(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する粘膜性免疫応答を誘導または増強するための粘膜アジュバントの製造における水溶性ポリアニオン性ヘテロポリマーの使用であって、該水溶性ポリアニオン性ヘテロポリマーが２種の異なるアニオン性構成繰り返し単位からなり、該アニオン性構成繰り返し単位の１つがアクリル酸であり、他方のアニオン性構成繰り返し単位が、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸およびアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸から選択される、使用。
【請求項２】
アジュバントが、さらに液体媒体中の水溶性ポリアニオン性ヘテロポリマーの水溶液に含まれる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
呼吸器疾患、胃腸疾患および性交渉により伝搬される疾患の治療用の前記請求項いずれか１項に記載の粘膜アジュバントの使用。
【請求項４】
アジュバントが、２種の異なるアニオン性構成繰り返し単位を有する水溶性ポリアニオン性ヘテロポリマーを含む、粘膜ワクチン用アジュバントであって、該アニオン性構成繰り返し単位の１つがアクリル酸であり、他方のアニオン性構成繰り返し単位が、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸またはアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸である、アジュバント。
【請求項５】
粘膜表面に投与されるワクチンに用いるための、請求項４記載のアジュバント。
【請求項６】
請求項４記載のアジュバントを含む粘膜ワクチン。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ワクチン組成物、その製造方法ならびに温血動物の粘膜性（非経口的でない）免疫のためのその使用に関する。
疾病および／または感染に対する防御を宿主生物に提供しうる２つの主なタイプの免疫があり、それらは非経口接種により提供される全身性（または全体性）免疫ならびに非経口的でない接種により提供される粘膜性（または局所性）免疫である。
伝統的には、ワクチンの開発は、非経口ワクチンを用いることによる体液性免疫応答（ＩｇＭまたはＩｇＧクラスの特異的抗体）および細胞性免疫応答（活性化Ｔリンパ球、活性化マクロファージ、またはその他のもの）を包含する全身免疫の誘導に焦点が絞られていた。かかる非経口ワクチンは、特に筋肉内または皮下経路で投与される。
非経口ワクチンおよび非経口接種により全身性免疫を提供することは、多くの異なる病原体に対する防御免疫を確立することにおいて有効であることがわかっているが、つねにそうではない。かかる免疫が全く効果ばないかまたは部分的に効果がない多くの例が存在する。さらにそのうえ、全身性免疫を提供するための非経口ワクチンおよび非経口接種は他の短所も有しており、かかる短所とは、免疫される生物の皮膚に傷をつける必要があること、投与が困難であること（例えば、かかるワクチン投与には熟練した人が必要）、かかるワクチンには高いグレードの純度が必要であること、本来の感染部位における免疫の確立が欠如していること、感染の臨床的および非臨床的徴候ならびに感染自体に対する生物の完全な防御ができないのと同様、感染防止ができないこと等である。さらに、非経口ワクチンは、免疫無防備状態の宿主（例えば、母性抗体を有する幼若動物）に対する有効な免疫が望まれる場合において問題を生じる可能性がある。
通常には、多数の病原体が粘膜（例えば、呼吸器、胃腸または性器）組織を通って宿主に感染する。粘膜性（または局所性）免疫はＩｇＡクラスの抗体の局所的生成および分泌により生じる。これらの抗体は、呼吸器、胃腸または性器器官の内腔中に分泌されうるダイマーを形成する。内腔中の特異的ＩｇＡ抗体は、病原体による宿主組織の透過を妨害または遮断することにより感染を抑制しうる。宿主組織透過の基礎となることが知られている機構は、ウイルスの中和、病原体により産生される酵素、トキシンまたは他の成分との複合体化（これらの成分の活性の中和および／またはこれらの成分の吸着を遮断）、粘膜表面への病原体付着阻害、粘膜表面において抗体により媒介される炎症反応の抑制、ならびに粘膜表面における生得の抗細菌因子との相乗作用を包含する。
粘膜性（非経口的でない）ワクチンおよび粘膜接種は、非経口ワクチンおよび非経口接種に優るさらなる長所を有する。これらの長所は、宿主の皮膚、組織または器官を傷つける必要性がなくなること、投与が容易であること、純度のグレードの低いものでも使用可能なこと、本来の感染部位における免疫の確立、病原体による宿主組織の透過の防止、臨床的および非臨床的感染の徴候ならびに感染自体に対する生物のより完全な防御、潜伏に対する防御、ならびに粘膜性および全身性免疫の同時誘導を包含する。さらにそのうえ、粘膜性免疫および粘膜接種は免疫無防備状態の宿主（例えば、母性抗体を有する幼若動物）の有効な免疫を可能にする。
よって、多くの場合、粘膜性（非経口的でない）ワクチン、粘膜接種およびそれらにより提供される免疫の使用は、非経口的ワクチン、非経口的接種およびそれらにより提供される免疫の使用よりも好ましいと思われる。
種々の因子に依存するが、生きた微生物による自然的または人工的感染は、かなりのレベルの粘膜性免疫を誘導しうる。これらの因子は、感染経路、微生物の性質、使用される感染用量ならびに宿主の免疫状態を包含する。
しかしながら、死んだ（複製しない）抗原の投与は粘膜性免疫をほとんど与えないかまたは全く与えない。この問題を改善するために、死んだ抗原に対する免疫応答を増大させるためにアジュバントが用いられている。
死んだ（複製しない）抗原による粘膜性免疫の十分な誘導には、粘膜への抗原の投与ならびに適当なアジュバンドまたは抗原提示系の使用の両方が必要である。
非経口ワクチン用の多くのアジュバントが知られているが、ごくわずかのものしか粘膜性免疫の増強に有効であることが示されていない。かかるアジュバントは、抗原に複合体化されたビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）のトキシン（コレラトキシン）またはその生成物（コレラトキシンサブユニットＢ--ＣＴＢ）、イー・コリ（E. coli）の熱感受性トキシンまたはその生成物、細菌トキシンまたはその生成物、抗原が入っている種々の天然または合成ポリマー微粒子または微小カプセル、抗原の入ったリポソームまたは抗原と混合されたリポソーム、レクチン、免疫刺激複合体、ムラミルジペプチドおよびその誘導体、ならびにカチオン性ポリマーを包含する（″Novel Delivery Systems for Oral Vaccines″,CRC Press, London, 1994参照）。
よく知られていることであるが、既知の粘膜アジュバントの使用は制限されている。これは、かかるアジュバントの都合の悪い副作用に関連した許容されない危険性、効果が不十分であるという問題、製造方法において用いられる機械的および／または化学的処理により生じる（部分的）変性、それに関連した複雑な製造手順、製品の不均一性、製造コストか高価なこと、アジュバント成分により誘発される特異的免疫応答、アジュバントまたはアジュバント含有ワクチンの不安定性、ならびにアジュバント使用による非特異的免疫反応の増強または活性化を包含するいくつかの要因による。
よって、安全で、高価でなく、製造容易であり、粘膜ワクチンに含有させることが容易な粘膜ワクチン（および詳細には、呼吸器疾患、胃腸疾患および性交渉により伝搬される疾患に対する粘膜ワクチン）に対する緊急の必要性が存在すると思われる。
抗原に対する免疫応答を誘導または増強しうる粘膜アジュバントを提供することが本発明の主要目的である。
安全で、高価でなく、製造容易であり、使用される粘膜ワクチンに含有させることが容易な粘膜ワクチン（および詳細には、呼吸器疾患、胃腸疾患および性交渉により伝搬される疾患に対する粘膜ワクチン）用の粘膜アジュバントを提供することが本発明のさらなる主要目的である。
抗原に対する免疫応答を誘導または増強するためのかかる粘膜アジュバントを含む粘膜ワクチンを提供することが本発明のさらなる主要目的である。
抗原に対する免疫応答の誘導または増強方法を提供し、粘膜アジュバントおよびかかる誘導または増強をなしうる粘膜アジュバントを含む粘膜ワクチンの提供方法を提供することが本発明のさらなる主要目的である。
本発明は、粘膜ワクチン中に含有させるための粘膜アジュバントに関し、さらに抗原に対する粘膜性および／または全身性免疫応答の誘導または増強に有用なかかるアジュバントを含有する粘膜ワクチンに関する。
よって、本発明の教示によれば、アニオン性構成繰り返し単位を有する水溶性ポリアニオン性ポリマーを含むワクチン用粘膜アジュバントが提供される。
本発明粘膜アジュバントは、同じまたは異なる単位であってよい水溶性ポリアニオン性ポリマー、あるいはアニオン性構成繰り返し単位（同じまたは異なる）および疎水性構成繰り返し単位を有するポリアニオン性ポリマーである。ポリアニオン性ポリマーは直鎖状（１または２個の他の構成単位に共有結合した化学単位を有するポリマー）、あるいは分枝状（１または２個の他の構成単位および場合によっては３種またはそれ以上の構成単位に共有結合した化学単位を有するポリマー）、あるいは網目状（１または２または３個またはそれ以上の構成単位に共結合した化学単位を有するポリマー）の構造であってよい。
本明細書において、下記の用語は下記の意味を有する。
用語「水溶性」は、本発明ポリアニオン性ポリマーについていう場合、１リットルあたり少なくとも０．０１グラムの濃度で水相に溶解しうるポリマーをいう。
用語「ポリマー」は、少なくとも３個の同一の化学構成繰り返し単位を有する化合物をいい、該単位は互いに共有結合している。
用語「構成的繰り返し単位」は、ポリマーの最小構造単位をいう。
用語「ホモポリマー」は１のタイプの構成繰り返し単位からなるポリマーをいう。
用語「ヘテロポリマー」は、２種またはそれ以上の異なる繰り返し単位を有するポリマーをいう。
用語「ポリアニオン性ポリマー」は、水性媒体に溶解した場合、アニオン性構成繰り返し単位（例えば、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基およびホウ酸基を含む単位）の存在により負に帯電するポリマーをいう。
用語「アニオン性構成繰り返し単位」は、生理学的条件下の水性媒体中で負に帯電するポリマーの構成繰り返し単位をいう。
用語「疎水性構成繰り返し単位」は、対応モノマーが有機溶媒よりも水相に溶解しにくい［すなわち、一定体積（ｍｌ）の水相中に溶解しうるモノマーの重量（グラム）が、一定体積（ｍｌ）の有機溶媒中に溶解しうるモノマーの重量（グラム）よりも小さい］ことを特徴とするポリマーの構成繰り返し単位をいう。
本発明粘膜アジュバントにおいて、好ましくは、ポリアニオン性ポリマーのアニオン性構成繰り返し単位をアクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチルスルホン酸、ビニル硫酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸（ビニルベンゼンスルホン酸）、ビニルフェニル硫酸、２−メタクリロイルオキシエタンスルホン酸、３−メタクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、３−メタクリルアミド−３−メチルブタン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ビニルリン酸、４−ビニル安息香酸、３−ビニルオキシプロパン−１−スルホン酸、Ｎ−ビニルサクシンイミド酸、ならびに上記のものの塩から得る。
より好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、ポリアニオン性ポリマーのアニオン性構成繰り返し単位をアクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸フマル酸、エチルスルホン酸、ビニル硫酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、およびアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ならびに上記のものの塩から得る。
本発明粘膜アジュバントにおいて、最も好ましくは、ポリアニオン性ポリマーのアニオン性構成繰り返し単位をアクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸およびフマル酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、およびアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ならびに上記のものの塩から得る。
本発明粘膜アジュバントは、好ましくは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ポリエチルスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸（ポリビニルベンゼンスルホン酸）、ポリビニルフェニル硫酸、ポリ２−メタクリロイルオキシエタンスルホン酸、ポリ３−メタクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ポリ３−メタクリルアミド−３−メチルブタン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリ４−ビニル安息香酸、ポリ３−ビニルオキシプロパン−１−スルホン酸、ポリＮ−ビニルサクシンイミド酸、ならびに上記のものの塩から得られるホモポリマーを包含する。
より好ましくは、ポリアニオン性ホモポリマーをポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ならびに上記のもののいずれかの塩から得る。
本発明粘膜アジュバントはさらに、カルボン酸基および硫酸基またはスルホン酸基、例えばアクリル酸ならびにビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸およびアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸のいずれかのごとき（これらに限らない）２種の異なる（種類の異なる）アニオン性基を有するポリアニオン性ヘテロポリマーを包含する。
好ましい具体例において、本発明粘膜アジュバントのポリアニオン性ポリマーはさらに、疎水性構成繰り返し単位を有する。
本発明粘膜アジュバントのポリアニオン性ポリマーの疎水性構成繰り返し単位をアルキルエステル、シクロアルキルエステル、ヒドロキシアルキルエステル、エーテル、グリコールおよび芳香族基ならびに上記のものの塩から得る。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、アルキルエステルはメチル−、エチル−、プロピル−、イソプロピル−、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ．ブチル−、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル−、ｎ−オクチル−、イソオクチル−、２−エチルヘキシル、ｎ−デシル−、テトラデシル−、ビニル−、アリル−およびオレイルエステルからなる群より選択される。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、シクロアルキルエステルはシクロヘキシル−、１−メチルシクロヘキシル−、３−ビニルシクロヘキシル−および３，３，５−トリメチルシクロヘキシルエステルからなる群より選択される。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、ヒドロキシアルキルエステルは２−ヒドロキシエチル−、２−ヒドロキシプロピル−、３−ヒドロキシプロピル−、３，４−ジヒドロキシブチル−、２−ヒドロキシペンチル−および２−ヒドロキシヘキシルエステルからなる群より選択される。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、エステルはメトキシメチル、エトキシエチル、アリルオキシメチル、２−エトキシエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、シクロヘキシルオキシメチル、１−エトキシエチル、２−エトキシエチル、２−ブトキシエチル、メトキシメトキシエチル、メトキシエトキシエチル、１−ブトキシプロピル、１−エトキシブチル、テトラヒドロフルフリル、フルフリルからなる群より選択される。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、グリコールはエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，５−ジメチル−１，６−ヘキサンジオール、１，１０−デカンジオール、ジエチレングリコールおよびトリエチレングリコールからなる群より選択される。
好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、芳香族基はベンジル、フェニルおよびノニルフェニルからなる群より選択される。
より好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、ポリアニオン性ポリマーの疎水性構成繰り返し単位は、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチルスルホン酸、ビニル硫酸およびスチレンスルホン酸のメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ペンチル−、ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、ノニル−、およびデシル−エステルならびに上記のものの塩からなる群より得られる。
最も好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、ポリアニオン性ポリマーの疎水性構成繰り返し単位を、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸およびフマル酸のブチル−、ペンチル−、ヘキシル−、ヘプチル−およびオクチル−エステルならびに上記のものの塩からなる群より得る。
本発明の特に好ましいポリアニオン性ポリマーはポリアクリル酸、ブチル−ポリアクリル酸、ポリ（アクリレート−コ−アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸）コポリマー（ｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ））、ポリ（アクリレート−コ−ビニルスルホネート）コポリマー（ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ））、ポリ（アクリレート−コ−ビニルベンゼンスルホネート）コポリマー（ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ））である。
本発明粘膜アジュバントにおいて、本発明ポリアニオン性ポリマーの疎水性構成繰り返し単位およびアニオン性構成繰り返し単位のモル比は、１個のアニオン性構成繰り返し単位につき０個の疎水性構成繰り返し単位ないし１個のアニオン性構成繰り返し単位につき０．６個の疎水性構成繰り返し単位の間である。
より好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、疎水性構成繰り返し単位およびアニオン性構成繰り返し単位のモル比は、１個のアニオン性構成繰り返し単位につき０．０２ないし０．６０個の疎水性構成繰り返し単位（１００個のアニオン性構成繰り返し単位ごとに２ないし６０個の疎水性構成繰り返し単位）である。
最も好ましくは、本発明粘膜アジュバントにおいて、疎水性構成繰り返し単位およびアニオン性構成繰り返し単位のモル比は、１個のアニオン性構成繰り返し単位につき０．０５ないし０．３０個の疎水性構成繰り返し単位（１００個のアニオン性構成繰り返し単位ごとに５ないし３０個の疎水性構成繰り返し単位）である。
本発明のもう１つの態様において、本発明粘膜アジュバント（そのポリアニオン性ポリマーを包含）を有する粘膜（非経口的でない）ワクチンが本明細書に開示され、該ワクチンは抗原に対する全身性または粘膜性いずれかの免疫を誘導するために非経口的でない経路により投与される。
この態様において、粘膜ワクチンはさらに、抗原または薬剤分子および／または医薬上許容される媒体（担体）を含んでいてもよい。
本発明のさらなる態様において、粘膜性または全身性免疫応答の誘導または増強のための粘膜アジュバントの製造または生成のための本発明水溶性ポリアニオン性ポリマーの使用が本明細書において開示される。
本発明のさらなる態様において、本明細書開示のポリアニオン性ポリマーを含む非経口的でないアジュバントが、抗原に対する全身性または粘膜性免疫の増強のために非経口的でない経路で投与される。
抗原は、生きたウイルスまたは不活化ウイルス、細菌、真菌、寄生虫および他の微生物ならびにこれらの微生物由来の成分または生成物、防御免疫を誘導しうる、化学合成により得られる生成物、ならびに防御免疫を誘導しうる、他の手段により得られる生成物を包含する。
好ましい抗原は、呼吸管の感染である疾病に対する防御免疫を誘導しうるものである。かかる疾病の例は、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、インフルエンザウイルス、鼻炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、アクチノバチルス・プレウロニューモニアエ（Actinobaccilus pleuropneumoniae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurellamultocida）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumonia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）による感染、ならびに例えばロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、イー・コリ、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、イェルシニア（Yersinia）、カンピロバクター（Campylobactor）、クロストリジウム（Clostridium）、ビブリオ（Vibrio）およびギアルジア（Giardia）、エントアメーバ（Entamoeba）、およびクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）による胃腸管感染である。
本発明アジュバントとして使用してもよいポリアニオン性ポリマーを、その天然形態の単離および精製により、あるいはその合成により得てもよい。
アニオン性構成繰り返し単位を有するポリアニオン性ポリマーならびに／あるいはアニオン性構成繰り返し単位および疎水性構成繰り返し単位の両方を有するポリアニオン性ポリマーの合成方法は当該分野においてよく知られている。かかる方法は、アニオン性および疎水性モノマーの共重合；適当なポリマーの直接的（部分的）グラフト重合、適当なポリマーの間接的（部分的）グラフト重合、ならびに適当なポリマーの部分加水分解を包含する。
粘膜接種（免疫化）用のワクチンにおける本発明アジュバントの使用は、本発明アジュバントが高価でなく、免疫原性がなく、水溶性であり、化学的に安定であり、製造容易であり、使用されるワクチンに含有させることが容易であるという点で、既知の粘膜アジュバントに優る、種々の重要な長所を提供する。さらにそのうえ、これらのアジュバントは、認知されている他のアジュバントよりも所望粘膜免疫応答の誘導において効果的である。結局、ここに記載した種々のアジュバントは、食品および医薬品の製造においてすでに広く用いられており、それゆえそれらの許容性は大きいものとなっている。
下記実施例において説明する、本発明粘膜アジュバント、およびかかるアジュバントを含有する粘膜ワクチンに関する観察結果は、以下の点により予期されなかったものである。全身性免疫のための大部分のよく知られたアジュバントは粘膜性免疫の増強において有効でないこと；現在使用されている粘膜アジュバントは全身性免疫にとり温和なアジュバントであるかまたはほとんどアジュバント効果がないこと；全身性免疫および粘膜性免疫の誘導および進展に関与する機構において重大な相異が存在すること；ならびに本明細書開示のポリアニオン性ポリマーは現在知られている数種の最も有望な粘膜アジュバントよりも有効であること。
本発明ポリアニオン性ポリマーは、非経口的でない経路により抗原とともに、あるいは抗原とは別個に投与された場合、抗原に対する粘膜性免疫応答の誘導および／または増強に有用であることがさらに注目される。
本発明アジュバントを有する粘膜ワクチンは粘膜性免疫の誘導において効果的であり、抗原およびアジュバントを含有するものであり、アジュバントは水溶性ポリアニオン性ポリマーである。
本発明アジュバントは固体（例えば、粉末形態）である。所望ならば、それらをそのようなものとして用い、免疫応答が望まれる表面に直接適用してもよい。かかる場合において、水溶性であるので、それらは粘膜表面の本来的に存在する液体により可溶化される。
あるいはまた、液体媒体中に溶解または含有させることにより本発明粘膜アジュバントを水溶液中に含有させてもよい。
この点において、本発明粘膜アジュバントはさらに、液体媒体（医薬上許容される担体のごとき）を有するワクチン中に含有されてもよい。例えば、例えば抗原（および／または薬剤分子）を含有する溶液（水溶液のごとき）中に可溶化（例えば粉末として）させることによりこれを行ってもよい。これを行うための別法は、まず固体アジュバントを水相に溶解し、ついで、抗原（および／または薬剤分子）の水溶液と混合するか、あるいは凍結乾燥抗原（および／または薬剤分子）をアジュバント含有溶液に可溶化させることによる。
好ましくは、ワクチン１ｍｌあたり０．０１ないし４０ｍｇのポリアニオン性ポリマー（粘膜アジュバント）を含むように本発明ワクチンを処方する。
より好ましくは、ワクチン１ｍｌあたり０．０２ないし２０ｍｇのポリアニオン性ポリマー（粘膜アジュバント）を含むように本発明ワクチンを処方する。
最も好ましくは、ワクチン１ｍｌあたり０．２５ないし５ｍｇのポリアニオン性ポリマー（粘膜アジュバント）を含むように本発明ワクチンを処方する。
鼻腔内、経口、口鼻、気管内および排泄腔内のごとき非経口的でない経路により本発明ワクチンを動物またはヒトの粘膜表面に適用してもよい。かかる適用を、例えば、液体エアロゾル、飲料水、食品等を用いて行ってもよい。
本明細書で用いる下記用語は次のような意味を有する。
用語「非経口的免疫」は、注射針または他のデバイスを用いることにより、とりわけ、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内および／または真皮内経路のうちの１つを用いて皮膚からワクチンを投与することを意味する。
用語「非経口的でない免疫」および「粘膜性免疫」は、とりわけ、鼻腔内、口鼻、気管内、胃内、精巣内、経口、直腸、排泄腔内および／または膣内経路のうちの１つにより粘膜表面にワクチンを投与することをいう。
用語「全身性免疫」はＩｇＭまたはＩｇＧクラスの血清抗体によりあるいは活性化Ｔリンパ球により媒介される抗原特異的な宿主の防御をいう。
用語「粘膜性免疫」は、宿主に存在するかまたは異なる器官の内腔中に分泌されるＩｇＡクラスの抗体により媒介される抗原特異的な宿主の防御をいう。
用語「粘膜ワクチン」は、抗原に対する粘膜性または全身性免疫応答を増強するために非経口的でない経路により投与されるワクチンをいう。
用語「粘膜アジュバント」は、抗原に対する粘膜性または全身性免疫応答を増強するために非経口的でない経路により投与されるアジュバントをいう。
用語「グラフト重合ポリマー」は、ポリマーの化学的、物理化学的または生物学的特性に重要な効果を有する化学基を付加することにより得られるポリマーをいう。
用語「コポリマー」は、有意に異なる化学的、物理化学的または生物学的特性を有する２種またはそれ以上の異なるモノマーを互いに結合させることにより得られるポリマーをいう。
用語「液体媒体」は、水溶液、生理学的水溶液、水中油型エマルジョン、および水溶液（および他のタイプの医薬上許容される担体）中の不溶性塩の懸濁液（これらに限らない）を包含する液体の媒体をいう。
好ましい液体媒体は水溶性であり、生理学的水溶液が最も好ましいが、本発明の長所の１つは、本明細書開示の粘膜アジュバントを含有するワクチン処方が生理学的なものである必要がないことである。
実施例１
アニオン性および疎水性モノマーの共重合によるアジュバントの合成
アクリル酸（ドイツ、ジュッセルドルフ、メルク（Merck））（５４０ミリモル）、アクリル酸ｎ−ブチル（ベルギー、ジャンセン（Jannesn））（６０ミリモル）および蒸留水（１５０ｍｌ）を反応容器で一緒に混合した。得られた反応混合物を攪拌し、そのｐＨを１０Ｎ水酸化ナトリウムで４．８に調整した。ついで反応混合物に窒素を飽和させてその中に存在する酸素を脱気した。
８８ｍＭ Ｎａ2Ｓ2Ｏ8溶液（５ｍｌ）および１７５ｍＭ Ｎａ2Ｓ2Ｏ5溶液（５ｍｌ）を上記反応混合物に加え、該反応混合物を連続的に攪拌しながら室温で６時間インキュベーションした。
その後、該反応混合物を１０ｋＤの遮断能を有する透析膜（Spectra／por）を用いて１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムに対して透析し、ついで蒸留水に対して少なくとも７日間透析してポリマーを得た。ついで、該生成物を凍結乾燥し、それから水を除去し、室温で乾燥粉末として貯蔵した。
その凍結乾燥生成物のＮＭＲ（溶媒として重水を用い、２５℃で５００メガサイクルの装置（BRUCKER AMX500）にてＴＭＳ（０ｐｐｍ標体）から算定された化学シフトによるプロトンＮＭＲ）による分析は、その生成物がアクリル酸ブチルモノマーとアクリル酸モノマーをモル比でアクリル酸モノマー９５に対してアクリル酸ブチルモノマーを５で含有するポリマーであることを示した。こうして形成されたポリマーの分子量をゲル浸透クロマトグラフィー（Vaccine１２、６５３−６５９（１９９４）に記載）により分析し、平均分子量が１０００００ダルトン以上であることが判明した。
実施例２
適当なポリマーの直接的（部分的）グラフト重合によるアジュバントの合成
ポリアクリル酸９０７（ＰＡＡ−９０７）（米国、オハイオ州、クリーブランド、BFGoodrich市販のCARBOPOL-907）試料（各１ｇ）を、各５０ｍｌの純粋なアルカノール（各々、オクタノール、ブタノールおよびメタノール）に可溶化させることでCohen（J.Polymer Sci．１４、７−２２、１９７６）により記載されている方法にしたがってエステル化し、その溶液を１３５℃に加熱した。１８Ｍ硫酸（５０μｌ）を各溶液に加え、その混合物を１３５℃に１０ないし３０分間維持した。ついで、５０ｍｌの冷蒸留水を各反応混合物に添加し、反応混合物を室温に冷却することで反応を終了させた。ついで各反応混合物のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて６に調整し、該混合物を減圧（１０-6バール）下８０℃に加熱することでその反応混合物から溶媒を除去した。
得られた生成物を蒸留水に溶かし、１０ｋＤの遮断能を有する膜（Spectra／por）を用いて蒸留水に対して少なくとも７日間透析し、凍結乾燥して水をその混合物から除去した。
この操作で得られた化合物は（グラフト重合ポリマー）オクチル−ＰＡＡ、ブチル−ＰＡＡおよびメチル−ＰＡＡであった。これらのグラフト重合ポリマーをＮＭＲ（溶媒としてＤＭＳＯを用い、１２０℃で５００メガサイクルの装置（BRUCKER AMX500）にてＴＭＳ（０ｐｐｍ標体）から算定された化学シフトによるプロトンＮＭＲ）で分析し、そのエステル化度（原料分子のカルボキシル基の総数に対するアルキル基の平均数）を測定した。このＮＭＲの結果は、オクチル−ＰＡＡで１６％、ブチル−ＰＡＡで１６％およびメチル−ＰＡＡで１５％のエステル化度であった。
実施例３
適当なポリマーの間接的（部分的）グラフト重合によるアジュバントの合成
ＰＡＡ−９０７（米国、オハイオ州、BFGoodrich市販のCARBOPOL-907）（３６ｇ）の無水ジメチルホルムアミド（１リットル）中溶液を調製した。ついで、この溶液（５０ｍｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ）と混合し、ＰＡＡ−９０７溶液を形成させた。
無水ジメチルホルムアミド（１リットル）当たり７１．２ｍｌの濃度のＣＨ3ＣＯＣｌの溶液を調製した。このＣＨ3ＣＯＣｌ溶液（７．５ｍｌ）を該ＰＡＡ−９０７溶液（ＰＡＡ−９０７のＣＯＯＨ１個に対して０．３個のＣＨ3ＣＯＣｌのモル比）に加え、この反応混合物をまず６０℃で６時間インキュベーションし、ついで室温で１８時間インキュベーションして、ＰＡＡ−９０７のＣＯＯＨ基とＣＨ3ＣＯＣｌの間で無水物を形成させた。
このように形成された混合物に、７ｍｌの純粋な無水１−ブタノールを添加し、その反応混合物を再び室温で２４時間インキュベーションし、無水物を該ブタノールと反応させ、ブチル−ＰＡＡエステルおよびブチルＯ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ3エステルを形成させた。得られた生成物を１０ｋＤの遮断能を有する透析膜（Spectra／por）を用いて蒸留水に対して少なくとも７日間透析した。該ポリマーをＮＭＲ（溶媒としてＤＭＳＯを用い、２５℃で５００メガサイクルの装置（BRUCKER AMX500）にてＴＭＳ（０ｐｐｍ標体）から算定された化学シフトによるプロトンＮＭＲ）で分析し、８４個のアクリル酸モノマーに対して１６個のアクリル酸ブチルモノマーのモル比のアクリル酸ブチルモノマーとアクリル酸モノマーであることが判明した。
実施例４
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡおよびＩｇＧ−産生細胞の数に対するブチル−ＰＡＡおよびＣＴＢの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２にて前記したように合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を種々の量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（超精製水１リットル当たりＮａ2ＨＰＯ4（１５．１６ｇ）およびＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２．８３ｇ）を含有する）に溶かし、以下の表１に示す濃度のブチル−ＰＡＡアジュバントを有するブチル−ＰＡＡアジュバント溶液（処方）を得た。
コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）をシグマ（Sigma）社より入手した。ついでそのＣＴＢを種々の量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（超精製水１リットル当たりＮａ2ＨＰＯ4（１５．１６ｇ）およびＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２．８３ｇ）を含有する）に溶かし、以下の表１に示す濃度のＣＴＢアジュバントを有するＣＴＢアジュバント溶液（処方）を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株ラソタ（Lasota）（オランダ、ウィースプ、Solvay Duphar）を（Wilsonら、Avian Diseases、２８、１０７９−１０８５（１９８４）にて特定されている方法および条件に従って）卵上で増殖させ、シュークロース密度勾配法で精製し、（Wilsonら、Avian Diseases、２８、１０７９−１０８５（１９８４）にて特定されている方法および条件に従って）β−プロピオラクトンで不活化し、ストック抗原溶液を得た。そのストック抗原溶液の最終濃度は、不活性化前に１ｍｌ当たり１０8.8の胚芽感染中央値（embryo-infective doses）を有した。
ついで１体積の上記製造の種々の各アジュバント処方を、１体積のストック抗原溶液と混合することにより、以下の表１に示される種々のワクチン処方を調製した。
最後に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（超精製水１リットル当たりＮａ2ＨＰＯ4（１５．１６ｇ）およびＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２．８３ｇ）を含有する）を調製した。このリン酸緩衝液を以下の実験における対照として用いた。
パート３：検体の免疫処理
２４匹の雌のマウス（ドイツ、チャールス・リバー、ＮＭＲＩ）を入手し、１群６匹の検体４群に分けた。
０日目に、４群の各々の検体をエーテルで軽く麻酔処理した。
第１の群（群１）の各検体に、抗原もアジュバントも含まない、この実施例のパート１に前記したリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を各４０μｌ用量ずつ、各検体の外鼻孔に該リン酸緩衝液（２０μｌ）を滴下することで投与した。
第２の群（群２）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液（２０μｌ）と前記したリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（２０μｌ）の混合液を含有する各４０μｌの用量を、各検体の外鼻孔にこの混合液（２０μｌ）を滴下することで投与した。
残りの２群（群３および４）の各検体を、表１に特定される、各４０μｌ用量のワクチン処方（ストック抗原溶液（２０μｌ）および特定のアジュバント処方（２０μｌ）を含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の外鼻孔に個々のワクチン処方（２０μｌ）を滴下することで鼻腔内免疫処理した。
リン酸緩衝液（群１の検体に投与）、ＮＤＶストック抗原溶液（群２の検体に投与）または抗原／アジュバントワクチン処方（群３および４の検体に投与）のいずれかの投与を１４日目に同じ混合物を用い、０日目に前記したと同じプロトコルを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週間）に、４群すべての検体を再びエーテルで麻酔処理し、できる限り多量の血液をその静脈管脈叢より集めた。
ついで、検体を頚部脱臼により殺し、肺の中に血液が入らないように、肺を注意して摘出した。その脾臓も取り出した。
Ｍ１９９培地（BioWhittaker）（５００ｍｌ）、ウシ胎児血清（Gibco BRL）（３０ｍｌ）、１Ｍ ＨＥＰＥＳ溶液（Sigma）（１１．６ｍｌ）、５．６％（ｗ／ｗ）ＮａＨＣＯ3溶液（Analar）（７ｍｌ）およびゲンタマイシン溶液（Gibco BRL）（１４５μｌ）を含むＭ１９９／ＦＣＳ培地を調製した。
各群内で、２検体の肺をプールし、さらに単一試料として１群当たり３つの試料を得るように処理した。
肺を小さな部分に細分割し、さらに１ｍｌ当たり０．４ｍｇの最終濃度のコラゲナーゼ（Sigma）および０．０１Ｍの最終濃度のＣａＣｌ2を補足した（前記の）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地（５ｍｌ）中３７℃で２時間インキュベーションした。
脾臓細胞を、Ｍ１９９／ＦＣＳ培地にコラゲナーゼまたはＣａＣｌ2のいずれも補足しなかったことを除いて、肺細胞と同じ方法にて処理した。
インキュベーションした後、肺細片をナイロン製シーブ（Nybold、メッシュ開口部２４３ミクロン）を通してミンチ状にし、細胞懸濁液をナイロン製シーブ（メッシュ開口部２４３ミクロン）を通して濾過し、遠心管に回収した。
脾臓細胞も同様の方法により処理し、遠心管に回収した。
遠心管（肺細胞懸濁液および脾臓細胞懸濁液を含有する）を４℃、１０００ＲＰＭ（１８０ｇ）で５分間遠心分離に付し、それから上澄を除去した。残りの細胞ペレットを（前記の）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地（２ｍｌ）に再び懸濁させた。得られた細胞懸濁液を３ｍｌのFicollpaque（Pharmacia）を含有する遠心管に加え、その遠心管を１８℃、２０００ＲＰＭ（５４０ｇ）で２０分間遠心分離に付した。
遠心分離操作により得られた、リンパ球を含有する２つの最も軽量のフラクションを新たな遠心管に集めた。ついで（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地（８ｍｌ）を約２ｍｌの細胞懸濁液に添加することで該細胞を洗浄し、４℃、１０００ＲＰＭ（１８０ｇ）で５分間遠心分離に付した。得られた上澄を除去し、洗浄操作を少なくとももう一度繰返した。
ついで、得られた細胞ペレットを２ｍｌの（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地に再び懸濁させ、０．８３％（ｗ／ｖ）のＮＨ4Ｃｌ（２ｍｌ）を各試料に加えた。ついで、細胞懸濁液を緩やかに混合し、つづいて４℃、１０００ＲＰＭ（１８０ｇ）で５分間遠心分離に付した。ついで、得られた細胞ペレットを直ちに（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地（８ｍｌ）に再び懸濁させた。ついで、遠心管を４℃、１０００ＲＰＭ（１８０ｇ）で５分間再び遠心分離に付した。上澄をペレットを分離し、細胞ペレットを（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地に再び懸濁させた。次に、生存細胞の数をトリパンブルー（Sigma）を用いて顕微鏡で測定し、懸濁液を０．１ｍｌ（１００μｌ）当たり２ｘ１０6個の細胞に調整した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的Ｉｇ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液および脾臓細胞懸濁液の両方の抗原特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ産生細胞数を、SedwickおよびHolt（J.Immunol.Meth.８７、３７−４４）に記載されているように、以下の記載に従って、ELISAプラーク検定（ELISPOT）により測定した：ELISAプレートを、不活性化前に１ｍｌ当たり約１０8.8の胚芽感染中央値の濃度の、０．０１５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3および０．０３５Ｍ ＮａＨＣＯ3を含有する、精製された不活化ＮＤＶ（株Lasota、Solvay Duphar）の炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中溶液（５０μｌ）で一夜コーティングした。その後、プレートをリン酸緩衝セイライン中０．０５％（ｗ／ｖ）Tween20（Merck）（オキソイド；PBS／Tween20）で５回洗浄した。
ついで前記したＭ１９９／ＦＣＳ培地（１００μｌ）を各ウェルに加えた。１００μｌ当たり２ｘ１０6個の細胞を含有する細胞懸濁液（１００μｌ）を第１列のウェルに加え、その後、同行のウェルを連続的に２倍に希釈した。
ついで、ウェルの底に沈殿している細胞が移動しないように、プレートをカバーし、防振性インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーションした後、ウェルに付着している細胞をウェルから取り出すのに十分な力で脱ミネラル水を各ウェルに噴射した。その後、ペレットを（前記した）ＰＢＳ／Tween20で５回洗浄した。（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地で５００倍に希釈したビオチン（Zymed）と接合した５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＡを各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。
ついでプレートを（前記した）ＰＢＳ／Tween20で１０回洗浄し、（前記した）Ｍ１９９／ＦＣＳ培地に予め５００倍に希釈したストレプトアビジン−アルカリ性リン酸塩複合体（Zymed）（５０μｌ）を各ウェルに加え、プレートを４℃で１８時間インキュベーションした。
ついで、該プレートを（前記した）ＰＢＳ／Tween20で１０回洗浄した。４倍容量の１Ｍ ２−アミノ、２−メチル、１−プロパノール緩衝液（ｐＨ１０．２５；Sigma）中１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Sigma）および１倍容量の３（ｗ／ｖ）％アガロース（Sigma）溶液からなる、温かい（４０℃）基質緩衝液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。ついでプレートを室温で２時間インキュベーションし、青色スポットの数が１０個と４０個の間にあるウェル中の青色スポットの数を顕微鏡（１００ｘ倍率）で計数した。ついで、ウェル中に計数されたスポットの数をウェルに加えられた細胞の数で割り、その値に１０6を掛けることにより、１０6個の細胞当たりの青色スポットの数を計数した。
ついで、各肺細胞懸濁液（各懸濁液を２群の個々の検体の肺から誘導する）をELISPOTにて三重試験した。ついで、各脾臓細胞懸濁液（各懸濁液は２群の個々の検体に由来する）をELISPOTにて三重試験した。肺および脾臓細胞懸濁液の３つの試料の平均値および平均標準偏差（ＳＥＭ）を算定した。
かかる算定結果を表１に列挙する。
0004344014.tif 000002
実施例５
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を、実施例４に前記した記載に従い、下記の表２に示す濃度のブチル−ＰＡＡアジュバントを有するアジュバント処方を形成するように調製した。
スルホリポ−シクロデキストリン／スクアラン／水（ＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水）アジュバント処方を、Hilgers（Immunology、６０、１４１−１４６、１９８７）がスルフェートおよびラウロイル基をポリシュークロースに付加することでスルホリポ−ポリシュークロースの合成について記載しているように、１モルのスルフェート、８モルのラウロイルおよび１モルのシクロデキストリンのモル比でスルフェートおよびラウロイル基をベータ−シクロデキストリンに付加することでスルホリポ−シクロデキストリン（ＳＬ−ＣＤ）を合成する以外、スルホリポ−ポリシュークロース／スクアラン／水処方について、Hilgers（Vaccine１２、６５３−６６０、１９９４）に記載されているプロトコルに従って調製した。ついで、得られた１ｇのＳＬ−ＣＤを２ｇのTween80に溶かした。８ｇのスクアランおよび３９０ｇのホスフェート緩衝セイライン（ＰＢＳ）をそのＳＬ−ＣＤ／Tween80溶液に添加した。得られた混合物を、Hilgers（Vaccine、１２、６５３−６６０、１９９４）がＳＬ−ポリシュークロース／スクアラン／水について記載しているようにマイクロ液化装置（Microfluidics Inc.）を通して乳化させ、ＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水のアジュバントエマルジョンを形成させた。以下の個々の例で使用したＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水のアジュバント処方中に存在するＳＬ−ＣＤ、Tween80およびスクアランの最終濃度は、アジュバントエマルジョン１リットル当たりＳＬ−ＣＤ（２．５ｇ）、アジュバントエマルジョン１リットル当たりTween80（５．０ｇ）およびアジュバントエマルジョン１リットル当たり２０ｇであった。
パート２：ワクチン処方の調製
以下の表２に特定されるニューキャッスル病ウイルスのストック抗原溶液および種々のワクチン処方を実施例４に前記されるように調製した。
パート３：検体の免疫処理
１８匹の雌のマウス（ドイツ、チャールズ・リバー、ＮＭＲＩ）を入手し、１群６匹の検体３群に分けた。
０日目に、各３群の検体をエーテルで軽く麻酔処理した。
ついで、１群（群１）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液（２０μｌ）および（前記した）リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（２０μｌ）の混合物を含有する各４０μｌ用量を、各検体の外鼻孔にこの混合物（２０μｌ）を滴下することで投与した。
残りの２群（群２および３）の各検体を、表２に示される、各４０μｌ用量のワクチン処方（ストック抗原溶液（２０μｌ）および特定のアジュバント処方（２０μｌ）を含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の外鼻孔に個々のワクチン処方（２０μｌ）を滴下することで鼻腔内免疫処理した。
純粋なＮＤＶストック抗原溶液（群１の検体に投与）または抗原／アジュバントワクチン処方（群２および３の検体に投与）のいずれかの投与を１４日目に同じ混合物を用い、０日目に前記したと同じプロトコルを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週間）に、３群の検体を再びエーテルで麻酔処理し、できる限り多量の血液をその静脈管脈叢より集めた。
ついで、検体を頚部脱臼により殺し、肺の中に血液が入らないように、肺を注意して摘出した。
（以下の表２に記載されているように）群１および群２の検体の場合、その脾臓も摘出した。
肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に記載されているように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞の数の測定を、群１および２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞の数を測定した以外は、実施例４に記載されているように行った。
その算定結果を表２に示す。
0004344014.tif 000003
実施例６
肺細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＰＡＡ−９０７の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を、実施例３に前記した記載に従い、下記の表４に示す濃度のブチル−ＰＡＡアジュバントを有するアジュバント処方を形成するように調製した。
ＰＡＡ−９０７（CARBOPOL−907；BFGoodrich）を、超純水１リットル当たりＮａ2ＨＰＯ4（１５．１６ｇ）およびＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２．８３ｇ）を含有する種々の量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に可溶化させ、表３に列挙する種々の濃度のＰＡＡ−９０７アジュバントを有する、ＰＡＡ−９０７アジュバント溶液（処方）を生成した。
パート２：ワクチン処方の調製
以下の表３に特定されるニューキャッスル病ウイルスのストック抗原溶液および種々のワクチン処方を実施例４の記載に従って調製した。
パート３：検体の免疫処理
４２匹の雌のマウス（ドイツ、チャールズ・リバー、ＮＭＲＩ）を入手し、１群６匹の検体７群に分けた。
０日目に、各７群の検体をエーテルで軽く麻酔処理した。
ついで、１群（群１）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液（２０μｌ）および（前記した）リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（２０μｌ）の混合物を含有する各４０μｌ用量を、各検体の外鼻孔にこの混合物（２０μｌ）を滴下することで投与した。
残りの６群（群２、３、４、５、６および７）の各検体を、表３に示される、各４０μｌ用量のワクチン処方（ストック抗原溶液（２０μｌ）および特定のアジュバント処方（２０μｌ）を含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の外鼻孔に個々のワクチン処方（２０μｌ）を滴下することで鼻腔内免疫処理に付した。
純粋なＮＤＶストック抗原溶液（群１の検体に投与）または抗原／アジュバントワクチン処方（群２−７の検体に投与）のいずれかの投与を１４日目に同じ混合物を用い、０日目に前記したと同じプロトコルを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週間）に、７群の検体を再びエーテルで麻酔処理し、できる限り多量の血液をその静脈管脈叢より集めた。
ついで、検体を頚部脱臼により殺し、肺の中に血液が入らないように、肺を注意して摘出した。
肺の細胞懸濁液を実施例４に記載されているように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞の数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞の数の測定を、実施例４に記載されているようにして行った。
その算定結果を表３に示す。
0004344014.tif 000004
実施例７
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡおよびＩｇＧ−産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＰＡＡ−９０７の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を、実施例４に前記した記載に従い、下記の表４に示す濃度のブチル−ＰＡＡアジュバントを有するアジュバント処方を形成するように調製した。
ＰＡＡ−９０７（CARBOPOL−907；BFGoodrich）およびそのアジュバント処方を、実施例６に前記されている記載に従い、以下の表４に示される濃度のＰＡＡ−９０７アジュバントを有する処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
以下の表４に特定されるニューキャッスル病ウイルスのストック抗原溶液および種々のワクチン処方を実施例４の記載に従って調製した。
ついで、ＮＤＶ抗原の種々の等級の希釈体、すなわち、ＰＢＳ中１／１２（標準濃度）（ｖ／ｖ）、１／４０（ｖ／ｖ）および１／１２０（ｖ／ｖ）希釈体も、ストック抗原溶液を適量のＰＢＳで希釈することにより調製した。これらの希釈で、各々、不活性化前に１ｍｌ当たり約１０7.8の胚芽感染中央値、不活性化前に１ｍｌ当たり約１０7.3の胚芽感染中央値および不活性化前に１ｍｌ当たり約１０6.8の胚芽感染中央値を有する抗原溶液が得られた。
パート３：検体の免疫処理
５４匹の雌のマウス（ドイツ、チャールズ・リバー、ＮＭＲＩ）を入手し、１群６匹の検体９群に分けた。
０日目に、各９群の検体をエーテルで軽く麻酔処理した。
ついで、３群（群１、２および３）の各検体に、各純粋なＮＤＶストック抗原溶液希釈体（２０μｌ）および（前記した）リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（２０μｌ）の混合物を含有する各４０μｌ用量を、各検体の外鼻孔にこの混合物（２０μｌ）を滴下することで投与した。群１、２および３の各検体に投与した純粋なＮＤＶストック抗原溶液の正確な希釈度を以下の表４に示す。
残りの６群（群４、５、６、７、８および９）の各検体を、表４に示される、各４０μｌ用量のワクチン処方（ストック抗原溶液（２０μｌ）および特定のアジュバント処方（２０μｌ）を含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の外鼻孔に個々のワクチン処方（２０μｌ）を滴下することで鼻腔内免疫処理に付した。
純粋なＮＤＶストック抗原溶液（群１−３の検体に投与）または抗原／アジュバントワクチン処方（群４−９の検体に投与）のいずれかの投与を１４日目に同じ混合物を用い、０日目に前記したと同じプロトコルを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に検体を再度エーテルで麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
グループ１および４の検体の場合（下記の表４に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、実施例４に上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１および４のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表４に示す。
0004344014.tif 000005
実施例８
肺細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡおよびＰＡＡ−９０７の影響
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２に上記したように合成したポリアクリル酸のブチル−エステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を実施例４に上記したように調製して、表５に示すブチル−ＰＡＡアジュバント濃度を有するアジュバント処方を形成させた。
ＰＡＡ−９０７（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９０７；BFGoodrich）および表５に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例６に上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
表５に示されるニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および様々なワクチン処方を実施例４に上記したように調製した。
パート３：検体の免疫化
４２匹の雌マウス（ＮＭＲＩ，Charles River, Germany）を得て、１グループあたり６検体の７つのグループに分けた。
０日目に、７つのグループ各々の検体をエーテルで弱く麻酔した。
次いで、１つのグループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液２０μｌおよびリン酸緩衝液ｐＨ＝７．５（上記）２０μｌの混合液を含有する各４０μｌ用量を、各検体の各外鼻孔に該混合溶液２０μｌを滴下することによって投与した。
次いで、残りの６つのグループ（グループ２、３、４、５、６および７）の各検体を、表５に示されるようなワクチン処方（２０μｌの貯蔵抗原溶液および２０μｌの特定のアジュバント処方を含有する抗原／アジュバント混合物）各４０μｌ用量を用いて、各検体の各外鼻孔に個々のワクチン処方２０μｌを滴下することによって鼻腔内免疫化した。
純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液（グループ１の検体に対して）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２−７の検体に対して）のいずれかの投与を１４日目に、同じ混合液で、０日目について上記した同じプロトコールを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、検体を再度エーテルで麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
次いで、肺細胞の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ３の２つの試料だけの肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表５に示す。
0004344014.tif 000006
実施例９
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ＰＡＡ−９０７、ＰＡＡ−９３４ＰＨ、Ａｌ（ＯＨ）3、リポソームおよびＣＴＢの影響
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２に上記したように合成したポリアクリル酸のブチル−エステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を実施例４に上記したように調製して、表６に示すブチル−ＰＡＡアジュバント濃度を有するアジュバント処方を得た。
ＰＡＡ−９０７（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９０７；BFGoodrich）および表６に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例６に上記したように調製した。
ＣＴＢおよび表６に示すＣＴＢアジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例４に上記したように調製した。
ＰＡＡ−９３４ＰＨ（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９３４ＰＨ；BFGoodrich）を超純水１リットル当たり１５．１６ｇのＮａ2ＨＰＯ4および２．８３ｇのＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを含有する様々な量のリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）中に可溶化して、表６に示すＰＡＡ−９３４ＰＨアジュバント変化濃度を有するＰＡＡ−９３４ＰＨアジュバント溶液（処方）を調製した。
４：５：１のモル比の各々、卵黄ホスファチジルコリン（Sigma）、コレステロール（Sigma）およびセチルホスフェート（Sigma）からなるリポソームをHaanら（Vaccine13,155-162,1995）による記載のように調製した。次いで、これらのリポソームを超純水１リットル当たり１５．１６ｇのＮａ2ＨＰＯ4および２．８３ｇのＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを含有する様々な量のリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）中に懸濁して、表６に示すリポソームアジュバント変化濃度を有するリポソームアジュバント懸濁液（処方）を調製した。
Ａｌ（ＯＨ）3（SUPERFOS）を超純水１リットル当たり１５．１６ｇのＮａ2ＨＰＯ4および２．８３ｇのＮａＨ4ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを含有する様々な量のリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）中に懸濁して、表６に示す種々の濃度のＡｌ（ＯＨ）3アジュバントを含有するＡｌ（ＯＨ）3アジュバント懸濁液（処方）を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
表６に示されるニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および様々なワクチン処方を実施例４に上記したように調製した。
パート３：検体の免疫化
４２匹の雌マウス（ＮＭＲＩ，Charles River, Germany）を得、１グループあたり６検体の７つのグループに分けた。
０日目に、７つのグループ各々の検体をエーテルで弱く麻酔した。
次いで、１つのグループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液２０μｌおよびリン酸緩衝液ｐＨ＝７．５（上記）２０μｌの混合液を含有する各４０μｌ用量を、各検体の各外鼻孔に該混合溶液２０μｌを滴下することによって投与した。
次いで、残りの６つのグループ（グループ２、３、４、５、６および７）の各検体を、表６に示されるようなワクチン処方（２０μｌの貯蔵抗原溶液および２０μｌの個々のアジュバント処方を含有する抗原／アジュバント混合物）各々４０μｌ投与量を用いて、各検体の各外鼻孔に個々のワクチン処方２０μｌを滴下することによって鼻腔内免疫化した。
純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液（グループ１の検体に対して）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２−７の検体に対して）のいずれかの投与を１４日日に、同じ混合液で、０日目について上記した同じプロトコールを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、検体をエーテルで再度麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記の表６に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、実施例４に上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１およびグループ２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表６に示す。
0004344014.tif 000007
実施例１０
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ＰＡＡ−９０７、ＰＡＡ−９３４ＰＨ、Ａｌ（ＯＨ）3、リポソームおよびＣＴＢの影響
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２に上記したように合成したポリアクリル酸のブチル−エステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を実施例４に上記したように調製して、表７に示すブチル−ＰＡＡアジュバント濃度を有するアジュバント処方を形成させた。
ＰＡＡ−９０７（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９０７；BFGoodrich）および表７に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例６に上記したように調製した。
ＣＴＢおよび表７に示すＣＴＢアジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例４に上記したように調製した。
ＰＡＡ−９３４ＰＨ（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９３４ＰＨ；BFGoodrich）およびそのアジュバント処方、リポソームおよびそのアジュバント処方ならびにＡｌ（ＯＨ）3（SUPERFOS）およびそのアジュバント処方を全て、表７に示す各アジュバント濃度を有するように実施例９に上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
表７に示されるニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および様々なワクチン処方を実施例４に上記したように調製した。
パート３：検体の免疫化
４２匹の雌マウス（ＮＭＲＩ，Charles River, Germany）を得、１グループあたり６検体の７つのグループに分けた。
０日目に、７つのグループ各々の検体をエーテルで弱く麻酔した。
次いで、１つのグループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液２０μｌおよびリン酸緩衝液ｐＨ＝７．５（上記）２０μｌの混合液を含有する各４０μｌ用量を、各検体の各鼻孔に該混合溶液２０μｌを滴下することによって投与した。
次いで、残りの６つのグループ（グループ２、３、４、５、６および７）の各検体を、表７に示されるようなワクチン処方（２０μｌの貯蔵抗原溶液および２０μｌの個々のアジュバント処方を含有する抗原／アジュバント混合物）各４０μｌ用量を用いて、各検体の各外鼻孔に個々のワクチン処方２０μｌを滴下することによって鼻腔内免疫化した。
純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液（グループ１の検体に対して）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２−７の検体に対して）のいずれかの投与を１４日目に、同じ混合液で、０日目について上記した同じプロトコールを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、検体をエーテルで再度麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記の表７に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１のみ２つの試料の肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１およびグループ２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表７に示す。
0004344014.tif 000008
実施例１１
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ＰＡＡ−９０７、ＰＡＡ−９３４ＰＨ、Ａｌ（ＯＨ）3、リポソームおよびＣＴＢの影響
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２に上記したように合成したポリアクリル酸のブチル−エステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を実施例４に上記したように調製して、表８に示すブチル−ＰＡＡアジュバント濃度を有するアジュバント処方を形成させた。
ＰＡＡ−９０７（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９０７；BFGoodrich）および表８に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例６に上記したように調製した。
ＣＴＢおよび表８に示すＣＴＢアジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例４に上記したように調製した。
ＰＡＡ−９３４ＰＨ（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９３４ＰＨ；BFGoodrich）およびそのアジュバント処方、リポソームおよびそのアジュバント処方ならびにＡｌ（ＯＨ）3（SUPERFOS）およびそのアジュバント処方を全て、表８に示す各アジュバント濃度を有するように実施例９に上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
表８に示されるニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および様々なワクチン処方を実施例４に上記したように調製した。
パート３：検体の免疫化
４２匹の雌マウス（ＮＭＲＩ，Charles River, Germany）を得、１グループあたり６検体の７つのグループに分けた。
０日目に、７つのグループ各々の検体をエーテルで弱く麻酔した。
次いで、１つのグループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液２０μｌおよびリン酸緩衝液ｐＨ＝７．５（上記）２０μｌの混合液を含有する各４０μｌ用量を、各検体の各外鼻孔に該混合溶液２０μｌを滴下することによって投与した。
次いで、残りの６つのグループ（グループ２、３、４、５、６および７）の検体を、表８に示されるようなワクチン処方（２０μｌの貯蔵抗原溶液および２０μｌの特定のアジュバント処方を含有する抗原／アジュバント混合物）各４０μｌ用量を用いて、各検体の各外鼻孔に特定のワクチン処方２０μｌを滴下することによって鼻腔内免疫化した。
純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液（グループ１の検体に対して）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２−７の検体に対して）のいずれかの投与を１４日目に、同じ混合液で、０日目について上記した同じプロトコールを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、検体をエーテルで再度麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記の表８に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、実施例４に上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１およびグループ２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表８に示す。
0004344014.tif 000009
実施例１２
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ−産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ＰＡＡ−９０７、ＰＡＡ−９３４ＰＨおよびＡｌ（ＯＨ）3の影響
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２に上記したように合成したポリアクリル酸のブチル−エステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を実施例４に上記したように調製して、表９に示すブチル−ＰＡＡアジュバント濃度を有するアジュバント処方を得た。
ＰＡＡ−９０７（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９０７；BFGoodrich）および表９に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するそのアジュバント処方を実施例６に上記したように調製した。
ＰＡＡ−９３４ＰＨ（ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９３４ＰＨ；BFGoodrich）およびそのアジュバント処方ならびにＡｌ（ＯＨ）3（SUPERFOS）およびそのアジュバント処方を全て、表９に示すＰＡＡ−９３４ＰＨアジュバントまたはＡｌ（ＯＨ）3アジュバント濃度を有するように実施例９に上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
表７に示されるニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および様々なワクチン処方を実施例４に上記したように調製した。
パート３：検体の免疫化
６０匹の雌マウス（ＮＭＲＩ，Charles River, Germany）を得て、１グループあたり６検体の１０グループに分けた。
０日目に、１０のグループ各々の検体をエーテルで弱く麻酔した。
次いで、２つのグループ（グループ１およびグループ２）の各検体に、純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液２０μｌおよびリン酸緩衝液ｐＨ＝７．５（上記）２０μｌの混合液を含有する各４０μｌ用量を各検体の各外鼻孔に該混合溶液２０μｌを滴下することによって投与した。
次いで、残りの８つのグループ（グループ３、４、５、６、７、８、９および１０）の各検体を、表９に示されるようなワクチン処方（２０μｌの抗原溶液および２０μｌの特定のアジュバント処方を含有する抗原／アジュバント混合物）各４０μｌ用量を用いて、各検体の各外鼻孔に該混合物２０μｌを滴下することによって鼻腔内免疫化した。
純粋なＮＤＶ貯蔵抗原溶液（グループ１およびグループ２の検体に対して）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ３−１０の検体に対して）のいずれかの投与を１４日目に、同じ混合液で、０日目について上記した同じプロトコールを用いて繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、５つのグループ（１、３、５、７および９）の検体をエーテルで再度麻酔し、できるだけ大量の血液をその各静脈叢から収集した。
次いで、これら５つのグループ（１、３、５、７および９）の検体を頚部脱臼によって殺し、その肺を血液が入らないように注意深く摘出した。
グループ１およびグループ３の検体の場合（下記の表９に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
２８日目（４週）に、他の５つのグループ（グループ２、４、６、８および１０）の検体を再度エーテルで麻酔し、できるだけ大量の血液をその静脈叢から収集した。
次いで、これら５つのグループ（グループ２、４、６、８および１０）の検体を頚部脱臼により殺し、その肺を血液が入らないように注意深く出した。
グループ２およびグループ４の検体の場合（下記の表９に示されるように）、その脾臓も摘出した。
次いで、肺および脾臓の細胞懸濁液を実施例４に上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ６およびグループ８のみ２つの試料の肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定は、グループ１−４のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４に上記したように行った。
かかる計算結果を表９に示す。
0004344014.tif 000010
実施例１３
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＰＡＡ−９０７の影響
パート１：アジュバント処方の調製
上記実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を上記実施例４の記載に従って調製して、下記表１０に示すブチル−ＰＡＡアジュバントの濃度を有するアジュバント処方を得た。
上記実施例６の記載に従って、下記表１０に示すＰＡＡ−９０７アジュバントの濃度を有するＰＡＡ−９０７（カルボポル（ＣＡＲＢＯＰＯＬ）−９０７；ビーエフグッドリッチ（ＢＦＧoodrich））およびそのアジュバント処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
上記実施例４の記載に従って、ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を調製した。
パート３：検体の免疫化
雌性マウス（ドイツ国チャールズ・リバーのＮＭＲＩ）８４匹を入手し、１グループが６検体からなる１４グループに分けた。
０日目、１４グループの各検体をエーテルで軽く麻酔した。
次いで、２グループ（グループ１およびグループ２）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液２０μlとリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（上記した）２０μlとの混合物を含有する各４０μl用量を、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより投与した。
次いで、残りの１２グループ（グループ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４）の各検体を、下記表１０に示すとおり、各４０μl用量のワクチン処方（ストック抗原溶液２０μlおよび特定のアジュバント処方２０μlを含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより鼻腔内免疫化した。
１４日目に、０日目について上記したと同一の混合物およびプロトコールを用いて、純粋なＮＤＶストック抗原溶液の投与（グループ１およびグループ２の検体へ）または抗原／アジュバントワクチン処方の投与（グループ３−１４の検体へ）を繰り返し行った。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週目）に、７グループ（グループ１、３、５、７、９、１１および１３）の検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら７グループ（グループ１、３、５、７、９、１１および１３）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取りだした。
グループ１およびグループ３の検体の場合（下記表１０に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
２８日目（４週目）に、他の７グループ（グループ２、４、６、８、１０、１２および１４）の検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら７グループ（グループ２、４、６、８、１０、１２および１４）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取り出した。
グループ２およびグループ４の検体の場合（下記表１０に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定
グループ１０および１２のみ２つの試料の肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
グループ１−４のみ３つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
かかる計算結果を下記表１０に示す。
0004344014.tif 000011
実施例１４
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水の影響
パート１：アジュバント処方の調製
上記実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を上記実施例４の記載に従って調製して、下記表１１に示すブチル−ＰＡＡアジュバントの濃度を有するアジュバント処方を形成した。
上記実施例５の記載に従って、下記表１１に示すＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水アジュバントの濃度を有するスルホリポ−シクロデキストリン／スクアラン／水（ＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水）アジュバント処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
上記実施例４の記載に従って、ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を調製した。
パート３：検体の免疫化
雌性マウス（ドイツ国チャールズ・リバーのＮＭＲＩ）７２匹を入手し、１グループが６検体からなる１２グループに分けた。
０日目、１２グループの各検体をエーテルで軽く麻酔した。
次いで、４グループ（グループ１、グループ２、グループ３およびグループ４）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液２０μl用量とリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（上記した）２０μlとの混合物を含有する各４０μlを、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより投与した。
次いで、残りの８グループ（グループ５、６、７、８、９、１０、１１および１２）の各検体を、下記表１１に示すとおり、各４０μl用量のワクチン処方（ストック抗原溶液２０μlおよび特定のアジュバント処方２０μlを含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより鼻腔内免疫化した。
１４日目に、０日目について上記したと同一の混合物およびプロトコールを用いて、純粋なＮＤＶワクチン処方（グループ１−４の検体へ）または抗原／アジュバントワクチン処方の投与（グループ５−１２の検体へ）を繰り返し行った。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週目）に、３グループ（グループ１、５および９）の検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループ（グループ１、５および９）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取りだした。
グループ１およびグループ５の検体の場合（下記表１１に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
２８日目（４週目）に、他の３グループ（グループ２、６および１０）の検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループ（グループ２、６、および１０）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取り出した。
グループ２およびグループ６の検体の場合（下記表１１に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
３５日目（５週目）に、別の３グループ（グループ３、７および１１）の検体を再度エーテルで麻酔し、その静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループ（グルーフ３、７および１１）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取り出した。
グループ３およびグループ７の検体の場合（下記表１１に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
４９日目（７週目）に、別の３グループ（グループ４、８および１２）の検体をエーテルで麻酔し、その静脈叢の各々からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループ（グループ４、８および１２）の検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取り出した。
グループ４およびグループ９の検体の場合（下記表１１に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定
上記実施例４の記載に従って、肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
グループ１−８のみ３つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
かかる計算結果を下記表１１に示す。
0004344014.tif 000012
実施例１５
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水の影響
パート１：アジュバント処方の調製
上記実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を上記実施例４の記載に従って調製して、下記表１２に示すブチル−ＰＡＡアジュバントの濃度を有するアジュバント処方を形成した。
上記実施例５の記載に従って、下記表１２に示すＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水アジュバントの濃度を有するスルホリポ−シクロデキスリン／スクアラン／水（ＳＬ−ＣＤ／スクアラン／水）アジュバント処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
上記実施例４の記載に従って、ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を調製した。
パート３：検体の免疫化
雌性マウス（ドイツ国チャールズ・リバーのＮＭＲＩ）１８匹を入手し、１グループが６検体からなる３グループに分けた。
０日目、３グループの各検体をエーテルで軽く麻酔した。
次いで、１グループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液２０μlとリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（上記した）２０μlとの混合物を含有する各４０μl用量を、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより投与した。
次いで、残りの２グループ（グループ２およびグループ３）の各検体を、下記表１２に示すとおり、各４０μl用量のワクチン処方（ストック抗原溶液２０μlおよび特定のアジュバント処方２０μlを含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより鼻腔内免疫化した。
２１日目に、０日目について上記したと同一の混合物およびプロトコールを用いて、純粋なＮＤＶストック抗原溶液の投与（グループ１の検体へ）または抗原／アジュバントワクチン処方の投与（グループ２および３の検体へ）を繰り返し行った。
パート４：細胞懸濁液の調製
４２日目（６週目）に、３グループの検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループの検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取りだした。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記表１２に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定
グループ１のみ２つの試料の肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
グループ１および２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
かかる計算結果を下記表１２に示す。
0004344014.tif 000013
実施例１６
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびＣＴＢの影響
パート１：アジュバント処方の調製
上記実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を上記実施例４の記載に従って調製して、下記表１３に示すブチル−ＰＡＡアジュバントの濃度を有するアジュバント処方を得た。
上記実施例４の記載に従って、下記表１３に示すＣＴＢアジュバントの濃度を有するＣＴＢおよびそのアジュバント処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
上記実施例４の記載に従って、ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を調製した。
パート３：検体の免疫化
雌性マウス（ドイツ国チャールズ・リバーのＮＭＲＩ）１８匹を入手し、１グループが６検体からなる３グループに分けた。
０日目、３グループの各検体をエーテルで軽く麻酔した。
次いで、１グループ（グループ１）の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液２０μlとリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（上記した）２０μlとの混合物を含有する各４０μl用量を、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより投与した。
次いで、残りの２グループ（グループ２およびグループ３）の各検体を、下記表１３に示すとおり、各４０μl用量のワクチン処方（抗原溶液２０μlおよび特定のアジュバント処方２０μlを含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより鼻腔内免疫化した。
２１日目に、０日目について上記したのと同一の混合物およびプロトコールを用いて、純粋なＮＤＶストック抗原溶液の投与（グループ１の検体へ）または抗原／アジュバントワクチン処方の投与（グループ２および３の検体へ）を繰り返し行った。
パート４：細胞懸濁液の調製
４２日目（６週目）に、３グループの検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループの検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取りだした。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記表１３に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定
上記実施例４の記載に従って、肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
グループ１および２のみ２つの試料の脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数を測定した以外は、上記実施例４の記載に従って、脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ産生細胞数の測定を行った。
かかる計算結果を下記表１３に示す。
0004344014.tif 000014
実施例１７
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するブチル−ＰＡＡおよびリポソームの影響
パート１：アジュバント処方の調製
上記実施例２の記載に従って合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ブチル−ＰＡＡ）を上記実施例４の記載に従って調製して、下記表１４に示すブチル−ＰＡＡアジュバントの濃度を有するそのアジュバント処方を得た。
上記実施例９の記載に従って、下記表１４に示すリポソームアジュバントの濃度を有するリポソームおよびそのアジュバント処方を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
上記実施例４の記載に従って、ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を調製した。
パート３：検体の免疫化
雌性マウス（ドイツ国チャールズ・リバーのＮＭＲＩ）１８匹を入手し、１グループが６検体からなる３グループに分けた。
０日目、３グループの各検体をエーテルで軽く麻酔した。
次いで、グループ１の各検体に、純粋なＮＤＶストック抗原溶液２０μlとリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（上記した）２０μlとの混合物を含有する各４０μl用量を、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより投与した。
次いで、残りの２グループ（グループ２およびグループ３）の各検体を、下記表１４に示すとおり、各４０μl用量のワクチン処方（抗原溶液２０μlおよび特定のアジュバント処方２０μlを含有する抗原／アジュバント混合物）で、各検体の各外鼻孔中にこの混合物２０μlを滴下することにより鼻腔内免疫化した。
１４日目に、０日目について上記したと同一の混合物およびプロトコールを用いて、純粋なＮＤＶストック抗原溶液の投与（グループ１の検体へ）または抗原／アジュバントワクチン処方の投与（グループ２およびグループ３の検体へ）を繰り返し行った。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週目）に、３グループの検体を再度エーテルで麻酔し、その各静脈叢からできる限り多量の血液を回収した。
次いで、これら３グループの検体を頚部脱臼により屠殺し、血液を侵入させないように注意深く肺を取りだした。
グループ１およびグループ２の検体の場合（下記表１４に示すとおり）、その脾臓も取り出した。
次いで、上記実施例４の記載に従って、肺および脾臓の細胞懸濁液を調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定を実施例４において上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定を、グループ１および２のみ２つのサンプルの脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定したことを除いて、実施例４において上記したように行った。
かかる計算の結果を以下の表１４に示す。
0004344014.tif 000015
実施例１８
肺および脾臓細胞懸濁液中の抗−ＮＤＶ ＩｇＡ産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ＰＡＡ−９０７、ＰＡＡ−９３４ＰＨ、リポソームおよびＣＴＢの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２において上記したように合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を、実施例４において上記したように調製し、下記表１５に示すＢｕｔｙｌ−ＰＡＡアジュバント濃度を有する、アジュバント処方を形成した。
ＰＡＡ−９０７（CARBOPOL-907；BFGoodrich）アジュバント処方を、下記表１５に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するように、実施例６において上記したように調製した。
ＰＡＡ−９３４ＰＨ（CARBOPOL-934PH；BFGoodrich）アジュバント処方およびＡｌ（ＯＨ）3（SUPERFOS）アジュバント処方を、それぞれ下記表１５に示すアジュバント濃度を有するように、実施例９において上記したように調製した。
ＣＴＢおよびそのアジュバント処方を、下記表１５に示すＣＴＢアジュバント濃度を有するように、実施例４において上記したように調製した。
リポソームおよびそのアジュバント処方を、下記表１５に示すリポソームアジュバント濃度を有するように、実施例９において上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
精製不活化インフルエンザウイルス、ＭＲＣ−１１株を入手し（SOLVAY DUPHAR, Weesp, The Netherlands）、胚性卵中で増殖させ、シュークロース勾配上で遠心分離により精製し、Vaccine 12, 653-660（1994）に記載されるように、０．０５％（ｖ／ｖ）β−プロピオラクトン＋０．０１％（ｗ／ｖ）チメロサールで、４日間４℃にて、続けて３日間室温にてインキュベーションして不活化した。
ついで、ストック抗原溶液を、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）１ｍｌあたり５０μｇの精製不活化インフルエンザウイルスＭＲＣ−１１株赤血球凝集素を含む不活化ＭＲＣ−１１より調製した。
ついで、用いるワクチン処方を１容積の抗原溶液と１容積のアジュバント溶液を混合することにより得た。
パート３：検体の免疫化
３６匹の
メスマウス（ＮＭＲＩ、Charles River, Germany）を入手し、１グループ当たり６検体の６個のグループに分けた。
０日目に、６個のグループのそれぞれの検体をエーテルでわずかに麻酔した。
ついで、グループ１の検体のそれぞれに、２０μｌの上記した純粋なＭＲＣ−１１ストック抗原溶液および２０μｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．５（上記）の混合物を含む４０μｌの用量を、各検体の各外鼻孔にこの混合物の２０μｌを滴下して投与した。
残りの５つのグループ（グループ２〜６）の検体のそれぞれを、下記表１５に示す４０μｌの用量のワクチン処方（２０μｌの抗原溶液および２０μｌの特定のアジュバント溶液を含む抗原／抗体混合物）を、各検体の各外鼻孔に２０μｌの混合物を滴下して免疫化した。
純粋なＭＲＣ−１１ストック抗原溶液（グループ１の検体）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２〜６の検体）のいずれかの投与を、０日目について上記したのと同じ混合物で、同じプロトコールを用いて１４日目に繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、６個のグループの検体を再度エーテルで麻酔し、可能な限り多くの血液をその静脈から集めた。
これら６個のグループの検体をついで頚部脱臼により屠殺し、その肺を中に血液が入るのを防ぐように注意深く取り出した。
グループ１およびグループ２の検体の場合には（下記の表１５に示すように）、その脾臓もまた取り出した。
肺および脾臓の細胞懸濁液を、ついで実施例４において上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定を、グループ１の２つのサンプルのみの肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定し、ＥＬＩＳＰＯＴ用に、プレートを１ｍｌのコーティング緩衝液当たり２５μｇの精製不活化インフルエンザウイルスＭＲＣ−１１株でコーティングしたことを除いて、上記の実施例４において上記したように行った。
脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定を、グループ１およびグループ２の２つのサンプルのみの脾臓細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数を測定し、ＥＬＩＳＰＯＴ用に、プレートを１ｍｌのコーティング緩衝液当たり２５μｇの精製不活化インフルエンザウイルスＭＲＣ−１１株でコーティングしたことを除いて、実施例４において上記したように行った。
かかる計算の結果を以下の表１５に示す。
0004344014.tif 000016
実施例１９
肺細胞懸濁液中の抗−ＮＤＡ ＩｇＡ産生細胞数および抗−ＢＳＡ ＩｇＡ産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡおよびＰＡＡ−９０７の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２において上記したように合成したポリアクリル酸のブチルエステル（ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ）を、実施例４において上記したように調製し、下記表１６に示すＢｕｔｙｌ−ＰＡＡアジュバント濃度を有する、アジュバント処方を形成した。
ＰＡＡ−９０７（CARBOPOL-907；BFGoodrich）アジュバント処方を、下記表１６に示すＰＡＡ−９０７アジュバント濃度を有するように、実施例６において上記したように調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
ニューカッスル病ウイルスストック抗原溶液および種々のワクチン処方を実施例４において上記したように調製した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（BSA, Fraction V, SIGMAより）を最終濃度５００μｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解することにより調製した。
パート３：検体の免疫化
３６匹のメスマウス（ＮＭＲＩ、Charles River, Germany）を入手し、１グループ当たり６検体の６個のグループに分けた。
０日目に、６個のグループのそれぞれの検体をエーテルでわずかに麻酔した。
ついで、グループ１の検体のそれぞれに、２０μｌの純粋なＮＤＶストック抗原溶液および２０μｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．５（上記）の混合物を含む４０μｌの用量を、各検体の各外鼻孔にこの混合物の２０μｌを滴下して投与した。
ついで、グループ４の検体のそれぞれに、４０μｌの用量の純粋なＢＳＡストック抗原溶液を、各外鼻孔に該ストック抗原溶液の２０μｌを滴下して投与した。
残りの４つのグループ（グループ２、３、５および６）の検体のそれぞれを、下記表１６に示す４０μｌのワクチン処方（２０μｌの特定の抗原溶液および２０μｌの特定のアジュバント溶液を含む抗原／抗体混合物）を、各検体の各外鼻孔に２０μｌの混合物を滴下して免疫化した。
純粋なワクチン処方（グループ１およびグループ２の検体）または抗原／アジュバントワクチン処方（グループ２、３、５および６の検体）のいずれかの投与を、０日目について上記したのと同じ混合物で、同じプロトコールを用いて１４日目に繰り返した。
パート４：細胞懸濁液の調製
２１日目（３週）に、６個のグループの検体を再度エーテルで麻酔し、可能な限り多くの血液をその静脈から集めた。
これら６個のグループの検体をついで頚部脱臼により屠殺し、その肺を中に血液が入るのを防ぐように注意深く取り出した。
肺の細胞懸濁液を、ついで実施例４において上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
肺細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定を、グループ４、５および６の検体についてのＥＬＩＳＰＯＴ用に、プレートを１ｍｌのコーティング緩衝液当たり２５μｇのＢＳＡでコーティングしたことを除いて、実施例４において上記したように行った。
かかる計算の結果を以下の表１６に示す。
0004344014.tif 000017
実施例２０
ポリ（アクリレート−コ−アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸）共重合体（ｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ））の合成
２つのｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ）共重合体をIliopoulos and Audebert in Macromolecules 24, 2566-2575（1991）に記載されるように、合成した。簡単には、モノアクリル酸（ＡＡ；Merck）およびアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＡ；Merck）を超純水中に溶解し、ｐＨを１０Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整し、超純水を添加し、最終全量モノマー濃度を２Ｍとした。少なくとも２０分間窒素に通すことにより、溶液から空気を除去した。（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8およびＮａ2Ｓ2Ｏ5を添加し、それぞれ１．４６ｍＭおよび２．９１ｍＭの最終濃度とした。混合物を２４℃にて２．２５時間または２０℃にて３時間、窒素下で連続して撹拌してインキュベートした。インキュベーション後、過量のメタノールを添加し、混合物を周囲温度にて一晩維持した。形成した沈澱物を１Ｌの超純水当たり９ｇのＮａＣｌの溶液中に回収し、４℃にて濾液中にモノマーが検出されなくなるまで（２１０ｎｍでの吸光度＜０．１吸収単位）透析し（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）、ついで超純水に対して透析した（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）。残留物を凍結乾燥させ、共重合体を粉末として回収し、使用するまで周囲温度にて保存した。標準として分子量５、９０、４５０、７５０、１０００および３０００ｋＤ（Aldrich）のポリアクリレートポリマーを用い、検出系として２１０ｎｍの吸光度を用い、セファクリルＳ４００カラム（Pharmacia, Sweden）上でゲル浸透クロマトグラフィーにより、ポリマーの分子量を調べた。得られた共重合体中のＡＭＰＳモノマーのパーセンテージを元素分析により調べた。共重合体の調製方法の詳細および得られた共重合体の詳細を、以下の表１７に示す。
0004344014.tif 000018
実施例２１
ポリ（アクリレート−コ−ビニルスルホネート）共重合体（ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ））の合成
ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ）共重合体を実施例２０においてｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ）について記載したように、合成した。簡単には、モノアクリル酸（ＡＡ；Merck）およびビニルスルホン酸ナトリウム塩（ＶＳ；Fluka）を超純水中に溶解し、ｐＨを１０Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整し、超純水を添加し、最終全量モノマー濃度を２Ｍとした。窒素で溶液を飽和することにより、空気を除去した。（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8およびＮａ2Ｓ2Ｏ5を添加し、それぞれ１．４６ｍＭおよび２．９１ｍＭの最終濃度とした。混合物を１９℃にて６時間、窒素下で連続して撹拌してインキュベートした。インキュベーション後、過量のメタノールを添加し、混合物を周囲温度にて一晩維持した。形成した沈澱物を１Ｌの超純水当たり９ｇのＮａＣｌの溶液中に回収し、４℃にて濾液中にモノマーが検出されなくなるまで（２１０ｎｍでの吸光度＜０．１吸収単位）透析し（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）、ついで超純水に対して透析した（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）。残留物を凍結乾燥させ、共重合体を粉末として回収し、使用するまで周囲温度にて保存した。標準として分子量５、９０、４５０、７５０、１０００および３０００ｋＤ（Aldrich）のポリアクリレートポリマーを用い、検出系として２１０ｎｍの吸光度を用い、セファクリルＳ４００カラム（Pharmacia, Sweden）上でゲル浸透クロマトグラフィーにより、ポリマーの分子量を調べた。得られた共重合体中のＶＳモノマーのパーセンテージを元素分析により調べた。共重合体の調製方法の詳細および共重合体の詳細を、以下の表１９に示す。
0004344014.tif 000019
実施例２２
ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体の合成
ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体を実施例２０においてｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ）について記載したように、合成した。簡単には、モノアクリル酸（ＡＡ；Merck）およびビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＶＢＳ）を超純水中に溶解し、ｐＨを１０Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整し、超純水を添加し、最終全量モノマー濃度を２Ｍとした。２つのモノマーの溶液を窒素で少なくとも２０分間飽和した。（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8およびＮａ2Ｓ2Ｏ5を添加し、それぞれ１．４６ｍＭおよび２．９１ｍＭの最終濃度とした。混合物を２０℃にて６または２４時間、窒素下で溶液を連続して撹拌してインキュベートした。インキュベーション後、過量のメタノールを添加し、混合物を周囲温度にて一晩維持した。形成した沈澱物を１Ｌの超純水当たり９ｇのＮａＣｌの溶液中に回収し、４℃にて濾液中にモノマーが検出されなくなるまで（２１０ｎｍでの吸光度＜０．１吸収単位）透析し（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）、ついで超純水に対して透析した（Spectro/Por；MWCO 12,000-14,000D）。残留物を凍結乾燥させ、共重合体を粉末として回収し、使用するまで周囲温度にて保存した。標準として分子量５、９０、４５０、７５０、１０００および３０００ｋＤ（Aldrich）のポリアクリレートポリマーを用い、検出系として２１０ｎｍの吸光度を用い、セファクリルＳ４００カラム（Pharmacia, Sweden）上でゲル浸透クロマトグラフィーにより、ポリマーの分子量を調べた。得られた共重合体中のＶＢＳモノマーのパーセンテージを元素分析により調べた。共重合体の調製方法の詳細および共重合体の詳細を、以下の表１９に示す。
0004344014.tif 000020
実施例２３
ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体の合成
ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体＃１０〜＃１８を、インキュベーション時間が２４および１６８時間の間であること、インキュベーション温度が３７℃であること、共重合体をＭＷ＞１００ｋＤａおよび１０〜１００ｋＤａのポリマーの２つのフラクションが得られる１００ｋＤ（UFP-100-E6、AGFiltration）および１０ｋＤ（UFP-10-E6、AGFiltration）上で濾過することにより回収することを除いて、実施例２２においてｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）について記載したように合成した。ポリマーを凍結乾燥させ、共重合体を粉末として回収し、使用するまで周囲温度にて保存した。共重合体およびその調製方法の詳細を、以下の表２０に示す。
0004344014.tif 000021
実施例２４
肺細胞懸濁液中の抗−ＮＤＡ ＩｇＡ産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ）およびｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体およびポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）の効果
パート１：アジュバント処方の調製
ＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ）およびｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）を実施例２、２１および２２において上記したように合成して調製し、下記表２１に示す濃度を有するアジュバント処方を形成した。
分子量６０００ｋＤ（PSS, Polysience Inc.）のポリスチレンスルホネートをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）中に溶解し、下記表２１に示すポリマー濃度を有するアジュバント処方を形成した。
パート２：ワクチン処方の調製
下記表２１に示す種々のワクチン処方を実施例４において上記したように調製した。実施例４において記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）を以下の実験において対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
３０匹のメスマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Charles River, Germany）を入手し、１グループ当たり６検体の５個のグループに分け、実施例４において記載した方法にしたがって、表２１中に示すワクチンで処置した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４において上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
実施例４において上記したように行った。
結果を以下の表２１に示す。
0004344014.tif 000022
実施例２５
肺細胞懸濁液中の抗−ＮＤＡ ＩｇＡ産生細胞数に対するＢＵＴＹＬ−ＰＡＡ、ｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ）およびｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）共重合体およびＰＳＳの効果
実施例２４を繰り返し、結果を表２２に示す。
0004344014.tif 000023
実施例２６
肺細胞懸濁液中の抗−Ａ／ブタ ＩｇＡ産生細胞数に対するｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ）共重合体の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例２０において上記したように合成したｐ（Ａ−ｃ−ＡＭＰＳ）をリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）中に溶解し、下記表２３に示すアジュバント処方を形成した。
パート２：ワクチン処方の調製
抗原調製Ａ／ブタ：インフルエンザウイルスＡ／ブタ株を、胚性卵中で増殖させ、シュークロース勾配上で遠心分離により精製し、Vaccine 12, 653-660（1994）に記載されるように、０．０５％（ｖ／ｖ）β−プロピオラクトン＋０．０１％（ｗ／ｖ）チメロサールで、４日間４℃にて、続けて３日間室温にてインキュベーションして不活化した。
１ｍｌ当たり２５０μｇのＨＡの抗原ストック溶液を調製した。ついで、下記表２３に示す種々のワクチン処方を上記したように調製したそれぞれのアジュバント処方の１容積とストックＡ／ブタ抗原溶液の１容積を混合することにより得た。実施例４において記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を以下の実験において対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
３６匹のメスマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Charles River, Germany）を入手し、１グループ当たり６検体の６個のグループに分け、実施例４において記載した方法にしたがって、表２３に示すワクチンで処置した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４において上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中の抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
ＥＬＩＳＰＯＴ用に、プレートを１ｍｌのコーティング緩衝液当たり５０μｇのインフルエンザＡ／ブタ株でコーティングしたことを除いて、実施例４において上記したように行った。
結果を以下の表２３に示す。
0004344014.tif 000024
実施例２７
肺細胞懸濁液中の抗−Ａ／ブタ ＩｇＡ産生細胞数に対するｐ（Ａ−ｃ−ＶＳ）共重合体、デキストランスルフェート（ＤＸＳ）およびＰＳＳの効果
パート１：アジュバント処方の調製
Ｂｕｔｙｌ−ＰＡＡ、ｐ（Ａ−ｃ−ＶＢＳ）およびＰＳＳをそれぞれ実施例４、２２および２４に記載したように得た。
分子量５００ｋＤ（ＤＸＳ；Pharmacia, Sweden）の硫酸デキストランをリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）中に溶解し、下記表２４に記載するポリマーの濃度を有するアジュバント処方を形成した。
パート２：ワクチン処方の調製
実施例２６に記載したように調製したストックＡ／ブタ抗原溶液を１ｍｌ当たり５０μｇＨＡの最終濃度に調整した。
ついで、下記表２４に示す種々のワクチン処方を、上記したように調製したそれぞれのアジュバント処方の１容積と上記のストックＡ／ブタ抗原溶液の１容積を混合することにより得た。
実施例４において記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を以下の実験において対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
３６匹のメスマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Charles River, Germany）を入手し、１グループ当たり６検体の６個のグループに分け、実施例４において記載した方法にしたがって、表２１に示すワクチンで処置した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４において上記したように調製した。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ−産生細胞数の測定
エリスポット（ELISPOT）用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/ブタ株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表２４に示す。
0004344014.tif 000025
実施例２８
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/ブタＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４に記載したようにブチル-ＰＡＡを合成および調製して、表２５に示すブチル-ＰＡＡ濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
実施例２６に記載したように調製した貯蔵Ａ/ブタ抗原溶液を、１ｍｌあたり５０、１５０、および５００μｇＨＡの最終濃度に調節した。次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、上記の各貯蔵Ａ/ブタ抗原溶液１容量と混合することにより、表２５に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
３６匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる６グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表２５に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/ブタ株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表２５に示す。
0004344014.tif 000026
実施例２９
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/ブタＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４に記載したようにブチル-ＰＡＡを合成および調製して、表２６に示す様々な濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例２６に記載したように調製した貯蔵Ａ/ブタ抗原溶液１容量と混合することにより、表２６に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
２４匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる４グループに分割し、一般的な方法論に従って、表２６に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/ブタ株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表２６に示す。
0004344014.tif 000027
実施例３０
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡの効果
パート１：アジュバント処方および抗原処方の調製
実施例４に記載したようにブチル-ＰＡＡを合成および調製して、表２７に示す濃度を有するアジュバント処方を得た。
抗原調製物Ａ/テキサス：ワクチン（Vaccine）, 12, 653-660（1994）に記載されているように、インフルエンザウイルスＡ/テキサス株（テキサス）を胚形成卵中で増殖させ、スクロース勾配による遠心分離で精製し、０．０５％（ｖ/ｖ）β-プロピオラクトンおよび０．０１％（ｗ/ｖ）チメロサールと共に、４℃で４日間、引き続いて室温で３日間、インキュベーションすることにより不活化した。界面活性剤を用いて、これらのウイルスから、そのヘマグルチニン/ノイラミニダーゼ（ＨＡ/ＮＡ）サブユニットを単離した。１ｍｌあたり２５０μｇＨＡの抗原貯蔵溶液を調製した。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、上記のように調製した貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表２７に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
１２匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる２グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表２７に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表２７に示す。
0004344014.tif 000028
実施例３１
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡの効果
実施例３０の実験を繰返した。結果を下記表２８に示す。
0004344014.tif 000029
実施例３２
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４および２１に記載したようにブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＳ）を各々合成し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）に溶解して、表２９に示す濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例３０に記載したように調製した貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表２９に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
２４匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる４グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表２９に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表２９に示す。
0004344014.tif 000030
実施例３３
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーの効果
アジュバント処方の調製
２つのｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーアジュバント処方を用いて、実施例３２を繰返した。結果を下記表３０に示す。
0004344014.tif 000031
実施例３４
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡ、硫酸デキストラン（ＤＸＳ）およびポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４、２２、２４および２７に記載したように、ブチル-ＰＡＡ、ｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）、ＰＳＳ、およびＤＸＳを各々合成し、表３１に示す濃度を有するアジュバントを得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例３０に記載したように調製した貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表３１に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
２４匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる４グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表３１に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表３１に示す。
0004344014.tif 000032
実施例３５
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよび様々なｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４および２３に記載したようにブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーを合成して、表３２に示す濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例３０に記載したように調製した各貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表３２に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
４８匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる６グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表３２に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表３２に示す。
0004344014.tif 000033
実施例３６
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよび様々なｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４および２３に記載したようにブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマーを合成して、表３３に示す濃度を有するアジュバント処方を得た。実施例２３に記載したように合成および精製したｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマー＃１２、＃１３、および＃１６の２つの画分（分子量１０〜１００ｋＤおよび＞１００ｋＤ）を、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）に溶解して、表３３に示すｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）アジュバント濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例３０に記載したように調製した各貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表３３に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
４８匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる６グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表３３に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表３３に示す。
0004344014.tif 000034
実施例３７
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマー＃５の効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４および２２に記載したようにブチル-ＰＡＡおよびｐ（Ａ-ｃ-ＶＢＳ）コポリマー＃５を合成および調製して、表３４に示す濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、実施例３０に記載したように調製した各貯蔵Ａ/テキサス抗原溶液１容量と混合することにより、表３４に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
１８匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる３グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表３４に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表３４に示す。
0004344014.tif 000035
実施例３８
肺細胞懸濁液中における抗-Ａ/テキサスＩｇＡ-産生細胞数に対するブチル-ＰＡＡおよびＣＴＢの効果
パート１：アジュバント処方の調製
実施例４に記載したように合成したブチル-ＰＡＡを、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）に溶解して、表３５に示すアジュバント処方を得た。ＣＴＢをリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）に溶解して、表３４に示すＣＴＢ濃度を有するアジュバント処方を得た。
パート２：ワクチン処方の調製
次いで、上記のように調製した各アジュバント処方１容量を、貯蔵抗原溶液１容量と混合することにより、表３５に示す様々なワクチン処方を調製した。実施例４に記載したように調製したリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．５）を下記実験の対照として用いた。
パート３：検体の免疫化
１８匹の雌マウス（ＢＡＬＢ/ｃ、チャールズ・リバー（Charles River）、ドイツ）を入手し、１グループあたり６検体からなる３グループに分割し、実施例４の一般的な方法論に従って、表３５に示すワクチンで処理した。
パート４：細胞懸濁液の調製
実施例４に記載したのと同様。
パート５：細胞懸濁液中における抗原特異的ＩｇＡ-産生細胞数の測定
エリスポット用として、実施例４に記載したコーティング緩衝液１ｍｌあたり５０μｇのインフルエンザＡ/テキサス株でプレートをコートしたこと以外は、実施例４に記載したの同様。結果を下記表３５に示す。
0004344014.tif 000036