(57)【要約】  本発明は、対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するための方法に関し、この方法は、対象から単離されたサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することと、キュバム複合体又はその構成要素の濃度を参照濃度と比較することとを含み、参照濃度と比較したキュバム複合体又はその構成要素の濃度により、ビタミンＢ１２の腸管摂取量が示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を決定するための方法であって、
前記対象から単離されたサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を決定することと、
前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度を参照濃度と比較することとを含み、
前記参照濃度と比較した前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度により、ビタミンＢ１２の腸管摂取量が示される、方法。
【請求項２】
対象がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有するかどうかを判定するための方法であって、
前記対象から単離されたサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することと、
前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度を参照濃度と比較することとを含み、
前記参照濃度と比較した前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度により、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害が示される、方法。
【請求項３】
前記対象由来のサンプル中の前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度が前記参照濃度と比較して高いことが、ビタミンＢ１２の腸管摂取の減少を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記キュバム複合体の前記構成要素が、アムニオンレス及び／若しくはキュビリン又はその分解生成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キュバム複合体の前記構成要素が、アムニオンレス又はその分解生成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが血清又は尿サンプルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定する工程が、フローサイトメトリー、抗体ベースアレイ、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析法を利用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ビタミンＢ１２の腸管摂取障害がビタミンＢ１２欠乏症の指標となる、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビタミンＢ１２の腸管摂取障害が、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害、消化管の一部のバイパス手術及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患又は病態に関連する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビタミンＢ１２の腸管摂取障害が、加齢性ビタミンＢ１２欠乏症に関連する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビタミンＢ１２の腸管摂取障害が、サルコペニア及び／又はフレイルに関連する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって、対象がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有するかどうかを判定することを含む、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を診断するための方法。
【請求項１４】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害である対象を治療するための方法であって、ビタミンＢ１２サプリメントを前記対象に投与することを含み、前記対象は、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている、方法。
【請求項１５】
請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む、対象のビタミンＢ１２欠乏症がビタミンＢ１２の食事摂取不足又はビタミンＢ１２の腸管吸収障害に起因するのかを判定するための方法。
【請求項１６】
前記対象から単離したサンプル中のビタミンＢ１２、ホロトランスコバラミン、メチルマロン酸及び／又はホモシステインの濃度を測定する工程を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ビタミンＢ１２の腸管吸収障害を有すると判定された対象が非経口ビタミンＢ１２の補給のために選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ビタミンＢ１２の食事摂取不足であると判定された対象が経口ビタミンＢ１２の補給のために選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法であって、前記対象に非経口ビタミンＢ１２サプリメントを投与することを含み、前記対象は、請求項１５又は１６に記載の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている、方法。
【請求項２０】
ビタミンＢ１２の食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法であって、前記対象に経口ビタミンＢ１２サプリメントを投与することを含み、前記対象は、請求項１５又は１６に記載の方法によって、ビタミンＢ１２の食事摂取不足であることが特定されている、方法。
【請求項２１】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象であって、請求項１５又は１６に記載の方法によってビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている対象の治療に使用するためのビタミンＢ１２サプリメント。
【請求項２２】
ビタミンＢ１２サプリメントが非経口ビタミンＢ１２サプリメントである、請求項２１に記載の使用のためのビタミンＢ１２サプリメント。
【請求項２３】
前記非経口ビタミンＢ１２サプリメントが、非経口、舌下、皮下、経皮又は経鼻投与される、請求項１９に記載の使用又は請求項２２に記載の使用のためのビタミンＢ１２サプリメント。
【請求項２４】
食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象であって、請求項１５又は１６に記載の方法によってビタミンＢ１２の食事摂取不足であることが特定されている対象の治療に使用するための経口ビタミンＢ１２サプリメント又はビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメント。
【請求項２５】
前記経口ビタミンＢ１２サプリメントが、ビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを含む、食料製品又は食料製品である、請求項２０に記載の方法又は請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ビタミンＢ１２の腸管摂取量に関するバイオマーカーとしてのキュバム複合体又はその構成要素の使用。
【請求項２７】
前記キュバム複合体の前記構成要素が、アムニオンレス及び／若しくはキュビリン又はその分解生成物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キュバム複合体又はその構成要素若しくはその分解生成物に特異的に結合することができる、抗体。
【請求項２９】
前記キュバム複合体の前記構成要素がアムニオンレス又はその分解生成物である、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するための請求項２８又は２９に記載の抗体の使用であって、好ましくは、前記腸管摂取量が請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって測定される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養失調の分野に関する。特に、本発明は、対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＢ１２又はコバラミンは、コバルト含有水溶性ビタミンの一種であり、ヒト体内では合成できないことから、食物から摂取するか、又は腸内細菌叢により合成されなければならない（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１３．５０（Ｐｔ４）：ｐ．３１５−２９）。ヒト体内におけるビタミンＢ１２の貯蔵は、いくつかの形態からなり、これらは、不活性であるため活性を得るには変換を要するシアノコバラミン並びにビタミンＢ１２の代謝活性型誘導体であるメチルコバラミン及びアデノシルコバラミンである。
【０００３】
ビタミンＢ１２は、胃中で食物マトリックスから分離された後、小腸で内因子（ＩＦ）に結合し、そこで、キュビリン（ＣＢＮ）タンパク質とアムニオンレス（ＡＭＮ）タンパク質から構成されるキュバムと呼ばれる、特異的なヘテロ二量体膜貫通型受容体を介して吸収される。腸細胞内で、ＣＢＮ−ＡＭＮ−ＩＦ−Ｂ１２複合体は、十分に特定されていない機構によってリソソームで分解され、ＬＭＢＤ１タンパク質を介して遊離ビタミンＢ１２がリソソームから排出される。その後、ビタミンＢ１２は、少なくとも一部にはＭＲＰ１トランスポーターを必要とする機構によって、細胞質及び腸細胞の基底外側膜を通って輸送され、血流に入る。
【０００４】
ビタミンＢ１２欠乏症は、遺伝的又は後天的のいずれかに由来し得る。先天的遺伝性ビタミンＢ１２欠乏症は、遺伝性内因子欠乏を引き起こす内因子の変異、又はＩｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群（又は遺伝性巨赤芽球性貧血）を引き起こすキュビリン若しくはアムニオンレスの変異から生じ得る（Ａｍｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１９９９．２１（３）：ｐ．３０９−１３）。
【０００５】
小児期の最初の数年に臨床的に発現する遺伝性ビタミンＢ１２欠乏症とは対照的に、後天性ビタミンＢ１２欠乏症は、かなり晩年に発現し、極めて多様な原因を有し得る。
【０００６】
ビタミンＢ１２の不適切な栄養摂取は、ビタミンＢ１２欠乏症の１つの考えられる原因であり、特に、完全菜食主義者は、食事性ビタミンＢ１２の主な供給源が肉、卵及び乳製品であることから、そのおそれがあるとみなされている。
【０００７】
ビタミンＢ１２の吸収が変わることも、ビタミンＢ１２欠乏症の重要な原因である。悪性貧血は、内因子を産生する胃壁細胞が破壊されることによってビタミンＢ１２欠乏症が引き起こされる、自己免疫疾患である。萎縮性胃炎、胃手術、低塩酸症又はプロトンポンプ阻害薬の使用などの胃機能不全もまた、内因子を産生しないことによって、及び／又は胃のｐＨが適切でないために食物性ビタミンＢ１２を放出することによって、ビタミンＢ１２の吸収低下を誘導し得る。ビタミンＢ１２の吸収不良は、膵酵素分泌の低下がハプトコリン分解に変更を与える慢性膵炎、及びクローン病においても観察される。ビタミンＢ１２の低下状態は、炎症性腸疾患の治療に使用される４−アミノサリチル酸又は２型糖尿病の治療に使用されるメトホルミンなどの広く処方されている薬物での長期治療に由来する副作用として生じることもある（Ｋｏｚｙｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０１３．９５（５）：ｐ．１００２−７）。
【０００８】
いくつかの慢性疾患、特に、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆／認知障害又は骨粗鬆症などの疾患に関連して、高齢者集団にて有病率が増加している中等度のビタミンＢ１２欠乏症の新たな証拠が出ている。いくつかの研究はまた、ビタミンＢ１２の変化を加齢に伴う身体機能障害と関連付けている。高齢者集団においては、筋力低下、歩行速度の低下及び機能障害が、ビタミンＢ１２欠乏症又は高濃度のホモシステイン及びメチルマロン酸（ビタミンＢ１２欠乏症の組織中の２つのバイオマーカー）のいずれかと相関することが示されている（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）。
【０００９】
ビタミンＢ１２欠乏症が食事摂取不足に起因するものであるのか、又はビタミンＢ１２の腸管吸収障害に起因するものであるのかを見分けられることが特に重要である。特に、腸管摂取障害を患っている対象にビタミンＢ１２の経口補給を用いることは、欠乏症を治療するのに有効であるとは思われない。また、ビタミンＢ１２欠乏症が食事摂取不足に起因するのであれば、例えば、費用及びコンプライアンスの要因により、経口補給が好ましい。
【００１０】
ビタミンＢ１２欠乏症の診断については、測定法のゴールドスタンダードが存在せず、これにより、欠乏症の複雑な病因とあいまって、診断遅延が生じることが多い。
【００１１】
総コバラミン濃度が第一選択評価として最も広く使用されており、これは、従来の微生物学的アッセイ又はより現代的な競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ若しくは化学発光アッセイなどの妥当性の確認されたいくつかの分析的方法によって、血清／血漿中で測定することができる。しかしながら、コバラミンアッセイは、ビタミンＢ１２の活性型と不活性型とを区別しないため、干渉を受けやすく、重いビタミンＢ１２欠乏症にもかかわらず、正常値となることがある。
【００１２】
生物活性ビタミンＢ１２欠乏症を評価するために使用される他の方法は、ホロトランスコバラミン（ビタミンＢ１２がその生物活性血清輸送トランスコバラミンＩＩに結合したもの）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）（ビタミンＢ１２依存酵素メチルマロニルＣｏＡムターゼの活性低下により蓄積する）及びホモシステイン（ビタミンＢ１２依存酵素メチオニンシンターゼの活性低下により蓄積する）の測定であるが、葉酸欠乏症と混同する可能性がある。これらの測定は、いずれの方法も十分な感度及び特異性を単独では有していないため、通常、組み合わせて使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、対象において可能性のあるビタミンＢ１２欠乏症を特定するための代替方法及びアプローチが必要とされている。特に、栄養摂取不足ではなく、腸管吸収障害に起因すると考えられるビタミンＢ１２欠乏症の特定を可能にする方法が有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、年齢とともにアムニオンレス濃度が血清又は血漿中で増加し、これが総ビタミンＢ１２循環濃度の減少と相関することを見出した。更に、本発明者らはまた、血清中を含む腸以外のサンプル中でキュバム複合体の構成要素を測定することが可能であり、血清中のキュバム複合体の濃度が年齢とともに上昇することも明らかにした。
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するための方法に関し、この方法は、対象から単離されたサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することと、キュバム複合体又はその構成要素の濃度を参照濃度と比較することとを含み、参照濃度と比較したキュバム複合体又はその構成要素の濃度により、ビタミンＢ１２の腸管摂取量が示される。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、対象がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有するかどうかを判定するための方法に関し、この方法は対象から単離されたサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することと、キュバム複合体又はその構成要素の濃度を参照濃度と比較することとを含み、参照濃度と比較したキュバム複合体又はその構成要素の濃度により、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害が示される。
【００１７】
対象由来のサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度が参照濃度と比較して高いことは、ビタミンＢ１２の腸管摂取の減少を示し得る。
【００１８】
キュバム複合体の構成要素は、アムニオンレス及び／若しくはキュビリン又はその分解生成物であってよい。特に、キュバム複合体の構成要素は、アムニオンレス又はその分解生成物であってよい。
【００１９】
サンプルは、血清又は尿サンプルであってよい。特に、サンプルは、血清サンプルであってよい。
【００２０】
キュバム複合体又はその構成要素の濃度検出は、フローサイトメトリー、抗体ベースアレイ、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析法を利用することができる。
【００２１】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、ビタミンＢ１２欠乏症の指標となり得る。
【００２２】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害、消化管の一部のバイパス手術及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患に関連し得る。
【００２３】
ビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、加齢性ビタミンＢ１２欠乏症に関連し得る。ビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、サルコペニア及び／又はフレイルに関連し得る。
【００２４】
更なる態様において、本発明は、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を診断するための方法を提供し、この方法は、本発明の第２の態様に定義する方法によって、対象がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有するかどうかを判定することを含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害である対象を治療するための方法に関し、この方法は、ビタミンＢ１２サプリメントを対象に投与することを含み、この対象は、本発明の第２の態様に定義する方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている。
【００２６】
更なる態様において、本発明は、対象のビタミンＢ１２欠乏症が、ビタミンＢ１２の食事摂取不足又はビタミンＢ１２の腸管吸収障害に起因するのかを判定するための方法を提供し、この方法は、本発明の第２の態様に定義する方法を実施することを含む。
【００２７】
方法は、対象から単離したサンプル中のビタミンＢ１２、ホロトランスコバラミン、メチルマロン酸及び／又はホモシステインの濃度を測定する工程を更に含み得る。
【００２８】
ビタミンＢ１２の腸管吸収障害を有すると判定された対象がビタミンＢ１２の補給のために選択され得る。好ましくは、ビタミンＢ１２の補給は、非経口ビタミンＢ１２の補給又は腸内で比較的高い効率で吸収される経口ビタミンＢ１２の補給である。例えば、シアノコバラミン及びメチルコバラミンは、他の経口ビタミンＢ１２サプリメントと比較して、小腸での吸収効率が相対的に高いことが知られている。
【００２９】
ビタミンＢ１２の食事摂取不足であると判定された対象が経口ビタミンＢ１２の補給のために選択され得る。
【００３０】
更なる態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法に関し、この方法は、非経口ビタミンＢ１２サプリメント又は比較的高い効率で腸から吸収される経口ビタミンＢ１２サプリメントを対象に投与することを含み、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている。
【００３１】
別の態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法に関し、この方法は、経口ビタミンＢ１２サプリメント又はビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを対象に投与することを含み、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の食事摂取不足であることが特定されている。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象の治療に使用するためのビタミンＢ１２サプリメントを提供し、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている。好ましくは、ビタミンＢ１２の補給は、非経口ビタミンＢ１２の補給又は比較的高い効率で腸から吸収される経口ビタミンＢ１２の補給である。
【００３３】
非経口ビタミンＢ１２サプリメントは、例えば、非経口、舌下又は経鼻投与により与えられてよい。非経口投与には、例えば、筋肉内、皮下、皮内又は静脈内注射を挙げることができる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象の治療に使用するための経口ビタミンＢ１２サプリメント又はビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを提供し、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の食事摂取不足であることが特定されている。
【００３５】
経口ビタミンＢ１２サプリメントは、食料製品であってよい。食料製品は、ビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを含み得る。
【００３６】
更なる態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取量に関するバイオマーカーとしてのキュバム複合体又はその構成要素の使用に関する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、ビタミンＢ１２欠乏症の診断に使用するためのキュバム複合体又はその構成要素を提供する。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、キュバム複合体又はその構成要素若しくはその分解生成物に特異的に結合することができる抗体を提供する。
【００３９】
更なる態様において、本発明は、対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するための、本明細書に定義する抗体の使用に関し、好ましくは、腸管摂取量は本発明の方法によって測定される。
【００４０】
更なる態様において、本発明は、腸管吸収障害に関連するビタミンＢ１２欠乏症を診断するのに使用される、キュバム複合体又はその構成要素に特異的に結合することができる抗体に関する。
【００４１】
したがって、本発明は、対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するための方法を提供する。本発明はまた、ビタミンＢ１２の腸管吸収障害又は食事摂取不足に関連するビタミンＢ１２欠乏症を患っている個体に対して、ビタミンＢ１２補給の改善された合理的な提供を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ラット血清中アムニオンレス相対濃度が年齢とともに増加することを示す。Ｓｏｍａｌｏｇｉｃマルチプレックス技術（三次元ＤＮＡ配列による特異的タンパク質認識）を様々な年齢のラット血清に適用した。１００を超える調節タンパク質中、アムニオンレスが、サルコペニアの発症に対応する１８月齢から有意に増加したことが認められた。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ（１群あたりｎ＝１０）で示す。＊＊ｐ値＜０．０１。
【図２】ビタミンＢ１２血清濃度が年齢とともに減少することを示す。競合結合ＥＩＡを用いて、様々な年齢のラット血清中の総ビタミンＢ１２濃度を測定した。ビタミンＢ１２濃度は、８月齢から２０月齢まで有意に減少し、２０月齢から２４月齢の間安定している。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ（１群あたりｎ＝１０）で示す。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．０１；＊＊＊ｐ値＜０．００１。
【図３】腓腹筋量が年齢とともに減少することを示す。様々な年齢のラットから腓腹筋を切開して取り出し、秤量し、各動物の総体重に対して標準化した。１８月齢から２４月齢の間に漸次的な減少が認められ、２４月齢の動物の筋肉重量は８月齢の動物の筋肉重量の半分に相当する。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ（１群あたりｎ＝１０）で示す。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．０１；＊＊＊ｐ値＜０．００１。
【図４】ＣＤ３２０がインビトロでげっ歯類筋管上に発現することを示す。筋管への分化期間中のＣ２Ｃ１２細胞上のＣＤ３２０に関してリアルタイム定量的ＰＣＲを実施した（ＤＭｘは、分化培地中の日数を示す）。データは、ＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子に対して標準化し、年齢の若い動物と比較した比として示す。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ（１群あたりｎ＝３）で示す。
【図５】ヒトアムニオンレスヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図６】ヒトキュビリンヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本方法は、対象から単離したサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することを含む。
【００４４】
キュバム複合体
キュバム複合体は、内因子（ＩＦ）−ビタミンＢ１２受容体であり、キュビリンとアムニオンレス（ＡＭＮ）という２つのタンパク質のヘテロ二量体膜貫通型受容体である（Ｆｙｆｅ  ｅｔ  ａｌ．；２００４；Ｂｌｏｏｄ：１０３（５））。キュバムは、回腸、腎臓及び卵黄嚢を含む、様々な組織上に発現するマルチリガンド受容体複合体である。腎臓の近位尿細管において、キュバムは、糸球体限外濾過液からの様々なタンパク質（例えば、アルブミン、トランスフェリン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びビタミンＤ結合タンパク質）の再吸収に関与し、これによりタンパク尿が減少する。回腸において、唯一知られているキュバムの機能は、輸送タンパク質であるＩＦと複合化した食事性ビタミンＢ１２の吸収を促進することである（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｔｒａｆｆｉｃ．Ｍａｙ  ２０１０；１１（５）：７０６−７２０）。
【００４５】
先天的遺伝性ビタミンＢ１２欠乏症は、キュビリン又はアムニオンレスの変異に起因する可能性があり、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群を引き起こす。
【００４６】
「キュバム複合体の構成要素」は、アムニオンレス又はキュビリンのいずれかであり得る。
【００４７】
アムニオンレス
アムニオンレスは、約４５ＫＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、キュバム複合体を細胞膜に係留し、ＣＢＮ−ＡＭＮ−ＩＦ−Ｂ１２複合体のエンドサイトーシスを担う。
【００４８】
アムニオンレスは、その細胞質ドメイン内に、ＦＸＮＰＸＦ型の２つの推定内在化シグナルを含有し、このシグナルが、Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２（Ｄａｂ２）及び／又は常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）とおそらく連係することによって、キュバム及びキュバムリガンドの内在化に関して活性となる（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｔｒａｆｆｉｃ．Ｍａｙ  ２０１０；１１（５）：７０６−７２０）。
【００４９】
図５は、配列番号１に該当するヒトアムニオンレスヌクレオチド配列及び配列番号２に該当するヒトアムニオンレスタンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２２０５）を示す。
【００５０】
アムニオンレスの厳密な配列は、個体間及び種間で変わり得ることが理解されよう。これらのバリアントは全て、本発明の方法及び使用に包含される。例えば、アムニオンレス配列は、図５に示す配列（配列番号２）と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７又は９９％の同一性を有し得ることが想定され得る。
【００５１】
キュビリン
キュビリンは、約４６０ｋＤａのグリコシル化細胞外タンパク質であり、内因子に対するリガンド結合ドメインを有する（Ｋｏｚｙｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｌｏｏｄ．１９９８  Ｍａｙ  １５；９１（１０）：３５９３−６００）。キュビリン前駆体タンパク質は、トランスゴルジプロテイナーゼのフーリンによるタンパク質分解プロセスを受けて２３個のＮ端末アミノ酸が除去される。
【００５２】
キュビリンは、８個の上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピートが続く短いＮ端末領域と、２７個の連続するＣＵＢドメインとで構成される。２つの異なるリガンド結合領域が同定されている。領域１（約７１ｋＤａ）は、１１３残基のＮ末端と、８個の上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピート並びにＣＵＢドメイン１及び２とを含み、領域２（約３７ｋＤａ）は、ＣＵＢドメイン６〜８を含み、内因子−コバラミン（ビタミンＢ（１２）；Ｃｂｌ）（ＩＦ−Ｃｂｌ）とアルブミンの両方に結合する（Ｙａｍｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｎｏｖ  ３０；２７６（４８）：４４７７７−８４）。キュビリンタンパク質は、同定可能な膜貫通領域も、エンドサイトーシスに関する古典的なシグナルも有していない。
【００５３】
図６は、配列番号３に該当するヒトキュビリンヌクレオチド配列及び配列番号４に該当するヒトキュビリン前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０７２）を示す。
【００５４】
イヌキュビリンｍＲＮＡ及びタンパク質配列は、それぞれＮＭ＿００１００３１４８．１及びＮＰ＿００１００３１４８．１から得られる。
【００５５】
キュビリンの厳密な配列は、個体間及び種間で変わり得ることが理解されよう。これらのバリアントは全て、本発明の方法及び使用に包含される。例えば、キュビリン配列は、図６に示すアミノ酸配列（配列番号４）と少なくとも６５、７０、７５、８５、９０、９５、９７又は９９％の同一性を有し得ることが想定され得る。
【００５６】
本方法は、キュバム複合体又はその構成要素を検出することを含み得る。キュバム複合体の構成要素は、完全長の成熟アムニオンレス若しくはキュビリンペプチド又はその分解生成物であってよい。
【００５７】
「分解生成物」は、完全長のアムニオンレス又はキュビリンペプチドの少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５、９８又は９９％であるペプチドであり得る。
【００５８】
更なる態様において、本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取量に関するバイオマーカーとしてのキュバム複合体又はその構成要素若しくはその分解生成物の使用を提供する。
【００５９】
ビタミンＢ１２
ビタミンＢ１２（コバラミンとも呼ばれる）は、コバルト含有水溶性ビタミンの一種であり、ヒト体内では合成できないことから、食物から摂取するか、又は腸内細菌叢により合成されなければならない。
【００６０】
コバラミンは、コバルトイオンの上部軸配位子に応じて、いくつかの化学的形態のビタミンＢ１２を指し得る。これらは、
シアノコバラミン（Ｒ＝−ＣＮ）
ヒドロキソコバラミン（Ｒ＝−ＯＨ）
メチルコバラミン（Ｒ＝−ＣＨ３）及び
アデノシルコバラミン（Ｒ＝−Ａｄｏ）である。
【００６１】
したがって、ビタミンＢ１２は、化学的に関連した化合物の種類（ビタマー）を含み、それらの全てがビタミン活性を有する。ビタミンＢ１２は、コリン環と呼ばれる平面テトラピロール環の中心に位置する、生化学的に珍しいコバルト元素を含有する。ビタミンの基本構造の生合成は、細菌（通常、ヒドロキソコバラミンを産生するもの）によってのみ達成されるが、異なる形態のビタミン間の変換はヒト体内で行うことができる。
【００６２】
ヒト体内におけるビタミンＢ１２の貯蔵は、いくつかの形態からなり、これらは、不活性であるため活性を得るには変換を要するシアノコバラミン並びにビタミンＢ１２の代謝活性型誘導体であるメチルコバラミン及びアデノシルコバラミンである。
【００６３】
ビタミンＢ１２は、胃中で食物マトリックスから分離された後、小腸で内因子（ＩＦ）に結合し、そこで、キュバム複合体を介して吸収される。腸細胞内で、ＣＢＮ−ＡＭＮ−ＩＦ−Ｂ１２複合体は、十分に特定されていない機構によってリソソームで分解され、ＬＭＢＤ１タンパク質を介して遊離ビタミンＢ１２がリソソームから排出される。その後、ビタミンＢ１２は、少なくとも一部にはＭＲＰ１トランスポーターを必要とする機構によって、細胞質及び腸細胞の基底外側膜を通って輸送され、血流に入る。
【００６４】
血中において、ビタミンＢ１２は、ビタミンＢ１２のおよそ８０％を運搬し、組織に生物学的に利用されないハプトコリンと、総ビタミンＢ１２のおよそ２０％を運搬し、ユビキタスなＣＤ３２０受容体に結合するか、又は体内の主なビタミンＢ１２貯蔵部位である肝臓でアシアロ糖タンパク質受容体複合体に結合することによって組織に生物学的に利用されるトランスコバラミンの２つの担体タンパク質と結合する。
【００６５】
ビタミンＢ１２は、ＤＮＡの合成及び制御、脂肪酸代謝並びにアミノ酸代謝に必要である。
【００６６】
腸管摂取量
「腸管摂取量」は、対象において、腸を介して血液中に吸収される、食事摂取からのビタミンＢ１２の量を指す。したがって、腸管摂取量は、対象における食事からのビタミンＢ１２の腸管摂取効率を表し得る。
【００６７】
「腸管摂取障害」は、腸内での食事性ビタミンＢ１２の摂取が非効率であること又は不十分であることを指し得、例えば、ビタミンＢ１２の腸管摂取の減少を指し得る。
【００６８】
好ましくは、対象は、ビタミンＢ１２の十分な栄養摂取から必要量のビタミンＢ１２を吸収していなければ、「ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有する」。
【００６９】
したがって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、ビタミンＢ１２欠乏症の一因であるか、又はその原因となる可能性がある。
【００７０】
ビタミンＢ１２の腸管摂取量は、対照コホートからの参照量と比較することができる。対照群は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害であると診断されたコホート及びビタミンＢ１２の腸管摂取障害でないことが前もって判定された対象のコホートから選択することができる。
【００７１】
ビタミンＢ１２欠乏症
米国成人の栄養所要量（ＲＤＡ）は、医学研究所により、食物からの平均吸収が約５０％であることに基づき、１日あたり２．４μｇに設定された（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０００）；Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔａｋｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｉａｍｉｎ，Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ，Ｎｉａｃｉｎ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６，Ｆｏｌａｔｅ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２，Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，ｐｐ３０６−５６）。１日所要量は体格に応じて変動することが示された。
【００７２】
ヒトにおけるビタミンＢ１２欠乏症の見込みは、ビタミンＢ１２の血中濃度に従って次のように定義することができる。１４８ピコモル／Ｌ未満（２００ピコグラム／ｍＬ未満）は欠乏症のおそれ、１４８〜２５８ピコモル／Ｌ（２０１〜３５０ピコグラム／ｍＬ）は欠乏症の可能性、２５８ピコモル／Ｌ超（３５０ピコグラム／ｍＬ超）は欠乏症の見込みはないことを示す（ＢＭＪ，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｈｔｔｐ：／／ｂｅｓｔｐｒａｃｔｉｃｅ．ｂｍｊ．ｃｏｍ／ｂｅｓｔ−ｐｒａｃｔｉｃｅ／ｍｏｎｏｇｒａｐｈ／８２２／ｂａｓｉｃｓ．ｈｔｍｌ）。しかしながら、ビタミンＢ１２量並びに活性及び不活性ビタミンＢ１２についての関連合併症を判定するゴールドスタンダードがないことから、血清ビタミンＢ１２のアッセイは、ビタミンＢ１２欠乏症を診断するために、更なる生化学的アッセイ又は主症状に基づいた臨床的評価と組み合わせることが多い。
【００７３】
ビタミンＢ１２欠乏症の更なる指標を与えるために実施することができる追加のアッセイは、対象から単離したサンプル中のホロトランスコバラミン、メチルマロン酸及び／又はホモシステインの濃度を測定することを含む。
【００７４】
ホロトランスコバラミンは、ビタミンＢ１２がその生物活性血清輸送トランスコバラミンＩＩに結合したものを指す。ホロトランスコバラミン濃度は、市販のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）を用いて測定することができる。ホロトランスコバラミン濃度が低いことは、潜在性ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。
【００７５】
メチルマロン酸（ＭＭＡ）は、ビタミンＢ１２依存酵素メチルマロニルＣｏＡムターゼの活性低下により蓄積する。したがって、ＭＭＡ濃度が高いことは、ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。
【００７６】
ホモシステインは、ビタミンＢ１２依存酵素メチオニンシンターゼの活性低下により蓄積する。ホモシステイン濃度が高いことは、潜在性ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。しかしながら、ホモシステイン濃度のアッセイは、葉酸欠乏症と混同する可能性がある。
【００７７】
ビタミンＢ１２欠乏症の主な症候群は、ビールメル病（悪性貧血）である。これは、骨髄前巨赤芽球症（巨赤芽球性貧血）、胃腸症状及び神経学的症状を伴う貧血によって特徴付けられる。
【００７８】
ビタミンＢ１２欠乏症はまた、躁病及び精神障害、疲労、記憶障害、興奮性、鬱病及び人格変化の症状を引き起こすこともある。乳児の場合、症状には、興奮、成長障害、無関心、拒食症及び発達退行が挙げられる。
【００７９】
ビタミンＢ１２欠乏症は、多数の病態及び疾患に関連する。したがって、本方法によって測定されるビタミンＢ１２の腸管摂取量は、例えば、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害、小腸の一部の胃バイパス及び骨粗鬆症に関連し得る。
【００８０】
加齢性ビタミンＢ１２欠乏症
高齢者におけるビタミンＢ１２欠乏症はよく認められ（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（２０１３）；５０（４）；３１５−２９）、ビタミンＢ１２の低下は、心臓血管疾患、認知機能障害、痴呆及び骨粗鬆症を含む多数の加齢性疾患のリスク上昇に関連付けられている。
【００８１】
本方法によって判定されるビタミンＢ１２の腸管摂取障害は、加齢性ビタミンＢ１２欠乏症に関連し得る。
【００８２】
サルコペニア又はフレイル
加齢に伴う筋肉量及び筋肉機能の損失は、全ての個体において避けられないものであるが、その進行は、遺伝子要因及び身体活動又は栄養摂取などの環境要因に大きく依存する。
【００８３】
サルコペニアは、加齢に伴う筋肉量及び筋肉機能の損失が悪化し、生活の質に影響を及ぼす点として定義されている。対照的に、フレイルは、加齢に伴う筋機能不全という別の分類であり、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能に基づいている。
【００８４】
サルコペニア及びフレイルは、神経筋伝達障害、興奮収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全並びに最終的な骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化などの病態生理学的変化に関連する多因性症候群である。したがって、これらの症候群の病因は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク同化ホルモン（アンドロゲン、ＩＧＦ−１）のホルモン減少及び栄養不良／栄養失調が重要な役割を果たしている。サルコペニア又はフレイル患者において最も広く認められる栄養失調は、ビタミンＤ濃度の低下である。
【００８５】
本方法によって測定されるビタミンＢ１２の腸管摂取量は、サルコペニア及び／又はフレイルに関連し得る。
【００８６】
「関連する」という用語は、ビタミンＢ１２欠乏症に関連する疾患（例えば、上に記載するもの）を患っているか、又はそのリスクのある対象におけるビタミンＢ１２の腸管摂取量を測定するために本方法を使用することができるということを示すために本明細書にて使用される。
【００８７】
本発明は、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を診断するための方法を更に提供し、この方法は、本発明の方法によって、対象がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有するかどうかを判定することを含む。
【００８８】
腸管摂取又は食事摂取に関連するビタミンＢ１２欠乏症の判定
更なる態様において、本発明は、対象のビタミンＢ１２欠乏症が、ビタミンＢ１２の食事摂取不足又はビタミンＢ１２の腸管吸収障害に起因するのかを判定するための方法に関し、ビタミンＢ１２の腸管摂取量は本発明の方法に従って測定される。
【００８９】
対象は、ビタミンＢ１２不足であり、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが判定された場合に、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症であると判定される。
【００９０】
対象は、ビタミンＢ１２不足であり、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害でないことが判定された場合に、ビタミンＢ１２の食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症であると判定される。
【００９１】
ビタミンＢ１２の腸管吸収障害を有すると判定された対象が非経口ビタミンＢ１２の補給のために選択され得る。
【００９２】
ビタミンＢ１２の食事摂取不足であると判定された対象が経口ビタミンＢ１２の補給のために選択され得る。
【００９３】
方法は、当該技術分野において知られているビタミンＢ１２欠乏症の１つ以上の更なるマーカーレベルを判定する工程を更に含み得る。例えば、方法は、対象から単離したサンプル中のビタミンＢ１２、ホロトランスコバラミン、メチルマロン酸及び／又はホモシステインの濃度を測定する工程を含み得る。
【００９４】
好ましくは、追加の測定は、キュバム複合体の構成要素の濃度を測定するために用いたものと同じサンプルを用いて実施される。
【００９５】
ビタミンＢ１２補給
本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害である対象を治療するための方法を更に提供し、この方法は、対象にビタミンＢ１２サプリメントを投与することを含み、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている。
【００９６】
ビタミンＢ１２サプリメントは、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン及びアデノシルコバラミンを含む形態で利用可能であり、単独で提供してもよいし、他のサプリメントと組み合わせて提供してもよい。ビタミンＢ１２補給の２つの主な経路は、食物サプリメントからの経口摂取又は非経口注入（主に筋肉内、場合により皮下）である。
【００９７】
有利には、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが本発明の方法によって判定された対象は、腸管吸収を必要としないビタミンＢ１２サプリメントで治療される。
【００９８】
したがって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害である対象を治療するための本方法は、ビタミンＢ１２の腸管吸収障害を有すると判定された対象を、非経口ビタミンＢ１２サプリメントで治療することを含み得る。
【００９９】
本発明は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法を更に提供し、この方法は、対象に非経口ビタミンＢ１２サプリメントを投与することを含み、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害を有することが特定されている。
【０１００】
非経口ビタミンＢ１２サプリメントは、例えば、非経口、筋肉内、皮下、舌下、経皮又は経鼻投与のためのサプリメントを包含し得る。
【０１０１】
本方法は、ビタミンＢ１２の腸管吸収障害を有すると判定された対象を、比較的高い効率で腸から吸収される経口ビタミンＢ１２サプリメントで治療することを更に含み得る。例えば、シアノコバラミン及びメチルコバラミンは、他の経口ビタミンＢ１２サプリメントと比較して、小腸内から吸収効率が相対的に高いことが知られている。
【０１０２】
本発明は、ビタミンＢ１２の食事摂取不足に起因するビタミンＢ１２欠乏症である対象を治療するための方法を更に提供し、この方法は、経口ビタミンＢ１２サプリメント又はビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを対象に投与することを含み、この対象は、本発明の方法によって、ビタミンＢ１２の食事摂取不足であることが特定されている。
【０１０３】
経口補給は、典型的に、１日あたり２５０μｇ〜１ｍｇのビタミンＢ１２を与えることを伴う。
【０１０４】
本方法は、ビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクスサプリメントを、ビタミンＢ１２の食事摂取不足であると判定された対象に投与することを含み得る。
【０１０５】
プロバイオティクスサプリメントは、宿主対象の腸内細菌バランスを改善してビタミンＢ１２摂取を高めることによって、宿主対象に有益な影響を与える任意のプロバイオティクス微生物を含むことができる。プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、レンサ球菌属、エンテロコッカス属及びサッカロミセス属又はこれらの混合物からなる群から選択され得る。
【０１０６】
腸内細菌叢の天然成分である特定のプロバイオティクス微生物、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓなどの乳酸産生細菌がビタミンＢ１２を産生することが知られている（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏ．；１１１（６）；（２０１１）参照）。有利には、プロバイオティクスサプリメントは、その場でビタミンＢ１２を産生する腸内の既存の微生物を強化することができる。
【０１０７】
経口補給は、食料又は飲料製品の形態であってよい。食料又は飲料製品は、ビタミンＢ１２産生細菌又はその場でビタミンＢ１２を産生する腸内の既存の微生物を強化することができる他のプロバイオティクスを含むプロバイオティクスサプリメントを含み得る。
【０１０８】
典型的には、医師が個々の対象に最も適切であろう実際の用量を決定し、この用量は特定の患者の年齢、体重及び応答に応じて変動する。用量は、活性ビタミンＢ１２の所要量をもたらすのに十分なものである。
【０１０９】
対象
対象は、ウシ、イヌ、ヤギ、シカ、ウマ、ネコ、ヒト、ヒツジ、ブタ及び霊長類などの哺乳動物を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、対象は、ヒトである。様々な実施形態において、対象は、ビタミンＢ１２欠乏症である可能性があるか、その疑いがあるか、又はそのリスクがある。
【０１１０】
対象は、内因子欠乏症、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、クローン病、炎症性腸疾患、２型糖尿病、心臓血管疾患、脳卒中、痴呆、認知障害、消化管の一部のバイパス手術及び骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を患っている場合がある。
【０１１１】
対象は、サルコペニア及び／若しくはフレイルを患っているか、又はそのリスクのある高齢の個体であり得る。
【０１１２】
ビタミンＢ１２補給は、スポーツ栄養補給プログラムの一環として一般に用いられる。本方法は、スポーツ栄養補給プログラムの一環としてのビタミンＢ１２補給の最も効果的な方法を判定するために使用することができる。
【０１１３】
サンプル
本方法は、対象から得たサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定することを含む。これは、「試験サンプル」と呼ばれることもある。したがって、本方法は、典型的には、ヒト又は動物の身体の外側で、例えば、試験を行う対象から事前に得た体液サンプルに対して行われる。
【０１１４】
サンプルは、例えば、血清、血漿又は尿サンプルであってよい。
【０１１５】
好ましくは、サンプルは、血液から得られ、すなわち、サンプルは、全血又は血液フラクションを含む。最も好ましくは、サンプルは、血漿又は血清を含む。
【０１１６】
血液サンプルを採取し、かつ血液フラクションを分離する技術は当該技術分野において既知である。例えば、静脈血サンプルは、針を使用して患者から採取され、プラスチックチューブ内に堆積されてもよい。採取チューブは、例えば、スプレーコーティングしたシリカ、及び血清分離のためのポリマーゲルを含んでもよい。血清は、室温において、１３００ＲＣＦで１０分間にわたり、遠心分離によって分離され、−８０℃で小さなプラスチックチューブに保存されてもよい。
【０１１７】
参照濃度（量）との比較
本方法は、参照濃度（量）との比較を含む。参照濃度（量）という用語は、「対照濃度（量）」と同義であり、当業者が技術データの正確な解釈を容易にするために使用するデータを広範に含む。
【０１１８】
試験サンプル中の標的濃度、例えば、対象由来のサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度は、対照群の１つ以上のコホート（集団／群）中の同じ標的のそれぞれの濃度と比較することができる。対照群は、ビタミンＢ１２の腸管摂取障害であると診断されたコホート及びビタミンＢ１２の腸管摂取障害でないことが前もって判定された対象のコホートから選択することができる。
【０１１９】
キュバム複合体又はその構成要素の濃度に関する参照濃度は、好ましくは、試験サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度を特徴付けるのに使用される単位と同じ単位を用いて測定される。したがって、キュバム複合体又はその構成要素の濃度の濃度が、μｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるキュバム複合体又はその構成要素の単位などの絶対値である場合、参照値もまた、一般集団又は対象の選択対照集団における個体のμｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるキュバム複合体又はその構成要素の単位に基づく。
【０１２０】
更に、参照値は、中央値又は平均値などの１つのカットオフ値であってよい。得られた体液サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の参照値、例えば、平均値濃度、濃度中央値又は「カットオフ」濃度は、一般集団又は選択集団中の個体の大規模サンプルを分析し、陽性判定基準を選択するための予測的中率法又は最適な特異度（最も高い真陰性率）及び感度（最も高い真陽性率）を定義する受信者操作特性曲線などの統計モデルを使用することによって確立することができ、これは、Ｋｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．に記載されているとおりである（この文献を参考として本明細書に援用する）。
【０１２１】
正しい参照値をどのように割り当てるについては、当業者に知られているが、これらは、例えば、性別、人種、遺伝的遺産、健康状態又は年齢に応じて変わる。
【０１２２】
特に、本発明者らは、キュバム複合体又はその構成要素の濃度が対象の年齢に応じて変動することを明らかにした。そのため、参照濃度は、試験サンプルの年齢と適合させる必要がある。
【０１２３】
特定のサンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度に対する対照又は参照濃度は、データベースに保存し、対象に対して実施した方法の結果を解釈するために使用してもよい。
【０１２４】
本方法は、参照濃度と比較した試験サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度の差異がビタミンＢ１２の腸管摂取量を示すことを提供する。
【０１２５】
本方法は、参照濃度と比較した試験サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度の差異がビタミンＢ１２の腸管摂取障害を示すことを提供し得る。
【０１２６】
例えば、試験サンプルで測定された濃度と参照濃度との間の１．１、１．５、２、３、４、５、１０、５０、１００又は１０００倍の差異は、ビタミンＢ１２の腸管摂取量の低減を示し得る。
【０１２７】
特定の実施形態において、試験サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度が参照濃度と比較して高いことは、ビタミンＢ１２の腸管摂取量の減少を示し得る。キュバム複合体又はその構成要素の濃度は、参照濃度と比較して、試験サンプルで１．１、１．５、２、３、４、５、１０、５０、１００又は１０００倍大きい場合がある。
【０１２８】
好ましい実施形態において、対象由来の血清サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度は、参照濃度よりも１．１、１．５、２、３、４、５、１０、５０、１００又は１０００倍大きい場合がある。
【０１２９】
検出方法
キュバム複合体又はその構成要素の濃度は、当該技術分野において知られている種々の好適な方法及び技術を用いて検出することができる。
【０１３０】
典型的には、サンプル中のキュバム複合体又はその構成要素の濃度及び参照値は、同じ分析方法を用いて測定される。
【０１３１】
この測定には、ポリペプチド又はその分解生成物の検出が含まれ得る。
【０１３２】
キュバム複合体又はその構成要素の濃度を測定する工程は、例えば、フローサイトメトリー、抗体ベースアレイ、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場（例えば、フィブロネクチン足場）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析法などの技術を使用して、ポリペプチドを検出することを含み得る。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において知られている一般的な方法に従って実施することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチ又は競合ＥＬＩＳＡであってよい。
【０１３４】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、以下の工程を含み得る。
−既知量の補足抗体が結合した表面（すなわち、マイクロタイタープレートウェル）を調製する
−この表面上のあらゆる非特異的結合部位をブロックする
−キュバム複合体又はその構成要素を含むサンプルをプレートに適用する
−プレートを洗浄して結合していない抗原を除去する
−キュバム複合体又はその構成要素に特異的に結合することができる一次抗体を加え、抗原に結合させる
−抗体Ｆｃ領域に特異的に結合する検出抗体として、酵素結合二次抗体を適用する
−プレートを洗浄して結合していない抗体−酵素複合体を除去した後、化学物質を加えて酵素を色又は蛍光又は電気化学シグナルに変換する
−プレートウェルの吸光度又は蛍光又は電気化学シグナルを測定して抗原の存在及び量を測定する
【０１３５】
競合ＥＬＩＳＡは、以下の工程を含み得る。
−キュバム複合体又はその構成要素に特異的に結合する標識抗体をキュバム複合体又はその構成要素を含むサンプルの存在下でインキュベートする
−次いで、この結合した抗体／抗原複合体を、抗原を被覆したウェルに加える
−プレートを洗浄することにより、結合していない抗体を除去する
−酵素が結合した、一次抗体に特異的な二次抗体を加える
−酵素の基質を加え、酵素とその基質の反応により発色又は蛍光シグナルを発生させる
−シグナルの最終的な飽和を防ぐために反応を停止する
【０１３６】
種々の酵素基質標識が利用可能であり、例えば米国特許第４，２７５，１４９号に開示されているものである。酵素は概して、検出することが可能な発色基質の化学的変化に触媒作用を及ぼす。例えば、酵素は基質の色変化に触媒作用を及ぼしてもよいし、又は基質の蛍光若しくは化学発光を変えてもよい。酵素標識の例としては、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を接合するための技術がよく知られている。
【０１３７】
アプタマーを使用する検出は、以下の工程を含み得る。
−キュバム複合体又は構成要素を特異的に認識するアプタマーについては、標準的な核酸合成技術を用いて合成してもよいし、例えば、試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技術を用いて、ランダム配列巨大プールから選択してもよい。
−アプタマーをサンプルと混合することにより、アプタマー−タンパク質複合体を形成する
−非特異的複合体を分離する
−結合したアプタマーをその標的タンパク質から取り外す
−アプタマーを回収し、例えば、マイクロアレイ又は質量分析技術を用いて測定する。
【０１３８】
アプタマーは、ステム、ループ、四重鎖、シュードノット、バルジ又はヘアピンの組み合わせを有する独特な三次構造で折り畳まれている一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であってよい。アプタマーの分子認識は、標的化合物との芳香環のスタッキング、静電及びファンデルワールス相互作用又は水素結合などの分子間相互作用から生じる。加えて、アプタマーとその標的との間の特異的な相互作用は、誘導適合機構によって補完されるため、アプタマーがその標的に対して独特な折り畳み構造を取る必要がある。アプタマーは、色素などの標識分子と連結するように、又は種々の用途のビーズ若しくは基質の表面上に固定化するように修飾され得る。
【０１３９】
アプタマーは、ナノテクノロジー、マイクロアレイ、マイクロ流体、質量分析法及び所与のサンプルを定量化するための他の技術と組み合わせることができる。
【０１４０】
相同性
相同性比較は、目で行うこともできるが、より一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを使用して実施する。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性又は同一性のパーセンテージを計算することができる。
【０１４１】
相同性パーセンテージは、連続的な配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０１４２】
これは、極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、ヌクレオチド配列中の１つの挿入又は欠失により、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、後続するコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合には、相同性パーセントが大幅に低下する可能性がある。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１４３】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸に対して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映している可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的に、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続するそれぞれの残基には小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適化アラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については４である。
【０１４４】
したがって、最大相同性パーセンテージの算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは２つともオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する別のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列の比較に使用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７：１８７−８参照）。
【０１４５】
最終的な相同性パーセンテージを同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的に、イエスかノーかのペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいて、それぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化類似性スコア行列が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値又は提供される場合はカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
【０１４６】
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性パーセンテージパーセンテージ、好ましくは配列同一性パーセンテージを算出することができる。典型的に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
【０１４７】
抗体
本発明は、キュバム複合体又はその構成要素若しくはその分解生成物に特異的に結合することができる抗体を提供する。
【０１４８】
抗体は、アムニオンレス又はその分解生成物に特異的に結合することができる。
【０１４９】
「抗体」という用語は、本明細書において、抗体又はその機能性断片を指すために使用される。機能性断片とは、親抗体と同じ抗原標的に結合する能力を保持する、すなわち、キュバム複合体又はその構成要素若しくはその分解生成物に結合する能力を保持する、抗体のいずれかの部分を意味する。
【０１５０】
抗体は、キメラ抗体であってもよい。キメラ抗体は、ある種（例えば、マウス）に由来する抗体可変ドメインを、別の種（例えば、ヒト）に由来する抗体の定常領域に移植することによって作製することができる。
【０１５１】
抗体は、古典的な完全長抗体であってもよい。例えば、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ分子であってよい。
【０１５２】
抗体は、機能性抗体断片であってもよい。具体的な抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一可変ドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結したＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとがペプチドリンカーによって連結されており、これにより、２つのドメインが連係して抗原結合部位を形成することができる、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、並びに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片は、改変されてもよい。例えば、ＶＨとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって分子を安定化することができる。
【０１５３】
本明細書に記載する抗体は、多重特異性抗体、とりわけ「ダイアボディ」と呼ばれることもある二重特異性抗体であってよい。これらは、２つ（又はそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。ダイアボディは、当該技術分野において知られている様々な方法で製造することができ、例えば、化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから作製することができる。抗体は、ミニボディであってもよい。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む、最小化した抗体様タンパク質である。場合により、ｓｃＦｖをＦｃ領域に結合することができ、ヒンジ領域の一部又は全てを含めてもよい。
【０１５４】
抗体は、ドメイン抗体（単一ドメイン抗体又はナノボディとも呼ばれる）であってもよい。これは、単一単量体の単一可変抗体ドメインを含有する抗体断片である。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科動物に本来みられるＶＨＨ断片及び軟骨魚類に本来みられるＶＮＡＲ断片が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体はまた、一般的なＩｇＧ分子から二量体可変ドメインを単量体に分割することによっても生成することができる。
【０１５５】
抗体は、合成抗体（抗体模倣体とも呼ばれる）であってもよい。抗体模倣体には、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、Ａｖｉｍｅｒｓ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ及びＤｕｏｃａｌｉｎｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのに役立てるために提供することを意味するものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１５７】
（実施例）
実施例１−血清中アムニオンレス濃度の増加と年齢との相関
発明者らは、ラット血清中タンパク質の加齢に伴う変化を特定するためにＳｏｍａｌｏｇｉｃ技術を用いて、ラット血清中アムニオンレス濃度が年齢とともに有意に増加することを見出した（図１）。
【０１５８】
競合結合免疫蛍光酵素アッセイを用いてラット血清中のコバラミン濃度を測定したところ、総ビタミンＢ１２濃度が年齢とともに減少することが示された（図２）。これは、血清中で測定されたアムニオンレス濃度の増加と一致した。ビタミンＢ１２の摂取又は吸収が低下した際には、肝臓のビタミンＢ１２貯蔵が身体のその他の部分にビタミンＢ１２を数週間提供することが知られているが、２０ヶ月で生じるビタミンＢ１２の循環濃度の減少の前に、アムニオンレス濃度が１８月齢で増加したという事実は、アムニオンレスの変化が加齢性ビタミンＢ１２欠乏症の原因となり得ることを示している。
【０１５９】
実施例２−筋肉量減少に伴うアムニオンレス濃度の変化
ラット血清中のアムニオンレス及びビタミンＢ１２の変化が１８月齢以降に生じることが更に認められ、これは、高齢ラットの後肢筋肉にて観察された筋肉量の減少開始と一致する。これを腓腹筋について図３に示した。予備のインビトロ実験では、組織のＶｉｔＢ１２受容体ＣＤ３２０が、増殖している前駆細胞上ではなく、分化した筋肉細胞上に発現することが実証された（図４）。これは、ビタミンＢ１２が骨格筋に入り、筋肉生理に影響し得ることを示唆している。
【０１６０】
本明細書にて言及する全ての公開物は、参考として本明細書に援用する。本発明に記載する方法及びシステムの様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、当業者には明白であろう。本発明について特に好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求する本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるものではないことを理解すべきである。事実、記載された本発明を実施するための様態の様々な修正は、分子生物学、細胞免疫学又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2017537303.tif 000002
【図２】
2017537303.tif 000003
【図３】
2017537303.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2017537303.tif 000007
【図６−２】
2017537303.tif 000008
【図６−３】
2017537303.tif 000009
【図６−４】
2017537303.tif 000010
【図６−５】
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【配列表】
2017537303000001.app
【国際調査報告】
2017537303.tif 000012
2017537303.tif 000013