(57)【要約】本明細書において、ヒトＡＮＧ２、ヒトＶＥＧＦ、ヒトＩＬ−１ベータ、及びヒトＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される２種類の抗原に特異的に結合する、新規な二重特異性抗体が報告される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１ベータと、ヒトＡＮＧ２、ヒトＶＥＧＦ、及びヒトＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される第２の抗原とに特異的に結合し、
ａ）
（ａ）配列番号：０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインと、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、
二重特異性抗体。
【請求項２】
ヒトＰＤＧＦ−Ｂと、ヒトＡＮＧ２、ヒトＶＥＧＦ、及びヒトＩＬ−１ベータからなる群より選択される第２の抗原とに特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、
二重特異性抗体。
【請求項３】
ヒトＡＮＧ−２に更に特異的に結合し、更に、
ａ）（ａ）配列番号：５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｄ）（ａ）配列番号：８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１又は２記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
ヒトＶＥＧＦに更に特異的に結合し、更に、
ａ）配列番号：１０７の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号：１０８の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３とを含むか、又は
ｂ）配列番号：１０９の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号：１１０の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３とを含む、請求項１又は２記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ヒトＩＬ−１ベータ及びヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
−
ａ）（ａ）配列番号：０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインと、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ヒトＩＬ−１ベータに特異的に結合する第１の結合部位と、
−
ａ）（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する第２の結合部位とを含む、
二重特異性抗体。
【請求項６】
抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、
ｉ）  ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されているか、又は
ｉｉ）  ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている、請求項６記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は、
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）  ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ
を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体と、場合により、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１３】
医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１４】
医薬が、眼血管疾患の処置、好ましくは、黄斑変性の処置のためのものである、請求項１２又は１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、二重特異性抗体及び、例えば、眼科にそれを使用する方法に関する。
【０００２】
［背景］
眼血管疾患、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）はそれぞれ、異常な脈絡膜又は網膜の血管新生による。これらは、先進国における失明の主因である。網膜は、ニューロン、グリア、及び血管の構成要素の十分に定義された層からなるため、比較的小さい障害、例えば、血管増殖又は浮腫に見られる障害より、視覚的機能の著しい損失がもたらされるおそれがある。遺伝性の網膜変性、例えば、網膜色素変性症（ＲＰ）も、血管異常、例えば、動脈狭窄及び血管萎縮に関連している。これらは、３，５００人に１人もの数で発症し、多くの場合、完全な失明に進行する、進行性の夜盲症、視野喪失、視神経萎縮、動脈衰弱、及び視野中心の喪失により特徴付けられる。
【０００３】
うっ血性網膜症は、網膜血管構造の損失又は機能障害により特徴付けられる。同損失又は機能障害は、血流減少及び低酸素がもたらす。網膜は、低酸素に対して、新たな血管を成長させるシグナルを生じさせることにより応答するが、これらの新たな血管は、通常、脆く、無秩序である。これらの異常な新しい血管の成長により、視野に対するほとんどの脅威を作っている。この成長は、リークし、出血をもたらし、又は、瘢痕をもたらし、網膜剥離となるおそれがある。うっ血性網膜症のための現在の処置は、異常な血管の成長を停止させることに努めているが、血管成長を引き起こしている基礎となるうっ血を解決していない。さらに、多数が発症するうっ血性網膜症である糖尿病性網膜症のための標準的な処置は、新たな血管成長を停止させ、中心視野を保護するための試みにおけるレーザーによる網膜の一部の破壊に関連している。血管成長の主なプロモーターである血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の機能を妨害する戦略が利用されている。短期間では、抗ＶＥＧＦ治療により、視野が改善されるが、基礎となるうっ血を解決されず、実際には、有益な側枝を含めた全ての血管成長を阻害してしまった場合、この状態を悪化させるおそれがある。また、年配及び／又は糖尿病の患者におけるこれらの薬剤の全身性曝露の重大な懸念も存在する。この場合、新たな血管成長が、うっ血性の脳、心臓、又は手足に必要となる場合がある。
【０００４】
典型的には、眼疾患について、Ｆａｂ又はＦａｂ２などのより小型の抗体フラグメントが、多くの場合、硝子体内適用により使用される。これらのフラグメントは、短い血清半減期しか有さず、全身毒性のリスクが低いためである。しかしながら、これらのより小型のフラグメントは、典型的には、（例えば、血清内でのより早い拡散による）より短い硝子体内での半減期も有し、典型的には、より頻繁に投与される必要がある。
【０００５】
１つの結合アームにおいてドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ）が、国際公開公報第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191（これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる）に、詳細に記載されている。これらの多重特異性抗体は、（このようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較して）第２の抗原に対する不適当な重鎖を伴った、第１の抗原に対する軽鎖のミスマッチにより生じる副次的結果を、明らかに減少させる。しかしながら、その調製において、副次的結果を完全には無くせない。主な副次的結果は、Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ型相互作用に基づいている。Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191；添付の図Ｓ１Ｉ）も参照のこと。
【０００６】
国際公開公報第２０１１／１１７３２９号には、二重特異性で二価の抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ２抗体が報告されている。ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及び使用方法が、国際公開公報第２０１４／１７７４６０号に報告されている。Kienast, Y., et al. (Clin. Canc. Res. 19 (2013) 6730-6740)には、Ａｎｇ−２−ＶＥＧＦ−Ａ  ＣｒｏｓｓＭａｂが、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ−２の機能を同時に妨害し、強力な抗腫瘍、抗血管新生、及び抗転移効果を媒介する、新規な二重特異性ヒトＩｇＧ１抗体として報告されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新規な二重特異性抗体及びそれを使用する方法を提供する。
【０００８】
本明細書において、ヒトＡＮＧ２、ヒトＶＥＧＦ、ヒトＩＬ−１ベータ、及びＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される、２種類の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が報告されている。
【０００９】
一実施態様において、抗体は、抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体ではない。
【００１０】
一実施態様において、抗体は、ヒトＩＬ−１ベータに特異的に結合し、
ａ）
（ａ）配列番号：０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインと、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００１１】
一実施態様において、抗体は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００１２】
一実施態様において、抗体は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｄ）（ａ）配列番号：８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００１３】
一実施態様において、抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００１４】
一実施態様において、抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である。
【００１５】
好ましい一実施態様では、抗体は、
ｉ）  ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されているか、又は
ｉｉ）  ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている。
【００１６】
一実施態様において、抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である。
【００１７】
一実施態様において、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【００１８】
一実施態様において、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）  ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ
を含む。
【００１９】
本明細書で報告された一態様は、本明細書で報告された抗体と、場合により、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬製剤である。
【００２０】
本明細書で報告された一態様は、医薬として使用するための、本明細書で報告された抗体である。
【００２１】
本明細書で報告された一態様は、医薬の製造における、本明細書で報告された抗体の使用である。
【００２２】
一実施態様において、医薬は、眼血管疾患の処置のためのもの、好ましくは、黄斑変性の処置のためのものである。
【００２３】
［本発明の実施態様の詳細な説明］
Ｉ．定義
本明細書における目的で、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されているヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、又は、同フレームワークは、アミノ酸配列の変化を含有してもよい。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。一部の実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して同一の配列である。
【００２４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間における非共有的相互作用の総計強度を意味する。特に断りない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対メンバー（例えば、抗体と抗原）間における１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を意味する。分子ＸとそのパートナーＹとの親和性は、一般的には、解離定数（ｋｄ）により表現することができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含めて、当技術分野において公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例となり、かつ、例示的な実施態様は、以下に記載されている。
【００２５】
「親和性成熟」抗体は、変化を有さない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において、１つ以上の変化を有する抗体を意味する。このような変化は、抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。
【００２６】
「抗ＩＬ−１ベータ抗体」及び「ＩＬ−１ベータに結合する抗体」という用語は、ＩＬ−１ベータに十分な親和性を有して結合可能な抗体を意味する。このため、該抗体は、ＩＬ−１ベータをターゲットとする診断剤及び／又は治療剤として有用である。一実施態様において、関連しない非ＩＬ−１ベータタンパク質に対する抗ＩＬ−１ベータ抗体の結合の度合いは、例えば、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴により測定された場合、ＩＬ−１ベータに対する抗体の結合性の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＩＬ−１ベータに結合する抗体は、１μM以下、１００nM以下、１０nM以下、１nM以下、又は０．１nM以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施態様では、抗ＩＬ−１ベータ抗体は、異なる種からのＩＬ−１ベータ間で保存されているＩＬ−１ベータのエピトープに結合する。
【００２７】
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味に使用され、種々の抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直線抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体と少なくとも同じアミノ酸残基と相互作用を有する抗体を意味する。これらの相互作用は、例えば、荷電アミノ酸残基間のイオン性相互作用、又は、疎水性アミノ酸残基間の疎水性相互作用である。
【００３０】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定のソース又は種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残り部分が、異なるソース又は種に由来する抗体を意味する。
【００３１】
抗体の「クラス」は、その重鎖により保有されている定常ドメイン又は定常領域の種類を意味する。５つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分割することができる。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３２】
「免疫コンジュゲート」という用語は、抗体と非抗体部分との間の共有コンジュゲートを意味する。このような非抗体部分は、検出可能なラベル、エフェクター分子、又は細胞毒剤であることができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「細胞毒剤」という用語は、細胞機能を阻害するかもしくは妨害し、及び／又は、細胞の死もしくは障害を引き起こす物質を意味する。細胞毒剤は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤もしくは薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド、（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素およびそのフラグメント、例えば、核酸分解酵素；抗生物質；細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のトキシン、例えば、小分子トキシンもしくは酵素活性トキシン（そのフラグメント及び／もしくは変異体を含む）；ならびに、以下に開示された種々の抗腫瘍もしくは抗癌剤を含む、これらに限定されない。
【００３４】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する、それらの生物学的活性を意味する。同Ｆｃ領域は、抗体クラスにより変化する。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
【００３５】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、必要な用量及び期間において、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有用な量を意味する。
【００３６】
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異型のＦｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に広がっている。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン−リシンジペプチド（Ｇｌｙ４４６Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、又は、存在しなくてもよい。本明細書において特に断りない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されており、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
【００３７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的には、ＶＨ（又はＶＬ）における下記配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で表される。
【００３８】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造と実質的に同じ構造を有するか、又は、本明細書で定義されたＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味するのに、本明細書において互換的に使用される。
【００３９】
「ホスト細胞」、「ホスト細胞株」、及び「ホスト細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を意味し、このような細胞の子孫を含む。ホスト細胞は、「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」を含む。トランスフォーメーションされた細胞は、初代のトランスフォーメーションされた細胞と、継代回数に関わらずそれ由来の子孫とを含む。子孫は、核酸含量において、親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。元のトランスフォーメーションされた細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生体活性を有する突然変異子孫は、本明細書に含まれる。
【００４０】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により生成された抗体のアミノ酸配列に対応するか、又は、ヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒトソースから得られたアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を、具体的に除外している。
【００４１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に出現するアミノ酸残基を表現するフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、サブグループの可変ドメイン配列からである。一般的には、サブグループの配列は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3におけるのと同じサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは、前記Kabat et al.,におけるのと同じサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは、前記Kabat et al.,におけるのと同じサブグループＩＩＩである。
【００４２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を意味する。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。その中で、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部又は実質的に全部が、非ヒト抗体のそれらに対応し、ＦＲの全部又は実質的に全部が、ヒト抗体のそれらに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は、構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は、抗原接触残基（「抗原コンタクト」）を含有する、抗体の可変ドメインの各領域を意味する。一般的には、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。
【００４４】
本明細書において、ＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において生じる超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）と、
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）において生じるＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）と、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）において生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）と、
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせとを
含む。
【００４５】
特に断りない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、前記Kabat et al.,に従ってナンバリングされる。
【００４６】
「免疫コンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００４７】
「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【００４８】
「単離された抗体」は、その本来の環境の成分から分離されているものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定された場合、９５％又は９９％より高い純度に精製される。抗体純度を評価するため方法のレビューについては、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【００４９】
「単離された核酸」は、その本来の環境の成分から分離されている核酸分子を意味する。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有されるが、この核酸分子が、染色体外又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【００５０】
抗ＩＬ−１ベータ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又は、それらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を意味し、１つのベクター又は別箇のベクター中のこのような核酸分子およびホスト細胞中の１つ以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、自然発生的に生じる突然変異を含有し、又は、モノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性ある変異型抗体を除いて、同一であり、及び／又は、同じエピトープに結合する。このような変異体は、一般的には、少量しか存在しない。種々の決定因子（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定因子を対象にする。このため、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に基づいて使用されるモノクローナル抗体は、各種の技術により調製することができる。同技術は、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない。モノクローナル抗体を調製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００５２】
「ネイキッドな抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒部分）又は放射性ラベルにコンジュゲートしていない抗体を意味する。ネイキッドな抗体は、医薬製剤中に存在することができる。
【００５３】
「ネイティブな抗体」は、変化する構造を有する、天然の免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続けて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続けて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の内の１つに割り当てることができる。
【００５４】
「添付文書」という用語は、治療剤製品の商業的な梱包に習慣的に含まれる説明書を意味するのに使用され、適用症、用途、用量、投与、組み合わせ治療、禁忌、及び／又はこのような治療剤製品の使用に関する警告についての情報を含有する。
【００５５】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮せずに、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセント同一性を達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアライメントは、当業者の範囲内にある種々の方法で、例えば、公衆に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。同パラメータは、比較される配列の全長に対する最大アライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む。ただし、本明細書の目的で、％  アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALING-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.,により作製され、ソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559にユーザ文書としてファイルされており、同ソースコードは、著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公衆に利用可能であり、又は、ソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレイティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定されており、変更しない。
【００５６】
ALIGN-2がアミノ酸配列比較に利用される状況において、所定のアミノ酸配列Ｂに対する、同配列Ｂと共に、又は、同配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａの％  アミノ酸配列同一性（％  アミノ酸配列同一性は、所定のアミノ酸配列Ｂに対する、同配列Ｂと共に、又は、同配列Ｂに対する、特定の％  アミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａとして代替的に表現することができる）は、下記のように算出される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
【００５７】
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムALIGN-2により、Ａ及びＢのそのプラグラムアライメントにおいて、同一マッチとしてスコアされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％  アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％  アミノ酸配列同一性と等しくないであろうことを理解されたい。特に断りない限り、本明細書において使用される全ての％  アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されているように得られる。
【００５８】
「医薬製剤」という用語は、有効であるようにそれに含有される活性成分の生物学的活性を可能にするような形態にあり、この製剤が投与されるであろう対象に許容できない毒性を有する更なる成分を含有しない調製物を意味する。
【００５９】
「薬学的に許容し得る担体」は、活性成分以外の医薬製剤中の成分を意味し、対象に対して毒性を有さない。薬学的に許容し得る担体は、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ＩＬ−１ベータ」という用語は、ヒトＩＬ−１ベータを意味する。この用語は、「全長」の非加工ＩＬ−１ベータ及び細胞中での処理により生じる任意の形態のＩＬ−１ベータを包含する。また、この用語は、ＩＬ−１ベータの天然の変異体、例えば、スプライス変異体又はアレル変異体も包含する。ヒトＩＬ−１ベータのアミノ酸配列は、配列番号：９２に示される。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「処置」（及びその文法上のバリエーション、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の本来の経過を変化させる試みにおける臨床的介在を意味し、予防又は臨床病理の経過中のいずれかにおいて行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を予防すること、兆候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患の進展速度の低下、疾患状態の改善又は寛解、及び緩和又は改善された予後を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾患の進行を遅延させ、又は、疾患の進展を遅れさせるのに使用される。
【００６２】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に抗体を結合させるのに関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的には、４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む各ドメインを有する類似構造を有する（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。１つのＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であることができる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補なＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリをスクリーニングするための抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離することができる（例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと）。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を伝播可能な核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構築物としてのベクターと、それが導入されるホスト細胞のゲノム内に組み込まれるベクターとを含む。特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現に向けさせることができる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００６４】
ＩＩ．組成物及び方法
本明細書において、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒトＰＤＧＦ−Ｂ）からなる群より選択される種々の抗原に特異的に結合する新規な二重特異性抗体が報告される。この場合、本抗体は、抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体ではない。本発明の抗体は、例えば、眼血管疾患、例えば、黄斑変性の処置に有用である。
【００６５】
Ａ．例示的な抗体
Ａ．１  本明細書で報告された二重特異性抗体の抗ＩＬ−１ベータ結合部位を得ることができる抗ＩＬ１ベータ抗体
本明細書において、４つの新規な抗ヒトＩＬ−１ベータ抗体が提供される。
【００６６】
第１の抗ヒトＩＬ−１ベータ抗体は、配列番号：２０のＶＨと配列番号：２５のＶＬとを有する、新規なマウス抗ヒトＩＬ−１ベータ抗体である。この抗体は、以下、ＩＬ−１ベータ−ｍｕｍＡｂと呼ばれる。この抗体は、ヒト、カニクイザル、ウサビ、及びマウスのＩＬ−１ベータに結合し、ＩＬ−１ベータとヒトＩＬ−１レセプターＩ及びＩＩとの間の相互作用を阻害する。
【００６７】
この抗体は、下記特性を有する。
【００６８】
【表１】
2017537896.tif 000002
【００６９】
【表２】
2017537896.tif 000003
【００７０】
【表３】
2017537896.tif 000004
【００７１】
【表４】
2017537896.tif 000005
【００７２】
【表５】
2017537896.tif 000006
【００７３】
【表６】
2017537896.tif 000007
【００７４】
【表７】
2017537896.tif 000008
【００７５】
刺激実験において、本明細書で報告されたマウス抗体は、Ａ５４９細胞のＩＬ−１β刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現を阻害することができることを示すことができた（以下の表を参照のこと）。
【００７６】
【表８】
2017537896.tif 000009
【００７７】
下記表に、ＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現阻害についてのＩＣ５０値が示される。
【００７８】
【表９】
2017537896.tif 000010
【００７９】
刺激実験において、本明細書で報告されたヒト化抗体は、Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＬ−６発現を低下させることを示すことができた（以下の表を参照のこと）。
【００８０】
【表１０】
2017537896.tif 000011
【００８１】
加えて、マウス抗体は、ストレス試験において安定性を示した。結合活性は、表面プラズモン共鳴を使用して決定されている（以下の表を参照のこと）。
【００８２】
【表１１】
2017537896.tif 000012
【００８３】
同じ安定性は、高分子量含量が決定された際に見ることができる（以下の表を参照のこと）。
【００８４】
【表１２】
2017537896.tif 000013
【００８５】
同じ安定性は、ＣＥ−ＳＤＳ分析において見ることができる（以下の表を参照のこと）。
【００８６】
【表１３】
2017537896.tif 000014
【００８７】
マウス抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【００８８】
【表１４】
2017537896.tif 000015
【００８９】
他の３つの抗体は、マウス抗ＩＬ−１ベータ抗体Ｈ３４のヒト化変異体：ｈｕＨ３４−１（配列番号：０１〜０５及び１６）、ｈｕＨ３４−２（配列番号：０６〜１０及び１６）及びｈｕＨ３４−３（配列番号：１１〜１６）である。
【００９０】
本明細書において、ヒト化抗ＩＬ−１ベータ抗体が報告される。この抗体は、マウス抗ＩＬ−１ベータ抗体Ｈ３４から得られる。
【００９１】
マウスＨ３４抗体のアミノ酸配列に基づいて、対応するヒト化抗ＩＬ−１β抗体が生成された（ｈｕＨ３４−２）。このヒト化変異体のＶＨは、ヒトＶＢａｓｅ＿ＶＨ１＿１及びヒトＩＧＨＪ４−０１−３生殖系のＪ−エレメント（ｈｕＨ３４−１）に基づいている。親和性を回復させるために、１つの逆突然変異が、フレームワーク領域２の４８位に導入された（Ｍ４８Ｉ）。フレームワーク領域中の３、４か所：Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｆ、Ｒ７１Ｖ、及びＡ９３Ｖが逆突然変異された。加えて、ＨＶＲ−Ｈ２の５２ａ位におけるシステインが、セリンに置き換えられた。ＶＬについて、ヒト化変異体は、ＩＧＫＪ２−０１  Ｊ−エレメントを有するヒトＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１生殖系に基づいている。１つの逆突然変異が、フレームワーク領域２の３６位に導入された（Ｙ３６Ｓ）。ヒト化ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号：０４に示される。ヒト化ＶＬのアミノ酸配列は、配列番号：０６に示される。
【００９２】
マウス抗ＩＬ−１ベータ抗体Ｈ３４は、大規模に製造することができる治療候補としての開発のために除去される必要があるＨＶＲ−Ｈ２におけるシステイン（Ｃ５２ａ、Ｋａｂａｔナンバリング）を含有する。マウス抗体中のこのＣｙｓをＣ５２ａＳ突然変異により除去することにより、約６〜７倍のＩＬ−１ベータに対する低下した親和性がもたらされる（以下の表を参照のこと）。
【００９３】
【表１５】
2017537896.tif 000016
【００９４】
Ｈ３４のヒト化版（ｈｕＨ３４−２）について、Ｃ５２ａＳ突然変異に基づく親和性の損失は補償される。この抗体は、マウス親抗体Ｈ３４と同等の親和性（及び、細胞アッセイ法における同等の機能活性）を有する。
【００９５】
この補償効果は、ヒト化に選択された生殖系配列及びフレームワークＩＧＨＪ４−０１−３及びＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１内の逆突然変異の選択に説明できる。更なる変異体が、ＶＨ（ＩＧＨＪ４−０１−３）及びＶＬ（ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１）それぞれについて、同じヒト生殖系に基づいて設計された。ｈｕＨ３４−２について記載された逆突然変異は、ＶＨ及びＶＬ配列（配列番号：７及び８）から省略された。
【００９６】
【表１６】
2017537896.tif 000017
【００９７】
一実施態様において、ヒト化抗ＩＬ−１ベータ抗体は、ヒト及びカニクイザルのＩＬ−１ベータに結合する。
【００９８】
ヒトＩＬ−１ベータの存在下において、表面プラズモン共鳴実験における結合シグナルは、ゲボキズマブから大きくなっている。このため、抗体に結合したＩＬ−１ｂは、ＩＬ−１レセプターＩに結合したままである。したがって、ゲボキズマブについての作用方式は、ＩＬ−１ＲＡｃ結合のアロステリック阻害である（アロステリック抗体）。
【００９９】
カナキヌマブについては、Ｉｌ−１レセプターＩに対するＨ３４及びｍｕｍＡｂのＩＬ−１ベータ結合は、抗体結合後に妨害される。このため、カナキヌマブ、Ｈ３４、及びｍｕｍＡｂについての作用方式は、レセプターブロッキングである（競合的抗体）。
【０１００】
【表１７】
2017537896.tif 000018
【０１０１】
刺激実験において、本明細書で報告されたヒト化抗体は、マウス親抗体と同じ活性を有することを示すことができた。下記表に、Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現阻害についてのＩＣ５０値が、種々の抗体について示される。
【０１０２】
【表１８】
2017537896.tif 000019
【０１０３】
下記表に、ＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現阻害についてのＩＣ５０が示される。
【表１９】
2017537896.tif 000020
【０１０４】
刺激実験において、本明細書で報告されたヒト化抗体が、Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＬ−６発現を低下させることを示すことができた（以下の表を参照のこと）。
【０１０５】
【表２０】
2017537896.tif 000021
【０１０６】
増殖阻害実験において、本明細書で報告されたヒト化抗体が、Ｄ１０細胞の増殖を阻害することを示すことができた（以下の表を参照のこと）。
【０１０７】
【表２１】
2017537896.tif 000022
【０１０８】
下記表に、ＴＨＰ１細胞のＭＳＵ刺激に基づくＴＮＦアルファ発現阻害についてのＩＣ５０値が、種々の抗体について示される。
【０１０９】
【表２２】
2017537896.tif 000023
【０１１０】
加えて、ヒト化抗体は、マウスＨ３４親抗体と比較して、ストレス試験において、改善された安定性を示す。結合活性は、表面プラズモン共鳴を使用して決定されている（以下の表を参照のこと）。
【０１１１】
【表２３】
2017537896.tif 000024
【０１１２】
同じ安定性は、高分子量含量が決定された際に見ることができる（以下の表を参照のこと）。
【０１１３】
【表２４】
2017537896.tif 000025
【０１１４】
同じ安定性は、ＣＥ−ＳＤＳ分析において見ることができる（以下の表を参照のこと）。
【０１１５】
【表２５】
2017537896.tif 000026
【０１１６】
種々のヒト化抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【０１１７】
【表２６】
2017537896.tif 000027
【０１１８】
ヒトＩＬ−１ベータに結合したｈｕＨ３４−２  Ｆａｂフラグメントの高解像結晶構造は、この抗体の機能的なエピトープにおける詳細な情報を示した。この構造は、ＩＬ−１シグナル伝達複合体（ＩＬ−１レセプター１に結合したヒトＩＬ−１ｂ、ＩＬ−Ｒ１、及びＩＬ−１アクセサリータンパク質であるＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＰＤＢコード４ＤＥＰ）の三元構造と比較された。ｈｕＨ３４のエピトープが、ＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１ＲＡｃＰの両方の相互作用部位と重複していることが見出された。このため、この抗体は、ＩＬ−１ベータとＩＬ−１Ｒ１とが会合する、その構築の第１工程において、ＩＬ−１ベータシグナル伝達複合体の形成を妨害する。
【０１１９】
抗体００３１は、ＩＬ−１ベータ結合特異性として、ｈｕＨ３４−２のＶＨ及びＶＬドメインを含む、二重特異性抗ＡＮＧ２／ＩＬ−１ベータ抗体である。
【０１２０】
抗体００３２は、ＩＬ−１ベータ結合特異性として、ｈｕＨ３４−２のＶＨ及びＶＬドメインを含む、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＩＬ−１ベータ抗体である。
【０１２１】
動力学結合値の決定のために、実施例５２に報告されたアッセイ法が使用された。
【０１２２】
【表２７】
2017537896.tif 000028
【０１２３】
【表２８】
2017537896.tif 000029
【０１２４】
【表２９】
2017537896.tif 000030
【０１２５】
全ての二重特異性抗体が、その抗原両方に同時に結合する特性を有することが、ＳＰＲ分析により示されている。
【０１２６】
ＡＮＧ２特異性ｐＴｉｅ２−ＥＬＩＳＡにおいて、抗体００３１は、国際公開公報第２０１４／０９４６５号に報告された抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体より、６倍活性である。
【０１２７】
一実施態様において、ヒト化抗ＩＬ−１ベータ抗体は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−１ベータに結合する。
【０１２８】
下記表に、Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現阻害についてのＩＣ５０値が示される。
【０１２９】
【表３０】
2017537896.tif 000031
【０１３０】
下記表に、ＨＵＶＥＣ細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＣＡＭ−１発現阻害についてのＩＣ５０値が示される。
【０１３１】
【表３１】
2017537896.tif 000032
【０１３２】
刺激実験において、本明細書で報告されたヒト化抗体が、Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激に基づくＩＬ−６発現を低下させることを示すことができた（以下の表を参照のこと）。
【０１３３】
【表３２】
2017537896.tif 000033
【０１３４】
種々の二重特異性抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【０１３５】
【表３３】
2017537896.tif 000034
【０１３６】
配列番号：０６〜１０及び１６（結合部位、ＨＶＲ、ＶＨ、ＶＬ）の配列を有する抗体ｈｕＨ３４−２が記載されている。二重特異性フォーマットの抗体ｈｕＨ３４−２が、配列番号：１０２〜１０３及び１８２〜１８９の配列に記載されている。これらの配列は全て、本発明の単独及び組み合わせの態様を構成する。
【０１３７】
好ましい一実施態様では、抗ＩＬ−１ベータ抗体は、（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、この抗体は、（ｄ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【０１３８】
好ましい一実施態様では、抗体は、配列番号：０６及び配列番号：１６それぞれにおけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、同ＶＨ及びＶＬ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１３９】
好ましい一実施態様では、抗ヒトＩＬ−１ベータ抗体は、ヒト及びカニクイザルのＩＬ−１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。好ましい一実施態様では、抗ヒトＩＬ−１ベータ抗体は、配列番号：０６のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを有する。
【０１４０】
Ａ．２  本明細書で報告された二重特異性抗体の抗ＰＤＧＦ−Ｂ結合部位を得ることができる抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体
本明細書において、種々の新規な抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。
【０１４１】
第１の抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号：２９のＶＨと配列番号：３４のＶＬとを有する、新規なマウス抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。この抗体は、以下、ＰＤＧＦ−Ｂ−ｍｕｍＡｂと呼ばれる。この抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスのＰＤＧＦ−Ｂに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂとそのレセプターとの間の相互作用を阻害する。
【０１４２】
この抗体は、以下の表に列記された下記特性を有する。
【０１４３】
【表３４】
2017537896.tif 000035
【０１４４】
【表３５】
2017537896.tif 000036
【０１４５】
【表３６】
2017537896.tif 000037
【０１４６】
【表３７】
2017537896.tif 000038
【０１４７】
【表３８】
2017537896.tif 000039
【０１４８】
【表３９】
2017537896.tif 000040
【０１４９】
【表４０】
2017537896.tif 000041
【０１５０】
【表４１】
2017537896.tif 000042
【０１５１】
【表４２】
2017537896.tif 000043
【０１５２】
抗体の保存安定性が、以下の表に示される（参照表面との活性濃度）。
【０１５３】
【表４３】
2017537896.tif 000044
【０１５４】
この抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【０１５５】
【表４４】
2017537896.tif 000045
【０１５６】
他の抗体は、ヒトＩｇローカストランスジェニックウサギから得られたヒト抗体である。これらの抗体は、以下の表に列記された下記特性を有する。
【０１５７】
抗体００８５は、配列番号：３８のＶＨ及び配列番号：４３のＶＬを含む抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。抗体００８６は、配列番号：４７のＶＨ及び配列番号：５２のＶＬを含む抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０１５８】
【表４５】
2017537896.tif 000046
【０１５９】
【表４６】
2017537896.tif 000047
【０１６０】
【表４７】
2017537896.tif 000048
【０１６１】
一実施態様において、ヒト化抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ヒト、ラット、マウス、及びカニクイザルのＰＤＧＦ−Ｂに結合する。
【０１６２】
【表４８】
2017537896.tif 000049
【０１６３】
【表４９】
2017537896.tif 000050
【０１６４】
多様な活性アッセイ法において、抗体は、以下の表に表わされたデータから分かる生物学的活性を示す。
【０１６５】
【表５０】
2017537896.tif 000051
【０１６６】
【表５１】
2017537896.tif 000052
【０１６７】
種々の抗体の動力学結合特性は、表面プラズモン共鳴技術を使用して決定されている（以下の表を参照のこと）。
【０１６８】
【表５２】
2017537896.tif 000053
【０１６９】
【表５３】
2017537896.tif 000054
【０１７０】
【表５４】
2017537896.tif 000055
【０１７１】
抗体００８６の保存安定性が、以下の表に示される（参照表面との活性濃度）。
【０１７２】
【表５５】
2017537896.tif 000056
【０１７３】
この抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【０１７４】
【表５６】
2017537896.tif 000057
【０１７５】
抗体０１４４は、ＰＤＧＦ−Ｂ結合親和性として、抗体００８５のＶＨ及びＶＬドメインを含む、二重特異性抗ＡＮＧ２／ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０１７６】
抗体０１１７は、ＰＤＧＦ−Ｂ結合親和性として、抗体００８５のＶＨ及びＶＬドメインを含む、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０１７７】
動力学結合値の決定のために、実施例５２に報告されたアッセイ法が使用された。
【０１７８】
【表５７】
2017537896.tif 000058
【０１７９】
【表５８】
2017537896.tif 000059
【０１８０】
【表５９】
2017537896.tif 000060
【０１８１】
全ての二重特異性抗体が、その抗原両方に同時に結合する特性を有することが、ＳＰＲ分析により示されている。
【０１８２】
二重特異性抗体は、細胞系アッセイ法において、結合活性及び生物学的活性を示す。
【０１８３】
【表６０】
2017537896.tif 000061
【０１８４】
【表６１】
2017537896.tif 000062
【０１８５】
ＡＮＧ２特異性ｐＴｉｅ２−ＥＬＩＳＡにおいて、抗体０１４４は、国際公開公報第２０１４／０９４６５号に報告された抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体より、６倍活性である。
【０１８６】
ＶＥＧＦ特異性レポーターアッセイ法において、抗体０１１７は、国際公開公報第２０１４／０９４６５号に報告された抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体と同様の活性を有する。
【０１８７】
配列番号：３８〜４６（結合部位、ＨＶＲ、ＶＨ、ＶＬ）の配列を有する抗体００８５が記載されている。二重特異性フォーマットの抗体００８５が、配列番号：１２９〜１３０、１５０〜１５３、１６２〜１６５、及び１７４〜１７７の配列に記載されている。これらの配列は全て、本発明の単独及び組み合わせの態様を構成する。
【０１８８】
配列番号：４７〜５５（結合部位、ＨＶＲ、ＶＨ、ＶＬ）の配列を有する抗体００８６が記載されている。二重特異性フォーマットの抗体００８６が、配列番号：１３１、１５４〜１５７、１６６〜１６９、及び１７８〜１８１の配列に記載されている。これらの配列は全て、本発明の単独及び組み合わせの態様を構成する。
【０１８９】
配列番号：１６２〜１６５（ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット、２つの重鎖、２つの軽鎖）の配列を有する抗体０１４４が記載されている。
【０１９０】
抗体０１４４及び０１４５は、種々のｐＨ値において、２週間インキュベーションされ、その後、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＡＮＧ２それぞれに対するそれらの結合性が決定されている。
【０１９１】
【表６２】
2017537896.tif 000063
【０１９２】
【表６３】
2017537896.tif 000064
【０１９３】
好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、この抗体は、（ｄ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【０１９４】
一実施態様において、抗体は、配列番号：２９及び配列番号：３４それぞれにおけるＶＨ及びＶＬ配列のヒト化変異体を含み、同ＶＨ及びＶＬ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１９５】
好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、この抗体は、（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【０１９６】
好ましい一実施態様では、本明細書で報告された抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。また、好ましい一実施態様では、本明細書で報告された抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号：３８のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。また、好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、二重特異性抗体である。
【０１９７】
一実施態様において、抗体は、配列番号：３８及び配列番号：４３それぞれにおけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、同ＶＨ及びＶＬ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１９８】
好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、この抗体は、（ｄ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【０１９９】
好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。また、好ましい一実施態様では、本明細書で報告された抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号：４７のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。また、好ましい一実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、二重特異性抗体である。
【０２００】
一実施態様において、抗体は、配列番号：４７及び配列番号：５２それぞれにおけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、同ＶＨ及びＶＬ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０１】
Ａ．３  本明細書で報告された二重特異性抗体の抗ＡＮＧ２結合部位を得ることができる抗ＡＮＧ２抗体
【表６４】
2017537896.tif 000065
【０２０２】
【表６５】
2017537896.tif 000066
【０２０３】
本明細書で報告された抗体の相対的な生物学的活性は、以下の表に与えられる。
【０２０４】
【表６６】
2017537896.tif 000067
【０２０５】
種々の抗体の熱安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価されている（以下の表を参照のこと）。
【０２０６】
【表６７】
2017537896.tif 000068
【０２０７】
加えて、抗体は、ストレス試験において、良好な安定性を示す。結合活性は、表面プラズモン共鳴を使用して決定されている（以下の表を参照のこと）。
【０２０８】
【表６８】
2017537896.tif 000069
【０２０９】
同じ安定性は、ＣＥ−ＳＤＳ分析において見ることができる（以下の表を参照のこと）。
【０２１０】
【表６９】
2017537896.tif 000070
【０２１１】
好ましい一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、（ａ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、この抗体は、（ｄ）配列番号：８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号：８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【０２１２】
一実施態様において、抗体は、配列番号：７４及び配列番号：７９それぞれにおけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、同ＶＨ及びＶＬ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２１３】
Ａ．４  本明細書で報告された二重特異性抗体の抗ＶＥＧＦ結合部位を得ることができる抗ＶＥＧＦ抗体
好ましい一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号：１０７の重鎖可変ドメインに含まれる、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。ＨＶＲは、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号：１０８の重鎖可変ドメインに含まれる、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。ＨＶＲは、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲを含む。
【０２１４】
一実施態様において、抗体は、配列番号：１０７及び配列番号：１０８それぞれにおけるＨＣ及びＬＣ配列を含み、同ＨＣ及びＬＣ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２１５】
好ましい一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号：１０９の重鎖可変ドメインに含まれる、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。ＨＶＲは、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号：１１０の重鎖可変ドメインに含まれる、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。ＨＶＲは、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲを含む。
【０２１６】
一実施態様において、抗体は、配列番号：１０９及び配列番号：１１０それぞれにおけるＨＣ及びＬＣ配列を含み、同ＨＣ及びＬＣ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２１７】
Ａ５．二重特異性抗体
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
【０２１８】
抗体は、ａ）において、ｂ）で報告された修飾を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、分離した鎖である。
【０２１９】
ｂ）の抗体では、軽鎖内において、可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨにより置き換えられており、重鎖内において、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬにより置き換えられている。
【０２２０】
一実施態様では、
ｉ）  ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、負に荷電したアミノ酸により置換されているか、又は
ｉｉ）  ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、負に荷電したアミノ酸により置換されている。
【０２２１】
好ましい一実施態様では、
ｉ）  ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されているか、又は
ｉｉ）  ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている。
【０２２２】
一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２２３】
一実施態様では、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２２４】
好ましい一実施態様では、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されているおり、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２２５】
一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸は、Ｅにより置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸は、Ｅにより置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２２６】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
【０２２７】
抗体は、ａ）において、ｂ）で報告された修飾を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、分離した鎖である。
【０２２８】
抗体のｂ）では、軽鎖内において、可変重鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨにより置き換えられており、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており、重鎖内において、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬにより置き換えられており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
【０２２９】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
【０２３０】
抗体は、ａ）において、ｂ）で報告された修飾を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、分離した鎖である。
【０２３１】
抗体のｂ）では、軽鎖内において、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており、重鎖内において、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
【０２３２】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）１〜４つの更なる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２及び／又は第３及び／又は第４及び／又は第５の抗原、好ましくは、１つの更なる抗原、すなわち、第２の抗原に特異的に結合する）、１、２、３、又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメントとを含み、
前記ｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記ａ）の全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合しており、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、多重特異性抗体である。
【０２３３】
一実施態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端において融合している。
【０２３４】
一実施態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖のＣ末端において融合している。
【０２３５】
一実施態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の軽鎖のＣ末端において融合している。
【０２３６】
一実施態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖それぞれのＣ末端において融合している。
【０２３７】
一実施態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の各重鎖のＣ末端において融合している。
【０２３８】
一実施態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の各軽鎖のＣ末端において融合している。
【０２３９】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）からなる第１のポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドが、そのＶＨドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２つの重鎖の内の一方のＣ末端に融合している第１のポリペプチドと、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなる第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドが、ＶＬドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２つの重鎖の内の他方のＣ末端に融合している第２のポリペプチドとを含み、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが共に、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成しており、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、三価の二重特異性抗体である。
【０２４０】
一実施態様において、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが連結しており、下記位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位と軽鎖可変ドメインの１００位（通常、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）
の間へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋により安定化されている。
【０２４１】
安定化のための非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59；Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393；又は、Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。一実施態様において、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの４４位と、軽鎖可変ドメインの１００位との間にある。一実施態様において、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの１０５位と、軽鎖可変ドメインの４３位（通常、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ってナンバリング）との間にある。一実施態様において、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間の前記任意のジスルフィド安定化を含まない三価の二重特異性抗体が好ましい。
【０２４２】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖と、
ｃ）１〜４つの抗原結合ペプチドであって、これらが、１つ又は２つの更なる抗原に（すなわち、第３及び／又は第４の抗原に）特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している１〜４つの抗原結合ペプチドとを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々抗原である、三重特異性又は四重特異性抗体である
【０２４３】
抗体は、ａ）において、ｂ）で報告された改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、分離した抗体である。
【０２４４】
一実施態様において、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つ又は２つの更なる抗原に特異的に結合する、１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
【０２４５】
一実施態様において、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントからなる群より選択される。
【０２４６】
一実施態様において、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメントである。
【０２４７】
一実施態様において、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦａｂフラグメントである。
【０２４８】
一実施態様において、抗原結合ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。
【０２４９】
一実施態様において、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つの更なる抗原に特異的に結合する、１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
【０２５０】
一実施態様において、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ペプチドを含む。好ましい一実施態様では、このような２つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドリンカーを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、２つの同一の抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
【０２５１】
一実施態様において、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３及び第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ペプチドを含む。一実施態様において、前記２つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドコネクターを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
【０２５２】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖であって、これらが、第１の抗原に特異的に結合する（かつ、２つのＦａｂフラグメントを含む）２つの軽鎖及び２つの重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つの更なるＦａｂフラグメントであって、前記更なるＦａｂフラグメントが両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合している２つの更なるＦａｂフラグメントを含み、
Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている、
ｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメント及びｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、かつ
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｉｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、かつ
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｖ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｖ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性の四価抗体である。
【０２５３】
一実施態様において、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はａ）の重鎖のＮ末端のいずれかに融合している。
【０２５４】
一実施態様において、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端のいずれかに融合している。
【０２５５】
一実施態様において、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドコネクターを介して、ａ）の重鎖のＮ末端に融合している。
【０２５６】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメント又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
【０２５７】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
【０２５８】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
【０２５９】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ）  ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
【０２６０】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ）  ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
【０２６１】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含む第１の抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第１の抗体の第２のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第１の抗体の（改変）重鎖と、
ｂ）前記ａ）の第１の抗体の２つの軽鎖と、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ−ＣＬドメインペアを含む第２の抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第２の抗体の第２のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第２の抗体の（改変）重鎖と、
ｄ）前記ｃ）の第２の抗体の２つの（改変）軽鎖であって、それぞれが、ＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む第２の抗体の２つの（改変）軽鎖とを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性の四価抗体である。
【０２６２】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のＮ末端が、軽鎖のＣ末端に、ペプチドリンカーを介して連結している第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖とを含み、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性抗体である。
【０２６３】
抗体は、ａ）において、ｂ）で報告された改変を含有せず、重鎖及び軽鎖は、分離した抗体である。
【０２６４】
本明細書で報告された一態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含むＦｖフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに連結しているＦｖフラグメントとを含み、
ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合しており、
第１及び第２の抗原が、（ヒト）ＡＮＧ２、（ヒト）ＶＥＧＦ、（ヒト）ＩＬ−１ベータ、及び（ヒト）ＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性抗体である。
【０２６５】
この二重特異性抗体において、ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。
【０２６６】
一実施態様において、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合していない。
【０２６７】
本明細書で報告された全ての態様では、第１の軽鎖は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【０２６８】
全ての態様の一実施態様では、本明細書で報告された抗体は、多重特異性抗体である。同多重特異性抗体は、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とし、この抗体は、ヒトＩＬ−１ベータ及び第２の非ヒトＩＬ−１ベータ抗原に特異的に結合する。
【０２６９】
ヘテロ二量体化を支援するためのＣＨ３改変についての複数のアプローチが、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、同第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５号、同第２０１２／０５８７６８号、同第２０１３／１５７９５４号、同第２０１３／０９６２９１号に記載されている。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、当技術分野において公知のアプローチにおいて、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは両方とも、相補的な方法において操作される。これにより、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、もはや、同じ構造の別の重鎖とホモ二量体化できない（例えば、ＣＨ３操作された第１の重鎖は、もはや、別のＣＨ３操作された第１の重鎖とホモ二量体化できない。ＣＨ３操作された第２の重鎖は、もはや、別のＣＨ３操作された第２の重鎖とホモ二量体化できない）。これにより、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的な方法で操作されているＣＨ３ドメインを含む別の重鎖とヘテロ二量体化させられる。本発明のこの実施態様について、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換により、相補的な方法で操作されている。これにより、第１の重鎖と第２の重鎖とは、ヘテロ二量体化させられる。一方、第１の重鎖と第２の重鎖とは、（例えば、立体障害の理由で）もはやホモ二量体化できない
【０２７０】
上記で引用され、上記に含まれた、当技術分野において公知の重鎖ヘテロ二量体化を支援するための種々のアプローチが、本発明の多重特異性抗体に使用される種々の代替手段として想到される。同多重特異性抗体は、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体から得られる「非架橋Ｆａｂ領域」と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体から得られる「架橋Ｆａｂ領域」とを、本発明について上記された特定のアミノ酸置換との組み合わせにおいて含む。
【０２７１】
本明細書で報告された多重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」技術により改変することができる。同技術は、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及び、Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681において、複数の例示により詳細に記載されている。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を向上させるように改変される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインそれぞれが、「ノブ」であることができ、一方、他のものが「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体を更に安定化し（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増大させる。
【０２７２】
好ましい一実施態様では、本明細書で報告された多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。また、ＣＨ３ドメイン間の更なる鎖間ジスルフィド架橋も、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することにより使用することができる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。このため、別の好ましい実施態様では、本明細書で報告された多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異とを含むか、又は、本明細書で報告された多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異とを含む（一方のＣＨ３ドメインにおける更なるＹ３４９Ｃ突然変異と他方のＣＨ３ドメインにおける更なるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異とは、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２７３】
ただし、欧州特許第１８７０４５９号に記載された他のノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術も、代替的又は付加的に使用することができる。一実施態様において、本明細書で報告された多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２７４】
一実施態様において、本明細書で報告された多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異とを含み、付加的に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２７５】
一実施態様において、本明細書で報告された多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異とを含むか、又は、本明細書で報告された多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異とを含み、付加的に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２７６】
「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化させるために多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術は、当技術分野において公知である。これらの技術、特に、国際公開公報第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、同第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５号、同第２０１２／０５８７６８号、同第２０１３／１５７９５４号、及び同第２０１３／０９６２９１号に記載されている技術が、本明細書において、本明細書で報告された多重特異性抗体との組み合わせにおいて、「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術」の代替技術として想到される。
【０２７７】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されたアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。このアプローチは、第１及び第２の重鎖の両方の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に、反対電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。
【０２７８】
したがって、この実施態様は、抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインが、各抗体ＣＨ３ドメイン間に位置する界面を形成しており、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインそれぞれの各アミノ酸配列が、抗体の三次構造において、前記界面内に位置しているアミノ酸のセットを含み、界面に位置しているこのアミノ酸のセットから、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第１のアミノ酸が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、界面に位置しているこのアミノ酸のセットから、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第２のアミノ酸が、負に荷電したアミノ酸により置換されている、本明細書で報告された多重特異性抗体に関する。この実施態様の多重特異性抗体は、本明細書において、「ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体」とも呼ばれる（この場合、「＋／−」の略称は、各ＣＨ３ドメインに導入された反対の荷電アミノ酸を意味する）。
【０２７９】
本明細書で報告された前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、負に荷電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０２８０】
本明細書で報告された前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負に荷電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０２８１】
本明細書で報告された前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋであり、負に荷電したアミノ酸は、Ｅである。
【０２８２】
本明細書で報告された前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位におけるアミノ酸Ｒは、Ｄにより置換されており、位におけるアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位におけるアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、３５７位におけるアミノ酸Ｅは、Ｋにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８３】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８４】
本明細書で報告された前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。加えて、下記置換の内の少なくとも１つが、他方の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる。３４９位におけるアミノ酸Ｙは、Ｅにより置換されており、３４９位におけるアミノ酸Ｙは、Ｄにより置換されており、３６８位におけるアミノ酸Ｌは、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。一実施態様において、３６８位におけるアミノ酸Ｌは、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８５】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｙにより置換されており、４０７位におけるアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ａにより置換されており、４０９位におけるアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。別の実施態様では、前述の置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４１１位（元はＴ）、３９９位（元はＤ）、４００位（元はＳ）、４０５位（元はＦ）、３９０位（元はＮ）、及び３９２位（元はＫ）における少なくとも１つのアミノ酸が置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。好ましい置換は、
−４１１位におけるアミノ酸Ｔを、Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、及びＷから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、
−３９９位におけるアミノ酸Ｄを、Ｒ、Ｗ、Ｙ、及びＫから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、
−４００位におけるアミノ酸Ｓを、Ｅ、Ｄ、Ｒ、及びＫから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、
−４０５位におけるアミノ酸Ｆを、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、及びＷから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、
−３９０位におけるアミノ酸Ｎを、Ｒ、Ｋ、及びＤから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、及び
−３９２位におけるアミノ酸Ｋを、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ、及びＥから選択されるアミノ酸により置換すること（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）である。
【０２８６】
（国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に従って操作された）本明細書で報告された前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位におけるアミノ酸Ｌは、Ｙにより置換されており、４０７位におけるアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｖにより置換されており、４０９位におけるアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位におけるアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ａにより置換されており、４０９位におけるアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。前記最後の前述の実施態様では、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位におけるアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、４１１位におけるアミノ酸Ｔは、Ｅにより置換されており、３９９位におけるアミノ酸Ｄは、Ｒにより置換されており、４００位におけるアミノ酸Ｓは、Ｒにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８７】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の一実施態様では、両重鎖のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸改変は、３６８及び／又は４０９位に導入される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８８】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。国際公開公報第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」技術に基づくアミノ酸改変に関する。本明細書で報告された前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作された多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｗにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位におけるアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。本明細書で報告された前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作された多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位におけるアミノ酸Ｔは、Ｙにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位におけるアミノ酸Ｙは、Ｔにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２８９】
ＩｇＧ２アイソタイプである、本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。
【０２９０】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位におけるアミノ酸Ｋ又はＮは、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位におけるアミノ酸Ｄ、３５６位におけるアミノ酸ＥもしくはＤ、又は３５７位におけるアミノ酸Ｅは、正に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｋ又はＲにより、好ましい一実施態様では、Ｋにより、好ましい一実施態様では、３９９又は３５６位におけるアミノ酸は、Ｋにより置換されている）置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。更なる一実施態様では、前述の置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位におけるアミノ酸Ｋ又はＲは、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。更なる一実施態様では、前述の置換に加えて又は代替的に、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４３９位におけるアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位におけるアミノ酸Ｋは、それぞれ独立して、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２９１】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書で報告された前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２５３位におけるアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、２８２位におけるアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、３２２位におけるアミノ酸Ｋは、Ｄにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２３９位におけるアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、２４０位におけるアミノ酸Ｅは、Ｋにより置換されており、２９２位におけるアミノ酸Ｋは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）。
【０２９２】
本明細書で報告された多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されたアプローチが、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。
【０２９３】
全ての態様の一実施態様及び本明細書で報告された実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。本発明の好ましい一実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
【０２９４】
本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、抗体は、二価又は三価の抗体である。一実施態様において、抗体は、二価抗体である。
【０２９５】
本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１のもの又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ２のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ３のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ４のもの又は更なる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告された全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。
【０２９６】
本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されたＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、更なるＣ末端グリシン−リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を含む。本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されたＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）を含む。
【０２９７】
一実施態様において、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【０２９８】
一実施態様において、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）  ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ
を含む。
【０２９９】
本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、本明細書で報告された抗体は、エフェクターサイレントな抗体である。本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、抗体は、エフェクターサイレントな抗体であり、ヒトＦｃＲｎに結合しない。本明細書で報告された全ての態様の好ましい一実施態様は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であり、両重鎖において、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３４Ａ（Ｋａｂａｔインデックスに従ってナンバリング）を有する。
【０３００】
更なる態様では、上記実施態様のいずれかの抗ＩＬ−１ベータ抗体は、以下のセクション１〜４に記載された特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせにおいて包含してもよい。
【０３０１】
１．抗体親和性
ＫＤ値を決定するための方法は、以下の実施例に概説されている。
【０３０２】
BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイ法を使用する場合、ＫＤ値を、下記のように代替的に測定することができる。BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用するアッセイ法を、２５℃において、固定抗原CM5チップにより、約１０応答単位（RU）において行う。一実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（CM5, BIACORE, Inc.）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により、供給元の説明に従って活性化させる。抗原を、流速５μl/分での注入前に、約１０応答単位（RU）のカップリングされたタンパク質を達成するために、１０mM 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８により、５μg/ml（約０．２μM）に希釈する。抗原の注入後に、１Ｍ エタノールアミンを、反応しなかった基をブロックするために注入する。動力学測定のために、２倍系列希釈のＦａｂ（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５％ ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃において、流速約２５μl/分で注入する。会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合及び解離のセンサグラムを同時に当て嵌めることにより算出する。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｄ／ｋａとして算出する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。上記表面プラズモン共鳴アッセイ法によるｏｎ速度が１０６M-1s-1を超える場合には、会合速度を、２５℃において、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０nM 抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５nm；放出＝３４０nm、バンドパス１６nm）における増大又は減少を、分光計、例えば、ストップフローを備える分光計（Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備える8000-シリーズ SLM-AMINCO（商標）分光計（ThermoSpectronic）において測定した場合、増大する濃度の抗体の存在下において測定する蛍光クエンチ技術を使用することにより決定することができる。
【０３０３】
２．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及び、Morrison, S.L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。更なる例では、キメラ抗体は、「クラススイッチ」抗体である。同抗体では、クラス又はサブクラスが、親抗体のクラス又はサブクラスから変更されている。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０３０４】
特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する抗原性を低下させるためにヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含む。同ドメインにおいて、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）は、非ヒト抗体から得られ、ＦＲ（又はその一部）は、ヒト抗体配列から得られる。また、ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。一部の実施態様では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が得られる抗体）からの対応する残基により置換される。
【０３０５】
ヒト化抗体及びそれらを製造する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633にレビューされており、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフト化を記載）；Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498（「表面再生」を記載）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびに、Osbourn, J. et al., Methods36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載）に更に記載されている。
【０３０６】
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域は、「ベスト−フィット」法（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）を使用して選択されるフレームワーク領域、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から得られるフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及び、Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）、ヒト成熟（体細胞性に成熟）フレームワーク領域又はヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）及び、ＦＲライブラリのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。
【０３０７】
３．多重特異性抗体
本明細書で提供された抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２種類の部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、一方の結合特異性は、ＩＬ−１ベータに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＩＬ−１ベータの２種類のエピトープに結合することができる。また、二重特異性抗体は、細胞毒剤を、ＩＬ−１ベータを発現している細胞に局在させるのにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【０３０８】
二重特異性抗体を製造するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアのリコンビナント共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983)537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）及び「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。また、多重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を製造するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４）、２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋させること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan, M. et al., Science229 (1985) 81-83を参照のこと）、二重特異性抗体を製造するためのロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）、二重特異性抗体フラグメントを製造するための「ディアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）及び、例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991)60-69に記載された三重特異性抗体を調製することによっても製造することができる
【０３０９】
また、「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開公報第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。
【０３１０】
また、本明細書における抗体又はフラグメントは、ＩＬ−１ベータ及び別の種類の抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開公報第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
【０３１１】
また、本明細書における抗体又はフラグメントは、国際公開公報２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５４号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、及び同第２０１０／１４５７９３号に記載された多重特異性抗体も含む。
【０３１２】
４．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体のアミノ酸変異体が想到される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することにより又はペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸残基からの欠失、及び／又は、同配列内への挿入、及び／又は、同配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物を得るのに行うことができる。ただし、最終的な構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合性を有するという条件である。
【０３１３】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異原性の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下の表に示す。更なる置換的変更は、表１中の「例示的な置換」の見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスへの言及において更に以下に記載される。アミノ酸置換は、対象となる抗体、ならびに、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、低下した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされた生成物に導入することができる。
【０３１４】
【表７０】
2017537896.tif 000071
【０３１５】
アミノ酸は、共通する側鎖の特性に基づいてグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）天然の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０３１６】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスのものに交換する必要があるであろう。
【０３１７】
ある種の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究に選択される得られた変異体は、親抗体に対する特定の生物学的特性（例えば、向上した親和性、低下した免疫原性）における改変（例えば、改善）を有し、及び／又は、親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、同抗体は、例えば、ファージディスプレイ系親和性成熟技術、例えば、本明細書で記載されたものを使用して、都合良く生成することができる。簡潔に、１つ以上のＨＶＲ残基が成熟され、変異型抗体は、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０３１８】
変異（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中にすることができる。このような突然変異は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）、及び／又は、抗原と接触する残基にすることができる。得られた変異ＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築及び二次ライブラリから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の一部の実施態様では、多様性が、各種の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかにより、成熟について選択される可変遺伝子内に導入される。ついで、二次ライブラリが調製される。ついで、このライブラリが、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するのにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、ＨＶＲ指定アプローチを含む。そのアプローチにおいて、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化される。抗原結合性に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発を使用して、又は、モデリングして、特異的に特定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合、ターゲッティングされる。
【０３１９】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、このような変異が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内に起こすことができる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書で提供された保存的置換）を、ＨＶＲ中にすることができる。このような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側でもよい。上記で提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは、変化していないか、又は、２つ以下、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０３２０】
突然変異誘発のためにターゲティングすることができる抗体の残基又は領域を特定するのに有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されている、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、ターゲット残基の残基又は基（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ）が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを決定する。更なる置換は、最初の置換に対する機能的感受性を証明するアミノ酸位置に導入することができる。代替的に又は付加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との間の接触点を特定する。このような接触残基及び隣接する残基は、置換のための候補としてターゲッティングすることができ、又は、除去することができる。変異体は、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定するのにスクリーニングすることができる。
【０３２１】
アミノ酸配列挿入は、長さが１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲で、アミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、ならびに、１つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を長くする、（例えば、ＡＤＥＰＴのための）酵素又はポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端に対する融合物を含む。
【０３２２】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、抗体がグリコシル化されている度合いを向上又は低下させるように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を改変させることにより、都合良く達成することができる。これにより、１つ以上のグリコシル化部位が形成又は除去される。
【０３２３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳類細胞により産生されるネイティブな抗体は、典型的には、二分岐したオリゴ糖を含む。同オリゴ糖は、一般的には、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により付着する（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖は、二分岐したオリゴ糖構造の「幹」において、ＧｌｃＮＡｃに付着した、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸ならびにフコースを含むことができる。一部の実施態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変を、特定の改善した特性を有する抗体変異体を形成するためにすることができる。
【０３２４】
一実施態様において、（直接又は間接的に）Ｆｃ領域に付着したフコースを欠いた炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体におけるフコース量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、２０％〜４０％であることができる。フコース量は、例えば、国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載された、MALDI-TOF質量分光法により測定された、Ａｓｎ２９７に付着した全ての糖構造の合計に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖（例えば、複雑で、ハイブリッドで、高いマンノース構造）内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域におけるおおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を意味する。ただし、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列突然変異により、２９７位の上流又は下流の約±３個のアミノ酸、すなわち、２９４〜３００位の間に位置することもできる。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する場合がある。例えば、米国特許出願公開公報第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、米国特許出願公開公報第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開公報第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622を含む。脱フコシル化抗体を産生可能な細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開公報第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び、国際公開公報第２００３／０８５１０号を参照のこと）を含む。
【０３２５】
二分岐したオリゴ糖を含む抗体変異体が更に提供される。例えば、同抗体において、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐したオリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃにより二分岐される。このような抗体変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する場合がある。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。また、Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有する場合がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０３２６】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供された抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０３２７】
特定の実施態様では、本発明は、全てのエフェクター機能の一部を有するが全ては有さない抗体変異体を考慮する。同変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期が重要である用途の望ましい候補となる。更なる特定のエフェクター機能（例えば、相補性及びＡＤＣＣ）は必須でないか、又は、有害である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞毒アッセイ法は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／欠損を確認するのに行うことができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイ法は、抗体がＦｃγＲ結合性を欠いている（このため、おそらくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確保するのに行うことができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現しているが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492における第４６４頁の表３中に概説されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法の非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと)；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞毒アッセイ法（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒アッセイ法（Promega, Madison, WI）を参照のこと)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に又は付加的に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているもの等の動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。Ｃｑ１結合アッセイ法も、抗体がＣ１ｑと結合できないため、ＣＤＣ活性を欠いているのを確認するのに行うことができる（例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと）。補完的な活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ法を行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合性及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照のこと）。
【０３２８】
低下したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ以上の置換を有するものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上に置換を有するＦｃ領域変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０３２９】
改善又は減少したＦｃＲに対する結合性を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。
【０３３０】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）における置換を有するＦｃ領域を含む。
【０３３１】
一部の実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、突然変異は、変化した（すなわち、改善したか又は減少したかのいずれかの）Ｃ１ｑ結合性及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらすＦｃ領域中になされる。
【０３３２】
延長した半減期及び、胎児への母方のＩｇＧ輸送を担う（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児型Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する改善した結合性を有する抗体は、米国特許出願公開公報第２００５／００１４９３４号に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合性を改善する、１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０３３３】
Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０３３４】
ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を形成するのが望ましい場合がある。同抗体において、抗体の１つ以上の残基は、システイン残基により置換されている。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセッシブル部位において起こる。システインによりそれらの残基を置換することにより、反応性チオール基は、抗体のアクセッシブル部位に位置することで、抗体を他の部分、例えば、薬剤部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートして、本明細書で更に記載された免疫コンジュゲートを形成するのに使用することができる。特定の実施態様では、任意の１つ以上の下記残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）は、システインにより置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。
【０３３５】
ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、当技術分野において公知であり、容易に利用できる、更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造中での利点を有する場合がある。このポリマーは、任意の分子量のものであることができ、分岐鎖又は非分岐鎖であることができる。抗体に付着するポリマー数は変化させることができ、２つ以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じか又は異なる分子であることができる。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定条件下での治療に使用されるであろうかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
【０３３６】
別の実施態様では、抗体と、放射への曝露により選択的に加熱することができる非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射は、任意の波長のものでよく、通常の細胞に有害でないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分近くの細胞が殺傷される温度に加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０３３７】
Ｂ．リコンビナント法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているリコンビナント法及び組成物を使用して産生することができる。一実施態様において、本明細書で記載された抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。更なる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含むホスト細胞が提供される。１つのこのような実施態様では、ホスト細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、（１）又は（２）によりトランスフォーメーションされている）。一実施態様において、ホスト細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、本明細書で報告された抗体を製造する方法が提供される。ここで、同方法は、抗体の発現に適した条件下において、本明細書で提供された抗体をコードする核酸を含むホスト細胞を培養することと、場合により、ホスト細胞（又はホスト細胞培養培地）から、抗体を回収することとを含む。
【０３３８】
抗体のリコンビナント産生のために、例えば、上記された抗体をコードする核酸が単離され、ホスト細胞中で更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター内に挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）従来の手法を使用してシークエンシングすることができる。
【０３３９】
抗体コードベクターのクローニング又は発現に適したホスト細胞は、本明細書で記載された原核生物又は真核生物の細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能を必要としない場合、抗体は、細菌中で産生することができる。細菌中での抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと（E. coli中での抗体フラグメントの発現が記載されている、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、細菌細胞のペーストから、可溶性画分中に単離することができ、更に精製することができる。
【０３４０】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を含む、糸状菌又は酵母が、抗体コードベクター用のクローニング又は発現ホストに適している。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０３４１】
グリコシル化抗体の発現に適したホスト細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。数多くのバキュロウイルス株が特定されており、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクション用の昆虫細胞に関して使用することができる。
【０３４２】
植物細胞培養物も、ホストとして利用することができる。（（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照のこと）。
【０３４３】
脊椎動物細胞も、ホストとして使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖させるのに適合した哺乳類の細胞株が有用であることができる。有用な哺乳類ホスト細胞株の他の例は、ＳＶ４０によりトランスフォーメーションされるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されている２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類ホスト細胞株は、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）ならびにメラノーマ細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０を含む。抗体産生に適した特定の哺乳類ホスト細胞株のレビューについては、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０３４４】
Ｃ．アッセイ法
本明細書で報告された抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイ法により、その物理的／化学的特性及び／又は生体活性を特定し、スクリーニングし、又は、特徴付けることができる。例示的なアッセイ法は、実施例に報告されている。
【０３４５】
Ｄ．免疫コンジュゲート
また、本発明は、１つ以上の細胞毒剤、例えば、化学療法剤又は薬剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、タンパク質トキシン、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性トキシン、またはそれらのフラグメント）又は放射性同位体にコンジュゲートした、本明細書で報告された抗体を含む免疫コンジュゲートも提供する。
【０３４６】
一実施態様において、免疫コンジュゲートは、抗体が１つ以上の薬剤にコンジュゲートした、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）である。同薬剤は、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５号を参照のこと）；オーリスタチン、例えば、モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照のこと）；ドラスタチン；カリチアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及び、Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照のこと）；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343；及び、米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリクロテセン；ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない。
【０３４７】
別の実施態様では、免疫コンジュゲートは、酵素活性トキシン又はそのフラグメントにコンジュゲートした、本明細書で記載された抗体を含む。同酵素活性トキシンは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、（Pseudomonas aeruginosa由来の）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、dianthinタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクロチン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない。
【０３４８】
別の実施態様では、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして、放射性コンジュゲートを形成している、本明細書で記載された抗体を含む。各種の放射性同位体が、放射性コンジュゲートを生成するのに利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、ＴＣ９９ｍもしくはＩ１２３、又は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像法（磁気共鳴映像法、ＭＲＩとしても公知）用のスピンラベル、例えば、再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄を含んでもよい。
【０３４９】
抗体と細胞毒剤とのコンジュゲートは、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロパノアート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン  ２，６−ジイソシアナート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して調製することができる。例えば、リシン免疫トキシンは、Vitetta, E.S. et al., Science238 (1987) 1098-1104に記載されたように調製することができる。炭素−１４ラベル１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート剤である。国際公開公報第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中で細胞毒剤の放出を容易にする「開裂性リンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０３５０】
本明細書における免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、架橋試薬により調製されたこのようなコンジュゲートに明確に想到するが、これに限定されない。同架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）を含むが、これらに限定されない。これらの試薬は、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されている。
【０３５１】
Ｅ．医薬製剤
本明細書で記載された多重特異性抗体の医薬製剤は、所望の度合いの純度を有するこのような抗体を、１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の状態で調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980）)。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書において、例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質薬分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開公報第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
【０３５２】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含む。後者の製剤は、ヒスチジン−アセタートバッファーを含む。
【０３５３】
また、本明細書における製剤は、処置される特定の適応症に必要な場合、２つ以上の活性成分、好ましくは、互いに有害に影響しない補完的な活性を有するものも含有することができる。例えば、抗ＡＮＧ２抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体を更に提供するのが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的に効果的な量で、組み合わせ中に適切に存在する。
【０３５４】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、又は、界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセルそれぞれに、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）の状態又はマイクロエマルジョンの状態で封入することができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０３５５】
持続放出型製剤が調製される場合がある。持続放出型製剤の適切な例は、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含む。同マトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの状態である。
【０３５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的には、無菌である。無菌は、例えば、ろ過滅菌膜によるろ過により容易に達成することができる。
【０３５７】
Ｆ．治療法及び組成物
本明細書で提供された多重特異性抗体のいずれかを、治療法に使用することができる。
【０３５８】
一態様において、医薬として使用するための、多重特異性抗体が提供される。更なる態様では、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を処置するのに使用するための、多重特異性抗体が提供される。特定の実施態様では、処置方法に使用するための、多重特異性抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、有効量の多重特異性抗体を、個体に投与することを含む、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を有する個体を処置する方法における使用のための、多重特異性抗体を提供する。このような一実施態様では、該方法は、更に、有効量の、例えば、以下に記載された少なくとも１つの更なる治療剤を、個体に投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、血管新生を阻害するのに使用するための、多重特異性抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体中の血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するのに有効量の多重特異性抗体を個体に投与することを含む方法に使用するための、多重特異性抗体を提供する。上記実施態様のいずれかの「個体」は、好ましくは、ヒトである。
【０３５９】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、多重特異性抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を処置するためのものである。更なる実施態様では、医薬は、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を有する個体に有効量の該医薬を投与することを含む、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を処置する方法に使用するためのものである。このような一実施態様では、該方法は、更に、有効量の、例えば、以下に記載された少なくとも１つの更なる治療剤を、個体に投与することを含む。更なる実施態様では、医薬は、血管新生を阻害するためのものである。更なる実施態様では、医薬は、個体中の血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するのに有効量の該医薬を個体に投与することを含む方法に使用するためのものである。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであることができる。
【０３６０】
更なる態様では、本発明は、眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を処置するための方法を提供する。一実施態様において、該方法は、このような眼血管疾患、好ましくは、黄斑変性を有する個体に、有効量の多重特異性抗体を投与することを含む。このような一実施態様では、該方法は、更に、有効量の、以下に記載された少なくとも１つの更なる治療剤を、個体に投与することを含む。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであることができる。
【０３６１】
更なる態様では、本発明は、個体中の血管新生を阻害するための方法を提供する。一実施態様において、該方法は、血管新生を阻害するのに有効量の多重特異性抗体を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０３６２】
更なる態様では、本発明は、例えば、上記治療法のいずれかに使用するための、本明細書で提供された多重特異性抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施態様において、医薬製剤は、本明細書で提供された多重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供された多重特異性抗体のいずれかと、例えば、以下で記載された少なくとも１つの更なる治療剤とを含む。
【０３６３】
本発明の抗体は、治療において、単独又は他の治療剤との組み合わせのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの更なる治療剤と共投与することができる。特定の実施態様では、更なる治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＡＮＧ２抗体である。
【０３６４】
上記されたこのような組み合わせの治療法は、組み合わせられた投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ又は別箇の製剤に含まれる）及び別箇の投与を包含する。この場合、本発明の抗体の投与を、１つ以上の更なる治療剤の投与前、同投与と同時に、及び／又は、同投与後に行うことができる。一実施態様において、多重特異性抗体の投与及び更なる治療剤の投与は互いに、約１か月以内又は約１、２、もしくは３週間以内、又は、約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に行う。
【０３６５】
本発明の抗体（及び任意の更なる治療剤）は、任意の適切な手段により投与することができる。同手段は、非経口、肺内、及び鼻内、及び局所処置の必要に応じて、病巣内投与を含む。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投与は、一部、投与が短期間であるか、又は、慢性的であるかに応じて、任意の適切な経路により、例えば、静脈内又は皮下注入などの注入によることができる。種々の投与計画は、種々の時点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与を含むが、これらに限定されない。パルス注入が、本明細書において考慮される。
【０３６６】
本発明の抗体は、適性診療規範（good medical practice）に合致する方法で、配合、製剤化、及び投与されるであろう。この文脈において考慮すべき要因は、処置される特定の障害、処置される特定のほ乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務家に公知の他の要因を含む。抗体は、対象となる障害を予防又は治療するのに現在使用されている１つ以上の薬剤と共に、任意選択的に配合されるが、同配合は必ずしも必要ではない。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記で検討された他の要因により決まる。これらは、一般的には、同じ用量で、本明細書で記載された投与経路により使用される。また、約１〜９９％ 本明細書で記載された用量で、又は、経験的に／臨床的に適切であると決定される任意の用量および任意の経路で使用される。
【０３６７】
疾患の予防又は治療のために、適切な用量の本発明の抗体（単独又は１つ以上の他の更なる治療剤との組み合わせ時に）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の既往歴、及び抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量により決まるであろう。抗体は、１回又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．５mg/kg〜１０mg/kg） 抗体が、例えば、１回以上の別箇の投与によるか又は連続的な注入によるかに関わらず、患者に投与するための最初の候補用量であることができる。１つの典型的な日量は、上記された要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であることができる。数日以上にわたる繰返しでの投与のために、症状に応じて、処置は、一般的には、疾患兆候の所望のサプレッションが生じるまで、持続されるであろう。抗体の１つの例示的な用量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲であろう。このため、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、又は１０mg/kgの内の１つ以上の用量（又は、それらの任意の組み合わせ）を、患者に投与することができる。このような用量は、例えば、毎週又は三週間毎に断続的に投与することができる（例えば、これにより、患者は、約２〜約２０回、又は、例えば、約６回の抗体の投与を受ける）。最初のより大きいローディング用量、続けて、１つ以上のより小さい用量が投与されてもよい。ただし、他の投与計画も有用であることができる。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイ法により、容易にモニターされる。
【０３６８】
上記製剤又は治療法のいずれかが、多重特異性抗体に代えて、又は、同多重特異性抗体に加えて、本発明の免疫コンジュゲートを使用して行うことができることが理解される。
【０３６９】
ＩＩＩ．製品
本発明の別の態様では、上記された障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、該容器上又は該容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成することができる。容器は、組成物自体、又は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物との組み合わせで、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有するバイアルでもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を処置するのに使用されることを示す。さらに、本製品は、（ａ）本製品に含有される組成物を含む第１容器であって、同組成物が本発明の抗体を含む第１容器と、（ｂ）本製品に含有される組成物を含む第２容器であって、同組成物が更なる細胞毒又はその他の方法での治療剤を含む第２容器とを含んでもよい。本発明のこの実施態様における製品は、組成物が特定の症状を処置するのに使用することができることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に又は付加的に、本製品は、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）容器を更に含む。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザ視点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０３７０】
上記製品のいずれかが、抗ＩＬ−１ベータ抗体に代えて、又は、同抗体に加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含むことができることが理解される。
【０３７１】
ＩＶ．具体的な実施態様
１．ヒトＡＮＧ２、ヒトＶＥＧＦ、ヒトＩＬ−１ベータ、及びヒトＰＤＧＦ−Ｂからなる群より選択される２種類の抗原に特異的に結合する、二重特異性抗体。
【０３７２】
２．ｉ）ヒトＡＮＧ２と、ｉｉ）ヒトＩＬ−１ベータ又はヒトＰＤＧＦ−Ｂとに特異的に結合する、二重特異性抗体。
【０３７３】
３．ｉ）ヒトＶＥＧＦと、ｉｉ）ヒトＩＬ−１ベータ又はヒトＰＤＧＦ−Ｂとの２つに特異的に結合する、二重特異性抗体。
【０３７４】
４．ヒトＩＬ−１ベータとヒトＰＤＧＦ−Ｂとに特異的に結合する、二重特異性抗体。
【０３７５】
５．抗体が、ヒトＩＬ−１ベータに特異的に結合し、
ａ）
（ａ）配列番号：０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインと、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜４のいずれか１つ記載の抗体。
【０３７６】
６．抗体が、ヒトＩＬ−１ベータに特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜５のいずれか１つ記載の抗体。
【０３７７】
７．抗体が、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜６のいずれか１つ記載の抗体。
【０３７８】
８．抗体が、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜７のいずれか１つ記載の抗体。
【０３７９】
９．抗体が、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜７のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８０】
１０．抗体が、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
（ａ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１〜７のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８１】
１１．抗体が、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合し、
ａ）（ａ）配列番号：５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｂ）（ａ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｃ）（ａ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
ｄ）（ａ）配列番号：８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１、２、及び５〜１０のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８２】
１２．抗体が、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合し、
（ａ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列番号：８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様１、２、及び５〜１１のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８３】
１３．抗体が、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、
ａ）配列番号：１０７の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号：１０８の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３とを含むか、又は
ｂ）配列番号：１０９の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号：１１０の重鎖可変ドメインに含有されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３とを含む、実施態様１、３、及び５〜１２のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８４】
１４．抗体が、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、
配列番号：１０７及び配列番号：１０８それぞれにおけるＨＣ及びＬＣ配列を含み、同ＨＣ及びＬＣ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む、実施態様１、３、及び５〜１３のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８５】
１５．抗体が、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、
配列番号：１０９及び配列番号：１１０それぞれにおけるＨＣ及びＬＣ配列を含み、同ＨＣ及びＬＣ配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む、実施態様１、３、及び５〜１３のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８６】
１６．抗体が、ヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものである、実施態様１〜１５のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８７】
１７．抗体が、カッパ軽鎖を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものである、実施態様１〜１６のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８８】
１８．抗体が、モノクローナル抗体である、実施態様１〜１７のいずれか１つ記載の抗体。
【０３８９】
１９．抗体が、二重特異性抗体である、実施態様１〜１８のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９０】
２０．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９１】
２１．抗体は、
ｉ）  ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されているか、又は
ｉｉ）  ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている、実施態様２０記載の抗体。
【０３９２】
２２．抗体は、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、Ｋにより置換されている、実施態様２０又は２１記載の抗体。
【０３９３】
２３．抗体は、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、Ｅにより置換されている、実施態様２０〜２２のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９４】
２４．抗体は、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸が、Ｋにより置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）が、Ｅにより置換されている、実施態様２０〜２３のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９５】
２５．抗体は、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸が、Ｋにより置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸が、Ｅにより置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸が、Ｋにより置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸が、Ｅにより置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸が、Ｋにより置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸が、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、実施態様２０〜２４のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９６】
２６．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９７】
２７．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９８】
２８．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）１〜４つの更なる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２及び／又は第３及び／又は第４及び／又は第５の抗原、好ましくは、１つの更なる抗原、すなわち、第２の抗原に特異的に結合する）、１、２、３、又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメントとを含み、
前記ｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記ａ）の全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合している、多重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０３９９】
２９．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）からなる第１のポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドが、そのＶＨドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２つの重鎖の内の一方のＣ末端に融合している第１のポリペプチドと、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなる第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドが、ＶＬドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２つの重鎖の内の他方のＣ末端に融合している第２のポリペプチドとを含み、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが共に、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成している、三価の二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４００】
３０．ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが連結しており、下記位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位と軽鎖可変ドメインの１００位（通常、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、
の間へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋により安定化されている、実施態様２９記載の抗体。
【０４０１】
３１．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖と、
ｃ）１〜４つの抗原結合ペプチドであって、これらが、１つ又は２つの更なる抗原に（すなわち、第３及び／又は第４の抗原に）特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している１〜４つの抗原結合ペプチドとを含む、三重特異性又は四重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０２】
３２．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する（かつ、２つのＦａｂフラグメントを含む）抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つの更なるＦａｂフラグメントであって、前記更なるＦａｂフラグメントが、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合している２つの更なるＦａｂフラグメントを含み、
Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている、
ｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメント及びｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、かつ
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｉｉ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、かつ
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｉｖ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
又は
ｖ）  ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている、
二重特異性の四価抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０３】
３３．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含む第１の抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第１の抗体の第２のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第１の抗体の（改変）重鎖と、
ｂ）前記ａ）の第１の抗体の２つの軽鎖と、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ−ＣＬドメインペアを含む第２の抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第２の抗体の第２のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第２の抗体の（改変）重鎖と、
ｄ）前記ｃ）の第２の抗体の２つの（改変）軽鎖であって、それぞれが、ＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む第２の抗体の２つの（改変）軽鎖とを含む、二重特異性の四価抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０４】
３４．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のＮ末端が、軽鎖のＣ末端に、ペプチドリンカーを介して連結している、二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０５】
３５．抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含むＦｖフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに連結しているＦｖフラグメントとを含み、
ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合している、二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０６】
３６．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、
−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｋ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４、及び
−突然変異Ｎ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ３を含む群より選択され、
ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、
−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ１、ならびに
−突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４を含む群より選択される、実施態様１〜３５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０７】
３７．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施態様１〜３５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０８】
３８．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）  ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ
を含む、実施態様１〜３７のいずれか１つ記載の抗体。
【０４０９】
３９．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ａ）第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源由来）であり、第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける全ての突然変異がまとまった際に、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は、ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は、ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄが突然変異（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は、ｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は、ｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング）から選択される１つ又は２つの突然変異と、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ、及びＹ４３６Ａ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング）を含む群から選択される１つ又は２つの突然変異とを含み、あるいは
ｂ）第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（すなわち、ヒト起源由来）であり、第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける全ての突然変異がまとまった際に、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は、ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は、ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２ＤがＦｃ領域に含まれるように、第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドの両方が、Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５ＡもしくはＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６ＡもしくはＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ、又はそれらの組み合わせ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング）を含み、全ての突然変異が、第１又は第２のＦｃ領域ポリペプチドにおけるものであるか、又は、１つもしくは２つの突然変異が、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおけるものであり、１つもしくは２つの突然変異が、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおけるものであるかのいずれかであり、あるいは、
ｃ）第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（すなわち、ヒト起源由来）であり、第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５ＡもしくはＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６ＡもしくはＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング）を含むか、又は、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａの組み合わせを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａの組み合わせ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング）を含む、実施態様１〜３７のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１０】
４０．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ａ）第１の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチドが、第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドから得られ、第２の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチドが、第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドから得られ、第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドが、第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドと同一であるか、又は、第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドとは異なり、
ｂ）第１の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチドが、第２の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチドとは、第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドが第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドとは異なるそれらのアミノ酸残基以外の１つ以上のアミノ酸残基において異なり、
ｃ）第１の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチド及び第２の突然変異Ｆｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域が、ａ）の第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチド及びａ）の第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域の親和性とは異なるヒトＦｃレセプターに対する親和性を有し、
第１のＦｃ領域ポリペプチドもしくは第２のＦｃ領域ポリペプチドのいずれか又は両方のＦｃ領域ポリペプチドが、それぞれ独立して、下記突然変異：
−Ｔ３０７Ｈ、又は
−Ｑ３１１Ｈ、又は
−Ｅ４３０Ｈ、又は
−Ｎ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｑ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｅ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｎ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅの内の１つ又は同突然変異の組み合わせを含む、実施態様１〜３７のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１１】
４１．抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール鎖）を含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ノブ鎖）を含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチド（ホール鎖）が、突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄを含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとが、１つ以上のジスルフィド架橋により連結されており、
第１のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインが両方とも、プロテインＡに結合するか、又は、両方ともプロテインＡに結合しない（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従ってナンバリング）、実施態様１〜３７のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１２】
４２．抗体が、突然変異
ｉ）Ｉ２５３ＡもしくはＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４ＡもしくはＬ３１４ＧもしくはＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６ＥもしくはＴ２５６Ａを含む、実施態様４１記載の抗体。
【０４１３】
４３．抗体が、突然変異
ｉ）Ｉ２５３ＡもしくはＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４ＡもしくはＬ３１４ＧもしくはＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）場合により、ａ）Ｔ２５０Ｑ及び／もしくはＴ２５６ＥもしくはＴ２５６Ａ、及び
ｉｖ）  ａ）Ｌ２５１ＡもしくはＬ２５１ＧもしくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０ＡもしくはＨ３１０Ｇを含む、実施態様４１又は４２記載の抗体。
【０４１４】
４４．抗体が、突然変異
ｉ）Ｉ２５３ＡもしくはＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４ＡもしくはＬ３１４ＧもしくはＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）  ａ）Ｔ２５０Ｑ及び／又はＴ２５６ＥもしくはＴ２５６Ａ、及び
ｉｖ）  ａ）Ｌ２５１ＡもしくはＬ２５１ＧもしくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０ＡもしくはＨ３１０Ｇ、
ｖ）場合により、ａ）Ｔ３０７ＡもしくはＴ３０７ＨもしくはＴ３０７ＱもしくはＴ３０７Ｐ、及び／又はｂ）Ｑ３１１Ｈ、及び／又はｃ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又はｄ）Ｓ２５４Ｔを含む、実施態様４１〜４３のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１５】
４５．抗体が、突然変異
ｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｉ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又は
ｉｉｉ）Ｓ２５４Ｔ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６ＥもしくはＴ２５６Ａ、及び／又は
ｖ）Ｔ３０７ＡもしくはＴ３０７ＨもしくはＴ３０７ＱもしくはＴ３０７Ｐ、及び／又は
ｖｉ）Ｑ３１１Ｈを含む、実施態様４１〜４４のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１６】
４６．医薬として使用するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１７】
４７．眼血管疾患の処置に使用するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４１８】
４８．眼疾患、特に、眼血管疾患の処置のための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体の使用。
【０４１９】
４９．眼疾患を処置するのに使用するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４２０】
５０．眼疾患、特に、眼血管疾患を処置するのに使用するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体。
【０４２１】
５１．眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、
有効量の実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体を、個体に投与することを含む、
方法。
【０４２２】
５２．実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体を含む、医薬製剤。
【０４２３】
５３．眼血管疾患の処置に使用するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体を含む、医薬製剤。
【０４２４】
５４．眼血管疾患の処置のための医薬を製造するための、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体の使用。
【０４２５】
５５．眼血管疾患を患う患者を処置する方法であって、
実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することにより、眼血管疾患を患う患者を処置する、方法。
【０４２６】
５６．抗体が、ガラス体内適用により投与される、実施態様５２又は５３記載の実施態様に記載の医薬製剤。
【０４２７】
５７．投与が、ガラス体内適用である、実施態様５５又は５６記載の投与。
【０４２８】
５８．実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体をコードする、核酸。
【０４２９】
５９．実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体をコードする１つ以上の核酸を含む、細胞。
【０４３０】
６０．下記工程：
ａ）場合により、実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体をコードする１つ以上の核酸により、哺乳類細胞をトランスフェクションする工程と、
ｂ）この細胞を、この抗体を発現するように培養する工程と、
ｃ）この抗体を、細胞又は培養培地から回収することにより、この抗体を製造する工程とを含む、
実施態様１〜４５のいずれか１つ記載の抗体を製造するための方法。
【実施例】
【０４３１】
Ｖ．実施例
下記は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供された全体的な説明から、種々の他の実施態様が実施することができることが理解される。
【０４３２】
実施例１
マウス抗ＩＬ１ベータ抗体Ｈ３４の元の生成及び特徴決定
材料−メスのBALB/cマウスを、Banting and Kingman（Freemont, CA）から得た。完全及び不完全フロイントアジュバント（CFA and IFA）を、Difco（Detroit, MI）から得た。HB101を、Hana Biologics, Inc.（Berkeley, CA）から得た。カルシウム及びマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ならびにグルタミンを、GIBCO Labs（Grand Island, NY）から得た。ウシ胎児血清を、Hyclone Labs（Logan, UT）から得た。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）及びヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補助剤ならびに５０％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１４５０を、Bethesda Research Labs（Gaithersburg, MD）から得た。ウサギ抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍペルオキシダーゼコンジュゲート、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ、マウスＩｇＧアイソタイプ特定キット、及びオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を、Zymed Labs（South San Francisco, CA）から得た。セファロースプロテイン−Ａ及びSephadex G-25を、Pharmacia（Piscataway, NJ）から得た。プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンデカン）を、Aldrich Chem. Co.（Milwaukee, WI）から得た。１２５Ｉ  Bolton-Hunter試薬を、New England Nuclear（Boston, MA）から得た。他の全ての化学薬品を、Sigmaからの分析グレードとした。
【０４３３】
ハイブリドーマ生成−ＩＬ−１ベータに対するハイブリドーマを、Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 347に以前に記載された、Kohler及びMilsteinの方法を使用して生成した。１２週齢のメスのBALB/cマウスの腹腔内及び後ろ足蹠に、ＣＦＡ中の５μg ＩＬ−１ベータ（精製されたＭＷ１７，５００型）を注入した。不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の５回の追加免疫注入を、３〜４週間間隔で与えた。血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより、定期的に決定した。５回の注入後に、力価を検出可能であった。融合用に選択された動物に、無菌ＰＢＳ中の１０μg ＩＬ−１ベータの静脈内（ＩＶ）追加免疫を受けさせた。脾臓を、４日後に摘出し、脾細胞を、P3X63-Ag8.653骨髄腫細胞と、５０％ ＰＥＧ１４５０を使用して融合させた。細胞を、９６ウェルプレート（１×１０６個／ウェル）において、ＨＡＴ培地中で培養した。ハイブリドーマ上清を、固相抗原ＥＬＩＳＡ、１２５Ｉ  ＩＬ−１ベータによる固相抗体ＲＩＡ、及びＩＬ−１ベータ誘引性胸腺細胞増殖の阻害（以下を参照のこと）により、抗ＩＬ−１ベータ活性についてアッセイした。ハイブリドーマを、胸腺細胞（５×１０５個／ウェル）を含むＨＡＴ培地中で、少なくとも３回の限界希釈によりクローニングした。
【０４３４】
抗体生成及び精製−モノクローナル抗体を、プリスタン処置マウス（前記Kohler et al.,）の腹腔内に２×１０６個 ハイブリドーマ細胞を注入することにより、腹水中に生成した。腹水を収集し、抗体を、セファロースプロテインＡクロマトグラフィー（Goding, J. Immunol. Methods 20 (1978) 241）により精製した。
【０４３５】
モノクローナル抗体ＩＬＢ１−Ｈ３４を、上記された対応する細胞株から調製した。
【０４３６】
ＩＬ−１ベータ抗体のＥＬＩＳＡ−ビニルアッセイプレート（Costar）を、ＰＢＳ中の５μg/ml 希釈抗原溶液により、５０μL／ウェルでコートし、４（摂氏）Ｃで一晩インキュベーションした。ウェルを、５％ 脱脂粉乳／０．０５％ チオメルサール／ＰＢＳを使用して、室温で１時間対比コートした。ウェルを、０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％ チオメルサール／ＰＢＳで洗浄し、５０μL／ウェル 抗ＩＬ−１ベータ抗体を、室温で２時間インキュベーションした。抗体を、ウサギ抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍペルオキシダーゼコンジュゲート及びＯＰＤ基質溶液を使用する間接ＥＬＩＳＡにより検出した。あるいは、精製されたモノクローナル抗体をビオチン化し（Geusdon et al., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979) 1131）、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ及びＯＰＤ基質溶液を使用して検出した。モノクローナル抗体のアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイプ特定キットを使用する間接ＥＬＩＳＡにより特定した。
【０４３７】
胸腺細胞増殖アッセイ法−ＩＬ−１ベータ及びＰＨＡ（１０μg/ml）を、ＭＥＭ／５％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）／１００μg/ml ゲンタマイシン、２−メルカプトエタノール（２×１０−５Ｍ）、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ培地中のC3H/HeJマウス胸腺細胞（１×１０６個／ウェル）の培養物に加えた。３７℃において４８時間後、０．５μCi/ウェル ３Ｈ  チミジンを加え、培養物を、一晩インキュベーションした。細胞を、ガラス繊維フィルタ上で、細胞採取器を使用して収集し、シンチレーション計測用に処理した。
【０４３８】
レセプター結合アッセイ法−１７，５００型のＩＬ−１ベータを、ジヨード１２５Ｉ  Bolton-Hunter試薬を使用し、製造メーカーの説明に従ってラベルした。ＰＢＳ １０μL中の１μg ＩＬ−１ベータを、１mCi 試薬と、４℃で４時間反応させた。ＰＢＳ／０．２％ ゼラチン ５００μLを加え、ラベルされたＩＬ−１ベータを、遊離したBolton-Hunter試薬から、ＰＢＳ／０．２％ ゼラチンを含むSephadex G-25の２０×１cmカラムにおけるクロマトグラフィーにより分離した。１２５Ｉ  ＩＬ−１ベータを、２４ウェル培養プレートにおけるＤＭＥＭ／１％ ＢＳＡ／０．１％ アジ化ナトリウム／０．０１％ Triton X-100中のBALB/c 3T3繊維芽細胞のコンフルエントな単層に加えた。３７℃における１時間後、単層を、ラベルされたＩＬ−１ベータを含まない培地中で、徹底的に洗浄した。単層を、ガンマカウントのために、０．１Ｎ ＮａＯＨを使用して取り出した。１２５Ｉ  ＩＬ−１ベータの非特異的結合を、２００倍モル過剰のラベルされていないＩＬ−１ベータの存在下において、インキュベーションすることにより測定した。
【０４３９】
抗体親和性の決定−モノクローナル抗体の親和性を、免疫沈降放射性免疫アッセイ法を使用して得られたデータから決定した。簡潔に、５０００cpm／チューブ １２５Ｉ  ＩＬ−１ベータを、精製されたモノクローナル抗体の希釈液と共に、１％ 脱脂粉乳／０．５％ チオメルサール／ＰＢＳ ０．３ml中において、４℃で一晩インキュベーションした。抗原−抗体複合体を、１０％ 正常マウス血清／ＰＢＳ及びＰＢＳ中の４ｍｇ／ml ヤギ抗マウスＩｇＧ血清を、１００μL／チューブでそれぞれ加えることにより沈殿させた。４℃における４時間後、１ml／チューブ 氷冷２％ ポリエチレングリコール−６０００を加え、このチューブを、３０００×ｇで４℃において２０分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットについて、ガンマカウンターにおいて計測した。親和性定数を、抗体の種々の濃度における結合／遊離比から算出した（Berson et al., Clin. Chim. Acta. 22 (1969) 51-69）。
【０４４０】
親和性定数を、上記された種々の抗体濃度における１２５Ｉ  ＩＬ−１ベータ結合の免疫沈降放射性免疫アッセイ法（ＲＩＡ）から得られたデータを使用して算出した。抗ＩＬ−１ベータ抗体Ｈ３４は、ＩＬ−１ベータについて、６４×１０９L/molの親和性を有する。
【０４４１】
実施例２
マウスの免疫化
NMRIマウスの免疫化について、ＲＩＭＭＳ（「急速な免疫化、複数個所」）スケジュールを使用した。
【０４４２】
実施例３
抗ＩＬ−１ベータ抗体血清力価の決定
ヒトリコンビナントＩＬ−１ベータを、９６ウェルNUNC Maxisorbプレートにおいて、ＰＢＳ中の２．５μg／ml、１００μl／ウェルで免疫化した。続けて、このプレートを、ＰＢＳ中の２％ CroteinCにより、２００μl／ウェルでブロッキングした。抗血清の系列希釈を、ＰＢＳ中の０．５％ CroteinCに、１００μl／ウェルにおいて、ダプリケートで加えた。ＰＢＳ中の０．５％ CroteinCに１：１６，０００希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch）により、１００μl／ウェルで検出した。全ての工程について、プレートを、３７℃で１時間インキュベーションした。全ての工程間において、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％ Tween 20で３回洗浄した。シグナルを、１００μl／ウェルで、BM Blue POD Substrate soluble（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を加えることにより発色させ、１００μl／ウェルで、１Ｍ ＨＣｌを加えることにより停止させた。吸光度を、参照としての６９０nmに対して、４５０nmにおいて読み取った。力価を、最大半値シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
【０４４３】
実施例４
ヒトＩＬ−１ベータ結合ＥＬＩＳＡ
変異体１
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＩＬ−１ベータ（Peprotech Cat. No 200-01B）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度５００ng/mLでＰＢＳ ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＩＬ−１ベータ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：２０００（ロバＦ（ａｂ）２抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham, NA9340V又はヒツジＩｇＧ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham RPN4201）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４４】
変異体２
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるＨｉｓタグ付きヒトＩＬ−１ベータ（Sino Biologics, Cat. No. 10139-H07E）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度０．２５μg/mLでＰＢＳ ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＩＬ−１ベータ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：２０００（ロバＦ（ａｂ）２抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham, NA9340V又はヒツジＩｇＧ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham RPN4201）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４５】
実施例５
カニクイザルＩＬ−１ベータ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＩＬ−１ベータ（Sino Biologics, Cat. No. 90010CNAE）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度０．５μg/mLでＰＢＳ ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＩＬ−１ベータ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：２０００（ロバＦ（ａｂ）２抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham, NA9340V又はヒツジＩｇＧ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham RPN4201）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４６】
実施例６
マウスＩＬ−１ベータ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるマウスＩＬ−１ベータ（Sino Biologics, Cat. No. 50101-MNAE）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度０．５μg/mLでＰＢＳ ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＩＬ−１ベータ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：２０００（ロバＦ（ａｂ）２抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham, NA9340V又はヒツジＩｇＧ抗マウスＩｇＧ  ＰＯＤ、Amersham RPN4201）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４７】
実施例７
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法：ヒトＩＬ−１ベータ：ヒトＩＬ−１レセプター１型
ヒトＩＬ−１ベータのヒトＩＬ−１レセプターＩ型に対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。ヒトＨｉｓタグ付きＩＬ−１ベータタンパク質（Sino Biologics, Cat.No.10139-H07E）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific Cat. No. 464718）において、濃度１μg/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程、結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）濃度を増大させる抗ＩＬ−１ベータ抗体 １２．５μLを、３００ng/mL Ｆｃタグ付きヒトＩＬ−１ベータレセプター（Sino Biologics, Ca.No10126-H02H） １２．５μLと、容量２５０μL中で１時間インキュベーションした。３）検出を、ペルオキシダーゼラベルされた抗ｈｕＦｃ抗体（ヤギＦ（ａｂ２）抗ヒトＦＣ  ＰＯＤ、Jackson, Cat. No 109-036-098）を使用して達成した。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Cat. No. 11835033001）を加えた１０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＩＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４８】
実施例８
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法：ヒトＩＬ−１ベータ：ヒトＩＬ−１レセプター２型
ヒトＩＬ−１ベータのヒトＩＬ−１レセプターＩＩ型に対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。ヒトＨｉｓタグ付きＩＬ−１ベータタンパク質（Sino Biologics, Cat.No.10139-H07E）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１μg/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）濃度を増大させる抗ＩＬ−１ベータ抗体 １２．５μLを、３０ng/mL Ｆｃタグ付きヒトＩＬ−１ベータレセプター（RnD, Ca.No.663-2R-50） １２．５μLと、容量２５０μL中で１時間インキュベーションした。３）検出を、ペルオキシダーゼラベルされた抗ｈｕＦｃ抗体（ヤギＦ（ａｂ２）抗ヒトＦＣ  ＰＯＤ、Jackson, Cat. No 109-036-098）を使用して達成した。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No. 11835033001）を加えた１０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＩＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０４４９】
実施例９
マウスハイブリドーマＨ３４マウス抗ＩＬ−１ベータ抗体生成ハイブリドーマの発現
培地には、下記試薬：ＲＰＭＩ（PAN）、２０％ 牛胎児血清、２mM グルタミン（PAN）、１×ピルビン酸ナトリウム（PAN）、１×ＮＥＡＳ（PAN）が含まれている。
【０４５０】
凍結させた細胞含有バイアルを、そのチューブを３７℃の水浴に６０秒間入れることにより予め融解させる。予め温めた（３７℃）培地に、細胞を、素早く再懸濁させ、バイアルから、培地 ８mLを予め含有する１０mLフラスコ（CellStar）に移す。フラスコを、１０００rpm（２５℃）で５分間遠心分離する。ついで、上清を捨て、細胞ペレットを、ピペットで上下させることにより、予め温めた（３７℃）培地 １０mL中に穏やかに再懸濁させる。溶液全体をＴ２５−フラスコに入れる。フラスコを、インキュベーター（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度）に２日間置いておく。
【０４５１】
細胞を、新たな培地中に希釈することにより、密度１〜２×１０５個／mlで、次の５日間で２〜３日毎に分割する。ついで、翌日、ウシ胎児血清部を、２０％から１回目の工程において１０％に減少させるのを開始する。１０％ 牛胎児血清での２回の分割後、培地（ＲＰＭＩ（PAN）、１０ ％ ウシ胎児血清、２mM グルタミン（PAN）、１×ピルビン酸ナトリウム（PAN）、１×ＮＥＡＳ（PAN））を、Hyclone-ADCF-MAb−培地（Thermo-Scientific）と１：１で混合する。この培地を、更に２回分割するのに使用する。ついで、Hyclone：１０％ ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩの比を３：１に上昇させる。細胞を、２〜３×１０５個／mlのより高い密度で播種する。Nutridoma CS（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）により加えられた１００％ Hyclone−培地において、少なくとも細胞を分割する。
【０４５２】
ついで、細胞溶液の量を、５回分割するために、２０ml（Ｔ７５フラスコ）に増やす。抗体生成のために、細胞 １５mlを、密度２×１０６個／mlで、Celline CL1000リアクタ中に充填し、８〜９日間インキュベーションする（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度）。収集のために、上清を、５０mlのfalcon中に充填し、４０００rpmで４回遠心分離する（各サイクル後、上清を、新たな５０mlのfalconに充填するものとする）。最後に、細胞フリー上清を、−２０℃で凍結させる。
【０４５３】
実施例１０
マウスハイブリドーマからの抗体精製
抗体含有Ｈ３４ハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程により精製した。抗体を、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrapプロテインＧ（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、２５mM クエン酸バッファー、ｐＨ３．０で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ９．０で、ｐＨ６．０に中和した。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４５４】
抗体含有ハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程により精製した。上清を、２Ｍ グリシン、ｐＨ８．６、６００mM ＮａＣｌと、５０％ v/vで混合し、１Ｍ グリシン、ｐＨ８．６、３００mM ＮａＣｌで平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、１００mM クエン酸バッファー、ｐＨ２．８で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ８．５で、ｐＨ６．０に中和した。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４５５】
実施例１１
ＨＥＫ細胞におけるヒト化抗体のトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬である293-free（Novagen）による懸濁液適合HEK293F（FreeStyle 293-F細胞;Invitrogen）細胞における、抗体の一過性発現
【０４５６】
細胞を、１２５ml振とうフラスコ中で融解させた後に、希釈により、少なくとも４回（容量３０ml）継代した（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmにおいて、インキュベーション／振とう）。
【０４５７】
細胞を、容量２５０ml中で、３×１０５個／mlに増殖させた。３日後に、細胞を分割し、新たに、１リットル振とうフラスコにおける容量２５０ml中に、密度７×１０５個／mlで播種した。トランスフェクションを、約１．４〜２．０×１０６個／mlの細胞密度で、２４時間後に行うものとする。
【０４５８】
トランスフェクション前に、２５０μg プラスミドＤＮＡ（１２２μg 軽鎖及び１２８μg 重鎖）を、終容量１０mlに、予め温めた（水浴：３７℃）Opti-MEM（Gibco）で希釈する。溶液を穏やかに混合し、室温で５分以内にインキュベーションする。ついで、293-freeトランスフェクション試薬 ３３３．３μlを、DNA-OptiMEM溶液に加える。穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベーションする。混合物の全量を、HEK細胞培養量 ２５０mlを含む１Ｌ振とうフラスコに加える。
【０４５９】
３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmにおいて、６又は７日間インキュベーション／振とうする。
【０４６０】
２０００rpm、４℃、１０分間での１回目の遠心分離工程により、上清を収集する。ついで、４０００rpm、４℃、２０分間での２回目の遠心分離のために、この上清を、新たな遠心分離フラスコ中に移す。その後、細胞フリー上清を、０．２２μm ボトルトップフィルタによりろ過し、フリーザー（−２０℃）において保存する。
【０４６１】
実施例１２
ＨＥＫ上清からの抗体精製
抗体含有培養上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程により精製した。ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、５０mM クエン酸バッファー、ｐＨ２．８で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ９．０で、ｐＨ６．０に中和した。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４６２】
実施例１３
抗体調製物の分析
抗体調製物のタンパク質濃度を、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
【０４６３】
抗体の純度及び完全性を、Protein Expressチップ及びHT Protein Express試薬キットを備えるLabChip GX II（PerkinElmer）を使用するＣＥ−ＳＤＳにより分析した。
【０４６４】
抗体調製物の凝集含量を、TSK-GEL QC-PAK GFC 300を使用し、ランニングバッファーとして２×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用する高性能ＳＥＣにより、又は、BioSuite高解像ＳＥＣ、２５０Å、５μm分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用し、ランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用する高性能ＳＥＣにより決定した。
【０４６５】
実施例１４
抗体からのＦａｂフラグメントの調製及び分析：
１２mg 抗体（２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の１mg/ml）を、Ｌ−システイン溶液 ２４０μl（Merck Millipore；２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の２５０mM）及びパパイン ３２７μl（Roche Life Science；０．００１U/mg 抗体）と共に、３７℃で１２０分間インキュベーションした。開裂後、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなＩｇＧ及びＦｃフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、２回目の精製工程としてのSuperdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。Ｆａｂフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４６６】
Ｆａｂフラグメントのタンパク質濃度を、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
【０４６７】
Ｆａｂフラグメントの純度及び完全性を、還元剤（５mM １，４−ジチオスレイトール）の存在及び不存在下における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE  ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Invitrogen）により、Simply Blue Safe Stain（Invitrogen）で染色して分析した。
【０４６８】
Ｆａｂ調製物の凝集含量を、BioSuite高解像ＳＥＣ、２５０Å、５μm分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用し、ランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用する高性能ＳＥＣにより決定した。
【０４６９】
実施例１５
Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激後のＩＣＡＭ−１発現
Ａ５４９細胞（１０，０００個／ウェル）を、１０％ ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０中で、一晩増殖させた。その後、この培地を、０．５％ 血清を加えたHunger培地に置き換えた。
【０４７０】
抗ＩＬ−１ベータ抗体を、２５０pg/ml ＩＬ−１ベータ及び種々の濃度の抗体（１０００、１００、１０、１、０．１、０ng/ml）と共に、２時間インキュベーションした。その後、Ａ５４９細胞を、ＩＬ−１ベータ／抗体混合物と共に、クアドルプリケートで一晩インキュベーションした。
【０４７１】
細胞を、氷冷したＰＢＳで４回洗浄し、その後、ＰＦＡで２０分間固定した。その後、細胞を、非透過性のＧＳＤＢでブロックした。抗ＩＣＡＭ−１抗体（R&D Systems、５μg/ml）との２時間のインキュベーション後、サンプルを、ＰＢＳで４回洗浄した。染色のために、サンプルを、１：１０００希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Amersham）と共に、１時間インキュベーションした。その後、サンプルを、ＰＢＳで４回洗浄し、ＡＢＴＳと共に２時間インキュベーションした。吸光を、４９５nmでの参照と共に４０５nmで測定した。
【０４７２】
実施例１６
Ａ５４９細胞のＩＬ−１ベータ刺激後のＩＬ−６決定（Quantikine ELISA, R&D Systems）
Ａ５４９細胞（１０，０００個／ウェル）を、１０％ ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０中で、一晩増殖させた。その後、この培地を、０．５％ 血清を加えたHunger培地に置き換え、培養を、９６時間継続した。
【０４７３】
抗ＩＬ−１ベータ抗体（１μg/ml）を、２５０pg/ml ＩＬ−１ベータと共に、２時間インキュベーションした。その後、Ａ５４９細胞を、ＩＬ−１ベータ／抗体混合物と共に、ダプリケートで一晩インキュベーションした。
【０４７４】
培養上清のサンプル １００μlを、更なる分析用に採取した。
【０４７５】
モノクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体でコートした９６ウェルプレートを、アッセイ希釈液RD1Wにより、１５分間ブロッキングした。その後、上清サンプルを加え、ＲＴで２時間インキュベーションした。ウェルを、ぞれぞれ洗浄バッファー ２００μlで４回洗浄した。その後、ウェルを、ＨＲＰにコンジュゲートさせたポリクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体により、ＲＴで２時間インキュベーションした。ウェルを、それぞれ洗浄バッファー ２００μlで４回洗浄した。その後、ウェルを、テトラメチルベンジジン及びＨ２Ｏ２により、２０分間インキュベーションした。反応を、２Ｎ シュウ酸の添加により、２０分後に停止させた。吸光を、５７０nmの参照波長と共に、４５０nmで決定した。
【０４７６】
実施例１７
生物活性アッセイ法
マウスのヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ−２）D10.G4.1株が、ＩＬ−１（インターロイキン−１）の生物活性についての、信頼性があり、好感度のアッセイ法として広く使用されている。D10細胞は、ＩＬ−１又はフィーダー細胞の不存在下において、ｃｏｎ  Ａに対して最少にのみ増殖するであろうためである（Symons, J.A., et al. in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (Eds): IRL Press. 272 (1987)を参照のこと）。この効果についてのＥＤ５０は、典型的には、１２pg/mL未満である。
【０４７７】
（新鮮に融解させた）３５，０００個のD10.G4.1  Ｔ−細胞／ウェルを、ＩＬ−１ベータ（１ng/ml）含有培地（ＲＰＭＩ／２．５μg/ml ＣｏｎＡ／１０％ ＦＣＳ）中において、７２時間刺激した。
【０４７８】
リードアウトを、CellTiterGlo（登録商標）Luminescent Cell Viabilityアッセイ法により、製造メーカーの説明に従って決定した。
【０４７９】
実施例１８
ＩＬ−１ベータにより誘引されたＨＵＶＥＣ細胞でのＩＣＡＭ−１アップレギュレーション
対応する培地ＥＢＭ／ＥＧＭ（Cat# CC-4176）中のＨＵＶＥＣ細胞（Lonza, Cat#00191027）を、９６ウェル培養プレート（Costar, Cat#3596）に、４０，０００個／ウェルで、ＥＢＭ＋２％ ＢＳＡ中に、２００μl/ウェルで播種した。細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で２４時間インキュベーションして、回収した。最終的に要求されるものの４０倍濃縮された、２つの希釈系列を行った。ＥＢＭ＋２％ ＢＳＡ中に、一方は、抗ＩＬ−１ｂ抗体  ｈｕＨ３４−２を含み、他方は、リコンビナントヒトＩＬ−１ベータ（R&D Systems, Cat#201-LB）を含む。２つの系列を、互いに１：１で混合し、ＲＴで１時間インキュベーションした。このＩＬ−１ベータ／抗ＩＬ−１ベータ抗体混合物 １０μlを、細胞に加え、穏やかに混合した。インキュベーションを、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で２０時間行った。その後、全ての培地を、細胞から除去し、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。１×Cell Dissociation Solution Non-enzymatic（Sigma, Cat# C5914）での１回の洗浄後、Cell Dissociation Solution １００μlとのインキュベーションを、３７℃で行った。５分毎に顕微鏡で観察することにより、剥離をチェックした。８０％ 細胞が球状になった時点で、細胞を、ＦＡＣＳプレート（９６ウェル、容量３４０μl、ＰＰ、Ｖ底プレート（Falcon Cat#353263））に移した。残りの細胞を、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ １００μlで、４回吸引することにより、培養プレートから剥離した。これも、ＦＡＣＳプレートに加えた。３００×ｇによる５分の遠心分離後、上清を捨てた。ペレットを、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１０μg/ml ヒトＩｇＧ（Sigma; Cat#I2511） １００μl中に再懸濁させ、ＲＴで１５分間インキュベーションした。抗ヒトＩＣＡＭ−１フルオレセインコンジュゲート（ＣＤ５４）（R&D Systems, Cat#BBA20） １０μlを加え、続けて、４℃で３０〜４５分間インキュベーションした。３００×ｇによる５分の遠心分離後、上清を捨てた。ペレットを、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ １１０μl中に再懸濁させ、ＬＳＲＩＩにおいて測定した。
【０４８０】
実施例１９
ＴＨＰ１細胞におけるＭＳＵ誘引ＴＮＦアルファ生成
ＴＨＰ１細胞（Invitrogen, Cat. No. thp-null）を、１０％ ＦＢＳ（熱不活性化）を加えた増殖培地ＲＰＭＩ  １６４０（Gibco, Cat#A10491）中で、密度１×１０６個／mlまで増殖させ、Falconチューブに移した。ＰＭＡ（ホルボールミリスチン酸酢酸、Invitrogen, Cat# tlrl-pma）を、終濃度３００ng/mlで加え、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で３時間インキュベーションした。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し（３００×ｇでの５分の遠心分離、上清を廃棄）、２mM Ｌ−グルタミン及び１０％ ＦＢＳ（熱不活性化）を加えたHunger  ＲＰＭＩ（Gibco, Cat#31870-025）中に、密度１．３３×１０６個／mlで再懸濁させた。１５０μl/ウェル 細胞懸濁液を、９６ウェル培養プレート（Costar, Cat#3596）において、２×１０５個／ウェルで播種した。一晩のインキュベーションを、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で行った。４倍濃縮したＭＳＵ懸濁液（尿酸一ナトリウム結晶、Invitrogen, Cat# tlrl-msu） ５０μlを、Hunger培地中に終濃度２５０μg/mlで加え、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で６時間インキュベーションした。抗ＩＬ−１ベータ抗体の希釈系列を、増殖培地中で行った。ＴＨＰ１細胞からの上清を捨て、ウェルを、ＰＢＳで１回洗浄した。ついで、調製された抗ＩＬ−１ｂ抗体の希釈系列を、このウェルに加えた。一晩のインキュベーションを、５％ ＣＯ２インキュベーター中において、３７℃で行った。上清を収集し、ＴＮＦアルファシングルプレックスにより分析した。
【０４８１】
実施例２０
化学的分解試験
サンプルを、３つのアリコートに分割し、２０mM Ｈｉｓ／Ｈｉｓ＊ＨＣｌ、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又はＰＢＳ中にそれぞれ再度緩衝させ、４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で保存した。対照サンプルを、−８０℃で保存した。
【０４８２】
インキュベーションの完了後、サンプルを、相対活性濃度（BIAcore）、凝集（ＳＥＣ）、及びフラグメント化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）について分析し、未処置対照と比較した。
【０４８３】
実施例２１
熱安定性
サンプルを、濃度１mg/mLで、２０mM ヒスチジン／ヒスチジン塩酸、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中において調製し、０．４μmフィルタプレートを通した遠心分離により、光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学半径を、動的光散乱により、サンプルを０．０５℃／分の速度で、２５℃から８０℃に加熱しながら、DynaProプレートリーダー（Wyatt）において繰返し測定した。
【０４８４】
あるいは、サンプルを、１０μLマイクロ−キュベットアレイに移し、静的光散乱データ及び２６６nmレーザーでの励起に基づく蛍光データを、Optim1000機器（Avacta Inc.）により、サンプルを０．１℃／分の速度で、２５℃から９０℃に加熱しながら記録した。
【０４８５】
凝集開始温度を、流体力学半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Optim1000）が増大し始める温度として定義する。
【０４８６】
融点を、蛍光強度ｖｓ波長グラフにおける変曲点として定義する。
【０４８７】
実施例２２
免疫化
マウス（NMRIマウス）及びウサギ（ヒトＩｇローカストランスジェニックウサギ）の免疫化のために、ＲＩＭＭＳ（「急速な免疫化、複数の部位」）に基づくスケジュールを使用した。抗原を、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling Tech.）とした。
【０４８８】
実施例２３
抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の血清力価の決定
ヒトリコンビナントＰＤＧＦ−Ｂを、９６ウェルNUNC Maxisorbプレートにおいて、２．５μg/ml（マウス）又は１．０μg/ml（ウサギ）で、ＰＢＳ中に１００μl／ウェルで免疫化し、続けて、ＰＢＳ中の２％ CroteinCにより、２００μl／ウェルでブロッキングし、抗血清の系列希釈を、ＰＢＳ中の０．５％ CroteinCに、１００μl／ウェルで、ダプリケートにおいて加えた。マウス血清について、ＰＢＳ中の０．５％ CroteinCに１：１６，０００希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch）により、又は、ウサギ血清について、ＰＢＳ中の０．５％ CroteinCに、１：５，０００希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ抗体（Southern Biotech）及び１：８，０００希釈したＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジンにより、１００μL／ウェルで検出した。全ての工程について、プレートを、３７℃で１時間インキュベーションした。全ての工程間において、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％ Tween 20で３回洗浄した。シグナルを、１００μL／ウェルで、BM Blue POD Substrate soluble（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を加えることにより発色させ、１００μL／ウェルで、１Ｍ ＨＣｌを加えることにより停止させた。吸光度を、参照としての６９０nmに対して、４５０nmにおいて読み取った。力価を、最大半値シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
【０４８９】
実施例２４
ウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
血液サンプルを、３匹の免疫化ウサギから採取した。ＥＤＴＡ含有白血球を、lympholyte mammal（Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada）を使用し、製造メーカーの仕様に従って、密度遠心分離する前に、１×ＰＢＳ（PAA, Pasching, Austria）で２倍希釈した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０４９０】
EL-4B5培地
１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT, USA）、２mM グルタミン、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA, Pasching, Austria）、２mM ピルビン酸ナトリウム、１０mM ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）、及び０．０５mM β−メルカプトエタノール（Gibco, Paisley, Scotland）を加えたＲＰＭＩ  １６４０（Pan Biotech, Aidenbach, Germany）を使用した。
【０４９１】
プレートのコーティング
無菌の細胞培養６ウェルプレートを、ＰＢＧＦ−ＢＢ（２μg/ml）又はＰＤＧＦ−ＡＡとＰＤＧＦ−ＣＣタンパク質との混合物（１μg/ml ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＣＣ）のいずれかで、炭酸バッファー（０．１Ｍ 炭酸ナトリウム、３４mM 炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中において、４℃で一晩コートした。使用前に、プレートを、無菌のＰＢＳで、３回洗浄した。
【０４９２】
マクロファージ／単球の枯渇
半分の血液サンプルのＰＢＭＣを、無菌の６ウェルプレート（細胞培養グレード）に播種し、非特異的な付着により、マクロファージ及び単球を枯渇させた。
【０４９３】
これらのタンパク質に結合するＢ細胞を除去し、１工程においてマクロファージ及び単球を除去するために、残り５０％ ＰＢＭＣを、ＰＤＧＦ−ＡＡとＰＤＧＦ−ＣＣタンパク質との混合物で予めコートしたプレートに播種した。
【０４９４】
各ウェルに、培地を最大４ml充填し、最大６×１０６個 免疫化したウサギからのＰＢＭＣを充填し、インキュベーター中において、３７℃で１時間結合させた。
【０４９５】
上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パニング工程に使用した。
【０４９６】
ＰＤＧＦ  ＢＢタンパク質でのＢ細胞の濃縮
ＰＤＧＦ  ＢＢタンパク質でコートした６ウェル組織培養プレートに、培地 ４ml当たりに、最大６×１０６個 ＰＢＬを播種し、インキュベーター中において、３７℃で１時間結合させた。付着しなかった細胞を、１×ＰＢＳで１〜２回、注意深くウェルを洗浄することにより除去した。残った付着細胞を、トリプシンにより、インキュベーター中において、３７℃で１０分間剥離した。トリプシン処理を、EL-4B5培地で停止させた。免疫蛍光染色まで、細胞を、氷上で維持した。
【０４９７】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ（AbD Serotec, Dusseldorf, Germany）を、単一細胞分取に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗ＩｇＧ抗体と共に、ＰＢＳ中においてインキュベーションし、４℃において暗所で４５分間インキュベーションした。染色後、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、直ちに、ＦＡＣＳ分析に供した。ＦＡＣＳ分析の前に、死んだ細胞と生きている細胞とを区別するために、濃度５μg/ml ヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を加えた。
【０４９８】
コンピュータ及びFACSDivaソフトウェアを備えるBecton Dickinson FACSAria（BD Biosciences, USA）を、単一細胞分取に使用した。
【０４９９】
Ｂ細胞培養
簡潔に、単一分取されたウサギＢ細胞を、Pansorbin細胞（１：１００，０００）（Calbiochem（Merck）, Darmstadt, Deutschland）、５ ％ ウサギ胸腺細胞上清（MicroCoat, Bernried, Germany）、及びγ線照射マウスEL-4B5胸腺細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を含有する、２００μl／ウェル EL-4B5培地により、９６ウェルプレートにおいて、インキュベーター中で、３７℃において７日間インキュベーションした。Ｂ細胞培養の上清を、スクリーニングのために除去し、残った細胞を、直ちに収集し、ＲＬＴバッファー（Qiagen, Hilden, Germany） １００μl中において、−８０℃で凍結させた。
【０５００】
実施例２５
ハイブリドーマ生成
細胞培養
マウス骨髄腫細胞株P3x63-Ag8.653を、マウス−マウスハイブリドーマの生成のための融合パートナーとして使用した。細胞を、融合前約１４日で融解させ、８−アザグアニンの存在下において培養した。３〜４日毎に、細胞を分割し、濃度１〜２×１０５個／mlに調節した。
【０５０１】
細胞融合
材料：
マウスハイブリドーマ培地（ＲＰＭＩ  １６４０（PAN）、ＦＢＳ  ultra-low-ＩｇＧ、２mM Ｌ−グルタミン、１mM Ｎａ−ピルビン酸、ＮＥＡＡ、muIL-6を含むNutridoma-CS、ＨＡＺ（SIGMA, #A9666））を、ＲＴで調節した。
ＲＰＭＩ  １６４０培地（３７℃）
ＲＰＭＩ  １６４０培地（４℃）
ＰＥＧ（３７℃）
【０５０２】
融合前に、骨髄腫細胞をおおよそ遠心分離する（２５０rpm、７分）。細胞ペレットを、培養培地中で再懸濁させる。１つの脾臓について、約１〜５×１０７個の細胞が必要である。
【０５０３】
細胞融合のために、約５：１の骨髄腫細胞に対するリンパ球の比を使用するべきである。P3x63-Ag8.653細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地 ５０ml中に再懸濁させ、遠心分離する（２５０rpm、７分）。上清を除去する。その後、細胞を、脾細胞に加える。
【０５０４】
融合の間、温度を、水浴中において、３７℃に調節する。
【０５０５】
ＰＥＧ溶液（３７℃）を、細胞に滴下する。
【０５０６】
融合混合物を、インキュベーター中において、３７℃で１５〜１２０分間インキュベーションする。その後、融合混合物を遠心分離し（２５０rpm、７分）、再懸濁させた培地 １２００μl中に再懸濁させる。細胞懸濁液 １００μlを、半固体ハイブリドーマ培地 ５０mlに加え、ホモジナイズし、各４mlを、６ウェルプレートのウェル当たりに加えた。９〜１３日の培養後、単一クローンを取り出す。
【０５０７】
実施例２６
ハイブリドーマの培養
約５×１０６個の細胞を、Hyclone培地 ５０ml中に懸濁させる。培養混合物を、９６時間インキュベーションする。その後、Hyclone培地 ７５mlを加えた。培養を、７日間継続した。生存率が４０％を下回って低下した場合、細胞懸濁液を、０．２２μmフィルタでろ過し、ろ液を、精製に使用した。
【０５０８】
実施例２７
Ｂ細胞のクローニング
ＶドメインのＰＣＲ増幅
トータルＲＮＡを、Ｂ細胞ライゼート（RLTバッファー- Qiagen - Cat. No 79216中に再懸濁）から、NucleoSpin 8/96 ＲＮＡキット（Macherey&Nagel;740709.4, 740698）を使用し、製造メーカーのプロトコルに従って調製した。ＲＮＡを、ＲＮＡｓｅフリー水 ６０μlにより溶出した。ＲＮＡ ６μlを使用して、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen 18080-400）及びオリゴｄＴ−プライマーを使用するリバーストランスクリプターゼ反応により、製造メーカーの説明に従って、ｃＤＮＡを生成した。全ての工程を、Hamilton ML Starシステムにおいて行った。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、AccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）により、終容量５０μl中において、野生型ウサギＢ細胞の重鎖用のプライマーrbHC.up及びrbHC.doならびに軽鎖用のrbLC.up及びrbLC.doと、トランスジェニックウサギＢ細胞の軽鎖用のBcPCR_FHLC_leader.fw及びBcPCR_huCkappa.revとを使用して増幅するのに、ｃＤＮＡ ４μlを使用した。全てのフォワードプライマーは、（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）シグナルペプチドに特異的であった。一方、リバースプライマーは、（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）定常領域に特異的であった。RbVH+RbVLについてのＰＣＲ条件を、以下の通りとした。高温での開始、９４℃で５分間、９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒を３５サイクル、及び最後の伸張、６８℃で７分間。ＨｕＶＬについてのＰＣＲ条件を、以下の通りとした。高温での開始、９４℃で５分間、９４℃で２０秒、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒を４０サイクル、及び最後の伸張、６８℃で７分間。
【０５０９】
【表７１】
2017537896.tif 000072
【０５１０】
ＰＣＲ溶液 ５０μlの内の８μlを、48 E-Gel ２％（Invitrogen G8008-02）にロードした。ポジティブなＰＣＲ反応を、NucleoSpin Extract IIキット（Macherey&Nagel;740609250）を使用し、製造メーカーのプロトコルに従って洗浄し、溶出バッファー ５０μl中に溶出した。全ての洗浄工程を、Hamilton ML Starletシステムにおいて行った。
【０５１１】
実施例２８
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして、発現ベクター内に、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518；MZ Li et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によりクローニングした。この発現ベクターには、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットが含まれる。発現カセットに加えて、プラスミドには、E.coli中でのプラスミド増幅のための、ｐＵＣ由来の複製起点と、アンピシリン抵抗性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子が含まれる。基本的なプラスミドの３つの変異体を使用した。１つのプラスミドは、ＶＨ領域を受容するように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含有する。２つのプラスミドは、ＶＬ領域を受容するウサギ又はヒトのカッパＬＣ定常領域を含有する。
【０５１２】
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする直線化発現プラスミドを、重複プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。
【０５１３】
精製されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、一本鎖オーバーハングを生成した。この反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
【０５１４】
次の工程において、プラスミド及びインサートを組み合わせ、ｒｅｃＡと共にインキュベーションし、部位特異的組換えを誘引した。組換えられたプラスミドを、E.coli中にトランスフォーメーションした。翌日、増殖したコロニーを取り出し、プラスミド調製、制限分析、及びＤＮＡ配列決定により、正しく組換えられたプラスミドを試験した。
【０５１５】
抗体発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを、HEK293細胞中で一過性に共トランスフェクションした。上清を、１週間後に収集した。
【０５１６】
実施例２９
ウサギモノクローナル一価抗体のリコンビナント発現
モノクローナル一価抗体として選択された候補のリコンビナント発現のために、全てのＶＨ鎖のウサギ定常領域を、ＣＨ３セグメント中にノブ突然変異を包含するヒト定常領域に変換した。ウサギの野生型Ｂ細胞由来のＶＬ鎖について、ウサギＣカッパ定常領域を、ヒトに変換した。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域を、AccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）により、終容量５０μl中において、シグナルペプチドに特異的なフォワードプライマーと、（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）ヒト定常領域に相同性を有するオーバーラップ配列（２０bp）を（３’端に）有するＣＤＲ３−Ｊ領域に特異的なリバースプライマーとを使用して増幅するのに、選択された候補のｃＤＮＡ ４μlを使用した。ＶＨ及びＶＬ鎖増幅用のＰＣＲ条件を、以下の通りとした。高温での開始、９４℃で５分間、９４℃で２０秒、６８℃で２０秒、６８℃で４５秒を３５サイクル、及び最後の伸張、６８℃で７分間。
【０５１７】
ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして、発現ベクター内に、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518；MZ Li et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によりクローニングした。この発現ベクターには、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットが含まれる。発現カセットに加えて、プラスミドには、E.coli中でのプラスミド増幅のための、ｐＵＣ由来の複製起点と、アンピシリン抵抗性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子が含まれる。基本的なプラスミドの２つの変異体を使用した。１つのプラスミドは、新たに増幅されたＶＨ鎖を受容するように設計されたヒトＩｇＧ定常領域を含有する。２つ目のプラスミドは、ＶＬ鎖を受容するヒトカッパＬＣ定常領域を含有する。
【０５１８】
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする直線化発現プラスミドを、重複プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。
【０５１９】
精製されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、一本鎖オーバーハングを生成した。この反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
【０５２０】
次の工程において、プラスミド及びインサートを組み合わせ、ｒｅｃＡと共にインキュベーションし、部位特異的組換えを誘引した。組換えられたプラスミドを、E.coli中にトランスフォーメーションした。翌日、増殖したコロニーを取り出し、プラスミド調製、制限分析、及びＤＮＡ配列決定により、正しく組換えられたプラスミドを試験した。
【０５２１】
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling, Cat. No. 8921BF）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA 9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, Cat. No. 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２２】
実施例３１
カニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＰＤＧＦ−ＢＢを、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Piercenet, 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２３】
実施例３２
マウスＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるマウスＰＤＧＦ−ＢＢ（Peprotech 315-18）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２４】
実施例３３
ラットＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるラットＰＤＧＦ−ＢＢ（R&D, 520-BB）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２５】
実施例３４
ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＰＤＧＦ−ＡＡ（Peprotech, Cat. No. AF-100-13A）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２６】
実施例３５
ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。抗原であるヒトＰＤＧＦ−ＣＣ（Peprotech, AF-100-00C）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度１２５ng/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の濃度を１時間増大させる。３）検出抗体、希釈＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ、NA9340V＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤ、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ＥＣＬ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ；NA9310V）。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, 34021）を加えた２０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２７】
実施例３６
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法：ヒトＰＤＧＦ−Ｂ：ＰＤＧＦ−ＢＢレセプター
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢのヒトＰＤＧＦ−ＢＢレセプターに対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）系技術を使用して行った。ヒトＦｃタグ付きＰＤＧＦ−ＢＢレセプタータンパク質（RnD, Cat.No.385-PR-100）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific, Cat. No. 464718）において、濃度７５０μg/mLでＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween ２５μL中において固定した。全ての下記工程を、ＰＢＳ ９０μLの注入及び吸引による３回の洗浄ルーチンにより行った。１）ブロッキング工程：結合していない表面を飽和させる（１時間、２％ ＢＳＡ）。２）濃度を増大させる抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体 １５μLを、７５nM ビオチン化ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling, 8921BF） １５μLと、容量３０μL中で１時間インキュベーションした。３）検出を、ペルオキシダーゼラベルされたストレプトアビジン（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 11089153001）を使用して達成した。基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Piercenet, 34021）を加えた１０〜３０分後に、光学密度を、３７０nmで決定した。ＩＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、４パラメータロジスティックモデルにより算出した。
【０５２８】
実施例３７
マウスハイブリドーマからの抗体精製
抗体含有ハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程により精製した。抗体を、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrapプロテインＧ（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉する。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去する。抗体を、２５mM クエン酸バッファー、ｐＨ３．０で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ９．０で、ｐＨ６．０に中和する。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用する。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行う。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存する。
【０５２９】
抗体含有ハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程により精製する。上清を、２Ｍ グリシン、ｐＨ８．６、６００mM ＮａＣｌと、５０％ v/vで混合し、１Ｍ グリシン、ｐＨ８．６、３００mM ＮａＣｌで平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉する。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去する。抗体を、１００mM クエン酸バッファー、ｐＨ２．８で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ８．５で、ｐＨ６．０に中和する。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用する。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行う。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存する。
【０５３０】
実施例３８
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ法
結合分析を、BIAcore B4000システム（GE Healthcare）を適用する表面プラズモン共鳴分光系技術を使用して行った。抗原であるヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling, 8921BF）を、Ｃ１センサチップ（GE Healthcare, BR-1005-35）において、濃度１μg/mLでＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０５％ Tween中において、アミンカップリング化学を使用して固定した。濃度を増大させる抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体を、１０mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０mM ＮａＣｌ中に加えた。１８０秒の会合期及び６００秒の解離期のリードアウト時間を利用して、見掛けのｋａ及び見掛けのｋｄを算出した。見掛けのＫＤ（結合力）を、BIAcore T200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して算出した。
【０５３１】
実施例３９
カニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢ結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ法
結合分析を、BIAcore B4000システム（GE Healthcare）を適用する表面プラズモン共鳴分光系技術を使用して行った。抗原であるカニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢを、Ｃ１センサチップ（GE Healthcare, BR-1005-35）において、濃度１μg/mLでＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween中において、アミンカップリング化学を使用して固定した。濃度を増大させる抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体を、１０mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０mM ＮａＣｌ中に加えた。１８０秒の会合期及び６００秒の解離期のリードアウト時間を利用して、見掛けのｋａ及び見掛けのｋｄを算出した。見掛けのＫＤ（結合力）を、BIAcore T200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して算出した。
【０５３２】
実施例４０
HEK細胞中でのヒト化抗体のトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬である293-free（Novagen）による懸濁液適合HEK293F（FreeStyle 293-F細胞；Invitrogen）細胞における、抗体の一過性発現
【０５３３】
細胞を、１２５ml振とうフラスコ中で融解させた後に、希釈により、少なくとも４回（容量３０ml）継代した（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmにおいて、インキュベーション／振とう）。
【０５３４】
細胞を、容量２５０ml中で、３×１０５個／mlに増殖させた。３日後に、細胞を分割し、新たに、１リットル振とうフラスコにおける容量２５０ml中に、密度７×１０５個／mlで播種した。トランスフェクションを、約１．４〜２．０×１０６個／mlの細胞密度で、２４時間後に行うものとする。
【０５３５】
トランスフェクション前に、２５０μg プラスミドＤＮＡ（１２２μg 軽鎖及び１２８μg 重鎖）を、終容量１０mlに、予め温めた（水浴：３７℃）Opti-MEM（Gibco）で希釈する。溶液を穏やかに混合し、室温で５分以内にインキュベーションする。ついで、293-freeトランスフェクション試薬 ３３３．３μlを、DNA-OptiMEM溶液に加える。穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベーションする。混合物の全量を、HEK細胞培養容量 ２５０mlを含む１Ｌ振とうフラスコに加える。
【０５３６】
３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmにおいて、６又は７日間インキュベーション／振とうする。
【０５３７】
２，０００rpm、４℃、１０分間での１回目の遠心分離工程により、上清を収集する。ついで、４０００rpm、４℃、２０分間での２回目の遠心分離のために、この上清を、新たな遠心分離フラスコ中に移す。その後、細胞フリー上清を、０．２２μm ボトルトップフィルタによりろ過し、フリーザー（−２０℃）において保存する。
【０５３８】
実施例４１
抗体からのＦａｂフラグメントの調製及び分析
５mg 抗体（２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の約１mg/ml）を、Ｌ−システイン溶液 ９０μl（Merck Millipore；２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の２５０mM）及びパパイン １２μl（Roche Life Science；３．２U/mg 抗体）と共に、３７℃で１２０分間インキュベーションした。開裂後、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなＩｇＧ及びＦｃフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、２回目の精製工程としてのSuperdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。Ｆａｂフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０５３９】
Ｆａｂフラグメントのタンパク質濃度を、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
【０５４０】
Ｆａｂフラグメントの純度及び完全性を、還元剤（５mM １，４−ジチオスレイトール）の存在及び不存在下における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE  ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Invitrogen）により、Simply Blue Safe Stain（Invitrogen）で染色して分析した。
【０５４１】
Ｆａｂ調製物の凝集含量を、Superdex 200 10/300 GL分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare）を使用し、ランニングバッファーとして２×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用する高性能ＳＥＣにより決定した。
【０５４２】
実施例４２
３Ｔ３細胞増殖ＥＬＩＳＡ
増殖阻害を決定するために、ＢｒｄＵ発色アッセイ法を、製造メーカーのマニュアルに従って使用した（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, # 11 647 229 001）。このアッセイ法において、５ng/ml ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗体を使用した。
【０５４３】
実施例４３
ホスホ−ＰＤＧＦ−Ｒベータ（Ｔｙｒ７５１）サンドイッチＥＬＩＳＡ
１０，０００個 ３Ｔ３細胞／ウェルを、１０％ ウシ新生仔血清を加えたＤＭＥＭ培地中において、２４時間培養した。その後、細胞を、Hunger培地（０．５％ ウシ新生仔血清を含むＤＭＥＭ培地）中において、２４時間インキュベーションした。
【０５４４】
添加前に、抗体（１μg/ml）を、５ng/ml ＰＤＧＦ−ＢＢを含有する培地中において、２時間予めインキュベーションした。３Ｔ３細胞を、５ng/ml ＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗体を含むHunger培地中において、１０分間インキュベーションした。
【０５４５】
溶解前に、細胞を、ＰＢＳで４回洗浄した。細胞の溶解を、溶解バッファー １００μl中において行った。
【０５４６】
溶解溶液を、ウサギ抗ＰＤＧＦ−Ｒベータ抗体でコートした９６ウェルプレートのウェルにおいて、４℃で一晩インキュベーションした。その後、ウェルを、ＰＢＳで４回洗浄した。マウス抗ホスホ−ＰＤＧＦレセプターベータ抗体との１時間のインキュベーション後、ウェルを、洗浄バッファーで４回洗浄した。検出のために、ウェルを、ＴＭＢ基質溶液 １００μlで、３０分間インキュベーションした。反応を、停止溶液 １００μlの添加により停止させた。吸光を、４５０nmで決定した。
【０５４７】
実施例４４
細胞遊走アッセイ法
ＣＩＭ−プレート  １６（ACEA Biosciences Inc., no05665817001、メンブラン孔径  ８μm）を使用。
【０５４８】
プロトコル
使用前に、初代ヒト網膜周皮細胞（ｈＴＥＲＴにより不死化された（ACBRI 183 CellSystems））を、（成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地（boSF-4ZR-500-S中において）一晩飢餓状態にする（５０〜７０％コンフルエント）。
【０５４９】
プレート準備
上側チャンバ：（５０μl 培地＋１００μl 細胞懸濁液）
【０５５０】
ＰＢＳ中の２０μg/ml フィブロネクチン（Sigma noF0895-2mg）で、両面をコーティング。
【０５５１】
各ウェルのセンサ側（底面側）に、フィブロネクチン溶液 ４０μlを加え、上側チャンバを、フード中において、３０分間インキュベーションする。フィブロネクチン溶液を、センサ側から注意深く吸引し、電極との接触を避ける。ウェル側が上に、センサ側が下になるように、ＵＣをひっくり返す。フィブロネクチン溶液 ５０μlをウェルに加え、フード下において、ＲＴで３０分間インキュベーションする。溶液を、ウェル内から注意深く吸引する。成長因子を含まないCSC血清フリー培地 ５０μlを、ウェルに加える。
【０５５２】
下側チャンバ：１６０μl/ウェル 試験サンプル（１×濃度）
【０５５３】
成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地（noSF-4ZR-500-S）中で全てを希釈する。サンプル／抗体の混合物を、フード中において２時間インキュベーションする。１６０μl/ウェル サンプルを加える。ＵＣとＬＣとを、CIM−プレート１６アッセンブリツールを使用してアッセイブリする。このCIM−プレート１６を、インキュベーター中において、３７℃で１時間置いて、平衡化させる。CIM−プレート１６を、RTCA DP分析器に入れる。RTCAソフトウェアのステップ１を開始することにより、バックグラウンド測定を開始する。
【０５５４】
細胞調製
細胞を、細胞剥離バッファーで剥離し、この細胞を、成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地（noSF-4ZR-500-S）中に、１．５×１０５個／mlで再懸濁させる。CIM−プレート１６を、RTCA分析器から取り出し、ＵＣに、基礎培地（成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地  noSF-4ZR-500-S） １００μl当たりに、１５，０００個 初代ヒト網膜周皮細胞（ｈＴＥＲＴにより不死化された（ACBRI 183 CellSystems））／ウェルを加える。このプレートを、RTCA分析器に戻し、１０〜２０時間の間、測定を直ちに開始する。
【０５５５】
実施例４５
細胞増殖アッセイ法
CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞増殖アッセイ法（Promega, G3580）。
【０５５６】
１００μl当たりに、２５００個／ウェル 初代ヒト網膜周皮細胞（ｈＴＥＲＴにより不死化された（ACBRI 183 CellSystems））。
【０５５７】
培地
増殖培地＝ＣＳＣ完全培地、培養追加免疫（ACBRI no4Z=-500）
アッセイ培地＝成長因子を含まないＣＳＣ血清フリー培地（ACBRI noSF-4ZR-500-S）
【０５５８】
Balbc３Ｔ３、１００μl当たりに、５０００個／ウェル
【０５５９】
培地
増殖培地＝ＤＭＥＭ（Gibco no41966）、１０％ ＮＢＣＳ
アッセイ培地＝ＤＭＥＭ（Gibco no41966）、０．４ ％ ＮＢＣＳ
【０５６０】
増殖アッセイ法
アッセイ前に、細胞を、増殖培地中に、２４〜４８時間播種する。細胞が８０〜９０％コンフルエントとなった時点で、細胞を、トリプシン溶液で収集する。細胞を、増殖培地中において、０．２５×１０５個／ml（又は０．５×１０５個／ml）で再懸濁させる。細胞懸濁液 １００μlを、９６ウェルプレートの各ウェルに加える。増殖培地を除去し、アッセイ培地 １００μlを、各ウェルに加える。２４時間インキュベーションする。標準又はサンプル １００μlを、各ウェルに加える（２×濃縮、アッセイバッファー中で希釈）。３７℃、５％ ＣＯ２で、７２時間インキュベーションする。染料溶液 ４０μlを細胞に加え、３７℃でインキュベーションする。種々の時点（１時間〜８時間）において、４９０nmで読み取る。
【０５６１】
実施例４６
抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の動力学スクリーニング
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約２０共鳴単位（RU）のリコンビナントヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（５μg/ml；オーダーコード220-BB；R&D Systems）を、シリーズＳ  Ｃ１チップ（GE Healthcare BR-1005-35）に、ｐＨ４．０において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、ＨＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５６２】
会合を、溶液中の濃度３０nM及び３nM 抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の注入により、流速１００μl/分において、３０分間測定した。解離期を、最大６００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。表面を、流速５μl/分での、６０秒間の０．８５％ Ｈ３ＰＯ４（リン酸）溶液の２回の連続的な注入で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、ブランク表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５６３】
実施例４７
抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  Ｆａｂの動力学特徴決定
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  Ｆａｂサンプルの結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約５０共鳴単位（RU）のリコンビナントヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．５μg/ml；オーダーコード220-BB；R&D Systems）を、シリーズＳ  ＣＭ３チップ（GE Healthcare BR-1005-36）に、ｐＨ４．０において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、ＨＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５６４】
会合を、種々の濃度の溶液における抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  Ｆａｂの注入により、流速３０μl/分で、１：３系列希釈において３００nMで開始して、１８０秒間測定した。解離期を、最大９００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。表面を、流速５μl/分での、６０秒間の０．８５％ Ｈ３ＰＯ４（リン酸）溶液で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、ブランク表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５６５】
実施例４８
抗体からのＦａｂフラグメントの調製及び分析
１２mg 抗体（２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の１mg/ml）を、Ｌ−システイン溶液 ２４０μl（Merck Millipore；２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の２５０mM）及びパパイン ３２７μl（Roche Life Science；０．００１U/mg 抗体）と共に、３７℃で１２０分間インキュベーションした。開裂後、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなＩｇＧ及びＦｃフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、２回目の精製工程としてのSuperdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。Ｆａｂフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存した。
【０５６６】
Ｆａｂフラグメントのタンパク質濃度を、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
【０５６７】
Ｆａｂフラグメントの純度及び完全性を、還元剤（５mM １，４−ジチオスレイトール）の存在及び不存在下における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE  ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Invitrogen）により、Simply Blue Safe Stain（Invitrogen）で染色して分析した。
【０５６８】
Ｆａｂ調製物の凝集含量を、BioSuite高解像ＳＥＣ、２５０Å、５μm分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用し、ランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用する高性能ＳＥＣにより決定した。
【０５６９】
実施例４９
成熟ＸＦａｂのＡＮＧ２結合動力学及び交叉反応性
ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物に対する成熟ＸＦａｂの結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約４０００RU 抗ヒト抗体（１０μg/ml 抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体；オーダーコードBR-1008-39；GE Healthcare）を、シリーズＳ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）に、ｐＨ５．０において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５７０】
ヒト又はカニクイザルのＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物を、１μg/ml 溶液を流速５μl/分で３０秒間注入することにより捕捉した。会合を、溶液中の種々の濃度におけるＸＦａｂの注入により、流速９０μl/分で、１：３系列希釈において３００nMで開始して、９０秒間測定した。解離期を、最大６００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。全ての表面を、流速５μl/分での、６０秒間の３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５７１】
実施例５０
生物学的活性
この方法により、ＡＮＧ２のそのレセプターであるＴｉｅ２への結合を阻害する、抗体の能力を決定される。細胞表面上でのＴｉｅ２レセプターチロシンキナーゼの発現のために、ヒト胚腎細胞株であるHEK293細胞株を、ヒトＴｉｅ２についての発現ベクターで安定的にトランスフェクションして、細胞株HEK293_Tie2を得た。
【０５７２】
この細胞を、Ｔｉｅ２レセプターに結合し、このレセプターの自己リン酸化を誘引するＡＮＧ２で刺激した。Ｔｉｅ２に対する結合は、本明細書で報告された抗ＡＮＧ２抗体の添加により阻害することができる。リン酸化のグレードを、ＥＬＩＳＡにより分析する。ＯＤ値は、リン酸化されたＴｉｅ２の量と関連し、抗体濃度に対してプロットされる。ＥＣ５０値を、同じプレートにおける参照基準に対して、相対生物学的活性（ＲＢＡ）として決定し、報告する。
【０５７３】
マルチウェルプレートを、ヒトＴｉｅ２レセプターに対する抗体でコートし（１００μl、１０μg/ml；R&D Systems, Cat# MAB3132；９６ウェルMaxisorb immunoプレート）、室温で一晩インキュベーションした。コートしたプレートを、容量２５０μlで３回洗浄した後、ブロッキング ２００μlと共に、室温で１〜２時間インキュベーションした。
【０５７４】
別に、HEK293_Tie2細胞（４０μl；５×１０６個／ml；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を、対象となる抗体の希釈系列とＡＮＧ２（R&D Systems, Cat# 623-CF）との、予めインキュベーションした混合物（８０μl）に加えた。１０分後、細胞を溶解させた（溶解バッファー ６０μlを加え、１５分間インキュベーション）。細胞ライゼートを、ＥＬＩＳＡのために、コートしたプレートに移した。
【０５７５】
ライゼートのＴｉｅ２レセプターは、抗Ｔｉｅ２捕捉抗体に結合する（ライゼート １００μl；ＲＴで９０分間インキュベーション）。Ｔｉｅ２レセプター上のリン酸化チロシンを、ビオチンにコンジュゲートさせた抗ホスホチロシン抗体（１００μl；０．３μg/ml 抗ホスホチロシン抗体、クローン4G10（登録商標）、ビオチンコンジュゲート、Upstate, Cat# 16-103；ＲＴで６０分間インキュベーション）により検出した。ビオチン残基を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１００μl；１００mU/ml；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat# 11089153001；ＲＴで３０分間インキュベーション）に結合させた。ペルオキシダーゼ基質であるＴＭＢ（１００μl；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat# 11835033001）を加えた。光学密度を、４５０nmで５〜１０分後に測定した。
【０５７６】
実施例５１
二重特異性抗体の生成及び精製
トランスフェクション試薬である293-free（Novagen）による、ＤＮＡのトランスフェクション後の懸濁液適合HEK293F（FreeStyle 293-F細胞；Invitrogen）細胞における、二重特異性抗体の一過性発現
【０５７７】
細胞を、１２５ml振とうフラスコ中で融解させた後に、希釈により、少なくとも４回（容量３０ml）、３又は４日毎に継代した（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmにおいて、インキュベーション／振とう）。細胞を、細胞密度３×１０５個／mlで、培地 ２５０ml中に播種することにより増殖させた。３日後に、細胞を分割し、新たに、培地 ５００ml中に、密度２×１０５個／mlで播種した。４日後、細胞を分割し、新たに、培地 １リットル中に、密度７×１０５個／mlで播種した（３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度、１１０rpmにおいて、インキュベーション／振とう）。トランスフェクションを、約１．４〜２．０×１０６個／mlの細胞密度で、２４時間後に行った。
【０５７８】
トランスフェクション前に、１０００μg プラスミドＤＮＡ（２×２５０μg 軽鎖コードプラスミドＤＮＡ及び２×２５０μg 重鎖コードプラスミドＤＮＡ）を、終容量４０mlに、予め温めた（水浴：３７℃）Opti-MEM（Gibco）で希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分以内にインキュベーションした。ついで、293-freeトランスフェクション試薬 １３３３μlを、DNA-OptiMEM溶液に加えた。混合物を、穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベーションした。混合物の全量を、HEK細胞培養物 １リットルに注意深く加えた。細胞を、１１０rpmで振とうしながら、３７℃、７％ ＣＯ２、８５％湿度で、７日間更にインキュベーションした。
【０５７９】
２０００rpm、４℃、１０分間での１回目の遠心分離工程により、上清を、７日後に収集した。ついで、４０００rpm、４℃、２０分間での２回目の遠心分離のために、この上清を、新たな遠心分離フラスコ中に移した。細胞フリー上清を、０．２２μmフィルタ（Millipore）によりろ過し、精製手順を開始するまで、フリーザー（−２０℃）において保存する。
【０５８０】
抗体含有培養上清をろ過し、少なくとも２回のクロマトグラフィー工程により精製した。ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化させた、CaptureSelect Pre-packedカラムＩｇＧ−ＣＨ１（life technologies, #494320005）を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、２５mM クエン酸バッファー、ｐＨ３．０で回収し、溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ９．０で、ｐＨ６．０に中和した。
【０５８１】
Superdex 200（商標）（GE Healthcare）におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、２番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、２０mM ヒスチジンバッファー、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン（Millipore, Billerica, MA）を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−８０℃で保存する。
【０５８２】
抗ＰＤＧＦ−Ｂ／ＡＮＧ２抗体（クローン0144-0004）を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して更に精製した。硫酸アンモニウムを、抗体含有溶液に対して、終濃度１Ｍになるように加えた。この溶液を、１Ｍ 硫酸アンモニウム、３５mM 酢酸、ｐＨ５．６中で平衡化させた、Butyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）カラムにアプライした。抗体を、３５mM 酢酸、ｐＨ５．６により直線勾配（０〜１００％）において溶出した。抗体含有画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにアプライした。
【０５８３】
抗体調製物のタンパク質濃度を、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
【０５８４】
抗体の純度及び完全性を、Protein Expressチップ及びHT Protein Express試薬キットを備えるLabChip GX II（PerkinElmer）を使用するＣＥ−ＳＤＳにより分析した。
【０５８５】
抗体調製物の凝集含量を、BioSuite高解像ＳＥＣ、２５０Å、５μm分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用し、ランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用する高性能ＳＥＣにより決定した。
【０５８６】
【表７２】
2017537896.tif 000073
【０５８７】
抗体０１４４は、配列番号：１１７（ＶＨ）及び配列番号：１１８（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位と、配列番号：９２（ＶＨ）及び配列番号：９７（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５８８】
抗体０１１７は、配列番号：１１９（ＶＨ）及び配列番号：１２０（ＶＬ）のＶＥＧＦ結合部位と、配列番号：９２（ＶＨ）及び配列番号：９７（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５８９】
抗体０１４５は、配列番号：１１９（ＶＨ）及び配列番号：１２０（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位と、配列番号：１０１（ＶＨ）及び配列番号：１０６（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５９０】
抗体０１４６は、配列番号：１１７（ＶＨ）及び配列番号：１１８（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位と、配列番号：１２１（ＶＨ）及び配列番号：１２２（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５９１】
抗体００３１は、配列番号：０６（ＶＨ）及び配列番号：１６（ＶＬ）のＩＬ−１ベータ結合部位と、配列番号：１４０（ＶＨ）及び配列番号：１４１（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５９２】
抗体００３２は、配列番号：１４２（ＶＨ）及び配列番号：１４３（ＶＬ）のＶＥＧＦ結合部位と、配列番号：０６（ＶＨ）及び配列番号：１６（ＶＬ）のＩＬ−１ベータ結合部位とを含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５９３】
実施例５２
二重特異性抗体の動力学特徴決定
ＰＤＧＦ−ＢＢ
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する二重特異性抗ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＡＮＧ２抗体の結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約５０共鳴単位（RU）のリコンビナントヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．５μg/ml；オーダーコード220-BB；R&D Systems）を、シリーズＳ  ＣＭ３チップ（GE Healthcare BR-1005-36）に、ｐＨ４．０において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、ＨＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５９４】
会合を、種々の濃度の溶液における二重特異性抗体の注入により、流速３０μl/分で、１：３系列希釈において３００nMで開始して、１８０秒間測定した。解離期を、最大９００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。表面を、流速５μl/分での、６０秒間の０．８５％ Ｈ３ＰＯ４（リン酸）溶液で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、ブランク表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５９５】
ＡＮＧ２：
ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−マウスＦｃ領域融合物に対する二重特異性抗体の結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約４０００RU 抗マウスＦｃ領域抗体（１０μg/ml 抗マウス（Ｆｃ）抗体）を、シリーズＳ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）に、ｐＨ５．０において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５９６】
ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−マウスＦｃ領域融合物を、１μg/ml 溶液を流速５μl/分で３０秒間注入することにより捕捉した。会合を、溶液中の種々の濃度における二重特異性抗体の注入により、流速９０μl/分で、１：３系列希釈において３００nMで開始して、９０秒間測定した。解離期を、最大６００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。全ての表面を、流速５μl/分での、６０秒間の３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５９７】
ＶＥＧＦ：
ヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１に対する二重特異性抗体の結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。抗ヘキサヒスチジン抗体を、ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）に、製造メーカーの説明に従って、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）とした。フローセルを、２５℃に設定し、サンプルブロックを、１２℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで２回下塗りした。
【０５９８】
ヒスチジンタグを含むヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１を、溶液を流速５μl/分で３０秒間注入することにより捕捉した。会合を、溶液中の種々の濃度における二重特異性抗体の注入により、流速９０μl/分で、１：３系列希釈において３００nMで開始して、９０秒間測定した。解離期を、最大６００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによりトリガーした。全ての表面を、流速５μl/分での、６０秒間の３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液で洗浄することにより再生させた。バルク屈折率差を、抗ヘキサヒスチジン抗体表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動力学パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５９９】
ＩＬ−１ベータ：
ヒトＩＬ−１ベータに対する抗ＩＬ−１ベータ抗体の結合動力学を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM Ｈｉｓ、１４０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Tween20、ｐＨ７．４）を使用して、２５℃で行った。抗ヒトＦｃ抗体を、シリーズＳ  ＣＭ５センサチップ（GE Healthcare）に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。二重特異性抗体を、捕捉応答１００〜２００RUをもたらすように、表面に捕捉させた。ヒトＩＬ−１ベータを、０．７４〜最大６０nM（１：３系列希釈）の濃度で、表面上に９０秒間注入した（会合期）。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、６００秒間モニターした。表面を、３Ｍ ＭｇＣｌ２（抗ヒトＦｃ抗体用）又は１０mM グリシン  ｐＨ１．５（抗マウスＦｃ抗体用）を、流速５μl/分で６０秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた（＝二重参照）。得られた曲線を、ラングミュア１：１結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
【０６００】
実施例５３
Ｘ−線構造決定
Ａｐｏ  ＦａｂフラグメントＨ３４
ＦａｂフラグメントＨ３４についての結晶化スクリーニングを、濃度３２mg/mlで行った。結晶化滴を、タンパク質溶液 ０．１μlを貯留液 ０．１μlと混合することにより、蒸気拡散シッティングドロップ実験において、２１℃でセットアップした。結晶が、沈殿剤としてＰＥＧを含有する種々の条件で現れた。Ｈ３４の構造を決定するのに使用された結晶は、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、２０％ ＰＥＧ４０００、及び０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム、１５％ ＰＥＧ４０００において、２日以内に現れた。
【０６０１】
結晶を、抗凍結剤としての無水パラフィンオイルにより収集し、ついで、液体Ｎ２中で瞬間冷却した。回折像を、温度１００Ｋにおいて、Swiss Light SourceのビームラインX10SAで、Pilatus 6M検出器により収集し、XDSパッケージ（Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800）により処理した。２つの結晶からのデータをマージして、空間群Ｐ１における１．６４Å解像データセット及び結晶学的非対称ユニット当たりに２つのＦａｂを生成した（以下の表を参照のこと）。
【０６０２】
構造を、検索モデルとして、Roche-internal PDB-ID 1htfrからのＦａｂ  ５７７を使用する分子置換により決定した。Ｆａｂを、定常ドメインと可変ドメインとに分割し、両方を、CCP4プログラムであるPHASER CCP4（CCP4（Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D, (1994) 760-763）において、エルボ角における可能性のある変化を考慮するために、別々の検索に使用した。モデルを、COOT（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501）において再構築し、CCP4プログラムで精密化した。
【０６０３】
【表７３】
2017537896.tif 000074
【０６０４】
ＦａｂフラグメントＨ３４とヒトＩＬ−１ベータとの複合体
結晶化スクリーニング前に、ＦａｂフラグメントＨ３４を、ＩＬ−１ベータ（Peprotech）と、モル比１．２：１で混合した。タンパク質混合物を、２１℃で２時間インキュベーションした。結晶化実験に使用されたタンパク質濃度を、３２mg/mlとした。結晶化滴を、タンパク質 ０．１μlを貯留液 ０．１μlと混合することにより、蒸気拡散シッティングドロップ実験において、２１℃でセットアップした。結晶は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０％ ＰＥＧ４０００において、２日以内に現れ、４日以内に、最終サイズ０．１５mm×０．０６mm×０．０１mmに成長した。
【０６０５】
結晶を、抗凍結剤を加えずに収集し、ついで、液体Ｎ２中で瞬間冷却した。回折像を、温度１００Ｋにおいて、Swiss Light SourceのビームラインX10SAで、Pilatus 6M検出器により収集し、XDSパッケージ（Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800 (1993)）により処理した。データ収集及び処理は、Ｈ３４アポ結晶についてと同じルートで行った（上記を参照のこと）。統計は、上記表において収集されている。２つの結晶からのデータをマージして、より完全なデータセットを得た。検索モデルとして、Ｈ３４  Ｆａｂ構造及びインターロイキン−１ベータ（PDB-ID 1l2h）を使用して、分子置換に成功した。モデル構築及び精密化を、上記のように行った。
【０６０６】
【表７４】
2017537896.tif 000075
【０６０７】
実施例５４
抗ＩＬ−１ベータ抗体の結合動力学及び交叉反応性
ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスＩＬ−１ベータに対する抗ＩＬ−１ベータ抗体の結合動力学と、ヒトＩＬ−１ベータ及びヒトＩＬ−１アルファに対する交叉反応性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM Ｈｉｓ、１４０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用して、２５℃で行った。抗ヒト又は抗マウスＦｃ抗体を、シリーズＳ  ＣＭ５センサチップ（GE Healthcare）に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。抗ＩＬ−１ベータ抗体を、捕捉応答１００〜２００RUをもたらすように、表面に捕捉させた。ＩＬ−１ベータ分子を、０．７４〜最大６０nM（１：３系列希釈）の濃度で、表面上に９０秒間注入した（会合期）。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、６００秒間モニターした。ヒトＩＬ−１ベータ及びヒトＩＬ−１αに対する交叉反応性を、上記された条件に従って、１００nM 抗原の１回の注入により決定した。表面を、３Ｍ ＭｇＣｌ２（抗ヒトＦｃ抗体用）又は１０mM グリシン  ｐＨ１．５（抗マウスＦｃ抗体用）を、流速５μl/分で６０秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。得られた曲線を、ラングミュア１：１結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
【０６０８】
実施例５５
抗ＩＬ−１ベータ  Ｆａｂと比較した抗ＩＬ−１ベータ  ＩｇＧの結合動力学
ヒトＩＬ−１ベータに対する抗ＩＬ−１ベータ  ＩｇＧ及びＦａｂの結合性を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM Ｈｉｓ、１４０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用して、２５℃で行った。抗ヒトＦｃ又は抗ヒトＦａｂ抗体を、シリーズＳ  ＣＭ５センサチップ（GE Healthcare）に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。抗ＩＬ−１ベータ  ＩｇＧ及びＦａｂを、約１００及び５０RUの捕捉応答それぞれをもたらすように、表面に捕捉させた。ヒトＩＬ−１ベータを、０．７４〜最大６０nM（１：３系列希釈）の濃度で、流速３０μl/分において表面上に９０秒間注入した（会合期）。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、６００秒間モニターした。表面を、３Ｍ ＭｇＣｌ２（抗ヒトＦｃ抗体用）又は１０mM グリシン  ｐＨ１．５（抗マウスＦｃ抗体用）を、流速５μl/分で６０秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。得られた曲線を、ラングミュア１：１結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
【０６０９】
実施例５６
抗ＩＬ−１ベータ抗体の作用分析方式
ヒトＩＬ−１ＲＩに対する抗体ＩＬ−１ベータの結合阻害を、BIACORE T200機器（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM Ｈｉｓ、１４０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Tween20、ｐＨ７．４）を使用して、２５℃で行った。ヒトＩＬ−１ＲＩを、シリーズＳ  ＣＭ５センサチップ（GE Healthcare）に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。１０nM ヒトＩＬ−１ベータを、１００nM〜０．０９８nMに低下させる濃度（１：２系列希釈）での、抗ＩＬ−１ベータ抗体と共に予めインキュベーションした。ＩＬ−１ベータ／抗ＩＬ−１ベータ抗体混合物を、フローセル上に５μl/分で注入した。６０秒後の結合応答（RU）を使用して、阻害をモニターした。表面を、１０mM ＮａＯＨを流速５μl/分で６０秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。
【０６１０】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実施例として、一部を詳細に説明されているが、この説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用された全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。
【配列表】
2017537896000001.app
【国際調査報告】
2017537896.tif 000076
2017537896.tif 000077
2017537896.tif 000078
2017537896.tif 000079
2017537896.tif 000080
2017537896.tif 000081
2017537896.tif 000082
2017537896.tif 000083