(57)【要約】  本発明は、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害剤である抗体、及び制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した疾患の処置、特に癌の処置のための本抗体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体。
【請求項２】
アミノ酸配列  配列番号9のエピトープと特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号2
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号3
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号4
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号6
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号7
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号8により定義された6つのCDRを有する抗体と同じ固着ゾーンを有する、請求項1又は2に記載の抗体。
【請求項４】
CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号2
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号3
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号4
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号6
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号7
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号8により定義された6つのCDRを有する、請求項1又は2に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体の重鎖可変領域がアミノ酸配列  配列番号1を有すること、及び前記抗体の軽鎖可変領域がアミノ酸配列  配列番号5を有することを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号11
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号12
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号13
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号15
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号16
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号17により定義された6つのCDRを有する抗体と同じ固着ゾーンを有する、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号11
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号12
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号13
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号15
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号16
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号17により定義された6つのCDRを有する、請求項1に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域がアミノ酸配列  配列番号10を有すること、及び前記抗体の軽鎖可変領域がアミノ酸配列  配列番号14を有することを特徴とする、請求項1、6、又は7のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置における使用のための請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が癌の処置において用いられることを特徴とする、請求項9に記載の、使用のための抗体。
【請求項１１】
癌が、慢性骨髄性白血病、結腸癌、メラノーマ、子宮の癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、中枢神経系の原発性リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、ホジキンリンパ腫、又は肝細胞癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の、使用のための抗体。
【請求項１２】
癌が、好ましくはエプスタイン・バーウイルスに関連した上咽頭癌、及びC型肝炎ウイルス又はB型肝炎ウイルスに関係した肝細胞癌からなる群から選択される、ウイルス誘発性癌であることを特徴とする、請求項10に記載の、使用のための抗体。
【請求項１３】
請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項1から8のいずれか一項に定義されているような抗体、及び抗癌剤を含む、併用製造物。
【請求項１５】
癌の処置における、同時使用、別々の使用、又は時間と共に拡散される使用のための、請求項14に定義されているような併用製造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害剤である抗体、及び制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置のための本抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトTリンパ球は、CD3と呼ばれる膜マーカー、及び抗原の特異的認識に直接的に関与する特異的受容体、TCR(T細胞受容体)の発現によって特徴づけられる。ナイーブTリンパ球によるこの抗原認識は、Tリンパ球の表現型及び活性の改変を生じる一次免疫応答の活性化を引き起こす。
【０００３】
様々な型のTリンパ球集団は、例えば、「エフェクター」細胞又はエフェクターTリンパ球を発生させ、それらは生物体を防御するための特殊な機能を果たしている。このように、補助的Tリンパ球とも呼ばれるCD4+Tリンパ球は、特に、Bリンパ球をそれらの体液性機能(特異的抗体の産生)において、及びCD8+Tリンパ球をそれらの細胞傷害活性において援助する主要なサイトカインを分泌する。
【０００４】
CD4+Tリンパ球の別の集団は、ナチュラル制御性Tリンパ球(以下、より簡潔に「制御性Tリンパ球」と呼ぶ)からなる。それらは、恒常的に、CD25分子(制御性Tリンパ球はまた「CD4+CD25+」と呼ばれる場合がある)及びFoxp3転写因子を過剰発現する。このわずかな割合のCD4+CD25+Tリンパ球は、TCRによって様々な自己抗原を認識するであろう免疫応答の「役者」を負に制御する特殊性を有している。制御性Tリンパ球はまた、特に、生物体を自己免疫病の発生から保護するための、免疫系の生理機能において主要な役割を果たしている。
【０００５】
しかしながら、病理学的状況において、制御性Tリンパ球が、不適切な免疫抑制を引き起こす場合があり、そのことが、その後、腫瘍成長、又は感染性病原体(ウイルス、細菌、寄生生物等)の残留を助けていることが提議されている。制御性Tリンパ球が、特に、エフェクターTリンパ球の活性を不適切に阻害することにより、抗腫瘍性又は抗ウイルス性免疫応答を低下させて、ウイルスの残留及び多くの癌の腫瘍進行を助けていることが、多数の研究によって示されている。
【０００６】
制御性Tリンパ球がエフェクターTリンパ球に抑制効果を発揮する機構はまだ十分にはわかっていない。しかしながら、様々な研究により、制御性Tリンパ球が免疫応答を抑制することができる様々な機構が示されている。その可能な説明のうち、例えば、Foxp3+制御性リンパ球が、グランザイム/パーフォリンの産生により(1)、又はエフェクターTリンパ球からIL-2を除去することにより、又はエフェクターTリンパ球の増殖を阻害することにより、特に、ガレクチン-1(それは、エフェクターTリンパ球上に発現している受容体と相互作用し、エフェクターTリンパ球の細胞周期の停止を引き起こす)等の表面分子を発現させることにより(2)、エフェクターTリンパ球を溶解し得ることを研究は示している。
【０００７】
したがって、癌におけるTregの生理病理学的役割は、新しい抗腫瘍性治療戦略の出現を促している。それは、免疫応答を阻害する因子、特に制御性Tリンパ球を中和すること、又は言い換えれば、腫瘍抗原に対する寛容を遮断することからなる。
【０００８】
これには抗腫瘍免疫の調節において制御性Tリンパ球とエフェクターTリンパ球の間のバランスを逆転させる目的があるからであり、CD4+CD25+制御性Tリンパ球を、特にこれらの制御性Tリンパ球によって発現した表面分子、及び特に、これらの制御性Tリンパ球の抑制活性において作用する表面分子をモノクローナル抗体で標的にすることにより、阻害することを目的とした治療戦略を開発しようと多くのチームが努力している。
【０００９】
げっ歯類において行われた分析により、例えば、IL-2のα受容体(CD25)に対して方向づけられたモノクローナル抗体によるCD4+CD25+制御性Tリンパ球の阻害がエフェクターT細胞の活性化及び増殖を促進するため、腫瘍成長が阻害されること(3)が示されている。しかしながら、CD25は、活性化されたエフェクターT細胞にも発現している。したがって、この戦略は注意して採用されなければならず、それがエフェクターTリンパ球の排除も促進する可能性があるからである。
【００１０】
GITRによるシグナル伝達の抗GITR抗体を介した活性化は、制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害することができたことも、実証されている(4)。この関連において、マウス腫瘍の処置における抗GITR抗体の使用は、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球の抗腫瘍応答を増加させることを可能にし、これは、腫瘍がすでに導入されている場合、より効果的である。しかしながら、活性化エフェクターTリンパ球もGITRを発現する。結果的に、抗GITR抗体の使用中にエフェクターTリンパ球が抑制されるリスクもまた存在する。
【００１１】
制御性Tリンパ球を阻害することを目指す戦略はまた、制御性Tリンパ球により発現するマーカー、CTLA4に対して方向づけられた、抗CTLA4抗体の使用により構想されている。例を挙げれば、制御性Tリンパ球におけるCTLA-4のKO(ノックアウト)を有するマウスモデルにおいて、又は抗CTLA-4抗体の使用中、エフェクターTリンパ球の活性の増加、及び制御性Tリンパ球により媒介される抑制の低下が示され、腫瘍成長の阻害がもたらされた(5)。しかしながら、活性化エフェクターTリンパ球も、CRLA-4マーカーを発現する。結果的に、抗GITR抗体の使用によるエフェクターTリンパ球の抑制のリスクもまた存在する。
【００１２】
このように、これらの様々な分子の有望な効果にも関わらず、制御性Tリンパ球の特異的枯渇への障壁の1つは、それらの表面マーカーの特異性の欠如である。これは、制御性Tリンパ球により発現した表面タンパク質、CD25、CTLA-4、又はGITRがまたエフェクターTリンパ球の活性化のマーカーでもあるからである。したがって、制御性Tリンパ球の枯渇のための標的としてのこれらのタンパク質の使用は、腫瘍退縮に必須である多くのCD4+及びCD8+エフェクターTリンパ球の排除という望ましくない効果を生じる。この関連において、治療プロトコールで制御性Tリンパ球を特異的に標的にすることは依然として非常に難しいままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】EP 1586325
【特許文献２】WO 95/14785
【特許文献３】WO 96/22378
【特許文献４】米国特許第5,882,877号
【特許文献５】WO 98/45322
【特許文献６】EP 0173494
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Sekiら、「Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis」、Clin Immunol. 2008年4月; 127(1):78〜88頁. doi:10.1016/j.clim.2008.01.006.電子出版2月20日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
結果的に、制御性Tリンパ球の抑制活性を選択的かつ効果的に阻害するための化合物の必要性がまだなお存在している。
【００１６】
したがって、本発明の目的の1つは、制御性Tリンパ球の特異的マーカーに対して方向づけられ、かつエフェクターTリンパ球の機能を変えることなく、制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害することができる抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、分子、ガレクチン-9が、活性化中の制御性Tリンパ球により特異的に発現していること、及びこの分子に対して方向づけられた抗体が、制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害することを可能にし、これが特異的な様式、すなわち、エフェクターTリンパ球を阻害することがない様式であることを示したことの価値を示している。更に、そのような抗体が、通常のCD4+Tリンパ球のガレクチン-9により誘導される免疫抑制因子CD4+Tリンパ球への変換を中和する能力があり、それに従って、本発明に従って治療されることになっている患者における抗腫瘍免疫応答の維持を促進することもまた実証されている。
【００１８】
ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害するそのような抗体は、制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置に用い得ることをまさに発見した。
【００１９】
ここで、「制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気」とは、制御性Tリンパ球の抑制活性が、特に病気の発生又は持続を促進することにより、役割を果たす任意の病気(自己免疫ではない)を意味する。特に、制御性Tリンパ球の抑制活性が腫瘍の発生を促進することは実証されている。したがって、本発明は、より具体的には、Tリンパ球の抑制活性が役割を果たしている癌に狙いを定める。
【００２０】
ガレクチン-9(より簡潔には「Gal9」と呼ばれる場合がある)は、ガレクチンのファミリーの一員を形成する。ガレクチン、又はS型レクチンは、脊椎動物において(ヒトにおける10個を含む)15個のメンバーよりなるファミリーを構成する。ガレクチン-9は、糖タンパク質及び糖脂質のβ-ガラクトシド残基と優先的に相互作用する。ヒトにおいて、ガレクチン-9は、3つのアイソフォーム、長いアイソフォーム、中位のアイソフォーム、及び短いアイソフォームで存在する。
【００２１】
癌の発生とガレクチン、特にガレクチン-9との間に存在する関連を決定するためにいくつかの研究が行われている。しかしながら、ガレクチン-9が、(CD4+であろうとCD8+であろうと)活性化Tリンパ球に対して細胞傷害活性を有し、非活性化Tリンパ球に対して少しも細胞傷害活性を有しないと、これらの研究の大部分により考えられている。
【００２２】
例えば、特許出願EP 1586325は、「インビトロ」で、ガレクチン-9が、特に悪性又は転移性細胞における、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するが、正常細胞のアポトーシスを誘導しないという仮説から出発している。したがって、その出願EP 1586325は、ガレクチン-9、又はガレクチン-9の産生及び/若しくは放出を引き起こす分子等を含む薬物に関する。
【００２３】
したがって、その目的は、ガレクチン-9、又はガレクチン-9を増加させることを可能にする因子を用いることであり、一方、本発明は、それどころか、それを阻害する傾向にある。
【００２４】
したがって、本発明の主題は、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体である。
【００２５】
言い換えれば、本発明は、制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害剤であることを特徴とする、ガレクチン-9に対して方向づけられた抗体に関する。
【００２６】
これは、本発明が、(i)一方において、ガレクチン-9が制御性Tリンパ球により直接的に発現すること、及びそれの発現がそれらの活性化中に増加すること、並びに(ii)第二に、ガレクチン-9が、エフェクターTリンパ球によって非常に弱く発現すること、及びこの発現が活性化中に消失することを観察した本発明者らによってなされた予想外の所見に基づいているからである。更に、本発明者らは、ガレクチン-9の抗体による阻害が、制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害を可能にすることを観察した。
【００２７】
「制御性Tリンパ球」は、CD25、CTLA-4、及びGITRを構成する発現、並びに転写因子Foxp3の特異的発現によって特徴づけられる、Tregとも呼ばれる、ナチュラル制御性Tリンパ球の亜集団を意味する。したがって、本発明により、より具体的に呼ばれる制御性Tリンパ球は、ナチュラル制御性Tリンパ球、又はnTregである。
【００２８】
「制御性Tリンパ球の抑制活性」とは、制御性Tリンパ球が、病理学的状況において、いったん活性化されたならば、エフェクターTリンパ球に発揮する免疫抑制活性を意味し、それは、特に腫瘍成長を促進する。好ましくは、制御性Tリンパ球の抑制活性は、エフェクターTリンパ球の活性の阻害により抗腫瘍免疫応答を低下させる活性として理解することができる。制御性Tリンパ球の抑制活性は、当業者に知られた様々な技術に従って分析することができ、例えば、Tregリンパ球と自己又は異種性免疫細胞(全PBMC又はT CD4+)の共培養を用いるMLR(混合白血球培養反応)方法を実行することができる。これは、(i)トリチウム標識されたチミジン等の放射性原子の取り込み、又は(ii)EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)の取り込み(EdUはDNAの合成中に取り込まれ、その後、蛍光の放出を可能にする酵素反応が続く(Click-iT EdU増殖試験))、又は(iii)フローサイトメトリー(CSFE)に基づいた増殖試験により行うことができる。
【００２９】
したがって、本発明による抗体の阻害効果は、例えば、試験されることになっている抗体の存在下で実行される、そのようなMLR方法によって分析することができる。
【００３０】
そのような分析方法の使用に関する詳細については、本明細書において、「実施例」及び「装置及び方法」のパートを参照することができる。
【００３１】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、区別せずに用いられ、免疫グロブリン分子、又は免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、所定の抗原の特異的固着部位を含む分子を指す。抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体の断片、並びに抗体及び抗体の断片の変種(ヒト化抗体等の誘導体を含む)も網羅する。
【００３２】
免疫グロブリンは、当業者に周知されており、ジスルフィド架橋により互いに連結された2つの重鎖からなり、各重鎖が、ジスルフィド架橋により軽鎖に連結されている。2種類の軽鎖、ラムダ(λ)鎖及びカッパ(κ)鎖が存在する。抗体の機能活性を決定する重鎖の5つの主要なクラス: IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEが存在する。
【００３３】
各鎖は別々の配列ドメインを含有する。軽鎖は、2つのドメイン、可変ドメイン(又は領域)(VL)及び定常ドメイン(CR)を含む。重鎖は、抗体のクラスに従って4つ又は5つのドメイン:1つの可変ドメイン(VH)、及び3つ又は更に4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、及び任意でCH4)を含む。軽鎖(VL)及び重鎖(VH)の可変領域は、抗原に対する特異性、及びこの抗原上の固着部位を決定する。
【００３４】
軽鎖(CL)及び重鎖(CH)の定常ドメインは、抗体鎖の互いとの会合、胎盤を通っての移動性、補体の固着、及び/又はFc受容体(FcR)への固着等の重要な生物学的性質を抗体に与える。Fv断片は、免疫グロブリンの、下記のFab断片のV末端部分に相当し、軽鎖及び重鎖の可変部(VL及びVH)を含む。抗体の特異性は、抗体の認識部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体の認識部位は、超可変領域、又は相補性を決定する領域(「相補性決定領域」又はCDR)に由来する残基から本質的になる。時々、非超可変領域又はフレームワーク領域(FR)に由来する残基が、そのドメインの全体構造、及びそれゆえに、認識部位に影響を及ぼす。用語「相補性決定領域」(CDR)は、天然の免疫グロブリンの固着部位の天然Fv領域の固着の親和性及び特異性を統合的に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの各軽鎖及び各重鎖は、それぞれ、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、及びH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3で表される3つの領域CDRを有する。結果的に、抗体の結合部位は、6つのCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDR間に挿入されたアミノ酸の配列に関し、すなわち、同じ種の様々な免疫グロブリン間で相対的に保存されている免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域の部分である。
【００３５】
本発明による抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、本発明による抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３６】
用語「モノクローナル抗体」又は「mAb」は、特定の抗原に対して方向づけられ、かつ単一のB細胞クローン又はハイブリドーマにより産生され得る、固有のアミノ酸組成を有する抗体を表す。モノクローナル抗体はまた、組換えであってもよく、すなわち、タンパク質工学技術により作製されてもよい。
【００３７】
用語「Fab」は、およそ50,000ダルトンの分子量及び抗原との結合活性を有する抗体断片を表す。それは、ジスルフィド架橋により連結された、重鎖のn末端側のおよそ半分、及び軽鎖の全部を含む。Fabは、特に、プロテアーゼ、パパインによる免疫グロブリンの処理により、得ることができる。
【００３８】
用語「F(ab')2」は、およそ100,000ダルトン及び抗原との結合活性を有する断片を表す。この断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋を介して連結された2つのFab断片よりわずかに大きい。これらの断片は、免疫グロブリンをプロテアーゼ、ペプシンで処理することにより得られる。Fab断片は、F(ab')2断片から、ヒンジ領域のジスルフィド架橋の切断により得ることができる。
【００３９】
単一のFv鎖「scFv」は、VLドメイン及びVHドメインをコードする遺伝子、並びにこれらのドメインに結合することを意図されたペプチドをコードする配列を用いて合成されたVH:VLポリペプチドに相当する。本発明によるscFvは、例えば遺伝子組換え技術を用いて、適切な立体構造で維持されたCDRを含む。
【００４０】
「scFv」の二量体は、ペプチド結合によって一緒に連結された2つのscFv分子に相当する。このFv鎖は、ペプチドをコードするリンカー配列により連結されたVH及びVLをコードする遺伝子を含む融合遺伝子の発現の結果である場合が多い。ヒトscFv断片は、好ましくは遺伝子組換え技術の使用によって、適切な立体構造で維持されるCDR領域を含み得る。「dsFv」断片は、ジスルフィド架橋により安定化されたVH-VLヘテロ二量体である;それは二価であり得る(dsFV2)。二価Sc(Fv)2又は多価抗体の断片は、一価scFvの会合により自発的に形成され得、又はscFv断片をペプチド結合配列により連結することにより作製され得る。
【００４１】
Fc断片は、抗体の生物学的性質、特に、免疫エフェクターにより認識される能力、又は補体を活性化する能力のための支持体である。それは、ヒンジ領域を越えた重鎖の定常断片からなる。
【００４２】
用語「ダイアボディ」は、2つの抗原固着部位を有する小さい抗体断片を意味する。これらの断片は、同じVH-VLポリペプチド鎖において、軽鎖可変ドメインVLに連結された重鎖可変ドメインVHを含む。同じ鎖の2つのドメインのマッチングを可能にするには短すぎる結合配列を用いて、別の鎖の2つの相補性ドメインとのマッチングが必然的に起こり、それゆえ、2つの抗原固着部位が生み出される。
【００４３】
したがって、本発明の抗体は、2つの重鎖及び2つの完全な軽鎖からなる免疫グロブリンであってもよく、又は本発明による免疫グロブリンの断片、例えば、F(ab')2、Fab、Fv、scFv、又はFcであってもよい。好ましくは、そのような抗体断片は、免疫グロブリンのFab領域、特にIgG1抗体のFv領域である。
【００４４】
本発明に記載された抗体は、単離され、かつ精製され、天然の抗体とは異なる。それが、本発明による抗体又はヌクレオチド配列の場合、用語「単離される」及び「精製される」は、その分子が、同じ型の他の生物学的高分子の大部分が欠如した状態で、存在することを示す。
【００４５】
用語「キメラ抗体」は、それを構成する各軽鎖及び/又は各重鎖の配列が、少なくとも2つの別々の動物に由来するハイブリッド配列を含み、又はそれからなる抗体を指す。好ましくは、本発明のキメラ抗体は、ヒト/マウスハイブリッドである。特に、本発明のキメラ抗体は、非ヒト動物、特にマウスに由来した抗体のVHドメイン及びVLドメイン、並びにヒト抗体のCHドメイン及びCLドメインを含み得る。したがって、優先的には、本発明の抗体は、下記で定義された1G3抗体に由来した抗体のVHドメイン及びVLドメイン、並びにヒト抗体のCHドメイン及びCLドメインを含む。
【００４６】
本発明によれば、用語「ヒト化抗体」は、CDR以外の重鎖及び軽鎖の配列が、ヒト起源の1つ又は複数の抗体の対応する配列によって置換されている、非ヒト動物に由来した抗体を指す。優先的には、用語「ヒト化抗体」は、重鎖及び軽鎖の配列が、ヒト起源であり、かつCDRが1G3抗体に由来している抗体を指す。
【００４７】
本発明による抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、すなわち、それらは、ポリクローナル抗体(モノクローナル抗体の混合物に相当し、それゆえに、同じ分子内のいくつかの抗原決定基を認識する)とは違って、ガレクチン-9における1つの抗原決定基のみを認識する。
【００４８】
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知される技術に従って得ることができる。例えば、細胞融合技術、重鎖と軽鎖の配列をクローニングする技術、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイの技術、ヒト免疫グロブリンのリストを有するマウスの免疫化、及びアドホック細胞又はトランスジェニック動物における発現を用いることが可能である。これら技術は、当業者に周知されている。
【００４９】
本発明は、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。特に、本発明者らは、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害するマウス抗体IgG1、カッパ、1G3を産生するハイブリドーマを開発した。本発明者らは、このモノクローナル抗体mAb 1G3の軽鎖及び重鎖の可変ドメインを特徴づけており、したがって、Table 1(表1)に提示された、この抗体のCDRを決定している。
【００５０】
【表１】
2017521485.tif 000002
【００５１】
したがって、本発明の特定の実施形態は、CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号2
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号3
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号4
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号6
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号7
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号8によって定義された6つのCDRを有する1G3抗体と同じ固着ゾーンを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
【００５２】
特に、本発明の主題は、CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号2
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号3
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号4
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号6
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号7
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号8によって定義された6つのCDRを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
【００５３】
特定の実施形態において、前記抗体の重鎖の可変領域は、アミノ酸配列  配列番号1を有し、前記抗体の軽鎖の可変領域は、アミノ酸配列  配列番号5を有する。
【００５４】
したがって、本発明による抗体は、ガレクチン-9と特異的に結合し、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害剤である。
【００５５】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、ガレクチン-9のエピトープと特異的に結合することができる。有利には、本発明による抗体は、膜又は細胞内ガレクチン-9と特異的に結合する能力がある。
【００５６】
更により具体的には、本発明による抗体は、上記で定義された1G3抗体により認識されるエピトープと結合することができる。
【００５７】
したがって、本発明の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、table 2(表2)に提示されたアミノ酸配列  配列番号9のエピトープと特異的に結合することができる。アミノ酸配列  配列番号9からなるこのエピトープは、P4ペプチドに対応し、かつその結合ペプチドの末端、及びガレクチン-9のC末端部の始めの部分を網羅する。この配列は、ガレクチン-9の3つのアイソフォーム内に存在する(Sアイソフォームのアミノ酸166〜178、Mアイソフォームのアミノ酸178〜190、Lアイソフォームのアミノ酸210〜222)。したがって、そのような抗体は、ガレクチン-9の全てのアイソフォームと反応することができる。
【００５８】
【表２】
2017521485.tif 000003
【００５９】
別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、キメラ抗体、好ましくはマウス/ヒトキメラ抗体である。特に、このマウス/ヒトキメラ抗体は、上記で定義されているような1G3抗体の可変ドメインを含み得る。
【００６０】
別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、ヒト化抗体である。特に、このヒト化抗体の可変ドメインは、ヒトアクセプターのフレームワーク領域、及び任意で、ヒト定常ドメイン、及び非ヒトドナーのCDR、特に上記で定義されたCDRを含み得る。
【００６１】
本発明者らはまた、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害するマウス抗体IgG1、カッパ、2E12を産生するハイブリドーマを開発した。本発明者らは、このモノクローナル抗体mAb 2E12の軽鎖及び重鎖の可変ドメインを特徴づけており、したがって、table 3(表3)に提示された、この抗体のCDRを決定している。
【００６２】
【表３】
2017521485.tif 000004
【００６３】
したがって、本発明の特定の実施形態は、CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号11
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号12
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号13
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号15
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号16
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号17により定義された6つのCDRを有する2E12抗体と同じ固着ゾーンを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
【００６４】
特に、本発明の主題は、CDRとして、
-  領域H-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号11
-  領域H-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号12
-  領域H-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号13
-  領域L-CDR1におけるアミノ酸配列  配列番号15
-  領域L-CDR2におけるアミノ酸配列  配列番号16
-  領域L-CDR3におけるアミノ酸配列  配列番号17によって定義された6つのCDRを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
【００６５】
特定の実施形態において、前記抗体の重鎖の可変領域はアミノ酸配列  配列番号10を有し、前記抗体の軽鎖の可変領域はアミノ酸配列  配列番号14を有する。
【００６６】
前に述べられているように、本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、ガレクチン-9のエピトープと特異的に結合する。有利には、本発明による抗体は、膜又は細胞内ガレクチン-9と特異的に結合することができる。
【００６７】
更に、より具体的には、本発明による抗体は、上記で定義された2E12抗体により認識されるエピトープと結合することができる。
【００６８】
別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、キメラ抗体、好ましくはマウス/ヒトキメラ抗体である。特に、このマウス/ヒトキメラ抗体は、上記で定義されているような2E12抗体の可変ドメインを含み得る。
【００６９】
別の特定の実施形態によれば、本発明による抗体は、ヒト化抗体である。特に、このヒト化抗体の可変ドメインは、ヒトアクセプターのフレームワーク領域、及び任意で、ヒト定常ドメイン、及び非ヒトドナーのCDR、特に上記で定義されたCDRを含み得る。
【００７０】
抗体産生方法
本発明の抗体は、当業者に知られた任意の技術、例えば、非限定的に、単独で、又は組み合わせて採用される、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術により産生することができる。
【００７１】
例えば、ガレクチン-9に対して方向づけられたモノクローナル抗体1G3又は2E12を産生するハイブリドーマの製造に関する下記の技術を用いることが可能である。
【００７２】
ガレクチン-9に対して方向づけられた、本発明による抗体の特異的結合は、先行技術の任意の公知の方法に従って分析することができる。用いることができるイムノアッセイとして、例えば、ウェスタンブロット技術、放射免疫学的試験、ELISA、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降試験、沈降試験、ゲル拡散沈降試験、免疫放射線試験、蛍光イムノアッセイ、又は補体固着試験を位置づけることが可能である。そのような試験は、当業者に周知されている。
【００７３】
このようにして作製された本発明による抗体の制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する作用は、当業者に知られた様々な技術に従って分析することができる。例えば、細胞増殖試験を行うことができる。したがって、ガレクチン-9に対して方向づけられた抗体1G3又は2E12について行われる細胞増殖試験に関して、下記で用いられる技術を参照することは可能である。
【００７４】
所望の配列のアミノ酸配列が知られている場合、当業者は、標準ポリペプチド作製技術によりその抗体を容易に再現することができる。
【００７５】
例えば、そのような抗体は、周知の固相方法により、好ましくは、市販のペプチド合成装置をその供給会社の推奨に従って用いて、合成することができる。
【００７６】
或いは、本発明の抗体は、適切な発現系における組換えDNAの、当業者に周知される技術により得ることができる。用語「発現系」は、適切な条件下、すなわち、ベクターにより運ばれ、かつ宿主細胞に導入される外来DNAによりコードされるタンパク質の発現を可能にする条件下での細胞宿主及び適合ベクターを意味する。典型的には、抗体をコードする核酸配列は、適切な発現ベクター内に挿入され得、その後、その発現ベクターは、所望の抗体を産生するだろう適切な原核生物又は真核生物宿主に導入される。
【００７７】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」は、抗体をコードするDNA又はRNA配列を宿主細胞に導入することができ、その結果、宿主細胞を形質転換し、かつ導入された配列の発現(すなわち、転写及び翻訳)を可能にする、媒介物に関する。発現ベクターは、典型的には、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターである。
【００７８】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来したベクターが挙げられる。そのような組換えウイルスは、それらがキャプシド形成することを可能にする細胞株のトランスフェクション等の周知の技術により、又は必要な欠損した機能を発現するプラスミド若しくは補完ウイルス(complementation virus)での一過性トランスフェクションにより、作製することができる。キャプシド形成を可能にする細胞株は、例えば、PA317、PsiCRIP、GPenv+、293等である。複製のためのそのような欠陥組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコールは、特許出願WO 95/14785、WO 96/22378、米国特許第5,882,877号等において入手可能である。
【００７９】
したがって、宿主細胞は、上記のような核酸又は適切なベクターによりトランスフェクションされ、それに感染し、又は形質転換される。
【００８０】
用語「形質転換」は、この場合、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質を産生するために、外来(外因性の又は細胞外の)遺伝子又はDNA若しくはRNA配列を宿主細胞に導入して、この宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現することに関する。
【００８１】
そのような通常の発現系には、非限定的に、大腸菌(E coli)の宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルス型のベクター、並びに哺乳類の細胞及びベクターが挙げられる。
【００８２】
本発明による抗体を発現する宿主細胞からの産生の方法は、(i)インビトロ又はエキソビボで、上記のような組換え核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞に導入する工程、(ii)このようにして得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエキソビボで培養する工程、(iii)任意で、前記抗体又はポリペプチドを発現及び/又は分泌する細胞を選択する工程からなる工程を含み得る。そのような宿主細胞は、本発明による抗体を産生するために用いることができる。
【００８３】
特定の実施形態によれば、本発明による抗体を産生するための方法は、(i)上記の形質転換された細胞を、その抗体の発現に適切な条件下で培養する工程、及び(ii)このようにして発現した抗体を回収する工程からなる工程を含み得る。
【００８４】
抗体は、例えば、A-Sepharoseタンパク質上での精製、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製、ゲル電気泳動による精製、透析による精製、又はアフィニティクロマトグラフィーによる精製等の免疫グロブリンの通常の精製方法により、培地から分離され得る。
【００８５】
本発明の特定の実施形態において、本発明によるヒトキメラ抗体は、前に述べられているようなVL及びVHドメインをコードする核酸配列を得る工程、CH及びCLドメインをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター内の核酸配列の挿入によりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築する工程、並びにその発現ベクターを動物細胞に導入することによりコード配列を発現する工程により産生することができる。
【００８６】
ヒトキメラ抗体のCHドメインは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得る。好ましくは、それは、クラスIgG、好ましくは、再び、IgG1の場合である。同様に、ヒトキメラ抗体のCLドメインは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得る。好ましくは、それはカッパクラスの場合である。
【００８７】
本発明によるキメラ抗体又はヒト化抗体は、特に、抗体の遺伝子操作により得られ得る。
【００８８】
キメラ抗体は、例えば、遺伝子トランスフェクション技術により、又は組換えDNA技術により構築され得る。
【００８９】
本発明によるヒト化抗体は、前に述べられているようなCDRドメインを得る工程、(i)ヒト抗体の重鎖定常領域と同一の重鎖定常領域及び(ii)ヒト抗体の軽鎖定常領域と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターへの核酸配列の挿入によりヒト抗体発現ベクターを構築する工程、並びにその発現ベクターを動物細胞に導入することによりコード配列を発現する工程により産生され得る。
【００９０】
ヒト化抗体発現ベクターに関して、それは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター内に存在する型、又は、それらの遺伝子が同じベクターに存在する型(直列型)の場合であり得る。直列型ベクターは、発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ等に関して好ましい。直列型のヒト化抗体発現ベクターの例として、pKANTEX93又はpEE18を引用することができる。
【００９１】
遺伝子又は組換えDNA技術に基づいたヒト化抗体作製方法は、先行技術において周知されている。抗体は、先行技術から知られた様々な技術に従って、例えば、CDRグラフティング、ベニヤリング(veneering)、若しくはリサーフェシング(resurfacing)により、又は鎖シャッフリングにより、ヒト化することができる。そのような抗体を調製するための組換えDNAに基づいた技術もまた知られている。
【００９２】
本発明によるFab断片は、抗体、特にガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体を、プロテアーゼ、パパインにより処理することにより得られ得る。このFab断片はまた、抗体のFab断片をコードするDNAを、原核生物又は真核生物発現系において用いることができるベクター内に挿入し、Fab断片を発現するのに適切な原核生物又は真核生物へこのベクターを導入することにより産生することができる。
【００９３】
本発明によるF(ab')2断片は、抗体、特にガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体を、プロテアーゼ、ペプシンにより処理することにより得ることができる。F(ab')2断片はまた、上記のようなFab'断片をチオエーテル結合又はジスルフィド架橋により連結することにより得られ得る。
【００９４】
本発明によるFab'断片は、抗体、特にガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体のF(ab')2複合体を還元剤、ジチオスレイトールにより処理することにより得ることができる。Fab'断片はまた、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物又は真核生物発現系において用いることができるベクター内に挿入し、Fab'断片を発現するのに適切な原核生物又は真核生物へこのベクターを導入することにより産生することができる。
【００９５】
本発明によるScFv断片は、前に記載されたVH及びVLドメインをコードするcDNAの配列を得て、その後、このDNAを、原核生物又は真核生物発現系において用いることができるベクター内に挿入し、ScFv断片を発現するのに適切な真核生物又は原核生物においてこのベクターを導入することにより、産生することができる。ヒト化ScFv断片を得るために、CDRグラフティング技術を用いることが可能である。この技術は、ドナーScFv断片の相補性決定領域(CDR)を選択する工程、及び既知の3次元構造を有するヒトScFv断片のフレームワーク上へそれらをグラフティングする工程を含む(例えば、WO 98/45322;EP 0173494参照)。
【００９６】
本発明による抗体のアミノ酸配列への改変を行うことができる。例えば、抗体の結合親和性及び/又は生物学的性質を向上させることが望ましい場合がある。ヒト化抗体が、ヒト抗体のフレームワーク(FR)における非ヒト動物由来の抗体のVH及びVLのCDRの単なる単純なグラフティングにより作製される場合、抗原と結合する能力が、非ヒト動物由来の本来の抗体のその能力と比較して低下することは知られている。CDRにおいてだけでなく、FRにおいても非ヒト抗体のVH及びVLのいくつかのアミノ酸残基が、抗原固着能力に直接的に、又は間接的に関連していると考えられている。したがって、これらのアミノ酸残基をヒト抗体のFR、VH、及びVL由来の様々なアミノ酸残基で置換することは、結合能力を低下させるだろう。結果的に、この問題を解決するために、ヒトCDRのグラフト化抗体上で、ヒト抗体のFR、VH、及びVLのアミノ酸配列の中で、抗原との結合に直接的に関連するアミノ酸残基、又はCDRアミノ酸残基と相互作用し、若しくは抗体の3次元構造を維持し、かつ抗原との結合に直接的に関連するアミノ酸残基を同定するための試験を行わなければならない。結合能力は、その同定されたアミノ酸を非ヒト抗体由来の本来の抗体のアミノ酸残基によって置換することにより増加させることができる。本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするDNA配列において、必要とされる特性を有する抗体をコードする機能性分子をもう一度、獲得すると同時に、改変及び変化させることができる。
【００９７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体の機能保存性変種に関する。
【００９８】
「機能保存性変種」は、全体的な立体構造及び制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害機能を変化させることなく、タンパク質における所定のアミノ酸残基が変化しているものである。したがって、制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する機能が保存されている限り、アミノ酸を、類似した性質(例えば、極性、水素結合能等)を有する別のアミノ酸と置換することは可能である。
【００９９】
したがって、本発明の特定の実施形態によれば、以下を含む、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する、前に定義されているような抗体を有することは可能である:
-  配列番号2により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR1
-  配列番号3により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR2
-  配列番号4により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR3
-  配列番号6により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR1
-  配列番号7により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR2
-  配列番号8により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR3。
【０１００】
本発明の別の特定の実施形態によれば、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する、前に定義されているような抗体は、前に定義されているような配列を有する6つのCDRの全部、すなわち、配列、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8を有するCDRと比較して、1個、2個、又は3個の異なるアミノ酸を有する。
【０１０１】
本発明の別の特定の実施形態によれば、以下を含む、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する、前に定義されているような抗体を有することは可能である:
-  配列番号11により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR1
-  配列番号12により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR2
-  配列番号13により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR3
-  配列番号15により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR1
-  配列番号16により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR2
-  配列番号17により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR3。
【０１０２】
本発明の別の特定の実施形態によれば、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する、前に定義されているような抗体は、前に定義されているような配列を有する6つのCDRの全部、すなわち、配列、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17を有するCDRと比較して、1個、2個、又は3個の異なるアミノ酸を有する。
【０１０３】
治療的使用
前に述べられているように、病理学的状況において、制御性Tリンパ球は、不適切な免疫抑制を引き起こす場合があり、その後、そのことは腫瘍増殖を促進することが知られている。制御性Tリンパ球が、特にエフェクターTリンパ球の活性を不適切に阻害することにより、抗腫瘍免疫応答を低下させ、それに従って、癌型の病態の発生を促進することが多数の研究により示されている。
【０１０４】
第一に、活性化中、ガレクチン-9は、制御性Tリンパ球によって直接的に発現するが、それはエフェクターTリンパ球によって非常に弱くのみ発現し、又は全く発現せず、ガレクチン-9を標的にすることは、エフェクターTリンパ球の枯渇を引き起こすリスクを冒すことなく、制御性Tリンパ球を特異的に阻害することを可能にすることが本明細書において実証されている。更に、抗体によるガレクチン-9の阻害が、制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害を可能にすることが実証されている。したがって、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する本発明による抗体は、制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置、特に癌の処置に用いることができる。
【０１０５】
したがって、本発明の1つの目的は、制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置における使用のための、前に記載されているような抗体に関する。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態は、癌処置に用いられる、前に記載されているような抗体に関する。
【０１０７】
「癌処置」は、例えば、腫瘍若しくは転移を抑制することができ、再発のリスクを低下させることができ、腫瘍若しくは転移の発生を遅れさせることができ、及び/又は病気の症状を処置することができる任意の処置を意味する。
【０１０８】
本発明が狙いとする癌は、制御性Tリンパ球がそれらの抑制活性を発揮している癌である。有利には、本発明が狙いとする癌は、制御性Tリンパ球が腫瘍組織又は循環において大量に存在している癌であり、制御性Tリンパ球の増殖が一般的に、それらの活性化の増加と相関している(6)。制御性Tリンパ球の頻度は、当業者に知られた任意の方法、例えば、腫瘍内リンパ球又は循環リンパ球のフローサイトメトリー(FACS)分析により、又は腫瘍組織の免疫組織学的マーキングにより、評価することができる。
【０１０９】
したがって、大まかに言えば、前に定義されているような抗体は、制御性Tリンパ球がそれらの抑制活性を発揮している全ての型の癌の処置に用いることができる。制御性Tリンパ球がそれらの抑制活性を発揮している多数の型の癌が、研究の対象であり、かつ当業者に知られている。
【０１１０】
したがって、腫瘍における高レベルの制御性Tリンパ球は、明らかに、慢性骨髄性白血病(7)、結腸癌(8)、メラノーマ(9)、子宮の癌(10)、乳癌(11)、膵臓癌(12)、胃癌(13)、卵巣癌(14)、中枢神経系の原発性リンパ腫(15)、多発性骨髄腫(16)、前立腺癌(17)、ホジキンリンパ腫又は肝細胞癌(18、19)における予後不良に関連していることは知られている。
【０１１１】
したがって、前に定義されているような抗体は、特に、癌の処置に用いることができ、その癌は、慢性骨髄性白血病、結腸癌、メラノーマ、子宮の癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、中枢神経系の原発性リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、ホジキンリンパ腫、及び肝細胞癌からなる群から選択される。
【０１１２】
いくつかの癌が、免疫抑制因子の役割を果たす、すなわち、免疫応答、及び潜在的に抗腫瘍応答を阻害するガレクチン-9を有する大量のエキソソームを産生することも、研究によって実証されている。ガレクチン-9を有する大量のエキソソームを産生する癌の非限定的例は、ウイルス誘発性癌、例えば、EBV(エプスタイン・バーウイルス)に関連した上咽頭癌、又はHCV(C型肝炎ウイルス)又はHBV(B型肝炎ウイルス)に関係した肝細胞癌(CHC)(20、21)である。
【０１１３】
したがって、前に定義されているような抗体は、特に、癌の処置に用いることができ、その癌は、好ましくはエプスタイン・バーウイルスに関連した上咽頭癌、及びC型肝炎ウイルス)又はB型肝炎ウイルスに関係した肝細胞癌からなる群から選択される、ウイルス誘発性癌である。
【０１１４】
制御性Tリンパ球の頻度を増加させることが、C型肝炎に起因する線維症の再発を予想する因子であることもまた実証されている(22、23)。
【０１１５】
したがって、本発明による抗体は、C型肝炎によって引き起こされる線維症の再発を防ぐのに用いることができる。
【０１１６】
前に記載された実施形態のそれぞれにおいて、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体は、そのような処置を必要とする患者へ適切な様式で投与される。
【０１１７】
本発明による抗体は、単独で、又は任意の他の適切な化合物と組み合わせて、用いることができる。
【０１１８】
本発明の1つの目的は、治療的量の本発明による抗体の患者への投与を含む、ガレクチン-9の発現及び制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した癌を処置するための方法に関する。
【０１１９】
用語「患者」は、制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気、特に癌に冒された、又は冒されるようにさせられたヒトであると理解される。
【０１２０】
抗体の「治療的活性量」という用語は、薬物処置として許容できる利益/リスクの比を有する、そのような癌を処置するのに十分な抗体の量を意味する。本発明による抗体及び組成物の量並びに投与回数は、臨床研究により、医師により、又は薬剤師により決定される。患者のそれぞれに特異的な「治療的活性」量は、処置されるべき病気の性質及び重症度、用いられる抗体の活性、用いられる組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、及び食事、投与方法、(単回投与又は複数回投与における)処置の期間、併用される薬物、並びに医療専門家に周知される他の因子等のいくらかの因子に依存し得る。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態によれば、前に定義されているような、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体は、制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気を処置するための第2の作用物質、例えば、抗癌剤と組み合わせて用いられる。
【０１２２】
したがって、用途が癌の処置である場合、抗体は、例えば、手術、放射線療法、化学療法、又はそれらの組み合わせ等の癌に対する公知の治療と組み合わせて用いることができる。例えば、抗体は、腫瘍抗原、特にEBV抗原に対するエフェクターリンパ球の1回又は複数回の注射を含む養子免疫療法と組み合わせて用いることができる。いくつかの態様によれば、癌治療のために、本発明によるガレクチン-9に対して方向づけられた抗体と組み合わせて用いられる他の抗癌剤は、抗血管新生剤を含む。ある特定の態様によれば、前記抗体は、サイトカイン、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激するサイトカインと共に同時投与される。
【０１２３】
したがって、本発明の1つの主題は、前に定義されているような抗体及び抗癌剤を含む併用製造物に関する。
【０１２４】
特定の実施形態は、癌の処置における、同時使用、別々の使用、又は時間と共に拡散される使用のためのそのような併用製造物に関する。
【０１２５】
薬学的組成物
投与のために、抗体は、一般的に、薬学的組成物の形に製剤化される。本発明による抗体を含む薬学的組成物は、先行技術の知られた方法により製剤化することができ、その方法において、治療用分子は、少なくとも1つの賦形剤と組み合わされる。
【０１２６】
したがって、本発明の1つの主題は、前に記載されているような抗体、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
【０１２７】
「薬学的に許容される担体」は、その投与が患者によって耐えられ得る、任意の標準薬学的担体を意味する。例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水が薬学的に許容される。
【０１２８】
薬学的に許容される担体は、通常には、例えば賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミン等から選択される、1つ又は複数の化合物を含むことができる。公知の賦形剤は、例えば、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸マグネシウム等である。当業者は、本組成物に適した化合物を決定することができるだろう。
【０１２９】
薬学的組成物の形、投与様式、用量、及び薬量学は、当然ながら、とりわけ、処置されるべき病気、その症状、その重症度、並びに患者の年齢、体重、及び性別に依存し得る。
【０１３０】
非限定的には、本発明による薬学的組成物は、局所的に、非経口的に、経鼻的に、静脈内に、皮下/皮内に、結膜に、又は筋肉内若しくは眼内方法により、投与され得るように製剤化することができる。
【０１３１】
本発明による薬学的組成物は、任意で、注射され得るのに適した薬学的に許容される賦形剤を含有してもよい。特に、それらは、等張性滅菌食塩水、リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウム等、又はこれらの塩の混合物であり得る。これらの組成物はまた、乾性組成物、特に凍結した、凍結乾燥した、又は冷蔵された乾性組成物であり得、それらは、環境に従って、滅菌水又は生理的水の添加後、注射液を構成する。
【０１３２】
用いられる用量は、特に、病態による投与様式、或いは構想された処置の期間等の様々なパラメータに従って適応し得る。
【０１３３】
薬学的組成物を調製するために、十分な量の抗体は、薬学的に許容される媒介物又は水性媒体中に溶解又は分散させることができる。
【０１３４】
注射による使用に適切な医薬品形態は、滅菌水溶液、分散体、ゴマ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤、及び滅菌注射液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、用いられる形態は、無菌でなければならず、かつシリンジを用いて容易に注射され得るのに十分流動性でなければならない。それは、製造及び保存条件下で安定であり、かつ細菌又は真菌等の微生物による汚染から保護されなければならない。
【０１３５】
活性化合物の溶液は、それらが、遊離の形をとろうと、薬学的視点から許容される塩としてであろうと、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と混合された水で調製することができる。その分散は、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、その2つの混合物中、又は油中で行われ得る。これらの調製物は、一般的に、通常の保存及び使用条件下で微生物の成長を防ぐために保存剤を含有する。
【０１３６】
本発明による抗体は、中性の形、又は塩の形で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、そのタンパク質の遊離アミノ基と形成され、かつ例えば、塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、マンデル酸等の有機酸と形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導され得る。
【０１３７】
薬物の形をとる製剤化後、その溶液は、その製剤の剤形と適合した様式で、かつ治療的活性量で投与することができる。薬物は上記のように投与され得るが、それらを放出するカプセルの形をとって投与されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ヒト血液から単離されたナチュラル制御性Tリンパ球の多パラメータのフローサイトメトリーによる表現型分析を示す図である。
【図２】エキソビボで単離されたナチュラル制御性Tリンパ球の抑制機能の分析を示す図である。(A)cpmにおける、自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの増殖の阻害の分析。(B)自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの細胞溶解パーセンテージの分析。
【図３】ヒト制御性Tリンパ球におけるガレクチン-9をコードする遺伝子の発現のqPCRによる分析を示す図である(n=12)。1) 8、D1、D2、A1、A2は、血液ポケットを表す。CTはサイクル閾値を表す。それは、ガレクチン-9の遺伝子の増幅の検出が開始する、平均閾値である。結果は、4つのハウスキーピング遺伝子(β-アクチン、GAPDH、HPRT、ユビキチン)での標準化後、ΔCTで表される。[ΔCT=CT(試料)-CT(ハウスキーピング遺伝子の平均)]
【図４】ヒト制御性Tリンパ球におけるガレクチン-9の3つのアイソフォームの発現のウェスタンブロットによる分析を示す図である。HeLa細胞が陰性対照として用いられる。
【図５】活性化中の通常のTリンパ球におけるガレクチン-9をコードする遺伝子の発現のqPCRによる分析を示す図である(n=4)。
【図６】活性化中のヒト制御性Tリンパ球におけるガレクチン-9をコードする遺伝子の発現のqPCRによる分析を示す図である(n=4)。
【図７】照射されたC15の存在下、制御性Tリンパ球の存在下又は非存在下、及び1μg/mlの濃度での1G3抗体の存在下又は非存在下でのPBMCの増殖の分析による、抗Gal9 1G3抗体による制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害の分析を示す図である。
【図８】ガレクチン-9により引き起こされたジャーカットのアポトーシスの阻害の分析を示す図である。1μg/mlでのガレクチン-9 S、及び5μg/mlでの抗体(9M1抗体(抗ガレクチン-9)、9S2-3(抗ガレクチン-9)、1G3(抗ガレクチン-9)、抗TIM3、2E12抗体(抗ガレクチン-9))の1時間のプレインキュベーション。
【図９】ガレクチン-9での処理後の活性化細胞(「A」、抗CD3及び抗CD28による)及び非活性化細胞(NA)に関する増殖の回復の分析を示す図である(試験された抗体=ECA-42(抗ガレクチン-9)、1G3(抗ガレクチン-9)、2E2(抗TIM3)、及び2E12(抗ガレクチン-9))。対照は培地に相当する。
【図１０】フローサイトメトリー(FACS)によるガレクチン-9の発現の分析を示す図である。A:制御性Tリンパ球及び新鮮に単離されたCD4+Tconv細胞由来のガレクチン-9の発現(n=2ドナー)。B:24時間の活性化後に制御性Tリンパ球及びCD4+Tconv細胞から抽出されたガレクチン-9の発現(n=5ドナー)。C:48時間の活性化後に制御性Tリンパ球及びCD4+Tconv細胞から抽出されたガレクチン-9の発現(n=5ドナー)。D:72時間の活性化後に制御性Tリンパ球及びCD4+Tconv細胞から抽出されたガレクチン-9の発現(n=5ドナー)。
【図１１】3日間の培養後の様々な条件下でのTconvリンパ球の相対的増殖を示す図である(活性化された、又は活性化されていない細胞、ガレクチン-9の存在下、並びに1G3(「抗X」)、対照アイソタイプ(IgG1)、阻害剤(ラクトース)、及び参照阻害剤(スクロース)と共のガレクチン-9の存在下)。
【図１２】5日間の培養後の様々な条件下でのPBMCの増殖を示す図である(活性化された、又は活性化されていない細胞、1G3又は対照アイソタイプ(IgG1)の存在下)。
【図１３】5日間の培養後の様々な条件下でのPBMCの生存率を示す図である(活性化された、又は活性化されていない細胞、1G3又は対照アイソタイプ(IgG1)の存在下)。
【図１４】非活性化及び活性化条件下での通常のCD4+T(Tconv)及び制御性Tリンパ球(「Treg」)によるガレクチン-9の分泌の測定を示す図である(試験は48時間の培養後行われた)。
【図１５】様々な条件下での、自己制御性Tリンパ球との共培養中の通常のTリンパ球の相対的増殖を示す図である(活性化された細胞、1G3(「抗X」)、対照アイソタイプ(IgG1)、阻害剤(ラクトース)、及び/又は参照阻害剤(スクロース)の存在下)。
【図１６】制御性Tリンパ球及び様々な濃度(1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml)の1G3の存在下でのPBMCの相対的増殖を示す図である。
【図１７】様々な処理下:PBMC単独(対照);PBMC+Treg+1G3(活性化);PBMC+Treg+IgG1(活性化);PBMC無し+1G3(活性化);PBMC無し+IgG1(活性化)での腫瘍体積を示す図である。
【図１８】日数の関数としてマウスの体重のグラフ表示である。A及びB:1G3又は対照アイソタイプIgG1(20μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)での独立した実験。
【図１９ＡＢ】日数の関数としてマウスの体重のグラフ表示である。（Ａ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(2μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(20×106個のPBMC+10% Treg)。（Ｂ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(20μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。
【図１９ＣＤ】日数の関数としてマウスの体重のグラフ表示である。（Ｃ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(20μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。（Ｄ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(200μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。
【図２０】6つの独立した実験の手作業で測定された腫瘍体積の平均(mm3)を示す図である(対照アイソタイプIgG1と比較した、マウス、50×106個のPBMC+6〜8% Tregあたり20μgの1G3)(手作業での測定)。(*p<=0.05、**p<=0.001)
【図２１ＡＢ】バイオルミネセンスにより測定された腫瘍体積の測定値を示す図である。（Ａ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(2μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。（Ｂ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(20μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。
【図２１ＣＤ】バイオルミネセンスにより測定された腫瘍体積の測定値を示す図である。（Ｃ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(20μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(40×106個のPBMC+6% Treg)。（Ｄ）1G3又は対照アイソタイプIgG1(200μg/マウス)で処理された、異種移植SCIDマウス(50×106個のPBMC+6% Treg)。
【図２２】6つの独立した実験の、バイオルミネセンスにより測定された腫瘍体積の平均を示す図である(マウス、50×106個のPBMC+6%〜8% Tregあたり20μgの1G3又はIgG1)(総流束の測定)(*p<=0.05、**p<=0.001)。
【図２３】6つの独立した実験について測定された、グラムでの腫瘍質量を示す図である(マウス、50×106個のPBMC+6%〜8% Tregあたり20μgの1G3又はIgG1)(*p<=0.05、**p<=0.001)。
【図２４】5日間の条件付け後の様々なマーカーの発現の比較細胞数測定分析を示す図である。A:活性化Tconv(明るい灰色)、Gal-9 Mで活性化されたTconv(中間の灰色)、又はGal-9 Sで活性化されたTconv(黒色)の間でのCD4の発現。B:活性化されたTconv(明るい灰色)、Gal-9 Mで活性化されたTconv(中間の灰色)、又はGal-9 Sで活性化されたTconv(黒色)の間でのCD127の発現。C:活性化されたTconv(明るい灰色)、Gal-9 Mで活性化されたTconv(中間の灰色)、又はGal-9 Sで活性化されたTconv(黒色)の間でのCD25の発現。
【図２５】Gal-9のM型又はS型により5日間、条件付けされたTconvとの3日間の培養後の、様々な条件によるPBMCの相対的増殖を示す図である。(*p<=0.05、**p<=0.001)
【図２６】制御性Tリンパ球と共培養されたPBMCの増殖の分析による、抗Gal9抗体1G3及び抗Gal9抗体2E12(1μg/mlの濃度)による制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害の分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３９】
1.装置及び方法
ドナー、細胞株、及び培養条件
ドナー細胞
健康なドナー細胞を、Etablissement Francais du Sang - Nord de France (EFS)から来た血液から、後者とCentre National de la Recherche Scientifique (CNRS) - Delegation Nord Pas-de-Calais et Picardieとの間の公式な倫理合意書に従って、単離した。研究は、Institut de Biologie de Lille(CNRS)及びEFSのInstitutional Committeeにより承認され、各ドナーは前もって、説明を受けた同意書にサインした。
【０１４０】
NPC細胞株
C15腫瘍細胞株は、SCIDマウスにおいて6〜7週間ごとに皮下に異種移植され、かつ連続的に増殖したEBV陽性NPC(上咽頭癌)に由来する。全ての動物実験は、Institut Pasteur de Lille(France)の飼育場において、フランス及びヨーロッパ法令に従って、有資格者によって行われた。C15細胞を、異種移植された腫瘍から回収し、その後、腫瘍状況を刺激する免疫細胞とプレインキュベートする前に、照射した(5000ラド)。
【０１４１】
ジャーカットヒトTリンパ細胞株
ジャーカット細胞株を、ヒトTリンパ球白血病から樹立した。それは、CD4+リンパ球の表現型を有する。
【０１４２】
細胞培養条件
用いられる標準培地は、10% ABヒト血清(BioWest、Nuaille、France)、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMの非必須アミノ酸、10mMのHEPES、50μg/mlのストレプトマイシン、50μg/ml  のゲンタマイシン、及び50μM  βメルカプトエタノールを追加されたRPMI 1640 (Invitrogen、Paisley、UK)である。細胞を、Hera Cell 150インキュベータ(Thermo Electron、Cergy Pontoise、France)において制御雰囲気(5% CO2及び95%湿度)下、37℃でインキュベートした。適切な場合、PBMC及びCD4+T細胞を、培養前、37℃で2時間のインキュベーション後プレートに固定している抗CD3抗体(1μg/ml)(Clinisciences、Montrouge、France)、及び即席で加えられる抗CD28可溶性抗体(100ng/ml)(Clinisciences)で活性化した。
【０１４３】
ヒト免疫細胞の単離
PBMCの単離
健康なドナーの末梢血単核球(PBMC)を、Ficoll Paque PLUS(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)を用いる標準密度勾配遠心分離により単離した。
【０１４４】
CD4+T細胞の単離
CD4+T細胞を、製造会社(Miltenyi Biotec、Berlin、Germany)の使用説明書に従ってネガティブセレクションプロトコールを用いてPBMCから単離した。簡単に述べれば、PBMCを、CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ、及びグリコホリンAに対して方向づけられたビオチン化抗体のカクテルと10分間、インキュベートする。その後、抗ビオチン磁気ボールを15分間、加えた。除去されるべき細胞は、磁気活性化細胞ソーティングカラム(MACS(登録商標))分離器内に置かれたMACS(登録商標)カラム中に磁気的に保持される。単離されるべき細胞は、カラムを通過し、収集され、非標的細胞が枯渇し、非マーキング化細胞が濃縮されている。フローサイトメトリー分析は、単離された細胞の98%より多くがCD4+細胞であることを示している。
【０１４５】
制御性Tリンパ球の単離
成人ドナーPBMCからのヒト制御性Tリンパ球の単離を、CD4+CD25+制御性Tリンパ球の単離用キット(Miltenyi Biotech、Germany)を用いて、製造会社の使用説明書に従い、行った。CD4+CD25-T細胞の画分を、フローサイトメトリー及び化学誘引実験のために保存した。フローサイトメトリー分析は、常に、CD4+CD25+画分の95%より多い濃縮を示している。
【０１４６】
細胞増殖試験
1×105細胞(PBMC又はCD4+T細胞)を、[3Hメチル]チミジンと、培養の最後18時間の間、インキュベートし、Tomtecコレクター(Wallac)を用いてガラス繊維フィルター(Printed Filtermat A、Wallac、Turku、Finland)上に収集した。次に、フィルターを、乾燥及びシンチレーション液(Beckman Coulter、United States)の添加後、バッグ内に密封した。収集前の最後の18時間の[3H]チミジン(1μCi/ウェル)(PerkinElmer、Courtaboeuf、France)の存在下でのインキュベーション後、増殖を測定した。放射活性を、βメーター(1450 Trilux、Wallac、Finland)を用いて測定した。各増殖試験を、3つの試料において行い、1分あたりのカウント(cpm)で推定した。実験に従って、増殖試験を、Toshiro Niki(Galpharma、Japan)により供給された1μg/mlの組換えガレクチン-9の短いアイソフォーム(Gal9S)、1μg/ml又は一連の抗ガレクチン-9抗体1G3、陰性対照としての役割を果たす非関連性抗IGg1抗体(eBioscience、United Kingdom)、10μg/mlのC15エキソソーム、及び5mMのラクトース又はスクロース(Sigma Aldrich)の存在下で行った。
【０１４７】
細胞溶解
細胞溶解測定技術は、細胞溶解後に放出される細胞プロテアーゼに比例したルシフェラーゼ活性を測定する細胞傷害性測定キット(CytoTox-Glo Assay、Promega、USA)の使用に基づいている。試験を、6×105個のCD4+CD25+及び2×105個の自己PBMCを共培養に置くことにより、行う。細胞を、丸底96ウェルプレート(Maxisorb Nunc、Denmark)において200μlの培地(RPMI-1640、1% 2mM L-グルタミン、0.02mMのピルビン酸ナトリウム、100μg/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の非働化(decomplemented)ABヒト血清)(GIBCO BRLTM、Invitrogen(登録商標)、GB)中、培養する。細胞を、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)1μg/mlの抗CD3及び100ng/mlの抗CD28により活性化する。48時間の培養後、50μlの試薬(アミノルシフェリン-Glo)を各ウェル内に入れる。軽い撹拌後、培養プレートを、室温で光を避けて、15分間、インキュベートする。ルミネセンスの最初の測定はルミノメーター(Centro LB960、C Berthold Technologies、France)で行われ、制御性Tリンパ球により溶解した細胞の量と比例する。次に、細胞の全溶解を引き起こすために、50μlのデジトニン溶液を、各ウェル内に入れる。次に、2回目のルミネセンス測定を行う前に、プレートを撹拌し、その後、室温で暗所中、15分間、インキュベートする。試験を3連で実施し、結果を溶解パーセンテージとして表す。
溶解パーセンテージ=細胞生存度/平均全溶解-バックグランドノイズ
細胞生存度=平均全溶解-細胞溶解
細胞溶解=Tregリンパ球によって引き起こされた平均溶解-バックグランドノイズ
【０１４８】
ジャーカット細胞におけるアポトーシスの誘導の試験
ウシ胎仔血清の5% RPMI中で培養されたジャーカット細胞を、無血清培地(ハイブリドーマSFM - Life Technologies)へ移し、その後、96ウェルプレートのウェルにおいて(100,000細胞/ウェル)、30nMガレクチン-9の存在下で24時間、インキュベートする。アポトーシス中の細胞の計数を、V-APCアネキシン(アロフィコシアニン)及びヨウ化プロピジウムでマーキングした後、フローサイトメトリーによって行う。モノクローナル抗体の保護作用を評価するために、ガレクチンを、その抗体の存在下で30分間、プレインキュベートし、24時間インキュベーションについてのそれの最終濃度は10μg/mlである。
【０１４９】
ウェスタンブロット
エキソソームを、20mM tris HCl、50mM NaCl、5mM EDTA、1% Triton X 100、0.02%アジ化ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche、Basle、Switzerland)で構成されるPYバッファー中に溶解させる(氷上で10分間)。遠心分離(20,000 g、15分間、+4℃)後、細胞片を除去し、上清を収集する。そのタンパク質濃度を、Bio Radタンパク質アッセイを用いて、製造会社(BioRad、Marnes la Coquette、France)の使用説明書に従い、測定した。その後、エキソソームをウェスタンブロットにより分析した。簡単に述べれば、そのタンパク質を、標準条件下で勾配にあらかじめ注がれたゲル(勾配4〜12%、Bis Tris、Invitrogen)を用いるSDS PAGE電気泳動により分離した。その後、そのタンパク質をニトロセルロース膜(Hybon dTM-C Extra、Amersham Biosciences、United Kingdom)上へ転写した。後者を、0.2% AuroraTNブロッキング試薬(MP Biomedicals、Illkirch Graffenstaden、France)、0.1% Tween20(Sigma Aldrich)、及びPBS(1×)を含有するブロッキングバッファー中、室温で1時間、ブロッキングし、その後、ガレクチン-9:ガレクチン-9-CT-L1に対して方向づけられた一次抗体  1:100(Galpharma、Japanにより供給された)と4℃で一晩、インキュベートした。膜をブロッキングバッファーで洗浄し、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた二次抗体(抗マウス、1:10000)(GE Healthcare、Wauwatosa、United States)と室温で1時間、インキュベートし、もう一度、ブロッキングバッファーで洗浄した。そのタンパク質の特定シグナルを、Western Lightning(登録商標)Plus ECL(基質のケミルミネセンスを増幅するキット)(PerkinElmer、Boston、MA、USA)、及びLAS3000ルミネセンス画像アナライザー(Fujifilm)を用いて表示させた。
【０１５０】
FACS分析
フローサイトメトリーによる細胞の免疫表現型試験を、「FACSCaliburフローサイトメーター」装置を用いて行った。それらを収集した後、細胞を「リン酸緩衝食塩水」(PBS)(GIBCO-Life Technologies)で洗浄し、蛍光色素とコンジュゲートされたモノクローナル抗体(1:10)でマーキングした。各試験について、適切な対照アイソタイプ(モノクローナル抗体)を、マーカーの調整のために用いた。最後に、データを、FlowJoソフトウェアで解析した。細胞の表面抗原を検出するために、CD4-フィコエリトリン(PE)-シアニン(Cy)5(BD Pharmingen、San Diego、United States)、CD25-PE(Miltenyi Biotech、Germany)、及びCD127-FITC(1:20)(Clinisciences、Montrouge、France)についての抗ヒトマウス抗体を、製造会社の使用説明書に従って用いた。
【０１５１】
リアルタイム定量的PCR
制御性Tリンパ球の全RNAを、「RNeasy Minikit II」キット(Qiagen)を用いて、製造会社の使用説明書に従い、単離した。RNAの濃度及び純度を、分光光度法(Ultrospec 3000、Pharmacia Biotec)により測定した。全RNAを、次の使用まで-80℃で保存した。
【０１５２】
mRNAの逆転写を以下の通り行った:2μgの全RNAを、1μlのオリゴdT(Roche Diagnostic、Meylan、France)及び0.1μl RNAsin(40U/μl、Promega、Charbonnieres、France)で構成される5μlのマスターミックスと混合し、その後、70℃で5〜10分間、インキュベートした。室温で5分後、以下の10μlの第2のミックスを加えた: 6μl 5×バッファー(Invitrogen)+1μl 0.1M DTT(Invitrogen)+2μl 10mM dNTPs(Amersham)+0.1μl RNAsin 40U/μl(Promega)+1μl Superscript(Invitrogen)。その反応に続いて、45℃での45〜60分間の1回目のインキュベーション、95℃での5分間の2回目のインキュベーション、その後、RNアーゼH(Promega)での20分間の処理を行った。最後に、10ngの全DNA/μlの最終濃度を得るために、超高純度蒸留水(GIBCO-Life Technologies)を加えた。そのDNAを次の使用まで-20℃で保存した。
【０１５３】
転写産物を、96ウェル光学プレート(Eurogentec S.A.、Belgium)において、Mx3005P(商標)配列検出システム(Agilent Technologies、France)でのリアルタイムPCR(RT-PCR)を用いて定量化した。各ウェルにおいて、RT-PCRのために設計され、かつMWG-Biotech社(Germany)から購入された10μlの特異的プライマーペアを、10pg/mlの最終濃度で配置し、-20℃で保存した。β-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)、ユビキチン、及びヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)のハウスキーピング遺伝子を、各プレートにおいて対照として用いた。PCR反応を、Meteor Taq DNAポリメラーゼ、MgCl2(4mMの最終濃度)、dNTPs(dUTPを含む)、SYBR(登録商標)260 Green I、安定剤、及びシグナルの標準化のために必要とされるパッシブリファレンス、並びに最適化成分を含むバッファーを含有する2×MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR(登録商標)258 Assay(Eurogentech)を用いて、20μlの最終体積で、かつ1μlのcDNA(10ngの全RNA/μlに相当)のために、製造会社の使用説明書に従って行った。
【０１５４】
PCRプログラムは、95℃で5分間のMeteor Taqの最初の変性及び活性化、続いて、以下のような40回の標準増幅サイクルを含んだ:95℃で15秒間(変性)、60℃で1分間(合成及び伸長)。蛍光産物を、各サイクルの最終段階で検出した。融解曲線の分析を、増幅後すぐに、製造会社の使用説明書に従って行った。
【０１５５】
定量的PCR反応を用いて、制御性Tリンパ球によるガレクチン-9の遺伝子の発現を定量化した。β-アクチン、G3PDH、ユビキチン、及びヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)のハウスキーピング遺伝子を、対照として用いた。全てのプライマーをRT-PCRのために設計し、MWG-Biotech社(Germany)から購入した。定量的解析を、各ウェルについてのサイクル閾値(CT)に基づいて行い、MxProソフトウェアを用いて計算した。各個々の値を、ΔCT:ΔCT=CT-CTハウスキーピング遺伝子の標準方法に従って4つのハウスキーピング遺伝子の平均を用いて標準化した。群間の比較について、遺伝子の相対的発現を、参照試料に1の任意の値を与えて、
【０１５６】
【数１】
2017521485.tif 000005
【０１５７】
で表した。
【０１５８】
ガレクチン-9に対して方向づけられたモノクローナル抗体1G3及び2E12を産生するハイブリドーマの製造
ヒトガレクチン-9のC末端部分(ガレクチン-9の長いアイソフォームの残基191〜355)を提示する組換えタンパク質を、免疫原として用いた。それは、大腸菌においてGST融合タンパク質の形をとって産生された。GST標識の分離後、そのタンパク質を排除クロマトグラフィーにより精製した。
【０１５９】
免疫化は、PX Therapeutics社(Grenoble、France)によって実施された。週齢8週間の5匹の雌BALB-cマウスを、上で述べられたガレクチン-9のC末端部分で免疫化した。免疫化について、40マイクログラムのタンパク質を、1回目の注射について完全フロイントアジュバントと併せて、又はその後の注射について不完全フロイントアジュバントと併せて、0日目、22日目、37日目、及び54日目に、腹腔内に注射した。免疫化の質を、免疫化マウスに由来した血清試料において下記のELISA試験により評価した。組換えC末端ガレクチン-9の同じ調製物を、一方で免疫化のために、他方でELISA試験のために用いた。これらの試験は、5匹の処理されたマウスにおいて良い免疫化を示した。
【０１６０】
最後の繰り返しから3日後、最良の応答を示した2匹のマウスを屠殺し、それらの脾細胞を摘出した。これらの脾細胞を、液体培地か又は半流動性培地かのいずれかにおいて、それぞれ、5:1及び2:1の比でのSp2/Oマウスミエローマ細胞との融合のために用いた。次に、上で述べられた組換えガレクチン-9調製物について、前と同様に、及び下に記載されているように行われたELiSA試験により、ハイブリドーマ上清を評価した。
【０１６１】
半流動性融合は成功し、ELISAにおいてガレクチン-9と反応する抗体を分泌する39個のハイブリドーマが得られた。免疫グロブリンの特に大量の分泌及びELISAにおける高度活性という理由により、それらのうちの7個を選択した。次に、産生された抗体の抗ガレクチン-9中和性質を研究するために、これらの7個のハイブリドーマを、新しい機能スクリーニングに供した。
【０１６２】
ELISA試験を以下のように行った。ガレクチン-9のC末端部分を提示する組換えタンパク質を、96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio-One、Courtaboeuf、France)のウェル内に以下の様式で吸着させた(50ng/ウェル):pH9.6における0.05M炭酸塩/重炭酸塩バッファー中での溶解、ウェルにおける室温で1時間のインキュベーション。0.1% Tween-20を含有するPBSでの洗浄後、ウェルを、PBSの溶液中3%ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温で1時間、飽和させた。次に、それらを、マウス血清又は試験されるべきハイブリドーマ上清とインキュベートした。血清及びハイブリドーマ上清を、1% BSAを含むPBS中に希釈し、その後、ウェルにおいて、室温で2時間、インキュベートした。0.1% PBS-Tween-20での洗浄工程後、プレートを、ペルオキシダーゼでマーキングされた二次抗体(抗マウス  ヤギ)により処理した。基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン又はTMB;Thermo Fisher Scientific)の添加後、最終の顕色が起こり、Multiskan Exマイクロプレートリーダー(Thermo Fisher Scientific)上で405nm及び620nmにおける吸光度の測定を行った。
【０１６３】
トランスジェニックマウスへのインビボ試験
免疫不全マウスは、第一に、脾臓摘出され、その後、ルシフェラーゼを発現するために改変CNPのC666-1細胞株を異種移植され、そのことは、意識のある動物上でバイオルミネセンスを画像化することにおいて腫瘍成長をモニターすることを可能にする。制御性Tリンパ球が多かれ少なかれ濃縮されたヒトPBMC(最初のPBMCにおいて2%制御性Tリンパ球、及びPBMCにおいて6%〜10%の制御性Tリンパ球の添加)の注射後、マウスの免疫系は再構成され、ヒト化される。PBMCは、腫瘍の成長をある程度まで制限する能力があること、及び制御性Tリンパ球の濃縮が、この効果に干渉しないことは、すでに示されている(Moralesら、Activation of a Helper and Not Regulatory Human CD4+ T Cell Response by Oncolytic H-1 Parvovirus; PLoS One. 2012; 7(2): e32197)。次に、抗Gal-9 1G3抗体を注射し、それの腫瘍成長への効果を評価した。
【０１６４】
以下の実験プロトコールに従った:
週齢6〜8週間のSCIDマウスは脾臓全摘出を受けた。7日後、これらの同じマウスに、上咽頭癌(NPC)に由来した(ルシフェラーゼを発現する)C666-luc腫瘍株の細胞を皮下に異種移植する。同じ日、マウスは、免疫系の再構成のために10%制御性Tリンパ球で濃縮された、又は濃縮されていない3千万〜5千万個のPBMCを腹腔内に受け、動物により、2μg、20μg、又は200μgのIgG1抗体又は1G3抗体を、以下のスキームに従って皮下に受けた(3匹のマウス/群):
-  群1:  IgG1アイソタイプ(再構成されていない)
-  群2:  1G3 (再構成されていない)
-  群3:  再構成された+10% Treg+IgG1アイソタイプ
-  群4:  再構成された(未処理)
-  群5:  再構成された+10% Treg+1G3
【０１６５】
全てのマウスは、免疫応答を活性化するために3μgのCPG-ODN2216(Miltenyi Biotech社により市販されている)を受けた。
【０１６６】
モニタリングを、小動物画像化プラットフォーム(IVIS(登録商標)Lumina XRMS、PerkinElmer)上でのルミネセンス読み取りにより、及び腫瘍体積及び質量の手作業での測定により、4週間の間、週に3回、行う。移植後7日目、14日目、及び21日目に、マウスは、CPG-ODN2216(Miltenyi Biotech社により市販されている)の繰り返し、及び前に提示された群に従って、1G3又はIgG1抗体の繰り返しを受ける。フローサイトメトリーにより再構成を検証するために、最初の繰り返し前に血液試料を採取する(プロコトール  58ページ参照)。28日間の測定後、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、免疫組織化学又は免疫蛍光プレートの調製を見込んで凍結保存し、フローサイトメトリーによる分析のために、血液試料をもう一度、採取する。
【０１６７】
様々な濃度[2μg/ml、20μg/ml、及び200μg/ml]の1G3及びIgG1アイソタイプの影響を、(i)マウスの体重、(ii)腫瘍体積、及び(iii)屠殺時点での腫瘍質量に関して評価した。
【０１６８】
(i)1G3抗体の注射のマウスの体重への影響の分析
入ってきたマウスの体重を定期的に測る[5日目から28日目まで]。
【０１６９】
(ii)1G3の腫瘍体積(手作業での測定)への影響の分析
上記のプロトコールに従い、かつ注射される1G3及び1G1の濃度を変化させるいくつかの個々の実験を、ヒト化SCIDマウスに実施した。腫瘍の体積を手作業で測定した。
【０１７０】
更に、1G3の腫瘍体積への影響を表すグラフを得るために、6つの独立したインビボ実験を含有する平均した結果を、1G3抗体又は対照アイソタイプ(20μg)に関して導き出した。
【０１７１】
統計解析を、順位和マンホイットニー検定により行った(*p<=0.05、**p<=0.001)。
【０１７２】
腫瘍の体積をまた、ルシフェリンの注射後、ルシフェラーゼの遺伝子を発現する腫瘍細胞により放射されるバイオルミネセンスの分析によって測定した。ルミネセンスを、マウスバイオルミネセンス測定システム(IVIS LUMINA)の使用により測定する。上記のプロトコールに従い、かつ注射される1G3及び1G1の濃度を変化させる6つの個々の実験を、ヒト化SCIDマウスに実施した。
【０１７３】
更に、1G3の腫瘍体積への影響を表すグラフを得るために、6つの独立したインビボ実験の平均結果を、1G3抗体又は対照アイソタイプ(20μg)に関して導き出した。
【０１７４】
最後に、安楽死時点での腫瘍のサイズを測定するために、1G3又は対照アイソタイプIgG1で処理されたマウスの腫瘍を、ミリメートル紙の上で写真撮影した。
【０１７５】
(iii)1G3の腫瘍質量への影響の分析
1G3又は対照アイソタイプIgG1で処理されたマウスの腫瘍の重量を、屠殺後、測った。その量はグラムで表される。
【０１７６】
統計解析を、順位和マンホイットニー検定により行った(*p<=0.05、**p<=0.001)(図22)。
【０１７７】
ガレクチン-9による制御性Tリンパ球の誘導を阻害する1G3の能力の分析
ガレクチン-9が、ナイーブCD4 T細胞のTregリンパ球への分化を誘導する能力があることは示されており(Seki、Oomizuら、2008)、そのことは、抗腫瘍免疫応答の疲弊の現象におけるこのレクチンの重要性を強固にしている。
【０１７８】
したがって、まず第一に、ガレクチン-9がTconv細胞をTregへ変換することができるかどうかをチェックした。Tconv細胞を、ガレクチン-9のアイソフォーム(Gal-9 S又はGal-9 M)の有り又は無し、1G3の有り又は無しで、活性化又は非活性化条件下で3日間又は5日間、培養した。これらの条件付け段階後、細胞を回収し、洗浄し、フローサイトメトリーにより分析し、PBMC又は自己Tconv細胞と共培養した。培地もELISA分析のために回収した。
【０１７９】
プロコトールは以下の通りである:PBMCを、Ficoll勾配上での精製により単離し、通常のTリンパ球を、供給会社(Miltenyi Biotech、T細胞単離キット)のプロトコールに従って磁気カラムにおいて単離した。PBMCの一部を、非活性化条件下で保存し、自己Tconvを、活性化及び非活性化条件下で5日間、培養する。活性化は、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Anne Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)により行われる。
【０１８０】
これらのT細胞は、3μg/mlでの1G3抗体の存在下又は非存在下で、2μg/mlでのGal-9 S又はMのアイソフォームにより条件付けされ、又は条件付けされない。5日後、条件付けされたTconvを洗浄し、生存率をトリパンブルーでの計数により確立し*(下記参照)、ELISA試験を目的として上清を回収し、CD4、CD25、及びCD127マーカーの発現を測定するために、105個の細胞をフローサイトメトリーにより分析する。通常の細胞の残りを、MLR試験のために保存していた自己PBMCと接触させて置く。
【０１８１】
1G3又は2E12抗体の存在下又は非存在下で、105個の条件付けされたTconvを105個の自己PBMCと共培養(比1:1)に置くことにより、抑制試験をMLR(混合リンパ球培養反応)により実施する。細胞は、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)1μg/mlの抗CD3、及び抗CD28(100ng/ml)で活性化される。
【０１８２】
3日間の共培養後、培養の終了の18時間前に、1μCi/ウェルのトリチウム標識されたチミジン(3H Th)(GE Healthcare、France)の取り込みにより増殖を評価する。3日後、プレートを、ガラス繊維フィルター(PerkinElmer、France)上で濾過する。フィルターを、シンチレーション液(Beckman Instruments Inc、Ready Safe、USA)においてインキュベートし、シンチレーションカウンター(1450 Trilux、Wallac、Finland)で読み取る。最後に、結果は、1分あたりのカウント(cpm)で表される。統計解析を順位和マンホイットニー検定により行う(*p<=0.05、**p<=0.001)。
【０１８３】
トリパンブルーでの計数
死細胞を着色するための重要なアゾ色素(トリパンブルー)。計数は、細胞懸濁液の1体積について0.4%トリパンブルー溶液(Sigma、USA)の1体積の取り込みにより評価される。3分後、その混合物を、Thomasプレート上に置く。青色に表示される死細胞、及び屈折性生細胞をカウントする。測定は3連で行われ、結果は生細胞のパーセンテージとして表される。
【０１８４】
ELISAによるガレクチン-9の分泌の測定
抗Gal-9抗体(クローン:SEA309Hu- Uscn Life Science Inc、USA)の0.2μg/ml溶液の50μlを、96ウェルプレート(NUNC、Denmark)内に4℃で一晩、固定する。1×PBS(Euromedex、France)-Tween(Sigma Aldrich、USA)0.05%での4回の洗浄後、プレートを、3% PBS-BSA(Sigma Aldrich(登録商標)、USA)で、室温で2時間、飽和させる。その後、それらを0.05% PBS-Tweenで3回、洗浄する。活性化された、又は活性化されていないTregリンパ球の培養上清の100μl/ウェルを、2連に置き、室温で2時間、インキュベートする。Tregリンパ球は、通常に、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Anne Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)により活性化される。
【０１８５】
各プレート上において、1% PBS-BSA中2.5ng/ml又は2.5pg/mlの濃度での一連の組換えガレクチン-9(Uscn Life Science Inc、USA)が行われる。
【０１８６】
PBS-Tweenでの3回の洗浄後、100μl/ウェルの1μg/mlでのビオチン化二次抗体を室温で1時間、インキュベートする。プレートをもう一度、3回、洗浄し、その反応物を、100μl/ウェルの1/10000でのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼの添加により、室温で30分間、増幅する。4回の洗浄後、プレートを、1mg/mlでOPD(O-フェニレンジアミンジヒドロクロライド)(Sigma-Aldrich(登録商標)、USA)を含む100μl/のウェル顕色溶液により、暗所中、10分間、顕色させる。この反応は、50μl/ウェルの2N HCl(VWR、USA)の添加により停止される。
【０１８７】
次に、プレートを、分光光度計(Multiskan Ex、ThermoLabsystems、France)を用いて、492nmの波長で読み取る。
【０１８８】
PBMCの生存率の測定
生死判別試験を、CellTiter-Glo方法により直接的に実施し、その方法は、ミトコンドリア代謝を測定することを可能にする。同じプロトコールを、Tconvリンパ球の生存率を評価するために用いる。
【０１８９】
2×105個の自己PBMCを共培養に置く。その細胞を、条件に依存して、活性化し[プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Anne Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)による活性化]、又は活性化せず、3μg/ml、6μg/ml、又は12μg/mlの濃度での1G3抗体又は対照アイソタイプ1G1とインキュベートする。培養は、不透明な「壁」を有する平底96ウェルプレート(Corning 3610、Corning Incorporated、USA)において100μlの培地(DMEM+4.5g/lグルコース+L-グルタミン、100U/mMのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%非働化ヒトAB血清)(GibcoBRL(商標)、Life Technologies、GB)中、行われる。
【０１９０】
試験は、Promega CellTiter-Gloルミネセント細胞生存率アッセイキット(Promega Corporation、USA)(細胞生存能の指標として細胞代謝(ATP)を測定するために、酸素の存在下でのルシフェラーゼの活性を用いる)を用いる。48時間の培養後、100μlの試薬(ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウムを含有するバッファー)を各ウェルに加え、プレートを2分間、撹拌し、その後、室温で光を避けて15分間、インキュベートする。試験は、3連で行われ、プレートは、ルミノメーター(Centro LB960、C Berthold Technologies、France)で読み取られる。読み取りは1秒間/ウェル。
【０１９１】
フローサイトメトリー(Facs)によるTconvリンパ球の膜マーキング
用いられる抗体(Ac)
蛍光色素と連結された抗ヒトモノクローナル一次抗体、抗CD4-PE(フィコエリトリン)-C(シアニン)5(BD Pharmingen TM、USA)、抗CD25-PE(Miltenyi Biotech、France)、抗CD127-FITC(フルオレセインイソチオシアネート)(Clinisciences、France)。
【０１９２】
補正のため、様々なモノクローナル抗体の対照アイソタイプを用いた。
【０１９３】
直接的マーキングプロトコール
100μlの体積の滅菌PBS(GIBCO BRL(商標)、Invitrogen(登録商標)、GB)中に細胞(2×105個)を採取し、10μlの抗CD4-PC、10μlの抗CD25-PE、及び4μlの抗CD127-FITCと、暗所中、室温で30分間、インキュベートする。次に、マーキングされた細胞を、400μlのPBSと共に採取し、蛍光を、Facscalibur(FACS Flow Supply System、Becton Dickinson、USA)によるフローサイトメトリーにより分析する。
【０１９４】
サイトメトリー結果を、Flow Joソフトウェア(Tree Star Incorporation、USA)により解析する。いくつかの実験について、マーキングされた抗体の添加後、細胞は、サイトメーターによる分析の前に、100μlの4% FBA(Sigma-Aldrich、USA)の添加により10分間、固定され、その後、200μlのPBS中に採取される。
【０１９５】
増殖及び抑制(MLR)(2E12)
増殖チェック
増殖試験を、48時間培養された105個のPBMCについて実施する。細胞を、96ウェル丸底プレート(Nunc、Denmark)において200μlの培地(RPMI-1640、1% 2mM L-グルタミン、0.02mMのピルビン酸ナトリウム、100U/mMのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の非働化ヒトAB血清)(GibcoBRL(商標)、Invitrogen、GB)中、培養する。それらを、1G3又は2E12抗体の存在下又は非存在下で、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Ann Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)により活性化する。
【０１９６】
抑制
1G3又は2E12抗体の存在下又は非存在下で、6×104個のTregを105個の自己PBMCとの共培養に置くことにより、抑制試験をMLR(混合リンパ球培養反応)により実施する。細胞は、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)1μg/mlの抗CD3、及び抗CD28(100ng/ml)で活性化される。
【０１９７】
培養の終了の18時間前に、1μCi/ウェルのトリチウム標識されたチミジン(3H Th)(GE Healthcare、France)の取り込みにより増殖を評価する。48時間後、プレートを、ガラス繊維フィルター(PerkinElmer、France)上で濾過する。フィルターを、シンチレーション液(Beckman Instruments Inc、Ready Safe、USA)においてインキュベートし、シンチレーションカウンター(1450 Trilux、Wallac、Finland)で読み取る。最後に、結果は、1分あたりのカウント(cpm)で表される。
【０１９８】
結果
PBMC及び制御性Tリンパ球の表現型分析
PBMCのフローサイトメトリー(FACS)における分析は、制御性Tリンパ球CD4+CD25+CD127-が、総PBMCの1%に相当することを示している(結果未呈示)。
【０１９９】
更に、エキソビボで単離された自己制御性Tリンパ球の表現型マーカーのFACS分析は、制御性Tリンパ球の95%が、CD4+CD25+であること、及びこれらの細胞のうち、90%がCD127-又はCD127低であり、かつ86%より多くがFoxP3+であることを示している(図1)。
【０２００】
活性化制御性Tリンパ球は抑制活性を有する
健康なドナー血液からエキソビボで単離されたヒト制御性Tリンパ球の抑制活性を、2つの補完的機能分析:自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの増殖の抑制の試験、及び自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの細胞溶解の試験により特徴づけた(図2)。
【０２０１】
図2Aは、活性化PBMC単独が、インビトロでよく増殖するが、エキソビボで単離された制御性Tリンパ球は、その活性化後さえもアネルギー性であることを示している。しかしながら、活性化PBMCの増殖は、4:2の比での活性化自己制御性Tリンパ球の存在下で24%より大きく減少している(図2A参照)。したがって、増殖試験(MLR)は、明らかに、エキソビボで単離され、かつ活性化状態にある制御性Tリンパ球が免疫抑制活性を有することを示している。
【０２０２】
増殖試験により得られた結果は、細胞溶解試験の結果により強化される。実際、図2Bにおいて、PBMC:制御性Tリンパ球の比が低ければ低いほど、活性化PBMCの溶解のパーセンテージが高いことが示されている。したがって、制御性Tリンパ球は、異なる比率で、かつ用量依存性様式で、自己PBMCの溶解を誘導する。
【０２０３】
ガレクチン-9は、制御性Tリンパ球上に存在し、かつそれによって発現している
リアルタイム定量的PCR(図3)及びウェスタンブロット(図4)による分析は、ガレクチン-9が、エキソビボで単離されたヒト制御性Tリンパ球上に存在すること、及び後者がガレクチン-9を発現することを示しており、制御性Tリンパ球が、ガレクチン-9チャネルを用いて、エフェクターTリンパ球の増殖を阻害することを示唆している。
【０２０４】
エフェクターTリンパ球によるガレクチン-9の発現は活性化で減少する;制御性Tリンパ球によるガレクチン-9の発現は活性化で増加する
図14は、Tconvリンパ球及び非活性化制御性Tリンパ球が、非常に少量のガレクチン-9(<10pg/ml:すなわち、ELISA試験の検出閾値より低い)を産生するが、活性化ヒト制御性Tリンパ球は、ガレクチン-9を合成し、かつ細胞外環境において分泌する能力があることを示している。更に、このガレクチン-9の分泌は、制御性Tリンパ球が活性化されている場合、有意に多く、そのことにより、この分泌をそれらの抑制機能に結びつけられる。
【０２０５】
図5は、通常のCD4+Tリンパ球と制御性Tリンパ球の比が活性化中にかなり減少することを示している。
【０２０６】
活性化された通常のCD4+Tリンパ球は、ガレクチン-9をコードする遺伝子をほんの少しだけ発現し、この発現は、それの活性化中、有意に減少する。
【０２０７】
他方、制御性Tリンパ球によるガレクチン-9をコードする遺伝子の発現は、それの活性化中、増加する(図5及び図6参照)。
【０２０８】
したがって、抗腫瘍作用を有するTリンパ球の構成的に活性化した効果は、抗Gal-9抗体の標的ではないだろう。他方、活性化され、それに従って、機能性である制御性Tリンパ球は、抗Gal-9抗体の格好の標的であろう。
【０２０９】
制御性Tリンパ球及びCD4+T細胞におけるガレクチン-9の異なるタンパク質発現の分析は、フローサイトメトリーにより強化された。図10を見ればわかるように、基礎的な発現は低く、制御性Tリンパ球と新鮮に単離されたCD4+T細胞との間ではほとんど同一である。それにもかかわらず、TCR(抗CD3/抗CD28)の活性化後、ガレクチン-9を非常に強く発現する制御性Tリンパ球における集団の出現に伴い、発現プロファイルが変化することが見出されている。この過剰発現は持続し、かつ時間に比例して増加するが、ガレクチン-9の基礎的発現はCD4+Tconv細胞において活性化後さえも低いままである(図10)。
【０２１０】
したがって、ガレクチン-9の過剰発現は、活性化制御性Tリンパ球に特異的であること、及び基礎条件下及び活性化後、CD4+Tconv細胞においてガレクチン-9の非常に低い発現があることが実証されている。したがって、エフェクターCD4+Tリンパ球を標的にするリスクは排除され、そのことは、本発明に従って治療されることになっている患者が免疫防御を維持することを可能にする。
【０２１１】
制御性Tリンパ球の抑制活性が、抗ガレクチン-9 1G3抗体により阻害される
1G3抗体の制御性Tリンパ球の活性への影響をインビトロで評価するために、トリチウム標識されたチミジンの取り込みに基づいた細胞増殖試験を用いた。
【０２１２】
図7は、制御性Tリンパ球の存在下又は非存在下、及び1μg/mlの濃度での1G3抗体の存在下又は非存在下での、照射されたC15の存在下におけるPBMCの増殖に関する試験の結果を示している。
【０２１３】
第一に、PBMCの活性化が、実際、それらの増殖の増加を生じること、及び制御性Tリンパ球の存在が、実際、PBMCの細胞増殖の低下を生じることが、試験の陽性対照により確認されている。
【０２１４】
C15腫瘍細胞の照射が、実際、それらの増殖の停止を引き起こすこともまた示されている。C15細胞はアネルギー性である。
【０２１５】
C15腫瘍細胞の存在は、実際、ヒトPBMCの細胞増殖の低下を生じる。
【０２１６】
次に、PBMCとC15の共培養における制御性Tリンパ球の存在が、およそ56%の、増殖の有意なさらなる低下を引き起こすことが示されている。
【０２１７】
図7は、明らかに、予想外のことには、1G3抗体の存在が、PBMCの増殖を回復することを可能にすることを示している。したがって、1G3抗体が、制御性Tリンパ球上に存在し、かつそれによって発現したガレクチン-9を中和することが示唆されている。結果的に、1G3抗体が、制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害することが示されている。
【０２１８】
1G3抗ガレクチン-9抗体が、他の抗ガレクチン-9抗体より優れた効力をもつ
1G3抗体の制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害への効果を他の抗ガレクチン-9抗体と、又は更に抗TIM3抗体と比較するために、いくつかの試験を実施した。
【０２１９】
したがって、様々な抗ガレクチン-9抗体の、ガレクチン-9により引き起こされるアポトーシスの阻害への効果、及びヒトPBMCのガレクチン-9での処理後の増殖の回復への抗ガレクチン-9抗体の効果を分析した。1G3と比較して試験される抗ガレクチン-9抗体は、1G3抗体と同じガレクチン-9のエピトープを認識しない。
【０２２０】
抗TIM3抗体もまた試験した。これは、Tリンパ球上に存在するだろうTim-3受容体と、ガレクチン-9のアポトーシス促進効果との間の関連に関してある理論が浮上しているからである。
【０２２１】
ガレクチン-9により引き起こされるアポトーシスの阻害
図8は、組換えガレクチン-9により引き起こされるジャーカットのアポトーシスへの、試験された抗体の効果に関する試験の結果を示す。
【０２２２】
試験された抗体は、9M1(抗ガレクチン-9)、9S2-3(抗ガレクチン-9)、及び1G3(抗ガレクチン-9)抗体、並びに抗TIM3、2E12(抗ガレクチン-9)抗体である。
【０２２３】
図8を見ればわかるように、ジャーカットのアポトーシスからの保護は、1G3抗体に関して、他の抗ガレクチン-9抗体9S2-3及び9M1、又は抗TIM3抗体に関するより良い。
【０２２４】
ガレクチン-9での処理後の増殖の回復
図9は、あらかじめガレクチン-9で処理されたヒトPBMCの増殖への、試験された抗体の効果に関する試験の結果を示す。
【０２２５】
試験された抗体は、ECA-42(抗ガレクチン-9)、1G3(抗ガレクチン-9)、2E2(抗TIM3)、及び2E12(抗ガレクチン-9)抗体である。
【０２２６】
図9を見ればわかるように、ヒトPBMCの増殖は、1G3抗体に関して、他の抗ガレクチン-9抗体、ECA-42及び2E12、又は抗TIM3抗体(2E2)に関するより効果的に回復している。
【０２２７】
Tconvリンパ球(T CD4+)への効果
図11は、新鮮に単離された細胞に関する増殖を、培養の最後の18時間の間のトリチウム標識されたチミジンの取り込みにより測定することによる、ガレクチン-9及び1G3のTconvリンパ球(T CD4+)への効果に関する試験の結果を示す。結果はまた、1分あたりのカウント(cpm)で示されている。
【０２２８】
PBMCのように(図9)、エキソビボで単離されたTconvリンパ球は、活性化条件下で増殖する。ガレクチン-9が、PBMCと同じように、Tconvリンパ球の増殖を有意に阻害することも示されている。
【０２２９】
最後に、抗ガレクチン-9(1G3)抗体が、Tconvリンパ球の増殖に少しの効果も生じないことは、この図11において注目されるべきである。
【０２３０】
1G3抗体及びその対照アイソタイプの、PBMCの増殖への細胞傷害性効果の分析
1G3抗体又はその対照アイソタイプ(IgG1)の増加性用量の効果を、3人のドナーの血液から抽出された新鮮に単離される細胞に関する増殖を、培養の最後の18時間の間のトリチウム標識されたチミジンの取り込みにより測定することにより、PBMCに関して分析した。結果は、CPMで得られた。
【０２３１】
図12において、エキソビボで単離PBMCが、インビトロで、活性化条件下において増殖することが観察される。更に、1G3抗体及びその対照アイソタイプIgG1が、高用量のモノクローナル抗体(3μg/mlから12μg/mlまで)に関してさえ、PBMCの増殖に影響しないことは注目されるべきである。
【０２３２】
1G3抗体及びその対照アイソタイプの、PBMCの生存率への細胞傷害性効果の分析
mAb 1G3及びその対照アイソタイプ(1G1)の用量の増加を、3人のドナーから新鮮に単離されたPBMCの生存率を発光分析により測定することにより分析した。ミトコンドリア代謝を、5日間の活性化の間、測定した。結果はRLUで得られた。
【０２３３】
図13は、エキソビボで単離されたPBMCが、インビトロで活性化条件下においてそれらの生存率を維持し、かつ増加させることを示している。これはまた、1G3及び1G1アイソタイプが、高用量の抗体(3μg/mlから12μg/mlまで)においてさえ、PBMCの生存率を改変しないことを実証している。
【０２３４】
したがって、1G3抗体は、PBMC及びヒトT CD4+の増殖にも生存率にも影響しないことが実証されている。したがって、腫瘍進行に好都合であろう免疫抑制の誘導等の二次的効果のリスクが低下している。これは、本発明に従って治療されることになっている患者において、免疫防御、特に抗腫瘍のより良い維持を可能にする。
【０２３５】
制御性Tリンパ球の抑制活性への1G3の中和効果の分析
1G3抗体による制御性Tリンパ球の機能の阻害についての可能性を、制御性Tリンパ球及び通常のTリンパ球の混合白血球培養反応の増殖に関する試験により分析した。
【０２３６】
予想した通り、結果は、制御性Tリンパ球が、共培養中の細胞の増殖を阻害することを実証した(図15)。加えて、1G3との2時間の前培養が、この阻害効果を逆転させるのに十分であった。1G3の対照アイソタイプの使用はTregリンパ球へ効果を生じず、そのことにより、制御性Tリンパ球により引き起こされる阻害のこの逆転が特異的であり、かつガレクチン-9を介して起こると結論づけることができる。
【０２３７】
1G3が制御性Tリンパ球を阻害するのが、可溶性ガレクチン-9に作用することによるのか、又は直接的に制御性Tリンパ球に作用することによるのかを決定するために、可溶性ガレクチン-9をブロックする阻害剤を用いて試験を行い、1G3抗体で得られた結果と比較した。
【０２３８】
結果は明らかに、化学的阻害剤が、制御性Tリンパ球の抑制活性へ有意な効果を生じなかったことを示している。1G3抗体と共の使用は、再び、制御性Tリンパ球により誘導される抑制の逆転を引き起こした。したがって、これらの結果は、ガレクチン-9が、制御性Tリンパ球により誘導される抑制において作用すること、及び1G3はこの阻害を逆転させる能力があることを確認している。
【０２３９】
制御性Tリンパ球の抑制活性のインビボ中和
様々な濃度[2μg/ml、20μg/ml、及び200μg/ml]の1G3及びIgG1アイソタイプの影響を、(i)マウスの体重、(ii)腫瘍体積、及び(iii)屠殺時の腫瘍質量に関して評価した。
【０２４０】
(i)1G3抗体の注射のマウスの体重への影響の分析
図18A及びBを見ればわかるように、1G3で処理されたマウスは、対照アイソタイプにより処理されたものと比較してより軽い。これらの結果は、処理されたマウスの体重の減少が腫瘍の減少と関係し得ることを示唆している。
【０２４１】
(ii)1G3の腫瘍体積への影響の分析(手作業での測定)
図19A〜Dに示された、得られた結果は、1G3のポジティブな結果を示し、1G3は、対照アイソタイプと比較して、腫瘍成長の有意な制限を引き起こしている。
【０２４２】
更に、図20に提示された結果は、明らかに、1G3による免疫化とその対照アイソタイプによる免疫化の間での有意な差を示しており、1G3を通しての腫瘍成長は大きく制限されている。
【０２４３】
これらの結果はまた、バイオルミネセンス測定(図21A〜D、図22)によっても確認され、1G3がその対照アイソタイプと比較して腫瘍成長への制限を誘導した。
【０２４４】
最後に、腫瘍の写真(未呈示)もまた、1G3の対照アイソタイプと比較して腫瘍成長への制限を引き起こす、1G3のポジティブな効果を示している。
【０２４５】
(iii)1G3の腫瘍のサイズへの影響の分析
腫瘍の質量に関する結果(図23)もまた、1G3の、その対照アイソタイプと比較しての有益な効果を確認している。
【０２４６】
ガレクチン-9による制御性Tリンパ球の誘導を阻害する1G3の能力の分析
ガレクチン-9が、ナイーブCD4 Tリンパ球のTregリンパ球への分化を誘導する能力があることは示されており(Sekiら、「Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis」; Clin Immunol. 2008年4月; 127(1):78〜88頁. doi:10.1016/j.clim.2008.01.006.電子出版2月20日)、そのことは、抗腫瘍免疫応答の疲弊の現象におけるこのレクチンの重要性を強固なものにしている。
【０２４７】
図25に提示された結果は、明らかに、ガレクチン-9の各アイソフォームで条件づけされたCD4+Tconvリンパ球は、抑制表現型を獲得し、PBMCの増殖を阻害することを示している。この阻害は、ガレクチン-9のS(短い)型に関して、M(中位)型に関するより強い。条件付けの間に1G3を加えることは、この抑制表現型の確立を阻害し、かつガレクチン-9を中和することにより増殖を有意に回復させることもまた見出されている。
【０２４８】
更に、図24に示されているように、試験の終了時点での細胞のFACS分析は、ガレクチン-9の各アイソフォームがCD25の発現の増加を引き起こすことを示している。しかしながら、図24によって示されているように、活性化された細胞は、通常時、CD25を過剰発現する。
【０２４９】
結果は、明らかに、ガレクチン-9をTconvリンパ球へ加えることが、(i)S型又はM型のガレクチン-9に関して、活性化Tconvリンパ球と比較してCD4の発現のわずかな増加を引き起こし、(ii)M型又はS型のガレクチン-9での条件付け段階中を除いて、CD127の発現への効果を生じず、(iii)M型又はS型のガレクチン-9に関して、活性化Tconvリンパ球と比較してCD25の発現の有意な増加を引き起こすことを示している。
【０２５０】
したがって、図24は、Tconvリンパ球のM型又はS型のガレクチン-9とのプレインキュベーションが、おそらくより高い抑制表現型という理由で、CD4及びCD25マーカーの発現を増加させることを示している。とは言っても、この仮説は、それがこれらの条件付けされたTconvリンパ球の抑制活性と相関している(そのことは、抑制表現型を確証することを可能にし、それは事実である(図25参照))場合に限り、受け入れられる。
【０２５１】
結論として言えば、ガレクチン-9が、通常のCD4+Tリンパ球の免疫抑制因子CD4+Tリンパ球への変換を引き起こすことが示されている。1G3抗体は、この変換の誘導を中和し、それゆえに、本発明に従って治療されることになっている患者において抗腫瘍免疫応答の維持を促進する能力がある。
【０２５２】
Tregリンパ球の抑制活性への2E12の中和効果の分析
2E12抗体による制御性Tリンパ球の抑制機能の阻害についての可能性を、制御性Tリンパ球の自己PBMC(2人の無関係のドナー)との混合白血球培養反応の増殖に関する試験により分析した。
【０２５３】
結果は、図26を見ればわかるように、制御性Tリンパ球の2E12との2時間の前培養が、制御性Tリンパ球による細胞の増殖の阻害を逆転するのに十分であったことを示している。2E12のこの対照アイソタイプの使用は、制御性Tリンパ球に効果を生じず、そのことにより、本発明者らは、制御性Tリンパ球の誘導型阻害のこの逆転が特異的であり、かつガレクチン-9を介して起こると再度、結論づけることができる。
【０２５４】
更に、1G3のように、2E12抗体は、この阻害を逆転させる能力があることが観察される。しかしながら、2E12の効力は、1G3と違って、PBMCの増殖のわずかな低下が観察される点において、実質的に1G3より高くない。
【０２５５】
(参考文献)
2017521485.tif 000006
2017521485.tif 000007
【図１】
2017521485.tif 000008
【図２】
2017521485.tif 000009
【図３】
2017521485.tif 000010
【図４】
2017521485.tif 000011
【図５】
2017521485.tif 000012
【図６】
2017521485.tif 000013
【図７】
2017521485.tif 000014
【図８】
2017521485.tif 000015
【図９】
2017521485.tif 000016
【図１０】
2017521485.tif 000017
【図１１】
2017521485.tif 000018
【図１２】
2017521485.tif 000019
【図１３】
2017521485.tif 000020
【図１４】
2017521485.tif 000021
【図１５】
2017521485.tif 000022
【図１６】
2017521485.tif 000023
【図１７】
2017521485.tif 000024
【図１８】
2017521485.tif 000025
【図１９ＡＢ】
2017521485.tif 000026
【図１９ＣＤ】
2017521485.tif 000027
【図２０】
2017521485.tif 000028
【図２１ＡＢ】
2017521485.tif 000029
【図２１ＣＤ】
2017521485.tif 000030
【図２２】
2017521485.tif 000031
【図２３】
2017521485.tif 000032
【図２４】
2017521485.tif 000033
【図２５】
2017521485.tif 000034
【図２６】
2017521485.tif 000035
【配列表】
2017521485000001.app
【国際調査報告】
2017521485.tif 000036
2017521485.tif 000037
2017521485.tif 000038
2017521485.tif 000039
2017521485.tif 000040
2017521485.tif 000041