(57)【要約】  本発明は、コラーゲン合成を促進するために、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用に関する。本発明はまた、酸化ストレスから皮膚細胞を保護するために、抗酸化物質としてのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用に関する。最後に、本発明はまた、皮膚老化及び／又は皮膚老化の兆候の出現を遅延させ、対処し、治療し、又は低減させるためのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン合成を誘導するためのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用。
【請求項２】
酸化ストレスから皮膚細胞を保護する抗酸化物質としてのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用。
【請求項３】
皮膚老化及び／又は皮膚老化の兆候の出現を、遅延又は対処し、治療又は低減させるための、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用。
【請求項４】
前記皮膚老化の兆候が皺、小皺、皮膚のたるみ、皮膚線維の弾力性の消失、しぼんだ皮膚、薄くなった皮膚、並びにくすみ及び／又は活力のない皮膚から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
皮膚老化の現れを修復し、及び／又は皺及び小皺を軟化させ、及び／又はしぼんだ若しくは薄くなった皮膚を再びきめ細かくし、及び／又は顔面及び／又は体部の皮膚を再びきめ細かくし、及び／又は張りをもたせ、及び／又は明るくするためのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の美容的使用。
【請求項６】
コラーゲン合成を誘導し、及び／又は酸化ストレスから皮膚細胞を保護する美容用組成物におけるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の使用。
【請求項７】
前記エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物が花柄の地上部由来の抽出物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物が水性アルコールのグリセリン抽出物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記抽出物が前記美容用組成物の総重量に対して固形分重量基準で０．０１％〜１０％、好ましくは前記美容用組成物の総重量に対して固形分重量基準で０．０１％〜５％配合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記美容用組成物は、１つ又は複数の配合剤又は添加剤、例えば軟化剤、染料、膜形成剤、界面活性剤、香料、保存料、乳化剤、油類、グリコール、ＵＶ遮断剤、及びビタミンを更に含む、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エシュショルジア・カリフォルニカ（Eschscholtzia californica：ハナビシソウ）抽出物又は上記抽出物を含む美容用組成物の、特に皮膚老化及び／又は皮膚老化の兆候の出現を遅延させ、又は対処するための美容的使用に関する。本発明はまた、上記抽出物又は上記組成物の抗酸化物質としての使用及びまたは、コラーゲン合成を誘導するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は人体の特殊な器官の１つである。皮膚は体の全表面を覆っており、成人ではその表面積は総じておよそ１．６ｍ２となることからも解るように、皮膚は非常に薄く、広範囲に存在する。その機能は、異物及び免疫対象物の物理的な侵入、温度調節、並びに体液の喪失のそれぞれの観点において、外部の環境から深部組織を保護することである。最後に、皮膚が恒久的に受ける機械的応力のため、他のいずれの器官よりも高い柔軟性で結合しているしっかりとしたまとまりのある（solid and coherent）構造となることが皮膚に求められる。解剖学的部位によって様相に少しの違いはあるが、皮膚は常に同じ基本的形態構造を有する。皮膚は、表面に表皮と、深部に真皮と、それらを分離し、また結び付ける表皮真皮接合部とからなる。
【０００３】
真皮の役割は皮膚の柔軟性及び強度を維持することである。真皮は、皮下組織と呼ばれる脂肪層の上にあり、間葉細胞である線維芽細胞が浸潤している、高密度、線維状、及び弾力性のある結合組織の１つである。線維芽細胞は、真皮を囲み、皮膚の実際の支持組織である細胞外マトリクスの構成物質の合成に関与している。細胞外マトリクスは、皮膚表面に平行して走る波状のコラーゲン束と弾力性のある線維（エラスチン及びフィブリリン）とから構成された線維状の枠組みにより構造化されている。
【０００４】
表皮を支持する物理的な役割の他に、真皮は他の必須機能を備える。真皮の優れた血管新生能により、表皮との栄養素の交換が可能となる。これはまた、真皮にマクロファージ型免疫細胞と、皮膚の免疫防御に必須の構成要素である樹状細胞とを多く含ませることを可能にする。さらに、真皮は、触感に関与する感覚受容器を有する、神経が分布した組織である。最後に、真皮は、表皮に向かう可溶性の成長因子及びサイトカインを合成することにより、創傷治癒の現象及び角化細胞の増殖及び分化を調節することに関与する。
【０００５】
コラーゲンは、皮膚に張力に関する強度を与える。エラスチンにより、皮膚は伸長し、変形した後に収縮して戻ることが可能になる。エラスチンは、皮膚の被膜に弾力性を与える。細胞外マトリクスはまた、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを含有し、これらは、内部に線維状のタンパク質が集まった、水和性の高い基礎となる物質を形成する。最後に、糖タンパク質構造は、膜のインテグリンを結合することによりマトリクスと細胞との間を結びつける。
【０００６】
皮膚の細胞外マトリクスは、皮膚構造を囲み、表皮を支持する間質材料である。線維状のタンパク質の網の中のコラーゲンは、皮膚の機械的特性に寄与する主な不溶性構成物質である。真皮の「コラーゲン線維」は、コラーゲンＶから構成される軸を中心にしたコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩのそれぞれからなる。これらのコラーゲンは線維性コラーゲンのグループに属する。成人では、コラーゲンＩは、平均してコラーゲンＩＩＩの６倍程多く含まれる。
【０００７】
コラーゲンＩの原線維は大きな引張り抵抗を有するため、断裂することなく伸長することができる。これらの原線維は、コラーゲン線維と称される平行な列に並んで配列される。コラーゲンＩＩＩは３つのα１鎖（ＩＩＩ）から構成され、胎児の皮膚の大部分を占め、拡張可能な構造である。コラーゲンＩの割合は皮下組織に近づくにつれて増加する。細胞外マトリクスはまた、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチンを含有し、プロテオグリカンの基礎となる物質も含有する。
【０００８】
細胞外マトリクスの構成物質の安定性は大きいが、細胞外マトリクスは、その大部分が結合組織の細胞によって局所的に産生される動的構造体である。これに関連して、線維芽細胞は、結合組織を維持及び再生する際に必須の役割を果たす。コラーゲン及び細胞外マトリクスの他の高分子の合成能及び分解能、又は線維を組織化若しくは配向させる能力は、皮膚組織の恒常性に重要である。
【０００９】
老化過程において、細胞とそれを囲むマトリクスとの間の伝達における異常の中には、細胞外マトリクスの構造の定量的及び定性的に過剰な変化を生じるものがある。例えば、コラーゲンＩＩＩに対するコラーゲンＩの比は老化過程にわたり低下する。
【００１０】
フリーラジカルは、不対電子を含有する化学種、原子、又は分子である。この化合物は極めて不安定であり、非常に安定した分子と反応してその電子を共有することができる。フリーラジカルは電子を１つ離す（酸化物質として挙動する）か、又は１つ結合する（還元物質として作用する）かのいずれかを行うことができる。前者の反応は一般に新しいラジカルの鎖反応形成を生じる。最初のフリーラジカルの産生が著しい細胞障害を引き起こすのは、このためである。
【００１１】
Ｏ２は、外部軌道に２つの不対電子を有する原子２つから形成されるビラジカル分子である。それゆえ、Ｏ２は、２つの電子の内の１つが捕捉され、部分的にＯ２・−に還元された後、Ｈ２Ｏ２に容易になることができる。したがって、これが活性酸素種（ＲＯＳ）形成の元となる。
【００１２】
ＲＯＳという用語は酸素フリーラジカルである、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）、及び一部の毒性の高い非ラジカル酸素系誘導体、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む。
【００１３】
ＲＯＳにより誘発される傷害には、脂質の過酸化、タンパク質の酸化、及びＤＮＡ突然変異がある。これらの有害作用は、特にアポトーシス（プログラムされた細胞死）により、機能及び完全性の消失又は更には細胞死を生じ得る。また、ＲＯＳによって、（ミトコンドリア）透過性遷移孔の開口部が活性化されることによりアポトーシスが開始される。
【００１４】
酸化ストレスは主にミトコンドリア由来であるため、これらの細胞小器官はＲＯＳの主な標的となる。
【００１５】
それゆえ、ミトコンドリアの機能は特に酸化傷害に曝されることで、主にＡＴＰ合成量が低下するだけでなく、透過性遷移孔が誘導されてアポトーシスによるプログラム細胞死が開始される。
【００１６】
一般の器官、特に皮膚の老化過程では、活性酸素種の過剰産生及び抗酸化物質保護機構の低減が例証されている。したがって、これらの現象は、抗酸化物質の防御能を超えるフリーラジカルの産生を伴う不均衡を生じる。皮膚レベルで存在するフリーラジカル量の増加は、いくつかのレベルでの傷害を生じさせる。タンパク質、細胞膜、及びＤＮＡが影響を受ける。いくつかの研究では、老化による脂質の過酸化が増大することで、細胞膜に脂質が増加し、そのため細胞膜の完全性に影響を与えることが示されている。これらの有害作用は皮膚細胞の機能を変化させるが、例えば成熟皮膚の線維芽細胞は、酸化ストレスにより生じる酸化したタンパク質が蓄積することに対して脆弱であることから、皮膚の細胞外マトリクスの構成物質を合成する機能が次第に失われる。
【００１７】
驚くべきことに、本出願人は、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物又はこのような抽出物を含む組成物が、コラーゲン合成を促進することにより、すなわちコラーゲンの発現を誘導してこのタンパク質含量を増加させることにより、また皮膚細胞を酸化ストレスから保護することにより、皮膚を老化から保護することを例証している。それゆえ、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物を、皮膚の抗老化活性物質として、コラーゲン発現を誘導する活性物質として、及び／又は抗酸化物質として使用することが可能である。
【００１８】
エシュショルジア・カリフォルニカは、カリフォルニアポピー又はエスコルチアとも称され、パパベラセアエ（Papaveraceae：ケシ）科の一年草であり、３０ｃｍ〜４０ｃｍの高さとなる。３ｃｍ〜５ｃｍ径の橙黄色の花は４枚の花弁の花冠を有する。果実は大量の種を含有する長い鞘である。
【００１９】
この植物は、従来不眠症を軽減し、睡眠を調節し、不安症を治療し、又は小児の情動不安を鎮めるのに使用される。
【００２０】
この植物はイソフラボンを含有することが知られている（非特許文献１）。一部のイソフラボンは、そのエストロゲン活性により、皮膚の抗老化作用を有し得ることがDweckにより記載されているが、Dweckは、メトキシ基を担持するイソフラボン、例えばエシュショルジア・カリフォルニカに存在するものはエストロゲン受容体に効率よく結合することができず、その結果エストロゲン作用を誘導することができないことを強調している。それゆえ本出願人によって観察されたこの植物の活性は、完全に予想外のものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Dweck A.C. "Isoflavones, Phytohormones and phytosterols", Journal of Applied Cosmetology, International Ediemme, Rome, IT, vol. 24, no.1, 1 January 2006, pages 17-32
【発明の概要】
【００２２】
本発明による美容的使用は、好ましくは、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物又はこのような抽出物を含む美容用組成物の使用である。
【００２３】
抽出物はエシュショルジア・カリフォルニカの地上部の抽出物、特に花柄の地上部の抽出物が好ましい。この抽出物は水性アルコールのグリセリン抽出物であることが有利となる。少なくとも以下の工程を含む方法により得られた水性アルコールのグリセリン抽出物が好ましい：
花柄の地上部を乾燥させる工程、
冷浸−アルコール（１５％〜２０％）、グリセリン（１４％〜１６％）、及び水（１００％まで適量）を用いて室温にて１０日間浸軟させ、およそ１９℃の温度にて手動で毎日撹拌させる工程、
圧搾する工程、
沈殿後、濾過する工程。
【００２４】
本発明により使用されるエシュショルジア・カリフォルニカの抽出物は、赤褐色であり、芳香臭を有する。以下の分析特性を有する：
相対密度：１〜１．０３５
屈折率：１．３５５〜１．３７５
乾燥残留物：最少１２．００
【００２５】
原材料供給元であるFytosan製の製品名「有機ハイドロアルコールグリセリン抽出物（organic hydro-alcoholic glycerine extract）」として本発明によるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物を購入することが可能である。
【００２６】
本発明の美容用組成物は、組成物の総重量に対して固形分重量基準で０．０１％〜１０％のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物を含むことが好ましい。本組成物は、組成物の総重量に対して固形分重量基準で０．０１％〜５％のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物を含むことが有利である。
【００２７】
本発明の組成物はまた、既知の従来化粧品に使用される１つ又は複数の配合剤又は添加剤及び皮膚用組成物、例えば例として、また非限定的に軟化剤、染料、膜形成剤、界面活性剤、香料、保存料、乳化剤、油類、グリコール、ビタミン、例えばビタミンＥ、ＵＶ遮断剤等を含むことができる。化粧品に関する知識に基づき、当業者であれば、求められている特性に応じてどの配合剤をどのような量で本発明の組成物に添加するかがわかるだろう。
【００２８】
本発明の組成物は、美容及び皮膚科学の分野の当業者に既知の任意の形態であってよく、顔面及び体部に塗布すること以外は何ら生薬的な制限（galenical restriction）はない。本発明の組成物は、ゲル、クリーム、ローション、オイル、ミルク、噴霧剤等の形態であることが有利である。
【００２９】
本出願人は、本発明で使用されるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物及び更にはそれを含む美容用組成物を、皮膚に塗布して、コラーゲン合成を例えばその発現を誘導することによって促進することにより、又は酸化ストレスから皮膚細胞を保護するための抗酸化物質として、使用することができることを例証している。
【００３０】
その結果、本発明のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物又はそれを含む美容用組成物を使用して皮膚老化及び／又は皮膚老化の兆候の出現を予防し、遅延させ、対処し、治療し、又は低減させることができる。
【００３１】
皮膚老化の兆候とは、皺、小皺、皮膚のたるみ、皮膚線維の弾力性の消失、しぼんだ皮膚、薄くなった皮膚、並びにくすみ及び／又は活力のない皮膚を意味する。
【００３２】
本発明の好ましい変形例により、その皮膚のコラーゲン合成を誘導する作用及びその抗酸化物質特性に基づいて、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物を、皮膚老化の現れを修復するために、特に皺及び小皺を軟化させ又はしぼんだ若しくは薄くなった皮膚を再びきめ細かくするために使用することができる。
【００３３】
本発明で使用されるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物及びそれを含む美容用組成物を、皮膚を再びきめ細かく、及び／又は張りをもたせ、及び／又は明るくするために使用することもできる。
【００３４】
本発明によるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物及びそれを含む美容用組成物を、顔面又は体部のいずれかの皮膚であってよい皮膚に塗布することで使用する。
【００３５】
皮膚が顔面の皮膚であるとき、皮膚は好ましくは顔面、首、デコルテ、及び／又は目の周りの領域の皮膚である。
【００３６】
特定の変形例によれば、本発明によるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物及びそれを含む美容用組成物を、皮膚に張りをもたせ、及び／又は皮膚を明るくするために、例えば痩身法（slimming：スリミング）の意味において体部の皮膚に塗布する。
【００３７】
以下の実施例は、コラーゲンＩの合成及びその抗酸化物質作用におけるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の作用を評価することに関する一方で、本発明の主題である組成物に関する。
【００３８】
実施例は以下の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】対照のコラーゲンＩ（ＴＲＩＴＣ）（写真Ａ）、陽性対照のビタミンＣ（写真Ｂ）、及び０．０５％濃度のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物（写真Ｃ）の免疫蛍光（光学蛍光顕微鏡を用いた観察、拡大率×２００）を示す図である。
【図２Ａ】ビタミンＣの存在下又は非存在下での線維芽細胞による細胞当たりの蛍光単位として表したコラーゲンＩの発現を示す図である。
【図２Ｂ】０．０５％のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の存在下又は非存在下での線維芽細胞による細胞当たりの蛍光単位として表したコラーゲンＩの発現を示す図である。
【図３】トロロックス及び様々な濃度のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の存在下又は非存在下で１００μＭのＨ２Ｏ２により誘導された、ヒト線維芽細胞による１分間当たり及び細胞当たりのＲＯＳの産生の割合を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
Ｉ．Ｉ型コラーゲン分泌におけるエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の活性の評価
Ａ．材料及び方法
線維芽細胞を、カバーガラスを備えた６ウェルプレートにＭＥＭ培地（最小必須培地）の１ディッシュ当たり７００００個の細胞量にて播種する。４８時間後、細胞を０．０５％、０．１％、及び０．２５％のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物又は陽性対照（ビタミンＣ）を用いて処理し又は処理せず（対照）に、インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間インキュベーションした。
【００４１】
次いで各細胞層を洗浄し、メタノールで固定した（−２０℃）後、Ｉ型コラーゲンを示す。
【００４２】
細胞を、目的のタンパク質に対する（directed against）一次抗体とともにインキュベーションした後、一次抗体に対する二次抗体とともにインキュベーションし、蛍光色素のＴＲＩＴＣ（ローダミンから得られたテトラメチルローダミンイソチオシアネート）に結合させた。各抗体間のインキュベーション時間は１時間である。細胞核をＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）染色によって示す。
【００４３】
カバーガラスをスライドガラスに載せた後、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ５０ｉ）下にて観察した。いくつかの視野の細胞集団を撮影する。ＴＲＩＴＣ蛍光画像（赤色）は、目的のタンパク質が局在する領域を示す。写真画像を、ＮＩＳエレメント画像分析ソフトウェア（Nikon）を用いて分析する。
【００４４】
Ｂ．結果
本試験は、０．０５％のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物が線維芽細胞による著しいＩ型コラーゲン合成を誘導し、エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物で処理したウェル内のコラーゲン含量の増加を生じたことを例証している。エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物が線維芽細胞による真皮のマトリクス合成を刺激している。これらの特性が、この抽出物に抗老化特性をもたらしている。
【００４５】
ＩＩ．抗酸化物質としてのエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の活性の評価
本方法論は、ＲＯＳに対するエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物の抗酸化物質活性を蛍光マーカーにより定量することからなる。
【００４６】
Ａ．材料及び方法
細胞を、蛍光プローブを用いて３７℃にて３０分間プレインキュベーションする。洗浄後、細胞を、抗酸化物質の参照化合物であるトロロックス（１０μＭ）又はエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物（所定の非細胞毒性濃度）と、酸化促進参照化合物であるＨ２Ｏ２（１００μＭ）の存在下において同時にインキュベーションする。直ちに細胞のＲＯＳの産生を６０分間記録する。蛍光をマイクロプレートリーダー（Varioskan-Thermo）を用いて５分毎に記録する。細胞は動態過程にわたり３７℃にて維持する。化合物は全て４連試験する。これらの作用を陰性（Ｈ２Ｏ２）及び陽性（トロロックス）の対照と同時に比較する。
【００４７】
Ｂ．結果
本試験は、試験した用量（０．０５％、０．１％、及び０．２５％）のエシュショルジア・カリフォルニカ抽出物が非常に顕著に、場合によりほぼ完全にＨ２Ｏ２により誘導された細胞ＲＯＳの産生を低減させることを例証する。
【００４８】
ＩＩＩ．配合例
割合は、組成物の総重量に対する重量百分率である。
【００４９】
ＳＰＦ１５のデイクリーム
％
キサンタンガム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２０
グリセリン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５．００
カプリリルグリコール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．３０
ヒドロキシエチルアクリレート／ナトリウムアクリロイルジメチル
タウレートコポリマー．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．７５
セチルリン酸カリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．７０
セテアリルアルコールセテアリルグルコシド．．．．．．．．．．．．．．．．１．５０
トコフェリル酢酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２０
Ｃ１２〜１５安息香酸アルキル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．４．００
サリチル酸ブチルオクチル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５．００
ホモサレート．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５．００
ブチルメトキシジベンゾイルメタン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３．００
オクトクリレン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２．７０
エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５０
トコフェロール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．０５
保存料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
香料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
脱塩水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量を追加して１００にする
【００５０】
ナイトクリーム
％
ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩．．．．．．．．．．２．５０
イソノナン酸イソノニル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．４．５０
シアバター．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２．００
イソノナン酸セテアリル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．８．００
セテアリルアルコール／セテアリルグルコシド．．．．．．．．．．．．．．．３．５０
ジメチコン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３．００
カルボマー．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２５
セルロース．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５０
エシュショルジア・カリフォルニカ抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．１．００
グリコール．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．６．２０
トコフェリル酢酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２０
保存料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．６０
キレート剤．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１０
トロメタミン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量を追加してｐＨを調整する
香料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
脱塩水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量を追加して１００にする
【図１】
2017537091.tif 000002
【図２Ａ】
2017537091.tif 000003
【図２Ｂ】
2017537091.tif 000004
【図３】
2017537091.tif 000005
【国際調査報告】
2017537091.tif 000006
2017537091.tif 000007
2017537091.tif 000008
2017537091.tif 000009
2017537091.tif 000010
2017537091.tif 000011