(57)【要約】本発明は、例えば、溶媒に曝露されている表面上にイオン化可能な官能基を両方とも担持し、かつ治療剤を包含する、シクロデキストリンをカプセル化するリポソームを含むリポソーム組成物、ならびにその使用を提供する。本発明は、イオン化可能な官能基（例えば、それらの溶媒に曝露されている表面、例えば、リポソーム内相表面上の弱塩基性および／または弱酸性官能基）を担持しているシクロデキストリンが、治療剤（例えば、イオン化不能および／または疎水性の組成物）を高濃度で効率的にカプセル化することができ、かつ治療剤を含有する官能化シクロデキストリンそれ自体がリポソーム中に高濃度で効率的に遠隔的に充填されることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたとき、予想外に低減した毒性および増強された有効性特性を示すリポソーム組成物を生じさせるという発見に部分的に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリン、治療剤、およびリポソームを含むリポソーム組成物であって、前記リポソームは、イオン化可能な化学基で置き換えられている、前記リポソームの内相に向いている少なくとも１つのヒドロキシル化学基を有するシクロデキストリンをカプセル化しており、前記シクロデキストリンは、前記治療剤をカプセル化している、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位が、イオン化可能な化学基で置き換えられたＣ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基からなる群より選択される少なくとも１つのヒドロキシル化学基を有する、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位が、イオン化可能な化学基で置き換えられたＣ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基からなる群より選択される少なくとも２つのヒドロキシル化学基を有する、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
前記シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位の前記Ｃ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基が、イオン化可能な化学基で置き換えられている、請求項３に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
前記シクロデキストリンの前記少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位が、前記シクロデキストリンの２、３、４、５、６、７、８、およびすべてのα−Ｄ−グルコピラノシド単位からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
前記イオン化可能な化学基が、すべての置き換えられた位置で同じである、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
前記イオン化可能な化学基が、弱塩基性官能基または弱酸性官能基である、請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
前記弱塩基性官能基（Ｘ）が、ＣＨ３−Ｘによって６．５から８．５の間のｐＫａを有する、請求項７に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
前記弱酸性官能基（Ｙ）が、ＣＨ３−Ｙによって４．０から６．５の間のｐＫａを有する、請求項７に記載のリポソーム組成物。
【請求項１０】
前記弱塩基性官能基または前記弱酸性官能基が、アミノ官能基、エチレンジアミノ官能基、ジメチルエチレンジアミノ官能基、ジメチルアニリノ官能基、ジメチルナフチルアミノ官能基、スクシニル官能基、カルボキシル官能基、スルホニル官能基およびスルフェート官能基からなる群より選択される、請求項７に記載のリポソーム組成物。
【請求項１１】
前記シクロデキストリンが、４．０から８．５の間のｐＫａ１を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１２】
液体医薬製剤または固体医薬製剤である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１３】
前記治療剤が、中性に荷電しているか、または疎水性である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１４】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１５】
前記治療剤が、小分子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１６】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンからなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１７】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンである、請求項１６に記載のリポソーム組成物。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のリポソーム組成物、および使用するための指示書を含むキット。
【請求項１９】
がんを有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソーム組成物が、皮下または静脈内の注射によって投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／９２７，２３３号（これは、参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
権利についての声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与された助成金ＣＡ  ０４３４６０、ＣＡ  ０５７３４５およびＣＡ  ００６２９２４の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。この声明は、米国特許法施行規則§４０１．１４（ａ）（ｆ）（４）にしたがうためだけに含まれたものであり、本出願が１つの発明しか開示および／または権利主張していないとの表明とも承認ともみなされるべきものではない。
【背景技術】
【０００３】
薬物送達のためのナノ粒子の開発において現在広い関心が存在する（ＨｅｉｄｅｌおよびＤａｖｉｓ（２０１１年）Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２８巻：１８７〜１９９頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  ４６４巻：１０６７〜１０７０頁；Ｃｈｏｉら（２０１０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０７巻：１２３５〜１２４０頁；Ｃｈｅｒｔｏｋら（２０１３年）Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  １０巻：３５３１〜３５４３頁；ＨｕｂｂｅｌｌおよびＬａｎｇｅｒ（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  １２巻：９６３〜９６６頁；Ｍｕｒａら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  １２巻：９９１〜１００３頁；ならびにＫａｎａｓｔｙら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  １２巻：９６７〜９７７頁）。この領域の研究は、治癒比（毒性をもたらす用量に対する有効性のために必要とされる用量）が低いことが多いがん薬物と特に関連がある。薬物を運ぶナノ粒子は、いくつかの機序を通して遊離薬物によって達成できるものを超えて、この治癒比を増加させることができる。特に、ナノ粒子によって送達される薬物は、増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果の結果として腫瘍における薬物の濃度を選択的に増強すると考えられる（Ｐｅｅｒら（２００７年）Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  ２巻：７５１〜７６０頁；Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：５６５〜５８０頁；Ｈｕｗｙｌｅｒら（２００８年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ３巻：２１〜２９頁；Ｍａｒｕｙａｍａら（２０１１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ６３巻：１６１〜１６９頁；ＭｕｓａｃｃｈｉｏおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２０１１年）Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １６巻：１３８８〜１４１２頁；Ｂａｒｙｓｈｎｉｋｏｖ（２０１２年）Ｖｅｓｔ．  Ｒｏｓｓ．  Ａｋａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｎａｕｋ．  ２３〜３１頁；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ４巻：１４５〜１６０頁；ＭａｔｓｕｍｕｒａおよびＭａｅｄａ（１９８６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４６巻：６３８７〜６３９２頁；Ｍａｅｄａら（２０１３年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ６５巻：７１〜７９頁；Ｆａｎｇら（２００３年）Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ５１９巻：２９〜４９頁；ならびにＦａｎｇら（２０１１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ６３巻：１３６〜１５１頁）。透過性の増強は、漏出性の腫瘍血管系からもたらされ、一方、保持の増強は、悪性腫瘍の特徴である乱れたリンパ系からもたらされる。
【０００４】
この分野における多くの現在の研究は、ナノ粒子の生成のための新規な材料を設計することに当てられている。この新世代のナノ粒子は、従来のナノ粒子、例えば、リポソーム中に組み込むことが困難である薬物、特に、水性媒体中で不溶性であるものを運ぶことができる。しかし、旧世代のナノ粒子は、ヒトにおいて広範に試験されてきており、規制当局、例えば、米国の米食品医薬品局および欧州の欧州医薬品庁によって承認されているという点において、主要な実用的な利点を有する。残念ながら、多くの薬物は容易にまたは効果的にリポソーム中に充填することができず、それによってこれらの一般的使用を損なっている。
【０００５】
一般に、リポソーム薬物充填は、受動的または能動的方法によって達成される（Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：５６５〜５８０頁；ＫｉｔａおよびＤｉｔｔｒｉｃｈ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：３２９〜３４２頁；ＳｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒおよびＳｃｈｏｔｔ（２０１０年）Ｍｅｔｈｏｄ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６０５巻：１２９〜１３８頁；ＦａｈｒおよびＬｉｕ（２００７年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ４巻：４０３〜４１６頁；Ｃｈａｎｄｒａｎら（１９９７年）Ｉｎｄ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ３５巻：８０１〜８０９頁）。受動的充填は、目的の薬物を含有する水溶液中の乾燥した脂質フィルムの溶解を伴う。このアプローチは水溶性薬物のためにのみ使用することができ、充填の効率は低いことが多い。対照的に、能動的充填は非常に効率的であり、高価な化学療法剤の高いリポソーム内濃度および最小の消耗をもたらし得る（Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：５６５〜５８０頁；ＦｅｎｓｋｅおよびＣｕｌｌｉｓ（２００８年）Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ５巻：２５〜４４頁；ならびにＢａｒｅｎｈｏｌｚ（２００３年）Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３巻：１〜８頁）。能動的充填において、事前形成されたリポソーム中への薬物内部移行は典型的には、膜内外ｐＨ勾配によって駆動される。リポソームの外側のｐＨは、薬物の一部が非イオン化形態で存在することを可能とし、脂質二重層を横切って移動することができる。リポソーム内に入ると、薬物は、異なるｐＨによってイオン化され、そこに捕捉される（図１Ａ）。多くの報告は、膜内外ｐＨ勾配の性質、膜−水分配、内部緩衝能、薬物の水溶解度、脂質組成、および他の要因に対するリポソーム充填の依存を強調してきた（Ａｂｒａｈａｍら（２００４年）Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ９６巻：４４９〜４６１頁；Ｈａｒａｎら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１５１巻：２０１〜２１５頁；Ｍａｄｄｅｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ  ５３巻：３７〜４６頁；およびＺｕｃｋｅｒら（２００９年）Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  １３９巻：７３〜８０頁）。最近のモデルにおいて記載されているように（Ｚｕｃｋｅｒら（２００９年）Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  １３９巻：７３〜８０頁）、薬物の水溶解度は、効率的な能動的充填のための要件の１つである。遠隔充填の成功のための別の重要な要素は、小分子上の弱塩基性官能基の存在である。
【０００６】
わずかな割合の化学療法剤のみが、確立された技法による能動的充填のために必要とされる特色を有する。事前形成されたリポソーム中へのこのようなイオン化不能な薬物の能動的充填への試みは、乏しい充填効率をもたらす（図１Ｂ）。この問題に対する１つの有望な解決策は、その他の点で充填不能な薬物へ弱塩基性官能基を添加することであり、添加はｐＨ勾配にわたってこれらの薬物を駆動するのに必要とされる電荷を提供する。しかし、薬物の共有結合的修飾はこれらの生物学的および化学的特性を変化させることが多く、多くの状況において望ましくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｂｒａｈａｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．（２００４年）９６巻：４４９〜４６１頁
【非特許文献２】Ｈａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９３年）１１５１巻：２０１〜２１５頁
【非特許文献３】Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ（１９９０年）５３巻：３７〜４６頁
【非特許文献４】Ｚｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．（２００９年）１３９巻：７３〜８０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、様々な化学的特性（例えば、非イオン性および／または疎水性）を有する治療剤を高効率かつ高濃度でカプセル化するリポソーム組成物を同定することが当技術分野で強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、イオン化可能な官能基（例えば、それらの溶媒に曝露されている表面、例えば、リポソーム内相表面上の弱塩基性および／または弱酸性官能基）を担持しているシクロデキストリンが、治療剤（例えば、イオン化不能および／または疎水性の組成物）を高濃度で効率的にカプセル化することができ、かつ治療剤を含有する官能化シクロデキストリンそれ自体がリポソーム中に高濃度で効率的に遠隔的に充填されることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたとき、予想外に低減した毒性および増強された有効性特性を示すリポソーム組成物を生じさせるという発見に部分的に基づいている（例えば、図１Ｃを参照）。シクロデキストリンは、疎水性薬物を可溶化するために一般に使用される環状糖のファミリーである（ＡｌｂｅｒｓおよびＭｕｌｌｅｒ（１９９５年）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １２巻：３１１〜３３７頁；ＺｈａｎｇおよびＭａ（２０１３年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ６５巻：１２１５〜１２３３頁；Ｌａｚａ−Ｋｎｏｅｒｒら（２０１０年）Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ．  １８巻：６４５〜６５６頁；Ｃｈａｌｌａら（２００５年）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  ６巻：Ｅ３２９〜Ｅ３５７頁；Ｕｅｋａｍａら（１９９８年）Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９８巻：２０４５〜２０７６頁；Ｓｚｅｊｔｌｉ（１９９８年）Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９８巻：１７４３〜１７５４頁；ＳｔｅｌｌａおよびＨｅ（２００８年）Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３６巻：３０〜４２頁；ＲａｊｅｗｓｋｉおよびＳｔｅｌｌａ（１９９６年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８５巻：１１４２〜１１６９頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９７年）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．  １４巻：１〜１０４頁；ならびにＩｒｉｅおよびＵｅｋａｍａ（１９９７年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８６巻：１４７〜１６２頁）。
【００１０】
一態様では、シクロデキストリン、治療剤、およびリポソームを含むリポソーム組成物であって、リポソームは、イオン化可能な化学基で置き換えられている、リポソームの内相に向いている少なくとも１つのヒドロキシル化学基を有するシクロデキストリンをカプセル化し、シクロデキストリンは、治療剤をカプセル化する、リポソーム組成物を提供する。一実施形態では、シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位は、イオン化可能な化学基で置き換えられたＣ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基からなる群より選択される少なくとも１つのヒドロキシル化学基を有する。別の実施形態では、シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位は、イオン化可能な化学基で置き換えられたＣ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基からなる群より選択される少なくとも２つのヒドロキシル化学基を有する。さらに別の実施形態では、シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位のＣ２、Ｃ３、およびＣ６ヒドロキシル化学基は、イオン化可能な化学基で置き換えられている。さらに別の実施形態では、シクロデキストリンの少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位は、シクロデキストリンの２、３、４、５、６、７、８、およびすべてのα−Ｄ−グルコピラノシド単位からなる群より選択される。別の実施形態では、イオン化可能な化学基は、すべての置き換えられた位置において同じである。さらに別の実施形態では、イオン化可能な化学基は、弱塩基性官能基（例えば、ＣＨ３−Ｘによって６．５から８．５の間のｐＫａを有する基Ｘ）または弱酸性官能基（例えば、ＣＨ３−Ｙによって４．０から６．５の間のｐＫａを有する基Ｙ）である。さらに別の実施形態では、弱塩基性官能基または弱酸性官能基は、アミノ官能基、エチレンジアミノ官能基、ジメチルエチレンジアミノ官能基、ジメチルアニリノ官能基、ジメチルナフチルアミノ官能基、スクシニル官能基、カルボキシル官能基、スルホニル官能基およびスルフェート官能基からなる群より選択される。別の実施形態では、シクロデキストリンは、４．０から８．５の間のｐＫａ１を有する。さらに別の実施形態では、組成物は、液体または固体の医薬製剤である。さらに別の実施形態では、治療剤は、中性に荷電しているか、または疎水性である。別の実施形態では、治療剤は、化学療法剤である。さらに別の実施形態では、治療剤は、小分子である。さらに別の実施形態では、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンからなる群より選択される。別の実施形態では、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンである。
【００１１】
別の態様では、本明細書に記載されているリポソーム組成物、および使用のための指示書を含むキットを提供する。
【００１２】
さらに別の態様では、がんを有する被験体を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されているリポソーム組成物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、治療剤は、化学療法剤である。別の実施形態では、リポソーム組成物は、注射によって皮下または静脈内に投与される。さらに別の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。さらに別の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、リポソームの能動的充填の略図の実施形態を示す。図１Ａは、効率的な組込みをもたらす膜内外ｐＨ勾配を使用したイオン化可能な親水性薬物の遠隔充填を示す。図１Ｂは、難溶性疎水性薬物が、図１Ａに示した条件下で事前形成されたリポソーム中への乏しい組込みをもたらすことを示す。図１Ｃは、イオン化可能なシクロデキストリン（Ｒ＝Ｈ、イオン化可能なアルキルまたはアリール基）中への難溶性薬物のカプセル化が、その水溶解度を増強し、ｐＨ勾配によって効率的なリポソームの充填を可能とすることを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、合成されたイオン化可能なシクロデキストリンの実施形態を示す。図２Ａは、現在開示されている合成されたイオン化可能なシクロデキストリンのいくつかを形成させる化学反応の実施形態を示す。図２Ｂは、それらの６’位においてイオン化可能な基を担持する現在開示されている合成されたイオン化可能なシクロデキストリンの一部の実施形態を示す。図２Ｃは、シクロデキストリンのトロイダル形状を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、膜内外ｐＨ勾配を使用した修飾β−シクロデキストリンの能動的充填を示す。図３Ａは、相対蛍光単位（ＲＬＵ）での、ｐＨ勾配の非存在下でリポソーム中に充填された（ＰＢＳリポソーム）同じ化合物のそれと比較した、ｐＨ勾配によってリポソーム中に充填された（クエン酸リポソーム）、β−シクロデキストリンＶの蛍光を示す。図３Ｂは、動的光散乱測定を示し、これは流体力学的半径の僅かな増加を示すが、シクロデキストリンＶを遠隔的に充填したリポソームの多分散性指数（ＰＤＩ）において変化はない。図３Ｃ〜３Ｄは、ｐＨ勾配によって充填された（クエン酸リポソーム；図３Ｃ）またはｐＨ勾配を伴わない（ＰＢＳリポソーム；図３Ｄ）、ダンシル化（ｄａｎｓｙｌａｔｅｄ）β−シクロデキストリンＶのｃｒｙｏＴＥＭ画像を示す。
【図４】図４は、対照（ＰＢＳ）リポソームに対するクエン酸リポソームにおける、ダンシル化ＩおよびシクロデキストリンＩＶの相対蛍光単位（ＲＬＵ）での、蛍光を分析することによる、クエン酸リポソーム中へのダンシル化シクロデキストリンの組込みを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、遠隔的に充填されたクマリン１０２（図５Ａ）、クマリン３１４（図５Ｂ）、クマリン３３４（図５Ｃ）、およびシクロヘキシルＤＮＰ（図５Ｄ）の蛍光強度によって見られるような、修飾β−シクロデキストリンを使用したリポソーム中への不溶性疎水性色素の遠隔充填を示す。差し込み図は、シクロデキストリンにカプセル化された色素（上）または遊離色素（下）と共にインキュベートしたリポソームを含有するバイアルの写真を示す。
【図６】図６は、クマリン３１４をクエン酸リポソーム中に移動させる様々なシクロデキストリンの能力を示す。複合体形成していないクマリン３１４、ならびにＩＩＩ（イオン化可能なモノ−６−エチレンジアミノ−６’デオキシ−シクロデキストリン）およびＩ（イオン化不能なβ−シクロデキストリン）と複合体形成したクマリン３１４、その後のクエン酸リポソーム中への遠隔充填の相対蛍光単位（ＲＬＵ）での蛍光を示す。
【図７】図７は、ＢＩ−２５３６およびＰＤ−０３２５９０１の構造および物理的特性を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＰＬＫ１阻害剤、ＢＩ−２５３６Ｌの充填および活性を示す。図８Ａは、ＢＩ−２５３６およびＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６を注射された動物の生存データを示す。すべての処置された動物（ｎ＝５）は、単回ｉｖ用量（１２５ｍｇ／ｋｇ）のその遊離形態のＢＩ−２５３６に一晩で死亡したが、一方、単回ｉ．ｖ．用量のＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、同様の用量（１２５ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）または非常により高い用量（５００ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）で急性毒性の徴候を何ら誘発しなかった。図８Ｂは、２つのｉ．ｖ．用量（矢印によって示された日）の（ｉ）空のリポソーム、（ｉｉ）遊離ＢＩ−２５３６（１００ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６（１００ｍｇ／ｋｇ）、および（ｉｖ）ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６（４００ｍｇ／ｋｇ）で処置された、ＨＣＴ１１６異種移植片を担持するヌードマウス（アーム毎にｎ＝４）の結果を示す。図８Ｃは、単回ｉ．ｖ．用量の（ｉ）空のリポソーム、（ｉｉ）ＢＩ−２５３６（１００ｍｇ／ｋｇ）、または（ｉｉｉ）ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置された、ＨＣＴ１１６異種移植片を担持するヌードマウスの結果を示す。任意の薬物処置の前、およびその後２４時間毎に、好中球を計数した。各処置アームにおける５匹のマウスの好中球数の平均および標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図９】図９は、示されるように、それぞれ、各組織について左から右へのヒストグラムとして、２時間、２４時間、および４８時間の時点におけるＣＹＣＬ−クマリン３３４の組織体内分布を示す。データは、平均および標準偏差として提示する。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＭＥＫ１阻害剤、ＰＤ−０３２５９０１の充填および活性を示す。図１０Ａは、単回用量のＰＤ−０３２５９０１およびＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１で処置した動物の生存曲線を示す。ＲＫＯ異種移植片を担持するヌードマウスを、単回用量（２００ｍｇ／ｋｇ）のその遊離形態のＰＤ−０３２５９０１、低用量（２００ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）、またはより高い用量（５００ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）での単回ｉ．ｖ．用量のＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１で処置した。図１０Ｂは、２つのｉ．ｖ．用量（矢印によって示された日）の（ｉ）ブランクリポソーム、（ｉｉ）遊離ＰＤ−０３２５９０１（１５０ｍｇ／ｋｇ）、または（ｉｉｉ）ＣＹＣＬ−ＰＤ−３２５９０１（２５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された、ＲＫＯ異種移植片を担持するヌードマウスの結果を示す。リポソーム製剤を、遊離薬物の同等物として報告した。各実験アームの相対腫瘍容積および標準偏差を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、第２の異種移植片モデルにおけるＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６およびＣＹＣＬ−ＰＤ０３２５９０１の抗腫瘍活性を示す。リポソーム製剤を、遊離薬物の同等物として報告した。各実験アームの相対腫瘍容積および標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
イオン化可能な官能基（例えば、それらの溶媒に曝露されている表面、例えば、リポソーム内相表面上の弱塩基性および／または弱酸性官能基）を担持するシクロデキストリンは、高濃度で治療剤（例えば、イオン化不能および／または疎水性の組成物）を効率的にカプセル化することができ、かつ治療剤を含有する官能化シクロデキストリンは高濃度でリポソーム中に効率的に遠隔的に充填され、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに予想外に低減された毒性および増強された有効性特性を示すリポソーム組成物を生じさせることが本明細書において決定されている。このように、本発明は、少なくとも部分的に、このような修飾シクロデキストリンおよび治療剤を含むリポソーム組成物およびキット、ならびにこのような組成物およびキットを作製および使用する方法を提供する。
【００１５】
Ａ．シクロデキストリン
用語「シクロデキストリン」は、トロイダルトポロジー構造を有するＣ１〜Ｃ４結合によって一緒に連結された６つまたはそれ超のα−Ｄ−グルコピラノシド単位から構成される環状オリゴ糖のファミリーをいい、トロイドのより大きい開口部およびより小さい開口部が、α−Ｄ−グルコピラノシド単位のある特定のヒドロキシル基を周囲環境（例えば、溶媒）に曝露する。用語「不活性なシクロデキストリン」は、基本式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するα−Ｄ−グルコピラノシド単位およびいずれの追加の化学的な置換も含まないグルコース構造を含有するシクロデキストリン（例えば、６つのグルコースモノマーを有するα−シクロデキストリン、７つのグルコースモノマーを有するβ−シクロデキストリン、および８つのグルコースモノマーを有するγ−シクロデキストリン）を指す。用語「シクロデキストリン内相」は、シクロデキストリン構造のトロイドトポロジー内に封入されている（すなわち、それによってカプセル化されている）相対的により低い親水性の領域を指す。用語「シクロデキストリン外相」は、シクロデキストリン構造のトロイドトポロジーによって封入されていない領域を指し、シクロデキストリンがリポソーム内にカプセル化されているとき、リポソーム内相を含むことができる。シクロデキストリンは、疎水性組成物を可溶化するのに有用である（例えば、ＡｌｂｅｒｓおよびＭｕｌｌｅｒ（１９９５年）、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１２巻：３１１〜３３７頁；ＺｈａｎｇおよびＭａ（２０１３年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、６５巻：１２１５〜１２３３頁；Ｌａｚａ−Ｋｎｏｅｒｒら（２０１０年）、Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ．、１８巻：６４５〜６５６頁；Ｃｈａｌｌａら（２００５年）、ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．  Ｔｅｃｈ．、６巻：Ｅ３２９〜３５７頁；Ｕｅｋａｍａら（１９９８年）、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９８巻：２０４５〜２０７６頁；Ｓｚｅｊｔｌｉ（１９９８年）、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９８巻：１７４３〜１７５４頁；ＳｔｅｌｌａおよびＨｅ（２００８年）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．、３６巻：３０〜４２頁；ＲａｊｅｗｓｋｉおよびＳｔｅｌｌａ（１９９６年）、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、８５巻：１１４２〜１１６９頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９７年）、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．、１４巻：１〜１０４頁；ならびにＩｒｉｅおよびＵｅｋａｍａ（１９９７年）、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、８６巻：１４７〜１６２頁を参照）。シクロデキストリン内相内に位置した任意の物質は、「カプセル化」されていると言われる。
【００１６】
本明細書において使用する場合、シクロデキストリンが、（ａ）所望の治療剤をカプセル化することができ、（ｂ）イオン化可能な（例えば、弱塩基性および／または弱酸性）官能基を担持し、リポソームによるカプセル化を促進することができる限り、シクロデキストリンに対する特定の制限は存在しない。
【００１７】
所望の治療剤をカプセル化するために、シクロデキストリンは、所望の治療剤の特性、および中に効率的に高濃度に充填するためのパラメータによって選択および／または化学修飾することができる。例えば、リポソーム内相中のより大量のシクロデキストリンの捕捉を促進するために、シクロデキストリン自体が、水中で高い溶解度を有することが好ましい。一部の実施形態では、シクロデキストリンの水溶解度は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ超である。このような増強された水溶解度を達成するための方法は、当技術分野で周知である。
【００１８】
一部の実施形態では、治療剤との大きい会合定数は、好ましく、治療剤のサイズに基づいてシクロデキストリン中のグルコース単位の数を選択することによって得ることができる（例えば、ＡｌｂｅｒｓおよびＭｕｌｌｅｒ（１９９５年）、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１２巻：３１１〜３３７頁；ＳｔｅｌｌａおよびＨｅ（２００８）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．、３６巻：３０〜４２頁；ならびにＲａｊｅｗｓｋｉおよびＳｔｅｌｌａ（１９９６年）、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、８５巻：１１４２〜１１６９頁を参照）。会合定数がｐＨによって決まるとき、シクロデキストリンは、会合定数がリポソーム内相のｐＨで大きくなるように選択することができる。結果として、シクロデキストリンの存在下での治療剤の溶解度（名目上の溶解度）が、さらに改善され得る。例えば、治療剤とのシクロデキストリンの会合定数は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、またはそれ超であり得る。
【００１９】
シクロデキストリンヒドロキシル基（例えば、不活性なシクロデキストリンのトロイドの上および下の稜線に沿って並ぶもの）との反応によって形成される誘導体は、容易に調製され、親（不活性な）シクロデキストリンの物理化学的性質を修飾する手段を提供する。シクロデキストリン内部相から見て外方を向いているものなどの修飾化ヒドロキシル基は、イオン化可能な化学基で置き換えられて、リポソーム中への充填、および修飾シクロデキストリン内の治療剤、例えば、難溶性または疎水性の薬剤の充填を促進し得ることが本明細書において決定された。一実施形態では、イオン化可能な化学基と置換された少なくとも１つのヒドロキシル基を有する修飾シクロデキストリンは、ある特定の溶媒（例えば、ｐＨ）条件下で荷電部分をもたらす。用語「荷電シクロデキストリン」は、そのヒドロキシル基の１つまたは複数が荷電部分および電荷担持部分と置換されたシクロデキストリンを指す。このような部分は、それ自体荷電基であり得、またはこれは、１つもしくは複数の荷電部分と置換された有機部分（例えば、Ｃｉ〜Ｃ６アルキルもしくはＣｉ〜Ｃ６アルキルエーテル部分）を含み得る。
【００２０】
一実施形態では、「イオン化可能な」または「荷電した」部分は、弱くイオン化可能なものである。弱くイオン化可能な部分は、弱塩基性または弱酸性であるものである。弱塩基性官能基（Ｘ）は、ＣＨ３−Ｘによって約６．０〜９．０、６．５〜８．５、７．０〜８．０、７．５〜８．０の間、および両端を含めて間の任意の範囲のｐＫａを有する。同様に、弱酸性官能基（Ｙ）は、ＣＨ３−Ｙによって、約３．０〜７．０、４．０〜６．５、４．５〜６．５、５．０〜６．０、５．０〜５．５の間、および両端を含めて間の任意の範囲のｌｏｇ解離定数（ｐＫａ）を有する。ｐＫａパラメータは、物質の酸／塩基性質の周知の尺度であり、ｐＫａ決定のための方法は、当技術分野で従来のものかつ慣例的なものである。例えば、多くの弱酸のｐＫａ値は、化学および薬理学の参考書籍中に表化されている。例えば、ＩＵＰＡＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ、Ｐ．  Ｈ．  ＳｔａｈｌおよびＣ．  Ｇ  Ｗｅｒｍｕｔｈ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第８２版、Ｄ．  Ｒ．  Ｌｉｄｅ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｆｌｏｒｉｄａ、２００１年、８−４４〜８−５６頁を参照。１つを超えるイオン化可能な基を有するシクロデキストリンは、第２のおよび後続の基のｐＫａを有するので、それぞれは、下付き文字を用いて表されている。
【００２１】
代表的なアニオン性部分には、これらに限定されないが、カルボキシレート、カルボキシメチル、スクシニル、スルホニル、ホスフェート、スルホアルキルエーテル、スルフェート、カーボネート、チオカーボネート、ジチオカーボネート、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート、ニトレート、およびボレート基が含まれる。
【００２２】
代表的なカチオン性部分には、これらに限定されないが、アミノ、グアニジン、および第四級（ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ）アンモニウム基が含まれる。
【００２３】
別の実施形態では、修飾シクロデキストリンは、「ポリアニオン」または「ポリカチオン」である。ポリアニオンは、１つを超える負に荷電した基を有する修飾シクロデキストリンであり、２つ超の単位の正味の陰イオンチャージャー（ｃｈａｒｇｅｒ）をもたらす。ポリカチオンは、１つを超える正に荷電した基を有する修飾シクロデキストリンであり、２つ超の単位の正味の陽イオンチャージャーをもたらす。
【００２４】
別の実施形態では、修飾シクロデキストリンは、「荷電可能な両親媒性物質」である。「荷電可能な」とは、両親媒性物質がｐＨ４〜ｐＨ８または８．５の範囲のｐＫを有することを意味する。したがって、荷電可能な両親媒性物質は、弱酸または弱塩基であり得る。本明細書において「両性の」とは、アニオン性およびカチオン性の特徴の両方のイオン化可能な基を有する修飾シクロデキストリンであって、１）カチオンおよびアニオン性の両親媒性物質の少なくとも一方、および任意選択で両方が、４から８〜８．５の間のｐＫを有する少なくとも１つの荷電基を有して荷電可能であり、２）カチオン性電荷は、ｐＨ４で優勢であり、３）アニオン性電荷は、ｐＨ８〜８．５で優勢である、修飾シクロデキストリンを意味する。
【００２５】
一部の実施形態では、「イオン化可能な」または「荷電した」シクロデキストリンは全体として、ポリイオン性であっても、両親媒性であっても、その他であっても、弱くイオン化可能である（すなわち、約４．０〜８．５、４．５〜８．０、５．０〜７．５、５．５〜７．０、６．０〜６．５の間、および両端を含めて間の任意の範囲のｐＫａ１を有する）。
【００２６】
シクロデキストリンの任意の１つ、一部、またはすべてのα−Ｄ−グルコピラノシド単位の任意の１つ、一部、またはすべてのヒドロキシル基を修飾して、本明細書に記載のイオン化可能な化学基にすることができる。各シクロデキストリンヒドロキシル基は、化学反応性が異なるので、修飾化部分との反応は、位置異性体および光学異性体の非晶質混合物を生じさせ得る。代わりに、ある特定の化学的性質は、予め修飾されたα−Ｄ−グルコピラノシド単位が反応されて均一な生成物を形成することを可能にすることができる。
【００２７】
行われる総計の置換は、置換度と呼ばれる用語によって記述される。例えば、７の置換度を有する６−エチレンジアミノ−β−シクロデキストリンは、６−エチレンジアミノ−β−シクロデキストリン分子１つ当たりのエチレンジアミノ基の平均数が７である６−エチレンジアミノ−β−シクロデキストリンの異性体の分布から構成される。置換度は、質量分析法または核磁気共鳴分光法によって決定することができる。理論的には、最大置換度は、α−シクロデキストリンについて１８、βについて２１、およびγ−シクロデキストリンについて２４であるが、ヒドロキシル基を有する置換基自体は、追加のヒドロキシルアルキル化の可能性を提示する。置換度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれ超であり得、完全な置換を包含し得る。
【００２８】
別のパラメータは、所与のヒドロキシル置換の立体化学上の場所である。一実施形態では、シクロデキストリン内部から見て外方を向いている少なくとも１つのヒドロキシルが、イオン化可能な化学基と置換される。例えば、少なくとも１つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位のうちのＣ２、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ２およびＣ３、Ｃ２およびＣ６、Ｃ３およびＣ６、ならびにＣ２−Ｃ３−Ｃ６ヒドロキシルの３つすべてがイオン化可能な化学基と置換される。ヒドロキシルの任意のこのような組み合わせを、修飾シクロデキストリン中のα−Ｄ−グルコピラノシド単位のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、最大ですべてと、かつ本明細書に記載の任意の置換度と組み合わせて、同様に組み合わせることができる。
【００２９】
本明細書に記載のシクロデキストリンの１種または複数を組み合わせることも許容される。
【００３０】
Ｂ．リポソーム
用語「リポソーム」は、脂質二重層によって封入されている内相を有する顕微鏡レベルの閉じた小胞を指す。リポソームは、小さな単一膜リポソーム、例えば、小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）、大きな単一膜リポソーム、例えば、大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）、より大きな単一膜リポソーム、例えば、巨大単層小胞（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＧＵＶ）、複数の同心円状膜を有する多層リポソーム、例えば、多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＬＶ）、または不規則であり、同心円状ではない複数の膜を有するリポソーム、例えば、多胞体小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＶＶ）であり得る。周知のリポソーム形態のさらなる記載について、米国特許出願公開第２０１２−０１２８７５７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，７３７，３２３号；ＷＯ９６／１４０５７；Ｎｅｗ（１９９０年）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３３〜１０４頁；およびＬａｓｉｃ（１９９３年）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照。
【００３１】
用語「リポソーム内相」は、リポソームの脂質二重層内に封入されている（すなわち、カプセル化されている）水性領域を指す。対照的に、用語「リポソーム外相」は、リポソームが液体に分散している場合、リポソームの脂質二重層によって封入されていない領域、例えば、内相および脂質二重層から離れた領域を指す。
【００３２】
本明細書において使用する場合、リポソームが治療剤を抱える修飾シクロデキストリンをカプセル化することができる限り、リポソームに対する特定の制限は存在しない。一部の実施形態では、リポソームは、修飾シクロデキストリン／治療剤複合体が、リポソーム内相内にカプセル化されると、リポソーム内相から外相へと望ましくなく漏れることを防止するバリア機能を有する。これが医薬として使用される場合、リポソームがｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を示し、かつリポソームがｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたとき、修飾シクロデキストリン／治療剤複合体のすべてが血液中のリポソーム外相に漏れることを防止するバリア機能を有することが好ましい。
【００３３】
一部の実施形態では、リポソームの膜構成成分は、リン脂質および／またはリン脂質誘導体を含む。このようなリン脂質およびリン脂質誘導体の代表例には、これらに限定されないが、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスフェート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、およびホスファチジン酸が含まれる。これらのリン脂質およびリン脂質誘導体の１つまたは複数を組み合わせることも許容される。
【００３４】
リン脂質およびリン脂質誘導体において脂肪酸残基に対して特定の制限は存在せず、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ超の炭素鎖長を有する飽和または不飽和の脂肪酸残基を含むことができる。代表的な非限定的例には、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、およびリノール酸に由来するアシル基が含まれる。天然物質に由来するリン脂質、例えば、卵黄レシチンおよびダイズレシチン、部分的水素化卵黄レシチン、（完全）水素化卵黄レシチン、部分的水素化ダイズレシチン、および（完全）水素化ダイズレシチン（その不飽和脂肪酸残基が部分的または完全に水素化されている）なども使用することができる。
【００３５】
リポソームを調製するときに使用されるリン脂質および／またはリン脂質誘導体の混合量（モル分率）に対する特定の制限は存在しない。一実施形態では、全リポソーム膜組成に対して１０〜８０％を使用することができる。別の実施形態では、３０〜６０％の範囲を使用することができる。
【００３６】
リン脂質および／またはリン脂質誘導体に加えて、リポソームは、膜安定剤としてステロール、例えば、コレステロールおよびコレスタノール、ならびに飽和または不飽和のアシル基を有する脂肪酸、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ超の炭素数を有するものをさらに含むことができる。
【００３７】
リポソームを調製するときに使用されるこれらのステロールの混合量（モル分率）に対する特定の制限は存在しないが、全リポソーム膜組成に対して１〜６０％が好ましく、１０〜５０％がより好ましく、３０〜５０％がさらにより好ましい。同様に、脂肪酸の混合量（モル分率）に対する特定の制限は存在しないが、全リポソーム膜組成に対して０〜３０％が好ましく、０〜２０％がより好ましく、０〜１０％がさらにより好ましい。抗酸化剤の混合量（モル分率）に関して、抗酸化効果を得ることができる量が添加されれば十分であるが、全リポソーム膜組成の０〜１５％が好ましく、０〜１０％がより好ましく、０〜５％がさらにより好ましい。
【００３８】
リポソームはまた、膜構成成分として機能性脂質および修飾脂質を含有することができる。機能性脂質の代表的な非限定的例には、血液中に保持された脂質誘導体（例えば、グリコホリン、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミニン酸（ｇｌｕｔａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、ポリエチレングリコール誘導体（メトキシポリエチレングリコール縮合物など）、例えば、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００］−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００］−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０］−１，２−ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００］−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、およびＮ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００］−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ホスホエタノールアミンおよびメトキシポリエチレングリコールの縮合物である））、温度感受性脂質誘導体（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ｐＨ感受性脂質誘導体（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などが含まれる。血液中に保持された脂質誘導体を含有するリポソームは、リポソームの血液保持を改善するために有用である。なぜなら、リポソームが肝臓内で外来性不純物として捕獲することが困難となるためである。同様に、温度感受性脂質誘導体を含有するリポソームは、特定の温度でリポソームの破壊を生じさせ、かつ／またはリポソームの表面特性における変化を生じさせるために有用である。さらに、これと、標的部位における温度の上昇とを組み合わせることによって、リポソームを標的部位において破壊し、標的部位において治療剤を放出することが可能である。ｐＨ感受性脂質誘導体を含有するリポソームは、リポソームがエンドサイトーシスによって細胞中に組み込まれるとき、リポソームおよびエンドソームの膜融合を増強するのに有用であり、それによって細胞質への治療剤の伝達が改善される。
【００３９】
修飾脂質の代表的な非限定的例には、ＰＥＧ脂質、糖脂質、抗体−修飾脂質、ペプチド−修飾脂質などが含まれる。このような修飾脂質を含有するリポソームを、所望の標的細胞または標的組織へ標的化することができる。また、リポソームを調製するときに使用される機能性脂質および修飾脂質の混合量（モル分率）に対して特定の制限は存在しない。一部の実施形態では、このような脂質は、リポソーム膜構成成分脂質全体の０〜５０％、０〜４０％、０〜３０％、０〜２０％、０〜１５％、０〜１０％、０〜５％、０〜１％またはそれ未満を構成する。
【００４０】
上記および当技術分野で周知の方法に基づいて、このような膜透過性を実際の適用を可能とするレベルで有するリポソーム膜構成成分の組成は、治療剤、標的組織などによって当業者が適切に選択することができる。
【００４１】
医薬として使用されるとき、リポソームが標的組織、細胞、または細胞内小器官に到達した後で、治療剤／シクロデキストリン複合体がリポソームから放出されることが好ましい。膜構成成分自体を含有する本明細書に記載されているリポソーム組成物は通常、生分解性であり、標的組織などにおいて最終的に分解し、カプセル化された治療剤／シクロデキストリン複合体がそれによって、希釈、化学平衡、および／または酵素的シクロデキストリン分解効果によって放出されると考えられる。
【００４２】
所望の適用によって、リポソームの粒径をレギュレートすることができる。例えば、注射用生成物などとして増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果によって、リポソームをがん性組織または炎症性組織に送ることが意図されるとき、リポソーム粒径が３０〜４００ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、７５〜１５０ｎｍ、およびその間の任意の範囲であることが好ましい。リポソームをマクロファージに送ることが意図される場合、リポソーム粒径が３０〜１０００ｎｍであることが好ましく、粒径が１００〜４００ｎｍであることがより好ましい。リポソーム組成物が経口調製物または経皮調製物として使用される場合、リポソームの粒径は、数ミクロンに設定することができる。正常組織において、血管壁はバリアとしての役割を果たし（血管壁は血管内皮細胞によって密に構成されるため）、微粒子、例えば、特定のサイズの超分子およびリポソームは、組織内に分布することができないことに留意すべきである。しかし、患部組織において、血管壁は緩く（間隙が血管内皮細胞の間に存在するため）、血管透過性が増加し、超分子および微粒子は血管外組織に分布することができる（増強された透過性）。さらに、リンパ系は正常組織において良好に発達しているが、リンパ系は患部組織において発達しておらず、かつ超分子または微粒子は、一度組み込まれると、全身系を通して再循環されず、患部組織において保持され（増強された保持）、これがＥＰＲ効果の基礎を形成することは公知である（Ｗａｎｇら（２０１２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ６３巻：１８５〜１９８頁；Ｐｅｅｒら（２００７年）Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  ２巻：７５１〜７６０頁；Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：５６５〜５８０頁；Ｈｕｗｙｌｅｒら（２００８年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ３巻：２１〜２９頁；Ｍａｒｕｙａｍａら（２０１１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ６３巻：１６１〜１６９頁；ＭｕｓａｃｃｈｉｏおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２０１１年）Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １６巻：１３８８〜１４１２頁；Ｂａｒｙｓｈｎｉｋｏｖ（２０１２年）Ｖｅｓｔ．  Ｒｏｓｓ．  Ａｋａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｎａｕｋ．  ２３〜３１頁；およびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ４巻：１４５〜１６０頁）。このように、リポソーム粒径を調整することによってリポソーム薬物動態を制御することが可能である。
【００４３】
用語「リポソーム粒径」は、動的光散乱法（例えば、準弾性光散乱法）による重量平均粒径を指す。例えば、リポソーム粒径は、動的光散乱機器（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．によって製造されたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳモデル、および大塚電子株式会社によって製造されたＥＬＳ−８０００）を使用して測定することができる。機器は粒子のブラウン運動を測定し、粒径は確立された動的光散乱の方法論的理論に基づいて決定される。
【００４４】
さらに、リポソーム内相の溶媒に対する特定の制限は存在しない。例示的な緩衝溶液には、これらに限定されないが、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、およびリン酸緩衝生理食塩溶液、生理食塩水、細胞培養のための培養培地などが含まれる。緩衝溶液が溶媒として使用される場合、緩衝剤の濃度が５〜３００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、またはその間の任意の範囲であることが好ましい。リポソーム内相のｐＨに対する特定の制限も存在しない。一部の実施形態では、リポソーム内相は、２〜１１、３〜９、４〜７、４〜５の間、および両端を含めて間の任意の範囲のｐＨを有する。
【００４５】
Ｃ．治療剤
治療剤が修飾シクロデキストリンによってカプセル化されている限り、本発明における治療剤に対して特定の制限は存在しない。例えば、α−シクロデキストリンは、０．４５〜０．６の内相細孔直径サイズを有し、β−シクロデキストリンは、０．６〜０．８ｎｍの内相細孔直径サイズを有し、γ−シクロデキストリンは、０．８〜０．９５ｎｍの内相細孔直径サイズを有することが公知である。シクロデキストリンは、カプセル化を可能とする治療剤のサイズにマッチするように選択することができる。上記のように、非炭素シクロデキストリン基（例えば、ヒドロキシル基）への修飾を選択して、シクロデキストリンおよび治療剤の間の分子間相互作用を調節して、それによってシクロデキストリンによる治療剤のカプセル化を調節することができる。
【００４６】
治療剤として、任意の所望の薬剤、例えば、医薬の分野において有用なもの（診断薬を含めた）、化粧品、食料製品などを使用することができる。例えば、治療剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、抗肥満薬、栄養補助食品（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌ）、コルチコステロイド、エラスターゼ阻害剤、鎮痛剤、抗真菌剤、オンコロジー治療（ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｔｈｅｒａｐｙ）、制吐剤、鎮痛剤、心血管薬剤（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔ）、抗炎症剤、駆虫剤、抗不整脈剤、抗生物質（ペニシリンを含めた）、抗凝血剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、降圧剤、抗ムスカリン剤、抗ミコバクテリア剤、抗新生物剤、免疫抑制剤、抗甲状腺剤、抗ウイルス剤、抗不安鎮静剤（催眠剤および神経弛緩剤）、収斂剤、ベータ−アドレナリン受容体ブロック剤、血液製剤および代用血液、心臓強心剤、造影剤、コルチコステロイド、鎮咳剤（ｃｏｕｇｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）（去痰剤および粘液溶解剤）、診断剤、診断用造影剤、利尿剤、ドーパミン作動性剤（抗パーキンソン病剤）、止血剤、免疫学的薬剤、脂質制御剤、筋弛緩剤、副交感神経様作用剤、副甲状腺カルシトニンおよびビホスホネート、プロスタグランジン、放射性医薬品、性ホルモン（ステロイドを含めた）、抗アレルギー剤、刺激物質および食欲抑制剤、交感神経様作用剤、甲状腺剤、血管拡張剤およびキサンチンを含めた種々の公知のクラスの有用な薬剤から選択することができる。治療剤に関して、１種または複数の薬剤を組み合わせることが許容される。
【００４７】
一実施形態では、治療剤は、低分子化合物、例えば、小分子でよい。これらの中で、抗腫瘍剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗心筋梗塞剤、およびコントラスト剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）として使用される化合物が適切である。
【００４８】
治療剤の分子量に関して、１００〜２，０００ダルトンの範囲が好ましく、２００〜１，５００ダルトンの範囲がより好ましく、３００〜１，０００ダルトンの範囲がさらにより好ましい。これらの範囲内で、治療剤のリポソーム膜透過性は一般に、本明細書に記載されている組成物によると十分である。
【００４９】
本発明における抗新生物剤または抗腫瘍剤に対して特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、ＢＩ−２５３６、ＰＤ−０３２５９０１、カンプトテシン；タキサン；イホスファミド、ニムスチン（ｎｉｍｓｔｉｎｅ）塩酸塩、カルボコン（ｃａｒｖｏｃｏｎ）、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、ブスルファン、メルファラン（ｍｅｌｆａｒａｎ）、ラニムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、６−メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、カルモフール（ｃａｒｍｆｕｒ）、シタラビン、シタラビンオクフォスフェート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メソトレキセート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン塩酸塩、ブレオマイシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン硫酸塩、ペプロマイシン硫酸塩、エトポシド、ビノレルビン酒石酸塩、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｅｓｔｉｎｅ）硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、アムルビシン塩酸塩、ゲフィニチブ、エキセメスタン、カペシタビン、エリブリン、メシル酸エリブリンなどが含まれる。上記の薬剤の中で塩として記録される化合物に関して、任意の塩が許容され、遊離体も許容される。遊離体として記録される化合物に関して、任意の塩が許容される。
【００５０】
同様に、抗菌剤に対する特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、アンホテリシン（ａｍｆｏｔｅｒｉｃｉｎｅ）Ｂ、セフォチアムヘキシル、セファロスポリン、クロラムフェニコール、ジクロフェナクなどが含まれる。上記の抗菌剤の化合物に関して、任意の塩が許容される。
【００５１】
また、抗炎症剤に対する特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、プロスタグランジン（ＰＧＥ１およびＰＧＥ２）、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ピロキシカム（ｐｙｒｏｘｉｃａｍ）、インドメタシン、プレドニゾロンなどが含まれる。上記の抗炎症剤の化合物に関して、任意の塩が許容される。
【００５２】
抗心筋梗塞剤に対する特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、アデノシン、アテノロール、ピルジカイニド（ｐｉｌｓｉｃａｍｉｄｅ）などが含まれる。上記の抗心筋梗塞剤の化合物に関して、任意の塩が許容される。
【００５３】
コントラスト剤に対する特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、イオパミドール、イオキサグル酸、イオヘキシル（ｉｏｈｅｘｙｌ）、イオメプロールなどが含まれる。コントラスト剤に関して、任意の塩が許容される。
【００５４】
一部の実施形態では、治療剤は、「難水溶性」または「疎水性」であり、この用語は互換的に使用され、約１０ｍｇ／ｍＬ未満、約９ｍｇ／ｍＬ未満、約８ｍｇ／ｍＬ未満、約７ｍｇ／ｍＬ未満、約６ｍｇ／ｍＬ未満、約５ｍｇ／ｍＬ未満、約４ｍｇ／ｍＬ未満、約３ｍｇ／ｍＬ未満、約２ｍｇ／ｍＬ未満、約１ｍｇ／ｍＬ未満、約９００μｇ／ｍＬ未満、約８００μｇ／ｍＬ未満、約７００μｇ／ｍＬ未満、約６００μｇ／ｍＬ未満、約５００μｇ／ｍＬ未満、約４００μｇ／ｍＬ未満、約３００μｇ／ｍＬ未満、約２００μｇ／ｍＬ未満、約１００μｇ／ｍＬ未満、約９５μｇ／ｍＬ未満、約９０μｇ／ｍＬ未満、約８５μｇ／ｍＬ未満、約８０μｇ／ｍＬ未満、約７５μｇ／ｍＬ未満、約７０μｇ／ｍＬ未満、約６５μｇ／ｍＬ未満、約６０μｇ／ｍＬ未満、約５５μｇ／ｍＬ未満、場合によって、約５０μｇ／ｍＬ未満、または両端を含めて間の任意の範囲の室温での水溶解度によって証明されるように、水中でわずかしか溶解でない治療剤を包含する。一実施形態では、１部の薬剤が１００〜１０００部の溶媒（例えば、水）によって可溶化することができるとき、用語「わずかに可溶性」が適用可能である。任意の所与の化合物についての室温での水溶解度は、容易に利用可能な化学技法およびツール、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたは分光光度法を使用して容易に決定することができることを認識されたい。
【００５５】
Ｄ．リポソーム組成物
用語「リポソーム組成物」は、リポソームを含有し、リポソーム内相中にその不活性な形態から化学修飾されたシクロデキストリン、および治療剤をさらに含有する組成物を指す。リポソーム組成物は、固体および液体形態を含むことができる。リポソーム組成物が固体形態である場合、処方した溶媒にこれを溶解または懸濁させることによって、液体形態へと作製することができる。リポソーム組成物が凍結した固体である場合、これを室温にて静置することによって融解させることによって、液体形態へと作製することができる。
【００５６】
リポソーム組成物中のリポソームの濃度および治療剤の濃度は、リポソーム組成物の目的、製剤、および当業者には周知の他の検討事項によって適切に設定することができる。リポソーム組成物が液体製剤である場合、リポソームを構成するすべての脂質の濃度としてのリポソームの濃度は、０．２〜１００ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭで設定し得る。リポソーム組成物が医薬として使用される場合、治療剤の濃度（投与量）を下記に記載する。リポソーム組成物中のシクロデキストリンの量に関して、これは治療剤に対して０．１〜１０００ｍｏｌ当量であることが好ましく、および治療剤に対して１〜１００ｍｏｌ当量であることがより好ましい。
【００５７】
リポソーム組成物が液体製剤である場合、リポソーム組成物の溶媒に対して特定の制限は存在しない。代表例には、これらに限定されないが、緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、およびリン酸緩衝生理食塩溶液、生理食塩水、および細胞培養のための培養培地が含まれる。リポソーム組成物のリポソーム外相のｐＨに対する特定の制限も存在しない。一部の実施形態では、例えば、ｐＨは、２〜１１、３〜１０、４〜９の間、７．４、７．０、またはリポソーム内相のｐＨより高い任意のｐＨである。
【００５８】
一部の実施形態では、医薬賦形剤、例えば、糖、例えば、単糖類、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、およびキシロース；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、およびマルトース；三糖類、例えば、ラフィノースおよびメレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）；多糖類、例えば、シクロデキストリン；ならびに糖アルコール、例えば、エリトリトール、キシリトール、ソルビトール（ｓｏｒｔｉｂｏｌ）、マンニトールおよびマルチトール；多価アルコール、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールを添加することができる。糖およびアルコールの組み合わせも使用することができる。
【００５９】
溶媒に分散しているリポソームの安定的な長期間の保存の目的のために、凝固などを含めた物理的安定性の観点から、溶媒中の電解質をできるだけ排除することが好ましい。さらに、脂質の化学的安定性の観点から、溶媒のｐＨを酸性から中性近傍（ｐＨ３．０〜８．０）に設定し、窒素通気によって溶解した酸素を除去することが好ましい。液体安定剤の代表例には、これらに限定されないが、生理食塩水、等張デキストロース、等張スクロース、リンガー液、およびハンクス液が含まれる。緩衝物質を添加して、保存安定性のために最適なｐＨを提供することができる。例えば、約６．０から約７．５の間のｐＨ、より好ましくは約６．５のｐＨは、リポソーム膜脂質の安定性のために最適であり、捕捉された実体の優れた保持を提供する。典型的には２〜２０ｍＭの濃度での、ヒスチジン、ヒドロキシエチルピペラジン−エチルスルホネート（ＨＥＰＥＳ）、モルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｐｏ）−エチルスルホネート（ＭＥＳ）、コハク酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩は、例示的な緩衝物質である。他の適切な担体は、例えば、水、緩衝水溶液、０．４％ＮａＣｌ、０．３％グリシンなどを含む。タンパク質、炭水化物、またはポリマー安定剤および張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｅｒ）、例えば、ゼラチン、アルブミン、デキストラン、またはポリビニルピロリドンを添加することができる。組成物の張度は、グルコースまたはより不活性な化合物、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはデキストリンで０．２５〜０．３５ｍｏｌ／ｋｇの生理的レベルに調整することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって、例えば、濾過によって無菌化することができる。このように得られた水溶液は、使用のためにパッケージ化することができるか、または無菌条件下にて濾過し、凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物を投与前に無菌水性媒体と合わせる。
【００６０】
リポソーム組成物中に含有される糖の濃度に対する特定の制限は存在しないが、リポソームが溶媒に分散している状態において、例えば、糖の濃度が２〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。多価アルコールの濃度に関して、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。
【００６１】
リポソーム組成物の固体製剤はまた、医薬賦形剤を含むことができる。このような構成要素は、例えば、糖、例えば、単糖類、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌｅ）、リボース、およびキシロース；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、およびマルトース；三糖類、例えば、ラフィノースおよびメレジトース；多糖類、例えば、シクロデキストリン；ならびに糖アルコール、例えば、エリトリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、およびマルチトールを含むことができる。より好ましいのは、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、およびソルビトールのブレンドである。さらにより好ましいのは、ラクトース、スクロース、およびトレハロースのブレンドである。これによって、固体製剤は長期間にわたって安定に保存することができる。凍結したとき、固体製剤が、多価アルコール（水溶液）、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテルおよび１，３−ブチレングリコールを含有することが好ましい。多価アルコール（水溶液）に関して、グリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールが好ましく、グリセリンおよびプロピレングリコールがより好ましい。これによって、固体製剤を長期間にわたって安定に保存することが可能である。糖および多価アルコールを、組み合わせ中で使用することができる。
【００６２】
本明細書に記載されているリポソーム組成物は、実体−対−脂質比によってさらに特徴付けることができる。一般に、実体−対−脂質比、例えば、薬剤の充填によって得られる治療剤充填比は、リポソーム内に捕捉された薬剤の量、能動的充填プロセスにおけるイオンの濃度、およびイオンの物理化学的特性および使用される対イオンのタイプによって決まる。組成物においておよび／または本発明の方法によって達成される高い充填効率のために、リポソーム中に捕捉された実体についての実体−対−脂質比は、充填プロセス中に捕えられた実体およびリポソーム脂質の量を基準として計算して、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、もしくはそれ超である（「インプット」比）。１００％（定量的）のカプセル化を達成することも可能である。
【００６３】
リポソーム中の実体−対脂質比は、重量比（リポソーム脂質の重量もしくはモル単位当たりの実体の重量）またはモル比（リポソーム脂質の重量もしくはモル単位当たりの実体のモル）に関して特徴付けることができる。１単位の実体−対−脂質比は、下記で例示するように、慣例的な計算によって他の単位に変換することができる。本明細書に記載されているリポソーム組成物中の実体の重量比は典型的には、１ｍｇの脂質当たり、少なくとも０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．５ｍｇ、または少なくとも０．６５ｍｇの実体である。モル比に関して、本発明による実体−対−脂質比は、１モルのリポソーム脂質当たり、少なくとも約０．０２〜約５、好ましくは少なくとも０．１〜約２、より好ましくは約０．１５〜約１．５モルの薬物である。
【００６４】
一実施形態では、実体−対−脂質比は、１モルのリポソーム脂質当たり少なくとも０．１モルの治療剤、好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、またはそれ超である。
【００６５】
本発明のリポソーム組成物は、捕捉された治療剤の高効率性、および低毒性のこれらの予想外の組み合わせによってさらに特徴付けることができる。一般に、本発明によってリポソームによってカプセル化された治療剤の活性、例えば、哺乳動物における抗がん治療剤の抗新生物活性は、例えば、本発明のリポソーム組成物を使用することを伴わずに、その日常的な非リポソーム製剤によって同じ量で投与された場合の治療用実体の活性と少なくとも等しく、少なくとも２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍もしくはそれを超えて高く、または少なくともこのような倍率で高く、一方、リポソームによってカプセル化された実体の毒性は、同じ用量およびスケジュールであるが、遊離の非カプセル化形態で投与される同じ治療用実体の毒性を超えないか、それの多くとも２分の１、多くとも３分の１、または多くとも４分の１である。
【００６６】
Ｅ．リポソーム組成物を作製する方法
リポソームを調製するための多数の方法が当技術分野で周知である。代表例には、これらに限定されないが、脂質フィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、超音波法、プレ小胞法（ｐｒｅ−ｖｅｓｉｃｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）、エタノール注射法、フレンチプレス法、コール酸除去法、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００バッチ法、Ｃａ２＋融合法、エーテル注射法、アニーリング法、凍結融解法などが含まれる。
【００６７】
リポソーム調製における様々な条件（膜構成成分の量、温度など）は、リポソーム調製方法、標的リポソーム組成、粒径などによって適切に選択することができる。しかし、シクロデキストリンは、リポソームから脂質（特に、コレステロールなど）を除去する効果を有することは公知である。したがって、リポソーム調製物中に使用される脂質の量が、この効果を考慮して設定されることが好ましい。
【００６８】
治療剤／シクロデキストリン複合体は、治療剤（例えば、治療剤を含有する溶液）を滴下添加した後にシクロデキストリン（例えば、シクロデキストリンを含有する溶液）を攪拌および混合するか、または逆の場合も同様にすることによって得ることができる。治療剤の物理的特性によって治療剤として溶媒に溶解した物質または固体物質を使用することが可能である。溶媒に対する特定の制限は存在せず、例えば、リポソーム外相と同一の物質を使用することができる。シクロデキストリンと混合される治療剤の量は、組込みの所望のレベルによって、等モル量または異なる比でよい。一部の実施形態では、治療剤の絶対量は、シクロデキストリンの量に対して０．００１〜１０ｍｏｌ当量、０．０１〜１ｍｏｌ当量、または両端を含む任意の範囲を含めた範囲でよい。また、加熱温度に対する特定の制限は存在しない。例えば、５℃もしくはそれ超、室温もしくはそれ超（例えば、２０℃もしくはそれ超も好ましい）またはリポソームの脂質二重膜の相転移温度もしくはそれ超は、すべて許容される。
【００６９】
リポソーム粒径は、必要に応じて任意選択で調整することができる。例えば、通常の細孔直径のメンブランフィルターを使用して高圧下で押出（押出濾過）を行うことによって、粒径を調整することができる。粒径の調整は、リポソーム組成物の製造の間に任意のタイミングで行うことができる。例えば、粒径の調整は、治療剤／シクロデキストリン複合体をリポソーム内相中に導入する前か、または治療剤／シクロデキストリン複合体をリポソーム内相中に遠隔的に充填した後に行うことができる。
【００７０】
任意の望まれない、または組み込まれなかった複合体または組成物、例えば、シクロデキストリンによってカプセル化されなかった治療剤、もしくはリポソームによってカプセル化されなかった治療剤シクロデキストリン複合体を除去するための周知の方法が存在する。代表例としては、限定することなく、透析、遠心分離、およびゲル濾過が挙げられる。
【００７１】
透析は、例えば、透析膜を使用して行うことができる。透析膜として、分子量カットオフを有する膜、例えば、セルロースチューブまたはＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒを引用することができる。遠心分離に関して、遠心加速度は、任意で、好ましくは１００，０００ｇまたはそれ超で、より好ましくは３００，０００ｇまたはそれ超で行われる。ゲル濾過は例えば、セファデックスまたはセファロースなどのカラムを使用して分子量に基づいて分画を行うことによって実施され得る。
【００７２】
一部の実施形態では、能動的遠隔充填法を使用して、リポソーム内で治療剤／シクロデキストリン複合体をカプセル化することができる。一般に、リポソームの内部空間内のイオン勾配（例えば、滴定アンモニウム（ｔｉｔｒａｔａｂｌｅ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）、例えば、非置換アンモニウムイオン）の存在は、例えば、「能動的」、「遠隔」、または「膜内外勾配駆動」充填の機序によって弱両親媒性基剤の増強されたカプセル化を提供することができる（Ｈａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１９９３年、１１５２巻、２５３〜２５８頁；Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１９９９年、１４１６巻、１〜１０頁）。
【００７３】
例えば、能動的遠隔充填は、膜内外ｐＨ勾配を使用することによって達成することができる。リポソーム内相および外相は、１〜５ｐＨ単位、２〜４ｐＨ単位、０．５ｐＨ単位、１ｐＨ単位、２ｐＨ単位、３ｐＨ単位、３．４ｐＨ単位、４ｐＨ単位、５ｐＨ単位、６ｐＨ単位、７ｐＨ単位、または両端を含む任意の範囲でｐＨが異なる。リポソーム内相または外相は、治療剤のタイプ、および修飾シクロデキストリン上のイオン化可能な基によって、より高いｐＨを有することができる。他方、リポソーム内相および外相がｐＨにおいて差異を実質的に有さない（すなわち、リポソーム外相および内相は、実質的に同じｐＨを有する）場合もまた許容される。
【００７４】
ｐＨ勾配は、ｐＨ勾配法において使用される当技術分野において従来から公知の化合物を使用することによって調整することができる。代表例には、これらに限定されないが、アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびグリシン；酸、例えば、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、炭酸、乳酸、ホウ酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、アジピン酸、塩酸、および硫酸；上記の酸の塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、およびアンモニウム塩；ならびにアルカリ化合物、例えば、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、アンモニア水、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどが含まれる。
【００７５】
多くの異なるイオンを、イオン勾配法において使用することができる。代表例には、これらに限定されないが、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ホウ酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどが含まれる。さらに、イオン勾配法に関して、リポソーム内相のイオン濃度は、治療剤のタイプによって適切に選択することができる。より高いイオン濃度がより好ましく、好ましくは１０ｍＭまたはそれ超であり、より好ましくは２０ｍＭまたはそれ超であり、さらにより好ましくは５０ｍＭまたはそれ超である。リポソーム内相または外相は、治療剤のタイプによってより高いイオン濃度を有することができる。他方、リポソーム内相および外相が、イオン濃度において差異を実質的に有さない、すなわち、リポソーム外相および内相が、実質的に同じイオン濃度を有する場合もまた許容される。イオン勾配はまた、リポソーム外相を置換または希釈することによって調整することができる。
【００７６】
一実施形態では、周知の方法を使用して、リポソームの膜透過性が増強されるステップを加えることができる。代表例には、これらに限定されないが、リポソーム含有組成物を加熱すること、リポソーム含有組成物に膜流動化剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を添加することなどが含まれる。
【００７７】
リポソーム含有組成物、例えば、溶液を加熱する場合、治療剤／シクロデキストリン複合体は一般に、より高い温度に加熱することによってリポソーム内相中により効率的に導入することができる。具体的には、治療剤／シクロデキストリン複合体および用いられるリポソーム膜構成成分の熱安定性を考慮して、加熱の温度を設定することが好ましい。特に、加熱の温度を、リポソームの脂質二重膜の相転移温度またはそれ超に設定することが好ましい。
【００７８】
リポソームの脂質二重膜の「相転移温度」という用語は、高温条件の示差熱分析における熱吸収が開始する温度（吸熱反応が始まる温度）を指す。示差熱分析は、標本および参照物質の温度を変化させる間に、時間または温度の関数として標本および参照物質の間の温度の差異を測定することによって、標本の熱的性質の分析を可能とする技法である。示差熱分析がリポソーム膜構成成分に関して行われる場合、温度が上昇するにつれリポソーム膜構成要素は流動化し、吸熱反応が観察される。吸熱反応が観察される温度範囲は、リポソーム膜構成要素によって大いに変化する。例えば、リポソーム膜構成要素が純粋な脂質からなる場合、吸熱反応が観察される温度範囲は非常に狭く、吸熱反応は吸熱ピーク温度に対して±１℃の範囲内で観察されることが多い。他方、リポソーム膜構成要素が複数の脂質からなる場合、特に、リポソーム膜構成要素が天然材料に由来する脂質からなる場合、吸熱反応が観察される温度範囲は広範となる傾向があり、吸熱反応は、例えば、吸熱ピーク温度に対して±５℃の範囲内で観察される（すなわち、広範なピークが観察される）。リポソーム膜の流動化が増加するため、治療剤／シクロデキストリン複合体の膜透過性は、リポソーム脂質二重膜の相転移温度より高く温度を上げることによって増加する。
【００７９】
例えば、温度範囲は、治療剤／シクロデキストリン複合体および用いられるリポソーム膜構成成分の熱安定性によって決まるが、一部の実施形態では、リポソーム脂質二重膜の相転移温度から＋２０℃、＋１０℃、＋５℃、もしくはそれ未満、またはその間の任意の範囲、例えば、このような相転移温度の＋５℃〜＋１０℃でよい。一般に、加熱温度は通常、２０〜１００℃、４０〜８０℃、４５〜６５℃、およびその間の任意の範囲の範囲でよい。加熱温度は相転移温度より高いか、等しいことが好ましい。
【００８０】
加熱ステップにおいて、温度を相転移温度に、またはそれ超に維持する時間について特定の制限は存在せず、これは例えば、数秒から３０分の範囲内に適正に設定し得る。治療剤および脂質の熱安定性、ならびに効率的な大量生産を考慮して、短時間内に処理を行うことが望ましい。すなわち、高温維持期間が１〜３０分であることが好ましく、２分〜５分がより好ましい。しかし、これらの温度維持時間は、本発明を少しも制限しない。
【００８１】
さらに、上述のように、得られた混合溶液に膜流動化剤を添加する（すなわち、これをリポソームの外相側に添加する）ことによって、リポソーム膜透過性を増強させることも可能である。代表例には、これらに限定されないが、水性溶媒中で可溶性である、有機溶媒、界面活性剤、酵素などが含まれる。代表的な有機溶媒には、これらに限定されないが、一価アルコール、例えば、エチルアルコールおよびベンジルアルコール；多価アルコール、例えば、グリセリンおよびプロピレングリコール；非プロトン性極性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。代表的な界面活性剤には、これらに限定されないが、アニオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸ナトリウム、モノアルキルスルフェート、およびモノアルキルホスフェート；カチオン性界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩；両性界面活性剤、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド；および非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルモノグリセリルエーテル、および脂肪酸ソルビタンエステルが含まれる。代表的な酵素には、これらに限定されないが、コリンエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼが含まれる。当業者は、膜流動化剤の添加、リポソームの安定性などによる治療剤の捕捉の効率の程度を考慮して、リポソーム膜構成成分の組成、膜流動化剤などによって膜流動化剤の量を設定することができる。
【００８２】
本明細書に記載されているリポソーム組成物を作製する方法は、治療剤／シクロデキストリン複合体のカプセル化の前および／または後に、得られたリポソーム組成物のリポソーム外相を調整するステップおよび／または得られたリポソーム組成物を乾燥させるステップをさらに含むことができる。
【００８３】
例えば、液体リポソーム組成物中のリポソーム外相は、液体製剤として使用される場合、調整（置換えなど）して、最終リポソーム組成物を作製することができる。リポソーム組成物が固体調製物へと作製される場合、上記の導入ステップにおいて得られる液体リポソーム組成物を乾燥させて、最終固体リポソーム組成物を作製することができる。冷凍乾燥および噴霧乾燥は、リポソーム組成物を乾燥させるための方法の代表的な非限定的例である。リポソーム組成物が固体調製物である場合、これは適切な溶媒に溶解または懸濁させ、液体製剤として使用することができる。使用のための溶媒は、リポソーム組成物についての使用の目的によって適切に設定することができる。例えば、リポソーム組成物を注射用生成物として使用する場合、溶媒は、注射と適合性の無菌蒸留水または他の溶媒でよい。リポソーム組成物を医薬として使用する場合、医師または患者は、溶媒を、その中に固体調製物が捕捉されているバイアル中に注入し、例えば、使用時に調製物を作製することができる。液体リポソーム組成物が凍結した固体調製物である場合、これを凍結した状態で保存し、室温にてこれを放置して融解させることによるか、またはこれを使用時に熱で急速に融解させることにより、液体状態に戻すことによって、液体製剤として使用することができる。
【００８４】
Ｆ．医薬組成物および投与の方法
本明細書に記載されているリポソーム組成物は、医薬組成物、例えば、医療分野における治療組成物または診断用組成物として使用することができる。例えば、リポソーム組成物は、抗新生物剤を治療剤として組み込むことによって治療組成物として使用することができ、コントラスト剤を治療剤として組み込むことによって診断用組成物として使用することができる。リポソーム組成物はまた、あらゆる他の目的、例えば、化粧品のために、または食品添加物として使用することができる。
【００８５】
典型的には、本発明のリポソーム医薬組成物は、液体溶液または懸濁液として、局所剤（ｔｏｐｉｃａｌ）または注射剤として調製される。しかし、注射前の液体ビヒクル中の溶液、または懸濁液に適した固体形態も調製することができる。組成物はまた、当技術分野で公知の方法によって腸溶コーティング錠剤またはゲルカプセル剤に製剤化することができる。
【００８６】
本発明のリポソーム組成物が医薬組成物として使用される場合、リポソーム組成物は、注射（静脈内、動脈内、もしくは局所注射）によって、経口的、経鼻、皮下、肺、または点眼薬によって投与することができ、特に、細胞もしくは臓器の標的化された群への局所注射、または他のこのような注射が、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および動脈内注射に加えて好ましい。経口投与の場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、液剤などを、リポソーム組成物の製剤の例として与え得る。非経口投与の場合、注射用生成物、点滴注入、点眼薬、軟膏剤、坐剤、懸濁液剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール、硬膏剤などは、リポソーム組成物の製剤の例として与えることができ、注射用生成物および点滴注入剤が特に好ましい。
【００８７】
リポソーム組成物が化粧品として使用されるとき、化粧品の形態として、例えば、ローション、クリーム、トナー、保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ）、フォーム、ファンデーション、リップスティック、顔用パック、皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリームなどを引用し得る。
【００８８】
物質、例えば、治療用実体を動物または細胞に「投与すること」という用語は、意図する標的に物質を投薬（ｄｉｓｐｅｎｓｅ）、送達、または塗布することを指すことを意図する。治療剤に関して、用語「投与すること」は、処置される状態または傷害によって決まり得る医学的に許容される任意の方法を含めた、動物における所望の場所への治療剤の送達のための任意の適切な経路によって、動物に治療剤を接触または投薬、送達または塗布することを指すことを意図する。可能な投与経路は、非経口経路、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、硬膜内、髄腔内、またはその他による注射、ならびに経口、経鼻、眼、直腸、膣、局部、または肺、例えば、吸入を含む。中枢神経系の腫瘍への本発明によって製剤化されるリポソームによる薬物の送達のために、腫瘍中への直接のリポソームのゆっくりとした持続性頭蓋内注入（対流−増強送達、またはＣＥＤ）は、特に有利なものである（Ｓａｉｔｏら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４巻：２５７２〜２５７９頁；Ｍａｍｏｔら（２００４年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６８巻：１〜９頁）。組成物はまた、組織表面に直接塗布することができる。持続放出、ｐＨ依存性放出、または他の特定の化学的もしくは環境条件が媒介する放出投与はまた、例えば、デポー注射、または侵食性インプラントなどの手段によって本発明に特に含まれる。
【００８９】
投与に際し、医薬組成物の投与量は、他の要因と共に、標的疾患のタイプ、治療剤のタイプ、ならびに患者の年齢、性別、および体重、症状の重症度に依存して異なり得る。リポソーム内にカプセル化された任意の所与の治療剤および所与の患者についての適当な用量レジメンの決定は、十分に主治医の技能の範囲内であることを理解すべきである。例えば、治療有効用量を送達するのに必要とされるリポソーム医薬組成物の量は、薬物試験の技術分野で一般である慣例的なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの方法によって決定することができる（例えば、Ｄ．  Ｂ．  Ｂｕｄｍａｎ、Ａ．  Ｈ．  Ｃａｌｖｅｒｔ、Ｅ．  Ｋ．  Ｒｏｗｉｎｓｋｙ（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＬＷＷ、２００３年）。
【００９０】
代わりに、主治医は、遊離形態で投与したときの所与の薬物についての推奨用量に依存することができる。一般に、様々な治療用実体についての治療有効投与量は、当業者には周知である。典型的には、本発明のリポソーム医薬組成物についての投与量は、１キログラムの体重当たり約０．００５〜約５００ｍｇの間の治療用実体、殆どの場合、約０．１〜約１００ｍｇの間の治療用実体／体重ｋｇの範囲である。
【００９１】
Ｇ．キット
本発明によれば、キットが、リポソーム組成物を調製するために提供される。キットを使用して、リポソーム組成物を治療剤または診断剤として調製することができ、これを臨床現場における医師もしくは技術者、または患者が使用することができる。
【００９２】
キットは、リポソーム試薬を含む。リポソーム試薬は、固体または液体形態でよい。リポソーム試薬が固体形態である場合、リポソーム試薬を適当な溶媒に溶解または懸濁させ、リポソームを得ることができ、上記のリポソーム分散液を乾燥させ、リポソーム試薬を得ることができる。乾燥は、リポソーム組成物の上記の乾燥と同様に実施することができる。キットを使用するとき、リポソーム試薬が固体形態である場合、リポソーム試薬を適当な溶媒に溶解または懸濁させ、リポソーム分散液を作製することができる。これを行うとき、溶媒は、上記のリポソーム分散液中のリポソーム外相と同様である。
【００９３】
本発明のキットは好ましくは、治療剤をさらに含有する。治療剤は、固体または液体形態（溶媒に溶解もしくは懸濁した状態）でよい。キットを使用するとき、治療剤が固体形態である場合、これを適当な溶媒に溶解または懸濁させ、液体形態を作製することが好ましい。溶媒は、治療剤の物理的特性などによって適切に設定することができ、例えば、上記のリポソーム分散液中のリポソーム外相と同様に作製し得る。
【００９４】
キットにおいて、リポソーム試薬および治療剤は別々にパッケージ化することができるか、またはこれらは固体形態で、一緒に混合し得る。
【００９５】
リポソーム試薬および治療剤が両方とも固体形態であり、一緒にパッケージ化される場合、リポソーム試薬および治療剤の混合物は、溶媒に適切に溶解または懸濁される。これを行うとき、溶媒は、上記のリポソーム分散液中のリポソーム外相と同様である。それによって、リポソーム分散液および治療剤が混合される状態を形成することが可能であり、この後、上記のリポソーム組成物の製造方法におけるリポソーム分散液のリポソーム内相中の治療剤の導入において他のステップを実施することによって使用が可能となる。
【００９６】
別の実施形態では、キットは、使用のための指示を含めた、本明細書に記載されているリポソーム組成物を含むことができる。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例を、本開示の主題の代表的な実施形態を実行するための指針を当業者に提供するために含めた。本開示および当技術分野における技能の一般的なレベルを踏まえると、当業者は、以下の実施例が、単に例示的であるように意図されており、多数の変化、改変、および変更を、本開示の主題の範囲から逸脱することなく用いることができることを認識することができる。以下の実施例を、例示として、かつ限定の目的でなく提供する。
【００９８】
実施例１：実施例２〜４についての材料および方法
Ａ．イオン化可能なβ−シクロデキストリンの合成のための一般的な方法
β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、第一級６’ヒドロキシル基においてピリジン中の０．９モル当量の塩化トシルでモノトシル化し、対応するトシレートを得て、これをアセトン中のヨウ化ナトリウムによる処理によってヨード誘導体に変換した。ヨード誘導体を、８０℃にて８〜１２時間適当なアミンと共に加熱することによって、所望のアミノ化シクロデキストリンに変換した（ＴａｎｇおよびＮｇ（２００８年）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．  ３巻：６９１〜６９７頁）。６’−モノ−スクシニル−β−シクロデキストリンを、ＤＭＦ中の０．９当量の無水コハク酸による親β−シクロデキストリンの処理によって合成した（Ｃｕｃｉｎｏｔｔａら（２００５年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌ．  ３７巻：１００９〜１０１４頁）。生成物がアセトン中で沈殿し、使用前にＨＰＬＣによって精製した。６’，６’，６’，６’，６’，６’，６’−ヘプタキス−スクシニル−β−シクロデキストリンを、ＤＭＦ中の過剰な無水コハク酸による処理によってβ−シクロデキストリンから合成し、アセトンと共に沈殿させた。分別結晶によって、所望の化合物を約８５％の純度で得た。
【００９９】
ダンシル化シクロデキストリンＩ、ＩＶ、およびＶを、ピリジン中の０．９モル当量の塩化ダンシルで処理することによって、それぞれ、市販のβ−シクロデキストリンおよび化合物ＩＩおよびＩＩＩから合成した。
【０１００】
各中間体および最終生成物を、分取Ｃ１８カラム、および溶媒Ａ（水）中の０〜９５％溶媒Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を使用してＨＰＬＣによって精製した。すべてのシクロデキストリンを、１Ｈ  ＮＭＲおよびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳによって特徴付け、従前に公開された参照文献とマッチした。
【０１０１】
６’，６’，６’，６’，６’，６’，６’−ヘプタキス−アミノ−β−シクロデキストリンはＣＴＤ  ｈｏｌｄｉｎｇｓから購入し、それ以上精製することなく使用した。
【０１０２】
ＢＩ−２５３６（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２００４年）ＷＯ公開済み特許出願第２００４−０７６４５４号）およびＰＤ−０３２５９０１（Ｗａｒｍｕｓら（２００８年）Ｂｉｏｏｒｇａ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １８巻：６１７１〜６１７頁）を、従前に記載されたように合成した。
【０１０３】
Ｂ．リポソームの調製のための一般的な手順
水素化卵ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）（モル比、５０：４５：５）を、クロロホルム（２０ｍｌ）に溶解した。溶媒を真空中で除去し、薄い脂質フィルムを得て、適当な緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４；２００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ４．０；または８０ｍＭのＡｒｇ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ９．０）中で５０℃にて２時間振盪することによってこれを湿潤化（ｈｙｄｒａｔｅ）させた。小胞懸濁液を３０分間超音波処理し、次いで、逐次的に０．４μｍ、０．２μｍ、および０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈ膜）を通して５０℃にて押出し、最終リポソームを得た。次いで、膜内外勾配を、３００ｍＭのスクロースまたはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対するリポソームの平衡透析によって一晩生じさせた。次いで、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で動的光散乱（ＤＬＳ）によって６３３ｎｍの波長および９０°検出角度にて平均サイズおよび多分散性指数を測定した。
【０１０４】
Ｃ．リポソームの受動的充填についてのプロトコール
方法１：脂質層中のＢＩ−２５３６のカプセル化。水素化卵ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）（モル比５０：４５：５）を、クロロホルム（２０ｍＬ）に溶解した。１０ミリグラムのＢＩ−２５３６（１ｍＬのクロロホルム中）を添加し、溶媒を蒸発させ、薄いフィルムを生じさせた。１ミリリットルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、脂質層を湿潤化させ、混合物を５０℃にて２時間上記のように振盪した。小胞懸濁液を３０分間超音波処理し、次いで、０．４μｍ、０．２μｍ、および０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ；Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ  Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ膜）を通して５０℃にて逐次的に押出し、所望のサイズで低い多分散性を有する最終リポソームを得た。次いで、リポソームをＰＢＳ中で一晩透析し、捕捉されていない薬物を除去した。次いで、平均サイズおよび多分散性指数を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚ９０で動的光散乱実験によって測定した。等容量のメタノールでリポソームを破裂させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００でＵＶ−ｖｉｓ吸光度を測定することによって、薬物含量を計算した。
【０１０５】
方法２：ＢＩ−２５３６の水性製剤による脂質層の湿潤化。水素化卵ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）（モル比５０：４５：５）をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶解し、溶媒を真空中で蒸発させ、薄いフィルムを生じさせた。１ミリリットルの水性ＢＩ−２５３６（４ｍｇ；ｐＨ５．５）を添加して脂質層を湿潤化させ、混合物を上記のように５０℃にて２時間振盪した。小胞懸濁液を３０分間超音波処理し、次いで、０．４μｍ、０．２μｍ、および０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ；Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ  Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ膜）を通して５０℃にて逐次的に押出し、所望のサイズで低い多分散性を有する最終リポソームを得た。次いで、リポソームをＰＢＳに対して一晩透析し、捕捉されていない薬物を除去した。次いで、平均サイズおよび多分散性指数を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚ９０で動的光散乱実験によって測定した。等容量のメタノールでリポソームを破裂させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００でＵＶ−ｖｉｓ吸光度を測定することによって、薬物含量を計算した。
【０１０６】
Ｄ．カプセル化された複合体の調製の一般的な手順
等モル量の薬物（０．１ｍｍｏｌ；３０〜５０ｍｇ）および適当なシクロデキストリン（０．１１ｍｍｏｌ；１１０〜１８５ｍｇ）を、それぞれ、メタノール（概ね飽和している；約１〜２ｍＬ）および脱イオン水（約１０〜２０ｍｇ／ｍＬ）に別々に溶解した。次いで、薬物のメタノール性溶液をシクロデキストリン溶液中で攪拌しながら滴下添加し、均一な懸濁液を確実にした。次いで、エッペンドルフサーモミキサーＲを使用して、この懸濁液を５５℃にて３６〜４８時間振盪した。溶液を濾過して、微粒子状物質を除去し、ドライアイス／アセトン浴中でフラッシュ凍結し、それに続いて凍結乾燥した。凍結乾燥した複合体を、−２０℃にてさらなる使用まで保存した。
【０１０７】
Ｅ．リポソームの遠隔充填のための一般的プロトコール
上記の凍結乾燥した粉末複合体を微粉砕し、適当なリポソーム溶液（５〜８ｍｇ／ｍＬ濃度の充填比を達成するために、６ｍＬのリポソーム溶液中の３０〜４０ｍｇの薬物当量）と共に１時間６５℃にてインキュベートした。これらを１，０００×ｇで３分間遠心分離し、微粒子状物質を除去し、次いで、３００ｍＭのスクロースまたは市販のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に対して一晩透析し、リポソーム中に充填されなかった材料を除去した。リポソーム製剤のサイズ分布を、上記のＭａｌｖｅｒｎ  ＺＳ９０機器を使用して特徴付けた。リポソーム中のＢＩ−２５３６およびＰＤ−０３２５９０１の濃度を、等容量のメタノールでのリポソーム溶液の破壊の後で、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１００を使用して、ＢＩ−２５３６について３６７ｎｍで、およびＰＤ−０３２５９０１について２７７ｎｍで３連で測定した。
【０１０８】
Ｆ．組織体内分布研究
クマリン３３４を薬物代用物として使用して、シクロデキストリンカプセル化リポソームの体内分布および薬物動態を評価した。クマリン３３４（３ｍｇ）をメタノール（６ｍＬ）に溶解し、シクロデキストリンＶＩの水溶液（２０ｍＬの水中１４ｍｇ）に滴下添加した。溶液を５５℃にて４８時間振盪し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末を、クエン酸リポソーム（内部ｐＨ４．０）と共に６５℃にて１時間インキュベートした。リポソーム溶液をＰＢＳに対して一晩透析した。充填効率を評価するために、１００μＬのリポソームを１００μＬのメタノールで破壊し、蛍光について分析した。充填効率は、９０％であると見出された。ＨＣＴ１１６皮下異種移植片を担持する雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｍａｃｄｉａｒｍｉｄら（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１巻：４３１〜４４５頁に記載されている修正されたプロトコールに従った研究において使用した。腫瘍容積が４００〜６００ｍｍ３に達したとき、１２匹のマウスを、２００μＬのシクロデキストリンにカプセル化された、リポソーム（ＣＹＣＬ−）のクマリン３３４（０．５ｍｇ／ｍＬ）で静脈内（ｉ．ｖ．）に処置した。処置後、４匹のマウスを２時間、２４時間、および４８時間の時点で安楽死させ、腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、心臓、および肺を切除し、秤量した。血液も収集し、血漿を分離し、４℃で保存した。血漿を除いて、それぞれの凍結した組織をホモジナイズし、０．９％食塩水中で超音波処理した［組織質量（ｍｇ）の３×容量（μＬ）］。メタノールを、ボルテックスしながら３３％の最終容量（ｖｏｌ／ｖｏｌ）まで添加した。試料を遠心分離し（６，０００×ｇ、１０分間）、上清中の蛍光を、励起４８５ｎｍ／放出５３０ｎｍを使用してＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ＩＩ蛍光マルチウェル（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ）プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。組織自己蛍光についての対照として、等容量の空のリポソームで処置された腫瘍担持動物を安楽死させ、それらの組織および血漿を回収した。
【０１０９】
Ｇ．Ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス処置
雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部の皮下（ｓ．ｃ．）に５百万個のＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）、ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）、またはＲＫＯ細胞を注射し、３週間成長させ、容量を３００〜４００ｍｍ３に到達させた。ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６の場合、動物を次いで４つのアームにランダムに隔離した。すべての場合において、リポソーム製剤（ＣＹＣＬ−薬物）は、遊離薬物の同等物として報告した。２週間の過程にわたって、第１のアームは空のリポソームを受容し、第２のアームは単回用量の遊離薬物の１００ｍｇ／ｋｇ製剤を、文献に報告されている製剤を使用して２回受容し（０日目および７日目）、第３および第４のアームはそれぞれ、１００ｍｇ／ｋｇおよび４００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６リポソーム製剤を同じ時点で受容した。腫瘍容積を４８時間毎に記録した。それぞれの群についての平均腫瘍サイズを、処置の最初の日に腫瘍容積に正規化した。ＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１の場合、第１のアームは空のリポソームで０日目および８日目に２回処置され、一方、他の２つのアームは、それぞれ、遊離ＰＤ−０３２５９０１およびＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１の２用量を同じ時点で投与された。実験の転帰を明確にするために、データは０日目の腫瘍容積に正規化した各群の平均腫瘍サイズとして提示する。各場合において腫瘍退縮実験を終了し、対照動物の腫瘍が２，０００ｍｍ３に達したとき、動物を安楽死させた。
【０１１０】
実施例２：リポソーム中への化学修飾されたβ−シクロデキストリンの遠隔充填
それらの６’位においてイオン化可能な基を担持する一組の修飾β−シクロデキストリンを設計し、合成した（図２）。類似体ＩＩ〜Ｖにおいて、６’第一級ヒドロキシル部分をアミノ基、エチレンジアミノ基、またはいずれかの蛍光性バージョンに修飾し、一方では、類似体ＶＩＩＩは、その位置におけるスクシニル基の導入を伴った。残りの類似体（ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸ）は、アミノ、エチレン−ジアミノ、またはスクシニル部分で置き換えられている７つの第一級ヒドロキシルのすべてを有した。すべての類似体をＨＰＬＣによって精製し、ＭＳおよびＮＭＲスペクトルによって特徴付けた。適当な陰性対照を、イオン化可能な基を含有しない同様のサイズの化学修飾を導入することによって合成した。
【０１１１】
２つの蛍光性（ダンシル化）シクロデキストリン（化合物ＩＶおよびＶ）を、リポソーム中に充填されるこれらの能力について試験した。リポソームを、２００ｍＭのクエン酸緩衝液で脂質フィルムを湿潤化させることによって生じさせ、そのためそれらの内部ｐＨは４．０であった。次いで、これらのリポソームをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、リポソームの外側からクエン酸塩を除去し、次いでＰＢＳに溶解しているシクロデキストリンと共に６５℃にて１時間インキュベートした。対照として、ＰＢＳを充填したリポソームを、クエン酸塩の代わりにＰＢＳで脂質フィルムを再び湿潤化することによって生じさせた。比較的高温（６５℃）でのインキュベーションによって、脂質二重層の流動性が増強され、そのためシクロデキストリンがこれを横切ることが可能となった。次いで、懸濁液をＰＢＳ中で一晩透析し、リポソーム中に組み込まれていないシクロデキストリンを除去し、ダンシル蛍光について分析した。これらの実験は、これらのシクロデキストリンのそれぞれの＞９０％がリポソーム中に捕捉されたことを示した（例えば、図３Ａおよび４を参照）。ｐＨ勾配の非存在下で、リポソーム中への同じ化合物の組込みはほとんど存在しなかった（図３Ａ）。光散乱によって、事前形成された「空」のリポソームが、狭い多分散性指数（＜０．１０）を伴う９８ｎｍの平均直径を有したことが示された（図３Ｂ）。シクロデキストリンの組込みは、多分散性指数を変化させることなく平均直径を１０５ｎｍに僅かに増加させただけであった（図３Ｃ）。低温透過型電子顕微鏡法によって、シクロデキストリンの組込み後のリポソームの構造が、リポソーム内の密度の増加を除いて変化しなかったことが明らかにされたが、これは、これらの中の高濃度のシクロデキストリンを恐らく反映する（図３Ｃ）。対照的に、膜内外ｐＨ勾配を有さない対照ＰＢＳ含有リポソームと共にインキュベートしたシクロデキストリンは、不規則形状の大きな小胞をもたらしたが、これらの中のシクロデキストリン組込みについての証拠はない（図３Ｄ）。対照リポソームで観察された形状の変化は恐らく、リポソーム構造の不安定化および「膨張」をもたらす、シクロデキストリンと脂質二重層との会合によるものであった。
【０１１２】
実施例３：化学修飾されたβ−シクロデキストリン内にカプセル化され、そしてリポソームに運搬される小さな疎水性化合物
有機色素（クマリン）を使用して、修飾シクロデキストリンが、疎水性化合物をカプセル化し、リポソーム二重層を横切って輸送し得るかどうかを決定した。クマリンは非常に疎水性であり、６’−モノ−エチレンジアミノ−６’−デオキシ−シクロデキストリン（化合物ＩＩＩ）中にカプセル化された後に水溶解度の劇的な改善が観察された。クマリンをカプセル化する最も効率的および便利な方法は冷凍乾燥によることであることが決定された（Ｃａｏら（２００５年）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄｕｓｔｒ．  Ｐｈａｒｍ．  ３１巻：７４７〜７５６頁；Ｂａｄｒ−Ｅｌｄｉｎら（２００８年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ７０巻：８１９〜８２７頁）。クマリンの溶解度は、この手順によって少なくとも１０倍から２０倍（１００μｇ／ｍＬから１〜２ｍｇ／ｍＬ）増加した。溶解すると、シクロデキストリン−クマリン複合体を、化合物を二重層を横切って駆動させるｐＨ勾配を使用して、正確に上記のような事前形成されたリポソームと共にインキュベートした。組み込まれていない複合体を除去する一晩の透析に続いて、リポソームを引き続いてメタノールで破壊し、クマリン蛍光を測定した。蛍光分光法によって示されるように、すべてのシクロデキストリン−色素複合体は、高効率でリポソーム中に組み込まれた（＞９５％；図５）。この高度に効率的な充填が、実際、脂質膜を横切る複合体の能動輸送によるものであって、増強された水溶解度のみによるものでないことを確認するために、シクロデキストリンの非存在下でのクマリン３１４の充填効率を評価し、同一の条件下でこれはリポソーム中に不十分にしか組み込まれなかったことが見出された（図６）。重要なことに、色素の実質的に増加した水溶解度にも関わらず、イオン化不能な天然β−シクロデキストリン内にカプセル化されたクマリン３１４は、充填効率を僅かしか改善しなかった。クマリン−シクロデキストリンリポソームは鮮黄色であり、一方、対照リポソーム（例えば、シクロデキストリンなしで作製）は無色であったため、リポソーム中へのクマリン色素の組込みは、肉眼によって容易に識別された（図５Ａ〜５Ｃ）。
【０１１３】
実施例４：化学修飾されたβ−シクロデキストリン内にカプセル化され、そしてリポソーム中へ運搬される化学療法剤
アミノ−官能化シクロデキストリンがＢＩ−２５３６のリポソーム製剤を生じさせる能力を決定した（図７）。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍによって開発されたＢＩ−２５３６は、有糸分裂の適正な遂行のために必要とされる酵素であるポロ様キナーゼ（ＰＬＫ１）の高度に選択的な阻害剤である（Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒら（２００７年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １７巻：３１６〜３２２頁；Ｌｅｎａｒｔら（２００７年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １７巻：３０４〜３１５頁；およびＳｔｅｗａｒｔら（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３９巻：３３０〜３３８頁）。ＢＩ−２５３６は、がん細胞、特に、ＴＰ５３において変異を抱えるものに対して強力な殺腫瘍性活性を有することが示された（Ｓｕｒら（２００９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６巻：３９６４〜３９６９頁；Ｓａｎｈａｊｉら（２０１３年）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １２巻：１３４０〜１３５１頁；Ｍｅｎｇら（２０１３年）Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  １２８巻：４６１〜４６９頁；およびＮａｐｐｉら（２００９年）Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ６９巻：１９１６〜１９２３頁）。ＢＩ−２５３６は、肺、乳房、卵巣、および子宮のがんを有する患者におけるいくつかの臨床治験の被験体であった（Ｍｒｏｓｓら（２０１２年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃ．  １０７巻：２８０〜２８６頁；Ｅｌｌｉｓら（２０１３年）Ｃｌｉｎ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃ．  １４巻：１９〜２７頁；Ｈｏｆｈｅｉｎｚら（２０１０年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  １６巻：４６６６〜４６７４頁；Ｓｅｂａｓｔｉａｎら（２０１０年）Ｊ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｏｎｃｏｌ．  ５巻：１０６０〜１０６７頁；Ｓｃｈｏｆｆｓｋｉら（２０１０年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃ．  ４６巻：２２０６〜２２１５頁；およびＭｒｏｓｓら（２００８年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２６巻：５５１１〜５５１７頁）。これはがん患者における有効性の証拠を示したが、その開発は、第ＩＩ相治験により治療量以下の用量での許容されない毒性（グレード４の好中球減少）が明らかとなった後に放棄された。
【０１１４】
本明細書において、アミノ化シクロデキストリンＶおよびＶＩは、ＢＩ−２５３６の水溶解度を劇的に改善させたことが決定された。クマリンと同様に、ＢＩ−２５３６複合体は、化合物ＶＩを使用してリポソーム中に再現性よく充填可能であることが決定され、１０ｍｇ／ｍＬの薬物を含有する安定的な水溶液を達成した。比較すると、遊離ＢＩ−２５３６の最大水溶解度は、０．５ｍｇ／ｍＬであると決定された。ＢＩ−２５３６のシクロデキストリンにカプセル化されたリポソーム（ＣＹＣＬ）形態の活性を評価するために、それらの効果を、ヒトＨＣＴ１１６結腸直腸がん細胞の皮下異種移植片を担持するヌードマウスにおいて評価した。ＨＣＴ１１６細胞をマウスの皮下に注射した３週間後に、マウスを空のリポソーム、遊離ＢＩ−２５３６、またはＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６で処置した。処置の開始において、腫瘍は既に比較的大きく、平均して約３００ｍｍ３であり、小さな腫瘍より臨床的症状をより緊密に模倣した。遊離薬物を静脈内（ｉｖ）に１２５ｍｇ／ｋｇで投与したときに、重度の急性毒性が明らかであった。マウスは数分以内に嗜眠状態となり、それらの目はガラス状となり、逆立てた毛皮が示され、数時間後に死亡した（図８Ａ）。僅かにより低い用量の遊離ＢＩ−２５３６（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスは薬物投与の直後にいくらか嗜眠状態であったが、生存した。しかし、末梢ＷＢＣの劇的な減少として顕在化する遅延毒性は、遊離薬物投与後の２４〜３６時間以内に明らかであった。このタイプの毒性は、ヒト臨床治験において観察されるものと同一であった（Ｍｒｏｓｓら（２００８年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２６巻：５５１１〜５５１７頁；Ｆｒｏｓｔら（２０１２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．  １９巻：ｅ２８〜３５頁；およびＶｏｓｅら（２０１３年）Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍ．  ５４巻：７０８〜７１３頁）。骨髄には毒性ではあるが、遊離ＢＩ−２５３６は有意な抗腫瘍応答を誘発することができ、その最大耐用量（ＭＴＤ）での２用量の後に、腫瘍成長を約３０％遅延させる（図７Ｂ）。この有効性は、他のマウスモデルにおいて従前に観察されたが（Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒら（２００７年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １７巻：３１６〜３２２頁；Ｎａｐｐｉら（２００９年）Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ６９巻：１９１６〜１９２３頁；Ａｃｋｅｒｍａｎｎら（２０１１年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  １７巻：７３１〜７４１頁；Ｇｒｉｎｓｈｔｅｉｎら（２０１１年）Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ７１巻：１３８５〜１３９５頁；Ｌｉｕら（２０１１年）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃ．  Ｄｒｕｇｓ  ２２巻：４４４〜４５３頁；およびＤｉｎｇら（２０１１年）Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ７１巻：５２２５〜５２３４頁）、これは臨床治験の理論的根拠を提供した。
【０１１５】
ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、毒性および有効性の両方に関して、遊離形態よりはるかに優れていることが証明された。ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、５００ｍｇ／ｋｇの用量でさえ、注目すべき有害反応を何ら生じかった。この用量は、すべての動物を死滅させた遊離薬物の用量より４倍高かった（図８Ａ）。１００ｍｇ／ｋｇの用量（遊離薬物のＭＴＤと等しい）で、ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、有意に改善された腫瘍応答を誘発し、２用量のみの後で腫瘍成長を概ね８０％遅延させた（図８Ｂ）。４００ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、より遅い成長だけでなく、腫瘍の部分的退縮ももたらした（図８Ｂ）。同等の用量の遊離ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６は、この量に近い用量でさえマウスは生存することができなかったため、投与することができなかった（図８Ｂ）。さらに、ＷＢＣの減少は非常により低かったため、比較的少ない骨髄毒性がＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６による処置からもたらされ、動物に危険をもたらさなかった（図８Ｃ）。最終的に、ＣＹＣＬ−ＢＩ−２５３６が、遺伝的に不活化されたＴＰ５３対立遺伝子を有する第２のヒト結腸直腸がんモデルであるＨＣＴ１１６細胞に対して、遊離薬物より非常に大きな有効性を有したことが決定された。どちらの場合も、有意な退縮が薬物のＣＹＣＬ−形態で観察されたが、遊離薬物では観察されなかった。
【０１１６】
ＣＹＣＬリポソームの体内分布および薬物動態を確立するために、シクロデキストリンＶＩ中にカプセル化したクマリン３３４を充填したリポソームを使用して、ＨＣＴ１１６担持マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって処置した。処置後２時間、２４時間、および４８時間で回収した主要な組織からの試料を、それらの蛍光について分析した。予想どおりに、クマリン３３４は、処置後４８時間で検査した組織の大部分から取り除かれた。重要なことに、リポソーム中にカプセル化された薬剤は、血液および腫瘍中で残り続けたが、これはペグ化されたリポソームの典型的な薬物動態と一致する（図９）。
【０１１７】
シクロデキストリンをベースとする充填方法をまた、リポソーム中に疎水性および不溶性薬剤を捕捉する最も一般的な手法と比較した。最初に、脂質二重層におけるＢＩ−２５３６の直接の捕捉を試みた。ＢＩ−２５３６を水素化卵ホスファチジルコリン−コレステロール−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）と共に同時蒸発させ、薄いフィルムを調製し、これを１ｍＬのＰＢＳと共に引き続いて湿潤化させ、７００ｐｓｉで１００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押出し、小型単層小胞（平均粒径（Ｚａｖｇ）１２６ｎｍ；ＰＤＩ０．０９）を調製した。捕捉されていない薬物を除去するためのＰＢＳに対する一晩の透析によって、薬物含有リポソームは、急速に膨潤し（Ｚａｖｇ５３９ｎｍ；ＰＤＩ０．４９）、捕捉された薬物の概ね９０％を放出した。第２に、脂質フィルムを、ＢＩ−２５３６の水性製剤と共に湿潤化させた（受動的充填）。脂質フィルムの湿潤化、それに続く押出および透析によって、安定的なリポソームがもたらされた。しかし、カプセル化の効率は、本明細書に記載されている修飾シクロデキストリンで達成可能なものより＜１０％、２０分の１だった。
【０１１８】
この手法の普遍性をさらに実証するために、Ｐｆｉｚｅｒによって開発されたが、第２相治験において網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）をもたらしたため放棄されたマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１（ＭＥＫ１）阻害剤であるＰＤ−０３２５９０１を評価した（Ｂｒｏｗｎら（２００７年）Ｃａｎｃ．  Ｃｈｅｍｏ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５９巻：６７１〜６７９頁；ＬｏＲｕｓｓｏら（２０１０年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  １６巻：１９２４〜１９３７頁；Ｈａｕｒａら（２０１０年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  １６巻：２４５０〜２４５７頁；およびＨｕａｎｇら（２００９年）Ｊ．  Ｏｃｕｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．  ２５巻：５１９〜５３０頁）。アミノ化シクロデキストリン（図２、化合物ＶＩおよびＶＩＩ）、ならびにスクシニル化シクロデキストリン（図２、化合物ＶＩＩＩおよびＩＸ）について、ＰＤ−０３２５９０１をカプセル化し、これらをそれぞれ、酸性または塩基性リポソーム中に充填するそれらの能力について試験した。遊離薬物は非常に不溶性であり（水中で０．１ｍｇ／ｍＬ）、その溶解度はシクロデキストリン中へのカプセル化の後に概ね４０倍増加した。最良のリポソーム充填はスクシニル化シクロデキストリンＩＸで達成され、この製剤を、ＢＩ−２５３６について上記のようなヒト腫瘍異種移植片を担持する動物において試験した。ＢＩ−２５３６と同様に、ＰＤ−０３２５９０１複合体は、リポソーム中に再現性よく充填可能であり、５ｍｇ／ｍＬの薬物を含有する安定的な溶液を達成した。
【０１１９】
ＰＤ−０３２５９０１のシクロデキストリン複合体化リポソーム（ＣＹＣＬ）形態の活性を評価するために、これらの効果をＲＫＯ異種移植片モデルにおいて分析した。遊離薬物では、重度の急性毒性が明らかであった。従前の研究において、遊離薬物はその溶解度が静脈内投薬のために十分でないため、経口胃管栄養法によって投与した。２００ｍｇ／ｋｇでの経口胃管栄養法の後、処置された動物は数分以内に嗜眠状態であり、次の数時間にわたって、動物は体を丸め、必ず２４時間内に死亡した（図１０Ａ）。僅かにより低い用量の遊離ＰＤ−０３２５９０１（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスは、投薬の直後に同様の症状を示したが、２４時間の間に回復した。しかし、遊離ＰＤ−０３２５９０１の単回用量は劇的な抗腫瘍応答を誘発することができず、腫瘍成長を約５％のみ遅延させた（図１０Ｂ）。この結果は、他のマウスのモデルにおいて従前に報告されたものと一致した。より高い有効性の遊離薬物は、複数回用量を必要とした。
【０１２０】
対照的に、ＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１は、遊離薬物よりはるかに優れていることが証明された。５００ｍｇ／ｋｇの用量でさえ、ＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１は、注目すべき有害反応を何ら生じなかった。この用量は、すべての動物を死滅させた遊離薬物の用量より２．５倍高かった（図１０Ａ）。２５０ｍｇ／ｋｇの単回用量で、ＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１は、腫瘍のより遅い成長だけでなく、部分的退縮ももたらした（図１０Ｂ）。最終的に、ＣＹＣＬ−ＰＤ−０３２５９０１を、２つの他のヒト結腸直腸がんモデル（遺伝的に不活化されたＴＰ５３対立遺伝子を有するＨＣＴ１１６およびその同遺伝子系対応物）に対して評価し、遊離薬物と比較してより高い有効性およびより低い毒性が同様に観察された（図１１）。
【０１２１】
上記の結果は、それらの外面上にイオン化可能な基を有する修飾シクロデキストリンを用いることに基づく、リポソーム中に疎水性薬物を充填するための一般的戦略を実証する（図２）。これらのシクロデキストリンの「ポケット」は、疎水性薬物をカプセル化し、単純なｐＨ勾配を使用してこれらを従来のリポソームの二重膜を横切って運ぶことができる。クマリン色素および有望な臨床的に重要な薬物を含めて多くのタイプの化合物は、修飾シクロデキストリン中へと首尾よくカプセル化することができることが本明細書において実証されてきた（図３、５、８、および１０）。この組込みはすべてのこれらの化合物の水溶解度を劇的に増加させただけでなく、これらがリポソーム中に遠隔的に充填されることを可能とした。さらに、充填されたリポソームは、がんのマウスモデルにおいて試験したとき、実質的により少ない毒性（図８）およびより大きな活性（図８および１０）を示した。
【０１２２】
シクロデキストリン封入複合体とリポソームとを組み合わせる従前の試みは、不溶性薬物の受動的充填（Ｚｈｕら（２０１３年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６５巻（８号）：１１０７〜１１１７頁；Ｍａｌａｅｋｅｈ−ＮｉｋｏｕｅｉおよびＤａｖｉｅｓ（２００９年）ＰＤＡ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３巻：１３９〜１４８頁；Ｒａｈｍａｎら（２０１２年）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  １９巻：３４６〜３５３頁；Ａｓｃｅｎｓｏら（２０１３年）Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２３巻：２１１〜２１９頁；Ｄｈｕｌｅら（２０１２年）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８巻：４４０〜４５１頁；Ｌａｐｅｎｄａら（２０１３年）Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９巻：４９９〜５１０頁；ならびにＭｅｎｄｏｎｃａら（２０１２年）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．  １３巻：１３５５〜１３６６頁）または可溶性薬物の能動的充填（Ｍｏｄｉら（２０１２年）Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６２巻：３３０〜３３９頁）に限定された。受動的充填は望ましくない膜組込みをもたらすことが多く、リポソームの安定性を低下させ、能動的充填よりもはるかに非効率的である。例えば、本明細書に記載されている手法によって達成される薬物対脂質比は、０．４から０．６の範囲であったが、これは受動的充填によって一般に達成される薬物対脂質比より１，０００倍超高い（Ｚｈｕら（２０１３年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６５巻（８号）：１１０７〜１１１７頁；Ｍａｌａｅｋｅｈ−ＮｉｋｏｕｅｉおよびＤａｖｉｅｓ（２００９年）ＰＤＡ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３巻：１３９〜１４８頁；Ｒａｈｍａｎら（２０１２年）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  １９巻：３４６〜３５３頁；Ａｓｃｅｎｓｏら（２０１３年）Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２３巻：２１１〜２１９頁；Ｄｈｕｌｅら（２０１２年）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８巻：４４０〜４５１頁；ならびにＭｏｄｉら（２０１２年）Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６２巻：３３０〜３３９頁）。
【０１２３】
今日および過去に開発された最も有望な薬物の多くは比較的不溶性であるため、本明細書に記載されている手法は広範に適用可能であり得る。手法は水溶解度を増加させるだけでなく、増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果によって腫瘍への薬物送達の選択性を増強する（Ｗａｎｇら（２０１２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ６３巻：１８５〜１９８頁；Ｐｅｅｒら（２００７年）Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  ２巻：７５１〜７６０頁；Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ（２０１１年）Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８巻：５６５〜５８０頁；Ｈｕｗｙｌｅｒら（２００８年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ３巻：２１〜２９頁；Ｍａｒｕｙａｍａら（２０１１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ６３巻：１６１〜１６９頁；ＭｕｓａｃｃｈｉｏおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２０１１年）Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １６巻：１３８８〜１４１２頁；Ｂａｒｙｓｈｎｉｋｏｖ（２０１２年）Ｖｅｓｔ．  Ｒｏｓｓ．  Ａｋａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｎａｕｋ．  ２３〜３１頁；ならびにＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ４巻：１４５〜１６０頁）。ＢＩ−２５３６を使用した結果は、同時に溶解度および選択的な腫瘍送達を増加させることにより、非常により少ない毒性および有効性の増加がもたらされるというこれらの特質の利点の際だった例を提供する。したがって、これらの戦略は、薬物開発の骨の折れる高価なプロセスにおける最後のステップの１つにおいて失敗する薬物を「救出」する能力を有し、その他の方法で得ることができるものより高い用量で、より少ない毒性を伴う投与を可能とする。
【０１２４】
参考としての援用
本願全体にわたって引用したすべての参考文献、特許出願、特許、および公開済み特許出願、ならびに図および配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書に参照されているが、このような参考文献は、これらの文書のいずれもが、当技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという承認を構成するものではないことが理解される。
【０１２５】
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣例的な実験しか使用せずに確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるように意図されている。
【図６】
2017502985.tif 000002
【図１】
2017502985.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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