(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍の処置に関する。特に、本発明は、Ｅ６／Ｅ７融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを使用して、子宮頸部腫瘍処置を改善するための方法及びＨＰＶ感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍を処置するための方法を提供する。子宮頸部腫瘍の処置において、該処置を必要とする対象に使用するための融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸部腫瘍の処置において、該処置を必要とする対象に使用するための融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物であって、該対象は、該組成物を必要とする対象に対する第１の用量の該組成物の投与を受け、かつ、第２の用量の該組成物の投与を受け、該対象は、該第１の用量の投与後の測定において、亢進した細胞性免疫応答を示し、該融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
該融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、該融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、組成物。
【請求項２】
前記対象における前記細胞性免疫応答は、前記第２の用量の投与後に測定された、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記対象は、第３の用量の前記組成物の投与を受ける、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記第１の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記第２の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記第１の用量及び前記第２の用量は、同一か又は異なる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記第１の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇであり、前記第２の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記亢進した細胞性免疫応答は、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答、亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答、亢進したサイトカイン分泌、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記亢進した細胞性免疫応答は、多機能性Ｔ細胞数の増加を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記多機能性Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、ＣＤ１０７ａ／ｂ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、少なくとも３種類、少なくとも４種類、又は少なくとも５種類のマーカーを示す、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記多機能性Ｔ細胞数は、前記ポリヌクレオチドの前記投与前の多機能性Ｔ細胞数より、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％増加する、請求項９又は１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、ＣＤ１０７ａ／ｂ、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を含む、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞数における、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍の増加である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞の増殖を含む、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞数における、少なくとも約１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、又は４．０倍の増加である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記亢進した細胞性免疫応答は、亢進したＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ応答を含む、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記亢進したサイトカイン発現は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＨＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記ＩＦＮ−γの発現は、前記投与前のレベルに対して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍亢進される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記ＩＬ−２の発現は、前記投与前のレベルに対して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍亢進される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記ＴＮＦ−αの発現は、前記投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍亢進される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
ＩＬ−４又はＩＬ−１７ａの発現が、前記投与後に亢進されない、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
前記子宮頸部腫瘍は、良性腫瘍又は悪性腫瘍である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記子宮頸部腫瘍は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、すりガラス細胞癌、絨毛腺癌（ＶＧＡ）、非癌性悪性腫瘍、メラノーマ、リンパ腫、又は子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
前記融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は８つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２６】
前記融合たんぱく質は、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２９】
前記異種ポリペプチドは、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（「ＦＬＴ３Ｌ」）又はその一部を含む、請求項２８に記載の使用のための組成物。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３１】
前記シグナルペプチドは、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のシグナルペプチド、ヘルペス単純ウイルス糖たんぱく質Ｄ（ＨＳＶ  ｇＤ）のシグナルペプチド、成長ホルモンのシグナルペプチド、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３０に記載の使用のための組成物。
【請求項３２】
前記シグナルペプチドは、ｔＰＡのシグナルペプチドである、請求項３１に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドは、ベクターである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡワクチンである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍の処置に関する。特に、本発明は、子宮頸部腫瘍処置を改善するための方法及びＨＰＶ感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍を処置するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
持続性のウイルス感染は、多くの場合、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の機能不活性化を誘引し、これにより、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖能力、免疫刺激性サイトカイン生成能力、ウイルス感染細胞の溶解能力が損なわれる（Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ，Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：５５３５〜５５４５，２００４）。子宮頸癌は、世界の女性における癌による死亡の主因の１つであり（Ｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ９：３４７〜３５６（２００９）；Ｐａｒｋｉｎ  Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｒａｙ，Ｆ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４（３Ｓ）：１１〜２５，２００７）、その症例の約７５％は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８と呼ばれる、最も一般的な高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型による持続性感染により引き起こされる（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：８９０〜９０７，２００７；Ｆｏｒｍａｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（５Ｓ）：Ｆ１２〜２３，２０１２）。ＨＰＶによる持続感染は、通常、実証可能なＨＰＶ特異的Ｔ細胞免疫の欠落に関連し、前悪性及び悪性患者において見られるウイルス特異的Ｔ細胞は、概ね機能不全であるか、場合によっては抑制的でさえあることが報告されている（ｄｅ  Ｖｏｓ  ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｗｉｊｋ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：７１８８〜７１９５  ２００８；Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ５９：７９９〜８０３，２０１０）。これらの知見から、ウイルス特異的Ｔ細胞の機能障害が、ＨＰＶ誘引子宮頸癌の発生に関連している可能性があることが示唆される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ，Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：５５３５〜５５４５，２００４
【非特許文献２】Ｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ９：３４７〜３５６（２００９）
【非特許文献３】Ｐａｒｋｉｎ  Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｒａｙ，Ｆ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４（３Ｓ）：１１〜２５，２００７
【非特許文献４】Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：８９０〜９０７，２００７
【非特許文献５】Ｆｏｒｍａｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（５Ｓ）：Ｆ１２〜２３，２０１２
【非特許文献６】ｄｅ  Ｖｏｓ  ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｗｉｊｋ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：７１８８〜７１９５  ２００８
【非特許文献７】Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ５９：７９９〜８０３，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
子宮頸癌は、高リスクなＨＰＶ感染、ウイルスの持続感染、持続感染細胞のクローン増殖及び前悪性病変への分化、そして、それらの漸進的な浸潤癌への変化という経過をたどって発症する（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：８９０〜９０７，２００７）。前悪性の子宮頸部上皮内腫瘍２及び３（ＣＩＮ２及び３）、特に、ＨＰＶ１６陽性のものは、高悪性度病変と考えられ、浸潤癌に進行する約３０％の確率を有する（Ｍｏｓｃｉｃｋｉ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（５Ｓ）：Ｆ２４〜３３，２０１２）。したがって、持続性ＨＰＶ感染の重篤な合併症を予防し、ＨＰＶ関連腫瘍を根絶することができる、効果的な治療ワクチンに対する喫緊の必要性が存在する。
ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７はそれぞれ、腫瘍抑制たんぱく質であるｐ５３及び網膜芽細胞腫（ｐＲｂ）に結合し、これらの分解を促進することにより、ウイルス性癌たんぱく質として作用する（Ｙｕｇａｗａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９：９７〜１１３，２００９）。これらのウイルス性癌たんぱく質は、ＣＩＮ２／３及び子宮頸癌に対する治療ワクチンについてのターゲットの理想的なセットであるが、それは、これらのたんぱく質が、腫瘍形成を誘引するためだけでなく、ＨＰＶに感染した前悪性細胞及び悪性細胞において構成的に発現されるためでもある（Ｙｕｇａｗａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９：９７〜１１３，２００９）。子宮頸病変の退縮が、体液性ではなく、細胞性免疫応答の存在に関連するため（Ｄｅｌｉｇｅｏｒｏｇｌｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ２０１３：５４０８５０，２０１３；Ｗｏｏ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  １２６：１３３〜１４１，２０１０）、ロバストなＥ６／Ｅ７特異的Ｔ細胞免疫を選択的に誘引可能な治療ワクチンが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、子宮頸部腫瘍を除去するための外科手術を必要としない対象を特定するための方法であって、有効量の、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、対象は、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法に関する。具体的な実施形態では、本明細書で記載される方法は、投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを更に含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、医療提供者に、投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを命じることを更に含んだ。
【０００６】
また、外科手術をすることなく子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、この融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、対象は、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示し、細胞性免疫応答は、投与後に少なくとも２倍亢進され、子宮頸部腫瘍が、外科手術をすることなく、対象から除去される、方法も開示される。
【０００７】
更に、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定することとを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【０００８】
更に、子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）医療提供者に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を対象に行うように命じることと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【０００９】
また、子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）融合たんぱく質の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｃ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法も提供される。一部の実施形態では、対象を特定することは、亢進した細胞性免疫応答を測定することを含む。
【００１０】
また、子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法も開示される。
【００１１】
更に、対象における子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【００１２】
また、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法も開示される。
【００１３】
更に、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、２つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【００１４】
一部の実施形態では、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）処置を必要とする対象から得られた血液サンプルを、ＨＬＡ型を特定するために供することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。一部の実施形態では、対象は、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示す。
【００１５】
また、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）対象が第１の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す場合に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に更に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法も開示される。
【００１６】
更に、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）第１の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。また、第２の用量の投与後に、細胞性免疫応答を測定することを更に含む、本明細書で記載される方法も開示される。更に、第３の用量のポリヌクレオチドを投与することを更に含む、本明細書で記載される方法が開示される。
【００１７】
特定の実施形態では、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）対象が第１の用量又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す場合に、第３の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に更に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【００１８】
更に、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量又は第２の用量の投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）対象が第１又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す場合に、第３の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法が開示される。
【００１９】
更に、全身性ＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、それを必要とする対象において亢進させる方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質が、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質が、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、方法が開示される。
【００２０】
更に、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、有効量のこの医薬組成物を投与した後に細胞性免疫応答が亢進されない場合に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を行うことに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キットが開示される。
【００２１】
また、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、初期量のポリヌクレオチドの投与後に多機能性Ｔ細胞数の増加を示す対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キットも開示される。
【００２２】
更に、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キットが開示される。
【００２３】
また、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、初期量のポリヌクレオチドの投与後に多機能性Ｔ細胞数の増加を示す対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キットも開示される。
【００２４】
更に、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、対象への、この医薬組成物の１回の投与又は２回の投与が亢進した細胞性免疫応答を示さない場合、この医薬組成物の更なる投与を中止することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キットが開示される。
【００２５】
実施形態
実施形態（Ｅ）１．子宮頸部腫瘍を除去するための外科手術を必要としない対象を特定するための方法であって、有効量の、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、対象は、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ２．投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを更に含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．医療提供者に、投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを命じることを更に含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４．外科手術をすることなく子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、対象は、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示し、細胞性免疫応答は、投与後に少なくとも２倍亢進され、子宮頸部腫瘍が、外科手術をすることなく、対象から除去される、方法。
Ｅ５．子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定することとを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ６．子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）医療提供者に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を対象に行うように命じることと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ７．子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）融合たんぱく質の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｃ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ８．対象を特定することは、亢進した細胞性免疫応答を測定することを含む、実施形態Ｅ５〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９．子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象集団に行う方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１０．子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１１．子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有し、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１２．子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、２つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１３．子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）処置を必要とする対象から得られた血液サンプルを、ＨＬＡ型を特定するために供することと、（ｂ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１４．対象が、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示す、実施形態Ｅ９〜Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを、更に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１６．子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）第１の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ１７．第２の用量の投与後に、細胞性免疫応答を測定することを更に含む、実施形態Ｅ１５又はＥ１６に記載の方法。
Ｅ１８．第３の用量のポリヌクレオチドを投与することを更に含む、実施形態Ｅ１５〜Ｅ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９．子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第３の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に更に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ２０．子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量又は第２の用量の投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）対象が第１又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す場合に、第３の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に投与することと、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、方法。
Ｅ２１．第１の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである、実施形態Ｅ１５〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２．第２の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである、実施形態Ｅ１５〜Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．第１の用量及び第２の用量は、同一か又は異なる、実施形態Ｅ１５〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２４．第３の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである、実施形態Ｅ１８〜Ｅ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．第１の用量、第２の用量、及び第３の用量が同一である、実施形態Ｅ１８〜Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２６．第１の用量、第２の用量、及び第３の用量が異なる、実施形態Ｅ１８〜Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２７．第１の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである、実施形態Ｅ１５〜Ｅ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２８．第３の用量が、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである、実施形態Ｅ１８〜Ｅ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２９．第１の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇである、実施形態Ｅ１５〜Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３０．第３の用量が、約１ｍｇ〜約４ｍｇである、実施形態Ｅ１８〜Ｅ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３１．第１の用量が、約１ｍｇであり、第２の用量が、約１ｍｇであり、第３の用量が、約１ｍｇである、実施形態Ｅ３０に記載の方法。Ｅ
Ｅ３２．第１の用量が、約２ｍｇであり、第２の用量が、約２ｍｇであり、第３の用量が、約２ｍｇである、実施形態Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３３．第１の用量が、約４ｍｇであり、第２の用量が、約４ｍｇであり、第３の用量が、約４ｍｇである、実施形態Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３４．亢進した細胞性免疫応答は、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答、亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答、亢進したサイトカイン分泌、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態Ｅ１〜Ｅ８及びＥ１４〜Ｅ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３５．亢進した細胞性免疫応答は、多機能性Ｔ細胞数の増加である、実施形態Ｅ１〜Ｅ８及びＥ１４〜Ｅ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３６．多機能性Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、及びＣＤ１０７ａ／ｂから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのマーカーを示す、実施形態Ｅ１〜Ｅ８及びＥ１４〜Ｅ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３７．多機能性Ｔ細胞数は、ポリヌクレオチドの投与前の多機能性Ｔ細胞数より、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％増加する、実施形態Ｅ３５又はＥ３６に記載の方法。
Ｅ３８．亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、ＣＤ１０７ａ／ｂ、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、実施形態Ｅ３４に記載の方法。
Ｅ３９．亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を含む、実施形態Ｅ３４に記載の方法。
Ｅ４０．亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞数における、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍の増加である、実施形態Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４１．亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答が、フローサイトメトリーにより測定される、実施形態Ｅ３４〜Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４２．亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞の増殖を含む、実施形態Ｅ３４〜Ｅ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４３．亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞数における、少なくとも約１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、又は４．０倍の増加である、実施形態Ｅ３４〜Ｅ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４４．亢進した細胞性免疫応答は、亢進したＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ応答を含む、実施形態Ｅ３４〜Ｅ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４５．ＩＦＮ−γ応答は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定される、実施形態Ｅ４４に記載の方法。
Ｅ４６．亢進したサイトカイン発現は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＨＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、実施形態Ｅ３４〜Ｅ４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４７．ＩＦＮ−γの発現は、前記投与前のレベルに対して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍亢進される、実施形態Ｅ４６に記載の方法。
Ｅ４８．ＩＬ−２の発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍亢進される、実施形態Ｅ４６に記載の方法。
Ｅ４９．ＴＮＦ−αの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍亢進される、実施形態Ｅ４６に記載の方法。
Ｅ５０．ＩＬ−４又はＩＬ−１７ａの発現が、投与後に亢進されない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５１．第２の用量が、第１の用量の、少なくとも約１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、又は１５週間後に投与される、実施形態Ｅ１５〜Ｅ５０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５２．第３の用量が、第２の用量の、少なくとも約１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、又は１５週間後に投与される、実施形態Ｅ１８〜Ｅ５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５３．ポリヌクレオチドが、エレクトロポレーションにより投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５４．子宮頸部腫瘍は、良性腫瘍又は悪性腫瘍である、実施形態Ｅ１〜Ｅ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５５．子宮頸部腫瘍は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、すりガラス細胞癌、絨毛腺癌（villoglandular  adenocarcinoma）（ＶＧＡ）、非癌性悪性腫瘍（non-carcinoma  malignancy）、メラノーマ、リンパ腫、又は子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）である、実施形態Ｅ１〜Ｅ５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５６．子宮頸部腫瘍が、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、又は子宮頸癌である、実施形態Ｅ１〜Ｅ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５７．全身性ＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、それを必要とする対象において亢進させる方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質が、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質が、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、方法。
Ｅ５８．投与が、少なくとも２回の投与又は３回の投与を含む、実施形態Ｅ５７に記載の方法。
Ｅ５９．ＩＦＮ−γの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍亢進される、実施形態Ｅ５７又はＥ５８に記載の方法。
Ｅ６０．ＩＬ−２の発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍亢進される、実施形態Ｅ５７〜Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１．ＴＮＦ−αの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍亢進される、実施形態Ｅ５７〜Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２．ＩＬ−４又はＩＬ−１７ａの発現が、投与後に亢進されない、実施形態Ｅ５７〜Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３．融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、有効量のこの医薬組成物を投与した後に細胞性免疫応答が亢進されない場合に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を行うことに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キット。
Ｅ６４．融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、初期量のポリヌクレオチドの投与後に多機能性Ｔ細胞数の増加を示す対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キット。
Ｅ６５．融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キット。
Ｅ６６．有効量が、少なくとも１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、又は６ｍｇである、実施形態Ｅ６３〜Ｅ６５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ６７．融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、対象への、この医薬組成物の１回の投与又は２回の投与が亢進した細胞性免疫応答を示さない場合、この医薬組成物の更なる投与を中止することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キット。
Ｅ６８．１回の投与が、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇである、実施形態Ｅ６７に記載のキット。
Ｅ６９．２回の投与が、第１の用量及び第２の用量を含み、第１の用量が、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇであり、第２の用量が、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇである、実施形態Ｅ６７又はＥ６８に記載のキット。
Ｅ７０．第１の用量及び第２の用量が同一である、実施形態Ｅ６７〜Ｅ６９のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７１．第１の用量及び第２の用量が異なる、実施形態Ｅ６７〜Ｅ６９のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７２．第１の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである、実施形態Ｅ６７〜Ｅ７１のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７３．第１の用量は、約１ｍｇ〜４ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇである、実施形態Ｅ６７〜Ｅ７１のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７４．第１の用量が、約１ｍｇであり、第２の用量が、約１ｍｇである、実施形態Ｅ７３に記載のキット。
Ｅ７５．第１の用量が、約２ｍｇであり、第２の用量が、約２ｍｇである、実施形態Ｅ７３に記載のキット。
Ｅ７６．第１の用量が、約４ｍｇであり、第２の用量が、約４ｍｇである、実施形態Ｅ７３に記載のキット。
Ｅ７７．融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は８つのアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２のいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ７６のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７８．融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有されるのと同じ数のエピトープ、又は、ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有されるエピトープより多くのエピトープを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及び７７のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ７７のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ７９．ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部はそれぞれ、完全なＥ６関連たんぱく質（Ｅ６ＡＰ）結合部位を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２並びにＥ７７及びＥ７８のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ７８のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ８０．完全なＥ６ＡＰ結合部位が、配列番号２（Ｅ６  ＨＰＶ１６）に対応するアミノ酸３５〜１３６又は配列番号４（Ｅ６  ＨＰＶ１８）に対応するアミノ酸３０〜１３１を含む、実施形態Ｅ７９に記載の方法又はキット。
Ｅ８１．ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部がそれぞれ、完全なＣＲ２ドメイン又は完全なＣＲ３ドメインを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ８０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ７６及びＥ７７〜Ｅ８０のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ８２．完全なＣＲ２ドメイン及びＣＲ３ドメインが、配列番号６（Ｅ７  ＨＰＶ１６）に対応するアミノ酸１８〜９８、又は配列番号８（Ｅ７  ＨＰＶ１８）に対応するアミノ酸２１〜１０５である、実施形態Ｅ８１に記載の方法又はキット。
Ｅ８３．ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部が、配列番号２のＮ末端配列（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ａが、配列番号２に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｂが、配列番号２に対応するアミノ酸残基３５〜１３５から選択されるアミノ酸であり、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部が、配列番号２のＣ末端配列（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｃが、配列番号２に対応する、３６以上のアミノ酸残基及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｄが、配列番号２に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ８２のいずれか１つに記載の方法並びに実施形態Ｅ６３〜Ｅ７６及びＥ７７〜Ｅ８２のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ８４．ｂが、配列番号２に対応するアミノ酸残基３５〜３９、５７〜６２、６９〜８５、８７〜８８、９８〜９９、１０７、１０９、１１４、及び１３５から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８３に記載の方法又はキット。
Ｅ８５．配列番号２に対応して、ｂがアミノ酸残基３５であり、ｃがアミノ酸残基３６であるか；ｂがアミノ酸残基３６であり、ｃがアミノ酸残基３６又は３７であるか；ｂがアミノ酸残基３７であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、又は３８であるか；ｂがアミノ酸残基３８であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、３８、又は３９であるか；ｂがアミノ酸残基３９であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、３８、３９、又は４０であるか；ｂがアミノ酸残基５７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１００から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１５から選択されるアミノ酸であるか；又は、ｂがアミノ酸残基１３５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３６から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８３又はＥ８４に記載の方法又はキット。
Ｅ８６．ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部が、配列番号４のＮ末端配列（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｉが、配列番号４に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｊが、配列番号４に対応するアミノ酸残基３０〜１３０から選択されるアミノ酸であり、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部が、配列番号４のＣ末端配列（１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｋが、配列番号４に対応する、３１以上のアミノ酸残基及びｊ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｌが、配列番号４に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ８５のいずれか１つに記載の方法並びに実施形態Ｅ６３〜Ｅ８５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ８７．ｊが、配列番号４に対応するアミノ酸残基３０〜３４、５２〜５７、６４〜８０、８２〜８３、９３、９４、１０２、１０４、１０９、及び１３０から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８５に記載の方法又はキット。
Ｅ８８．配列番号４に対応して、ｊがアミノ酸残基３０であり、ｋがアミノ酸残基３１であるか；ｊがアミノ酸残基３１であり、ｋがアミノ酸残基３１又は３２であるか；ｊがアミノ酸残基３２であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、又は３３であるか；ｊがアミノ酸残基３３であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、３３、又は３４であるか；ｊがアミノ酸残基３４であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、３３、３４、又は３５であるか；ｊがアミノ酸残基５２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１０から選択されるアミノ酸であるか；又は、ｊがアミノ酸残基１３０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１３１から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８６又はＥ８７に記載の方法又はキット。
Ｅ８９．ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部が、配列番号６のＮ末端配列（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｅが、配列番号６に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｆが、配列番号６に対応するアミノ酸残基１８〜９７から選択されるアミノ酸であり、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部が、配列番号６のＣ末端配列（１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｇが、配列番号６に対応する、１９以上のアミノ酸残基及びｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｈが、配列番号６に対応するアミノ酸残基９７又は９８から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ８８のいずれか１つに記載の方法並びにＥＭ６３〜８８のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ９０．ｆが、配列番号６に対応するアミノ酸残基１８〜３９及び４４〜９７から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８９に記載の方法又はキット。
Ｅ９１．ｆは、配列番号６に対応する１８〜３９から選択されるアミノ酸残基であり、ｇは、配列番号６に対応する、１９以上のアミノ酸残基及びｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であるか、又は、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸残基４４〜９７から選択されるアミノ酸残基であり、ｇは、配列番号６に対応する、４５以上のアミノ酸残基及びアミノ酸ｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ８９又はＥ９０に記載の方法又はキット。
Ｅ９２．ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部が、配列番号８のＮ末端配列（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｍが、配列番号８に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｎが、配列番号８に対応するアミノ酸残基２１〜１０４から選択されるアミノ酸であり、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部が、配列番号８のＣ末端配列（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｏが、配列番号８に対応する、２２以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｐが、配列番号８に対応するアミノ酸残基１０４又は１０５から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ９１のいずれか１つに記載の方法並びに実施形態Ｅ６３〜Ｅ９１のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ９３．ｎが、配列番号８に対応するアミノ酸残基２１〜４２及び４７〜１０４から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ９２に記載の方法又はキット。
Ｅ９４．配列番号８に対応して、ｎは、２１〜４１から選択されるアミノ酸残基であり、ｏは、２２以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であるか、又は、ｎは、アミノ酸残基４７〜１０４から選択されるアミノ酸残基であり、ｏは、４８以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸である、実施形態Ｅ９２又はＥ９３に記載の方法又はキット。
Ｅ９５．融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６の天然の全長Ｅ６たんぱく質、ＨＰＶ１６の天然の全長Ｅ７たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然の全長Ｅ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然の全長Ｅ７たんぱく質を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ９４のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ９４のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ９６．融合たんぱく質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ；（ｉｉ）１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ；（ｉｉｉ）１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；（ｉｖ）１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ；（ｖ）１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ；（ｖｉ）１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；（ｖｉｉ）１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；又は、（ｖｉｉｉ）１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄを含む、実施形態Ｅ９５に記載の方法又はキット。
Ｅ９７．融合たんぱく質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐを含み、ａは、配列番号２のアミノ酸残基１であり、ｂは、配列番号２のアミノ酸残基８５であり、ｃは、配列番号２のアミノ酸残基７１であり、ｄは、配列番号２のアミノ酸残基１５８であり、ｅは、配列番号６のアミノ酸残基１であり、ｆは、配列番号６のアミノ酸残基６５であり、ｇは、配列番号６のアミノ酸残基５１であり、ｈは、配列番号６のアミノ酸残基９８であり、ｉは、配列番号４のアミノ酸残基１であり、ｊは、配列番号４のアミノ酸残基８５であり、ｋは、配列番号４のアミノ酸残基７１であり、ｌは、配列番号４のアミノ酸残基１５８であり、ｍは、配列番号８のアミノ酸残基１であり、ｎは、配列番号８のアミノ酸残基６５であり、ｏは、配列番号８のアミノ酸残基５１であり、ｐは、配列番号８のアミノ酸残基１０５である、実施形態Ｅ９６に記載の方法又はキット。
Ｅ９８．融合たんぱく質は、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ９５に記載の方法又はキット。
Ｅ９９．ポリヌクレオチドが、ヒトでの発現用にコドン最適化されている、実施形態Ｅ９５〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の方法又はキット。
Ｅ１００．ポリヌクレオチドは、配列番号９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｅ９５〜Ｅ９９のいずれか１つに記載の方法又はキット。
Ｅ１０１．ポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ１００のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ１００のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１０２．異種ポリペプチドが、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（「ＦＬＴ３Ｌ」）又はその一部を含む、実施形態Ｅ１０１に記載の方法又はキット。
Ｅ１０３．ＦＬＴ３Ｌ又はその一部が、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインを含む、実施形態Ｅ１０２に記載の方法又はキット。
Ｅ１０４．ＦＬＴ３Ｌ又はその一部が、配列番号１２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１０２又はＥ１０３に記載の方法又はキット。
Ｅ１０５．異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態Ｅ１０１〜Ｅ１０４のいずれか１つに記載の方法又はキット。
Ｅ１０６．ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ１０５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ６３〜Ｅ１０５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１０７．シグナルペプチドは、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のシグナルペプチド、ヘルペス単純ウイルス糖たんぱく質Ｄ（ＨＳＶ  ｇＤ）のシグナルペプチド、成長ホルモンのシグナルペプチド、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態Ｅ１０６に記載の方法又はキット。
Ｅ１０８．シグナルペプチドは、ｔＰＡのシグナルペプチドである、実施形態Ｅ１０６に記載の方法又はキット。
Ｅ１０９．シグナルペプチドが、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１０８に記載の方法又はキット。
Ｅ１１０．シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態Ｅ１０９に記載の方法又はキット。
Ｅ１１１．ポリヌクレオチドは、ベクターである、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ１１０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ７７〜Ｅ１１０のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１１２．ベクターが、プラスミドである、実施形態Ｅ１１１に記載の方法又はキット。
Ｅ１１３．プラスミドが、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＶ４０エンハンサー、ｐＣＭＶプロモーター、ｇＩＶＳ、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む、実施形態Ｅ１１２に記載の方法又はキット。
Ｅ１１４．プラスミドが、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＶ４０エンハンサー、ＣｏｌＥ１、ｐＣＭＶプロモーター、及びｇＩＶＳを更に含む、実施形態Ｅ１１３に記載の方法又はキット。
Ｅ１１５．ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ又はＲＮＡである、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ１１４のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ７７〜Ｅ１１４のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１１６．ポリヌクレオチドは、ＤＮＡワクチンである、実施形態Ｅ１〜Ｅ６２及びＥ７７〜Ｅ１１５のいずれか１つに記載の方法又は実施形態Ｅ７７〜Ｅ１１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１１７．ヒトパピローマウイルス感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍の処置又は予防において有効な、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、少なくとも３つのアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、ことと、
（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む、方法。
Ｅ１１８．融合たんぱく質は、完全なＥ６関連たんぱく質（ＡＰ）結合部位を含まない、実施形態Ｅ１１７に記載の方法。
Ｅ１１９．ヒトパピローマウイルス感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍の処置又は予防において有効な、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、
融合たんぱく質が、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質が、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質が、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質並びにＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有される免疫原性についての少なくとも全てのエピトープを含む、ことと、（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることであって、融合たんぱく質が発現される、ことと、を含む、方法。
Ｅ１２０．ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１６の天然のＥ７たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有される免疫原性についての少なくとも全てのエピトープを含む状態で、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の配列、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の配列、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の配列、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の配列を含む融合たんぱく質におけるＰ５３結合部位及びｐＲｂ結合部位を除去する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、
（ａ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸３５〜１３５のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）とＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列（overlapping  sequence）を含み、
（ｂ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸１８〜９７のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）とＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ７ｇ−ｈ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｃ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸３０〜１３０のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）とＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ６Ｎｋ−ｌ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｄ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、配列番号８に対応するアミノ酸２１〜１０４のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）とＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含む、ことと、
（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む、方法。
Ｅ１２１．（ａ）におけるＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、又は少なくとも２０個のアミノ酸を含むか、（ｂ）におけるＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、又は少なくとも２０個のアミノ酸を含むか、（ｃ）におけるＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、又は、（ｄ）におけるＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含む、実施形態Ｅ１２０に記載の方法。
Ｅ１２２．ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の免疫原性についての全てのエピトープを含む状態で、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の配列、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の配列、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の配列、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の配列を含む融合たんぱく質における、ＨＰＶ１６及び／若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質、並びに／又は、ＨＰＶ１６及び／若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のホモ二量体の形成を防止する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、
（ａ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸３７〜７２のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）とＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｂ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸４４〜９７のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）とＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ７ｇ−ｈ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｃ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号４に対応するアミノ酸３２〜６７のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）とＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ６Ｎｋ−ｌ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｄ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、配列番号８に対応するアミノ酸４７〜１０４のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）とＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含む、ことと、
（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む、方法。
Ｅ１２３．（ａ）におけるＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、（ｂ）におけるＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、（ｃ）におけるＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、又は、（ｄ）におけるＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含む、実施形態１２２に記載の方法。
Ｅ１２４．融合たんぱく質が、配列番号１０ではない、実施形態１１７〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】治療用分子（例えば、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡ治療ワクチン、ＧＸ−１８８と命名）の図を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８型のＥ６及びＥ７遺伝子の、シャッフルされたオーバーラップＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインを、ｐＧＸ２７ベクター内に挿入することにより構築された、ＧＸ−１８８ワクチンを示す。これらのＥ６及びＥ７ドメインの前には、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）の分泌シグナル配列及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインがある。挿入されたウイルスドメインは、ＨＰＶの株、遺伝子、及びドメインに従って略され、例えば、１６Ｅ６Ｎは、ＨＰＶ１６  Ｅ６のＮ末端ドメインを表わす。他に使用される略称は、ＭＣＳ、マルチクローニングサイト；ＳＶ４０ポリＡ、シミアンウイルス４０後期ポリアデニル化配列；ＳＶ４０エンハンサー、シミアンウイルス４０エンハンサー；ＫａｎＲ、カナマイシン抵抗性遺伝子；ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１型細菌複製起点；ｐＣＭＶ、サイトメガロウイルス初期エンハンサー／プロモーター；ｇＩＶＳ、ウサギβ−グロビン介在配列である。各遺伝子セグメント上方の数字は、対応するアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】臨床試験の概要を示す。臨床試験は、３つの期間、即ち、募集した患者のスクリーニング、３回のワクチン注射による処置、及び患者のフォローアップモニタリングを有した。患者は、スクリーング（ＶＳ）、処置（ＶＴ）、及びフォローアップモニタリング（ＶＦ）のため、これら３つの期間中に、検査され、及び／又はワクチンを受けるように示された時点においてクリニックを訪れた。
【図２Ａ】ＧＸ−１８８  Ｅ６／Ｅ７融合たんぱく質の細胞内局在及び細胞内ｐ５３及びｐＲｂたんぱく質の分解におけるその効果を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐＧＸ２７コントロールベクター、ＧＸ−１８８、又は野生型Ｅ６若しくはＥ７遺伝子を挿入したｐＧＸ２７でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライゼートを調製し、たんぱく質発現を、免疫ブロットにより分析した。溶解緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁させた細胞を示す。抽出物の上清を、細胞質抽出物として収集した。ペレットを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１  ０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びＰＩＣ）中に再懸濁させ、ペレット化後のその上清を、核抽出物として収集した。画分の純度を、ウェスタンブロットにより、それぞれ細胞質及び核の画分を規定する、チューブリン及びラミンについて調査した。
【図２Ｂ】ＧＸ−１８８  Ｅ６／Ｅ７融合たんぱく質の細胞内局在及び細胞内ｐ５３及びｐＲｂたんぱく質の分解におけるその効果を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐＧＸ２７コントロールベクター、ＧＸ−１８８、又は野生型Ｅ６若しくはＥ７遺伝子を挿入したｐＧＸ２７でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライゼートを調製し、たんぱく質発現を、免疫ブロットにより分析した。溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４、及びＰＩＣ）中に再懸濁させた細胞を示す。上清を、ホールセルのライゼートとして収集した。細胞内ｐ５３たんぱく質の発現レベルについての分析を示す。
【図２Ｃ】ＧＸ−１８８  Ｅ６／Ｅ７融合たんぱく質の細胞内局在及び細胞内ｐ５３及びｐＲｂたんぱく質の分解におけるその効果を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐＧＸ２７コントロールベクター、ＧＸ−１８８、又は野生型Ｅ６若しくはＥ７遺伝子を挿入したｐＧＸ２７でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライゼートを調製し、たんぱく質発現を、免疫ブロットにより分析した。溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４、及びＰＩＣ）中に再懸濁させた細胞を示す。上清を、ホールセルのライゼートとして収集した。細胞内ｐＲｂたんぱく質の発現レベルについての分析を示す。
【図３Ａ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０１における１ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０１におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において７６．６％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｂ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０２における１ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０２におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において６９．３％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｃ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０３における１ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０３におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において８８．９％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｄ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０４における２ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０４におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において８９．２％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｅ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。Ａ０５における２ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０５におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において６９．１％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｆ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。Ａ０６における２ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０６におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において８９．４％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｇ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０７における４ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０７におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において８４．２％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｈ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０８における４ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０８におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において７５．１％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図３Ｉ】エレクトロポレーションによるＧＸ−１８８を使用したワクチン接種が顕著なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ応答を誘引したことを示す。全ての患者においてＧＸ−１８８によるワクチン接種前（ＶＳ）、同ワクチン接種中（ＶＴ２、ＶＴ４）、及び同ワクチン接種後（ＶＦ１、ＶＦ２）に、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、凍結保存した。ＰＢＭＣ中のＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞数を、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＬＯＴアッセイにより、示された時点におけるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールによる４８時間の刺激後に、個々に測定した。スポットのバックグラウンド数（５．７±２．２（平均±標準偏差）であった）を差し引いた後の各抗原に対する、トリプリケートウェル中における１０６個のＰＢＭＣ当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。患者Ａ０９における４ｍｇのＧＸ−１８８の投与結果を示す。患者Ａ０９におけるスポット総数中のＥ６特異的応答の割合は、ＶＦ１において７０．１％であった。各患者において見出されたＨＰＶ型を、丸括弧中に示す。ＮＤ−測定せず。
【図４Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度における顕著な増加を誘発したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激した。ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色、続けて、多色フローサイトメトリー分析により測定した。フローサイトメトリーによりＩＦＮ−γ生成ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を判別するゲーティング戦略を示す。
【図４Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度における顕著な増加を誘発したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激した。ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色、続けて、多色フローサイトメトリー分析により測定した。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）にＩＦＮ−γを生成するＣＤ４の頻度の代表的なプロットを示す。図４Ｂは、図４Ｂのプロットのサマリーグラフを示す。
【図４Ｃ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度における顕著な増加を誘発したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激した。ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色、続けて、多色フローサイトメトリー分析により測定した。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、コントロールとしての培地のみの応答により決定し、ＣＤ４について０．００４±０．００２％、及び、ＣＤ８  Ｔ細胞について０．００３±０．００２（平均±標準偏差）であった。
【図４Ｄ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度における顕著な増加を誘発したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激した。ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色、続けて、多色フローサイトメトリー分析により測定した。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）にＩＦＮ−γを生成するＣＤ８の頻度の代表的なプロットを示す。
【図４Ｅ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度における顕著な増加を誘発したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激した。ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色、続けて、多色フローサイトメトリー分析により測定した。図４Ｄのプロットのサマリーグラフを示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、コントロールとしての培地のみの応答により決定し、ＣＤ４について０．００４±０．００２％、及び、ＣＤ８  Ｔ細胞について０．００３±０．００２（平均±標準偏差）であった。
【図５Ａ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＩＦＮ−γレベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、４．１９±０．４１であった。
【図５Ｂ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＩＬ−２レベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、５．１１±０．６３であった。
【図５Ｃ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＴＮＦ−αレベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、５．５８±０．８８であった。
【図５Ｄ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＩＬ−４レベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、３．３±０．２４であった。
【図５Ｅ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＩＬ−１０レベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、ＩＬ−１０について、５．０１±０．６４であった（Ｅ）。
【図５Ｆ】ＧＸ−１８８免疫化がＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答を生じさせたが、Ｔｈ２又はＴｈ１７応答を生じさせなかったことを示す。ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１＋ＶＦ２）における患者からの凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの混合物により、４８時間刺激した。ＶＦ１及びＶＦ２においてプールされたＰＢＭＣを、ＶＦ２前に外科手術を受けたため、ＶＦ１細胞を使用した患者Ａ０４を除いて、全ての患者に使用した。培養上清中の示されたサイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞数測定ビーズアレイキットを使用して定量した。ダプリケートの平均±標準偏差を示す。水平の破線は、各サイトカインの検量線により決定されたカットオフレベルを示す。ＧＸ−１８８免疫化後に測定されたＩＬ−１７Ａレベルを示す。バックグラウンドとしての培地単独の平均値（平均±標準偏差ｐｇ  ｍＬ−１）は、５．４５±０．２８であった。
【図６Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ゲートしたＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＬ−２を共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度のサマリーグラフを示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図６Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＴＮＦ−αを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度のサマリーグラフを示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図６Ｃ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＭＩＰ−１βを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度のサマリーグラフを示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図６Ｄ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１０７ａ／ｂを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度のサマリーグラフを示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図６Ｅ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ワクチン接種後（ＶＦ１）のＢｏｏｌｅａｎゲート後の、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７ペプチドに対するＡ０８患者の多機能応答の代表的なグラフを示す。ＣＤ１０７ａ／ｂ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１β、及びＴＮＦ−αの５つの機能について、それぞれ３１通りの可能性のある組み合わせにより、ｘ軸に沿って列記する。ｘ軸の下の５本の水平なバーは、５、４、３、２、又は１つの機能性応答集団を示す。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図６Ｆ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、図４Ａ〜４Ｅに記載されるように、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）において刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及び細胞傷害性脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の相対的な頻度を、ワクチン接種後（ＶＦ１）の５つの機能性応答の各組み合わせにより表わす各円グラフを示す。各円グラフの右下の数字は、３つ以上の機能性分子を生成するＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示す。分析のための応答性ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度が低すぎたため、Ａ０４患者の多機能プロファイルを利用できなかった。グラフに示されたデータは、２つの独立した実験の平均を表わす。各実験はダプリケートであり、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみの応答により決定し、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋について０．０００８±０．００１％、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋について０．００１６±０．００１４％、ＩＦＮ−γ＋ＭＩＰ−１β＋について０．００１５±０．００１９％、及びＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋ＣＤ８  Ｔ細胞について０．０００９±０．００１２％（平均±標準偏差）であった。
【図７Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を強く誘引したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集した患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーにより機能性分子生成ＣＤ８  Ｔ細胞を判別するゲーティング戦略を示す。
【図７Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を強く誘引したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集した患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ゲートしたＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＬ−２を共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の代表的なプロットを示す。
【図７Ｃ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を強く誘引したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集した患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＴＮＦ−αを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の代表的なプロットを示す。
【図７Ｄ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を強く誘引したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集した患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＭＩＰ−１βを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の代表的なプロットを示す。
【図７Ｅ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を強く誘引したことを示す。ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集した患者の凍結保存ＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの組み合わせ混合物により、１３時間刺激し、ついで、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂのＨＰＶ１６特異的発現を検出するために、多色フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１０７ａ／ｂを共発現しているＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の代表的なプロットを示す。プロット数は、ゲートしたＣＤ８  Ｔ細胞における応答性集団の頻度を示す。
【図８Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に刺激し、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３８及びＫｉ６７の発現を調べるために、以下に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＫｉ６７及びＣＤ３８の発現を、フローサイトメトリーにより判別するゲーティング戦略を示す。
【図８Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に刺激し、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３８及びＫｉ６７の発現を調べるために、以下に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。増殖しているＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の代表的なプロットを示す。図８Ｂに示された細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞でゲートされる。
【図８Ｃ】ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を誘引したことを示す。患者のＰＢＭＣを、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に刺激し、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３８及びＫｉ６７の発現を調べるために、以下に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。図８Ｃに示されたデータは、ダプリケートの平均を表わし、エラーバーは、標準偏差を表わす。バックグラウンド値を、培地のみのコントロールの応答により決定し、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞について、０．０１１±０．０１５％（平均±標準偏差）であった。
【図９Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。免疫化前（ＶＳ）及び免疫化後（ＶＴ２、ＶＴ４、及びＶＦ）のタイミングにおける、１ｍｇのＧＸ−１８８の投与後の各ワクチン投与群についての、ＨＰＶ１６  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｃ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｄ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｅ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。免疫化前（ＶＳ）及び免疫化後（ＶＴ２、ＶＴ４、及びＶＦ）のタイミングにおける、２ｍｇのＧＸ１８８の投与後の各ワクチン投与群についての、ＨＰＶ１６  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｆ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｇ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｈ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｉ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。免疫化前（ＶＳ）及び免疫化後（ＶＴ２、ＶＴ４、及びＶＦ）のタイミングにおける、４ｍｇのＧＸ−１８８の投与後の各ワクチン投与群についての、ＨＰＶ１６  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｊ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｋ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ６  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図９Ｌ】ＧＸ−１８８ワクチン接種後の、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６及びＥ７たんぱく質に対するＩｇＧ力価を示す。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組換えＥ６及びＥ７たんぱく質に対する血漿ＩｇＧ抗体力価を、ある希釈範囲において、各患者についてＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＰＶ１８  Ｅ７  ＩｇＧ力価の結果を示す。データは、陽性を示すサンプルの希釈倍率として現わされる。サンプルの平均光学密度が陰性のカットオフ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。患者の血漿を、無関係の組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）でコートしたウェルにおいて調査した際、全サンプルの光学密度は、陰性のカットオフ値を下回った。
【図１０Ａ】膣頸管検査、細胞学、及び組織学により判定されたように、ＧＸ−１８８ワクチン接種が子宮頸部病変の排除をもたらしたことを示す。ＧＸ−１８８免疫化前（ＶＳ）及び同免疫化後（ＶＦ２）における、代表的な応答者（Ａ０５）及び非応答者（Ａ０９）の患者からの、子宮頸部の膣頸管検査の写真を示す。ＶＳでの患者Ａ０５は、移行帯における荒い穿孔を伴った、密集した白化上皮を示したが、ＶＦ２では、穿孔を伴わず、小さくなった中程度の白化上皮を表わした。ＶＳ及びＶＦ２でのＡ０９は、移行帯における丸まった周縁部及び荒い穿孔を伴った、密集した白化上皮を示した。
【図１０Ｂ】膣頸管検査、細胞学、及び組織学により判定されたように、ＧＸ−１８８ワクチン接種が子宮頸部病変の排除をもたらしたことを示す。ＧＸ−１８８免疫化前（ＶＳ）及び同免疫化後（ＶＦ２）における、代表的な応答者（Ａ０５）及び非応答者（Ａ０９）の患者からの、子宮頸管内の細胞学の写真を示す。ＶＳでの患者Ａ０５は、拡張した核サイズ及び過染色症を伴った、高度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を示した（４００倍）が、ＶＦ２では、上皮内病変を伴わず（ＮＩＬ）に、正色素性の上皮のみを示した（４００倍）。ＶＳ及びＶＦ２での患者Ａ０９は、ＨＳＩＬ変動核サイズ及び過染色症を表わした（４００倍）。
【図１０Ｃ】膣頸管検査、細胞学、及び組織学により判定されたように、ＧＸ−１８８ワクチン接種が子宮頸部病変の排除をもたらしたことを示す。ＧＸ−１８８免疫化前（ＶＳ）及び同免疫化後（ＶＦ２）における、代表的な応答者（Ａ０５）及び非応答者（Ａ０９）の患者からの、組織学の写真を示す。ＶＳでの患者Ａ０５は、上皮の十分な厚みを有し、上層に視認できる有糸分裂を伴うＣＩＮ３と診断された（４００倍）が、ＶＦ２では、異常な腫瘍細胞を伴わず正常な扁平上皮を表わした（２００倍）。ＶＳ及びＶＦ２での患者Ａ０９は、厚く、異常な上皮を有し、上層に核異常を伴うケラチン化細胞が存在するＣＩＮ３と診断された（２００倍）。
【図１１Ａ】ＧＸ−１８８ワクチン接種の非応答者及び応答者における、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の多機能アッセイを示す。ＨＰＶ１６特異的ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、又はＣＤ１０７ａ／ｂ生成ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、ワクチン接種後２０週（ＶＦ１）において、Ｂｏｏｌｅａｎゲーティングを使用して測定した。患者を、臨床的及びウイルス学的アウトカムに従って、非応答者（Ａ０４及びＡ０９）と、応答者（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、及びＡ０８）とにグループ分けした。ＧＸ−１８８ワクチン接種後のＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７ペプチドに対する非応答者の多機能ＣＤ８  Ｔ細胞応答がグラフとして表わされることを示す。同グラフ中、黒色のバーは、平均応答を表わし、ドットは、単独の対象からの応答に対応する。サイトカインの、考えられる機能性の組み合わせが、それぞれ、ｘ軸に沿って列記されている。ｘ軸の下の種々の色の５本の水平なバーは、５、４、３、２、又は１つの機能性応答集団を示す。
【図１１Ｂ】ＧＸ−１８８ワクチン接種の非応答者及び応答者における、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の多機能アッセイを示す。ＨＰＶ１６特異的ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、又はＣＤ１０７ａ／ｂ生成ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、ワクチン接種後２０週（ＶＦ１）において、Ｂｏｏｌｅａｎゲーティングを使用して測定した。患者を、臨床的及びウイルス学的アウトカムに従って、非応答者（Ａ０４及びＡ０９）と、応答者（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、及びＡ０８）とにグループ分けした。円グラフとして表わされたＧＸ−１８８ワクチン接種後のＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７ペプチドに対する応答者の多機能ＣＤ８  Ｔ細胞応答を示す。円グラフは、５つの機能性応答の各組み合わせを有するＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の相対的頻度を表わす。
【図１２Ａ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＩＦＮ−γ測定を示す。
【図１２Ｂ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＩＬ−２測定を示す。
【図１２Ｃ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＴＮＦ−α測定を示す。
【図１２Ｄ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＩＬ−４測定を示す。
【図１２Ｅ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＩＬ−１０測定を示す。
【図１２Ｆ】細胞数測定ビーズアレイにより生成した、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を示す。１０ｐｇ  ｍＬ−１（定量限界を概説するデフォルト）を下回るたんぱく質の有効な分析を確保するために、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準を、５０ＬＩアッセイ希釈において再構成した。標準を、５〜５，０００ｐｇ  ｍＬ−１（希釈率；１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、及び１：１０２８）から構築した。サイトカインの検量線を、全てのサイトカインについて、ｐｏｗｅｒ  ｆｉｔ及びＲ２＞０．９６を使用してサンプル取得後に生成した。細胞上清中の各サイトカイン濃度を、対応する検量線からの内挿により決定した。ＩＬ−１７Ａ測定を示す。
【図１３Ａ】ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７たんぱく質の天然変異体を示す。ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の天然変異体の配列比較を示す：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ：ＡＡＡ９１６７０．１（配列番号１９）；ＡＡＡ９１６７３．１（配列番号２０）；ＡＡＡ９１６６９．１（配列番号２１）；ＡＡＡ９１６７４．１（配列番号２２）；ＡＡＡ９１６８０．１（配列番号２３）；ＡＡＡ９１６８１．１（配列番号２４）；ＡＡＡ９１６６８．１（配列番号２５）；ＡＡＡ９１６５８．１（配列番号２６）；ＡＡＡ９１６６２．１（配列番号２７）；ＡＡＡ９１６６７．１（配列番号２８）；ＡＡＡ９１６７６．１（配列番号２９）；ＡＡＡ９１６７１．１（配列番号３０）；ＡＡＡ９１６５６．１（配列番号３１）；ＡＡＡ９１６８２．１（配列番号３２）；ＡＡＡ９１６５７．１（配列番号３３）；ＡＡＡ９１６６０．１（配列番号３４）；ＡＡＡ９１６７７．１（配列番号３５）；ＡＡＡ９１６７８．１（配列番号３６）；ＡＡＡ９１６７２．１（配列番号３７）；ＡＡＡ９１６６１．１（配列番号３８）；ＡＡＡ９１６６４．１（配列番号３９）；ＡＡＡ９１６７５．１（配列番号４０）；ＡＡＡ９１６６５．１（配列番号４１）；ＡＡＡ９１６６３．１（配列番号４２）；ＡＡＡ９１６５９．１（配列番号４３）；ＡＡＡ９１６５４．１（配列番号４４）；ＡＡＡ９１６６６．１（配列番号４５）；ＡＡＡ９１６７９．１（配列番号４６）；及びＡＡＡ９１６５５．１（配列番号４７）。
【図１３Ｂ】ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７たんぱく質の天然変異体を示す。ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の天然変異体の配列比較を示す：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ：ＡＨＺ９６６７８．１（配列番号４８）；ＡＢＰ９９７８４．１（配列番号４９）；ＣＡＢ５３０９６．１（配列番号５０）；ＡＧＵ９０３２７．１（配列番号５１）；ＡＤＣ３５６６０．１（配列番号５２）；ＡＨＺ９６６７７．１（配列番号５３）；ＡＢＰ９９７３６．１（配列番号５４）；ＡＢＰ９９７０４．１（配列番号５５）、ＡＧＭ３４４２５．１（配列番号１０３）、及びＡＧＭ３４４２３．１（配列番号１０４）。
【図１３Ｃ】ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７たんぱく質の天然変異体を示す。ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の天然変異体の配列比較を示す：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ：ＡＢＬ９６５８７．１（配列番号５６）；ＡＢＬ９６５９１．１（配列番号５７）；ＡＦＪ１９７２６．１（配列番号５８）；ＡＦＪ１９７２２．１（配列番号５９）；ＡＦＪ１９７５２．１（配列番号６０）；ＡＦＪ１９７３２．１（配列番号６１）；ＡＦＪ１９７６２．１（配列番号６２）；ＡＦＪ１９６６８．１（配列番号６３）；ＡＦＪ１９６６４．１（配列番号６４）；ＡＦＪ１９７６６．１（配列番号６５）；ＡＦＪ１９７５６．１（配列番号６６）；ＡＦＪ１９６８０．１（配列番号６７）；ＡＦＪ１９７７２．１（配列番号６８）；ＡＦＪ１９６９６．１（配列番号：６９）；ＡＦＪ１９６９０．１（配列番号７０）；ＡＦＪ１９７１２．１（配列番号：７１）；ＡＧＯ０４５０４．１（配列番号７２）；ＡＦＪ１９７７０．１（配列番号７３）；ＡＦＪ１９５２０．２（配列番号７４）；ＡＦＪ１９７０８．１（配列番号７５）；ＡＦＪ１９６７４．１（配列番号７６）；ＡＧＯ０４４９８．１（配列番号７７）；ＡＧＯ０４４９６．１（配列番号７８）；ＡＦＪ１９６８４．１（配列番号７９）；ＡＦＪ１９６７８．１（配列番号８０）；ＡＦＪ１９６９８．１（配列番号８１）；ＡＦＪ１９７４６．１（配列番号８２）；ＡＡＦ１３３９５．１（配列番号８３）；ＡＦＵ０６６５４．１（配列番号８４）；ＡＦＵ０６６５０．１（配列番号８５）；ＡＡＢ７０７３８．１（配列番号８６）；ＡＣＮ２２５５５．１（配列番号８７）；ＡＢＫ３２５１０．１（配列番号８８）；ＡＢＣ５４５７３．１（配列番号８９）；ＡＣＮ２２５５４．１（配列番号９０）；ＡＢＫ３２５１１．１（配列番号９１）；ＡＣＱ９０２１６．１（配列番号９２）；ＡＤＹ７５５７６．１（配列番号９３）；ＡＡＭ０３０２５．１（配列番号９４）；及びＡＡＬ９６６３４．１（配列番号９５）。
【図１３Ｄ】ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７たんぱく質の天然変異体を示す。ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の天然変異体の配列比較を示す：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ：ＡＢＰ９９７８５．１（配列番号９６）；ＡＧＵ９０４１６．１（配列番号９７）；ＡＧＵ９０３８４．１（配列番号９８）；ＣＡＢ５３０９７．１（配列番号９９）；Ｐ０６７８８．２．１（配列番号１００）；ＣＡＢ５３０９８．１（配列番号１０１）；及びＣＡＢ５３０９９．１（配列番号１０２）。
【図１４】ＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンの変形例の図を示す。レーン１（Ａ）は、陰性コントロール：ｐＧＸ２７ベクターのみを表わす。レーン２（Ｂ）は、ＧＸ−１８８陽性コントロール：図１Ａで示されるＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンを表わす。レーン３（Ｃ−１）は、ＨＰＶ１６  Ｅ６変異体を表わす。Ｃ−１構築物は、ＧＸ−１８８と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ６のヒスチジン（Ｈ）２１、チロシン（Ｙ）８５、及びバリン（Ｖ）９０において、それぞれ、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びロイシン（Ｌ）による変異／置換を含有する。レーン４（Ｃ−２）は、ＨＰＶ１６  Ｅ７変異体を表わす。Ｃ−２構築物は、ＧＸ−１８８と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ７のメチオニン（Ｍ）１２におけるリジン（Ｋ）による変異／置換、並びに、ＧＸ−１８８と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ７のアスパラギン（Ｎ）２９、アルギニン（Ｒ）７７、及びグリシン（Ｇ）８５におけるセリン（Ｓ）による変異／置換を含有する。レーン５（Ｄ−１）は、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜７８番目アミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７９番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５９番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目についての配列を有するＤＮＡワクチンの変形例を表わす。レーン６（Ｄ−２）は、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜１３０番目アミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の４５番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の４４番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目についての配列を有するＤＮＡワクチンの変形例を表わす。レーン７（Ｅ−１）は、異なるシャッフル順序（即ち、ＮＣＮＣＮＣＮＣ）を有するＤＮＡワクチンの変形例を表わす。Ｅ−１構築物は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜８５番目アミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５１番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７１番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。Ｅ−２は、異なるシャッフル順序（即ち、ＣＣＮＮＣＣＮＮ）を有するＤＮＡワクチンの変形例を表わす。Ｅ−２構築物は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７１番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５１番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。
【図１５】ＧＸ−１８８ワクチンの変形例についてのワクチンスケジュールの模式図を示す。Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに、各ワクチン変形例を、エレクトロポレーション送達により投与した。Ａ（陰性コントロール）、Ｂ（陽性コントロール）、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｅ−１、及びＥ−２。マウスを、１回の免疫化後２週間で分析するか、又は、最初の免疫化後２週間で追加免疫するかのいずれかをした。ついで、追加免疫を受けたマウスを、最後の免疫化後２週間で分析した。
【図１６Ａ】図１５で示された１回のワクチン接種後のワクチン誘引免疫応答の結果を示す。Ｙ軸は、ＳＦＣ／１×１０６個の脾臓細胞を示す。一方、Ｘ軸は、ＧＸ−１８８ワクチンの変形例を示す。
【図１６Ｂ】図１５で示された追加ワクチン接種後のワクチン誘引免疫応答の結果を示す。Ｙ軸は、ＳＦＣ／１×１０６個の脾臓細胞を示す。一方、Ｘ軸は、ＧＸ−１８８ワクチンの変形例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．定義
特に断らない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含む本願が優先するものとする。文脈により別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び他の参考文献は、各個々の刊行物又は特許出願が具体的に、かつ個々に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、全ての目的について、それら全体が参照により組み込まれる。
【００２８】
本明細書で記載されたものに類似するか、又は、本明細書で記載されたものと同等の方法及び材料が、本発明の実施又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料が以下に説明される。これらの材料、方法、及び例は、単に例示的なものであり、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２９】
本発明を更に定義するために、下記の用語及び定義が提供される。
【００３０】
「ａ」又は「ａｎ」実体という用語は、１つ又は２つ以上のその実体を意味することに留意されたい。例えば、「ポリヌクレオチド（a  polypeptide）」は、１つ又は２つ以上のポリペプチドを表わすと理解される。また、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は２つ以上（one  or  more）」、及び「少なくとも１つ（at  least  one）」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され得る。
【００３１】
本明細書において、「約」という用語は、おおよそ、ざっと、付近の領域、又は、その領域を意味するのに使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用された場合、この用語は、説明された数値の上方及び下方の境界を広げることによりその範囲を修飾する。一般的には、本明細書において、「約」という用語は、ある数値を、記載された値の上方及び下方の上下１０％の変更値により修飾するのに使用される。
【００３２】
本明細書において、「含む（comprising）」の語を用いて態様が記載される場合には常に、「からなる（consisting  of）」及び／又は「から本質的になる（consisting  essentially  of）」に関して記載される他の類似する態様も提供されることが理解される。
【００３３】
また、本明細書において、実施形態が処置フォーマットの方法として記載される場合には、スイスタイプの医療用途フォーマット及び／又は使用フォーマットのための医薬組成物として記載される他の類似するフォーマットも提供されることが理解される。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、単独の核酸及び複数の核酸を包含し、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を意味することを意図している。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来的でない結合（例えば、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるアミド結合）を含む。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する、任意の１つ又は２つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を意味する。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドは、その本来の環境から取り出した核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図している。単離されたポリヌクレオチドの例は、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、又は、溶液中で他のポリヌクレオチドから精製（部分的又は実質的に）された組換えポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明に基づく単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生成されたこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、又は転写終了シグナルを含み得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「コード領域」又は「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「ストップコドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えることができる。ただし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’端における開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシ末端をコードする、３’端における翻訳ストップコドンとにより決定される。本発明の２つ以上のコード領域は、例えば、単一のベクター上の単一のポリヌクレオチド構築物、又は、例えば、別箇の（異なる）ベクター上の別箇のポリヌクレオチド構築物で表され得る。例えば、単一のベクターは、単一のコード領域のみを含有することができ、又は、２つ以上のコード領域を含むことができるということになる。例えば、単一のベクターは、以下で説明されるように、キメラ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを別々にコードし得る。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のキメラ分子をコードする核酸に融合されるか、又は、融合されないかのいずれかの、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、特定のエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用する場合、ヌクレオチド配列に関する「最適化」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列の特性を向上させるように変異させられているものを意味する。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを向上させる、翻訳レベルを向上させる、定常状態のｍＲＮＡレベルを向上させる、調節たんぱく質、例えば、一般的な転写因子の結合を増加若しくは低下させる、スプライシングを増加若しくは低下させる、又は、ポリヌクレオチド配列により生成されるポリペプチドの収率を向上させるために行われる。ポリヌクレオチド配列に対して、そのポリヌクレオチド配列を最適化するために行われ得る改変の例は、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含量最適化、繰返し配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、３’スプライス部位の除去、転写若しくは翻訳を抑制するシス作用性エレメントの除去、ポリＴ若しくはポリＡ配列の追加若しくは除去、転写開始部位付近に転写を向上させる配列、例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の追加、ステムループ構造を形成し得る配列の除去、不安定化配列の除去、及びそれらの２つ以上の組み合わせを含む。
【００３７】
哺乳類細胞により分泌される特定のたんぱく質は、分泌シグナルペプチドに連結している。同分泌シグナルペプチドは、成長中のたんぱく質鎖の粗面小胞体を通過させるエクスポートが開始されると、成熟たんぱく質から開裂される。当業者であれば、シグナルペプチドがポリペプチドのＮ末端に一般的に融合され、完全な又は「全長の」ポリペプチドから開裂されて、分泌型又は「成熟」型のポリペプチドを生成することを知っている。特定の実施形態では、ポリペプチドを分泌に向かわせる能力を保持している、ネイティブなシグナルペプチド又はその配列の機能性誘導体が、ポリペプチドと操作可能に関連付けられる。あるいは、異種シグナルペプチド、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ヘルペス単純ウイルス糖たんぱく質Ｄ（ＨＳＶ  ｇＤ）のシグナルペプチド、成長ホルモンのシグナルペプチド、及びそれらの任意の組み合わせが使用され得る。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、ｔＰＡのシグナルペプチドをコードする核酸配列を更に含む。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（「ＦＬＴ３Ｌ」）又はその一部を含む、異種ポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む。ＦＬＴ３Ｌは、樹状細胞（ＤＣ）の増殖及び成熟を誘引する因子である。この樹状細胞は、抗原に対する免疫応答を向上させることができ、腫瘍抗原と融合された場合、腫瘍を除去する優れた効果を示す。
【００３９】
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して、３’に位置するヌクレオチド配列を意味する。特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置している。
【００４０】
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して、５’に位置するヌクレオチド配列を意味する。特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域又は転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、大部分のプロモーターは、転写開始部位の上流に位置している。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、又はコード領域の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセッシング、安定性、又は翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を意味する。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダ配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造を含み得る。コード領域が真核生物細胞中での発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終了配列は、通常、コード配列に対して３’に位置するであろう。
【００４２】
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上のコード領域と操作可能に関連付けられた、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。操作可能な関連付けにおいては、ある遺伝子産物、例えば、あるポリペプチド用のコード領域は、１つ又は２つ以上の調節領域に対して、その１つ又は複数の調節領域の影響又は制御下において、その遺伝子産物の発現が生じるような様式で関連付けられる。例えば、プロモーター機能の誘引がコード領域によりコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び、プロモーターとコード領域との間の結合の性質が遺伝子産物の発現を行わせるプロモーターの能力と干渉しないか、又は、転写されるＤＮＡテンプレートの能力と干渉しない場合、コード領域及びプロモーターは、「操作可能に関連付けられ」ている。また、プロモーターを除く、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終了シグナルも、遺伝子産物発現を行わせるように、コード領域と操作可能に関連付けられ得る。
【００４３】
各種の転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、脊椎動物細胞中で機能する転写制御領域（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（イントロンＡに関連する中程度の初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない。他の転写制御領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えば、アクチン、ヒートショックたんぱく質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβグロビン、並びに、真核生物細胞中で遺伝子発現を制御可能な他の配列を含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。特定の実施形態では、転写制御領域は、ＳＶ４０ポリＡ、ＳＶ４０エンハンサー、ｐＣＭＶ初期エンハンサー／プロモーター、ウサギβグロビン介在配列（ｇｌＶＳ）、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００４４】
同様に、各種の翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、転写開始コドン及び終了コドン、並びにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを生成するプロセスを意味する。発現には、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子へアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は任意の他のＲＮＡ産物への転写、並びに、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられるが、これらに限定されない。発現により、「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により生成されたメッセンジャーＲＮＡ、であってもよいし、転写産物から翻訳されたポリペプチドであってもよい。本明細書で記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化若しくはスプライシングを含む核酸、又は、翻訳後修飾、例えば、メチル化、糖化、脂質の付加、他のたんぱく質サブユニットとの連結、若しくはたんぱく質分解的開裂を有するポリペプチドを更に含む。
【００４６】
「ベクター」は、核酸のクローニング、及び／又は宿主細胞内への核酸の導入のための任意のビヒクルを意味する。ベクターは、他の核酸セグメントとつなげられ、そのつなげられたセグメントの複製をもたらし得る、レプリコンであってもよい。「レプリコン」は、インビボでの複製の自律ユニットとして機能する、即ち、それ自身の制御下において複製可能な、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味する。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにおいて、核酸を細胞内に導入するためのウイルス及び非ウイルスビヒクルの両方を含む。多くの数のベクターが公知であり、当技術分野において使用されており、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、又は改変細菌ウイルスなどがある。適切なベクター内へのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチドフラグメントを相補的な付着端を有する選択されたベクター内にライゲートすることにより達成され得る。
【００４７】
ベクターは、ベクターを包含している細胞の選択又は識別を提供する選択マーカー又はレポーターをコードするように操作されてもよい。選択マーカー又はレポーターの発現により、ベクター上に含まれる他のコード領域を包含し、発現する、宿主細胞の識別及び／又は選択が可能となる。当技術分野において公知であり、使用される選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を付与する遺伝子、及び、表現型マーカーとして使用される遺伝子、即ち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。当技術分野において公知であり、使用されるレポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。また、選択マーカーは、レポーターであるとも考えることもできる。
【００４８】
「プラスミド」という用語は、多くの場合、細胞の中心代謝の一部でない遺伝子を有し、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある、染色体外エレメントを意味する。このようなエレメントは、任意の起源由来の、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ若しくはヌクレオチド配列、線状、環状、若しくはスーパーコイル状の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡでもよい。同エレメント中には、数多くのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入可能な固有の構築物内に連結され、又は、組み込まれている。
【００４９】
使用され得る真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−たんぱく質複合体、及び生体ポリマーを含む。
【００５０】
「クローニングベクター」は、逐次的に複製し、複製起点を含む単位長さの核酸、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである「レプリコン」を意味する。このレプリコンに対して、別の核酸セグメントがつなげられ、そのつなげられたセグメントの複製がもたらされ得る。特定のクローニングベクターは、ある細胞種、例えば、細菌において複製して、別のもの、例えば、真核生物細胞において発現させることが可能である。クローニングベクターは、典型的には、対象となる核酸配列の挿入用のベクター及び／又は１つ若しくは２つ以上のマルチクローニングサイトを含む細胞の選択に使用され得る１つ又は２つ以上の配列を含む。
【００５１】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞内に挿入された後、挿入された核酸配列を発現させることができるように設計されたビヒクルを意味する。挿入された核酸配列は、上記のように、調節領域と操作可能に関連付けて配置される。
【００５２】
ベクターは、当技術分野において周知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクタミン（リポソーム融合）、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポータにより、宿主細胞内に導入される。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「培養する」、「培養するために」、及び「培養すること」は、細胞が増殖若しくは分裂することが可能なインビトロ条件下において、細胞をインキュベートすること、又は、細胞を生きた状態で維持することを意味する。本明細書で使用する場合、「培養細胞」は、インビトロで増殖した細胞を意味する。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含するように意図されており、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）により直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸からなる１本以上の任意の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。このため、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「たんぱく質」、「アミノ酸鎖」、又は、２つ以上のアミノ酸からなる１本又は複数本の鎖を意味するために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポチペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかに代えて、又は、これらの用語のいずれかと同じ意味で使用され得る。また、「ポリペプチド」という用語では、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を意味することも意図されており、この発現後修飾には、糖化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、たんぱく質分解的開裂、又は非天然アミノ酸による修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物学的起源から得られ、又は、組換え技術により生成され得るが、指定された核酸配列からの翻訳は必ずしも必要ではない。ポリペプチドは、化学合成を含む、任意の方法で生成され得る。
【００５５】
「単離された」ポリペプチド、又は、そのフラグメント、変異体、若しくは誘導体は、その天然の環境にないポリペプチドを意味する。特定のレベルで精製されている必要はない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ又は天然の環境から、単純に取り出され得る。宿主細胞中で発現された、組み換え的に生成されたポリペプチド及びたんぱく質は、本発明の目的で単離されていると考えられ、例えば、任意の適切な方法により、分離され、分画され、又は、部分的若しくは実質的に精製されているネイティブ又は組換えポリペプチドである。
【００５６】
また、本発明には、ポリペプチドのフラグメント又は変異体、及びそれらの任意の組み合わせも含まれる。本発明のポリペプチド結合ドメイン又は結合分子に言及する場合、「フラグメント」又は「変異体」という用語は、参照ポリペプチドの少なくともいくらかの特性を保持している、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドのフラグメントは、本明細書における他の箇所で検討された特定の抗体フラグメントに加えて、たんぱく質分解的フラグメント及び欠失フラグメメントを含むが、天然の全長ポリペプチド（又は成熟したポリペプチド）を含まない。本発明のポリペプチド結合ドメイン又は結合分子の変異体は、上記されたフラグメントを含み、また、アミノ酸置換、欠失、又は挿入により変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドも含む。変異体は、天然のものであってもよいし、又は非天然のものであってもよい。非天然の変異体は、当技術分野において公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加を含み得る。
【００５７】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などがある。このため、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換わっている場合、この置換は、保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸配列が、側鎖のファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる、構造的に類似した配列で保存的に置き換えられ得る。
【００５８】
当技術分野において公知であるように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチド配列に対して比較することにより決定される。本明細書で検討される場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性を有するかどうかは、当技術分野において公知の方法及びコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して決定される。これらは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）を含むが、これに限定されない。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所的なホモロジーアルゴリズムを使用して、２つの配列間のホモロジーの最良のセグメントを見出す。特定の配列が例えば本発明に基づく参照配列に対して９５％の同一性を有するかどうかを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴ又は任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、当然、パラメータは、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列中のアミノ酸の総数の最大５％のホモロジーにおけるギャップが許容されるように設定される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ＧＸ−１８８変形例」、「ＧＸ−１８８の類似体」、「ＧＸ−１８８の変形構築物」、「ＧＸ−１８８の類似構築物」という用語、又は任意の類似する用語は、少なくとも１つの用量の構築物の投与後に、その構築物がＧＸ−１８８（図１Ａ又は配列番号９）の投与後に誘引される細胞性免疫応答に類似する、インビボにおける細胞性免疫応答を誘引することを示す。細胞性免疫応答は、変形構築物がＧＸ−１８８により誘引される細胞性免疫応答と同じか又は同応答より高い細胞性免疫応答を誘引し得る場合、類似し得る。他の実施形態では、細胞性免疫応答は、変形構築物がＧＸ−１８８により誘引される細胞性免疫応答より、少なくとも約０．９倍（例えば、９０％）、約０．８倍、約０．７倍、約０．６倍、約０．５倍、又は約０．４倍高い細胞性免疫応答を誘引する場合、類似し得る。一実施形態において、細胞性免疫応答は、ＣＤ８  Ｔ細胞応答、ＣＤ４  Ｔ細胞応答、サイトカイン分泌、又はそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態では、細胞性免疫応答は、多機能性Ｔ細胞数の増加を含む。特定の実施形態では、多機能性Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、ＣＤ１０７ａ／ｂ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、少なくとも３種類、少なくとも４種類、又は少なくとも５種類のマーカーを示す。
【００６０】
「融合」又は「キメラ」分子は、本来天然には連結されない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。別々のたんぱく質において通常存在するアミノ酸配列が、融合ポリペプチドとして、１つになっていてもよいし、同じたんぱく質において通常存在するアミノ酸配列が、融合ポリペプチド中に新たな配列で存在していてもよい。融合たんぱく質は、例えば、化学合成により、又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされたポリヌクレオチドを作製し、翻訳することにより調製される。キメラたんぱく質は、共有性の非ペプチド結合又は非共有結合により、第１のアミノ酸配列と連結された第２のアミノ酸配列を更に含み得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「分割する」、「分割すること」という用語、又は任意の類似する用語は、概念的な用語であり、アミノ酸配列を、その配列内のアミノ酸のＣ末端において２つのアミノ酸配列に分割することを意味する。例えば、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、２つの部分である、Ｎ末端部とＣ末端部に分割され得る。ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質がアミノ酸８５において２つの部分に分割される場合、Ｎ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸１〜アミノ酸８５を含むことができる一方で、Ｃ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸８６〜１５８を含むことができる。ただし、「分割する」という用語は、Ｎ末端部の境界（即ち、Ｎ末端部のＣ末端）及びＣ末端部の境界（Ｃ末端部のＮ末端）を、たんぱく質を２つの部分に分割する正確なアミノ酸部位に限定しない。例えば、一実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質がアミノ酸８５において２つの部分に分割される場合、Ｎ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸１〜アミノ酸８５を含むことができ、Ｃ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸７１〜１５８を含むことができる。アミノ酸７１〜８５は、Ｎ末端部とＣ末端部との間のオーバーラップ配列であり得る。別の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質がアミノ酸７０において２つの部分に分割される場合、Ｎ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸１〜アミノ酸７０を含む一方で、Ｃ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸７１〜１５８を含む。他の実施形態では、Ｎ末端部は、オーバーラップ配列を含有する。例えば、Ｎ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸１〜アミノ酸８５を含み得る一方で、Ｃ末端部は、配列番号２に対応するアミノ酸７１〜１５８を含み得る。本発明の融合たんぱく質は、その配列に基づいて融合たんぱく質を構築し、ついで、融合たんぱく質をコードするヌクレオチド配列を、合成的に、組換え的に、又は当技術分野において公知の任意の他の方法により調製することにより生成され得る。
【００６２】
「癌」及び「癌性」という用語は、細胞の集団が制御されていない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳類における生理学的状態を意味し、又は、説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜若しくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌（hepatic  carcinoma）、及び種々の種類の頭頸部癌が挙げられる。
【００６３】
「腫瘍（tumor）」及び「新生物（neoplasm）」は、良性（非癌性）又は前癌病変を含む悪性（癌性）のいずれかである、過剰な細胞増殖（growth）又は増殖（proliferation）に起因する組織の任意の塊を意味する。腫瘍は、子宮頸部腫瘍であり得る。具体的な実施形態では、子宮頸部腫瘍は、良性腫瘍又は悪性腫瘍である。特定の実施形態では、子宮頸部腫瘍は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、すりガラス細胞癌、絨毛腺癌（ＶＧＡ）、非癌性悪性腫瘍、メラノーマ、リンパ腫、又は子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）である。一部の実施形態では、子宮頸部腫瘍は、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、又は子宮頸癌である。
【００６４】
「癌細胞」、「腫瘍細胞」という用語、及び文法的な同等物は、腫瘍又は前癌病変に由来する細胞の総集団を意味し、腫瘍細胞集団の大部分を含む非発癌性細胞及び発癌性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む。
【００６５】
本明細書で開示される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの「有効量」は、具体的に記載される目的を行うのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、ルーチン様式において、記載される目的に関して決定され得る。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「治療的な有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要となる用量及び期間において、有効な量を意味する。治療結果は、例えば、症状の減少、生存の延長などであってよい。治療結果は、「治癒」である必要はない。
【００６７】
「処置すること」若しくは「処置」若しくは「処置するため」又は「軽減すること」若しくは「軽減するため」などの用語は、診断された病理状態又は障害の症状を治癒し、遅延させ、減少させ、及び／又は、同状態又は障害の進行を停止させる治療手段を意味する。このため、処置を必要とする対象は、障害を有すると既に診断された対象又は同障害を有すると疑われる対象を含む。
【００６８】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」は、診断、予後、又は治療が望まれる、任意の対象、特に、哺乳類の対象を意味する。哺乳類の対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、競技用の動物、ペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、キャトル、ウシ；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー；イヌ科、例えば、イヌ及びオオカミ；ネコ科、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ；ウマ科、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ；クマ、食用動物、例えば、ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄動物、例えば、シカ及びキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、哺乳類は、ヒトの対象である。
【００６９】
ＩＩ．治療用分子
本発明は、ヒトパピローマウイルスに関連する疾患又は状態における、治療用分子又は治療用分子の使用に関する。本明細書の他の箇所で示されるように、治療用分子は、診断剤としても使用され得る。一態様において、本治療用分子は、２つ以上のたんぱく質を融合させることにより構築され、ここで、このたんぱく質の融合は、それぞれのたんぱく質が２つの部分（Ｎ末端部及びＣ末端部）に分割されるが、依然として各たんぱく質の少なくとも全てのエピトープを含むように行われる。本発明において使用され得るたんぱく質は、少なくとも２つのたんぱく質、少なくとも３つのたんぱく質、少なくとも４つのたんぱく質、又はそれ以上のたんぱく質を含む。特定の実施形態では、治療用分子は、少なくとも４つのたんぱく質、又は、それをコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列を含む。治療用分子が４つのたんぱく質を利用する場合、治療用分子は、８つのポリペプチド部分又はそれらの８つのヌクレオチド配列を含む。４つのたんぱく質から得られた８つの部分（各たんぱく質が２つの部分に分割）は、これらのたんぱく質が、全長たんぱく質と結合する１つ又は２つ以上の腫瘍抑制因子と結合しないか、又は、４つのたんぱく質のいずれかと二量体を形成しないような任意の順序で配置され得る。
【００７０】
本発明の治療用分子に使用される４つのたんぱく質は、ヒトパピローマウイルス型１６（ＨＰＶ１６）のＥ６たんぱく質、ヒトパピローマウイルス型１８（ＨＰＶ１８）のＥ６たんぱく質、並びに、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質であり得る。ただし、ＨＰＶ血清型からの１つ又は２つ以上のＥ６たんぱく質及び１つ又は２つ以上のＥ７たんぱく質の任意の他の組み合わせが可能であり、同血清型は、例えば、高リスク血清型について、ＨＰＶ血清型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、及び８２、低リスク血清型について、ＨＰＶ血清型６、１１、４０、４２、４３、４４、５４、６１、７２、７３、及び８１、又はそれらの任意の組み合わせである。したがって、４つのたんぱく質がそれぞれ、２つの部分に分割又は切断された場合、本治療用分子は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、本発明に使用されるたんぱく質は、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のみに由来する。
【００７１】
ＩＩ．Ａ．ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質
ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、細胞形質転換の誘引及び維持に主要な役割を果たす。Ｅ６たんぱく質は、多くの宿主細胞の重要な調節たんぱく質の破壊を刺激することにより、癌たんぱく質として主に作用する。Ｅ６たんぱく質は、宿主のＥ６−ＡＰユビキチンたんぱく質リガーゼと結合し、腫瘍抑制因子であるｐ５３及びｐ７３を、２６Ｓプロテアソームによる分解の標的とすることにより、不活性化する。ひいては、ＤＮＡ損傷及び染色体不安定化が増大し、細胞増殖及び癌進行をもたらす。
【００７２】
ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質の数多くの配列が報告されている。例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＡＬ９６６３０．１及びＡＢＰ９９７８４．１としてそれぞれ報告されている。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質をコードする野生型ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＦ４８６３２５．１及びＥＦ２０２１５３．１としてそれぞれ報告されている。これらの配列を、表１に再現する。
【００７３】
【表１】
2017525760.tif 000002
【００７４】
本明細書で使用する場合、「ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質」という用語は、その任意の天然の変異体又は機能性変異体を含む。ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の天然の変異体の例には、図１３Ａに列記された配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＧＳ４２３６５．１、ＡＧＳ４２３７２．１、ＡＢＯ１５５７１．１、ＡＧＳ４２３７３．１、ＡＢＫ３２５０９．１、ＡＨＺ９６６９２．１、ＡＡＬ０１３６８．１、ＡＦＳ６４２４３．１、ＡＧＳ４２３７７．１、ＡＧＳ４２３５２．１、ＡＡＤ３３２５２．１、ＡＧＳ４２３１３．１、ＢＡＮ１５９４７．１、ＡＣＫ５７８５３．１、ＮＰ＿０４１３２５．１、ＡＧＳ４２２６９．１、ＡＥＶ６６１２２．１、ＡＧＳ４２２６７．１、ＡＣＬ１２３１０．１、ＡＢＯ６１７４９．１、ＡＡＬ０１３５１．１、ＡＡＶ９１６７６．１、ＡＧＳ４２３４１．１、ＡＧＳ４２３１４．１、ＢＡＮ１５９３７．１、ＡＣＳ９２６９２．１、ＡＡＭ２９１７０．１、ＡＡＱ１０７１２．１、ＡＡＬ９６６２１．１、ＡＡＬ９６６２３．１、ＡＧＳ４２３５３．１、ＡＤＹ７５５７４．１、ＡＡＬ９６６０４．１、ＡＥＶ６６１４０．１、ＡＣＫ５７８７０．１、ＡＣＪ６６７１２．１、ＡＦＳ６４２２７．１、ＡＡＬ９６６１９．１、ＡＡＬ９６６２０．１、ＡＢＯ６１７４７．１、ＡＣＫ５７８５５．１、ＡＤＨ９４０４２．１、ＡＦＳ６４２５２．１、ＡＡＬ９６６１２．１、ＡＦＳ６４２５７．１、ＡＡＬ９６６１４．１、ＡＣＪ６６７１６．１、ＢＡＮ１５９４６．１、ＡＤＹ７５５７３．１、ＡＧＳ４２３１５．１、ＡＡＡ９１６７３．１、ＡＡＡ９１６６９．１、ＡＡＡ９１６７４．１、ＡＡＡ９１６８０．１、ＡＡＡ９１６８１．１、ＡＡＡ９１６６８．１、ＡＡＡ９１６５８．１、ＡＡＡ９１６６２．１、ＡＡＡ９１６６７．１、ＡＡＡ９１６７６．１、ＡＡＡ９１６７１．１、ＡＡＡ９１６５６．１、ＡＡＡ９１６８２．１、ＡＡＡ９１６５７．１、ＡＡＡ９１６６０．１、ＡＡＡ９１６７７．１、ＡＡＡ９１６７８．１、ＡＡＡ９１６７２．１、ＡＡＡ９１６６１．１  ＡＡＡ９１６６４．１、ＡＡＡ９１６７５．１、ＡＡＡ９１６６５．１、ＡＡＡ９１６６３．１、ＡＡＡ９１６５９．１、ＡＡＡ９１６５４．１、ＡＡＡ９１６６６．１、ＡＡＡ９１６７９．１、及びＡＡＡ９１６５５．１。特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、Ｄ１１Ｅ、Ｅ１４Ｄ、Ｒ１５Ｐ、Ｒ１７Ｉ、Ｒ１７Ｔ、Ｒ１７Ｇ、Ｌ１９Ｖ、Ｈ２１Ｑ、Ｈ２１Ｄ、Ｈ２１Ｅ、Ｄ３２Ｎ、Ｄ３２Ｅ、Ｉ３４Ｒ、Ｉ３４Ｌ、Ｉ３４Ｔ、Ｌ３５Ｖ、Ｅ３６Ｑ、Ｖ４９Ｌ、Ｒ５４Ｗ、Ｉ５９Ｖ、Ｒ６２Ｋ、Ｎ６５Ｓ、Ａ６８Ｇ、Ｄ７１Ｅ、Ｉ８０Ｖ、Ｙ８５Ｈ、Ｖ９０Ｌ、Ｐ１０２Ｌ、Ｉ１０８Ｆ、Ｉ１０８Ｘ、Ｅ１２０Ｄ、Ｋ１２２Ｒ、Ｑ１２３Ｅ、Ｒ１３１Ｔ、Ｉ１３５Ｍ、Ｑ１５７Ｌ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ又は２つ以上の置換を含む。
【００７５】
ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の例には、図１３Ｂに列記された配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＡＢ５３０９６．１、ＡＧＵ９０３２７．１、ＡＤＣ３５６６０．１、ＡＨＺ９６６７７．１、ＡＢＰ９９７３６．１、ＡＢＰ９９７０４．１、ＡＨＺ９６６７８．１、ＡＧＭ３４４２５．１、ＡＧＭ３４４２４．１、及びＡＢＰ９９７８４．１。特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、Ｌ１４Ｖ、Ｅ４３Ｇ、Ｙ８０Ｈ、Ｋ１２９Ｎ、Ｈ１３３Ｒ、Ｒ１４４Ｑ、Ｒ１５３Ｈ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ又は２つ以上の置換を含む。
【００７６】
ＩＩ．Ａ．１．ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質
一実施形態において、融合たんぱく質に有用なＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のｐ５３への結合を防ぐために、Ｅ６たんぱく質は、２つの部分である、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部とＥ６たんぱく質のＣ末端部とに分割され、それらはそれぞれ、１つ又は２つ以上のＥ６関連たんぱく質結合部位を含まない。得られた構築物は、Ｅ６たんぱく質の全てのエピトープを含む一方で、完全なＥ６ＡＰ結合部位を含まないため、Ｅ６−ＡＰと複合体を形成できない。一実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＥ６−ＡＰ結合部位は、配列番号２に対応する、Ｌ３５〜Ｙ３９、Ｌ５７〜Ｒ６２、Ｖ６９〜Ｙ８５、Ｃ８７、Ｙ８８、Ｑ９８、Ｙ９９、Ｌ１０７、Ｒ１０９、Ｑ１１４、及びＲ１３６を含む。別の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＥ６−ＡＰ結合部位は、配列番号２に対応するＬ３５〜Ｒ１３６を含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部は、ａ〜ｂのアミノ酸配列（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）を有し、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、ｃ〜ｄのアミノ酸配列（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）を有し、ここで、ａは、配列番号２に対応するアミノ酸１又は２であり、ｂは、配列番号２に対応するアミノ酸３５〜１３５から選択されるアミノ酸であり、ｃは、配列番号２に対応する、アミノ酸３６以上のアミノ酸及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｄは、配列番号２に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００７７】
ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸２２ＬＥＵ、２３ＣＹＳ、４１ＬＹＳ、４２ＧＬＮ、４３ＧＬＮ、４５ＬＥＵ、４６ＡＲＧ、４７ＡＲＧ、４９ＶＡＬ、５０ＴＹＲ、５１ＡＳＰ、５３ＡＬＡ、５４ＰＨＥ、５７ＬＥＵ、７１ＡＳＰ、７４ＬＥＵ、７５ＬＹＳ、７６ＰＨＥ、７８ＳＥＲ、７９ＬＹＳ、８０ＩＬＥ、８２ＧＬＵ、８３ＴＹＲ、８４ＡＲＧ、８５ＴＹＲ、８６ＴＹＲ、又は９９ＴＹＲにおいて、ｐ５３と相互作用し得る。ｐ５３上の対応する相互作用部位は、ｐ５３の１１０ＡＲＧ、１１１ＬＥＵ  １１２ＧＬＹ、１１３ＰＨＥ、１１４ＬＥＵ、１１５ＨＩＳ、１１６ＳＥＲ、１２４ＣＹＳ、１２６ＴＹＲ、１２８ＰＲＯ、１３１ＡＳＮ、１４２ＰＲＯ、１４４ＧＬＮ  １４６ＴＲＰ、２２９ＣＹＳ、及び２３１ＴＨＲを含み得る。したがって、特定の実施形態では、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ６たんぱく質を、配列番号２に対応するアミノ酸２２〜９８から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明の融合たんぱく質は、別のＥ６たんぱく質との相互作用を防止することにより、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質と二量体を形成しない。Ｅ６たんぱく質がｐ５３を分解するためには、別のＥ６たんぱく質と二量体を形成する必要がある。したがって、Ｅ６たんぱく質上の二量体形成部位を破壊することにより、Ｅ６たんぱく質は、もはやｐ５３を分解することができない。ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するＱ４２、Ｋ７２、Ｆ７６、及びＹ７７において、直接的に相互作用することにより、別のＥ６たんぱく質と二量体を形成する。一実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ６たんぱく質を、配列番号２に対応するアミノ酸４２〜７６から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）及びＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、ａは、配列番号２に対応するアミノ酸１又は２であり、ｂは、配列番号２に対応するアミノ酸４２〜７６から選択されるアミノ酸であり、ｃは、配列番号２に対応する、アミノ酸４３以上のアミノ酸及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｄは、配列番号２に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００７９】
ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質が別のＥ６たんぱく質と二量体を形成するためには、Ｅ６たんぱく質が、そのジンクフィンガーモチーフ１中に亜鉛を包含する必要がある。ジンクフィンガーモチーフ１が亜鉛を包含していない場合、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、もはや二量体を形成できない。特に、配列番号２に対応するアミノ酸３７、４０、７０、及び７３に位置するジンクフィンガーモチーフ１の４つのシステインは、亜鉛と直接相互作用する。一実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部は、ジンクフィンガーモチーフ１内に１つのシステイン、２つのシステイン、又は３つのシステインのみを含有し、一方で、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、ジンクフィンガーモチーフ１内に３つのシステイン、２つのシステイン、又は１つのシステインをそれぞれ含有する。別の実施形態では、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ６たんぱく質を、配列番号２に対応するアミノ酸３７〜７２から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）及びＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、ａは、配列番号２に対応するアミノ酸１又は２であり、ｂは、配列番号２に対応するアミノ酸３７〜７２から選択されるアミノ酸であり、ｃは、配列番号２に対応する、アミノ酸３８以上のアミノ酸及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｄは、配列番号２に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００８０】
一部の実施形態では、融合たんぱく質は、１６Ｅ６Ｎａ−ｂ及び１６Ｅ６Ｃｃ−ｄを含み、ここで、配列番号２に対応して、ａがアミノ酸１又は２であり、ｄがアミノ酸１５７又は１５８であり、ｂ及びｃが以下の通り、即ち、ｂがアミノ酸残基３５であり、ｃがアミノ酸残基３６であるか；ｂがアミノ酸残基３６であり、ｃがアミノ酸残基３６又は３７であるか；ｂがアミノ酸残基３７であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、又は３８であるか；ｂがアミノ酸残基３８であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、３８、又は３９であるか；ｂがアミノ酸残基３９であり、ｃがアミノ酸残基３６、３７、３８、３９、又は４０であるか；ｂがアミノ酸残基４０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜４９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基４９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜５９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基５９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜６９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基６９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基７９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜８９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基８９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜９９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基９９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１００から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１００であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１０９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１０９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１１９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１１９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２５から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２６から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２６であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２７から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２７であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２８から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２８であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１２９から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１２９であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３０から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１３０であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３１から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１３１であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３２から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１３２であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３３から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１３３であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３４から選択されるアミノ酸であるか；ｂがアミノ酸残基１３４であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３５から選択されるアミノ酸であるか；又は、ｂがアミノ酸残基１３５であり、ｃがアミノ酸残基３６〜１３６から選択されるアミノ酸である。
【００８１】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、互いにアライメントさせた場合、オーバーラップ配列を含有する。オーバーラップ配列は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の、少なくとも１、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、又は１２０個のアミノ酸であり得る。Ｎ末端部又はＣ末端部は、オーバーラップ配列を含有し得るが、Ｎ末端部又はＣ末端部はいずれも、完全なＥ６ＡＰ結合ドメイン、例えば、配列番号２に対応するアミノ酸３５〜１３６を含まない。
【００８２】
複合体Ｅ６／Ｅ６−ＡＰは、宿主のＮＦＸ１−９１であるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の抑制因子を含む複数の他の基質を、プロテアソームによる分解の標的とする。結果として引き起こされるｈＴＥＲＴの発現の増加により、テロメア長の短縮が妨がれ、細胞の不死化がもたらされる。Ｂａｋ、Ｆａｓ関連死ドメイン含有たんぱく質（ＦＡＤＤ）、及びプロカスパーゼ８を含む他の細胞ターゲットは、Ｅ６／Ｅ６−ＡＰにより分解され、アポトーシスの阻害を引き起こす。また、Ｅ６たんぱく質は、宿主のＩＲＦ３及びＴＹＫ２と相互作用することにより、免疫応答を阻害する。これらの相互作用は、ＩＲＦ３転写活性を妨げ、ＴＹＫ２媒介性ＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化をインターフェロンアルファにより阻害し、インターフェロンシグナル伝達経路の阻害をもたらす。したがって、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質を、融合たんぱく質が、ｐ５３以外の１種類又は２種類以上の基質、例えば、ｈＴＥＲＴの抑制因子、Ｂａｋ、ＦＡＤＤ、プロカスパーゼ８などに結合することができず、又は、宿主のＩＲＦ３及びＴＹＫ２と相互作用することができないように、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部と、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部とに分割することができる。
【００８３】
ＩＩ．Ａ．２．ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質
融合たんぱく質に有用なＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のｐ５３への結合を防ぐために、Ｅ６たんぱく質は、２つの部分である、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部とＥ６たんぱく質のＣ末端部とに分割され、それらはそれぞれ、１つ又は２つ以上のＥ６関連たんぱく質結合部位を含まない。一実施形態において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＥ６−ＡＰ結合部位は、配列番号４に対応する、Ｉ３０〜Ｙ３４、Ｌ５２〜Ｒ５７、Ａ６４〜Ｙ８０、Ｓ８２、Ｄ８３、Ｌ９３、Ｔ９４、Ｌ１０２、Ｒ１０４、Ｑ１０９、及びＡ１３１を含む。別の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＥ６−ＡＰ結合部位は、配列番号４に対応するＩ３０〜Ａ１３１を含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部は、ａ〜ｂのアミノ酸配列（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）を有し、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、ｃ〜ｄのアミノ酸配列（１６Ｅ６Ｃｋ−ｌ）を有し、ここで、ｉは、配列番号４に対応するアミノ酸１又は２であり、ｊは、配列番号４に対応するアミノ酸３０〜１３０から選択されるアミノ酸であり、ｋは、配列番号４に対応する、アミノ酸３１以上のアミノ酸及びアミノ酸ｊ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｌは、配列番号４に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００８４】
ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号４に対応するアミノ酸１７ＬＥＵ、１８ＣＹＳ、３６ＬＹＳ、４４ＶＡＬ、４５ＰＨＥ、４６ＧＬＵ、４８ＡＬＡ、４９ＰＨＥ、５２ＬＥＵ、６６ＨＩＳ、６９ＩＬＥ、７０ＡＳＰ、７１ＰＨＥ、７３ＳＥＲ、７４ＡＲＧ、７５ＩＬＥ、７７ＧＬＵ、７８ＬＥＵ、７９ＡＲＧ、８０ＴＹＲ、又は８１ＴＹＲにおいて、ｐ５３と相互作用し得る。ｐ５３上の対応する相互作用部位は、ｐ５３の１１０ＡＲＧ、１１１ＬＥＵ  １１２ＧＬＹ、１１３ＰＨＥ、１１４ＬＥＵ、１１５ＨＩＳ、１１６ＳＥＲ、１２４ＣＹＳ、１２６ＴＹＲ、１２８ＰＲＯ、１３１ＡＳＮ、１４２ＰＲＯ、１４４ＧＬＮ、１４６ＴＲＰ、２２９ＣＹＳ、及び２３１ＴＨＲを含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ６たんぱく質を、配列番号４に対応するアミノ酸１７〜８０から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の融合たんぱく質は、別のＥ６たんぱく質との相互作用を防止することにより、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号４に対応するＴ３７、Ｋ６７、Ｆ７１、及びＹ７２において、直接的に相互作用することにより、別のＥ６たんぱく質と二量体を形成する。したがって、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質を、配列番号４に対応するアミノ酸３７〜７１から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１８のＥ６のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ）を含み、ここで、ｉは、配列番号４に対応するアミノ酸１又は２であり、ｊは、配列番号４に対応するアミノ酸３７〜７１から選択されるアミノ酸であり、ｋは、配列番号４に対応する、アミノ酸３８以上のアミノ酸及びアミノ酸ｊ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｌは、配列番号４に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００８６】
ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質が別のＥ６たんぱく質と二量体を形成してｐ５３を分解するためには、Ｅ６たんぱく質が、そのジンクフィンガーモチーフ１中に亜鉛を包含する必要がある。したがって、ジンクフィンガーモチーフ１が亜鉛を包含していない場合、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、もはや二量体を形成できない。特に、配列番号４に対応するアミノ酸３２、３５、６５、及び６８に位置するジンクフィンガーモチーフ１の４つのシステインは、亜鉛と直接相互作用する。一実施形態において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部は、ジンクフィンガーモチーフ１内に１つのシステイン、２つのシステイン、又は３つのシステインのみを含有し、一方で、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、ジンクフィンガーモチーフ１内に３つのシステイン、２つのシステイン、又は１つのシステインをそれぞれ含有する。別の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ６たんぱく質を、配列番号４に対応するアミノ酸３２〜６７から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、ｉは、配列番号４に対応するアミノ酸１又は２であり、ｊは、配列番号４に対応するアミノ酸３２〜６７から選択されるアミノ酸であり、ｋは、配列番号４に対応する、アミノ酸３３以上のアミノ酸及びアミノ酸ｊ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｌは、配列番号４に対応するアミノ酸１５７又は１５８である。
【００８７】
一部の実施形態では、融合たんぱく質は、１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ及び１８Ｅ６Ｃｋ−ｌを含み、ここで、配列番号４に対応して、ｉは、アミノ酸１又は２であり、ｌは、アミノ酸１５７又は１５８であり、ｊ及びｋは、以下の通り、即ち、ｊがアミノ酸残基３０であり、ｋがアミノ酸残基３１であるか；ｊがアミノ酸残基３１であり、ｋがアミノ酸残基３１又は３２であるか；ｊがアミノ酸残基３２であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、又は３３であるか；ｊがアミノ酸残基３３であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、３３、又は３４であるか；ｊがアミノ酸残基３４であり、ｋがアミノ酸残基３１、３２、３３、３４、又は３５であるか；ｊがアミノ酸残基３５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜３６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基３６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜３７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基３７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜３８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基３８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜３９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基３９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜４９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基４９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜５９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基５９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜６９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基６９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基７９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜８９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基８９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜９９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基９９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１００から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１００であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１０９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１０９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１１９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１１９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２０から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２１から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２１であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２２から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２２であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２３から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２３であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２４から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２４であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２５から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２５であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２６から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２６であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２７から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２７であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２８から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２８であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１２９から選択されるアミノ酸であるか；ｊがアミノ酸残基１２９であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１３０から選択されるアミノ酸であるか；又は、ｊがアミノ酸残基１３０であり、ｋがアミノ酸残基３１〜１３１から選択されるアミノ酸である。
【００８８】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部は、互いにアライメントさせた場合、オーバーラップ配列を含有する。オーバーラップ配列は、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の、少なくとも１、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、又は１２０個のアミノ酸であり得る。Ｎ末端部又はＣ末端部は、オーバーラップ配列を含有し得るが、Ｎ末端部又はＣ末端部はいずれも、完全なＥ６ＡＰ結合ドメイン、例えば、配列番号４に対応するアミノ酸３０〜１３１を含まない。
【００８９】
加えて、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質を、融合たんぱく質が、ｐ５３以外の１種類又は２種類以上の基質、例えば、ｈＴＥＲＴの抑制因子、Ｂａｋ、ＦＡＤＤ、プロカスパーゼ８などに結合することができず、又は、宿主のＩＲＦ３及びＴＹＫ２と相互作用することができないように、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部と、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部とに分割することができる。
【００９０】
ＩＩ．Ｂ．ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質
ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、形質転換及びトランス活性化活性の両方を有する。これらのＥ７たんぱく質は、宿主の網膜芽細胞腫たんぱく質ＲＢ１／ｐＲｂの機能を破壊する。ＲＢ１／ｐＲｂは、細胞周期の重要な調節因子である。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、ＲＢ１からのＥ２Ｆ１転写因子の分解を誘引する。同因子は、Ｅ２Ｆ１調節Ｓ期遺伝子のその後の転写を活性化する。細胞周期を停止させるＲＢ１の能力の活性化は、細胞形質転換に重要である。制御されない細胞成長及び増殖が、ウイルス感染により誘引される。Ｇ１からＳ期への進行の刺激は、ウイルスが、細胞内ＤＮＡ複製機構を効率的に使用して、ウイルスゲノム複製を達成することを可能にする。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、ＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ２により媒介されるヒストン脱アセチル化と干渉し、転写の活性化をもたらす。
【００９１】
ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質の数多くの配列が報告されている。例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号６）及びＡＢＰ９９７８５．１（配列番号８）としてそれぞれ報告されている。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質をコードする野生型のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００１５２６．２（配列番号５）及びＥＦ２０２１５３．１（配列番号７）としてそれぞれ報告されている。これらの配列を、表２に再現する。
【００９２】
【表２】
2017525760.tif 000003
【００９３】
本明細書で使用する場合、「ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質」という用語は、その任意の天然の変異体又は機能性変異体を含む。ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の天然の変異体の例には、図１３Ｃ〜Ｄに列記されたたんぱく質が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＡＢ７０７３８．１、ＡＣＮ２２５５５．１、ＡＢＫ３２５１０．１、ＡＡＬ９６６４９．１、ＡＢＣ５４５７３．１、ＡＣＮ２２５５４．１、ＡＡＬ９６６３１．１、ＡＢＫ３２５１２．１、ＡＣＪ６６７１３．１、ＡＡＬ９６６５０．１、ＡＢＫ３２５１１．１、ＡＤＹ７５５７６．１、ＡＡＭ０３０２５．１、ＡＡＬ９６６３４．１、ＡＡＬ６６７３６．１、ＡＦＵ０６６５４．１、ＡＦＵ０６６５０．１、ＡＢＬ９６５８５．１、ＡＤＨ９４０４３．１、ＡＦＵ０６６６２．１、ＡＡＯ１５６９２．１、ＡＦＵ０６６７６．１、ＡＦＵ０６５９４．１、ＡＡＦ１３３９５．１、ＡＦＪ１９５１６．１、ＡＦＪ１９７２０．１、ＡＦＪ１９７１２．１、ＡＧＯ０４５０４．１、ＡＦＪ１９７７０．１、ＡＦＪ１９５２０．２、ＡＦＪ１９７７８．１、ＡＢＬ９６５８６．１、ＡＦＪ１９６９４．１、ＡＦＪ１９６８６．１、ＡＦＪ１９７７４．１、ＡＦＪ１９７０８．１、ＡＢＬ９６５８７．１、ＡＦＪ１９６７４．１、ＡＦＪ１９７０４．１、ＡＧＯ０４４８８．１、ＡＢＬ９６５９１．１、ＡＦＪ１９７４８．１、ＡＧＯ０４４９８．１、ＡＧＯ０４４９６．１、ＡＦＪ１９６８４．１、ＡＦＪ１９６７８．１、ＡＧＯ０４４８４．１、ＡＦＪ１９６９８．１、ＡＦＪ１９７７６．１、ＡＦＪ１９７４６．１、ＡＦＪ１９７２６．１、ＡＦＪ１９７２２．１、ＡＦＪ１９７５２．１、ＡＦＪ１９７３２．１、ＡＦＪ１９７６２．１、ＡＦＪ１９６６８．１、ＡＦＪ１９６６４．１、ＡＦＪ１９７６６．１、ＡＦＪ１９７５６．１、ＡＦＪ１９６８０．１、ＡＦＪ１９７７２．１、ＡＦＪ１９６９６．１、ＡＦＪ１９６９０．１、ＡＧＯ０４４９６．１、及びＡＣＱ９０２１６．１。特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、Ｐ６Ｓ、Ｔ７Ｋ、Ｅ１０Ｋ、Ｍ１２Ｋ、Ｄ１４Ｇ、Ｌ１５Ｖ、Ｔ２０Ｉ、Ｔ２０Ｓ、Ｙ２３Ｈ、Ｙ２３Ｃ、Ｙ２３Ｎ、Ｃ２４Ｓ、Ｙ２５Ｄ、Ｅ２６Ｖ、Ｑ２７Ｈ、Ｌ２８Ｓ、Ｌ２８Ｆ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ２９Ｙ、Ｎ２９Ｈ、Ｎ２９Ｐ、Ｄ３０Ｈ、Ｄ３０Ｆ、Ｓ３１Ｎ、Ｓ３１Ｒ、Ｅ３３Ｄ、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ３６Ｈ、Ｅ３７Ｇ、Ｉ３８Ｋ、Ｄ３９Ｅ、Ｄ３９Ｎ、Ｇ４０Ｃ、Ｐ４１Ｑ、Ａ４２Ｄ、Ａ４２Ｔ、Ｇ４３Ｅ、Ｅ４６Ｋ、Ｄ４８Ｖ、Ｒ４９Ｇ、Ａ５０Ｖ、Ｈ５１Ｌ、Ｎ５３Ｋ、Ｎ５３Ｔ、Ｉ５４Ｎ、Ｖ５５Ｉ、Ｔ５６Ｉ、Ｃ５８Ｙ、Ｋ６０Ｒ、Ｋ６０Ｍ、Ｃ６１Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｓ６３Ｆ、Ｌ６５Ｐ、Ｒ６６Ｗ、Ｌ６７Ｍ、Ｌ６７Ｆ、Ｌ６７Ｓ、Ｑ７０Ｒ、Ｈ７３Ｌ、Ｈ７３Ｒ、Ｖ７４Ｌ、Ｒ７７Ｃ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ７７Ｓ、Ｔ７８Ａ、Ｅ８０Ｙ、Ｄ８１Ｇ、Ｌ８２Ｐ、Ｌ８２Ｍ、Ｍ８４Ｔ、Ｍ８４Ｉ、Ｇ８５Ｄ、Ｇ８５Ｓ、Ｇ８５Ａ、Ｔ８６Ａ、Ｔ８６Ｉ、Ｖ９０Ｍ、Ｃ９１Ｓ、Ｑ９６Ｒ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ又は２つ以上の置換を含む。
【００９４】
ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＧＵ９０４１６．１、ＡＧＵ９０３８４．１、ＣＡＢ５３０９７．１、Ｐ０６７８８．２、ＡＢＰ９９７４５．１、ＣＡＢ５３０９８．１、ＣＡＢ５３０９９．１、ＡＤＣ３５６６１．１、ＡＢＰ９９７８５．１、及びＰ０６７８８．２．１が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、Ｄ１０Ｎ、Ｅ２０Ｄ、Ｄ２４Ｇ、Ｅ３５Ｋ、Ｅ７３Ｋ、Ｒ８４Ｇ、Ｓ９２Ｎ、Ｓ９２Ｋ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ又は２つ以上の置換を含む。
【００９５】
ＩＩ．Ｂ．１．ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質
一実施形態において、融合たんぱく質に有用なＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の、ｐＲｂへの結合を防止するために、Ｅ７たんぱく質を、２つの部分、即ち、Ｅ７たんぱく質のＮ末端部とＥ７たんぱく質のＣ末端部とに分割することができ、それらはそれぞれ、１つ又は２つ以上のｐＲｂ結合部位を含まず、一方で、Ｎ末端部及びＣ末端部は、アライメントさせた場合、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の完全な配列を含む。ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質上のｐＲｂ結合部位は、Ｅ７たんぱく質のＣＲ２ドメイン及びＣＲ３ドメインを含む。一実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のｐＲｂ結合部位は、配列番号６に対応する、Ｅ１８〜Ｄ３９、Ｑ４４〜Ｐ９８、又はＥ１８〜Ｐ９８を含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部は、ｅ〜ｆのアミノ酸配列（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）を有し、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部は、ｇ〜ｈのアミノ酸配列（１６Ｅ６Ｃｇ−ｈ）を有し、ここで、ｅは、配列番号６に対応するアミノ酸１又は２であり、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸１８〜９７から選択されるアミノ酸であり、ｇは、配列番号６に対応する、アミノ酸１９以上のアミノ酸及びアミノ酸ｆ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｈは、配列番号６に対応するアミノ酸９７又は９８である。
【００９６】
ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸５１ＨＩＳ、５２ＴＹＲ、５３ＡＳＮ、６３ＳＥＲ、６４ＴＨＲ、６５ＬＥＵ、６６ＡＲＧ、６７ＬＥＵ、６８ＣＹＳ、６９ＶＡＬ、７０ＧＬＮ、８０ＧＬＵ、８２ＬＥＵ、８３ＬＥＵ、８７ＬＥＵ、８９ＩＬＥ、９０ＶＡＬ、９２ＰＲＯ、９３ＩＬＥ、９５ＳＥＲ、９７ＬＹＳ、又は９８ＰＲＯにおいて、ｐＲｂと相互作用し得る。ｐＲｂ上の対応する相互作用部位は、ｐＲｂの３７８ＶＡＬ、３７９ＭＥＴ、３８０ＡＳＮ、３８１ＴＨＲ、３８２ＩＬＥ、３８３ＧＬＮ、３８４ＧＬＮ、３８７ＭＥＴ、３８８ＩＬＥ、３９０ＡＳＮ、４９７ＴＨＲ、４９８ＴＹＲ、４９９ＳＥＲ、５００ＡＲＧ、５０１ＳＥＲ、５０３ＳＥＲ、及び５３１ＶＡＬを含む。したがって、特定の実施形態では、Ｅ７たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質を、配列番号６に対応するアミノ酸５１〜９７から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成され得る。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明の融合たんぱく質は、別のＥ７たんぱく質との相互作用を防止することにより、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、α１へリックス（７３ＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭ８４）（配列番号１６）、β２シート（６４ＴＬＲＬＣＶＱＳ７１）（配列番号１７）、及び／又はβ１シート（４８ＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣ５８）（配列番号１８）において、直接相互作用することにより、別のＥ７たんぱく質と二量体を形成する。したがって、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質のα１へリックス、β２シート、又はβ１シートを破壊するために、２つの部分に分割され得る。一部の実施形態では、Ｅ６たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質を、ＣＲ３ドメインを破壊し得るアミノ酸において、即ち、配列番号６に対応するアミノ酸４４〜９７から選択されるアミノ酸のＣ末端において分割することにより生成される。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎｅ−ｆ）及びＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、ｅは、配列番号６に対応するアミノ酸１又は２であり、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸４４〜９７から選択されるアミノ酸であり、ｇは、配列番号６に対応する、アミノ酸４５以上のアミノ酸及びアミノ酸ｆ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｈは、配列番号６に対応するアミノ酸９７又は９８である。
【００９８】
一部の実施形態では、融合たんぱく質は、１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ及び１６Ｅ７Ｃｇ−ｈを含み、ここで、配列番号６に対応して、ｅがアミノ酸１又は２であり、ｈがアミノ酸９７又は９８であり、ｆ及びｇが以下の通り、即ち、ｆがアミノ酸残基１８であり、ｇがアミノ酸残基１９であるか；ｆがアミノ酸残基１９であり、ｇがアミノ酸残基１９又は２０であるか；ｆがアミノ酸残基２０であり、ｇがアミノ酸残基１９、２０、又は２１であるか；ｆがアミノ酸残基２１であり、ｇがアミノ酸残基１９、２０、２１、又は２２であるか；ｆがアミノ酸残基２２であり、ｇがアミノ酸残基１９、２０、２１、２２、又は２３であるか；ｆがアミノ酸残基２３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜２９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基２９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３３であり、ｇがアミノ酸残基１９  ６〜３４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜３９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基３９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸���基４８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜４９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基４９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜５９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基５９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜６９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基６９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基７９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８０から選択されるアミノ酸���あるか；ｆがアミノ酸残基８０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８７から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８８から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８８であり、ｇがアミノ酸残基１９〜８９から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基８９であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９０から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９０であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９１から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９１であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９２から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９２であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９３から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９３であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９４から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９４であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９５から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９５であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９６から選択されるアミノ酸であるか；ｆがアミノ酸残基９６であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９７から選択されるアミノ酸であるか；又は、ｆがアミノ酸残基９７であり、ｇがアミノ酸残基１９〜９８から選択されるアミノ酸である。
【００９９】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部及びＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部は、互いにアライメントさせた場合、オーバーラップ配列を含有する。オーバーラップ配列は、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の、少なくとも１、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個のアミノ酸であり得る。Ｃ末端部のＮ末端部は、オーバーラップ配列を含有し得るが、Ｎ末端部又はＣ末端部はいずれも、完全なｐＲｂ結合ドメイン、例えば、配列番号６に対応するアミノ酸１８〜９８を含まない。
【０１００】
ＩＩ．Ｂ．２．ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質
特定の実施形態では、融合たんぱく質に有用なＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の、ｐＲｂへの結合を防止するために、Ｅ７たんぱく質を、２つの部分、即ち、Ｅ７たんぱく質のＮ末端部とＥ７たんぱく質のＣ末端部とに分割することができ、それらはそれぞれ、１つ又は２つ以上のｐＲｂ結合部位を含まず、一方で、Ｎ末端部及びＣ末端部は、アライメントさせた場合、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の完全な配列を含む。ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質上のｐＲｂ結合部位は、Ｅ７たんぱく質のＣＲ２ドメイン及びＣＲ３ドメインを含む。一実施形態において、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のｐＲｂ結合部位は、配列番号８に対応する、Ｉ２１〜Ｄ４２、Ｑ４７〜Ｑ１０５、又はＩ２１〜Ｑ１０５を含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部は、ｍ〜ｎのアミノ酸配列（１６Ｅ７Ｎｍ−ｎ）を有し、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部は、ｏ〜ｐのアミノ酸配列（１６Ｅ６ＮＣｏ−ｐ）を有し、ここで、ｍは、配列番号８に対応するアミノ酸１又は２であり、ｎは、配列番号８に対応するアミノ酸２１〜１０４から選択されるアミノ酸であり、ｏは、配列番号８に対応する、アミノ酸２２以上のアミノ酸及びアミノ酸ｎ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｐは、配列番号８に対応するアミノ酸１０４又は１０５である。
【０１０１】
ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、配列番号８に対応するアミノ酸５８ＡＲＧ、５９ＨＩＳ、６０ＴＨＲ、７０ＡＬＡ、７１ＡＲＧ、７２ＩＬＥ、７３ＧＬＵ、７４ＬＥＵ、７５ＶＡＬ、７６ＶＡＬ、７７ＧＬＵ、８７ＧＬＮ、８９ＬＥＵ、９０ＰＨＥ、９４ＬＥＵ、９６ＰＨＥ、９７ＶＡＬ、９９ＰＲＯ、１００ＴＲＰ、１０２ＡＬＡ、１０４ＧＬＮ、及び１０５ＧＬＮにおいて、ｐＲｂと相互作用し得る。ｐＲｂ上の対応する相互作用部位は、ｐＲｂの３７８ＶＡＬ、３７９ＭＥＴ、３８０ＡＳＮ、３８１ＴＨＲ、３８２ＩＬＥ、３８３ＧＬＮ、３８４ＧＬＮ、３８７ＭＥＴ、３８８ＩＬＥ、３９０ＡＳＮ、４９７ＴＨＲ、４９８ＴＹＲ、４９９ＳＥＲ、５００ＡＲＧ、５０１ＳＥＲ、５０３ＳＥＲ、及び５３１ＶＡＬを含む。したがって、特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質を、配列番号８に対応するアミノ酸５８〜１０４から選択されるアミノ酸のＣ末端において、２つの部分に分割することにより生成される。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明の融合たんぱく質は、別のＥ７たんぱく質との相互作用を防止することにより、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、α１へリックス（８０ＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬ９１）、β２シート（７１ＲＩＥＬＶＶＥＳ７８）、及び／又はβ１シート（５５ＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣ６５）において、直接相互作用することにより、別のＥ７たんぱく質と二量体を形成する。したがって、Ｅ７たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質を、Ｅ７たんぱく質のα１へリックス、β２シート、又はβ１シートを破壊するアミノ酸において、２つの部分に分割することにより生成され得る。一部の実施形態では、Ｅ７たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部は、Ｅ７たんぱく質を、ＣＲ３ドメインを破壊するアミノ酸において、即ち、配列番号８に対応するアミノ酸４７〜１０４から選択されるアミノ酸のＣ末端において分割することにより生成される。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質は、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）を含み、ここで、ｍは、配列番号８に対応するアミノ酸１又は２であり、ｎは、配列番号８に対応するアミノ酸２１〜１０４から選択されるアミノ酸であり、ｏは、配列番号８に対応する、アミノ酸２２以上のアミノ酸及びアミノ酸ｎ＋１以下のアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、ｐは、配列番号８に対応するアミノ酸１０４又は１０５である。
【０１０３】
一部の実施形態では、融合たんぱく質は、１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ及び１８Ｅ７Ｃｏ−ｐを含み、ここで、配列番号８に対応して、ｍがアミノ酸１又は２であり、ｐがアミノ酸１０４又は１０５であり、ｎ及びｏが以下の通り、即ち、ｎがアミノ酸残基２１であり、ｏがアミノ酸残基２２であるか；ｎがアミノ酸残基２２であり、ｏがアミノ酸残基２２又は２３であるか；ｎがアミノ酸残基２３であり、ｏがアミノ酸残基２２、２３、又は２４であるか；ｎがアミノ酸残基２４であり、ｏがアミノ酸残基２２、２３、２４、又は２５であるか；ｎがアミノ酸残基２５であり、ｏがアミノ酸残基２２、２３、２４、２５、又は２６であるか；ｎがアミノ酸残基２６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜２７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基２７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜２８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基２８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜２９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基２９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜３９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基３９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜４９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基４９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜５９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基５９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜６９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基６９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜７９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基７９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜８９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基８９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９０から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９０であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９５から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９５であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９６から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９６であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９７から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９７であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９８から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９８であり、ｏがアミノ酸残基２２〜９９から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基９９であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１００から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基１００であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１０１から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基１０１であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１０２から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基１０２であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１０３から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基１０３であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１０４から選択されるアミノ酸であるか；ｎがアミノ酸残基１０４であり、ｏがアミノ酸残基２２〜１０５から選択されるアミノ酸である。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部は、互いにアライメントさせた場合、オーバーラップ配列を含有する。オーバーラップ配列は、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の、少なくとも１、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個のアミノ酸であり得る。Ｎ末端部又はＣ末端部は、オーバーラップ配列を含有し得るが、Ｎ末端部又はＣ末端部はいずれも、完全なｐＲｂ結合ドメイン、例えば、配列番号８に対応するアミノ酸２１〜１０５を含まない。
【０１０５】
ＩＩ．Ｃ．融合たんぱく質
一態様において、本発明の治療用分子は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、若しくは少なくとも８つの部分を含む融合たんぱく質、又は、この融合たんぱく質をコードするヌクレオチド配列であり、この融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、この融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。
【０１０６】
別の態様では、本発明の治療用分子は、２つ以上のアミノ酸配列を含む。例えば、本発明の治療用分子は、８つのアミノ酸配列、又は、この８つのアミノ酸配列をコードする８つのヌクレオチド配列を含み、この８つのアミノ酸配列は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部である。
【０１０７】
他の態様では、本発明の治療用分子は、（ｉ）７つのアミノ酸配列、又は、この７つのアミノ酸配列をコードする７つのヌクレオチド配列（７つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；（ｉｉ）６つのアミノ酸配列、又は、この６つのアミノ酸配列をコードする６つのヌクレオチド配列（６つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；（ｉｉｉ）５つのアミノ酸配列、又は、この５つのアミノ酸配列をコードする５つのヌクレオチド配列（５つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；（ｉｖ）４つのアミノ酸配列、又は、この４つのアミノ酸配列をコードする４つのヌクレオチド配列（４つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；（ｖ）３つのアミノ酸配列、又は、この３つのアミノ酸配列をコードする３つのヌクレオチド配列（３つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；（ｖｉ）２つのアミノ酸配列、又は、３つのアミノ酸配列をコードする３つのヌクレオチド配列（２つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）；又は、（ｖｉｉ）１つのアミノ酸配列、又は、このアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（１つのアミノ酸配列は、８つのポリペプチド部分を含有する）を含み、この８つのポリペプチド部分は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部である。
【０１０８】
一部の実施形態では、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は８つのアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、かつ、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有されるのと同じ数のエピトープ、又は、ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有されるエピトープより多くのエピトープを更に含み得る。
【０１０９】
他の実施形態では、融合たんぱく質中のＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部はそれぞれ、完全なＥ６関連たんぱく質（Ｅ６ＡＰ）結合部位を含まない。更に他の実施形態では、融合たんぱく質は、完全なＥ６ＡＰ結合部位を含まず、同Ｅ６ＡＰ結合部位は、配列番号２（Ｅ６  ＨＰＶ１６）に対応するアミノ酸３５〜１３６、又は、配列番号４（Ｅ６  ＨＰＶ１８）に対応するアミノ酸３０〜１３１を含む。例えば、融合たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸３５〜１３６又は配列番号４に対応するアミノ酸３０〜１３１の連続的な配列を含まない。更に他の実施形態では、融合たんぱく質中のＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部はそれぞれ、完全なＣＲ２ドメイン若しくは完全なＣＲ３ドメインを含まないか、又は、ＣＲ２ドメイン若しくはＣＲ３ドメインのいずれかを含むが、両方は含まない。一部の実施形態では、融合たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸１８〜９８又は配列番号８（Ｅ７  ＨＰＶ１８）に対応するアミノ酸２１〜１０５の連続的な配列を含まない。
【０１１０】
特定の実施形態では、融合たんぱく質は、（ｉ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号２のＮ末端配列（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ａは、配列番号２に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｂは、配列番号２に対応するアミノ酸残基３５〜１３５から選択されるアミノ酸である）、（ｉｉ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号２のＣ末端配列（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｃは、配列番号２に対応する、３６以上のアミノ酸残基及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｄは、配列番号２に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である）、（ｉｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号４のＮ末端配列（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｉは、配列番号４に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｊは、配列番号４に対応するアミノ酸残基３０〜１３０から選択されるアミノ酸である）、（ｉｖ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号４のＣ末端配列（１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｋは、配列番号４に対応する、３１以上のアミノ酸残基及びｊ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｌは、配列番号４に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である）、（ｖ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号６のＮ末端配列（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｅは、配列番号６に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸残基１８〜９７から選択されるアミノ酸である）、（ｖｉ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号６のＣ末端配列（１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｇは、配列番号６に対応する、１９以上のアミノ酸残基及びｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｈは、配列番号６に対応するアミノ酸残基９７又は９８から選択されるアミノ酸である）、（ｖｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号８のＮ末端配列（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｍは、配列番号８に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｎは、配列番号８に対応するアミノ酸残基２１〜１０４から選択されるアミノ酸である）、並びに（ｖｉｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号８のＣ末端配列（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｏは、配列番号８に対応する、２２以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｌが、配列番号８に対応するアミノ酸残基１０４又は１０５から選択されるアミノ酸である）を含み、融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質並びにＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質の少なくとも全てのエピトープを含有する。
【０１１１】
他の実施形態では、融合たんぱく質は、（ｉ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号２のＮ末端配列（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ａは、配列番号２に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｂは、配列番号２に対応するアミノ酸残基３５〜３９、５７〜６２、６９〜８５、８７〜８８、９８〜９９、１０７、１０９、１１４、及び１３５から選択されるアミノ酸である）、（ｉｉ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号２のＣ末端配列（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｃは、配列番号２に対応する、３６以上のアミノ酸残基及びアミノ酸ｂ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｄは、配列番号２に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である）、（ｉｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号４のＮ末端配列（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｉは、配列番号４に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｊは、配列番号４に対応するアミノ酸残基３０〜３４、５２〜５７、６４〜８０、８２〜８３、９３、９４、１０２、１０４、１０９、及び１３０から選択されるアミノ酸である）、（ｉｖ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号４のＣ末端配列（１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｋは、配列番号４に対応する、３１以上のアミノ酸残基及びｊ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｌは、配列番号４に対応するアミノ酸残基１５７又は１５８から選択されるアミノ酸である）、（ｖ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号６のＮ末端配列（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｅは、配列番号６に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸残基１８〜３９及び４４〜９７から選択されるアミノ酸である）、（ｖｉ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号６のＣ末端配列（１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｇは、配列番号６に対応する、１９以上のアミノ酸残基及びｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｈは、配列番号６に対応するアミノ酸残基９７又は９８から選択されるアミノ酸である）、（ｖｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（同末端部は、配列番号８のＮ末端配列（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｍは、配列番号８に対応するアミノ酸残基１又は２から選択されるアミノ酸であり、ｎは、配列番号８に対応するアミノ酸残基２１〜４２及び４７〜１０４から選択されるアミノ酸である）、並びに（ｖｉｉｉ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（同末端部は、配列番号８のＣ末端配列（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｏは、配列番号８に対応する、２２以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であり、ｐが、配列番号８に対応するアミノ酸残基１０４又は１０５から選択されるアミノ酸である）を含み、融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質並びにＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質の少なくとも全てのエピトープを含有する。更に他の実施形態では、ｆは、配列番号６に対応する１８〜３９から選択されるアミノ酸残基であり、ｇは、配列番号６に対応する、１９以上のアミノ酸残基及びｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であるか、又は、ｆは、配列番号６に対応するアミノ酸残基４４〜９７から選択されるアミノ酸残基であり、ｇは、配列番号６に対応する、４５以上のアミノ酸残基及びアミノ酸ｆ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸である。更に他の実施形態では、配列番号８に対応して、ｎは、２１〜４１から選択されるアミノ酸残基であり、ｏは、２２以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸であるか、又は、ｎは、アミノ酸残基４７〜１０４から選択されるアミノ酸残基であり、ｏは、４８以上のアミノ酸残基及びｎ＋１以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸である。更に他の実施形態では、融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６の天然の全長Ｅ６たんぱく質、ＨＰＶ１６の天然の全長Ｅ７たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然の全長Ｅ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然の全長Ｅ７たんぱく質を含まない。
【０１１２】
融合たんぱく質は、これらのたんぱく質の８つの部分を、任意の順序で含み得る。８つの部分の全ての可能性のある組み合わせは、３３，６００通りの可能性を含み、これらは、本願の一部である。一部の実施形態では、融合たんぱく質は、同じたんぱく質からのＮ末端部及びＣ末端部が互いのすぐ隣りに配置されないように構築される。他の実施形態では、融合たんぱく質は、同じＨＰＶ血清型からのＮ末端部及びＣ末端部が互いに隣り合って配置されるように構築される。更に他の実施形態では、異なるたんぱく質（同じＨＰＶ血清型）からのＮ末端部が互いに隣り合って配置され、異なるたんぱく質（同じＨＰＶ血清型）からのＣ末端部が互いに隣り合って配置される。特定の実施形態では、融合たんぱく質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ；（ｉｉ）１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ；（ｉｉｉ）１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；（ｉｖ）１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ；（ｖ）１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ；（ｖｉ）１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；（ｖｉｉ）１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ；又は（ｖｉｉｉ）１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄを含む。一部の実施形態では、（−）は、ペプチド結合である。特定の実施形態では、（−）は、１つ又は２つ以上のアミノ酸である。
【０１１３】
特定の実施形態では、融合たんぱく質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１６Ｅ６Ｎａ−ｂ−１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ−１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ−１６Ｅ７Ｃｇ−ｈ−１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ−１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ−１８Ｅ６Ｃｋ−ｌ−１８Ｅ７Ｃｏ−ｐを含み、ａは、配列番号２のアミノ酸残基１であり、ｂは、配列番号２のアミノ酸残基８５であり、ｃは、配列番号２のアミノ酸残基７１であり、ｄは、配列番号２のアミノ酸残基１５８であり、ｅは、配列番号６のアミノ酸残基１であり、ｆは、配列番号６のアミノ酸残基６５であり、ｇは、配列番号６のアミノ酸残基５１であり、ｈは、配列番号６のアミノ酸残基９８であり、ｉは、配列番号４のアミノ酸残基１であり、ｊは、配列番号４のアミノ酸残基８５であり、ｋは、配列番号４のアミノ酸残基７１であり、ｌは、配列番号４のアミノ酸残基１５８であり、ｍは、配列番号８のアミノ酸残基１であり、ｎは、配列番号８のアミノ酸残基６５であり、ｏは、配列番号８のアミノ酸残基５１であり、ｐは、配列番号８のアミノ酸残基１０５である。一部の実施形態では、融合たんぱく質は、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
他の実施形態では、融合たんぱく質は、異種部分を含む。異種部分は、異種ポリペプチド又は非ポリペプチド部分であり得る。
【０１１５】
異種ポリペプチドの例には、シグナルペプチド、免疫エンハンサーペプチド、又は融合たんぱく質の特性を向上させる任意の他のペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
一実施形態において、融合たんぱく質に融合されるシグナルペプチドには、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のシグナルペプチド、ヘルペス単純ウイルス糖たんぱく質Ｄ（ＨＳＶ  ｇＤ）のシグナルペプチド、成長ホルモンのシグナルペプチド、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、融合たんぱく質に融合されるシグナルペプチドは、配列番号１４に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
別の実施形態では、免疫エンハンサーペプチドには、ＣＤ４０リガンド、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、フラジェリン、ＯＸ４０、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、免疫エンハンサーペプチドは、ＦＬＴ３Ｌである。別の実施形態では、融合たんぱく質は、配列番号１２に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫エンハンサーペプチドに融合される。
【０１１８】
２０１３年８月１日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０１９５９０５号中のポリヌクレオチド又は融合たんぱく質の説明は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
融合たんぱく質、シグナルペプチド、及び免疫エンハンサーペプチドの例を、表３に示す。
【０１２０】
【表３−１】
2017525760.tif 000004
【０１２１】
【表３−２】
2017525760.tif 000005
【０１２２】
ＩＩ．Ｄ．融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチド
本発明の治療用分子は、本明細書で記載される１つ又は２つ以上のたんぱく質分子、又は、このたんぱく質分子をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。一態様において、本発明の治療用分子は、１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＰＮＡ配列を含み得る。
【０１２３】
別の態様では、治療用分子（例えば、融合たんぱく質）をコードするポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。「コドン最適化」という用語は、それが種々の宿主の形質転換のための遺伝子又は核酸分子のコード領域に言及される場合、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを変化させることなく、宿主生物の典型的なコドン利用を反映する遺伝子又は核酸分子のコード領域中のコドンの改変を意味する。このような最適化は、少なくとも１つ又は２つ以上又は相当数のコドンを、その生物の遺伝子により頻繁に使用される１つ又は２つ以上のコドンで置き換えることを含む。
【０１２４】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における違いにより、遺伝子をコードする配列におけるバリエーションが生じ得る。各コドンが３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドが４つの特定の塩基に制限されることから、ヌクレオチドの６４通りの組み合わせが可能であり、そのうちの６１通りによって、アミノ酸がコードされる（残りの３つのコドンは、翻訳を終了するシグナルをコードする）。アミノ酸をコードするコドンを示す「遺伝暗号」を、本明細書において表４として再現する。結果として、多くのアミノ酸が２つ以上のコドンにより指定される。例えば、アラニン及びプロリンといったアミノ酸は、４種類のトリプレットによりコードされ、６種類のトリプレットにより、セリン及びアルギニンがコードされる。一方、トリプトファン及びメチオニンは、１種類のみのトリプレットによりコードされる。この縮退により、ＤＮＡ塩基組成は、そのＤＮＡによりコードされるたんぱく質のアミノ酸配列の変化を伴うことなく、広い範囲にわたって変化し得る。
【０１２５】
【表４】
2017525760.tif 000006
【０１２６】
多くの生物は、伸長中のペプチド鎖に特定のアミノ酸を挿入するためにコードする特定のコドンの使用についてのバイアスを示す。生物間でのコドン利用の差であるコドンの優先度又はコドンバイアスは、遺伝暗号の縮退によりもたらされ、多くの生物間で十分に実証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率に関連し、この翻訳効率は、特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能に依存すると考えられている。細胞における特定のｔＲＮＡの優先性は、一般的には、ペプチド合成中に最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所定の生物中での最適な遺伝子発現のために適合化され得る。
【０１２７】
多様な動物、植物、及び微生物種について、膨大な遺伝子配列が利用可能であることから、コドン利用の相対的な頻度が算出されている。コドン利用表が、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／において利用可能である「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において利用可能である（２０１２年６月１８日に閲覧）。Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。
【０１２８】
各アミノ酸についてのコドン頻度を算出し、ついで、コドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることにより、所定のポリペプチド配列をコードするために、頻度を最適化したランダムなコドンの割り当てを、手作業で行うことができる。加えて、種々のアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが、最適な配列を算出するために使用され得る。
【０１２９】
一実施形態において、治療用分子（例えば、融合たんぱく質）をコードするヌクレオチド配列は、ヒトでの発現用にコドン最適化される。別の実施形態では、治療用分子（例えば、融合たんぱく質）をコードするヌクレオチド配列は、原核生物又は真核生物での発現用にコドン最適化される。
【０１３０】
他の実施形態では、本発明の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部のコドン最適化配列を含む。これらの末端部は、本明細書の別の箇所で記載されている。
【０１３１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記された異種部分（例えば、異種ポリペプチド又は非ペプチド部分）をコードするヌクレオチド配列を更に含む。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（「ＦＬＴ３Ｌ」）若しくはその一部、ｔＰＡのシグナルペプチド、又は両方を含む。更に他の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。
【０１３２】
更に他の実施形態では、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードし、このヌクレオチド配列は、配列番号１３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。更に他の実施形態では、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、免疫性向上ペプチドをコードし、このヌクレオチド配列は、配列番号１１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３３】
ＩＩ．Ｄ．１．転写制御配列
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、少なくとも１つの転写制御配列に操作可能に連結される。本明細書で使用される転写制御配列は、任意の調節ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター配列又はプロモーター−エンハンサーの組み合わせである。同転写制御配列は、操作可能に連結されたコード核酸の効率的な転写及び翻訳を容易にする。遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳類又はウイルスのプロモーター、例えば、構成的又は誘導性プロモーターであり得る。構成的な哺乳類プロモーターには、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ用のプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、及び他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物細胞中で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、及び他のレトロウイルス由来のプロモーター、並びに、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。また、本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘引剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下において、転写及び翻訳を促進するために誘引される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０１３４】
一般的には、転写制御配列は、必要に応じて、転写及び翻訳の開始それぞれに関与する、５’非転写及び５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などを含むであろう。特に、このような５’非転写配列は、操作可能に結合されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。遺伝子発現配列は、場合により必要に応じて、エンハンサー配列又は上流のアクチベーター配列を含む。
【０１３５】
ＩＩ．Ｄ．２．ベクター
また、本発明は、本発明の治療用分子（例えば、融合たんぱく質）をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供する。適切なベクターは、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含む。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、発現ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必須のエレメント、又は、ＲＮＡウイルスベクターの場合には、適切な宿主細胞内に導入されたとき、複製及び翻訳に必須のエレメントを含有する任意の核酸構築物を意味する。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を含み得る。
【０１３７】
本発明の発現ベクターは、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードする、最適化されたポリヌクレオチドを含むであろう。一実施形態において、本融合たんぱく質に最適化されたコード配列は、発現制御配列に操作可能に連結される。本明細書で使用する場合、２つの核酸配列について、それぞれの部分核酸配列が、その機能を保持し得るように、共有結合されている場合は、操作可能に連結されている。コード配列及び遺伝子発現制御配列について、その遺伝子発現制御配列の影響又は制御下において、そのコード配列の発現又は転写及び／若しくは翻訳が行われるように、共有結合されている場合、これらのコード配列及び遺伝子発現制御配列が、操作可能に連結されていると表現される。２つのＤＮＡ配列が、５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、及び、これら２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力と干渉せず、又は、（３）たんぱく質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力と干渉しない場合、これら２つのＤＮＡ配列が操作可能に連結されていると表現される。このため、ある遺伝子発現配列とコード核酸配列について、その遺伝子発現配列がそのコード核酸配列の転写を達成可能であり、これにより、得られた転写産物が所望のたんぱく質又はポリペプチドに翻訳される場合には、その遺伝子発現配列とコード核酸配列は、操作可能に連結されていることになるであろう。
【０１３８】
ウイルスベクターには、下記ウイルス：レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ−４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びに、ＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルスなどのウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において周知の他のベクターを容易に利用することができる。特定のウイルスベクターは、必須でない遺伝子を、対象となる遺伝子で置き換えた、非細胞変性（non-cytopathic）真核生物ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルスを含む。レトロウイルスのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、宿主細胞ＤＮＡ内へのその後のプロウイルス組込みとを含む。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療の臨床試験に承認されてきた。最も有用なものは、複製欠損である（即ち、所望のたんぱく質合成を指示できるが、感染粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このように遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率な形質導入に一般的な有用性を有する。複製欠損のレトロウイルスを生成するための標準的なプロトコル（外来性遺伝子材料をプラスミドに包含する工程、パッケージ細胞株をプラスミドでトランスフェクションする工程、組換えレトロウイルスをパッケージ細胞株により生成する工程、ウイルス粒子を組織培養培地から収集する工程、及びターゲット細胞をウイルス粒子により感染させる工程を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）に提供される。
【０１３９】
一実施形態において、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ関連ウイルスである。アデノ関連ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、広い範囲の細胞型及び種に感染可能である。アデノ関連ウイルスは、熱及び脂肪族溶媒に対する安定性；多様の系統の細胞、例えば、造血細胞中への高い形質導入頻度；重複感染防止の欠損により複数回の形質導入が可能であることなどの利点を更に有する。報告によれば、アデノ関連ウイルスは、ヒトの細胞ＤＮＡ内に、部位特異的方法において組み込むことにより、挿入変異誘発の確率及びレトロウイルス感染の挿入遺伝子発現特性のばらつきを最少化することができる。加えて、野生型のアデノ関連ウイルス感染に続けて、組織培養において、選択圧の不存在下において、１００回を超える継代が行われた。これは、アデノ関連ウイルスのゲノム組込みが比較的安定した事象であることを意味する。また、アデノ関連ウイルスは、染色体外法においても機能し得る。
【０１４０】
他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。この数年の間に、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内での複製及び宿主ゲノムへの組込みができないため、インビボにおいて遺伝子を細胞に送達するために特に有利であることが見出されてきた。しかしながら、宿主細胞に適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で操作可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。商業的な供給元から入手できる一部の一般的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、種々のｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、種々のｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。具体的なプラスミドの更なる例は、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）からの、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０を含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び／又は追加する、標準的な分子生物学的技術を使用して、カスタム設計され得る。
【０１４１】
一部の実施形態では、本発明の融合たんぱく質をコードするプラスミドは、配列番号１５に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１４２】
ＩＩ．Ｄ．３．医薬組成物
本発明の融合たんぱく質又は本発明の単離されたポリヌクレオチドを含有する組成物は、適切な薬学的に許容され得る担体を含有し得る。例えば、この担体は、活性化合物の作用部位への送達用に設計された調製物への加工を容易にする、賦形剤及び／又は補助剤を含有し得る。
【０１４３】
医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（即ち、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内）用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位用量形態で、例えば、アンプル、又は、保存剤が添加されたマルチドーズ容器にて提供され得る。本組成物は、例えば、油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳液などの形態であってよく、調合剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤を含有していてもよい。あるいは、有効成分は、適切なビヒクル、例えば、パイロジェンフリー水による構成のために、粉末状であることができる。
【０１４４】
また、非経口投与に適した製剤は、水溶性形態における活性化合物、例えば、水溶性塩の水溶液を含む。加えて、適切な油状注射懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤が投与され得る。適切な脂溶性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリド類を含む。水性注射用懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及びデキストランなどの、懸濁剤の粘度を増大させる物質を含有し得る。場合により、懸濁剤は、安定化剤も含有し得る。また、細胞又は間質腔内への送達のために、リポソームを用いて、本発明の分子を被包してもよい。例示的な薬学的に許容され得る担体は、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。一部の実施形態では、本組成物は、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、又は塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、本組成物は、薬学的に許容され得る物質、例えば、湿潤剤又は少量の補助剤、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、保存剤、又は緩衝液を含む。これらは、有効成分の有効期間又は有効性を向上させる。
【０１４５】
本発明の組成物は、各種の形態であってよく、例えば、液状（例えば、注射用及び注入用の溶液）、分散液、懸濁液、半固体、及び固体の用量形態を含む。好ましい形態は、投与方式及び治療用途により決まる。
【０１４６】
本組成物は、液剤、マイクロ乳剤、分散剤、リポソーム剤、又は高薬剤濃度に適した他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射用液は、必要量の有効成分を、必要に応じて上記で列挙された成分のうちの１つ又はその組み合わせと合わせて、適切な溶媒中に混合し、続けて、滅菌ろ過することにより調製され得る。一般的には、分散剤は、有効成分を、基剤である分散媒体と上記で列記されたもののうち必要な他の成分とを含有する無菌のビヒクルと混合することにより調製される。無菌の注射用液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過された溶液から、有効成分と任意の更なる所望の成分との粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。液剤の適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、及び、界面活性剤の使用により維持され得る。例えば、モノステアリン酸塩又はゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に含めることによって、注射用組成物の吸収を持続させることができる。
【０１４７】
有効成分は、徐放性製剤又はデバイスと共に製剤化され得る。このような製剤及びデバイスの例は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む。生分解性で、生体適合性のポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。このような製剤及びデバイスを調製するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１４８】
注射用デポ剤は、薬剤のマイクロカプセル化マトリクスを生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド中に形成することにより調製され得る。薬剤とポリマーの比及び利用されるポリマーの性質に応じて、薬剤放出の速度が制御され得る。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステル及びポリ無水物である。また、注射用デポ剤は、薬剤を、リポソーム又はマイクロエマルジョン中に捕捉することにより調製され得る。
【０１４９】
補助的な活性化合物が、本組成物に包含され得る。一実施形態において、本発明の融合たんぱく質又はこのたんぱく質をコードするポリヌクレオチドは、別のＨＰＶ治療剤と共に製剤化される。
【０１５０】
一実施形態において、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドは、注射用の保存液（０．２ｍｇ／ｍＬ塩化カリウム、１．４４ｍｇ／ｍＬ第１リン酸ナトリウム（無水物）、０．２４ｍｇ／ｍＬ第１リン酸カリウム（無水物、結晶）、及び８ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５〜７．９）と共に製剤化される。
【０１５１】
投与計画は、最適で所望の応答を提供するように調節され得る。例えば、単回のボーラスが投与されることができ、複数に分割した用量が経時的に投与されることができ、又は、用量は、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に減少され、又は、増大されることができる。投与の容易性及び用量の均一性のために、単位用量形態で、非経口組成物を製剤化することが有利である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９８０）を参照のこと。
【０１５２】
また、適切な薬学的担体の非限定的な例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤の一部の例は、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。また、本組成物は、ｐＨ緩衝試薬及び湿潤又は乳化剤も含有し得る。
【０１５３】
経口投与のために、医薬組成物は、従来の手法により調製された錠剤又はカプセル剤の形態をとり得る。また、本組成物は、シロップ剤又は懸濁剤などの液剤としても調製され得る。液剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化食用脂）、乳濁化剤（レシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は分画植物油）、及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）を含み得る。また、調製物は、着香剤、着色剤、及び甘味料も含み得る。あるいは、本組成物は、水又は別の適切なビヒクルによる構成のための乾燥生成物として提供され得る。
【０１５４】
バッカル投与のために、本組成物は、従来のプロトコルに従って、錠剤又はロゼンジ剤の形態をとり得る。
【０１５５】
吸入による投与のために、本発明に基づく使用のための化合物は、賦形剤の有無を問わない噴霧エアロゾルの形態で、又は、場合により噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスを含む加圧パック又は噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で都合良く送達される。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、計量された量を送達するバルブを設けることにより決定され得る。吸入器又は注入器に使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジが、化合物と適切な粉末ベース、例えば、ラクトース又はデンプンとの粉末混合物を含有して製剤化され得る。
【０１５６】
また、本医薬組成物は、例えば、従来の坐剤ベース、例えば、ココアバター又は他のグリセリドを含有させて、坐剤又は保持浣腸剤として、直腸投与用にも製剤化され得る。
【０１５７】
一実施形態において、医薬組成物は、融合たんぱく質、この融合たんぱく質をコードする最適化されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、又はこのベクターを含む宿主細胞と、薬学的に許容され得る担体とを含む。一部の実施形態では、本組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下腔内投与、硬膜下投与、及び経口投与からなる群から選択される経路により投与される。非経口投与は、静脈内又は皮下投与であり得る。
【０１５８】
特定の実施形態では、本医薬組成物は、例えば、エレクトロポレーションにより処方される。
【０１５９】
ＩＩＩ．診断及び処置方法
本発明は、本明細書で記載される治療用分子に対する応答者を、非応答者から特定する方法に関する。本発明は、本発明の治療用分子に対してより良好に応答するであろう患者集団を特定する方法、又は、本発明の治療用分子治療計画を改善する方法に更に関する。
【０１６０】
一実施形態において、本願は、子宮頸部腫瘍を除去するための外科手術を必要としない対象を特定するための方法であって、有効量の本明細書で記載される治療用分子（例えば、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチド）を、対象に投与することを含み、対象が、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示す、方法に関する。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「細胞性免疫応答」又は「細胞媒介性免疫応答」という用語は、抗原に対する応答において、抗体（体液性免疫）が関与するのではなく、食作用、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔ細胞）及び種々のサイトカインの放出の活性化が関与する、免疫応答を包含することを意図している。細胞性免疫は、（ｉ）外来性抗原のエピトープを表面上に提示している身体細胞、例えば、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を含む細胞、及び腫瘍抗原を提示している癌細胞などに、アポトーシスを誘引することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することによって、（ｉｉ）マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して、それらに病原体を破壊させることによって、又は、（ｉｉｉ）適応免疫応答及び自然免疫応答に関与する他の細胞の機能に影響を及ぼす各種のサイトカインを分泌するように細胞を刺激することによって、身体を保護する。
【０１６２】
ウイルス感染が宿主細胞中で確立されると、細胞媒介性免疫応答を活性化する、一連の分子及び細胞シグナルが開始される。これらのシグナルは、局所的な樹状細胞の動員に加えて、インターフェロン、他のサイトカイン、及び炎症性メディエータの生成を含む。樹状細胞は、ナイーブなＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために重要な細胞リンクを提供すると考えられる。ナイーブなＴ細胞上のＴＣＲの、樹状細胞により提示されたウイルス−ペプチドＭＨＣ複合体との会合が、Ｔ細胞の隔離をもたらし、抗ウイルスＴ細胞応答を開始する。また、ウイルス特異的Ｔ細胞の増殖及び分化を確保することは、炎症性メディエータ、例えば、インターフェロン及び他の危険信号を伴って生じる（Ｚａｊａｃ  Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｌ．Ｅ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３（３）：７０〜７７、２００８）。
【０１６３】
ＣＤ８  Ｔ細胞は、炎症性メディエータ及び細胞傷害性エフェクター分子の両方を生成するその能力のために、強力な抗ウイルスエフェクター細胞である。ＣＤ８  Ｔ細胞は、一般的には、ウイルス感染したターゲット細胞を殺傷する能力のために、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる。エフェクターＴ細胞は、適切なペプチド−ＭＨＣ複合体を提示しているウイルス感染したターゲット細胞と会合した後に、活性化されるようになる。これらの殺傷機能は、Ｔ細胞によるパーフォリン及びグランザイム分子のその後の放出によりトリガーされる。このトリガーにより、感染細胞の破壊が確保される。感染細胞の直接的な殺傷に加えて、ＣＤ８  Ｔ細胞は、ある範囲のサイトカイン及びケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）も生成する。これらの生成は、感染細胞を死なせることなく、ウイルス感染を除去するために役立ち得る（Ｚａｊａｃ  Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｌ．Ｅ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３（３）：７０〜７７、２００８）。
【０１６４】
また、ＣＤ４  Ｔ細胞も、ＩＦＮ−γ生成により、一部の環境では、ウイルス感染細胞の溶解を誘引することにより、抗ウイルス機能を直接発揮できるため、ウイルス感染に対する細胞媒介性免疫応答の重要な構成員である。ＭＨＣクラスＩＩの上での抗原認識後に、エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞の活性化、増殖、及び同Ｔ細胞への分化をもたらすシグナル伝達カスケードが、ＣＤ４  Ｔ細胞内で開始される。同Ｔ細胞は、そのサイトカイン生成プロファイルに基づいて、２つの分極した部分集合に分けられる。Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞は、ＩＦＮ−γを主に生成し、種々のウイルス感染及び細胞内細菌による感染に対する免疫応答に重要である。エフェクター細胞のこのサブクラスは、典型的には、抗ウイルス細胞媒介性免疫性に関連する。対照的に、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３のサイトカインを主に分泌し、抗体生成及び体液性免疫応答に関連する。ＣＤ４  Ｔ細胞の部分集合の定義は、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞を超えて拡張されており、レギュラトリーＣＤ４  Ｔ細胞（ＩＬ−１０を分泌）及びＩＬ−１７生成「Ｔｈ１７」細胞（ＩＬ−１７Ａを分泌）の固有集団の重要性が明らかになっている（Ｚａｊａｃ  Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｌ．Ｅ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３（３）：７０〜７７、２００８）。
【０１６５】
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを更に含む。特定の実施形態では、本明細書で記載される方法は、医療提供者に、投与後の対象における亢進した細胞性免疫応答を測定することを命じることを更に含む。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、「医療提供者」という用語は、生きた対象、例えば、ヒトの患者と直接対話し、及び／又は、同生きた対象に治療用分子を投与する、個人又は施設を意味する。医療提供者の非限定的な例には、医師、看護師、技師、セラピスト、薬剤師、カウンセラー、代替医療の専門家、医療施設、医院、病院、救急処置室、クリニック、外来診療施設、代替医療クリニック／施設、及び一般的及び／若しくは特化した処置、評価、維持、治療、薬物治療、並びに／又は、患者の健康状態の全て若しくは任意の部分に関する助言を提供する任意の他の実体を含む。同実体は、一般的な医療、特化した医療、外科手術、並びに／又は他の種類の処置、評価、維持、治療、薬物治療、及び／若しくは助言が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本明細書で使用する場合、「医療提供者に命じること」という用語は、医療提供者に口頭で指示すること、若しくは、医療提供者に指示書を使用することにより命じること、又は、両方を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、本願は、外科手術をすることなく子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、対象が、投与後に亢進した細胞性免疫応答を示し、細胞性免疫応答が、投与後に少なくとも約２倍亢進され、子宮頸部腫瘍が、外科手術をすることなく、対象から除去される、方法に関する。
【０１６９】
本明細書で使用する場合、「亢進した細胞応答」という用語は、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、少なくとも約２倍亢進した、ＣＤ８  Ｔ細胞応答、亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答、亢進したサイトカイン分泌、又はそれらの任意の組み合わせを意味する。例えば、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡ治療ワクチン（ＧＸ−１８８））による少なくとも１回の免疫化（即ち、少なくとも１つの用量の投与）後における、共通するＴｈ１エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの生成／発現の亢進を、ワクチン接種前の共通するＴｈ１エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αのベースライン生成と比較した。
【０１７０】
一部の実施形態では、亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞の増殖を含む。具体的な実施形態では、亢進したＣＤ４  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４細胞数における、少なくとも約１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、又は４．０倍の増加である。
【０１７１】
特定の実施形態では、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、ＣＤ１０７ａ／ｂ、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む。一部の実施形態では、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を含む。具体的な実施形態では、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＣＤ３８＋Ｋｉ６７＋ＣＤ８  Ｔ細胞数における、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍の増加である。特定の実施形態では、亢進したＣＤ８  Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーにより測定される。
【０１７２】
具体的な実施形態では、ＩＦＮ−γの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍亢進される。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＩＬ−２の発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍亢進される。
【０１７４】
具体的な実施形態では、ＴＮＦ−αの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍亢進される。
【０１７５】
特定の実施形態では、亢進した細胞性免疫応答は、亢進したＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ応答を含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ−γ応答は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定される。
【０１７６】
特定の実施形態では、亢進した細胞性免疫応答は、多機能性Ｔ細胞数の増加である。本明細書で使用する場合、「多機能性Ｔ細胞」という用語は、細胞溶解活性、増殖能、及びエフェクター分子の分泌の亢進を示す、多機能性ＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を意味する。一部の実施形態では、多機能性Ｔ細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのマーカーを示す。特定の実施形態では、多機能性Ｔ細胞は、少なくともＩＦＮ−γ及びＩＬ−２と、少なくとも１つの更なるマーカーを分泌する。具体的な実施形態では、多機能性Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−β、及びＣＤ１０７ａ／ｂから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのマーカーを示す。
【０１７７】
一部の実施形態では、本願は、多機能性Ｔ細胞数が、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与前の多機能性Ｔ細胞数より、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％増加する、本明細書で記載される方法に関する。
【０１７８】
一部の実施形態では、本願は、全身性ＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、それを必要とする対象において亢進させる方法であって、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、この多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、又はそれらの任意の組み合わせの亢進した発現を含む、方法に関する。具体的な実施形態では、投与は、少なくとも２回の投与又は３回の投与を含む。
【０１７９】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定すること、とを含む、方法に関する。
【０１８０】
本明細書で使用する場合、「対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定すること」は、患者が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を必要とすることを決定するために、一般的及び／又は特化した評価並びに／又は患者の健康状態の全て若しくは任意の部分に関する助言を提供することを意味する。
【０１８１】
一部の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｂ）医療提供者に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を対象に行うように命じることと、を含む、方法に関する。
【０１８２】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）融合たんぱく質の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示さない対象を特定することと、（ｃ）この対象が子宮頸部腫瘍を除去する外科手術に適していると判定することと、を含む、方法に関する。
【０１８３】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象集団に行う方法であって、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有する、方法に関する。
【０１８４】
一部の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍の処置を、それを必要とする対象に行う方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することと、を含む、方法に関する。
【０１８５】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、対象集団に投与することを含み、各対象は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ０２を保有する、方法に関する。
【０１８６】
一部の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象を特定することと、（ｂ）本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することと、を含む、方法に関する。
【０１８７】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍の処置を改善する方法であって、（ａ）処置を必要とする対象から得られた血液サンプルを、ＨＬＡ型を特定するために供することと、（ｂ）本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に投与することと、を含む、方法に関する。
【０１８８】
ＨＬＡ−Ａは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座によりコードされる一群のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であり、ヒト染色体６ｐ２１．３に位置している（ＨＬＡ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ＠ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ−Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｎｏｌａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２０１３年１１月１０日、２０１３年１２月８日に検索）。ＨＬＡは、ヒトに特異的な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である。ＨＬＡ−Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要な型のうちの１つである。他のものは、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃである。２０１３年１２月時点で、１７４０個の活性たんぱく質及び１１７個のヌルたんぱく質をコードする２４３２箇所の公知のＨＬＡ−Ａアレルが存在する（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．２０１３、２０１３年１２月２０日に検索）。（ＨＬＡ）−Ａ０２は、ＨＬＡ−Ａ血清型グループ内のヒト白血球抗原血清型である。また、（ＨＬＡ）−Ａ０２は、ＨＬＡ−Ａ＊０２（Ａ＊０２）、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ０２、及びＨＬＡ−Ａ＊２を意味する。
【０１８９】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量の投与後に亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを更に投与することと、を含む、方法に関する。
【０１９０】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量の本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）第１の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第２の用量のこのポリヌクレオチドを投与することと、を含む、方法に関する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、第２の用量の投与後に、細胞性免疫応答を測定することを更に含む。特定の実施形態では、本明細書で記載される方法は、第３の用量の本明細書で記載されるポリヌクレオチドを投与することを含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す対象に、第３の用量のポリヌクレオチドを、この対象に更に投与することとを含む、方法に関する。
【０１９２】
特定の実施形態では、本願は、子宮頸部腫瘍を処置する方法であって、（ａ）第１の用量及び第２の用量の本明細書に記載する融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、（ｂ）第１の用量又は第２の用量の投与後に細胞性免疫応答を測定することと、（ｃ）対象が第１又は第２の用量の投与後に、亢進した細胞性免疫応答を示す場合に、第３の用量のこのポリヌクレオチドを、この対象に投与することと、を含む、方法に関する。
【０１９３】
本明細書で記載される方法によると、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドは、特定の用量で投与され得る。例えば、一部の実施形態では、第１の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである。特定の実施形態では、第１の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである。
【０１９４】
特定の実施形態では、第２の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである。
【０１９５】
特定の実施形態では、第３の用量は、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１．５ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約２．５ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約３．５ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約４．５ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである。一部の実施形態では、第３の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである。
【０１９６】
一部の実施形態では、第２の用量は、第１の用量の、少なくとも約１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、又は１５週間後に投与される。特定の実施形態では、第３の用量は、第２の用量の、少なくとも約１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、又は１５週間後に投与される。
【０１９７】
本発明の一部の実施形態は、全身性ＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、それを必要とする対象において誘引する方法であって、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合せず、また、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成せず、多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２と、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの任意のマーカーとの亢進した発現を含む、方法を含む。他の実施形態では、任意のマーカーは、ＴＮＦ−αである。
【０１９８】
更なる実施形態では、本方法の投与は、少なくとも２回の投与又は３回の投与を含む。他の実施形態では、ＩＦＮ−γの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍亢進される。更に他の実施形態では、ＩＬ−２の発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍亢進される。更に他の実施形態では、ＴＮＦ−αの発現は、投与前のレベルに対して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、又は少なくとも約２５倍亢進される。
【０１９９】
更に他の実施形態では、投与は、ＩＬ−４又はＩＬ−１７ａの発現を亢進させない。
【０２００】
特定の実施形態では、診断方法の目的のための治療用分子は、他の種類のＨＰＶワクチンを含む。例えば、本方法に有用なＨＰＶワクチンの例としては、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
ＩＶ．医薬キット
また、本発明は、治療用分子を含む医薬組成物と、この組成物の使用に関する指示と、を含む、医薬キットも含む。一実施形態において、本発明は、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、有効量のこの医薬組成物を投与した後に細胞性免疫応答が亢進されない場合に、子宮頸部腫瘍を除去する外科手術を行うことに関する指示と、を含む、キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、キットに関する。
【０２０２】
別の実施形態では、医薬キットは、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、初期量のポリヌクレオチドの投与後に多機能性Ｔ細胞数の増加を示す対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含み、この融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。
【０２０３】
他の実施形態では、医薬キットは、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、初期量のポリヌクレオチドの投与後に多機能性Ｔ細胞数の増加を示す対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含み、この融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。一実施形態において、多機能性Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌する。
【０２０４】
一部の実施形態では、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、ＨＬＡ−Ａ０２を保有する対象に有効量のこの医薬組成物を投与することに関する指示と、を含む、医薬キットであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、医薬キット。他の実施形態では、本キットは、有効量の治療用分子を含み、この有効量は、少なくとも１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、又は６ｍｇである。
【０２０５】
一部の実施形態では、医薬キットは、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と、対象への、この医薬組成物の１回の投与又は２回の投与が亢進した細胞性免疫応答を示さない場合、この医薬組成物の更なる投与を中止することに関する指示と、を含み、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部から選択される、３つ以上のアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない。特定の実施形態では、１回の投与は、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇである。他の実施形態では、２回の投与は、第１の用量及び第２の用量を含み、第１の用量が、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇであり、第２の用量が、少なくとも約０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、又は５ｍｇである。更に他の実施形態では、第１の用量及び第２の用量は同一である。更に他の実施形態では、第１の用量及び第２の用量は異なる。
【０２０６】
特定の実施形態では、本キットの第１の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇであり、本キットの第２の用量は、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約４ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約９ｍｇ、約１ｍｇ〜約８ｍｇ、約１ｍｇ〜約７ｍｇ、約１ｍｇ〜約６ｍｇである。特定の実施形態では、本キットの第１の用量は、約１ｍｇ〜４ｍｇであり、本キットの第２の用量は、約１ｍｇ〜約４ｍｇである。一部の実施形態では、第１の用量は、約１ｍｇであり、第２の用量は、約１ｍｇである。他の実施形態では、第１の用量は、約２ｍｇであり、第２の用量は、約２ｍｇである。更に他の実施形態では、第１の用量は、約４ｍｇであり、第２の用量は、約４ｍｇである。
【０２０７】
Ｖ．製造方法
また、本発明は、ヒトパピローマウイルスに関連する疾患又は状態を処置するための治療用分子を製造する方法にも関する。特に、治療用分子は、ＨＰＶ由来の複数のたんぱく質の全てのエピトープを含有するが、ｐ５３結合ドメイン及びｐＲｂ結合ドメインを含有せず、又は、ＨＰＶ由来のたんぱく質と二量体を形成しないように構築される。
【０２０８】
本発明の一実施形態は、ヒトパピローマウイルス感染により引き起こされる子宮頸部腫瘍の処置又は予防において有効な、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部、から選択される、少なくとも３つのアミノ酸配列を含み、
融合たんぱく質は、ｐ５３に結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質と二量体を形成せず、融合たんぱく質は、ｐＲｂに結合しないか、又は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質と二量体を形成しない、ことと、
（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む、方法を含む。別の実施形態では、融合たんぱく質は、完全なＥ６関連たんぱく質（ＡＰ）結合部位を含まない。他の実施形態では、融合たんぱく質は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１７の天然のＥ６たんぱく質並びにＨＰＶ１６及びＨＰＶ１７の天然のＥ７たんぱく質に含有される免疫原性についての少なくとも全てのエピトープを含む。
【０２０９】
本発明の一部の実施形態は、ＨＰＶ１６の天然のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１６の天然のＥ７たんぱく質、ＨＰＶ１８の天然のＥ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８の天然のＥ７たんぱく質に含有される免疫原性についての少なくとも全てのエピトープを含む状態で、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の配列、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の配列、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の配列、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の配列を含む融合たんぱく質におけるＰ５３結合部位及びｐＲｂ結合部位を除去する方法を含み、この方法は、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、
（ａ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸３５〜１３５のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）とＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｂ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸１８〜９７のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）とＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ７ｇ−ｈ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｃ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸３０〜１３０のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）とＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ６Ｎｋ−ｌ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｄ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、配列番号８に対応するアミノ酸２１〜１０４のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）とＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含む、ことと、（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む。
【０２１０】
特定の実施形態では、（ａ）におけるＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、又は少なくとも２０個のアミノ酸を含むか、（ｂ）におけるＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、又は少なくとも２０個のアミノ酸を含むか、（ｃ）におけるＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、又は、（ｄ）におけるＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含み、ここで、これらのオーバーラップ配列は、Ｅ６たんぱく質又はＥ７たんぱく質のＮ末端部及びＣ末端部への開裂により、破壊され、又は、欠失した任意のエピトープを追加し、又は、提供するために十分なものである。
【０２１１】
他の実施形態では、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の免疫原性についての全てのエピトープを含む状態で、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の配列、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の配列、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の配列、及びＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の配列を含む融合たんぱく質における、ＨＰＶ１６及び／若しくはＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質、並びに／又は、ＨＰＶ１６及び／若しくはＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の二量体の形成を防止する方法であって、（ｉ）融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを構築することであって、融合たんぱく質は、
（１）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（２）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（３）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部、
（４）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部、
（５）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部、
（６）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部、
（７）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部、及び
（８）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部を含み、ここで、
（ａ）ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質は、配列番号２に対応するアミノ酸３７〜７２のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ６Ｎａ−ｂ）とＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ６Ｃｃ−ｄ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｂ）ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質は、配列番号６に対応するアミノ酸４４〜９７のＣ末端において、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１６Ｅ７Ｎｅ−ｆ）とＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１６Ｅ７ｇ−ｈ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｃ）ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質は、配列番号４に対応するアミノ酸３２〜６７のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ６Ｎｉ−ｊ）とＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ６Ｎｋ−ｌ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含み、
（ｄ）ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質は、配列番号８に対応するアミノ酸４７〜１０４のＣ末端において、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＮ末端部（１８Ｅ７Ｎｍ−ｎ）とＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質のＣ末端部（１８Ｅ７Ｃｏ−ｐ）とに分割され、これらのＮ末端部とＣ末端部は、互いにアライメントさせると、ＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質の全配列と任意のオーバーラップ配列を含む、ことと、（ｉｉ）このポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクションすることと、を含む。他の実施形態では、（ａ）におけるＨＰＶ１６のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、（ｂ）におけるＨＰＶ１６のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、（ｃ）におけるＨＰＶ１８のＥ６たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含むか、又は、（ｄ）におけるＨＰＶ１８のＥ７たんぱく質についてのオーバーラップ配列は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチドを製造する方法は、本明細書で記載されるいずれかの治療用分子をもたらし得る。他の実施形態では、本方法は、本明細書で記載されているが、配列番号９を含まない、いずれかのポリヌクレオチドをもたらす。
【０２１３】
Ｖ．Ａ．１．宿主細胞
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞も提供する。本明細書で使用する場合、「形質転換」という用語は、ＤＮＡをレシピエントの宿主細胞内に導入し、遺伝子型を変化させ、その後に、レシピエント細胞に変化をもたらすことを意味する、広い意味で使用されるであろう。
【０２１４】
「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターにより、形質転換される細胞を意味する。本発明の宿主細胞は、好ましくは、哺乳類起源、最も好ましくは、ヒト又はマウス起源のものである。当業者であれば、その目的に最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ、ＣＡＰＴＩ、ＤＧ４４、及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＤＨＦＲ陰性）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を含むＣＶＩの派生株）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスメラノーマ）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウスメラノーマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、及びＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、商業的なサービスであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は公表された文献から典型的に入手できる。
【０２１５】
本発明の単離された核酸分子の宿主細胞内への導入は、当業者に周知の種々の技術により達成され得る。これらには、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトなウイルスによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０〜４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主内へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションによる。形質転換細胞は、軽鎖及び重鎖の生成に適した条件下において増殖され、重鎖及び／又は軽鎖たんぱく質の合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。
【０２１６】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、エレクトロポレーションにより、対象に投与される。インビボでのエレクトロポレーション（ＥＰ）は、注入されたＤＮＡのトランスフェクション効率及び免疫細胞、例えば、樹状細胞、Ｔ及びＢリンパ球の免疫化部分へのリクルートを向上させるために、小さく局所的な電界を同時に加えることにより、ＤＮＡワクチンの免疫原性を顕著に増大させる技術である。動物における動物実験から、インビボでのＥＰは、数多くの抗原をコードするＤＮＡワクチンの免疫原性を向上させることが示されてきた。ヒトにおいては、インビボでのＥＰは、化学療法剤を腫瘍に直接送達することにおいて成功してきた。ごく最近、腫瘍抗原をコードするＤＮＡワクチンが、癌患者に対して、可能性のある免疫療法として、ＥＰにより投与された（Ｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６（５）：１〜１０、２０１１）。
【０２１７】
本発明の単離された核酸分子を含む宿主細胞は、適切な増殖培地中において増殖される。本明細書で使用する場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及び成長因子を含み得る。場合により、培地は、１つ又は２つ以上の選択因子を含有し得る。場合により、培地は、仔ウシ血清又はウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有し得る。一実施形態において、培地は、ＩｇＧを実質的に含有しない。増殖培地は、一般的には、ＤＮＡ構築物を含有する細胞を、例えば、ＤＮＡ構築物上の選択マーカーにより補足され、ＤＮＡ構築物と共トランスフェクションされた、薬剤選択又は必須栄養素の欠損により選択するであろう。培養される哺乳類細胞は、一般的には、市販の血清含有又は血清非含有の培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中において増殖される。一実施形態において、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適した培地の選択は、当業者のレベル内である。
【０２１８】
Ｖ．Ａ．２．ポリペプチドの調製
また、本発明は、ポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド分子によりコードされたポリペプチドを提供する。
【０２１９】
組換えたんぱく質生成のために、融合たんぱく質をコードする本発明のポリヌクレオチド配列は、適切な発現ビヒクル、即ち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必須のエレメント、又は、ＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製及び翻訳に必須のエレメントを含有するベクター内に挿入される。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ベクター内に適切な読み枠で挿入される。ついで、発現ベクターは、ポリペプチドを発現させるであろう、適切なターゲット細胞内にトランスフェクションされる。当技術分野において公知のトランスフェクション技術には、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７８，Ｃｅｌｌ  １４：７２５）及びエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２，ＥＭＢＯ，Ｊ．１：８４１）が挙げられるが、これらに限定されない。各種の宿主発現ベクター系が、本明細書で記載される融合たんぱく質を、真核生物細胞中で発現させるために利用され得る。一実施形態において、真核生物細胞は、哺乳類細胞を含む動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰＴＩ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）である。
【０２２１】
本発明の融合たんぱく質は、トランスジェニック動物、例えば、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、又はウシ中で合成され得る。「トランスジェニック動物」という用語は、そのゲノム内に外来遺伝子を包含している非ヒト動物を意味する。この遺伝子は、生殖細胞系組織に存在するため、親から子孫に受け継がれる。外来性遺伝子は、単細胞胚内に導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８）。トランスジェニック動物を製造する方法は、免疫グロブリン分子を生成する遺伝子組換えを含めて、当技術分野において公知である（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｃｅｌｌ  ３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：８３１；Ｒｏｂｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０（３）：２６７）。
【０２２２】
発現ベクターは、組換え的に生成されたたんぱく質の容易な精製又は特定を可能にするタグをコードし得る。例としては、限定するわけではないが、ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）を含む。このベクター中において、本明細書で記載される融合たんぱく質をコードする配列は、このベクター内のｌａｃＺコード領域を含むフレーム中にライゲートされ得、これにより、ハイブリッドたんぱく質が生成される。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むたんぱく質を発現させるために使用され得る。これらのたんぱく質は、通常、可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続けて、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、細胞から容易に精製され得る。ベクターは、精製後のタグの容易な除去のために、開裂部位（例えば、ＰｒｅＣｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））を含む。
【０２２３】
本発明の目的で、数多くの発現ベクター系が利用され得る。これらの発現ベクターは、典型的には、宿主生物中において、エピソーム、又は、宿主の染色体ＤＮＡの必須部分のいずれかとして複製可能である。発現ベクターは、発現制御配列を含み得る。同発現制御配列には、プロモーター（例えば、本来関連するプロモーター又は異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライシングシグナル、エンハンサーエレメント、及び転写終了配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクション可能な、ベクター中の真核生物のプロモーター系である。また、発現ベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、又はＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、又はＳＶ４０ウイルス由来のＤＮＡエレメントを利用し得る。他のものは、内部リボソーム結合部位を含むポリシストロニック系の使用を含む。
【０２２４】
一般的には、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にする、選択マーカー（例えば、アンピシリン抵抗性、ヒグロマイシン抵抗性、テトラサイクリン抵抗性、又はネオマイシン抵抗性）を含有する（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。染色体内にＤＮＡを組み込んだ細胞は、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする、１つ又は２つ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。これらのマーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、又は重金属、例えば、銅に対する抵抗性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されるか、又は、共形質転換により同じ細胞内に導入されるかのいずれかであり得る。
【０２２５】
より一般的には、ポリペプチドをコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製された後、発現ベクターは、適切な宿主細胞内に導入され得る。即ち、宿主細胞は、形質転換され得る。プラスミドの宿主細胞内への導入は、上記で検討されるように、当業者に周知の種々の技術により達成され得る。組換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの説明において、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、明確に別の方法で示さない限り、ポリペプチドの起源を示すために、同じ意味で使用される。即ち、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンした全細胞から、又は、培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
【０２２６】
また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、非哺乳類細胞、例えば、細菌又は酵母又は植物細胞中において、遺伝子数を増大させるために倍加され得る。これに関して、種々の単細胞の非哺乳類微生物、例えば、細菌、即ち、培養又は発酵中に増殖され得るものも、形質転換され得ることが理解されるであろう。形質転換に感受性の細菌は、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌又はサルモネラ；バチルス科、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；肺炎球菌；レンサ球菌、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの株を含む。細菌中で発現された場合、ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部になることが、更に理解されるであろう。ポリペプチドは、単離され、精製され、ついで、機能性分子にアセンブルされるべきである。
【０２２７】
あるいは、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノム内への導入用の導入遺伝子に組み込まれ、その後、トランスジェニック動物の乳中に発現させ得る（例えば、Ｄｅｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎ，米国特許第５，３０４，４８９号、及びＭｅａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。適切な導入遺伝子は、哺乳類腺特異的遺伝子、例えば、カゼイン又はベータラクトグロブリンからのプロモーター及びエンハンサーとの操作可能な連結におけるポリペプチド用のコード配列を含む。インビトロ生成は、所望のポリペプチド又はポリヌクレオチドを大量に得るために、規模拡大が可能である。
【実施例】
【０２２８】
（実施例１）
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡ治療ワクチン（ＧＸ−１８８）
本明細書で記載されるｐＧＸ−１８８治療ＨＰＶ  ＤＮＡワクチン（ＧＸ−１８８）は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン及びｔｐａのシグナル配列に融合された、ＨＰＶ血清型１６及び１８（ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８）のＥ６及びＥ７たんぱく質をコードするプラスミドＤＮＡを含有する（図１Ａ）。
【０２２９】
合成のコドン最適化Ｅ６又はＥ７遺伝子を、小さなオーバーラップ配列（１６個のアミノ酸をコード）を有する２つの部分（Ｃ末端領域及びＮ末端領域）にフラグメント化し、図１Ａに示されるように、シャッフルした。ｔｐａ、ＦＬＴ３Ｌ、及びシャッフルされたＥ６／Ｅ７遺伝子を含む融合ＤＮＡ配列を、ｐＧＸ２７ベクター（Ｐａｒｋ  Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２９：５４８１〜５４８７，２０１１）中に挿入して、ｐＧＸ２７−ｔＦＥ６Ｅ７を生成した。ＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ中で、ｃＧＭＰ条件下において生成した。
【０２３０】
２９３Ｔ細胞を、ｐＧＸ２７コントロールベクターのみ、ＧＸ−１８８、又は野生型Ｅ６若しくはＥ７遺伝子を挿入したｐＧＸ２７でトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライゼートを調製し、たんぱく質発現を、免疫ブロットにより分析した。細胞の核画分及び細胞質画分を、下記のように調製した。細胞を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、３，０００ｒｐｍで５分間収集した。細胞を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁させた。氷上で５分間インキュベートした後、ＮＰ−４０を、終濃度０．２５％で加えた。混合物を、高速で１０秒間ボルテックスした。抽出物を、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより収集した。上清を、細胞質抽出物として収集した。ペレットを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びＰＩＣ）中に再懸濁させ、続けて、穏やかな振とう下において、４℃で３０分間インキュベートした。この混合物を、１３，０００ｒｐｍで１５分間スピンした。上清を、核抽出物として収集した。ホールセルのたんぱく質ライゼートのために、細胞を、溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４、及びＰＩＣ）中に再懸濁させた。下記抗体を使用した。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，から購入した抗ＨＰＶ１６  Ｅ６（Ｎ−１７）、抗ＨＰＶ１６  Ｅ７（ＥＤ１７）、抗ｐ５３（ＦＬ−３９３）、抗ｐＲｂ（Ｃ−１５）抗体、並びに、Ａｂｃａｍから購入した抗ラミンＢ１及び抗β−チューブリン抗体。
【０２３１】
ＦＬＴ３Ｌ及びｔｐａを包含させた目的は、抗原提示及び融合たんぱく質の分泌経路への輸送のそれぞれを促進することである。ＧＸ−１８８誘引Ｅ６／Ｅ７融合たんぱく質がトランスフェクションされた細胞の細胞質区画においてのみ検出されたために、ｔｐａの活性は明らかである。一方、ｔｐａを含まない同じベクターにより発現されたＥ７たんぱく質は、図２Ａに示されるように、細胞質区画及び核区画の両方において見出された。遺伝子シャッフルを、融合たんぱく質のＥ６及びＥ７領域のホモ二量体を防止するように行った。この二量体化は、腫瘍抑制たんぱく質であるｐ５３及びｐＲｂのその結合及び分解に重要である（Ｚａｎｉｅｒ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０：６０４〜６１７，２０１２；Ｌｉｕ  Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８１：５７８〜５８６、２００６）。ＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンにより生成されたＥ６／Ｅ７融合たんぱく質は、ｐ５３及びｐＲｂたんぱく質を分解できなかったが、野生型Ｅ６及びＥ７たんぱく質は、図２Ｂ及び２Ｃそれぞれに示されるように、その分解を誘引した。
【０２３２】
試験設計及び患者
この第１相臨床試験を、非盲検、単一施設、用量漸増試験として、Ｃｈｅｉｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＆  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａにおいて行った。プライマリーエンドポイントは、子宮頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）を有する患者における安全性及び忍容性を評価することとした。セカンダリーエンドポイントは、本明細書で記載されるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７特異的Ｔ細胞免疫応答の全身性誘引と、子宮頸部に含まれる病変及びＨＰＶ感染状態の変化とを含んだ。組織学的及びウイルス学的に証明されたＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８関連ＣＩＮ３を有する２０〜５０歳の年齢の女性を、本試験に登録した。ＣＩＮ３を、膣頸管検査直接生検により確認した。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８陽性を、ポリメラーゼ連鎖反応により決定した。Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、又はヒト免疫不全ウイルス感染、不整脈を含む異常な心電図検査（ＥＣＧ）、重篤な薬物有害事象又は重篤なアレルギー性疾患の既往歴を有する対象を除外した。妊娠中又は妊娠を計画していた女性は、本試験に募集しなかった。一連の３回のワクチン注射からなるワクチン接種を、０週、４週、及び１２週において、交互の三角筋に筋肉内投与した。標準的な３＋３用量漸増スキームを行い、１ｍｇ、２ｍｇ、及び４ｍｇの用量レベルを試験した。最大用量において、４ｍｇのＧＸ−１８８を、２ｍｇ＋２ｍｇに分割し、左右の三角筋に注射した。筋肉内注射器には、細胞内へのＤＮＡ取込みを容易にするために、ＥＰデバイス（ＴｒｉＧｒｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｃｈｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。
【０２３３】
本研究の組み入れ基準及び除外基準に従って、ＣＩＮ３のみを有する１１名のスクリーニングされた患者のうちの９名を登録した（表１）。スクリーニングされた患者を、治験の開始の２週間前のスクリーニング（ＶＳ）時点の受診時において、膣頸管検査、細胞学、組織学、及びＨＰＶ型検査を含む複数の方法により調査した。膣頸管検査、組織学、子宮頸管内細胞学、及びＨＰＶ遺伝子型判定試験を含む評価を、治験実施施設におけるローカルラボにより行った。この評価を、標準化された方法又はＣｈｅｉｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒの内部プロトコルを遵守して行った。処置に対する応答を、ＧＸ−１８８ワクチン接種の２０週及び３６週後に、ウイルス学及び組織学の結果を使用して評価した。
【０２３４】
組織学的及び細胞学的評価組織学的評価のために、生検サンプルを、スクリーニング中と、２０週及び３６週における２回のフォローアップ受診時に採取した。サンプルを、１０％ホルムアルデヒドで固定した。４〜５μｍの切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。子宮頸管内サンプルを、膣頸管検査中に、サイトブラシ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して収集した。この子宮頸管内細胞学試験も、ＧＸ−１８８ワクチン接種の評価のために、組織学に加えて使用した。組織学的及び細胞学的分析からのデータを、少なくとも２名の病理医により、独立してレビューした。結果を、全ての病理医及び研究者の会議により議論した後に確認した。
【０２３５】
ウイルス学的応答についてのＰＣＲＨＰＶ型判定を、対象がＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８に感染したかどうかを決定するために行った。サンプルを、スワブ型デバイスを使用することにより、子宮頸部から収集した。トータルＤＮＡを、ＡＣＣＵＰＲＥＰ（登録商標）ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｍ．Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を使用して抽出した。ＨＰＶ検出及び遺伝子型判定を、多重ＰＣＲシステムにより、ＩＶＤ  ＣＥマークＳＥＥＰＬＥＸ（登録商標）ＨＰＶ４Ａ  ＡＣＥスクリーニングキット（Ｓｅｅｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を使用し、製造メーカーのプロトコルに従って行った。ＳＥＥＰＬＥＸ（登録商標）ＨＰＶ４Ａ  ＡＣＥスクリーニングキットは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、他の高リスク型（高リスク共通：２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、及び／又は８２）、ＨＰＶ６、及びＨＰＶ１１型を、同時に特定することができる。ＰＣＲ産物を、自動ＭｕｌｔｉＮＡ機器（株式会社島津製作所，東京，日本）を使用して分析した。ＨＰＶ  ＤＮＡ遺伝子型判定を、Ｃｈｅｉｌ  ＨＰＶ  ＤＮＡチップを使用してリアルタイムＰＣＲにより、子宮頸部細胞において二重チェックして、既に記載されたように、ＨＰＶ遺伝子型の精度を補償した（Ｈａｈｎ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ１６９：２０２〜２０６，２０１３）。
【０２３６】
ＨＬＡの配列ベースの型判定（ＳＢＴ）を、ヘテロ接合性増幅、続けて、ＨＬＡ−Ａ及び−Ｂの完全なエクソン２、３の配列決定により行った。遺伝子座特異的増幅プライマーを、社内法において使用した。ＰＣＲによる増幅後に、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行って、量及び質を評価した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び自動ＡＢＩ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用するサイクル配列決定反応を行った。これらのデータを、ＳＢＴ分析プログラム（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｓｓｉｇｎ  ＳＢＴ  ｖ３．５．１）を使用することにより分析した。
【０２３７】
ＧＸ−１８８ワクチンは、９名の患者のうちの７名（７８％）において、完全な応答を達成した。７名の応答者の中でも、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２を保有する６名の患者は、高い多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答及びＣＩＮ３の完全な退縮を示した（表５）。
【０２３８】
参加した全ての対象は、ＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンの３回の注射を、エレクトロポレーションにより受けた。最後の２回の注射は、１回目の注射の４週後及び１２週後に行った（図１Ｂ）。全ての対象が、２、４、８、及び１６週間の間隔において、処置（ＶＴ）及びフォローアップ（ＶＦ）の間に合計６回の受診を完了し、脱落者は出なかった（図１Ｂ）。
【０２３９】
【表５】
2017525760.tif 000007
【０２４０】
合計４９の有害事象（ＡＥ）が、全受診中に記録された。湿疹、出血斑、膣のかゆみ、眠気、食欲不振、及びめまいを含む２３のＡＥを、ワクチン接種には無関係であると判定した。悪寒、注射部位の疼痛、浮腫、及び知覚鈍麻を含む１９のＡＥを、ＧＸ−１８８ワクチン接種に関連すると記録した（表２）。頭痛、鼻炎、及び疲労を含む残り７のＡＥの原因は不明であったが、それらは、ＧＸ−１８８ワクチン接種に関連している可能性があると考えられた。ＧＸ−１８８ワクチン関連ＡＥの発生は、より高い用量において、より頻繁になった（１ｍｇコホートについては３、２ｍｇコホートについては９、及び４ｍｇコホートについては１４）。これは、おそらく、注射量の増大のためである（１ｍｇコホートについては０．５ｍＬ、２ｍｇコホートについては１ｍＬ、及び４ｍｇコホートについては２ｍＬ）。ただし、これらのＡＥは全て、軽度（グレード１）であると考えられた。全ての患者は、ＧＸ−１８８ワクチン接種後３日以内に完全に回復した。いずれの所定用量においても、重篤なＡＥ、及び検査所見の異常のどちらも観察されなかった（表６及び表７）ため、ＧＸ−１８８の用量を、本臨床試験プロトコルの３＋３用量漸増設計に従って各用量レベルにおいて更なる３名の対象の登録をすることなく、１ｍｇから２ｍｇに、ついで、４ｍｇに増大させた（各用量において３名の患者）。
【０２４１】
【表６】
2017525760.tif 000008
【０２４２】
【表７】
2017525760.tif 000009
データを、平均値±標準偏差として表わす。
【０２４３】
ＦＬＴ３Ｌたんぱく質の投与が白血球（ＷＢＣ）の頻度（frequency）を向上させ得ることが報告されていることから（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９６：８７８〜８８４，２０００；Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：３２２〜３２９，２００２）、ＷＢＣ数及びＦＬＴ３Ｌレベルを、血中で測定した。ＷＢＣ数の変化は観察されなかった（表６）。これは、ＧＸ−１８８ワクチン接種に基づいて、血中ＦＬＴ３Ｌレベルがほとんどアップレギュレーションされなかったためであろう（表８）。
【０２４４】
【表８】
2017525760.tif 000010
データを、平均値±標準偏差として表わす。（ｐｇ  ｍＬ−１）
【０２４５】
本明細書で記載されるアプローチの免疫学的安全性を決定するために、ＥＰによるＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンを多く送達することにより、抗ＦＬＴ３Ｌ及び抗ＤＮＡ抗体が生じたかどうかを調査した。これらの抗体は、自己免疫疾患に関連することが公知である（Ｓａａｄｅ，Ｆ．ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ，Ｎ．，Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ１１：１８９〜２０９，２０１２）。
【０２４６】
血中ＦＬＴ３Ｌレベルを、ＦＬＴ３Ｌ  ＥＬＩＳＡキット（ＤＦＫ００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造メーカーの指示に従って測定した。簡潔には、血漿サンプル及び標準を、ヒトＦＬＴ３Ｌに特異的なモノクローナル抗体でコートしたマイクロプレートに加えた。結合しなかった物質を洗い流した後、ヒトＦｌｔ−３リガンドに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を、ウェルに加えた。結合しなかった抗体−酵素試薬を除去する洗浄後に、基質溶液を、ウェルに加えた。発色を、２Ｎ硫酸を加えることにより停止させた。色の強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｐｌｕｓ  ３８４）を使用して測定した。血中ＦＬＴ３Ｌレベル（ｐｇ／ｍＬ）を、ｌｏｇ／ｌｏｇ曲線当嵌めを生成可能なコンピュータソフトウェア（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖ５．４．１）を使用して検量線を作製することにより算出した。データを、トリプリケートサンプルの平均値±標準偏差として表わす。
【０２４７】
抗ｄｓＤＮＡ抗体レベルを、ＥＬＩＳＡ（ＣＨＯＲＵＳ  ｄｓＤＮＡ−Ｇ，ＤＩＥＳＳＥ，Ｉｔａｌｙ）により決定した。簡潔には、血漿（５０μｌ）を、精製されたヒトＤＮＡでコートしたマイクロプレートウェル内に加えた。ついで、洗浄後に、インキュベーションを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体と共に行った。結合しなかったコンジュゲートを除去した。ＴＭＢ基質を加えた。結果の妥当性をチェックするために、キットに添付のコントロールサンプルを使用した。コントロールサンプルについてのシグナルが許容範囲外の値を有する場合、校正を繰り返すべきである。校正範囲を、１０．０〜１５０．０ＩＵ  ｍＬ−１とした。試験サンプルを、下記のように解釈した。結果が３０．０ＩＵ  ｍＬ−１超の場合には陽性、結果が２０．０ＩＵ  ｍＬ−１未満の場合には陰性、２０．０〜３０．０ＩＵ  ｍＬ−１の全ての値については疑わしい。疑わしい結果の場合には、試験を、繰り返すべきである。診断感度、交叉反応、特異性、及び試験精度は、キットのマニュアルに記載されていた。検出限界は、１０ＩＵ  ｍＬ−１であった。
【０２４８】
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体レベルは、コントロール血清と比較して、ワクチン接種後に有意には誘引されなかった（データを示さず）。ＣＩＮ３を有する患者の血中のＤＮＡに対する抗体レベルは、検出限界を下回った（表９）。このレベルは、ＥＰなしにＤＮＡワクチンで免疫化された対象から得られた以前の結果と同等である（Ｌｅ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１８９３〜１９０１，２０００；Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１１１０〜１１１７，２００６）。まとめると、これらの結果から、ＥＰ及び遺伝子アジュバントの包含は、ＤＮＡワクチンの臨床試験において比較的忍容性であり、ＥＰなしでの基本的なＤＮＡワクチンの投与で観察された安全性プロファイルに非常に類似することが示される。
【０２４９】
【表９】
2017525760.tif 000011
検出限界、１０ＩＵ  ｍＬ−１
【０２５０】
（実施例２）
細胞性免疫におけるＧＸ−１８８ワクチン接種の効果
ＧＸ−１８８により誘引される細胞性免疫応答を調査するために、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７たんぱく質の全長をカバーするオーバーラップペプチドの混合物で刺激することにより、ＨＰＶ特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞数を測定した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、ＧＸ−１８８ワクチン接種前のＶＳ時点（−２週）と、同ワクチン接種中のＶＴ２（２週）及びＶＴ４時点（８週）と、同ワクチン接種後のＶＦ１（２０週）及びＶＦ２時点（３６週）で行った。
【０２５１】
凍結保存し、融解させたＰＢＭＣを、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、３７℃、５％  ＣＯ２において、６時間以上適応させた。その後、ＰＢＭＣ（ウェル当たりに２×１０５個）を、２μｇ  ｍＬ−１のＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７由来ペプチド（１０個のアミノ酸オーバーラップを含む２０ｍｅｒ）の４種類のプールで、４８時間刺激した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び培地のみをそれぞれ、陽性及び陰性コントロールとして使用した。刺激後、ＩＦＮ−γ分泌細胞を示すスポットを、製造メーカーの指示（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って発色させた。スポット数を、自動ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）分析器（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）で分析した。ＨＰＶ特異的応答を、培地のみのコントロールにおけるスポットの平均数を、実験ウェルにおけるスポットの平均数から差し引くことにより算出した。同応答を、１０６個のＰＢＭＣ当たりにＳＦＣとして表わした（Ｕｒｂａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，２０１（５）：６７５〜８０、２００５）。このアッセイは、トリプリケートで行った。スポットのバックグラウンド数は、５．７±２．２（平均±標準偏差）であった。抗原特異的Ｔ細胞応答は、バックグラウンドを差し引いた抗原ウェルの平均数が培地コントロールの平均数より３倍高かった場合、陽性であり、又は、１０６個のＰＢＭＣ当たりに５５ＳＦＣを超えると考えられた（Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．４（１１５）：１１５ｒａ１，２０１２；Ｓｔｒｅｅｃｋ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．，４（４）：４６１〜９，２００９）。加えて、分析後のワクチン誘引応答を、ワクチン接種前の結果と比較して、ワクチン接種後のＴ細胞頻度における、少なくとも３倍の上昇として定義した（ｄｅ  Ｖｏｓ  ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｗｉｊｋ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，６１（９）：１４８５〜９２，２０１２）。
【０２５２】
比較的高い既存のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を、ワクチン接種前に、１名の患者（Ａ０３）において検出したが、他の８名の患者は、弱い既存のＨＰＶ特異的細胞性免疫を表わした。上記された基準に基づいて、全ての対象は、図３Ａ〜３Ｉで示されるように、ワクチン接種前のバックグラウンドレベルと比較して、ワクチン誘引Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答における顕著な向上を示した。９名の患者のうちの２名（Ａ０６及びＡ０８）は、１回の免疫化後（ＶＴ２）でも、相当向上したＩＦＮ−γ応答を表わした。更なる４名の患者は、２回のワクチン接種後（ＶＴ４）に、このような向上した応答を示した。１ｍｇ用量群における２名の患者（Ａ０１及びＡ０３）（図３Ａ及び３Ｄ）は、ＧＸ−１８８ワクチンの３ショット後（ＶＦ１）に、向上したＩＦＮ−γ応答を表わした。これは、ワクチン誘引細胞性免疫応答は、ＧＸ−１８８ワクチン接種の間において、全ての患者において進行的に強くなったことを示唆している。特に、患者Ａ０８（図３Ｈ）は、１０６のＰＢＭＣ当たりに最大３，５００のスポット形成単位（ＳＦＵ）の反応性を伴って、最も大きいＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示した。Ｅ６抗原に対するＴ細胞応答は、図３Ａ〜３Ｉで示されるように、全ての患者におけるＥ７抗原に対するＴ細胞応答より強力であったと考えられる（ＶＦ１において、Ｅ６に対して６９〜８９％である一方で、Ｅ７に対して１１〜３１％）。
【０２５３】
免疫化後約４週で通常形成し始めるメモリーＴ細胞の確立は、通常、ワクチンの保護活性に必要不可欠な要因の１つである（Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ、Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：５５３５〜５５４５，２００４；Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：２５１〜２６２，２００２）。比較的高いレベルのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答が、最後のワクチン接種後２４週（ＶＦ２）において、９名の患者のうちの８名において観察された。同応答は、ワクチン接種後８週（ＶＦ１）における応答と比較した場合、１名の患者（Ａ０３）について低下し、３名の患者（Ａ０１、Ａ０６、及びＡ０９）について同等であり、４名の患者（Ａ０２、Ａ０５、Ａ０７、及びＡ０８）について向上した（図３Ｂ、３Ｅ、３Ｇ、及び３Ｈ）。全体として、この知見は、ＧＸ−１８８ワクチン接種誘引Ｅ６／Ｅ７特異的メモリーＴ細胞応答が最後のワクチン接種後の少なくとも２４週間維持され得たことを示している。
【０２５４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されたＥ６／Ｅ７抗原に対するＩＦＮ−γ応答がＴ細胞により主に生成されたかどうかに対処し、主な役割を果たしたＴ細胞の部分集合を決定するために、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを、ワクチン接種前後の時点（ＶＳ及びＶＦ１）において、ＩＦＮ−γについて行った。具体的には、ＧＸ−１８８ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に収集された患者の、凍結保存し、融解させたＰＢＭＣを、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）に再懸濁させ、３７℃、５％  ＣＯ２において、６時間以上静置した。ＰＢＭＣを、ダプリケートで播種し、１μｇ  ｍＬ−１のα−ＣＤ２８（Ｌ２９３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びα−ＣＤ４９ｄ（Ｌ２５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において、１つのプールにＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７ペプチド（８個のアミノ酸オーバーラップを含む１５ｍｅｒ）を組み合わせた濃度２μｇ／ｍＬの混合物、α−ＣＤ３  ｍＡｂ（陽性コントロール）、又は培地単独（陰性コントロール）で、１３時間刺激した。分泌阻害剤（モネンシン／ブレフェルジンＡ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、最初の刺激後９０分で加えた。刺激後、後続の免疫染色及び多染性フローサイトメトリー分析のために、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。細胞を染色するための抗体を、ＣＤ１９−ＡＰＣＣｙ７（ＨＩＢ１９，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ４，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７（ＲＰＡ−Ｔ８，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３−ＢＶ６０５（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５）（ＵＣＨＴ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３−ＢＶ５００（ＵＣＨＴ１，ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−ＡＰＣＣｙ７（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭＩＰ−１β−ＰＥ  （Ｄ２１−１３５１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ−ＡＰＣ（４Ｓ．Ｂ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α−ＢＶ４２１（ＭＡｂ１１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−２−ＢＶ７１１（５３４４．１１１，ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣ（Ｈ４Ａ３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＣＤ１０７ｂ−ＦＩＴＣ（Ｈ４Ｂ４，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とした。ＦＡＣＳ分析を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により行い、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析した。Ｂｏｏｌｅａｎゲーティングを使用して、ＣＤ８  Ｔ細胞からの同時サイトカイン生成を測定した。多機能性の分析を、ＳＰＩＣＥ（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．，７９（２）：１６７〜７４，２０１１）により行った。陽性応答を、培地のみのコントロールより、少なくとも２倍の割合のサイトカイン生成Ｔ細胞として定義した。応答は、非生成細胞から分離されたサイトカイン生成細胞の明確に区別できる集団として視認されるべきである。ワクチン誘引応答を、ベースラインサンプル（ワクチン接種前）の抗原特異的サイトカイン生成Ｔ細胞の割合における、少なくとも３倍の増加として定義した（Ｗｅｌｔｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１；１４（１）：１７８〜８７，２００８）。
【０２５５】
図４Ａ〜４Ｅに示されるように、ＧＸ−１８８によるワクチン接種により、９名全ての患者において、ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４  Ｔ細胞応答の亢進がもたらされた（図４Ｂ及び４Ｃ）。一方、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、９名の患者のうち、患者Ａ０４を除いた８名全てにおいて亢進された（図４Ｄ及び４Ｅ）。このため、１名の患者を除いて、ＧＸ−１８８ワクチンは、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方の活性化を誘引した。
【０２５６】
持続性のＨＰＶ感染がＨＰＶに対するＴヘルパー（Ｔｈ）１型細胞性応答を損ない、子宮頸癌の進行をもたらすことから（Ｄｅｌｉｇｅｏｒｏｇｌｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ２０１３：５４０８５０，２０１３；Ｂａｉｓ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５８：１０９６〜１１００，２００５；Ｃｌｅｒｉｃｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８９：２４５〜２５０，１９９７；Ｐｅｇｈｉｎｉ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７３：９２０〜９２６，２０１２）、ＧＸ−１８８  ＤＮＡワクチンがＨＰＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ１エフェクター細胞への分化をもたらし得たかどうかを調査した。凍結保存し、融解させたＰＢＭＣ（ウェル当たりに２×１０５個）を、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）に再懸濁させ、３７℃、５％  ＣＯ２において、６時間以上静置した。その後、ＰＢＭＣを、ダプリケートで播種し、１つのプールにＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７ペプチド（８個のアミノ酸オーバーラップを含む１５ｍｅｒ）を組み合わせた濃度２μｇ  ｍＬ−１の混合物を含む、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリン、及び１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、又は陰性コントロールとしての培地のみにおいて、９６ウェルプレート中で刺激した。培養上清を、刺激後４８時間で収集し、サイトカインを、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量した。製造メーカーの説明に従って、計画された検出限界を、２．５〜５ｐｇ  ｍＬ−１（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γ）又は１９ｐｇ  ｍＬ−１（ＩＬ−１７Ａ）とした。カットオフ値を、５ｐｇ  ｍＬ−１に設定した。各サイトカインの検量線が、図１２に示されるように、５ｐｇ  ｍＬ−１の濃度で直線性を開始したことを示したためである。陽性の抗原特異的反応を、カットオフ値を上回るサイトカイン濃度及び培地コントロールの濃度の２倍超として定義した（Ｗｅｌｔｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１；１４（１）：１７８〜８７，２００８）。ワクチン誘引応答を、抗原特異的サイトカイン生成における、ベースラインサンプルを少なくとも３倍上回る亢進として定義した（Ｗｅｌｔｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１；１４（１）：１７８〜８７，２００８）。
【０２５７】
ワクチン接種前の共通のＴｈ１エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αのベースライン生成は、Ｅ６／Ｅ７ペプチドによる刺激まで、かなり低かった。しかしながら、これらのサイトカイン量は、ワクチン接種後に、大部分の患者において、図５Ａ〜Ｃにそれぞれ示されるように、顕著に増加した（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αについて、それぞれ中央値４９．９倍、１３倍、及び２２．９倍の増加）。また、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＣＳデータと一致して、Ａ０８患者は、Ｔｈ１サイトカイン生成の最大の亢進を示した。ＩＬ−２生成レベルが機能性メモリーＴ細胞分化中に進行して増加したとすると（Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：２２５〜２３４，２００３）、ＩＬ−２生成におけるこの実質的な亢進は、ＧＸ−１８８ワクチン接種に基づくＨＰＶ特異的メモリーＴ細胞の効率的な発生を示す可能性がある。一方、Ｔｈ２（ＩＬ−４及びＩＬ−１０）（それぞれ図５Ｄ〜Ｅ）及びＴｈ１７（ＩＬ−１７Ａ）（図５Ｆ）のサイトカインは、ワクチン接種により顕著には増加しなかったが、患者Ａ０４は、免疫抑制サイトカインであるＩＬ−１０の生成における、わずかに亢進したレベルを有した。上記ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＣＳ分析をまとめると、これらの結果から、ＧＸ−１８８ワクチン接種により、強いＴｈ１分極ＨＰＶ特異的細胞性免疫応答の誘引がもたらされることが示唆される。
【０２５８】
（実施例３）
ＧＸ−１８８ワクチン誘引多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞
持続性のウイルス感染中に、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、ウイルス抗原に対して非反応性になり、エフェクター機能の進行性の喪失を示す（Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：４９１１〜４９２７，２００３；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：６７０〜６８４，２００７）。ＧＸ−１８８ワクチン接種がＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞機能性の複数の態様を誘引したかどうかを決定するために、エフェクターサイトカイン；ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＭＩＰ−１βを同時生成するＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の能力を評価した。ＩＦＮ−γについてのＩＣＳにより得られた結果（図４Ａ〜４Ｅ）と同様に、Ａ０４を除いて、９名の患者のうちの８名は、ワクチン接種前（ＶＳ）と比較して、ワクチン接種後（ＶＦ１）に、ＩＦＮ−γとＩＬ−２、ＴＮＦ−α、又はＭＩＰ−１βとを同時生成するＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の割合の増加を表わした（図６Ａ〜Ｃ及び図７Ｂ〜Ｄ）。
【０２５９】
ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の細胞溶解活性は、ウイルス感染に対するワクチン効能の評価における、別の主要なインジケータである（Ｐａｎｔａｌｅｏ，Ｇ．ａｎｄ  Ｈａｒａｒｉ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：４１７〜４２３，２００６；Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：２４７〜２５８，２００８）。ＣＤ１０７ａ／ｂの発現が細胞傷害性Ｔ細胞による脱顆粒化中において排他的に見出されることから（Ｂｅｔｔｓ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：６５〜７８，２００３）、ＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の、ＩＦＮ−γを同時に生成し、ＣＤ１０７ａ／ｂ発現をアップレギュレーションする能力も評価した。図６Ｄ及び図７Ｅに反映されるように、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ１０７ａ／ｂ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、ワクチン接種後に、Ａ０４を除いた全ての患者において上昇した。これら８名の患者におけるワクチン接種により誘引されたＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の多機能性を決定するために、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、及びＣＤ１０７ａ／ｂを、Ｂｏｏｌｅａｎゲーティングを使用して同時に評価した。患者Ａ０８は、最も高い多機能性プロファイルを示し、８７．６％のＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、少なくとも３つが陽性であり、１５％のＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、５つ全ての機能を有した（図６Ｅ〜Ｆ）。他の６名の患者（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ０５、Ａ０６、及びＡ０７）において、７．８％〜４６．３％のＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、３つ以上の機能を有した（図６Ｆ）。しかしながら、患者Ａ０９からのＨＰＶ１６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、多機能性ではなかった（図６Ｆ）。全体として、これらの結果から、ＧＸ−１８８ワクチン接種により、大部分の患者において、種々の多機能性プロファイルを有する抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を誘引することができたことが示されている。
【０２６０】
抗原刺激に基づく応答性Ｔ細胞の最適な増殖は、治療的なワクチン接種による効果的な保護免疫を提供するために必須であることが公知になっている（Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：４９１１〜４９２７，２００３；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：８９６０〜８９６８，２００５）。したがって、ワクチン接種前（ＶＳ）及び同ワクチン接種後（ＶＦ１）に、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７ペプチドに応答するＣＤ８  Ｔ細胞の活性化誘引増殖を、それぞれ増殖及び活性化のマーカーとして機能する、Ｋｉ６７及びＣＤ３８の発現レベルを測定することにより調査した（Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：１７１０〜１７１５，１９８４；Ｓａｎｄｏｖａｌ−Ｍｏｎｔｅｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓａｎｔｏｓ−Ａｒｇｕｍｅｄｏ，Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７７：５１３〜５２１，２００５）。Ｋｉ−６７は、エクスビボにおける抗原特異的細胞増殖を測定するために妥当なツールであると証明され、標準的な増殖アッセイ、例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ラベル及び５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）包含に対する代替として使用することができた（Ｓｏａｒｅｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ３６２（１〜２）：４３〜５０、２０１０；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．，７７（３）：２７５〜８４，２０１０）。
【０２６１】
凍結保存し、融解させたＰＢＭＣ（ウェル当たりに１×１０６個）を、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、３７℃、５％  ＣＯ２において、６時間以上適応させた。ＰＢＭＣを、ダプリケートで播種し、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリン、及び１００μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０中の、１つのプールにＨＰＶ１６のＥ６及びＥ７ペプチド（８個のアミノ酸オーバーラップを含む１５ｍｅｒ）を組み合わせた濃度２μｇ  ｍＬ−１の混合物により、５日間刺激した。α−ＣＤ３  ｍＡｂ及び培地単独を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。３日後、細胞培養物を、１００μｌの新たなＲ１０培地で置き換えた。培養の終了時に、後続の免疫染色及び多染性フローサイトメトリー分析のために、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７、ＣＤ３８−ＢＶ４２１（ＨＩＴ２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３−ＢＶ６０５、Ｋｉ−６７−ＰＥ（Ｂ５６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ＡＰＣＣｙ７により染色した。培地コントロールの応答より少なくとも３倍高い応答が、陽性であると考えられた。ワクチン誘引応答を、ベースラインサンプルの抗原特異的増殖性ＣＤ８  Ｔ細胞の割合における、少なくとも３倍の増加として定義した。
【０２６２】
図８に示されるように、１名の患者（Ａ０１）は、ワクチン接種前（ＶＳ）に比較的高い既存レベルを示したが、残りの患者は、低レベルのＫｉ６７＋ＣＤ３８＋ＣＤ８  Ｔ細胞を示した。ワクチン接種後に、全ての患者は、ＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖活性における、有意義な改善を示した。図６に示された機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答のパターンに基づいて、２名の患者（Ａ０４及びＡ０９）は、ＣＤ８  Ｔ細胞集団の増殖における、小さな増加のみを示した。一方、他の７名の患者は、Ｋｉ６７＋ＣＤ３８＋ＣＤ８  Ｔ細胞集団の非常に大きな増加を、３．１倍〜２１．２倍の範囲内の増加で示した。本明細書において、刺激していない細胞からのＫｉ６７発現のバックグラウンドレベルは、非常に低かった（０．０１１±０．０１５％）ため、ペプチド刺激Ｋｉ６７＋ＣＤ３８＋ＣＤ８  Ｔ細胞は、図８に示されるように、抗原特異的増殖性ＣＤ８  Ｔ細胞と考えることができる。まとめると、これらの結果から、ＣＩＮ３患者におけるＧＸ−１８８ワクチン接種により、ＨＰＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖及び多機能性の両方が実質的に向上されたことが示される。
【０２６３】
（実施例４）
ＧＸ−１８８ワクチン接種後のＥ７及びＥ６たんぱく質に対する抗体応答の測定
血漿サンプルについて、エンドポイント希釈酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、Ｅ６及びＥ７に対する総ＩｇＧ抗体応答を評価した。具体的には、血漿サンプルを収集し、−７０℃で凍結させた。結合性ＥＬＩＳＡを、ＧＸ−１８８ワクチン接種により誘引された抗ＨＰＶ１６／１８  Ｅ６又はＥ７抗体応答を測定するために行った。抗体のエンドポイント力価を、９６ウェルの酵素免疫アッセイプレート（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標））をＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８のＥ６又はＥ７たんぱく質（１μｇ  ｍＬ−１）でコートすることにより決定した（組換えＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、及びＨＰＶ１８  Ｅ７を、ＰｒｏｔｅｉｎＸ  Ｌａｂから購入し、組換えＨＰＶ１８  Ｅ６を、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅから購入した）。プレートを、ＰＢＳ、５％スキムミルクにより、室温で１時間ブロックした。試験血漿を、５％スキムミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中において、系列希釈し、トリプリケートでプレートウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ＨＲＰにコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，Ａ８０−１０４Ｐ）と共に、このプレートを室温で１時間インキュベートすることにより、Ｅ６又はＥ７特異的抗体を検出した。最後の洗浄（Ｔａｂｌｅｔ，Ｆｌｕｋａ）後に、特異的結合を、ＴＭＢ基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）により検出した。反応を、０．５ＮＨ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｐｌｕｓ  ３８４）において、４５０ｎｍで読み取った。陰性カットオフ（ＮＣＯ）値を、１２名の健康なコントロール血漿（Ｂｉｏｃｈｅｍｅｄ）の平均光学密度＋１．６４５×標準偏差として定義した（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２８９（１〜２）：１〜１６，２００４）。サンプルの平均光学密度がＮＣＯ値（ＨＰＶ１６  Ｅ６については０．１７３、ＨＰＶ１６  Ｅ７については０．２１３、ＨＰＶ１８  Ｅ６については０．２１４、及びＨＰＶ１８  Ｅ７については０．２２７）より高かった場合は、陽性と考えられた。サンプルのプレートへの非特異的な結合を説明するために、各血漿を、無関係なたんぱく質であるＥＰＯ−ＢＲＰ（ＥＤＱＭ，ｂａｔｃｈ  ３，ｐｈ．Ｅｕｒ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）でコートしたウェルにおいて試験した。
【０２６４】
全ての患者は、図９Ａ〜９Ｌに示されるように、ベースライン（ＶＳ）において、Ｅ６及びＥ７たんぱく質の両方に対して、わずかに検出可能か又は検出不可能なＩｇＧ力価を有した。これは、有意義な既存のＥ６及びＥ７特異的ＩｇＧ抗体応答を示さない。興味深いことに、Ｅ６に対する抗体力価は、ワクチン接種後のいずれの用量コホートにおいても、少しも発生又はブーストされなかった。９名の患者のうちの３名（Ａ０５、Ａ０７、及びＡ０９）では、ワクチン接種後に弱い抗Ｅ７抗体応答を、１：８〜１：２５６の範囲の抗体力価で生じた（図９Ａ〜９Ｌ）。Ｅ７抗原に対するＴ細胞応答は、Ｅ６抗原に対するＴ細胞応答より低かったこと、及び、Ｅ７たんぱく質に対する測定可能な抗体力価は、ＰＢＭＣ中におけるＥ７抗原に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答に関連しなかったことは、注目する価値がある。
【０２６５】
（実施例５）
ＨＰＶ感染及び病変におけるＧＸ−１８８ワクチン接種の効果
ＧＸ−１８８誘引臨床応答を、臨床試験の３６週の期間にわたる、患者のＨＰＶ感染状態並びに、患者の高度子宮頸部病変の細胞学的及び組織学的変化を評価することにより決定した（表１０及び図１Ｂ）。ベースライン（ＶＳ）において、９名全ての患者は、膣頸管検査直接生検標本の組織学的評価に基づいて、重篤な異形成（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、及びＡ０８）又は上皮内癌（Ａ０３、Ａ０４、及びＡ０９）のいずれかを伴うＣＩＮ３を有した（表５及び１０）。最後のワクチン接種後８週（ＶＦ１）において、９名の患者のうちの６名において、病変がなくなった（各コホートから２名の患者、１ｍｇコホートからＡ０１及びＡ０３、２ｍｇコホートからＡ０５及びＡ０６、４ｍｇコホートからＡ０７及びＡ０８）。これは、おそらく１ｍｇで飽和用量であるために、用量非依存性の応答を示す（表１０）。これらの応答患者のうちの３名（Ａ０３、Ａ０６、及びＡ０８）は、２回目の免疫化後の１２週（ＶＴ４）において、細胞学的分析に基づく上皮内病変について、陰性であった。一方、他の３名の患者（Ａ０１、Ａ０５、及びＡ０７）は、３回目のワクチン接種後の２０週（ＶＦ１）に、このような応答を示した。最後の応答患者（Ａ０２）は、３６週の治験の終了時に（ＶＦ２）、病変が排除された。特に、６名の早期応答者は誰も、治験の残り期間の間に、何ら子宮頸部異形成の再発を表わさなかった。２名の非応答者の症例では、患者Ａ０４を、２４週において、子宮頸部の円錐切除により処置し、一方で、患者Ａ０９は、同患者の希望に基づいて、治験終了まで外科手術をすることなくモニターされ、浸潤癌に進行することなく、ＣＩＮ３で安定したままであった。
【０２６６】
ワクチン接種前（ＶＳ）及び治験の終了時（ＶＦ２）における膣頸管検査、細胞学、及び組織学的画像分析から、図１０における代表的な応答者であるＡ０５及び非応答者であるＡ０９患者からの写真により示されるように、応答者と非応答者との間でのＧＸ−１８８に対する臨床応答における差が、より明確に証明された。子宮頸部の膣頸管検査評価において、患者Ａ０５は、ワクチン接種後の形質転換ゾーンにおいて、顕著に減少した密集した白化上皮と、荒い穿孔の消失とを表わした。一方、患者Ａ０９は、図１０Ａに示されるように、子宮頸部における密集した病変を有したままであった。子宮頸部内細胞学検査から、ＧＸ−１８８ワクチン接種により、患者Ａ０５における、細長い細胞質突起及び正染性核を伴う高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）の正常化が誘引されたことが証明されたが、図１０Ｂに示されるように、患者Ａ０９における細胞学的外観には変化はなかった。図１０Ｃに示されるように、組織学的特徴において、生検から、ワクチン接種後の患者Ａ０５において、著しい核の変化を伴うＣＩＮ３の異常な厚みの上皮が、異常な上皮を伴わない正常な扁平上皮に退行したことがわかったが、患者Ａ０９においては存在したままであった。
【０２６７】
ＨＰＶ１６は、治験の開始時において、９名全ての対象の病変において特定された。１名の患者（Ａ０５）では、ＨＰＶ１８の同時感染も見出された。１２週（ＶＴ４）において、４名の患者（Ａ０１、Ａ０３、Ａ０６、及びＡ０８）及び患者Ａ０５はそれぞれ、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８ウイルスの排除を示した（表１０）。このことは、２回目の免疫化後でのウイルス排除を示している。２０週（ＶＦ１）において、子宮頸部病変におけるＨＰＶ  ＤＮＡは、９名の患者のうちの６名（Ａ０１、Ａ０３、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、及びＡ０８）において排除され、更に１名の患者（Ａ０２）では、３６週（ＶＦ２）においてウイルスが排除された。また、これら７名の患者では、同一の動態で病変を除去され、臨床的応答とウイルス学的応答との間の完全な相関が存在した（表１０）。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８以外に、２名の患者（Ａ０６及びＡ０７）において、他の高リスク共通型のＨＰＶの同時感染が、ベースライン（ＶＳ）において見出された。他の患者（Ａ０５）は、治験の最中（ＶＴ４）において、共通のＨＰＶ型に感染した。Ａ０７患者とは対照的に、Ａ０５及びＡ０６患者では、それぞれＶＦ２及びＶＴ４において、同時感染した共通型のＨＰＶが排除された。これは、おそらく、ＨＰＶ１６感染上皮内腫瘍細胞の排除により生じたバイスタンダー効果による。これらのウイルス排除の別の理由は、ワクチン接種に基づいて生じた、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の交叉反応による。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８と他の高リスク型株との間のＥ６及びＥ７のアミノ酸配列における約５０〜６０％の相同性が存在するためである。
【０２６８】
早期の時点（ＶＴ４）において病変及びＨＰＶ感染が排除された３名の患者（Ａ０３、Ａ０６、及びＡ０８）は、比較的大きいＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を即座に表わした（表１０、図６及び８）ことが注目に値する。加えて、有意義な多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を有する他の４名の患者（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０５、及びＡ０７）は、３回目のワクチン接種後の２０週（ＶＦ１）又は治験の終了時（３６週でのＶＦ２）のいずれかにおいて、病変及びＨＰＶ感染の完全な解消を示した（表１０、図６及び８）。対照的に、２名の非応答患者（Ａ０４及びＡ０９）は、多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答をほとんど有さなかった。多機能性Ｔ細胞応答の誘引と臨床的アウトカムとの間の相関は、患者からの個々のデータを非応答者（Ａ０４及びＡ０９）と、３つ以上の機能を有する多機能性プロファイルを生じさせた応答者（Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、及びＡ０８）とにグループ分けした場合に、容易に明らかである（図１１）。したがって、本明細書で示された結果から、ＧＸ−１８８ワクチンの臨床的効能は、全身性のＨＰＶ特異的多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞応答の度合いと強く相関することが示される。全体として、ＧＸ−１８８ワクチン接種により、７８％（９名の患者のうち７名）の、臨床的及びウイルス学的に有意義で完全な応答率がもたらされた（表１０）。
【０２６９】
【表１０】
2017525760.tif 000012
ａＨＰＶの検出についてのＰＣＲ結果（陰性、ＨＰＶ１６及び１８の両方が陰性；１６、ＨＰＶ１６陽性；共通、他の高リスクＨＰＶ２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、及び／又は８２陽性）
ｂ未実行。Ａ０４患者を、２４週において子宮頸部の円錐切除により処置した。
ｃＡ０７患者は、同患者の個人的な事情のために、３６週の代わりに４２週において、受診し、膣頸管検査及び子宮頸部生検についての検査を受けた。
ＣＩＮ３；子宮頸部上皮内腫瘍グレードＩＩＩ、ＡＳＣ−Ｈ；高度扁平上皮内病変を排除できない異常な扁平細胞、ＡＳＣ−ＵＳ；意義不明の異常な扁平細胞、ＨＳＩＬ；高度扁平上皮内病変、ＮＩＬ；上皮内病変なし
【０２７０】
本明細書で使用した統計学的解析：安全性、薬力学的及び薬物動態的アウトカムの記述統計を、ＳＡＳ（登録商標）（Ｖ９．１）ソフトウェアを使用して行った。標準的な両側性の対応のあるスチューデントｔ検定を、全ての定量的データの統計学的有意差を、Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して分析するために行った。
【０２７１】
（実施例６）
ＧＸ−１８８変形例の構築及びその免疫原性
ＧＸ−１８８構築物の多くの変形例を、記載されるように構築した。構築したＧＸ−１８８変形例は、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｅ−１、及びＥ−２を含む。図１４を参照のこと。一部の構築物（Ｃ−１及びＣ−２）は、Ｅ６又はＥ７たんぱく質部分における１つ又は２つ以上の変異又は置換（即ち、それぞれ、Ｃ−１については、１６Ｅ６Ｎ中のＨ２１Ｑ並びに１６Ｅ６Ｃ中のＹ８５Ｈ及びＶ９０Ｌと、Ｃ−２については、１６Ｅ７Ｎ中のＭ１２Ｋ及びＮ２９Ｓ並びに１６Ｅ７Ｃ中のＲ７７Ｓ及びＧ８５Ｓ）を含有する。一部の構築物（Ｄ−１及びＤ−２）は、より短い又はより長いオーバーラップ配列（即ち、それぞれ、０＋０＋０＋０及び８６＋４２＋１５＋１５）を含有する。一部の構築物（Ｅ−１及びＥ−２）は、Ｅ６及びＥ７たんぱく質部分の異なる抗原シャッフル順序（それぞれ、ＮＣＮＣＮＣＮＣ及びＣＣＮＮＣＣＮＮ）を含有する。変異／置換の変形例（Ｃ−１及びＣ−２）は、図１３Ａ〜１３Ｄに示されるように、天然の変異及び／又は置換に基づいている。
【０２７２】
ＧＸ−１８８から変形例を構築するために、置換／変異、オーバーラップ配列の変更、及び抗原シャッフルの変更を含有する各遺伝子フラグメントを、ＧＸ−１８８内への挿入を容易にするために、その末端にＢｓｔＸＩ（５’）及びＡｌｅＩ（３’）の制限部位を有するように、化学的に合成した。
【０２７３】
ＧＸ−１８８並びにＣ−１、Ｃ−２、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｅ−１、及びＥ−２のフラグメントを、ＢｓｔＸＩ及びＡｌｅＩ制限酵素により消化し、ついで、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｅ−１、及びＥ−２の各プラスミドをそれぞれ生成するようにライゲートした。特に、Ｃ−１構築物については、ＨＰＶ１６  Ｅ６のヒスチジン（Ｈ）２１、チロシン（Ｙ）８５、及びバリン（Ｖ）９０をそれぞれ、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びロイシン（Ｌ）により置換した。Ｃ−１構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１０５として示す。Ｃ−１構築物のアミノ酸配列を、配列番号１０６として示す。Ｃ−２構築物について、ＨＰＶ１６  Ｅ７のメチオニン（Ｍ）１２を、リジン（Ｋ）により置換し、ＨＰＶ１６  Ｅ７のアスパラギン（Ｎ）２９、アルギニン（Ｒ）７７、及びグリシン（Ｇ）８５を、セリン（Ｓ）により置換した。Ｃ−２構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１０７として示す。Ｃ−２構築物のアミノ酸配列を、配列番号１０８として示す。Ｄ−１構築物は、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜７８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７９番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５９番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。Ｄ−１構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１０９として示す。Ｄ−１構築物のアミノ酸配列を、配列番号１１０として示す。Ｄ−２構築物は、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜１３０番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の４５番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の４４番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。Ｄ−２構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１１１として示す。Ｄ−２構築物のアミノ酸配列を、配列番号１１２として示す。Ｅ−１構築物は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５１番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７１番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。Ｅ−１構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１１３として示す。Ｅ−１構築物のアミノ酸配列を、配列番号１１４として示す。Ｅ−２構築物は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＰＶ１６  Ｅ６の７１番目〜１５８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ７の５１番目〜９８番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１６  Ｅ６の１番目〜６５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ６の１番目〜８５番目のアミノ酸、ＨＰＶ１８  Ｅ７の１番目〜６５番目、ＨＰＶ１８  Ｅ６の７１番目〜１５８番目、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の５１番目〜１０５番目を含有する。Ｅ−２構築物をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド配列全体を、配列番号１１５として示す。Ｅ−２構築物のアミノ酸配列を、配列番号１１６として示す。
【０２７４】
ＧＸ−１８８及びＧＸ−１８８変形例により誘引された細胞性免疫応答を調査するために、エレクトロポレーション送達により、８μｇのＧＸ−１８８及びＧＸ−１８８変形例プラスミドＤＮＡを、１回又は２回、マウスにワクチン接種した。図１５に、各構築物のワクチン接種スケジュールをまとめる。ワクチン接種したマウスを、各ワクチン接種後２週間で分析した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、ワクチン誘引Ｔ細胞応答を測定するために行った。脾臓細胞を、１個の細胞レベルに調製し、実施例２で記載されるように、２μｇ  ｍＬ−１の４種類のペプチドプールにより、２４時間刺激した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及び培地のみをそれぞれ、陽性及び陰性コントロールとして使用した。刺激後、スポット形成細胞（ＳＦＣ）を、製造メーカーの指示（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って発色させた。応答性細胞数を、刺激せずに誘引されたスポットの平均数を刺激物質の存在下でのスポット数から差し引くことにより算出した。応答性細胞数を、１０６個脾臓細胞当たりのＳＦＣとして表わす。
【０２７５】
ワクチン変形例で免疫化したマウスは、モックベクターによりワクチン接種したマウスと比較して、１回又は複数回のワクチン接種の両方において顕著に増加したＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示した（図１６Ａ及び１６Ｂを参照のこと）。ほとんどのＧＸ−１８８変形例は、複数回のワクチン接種後に、ＧＸ−１８８に対するのと同等のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示した。これらの結果から、ワクチンＧＸ−１８８変形例によっても、ワクチン接種後に、十分な細胞媒介性免疫応答、例えば、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を誘引し得ることが示される。特に、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、Ｅ１及びＥ２（抗原シャッフル）の１回のワクチン接種後に最も低かったが、ワクチン誘引Ｔ細胞応答は、追加免疫ワクチン接種後に亢進し、他のＧＸ−１８８変形例と同等であった。この結果から、置換／変異及び抗原シャッフルは、複数回のワクチン接種に対してワクチン誘引Ｔ細胞応答を誘引する能力を保持し得ることが示唆される。
【０２７６】
本開示は、本開示の個々の態様の１つの例示として意図して記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではなく、機能的に均等の任意の組成及び方法が、本開示の範囲内である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本開示の種々の変形形態が、前述の説明及び添付の図面から、当業者に明らかとなるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
【０２７７】
本明細書で言及された全ての刊行物、及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が具体的に、かつ個々に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、参照により組み込まれる。
【０２７８】
本願は、２０１４年８月１５日に出願された米国仮出願第６２／０３８，１３４号及び２０１４年８月１９日に出願された米国仮出願第６２／０３９，２７０号に対する利益を主張する。これらの出願は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2017525760.tif 000013
【図１Ｂ】
2017525760.tif 000014
【図２Ａ】
2017525760.tif 000015
【図２Ｂ】
2017525760.tif 000016
【図２Ｃ】
2017525760.tif 000017
【図３Ａ】
2017525760.tif 000018
【図３Ｂ】
2017525760.tif 000019
【図３Ｃ】
2017525760.tif 000020
【図３Ｄ】
2017525760.tif 000021
【図３Ｅ】
2017525760.tif 000022
【図３Ｆ】
2017525760.tif 000023
【図３Ｇ】
2017525760.tif 000024
【図３Ｈ】
2017525760.tif 000025
【図３Ｉ】
2017525760.tif 000026
【図４Ａ】
2017525760.tif 000027
【図４Ｂ】
2017525760.tif 000028
【図４Ｃ】
2017525760.tif 000029
【図４Ｄ】
2017525760.tif 000030
【図４Ｅ】
2017525760.tif 000031
【図５Ａ】
2017525760.tif 000032
【図５Ｂ】
2017525760.tif 000033
【図５Ｃ】
2017525760.tif 000034
【図５Ｄ】
2017525760.tif 000035
【図５Ｅ】
2017525760.tif 000036
【図５Ｆ】
2017525760.tif 000037
【図６Ａ】
2017525760.tif 000038
【図６Ｂ】
2017525760.tif 000039
【図６Ｃ】
2017525760.tif 000040
【図６Ｄ】
2017525760.tif 000041
【図６Ｅ】
2017525760.tif 000042
【図６Ｆ】
2017525760.tif 000043
【図７Ａ】
2017525760.tif 000044
【図７Ｂ】
2017525760.tif 000045
【図７Ｃ】
2017525760.tif 000046
【図７Ｄ】
2017525760.tif 000047
【図７Ｅ】
2017525760.tif 000048
【図８Ａ】
2017525760.tif 000049
【図８Ｂ】
2017525760.tif 000050
【図８Ｃ】
2017525760.tif 000051
【図９Ａ】
2017525760.tif 000052
【図９Ｂ】
2017525760.tif 000053
【図９Ｃ】
2017525760.tif 000054
【図９Ｄ】
2017525760.tif 000055
【図９Ｅ】
2017525760.tif 000056
【図９Ｆ】
2017525760.tif 000057
【図９Ｇ】
2017525760.tif 000058
【図９Ｈ】
2017525760.tif 000059
【図９Ｉ】
2017525760.tif 000060
【図９Ｊ】
2017525760.tif 000061
【図９Ｋ】
2017525760.tif 000062
【図９Ｌ】
2017525760.tif 000063
【図１０Ａ】
2017525760.tif 000064
【図１０Ｂ】
2017525760.tif 000065
【図１０Ｃ】
2017525760.tif 000066
【図１１Ａ】
2017525760.tif 000067
【図１１Ｂ】
2017525760.tif 000068
【図１２Ａ】
2017525760.tif 000069
【図１２Ｂ】
2017525760.tif 000070
【図１２Ｃ】
2017525760.tif 000071
【図１２Ｄ】
2017525760.tif 000072
【図１２Ｅ】
2017525760.tif 000073
【図１２Ｆ】
2017525760.tif 000074
【図１３Ａ】
2017525760.tif 000075
【図１３Ｂ】
2017525760.tif 000076
【図１３Ｃ】
2017525760.tif 000077
【図１３Ｄ】
2017525760.tif 000078
【図１４】
2017525760.tif 000079
【図１５】
2017525760.tif 000080
【図１６Ａ】
2017525760.tif 000081
【図１６Ｂ】
2017525760.tif 000082
【配列表】
2017525760000001.app
【国際調査報告】
2017525760.tif 000083
2017525760.tif 000084
2017525760.tif 000085