(57)【要約】本発明は、患者の（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷の治療または予防、および／または（ｉｉ）骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成の誘導または増強、に用いる骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする配列を有するＲＮＡを含む医薬組成物に関する。本発明は、ＢＭＰをコードするＲＮＡ（ＢＭＰ・ＲＮＡ）にも関し、特に化学修飾された形態でのＢＭＰ・ＲＮＡに関する。本発明は、ＢＭＰ・ＲＮＡを含む、またはＢＭＰ・ＲＮＡと複合体化された複合体にも関し、特にリポフェクション、マグネトフェクション、およびマグネトリポフェクション複合体のようなトランスフェクション複合体に関する。本発明は、さらに、ＲＮＡまたは複合体が配合されたキャリアおよびキャリア体と、このキャリアまたはキャリア体を含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、持続性ｍＲＮＡ送達のためのマトリクスまたは足場と、インビボ、エキソビボ、およびインビトロでの骨再生におけるその利用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする配列を有するポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む医薬組成物であって、患者の
（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷の治療または予防、および／または、
（ｉｉ）骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成の誘導または増強に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
前記ＢＭＰがＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＡが、非化学修飾ＲＮＡまたは化学修飾ＲＮＡである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
標的細胞内または標的組織内に前記ＲＮＡを送達および／または導入するための１種類以上の薬剤または１種類以上の試薬をさらに含む、請求行１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
リポソームトランスフェクション試薬（ＬＴＲ）をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、前記薬剤、前記試薬、または前記ＬＴＲと複合体を形成する、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＲＮＡがインビボで送達される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＲＮＡが、前記患者に導入される細胞内にエキソビボで送達される、請求項１〜６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＲＮＡは、前記患者の細胞内にエキソビボで送達され、前記ＲＮＡが送達された前記細胞は、前記患者に再導入される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＲＮＡおよび／または前記細胞は、前記患者の組織内または前記患者の組織近傍に投与され、前記患者においては骨成長の誘導が望まれている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記細胞が骨芽前駆細胞である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＭＳＣが、脂肪質由来の間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）または骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭＳＣ）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡが添加された、または前記ＲＮＡが配合されたマトリクスまたは足場をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記マトリクスまたは足場が、コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記マトリクスまたは足場が、コラーゲンスポンジ、および／またはフィブリン塊もしくはフィブリング接着剤である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記マトリクスまたは足場が真空乾燥されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記細胞が、請求項１４〜１７のいずれか一項に規定されるマトリクスまたは足場に播種されている、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記マトリクスまたは足場は、前記患者の骨または骨組織内に移植される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記化学修飾ＲＮＡのシチジンの２５％は５‐メチルシチジン（ｍ５Ｃ）であり、前記化学修飾ＲＮＡのウリジンの２５％は２‐チオウリジン（ｓ２Ｕ）である、請求項３〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか一項に規定されるマトリクスまたは足場。
【請求項２２】
請求項２１に記載のマトリクスまたは足場を含む医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＲＮＡの持続性かつ／または遅延性送達に使用される、かつ／またはそのために製造される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２１に記載のマトリクスもしくは足場、または請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷の治療または予防、および／または（ｉｉ）骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成の誘発または増強、に用いる骨形成タンパク質（bone morphogenetic protein：ＢＭＰ）をコードする配列を有するポリリボヌクレオチド（polyribonucleotide：ＲＮＡ）を含む医薬組成物に関する。本発明は、ＢＭＰをコードするＲＮＡ（ＢＭＰ・ＲＮＡ）にも関し、特に化学修飾された形態でのＢＭＰ・ＲＮＡに関する。本発明は、ＢＭＰ・ＲＮＡを含む、またはＢＭＰ・ＲＮＡと複合体化された複合体にも関し、特にリポフェクション、マグネトフェクション、およびマグネトリポフェクション複合体のようなトランスフェクション複合体に関する。本発明は、さらに、ＲＮＡまたは複合体が配合されたキャリアおよびキャリア体と、このキャリアまたはキャリア体を含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、持続性ｍＲＮＡ送達のためのマトリクスまたは足場と、インビボ、エキソビボ、およびインビトロでの骨再生におけるその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、主にコラーゲンとヒドロキシアパタイトからなる密性結合組織の一種である。骨組織は、骨芽細胞、破骨細胞、および骨細胞という主に３つの細胞型によって定着しており、他の器官を保護するとともに、身体を支持し、動作を可能する（非特許文献１）。骨は、また、骨髄中に赤血球および白血球を生成し、生命に不可欠なすべてのミネラル分を保存する（非特許文献２）。骨組織が損傷した場合、組織の通常機能を回復しようと骨化作用が生じる。一般に、治癒作用には、細胞の増殖・移動・分化の制御といった、骨髄、骨皮質、骨膜、および周囲の軟組織の協調応答が必要となる（非特許文献３、非特許文献４）。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来の成長因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）といった多くのシグナリング分子が新しい骨の形成の制御に関わっている。サイトカインの放出、低酸素症、および血管破裂を通して、細胞は骨折部位に動員される。
【０００３】
骨折治癒は複雑な生理的過程である。様々な理由からこの過程が進まないことがあり、例えば癒着が遅れたりまたは癒着不能になったりする。治療の選択肢は、骨折修復に至る細胞の過程を増強するよう主に設計されている。同時に、骨折部位を機械的に支持するための生体材料（非特許文献５、非特許文献６）および必要とされる成長因子を送達するためのプラットフォーム（非特許文献７、非特許文献８）がたびたび用いられる。
【０００４】
ＢＭＰはおそらく骨再生に関わる最も重要な成長因子である（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＢＭＰは、（１）骨格前駆細胞の関与、（２）生後発育における骨芽細胞の成熟、という２つの異なるレベルで骨形成を制御する（非特許文献１２）。具体的には、ＢＭＰ‐２は、インビトロとインビボの両方において骨形成誘導に効果的であることが証明されている（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。しかしながら、ＢＭＰタンパク質（特に組み換え型ＢＭＰ‐２）を用いた骨欠損の治療は高価であり、また、構造異常のある骨の形成や炎症などの深刻な副作用を伴いうる超生理的濃度を必要とする（Zara, Tissue Engineering: Part A 17 (9 & 10), 2011, 1389-1399）。
【０００５】
現在、治療目的で遺伝子を骨組織に導入する可能性を探求している研究者が数名存在する。タンパク質送達よりも遺伝子送達の方が優れている点が既に実証されている。利点としては、タンパク質を局所的かつ集中的に、または必要に応じて散在的に発現させられるという柔軟性が挙げられる。加えてタンパク質は細胞内で生成される。したがって、これにより治療的経路の発生が促進される。遺伝子導入を介して送達されたタンパク質は、その組み換え型同等物とは違い、発生初期段階にあり、さまざまな割合で存在する不正確に折り畳まれた抗原性を有しうる分子によって汚染されていない（非特許文献１６）。さらに、より長期間タンパク質を発現させることができ、導入遺伝子の発現レベルを制御することもできる。したがって、治療時に用いる治療用タンパク質の用量を減らすことができる（非特許文献１６）。特に、ＢＭＰ‐２をコードするプラスミドＤＮＡを用いた遺伝子導入には、骨の治癒および再生を行う潜在可能性があることが示されている（非特許文献１７、１８、１９）。
【０００６】
しかしながら、利点があるにもかかわらず、現在の遺伝子送達用のウイルスベクターは、強力な免疫原性や挿入突然変異といった安全性の問題と関連している。非ウイルスベクターには、遺伝子導入効率が低いという制限がある（非特許文献１６）。後者は、プラスミドＤＮＡを核へ十分に搬送できないことの主な原因とされている。
【０００７】
ＤＮＡに基づく遺伝子治療に代わるものとして、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）による送達がある。近年、ｍＲＮＡを用いた転写治療は、遺伝子および組み換え型タンパク質治療に代わるより安全な治療法として大きな関心を集めている。ｍＲＮＡには、組み換え型タンパク質に伴う免疫原生のリスクも遺伝子治療に伴う突然変異のリスクもない。さらなる技術的な利点は、ＤＮＡの場合は活性化するには核に到達する必要がある一方、ｍＲＮＡであれば細胞質に到達するだけで活性化することである（Yamamoto, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-489、Tavernier, Journal of Controlled Release 150, 2011, 238-247）。したがって、ｍＲＮＡは、幅広い医療分野において先駆的治療法として台頭してきている（Yamamoto, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-4891、Tavernier, Journal of Controlled Release 150, 2011, 238-247、Kormann, Nature Biotechnology 29, 2011, 154-157、Esteller, Nature Review Genetics 12, 2011, 861-874）。特に、ｍＲＮＡは近年非ウイルス遺伝子療法の代替手段として台頭してきている。ｍＲＮＡは細胞質でその機能を発揮するため、核膜を横切ることに関する制限を克服している。すなわち、ｍＲＮＡに基づく転写治療はそのような制限とは無関係である。
【０００８】
ｍＲＮＡは多くの治療法に対して潜在的なツールを提供することが明らかだが、強力な免疫原生と従来のｍＲＮＡの限定的な安定性により臨床での利用は今のところ（癌ワクチンなどに）限られている（非特許文献２０）。
【０００９】
非特許文献２１では、長さ１２０ヌクレオチドのポリＡ鎖を加えることによるｍＲＮＡの安定性の向上が実証されている。非特許文献２１ではさらに、ＵＴＲを最適化して安定性と翻訳効率を実現することについての研究が報告されている。さらに、ｍＲＮＡの化学修飾も報告されており、これにより安定性の向上と自然免疫系の活性低下がもたされる。特に、治療用マウスエリスロポエチン（therapeutic mouse erythropoietin：ＥＰＯ）とサーファクタントタンパク質Ｂ（surfactant protein B：ＳＰ‐Ｂ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡ（chemically modified RNA：ｃｍＲＮＡ）の生成と治療能が報告されており、前者は血液形成を誘導し、後者には致命的な先天性肺疾患を治療できる可能性がある（非特許文献２２）。加えて、ＤＮＡまたはｃｍＲＮＡを配合し、細胞を播種するための３Ｄマトリックスとしてコラーゲンスポンジが用いられている。（Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218、Reckhenrich, Biomaterials 32, 2011, 1996-2003、Scherer, The Journal of Gene Medicine 4, 2002, 634-643、Elangovan, Journal of Controlled Release 218, 2015, 22-28、特許文献１）。近年の研究によれば、３Ｄ足場内での培養は、細胞の形状、細胞のシグナリング、および細胞の性状に関して、「ペトリ皿」に基づく２Ｄ細胞培養よりもインビボ環境により類似している。これは細胞内での遺伝子発現に影響しうる（Mueller-Klieser, American Journal of Pysiology-Cell Physiology, 273, 1997, C1109-C1123）。コラーゲンスポンジは、細胞の移動、付着、粘着、場合によっては分化を修飾することができる３Ｄマトリックスのうちの１つである（Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218）。また、Ｔのすべての転写因子ＦＯＸＰ３をコードするｃｍＲＮＡによってアレルギー性喘息を治療することが非特許文献２３によって提案されている。ｃｍＲＮＡは、欠陥・欠損遺伝子またはタンパク質関連疾患の優れた治療ツールとしても特許文献２に開示されている。一般に、ｃｍＲＮＡを用いた転写治療は、遺伝子治療および組み換え型タンパク質治療において、より安全かつ有望な代替的治療法として台頭してきている。しかしながら、翻訳が一時的であること、安定性がＤＮＡと比べて低いことから、ｃｍＲＮＡの利用範囲は限られている。さらに、例えばＥＰＯ・ｃｍＲＮＡを使用した場合、治療を成功させるには反復的利用／投与が必要となることが想定される（ヘマトクリットの恒常的適応が必要とされる）。
【００１０】
より進んだ遺伝子治療手法では、欠損組織を修復するため、遺伝子的に修飾された自家組織移植片を使用する。この治療方針では、前駆細胞を含み、かつ空間充填性や誘導性足場または導電性足場という性質を有する、最小限の操作が行われた自家組織を通して遺伝子を送達することで治癒工程が促進される（参考文献２５、参考文献３２）。例えば、脂肪組織には骨芽前駆細胞が含まれることが知られており、天然の足場材料として機能する能力があるとともに容易に採種可能である（参考文献２５、参考文献３３）。参考文献２５では、骨および軟骨の欠損を修復するために、アデノウイルスを搬送するヒトＢＭＰ‐２・ｃＤＮＡが形質導入された脂肪・筋肉組織の移植片が用いられている。しかしながらこの手法にも上述の欠点が伴う。
【００１１】
遺伝子または薬品の持続性送達系は反復投与を必要としないため、長年の間、高い関心を集め続けている。結果として、患者は処方された医薬品をより容易に使用でき、これにより治療手法がより良好に受け入れられるようになる（Bartus, Science 281, 1998, 1161）。ＲＮＡ治療の場合、骨疾患などにより長期間にわたるタンパク質の発現が望ましいとき、このような遅延送達系が特に適している。にもかかわらず、ＲＮＡを持続的に送達する効率的な方法はこれまでのところ見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０１／００７０８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／０１２３１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Balmayor, Stem Cell Therapy for Bone Disorders. In: Chase LG, Vemuri MC (eds.) Mesenchymal Stem Cell Therapy. Humana Press, New York 2012, 101-116
【非特許文献２】Carmona, Bone Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General 2004, U.S. Department of Health and Human Services, Office of the Surgeon General., Rockville, MD
【非特許文献３】Dimitriou, Injury 36(12), 2005,1392-1404
【非特許文献４】Einhorn, Clin Orthop Relat Res 355, 1998, 7-21
【非特許文献５】Tanner, J R Soc Interface 5, 2010, 541-557
【非特許文献６】Tanner, Proc Inst Mech Eng H 224(12), 2010, 1359-1372
【非特許文献７】Mourino, Expert Opin Drug Deliv 10(10), 2013, 1353-1365
【非特許文献８】Romagnoli, Clin Cases Miner Bone Metab 10(3), 2013, 155-161
【非特許文献９】Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3), 2008, 81-96
【非特許文献１０】Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1), 2008, 1-13
【非特許文献１１】Urist, Clin Orthop Relat Res 53, 1967, 243-283
【非特許文献１２】Yamaguchi, Endocr Rev 21(4), 2000, 393-411
【非特許文献１３】Keibl, Injury 42(8), 2011, 814-820
【非特許文献１４】Katagiri, J Cell Biol 127(6 Pt 1), 1994, 1755-1766
【非特許文献１５】Shekaran, Bone regeneration using an alpha 2 beta 1 integrin-specific hydrogel as a BMP-2 delivery vehicle. Biomaterials, 2014
【非特許文献１６】Evans, Adv Drug Deliv Rev 64(12), 2012, 1331-1340
【非特許文献１７】Lu, J Biomater Sci Polym Ed 23(1-4), 2012, 509-526
【非特許文献１８】Chang, Neurosurgery 65, 2009, 75-81
【非特許文献１９】Park, Gene Ther 10(13), 2003, 1089-1098
【非特許文献２０】Van Tendeloo, Curr Opin Mol Ther 9(5), 2007,423-431
【非特許文献２１】Holtkamp, Blood 108(13), 2006, 4009-4017
【非特許文献２２】Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157
【非特許文献２３】Mays, J Clin Invest 123(3), 2013, 1216-1228
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の基礎をなす技術課題は、骨に関する医療行為において改善手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
特許請求の範囲によって特徴づけられる実施形態を提供することにより上記技術課題は解決される。
【００１６】
したがって、本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする配列を有するポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含み、患者の
（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷の治療または予防、および／または
（ｉｉ）骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成の誘導または増強に用いられる医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明は、（必要とする患者に対する）
（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷を治療または予防する方法、および／または、
（ｉｉ）骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成を誘導または増強する方法にも関し、
上記方法は、必要とする患者に、骨ＢＭＰをコードする配列を有するＲＮＡを（含む医薬組成物を）薬学的に有効な量投与するステップを含む。
【００１８】
本明細書および以下の実施例に記載されるように、驚くべきことに、ＢＭＰをコードするＲＮＡ、特にヒトＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡ（配列番号１によってコードされる配列番号３、すなわちｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ）またはヒトＢＭＰ‐７をコードするｃｍＲＮＡ（配列番号２によってコードされる配列番号４、すなわちｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ）によって骨形成が誘導／増強されるということが見出されたため、本発明は上記特定した技術課題を解決する。したがって、本発明の文脈では、ＢＭＰをコードするＲＮＡの使用により、骨再生の転写治療、および骨関連の疾患、障害、または損傷の治療または予防を達成できることが原理的に証明された。
【発明の効果】
【００１９】
さらに、本発明の文脈では、ＢＭＰをコードするＲＮＡ（ＢＭＰ・ＲＮＡ）を用いると、一度の治療のみで骨関連の疾患、障害、または損傷の適切な／完全な治療（または予防）が十分行われることが証明される。したがって、本発明の手段および方法による利点の１つは、ＢＭＰ・ＲＮＡの投与が一度きりでよいことである。
【００２０】
本発明の手段および方法のもう１つの利点は、例えばウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによる制限、ならびに安全性の問題および／または限られた安定性／発現性という欠点とは無関係に、ＤＮＡに基づく遺伝子治療および従来の転写治療に代わる治療法を適用できることである。
【００２１】
本発明にかかるＲＮＡの使用の別の利点は、治療の持続期間を（例えばＤＮＡベクターの使用と比べて）調整可能であることである。例えば幹細胞を誘導する場合、体細胞を幹細胞に再プログラム化するためには、転写因子の活性化が一時的であることが基本的に望ましい。ＢＭＰをコードする関連ＲＮＡの投与を通じ、活性は時間経過とともに制御可能となる。これに対し、以前の方法では、投与遺伝子の共適応というリスクがあり、これは例えば腫瘍形成などの合併症を生じるおそれがある上、持続期間の制御を不可能にする場合もある。
【００２２】
以下の限定的図目的ではない図面および実施例を参照しつつ、本発明をさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】天然アガロースゲルの電気泳動を用いた修飾ｍＲＮＡの完全性およびサイズの測定を示す図である。ｃｍＲＮＡおよびRiboRuler RNA ladder High Rangeをローディングダイを含むRiboRulerホルムアミドと混ぜ、７０℃で１０分間培養した。その後、試料を氷上で冷却し、アガロースゲルに適用した。臭化エチジウム染色とIntas Gel Imaging System上での視覚化とによって検出を行った。
【図２】（Ａ）は、ｃｍＲＮＡ用量２０ｐｇ／ｃｅｌｌで、Lipofectamine2000（ＬＦ）、Dogtor、DF-Gold、またはbPEIをエンハンサーとして用いて形成したMetLuc・ｃｍＲＮＡ複合体によってトランスフェクトされたＡＭＳＣにおけるMetridiaルシフェラーゼの発現の動態を示す図であり、（Ｂ）は、トランスフェクトから５時間後および２４時間後の細胞生存率を示す図である。非トランスフェクト対照（細胞生存率１００％）とトランスフェクト細胞の間の有意差を（＊）で示す。（Ｃ）は、ともにMetLucをコードするｐＤＮＡまたはｃｍＲＮＡが、DF-Goldリポプレックスでトランスフェクトされた後のＡＭＳＣにおけるレポーターの発現のタイムプロファイルを比較した図である。「ｐＤＮＡ」と「ｃｍＲＮＡ」曲線下面積、ＡＵＣｐＤＮＡとＡＵＣｃｍＲＮＡは、０時間と１２０時間の時点の間のデータを積分することによって算出した。ｐＤＮＡとｃｍＲＮＡデータの間の有意差を（＊）で示す。
【図３】DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスおよびDF-Gold／SO-Mag6-115／ｃｍＲＮＡ磁気トリプレックスでトランスフェクト後のＡＭＳＣおよびＢＭＳＣにおけるTomato、ｅＧＦＰ、およびMetLucレポーターの発現を示す図である。適用したｃｍＲＮＡ用量は２０ｐｇ／ｃｅｌｌである。（Ａ）tomato N1・ｃｍＲＮＡ複合体、または（Ｂ）ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡ複合体でトランスフェクト後２４時間に撮影した蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２５０μｍを表す。（Ｃ）は、ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡの複合体でトランスフェクトした２４時間後にｅＧＦＰを発現した細胞の割合を表したファックス分析の結果である。非トランスフェクト細胞とリポフェクト（＊）またはマグネトフェクト（＊＊）を行った細胞との間の有意差、およびリポフェクションとマグネトフェクションとの間（‡）の有意差を図に示した。（Ｄ）は、MetLuc・ｃｍＲＮＡの複合体でトランスフェクトした両細胞型のMetridiaルシフェラーゼの発現の時間経過を示す図である。ＡＭＳＣとＢＭＳＣにおけるマグネトフェクションとリポフェクションの間の有意差を（＊）および（＊＊）でそれぞれ表した。ＭＡＩを算出するために、ＢＭＳＣとＡＭＳＣの両方について、「マグネトフェクション」曲線下面積、ＡＵＣＭＦを「リポフェクション」曲線下面積、ＡＵＣＬＦに正規化した。
【図４】DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスまたはDF-Gold／SO-Mag6-115／ｃｍＲＮＡ磁気トリプレックスでトランスフェクト後、様々な時点でＡＭＳＣにおいて生成されたｈＢＭＰ‐２を示す図である。生成されたｈＢＭＰ‐２は、適用したｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ用量（２０ｐｇ／ｃｅｌｌ）に正規化した。（Ａ）は、上清において計測された分泌ｈＢＭＰ‐２の含有量でのトランスフェクション時に用いられた培地（骨形成培地ｖｓOpti-MEM）の影響を示す図であり、（＊）は比較群間における有意差を示す。（Ｂ）は、トランスフェクト後、１、２、３日目の上清（分泌ｈＢＭＰ‐２）および細胞可溶化物（細胞内ｈＢＭＰ‐２）で計測した、内生ｈＢＭＰ‐２（ｃｍＲＮＡ（−））およびトランスフェクトが行われた細胞（ｃｍＲＮＡ（＋））によって生成されたｈＢＭＰ‐２の含有量である。（＊）は、非処理細胞とトランスフェクト細胞の間の分泌ｈＢＭＰ‐２における有意差を示す。（＊＊）は、所与の観測時間におけるトランスフェクト細胞についての分泌ｈＢＭＰ‐２と内生ｈＢＭＰ‐２の間の有意差を示す。（♯）は、リポフェクションとマグネトフェクションの間の分泌ｈＢＭＰ‐２における有意差を示す。（Ｃ）は、トランスフェクト細胞内のｈＢＭＰ‐２の合計含有量（分泌ｈＢＭＰ‐２＋細胞内ｈＢＭＰ‐２）の時間経過を示す。ＭＡＩ＝６．０を算出するために、内生ｈＢＭＰ‐２のレベルを示す「非処理細胞」曲線下面積ＡＵＣｒｅｆを減算後、「マグネトフェクション」曲線下面積ＡＵＣＭＦを「リポフェクション」曲線下面積ＡＵＣＬＦに正規化した。
【図５】DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスでトランスフェクトした細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す図である。（Ａ）は、トランスフェクト後１２日目のＡＬＰ染色である。（Ｂ）は、トランスフェクト後３、７、１２日目のＡＬＰ活性を示す図である。（＊）は非トランスフェクト細胞とトランスフェクト細胞の間の有意差を示し、（＊＊）はトランスフェクト後３日目と１２日目の間の有意差を示す。適用ｃｍＲＮＡ用量２０ｐｇ／ｃｅｌｌにおけるｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの複合体を用いてＡＭＳＣにリポフェクションとマグネトフェクションを施した後の骨関連遺伝子の発現増加が確認された。トランスフェクト後、３、７、１４、および２１日目における（Ｃ）RunX2、（Ｄ）Osx、（Ｅ）ALP、（Ｆ）Coll I、（Ｇ）OPN、（Ｈ）OCNの発現の倍率増加が確認された。グレーのバーはDF-Fold／ｃｍＲＮＡ複合体によるリポフェクションを示し、斜線のバーはSO-Mag6-115／DF-Gold／ｃｍＲＮＡトリプレックスによるマグネトフェクションを示す。（＊）は、同じ観測時間におけるリポフェクション群とマグネトフェクション群の間の有意差を示す。（＊＊）は、リポフェクション群とマグネトフェクション群（‡）について、トランスフェクト後の時間経過が異なるものを比較した場合の有意差を示す。
【図６】リポフェクションおよびマグネトフェクション後のＡＭＳＣの無機化を示す図である。トランスフェクト後２１日目にアリザリン・レッド染色を行った。（Ａ）は非トランスフェクト細胞、（Ｂ）はマグネトフェクション後の細胞、（Ｃ）はリポフェクション後の細胞である。（Ｄ）はトランスフェクト後、１４日目および２１日目のアリザリン・レッド染色を定量化した図である。非トランスフェクト細胞とトランスフェクト細胞の間の有意差を（＊）で示し、異なるトランスフェクトが施された細胞間の比較を（‡）で示す。
【図７】エンハンサー対ｃｍＲＮＡの容積／重量比を４とし、１ディスク当たりのｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡまたはtomato N1・ｃｍＲＮＡ用量を５μｇとして得た、DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスでトランスフェクトした３ｍｍの脂肪ディスク体を示す図である。（Ａ）は、tomato N1・ｃｍＲＮＡ複合体でトランスフェクト後２４時間に撮影した脂肪ディスク体の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５００μｍを表す。DF-Gold／ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ複合体で脂肪ディスク体にリポフェクションを行った後の骨関連遺伝子の発現の誘導である。（Ｂ）ｈＢＭＰ‐２、（Ｃ）ＲｕｎＸ２、（Ｄ）ＡＬＰ、および（Ｅ）Ｃｏｌｌ  Ｉの発現における倍率増加を示す。全てのＲＮＡが抽出され、トランスフェクト後３日目と７日目にＲＴ−ＰＣＲを行った。発現は、非トランスフェクト対照と比べた誘導倍率として報告する。全ての値をβ‐チュービュリンに正規化した。（＊）は、ＡＬＰとＣｏｌｌ  Ｉの発現についてのトランスフェクト後３日目と７日目の間の有意差を示す。
【図８】DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスまたはDF-Gold／SO-Mag6-115／ｃｍＲＮＡ磁気トリプレックスでトランスフェクト後のさまざまな時点においてＡＭＳＣに生成されたｈＢＭＰ‐７を示す図である。生成されたｈＢＭＰ‐７は、適用したｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ用量（２０ｐｇ／ｃｅｌｌおよび３２ｐｇ／ｃｅｌｌ）に正規化した。
【図９】DF-Gold/ｈＢＭＰ−７・ｃｍＲＮＡリポプレックスでリポフェクションを行った後のＡＭＳＣの無機化、およびSO-Mag6-115／DF-Gold／ｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡトリプレックスでマグネトフェクションを行った後のＡＭＳＣの無機化を示す図である。用いたｃｍＲＮＡの用量は２０ｐｇ／ｃｅｌｌおよび３２ｐｇ／ｃｅｌｌである。トランスフェクト後２１日目にアリザリン・レッド染色を行った。（Ａ）は非トランスフェクト細胞、（Ｂ）〜（Ｃ）はリポフェクション後の細胞、（Ｃ）〜（Ｄ）はマグネトフェクション後の細胞である。
【図１０】DF-Gold／MetLuc・ｍＲＮＡリポプレックスでＡＭＳＣをトランスフェクトした後のさまざまな時点におけるMetLucの発現を示す図である。試験を行ったDF-Gold対ｍＲＮＡの容積／重量比は、適用したｍＲＮＡ用量２．５、５、１０、２０ｐｇ／ｃｅｌｌで、ｍＲＮＡ１μｇにつき、DF-Goldが０．５〜５μｌである。
【図１１】DF-Gold／MetLuc・ｍＲＮＡリポプレックスでＢＭＳＣをトランスフェクトした後のさまざまな時点におけるMetLucの発現を示す図である。試験を行ったDF-Gold対ｍＲＮＡの容積／重量比は、適用したｍＲＮＡ用量２．５、５、１０、２０ｐｇ／ｃｅｌｌで、ｍＲＮＡ１μｇにつき、DF-Goldが０．５〜５μｌの範囲である。
【図１２】DF-Gold対mRNAの容積／重量比４でDF-Gold／ｅＧＦＰ・ｍＲＮＡリポプレックスを用いたトランスフェクト後（リポフェクション）２４時間、およびＦｅ対ｍＲＮＡの重量／重量比０．５でDF-Gold／SO-Mag6-115／ｅＧＦＰ・ｍＲＮＡ磁気トリプレックスを用いたトランスフェクト後（マグネトフェクション）２４時間の、（Ａ）ＡＭＳＣおよび（Ｂ）ＢＭＳＣについてのフローサイトメトリーのヒストグラムである。
【図１３】骨移植片材料に移植されたＢＭＰ‐２・ＲＮＡである（骨全体のμ‐ＣＴ結果）。処置から２週間後にすべての群についてμＣＴによる３Ｄ再現の縦断面を得た。（Ａ）はフィブリン、（Ｂ）はC12-(2-3-2)／ＦＦＬ・ｃｍＲＮＡ、（Ｃ）C12-(2-3-2)／ｈＢＭＰ−２・ｃｍＲＮＡである。すべての試料についてImageJソフトウェアで同じ閾値（２５００〜４５００）を設定することにより、仮骨形成領域をハイライトした。（Ｄ）ImageJによって定量化した仮骨形成量である。
【図１４】コラーゲンスポンジへの複合体の配合および細胞播種を示す図である。（Ａ）Luc・SNIM・RNAリポプレックス（リポプレックスの平均流体力学的径：６５．８ｎｍ）を配合した場合と配合していない場合の真空乾燥させたコラーゲンスポンジの走査型電子顕微鏡写真である。（Ｂ）tdTomato・ｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジ上に播種後３０時間のＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡写真であり、tdTomato・ｍＲＮＡの１０％がＦＩＴＣでラベルされた。（Ｃ）コラーゲンスポンジ上に播種後７日のＮＩＨ３Ｔ３細胞のヘマトキシリン染色である。細胞核はヘマトキシリンで濃青色に染色された。スケールバーは１００μｍを示す。上側の図の左端がコラーゲンスポンジの表面を示す。
【図１５】ｅＧＦＰ・ｍＲＮＡ複合体を配合したコラーゲンスポンジ上にＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種後４８時間のトランスフェクション効率と細胞生存率を示す図である。（Ａ）４倍に拡大した蛍光顕微鏡写真（JULYTM）であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｅＧＦＰ・ｍＲＮＡの発現が見られる。（Ｂ）ファックス分析を示す図であり、１００ｐｇ／ｃｅｌｌのｅＧＦＰ・ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞では、非トランスフェクト細胞と比べて、平均蛍光強度の明らかなシフトが確認できた。（Ｃ）ファックス分析を示す図であり、ｍＲＮＡ用量はトランスフェクション効率と相関関係にある。（Ｄ）および（Ｅ）は、それぞれＰＩ染色とＷＳＴアッセイのファックス分析を示す図であり、細胞生存率はおよそ６０〜７０％を示している。示したデータはすべて３連の値からの平均±標準偏差である。
【図１６】ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた２Ｄ培養対３Ｄ培養におけるMetridiaルシフェラーゼ・ｍＲＮＡの発現の動態を示す図である。トランスフェクト後２４時間おきに上清を回収し、直後にMet Lucの発現を計測した。示したデータはすべて３連の値からの平均±標準偏差である。Ｙ軸は対数目盛である。
【図１７】さまざまな細胞密度のＭＳＣを用いた場合の、コラーゲンスポンジでのMetridiaルシフェラーゼの発現の動態を示す図である。この実験で用いたｍＲＮＡリポプレックスの量は５０ｐｇ／ｃｅｌｌである。トランスフェクト後２４時間おきに上清を回収し、−２０℃で保管した。８日後、すべての時点においてMetridiaルシフェラーゼの発現が計測された。示したデータは３連の値からの平均±標準偏差である。Ｙ軸は対数目盛である。
【図１８】インビボでの骨再生について免疫組織化学分析を行った図である。（Ａ）無機化された骨組織の染色を行った写真である。赤色の長方形により、大腿骨の欠損部位におけるスポンジの配置箇所を示す。黒色の領域が高度に無機化された領域である。（Ｂ）骨膜領域における仮骨形成である。（Ｃ）線維組織形成の割合である。（Ｄ）類骨形成の割合である。ｔ検定（ｎ＝９）を用いて値を比較した。
【図１９】ｈＢＭＰ２・ｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジ上に播種されたＭＳＣによるｈＢＭＰ２の発現を示す図である。３つの異なる用量を試験した。示したデータは３連の値からの平均±標準偏差である。
【図２０】インビトロでの骨分化を示す図である。ＲＴ‐ｑＰＣＲの結果であり、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジ上に細胞を播種後７日目と１４日目における骨芽細胞マーカーの発現を倍率増加で表した図である。値は３連の平均±標準偏差である。（Ａ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞：値はＧＡＰＤＨの発現に正規化した。データは３Ｄにおける非トランスフェクト細胞に対する倍率増加として表した。（Ｂ）ＭＳＣ：値はβ‐チュービュリンの発現に正規化した。データは、２Ｄにおける非トランスフェクト細胞に対する倍率増加として表し、多重ｔ検定を用いて比較した。
【図２１】インビボでの骨再生を示す図である。（Ａ）移植後２週間のラットの大腿骨のμ‐ＣＴ画像である。赤色部分は新たに形成された骨を表す。（Ｂ）移植後２週間の骨形成領域を評価するμ‐ＣＴ分析である。値はｔ検定（ｎ＝９）を用いて比較した。
【図２２】真空乾燥されたｍＲＮＡリポプレックスのコラーゲンスポンジ上での安定性を示す図である。MetLuc・ｍＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジを２時間真空乾燥し、次いで真空封止を行い室温で保管した。真空乾燥後さまざまな時点において、プレートを開け、スポンジ上にＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種した。細胞播種後２４時間でMetLucの発現を計測した。示したデータはすべて３連の値からの平均±標準偏差である。Ｙ軸は対数目盛である。
【図２３】真空乾燥前後のコラーゲンスポンジのＳＥＭ画像である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図２４】コラーゲンスポンジ上のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＳＮＩＭ MetLuc・ｍＲＮＡまたは非修飾MetLuc・ｍＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした後のMetLucの発現の動態を示す図である。トランスフェクト後２４時間おきに上清を回収し、−２０℃で保管した。１０日後、すべての時点においてMetridiaルシフェラーゼの発現が計測された。示したデータは３連の平均±標準偏差である。Ｙ軸は対数目盛である。
【図２５】コラーゲンスポンジ上のＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるMetLucの発現の動態に基づいてスポンジの真空乾燥の効果を示す図である。トランスフェクト後２４時間おきに上清を回収し、−２０℃で保管した。５日後、すべての時点においてMetridiaルシフェラーゼの発現が計測された。示したデータは３連の平均±標準偏差である。Ｙ軸は対数目盛である。
【図２６】ファックス分析であり、ラットの脂肪組織から分離後のＭＳＣの陽性マーカー（ＣＤ９０およびＣＤ２９）と陰性マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ１０６、およびＣＤ３１）を研究した図である。ＩｇＭ、Ｋ‐ＦＩＴＣ、ｌｇＧ１、Ｋ‐ＦＩＴＣ、およびｌｇＧ１、Ｋ‐ＰＥは対照として用いた。
【図２７】分化時のスポンジ形態の巨視的変化を示す図である。写真は、スポンジ上にＭＳＣを播種後７日目に９６ウェルプレートから撮影したものである。
【図２８】骨のさまざまな箇所におけるｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡリポプレックスを配合したコラーゲンスポンジのインビボでの骨形成効果を示す図である。ｔ検定を用いて値を比較した。
【図２９】μ‐ＣＴ写真であり、術後２週間における、インビボでの骨再生に用いたｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジの効果を確認できる。黄色い部分が新たに形成された骨である。
【図３０】（Ａ）ラットの大腿骨の骨髄において、ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを配合した移植片では組織の無機化が有意に増加している。（Ｂ）ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジを移植した結果として、骨膜組織の形成が有意に増加している。（Ｃ）ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジで処置した場合、全容積に対する線維組織（fb.V/TV）が有意に増加している。（Ｄ）ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジで処置した場合、全容積に対する類骨（OV/TV）の形成が増加している。（Ｅ）ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジを移植した結果、骨の再吸収はより少なかった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は特に後述の実施例に記載された実験に基づく。
【００２５】
これらの実施例から、ＢＭＰ・ＲＮＡ（例えばｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡまたはｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ）でトランスフェクトされた細胞（例えばＢＭＳＣやＡＭＳＣのようなＭＳＣ）を用いると、生物学的に活性なＢＭＰ（例えばＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７）の分泌レベルが、特に長期間的に（例えば７日超）、上昇することが特に分かる。これらの分泌タンパク質のレベルは、（インビトロ実験において）骨形成分化の誘導に有効であった。これは、特にトランスフェクト細胞において現れたアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase：ＡＬＰ）レベルの上昇を測定することによる骨形成マーカーの発現、およびＲｕｎＸ２、ＡＬＰ、オステリックス（Osterix）、オステオカルシン（Osteocalcin）、オステオポンチン（Osteopontin）、およびＩ型コラーゲン（Collagen Type I）（定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって検出）の発現が増強することによって明らかとなった。これはさらに無機化（堆積した無機化マトリックス）によって（インビトロで）確認された。無機化は、トランスフェクト後（ｃｍＲＮＡを含むＭＳＣ）２週間で得られたアリザリン・レッド染色陽性によって確認された。ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡおよびｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡのようなＢＭＰ・ＲＮＡの骨形成における潜在能力もＢＭＰ・ＲＮＡでトランスフェクトされたヒト脂肪／脂肪質組織に対して（エキソビボ）で実証された。ｈＢＭＰ‐２、ＲｕｎＸ２、ＡＬＰ、およびＩ型コラーゲンの発現によって示されるように、ヒト脂肪／脂肪質組織は（インビトロでの）骨形成反応も生じた。
【００２６】
トランスフェクション条件を最適化して、細胞毒性を最小化しつつも、より高いトランスフェクション効率を得られることも本発明の文脈において実証された。この文脈において、ｃｍＲＮＡを用いたＭＳＣのトランスフェクションは、当初、数種類のトランスフェクション試薬とさまざまなリポーターｃｍＲＮＡ（蛍光タンパク質）を用いて研究された。高トランスフェクション効率が達成され、結果的に持続性タンパク質発現（最長５日）が得られた。発現ピークは、通常、トランスフェクションから２４〜４８時間後に見られた。
【００２７】
さらに、細胞毒性スクリーニングを行って、ＭＳＣのトランスフェクトに用いた複合体の生体適合性を試験した。発現と細胞生存率の結果から、最も良好なトランスフェクション・プロトコルを選択し、ＢＭＰ・ＲＮＡ（例えばｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡまたはｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ）を用いて細胞（ＭＳＣ）をさらにトランスフェクトした。特に、レポーター系としてMetridiaルシフェラーゼを用いることにより、DreamFect Gold（DF-Gold）が、（ｃｍ）ＲＮＡを細胞内へ送達させるのに非常に適した非ウイルス性の脂質エンハンサーであることが確認された。DF-Gold／（ｃｍ）ＲＮＡの複合体は、（ｃｍ）ＲＮＡのトランスフェクションに対しては非常に効率的でありつつも、細胞に対して非常に穏やかに作用する。
【００２８】
トランスフェクションを行う目的で、本発明の文脈および後述の実施例では、リポフェクションおよびマグネトフェクション処置を用いた。それにより、さまざまな（ｃｍ）ＲＮＡを用いて、特に２つの異なる主要な細胞型であるＡＭＳＣとＢＭＳＣにおいて、トランスフェクション効率の強固な増強が得られた。特に、リポフェクションとマグネトフェクションによる細胞（例えばＢＭＳＣやＡＭＳＣのようなＭＳＣ）内へのＢＭＰ・ＲＮＡ（例えばｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡまたはｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ）の導入は、インビトロでの骨形成をサポートしたことが確認された。
【００２９】
最高トランスフェクション効率はマグネトフェクションによって得られ、特にマグネトフェクションをＭＳＣ（例えばＢＭＳＣまたはＡＭＳＣ）に適用した場合に得られた。
【００３０】
ＢＭＳＣにトランスフェクトを行うのは特に難しいとされている。（Lakshmipathy, Stem cells 22(4), 2004, 531-543)。しかしながら、ＢＭＳＣであっても、ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡの磁気リポプレックスを用いたマグネトフェクションを介した効率的なトランスフェクションを達成でき、２４時間後に陽性細胞８０％という結果が得られることが本発明の文脈において確認された。同様に、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡを用いた場合、ＡＭＳＣでは、マグネトフェクション優位指数（Magnetofection Advantage Index：ＭＡＩ）における６倍増が定量化された。特に、ｈＢＭＰ‐２でトランスフェクトされたＡＭＳＣは、７日間にわたり、非トランスフェクト細胞と比べて非常に大量のｈＢＭＰ‐２を分泌することができた。この場合、タンパク質発現における平衡状態が２４〜７２時間の間に認められた。本発明によれば、この効果は、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ（または別のＢＭＰ・ＲＮＡ）の治療効果においても利益となりうる。実際、トランスフェクト細胞によるｈＢＭＰ‐２（または別のＢＭＰ）の定常的生成の結果、骨形成遺伝子の発現および無機化も増強された。
【００３１】
さらに、マグネトフェクションを介してトランスフェクトされたＡＭＳＣは、転写因子ＲｕｎＸ２、オステオポンチン、アルカリホスファターゼの発現を高めるとともに無機物の堆積も高めることが確認された。理論に縛られることなく、ＲｕｎＸ２の発現は、骨形成分化の進行の制御における転写因子ＲｕｎＸ２の役割を反映している。マグネトフェクションを介してｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＳＣは、ＲｕｎＸ２を最も多く持続的に発現し、インビトロにおけるそれら試料で認められる、より顕著な骨形成とうまく相関する。
【００３２】
原則的には、ＢＭＰ‐２について上述した内容は、ＢＭＰ‐７についても本発明の文脈において同様に示された。特に、ｈＢＭＰ‐７でトランスフェクトされたＡＭＳＣは、３日間にわたり、非トランスフェクト細胞と比べてかなり大量のｈＢＭＰ‐７を分泌することができた。この場合、タンパク質発現の最大値はトランスフェクション後２４時間に見られた。２つの異なるｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡ用量、すなわち２０ｐｇ／ｃｅｌｌと３２ｐｇ／ｃｅｌｌについて試験を行った。２０ｐｇ／ｃｅｌｌでトランスフェクトされた細胞は、用量３２ｐｇ／ｃｅｌｌの場合と比べてｈＢＭＰ‐７の分泌量が有意に多かった。トランスフェクトされたＡＭＳＣは無機化されたマトリクスを堆積することができ、これは、インビトロでのそれらの試料における骨形成の増強を示す。
【００３３】
上述したように、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ（または別のＢＭＰ・ＲＮＡ）でトランスフェクトされた脂肪組織の生検で発現したｈＢＭＰ‐２のレベル（または別のＢＭＰのレベル）は増強することが本発明の文脈において実証されており、それにより最長７日間インビトロで培養された場合のいくつかの骨形成のマーカーの発現が上方制御された。これらの結果に基づき、ｈＢＭＰ‐２でトランスフェクトされた脂肪移植片（または他のＢＭＰでトランスフェクトされた脂肪移植片）は、効率のよいｈＢＭＰ‐２（または別のＢＭＰ）源および自家組織修復用の前駆細胞として作用すると結論付けることができる。したがって、本発明の文脈で得られたこのインビトロでの結果は、ＢＭＰ・ＲＮＡ、特にｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮおよびｈＢＭＰ‐７・ｃｍＲＮＡは、骨再生のための自家組織移植技術の利用における一歩前進を示すものである。これによりウイルスベクターおよびそれに関連する欠点（安全性の問題など上記参照）を回避できる。
【００３４】
後述の実施例および本明細書の開示では、臨床的に関連する動物モデルを用いた骨形成の研究への堅実な基礎が記載される。したがって、当業者であれば容易にそのような研究を行うことができる。
【００３５】
非限定的な例として、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡを骨の移植片材料に移植し、ラットの大腿骨の非致命的なサイズの骨欠損にインビボで投与した。得られたマイクロ・コンピュータ・トモグラフィ（Micro Computer Tomography：μＣＴ）の結果は、骨治癒におけるｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの治療効果を支持するものである。ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡで治療されたそれら動物においては、インビボでの骨形成の刺激が認められた。これに対して、不特定のｃｍＲＮＡ（例えばホタル由来のルシフェラーゼ（firefly luciferase：ＦＦＬ）をコードするｃｍＲＮＡ）で治療された動物では骨形成は確認されなかった。これにより、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡは骨欠損部位におけるインビボでのｈＢＭＰ‐２の治療的発現を仲介し、骨形成を生じることが実証される。
【００３６】
キャリア／キャリア体（例えばコラーゲンスポンジまたはフィブリン塊）にＲＮＡ、特にＢＭＰをコードするＲＮＡを配合した場合、およびトランスフェクトされるべき細胞がそこに播種された場合も、該キャリア／キャリア体は効率的なトランスフェクション系の一部となりうることが本発明の文脈においてさらに実証された。そのため、キャリア／キャリア体は骨再生において３Ｄマトリクスとして機能することができる。加えて、キャリア／キャリア体（例えばコラーゲンスポンジまたはフィブリン塊）は、細胞を播種する３Ｄ足場としてだけでなく、ＲＮＡ（特にＢＭＰをコードするＲＮＡ、例えばｃｍＲＮＡ、または非化学修飾ＢＭＰをコードするＲＮＡ）を持続的に送達するためのデポーとしても使用可能であることが本発明の文脈において証明された。
【００３７】
特に、後述の実施例でも実証されるように、まず、リポプレックスを含む（ｍ）ＲＮＡをコラーゲンスポンジに予備配合し、真空乾燥させた。次いで、その乾燥および配合が行われたスポンジを細胞を播種するための３Ｄマトリクスとして用いた。したがって、本発明は、細胞播種と（ｍ）ＲＮＡのトランスフェクション工程を単一工程として組み合わせ簡素化した送達系にも関する。加えて、（ｍ）ＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジは遅延送達性を示した。そのため、このコラーゲンスポンジにより、古典的な２ＤのｍＲＮＡトランスフェクションに伴う急速かつ一時的なタンパク質生成という問題を克服することができる。臨床応用での例として、ｈＢＭＰ２・（ｍ）ＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジを用いてインビトロとインビボでの骨再生を調査した。さらに、真空乾燥され（ｍ）ＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジの、すぐ使用できるバイオ製品としての可能性を調査するために、その貯蔵寿命を成功裏に終わった長期間安定性試験において評価した。したがって、本発明は、持続性のある（ｍ）ＲＮＡ送達デポーをさらに提供するものである。これにより、臨床的手法において遺伝子治療用の便利かつ安全な代替手段への新たな道が開かれた。
【００３８】
驚くべきことに、非修飾（ｍ）ＲＮＡですらも、特に本明細書に開示される持続性送達系／デポーの一部であり、かつ該系／デポーによって投与される場合、遺伝子治療目的に使用できることが本発明の文脈において実証された。
【００３９】
本発明の別の利点は、細胞のトランスフェクション効率が高い（１００％に近い）ことと細胞の毒性が低いことである。上述したように、安定性の問題を考慮し、特にコラーゲンスポンジに配合された場合の真空乾燥したＲＮＡは、長期間（例えば室温で最短で６カ月）の安定性を保った。さらに、本発明の文脈では、ｈＢＭＰ２・ＲＮＡを用いた、（ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞およびＭＳＣによる）インビトロと（ラットの大腿骨欠損での）インビボでの骨再生により、前臨床応用における上記系の能力が確認された。
【００４０】
結論的には、本発明は、特に、長期間にわたってタンパク質を発現させるための安定的かつ効率的なＲＮＡ送達系としてＲＮＡを配合した（真空乾燥した）キャリア（コラーゲンスポンジ）を提供し、それにより転写治療を臨床手法へと一歩近づけるものである。特に、すぐ使用できるバイオ製品としての、ＲＮＡが配合され真空乾燥されたコラーゲンスポンジの安全性、効率性、および安定性が本発明により明らかとなった。ウイルスも遺伝子も用いない技術によりＲＮＡ持続性送達系が実現され、この系はＲＮＡ修飾にも細胞型にも細胞密度にも依存しない。この技術を用いてインビトロおよびインビボで骨分化を調査したことで、長期間にわたるタンパク質の送達が治療の目的である場合、ＲＮＡ配合した真空乾燥コラーゲンスポンジの臨床利用における能力が確認された。この研究により、メッセンジャーＲＮＡの容易かつ有望な利用への新たな道が開かれた。これは安全性の面においてＤＮＡに基づく遺伝子治療に勝るものである。
【００４１】
本発明はさらに以下の項目に関する。
１．骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする配列を有するポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む医薬組成物であって、患者の
（ｉ）骨疾患、骨障害、または骨損傷の治療または予防、および／または
（ｉｉ）骨形成における分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨の形態形成の誘導または増強に用いられる医薬組成物。
２．上記ＢＭＰがＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７である、項目１に記載の医薬組成物。
３．上記ＲＮＡがカプセル化されている、項目１または２に記載の医薬組成物。
４．上記ＲＮＡがリポフェクションによってトランスフェクトされる、項目１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５．上記ＲＮＡがマグネトフェクションによってトランスフェクトされる、項目１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６．磁気ナノ粒子（magnetic nanoparticle：ＭＮＰ）をさらに含む、項目５に記載の医薬組成物。
７．リポソームトランスフェクション試薬（liposomal transfection reagent：ＬＴＲ）をさらに含む項目４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成。
８．上記ＲＮＡに対する上記ＬＴＲの重量／重量比が、上記ＲＮＡ１μｇにつき、上記ＬＴＲが２〜２０μｇである、項目７に記載の医薬組成物。
９．上記ＭＮＰ：上記ＬＴＲ：上記ＲＮＡの比が、約０．５（鉄重量）：約２〜５または４〜７（重量）：約１（重量）である、項目７または８に記載の医薬組成物。
１０．上記ＲＮＡがインビボで送達される、項目１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１１．上記ＲＮＡが上記患者の骨または骨組織内に直接投与される、項目１０に記載の医薬組成物。
１２．上記ＲＮＡが、上記患者に導入される細胞にエキソビボで送達される、項目１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１３．上記ＲＮＡが上記患者の細胞にエキソビボで送達され、かつ、上記ＲＮＡが送達された上記細胞が、上記患者に再導入される、項目１２に記載の医薬組成物。
１４．上記細胞が骨芽前駆細胞である、項目１２または１３に記載の医薬組成物。
１５．上記細胞が間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell：ＭＳＣ）である、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１６．上記ＭＳＣが、脂肪質由来の間葉系幹細胞（adipose-derived mesenchymal stem cell：ＡＭＳＣ）、または骨髄由来のＭＳＣ（bone marrow-derived MSC：ＢＭＳＣ）である、項目１５に記載の医薬組成物。
１７．ＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７をコードする配列を有するＲＮＡであって、このＲＮＡのシチジンの２５％は５‐メチルシチジン（ｍ５Ｃ）であり、このＲＮＡのウリジンの２５％は２‐チオウリジン（ｓ２Ｕ）である、ＲＮＡ。
１８．上記ＲＮＡが項目１７のＲＮＡである、項目１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００４２】
原則的には、本発明の医薬組成物は、骨に関連する、骨に関係がある、骨と生理的に連結している、または骨に影響を与える任意の疾患、障害、欠損、または損傷（本明細書では単に骨疾患とも称される）の治療または予防に用いられる。この文脈では、本発明にかかるＲＮＡは治療または予防に用いられるうるため、ＲＮＡが導入される細胞または組織において、天然では所望する程度まで発現しないか、まったく発現しないＢＭＰを形成することができる。ＲＮＡは、（ｉ）遺伝子欠陥や疾患のせいでＢＭＰが形成されない場合と（ｉｉ）ＢＭＰの導入が身体にとって有益な場合の両方において使用されうる。このＲＮＡは、適切な程度まで発現しないＢＭＰを補うためにも用いることができる。
【００４３】
特に、本発明にしたがって治療または予防される骨疾患は、例えばＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、および／またはＢＭＰ‐１５、好ましくはＢＭＰ‐７、より好ましくはＢＭＰ‐２、のような１種類以上のＢＭＰの（機能）に関連する、関係がある、または生理的に連結している。より具体的には、本発明にしたがって治療される骨疾患は、１種類以上のＢＭＰの（機能）の送達、誘導、および／または増加によって（その症状が）治療、予防、または改善できる骨疾患である。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、特には患者における、より具体的には本発明の文脈での骨疾患の治療または予防の文脈における、骨形成分化（例えば骨形成細胞へのＭＳＣの分化）、骨生成、骨化作用、骨再生、骨形態形成、骨形成、骨成長、無機化、および／または石灰化の誘導または増強にも用いられる。
【００４５】
本分野では、多くの種類の骨疾患が知られており、それらは例えば参考文献１６の特に表１に記載されている。本発明の文脈において治療または予防される骨疾患の例としては、骨形成不全（単一遺伝子性、ドミナント・ネガティブ性、遺伝子性）、（変性）骨粗鬆症、（骨粗鬆症による）骨折、癒着不能、骨欠損、分節性欠損、骨嚢腫、脊椎固定、虚血壊死、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫）、骨溶解（例えば、がん誘導の骨溶解、無菌性弛緩）が挙げられる。
【００４６】
本発明にしたがってＢＭＰ・ＲＮＡが用いられうる特定の分野の一つとして、骨関連の再生医療分野がある。疾患経過または加齢の文脈では、特に、疾患または老化作用のせいでＢＭＰの生成が減少し過ぎたり、もしくはまったく作られなくなった場合、ＢＭＰの導入によって治療、緩和、予防、または治癒すら可能な変性骨疾患が発生する。ＢＭＰをコードする関連ＢＭＰ・ＲＮＡの導入により、変性作用は停止、あるいは再生し始めることすらある。しかがって、一態様では、本発明にしたがって治療または予防される骨疾患は変性骨疾患である。変性骨疾患の例としては、変性骨粗鬆症、ページェット病、脊椎症（進行性変性関節炎としても知られる）、骨軟化症、くる病などが特に挙げられる。
【００４７】
一態様では、本発明の医薬組成物は骨治癒に用いられる。例えば、（骨粗鬆症による）骨折、癒着不能、分節性欠損、骨嚢腫、脊椎固定、虚血壊死などが本文脈では治癒される。
【００４８】
具体的には、癒着不能、分節性欠損、および骨折、より具体的には骨粗鬆症による骨折を本発明にしたがって治療、予防、および／または治癒することが想定される。
【００４９】
本発明にしたがって用いられるＲＮＡは、骨疾患の進行にも影響を及ぼしうる。例としては、直接的に遺伝子欠損に起因するわけではないが、ＢＭＰ・ＲＮＡ発現から良い影響を受ける疾患経過を伴う骨疾患が挙げられる。例として、「組織工学」のための因子としての骨治癒用のＢＭＰが挙げられる。
【００５０】
本発明にしたがってＲＮＡによってコードされるＢＭＰは、ＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、および／またはＢＭＰ‐１５、好ましくはＢＭＰ‐７、より好ましくはＢＭＰ‐２、であってもよい。本発明にしたがって用いられる好ましいＢＭＰはヒトＢＭＰ（ｈＢＭＰ）である。ＢＭＰは本分野では周知であり、例えば参考文献９、参考文献１０、参考文献１１に記載されている。（ｈ）ＢＭＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本分野では既知のデータベース（例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/で閲覧可能なＮＣＢＩ）を介して入手可能である。各データベースのエントリーの例は後述の表５に挙げられる。
【００５１】
ｈＢＭＰ−２の特定のヌクレオチド配列を配列番号１に記載する。ｈＢＭＰ‐７の特定のヌクレオチド配列を配列番号２に記載する。ｈＢＭＰ‐２の特定のアミノ酸配列を配列番号３に記載する。ｈＢＭＰ‐７の特定のアミノ酸配列を配列番号４に記載する。
【００５２】
「ＢＭＰ」（または「ＢＭＰ・ＲＮＡ」）という用語は、各ＢＭＰ（または各ＢＭＰ・ＲＮＡ）の機能的断片および変異型も包含することが本発明の文脈においては想定されている。
【００５３】
ＢＭＰ・ＲＮＡ自体とは別に、ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型も本発明にしたがって用いられうる。ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型は、構造的にはＢＭＰ・ＲＮＡ自体とは異なることもあるが、機能的にはＢＭＰ・ＲＮＡ自体と同じような活性を有する。特に、ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型は、ＢＭＰ自体として機能する、すなわち骨形成作用を呈することができるタンパク質をコードすることが意図されている。より具体的には、ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型は、骨形成を制御可能なタンパク質をコードすることが意図されている。この文脈では、骨形成は、（ｉ）骨格前駆細胞の関与、および／または（ｉｉ）生後発育における骨芽細胞の成熟という２つの異なるレベルにおいて制御されうる。そのため、ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型は、骨形成分化、骨形成、骨化作用、骨再生、および／または骨形態形成を誘導または増強することができるタンパク質をコードすることが意図されている。当業者であれば、所与のＢＭＰ・ＲＮＡの変異型がＢＭＰ・ＲＮＡ自体として機能するか、例えば骨形態形成作用を呈することができるタンパク質をコードするかを容易に判断することができる。この目的で、当業者は、従来技術（例えば参考文献１２で開示されるもの）や後述の実施例に記載される手段および方法を参照する場合もある。例えば、当業者は、所与のＢＭＰ・ＲＮＡの変異型が、インビトロ、エキソビボ、および／またはインビボで（例えば以下の実施例５または実施例７で測定したように）骨形成を誘導するかを判断しうる。
【００５４】
原則的には、ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型はＢＭＰ・ＲＮＡ自体に類似しているほど好ましい。
【００５５】
本発明にかかる特定のＢＭＰ・ＲＮＡまたはＢＭＰ・ＲＮＡの変異型は、以下の群から選択されるＲＮＡとしてもよい。
（ａ）ＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２（特に好ましい）、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７（好ましい）、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、またはＢＭＰ‐１５のアミノ酸配列をコードする、例えば配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードする、ＲＮＡ。
（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基を置換、挿入、および／または削除したＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２（特に好ましい）、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７（好ましい）、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、またはＢＭＰ‐１５のアミノ酸配列をコードする、例えば１つ以上のアミノ酸残基を置換、挿入、および／または削除した配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードする、ＲＮＡ（このＲＮＡは骨形態形成作用を呈することができるタンパク質をコードする）。
（ｃ）ＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２（特に好ましい）、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７（好ましい）、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、またはＢＭＰ‐１５のアミノ酸配列をコードする、例えば配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズする（ヌクレオチド配列によってコードされた）ＲＮＡ（このＲＮＡは骨形態形成作用を呈することができるタンパク質をコードする）。
（ｄ）ＢＭＰ‐１、ＢＭＰ‐２（特に好ましい）、ＢＭＰ‐３、ＢＭＰ‐４、ＢＭＰ‐５、ＢＭＰ‐６、ＢＭＰ‐７（好ましい）、ＢＭＰ‐８ａ、ＢＭＰ‐８ｂ、ＢＭＰ‐１０、またはＢＭＰ‐１５の（全長）アミノ酸配列、例えば配列番号３または配列番号４に記載される（全長）アミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするＲＮＡ（このＲＮＡは骨形態形成作用を呈することができるタンパク質をコードする）。
【００５６】
本発明の文脈では、「１つ以上のアミノ酸残基を置換、挿入、および／または削除した」は、具体的には、最大で５００、最大で４００、最大で３００、最大で２００、最大で１００、最大で５０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または１のアミノ酸残基を置換、挿入、および／または削除したことを意味する。ある１つの具体的態様では、この用語は、１つ以上のアミノ酸、好ましくは保存アミノ酸、が交換されることを意味し、例えば、最大で５００、最大で４００、最大で３００、最大で２００、最大で１００、最大で５０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または１の（保存）アミノ酸が交換されることを意味する。
【００５７】
本発明の文脈では、「ハイブリダイズする」は、ある核酸分子と別の（相補的）核酸分子との間でハイブリダイゼーションが起こり得ることを意味している。２つの核酸分子のハイブリダイゼーションは、通常、従来のハイブリダイゼーション条件下で行われる。本発明の文脈では、最も厳しいハイブリダイゼーション条件が好ましい。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning1: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されている。特定の実施形態では、「ハイブリダイズする」は、以下の（もっとも厳しい）ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションが行われることを意味する。
【００５８】
ハイブリダイゼーション・バッファ：
２×ＳＳＣ、好ましくは１×ＳＳＣ；１０×デンハート液（Fikoll＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ、比率１：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ；５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ；または０．２５Ｍのリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２；１ｍＭ  ＥＤＴＡ
７％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度Ｔ：６０℃、好ましくは６５℃
洗浄バッファ：２×ＳＳＣ、好ましくは１×ＳＳＣ、より好ましくは０、１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ
洗浄温度Ｔ：６０℃、好ましくは６５℃
【００５９】
上述したように、ＢＭＰの機能的断片をコードするＲＮＡも本発明にしたがって用いてもよい。この文脈における「機能的」とは、上記断片が、全長ＢＭＰ・ＲＮＡと同じように機能的に活性であることを意味する。特に、ＢＭＰの機能的に活性な断片は、骨形成作用をなおも呈することができるＢＭＰ断片である。ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型の機能的活性について上述した内容は、必要な変更を加えて、ＢＭＰの機能的断片にも適用される。
【００６０】
ＢＭＰの特定の（機能的）断片は、各ＢＭＰの少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、または少なくとも７００個の（連続）アミノ酸残基のアミノ酸長さであってもよい。
【００６１】
本明細書に記載されたＢＭＰ・ＲＮＡの変異型のいずれかによってコードされたタンパク質の機能的断片をコードするＢＭＰ・ＲＮＡも本発明の文脈において用いてもよい。またそのようなＢＭＰ・ＲＮＡは、各ＢＭＰとして機能することができる、すなわち骨形成作用を呈することができるタンパク質をコードすることを特に意図している。ＢＭＰ・ＲＮＡの変異型およびＢＭＰ断片の機能活性について上述した内容は、必要な変更を加えて、そのようなＢＭＰ・ＲＮＡにも適用される。
【００６２】
原則的には、本明細書で用いられる「ＢＭＰ・ＲＮＡ」という用語の意味は、（ｉ）ＢＭＰ自体および全長ＢＭＰをコードする本明細書に記載されるすべてのＲＮＡと、（ｉｉ）ＢＭＰ変異型をコードする本明細書に記載されるすべての変異型ＲＮＡと、（ｉｉｉ）ＢＭＰの機能的断片（の変異型）をコードする本明細書に記載されるすべてのＲＮＡとを包含する。
【００６３】
本発明にしたがって用いられるＢＭＰ・ＲＮＡ構成の例示的ヌクレオチド配列を、配列番号２９または３０（ともにｈＢＭＰ‐２・（ｃｍ）ＲＮＡ）と配列番号２９（ｈＢＭＰ‐７・（ｃｍ）ＲＮＡ）に記載する。
【００６４】
本発明の文脈では、ＲＮＡは、細胞に進入した際、タンパク質もしくはその機能的断片の発現に適している、またはタンパク質もしくはその機能的断片に翻訳可能である任意のポリリボヌクレオチド分子を意味すると理解されるべきである。「タンパク質」という用語は、本明細書では任意の種類のアミノ酸配列、すなわち２つ以上のアミノ酸残基の鎖であって、それぞれがペプチド結合を介して結合し、かつペプチドおよび融合タンパク質を含むもの、を包含する。
【００６５】
特に好ましい態様では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡ、例えば本発明の医薬組成物に含まれるＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。この態様によれば、これは本明細書で定義されるどのＲＮＡもｍＲＮＡの形態をとりうることを意味する。
【００６６】
用いられるＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（例えば分子間または分子内ハイブリダイゼーションに起因する）、または好ましくは一本鎖ＲＮＡであってもよい（しかしながら一本鎖ＲＮＡは分子内ハイブリダイゼーションに起因する二本鎖部分を少なくとも含むこともあり、例えばヘアピン構造が挙げられる）。
【００６７】
一態様では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡは非天然ＲＮＡであり、特に非天然ｍＲＮＡである。
【００６８】
本発明にしたがって用いられるＲＮＡは、化学修飾されたＲＮＡ（ｃｍＲＮＡ）であってもよい。原則的にはこれが好ましい。ｃｍＲＮＡは本分野では既知であり、例えば参考文献２２、参考文献２３、および特許文献２に記載されている。特に、用いられるｃｍＲＮＡは特許文献２に記載されるｃｍＲＮＡであってもよい。
【００６９】
本発明にしたがって用いられるＲＮＡおよび特にｃｍＲＮＡは、高安定性および／または低免疫原生を有していると好ましい。特に、上記ＲＮＡおよび特にｃｍＲＮＡにより、トール様受容体および／またはレチノイド誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）とのＲＮＡ相互作用が阻害されることが想定される。これは原則的には本明細書で定義するどの（ｃｍ）ＲＮＡにもあてはまる。
【００７０】
免疫原生および安定性はそれ自体知られているやり方で測定することができる。
【００７１】
ＲＮＡの免疫原生の測定については、当業者に周知の種々の方法を用いることができる。非常に適している方法は、ＲＮＡの投与に対する反応として生じる、細胞内における炎症マーカーの測定である。例えば、ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐８、ＩＬ‐６、ＩＬ−１２、または当業者に知られる他のサイトカインなど、炎症に関連するサイトカインが通常計測される。ＤＣ活性化マーカーの発現も免疫原生の評価に用いることができる。免疫反応の別の表示は、トール様受容体であるＴＬＲ‐３、ＴＬＲ‐７、およびＴＬＲ‐８とヘリカーゼＲＩＧ‐Ｉへの結合によって検出される。
【００７２】
免疫原生は、通常、対照と関連して測定される。一般的な方法では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡが細胞に投与され、ＲＮＡ投与への反応としての一定の時間間隔での炎症マーカーの分泌が計測される。比較に用いる基準として、免疫反応をほとんどまたはまったく生じないことで知られるＲＮＡを用いてもよく、その場合、本発明にしたがって用いられるＲＮＡへの免疫反応は同じ範囲にとどまり、上昇しないはずである。本発明にしたがって用いられるＲＮＡでは、例えば、免疫反応は、少なくとも３０％、通常少なくとも５０％、さらには７５％、またはさらには完全に抑えられるまで低下することが想定される。
【００７３】
免疫原生は上記因子の計測、特に、ＴＮＦ‐αレベルおよびＩＬ‐８レベルと、ＴＬＲ‐３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、およびヘリカーゼＲＩＧ‐Ｉへの結合能の計測によって測定することができる。それによって（ｍ）ＲＮＡが所望の低免疫原生を有しているかを確認するために、関与するポリリボヌクレオチドを投与した後の、上記因子のうちの１以上の因子の量を計測することができる。したがって、例えば、試験される一定量の（ｍ）ＲＮＡを静脈または腹腔内を介してマウスに投与することができ、所定の期間（例えば７日または１４日）が経過したのち、上記因子のうちの１つ以上を血液内で計測することができる。次いで、一定量の因子は、処置を行わなかった動物の血液に存在する一定量の因子と関連付けられる。免疫原生の測定については、ＴＬＲ‐３、ＴＬＲ‐７、ＴＬＲ‐８および／またはヘリカーゼＲＩＧ−１との結合能を測定することが非常に有益であることが見出された。ＴＮＦ‐αのレベルおよびＩＬ‐８のレベルからも非常に良好な目安が得られる。本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡでは、例えば、ＴＬＲ‐３、ＴＬＲ‐７、ＴＬＲ‐８およびＲＩＧ‐１との結合能を、非修飾ＲＮＡと比較して少なくとも５０％低下させることが可能である。通例、それら因子との結合は少なくとも７５％、またはさらに８０％まで低下させることが可能である。好適な実施形態では、ＴＬＲ‐３、ＴＬＲ‐７、ＴＬＲ‐８、およびＲＩＧ‐１との結合能は、本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡおよびｍＲＮＡが投与されていない動物のものと同じ範囲にある。言い換えれば、ある特定の態様では、本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡでは炎症反応も免疫反応も事実上まったく生じないことが想定される。
【００７４】
特に、本発明にしたがって用いられるＲＮＡはそのような低免疫原生を示すため、患者の一般的状態には影響を及ぼさないことが想定される。したがって、上記因子の僅かな増加は、結果的に一般的状態が悪化しない限り許容されうる。
【００７５】
本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡのさらなる性質はその効率性と安定性である。このため、転写効率、トランスフェクション効率、翻訳効率、およびタンパク質発現の持続期間は重要であり、それ自体が知られている方法によって測定される。
【００７６】
転写効率は、ＲＮＡがどの程度効率よくＤＮＡから生成できるかを示すものである。
【００７７】
ここで、修飾ヌクレオチドを多く用いた場合、問題が生じうる。本発明にしたがって修飾されたＲＮＡは高転写効率で生成されうる。
【００７８】
本発明にしたがって用いられる特定のＲＮＡは、（化学的に）修飾されたシチジンヌクレオチドおよび／または（化学的に）修飾されたウリジンヌクレオチドを有するＲＮＡである。そのようなＲＮＡは例えば特許文献２に記載されている。
【００７９】
適した（化学）修飾の例を表４に挙げる。好ましい修飾シチジンは５‐メチルシチジン（ｍ５Ｃ）である。好ましい修飾ウリジンは２‐チオウリジン（ｓ２Ｃ）である。
【００８０】
特に、本発明にしたがって用いられるｃｍＲＮＡは、修飾シチジンヌクレオチドを５〜５０％および／または修飾ウリジンヌクレオチドを５〜５０％、ならびに、非修飾シチジンヌクレオチドを５０〜９５％および／または非修飾ウリジンヌクレオチドを５０〜９５％有しうる。アデノシンヌクレオチドとグアノシンヌクレオチドは非修飾であってもよいし、部分的に修飾されていてもよいが、非修飾の状態で存在しているのが好ましい。７、５〜３５％のシチジンヌクレオチドおよび／またはウリジンヌクレオチドが修飾されていると好ましく、修飾シチジンヌクレオチドの含有量が１５％〜２５％の範囲にあり、かつ／または修飾ウリジンヌクレオチドの含有量が１５％〜２５％の範囲にあるとより好ましい。
【００８１】
本発明にしたがって用いられるｃｍＲＮＡの非限定的な例の１つとして、ＲＮＡのシチジンの約２５％が修飾されたシチジンであり（例えば５‐メチルシチジン（ｍ５Ｃ））、かつ／またはＲＮＡのウリジンの約２５％が修飾されたウリジン（例えば２‐チオウリジン（ｓ２Ｕ））であるＲＮＡ（ｍ５Ｃ（０．２５）ｓ２Ｕ（０．２５）ＲＮＡ）が挙げられる。アデノシンヌクレオチドとグアノシンヌクレオチドは非修飾の状態で存在するのが好ましい。
【００８２】
しかしながら、別の態様では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡはｃｍＲＮＡでない場合もある。すなわち、ＲＮＡは非化学修飾ＲＮＡであってもよい。この態様について、非化学修飾ＲＮＡは非天然ＲＮＡでもよいし、または好ましくは天然ＲＮＡであってもよい。本発明の文脈で用いられる非化学修飾ＲＮＡは、修飾されていない、すなわち天然のヌクレオチド残基、すなわち天然のアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンのみを含むことが特に想定される。他の天然のヌクレオチドも原則的には含まれる（例えばイノシンやチミジンなど）。特に、ＲＮＡは、上述したようなｃｍＲＮＡ、例えば特許文献２に記載されたｃｍＲＮＡでない場合もある。しかしながら、本発明にしたがって用いられる非化学修飾ＲＮＡであっても低免疫原生を有し、例えばトール様受容体およびレチノイド誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）との（ｍ）ＲＮＡ相互作用を阻害しうる。特に、本発明にしたがって本明細書の別の箇所に記載されているように、マトリクスまたは足場、すなわちキャリアに配合した場合、非化学修飾ＲＮＡは有利に用いることができる。そのため、非化学修飾ＲＮＡも、例えば、長寿命を示す。これにより、非化学修飾ＲＮＡが配合されたキャリアは、持続性／遅延性ＲＮＡ送達を行うための望ましいデポーとなる。非化学修飾ＲＮＡの別の利点は、用いられるＲＮＡを化学修飾する工程が不要なことである。
【００８３】
したがって、本明細書の文脈では、マトリクスまたは足場、すなわちキャリアで用いられる医薬組成物および本明細書に開示される医薬組成物は、ＲＮＡ、特に本発明にしたがって用いられる非化学修飾ＲＮＡを持続的かつ／または遅延的に送達するために製造されることも想定される。より具体的には、上記医薬組成物またはマトリクス／足場は、ＲＮＡの持続性／または遅延性送達を行うための系、例えばデポーとして製造してもよい。以下でより詳細に説明するが、この態様についても、ＲＮＡが本発明にかかる複合体の形態をとり、マトリクス／足場は、真空乾燥または凍結乾燥されている場合があるとともにＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジであることが好ましい。
【００８４】
原則的には、本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡはそのまま直接用いてもよい。しかしながら、例えば（さらに）有益な性質を導入するために、ｍＲＮＡを（さらに）修飾する可能性もある。第１に、他のコード配列または非コード配列をコーディング鎖に付すことによってｍＲＮＡを修飾してもよい。第２に、修飾ヌクレオチドに供給された官能基に別の分子を結合させることによって修飾してもよい。
【００８５】
この文脈では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡには、別の機能的領域および／または３’もしくは５’非コード領域があってもよい。３’および／または５’非コード領域は、コードされたタンパク質（ＢＭＰ）、またはＲＮＡの安定化に貢献するそれ以外の人工的配列の側面に位置する領域であってもよい。当業者であれば、日常的な実験によって毎回これに適した配列を見出すことができる。
【００８６】
好適な実施形態では、ＲＮＡは、特に翻訳を向上させるために、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および／または３’端にあるポリＡ鎖を含む。ＲＮＡには翻訳を促進するさらなる領域があってもよい。
【００８７】
必須なのは、ＢＭＰまたはその機能的断片の機能である、（ｍ）ＲＮＡが用いられる骨疾患の治療、緩和、または予防が実現できることである。
【００８８】
一実施形態では、用いられる（ｍ）ＲＮＡを、標的細胞に特異の表面受容体と結合する標的リガンドを組み合わせて、受容体を介して標的細胞のトランスフェクトを可能にしてもよい。この目的で、まず（ｍ）ＲＮＡの細胞への導入に適したビヒクルを、あるいは（ｍ）ＲＮＡ自体をリガンドで修飾してもよい。（ｍ）ＲＮＡの細胞への導入に適したビヒクルの例としてカチオン剤が挙げられる。カチオン剤としては、カチオン脂質、カチオンポリマー、または、ナノ粒子、ナノカプセル、磁気ナノ粒子、およびナノエマルションも挙げられる。適したビヒクルは当業者には既知であり、専門書に記載されている。適したリガンドも当業者には周知であり、文献に記載されるとともに入手可能である。リガンドとしては、例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、クレンブテロール、糖、ウロン酸、抗体、アプタマーなどを用いることができる。このようなビヒクルおよびリガンドの例は本明細書の別の箇所にも記載した。
【００８９】
上述したように、（ｍ）ＲＮＡ自体をリガンドで修飾してもよい。この目的で、リボースの２’位置に一級アミノ基またはアジド基をもつ修飾ヌクレオチドを有する（ｍ）ＲＮＡが好ましい。表４に例を挙げた。このような修飾は、それらは生物活性に貢献するため特に好ましい。これらの修飾を介して、アミド生成または「クリック・ケミストリ」、例えば生体共役技術、によってリガンドを容易に組み込むことができる。
【００９０】
特定の実施形態では、タンパク質、例えば受容体（アプタマー）、に結合できるＲＮＡ配列が（ｍ）ＲＮＡの５’端に導入される。この作業には、ＤＮＡレベルでリガンドを既にマトリクス内に直接導入でき、さらにクローン化して、例えばインビトロ翻訳（in vitro translation：ＩＶＴ）によって、（ｍ）ＲＮＡ内に導入できるという利点がある。したがってリガンドを用いてさらに（ｍ）ＲＮＡを修飾する必要がなくなる。
【００９１】
さらなる実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の不活性ポリマーを用いて（ｍ）ＲＮＡに追加的修飾を行う。これを行う方法は当業者に周知であり、リガンドに関して知られている工程を用いることができる。したがって、例えば、転写後にポリエチレングリコールが結合されることになるポリエチレングリコール用結合部は、（ｍ）ＲＮＡに用いられる修飾ヌクレオチドのごく一部とすることができる。ポリエチレングリコールは（ｍ）ＲＮＡの細胞外での安定化に役立つ。すなわち、ポリエチレングリコールはポリリボヌクレオチド分子が細胞に到達するまで保護する役目を果たす。細胞に進入する際、ＰＥＧは切断される。したがって、ＰＥＧとＲＮＡの間の結合は、細胞進入時の切断が促進されるように設計されていると好ましい。このため、例えば、ｐＨに依存して切断される官能基を用いることができる。ＲＮＡを安定化させるその他の分子も修飾ヌクレオチドの適切な活性部を介して提供されうる。このようにして、（ｍ）ＲＮＡは立体安定化によって酵素分解から守られ、生体液成分との相互作用を阻止することができる。このように修飾された（ｍ）ＲＮＡは、「ステルス」（ｍ）ＲＮＡと表すことができる。
【００９２】
ＲＮＡの好ましい保護および安定化方法は欧州特許第１１９８４８９号明細書に記載され、その内容は参照によって本明細書に明白に援用される。本発明にしたがって用いられるＲＮＡは、欧州特許第１１９８４８９号明細書に記載の方法で保護することができる。ＲＮＡはまずこの方法によって有利に安定化および保護され、次にこのように処置されたＲＮＡの活性は制限されない、またはそれほど制限されないことが見出された。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡは欧州特許第１１９８４８９号明細書にしたがって処置される。
【００９３】
一実施形態では、本発明にしたがって用いられるＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｃｍＲＮＡ等）はカプセル化してもよい。すなわちカプセルで包んでもよい。例えば、カプセルはナノカプセルとしてもよい。適したカプセルは本分野では既知であり、本明細書の別の箇所にも記載した。
【００９４】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、標的細胞内または標的組織内にＲＮＡを送達および／または導入するための１つ以上の薬剤または１つ以上の試薬をさらに含む。特に、これらの薬剤または試薬は、細胞内または組織内へのＲＮＡの送達および／または導入を支持することが想定される。これら薬剤または試薬はＲＮＡとともに投与してもよい。送達／導入されるＲＮＡは、これら薬剤または試薬と（例えば共有結合や錯体化によって）結合させてもよいし、（例えば単に混ぜ合わせるのみで）結合させなくてもよい。それら薬剤または試薬は本分野では既知であり（例えばTavernier, J Control Release 150(3) (2011), 238-47）、例えば、脂質・リポソーム、ミセル、ポリマー、およびデンドリマーからなる群から特に選択される。上記薬剤または試薬の具体例としては、ＤＯＴＡＰ（１，２‐ジオレオイル‐３‐トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２‐ジオレオイル‐３‐ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２‐ジ‐０‐オクタデセニル‐３‐トリメチルアンモニウムプロパン）、ＸＴＣ （２，２‐ジリノレイル‐４−ジメチルアミノエチル‐［１，３］−ジオキソラン）とＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）‐ヘプタトリアコンタ‐６，９，２８，３１‐テトラエン‐１９‐イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）、ＡＬＮＹ‐１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）‐Ｎ，Ｎ−ジメチル‐２，２‐ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエニル）テトラヒドロ‐３ａＨ‐シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール‐５‐アミン））、ＮＣ９８‐５（４，７，１３‐トリス（３‐オキソ‐３‐（ウンデシルアミノ）プロピル）‐ＮＩ，Ｎ１６−ジウンデシル‐４，７，１０，１３‐テトラアザヘキサデカン‐１，１６‐ジアミド）、Ｃ１２‐２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２‐ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、１，２‐ジステアリルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２‐ジオレイルオキシ‐Ｎ，Ｎ−ジメチル‐３‐アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２ジリノレニルオキシＮ，Ｎジメチル‐３‐アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ，ＮジオレイルＮ，Ｎジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，ＮジステアリルＮ，Ｎジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ‐（１，２‐ジミリスチルオキシプロパ‐３‐イル)‐Ｎ,Ｎ−ジメチル‐Ｎ‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３‐ジメチルアミノ‐２‐（コレスタ‐５‐エン‐３‐β‐オキシブタン‐４−オキシ）‐ｌ‐（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２‐オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２‐［５’‐（コレスタ‐５‐エン‐３β‐オキシ）‐３’‐オキサペントキシ］‐３‐ジメチル  １‐１‐（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１‐２’‐オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル‐３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２‐Ｎ，Ｎ’‐ジオレイルカルバミル‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３‐ジリノレオイル‐Ｎ，Ｎ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡ���）、１，２‐Ｎ，Ｎ’‐ジリノレイルカルバミル‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノメチル‐［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ）、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１、３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＸＴＣ２‐ＤＭＡ）、またはそれらの混合物が挙げられる（Heyes, J Controlled Release 107 (2005), 276-287、Morrissey, Nat. Biotechnol. 23(8) (2005), 1003-1007、国際公開第２００５／１２１３４８号パンフレット）。例としてさらにＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐Ｎ‐エチルカルボキシアミドコレステロール）や１，４−ビス（３‐Ｎ‐オレイルアミノ‐プロピル）ピペラジンが挙げられる（Gao, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179 (1991), 280、Wolf, et al BioTechniques 23 (1997), 139、米国特許第５７４４３３５号明細書）。さらに別の例として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド）ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Invitrogen社）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Invitrogen社）、ＦＵＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥが挙げられる。さらに別の例として、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド‐ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、ポリリシン、ポリアルギニン、オリゴ／ポリアミン、およびポリエチレンイミンが挙げられる。これらは修飾されていてもよいし、非修飾でもよい。
【００９５】
薬剤または試薬は、オリゴマー、ポリマー、またはリピドイドでもよい。それらは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載される特徴的なオリゴ（アルキレンアミン）部分のようなオリゴ（アルキレンアミン）部分を含んでいてもよい。特に、薬剤または試薬は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載されたオリゴマー、ポリマー、またはリピドイドでもよい。これらの特定の薬剤または試薬の主な特徴の１つは、以下の式（Ｉ）で表わされる一般的な構造実体を含むことである。
【化１】
2017534649.tif 000002
【００９６】
このような薬剤または試薬は、以下のａ）、ｂ）、およびｃ）から選択されるオリゴ（アルキレンアミン）（を含む成分）であってもよい。
【００９７】
ａ）側鎖としてかつ／または末端基として式（ＩＩ）で表わされる複数の基を含むオリゴマーまたはポリマー。
【化２】
2017534649.tif 000003
ここで、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎ、およびＲ２〜Ｒ６は、式（ＩＩ）で表わされる複数の基において、基毎に独立して以下のように定義される。
ａは１であり、かつｂは２〜４の整数である；またはａは２〜４の整数であり、かつｂは１である。
ｐは１または２である。
ｍは１または２であり、ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上である。
Ｒ２〜Ｒ５は互いに独立して、水素；‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｒ７基、‐ＣＨ（Ｒ７）‐ＣＨ２‐ＯＨ基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｏ‐Ｒ７基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐ＮＨ‐Ｒ７基、または‐ＣＨ２‐Ｒ７基（Ｒ７はＣ３〜Ｃ１８アルキルまたはＣ‐Ｃの二重結合を１つ有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択される。
Ｒ６は、水素；‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｒ７基、‐ＣＨ（Ｒ７）‐ＣＨ２‐ＯＨ基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｏ‐Ｒ７基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐ＮＨ‐Ｒ７基、または‐ＣＨ２‐Ｒ７基（Ｒ７はＣ３〜Ｃ１８アルキルまたはＣ‐Ｃの二重結合を１つ有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；‐Ｃ（ＮＨ）‐ＮＨ２；ポリ（エチレングリコール）鎖、および受容体リガンドから選択される。
さらにここで、式（ＩＩ）に示される１つまたは複数の窒素原子をプロトン化して、式（ＩＩ）のカチオン基を提供してもよい。
【００９８】
ｂ）反復単位として式（ＩＩＩ）で表わされる複数の基を含むオリゴマーまたはポリマー。
【化３】
2017534649.tif 000004
ここで、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎ、およびＲ２〜Ｒ５は、式（ＩＩＩ）で表わされる複数の基において、基毎に独立して以下のように定義される。
ａは１であり、かつｂは２〜４の整数である；またはａは２〜４の整数であり、かつｂは１である。
ｐは１または２である。
ｍは１または２であり、ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上である。
Ｒ２〜Ｒ５は互いに独立して、水素；‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｒ７基、‐ＣＨ（Ｒ７）‐ＣＨ２‐ＯＨ基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｏ‐Ｒ７基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐ＮＨ‐Ｒ７基、または‐ＣＨ２‐Ｒ７基（Ｒ７はＣ３〜Ｃ１８アルキルまたはＣ‐Ｃの二重結合を１つ有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；‐Ｃ（ＮＨ）‐ＮＨ２；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択される。
さらにここで、式（ＩＩＩ）に示される１つまたは複数の窒素原子をプロトン化して、式（ＩＩＩ）のカチオン基を提供してもよい。
【００９９】
ｃ）式（ＩＶ）で表わされる構造を有するリピドイド。
【化４】
2017534649.tif 000005
ここで、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎ、およびＲ１〜Ｒ６は以下のように定義される。
ａは１であり、かつｂは２〜４の整数である；またはａは２〜４の整数であり、かつｂは１である。
ｐは１または２である。
ｍは１または２であり、ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上である。
Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つの残基が、‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｒ７基、‐ＣＨ（Ｒ７）‐ＣＨ２‐ＯＨ基、‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｏ‐Ｒ７基、‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐ＮＨ‐Ｒ７基、または‐ＣＨ２‐Ｒ７基（Ｒ７はＣ３〜Ｃ１８アルキルまたはＣ‐Ｃの二重結合を１つ有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である場合、Ｒ１〜Ｒ６は互いに独立して、水素；‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｒ７基、‐ＣＨ（Ｒ７）‐ＣＨ２‐ＯＨ基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝Ｏ）‐０‐Ｒ７基、‐ＣＨ２−ＣＨ２‐（Ｃ＝０）‐ＮＨ‐Ｒ７基、または‐ＣＨ２‐Ｒ７基（Ｒ７はＣ３〜Ｃ１８アルキルまたはＣ‐Ｃの二重結合を１つ有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；‐Ｃ（ＮＨ）‐ＮＨ２；ポリ（エチレングリコール）鎖、および受容体リガンドから選択される。
さらにここで、式（ＩＶ）に示される１つまたは複数の窒素原子をプロトン化して、式（ＩＶ）のカチオンリピドイドを提供してもよい。
【０１００】
より具体的な態様では、このような薬剤または試薬は、以下のａ）およびｂ）から選択されるオリゴ（アルキレンアミン）（を含む成分）であってもよい。
ａ）は、側鎖としてかつ／または末端基として式（ＩＩａ）で表わされる複数の基を含むオリゴマーまたはポリマーである。
【０１０１】
‐ＮＲ２｛ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ３‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｂ‐ＮＲ４｝ｍ‐［ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ５］ｎ−Ｒ６    （ＩＩａ）
【０１０２】
ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ２〜Ｒ６は、上記したように定義され、式（ＩＩａ）に示される窒素原子のうち１つまたは複数をプロトン化して、カチオン性オリゴマー構造またはカチオン性ポリマー構造を提供してもよい。
【０１０３】
ｂ）は、反復単位として式（ＩＩＩａ）で表わされる複数の基を含むオリゴマーまたはポリマーである。
【０１０４】
‐ＮＲ２｛ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ３‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｂ‐ＮＲ４｝ｍ‐［ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ５］ｎ‐    （ＩＩＩａ）
【０１０５】
ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ２〜Ｒ５は、上記したように定義され、式（ＩＩＩａ）に示される窒素原子のうち１つまたは複数をプロトン化して、カチオン性オリゴマー構造またはカチオン性ポリマー構造を提供してもよい。
【０１０６】
別のより具体的な態様では、このような薬剤または試薬は、式（ＩＶａ）で表わされる構造を有するリピドイドから選択されるオリゴ（アルキレンアミン）（を含む成分）であってもよい。
【０１０７】
Ｒ１‐ＮＲ２｛ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ３‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｂ‐ＮＲ４｝ｍ‐［ＣＨ２‐（ＣＨ２）ａ‐ＮＲ５］ｎ−Ｒ６    （ＩＶａ）
【０１０８】
ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ１〜Ｒ６は、上記したように定義され、式（ＩＶａ）に示される窒素原子のうち１つまたは複数をプロトン化して、カチオン性リピドイドを提供してもよい。
【０１０９】
そのような薬剤または試薬について、式（ＩＩ）、（ｌｌａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）、または（ＩＶａ）において、ｎは１あってもよく；またはｍが１であり、かつｎが１であってもよい。
【０１１０】
さらに、そのような薬剤または試薬について、式（ＩＩ）、（ｌｌａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）、または（ＩＶａ）において、ａは１であり、かつｂが２であってもよく；またはａが２であり、かつｂが１であってもよい。
【０１１１】
ある特定の一態様では、上記オリゴマー、ポリマー、またはリピドイドは、カチオン性（例えばプロトン化された）オリゴマー、ポリマー、またはリピドイドであってもよい。
【０１１２】
本発明の文脈で用いられるそのようなオリゴマー、ポリマー、またはリピドイドの一例として、限定はしないが、１００ｍｇのＮ，Ｎ’‐ビス（２‐アミノエチル）‐１，３‐プロパンジアミン（０．６２３ｍｍｏｌ）と５７５．０７ｍｇの１，２‐エポシキドデカン（３．１２ｍｍｏｌ、（Ｎ−１）ｅｑ．、ここで、Ｎはオリゴ（アルキレンアミン）１単位につき、一級アミンの２×量に２級アミンの１×量を足したものである）を混ぜ、８０℃で９６時間常に振動させて混合することで調製したカチオン性脂質が挙げられる。このようなオリゴマー、ポリマー、またはリピドイドは、リピドイド「C12-(2-3-2)」とも称される。
【０１１３】
本発明にしたがって用いられる薬剤または試薬、特にポリマーは、コポリマー、特に統計コポリマーであってもよい。そのようなコポリマーは、（例えば、長さが互い違いでないアルキレンアミン反復単位からなる類似配列を含むあまり好ましくないポリマーとは対照的に）長さが互い違いのアルキレンアミン反復単位からなる統計／ランダム配列を含むコポリマーであってもよい。コポリマーはカチオン性（例えばプロトン化された）コポリマーであってもよい。本発明にしたがって用いられるコポリマーは本分野では既知であり、例えば、欧州特許出願番号１４１９９４３９．２、特許文献１、欧州特許第１１９８４８９号明細書、カナダ特許公開第２３７７２０７に記載されている。
【０１１４】
特に、コポリマーは、以下の式（ａ１）および（ａ２）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ａ）と、
【化５】
2017534649.tif 000006
以下の式（ｂ１）〜（ｂ４）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ｂ）とを含む統計コポリマーであってもよい。
【化６】
2017534649.tif 000007
ここで、反復単位（ｂ）の合計に対する反復単位（ａ）の合計のモル比は０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、
コポリマーに含まれる反復単位（ａ）および／または反復単位（ｂ）の窒素原子のうちの１つまたは複数をプロトン化してカチオン性コポリマーを提供してもよい。
【０１１５】
コポリマーは、任意の反復単位（ａ）と任意の反復単位（ｂ）をコポリマー高分子中に統計的に分布させた統計コポリマーであってもよい。それは、重合反応中に反復単位（ａ）を生じるモノマーと、重合反応中に反復単位（ｂ）を生じるモノマーの混合物の共重合から通常得られる。コポリマーは、任意の反復単位（ａ）と任意の反復単位（ｂ）がポリマー高分子中にランダムに分布したランダムコポリマーだと好ましい。
【０１１６】
本発明に係るコポリマーは、線状、分岐、または樹状コポリマーとすることができる。当業者であれば分かることだが、２原子価（すなわち隣接単位への空き結合）を有する式（ａ１）、（ｂ１）、または（ｂ３）の反復単位の存在は、コポリマー構造が線状に発達することにつながる。したがって、本発明の線状コポリマーは、式（ａ１）の反復単位と１つまたは複数のタイプの式（ｂ１）および（ｂ３）の反復単位を含むが、式（ａ２）、（ｂ２）、および（ｂ４）の反復単位は含まない。さらに分かることだが、３原子価を有する式（ａ２）、（ｂ２）、または（ｂ４）の反復単位の存在により、コポリマー構造における分岐点がつくられる。したがって、分岐コポリマーは１つまたは複数のタイプの式（ａ２）、（ｂ２）、および（ｂ４）の反復単位を含み、さらに、１つまたは複数のタイプの式（ａ１）、（ｂ１）、および（ｂ３）の反復単位も含みうる。
【０１１７】
本発明に係るコポリマーは、上記定義した式（ａ１）および（ａ２）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ａ）と、上記定義した式（ｂ１）〜（ｂ４）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ｂ）を含む。好ましいのは、上記定義した式（ａ１）および（ａ２）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ａ）と、上記定義した式（ｂ１）および（ｂ２）の反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ｂ）を含むコポリマーである。
【０１１８】
本発明に係るコポリマーは、反復単位（ａ２）、（ｂ２）、および（ｂ４）から選択された１つまたは複数のタイプの反復単位を含み、任意でさらに１つまたは複数のタイプの式（ａ１）、（ｂ１）、および（ｂ３）の反復単位を含む分岐コポリマーだと好ましく、なかでも、式（ａ２）の反復単位と、１つまたは複数のタイプの反復単位（ｂ２）および（ｂ４）とを含み、任意でさらに１つまたは複数のタイプの式（ａ１）、（ｂ１）、および（ｂ３）の反復単位を含むコポリマーだと好ましい。上記にしたがうと、より好ましいコポリマーは、式（ａ２）の反復単位と式（ｂ２）の反復単位とを含み、任意でさらに１つまたは複数のタイプの式（ａ１）と（ｂ１）の反復単位を含む分岐コポリマーである。
【０１１９】
本発明に係るコポリマーでは、反復単位（ａ）と反復単位（ｂ）合計数は通常２０以上であり、好ましく５０以上、より好ましくは１００以上である。通常、反復単位（ａ）と反復単位（ｂ）の合計数は１００００以下、好ましくは５０００以下、より好ましくは１０００以下である。
【０１２０】
さらに、本発明に係るコポリマーでは、コポリマーに含まれるすべての反復単位のうち反復単位（ａ）と反復単位（ｂ）が占める割合は、８０モル％以上だと好ましく、９０モル％以上だとより好ましい。さらに好ましいのは、コポリマーに含まれるすべての反復単位のうち、反復単位（ａ１）および（ａ２）から選択された反復単位（ａ）と反復単位（ｂ１）および反復単位（ｂ２）から選択された反復単位（ｂ）が占める割合が８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上のコポリマーである。最も好ましいのは、コポリマーに含まれるすべての反復単位が反復単位（ａ）または（ｂ）であることであり、なかでも、コポリマーに含まれるすべての反復単位が反復単位（ａ１）および（ａ２）から選択された反復単位（ａ）であるか、または反復単位（ｂ１）および（ｂ２）から選択された反復単位（ｂ）であると好ましい。
【０１２１】
本発明に係るコポリマーの重量平均分子量は、例えば、線状ポリ（酸化エチレン）基準に対するサイズ排除クロマトグラフィで測定した場合、一般的に１，０００〜５００，０００Ｄａの範囲、好ましくは２，５００〜２５０，０００Ｄａの範囲、より好ましくは５，０００〜５０，０００より少ない範囲にある。
【０１２２】
本発明に係るコポリマーの末端基は、以下の式（ｃ１）〜（ｃ３）で表わされる基、好ましくは式（ｃ１）および（ｃ２）表わされる基から独立して選択される１つまたは複数のタイプの基（ｃ）を通常含む。
【化７】
2017534649.tif 000008
【０１２３】
好ましくは、コポリマーに含まれる末端基は、以下の式（ｃ１）〜（ｃ３）ので表わされる基、好ましくは式（ｃ１）および（ｃ２）で表わされる基から独立して選択される１つまたは複数のタイプの基（ｃ）からなる。当業者であれば分かることだが、末端基の数は本発明に係るコポリマーの構造に依存する。線状コポリマーには末端は２つしかないが、分岐コポリマーには多くの末端基が含まれ、特に樹状コポリマーには多く含まれる。これも分かることだが、コポリマーに含まれる末端基（ｃ）の１つまたは複数の窒素原子をプロトン化してカチオン性コポリマーを提供してもよい。
【０１２４】
本発明に係るコポリマーでは、反復単位（ｂ）の合計に対する反復単位（ａ）の合計のモル比は、０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、好ましくは０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲にある。このモル比は例えばＮＭＲによって測定することができる。したがって、上記比は、本発明に係るコポリマーの複数の高分子に対して通常測定され、複数の高分子に含まれる反復単位（ｂ）の合計に対する反復単位（ａ）の合計の全体比を通常示すということがわかるであろう。
【０１２５】
上記で示したように、本発明に係るコポリマーの１つまたは複数の窒素原子をプロトン化して、オリゴカチオンまたはポリカチオンの形態を通常示すカチオンの形態のコポリマーを得てもよい。反復単位（ａ）もしくは（ｂ）または末端基（ｃ）に含まれる第一級、第二級、または第三級アミノ基が、特に、生理的流体を含めた水や水溶液において、プロトン受容体として作用しうる。したがって、本発明のコポリマーは、ｐＨ７．５未満の水溶液において通常は全体として正電荷を示す。本明細書でいう水溶液は、溶媒が５０％（容積／容積）以上、好ましくは８０％または９０％以上、最も好ましくは１００％の水を含む溶液である。また、本発明に係る組成物は、例えば血液や肺液などを含むｐＨ７．５未満の生理的流体と接している際、窒素原子がプロトン化された状態にある反復単位（ａ）および（ｂ）を通常含む。本発明に係る組成物に用いられるコポリマーのｐＫａ値は、自動ｐＫａ滴定装置を用いた中和摘定によって測定することができる。そして所定のｐＨ値における実効電荷は、例えばヘンダーソン・ハッセルバルヒの式から算出することができる。塩基中心のいくつかによって任意の電荷が共有されてもよいし、そのような電荷は必ずしも一点に起因するものではない。生理的ｐＨを有する溶液では、本発明に係る組成物に用いられるコポリマーは、通常、プロトン化された状態のアミノ基を有する反復単位とプロトン化されていない状態のアミノ基を含む反復単位とを含む。
【０１２６】
しかしながら、当業者であれば分かることだが、本発明に係るコポリマーも本発明に係る組成物も、カチオンの形態でコポリマーを含む乾燥塩の形態としても得られうる。
【０１２７】
これも分かることだが、コポリマーおよび核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ、を含む本発明に係る組成物に含まれるプロトン化されたアミノ基の正電荷に対する対イオン（アニオン）は、核酸に含まれるアニオン部分から通常得られる。核酸中のアニオン部分に対して正電荷を帯びた基の存在が過多だった場合、正電荷は他のアニオン、特にＣｌ‐やＨＣＯ３-などの生理的流体において通常生じるアニオンによって打ち消すことができる。
【０１２８】
上記にしたがって、本発明に係る好ましいコポリマーはランダムポリマーであり、
すべての反復単位の８０ｍｏｌ％以上、より好ましくはすべての反復単位が、
以下の式（ａ１）および（ａ２）で表わされる反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ａ）と、
【化８】
2017534649.tif 000009
以下の式（ｂ１）および（ｂ２）で表わされる反復単位から独立して選択される複数の反復単位（ｂ）とから形成され、
【化９】
2017534649.tif 000010
【化１０】
2017534649.tif 000011
反復単位（ｂ）の合計に対する反復単位（ａ）の合計のモル比が、０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、好ましくは０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲にあり、
コポリマーの末端基は、
式（ｃ１）および（ｃ２）で表わされる基から独立して選択される基（ｃ）から形成され、
【化１１】
2017534649.tif 000012
コポリマーに含まれる反復単位（ａ）および／もしくは（ｂ）ならびに／または末端基（ｃ）の１つまたは複数の窒素原子をプロトン化してカチオン性コポリマーを提供してもよい。コポリマーが、単位（ａ２）および（ｂ２）と、任意で単位（ａ１）および／または（ｂ１）とを含む分岐コポリマーだとさらに好ましい。
【０１２９】
本発明に係るコポリマーは、分岐または線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリアルキレンイミンの調製に用いられる既知の手順と類似する手順によって調製できると都合がよい。コポリマーの生成に用いられるモノマーはそのように調整される必要があることが分かるであろう。本発明の文脈では、モノマーは定量的な手法で都合よく反応させることができ、コポリマーに含まれる単位（ａ）と（ｂ）の比は、重合されるモノマー混合物においてモノマー比をそのように調整することによって調整できることが見出された。ポリエチレンイミンは例えばアジリジンの開環重合によって調製できる一方、本発明に係るコポリマーは、アジリジンと、アゼチジンと、必要に応じてピロリジンとを含む、またはそれらからなるモノマー混合物の開環重合によって、あるいは好適な実施形態では、アジリジンおよびアゼチジンを含む、またはそれらからなるモノマー混合物の開環重合によって調製することができる。「必要に応じて」という表現は、ピロリジンによって形成されるはずの反復単位（ｂ３）および（ｂ４）、または末端基（ｃ３）の存在有無を表すことは分かるであろう。置換されていない環状アミンを開環重合すると、通常は分岐コポリマーが生成する。本発明に係る線状コポリマーは、例えば適切なＮ置換アジリジン、Ｎ置換アゼチジン、およびＮ置換ピロリジンの重合、またはＮ置換アジリジンとＮ置換アゼチジンの重合によって調製することができ、これに次いで、例えば、結果物であるポリアルキレンイミン鎖に結合しているＮ置換基の加水分解開裂を行ってよい。これは例えば、Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, New synthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, January 1988, Volume 19, Issue 1, pp. 13-19に公開される手順と類似するものである。
【０１３０】
デンドリマー（樹状コポリマー）の調製には、ポリエチレンイミン・デンドリマーまたはポリプロピレンアミン・デンドリマーの生成で知られる合成手法と類似の方法が適用される。ポリプロピレンイミン・デンドリマーは、一級アミンにマイケル付加の反復配列を用い、次いで不均一触媒水素化を行うことでアクリロニトリルの構成要素から合成することができ、（Newkome and Shreiner, Poly(amidoamine), polypropylenimine, and related dendrimers and dendrons possessing different 1→2 branching motifs; An overview of the divergent procedures. Polymer 49 (2008) 1-173、De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropylenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1 ) 51-62）。ポリエチレンイミン・デンドリマーは、第一級アミンに対する臭化ビニルの構成要素のマイケル付加の反復配列を用い、次いでガブリエルアミン合成法を用いて臭化アルキルをアミンに変換することで生成することができる（Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286:747-752）。したがって、当業者が生成可能なのは、例えばプロピレンイミンとエチレンイミンが厳密に交互に層をなすデンドリマーだけではないだろう。同様に、式（ａ２）、（ｂ２）、および（ｂ４）の反復単位のランダム組成物、好ましくは反復単位（ａ２）および（ｂ２）のランダム組成物を含む、またはそれらからなる層を有するデンドリマーも生成することができる。
【０１３１】
アジリジンとアゼチジンの開環重合、またはアジリジンとアゼチジンとピロリジンの開環重合は、水などの溶液中で行うことができる。全モノマー濃度は特に限定されないが、通常の濃度範囲は１０％重量／重量〜８０％重量／重量、好ましくは３０％重量／重量〜６０％重量／重量である。通常、重合はプロトンによって開始されるため、反応系にはブレンステッド酸、特に硫酸等の無機酸を加えることが好ましい。加える酸は一般に、モノマーの全濃度に対して当量０．００１〜０．０１などの少量で十分である。反応は、例えば５０℃〜１５０℃、特に９０℃〜１４０℃の温度範囲などの都合よい速度で進行する。これらの範囲では、分子量の大きいコポリマーは通常高温にあり、分子量の小さいコポリマーは低温にある。
【０１３２】
原則的には、リピドイドは本発明にしたがって用いられる好ましい薬剤または試薬であり、特にオリゴマーと、さらに特にはポリマーと比較して好ましい。
【０１３３】
ＲＮＡを標的細胞または標的組織内に送達および／または導入するための１つ以上の薬剤または１つ以上の試薬のさらなる例として、リポソームトランスフェクション試薬（ＬＴＲ）や磁性粒子（ＭＰ）などが本発明の別の箇所で挙げられている。
【０１３４】
ＲＮＡを標的細胞または標的組織内に送達および／または導入するためのある特定の方式の一つとして、トランスフェクションが挙げられる。したがって、一態様では、用いられるＲＮＡは、（（標的）細胞または組織内へ）トランスフェクトされ、トランスフェクションによって送達／投与され、かつ／またはトランスフェクション用に調製されることが想定されている。ＲＮＡをトランスフェクトするための手段および方法は本分野で周知であり、例えばTavernier, J Control Release 150(3) (2011), 238-47、Yamamoto (Eur J Pharm Biopharm. 71(3) (2009), 484-9)、参考文献２２に記載されている。
【０１３５】
トランスフェクションの特定の方式は、リポフェクション、マグネトフェクション、またはマグネトリポフェクションである。本発明の文脈では、これらの種類のトランスフェクションにより良好な結果が達成された。結果はマグネトフェクションを用いた場合に特に良好であり、マグネトリポフェクションを用いた場合には非常に良好であった。
【０１３６】
したがって、一態様では、用いられるＲＮＡは、リポフェクション用に調製され、リポフェクションによってトランスフェクトされるために調製され、リポフェクションによって送達／導入され、かつ／またはリポフェクションによって投与されてもよい。
【０１３７】
この態様によれば、本発明の医薬組成物には、少なくとも１種類の脂質またはリポソームトランスフェクション試薬またはエンハンサーを（さらに）含めてもよい（ＬＴＲ：リポソーム型トランスフェクション試薬）。用いられるＲＮＡは、ＬＴＲに含まれ、ＬＴＲと複合体化し、かつ／またはＬＴＲによって送達されてもよい。特に、用いられるＲＮＡは、ＲＮＡとＬＴＲを含むリポフェクション複合体に含まれ、かつ／またはＲＮＡとＬＴＲを含むリポフェクション複合体によって送達されてもよい。本発明の医薬組成物にはリポフェクション複合体を（さらに）含めてもよい。
【０１３８】
ＬＴＲは本分野では既知であり、例えばOzBiosciences社（フランス、マルセイユ）のものが流通している。本発明にしたがって用いられるＬＴＲは、標的細胞または標的組織内にＲＮＡを送達および／または導入するための上記薬剤または試薬からなる群から選択してもよい。例えば、そのようなＬＴＲは脂質またはリピドイドであってもよく、好ましくは国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６号明細書に開示されるリピドイドのようなカチオン性脂質またはカチオン性リピドイド（例えばC12-(2-3-2)）、欧州特許第２２８５７７２号明細書に開示される脂質（例えばDogtor)、欧州特許第１００３７１１号明細書に開示されるリポポリアミン（例えばDreamFect（商標）やDreamFect Gold（商標））などが挙げられる。具体的なＬＴＲとしては以下よりなる群から選択してもよい。
（ｉ）C12-(2-3-2)
（ｉｉ）DreamFect（商標）、好ましくはDreamFect Gold（商標）（DF（商標）／DF-Gold（商標）、OzBiosciences社、フランス国、マルセイユ）
（ｉｉｉ）Dogtor（OzBiosciences社、フランス国、マルセイユ）
（ｉｖ）例えばLipofectamine 2000のようなLipofectamine（Invitrogene社、米国、カリフォルニア）
【０１３９】
原則として、ＬＴＲとしては、Dogtorが好ましいが、DreamFect（商標）だとより好ましく、DF-Gold（商標）とC12-(2-3-2)であればさらにより好ましい。
【０１４０】
DogtorのようなＬＴＲは例えば欧州特許第２２８５７７２号明細書に記載されている。DF（商標）やDF-Gold（商標）のようなＬＴＲは例えば欧州特許第１００３７１１号明細書に記載されている。原則として、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６号明細書に開示されるオリゴマーやポリマー、リピドイド、欧州特許第２２８５７７２号明細書に開示される特定のカチオン性脂質、欧州特許第1003711号明細書に開示される特定のリポポリアミンが本発明に係る好ましいＬＴＲである。C12-(2-3-2)やDF-Gold（商標）のようなＬＴＲだと最も好ましい。
【０１４１】
限定はしないが、リポフェクション複合体の例として、DF-Gold（商標）／ＲＮＡリポプレックスと、C12-(2-3-2)／ＲＮＡリポプレックスが挙げられる。
【０１４２】
標的細胞内または標的組織内にＲＮＡを送達および／または導入するための本明細書に記載された薬剤および試薬と、本明細書に記載されたＬＴＲは、１種類または複数種類の（例えば２種類、３種類、または４種類の）別の脂質（例えばコレステロール、ＤＯＰＥ、および／またはＰＥＧ‐脂質（例えばＤＭＰＥ−ＰＥＧ）など）と組み合わせてもよい。これらの別の脂質は、薬剤／試薬およびＬＴＲの所望の機能をサポートし（細胞内または組織内へのＲＮＡの送達および／または導入をサポートおよび／または増強し、トランスフェクション効率を向上させる）、「ヘルパー脂質」として機能しうる。このような「ヘルパー脂質」の具体例として、コレステロール、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、および／またはＰＥＧ脂質（例えばＤＭＰＥ‐ＰＥＧ、ＤＭＧ‐ＰＥＧ（例えばＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ））が挙げられる。別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）は、本明細書に開示する複合体／粒子の一部であってもよい。当業者であれば本発明に係る複合体／粒子を容易に調製することができる。別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）の例も本分野で既知である。当業者であれば、適した別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）、薬剤／試薬／ＬＴＲと上記別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）の比を容易に選択することができる。そのような比は、薬剤／試薬／ＬＴＲ対別の脂質のモル比が、１〜４：１〜５、３〜４：４〜６、約４：約５、約４：約５．３であってもよい（より狭い範囲のものが好ましい）。例えば、薬剤／試薬／ＬＴＲを、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ‐ＰＥＧのような３種類の別の脂質と組み合わせてもよく、そのモル比は８：５．３：４．４：０．９、またはより具体的には８：５．２９：４．４１：０．８８としてもよい。
【０１４３】
別の態様では、用いられるＲＮＡは、マグネトフェクション用に調製され、マグネトフェクションによってトランスフェクトされるために調製され、マグネトフェクションによって送達／導入され、かつ／またはマグネトフェクションによって投与されてもよい。マグネトフェクションの原則は本分野で既知であり、例えば、国際公開第０２／００８７０号パンフレットに記載されている。
【０１４４】
この態様によれば、本発明の医薬組成物には、少なくとも１種類の磁性粒子（ＭＰ）、特に少なくとも１種類の磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を（さらに）含めてもよい。用いられるＲＮＡは、ＭＰに含まれ、ＭＰと複合体化し、かつ／またはＭＰによって送達されてもよい。特に、用いられるＲＮＡは、ＲＮＡとＭＰを含むマグネトフェクション複合体に含まれ、かつ／またはＲＮＡとＭＰを含むマグネトフェクション複合体によって送達されてもよい。本発明の医薬組成物には、マグネトフェクション複合体を（さらに）含めてもよい。
【０１４５】
用いられるＭＰ（またはＭＮＰ）は、コアシェルＭＰ、酸化鉄シリカＭＰ、および／または（分岐）ＰＥＩで装飾されたＭＰであってもよい。具体的なＭＰ（またはＭＮＰ）として、ＳｉＯｘ／ホスホネート‐ＰＥＩコーティングが施されたＭＰ（またはＭＮＰ）が挙げられ、これはSO-Mag6-115ＭＰ（またはＭＮＰ）とも称される。ＭＰ（またはＭＮＰ）は後述する実施例にしたがって生成してもよく、例えば参考文献２７、２８にしたがって生成してもよい。
【０１４６】
限定はしないが、マグネトフェクション複合体の一例として、SO-Mag6-115ＭＰ（またはＭＮＰ）／ＲＮＡマグネトフェクション複合体が挙げられる。別のＭＰ（またはＭＮＰ）およびマグネトフェクション複合体は国際公開第０２／００８７０号パンフレットに記載されている。
【０１４７】
より具体的な態様では、マグネトフェクション複合体には第３の成分を含めてもよく、したがってその場合、磁気トリプレックスの形態をとりうる。第３の成分は（例えば上で定義したような）ＬＴＲであってもよい。そうすると、磁気トリプレックスはマグネトリポフェクション複合体と称することができ、例えば、以下で定義するマグネトリポフェクション複合体であってもよい。
【０１４８】
さらに別のより具体的な態様では、用いられるＲＮＡは、マグネトリポフェクション用に調製され、マグネトリポフェクションによりトランスフェクトされるために調製され、マグネトリポフェクションによって送達／導入され、かつ／またはマグネトリポフェクションによって投与されてもよい。
【０１４９】
原則的には、マグネトリポフェクションはリポフェクションとマグネトフェクションと組み合わせたものであり、特に、両トランスフェション手法の利点を組み合わせたものである。したがって、原則的には、リポフェクションとマグネトフェクションについて本明細書で述べてきたことは、必要な変更を加えて、マグネトリポフェクションにも適用される。
【０１５０】
マグネトリポフェクションの態様によれば、本発明の医薬組成物には、少なくとも１種類のマグネトリポフェクション複合体（磁気リポプレックスとも称される）を（さらに）含めてもよい。用いられるＲＮＡは、そのような複合体に含まれ、そのような複合体と複合体化され、かつ／またはそのような複合体によって送達されてもよい。マグネトリポフェクション複合体は磁気トリプレックスであってもよく、例えば、ＲＮＡと、少なくとも１種類の（上で定義したような）ＭＰと、少なくとも１種類の（上で定義したような）ＬＴＲとを含んでいてもよい。
【０１５１】
限定はしないが、マグネトリポフェクション複合体の一例として、SO-Mag6-115ＭＰ（またはＭＮＰ）／DF-Gold／ＲＮＡのマグネトリポフェクション複合体が挙げられる。
【０１５２】
原則的には、本発明にしたがって用いられるトランスフェクション複合体の成分（例えばＲＮＡ、ＬＴＲ、ＭＰ）間の適切な比は、当業者であれば容易に判断することができる。要領は例えば参考文献２２、２３、国際公開第０２／００８７０号パンフレット、および後述の実施例に記載されている。
【０１５３】
しかしながら、既に述べたように、ある特定の比を採用すると非常に有用であること、例えば高度に効果的かつ／または効率的なトランスフェクションを得られること、が本発明の文脈において見出された。
【０１５４】
そのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲがおよそ１〜４０μｇ、５〜３５μｇ、１０〜３０μｇ、１５〜２５μｇ、１７〜２３μｇ、１８〜２２μｇ、１９〜２１μｇ、１〜２０μｇ、２〜２０μｇ、３〜２０μｇ、１〜１５μｇ、２〜１５μｇ、３〜１５μｇ、１〜１０μｇ、２〜１０μｇ、３〜１０μｇ、４〜１０μｇ、５〜１０μｇ、４〜１２μｇ、５〜１１μｇ、６〜１０μｇ、または７〜９μｇの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比である。同様に、特に、（例えば後述の実施例にあるように）ＬＴＲがＬＴＲ溶液として調製された場合、そのような比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲ溶液が０．５〜１５μｌ、０．５〜１０μｌ、０．５〜８μｌ、１〜１５μｌ、１〜１０μｌ、１〜８μｌ、１〜６μｌ、１．５〜５．５μｌ、２〜５μｌ、３〜４μｌ、１〜３μｌ、４〜６μｌ、１．５〜２．５μｌ、４．５〜５．５μｌ、１．７〜２．３μｌ、または４．７〜５．３μｌの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。この文脈では、好ましいＬＴＲはDreamFect（商標）であり、より好ましいのはDF-Gold（商標）またはC12-(2-3-2)である。好ましいＲＮＡはＢＭＰ‐７・ＲＮＡであり、より好ましいのはＢＭＰ‐２・ＲＮＡである。
【０１５５】
ＲＮＡに対するＬＴＲの別の特定の比はＮ／Ｐ比（Ｎ／Ｐは、ＲＮＡのリン酸塩基に対するＬＴＲのアミノ基のモル比の略）であり、約４〜１２、好ましくは約６〜１０、好ましくは約９〜１１、より好ましくは約８である。
【０１５６】
特に、脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）のような細胞をトランスフェトする場合、そのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲがおよそ５〜３５μｇ、１０〜３０μｇ、１５〜２５μｇ、１７〜２３μｇ、１８〜２２μｇ、または１９〜２１μｇの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比である。同様に、特に、（例えば後述の実施例にあるように）ＬＴＲがＬＴＲ溶液として調製された場合、そのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲ溶液が４〜６μｌ、４．５〜５．５μｌ、または４．７〜５．３μｌの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい比は（これにより高度に効果的かつ効率的なＡＭＳＣのトランスフェクションがもたらされる）、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲが約２０μｇであるＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比、および／または上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲ溶液が約５μｌであるＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比である。好ましいＬＴＲおよび／またはＲＮＡについて上述した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０１５７】
特に、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭＳＣ）のような細胞をトランスフェトする場合、そのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲがおよそ４〜１２μｇ、５〜１１μｇ、６〜１０μｇ、または７〜９μｇの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比である。同様に、特に、（例えば後述の実施例にあるように）ＬＴＲがＬＴＲ溶液として調製された場合、そのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲ溶液が１〜３μｌ、１．５〜２．５μｌ、または１．７〜２．３μｌの範囲にあるＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい比は（これにより高度に効果的かつ効率的なＢＭＳＣのトランスフェクションがもたらされる）、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲが約８μｇであるＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比、および／または上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＬＴＲ溶液が約２μｌであるＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比である。好ましいＬＴＲおよび／またはＲＮＡについて上述した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０１５８】
別のそのような特定の比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＭＰが、０．０５〜５μｇ、０．０５〜３μｇ、０．０５〜１μｇ、０．０７〜５μｇ、０．１〜５μｇ、０．１〜１μｇ、０．２〜０．８μｇ、０．３〜０．７μｇ、または０．４〜０．６μｇ（鉄重量）の範囲にあるＲＮＡに対するＭＰの鉄重量／重量比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき上記ＭＰが約０．５μｇであるＲＮＡに対するＭＰの鉄重量／重量比である。この文脈では、好ましいＭＰはSO-Mag6-115ＭＰ（またはより好ましくはＭＮＰ）である。好ましいＲＮＡはＢＭＰ‐７であり、より好ましいのはＢＭＰ‐２・ＲＮＡである。
【０１５９】
別のそのような特定の比は、上記ＬＴＲ約１２〜２０μｇにつき（好ましくは約１６μｇにつき）上記ＭＰが、およそ０．０５〜５μｇ、０．０５〜３μｇ、０．０５〜１μｇ、０．０７〜５μｇ、０．１〜５μｇ、０．１〜１μｇ、０．２〜０．８μｇ、０．３〜０．７μｇ、または０．４〜０．６μｇ（鉄重量）の範囲にあるＬＴＲに対するＭＰの鉄重量／重量比である。同様に、特に、（例えば後述の実施例にあるように）ＬＴＲがＬＴＲ溶液として調製された場合、そのような特定の比は、上記ＬＴＲ溶液４μｌにつき上記ＭＰが０．０５〜５μｇ、０．０５〜３μｇ、０．０５〜１μｇ、０．０７〜５μｇ、０．１〜５μｇ、０．１〜１μｇ、０．２〜０．８μｇ、０．３〜０．７μｇ、または０．４〜０．６μｇ（鉄重量）の範囲にあるＬＴＲ溶液に対するＭＰの鉄重量／容積比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい比は、上記ＬＴＲ約１２〜２０μｇにつき（好ましくは約１６μｇにつき）上記ＭＰが約０．５μｇであるＬＴＲに対するＭＰの鉄重量／重量比、および／または上記ＬＴＲ溶液４μｌにつき上記ＭＰが約０．５μｇであるＬＴＲ溶液に対するＭＰの鉄重量／容積比である。この文脈では、好ましいＭＰはSO-Mag6-115ＭＰ（またはより好ましくはＭＮＰ）である。好ましいＬＴＲはDreamFect（商標）であり、より好ましいのはDF-Gold（商標）またはC12-(2-3-2)である。
【０１６０】
さらに、そのような特定の比は、上記ＭＰが０．０５〜５μｇ、０．０５〜３μｇ、０．０５〜１μｇ、０．０７〜５μｇ、０．１〜５μｇ、０．１〜１μｇ、０．２〜０．８μｇ、０．３〜０．７μｇ、または０．４〜０．６μｇ（鉄重量）：上記ＬＴＲが１〜４０μｇ、５〜３５μｇ、１０〜３０μｇ、 １５〜２５μｇ、１７〜２３μｇ、１８〜２２μｇ、１９〜２１μｇ、１〜２０μｇ、２〜２０μｇ、３〜２０μｇ、１〜１５μｇ、２〜１５μｇ、３〜１５μｇ、１〜１０μｇ、２〜１０μｇ、３〜１０μｇ、４〜１０μｇ、５〜１０μｇ、４〜１２μｇ、５〜１１μｇ、６〜１０μｇ、または７〜９μｇ：上記ＲＮＡが０．１〜１０μｇ、０．１〜７μｇ、０．１〜４μｇ、０．４〜１０μｇ、０．７〜１０μｇ、０．７〜４μｇ、０．８〜３μｇ、０．９〜２μｇ、０．５〜１．５μｇ、または０．７〜１．３μｇの範囲にあるＭＰ：ＬＴＲ：ＲＮＡの鉄重量／重量／重量比である。同様に、特に、（例えば後述の実施例にあるように）ＬＴＲがＬＴＲ溶液として調製された場合、そのような比は、上記ＭＰが０．０５〜５μｇ、０．０５〜３μｇ、０．０５〜１μｇ、０．０７〜５μｇ、０．１〜５μｇ、０．１〜１μｇ、０．２〜０．８μｇ、０．３〜０．７μｇ、または０．４〜０．６μｇ（鉄重量）：上記ＬＴＲ溶液が０．４〜４０μｌ、０．４〜２０μｌ、０．４〜１０μｌ、０．８〜４０μｌ、２〜４０μｌ、２〜１０μｌ、２〜８μｌ、２〜６μｌ、または３〜５μｌ：上記ＲＮＡが０．１〜１０μｇ、０．１〜７μｇ、０．１〜４μｇ、０．４〜１０μｇ、０．７〜１０μｇ、０．７〜４μｇ、０．８〜３μｇ、０．９〜２μｇ、０．５〜１．５μｇ、または０．７〜１．３μｇの範囲にあるＭＰ：ＬＴＲ溶液：ＲＮＡの鉄重量／容積／重量比である。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい比は、上記ＭＰが約０．５μｇ：上記ＬＴＲが約１２〜２０μｇ（好ましくは約１６μｇ）：上記ＲＮＡが約１μｇであるＭＰ：ＬＴＲ：ＲＮＡの鉄重量／重量／重量比、および／または上記ＭＰが約０．５μｇ：上記ＬＴＲ溶液が約４μｌ：上記ＲＮＡが約１μｇであるＭＰ：ＬＴＲ溶液：ＲＮＡの鉄重量／容積／重量比である。好ましいＬＴＲ、ＲＮＡ、および／またはＭＰについて上述した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０１６１】
本発明にしたがって用いられるＬＴＲ溶液の濃度は、１μｌにつきＬＴＲが約０．１〜１０、０．５〜８、１〜７、２〜６、３〜５、または１〜２μｇの範囲としてもよい（より狭い範囲のものが好ましい）。限定はしないが、特定の濃度の例として、１μｌにつきＬＴＲが０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、または８μｇのものが挙げられる。１μｌにつきＬＴＲが２または４μｇだと好ましい。
【０１６２】
本発明の文脈で用いられる複合体の形成は、ＲＮＡ濃度が例えば約５０μｇ／ｍｌ〜約３５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１００μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５０μｇ／ｍｌ〜約２５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２００μｇ／ｍｌのときに生じ得る。
【０１６３】
ＲＮＡによってコードされるタンパク質の安定的かつ適切な発現を実現するには、十分なＲＮＡが所望の細胞に辿り着くことが重要である。これと、ゆえにトランスフェクションの効率性は、ラベルしたＲＮＡの投与後、細胞に辿り着いたＲＮＡの内容がラベリングの計測によって測定してもよい。ラベリングの測定にはフローサイトメトリーを用いることができる。蛍光分子を用いてラベリングを実行した場合、トランスフェクション効率は、細胞集団のパーセンテージなどとして算出することができ、ＰＢＳで処理されただけの対照細胞と比べて蛍光強度が高い。本発明にしたがって用いられたＲＮＡは効果的に生成することができ、トランスフェクション効率もが高い。
【０１６４】
翻訳効率により、ＲＮＡがタンパク質に翻訳される効率が指定される。翻訳効率が高いほど、治療に使わなくてはならないＲＮＡの投与量を減らすことができる。翻訳効率は、用いられるＲＮＡに対する翻訳の割合と対照ＲＮＡに対する翻訳比を比べることによって測定することができる。原則的には、本発明で用いられるＲＮＡを使用した場合の翻訳効率はいくらか低い可能性がある。しかしながら、これは、タンパク質発現の持続期間に示されるはるかに高い安定性によって十分に補償されうる。
【０１６５】
原則的には、本発明の活性化合物／医薬組成物の投与計画は、臨床学的因子などに基づいて主治医が決定することができる。医療分野で知られているように、任意の一患者に対する投薬は、患者の大きさ、体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間と経路、全体的な健康状態などの多くの因子と、同時投与されうる他の薬とに依存する。しかしながら、当業者／主治医であれば、（治療上）効果的な濃度および／または投与量を、例えば、インビボまたはエキソビボで容易に導き出すことができる。骨などから（例えば適したプローブによって）対応試料を採種し、活性化合物（ＢＭＰおよび／または適したマーカー）を検出し、それらに対応する濃度を上記試料中で例えばＨＰＬＣによって測定してもよい。
【０１６６】
活性化合物濃度の測定は、実験動物や非ヒト・トランスジェニック動物（例えばトランスジェニック・ネズミ、ラット、ブタなど）のような動物のみならず、人間の患者、健康な（人間の）個人においても得ることができる。骨などにおける活性化合物濃度の測定は、（健康な）ボランティアに対して例えば導き出して、（人間の）患者のための対応する投与計画を作成してもよいことが想定される。例えば、用量依存性（例えば投与用量対骨の様々な領域で検出された濃度／投与量）は、本分野で既知の標準的な方法で測定してもよい。別の方法では、限定はしないが、ラベリングしたペプチドをインビボで検出するか（例えば、放射性ラベリングや蛍光ラベリングのような対応するラベリング技術によって）、または生理学的／生化学的アッセイが行われる。骨のある一部において活性化合物の所望濃度を得るために投与される活性化合物の用量はこのように導き出してもよい。そのような濃度を導き出すためのこれらの方法または他の方法も本分野では既知である。
【０１６７】
特に、本発明にしたがってトラスフェクトされるＲＮＡの適した用量（例えば１細胞当たりのμｇＲＮＡ）は当業者であれば容易に設定することができる。要領は例えば参考文献２２、２３、国際公開第０２／００８７０号パンフレット、および後述の実施例に記載されている。
【０１６８】
各場合に用いられる用量は、ＢＭＰ・ＲＮＡが果たさなければならない機能に依存する。上述したように、ＲＮＡ活性の持続期間は熟考の上調整することができる。用量および／または治療の継続期間も特定の徴候に依存しうる。例えば、ＢＭＰ遺伝子の欠陥に起因する骨疾患の長期治療にＲＮＡを使用する場合は、活性の継続期間は可能な限り長期にわたることになる。一方、他の徴候がある場合は、熟考の上、適した期間に調整することもできる。各場合における用量はそのように設定してもよい。
【０１６９】
しかしながら、既に述べたように、ある特定の用量を採用すると非常に有用であること、特に、高度に効果的かつ／または効率的なトランスフェクションを得られること、が本発明の文脈において見出された。
【０１７０】
トランスフェクトされるＲＮＡのそのような特定の用量は、（トランスフェクトされる）１細胞につきＲＮＡが０．５〜１００ｐｇ、０．５〜７０ｐｇ、０．５〜４０ｐｇ、５〜１００ｐｇ、１０〜１００ｐｇ、１〜５０ｐｇ、５〜４０ｐｇ、１０〜３０ｐｇ、または１５〜２５ｐｇの範囲にある。原則的にはより狭い範囲のものが好ましい。最も好ましい用量は、（トランスフェクトされる）１細胞につきＲＮＡが約２０ｐｇという用量である。上記（範囲の）用量は、ＲＮＡがエキソビボまたはインビトロで（細胞または組織に）送達される場合に特に有用である。
【０１７１】
一態様では、本発明の医薬組成物はマトリクスまたは足場（本明細書の別の箇所および本分野では「キャリア」とも称される）を含む。この態様では、用いられるＲＮＡはキャリアに既に添加されているか、またはキャリア内／上に既に配合されていることが特に想定される。より具体的には、本発明の医薬組成物には、キャリアと本明細書に記載される複合体の組み合わせが含まれることが想定されており、この組み合わせは、用いられるＲＮＡを含み、かつ上記と同様にキャリアに既に添加されているか、またはキャリア内／上に既に配合されていてもよい。言い換えると、ＲＮＡはこの複合体の形態でキャリア内／上に配合されるか、または既に添加されていることが想定される。本明細書の別の箇所で複合体およびＲＮＡについて記載される内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０１７２】
本発明の文脈では、キャリアは、変換／トランスフェクトされる細胞または組織とインビボ、エキソビボ、またはインビトロで接触可能な物体または物質である。キャリアは、本発明にしたがって用いられるＲＮＡを運搬し、かつ任意で、変換／トランスフェクトされる細胞がキャリアに播種されることが想定される。それゆえ、本明細書に記載されるように、ＲＮＡは複合体に含まれることが特に想定される。本発明にしたがって用いられるキャリアは本分野で既知であり、例えば特許文献１や参考文献１０〜１２に記載されている。ＲＮＡに加え、キャリア内／上には、小分子および／またはサイトカインなどのような化合物も配合してよい。これは、例えば、（キャリア内に）播種される細胞の移動を増強し、かつ／またはトランスフェクションの有効性を向上させうる。
【０１７３】
キャリアは密着して結合する材料、すなわち固体物質、特に好ましくは、ゲル、スポンジ、ホイル、粉末、顆粒、または筋膜などのプラスチックまたは変形可能な固形物質であってもよい。キャリアは、生物学的に非吸収性または好ましくは生物学的に再吸収性を有する材料からなりうる。
【０１７４】
キャリアは、好ましくはＲＮＡの存在下で、本発明に係る（コ）ポリマーの架橋反応によって生成されたキャリアであってもよい。したがって、例えば、本発明に係る架橋されたポリマーにおいて、化学的に修飾されていてもいなくてもよい既知の遺伝子ベクター（裸のＲＮＡ、リポプレックス、ポリプレックス等）を導入する可能性がある。この目的で、水性溶媒中または有機溶媒中で架橋反応を引き起こす薬剤を加えることにより、オリゴヌクレオチド等の遺伝子ベクターの存在下で例えばインサイチュで架橋反応が生じる。架橋剤の性質はコポリマーの構造に依存する。したがって、例えばポリマー骨格（特許文献１の図２に例えば示されるように）は、システイニル‐、システインまたは非アミノ酸様ジチオール等のジチオールを加えることによって架橋することができる。カルボン酸を含む（コ）ポリマーの架橋は、カルボン酸が活性化している間に任意のジアミンを加えることによって生じさせることができる（例えばインサイチュでの活性化エステルに対するカルボン酸の反応）(Nathan et al. Macromolecules 25 (1992), 4476-4484)。一級または二級アミンを有するポリマー骨格は、例えば、活性化ジカルボン酸を加えることによって生じさせることができる。架橋後、調製物は膜が形成するまで乾燥させることができる。
【０１７５】
生物学的に非再吸収性の材料の一例としてシリコン（例えばカテーテル用）が挙げられる。しかしながら、移植して体内に導入することができ、かつ／または例えば形成手術で既に用いられている、別の生物学的に非再吸収性の材料を用いることも可能である。それらの例として、ＰＴＦＥ（例えば血管置換用）、ポリウレタン（例えばカテーテル用）、金属材料（例えば医療用スチール、内部人工器官用のチタン合金、血管支持体として用いられる金属メッシュ（ステント））が挙げられる。
【０１７６】
キャリアは生物学的に再吸収性の材料であることが好ましい。その例としては、（例えばトロンビンまたはフィブリノゲンから生成される）フィブリン接着剤またはフィブリン塊、キチン、オキシセルロース、ゼラチン、ポリエチレングリコールカーボネート、例えばポリ乳酸やポリグリコール酸などの脂肪族ポリエステル、ポリアミドおよびポリウレタンまたはポリエーテルのようなそれに由来するアミノ酸化合物、ならびに対応する混合重合化物である。さらに、任意の他の生物学的に分解可能なポリマー、特にヒドロゲルに基づくいわゆる自己硬化性接着剤をキャリアとして用いることができる。特に、体内で酵素的にかつ／または加水分解プロセスによって分解することができる任意の材料が、生物学的に再吸収性の材料として適している。それらの例として、また、生体再吸収性を有する化学的に定義された硫酸カルシウム、燐酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ無水物、精製蛋白質または部分精製細胞外マトリクスからなるキャリアが挙げられる。キャリア・コラーゲンが特に好ましく、特に、例えばシグマ社またはコラーゲンコーポレーション社によって販売されている軟骨および皮膚コラーゲンから生成されたコラーゲンマトリクスが好ましい。コラーゲンマトリクス生成の例は、例えば米国特許第４,３９４,３７０号および第４,９７５,５２７号に記載されている。キャリアはフィブリン、特にフィブリン塊とすることもできる。
【０１７７】
キャリアは、コラーゲンに由来することが非常に好ましく、特にコラーゲンスポンジであることが好ましい。コラーゲンスポンジは本分野で既知であり（例えば特許文献１、Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752、Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002、Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825）、例えば、Resorba社（ドイツ国、ニュルンベルク）の「KOLLAGEN resorb（商標）」として購入することができる。
【０１７８】
一般的に、グルコサミノグリカンのよう負電荷を持つ多糖類は、イオン的相互作用によってコラーゲンに結合する。結合は、コラーゲン細繊維における正電荷を持つアミノ酸（リジン、ヒドロキシリジンおよびアルギニン）に、またはカルシウムのような二価陽イオンによって媒介されると負電荷を持つアミノ酸にも生じうる。さらに、コラーゲンのイオン結合特性には、酸またはアルカリ溶液による前処理およびその後の凍結乾燥によって意図的に影響を及ぼすことができる。コラーゲン化学における既知のこれらの技術によって、本発明に係るＲＮＡ（例えば本明細書に記載する複合体）の懸濁液を用いてコラーゲン材料を浸漬して、本発明にしたがって用いられるキャリア材料としてのコラーゲンとＲＮＡとＲＮＡ複合体との間にイオン結合を生成することが可能になる。
【０１７９】
コラーゲンにおいて、正電荷を持つアミノ酸は短いカチオン部分に濃縮されない。しかしながら、キャリアのそのような構造的特徴は、ＲＮＡの効率的な結合には有益である。キャリア材料とのより強固な結合を実現するために、ペプチド（Plank et al. Human Gene Therapy 10 (1999), 319-333）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン物質結合ＲＮＡを用いてコラーゲンを誘導体化することができる。この目的で、コラーゲンスポンジを例えば二官能能カップリング試薬であるスクシニミジル・ピリジル・ジチオプロピオネート（succinimidyl-pyridyl-dithiopropionate：ＳＰＤＰ）によって修正する。ポリエチレンイミンはイミノチオランによって誘導体化され、これによりチオール基の導入が生じる。カップリング対象のカチオン性ペプチドは、Ｃ末端にシステインを有する。チオール基はジスルフィド架橋を形成することによってＳＰＤＰで誘導体化されたコラーゲンスポンジと反応する。そのようにして得られたスポンジ誘導体は、ＲＮＡに強固に結合するはずであり、ＲＮＡの放出は所望の長時間の遅れをもって生じると予想される。
【０１８０】
本発明にしたがって用いられる、ＲＮＡが配合されたマトリクス／足場（すなわちキャリア）を生成するために、例えば、乾燥（コラーゲン）材料を、約５％、好ましくは約２％グルコースの凍結乾燥保護剤溶液中でＲＮＡ／（ポリマー）複合体と共に培養することができる。次いで、配合が行われたキャリア、例えばスポンジを凍結乾燥および／または真空乾燥してもよい。
【０１８１】
一般に、本発明に係るＲＮＡ配合キャリアは、対応するキャリアを、特に本発明に記載する複合体に含まれるようにＲＮＡと接触させることによって生成することができ、キャリアは、ＲＮＡまたは複合体が好ましくは遅れて再放出されるように、ＲＮＡもしくは複合体を吸収する、またはＲＮＡもしくは複合体と結合する。対応する方法は、当業者に既知である（Bonadio et al. (1999), Nat. Med. 5(7): 753-759、Shea, L.D. et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17(6): 551-554）。例えば、本明細書では、キャリアとしてのコラーゲンスポンジまたはフィブリン塊とＲＮＡ／ＬＴＲ複合体の組み合わせの生成を記載する。
【０１８２】
原則的には、本発明にしたがって用いられるＲＮＡは、任意の適した送達／投与経路またはモードによって送達／投与することができる。
【０１８３】
本発明にしたがって用いられるＲＮＡは、ＲＮＡによってコードされたタンパク質またはタンパク質断片を必要とする、例えば遺伝子欠陥に起因する疾患を患う患者にそれ自体が知られている手法で投与してもよい。このため、ＲＮＡは、一般的な薬学的忍容性のある添加剤を含む医薬品として製造してもよい。医薬品の形態は投与箇所および性質に依存する。一態様では、本発明に用いられるＲＮＡは安定性が非常に高いという特徴を有するため、使用される箇所および形態に応じて様々な方法で製造することができる。例えば、ＲＮＡを凍結乾燥させてこの形態で（例えば破砕または粉砕）処理および保存して、その後必要な時に再構成され、ＲＮＡの生物活性は維持される。
【０１８４】
一態様では、本発明の医薬組成物（またはそれに含まれるＲＮＡ）は、遺伝子治療によって送達／投与されるか、または遺伝子治療用に調製される。特に、遺伝子治療は、転写治療、より具体的には転写置換治療であると想定されている。
【０１８５】
ＲＮＡは、例えばキャリアに（例えば複合体として）配合した場合、インビボまたはエキソビボで送達／投与してもよい。送達／投与の適した経路またはモードは本分野で既知であり、例えばMitragotri (Nat Rev Drug Discov 13(9) (2014), 55-72)、Tavernier G (Journal of Controlled Release 150, 2011, 238-247)、およびYin (Nat Rev Genet 15(8) (2014), 541-55)に記載されている。例えば、ＲＮＡは、例えばキャリアに（例えば複合体として）配合された場合、細胞内に、好ましくは高等真核生物の細胞内に、好ましくは脊椎動物の細胞内に、特には哺乳類の細胞内に、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで導入することができる。本発明によれば、記載する手段および方法は、インビボおよびエキソビボの送達／投与方法の文脈において特に有用であることが実証された。
【０１８６】
一態様では、ＲＮＡはインビトロで送達／投与してもよい。この態様によれば、ＲＮＡ（またはＲＮＡを含む医薬組成物）は、インビボでの送達／投与用に調製してもよいし、かつ／またはインビボで送達／投与される。
【０１８７】
インビボでの使用に関連して、例えばキャリアに（例えば複合体として）配合したＲＮＡを、スポンジまたは塊などの形態で、または関節置換術などのコーティングとして、または内部人工器官として、移植片として直接導入することが例えば可能である（例えば、組織の組み込みを向上させるため）。さらに、コーティングした材料の加工は、一般的な組織接着剤系（例えばフィブリン接着剤）によって生物において意図的に導入され、固定され、デポーの形で有効となる（トランスフェクション）粉末の形態で可能となる。
【０１８８】
特に、ＲＮＡは患者の組織内、特に、骨成長、骨再生、骨成形、骨形成、骨化などの誘導が望まれる組織内、またはその近傍に送達／投与されることが想定される。そのような組織は例えば骨組織自体であってもよい。したがって、ＲＮＡは患者の骨内部または骨組織内部に直接送達／投与してもよい。例えば、ＲＮＡは骨欠損部またはその近傍に直接適用してもよい。組織は例えば筋肉組織のような他の組織であってもよい。そのような場合、例えば異所性骨形成がＲＮＡによって誘導されうる。これらの目的およびインビボでの送達／投与における他の目的で、例えば本明細書に記載する複合体の形態のＲＮＡは、本明細書で既に記載したマトリクスまたは足場、すなわちキャリア（例えばコラーゲン／コラーゲンスポンジ、フィブリン／フィブリン塊、チタン膜、ヘパリン・キトサンマトリクス、ヒドロキシアパタイト）に添加または配合してもよい。これは移植前に行われることが特に想定される。しかしながら、ＲＮＡはマトリクスまたは足場を用いずに送達／投与してもよい。原則的には、骨疾患（例えば骨欠損または骨折）の治療（予防または治癒）に対するＲＮＡの（直接）利用は、例えば組み換え型ｈＢＭＰ‐２および組み換え型ｈＢＭＰ‐７のような組み換え型タンパク質の（直接）投与における手順と同じ手順を用いて行ってもよい（例えばKatanec, Coll Antropol 38(1) (2014), 325-30、Cicciu, Open Dent J 6 (2012), 51-5、Docherty Skogh, Plast Reconstr Surg 123(6) (2009), 192e-3e、Baltzer, Orthop Rev (Pavia) 4(1) (2012), e4、Heliotis M, Int J Oral Maxillofac Surg 35(3) (2006), 265-9、van den Bergh JP, J Clin Periodontol 27(9) (2000), 627-36)参照）。ＲＮＡは、骨セメントまたは骨充填材に添加してもよい。この文脈では、ペイスト状の製品を生成してもよい。これは骨欠損にも利用してよい。原則的には、ＲＮＡは、例えばマトリクスまたは足場を用いずに、骨内部に直接注入してもよい。しかしながら、マトリクスまたは足場を用いた直接注入も原則的には可能である。
【０１８９】
別の態様では、エキソビボでＲＮＡを送達／投与してもよい。この態様によれば、ＲＮＡ（またはＲＮＡを含む医薬組成物）は、エキソビボでの送達／投与用に調製してもよいし、かつ／またはエキソビボで送達／投与される。例えば、ＲＮＡは、患者に導入される細胞（例えば骨細胞）、すなわちトランスフェクトされた（遺伝子的に修飾された）形態で患者に導入されうる細胞にエキソビボで送達／投与してもよい。一具体的実施形態では、ＲＮＡは、患者の細胞（例えば骨細胞）にエキソビボで送達／投与され、このＲＮＡが送達／投与された細胞は、上記患者すなわち同じ患者に再導入される。すなわち、ＲＮＡが送達／投与された細胞は、トランスフェクトされた（遺伝子的に修飾された）形態で上記患者に再導入してもよい。したがって、一つの好適な実施形態では、細胞はまさに治療を受ける患者自身に由来する。
【０１９０】
患者に（再）導入される細胞は、この目的に適した任意の細胞としてよい。細胞は例えば骨芽前駆細胞であってもよい。細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であってもよく、例えば筋肉由来の間葉系幹細胞（ＭＭＳＣ）、または好ましくは脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）または骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭＳＣ）であってもよい。
【０１９１】
エキソビボでの送達／投与のより具体的な実施形態では、ＲＮＡ（またはＲＮＡを含む医薬組成物）は、自家組織移植片による送達／投与用に調製される、かつ／または自家組織移植片によって送達／投与される。自家組織移植片、特にそれに含まれる細胞は、本明細書に記載される手段および方法にしたがってトランスフェクトされ、ゆえに遺伝子的に修飾される、すなわち、本発明に係るＲＮＡ（またはＲＮＡを含む医薬組成物）のエキソビボでの送達／投与の結果として１種類または複数種類の本明細書に記載されるＢＭＰを発現することが特に想定される。より具体的には、自家組織移植片、特にそれに含まれる細胞は、本発明にしたがってトランスクフェクトされる、すなわち、１種類または複数種類の本明細書に記載されるＢＭＰ・ＲＮＡとそのトランスフェクト手段および方法とによってトランスフェクトされることが想定される。本明細書の別の箇所でこれらの手段および方法について記載した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０１９２】
本発明にしたがって用いられる自家組織移植片には、前駆細胞を含めてもよい。骨芽前駆細胞が含まれることが特に想定される。自家組織移植片には、筋肉細胞または（ＡＭＳＣのような）脂肪細胞を含めてもよい。自家組織移植片には、例えば骨芽細胞、破骨細胞、および／または骨細胞（osteocyte）のような骨細胞を含めてもよい。具体的な態様では、自家組織移植片は骨組織パルプであるか、または骨組織パルプを含む。骨組織パルプには、本明細書で定義される任意の（骨）細胞、特に、本発明にしたがってトランスフェクトされるまたはされた、すなわち、ＢＭＰを発現するために本発明にしたがって遺伝子的に修飾されるまたはされた本明細書で定義される任意の（骨）細胞を含めてよい。
【０１９３】
原則的には、ＢＭＰ・ＲＮＡをエキソビボで送達／トランスフェクトするための適した手段および方法は本分野で既知であり、また後述する実施例からも明らかである。しかしながら、本発明の一具体的実施例の文脈では、ＢＭＰ・ＲＮＡはOpti-MEM培地（Gibco（商標）、Invitrogen社、米国、カリフォルニア州）において送達／トランスフェクトされる。既に述べたように、この種の送達／トランスフェクション培地を用いた場合、非常に良好な送達／トランスフェクション有効性が達成された。
【０１９４】
これもまたエキソビボで送達／投与する目的で、例えば複合体の形態でのＲＮＡは、マトリクスまたは足場に、すなわち本明細書で既に記載したキャリア（例えばコラーゲン／コラーゲンスポンジ、フィブリン／フィブリン塊、チタン膜、ヘパリン・キトサンマトリクス、ヒドロキシアパタイト）に添加または配合してもよい。
【０１９５】
この文脈において、キャリア／キャリア体には、第１工程では、ＲＮＡまたは好ましくはＲＮＡ複合体が予備配合され、任意で乾燥され（例えば真空乾燥および／または凍結乾燥）、第２工程では、ＲＮＡが送達／投与（例えばトランスフェクト）される細胞が播種される。
【０１９６】
乾燥目的で、適した濃度（例えば約１％〜約６％、好ましくは約２％〜約５％、または特には約５％、約３％、または最も好ましくは約２％濃度）の凍結乾燥防止剤（例えばスクロース）をＲＮＡ／ＲＮＡ複合体に加えてもよい。
【０１９７】
ＲＮＡ配合キャリアにおけるトランスフェクション有効性および／または細胞生存率を（例えば後述の実施例に記載されるように）モニタリングしてもよい。この点において働きが弱いキャリアは仕分けしてもよい。
【０１９８】
ＲＮＡ配合キャリアを、特に良好な働きを示す場合は、患者に投与してもよい。原則的には、次いで、本明細書に開示されるエキソビボでの目的の文脈においてＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を、インビボでの目的に関連して本明細書で既に記載したのと同じやり方で、好ましくは該細胞が配合されたマトリクス／足場とともに送達／投与してもよい。例えば、細胞は患者の組織内、特に、骨成長、骨再生、骨成形、骨形成、骨化などの誘導が望まれる組織内、またはその近傍に投与してもよい。この組織もまた骨組織自体であってもよいが、筋肉組織のような他の組織でもよい。一特定態様では、骨欠損内に、または骨欠損に隣接する部位に直接配置／移植してもよい。
【０１９９】
上記のＲＮＡ配合キャリアと、その送達／投与および生成の手段および方法は、自家組織移植、特に本明細書に記載される自家組織移植において特に有用である。この点について本明細書の他の箇所で述べた内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。特に、キャリアには、例えば骨芽前駆細胞のような前駆細胞、例えば骨芽細胞、破骨細胞、および／または骨細胞（osteocyte）のような骨細胞、ＭＭＳＣまたはＡＭＳＣ等のようなＭＳＣを播種してもよい。
【０２００】
本明細書に記載されたＲＮＡ配合キャリアは、持続性かつ／または遅延性ＲＮＡ送達において特に有用であり、例えば、ＲＮＡ送達のデポーおよび（持続性／遅延性）ＲＮＡ送達系として有用である。上記キャリアは原則的にはインビボ、インビトロ、およびエキソビトロでの送達／投与に適用されるが、特には本明細書に記載されるインビボでの送達／投与の目的に適用される。
【０２０１】
持続性／遅延性送達の意味は本分野で既知であり、本発明の文脈において個々適用される。例えば、持続性／遅延性ＲＮＡ送達は、特に、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヵ月の期間にわたって薬学的に有効な量のＲＮＡを送達することとしてもよい。原則的には長期間であるほど好ましい。
【０２０２】
当業者であれば、本発明の観点に適したＲＮＡ配合キャリア／キャリア体を容易に生成することができる。この目的で、当業者は本分野で既知の手段および方法（Chevally, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218）と、本明細書および後述の実施例に記載した手段および方法を利用してもよい。例えば、当業者であれば上記方法における工程を適用することができる。例えば、ＲＮＡ配合キャリアを本明細書に記載されたインビボでの送達／投与の目的で生成する場合は、細胞播種の工程（およびおそらくそれに関連する工程）を省略してもよい。本発明は、ＲＮＡ配合キャリアを生成するための手段および方法にも関する。
【０２０３】
例えば、本発明に係るＲＮＡまたはキャリア／キャリア体に配合されたＲＮＡの量は、１キャリア／キャリア体につき、約０．１μｇ〜約１０μｇ、好ましくは約０．５μｇ〜約８μｇ、好ましくは約１μｇ〜約６μｇ、好ましくは約１．５μｇ〜約５μｇ、最も好ましくは約２μｇ〜約３．５μｇの範囲であってもよい。キャリア／キャリア体に播種される細胞の量は、例えば、１キャリア／キャリア体につき、約５，０００〜約５０，０００個、好ましくは約７，５００〜約４０，０００個、好ましくは約１０，０００〜約３０，０００個としてもよい。特定の例としては、１キャリア体につき、約１０，０００個、約２０，０００個、および約３０，０００個が挙げられる。
【０２０４】
限定的な例ではないが、上記値は、本発明の文脈において例示されるキャリア体に特に適用される（すなわち直径５〜７ｍｍ、厚さ約１〜２ｍｍ、容積おおよそ約５０ｍｍ３）。本発明で用いられるキャリア体は、治療対象である骨破片などの形と直径に応じて、例えば、直径約１ｍｍ〜数センチメートル（例えば直径約５ｃｍ）、厚さ約２ｍｍ〜２ｃｍのディスク体としてもよい。これはおおよそ容積数ｍｍ３〜ｃｍ３と見積もられる、原則的には、キャリア体の形状（例えばディスク形状）は、例えば、骨破片の形状に適合させてもよいし、またはそうでなければ適した形状としてもよい。例えば、円形ではなく不規則な形状であってもよい。
【０２０５】
一般に、キャリア体（例えば（コラーゲン）スポンジ）はその特定の用途に適合させてもよい。例えば、その形状は、治療対象の骨破片、骨傷害、骨空洞（例えば骨破片、骨損傷、（歯）嚢胞などによって生じる）、骨損傷などに適合させてもよい。一態様では、キャリア体の形状は骨破片／骨空洞に適合することが想定される。言い換えると、キャリア体の形状は骨破片／骨空洞と同じであってもよい。特に、キャリア体は、いったん骨の損傷部位（例えば骨破片／骨傷害）内に／近傍に移植されると、骨の残余部分とともに骨の元の形状に似通ることが想定される。
【０２０６】
典型的にはキャリア体は圧搾可能である（例えば（コラーゲン）スポンジ）。したがって、キャリア体の当初の形状は、治療対象の骨破片や骨空洞等と比べていくらか膨らんだ状態にあるが、移植後に骨の元の形状に似通るよう、骨破片や骨空洞などの形状に合わせて圧搾されうる。
【０２０７】
また、これらの態様について、キャリア体は例えば（例えば本明細書に記載するような）コラーゲンスポンジまたはフィブリン塊としてもよい。当業者／主治医であれば、あるキャリア体に配合するＲＮＡおよび／または細胞の量などは容易にそのキャリア体に適合させることができる。
【０２０８】
さらなる実施形態では、ＲＮＡは、例えば移植片のコーティング用のキャリアとして、遅延放出性ポリマー中に含まれる。この目的で、ＲＮＡはそのように用いてもよいし、または例えばコーティングポリマーおよび／またはポリマー複合体で保護されたＲＮＡとして用いてもよい。
【０２０９】
しかも、移植片はＲＮＡを投与する際の別の選択肢である。移植片の表面には、例えばその移植片が内方成長するための有益な因子として、ＢＭＰをコードするＲＮＡを含む遅延放出性ポリマーのコーティングを施してもよい。本発明によれば、１因子（ＢＭＰ）のみをコードする（ｍ）ＲＮＡを含むコーティングと、いくつかの因子（ＢＭＰ）をコードする（ｍ）ＲＮＡを含むコーティングの両方が想定される。時差式で放出される様々な因子（ＢＭＰ）も含めてもよい。
【０２１０】
「１種類または複数種類の因子（ＢＭＰ）をコードするＲＮＡ」という表現は、個別の形態で、または融合タンパク質として、２種類以上のタンパク質をコードするＲＮＡ配列と、様々な（ＢＭＰ）タンパク質をコードする様々なＲＮＡ配列の組み合わせ（その場合、各ＲＮＡ配列が１つのタンパク質をコードする）との両方を意味すると理解されるべきである。
【０２１１】
本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡは、移植されたプロテーゼの内方成長を促進するために用いられると有利となりうる。プロテーゼの表面に、義歯、臀部内プロテーゼ、膝内プロテーゼ、または脊椎融合体などを挿入可能な場合、本発明にしたがって用いられる（ｍ）ＲＮＡが、内方成長および新たに挿入されたプロテーゼに必要な他の機能を促進することができるＢＭＰを放出するようにしてもよい。したがって、例えば、プロテーゼの移植という文脈におけるＢＭＰ‐２やＢＭＰ‐７等の成長因子等の生物学的に活性な物質の投与、またはその後の処置は、本発明にしたがって適用してもよい。この実施形態では、本発明にしたがって用いられるＢＭＰをコードするＲＮＡは、ＲＮＡを放出するコーティングにおいて移植片に（慎重に）加え、次いで、そこから徐々に（慎重に）放出させてもよい。それにより、例えば、移植片の近傍の細胞が継続的または間欠的に生成し、必要ならば所望の因子を放出することができる。（ｍ）ＲＮＡは全身投与も可能である。望まない副作用の発生などを回避するため、遺伝子欠損による影響を受けない細胞では（ｍ）ＲＮＡ翻訳を望まない場合もありうる。コードされたタンパク質を必要とする細胞、例えば遺伝子欠損がある細胞においてのみ（ｍ）ＲＮＡが選択的に翻訳されるために、例えばリガンドを介して、影響を受ける組織のアドレス指定を可能にする配列によって対応ベクターを補足してもよい。さらなる実施形態では、標的細胞に発現しない内因性のミクロＲＮＡが結合する配列に（ｍ）ＲＮＡを含むベクターを加えてもよい。それにより（ｍ）ＲＮＡは、標的細胞では維持されつつも関連する内因性ミクロＲＮＡを含むすべての細胞においては劣化する。したがって副作用を最小限に抑えることができる。
【０２１２】
ＲＮＡを全身投与する場合、ＲＮＡは通常、毒性を調整する薬剤や安定剤などの標準的な添加剤が加えられた注入可能な液体として、好ましくは１回分の投与量単位で作製される。安定剤としては、例えば脂質、ポリマー、およびナノシステム、またはリポソームなどの通常知られているものが用いられる。好適な実施形態では、非経口的投与に適した組成物が提供される。
【０２１３】
通例生体忍容性を有する一般的なキャリア、すなわち薬学的忍容性を有する、合成、天然、または天然・合成混合ポリマー（その放出性は個別に調整することができる）は、周知であり、したがってここではこれ以上の説明は不要である。例えば、ポリラクチドまたはポリラクチド／グリコライドポリマーが用いられる。このようにして、例えば、長期間または短時間にわたって継続的・間欠的に所望の因子を選択的に所望の部位で放出することが可能になる。
【０２１４】
本発明にしたがって用いられるＲＮＡを用いると高安定性が特に得られ、これにより長期間にわたる継続的なタンパク質発現がもたらされる。例えば、遺伝子欠損に起因する骨疾患の治療または予防を意図してＲＮＡを用いる場合、ＲＮＡが細胞に残存する期間が長いほどその価値は高まりうる。ＲＮＡの分解スピードが速いほどタンパク質発現の終了も速まり、場合によってはＲＮＡをより頻繁に投与しなくてはならなくなる。反対に、細胞内に長期間留まる安定したＲＮＡならば投与の頻度は非常に少なくなりうる。本発明にしたがって用いられるＲＮＡ（特にｃｍＲＮＡ）は最大で４週間安定して発現することが確認された。したがって、これを必要とする場合、非常に長期間作用するＲＮＡを用いてもよい。したがって、最大で４週間継続するＲＮＡ発現は慢性骨疾患の治療に理想的に適している。このＲＮＡは、たまに（例えば４週間おき）、またはたった一回投与するのみでよい。
【０２１５】
この文脈において、ＢＭＰ・ＲＮＡを用いて一回治療すれば、骨関連の疾患、障害、または損傷の適切かつさらには完全な治療（または予防）を行うのに十分であるという事実が本明細書には記載されている。したがって、具体的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、一回の投与／治療用に調製され、かつ／または一度のみ／一回の治療としてのみ投与されることになる。この具体的な実施形態によれば、後続の二回目の投与／治療（または三回目以降の投与／治療）を行う必要はない。
【０２１６】
他の実施形態については、例えばＲＮＡの発現が一時的でよい場合、タンパク質の発現の持続期間は安定性に影響を与えることにより調整してもよい。用いられるＲＮＡのさらなる有益な性質は、所望の期間生じるよう、タンパク質の発現の持続期間を調節できるように、安定性によって作用の持続期間を選択的に調整できることである（上記参照）。
【０２１７】
本発明にしたがって用いられるｍＲＮＡの安定性は、それ自体が既知の方法によって測定することができる。特に適しているのは、ＲＮＡを含まない細胞と比較した場合のＲＮＡを含む細胞の生存率を測定する方法である。コードされたタンパク質（ＢＭＰ）の一定期間における生成をモニタしてもよい。ここでは、ＲＮＡの安定性は、ＲＮＡを細胞に導入した場合、所望のタンパク質を発現することができるか、あるいはタンパク質に翻訳可能なＲＮＡ、またはその機能的断片が、長い期間発現可能で有り続け、すぐに分解、不活性化されないことを意味していると理解される。
【０２１８】
したがって、細胞内のＲＮＡの安定性および生存期間を試験する方法は、ＲＮＡによってコードされたタンパク質がどのくらい長く細胞内で検出可能か、またはその機能を発揮するかを測定することからなる。この方法は実施例に記載する。したがって、例えば、レポーター分子をコードする配列を有する（ｍ）ＲＮＡと、任意で所望のタンパク質をコードするＲＮＡとを細胞内に導入することができ、所定の期間経過後、レポーター分子の存在と、任意でコードされたタンパク質とが測定される。適したレポーター分子は最新技術では周知であり、一般的に用いられるものをここでも用いることができる。好適な実施形態では、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）がレポーター分子として用いられる。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、患者、好ましくはヒト患者／ヒトが投与対象である。しかしながら、本明細書に記載される骨疾患（および関連する状態）は、例えば、ペット（例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ラット、およびマウス）、家畜類（例えば乳牛、ブタ、ヒツジ）、ウマ、ポニー、またはトリ（例えばニワトリ、シチメンチョウ、オウム）のような非ヒト動物対象／患者において治療または予防してもよい。
【０２２０】
本発明のどの医薬組成物も、使用説明書または指示リーフレットと併せて提供してもよい。使用説明書／指示リーフレットには、本発明にしたがって、本明細書に記載された疾患または障害（骨疾患）の治療または予防方法について当業者／主治医への指導を含めてもよい。特に、使用説明書／指示リーフレットには、本明細書に記載された送達／投与のモードおよび送達／投与計画（例えば送達／投与の経路、投与計画、送達／投与の期間、送達／投与の頻度）についての指導を含めてもよい。特に、使用説明書／指示リーフレットには、医薬組成物は一回の投与／治療用に調製され、かつ／または一度のみ／一回の治療としてのみ投与されるという指示を含めてもよい。使用説明書／指示リーフレットには、後続の二回目の投与／治療（または三回目以降の投与／治療）を行う必要はないという指示をさらに含めてもよい。原則的には、送達／投与のモードおよび送達／投与計画について、例えばエキソビボまたはインビボでの送達／投与、ＭＰ、ＬＴＲおよび／またはＲＮＡの比、用量について本明細書の別の箇所で述べた内容は、使用説明書／指示リーフレット中に指示として含めてもよい。
【０２２１】
本発明は、本明細書に記載および定義されるＢＭＰ・（ｃｍ）ＲＮＡにさらに関する。本明細書の別の箇所でＢＭＰおよびＲＮＡについて記載した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０２２２】
限定はしないが、本発明の（ｃｍ）ＢＭＰ／ＲＮＡの好適な例として、ＢＭＰ（例えばＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７）、またはＢＭＰの機能的断片をコードする配列を有するＲＮＡが挙げられ、このＲＮＡのシチジンの５〜５０％、７、５〜３０％、１５〜２５％、または好ましくは約２５％が化学的に修飾されたシチジン（例えば５‐メチルシチジン：ｍ５Ｃ）および／またはこのＲＮＡのウリジンの５〜５０％、７、５〜３０％、１５〜２５％、または好ましくは約２５％が化学的に修飾されたウリジン（例えば２‐チオウリジン：ｓ２Ｕ）である。
【０２２３】
一態様では、本発明は医薬組成物に関し、好ましくは本明細書に記載される複合体の形態、より好ましくは本明細書に記載されるＲＮＡが配合されたキャリアの形態をした、ＢＭＰをコードするＲＮＡ、特に上記ＢＭＰをコードするＲＮＡを含む本明細書に記載される医薬組成物に特に関する。
【０２２４】
本発明は、本明細書に記載および定義された複合体、すなわち本明細書に記載される（ｃｍ）ＲＮＡを含む、または本明細書に記載される（ｃｍ）ＲＮＡと複合体化された複合体にも関する。特に、本発明は、本明細書に記載および定義されたトランスフェクション複合体（例えばリポフェクション、マグネトフェクション、およびマグネトリポフェクション複合体）に関する。原則的には、本明細書の別の箇所でＢＭＰ、ＲＮＡ、ＬＴＲ、ＭＰ、および複合体の他の必須要素について記載した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０２２５】
限定はしないが、本発明の複合体の好適な例として、ＢＭＰ（例えばＢＭＰ‐２またはＢＭＰ‐７）、またはＢＭＰの機能的断片をコードする配列を含む／該配列と複合体化する複合体が挙げられ、このＲＮＡのシチジンの５〜５０％、７、５〜３０％、１５〜２５％、または好ましくは約２５％が化学的に修飾されたシチジン（例えば５‐メチルシチジン：ｍ５Ｃ）であり、かつ／またはこのＲＮＡのウリジンの５〜５０％、７、５〜３０％、１５〜２５％、または好ましくは約２５％が化学的に修飾されたウリジン（例えば２‐チオウリジン：ｓ２Ｕ）である。より具体的には、そのような複合体には、本明細書に記載および定義される、１種類または複数種類のＬＴＲ（例えば、Lipofectamine 2000、Dogtor、DreamFect（商標）、または好ましくはDF-Gold（商標）もしくはC12-(2-3-2)）および／またはＭＰ（例えば、コアシェルＭＰ、酸化鉄シリカＭＰ、および／またはＳｉＯｘ／ホスホン酸塩‐ＰＥＩコーティング（例えばＳＯ‐Ｍａｇ６‐１１５ＭＰ）のような（分岐）ＰＥＩ装飾ＭＰを含めてもよい。さらに具体的には、ＭＰ、ＬＴＲ、および／またはＲＮＡは、本明細書で上記した各比でそのような複合体（または本発明の他の複合体）に含めてもよい。特に、これらの比は、上記ＲＮＡ１μｇにつき、上記ＬＴＲが約８μｇまたは約２０μｇというＲＮＡに対するＬＴＲの重量／重量比、上記ＲＮＡ１μｇにつき、上記ＬＴＲ溶液が約２μｌまたは約５μｌというＲＮＡに対するＬＴＲ溶液の容積／重量比、
上記ＲＮＡ１μｇにつき、上記ＭＰが約０．５μｇというＲＮＡに対するＭＰの鉄重量／重量比、上記ＬＴＲ約２〜２０μｇにつき（好ましくは約１６μｇにつき）、上記ＭＰ約０．５μｇというＬＴＲに対するＭＰの鉄重量／重量比、
上記ＬＴＲ溶液４μｌにつき、上記ＭＰが約０．５μｇというＬＴＲ溶液に対するＭＰの鉄重量／容積比、
本明細書の別の箇所に記載される鉄重量／重量／重量比、例えば、上記ＭＰ約０．５μｇ：上記ＬＴＲ約１２〜２０μｇ（好ましくは約１６μｇにつき）：上記ＲＮＡ約１μｇという鉄重量／容積／重量比、および／または、
本明細書の別の箇所に記載される重量／容積／重量比、例えば、上記ＭＰ約０．５μｇ：上記ＬＴＲ溶液約４μｌ：上記ＲＮＡ約１μｇという鉄重量／容積／重量比、としてもよい。
そのような複合体（または本発明の他の複合体）には、１種類または複数種類の別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）も含めてよい。本明細書で既に述べた上記別の脂質（例えば「ヘルパー脂質」）について記載した内容は、必要な変更を加えて、ここでも適用される。
【０２２６】
また、上記のＲＮＡまたは複合体は、本発明の手段および方法にしたがって用いることが意図される。この文脈では、ＲＮＡまたは複合体は、本発明の医薬組成物に含まれることが意図される。本発明は、本明細書に記載および定義されるＢＭＰ・（ｃｍ）ＲＮＡまたは複合体を含む医薬組成物にも関する。
【０２２７】
ＢＭＰ・ＲＮＡおよび複合体は、本分野で既知の手段および方法と、本明細書に記載および後述の実施例に記載する手段および方法とによって容易に調製することができる。例えば、ＢＭＰ・ＲＮＡは、インビトロでの転写系によって調製することができ、ゆえにインビトロ転写ＢＭＰ・ＲＮＡ（ＩＶＴ・ＢＭＰ／ＲＮＡ）とすることができる。この文脈では、ＢＭＰ・ＲＮＡが、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰの混合物からインビトロでの転写によって生成される方法が例えば適している。インビトロでの転写を行うのに必要な材料は当業者には周知であり、特に、緩衝剤、酵素、およびヌクレオチド混合物は商業的に入手可能である。本発明にしたがって用いられるＲＮＡの生成に用いられるＤＮＡの性質も重要ではない。通例、それはクローン化ＤＮＡとしてもよい。
【０２２８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるマトリクスまたは足場／キャリア／キャリア体に関する。すなわち、例えば、本明細書に記載の複合体の形態をとり、任意で本明細書に記載の細胞がさらに播種された、本発明にしたがって用いられるＲＮＡ配合マトリクス／足場／キャリア／キャリア体に関する。
【０２２９】
別の態様では、本発明は、本明細書に定義されたＲＮＡ配合マトリクス／キャリア／キャリア体を含む医薬組成物にも関する。
【０２３０】
本発明は、特に骨再生および／または本明細書に記載の骨疾患で使用可能な、すぐに使えるバイオ製品としての本明細書に記載されたＲＮＡ配合キャリアにも関する。
【０２３１】
本発明は、持続性かつ／または遅延性送達用、および持続性送達系／デポーとして製造されたマトリクス／足場／キャリア／キャリア体、医薬組成物、またはバイオ製品の使用にもさらに関する。
【０２３２】
本明細書では特許文献を含む多くの文献が引用されている。これら文献の内容はすべて、本発明の特許性と関連するわけではないが、参照により本明細書に援用する。より具体的には、各文献それぞれが具体的かつ個別に示されて参照により援用されるのと同じ程度にすべての参考文献が参照により援用される。
【０２３３】
以下に実施例を参照しつつ本発明を記載する。各実施例は例示に過ぎないため、本発明の範囲の限定事項と解釈せぬよう留意されたい。
【実施例】
【０２３４】
（実施例１）
材料および方法（特に実施例１〜７に関する）
材料：ダルベッコ・変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ）と、カルシウム・マグネシウム非含有ダルベッコ・リン酸緩衝塩類溶液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium：ＤＰＢＳ）と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、ペニシリン／ストレプトマイシン（Penicillin/Streptomycin：Ｐ／Ｓ）と、アクターゼ溶液（Accutase solution）は、PAA Laboratories GmbH社（オーストリア、パージング）から購入した。Opti-MEM培地と、コラゲナーゼ・タイプＩＩ（Collagenase type II）はGibco（商標）（Invitrogen社、米国カリフォルニア州）から得た。Ficoll-Paque（商標）はGE Healthcare Ltd社（米国、コネティカット州）から購入した。テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）と、３‐（トリヒドロキシシリル）プロピルメチル・ホスホネート（ＴＨＰＭＰ）と、分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）はSigma-Aldrich社（米国、ミズーリ州）から得た。他の試薬および材料は、特に規定がない限りSigma-Aldrich社から得た。２４ウェル磁気プレート（OzBiosciences社、フランス国、マルセイユ）を用いてマグネトフェクションの実験を行った。
【０２３５】
動物：メスのＳＤラット（２５０〜３００ｇ）をCharles River Laboratories社（ドイツ国、ズルツフェルト）から購入し、脂質と骨髄の両方の間葉系幹細胞分離に用いた。組織採種の直前に二酸化炭素窒息により動物を安楽死させた。用いた処置は地方倫理委員会により許可されており、ドイツの動物保護法に従って行われた。
【０２３６】
ラット由来の間葉系幹細胞の分離と培養：以前から知られるプロトコル（参考文献２４）を用いて骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）を分離した。手短に述べると、大腿骨と脛骨をすべての周囲組織から清浄し、両骨端において切断し、２．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ・タイプＩＩを含む無菌ＤＭＥＭ中で３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養した。骨髄をいったん完全ＤＭＥＭ（すなわち１０％のＦＢＳと１％のＰ／Ｓが追加されているもの）で洗い流したら、新しい完全ＤＭＥＭ中に細胞を沈殿させ再懸濁させた。その後、Ficoll-Paque（商標）を用いて密度勾配遠心分離法で単核細胞破片を収集し（５００ｇ、３０分）、完全ＤＭＥＭで洗浄し再懸濁させた。３０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２で細胞を蒔いた。２４時間培養後、培地を交換して非接着性細胞を除去した。
【０２３７】
脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）を分離するために、腹腔領域から採取した脂肪組織をｍｍサイズの小片に切断し、無菌ＤＰＢＳが入ったfalconチューブに移した。ＤＰＢＳを用いて脂肪片を複数回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ・タイプＩＩ溶液中において３７℃で３０分間培養した。次に、完全ＤＭＥＭ培地を加えてコラゲナーゼの作用を停止させ、６００ｇで１０分間遠心分離にかけた。得られた細胞ペレットを完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、その細胞懸濁液を４０μｍセルストレーナー（BD Falcon社、米国、ニュージャージー州）を用いて濾過し、３０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２で蒔いた。
【０２３８】
完全ＤＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２で、ＢＭＳＣとＡＭＳＣの両タイプの細胞を増殖させ培養した。トランスフェクションおよび分化実験のために細胞は最大６継代まで使用した。培養時、培地は３日おき交換し、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を維持した。分離した両ＭＳＣの特性評価は参考文献２４に公開されたプロトコルにしたがって行った。
【０２３９】
エキソビボでのヒト脂肪組織培養：ドイツ国ミュンヘンの工科大学にある「Klinikum rechts der Isar」大学病院の地方倫理委員会によって承認された書面による患者のインフォームド・コンセントを基に、再建手術を受ける健康な患者から新鮮なヒト皮下脂肪組織を得た。
【０２４０】
無菌状態で皮膚および血管からヒト脂肪組織を切り出した。次いで、およそ１ｍｍの厚さのスライス片になるよう組織を慎重に切断した。その後、皮膚用の生検パンチ（３ｍｍ）を用いて参考文献２５に記載のプロトコルにしたがって３ｍｍ×１ｍｍの均一な円形外植片を型抜きした。得られた組織外植片を無菌ＤＰＢＳを用いて３回洗浄し、直径３５ｍｍのペトリ皿に入れた。その後、最大７日間、完全ＤＭＥＭ中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。最初は２時間後、その後は培養中２４時間おきに培地交換を行い、十分な酸素供給状態を維持した（参考文献２６）。
【０２４１】
酸化鉄シリカ磁気ナノ粒子の合成：以前より知られるやり方で（参考文献２７、２８）酸化鉄シリカ・コアシェル磁気ナノ粒子を合成した。はじめに、鉄塩の水溶液からＦｅ（ＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩＩ）水酸化物を沈殿させ、磁鉄鉱「コア」ナノ粒子への変換を行った。その後、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）と３‐（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホネート（ＴＨＰＭＰ）の共縮合によって表面にホスホン酸基を有する酸化ケイ素コーティングを生じさせ、ナノ粒子の表面を安定させた。最後に、ｐＨ７．０の25-kD分岐ポリエチレンイミン水溶液を、ＰＥＩ対鉄の重量／重量比１１．５％で適用して粒子表面を装飾した。得られたＳｉＯｘ／ホスホネート‐ＰＥＩコーティングが施された磁気ナノ粒子は、今後、SO-Mag6-115ＭＮＰまたはＭＮＰと称される。これらのナノ粒子の物理化学的特性評価の詳細は参考文献２７、２８に報告されている。簡単に説明すると、Malvern Instruments社（ドイツ国、ヘレンベルク）のゼータサイザーナノＺＳを用いて動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定したところ、水に懸濁した状態の粒子の平均流体学的径はＤｈ＝９７±１４（ＰＤＩ＝０．３２±０．０３）、導電学的電位はζ＝＋３４．１±２．７である。
【０２４２】
MetLuc、ｅＧＦＰ、tomato、ヒトＢＭＰ‐２をコードする化学修飾メッセンジャーＲＮＡの生成：Metridiaルシフェラーゼ（Metridia longa）とヒトＢＭＰ-２・ｍＲＮＡのコドン最適化された読み枠を含むプラスミドベクターを合成し、GeneArt（Life Technologies社、米国、カリフォルニア州）によるｐＶＡＸＡ１２０のBamHI-EcoRI部位にクローニングした。ｅＧＦＰは、EcoRI-HindIIIを用いてｐｅＧＦＰ‐Ｎ１（Clontech社、米国、カリフォルニア州）から切除し、セミブラント法によるライゲーションによってｐＶＡＸＡ１２０のEcoRI-HindIIIにクローニングした。Tomatoのコード配列は、ptd Tomato-N1（Clontech社、米国、カリフォルニア州）からNotI-KpnIとともに切除し、セミブラント法によるライゲーションによってｐＶＡＸＡ１２０のEcoRI-KpnI部位に結紮した。ベクターｐＶＡＸＡ１２０は以前から知られており（参考文献２２）、ｐＶＡＸ１（Invitrogen社、米国、カリフォルニア州）のPstI-NotI部位同士の間に１２０Ａをひと続きクローニングすることにより作製した。
【０２４３】
インビトロでの転写（in vitro transcription：ＩＶＴ）用のテンプレートを生成するために、上記プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）（すなわちｐＶＡＸＡ１２０‐MetLuc、ｐＶＡＸＡ１２０‐ｅＧＦＰ、ｐＶＡＸＡ１２０‐Tomato、またはｐＶＡＸＡ１２０‐ｈＢＭＰ‐２）をNotIを用いた制限消化によって線状化した。クロロホルム・エタノール沈殿によってテンプレートｐＤＮＡをさらに精製した。ＩＶＴは、RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7（Promega社、米国、ウィスコンシン州）を用いて行った。キャップｍＲＮＡを合成する際、反転防止キャップアナログ（anti-reverse cap analogue：ARCA、m7,3'-OGpppG、Jena Biosciences社、ドイツ国、イエナ）を用いて所望の方向のみを向くキャップを組み込むことを確実にした。修正ｍＲＮＡを生成する際、シチジン‐５’‐トリホスフェートとウリジン‐５’‐トリホスフェートの２５％を５‐メチルシチジン‐５’‐トリホスフェートと２‐チオウリヂン‐５’‐トリホスフェートで置換した（Jena Biosciences社、ドイツ国、イエナ）。酢酸アンモニウム沈殿物によって得られた修正ｍＲＮＡの精製を行った。天然アガロースゲル電気泳動法によって生成した修正ｍＲＮＡの完全性およびサイズを確認した。
【０２４４】
トランスフェクション複合体の形成および特性評価：リポプレックスとポリプレックスは、Lipofectamine2000（Invitrogene社、米国、カリフォルニア州）、DreamFect Gold（DF-Gold）、Dogtor（OzBiosciences社、フランス国、マルセイユ）、ｂＰＥＩなどの選択された脂質トランスフェクション試薬をｃｍＲＮＡと混合することにより常に新たに調製した。用いたリポソーム・トランスフェクション試薬対ｃｍＲＮＡの容積対重量比は、製造業者の指示にしたがって選択した（すなわち、ｍＲＮＡ１μｇにつき、Lipofectamine2000なら２μｌ、DF-Goldなら４μｌ、Dogtorなら４μｌ）。ｂＰＥＩの場合、１０ｍｇ／ｍｌ水溶液となるよう調製し、使用前ｐＨは７．０に調整した。Ｎ／Ｐ＝８でｂＰＥＩとｃｍＲＮＡ溶液を混合することによって複合体を形成し、次いで室温で２０分間培養して複合体をアセンブリングさせた。磁気リポプレックスを調製するために、SO-Mag6-115ＭＮＰの水性懸濁液（０．１μｇＦｅ／μｌ）とDF-Gold希釈液（８０μｌのDF-Goldを１００μｌの水で希釈したもの）を同容量ずつ混合した。その後、ｃｍＲＮＡの希釈液（水１μｌにつき、またはＮａＣｌもしくは無添加Opti-MEM１５０ｍＭにつき０．２μｇ）を加え、慎重に混合し、室温で２０分間保存した。得られたSO-Mag6-115／DF-Gold／ｃｍＲＮＡ複合体に含まれる成分比は、０．５：４：１（鉄重量／容積／重量）であった。複合体は、ＤＬＳ法を用いて、平均流体学的径（Hydrodynamic diameter：Ｄｈ）、多分散性指数（polydispersity index：ＰＤＩ）、およびゼータ電位（ζ）について特性評価を行った（表１）。
【０２４５】
ＡＭＳＣおよびＢＭＳＣにおけるトランスフェクションプロトコル：トランスフェクションを行うために、２４ウェルプレートに１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２でＡＭＳＣとＢＭＳＣを播種した。２４時間培養後、細胞培地は新たな無添加Opti-MEMと交換した。上述の方法で、ｃｍＲＮＡを２０ｐｇ／ｃｅｌｌ含むリポプレックスまたはｂＰＥＩ複合体（すなわちMetLuc・ｃｍＲＮＡ、ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡ、またはtomato・ｃｍＲＮＡ）を１００μｌ調製し、細胞に加えた。トランスフェクションから５時間後、培地は完全ＤＭＥＭと交換した。結果を評価するまで、標準条件下で最大１０日間細胞をさらに培養した。トランスフェクションの有効性をさらに高めるため、SO-Mag6-115ＭＮＰを脂質トランスフェクション試薬およびｃｍＲＮＡと関連させて、鉄重量／容積／重量比が上述のように０．５：４：１となる磁気SO-Mag6-115粒子／DF-Gold／ｃｍＲＮＡリポプレックスを作製した。トランスフェクションを行う際、２０ｐｇのｃｍＲＮＡ／ｃｅｌｌを含む磁気リポプレックス１００μｌ（すなわち、MetLuc・ｃｍＲＮＡ、ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡ、またはtomato・ｃｍＲＮＡ）を、培養中のＡＭＳＣまたはＢＭＳＣに加え、細胞培養プレートを２４ウェル磁気プレートの上に３０分間載置することで磁場を印加した。次に、磁気プレートを取り除き、トランスフェクションを継続させた。全研究においてすべてのトランスフェクションを３連で行った。トランスフェクションの有効性の観点からマグネトフェクションの効果の定量的特性評価を行うために、以下のようにＭＡＩを算出した。
【０２４６】
【数１】
2017534649.tif 000013
（１）
（ＡＵＣは、それぞれ、マグネトフェクション（magnetofection：ＭＦ）後とリポフェクション（lipofection：ＬＦ）後の標的タンパク質（MetLucおよびｈＢＭＰ‐２）の発現の動態についての曲線下面積値を表す。）
【０２４７】
本研究の目的の一つは、トランスフェクション効率の観点からＡＭＳＣとＢＭＳＣを比較することである。したがって、用いたリポソームトランスフェクション試薬対ｍＲＮＡの容積対重量比は、製造業者の指示にしたがって両細胞型とも同じになるように選択した。しかしながら、２．５、５、１０、および２０ｐｇ／ｃｅｌｌの用量で、核酸１μｇにつきトランスフェクション試薬０．５〜５μｌのDF-Gold対ｃｍＲＮＡ比を用いて、両細胞についてトランスフェクションプロトコルの最適化をさらに行った。詳細は図１０〜図１２および対応する実施例箇所を参照されたい。
【０２４８】
トランスフェクトされた細胞におけるMetridiaルシフェラーゼ活性の評価：Metridiaルシフェラーゼは、セレンテラジンの酸化を触媒し、セレンテラミド、ＣＯ２、および光（λｍａｘ４８０ｎｍ）を生成する。この反応に基づき、セレンテラジンはさまざまな分泌ルシフェラーゼを検出するための基質として用いることができる（参考文献２９）。本研究では、天然セレンテラジン（Synchem OHG社、ドイツ国、フェルスベルク）を用いてMetLuc活性のアッセイを行った。手短に述べると、上清５０μｌ（トランスフェクト後、５時間、１、２、３、５、７日にトランスフェクトされた細胞から収集）当たりの同容量と、セレンテラジン溶液（ｐＨ７．０の脱気リン酸ナトリウム・バッファ中５０μＭ）を白色不透明な９６ウェルプレート内で混合した。発光強度は、Perkin Elmer社（米国、マサチューセッツ州）のWallac Victor 1420 multilabel counterを用い、室温で、単位時間当たりの発光単位または相対発光単位（relative light units：ＲＬＵ）によって計測した。すべての試料について３連で計測を行った。MetLuc活性は、以下の式を用いて算出した正規化相対発光単位によって表した。
【０２４９】
【数２】
2017534649.tif 000014
（２）
（ＲＬＵは上述の器機によって得られた値であり、Ｖ１は計測を行うために収集された上清の容積に対応し、Ｖ２はｍｌで表した上清の容積の総量である。）
【０２５０】
増強された緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein：ｅＧＦＰ）陽性細胞：ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの観点からトランスフェクション効率を評価するために、ｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーによって分析した。このために、トランスフェクトから２４時間後、ＤＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、２４ウェルプレートの１ウェルにつきアクターゼを１００μｌ用いて取り外しを行った。次いで、細胞培養プレートを５００ｇで１０分間遠心分離にかけ、細胞をＤＰＢＳ（２％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。MACSQuant Analyzer（Miltenyi Biotech社、ドイツ国、ベルギッシュグラートバハ）を用い、１試料につき少なくとも５０００イベント収集してフローサイトメトリーを行った。
【０２５１】
増強された緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein：ｅＧＦＰ）細胞およびtomato発現細胞：蛍光顕微鏡（Biorevo BZ9000、Keyence社、日本国、大阪）を用い、ｅＧＦＰとtomato・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＳＣとＢＭＳＣをトランスフェクトから２４時間後に撮像した。
【０２５２】
化学修飾ｍＲＮＡの複合体の細胞毒性スクリーニング：細胞毒性スクリーニングは、ＡＭＳＣをさまざまなMetLuc・ｃｍＲＮＡ複合体でトランスフェクトし、製造業者指示にしたがって３連で行った標準ＭＴＳアッセイ（CellTiter 96、Promega社、米国、ウィスコンシン州）を用いて、トランスフェクト後５時間、２４時間の細胞呼吸活性（生存率）を分析することにより行った。実験の詳細については本明細書の他の箇所を参照されたい。
【０２５３】
トランスフェクト細胞によるＢＭＰ‐２の生成：上記のリポフェクション・プロトコルおよびマグネトフェクション・プロトコルを用いて、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡをＡＭＳＣに送達した。１細胞につき、２０または３２ｐｇのｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡを用いてトランスフェクションを行った。規定した時点において、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（Quantikine、R&D Systems社、米国、ミネソタ州）を用いて製造業者の指示にしたがって上清および細胞溶解物中の分泌・細胞関連ヒトＢＭＰ‐２のレベルを測定した。吸光度は、PerkinElmer社（米国、マサチューセッツ州）のWallac Victor 1420 multilabel counterを用いて４５０ｎｍで計測した。波長補正は５７０ｎｍに設定した。実験は３連行い、タンパク質含有量は標準曲線を用いて測定した（範囲：０〜４０００ｐｇ／ｍｌ  ｈＭＢＰ−２）。
【０２５４】
加えて、骨形成培地（すなわち、２％ＦＢＳ、βグリセロリン酸１０ｍＭ、アスコルビン酸２００μＭ）の存在下においても細胞のトランスフェクトを行った。骨形成培地はデキサメタゾンを用いずい調製した。したがって、別の実験において、細胞放出ｈＢＭＰ‐２の骨形成能に関する関連情報を得ることができる。
【０２５５】
ヒト一次組織へのｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡのトランスフェクション：参考文献２５に記載された以前から知られるプロトコルを僅かに変更したものにしたがって外植片をトランスフェクトした。手短に述べると、洗浄したヒト脂質組織のディスク体を４８ウェルプレートに入れ、DF-Goldリポプレックス（ｃｍＲＮＡ１μｇにつき、DF-Gold４μｌ）を用いて５μｇのｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡまたはtomato・ｃｍＲＮＡを用いてトランスフェクトを行った。複合体を含む８０μｌの懸濁液を組織のディスク体に直接注入した。プレートを１時間、培養器に戻した。そのあと、５００μｌの新たな無添加Opti-MEMをトランスフェクトされた外植片が入った各ウェルに加え、培養をさらに５時間続けた。その後培地を骨形成培地に変え、外植片を以前より知られる方法でさらに３日間と７日間培養した。組織外植片のトランスフェクトはすべて新たに採種した組織を用いて無菌状態で行った。
【０２５６】
蛍光顕微鏡（Biorevo BZ9000、Keyence社、日本国、大阪）を用い、トランスフェクトから２４時間後にtomato・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトされた脂肪質組織ディスク体を撮像した。
【０２５７】
インビトロでの骨形成：ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＳＣを骨形成刺激下で培養して、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡのインビトロでの骨形成誘導能を評価した。リポフェクションの方法とマグネトフェクションの方法の両方を用いて、以前から知られるやり方でｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡを細胞に導入した。トランスフェクションから５時間後、培地をデキサメタゾンを含まない骨形成培地と交換した。トランスフェクトされた細胞は最長２１日まで骨形成培地に維持し、その培地は３日おきに部分的に交換した（すなわち、容積の半分を新たな骨形成培地と置換した）。同じ条件下で培養した非トランスフェクト細胞を対照として用いた。インビトロでの骨形成後、骨関連遺伝子の発現および無機化の発生を評価した。
【０２５８】
アルカリホスファターゼ（Alkaline phosphatase：ＡＬＰ）活性：トランスフェクト後３、７、１２日目にアルカリホスファターゼ活性を評価した。この目的で、アルカリホスファターゼ比色分析アッセイ（Abeam社、英国、ケンブリッジ）を製造業者の指示にしたがって用いた。
【０２５９】
このアッセイは、ｐ‐ニトロフェニルリン酸（p-nitrophenyl phosphate：ｐＮＰＰ）をホスファターゼ基質として用いることに基づく。ｐＮＰＰはＡＬＰの存在下で脱リン化する。結果として、黄色のｐ‐ニトロフェノール（p-nitrophenol：ｐＮＰ）化合物が形成され、それは４０５ｎｍにおける最大吸光度によって特徴付けられる。ＡＬＰアッセイは製造業者のプロトコルに基づいて行った。手短に述べると、トランスフェクト細胞をＤＰＢＥで２回洗浄し、次いでアッセイ・バッファを用いて室温で２０分間培養した。細胞単層が良好に均質化された後、試料を遠心分離して不溶性材料を除去した。ｐＮＰＰ溶液を試料および対照試料に加え、室温で６０分培養し、光から保護した。ｐＮＰ生成は、上述したように、multilabel counterを用いて４０５ｎｍで吸光度を計測することで測定した。ｐＮＰ含有量の値は標準曲線に基づいて算出した。すべての場合において３連の評価を行った。
【０２６０】
さらに、ＡＬＰはFast blue B saltとNaphthol AS-MX phosphate（参考文献３０）の染色混合物と３７℃で３０分間培養することにより固定細胞内で染色した。染色溶液はＤＰＢＳで洗い落し、顕微鏡下で細胞を分析した。紫色に染色された領域が陽性と考えられる。
【０２６１】
定量的リアルタイムＰＣＲ：ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡをトランスフェクト後３、７、１４、２１日目に、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いでTRIzol（Life technology社、米国、カリフォルニア州）によって溶解した。全ＲＮＡをフェノール／クロロホルム法に基づいて分離した。BioPhotometer plus UV spectrophotometer（Eppendorf AG社、ドイツ国、ハンブルグ）を用いて、分光光度法によりＲＮＡ濃度および純度を測定した。First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific社、米国、マサチューセッツ州）を用いて、製造業者の指示にしたがって全ＲＮＡからファーストストランドｃＤＮＡを逆転写した。骨関連遺伝子の発現は、リアルタイムでの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription polymerase chain reaction：ＲＴ‐ＰＣＲ）によって測定した。表２に増幅プライマーを列挙する。SsoFast Eva Green Supermix（Bio-Rad Laboratories Inc.社、米国、カリフォルニア州）を用いて、Bio-Rad CFX96サーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories Inc.社、米国、カリフォルニア州）に基づいてリアルタイムでのＰＣＲを行った。
【０２６２】
トランスフェクト脂肪質組織の場合、全ＲＮＡはトランスフェクト後、３、７日目に抽出した。洗浄した組織は、RNAlater試薬（Qiagen GmbH社、ドイツ国、ヒルデン）中に製造業者のプロトコルにしたがって回収した。ＲＮＡ抽出の前に、手持ち式ホモジナイザ（PT1200E Polytron、Kinematica GmbH社、ドイツ国、エシュバッハ）を用いてTRIzolにおいて組織を均質化した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、およびＲＴ‐ＰＣＲは、細胞について上述した同じプロトコルを用いて行った。ｈＢＭＰ‐２、RunX2、ＡＬＰ、およびColl Iの発現レベルを分析した。表３に増幅プライマーを列挙する。
【０２６３】
全体として、β‐チュービュリンを参照遺伝子として選択した。データは対照、すなわち非トランスフェクト細胞および組織、と比べた誘導倍率として表した。
【０２６４】
アリザリンレッド染色および定量化：トランスフェクト後１４日目と２１日目にアリザリンレッド染色を行い、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ複合体を用いてトランスフェクトした細胞におけるカルシウム沈着を評価した。このカルシウム沈着は、ＡＭＳＣの骨形成分化の指標となる。手短に述べると、アリザリンレッド溶液（ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を用いて、室温で１５分間、エタノール固定細胞を培養した。染色細胞を広範囲にわたって洗浄して非特異的な染色および／または、存在した場合は沈殿物を除去した。無機化された小結節およびカルシウム沈着は赤斑として染色され、骨形成を示す。その後アリザリンレッド染料は、１００ｍＭの塩化セチルピリジニウムを用いて室温で３時間かけて抽出した。次いで５７０ｎｍで吸光度を計測した。実験は３連で行い、結果は、非トランスフェクト対照細胞と比較して報告する。
【０２６５】
統計的分析：すべての得られた値は平均±標準偏差として報告する。統計的分析は、GraphPad Prism version 6.00（GraphPad Software社、米国、カリフォルニア州）を用いて行った。データの正規分布は、シャピロ‐ウィルク検定を適用して分析した。One-way ANOVAとそれに引き続いてTukeyの多重比較検定を行って、さまざまなトランスフェクション試薬（図２Ａ）およびフローサイトメトリー結果（図３Ｃ）を用いて、トランスフェクト細胞のMetLuc発現を分析した。加えて、２つの独立した試料の分析を行う場合はスチューデントのｔ検定を用いた。すべての統計的分析は、用いたソフトウェアの勧めにしたがって行った。確率がｐ＜０．０５であれば有意差とみなした。曲線下面積（Area under the curve：ＡＵＣ）値は、Origin Pro 9G Software（Microcal1 software、OriginLab Corp社、米国、マサチューセッツ州）を用いて算出した。
【０２６６】
化学修飾ｍＲＮＡの生成：公開されているプロトコル（参考文献２２）を用いて、ｅＧＮＰ、Tomato、MetLuc、およびヒトＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡを生成した。生成したｃｍＲＮＡの分子サイズと品質は、アガロースゲル電気泳動法（図１）によって分析した。すべてのｃｍＲＮＡが所期のサイズをしており、劣化（しみ）や追加的副産物（予期しないサイズの余分なバンド）は検出されなかった。
【０２６７】
ＭＴＳアッセイ：細胞単層を、２００μｌ／ｗｅｌｌのＭＴＳ試液（フェノールレッドを含まない無血清ＭＥＭ中で５：１の比）で処理し、標準培養条件下において光から保護した状態で３時間培養した。各ウェルから得た１００μｌの培地を９６ウェルプレートに移し、PerkinElmer社（米国、マサチューセッツ州）のWallac Victor 1420 multilabel counterを用いて吸光度を４９０ｎｍで測定した。ラテックスゴムを用いて細胞死の誘導（陽性対照）を行った（参考文献２４）。非処理細胞は陰性対照（すなわち細胞生存率１００％）として用いた。
【０２６８】
インビボ試験用ｃｍＲＮＡの製造
C12-(2-3-2)／ｃｍＲＮＡリポイドの製造：１００ｍｇのＮ，Ｎ’‐ビス（２‐アミノエチル）‐１，３‐プロパンジアミン（０．６２３ｍｍｌ）と、５７５．０７ｍｇの１，２‐エポキシドデカン（３．１２ｍｍｏｌ、（Ｎ−１）ｅｑ．、ここでＮは、１オリゴ（アルキレンアミン）につき一級アミンの２倍量＋二級アミン１倍量）を混ぜ、常に振動を与えつつ８０℃で９６時間混合してカチオン性脂質（C12-(2-3-2)と称される）を調製した。カチオン性脂質C12-(2-3-2)、ヘルパー脂質ＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ‐脂質ＤＭＰＥ‐ＰＥＧ  ２ｋをモル比８：５．２９：４．４１：０．８を用いてリポイド粒子を製造した。手短に述べると、無水エタノールにおいて各脂質貯蔵液を適切な容積だけ組み合わせて、それぞれの濃度を、５０、２０、２０、２０ｍｇ／ｍｌとした。容積は最終的には２００μｌに調整した。迅速な溶液交換によってリポソームを形成することができた。その後、クエン酸塩バッファ中で２００μｌのリポソーム混合物を８００μｌのｃｍＲＮＡと混ぜた（すなわちｈＢＭＰ−２・ｃｍＲＮＡまたはＦＦＬ・ｃｍＲＮＡ）。最終的なｃｍＲＮＡ濃度は、Ｎ／Ｐ比１７で２００μｇ／ｍｌに固定した。室温で３０分培養後、リポプレックスを水で一晩透析した。
【０２６９】
C12-(2-3-2)／ｃｍＲＮＡリポイドを含むインビボ試験用フィブリン塊：C12-(2-3-2)／ｃｍＲＮＡ複合体を含むフィブリン塊の調製は移植の直前に行った。したがって、ともに２．５μｇのｃｍＲＮＡを含むC12-(2-3-2)／ｈＢＭＰ−２・ｃｍＲＮＡ複合体とC12-(2-3-2)／ＦＦＬ・ｃｍＲＮＡ複合体をそれぞれ独立して５０μｌのフィブリノゲン（３０００ＫＩＵ／ｍＬ、Tissucol、Baxter社、ドイツ国、ウンターシュライスハイム）と混ぜ、凍結乾燥させた。
【０２７０】
フィブリノゲン‐ｃｍＲＮＡ粉末を３０分間無菌水で戻した後に外科手術を始めた。完全に均質化した後、フィブリノゲン‐C12-(2-3-2)／ｃｍＲＮＡを５０μｌのトロンビン（４Ｕ／ｍＬ、Tissucol、Baxter社、ドイツ国、ウンターシュライスハイム）と混ぜ、２分間凝固させた。対照として、ｃｍＲＮＡをまったく使用せずに上記と同じ手順にしたがってフィブリン塊を作製した。
【０２７１】
ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ利用における非致命的なサイズ欠損（インビボ試験用）：無菌状態において、３ｍｍという非致命的なサイズの超皮質性の骨欠損を形成した。骨欠損は、１８匹のオスのＳＤラット（Charles River Laboratories社、ドイツ国、ズルツフェルト）の大腿骨幹の中央部に左右相称で形成した。重量が６５０〜７５０ｇのラットを無作為に選び、フィブリン（すなわち対照群）、フィブリン＋２．５μｇＦＦＬ・ｃｍＲＮＡ、フィブリン＋２．５μｇｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの３つの群（それぞれｎ＝６）に分けた。
【０２７２】
１１０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ketanest S、２５ｍｇ/ｍｌ、Pfizer社、ドイツ国、カールスルーエ）と１２ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Rompun、２０ｍｇ/ｍｌ、Bayer社、ドイツ国、レバークーゼン）の混合物を筋肉注射して麻酔導入を行った。大腿骨幹の中央部に３ｍｍのドリル孔をあけ、０．９％塩化ナトリウム溶液（B-Braun社、ドイツ国、メルズンゲン）を用いて灌注を行った。各群によれば、上記欠損は、移植直前に生成された１００μｌのフィブリン塊で埋められた。したがって、塊は鉗子を用いてエッペンドルフ・チューブから移され、完全に骨欠損を埋めた状態で配置した。
【０２７３】
ラットには鎮痛処置として４日間にわたり一日一回カルプロフェン（rimadyl、Pfizer社、ドイツ国、カールスルーエ）（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射して与えた。
【０２７４】
手術から２週間後、ラットは全身麻酔をして心臓内注射を行うことによりペントバルビタールを過量服用させて（１２０ｍｇ／ｋｇ、Eutha77、Essex Pharma社、ドイツ国、ハンブルグ）死亡させた。大腿骨を採取し、ホルマリン溶液（中性緩衝ホルマリン、１０％、Sigma-Aldrich社、米国、ミズーリ州）で２４時間保存した。その後、次の処理を行うまで、８０％エタノールへ移して保管した。
【０２７５】
インビボ試験のためのマイクロコンピュータ断層撮影法（Micro Computer Tomography：μＣＴ）：すべての外植大腿骨についてマイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）による分析を行った（mCT 40、Scanco Medical AG社、スイス国、バッサースドルフ）。計測に用いた設定を以下に記す。増分は角度０°で１５７μｍに設定した。画像の３Ｄ画素サイズは全スライス数６６５で８０００μｍに設定した。したがって、各試料は縦方向における間隔の計が５．３２ｍｍで調査された。ビームの積分時間は最大３００ｍｓに設定し、各計測点につき３つのデータセットを検出した（それらの平均値がその後の計算に用いられる）。μＣＴ装置はヒドロキシアパタイト・ファントムを用いて１週間に一度較正した。
【０２７６】
ソフトウェアImageJ（国立衛生研究所、米国、メリーランド州）を用いて、３Ｄセグメンテーション・アルゴリズムによって、無機化された骨と注状仮骨構造の分析を行った。μＣＴデータのセットは、Karl Heinz Kunzelmann教授（ドイツ国、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン、充填／修復歯科学科）が親切にも提供して下さったKHK_microCTと称されるプラグインによって設定される３Ｄ層に変換した。無機化された骨と仮骨の密度レベルを分離するために、グレイスケール閾値を導入し、既に調査された２つの密度間隔用に値を２５００〜４５００に設定した。その後、BoneJ（登録商標）と称される別のプラグインを仮骨構造の３Ｄ撮像および定量化に用いた。考慮した数値は骨量（bone volume：ＢＶ）のみであり、それを用いて各標本の新たに形成された仮骨の量を比較した。上記量は、上記のKHK_microCTと称されるプラグインによって、自動的にメートル法の数値に変換された。仮骨構造の詳細な３Ｄ画像は、「３Ｄビューアー」と称される内蔵プラグインによって得た。
【０２７７】
（実施例２）ＡＭＳＣおよびＢＭＳＣでのトランスフェクションにおけるDF-Gold対ｍＲＮＡ比の最適化
DF-Goldを含むｍＲＮＡリポプレックスを用いたＡＭＳＣおよびＢＭＳＣ用のトランスフェクション・プロトコルをさらに最適化するため、さまざまなパラメータを考慮した。用量２．５、５、１０、２０ｐｇ／ｃｅｌｌにおいて、核酸１μｇにつき、エンハンサーが０．５〜５μｌの場合のDF-Gold対ｍＲＮＡの容積／重量比を調査した。結果を図１０および図１１に示した。両細胞型について、用量は１細胞当たり２０ｐｇのｍＲＮＡが最適であることが確認された。また、用いられるエンハンサーの量としては、ＡＭＳＣの場合は１μｇのｍＲＮＡにつき５μｌのDF-Goldが、ＢＭＳＣの場合は１μｇのｍＲＮＡにつき２μｌのDF-Goldが最も良好であることが確認できた。
【０２７８】
（実施例３）リポフェクションおよびマグネトフェクションによる幹細胞へのｃｍＲＮＡの効率的な送達
まず、ｃｍＲＮＡを含む脂肪質由来の幹細胞（adipose-derived stem cells：ＡＭＳＣ）をトランスフェクトするさまざまな試薬の効率性を調査した。図２Ａに、トランスフェクトから１２０時間後までのMetridiaルシフェラーゼの発現の動態を示す。試験を行ったすべての試薬において、最大発現はトランスフェクトから２４時間後に得られた。ｂＰＥＩがすべての試薬中最も効率的でない試薬であり、どの計測時点においてもｂＰＥＩでは有意差のある発現を確認できなかった（ｐ＞０．０５）。試薬は、基づく脂質が違うと、得られるMetLuc発現の動態も違った。２４時間後時点では、Lipofectamine2000において最高発現が見られたが（ｐ＜０．０００１）、Lipofectamine2000は最も短命であり、４８時間後以降の時点ではMetLuc活性は低レベルであった。一方、DreamFect Gold（DF-Gold）とDogtorは、２４時間後の時点ではLipofectamine2000と比べていくらか非効率的であったが、１２０時間後までMetLuc発現を維持した。トランスフェクション効率以外にも、ＡＭＳＣにおけるさまざまなトランスフェクション試薬の細胞毒性も試験した。Lipofectamine2000を含むMetLuc・ｃｍＲＮＡ複合体の毒性がもっとも高く、細胞生存率は５時間以内で７５％未満まで低下した（図２Ｂ）。DF-Goldの複合体とｂＰＥＩの複合体の細胞毒性は弱いという結果であり、両計測時点において８０％以上の細胞生存率が見られた。トランスフェクト後２４時間では、DF-Goldでトランスフェクトされた細胞と非トランスフェクト対照細胞との間に統計学的な有意差は見られなかった（ｐ＝０．０６）。
【０２７９】
導入遺伝子の発現期間が長いこと（トランスフェクト後１２０時間まで）と弱毒性であるという所望の特徴に基づき、ｃｍＲＮＡを含む間葉系幹細胞（ＡＭＳＣおよびＢＭＳＣ）をトランスフェクトするものとしてDF-Goldを選択した。両細胞型について１細胞当たりのｃｍＲＮＡの用量を最適化した。結果として、２０ｐｇ／ｃｅｌｌがトランスフェクションに最適な用量だと判明した。図１０および図１１にデータを示す。ＡＭＳＣとＢＭＳＣの比較をより正確に行うため、DF-Gold対ｃｍＲＮＡの容積／重量比は４に固定した（製造業者の指示）。しかしながら、この比も両細胞型について精緻した。結果として、ＡＭＳＣの場合は容積／重量比５、ＢＭＳＣの場合は２であった（図１０および図１１）。
【０２８０】
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は遺伝子導入において一般的に用いられる非ウイルス性ベクターであるため、MetLucの発現は、MetLuc・ｃｍＲＮＡまたはそのプラスミド等価物（ｐＶＡＸＡ１２０‐MetLuc）のいずれかとトランスフェクトした後に比較した。標的タンパク質の発現は、細胞をｐＤＮＡでリポフェクトしてから２４時間後は多いようだが、４８時間後から観測終了時間である１２０時間後までを見た場合、ｃｍＲＮＡの発現は、大幅に低下したｐＤＮＡと比べて、この文脈においては高発現を維持していた。理論に縛られることなく、上記永続的な発現は、例えば、本発明にしたがって用いたリポプレックス（例えばDF-Gold（商標）／ｃｍＲＮＡ）を用いたことによって、ｍＲＮＡを分解からより良好に保護できることを示す証拠であるとともにｃｍＲＮＡが安定化したことを証明するものでもある。
【０２８１】
ｐＤＮＡとｃｍＲＮＡ（両方ともMetLucをコードする）にリポフェクションを行った後の標的タンパク質発現の有効性を比較した（図２Ｃ）。トランスフェクトから２４時間後、ｐＤＮＡでトランスフェクトしたＡＭＳＣのトランスフェクション効率は、ほぼ２倍高かった（ｐ＝０．００５）。しかしながら、トランスフェクト後４８時間〜１２０時間のMetLucの発現レベルは、ｃｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞の方が有意差（ｐ＝０．０００２）を持って上回っており、トランスフェクト後１２０時間まで有意差（ｐ＝０．００７）をもって上回り続けた。０〜１２０時間後時点のデータを積分することによって算出した「ｐＤＮＡ」と「ｃｍＲＮＡ」の曲線下面積、ＡＵＣｐＤＮＡ＝１．７１・１０８（正規化ＲＬＵ・ｈ）とＡＵＣｃｍＲＤＮＡ＝１．６８・１０８（正規化ＲＬＵ・ｈ）から、ｃｍＲＮＡ送達は、ｐＤＮＡ送達後に達成される標的タンパク質の「生物学的利用能」と類似する標的タンパク質の「生物学的利用能」をもたらしうることが確認できた。
【０２８２】
ｃｍＲＮＡトランスフェクションの効率性をさらに高めるため、マグネトフェクションを用いた。この目的で、ＰＥＩ装飾された酸化鉄コアシリカシェル磁気ナノ粒子（すなわちSO-Mag6-115）を用いた。SO-Mag6-115ナノ粒子の特徴は、流体力学的径がおよそ９６±１４ｎｍであり、正のゼータ電位が３４±３ｍＶと高いことであった。目視では、磁気ナノ粒子は水性懸濁液中で安定しているようであった。水中、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、または細胞培地中では沈降は見られなかった。さらに、ナノ粒子は外部から印加された磁場に対して明らかな反応を見せた。
【０２８３】
マグネトフェクション実験では、ＢＭＳＣとＡＭＳＣを並列的に比較しながらトランスフェクトを行った。マグネトフェクションは、リポフェクションと比べ、両細胞型において有意差のある高いトランスフェクション効率をもたらした（図３）。ｅＧＦＰでトランスフェクトされた細胞のトランスフェクトから２４時間後のフローサイトメトリー分析では、陽性細胞の割合は５９．７％（ＡＭＳＣ）と７３．２％（ＢＭＳＣ）であった（図３Ｃ）。これに対し、リポフェクションを行った場合（すなわちDF-Goldをトランスフェクション試薬として用いた場合）、３７．５％（ＡＭＳＣ）と３８．９％（ＢＭＳＣ）の細胞がｅＧＦＰについて陽性を示した。代表的なヒストグラムを図１２に示す。このフローサイトメトリーのデータは、蛍光顕微鏡検査とMetLucアッセイのデータと一致する（図３Ａ、３Ｂ、３Ｄ）。図３Ａでは、tomato・ｃｍＲＮＡの細胞導入にマグネトフェクションを用いた場合、tomatoタンパク質を発現するトランスフェクト済みＢＭＳＣの割合が明らかに高かったことがわかる。ｅＧＦＰをコードするｃｍＲＮＡの送達後も類似のパターンが見られた。図３Ｂは、ｅＧＦＰを発現しているＡＭＳＣとＢＭＳＣの蛍光顕微鏡写真である。同様に、図３Ｄは、MetLuc・ｃｍＲＮＡを用いたマグネトフェクションによってトランスフェクトされたＡＭＳＣとＢＭＳＣ両方の場合ともに、トランスフェクションから２４時間後に、MetLucの発現が有意差（ｐ＜０．０００１）をもって高まったことを示している。
【０２８４】
マグネトフェクションのより顕著な影響がＢＭＳＣに対して明らかに得られた。図３Ｄに両細胞型についてのＭＡＩを示す。ＢＭＳＣとＡＭＳＣではそれぞれ４．４倍（ＭＡＩ）と２．４倍（ＭＡＩ）のMetLuc活性増加が測定された。これらのデータから、マグネトフェクションを用いた場合、両ＭＳＣ型においてタンパク質発現が有意差をもって増強されたことが証明される。
【０２８５】
（実施例４）トランスフェクトされた幹細胞によるｈＢＭＰ−２の分泌増強
Opti-MEM培地において、またさらに、次に行う実験での骨形成状態の重要性を考慮して骨形成培地の存在下において、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡのトランスフェクションを行った。興味深いことに、Opti-MEMを用いてトランスフェクションを行い、さらに５時間後に培地を骨形成培地に交換した場合、トランスフェクション効率が低下したようすはなかった（図４Ａ）。有意差をもってｈＢＭＰ‐２の発現低下が確認されたのは、骨形成培地の存在下でトランスフェクションが行われたときであった（ｐ＜０．０５）。図４Ｂに、トランスフェクション後のさまざまな時点における、トランスフェクト済み細胞の細胞可溶化物および上清において定量化された、分泌され、細胞と関連するｈＢＭＰ‐２の含有量を示す。非トランスフェクト対照細胞と比べ、トランスフェクトが行われた細胞から得た試料では、有意差のある高いｈＢＭＰ‐２レベルが検出された（ｐ＜０．００１）。ｈＢＭＰ‐２の発現の最大値は、トランスフェクトから４８時間後に見られた。ｈＢＭＰ‐２の細胞内レベルは４８時間後以降、有意差をもって低下した（ｐ＝０．００７）。ｈＢＭＰ‐２の高細胞内レベルにもかかわらず、トランスフェクトされたＡＭＳＣは、トランスフェクト後最大７日まで有意差をもって高ｈＢＭＰ‐２レベルを分泌した（図４Ｂ、図４Ｃ）（ｐ＝０．０００８）。図４Ｂおよび図４Ｃに、マグネトフェクションを行った細胞の試料におけるｈＢＭＰ‐２レベルを示す。細胞によって生成されたｈＢＭＰ−２の全量は、ｃｍＲＮＡ１μｇにつき、およそ７００ｐｇであった（図４Ｃ）。これは、リポフェクション後に得られたｈＢＭＰ−２レベルと比較して６倍の増加（ＭＡＩ）である（図４Ｃ）。マグネトフェクションにおいて確認された高ｈＢＭＰ‐２レベルは、ｅＧＦＰレポーター（図３Ｂ、図１２）、MetLuc（図３Ｄ）、Tomato（図３Ａ）をコードするｃｍＲＮＡについて確認されたトランスフェクションにおける高効率および高発現と一致する。トランスフェクト細胞におけるｈＢＭＰ‐２の細胞内レベルもマグネトフェクションによってかなりの上昇がみられたことは特筆に値する事実である（ｐ＜０．０００３）。図４Ｂでは、トランスフェクト後２４時間のｈＢＭＰ‐２の細胞内量は、分泌ｈＢＭＰ‐２とほぼ同じであることが確認された（ｐ＝０．８）。この時点より後では、トランスフェクト細胞のｈＢＭＰ‐２の分泌量は、細胞可溶化物中で定量化されたレベルと比べて有意差をもって多かった（ｐ＜０．００１）。
【０２８６】
（実施例５）ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ送達によりＡＭＳＣにおけるインビトロでの骨形成が誘導された：
インビトロでの骨形成の最初の徴候を確認するために、ｈＢＭＰ‐２でトランスフェクトされたＡＭＳＣのアルカリホススファターゼ（alkaline phosphatase：ＡＬＰ）活性を評価した。ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの導入から１２日後、トランスフェクト細胞においてＡＬＰ発現の増加を確認することができた（図５Ａ、図５Ｂ）。ＡＬＰ活性の定量化によれば、対照群と比べ、トランスフェクト細胞では早くも７日目に有意な増加がみられ、１２日目までそれが継続したことが実証された（図５Ｂ、ｐ＜０．０１）。
【０２８７】
その後、リアルタイムＰＣＲを用いて、さまざまな時点における骨形成関連遺伝子の発現を定量化した（図５Ｃ〜図５Ｈ）。リポフェクション群とマグネトフェクション群の両方について、非トランスフェクトクト細胞と比べ、Runx2、Osterix、ＡＬＰ、Coll I、Ospeopontin、およびOsteocalcinの発現が時間経過とともに増加した。興味深いことに、RunX2、ＡＬＰ、およびＯＰＮのマグネトフェクション群は、トランスフェクションから１４日後、リポフェクション群と比べて有意に高い発現を示した。特にＯＰＮにおけるマグネトフェクションが１４日後でも継続的な高発現を示した。一方、RunX2の発現の低下が、マグネトフェクション群においてたった１４日後に見られた。
【０２８８】
アリザリンレッド染色（図６Ｂ、図６Ｃ）を行ったところ、トランスフェクトを行った群での灰化結節の数は、非トランスフェクト細胞（図６Ａ）よりも明らかに多かった。また、リポフェクション後、染色強度はｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ用量が少ない場合（すなわち２０ｐｇ／ｃｅｌｌ、図６Ｃ）の方が明らかに強かった。これは、MetLuc・ｃｍＲＮＡを用いた滴定実験（図１０）で得た最適用量と合致する。３２ｐｇ／ｃｅｌｌという高用量では、無機化は目視で低下していた（図６Ｃ右側）。しかしながら、ｃｍＲＮＡ導入にマグネトフェクションを用いた場合、無機化は高まった（図６Ｂ）。アリザリンレッド染色の定量的分析によりこれらの結果が確認された。図６Ｄでは、リポプレックスを用いた場合、低用量群（２０ｐｇ／ｃｅｌｌ）の方が高用量群（３２ｐｇ／ｃｅｌｌ）の場合よりも有意に無機化が高まることが示されている（ｐ＜０．０００１）。２０ｐｇのｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞では、培養時間が経つにつれて無機化が高まった。高用量群に対してマグネトフェクションを用いると、無機化が有意に高まったことが検出された（１４日目ではｐ＝０．０４、２１日目ではｐ＝０．００７、図６Ｄ）。さらに、それはトランスフェクト後１４日目という早い段階で明らかに認められた。
【０２８９】
（実施例６）ヒト脂肪質組織のトランスフェクションによりインビトロでの遺伝子発現が誘導された：
DF-Gold／tomato Ｎ１・ｃｍＲＮＡ複合体またはDF-Gold／ｈＢＭＰ−２・ｃｍＲＮＡ複合体を用いてヒト脂肪質組織のトランスフェクトを行った。図７Ａに示すように、トランスフェクト後、脂肪ディスク体内部の多くの細胞がtomato Ｎ１陽性となった。ｈＢＭＰ‐２でトランスフェクトされたディスク体について、ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、トランスフェクトされた組織は、処置されていない外植片と比べ、４倍以上のｈＢＭＰ‐２発現増加があることが分かった（図７Ｂ）。また、骨形成条件下で培養されたトランスフェクト組織においては、対照と比べ、RunX2、Osterix、Coll Iなどの骨関連遺伝子の発現増加がはっきりと認められた。ＡＬＰおよびColl Iの発現は、トランスフェクト後３日目〜７日目、有意差をもって増加した（ｐ＜０．００１）。
【０２９０】
（実施例７）ＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡは、インビボにおいて、２週間で骨形成をおよそ２倍にした：
図１３Ａ〜図１３Ｃには、すべての研究対象群について、処置から２週間後のμＣＴ３Ｄによる再現および縦断面を示す。C12-(2-3-2)／ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ群のμＣＴ断面において、新しい骨が形成される徴候が確認できる。対して、フィブリンまたはC12-(2-3-2)／ＦＦＬ・ｃｍＲＮＡ群では新たな骨が形成される徴候は認められなかった。このモデルを用いて、自然発生的な骨治癒過程におけるｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの影響を測定した。図３Ｄに、すべて群について仮骨の形成量の定量的分析を示す。このμＣＴデータによれば、C12-(2-3-2)／ｈＢＭＰ−２・ｃｍＲＮＡを含むフィブリンで処置した動物では、対照群と比べ、２週間後の仮骨形成に有意な増加が見られた（Ｐ＜０．０５）。フィブリン群と、C12-(2-3-2)／ＦＦＬ・ｃｍＲＮＡを含むフィブリン群との間に有意差は見られなかった。それらの群では、有意な仮骨形成は確認できなかった。
【０２９１】
得られたμＣＴ結果によれば、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡの骨治癒に対する治療効果が実証された。ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡで処置された動物では、インビボでの骨形成の刺激が明らかに確認された。対して、非特異的なｃｍＲＮＡ（すなわちＦＦＬ／ｃｍＲＮＡ）で処置された動物では骨形成は確認できなかった。これは、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡにより、骨欠損部位におけるｈＢＭＰ‐２の治癒的効果をもたらす発現が仲介され、骨形成が生じることを実証するものである。
【０２９２】
さらなる材料および方法（特に実施例８〜１４に関する）
材料：ダルベッコ・変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ）と、α最小必須培地（alpha Minimum essential medium：α‐ＭＥＭ）と、カルシウム・マグネシウム非含有ダルベッコ・リン酸緩衝塩類溶液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium：ＤＰＢＳ）と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、ペニシリン／ストレプトマイシン（Penicillin/Streptomycin：Ｐ／Ｓ）と、０．０５％のTrypsine-EDTAと、コラゲナーゼ・タイプＩおよびタイプＩＩ（collagenase type I and II）は、Life Technologies GmbH社（ドイツ国、ダルムシュタット）のGibcoから購入した。
【０２９３】
１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：ＤＰＰＣ）を含むヘルパー脂質と、コレステロールは、Avanti Polar Lipids社（米国、アラスカ州）から提供を受けた。エタノールや１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロール・メトキシポリエチレングリコール（1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol：ＤＭＧ‐ＰＥＧ）２ｋＤなど、複合体の調製に必要な他の材料はCarlRoth社（ドイツ国、カールスルーエ）とNof America Corporation社（米国、ニューヨーク州）から購入した。「KOLLAGEN resorbTM」という商品名のコラーゲンスポンジは、Resorba社（ドイツ、 ニュルンベルク）より提供を受けた。他の試薬および材料は、特に規定がない限りSigma-Aldrich社から得た。
【０２９４】
複合体の調製：ヘルパー脂質としてのＤＰＰＣおよびコレステロールと、ペグ化脂質としてのＤＭＧ‐ＰＥＧ２ｋとともに、カチオン性脂質であるC12-(2-3-2)（ethris GmbH社より提供、「Ｃ１２ＥＰＥ」としても知られる）を非ウイルス性トランスフェクション剤として用いた。
【０２９５】
ＲＮＡ濃度２００μｇ／ｍｌ、Ｎ／Ｐ比（ＲＮＡのリン酸基に対する脂質のアミノ基のモル比を表す）８でＲＮＡ複合体を形成した。複合体を誘導して、脂質相のエタン酸溶液をｃｍＲＮＡを含む水相の内側にインシュリン注射器で素早く注入することにより自己組織化させ、次いで高速で１５秒間渦動させ、室温で３０分間培養した。分画分子量が７ｋＤａの透析カセット（Pierce、米国）を用いて、合成したリポプレックスを再蒸留水で透析した。３０分後に１回水を交換し、その後一晩透析した。
【０２９６】
粒径およびゼータ電位の計測：リポプレックスの粒径は、Zetasizer（Malvern Instruments社、英国、ウースター）を用いてレーザー光散乱によって計測した。清潔な使い捨てのキュベット・セルを複合体７５０μｌで満たし、粒径の場合は全部で３０回、表面電荷の評価の場合は３００回、操作を行った。
【０２９７】
Metridiaルシフェラーゼによるアッセイ：レポーターｍＲＮＡであるMetridiaルシフェラーゼの発現の動態を用いて、持続性ｍＲＮＡ送達におけるコラーゲンスポンジの性質を試験した。このために、細胞培養上清をトランスフェクト後２４時間おきに回収し、新しい培地と交換した。回収した培地は、すぐに計測を行うか、または実験の最終日に試料をまとめて計測するまで−２０℃で凍結した。Met lucの発現を定量化するために、黒色の９６ウェルプレート（Costar社、米国、ニューヨーク州）中で８０μｌの上清と３０μｌの０．０５ｍＭセレンテラジン（Synchem社、ドイツ国、フェルスベルク）を丁寧に混ぜ、発光読取器（Wallac Victor、Perkin-Elmer Life Sciences社）を用いて３連で計測した。
【０２９８】
ラットの間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells：ＭＳＣ）の分離および増殖：ラットの骨髄間葉系幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells：ＢＭＳＣ）はethris GmbH社から提供を受けた。脂肪質間葉系幹細胞（Adipose mesenchymal stem cells：ＡＭＳＣ）は、オスのラットの脂肪組織から分離した。この処置では、脂肪組織をミリメートルサイズの小片に切断し、無菌ＤＰＢＳが入ったファルコンチューブ（Corning Inc社、米国、ニューヨーク州）に移し、ＤＰＢＳで何度か洗浄した。次に、コラゲナーゼ・タイプＩＩ溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）中で脂肪片を加湿された３７℃条件下で３０分間培養した。次いで、完全ＤＭＥＭ培地（１０％容積／容積ＦＢＳと１％容積／容積ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）を加えてコラゲナーゼ活性を停止させ、６００ｇで１０分間遠心分離した。上部の脂肪層を回収し、完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。次の工程では、細胞懸濁液を４０μｍセルストレーナー（Corning Inc.社、米国、ニューヨーク州）で濾過し、Ｔ７５ｃｍフラスコ（Corning Inc.社、米国、ニューヨーク州）に蒔き、加湿された３７℃、５％ＣＯ２の完全ＤＭＥＭ（参考文献２０）に配置した。非接着細胞を除去するために、翌日、培地交換を行った。細胞密度１５００〜３０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２で細胞を増殖させ、培地は３日おきに交換した。本研究では、ＭＳＣは６継代まで使用した。
【０２９９】
実験設定：パンチャー（VBS Lochzange, Nr. 19970181）を用いてコラーゲンスポンジを小片（６ｍｍ径）に切断した。それら小片を、無菌状況下にある、底が平らでポリプロピレンコーティングを施していない９６ウェルプレート（Eppendorf社、ドイツ国、ハンブルグ）のウェルに入れた。分散保護剤（lyoprotective）として、スクロース（２％）中の５０μｌのリポプレックスを各片に滴下し、室温で９０分間培養してスポンジに完全に浸漬させた。次いで、配合スポンジを高真空環境（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH社、ドイツ国、オステローデ・アム・ハルツ）に移し、そこで０．０５ｍｂａｒで少なくとも２時間乾燥させた。その後、スポンジは細胞播種に用いるか、真空封止されて使用まで室温で保管した。細胞播種を行う場合、５０μｌの完全培地（ＮＩＨ３Ｔ３およびＭＳＣ細胞用の完全ＤＭＥＭ）における所望の細胞密度を各スポンジに加え、その後、加湿された３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分間培養した。ポリプロピレンのコーティングが施されていないプレート上では成長できないため、細胞は、培養時、コラーゲンスポンジ上に播種する必要があった。次いで、２００μｌの完全培地をウェルに加えて、プレートを細胞培地インキュベータで培養した。
【０３００】
laminar hood（BDK Luft und reinraumtechnik GmbH社、ドイツ国、Sonnenbuhl-Genkingen）を用いてすべての処置を無菌状態で行った。さらに、コラーゲンスポンジが高い静電荷を有するため、プラスチック材料は回避した。
【０３０１】
ｃｍＲＮＡ導入の効果：ファックス分析を行って、３Ｄ系におけるｃｍＲＮＡトランスフェクションの効果を特性評価した。このため、各スポンジを、カルシウムとマグネシウムを含むハンクのバランス電解液（Hanks' balanced salt solution：ＨＢＳＳ）中で、３００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ・タイプＩとともに４〜７時間培養した。培養時、数回スポンジを目視で観察して、完全なコラーゲンの消化を確認した。細胞を５００ｇで５分間遠心分離にかけ、ＤＰＢＳで洗浄した。次の工程では、１０μｌの０．０５％Trypsin-EDTAとともに細胞を３７℃で５分間培養して細胞の剥離を促進させた。各ウェルに、２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳを９０μｌ加えて剥離を停止させた。
【０３０２】
Attune NxTフローサイトメトリー（Life technologies社、米国、ニューヨーク州）を用いてファックス分析を行った。各実験の前に、キャリブレーション用ビーズ（Molecular probes、Life technologies社、米国、ニューヨーク州）を用いて機械を較正した。細胞破片は、前方散乱・側方散乱ゲ―ティング（forward- and side-scatter gating）を用いて分析から除いた。２Ｄおよび３Ｄ条件下で培養された非トランスフェクト細胞を陰性対照として用いて、ｅＧＦＰの蛍光発光を検出するために蛍光チャネルを調整した。３連で得たデータを、FlowJo_V10ソフトウェアで分析した。
【０３０３】
細胞死／生存の測定：ヨウ化プロピジウム染色およびＷＳＴアッセイを用いて細胞生存率を評価した。両アッセイにおいて、さまざまな用量のｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡ複合体が配合された真空乾燥コラーゲンスポンジを使用した。１スポンジにつき１０，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を完全ＤＭＥＭ培地に播種し、加湿された３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。
【０３０４】
生死染色を行うために、前述したやり方で細胞をファックス分析用に調製した。次いで、ヨウ化プロピジウム溶液の１ｍｇ／ｍｌの貯蔵液の１：１０００希釈物を計測の直前に各ウェルに加えた。
【０３０５】
細胞生存は、製造業者（colorimetric cell viability kit II (WST-1)、Promokine社、ドイツ国、ハイデルベルク）の指示にしたがってＷＳＴ反応アッセイによっても評価した。ＷＳＴ試薬を加える前に、３回ピペットを上下させて上清を取り、各ウェルにおいてスポンジから均質な溶液を得た。次いで、１００μｌの上清を新しい細胞培養９６ウェルプレート（Corning Inc.社、米国、ニューヨーク州）に移し、計測を行った。トランスフェクトを行わなかったウェルから得た上清をブランクとして用いた。多重分光光度読取装置（multiple spectrophotometric reader）（Wallac Victor、Perkin-Elmer Life Sciences社、米国。マサチューセッツ州）を用いて、４５０ｎｍで３連で吸光度を計測した。
【０３０６】
ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡ配合のコラーゲンマトリクスで培養されたＭＳＣによるｈＢＭＰ‐２の分泌：さまざまな用量のｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡリポプレックスでトランスフェクトされたＭＳＣから得た培地試料をトランスフェクトから２４時間後に回収し、ヒトＢＭＰ−２ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス）を製造業者の指示にしたがって用いてｈＢＭＰ‐２の濃度を計測した。実験は３連で行い、標準曲線（ｒ２＝０．９９）を用いてタンパク質含有量を測定した。
【０３０７】
走査型電子顕微鏡：走査型電子顕微鏡（Scanning electron microscopy：ＳＥＭ）を用いてコラーゲンスポンジのモフォロジーの特性評価を行い、スポンジ上に配合されたｍＲＮＡ複合体を評価した。スパッタ装置（sputter coater）（Edwards sputter coater S150B、HHV Ltd社、英国、ウェストサセックス）を用いて、金とパラジウムを６０／４０の比で用いてすべての試料にコーティングを施した。次いで、Zeiss-Leo DSM 982 Gemini（FELMI-ZFE社、オーストリア、グラーツ）を１．２ｋＶで用いてＳＥＭを行った。
【０３０８】
コラーゲンスポンジに播種した細胞のヘマトキシリン染色：コラーゲンスポンジにＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種してから２４時間後、リン酸緩衝塩類溶液（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で細胞を固定し、室温で一晩おいた。次いで、コラーゲンスポンジを脱水し、パラフィンに埋め込んだ。コラーゲン部（７μｍｍ）を脱パラフィンし、標準プロトコルにしたがってヘマトキシリンで染色した。
【０３０９】
ＲＮＡ分離およびリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcriptase real-time polymerase chain reaction：ＲＴ‐ＰＣＲ）：ｈＢＭＰ‐２配合のコラーゲンスポンジに細胞を播種後７日目と１４日目に、ハンクのバランス電解液（Hanks' balanced salt solution：ＨＢＳＳ）中の適切な量のコラゲナーゼ・タイプＩを各ウェルに加えて、コラゲナーゼ・タイプＩの最終濃度が３００Ｕ／ｍｌになるようにした。次いで、加湿された３７℃、５％ＣＯ２条件下で、プレートを４〜７時間培養した。コラーゲンスポンジが完全に溶けたら、細胞を５００ｇで５分間遠心分離にかけた。ＲＮＡを完全を分離するため、上清を取り除き、細胞はその後、製造業者に指示にしたがい、TRIzol試薬（Ambion、life technologies社、ドイツ国、ダルムシュタット）で溶解した。
【０３１０】
ＲＮＡ濃度と純度は、NanoDrop 2000C分光測定器（Thermo Scientific社、米国、デラウェア州）で測定した。First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific社、ドイツ国、ダルムシュタット）を製造業者の指示にしたがい使用して、４５０ｎｇの全ＲＮＡから第一鎖（first-strand）ｃＤＮＡを逆転写した。ｈＢＭＰ‐２でトランスフェクトを行った群と行わなかった群それぞれについて、スポンジを１５個使用し、ＲＮＡ分離を行うために溶解した細胞と一緒にプールした。
【０３１１】
骨関連遺伝子の発現を評価するために、soAdvanced Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad社、ドイツ国、ミュンヘン）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ（ｎ＝３）を行った。ＰＣＲはLight Cycler 96 thermal cycler（Roche社、ドイツ国、マンハイム）に対し行った。標的遺伝子の発現レベルはＧＡＰＤＨ（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の場合）とβ‐チュービュリン（ＭＳＣの場合）の発現レベルに正規化した。データは、対照（すなわち、トランスフェクトされていない３Ｄ培養でのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞およびトランスフェクトされていない２Ｄ培養でのＭＳＣ）に対する誘導倍率として表してある。プライマー配列は以下のように５’〜３’まで列挙した。
【０３１２】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する骨再生実験用のマウスのプライマー
【０３１３】
【表１】
2017534649.tif 000015
【０３１４】
ＭＳＣに対する骨再生実験用のラットのプライマー
【０３１５】
【表２】
2017534649.tif 000016
【０３１６】
インビトロでの骨分化：以前から知られているやり方で、２％スクロース中でコラーゲンスポンジに３μｇのｈＢＭＰ２・ｍＲＮＡリポプレックスを配合し、真空乾燥させた。次の工程では、５０μｌのＤＭＥＭ中にある新たに分離したラットのＡＭＳＣを各コラーゲンスポンジに３０，０００個ずつ播種し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において３７℃で３０分間培養して、コラーゲンスポンジへの細胞の接着を確実にした。次いで、２５０μｌの骨形成培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋β‐グリセロリン酸１０ｍＭ＋Ｌ‐アスコルビン酸２００μＭ＋１％ペニシリン‐ストレプトマイシン（Pen-Strp）を各ウェルに加えた。培地の半分は２、３日おきに新しいものと交換した。３Ｄ（コラーゲンスポンジに播種）および２Ｄ（通常の細胞培養フラスコに播種）下の非トランスフェクト細胞を含む陰性対照も、３Ｄ下のトランスフェクト細胞とまったく同様に処置した。播種後から７日目および１４日目、ＲＴ‐ＰＣＲによって骨形成マーカーの発現について細胞を調査した。
【０３１７】
インビボでの骨分化：インビボでの移植実験は、Care and Use of Laboratory Animalsに規定されるガイドライン（米国National Research Council Committee、National Academies Press（米国）、2011）にしたがって計画した。全部で９匹のＳＤラット（６ヵ月のオス、平均体重：６００〜７００ｇ、Janvier社、フランス国、ル・ジュネスト＝サン＝ティスル）を用いた。各ラットにおいて、左足の大腿骨欠損は空のコラーゲンスポンジで処置し（陰性対照）、右足の大腿骨欠損は２．５μｇのｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡが配合されたスポンジで治癒を行った。術中術後の感染症を回避し、痛みを和らげるため、日常的に用いられている抗生物質と鎮痛剤を処方し、動物には、Medetomidin（Domitor（登録商標）、Orion pharma社、フィンランド国、エスポー：１３５μｇ／ｋｇ）とMidazolam（Dormicum（登録商標）、ドイツ国、Unterhaching：２．５ｍｇ／ｋｇ）と、Fentanyl（Duragesic（登録商標）、ベルギー国、ベーアセ：５μｇ／ｋｇ）との混合薬を用いて麻酔をかけた。
【０３１８】
剃毛と消毒後、横方向外部領域に小さく皮膚切開を行った。２ｍｍ外径の骨用ドリルを用いて、大腿骨の中央部に全層骨欠損を作製した。
【０３１９】
欠損部に足場を適用後、ポリビニル膜を用いて移植領域を覆い、頭蓋骨膜の自己再生能の影響を最小限に抑えた。最後に４−０バイクリル縫合糸を用いて頭蓋骨膜とそれを覆っている皮膚を閉じた。ナトリウムペントバルビタール（Narcoren（登録商標）、Merial GmbH社、ドイツ国、ハルベルクモース：４００ｍｇ／ｋｇ）を用いてラットの皮膚を乱切りし、試料を回収してμＣＴおよび組織学的分析を行った。
【０３２０】
マイクロＣＴ（μ‐ＣＴ）分析：μＣＴ４０（Scanco Medical社、スイス国、バッサースドルフ）を用いて、３次元Ｘ線マイクロＣＴ（μ‐ＣＴ）画像処理を行って骨形成を定量化した。骨の容積を計測して、各標本（空のコラーゲンスポンジで処置した欠損とｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合コラーゲンスポンジで処置した欠損）において新たに形成された仮骨の量を比較した。
【０３２１】
ラット大腿骨欠損の組織学的考察：組織プレパラートによって骨再生の性質的側面および形態学的側面を分析した。４０％〜１００％のグレードシリーズのエタノール中で大腿骨を脱水し、メタクリル樹脂（Technovit 7200、Heraeus Kulzer GmbH社、ドイツ国、ヴェールハイム）に包埋した。薄く削った小片（およそ３０μｍ）をプレパラートにし、Levai Laczko染色で染色し、光顕微鏡下で評価した（Donath K. and Breuner G., J. Oral Pathology (11), 1982, 318-326、Laczko J. and Levai G. (31), Mikroskopie, 1975, 1-4）。
【０３２２】
統計学的分析：すべての統計学的分析は、ウィンドウズ用GraphPad Prism version 6.05（GraphPad Software Inc.社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて行った。統計学的有意差は、ｔ検定および多重ｔ検定を用いて測定した。Ｐ＜０．０５の場合、有意差があるとみなした。
【０３２３】
（実施例８）C12-(2-3-2)を用いた、さらなる代替的なｃｍＲＮＡ複合体形成：
Ethris GmbH社より提供を受けたカチオン性脂質を非ウイルスベクターとして用いて、脂質の陽性アミノ基とｃｍＲＮＡの陰性リン酸基との静電的相互作用に基づいて、ｃｍＲＮＡをもちいて安定したリポプレックスを作製した（Anderson, Human amino groups of lipid and negative phosphate groups of cmRNA, Human Gene Therapy 14, 2003, 191-202）。リポプレックス構造を安定化させ漏洩を抑制するために、１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：ＤＰＰＣ）およびコレステロールと名付けられた２種類のヘルパー脂質をEthris脂質に混合した（Anderson, Drug Delivery 11, 2004, 33-39、Liang, Journal of Colliod and Interface Science 278, 2004, 53-62）。最後に、上記脂質混合物に１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol：ＤＭＧ‐ＰＥＧ）２ｋＤを加えてＰＥＧ化（PEGylated）リポソームを得た。これは既に周知のことだが、ＰＥＧ化（PEGylation）を行うことで、水溶性が増し、酵素分解を回避でき、免疫および抗原反応を制限することができるため、リポソーム製造の物理化学的特性が向上する（Milla, Current Drug Metabolism 13, 2012, 105-119）。エタン酸脂質混合物全体における最終的なＮ／Ｐ比は８／５．２９／４．４１／０．８８であり、これは、ｃｍＲＮＡ分子の１リン酸基に対する、C12-(2-3-2)／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＭＧ‐ＰＥＧのアミノ基のモル比をそれぞれ表す。ｃｍＲＮＡリポプレックスの生物物理学的特性を表６にまとめた。すべての生成物の流体力学的径は概略でおよそ５０ｎｍであり、多分散性指標は０．１に近似である。これは生成物が均質であることを示している。また、すべての複合物の合計表面電荷は中性に近いが僅かに陽性である。
【０３２４】
（実施例９）コラーゲンスポンジ上へのｃｍＲＮＡ複合体の配合と細胞播種
コラーゲンスポンジへの配合を行う前に、ｃｍＲＮＡリポプレックス溶液に凍結乾燥防止剤として２％のスクロースを加えた。凍結乾燥防止剤は、真空乾燥処理における脱水時に生物学的系の完全性を維持するものである（Kannan, Journal of Liposome Research, 2014, 1-9）。走査型電子顕微鏡（scanning electron microscopy：SEM）によってスポンジを可視化することにより、２％スクロースを含む真空乾燥済みコラーゲンスポンジは、真空乾燥前（図２３）と比較して、小さな孔を有する閉じた鳥かごに似た形状を呈することが確認できた。
【０３２５】
ｃｍＲＮＡリポプレックスがスポンジに配合されている可能性を確実にするために、ｃｍＲＮＡ配合スポンジをＳＥＭによって調査し、ｃｍＲＮＡを含むリポプレックスをコラーゲンスポンジ上に検出した（図１４Ａ）。
【０３２６】
コラーゲン上のｃｍＲＮＡ配合だけでなく細胞のトランスフェクションも調査するために、スポンジにtdTomato／ｃｍＲＮＡリポプレックスを２μｇ配合した。tdTomato・ｃｍＲＮＡの１０％は共有結合によってＦＩＴＣと共役している。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の播種から３０時間後、Leica DMi8蛍光顕微鏡（Leica microsystems社、スイス国、ヘーアブルーク）を用い、スポンジ上における細胞およびｃｍＲＮＡリポプレックスの分散度とトランスフェクション有効性を視覚化した。図１４Ｂに見られるように、細胞はトランスフェクトされ、主にｃｍＲＮＡを高蓄積した箇所（緑色斑）においてtdTomatoタンパク質が発現した（赤色斑）。
【０３２７】
３Ｄマトリクス上での細胞挙動を調査するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種してから７日後に、縦長に切断したスポンジにヘマトキシリン染色を行うことにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のコラーゲンスポンジ内への移動を確認した。図１Ｃから、細胞はスポンジ内へ移動でき、マトリクス全体を成長およびシグナリングに使用できることが明らかとなった。これはインビボでの環境により酷似している。
【０３２８】
第一に、細胞はコラーゲンスポンジの３Ｄマトリクス内で成長できることが確認できた。他の研究によっても、コラーゲンスポンジが細胞培養に適した３Ｄ足場であることが証明されており、それにより細胞シグナリングや細胞挙動が向上し、細胞における遺伝子発現に影響がもたらされる（Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218）。次いで、ｃｍＲＮＡリポプレックスおよび細胞が均一に分散していることが、蛍光標識されたｃｍＲＮＡによってＳＥＭおよび蛍光顕微鏡を用いて可視化された（図１４）。
【０３２９】
（実施例１０）コラーゲンスポンジ上でのトランスフェクション有効性と細胞生存率
コラーゲンスポンジ上での細胞トランスフェクションの有効性と安全性を確認するため、トランスフェクトから４８時間後にＮＩＨ３Ｔ３細胞系におけるｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡの発現を評価した。第一に、JULY（商標）蛍光顕微鏡（Baker and Baker Ruskinn社、米国）を用いて、陽性ｅＧＦＰを発現している細胞を視覚化した（図１５Ａ）。これらの結果を定量化するため、ファックス分析を行ったところ、トランスフェクトされた細胞における平均蛍光強度の有意な増加が見られた（図１５Ｂ）。用量反応実験において、１細胞当たりのｃｍＲＮＡ量を増加させた場合、最大で１００％のトランスフェクション効率が確認された（図１５Ｃ）。
【０３３０】
臨床環境では、トランスフェクション効率だけでなく細胞毒性も決定要因となる。したがって、ＧＦＰの発現に加えて細胞生存率についても、２つの異なる方法を用いて（すなわちＰＩ染色とそれに続くファックス分析およびＷＳＴアッセイ）、２つの独立した実験においてトランスフェクトから４８時間後に定量化を行った。どちらの方法においても細胞生存率６０〜７０％という類似する結果が得られた（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。トランスフェクション効率とは違い、有効性について用量依存的な増加が見られた場合でも、細胞生存率は用量に依存するものではないようであった。
【０３３１】
コラーゲンスポンジ上のｅＧＦＰ・ｃｍＲＮＡのトランスフェクション有効性をファックス分析で定量化することにより、トランスフェクトされた細胞率が１００％に到達するという著しく高い有効性をわれわれの技術は達成することが証明された（図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。この技術を臨床アプローチで立証するために、細胞生存率も評価し、６０〜７０％という用量依存的な細胞生存率が確認された。これはわれわれのインビトロ手法およびインビボ手法の両方で忍容されるものであった（図１５Ｄおよび図１５Ｅ）。細胞生存率のアッセイにおける用量非依存性は、３Ｄマトリクス内に細胞が均一に分布していることの結果と言え、これはインビボ環境に酷似しており、より多いｃｍＲＮＡ複合体の用量の場合でも細胞は耐性があるという点で細胞シグナリングおよび細胞増殖を向上させることもできる（Mueller-Klieser、American Journal of Physiology-Cell Physiology 273, 1997, C1109-C1123)。この細胞生存率が用量に依存しない動向は、全体的に有効性が低くｃｍＲＮＡの用量を増やす必要がある場合に特に有益である。
【０３３２】
（実施例１１）コラーゲンスポンジは、持続性ｃｍＲＮＡ送達のためのデポーとしての機能する：コラーゲンスポンジが持続性ｃｍＲＮＡ送達系を実現できるかどうかを調査するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のMetridiaルシフェラーゼ（Met luc）・ｃｍＲＮＡの発現動態を２４時間おきに計測し、２Ｄ培養および３Ｄ培養において比較した（図１６）。
【０３３３】
結果を見ると、最初の６日間はタンパク質の発現が安定していたことから、コラーゲンスポンジには持続性ｃｍＲＮＡ送達系としての性質があることが確認できた。加えて、８日後の発現がほぼゼロである２Ｄでの細胞培養と比較して、ｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジでは、ｃｍＲＮＡ用量が多くても、１１日後でも比較的高いタンパク質の発現レベルがみられた。
【０３３４】
非修飾ｍＲＮＡを含むリポプレックスをコラーゲンスポンジに配合した場合も同様の結果が得られた（図２４）。しかしながら、真空乾燥を行わなかったコラーゲンスポンジを用いた場合、この系では遅延送達効率は得られなかった（図２５）。このことから、持続的なｃｍＲＮＡ送達系を本設定において実現するには、真空乾燥は必須かつ重要な工程であることが証明された。
【０３３５】
次の工程では、骨髄組織（ＢＭＳＣ）と脂肪質組織（ＡＭＳＣ）から分離したラットの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いて、初代培養細胞について系を試験した。両方の細胞型を用い、リポプレックスを配合したコラーゲンスポンジに播種する細胞数を増やしつつ、Met lucの発現の動態を測定した。図１７に示すように、細胞密度にかかわらず、複合体を配合したコラーゲンスポンジに播種されたＭＳＣでは、少なくともその後４日間はタンパク質の発現が続いた。細胞密度が高くても（＞１００００細胞／スポンジ）Met lucの発現における有意な増加は見られなかったため、これより先の実験は１スポンジ当たり１０〜２００００個の細胞を用いて行った。
【０３３６】
Metridiaルシフェラーゼ・ｃｍＲＮＡの発現の動態を計測して、細胞系（図１６）およびさまざまな細胞密度の初代培養細胞（図１７）と、修正ｍＲＮＡおよび非修正ｍＲＮＡ（図２４）も用いて、持続性ｃｍＲＮＡ送達用のコラーゲンスポンジの能力を評価した。動態の結果を見ると、真空乾燥を行ったｃｍＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジでは、ｃｍＲＮＡについて強固な持続性送達系が実現されており、これはＲＮＡの修正、細胞型、および細胞密度から独立したものである。接触阻止および細胞密度に対してより敏感な初代培養細胞についても強固な持続性送達系が実現されている（参考文献２１）。そのような系は、低細胞密度への切り替えも実現可能な場合、細胞源や患者の試料がない場合に非常に有利となるだろう。このような遅延送達系を実現するために、乾燥を行っていないスポンジにおけるｃｍＲＮＡの発現レベルはすぐに下降してしまうことから（図２５）、真空乾燥は重要な役割を果たしていると思われる。真空乾燥するとｃｍＲＮＡ送達が長期間可能になるのは、治療に縛られることなく、真空乾燥されたコラーゲンスポンジは閉じた鳥かごのような構造（図２３）をしていることに起因すると考えられる。この場合、閉じ込められたリポプレックスは、細胞と接触するときもマトリクスから放出されるときも時間が必要となる（参考文献１０）。コラーゲンスポンジにおいて真空乾燥済みのｃｍＲＮＡリポプレックスが均一に分布していることは（図１４Ａ）、数日間の間、トランスフェクションの有効性のピークやバースト放出なしに、安定して発現が続くもう１つの理由でもある（Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752）。
【０３３７】
真空乾燥にはもう１つの実質的影響がある。真空乾燥を行ったコラーゲンスポンジ上のｃｍＲＮＡ複合体は室温で少なくとも６ヵ月間安定しているということである（図２２、実施例１４も参照）。非常に敏感なｍＲＮＡ分子におけるこのかなり長い貯蔵寿命は本研究において初めて達成された。これにより、ｃｍＲＮＡを用いた潜在的治療法を使用する利用価値および容易性が高まり、ｃｍＲＮＡの臨床利用は実現に一歩近づくことができる。
【０３３８】
われわれの技術が、レポーターｃｍＲＮＡを細胞系内および初代培養細胞内への送達に最適化した場合、われわれの系は、ｈＢＭＰ２を用いて生理学的効果（すなわち骨形成）について調査するために試験された。
【０３３９】
（実施例１２）インビトロでの細胞分化
生理学的効果について、持続性ｃｍＲＮＡ送達系の性能を実証するために、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡリポプレックスを用いて、２つの異なる細胞（すなわちＭＣ３Ｔ３−Ｅ１とＭＳＣ）で２つのインビトロでの骨分化実験を計画した（Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752; Meine, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002、Kim, Biomaterials 28, 2007, 1830-1837）。
【０３４０】
骨芽細胞様の細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）における骨分化を確認するために、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合コラーゲンスポンジ上に細胞を播種後７日目と１４日目に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription polymerase chain reaction：ＲＴ‐ｑＰＣＲ）を行って、骨形成マーカー（ＯＣＮとＡＬＰ）の発現を定量化した。配合のないコラーゲンスポンジに播種された非トランスフェクト細胞を陰性対照として用いた。図２０Ａに示すように、両マーカーとも両時点において強く発現し、発現は１４日目まで増加した。
【０３４１】
次の工程では、同じ設定を用いてＭＳＣを用いてインビトロでの骨分化を行った。まず、新たに分離したＭＳＣを陽性マーカーと陰性マーカーについてファックス分析を用いて評価した（図２６）。次いで、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡリポプレックスを配合したコラーゲンスポンジにＭＳＣを播種した。トランスフェクトから２４時間後、ＥＬＩＳＡを用いて上清中でｈＢＭＰ２の発現を定量化した（図１９）。７日後と１４日後に、ＲＴ‐ｑＰＣＲを用いて骨形成マーカー（ＲＵＮＸ２、ＯＳＸ、ＯＣＮ、ＡＬＰ）の発現を検出した。予想外なことに、３Ｄコラーゲン足場に播種されたトランスフェクトされたＭＳＣだけでなく、トランスフェクトされていないＭＳＣにおいても、すべてのマーカーが強く発現した。したがって、（培地および洗浄について）３Ｄにおける細胞とまったく同様に処置した従来の２Ｄ環境（ペトリ皿での標準的な細胞培養）での非トランスフェクトＭＳＣ培養を陰性対照として選択して、３Ｄでの細胞に見られる分化マーカーの発現を正規化した。図２０Ｂに示すように、３Ｄコラーゲンマトリクスでのみ行った培養は、ＭＳＣにおける骨形成マーカーの発現を有意差をもって上方制御した。
【０３４２】
ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡを配合したコラーゲンスポンジに播種された骨芽細胞様の細胞系（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）とＭＳＣを用いてインビトロでの骨分化を行った（参照文献１０、１９）（図２０）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の場合、トランスフェクトされた細胞では、骨形成マーカーの発現が３Ｄコラーゲン足場に播種された非トランスフェクト細胞と比べて数倍多かったことから（図２０Ａ）、ｈＢＭＰ‐２・ｃｍＲＮＡは、骨形成の誘発に有意な影響を及ぼしたといえる。
【０３４３】
これに対して、コラーゲンスポンジ上の、ｈＢＭＰ２でトランスフェクトされたＭＳＣとされていないＭＳＣの間では、骨形成マーカーの発現において有意差はほぼなかった（図２０Ｂ）。しかしながら、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジ上に播種されたＭＳＣに由来するｈＢＭＰ２の発現は、ＥＬＩＳＡによって既に検出されている（図１９）。このデータによれば、コラーゲンスポンジ自体がインビトロでＭＳＣにおける骨再生を誘発することができる。以前より、コラーゲンスポンジにより軟骨形成が開始されうることが示されている（Bosnakovski, Biotechnology and Bioengineering 93, 2006, 1152-1163）。この現象について別の説明の仕方をすると、ＭＳＣを含むトランスフェクトされたコラーゲンスポンジとされていないコラーゲンスポンジでは、劇的な巨視的変化がみられる（図２７）。７日目まで、ｈＢＭＰ２が配合されたスポンジはふんわりとしサイズも膨らんでいるように見えたが、配合されていないスポンジは時間経過とともに縮合し縮んでいるように見えた。配合のない収縮スポンジではＭＳＣの融合性が強くなり過ぎるため、ＭＳＣは多能性を失い、最終分化細胞へと再プログラム化を始めてしまう（Sekiya, Stem Cells 20, 2002, 530-541、Coulter, PNAS 97, 2000, 3213-3218）。ＭＳＣが骨形成培地で成長するにつれて、骨形成分化が行われる可能性が最も高くなるはずである。
【０３４４】
（実施例１３）インビボでの細胞分化
ラットの大腿骨欠損モデルによってインビボ骨再生作用を評価した。実験群と対照群として、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡを配合した真空乾燥コラーゲンスポンジと、配合していない真空乾燥コラーゲンスポンジを２つの群の動物の欠損に適用した。詳細には、ラットの大腿骨の中央部に作製した２ｍｍ径の骨欠損内に用意したスポンジを移植した。骨治癒を視覚化および定量化するために、手術から２週間後にマイクロＣＴ（μ‐ＣＴ）スキャンを撮影した。図２１Ａに示すように、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡで処置した群の方が新たに形成された骨が多く見られた。定量化された結果により、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジは、空のコラーゲンと比較して有意差をもって骨再生を増進させたことも証明された（図２１Ｂ）。仮骨形成に対するｈＢＭＰ２の効果も、μ‐ＣＴの３Ｄスキャンモデルにおいて良好に視覚化されている（図２９）。さらに詳細には、骨のさまざまな箇所（骨膜、皮質、骨髄）をμ‐ＣＴでさらに分析することにより、骨再生は骨髄領域において最も多く得られたことが判明した（図２７）。骨髄領域には大量の骨髄幹細胞が確かに存在する。
【０３４５】
新たに形成された骨の有効性を確認するため、免疫組織化学も２週間後に行い、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡで処置した群により高度な無機化骨組織が見られた。μ‐ＣＴの結果と同様に、高度に無機化された領域（免疫組織学画像中、真黒い箇所）は、主に骨の骨髄部分に見れらた（図１８Ａ）。さらに、骨膜領域における組織学的分析によれば、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡで処置した群は、対照群と比較して、仮骨形成が有意に増加していた（図１８Ｂ）。別の分析でも、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合のスポンジで処置した群では、空のスポンジで処置した群と比べ、有意に多くの線維組織が形成されたことが証明された（図１８Ｃ）。骨治癒過程では、線維組織の形成により、類骨形成さらには骨再生への動向が誘引されうる（Luellmann-Rauch, De BoeckSuperrieur, 2008）。それゆえに、図１８Ｄでは、ｈＢＭＰ・ｃｍＲＮＡで処置した群においてより多くの類骨形成が見られる。
【０３４６】
前臨床レベルでわれわれのｃｍＲＮＡ送達系を試験するため、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡを用いてｃｍＲＮＡ配合のコラーゲンスポンジをインビボでの骨形成に適用した。ＰＥＩを用いて化学修正を行ったＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ複合体のインビボでの骨形成効果が最近公開された（Elangovan, Journal of Controlled Release 218, 2015, 22-28）。
【０３４７】
しかしながら、この研究では、半分のサイズのＰＥＩ複合体を用いたｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡリポプレックス複合体が用いられており（表６）、これはインビボでの薬物動態および体内分布だけでなくインビトロでの細胞接種が向上させることができる（Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752、Albanese, Annual Review of Biomedical Engineering 14, 2012, 1-16）。その後、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡリポプレックスは真空乾燥によりコラーゲンスポンジに固定され、すぐに使えるバイオ製品として形成される。最後に、われわれのバイオ製品の有効性を動物モデルによって評価し、インビボで骨再生を行うためのｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ送達での本技術の機能性を証明した。
【０３４８】
さまざまな研究により、さまざまなキャリアを用いて骨組織工学におけるＢＭＰ２タンパク質の効果が証明されている（Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002、Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825）。しかしながら、現在のところ、ＦＤＡによって承認されている組み換え型ｈＢＭＰ２用のキャリアはコラーゲンのみである。したがって、固定されたｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡのキャリアとしてのコラーゲンの効率は本研究では調査した。
【０３４９】
インビボでの実験を行うために、配合済みのコラーゲンスポンジと配合のないコラーゲンスポンジをラットの大腿骨欠損に移植した。２週間後、ラットを死亡させ、μ‐ＣＴと免疫組織化学を用いて骨形成を評価した。得られた結果は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のインビトロでの骨再生における結果と類似するものであった。μ‐ＣＴ結果と免疫組織化学の両方により、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合コラーゲンで処置した欠損における骨形成は、空のコラーゲンと比べ有意に高レベルであったことが示された（図２１、図１８Ａ、図１８Ｂ、図２９）。骨のさまざまな部分（骨膜、皮質、骨髄）をさらに分析することで、最大の骨形成は骨髄領域で生じたことが証明された（図２８、図２１Ａ、図１８Ａ）。しかしながら、理想とする再生医療のためには新たな骨は主に皮質領域で生じるべきであり、このような骨髄部での骨形成は、骨欠損にコラーゲンスポンジを配置したことに起因する。われわれの研究では、配合が行われたコラーゲンスポンジと行われなかったコラーゲンスポンジを（皮質部分だけでなく）骨欠損全体に配置した。骨髄領域には、骨の他の部分と比べてはるかに多くのＢＭＳＣが含まれるため、骨形成は骨髄領域で最も多く生じた。言い換えると、皮質骨形成を実現するには、ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡ配合コラーゲンスポンジは皮質領域にのみ配置されるべきであるが、これは骨が小さすぎるラットモデルでは実現不可能である。同じ動物を組み換え型ＢＭＰ２タンパク質で処置している他の公表文献でも、２週間経過後、皮質領域よりも骨髄領域で多くの骨形成が確認されている。しかしながら、４週間経過後では、より多くの皮質骨形成が見られた（Keibl, Injury 42, 2011, 814-820）。したがって、皮質領域での骨再生の調査には、後の時点で追加実験を行うことが有用となりうる。
【０３５０】
さらに行った組織学的分析により、ｈＢＭＰ２で処置を行った群では有意に多くの線維組織が生じたことが証明された（図１８Ｃ）。これは骨組織形成のサインとも考えられる。骨治癒過程では、線維組織の形成は、機能的線維組織から類骨形成へ向かう動きを辿ることがあるためである（Luellmann-Rauch, De Boeck Superrieur, 2008）。同様に、ｈＢＭＰ・ｃｍＲＮＡで処置された群においては、より多くの類骨形成が検出された（図１８Ｄ）。
【０３５１】
これらの結果は、ＭＳＣを用いたインビトロでの骨再生で確認された内容（ｈＢＭＰ２・ｃｍＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジと配合されていないコラーゲンスポンジが骨形成においてほぼ同じ働きをする）とは異なるものである。この違いはインビトロ環境とインビボ環境の違いに起因しうる。インビボでの骨再生においては、小分子、成長因子やサイトカインの存在など、多くの因子がＢＭＰおよびコラーゲンスポンジの効果に影響しうるからである。（Lynch, Journal of Periodontology 62, 1991, 710-716、Wan, PNASA 105, 2008, 868-691、Mountziaris, Tissue Engineering Part B: Reviews 14, 2008, 179-186）。このような因子はインビトロ環境では欠けており、したがって、インビボでの結果はインビトロでの場合を正確に辿るものではない。それゆえ、コラーゲンスポンジおよび本明細書に記載される他のキャリアは、所望のｃｍＲＮＡリポプレックスだけでなく、スポンジ内部でのＭＳＣの移動を増強することができる小分子やサイトカインを前もって配合することで（Xu, Oncology Reports 23, 2010, 1561-1567、Wu, Stem Cell Reviews and Reports 8, 2012, 243-250）、トランスフェクションの有効性を向上させることもある。
【０３５２】
骨組織形態計測のさらなる結果：解剖後、大腿骨を採取して周囲軟組織を除去し、その後４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde：ＰＦＡ）で２４時間固定した。次に、段階的なアルコールとキシレンに浸漬させることによって試料を脱水し、最終的にメタクリル酸メチル（methylmethacrylate：ＭＭＡ）に埋め込んだ。その後、微細粉砕して断面を作製し、トルジイン青と酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（Tartrate Resistant Acid Phosphatase：ＴＲＡｃＰ）を用いてコッサ染色のプロトコルにしたがった染色を行った。
【０３５３】
ドリル孔領域は、組織形態計測を行うために、４つの理論的領域に分割した。すなわち、
・ドリル孔周囲の骨膜領域（Ｍ１）
・移植片が配置された緻密骨質内部の可視可能なドリル孔の領域（Ｍ２）
・移植片の一部も配置された骨髄内部のドリル孔の領域（Ｍ３）
・移植片が配置された骨髄内部のドリル孔領域の周囲の画定領域（Ｍ４）
【０３５４】
コッサ染色されたスライス片について、新たな骨の形成を示唆する組織の無機化が生じているかを検査した。この手順により、単位組織容積当たりの無機化組織量（ＢＶ／ＴＶ）が、ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡが配合されたコレーゲンスポンジを移植したドリル孔内の領域Ｍ４において、有意差をもって多いことが確認され（マン‐ホイットニーのＵ検定を用いてｐ＝０．０１）、骨髄内部で移植片の外側表面における骨形成が増強したことが示された。周囲表面において移植片に最も集中的に接触するのは造血幹細胞と思われるが、骨形成はこの骨髄内部において生じることが予想された（図３０Ａ）。
【０３５５】
ドリル孔周囲の骨膜領域（Ｍ１）では、空のスポンジを単に移植した骨と比べ、ｈＢＭＰ２をコードするｃｍＲＮＡを配合したスポンジを移植した骨の方が合計組織量が多く、機能的ｈＢＭＰ‐２の過剰発現の結果として骨形成作用が増加したことが示された（図３０Ｂ）。
【０３５６】
トルオール・ブルー染色を行ったスライス片の検査では、ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジを移植した場合、緻密骨質内部のドリル孔の領域（Ｍ２）において線維組織の生成が有意に多かったことが示された（図３０Ｃ）。さらに、線維組織の増加だけでなく、類骨形成を指向する線維組織形成の増加も生じ（図３０Ｄ）、新たに発達する骨組織の前駆体として、細胞外マトリクスが多く形成されたことが示された。
【０３５７】
ＴＲＡｃＰ染色では、ｈＢＭＰ‐２をコードするｃｍＲＮＡが配合されたコラーゲンスポンジで処置した場合、緻密骨質領域内部（Ｍ２）において、骨周囲のミリメートル当たりの破骨細胞（Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ）が有意に少ないことが確認され、ドリル孔の骨表面での炎症過程に起因して骨の再吸収が少なかったことが示された（図３０Ｅ）。
【０３５８】
（実施例１４）真空乾燥されたｃｍＲＮＡリポプレックスのコラーゲンスポンジ上での安定性についてのアッセイ
長期間安定性評価を行って、コラーゲンスポンジ上の真空乾燥させたバイオ製品としてのｃｍＲＮＡリポプレックスの貯蔵寿命を評価した。この目的で、コラーゲンスポンジ上に真空乾燥したMet Luc・ｃｍＲＮＡリポプレックスを含む９６ウェルプレートを真空封止し、室温で保存した。所定の時点において、プレートのうちの１つを用いてスポンジ上にＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種した。細胞播種から２４時間後、Metridiaルシフェラーゼの発現が計測された。次いで、さまざまな時点における保存プレートでの発現を、真空乾燥後すぐに使用したプレートでの発現（時点＝０）と比較した。図９に示すように、適用したｃｍＲＮＡ用量にかかわらず、コラーゲンスポンジ上の真空乾燥したｃｍＲＮＡ複合体は室温で少なくとも６ヵ月間安定していた。
【０３５９】
本発明は以下の表を参照するものである。
【０３６０】
【表３】
2017534649.tif 000017
【０３６１】
【表４】
2017534649.tif 000018
【０３６２】
【表５】
2017534649.tif 000019
【０３６３】
【表６】
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【０３６４】
【表７】
2017534649.tif 000021
【０３６５】
【表８】
2017534649.tif 000022
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【図１】
2017534649.tif 000023
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017534649.tif 000033
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2017534649.tif 000036
【図１３−１】
2017534649.tif 000037
【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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