。Ｆ）親ウイルスと比較した、操作されたファージによるＰＡＯ１Ｋ及びＰＡ７２４５の８時間初期バイオフィルム破壊の改善。バイオフィルムを完全に除去するために、ゲンタマイシンを最少阻害濃度の１０倍で使用した。示したデータは、３連で実施した３回の個別の実験の代表値である。バーは平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、２つの個別の特性改善を有するウイルスの反復的な工学の２つ目の例を示す概略図である。Ａ）遺伝子コードされた種々のペイロードを改善されたｇｐ４９座位から発現するように操作したＬＵＺ１９の概略図。ｇｐ４９遺伝子を主要カプシド（ｇｐ３２）プロモーター及びターミネーター（Ｐｇｐ３２及びＴｇｐ３２）を両端に配した目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するカセットに置き換えた。使用したバイオフィルム分散ＧＯＩ：ＥＰＳデポリメラーゼ（Ｐｐ１５ｇｐ４４−シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）φ１５に由来する尾部スパイクｇｐ４４；ＮＴＵｇｐ３４−クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ファージＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１（ＮＴＵ）に由来する尾部スパイクｇｐ３４；ＬＫＡ１ｇｐ４９−Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＬＫＡ１に由来する尾部スパイクｇｐ４９）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＰＳＭａ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＰＳＭａ３及びＰＳＭｂ２）に由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤、ならびにアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）に由来するＤｓｐＢサーファクチン。Ｂ）１００ファージで３時間処理した２４時間のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１Ｋバイオフィルムに対する操作されたＬＵＺ１９ファージの活性を示す、バイオフィルム分散アッセイ。ゲンタマイシンは、最少阻害濃度（ＭＩＣ）の１０倍で使用した。Ｃ）改変ｇｐ４９座位からＧＯＩを発現するように更に操作した、先に操作されたＷＨＲ  ＬＵＺ１９ファージの概略図。Ｄ）１００ファージで３時間処理した２４時間のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１Ｋバイオフィルムに対する活性を有する、酵素及びサーファクチンを発現するように更に改変した操作されたＷＨＲ  ＬＵＺ１９を示す、バイオフィルム分散アッセイ。操作されたペイロード：ＥＰＳデポリメラーゼＰｐ１５ｇｐ４４及びＳｅＰＳＭａ。ゲンタマイシンは、ＭＩＣの１０倍で使用した。Ｅ）バイオフィルム分散部分を発現するように更に操作した際の宿主域の統合及び保持を示す、精製された親（ＬＫＤ１６及びＬＵＺ１９）及びＬＵＺ１９誘導体に対する実験室及び臨床単離物の感受性。Ｆ）バイオフィルム分散ペイロードＰｐ１５ｇｐ４４及びＳｅＰＳＭａ付加後のＷＨＲ  ＬＵＺ１９宿主域の維持を示すベン図。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、阻害濃度以下の抗生物質と組み合わせて、宿主細胞によるウイルス耐性の獲得を阻害できるウイルスの作製を示す概略図である。Ａ）ＭＳ２またはＰＲＲ１ファージのいずれかに由来するリシンを発現するように操作された野生型ＬＵＺ１９の概略図。Ｂ）及びＣ）ｓｓＲＮＡバクテリオファージ由来リシンを発現するＬＵＺ１９による、阻害濃度以下のカルベニシリン（Ｃｂ−１／５×ＭＩＣ）に対するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１Ｋの感受性化を示すタイムキルアッセイ。これらのデータは、非天然リシンを発現する操作されたバクテリオファージを阻害以下の抗生物質濃度と組み合わせると、細菌が単一のウイルスに対する耐性を急速に獲得するのを防ぐことができることを実証している。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、宿主細胞によるウイルス耐性の獲得を阻害できる２つ目のウイルスの作製を示す概略図である。Ａ）改変ｇｐ４９座位からバクテリオシンタンパク質ＰｙｏＳ５を発現するように操作された野生型ＬＵＺ１９の概略図。Ｂ）ＸＤＲＰＡ  ＰＡ７４１６株の成長は、初めは野生型ＬＵＺ１９によって阻害されたが、細菌は、急速にウイルスを回避し、細菌の再成長に至ることを示す、タイムキルアッセイ。約１×１０７ｃｆｕを各ウェルに加えた。指定のウイルスまたはビヒクルを高ＭＯＩ＝１０ｐｆｕ／ｃｆｕ及び低ＭＯＩ＝０．０１ｐｆｕ／ｃｆｕで時間０ｈに加えた。Ｃ）野生型ウイルスと比較して、ＰｙｏＳ５コードＬＵＺ１９がＸＤＲＰＡ  ＰＡ７４１６株の成長及び再成長を阻害できることを示す、タイムキルアッセイ。約１×１０７ｃｆｕを各ウェルに加えた。指定のウイルスまたはビヒクルを高ＭＯＩ＝１０ｐｆｕ／ｃｆｕ及び低ＭＯＩ＝０．０１ｐｆｕ／ｃｆｕで時間０ｈに加えた。Ｄ）２４時間後の野生型ＬＵＺ１９またはＬＵＺ１９＋ｐｙｏＳ５のいずれかの存在下におけるＰＡ７４１６成長の比較。グラフは、低ＭＯＩ実験のデータを示す。
【図１０】２つ以上の特徴が改善した遺伝子的改変バクテリオファージを作製するために、標的化されたウイルスゲノム編集とバクテリオファージ表現型スクリーニングを統合したシステムの概略図である。このシステムは、所望の表現型形質を有する変異体または天然ウイルスをスクリーニング及び配列決定し、これらの形質を単回または複数回の工学的ステップで１つ以上のウイルス土台に組み込む反復的なラウンドに基づく。このプロセスは、特定のバクテリオファージ表現型形質の基となる遺伝因子を迅速に特定し、多数の個別の変異またはアレルを単一のバクテリオファージゲノムに組み込み、２つ以上の改善された特徴を併せ持つ操作されたウイルスを作製する、直接的かつ合理的な方法を提供する。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｇは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＭ１３ゲノムのインビトロ工学を示す。Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉテンペレートファージＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｐａｐｒｉｋａの概略図。Ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９とともに個別の反応でｇＲＮＡ１及び２を使用してインビトロ消化した環状Ｍ１３ゲノムＤＮＡのゲル電気泳動。ゲルの下にある図は、未消化の天然環状及び線状Ｍ１３ゲノムと、２重消化されたＭ１３ゲノムとをそれぞれ示している。これらのデータは、両方のｇＲＮＡがＭ１３  ｄｓＤＮＡを正しい位置で正確かつ完全に消化することを実証している。Ｃ）ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９の両方を同じ反応で使用してインビトロ消化した環状Ｍ１３ゲノムＤＮＡのゲル電気泳動（２重消化）。ゲルの下にある図は、未消化の天然環状及び線状Ｍ１３ゲノムと、２重消化されたＭ１３ゲノムとをそれぞれ示している。Ｄ）パプリカ蛍光レポーターを含有するＰＣＲ作製したインサートを示すゲル電気泳動。Ｅ）機能性ウイルス粒子を回収するための、インビトロ消化してアセンブルした操作されたＭ１３ｐａｐｒｉｋａｇＤＮＡによるＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換。Ｍ１３は宿主細胞を溶解しないテンペレートファージバクテリオファージであるため、ウイルスプラークは薄く、ベール状であり、その結果プラーク形成が少ない。未消化のＭ１３  ｇＤＮＡをポジティブ対照として使用した。Ｃａｓ９で消化し、インサートのない状態（インサートなし）でアセンブルしたＭ１３  ｇＤＮＡは、消化の完全性及び低レベルのバックグラウンドの両方を示している。Ｆ）Ｍ１３ｐａｐｒｉｋａ工学のプラークＰＣＲ検証。フォワード及びリバースプライマーは、インサート相同領域の外側に設計した。操作されていないＭ１３  ｇＤＮＡは、０．９ｋｂの産物をもたらし、ＰＣＲ反応のネガティブ対照として使用した。Ｇ）プラーク形成中の親及び操作されたＭ１３ｐａｐｒｉｋａの蛍光（下）及び明視野（上）の画像。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、２つ目のＥ．ｃｏｌｉファージゲノムのインビトロ工学を示す。Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉファージλΔｃＩＩの概略図。線状ファージゲノムは、４８．５ｋｂの大きさである。Ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに個別の反応でｇＲＮＡ１及び２を使用してインビトロ消化したλゲノムＤＮＡのゲル電気泳動。ゲルの下にある図は、線状未消化物及び想定される消化生成物を示す。これらのデータは、両方のｇＲＮＡがλ  ｄｓＤＮＡを正しい位置で正確かつ完全に消化することを実証している。Ｃ）ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの両方を同じ反応で使用してインビトロ２重消化したλゲノムＤＮＡのゲル電気泳動。ゲルの下にある図は、線状未消化物及び想定される２重消化生成物を示す。Ｄ）野生型及び組換えファージゲノムをインビトロでパッケージングするためのファージλパッケージング緩衝液の使用を示す概略図。Ｃａｓ９で２重消化し、アセンブルしたファージλゲノムを、製造業者のプロトコルに従ってインビトロでパッケージングし、Ｅ．ｃｏｌｉで平板培養して、新しく操作されたλ  ΔｃＩＩファージを回収した。Ｅ）λ  ΔｃＩＩ遺伝子のＰＣＲ検証。フォワードプライマーは、操作領域の外側に位置した。欠失ポジティブクローンは、３００ｂｐの推定サイズを有する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、ヒトサイトメガロウイルスウイルス（ＨＣＭＶ）の配列のインビトロ工学を示す。Ａ）２３５ｋｂの完全長ＨＣＭＶウイルスゲノムの概略図。上部のタバコ形状のゲノムは完全長ゲノムを表し、黒色の部分は操作領域を表す。小さな白色の部分は、本明細書に記載のインビトロ工学的方法を使用して付加される２３５ｂｐの挿入部を表す。Ｂ）２つのｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９を使用してインビトロで２重消化した、１７．８ｋｂのＨＣＭＶゲノム領域を有するプラスミドのゲル電気泳動。ゲルの下にある図は、環状未消化物及び２重消化線状生成物を示す。これらのデータは、両方のｇＲＮＡがＨＣＭＶ  ｄｓＤＮＡ配列を正しい位置で正確かつ完全に消化することを実証している。Ｃ）新しいＲＬ１３挿入配列を含有するＰＣＲ作製したインサートを示すゲル電気泳動。Ｄ）改変したＨＣＭＶ配列のＰＣＲ検証。フォワードプライマーは、操作領域の外側に位置した。挿入ポジティブクローンは、５００ｂｐの推定サイズを有する。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｆは、ファージ末端の迅速な特定を示す。Ａ）精製されたウイルス粒子からのゲノムＤＮＡの単離。Ｂ）ｇＤＮＡの次世代シーケンシング（ＭｉＳｅｑまたはＰａｃＢｉｏ）、及び元の配列を再構築するための高品質ＤＮＡリードのより長いアセンブリへの自動マージ。薄い灰色、ＤＴＲ−定方向末端反復配列。自動アセンブリソフトウェアは、末端反復ゲノムのＤＴＲをウイルス配列の内側領域に誤って配置する。ゲノム物理的末端を予測配列の標的化されたＣａｓ９消化によって確認する。Ｃ）ダブルカバレッジシーケンシング領域の特定と、密接に関連する末端反復ゲノムにマッチするＢＬＡＳＴの検索とに基づいた物理的ゲノム末端のインシリコ予測。物理的末端を予測物理的末端のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ切断によって確認する。Ｄ）Ｃａｓ９不活性化の後、ゲノム物理的末端に該当するＤＮＡ断片を精製し、配列決定する。Ｅ）物理的末端配列決定に基づいた正確なゲノムアセンブリ。Ｆ）インシリコゲノム再配置によって予測された特定位置でのＣａｓ９標的化消化を使用したＬＢＬ３及び１４−１ファージ（末端反復ゲノム）のゲノム物理的末端マッピングの例。薄い灰色の矢印は、精製し、配列決定したＤＮＡ断片を指す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、キメラｓｇＲＮＡの設計及び合成戦略の概略図を示す。Ａ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）の両端に位置するＮＧＧ  ＰＡＭモチーフ（濃い灰色の下線が付いた配列）及びｓｇＲＮＡ標的部位（薄い灰色の配列）の位置を示す図。黒色の配列は、残りのウイルスゲノム配列を表す。Ｂ）ｓｇＲＮＡのインビトロ転写用鋳型として使用したオリゴヌクレオチドの消化。Ｔ７プロモーターを構成する配列、ｓｇＲＮＡ標的指向配列及び保存キメラｓｇＲＮＡ領域をそれぞれ下線付きの濃い灰色、薄い灰色及び黒字で表す。Ｃ）インビトロ転写されたキメラｓｇＲＮＡの図。薄い灰色及び黒色の配列は、各機能性ｓｇＲＮＡを構成する標的指向及び保存キメラ領域をそれぞれ示す。Ｎは全て、各ｓｇＲＮＡの標的特異性を変更するために使用される可変配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本開示は、インビトロ工学のための組成物及びその方法を提供し、更にウイルス特性の改善に関する。本開示は、核酸のインビトロ工学のための方法を更に提供する。
【００６６】
本組成物及び方法について記載する前に、本開示は、記載される特定の組成物、方法及び実験条件に限定されるものではなく、かかる組成物、方法及び条件は多様であり得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的にし、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００６７】
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法及び材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。以下に記載する定義は、本開示を理解するためのものであるが、いかなる場合も、当業者が有する用語の理解に取って代わるものとみなされるべきでない。
【００６８】
本明細書及び添付する特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ある」、「1つの」及び「その」は、文脈により別途明示される場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「その方法」への言及は、本開示などを読むことによって当業者に明らかになるであろう、本明細書に記載される形態の１つ以上の方法及び／またはステップを含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、任意の数値を指すときの「約」または「およそ」という用語は、指定値のプラスまたはマイナス１０％の値を意味することが意図される。例えば、「約５０℃」（または「およそ５０℃」）は、４５℃以上〜５５℃以下の温度範囲を包含する。同様に、「約１００ｍＭ」（または「およそ１００ｍＭ」）は、９０ｍＭ以上〜１１０ｍＭ以下の濃度範囲を包含する。あるいは、「約」または「およそ」は、指定値の５％以内、ある場合には指定値の２．５％以内を意味し得、または「約」は、最も近い有効数字に丸められることを意味し得る。本出願中に記載される全ての範囲は、その範囲の上限及び下限の値を含む。
【００７０】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」及び「宿主細胞」という用語は、初代対象細胞及びその任意の子孫を含み、継代数は問わない。全ての子孫が親細胞と正確に同一であるわけではないが（意図的なもしくは故意ではない変異または環境の違いによる）、このように変更された子孫は、当該子孫が元の形質転換細胞と同じ機能性を保持する限り、これらの用語に含まれることを理解されたい。
【００７１】
本明細書で使用される「アセンブリ」または「アセンブル」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の連結を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「修復核酸分子」という用語は、連続した核酸配列分子または閉じたプラスミドＤＮＡを生成するために、１つ以上のＤＮＡ断片または消化もしくは切断されたＤＮＡプラスミドもしくはＤＮＡ核酸分子とアセンブル可能である核酸分子を指す。
【００７３】
「デノボ合成」、「デノボアセンブリ」、「化学合成」及び「ＤＮＡ合成」という用語は、既存の前駆体鋳型を必要とせずに核酸配列を作製する方法を指す。
【００７４】
「インビトロ」で実施される本発明の各方法において、タンパク質構成成分の全ては、単離され、及び／または実質的に精製される。インビトロでのアセンブリ反応は、生細胞中において、または細胞粗抽出物を使用して実施されるものではなく、この反応は細胞を含まない環境で実施される。
【００７５】
「機能性ＲＮＡ分子」とは、１つ以上のタンパク質または核酸分子と相互に作用して、当該機能性ＲＮＡを産生する遺伝子以外の遺伝子または遺伝子産物の発現または活性に影響を与える構造的、触媒的または調節的機能を果たすか、あるいはそれらの機能に関与することができるＲＮＡ分子である。機能性ＲＮＡは、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、クリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）もしくはトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）またはリボザイムであり得る。
【００７６】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは発現されるＲＮＡをコードする核酸分子（典型的にはＤＮＡであるが、場合によりＲＮＡ）の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子は、発現されるＲＮＡをコードする配列を含む（ポリペプチドコード配列を含み得、または例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、リボザイムなどの機能性ＲＮＡを含み得る）。遺伝子は、その発現に必要とされるか、または影響を与える調節配列のみならず、天然状態において、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列に関係する配列、例えば、イントロン配列、５’または３’非翻訳配列などを更に含み得る。いくつかの例において、遺伝子は、イントロンを含んでも含まなくてもよい、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のうちのタンパク質をコードしている部分のみを指す場合もある。遺伝子は、好ましくは５０ヌクレオチド長超、より好ましくは１００ヌクレオチド長超であり、例えば、１００ヌクレオチド〜１００，０００ヌクレオチド長または約２００ヌクレオチド〜約５０，０００ヌクレオチド長または約２００ヌクレオチド〜約２０，０００ヌクレオチド長などの５０ヌクレオチド〜５００，０００ヌクレオチド長であり得る。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすること、または既知もしくは予測される配列情報から合成することを含め、種々の供給源から得ることができる。
【００７７】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のセグメントを指し、また修飾骨格（例えば、ペプチド核酸、ロックド核酸）または修飾もしくは非天然ヌクレオ塩基を有する核酸も含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、遺伝子またはその一部を含む一本鎖核酸は、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【００７８】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード領域」という用語は、適切な発現制御配列の制御下に置かれ、かつ適切な細胞機構または酵素が存在するとき、転写されて、機能性ＲＮＡ、またはポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡ転写物を産生することができる核酸配列の領域を指す。「非コード配列」または「非コード領域」という用語は、転写及びアミノ酸に翻訳されない核酸配列の領域（例えば、イントロン、非翻訳領域など）、または転写されないか、もしくは成熟機能性ＲＮＡ配列の少なくとも一部を形成しない核酸配列の領域を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により線状に連結した単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の単一または複数の鎖を指し、産生物の特定の長さを示すものではない。したがって、２つ以上のアミノ酸の単一または複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または区別なく、使用することができる。
【００８０】
核酸分子は、示された供給源「から得る」ことができ、これには、示された供給源からの核酸セグメントの単離（全部または一部）が含まれる。核酸分子はまた、例えば、示されたポリヌクレオチド供給源からの、または示されたポリヌクレオチド供給源に関連する配列に基づく、直接クローニング、ＰＣＲ増幅または人工合成によって、示された供給源から得ることもできる。特定の供給源または種から得られた遺伝子または核酸分子は、供給源の核酸分子に対して配列改変を有する遺伝子または核酸分子も含む。例えば、供給源（例えば、特定の参照遺伝子）から得られた遺伝子または核酸分子は、供給源の遺伝子または核酸分子に対して、意図しないまたは故意に導入された１つ以上の変異を含み得る。置換、欠失または挿入を含む１つ以上の変異が故意に導入される場合、この配列変更は、細胞もしくは核酸のランダム変異もしくは標的化された変異によって、増幅もしくは他の分子生物学的技術によって、または化学合成、またはこれらの任意の組み合わせによって、導入することができる。機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から得られる遺伝子または核酸分子は、その参照もしくは供給源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドまたはその機能性断片に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。例えば、機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から得られる遺伝子または核酸分子は、その参照もしくは供給源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドまたはその機能性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはタンパク質は、その天然環境またはその核酸もしくはタンパク質が本来存在する状況から取り出されたものである。例えば、単離されたタンパク質または核酸分子は、その自然環境または天然環境中において関連している細胞または生物から取り出されたものである。単離された核酸またはタンパク質は、場合により、部分的または実質的に精製され得るが、特定レベルの精製が単離に必要というわけではない。したがって、例えば、単離された核酸分子は、その核酸分子が本来組み込まれている染色体、ゲノムまたはエピソームから切り出された核酸配列であり得る。
【００８２】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞物質及び細胞構成成分を実質的に含まない。精製された核酸分子またはタンパク質は、例えば、緩衝液または溶媒以外の化学物質を含み得ない。「実質的に含まない」とは、新規核酸分子以外の他の成分が検出不可能であることを意味するものではない。
【００８３】
「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」及び「野生型」という用語は、自然中に認められる形態を指す。例えば、天然または野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然源中に存在し、天然源から単離することができ、人工的操作によって意図的に改変されていないものである。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「発現」は、少なくともＲＮＡ産生レベルでの遺伝子の発現を含み、「発現産物」は、発現された遺伝子から生じた産生物、例えば、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）を含む。「発現の増加」という用語は、ｍＲＮＡ産生の増加及び／またはポリペプチド発現の増加を促進する遺伝子発現の変化を含む。「産生の増加」は、タンパク質の存在量または遺伝子発現から生じる活性タンパク質の存在量、タンパク質代謝回転率、タンパク質活性化状態などに関するとき、ポリペプチドの天然での産生または酵素活性と比較した、ポリペプチド発現量、ポリペプチドの酵素活性レベルまたはその両方の組み合わせにおける増加を含む。
【００８５】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」とは、細胞またはウイルス中に導入された（「形質転換を生じさせた」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換された生物は、組換え細胞または組換えウイルスとも呼ばれることがあり、更なる外因性遺伝子（複数可）が導入されてもよい。核酸分子で形質転換された細胞またはウイルスの子孫も同様に、外因性核酸分子を受け継いでいるのであれば、「形質転換」または「組換え」と呼ばれる。外因性遺伝子は、形質転換される生物に対して、別の種に由来するもの（ゆえに「異種」）であっても、同じ種に由来するもの（ゆえに「同種」）であってもよい。「内因性」核酸分子、遺伝子またはタンパク質は、生物中に生じるか、または生物によって自然に産生される天然核酸分子、遺伝子またはタンパク質である。
【００８６】
更に、本明細書で遺伝子またはタンパク質との関連にて使用される「外因性」という用語は、宿主生物種に由来しない遺伝子またはタンパク質を指す。
【００８７】
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、外因性遺伝子、すなわち、人間の介入によって、微生物または前駆細胞中に導入された遺伝子を指す。
【００８８】
本明細書で使用される遺伝子またはタンパク質の「オルソログ」という用語は、別の種との機能的同等性を指す。
【００８９】
本明細書において遺伝子または種の名称の後の括弧内に概して記載される遺伝子及びタンパク質のアクセッション番号は、米国国立衛生研究所が管理する国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で一般に入手できる、配列登録に対する固有の識別子である。「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」（ＧＩ）配列識別番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に固有のものである。いかなるものであれ配列に変更がある場合には、新しいＧＩ番号が付与される。特定のＧｅｎＢａｎｋ登録に表示される、配列の各種ＧＩ番号、更新番号及び更新日を追跡するには、配列更新履歴ツールを利用することができる。アクセッション番号及びＧＩ番号に基づいて核酸もしくは遺伝子配列またはタンパク質配列を検索し、取得することは、当該技術分野、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学及び分子遺伝子学においてよく知られている。
【００９０】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチド配列に対する「同一性パーセント」または「相同性」という用語は、最大同一性パーセントを得るように配列をアラインメントし、必要に応じて、最大相同性パーセントを達成するようにギャップを導入した後の、既知のポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ端末またはＣ端末の挿入または欠失は相同性に影響を及ぼすものと解釈されるものではなく、約３０未満、約２０未満または約１０未満のアミノ酸残基のポリペプチド配列の内部の欠失及び／または挿入は相同性に影響を及ぼすものと解釈されるものではない。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索向けに作られた、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘの各プログラムが採用されているアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析によって決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８）。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、まず、クエリー配列とデータベース配列との間の類似セグメントをギャップありまたはなしで検討し、次いで、特定された全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、事前に選択した有意性の閾値を満足するマッチのみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的事項の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、行列及びフィルター（低複雑度）の検索パラメーターは、デフォルト設定であり得る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコア行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９）であり、８５を超える長さのクエリー配列（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）に推奨される。
【００９１】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎの場合、スコア行列は、Ｍ（すなわち、一対のマッチ残基に対するリワードスコア）のＮ（すなわち、ミスマッチ残基に対するペナルティスコア）に対する比によって設定され、Ｍ及びＮのデフォルト値は、それぞれ＋５及び−４であり得る。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、次のように調整することができる。Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）、Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）、ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってｗｉｎｋ番目の位置ごとにワードヒットを生成する）及びｇａｐｗ＝１６（ギャップ付きアラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。アミノ酸配列を比較する場合の同等のＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１及びｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で使用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーター  ＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を使用でき、タンパク質比較での同等設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２であり得る。
【００９２】
したがって、本開示のポリペプチドまたは核酸配列に関するとき、完全長のポリペプチドもしくは核酸配列、または全タンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０以上のアミノ酸残基の連続配列を含むその断片；かかる配列のバリアント（例えば、挿入及び置換を含有する本開示の配列（複数可）のＮ末端及び／もしくはＣ末端及び／またはその配列中に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されている）に対して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性または約１００％の配列同一性が含まれる。企図されるバリアントは、追加的にまたは代替的に、例えば、相同組換えまたは部位特異的もしくはＰＣＲ変異導入による所定の変異を含有するもの、ならびに対応する他の種のポリペプチドまたは核酸（限定するものではないが、本明細書に記載されるものを含む）、挿入及び置換を含有するポリペプチドまたは核酸のファミリーのアレルまたは他の天然バリアント、及び／または誘導体であって、そのポリペプチドが、置換、化学的、酵素的または他の適切な手段によって、挿入及び置換を含有する天然アミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）で共有結合的に修飾されている誘導体を含み得る。
【００９３】
「天然（ｎａｔｉｖｅ）」という用語は、宿主、生物またはウイルス中において自然に生じる核酸配列またはアミノ酸配列を指すために本明細書で使用される。「非天然」という用語は、宿主、生物またはウイルス中において自然に生じない核酸配列またはアミノ酸配列を指すために本明細書で使用される。細胞またはウイルスから取り出され、実験操作に供せられ、宿主細胞またはウイルス中に導入または再導入された核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」とみなされる。宿主細胞またはウイルス中に導入された合成遺伝子または部分的合成遺伝子は、「非天然」である。非天然遺伝子は、ウイルスに対して内因性である遺伝子を含み、この遺伝子は、宿主ゲノムに組み換えられた１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結されている。
【００９４】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、人工的操作によって変更された核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）例えば、化学的または酵素的技術を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼ性またはエンドヌクレアーゼ性）、連結、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、組込みもしくは組換え（相同及び部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって）、インビトロで部分的または完全に合成されたまたは修飾された任意の核酸分子；２）天然では結合されていない、結合されたヌクレオチド配列を含む任意の核酸；３）分子クローニング技術を使用して、天然の核酸分子配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠くように操作された任意の核酸分子；及び／または４）分子クローニング技術を使用して、天然の核酸配列に対して１つ以上の配列変更または再編成を有するように操作された任意の核酸分子を含む。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって作製された任意の核酸分子、またはリンカーが結合された任意の核酸分子、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子のような組換えＤＮＡ分子である。
【００９５】
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、遺伝子工学によって産生されたタンパク質を指す。
【００９６】
生物またはウイルスに適用されるときの組換え、操作された、または遺伝子操作されたという用語は、生物またはウイルスへの異種または外因性（例えば、非天然）組換え核酸配列の導入によって操作された生物またはウイルスを指し、限定するものではないが、遺伝子ノックアウト、標的化された変異及び遺伝子置換、プロモーター置換、欠失または挿入、または生物もしくはウイルスへの核酸分子、例えば、導入遺伝子、合成遺伝子、プロモーターまたは他の配列の移入を含む。組換えまたは遺伝子操作された生物またはウイルスはまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入された生物またはウイルスであり得る。このような構築物には、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス及びリボザイム構築物が挙げられるが、これらに限定されない。また、ゲノムがＣａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼの働きによって変更された生物またはウイルスも含まれる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作されたウイルスもしくは生物のゲノム中に組み込まれ得るか、または他の場合には組換え／遺伝子操作されたウイルスもしくは生物のゲノム中に組み込まれない。本明細書で使用される場合、「組換えウイルス」または「組換え宿主細胞」は、本開示の組換えウイルスの子孫または誘導体を含む。変異または環境的影響のいずれかに起因して、ある種の改変が後の世代に生じ得るので、このような子孫または誘導体は、事実上、親細胞と同一ではないが、本明細書で使用される用語の範囲内になおも含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される「工学的ステップ」という用語は、本明細書で開示されるまたは当該技術分野において知られている任意の工学的方法の実施を指す。例えば、「工学的ステップ」は、目的の工学的方法の単一ラウンド、例えば、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法の単一ラウンド、１回のＰＣＲによる変異導入または２つのＤＮＡ片を結合する１回のライゲーション反応などであり得る。同様に、「反復的な工学的ステップ」とは、２回以上連続して工学的方法を実施することを指す。
【００９８】
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素に関して使用されるとき、宿主種に由来しないポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を指す。例えば、本明細書で使用される「異種遺伝子」または「異種核酸配列」とは、それらが導入される宿主生物またはウイルスの種とは異なる種に由来する遺伝子または核酸配列を指す。遺伝子配列の発現を操作するために使用される遺伝子調節配列もしくは補助的核酸配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、配列内リボソーム進入配列、ゲノム相同領域、組換え部位など）またはタンパク質ドメインもしくはタンパク質局在化配列をコードする核酸配列に関するときの「異種」とは、当該調節もしくは補助的配列またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする配列が、当該調節もしくは補助的核酸配列またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする核酸配列がゲノム、染色体またはエピソーム中で近接している遺伝子とは異なる供給源に由来することを意味する。したがって、その天然状態（例えば、遺伝子操作されていない生物またはウイルスのゲノム中）では作動可能に連結していない遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、そのプロモーターが、連結される遺伝子と同じ種（または場合によっては同じ生物またはウイルス）に由来し得る場合であっても、本明細書において、「異種プロモーター」と呼ばれる。同様に、操作されたタンパク質のタンパク質局在化配列またはタンパク質ドメインに関するときの「異種」とは、当該局在化配列またはタンパク質ドメインが、遺伝子工学によって導入されるものとは異なるタンパク質に由来することを意味する。
【００９９】
「調節配列」、「調節エレメント」または「調節エレメント配列」とは、コード配列の上流（５’）、コード配列中、またはコード配列の下流（３’）に位置するヌクレオチド配列を指す。コード配列の転写及び／またはコード配列の転写から生じたＲＮＡ分子の翻訳は、典型的に、調節配列の有無の影響を受ける。これらの調節エレメント配列は、プロモーター、シスエレメント、エンハンサー、ターミネーターまたはイントロンを含み得る。調節エレメントは、特定のポリヌクレオチド配列に由来する非翻訳領域（ＵＴＲ）から単離または特定することができる。本明細書に記載の調節エレメントのいずれかがキメラまたはハイブリッド調節発現エレメント中に存在し得る。本明細書に記載の調節エレメントのいずれかが本発明の組換え構築物中に存在し得る。
【０１００】
「プロモーター」、「プロモーター領域」または「プロモーター配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、５’末端から３’末端（「下流」）方向への遺伝子の転写を開始することができる核酸配列を指す。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合が遺伝子の転写の主原因であるとき、その遺伝子は、プロモーター「の制御下」にあり、またはプロモーター「によって制御」される。プロモーターまたはプロモーター領域は、典型的に、転写の適切な開始に必要なＲＮＡポリメラーゼ及び他の因子の認識部位を提供する。プロモーターは、遺伝子のゲノムコピーの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離することができる。あるいは、プロモーターは、合成的に作製されてもよいし、既知のＤＮＡエレメントを変更することによって設計されてもよい。あるプロモーターの配列と別のプロモーターの配列とを組み合わせたキメラプロモーターも考えられる。プロモーターは、例えば、代謝、環境または発育条件に基づいた発現パターンによって定義することができる。プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子、例えば、コード配列の発現を調節するための調節エレメントとして使用することができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び好ましくは他の転写因子によって認識される配列に加えて、シスエレメントまたはエンハンサードメインなどの作動可能に連結された遺伝子の転写に影響を与える調節配列エレメントを含み得る。「ウイルスプロモーター」は、ウイルスゲノム内に位置する１つ以上の遺伝子の転写を開始する天然または非天然プロモーターである。
【０１０１】
本明細書で使用される「構成性」プロモーターという用語は、ほとんどの環境及び発育条件下で活性であるプロモーターを指す。構成性プロモーターは、光及び培地組成などの外部環境にかかわらず活性である。いくつかの例において、構成性プロモーターは、栄養素の存在下及び非存在下で活性である。例えば、構成性プロモーターは、窒素枯渇条件下でも、窒素が制限されない条件（窒素充足条件）下でも活性である（プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介する）プロモーターであってもよい。対照的に、「誘導性」プロモーターは、栄養素または制御因子の有無、光の存在などの特定の環境条件に応答して活性となるプロモーターである。
【０１０２】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に置かれ、これにより、当該制御配列がポリペプチド及び／または機能性ＲＮＡ）のコード配列の発現を誘導または制御するような構成を指す。したがって、プロモーターは、そのプロモーターが核酸配列の転写を媒介するのであれば、核酸配列と作動可能に連結されている。宿主細胞中に導入されると、発現カセットは、適切な条件下で、コードされたＲＮＡまたはポリペプチドの転写及び／または翻訳をもたらすことができる。翻訳されないまたは翻訳され得ないアンチセンスまたはセンス構築物は、この定義から除外されない。導入遺伝子の発現と内因性遺伝子の抑制（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉによる）の両方の場合、当業者であれば、挿入されるポリヌクレオチド配列は、同一である必要はなく、由来する遺伝子の配列に対して実質的に同一であるだけでよいことを認識するであろう。本明細書で説明されるように、これらの実質的に同一のバリアントは、特定の核酸配列を参照することにより、具体的に対象として包含される。
【０１０３】
本明細書で使用される「選択マーカー」または「選択マーカー遺伝子」という用語は、本発明の核酸構築物を用いてトランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択を容易にするために細胞で発現される、細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。本用語はまた、当該表現型をもたらす遺伝子産物を指すために使用され得る。選択マーカーの非限定的な例には、１）アミカシン（ａｐｈＡ６）、アンピシリン（ａｍｐＲ）、ブラストサイジン（ｂｌｓ、ｂｓｒ、ｂｓｄ）、ブレオマイシンまたはフレオマイシン（ＺＥＯＣＩＮ（商標））（ｂｌｅ）、クロラムフェニコール（ｃａｔ）、エメチン（ＲＢＳ１４ｐまたはｃｒｙ１−１）、エリスロマイシン（ｅｒｍＥ）、Ｇ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（商標））（ｎｅｏ）、ゲンタマイシン（ａａｃ３またはａａｃＣ４）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈＩＶ、ｈｐｈ、ｈｐｔ）、カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、メトトレキサート（ＤＨＦＲｍｔｘＲ）、ペニシリン及び他のβ−ラクタム（β−ラクタマーゼ）、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（ａａｄＡ、ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐ）、及びテトラサイクリン（ｔｅｔＡ、ｔｅｔＭ、ｔｅｔＱ）などの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子；２）アミノトリアゾール、アミトロール、アンドリミド、アリールオキシフェノキシプロピオン酸、アトラジン、ビピリジリウム、ブロモキシニル、シクロヘキサンジオンオキシム  ダラポン、ジカンバ、ジクロホップ（ｄｉｃｌｆｏｐ）、ジクロロフェニルジメチル尿素（ＤＣＭＵ）、ジフノン、ジケトニトリル、ジウロン、フルリドン、グルホシネート、グリホサート、ハロゲン化ヒドロベンゾニトリル、ハロキシホップ、４−ヒドロキシピリジン、イミダゾリノン、イソキサフルトール、イソオキサゾール、イソオキサゾリジノン、ミロアミドＢ、ｐ−ニトロジフェニルエーテル、ノルフルラゾン、オキサジアゾール、ｍ−フェノキシベンズアミド、Ｎ−フェニルイミド、ピノキサジン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、ピリダジノン、ピラゾリネート、スルホニル尿素、１，２，４−トリアゾールピリミジン、トリケトンまたは尿素などの除草剤に対する耐性を付与する遺伝子；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｈａｓ）；アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ、ｃｓｒ１−１、ｃｓｒ１−２、ｉｍｒ１、ｉｍｒ２）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ａｐｔ）、アントラニル酸シンターゼ、ブロモキシニルニトリラーゼ（ｂｘｎ）、シトクロムＰ４５０−ＮＡＤＨ−シトクロムＰ４５０酸化還元酵素、ダラポン  脱ハロゲン化酵素（ｄｅｈａｌ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ）、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）クラスＩ、ＥＰＳＰＳ  クラスＩＩ（ａｒｏＡ）、クラスＩ／ＩＩ以外のＥＰＳＰＳ、グルタチオン還元酵素、グリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ｇａｔ）、グリホサート酸化還元酵素（ｇｏｘ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ｈｐｐｄ）、イソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、リコピンシクラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフ��ラーゼ（ｐａｔ、ｂａｒ）、フィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ）、プレニルトランスフェラーゼ、プロトポルフィリンオキシダーゼ、ｐｓｂＡ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）及びＳＭＭエステラーゼ（ＳｕｌＥ）スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ）；３）栄養要求性菌株にまたは他の代謝作用を付与するために使用され得る遺伝子、例えば、ａｒｇ７、ｈｉｓ３、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＧ、ｌｙｓＡ、ｍａｎＡ、ｍｅｔＥ、ｎｉｔ1、ｔｒｐＢ、ｕｒａ３、ｘｙｌＡなど、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子またはオルニチン脱炭酸酵素遺伝子；チミジンキナーゼなどの陰性選択因子；または２−デオキシグルコース耐性遺伝子などの毒素耐性因子が挙げられる。
【０１０４】
「レポーター遺伝子」は、検出可能であるか、または検出可能な生成物を産生する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子は、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｉｄＡ、ｘｙｌＥ、アルカリホスファターゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、α−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ルシフェリン／ルシフェラーゼ遺伝子、Ｒ座遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、または蛍光タンパク質、例えば、限定するものではないが、青色、シアン色、緑色、赤色、パプリカ色もしくは黄色蛍光タンパク質、光変換型、光切り替え型もしくは光学的ハイライター蛍光タンパク質、もしくはこれらのバリアントのいずれか、例えば、限定するものではないが、コドン最適化、迅速なフォールディング、単量体、安定性の増大及び蛍光の向上したバリアントをコードする遺伝子などの検出可能なシグナルを生じる可視マーカーまたは酵素をコードし得る。
【０１０５】
本明細書で使用される「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」または「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」という用語は、１つ以上のガイドＲＮＡによって切断標的部位に誘導される核酸切断酵素を指す。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２及びＣ２ｃ３が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で使用される「ターミネーター」または「ターミネーター配列」または「転写ターミネーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終了させる遺伝子配列の調節部分を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される「宿主細胞への導入」及び「形質転換」という用語は、１つ以上の物理的、化学的または生物学的方法を使用することによる、宿主細胞または生物への１つ以上の外因性核酸配列またはポリヌクレオチドの導入を指す。形質転換の物理的及び化学的方法（すなわち、「トランスフェクション」）には、非限定的な例として、エレクトロポレーション、パーティクルガン、化学的誘導コンピテンス及びリポソーム送達が挙げられる。形質転換の生物学的方法（すなわち、「形質導入」）には、ウイルスまたは微生物（例えば、アグロバクテリウム）を使用したＤＮＡの移行を含む。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、ゲノムを「設計する」ことは、目的とする最終ゲノムの所望の核酸配列を決定することを指す。設計は、基本的な知識、文献源、実験データまたはこれらの任意の組み合わせから知ることができる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、核酸分子、タンパク質、ウイルス粒子またはこれらの組み合わせに関するときの「組換え」または「操作された」とは、人工的操作によって作製された非天然核酸分子、タンパク質、ウイルス粒子またはこれらの組み合わせを意味する。非限定的な例として、組換えまたは操作された核酸分子は、１）例えば、化学的または酵素的技術を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼ性またはエンドヌクレアーゼ性）、連結、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、組込みもしくは組換え（相同及び部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって）、インビトロで部分的または完全に合成されたまたは修飾された任意の核酸分子；２）天然では結合されていない、結合されたヌクレオチド配列を含む任意の核酸分子；３）分子クローニング技術を使用して、天然の核酸分子配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠くように操作された任意の核酸分子；及び／または４）分子クローニング技術を使用して、天然の核酸配列に対して１つ以上の配列変更または再編成を有するように操作された任意の核酸分子を含む。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって作製された任意の核酸分子、またはリンカーが結合された任意の核酸分子、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子のような組換えＤＮＡ分子である。組換えまたは操作されたＲＮＡまたはタンパク質は、組換えまたは操作された核酸分子からそれぞれ転写または翻訳されたものである。組換えまたは操作されたウイルス粒子またはウイルスは、操作されたウイルス配列またはウイルスゲノムから作製されたものである。
【０１１０】
「ウイルスゲノム」という用語は、遺伝子及び非コード配列を含む、ウイルス粒子中の１つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に含まれる完全な遺伝子相補体を指す。「操作されたウイルスゲノム」という用語は、人工的操作の結果であり、かつ適合性のある宿主細胞中に導入されると非天然ウイルス粒子を産生することができる、非天然ウイルスゲノムを指す。
【０１１１】
「ウイルス核酸」という用語は、ウイルスゲノムに由来する配列を含む核酸を指す。「ウイルス核酸」は、全ウイルスゲノムまたはウイルスゲノムの一部を含み得る。ウイルス核酸は、ウイルスタンパク質を含むアミノ酸配列をコードし得る。場合によっては、所定のウイルスのオープンリーディングフレームによってコードされた完全な成熟タンパク質またはポリペプチド配列は、定義または特徴付けされなくてもよい。変異（変更、欠失または置換など）または異種配列の挿入に適した部位を含み得るウイルス核酸配列によってコードされた本明細書で提供されるアミノ酸配列は、ウイルスポリペプチドまたはウイルスタンパク質の全部または一部を含み得るコード化アミノ酸配列として本明細書で開示され得る。
【０１１２】
「ウイルス粒子」及び「ビリオン」という用語は、ウイルスが感染細胞の内部以外に存在する間、または細胞に感染する過程中にみられる独立した形態を指す。これらのウイルス粒子（ビリオン）は、カプシドと呼ばれるタンパク質コートに囲まれた、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムのいずれかから構成される。いくつかのビリオンはまた、カプシドタンパク質コートの内側または外側のいずれかに更なる脂質エンベロープを有する。「ウイルス粒子」、「ビリオン」及び「ウイルス」という用語は、区別なく使用することができる。
【０１１３】
本明細書で使用される「ウイルス特性」という用語は、ウイルスの複製もしくは生活環のいずれかの側面またはウイルスの複製もしくは生活環から生じる側面を指す。本明細書で使用される場合、「ウイルス特性」とは、多くの場合、所望の結果を達成するために人間の介入によって変更または操作することができる特性を指す。ウイルス特性の非限定的な例には、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集が挙げられる。いくつかの態様において、改善された１つの特性または改善された複数の特性及び改善された１つのウイルス特性または改善された複数のウイルス特性は、区別なく使用される。
【０１１４】
「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は、区別なく使用することができ、細菌に感染するウイルスを指す。
【０１１５】
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔のある短い回文の繰り返し配列）は、塩基配列の短い反復を含有するＤＮＡ座位である。各反復の後には、可動性遺伝因子への過去の曝露に由来する「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが続く。ＣＲＩＳＰＲは、配列決定された細菌ゲノムの約４０％及び配列決定された古細菌の９０％にみられる。ＣＲＩＳＰＲは、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲ機能に関係するタンパク質をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子を伴う。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、原核生物の免疫システムであり、プラスミド及びファージなどの外来遺伝因子に対する耐性を付与し、獲得免疫の形成をもたらす。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、短いｃｒＲＮＡをコードし、この配列により、標的配列にＣａｓエンドヌクレアーゼを特異的に誘導し、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の方法でこれらの外因性遺伝因子を切断する。
【０１１６】
遺伝子編集及び遺伝子調節には多くの種でＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが使用されている。これらのシステムは、１つのＣａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）と標的指向ｃｒＲＮＡを要するだけなので、特に有用である。天然の系では、エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、活性化のために、個別に転写される２つのＲＮＡを必要とするが、これらの２つのＲＮＡを共有結合させて１つのキメラｇＲＮＡを形成することもできる。Ｃａｓ９タンパク質及び適切なｇＲＮＡが細胞中に送達されると、生物のゲノムは、任意の所望の位置で切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ウイルス、プラスミド及び他の可動性遺伝因子に対する保護をもたらすＲＮＡ誘導型防御システムを構成する。この防御経路は、３つのステップを有する。まず、侵入した核酸のコピーがＣＲＩＳＰＲアレイ中に組み込まれる。次に、ＣＲＩＳＰＲアレイが長いＣＲＩＳＰＲ転写物に転写され、その後プロセッシングされて成熟ｃｒＲＮＡになる。次いで、ｃｒＲＮＡは、エフェクター複合体に組み入れられ、ｃｒＲＮＡは、侵入した核酸へこの複合体を誘導し、Ｃａｓタンパク質がこの核酸を分解する。上述のように、天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９の活性化を可能にするために、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの両方を要する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと相補的であるため、塩基対となり、ＲＮＡ二本鎖を形成する。これがＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ  ＩＩＩにより切断され、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成する。このハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのガイドとして機能し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、侵入した核酸を切断して侵入ＤＮＡの二本鎖を分解し、宿主細胞を保護する。Ｃａｓ９による切断は、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に厳密に依存する。ガイドＲＮＡによって定められた特定部位で切断するようにＣａｓ９をプログラムできることにより、Ｃａｓ９は、ゲノム工学及び遺伝子調節のための多機能プラットフォームとして採用されるに至っている。ゲノム工学の当該方法は、２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、２０１４年６月１９日に公開された同第２０１４／０１７０７５３号、ならびに２０１４年９月１８日に、ともに公開された同第２０１４／０２７３０３７号及び同第２０１４／０２７３２２６号に記載されており、これらの全てを参考として援用する。
【０１１７】
ゲノム工学に使用することができるプログラム可能な他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムも記載されており、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２及びＣ２ｃ３システムが含まれる。Ｃｐｆ１システムは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムであり、１つの標的指向ガイドＲＮＡによる粘着末端ＤＮＡ切断を媒介する（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３，１−１３）（参考として援用する）。Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３はともにＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムであり、Ｃ２ｃ２は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムであることが提案されている（Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２０１５）６０，１−１３）（参考として援用する）。
【０１１８】
ＤＮＡアセンブリ
遺伝子工学の際のＤＮＡのアセンブリについては、当該技術分野において知られている様々な方法がある。Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ｇｅｎｏｍｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）３１９：１２１５−１２２０（参考として援用する）及びＰＣＴ国際公開第２００９／１０３０２７号（参考として援用する）に記載されているように、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍゲノムの各部分をアセンブルするために、サーマルサイクラーによる２ステップ法が使用された。別のアプローチについては、Ｌｉ，Ｍ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．（２００７）４：２５１−２５６（参考として援用する）により記載されている。ＰＣＴ国際公開第２００６／０２１９４４号（参考として援用する）には、Ｔ７  ５’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を利用する１ステップアセンブリ法が開示されている。ハイスループットスクリーニングに使用される化合物のアセンブリのためのコンビナトリアル手法は、今では定着している。加えて、コード配列をランダムに断片化し、再度アニーリングを行う遺伝子シャッフリング手法も長年にわたり実施されている。例えば、キメラ遺伝子断片のライブラリーを作製するためのプロトコルは、Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）２６．２．１−２６．２．１７；ＭｃＫｅｅ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＥＩ  ａｂｓｔｒａｃｔに記載されている。種々の構成成分を完全なまたは最小のゲノムにアセンブルするための手法は、確立されている。例えば、２００７年１１月１５日に公開された米国特許出願公開第２０００／０２６４６８８号（参考として援用する）は、ゲノムの各部分を含むカセットを作製及びアセンブルすることによって、合成ゲノムを構築するための方法について記載している。核酸をアセンブルする順次的な階層的方法については、２００７年１月４日に公開された米国特許出願公開第２００７／００４０４１号（参考として援用する）に記載されている。
【０１１９】
更に、２０１０年２月１１日及び２０１２年３月１日にそれぞれ公開された米国特許出願公開第２０１０／００３５７６８号及び同第２０１２／００５３０８７号には、ＤＮＡのアセンブリのための単一容器法が記載されている（両出願を参考として援用する）。この方法は、ギブソンアセンブリ法と呼ばれており、断片の長さまたは末端適合性に関係なく、多数のＤＮＡ断片のアセンブリを首尾良く行うことができる。ギブソンアセンブリ反応は、３つの酵素作用：５’エキソヌクレアーゼが長い突出部を生成すること、ポリメラーゼが、アニーリングされた一本鎖領域のギャップを埋めること、及びＤＮＡリガーゼが、アニーリングされ埋められたギャップのニックを閉じることを使用して、等温条件下で単一のチューブ中で実施される。本方法は、広く採用されており、世界中の合成生物学プロジェクトにおいて主要な中心的手法である。本方法を適用して、６００個の重複する６０-ｍｅｒから１６．３ｋｂのマウスミトコンドリアゲノムがアセンブルされた。酵母菌中でのインビボアセンブリと組み合わせて、ギブソンアセンブリを使用し、１．１Ｍｂｐのマイコプラズマ・ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）ゲノムが合成された。合成されたゲノムは、Ｍ．カプリコルム（ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）レシピエント細胞に移され、新たな自己複製Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ細胞が作製された。５’エキソヌクレアーゼ作用が５’末端配列をチュウバックし、アニーリングのための相補配列を露出させる。次いで、ポリメラーゼ活性が、アニーリングされた領域のギャップを埋める。その後、ＤＮＡリガーゼがニックを閉じ、ＤＮＡ断片を共有結合させる。隣接する断片の重複配列は、ゴールデンゲートアセンブリで使用されるものよりも非常に長いことから、正確なアセンブリの割合がより高くなる。
【０１２０】
ウイルス
ウイルスは、一般の顕微鏡では見えないほど微小で、代謝的に不活性な感染因子であり、生きている宿主細胞の内部でのみ複製する。ウイルスは、動物、植物、真菌、藻、細菌及び古細菌を含む全ての種類の生命体に感染し得る。感染細胞の内部以外にある間、または細胞に感染する過程中、ウイルスは、独立した粒子の形態で存在する。これらのウイルス粒子（ビリオン）は、カプシドと呼ばれるタンパク質コートに囲まれた、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムのいずれかから構成される。いくつかのビリオンはまた、カプシドタンパク質コートの内側または外側のいずれかに更なる脂質エンベロープを有する。
【０１２１】
２つのウイルス複製サイクルがあるが、その用語は、原核生物と真核生物のウイルス分野で異なる。潜在性または溶原性ウイルスは、ウイルス遺伝物質を宿主細胞のゲノムに組み入れるか、またはエピソームレプリコンを形成する。宿主細胞が複製すると、ウイルス遺伝物質も複製され、ウイルス産生の開始まで宿主ゲノムと別々に存在し続ける。ウイルス産生の開始及び細胞死が溶菌サイクルまたはビルレントサイクルの指標である。溶菌サイクル中、ウイルスゲノムは、宿主ゲノムとは別に複製され、多くのウイルスを生成するために、細胞の複製及び翻訳機構を乗っ取る。十分なウイルスが蓄積され次第、特殊なウイルスタンパク質が宿主細胞の壁及び／または膜を溶解する。宿主細胞は、高い内部浸透圧によって破裂する。このプロセスは溶菌と呼ばれる。これにより、子孫ウイルスが環境中に放出され、そこで他の細胞に感染し、このプロセスを繰り返す。ビルレントウイルスは、潜伏状態または溶原状態に入らないものであり、その代わりに、宿主細胞の機構を乗っ取ることによってのみ複製する（テンペレートウイルスとは対照的に、潜伏状態に入らない）。
【０１２２】
ウイルス変異研究
ウイルス変異研究とは、本明細書で使用される場合、急速な進化、適応及び／またはランダムもしくは特異的変異導入の研究を指し、これらの用語は区別なく使用され得る。進化及び／または適応研究は、特定の特徴または特定の条件下におけるウイルスの選択を含む。これらの方法は、ウイルス複製に固有の天然に高い変異率により多くのウイルス多様性をもたらすため、ウイルスに特に有用である。例えば、菌株は、高温の条件下で進化し、これらの条件下での生存及び増殖を促進する分子変化を観察することができる。非限定的な例として、ウイルスまたはバクテリオファージ実験の進化または適応を使用することで、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、または標的化された宿主ゲノム消化もしくは編集に関して変化を有するバリアントを選択することができる。ウイルスの進化または適応実験の非限定的な例には、同時感染、共進化または同時形質転換の実験が挙げられる。同時感染とは、２つ以上のウイルスが同じ宿主に同時に感染することを指し、これにより、多くの場合、２つ以上のウイルス間で遺伝子の交換がなされる。共進化とは、２つ以上のウイルスまたはバクテリオファージ間での組換えが許容性または非許容性の宿主内で生じる研究を指し、これにより、異なるウイルス特性、例えば、より広い宿主域を有する新しいウイルスまたはバクテリオファージのアセンブリが生じる。同時形質転換とは、２つの裸のゲノムにより、許容性または非許容性の菌株中で一緒に形質転換を起こす場合を指す。これらの進化または適応実験のいずれも、許容性（感受性）または非許容性（耐性）宿主で実施することができる。この種の実験は、多くの場合、１つ以上の他の選択されたウイルスの非存在下または存在下で、選択された宿主中でウイルスを複数回継代することを含む。ウイルスは、多数のバリアントをもたらす変異を獲得する。継代を通して、ある特定のバリアントが継代及び選択条件に基づいて濃縮される。
【０１２３】
変異導入は、任意の方法、例えば、挿入変異導入、化学的変異導入、ガンマ線もしくは紫外線での照射、またはＰＣＲによる変異導入によってなされ得る。ゲノム配列の変異またはバリアントを作製する方法は、よく知られている。例えば、ガンマ線照射、紫外線照射及び可能性のある多数の化学的変異誘発物質（例えば、５−ブロモデオキシウリジン、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ＩＣＲ化合物など）のいずれかによる処理または染色体切断を引き起こすエンジイン抗生物質などの化合物（例えば、ブレオマイシン、アドリアマイシン、ネオカルジノスタチン）による処理は、藻、真菌及びツボカビ門の変異導入のために使用されている方法である（例えば、米国特許第８，２３２，０９０号；米国特許出願公開第２０１２００８８８３１号；米国特許出願公開第２０１００２８５５５７号；米国特許出願公開第２０１２０２５８４９８号参照）。多数の化学的変異誘発物質が当該技術分野において知られており、限定するものではないが、インターカレート剤、アルキル化剤、脱アミノ化剤、塩基類似体を含む。インターカレート剤には、非限定的な例として、アクリジン誘導体またはフェナントリジン誘導体、例えば、臭化エチジウム（２，７−ジアミノ−１０−エチル−６−フェニルフェナントリジウムブロミドまたは３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニルフェナントリジニウムブロミドとしても知られる）などが挙げられる。アルキル化剤の非限定的な例には、ニトロソグアニジン誘導体（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、エタンスルホン酸エチル、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、亜硝酸またはＨＮＯ２及びナイトロジェンマスタードまたはＩＣＲ化合物が挙げられる。変異誘発物質として使用され得る塩基類似体の非限定的な例には、化合物の５−ブロモ−ウラシル（デオキシヌクレオシドの５−ブロモデオキシウリジンとしても知られる）、５−ブロモデオキシウリジン及び２−アミノプリンが挙げられる。ＰＣＲによる変異導入方法は、当該技術分野においてよく知られており、反応条件、及び／またはＰＣＲ増幅全体のエラー率を上げるＤＮＡポリメラーゼを含むことが多い。
【０１２４】
変異導入は、追加的にまたは代替的に、後続して生じる目的のウイルスゲノムへの組換えのために、外因性核酸分子をウイルスゲノムまたは宿主細胞へ直接導入することを含み得る。例えば、宿主細胞中に導入される外因性核酸分子は、ランダムなまたは標的化された組込みによってウイルス遺伝子座に組み込むことができ、外来ＤＮＡが挿入する遺伝子またはゲノム中に挿入される外来ＤＮＡに近接する遺伝子の発現に影響を与える（例えば、米国特許第７，０１９，１２２号；米国特許第８，２１６，８４４号）。典型的に、導入される核酸分子は、外因性核酸分子構築物を組み込んだ形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。いくつかの実施形態における外因性核酸分子は、転移因子またはその構成要素、例えば、トランスポザーゼによって認識され得る逆向き反復配列及び／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子などを含み得、あるいは、外因性核酸分子は、組込みウイルスなどのウイルスに少なくとも部分的に基づき得る。
【０１２５】
ランダム挿入変異導入の場合、構築物は、好ましくは、組み込まれた構築物を有する形質転換体の選択に使用することができる選択マーカーを含み、この選択マーカーは、必要に応じて、組み込まれた選択マーカー遺伝子によって中断された遺伝子の単離及び特定のための分離マーカー及び分子タグとしても機能し得る。選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子に限定されず、ウイルスに対して成長上の利点をもたらし得る任意の遺伝子（確立された機能及び仮定的な機能の両方の遺伝子）も含む。あるいは、特定の遺伝子座を標的にしてもよい。遺伝子破壊のための構築物は、例えば、目的の遺伝子座に由来する配列、例えば、調節因子をコードする遺伝子の少なくとも一部、及び任意に当該遺伝子周辺の追加のゲノム配列が両端に配置された選択マーカー遺伝子を含み得る。このようなフランキング配列は、例えば、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチドまたは少なくとも１キロベースのゲノム配列を含み得る。
【０１２６】
ウイルスバリアントのコレクションは、上記方法、当該技術分野において知られている他の方法またはこれらの任意の組み合わせのいずれかによって作製することができる。次いで、バリアントのコレクションは、所望の表現型についてスクリーニングすることができる。所望の表現型（複数可）を有する単離ウイルスは、更にもう１度、変異研究に供されてもよい。所望の特性または表現型を示す単離ウイルスは、追加的にまたは代替的に、所望の特性または表現型に関与する遺伝子変異を特定するために、配列決定を行ってもよい。これらの特定された遺伝子損傷は、新たな基準バックグラウンドで変異を再現し、所望の特性または表現型について試験を行うことによって確認することができる。
【０１２７】
ウイルスペイロード
溶菌酵素
「溶菌酵素」は、好適な条件下で、適切な時間の間に、１つ以上の細菌を殺傷する任意の細菌細胞壁溶菌酵素を含む。溶菌酵素の例には、限定するものではないが、種々の細胞壁アミダーゼが挙げられる。溶菌酵素は、バクテリオファージ溶菌酵素（バクテリオファージから抽出または単離された溶菌酵素を指す）または類似のタンパク質構造を有し、溶菌酵素機能を保持する合成溶菌酵素であってよい。
【０１２８】
溶菌酵素は、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を特に切断することができ、細菌細胞壁を破壊する。また現在では、細菌細胞壁のペプチドグリカンは、大部分の細菌で高度に保存されており、わずかな結合切断のみで細菌細胞壁を破壊することができると想定されている。これらの結合を切断する溶菌酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼまたはＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４）は、Ｃ1連鎖球菌ファージリシン酵素がアミダーゼであることを報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７、１９９０）は、Ｃｐ−１ファージのＳ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するＣｐｌリシンがリゾチームであることを報告した。Ｃａｌｄｅｎｔｅｙ及びＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ファージΦ６の溶菌酵素がエンドペプチダーゼであり、メソ−ジアミノピメリン酸及びＤ−アラニンによって形成されたペプチド架橋を分裂させることを報告した。Ｅ．ｃｏｌｉファージＴ１及びＴ６溶菌酵素は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージ由来の溶菌酵素（ｐｌｙ）（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）と同様にアミダーゼである。細菌細胞壁を切断することができる、当該技術分野において知られている他の溶菌酵素も存在する。
【０１２９】
バクテリオファージによって遺伝的にコードされている溶菌酵素は、例えば、宿主細菌に対して、少なくとも一部の細胞壁の分解または細胞壁の合成阻害活性を有することによって、宿主細菌を殺傷できるポリペプチドを含む。ポリペプチドは、天然溶菌酵素及びそのバリアントを包含する配列を有し得る。ポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）などの種々の供給源から単離してもよいし、組換えまたは合成方法によって作製してもよい。ポリペプチドは、例えば、カルボキシル端末側にコリン結合部分を含み得、細胞壁のペプチドグリカンを切断することができるアミノ端末側の酵素活性（ペプチドグリカン中のアミド結合に作用するアミダーゼ活性など）を特徴とし得る。多数の酵素活性物質、例えば、ＰｌｙＧＢＳリシンなどの２つの酵素ドメインを含む溶菌酵素について記載されている。更に、触媒ドメインのみを含み、細胞壁結合ドメインを含まない他の溶菌酵素についても記載されている。
【０１３０】
クオラム抑制ポリペプチド
オートインデューサーは、クオラムセンシングに関与する細菌によって産生及び使用される小さな化学的シグナル伝達分子である。クオラムセンシングにより、細菌は、オートインデューサーの存在を介して互いを感知し、多種多様な集団レベルでの行動を調節することができる。このような行動には、共生、病原性、運動性、抗生物質産生及びバイオフィルム形成が含まれる。オートインデューサーは、種に応じて多数の異なる化学的形態を取るが、それらが有する作用は多くの場合類似しており、これにより、遺伝子操作されたバクテリオファージは、類似のオートインデューサーを利用する多種多様な細菌に影響を与えることができる。一般に、グラム陰性細菌は、オートインデューサーとしてＡＨＬを使用し、グラム陽性細菌は、プロセシングされたオリゴペプチドをコミュニケーションのために使用するが、オートインデューサー２（ＡＩ−２）は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に共通である。
【０１３１】
異なる種のグラム陰性細菌によって産生されるＡＨＬは、アシル側鎖（４〜２０個の炭素原子を含有することが多い）の長さ及び組成が異なる。ＡＨＬは、受動輸送と能動輸送の両方の機構によって、細胞の内外に拡散することができる。ＡＨＬを感知するためのレセプターは、ＬｕｘＲなどの多数の転写調節因子を含み、これらの因子は、細菌の集団行動を制御する多様な遺伝子発現を活性化することができるＤＮＡ結合転写因子として機能する。
【０１３２】
オートインデューサーは、クオラム抑制ポリペプチドによって阻害することができる。クオラム抑制ポリペプチドは、オートインデューサーを低活性化または不活性化するように、オートインデューサーを改変または分解することができる。ある種のクオラム抑制ポリペプチドは、オートインデューサーを不活性化する（例えば、改変または分解による）酵素であり、例えば、各種細菌に由来するＡＨＬを不活性化する広範な基質特異性を有する、ＡＨＬのアシル部分からラクトン環を切断する本明細書に記載のＡｉｉＡラクトナーゼタンパク質などである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１４）：１３６．４５−５１）。
【０１３３】
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法は、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来するクオラム抑制ポリペプチドをコードするように操作された合成バクテリオファージを作製するために採用することができる。クオラム抑制ポリペプチドは、遊離タンパク質として発現され、例えば、ファージの感染及び宿主細菌の溶解の際に、ファージ及び／または細菌の周囲領域に放出され得る。同様に可能なものとして、クオラム抑制ポリペプチドはまた、当該技術分野において知られている方法を使用して、細菌宿主細胞から発現させ、能動的に分泌させることもできる。同じく、クオラム抑制ポリペプチドは、バクテリオファージタンパク質、例えば、カプシド、尾部または頭部タンパク質に翻訳的に融合させてもよい。
【０１３４】
尾繊維
本開示は、いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージを操作することによって、バクテリオファージ宿主域を調整することを企図する。いくつかの実施形態において、ウイルス宿主域を調整することは、異種、天然、非天然の尾繊維及びこれらの任意の組み合わせを有するようにウイルスを操作することを伴う。バクテリオファージの宿主細胞特異性は、ウイルス粒子の尾繊維（複数可）の影響を受け得る。宿主バクテリオファージの尾繊維または尾繊維の一部を変更する（例えば、交換する及び／または変異させる）と、宿主域が変わり得る（例えば、拡大し得る）。
【０１３５】
尾繊維タンパク質は、典型的に、抗原性決定基及び宿主域決定基を含有する。異種尾繊維は、１種類のバクテリオファージのゲノムから単離されたまたは当該ゲノムに基づいて合成された１セットのゲノム断片によってコードされ得る。この尾繊維の遺伝子断片セットは、複数のバクテリオファージのゲノムから単離されたまたは当該ゲノムに基づいて作製されたゲノム断片のサブセットを含有し得る。例えば、尾繊維の保存領域は、シャーシバクテリオファージのゲノムから単離されたゲノム断片によってコードされ得るのに対し、宿主域決定基領域は、異なる種類のバクテリオファージのゲノムから単離されたゲノム断片によってコードされ得る。
【０１３６】
抗菌性ペプチド
本開示は、非限定的な例として、宿主細胞によって任意に分泌される抗菌性ペプチドを発現するように操作されたバクテリオファージを企図する。例えば、操作されたバクテリオファージは、抗菌物質、例えば、限定するものではないが、宿主細菌のバクテリオファージに対する耐性の発生及び／または伝播を阻害し、２種以上の異なる細菌種を含む細菌感染などの細菌感染におけるより迅速でより効果的な細菌の殺傷を可能にする天然ペプチドを含む、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）または抗菌性ポリペプチドを発現することができる。
【０１３７】
バクテリオファージは、その増幅及び捕食者−宿主機構によって、例えば、宿主細菌中で増殖し、次いで、溶解が生じて、増殖したバクテリオファージを放出して細菌を殺傷し、続いて、同じ機構によって周囲の細菌に感染し、細菌を殺傷することによって、細菌感染を排除する魅力的な抗菌物質を提供する。細菌感染の排除におけるバクテリオファージの実用は、（ｉ）同一種内及び異種間の両方の細菌宿主域が極めて狭く、また（ｉｉ）細菌宿主集団によるバクテリオファージに対する耐性が極めて迅速に発生するなどの大きな制限によって妨げられる。そのため、多くの化学分野で一般的に思われているように、現実の状況において理論的結果を達成するのは困難である。したがって、バクテリオファージは、理論的上、抗菌物質として有用であると考えられるが、実際には、抗菌特性が抑制されており、細菌感染を排除するための使用は、宿主のバクテリオファージに対する耐性の迅速な発生により実現するのが極めて困難である。その結果として、バクテリオファージは、宿主細菌の長期的排除に効果がなかった。
【０１３８】
したがって、本開示は、抗菌物質操作された（antimicrobial-agent engineered）バクテリオファージを企図し、このバクテリオファージは、宿主細胞によって任意に分泌される抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）を発現するように、改変または操作される。抗菌物質操作された異なるバクテリオファージの少なくとも１つまたは任意の組み合わせを、単独でまたは任意の組み合わせで使用して、細菌感染を排除または殺傷することができる。いくつかの実施形態において、抗菌物質操作されたバクテリオファージは、抗菌物質操作された他のバクテリオファージ、精製された抗菌性ペプチド（複数可）または小分子抗生物質などの追加の物質とともに使用することができる。抗菌性ペプチド操作されたバクテリオファージ（またはＡＭＰ操作されたバクテリオファージ）は、当業者に知られている任意の抗菌物質をコードし得る。
【０１３９】
本発明の態様のいくつかの実施形態において、抗菌物質操作されたバクテリオファージは、核酸である抗菌物質、例えば、当業者に周知の一般的に知られた細菌遺伝子を「遺伝子サイレンシング」することによって機能する抗菌物質を発現及び分泌することができる。核酸系抗菌物質には、例えば、ＲＮＡ干渉誘導（ＲＮＡｉ）分子、例えば、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びこれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡ干渉分子遺伝子は、細菌の生存能力（すなわち、生存）のために発現される、生存に重要な遺伝子の発現をサイレンシングする。核酸系抗菌物質は、アンチセンスオリゴ核酸または核酸類似体、例えば、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、擬似相補的ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）などであり得る。あるいは、核酸系抗菌物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び核酸類似体、例えば、ＰＮＡ、ｐｃＰＮＡ及びＬＮＡであり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、目的タンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡなどを含む群から選択することができる。このような核酸阻害物質には、例えば、転写抑制因子であるタンパク質をコードする核酸配列、またはアンチセンス分子、またはリボザイム、または小分子阻害核酸配列、例えばＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４０】
抗菌性ペプチドは、追加的にまたは代替的に、抗菌酵素であり得る。例示的な抗菌活性物質には、溶菌酵素、アシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、リソスタフィンまたは孔形成ペプチドを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４１】
抗菌性ペプチドまたは抗菌性ポリペプチドは、負電荷を帯びた細菌膜に結合し、水性チャネルを形成することにより膜を破壊し、脂質二重層自体を折り返すようにするか、または膜を覆ってミセルを形成することによって、細菌膜を直接破壊することができる。これらの直接的な殺菌効果に加えて、抗菌性ペプチド及びポリペプチドは、ＴＬＲシグナル伝達及び更なる免疫応答を活性化すること、白血球化学走性物質として機能すること、食細胞の攻撃による殺菌性オプソニン作用を増加させること、細菌の成長に必要な必須栄養素を除去すること、ならびに細菌プロテアーゼを阻害すること、またはこれらの任意の組み合わせが可能であり得る。
【０１４２】
バイオサーファクタント
細菌バイオフィルム形成は、局所感染をもたらし得るだけでなく、菌血症（血液中の細菌の存在）及び細菌性敗血症（血流を通した細菌またはその産生物の広がりによって引き起こされる多臓器不全）などの治療が困難で、時には致命的である全身感染をもたらし得る。バイオフィルムマトリックスを構成する細胞外物質は、抗体及び食細胞などの通常の免疫防御機構ならびに抗菌酵素及び抗生物質を含む抗菌物質からバイオフィルムに内在する細菌を保護し隔離するバリアとして機能することができる。バイオフィルムはまた、バイオフィルムに内在する細菌の成長及び増殖を促進する。
【０１４３】
本開示は、表面上に堆積したバイオフィルムを除去するか、またはゆるめることを促進するために使用される追加の物質を発現する操作されたウイルスを作製する方法及びその組成物を提供する。例えば、組成物は、バイオサーファクタントを含み得る。例示的なバイオサーファクタントには、糖脂質、リポペプチド、デプシペプチド、リン脂質、置換脂肪酸、リポ多糖体、サーラクチン（ｓｕｒｌａｃｔｉｎ）、サーファクチン、ビスコシン（ｖｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びラムノリピドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
ウイルス工学
ウイルス粒子を遺伝子操作する方法は、広く適用できる標的指向可能なインビトロ工学的方法がないために、労力を要し、長い時間がかかる。現在のインビボ法は、改変されたウイルス及びウイルスベクターを作製するのに数週間から数ヶ月かかることがある（Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００４  Ｆｅｂ；２（２）：１６６−７３、参考として本明細書に援用する）。更に、細胞中でウイルスゲノムを操作することに本質的に付随する毒性がある。本開示以前には、ウイルスの正確なインビトロ遺伝子工学に関する広く適用できる方法を開発する努力は、ほとんど失敗に終わっている。ウイルスゲノムを完全にインビトロで迅速に操作するための広く適用できるプロセスが本明細書にて記載される。
【０１４５】
本明細書で開示されるインビトロ遺伝子工学システム及び方法は、ウイルス遺伝子工学の既存方法にまさるいくつかの利点がある。１）毒性遺伝子／産物を完全にインビトロで簡単に操作できる。２）迅速である。すなわち、インビボ方法で数週間または数ヶ月かかるのと比較して、１日で実施できる。３）ウイルスゲノムの大部分にわたってゲノム改変を保持できる。４）宿主組換え経路を必要としない。５）以前の方法よりも直接的であり、エラーが起こりにくい。６）プロトコルを変更することなく、多数のウイルスに適用可能である。
【０１４６】
本開示は、全ゲノムを部位特異的に操作するためのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる消化及びインビトロアセンブリの方法を提供する。本開示は、ウイルスゲノムを遺伝子的に改変できる正確さ、単純さ及び速さを大幅に向上させる。更に、この技術は、これまでに定着した、往々にして毒性であるビルレントウイルスゲノムを宿主細胞内で操作することの難しさを克服する。この完全なインビトロアプローチはまた、工学に関して遺伝子的に扱いやすい宿主株の要件、古細菌、原核生物及び真核生物の多数の興味深い重要なウイルスの操作を妨げる要件を取り除く。このアプローチは、操作されるウイルスゲノムの増幅を行わないので、メチル化などの大部分のウイルスゲノム修飾の保持を可能にする。ゲノム修飾は、ウイルスの適合性に重大な影響を与え得ることが十分にわかっているため、これらのゲノム修飾の保持は、他の工学技術にまさる明らかな利点を提供する。更に、この技法は、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び真核生物ゲノム編集のためのｇＲＮＡの使用を中心に構成されていないインビボＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼゲノム工学に関連する他の方法とは異なり、むしろ既知のウイルス工学の問題を完全にインビトロで克服することに関する。
【０１４７】
いくつかの態様において、本明細書で提供される新規方法は、ウイルス核酸またはウイルスゲノムの改変を含み得、例えば、本明細書で開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びアセンブリを使用し、操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムを、当該操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムを含む操作されたウイルス粒子または操作されたウイルスを産生する宿主に直接導入する。例えば、いくつかの態様において、方法は、操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムの増幅（例えばベクターでの複製による）を目的とした、操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムのクローニング宿主への導入を行うことなく、ウイルス核酸またはウイルスゲノムを操作することを含む。例えば、いくつかの方法において、操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムは、操作されたウイルス核酸または操作されたウイルスゲノムを、操作されたウイルス粒子または操作されたウイルスを産生する宿主細胞へ導入する前に、酵母菌、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の既知のクローニング宿主、限定するものではないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種もしくはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種などへ導入しない。
【０１４８】
本明細書に記載の新規方法は、ウイルスゲノム中の２、３、４、５またはそれ以上の部位の標的化された操作を可能にする。方法は、完全にインビトロで実施することができ、複数部位に変更を加えたウイルスゲノムの作製を可能にするものであり、従来の工学的方法の使用では達成されない偉業である。操作されていないウイルス核酸または操作されていないウイルスゲノムに対して２、３、４、５またはそれ以上の改変を有する操作されたウイルス核酸及び／または操作されたウイルスゲノムを含む、操作されたウイルスが本明細書で提供される。２つ以上の改変は、挿入、欠失、置換またはこれらの任意の組み合わせであり得る。２つ以上の改変は、本明細書で開示される任意のものなどの１、２またはそれ以上の改善されたウイルス特性をもたらすことができる。操作されたウイルスは、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法によって、完全に作製することができる。本明細書で開示されるインビトロ工学的方法は、古典的またはランダム変異導入とは対照的に標的化された改変をもたらす。古典的またはランダム変異導入によって生成される改変とは異なり、標的化された改変は、任意の表現型アッセイの前に、ＰＣＲ及び／または配列決定などの標準的な分子遺伝学的実験方法を使用して簡便にスクリーニングすることができる。
【０１４９】
また、改善されたウイルス特性を有する合成ウイルスを作製するためのシステムが本明細書で開示される（例えば、図１０参照）。システムは、所望の特性を付与する役割を持つ核酸配列を特定し、次いで、改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を作製するために、選択されたウイルスゲノム中にこれらの配列変更を組み込むことを含む。所望のウイルス特性を付与することができる核酸配列は、基本的な科学知識、文献検索、経験的試験、変異研究またはこれらの任意の組み合わせによって特定することができる。変異研究は、進化研究、適応研究、変異導入研究及び／または当該技術分野において知られている他の実験的アプローチを含み得る。変異導入研究は、紫外線（ＵＶ）、化学的及び／または挿入変異導入を含み得る。挿入変異導入は、トランスポゾン及び／または選択マーカー挿入変異導入を含み得る。目的の核酸配列の特定に使用される変異実験は、インビトロ工学の出発点となるウイルスまたはウイルスのウイルスゲノムを使用して実施することができる。追加的にまたは代替的に、選択されたウイルスに追加の特性を付与する目的で最初に選択されたウイルスまたはウイルスゲノムに組み込む組換え核酸配列を特定するために、選択されたウイルスまたはウイルスゲノムではなく、関連する異種のウイルスまたはウイルスゲノムを変異研究に使用することができる。
【０１５０】
所望の特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化もしくは編集、当業者であれば容易に認識するであろう他の所望の特性、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。所望の特性を付与することが特定された核酸配列は、１つ以上の改善されたウイルス特性の所望のセットが確認されるまで、１ラウンド以上の反復的な工学及び試験によって単一のウイルスゲノム中に１つ以上の変化を組み込む、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、選択されたウイルスゲノム中に組み込むことができる。最終的な目的のウイルスゲノムは、天然由来核酸分子と合成核酸分子の組み合わせてであってもよいし、本明細書に記載の方法及び／または当該技術分野において知られている方法を使用して、完全にデノボ合成されてもよい。改善されたウイルス特性を有するウイルスまたはウイルス粒子を作製することは、目的の操作されたウイルスゲノムを適合性のある細胞に導入することを含み得、ゲノムは、その細胞中で活性化されることにより、ウイルス粒子またはウイルスを生成する。選択されたウイルスゲノムに組み込むための所望の特性を付与することが特定された核酸分子を調製するために、消化、ＰＣＲ増幅、合成、当該技術分野においてよく知られている他の方法またはこれらの任意の組み合わせによって、目的の配列を、当該配列が特定されたウイルスゲノムから単離または増幅することができる。合成核酸配列は、化学合成されてもよいし、化学合成された重複するオリゴヌクレオチドからアセンブルしてもよい。追加的にまたは代替的に、所望の表現型を付与するために、選択されたウイルスゲノムに組み込まれる核酸分子は、天然由来核酸配列と合成核酸配列の組み合わせであり得る。選択されたウイルスゲノムに組み込まれる核酸分子の設計に応じて、結果として得られる操作されたウイルスゲノムは、所望のウイルス特性を付与するために、核酸配列の付加、欠失、代替配列との置換またはこれらの任意の組み合わせを有し得る。配列を変更する目的で、配列の除去、欠失、置換またはこれらの任意の組み合わせを行うような核酸分子の設計方法は、当業者によく知られている。本明細書に記載のシステム及び方法によって作製された、操作されたウイルスゲノムを使用して、改善されたウイルス特性を有するウイルスまたはウイルス粒子を作製することができる。改善されたウイルス特性を有するウイルスまたはウイルス粒子を作製することは、操作されたウイルスゲノムを適合性のある細胞に導入することを含み得、ゲノムは、その細胞中で活性化されることにより、ウイルス粒子またはウイルスを生成する。操作されたゲノムを細胞に導入することは、エレクトロポレーション、形質転換、接合、細胞と予めパッケージしたウイルスゲノムとの接触などによって、または当該技術分野においてよく知られている他の方法によって実施することができる。
【０１５１】
本開示は、更に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用して核酸をインビトロで操作するための方法の発見に関する。本開示は、ウイルス核酸のインビトロ遺伝子工学によるウイルス特性の改善に更に関する。具体的には、本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９などのエンドヌクレアーゼを使用したウイルス配列のインビトロ消化、続いて、消化されたウイルスゲノムへのＤＮＡまたはＲＮＡ断片（複数可）の挿入による組換え核酸のアセンブリに関する。
【０１５２】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス核酸の単離と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用したウイルス核酸の領域のインビトロ消化と、消化されたウイルス核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含む、ウイルス核酸を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、インビトロ消化は、ＲＮＡ誘導型酵素消化である。いくつかの例において、酵素消化は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって実施される。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９由来酵素、Ｃａｓ９関連酵素または任意の精製されたプログラム可能なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。いくつかの例において、消化は、標的指向ＲＮＡを更に含む。いくつかの例において、消化は、スペルミジンを更に含む。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、熱への曝露などの標準的方法によって不活性化され、及び／または例えばフェノールクロロホルム抽出などの標準的方法によって除去される。いくつかの例において、活性化の熱は、例えば、少なくとも摂氏８０度などの熱にタンパク質含有溶液をさらすことによって達成される。
【０１５３】
任意のプログラム可能なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを本明細書の方法及び組成物に使用することができ、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３またはこれらのホモログまたはこれらの改変体である。任意のプログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを本明細書の方法及び組成物にて使用することができ、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＲＮＡｉ誘導型ヌクレアーゼは、非限定的な例として、化膿連鎖球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、S.サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質であり得る。また、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号（その全体を参考として本明細書に援用する）において配列番号：１〜２５６及び７９５〜１３４６として提供されているｃａｓ９タンパク質、ならびに２つ以上のＣａｓ９タンパク質に由来するドメインを合わせ持ち得るキメラＣａｓ９タンパク質、ならびに特定されているＣａｓ９タンパク質のバリアント及び変異体も考えられる。Ｃａｓ９に加えて、当業者であれば、あらゆる既知の機能的等価物も十分な代替例であることを容易に認識するであろう。
【０１５４】
ウイルス粒子は、古細菌、原核生物または真核生物に特異的なウイルスであってよい。例えば、ウイルスは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に感染することができるものであり得る。いくつかの例において、ウイルスは、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の属内のものなどの病原菌種に感染するものであり得る。いくつかの例において、ウイルスは、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）、アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、ハロフェラックス（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ）、ハロラブラム（Ｈａｌｏｒｕｌｂｕｍ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スチギオロブス（Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）またはサーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属内のものなどの古細菌種に感染することができる。いくつかの例において、ウイルスは、ヒト、哺乳類、動物、植物、藻または真菌などの真核生物宿主に感染することができる。ウイルス核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。いくつかの例において、ウイルス核酸は、全ウイルスゲノム、ウイルスゲノムの一部、または単一もしくは多数のウイルス遺伝子から構成される。いくつかの例において、ウイルスゲノムの一部は、工学の前に、プラスミドにサブクローニングされる。
【０１５５】
ウイルス核酸は、１つ以上のヌクレオチド、単一の遺伝子、多数の遺伝子もしくは任意の大きさのゲノム領域を除去するために、または新しい配列の挿入のためにＤＮＡを開裂するために、標的指向ＲＮＡ（複数可）と結合されたＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって１回または２回（またはそれ以上）インビトロで消化され得る。Ｃａｓ９に加えて、任意のプログラム可能なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたは他の標的指向可能なＤＮＡ切断機構であれば十分であり、機能的に等価であることを当業者は理解するであろう。多数の消化を同時に実施することができるが、順次的なＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９消化により効率が上がることがわかった。更に、スペルミジンを反応混合物に添加してＤＮＡからのＣａｓ９分離を高めることができ、これにより、Ｃａｓ９の酵素活性の利用可能性がより高まる。Ｃａｓ９切断によって除去されたウイルス配列は、Ｃａｓ９が平滑切断酵素であり、断片が挿入部位に対して相同性を含まないので、ゲノムに戻って再結合することはない。更に、Ｃａｓ９の熱失活は、消化からアセンブリ反応に直接移ることを可能とし、プロトコルが単純化する。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「標的指向ＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を組み込んだ操作されたキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または選択されたＣＲＩＳＰＲシステムに適合する単一のｇＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ座位から転写され、エフェクター複合体に組み込まれ、侵入した核酸配列へ複合体を誘導して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる核酸消化をもたらす。ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと相補的であるため、塩基対となり、Ｃａｓ９による切断に必要なＲＮＡ二本鎖を形成する。ハイブリッドｇＲＮＡは、標的指向ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと連結させたキメラＲＮＡであり、これにより、Ｃａｓ９による消化に単一のＲＮＡの使用が可能になる。Ｃａｓ９による消化は、両方ともインビトロ転写されたｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡの混合物またはキメラｇＲＮＡを用いて実施することができる。
【０１５７】
ＤＮＡまたはＲＮＡインサートは、当該技術分野において知られている任意の手段によって、特に、インビトロ合成、化学合成、デノボ合成、デノボアセンブリ、増幅（ＰＣＲ）、プラスミド、ウイルスもしくは細菌からの酵素による分離、またはこれらの任意の組み合わせによって、得ることができる。一態様において、ＤＮＡまたはＲＮＡインサートは、オリゴのアセンブリまたはプライマーを用いたＰＣＲによって、組込み部位に対して重複配列を含有するように作製される。ＤＮＡまたはＲＮＡインサートは、天然由来核酸と合成核酸の組み合わせであるか、完全に天然由来または合成由来であり得る。
【０１５８】
ＤＮＡまたはＲＮＡインサートと消化されたウイルス核酸とのアセンブリは、当該技術分野において知られている任意の方法、例えばインビトロクローニング反応または前述した方法のいずれかを使用して実施することができる。一態様において、消化されたウイルスゲノムへのＤＮＡまたはＲＮＡインサートのアセンブリは、ギブソンアセンブリ法を使用して実施される。一態様において、消化されたウイルスゲノムへのＤＮＡまたはＲＮＡインサートのアセンブリは、宿主細胞の組換え機構を使用してインビボで実施される。ＤＮＡまたはＲＮＡインサートのアセンブリは、核酸配列の付加、欠失、置換またはこれらの任意の組み合わせをもたらし得る。消化されたウイルス核酸へのアセンブリによって、目的の核酸の付加、欠失、置換またはこれらの任意の組み合わせを生じさせるようなＤＮＡまたはＲＮＡ配列の設計プロセスは、当該技術分野においてよく知られている。
【０１５９】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス核酸の単離と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用したウイルス核酸の領域のインビトロ消化と、消化されたウイルス核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、アセンブリは、（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）クラウディング剤と、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）単離した耐熱性リガーゼと、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物と、（ｆ）好適な緩衝液とを含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、消化されたウイルス核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される。いくつかの態様において、エキソヌクレアーゼはＴ５エキソヌクレアーゼであり、接触は等温条件下であり、及び／またはクラウディング剤はＰＥＧであり、及び／または非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼはＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼもしくはＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、及び／またはリガーゼはＴａｑリガーゼである。いくつかの例において、インビトロアセンブリは、１ステップまたは等温ギブソンアセンブリによって実施される。いくつかの例において、インビトロアセンブリは、２ステップギブソンアセンブリによって実施される。いくつかの例において、消化された核酸及びＤＮＡまたはＲＮＡ断片は、リガーゼ酵素を使用した平滑ライゲーションによってインビトロでアセンブルすることができる。
【０１６０】
いくつかの態様において、本開示は、アセンブリステップを含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、アセンブリは、宿主細胞の組換え機構を使用して、適合性のある宿主細胞においてインビボで実施される。本明細書に開示の精製された酵素を活用することによって、組換え核酸を完全にインビトロでアセンブルすることができるが、感受性の宿主株内の天然または操作された組換え経路を活用することによって、このプロセスを達成することもできる。いくつかの場合において、適合性のある宿主細胞は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｖ．ナトリージェンス（ｎａｔｒｉｇｅｎｓ）または当該技術分野において利用可能な他の生物であり得る。組換えウイルスゲノムをインビボでアセンブルするには、一部の宿主細胞では、末端相同領域を有する挿入用修復断片とともに、精製されインビトロ消化されたウイルスゲノムで形質転換するだけで十分である。挿入用修復断片は、当該技術分野において知られている標準的技術によって合成または増幅してもよいし、選択された宿主細胞内で安定的に複製されるプラスミド中にあってもよい。この方法は、宿主細胞が相同及び非相同の両方のＤＮＡ修復経路を持つこと、十分な量のインサート及び消化されたゲノムを宿主細胞に一緒に送達するという課題、ならびにほとんどの宿主の相同組換え経路が低効率であることから、インビトロアセンブリよりも低効率になる可能性がある。宿主による組換えのない消化されたゲノム単独では機能性ウイルス粒子及び後続のプラークを形成しないので、形質転換及び平板培養後に得られたプラークを所定のインサートについてＰＣＲによってスクリーニングし、操作された所望のウイルス核酸の正しいアセンブリを確認することができる。
【０１６１】
いくつかの態様において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、単離された組換えＣａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは少なくとも１つある。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは２つある。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１セットのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの例において、インビトロ消化反応は、２つのｇＲＮＡを使用する。いくつかの例において、インビトロ消化反応は、例えば、２つの配列を同時に標的とするために、２セットのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。
【０１６２】
いくつかの態様において、本開示は、インビトロ消化ステップを含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、少なくとも摂氏８０度などの熱への曝露などの標準的方法によって不活性化される。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、フェノールクロロホルム抽出によって除去される。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、当該技術分野において知られている他の抽出方法によって除去される。
【０１６３】
いくつかの態様において、本開示は、操作されたウイルス核酸をもたらす、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、次いで、操作されたウイルス核酸で宿主細胞を形質転換する。いくつかの例において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｖ．ナトリージェンス（ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたは当該技術分野においてよく知られている他の生物である。いくつかの例において、形質転換は、ヒートショック、エレクトロポレーション、微粒子銃、パーティクルガン、接合、形質導入、リポフェクションまたは当該技術分野においてよく知られている他の確立された方法によって実施される。いくつかの例において、操作されたウイルス核酸で宿主細胞を形質転換し、次いで、複製後、操作されたウイルス核酸を再度単離する。いくつかの例において、単離された操作されたウイルス核酸は、本明細書で反復的なインビトロ工学と呼ばれるプロセスである、インビトロ工学の別ラウンドのための出発ウイルス核酸として使用される。いくつかの例において、反復的なインビトロ工学は、１ラウンドである。他の例において、反復的なインビトロ工学は、少なくとも１ラウンドである。他の例において、反復的なインビトロ工学は、２ラウンド以上である。
【０１６４】
いくつかの態様において、本開示は、操作されたウイルス核酸をもたらす、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、操作されたウイルス核酸は、商業的に入手可能であり得るインビトロパッケージングキットを使用して、ウイルス粒子内にパッケージングされる。いくつかの例において、インビトロパッケージングキットは、Ｍａｘｐｌａｘ  ｌａｍｂｄａ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔである。
【０１６５】
いくつかの態様において、本開示は、操作された組換えウイルス核酸をもたらす、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、操作されたウイルス核酸は、参照及び／または操作されていないウイルスと比較して、ウイルスの特性を改善または変更する。いくつかの例において、改善されたまたは変更されるウイルス特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、標的化された宿主ゲノム消化もしくは編集、またはこれらの任意の組み合わせなどの特性である。いくつかの例において、特性の改善は、特性の増大、減少または変更であり得る。例えば、改善されたウイルス特性は、宿主域の拡大もしくは縮小、ウイルス溶菌サイクルの変更、宿主細胞に対する吸着の増加もしくは減少、宿主細胞に対する付着の増加もしくは減少、注入の増加もしくは減少、複製及びアセンブリの増加もしくは減少または変更、溶解の増加もしくは減少、放出数の増加もしくは減少、免疫回避の増加もしくは減少または変更、免疫刺激の増加もしくは減少または変更、免疫不活性化の増加もしくは減少または変更、バイオフィルムの分散の増加もしくは減少または変更、細菌のファージ耐性の増加もしくは減少または変更、細菌の抗生物質感受性化の増加もしくは減少または変更、ビルレンス因子の調節の増加もしくは減少または変更、標的化された宿主ゲノム消化または編集の増加もしくは減少または変更、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１６６】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性の改善、例えば宿主域の増大などをもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。宿主域とは、ウイルスが感染し得る細胞種、株または宿主種の数である。宿主域の増大は、参照及び／または操作されていないウイルスと比較した、ウイルスが感染し得る別個の細胞種、株または種の絶対数の拡大である。いくつかの例において、宿主域の増大は、ウイルスが感染することができる細菌種内の細菌株またはバリアントの数の増加である。宿主域における増大は、少なくとも１つまたは２つ以上の株、細胞種または種の増加であり得る。宿主域は、例えば、当該技術分野においてよく知られている標準的なプラークアッセイによって、評価することができる。
【０１６７】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、ウイルス溶菌サイクルなどの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。ウイルス溶菌サイクルは、ウイルスの複製の２つのサイクルのうちの１つであり、もう１つは、溶原サイクルである。溶菌サイクルは、感染細胞及び感染細胞膜の破壊をもたらす。溶菌サイクルは、６つのステップを含み、その各々を個別に操作することができる。ウイルス溶菌サイクルの６つのステップは、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶解、ならびに放出数である。
【０１６８】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、吸着などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。吸着とは、ウイルスが宿主細胞に接触する行為である。ウイルスの吸着は、所定の宿主細胞に対するウイルスの親和性として特徴付けられ、Ｈｙｍａｎ及びＡｂｅｄｏｎによって概略されているアッセイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９）などの標準的な吸着アッセイによって評価することができる。追加的にまたは代替的に、ウイルスの吸着は、受容体リガンド相互作用を分析するために生化学で広く使用されている他の標準的な親和性アッセイによって測定することができる。
【０１６９】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、付着などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。ウイルス付着とは、ウイルスが宿主細胞に強く吸着するときである。ウイルス付着は、ウイルスと宿主細胞の受容体との間の不可逆的相互作用である。
【０１７０】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、注入などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。注入は、ウイルスゲノムの注入を指し、ウイルスがその遺伝物質を宿主細胞中に挿入するときである。ウイルスゲノムの注入は、一例として、カリウムイオン流出の測定によって、測定することができる（Ｃａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２０１２  Ｎｏｖ；１９４（２１）：５７２８−３８；Ｌｅａｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１３  ８（８）：ｅ７０９３６、両文献の全体を参考として本明細書に援用する）。
【０１７１】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、複製及びアセンブリなどの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。ウイルスの複製及びアセンブリとは、宿主細胞が新規ウイルスを構築することを指す。ウイルスゲノムの注入後、宿主細胞機構を乗っ取り、ウイルス遺伝子が転写され、ウイルスタンパク質が翻訳され、複製されたウイルスゲノムを含むウイルス粒子がアセンブルされる。ウイルスの複製及びアセンブリは、最終的に、宿主細胞の溶解をもたらすことから、標準的なプラークアッセイまたは二重寒天プラークアッセイによってウイルス成長速度を観察することで、複製及びアセンブリを評価することができる。ウイルスの複製率は、追加的にまたは代替的に、標準的なプラークアッセイの１ステップ曲線での放出数を測定することによって、または当該技術分野においてよく知られている他の標準的なウイルス適合性アッセイによって、決定することができる。
【０１７２】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、溶解などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。溶解とは、宿主細胞の溶解を指す。新しいウイルス粒子の複製及びアセンブリの後、酵素が産生され、この酵素により宿主細胞壁及び／または細胞膜が内部から分解され、流体の流入が可能となり、最終的に宿主細胞の溶解をもたらす。ウイルスのビルレント複製を増加または阻害する能力は、所定のウイルスが溶解によって宿主細胞を殺傷するのにかかる時間を増加または減少させることができる。ウイルスビルレンスは、感染と宿主細胞の溶解との間の時間を分析し、標準的なプラークアッセイまたは二重寒天プラークアッセイによってウイルス成長速度を観察することで、評価することができる。追加的にまたは代替的に、参照及び／または操作されていないウイルスと比較した操作されたウイルスの細菌溶解の増加は、アッセイ後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、プラークアッセイ後のプラーク形成単位（ＰＦＵ）数もしくは直径によって、バイオフィルムアッセイまたは当該技術分野においてよく知られている他の標準的なアッセイから決定することができる。
【０１７３】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、放出数などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。放出数とは、感染細胞によって産生されたウイルスの数を指す。放出数は、Ｅｌｌｉｓ及びＤｅｌｂｒｕｃｋ（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９３９  Ｊａｎ  ２０；２２（３）：３６５−３８４、参考として本明細書に援用する）ならびにＤｅｌｂｒｕｃｋ（Ｄｅｌｂｒｕｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９４０，２３；６４３、参考として本明細書に援用する）によって概略されているものなどの標準的な放出数アッセイによって評価することができる。
【０１７４】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、免疫回避などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。免疫回避とは、自然免疫または適応免疫システムによるクリアランスを逃れるウイルスの能力である。免疫回避は、中和抗体の産生レベルまたは速度を調べることによって評価することができる。追加的にまたは代替的に、免疫回避は、所定のウイルスの動物内における半減期または滞留時間を分析することによって測定することができる。
【０１７５】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、免疫刺激などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。免疫刺激とは、野生型または操作されていないウイルスに通常は関連しない免疫応答を誘発するウイルスの能力である。これは、標準的ＥＬＩＳＡキット、フローサイトメトリー、組織学または当業者に知られている他の一般的な免疫学的アッセイを使用して、ウイルスの存在下で産生される免疫因子を分析することによって評価することができる。
【０１７６】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、免疫不活性化などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。免疫不活性化とは、野生型または操作されていないウイルスに通常関連する免疫応答を減少させるウイルスの能力である。これは、標準的ＥＬＩＳＡキット、フローサイトメトリー、組織学または当業者に知られている他の一般的な免疫学的アッセイを使用して、ウイルスの存在下で産生される免疫因子を分析することによって評価することができる。
【０１７７】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス特性、例えば、バイオフィルム分散などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作するための方法を提供する。バイオフィルム分散とは、バイオフィルムの分解、弱体化または浸透性の増加をもたらす能力である。バイオフィルム分散をもたらすことができる作用には、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）の分解、クオラムセンシング分子の調節、及びバイオフィルムまたは細菌感染部位内の細胞外ＤＮＡまたはＲＮＡの分解が挙げられるが、これらに限定されない。「エキソポリサッカライドの分解」とは、微生物によってその環境中に分泌され、バイオフィルムの構造的完全性をもたらす高分子量化合物を分解または分離できるタンパク質または酵素を産生するウイルスの能力である。ＥＰＳ分解活性物質には、界面活性剤、グリコシダーゼ及びプロテアーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの活性は、当業者に知られている標準的な生化学的アッセイを使用して測定することができる。クオラムセンシング分子の調節もまた、バイオフィルム分散をもたらすことができる。クオラムセンシング分子は、多数のヒト病原菌において高度に保存されたビルレンスの調節因子であることが知られている。クオラムセンシング分子を分解することができる酵素活性を有するタンパク質が特定されており、それらの活性は、種々の微生物レポーターアッセイ、生化学的レポーターアッセイによって、またはＴＬＣを用いた切断産物の分析によって測定されている（Ｒａｊｅｓｈ  ａｎｄ  Ｒａｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｕｌｙ−Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ  １６９，Ｉｓｓｕｅｓ  ７−８，Ｐａｇｅｓ  ５６１−５６９、参考として本明細書に援用する）。バイオフィルムまたは細菌感染部位内の細胞外ＤＮＡまたはＲＮＡの分解もまた、バイオフィルム分散をもたらすことができる。ウイルスにコードされたＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ活性は、当業者に知られている市販のキット、非限定的な例として、Ｊｅｎａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから入手可能なものなどによって測定することができる。バイオフィルムの防止、浸透、破壊または分散についても、処理後に存在するバイオフィルムを定量化し、対照状態と比較することによって、評価することができる。バイオフィルム測定は、当該技術分野においてよく知られており、非限定的な例として、クリスタルバイオレットなどの色素でバイオフィルムを染色し、分光光度計における吸光度を定量化することが挙げられる。
【０１７８】
いくつかの例において、本開示は、ウイルス特性、例えば、細菌のファージ耐性などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作する方法を提供する。ファージまたはバクテリオファージは、区別なく使用することができる用語であり、細菌に感染するウイルスを指す。細菌のファージ耐性とは、特定のウイルスでの処理または曝露を受けた集団からのバクテリオファージ耐性菌の出現を指す。これは、細菌中のランダム変異によって、または集団中の特定の細菌がウイルスによって感染不可能であったために生じる。これらの耐性菌が拡大すると、新しい集団は、最初に曝露されたウイルスまたはバクテリオファージに耐性を示す。細菌の耐性を評価する非限定的な例は、耐性菌の数が集団の再成長速度に直接影響を与えるので、ウイルス処理後の細菌成長率を追跡することである。バクテリオファージは、少なくとも３つの方法によって、細菌がウイルス耐性を獲得するのを防ぐように操作することができる。１）既知のウイルス耐性系を阻害すること、２）第２の毒素をコードすること、及び／または３）溶解能力の増大によってビルレンスを上げること。バクテリオファージは、一例として、既知または合成の阻害タンパク質の発現によって、既知のウイルス耐性系を回避または阻害することができる。これらの阻害タンパク質の活性は、古典的な二重層プラーク力価測定法及び／または平板培養効率分析によって観察することができる。ウイルス耐性系には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び制限修飾系を挙げることができるが、これらに限定されない。ウイルス耐性の予防はまた、殺菌性ペイロードなどの第２の毒素の発現によって達成することができる。これらの第２の毒素の活性は、所定のウイルスの天然の溶解活性とは関係がなく、成長／殺傷曲線分析によって測定することができる。追加的にまたは代替的に、遺伝子的にコードされた毒素タンパク質は、精製して、タンパク質毒素の特性決定に一般的に使用され当業者によく知られている確立された生化学的及び／または表現型アッセイを使用して、特性決定することができる。
【０１７９】
いくつかの例において、本開示は、ウイルス特性、例えば、細菌の抗生物質感受性化などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作する方法を提供する。「細菌の抗生物質感受性化」とは、抗菌物質に対する感染細胞または近隣細胞の感受性を高めるための遺伝子的にコードされたペイロードを発現するウイルスの能力を指す。ペイロードは、ウイルスまたはバクテリオファージに遺伝子的にコードすることができ、次いで、宿主細胞内で発現される。発現されたペイロードは、必要に応じて、宿主細胞によって分泌され得、宿主細胞の溶解時に放出され得る。抗生物質感受性化作用は、相乗効果試験、例えば、よく知られた微量液体希釈チェッカーボードアッセイによって観察することができる。
【０１８０】
いくつかの例において、本開示は、ウイルス特性、例えば、ビルレンス因子の調節などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作する方法を提供する。「ビルレンス因子の調節」とは、既知のビルレンス因子の発現または活性を調節することができるタンパク質または化合物をウイルスが遺伝子的にコードしていることを指す。ビルレンス因子調節物質の非限定的な例は、転写因子、抗体及び免疫タンパク質である。ビルレンス因子及びビルレンス因子調節物質の発現または活性は、例えば、動物モデル、生化学的試験またはレポーターアッセイにおいて観察することができる。
【０１８１】
いくつかの例において、本開示は、ウイルス特性、例えば、標的化された宿主ゲノム消化または編集などの改善をもたらす、ウイルス核酸を操作する方法を提供する。「標的化された宿主ゲノム消化または編集」とは、所定の遺伝子座における標的化されたゲノム消化が可能な配列特異的ヌクレアーゼを遺伝子的にコードし、任意に、例えば、修復ＤＮＡ分子の挿入によって編集することができる、ウイルスの能力を指す。標的化された消化作用は、配列決定、生細胞計測、新規配列の組込み確認及び／または当業者に知られている他の標準的な技術によって観察することができる。
【０１８２】
いくつかの態様において、本開示は、インビトロ消化ステップを含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、消化されたウイルス核酸は、インビトロまたはインビボアセンブリ反応に使用するのではなく、単離され、配列決定される。いくつかの例において、ウイルス核酸断片から得た配列決定の結果を使用して、ウイルスゲノム末端を特定する。いくつかの例において、修正されたウイルスゲノム配列を使用して、更なるインビトロ工学アプローチ及びステップを計画及び設計する。
【０１８３】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス核酸の単離を含む、ウイルス配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、ウイルス核酸は、完全なウイルスゲノムである。いくつかの例において、完全なウイルスゲノムは、ウイルス粒子から単離される。いくつかの例において、ウイルス核酸は、ウイルスゲノムのサブセクションである。いくつかの例において、ウイルス核酸は、プラスミド中に含まれるウイルスゲノムのサブセクションである。いくつかの例において、ウイルスゲノムサブセクションを含むプラスミドは、宿主細胞から単離される。いくつかの例において、ウイルスゲノムサブセクションは、インビトロ工学の前に、プラスミドにクローニングされ、宿主細胞を形質転換し、単離される。いくつかの例において、ウイルス核酸はデノボ合成される。デノボ合成は、当該技術分野において知られている標準的方法を使用して、オリゴを合成し、それらをインビトロまたはインビボでアセンブルすることを含み得る。いくつかの例において、ウイルス核酸は、消化の前に、例えば、ＰＣＲ増幅などで増幅される。
【０１８４】
いくつかの態様において、本開示は、（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）クラウディング剤と、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）単離した耐熱性リガーゼと、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物と、（ｆ）好適な緩衝液と、（ｇ）精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとを含む、ウイルス配列を操作するためのキットを提供する。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、キットは、個別化された標的指向ＲＮＡを更に含む。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、キメラｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの例において、キットは、アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む。いくつかの例において、キットは、コンピテント宿主細胞を更に含む。いくつかの例において、キットは、単離されたウイルス核酸を更に含む。
【０１８５】
いくつかの態様において、本開示は、単離されたウイルス核酸、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、少なくとも１つの標的指向ＲＮＡ、及び単離されたウイルス核酸に消化部位でアセンブルされるＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む、ウイルス核酸のインビトロ工学のためのシステムを提供する。いくつかの例において、単離されたウイルス核酸は、ウイルス粒子から単離された完全なゲノムである。いくつかの例において、単離されたウイルス核酸は、プラスミドにサブクローニングされ、宿主細胞から単離されたウイルスゲノムサブセクションである。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡまたはｇＲＮＡは２つある。いくつかの例において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは２セットある。
【０１８６】
いくつかの態様において、本開示は、単離されたウイルス核酸と、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、少なくとも１つの標的指向ＲＮＡと、単離された核酸の消化部位に挿入される核酸断片とを含む、インビトロ工学的ウイルス核酸システムを含む。いくつかの例において、システムは、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的指向ＲＮＡとが、単離されたウイルス核酸を消化できる複合体を形成するものである。いくつかの例において、システムは、スペルミジンを更に含む。いくつかの例において、システムは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、クラウディング剤と、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、単離した耐熱性リガーゼと、ｄＮＴＰの混合物と、好適な緩衝液とを更に含み、該システムは、組換えウイルス核酸を形成するための、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの消化部位での単離されたウイルス核酸への核酸断片の挿入に効果的である条件下にある。
【０１８７】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムは、組換えウイルス核酸が、参照及び／または操作されていないウイルス核酸と比較して少なくとも１つの改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができるようなものである。いくつかの例において、改善されたウイルス特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【０１８８】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムにおいて、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、消化後、不活性化されるか、または除去される。
【０１８９】
本明細書で開示される方法は、多数の他のウイルスゲノム及びウイルスベクター構築物に使用でき、ＲＮＡゲノムまたは後にウイルスＲＮＡにインビトロ転写されるＤＮＡ鋳型を直接編集することによるＲＮＡゲノムの修正に使用でき、原核生物ウイルス及び真核生物ウイルスの両方を操作し、直接修正するために使用でき、ファージディスプレイ、ファージ治療、ウイルス診断またはワクチン開発／作製のために使用されるウイルスゲノムの直接修正に使用することができる。
【０１９０】
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された組換えウイルス核酸を提供する。いくつかの例において、組換えウイルス核酸は、操作されていないウイルス核酸と比較して少なくとも１つの改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる。いくつかの例において、改善されたウイルス特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【０１９１】
いくつかの態様において、本開示は、操作されていないウイルス核酸と比較して少なくとも１つの改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる組換え核酸を含む、操作されたウイルス組成物を提供する。いくつかの例において、改善されたウイルス特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。いくつかの例において、本開示にかかる操作されたウイルス核酸は、本明細書に記載される方法のステップのいずれかによって作製される。
【０１９２】
方法は、ヌクレオチド、遺伝子または全ゲノム領域を変更するために使用され得る。例えば、以下の実施例で記載されるように、この方法は、ＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子をＬＵＺ１９に置き換えて、ウイルス宿主域の改善をもたらすことが示されている。更に、この方法を使用して、ウイルス管複合体に単一の変異を挿入し、ウイルスの複製を改善することができる。方法はまた、抗菌性ペプチド、ピオシン、ＥＰＳデポリメラーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ阻害タンパク質、バクテリオファージ由来の尾繊維、レポーター遺伝子（すなわち、Ｌｕｘ、ＧＦＰ）、クオラム抑制遺伝子、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムタンパク質（すなわち、Ｃａｓ９）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、転写因子及びヒト免疫調節因子の操作をバクテリオファージにもたらし、バクテリオファージ治療または関連用途におけるバクテリオファージの活性を改善するために使用することができる。これらの要素は、天然プロモーター、異種プロモーター、誘導性プロモーターまたはこれらの任意の組み合わせなどの天然または異種の調節エレメントに作動可能に連結することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本開示は、宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸と比較して２つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルスを提供する。いくつかの態様において、産生されるウイルス粒子は、少なくとも３つの改善されたウイルス特性を有する。いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルスを提供する。いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、操作されたウイルスゲノムである。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、操作されたバクテリオファージゲノムである。操作されたバクテリオファージのいくつかの態様において、改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つは、宿主域である。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたウイルス核酸を含む、２つ以上の改善されたウイルス特性を有する操作されたウイルスを提供する。いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変の結果である。いくつかの態様において、少なくとも１つの改善されたウイルス特性は、操作されたウイルス核酸中における少なくとも２つの改変の結果である。いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸に含まれる改変は、１回の工学的ステップの結果である。いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸に含まれる改変は、反復的な工学的ステップの結果である。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたウイルス核酸を含む、２つ以上の改善されたウイルス特性を有する操作されたウイルスを提供する。
【０１９７】
いくつかの態様において、改変のうちの少なくとも１つは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５０または配列番号２５に含まれる配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する核酸配列中にある。
【０１９８】
いくつかの態様において、改変のうちの少なくとも１つは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５、配列番号４８または配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある。
【０１９９】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部を更に含む。いくつかの態様において、異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号２６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する。いくつかの態様において、異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【０２００】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部を更に含む。いくつかの態様において、操作されたｇｐ３４遺伝子は、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、異種ｇｐ３４遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する。
【０２０１】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号５０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する１つ以上の配列中における改変を更に含む。
【０２０２】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、及び配列番号５０に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列のそれぞれにおける改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号１の核酸位置５０に対応する位置でのＧからＡへの置換、配列番号５０の核酸位置１６０に対応する位置でのＧからＴへの置換、配列番号２の核酸位置２４５に対応する位置でのＡからＧへの置換、配列番号２の核酸位置２４７〜２４８に対応する位置でのＡＴからＴＣへの置換、及び配列番号３の核酸位置７５７に対応する位置でのＡからＧへの置換を含む。
【０２０３】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変を更に含む。
【０２０４】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号３４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む。
【０２０５】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する配列中に含まれる配列の異種核酸分子での置換である。いくつかの態様において、異種核酸分子は、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する異種核酸配列を含む。
【０２０６】
いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む。いくつかの態様において、改変は、配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子での置換である。いくつかの態様において、異種核酸分子は、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む。
【０２０７】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、配列番号２１に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む。
【０２０８】
いくつかの態様において、操作されたウイルス核酸は、配列番号２２に含まれる核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、本開示は、２つ以上の所望のウイルス特性を有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、（ｂ）第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を、得られる第２のウイルスゲノムが第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含むように、少なくとも１つの修復核酸分子と結合することによって、第２のウイルスゲノムを操作することを含み、第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる。いくつかの態様において、本明細書で開示される方法は、（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すことを更に含む。いくつかの態様において、改善されたウイルス特性のそれぞれは、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、ステップ（ｂ）の第２のウイルスゲノムを操作することは、（１）エンドヌクレアーゼを使用した第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、（２）消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることとを更に含む。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、ウイルス粒子から単離される。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムまたは少なくとも１つの修復核酸分子は、デノボ合成される。いくつかの態様において、デノボ合成は、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムまたは少なくとも１つの修復核酸分子は、インビトロ消化の前に増幅される。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する操作された目的のウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、少なくとも１８ｋｂである。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、少なくとも２ｋｂ〜少なくとも４Ｍｂである。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、少なくとも１８ｋｂ〜少なくとも４Ｍｂである。いくつかの態様において、第１のウイルスゲノムは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも７５ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも８５ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２５ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１７５ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、少なくとも２Ｍｂ、少なくとも２．５Ｍｂ、少なくとも３Ｍｂまたは少なくとも３．５Ｍｂである。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、アセンブリは、インビトロまたはインビボで実施される。いくつかの態様において、アセンブリは、（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）クラウディング剤と、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）単離した耐熱性リガーゼと、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物と、（ｆ）好適な緩衝液とを含む混合物を用いて、操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、消化されたウイルス核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、アセンブリは、インビトロまたはインビボで実施される。いくつかの態様において、アセンブリは、宿主細胞においてインビボで実施される。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、方法は、１つまたは２つのガイドＲＮＡを更に含む。いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、（１）キメラｇＲＮＡ、または（２）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、熱不活性されるか、または除去される。いくつかの態様において、インビトロ消化は、スペルミジンを更に含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む。いくつかの態様において、方法は、操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれかによって作製される操作されたウイルスを提供する。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示される工学的方法のいずれかによって作製された、本明細書で開示される操作されたウイルスのいずれかの組成物を提供する。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、本開示は、精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、クラウディング剤と、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、単離された耐熱性リガーゼと、ｄＮＴＰの混合物と、好適な緩衝液とを含む、ウイルス核酸分子を操作するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、個別化されたガイドＲＮＡを更に含む。いくつかの態様において、キットは、アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む。いくつかの態様において、キットは、形質転換のためのコンピテント宿主細胞を更に含む。いくつかの態様において、キットは、単離されたウイルスゲノム核酸を更に含む。
【０２２０】
いくつかの態様において、本開示は、単離されたウイルス核酸と、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、少なくとも１つの標的指向ＲＮＡと、単離された核酸の消化部位に挿入される核酸断片とを含む、インビトロ工学的ウイルス核酸システムを含む。いくつかの例において、システムは、組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的指向ＲＮＡとが、単離されたウイルス核酸を消化できる複合体を形成するものである。いくつかの例において、システムは、スペルミジンを更に含む。いくつかの例において、システムは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、クラウディング剤と、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、単離した耐熱性リガーゼと、ｄＮＴＰの混合物と、好適な緩衝液とを更に含み、該システムは、組換えウイルス核酸を形成するための、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの消化部位での単離されたウイルス核酸への核酸断片の挿入に効果的である条件下にある。
【０２２１】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムは、組換えウイルス核酸が、操作されていないウイルス核酸と比較して少なくとも１つの改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができるようなものである。いくつかの例において、改善されたウイルス特性は、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される。
【０２２２】
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステムにおいて、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、消化後、不活性化されるか、または除去される。
【０２２３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、単離された核酸中の配列を修正するためのエラー修正法として使用される。標準的なエラー修正方法はＰＣＲに基づくものであるが、１）ＰＣＲは、付加的な望ましくない変異を核酸に導入する可能性があること、また、２）ＰＣＲは、この文脈において、約５ｋｂのサイズ制限があることの２つの本質的な問題がある。したがって、標準的なＰＣＲに基づくエラー修正方法は、ＰＣＲにより生成される変異または増幅の失敗のいずれかの結果として、５ｋｂよりも大きいプラスミドに対して、確実に実施することができない。本明細書に記載の核酸配列のインビトロ工学的方法は、ＰＣＲ増幅の必要性を避けるものであり、サイズ制限がなくなり、ＰＣＲにより生成される変異の可能性を排除する。
【０２２４】
いくつかの態様において、本開示は、核酸の単離と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した核酸の領域のインビトロ消化と、消化された核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。一態様において、インビトロ消化は、ＲＮＡ誘導型酵素消化である。別の態様において、酵素消化は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素を使用して実施される。追加の態様において、消化は、標的指向ＲＮＡを更に含む。別の態様において、消化は、スペルミジンを更に含む。特定の態様において、標的指向ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡである。更なる態様において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、少なくとも摂氏８０度などの熱への曝露などの標準的方法によって不活性化される。追加的にまたは代替的に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、フェノールクロロホルム抽出などの標準的方法によって除去される。
【０２２５】
いくつかの態様において、本開示は、核酸の単離と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した核酸の領域のインビトロ消化と、消化された核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、アセンブリは、（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）クラウディング剤と、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された耐熱性の非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）単離した耐熱性リガーゼと、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物と、（ｆ）好適な緩衝液とを含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、消化されたウイルス核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される。いくつかの態様において、エキソヌクレアーゼはＴ５エキソヌクレアーゼであり、接触は等温条件下であり、及び／またはクラウディング剤はＰＥＧであり、及び／または非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼはＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼもしくはＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、及び／またはリガーゼはＴａｑリガーゼである。いくつかの例において、インビトロアセンブリは、１ステップまたは等温ギブソンアセンブリによって実施される。いくつかの例において、インビトロアセンブリは、２ステップギブソンアセンブリによって実施される。
【０２２６】
いくつかの態様において、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、単離された組換えＣａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは少なくとも１つある。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは２つある。いくつかの例において、標的指向ＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１セットのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの例において、インビトロ消化反応は、２つのｇＲＮＡを使用する。いくつかの例において、インビトロ消化反応は、２セットのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。
【０２２７】
いくつかの態様において、本開示は、インビトロ消化ステップを含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、少なくとも摂氏８０度などの熱への曝露などの標準的方法によって不活性化される。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、フェノールクロロホルム抽出によって除去される。いくつかの例において、消化後、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、当該技術分野において知られている他の抽出方法によって除去される。
【０２２８】
いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸をもたらす、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、次いで、操作された核酸で宿主細胞を形質転換させる。いくつかの例において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたは当該技術分野においてよく知られている他の微生物である。いくつかの例において、形質転換は、ヒートショック、エレクトロポレーション、微粒子銃、パーティクルガン、接合、形質導入、リポフェクションまたは当該技術分野においてよく知られている他の確立された方法によって実施される。
【０２２９】
いくつかの態様において、本開示は、単離された核酸を含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、核酸は、宿主細胞から単離された完全なゲノムである。いくつかの例において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたは他のよく知られている微生物である。いくつかの例において、核酸は、プラスミドである。いくつかの例において、プラスミドは、宿主細胞から単離される。いくつかの例において、目的の核酸は、本明細書に記載の方法によるインビトロ操作の前に、プラスミドにクローニングされ、宿主細胞を形質転換し、単離される。
【０２３０】
いくつかの態様において、本開示は、核酸の単離を含む、核酸配列を操作するインビトロ法を提供する。いくつかの例において、単離された核酸は、ゲノムまたはプラスミドである。いくつかの例において、単離されたゲノムまたはプラスミドは、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１２ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂまたは少なくとも２８ｋｂである。いくつかの例において、単離されたゲノムまたはプラスミドは、６ｋｂ〜１ＭＢである。いくつかの例において、単離されたゲノムまたはプラスミドは、６ｋｂ〜１０ｋｂ、８ｋｂ〜１５ｋｂ、１２ｋｂ〜２０ｋｂ、１５ｋｂ〜２２ｋｂ、２０ｋｂ〜２５ｋｂ、２２ｋｂ〜２８ｋｂ、２５ｋｂ〜３０ｋｂ、２５ｋｂ〜５０ｋｂまたは４０ｋｂ〜１００ｋｂである。
【０２３１】
上に開示した実施形態のいずれかについて追加的にまたは代替的に、本開示は、次の実施形態を含む。
【０２３２】
実施形態１は、宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して２つ以上または任意に３つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルスである。
【０２３３】
実施形態２は、改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、実施形態１の操作されたウイルスである。
【０２３４】
実施形態３は、ウイルス核酸が、次のウイルス核酸：ウイルスゲノム、ウイルスゲノム断片、バクテリオファージゲノム、バクテリオファージゲノム断片、溶菌バクテリオファージゲノム、溶菌バクテリオファージゲノム断片またはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上である、実施形態１または２の操作されたウイルスである。
【０２３５】
実施形態４は、操作されたウイルス核酸がバクテリオファージゲノムであり、任意に、改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つが宿主域である、実施形態１〜３のいずれかの操作されたウイルスである。
【０２３６】
実施形態５は、以下のうちの少なくとも１つを満たす、実施形態１〜４のいずれかの操作されたウイルスである。１）改善されたウイルス特性のそれぞれが、操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変の結果である。２）少なくとも１つの改善されたウイルス特性が、操作されたウイルス核酸中における少なくとも２つの改変の結果である。３）操作されたウイルス核酸に含まれる改変が、１回の工学的ステップの結果である。４）操作されたウイルス核酸に含まれる改変が、反復的な工学的ステップの結果である。５）以上の任意の組み合わせ。
【０２３７】
実施形態６は、改変のうちの少なくとも１つが、
１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５０もしくは配列番号２５に含まれる配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する核酸配列、または
２）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５、配列番号４８もしくは配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または
３）以上の任意の組み合わせ内にある、実施形態１〜５のいずれかの操作されたウイルスである。
【０２３８】
実施形態７は、操作されたウイルス核酸が、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む操作されたウイルスゲノムを含む、実施形態１〜６のいずれかの操作されたウイルスである。
【０２３９】
実施形態８は、操作されたウイルスゲノムが、以下のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態１〜７のいずれかの操作されたウイルスである。
１）異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部（任意に、当該異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号２６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する）、
２）異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部（任意に、当該異種ｇｐ１８遺伝子は、配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする）、
３）操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部（任意に、当該異種ｇｐ３４遺伝子は、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸配列をコードするか、または任意に、異種ｇｐ３４遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する）、
４）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号５０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する１つ以上の配列中における改変、ならびに
任意に、配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列、及び配列番号５０に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列のそれぞれにおける改変
（任意に、当該改変は、配列番号１の核酸位置５０に対応する位置でのＧからＡへの置換、配列番号５０の核酸位置１６０に対応する位置でのＧからＴへの置換、配列番号２の核酸位置２４５に対応する位置でのＡからＧへの置換、配列番号２の核酸位置２４７〜２４８に対応する位置でのＡＴからＴＣへの置換、及び配列番号３の核酸位置７５７に対応する位置でのＡからＧへの置換を含む）、
５）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変、ならびに
任意に、配列番号３４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変
（任意に、当該改変は、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む）、
６）配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する配列中における改変
（任意に、当該改変は、配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有する配列中に含まれる配列の異種核酸分子での置換であり、
かつ任意に、当該異種核酸分子は、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有する異種核酸配列を含む）、
７）配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変
（任意に、当該改変は、配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子での置換であり、
かつ任意に、当該異種核酸分子は、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む）、
８）以上の任意の組み合わせ。
【０２４０】
実施形態９は、操作されたウイルス核酸が、１）配列番号２１に含まれる核酸配列もしくはその一部を含むプロモーター、２）配列番号２２に含まれる核酸配列もしくはその一部を含むターミネーター、または３）これらの任意の組み合わせに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれかの操作されたウイルスである。
【０２４１】
実施形態１０は、所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法であり、この方法は、（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、（ｂ）第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子と結合して、第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含む第２のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することであって、当該第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができることと、任意に、（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すこととを含む。
【０２４２】
実施形態１１は、改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、実施形態１０の方法である。
【０２４３】
実施形態１２は、ステップ（ｂ）の操作されたウイルスゲノムを作製することが、（１）エンドヌクレアーゼを使用した第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、（２）消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることとを含む、実施形態１０または１１のいずれかの方法である。
【０２４４】
実施形態１３は、次の要素のうちの少なくとも１つを満たす、実施形態１０〜１２のいずれかの方法である。１）第１のウイルスゲノムがウイルス粒子から単離される。２）第１のウイルス及び／または少なくとも１つの修復核酸分子がデノボ合成され、任意に、デノボ合成は、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む。３）第１のウイルスゲノム及び／または少なくとも１つの修復核酸分子がインビトロ消化の前に増幅される。あるいは、４）これらの任意の組み合わせ。
【０２４５】
実施形態１４は、第１のウイルスゲノムが、次のうちの少なくとも１つ：
１）少なくとも３ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも２５ｋｂもしくは少なくとも３０ｋｂ；
２）少なくとも１８ｋｂ；
３）少なくとも２ｋｂ〜少なくとも４Ｍｂ；
４）少なくとも１８ｋｂ〜少なくとも４Ｍｂ；または
５）少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも７５ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも８５ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２５ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１７５ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、少なくとも２Ｍｂ、少なくとも２．５Ｍｂ、少なくとも３Ｍｂもしくは少なくとも３．５Ｍｂである、実施形態１０〜１３のいずれかの方法である。
【０２４６】
実施形態１５は、アセンブリがインビトロで実施され、任意に、当該アセンブリは、（ａ）任意に非耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｂ）任意に、クラウディング剤と、（ｃ）任意に耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）任意に耐熱性である、単離されたリガーゼと、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物と、（ｆ）任意に、好適な緩衝液とを含む混合物を用いて、操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、消化されたウイルス核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、実施形態１０〜１４のいずれかの方法である。
【０２４７】
実施形態１６は、アセンブリがインビボで実施され、任意に、当該インビボアセンブリは、宿主細胞で実施される、実施形態１０〜１４のいずれかの方法である。
【０２４８】
実施形態１７は、次の要素のうちの少なくとも１つを満たす、実施形態１０〜１６のいずれかの方法である。１）エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。２）方法が少なくとも１つのガイドＲＮＡを更に含む。３）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素であり、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、（ａ）キメラｇＲＮＡ、または（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。４）エンドヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される。５）インビトロ消化がスペルミジンを更に含む。６）方法が、操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む。７）方法が、操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む。あるいは、８）以上の任意の組み合わせ。
【０２４９】
実施形態１８は、実施形態１０〜１７のいずれかの方法によって作製された操作されたウイルスであり、任意に、当該操作されたウイルスは、実施形態１〜９のいずれかによる操作されたウイルスである。
【０２５０】
実施形態１９は、（ａ）精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）任意に非耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｃ）任意に耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｄ）任意に耐熱性である、単離されたリガーゼとを含み、任意に、１）クラウディング剤、２）ｄＮＴＰの混合物、３）好適な緩衝液、４）個別化されたガイドＲＮＡ、５）アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子、６）形質転換のためのコンピテント宿主細胞、７）単離されたウイルスゲノム核酸、または８）以上の任意の組み合わせのいずれかを更に含む、任意に、ウイルス核酸分子である核酸分子を操作するためのキットである。
【０２５１】
実施形態２０は、（ａ）核酸を準備することと、（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した核酸の領域のインビトロ消化と、（ｃ）消化された核酸へのＤＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリとを含み、アセンブリは、（ｉ）任意に非耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｉｉ）任意に耐熱性である、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または当該ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、（ｉｉｉ）任意に耐熱性である、単離されたリガーゼと、（ｉｖ）ｄＮＴＰの混合物とを含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、消化された核酸への断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施され、任意に、当該インビトロアセンブリ混合物は、（ｖ）クラウディング剤、または（ｖｉ）好適な緩衝液を更に含む、核酸配列を操作する方法である。
【０２５２】
実施形態２１は、次の要素のうちの少なくとも１つを満たす、実施形態２０の方法である。１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である。２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される。３）方法が、組換え核酸による宿主細胞の形質転換を更に含む。４）核酸が、宿主細胞から単離されたプラスミドであり、任意に、当該プラスミドは、少なくとも６ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂまたは少なくとも２０ｋｂである。あるいは、５）以上の任意の組み合わせ。
【０２５３】
全ての態様における開示について、以下の実施例で更に例示する。しかし、以下の実施例は、本開示の範囲を限定するものではなく、本開示の範囲は、添付する特許請求の範囲によって定義される。本明細書で示される一般的方法に関する説明は、例示のみを目的に行うものである。他の代替的な方法及び実施形態については、本開示の検討により、当業者に明らかとなり、これらは、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるものとする。
【実施例】
【０２５４】
実施例Ｉ
インビトロウイルスゲノム工学
４３ｋｂのｄｓＤＮＡ  ＬＵＺ１９ウイルスゲノム（アクセッション番号ＮＣ＿０１０３２６．１）を、例えば、Ｎｏｒｇｅｎ  ＢｉｏｔｅｋファージＤＮＡ単離キットまたは当業者に知られている任意の他の方法を使用して、ウイルス粒子から単離した（図２Ａ）。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＣａｓ９とインビトロ転写されたｇＲＮＡとを使用して、２つの別々の位置で部位特異的消化を実施した。未消化の４３ｋｂのゲノムＤＮＡは、最も大きいＤＮＡラダーバンド（１０ｋｂ）よりもずっと少なくしか移動しない。線状ゲノムの消化により、約３９ｋｂ、約４．３ｋｂ及び約２００ｂｐの３つのサイズの断片が得られる。標的指向ｇＲＮＡを過剰に使用し、２００ｂｐ断片を遮断する（図２Ｂ）。ＬＵＺ１９消化部位の直上流及び下流領域と１００ｂｐの相同性がある５’末端を有するプライマーを使用して、ΦＫＦ７７由来ｇｐ７の断片をＰＣＲ増幅した（図２Ｃ）。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したＬＵＺ１９ゲノムにＰＣＲ増幅したΦＫＦ７７  ｇｐ７断片（配列番号８）をシームレスに組み込み、天然ｇｐ７領域（配列番号２３）を置き換えた（図２Ｄ）。Ｃａｓ９切断はインビトロでのギブソンアセンブリに必要な相同性を欠く平滑末端の二本鎖分解をもたらすので、バックグラウンドはほとんど観察されない。インビトロ編集したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た（図２Ｅ）。回収したウイルスへのΦＫＦ７７遺伝子断片の組み込みは、操作領域の内側及び外側のプライマーを用いたＰＣＲを使用して検証した。未編集のＬＵＺ１９  ｇＤＮＡをネガティブ対照として使用したところ、全ての実験ウイルスは新しいΦＫＦ７７遺伝子断片を含有した（最後の７レーン）。
【０２５５】
これらのデータは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ溶菌ファージゲノムを編集するためのインビトロウイルス工学の実施例を示すものである。ＬＵＺ１９などのファージの操作は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの異種細菌宿主における毒性作用、ビルレントウイルスに適した選択マーカーがないこと、及びＬＵＺ１９ゲノム内に固有の標準的な制限酵素部位がないことから、標準的方法では行うことができない。したがって、これらのデータは、本明細書に記載のインビトロ工学的方法により、さもなければ遺伝子的に扱いにくいウイルスゲノムの直接的かつ迅速な操作が可能になる方法を実証するものである。
【０２５６】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの形質転換については、化学的にコンピテントにしたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞を、Ｉｒａｎｉ及びＲｏｗｅ（Ｉｒａｎｉ，Ｖ．Ｒ．＆Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｊ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９７，２２，５４−５６）に記載されているように調製した。基本的には、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞の種培養液３ｍｌを４００ｍｌの新しいＬＢ中に希釈した。別途の記載がない限り、３７℃、振盪（２２０ｒｐｍ）下、ＯＤ６００＝０．６まで、培養物を増殖させた。細胞を氷上で１０分間冷却し、５００ｍｌの遠心分離ボトル中に移し、冷却遠心機（４℃）中、５，０００ｇ、２０分間でペレット化した。細菌ペレットを１００ｍｌの氷冷した１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄した後、２つの５０ｍｌコニカルチューブに分配し、冷却遠心機（４℃）中５，０００ｇでペレット化した。細胞を３０ｍｌの１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で更に１回洗浄した後、遠心分離し、１５ｍｌの冷却した１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に再懸濁した。細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした後、４℃で遠心分離し、４ｍｌの冷却した１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に再懸濁した。２００μｌのアリコートを別個の１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ中に入れ、氷上で最大２日間維持した。精製したＤＮＡを各アリコートの細胞に加え、短くボルテックス処理し、氷上で更に１時間インキュベートした。細胞に５０℃で３分間ヒートショックを与え、そのまま氷上に戻して５分間静置した後、平板培養した。各形質転換物を４ｍｌの５０℃のＬＢトップアガーに加え、予め温めておいたＬＢプレート上に播いた。プレートを逆さにし、３７℃ＯＮでインキュベートしてプラーク形成させた。
【０２５７】
実施例ＩＩ
宿主域が拡大した操作されたウイルス
大規模臨床ライブラリー（２８２個のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ単離物）を、ファージＬＵＺ１９及びＬＫＤ１６に対する感受性について、二重寒天プラークアッセイを使用してスクリーニングした。６６株が２つのウイルスのうちの少なくとも１つに感染することができ、１８株及び６株はそれぞれＬＵＺ１９及びＬＫＤ１６に一意的に感染した。したがって、宿主域の拡大に関与するＬＫＤ１６遺伝因子を試験するための土台としてＬＵＺ１９を選択した。２つのウイルスの間の比較ゲノム解析は、ＬＫＤ１６の遺伝子産物１８（ｇｐ１８）がＬＵＺ１９  ｇｐ１８ホモログとは異なる配列を有することを示したことから、ｇｐ１８が宿主域決定に関与し得ることが示された。ＬＵＺ１９ウイルス粒子からウイルスゲノムを上記のとおりに単離した。ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたｇＲＮＡとを使用して部位特異的消化を実施し、ＬＵＺ１９  ｇｐ１８遺伝子を切り出した。組込みのためのＬＵＺ１９相同末端部を有するＬＫＤ１６由来ｇｐ１８をＰＣＲ増幅した。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したＬＵＺ１９ゲノムにＰＣＲ増幅したＬＫＤ１６  ｇｐ１８（配列番号７）をシームレスに組み込み、天然ｇｐ１８配列（配列番号５０）を置き換えた。インビトロ操作したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た。ＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子を有する操作されたＬＵＺ１９ウイルスは、ＬＵＺ１９ファージに通常感染する全ての株に加え、先にはＬＫＤ１６にしか感染しなかった３株にも感染することができ、宿主域の拡大を示した（図３Ｂ及び６Ｂ）。これは、ｇｐ１８がＬＫＤ１６の宿主域差に関与する遺伝因子であり、この遺伝子を有する操作されたＬＵＺ１９ウイルスがより多くの宿主株でより良好に複製できることを示している。
【０２５８】
これらのデータは、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を、さもなければ遺伝子的に扱いにくいウイルスゲノムに実施することで、宿主域の拡大という改善されたウイルス特性をもたらすことを実証するものである。宿主域の拡大したバクテリオファージを合理的に操作することができることは、細菌を殺傷するためのウイルスを開発する際に大きな価値となる特性である。
【０２５９】
実施例ＩＩＩ
ウイルス属の宿主域を有する操作されたウイルス
ＬＵＺ１９及び／またはＬＵＺ１９誘導体を進化または同時感染実験のための出発物質として使用して、ΦＫＭＶウイルス属の宿主域を１つの代表的なウイルスに集約するための標的を特定した。同時形質転換または同時感染実験は、許容性（ＰＡＯ１Ｋ）または非許容性（耐性）の宿主（ＰＡ７４１０またはＰＡ７６４９）のいずれかで実施した（図４Ａ）。同時感染及び同時形質転換はいずれも、それぞれＬＫＤ１６またはΦＫＭＶの存在下で実施した。宿主域は、指定の細菌株での二重寒天プラークアッセイを使用して試験した。目的株における宿主域の拡大についてスクリーニングした後、進化したファージを、許容性株と選択的株（ＬＵＺ１９にのみ感染する株−ＰＡ７６３２）によって交互に３〜５回継代した。進化したファージをＰＡＯ１Ｋ中で増幅し、ｇＤＮＡを精製し、配列決定した。ＬＵＺ１９と、先にはＬＫＤ１６またはΦＫＭＶにのみ感受性であった株にも感染できる進化したＬＵＺ１９との間の比較ゲノム解析を使用して、宿主域の拡大に関与する点変異を特定した（図４Ｂ）。
【０２６０】
大規模臨床ライブラリー（２８２個のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ単離物）を、ウイルスのΦＫＭＶ属に対する感受性について、二重寒天プラークアッセイを使用してスクリーニングした。３つのファージ（ＬＵＺ１９、ＬＫＤ１６及びΦＫＭＶ）は宿主域差を呈し、６７の株に感染できたが、ＬＵＺ１９が臨床単離物の大部分に感染した（図４Ｃ）。６つの臨床単離物（ＰＡ７２４５、ＰＡ７２５５、ＰＡ７４２７、ＰＡ７５０３、ＰＡ７６８６及びＰＡ７４１０）はＬＫＤ１６にのみ感受性であり、１つの臨床単離物はΦＫＭＶ（ＰＡ７６４９）にのみ感受性であった。したがって、進化／同時感染／同時形質転換実験のための土台としてＬＵＺ１９を選択し、ΦＫＭＶ属に感受性である全ての臨床単離物に感染することができるバリアントを得た。比較ゲノム解析では、ＬＫＤ１６またはΦＫＭＶにのみ感受性である株を感染させるには、ＬＵＺ１９にいくつかの点変異が必要であることが明らかになった。（ｉ）ｇｐ１３  Ｃ１７Ｙ（配列番号１の位置５０）がＰＡ７４２７の感染に必要である。（ｉｉ）ｇｐ１８  Ｄ３６Ｙ（配列番号５０の位置１０６）がＰＡ７２４５、ＰＡ７５０３及びＰＡ７６８６の感染に必要である。ｇｐ３８  Ｄ８２Ｇ及びＩ８３Ｓ（それぞれ配列番号２の２４５及び２４７〜２４８）がＰＡ７４１０及びＰＡ７６４９の感染を可能にする。（ｉｖ）ｇｐ４０  Ｎ２５３Ｄ（配列番号３の位置７５７）がＰＡ７２５５の感染を可能にする（図４Ｂ）。本明細書に記載のインビトロ工学的方法を使用して、ＬＵＺ１９土台への上記の変異について反復操作することにより、ΦＫＭＶ属ファージに感受性である全ての臨床単離物に感染することができる幅広いＬＵＺ１９宿主域（ＷＨＲ  ＬＵＺ１９）が得られた（図４Ｃ）。
【０２６１】
これらのデータは、宿主域の差に関与する遺伝子変異を最初に特定し、その後、進化実験、スクリーニング、配列決定、比較ゲノム解析及びこれらの任意の組み合わせによって、ウイルス属の宿主域を１つのウイルスゲノムに集約させる、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法の使用例を提供するものである。
【０２６２】
実施例ＩＶ
改善されたウイルスの複製は初期バイオフィルム破壊を改善する。
別の例において、ウイルス進化及び比較ゲノム解析では、尾部管状タンパク質Ｂ（Ｇｐ３４）中にＬ５５Δ変異を有するＬＵＺ１９進化ファージは、放出数の増加に起因して、より大きな比率で複製することが示された（図５Ｂ）。Ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異が改善されたウイルス特性を有することを検証するために、ＬＵＺ１９ウイルスゲノムをウイルス粒子から単離した。ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたｇＲＮＡとを使用して部位特異的消化を実施し、ｇｐ３４遺伝子（配列番号４）を除去した。アミノ酸位置５５にロイシンコドンの欠失を有するｇｐ３４  Ｌ５５Δ遺伝子（Ｇｐ３４  Ｌ５５Δ、配列番号４の位置１６３〜１６５）をＬＵＺ１９進化ファージからＰＣＲ増幅した。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したＬＵＺ１９ゲノムにＰＣＲ増幅したｇｐ３４  Ｌ５５Δ遺伝子をシームレスに組み込んだ。インビトロ変換したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た。Ｇｐ３４  Ｌ５５Δを有する操作されたＬＵＺ１９ウイルスは、細菌を拡散させ、溶解することができた。ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異（ファージ＊）を有するＬＵＺ１９ファージが野生型ＬＵＺ１９よりも大きい除去領域を有することを明らかにするために、二重寒天プラークアッセイを使用した。２日間にわたって画像を撮り、除去領域を測定した（図５Ｂ）。溶解幅の拡大領域は、Ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異を有するウイルスが良好に細菌を拡散させ、溶解することができたことを示すものである。クリスタルバイオレットバイオフィルムアッセイは、クリスタルバイオレットの取り込みを尺度としてバイオフィルムの蓄積を測定する（図５Ｃ）。ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異を有するウイルスで処理したサンプルは、野生型ｇｐ３４遺伝子を有するウイルスと比較して、バイオフィルムが大幅に減少した。図は、ｇｐ３４変異（アスタリスク）の位置を野生型ＬＵＺ１９ゲノムと比較して示す（図５Ｄ）。当該技術分野において知られている標準的アッセイを使用して、野生型及びｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異体の両方のウイルスの吸着、潜伏期間及び放出数を測定した。これらのデータにより、ｇｐ３４  Ｌ５５Δ変異を有するウイルスの放出数が大幅に増加したことが示された（図５Ｅ）。
【０２６３】
これらのデータは、細菌溶解、放出数、複製及び初期バイオフィルム破壊の増加という改善されたウイルス特性を有するウイルスを作製するための、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法の使用例を提供するものである。
【０２６４】
実施例Ｖ
初期バイオフィルム破壊及び宿主域拡大を有する反復操作ウイルス
実施例ＩＩで作製した宿主域の拡大したＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８組換えウイルスゲノムをウイルス粒子から単離した。ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたｇＲＮＡとを使用して部位特異的消化を実施し、ｇｐ３４（配列番号４）を除去した。次いで、実施例ＩＶで特性評価された溶菌活性が増加するｇｐ３４  ΔＬｅｕ５５変異（配列番号４の位置１６３〜１６５）をＰＣＲ増幅し、消化したＬＵＺ１９ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスゲノムにギブソンアセンブリを使用してアセンブルした。反復的にインビトロ操作されたゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子、すなわち、ＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子とｇｐ３４  ΔＬｅｕ５５変異との両方を有する操作されたＬＵＺ１９ウイルス（ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８）を得た。
【０２６５】
二重寒天プラーク、バイオフィルム及びインビトロヒトケラチノサイト付着アッセイを使用して、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスの改善されたウイルス特性について分析した。図６Ｄは、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８が改善された宿主域を有することを示す。前もって形成されたＭＤＲ  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを破壊する能力について、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８と天然ＬＵＺ１９とを比較した。具体的には、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８及び野生型ＬＵＺ１９をＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムとともにインキュベートし、クリスタルバイオレットを使用して破壊を測定した。図６Ｅは、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８において、野生型ＬＵＺ１９と比較して、前もって形成されたＭＤＲ  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを破壊する能力が向上したことを示す。ヒトケラチノサイトに付着した細菌に対するファージ処理の有効性について、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ウイルスを分析した。具体的には、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａをＨａＣａＴ細胞の単層に付着させた。次いで、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８または野生型ＬＵＺ１９とともに細胞をインキュベートした。結果は、ＬＵＺ１９＊ＬＫＤ１６ｇｐ１８ファージがヒトケラチノサイトに付着した多剤耐性（ＭＤＲ）Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞をより良好に殺傷できることを示した（図６Ｆ参照）。
【０２６６】
これらのデータは、宿主域の拡大及び放出数の増加などの複数の個別の改善されたウイルス特性を有するバクテリオファージを反復的に操作するシステムにおいて、本明細書に記載のインビトロ工学的方法がどのように使用されるかの例を提供するものである。重要なことに、これらの工学的ステップは、標準的方法の使用では直接的に実施できないか、全く実施することができない。更に、これらのデータは、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法が、合成生物学用途のための重要な特性である操作の反復的なラウンドについて、順次に使用されたことを実証するものである。
【０２６７】
実施例ＶＩ
バイオフィルム分散ペイロード及び完全なウイルス属を対象とする拡大された宿主域を有する反復操作ウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、ｇｐ４９（配列番号２５）をエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）デポリメラーゼまたはフェノール可溶性モルホリン（ＰＳＭ）のいずれかに置き換えてＬＵＺ１９にクローニングし、成熟バイオフィルムを分散させる能力を決定した（図７）。細胞外マトリックスデポリメラーゼまたは界面活性剤ポリペプチドを発現するＬＵＺ１９及びＷＨＲ  ＬＵＺ１９を操作するために、ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼ（この場合Ｃａｓ９）及びインビトロ転写されたｇＲＮＡを使用した消化によりＬＵＺ１９またはＷＨＲＬＵＺ１９のｇｐ４９（配列番号２５）を除去した後、ギブソンアセンブリを使用して、主要カプシドプロモーターＰｇｐ３２（配列番号２１）及びターミネーターＴｇｐ３２（配列番号２２）を両端に配した目的の遺伝子（ＧＯＩ）に置き換えた（図７Ａ及び７Ｃ）。野生型ＬＵＺ１９の場合、ＧＯＩは、ＥＰＳデポリメラーゼ（Ｐｐ１５ｇｐ４４−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａΦ１５に由来する尾部スパイクｇｐ４４（配列番号１４）；ＮＴＵｇｐ３４−Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅファージＮＴＵに由来する尾部スパイクｇｐ３４（配列番号１３）；ＬＫＡ１ｇｐ４９−Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＬＫＡ１に由来する尾部スパイクｇｐ４９（配列番号１２））、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＰＳＭａ、配列番号１８）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＰＳＭａ３（配列番号１６）及びＰＳＭｂ２（配列番号１７））に由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤、ならびにＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（配列番号１５）に由来するＤｓｐＢサーファクチン（図７Ｂ）であった。ＷＨＲ  ＬＵＺ１９の場合、ＧＯＩは、ＥＰＳデポリメラーゼＰｐ１５ｇｐ４４（配列番号１４）及びサーファクチンＳｅＰＳＭａ（配列番号１８）であった（図７Ｄ）。操作したファージを適切な宿主細胞で増幅し、単離し、配列決定により検証した。
【０２６８】
操作されたファージの成熟バイオフィルム分散能力について、ＭＢＥＣデバイスで２４時間成長させたバイオフィルムに対し１ウェル当たり１００ファージを３時間使用して試験した。簡潔に述べれば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの一晩培養物を、硫酸マグネシウム（１ｍＭ）、グルコース（０．２％）及びカザミノ酸（０．５％）を添加したＭ６３最小培地に希釈（１：１００）し、次いで、滅菌マイクロタイタープレート（１５０μｌ／ウェル）に加えた。ペグ付き蓋をマイクロタイタープレートに差し込んだ。３７℃で２４時間インキュベーションした後、１ウェル当たり１００ファージを含有する完全ＭＧ６３  １６０μｌを入れたマイクロタイタープレートにペグ付き蓋を移した。３７℃で３時間インキュベーションした後、ペグ付き蓋を水中で３回洗浄し、乾燥させ、２００μｌの０．５％クリスタルバイオレットで染色した。その後、プレートを水ですすぎ、結合していないクリスタルバイオレットを除去し、乾燥させた。当該色素は２００μｌの３０％酢酸中に溶解し、吸光度はＯＤ＝５５０ｎｍで測定した。
【０２６９】
ＤｓｐＢは、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムに対して界面活性であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する活性がないので、ネガティブ対照として機能した。２つのペイロード（Ｐｐ１５ｇｐ４４及びＳｅＰＳＭａ）は、著しい抗バイオフィルム活性を示した（図７Ｂ）。とりわけ、ＰＳＭは、グラム陽性細菌に対して抗バイオフィルム活性であることが知られているサーファクチンであるが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムを分散させることはこれまでに示されていない。これらのペイロードをＷＨＲ  ＬＵＺ１９中に操作して、幅広い宿主域を有するファージを更に操作してバイオフィルム分散活性を呈することが可能かどうか判定した。これらの結果は、Ｐｐ１５ｇｐ４４またはＳｅＰＳＭａをコードするＷＨＲ  ＬＵＺ１９が、そのバイオフィルム分散活性（図７Ｄ）と、Φ−ＫＭＶ属のウイルスに感受性である臨床単離物に全て感染する能力とを保持することを示している（図７Ｅ、７Ｆ）。
【０２７０】
これらのデータは、限定するものではないが、バイオフィルムの分散及び宿主域の特性などの複数の個別の改善されたウイルス特性を有するバクテリオファージを反復的に操作するシステムにおいて、本明細書に記載のインビトロ工学的方法がどのように使用できるかの例を提供するものである。
【０２７１】
実施例ＶＩＩ
抗生物質感受性化ペイロードを発現する操作されたウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、ｓｓＲＮＡウイルスＰＲＲ１及びＭＳ２に由来するリシンを発現するようにＬＵＺ１９を操作した。ＰＲＲ１（配列番号２０）またはＭＳ２（配列番号１９）ｓｓＲＮＡファージのいずれかに由来するリシンを主要カプシドプロモーターＰｇｐ３２（配列番号２１）及びターミネーターＴｇｐ３２（配列番号２２）を両端に配したＬＵＺ１９  ｇｐ４９座位（配列番号２５）に操作し、ファージに対する細菌耐性の発生を阻害する能力を判定した（図８Ａ）。これらのリシンは、細胞壁合成に重要な酵素に結合及び不活性化することによって細胞壁の新しい形成を阻害し、他の抗菌物質、特に細胞壁を標的とするカルベニシリンなどの抗生物質に対する細菌の感受性を高めると一般的に言われる。
【０２７２】
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して上記のとおりに構築物を作製した。操作したファージを適切な宿主細胞で増幅し、単離し、配列決定により検証した。カルベニシリン（１／５×ＭＩＣ）存在下でのファージ処理に対する細菌耐性の発現を阻害する操作されたファージの能力について、標準的なタイムキルアッセイで試験した（図８Ｂ、８Ｃ）。これらの結果は、阻害濃度以下（１／５×ＭＩＣ）のカルベニシリンと組み合わせたｓｓＲＮＡファージ由来のリシンを発現する操作されたＬＵＺ１９が、ファージ処理後の細菌の再成長を妨げることを示している。
【０２７３】
これらのデータは、改善されたウイルス特性、特にこの場合、細菌におけるファージ耐性発生の防止を有するウイルスを作製するための、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法の採用例を提供するものである。
【０２７４】
実施例ＶＩＩＩ
種特異的抗菌性タンパク質ペイロードを発現する操作されたウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来抗菌性タンパク質ＰｙｏＳ５を発現するようにＬＵＺ１９を操作した。バクテリオシンＰｙｏＳ５は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの１つの株によって産生される種特異的抗菌性タンパク質であり、競合するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株の成長を妨げる。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株のＰＡ０１  ｇＤＮＡを鋳型に使用してｐｙｏＳ５（配列番号６）をＰＣＲ増幅した後、主要カプシドプロモーターＰｇｐ３２（配列番号２１）及びターミネーターＴｇｐ３２（配列番号２２）を両端に配したＬＵＺ１９  ｇｐ４９座位（配列番号２５）にクローニングした（図９Ａ）。ＰｙｏＳ５は、広く分布しているピオケリン受容体ＦｐｔＡに結合した後、構造変化を起こし、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ膜中に孔を形成する。
【０２７５】
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して上記のとおりにＬＵＺ１９＋ｐｙｏＳ５を作製した。操作したファージを感受性宿主ＰＡ０１で増幅し、単離し、配列決定により検証した。実験室株ＰＡ０１はＰｙｏＳ５に耐性であることがわかっているため、分析には細菌株ＰＡ７４１６を選択したが、インシリコ解析では、ＭＤＲ  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株のＰＡ７４１６は、ファージＬＵＺ１９と、ＰｙｏＳ５受容体ＦｐｔＡをコードしたファージＬＵＺ１９の両方に感受性であることが示された。
【０２７６】
ファージ処理に対するＰＡ７４１６細菌耐性の発現を阻害する操作されたファージの能力について、標準的なタイムキルアッセイで試験した。これらの結果では、野生型ＬＵＺ１９は、初めはＰＡ７４１６の成長を阻害するものの、細菌が急速に耐性となり、８〜１２時間後には再成長が生じることを示している（図９Ｂ）。一方、操作されたＬＵＺ１９＋ｐｙｏＳ５は、ファージ処理後２４時間を超えて、ＰＡ７４１６細菌の再成長を阻害する（図９Ｃ、９Ｄ）。
【０２７７】
これらのデータは、改善されたウイルス特性、特にこの場合、細菌におけるファージ耐性発生の防止を有するウイルスを作製するための、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法の採用例を提供するものである。
【０２７８】
実施例ＩＸ
抗菌性産物を作製するためにバクテリオファージを反復的に操作するためのシステム
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用すれば、宿主株の広範な遺伝子操作を行うことなく、バクテリオファージゲノムを迅速に操作することができる。当業者によく知られているウイルス変異研究及び選択技術と、完全ゲノム配列決定、比較ゲノム解析及び本開示のインビトロ工学的方法とを組み合わせると、改善された新しい抗菌物質の開発のための改善された新しいシステムが創出される。このシステムは、１つのウイルス土台の１、２または２以上の別個の特性を反復的に改善して、ウイルス系抗菌物質を作製することに基づく。別個のウイルス特性を改善するＬＵＺ１９ゲノムの順次的な精製及び編集が開示されているが（図６、７及び１０）、この技術は、他の多数のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバクテリオファージまたは任意の他の細菌株もしくは細菌種に感染する他のバクテリオファージに拡大することができる。更に、この技術を使用して同じ細菌種に感染する多数の個々のバクテリオファージの特性を改善し、細菌感染、汚染を防止もしくは処理する優れたバクテリオファージカクテルを作製する、またはミクロビオームを変えることができる。
【０２７９】
これらのデータは、目的の改善されたウイルス特性を組み込むために、ゲノム配列決定、比較ゲノム解析及びウイルス変異／選択研究と組み合わせたインビトロ工学をどのように順次的に実施して、段階的改善または操作による変化を達成できるかを実証するものである（図１０）。
【０２８０】
実施例Ｘ
方法
ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などの市販のインビトロ転写キットを使用して、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を合成し、精製した。ガイドＲＮＡは、当該技術分野にてよく知られている方法を使用して設計した（図１５）。
【０２８１】
インビトロ転写されたｇＲＮＡを作業用ストック溶液５００ｎｇ／μＬに希釈する。
【０２８２】
Ｃａｓ９などの精製されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用せずに反応物をアセンブルする。Ｈｉｓタグ付きＣａｓ９（配列番号２７）をコードする遺伝子配列を含むプラスミドの発現と、よく知られているニッケルアフィニティー精製法による精製とにより、精製されたＣａｓ９（配列番号３１）を得た。任意に、反復的な消化のためにゲノムの最も内側の部分を初めに切断するｇＲＮＡを使用する。
完全な反応混合物：
2017537643.tif 000003
＊完全な反応混合物は、一度に多数の部位を切断する（同時消化）ための単一ステップで使用することができるが、ウイルスｇＤＮＡの切断効率が低くなる場合がある。同時消化反応物を氷上でアセンブルした後、Ｃａｓ９の添加及び３７℃で３０分間インキュベーションを行う。改変した２ステップ（またはそれ以上）反応も実施可能であり、この場合、より完全な消化が可能である（以下で概略する）。
＊＊１０×Ｃａｓ９緩衝液は、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１．５Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含有する。
ステップ１の反応物をアセンブルし、ＲＴで５分間インキュベートする。
ステップ１  反応混合物：
2017537643.tif 000004
【０２８３】
氷上で１０分間インキュベートする。
【０２８４】
３７℃で２分間インキュベートする。
【０２８５】
Ｃａｓ９酵素を４μｌ加える（０．４５ｍｇ／ｍｌ）。３７℃で３０分間インキュベートする。
【０２８６】
ステップ２の反応：第２のｇＲＮＡ及び追加のＣａｓ９酵素の添加。
ステップ２  反応混合物：
2017537643.tif 000005
【０２８７】
ステップ２の反応物を３７℃で３０分間インキュベートする。２つを超える位置でゲノムを消化するために、更なるステップを加えることができる。
【０２８８】
８０℃で１０分間インキュベートすることによって、Ｃａｓ９酵素を不活性化する。フェノールクロロホルム抽出（ギブソンアセンブリにおける断片アセンブリの効率を向上させる）、または当該技術分野においてよく知られている他の不活性化、失活化もしくは精製方法を使用した任意選択の精製。
【０２８９】
５μＬのサンプルをアガロースゲルに流し、適切な切断について検証する。
【０２９０】
ギブソンアセンブリを使用するインビトロアセンブリについては、ＮＥＢギブソンアセンブリプロトコルに従って、適切な濃度の消化物及びインビトロ作製したインサートＤＮＡを使用した。
【０２９１】
インビトロアセンブリ後、任意に、宿主細胞を形質転換し、操作されたゲノムを増幅し、ゲノムを分離するか、または操作されたウイルスを回収する。
【０２９２】
実施例ＸＩ
Ｅ．ｃｏｌｉファージＭ１３の操作
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に感染するウイルスを操作し、蛍光レポーターパプリカ（配列番号５）を発現するようにした。図１１Ａは、パプリカ蛍光タンパク質遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１３ファージゲノムに組み込むためのインビトロ工学的アプローチの概略図を示している。この工学的プロセスは、改善されたウイルス特性を構成するものとして、蛍光レポーターを発現する溶原性ファージを生じるように設計した。これは、類似のウイルスが診断剤として使用されているからである。ウイルス粒子からＭ１３ウイルスゲノム（アクセッション番号Ｘ０２５１３）を単離した。この実験設計は２つのｇＲＮＡの使用を伴うため、個別のインビトロＣａｓ９消化反応において、個々のｇＲＮＡの機能をまず確認した（図１１Ｂ）。各ｇＲＮＡが機能的であることが判明したら、ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼ及び両方のインビトロ転写されたｇＲＮＡを使用して部位特異的消化を実施した（図１１Ｃ）。蛍光レポーター遺伝子であるパプリカ（配列番号２９）は、ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼ消化、例えば、Ｃａｓ９を使用してＭ１３ゲノムから分離したＬａｃＺａ遺伝子の両端に位置する配列に相同な５’及び３’配列を付加したプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅した（図１１Ｄ）。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したＭ１３ゲノムにＰＣＲ増幅したパプリカ遺伝子をシームレスに組み込み、ＬａｃＺａ遺伝子（配列番号２８）に置き換えた。操作したゲノムでＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を直接形質転換し、パプリカ遺伝子をコードする機能性ウイルス粒子を得た。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラーク形成の能力によって、操作したファージを評価した（図１１Ｅ）。プラークからウイルスＤＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅して、挿入したパプリカ遺伝子の存在を確認した（図１１Ｆ）。組換えパプリカタンパク質の存在及び機能を蛍光イメージングによって確認した（図１１Ｇ）。
【０２９３】
これらのデータは、レポーター遺伝子をＥ．ｃｏｌｉファージゲノムに操作する、本明細書に記載のインビトロ工学的方法の成功した使用を実証するものである。本開示の方法を、別の細菌属に感染するものを含む、別のウイルス属に拡大できることが示されている。
【０２９４】
実施例ＸＩＩ
Ｅ．ｃｏｌｉファージλの操作
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに感染する第２のウイルスを編集した。図１２Ａは、単離されたλファージゲノム（アクセッション番号ＮＣ＿００１４１６．１）からｃｌｌ遺伝子（配列番号３０）を欠失させるためのインビトロ工学的アプローチの概略図を示している。この工学的プロセスは、改善されたウイルス特性を構成するものとして、構成的に溶菌性ウイルスを生じるように設計した。ウイルス粒子からλウイルスゲノムを単離した。この実験設計は２つのｇＲＮＡの使用を伴うため、個別のインビトロＣａｓ９消化反応において、個々のｇＲＮＡの機能をまず確認した（図１２Ｂ）。各ｇＲＮＡが機能的であることが判明したら、ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼ及び両方のインビトロ転写されたｇＲＮＡを使用して部位特異的消化を実施した（図１２Ｃ）。単離したλウイルスゲノム中のＣａｓ９に標的化された切断部位の両端に位置する配列に相同な５’及び３’配列を含む二本鎖ＤＮＡ修復鋳型（配列番号９）を作製するために、合成した２つの一本鎖ＤＮＡ分子をインビトロでアニーリングした。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したλゲノムにＰＣＲ増幅した修復鋳型をシームレスに組み込んだ。次いで、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅのＭａｘｐｌａｘラムダパッケージング抽出キットを製造業者の方法に従って使用して、操作したゲノムをインビトロでパッケージングした（図１２Ｄ）。インビトロパッケージング後、製造業者推奨のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用した二重寒天プラークアッセイから、操作したλゲノムを回収した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラーク形成能力に基づいて、操作したファージが機能的であるかを判定した。形成されたプラークからウイルスＤＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅して、ｃｌｌ遺伝子がないことを確認した（図１２Ｅ）。
【０２９５】
これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉファージゲノムから望ましくない遺伝子を除去する、本明細書に記載のインビトロ工学的方法の成功した使用を実証するものである。これらのデータはまた、操作されたウイルスゲノムのインビトロパッケージングの例を提供するものであり、これにより、ウイルス回収効率が向上し、宿主細胞への直接形質転換の代替法がもたらされる。更に、これらのデータは、アニーリングしたインビトロ合成オリゴヌクレオチドを工学用インサートとして利用する例を提供するものである。また、これらのデータは、改善されたウイルス特性、すなわち、構成的に溶菌性の表現型を生じるようにファージゲノムを操作する、本アプローチの別の利用例を提供するものである。最後に、これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉに感染する第２のウイルス属を、記載のインビトロ工学的方法を使用して操作できることを示すものである。
【０２９６】
実施例ＸＩＩＩ
ヒトＣＭＶのエラー修正
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、ヒトウイルスの一部を編集した。図１３Ａは、エラー修正に利用されるインビトロ工学的アプローチの概略図を示す。約２３０ｋｂのＨＣＭＶウイルスゲノムのうちの１８ｋｂのサブセクションをＥ．ｃｏｌｉ複製プラスミド中に入れた。ＨＣＭＶゲノム（配列番号１０）のこのサブセクションは、ウイルスゲノムの開始点を含み、ＲＬ１３変異アレル（配列番号３３）を有する。ＨＣＭＶ断片とＥ．ｃｏｌｉプラスミドを合わせると、ほぼ２８ｋｂの大きさであった。これは現在のほとんどのエラー修正技術の仕様を上回る大きさである。エラー修正のために、Ｅ．ｃｏｌｉから２８ｋｂのプラスミドを単離し、ＲＮＡ依存型ヌクレアーゼ及びインビトロ転写された２つのｇＲＮＡを使用して部位特異的消化を実施した（図１３Ｂ）。Ｃａｓ９による消化により、変異部位の直上流及び下流のＲＬ１３遺伝子領域を切断した。ＲＬ１３遺伝子（配列番号３２）の修正済み領域を合成し、それぞれのＲＮＡ特異的Ｃａｓ９消化部位に隣接する領域に相同な追加の５’及び３’フランキング配列を含めてＰＣＲ増幅した（図１３Ｃ）。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したプラスミドに合成した修復鋳型をシームレスに組み込んだ。次いで、プラスミド中に含まれる修正したＲＬ１３を含有するＨＣＭＶ断片（配列番号１１）によりＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、抗生物質含有培地で回収した。Ｅ．ｃｏｌｉコロニーをＰＣＲによってスクリーニングし、修正したＲＬ１３遺伝子の存在を確認した。修正したＲＬ１３遺伝子は、エラー含有ＲＬ１３遺伝子と比較して付加配列を含有しているため、エラー含有ＲＬ１３遺伝子との区別が可能であった（図１３Ｄ）。次いで、下流用途での後の使用のために、標準的技術を使用して、エラー修正したゲノム断片をＥ．ｃｏｌｉ中で増幅した。
【０２９７】
これらのデータは、ヒト特異的ウイルスゲノムの遺伝子を操作する、本明細書に記載のインビトロ工学的方法の成功した使用を実証するものであり、更に、インビトロアセンブリ反応に修復鋳型として合成ＤＮＡを使用する方法も提供する。これらのデータはまた、標準的なエラー修正技術には大きすぎるＤＮＡまたはプラスミドのエラー修正のための本インビトロ工学的方法の使用を実証するものである。標準的なエラー修正技術は、約５ｋｂのサイズ制限があり、ＰＣＲに基づくため、本質的に、望ましくないエラーをより多く生じる可能性がある。本明細書に記載のインビトロ工学的方法は、プラスミドまたはウイルスゲノムの全部または更に大きい部分のＰＣＲ増幅に依存しないため、５ｋｂの大きさを超える配列のエラー修正用途に適用できる。
【０２９８】
実施例ＸＩＶ
末端が重複しているウイルス末端の迅速な特定
本明細書で開示されるインビトロ消化法はまた、末端重複ウイルスゲノムの正確な末端を特定するのにも採用できる。図１４は、ＬＢＬ３及び１４−１ファージゲノムの末端を決定するために使用したインビトロ消化アプローチの概略図を示している。ＬＢＬ３及び１４−１（アクセッション番号ＮＣ＿０１１７０３．１）ファージゲノムＤＮＡをウイルス粒子から精製した（図１４Ａ）。ＭｉＳｅｑまたはＰａｃＢｉｏプラットフォームを使用して次世代シーケンシングを実施し、続いて、元の配列を再構築するために高品質ＤＮＡリードをより長いアセンブリに自動マージした（図１４Ｂ）。通常、自動アセンブリソフトウェアは、ウイルスまたはバクテリオファージゲノムを環状コンティグに誤ってアセンブルし、末端反復ゲノムのＤＴＲをウイルス配列の内側領域に配置する。ダブルカバレッジシーケンシング領域の特定と、密接に関連する末端反復ゲノムにマッチするＢＬＡＳＴの検索結果とに基づいて、物理的ゲノム末端のインシリコ予測を実施する（図１４Ｃ）。これらの予測末端をＣａｓ９エンドヌクレアーゼ切断によって確認した。Ｃａｓ９不活性化の後、ゲノム物理的末端に該当するＤＮＡ断片を精製し、配列決定した（図１４Ｄ）。これらのシーケンシング結果は、真の物理的末端配列に基づく正確なゲノムアセンブリをもたらした（図１４Ｅ）。
【０２９９】
ファージゲノムシーケンシングに付随する最大の技術的課題の１つは、その反復性に起因するゲノム物理的末端の正確なマッピングである。これらのセグメントは、循環置換ゲノムにおける４〜１４ｂｐ（例えば、ほとんどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及び、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）ファージ）から、末端反復ゲノムにおける数百塩基対（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのΦＫＭＶ様、ＰＢ１様及びＮ４様ファージ属）、更には数千塩基対（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ５及びＤＴＲ）までに及び得る。反復末端（またはＤＴＲ−定方向末端反復配列）のマッピングは、現在、綿密な配列解析（ダブルカバレッジＤＮＡ断片を特定するため）、プライマーウォーキング（サンガー配列決定）、主要ＤＮＡニックの特定及び制限エンドヌクレアーゼ分析の組み合わせによって実施されている。しかしながら、これらの各アプローチは、（ｉ）ＮＧＳデータ内でダブルシーケンシングカバレッジ境界の定義が不十分であること、（ｉｉ）ＤＴＲコンカテマーによるプライマーウォーキングの読み取りは不確定な結果をもたらすこと、（ｉｉｉ）ファージ末端近傍に制限部位が存在する可能性が低いことまたはメチル化などのＤＮＡ修飾によって制限部位が妨害されることに起因して、使用が制限されることが多く、または決定的でない。特定位置におけるファージＤＮＡの標的化されたＣａｓ９切断を使用すると、信頼性のないまたは煩わしい解析または手順の必要性がなくなり、ファージゲノムの物理的末端の特定が大幅に簡略化される。このアプローチは、既に配列決定されたファージゲノムの末端の正確なマッピング（ＬＢＬ３及び１４−１ＤＴＲのマッピングによって例示されるとおり）のみならず、新しく特定されたウイルスのＤＴＲの迅速な特定の可能性も有する。
【０３００】
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法中の標的化されたＣａｓ９消化を使用した末端反復ファージゲノムの物理的末端のマッピングは、シーケンシングカバレッジにおける微妙な変化に依存せず、コンカテマー形成に関係なく実施できるので、現在のアプローチにまさる独自の利点を示すものである。加えて、Ｃａｓ９活性は、多数の制限酵素に比べて、ＤＮＡ改変の影響を受けにくい。
【０３０１】
これらのデータは、真のファージゲノム配列配置の特定を可能にする、ＲＮＡ誘導型インビトロＣａｓ９切断の成功した使用を示すものである。次いで、この情報を使用して、これらのファージを操作するための下流のインビトロ工学的アプローチを設計することができる。これは、真のゲノム境界を欠くために以前では不可能であった偉業である。
【０３０２】
実施例ＸＶ
インビボアセンブリを用いる工学的方法
本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用して、精製されたウイルス核酸を部位特異的に消化し、消化されたウイルス核酸へのＤＮＡまたはＲＮＡ断片の挿入によって、操作された核酸をアセンブルするインビトロ法を提供する。本明細書に開示の精製された酵素を活用することによって、組換え核酸を完全にインビトロでアセンブルすることができるが、感受性の宿主株内の天然または操作された組換え経路を活用することによって、このプロセスを達成することもできる。組換えウイルスゲノムをインビボでアセンブルするには、一部の宿主細胞では、末端相同領域を有する挿入用修復断片とともに、精製されインビトロ消化されたウイルスゲノムで形質転換するだけで十分である。挿入用修復断片は、当該技術分野において知られている標準的技術によって合成または増幅してもよいし、選択された宿主細胞内で安定的に複製されるプラスミド中にあってもよい。この方法は、宿主細胞が相同及び非相同の両方のＤＮＡ修復経路を持つこと、十分な量のインサート及び消化されたゲノムを宿主細胞に一緒に送達するという課題、ならびにほとんどの宿主の相同組換え経路が低効率であることから、インビトロアセンブリよりも低効率になる可能性がある。宿主による組換えのない消化されたゲノム単独では機能性ウイルス粒子及び後続のプラークを形成しないので、形質転換及び平板培養後に得られたプラークを所定のインサートについてＰＣＲによってスクリーニングし、操作された所望のウイルス核酸の正しいアセンブリを確認することができる。
【０３０３】
実施例ＸＶＩ
本明細書に開示の操作されたウイルス
表１は、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法によって作製された、操作されたウイルスについてまとめたものである。表２は、本明細書で開示される操作されたウイルスについて、対応する実施例及び図と合わせてまとめたものである。表３は、本明細書で開示される野生型ウイルスと、その完全ゲノム配列のアクセッション番号の一覧である。表４は、本明細書で開示される野生型核酸配列の一部と、その対応するアミノ酸配列の一覧である。
【０３０４】
（表１）本明細書に開示の操作されたウイルス
2017537643.tif 000006
2017537643.tif 000007
2017537643.tif 000008
ＰＭ−点変異、Ｒｅｐｌａｃｅ−置換、Ｄｅｌｅｔｅ−欠失、Ｉｎｓｅｒｔ−挿入
【０３０５】
（表２）本明細書に開示の操作されたウイルス
2017537643.tif 000009
ＰＯＣ−概念実証
【０３０６】
（表３）本明細書に開示の野生型ウイルス
2017537643.tif 000010
【０３０７】
（表４）本明細書に開示の野生型配列
2017537643.tif 000011
【０３０８】
当業者であれば、前述の説明から、本開示の本質的な特徴を容易に見定めることができ、本開示の変更及び改変をその趣旨及び範囲から逸脱することなく行い、種々の用途及び条件に適合させ、本開示を最大限に活用することができる。前述の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる場合であれ本開示の範囲を限定するものではない。上記及び図面にて引用される全ての出願、特許及び公開物（参照マニュアルを含む）の全開示は、参考としてその全体を本明細書に援用する。
【０３０９】
配列表
配列番号１
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖ様ウイルス属（Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ）  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ１３
2017537643.tif 000012
配列番号２
ＤＮＡ
属／種− Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型 ＬＵＺ１９  ｇｐ３８
2017537643.tif 000013
配列番号３
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ４０
2017537643.tif 000014
配列番号４
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ３４
2017537643.tif 000015
配列番号５
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９ Ｇｐ３４タンパク質
2017537643.tif 000016
配列番号６
ＤＮＡ
属／種−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
記述表題− ＰｙｏＳ５配列
2017537643.tif 000017
配列番号７
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ ＬＫＤ１６
記述表題−ＬＫＤ１６  ｇｐ１８付加配列
2017537643.tif 000018
配列番号８
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ ｐｈｉ-ＫＦ７７
記述表題−ΦＫＦ７７  ｇｐ７付加配列
2017537643.tif 000019
配列番号９
ＤＮＡ
属／種−ラムダ様ラムダ
記述表題−Ｅ． ｃｏｌｉファージλ ｃＩＩ
2017537643.tif 000020
配列番号１０
ＤＮＡ
属／種−サイトメガロウイルスＨＣＭＶ
記述表題−ＨＣＭＶ断片編集前
2017537643.tif 000021
2017537643.tif 000022
2017537643.tif 000023
2017537643.tif 000024
2017537643.tif 000025
配列番号 １１
ＤＮＡ
属／種−サイトメガロウイルスＨＣＭＶ
記述表題−ＨＣＭＶ断片編集後
2017537643.tif 000026
2017537643.tif 000027
2017537643.tif 000028
2017537643.tif 000029
2017537643.tif 000030
配列番号 １２
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＫＡ１
記述表題−ＬＫＡ１  ｇｐ４９配列
2017537643.tif 000031
配列番号 １３
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１
記述表題−ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１  ｇｐ３４
2017537643.tif 000032
配列番号 １４
ＤＮＡ
属／種−Ｔ７様Ｐｐ１５
記述表題−Ｐｐ１５  ｇｐ４４付加配列
2017537643.tif 000033
配列番号 １５
ＤＮＡ
属／種−Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
記述表題−ｄｓｐＢ付加配列
2017537643.tif 000034
配列番号 １６
ＤＮＡ
属／種−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
記述表題−ＳａＰＳＭａ３付加配列
2017537643.tif 000035
配列番号 １７
ＤＮＡ
属／種−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
記述表題−ＳａＰＡＭｂ２付加配列
2017537643.tif 000036
配列番号 １８
ＤＮＡ
属／種−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
記述表題−ＳｅＰＳＭａ付加配列
2017537643.tif 000037
配列番号 １９
ＤＮＡ
属／種−レビウイルスＭＳ２
記述表題−ＭＳ２ Ｌ付加配列
2017537643.tif 000038
配列番号２０
ＤＮＡ
属／種−レビウイルスＰＲＲ１
記述表題−ＰＲＲ１  Ｌ付加配列
2017537643.tif 000039
配列番号２１
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ   ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  ｇｐ３２プロモーター（Ｐ３２）
2017537643.tif 000040
配列番号２２
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ   ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  ｇｐ３２ターミネーター（Ｔ３２）
2017537643.tif 000041
配列番号２３
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ７領域
2017537643.tif 000042
配列番号２４
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ１８領域
2017537643.tif 000043
配列番号２５
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ４９及びｇｐ４８−ｇｐ４９遺伝子間領域
2017537643.tif 000044
配列番号２６
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＫＤ１６
記述表題−野生型ＬＫＤ１６  ｇｐ１８遺伝子
2017537643.tif 000045
配列番号２７
ＤＮＡ
合成（人工／未知）
記述表題−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９−Ｈｉｓをコードする遺伝子
2017537643.tif 000046
配列番号２８
ＤＮＡ
属／種−イノウイルスＭ１３ＭＰ１８
記述表題−野生型M13MP18置換配列
2017537643.tif 000047
配列番号２９
ＤＮＡ
未知／人工−ＤＮＡ２．０から市販
記述表題−パプリカ配列
2017537643.tif 000048
配列番号３０
ＤＮＡ
属／種−ラムダ様ラムダ
記述表題−野生型Ｅ．  ｃｏｌｉファージλ  ｃＩＩ配列
2017537643.tif 000049
配列番号３１
タンパク質
合成（人工／未知）
記述表題−配列番号２７から翻訳されたＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９−Ｈｉｓ
2017537643.tif 000050
配列番号３２
ＤＮＡ
属／種−サイトメガロウイルスＨＣＭＶ
記述表題−ＨＣＭＶ  ＲＬ１３断片編集後
2017537643.tif 000051
配列番号３３
ＤＮＡ
属／種−サイトメガロウイルスＨＣＭＶ
記述表題−ＨＣＭＶ  ＲＬ１３断片編集前
2017537643.tif 000052
配列番号３４
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  Ｇｐ１３タンパク質配列
2017537643.tif 000053
配列番号３５
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ LUZ19
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  Ｇｐ３８タンパク質配列
2017537643.tif 000054
配列番号３６
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−野生型ＬＵＺ１９  Ｇｐ４０タンパク質配列
2017537643.tif 000055
配列番号３７
タンパク質
属／種−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
記述表題−ＰｙｏＳ５タンパク質配列
2017537643.tif 000056
配列番号３８
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＫＤ１６
記述表題−ＬＫＤ１６  Ｇｐ１８タンパク質配列
2017537643.tif 000057
配列番号３９
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＫＡ１
記述表題−ＬＫＡ１  Ｇｐ４９タンパク質配列
2017537643.tif 000058
配列番号４０
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１
記述表題−ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１  Ｇｐ３４タンパク質配列
2017537643.tif 000059
配列番号４１
タンパク質
属／種−Ｔ７様Ｐｐ１５
記述表題−Ｐｐ１５  Ｇｐ４４タンパク質配列
2017537643.tif 000060
配列番号４２
タンパク質
属／種−Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
記述表題−ＤｓｐＢタンパク質配列
2017537643.tif 000061
配列番号43
タンパク質
属／種−Staphylococcus aureus
記述表題−SaPSMa3タンパク質配列
2017537643.tif 000062
配列番号４４
タンパク質
属／種−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
記述表題−ＳａＰＡＭｂ２タンパク質配列
2017537643.tif 000063
配列番号４５
タンパク質
属／種−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
記述表題−ＳｅＰＳＭａタンパク質配列
2017537643.tif 000064
配列番号４６
タンパク質
属／種−レビウイルスＭＳ２
記述表題−ＭＳ２  Ｌタンパク質配列
2017537643.tif 000065
配列番号４７
タンパク質
属／種−レビウイルスＰＲＲ１
記述表題−ＰＲＲ１  Ｌタンパク質配列
2017537643.tif 000066
配列番号４８
タンパク質属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  Ｇｐ１８タンパク質配列
2017537643.tif 000067
配列番号４９
タンパク質
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  Ｇｐ４９タンパク質配列
2017537643.tif 000068
配列番号５０
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  ｇｐ１８遺伝子配列
2017537643.tif 000069
配列番号５１
ＤＮＡ
属／種−Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９
記述表題−ＬＵＺ１９  Ｇｐ４９タンパク質配列
2017537643.tif 000070
【図１】
2017537643.tif 000071
【図２】
2017537643.tif 000072
【図３】
2017537643.tif 000073
【図４】
2017537643.tif 000074
【図５】
2017537643.tif 000075
【図６】
2017537643.tif 000076
【図７】
2017537643.tif 000077
【図８】
2017537643.tif 000078
【図９】
2017537643.tif 000079
【図１０】
2017537643.tif 000080
【図１１】
2017537643.tif 000081
【図１２】
2017537643.tif 000082
【図１３】
2017537643.tif 000083
【図１４】
2017537643.tif 000084
【図１５】
2017537643.tif 000085
【配列表】
2017537643000001.app
【国際調査報告】
2017537643.tif 000086
2017537643.tif 000087
2017537643.tif 000088
2017537643.tif 000089
2017537643.tif 000090