(57)【要約】本発明は、一般には、心臓障害の予後予測及び／又は診断のためのアッセイ、方法及びキットに関する。本発明は、例えば、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の予測又は診断に使用するための新規クラスの循環心筋トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドバイオマーカーに対する結合剤も提供する。加えて、本発明の結合剤を使用して、心筋梗塞の予後予測及び診断の際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを向上させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測する方法であって、
（ｉ）前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定された前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと、適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
前記対照集団と比較した前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になることの予測であり、さらに、前記測定するステップが、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む、方法。
【請求項２】
対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断する方法であって、
（ｉ）前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定された前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと、適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
前記対照集団と比較した前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を示し、さらに、前記測定するステップが、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む、方法。
【請求項３】
前記対象からの第１の生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
前記第１の生体試料と同じ対象から採取されるが時間の点ではより後に採取される第２の生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
前記第１の試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと、前記第２の試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルとを比較するステップと、
を含み、
前記第１の試料と前記第２の試料間での前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害になるリスク増加を示すか、又は、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害、及び／又は心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害の持続、を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
心拍数、ヘモグロビン濃度、血圧、年齢、性別、体重、身体活動レベル、並びに肥満、糖尿病及び心イベントを含むイベントの家族歴、並びにトロポニンＴ及びトロポニンＩの循環レベルを含む、１つ又は複数のリスク因子の分析と併せて実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リスク因子が、心拍数及びヘモグロビン濃度を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉｉｉ）前記対象に処置レジメンを行うステップであり、前記対象が、前記対照集団における前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルと比較して、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加を有することが判明している、ステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する対象の反応性をモニターするための方法であって、
（ｉ）前記対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）同じ対象から採取される、前記対象からの第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦの測定レベルと前記第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦの測定レベルとを比較するステップと
を含み、
前記第１の試料と前記第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示し、前記第１の試料と前記第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦのレベルの減少が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示す、方法。
【請求項８】
前記対照集団が、前記心臓障害であることがわかっている、性別及び年齢を一致させた対象である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記基準範囲が、前記対照集団からの平均循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチド濃度である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心臓障害が、心房細動、心不全、心膜炎、神経伝導障害、血管迷走神経性失神、又はこれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料が、体液又は心臓組織試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が、静脈血及び動脈血を含む血液、血漿、血清並びに間質液から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合剤が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ若しくはヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤又は前記抗体が、固相に固定されている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する対象又はそのような心臓障害になるリスクがある対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するアッセイであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、前記対象からの生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイ。
【請求項１９】
（ｉ）前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定された前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
前記対照集団と比較した前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害になることの予測であり、又は対象を心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害と診断するのに役立ち、さらに、前記測定するステップが、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ又は化学発光アッセイである、請求項１８又は１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記結合剤が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２２】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する対象又はそのような心臓障害になるリスクがある対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するためのキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キット。
【請求項２３】
前記結合剤が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの測定方法についての取扱説明書をさらに含む、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２５】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクの予測に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤。
【請求項２６】
対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の診断に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤。
【請求項２７】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用。
【請求項２８】
対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用。
【請求項２９】
単離されたトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチド。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、請求項２６に記載の単離されたＴｎＴｕＯＲＦペプチド。
【請求項３１】
対象の心筋梗塞リスクを予測する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、前記対象からの生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイ。
【請求項３２】
対象の心筋梗塞を診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、前記対象からの生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイ。
【請求項３３】
前記心筋トロポニンが、トロポニンＴ及びトロポニンＩを含む、請求項３１又は３２に記載のアッセイ。
【請求項３４】
前記心筋トロポニンが、高感度トロポニンＴ×トロポニンＩによって表される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３５】
心筋トロポニンの前記感度及び前記偽陽性パフォーマンスが、心筋トロポニンのＴｎＴｕＯＲＦペプチドに対する生成物比を用いることによって改善される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３６】
生成物比が、高感度トロポニンＴ×トロポニンＩ／ＴｎＴｕＯＲＦペプチドによって表される、請求項３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
心イベント後の対象における死亡率を予測するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、前記対象からの生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイ。
【請求項３８】
心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、前記対象からの生体試料中の前記ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイ。
【請求項３９】
対象における心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するためのキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キット。
【請求項４０】
心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するためのキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キット。
【請求項４１】
対象における心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤。
【請求項４２】
心イベント後の対象における死亡率の予測に使用するための、前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤。
【請求項４３】
心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、前記対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、心臓障害の予後予測及び／又は診断のための方法、アッセイ及びキットに関する。
【発明の背景】
【０００２】
下記は、本発明の理解に有用な可能性がある情報を含む。これは、本明細書において具体的に又は暗に言及又は参照される情報、公報又は文献のいずれかが、今般記載若しくは特許請求される発明の先行技術である、又は当該発明に不可欠であることを認めることではない。本明細書において言及されるすべての公報及び特許は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
心筋トロポニン（ｃＴｎ）の検出のための高感度（ｈｓ）アッセイの出現は、循環器におけるトロポニンについての我々の認識を有意に変え、急性心筋梗塞の診断へのそのようなトロポニンの使用の態様を変えた（ＭＩ；Ｔｈｙｇｅｓｅｎら（２０１２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２０２０−２０３５；Ｋｅｌｌｅｒら（２００９）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１：８６８〜８７７；Ｒｅｉｃｈｌｉｎら（２００９）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１：８５８〜８６７）。やがてこれらのアッセイは心筋梗塞（ＭＩ）の診断に大きな改善をもたらしたが、この改善は、９９パーセンタイルガイドラインより高い上昇したトロポニンレベルを有するが実際にはＭＩを有さない患者数の増加という犠牲の上で実現された（Ｒｅｉｃｈｌｉｎら（２０１２）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１２５：１２０５〜１２１３；Ｔｈｙｇｅｓｅｎら（２０１２）Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３３：２２５２〜２２５７；Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒら（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２（３）：ｅ０００２０４．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＪＡＨＡ．１１３．０００２０４）。こうした犠牲はアッセイ特異度の有意な低下を浸透させ、結果として、バイオマーカーに基づく幾つかの戦略がｈｓｃＴｎ測定に役立てるために提案された（Ｅｇｇｅｒｓら（２００８）Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２９：２３２７〜２３３５；Ｈａａｆら（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１２４：７３１〜７３９；Ｍａｉｓｅｌら（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６２：１５０〜１６０；Ｃｕｌｌｅｎら（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６２：１２４２〜１２４９）。これらの制限を克服するための１つの有望な戦略は、上流オープンリーディングフレームペプチドを含む、生産される有望な全心筋トロポニンの考慮である。
【０００４】
上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）は、タンパク質の主コード領域の上流（５’）の開始及び終止コドンによって定義されるアミノ酸コード配列である。ヒト及びマウストランスクリプトームのおおよそ４０〜５０％はｕＯＲＦを含有し（Ｃａｌｖｏら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：７５０７〜７５１２；Ｉａｃｏｎｏら（２００５）Ｇｅｎｅ  ３４９：９７〜１０５）、ｕＯＲＦは偶然から予測されるより低い頻度であり（Ｎｅａｆｓｅｙら（２００７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２４：１７４４〜１７５１）、これは、ｕＯＲＦが選択圧下にあることを示唆している。しかし、ｕＯＲＦは、転写因子、成長因子、癌源遺伝子及びそれらの受容体を含有するタンパク質サブグループにおいて過発現される（Ｄａｖｕｌｕｒｉら（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１８０７〜１８１６）。複雑であることに加えて、ｕＯＲＦは極めて多様であり、ｃａｐ及び主ＯＲＦ  ＡＵＧに対する位置、転写物当たりの数並びに長さが様々である（Ｃａｌｖｏら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：７５０７〜７５１２；Ｓｏｍｅｒｓら（２０１３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４５：１６９０〜１７００）。哺乳動物細胞の場合、細胞機能に対するｕＯＲＦの直接翻訳作用に関する実験的証拠は限られており、ｕＯＲＦ由来ペプチドが循環器に存在する証拠はない。グルココルチコイド受容体転写物１Ａ（ＧＲ−１Ａ）がその１０２６ｂｐ  ５’−ＵＴＲに５つのｕＯＲＦ開始部位を有することが記録された報告書はわずか１つである。これらのｕＯＲＦの１つは９３アミノ酸ペプチドをコードし、そのようなペプチドは、マウス及びヒト細胞培養物の核、サイトゾル及び細胞膜で検出され、ＧＲ−１Ａ転写の促進に関与することが判明した（Ｄｉｂａら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：１４９〜１６１）。
【０００５】
本出願人は、ｕＯＲＦペプチドがヒト心筋トロポニンＴ（ＴｎＴ）遺伝子の５’−ＵＴＲに存在することをここで立証し、そして心筋ＴｎＴｕＯＲＦペプチドがヒト循環器に実際に存在することと、その心筋ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのアッセイ定量には心臓障害の予後予測及び診断並びに心筋梗塞をはじめとする心臓障害の確証されたバイオマーカーの感度及び偽陽性パフォーマンス（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の改善に有用性があることとを立証する初めての直接的証拠を驚くべきことに提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本願に記載し、本願にて請求する本発明は、当発明の概要において示す又は説明する又は言及するものを含むがそれらに限定されない、多くの属性及び実施形態を有する。当発明の概要は、すべてを含むことを意図したものではなく、本願に記載し、本願にて請求する本発明は、限定のためにではなく単に説明のために含める当発明の概要の中で確認される特徴若しくは実施形態に、又はそのような特徴若しくは実施形態によって、限定されない。
【０００７】
本発明は、一般には、心臓障害の予後予測及び／又は診断のためのアッセイ、方法及びキットに関する。特に、本発明は、例えば心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の、予後予測及び／又は診断のためのアッセイ、方法及びキットにおける、トロポニンＴの上流オープンリーディングフレームによってコードされている新規クラスの循環バイオマーカー及びこのペプチドに特異的な結合剤の使用に関する。
【０００８】
本発明の一態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測する方法であって、
（ｉ）対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定されたＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
対照集団と比較したＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になることの予測であり、さらに、上記測定するステップが、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む方法を提供する。
【０００９】
一実施形態において、上記方法は、（ｉｉｉ）対象に処置レジメンを行うステップであり、対象が、対照集団からの循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと比較してＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加を有することが判明している、ステップをさらに含む。
【００１０】
別の実施形態において、上記方法は、対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の生体試料と同じ対象から採取されるが時間の点ではより後に採取される第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを比較するステップとをさらに含み、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になるリスク増加を示す。
【００１１】
本発明の別の態様では、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断する方法であって、
（ｉ）対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定されたＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
対照集団と比較したＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を示し、さらに、上記測定するステップが、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む方法を提供する。
【００１２】
一実施形態において、上記方法は、（ｉｉｉ）対象に処置レジメンを行うステップであり、対象が、対照集団からの循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと比較してＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加を有することが判明している、ステップをさらに含む。
【００１３】
本発明のいずれかの態様による別の実施形態において、生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定は、１回より多く行われることがある。例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、１５回などの測定が、数時間、数日、数週間、数カ月又は数年に及ぶ期間にわたって実行されることもある。
【００１４】
さらなる実施形態において、上記方法は、対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の生体試料と同じ対象から採取されるが時間の点ではより後に採取される第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを比較するステップとをさらに含み、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加は、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害、及び／又は心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害の持続を示す。
【００１５】
本発明のいずれかの態様による特定の実施形態において、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害には、例えば、心房細動、心不全、心膜炎、血管迷走神経性失神、神経伝導障害及びそれらの組合せが含まれる。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する対象の反応性をモニターするための方法であって、
（ｉ）対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）同じ対象から採取される、上記対象からの第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルを比較するステップと
を含み、
第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示し、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの減少が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物又は治療法での処置に対する好反応を示すものである方法を提供する。
【００１７】
処置すべき心臓障害によっては、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベル増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示す可能性がある。言い換えれば、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベル減少は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示す。
【００１８】
したがって、本発明のまたさらなる態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する対象の反応性をモニターするための方法であって、
（ｉ）対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）同じ対象から採取される、上記対象からの第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルを比較するステップと
を含み、
第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの減少が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示し、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示すものである方法を提供する。
【００１９】
本明細書において開示するいずれかの方法による他の実施形態において、上記測定するステップは、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む。一実施形態において、結合剤は、抗体又はその抗原結合断片である。別の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。他の実施形態において、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合は、固相に固定されている抗体を使用して測定される。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する対象又はそのような心臓障害になるリスクがある対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するアッセイであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【００２１】
本発明のまたさらなる態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する対象又はそのような心臓障害になるリスクがある対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キットを提供する。
【００２２】
本発明の別の態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクの予測に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を提供する。
【００２３】
本発明のまたさらなる態様では、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の診断に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用を提供する。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、単離されたトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドを提供する。
【００２７】
一実施形態では、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドは、配列番号１、２、３又は４のいずれか１つで示されるペプチドの群から選択される。
【００２８】
本発明の別の態様では、対象の心筋梗塞リスクを予測する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【００２９】
本発明のまたさらなる態様では、対象における心筋梗塞を診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【００３０】
いずれかの態様による一実施形態において、心筋トロポニンは、トロポニンＴ及びトロポニンＩを含む。別の態様において、上記アッセイは、心筋トロポニンとＴｎＴｕＯＲＦペプチド間の生成物比を算出することを含む。
【００３１】
本発明のまたさらなる態様では、心イベント後の対象における死亡率を予測するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【００３２】
本発明のまた別の態様では、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【００３３】
本発明のさらなる態様では、対象における心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キットを提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様では、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キットを提供する。
【００３５】
本発明のまたさらなる態様では、対象における心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を提供する。
【００３６】
本発明のまたさらなる態様では、心イベント後の対象における死亡率の予測に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を提供する。
【００３７】
本発明のまたさらなる態様では、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＴｎＴｕＯＲＦ及びｒ２４４抗血清の遺伝子位置及びエピトープ設計を示す図である。ヒト心筋トロポニンのＴをコードする主オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＮＣＢＩアクセッションＮＧ＿００７５５６）が（ＡＴＧ＋１  ｃＴｎＴ  ＯＲＦ）によって示されている。ｃＴｎＴ  ＯＲＦから５’上流の−１５１２塩基対（ｂｐ）に、配列ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳを有する推定１２アミノ酸ペプチド（ＴｎＴｕＯＲＦ）をコードするｕＯＲＦがある。本出願人は、イムノアッセイで使用するためのＴｎＴｕＯＲＦのアミノ末端に対するポリクローナル抗血清（ｒ２４４）をウサギにおいて産生させた。
【図２】合成ＴｎＴｕＯＲＦペプチド標準曲線（黒丸）と比較してヒト静脈血漿の並行希釈（白丸；示されている希釈度）を示す代表的ＴｎＴｕＯＲＦイムノアッセイ曲線を示す図である。
【図３】クレアチニンとの統計的に有意な（スピアマンの順位相関分析により、ｒ＝０．２０１、ｐ＜０．０５）負の相関によって立証されるような、１０９の正常な健常ボランティア血漿試料中の免疫反応性（ＩＲ）ＴｎＴｕＯＲＦの濃度を示す図である。
【図４】臨床的に必要と判断された心臓カテーテル留置を受けた患者１６名におけるＩＲ  ＴｎＴｕＯＲＦ（上方パネル）及び免疫反応性ｈｓＴｎＴ（下方パネル）の局所動脈−静脈濃度を示す図である。静脈濃度は灰色バーであり、これに対して黒いバーは、器官の循環レベルへの可能性のある寄与を比較するための、時間を一致させた動脈試料である。ＦＶ＝大腿静脈、ＲＶ＝腎静脈、ＨＶ＝肝静脈、ＩＶＣ＝下大静脈、ＪＵＧ＝頸静脈、ＣＳ＝心冠静脈洞、ＰＡ＝肺動脈。バーは、平均±ＳＤであり、対応ｔ検定により、＊＝＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図５】ヒト循環器における免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を示す図である。（Ａ）ヒト血漿からの免疫親和性精製ＴｎＴｕＯＲＦが逆相ＨＰＬＣで２つのピーク（Ｉ及びＩＩ）として溶出した。ピークＩＩは、示されているように合成ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと一致して溶出した。灰色の線は、アセトニトリルの濃度を示す。（Ｂ）パネルＡからの免疫反応性ピークＩ及びＩＩのサイズ排除ＨＰＬＣは、ピークＩＩがＴｎＴｕＯＲＦの理論重量（予測Ｍｒ  １．３ｋ）と一致する、約１．５キロダルトン（ｋ）の見かけのＭｒを有することを明示した。ピークＩは、カルボキシ末端短縮形と一致する、約１ｋの見掛けのＭｒを有した。矢印は、較正ペプチドの分子量値を示す。Ｖｔ＝カラムの総容積。
【図６】病院での症状提示（ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）から症状提示７２時間後までのＳＴ上昇ＭＩ患者４名の静脈血中のＴｎＴｕＯＲＦ（パネルＡ）及びｈｓＴｎＴ（パネルＢ）の同時免疫反応性（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）（ＩＲ）濃度を示す図である。データは平均±ＳＤである。
【図７】他の心臓の状態（ｎ＝２６）を診断するためのＮＴプロＢＮＰ、ＴｎＴｕＯＲＦ及びＴｎＴｕＯＲＦ＋Ｈｂ＋心拍数（ＨＲ）変数のパフォーマンスについての受信者操作曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）分析グラフを示す図である。
【図８】急性ＮＳＴＥＭＩ（ｎ＝９６）を診断するためのｈｓＴｎＴ及びトロポニンプラス（ＴｒｏｐｏｎｉｎＰＬＵＳ）のパフォーマンスについての受信者操作曲線（ＲＯＣ）分析グラフを示す図である。
【図９】指標となる入院１年以内の急性非代償性心不全での再入院（ｎ＝１０）を予測するための２４時間ＮＴプロＢＮＰ及びＮＴプロＢＮＰ×ＴｎＴｕＯＲＦの予後予測能力を示す受信者操作曲線（ＲＯＣ）分析グラフを示す図である。
【定義】
【００３９】
通則
特に別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野の（例えば、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学の）当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【００４０】
別段の指示がない限り、本発明で用いる組換えタンパク質及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１及び２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１〜４巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、並びにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、（編者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂版を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）、並びにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂版を含む）などの出所の文献全体にわたって記載され、説明されている。
【００４１】
用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味の明確な支持を提供すると解釈されるものとする。
【００４２】
本明細書全体を通して、特に別段の記述がない限り、又は文脈が別様に要求していない限り、単一のステップ、組成物、ステップ群又は組成物群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップ群又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ又は複数）を包含すると解釈されるものとする。
【００４３】
本明細書において開示する数の範囲（例えば１〜１０）がその範囲内のすべての関連数（例えば１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９及び１０）及びまたその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば２〜８、１．５〜５．５及び３．１〜４．７）への言及も包含すること、したがって、本明細書において明確に開示するすべての範囲のすべての部分範囲が明確に開示されていることを意図している。これらは具体的に意図しているものの単なる例に過ぎず、列挙されている最低値と最高値の間の数値のすべての可能な組合せは、同様に、本願において明確に述べられていると考えるものとする。
【００４４】
本明細書全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は語尾変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられている要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を含意するが、他の任意の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の除外を含意しないと解されることになる。
【００４５】
本明細書に記載する本発明が、具体的に記載するもの以外の変形形態及び修飾形態を受け入れる余地があることは、当業者には理解されるであろう。本発明はすべてのそのような変形形態及び修飾形態を含むと解するべきである。本発明は、本明細書において個々に又は集合的に言及する又は示すステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びに前述のステップ又は特徴のすべての組合せ又はいずれか２つ以上も含む。
【００４６】
本発明は、単に例示を目的とする意図をもつ、本明細書に記載の特定の実施形態によって、範囲が限定されないものとする。機能的に等価の生成物、組成物及び方法は明らかに、本明細書に記載の本発明の範囲内にある。
【００４７】
本明細書におけるいずれの実施形態も、特に別段の記述がない限り、他のいずれかの実施形態に準用されると解釈されるものとする。
【００４８】
精選定義集
本明細書全体を通して、用語「ＴｎＴｕＯＲＦ」は、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレームを意味する。本明細書において、用語「ＴｎＴｕＯＲＦ」及び「ＴｎＴｕＯＲＦペプチド」は同義で用いており、別個の化学エンティティー（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）として循環器に存在し、トロポニンＴ遺伝子の上流オープンリーディングフレームによってコードされている、任意のペプチドを意味することを意図したものである。
【００４９】
本発明による用語「急性心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害」は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の任意の心臓障害を含み、例えば、心房細動、心不全、心膜炎、神経伝導障害及びそれらの組合せを含む。
【００５０】
本明細書で用いる場合の用語「生体試料」は、静脈血及び動脈血を含む血液、血漿、血清、間質液、又は他の任意の体液から選択される生体液を含む。用語「生体試料」は、心臓組織試料も含む。本明細書で用いる場合の用語「生体試料」及び「体液試料」は、例えば、患者などの興味のある対象の診断、予後予測、分類又は評価を目的として得られる、生体試料又は体液の試料を指す。特定の実施形態において、そのような試料は、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害を診断するために得られることもあり、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害のリスク層別化を実行するために得られることもあり、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害を有する患者の疾患経過の予後予測を行うために得られることもあり、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害のリスクが上昇した患者を特定するために得られることもあり、又はそれらの組合せであることもある。加えて、当業者は、特定の体液試料が分画又は精製手順後、例えば、全血の血清又は血漿成分への分離後に、より容易に分析されることを実感していることだろう。
【００５１】
本明細書で用いる場合の用語「レベル」は、ＴｎＴｕＯＲＦの重量当たりの量又は重量当たりの重量を指すことを意図したものである。この用語は、体積当たりの量又は体積当たりの重量として表現される「濃度」を包含することも意図したものである。用語「循環レベル」は、循環体液中に存在するＴｎＴｕＯＲＦペプチドの重量当たりの量又は重量当たりの重量又は濃度を指すことを意図したものである。
【００５２】
対照と比較してＴｎＴｕＯＲＦペプチド（若しくはその物質のための他の任意のバイオマーカー）の循環レベルの「増加」若しくは「減少」、又は一実施形態では対照（レベル）からの「変化」若しくは「偏差」は、統計的に有意である。対照レベル又は平均若しくは履歴対照レベルからのレベル増加、レベル減少、偏差又は変化は、上記レベルが上記対照レベルと比較して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、又は約５０％以上異なる場合、存在すると考えることができる。或いは、統計的に有意なものは、Ｐ≦０．０５と算出することができる。レベル増加、レベル減少、偏差及び変化を、アッセイ基準限界又は基準範囲によって判定することもできる。これらは、直観的評価又はノンパラメトリック法から算出することができる。概して、これらの方法は、０．０２５及び０．９７５フラクタイルを０．０２５＊（ｎ＋１）及び０．９７５（ｎ＋１）として計算することがある。このような方法は、当技術分野において周知である。対照中に不在のマーカーの存在を、より高いレベル、偏差又は変化として見ることもある。対照中に存在するマーカーの不在を、より低いレベル、偏差又は変化と見ることもある。
【００５３】
具体的には、本明細書で用いる場合の用語「基準範囲」は、代表的濃度の統計バンド内の数値、又は代替的には上側濃度若しくは下側濃度に関する数値を指すことを意図したものである。基準範囲は、循環ＴｎＴｕＯＲＦのレベルを人工的に上昇させることがあろう既存の状態を一切有さない対象から通常は得られるであろう。これらの状態については本明細書の他の箇所で論じる。
【００５４】
本明細書で用いる場合の用語「デルタ％」は、所与の変数（すなわち、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベル又は濃度）の変化率を指すと解される。デルタ％は、生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの最終濃度を得、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの初期濃度を引き、それをＴｎＴｕＯＲＦペプチドの初期濃度で割ることによって決定され、結果は百分率として提示される。したがって、非限定的な例として、８００ｐｍｏｌ／ｍＬの初期濃度からの３００ｐｍｏｌ／ｍＬの増加は、３７．５％の変化を表す。
【００５５】
分かりやすくするために、３１〜３９デルタ％の増加は、例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は３９％のデルタ％増加、並びにこれらの値間の分数を含む。
【００５６】
本明細書で用いる場合の用語「対象」は、ヒト又は非ヒト霊長類を指すことを意図したものである。一実施形態において、対象はヒトである。
【００５７】
本発明による用語「適切な対照集団」は、心臓障害情報がわかっている、性別及び年齢を一致させた対象からの平均循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを指す。上記対照集団を用いて、測定されるＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを比較する適切な基準範囲を得る。
【００５８】
本明細書で用いる場合の用語「結合剤」は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに結合する任意の分子を指すことを意図したものであり、小分子、ポリクローナルであるかモノクローナルであるかにかかわらず任意の種からの抗体、抗原結合断片（例えばＦａｂ及びＦａｂ２）、ヒト化抗体、キメラ抗体、或いは、アミノ酸の置換及び／又は他のペプチド若しくはタンパク質（例えばＰＥＧ）との融合を含む他の方法で修飾された抗体を含む。この用語は、任意の種からの受容体若しくは結合タンパク質又はそれらの修飾形態も含む。一例では、結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦと特異的に結合する。
【００５９】
本明細書で用いる場合の用語「特異的に結合する」は、結合剤が、特定の物質と、別の物質と反応又は会合するより、高い頻度で、迅速に、長い間継続して、及び／又は大きい親和性で反応又は会合することを意味すると解釈するものとする。例えば、ＴｎＴｕＯＲＦと特異的に結合する結合剤は、そのタンパク質又はそのエピトープ若しくは免疫原性断片に、無関係のタンパク質及び／又はそのエピトープ若しくは免疫原性断片と結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、及び／又は長い間継続して結合する。例えば、第１の標的（例えばＴｎＴｕＯＲＦ）と特異的に結合する結合剤が第２の標的と特異的に結合することもあり、又はしないこともあることは、この定義を読むことによって理解される。したがって、「特異的結合」は、別の分子の排他的結合又は検出不能な結合を必ずしも必要としない。必然的にではないが、一般には、結合への言及は特異的結合を意味する。
【００６０】
用語「抗体」は、少なくとも１つの可変領域内に含有されている抗原結合部位によってＴｎＴｕＯＲＦ等の標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。この用語は、４本鎖抗体（例えば、２本の軽鎖及び２本の重鎖）、組換え又は修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、ハーフ抗体、二重特異性抗体）並びにシングルドメイン抗体、例えばドメイン抗体及び重鎖のみ抗体（例えば、ラクダ化抗体又は軟骨魚類免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ））を含む。抗体は、定常領域又は定常断片又は結晶性断片（Ｆｃ）に配列されることがある、定常ドメインを一般に含む。抗体の好ましい形態は、４本鎖構造を基本単位として含む。完全長抗体は、共有結合している２本の重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）と、２本の軽鎖（各々約２３ｋＤａ）とを含む。軽鎖は、可変領域及び定常ドメインを一般に含み、哺乳動物ではκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は、可変領域と、ヒンジ領域によってさらなる定常ドメイン（複数可）と結合している１つ又は２つの定常ドメイン（複数可）とを一般に含む。哺乳動物の重鎖は、次のタイプのうちの１つのものである：α、δ、ε、γ又はμ。各軽鎖も重鎖の１本と共有結合している。例えば、２本の重鎖、及び重鎖と軽鎖とは、鎖間ジスルフィド結合によって及び非共有結合性相互作用によって互いに保持されている。鎖間ジスルフィド結合の数は、抗体のタイプによって変わることがある。各鎖は、Ｎ末端可変領域（各々、長さが約１１０アミノ酸である、ＶＨ又はＶＬ）、及びＣ末端に１又は複数の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（長さが約１１０アミノ酸であるＣＬ）は、重鎖の第１の定常ドメイン（長さが約３３０〜４４０アミノ酸であるＣＨ）と整列しており、ジスルフィド結合している。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列している。抗体重鎖は、２つ以上のさらなるＣＨドメイン（例えばＣＨ２、ＣＨ３など）を含むことができ、ＣＨ１定常ドメインとＣｍ定常ドメイン間に同定することができるヒンジ領域を含むことができる。抗体は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）又はクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。一例では、抗体は、ネズミ（マウス若しくはラット）抗体又は霊長類（好ましくはヒト）抗体である。用語「抗体」は、インタクトポリクローナル又はモノクローナル抗体のみならず、変異体、抗原結合部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体又はベニヤード抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｄｉｂｏｄｙ）も含む。
【００６１】
用語「抗原結合断片」は、ＴｎＴｕＯＲＦと結合する能力を保持する抗体、好ましくはＴｎＴｕＯＲＦと特異的に結合する抗体、の任意の断片を意味すると解釈するものとする。この用語は、数ある中でも、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、１本鎖抗体（ＳＣＡ又はＳＣＡＢ）を含む。「Ｆａｂ断片」は、抗体分子の一価抗原結合断片からなり、酵素パパインで全抗体分子を消化して、インタクト軽鎖と重鎖の一部分とからなる断片を生じさせることによって生産することができる。抗体分子の「Ｆａｂ’断片」は、全抗体分子をペプシンで処理し、その後、還元して、インタクト軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得ることができる。この要領で処理して抗体１分子につき２つのＦａｂ’断片が得られる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって互いに保持されている２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、全抗体分子を酵素ペプシンで処理することにより、その後の還元なしで得られる。「Ｆｖ断片」は、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子改変断片である。「１本鎖抗体」（ＳＣＡ）は、適切な、可動性ポリペプチドリンカーによって連結されている軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子改変１本鎖分子である。
【００６２】
用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種（例えば、マウスなどのネズミ）に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（複数可）の残部が、別の種（例えば、ヒトなどの霊長類）に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体はもちろん、所望の生物活性を示すのであればそのような抗体の断片も指す（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５）。
【００６３】
用語「ヒト化抗体」は、組換え技術を用いて一般に調製されるキメラ分子であって、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来するエピトープ結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく残りの免疫グロブリン分子構造とを有するキメラ分子を指すと解するものとする。抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域にグラフトされた非ヒト抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体からの残りの領域とを好ましくは含む。エピトープ結合部位は、野生型であることもあり、又は１若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されていることもある。重鎖と軽鎖の両方の可変領域が、問題のエピトープに応じて様々であり結合能力を決める３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、これらに隣接して、所与の種において比較的保存されており、上記ＣＤＲに足場を提供すると推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）があることは公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製する場合、修飾すべきヒト抗体中に存在するＦＲ上に非ヒト抗体に由来するＣＤＲをグラフトすることによって可変領域を「作り直す」又は「ヒト化する」ことができる。
【００６４】
用語「エピトープ」は、抗体及び／又はＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意の抗原（例えばタンパク質）決定基を含む。すなわち、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位。エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面上の基から通常はなり、特異的三次元構造特性はもちろん、特異的電荷特性も通常は有する。エピトープは、例えば少なくとも３、５又は８〜１０個のアミノ酸を概して含む。上記アミノ酸は、連続したアミノ酸であることもあり、又は三次フォールディングによって並置されている連続していないアミノ酸であることもある。高次構造エピトープと非高次構造エピトープは、高次構造エピトープとの結合が変性溶媒の存在下で失われるが、非高次構造エピトープとの結合は失われないことで区別される。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「抗原変異体」は、１つ若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されている、特異的に同定された配列とは異なるペプチド配列を指す。１、２、３又は４個のアミノ酸の置換、付加又は欠失が具体的には考えられる。変異体は、天然に存在する対立遺伝子抗原変異体であることもあり、又は天然に存在しない抗原変異体であることもある。変異体は、同じ種からのものであることもあり、又は他の種からのものであることもあり、ホモログ、パラログ及びオルソログを包含することができる。特定の実施形態において、本発明に有用なポリペプチドの抗原変異体は、親ポリペプチドと同じ又は同様である、ホルモン機能又は抗原結合特性をはじめとする生物活性を有する。（ポリ）ペプチドに関して用語「抗原変異体」は、本明細書にて定義のポリペプチドのすべての形態を包含する。用語「抗原変異体」は、天然に存在するポリペプチド、組換え生産されたポリペプチド及び合成生産されたポリペプチドを包含する。
【００６６】
当技術分野において公知のコンピュータ／データベース法に加えて、ポリペプチド抗原変異体は、当技術分野において公知の物理的方法によって、例えば、本発明のポリペプチドに対して産生された抗原を使用する発現ライブラリーのスクリーニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７）によって、同じくＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載されている組換えＤＮＡ法によって、又はそのような抗体を活用する天然源からのポリペプチドの同定によって、同定することができる。
【詳細な説明】
【００６７】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の予後予測又は診断のためのアッセイ、方法及びキットにおける、本明細書に記載するトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチド及び結合剤の使用は、例えば心房細動、心不全、心膜炎、神経伝導障害、血管迷走神経性失神及びこれらの組合せ（Ｔｈｙｇｅｓｓｅｎら（２０１２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２０２０〜２０３５；２０２４頁の表Ｉにおいて定義されている）の早期発症の検出に明らかな臨床的意義がある。本明細書に記載する本発明は、心臓障害リスク又は既存の心臓障害が悪化するリスクが潜在的にある可能性がある対象を層別化する能力を臨床医に与える。加えて、本開示の方法、アッセイ及びキットは、既存の治療に対する対象の反応性をモニターする手段を臨床医に与える。例えば、対象におけるＴｎＴｕＯＲＦのレベルを経時的に測定することによって、臨床医は、治療又は処置に対する対象の反応をモニターすることができる。
【００６８】
さらに、心筋梗塞の予測又は診断の際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するための、心イベント後に急性非代償性心不全で再入院する対象のリスクを予測する際の又は心イベント後の対象における死亡率を予測する際のＮＴ−プロＢＮＰの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するための、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに特異的な結合剤を含むアッセイ、方法及びキットが、本発明から得られる。
【００６９】
本明細書に記載する本発明は、以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。
【００７０】
ＴｎＴｕＯＲＦペプチドはヒト循環器に存在する
本出願人は、心筋トロポニンの上流オープンリーディングフレームによってコードされたペプチドが、循環器に及び特にヒト血漿中にはっきりと区別できる別個のバイオマーカーとして存在するという本発明者らの仮説を先ず確認することを試みた。
【００７１】
心筋トロポニン遺伝子の詳細なバイオインフォマティック分析に従って、本出願人は、心筋トロポニンＴの主開始コドンの−１５１２ｂｐ（すなわち上流）に位置するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した（図１）。＋２のコザックスコア及び翻訳される高い尤度から、本出願人は、この上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）が推定１２アミノ酸ペプチドをコードするはずであると予測し、免疫組織化学検査を用いてそのようなペプチドの存在を確認することを試みた。
【００７２】
本出願人は、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ（配列番号１）の予測配列を有する推定１２アミノ酸ペプチドのアミノ末端に対するポリクローナル抗体を先ずは産生させた。この抗体（ｒ２４４）は、他の公知の確証されている循環ペプチド及び／又は薬物、重要なことには、例えば心筋トロポニンＴ及び心筋トロポニンＩ、Ｎ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）、並びに脳ナトリウム利尿ペプチドの成熟形態を含む、そのような循環ペプチド及び／又は薬物との交差反応性を殆ど又は全く示さなかった（ＢＮＰ、実施例２の表ＩＩＩ）。
【００７３】
次いで、ｒ２４４ポリクローナル抗体を使用して、高感度で特異的なラジオイムノアッセイを開発した。図２は、合成ＴｎＴｕＯＲＦペプチド標準曲線と比較してヒト静脈血漿（健常成人対象の末梢血から得た）の並行希釈（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を示す代表的ＴｎＴｕＯＲＦイムノアッセイ曲線を示す。これらのデータは、循環器にはっきりと区別できる化学エンティティーとして存在する、上流オープンリーディングフレームコード配列、この場合はトロポニンＴのｕＯＲＦ、によってコードされたペプチドの存在を立証する初めての直接的証拠を提供する。
【００７４】
さらに、及び重要なこととして、ＴｎＴｕＯＲＦには高感度トロポニンＴ（ｈｓＴｎＴ）レベル、年齢、血圧及びボディーマスインデックスとの有意な関連性がなかった。
【００７５】
次に、本出願人は、イムノアッセイと結合された逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によるイムノアッセイによって検出されるＴｎＴｕＯＲＦ種を同定することを試みた（図５）。これらの分析の結果によって、免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦはヒト血漿中に（ｉ）インタクト１２アミノ酸ペプチド（すなわち、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ；配列番号１）及び（ｉｉ）ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩ（配列番号２）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶ（配列番号３）及びＭＡＰＥＧＷＶＩＶ（配列番号４）をはじめとするカルボキシ末端短縮形として存在することが確認されたが、これらに限定されない。
【００７６】
心臓障害のバイオマーカーとしてのＴｎＴｕＯＲＦ
免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦが実際にヒト循環器に存在することが確証されたので、本出願人は、急性冠症候群をはじめとする心臓障害におけるそのような免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦの潜在的臨床的有用性を判定することを試みた。先ず、４つの独立したコホートからの患者、すなわち、（ｉ）心血管、内分泌又は神経疾患の証拠も病歴もない健常ボランティア（ｎ＝１０９）、（ｉｉ）臨床的に必要と判断された心臓カテーテル留置を受けた患者（ｎ＝１６）、（ｉｉｉ）記録されたＳＴ上昇心筋梗塞がある患者（ｎ＝４）及び急性冠症候群コホート（ｎ＝５０２）をリクルートした。これらの種々の患者コホートからの血液サンプリング範囲の詳細は、実施例１の方法セクションに記載する。
【００７７】
最初の測定セットは、心筋梗塞をもたらす急性心虚血（すなわち患者コホート（ｉｉｉ））の診断バイオマーカーとしての循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの潜在的臨床的有用性の調査を含んでいた。図５のＡは、静脈ＴｎＴｕＯＲＦペプチド濃度は症状発症後最初の４〜５時間に減少する傾向があり、一般的な増加は約２４時間で安定水準に戻ったが、ＴｎＴｕＯＲＦのレベルは実際には正常対照で観察されたものの半分未満であったこと（実施例５）を示す。ｈｓＴｎＴマーカー濃度が虚血イベント後の急性期にＳＴＥＭＩ患者の血漿において急上昇するｈｓＴｎＴ（図５のＢ）と比較して、これらのデータは、心筋梗塞をもたらす急性心虚血の診断におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチドの臨床的有用性の裏付けにならない。
【００７８】
急性冠症候群（Ｔｈｙｇｅｓｓｅｎら（２０１２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２０２０〜２０３５）をはじめとする他の心臓障害の予測又は診断におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチドの潜在的有用性を評価するために、本出願人は、心臓に起因することが疑われる胸痛の主訴を救急診療部（ＥＤ）に提示した患者５０２名の予期的観察研究に着手した。患者人口統計学的及び分析物データを表ＩＩ（実施例１）に提示する。様々な分析の結果により、ＥＤに提示した患者のＴｎＴｕＯＲＦペプチド血漿濃度は心筋梗塞（ＭＩ）及び安定狭心症（ＵＡ）以外の心臓障害の診断に有用性があることが確認された（図７）。
【００７９】
したがって、本出願人は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する患者においてＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環濃度が患者の症状発症後最初の１２時間で最も高いという驚くべき知見を得た。障害時間に関して臨床症状提示（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）開始後最初の１２、１０、８、６、４、２若しくは１時間に又は臨床症状提示時に観察されるレベルは、驚くほど高く、多くの場合、正常対照集団におけるレベルより最大２倍、３倍、４倍及び５倍高い、一般には１．５倍高いレベルに達した。
【００８０】
つまり、１つ又は複数のＴｎＴｕＯＲＦペプチドは、例えば、心房細動、心不全、心膜炎、神経伝導障害及びこれらの組合せ並びに本明細書において述べるような他の障害をはじめとする、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の、明確な早期マーカーとして有用である。
【００８１】
これらの驚くべき知見に基づいて、本出願人は、対象から、特に、例えば障害の臨床症状提示開始後１２、１０、８、６、４、２若しくは１時間以内に又は臨床症状提示時に、採取した生体試料において１つ若しくは複数のＴｎＴｕＯＲＦペプチド又はその断片についてスクリーニングすることが有用になると初めて断定した。
【００８２】
したがって、本発明の一態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測する方法であって、
（ｉ）対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定されたＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
対照集団と比較したＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になることの予測であり、さらに、上記測定するステップが、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む方法を提供する。
【００８３】
本発明の別の態様では、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断する方法であって、
（ｉ）対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）測定されたＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと適切な対照集団からの基準範囲とを比較するステップと
を含み、
対照集団と比較したＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になることを示し、さらに、上記測定するステップが、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することを含む方法を提供する。
【００８４】
評価のために、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルが基準値又は対照値と有用に比較される又は相関付けられることがあることは、当業者には理解されるであろう。一実施形態において、対照集団は、心臓障害であることがわかっている、性別及び年齢を一致させた対象である。
【００８５】
本明細書で用いる場合、対照集団は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの試料が採取され、平均レベルが決定される、個体又は群であることができる。通常、上記個体又は群は、心臓障害に罹患していることがわかっていない正常な健常個体又は個体の群を含むことになる。一実施形態において、基準範囲は、対照集団からの平均循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチド濃度である。対照集団におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルは、約４３０〜１１３０ｐｇ／ｍＬの範囲であり、平均は約７７８ｐｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．００１）である。或いは、対照集団は、事前に検査を受けた個体又は群からの複数の読取値に基づいて評価することができる。平均が約１１５９ｐｇ／ｍＬである、ほぼ７３０〜１５９０ｐｇ／ｍＬ程度のレベルは、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を典型的に示す。
【００８６】
試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップが、研究される生体イベントに依存して、単一試料での単回測定であることもあり、多数の試料での反復測定であることもあることは理解されるであろう。心臓障害の場合、測定は、例えば、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの１〜２０回以上の測定、様々な時点で採取された試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの１〜１０回、１〜５回、１〜３回、又は２回、又は３回の測定を含むことがある。一実施形態において、測定は、障害又は疑われる障害の臨床症状提示開始又は臨床症状提示後最初の１２、１０、８、６、５、４、２時間以内、又は１時間以下以内に採取された試料でのものである。上記サンプル期間外の単回又は反復測定を用いて、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルが正常対照レベルに入るのか、又は例えば心組織対照レベルに入るのかを確証することもできる。
【００８７】
本発明のアッセイ、方法及びキットは、発症又は症状提示の最初の１時間以内に採取された１つ又は２つの試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定すること、その後、発症若しくは症状提示後２〜４時間若しくは２〜３時間以内に採取された１つ又は２つの試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定すること、つまりＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの初期測定を含む。
【００８８】
したがって、特定実施形態において、心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測する方法、又は対象における心筋梗塞若しくは不安定狭心症以外の心臓障害を診断する方法は、対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の生体試料と同じ対象から採取されるが時間の点ではより後に採取される第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを比較するステップとをさらに含み、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加は、心臓障害になるリスク増加を示す。
【００８９】
上で述べたように、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルは、心臓障害の発症又は症状提示の最初の１〜１２、１０、８、６、４又は２時間以下以内に測定されることがあり、例えば、正常対照において測定されるレベルより１．５〜５倍高い。
【００９０】
上で定義したような生体試料は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドが存在できる、又はＴｎＴｕＯＲＦペプチドを分泌することができる、いずれの生体物質であってもよい。一実施形態において、生体試料は、循環器系生体試料、例えば、静脈血及び動脈血、血漿、血清又は間質液である。別の実施形態において、生体試料は、心組織又は心臓組織試料である。
【００９１】
生体試料中の「ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定すること」という用語は、当業者には公知と予想されるような、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ及び免疫放射定量測定法をはじめとする、イムノアッセイなどの、試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベル又は濃度の決定を可能にする方法論を指す。一例では、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルは、ｐｇ／ｍＬとして表される。用語ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベル及びＴｎＴｕＯＲＦペプチド濃度は、同義で用いることができる。
【００９２】
本発明によるアッセイ、方法及びキットにおいて、測定ステップは、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に又は特異的に結合する結合剤であって、生体イベントの他のマーカーとの低い交差反応性を有する結合剤とＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合を検出することを含む。特定の実施形態において、結合剤は、抗体又はその抗原結合断片である。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体若しくはヒト化抗体であってもよいし、又はそれらの抗原結合断片であってもよい。他の実施形態において、結合剤又は抗体は、固相に固定されていることもある。抗体及び抗原結合断片をはじめとする結合剤のより詳細な説明は、本明細書の他の箇所で概説する。
【００９３】
心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を予測又は診断する際のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの特異度及び感度は、ＴｎＴｕＯＲＦの濃度を心拍数値及びヘモグロビン濃度に加えたとき、さらに改善された。実例として、及び図７を参照して、ＴｎＴｕＯＲＦを心拍数及びＨｂ濃度に加えたとき、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の診断は、ＡＵＣ＝０．７９（Ｐ＜０．００１）からＡＵＣ＝０．８３（Ｐ＜０．００１）へと好転した。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の心臓障害を予測又は診断するためのアッセイ、方法及びキットを、例えば、心拍数、ヘモグロビン濃度、血圧、年齢、性別、体重、身体活動レベル、並びに肥満、糖尿病及び心イベントを含むイベントの家族歴、並びに、トロポニンＴ及びトロポニンＩの循環レベルなどの、１つ又は複数のリスク因子の分析と併せて実行することもできる。
【００９４】
上で言及した「ＡＵＣ」値に関して、並びにＴｎＴｕＯＲＦペプチド、及び対象を心臓障害であると予測又は診断するＴｎＴｕＯＲＦペプチドの能力に関して後続の実施例に記載するように、集団研究を用いて決定閾値を選択することもできる。受信者操作特性（「ＲＯＣ」）は、レーダー画像の分析のために第二次世界大戦中に開発された信号検出理論から生まれたものであり、ＲＯＣ分析は、多くの場合、「罹病」亜集団を「非罹病」亜集団と最もよく区別することができる閾値を選択するために用いられる。この場合の偽陽性は、人物が陽性反応を示すが実際には疾患を有さないときに起こる。その一方で、偽陰性は、人物が実際には疾患を有しながら健常であることを示唆する陰性反応を示すときに起こる。ＲＯＣ曲線を描くために、決定閾値を継続的に変化させながら真陽性率（ＴＰＲ）及び偽陽性率（ＦＰＲ）を決定する。ＴＰＲは感度と等価であり、ＦＰＲは、１−特異度に等しいので、ＲＯＣグラフは、感度対（１−特異度）プロットと呼ばれることもある。完全検定は、１．０の（ＲＯＣ）曲線下面積（すなわちＡＵＣ）を有することとなり、無作為検定は、０．５の面積を有することになる。閾値は、許容可能な特異度及び感度レベルをもたらすように選択される。
【００９５】
上で説明したように、本開示の方法、アッセイ及びキットは、既存の治療に対する対象の反応性をモニターする手段を臨床医に与える。
【００９６】
したがって、本発明の別の実施形態において、対象を心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害であると予測又は診断するための方法は、対象が、対照集団におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルと比較してＴｎＴｕＯＲＦペプチドの循環レベルの増加を有すると判明した場合、対象に処置レジメンを行うことをさらに含む。
【００９７】
さらに、本発明のまた別の態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する対象の反応性をモニターするための方法であって、
（ｉ）対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）同じ対象から採取される、上記対象からの第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦの測定レベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦの測定レベルを比較するステップと
を含み、
第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示し、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦのレベルの減少が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示すものである方法を提供する。
【００９８】
処置すべき心臓障害によっては、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示す可能性がある。言い換えれば、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの減少は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示す。
【００９９】
したがって、本発明のまたさらなる態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する対象の反応性をモニターするための方法であって、
（ｉ）対象からの第１の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）同じ対象から採取される、上記対象からの第２の生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）第１の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルと第２の試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドの測定レベルを比較するステップと
を含み、
第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの減少が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する反応不良を示し、第１の試料と第２の試料間でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの増加が、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害のための薬物での処置、又は治療に対する好反応を示すものである方法を提供する。
【０１００】
対象をモニターすべき場合、多数の生体試料を継時的に採取することもある。逐次サンプリングによって、マーカーレベルの変化を継時的に測定することが可能になる。サンプリングは、イベントのおおよその開始時間、イベントの重症度に関する情報をもたらすことができ、どの治療レジメンが適切である可能性があるのかを示し、用いられる治療レジメンに対する応答を示し、又は長期予後予測を示すことができる。救急車内、診療所内、臨床症状提示時、入院中、外来の際、又は定期的人間ドック中などのようなケアの時点で分析を行うことができる。
【０１０１】
さらに、上記方法を、例えば、心拍数、ヘモグロビン濃度、血圧、年齢、性別、体重、身体活動レベル、並びに、肥満、糖尿病及び心イベントをはじめとするイベントの家族歴、並びに、トロポニンＴ及びトロポニンＩの循環レベルなどの、１つ又は複数の心臓障害リスク因子の分析と併せて実行することもできる。
【０１０２】
最後に、本発明が、特異的ＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合メンバー、並びに対象を心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害がある、又はそのような心臓障害を発症するリスクがあると予測又は診断するための薬剤の製造における上記特異的ＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合メンバーの使用にも関することは、当業者には理解されるであろう。
【０１０３】
したがって、本発明は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクの予測に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤も提供する。
【０１０４】
本発明は、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害の診断に使用するための、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤をさらに提供する。
【０１０５】
本発明は、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害になる対象のリスクを予測するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用も提供する。
【０１０６】
本発明は、対象における心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を診断するための薬剤の製造における、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤の使用をさらに提供する。
【０１０７】
心筋梗塞のバイオマーカーとしてのＴｎＴｕＯＲＦ
心筋梗塞をもたらす急性心虚血を直接予測又は診断することができる点でのＴｎＴｕＯＲＦペプチドの有用性欠如にもかかわらず、驚くべきことに、本出願人は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドが、心筋梗塞を予測及び／又は診断する際の既存心筋トロポニンバイオマーカーの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善することを立証する。絶対的には、トロポニンＩ×ｈｓトロポニンＴ／ＴｎＴｕＯＲＦ（本明細書ではトロポニンプラス（商標）と呼ぶ）の生成物比が、２時間以内に検出された心筋梗塞患者数を４％増加させ（すなわち、９４／９６  ＮＳＴＥＭＩ患者又は９８％；９０／９６  ＮＳＴＥＭＩ患者又は９０％を検出したｈｓＴＮＴ及び８８／９６  ＮＳＴＥＭＩ患者又は９２％を検出したＴｎＩと比較）、偽陽性診断率を７％低下させた（実施例６；図８）。
【０１０８】
したがって、本発明のさらなる態様では、対象における心筋梗塞リスクを予測する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【０１０９】
本発明は、対象における心筋梗塞リスクを診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイをさらに提供する。
【０１１０】
いずれかの態様による一実施形態において、心筋トロポニンは、トロポニンＴ及びトロポニンＩを含む。一例では、心筋トロポニンを高感度トロポニンＴ（ｈｓＴｎＴ）×トロポニンＩによって表すことができる。別の実施形態では、心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスは、心筋トロポニンのＴｎＴｕＯＲＦペプチドに対する生成物比を用いることによって改善される。一例では、上記生成物比は、ｈｓＴｎＴ×ＴｎＩ／ＴｎＴｕＯＲＦによって表される。上で説明したように、この生成物比は、心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスを増す。
【０１１１】
本発明は、対象における心筋梗塞を予測又は診断する際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キットも提供する。
【０１１２】
一実施形態において、キットは、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのレベルの測定方法についての取扱説明書をさらに含む。
【０１１３】
本発明は、対象における心筋梗塞を予後予測又は診断の際の心筋トロポニンの感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤をさらに提供する。
【０１１４】
さらに、予後予測に関しては、トロポニンプラス（商標）（すなわちｈｓＴｎＴ×ＴｎＩ／ＴｎＴｕＯＲＦ）は、１年での死亡率をｈｓＴＮＴ及びＴｎＩ単独（それぞれＡＵＣ＝０．７２及び０．７１）より正確に予測した（ＡＵＣ＝０．７４、Ｐ＜０．００１）が、トロポニンＴ又はトロポニンのＩいずれかでは１年以内の心筋梗塞又は慢性心不全による再入院の予測を改善しなかった。
【０１１５】
したがって、本発明のまたさらなる態様では、心イベント後の対象における死亡率を予測するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【０１１６】
一実施形態では、上記アッセイを用いて、心イベント後９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月及び１５カ月まで、より一般的には心イベント後１２カ月までの対象における死亡率を予測することができる。
【０１１７】
本発明は、心イベント後の対象における死亡率の予測に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤をさらに提供する。
【０１１８】
一致させたＮＴプロＢＮＰへの単一入院患者２４時間ＴｎＴｕＯＲＦ濃度の追加は、約１年の急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）での再入院を予測するための２４時間ＮＴプロＢＮＰのみのＲＯＣ曲線を改善した（ＡＵＣ＝０．９３対０．９１；図９）。
【０１１９】
したがって、本発明のさらなる態様では、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスを改善するアッセイであって、トロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、上記対象からの生体試料中のＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【０１２０】
一実施形態では、上記アッセイを用いて、心イベント後９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月及び１５カ月まで、より一般的には心イベント後１２カ月までに急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測することができる。
【０１２１】
本発明は、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するキットであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦとの結合に基づいて定量的に測定することができる、キットをさらに提供する。
【０１２２】
最後に、本発明は、心イベント後に急性非代償性心不全になる対象のリスクを予測する際のＮ末端脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−プロＢＮＰ）の感度及び偽陽性パフォーマンスの改善に使用するための、対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドに選択的に結合するＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤も提供する。
【０１２３】
ＴｎＴｕＯＲＦに対する結合剤
ＴｎＴＵＯＲＦペプチドは、体液試料において、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤との間の結合を検出することによって測定される。本開示の方法で使用するための結合剤は、例えばＡＮＰ及びＢＮＰとの、低い交差反応性を好ましくは有する。結合剤としては、抗原ＴｎＴｕＯＲＦペプチド又はその断片を免疫抗原として使用して調製される、抗体又は抗原結合断片、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ）２を挙げることができる。ポリペプチド又は断片を記載の担体に結合させてもよい。一例では、結合剤は、抗体である。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、又はポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにそれらの断片の生産方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８を参照されたい）が、本出願人も社内で開発した（例えば、Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａら（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：２５５〜２６４）。特異性のため、モノクローナル抗体が好ましい。ヒト化抗体がインビトロアッセイに必要とされないことは、当業者には理解されるであろう。
【０１２４】
一例では、抗体は、抗原ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに対して産生される。一例では、抗原ＴｎＴｕＯＲＦペプチドは、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ（配列番号１）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩ（配列番号２）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶ（配列番号３）又はＭＡＰＥＧＷＶＩＶ（配列番号４）を含む。この抗原ＴｎＴｕＯＲＦペプチドは、特異的アミノ酸検出に十分なエピトープを一般に提供する。
【０１２５】
モノクローナル抗体は、公知技術の方法によって生産することができる。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（５５１７）：４９５〜７によって記載された免疫学的方法、及びＨｕｓｅら（１９８９）２４６（４９３５）：１２７５〜８１によって記載された組換えＤＮＡ法が挙げられる。１本鎖可変抗体断片を生産するための組換えファージ抗体系、及びＮＴ−ＣＮＰペプチドに対する抗体を生産するためのその後の突然変異（例えば部位特異的突然変異誘発）又は鎖交換の使用も考えられる。
【０１２６】
ポリクローナル抗体を生成するための従来の手順は、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（上掲）において詳述されている。簡単に言うと、プロトコルは、選択された動物宿主、例えばウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラット又はマウス（通常はウサギ）に対する単離されたＮＴ−ＣＮＰペプチドでの間隔をあけた何回もの免疫処置とともに、瀉血及び採血前の１回又は複数回の検査を必要とする。血清を遠心分離によって血餅から分離してもよい。ＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイ競合アッセイ又は技術等価の方法を用いて血清をポリクローナル抗体の存在について検査してもよい。
【０１２７】
ＴｎＴｕＯＲＦに特異的な抗体は、これらの又は類似のペプチドを、先ず、大きいタンパク質、例えばリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシサイログロブリンと複合体化して、そのようなペプチドを免疫原性にした後、産生させることができる。結合は、例えば一般的な薬剤グルタルアルデヒド、カルボジイミド又はＮ−（ｅ−マレイミド−カプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＭＣＳ）をはじめとする任意のタンパク質架橋剤の使用によって果たすことができるが、但し、システイン残基をカップリング前にペプチド配列に付加させることを条件とする。これらの複合体のウサギ、ヒツジ、マウス又は他の種への１カ月間隔での注射、続いて２週間後の血液試料の採集によって、マウスの脾臓からポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を生産することが可能になる。
【０１２８】
例えば、上に記載したマウス宿主を屠殺し、マウスの脾臓を除去してもよい。次いでメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、抗体の可変領域の重鎖及び軽鎖に特異的なプライマーとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅とを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列をリンカー配列で連結させて、正しいリーディングフレームを確保する。次いで、宿主への形質転換のために、ＤＮＡ構造をベクター、例えばプラスミド若しくはバクテリオファージ、又はウイルスに挿入する。一例では、ベクターはバクテリオファージである。
【０１２９】
適切な宿主は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞から選択することができる。一例では、原核細胞宿主、好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を使用する。バクテリオファージがウイルスコートを生産し、上記コート上で抗体断片、ファージディスプレイライブラリー、が発現される。ファージディスプレイライブラリーを、特異的抗原に対して適切な親和性を有する抗体断片についてスクリーニングすることができる。ライブラリーを何回もスクリーニングすることができ、タンパク質工学技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及び鎖シャフリングによって抗体構築物を修飾することができ、上記技術はすべて当業者の能力の範囲内である。
【０１３０】
ペプチド結合アッセイを含む結合剤の検出
本発明は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドを結合剤と結合させることと、その後、結合されたペプチドの量を検出することとを含む、検出システムの使用を含む。類似の解決策は、試料中の未結合の結合剤の量を検出して、未結合の又は結合したＴｎＴｕＯＲＦの指標を得ることである。そのような代替法は、結合した結合剤の量を直接検出するための機能的代替手段として本発明の範囲内に入ると解釈される。試料体積がわかっている場合、試料中のＴｎＴｕＯＲＦの量から試料中のＴｎＴｕＯＲＦの濃度を容易に算出することができることは、当業者には理解されるであろう。
【０１３１】
本発明によるアッセイ、方法及びキットにおいて、測定ステップは、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に又は特異的に結合し、生体イベントの他のマーカーとの低い交差反応性を有する結合剤とＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合を検出することを含む。
【０１３２】
したがって、本発明のまた別の態様では、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する対象又はそのような心臓障害になるリスクがある対象からの生体試料中のトロポニンＴ上流オープンリーディングフレーム（ＴｎＴｕＯＲＦ）ペプチドのレベルを測定するアッセイであって、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに選択的に結合する結合剤を含み、該結合剤は、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドとの結合に基づいて定量的に測定することができる、アッセイを提供する。
【０１３３】
特定の実施形態において、結合剤は、抗体又はその抗原結合断片である。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体若しくはヒト化抗体であってもよいし、又はそれらの抗原結合断片であってもよい。それ故、一実施形態において、本発明のアッセイは、イムノアッセイである。
【０１３４】
本発明の抗体は、試料中のＴｎＴｕＯＲＦの存在及び／又は量を決定するためのイムノアッセイに特に有用である。異なる抗体の可変的結合親和性のため、試料中のＴｎＴｕＯＲＦの量に対する測定値の標準結合曲線を特定の抗体について確立して、試料中のＴｎＴｕＯＲＦの量を決定できるようにするべきであることは、当業者には理解されるであろう。そのような曲線を使用して、試料中のＴｎＴｕＯＲＦの真の量を決定する。
【０１３５】
試料材料は、生体液を含むが、それらに限定されない。本開示に関して、通常、生体液は全血、血漿又は血清から選択される。
【０１３６】
ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに特異的なイムノアッセイは、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと特異的に結合する抗体の生産を通常は必要とすることになる。一例では、抗体は、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ（配列番号１）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩ（配列番号２）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶ（配列番号３）又はＭＡＰＥＧＷＶＩＶ（配列番号４）によって定義されるＴｎＴｕＯＲＦペプチドを認識する。抗体を使用して、下記競合結合アッセイにおけるような広範な特異度を有するイムノアッセイを構築することができ、又はサンドイッチ型アッセイで下記の他の抗体と併用して、ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに特異的なアッセイを生成することができる。非競合アッセイも可能であることは、当業者には理解されるであろう。サンドイッチイムノアッセイのための後者の抗体は、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的なものはもちろん、それらのカルボキシ短縮形態（すなわち配列番号２〜４）も含む。
【０１３７】
別の例では、指示薬も使用することがある。指示薬は、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡアッセイ形式で利用されることがある。
【０１３８】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を競合結合アッセイ又はサンドイッチ型アッセイで使用することができる。この方法の一例では、液体試料を抗体と接触させ、抗体によって認識されるエピトープを含有する標識ＴｎＴｕＯＲＦペプチド又は修飾ペプチドと同時に又は逐次的に接触させる。
【０１３９】
標識は、放射活性成分、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃであってもよく、又は時間分解蛍光、蛍光、蛍光分極、発光、化学発光若しくは比色法によって測定することができる非放射活性成分であってもよい。これらの化合物には、放射活性計数法、発光又は蛍光光出力の測定、吸光度などによって直接測定することができる、ユーロピウム若しくは他のアクチニド元素、アクリジニウムエステル、フルオレセイン、又は放射活性物質、例えば上記のものが含まれる。標識は、間接的に測定することができる任意の成分、例えば、ビオチン、ジゴキシン、又は酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼであってもよい。これらの標識を多数の方法で間接的に測定することができる。例えばホースラディッシュペルオキシダーゼを、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）及び過酸化物などの基質と共にインキュベートして、吸光度を測定することができる着色生成物を生じさせることができ、又はルミノール及び過酸化物と共にインキュベートして、ルミノメータで測定することができる化学発光光を得ることができる。ビオチン又はジゴキシンを、それらと強力に結合する結合剤と反応させることができる；例えば、アビジンはビオチンと強力に結合するであろう。そしてまた、これらの結合剤を、測定可能な標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又は上記の他の直接若しくは間接的に測定される標識と、共有結合又は連結させることができる。これらの標識及び上記のものを、ペプチド又はタンパク質に、合成中に、標識との直接反応によって、又はＭＣＳ及びカルボジイミドなどの一般に利用可能な架橋剤の使用によって、又はキレート剤の添加によって結合させることができる。
【０１４０】
抗体との、通常は１８〜２５時間、４℃での、又は１〜２４０分間、３０℃〜４０℃での接触後、結合剤（抗体）と結合した標識ペプチドを未結合標識ペプチドから分離する。溶液相アッセイでは、上記分離を、固相粒子、例えばセルロース、又は磁性材料に結合された抗ガンマグロブリン抗体（二次抗体）の添加によって果たすことができる。二次抗体は、一次抗体に使用されるものとは異なる種で産生され、一次抗体に結合する。したがって、すべての一次抗体は、二次抗体によって固相と結合される。この複合体を遠心分離又は磁気引力によって溶液から除去し、結合標識ペプチドを、そのペプチドに結合している標識を使用して測定する。遊離標識から結合したものを分離するための他の選択肢としては、溶液から沈殿する免疫複合体の形成、ポリエチレングリコールによる抗体の沈殿、又は遊離標識ペプチドを木炭と結合させて遠心分離又は濾過により溶液から除去することが挙げられる。分離された結合又は遊離相中の標識を、上に提示したものなどの適切な方法によって測定する。
【０１４１】
競合結合アッセイを固相アッセイとして構成することもでき、固相アッセイは、より容易に行われ、したがって上記のものより好ましい。このタイプのアッセイは、ウェルを有するプレート（ＥＬＩＳＡプレート若しくはイムノアッセイプレートとして一般に知られている）、固体ビーズ、又はチューブの表面を使用する。一次抗体を、プレート、ビーズ若しくはチューブの表面に吸着若しくは共有結合させるか、又はプレートに吸着若しくは共有結合している二次抗ガンマグロブリン若しくは抗Ｆｃ領域抗体によって間接的に結合させる。試料及び標識ペプチド（上記の通り）を一緒に又は逐次的にプレートに加え、試料中のＴｎＴｕＯＲＦと標識ペプチド間での抗体結合についての競合を可能にする条件下でインキュベートする。その後、未結合標識ペプチドを吸引除去し、プレートをすすいで、プレートに付着している抗体結合標識ペプチドを遊離させる。次いで、上で説明した技術を用いて標識ペプチドを測定することができる。
【０１４２】
サンドイッチ型アッセイは、特異度、速度及びより大きい測定範囲という理由で、より好ましい。このタイプのアッセイでは、ＮＴ−ＣＮＰに対して過剰な一次抗体を、固相競合結合アッセイについて上で説明したように、吸着、共有結合、又は抗体Ｆｃ若しくはガンマグロブリン抗体によってＥＬＩＳＡプレートのウェル、ビーズ又はチューブに付着させる。試料流体又は抽出物を固相に付着している抗体と接触させる。抗体が過剰に存在するため、この結合反応は通常は迅速である。ＴｎＴｕＯＲＦペプチドに対する二次抗体も、一次抗体と同時に又は逐次的に、試料と共にインキュベートする。この二次抗体は、一次抗体の結合部位とは異なるＮＴ−ＣＮＰ上の部位と結合するように選択される。これら２種の抗体の反応は、２種の抗体間にサンドイッチされた試料からのＮＴ−ＣＮＰを伴うサンドイッチをもたらす。二次抗体は、通常は、競合結合アッセイについて上で詳述したような容易に測定可能な化合物で標識される。或いは、二次抗体と特異的に結合する標識三次抗体を試料と接触させてもよい。未結合材料の洗浄後、競合結合アッセイについて概説した方法によって結合標識抗体を測定することができる。未結合標識抗体を洗浄除去した後、競合結合アッセイについて概説したように結合標識を定量することができる。
【０１４３】
ディップスティック型アッセイを用いてもよい。これらのアッセイは、当技術分野において周知である。それらのアッセイは、例えば、特異的抗体が付着している金又は着色ラテックス粒子などの小粒子を用いることがある。測定すべき液体試料を、粒子が前もって負荷された膜又は紙ストリップの一端に加え、ストリップに沿って泳動させてもよい。試料中の抗原の粒子との結合は、抗原又は抗体などの粒子用の結合剤をさらにストリップに沿って含有する捕捉部位と結合する粒子の能力を修飾する。これらの部位での着色粒子の蓄積は、試料中の競合抗原の濃度に応じて発色をもたらす。他のディップスティック法は、紙又は膜ストリップと共有結合している抗体を用いて試料中の抗原を捕捉することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素に結合された二次抗原を用いるその後の反応、及び色、蛍光又は化学発光光出力を生成するための基質とのインキュベーションによって、試料中の抗原の定量が可能になる。
【０１４４】
キット
典型的に、キットは、当技術分野において公知のアッセイ用に、及び特定の実施形態では当技術分野において公知であるようなＲＩＡ又はＥＬＩＳＡアッセイ用に構成されることになる。
【０１４５】
キットは、本明細書において述べる障害のための１つ又は複数のさらなるマーカーも含むことがある。心臓障害の場合、例えば、さらなるマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＡＮＰ、ＡＮＰ−ＳＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、エンドセリン、アドレノメデュリン、レニン及びアンジオテンシンＩＩのうちの１つ又は複数を含むことがある。
【０１４６】
キットは、１つ又は複数の容器で構成されていることがあり、採集用具、例えばボトル、バッグ（例えば静脈内輸液バッグ）、バイアル、注射器及び試験管も含むことがある。少なくとも１つの容器が含まれることになり、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害などの生体イベントの予測、診断又はモニタリングに有効である生成物を保持することになる。生成物は、通常、ポリペプチド及び／若しくは結合剤、特に本発明の抗体若しくは抗原結合断片、又はこれらのいずれかを含む組成物である。一実施形態において、容器上の又は容器に付随する取扱説明書又はラベルは、組成物が心臓障害の予測、診断又はモニタリングに使用されることを指示する。他の構成要素としては、針、希釈液及び緩衝液を挙げることができる。キットは、医薬的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液を備えている少なくとも１つの容器を含むことができることが有用である。
【０１４７】
ＴｎＴｕＯＲＦペプチド又はその断片（複数可）に選択的に結合する結合剤が、望ましくはキットに含められる。一実施形態において、結合剤は、本発明の抗体又は抗原結合断片である。アッセイ及びキットにおいて使用される抗体は、例えば、モノクローナルであってもよいし、又はポリクローナルであってもよく、上記のいずれかの哺乳動物において調製されることがあり、例えば、天然及び融合ペプチドを使用して調製された抗原結合断片及び抗体を含む。
【０１４８】
１つのキット実施形態では、ＴｎＴｕＯＲＦペプチド結合剤を固体マトリックス、例えば、多孔性ストリップ又はチップに固定して、ＴｎＴｕＯＲＦペプチド又はその断片（複数可）のための少なくとも１つの検出部位を形成する。多孔性ストリップの測定又は検出領域は、複数の検出部位を含むこともあり、そのような検出部位が検出試薬を含有する。上記部位は、棒、十字形若しくはドット又は他の配列で配列されていることもある。試験ストリップ又はチップは、陰性及び／又は陽性対照のための部位を含有することがある。或いは、対照部位が異なるストリップ又はチップ上にあることもある。異なる検出部位が、固定された核酸又は抗体の異なる量、例えば、第１の検出部位にはより多い量、及び後続の部位にはより少ない量を含有することもある。検査生体試料の添加時に検出可能シグナルを提示する部位の数は、試料中に存在するＴｎＴｕＯＲＦペプチド又はその断片（複数可）の量の定量的指標となる。
【０１４９】
試料検査を行うための適切な成分（マーカー、抗体及び試薬）を有する使い捨て試験用カートリッジを含む試料分析用デバイスをキットに含めてもよい。上記デバイスは、検査ゾーン及び検査結果ウィンドウを適宜含むことになる。免疫クロマトグラフィーカートリッジは、そのようなデバイスの例である。例えば、米国特許第６，３９９，３９８号、米国特許第６，２３５，２４１号及び米国特許第５，５０４，０１３号を参照されたい。
【０１５０】
或いは、上記デバイスは、対照レベル及び他のマーカーレベルに対する測定マーカーのレベルの入力、記憶及び評価を可能にする電子デバイスであってもよい。米国特許出願公開第２００６／０２３４３１５号には、そのようなデバイスの例が提供されている。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ）（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用してＳＥＬＤＩ結果を処理するために使用することができるＣｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（登録商標）も本発明において有用である。
【０１５１】
ＴｎＴｕＯＲＦペプチドの臨床的有用性
急性冠症候群（ＡＣＳ）をはじめとする心臓障害の臨床診断は、トロポニンＴ及びトロポニンＩをはじめとする心筋トロポニンなどの循環診断バイオマーカーに依存するところが大きい。しかし、高感度（ｈｓ）アッセイを用いたときでさえ、循環トロポニンの検出可能な変化が遅れることは、疑われる心臓障害を提示する有意な数の患者において臨床的不確実性につながる。したがって、心臓障害の早期情報を提供することができる新規バイオマーカーの同定が主として重要である。本出願人は、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）ペプチドがヒト循環器にはっきりと区別できる化学的エンティティーとして存在することの初めての証拠をここに提供する。このｕＯＲＦは、心筋トロポニンＴに由来し（ＴｎＴｕＯＲＦ）、正常な健常個体に存在する。ＴｎＴｕＯＲＦの最高血漿レベルは、例えば心房細動、心不全、心膜炎及び神経伝導障害を含むがこれらに限定されない、心筋梗塞又は不安定狭心症以外の心臓障害を有する患者において観察され、したがって、ＴｎＴｕＯＲＦの最高血漿レベルを本発明のアッセイ、方法及びキットにおいて用いて、対象における心臓障害を予測又は診断することができる。
【０１５２】
次に、以下の非限定的実施例に関して本発明を例証することにする。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：方法及び材料
化学物質
合成ヒトＴｎＴｕＯＲＦ、ＴｎＴｕＯＲＦ（Ｔｙｒ）、ＴｎＴｕＯＲＦ（Ｃｙｓ）、及び小胞内在性膜タンパク質３６のシグナルペプチドのアミノ酸１〜７（ＶＩＰ３６ｓｐ（１〜７））を、質量分析及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって９５％より高い純度でミモトープ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成した。他のすべての合成又は精製タンパク質は、Ｈｙｔｅｓｔ（Ｔｕｒｋｕ、ＦＩ）、株式会社ペプチド研究所（大阪府、日本）又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１５４】
ヒトＴｎＴｕＯＲＦアッセイ開発
ヒト心筋トロポニンＴの主オープンリーディングフレームの上流５’領域（ＮＣＢＩアクセッションＮＧ＿００７５５６）の評価により、＋２のコザックスコアを有し、効率的に翻訳される尤度が高い、主オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）開始部位の上流１５１２ｂｐをコードする推定１２アミノ酸ペプチド（全アミノ酸配列ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩＳ；配列番号１）を同定した（図１）。この配列は、速筋型（ＮＣＢＩアクセッションＮＧ＿０１３０８５）又は遅筋型（ＮＣＢＩアクセッションＮＧ＿０１１８２９）ヒト骨格筋トロポニンＴには見られなかった。しかし、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索エンジンでの調査により、相同性を示すような１つの部分配列、小胞内在性膜タンパク質３６のシグナルペプチドの最初の７アミノ酸（配列ＭＡＡＥＧＷＩ）、が明らかになった（Ｆｉｅｌｅｒら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：１７２９〜１７４０）。本出願人は、シグナルペプチドがヒト循環器に存在することを以前に証明した（Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａら（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：２５５〜２６４；Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎら（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５８：７５７〜７６７）ので、検出抗体をＴｎＴｕＯＲＦのアミノ末端に対して作り、ＶＩＰ３６ｓｐ（１〜７）ペプチドを潜在的干渉について評価した。ＴｎＴｕＯＲＦのアミノ末端に特異的な抗体を本出願人の以前のプロトコル（Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａら（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：２５５〜２６４；Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎら（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５８（７５７〜７６７）に従って発生させた。簡単に言うと、全身性ＴｎＴｕＯＲＦ（Ｃｙｓ）をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、４匹のニュージーランド白ウサギの５〜６部位に皮内注射した。注射１１〜１３日後にウサギから採血し、妥当な抗血清（ｒ２４４）力価が得られるまで４〜６週間ごとに上記手順を繰り返した。
【０１５５】
１２５Ｉ−放射性標識ヒトＴｎＴｕＯＲＦ（Ｔｙｒ）の調製
５μＬの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の５μｇクロラミンＴの存在下、０．５ｍＣｉ  Ｎａ−１２５Ｉを使用して、１５〜２０秒間、ヒトＴｎＴｕＯＲＦ（Ｔｙｒ）（２．５μｇ）をヨウ素化した。さらなる５μＬのリン酸緩衝液中の５０μｇのシステインＨＣｌの添加によって反応を停止させた。得られたヨージネートを１０ｃｍ  ＲＰ３００  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ＨＰＬＣカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に負荷し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中０％〜６０％アセトニトリルの勾配で１５分にわたって１ｍＬ／分の流速で純粋なＴｎＴｕＯＲＦ（１２５Ｉ−Ｔｙｒ）を溶出させた。
【０１５６】
ＴｎＴｕＯＲＦ及び心臓マーカーアッセイ
ＴｎＴｕＯＲＦアッセイには、抗血清ｒ２４４を１：１５，０００の最終希釈度で使用した。すべての放射活性トレース及び抗血清をイムノアッセイ用緩衝液（Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａら（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：２５５〜２６４）で希釈した。血漿試料及び標準物質をアッセイ用緩衝液で１：３希釈した。アッセイインキュベートは、混合し、２２時間、４℃で放置してインキュベートした、希釈度１：５０００の５０ｕＬの抗体と混合した５０ｕＬの試料又は標準物質（０〜１３，０００ｐｇ／ｍＬ  ＴｎＴｕＯＲＦペプチド）から成った。次いで、５０ｕＬのヨウ素化ＴｎＴｕＯＲＦ（Ｔｙｒ）トレーサー（約３０００ｃｐｍ）を添加し、チューブを混合し、さらに２２時間、４℃で放置してインキュベートした。次いで、遊離及び結合ＴｎＴｕＯＲＦを、固相二次抗体法（ロバ抗ウサギＳａｃＣｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｏｌｄｏｎ、ＵＫ）によって分離した。２％ポリエチレングリコール／リン酸緩衝液中のＳａｃ−Ｃｅｌ（５００ｕＬ）（最終Ｓａｃ−Ｃｅｌ濃度５％）を各チューブに添加し、室温で３０分間放置してインキュベートした。次いで、チューブを２８００×ｇで１５分間、遠心分離し、上清をデカントし、ペレットをガンママスター（Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒ）カウンター（ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でカウントした。溶血の評価により、ＴｎＴｕＯＲＦが、最大１．５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度まで又は最大２．０ｇ／Ｌの血漿脂質含有量によって改変されなかったと判定した。ＮＴ−プロＢＮＰは、社内イムノアッセイ（Ｒｉｃｈａｒｄｓら（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４７：５２〜６０；Ｗｒｉｇｈｔら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４２：１７９３〜１８００）によって判定した。高感度ＴｎＴは、１４ｐｇ／ｍＬの９９パーセンタイルカットオフを用いてエレクシス（Ｅｌｅｃｓｙｓ）２０１０アナライザー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で判定した。すべてのｈｓＴｎＴ結果をＲｏｃｈｅによるｈｓＴｎＴの世界的再評価（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（Ａｐｐｌｅら（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５８：１５９９〜１６００）中にＰｅｎｚｂｅｒｇに提出し、３つだけは修正を要すると報告された。ＴｎＩは、０．０３ｕｇ／Ｌの９９パーセンタイルカットオフを用いてレイトジェネレーションアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ）によって判定した。
【０１５７】
ヒト血漿試料採集
ヒト血漿試料は、４つの研究群（人口統計学的データを表Ｉ及びＩＩに示す）から、ニュージーランド保健省のＨｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された倫理プロトコルに従って得た。すべての参加者は、リクルートメント前にインフォームドコンセントを与えた。すべての調査は、ヘルシンキ宣言の指針を順守する。血漿試料を、（ｉ）心血管、内分泌又は神経疾患の証拠又は病歴のない健常ボランティア（ｎ＝１０９）、（ｉｉ）臨床的に必要と判断された心臓カテーテル留置を受けた患者（ｎ＝１６）、（ｉｉｉ）記録されたＳＴ上昇心筋梗塞がある患者（ｎ＝４）及び（ｉｖ）ＡＣＳコホート（ｎ＝５０２）から採取した。この研究のために、胸痛持続時間＜４時間の主訴をＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに提示した患者に、急性冠動脈イベントにおけるシグナルペプチド（ＳＰＡＣＥ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｚｃｔｒ．ｏｒｇ．ａｕ、ＡＣＴＲＮ１２６０９００００５７２８０）として公知の本発明者らの予期的観察研究へのリクルートメントを申し出た。ＡＣＳが疑われ、明らかな心臓以外の原因のない、２０分以上続く急性胸、上腹部、頸部、顎又は腕痛の主訴を有する患者を、ガイドライン定義（Ｌｅｕｐｋｅｒら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：２５４３〜２５４９）に従って登録した。より一般的な／非定型な症状（例えば、疲労、悪心、嘔吐、発汗及び失神型めまい）は、組み入れ基準として用いなかった。急性ＭＩの宣告診断（ａｄｊｕｄｉｃａｔｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）は、２名の独立した心臓専門医が２００７  ＥＳＣ／ＡＣＣＦ／ＡＨＡ／ＷＨＦタスクフォースガイドライン（Ｔｈｙｇｅｓｅｎら（２００７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ３５２：９８〜１００）に従って、ＴｎＴｕＯＲＦではなくすべての臨床データにわたって診断した。診断の生化学成分は、入院２４時間以内の血漿ｃＴｎＩの上昇≧０．０３ｕｇ／Ｌを用いた。すべての関連臨床、人口統計学的及び診断パラメータを、指標となる入院時に採集し、４５及び３６５日に追跡調査した。
【０１５８】
【表１】
2017500547.tif 000003
【０１５９】
１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｎａ３−ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が入っている冷却したバキュテナーチューブにすべての患者から採血した。試料を採血から２時間以内に遠心分離し、血漿を−８０℃で保存した。（ｉ）群については、単一試料を（一晩絶食後）前腕静脈から採取し、直ちに遠心分離して血漿を調製し、−８０℃で保管した。（ｉｉ）群の患者には左大腿動脈経由でカテーテル留置し、局所血管部位（大腿静脈、腎静脈、肝静脈、下大静脈、頸静脈、心冠静脈洞及び肺動脈）から採血した。入口及び出口大腿動脈試料を比較のために採取した。（ｉｉｉ）群のＳＴＥＭＩ患者は、病院での症状提示時、症状提示後次の時間に採取した前腕静脈試料を有した：０、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間。（ｉｖ）群の患者は、病院での症状提示時、並びに症状提示１、２及び２４時間後に採取した血液試料を有した。
【０１６０】
【表２】
2017500547.tif 000004
【０１６１】
ヒト血漿からのＴｎＴｕＯＲＦペプチドの精製
ヒト血漿において検出された免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦを生成するために、ｒ２４４からの抗ＴｎＴｕＯＲＦ  ＩｇＧを、ＴｎＴｕＯＲＦ（Ｃｙｓ）と結合されたスルホリンク（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ）（商標）カラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＩＬ）での抗原親和性クロマトグラフィーによって精製した。２ｍＬのｒ２４４無希釈抗血清をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１：１ｖ／ｖ希釈し、スルホリンク（商標）カラムに通した。結合した抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させ、０．１Ｍリン酸緩衝液での３回の洗浄によって０．１Ｍリン酸緩衝液に透析した。次いで、精製されたｒ２４４抗ＴｎＴｕＯＲＦ  ＩｇＧを、製造業者の取扱説明書に従って調製したプロテインＡアガロースゲル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＩＬ）に結合させた。純粋なＴｎＴｕＯＲＦを得るために、１００ｍＬのＳＴ上昇ＭＩ患者血漿をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１：１ｖ／ｖ希釈し、プロテインＡ／ｒ２４４−ＩｇＧカラムに重力下、室温で２時間にわたって通した。次いで、カラムを０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させた。１ｍＬ画分を回収し、アリコートをイムノアッセイ用緩衝液で１：１０ｖ／ｖ希釈し、特異的イムノアッセイに付して、精製されたＴｎＴｕＯＲＦの量を決定した。グリシン溶出生画分を直ちに−８０℃で、ＨＰＬＣによる分析まで保存した。
【０１６２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
０．１Ｍグリシン中の免疫親和性精製ＴｎＴｕＯＲＦペプチドを４０℃の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に直接負荷し、１０〜４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの勾配で３０分にわたって１ｍＬ／分の流速で溶出させた。画分を１分間隔で回収し、アリコートをＴｎＴｕＯＲＦイムノアッセイに付した。免疫反応性画分を空気下で乾燥させ、次いで、Ｇ２０００シリカカラム（東ソー株式会社、日本）を用いる６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの定組成勾配で０．２５ｍＬ／分の流速でのサイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣに付した。画分を１分間隔で回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣの場合と同様にイムノアッセイによって調べて、適切な分子サイズを決定した。免疫精製されたＴｎＴｕＯＲＦの溶出後、ＲＰ−ＨＰＬＣを合成ＴｎＴｕＯＲＦペプチドで較正した。ＳＥ−ＨＰＬＣ実行は、シトクロムＣ（Ｍｒ１２，０００）、アプロチニン（ＭＲ６，５００）、ＣＮＰ２２（Ｍｒ２，２００）及びアンジオテンシンＩＩ（Ｍｒ１，０４５）ペプチドで較正した。
【０１６３】
統計
結果を平均±ＳＤとして提示する。対応両側スチューデントｔ検定を用いて平均の比較を適宜行った。スピアマンの順位相関検定及び受信者操作曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）分析を用いる血漿分析物濃度の関係分析を、ＳＰＳＳ  ｖ１７を使用して行った。ＲＯＣ曲線生成及びバイオマーカーパネル比較のために、バイオマーカーデータを標準化変数（ｚスコア）として分析した。すべての場合、標準化変数は、ｔ＝０、１及び２時間試料から得た最大バイオマーカー値、すなわち３つの値の最大値から導出した。すべての分析において、Ｐ値＜０．０５を有意と考えた。
【０１６４】
実施例２：ヒト血漿中の内因性ＴｎＴｕＯＲＦの同定
ＴｎＴｕＯＲＦのアミノ末端に対するポリクローナル抗体ｒ２４４により、３１±３％の平均ゼロ結合、２６±６ｐｇ／ｍＬの試料検出限界、４５８±１０５ｐｇ／ｍＬのＥＤ５０及び１３０〜３９００ｐｇ／ｍＬの動作範囲を有する、高感度、特異的ラジオイムノアッセイ（図２）を得、アッセイ内変動係数（ＣＶ）は、２５アッセイにわたって＜１０％であった。アッセイ間ＣＶは、１３００ｐｇ／ｍＬで１４％、７４７ｐｇ／ｍＬで１５％であった。抗血清２４４と関連内因性ペプチド、特に心筋トロポニンＴ、トロポニンＩ及びＶＩＰ３６ｓｐ（１〜７）、並びに周知薬剤との交差反応性は無視できた（表ＩＩＩ）。初期評価により、ＴｎＴｕＯＲＦ免疫反応性がＮａ３−ＥＤＴＡに採集した末梢血からのヒト血漿中に存在すること、及びそのＴｎＴｕＯＲＦ免疫反応性が合成標準曲線と並行して弱まることを確認した（図２）。正常ヒト静脈血漿中の免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦのレベル（平均±ＳＤ）は、７２５±３４０ｐｇ／ｍＬ（範囲２７３〜２２６０ｐｇ／ｍＬ、正常範囲の上限の９９パーセンタイル＝１８８５ｐｇ／ｍＬ）であり、免疫反応性がすべての試料において検出された。ＴｎＴｕＯＲＦ濃度は、男性のほうが有意に高く（８２５±４０３ｐｇ／ｍＬ対６６６±２８５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０１８）、血漿クレアチニンとのみ有意な生化学的相関を有した（ｒ＝０．２０１、ｐ＝０．０３６、図３）。付随するｈｓＴＮＴレベル、年齢、血圧及びＢＭＩにはＴｎＴｕＯＲＦとの有意な関連性はなかった。対応するｈｓＴＮＴレベルは、６．０±２．４ｐｇ／ｍＬ（範囲３．０〜１４．９ｐｇ／ｍＬ）であり、免疫反応性が試料の４９％（５３名／１０９名）に存在した。ｈｓＴｎＴレベルは、男性のほうが高い傾向があり（６．６±２．４ｐｇ／ｍＬ対５．５±２．３ｐｇ／ｍＬ）、年齢と有意に相関した（ｒ＝０．３２８、Ｐ＝０．０１７）。
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
実施例３：循環器への免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦ放出
ＭＩの診断に使用されるＴｎＴの形態は、心臓特異的であると考えられる（Ｔｈｙｇｅｓｓｅｎら（２０１２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２０２０〜２０３５）。これを踏まえて、本出願人は、ＴｎＴｕＯＲＦのレベルが心臓に供給する血液（すなわち動脈試料）中より心臓から流出する血液中（すなわち、心冠静脈洞試料中）のほうが高くなると予想した。冠静脈洞血漿は、同時に採取した動脈血漿試料と比較して、より高い濃度の免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦを含有する傾向があった（９７８．２±１１８．１ｐｇ／ｍＬ対９０８．７±８８．９ｐｇ／ｍＬ、平均±ＳＤ、Ｐ＝０．４７２、図４）。しかし、ＴｎＴｕＯＲＦの静脈レベル上昇も肝静脈全域にわたって観察されたが、大腿静脈全域にわたってＴｎＴｕＯＲＦのレベルが低減される傾向があった。比較すると、ｈｓＴｎＴのレベルは、心冠静脈洞試料において有意に上昇された（１３．１±２．７ｐｇ／ｍＬ対１０．１±１．８ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．０１９）。ｈｓＴｎＴの腎静脈レベルは、動脈レベルと比較して有意に低かった（８．６±１．５ｐｇ／ｍＬ対１０．１±１．７ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．００２、図４）。このように、ＴｎＴｕＯＲＦ及びｃＴｎＴの局所血漿プロファイルは、純生産量及びクリアランスの勾配に関して、器官によって異なった。
【０１６７】
実施例４：ＲＩＡによって検出された免疫反応性種の分析
精製ＴｎＴｕＯＲＦを１００ｍＬの血漿から免疫親和性精製によって調製し、次いで、イムノアッセイと結合されたＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣによるさらなる精製に付した。主ＲＰ−ＨＰＬＣによって２つの大きい免疫反応性ピークを同定し、２番目に溶出したものが合成ＴｎＴｕＯＲＦペプチドと一致した（ピークＩＩ、図５のＡ）。ＳＥ−ＨＰＬＣでは、ＲＰ−ＨＰＬＣで得られたピークＩＩがおおよそ１．５Ｋ分子量で溶出した一方で、ピークＩは、およそ１Ｋ分子量で溶出した（図５のＢ）。考え合わせると、これらの結果は、免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦがヒト血漿中に（ｉ）１２アミノ酸インタクト形態、及び（ｉｉ）ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶＩ（配列番号２）、ＭＡＰＥＧＷＶＩＶＶ（配列番号３）又はＭＡＰＥＧＷＶＩＶ（配列番号４）を含む、カルボキシル末端短縮形体として存在することを示唆している。
【０１６８】
本出願人は、タンデムＭｓ／ＭＳを使用して循環ＴｎＴｕＯＲＦペプチドのさらなる特性評価を行って、このペプチドの配列及び分解を確認することにする。
【０１６９】
実施例５：ＳＴＥＭＩ患者におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチド
免疫反応性ＴｎＴｕＯＲＦがヒト循環器に存在することを確証したので、本出願人は、心筋梗塞をもたらす急性心虚血の診断バイオマーカーとしての循環ＴｎＴｕＯＲＦの臨床的有用性を判定することを試みた。症状発症が症状提示前４時間未満であった、記録されたＳＴ上昇心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）がある患者４名において、静脈ＴｎＴｕＯＲＦ濃度は、症状発症４〜５時間後には減少する傾向があり、そして２４時間までに増加して安定水準に戻った（図６のＡ）。症状発症後５時間までの平均濃度は、正常対照に見られるもののほぼ半分であり、７２時間までにその対照で見られる範囲に完全には戻らなかった。このプロファイルは、ＳＴＥＭＩの血漿において急上昇するｈｓＴｎＴのプロファイルとは異なる（図６のＢ）。
【０１７０】
実施例６：胸痛を提示する患者の予期的観察研究におけるＴｎＴｕＯＲＦペプチド
ＴｎＴｕＯＲＦ測定がＡＣＳの診断に役立つ可能性を評価するために、本出願人は、心臓に起因することが疑われる胸痛の主訴を継続的に提示する患者５０２名の予期的観察研究に着手した。患者人口統計学的及び分析物データを表ＩＩに示す。患者のおおよそ２３％は、心筋梗塞（ＭＩ）の最終宣告診断を有した。提示ＴｎＴｕＯＲＦ濃度は、急性ＭＩ（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．４６、Ｐ＝ＮＳ）の診断にも不安定狭心症（ＵＡ、ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．４７、Ｐ＝ＮＳ）の診断にも一切有用性も有さなかったが、ＡＣＳ以外の心臓障害を有する患者の良好な診断能力を有し（ＡＵＣ＝０．７９、Ｐ＜０．００１、図７）、ＮＴプロＢＮＰより正確であった（ＡＵＣ＝０．７２、Ｐ＜０．００１）。したがって、症状提示２時間以内のＴｎＴｕＯＲＦの最大濃度は、非ＭＩ、非ＵＡ心臓障害を有する患者では、他のすべての患者群と比較して有意に高かった（１１５９±４２９ｐｇ／ｍＬ対７７８±３５３ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１）。さらに、ＴｎＴｕＯＲＦを心拍数及びヘモグロビン（ＨＢ）濃度に加えたとき、代替心臓障害の診断のためのＡＵＣは０．８３に好転した（Ｐ＜０．００１、図７）。ｈｓＴｎＴ及びＴｎＩ両方は、それぞれ０．９５及び０．９７のＲＯＣ曲線（ＮＳＴＥＭＩ  ｎ＝９６、両方ともＰ＜０．００１）で、非ＳＴ上昇ＭＩ（ＮＳＴＥＭＩ）を診断する優れた診断能力を有した。比較すると、ＴｎＩ×ｈｓＴｎＴ／ＴｎＴｕＯＲＦ（ここでは「トロポニンプラス（商標）」と呼ぶ）の生成物比は、０．９７のＡＵＣをもたらした（Ｐ＜０．００１、図８）。絶対的には、症状提示２時間以内に、ｈｓＴｎＴはＮＳＴＥＭＩ患者の９４％（９０名／９６名）を検出した一方で、ＴｎＩは、９２％（８８名／９６名）を検出したが、ｈｓＴｎＴによって示されたこの改善された感度は、偽陽性増加という犠牲を払って実現された（ｈｓＴｎＴ陽性非ＭＩ患者＝６８名対ＴｎＩ陽性非ＭＩ患者＝３２名）。比較すると、トロポニンプラスは、２時間以内にＮＳＴＥＭＩ患者の９８％（９４名／９６名）を検出し、６３の非ＭＩ陽性結果を生じさせた。このように、ｈｓＴｎＴ単独と比較して、トロポニンプラス比は、２時間以内に検出されるＭＩ患者数を４％増加させ、偽陽性率を７％低下させた。
【０１７１】
予後予測に関しては、トロポニンプラスは、１年での死亡率をｈｓＴＮＴ及びＴｎＩ単独（それぞれ、ＡＵＣ  ０．７２及び０．７１）よりわずかに良好に予測した（ＡＵＣ＝０．７４、Ｐ＜０．００１）が、トロポニンＴ又はトロポニンＩのいずれかでは１年以内のＭＩ又はＣＨＦによる再入院の予測を改善しなかった。一致させたＮＴプロＢＮＰへの単一入院患者２４時間ＴｎＴｕＯＲＦ濃度の追加は、１年以内に急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）による再入院を予測するための２４時間ＮＴプロＢＮＰのみのＲＯＣ曲線を改善した（０．９３対０．９１、図９）。
【０１７２】
考察／要約
本出願人の結果は、循環器内のはっきりと区別できる別々のエンティティーとしてのｕＯＲＦペプチドの初めての証明である。ＧＲ−１Ａ受容体からのｕＯＲＦペプチドが分離細胞サイトゾル抽出物中に存在すること（Ｄｉｂａら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：１４９〜１６１）は以前に報告されており、著者は、上記ｕＯＲＦペプチドが彼らの実験で使用した培地中に存在することを報告しなかった。本出願人は、イムノアッセイでもＨＰＬＣでもヒト血漿中のＴｎＴｕＯＲＦがｈｓＴＮＴと関連しているという証拠を見いださず、実際、ＴｎＴｕＯＲＦの血漿レベルはｈｓＴｎＴ及びＴｎＩと負の相関をもつ傾向があった。しかし、本出願人は、ＴｎＴとＴｎＩの両方について報告されている（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：９８〜１００；Ｓａｖｕｋｏｓｋｉら（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５８：１０４０〜１０４８）ような、ＴｎＴｕＯＲＦが他の血漿エンティティー、例えば自己抗体又は他の結合タンパク質と関連又は結合する可能性を排除することができない。
【０１７３】
調べたＳＴＥＭＩ患者コホート（実施例１、表Ｉ）において、局所血漿濃度分析は、最高量のｈｓＴｎＴを含有する心冠静脈洞を明示した。この観察は、ｈｓＴｎＴの心血管診断の有用性と完全に一致する。しかし、特筆すべきは、４／１６個体が上昇した肝動脈−静脈ｈｓＴｎＴ勾配を有し、６／１６が上昇した顎動脈−静脈勾配を有し、１１／１６が上昇した大腿動脈−静脈勾配を有したことである。これがアッセイの問題に関係する可能性は低く、それは、差異が常にアッセイＣＶよりはるかに大きかったからである。これらの観察の関連性は不明確であるが、ｈｓＴｎＴアッセイで観察された診断特異度の減少は、特に、偽陽性トロポニンＴの可能性のある原因と述べられていること（Ｊａｆｆｅら（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５８：１８１９〜１８２４）に照らして、一因となる可能性があろう。腎静脈ｈｓＴｎＴ濃度の有意な減少は、腎臓がｈｓＴｎＴの主クリアランス機構である可能性が高いことを示す。ＴｎＴｕＯＲＦに関しては、本出願人は、心冠静脈洞全域にわたって動脈−静脈勾配上昇を観察したが、この観察は、統計的に有意でなかった。
【０１７４】
インタクト形態及びカルボキシ末端分解形態と一致する、免疫精製ＴｎＴｕＯＲＦが、ＲＰ−及びＳＥ−ＨＰＬＣシステムで溶出した。したがって、ＴｎＴｕＯＲＦは、分解に関してｃＴｎＴ及びｃＴｎＩと同等であるが、同様の酵素又はプロセスがこのことを説明するかどうかは不明である。重要なこととして、イムノアッセイ検証に関して、ｃＴｎＴ及びｃＴｎＩは、ＴｎＴｕＯＲＦ抗体と交差反応もせず、ＲＰ−及びＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルに現れもしなかった。さらに、ＢＬＡＳＴ配列アラインメントツールを使用して、最も近いペプチド同一性がＶＩＰ３６ｓｐ（１〜７）であることが判明した。このペプチドは、ＴｎＴｕＯＲＦの最初の７アミノ酸とアミノ酸２個だけ異なるが、ＴｎＴｕＯＲＦペプチド抗体との交差反応性＜０．３％を有し、そのため本発明のアッセイに干渉する可能性が極小であることを示した。これらのデータは、ＴｎＴｕＯＲＦ内の３位のプロリンが、本発明者らの抗体認識に主に関与し、アッセイ特異度の維持に役立つことを示唆しており、このペプチドの配列及び分解を確認するためにタンデムＭＳ／ＭＳによる循環ｔｎＴｕＯＲＦの完全特性評価が必要になる。
【０１７５】
最新の証拠は、ｕＯＲＦがタンパク質生産と負の相関関係をもつことを示唆している（Ｃａｌｖｏら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：７５０７〜７５１２；Ｖｏｇｅｌら（２０１０）Ｍｏｌ．Ｓｙｓ．Ｂｉｏｌ．６：４００〜４０８；Ｍａｔｓｕｉら（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．５８１：４１８４〜４１８８）が、ｕＯＲＦの実際の機能活性は、ほんの少数のケースでしか実証されていない。例えば、ｕＯＲＦによるシス作用性ペプチドの生産は、ｕＯＲＦの末端でリボソームを停止させることによって下流主ＯＲＦの翻訳開始を低減させることができる（Ｏｙａｍａら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４：２０４８〜２０５２）。この証拠は、静脈ＴｎＴｕＯＲＦ濃度が、記録されたＳＴＥＭＩを有する患者において最初は減少するという本出願人の観察と相まって、本出願人に、急性心筋梗塞の疑いのある胸痛を提示する患者においてＴｎＴｕＯＲＦとｈｓＴｎＴ及び／又はＴｎＩとの間に潜在的に有用な相互関係が存在するかどうかを調査することを促した。予想通り、症状提示２時間以内のｈｓＴｎＴ及びＴｎＩの平均最大濃度は、心筋梗塞患者では他の患者群と比較して有意に高かった。対照的に、ＴｎＴｕＯＲＦの最大濃度は、心筋梗塞患者でのほうが低い傾向があり、他の心臓障害を有する患者と比較して有意に低かった。心筋トロポニンＴ及びトロポニンＩ（トロポニンプラス（商標））との比の分母としてのＴｎＴｕＯＲＦの利用は、ｈｓＴｎＴ測定のみと比較してＮＳＴＥＭＩの診断及び１年死亡率の予後予測を改善した。心拍数及びＨｂ変数を加えることによって改善することができた、心筋梗塞以外の心臓障害を提示する胸痛患者を特定する際のＴｎＴｕＯＲＦの診断性能も、興味を引いた。
【０１７６】
本発明を実施例によって説明したが、特許請求の範囲において定義する本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修飾を加えることができることは理解されるはずである。さらに、公知の均等物が特異的特徴に対して存在する場合、そのような均等物は、本明細書中で具体的に言及されているかのごとく組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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