(57)【要約】  サンプル（２０）を画像化するための光学構成（１０）が開示される。この構成は、照明ビーム（４０）を作り出すための照明対物レンズ（３０）と、サンプル（２０）からの放射（６０）を画像化するための検出対物レンズ（５０）とを含む。照明対物レンズ（３０）は、検出対物レンズ（５０）に対して非垂直角度で配列される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル・マウント（２３）に装着されたサンプル（２０）を画像化するための光学構成（１０）であって、
−  照明（４０）を作り出すための照明対物レンズ（３０）と、
−  前記サンプル（２０）からの放射（６０）を画像化するための検出対物レンズ（５０）と
を備え、
それによって、前記照明対物レンズ（３０）が、前記サンプル・マウント（２３）のまわりの前記検出対物レンズ（５０）に対して鈍角で前記サンプル・マウント（２３）のまわりに配列される、光学構成（１０）。
【請求項２】
前記照明対物レンズ（３０）および前記検出対物レンズ（５０）が、実質的に水平な面に配置される、請求項１に記載の光学構成。
【請求項３】
前記照明対物レンズ（３０）および前記検出対物レンズ（５０）からなる面に垂直な方向に位置づけられたカメラ（８０）をさらに備える、請求項１または２に記載の光学構成（１０）。
【請求項４】
平行移動可能な照明ビーム発生器（３６、７０、９０）を前記照明対物レンズ（３０）の後焦点面（３４）にさらに備える、上述の請求項のいずれかに記載の光学構成（１０）。
【請求項５】
平行移動可能な照明ビーム発生器（３６、７０、９０）が、可動ミラー（７０）を含む、請求項４に記載の光学構成（１０）。
【請求項６】
前記カメラと前記平行移動可能な照明ビーム発生器（３６、９０）とに接続された制御プロセッサ（９５）をさらに含む、請求項４または５のいずれか一項に記載の光学構成。
【請求項７】
前記サンプル・マウント（２２）のまわりの前記照明レンズ（３０）に対してさらなる非垂直の角度で配列されたさらなる検出レンズ（５７）をさらに含む、上述の請求項のいずれかに記載の光学構成（１０）。
【請求項８】
照明対物レンズ（３０）および検出対物レンズ（５０、５７）として交互に使用することができる複数の対物レンズ（３０、５０、５７）を含む、上述の請求項のいずれかに記載の光学構成（１０）。
【請求項９】
前記複数の対物レンズ（３０、５０、５７）のうちの３つが、前記複数の対物レンズ（３０、５０、５７）に対して互いにほぼ１２０°で配列される、請求項８に記載の光学構成（１０）。
【請求項１０】
前記照明対物レンズ（３０）の中の検出器（１００）に接続された画像プロセッサ（１１０）をさらに含む、上述の請求項のいずれかに記載の光学構成（１０）。
【請求項１１】
前記照明（４０）が、前記サンプル（２０）上に投影される１次元ラインの形態のものである、上述の請求項のいずれかに記載の光学構成（１０）。
【請求項１２】
照明（４０）を作り出すための照明対物レンズ（３０）と、浸漬媒体（２２）の中のサンプル（２０）からの放射（６０）を画像化するための検出対物レンズ（５０）とを備える光学構成において前記サンプル（２０）を画像化する方法であって、前記照明対物レンズ（３０）および前記検出対物レンズ（３０）が、互いに鈍角で配列され、
−  照明（４０）を生成するステップと、
−  前記照明対物レンズ（３０）の後部の中にオフセンタ方向で前記照明（４０）を誘導するステップと、
−  前記浸漬媒体（２２）からの放射をモニタするステップと、
−  前記オフセンタ方向を変更するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記浸漬媒体（２２）からの前記放射が、信号を制御プロセッサ（９５）に供給するカメラ（８０）によって画像化され、前記制御プロセッサ（９５）が、前記照明（４０）の前記誘導を制御する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御プロセッサ（９５）が、可動ミラー（７０）の位置を制御する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月２５日に出願にされた英国特許出願第１３２０７３３．７号の優先権および利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、サンプルを画像化するための光学構成（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
顕微鏡は、それ自体小さすぎるか、または小さすぎて肉眼では見ることができない細部を有する物体を画像化するために使用される科学器具である。市場で入手できる多くのタイプの顕微鏡がある。これらのうちの最も一般的なもので、最初に発明されたものは、いわゆる光学顕微鏡であり、それは、サンプルの画像を拡大するためにレンズ系における光を使用する。光学顕微鏡からの画像は、接眼レンズを通して観察するか、または、現在ではより一般的に、いわゆる顕微鏡写真を生成するために感光性カメラによって捕捉することができる。画像は、以前は、写真フィルムに捕捉されたが、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラの最新の開発により、デジタル画像の捕捉および記憶が可能になっている。
【０００４】
光学顕微鏡で使用されている照明源は、何年にもわたって開発されており、異なる波長の光または他のタイプの放射を放出することができる多種多様な照明源が現在利用可能である。照明源と画像化されるべきサンプルとの間に光フィルタを置いて、サンプルを照明する放射の波長を制限することができる。
【０００５】
最新の生物顕微鏡検査は、サンプルとしての細胞内の特定の構造を画像化するために蛍光プローブを使用する。通常の透過照明光顕微鏡検査とは対照的に、蛍光顕微鏡検査におけるサンプルは対物レンズを通して狭い組の光波長を用いて照明される。これらの狭い組の光波長はサンプル中の蛍光体と相互作用し、次に、蛍光体は異なる波長の光を放出する。この放出された／蛍光を放たれた光を使用して、サンプルの画像が構築される。
【０００６】
欧州特許第１０１９７６９号（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊｅｎａ）は、単一対物レンズまたは二重対物レンズ系を有する顕微鏡として使用することができるコンパクトな共焦点シータ顕微鏡を教示している。顕微鏡は、照明および検出の別個の方向を有しており、それによって、対物レンズの検出の方向は、照明の方向に対して設定角度に傾けられる。設定角度は、照明円錐と検出円錐との重なりの区域が、従来の共焦点顕微鏡と比較して減少するように選ばれる。顕微鏡の対物レンズと像平面との間の光路に、ビーム・スプリッタまたはリフレクタが、照明光を注入し、および／または検出光に結合して外に出すように位置づけられる。この特許で開示されている顕微鏡は点照明を使用している。
【０００７】
典型的な光シート顕微鏡の光学性能は、照明対物レンズおよび検出対物レンズの物理的寸法によって課される幾何学的制約によって制限される。光シート顕微鏡の光学性能（コントラスト、光学分解能、および光収集（ｌｉｇｈｔ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））は、照明対物レンズおよび検出対物レンズの開口数（ＮＡ）によって決まる。
【０００８】
図１ａおよび図１ｂは、当技術分野で知られているような光シート顕微鏡の一例を示す。照明対物レンズ３０は、サンプル２０を照明する照明ビーム４０を作り出す。放射６０は、サンプル２０で反射されるかまたはサンプル２０から蛍光を放たれ、検出対物レンズ５０に入り、検出器（図示せず）を使用して測定され、画像がコンピュータ（図示せず）において生成される。使用される検出器は、一般に、ＣＣＤ検出器である。
【０００９】
検出対物レンズ５０の開口数（ＮＡ）は、検出レンズ５０に入ることができる光の最大円錐を規定する。開口数は、以下のように定義される。ＮＡ＝ｎ×ｓｉｎ（θｄｅｔ）。ほとんどの光シート顕微鏡では屈折率ｎ＝１．３３（水）である。θｄｅｔは、検出対物レンズ５０に入るかまたは出ていくことができる光の最大円錐の半角である。
【００１０】
照明対物レンズ３０の照明光円錐３５および検出対物レンズ５０の検出光円錐５５は、垂直光シート構成では重なってはならない。言い換えれば、角度θｉｌｌ（照明光円錐３５の半角）およびθｄｅｔ（検出光円錐５５の半角）は、９０°未満としなければならない。検出対物レンズ５０および照明対物レンズ３０の機械的ハウジングは、通常、開口数の特定の値に対して必要とされるものよりも著しく大きい円錐を占有する。これは、最適とは言えないことがある照明対物レンズ３０および検出対物レンズ５０の構成をもたらす。
【００１１】
国際特許出願第ＷＯ２０１４／０６３７６４Ａ１号（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）は、サンプル・テーブルの上または上方に装着された照明用レンズを有する顕微鏡を教示している。照明用レンズは、サンプル・テーブル上にある検査中のサンプルを照明するために少なくとも１つの照明用ビームを２次元光シートの形態で案内する。少なくとも１つの検出対物レンズが、サンプルの真下に装着され、検査中のサンプルから反射されるかまたは放出される検出ビームを検出する。照明レンズの光軸は、検出対物レンズの光軸を基準にして９０°よりも大きい角度で配列される。照明用ビームは、光シートが検出対物レンズの焦平面内にあるように、照明用レンズの光軸の外側で、ある入射角で照明用レンズに入射することが好ましい。
【００１２】
この顕微鏡の構成は、サンプルの画像をカメラで正確に記録できることを保証するために、サンプル、照明用ビーム源、および検出レンズの構成に高度の精度を必要とする。
【００１３】
米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０３２０４３８Ａ１号（Ｋｎｅｂｅｌ等、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨに譲渡された）は、さらに、光源と、照明光学系と、目標領域の端から端まで照明焦点を移動させるための、照明用ビームが照明光学系の入射瞳に入る入射の方向を変えることによってそのようにする際の走査デバイスとを含む走査型顕微鏡を教示している。照明用レンズおよび検出対物レンズは、サンプル・テーブルの上方で互いに鋭角（９０°未満の）に装着され、サンプル・テーブルの面に垂直な面内にある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、サンプル・マウントに装着されているサンプルを画像化するための光学構成を教示する。光学構成は、照明を作り出すための照明対物レンズと、サンプルからの放射を画像化するための検出対物レンズとを含む。照明対物レンズおよび検出対物レンズは、互いに鈍角（９０°よりも大きい）でサンプル・マウントのまわりに配列される。本開示の１つの態様では、照明は、サンプル上に投影される１次元ラインの形態のものである。
【００１５】
照明対物レンズおよび検出対物レンズは、実質的に水平な面に配置される。
【００１６】
本開示の１つの態様では、光学構成は、照明対物レンズおよび検出対物レンズからなる面に垂直な方向に位置づけられ、サンプルが、検出対物レンズの光軸と平行の照明光シートで照明されることを保証するために照明対物レンズの背面に配置された平行移動可能な照明ビームの発生器と協働するカメラをさらに備える。制御プロセッサは、カメラと平行移動可能な照明ビームの発生器との両方に接続されて、照明光シートが正しい位置にあるようにフィードバックループとして働く。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、照明レンズに対してさらなる非垂直の角度で配列されるさらなる検出レンズを有する。このさらなる態様では、さらなる検出レンズ、検出対物レンズ、および照明対物レンズは、互いにほぼ等しい角度で配列される。
【００１８】
対物レンズは、代替として、照明対物レンズまたは検出対物レンズとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】当技術分野で知られているような光学構成を示す図である。図１ａは概観であり、図１ｂは検出対物レンズおよび照明対物レンズの光円錐の分解図である。
【図２】本開示の光学構成を示す図である。図２ａは光学構成の概観である。図２ｂは、照明対物レンズおよび検出対物レンズからの光円錐の分解図である。
【図３】照明対物レンズ中に反射される光源の一例を示す図である。
【図４】照明対物レンズおよび検出対物レンズの両方として使用することができる３つの対物レンズの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明を図面に基づいて説明する。本明細書で説明する本発明の実施形態および態様は、例にすぎず、特許請求の範囲の保護範囲を決して限定しないことを理解されよう。本発明は、特許請求の範囲およびその等価物によって定義される。本発明の１つの態様または実施形態の特徴は、本発明の異なる１つまたは複数の態様および／または実施形態の特徴と組み合わせることができることを理解されよう。
【００２１】
図２ａは、本開示の１つの態様による光学構成１０の一例を示す。照明対物レンズ３０は、サンプル・マウント２２中のサンプル２０を照明する照明光シート４０を生成する。照明対物レンズ３０は、照明光円錐３５と中心軸３２とを有する。検出対物レンズ５０は、検出光円錐５５内のサンプル２０からの放射されたかまたは蛍光を放たれた放射を受け取り、軸５２を有する。照明対物レンズ３０および検出対物レンズ５０は共に同じ浸漬媒体２２を有する同じチャンバに浸漬され、サンプル・マウント２３のまわりに配列される（照明対物レンズ３０および検出対物レンズ５０の浸漬媒体２２を分離しない）。図２ｂは、サンプル２０のまわりの区域の分解図を示す。照明対物レンズ３０は、検出対物レンズ５０に対して非垂直角度で配列されていることが分かる。特に、照明光シート４０の面は、検出対物レンズ５０の中心軸５２に対して非垂直角度である。非垂直軸は９０°よりも大きい。本発明の別の態様では、照明対物レンズ３０は、ラインまたはラインのアレイ（１次元照明）を生成し、それは、サンプル・マウント２２を移動させることによってサンプル２０の端から端まで走査され得る。
【００２２】
サンプル２０は、浸漬媒体２２に浸漬され、サンプル・マウント２３に装着される。浸漬媒体２２と、サンプル・マウント２３が製作される材料とは、同じ屈折率を有する。光学構成１０の１つの非限定の例では、浸漬媒体２２は水であり、サンプル・マウント２３の材料はフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）である。
【００２３】
検出対物レンズ５０に入る反射されたかまたは蛍光を放たれた放射は、検出器１００上で画像化され、画像は、検出器１００に接続されたプロセッサ１１０において処理される。検出器はＣＣＤ検出器とすることができるが、これは本発明の限定ではない。
【００２４】
図３は、照明対物レンズ３０をより詳細に示す。放射源３６は、照明対物レンズ３０の後焦点面３４に光パターン６２を生成する。この光パターン６２は、サンプル２０に光シート４０または走査ラインをもたらす。
【００２５】
可動ミラー７０は、放射源３６からの光パターン６２を照明対物レンズ３０の後部の中に、照明対物レンズ３０の中心軸３２から外れているオフセンタ方向３８で反射する。光パターン６２の照明経路と、照明対物レンズ３０の中心軸３２に沿った反射光経路とによって形成される面に存する方向に、可動ミラー７０を平行移動させて、光パターン６２が照明対物レンズ３０の後部の中に反射される方向を変更することができる。後焦点面３４において光パターン６２を平行移動させると、光シート（または走査ライン）４０は、物空間で回転し、その結果、サンプル２０での光シート４０は、検出対物レンズ５０の中心軸５２に実質的に垂直な角度でサンプル２０を照明する。可動ミラー７０のこの平行移動は、手動で、または電動ステージ９０の使用によって制御することができる。
【００２６】
光シート４０（または走査ライン）の位置合せは、照明対物レンズ３０および検出対物レンズ５０の両方に属する面に垂直に位置づけられたカメラ８０によってモニタされる。
【００２７】
カメラ８０は、蛍光体溶液の蛍光放出によって、またはサンプル２０の浸漬媒体２２（通常、上記したように水、しかし、さらに、例えば、空気、オイル）中の光散乱によって照明ビームを画像化する。カメラ８０と電動ステージ９０とに接続された制御プロセッサ９５によって実行される自動画像解析を使用して、照明面とカメラ対物面との間の角度差を決定することができる。この角度差は、コンピュータ制御ループ９３によって最小化することができる。
【実施例１】
【００２８】
Ｎｉｋｏｎ２５×（または１００×）検出対物レンズ３０および照明対物レンズ５０を使用している。照明対物レンズ３０の中心軸３２と検出対物レンズ５０の中心軸５２との間の角度は、１２０°であった。照明のための標準光シートセットアップは、０．３のＮＡ値を有していた。本開示の教示による傾斜光シートセットアップは、０．６の開口数を有していた。
【実施例２】
【００２９】
Ｎｉｋｏｎ２５×（または１００×）検出対物レンズ５０を、１６×照明対物レンズ３０とともに使用した。照明対物レンズ３０の中心軸３２と検出対物レンズ５０の軸５２との間の角度は、１０５°であった。本開示の光学構成１０を使用している光シートは、先行技術の光学構成のポイント０．３の開口数と比較して、０．６の開口数を有していた。
【実施例３】
【００３０】
Ｎｉｋｏｎ２５×（または１００×）対物レンズを、代替として、検出対物レンズ５０および照明対物レンズ３０として使用した。これは、サンプル２０の回転またはさもなければ移動なしに、同じサンプル２０について全部で６つの視像をもたらす。次に、６つの異なる画像をコンピュータで処理して、サンプルまたはタスクの３次元視像を得ることができる。これが図４に示され、さらなる対物レンズ５７が示されており、３つの対物レンズ３０、５０、および５７が互いに実質的に１２０°で配列される。さらなる対物レンズ５７は、やはり、検出対物レンズ５０および照明対物レンズ３０と同じ面に装着される。
【符号の説明】
【００３１】
１０  光学構成
２０  サンプル
２２  浸漬媒体
２３  サンプル・マウント
３０  照明対物レンズ
３２  中心軸
３４  後焦点面
３６  発生源
３８  オフセンタ方向
４０  照明光シート
５０  検出対物レンズ
５２  軸
５５  検出光円錐
５７  さらなる対物レンズ
６０  放射源
６２  光パターン
７０  可動ミラー
８０  カメラ
９０  電動ステージ
９５  制御プロセッサ
１００  検出器
１１０  画像プロセッサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2017500603.tif 000008
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