(57)【要約】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有量が高い微生物油を生産する改良されたラビリンチュラ綱類株を開示する。これらの株は、野生株と比べて生産性が高い。また、ＤＨＡ含有量が高い微生物油組成物も提供する。ＤＨＡなどの脂質を生産するための株の改良方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
総脂肪酸の少なくとも２５％をＤＨＡとして、及び総脂肪酸の少なくとも６％をミリスチン酸として含む、微生物油。
【請求項２】
ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも３．５：１である、請求項１に記載の微生物油。
【請求項３】
ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも４：１である、請求項１に記載の微生物油。
【請求項４】
前記微生物油の総脂肪酸の少なくとも３０％がＤＨＡである、請求項３に記載の微生物油。
【請求項５】
前記微生物油の総脂肪酸の少なくとも３５％がＤＨＡである、請求項４に記載の微生物油。
【請求項６】
総脂肪酸に１０％以下のＤＰＡが含まれる、請求項１に記載の微生物油。
【請求項７】
総脂肪酸に２％未満のＡＲＡが含まれる、請求項１に記載の微生物油。
【請求項８】
総脂肪酸に１％未満のＥＰＡが含まれる、請求項１に記載の微生物油。
【請求項９】
前記微生物油の脂肪酸の少なくとも１０％がミリスチン酸である、請求項１に記載の微生物油。
【請求項１０】
前記微生物油の脂肪酸の少なくとも１２％がミリスチン酸である、請求項９に記載の微生物油。
【請求項１１】
前記微生物油の脂肪酸の少なくとも１５％がミリスチン酸である、請求項１０に記載の微生物油。
【請求項１２】
請求項１に記載の微生物油が含まれる、製品。
【請求項１３】
食品、動物飼料、化粧品、または医薬品である、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
変異微生物から分離される、請求項１に記載の微生物油。
【請求項１５】
請求項１に記載の微生物油を生産する、変異ラビリンチュラ綱（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）微生物。
【請求項１６】
その脂肪酸の少なくとも２５％をＤＨＡとして、及びその脂肪酸の少なくとも６％をミリスチン酸として生産する、変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項１７】
その脂肪酸の少なくとも３０％をＤＨＡとして、及びその脂肪酸の少なくとも１０％をミリスチン酸として生産する、請求項１６に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項１８】
小規模培養で少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産し、さらに、由来元である野生株よりも、総脂肪酸のパーセントとして少なくとも２０％多くのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び少なくとも１００％多くのミリスチン酸を生産する、請求項１６に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項１９】
前記微生物により生産される総脂肪酸には、少なくとも３０％のＤＨＡ及び少なくとも１０％のミリスチン酸が含まれる、請求項１６に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列と少なくとも９８％の同一性を有する１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む、請求項１９に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項２１】
配列番号５及び配列番号９から選択される配列、
配列番号６及び配列番号１０から選択される配列、
配列番号７及び配列番号１１から選択される配列、ならびに
配列番号８及び配列番号１２から選択される配列
と少なくとも９８％の同一性を有する１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む、請求項２０に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項２２】
配列番号５及び配列番号９から選択される配列、
配列番号６及び配列番号１０から選択される配列、
配列番号７及び配列番号１１から選択される配列、ならびに
配列番号８及び配列番号１２から選択される配列
と少なくとも９８．５％の同一性を有する１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む、請求項２１に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項２３】
ＮＲＲＬ番号５０８３６として寄託された株、ＮＲＲＬ番号５０８３７として寄託された株、またはそのいずれかの由来株である、請求項２２に記載の変異ラビリンチュラ綱微生物。
【請求項２４】
請求項１６に記載の前記変異微生物が含まれる、微生物バイオマス。
【請求項２５】
請求項２４に記載の微生物バイオマスが含まれる、製品。
【請求項２６】
高脂質生産性を有する微生物由来株の選択方法であって、
脂質生産に関与する酵素または因子を阻害する少なくとも１種類の化合物を含むケモスタットまたはサイトスタットで原株の微生物を培養する工程と、
前記サイトスタットまたはケモスタットの培養物から、前記原株の微生物と比べて強化された脂質生産性をもつ少なくとも１種類の由来株微生物を分離する工程
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記由来株が、１種類以上のＦＡＭＥ脂質の増大した生産性を有している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記由来株が、少なくとも１種類の多価不飽和脂肪酸の増大した生産性を有している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記由来株が、ＡＲＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち少なくとも１つの増大した生産性を有している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記由来株が、ＤＨＡの増大した生産性を有している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記由来株が、ミリスチン酸の増大した生産性を有している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
脂質生産に関与する酵素を阻害する前記化合物が、没食子酸アルキル、没食子酸プロピル、カプサイシン、セルレニン、クルクミン、シクロプロペン、ジフェニルアミン、ノルフルラゾン、ピリダジノン、セトキシジム、トルイル酸、トリクロサン、３−デシノイル−ＮＡＣ、ジアザボリン、イソニアジド、チオラクトマイシン、ＳＢＰＴ０４、ＢＰ１、ＴＯＦＡ、ソラフェンＡ、セサミン、セサモール、クルクミン、シクロエート、チオカルバメート、スルホキシド、リンゴ酸塩、１種類以上の脂肪酸、キャノーラ油、ピーナッツ油、またはゴマ油を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養する工程がサイトスタット培養である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記ケモスタットまたはサイトスタット培養の前に、少なくとも１回の変異誘発手順を実施する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１回の変異誘発手順には、化学的変異原、ガンマ線照射、またはＵＶ照射による処置が含まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
脂質生産に関与する酵素または因子を阻害する少なくとも１種類の化合物を含むケモスタットまたはサイトスタットで前記原微生物株を培養する前に、脂質生産に関与する酵素を阻害する化合物の非存在下でケモスタットまたはサイトスタットで前記原微生物株を培養する工程と、前記対象微生物株と比べて強化された増殖率を有する少なくとも１種類の対象微生物株バリアントを分離する工程とをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
強化された脂質生産性を有する前記少なくとも１種類の微生物由来株の分離後に、前記微生物由来株をＵＶ処置する工程と、さらに強化された脂質生産性を有するＵＶ処置済み由来株を選択する工程とをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記さらに強化された脂質生産性を有するＵＶ処置済み由来株を選択する工程には、前記ＵＶ処置済み由来株をサイトスタットまたはケモスタットで培養することが含まれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
２回以上の変異誘発手順を実施し、少なくとも１回の変異誘発手順の後にサイトスタットまたはケモスタット選択を実施する、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
２回以上の変異誘発手順を実施し、各変異誘発手順の後にサイトスタットまたはケモスタット選択を実施する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトスタットまたはケモスタット選択では、脂質生産に関与する酵素または因子を阻害する少なくとも１種類の化合物がサイトスタットまたはケモスタット培養中に含まれる、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種類の第１の微生物由来株が、１回目の変異誘発手順後に、脂質生産に関与する酵素または因子を阻害する第１の化合物を含むサイトスタットまたはケモスタットで選択され、少なくとも１種類の第２の微生物由来株が、２回目の変異誘発手順後に、脂質生産に関与する酵素または因子を阻害する第２の化合物を含むサイトスタットまたはケモスタットで選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
変異微生物の形質の強化方法であって、
微生物を変異誘発して、変異誘発済み微生物の集団を得る工程と、
前記変異誘発済み微生物を少なくとも１種類の関心対象の形質について選択して、少なくとも１種類の関心対象の形質を有する少なくとも１種類の変異微生物を得る工程と、
前記少なくとも１種類の変異微生物をＵＶ処置して、強化された関心対象の形質を有する少なくとも１種類のＵＶ処置済み変異体を得る工程と
を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記変異誘発には、化学的変異原、ガンマ線照射、またはＵＶ照射での処置が含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種類の関心対象の形質には、増殖率、バイオマス蓄積度、産物の生産率、産物の生産量、１種類以上の化合物に対する抵抗性もしくは耐性、または温度耐性が含まれる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１種類の関心対象の形質には、脂質の生産率が含まれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１種類の関心対象の形質には、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産率が含まれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記選択することには、野生型細胞の増殖を阻害する化合物の存在下での増殖が含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記選択することには、ケモスタットまたはサイトスタットでの増殖が含まれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択することには、１種類以上の変異誘発済み微生物により生産された産物の量を検定することが含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１種類の変異微生物をＵＶ処置した後に、前記少なくとも１種類のＵＶ処置済み変異体をサイトスタットまたはケモスタットで培養する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１４年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／００２，１０７号に基づく優先権を主張し、ここにその内容を参照により援用する。
【０００２】
配列表
本出願には、２０１５年５月２２日作成の容量１６キロバイト（ｋｂ）の配列表テキストファイル「ＳＧＩ１７１０＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本出願と同時に提出された核酸配列レファレンスが含まれ、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．５２（ｅ）（ｉｉｉ）（５）に従ってその内容を参照により援用する。
【０００３】
本発明は、一つには、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのオメガ−３多価不飽和脂肪酸（オメガ−３  ＰＵＦＡ）を含む脂質の生産に有用な微生物株に関する。本発明はまた、原株と比べて強化された脂質生産性を有する由来株を選択し分離する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
長鎖オメガ３脂肪酸は、人の食生活に必須の要素であり、現在主として魚油に由来している。水産資源の重金属汚染はもとより魚の乱獲の問題もあり、人の健康を促進することが実証されているエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの各種オメガ３脂肪酸の維持可能な代替供給源が必要とされている。
【０００５】
現在ツボカビ類（ラビリンチュラ綱の真核海洋微生物）がＤＨＡ供給源として用いられているが、今のところ魚由来のＤＨＡと比べてツボカビ類により生産されるＤＨＡはコストが高い。ＤＨＡ生産率が強化された株を用いることで、ＤＨＡ生産コストを下げることができる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書では、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の生産に有用なラビリンチュラ綱微生物の新規株、及びそのような株により生産される油を提供する。本明細書で提供する株はまた、原株と比べて強化された脂質生産性、増殖性、栄養利用性または薬剤耐性といった新規のまたは改良された形質を有する株を含む由来株の分離にも用いることができる。本明細書ではまた、たとえば変異誘発及び／または選択剤の存在下（随意）でサイトスタットもしくはケモスタット選択することで、原株と比べて、限定ではないが脂質生産率などの形質が強化された由来株を分離する方法も提供する。
【０００７】
本明細書の一態様では、ＤＨＡの生産に有用な新規のラビリンチュラ綱微生物を提供する。このラビリンチュラ綱微生物は、郵便番号６１６０４米国イリノイ州ペオリア  ユニバーシティストリート１８１５Ｎ所在のＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に２０１３年４月４日にＮＲＲＬ−５０８３６（ＮＨ−０５７８３株）及びＮＲＲＬ−５０８３７（ＮＨ−０６１６１株）として寄託されている微生物であり得、または、これら寄託された株のいずれかに由来する株の微生物であり得る。本明細書で提供する株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／または配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含み得、あるいは配列番号５、配列番号６、配列番号７及び／または配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含み得、あるいは配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び／または配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含み得る。
【０００８】
本明細書にはさらに、目的の形質について選択するかもしくは選択しない継代培養、ケモスタットもしくはサイトスタット選択、変異誘発、遺伝子操作、またはそれらの任意の組合せを限定ではなく含む何らかの方法による由来株ＮＨ−０５７８３またはＮＨ−０６１６１の分離微生物を含む。
【０００９】
さまざま実施形態で、ＮＲＲＬ−５０８３６（ＮＨ−０５７８３株）及びＮＲＲＬ−５０８３７（ＮＨ−０６１６１株）ならびにそれらの由来株を含む本明細書で提供する株は、脂肪酸の少なくとも２５％をＤＨＡとして生産できる。たとえば、由来株（たとえば変異株またはバリアント株）を含むある株により生産される脂肪酸の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％がＤＨＡであり得る。株は、小規模の回分培養で生育すると、ＤＨＡを少なくとも４０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。いくつかの実施形態では、株は、振盪フラスコ中２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、４００ｍＬまたは５００ｍＬの回分培養で生育すると、ＤＨＡを少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。いくつかの実施形態では、株は、少なくとも１リットルの発酵培養で生育すると、ＤＨＡを少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも８００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。本明細書に開示の株及びそれらの由来株は、ＤＨＡ対ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）（Ｃ２２：５ｎ６）の比が少なくとも３．５対１であるかまたは少なくとも約４．０対１であるような脂質を生産できる。本明細書で提供する微生物によりドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）として生産される脂肪酸のパーセンテージは、たとえば、１２％未満か１０％未満である。ＮＨ−０５７８３株、ＮＨ−０６１６１株、及びそれらの由来株は、油を生産することができ、その油の脂肪酸の少なくとも２５％、３０％または３５％がＤＨＡであり、脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％がミリスチン酸である。いくつかの例では、脂肪酸の約５％未満、約３％未満または約２％未満がエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。また、本明細書で提供する株またはその由来株により生産される油の脂肪酸の２％未満、１％未満または０．５％未満がアラキドン酸（ＡＲＡ）であり得る。
【００１０】
本明細書の別の態様では、ラビリンチュラ綱の分離微生物及び変異微生物、ならびにそれらに由来する変異体またはバリアントを提供し、これら微生物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９．９９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する。株は、たとえばＤＨＡなどオメガ−３脂肪酸の生産に有用であり得、生産される脂質の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％がＤＨＡであるような脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、トラストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもＤＨＡを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多く生産する。あるいは、またはそれに加えて、いくつかの例では、株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもミリスチン酸を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも３００％多く生産する。たとえば、ある変異微生物は、その総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％をミリスチン酸として生産できる。株はさらに、ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも約３．５対１であるか、少なくとも約４．０対１である脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、小規模の回分培養で１２〜２４時間生育すると、たとえば１４時間または２３時間回分培養すると、ＤＨＡを少なくとも４０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。
【００１１】
本明細書の別の態様では、ラビリンチュラ綱の分離微生物及び変異微生物を提供し、これら微生物は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９．９９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する。株は、たとえばＤＨＡなどオメガ−３脂肪酸の生産に有用であり得、生産される脂質の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％がＤＨＡであるような脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもＤＨＡを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多く生産する。あるいは、またはそれに加えて、いくつかの例では、株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもミリスチン酸を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも３００％多く生産する。たとえば、ある変異微生物は、その総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％をミリスチン酸として生産できる。株はさらに、ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも約３．５対１であるか、少なくとも約４．０対１である脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、小規模の回分培養で１２〜２４時間生育すると、たとえば１４時間または２３時間回分培養で生育すると、ＤＨＡを少なくとも４０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。
【００１２】
本明細書のさらに別の態様では、ラビリンチュラ綱の分離微生物及び変異微生物、ならびにそれらに由来する変異体またはバリアントを提供し、これら微生物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％．９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する。株は、たとえばＤＨＡなどオメガ−３脂肪酸の生産に有用であり得、生産される脂質の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％がＤＨＡであるような脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもＤＨＡを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多く生産する。あるいは、またはそれに加えて、いくつかの例では、株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属に属する、と特徴付けることができ、野生株または天然株の変異体であり得、この変異体は、由来元の野生株よりもミリスチン酸を少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも３００％多く生産する。たとえば、ある変異微生物は、その総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％をミリスチン酸として生産できる。株はさらに、ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも約３．５対１であるか、少なくとも約４．０対１である脂質を生産できる。いくつかの例では、株は、小規模の回分培養で１２〜２４時間生育すると、たとえば１４時間または２３時間回分培養すると、ＤＨＡを少なくとも４０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈまたは少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産できる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、由来元の株と比べて、生産される総脂肪酸のパーセンテージとしてより多くのミリスチン酸を生産する変異微生物を提供する。たとえば、変異体は、由来元の株と比べて、生産される総脂肪酸のパーセンテージとして少なくとも２０％多くの、少なくとも３０％多くの、少なくとも４０％多くの、少なくとも５０％多くの、少なくとも７０％多くの、または少なくとも１００％多くのミリスチン酸を生産できる。いくつかの例では、変異体は、由来元の株と比べて、生産される総脂肪酸のパーセンテージとして少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍または少なくとも６倍のミリスチン酸を生産できる。変異微生物は、たとえば、その脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％をミリスチン酸として生産できる。いくつかの例では、微生物は、ラビリンチュラ綱（ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）に属する。いくつかの例では、微生物は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属の種である。変異微生物はさらに、由来元の株と比べて、総脂肪酸のパーセンテージとしてより多くのＤＨＡを生産できる。本明細書ではまた、由来元の株が生産するよりも、総脂肪酸のパーセンテージとして多くのミリスチン酸及び多くのＤＨＡを生産する変異微生物を提供する。たとえば、変異体は、野生株または原株と比べて総脂肪酸のパーセンテージとして少なくとも５０％多くの、または少なくとも１００％多くのミリスチン酸を生産することに加えて、由来元の株と比べて、生産される総脂肪酸のパーセンテージとして少なくとも２０％多くの、少なくとも３０％多くの、少なくとも４０％多くの、少なくとも５０％多くの、少なくとも７０％多くの、または少なくとも１００％多くのＤＨＡを生産できる。変異微生物は、たとえば、その脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも３９％をＤＨＡとして、またその脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％をミリスチン酸として生産できる。いくつかの例では、ある変異ラビリンチュラ綱株は、小規模の回分発酵培養で、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産する。たとえば、本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、小規模培養で、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで、または少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産できる。さまざまな例において、本明細書で提供する変異微生物により生産される総脂肪酸には、ＡＲＡが２％未満、たとえばＡＲＡが１％未満含まれ、ＥＰＡが３％未満、たとえばＥＰＡが１％未満含まれ得る。変異微生物により生産されるＤＨＡ対ＤＰＡの比は、いくつかの例では少なくとも４：１であり得る。
【００１４】
そのような変異株は、たとえば、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム属、ジャポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属またはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属などの株であり得る。たとえば、本明細書で提供する変異株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属の株であり得る。いくつかの例では、微生物は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属の種である。たとえば、脂肪酸の高パーセンテージをＤＨＡとして、また脂肪酸の高パーセンテージをミリスチン酸として生産する変異株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．１％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．３％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一である１８ＳｒＤＮＡ配列を有するオーランチオキトリウム属株またはシゾキトリウム属株であり得る。
【００１５】
ある変異ラビリンチュラ綱株により生産される総脂肪酸は、たとえば、１０％以下のＤＰＡ、９％以下のＤＰＡ、８％以下のＤＰＡ、７％以下のＤＰＡ、または６％以下のＤＰＡを含み得る。本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株により生産される脂肪酸中のＤＨＡ対ＤＰＡの比は、たとえば、約３．５：１かそれ以上、たとえば約４：１かそれ以上、たとえば約４．５：１かそれ以上、約４．９：１かそれ以上、または約５：１かそれ以上であり得る。
【００１６】
本発明の別の態様は、ある微生物原株と比べて高い脂質生産性を有する１種類以上の微生物株の由来体または変異体を分離する方法であり、該方法は、脂質代謝に関与する酵素または因子の少なくとも１種類の阻害剤の存在下で対象の微生物菌株をサイトスタットまたはケモスタットで培養することと、微生物株の由来体または変異体のうち高い脂質生産性を示すものを少なくとも１種類分離することを含む。高い脂質生産性とは、生産される脂質の培養液体積当たりの増量、生産される脂質の乾燥菌体重量パーセントとしての増加、生産されるトリグリセリド（ＴＡＧ）の培養液体積当たりの増量、生産されるＴＡＧの乾燥菌体重量パーセントとしての増加、生産されるＦＡＭＥの培養液体積当たりの増量、生産されるＦＡＭＥの乾燥菌体重量パーセントとしての増加、生産される脂肪酸１種類以上（たとえば、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃｌ２、Ｃ１４、Ｃｌ６またはＣ１８脂肪酸のうちの１種類以上）の培養液体積当たりの増量、生産される脂肪酸１種類以上の乾燥菌体重量パーセントとしての増加、生産される脂肪酸１種類以上の生産される総脂肪酸（ＦＡＭＥ）のパーセンテージとしての増加、生産されるＰＵＦＡ１種類以上（たとえばＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡのうちの１種類以上）の培養液体積当たりの増量、生産されるＰＵＦＡ１種類以上の乾燥菌体重量パーセントとしての増加、生産されるＰＵＦＡ１種類以上の生産される総脂肪酸（ＦＡＭＥ）のパーセンテージとしての増加、分離株により生産される総脂質、ＴＡＧ、ＦＡＭＥ、脂肪酸１種類以上もしくはＰＵＦＡ１種類以上のうちのいずれかの生産率の増加、のうちのどれでもよい。対象の株をサイトスタットまたはケモスタットで培養してからコロニーを分離することができ、分離コロニーから生育させた分離由来株を上述のいずれかの値について試験できる。また、由来株は、増殖率またはバイオマス蓄積度、たとえば培養の脂質生産期における増殖率またはバイオマス蓄積度などに基づいて試験し選択することもできる。
【００１７】
脂質生合成阻害剤を用いて対象の微生物株を選択するステップの前または後に、随意で、脂質生合成阻害剤を含まないサイトスタットまたはケモスタットで株を選択することができる。対象の微生物株をサイトスタットまたはケモスタットで選択する前に、方法は、やはり随意で、株を１種類以上の変異誘発プロトコルに供することも含み得、該変異誘発プロトコルは、たとえば１種類以上の化学的変異原、ＵＶ光またはガンマ線照射などを用いることができる。さらに、方法は、随意で、対象の微生物株を、同一の脂質生合成阻害剤または異なる脂質生合成阻害剤を用いるサイトスタットまたはケモスタットで培養して、順次選択することを含み得る。たとえば、変異誘発手順を行ってから、脂質代謝に関与する酵素または因子の少なくとも１種類の阻害剤の存在下でサイトスタットまたはケモスタットで選択する、ということを１回、２回、３回、または４回以上行うことができる。
【００１８】
本発明のさらなる態様では、微生物をＵＶ照射で処置してから、ある形質、たとえば限定ではないが、高濃度の総脂質、ＴＡＧ、ＰＵＦＡ、オメガ−３脂肪酸、または高濃度の１種類以上の特定の脂肪酸、たとえばミリスチン酸、オレイン酸、ＡＲＡ、ＤＨＡもしくはＥＰＡといった形質についてスクリーニングすることができる。微生物のＵＶ処置は株の変異誘発後に行うことができ、変異誘発はＵＶまたは他の変異原を利用することができる。いくつかの例では、微生物は、変異後、ＵＶ処置前に、目的の形質についてスクリーニングまたは選択され得る。さらに、それに加えて、またはその代わりに、微生物はＵＶ処置後に目的の形質についてスクリーニングまたは選択され得る。たとえば、高い脂質生産性について選択された変異誘発済み微生物をＵＶ照射した後、さらに高い脂質生産性について選択または試験することができる。随意で、ＵＶ処置した株を、目的の形質について選択できる化合物、たとえば脂質生合成を阻害する化合物を用いてまたは用いずに、ケモスタットまたはサイトスタットで選択することができる。ケモスタットまたはサイトスタットで選択した後に分離した株を、続いて、目的の形質が強化されているか、たとえば脂質増加、ＰＵＦＡ増加、ＡＲＡ増加、ＥＰＡ増加、またはＤＨＡ増加について試験して、変異誘発済み原株と比べて脂質、ＰＵＦＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡの生産率または生産レベルが増大した由来株を分離することができる。
【００１９】
脂質生産性が強化された由来株を選択する方法で用いられ得る対象の微生物株は、たとえば、藻類株、細菌株、菌類株または不等毛類株であり得る。いくつかの例では、微生物株は、油糧酵母株、たとえばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｔｕｌａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株である。いくつかの例では、微生物株は、藻類株、たとえばボツリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ハンチア属（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）、ヘマトコッカス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｉｓｉｓ）、モノダス属（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ネオクロリス属（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｃｈｉａ）、パリエトクロリス属（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）またはポルフィリディウム属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）の株である。いくつかの例では、微生物株は、ラビリンチュリッド（ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）株またはヤブレツボカビ株である。たとえば、株は、ラビリンチュラ、ラビリンチュロイデス、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属、アプラノキトリウム属、オーランチオキトリウム属、ジャポノキトリウム属、オブロンギキトリウム属、ディプロフリスまたはウルケニアの種であり得る。
【００２０】
本発明は、野生株の由来株、実験室株及び操作した株を含み、これらには遺伝子操作した株や、脂質代謝において作用する酵素の阻害剤を培養培地中に含むサイトスタットやケモスタットで選択するという標準的なやり方で改良した株が含まれる。また、本明細書の方法による由来株を次に遺伝子操作するか、または標準的方法でさらに改良した株も含まれる。このような株は、たとえばＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸や、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸を含有する油の生産に有用であり得る。株は、人や動物の栄養製品の成分として用いることができるバイオマスの生産に用いることができる。
【００２１】
また、本明細書で提供する分離ラビリンチュラ綱株が含まれるバイオマスも提供する。いくつかの例では、分離株の乾燥バイオマスの脂肪酸の少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも３５重量％がＤＨＡである。あるいは、またはそれに加えて、分離株の乾燥バイオマスの脂肪酸の少なくとも６重量％、少なくとも８重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、または少なくとも２５重量％がミリスチン酸であり得る。いくつかの例では、分離ラビリンチュラ綱バイオマスには、バイオマスの乾燥菌体重量の少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、または少なくとも７０重量％の脂肪酸が含まれ得、脂肪酸の少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、または少なくとも５０重量％がオメガ−３脂肪酸であり得る。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、本明細書で提供する微生物またはその由来体から分離された微生物油、たとえば本明細書で提供する任意の微生物の培養後の全培養のまたは採取したバイオマスの微生物油である。微生物油は、たとえば、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％のＤＨＡを含み得る。いくつかの実施形態では、微生物油は、その脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％をミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）として含み得る。いくつかの実施形態では、ドコサヘキサエン酸対ドコサペンタエン酸の比は、３．５：１かそれ以上、あるいは約４：１かそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、微生物油には、約５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満のＥＰＡが含まれる。いくつかの実施形態では、微生物油には、約２％未満、１％未満、０．５％未満、または検出不能な量のＡＲＡが含まれる。
【００２３】
本発明はまた、本発明のラビリンチュラ綱微生物もしくはバイオマスのいずれか１種類またはそれらの混合物が含まれる食品、動物飼料、化粧品、栄養製品、治療製品、または医薬品にも関する。本発明はまた、本発明の各種微生物油のいずれかが含まれる人や動物用の食品、化粧品または医薬組成物にも関する。いくつかの実施形態では、食品は乳児用調合乳である。いくつかの実施形態では、食品は、ミルク、飲料、治療飲料、栄養飲料またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、食品は、動物や人の食品の添加剤である。いくつかの実施形態では、食品は栄養サプリメントである。いくつかの実施形態では、食品は、動物飼料である。いくつかの実施形態では、動物飼料は養殖飼料である。いくつかの実施形態では、動物飼料は、ペットの餌、動物園の動物の餌、使役動物の餌、家畜の餌、またはそれらの組合せである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本開示の株を特徴づけるための配列が提供されている各フラグメントの起源を示す１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子座のマップである。
【図２】ガンマ線照射されたＷＨ−０５５５４の、脂質生合成阻害剤セルレニンの存在下でのサイトスタット培養の増殖特徴を示す図である。
【図３Ａ】ＷＨ−０５５５４と、脂質生合成阻害剤を含むサイトスタットで選択された由来株の、小規模回分培養での２３時間培養期間の脂質の比率変化を示す図である。
【図３Ｂ】ＷＨ−０５５５４と、脂質生合成阻害剤を含むサイトスタットで選択された由来株の、小規模回分培養での２３時間培養期間の脂質の比率変化を示す図である。
【図３Ｃ】ＷＨ−０５５５４と、脂質生合成阻害剤を含むサイトスタットで選択された由来株の、小規模回分培養での２３時間培養期間の脂質の比率変化を示す図である。
【図４】原株ＷＨ−０５５５４、ならびに標準的なやり方で改良したＮＨ−０５７８３株、ＮＨ−０６１６１株及びＮＨ−０６１８１株の総脂肪酸の組成を表す図である。小規模発酵培養のＦＡＭＥ分析から、改良株ＮＨ−０５７８３のミリスチン酸及びＤＨＡが増加したことが示され、また、改良株ＮＨ−０５７８３の由来株であるＵＶ処置したＮＨ−０６１６１株及びＮＨ−０６１８１株ではさらにミリスチン酸及びＤＨＡが増加したことが示された。
【図５】ＷＨ−０５６２８株とＷＨ−０５５５４株をＡｕｒａｎｔｉｏｎｃｈｙｔｒｉｕｍ種に類別した、様々なツボカビ類株の類縁性を示す系統樹図である。
【図６】野生株ＷＨ−０５６２８（黒塗り棒）及び標準的なやり方で改良されたＮＨ−０５７８３株（白っぽい棒）により生産されたさまざまなカロテノイドの量を示す棒グラフである。
【図７Ａ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝０時間で示す。
【図７Ｂ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝６時間で示す。
【図７Ｃ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝２４時間で示す。
【図７Ｄ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝３０時間で示す。
【図７Ｅ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝４８時間で示す。
【図７Ｆ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。標準的なやり方で改良された株ＮＨ−０５７８３をＴ＝７２時間（図７Ｆ）で示す。
【図７Ｇ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝０時間で示す。
【図７Ｈ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝６時間（図７Ｈ）で示す。
【図７Ｉ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝２４時間で示す。
【図７Ｊ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝３０時間で示す。
【図７Ｋ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝４８時間で示す。
【図７Ｌ】本発明のラビリンチュラ綱株の細胞の形態を示す顕微鏡写真の一式である。分離野生株ＷＨ−０５６２８をＴ＝７２時間で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
特に別途定義しないかぎり、本明細書で使用するすべての技術用語、表記法、その他科学用語や術語の意味は、本発明の技術分野の当業者により一般的に理解されるものを意図している。なかには、一般的に理解される用語の意味を明確さ及び／または参照の便利さを期して本明細書内で定義する場合もあるが、そのような定義が本明細書に含まれるからといって、当技術分野で一般に理解される意味ではない何か実質的な違いがあるということにはならない。本明細書に記載または参照する技術や手順の多くは、当業者らが十分に理解し、従来の方法論を用いて一般的に利用しているものである。
【００２６】
単数を表す「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から複数の意味が明らかに除外されないかぎりは、複数の意味も包含する。たとえば、「ａ  ｃｅｌｌ」という語には、単数または複数の細胞という意味が含まれ、１つ以上の細胞という意味も含まれる。本明細書では「Ａ及び／またはＢ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「ＡまたはＢ」、及び「Ａ及びＢ」という意味すべてを包含する。
【００２７】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、所与の値のプラスもしくはマイナス１０％以内、または近似の有効数字に丸めた値のいずれかを意味し、どの場合にもその値を含むものとする。範囲として記載している場合には、両端の値も含む。
【００２８】
本開示の全体を通して、さまざまな情報源を参照し、及び／または参照により援用している。情報源には、たとえば、科学誌の文献、特許文書、教科書及びワールド・ワイド・ウェブのブラウザは起動しないページアドレスが含まれる。このような情報源を当業者が利用できるようにレファレンスを明記しているが、本明細書に全体を引用している情報源は、特に「参照により援用」と書いていなくても、その１つひとつの内容を参照により明確に援用するものである。
【００２９】
本出願中の見出しは読み手の便宜だけを目的とし、本発明またはその実施形態の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
新規ラビリンチュラ綱株
本明細書では、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（Ｃ２２：６ｎ３）などのオメガ−３脂肪酸を生産する能力のあるラビリンチュラ綱（本明細書では「ラビリンチュラ綱」として言及）の新規分離株を提供する。開示の真核微生物は、高ＤＨＡ生産率を有する株を識別するように設計されたスクリーニングで特定した。本明細書で提供する株は、ブタペスト条約にしたがい、２０１３年４月４日に、郵便番号６１６０４米国イリノイ州ペオリア  ユニバーシティストリート１８１５Ｎ所在のＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＲＳ）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）にＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社によって寄託された。これら寄託株の受領番号はＮＲＲＬ−５０８３６（ＮＨ−０５７８３株）及びＮＲＲＬ−５０８３７（ＮＨ−０６１６１株）である。
【００３１】
（表１）微生物分離株と対応する受領番号
2017518747.tif 000002
【００３２】
ラビリンチュラ綱はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界に属し、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）とラビリンチュラ科（Ｌａｂｒｙｎｔｈｕｙｌａｃｅａｅ）の２つの科を包含する。ラビリンチュラ類（Ｌａｂｒｙｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）の属には、アプラノキトリウム属、オーランチオキトリウム属、ディプロフリス、ジャポノキトリウム属、ラビリンチュラ属（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）、ラビリンチュロイデス、オブロンギキトリウム属、シゾキトリウム属、トラストキトリウム属、及びウルケニアが含まれる。
【００３３】
いくつかの例では、本発明の微生物は、寄託株を特定する特徴のすべてを有し、具体的には、ＤＨＡを生産できるという寄託株を特定する特徴を有する。本発明の特定の微生物は、上述の寄託微生物ならびにそれらの由来株を指す場合もある。たとえば、本明細書では、ＮＲＲＬ受領番号５０８３６及びＮＲＲＬ受領番号５０８３７としてＡＲＳ微生物株保存機関に寄託された株の由来株である微生物を提供し、これらの由来株はＤＨＡを生産する。これらの株は、その総脂肪酸の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％をＤＨＡとして生産し得る。また、これらの株はさらに、その総脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％をミリスチン酸として生産し得る。
【００３４】
本明細書では「脂質（ｌｉｐｉｄ）」という用語は、油脂を指し、遊離脂肪酸、脂肪酸アルコールやワックスエステルなどの脂肪酸誘導体、テルペノイド、炭化水素（たとえばアルカンやアルケン）、ステロール、及びグリセリン脂肪酸エステルを含み、膜脂質または貯蔵脂質、たとえばリン脂質、ガラクト脂質、硫脂質、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールを含む。（たとえば脂肪酸生合成から誘導されるアシル鎖を含む）脂肪酸成分を含む脂質としては、たとえば、リン脂質、糖脂質、ガラクト脂質、硫脂質、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、スフィンゴミエリン及びグリコスフィンゴ脂質、エイコサノイド、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、レゾルビン、プロテクチン、イソプロスタン、オキシリピンが挙げられる。本明細書では「総脂肪酸（ｔｏｔａｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）」という用語は、当分野で知られており本明細書でも説明する分析や定量化のために脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）へと誘導され得る上述及びその他細胞脂質の成分である脂肪酸（直鎖アシル部分）を含む。したがって、「脂肪酸パーセント」、「脂肪酸％」または「総脂肪酸％」及び「ＦＡＭＥパーセント」または「ＦＡＭＥ％」は、脂質または油の脂肪酸成分を指す場合に交換可能に使用され得る。
【００３５】
多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）としては、オメガ−３脂肪酸とオメガ−６脂肪酸が挙げられる。オメガ−３脂肪酸としては、限定ではないが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（Ｃ２２：６ｎ３）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）（Ｃ２０：５ｎ３）が挙げられる。オメガ−６脂肪酸としては、限定ではないが、アラキドン酸（ＡＲＡ）（Ｃ２０：４ｎ６）及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）（Ｃ２２：５ｎ６）、ガンマ−リノール酸（Ｃ１８：３  ｎ−６）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２  ｎ−６）及びエイコサトリエン酸（Ｃ２０：３  ｎ−６）が挙げられる。オメガ−３脂肪酸としては、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ３）、ステアリドン酸（Ｃ１８：４ｎ３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４  ｎ−３）、オクタデカペンタエン酸（Ｃ１８：５  ｎ−３）も挙げられる。
【００３６】
１８Ｓ遺伝子領域に独特の配列を与える１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４つの重複するフラグメントを、野生型分離株ＷＨ−０５５５４（配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４）ならびに由来株ＮＨ−０５７８３（配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８）及びＮＨ−０６１６１（配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２）について得た。１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子はマルチコピーなので、異なる配列の並びから決定された４つのフラグメントの配列は、別々に準備して、異なる遺伝子座からの配列を含むキメラ配列を呈するのを回避した。ＷＨ−０５７８３株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子座に各フラグメントをマッピングした図を説明目的で図１に示す。
【００３７】
本明細書では、特に断らない限りは、同一性パーセント（％）への言及は、（１）標準デフォルトパラメータ（デフォルトでクエリ配列は低複雑領域についてフィルタ）を用いるアミノ酸検索用ｂｌａｓｔｐ及び核酸検索用ｂｌａｓｔｎによるＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴ相同性検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．  Ｌ．，  Ｓｃｈａａｆｆｅｒ，  Ａ．  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．（１９９７）"Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．"  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に説明されており、本明細書にその内容を参照により援用する）、（２）ＢＬＡＳＴ  ２アラインメント（以下に説明するパラメータを用いる）及び／または（３）標準デフォルトパラメータを用いるＰｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）により実施される相同性の評価を指す。なお、ＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ  ２では標準パラメータが一部異なるため、２つの特定の配列がＢＬＡＳＴ  ２プログラムでは有意な相同性を有すると認識され得るが、一方の配列をクエリ配列として用いるＢＬＡＳＴ  ２．０  Ｂａｓｉｃ  ＢＬＡＳＴによる検索では第２の配列をトップマッチとして同定しないかもしれないことに留意されたい。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、自動化された簡便なバージョンの「プロファイル」検索を提供しており、配列相同体を高感度で探す。このプログラムではまずｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴデータベース検索を行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、戻り値の有意なアラインメントの情報を用いて部位特異的スコアマトリックスを構築し、これが次回のデータベース検索用のクエリ配列と置き換わる。したがって、同一性パーセントは、これらのプログラムのうちのどれを用いても決定できることを理解されたい。
【００３８】
たとえば、Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ  （１９９９）の"Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ"，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７−２５０（本明細書にその内容を参照により援用する）に説明されているように、ＢＬＡＳＴ  ２の配列を使って２つの特定の配列を互いに対してアラインメントできる。ＢＬＡＳＴ  ２の配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを用いてｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで実行されて、２つの配列間のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を実行して結果のアラインメントにギャップ（欠失及び挿入）を差し込むことを可能にする。本明細書では明瞭さを期して、ＢＬＡＳＴ  ２の配列アラインメントを以下の標準デフォルトパラメータを用いて行う。ｂｌａｓｔｎの場合、０  ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、一致の報酬＝１、不一致のペナルティ＝−２、ギャップ開始時ペナルティ（５）、ギャップ伸長時ペナルティ（２）、ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）、配列長（１１）、フィルタ（オン）とする。ｂｌａｓｔｐの場合、０  ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、ギャップ開始時ペナルティ（１１）、ギャップ伸長時ペナルティ（１）、ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）、配列長（３）、フィルタ（オン）とする。
【００３９】
本明細書でその配列を提供する各フラグメントは、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の同じ領域に沿って伸長するが、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に関しては異なる塩基位置で開始し終了する。たとえば、配列番号１、５及び９はすべて図１の「フラグメント１」に対応するが、長さが異なり、異なる位置で開始及び／または終了する場合があり、配列番号２、６及び１０はすべて図１の「フラグメント２」に対応するが、長さが異なり、異なる位置で開始し終了する場合があり、配列番号３、７及び１１はすべて図１の「フラグメント３」に対応するが、長さが異なり、異なる位置で開始及び／または終了する場合があり、配列番号４、８及び１２はすべて図１の「フラグメント４」に対応するが、長さが異なり、異なる位置で開始し終了する場合がある。したがって、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の同一のフラグメントに対応するこれらの配列間の同一性％は、ＢＬＡＳＴアライメントが開始（または終了）する部位に基づいて計算される場合もあり、それは、ある配列の最初のヌクレオチドから１０個、２０個、５０個、７５個、１００個または２００個のヌクレオチド以内であり得、ある配列の最初のヌクレオチドから１０個、２０個、５０個、７５個、１００個または２００個のヌクレオチド以内であり得る。同様に、本明細書に提供する配列番号１〜１２に対する他の配列の同一性％を評価する場合、同一性％は、２つのフラグメント間でＢＬＡＳＴアラインメントが開始し終了する部位で開始し終了し得る。好ましくは、本明細書で特定する同一性％は、配列番号１〜１２のいずれかの少なくとも２００個、少なくとも３００個、または少なくとも４００個の連続するヌクレオチドに亘り、さらに好ましくは配列番号１〜１２のいずれかの少なくとも５００個のヌクレオチドに亘る。
【００４０】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、不等毛類ラビリンチュラ綱の変異微生物を提供する。いくつかの例では、変異微生物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。微生物は、好ましくは、生産される油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産でき、また好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産できる。変異微生物は、さらに、たとえば、脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である微生物油を生産でき、好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである脂質を生産できる。いくつかの例では、微生物は、脂肪酸の５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満がパルミチン酸である微生物油を生産する。たとえば、変異微生物が生産する総脂肪酸のパーセンテージは、パルミチン酸よりもミリスチン酸のほうが高くなり得る。いくつかの例では、変異微生物は、小規模回分培養で、少なくとも４５ｍｇ／リットル／時間のペースでＤＨＡを生産できる。いくつかの例では、好ましくは、株は、体積２〜１０ｍＬの回分培養で、たとえば体積５〜６ｍＬなど体積４〜８ｍＬの回分培養で、約１２〜約２４時間インキュベートされて、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、約５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産できる。好ましい例では、株は、ＤＨＡ対ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の比が少なくとも約３．５：１かまたは少なくとも約４．０：１である脂質を生産できる。微生物は、好ましくは、脂肪酸の５％未満、２％未満、１％未満、または約０．５％未満がＥＰＡである脂質を生産できる。さらに、微生物は、好ましくは、脂肪酸の２％未満、１％未満、約０．５％未満、または約０．２％未満がＡＲＡである脂質を生産する。
【００４１】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、不等毛類ラビリンチュラ綱の変異微生物を提供する。いくつかの例では、変異微生物は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。微生物は、好ましくは、生産される油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産でき、また好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産できる。変異微生物は、さらに、たとえば、脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である微生物油を生産でき、好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである脂質を生産できる。いくつかの例では、微生物は、脂肪酸の５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満がパルミチン酸である微生物油を生産する。たとえば、変異微生物が生産する総脂肪酸のパーセンテージは、パルミチン酸よりもミリスチン酸のほうが高くなり得る。いくつかの例では、変異微生物は、小規模回分培養で、少なくとも４５ｍｇ／リットル／時間のペースでＤＨＡを生産できる。いくつかの例では、好ましくは、株は、体積２〜１０ｍＬの回分培養で、たとえば体積５〜６ｍＬなど体積４〜８ｍＬの回分培養で、約１２〜約２４時間インキュベートされて、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、約５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産できる。好ましい例では、株は、ＤＨＡ対ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の比が少なくとも約３．５：１かまたは少なくとも約４．０：１である脂質を生産できる。微生物は、好ましくは、脂肪酸の５％未満、２％未満、１％未満、または約０．５％未満がＥＰＡである脂質を生産できる。さらに、微生物は、好ましくは、脂肪酸の２％未満、１％未満、約０．５％未満、または約０．２％未満がＡＲＡである脂質を生産する。いくつかの例では、変異微生物は、ＮＨ−０５７８３（ＮＲＲＬ−５０８３６）であるか、またはその由来株である。
【００４２】
本発明はまた、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、不等毛類ラビリンチュラ綱の変異微生物を提供する。いくつかの例では、変異微生物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の同一性を有する配列を含む１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。微生物は、好ましくは、生産される油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産でき、また好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである微生物油を生産できる。変異微生物は、さらに、たとえば、脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である微生物油を生産でき、好ましくは、脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される微生物油の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、約４０％、または少なくとも４５％がＤＨＡである脂質を生産できる。いくつかの例では、微生物は、脂肪酸の５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満がパルミチン酸である微生物油を生産する。たとえば、変異微生物が生産する総脂肪酸のパーセンテージは、パルミチン酸よりもミリスチン酸のほうが高くなり得る。いくつかの例では、変異微生物は、小規模回分培養で、少なくとも４５ｍｇ／リットル／時間のペースでＤＨＡを生産できる。いくつかの例では、好ましくは、株は、体積２〜１０ｍＬの回分培養で、たとえば体積５〜６ｍＬなど体積４〜８ｍＬの回分培養で、約１２〜約２４時間インキュベートされて、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ／ｈ、約５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１３０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産できる。好ましい例では、株は、ＤＨＡ対ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の比が少なくとも約３．５：１かまたは少なくとも約４．０：１である脂質を生産できる。微生物は、好ましくは、脂肪酸の５％未満、２％未満、１％未満、または約０．５％未満がＥＰＡである脂質を生産できる。さらに、微生物は、好ましくは、脂肪酸の２％未満、１％未満、約０．５％未満、または約０．２％未満がＡＲＡである脂質を生産する。いくつかの例では、変異微生物は、ＮＨ−０６１６１（ＮＲＲＬ−５０８３７）であるか、またはその由来株である。
【００４３】
「由来体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語を株に関して使用する場合は、ある株またはその子孫株の変異体及びバリアントを包含する。したがって、たとえばある野生株の由来株は、野生株または天然株に直接由来することもできるし、野生株または天然株に（直接または間接的に）由来する株に由来する株であってもよい。
【００４４】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供する変異株は、体積が少なくとも１００ｍＬ、少なくとも２００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、または少なくとも１リットルの培養中、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも４００ｍｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡを生産できる。
【００４５】
本発明はまた、変異ラビリンチュラ綱株を提供するが、これらの株は、由来元の野生株または原株と比べて、株が生産する総脂肪酸のパーセンテージとしてミリスチン酸が増加した変異体である。そのような変異株は、たとえば、ラビリンチュラ属、ラビリンチュロイデス属、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属、アプラノキトリウム属、オーランチオキトリウム属、ジャポノキトリウム属、オブロンギキトリウム属、ディプロフリス属、またはウルケニア属の株であり得る。たとえば、本明細書で提供する変異株は、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属またはオーランチオキトリウム属の株であり得る。たとえば、高パーセンテージの脂肪酸をミリスチン酸として生産する変異株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％同一である１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有するオーランチオキトリウム属株かシゾキトリウム属株であり得る。総脂肪酸としてのミリスチン酸パーセントは、由来元の株により生産されるミリスチン酸パーセントと比べて、変異ラビリンチュラ綱微生物で５０％以上増加し得る。さまざまな例で、生産される総脂肪酸としてのミリスチン酸パーセントは、由来元の株と比べて、変異体では少なくとも１００％増加する。
【００４６】
さまざまな例で、由来元の株が生産するよりも高パーセンテージの総脂肪酸をミリスチン酸として生産する本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である脂肪酸を生産できる。株は、トリクロサン及び／またはセルレニンに抵抗性があり得る。微生物は、好ましくは、培養液中の脂質生合成阻害剤の非存在下で、生産される脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である脂質を生産できる。株は、さらに、総脂肪酸のパーセントとしてより多くのＰＵＦＡを生産し得る。
【００４７】
たとえば、本発明はまた、変異ラビリンチュラ綱株を提供し、これらの株は、由来元の野生株と比べて、生産される総脂肪酸パーセンテージとして増量したＤＨＡ、そしてさらには生産される総脂肪酸パーセンテージとして増量したミリスチン酸を有する変異体である。たとえば、由来元の株により生産されるＤＨＡパーセントとミリスチン酸パーセントと比べて、変異ラビリンチュラ綱微生物では、生産される総脂肪酸としてのＤＨＡパーセントは２０％以上増加し得、生産される総脂肪酸としてのミリスチン酸パーセントは５０％以上増加し得る。さまざまな例で、由来元の株と比べて、変異体では、生産される総脂肪酸のＤＨＡパーセントは少なくとも３０％増加し、生産される総脂肪酸としてのミリスチン酸パーセントは少なくとも１００％増加する。株は、セルレニン及び／またはトリクロサンなどの脂肪酸シンターゼ阻害剤に抵抗性があり得る。
【００４８】
さまざまな例で、由来元の株が生産するよりも高いパーセンテージの脂肪酸をドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）として、及び高いパーセンテージの脂肪酸をミリスチン酸として生産する本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、総脂肪酸の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも３９％がＤＨＡであり、総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である脂肪酸を生産できる。由来元の株が生産するよりも高パーセンテージの脂肪酸をドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）として、及び高パーセンテージの脂肪酸をミリスチン酸として生産する本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、培養液中の脂質生合成阻害剤の非存在下で、総脂肪酸の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも３９％がＤＨＡであり、総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％がミリスチン酸である脂肪酸を生産できる。本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、小規模の回分発酵培養で、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１６０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１８０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２１０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースでＤＨＡを生産できる。本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株は、由来元の株よりも高いペースでＤＨＡを生産できる。
【００４９】
変異ラビリンチュラ綱株により生産される総脂肪酸には、たとえば、１０％以下のＤＰＡ、９％以下のＤＰＡ、８％以下のＤＰＡ、７％以下のＤＰＡ、１０％以下のＤＰＡ、または６％以下のＤＰＡが含有され得る。本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱株により生産される脂肪酸中のＤＨＡ対ＤＰＡの比は、約４：１かそれ以上、たとえば、約４．５：１かそれ以上、約４．９：１かそれ以上、または約５：１であり得る。
【００５０】
本発明には、本明細書で提供する変異ラビリンチュラ綱微生物を含む分離ラビリンチュラ綱バイオマスも含まれる。いくつかの実施形態では、バイオマスの乾燥菌体重量の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％が脂肪酸である。いくつかの実施形態では、バイオマスは、脂肪酸の少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％をＤＨＡとして含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは、脂肪酸の少なくとも６重量％、少なくとも８重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、または少なくとも３０重量％をミリスチン酸として含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは、脂肪酸の６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、または０．５５重量％以下をＥＰＡとして含む。いくつかの実施形態では、バイオマスはＥＰＡをほぼ含まない。いくつかの実施形態では、バイオマスは、脂肪酸の約０．５重量％〜約１重量％、約０．５重量％〜約２重量％、約０．５重量％〜約５重量％、約０．５重量％〜約６重量％、約１重量％〜約５重量％、約１重量％〜約６重量％、約２重量％〜約５重量％、または約２重量％〜約６重量％、または約２重量％〜約１０重量％をＤＰＡとして含む。
【００５１】
微生物油
本発明はさらに、本明細書で提供する微生物によって生産される微生物油に関する。本発明の微生物油は微生物由来のどのような油でもよく、たとえば微生物バイオマスから抽出したまま未処理の粗油、微生物粗油を精製、漂白及び／または脱臭などの処理工程で処理して得られる精製油、微生物粗油または精製した微生物油を希釈して得られる希釈微生物油、またはたとえば微生物粗油または精製した微生物油をさらに不純物除去法で処理して油中の（ＤＨＡなどの）脂肪酸濃度を高めて得られる濃縮油が例として挙げられるが、特に断らない限りは、本明細書で開示する微生物油は、微生物または微生物バイオマスから抽出された未処理の粗油である。たとえば、限定ではないがヘキサンなどの炭化水素、メタノールなどのアルコール、クロロホルム、塩化メチレンなどが例として挙げられる有機溶媒または水と混和する溶媒などの溶媒を加えて、溶解細胞または非溶解細胞を抽出することによって、粗油を得ることができる。
【００５２】
本明細書に開示の粗油に含まれる脂肪酸含有量は、一般には、本明細書の実施例で説明する脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析により決定される。本明細書では、「ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ（脂肪酸）」という用語（ならびに「オメガ−３脂肪酸」「ＰＵＦＡ」「ＤＨＡ」「ミリスチン酸」などの他の脂肪酸の用語）は、細胞脂質または微生物油の脂肪酸含有量に関して使われる場合は、遊離脂肪酸に加えて、限定ではないがトリグリセリド、ジグリセリド及びモノグリセリド、ワックスエステル、ならびにリン脂質などの極性脂質などの脂質の文脈での脂肪酸（たとえばエステル化されるかまたはその他生化学的に他の化学部分に接合されたアシル鎖など）を指す。したがって、微生物油の総脂肪酸中のＤＨＡなど特定の脂肪酸種のパーセンテージとは、たとえばグリセロ脂質やリン脂質中の脂肪酸を含み、総脂肪酸のパーセントまたは「ＦＡＭＥ脂質パーセント」として表される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、微生物油にはＤＨＡが少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、または少なくとも８０重量％含まれる。いくつかの例では、微生物油は、脂質の脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％をミリスチン酸として含み得る。いくつかの実施形態では、微生物油は、ＦＡＭＥの約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下をＥＰＡとして含む。いくつかの実施形態では、微生物油は、ＥＰＡをほぼ含まない。いくつかの実施形態では、微生物油は、ＦＡＭＥの約０．５％〜約１％、約０．５％〜約２％、約０．５％〜約２．５％、約０．５％〜約３％、約０．５％〜約３．５％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約６％、約１％〜約２％、約２％〜約３％、約２％〜約３．５％、約１％〜約２．５％、約１％〜約３％、約１％〜約３．５％、約１％〜約５％、または約１％〜約６％をＤＰＡ  ｎ６として含む。いくつかの実施形態では、微生物油は、ＤＨＡ対ＤＰＡ  ｎ６の重量比が、約４：１かそれ以上、少なくとも５：１、または少なくとも６：１である。
【００５４】
脂質の生産
脂質は、本発明の１種類以上の分離ラビリンチュラ綱微生物またはその由来体を用いて生産され得る。ラビリンチュラ綱類のバイオマスの接種、増殖及び回収のさまざまな発酵パラメータは、米国特許第５，１３０，２４２号、同第６，５８２，９４１号、同第８，２０７，３６３号、同第６，６０７，９００号、同第６，６０７，９００号及び米国特許出願公開第２００８０１５５７０５号にも説明されているように当分野では知られており、これらの文書すべてを参照により本明細書に援用する。
【００５５】
ラビリンチュラ綱微生物の増殖にはどのような培地を使ってもよい。たとえば、ラビリンチュラ綱類を培養するレシピは、米国特許第８，２０７，３６３号にも記載されているし、本明細書の実施例でも説明されている。培養培地は、随意で、最終的な培地配合のたとえば１％〜９９％の希釈で存在し得る天然または人工の海水を含む場合がある。ラビリンチュラ綱微生物の培養培地は、微生物用に少なくとも１種類の炭素源を含む。培養培地中に存在し得る炭素源の例としては、限定ではないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、Ｌ−フコース（ガラクトース由来）、ラクトース、ラクツロース、マルトース、ｍａｌｔｒｉｏｓｅキシロース、サッカロース、可溶性デンプン、デキストリン（トウモロコシ由来）及びアルファ−シクロデキストリン（デンプン由来）、グリコーゲン、ゼラチン、糖蜜、コーンスティープリカー、ｍ−イノシトール（コーンスティープリカー由来）、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、アセテート（たとえば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム）、酢酸、マンニトール、エタノール、ガラクツロン酸（ペクチン由来）、セロビオース（セルロース由来）、ならびにマルチトール、エリスリトール及びアドニトールなどのポリオール、ならびにグリセロール及びｔｗｅｅｎ  ８０などのオレイン酸、ならびにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチル−β−Ｄ−マンノサミンなどのアミノ糖が挙げられる。培養培地は、窒素源を含むことができ、それはたとえば、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは硝酸アンモニウムなどの無機窒素源であり得る。あるいは、またはそれに加えて、培養培地に与えられる窒素源は、有機窒素源であり得、限定ではないが、ペプトン、酵母エキス、ポリペプトン、麦芽エキス、大豆粉、肉エキス、魚肉、カザミノ酸、コーンスティープリカー、グルタメート又は尿素が例として挙げられる。培養培地はまた、リン酸カリウムやリン酸ナトリウムなど何らかの形のリン酸塩、及び無機塩、酸、または塩基を含み、それらはたとえば硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸、クエン酸、リン酸、オルトバナジン酸ナトリウム、クロム酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン及び塩化カルシウムなど、微量栄養素も含めて栄養素を補給できるものである。１種類以上のキレート化合物（たとえばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸またはクエン酸塩）もまた培養培地中に存在し得る。さらに、１種類以上のビタミン、たとえば限定ではないが、塩酸ピリドキシン、塩酸チアミン、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸及びビタミンＢ１２も培地成分として存在し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、培養培地には、飽和度パーセントで少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の溶解酸素が含まれる。いくつかの実施形態では、培養培地には、飽和度パーセントで約５％〜約２０％、約５％〜約５０％、約５％〜約１００％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約１００％、約２０％〜約５０％、または約２０％〜約１００％の溶解酸素が含まれる。
【００５７】
発酵体積は実施可能などのような体積でもよい。いくつかの実施形態では、発酵体積（培養体積）は、少なくとも約１リットルまたは少なくとも約２リットル、少なくとも約５リットル、少なくとも約１０リットル、少なくとも約５０リットル、少なくとも約１００リットル、少なくとも約２００リットル、少なくとも約５００リットル、少なくとも約１０００リットル、少なくとも約１０，０００リットル、少なくとも約２０，０００リットル、少なくとも約５０，０００リットル、少なくとも約１００，０００リットル、少なくとも約１５０，０００リットル、少なくとも約２００，０００リットル、または少なくとも約２５０，０００リットルである。いくつかの実施形態では、発酵体積は、約１リットル〜約３００，０００リットル、約２リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約２００リットル、約５００リットル、約１０００リットル、約１０，０００リットル、約２０，０００リットル、約５０，０００リットル、約１００，０００リットル、約１５０，０００リットル、約２００，０００リットル、約２５０，０００リットル、または約３００，０００リットルである。
【００５８】
発酵は、温度約１５℃〜約４０℃、たとえば約１７℃〜約３５℃、または約１８℃〜約３５℃、または約２０℃〜約３２℃、または約２２℃〜約３０℃で実施することができる。たとえば、少なくとも発酵の１つの段階を温度約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、または約３５℃で実施することができる。培養培地のｐＨは約４．０〜約８．５であり得、たとえば培養培地のｐＨは約４．２〜約８．０、または約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．８、または約５．０〜約７．５であり得、たとえば発酵は約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．０、または約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．５の培地でなされ得る。
【００５９】
培養は、通気振盪培養、振盪培養、静置培養、回分培養、流加培養、連続培養、ローリング回分培養またはｗａｖｅ式培養などで、１〜３０日間、１〜２１日間、１〜１５日間、１〜１２日間、１〜９日間、１〜７日間、または１〜５日間かけて、温度４〜４０℃で、好ましくは１８〜３５℃で行うことができる。さまざまな培養法で、たとえば温度、溶解酸素濃度、撹拌または攪乱度、１種類以上の栄養素の可用性などが異なり得る２つ以上の培養期（たとえば増殖期と脂質生産期）があり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する分離ラビリンチュラ綱の培養は、炭素源、窒素源及び栄養源を有する約ｐＨ４．５〜約ｐＨ８．０、約１５℃〜約３５℃の培養培地での培養期の間、少なくとも約２ｇ／Ｌ／日、少なくとも約４ｇ／Ｌ／日または少なくとも約８ｇ／Ｌ／日のオメガ−３脂肪酸生産性を有する。いくつかの実施形態では、分離ラビリンチュラ綱の培養は、炭素源、窒素源及びその他の栄養源を有する約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．５、約２０℃〜約３５℃の培養培地での培養期の間、約１ｇ／Ｌ／日〜約３０ｇ／Ｌ／日、約２ｇ／Ｌ／日〜約２５ｇ／Ｌ／日、約２ｇ／Ｌ／日〜約２５ｇ／Ｌ／日、約３ｇ／Ｌ／日〜約２０ｇ／Ｌ／日または約４ｇ／Ｌ／日〜約２０ｇ／Ｌ／日のオメガ−３脂肪酸生産性を有する。
【００６１】
抽出
さまざまな培養培地での発酵で得られた細胞バイオマスを回収するには、濾過や遠心分離などさまざまな手順を用いることができる。次いで細胞を洗浄し、凍結、凍結乾燥またはスプレー乾燥させ、酸素を存在させない非酸化環境で保存した後、加工食品や飼料に混合することができる。
【００６２】
ＤＨＡを含有する脂質は、回収した細胞バイオマスをたとえばミリング、超音波処理または他の何らかの便利な手段で破壊または破砕してから、クロロホルム、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール、エタノールなどの溶媒を用いるかまたは超臨界流体抽出手段により抽出することで、得ることができる。オメガ−３多価不飽和脂肪酸は、脂質を加水分解して、高不飽和画分を尿素付加や分留、カラムクロマトグラフ法または超臨界流体分画など従来の方法により濃縮することで、さらに濃縮することができる。また、細胞を破壊または溶解して、脂質を植物油または動物油（たとえば魚油）として抽出することができる。抽出した油は、植物油を精製するのに日常的に使われる公知の方法（たとえば化学的または物理的な精製法）で精製することができる。このような精製法により、抽出された油を食用油として使用または販売する前に、不純物が除去される。精製後、油を直接飼料や食品の添加物として用いて、オメガ−３及び／またはオメガ−６強化製品を製造することができる。あるいは、以下に説明するように油をさらに処理して精製してから、上述の用途や、医薬用途にも使用できる。
【００６３】
オメガ−３またはオメガ−６強化（濃縮）油を製造する別の方法では、採取した細胞バイオマス（新鮮または乾燥済）を、超音波処理、液せん断破壊、ビーズミル、高圧印加、凍結融解または細胞壁の酵素消化などの公知の技法により、破裂させるかまたは透過処理することができる。破裂細胞の脂質は、ヘキサン、クロロホルム、エーテルまたはメタノールなどの溶媒または混合溶媒を用いて抽出する。溶媒を除去し、塩基、酸または酵素による加水分解など、トリグリセリドを遊離脂肪酸または脂肪酸エステルに転換する任意の公知の方法で、脂質を加水分解する。加水分解が完了すると、非鹸化化合物をエーテル、ヘキサンまたはクロロホルムなどの溶媒中に抽出して、除去する。次いで残った溶液に酸を添加して酸性化し、遊離脂肪酸をヘキサン、エーテルまたはクロロホルムなどの溶媒中に抽出する。次に、遊離脂肪酸を含有する溶媒溶液を非ＰＵＦＡ化合物が結晶化する温度にまで冷却すると、非ＰＵＦＡ化合物を濾過、遠心分離または沈殿により除去することができる。残ったＰＵＦＡが濃縮液中に得られ、人間用の栄養サプリメントとして、食品添加物として、または医薬用途に用いられる。
【００６４】
製品
本発明の組成物としては、限定ではないが、食品、医薬組成物、化粧品及び産業組成物が挙げられる。
【００６５】
本明細書で提供する微生物油を含み得る食品には、固体と液体両方の組成物が含まれる。食品は、動物や人間の食物の添加剤であり得る。食物としては、限定ではないが、一般的な食物、（ミルク、飲料、治療飲料及び栄養飲料などの）液体製品、機能性食品、サプリメント、栄養補助食品、（未熟児用も含む）乳児用調合乳、妊婦や授乳中の女性用の食品、成人用食品、老人用食品及び動物飼料などが挙げられる。
【００６６】
本発明のラビリンチュラ綱バイオマスまたは微生物油は、油、ショートニング、スプレッド、その他の脂肪性材料、飲料、ソース、（ミルク、ヨーグルト、チーズ、アイスクリームなどの）乳製品もしくは大豆製品、焼いた食品、たとえば（カプセル剤や錠剤としての）栄養サプリメントなどの栄養製品、ビタミンサプリメント、ダイエットサプリメント、粉末飲料、完成（ｆｉｎｉｓｈｅｄ）もしくは半完成（ｓｅｍｉ−ｆｉｎｉｓｈｅｄ）粉末食品、及びそれらの組合せのうちの１つ以上にそのまま用いられるか、または添加剤として用いられ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、組成物は、限定ではないが水生動物や陸生動物の飼料を含む動物飼料である。いくつかの実施形態では、組成物は、肉、卵またはミルクが人間の消費用に採取される何らかの動物などの、肉または産物を人間が消費する何らかの動物用の飼料または飼料サプリメントである。これら動物に給餌すると、ＬＣ−ＰＵＦＡなどの栄養分がその動物の肉、ミルク、卵または他の産物に吸収される場合があり、そのような栄養分の含有量が増加し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。適切な医薬組成物としては、限定ではないが、抗炎症組成物、冠動脈心疾患の治療薬、動脈硬化治療薬、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗しょう症薬、抗鬱剤、抗痙攣薬、抗ピロリ菌薬、神経変性疾患治療薬、肝臓変性疾患治療薬、抗生物質、コレステロール降下組成物及びトリグリセリド降下組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は医療用食品である。医療用食品としては、医師の指示下で外用摂取または投与される組成物に含まれる、何らかの症状に特化した食事管理用の食品が挙げられ、そのための特別な栄養要件は、公認の科学的原理に基づき、医学的評価によって決定される。
【００６９】
微生物油は剤形として製剤され得る。剤形としては、限定ではないが、錠剤、カプセル剤、カシェー剤、ペレット剤、丸薬、粉末剤や顆粒剤、及び非経口剤形が挙げられ、非経口剤形としては、限定ではないが、有効量の微生物油を含有する溶液、懸濁液、乳剤及び乾燥粉末剤が挙げられる。そのような製剤は、薬学的に許容可能な希釈剤、フィラー、崩壊剤、結合剤、滑剤、界面活性剤、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、バッファー、湿潤剤、モイスチャライザー、可溶化剤、保存剤などを含み得ることも当分野で知られている。投与形態としては、限定ではないが、微生物油及び１種類以上の適切な薬学的に許容可能な担体を含有する錠剤、糖衣錠、カプセル剤、カプレット及び丸薬が挙げられ得る。
【００７０】
経口投与用に、微生物油を当分野で公知の薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる。そのような担体のおかげで、本発明の微生物油を、治療対象が経口摂取する錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤することが可能になる。いくつかの実施形態では、剤形は、錠剤、丸薬またはカプレットである。経口利用のための医薬調製物は、所望により適切な補助物質を加えてから、固体の賦形剤を加え、得られた混合物を随意で粉砕し、顆粒状混合物を処理して、錠剤または糖衣錠の芯剤を得ることにより、得られ得る。適切な賦形剤としては、限定ではないが、糖（限定ではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールなど）や、セルロース調製物（限定でないが、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））が挙げられる。所望により、限定ではないが例として、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（たとえばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を加えることができる。経口利用可能な医薬調製物としては、限定ではないが、ゼラチン製のプッシュフィット型カプセル剤、ならびにゼラチンと（グリセロールやソルビトールなどの）可塑剤とで作製された密閉型軟カプセル剤が挙げられる。
【００７１】
さらなる実施形態では、組成物は、化粧品または身だしなみ用品である。化粧品や身だしなみ用品としては、限定ではないが、乳液、クリーム、ローション、マスク、石鹸、シャンプー、シェービングクリーム、洗顔剤、フェイシャルクリーム、コンディショナー、メイクアップ用品、入浴剤及び消散剤が挙げられる。化粧品は薬用または非薬用であり得る。
【００７２】
由来株の分離方法
本明細書ではさらに、脂質生産性が強化された微生物株を分離する方法を提供し、該方法には、脂質代謝に関与する酵素の活性を阻害する少なくとも１種類の化合物を含む培養培地を含むサイトスタットまたはケモスタットで原微生物株を培養して、阻害剤により選択された集団を提供することと、阻害剤により選択された集団から原微生物株と比べて脂質生産性が高い微生物を分離して、脂質生産性が強化された由来株を提供すること、が含まれる。強化された脂質生産性としては、限定ではないが、任意の種類の脂質または特定の脂質の総生産量または生産率の増加が挙げられ、脂質としては、限定ではないが、総脂質、中性脂質、ＦＡＭＥ脂質（「ＦＡＭＥ」）、総脂肪酸、任意の脂肪酸または脂肪酸誘導体（たとえば１種類以上の脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンもしくはアルケン）、トリグリセリド（ＴＡＧ）、不飽和脂肪酸、オレイン酸、オメガ−３脂肪酸、ＤＨＡ、ＥＰＡ、オメガ−６脂肪酸、ＡＲＡ、飽和脂肪酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などが挙げられる。いくつかの例では、サイトスタットで培養して、サイトスタットにより選択された集団を得る。いくつかの例では、微生物は、サイトスタットまたはケモスタットで培養される前に変異手順を受ける。いくつかの例では、脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤の存在下で微生物を培養する前に、微生物を脂質生合成阻害剤の非存在下でサイトスタット培養またはケモスタット培養し、増殖特性が改良された１種類以上の微生物を選択することができる。いくつかの例では、変異手順を受ける微生物は、変異誘発手順の後でＵＶ処置され得る。変異誘発後のＵＶ処置は、サイトスタット培養またはケモスタット培養の前に行ってもよいし、変異させた集団を脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤を含むサイトスタットまたはケモスタットで選択してから行って、阻害剤により選択された変異誘発済み微生物の集団がＵＶ処置されるようにしてもよい。いくつかの例では、選択は脂質生合成阻害剤の存在下でなされ、かつたとえばサイトスタットまたはケモスタットでなされ得る。
【００７３】
微生物または株は、変異誘発手順を複数回受ける場合があり、随意であるが好ましくは、毎回の変異誘発手順の後に、脂質代謝に関与する酵素または因子を阻害する少なくとも１種類の化合物を含むサイトスタットまたはケモスタットで培養される。変異誘発手順を複数回行う場合、随意で、１回の、２回以上の、または毎回の変異誘発手順の後に微生物をＵＶ照射することができる。
【００７４】
このように、本明細書では、強化された脂質生産性を有する微生物株を分離する方法を提供し、該方法には、原微生物株に変異誘発手順を施すことと、脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤の存在下で変異誘発済み微生物をサイトスタット培養またはケモスタット培養して阻害剤により選択された変異誘発済み集団を提供することと、阻害剤により選択された変異誘発済み集団から原微生物株と比べて高い脂質生産性を有する少なくとも１種類の微生物由来株を分離すること、が含まれる。ある例では、方法は、原微生物株に変異誘発手順を施すこと、脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤の存在下で一定期間にわたり複数回細胞分裂させながら変異誘発済み微生物をサイトスタット培養またはケモスタット培養して、阻害剤により選択された微生物集団を提供すること、少なくとも１種類の変異誘発済み微生物をＵＶ照射すること、及び原株と比べて高い脂質生産性を有する少なくとも１種類の微生物原株の由来株の微生物を分離すること、を含み得る。変異誘発済み微生物を脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤を含むサイトスタットまたはケモスタットで選択する前及び／または後に、ＵＶ照射で処置することができる。脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤の存在下または非存在下でのサイトスタットまたはケモスタットでの選択は、ＵＶ処置の後でも実施できる。
【００７５】
本明細書のさらなる態様では、変異誘発済み株の形質を改善する方法を提供し、該方法では、原微生物株に変異誘発手順を施した後にＵＶ処置を施す。本発明を何ら特定の機構に限定するわけではないが、ＵＶ処置は変異誘発済み株の形質を強化する場合がある。ＵＶ処置は、変異誘発後、目的の形質についての選択またはスクリーニングの前か後に実施され得る。いくつかの例では、目的の形質についての選択には、サイトスタットまたはケモスタットでの選択が含まれ得る。あるいは、またはそれに加えて、目的の形質についての選択またはスクリーニングには、（１種類以上の化合物に対する抵抗性試験を含む）増殖アッセイ、生化学分析、遺伝子分析、または表現型、細胞もしくは生化学アッセイが含まれ得る。
【００７６】
いくつかの例では、目的の形質についての選択またはスクリーニングは、ＵＶ処置前に実施される。目的の形質についての選択には、随意で、変異誘発済み微生物をサイトスタット培養またはケモスタット培養することが含まれ得る。いくつかの例では、目的の形質についての選択には、変異誘発済み微生物を、野生型細胞の増殖を阻害するかまたはたとえば脂質代謝に関与する酵素もしくは因子の活性を阻害する少なくとも１種類の化合物を含むサイトスタットまたはケモスタットで培養することが含まれ得る。あるいは、またはそれに加えて、変異誘発済み微生物をたとえば生化学分析または細胞もしくは生化学アッセイでスクリーニングするかまたは特徴づけて、目的の形質、たとえば任意の化合物もしくは化合物群もしくは化合物類に関する生産性、対化合物抵抗性、温度耐性、増殖率などについて評価することができる。
【００７７】
微生物または株に対して変異誘発手順を複数回行うことができ、随意であるが好ましくは、毎回変異誘発手順をした後にＵＶ照射が実施され得、また随意で、複数回の変異誘発手順の後、ＵＶ処置の前及び／または後に、目的の形質について微生物を選択する。
【００７８】
本明細書で提供する方法は、任意の対象の微生物株に実施することができ、その非限定的な例は、不等毛類、藻類、菌類または細菌類であり得る。限定ではないが高脂質生産性などの目的の形質があるとして選択される株は、組換え株または非組換え株であり得る。たとえば、株は、対象とする脂質をかなりまたは大量に生産するとして知られていない種の株であり得るが、遺伝子操作によって、脂質生産性を高めるかまたは特定の脂質もしくは脂質類を生産するようになる１種類以上の遺伝子を発現することがあり得る。ＵＶ処置を受けた微生物は、分離された単一の細胞由来であり得、または変異誘発手順を受けた細胞集団であり得る。変異誘発手順（たとえば変異誘発化合物を用いての処置、ガンマ線照射、またはＵＶ照射であり得る）に続いてＵＶ処置を受ける微生物は、選択手順の前に、１回以上の変異誘発手順及び／または１回以上のスクリーニングもしくは選択手順を受けている微生物であり得る。
【００７９】
本明細書の方法で用いる微生物には、原核生物と真核生物を含むあらゆる微生物が含まれ得る。この方法を脂質生産性が強化された株を得るために使用する場合、脂質を自然に蓄積する種が好ましいが、本発明はそのような種に限定されない。本明細書のどの方法でも用いられる微生物は、いくつかの例では、ラビリンチュラ綱の不等毛類株であり得、アプラノキトリウム属、オーランチオキトリウム属、ディプロフリス属、ジャポノキトリウム属、ラビリンチュラ属、ラビリンチュロイデス属、オブロンギキトリウム属、シゾキトリウム属、トラストキトリウム属、またはウルケニア属のいずれかの種などの、たとえばヤブレツボカビ（Ｔｈｒｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）またはラビリンチュリッドであり得る。
【００８０】
さらなる例では、微生物は藻類であり得、たとえば、アクナンテス属（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプローラ属（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス属（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ボエケロウィア属（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス属（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ属（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリジウム属（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボツリオコッカス属、ブラクテアコックス属（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ属、クロオモナス属（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ属（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプセコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス属（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、キクロテラ属、ドナリエラ属、エリプソイドン属（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスフェラ属（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウム属（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ属、ユウスティグマトス属（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランセイア属（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア属（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラギラロプシス属（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、グロエオサムニオン属（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス属、ハロカフェテリア属（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、ハンチア属、ヘテロシグマ属（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ヒメノモナス属（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポキンクリス属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクティニウム属（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス属、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属、ナウィクラ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス属、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、サヤミドロ属（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス属（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ属、パラクロレラ属（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パリエトクロリス属、パスケリア属（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス属（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファガス属（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム属（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス属（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラスツルム属（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、シゾクラミデラ属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）、スケレトネマ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ属（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スティココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラクロレラ属（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ属（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ属（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ヴィリデイエラ属（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ヴィシェリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）及びボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群より選択される属の種などの、肉微小藻などであり得る。たとえば、限定ではないが、キクロテラ属、フェオダクチラム属またはタラシオシラ属の種などの珪藻類が用いられ得る。あるいは、クリプセコディニウム属などの鞭毛虫（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）が用いられ得る。あるいは、モノダス属またはナンノクロロプシス属の種などのユウスティグマトファイト属（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ）が、本明細書で提供する方法で用いられ得る。
【００８１】
さらに他の例では、強化された脂質生産性などの目的の形質があるとして選択される微生物は、たとえばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、モルティエラ属、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種などの、組換えまたは非組換え菌類であり得る。いくつかの例では、高脂質生産性があるとして選択される微生物は、油糧酵母菌であり、たとえば、カンジダ属、クリプトコッカス属、クンニングアメラ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、リポマイセス属、ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、タンニジウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）、トリコスポロン属、またはヤロウイア属の種である。高脂質生産性があるとして選択される候補となり得る油糧菌類の非限定的な種の例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニングアメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、デバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ゲオトリクム・ヒステリダルム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｓｔｅｒｉｄａｒｕｍ）、ゲオトリクム・ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、リポマイセス・オリエンタリス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、リポマイセス・スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス・テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）、モルティエラ・アルピネ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）、モルティエラ・ラマンニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、ロドスポリジウム・スファエロカプム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ）、ロドトルラ・オーランテイアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・テルペンドイダリス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｅｒｐｅｎｄｏｉｄａｌｉｓ）、ロドトルラ・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、スポロボロマイセス・アルボルベッセンス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、タンニジウム・クテニジウム（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ  ｃｔｅｎｉｄｉｕｍ）、タンニジウム・エレガンス（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ  ｅｌｅｇａｎｓ）、トルラスポラ・デルブルッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ）、トリコスポロン・ベーレンド（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｈｒｅｎｄ）、トリコスポロン・ブラッシカエ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、トリコスポロン種ＣＢＳ  ７６１７、トリコスポロン・ドメスティカム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ）、トリコスポロン・ルビエリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ）、トリコスポロン・モンテビディーンセ（��ｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｅｎｓｅ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。
【００８２】
高脂質生産性などの目的の形質があるとして選択される株はまた、組換えまたは非組換え細菌であり得る。たとえば、高脂質生産性があるとして選択され得る、トリグリセリドを生産することがわかっている細菌としては、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種が挙げられ得る。候補となり得るシアノバクテリア属としては、アグメネルム属（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アナベノプシス属（Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ）、アナシスティス属（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）、アファニゾメノン属（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）、アステロカプサ属（Ａｓｔｅｒｏｃａｐｓａ）、ボルジア属（Ｂｏｒｚｉａ）、カロスリックス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、チャメシフォン属（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ）、クロオコッカス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ）、クロログロエオプシス属（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ）、クロオコッキディオプシス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ）、クロオコッカス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ）、クリナリウム属（Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ）、シアノバクテリウム属（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノビウム属（Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ）、シアノシスティス属（Ｃｙａｎｏｃｙｓｔｉｓ）、シアノスピラ属（Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）、シリンドロスペルモプシス属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ）、シリンドロスペルマム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ダクティロコッコプシス属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ）、デルモカルペラ属（Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ）、フィシェレーラ属（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）、フレミエラ属（Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ）、ゲイトレリア属（Ｇｅｉｔｌｅｒｉａ）、ゲイトレリネマ属（Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グロエオカプサ属（Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ）、グロエオセイス属（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ）、ハロスピルリナ属（Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、エンガリエーラ属（Ｉｙｅｎｇａｒｉｅｌｌａ）、レプトリングビヤ属（Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ）、リムノスリックス属（Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ）、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ）、ミクロコレウス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ）、ミクロシスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ミクソサルシナ属（Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストク属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ノストクオプシス属（Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）、フォルミディウム属（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）、プランクトスリックス属（Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）、プレウロカプサ属（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロクロロン属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ）、プロクロロスリックス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ）、シュードアナベナ属（Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ）、リヴラリア属（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ）、シゾスリックス属（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ）、シトネーマ属（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、スタニエリア属（Ｓｔａｎｉｅｒｉａ）、スターリア属（Ｓｔａｒｒｉａ）、スティゴネマ属（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ）、シムプロカ属（Ｓｙｍｐｌｏｃａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、トリポスリックス属（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）、トリコデスミウム属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、チコネマ属（Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）、及びキセノコッカス属（Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００８３】
サイトスタット及びケモスタットでの選択
本発明は、脂質生合成阻害剤またはその他の脂質生合成に影響する化合物に高い耐性を有するバリアントを選択する方法を含む。選択手順は、ケモスタットまたはサイトスタットを用いて、選択条件下でもっとも急速に増殖するバリアントを培養中に集積しながら、脂質生合成を阻害する化合物に高い耐性を有する１種類以上の由来体または変異体を選択することができる。
【００８４】
ケモスタットは、培地を含むバイオリアクターであり、培地はたとえば選択培地（たとえばその化合物に対し抵抗性がない細胞やその栄養源を利用しない細胞の増殖を低下させるかまたは制限する化合物または栄養源を含む培地）であり得、培養培地中に１種類の栄養素が制限量で存在する。培養物は、この制限栄養素の濃度が、細胞分裂が減衰するレベルにまで低下するまで、生育する。細胞培養液の一定の排出と同じ流量で新培地の一定の流加が維持される。こうすることで、培養物は連続的に希釈されながら連続的に増殖（分裂）し、培養物の増殖（細胞分裂速度）が培養希釈率と直接関連づけられる。したがって、培養希釈率を調節すれば細胞分裂速度を調節することができ、選択条件下で有利に増殖するバリアントは培養液中に集積するが、増殖性が低い細胞は培養の連続的な希釈を通じて「流出」する。
【００８５】
サイトスタットはケモスタットと似ているが、培養物は栄養制限に接近することが許されず（培養物は、栄養制限が生じるような密度よりも低い密度に維持される）、またサイトスタットの希釈は培養物の細胞密度に基づいて実施され、細胞密度は定期的にまたは連続的にたとえばサイトスタットと一体であり得るフローサイトメーターで監視される（たとえば米国特許第７，９０１，９３７号を参照）。サイトスタットの培養物は栄養制限に接近しないので（または、増殖に影響しかねない発酵産物が著しく集積することがないので）、サイトスタットの培養物は安定した生育状態にあると考えられる。ケモスタットの培養と同様、選択培地を含むサイトスタットでは、選択条件下で最高の増殖率を有する細胞は培養中に集積するが、培養中の増殖性が低いバリアントは培養物の希釈を通じて次第に減少する。サイトスタットでは、有利に増殖する変異体が途中で定期的に栄養素が枯渇することで邪魔をされずより速く分裂するように、栄養素の制限がないので、変異体は培養中に急激に増える。そのうえ、希釈率は細胞分裂速度に合わせて較正されるので、細胞が一定の密度に達するようになる（通常は培養中に抵抗性を示す変異体が出現すると一定密度に達する）まで過剰な希釈なしに繁殖することができる。希釈が培養物の細胞密度と直接連動するこの連続集積法は、サイトスタット条件に好都合なバリアントの選択に要する時間を大幅に短縮する。
【００８６】
ツボカビ類や油糧酵母菌類などの微生物による脂質生産は、細胞分裂が生じない栄養制限（典型的なのは窒素制限）の間良好に誘導されるが、高速の細胞分裂に依存して目的の変異体を分離するケモスタット／サイトスタット選択法は、強化された脂質生産性を有する変異体の分離にも成功裏に用いられ得ることが見出されている。
【００８７】
本明細書では「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、酵素またはその他の因子の活性を何らかの手段で減じることを指す。「脂質代謝に関与する因子（ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」とは、その存在または量によって細胞中の脂質生合成が可能になるか、誘発されるか、抑制されるか、増加するかまたは減少する任意の分子を意味する。関与する因子は、タンパク質またはペプチドであり得、例として、脂質生合成もしくは分解に関与する酵素の生合成を命令するかまたは増加させるタンパク質、または脂質生合成もしくは分解に関与する他のタンパク質酵素の活性を調節するタンパク質、たとえば、転写因子、キナーゼもしくはホスファターゼ、またはタンパク質もしくはペプチド酵素阻害因子もしくはアロステリック調節因子が挙げられる。脂質代謝に関与する因子はまた、たとえば担体タンパク質またはトランスポーターでもあり得る。脂質代謝に関与する因子はタンパク質やペプチドでなくてもよく、たとえば、小分子の補助因子、経路中間体、転写誘導因子もしくは抑制因子化合物、またはタンパク質の活性に直接または間接的に影響する脂質もしくはヌクレオチド補助因子などであり得る。
【００８８】
ケモスタットまたはサイトスタットは、阻害剤として、たとえば、リンゴ酸、１種類以上の脂肪酸、酵素阻害剤、または脂質生産に影響するその他の化合物、たとえば没食子酸アルキル、没食子酸プロピル、カプサイシン、セルレニン、クルクミン、シクロプロペン、ジフェニルアミン、ノルフルラゾン、ピリダジノン、セトキシジム、トルイル酸、トリクロサン、ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、キザロホップ、６−アミノニコチンアミド、リンゴ酸塩、１種類以上の脂肪酸（たとえばオレイン酸）、キャノーラ油、ピーナッツ油、またはセサミンもしくはセサモールを含み得る。脂質生合成に影響し得る任意の化合物またはその組合せを用いてよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の阻害剤またはその成分をケモスタットまたはサイトスタットの培養に与える場合がある。たとえば、阻害剤は、脱水酵素、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ、またはＦＡＳのベータ−ケトアシルシンターゼの活性の阻害剤であり得る。ヒドロキシアシル担体タンパク質脱水酵素（「脱水酵素」または「ＤＨ」）阻害剤としては、３−デシノイル−Ｎ−アセチル−システアミン（３−デシノイル−ＮＡＣ）及びその誘導体が挙げられる（Ｉｓｈｉｋａｗａら（２０１２）  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３４：７６９−７７２）。エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（「ＥＲ」）の活性の阻害剤の例としては、限定ではないが、ジアザボリン、トリクロサン及びイソニアジドが挙げられる。ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（「ＫＡＳ」）の活性の阻害剤の例としては、限定ではないが、セルレニン、チオラクトマイシン及びＳＢＰＴ０４が挙げられる（Ｋｉｎｇｒｙら（２０１２）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９５：３５１−３５８）。酵素アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）酵素の阻害剤としては、限定ではないが、ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、キザロホップ、ＢＰ１、ＴＯＦＡ及びソラフェンＡが挙げられる（Ｂｅｃｋｅｒら（２００７））。
【００８９】
また、脂肪酸不飽和化酵素及び脂肪酸エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）の阻害剤、たとえば、セサミンまたはクルクミンなどの脂肪酸不飽和化酵素阻害剤（米国特許第８，３４９，５９５号）、またはシクロエート、チオカルバメート及びスルホキシドなどの脂肪酸エロンガーゼ阻害剤も考えられる。
【００９０】
いくつかの例では、ケモスタットまたはサイトスタットで阻害剤としてトリクロサンを使用する場合がある。いくつかの例では、ケモスタットまたはサイトスタットで阻害剤としてセルレニンを使用する場合がある。さらに、野生型からの分離株または微生物株保存機関から入手した株などの任意の対象の株を、随意で、脂質代謝に関与する酵素またはその他の因子の阻害剤の非存在下でケモスタットまたはサイトスタットで培養して、もとの株よりも速く増殖する分離株を選択することができる。そのような選択は、阻害物化合物に抵抗性のある変異体を選別する前か後に実施することができる。
【００９１】
脂質生合成阻害剤を含むかまたは含まないサイトスタットまたはケモスタットでの選択は、細胞分裂周期が複数回連続できるような任意の期間にわたり実施でき、またその生物の増殖速度に依存し得る。ケモスタットまたはサイトスタットは任意の体積容量であり得る。菌類やツボカビ類などの微生物株の場合、たとえば、培養は、発酵槽の体積容量が約２５ｍＬ〜約１０Ｌのケモスタットまたはサイトスタットで実施でき、発酵槽の体積容量は２００ｍＬ〜約５Ｌ、または約３００ｍＬ〜約２Ｌ、または約４００ｍＬ〜約１Ｌであり得る。培養期間は、たとえば１日から数か月など、任意の期間であり得る。好ましくは、菌類やツボカビ類の場合、ケモスタットまたはサイトスタットでの培養期間は、少なくとも１日、たとえば、約２日間〜約３０日間、または約３日間〜約２０日間、または約４日間〜約１５日間の期間である。いくつかの実施形態では、サイトスタットでの選別が好ましい。サイトスタットでの培養期間は、いくつかの実施形態では、たとえば約３日間〜約１０日間である。
【００９２】
任意の期間増殖させた培養から微生物の単コロニーを希釈平板法またはフローサイトメトリーにより分離して、このまたはこれらの分離株を任意の所望の性質についてスクリーニングすることができる。
【００９３】
たとえば、分離株は、高増殖率、高バイオマス蓄積度、脂質または脂肪酸の高生産率、高トリグリセリド生産率、高総脂質蓄積度、高ＦＡＭＥ蓄積度、高トリグリセリド蓄積度、高ＦＡＭＥ生産率、高ＤＨＡ生産率、高ＤＨＡ蓄積度、脂肪酸パーセンテージとしてのＤＨＡの増加、ＤＨＡ対ＤＰＡ比の増大などのいずれか１つまたはそれらの組合せについて、試験され得る。親油性色素（たとえばボディパイまたはナイルレッド）の使用またはＦＡＭＥ分析を含め、脂質または脂肪酸の量を決定する任意の実施可能な方法をとることができる。試験は、試験前に株を培養するのに用いられ得る上述したような条件、たとえば特定の炭素源や窒素源もしくはその濃度、または塩分濃度、温度、ｐＨなどを用いる条件を含むあらゆる培養条件下で実施することができる。
【００９４】
本明細書では、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、遺伝子に突然変異つまり変化が生じた微生物を包含する。変異体は、自然に生じる（つまり、自発的に生じる）こともあるし、たとえば（薬物を含む）化学薬品、ガンマ線照射またはＵＶ光により誘発されることもある。バリアントという用語は、典型的には、自発的に生じた変異体、たとえば、もとの株（つまり原株）から生じた、原株とは別個の安定した遺伝性の形質をもつ分離株だが、その突然変異の性質、またはその別個の形質の原因となった遺伝子やタンパク質でさえも未知であり得る変異体をも包含するのに用いられる。「由来（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」株（由来株）とは、継代培養され原株とは別に維持されている、原株の子孫株である。由来株は、バリアント株または変異株であり得、たとえば、原株とは別個の１種類以上の遺伝性の形質を有するバリアント株または変異株であり得る。由来株はまた、たとえば代謝酵素や（たとえば転写因子、転写活性化因子、アロステリックタンパク質、トランスポーターなどの）調節因子をコード化する非天然遺伝子などの、少なくとも１種類の非天然遺伝子を含むように遺伝子操作された株であり得る。
【００９５】
変異誘発
本発明は、本明細書で提供するあらゆる株のバリアントを含み、バリアントは変異体であり得、天然に生じる変異体であるか、または多数の変異誘発技術（限定ではないが、化学的変異誘発、ガンマ線照射、ＵＶ照射、または、使用され得る細胞に（直接または間接的に）導入されて微生物細胞の遺伝子座を変える核酸コンストラクトを用いる分子生物学的技術、たとえば限定ではないが、挿入変異誘発、部位特異的変異誘発、遺伝子置換または遺伝子切除）のいずれかによって作製された変異体であり得る。本発明にはまた、微生物株の（変異体を含む）バリアントを選択する方法も含まれ、該方法には、限定ではないが本明細書で提供するような１つ以上の変異誘発ステップが含まれ得る。
【００９６】
微生物株の変異体を作製する方法は公知である。たとえば、ガンマ線照射、ＵＶ照射、及び考えられる多数の化学的変異原（たとえば５−ブロモデオキシウリジン、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ＩＣＲ化合物など）のいずれかでの処置、または染色体切断を生じさせるエンジイン抗生物質などの化合物（たとえばブレオマイシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン）での処置は、藻類、菌類及びツボカビ類の変異誘発に用いられている方法である（たとえば、米国特許第８，２３２，０９０号、米国特許出願第２０１２００８８８３１号、同第２０１００２８５５５７号、同第２０１２０２５８４９８号を参照）。物理的変異原のなかでも電磁放射には放射線放射、ガンマ線及びＸ線、電離放射、紫外線光または高温が含まれる。当分野では多数の化学的変異原も知られており、限定ではないが、挿入剤、アルキル化剤、脱アミノ化剤、塩基類似体などがある。挿入剤としては、限定ではないが、アクリジン誘導体またはフェナントリジン誘導体、たとえば臭化エチジウム（２，７−ジアミノ−１０−エチル−６−フェニルフェナントリジウムブロミドまたは３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウムブロミドとしても知られている）が例として挙げられる。アルキル化剤の非限定的な例としては、ニトロソグアニジン誘導体（たとえばＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−ニトロソグアニジン）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、エチルエタンスルホン酸、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、亜硝酸、またはＨＮＯ２、及びナイトロジェンマスタードまたはＩＣＲ化合物が挙げられる。変異原として用いられ得る塩基類似体の非限定的な例としては、化合物５−ブロモ−ウラシル（デオキシヌクレオシド５−ブロモデオキシウリジンとしても知られている）、５−ブロモデオキシウリジン及び２−アミノプリンが挙げられる。
【００９７】
変異誘発には、外因性核酸分子を対象の微生物細胞に導入することを含む、分子生物学的技術を用いることもできる。たとえば、細胞に導入される外因性核酸分子を、ランダムまたは標的化組込みにより遺伝子座に組み込んで、外来性ＤＮＡが挿入する遺伝子またはゲノムに挿入された外来性ＤＮＡ付近の遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる（たとえば米国特許第７，０１９，１２２号及び同第８，２１６，８４４号）。たとえば外因性核酸分子としては、たとえばトランスポザーゼに認識され得る逆方向反復などの転移因子またはそのコンポーネント及び／またはトランスポザーゼをコードする遺伝子が挙げられ、あるいは外因性核酸分子は、組込みウイルスたとえばレトロウイルスなどのウイルスに少なくとも部分的に基づく場合もある。
【００９８】
変異誘発対象の微生物は変異原または任意の公知の方法による変異誘発因子に曝露され得る。一般に、変異誘発は、適当な量の対象の微生物株の細胞を、適当な時間と条件で変異原または変異誘発因子に曝露することで実施され得る。対象の微生物株を変異原または変異誘発遺伝子に曝露して、変異体の作製には効果的だがあまり多くの細胞を死滅させないような濃度範囲を決定する予備実験を１回以上行うことが多い。このような手順は当分野では公知である。たとえば、そのような実験で得た結果に基づいて、約０．５％〜約９５％、または約１％〜約９０％、または約２％〜約８０％、または約５％〜約７０％、または約１０％〜約５０％の細胞が生存可能な濃度及び／または曝露期間を変異誘発手順で用いることができることが示され得る。細胞を変異原に曝露する時間は、使用する変異原の性質による。細胞を変異原と接触させる時間は、たとえば約１分〜約２４時間、または約３０分〜約６時間、または約１．０時間〜約３．０時間であり得る。一連の簡単な試験を行って、変異原でさまざまな処置を行った後の変異誘発対象の細胞の生存率を決定するとよい。
【００９９】
限定ではなく例として、変異誘発は、たとえば化学的変異原または変異原化合物を含み得る滅菌液体培地または滅菌水中に、変異誘発対象の細胞を１０５〜１０１０個／ｍＬの量で、たとえば約１０６〜１０８個／ｍＬの密度で浮遊させるか、または変異対象の細胞を寒天プレートに拡げて変異原に曝露する（寒天プレートはたとえばガンマ線またはＵＶ照射に利用できる）ことにより実施することができる。微生物細胞の変異誘発は、培養フラスコまたは試験管中の培養を用いて実施することができ、また対象の微生物が生存可能な任意の温度で実施することができる。
【０１００】
化学的変異原で処置した後、細胞を滅菌水または培地で少なくとも１回洗浄するか、または変異原を含まない培地中で希釈することができる。細胞は、回復期間中は変異原の非存在下及び一切の選択剤の非存在下で培養され得、その後選択剤の存在下でサイトスタットまたはケモスタットで培養され得る。
【０１０１】
だいたい数日間から数週間であり得るサイトスタットまたはケモスタット培養期間の後、細胞を希釈平板培養してもよいし、または細胞を分別して単コロニー分離してもよい。コロニーを液体培養で生育して、たとえば脂質生産率や増殖率を試験することができる。
【０１０２】
変異誘発及びサイトスタットまたはケモスタット選択の手順を２回以上続けて実施することもできる。連続する複数のサイトスタットまたはケモスタットのインキュベーションに異なる種類の阻害因子（たとえば異なる種類の酵素を経路で阻害する脂質生合成阻害剤）を含むことができる。変異誘発手順に同種または異種の変異原を用いることができる。ある具体的な例では、変異誘発手順を１回以上受けた細胞をさらにＵＶ処置に供し、脂質生合成阻害剤を含まないサイトスタットで選択する。
【０１０３】
ＵＶ処置
本明細書では、微生物をＵＶ光で処置し、ＵＶ処置した微生物を培養し、所望の形質についてスクリーニングすることにより微生物の性能を改善する方法を提供する。「〜の性能を改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ）」とは、たとえば増殖率の改善、生産性の増大、化学物質、ｐＨ、塩分などに対する抵抗性または耐性の強化を意味する。ＵＶ照射は、たとえば化学物質またはガンマ線照射を用いるような変異誘発手順の後に行うことができ、または、別のＵＶ変異誘発ステップの後で微生物にＵＶ処置を行うこともできる。随意で、変異誘発ステップの後、細胞をＵＶ放射に曝露する前に、選択を実施することもできる。
【０１０４】
たとえば、変異誘発手順を実施することができ、変異原で処置された細胞集団を、特定の形質の存在または程度について、たとえば高増殖率、高産物生産率、１種類以上の特定の生産される産物の絶対的もしくは相対的な生産量、化合物または生育条件に対する細胞の抵抗性または耐性などについて選択することができる。スクリーニングで所望の形質を有するとして選択された細胞は、次いでＵＶ照射の処置を受ける。好ましくは、次に細胞を該形質の存在または程度について再試験して、たとえば高増殖率、高産物生産率、化合物または生育条件に対する細胞の抵抗性または耐性の向上などの形質が強化または改善されたクローンを特定する。
【０１０５】
ＵＶ照射後、選択の前に、随意で細胞を光から保護する。たとえば、ＵＶ処置後の細胞をプレートに蒔き、そのプレートを棚などの暗所に保存するか、光不透過材でくるんでもよい。細胞は３０分間〜３０日間、たとえば１時間〜２週間、または２時間〜１週間、暗所に保存され得る。
【０１０６】
本発明の範囲を何ら特定の機構に限定するわけではないが、野生型とは別個のある特定の形質を示す分離変異体またはバリアントは、ＵＶ処置後に強化された形質を示すと考えられる。
【０１０７】
ＵＶ処置には、ＵＶ変異誘発の公知の方法を用いることができる。たとえば、ＵＶランプまたは核酸とタンパク質のＵＶ架橋に用いられるクロスリンカーデバイスを用いることができ、処置の強度と持続時間は、たとえば細胞の約０．１％から約９９．９９％が処置により死滅するように、たとえばＵＶ処置を受ける微生物集団の少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が処置により死滅するように、調整できる。約３００μＪ／ｃｍ２〜約３０，０００μＪ／ｃｍ２、または約５００μＪ／ｃｍ２〜約１５，０００μＪ／ｃｍ２などの、約１００μＪ／ｃｍ２〜約５０，０００μＪ／ｃｍ２のＵＶ照射を、たとえば少なくとも約１０００μＪ／ｃｍ２、３０００μＪ／ｃｍ２、５０００μＪ／ｃｍ２、７０００μＪ／ｃｍ２、または１００００μＪ／ｃｍ２のエネルギー準位で実施できる。
【０１０８】
ＵＶ処置済みの微生物は、ＵＶ処置後、随意で、約１５分間〜約２週間以上、たとえば約３０分間〜約１週間の間、暗所でインキュベートされ得る。暗所で保管された後に細胞集団が選択され得、随意であるが好ましくは、暗所で保管された後に選択されてからさらに一定期間培養され得る。たとえば、細胞をＵＶ処置し、暗所でインキュベートし、次いで選択またはスクリーニングする場合があり、たとえば、ＵＶ処置済み細胞は、たとえば脂質生合成阻害剤などの選択化合物を随意で含み得るサイトスタットまたはケモスタットでの増殖により選択され得る。あるいは、ＵＶ処置後、細胞は、暗所でのインキュベーション期間なしに、明所で保管され得る。細胞はＵＶ処置の直後に選択される場合もあるし、または選択の前に「成育（ｇｒｏｗ  ｏｕｔ）」培養期間が実施される場合もある。ＵＶ処置後に行う培養期間は、随意で、選択化合物を含むかまたは含まないサイトスタットまたはケモスタットで実施され得、最良の生育特徴をもつ細胞が成育期間中に選択される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞は、１回目、２回目、３回目、または４回目以降の変異誘発手順及び、随意であるが好ましくは、サイトスタットもしくはケモスタット選択などのスクリーニングまたは選択の後に、ＵＶ処置され得る。たとえば、細胞は、化学的変異原またはガンマ線もしくはＵＶ照射などの変異原で処置された後、続いてケモスタットまたはサイトスタットで選択され得る（好ましくは、目的の形質は脂質生産性であり、ケモスタットまたはサイトスタットは脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤を含む）。１回以上の変異誘発及び選択手順で分離した株を、たとえば強化された増殖率もしくは脂質生産率、または特定の化学物質に対する強化された抵抗性もしくは耐性などの所望の形質についてスクリーニングまたは選択し、たとえば本明細書で説明するようにＵＶ処置を施し、次いで（随意であるが好ましくは暗所でのインキュベーション期間の後に）随意で阻害剤または選択剤を含むかまたは含まないサイトスタットまたはケモスタットで選択して、以前に変異誘発した株と比べて強化された特性（たとえば脂質生合成など）をもつ変異体を分離することができる。あるいは、細胞は、１回目、２回目、３回目、または４回目以降の変異誘発手順及び選択の後にＵＶ処置され、次いで脂質生合成を阻害する化合物を含むプレートに蒔かれて、強化された脂質生産性などの強化された形質をもつ変異体が分離される場合もある。
【０１１０】
ＵＶ照射は、たとえば化学物質またはガンマ線照射を用いる変異誘発手順などの任意の変異誘発手順の後にでも実施でき、または微生物は別のＵＶ変異誘発ステップの後にＵＶ処置され得る。随意で、変異誘発ステップの後、細胞をＵＶ放射に曝露する前に、選択を実施することができる。たとえば、複数回の変異誘発ステップを用いる株分離法において、ＵＶ処置は、１回だけの、数回の、または毎回の変異誘発手順の後に実施できる。
【０１１１】
上述したすべての実施形態に加えて、または代わりに、本明細書では以下の実施形態も提供する。
【０１１２】
実施形態１は、少なくとも２０％のＤＨＡ、少なくとも２５％のＤＨＡ、少なくとも３０％のＤＨＡ、少なくとも３５％のＤＨＡ、または少なくとも３８％のＤＨＡを生産する変異ラビリンチュラ綱微生物であって、以下のうち１つ以上が当てはまる。
前記変異微生物は、ＤＨＡを小規模培養で少なくとも１２５ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１７０ｍｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも１９０ｍｇ／Ｌ／ｈのペースで生産する；
前記変異微生物により生産される総脂肪酸には、１０％以下のドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）が含まれ、随意で少なくとも１％、少なくとも２％、または少なくとも３％のＤＰＡが含まれる；
前記変異微生物により生産されるＤＨＡ対ＤＰＡの比は、少なくとも３．５：１かまたは少なくとも４：１であり、随意でＤＨＡ対ＤＰＡの比は１０：１未満である、
前記変異微生物により生産される総脂肪酸には、２％未満または１％未満のアラキドン酸（ＡＲＡ）が含まれ、随意で０％のＡＲＡが含まれる；
前記変異微生物により生産される総脂肪酸には、１％未満または０．５％未満のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれ、随意で０％よりも多くのＥＰＡが含まれる；及び
前記変異微生物により生産される総脂肪酸には、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％のミリスチン酸が含まれ、随意で６０％未満または５０％未満のミリスチン酸が含まれる。
【０１１３】
実施形態２は、実施形態２による変異ラビリンチュラ綱微生物であり、前記変異微生物は、標準的な方法による由来変異体であり、随意で、前記変異体は、電離放射、ガンマ線、Ｘ線、紫外線光または化学的変異原による変異誘発により得られる。
【０１１４】
実施形態３は、実施形態３による変異ラビリンチュラ綱微生物であり、前記変異微生物は、分子遺伝学的技術により生産され、随意で、前記分子遺伝学的技術は、挿入変異、転移因子、欠失、挿入、破壊もしくは遺伝子置換を生じさせる相同組換え、ＴＡＬＥＮ  ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡコンストラクト、及びリボザイムからなる群より選択される。
【０１１５】
実施形態４は、実施形態１〜実施形態３のいずれかによる変異ラビリンチュラ綱微生物であり、前記変異微生物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する１８ＳｒＤＮＡ配列を含む。
【０１１６】
実施形態５は、実施形態１〜実施形態３のいずれかによる変異ラビリンチュラ綱微生物であり、前記変異微生物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する１８ＳｒＤＮＡ配列を含み、
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する１８ＳｒＤＮＡ配列を含み、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する１８ＳｒＤＮＡ配列を含む。
【０１１７】
実施形態６は、実施形態１〜実施形態６のいずれかによる変異ラビリンチュラ綱類微生物であって、前記変異ラビリンチュラ綱微生物は、ラビリンチュラ属、ラビリンチュロイデス属、トラストキトリウム属、シゾキトリウム属、アプラノキトリウム属、オーランチオキトリウム属、ジャポノキトリウム属、ディプロフリス属、またはウルケニア属のいずれかに属する種である。
【０１１８】
実施形態７は、ＮＲＲＬ番号５０８３６として寄託された株の変異ラビリンチュラ綱類微生物、またはその由来体である。
【０１１９】
実施形態８は、ＮＲＲＬ番号５０８３７として寄託された株の変異ラビリンチュラ綱類微生物、またはその由来体である。
【０１２０】
実施形態９は、実施形態１〜実施形態１８のいずれかの分離ラビリンチュラ綱微生物が含まれる微生物バイオマスである。
【０１２１】
実施形態１０は、実施形態９による微生物バイオマスが含まれる産物である。
【０１２２】
実施形態１１は、微生物油であり、前記微生物油の総脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも３８％がＤＨＡであり、前記微生物油の総脂肪酸の少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％がミリスチン酸であり、さらに、ＤＨＡ対ＤＰＡの比が少なくとも３．５：１かまたは少なくとも４：１であること、総脂肪酸に含まれるＤＰＡが１０％以下であること、総脂肪酸に含まれるＡＲＡが２％以下または１％以下であること、及び総脂肪酸に含まれるＥＰＡが１％以下または０．５％以下であること、のうちの１つ以上が満たされる。
【０１２３】
実施形態１２は、請求項１による微生物油であり、前記微生物油は変異微生物から分離され、随意で、前記微生物は標準的な方法で由来させるかまたは遺伝子操作されている。
【０１２４】
実施形態１３は、実施形態１３または実施形態１４による微生物油が含まれる製品であり、随意で、前記製品は、食品、動物飼料、化粧品または医薬品である。
【０１２５】
実施形態１４は、脂質生産性が強化された変異微生物株の分離方法であり、前記方法は、脂質代謝に関与する酵素の活性を阻害する少なくとも１種類の化合物を含む培養培地を含むサイトスタットまたはケモスタットで原株の微生物を培養して、阻害剤により選択された集団を提供することと、前記阻害剤により選択された集団から前記原微生物株よりも高い脂質生産性を有する微生物を分離して、脂質生産性が強化された由来株を提供することとを含み、随意で、前記培養の少なくとも一部は、脂質生合成に関与する酵素または因子の阻害剤の存在下で実施される。
【０１２６】
実施形態１５は、実施形態１４の方法であり、前記微生物は変異誘発手順を受ける。
【実施例】
【０１２７】
実施例１  野生型ラビリンチュラ綱株の分離
脂質生産性を評価するために数百種の微生物を分離する採集プロジェクトを開始した。合法的なアクセス及び生物分類に関する生物学的知識に基づき、試料の野生株分離ビオトープを特定した。ビオトープは、外洋、河口、近海潟湖、マングローブ潟湖、潮溜まり、高塩水、淡水、または養殖場として類別した。試料採取場所は、温帯、亜熱帯、熱帯地方に亘った。採水試料には、２リットルの直接試料も含まれた。１０μｍネットを用いてプランクトンを網で採集した場合もあった。２０１０年から２０１２年にかけて、全部で４６６種類の環境試料を採集した。温度は４℃から６１℃の範囲であり、ｐＨは２．４５から９．１８の範囲であった。溶解酸素は空気飽和ゼロから２０４％の範囲であり、塩分はゼロｐｐｔから１０５ｐｐｔの範囲であった。どの試料も現地で１２５ｆ／２培地（培地成分：ＮａＮＯ３  ７５ｍｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．００５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．０１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ０．０１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  ４ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ２  ３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２  ０．１８ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ  ０．００６ｍｇ／Ｌ、チアミン０．１ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．００５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．０２２ｍｇ／Ｌ）及び海水−グルコース−酵母−ペプトン（ＳＷＧＹＰ）培地（滅菌濾過海水１リットル当たりの培地成分：グルコース２ｇ、ペプトン１ｇ、Ｄｉｆｃｏ酵母エキス１ｇ）に接種して、増殖を開始させた。別の試料セットを、１０％グリセロールを含む二連の５０ｍＬアリコートとして作製し、続いてドライアイスで凍結させた。最後に、その後のＤＮＡ分離用に、追加の試料を、１０％グリセロール、２Ｌ体積で凍結させた。試料は採集当日に実験室に発送され、翌日到着して、静置または振盪フラスコ中発酵ブイヨン中に接種された。カルベニシリン、ストレプトマイシン及びニスタチンを培養に含めて、細菌または菌類の増殖を遅らせた。
【０１２８】
接種した集積物を１５℃〜３０℃の温度でインキュベートし、続いて抗生物質と一緒にＳＷＧＹＰまたはｆ／２寒天上に蒔いた。分離コロニーを回収し、ＳＷＧＹＰまたはｆ／２培地で増幅させ、１８ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施して、分離微生物の分類学的同定を行った。
【０１２９】
実施例２  分離株の脂質生産性の比較
分離ラビリンチュラ綱株の脂質生産性についてＭｉｃｒｏ２４ミニチュアバイオリアクターシステム（ニューヨーク州ポートワシントン  Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスクリーニングした。簡単に説明すると、酵母エキス５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．６５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ２．５ｇ／Ｌ、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ塩（フロリダ州アポップカ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）  ８ｇ／Ｌ、微量元素溶液５ｍＬ、ビタミン溶液１ｍＬ／Ｌ、及びデキストロース２０ｇ／Ｌを含む培養培地を含む６ｍＬの培養を設定した。微量元素溶液には、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩６ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ  ０．２９ｇ／Ｌ、Ｈ２ＢＯ３  ６．８４ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ  ０．８６ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、及びＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ保存液（５ｇ／Ｌ）  １ｍＬが含まれた。ビタミン溶液には、チアミン２００ｍｇ／Ｌ、１リットル当たり１０ｍＬのビオチン保存液０．１ｇ／Ｌ、及び１リットル当たり１ｍＬのシアノコバラミン保存液１ｇ／Ｌが含まれた。３％シリコーン消泡剤１０マイクロリットルを各６ｍＬの培養に加えた。培養は、各株の６００マイクロリットルの対数中期の培養を接種し、６００ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃、ｐＨ約６．８で、１４時間インキュベートした。溶解酸素濃度は飽和度１０％であった。
【０１３０】
試験期間の終わりに細胞を回収して、バイオマス及びＦＡＭＥについてアリコートを分析した。バイオマスの評価は、事前に秤量した１５ｍＬのファルコン管に４ｍＬの発酵ブイヨンをピペットで移した。培養アリコートが入った試験管を３２２０ｘｇで２０分間遠心分離して、上清をデカントした。次いでペレットを−８０℃で一晩凍結させてから、１６〜２４時間凍結乾燥させた。乾燥ペレットが入ったファルコン管を秤量し、空の試験管の重量を引いて凍結乾燥ペレットの重量を求めた。凍結乾燥ペレットの重量を、アリコート体積（４ｍＬ）で割って標準化して、培養１ｍＬ当たりのバイオマス値を得た。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）は、ガスクロマトグラフィーによる標準的な方法で、三連の５０〜２００μＬ体積の培養アリコートの脂肪酸含有量を分析して評価した。培養アリコートは、ＦＡＭＥ試料の準備のために、分注及び乾燥前に１倍のＰＢＳ中１：１０に希釈した。試料をＨＴ−４Ｘ  ＧｅｎｅＶａｃにより乾燥させて、脂肪酸メチルエステル分析に供する準備ができるまで−２０℃で保存した。抽出は、５Ｍ  水酸化カリウムのメタノール溶液０．５ｍＬ及び２５ｐｐｍのブチル化ヒドロキシトルエンを含むテトラヒドロフラン０．２ｍＬを試料に添加した。次に、Ｃ１１：０遊離脂肪酸２ｍｇ／ｍＬ、Ｃ１３：０トリグリセリド２ｍｇ／ｍＬ、及びＣ２３：０脂肪酸を含むｎ−ヘプタン２ｍｇ／ｍＬを含むメチルエステル内部標準ミックス４０ｕＬを添加した。４２５〜６００μｍの酸洗浄済ガラスビーズ約０．５ｍＬを添加後、試料を１２００ｒｐｍで７分間ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒにかけた。次に試料を８０℃で５分間加熱してから、２５００ｒｐｍで５分間マルチチューブボルテクサーにかけた。次に、１４％三フッ化ホウ素を含むメタノールを試料に添加してから、８０℃の加熱ブロックに戻して３０分間置いた。次に、試料を２５００ｒｐｍで５分間再度ボルテックスした。最後に、試料にｎ−ヘプタン２ｍＬ及び５Ｍ  塩化ナトリウム０．５ｍＬを添加し、２５００ｒｐｍで５分間最終回のボルテックスにかけた。試料を激しく振って確実に乳濁させた。次に試験管立てを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、その後水素炎イオン化検出器を備える７８９０  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＣと対にしたＧｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳオートサンプラーで最上層を採取した。
【０１３１】
このスクリーニングでは、生産される総ＦＡＭＥ脂質のＤＨＡ％及びＤＨＡ生産率（ＤＨＡ生産量をｍｇ／リットル／時間として計算）により決定される高ＤＨＡ生産株として、野生株「８８６」及び「１６０２」を選択した（表２）。これらの株を、ＷＨ−５６２８（「８８６」）とＷＨ−５５５４（「１６０２」）と改名した。
【０１３２】
（表２）小規模発酵のラビリンチュラ綱分離株の生産性
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【０１３３】
実施例３  強化された増殖率を有するツボカビ類バリアントのサイトスタット選択
１６０２（ＷＨ−０５５５４）株を、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ塩（フロリダ州アポップカ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１７ｇ／Ｌ、デキストロース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．６５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、及び塩化カリウム０．５ｇ／Ｌを含む最少培地を有する０．５Ｌサイトスタットの接種に用いた。サイトスタットは、Ｉｎｆｏｒｓ発酵槽（スイス国ボットミンゲン／バーゼル）、ＭＳＰフローサイトプレップ（ミネソタ州ショアビュー）及びＡｃｃｕｒｉサイトメーターを備えていた。発酵は３０℃に保ち、ｐＨは、０．５Ｍ  水酸化ナトリウム及び０．５Ｍ  リン酸の添加により安定してｐＨ５．８に保った。細胞濃度は、５日間をとおして常に５００，０００個／ｍＬに保った。希釈率は当初は０．１／ｈｒであったが、４日目と５日目には０．５／ｈｒ以上に上昇した。５日目に発酵を中断し、発酵槽培養アリコートをプレートに蒔いた。このプレートを３０℃でインキュベートした後、コロニーを選択し、得られた株である１６０２−ＲＲ０１を単コロニーから分離した。１Ｌの発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）内での１６０２−ＲＲ０１株の増殖率は、親株１６０２よりもおよそ２０％高かったので（表３）、これをその後の変異誘発実験でベースライン株として用いることにした。
【０１３４】
（表３）原株１６０２の分離株とサイトスタット選択された由来株の増殖率
2017518747.tif 000004
【０１３５】
実施例４  急増殖するセルレニン抵抗性ツボカビ類株の選択
別々の処置で、４種類の線量（２５Ｇｙ、７５Ｇｙ、１００Ｇｙ及び１５０Ｇｙ）のガンマ線放射を用いて、実施例３で急増殖について選択したＷＨ−５５５４株の分離株である１６０２−ＲＲ０１株の細胞４００Ｘ１０６個の変異誘発を行った。変異誘発した細胞をペレット化（２，０００ｘｇで５分間）し、最少培地５ｍＬに再度浮遊させ、セルレニン３μｇ／ｍＬを含む最少培地５００ｍＬを収容するサイトスタット発酵槽に接種した（サイトスタットの設定は実施例３と同じ）。セルレニンは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）酵素のケトアシルシンターゼドメイン（ＫＡＳ）に結合するＦＡＳ阻害剤である（Ｐｒｉｃｅら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５５１−６５５９）。培養の希釈率は、最初の４０時間は一定して０〜０．０５のままだったが、その後上昇し始めた。だいたい４５時間で、希釈率は＞０．０５に上昇し（図２）、セルレニン抵抗性バリアントが集積し始めたことが示された。培養への培地供給を５６〜６８時間で中断して、培養の細胞密度を高めた。６８時間で培養をセルレニン３μｇ／ｍＬを含む新培地で徒手的に希釈して再度５００，０００個／ｍＬとし、７１時間でサイトスタット機能を再開させた。発酵を８２時間で中断し、この時点で５ｍＬの細胞をセルレニンなしの最少培地を収容する振盪フラスコ内で継代培養して５０ｍＬの培養にした。培養はセルレニンなしで３日間に亘り３回継代培養し、その後セルレニン０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び２０μｇ／ｍＬをそれぞれ含む寒天プレートに蒔いた。セルレニンの全濃度について増殖を観察した。各プレートからコロニーを５つ抜き取って、Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽で生産性を評価した（Ｉｓｅｔｔら（２００７）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９８：１０１７−１０２８）；ニューヨーク州ポートワシントン  Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。このバイオリアクターシステムにより、完全最少培地で、３０℃で２３時間インキュベートした複数の小規模（６ｍＬ）の培養の同時試験が可能であった。最少培地には、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．６５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ２．５ｇ／Ｌ、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ塩１７ｇ／Ｌ、微量元素溶液５ｍＬ、ビタミン溶液１ｍＬ／Ｌ、及びデキストロース４０ｇ／Ｌが含まれた。微量元素溶液には、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩６ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ  ０．２９ｇ／Ｌ、Ｈ２ＢＯ３  ６．８４ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ  ０．８６ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、及びＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ保存液（５ｇ／Ｌ）  １ｍＬが含まれた。ビタミン溶液には、チアミン２００ｍｇ／Ｌ、１リットル当たり１０ｍＬのビオチン保存液０．１ｇ／Ｌ、及び１リットル当たり１ｍＬのシアノコバラミン保存液１ｇ／Ｌが含まれた。インキュベーション培地に含まれる窒素は、（開始ＯＤ７４０値を１．４として培養を接種した後）だいたい培養８時間で枯渇するように計算した量で存在させたが、グルコースは、２４時間時点で発酵中ずっと完全レベルであるのが可能なレベルで培地に与えた。したがって、Ｍｉｃｒｏ２４の培養培地は、試験の対象である株がおよそ８時間の間は活発に増殖し、その後およそ１６時間で増殖及び活発な脂質生成は緩慢になってやがて停止するように設計した。
【０１３６】
２４時間のＭｉｃｒｏ２４培養期間の終わりに、培養アリコートを回収して、実施例３で説明したようにしてバイオマスと脂肪酸（ＦＡＭＥ脂質）を評価した。いくつかの由来株は、原株１６０２と比べて総有機炭素の高いパーセンテージがＤＨＡであったのみならず、ＦＡＭＥ／ＴＯＣが増加していることが認められた。
【０１３７】
培養期間中のＴＯＣ、ＦＡＭＥ脂質及びＤＨＡの比率変化を図３に示す。いくつかの由来株は、２４時間の培養期間中、原株である１６０２よりも急速に総有機炭素、ＦＡＭＥ脂質及びＤＨＡが増加したことが示された。Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽で一番性能が良かったのは、（２０μｇ／ｍＬのセルレニン寒天プレートから分離した）クローン１６０２−ＲＲ０２−２０−２であり、特にＦＡＭＥ及びＤＨＡの生産性が良好であった。このセルレニン抵抗性株はまた、大容量発酵においてバイオマスとＤＨＡの両方の生産性が野生株を上回り、ＮＨ−５５７４という名称を与えられた。
【０１３８】
実施例５  急増殖するトリクロサン抵抗性ツボカビ類株の選択
別々の処置で、５種類の線量（２５Ｇｙ、７５Ｇｙ、１００Ｇｙ、１５０Ｇｙ及び２５０Ｇｙ）のガンマ線放射を用いて、実施例４でセルレニン抵抗性について選択したＮＨ−５５７４株の４００Ｘ１０６個の細胞の変異誘発を行った。変異誘発した細胞をペレット化（２，０００ｘｇで５分間）し、最少培地５ｍＬに再度浮遊させ、トリクロサン０．５ｍｇ／Ｌを含む最少培地を収容するサイトスタット発酵槽に接種した（サイトスタットは実施例３で説明したように設定した）。トリクロサンは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）酵素のエノイルレダクターゼドメイン（ＥＲ）に結合するＦＡＳ阻害剤である（Ｈｅａｔｈら（１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，．  ２７４：１１１１０−１１１１４）。サイトスタット培養の希釈率は、最初の５５時間は一定して０〜０．０５のままだったが、だいたい５６時間で上昇し始め、希釈率は＞０．５に上昇した。発酵は１１５時間で中断し、この時点で５ｍＬの細胞を、トリクロサンなしの最少培地を収容する５０ｍＬの振盪フラスコ内に継代培養した。培養はトリクロサンなしで３日間に亘り３回継代培養し、その後それぞれ０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ及び２ｍｇ／Ｌのトリクロサンを含む寒天プレートに蒔いた。トリクロサン全濃度について増殖を観察し、全プレートから全部で２０コロニーを抜き取って、Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽で生産性を評価した。（実施例４で説明した）Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽アッセイで一番性能が良かったのは、クローン１６０２−ＲＲ０３−０８であった。表４は、セルレニン＋トリクロサン抵抗性株の両方が、ＤＨＡ生産性の両方において明確に野生型を上回ったことを示す。さらに、ＮＨ−５７８３株と改名されたクローン１６０２−ＲＲ０３−０８はまた、総脂肪酸パーセンテージとしてＤＨＡ含有量がより高かった（表４）。
【０１３９】
（表４）小規模発酵におけるラビリンチュラ綱分離株の生産性
2017518747.tif 000005
【０１４０】
図４に、ＷＨ−５５５４株及びＷＨ−５７８３株により生産された脂肪酸の独立成分分析の図を示す。同図から、ＤＨＡ対ＤＰＡの比はＮＨ−５７８３株（４．０１）と野生型原株ＷＨ−５５５４（４．３７）ではだいたい同じだが、ＷＨ−５７８３株のほうが原株よりもＤＨＡとしてのＦＡＭＥのパーセンテージが高い（原株の２６％に対し３１％）ことがわかる。ミリスチン酸の顕著な増加も目立つが、これはＮＨ−５７８３ではＦＡＭＥのパーセンテージで野生型原株ＷＨ−５５５４の２倍以上である。
【０１４１】
実施例６  株のＤＨＡ生産性をさらに強化するＵＶ処置
実施例５で分離したＮＨ−５７８３株の細胞４億個を４つの２０×２０ｃｍの寒天プレートに蒔き、２時間かけて付着させた。４つのプレートを４種類の線量（３０００μＪ／ｃｍ２、５０００μＪ／ｃｍ２、７０００μＪ／ｃｍ２、及び１００００μＪ／ｃｍ２）のＵＶ放射に曝露してから、暗所で２時間かけて回復させ、その後細胞を６ｍＬの最少培地中に剥離させて阻害剤なしの最少培地を収容するサイトスタット発酵槽に注入した（サイトスタット設定は実施例３と同じ）。希釈率は最初の１２時間は緩慢だった（約０．２）が、その後は野生型の増殖率に近似して上昇した（＞０．５）。２４時間発酵と１２０時間発酵の後に細胞をサイトスタットから回収し、単一クローンを寒天プレート上に分離した。２４時間時点の９クローンと、１２０時間時点の１０クローンを抜き出して、Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽で生産性を評価した。Ｍｉｃｒｏ２４発酵槽で一番性能が良かったのは、２４時間時点のクローン１６０２−ＲＲ１３−０４（ＮＨ−６１６１）と、１２０時間時点のクローン１６０２−ＲＲ１３−１０（ＮＨ−６１８１）であった。結果を表５に示し、また図４にもグラフ化するが、ＵＶ処置しサイトスタット選択した株はＤＨＡとして高パーセンテージの脂肪酸を生産したことが示された（ＮＨ−６１６１とＮＨ−６１８１では３９％であったのに対し、セルレニン／トリクロサンで選択された原株ＮＨ−５７８３では３０％、野生型原株ＷＨ−５５５４ではわずか２４．６％）。さらに、ＮＨ−６１６１株とＮＨ−６１８１株は、原株ＮＨ−５７８３よりもＤＨＡ及びミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）（Ｃ１４：０）の含有量が総脂肪酸パーセンテージとしてかなり高かった（３２％及び３１％に対してセルレニンで選択されたＮＨ−５７８３株は１２．７％、野生型ＷＨ−５５５４はわずか５％）。
【０１４２】
（表５）各株の脂肪酸組成
2017518747.tif 000006
【０１４３】
実施例７  野生型分離株ＷＨ−５５５４と標準的なやり方で改良した由来株の脂質生産性比較
標準的なやり方で改良した株のＤＨＡ生産性についてＭｉｃｒｏ２４ミニチュアバイオリアクターシステム（ニューヨーク州ポートワシントン  Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でスクリーニングした。簡単に説明すると、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．６５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ２．５ｇ／Ｌ、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ塩  １７ｇ／Ｌ、微量元素溶液５ｍＬ、ビタミン溶液１ｍＬ／Ｌ、及びデキストロース４０ｇ／Ｌを含む培養培地を含む６ｍＬの培養を設定した。微量元素溶液には、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩６ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ  ０．２９ｇ／Ｌ、Ｈ２ＢＯ３  ６．８４ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ  ０．８６ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ保存液（６０ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ保存液（２ｇ／Ｌ）  １ｍＬ、及びＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ保存液（５ｇ／Ｌ）  １ｍＬが含まれた。ビタミン溶液には、チアミン２００ｍｇ／Ｌ、１リットル当たり１０ｍＬのビオチン保存液０．１ｇ／Ｌ、及び１リットル当たり１ｍＬのシアノコバラミン保存液１ｇ／Ｌが含まれた。
【０１４４】
６ｍＬの培養の開始ＯＤ７４０値が１．４となるように、振盪フラスコの各株の対数中期の培養を用いて標準化した。Ｍｉｃｒｏ２４の発酵物は、６００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で２３時間インキュベートした。各株を二連培養で発酵した。溶解酸素濃度は飽和度１０％であった。発酵の開始時と終了時に細胞を回収して、ＴＯＣ、ＦＡＭＥグルコース及びアンモニアについてアリコートを分析した。標準的なやり方で改良した株のＭｉｃｒｏ２４の小規模発酵データの一例を表６に示す。２回変異誘発し、サイトスタット選別したＮＨ−５７８３株は、その原株ＷＨ−５５５４と比べて、脂肪酸パーセントとしてのＤＨＡならびにＤＨＡ生産性が大幅に増加していた。ＵＶ処置したＮＨ−５７８３由来株（ＮＨ−６１６１及びＮＨ−６１６８１）は、ＦＡＭＥのパーセントとしてのＤＨＡ及びＤＨＡ生産率の両方においてさらに大幅な増加を示した。
【０１４５】
（表６）標準的なやり方で改良した株の小規模発酵におけるＤＨＡ生産性
2017518747.tif 000007
【０１４６】
実施例８  分離株の系統樹
１８ＳｒＤＮＡ、アクチン及びβチューブリンの３種類の遺伝子座を調査して、Ｔｓｕｉら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ５０：  １２９−１４０  （２００７））にしたがい系統樹を決定した。すべてのヤブレツボカビ関連の属を分析に含めたが、例外としてビオコソエカ属（Ｂｉｏｃｏｓｏｅｃａ）の種及びカエシテルス属（Ｃａｅｃｉｔｅｌｌｕｓ）の種は除外した。各座について、系統樹を構築する４つの方法として最尤法、最大節約法、最小進化法及び近隣結合法を実施した。便宜上、図８では、もっとも厳密な方法（最尤法）だけを１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列に与えた。距離行列法（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）の結果は、ＷＨ−５５５４株とＷＨ−５６２８株が近縁関係にあることを示している。これらの株にもっとも近縁なのは、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）（基礎異名シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ））と考えられる。シゾキトリウム属の種ＡＴＣＣ  ２０８８８もまた、ＷＨ−５５５４株及びＷＨ−５６２８株と近縁であるが、オーランチオキトリウム・マングロベイほどではない。３つの遺伝子座のギャップ差バーコードに基づき、本明細書ではＷＨ−５５５４とＷＨ−５６２８と命名しＡＲＳ微生物株保存機関にＮＲＲＬ−５０８３４（ＷＨ−５５５４株）とＮＲＲＬ−５０８３５（ＷＨ−５６２８株）として寄託した新規分離株は、オーランチオキトリウム属の種であると考える。距離行列法の結果は、ＷＨ−５５５４株とＷＨ−５６２８株が近縁関係にあることを示している。新規分離株の脂質プロファイルがこのことを立証している。Ｙｏｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ（Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４８：  １９９−２１１  （２００７））は、オーランチオキトリウム属の種はＦＡＭＥ脂質の５％以下をアラキドン酸（ＡＲＡ）として、またＦＡＭＥ脂質の最大約８０％をＤＨＡとして有すると定義している。一方で、シゾキトリウム属の種のＡＲＡ含有量は、ＦＡＭＥの約２０％である。表８は、ＮＨ−６１６１から分離した微生物粗油の脂肪酸組成の分析結果を示す。
【０１４７】
（表８）微生物粗油中の脂肪酸（％ＦＡＭＥ）
2017518747.tif 000008
【０１４８】
さらに、分離されたＷＨ−５５５４株に由来する分離されたＷＨ−５６２８株及びＮＨ−５７８３株（実施例６参照）のカロテノイド分析から、両方の株がカロテノイドであるエキネノン、カンタキサンチン、フェニコキサンチン及びアスタキサンチンを生産することが示されたが（表９及び図９）、これはオーランチオキトリウム属の種の特徴であって、シゾキトリウム属の種には見られない（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ  （２００７））。
【０１４９】
（表９）ラビリンチュラ綱分離株のカロテノイド含有量
2017518747.tif 000009
【０１５０】
最後に、分離株ＷＨ−５６２８、及びＷＨ−５５５４由来株であるＮＨ−５７８３の各細胞を栄養生長中に顕微鏡観察した（図１０）。Ｙｏｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ  （２００７）によるオーランチオキトリウム属の形態学的記述と一致して、ＷＨ−５６２８株及びＮＨ−５７８３株の栄養細胞は、単一細胞として分散しており、シゾキトリウム属の特徴である大きな凝集塊としては観察されなかった。液体培地中１５℃で繁殖させた培養は、繁殖後６０時間着色しているのが肉眼観察され、これはＮＨ−５７８３株（ひいては親株であるＷＨ−５５５４）及びＷＨ−５６２８株の両方がオーランチオキトリウム属であってシゾキトリウム属ではないとする同定と一致する表現型である。
【０１５１】
配列表
配列番号１
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＷＨ−０５５５４株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント１
2017518747.tif 000010
配列番号２
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＷＨ−０５５５４株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント２
2017518747.tif 000011
配列番号３
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＷＨ−０５５５４株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント３
2017518747.tif 000012
配列番号４
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＷＨ−０５５５４株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント４
2017518747.tif 000013
配列番号５
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０５７８３株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント１
2017518747.tif 000014
配列番号６
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０５７８３株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント２
2017518747.tif 000015
配列番号７
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０５７８３株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント３
2017518747.tif 000016
配列番号８
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０５７８３株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント４
2017518747.tif 000017
配列番号９
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０６１６１株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント１
2017518747.tif 000018
配列番号１０
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０６１６１株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント２
2017518747.tif 000019
配列番号１１
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０６１６１株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント３
2017518747.tif 000020
配列番号１２
ＤＮＡ
オーランチオキトリウム属の種
ＮＨ−０６１６１株の１８Ｓ  ｒＤＮＡフラグメント４
2017518747.tif 000021
【図１】
2017518747.tif 000022
【図２】
2017518747.tif 000023
【図３Ａ】
2017518747.tif 000024
【図３Ｂ】
2017518747.tif 000025
【図３Ｃ】
2017518747.tif 000026
【図４】
2017518747.tif 000027
【図５】
2017518747.tif 000028
【図６】
2017518747.tif 000029
【図７Ａ】
2017518747.tif 000030
【図７Ｂ】
2017518747.tif 000031
【図７Ｃ】
2017518747.tif 000032
【図７Ｄ】
2017518747.tif 000033
【図７Ｅ】
2017518747.tif 000034
【図７Ｆ】
2017518747.tif 000035
【図７Ｇ】
2017518747.tif 000036
【図７Ｈ】
2017518747.tif 000037
【図７Ｉ】
2017518747.tif 000038
【図７Ｊ】
2017518747.tif 000039
【図７Ｋ】
2017518747.tif 000040
【図７Ｌ】
2017518747.tif 000041
【配列表】
2017518747000001.app
【国際調査報告】
2017518747.tif 000042
2017518747.tif 000043
2017518747.tif 000044
2017518747.tif 000045