(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程１〜３を含むことを特徴とする、変形性関節症の検出方法。
工程１：関節液を、ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素で処理する工程。
工程２：工程１で得られた酵素処理した関節液中に含まれる、下記式(1) で示されるオリゴ糖の量を測定する工程。
Gal−GlcNAc(6S)           式(1)
（Gal はガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、(6S)は、６位の水酸基が硫酸化されていることを、− はグリコシド結合を示す）
工程３：工程２で測定したGal−GlcNAc(6S)の量の減少と、変形性関節症の発症又は増悪とを関連づけて、関節疾患を検出する工程。
【請求項２】
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素が、バチルス(Bacillus)属に属する微生物由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素を、その構成要素として含む、請求項１又は２に記載の検出方法を行うための検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、関節疾患の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
関節は、骨格の構成要素が互いに結合している部位で、普通は、そこで各構成要素が互いに独立に動くようになっており、我々が日常、人間らしい生活を送るにあたって、非常に重要な役割を果たしている。すなわち、何らかの原因により、関節に障害が認められると、人間は、本来の動きを行うことができなくなり、日常生活や仕事に多大な影響を与えることになる。
【０００３】
関節において何らかの異常が認められる関節疾患も、他の疾患と同様に、早期の発見と早期の治療をすることが肝要である。早期のうちに、関節疾患の原因を突き止め、適切な治療を施すことにより、関節疾患を治癒させたり、その進行を遅らせたりすることが可能になるからである。
【０００４】
関節疾患の検出方法の代表的なものとしては、Ｘ線撮影が知られている。
しかしながら、Ｘ線撮影では、病期進行に伴う軟骨の変性変化は評価しにくく、定量的な検出方法ではないことから、病期の微妙な進行程度の検出には向いていない面がある。さらに病期の進行程度の判定は、経験に基づく部分も多いため、判定者によって結論が異なってしまう場合も想定される。さらに放射線（Ｘ線）の被爆も、極力避けることが望ましい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、関節疾患を、放射線被曝等の危険性を回避して、定量的かつ客観的に検出する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、関節液を特定の酵素で処理して得られる特定のオリゴ糖の量が、関節疾患の病期の進行に伴って変化することを見出し、この特定のオリゴ糖の量を測定することにより、Ｘ線によらずとも関節疾患の病期の進行程度を検出することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記工程１〜３を含むことを特徴とする、変形性関節症の検出方法（以下、本発明検出方法という）を提供する。
工程１：関節液を、ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素で処理する工程。
【０００８】
工程２：工程１で得られた酵素処理した関節液中に含まれる、下記式(1) で示されるオリゴ糖の量を測定する工程。
Gal-GlcNAc(6S)    式(1)
〔Gal はガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、(6S)は、６位の水酸基が硫酸化されていることを、- はグリコシド結合を示す（以下、同様である）〕。
【０００９】
工程３：工程２で測定したGal−GlcNAc(6S)の量の減少と、変形性関節症の発症又は増悪とを関連づけて、関節疾患を検出する工程。
また、本発明は、ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素を、その構成要素として含む、本発明検出方法を行うための検出用キット（以下、本発明検出用キットともいう）を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明検出方法の検出対象は、上記の通り、変形性関節症（変形性股関節症、変形性膝関節症等）である。
【００１１】
本発明検出方法の内容について、上述の各工程の順を追って説明する。
工程１：
この工程は、関節液を、ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素で処理する工程である。
【００１２】
関節液は、変形性関節症を検出する対象〔哺乳動物（ヒトを含む）〕の関節液を用いることができる。例えば、ヒトの変形性関節症を検出する場合には、検出対象者の問題となる関節の関節液を採取して用い、イヌやウマ等の動物の変形性関節症を検出する場合には、検出対象動物の問題となる関節の関節液を採取して用いることができる。
【００１３】
なお、本発明で使用する関節液は、酵素処理前に前処理等を行う必要は必ずしもないが、不溶性異物や未分解物等を除去するため、フィルター、限外濾過膜等で濾過したり、遠心分離する等の固液分離処理を行うことが好ましい。また、生理食塩水等で適宜希釈した関節液を用いることもできる。
【００１４】
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素（以下、ＫＳ分解酵素ともいう）は、この機能を有する限り、供給源は特に限定されず、微生物であっても、高等生物であってもよい。また、遺伝子工学的手法等により、ＫＳ分解酵素の産生能が人為的に付与されたり強化された生物であってもよい。ＫＳ分解酵素は、これらの供給源から、その供給源に応じた手法、例えば、微生物であれば、適切な条件下で菌体外又は菌体内に分泌されるＫＳ分解酵素を、常法により、単離・精製することにより製造することができる。
【００１５】
具体的に、ＫＳ分解酵素の供給源として用いられる微生物として、バチルス(Bacillus)属に属する微生物を挙げることができる。具体的には、バチルスｓｐ．Ｋｓ３６〔Bacillus sp. Ks36 （受託番号：FERM P-10204号）〕、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２〔Bacillus circulans KsT202 （受託番号：FERM BP-5285号）〕等が挙げられる。これらのバチルス属に属する微生物からは、ＫＳ分解酵素として、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが産生される。前者のバチルスｓｐ．Ｋｓ３６に由来するＫＳ分解酵素は、ケラタナーゼIIとも呼ばれ、生化学工業株式会社等から市販されている。後者のバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２に由来するＫＳ分解酵素の詳細については、ＷＯ９６／１６１６６に記載されている。
【００１６】
ＫＳ分解酵素による関節液の酵素処理は、関節液とＫＳ分解酵素溶液を混合し、この混合液をインキュベートすることによって行うことができる。また、ＫＳ分解酵素を適当な担体に結合した固定化酵素に関節液を接触させることによっても行うことができる。この酵素処理は、この酵素が作用する条件を設定して行えばよいが、用いる酵素の至適温度、至適pH条件下で行うことが好ましいことは勿論である。
【００１７】
ＫＳ分解酵素で関節液を処理すると、関節液中のケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合が分解されて、下記のオリゴ糖を生ずる。
Gal-GlcNAc(6S)    式(1)
Gal(6S)-GlcNAc(6S)    式(2)
〔以下、上記式(1) で示されるオリゴ糖を「Ｌ２」という。また上記式(2) で示されるオリゴ糖を「Ｌ４」という。〕
なお、Gal とGlcNAcの間のグリコシド結合は、β−１，４グリコシド結合であることが好ましい。
【００１８】
後述する通り、Ｌ２とＬ４はいずれも関節液中のケラタン硫酸に由来するものであるにもかかわらず、変形性関節症、特に「変形性関節症の病期の進行」と関連があるのは意外にもＬ２のみであり、Ｌ４には有意な関連性が見られない。従って、本発明検出方法においては、ＫＳ分解酵素で処理した関節液（以下、酵素処理した関節液ともいう）のＬ２の量を測定することが必要となり、かつ、かかる点が本発明検出方法の最も特徴的な点の一つである。
【００１９】
工程２：
この工程は、工程１で得られた酵素処理した関節液中に含まれるＬ２の量を測定する工程である。
【００２０】
この測定方法は、酵素処理した関節液中のＬ２を定量的に測定できる方法である限り限定されず、例えば、液体クロマトグラフィーを用いる方法や、電気泳動法（キャピラリー電気泳動や、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動等）、免疫学的測定法等が挙げられる。
【００２１】
液体クロマトグラフィーを用いる方法の一例について、実施例で具体的に説明する。なお、液体クロマトグラフィーによる測定を行う前に、酵素処理した関節液中の不溶性異物や未分解物等を除去するために、フィルター、限外濾過等による濾過や遠心分離等の固液分離処理を行うことが好ましい。
【００２２】
工程２で測定したGal−GlcNAc(6S)の量の減少と、変形性関節症の発症又は増悪とを関連づけて、関節疾患を検出する工程。
【００２３】
工程２で測定した、酵素処理した関節液中のＬ２の量と変形性関節症との関連性、例えば変形性関節症になると酵素処理した関節液中のＬ２が減少することや、変形性関節症の病期の進行に伴って酵素処理した関節液中のＬ２が減少することを利用して、変形性関節症を検出することができる。
【００２４】
なお、変形性関節症の「検出」とは、変形性関節症に関連する情報を広く把握すること、すなわち、変形性関節症の有無や罹患している変形性関節症の種類の特定、変形性関節症の病期の進行程度の特定等を意味するものである。
【００２５】
このように工程３は、工程２で測定したＬ２の量と、変形性関節症の有無や病期の進行程度等とを関連づける工程であり、具体的には、例えば、以下のように関連づけて検出することができる。
【００２６】
酵素処理した関節液中のＬ２の量が、正常とは異なる場合（具体的には、酵素処理した関節液のＬ２の濃度が正常とは異なる場合等）には、変形性関節症について陽性であると関連づけることが可能であり、変形性関節症の有無を検出することができる。また、酵素処理した関節液中のＬ２の量の変化の程度により、変形性関節症の病期の進行程度を特定して検出することができる。具体的には、変形性関節症の病期が進行するほど、酵素処理した関節液中のＬ２の量が減少する傾向が認められる。
【００２７】
例えば、変形性関節症患者に変形性関節症に対する医薬を投与した場合において、この患者の酵素処理した関節液中のＬ２濃度を継続的に測定し、Ｌ２濃度が正常に近づいていけば、変形性関節症の病期の進行が停止し、改善の方向にあると判断することができる。同様に、酵素処理した関節液中のＬ２濃度が変化しなければ、病期の進行が停止して病期に変化がないことが、酵素処理した関節液中のＬ２濃度が正常から遠ざかっていけば、病期が進行して悪化の方向にあることが判断され得る。
【００２８】
このように、本発明検出方法によって、変形性関節症を検出することが可能であり、変形性関節症患者（初診の変形性関節症患者を含む）の状態の把握のみならず、投与した医薬の効果を評価すること等により、治療方針について、薬剤の選択を含め、極めて有用な情報が提供され得る。
【００２９】
変形性関節症の検出基準となる、酵素処理した関節液中のＬ２濃度は適宜定められ、測定された酵素処理した関節液中のＬ２濃度に基づいて検出が行われる。また、本発明検出方法は、病期の進行程度の検出に用いることが極めて好ましい。
【００３０】
本発明検出方法は、必要に応じて、関節疾患の他の検出手段と組み合わせることによって、変形性関節症の状態の把握を行うことが可能である。例えば、前述したＸ線撮影で、骨や軟骨の破壊と増殖の変化の程度を調べ、この結果と、本発明検出方法により得られる結果を組み合わせることによって、変形性関節症についての情報を充実させることができる。
【００３１】
本発明は、本発明検出方法を行うための検出用キット（本発明検出用キット）をも提供する。すなわち、本発明検出方法を実施して、変形性関節症を検出するために必要な要素、例えば、ＫＳ分解酵素等を含む検出キットが、本発明により提供される。本発明検出用キットには、その他、本発明検出方法を実施するために必要な、一般的な検出用キットに含まれ得る要素、例えば、希釈用の生理食塩水や精製水や緩衝液（関節液の希釈等のために用いる）等が、必要に応じて含まれ得る。
【００３２】
また、本発明検出用キットは、測定対象であるＬ２の標準標品を含むことが好ましい。Ｌ２の標準標品は、例えば、『新生化学実験講座３，糖質II，「プロテオグリカンとグリコサミノグリカン」第６２頁（１９９１年，東京化学同人）』や、ＷＯ９６／１６１６６に記載されている方法等によって調製することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(1) Ｘ線による関節疾患の病期の進行程度の検出
Ｘ線による関節疾患の病期の進行程度の検出は、変形性股関節症（以下、股ＯＡという）患者５０人（54.2±16.3歳）の関節の単純Ｘ線撮影像から、下記の日本整形外科学会判定基準（初期，進行期及び末期に分類されている）に基づき、股ＯＡの診断に経験のある医師が行った。
【００３４】
日本整形外科学会判定基準
▲１▼初期：
i)関節裂隙・関節適合について
関節面の不適合あり、部分的な狭小化が認められる。
ii)骨硬化・骨嚢包について
臼蓋の骨硬化が認められる。
iii)臼蓋及び大腿骨頭の変化について
軽度の骨棘形成が認められる。
【００３５】
▲２▼進行期：
i)関節裂隙・関節適合について
関節面の不適合あり、部分的な軟骨下骨質の接触が認められる。
ii)骨硬化・骨嚢包について
臼蓋の骨硬化、臼蓋あるいは骨頭の骨嚢包が認められる。
iii)臼蓋及び大腿骨頭の変化について
骨棘形成や臼底の増殖性変化が認められる。
【００３６】
▲３▼末期：
i)関節裂隙・関節適合について
関節面の不適合あり、荷重部関節裂隙の広範な消失が認められる。
ii)骨硬化・骨嚢包について
広範な骨硬化や巨大な骨嚢包が認められる。
iii)臼蓋及び大腿骨頭の変化について
著明な骨棘形成や臼底の二重像、臼蓋の破壊が認められる。
【００３７】
(2) 関節液の採取
上記(1) の患者の関節から、手術または関節造影に際して関節液を採取し、凍結保存した。試料を解凍後よく攪拌し、５０μｌあるいは１００μｌをチューブに採取した。試料の重量を測定し、５０μｌの試料は試料重量の２０倍、１００μｌの試料は試料重量の１０倍になるよう生理食塩水で希釈した。希釈後０．４５μm のフィルターで試料を濾過した。
【００３８】
(3) 酵素処理した関節液の調製
２０倍希釈試料は１００μｌをチュ−ブに採取した。０．１Ｕ/ ｍｌのケラタナーゼII（生化学工業株式会社製) 溶液を２０μｌ添加し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）２０μｌを加え、軽く攪拌後、３７℃で４８時間消化した。１０倍希釈試料については試料５０μｌ、蒸留水５０μｌ、ケラタナーゼII溶液を２０μｌ添加し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）２０μｌを加え、同様に消化した。ケラタン硫酸は、Ｌ２とＬ４に分解される。
【００３９】
消化終了後、それぞれ全量を分画分子量３万の遠心限外濾過チュ−ブ（ウルトラフリ−Ｃ３ＧＣ）にのせて、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心した。Ｌ２，Ｌ４は、濾液に回収される。
【００４０】
(4) 酵素処理した関節液の分析
限外濾過した濾液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のバイアルに移し、その４０μｌをＨＰＬＣに注入した。Ｌ２とＬ４の標準標品（いずれも、『新生化学実験講座３，糖質II，「プロテオグリカンとグリコサミノグリカン」第６２頁（１９９１年，東京化学同人）』に記載された方法で調製した）の溶出位置を指標に、Ｌ２とＬ４を分析した。なおＬ２とＬ４の量は、ＨＰＬＣからの溶出を、電気化学検出器（印加電圧：＋３６０ｍＶ）でモニターし、この溶出曲線の積分値として求めた。
【００４１】
Ｌ２とＬ４を分析するＨＰＬＣ条件を、以下に示す。
１．Ｌ２のＨＰＬＣ条件
（１）カラム    ：Ｎ（ＣＨ3)2 結合シリカゲル、φ８mm×１５cm（商品名：Senshu Pak.,（株）センシュー科学）
（２）溶出      ：１２mM  ＮａＨ2 ＰＯ4 ／10% アセトニトリル
（３）流速      ：０．６５ml／min
（４）反応液    ：１％２−シアノアセトアミドを含む５０mM四ホウ酸ナトリウム
（５）反応液流速：０．５ml／min
（６）反応温度  ：１４７℃
（７）反応コイル：φ０．４mm×１０m
（８）検出      ：電気化学検出, 印加電圧：＋３６０ｍＶ（グラッシカーボン）
【００４２】
２．Ｌ４のＨＰＬＣ条件
（１）カラム    ：Ｎ（ＣＨ3)2 結合シリカゲル、φ８mm×１５cm（商品名：Senshu Pak.,（株）センシュー科学）
（２）溶出      ：１２mM  Ｎａ2 ＳＯ4 ／10% アセトニトリル
（３）流速      ：０．６５ml／min
（４）反応液    ：１％２−シアノアセトアミドを含む５０mM四ホウ酸ナトリウム
（５）反応液流速：０．５ml／min
（６）反応温度  ：１４７℃
（７）反応コイル：φ０．４mm×１０m
（８）検出      ：電気化学検出, 印加電圧：＋３６０ｍＶ（グラッシカーボン
Ｌ２についての結果を第１図に、Ｌ４についての結果を第２図に示す。
【００４３】
この結果から、股ＯＡの病期進行の程度が高いほど、酵素処理した関節液中のＬ２濃度が有意に減少することが示された。これに対し、酵素処理した関節液中のＬ４濃度と股ＯＡの病期との間には有意な相関は認められなかった。
【００４４】
この結果から、酵素処理した関節液中のＬ２濃度を測定することにより、関節疾患の病期の進行程度の検出が可能であることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明検出方法を用いることにより、変形性関節症の病期の進行程度を、放射線被曝の危険性を回避して、客観的かつ定量的に検出することができる。また、この本発明検出方法は、本発明検出用キットにより、簡便に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素処理した関節液におけるＬ２の濃度と、変形性股関節症の病期の関係を示す図面である。
【図２】酵素処理した関節液におけるＬ４の濃度と、変形性股関節症の病期の関係を示す図面である。
【図１】
0004344436.tif 000002
【図２】
0004344436.tif 000003