(57)【要約】  本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの、当該状態の治療又は予防のための方法であって、当該異常な皮膚状態の治療処置のための組換えポリペプチドを産生する少なくとも１つの操作された株を含む細菌の生きた培養物を含有する細胞培養組成物を投与することを含む、方法に関する。本発明はまた、異常な皮膚状態を治療し又は予防するために、有効成分として、非ワクチン性の（ｎｏｎ−ｖａｃｃｉｎｏｇｅｎｉｃ）薬理学的に活性な組換え治療用ポリペプチドを発現する操作された微生物を含有する医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防方法であって、以下、当該ヒトに、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、又はオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物を投与することを含み、ここで、当該細胞培養組成物が異常な皮膚状態を治療し又は予防するための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、方法。
【請求項２】
前記組成物が、細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の操作された株を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養組成物が生細胞培養組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記皮膚状態が、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、湿疹、脂漏性皮膚炎、乾燥皮膚、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚（ＵＶ−ｉｒｒｉｔａｔｅｄ  ｓｋｉｎ）、洗剤かぶれを起こした皮膚（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｉｒｒｉｔａｔｅｄ  ｓｋｉｎ）、皮膚の菲薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ｓｋｉｎ）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚状態が湿疹である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記湿疹が軽度の湿疹である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記湿疹が中等度の湿疹である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記湿疹が重度の湿疹である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記湿疹が手湿疹である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防方法であって、以下、当該ヒトに、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物を投与することを含み、ここで、当該細胞培養組成物が、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、方法。
【請求項１２】
前記細胞培養組成物が表皮ブドウ球菌を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養組成物が生きた培養組成物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が配列番号１を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約７５％の相同性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８５％の相同性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９０％の相同性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮膚状態が、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症、脂漏性皮膚炎、乾燥皮膚、湿疹、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚、洗剤かぶれを起こした皮膚、皮膚の菲薄化、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記皮膚状態が湿疹である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防用の医薬組成物であって、以下、（ａ）ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物であって、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する細胞培養組成物、ならびに、（ｂ）薬学的に許容される担体、を含有する、医薬組成物。
【請求項２４】
細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
表皮ブドウ球菌の操作された株を含有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞培養組成物が生細胞培養組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
０％の水から約９０％以下の水を含有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記薬学的に許容される担体が、水溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル又は軟膏から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防用の医薬組成物であって、以下、（Ｉ）ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物であって、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための、（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチドを含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、細胞培養組成物、ならびに、（ＩＩ）薬学的に許容される担体、を含有する、医薬組成物。
【請求項３０】
細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記細胞培養組成物が表皮ブドウ球菌を含有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記細胞培養組成物が生細胞培養組成物である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が配列番号１を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約７５％の相同性を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８５％の相同性を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９０％の相同性を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
０％の水から約９０％以下の水を含有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記薬学的に許容される担体が、水溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル又は軟膏から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項４２】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防用の医薬の製造のための細胞培養組成物の使用であって、当該細胞培養組成物が、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有し、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、使用。
【請求項４３】
異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とするヒトの当該状態の治療又は予防用の医薬の製造のための細胞培養組成物の使用であって、当該細胞培養組成物が、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有し、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチドを含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，５５８号及び２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，６５２号の優先権を主張し、その各々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、合成生物学、微生物学、タンパク質化学、スキンケア、細胞外タンパク質輸送、細胞内輸送、ならびに皮膚疾患の治療及び予防の分野に関する。より具体的には、本発明は、皮膚疾患の治療処置及び予防のための組換えポリペプチドを産生する片利共生皮膚細菌の操作された株を用いる、特に組換えフィラグリンを産生する表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の操作された株を用いる、方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
組換えＤＮＡ技術を使用して生成される化合物の出現は、動物、特にヒトの多種多様な疾患状態を治療する可能性を有する無数の治療剤の開発を容易にした。これらの薬剤は事実上、主にタンパク質である。
【０００４】
表皮、皮膚の扁平重層上皮は、複数の副層から成り、そして外界に対する体の最も重要なバリアの一つである。角質層は表皮の最外層であり、有核表皮層の細胞からのケラチノサイト分化における最終無核化ステップの結果として生じる。角質層は最も重要な物理的バリアとして認識されるが、有核表皮層もバリア機能に重要である（Ｐｒｏｋｓｃｈ、Ｂｒａｎｄｎｅｒら、２００８）。ともに、皮膚バリアは、一方向の広範な水分喪失から（内外（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔｓｉｄｅ）バリア）、及び、環境からの有害物質の侵入から保護する（外内（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎｓｉｄｅ）バリア）（Ｐｒｏｋｓｃｈ、Ｂｒａｎｄｎｅｒら、２００８）。バリアの維持は基底層の平衡増殖及びカルシウムイオン勾配の保持、ひいては適切な表皮分化にも重要である（Ｌｅｅ、Ｊｅｏｎｇら、２００６）。
【０００５】
最近の研究は、皮膚片利共生微生物が健康な皮膚を維持し、皮膚バリアを維持するために不可欠であるということを示差する。片利共生微生物はそれらの対象、例えばヒトの宿主に有益なものである。研究は、特定の皮膚疾患（例えば尋常性座瘡及びアトピー性皮膚炎）が正常な細菌叢の乱れと関連付けることができることも示唆する（Ｌｉｎ、Ｗａｎｇら、２００７）。それゆえ、皮膚の細菌叢が、健康を増進し又は疾患を抑制するために特定の皮膚片利共生生物を用いて調節され得るという考えはいくらかの注目を集めている（Ｍｕｉｚｚｕｄｄｉｎ、Ｍａｈｅｒら、２０１２）。多くの皮膚片利共生細菌は病原性であると考えられていないため、それらが治療価値を有する場合、これらの細菌は局所的に使用することができる可能性がある（Ｎａｋａｔｓｕｊｉ及びＧａｌｌｏ  ２０１４）。これまでのところ、本分野における限られた量の研究は、従来のプロバイオティック細菌が皮膚に使用される場合に大きな価値があり得ることを示唆する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）溶解物の局所適用は「反応性皮膚（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｋｉｎ）」の臨床的改善を誘導することが示されている（Ｇｕｅｎｉｃｈｅ、Ｂａｓｔｉｅｎら、２０１０）。これは、気温などの物理的変化及び局所適用製品に見られるような化学的変化に対してより敏感な皮膚である（Ｇｕｅｎｉｃｈｅ、Ｂａｓｔｉｅｎら、２０１０）。ボランティアの皮膚へのＢ．ロンガム溶解物の適用は、テープストリッピング後に感受性を減少させ、かつ経表皮水分喪失量（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｗａｔｅｒ  ｌｏｓｓ）（ＴＥＷＬ）を減少させることを示した。さらに、エクス・ビボの（ｅｘ  ｖｉｖｏ）皮膚への当該溶解物の適用は炎症の兆候、例えば血管拡張、浮腫及びＴＮＦ−α放出を減少させることを示した（Ｇｕｅｎｉｃｈｅ、Ｂａｓｔｉｅｎら、２０１０、Ｎａｋａｔｓｕｊｉ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ  ２０１４、Ｖｏｌｚ、Ｓｋａｂｙｔｓｋａら、２０１４）。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の局所適用はまた、火傷マウスモデルの組織修復を改善し、ヒトの慢性下腿潰瘍及び火傷における感染を予防することを実証した（Ｐｅｒａｌ、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００９、Ｐｅｒａｌ、Ｒａｃｈｉｄら、２０１０、Ｂｒａｃｈｋｏｖａ、Ｍａｒｑｕｅｓら、２０１１）。
【０００６】
しかしながら、皮膚の治療には現在多くの制限が存在する。多くの治療、例えば局所コルチコステロイド又は高価な生物製剤は、表皮における不足した内在性タンパク質、又は皮膚における微生物多様性の不均衡の根本的な問題を処理しない。組換えタンパク質は皮膚疾患の治療における治療剤の有望なグループを代表するが、いくつかの問題が文脈においてそれらの使用に付随する。従来の方法は、細菌系から抽出され、精製され、濃縮され、そして送達系に取り込まれる、組換えタンパク質の精製の使用を採用する。組換えタンパク質の精製は多くの場合、タンパク質を得るための非常に高価な方法である。さらに、タンパク質分解、非効率的な送達、及び治療効果を達成するための規定外の反復適用の必要性を含む、多くの問題がこれに付随する。
【０００７】
本発明者らの方法は対照的に、細菌を皮膚でコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）させ、そして皮膚に有益な治療用ポリペプチドを持続的に分泌させることによって、これらの問題に対処する。このアプローチは、治療用タンパク質に適した送達系を作成することによって複数の局所適用の必要性を低減する。
【０００８】
組換えタンパク質の生産のために現在までに使用されている微生物の大半は、生理学的フローラの通常の構成要素ではないか、任意の病原性リスクを欠いているので、ヒト及び動物に安全に投与することができない。このことは特に、多くの場合に病原性とみなされる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に当てはまる。しかしながら、ここで、本発明者らは、ヒト及び動物に安全に投与することができる微生物、特に表皮ブドウ球菌を用いる組換えタンパク質の生産方法を説明する。
【０００９】
組換えタンパク質の生産に既に使用されている他の種も、それらが非病原性及びヒト又は動物の粘膜にコロニー形成する能力の必要条件を満たすならば、使用することができる。例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、その認識された有利な特性の観点から、多くの真核生物のタンパク質を生産するためにクローニングベクターとして幅広く使用されている（Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ  １９９３）。それゆえ、本発明は、微生物を適切に選択し適応させることによって、ポリペプチドを発現させ、そして、実験室又は産業環境での生産にこれまで使用された発現ベクターを特定の皮膚疾患に対応させる（図１参照）。それゆえ、本発明は、前記操作された微生物の治療的使用、及びそれを含有する組成物に関し、それによってヒトの皮膚状態を治療するための薬物の治療的送達の分野における長年の要望を満たす。
【００１０】
湿疹としても知られているアトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、通常、皮膚の最も外側の部分を含む保護層である皮膚の角質層に欠陥を伴う、慢性炎症性皮膚疾患である。この欠陥は遺伝的、環境的及び免疫学的要因の集合によって引き起こされ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の過繁殖と関連する。ＡＤの遺伝的基盤は、ＡＤ患者の約５０％にみられるフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）の欠陥を含むようである（ＭｃＡｌｅｅｒ  ２０１３）。アトピー性皮膚炎の罹患率は増加しており、全世界の人口の０．１〜１％、先進国ではより高い割合で影響を与えている。ＡＤは小児でより一般的であり、２０％もの子供に影響を与える（ＭｃＡｌｅｅｒ  ２０１３）。これらの子供のうち、２５％は回復せず、成人期までアトピー性皮膚炎を患い続ける。多くの場合、ＡＤは「アトピックマーチ（ａｔｏｐｉｃ  ｍａｒｃｈ）」として知られるプロセスによって、喘息を含むより重度のアレルギー症状をもたらし得る。
【００１１】
ＡＤの病因は完全には解明されていないが、フィラグリン発現の欠陥はアトピー性皮膚炎の大部分の症例に起因し、その病因は免疫応答に関連している。ＡＤは、乾燥皮膚、平均的な人よりもかゆみを起こしやすい皮膚、細菌、ウイルス、真菌などにより引き起こされる感染、ならびに感情的及び環境的要因の組み合わせによって引き起こされ得ることが示されている。フィラグリンは１ｑ２１表皮分化複合体上のＦＬＧ遺伝子によってコードされている。フィラグリンはケラチノサイトを分化させることによって産生されるタンパク質であり、そして、ケラチンフィラメントを、他の成分と組み合わせて周辺帯（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を含む細胞骨格へと凝集させる役割を果たす（Ｂｒｏｗｎ  ＆  ＭｃＬｅａｎ  ２０１２）。フィラグリン機能喪失突然変異（Ｒ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４）は、最も一般的な角化の遺伝性疾患である尋常性魚鱗癬を引き起こす。同様の変異は、ＡＤ、刺激性接触皮膚炎、喘息、及び食物アレルギーを含む、他の皮膚及びアレルギー状態にも関連する。いくつかの研究は、皮膚でのフィラグリンの増加がＡＤ表現型を緩和するのを助けることを示している（例えばＳｔｏｕｔら、２０１４、Ｏｔｓｕｋａら、２０１４）。
【００１２】
現在、ＡＤの主な治療には局所コルチコステロイド及び抗生物質が挙げられ、そのいずれもＡＤのより重症な症例では限られた有効性を有する。抗生物質の主な欠点には抗生物質耐性及びマイクロバイオーム生態系の調節異常の問題が挙げられる。マイクロバイオームは特定の環境に存在する微生物の集合体である。本明細書で言及されるマイクロバイオームは、最大のヒトの器官である皮膚に存在する微生物の全体である。局所コルチコステロイドは、軽度のＡＤ患者に症状からの猶予を与えるが、慢性又は重度の疾患を有する患者の要望には対応していない。ＡＤ治療のためのいくつかの標的療法が開発中であるが、この市場における競争状況は、効果的なＡＤのための標的療法に対する大いに満たされていない必要性を特徴とする。１つの生物学的療法であるデュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）は、リジェネロン・ファーマシューティカルズ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びサノフィ（Ｓａｎｏｆｉ）によって開発されている、ＡＤのための第ＩＩ相臨床試験中の抗ＩＬ４／１３受容体モノクローナル抗体である。この薬物は有望な有効性を示しており、今後５年以内に上市されることが期待される。ＡＤの免疫調節のための他の類似の生物学的製剤が開発中である。しかしながら、これらの薬物は高い生産及びＲ＆Ｄコストのために消費者に数万ドルの費用がかかることが予想され、保険会社は必ずしもそれらの費用をカバーしない可能性がある。これらの薬物は免疫応答を減衰させるが、それらは皮膚バリアの再構築、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を予防するための微生物生態系の正常化に直接影響を及ぼさない。したがって、望ましくない副作用を最小限に抑えながら、ＡＤのような異常な皮膚状態の有効な治療及び予防のための新たな組成物及び方法が必要とされる。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
本発明は、皮膚状態を治療するために、有効成分として、非ワクチン性の（ｎｏｎ−ｖａｃｃｉｎｏｇｅｎｉｃ）、薬理学的に活性な組換え治療用ポリペプチド（すなわちタンパク質、ペプチド、又はアミノ酸）を発現する操作された微生物を含有する、医薬組成物に言及する。このような非ワクチン性のポリペプチドは、ワクチンに用いられるものとは対照的に、一般的に免疫応答を誘発せず、なおかつ治療上有効なものである。
【００１４】
本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防方法であって、以下、当該患者に、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、又はオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物を投与することを含み、ここで、当該組成物が異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、方法に関する。
【００１５】
一態様では、本発明は、該組成物が操作された細菌株を作成するために細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、方法に関する。
【００１６】
別の態様では本発明は、該組成物が表皮ブドウ球菌の操作された株を含有する、方法に関する。
【００１７】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が生細胞培養組成物である、方法に関する。
【００１８】
別の態様では本発明は、該皮膚状態が、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥皮膚、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚（ＵＶ−ｉｒｒｉｔａｔｅｄ  ｓｋｉｎ）、洗剤かぶれを起こした皮膚（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｉｒｒｉｔａｔｅｄ  ｓｋｉｎ）（洗剤に使用される酵素及び分子ならびにラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む）、皮膚の菲薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ｓｋｉｎ）（例えば高齢者及び子供の皮膚）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症から選択される、方法に関する。
【００１９】
別の態様では本発明は、該皮膚状態が湿疹である、方法に関する。
【００２０】
別の態様では本発明は、該湿疹が軽度の湿疹である、方法に関する。
【００２１】
別の態様では本発明は、該湿疹が中等度の湿疹である、方法に関する。
【００２２】
別の態様では本発明は、該湿疹が重度の湿疹である、方法に関する。
【００２３】
別の態様では本発明は、該皮膚状態が手湿疹である、方法に関する。
【００２４】
別の態様では本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防方法であって、当該患者に、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物を投与することを含み、ここで、当該細胞培養組成物が、異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、方法に関する。
【００２５】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が表皮ブドウ球菌を含有する、方法に関する。
【００２６】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が生きた培養組成物である、方法に関する。
【００２７】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む、方法に関する。
【００２８】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が配列番号１を含む、方法に関する。
【００２９】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約７５％の相同性を有する、方法に関する。
【００３０】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８０％の相同性を有する、方法に関する。
【００３１】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８５％の相同性を有する、方法に関する。
【００３２】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９０％の相同性を有する、方法に関する。
【００３３】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有する、方法に関する。
【００３４】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７から選択される配列と、少なくとも約７５％の相同性、又は８０％の相同性、又は８５％の相同性、又は９０％の相同性、又は９５％の相同性を有する、方法に関する。
【００３５】
別の態様では本発明は、該皮膚状態が、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥皮膚、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚、洗剤かぶれを起こした皮膚（洗剤に使用される酵素及び分子ならびにラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む）、皮膚の菲薄化（例えば高齢者及び子供の皮膚）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症から選択される、方法に関する。
【００３６】
別の態様では本発明は、該皮膚状態が湿疹である、方法に関する。
【００３７】
別の態様では本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防用の医薬組成物であって、以下、（ａ）ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物であって、異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する細胞培養組成物、ならびに、（ｂ）薬学的に許容される担体、を含有する、医薬組成物に関する。
【００３８】
別の態様では本発明は、該組成物が、細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、医薬組成物に関する。
【００３９】
別の態様では本発明は、該組成物が表皮ブドウ球菌の操作された株を含有する、医薬組成物に関する。
【００４０】
別の態様では本発明は、該組成物が生細胞培養組成物を含有する、医薬組成物に関する。
【００４１】
別の態様では本発明は、該組成物が、０％の水から約９０％以下の水を含有する、医薬組成物に関する。
【００４２】
別の態様では本発明は、水溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル又は軟膏から選択される薬学的に許容される担体に関する。
【００４３】
別の態様では本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防用の医薬組成物であって、以下、（Ｉ）ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細菌株を含有する細胞培養組成物であって、異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチドを含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、細胞培養組成物、ならびに、（ＩＩ）薬学的に許容される担体、を含有する、医薬組成物に関する。
【００４４】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が、細菌ＤＮＡで組み換えられたヒト標的ＤＮＡを含む細菌株を含有する、医薬組成物に関する。
【００４５】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が表皮ブドウ球菌を含有する、医薬組成物に関する。
【００４６】
別の態様では本発明は、該細胞培養組成物が生細胞培養組成物である、医薬組成物に関する。
【００４７】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む、医薬組成物に関する。
【００４８】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が配列番号１を含む、医薬組成物に関する。
【００４９】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約７５％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５０】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８０％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５１】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約８５％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５２】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９０％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５３】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５４】
別の態様では本発明は、該フィラグリンのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７から選択される配列と、少なくとも約７５％の相同性、又は８０％の相同性、又は８５％の相同性、又は９０％の相同性、又は９５％の相同性を有する、医薬組成物に関する。
【００５５】
別の態様では本発明は、該組成物が、０％の水から約９０％以下の水を含有する、医薬組成物に関する。
【００５６】
別の態様では本発明は、該薬学的に許容される担体が水溶液、エマルジョン、クリーム、ローション、ゲル又は軟膏である、医薬組成物に関する。
【００５７】
別の態様では本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防用の医薬の製造のための細胞培養組成物の使用であって、当該細胞培養組成物が、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細胞株を含有し、異常な皮膚状態を治療し又は予防するための組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、使用に関する。
【００５８】
別の態様では本発明は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする患者（ヒト又は動物の対象）の当該状態の治療又は予防用の医薬の製造のための細胞培養組成物の使用であって、当該細胞培養組成物が、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカス、及びそれらの混合物から選択される細胞株を含有し、異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための（ａ）フィラグリンのアミノ酸配列、（ｂ）分泌シグナル、及び（ｃ）細胞膜透過性ペプチドを含む組換えポリペプチドの治療上有効量を産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含有する、使用に関する。
【００５９】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は特に断らない限り以下の意味を有する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「異常な皮膚状態」は、一般的にヒトの皮膚の正常又は基本状態と比較して望ましくない又は有害である皮膚の状態（ｓｔａｔｅ）又は状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を指す。異常な皮膚状態の例には、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥皮膚、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚、洗剤かぶれを起こした皮膚（洗剤に使用される酵素及び分子ならびにラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む）、皮膚の菲薄化（例えば高齢者及び子供の皮膚）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「患者」又は「対象」は、本発明の治療及び組成物に供されるであろうヒト又は動物（動物の場合、より典型的には家畜哺乳動物などの哺乳動物、又は家禽動物などの動物ならびに魚及び他の魚介類又は淡水食生物（ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ｆｏｏｄ  ｃｒｅａｔｕｒｅｓ））、を指す。このような患者又は対象は、本発明の医薬組成物、あるいは、異常な皮膚状態を治療し、予防し、又はそのリスクを低減する方法の必要があると考えられるであろう。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効量」は、薬学的に活性な化合物、又は化合物の組み合わせの量、あるいは、病態又は病状、例えば異常な皮膚状態を治療し、予防し、又はそのリスクを低減するために、単独又は組み合わせて投与される場合に、操作された細菌株又は株（複数）によってもたらされる薬学的に活性な化合物、例えば皮膚治療剤又は剤（複数）、の量を指す。当該用語は、活性化合物又は化合物の組み合わせを含有する医薬組成物、あるいは薬学的に活性な化合物をもたらす操作された細菌株又は株（複数）の量も指す。例えば、有効量は、化合物の量、あるいは、生物学的活性、例えば異常な皮膚状態治療し又は予防するための活性を誘発するのに十分な、レシピエント患者又は対象に与えられる製剤中に存在する操作された細菌株又は株（複数）によってもたらされた化合物の量を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、語句「薬学的に許容される」は、それらの活性化合物、材料、操作された細菌株又は株（複数）、組成物、担体、及び／又は剤形を指し、それは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題又は合併症なしに、人間及び動物の組織に接触した使用に適している。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、異常な皮膚状態を治癒し又は改善する治療的介入を提供することを指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」は、例えば患者又は対象が異常な皮膚状態になりやすい、又は異常な皮膚状態にかかるリスクがある場合に、異常な皮膚状態が生じるのを完全に又はほぼ完全に阻止することを指す。予防することは、抑制、すなわち異常な皮膚状態の発症を阻止することも含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「のリスクを低減する」は、例えば患者又は対象が異常な皮膚状態になりやすい、又は異常な皮膚状態にかかるリスクがある場合に、異常な皮膚状態の発生の可能性又は確率を低下させることを意味する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「操作された細菌株」は、生体外で調製されたＤＮＡの細菌株への導入によって「遺伝子的に改変された」又は「操作された」細菌の株を指す。例えば、新しい遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの細菌への導入は、細菌にそれらの遺伝子を発現させるであろう。あるいは、新しい遺伝子を含むＤＮＡを細菌に導入し、その後、細菌がそれらの遺伝子を発現することになる細菌のゲノムに組み込むことができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「担体」、「担体系」又は「ビヒクル」は、患者又は対象に局所的に適用される組成物で投与するための薬学的に活性な成分又はその他の物質を送達し、含み、又は「担持する」のに適している相溶性のある物質を指す。本明細書中で有用な担体は薬学的に許容されるべきである。本明細書中で有用な担体及びビヒクルは、非毒性であり、かつ有害な方法で含まれている製剤の他の成分と相互作用しない、当該技術分野で知られている任意のそのような材料を含む。用語「水性」は、水を含有する製剤、あるいは皮膚又は粘膜組織への適用後に水を含有するようになる製剤を指す。「担体」のさらなる例には、水、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、単糖、二糖、多糖、炭化水素油、油脂、ワックス、脂肪酸、シリコーン油、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、ならびにそのような担体の水ベースの混合物及びエマルジョンベースの混合物が挙げられる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、鎖中に一緒に結合しているアミノ酸残基から成る生体分子又は巨大分子を指す。本明細書で用いられるポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の１又は複数の長鎖から成るタンパク質（一般に高分子量）、及び数個のアミノ酸の小ペプチド（一般に低分子量）を包含することを意図する。他の実施形態では、技術的にはポリペプチドではないが、単一アミノ酸も本発明の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、異常な皮膚状態の治療処置又は予防のための組換えポリペプチドを産生する操作された細菌株の作成を示す、本発明のフローチャートを示す。
【図２】図２は、プラスミド及びシャトルベクターｐＢＴ−２のベクター設計を示す。ベクターｐＢＴ−２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのクローニング及びスタフィロコッカスでの発現に使用できる代替シャトルベクターの例示である。
【図３】図３は、図４に記載のＦＬＧ（フィラグリン）遺伝子インサートを含むシャトルベクターｐＢＴ−２の改変版のベクター設計を示す。このコンストラクトは表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）でのフィラグリン発現のための代替コンストラクトの例示であり、ｐＡＺＴ−０１として以前に記載されている。
【図４】図４は、先に図２で示されたプラスミドｐＢＴ−２にクローニングしたＦＬＧ遺伝子インサートの詳細地図であり、スタフィロコッカスでの発現のために様々なベクターにクローニングすることができる。このインサートは、キシロースリプレッサー（ｘｙｌＲ）、キシロースオペレーター（ｘｙｌＯ）、シス作用性カタボライト応答エレメント（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＲＥ）を含むキシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）、Ｓｅｃ（分泌経路）輸出シグナル、フィラグリン（ＦＬＧ）をコードする遺伝子、及び細胞膜透過性ペプチドを含む。
【図５】図５は、プラスミドｐＪＢ３８のベクター設計（Ｃｈｅｕｎｇ，ＡＬ．ら（２００４））を示す。制限部位はベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に組み込まれる。ベクターのＭＣＳには、キシロース誘導性プロモーター、リボソーム結合部位、輸出シグナル（例えばＳｅｃＡ輸出シグナル）、フィラグリンモノマーに隣接する部分的ＦＬＧ（フィラグリン）リピート、及び細胞浸透シグナルを有するフィラグリン発現ベクターが挿入される。ｐＡＺＴ−０１のインサートはバイオ・ベーシック・インク（Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．）（マーカム、ＯＮ、カナダ）によって構築され、ｐＪＢ３８にクローニングされた。
【図６】図６は、蛍光顕微鏡検査により確認された、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現プラットフォームを含むｐＣＭ１１を用いた表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８の形質転換を示す。プラスミドｐＣＭ１１（ＧＦＰ発現プラットフォームを含む）をヒートショック法を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換するために使用した。次いで大腸菌ＤＨ５αから単離したプラスミドｐＣＭ１１をエレクトロポレーションを用いて大腸菌ＤＣ１０Ｂの形質転換に使用した。次いでプラスミドｐＣＭ１１を大腸菌ＤＣ１０Ｂから単離し、エレクトロポレーションを用いて表皮ブドウ球菌を形質転換するために使用した。対照として、図６Ａは表皮ブドウ球菌の固有の蛍光を示し、その株がＧＦＰ発現プラスミドでの形質転換前にそれ自体で固有の蛍光を最小限有するか全く有さないことを確認する。図６Ｂでは、表皮ブドウ球菌は、ＧＦＰインサートを含むｐＣＭ１１で形質転換され、蛍光によって示されたように次に発現される。これらの画像はＧＦＰ蛍光によって示されるように、表皮ブドウ球菌の形質転換及び当該株内でのｐＣＭ１１の発現を確認する。
【図７】図７は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）インサートを含むｐＣＭ１１で形質転換された表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を示し、これを次にマウスの背部皮膚に３日間適用した。次いで、皮膚の切片を死後、光学顕微鏡検査のために採取した（図７Ａ及び７Ｂ）。ここに示された切片をマラカイトグリーン染色を用いて染色し、２００ｘ（図７Ａ）及びさらなる拡大（図７Ｂ）で視覚化した。本図は３日後のマウス皮膚上での表皮ブドウ球菌のコロニー形成を示す。（Ｓｔａｐｈ  ｅｐｉは、表皮ブドウ球菌を指す）。
【図８】図８は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）インサートを含むｐＣＭ１１で形質転換された表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を示し、これを次にマウスの背部皮膚に３日間適用した。次いで皮膚の切片を死後、光学顕微鏡検査のために採取した（図８Ａ及び８Ｂ）。図８ＡはＧＦＰの蛍光を示し、表皮ブドウ球菌が３日後に皮膚にコロニー形成することだけでなく、ＧＦＰの発現がその時点で維持されることを示す。図８ＡはＧＦＰからの蛍光を示し、図８ＢはＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と抗ＧＦＰモノクローナル抗体との両方で染色した皮膚の切片を示す。図８Ｃは二光子顕微鏡法を用いて可視化した皮膚の切片を示し、蛍光によって示されたように表皮ブドウ球菌のコロニー形成及びＧＦＰ発現の程度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、皮膚疾患の治療又は予防のための組換え治療用ポリペプチドを発現するように遺伝子組換えが行われている皮膚コロニー形成細菌を提供する（図１）。遺伝子操作されたタンパク質産生細菌を使用することは、皮膚疾患を治療する先行技術の方法よりもいくつかの利点を有する。治療用タンパク質は皮膚状態に結びつく欠陥の根本的な原因を治療することができる。さらに、細菌は治療用タンパク質を持続的に産生するために挿入された遺伝子を保持しながら、自己複製することができる。
【００７２】
本発明は皮膚コロニー形成細菌、例えばヒトフィラグリンを発現するように遺伝子組換えが行われている表皮ブドウ球菌などを提供する。遺伝子操作されたフィラグリン産生細菌を使用することは、フィラグリンの補充を用いるよりもいくつかの利点を有する。第１に、細菌は挿入されたフィラグリン遺伝子を保持しながら自己複製することができる。第２に、表皮ブドウ球菌は皮膚に常在し、ＡＤフレアにおける皮膚フローラを支配する同じジャンルの細菌種である黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することが示されている。
【００７３】
１．細菌株
細胞培養組成物
広い範囲の細菌が本発明での使用に適している。例としては、非病原性及び片利共生細菌が挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適している細菌には、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス（例えば、表皮ブドウ球菌）、ラクトバチルス（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、ペディオコッカス、ロイコノストック、又はオエノコッカスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
特定の実施形態は細菌の表皮ブドウ球菌の使用を含む。使用されることになる表皮ブドウ球菌の株はバイオフィルムを生成することができない。この例は表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ１２２２８である。
【００７５】
しかしながら、皮膚に見られる他の関連又は類似の種を使用することもできる。
【００７６】
２．フィラグリン及びフィラグリン遺伝子
本発明の実施形態で選択された有用な遺伝子はフィラグリン（ＦＬＧ）をコードする哺乳動物遺伝子である。フィラグリンはケラチノサイトを分化させることによって産生されるタンパク質であり、そして、ケラチンフィラメントを他の成分と組み合わせて周辺帯を含む細胞骨格へと凝集させる役割を果たす。ＦＬＧは染色体１ｑ２１上に位置する大きな遺伝子であり、タンパク質分解されて機能性フィラグリンモノマーを放出する不要性ポリタンパク質であるプロフィラグリンを産生する（Ａｒｍｅｎｇｏｔ−Ｃａｒｂｏら、２０１４）。本発明のための遺伝子は任意の哺乳動物由来のものとすることができる。非限定的な例としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、イヌ、霊長類、またはヒト遺伝子配列が挙げられる。好ましい実施形態では、当該遺伝子配列はヒト遺伝子配列である。フィラグリンタンパク質の非限定的な例は表１に記載され、その配列はさらに対応する配列表に記載される。
【００７７】
【表１】
2017518370.tif 000002
【００７８】
３．分泌シグナル
分泌シグナル又は輸出シグナルは、タンパク質が分泌経路に向かうことになっており、そのため細胞から分泌されることを示す、タンパク質上のペプチドである。細菌細胞の外にタンパク質、例えばフィラグリン分子の排出を促進する任意の分泌シグナルは、分泌シグナルとして考えられる。分泌シグナルの非限定的な例を表２に記載する。
【００７９】
【表２】
2017518370.tif 000003
【００８０】
４．細胞膜透過性ペプチド
細胞膜透過性ペプチドは、受容体を使用することなく、そして著しい膜の損傷を引き起こすことなく、イン・ビボでのカーゴ（ｃａｒｇｏ）の輸送を媒介するために使用することができる。皮膚ケラチノサイトへの侵入を促進する細胞膜透過性ペプチドは本発明の細胞膜透過性ペプチドとして考えられる。非限定的な例を表３に記載する。
【００８１】
【表３】
2017518370.tif 000004
【００８２】
５．遺伝子コンストラクト
本発明は標準的な分子生物学技術、例えば（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）に記載されるものを利用する。本発明に使用される遺伝子コンストラクトの例は、プラスミドベクターｐＢＴ−２（図２）、大腸菌とブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）種との間の対立遺伝子交換シャトルベクターに基づく（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｏｓｈｉｄａら、１９８６）。図３のプラスミドは、治療用タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡをｐＢＴ−２のＭＣＳの制限部位に挿入することによって構築される。インサートはプロモーターによって駆動されるコーディング配列を含む。このようなプロモーターは構成的又は誘導性のいずれかとすることができる。誘導性プロモーターの例としては、化学化合物、例えばアルコール、糖類、金属、又はテトラサイクリンによって、あるいは物理的要因、例えば光又は高温によって活性化されるものが挙げられる。
【００８３】
遺伝子コンストラクトはプラスミドベクターｐＪＢ３８、大腸菌とブドウ球菌種との間の対立遺伝子交換シャトルベクターに基づくことができる。（Ｃｈｅｕｎｇ  ＡＬら、２００４）参照。ヒトＦＬＧのｍＲＮＡ配列はジーンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２０１６を有し、上記配列番号１として再現される。プラスミドｐＡＺＴ−０１（図５）は、ＦＬＧのｃＤＮＡの一部をｐＪＢ３８の制限部位に挿入することによって構築することができる。インサートは構成的キシロースプロモーターによって駆動されるコーディング配列を含む。当該コンストラクトは分泌シグナル及び細胞膜透過性ペプチドもコードし、したがってフィラグリン融合タンパク質をもたらす。
【００８４】
６．組換え細菌株の使用
治療されることになる障害は、皮膚に関連する任意の障害で有り得ることが理解されるであろう。好ましい実施形態では、障害は、乾癬、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角化症、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾燥皮膚、アレルギー、発疹、ＵＶ炎症を起こした皮膚、洗剤かぶれを起こした皮膚（洗剤に使用される酵素及び化合物ならびにラウリル硫酸ナトリウムによって引き起こされる刺激を含む）、皮膚の菲薄化（例えば高齢者及び子供の皮膚）、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、膿痂疹、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｉｏ）、脱毛症、及び多毛症を含む群から選択される。
【００８５】
本発明に従って投与することができるタンパク質の例は主に真核生物のタンパク質である。これらは単一のアミノ酸、小ペプチド、及び大きなタンパク質を含むことができるが、これらに限定されない。より具体的には、組換え治療用タンパク質として本発明において有用なタンパク質をコードする遺伝子には、以下の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４及びＩＬ−１５を含むが、これらに限定されない遺伝子のインターロイキンファミリーのメンバー、ならびにそれらの受容体アンタゴニストをコードする遺伝子。エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、白血病抑制因子及びトロンボポエチンを含むがこれらに限定されない、造血成長因子をコードする遺伝子も本発明において企図される。向神経性因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）をコードする遺伝子も企図され、神経成長因子、脳由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子を含むがこれらに限定されない。加えて、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ及びＩＦＮ−ガンマを含むがこれらに限定されない、インターフェロンをコードする遺伝子が含まれる。さらに本発明に企図されるのは、ケモカインをコードする遺伝子、例えばサイトカインのＣ−Ｃファミリー及びＣ−Ｘ−Ｃファミリー、ホルモンをコードする遺伝子、例えばプロインスリン及び成長ホルモン、ならびに、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ又は他の酵素、例えばトリプシンインヒビターを含む、血栓溶解酵素をコードする遺伝子である。本発明は組織修復因子、成長及び調節因子、例えば、これらに限定されないが、オンコスタチンＭ（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎｅ  Ｍ）、血小板由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、骨形態形成タンパク質、インスリン様成長因子、カルシトニン、トランスフォーミング増殖因子アルファ及びベータをコードする遺伝子をさらに含む。さらに企図される遺伝子は、構造タンパク質、例えばフィラグリン、アクチン、コラーゲン、フィブリン、エラスチン又は硬タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００８６】
製剤
本発明に係る使用のための製剤は、治療上有効量の所望のポリペプチドを産生するための任意の薬学的有効量の組換え細菌、例えば、組換え細菌の重量で少なくとも約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、約１０．０％、約１１．０％、約１２．０％、約１３．０％、約１４．０％、約１５．０％、約１６．０％、約１７．０％、約１８．０％、約１９．０％、約２０．０％、約２５．０％、約３０．０％、約３５．０％、約４０．０％、約４５．０％、約５０．０％又はそれ以上を含むことができ、その上限は組換え細菌の約９０．０重量％であることがさらに明らかであろう。
【００８７】
代替の実施形態では、本発明に係る使用のための製剤は、例えば、組換え細菌の重量で少なくとも約０．０１％から約３０％、約０．０１％から約２０％、約０．０１％から約５％、約０．１％から約３０％、約０．１％から約２０％、約０．１％から約１５％、約０．１％から約１０％、約０．１％から約５％、約０．２％から約５％、約０．３％から約５％、約０．４％から約５％、約０．５％から約５％、約１％から約５％、又はそれ以上を含むことができる。
【００８８】
本発明における使用のための局所製剤は、体表面への適用に適した任意の形態、例えばクリーム、ローション、スプレー、溶液、ゲル、軟膏、ペースト、プラスター、ペイント（ｐａｉｎｔ）、生体接着剤、懸濁剤、エマルジョンなどとすることができ、及び／又は、リポソーム、ミセル及び／又はマイクロスフェアを含むように調製することができる。このような製剤は、体表面から蒸発する水分が体表面への適用時及びその後に製剤中に維持されるように、閉塞性被覆層（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｖｅｒｌａｙｅｒ）と組み合わせて使用することができる。当該製剤は生細胞培養組成物を含むことができ、そして組換えポリペプチドを産生する少なくとも１つの操作された細菌株を含むことができる。この操作された生細胞培養組成物は異常な皮膚状態を治療し又は予防するために、皮膚に直接ポリペプチドを送達することができる。
【００８９】
局所製剤は、任意の他の活性成分（複数）が当該技術分野で知られている皮膚科学的ビヒクル（例えば水性又は非水性ゲル、軟膏、油中水型又は水中油型エマルジョン）中に溶解され又は分散されるものを含む。そのようなビヒクルの構成成分は、水、水性緩衝液、非水性溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、ベンジルアルコール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノラウレート、グリコフロール又はグリセロール）、油（例えば鉱物油、例えば流動パラフィン、天然又は合成トリグリセリド、例えばミグリオール（商標）、あるいはシリコーン油、例えばジメチコン）を含むことができる。とりわけ、製剤の性質ならびに意図される使用及び適用の部位に応じて、用いられる皮膚科学的ビヒクルは、以下のリスト：可溶化剤又は溶媒（例えばβ−シクロデキストリン、例えばヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、あるいはアルコール又はポリオール、例えばエタノール、プロピレングリコール又はグリセロール）；増粘剤（例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はカルボマー）；ゲル化剤（例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体）；保存剤（例えばベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン、クロルブトール、安息香酸、ソルビン酸カリウムもしくはＥＤＴＡ又はそれらの塩）；及びｐＨ緩衝剤（複数）（例えば、リン酸二水素塩とリン酸水素塩との混合物、またはクエン酸とリン酸水素塩との混合物）、から選択される１又は複数の成分（例えば、製剤が水性ゲルの場合、水に加えられる成分）を含むことができる。
【００９０】
薬学的に許容される担体も本発明の製剤中に組み込むことができ、当該技術分野で従来使用されている任意の担体とすることができる。その例としては水、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、単糖、二糖、多糖、炭化水素油、油脂、ワックス、脂肪酸、シリコーン油、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、ならびにそのような担体の水ベースの混合物及びエマルジョンベースの混合物が挙げられる。用語「薬学的に許容される」又は「薬学的に許容される担体」は、望ましくない生物学的効果又は製剤の他の成分との不要な相互作用なしに医薬製剤に組み込むことができる化合物又は組成物を意味するために本明細書中で使用される。本明細書で使用される「担体」又は「ビヒクル」は、局所適用される組成物への組み込みに適した担体材料を指す。本明細書において有用な担体及びビヒクルは、非毒性であり、かつ有害な方法で含まれている製剤の他の成分と相互作用しない当該技術分野で知られている任意のそのような材料を含む。用語「水性」は、水を含有する製剤、あるいは皮膚又は粘膜組織への適用後に水を含有するようになる製剤を指す。
【００９１】
フィルム形成剤（ｆｉｌｍ  ｆｏｒｍｅｒ）は、それが乾燥している場合、適用の部位を覆う保護フィルムを形成する。フィルムは活性成分の除去を抑制し、治療されている部位と接触して活性成分を維持する。本発明における使用に適したフィルム形成剤の例は弾性コロジオン（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｃｏｌｌｏｄｉｏｎ）、ＵＳＰである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）、の１５３０ページに記載されるように、コロジオンは、蒸発してピロキシリンのフィルムを残す、ピロキシリン（ニトロセルロース）を含有するエチルエーテル／エタノール溶液である。フィルム形成剤はさらに担体として作用することができる。乾燥してフィルムを形成する溶液はしばしばペイントと呼ばれる。クリームは、医薬製剤の分野でよく知られているように、水中油型又は油中水型いずれかの粘稠液又は半固体エマルジョンである。
【００９２】
クリーム基剤は水洗性であり、そして油相、乳化剤、及び水相を含む。油相は「内部」相とも呼ばれ、一般的にワセリン及び脂肪アルコール、例えばセチル又はステアリルアルコールからなる。水相は通常、必ずではないが、体積で油相を超え、かつ一般的に保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は一般に、非イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性界面活性剤である。
【００９３】
ローションは摩擦なしに皮膚表面に適用される調製物であり、典型的には、活性剤を含む粒子が水又はアルコール基剤中に存在する液体又は半液体調製物である。ローションは通常、固体の懸濁液であり、好ましくは水中油型の液体油性エマルジョンを含む。ローションは、より流動性の組成物を適用する容易さのために、広い体面積を治療するのに本明細書において好ましい製剤である。一般的にローション中の不溶物が微細化されることが必要である。
【００９４】
ローションは典型的に、より良い分散液、ならびに皮膚に接触する活性剤を局在化し及び保持するのに有用な化合物を生成するための懸濁化剤、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを含有することになる。
【００９５】
溶液は、１又は複数の化学物質（溶質）を、溶解される物質の分子が溶媒の分子の中に分散されるような液体中に、溶解することによって調製された均質な混合物である。溶液は、溶質を緩衝し、安定化し又は保存するためのその他の薬学的又は化粧品的に許容される化学物質を含むことができる。溶液の調製に使用される溶媒の一般的な例は、エタノール、水、プロピレングリコール又は任意の他の許容されるビヒクルである。当然よく知られているように、ゲルは半固体の懸濁型系（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｔｙｐｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である。単層ゲルは、典型的に水性である担体液全体に実質的に均質に分散した有機高分子を含むだけでなく、好ましくはアルコール、そして場合により油も含む。好ましい「有機高分子」すなわち、ゲル化剤は、架橋アクリル酸ポリマー、例えばポリマーの「カルボマー」ファミリー、例えば、カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）の商標で商業的に得られるカルボキシポリアルキレンである。親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、及びポリビニルアルコール；セルロース系ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート及びメチルセルロース；ガム、例えばトラガカント及びキサンタンガム；アルギン酸ナトリウム；ならびにゼラチンも好ましい。均質なゲルを調製するために、分散剤、例えばアルコール又はグリセリンを添加することができ、あるいは、ゲル化剤は粉砕、機械的混合もしくは撹拌、又はそれらの組み合わせによって分散され得る。軟膏は、当該技術分野でもよく知られているように、典型的にワセリン又は他の石油誘導体に基づく半固体の調製物である。使用されることになる特定の軟膏基剤は、当業者に認識されるように、多くの望ましい特性、例えば、軟化性（ｅｍｏｌｌｉｅｎｃｙ）などを提供することになるものである。その他の担体又はビヒクルと同様に、軟膏基剤は不活性、安定、非刺激性、及び非感作性でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）、１３９９〜１４０４ページに記載されているように、軟膏基剤は４つのクラス：油脂性基剤；乳化性（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅ）基剤；エマルジョン基剤；及び水溶性基剤に分類することができる。油脂性軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、及び石油から得られる半固体の炭化水素が挙げられる。吸収性軟膏基剤としても知られている乳化性軟膏基剤は、水をほとんど又は全く含まず、そして例えばヒドロキシステアリン硫酸（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、無水ラノリン、及び親水性ワセリンを含む。
【００９６】
エマルジョン軟膏基剤は油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョン又は水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかであり、例えば、アセチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ラノリン、及びステアリン酸を含む。好ましい水溶性軟膏基剤は様々な分子量のポリエチレングリコールから調製される；詳細についてはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙを参照のこと。
【００９７】
ペーストは活性剤が好適な基剤に懸濁される半固体の剤形である。その基剤の性質に応じて、ペーストは脂肪ペースト又は単相水性ゲルから作られたペーストに分けられる。脂肪ペースト中の基剤は一般にワセリン又は親水性ワセリンなどである。単相水性ゲルから作られたぺーストは一般に、カルボキシメチルセルロースなどを基剤として取り入れる。
【００９８】
エンハンサーは、典型的に「可塑化」エンハンサーといわれる親油性コエンハンサー（ｃｏ−ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、すなわち、約１５０から１０００の範囲の分子量、約１重量％未満、好ましくは約０．５重量％未満、及び最も好ましくは約０．２重量％未満の水溶解度を有するエンハンサーである。可塑化エンハンサーのヒルデブランド（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ）溶解度パラメータδは、約２．５から約１０の範囲、好ましくは約５から約１０の範囲である。好ましい親油性エンハンサーは脂肪エステル、脂肪アルコール、及び脂肪エーテルである。特定の最も好ましい脂肪酸エステルの例としては、ラウリン酸メチル、オレイン酸エチル、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールグリセロールジラウレート、グリセロールモノラウレート、グリセロールモノオレエート、イソプロピルｎ−デカノエートおよびオクチルドデシルミリステートが挙げられる。脂肪アルコールには、例えばステアリルアルコール及びオレイルアルコールが挙げられ、脂肪族エーテルはジオール又はトリオール、好ましくはＣ2〜Ｃ4アルカンジオール又はトリオールが１又は２つの脂肪族エーテル置換基で置換されている化合物を含む。
【００９９】
追加の透過エンハンサーは局所薬物送達の分野における当業者に知られることとなり、及び／又は、関連する文書及び文献に記載されている。例えば、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ、編集者Ｓｍｉｔｈら（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１００】
様々なその他の添加剤が上記で定義されたものに加えて本発明の組成物に含まれ得る。これらには、抗酸化剤、収斂剤、香料、保存剤、皮膚軟化剤、顔料、色素、保湿剤、プロペラントおよび日焼け止め剤、並びに、その存在が薬学的に又は他の点で望ましくなり得る他のクラスの物質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の製剤に含めるための任意の添加剤の典型的な例は以下の通りである：保存剤、例えばソルベート；溶媒、例えばイソプロパノール及びプロピレングリコール；収斂剤、例えばメントール及びエタノール；皮膚軟化剤、例えばポリアルキレンメチルグルコシド；保湿剤、例えばグリセリン；乳化剤、例えばグリセロールステアレート、ＰＥＧ−１００ステアレート、ポリグリセリル−３ヒドロキシラウリルエーテル、及びポリソルベート６０；ソルビトール及び他のポリヒドロキシアルコール、例えばポリエチレングリコール；日焼け止め剤、例えばオクチルメトキシルシンナメート（ｏｃｔｙｌ  ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ）（Ｐａｒｓｏｌ  ＭＣＸとして市販されている）及びブチルメトキシベンゾイルメタン（Ｐａｒｓｏｌ  １７８９の商品名で入手可能）；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、ε−トコフェロール、ζ1−トコフェロール、ζ2−トコフェロール、η−トコフェロール、及びレチノール（ビタミンＡ）；精油、セラミド、必須脂肪酸、鉱油、植物油（例えば、大豆油、ヤシ油、シアバターの液体画分、ヒマワリ油）、動物油（例えば、ペルヒドロスクワレン）、合成油、シリコーン油又はワックス（例えば、シクロメチコン及びジメチコン）、フッ素化油（一般にパーフルオロポリエーテル）、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコール）、及びワックス（例えば、蜜蝋、カルナバワックス、及びパラフィンワックス）；皮膚感調整剤（ｓｋｉｎ−ｆｅｅｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）；及び増粘剤及び構造剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｎｔｓ）、例えば膨潤粘土、及びＣａｒｂｏｐｏｌの商標で商業的に入手することができる架橋カルボキシポリアルキレン。その他の添加剤は、有益な薬剤、例えば皮膚（特に、角質層における皮膚の上層）を調整し、その含水量の減少を抑制することによって皮膚を柔軟に保ち、及び／又は、皮膚を保護する物質を含む。このような調整剤及び保湿剤は、例として、ピロリジンカルボン酸及びアミノ酸；有機抗殺菌剤、例えば２，４，４’−トリクロロ−２−ヒドロキシジフェニルエーテル（トリクロサン）及び安息香酸；抗炎症剤、例えばアセチルサリチル酸およびグリシルレチン酸；抗脂漏剤（ａｎｔｉ−ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、例えばレチノイン酸；血管拡張剤、例えばニコチン酸；メラニン生成の阻害剤、例えばコウジ酸；ならびにそれらの混合物が挙げられる。さらなる追加の活性剤には、例えば、アルファヒドロキシ酸、アルファケト酸、高分子ヒドロキシ酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｓ）、モイスチャライザー、コラーゲン、海洋エキス、及び抗酸化剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、β−トコフェロール、γ−トコフェロ���ル、δ−トコフェロール、ε−トコフェロール、ζ1−トコフェロール、ζ2−トコフェロール、η−トコフェロール、及びレチノール（ビタミンＡ）、及び／又は、それらの薬学的に許容される塩、エステル、アミド、もしくは他の誘導体が挙げられる。好ましいトコフェロール化合物はα−トコフェロールである。追加の薬剤は、例えば、いずれもＬａｎｃａｓｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  ＡＧに譲渡された、Ｇｒｏｓｓらの国際公開第９４／０００９８号及びＧｒｏｓｓらの国際公開第９４／００１０９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載された、皮膚組織における酸素供給を改善することができるものを含む。日焼け止め剤及びＵＶ吸収化合物も含めることができる。そのような日焼け止め剤及びＵＶ吸収化合物の非限定的な例には、アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アボベンゾン、シノキセート、ジオキシベンゾン、ホモサレート、アントラニル酸メンチル、オクトクリレン、メトキシ桂皮酸オクチル、オクチルサリチレート、オキシベンゾン、パディメートＯ、フェニルベンズイミダゾールスルホン酸、スリソベンゾン、酸化チタン、トロラミンサリチレート、酸化亜鉛、エンスリゾール、メラジメート（ｍｅｒａｄｉｍａｔｅ）、オクチノキサート、オクチサラートおよびオクトクリレンが挙げられる。「Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ  ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｕｓｅ」パート３５２、サブチャプターＤ、チャプター１、タイトル２１を参照のこと（その全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
他の実施形態は本発明の製剤による治療を促進する様々な非発がん性、非刺激性の治癒物質を含むことができる。そのような治癒物質は、栄養素、ミネラル、ビタミン、電解質、酵素、ハーブ、植物抽出物、腺又は動物抽出物、あるいは皮膚疾患の治癒を促進するために製剤に添加することができる安全な治療剤を含むことができる。
【０１０２】
これら様々な添加剤の量は化粧品分野において従来使用される量であり、例えば、局所製剤の総重量の約０．０１％から約２０％の範囲である。
【０１０３】
本発明の製剤は従来の添加剤、例えば乳白剤、芳香剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、などを含むこともできる。特定の実施形態では、その他の薬剤、例えば保存時の腐敗を防止するため、すなわち酵母やカビなどの微生物の増殖を抑制するための、抗菌剤を添加することもできる。好適な抗菌剤は典型的に、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチル及びプロピルエステル（すなわち、メチル及びプロピルパラベン）、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、イミド尿素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、その他の薬剤、例えばリプレッサー及びインデューサー、すなわち、目的のポリペプチドの生産を阻害し（すなわちグリコース）又は誘導する（すなわちキシロース）薬剤を添加することもできる。このような添加剤は、それらが製剤の機能に適合し、かつ妨げにならない限り、使用することができる。
【０１０４】
製剤は、投与されることになる化学物質又は組成物の他の成分によって生じる皮膚刺激又は皮膚損傷の可能性を最小化又は排除するための、刺激緩和添加剤を含むこともできる。
【０１０５】
好適な刺激緩和添加剤には、例えば：α−トコフェロール；モノアミンオキシダーゼ阻害剤、特にフェニルアルコール、例えば２−フェニル−１−エタノール；グリセリン；サリチル酸塩；アスコルビン酸塩；イオノフォア例えばモネンシン；両親媒性アミン；塩化アンモニウム；Ｎ−アセチルシステイン；カプサイシン；クロロキンが挙げられる。刺激緩和添加剤は、存在するならば、刺激又は皮膚損傷を緩和するのに効果的な、典型的には製剤の約２０重量％以下、より典型的には約５重量％以下を表す濃度で、組成物に組み込むことができる。
【０１０６】
特定の実施形態において本製剤に組み込まれ、従って活性剤とともに局所的に適用することができるさらに好適な薬理学的に活性な薬剤には、以下：色素性もしくは非色素性のしみ、角化症、及びしわを改善し又は根絶する薬剤；抗菌剤（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ）；抗菌剤（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ）；抗掻痒剤及び抗乾燥症剤（ａｎｔｉｘｅｒｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）；抗炎症剤；局所麻酔薬及び鎮痛薬；コルチコステロイド；レチノイド；ビタミン；ホルモン；ならびに代謝拮抗剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
局所の薬理学的に活性な薬剤のいくつかの例としては、アシクロビル、アンフォテリシン、クロルヘキシジン、クロトリマゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ミコナゾール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ナイスタチン、ネオマイシン、カナマイシン、フェニトイン、パラ−アミノ安息香酸エステル、メトキシケイ皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、トコフェロール、酢酸トコフェロール、硫化セレン、亜鉛ピリチオン、ジフェンヒドラミン、プラモキシン、リドカイン、プロカイン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、クロタミトン、ヒドロキノンならびにそのモノメチル及びベンジルエーテル、ナプロキセン、イブプロフェン、クロモリン、レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、コールタール、グリセオフルビン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン２１−アセテート、ヒドロコルチゾン１７−バレレート、ヒドロコルチゾン１７−ブチレート、プロゲステロン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ミノキシジル、ジピリダモール、ジフェニルヒダントイン、過酸化ベンゾイル、及び５−フルオロウラシルが挙げられる。
【０１０８】
クリーム、ローション、ゲル、軟膏、ペーストなどは、患部表面に塗布し、穏やかに塗りこむことができる。溶液は同様に塗布することができるが、より典型的には点滴器（ｄｒｏｐｐｅｒ）、綿棒などにより塗布され、そして患部に注意深く塗布されることになる。
【０１０９】
適用レジメンは容易に決定することができる多くの要因、例えば症状の重篤度及び初期治療へのその応答性に依存することになるが、通常は継続的に１日当たり１又は複数回の適用を含むであろう。当業者は投与されることになる製剤の最適量、投与方法及び反復率（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）を容易に決定することができる。一般的に、本発明の製剤は１週間に１回又は２回から、１日に１回又は２回までの範囲で適用されるであろうことが検討される。
【０１１０】
本明細書に記載されるように、組成物のために選択された細菌種は既知の組換え技術を用いて形質転換されて、目的の化合物を発現する。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに説明し、実証する。本実施例は例示の目的のためだけに与えられており、本発明の限定として解釈されるべきではなく、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくそれらの多くの変形が可能である。
【０１１２】
実施例１  ベクターｐＡＺＴ−０１を用いてエレメントのフィラグリンを発現する表皮ブドウ球菌
Ａ．細菌
黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株の細菌をベクターの調製に使用した（Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈ、ＢＮ．ら、１９８３）。当該株のストック溶液をブレインハートフュージョン培地（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）（ＢＨＩ）中の５０％グリセロール中に、−２０℃で保存した。
【０１１３】
表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ１２２２８の細菌を使用した（Ｚｈａｎｇ，ＹＱ．ら、２００３）。当該株のストック溶液をブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ）中の５０％グリセロール中に、-２０℃で保存した。細菌をブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ）で培養した。１６時間のインキュベーション後、細菌を遠心分離により回収し、ブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ）中で２×１０9細菌／１００μｌに１０倍濃縮した。細菌のストック調製物を、５ｍＬの培養液にスラントからの細胞を接種することによって調製した。細胞を３０℃で一晩増殖させた。次いで、３ｍＬの十分に増殖した培養物を１ｍｌの６０％グリセロールに添加し、-８０℃で保存した。
【０１１４】
Ｂ．ベクターへのゲノムの組込
プラスミドＡＺＴ−０１は、フィラグリン発現インサートを有するシャトルベクターｐＪＢ３８からなる（図５）（Ｃｈｅｕｎｇ、ＡＬ．ら、２００４）。ｐＪＢ３８へのインサートはフィラグリンＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２０１６）についての完全なオペロン、キシロース−誘導性プロモーターを含み、目的の化合物の生産に使用された。ｐＪＢ３８−ＦＬＧベクター（図５）はバイオ・ベーシック・インク（マーカム、ＯＮ、カナダ）によって構築され、クローニングされた。
【０１１５】
Ｃ．形質転換
フィラグリン配列を含むベクター、又は異常なヒトの皮膚の治療処置の目的で構築された任意のベクターを以下のステップを含む以下のプロトコルに従って、表皮ブドウ球菌株に形質転換した：黄色ブドウ球菌細菌細胞の調製、黄色ブドウ球菌の形質転換、黄色ブドウ球菌からのプラスミドＤＮＡの単離、表皮ブドウ球菌細菌細胞の調製、表皮ブドウ球菌の形質転換、細菌の増殖、及び形質転換された細菌の保存。代替の中間株も形質転換、及び表皮ブドウ球菌への形質転換のための調製におけるプラスミドＤＮＡの単離に使用することができる。これらの株にはメチル化を欠損した株を含む黄色ブドウ球菌及び大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
黄色ブドウ球菌の調製及び形質転換：細胞の調製：黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０細胞を、５０ｍｌの培養物を３７℃、ＢＨＩ培地中で一晩増殖させ、次いで１００ｍｌの新鮮なＢＨＩ培地に一晩培養物の１０ｍｌを接種することによって、エレクトロコンピテントにした。ＯＤ600が０．２〜０．３に達したら、細胞をペレット化し（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）、１ｘ容量の４℃１０％スクロースで再懸濁した。本工程を３回繰り返し、次いで細胞を０．１ｘ容量の４℃１０％スクロースで再懸濁し、ペレット化し、そして１ｍｌの１０％スクロースで再懸濁した。
【０１１７】
ＲＮ４２２０の形質転換のために、２００〜５００ｍｇのｐＡＺＴ−０１を先に調製したエレクトロコンピテントセルと混合し、そしてＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリーズ、ＣＡ）を使用して２．５ｋＶで室温でのエレクトロポレーションを用いて形質転換した。形質転換された細胞を選択ＢＨＩ培地上に２８℃で一晩プレーティングし、選択ＢＨＩ培地で一晩増殖させ、次いでＤＮＡを単離するために使用した。
【０１１８】
表皮ブドウ球菌の調製及び形質転換：エレクトロコンピテント表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を以下の方法を使用して作製した。まず、−８０℃のストックからのＡＴＣＣ１２２２８の５０ｍｌの一晩培養物をＢ２培地（１．０％トリプトン、２．５％酵母エキス、０．５％グルコース、２．５％ＮａＣｌ、０．１％Ｋ2ＰＯ4、ｐＨ７．５）中で、３７℃で増殖させた。一晩培養物の１０ｍｌを新鮮な予熱した（ｐｒｅ−ｗａｒｍｅｄ）Ｂ２培地に希釈し、ＯＤ600が０．５〜０．６に達するまで振とうし、次いで１０分間４℃でペレット化した。次に、細胞を１、１／２、１／２０、及び１／５０容量の冷やした１０％グリセロールで洗浄し、洗浄の間に４℃でペレット化した。最終ペレットを７００μｌの冷やした１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１１９】
エレクトロコンピテントＡＴＣＣ１２２２８を、２．５ｋＶ、２５ｕＦ、１００Ωでのエレクトロポレーション（Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、ＣＡ）を使用して、通常の読み取りは４．５〜５ミリ秒である）を用いて、黄色ブドウ球菌から単離されたｐＡＺＴ−０１で形質転換した。次いで細胞を２８℃で選択ＢＨＩ培地にプレーティングした。
【０１２０】
細菌の形質転換は、代替の中間株、バクテリオファージ形質導入、及びヒートショックを含むがこれらに限定されない、形質転換の代替方法によって行うこともできる。
【０１２１】
Ｄ．タンパク質発現の誘導
フィラグリン発現を以下の方法でｐＡＺＴ−０１により形質転換されたＡＴＣＣ１２２２８において誘導した。まず、選択ＢＨＩ培地中で形質転換されたＡＴＣＣ１２２２８の２８℃での一晩培養物の５ｍｌを採取して、抗生物質を含む新鮮なＢＨＩの１００ｍｌに接種した。細胞をＯＤ600が０．５〜０．６５に達するまで増殖させ、次いで細胞を最終濃度の１．５％キシロースを用いて４．５時間誘導した。
【０１２２】
Ｅ．タンパク質発現及び分泌の分析
分析のために細胞を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びウェスタンブロッティングにより分析した。非誘導試料及び誘導試料からの細菌細胞をペレット化し、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ細胞溶解試薬（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ＭＯ）で溶解した。誘導試料からの上清も回収し、濃縮した。試料を還元試料緩衝液中に再懸濁し、次いでＴｒｉｓ−ＨＣＬランニングバッファーを用いて４〜１５％Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動した。電気泳動後に、ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、フィラグリンに対する一次ヤギモノクローナル抗体（ｓｃ−２５８９７、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ））で順次プローブした。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギ（ａｎｔｉ−ｇｏａｌ）抗体（ｓｃ−２０２０）をプローブし、二次抗体を、増強化学発光基質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ、サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用してオートラジオグラフィー（Ｓｙｎｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＧｎｏｍｅ  Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）によって検出した。
【０１２３】
上清及び細胞溶解物の分析は、目的のタンパク質を含むプラスミドによる形質転換、続くタンパク質発現の誘導にあたり、治療用ポリペプチドの成功した発現及び分泌を実証する。
【０１２４】
タンパク質発現及び分泌の検出は代替方法を用いても可能であり、現在の実施例は本発明の限定として解釈されるべきではない。
【０１２５】
Ｆ．前述の組成物によるヒト対象の治療
ｐＡＺＴ−０１を含む表皮ブドウ球菌の約１ｘ１０9コロニー形成単位（ＣＦＵ）を薬学的に許容される担体に加えることができる。前述の組成物は、異常な皮膚状態の治療又は予防を必要とする対象、例えば湿疹などの異常な皮膚状態を有するヒト対象の、当該状態の治療又は予防に有用である。当該組成物は、１日当たり少なくとも１回から、例えば１日当たり約３〜４回まで、又は必要に応じてもしくは処方通りに、適用することができる。当該組成物は状態の治療を確実にするため、又は状態を予防し続けるために必要とされる限り使用することができる。治療期間は約１日から約１０〜１４日まで又はそれ以上に変化させることができる。特定の例では、長期又は慢性治療を施すことができる。
【０１２６】
実施例２  表皮層にコロニー形成し、かつＧＦＰを発現する表皮ブドウ球菌
Ａ．細菌
大腸菌株ＤＨ５α及びＤＣ１０Ｂの細菌をプラスミド構築及び調製に使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９；Ｍｏｎｋ，Ｉ．ら、２０１２）。表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８株の細菌をネズミ科のコロニー形成及び発現実験におけるＧＦＰの異種発現に使用した。当該株のストック溶液をブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ）中の５０％グリセロール中に-２０℃で保存した。細菌をブレインハートフュージョン培地（ＢＨＩ）中で培養した。１６時間のインキュベーション後、細菌を遠心分離により回収し、ＢＨＩ中で２×１０9細菌／１００μｌに１０倍濃縮した。細菌のストック調製物を、５ｍＬの培養液にスラントからの細胞を接種することによって調製した。細胞を３０℃で一晩増殖させた。次いで、３ｍＬの十分に増殖した培養物を１ｍｌの６０％グリセロールに添加し、-８０℃で保存した。
【０１２７】
Ｂ．ベクター
プラスミドｐＣＭ１１はｓＧＦＰ発現インサートを有するシャトルベクターからなる（Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅら、２０１０）。
【０１２８】
Ｃ．形質転換
ＧＦＰ配列を含むベクター（例えばｐＣＭ１１（Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅら、２０１０））、又は異種発現の目的で構築された任意のベクターを以下のステップを含む以下のプロトコルに従って、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ１２２２８に形質転換した：ＤＨ５αへの形質転換、ＤＨ５αからのプラスミドＤＮＡの単離、ＤＣ１０Ｂの形質転換、ＤＣ１０ＢからのプラスミドＤＮＡの単離、表皮ブドウ球菌の調製及び形質転換、形質転換された表皮ブドウ球菌の増殖及び適用。
【０１２９】
大腸菌ＤＨ５αをヒートショック法を用いてｐＣＭ１１で形質転換し、選択ＬＢ（ルリア培地）上に一晩３７℃でプレーティングした。プラスミドＤＮＡを、ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（アーバイン、ＣＡ）を使用してＤＨ５α形質転換体からの選択ＬＢ培地での３７℃一晩培養物から精製した。次に、２００〜５００ｎｇのｐＣＭ１１ＤＮＡを、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、ＣＡ）を使用して２．５ｋＶ、室温でのエレクトロポレーションを用いてＤＣ１０Ｂを形質転換するために使用した。形質転換された細胞を一晩３７℃でプレーティングし、次いでＤＮＡを前記方法を用いて精製した。
【０１３０】
次に、エレクトロコンピテント表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を以下の方法を用いて作製した。まず、ＡＴＣＣ１２２２８の５０ｍｌの一晩培養物をＢ２培地（１．０％トリプトン、２．５％酵母エキス、０．５％グルコース、２．５％ＮａＣｌ、０．１％Ｋ2ＰＯ4、ｐＨ７．５）中で、３７℃で増殖させた。一晩培養物の１０ｍｌを新鮮な予熱したＢ２培地に希釈し、ＯＤ600が０．５〜０．６に達するまで振とうし、次いで１０分間４℃でペレット化した。次に、細胞を１、１／２、１／２０、及び１／５０容量の冷やした１０％グリセロールで洗浄し、洗浄の間に４℃でペレット化した。最終ペレットを７００μｌの冷やした１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１３１】
エレクトロコンピテントＡＴＣＣ１２２２８を、Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、ＣＡ）を使用して２．５ｋＶでエレクトロポレーションを用いて、ＤＣ１０Ｂから単離されたｐＣＭ１１で形質転換した。次いで細胞を３７℃で選択ＢＨＩ培地上にプレーティングした。
【０１３２】
ＧＦＰインサートの形質転換及び発現を、図６において形質転換された表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８の蛍光によって見られるように顕微鏡を用いて確認した。
【０１３３】
Ｄ．ｐＣＭ１１で形質転換されたＡＴＣＣ１２２２８によるネズミ科の研究
マウス皮膚へのＡＴＣＣ１２２２８のコロニー形成を可視化するために、マウスをＧＦＰ発現ＡＴＣＣ１２２２８（ｐＣＭ１１で形質転換されたＡＴＣＣ１２２２８）で処置した。マウスの小さなコホート（ｎ＝５）を毛を除去するために刈って、ｐＣＭ１１中のＧＦＰを発現する表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８で背部皮膚を処置した。約１ｘ１０9ＣＦＵの表皮ブドウ球菌を綿棒（ｃｏｔｔｏｎ  ｗｏｏｌ  ｔｉｐｐｅｄ  ｓｔｉｃｋ）で塗布した。処置の開始後、マウスを表皮ブドウ球菌コロニー形成の兆候についてモニターした。
【０１３４】
皮膚の切片を画像研究のために死後、皮膚から採取した。切片を蛍光顕微鏡を用いて画像化し（図７）、ＤＡＰＩ及び抗ＧＦＰモノクローナル抗体での染色を含んだ（図８）。追加の画像を二光子顕微鏡法を使用して可視化した（図８）。
【０１３５】
図７は、ＧＦＰインサートを含むｐＣＭ１１で形質転換された表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を示し、これを次にマウスの背部皮膚に３日間適用した。次いで、皮膚の切片を死後、光学顕微鏡検査のために採取した（図７Ａ及び７Ｂ）。ここに示された切片をマラカイトグリーン染色を用いて染色し、２００ｘ（図７Ａ）及び図７Ｂにおけるさらなる拡大で視覚化した。この図は３日後のマウス皮膚上での表皮ブドウ球菌のコロニー形成を示す。
【０１３６】
図８は、ＧＦＰインサートを含むｐＣＭ１１で形質転換された表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８を示し、これを次にマウスの背部皮膚に３日間適用した。次いで皮膚の切片を死後、光学顕微鏡検査のために採取した（図８Ａ及び８Ｂ）。図８ＡはＧＦＰの蛍光を示し、表皮ブドウ球菌が３日後に皮膚にコロニー形成することだけでなく、ＧＦＰの発現がその時点で維持されていることを示す。図８ＡはＧＦＰからの蛍光を示し、図８ＢはＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と抗ＧＦＰモノクローナル抗体との両方で染色した皮膚の切片を示す。図８Ｃは二光子顕微鏡法を用いて可視化した皮膚の切片を示す。この画像は蛍光によって示された表皮ブドウ球菌のコロニー形成及びＧＦＰ発現の程度を示す。
【０１３７】
多くの例示的な態様及び実施形態が上記で説明されてきたが、当業者はそれらの特定の変更、置換、追加及びサブコンビネーションを認識するであろう。それゆえ、以下の添付の特許請求の範囲及び今後導入される特許請求の範囲は、それらの真の趣旨及び範囲内で、全てのそのような変更、置換、追加及びサブコンビネーションを含むものと解釈されることを意図する。
【０１３８】
参照による組み込み
本明細書で参照した特許出願書類、科学文献、政府報告書、ウェブサイト、及び他の文献を含む特許文献の各々の開示全体は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。用語が矛盾する場合は、本明細書が調整する。
【０１３９】
本明細書中に開示された全ての配列リスト、又は配列番号はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
等価物
本発明は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化することができる。前述の実施形態は本明細書に記載の発明を限定するのではなく全ての点で例示的なものであるとみなされるべきである。本発明の方法及び組成物の様々な実施形態において、用語「含む」が列挙されたステップ又は構成要素に関して使用される場合、方法及び組成物が列挙されたステップ又は構成要素から本質的になるか、あるいはそれらからなることも企図される。さらに、ステップの順序又は特定の動作を行う順序は、本発明が実施可能であり続ける限り重要ではないことを理解すべきである。また、２以上のステップ又は動作は同時に実行することができる。
【０１４１】
本明細書において、単数形は文脈上別段明確に指示しない限り複数形を含む。別段定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が調整することになる。
【０１４２】
本明細書で使用される全てのパーセンテージ及び比率は、別段指示されない限り重量による。
【０１４３】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものに補足的な例示的手順又は他の詳細を提供する限り、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１４４】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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