(57)【要約】  本発明は、２０％未満の酸素で細胞を少なくとも２日間培養すること、及び前記細胞からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法を包含する。本発明は更に、２０％未満の酸素で少なくとも２日間培養した細胞から生成されるエクソソーム標品を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−８％酸素で少なくとも５日間細胞を培養すること、及び細胞培養からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法。
【請求項２】
前記細胞は、５〜１５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、５〜１０日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、１０〜１５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、少なくとも１５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、少なくとも５継代培養される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記エクソソーム標品は、５％未満のポリエチレングリコールを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記エクソソームは、ポリエチレングリコールを使用して精製される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エクソソームは、限外濾過を使用して精製される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールは、精製後に前記エクソソームに加えられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、３〜７％酸素で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、４〜６％酸素で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、４．５〜５．５％酸素で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
２〜８％酸素で少なくとも５日間培養した細胞から生成された少なくとも１０６のエクソソームを含むエクソソーム標品。
【請求項１６】
前記エクソソームのｍｉＲ−２１０  ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６ａの含量は、20％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い、請求項１５に記載のエクソソーム標品。
【請求項１７】
前記細胞は、５〜１５日間培養された、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項１８】
前記細胞は、５〜１０日間培養された、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項１９】
前記細胞は、１０〜１５日間培養された、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２０】
前記細胞は、少なくとも１５日間培養された、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２１】
前記細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２２】
前記細胞は、少なくとも５継代の間継代培養された、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２３】
前記エクソソーム標品は、５％未満のポリエチレングリコールを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２４】
前記エクソソームは、ポリエチレングリコールを使用して精製された、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２５】
前記エクソソームは、限外濾過を使用して精製された、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２６】
ポリエチレングリコールは、精製後に前記エクソソームに加えられた、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２７】
前記細胞は、３〜７％酸素で培養された、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２８】
前記細胞は、４〜６％酸素で培養された、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【請求項２９】
前記細胞は、４．５〜５．５％酸素で培養された、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載のエクソソーム標品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
エクソソームは細胞由来小胞である（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（８）：  ｅ１０３３１０．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０３３１０．）。エクソソームは、尿、血漿及び腹水などの体液中で発見される（同上）。エクソソームはエンドソーム多小胞体の内側への出芽によって生成される（同上）。エクソソームのカーゴとしては、細胞膜上で発現したタンパク質／糖タンパク質、並びに親細胞のサイトゾルに存在する分子及び可溶性因子が挙げられる（同上）。エクソソームは通常４０−１００ｎｍの範囲の直径をもつ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８：１７０１−１７０６，  ２０１４．）。エクソソームは特異的タンパク質、脂質、ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを含有する（同上）。
【０００２】
心筋球由来細胞（Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌ）から生成したエクソソームは脈管形成を増強し、心筋細胞の生存及び増殖を促進する。参照により本明細書に組み込まれるＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４  Ｍａｙ  ８；２（５）：６０６−１９。心筋球由来細胞から生成されたエクソソームはｍｉＲ−１４６ａが豊富である。
【０００３】
米国における主要な死因は依然として心臓病である。Ｋｏｃｈａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔ  Ｒｅｐ．  ２０１１；６０：１−１１６．老人人口に合わせて、虚血性心疾患の全世界の発生率及び死亡率は、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）における現在のケア基準の改善によって減少している（Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１２９：１４９３−１５０１．）。しかし、その結果、非致死性虚血性心疾患に起因する心臓発作生存者数及び身体障害年齢が増加し、このことは全体として虚血性心疾患の世界的な経済負担に大きく関わっている（同上）。このことは、現在のケア基準に対するＭＡＣＥの改善から、慢性狭心症及び心不全を罹患した生存患者のクオリティオブライフ、適応度及び生命力の改善への移行が必要とされていることを示唆する（同上）。
【０００４】
心筋球由来細胞（ＣＤＣ）は、再生及び免疫調節能力をもつ心臓試料から得られた細胞である。ＣＤＣの治療能力は臨床実験で評価が行われている最中である。２つの臨床試験（ＣＡＤＵＣＥＵＳ及びＡＬＬＳＴＡＲ）において心筋梗塞（ＭＩ）後に投与したＣＤＣが梗塞サイズの減少及び生存可能な心筋の増加に安全かつ有効であることが示されている。エクソソームは代表的な再生医療の次世代治療プラットフォームである。これらのナノサイズの細胞外膜小胞は、機能的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びＤＮＡ分子並びにタンパク質の強力な輸送媒体であり、増えてきた証拠が、これらの細胞外膜小胞は生成細胞として類似の治療的利益を付与しうることを示唆する。ＣＤＣ由来エクソソームは、現在多数の前臨床モデルでＣＤＣの効果を再現することが示されている。ｄｅ  Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０；  Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４；２：６０６−６１９；  Ｔｓｅｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０．調査から、ＣＤＣは、線維症を制限し、免疫反応を調節し、心筋細胞増殖、分岐血管新生を刺激し、及び心筋梗塞（ＭＩ）モデルにおける機能回復を改善する特定のｍｉＲＮＡを含有するエクソソームを分泌することがわかった。前臨床データの全体性は、エクソソームがＣＤＣの主要作用機序（ＭＯＡ）に必須な分泌有効成分（ＡＰＩ）であることを示す。
【０００５】
ＣＤＣ及びそれらの単離エクソソームは、心臓疾病の世界的負担を軽減する大きな治療的可能性を保持する。第１相ＣＡＤＵＣＥＵＳ及びＡＬＬＳＴＡＲ臨床試験では、ＣＤＣが梗塞サイズを縮小し、心筋組織生存能力を増加させることが示された（図１参照）。Ｍａｌｌｉａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１４；６３：１１０−１２２；  Ｍａｋｋａｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ．２０１２；３７９：８９５−９０４；  Ｍａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１４；６４. 
【０００６】
ＣＡＤＵＣＥＵＳは、治療再生 を示唆する生存可能な心筋の増加を観察するための最初の臨床試験である。Ｍａｋｋａｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ．２０１２；３７９：８９５−９０４．５年のサブスタディと共に進行中のＡＬＬＳＴＡＲ第２相試験は、クオリティオブライフ指標並びに入院期間及び死亡率に与える影響力を評価するであろう。
【０００７】
ナノサイズのエクソソームは、微生物捕捉フィルタ（例えば０．２２μｍ以下のフィルタ）を使用する方法で滅菌保証を増加させる能力など、細胞に対する大きな生成利点及び毒物学利点を有する。非生物エクソソームは、まさに非生物としての特質に起因して悪性腫瘍形成及び免疫原性応答リスクが潜在的に低下する。また、エクソソームは、細胞と比較して、安定した薬物貯蔵温度の選択肢でより大きい柔軟性（例えば室温及び低温対液体窒素）を有する。ＣＤＣ−エクソソーム生成に関する現在の研究過程は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有条件下での初めての播種及びコンフルエントまでのＣＤＣ増殖が関わる。エクソソーム生成では、ＣＤＣのコンフルエント層を洗浄し、無血清（ＦＢＳ−エクソソームを含まない）下で培養し、通常酸素圧（２０％Ｏ２）条件の下で１５日間培養した。次いで、沈降法（研究だけに用いることにした）によって、解凍した条件培地（エクソソーム含有）からエクソソームを単離し、基本無血清培地（研究グレード試薬）で定式化した。
【０００８】
ＣＤＣエクソソームは、心臓機能を改善し、血管形成及び心筋細胞増殖を刺激し、炎症過程を調節し、及び心筋細胞アポトーシスを阻害することが可能であるが、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームは否定的である。エクソソーム分泌がＧＷ４８６９で阻害されるとＣＤＣの心臓機能的利点が縮小された。
【０００９】
ＣＤＣエクソソームマイクロＲＮＡ組成物をｍｉＲＮＡアレイで特徴付けた。ｍｉＲ−２１０及びｍｉＲ−１４６ａは、ＮＨＤＦエクソソームと比較してＣＤＣエクソソームでアップレギュレーションされることがわかった。
【００１０】
ｍｉＲ−２１０は細胞性低酸素応答の中心的存在であり、内皮及び心筋細胞の細胞生存率及びミトコンドリア代謝を調節することができる。加えて、ｍｉＲ−２１０はＴ細胞分化で役割を果たすことが示されている（Ｒｅｆ：  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２０１４）．  １５，  ３９３−４０１）。低酸素誘導性因子１-α（ＨＩＦ１α）は、近位ｍｉＲ−２１０プロモータ上で低酸素応答性領域（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ））に直接結合する。ＨＩＦ１ａがｍｉＲ−２１０の標的として同定されたことは、ＨＩＦ−１ａ発現の阻害におけるｍｉＲ−２１０によるネガティブフィードバックを示唆する（文献： Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２０１４）．  １５，  ３９３−４０１）。ＨＩＦ１α経路の下流標的はストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。 ｍｉＲ−２１０は、プロセスパラメータを評価するための主要ＣＤＣエクソソームｍｉＲＮＡ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）パネルの一部である。
【００１１】
ｍｉＲ−１４６ａは、様々な疾患の重要免疫調節分子であり、インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）のダウンレギュレーションをもたらす活性化Ｂ細胞核因子カッパ−軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）依存性シグナル伝達経路におけるトール様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化と同時に誘導される。ｍｉＲ−１４６ａの分子標的の１つはＣＸＣＲ４経路であり、ＣＸＣＲ４経路は先天性及び適応性免疫応答に関与するＳＤＦ−１の７回膜貫通型受容体Ｇタンパク質共役受容体である。ｍｉＲ−１４６ａは、プロセスパラメータを評価するための主要ＣＤＣエクソソームｍｉＲＮＡ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）パネルの一部である。
【００１２】
特に臨床用途の技術分野では、多様なタンパク質及びＲＮＡ構成要素を有し、しかもより短い時時間帯で生成できる良好なエクソソーム標品が必要である。本発明は、当該技術分野でこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、２０％未満の酸素で細胞を少なくとも２日間培養すること、細胞からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法を包含する。本発明は更に、２０％未満の酸素で少なくとも２日間培養した細胞から生成されたエクソソーム標品を包含する。
【００１４】
好ましくは、細胞は、少なくとも５日間、具体的には５−１５日間、５−１０日間、１０−１５日間、又は少なくとも１５日間培養される。
【００１５】
好ましくは、酸素は、２−８％、３−７％、４−６％、又は４．５−５．５％酸素で培養される。
【００１６】
１つの実施形態において、細胞は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。
【００１７】
１つの実施形態において、細胞は少なくとも５継代である。
【００１８】
１つの実施形態において、エクソソーム標品は５％未満のポリエチレングリコールを含む。
【００１９】
１つの実施形態において、エクソソームはポリエチレングリコールを使用して精製される。１つの実施形態において、エクソソームは限外濾過を使用して精製される。１つの実施形態において、ポリエチレングリコールは精製後、エクソソームに加えられる。
【００２０】
１つの実施形態において、エクソソームのｍｉＲ−２１０  ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６ａの含量は、２０％酸素で培養した細胞から生成された同含量より高い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ及びＢはナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動によって定量された、限外濾過（ＵＦＣ）後の条件培地におけるＣＤＣ由来エクソソームのサイズ及び濃度を示す。
【図２】図２Ａ及びＢはナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動によって定量された、ＰＥＧ（ＥｘｏＱｕｉｃｋ）（Ａ）沈降又は抗体による架橋（Ｂ）後のＣＤＣ由来エクソソームのサイズ及び得られた濃度の変化を示す。
【図３】図３は、ＤＣタンパク質アッセイで定量された、種々のＰＥＧ沈殿溶液、ＥｘｏＱｕｉｃｋ及び限外濾過によって単離されたＣＤＣ由来エクソソーム中の総タンパク質量を示す。
【図４】図４Ａ−Ｄは、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動で定量された、限外濾過（ＵＦＣ）分離後の種々の温度条件（４〜−８０℃）におけるＣＤＣ由来エクソソーム安定性を示す。
【図５】図５は、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動によって定量された、培養５日又は１５日後の０．２２μｍ微生物除去濾過の有無で、条件培地中、及び限外濾過（ＵＦＣ）を使用して単離された全体のＣＤＣ由来エクソソーム量の増加を示す。
【図６】図６は、ＤＣタンパク質アッセイで定量された、培養５日又は１５日後の沈殿ＰＥＧ（Ｅｘｏｑｕｉｃｋ）中のＣＤＣ由来エクソソーム、及び限外濾過（ＵＦＣ）調製によるＣＤＣ由来エクソソーム中の総タンパク質量の増加を示す。
【図７】図７は、ＤＣタンパク質アッセイで定量された、培養５日又は１５日後のＣＤＣ継代数の増加に伴う、ＣＤＣ由来エクソソーム中の総タンパク質濃度の増加を示す。
【図８】図８は、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動によって定量された、５日培養及び１５日培養の両方からの、生理的酸素濃度（５％Ｏ２）におけるＣＤＣ由来エクソソーム総数の全体的増加を示す。
【図９】図９は、ＤＣタンパク質アッセイで定量された、５日培養及び１５日培養からの、生理的酸素濃度（５％  Ｏ２）及び限外濾過（ＵＦＣ）単離を用いたＣＤＣ由来エクソソームにおける総タンパク質量の全体的増加を示す。
【図１０】図１０は、２６０ｎｍ吸光度でＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計によって定量された、限外濾過（ＵＦＣ）単離で特に生理的酸素濃度（５％Ｏ２）及び１５日間培養でのＣＤＣ由来エクソソーム中の全ＲＮＡ量の全体的増加を示す。
【図１１】図１１は、６３０／６８０ｎｍ吸光度でＲＮＡアッセイキットを用いたＱｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメータによって定量された、５０％及び７５％ＰＥＧ溶液並びにＥｘｏｑｕｉｃｋに対する２５％ＰＥＧ沈殿でのＣＤＣ由来エクソソーム中の全ＲＮＡ量の増加を示す。
【図１２】図１２は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較してアップレギュレーションしたＣＤＣ由来エクソソーム中のｍｉＲ−１４６Ａ発現を示す。
【図１３】図１３は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較してアップレギュレーションしたＣＤＣ由来エクソソーム中のｍｉＲ−２１０発現を示す。
【図１４】図１４は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較した、１５日間培養（５％Ｏ２）かつ種々のＰＥＧ沈殿溶液で単離されたＣＤＣ由来エクソソームにおける類似のアップレギュレーションｍｉＲ−１４６Ａ発現を示す。
【図１５】図１５は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較してアップレギュレーションしたＣＤＣ由来エクソソーム中のｍｉＲ−２１０発現を示す。
【図１６】図１６は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較した、１５日間培養かつ低酸素（２％及び５％Ｏ２）からのＣＤＣ由来エクソソームにおけるアップレギュレーションしたｍｉＲ−１４６Ａ発現を示す。
【図１７】図１７は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量された、Ｕ６ハウスキーピング遺伝子及び負コントロール線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームと比較した、１５日間培養かつ低酸素（２％及び５％Ｏ２）からのＣＤＣ由来エクソソームにおけるアップレギュレーションしたｍｉＲ−２１０発現を示す。
【図１８】図１８は、ＥｘｏＱｕｉｃｋ又は遠心分離による限外濾過のいずれかで単離及び濃縮された１５日間培養からのＣＤＣ由来エクソソームにおける類似のタンパク質とアップレギュレーションしたｍｉＲ−２１０とｍｉＲ−１４６Ａを示す。
【図１９】図１９Ａ及びＢは、２ｋＤａ〜１０ｋＤａ限外濾過膜を用いて単離及び濃縮した１４日間培養から単離されたＣＤＣ由来エクソソームの類似の粒子濃度と粒度を示す。３０ｋＤａ限外濾過膜でエクソソーム濃度の僅かに大きい減少が観察された。
【図２０】図２０は、２ｋＤＡ〜３０ｋＤａで単離及び濃縮された１５日間培養からのＣＤＣ由来エクソソームは、類似のアップレギュレーションしたｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示したことを表す。
【図２１】図２１Ａ−Ｃは、濾過なし（ｎ／ａ）と比較して、単離、濃縮及びフィルタ滅菌された１５日間培養からのＣＤＣ由来エクソソームにおける類似のタンパク質とアップレギュレーションしたｍｉＲ−２１０とｍｉＲ−１４６Ａ発現を表す。エクソソーム平均サイズが〜１５０ｎｍ及び典型的には２００ｎｍ未満の場合、フィルタ滅菌が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
約２０％酸素の標準実験室条件下で培養した初代細胞から生成されたエクソソームのサイズ及び量を測定した。（図１）ＰＥＧの使用は、ナノサイトによる定量を妨げる凝集体を生成することが示された。（図２）限外濾過は、これらの凝集体を生成がなく、正確な定量を可能にした。エクソソーム中の総タンパク質量の分析によって、さまざまなＰＥＧ調製及び限外濾過がエクソソームの調製に使用できることが示された。（図３及び図１１）
【００２３】
種々の濃度でのエクソソーム貯蔵の影響を調査した。（図４）
【００２４】
無血清培地で１５日間培養法により細胞からエクソソームを調製してから(Ｉｂｒａｈｉｍ  ２０１４)、５及び１５日間培養のエクソソーム標品を比較した。（図５）１５日培養は、より高いエクソソーム収量を示した。また、１５日培養は、５日培養より高い総タンパク質量も示した。（図６）予想外に、４継代及び５継代の細胞からのエクソソーム標品は３継代細胞からのエクソソーム標品より高い総タンパク質量を示した。（図７）
【００２５】
種々の濃度でのエクソソーム貯蔵の影響を調査した。予想外に、酸素レベルの２０％から５％への低下によってエクソソーム数が実質的に増加した。（図８）同様に、酸素レベルの２０％から５％への低下によって、５日及び１５日の両方でエクソソームに関連した全タンパク質量が実質的に増加した。（図９）５日での総タンパク質レベルは１５日レベルより一層高かった。
【００２６】
酸素レベルの２０％から５％への低下によって、１５日におけるエクソソームに関連したＲＮＡ全タンパク質量が実質的に増加した。（図１０）５日におけるエクソソームに関連したＲＮＡの量は２０％と５％で類似した。
【００２７】
ｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０  ＲＮＡレベルは、２０％酸素での５及び１５日エクソソーム標品から調査した。（図１２及び図１３）ｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０  ＲＮＡの量は１５日より５日で低かった。（図１４及び図１５）別のエクソソーム調製手順でも類似の結果が得られた。
【００２８】
酸素レベルの２０％から５％又は２％への低下によって、１５日におけるエクソソームに関連したｍｉＲ−１４６Ａ  ＲＮＡの量は実質的に増加した。（図１６）１５日におけるエクソソームに関連したｍｉＲ−２１０  ＲＮＡの量は２％酸素で最も高かった。（図１７）５日におけるエクソソームに関連したｍｉＲ−１４６Ａ  ＲＮＡの量は２０％、５％及び２％酸素で類似した。
【００２９】
酸素レベルの２０％から５％又は２％への低下によって、５日及び１５日におけるエクソソームに関連したｍｉＲ−２１０  ＲＮＡの量は実質的に増加した。１５日におけるエクソソームに関連したｍｉＲ−２１０  ＲＮＡの量は２％酸素で最も高かった。
【００３０】
ＥｘｏＱｕｉｃｋ又は遠心分離による限外濾過のいずれかで単離及び濃縮した１５日培養からのＣＤＣ由来エクソソームは、類似のタンパク質とアップレギュレーションしたｍｉＲ−２１０とｍｉＲ−１４６Ａ発現を示した。（図１８）
【００３１】
２ｋＤａ〜１０ｋＤａ限外濾過膜で単離及び濃縮した１５日培養から単離されたＣＤＣ由来エクソソームは、類似の粒子濃度及びサイズを示し、３０ｋｄａではエクソソーム濃度の僅かに大きい減少が観察された。（図１９）
【００３２】
２ｋＤＡ〜３０ｋＤａ限外濾過膜で単離及び濃縮した１５日間培養からのＣＤＣ由来エクソソームは、類似のアップレギュレーションしたｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示した。（図２０）
【００３３】
濾過なし（ｎ／ａ）と比較して、単離、濃縮及びフィルタ滅菌した１５日培養からのＣＤＣ由来エクソソームは、類似のタンパク質とアップレギュレーションしたｍｉＲ−２１０とｍｉＲ−１４６Ａ発現を示した。（図２１）エクソソーム平均サイズが〜１５０ｎｍ及び典型的には２００ｎｍ未満の場合、フィルタ滅菌が可能である。
【００３４】
従って、培養の間に酸素濃度を低下させることは、これらの細胞から採取したエクソソームの量及び組成に変化を生じさせる。これは、好ましい質をもったエクソソームの生成を可能にする。本発明は、これらのエクソソーム標品及びそれらの生成方法を包含する。
エクソソームの生成方法
【００３５】
本発明は細胞を培養することを含むエクソソームの生成方法を包含する。本発明は、２０％未満の酸素で少なくとも２日間細胞を培養すること、及び細胞からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法を包含する。
【００３６】
好ましくは、細胞培養は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２の細胞を含む。
【００３７】
好ましくは、細胞は初代細胞である。初代細胞は、少なくとも継代数を２、３、４、５、６、７、８、９又は１０とすることができる。不死化細胞も本発明によって包含される。
【００３８】
好ましくは、細胞はヒト細胞である。特に好ましい細胞型は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。他の好ましい細胞型は、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞である。
【００３９】
１つの実施形態において、細胞は、ルーチンな培養条件、例えば２０％Ｏ２、３７℃で、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ中にＴ１７５フラスコ当たり１０６の細胞を播種することによって増殖させることができる。
【００４０】
種々の実施形態において、酸素濃度は、１−２％、２−３％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、９−１０％、１０−１１％、１１−１２％、１２−１３％、１３−１４％、１４−１５％、１５−１６％、１７−１８％、又は１８−１９％である。好ましくは、酸素濃度は２−８％、３−７％酸素、４−６％酸素、又は４．５−５．５％酸素である。
【００４１】
細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間培養することができる。好ましくは、細胞を、５−１５日間、５−１０日間、又は１０−１５日間培養する。
【００４２】
好ましくは、細胞培養はインスリンサプリメン及び／又は化学的に定義された脂質濃縮物及びコレステロール脂質濃縮物を含む。
エクソソーム標品
【００４３】
本発明は、本発明の細胞培養から生成されたエクソソーム標品を包含する。種々の実施形態において、エクソソーム標品は直径５０〜２５０ｎｍのエクソソームを含む。好ましくは、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のエクソソームは、少なくとも５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、又は１６０ｎｍである。好ましくは、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のエクソソームは、直径で少なくとも２５０ｎｍ未満、２４０ｎｍ、２３０ｎｍ、２２０ｎｍ、２１０ｎｍ、２００ｎｍ、１９０ｎｍ、１８０ｎｍ、１７０ｎｍ、１６０ｎｍ、１５０ｎｍ、又は１４０ｎｍである。従って、本発明は、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のエクソソームが、直径５０〜２５０ｎｍ、直径６０〜２５０ｎｍ、直径６０〜２４０ｎｍ、直径５０〜２４０ｎｍなどであるエクソソーム標品を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、少なくとも１０５、５ｘ１０５、１０６、５ｘ１０６、１０７、５ｘ１０７、１０８、５ｘ１０８、１０９、５ｘ１０９、１０１０、５ｘ１０１０、１０１１、５ｘ１０１１、又は１０１２、又は５ｘ１０１２のエクソソームを含有する。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、又は１０１１から１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２などのエクソソームを含有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、マイクロＲＮＡを含有する１つ以上のエクソソームを含む。種々の実施形態において、これらのマイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４６Ａ及び／又はｍｉＲ−２１０を含みうる。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、ｍｉＲ−２１０が濃縮されたエクソソームを含む。
【００４６】
種々の実施形態において、エクソソームを生成する細胞培養での酸素濃度は、１−２％、２−３％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、９−１０％、１０−１１％、１１−１２％、１２−１３％、１３−１４％、１４−１５％、１５−１６％、１７−１８％、又は１８−１９％である。好ましくは、酸素濃度は２−８％、３−７％酸素、４−６％酸素、又は４．５−５．５％酸素である。より低い酸素濃度（例えば２−８％酸素）で培養した細胞から生成されたエクソソームは、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームと、ＲＮＡ及びタンパク質構成成分が異なる。
【００４７】
１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質含量は、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成された５個のエクソソームの全ＲＮＡ含量は、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのｍｉＲ１４６Ａ  ＲＮＡ含量は、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのｍｉＲ−２１０  ＲＮＡ含量は２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。
エクソソーム採取
【００４８】
エクソソームは、ルーチン技術によって細胞培養から採取することができる。例えば、細胞はコンフルエントに達したときに、２５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄され、３０ｍｌのＩＭＤＭが加えられ（ＦＢＳなし）、特定の酸素濃度にある恒温器に戻すことができる。一定時間の後、ＩＭＤＭ培地を取り除き、５０ｍｌの円すい管に配置することができる。培地は、細胞残屑を除去するため３０００ｘｇで１５分間遠心分離することができる。培地は、１５ｍｌの円すい管に１０ｍｌの画分で分割され、−８０℃で保存される。
【００４９】
エクソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間培養した後に採取することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、エクソソームは、培養の２、３、４、又は５日おきに採取する。
エクソソーム精製
【００５１】
エクソソーム標品は、当該技術分野におけるルーチン技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、エクソソームの調製は、細胞の遠心分離及び／又は細胞によるコンディション化培地を含む。いくつかの実施形態において、超遠心分離法が使用される。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製はサイズ排除濾過による。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過及び／又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、細胞由来のエクソソームからより大きいサイズの粒子を分離するために、少なくとも１０００ｘｇ、２０００ｘｇ、３０００ｘｇ、４０００ｘｇ、５０００ｘｇ、６０００ｘｇ、７０００ｘｇ，８０００ｘｇ，又は９０００ｘｇから２０００ｘｇ，３０００ｘｇ，４０００ｘｇ，５０００ｘｇ，６０００ｘｇ、７０００ｘｇ、８０００ｘｇ、９０００ｘｇ、１０，０００ｘｇ、又はそれ以上迄の遠心力を使用することを含め、異なる超遠心分離が使用される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、濾過又は限外濾過の使用を含む。特定の実施形態において、異なる細孔寸法のサイズ排除膜が使用される。例えば、サイズ排除膜は、少なくとも０．１、０．５μｍ、１．０μｍ、２．５μｍ、５μｍから０．５μｍ、１．０μｍ、２．５μｍ、５μｍ、又はそれ以上迄の細孔寸法をもつフィルタの使用を含むことができる。いくつかの実施形態において、細孔寸法は約０．２μｍである。いくつかの実施形態において、濾過又は限外濾過は、０．１ｋＤａ、０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は２５０ｋＤａから０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、５００ｋＤａ、又はそれ以上迄の範囲のサイズ排除を含む。
【００５４】
好ましくは、単離したエクソソームは、０．２２μｍの微生物排除フィルタを用いてフィルタ滅菌される。好ましくは、エクソソームは、０．４５μｍを使用して細胞残屑を除去する。
【００５５】
種々の実施形態において、かかる系は可変流体流系を組み合わせて使用される。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、エクソソーム画分を精製及び／又は濃縮するために使用される接線流濾過（ＴＦＦ）系の使用を含む。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、（ＨＰＬＣ）を使用してエクソソームを均一にサイズ化した粒子に精製することを含む。種々の実施形態において、使用される密度勾配は、例えばショ糖密度勾配での遠心分離又は調製で離散型糖クッション（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｕｇａｒ  ｃｕｓｈｉｏｎ）の応用である。
【００５６】
他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は沈殿剤の使用を含む。例えば、ＥＸＯＱＵＩＣＫ（登録商標）などの沈殿剤は、コンディション化細胞培地に加えて、迅速かつ急速にエクソソーム集団を沈殿させることができる。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、容量排除ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の使用を含む。別の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、フローフィールドフローフラクショネーション（ＦｌＦＦＦ）、溶出ベース技術の使用を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧを５％、１０％、１５％、又は２０％の最終濃度で使用し、エクソソームを沈殿させる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１５０００、又は２３０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００−６０００、６０００−８０００、８０００−１００００、１００００−１２０００、１２０００−１５０００、 又は１５０００−２３０００ダルトンの分子量を有する。
【００５８】
特定の実施形態において、エクソソームの調製は、特異的バイオマーカーを有する、又は特定の生体分子を含む１つ以上のエクソソームを単離するための１つ以上の捕捉剤の使用を含む。１つの実施形態において、１つ以上の捕捉剤が少なくとも１つの抗体を含む。例えば、エクソソーム関連抗原を認識する抗体免疫親和性を利用して特異的エクソソームを捕捉する。他の実施形態において、少なくとも１つの抗体が、電磁ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレート又はマイクロ流体デバイスなどの固定化表面に接合し、それによって対象の特異的エクソソーム集団の単離を可能にする。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは１−２％、２−３％、３−４％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、又は９−１０％の最終濃度に調製した後、エクソソーム標品に加える。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１５０００、又は２３０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００−６０００、６０００−８０００、８０００−１００００、１００００−１２０００、１２０００−１５０００、又は１５０００−２３０００ダルトンの分子量を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、エクソソームの凝集を起こす薬剤を、精製前又は精製後にエクソソーム標品に加える。
エクソソーム分析
【００６１】
２０％未満の酸素で培養した細胞のエクソソーム標品は、分析することができる。エクソソームは、２０％酸素で培養した類似の細胞から調製したエクソソームと比較することができる。２０％未満の酸素（例えば２−８％酸素）で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質又はＲＮＡ含量が、２０％酸素で培養した細胞から生成されたものより高いかどうかは、本明細書に記載した技術又は他の類似の技術を用いて決定することができる。
【００６２】
エクソソームの数及びサイズは、例えばナノサイトによる定量法を用いて定量が可能である。
【００６３】
エクソソームのタンパク質含量は、総タンパク質レベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的タンパク質レベルの測定に対してはルーチンなタンパク質検出技術（例えばウエスタンブロット）を使用して分析することができる。
【００６４】
エクソソームのＲＮＡ含量は、全ＲＮＡレベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的ＲＮＡレベルの測定に対してはルーチンな核酸検出法（例えば、ＰＣＲ又はプローブハイブリダイゼーション）を使用して分析することができる。好ましいＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０  ＲＮＡである。
【実施例】
【００６５】
実施例１
エクソソーム標品
受領次第直ちに、心臓を肉眼的に解剖し、外植片と称した、それぞれ約２５ｍｇ（５００μπιｘ５００μπιｘ５００μπι；いくつかの実施形態では他のサイズを使用する）の生検サイズの塊に切断した。ヒト心臓は、以前に記載（米国特許ＵＳ２０１５０２１６９０５  Ａ１を参照）した自動ティッシュスライサー（Ｚｉｍｍｅｒ（登録商標）Ｄｅｒｍａｔｏｍｅ）及び自動ティッシュチョッパー（Ｍｃｌｌｗａｉｎ（商標）ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｈｏｐｐｅｒ，  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，  Ｉｎｃ．）を使用して切断した。次いで、外植片を、以前に記載（例えば、本明細書に参照として全体が組み込まれているＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７並びに米国特許出願第１１／６６６，６８５号（２００７年４月２１出願）及び第１３／４１２，０５１号（２０１２年３月５日出願）を参照）したように処理した。
【００６６】
同種異系のＣＤＣを生成するために、外植片をＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に配置した。１−２週間後、外植片から新たに出現した細胞増生がコンフルエントになった。これらの外植片由来細胞（ＥＤＣ）をＩＸＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って採取した。ＥＤＣは、Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＭＣＢ）として凍結保存し、次いで心筋球（ＣＳｐｓ）として培養するか、又はＣＳｐ培養条件に直ちに配置した。ＣＳｐは、ＵｌｔｒａＬｏｗ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）面で増殖させた。
【００６７】
同種異系ＣＤＣをフィブロネクチンコートＮｕｎｃ＊ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋｓ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）面に播種して増殖させ、コンフルエントになったときに細胞を継代した。様々な継代数でＣＤＣをフィブロネクチンコートＣｅｌｌＢｉｎｄ多層培養器上に播種し、エクソソーム生成用コンフルエントにすることができた。コンフルエントと同時に、培地を無血清条件（例えば、ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミンを含むイスコフ改変ダルベッコ培地）と交換した。細胞は、５又は１５日間で培地に順化できた。
実施例２
エクソソーム単離
【００６８】
エクソソームは、０．４５μｍを使用して濾過し、細胞残屑を除去した後、サイズ（２〜３０ｋｄａ）ベースの限外濾過、ポリエチレングリコール沈殿又はＥｘｏｑｕｉｃｋ  （ＳＢＩ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）によって単離した。一定の状況で、単離したエクソソームを０．２２μｍの微生物排除フィルタでフィルタ滅菌した。エクソソームを幾つかの透析濾過を使用して定式化し、緩衝剤を許容される注射剤溶液（例えば、プラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）、リンゲル液）に置き替えた。
実施例３
エクソソーム分析
【００６９】
エクソソームタンパク質は、ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使用して評価した。エクソソーム粒度及び濃度は、ブラウン運動及びナノサイトによる追跡分析（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，  Ｍａｌｖｅｒｎ  ＵＫ）を使用して評価した。ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｑｕｂｉｔ又はＡＡＴＩ断片化アナライザ（Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，  Ａｎｋｅｎｙ，  ＩＡ）を使用して定量した。逆転写反応及びｑＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）を使用して行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2017537630.tif 000018
【図１８】
2017537630.tif 000019
【図１９】
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【図２０】
2017537630.tif 000021
【図２１】
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【国際調査報告】
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