(57)【要約】  本発明は、多孔質固体担体及び該固体担体に共有結合した複数のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ポリマー鎖を含む分離マトリックスについて開示する。ポリビニルピロリドンポリマー鎖は、ビニルピロリドンホモポリマー鎖又は７０モル％以上のビニルピロリドンモノマー残基及び２モル％未満の負荷電モノマー残基を含むコポリマー鎖のいずれかである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質固体担体と該固体担体に共有結合した複数のポリビニルピロリドンポリマー鎖とを含む分離マトリックスであって、ポリビニルピロリドンポリマー鎖がビニルピロリドンホモポリマー鎖又は７０モル％以上のビニルピロリドンモノマー残基及び２モル％未満の負荷電モノマー残基を含むコポリマー鎖である、分離マトリックス。
【請求項２】
ポリビニルピロリドンポリマー鎖が１モル％未満の負荷電モノマー残基を含む、請求項１に記載の分離マトリックス。
【請求項３】
ポリビニルピロリドンポリマー鎖が３０モル％以下の正荷電モノマー残基を含む、請求項１又は請求項２に記載の分離マトリックス。
【請求項４】
多孔質固体担体が、粒子、例えば平均粒径１０〜５００μｍを有する粒子を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項５】
多孔質固体担体がポロシティ８０〜９８％、例えば９０〜９８％を有する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項６】
多孔質固体担体が、スチレンポリマー、メタクリレートポリマー、ビニルエーテルポリマー、ビニルアルコールポリマー及び多糖類からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項７】
多孔質固体担体が、アガロース、寒天、セルロース及びデキストランからなる群から選択される多糖類を含む、請求項６に記載の分離マトリックス。
【請求項８】
複数のポリビニルピロリドンポリマー鎖が、単一の連結部分を介して固体担体に各々共有結合で連結される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項９】
単一の連結部分がエーテル連結Ｃ3鎖を含む、請求項８に記載の分離マトリックス。
【請求項１０】
１ｍｌマトリックス当たり０．５〜４．０μｍｏｌ、例えば０．７〜３．０μｍｏｌのビニルピロリドンモノマー残基を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項１１】
１ｇ乾燥マトリックス当たり０．５０〜０．８０ｇのポリビニルピロリドンポリマーを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項１２】
１ｍｌマトリックス当たり１００〜２００ｍｇ、例えば１２０〜１８０ｍｇのポリビニルピロリドンポリマーを含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項１３】
５μｇ未満／ｇの炭素浸出物を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
【請求項１４】
ａ）多孔質固体担体と該固体担体に共有結合した複数のポリビニルピロリドンポリマー鎖とを含む分離マトリックスであって、ポリビニルピロリドンポリマー鎖がビニルピロリドンホモポリマー鎖又は７０モル％以上のビニルピロリドンモノマー残基を含むコポリマー鎖である分離マトリックスが充填されたカラムを用意するステップと、ｂ）飲料を前記カラムに流し、カラムのフロースルーを安定化飲料として回収するステップを含む、醸造酒の安定化方法。
【請求項１５】
分離マトリックスが請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載したものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｃ）カラムを再生液で再生するステップ、及びｄ）ステップａ）〜ｃ）を２回以上、例えば１０回以上又は５０回以上繰り返すステップをさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
再生液が、ＮａＯＨ、例えば、０．１Ｍ以上のＮａＯＨ又は０．１〜２ＭのＮａＯＨを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）において、カラム内の飲料の滞留時間が２分以下、例えば１分以下である、請求項１４乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
醸造酒がビールである、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）において、安定化飲料が、カラムに流す前の飲料のチルヘイズの２５％未満のチルヘイズを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）５μｍｏｌ／ｍｌ以上のラジカル反応性部分を含む多孔質固体担体を用意するステップ、ｂ）担体と、モノマー組成物の７０％以上のモノマーがＮ−ビニルピロリドンであるモノマー組成物とを接触させるステップ、ｃ）ラジカル重合を開始して、担体にポリビニルピロリドンポリマー鎖が共有結合したマトリックスを形成するステップ、並びにｄ）マトリックスを洗浄するステップを含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載の分離マトリックスの製造方法。
【請求項２２】
ラジカル反応性部分がＣ＝Ｃ二重結合である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップａ）が、ｉ）ジビニルベンゼンコポリマー担体を用意するステップ、或いはｉｉ）ヒドロキシ官能性担体をアリルハライド又はアリルグリシジルエーテルと反応させるステップを含む、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｃ）が、Ｎ−ビニルピロリドン及び０．０５〜３ｍｏｌ／ｌの塩、例えば０．１〜２Ｍの硫酸ナトリウムを含む水溶液中に懸濁した担体を用いて実施される、請求項２１乃至請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲料の安定化及び特に醸造酒の安定化のための分離マトリックスに関する。本発明は、飲料を安定化する方法及び醸造酒の安定化のための分離マトリックスの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール及びワインのような醸造酒において、濁り活性（ＨＡ）化合物の沈殿／凝集のため保存中に不都合な濁りが生じることがある。これらの化合物には、ＨＡポリフェノール及びＨＡポリペプチド並びにそれらの複合反応生成物が含まれる。飲料のコロイド安定性を高め、それらの保存期間を向上させるために、飲料を処理してＨＡ化合物の濃度を低下させることができるが、これはビール又はワインの安定化と呼ばれることが多い。
【０００３】
コロイド性の濁りの安定性を改善するためにビール及びワインを清澄化するための技術がいくつか存在する。濁り前駆物質を除去する最も一般的な方法は、シリカヒドロゲル（ＳＨＧ）及び／又は架橋ポリビニルピロリドン粒子（ポリビニルポリピロリドン又はＰＶＰＰ）を未安定化ビールに添加することである。典型的な添加量は１５〜４０ｇＰＶＰＰ／ｈｌ及び約５０ｇＳＨＧ／ｈｌである（ＣＷ  Ｂａｍｆｏｒｔｈ：Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｂｒｅｗ  Ｃｈｅｍ  ５７（３）、８１〜９０，１９９９）。ＳＨＧは濁り活性ポリペプチドを減少させるためのものであり、ＰＶＰＰはポリフェノールを減少させるためのものである。ＳＨＧ及びＰＶＰＰは共に微粒子の形態で飲料に添加され、しかる後に濾過により除去される。伝統的に、濾過ケークは廃棄されてきたが、例えば国際公開第２０１２／０１１８０８号に記載のように、分離再生設備におけるＰＶＰＰ粒子の再生も提唱されてきた。しかし、その再生には複雑な操作及び追加の装置のためのスペースが必要とされる。
【０００４】
米国特許第６００１４０６号明細書には、イオン交換体、特に水不溶性多孔質親水性マトリックスにイオン子交換基を共有結合したものを用いた飲料安定化法が記載されている。かかる系は、Ｈａｎｄｔｍａｎｎ  Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｋ社及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社からＣｏｍｂｉｎｅｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＳＳ）という商品名で市販されており、正荷電架橋アガロースビーズを充填ベッドカラムに使用する。このビーズは安定化及び再生サイクルの両期間中カラム内に残ったままであり、余分な操作なしで数年間再使用できる。
【０００５】
プロセス効率及び飲料安定化に対する要件の増大に伴って、ＨＡ化合物に対する結合能が向上した吸着材に対するニーズが存在している。米国特許第８１３７５５９号には、このニーズを達成するためアガロースビーズ上のジエチレングリコール系リガンドを用いた試みが記載されているが、向上した安定性をもたらし、再生前に安定化できる飲料の量を増やすことのできる吸着材に対するニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６００１４０６号
【特許文献２】米国特許第８１３７５５９号
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様では、醸造酒中のＨＡ化合物の結合能が向上した分離マトリックスを提供する。これは請求項１に記載の分離マトリックスを用いて達成される。
【０００８】
１つの利点は、本分離マトリックスが、先行技術のマトリックスと比較して醸造酒の濁り安定性を改善できることである。追加の利点は、本分離マトリックスが充填ベッドで使用及び再生できること、食品安全性又は食品純度に関して懸念される浸出物を生成しないこと並びにマトリックスの製造が容易なことである。
【０００９】
本発明の第２の態様では、マトリックスに対する飲料のローディング量を増やすことのできる醸造酒の安定化方法を提供する。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。
【００１０】
本発明の第３の態様では、醸造酒中のＨＡ化合物に対する結合能が向上した分離マトリックスの製造方法を提供する。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。
【００１１】
本発明のその他の好適な実施形態は従属項に記載される。
【００１２】
定義
本明細書において「ビニルピロリドン」は１−ビニル−２−ピロリドン（ＣＡＳ８８−１２−０）を意味し、Ｎ−ビニルピロリドンとしても知られている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＶＰ鎖に対する単一の連結部分の具体例であり、ａ）はアリル基に由来し、ｂ）はチオール基に由来する。Ｓは担体である。
【図２】本発明のグラフト方法を示す図であり、まずヒドロキシ官能性担体をアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）と反応させ、次いでビニルピロリドン（ＶＰ）をアリル官能性担体にグラフトする。
【図３】ＣＳＳ吸着材アニオン交換マトリックスについての典型的な安定化曲線を示す図。
【図４】小規模ビール安定性試験の配置を示す図。
【図５】ＥＢＣチルヘイズ法で得られた典型的な出力データを示す図。
【図６】未安定化ビール、対照で安定化したビール及び本発明の３種類の試作品で安定化したビールにおけるタンノイド含有量を示す図。
【図７】チルヘイズ分析に関して正規化した結果を示すグラフである。３つのグラフは、３つの異なる日に製造した３つのバッチの新鮮なビールに関する。
【図８】試作品に関する総ポリフェノール減少を示す図。
【図９】総ポリフェノール減少とチルヘイズとの相関関係を示す図。
【図１０】選択された実験について反応温度曲線を示す図。３１１：５５℃  １．９％開始剤；３５４：５５℃  １．０％開始剤；３７４：４５℃  １．０％開始剤；３９２：３５℃１．０％開始剤；４９３：４５℃  １．０％開始剤、１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一態様では、本発明は、多孔質固体担体及び固体担体に共有結合した複数のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ポリマー鎖を含む分離マトリックスについて開示する。ポリビニルピロリドンポリマー鎖はビニルピロリドンホモポリマー鎖又は７０モル％以上のビニルピロリドンモノマー残基と２モル％未満又は１モル％未満の負荷電モノマー残基とを含むコポリマー鎖である。負電荷は、大半が負に荷電したＨＡ化合物を寄せ付けず、マトリックスの性能を低下させる。ポリビニルピロリドンポリマー鎖が負荷電モノマー残基を含んでいないと、有利なことがある。好適には、モビリティを高め、ＨＡ化合物へのアクセシビリティーを与えるため、ポリビニルピロリドンポリマー鎖は架橋されていない。
【００１５】
ある実施形態では、ポリビニルピロリドンポリマー鎖は、３０モル％以下の正荷電モノマー残基を含む。正電荷は、負荷電ＨＡ化合物との有利な追加の相互作用をもたらす。正荷電モノマー残基は、ビニルピロリドンとコモノマー、例えば、ジアリルメチルアンモニウムクロリド（ＤＡＤＭＡＣ）、３−（メタクリロイルアミノ）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＭＡＰＴＡＣ）、２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウムクロリド、ビニルピリジンなどとのグラフト共重合によって導入することができる。
【００１６】
ポリビニルピロリドンポリマー鎖は、代替的にもしくは追加として、非ビニルピロリドンの非荷電モノマー残基を含んでいてもよい。かかる残基は、特にこれらが疎水性部分及び／又は水素結合部分を含有する場合、鎖とＨＡとの相互作用を好ましい方法で調節し得る。これらの目的のために使用し得るモノマーの具体例としては、例えばＮ−ビニルカプロラクタム、スチレン、アルキルビニルエーテル（疎水性）及び例えばＰＥＧ−モノメタクリレート、ＰＥＧモノビニルエーテル、ＰＥＧモノアリルエーテル、ヒドロキシアルキルビニルエーテル、アリルアルコール（水素結合）が挙げられる。非荷電コモノマーだけを使用する場合、その量は３０モル％以下であり、非荷電及び正荷電コモノマーの組合せを使用する場合、その合計量は３０モル％以下である。
【００１７】
ある実施形態では、固体担体は、ポリビニルピロリドンポリマー鎖の一部ではない正荷電部分を含んでいてもよい。かかる部分は、例えば、担体（例えば、寒天又はアガロースなどの多糖類担体）上のヒドロキシル基と、正荷電試薬とを反応させることによって導入することができる。かかる試薬の例としては、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド及びジエチルアミノエチルクロリドが挙げられる。
【００１８】
ある実施形態では、多孔質固体担体は、粒子、例えば（体積加重）平均粒径１０〜５００μｍを有する粒子を含む。粒径の大きな粒子は充填ベッドでの低い背圧をもたらし、この目的に照らすと、粒子が１５０〜５００μｍ、例えば２００〜４００μｍの平均粒径を有していると有利である。粒子は好適には球形又は実質的に球形であり、充填が容易になる。
【００１９】
ある実施形態では、多孔質固体担体は、８０〜９８％、例えば９０〜９８％のポロシティを有する。ポロシティが高いと、担体は細孔を塞がずに大量のポリビニルピロリドンポリマー鎖を保有できるので、有利である。ポロシティは、担体中の細孔の体積分率として定義され、蒸留水で平衡化した担体の固体含有量を測定することによって簡便に測定し得る。モノリシック又はメンブレンの形状の担体では、水で平衡化した担体から過剰な水を除去し、秤量し、次いでオーブン内で例えば１００℃で乾燥し、再度秤量する。細孔の体積分率は、細孔壁材料の密度の推定値を用いて計算できる。粒子形状の担体については、ガラスフィルターで粒子の濾過ケークが得られるまで穏やかな真空吸引によって過剰な水を除く。過剰の水が除去されるのは、水位が濾過ケークの上面よりも下がって濾過ケークに最初の亀裂が生じた時である。濾過ケークでの蒸発を避けるため、それ以上吸引は避けるべきである。濾過ケークの試料を秤量し、乾燥して、細孔壁材料の密度の推定値を用いて湿潤（ｍwet）及び乾燥（ｍdry）の重量からポロシティを計算する。典型的な細孔壁材料の密度（ρmat）は、アガロース１．５ｇ／ｃｍ3、スチレン−ジビニルベンゼン１．１ｇ／ｃｍ3、メタクリレートポリマー１．１５ｇ／ｃｍ3、ポリビニルアルコール１．２ｇ／ｃｍ3、シリカ２．２ｇ／ｃｍ3である。体積％単位のポロシティ（ｐ）は、ｐ＝１００×（（ｍwet−ｍdry）／ρH2O）／（（ｍwet−ｍdry）／ρH2O＋ｍdry／ρmat)として計算することができ、式中、ρH2Oは問題とする温度での水の密度であり、典型的には１．０ｇ／ｃｍ3である。
【００２０】
或いは、担体の細孔構造は、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって特徴付けることができ、その場合にはＫａｖ値が得られる。Ｋａｖ値は、あるサイズのプローブ分子にアクセスできる担体の体積分率の尺度である。典型的にはサイズの明確なタンパク質分子がプローブ分子として使用されるが、デキストランフラクションをプローブ分子として使用することもできる。Ｋａｖ値の測定及び計算の詳細は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｐ．１０〜１１に記載されており、その記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。ある実施形態では、担体でのヒト血清アルブミン（Ｍｗ６７ｋＤａ）に対するＫａｖは０．４以上、例えば０．５以上又は０．５〜０．９である。
【００２１】
ある実施形態では、多孔質固体担体は、スチレンポリマー、メタクリレートポリマー、ビニルエーテルポリマー、ビニルアルコールポリマー及び多糖類からなる群から選択される。
【００２２】
ある実施形態では、多孔質固体担体は、アガロース、寒天、セルロース又はデキストランからなる群から選択される多糖類を含む。多糖類は親水性であり、飲料中の化合物との疎水性相互作用による汚損（ファウリング）のリスクが最小限となる。アガロース及び寒天は、熱ゲル化によって、高いポロシティ（例えば、ポロシティ９０〜９８％）の高剛性ヒドロゲルの形態に容易に調製できる。これら２者のうち、アガロースは、高価ではあるが、本質的に負電荷を含んでいないという利点を有する。寒天を使用する場合、加水分解性の負荷電基を除去するため、アルカリで処理するのが有利である。多糖類担体に含まれる負荷電酸性基の量は、好適には、１ｍｌ当たり１０μｍｏｌ未満又は５μｍｏｌ未満である。この含有量は、カチオン交換体の分野で周知の滴定法によって求めることができる。
【００２３】
担体は、エクステンダー（担体の細孔表面に結合したポリマー）をさらに含んでいてもよい。エクステンダーは、例えば、ヒドロキシ官能性ポリマー、特にデキストランのような多糖類であってよく、これらは共有結合により担体のヒドロキシル基に結合させることができる。具体例は、エピクロルヒドリン又はジエポキシドを用いてエポキシ活性化しておいた寒天／アガロースのヒドロキシルにデキストランポリマーを結合させた寒天又はアガロースビーズである。エクステンダーは、好適には、マトリックスのアルカリ再生条件下で安定なエーテル基を含むリンカー構造によって結合させることができる。エクステンダーは、ＨＡ化合物とＰＶＰ鎖との相互作用を促進するとともに、物質移動速度を高めることができる。
【００２４】
ある実施形態では、複数のポリビニルピロリドンポリマー鎖が、単一の連結部分を介して固体担体に各々共有結合で連結している。単一の連結部分としては、例えば、図１ａ）に例示した−Ｏ−ＣＨ2ＣＨＣＨ2−又は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨＣＨ2−などのエーテル結合Ｃ3鎖を含むものがある。かかる連結部分は、担体のヒドロキシル基をアリルハライド又はアリルグリシジルエーテルと反応させ、担体の存在下でビニルピロリドンを重合することによって得ることができる。重合がアリル基を介して進行すると、２つのポリビニルピロリドンポリマー鎖末端が同じ連結部分を介して連結する。この場合、１本の鎖が２つの隣接アリル基を介して重合できるほどアリル密度が十分に高ければ、マトリックスは２つの連結部分で連結した数本のポリビニルピロリドンポリマー鎖をさらに含むこともある。単一連結部分は、図１ｂ）に例示したチオエーテル結合を含んでいてもよい。この場合、チオール基は担体に導入されており、それらはビニルピロリドンの重合において連鎖移動剤として作用する。複数箇所での結合とは対照的に、単一連結部分による連結はポリマー鎖のモビリティを向上させ、これらのＨＡ化合物へのアクセシビリティー及びＨＡ化合物との相互作用を向上させる。
【００２５】
ある実施形態では、マトリックスは１ｍｌマトリックス当たり０．５０〜４．０μｍｏｌ、例えば０．７０〜３．０μｍｏｌ又は１．０〜３．０μｍｏｌのビニルピロリドンモノマー残基を含む。ビニルピロリドンモノマー残基の含有量は、分光学的（例えばＮＭＲ又はＦＴＩＲ）又は例えば窒素元素分析によって求めることができ、窒素元素分析では正荷電モノマーを介して導入された窒素を滴定して、全窒素から減算すればよい。高いビニルピロリドンモノマー残基含有量は、結合能及び処理飲料の安定性の両面で有利である。
【００２６】
ある実施形態では、マトリックスは１ｇ乾燥マトリックス当たり０．５０〜０．８０ｇ、例えば０．６０〜０．８０ｇのポリビニルピロリドンポリマーを含む。或いは、マトリックスは１ｍｌの水気をきったマトリックス当たり１００〜２００ｍｇ、例えば１２０〜１８０ｍｇのポリビニルピロリドンポリマーを含む。
【００２７】
高いポリビニルピロリドンポリマー含有量は、結合能及び処理飲料の安定性の両面で有利である。高いポリビニルピロリドンポリマー含有量は、上述の高ポロシティとの組合せにより特に有利である。しかし過度に高いポリビニルピロリドンポリマー含有量は、マトリックスの物質移動及び／又は機械的性質に悪影響を与え得る。
【００２８】
ある実施形態では、マトリックスに含まれる炭素進出物は、１ｇ乾燥マトリックス当たり５μｇ未満（例えば２μｇ未満又は１μｇ未満）である。低い浸出物含有量は、使用前にマトリックスを丁寧に洗浄すること、それ自体浸出物含有量が低い担体材料を使用することによって達成できる。炭素浸出物の量は、Ｍ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（１），４７〜５５，１９９８に記載された方法で適切に決定することができ、この方法では、１０ｍｌの水膨潤マトリックスを５０ｍｌの高純度水中で１週間インキュベートし、上清の全有機炭素（ＴＯＣ）含有量を求める。食品安全性の観点からだけでなく、特定の国におけるビールに関する純度規制の点からも、浸出物／抽出物含有量を最小限にするのが有利である。
【００２９】
ポリ（ビニルピロリドン）（以下、ＰＶＰと略す）は、図１に示すようなグラフト反応順序で結合させることができる。
１．アリル化．このステップでアリル基が導入される。アリルグリシジルエーテル又はアリルハライドを、アルカリ条件下でヒドロキシル官能性ベースマトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓなどの架橋アガロースベースマトリックス）に結合させる。
２．ＰＶＰのグラフト．ビニルピロリドン（ＶＰ）及びラジカル開始剤（例えばＡＤＢＡ）をアリル化粒子を含有する水溶液に溶解する。純水又は塩水溶液（例えば硫酸ナトリウム）を反応溶媒の候補として挙げられる。混合物を加熱すると、開始剤が分解してフリーラジカルが生じ、ビニルピロリドンの重合を開始する。成長ＰＶＰ鎖は、粒子上のアリル基とも反応して、ＰＶＰ鎖が粒子に共有結合する。
【００３０】
ＰＶＰ鎖の精密な構造、例えば分子量、分子量分布及びアリル基の消費量は詳細には知られていない。
【００３１】
測定することのできる主なパラメーターは、グラフト反応前後の１ｍＬゲルの乾燥重量（固体含有量）である。こうして、結合ＰＶＰ量をｍｇ／ｍＬで計算することができる。
【００３２】
他のパラメーター、例えば、ＰＶＰ／アリル基平均量（平均鎖長の指標となる）又は構造中のＰＶＰ％も計算することができる。
【００３３】
以下のパラメーターは、ＰＶＰ結合量に影響を与えると考えられる。
・反応混合物中のＶＰ濃度。
・開始剤濃度
・重合温度
・粒子に結合したアリル基の量
・開始剤の種類
・反応溶媒
・粒子のスラリー濃度（アリル化粒子の量）
・ベースマトリックスのパラメーター（粒径、細孔径分布、乾燥重量）。
【００３４】
ＶＰの重合は発熱反応である。潜在的温度上昇は、反応速度、全熱量及び存在する反応溶媒がどれだけ熱を吸収するか（すなわち、溶媒の熱容量）によって影響される。
【００３５】
発生する全熱量は、主にＶＰの使用量によって左右されるが、反応速度は単位時間当たりの発熱量を左右する。開始剤濃度及び反応温度は、反応速度に影響を与える主要なパラメーターである。ｔｅｍｐ  ｌｏｇを、反応容器内の温度を継時的に追跡するのに使用することができる。
【００３６】
一態様では、本発明は、醸造酒、例えばビールを安定化する方法であって、以下のステップを含む方法について開示する。
ａ）多孔質固体担体と該固体担体に共有結合した複数のポリビニルピロリドンポリマー鎖とを含む分離マトリックスであって、ポリビニルピロリドンポリマー鎖がビニルピロリドンホモポリマー鎖又は７０モル％以上のビニルピロリドンモノマー残基を含むコポリマー鎖である分離マトリックスが充填されたカラムを用意するステップ。本分離マトリックスは、例えば上述の分離マトリックスであってよい。
ｂ）飲料を上記カラムに流し、カラムのフロースルーを安定化飲料として回収するステップ。ステップｂ）において、飲料のカラム内の滞留時間は２分以下、例えば１分以下又は１０秒〜１分である。滞留時間は、カラムのベッド高さ（ｃｍ）をカラムのベッドを通過する飲料の流速（ｃｍ／分）で除したものとして計算される。経済的理由から滞留時間は短いことが望ましく、本発明のマトリックスは十分に高い物質移動速度を有し、１分未満又は２分未満の滞留時間で十分な濁り安定性をもたらす。ステップｂ）において安定化飲料（ビール）のチルヘイズは、カラムの通過前の飲料のチルヘイズの２５％未満である。チルヘイズは、周知のＥＢＣ法（分析法番号３１．１）に従って適切に測定することができ、カラムへの滞留時間は１分未満、例えば１８秒である。
【００３７】
ある実施形態では、この方法は、
ｃ）カラムを再生液で再生するステップ、及び
ｄ）ステップａ）〜ｃ）を２回以上（例えば１０回以上、５０回以上又は５００回以上）繰り返すステップをさらに含む。これは、分離マトリックスを何回も再使用でき、プロセス全体の経済性の点で有益であるという利点を有する。
【００３８】
ある実施形態では、再生液は、ＮａＯＨ、例えば０．１Ｍ以上のＮａＯＨ又は０．１〜２ＭのＮａＯＨ、例えば約１ＭのＮａＯＨを含む。ＮａＯＨ溶液は、吸着された夾雑物を効率的に除去することができ、ＮａＯＨはさらに、飲料工業で容認された清澄化剤であり、清澄化後にｐＨを調製すれば有毒又は雑味成分は残らない。
【００３９】
第３の態様では、本発明は、上述の分離マトリックスの製造方法について開示する。この方法は以下のステップを含む。
ａ）５μｍｏｌ／ｍｌ以上のラジカル反応性部分を含む多孔質固体担体を用意するステップ。ラジカル反応性部分は、Ｃ＝Ｃ二重結合のような重合性部分、チオールのような連鎖移動部分であってよいし、或いは固定化された開始剤であってもよい。
ｂ）担体を、モノマー組成物の７０モル％以上のモノマーがＮ−ビニルピロリドンであって、モノマーの１モル％未満又は２モル％未満が負に荷電されているモノマー組成物と接触させるステップ。
ｃ）ラジカル重合を開始して、担体にポリビニルピロリドンポリマー鎖が共有結合したマトリックスを形成するステップ。
ｄ）マトリックスを洗浄するステップ。
【００４０】
ある実施形態では、ステップａ）は、ｉ）５μｍｏｌ／ｍｌ以上の残留二重結合を含むジビニルベンゼンコポリマー担体を用意するステップ、或いはｉｉ）ヒドロキシ官能性担体をアリルハライド又はアリルグリシジルエーテルと反応させるステップを含む。
【００４１】
ある実施形態では、ステップｃ）は、モノマー組成物及び０．０５〜３ｍｏｌ／ｌの塩（例えば０．１〜２Ｍの硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウム）を含む水溶液中に懸濁した担体を用いて実施される。塩水溶液を使用する利点は、塩水溶液が高い熱容量を有すること、及び特定の量のグラフトＰＶＰを得るのに必要なモノマー量を低減できることである。これらの要因は、発熱による熱の発生に起因する温度上昇を抑制できることを意味し、このプロセスのスケーラビリティにとって重要である。
【００４２】
アルコールチルヘイズ
Ｐｆｅｕｆｆｅｒ社によるアッセイ法の抜粋。欧州ビール醸造学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂｒｅｗｅｒｓ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）（ＥＢＣ）分析法３１．１
「大幅に過冷却されると、ビールは、ビールの状態に依存して、ポリフェノールタンパク質複合体の沈殿に起因する可逆的な濁度を示す。エタノールの添加はこの複合体の溶解度を低下させ、濁度の形成が加速させる。この低温試験は、迅速に実施することができ、ビールの推定長期濁度を予測できるようになる。ビールの安定化処理の直後であっても、この試験は、ビールの潜在的濁度及び安定化手段の有効性について正確な情報を与え、それらについて評価し必要に応じて変更することができる。」。
【００４３】
タンノイド
Ｐｆｅｕｆｆｅｒ社によるアッセイの抜粋。
【００４４】
「タンノイドは、ＰＶＰで沈殿し得るポリフェノールの量である。これらには低乃至中分子量ポリフェノール並びにカテキンのポリマー及びアントシアノーゲンがある。タンノイドはモルト及びホップに由来する。これらはビールには少量しか存在しないが、コロイド安定性及び香りの一貫性に関して非常に重要である。ビール、麦汁、オオムギ、モルト及びホップ抽出液中のタンノイド含有量は、ＰＶＰを用いた沈殿によって求めることができる。ＰＶＰはタンパク質様化合物であり、Ｈ−橋かけによってタンノイドに結合して、それらと不溶性複合体を形成し、濁度をもたらす。ＰＶＰ溶液を試料に連続敵に添加すると、濁度はすべてのタンノイド分子がＰＶＰに結合するまで増加する。さらにＰＶＰをバッチ処理すると、希釈のため濁度の増加につながる。濁度ピークに達するまでのＰＶＰの添加量は、タンノイド含有量に比例する。」。
【００４５】
総ポリフェノール
ＥＢＣ法９．１１によるアッセイの説明。総ポリフェノールアッセイは、すべてのポリフェノールを網羅する。総ポリフェノール＞２００ｍｇ／Ｌの高含有量のビールは安定化が困難であると考えられるが、総ポリフェノール＜１５０ｍｇ／ＬのビールはＰＶＰＰ処理を用いて比較的容易に安定化できる。総ポリフェノールの測定は、ビールポリフェノールを塩基性条件下でクエン酸鉄アンモニウムと反応させることによって行われる。鉄−ポリフェノール錯体は、ブランク溶液を対照として６００ｎｍの吸光度で測定される。
【実施例】
【００４６】
例１：グラフト研究
本研究の主な目的は、温度を制御して沸騰を避けることができ、適量のＰＶＰを結合させることのできる反応条件を見出すことであった。本研究では、以下の合成パラメーターが含まれていた。
・重合温度（３５〜５５℃で変更）
・開始剤濃度（１．０〜１．９％ｗ／ｗで変更）
・アリル基の量（８２〜１７０μｍｏｌ／ｍＬで変更）
・ＶＰ濃度（１０．０〜３９．２％ｗ／ｗで変更）
・スラリー濃度（１８．５〜３６．９％ｖ／ｗで変更）。
【００４７】
開始剤（ＡＤＢＡ）は水に容易に溶解し、適切な温度範囲で分解するので、開始剤の種類は全研究を通して一定に保った。
【００４８】
【表１】
2017500191.tif 000003
ゲルの量［ｍＬ］：
グラフトすべきゲルの量。
反応スラリー濃度［ｖ／ｗ］：
本パラメーターは、反応スラリーをどの程度濃縮すべきかについて決定する。値が高いほど、１ｍＬゲル当たりの反応溶液が少なくなる。
％ＶＰ＋開始剤［％ｗ／ｗ］：
本パラメーターは、活性物質であるＶＰ及び開始剤からなる反応懸濁液の重量％をどの程度にすべきかついて決定する。
開始剤濃度［％ｗ／ｗ］：
本パラメーターは、ＶＰの量に対して使用すべき開始剤の％量を決定する。
【００４９】
以下の典型的なレシピを参照されたい。
【００５０】
アリル化法（典型的レシピ）
（体積加重）平均粒径が２００μｍ（１００〜３００μｍの篩通過画分）で、エピクロルヒドリンで架橋した６％アガロースビーズをベースマトリックスとして使用した。
【００５１】
１００ｍＬのベースマトリックスゲルをガラスフィルター（孔径番号２）に移し、吸引乾燥した。次いで、ゲルを、２０００ｍＬの水で数回に分けて洗浄した。最終洗浄後、ゲルを吸引乾燥し、５００ｍＬの丸底フラスコに移し、水を合計重量８７．１４ｇまで加えた。９２．１６ｇの５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液を添加した。
【００５２】
丸底フラスコを、５０℃に保温した浴に取り付けて浸漬した。直径５ｃｍの二枚刃のスイングアウト式攪拌機を使用し、撹拌は３５０ｒｐｍに設定した。温度が５０℃に達したときに、３３．０ｇのアリルグリシジルエーテルを添加した。反応は１８時間放置した。次いで反応液を１１４．９８ｇの６０％酢酸で数回に分けて中和した。
【００５３】
ゲルを２０×ＧＶの水で洗浄し、次いで５×ＧＶのエタノール、再度２０×ＧＶの水及び最終的に３×ＧＶの２０％エタノール溶液で洗浄した。
【００５４】
アリル含有量を滴定して求めたところ、２３１μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００５５】
グラフト方法（典型的レシピ）、合成の詳細については表１参照
２８４．１ｇの無水硫酸ナトリウムをメスフラスコ内で最終体積２０００ｍＬになるように溶解することによって１．０Ｍの硫酸ナトリウムを調製した。
【００５６】
１００ｍＬのゲル＝２３４．０ｇのスラリーをフィルター（孔径番号２）に移し、吸引乾燥した。ゲルを、５０００ｍＬの水で数回に分けて洗浄した。次いでこのゲルを、３×１５０ｍＬの１．０Ｍ  硫酸ナトリウムで洗浄したが、これらの洗浄の合間には吸引乾燥した。
【００５７】
丸底フラスコを秤に乗せ、容器重量を測定した。「乾燥」ゲルをこの丸底フラスコに移し、１．０Ｍ硫酸ナトリウム溶液で全重量を２４４．７ｇに調整した。
【００５８】
２６．３ｇのビニルピロリドン及び０．２５ｇのＡＤＢＡを添加した。
【００５９】
丸底フラスコを取り付けた。５ｃｍのスイングアウト式二枚刃撹拌器を備えたオーバーヘッド攪拌機モーターを使用した。反応溶液に窒素ガスを（パスツールピペットで）約２５分間吹き込んだ。撹拌速度は２００ｒｐｍであった。
【００６０】
グリセロール浴は４５度に設定した。この温度に到達したら、丸底フラスコをグリセロール浴に浸漬して、反応を開始させた。
【００６１】
数時間後、水中ポリマーの懸濁液が形成され、ポリマー粒子は直径約２ｍｍであった。反応を一晩進行させた。約２００ｇの蒸留水を加え、反応溶液を希釈した。ポリマーの塊はなくなり、反応溶液は容易に濾別された。
【００６２】
このゲルを２０Ｌの蒸留水及び１Ｌの２０％エタノールで洗浄した。
【００６３】
グラフト反応後に乾燥重量を記録したところ、２６５ｍｇ／ｍＬであった。
【００６４】
乾燥重量測定
１２０℃に設定した乾燥重量秤を、すべての乾燥重量測定に使用した。乾燥重量測定には、１ｍＬのゲルを、１．０ｍｌの濾過ケークを収容するように設計されたＰＴＦＥトップを有するガラスフィルターから秤のアルミニウムカップに移した。
【００６５】
反応中に顕著な温度上昇がなく、あらゆる点で生産規模に適した１００〜２００ｍｇ／ｍＬの結合ＰＶＰを得るレシピを求めた。
【００６６】
【表２】
2017500191.tif 000004
第１の試作品である３１１は、１７０μｍｏｌ／ｍＬのアリル含有量を有していた。ＰＶＰの結合量は２１６ｍｇ／ｍＬであった。この一連の実験の合成設計は、良好と思われたが、発熱による沸騰が起きた。攪拌機にからみつく非常に粘稠な溶液が形成される。粘度は沸騰の発生と同時に増加した。しかし反応液は１回も吹きこぼれず、そのため一晩進行させた。
【００６７】
次の実験３５４は、開始剤の量を１．９％から１．０％に減らした。理論的には開始剤濃度が低いほど反応速度が低いはずであり、この理論によれば沸騰のリスクが低くなるはずである。しかし、実際にはそのようにはならず、沸騰は依然として起こった。ただし、沸騰の発生は１７分から２９分まで遅らせることができた。ＰＶＰの結合量は実際には２２７ｍｇ／ｍＬであり、３１１の２１６ｍｇ／ｍＬよりも高かった。開始剤濃度を１．０％に設定することが沸騰及びＰＶＰの結合量の両面でよい効果を有したので、後続の全実験では開始剤濃度を１．０％に設定した。しかし、このパラメーターは今後の実験でさらに最適化することができ、例えば開始剤濃度をさらに低くすることも興味深い検討課題である。
【００６８】
以下の２つの実験３７４及び３９２では、温度以外の全パラメーターを一定に保った。先行実験は５５℃で行ったが、３７４及び３９２ではそれぞれ４５℃及び３５℃を用いた。４５℃で行うと、沸騰は反応開始後５９分までさらに遅くなった。３５℃を用いると、沸騰は起こらなかった。これらの反応の温度プロファイルは、後続の実験から選んだ温度曲線と共に別表Ａに示す。４５℃では５５℃よりもＰＶＰの結合量がさらに増え、２７ｍｇ／ｍｌに対して２３８ｍｇ／ｍＬであった。４５℃での一段と制御された反応がＰＶＰの結合には好ましいと思われた。しかし、３５℃では、ＰＶＰの結合量が明らかに低下し、１３４ｍｇ／ｍＬしか結合しなかった。このように、反応温度は、沸騰の発生傾向及びＰＶＰの結合量に対して顕著な影響を有する。４５℃で大量のＰＶＰを結合させることができ、沸騰の発生傾向が５５℃よりも低いので、その後のすべての実験では４５℃を用いた。
【００６９】
沸騰を完全に避けるために、次の２つの実験では反応液中のＶＰの量を半分の１９．６％にした。アリル含有量の影響についてさらに検討した。すべての先行実験と同様に、４１０ではアリルレベルは１７０μｍｏｌであったが、４３１ではアリル含有量は８２μｍｏｌ／ｍＬであった。ＶＰ濃度を下げると沸騰は回避されたが、反応溶液は依然として非常に粘稠であり、攪拌機にまとわりついた。この問題は、生産性に優れるレシピを得るためにも解決しなければならない。
【００７０】
４１０では、ＰＶＰの結合量も３７４よりも明らかに少なく、２３８ｍｇ／ｍＬに対して１２０ｍｇ／ｍＬであった。ＶＰ濃度を半分に下げると、ＶＰの結合量の量が半分になったことは興味深い点である。アリル含有量の影響はあまり明白ではなかった。８２μｍｏｌ／ｍＬのアリルレベルを使用した４３１ではＰＶＰ結合量は１１３ｍｇ／ｍＬであったが、これに足しいてアリルレベルが２倍以上高い１７０μｍｏｌ／ｍＬの４１０ではＰＶＰ結合量は１２０ｍｇ／ｍＬであった。
【００７１】
反応溶液中１９．６％のＶＰでＰＶＰ結合量を増やすことができるか否かを確認するため、０．５Ｍ（４５８）及び１．０Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4（４７４）を反応溶媒として試した。０．５Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4を使用すると、ＰＶＰ結合量が増加し、４１０の１２０ｍｇ／ｍＬに対して４５８では１５４ｍｇ／ｍＬであった。硫酸ナトリウム濃度を１．０Ｍに高めると、ＰＶＰ結合量は格段に減少し、４７４ではわずか７９ｍｇ／ｍＬであった。ただし、いずれの合成でも反応溶液中でＰＶＰの顕著な沈殿が起こり、それによって効果的なカップリグが妨げられていた可能性がある。
【００７２】
次の実験４９３では、１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4を反応溶媒として維持しながら、沈殿を避けるためにＰＶＰの量をわずか１０％に減らしてみた。これは前途有望であることが判明した。この実験では１９２ｍｇ／ｍＬのＰＶＰが結合した。ポリマー粒子によるわずかな相分離が認められたが、反応完了後に水を添加すると、リマーの液滴は容易に溶解し、反応溶液は透明になった。この粒子はフィルター上で容易に洗浄できる。スケールアップに際してはポリマー液滴を観察下において容易に溶解できることを確認しなければならない。
【００７３】
５１８では高いＶＰ／粒子比（すなわち、低い反応スラリー濃度）を試したが、それ以外のすべての点では４９３と同じグラフトレシピを用いた。使用した粒子の量は、他のすべての合成では１００ｍＬであったのに対して、５１８では５０ｍＬであった。こうするとＰＶＰ量がさらに増大すると思われたが、そうではなく、このレシピで結合したＰＶＰは減り、４９３で１９４ｍｇ／ｍＬであったのに対して、５１８では１１６ｍｇ／ｍＬであった。
【００７４】
５３８は４９３の再現実験であり、このレシピがロバストであることが確認された。５３８ではＰＶＰ結合量が１９４ｍｇ／ｍＬであり、４９３の１９２ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ結果が得られた。
【００７５】
最後の実験の７９６は、最適化されたグラフトレシピについてのアリル含有量の影響を確認するために行った。４９３では１６６μｍｏｌ／ｍＬを使用したのに対して、７９６では８２μｍｏｌ／ｍＬのアリルレベルを使用した。これはＰＶＰ結合量の減少をもたらし、４９３の１９２ｍｇ／ｍＬに対して、１６５ｍｇ／ｍＬであった。ただし、アリルレベルの影響は大きくはない。
・沸騰は、１９．６％以下のＶＰを使用した実験で避けることができる。
・温度は、ＰＶＰの結合量及び沸騰傾向に多大な影響を有する。３５℃を超える温度は、カップリング反応の効率を高める。
・ＶＰ＋開始剤の量は重要な合成パラメーターであり、ＰＶＰの結合量、沸騰傾向及び反応溶液の粘度に顕著な影響を与える。
・アリル含有量はＰＶＰの結合量に影響を与え、アリル含有量が高いほど、ＰＶＰの結合量も高い。ただし、この影響は大きくはない。アリル基の量を１６６から８２μｍｏｌ／ｍＬに下げても、ＰＶＰの結合量は１９２から１６５ｍｇ／ｍＬにしか減少しない。
・反応溶液に硫酸ナトリウムを使用すると、ＰＶＰの結合量に多大な好影響を与えるが、ＰＶＰの沈殿を避けることが条件とされる。
・沸騰、粘稠な反応溶液又はＰＶＰの沈殿は、１０％ＶＰに１．０Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4を併用する試作品４９３で避けることができた。これらの条件は、１９２ｍｇ／ｍＬのＰＶＰ結合量をもたらし、これは対照試作品９０１８でのＰＶＰ結合量１９９ｍｇ／ｍＬと同等である。この試作品は性能がよく、この試作品に使用した反応条件は、さらなる最適化の出発点として使用することができる。
【００７６】
表３に示す９０１８以外の試作品について、１ｍＬの試作品樹脂を充填したカラムに７５０ｍｌ未安定化ラガービールを流速３．３ｍＬ／分（滞留時間１８秒）、温度＜５℃で流すことによって評価した。フロースルービールを、「アルコールチルヘイズ」、「タンノイド」及び「総ポリフェノール」について分析し、未安定化ビール及び未安定化ビールをＣＳＳ吸着材（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ）で処理したものと比較した。３種類の最初の被験試作品ついてタンノイド含有量はゼロであり、タンノイドの破過（ブレイクスルー）の評価には１ｍＬカラムでさらに多量のビールを処理する必要があるので、タンノイド含有量アッセイは残りの試作品については行わなかった。ＣＳＳ吸着材処理後のビールには高レベルのタンノイドが認められたが、「タンノイド」アッセイがコロイド安定性と最も相関性の高いアッセイと考えられるので、試作品の効果が極めて優れていることが示されたことになる。
【００７７】
【表３】
2017500191.tif 000005
ビール安定化方法
カラムの充填：
各試作品及び対照品（ＣＳＳ吸着材  ロット１００３９０１９）をＴｒｉｃｏｒｎ５／１００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に２ｍＬ／分で充填した。ベッド高さは２ｍＬ／分で５．１±０．１ｃｍに調整し、１．０ｍＬ樹脂のベッド体積を得た。上端のアダプターを５．１ｃｍ標線の１ｍｍ下に調整し、カラムを２ｍＬ／分で５カラム体積の水で平衡化してから、ビールを処理した。
【００７８】
ビールの処理：
図４は、小規模ビール安定化処理の配置を示す図である。未安定化ビールの１８ＬのＣｏｒｎｅｌｉｕｓ瓶はＳｌｏｔｔｋａｌｌａｎｓ醸造所（スウェーデン、ウプサラ）から入手し、０℃のインキュベーターに３日間置いた。滅菌濾過された新鮮なビールは、安定な結果を得るために数日間元の状態にもどさなければならない。ビール瓶からのチューブを２つのポンプ及び４つのポンプヘッドに分け（Ｐ−９００ポンプ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）４種類の試作品を同時に動かせるようにした。ビールチューブから泡を取り除くのは不可能なので、実際の流速は較正しなければならない。全ポンプヘッドを４．０ｍＬ／分に設定して１０ｍＬメスフラスコに流し込み、メスフラスコの標線に達するまでの時間を記録したところ、すべてのポンプについてビールの実際の流速は３．３ｍＬ／分であと算出された。試作品を詰めた４つのカラムをインキュベーターに入れて、ポンプヘッドからのチューブをカラムに連結した。１０００ｍＬの回収ボトルをインキュベーター内の各カラムの後端に連結した。一連の試験の第１のカラムは、常にＣＳＳ吸着材ロット１００３９０１９を含む対照カラムとした。これらのビーズは１００〜３００μｍの範囲の粒径を有し、体積加重平均直径は２００μｍであり、第４級アンモニウム基含有量は０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ｍｌであった。７５０ｍＬのビールを流速３．３ｍＬ／分で各カラムに送液したが、この流速は滞留時間１８秒に相当し、通常のＣＳＳプロセスよりも約３倍速い。処理時間は３．７５時間であった。カラムに流したビールは１０００ｍＬの分析用ボトルに回収した。
【００７９】
アルコールチルヘイズ分析法
１０００ｍＬの回収ボトルからのビール試料を、ビール安定化処理後２０時間以内に分析した。Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ瓶からの第１の未安定化ビールを分析し、次いでＣＳＳ吸着材対照試料及び試作品を分析した。約２０ｍＬのビールを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、二酸化炭素を除くためチューブを短時間振盪した。ビールの泡が収まったら、ピペットで４×１．０ｍＬのビールを慎重にキュベットに採取した。ピペットで１２０μＬのエタノールを清澄なキュベットに加え、分析前にキュベットを５回慎重に上下逆さにして振った。キュベットとクーラーとの熱接触を増大させるため、０．６ｍＬのエチレングリコールをＴａｎｎｏｍｅｔｅｒのキュベットチャンバーに加えた。キュベットをキュベットチャンバーに配置して、アルコールチルヘイズ分析を開始した。キュベット内の試料を−５℃まで冷却し、試料を４０分間インキュベートした後濁度を測定した。約１０分以降、濁度は４０分間同じ濁度のままであることが判明したので、分析速度を高めるため、いくつかの試料については濁度は２０分後にモニターした。
【００８０】
アルコールチルヘイズは、ＥＢＣ単位の最終濁り値から初期濁り値を減じることによって算出した。図５参照。
【００８１】
タンノイド法
ガラス製潅流シリンジを０．４００ｇ／Ｌ  ＰＶＰ溶液で満たし、Ｔａｎｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｆｅｕｆｆｅｒ社（ドイツ））のホルダーに配置した。１０００ｍＬの回収ボトルからのビール試料を、ビール安定化処理後２０時間以内に分析した。Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ瓶からの第１の未安定化ビールを分析し、次いでＣＳＳ吸着材対照試料及び試作品を分析した。約２０ｍＬのビールを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、二酸化炭素を除くためチューブを短時間振盪した。ビールの泡が収まったら、ピペットで４×１．０ｍＬのビールを慎重にキュベットに移した。撹拌棒をキュベットのボトルに配置した。潅流シリンジからのＰＶＰ溶液によって、２５℃、５ｍＬ／時で、１００ｍｇ／Ｌ  ＰＶＰまで或いはタンノイドピークがその最大に達するまで試料を滴定し、タンノイド含有量をＴａｎｎｏｌａｂソフトウェアで自動的に計算した。
【００８２】
総ポリフェノール法
１０００ｍＬの回収ボトルからのビール試料を、ビール安定化処理後４時間以内に分析した。Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ瓶からの第１の未安定化ビールを分析し、次いでＣＳＳ吸着材対照試料及び試作品を分析した。約５０ｍＬのビールをＷｈａｔｍａｎ（商標）濾紙で濾過し、２００ｍＬのＥ−フラスコに回収した。ピペットで２×１０ｍＬのビールを２本の２５ｍＬメスフラスコに採取した。８ｍＬのＣＭＣ／ＥＤＴＡ溶液を両方のメスフラスコに添加した。５００μＬの鉄試薬を一方のフラスコだけに添加し、ピペットで５００μＬのアンモニア溶液を両方のメスフラスコに加えた。ＭｉｌｌｉＱ（商標）水をメスフラスコの標線まで加えた。フラスコを簡単に混合した。鉄試薬を含まないフラスコはブランク試料であった。１０ｃｍキュベットを用いて、１０分以降（６０分以内）に試料及びブランクの６００ｎｍ吸光度を測定した。フラスコ内の総ポリフェノール含有量は次式によって算出した。
【００８３】
ＴＰ＝（ＡS−ＡB）×８２０
式中、
ＴＰ＝総ポリフェノール（ｍｇ／Ｌ）
ＡS＝試料の吸光度（ＡＵ）
ＡB＝ブランクの吸光度（ＡＵ）。
【００８４】
総ポリフェノールの減少率は、試作品で処理したビール試料の総ポリフェノールを未安定化ビールの総ポリフェノールで除すことによって計算した。
【００８５】
未安定化ビールの物理的及び化学的性質は急速に変化するので、所要時間の２４時間以内に未安定化ビールで試験及び分析できるのは、３〜６種類の試作品と対照ＣＳＳ吸着材だけであった。そのため、１２種類の試作品は４セットのビール処理で試験した。
【００８６】
まず、試作品をタンノイド含有量アッセイで分析した。試験した最初の３種類の試作品はビール中のすべてのタンノイドと結合したので、それらのタンノイド結合能を評価するのは不可能であり、それ以降の試作品についてはアルコールチルヘイズ分析だけで評価した。ＰＶＰグラフトビーズに関しては、タンノイド容量の検討には媒体１ｍＬ当たりさらに大量のビールが必要とされる。しかし、ＣＳＳ吸着材ビーズはタンノイド含有量を６９．８ｍｇ／Ｌから３２．８ｍｇ／Ｌにしか減少させず、ＰＶＰグラフト試作品が、ＣＳＳ吸着材に比べて格段に多くのタンノイドと結合できることを示している。
【００８７】
図６は、タンノイド含有量の結果を示す。「Ｕｐｐｓａｌａ  １」というロットを使用した。
【００８８】
表４は、試作品に関するアルコールチルヘイズ分析の結果を示す。チルヘイズを正規化し、未安定化ビールと比較したチルヘイズの相対百分率を試作品について計算した。「Ｕｐｐｓａｌａ  １」というロットを使用した。
【００８９】
【表４】
2017500191.tif 000006
結果に顕著な差があるか否かを判定するためアッセイ間のバラツキを推定するために、４回行ったＣＳＳ吸着材の平均及び相対標準偏差について調べた。
Ｎ＝４
平均＝４２．１％
ＳＤ＝２．９％
ＲＳＤ＝６．９％。
【００９０】
表５及び図８は、総ポリフェノールの減少の結果を示す。総ポリフェノール減少率は、７５０ｍＬのビールフラクションについて測定し、さらに試作品がさらに総ポリフェノールを吸着し続けていた場合には、７５０ｍＬ後に回収された５０ｍＬのフラクションについて測定した。図６において、各試作品に関して第１のバーは７５０ｍＬのフラクションであり、第２のバーは５０ｍＬのフラクションである。「Ｕｐｐｓａｌａ  ２」というロットのビールを使用した。
【００９１】
【表５】
2017500191.tif 000007
−すべての試作品は、７５０ｍＬのビール／ｍＬ媒体の現行のＣＳＳ吸着材処理と略同一のビール処理設定を用いて、ＣＳＳ吸着材よりも低いチルヘイズを示した。
−２つの試作品は、他の試作品とは大きく異なっていた。３９２で処理したビールはチルヘイズを全く示さず、４７４は他の試作品よりも顕著に高いチルヘイズを示した。
−他のすべての試作品で処理したビールは１．４〜４．４ＥＢＣ単位のチルヘイズを示し、これらは区別が困難である。
−すべての試作品は、ＣＳＳ吸着材よりも高い総ポリフェノール減少率を示した。試作品４７４は、他の試作品よりも総ポリフェノール減少率が低かった。
【００９２】
なお、アルコールチルヘイズアッセイは、０℃以上及び低アルコール含有量ではポリペプチドを架橋できない単純な単量体フラバノールも含む。これらのフラバノールも重合できないが、これらのポリフェノールの酸化生成物が安定であるからである。３１１、３７４及び４３１で処理したビールはタンノイド含有量はゼロであったが、チルヘイズには２．８〜４．４ＥＢＣ単位の差があった。これは主に単量体フラバノールに対する結合の選択性が試作品間で異なることによる。
【００９３】
試作品の設計面から、ビール処理の結果が合成に用いたパラメーターとどのように関係しているかを判断するため、試作品３９２（チルヘイズが観察されなかった）及び４７４（チルヘイズ含有量が比較的高い）を除いて相関は概して存在しない。３９２は、他の試作品よりも１０〜２０℃低い３５℃で合成した唯一の試作品である。高い温度でのリガンド合成がＰＶＰポリマーの順応性に影響を与え、低い温度ではポリマーの柔軟性が高まって数個のヒドロキシル基しか露出されていない低分子量ポリフェノールとも結合できるようになる推量される。４７４は、他の試作品よりもリガンド密度が大幅に低く、処理中に複雑なポリフェノールの破過が起きた。図８は、総ポリフェノールとチルヘイズとの相関関係を示す。この図から、＞１００ｍｇＰＶＰ／ｍＬ媒体の試作品の間で、低ＰＶＰ／ｍＬ媒体の試作品（４７４）及びＣＳＳ吸着材と比較してポリフェノール減少率の大きい試作品を識別することは簡単である。
【００９４】
例２：比較例
米国特許出願第２０１０００２８５０５号明細書及び米国特許第８１３７５５９号明細書に開示された方法に従って、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  ＦａｓｔＦｌｏｗ架橋アガロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をアリルグリシジルエーテルでアリル化し、１０ｇの湿潤アリル化ビーズを、４０ｇのジエチレングリコールビニルエーテル中の１．６ｇの２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）溶液と不活性雰囲気下７０℃で１８時間反応させることによって、ジエチレングリコールビニルエーテル（ＤＥＧＶＥ）をグラフトしたアガロースビーズ調製した。ビーズは次いで大量の水及びエタノールで洗浄した。グラフトＤＥＧＶＥの含有量を乾燥含有量の増加量から測定したところ、１ｍＬビーズ当たり０．７６ｍｍｏｌ  ＤＥＧＶＥモノマー残基であることが判明した。
【００９５】
ＤＥＧＶＥグラフト試作品及びＣＳＳ吸着材ビーズの試料の５ｍｌアリコートを、ＸＫ１６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に充填し、１０００ｍｌの濾過未安定化ビールを流速１３ｍｌ／分で送液した。カラム通過前後のチルヘイズを測定したところ、チルヘイズの減少率はＤＥＧＶＥ試作品とＣＳＳ吸着材とでほぼ同じであることが判明した。したがって、例１に示すＰＶＰグラフト試作品はＣＳＳ吸着材ビーズよりも格段に優れたヘイズ減少を示すので、これらはＤＥＧＶＥ試作品よりも優れている。
【００９６】
本明細書では、本発明を最良の形態を含めて開示するとともに、装置又はシステムの製造・使用及び方法の実施を始め、本発明を当業者が実施できるようにするため、例を用いて説明してきた。本発明の特許性を有する範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に自明な他の例も包含する。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言上の差のない構成要素を有しているか、或いは特許請求の範囲の文言と実質的な差のない均等な構成要素を有していれば、特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。本明細書で引用した特許及び特許出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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