(57)【要約】  ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含む有効量のペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む、癌間質を調整する、腫瘍脈管構造を正常化する、および／または腫瘍において血管機能を改善するための方法が本明細書中で提供される。有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を投与することを含む、腫瘍を処置し、腫瘍担持患者の生存時間を増大させるための方法も提供される。１つ以上の免疫療法剤と組み合わせて、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を投与することを含む、腫瘍を処置し、腫瘍担持患者の生存を延長させるための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腫瘍を処置するための方法であって、１つ以上の免疫療法剤と組み合わせて、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＬＩＧＨＴポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列によりコードされる、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記腫瘍ホーミングペプチドが、ＲＧＲ含有ペプチド、ＣＧＫＲＫ含有ペプチドおよびＣＲＥＫＡ含有ペプチドから選択される、方法。
【請求項４】
前記腫瘍ホーミングペプチドがＲＧＲ含有ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＧＲ含有ペプチドが、アミノ酸配列ＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＧＲ含有ペプチドがＬＩＧＨＴポリペプチドのＣ末端で複合化される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド−タンパク質複合物が、前記１つ以上の免疫療法剤の前に、前記１つ以上の免疫療法剤と同時に、または前記１つ以上の免疫療法剤の後に前記対象に投与される、請求項１〜６からの何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の免疫療法剤が、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍特異的なワクチンを投与することをさらに含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質−ペプチド複合物が、１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒｅ）抗体または腫瘍特異的なワクチンの前に投与される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物の有効量が、約２０ｎｇ／ｋｇ体重または／ｃｍ２表面積である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
癌患者の生存時間を増大させるかまたは延長させるための方法であって、１つ以上の免疫療法剤と組み合わせてＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含む有効量のペプチド−タンパク質複合物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記ＬＩＧＨＴポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍ホーミングペプチドが、ＲＧＲ含有ペプチド、ＣＧＫＲＫ含有ペプチドおよびＣＲＥＫＡ含有ペプチドから選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍ホーミングペプチドがＲＧＲ含有ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＧＲ含有ペプチドがアミノ酸配列ＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＧＲ含有ペプチドがＬＩＧＨＴポリペプチドのＣ末端で複合化される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチド−タンパク質複合物が、前記１つ以上の免疫療法剤の前に、前記１つ以上の免疫療法剤と同時に、または前記１つ以上の免疫療法剤の後に、前記対象に投与される、請求項１３〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の免疫療法剤が、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項１３〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍特異的なワクチンを投与することをさらに含む、請求項１３〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質−ペプチド複合物が、前記１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒｅ）抗体または腫瘍−特異的なワクチンの前に投与される、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、腫瘍の処置のための、および腫瘍を有する患者の生存時間を増大させるための方法および組成物に関する。腫瘍内で間質および／または脈管構造を調整するかまたは正常化する、および腫瘍内で血管機能を改善するための方法および組成物も提供される。本発明は、任意選択により免疫療法、化学療法および／または放射線療法に対する補助剤としての、腫瘍ホーミングペプチドに複合化されるＬＩＧＨＴポリペプチドを含むタンパク質複合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は、それらの成長のための栄養を得るため、および遠隔臓器に転移するために、宿主脈管構造を取り入れ、新しい血管の形成（血管形成）を誘導し、内皮および他の間質細胞を骨髄から動員する。その結果腫瘍内で生じる脈管構造は、構造的に、および機能的に異常である。腫瘍血管は漏出性であり、拡張されて間質性の高血圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）につながる。血管を裏打ちする内皮細胞は、異常な形態を有し、内皮細胞に対する支持体を提供する周皮細胞は、緩く付着するか、未成熟であるか、または存在しない。基底膜も異常であることが多い。
【０００３】
腫瘍血管におけるこれらの構造および機能的異常性は、例えば酸素障害およびアシドーシスを伴い、異常な腫瘍微小環境を生じさせる。この低酸素は、次に腫瘍浸潤、転移および悪性度を向上させ得る。腫瘍脈管構造における不規則性を含む間質細胞により生じる異常な腫瘍微小環境は、抗癌治療剤の効果的な送達も妨害し得、それによりそれらの有効性を低下させる。
【０００４】
腫瘍の新しい処置を考案することにおいて、一時的に腫瘍脈管構造も正常化し、低酸素症も緩和する血管新生阻害剤を用いてこれらの血管異常性を低下させるかまたは消失させることに多大な努力が注がれてきた（例えば、（非特許文献１）参照）。しかし、血管新生阻害剤は、腫瘍血管の破壊を含め、腫瘍血管に対して大きな損害を与え得る。
【０００５】
したがって、既知の抗血管新生療法の効果に損害を与えることなく、腫瘍脈管構造を効果的に標的とし得る新規処置が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊａｉｎ，２００１  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，６８５−６９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様は、癌間質を調整する、腫瘍脈管構造を正常化する、および／または腫瘍において血管機能を改善するための方法であって、ＬＩＧＨＴポリペプチド（ＴＮＦＳＦ１４としても知られる）および腫瘍ホーミングペプチドを含む有効量のペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む方法を提供する。
【０００８】
ＬＩＧＨＴポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０００９】
腫瘍ホーミングペプチドは、例えばＲＧＲ含有ペプチド、ＮＧＲ含有ペプチド、ＲＧＤ含有ペプチド、ＣＧＫＲＫ含有ペプチドおよびＣＲＥＫＡ含有ペプチドから選択され得る。代表的な実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドはＲＧＲ含有ペプチドである。ＲＧＲ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）を含み得る。ある実施形態において、ＲＧＲ含有ペプチドはＬＩＧＨＴポリペプチドのＣ末端で複合化される。腫瘍ホーミングペプチドは、リンカー配列を介してＬＩＧＨＴポリペプチドに複合化され得る。代表的な実施形態において、リンカーは、１つ以上の、任意選択により２つ以上または３つ以上のグリシン（Ｇ）残基を含み得る。
【００１０】
第一の態様のある実施形態において、有効量のＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物は、約０．２ｎｇ〜２０ｎｇ／ｋｇ体重の間であり得る。ある例において、有効量は約６ｎｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００１１】
前記の腫瘍脈管構造の正常化および／または腫瘍血管機能の改善は、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、マクロファージおよび他の腫瘍内免疫細胞を含む間質細胞からの因子／サイトカインの分泌の変化、大血管の選択的損失；血管の漏出性低下；血管への周皮細胞再付着；周囲のコラーゲンＩＶ線維の整列化；ＣＤ８＋および／またはＣＤ４５＋Ｔ細胞の浸潤促進；炎症性接着分子の発現上昇；およびα平滑筋（αＳＭＣ）陽性腫瘍周皮細胞における血管平滑筋マーカーの発現上昇のうち１つ以上を含み得るかまたはこれを特徴とし得る。いくつかの実施形態において、前記の腫瘍脈管構造の正常化および／または腫瘍血管機能の改善は、腫瘍血管完全性の修復、腫瘍血管の漏出性の低下および／または腫瘍灌流の増加のうち１つ以上を含み得るか、または結果としてこれが起こり得る。
【００１２】
前記の腫瘍脈管構造の正常化および／または腫瘍血管機能の改善は、腫瘍、例えば脳腫瘍に付随する浮腫形成の減少を引き起こし得るかまたは誘導し得る。この腫瘍脈管構造の正常化および／または腫瘍血管機能の改善は、腫瘍転移性拡延の低下、特に血液由来の腫瘍転移の減少を引き起こし得るかまたは誘導し得る。
【００１３】
本発明の第二の態様は、腫瘍において異所性または三次リンパ節の形成を誘導するための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露させることを含む方法を提供する。
【００１４】
異所性または三次リンパ節は、高内皮細静脈（ＨＥＶ）を含み得る。
【００１５】
ＬＩＧＨＴポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００１６】
代表的な実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドは、ＲＧＲ含有ペプチドである。ＲＧＲ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）を含み得る。ある実施形態において、ＲＧＲ含有ペプチドは、ＬＩＧＨＴポリペプチドのＣ末端で複合化される。腫瘍ホーミングペプチドは、リンカー配列を介してＬＩＧＨＴポリペプチドに複合化され得る。代表的な実施形態において、リンカーは、１つ以上の、任意選択により２つ以上または３つ以上のグリシン（Ｇ）残基を含み得る。
【００１７】
第二の態様のある実施形態において、有効量のＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物は、約２０ｎｇ〜２０００ｎｇ／ｋｇ体重の間であり得る。ある例において、有効量は、約６００〜７００ｎｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００１８】
本発明の第三の態様は、対象において腫瘍を処置するための方法であって、有効量の、本明細書中で開示されるようなＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本ペプチド−タンパク質複合物は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法と組み合わせて、対象に投与され得る。本複合物は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法の前に、これと同時に、またはこの後に、対象に投与され得る。
【００２０】
免疫療法は、任意選択により例えば、自己の腫瘍物質または既知の抗腫瘍抗原／アジュバント製剤を伴う、養子細胞移入または１つ以上の抗腫瘍もしくは免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍特異的なワクチンまたは他の免疫細胞調整剤の投与を含み得る。養子細胞移入は、自己の腫瘍浸潤性リンパ球の移入を含み得る。代表的な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ−１抗体を含み得る。代表的な実施形態において、化学療法は、シクロホスファミドの投与を含み得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、と複合化されるＬＩＧＨＴポリペプチドの投与を含む。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を含み得る。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【００２２】
さらなる特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンと組み合わせて、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、と複合化されたＬＩＧＨＴポリペプチドの投与を含む。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンの前に投与される。
【００２３】
本発明の第四の態様は、癌患者の生存時間を増大させるかまたは延長するための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本ペプチド−タンパク質複合物は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法と組み合わせて対象に投与され得る。本複合物は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法の前に、これと同時に、またはこの後に対象に投与され得る。
【００２５】
免疫療法は、任意選択により例えば、自己腫瘍物質または既知の抗腫瘍抗原／アジュバント製剤を伴う、養子細胞移入または１つ以上の抗腫瘍もしくは免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍特異的なワクチンまたは他の免疫細胞調整剤の投与を含み得る。養子細胞移入は、自己の腫瘍浸潤性リンパ球の移入を含み得る。代表的な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ−１抗体を含み得る。代表的な実施形態において、化学療法は、シクロホスファミドの投与を含み得る。
【００２６】
特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、に複合化されたＬＩＧＨＴポリペプチドの投与を含む。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を含み得る。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【００２７】
さらなる特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンと組み合わせられた、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、に複合化されたＬＩＧＨＴポリペプチドの投与を含む。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンの前に投与される。
【００２８】
第三および第四の態様によれば、本ペプチド−タンパク質複合物の有効量は、約６ｎｇ／ｋｇ体重と約６００〜７００ｎｇ／ｋｇ体重との間であり得る。
【００２９】
本発明の第五の態様は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法に対する腫瘍の感受性を上昇させるための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む方法を提供する。
【００３０】
腫瘍は、前記の処置なしで、１つ以上の化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法剤に耐性であり得る。
【００３１】
本発明の第六の態様は、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングＲＧＲ含有ペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を提供する。
【００３２】
本発明の第七の態様は、第六の態様によるＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
第六の態様によるペプチド−タンパク質複合物をコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００３４】
腫瘍を処置するための、または腫瘍がある患者の生存期間を増大させるための、腫瘍脈管構造および間質を正常化する、および／または腫瘍において血管機能を改善するための薬剤の製造における、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物の使用も提供される。
【００３５】
本発明の実施形態は、次の図面を参照して、単に非限定的な例として本明細書中に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本明細書中で例示されるようなＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの短期処置の略図。
【図２】本明細書中で例示されるようなＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの長期処置の略図。
【図３】腫瘍微小環境に標的が定められたＬＩＧＨＴは、腫瘍脈管構造を正常化する。０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ（６〜７ｎｇ／ｋｇの用量に相当）またはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲを２週間にわたり週２回、ｉ．ｖ．注射し、組織学により組織を分析した。Ａ〜Ｂ．ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、小血管（大きさ＜３０μｍ）の顕著な増加およびより大きい血管（１５０〜２００μｍ）の減少を誘導し、一方でＣＤ３１の総表面積はそのままであった（Ｂ、右）。Ｃ．ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、脈管構造からのαＳＭＡ＋周皮細胞の突出を顕著に減少させ、脈管構造に付随しない間質Ｃｏｌ  ＩＶを減少させた。正常化脈管構造にごく接近している血管基底膜Ｃｏｌ  ＩＶ染色の裏打ちに注意。
【図４】ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、血管機能および腫瘍灌流を改善する。ＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの２週間の処置後、７０ｋＤａ  ＴＲＩＴＣ−デキストランまたはＦＩＴＣ−レクチンをｉ．ｖ．注射した。組織にホルマリンを灌流させ、ＯＣＴ中で包埋した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡を使用してデキストランおよびレクチンの腫瘍内レベルをそれぞれ分析し、ＮＩＳソフトウェア（バージョン３．０）を用いることによって定量化した。０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲによって、血管漏出性が低下し、腫瘍灌流が増加した。グラフにおいて、左手のバー＝０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ（ｎ＝５）；右手のバー＝０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ（ｎ＝４）。＊ｐ＝＜０．０５。
【図５】ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、より収縮性の表現型への周皮細胞の切り替えを誘導する。２５ｗｋ齢ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスに週に２回、０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲをｉ．ｖ．注射し、組織学のために組織を回収した。Ａ．ＣＤ３１およびａＳＭＡに関連する収縮性マーカー、カルポニンおよびカルデスモンでの血管マーカーＣＤ３１の免疫組織化学分析。注、カルポニンおよびカルデスモンの両者とも、腫瘍脈管構造に付随するａＳＭＡ陽性周皮細胞で専ら見られた。Ｂ．カルポニンおよびカルデスモンは、対照（左手バー）と比較して、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置後に顕著に上方制御されることが分かった（右手バー）。＊ｐ＝＜０．０５。
【図６】ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、短期処置後、腫瘍脈管構造を活性化し、Ｔ細胞浸潤を促進する。Ａ．ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置（０．２ｎｇ、２週間にわたり週２回注射）によって、腫瘍ＥＣでの炎症性接着分子ＩＣＡＭ−１の発現が増加する。Ｂ．対照および０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置マウスにインビトロ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射し、腫瘍を回収し、ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲによって、それらだけにおける何れかの処置と比較して、Ｔ細胞浸潤が顕著に改善する。スケールバー、Ａ．１００μｍ、Ｂ．５０μｍ、＊ｐ＝＜０．０５。
【図７】ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、養子移入およびワクチン併用療法において生存を延長させる。Ａ．インビトロ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの養子移入でマウスを処置し、セットエンドポイント（ｓｅｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）（３０週間）で生存を評価した。２回の養子移入（２ｘＡｄＴ）後の０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置腫瘍は見劣りしており、これは、血管機能および免疫細胞浸潤の上昇を示す。Ｐ＝０．０３８（フィッシャーの正確確率検定／ピアソンのカイ２乗検定）。Ｂ．抗Ｔａｇタンパク質でマウスにワクチン接種し、ＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲで処置し、生存を監視した。ワクチン単独と比較して、Ｐ＝０．００６  ワクチン＋ＬＲ。
【図８】０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲおよび化学療法。飲用水中の低用量シクロホスファミドと組み合わせてＬＩＧＨＴ（対照）またはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲで週２回のｉ．ｖ．でマウスを長期間処置した。Ａ．様々な処置群において組織学によって腫瘍内アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）を分析し、Ｂ．定量した。＊＊ｐ＝＜０．０１、ｎ＝５〜７匹マウス。Ｃ．処置後の腫瘍量の評価。未処置と比較して＊ｐ＝０．０２、全実験群と比較して＊＊ｐ≦０．００１、ｎ＝１０〜１２匹マウス。スケールバー、１００μｍ、Ｄ．生存分析。第２２週からＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ、シクロホスファミドおよび組み合わせでＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスを処置した。生存を監視した。シクロホスファミド単独と比較して、Ｐ＝０．０５シクロホスファミド＋ＬＲ、ｎ＝８〜１０匹マウス。
【図９】２週間にわたり週２回の２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲのｉ．ｖ．注射（６００〜７００ｎｇ／ｋｇの用量に相当）により処置したＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの腫瘍における高内皮細静脈（ＨＥＶ）を含有する異所性リンパ節構造。処置した腫瘍の６０〜７５％においてＨＥＶを観察した。上段：ＨＥＶ構造をＭＥＣＡ７９抗体（赤色）で可視化し、緑色（レクチン）は血管を示す。中段：ＨＥＶ構造は浸潤性免疫細胞（ＣＤ４５＋）に付随する。下段：リンパ節構造と同様に、Ｂ細胞（Ｂ２２０）は免疫浸潤物の中央にある。
【図１０】２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでのＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの長期処置後の腫瘍細胞枯渇。Ｄａｐｉ染色（Ａ、上パネル）およびＨ＆Ｅ染色（Ｂ）した腫瘍切片は、腫瘍細胞の実質的な縮小を示す。ＴＵＮＥＬシグナルの増加は、腫瘍細胞アポトーシスの増加を示す（Ａ、下パネル）。
【図１１】チェックポイント遮断および抗腫瘍ワクチン接種と組み合わせたＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスにおける２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの処置後の生存データ。Ａ．第２３から４５週までの、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲおよび抗ＰＤ１／ＣＴＬＡ４抗体処置によるＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウス生存率。Ｂ．２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲおよび抗Ｔａｇワクチン＋／−抗体。ＡおよびＢに対して、ｎ＝１０〜１２；未処置に対して、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１２】指示どおりの２６週齢ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスでの短期（２週間）処置。腫瘍を単離し、総腫瘍量を重量により決定した。ＬＲ＝２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ。統計学的有意性が示された。Ｎ＝マウス数。
【図１３】ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、マウス乳癌において血管正常化を誘導し、続いて血管灌流を増加させ、腫瘍低酸素状態を軽減する。４Ｔ１乳癌が同所移植されたマウスを２週間にわたり２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでｉ．ｖ．処置した。Ａ．全体的な血管分布（ＣＤ３１＋血管）の評価。Ｂ．ＦＩＴＣ−レクチンでの灌流の分析。Ｃ．処置後の収縮性マーカー、カルデスモンの誘導。Ｄ．ピモニダゾール注射後の腫瘍低酸素の評価。Ｎ＝３〜６匹マウス、スケールバー、Ａ、１００μｍ、Ｂ〜Ｄ、５０μｍ。左手画像＝未処置。右手画像＝ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置。
【図１４】Ｐａｎｃ０２膵臓腺癌およびルイス肺癌それぞれへのＦＡＭ標識ＣＲＥＫＡおよびＣＧＫＲＫ含有ペプチドの結合。可視化は、抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ抗体でのＦＡＭ標識ペプチドのものであった。拡大率：４０ｘ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書中で参照される配列識別子に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列のリストを提供する。ヒトおよびマウスＬＩＧＨＴのアミノ酸配列は、配列番号１および３でそれぞれ提供する。ヒトおよびマウスＬＩＧＨＴのヌクレオチド配列は配列番号２および４でそれぞれ提供する。配列番号５は、本研究において使用される代表的なＲＧＲ含有ペプチドのアミノ酸配列を提供し、一方で配列番号６は、本研究において使用される代表的なＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物のアミノ酸配列を提供する。さらなる代表的な腫瘍ホーミングペプチドの配列は、配列番号７〜１３および１５で提供する。
【００３８】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的な目的語の１つまたは複数を指すために本明細書中で使用される（すなわち、少なくとも１つを指す）。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【００３９】
本明細書および続く特許請求の範囲全体を通じて、文脈から別段の要求がない限り、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形物は、定められた整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の包含を意味するが、あらゆる他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の排除を意味しないことを理解されたい。
【００４０】
本明細書の文脈において、「約」という用語は、当業者が同じ機能または結果を達成するという状況で列挙される値と同等とみなす数の範囲を指すものと理解される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「ＬＩＧＨＴ」という用語は、リンホトキシンと相同であり、インディシブル（ｉｎｄｉｃｉｂｌｅ）発現を呈し、Ｔリンパ球により発現される受容体であるＨＶＥＭについてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合する」と言われるポリペプチドを指す。ＬＩＧＨＴは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）に結合する。ＬＩＧＨＴはＴＮＦＳＦ１４としても知られる。
【００４２】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により一緒に連結されるアミノ酸から構成されるポリマーを意味する。「ペプチド」という用語は、一部の例においてペプチドがポリペプチドよりも短いものであり得る（すなわちより少ないアミノ酸残基から構成される）ものの、このようなポリマーを指すためにも使用され得る。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００４３】
「腫瘍ホーミングペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞、一般的には腫瘍脈管構造または間質細胞を認識し、結合する能力を有するペプチドを指す。したがって、「腫瘍ホーミングペプチド」という用語は、「腫瘍脈管構造ホーミングペプチド」と交換可能に使用され得る。このような認識および結合は、腫瘍、腫瘍脈管構造または間質細胞に対して、優先的、特異的または選択的であり得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語および文法的同等物は、腫瘍を治療する、腫瘍の確立を妨げる、またはそうでなければ腫瘍の進行を予防する、妨害する、遅延させる、もしくは逆転させる、ありとあらゆる使用を指す。したがって、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、その最も広い文脈において考慮されるべきものである。例えば、処置は、必ずしも完全に回復するまで患者が処置されることを示すものではない。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、その意味内で、薬剤または化合物の、無毒性であるが所望の効果をもたらすために十分な量または用量を含む。必要とされる正確な量または用量は、処置されている種、対象の、年齢、体格、体重および全身的な状態、処置されている腫瘍の重症度、投与されている特定の薬剤および投与形式などの要因に依存して対象により変動する。したがって、正確な「有効量」を指定することは可能ではない。しかし、いかなるケースに対しても、適切な「有効量」は、通常の実験のみを使用して当業者により決定され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「感受性」という用語は、細胞が、細胞の増殖を阻害する、細胞を死滅させる、または１つ以上の細胞機能を阻害するために設計される薬剤への曝露を切り抜ける能力を指すためにその最も広い文脈で使用される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「耐性」という用語は、その最も広い文脈において、細胞の増殖を阻害するか、細胞を死滅させるか、または１つ以上の細胞機能を阻害するための治療剤の効果を低下させること、および細胞が、細胞の増殖を阻害するか、細胞を死滅させるか、または１つ以上の細胞機能を阻害するために設計される薬剤への曝露を切り抜ける能力を指すために使用される。細胞により示される耐性は、例えば薬剤に予め曝露されることにより獲得され得るか、または固有もしくは先天的なものあり得る。細胞により示される耐性は、薬剤が細胞に対して完全に無効にされる場合は完全であり得、または薬剤の効果が低下させられる場合は部分的であり得る。
【００４８】
「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物を指し、ヒト、霊長類、家畜動物（例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、パフォーマンスおよびショー用の動物（例えばウマ、家畜、イヌ、ネコ）、ペット動物（例えばイヌ、ネコ）および捕獲野生動物が挙げられる。好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
本明細書中で記載および例示されるように、発明者らは、腫瘍に対する、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に対する治療的有用性を明らかにした。本明細書中で例証されるのは、とりわけ、このような複合物が、癌間質細胞を操り、構造的に、および機能的に、の両方で腫瘍の脈管構造を正常化する、腫瘍において高内皮細静脈（ＨＥＶ）を誘導する、腫瘍細胞を死滅させる、および腫瘍担持対象の生存を増大させる能力である。代表的なペプチド−タンパク質複合物はまた、腫瘍が耐性を示し得る薬剤を含め、化学療法剤に対して腫瘍細胞の感受性を高めることも示される。さらに、特に１つ以上の免疫療法剤と一緒に投与される場合、代表的なペプチド−タンパク質複合物が、腫瘍担持対象の生存時間を延長させる能力も例証される。
【００５０】
理論により縛られることを望むものではないが、発明者らは、本明細書中で定められるペプチド−タンパク質複合物が、腫瘍内間質細胞を直接刺激し、この結果として、腫瘍血管を正常化するために間接的に作用することを示唆する。例えば、発明者らは、腫瘍におけるマクロファージがＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ刺激後に血管を正常化するＴＧＦβを分泌することを見出した。ＨＥＶ誘導に対して、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、間質細胞を刺激して、ＣＣＬ２１を分泌させるが、これは、ＨＥＶを誘導するのに関与する可能性が最も大きい。
【００５１】
ある態様において、本明細書中に記載の発明は、癌間質を調整し、腫瘍脈管構造を正常化し、および／または腫瘍において血管機能を改善するための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む方法を提供する。
【００５２】
腫瘍脈管構造の正常化および血管機能の改善は、当業者にとって周知の多くの手段またはパラメーターによって、決定され得るか、評価され得るか、または測定され得る。単なる例として、腫瘍脈管構造の正常化および血管機能の改善は、血管細胞を含むが限定されない間質細胞による因子／サイトカインの差別的分泌、大血管の選択的損失；血管の漏出性低下；血管への周皮細胞再付着；周囲のコラーゲンＩＶ線維の整列化；ＣＤ８＋および／またはＣＤ４５＋Ｔ細胞の浸潤促進；炎症性接着分子の発現上昇；α平滑筋（αＳＭＣ）陽性腫瘍周皮細胞における収縮マーカーの発現上昇および／または未分化状態から分化した状態への周皮細胞の表現型切り替えのうち１つ以上を含み得るか、またはこれを特徴とし得る。
【００５３】
腫瘍脈管構造の正常化および／または腫瘍血管機能の改善は、腫瘍血管完全性の修復、腫瘍血管の漏出性の低下および／または腫瘍灌流の増加のうち１つ以上を含み得るか、または結果としてこれが起こり得る。結果として、本発明の方法および組成物は、腫瘍、例えば脳腫瘍に付随する浮腫形成の減少において適用され、腫瘍の転移性拡大の低下、より具体的には血液由来の腫瘍の転移の減少において適用される。
【００５４】
別の態様において、本発明は、腫瘍において高内皮細静脈（ＨＥＶ）を有する異所性リンパ節構造の形成を誘導するための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む方法を提供する。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、対象において腫瘍を処置するための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、癌患者の生存時間を増大させるかまたは延長させる方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍灌流を改善することによって、化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法剤に対する腫瘍の感受性を高めるための方法であって、有効量の、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物に腫瘍を曝露することを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の特定の臨床実施形態は、任意選択により、免疫療法（養子細胞移入、ワクチン接種またはワクチン接種＋免疫チェックポイント調節など）もしくは化学療法または両方と併用しようとする、腫瘍血管正常化剤としての「低用量」（任意選択により約０．２〜２０ｎｇ／ｋｇ体重の間）のタンパク質複合物の投与を企図する。本複合物は、免疫細胞または薬物の腫瘍への接近を促進するためのアジュバントとして使用され得る。企図される「低用量」処置は、癌間質（支持）細胞の破壊を誘導せず（本発明の発明者らは、最長８週間にわたり連続処置を分析した；データは示さない）、既存の抗血管新生および化学療法薬の長期処置とともに見られることが多い。既存の抗血管新生薬による（血管を含む）間質の破壊は、最初の有益な抗腫瘍効果を有し得るが、究極的には再発を引き起こす。
【００５９】
本発明の特定の臨床実施形態は、「高用量」（任意選択により約２０〜２０００ｎｇ／ｋｇ体重の間）のペプチド−タンパク質複合物単独の、または免疫刺激（養子細胞移入、ワクチン接種、チェックポイント制御阻害剤またはワクチン接種＋チェックポイント調節阻害剤など）があるアジュバントとしての投与を企図する。本複合物は、適応免疫細胞の腫瘍環境への接近を促進し、抗腫瘍Ｔ細胞プライミングに対する最適な状態を生成させるための使用であり得る。
【００６０】
本発明によるペプチド−タンパク質複合物において使用しようとするＬＩＧＨＴポリペプチドは、ネイティブヒトＬＩＧＨＴ配列に相当する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するマウスポリペプチドを含め、ヒトＬＩＧＨＴの相同体も使用し得る。本発明の実施形態は、ＬＩＧＨＴの変異体の使用も企図する。
【００６１】
「変異体」という用語は、本明細書中で使用される場合、実質的に同様である配列を指す。一般に、ポリペプチド配列変異体は、受容体結合活性など、共通して質的な生物学的活性も保持する。さらに、これらのポリペプチド配列変異体は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有し得る。「配列同一性」または「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較枠またはスパンにわたる２つの最適に整列させた配列またはサブ配列を比較することによって決定され得、比較枠中のポリヌクレオチド配列部分は、任意選択により、２つの配列の最適整列化に対して（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。
【００６２】
本発明のペプチド−タンパク質複合物での使用のための腫瘍ホーミングペプチドは、腫瘍に、または任意選択により腫瘍脈管構造もしくは他の間質細胞（例えばマクロファージ、線維芽細胞、他の免疫細胞または細胞外マトリクス要素）に複合化される、ＬＩＧＨＴポリペプチドを標的化するかまたは方向付け可能である何れかのペプチドであり得る。このようなホーミングまたは標的化可能な適切なペプチドは当業者にとって周知である。例としては、ペプチドモチーフＲＧＲ、ＮＧＲ、ＣＧＫＲＫ（配列番号７）、ＣＲＥＫＡ（配列番号８）、ＲＧＤ、ｉｓｏＤＧＲ、ＳＲＰＲＲ（配列番号９）、ＣＤＴＲＬ（配列番号１０）、ＨＭＧＮ２由来ペプチドＰＱＲＲＳＡＲＬＳＡ（配列番号１１）またはＫＤＥＰＱＲＲＳＡＲＬＳＡＫＰＡＰＰＫＰＥＰＫＰＫＫＡＰＡＫＫ（配列番号１２）、ＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号１３）またはそれらの保存的変異体を含むペプチドが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＲＧＲペプチド、例えばペプチドＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）（Ｊｏｙｃｅら、２００３）などを含む。しかし、当業者にとって当然のことながら、本発明の範囲は代表的なホーミングペプチドに限定されず、多くの他の適切なペプチドを使用し得る（例えば、ＬｉおよびＣｈｏ，２０１２参照）。さらに、様々なホーミングペプチドの結合親和性が具体的な腫瘍に依存して変動し得ると認識すると、当業者にとって当然のことながら、これは、いかなる状況においても使用するための最も適切なホーミングペプチドを決定するための単なる最適化に相当するに過ぎない。例えば、本発明の発明者らは、少なくとも一部の状況において、半定量的免疫組織化学により判定した場合、マウスにおいてＣＧＫＲＫ含有ペプチドが優先的にルイス肺細胞癌に誘導される一方で、マウスにおいてＣＲＥＫＡ含有ペプチドがｐａｎｃ０２膵臓腺癌に強く結合すると判断した（データは示さない）。したがって、ＲＧＲ含有ペプチドに複合化されたＬＩＧＨＴの活性および有効性を明らかにする本明細書中で提供されるデータは、単なる例証として提供される。
【００６３】
本発明による使用のための腫瘍ホーミングペプチドは、例えば、一般的には連続配列としての、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０または８０残基未満と、比較的長さが短いものであり得る。あるいは、本ペプチドは、より大きいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列と関連して（例えばそれに埋め込まれて）提供される場合、ホーミング活性を保持し得る。したがって、本発明は、異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に融合された腫瘍ホーミングペプチドを含有する、キメラペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をさらに提供する。このようなキメラペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば最長で約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、８００、１０００または２０００残基またはそれを超える長さを有し得る。
【００６４】
腫瘍ホーミングペプチドのペプチド模倣物も本開示により企図され、包含される。「ペプチド模倣物」という用語は、本明細書中で使用される場合、構造的にベースとされるペプチドの腫瘍ホーミング活性を有するペプチド様の分子を意味する。このようなペプチド模倣物としては、化学修飾ペプチド、非天然のアミノ酸を含有するペプチド様分子およびペプトイドが挙げられる（例えば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｖｏｌ．１（ｅｄ．Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５）、８０３−８６１頁を参照）。
【００６５】
例えば、束縛されるアミノ酸（例えばα−メチル化アミノ酸、α，α−ジアルキルグリシン、α−、β−またはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸、α，β−不飽和アミノ酸、β，β−ジメチルまたはβ−メチルアミノ酸または他のアミノ酸模倣物）を含有するペプチド様分子、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分（例えば、非ペプチド性の３−ターン模倣物、γ−ターン模倣物、βシート構造の模倣物またはヘリックス構造の模倣物）またはアミド結合アイソスター（例えば還元型アミド結合、メチレンエーテル結合、エチレン結合、チオアミド結合または他のアミドアイソスター）を含め、様々なペプチド模倣物が当技術分野で公知である。ペプチド模倣物を同定するための方法は当技術分野で周知であり、これには、例えば、可能性のあるペプチド模倣物のライブラリを含有するデータベースのスクリーニングが含まれる。
【００６６】
本発明の腫瘍ホーミングペプチドまたはペプチド模倣物は、環状であり得るかまたはそうでなければ立体構造的に束縛され得る。立体構造的に束縛される分子は、親和性向上、代謝的安定性、膜透過性または溶解性などの特性が向上し得る。立体構造的束縛の方法は当技術分野で周知である。
【００６７】
腫瘍ホーミングペプチドは、ＬＩＧＨＴポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に複合化され得る。本複合物は、ＬＩＧＨＴポリペプチドとホーミングペプチドとの間に短いリンカー配列を含んでもよいし、または含まなくてもよい。代表的な実施形態において、リンカーは、１つ以上の、任意選択により２つ以上または３つ以上グリシン（Ｇ）残基を含む。
【００６８】
本明細書中で、ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチドを含むペプチド−タンパク質複合物それ自身も提供される。代表的な実施形態において、本複合物は、配列番号１または３に記載のＬＩＧＨＴポリペプチド配列および配列番号５に記載のＲＧＲ含有ペプチド配列を含み得るか、または配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み得る。本明細書中で開示され、企図されるペプチド−タンパク質複合物を含むヌクレオチド配列も提供される。
【００６９】
ペプチド−タンパク質複合物の何らかの適切な量または用量が、本発明に従い、必要とする対象に投与され得る。何らかの特定の対象に対する治療的有効量は、医学で周知の他の関連要因と一緒に、処置されている腫瘍および腫瘍の重症度；使用される複合物の活性；使用される組成物；対象の、年齢、体重、総体的健康状態、性別および食事；投与時間；投与経路；分子または薬剤の隔離速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）；処置持続時間；本処置と組み合わせるかまたは同時に使用される薬物を含む様々な要因に依存し得る。当業者は、通常の実験によって、使用しようとするタンパク質複合物の有効な無毒性量を決定することができる。
【００７０】
ペプチド−タンパク質複合物の有効量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重、または一般的には約０．２ｎｇ／ｋｇ体重〜約１０μｇ／ｋｇ体重の間であり得る。有効量は、例えば、約０．２ｎｇ、０．４ｎｇ、０．６ｎｇ、０．８ｎｇ、１ｎｇ、１．５ｎｇ、２ｎｇ、２．５ｎｇ、３ｎｇ、３．５ｎｇ、４ｎｇ、４．５ｎｇ、５ｎｇ、５．５ｎｇ、６ｎｇ、６．５ｎｇ、７ｎｇ、７．５ｎｇ、８ｎｇ、８．５ｎｇ、９ｎｇ、９．５ｎｇ、１０ｎｇ、１１ｎｇ、１２ｎｇ、１３ｎｇ、１４ｎｇ、１５ｎｇ、１６ｎｇ、１７ｎｇ、１８ｎｇ、１９ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４５ｎｇ、５０ｎｇ、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、２５０ｎｇ、３００ｎｇ、３５０ｎｇ、４００ｎｇ、４５０ｎｇ、５００ｎｇ、５５０ｎｇ、６００ｎｇ、６５０ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、８５０ｎｇ、９００ｎｇ、９５０ｎｇ、１０００ｎｇ、１１００ｎｇ、１２００ｎｇ、１３００ｎｇ、１４００ｎｇ、１５００ｎｇ、１６００ｎｇ、１７００ｎｇ、１８００ｎｇ、１９００ｎｇまたは２０００ｎｇ／ｋｇ体重であり得る。上記のように、特定の実施形態において、タンパク質複合物とともに、それぞれ約０．２〜２０ｎｇ／ｋｇ体重の間および約２０〜２０００ｎｇ／ｋｇ体重の間の「低用量」および「高用量処置」は、具体的な筋書きでの使用のために企図される。約６〜７μｇ／ｋｇ体重または６〜７μｇ／ｋｇ体重を上回る非常に高い用量は、血管死が所望の転帰である場合に考慮され得る。
【００７１】
当業者にとって当然のことながら、投与されるべき複合物の適切な用量を決定する要因はとりわけ、使用される腫瘍ホーミングペプチドおよび処置しようとする特定の腫瘍型に対するその腫瘍ホーミングペプチドの、親和性、選択性および／または特異性の性質である。
【００７２】
当業者はまた、本明細書中で例証されるマウス実験に基づくヒトへの投与のための適切なおよび有効な投与量の範囲を決定することにおいて、用量漸増試験を行うことも認識しよう。したがって、当業者にとって当然のことながら、上述の用量および投与量範囲は、本明細書中で例証されるマウス実験で投与された用量に基づく単なる代表例であり、ヒトにおいて使用されるべき実際の用量または投与量範囲は、このような用量漸増試験の結果に依存して変動し得る。本明細書中で例証されるデータに基づき、ヒトに投与されるべき適切なおよび有効な用量または投与量の範囲は、不要な負荷または実験なく、通常の最適化により決定され得る。
【００７３】
本明細書中で開示されるホーミングペプチドが腫瘍脈管構造を標的とする能力により、本明細書中で開示される方法および組成物は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌；インスリノーマを含む膵臓癌；膀胱癌；腎臓癌；乳癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳の癌；神経芽細胞腫；頭部および頸部癌；甲状腺癌；子宮頸癌；前立腺癌；精巣腫瘍；卵巣癌；子宮内膜癌；直腸および結直腸癌；胃癌；食道癌；メラノーマおよび扁平上皮癌を含む皮膚癌；扁平上皮癌を含む口腔癌；ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む肝臓癌；リンパ腫；骨肉腫、脂肪肉腫および線維肉腫を含む肉腫に関連するものを含むが限定されないあらゆる癌性腫瘍の処置に適用可能である。
【００７４】
本明細書中で開示される特定の実施形態は、併用処置を企図し、ここで本ペプチド−タンパク質複合物の投与は、１つ以上のさらなる抗腫瘍療法と並行する。このようなさらなる療法としては、例えば、放射線療法、化学療法または免疫療法／免疫刺激／腫瘍成長を助長することが知られる間質免疫細胞、例えば骨髄サプレッサー細胞および制御Ｔ細胞など、の欠失が挙げられ得る。本明細書中で企図されるのは、組み合わせの何れかの構成要素単独よりも高い程度まで、腫瘍細胞の成長を阻害するかまたは腫瘍細胞の生存を抑えるか、または腫瘍を有する対象の生存を増大させることにおいて併用処置が有効である相乗的組み合わせである。したがって、いくつかの実施形態において、相乗的に有効な量のペプチド−タンパク質複合物および例えば、化学療法剤または免疫療法剤を対象に投与する。相乗的に有効な量は、併用して、癌細胞の成長を阻害するかまたは癌細胞の生存能を低下させるのに有効であり、何れかの構成要素単独よりも大きい反応を生じさせる各成分の量を指す。
【００７５】
このような併用療法に対して、併用療法の各構成要素は、所望の効果を提供するように、同時に、または何れかの順序で連続的に、または異なる時間に投与され得る。あるいは、組み合わせ製品として１つの投与単位中で一緒に構成要素を処方し得る。個別に投与される場合、成分にとって、同じ投与経路により投与されることが好ましいものであり得るが、必ずしもそうではない。
【００７６】
適切な化学療法剤は、例えば、アルキル化剤（シクロホスファミド、オキサリプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メクロエタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）およびメルファランなど）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルダラビオン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｏｎｅ）および葉酸拮抗剤など）またはアルカロイドおよび他の抗腫瘍剤（ビンカアルカロイド、タキサン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンなど）であり得る。代表的な実施形態において、化学療法剤はアルキル化剤、任意選択によりシクロホスファミドである。
【００７７】
免疫療法または免疫刺激は、単なる例として、養子細胞移入または１つ以上の抗腫瘍または免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍特異的なワクチンまたは免疫細胞枯渇試薬の投与を含み得る。養子細胞移入は、一般的には、免疫細胞、一般的には対象からのＴリンパ球の回収および処置しようとする腫瘍を有する対象へのこれらの細胞の導入を含む。養子細胞移入のための細胞は、処置しようとする腫瘍担持対象（自己）由来であり得るか、または異なる対象（異種）由来であり得る。
【００７８】
適切な免疫チェックポイント阻害剤としては、免疫チェックポイント経路に対する、抗体、例えば、モノクローナル抗体、低分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ治療剤、二特異性／三特異性／多特異性抗体、ドメイン抗体、その抗体断片および他の抗体様分子（ナノボディ、アフィボディ、ＴおよびＢ細胞、ＩｍｍＴＡＣ、二重親和性Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）（抗体様）二特異性治療用タンパク質、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（抗体様）治療用タンパク質、Ａｖｉｍｅｒ（抗体様）タンパク質技術）などが挙げられる。代表的な免疫チェックポイント抗体としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブおよびトレメリムマブなど）、抗ＰＤ−１抗体（ＭＤＸ−１１０６［ＢＭＳ−９３６５５８としても知られる］、ＭＫ３４７５、ＣＴ−０１１およびＡＭＰ−２２４など）およびＰＤＬ１（ＰＤ−１リガンド）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４に対する抗体（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２参照）が挙げられる。しかし、これらは単なる例として提供され、当業者にとって当然のことながら、Ｔ細胞に向けられる他の抗体または他の腫瘍細胞マーカーに向けられる抗体を使用し得る。適切な抗腫瘍抗体の同一性は、例えば処置しようとする腫瘍の性質またはタイプに依存する。適切な抗腫瘍抗体は、当業者にとって周知である（例えば、Ｒｏｓｓら、２００３参照）。養子細胞移入および抗腫瘍または免疫チェックポイント抗体のための細胞は、まとめて免疫療法剤とみなされる。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明は、腫瘍を有する対象の生存時間を増大または延長させるための方法であって、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、に複合化されたＬＩＧＨＴポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を含み得る。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、腫瘍を有する対象の生存時間を増大させるかまたは延長させるための方法であって、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンと組み合わせて、腫瘍ホーミングペプチド、任意選択によりＲＧＲ含有ペプチド、に複合化されたＬＩＧＨＴポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。代表的な実施形態において、ＬＩＧＨＴ含有複合物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および腫瘍特異的なワクチンの前に投与される。
【００８１】
本明細書中で開示される特定の実施形態は、本明細書中で開示されるとおりのタンパク質複合物を用いた、化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍および腫瘍細胞の感受性増大を企図する。腫瘍または腫瘍細胞は、本タンパク質複合物での処置なしでは、化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法剤に対して耐性を呈し得る。
【００８２】
したがって、本発明の実施形態は、化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法剤に対する腫瘍または腫瘍細胞の感受性の変化を判定するための方法も提供する。このような方法は、
（ａ）ＬＩＧＨＴポリペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドを含むタンパク質複合物を対象に投与し；
（ｂ）少なくとも１つの腫瘍細胞を含む対象からの生体試料中での薬剤に対する感受性または耐性を判定し；
（ｃ）ある期間にわたり、段階（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回繰り返し；
（ｄ）試料中でのその感受性または耐性を比較すること
を含み得る。
【００８３】
癌間質を調整するか、腫瘍脈管構造を正常化するか、血管機能を改善するか、ＨＥＶを誘導するか、化学療法もしくは免疫療法剤に対する腫瘍の感受性を高めるか、またはそうでなければ腫瘍を処置するための本明細書中で定められるとおりのペプチド−タンパク質複合物への腫瘍の曝露は、複合物を腫瘍の血管成分および／または間質成分に、腫瘍細胞および／または細胞外マトリクスに投与すること、またはこれらを標的化することを含み得る。
【００８４】
本明細書中で開示されるとおりのタンパク質複合物は、医薬組成物の形態で本発明の態様および実施形態に従い、対象に投与され得るか、または細胞と接触させられ得、この組成物は、対象へのインビボ投与に適切な１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤、および任意選択により１つ以上の化学療法、免疫療法および／または放射線療法剤を含み得る。例えば本明細書中で開示されるような相乗的組み合わせで複数の薬剤を投与しようとする場合、この組み合わせ中の各薬剤は、別個の組成物に処方され得るか、または単一の組成物に同時処方され得る。異なる組成物中で処方される場合、その組成物を同時投与し得る。「同時投与される」とは、同じ処方物中で、または同じもしくは異なる経路を介して２つの異なる処方物中で、または同じもしくは異なる経路による連続投与で、同時に投与することを意味する。「連続」投与とは、２つの組成物の投与間の、秒、分、時間または日の異なる時間を意味する。この組成物は、あらゆる順序で投与し得るが、特定の実施形態において、本ペプチド−タンパク質複合物については、化学療法、免疫療法または放射線療法剤の前に投与することが有利であり得る。
【００８５】
組成物は、非経口（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下を含む）、局所（皮膚、経皮、皮下などを含む）、経口、鼻腔、粘膜（舌下を含む）または腔内経路によるなど、何らかの都合の良い、または適切な経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。したがって、組成物は、溶液、懸濁液、エマルションおよび固形を含む様々な形態に処方され得、一般的には、例えば、非経口投与に適切な注射可能な処方物、経口摂取のための、カプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤として、吸入による投与に適切なエアロゾル形態で（鼻腔内吸入または経口吸入によるなど）、または局所投与に適切な軟膏、クリーム、ゲルもしくはローションなど、選択される投与経路に適切となるように処方される。好ましい投与経路は、処置しようとする腫瘍および所望の転帰を含む多くの要因に依存する。
【００８６】
所定の状況に対して最も有利な経路は、当業者により決定され得る。例えば処置しようとする身体の部位に所望の薬剤の適切な濃度が直接送達されることが必要とされる状況において、投与は全身的というよりむしろ局部的であり得る。局部的投与は、必要とされる部位への所望の薬剤の非常に高い局部的濃度を送達することを可能にし、したがって、化合物への身体の他の臓器の曝露を回避し、それにより副作用の可能性を減少させながら、所望の治療的または予防的効果を達成するのに適切である。
【００８７】
一般に、適切な組成物は、当業者にとって公知の方法に従い調製し得、薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含み得る。希釈剤、アジュバントおよび賦形剤は、本組成物の他の成分と適合性であり、その受容者にとって有害ではないという点で「許容可能」でなければならない。医薬組成物の調製のための医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡなどの教科書で提示されるとおり、当技術分野で周知である。担体は、投与経路に依存し、繰り返すが、当業者は、それぞれの特定のケースに対して最も適切な処方を容易に決定することができる。
【００８８】
注射可能な溶液または懸濁液としての投与に対して、無毒性で非経口的な許容可能な希釈剤または担体は、リンゲル液、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび１，２プロピレングリコールを含み得る。経口使用のための適切な担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントの一部の例としては、ピーナツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが挙げられる。さらに、これらの経口製剤は、適切な香味料および着色剤を含有し得る。カプセル形態で使用される場合、カプセルは、崩壊を遅延させるモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの化合物でコーティングし得る。
【００８９】
アジュバントとしては、一般的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝剤が挙げられる。
【００９０】
非経口投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者にとって明らかであり、例えば参照により本明細書によって組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．により詳細に記載されている。本組成物は、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤などの何らかの適切な界面活性剤を組み込み得る。懸濁剤、例えば、天然ガム、セルロース誘導体など、または無機材料、例えば、シリカ  セオウシリカ（ｓｉｌｉｃａ  ｃｅｏｕｓｓｉｌｉｃａ）など、および他の成分、例えばラノリンなども含み得る。
【００９１】
経口投与のための固形形態は、ヒトおよび獣医学の薬務において許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味料、コーティング剤、保存剤、潤滑剤および／または時間遅延剤を含有し得る。適切な結合剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味料としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤としては、コムスターチ（ｃｏｍ  ｓｔａｒｃｈ）、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が挙げられる。適切な希釈剤としては、ラクトース，ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが挙げられる。適切な香味剤としては、ペパーミント油、ウィンターグリーン油、チェリー、オレンジまたはラズベリー香味料が挙げられる。適切なコーティング剤としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンが挙げられる。適切な保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００９２】
経口投与のための液体形態は、上記の物質に加えて、液体担体を含有し得る。適切な液体担体としては、水、油、例えばオリーブ油、ピーナツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、落花生油、ココナツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはそれらの混合物が挙げられる。
【００９３】
経口投与のための懸濁液は、分散剤および／または懸濁剤をさらに含み得る。適切な懸濁剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤としては、レシチン、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、例えばステアリン酸、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレートなどが挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタンモノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレートなど。
【００９４】
経口投与用のエマルションは、１つ以上の乳化剤をさらに含み得る。適切な乳化剤としては、上記で示されるような分散剤またはグアーガム、アラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然ガムが挙げられる。
【００９５】
本発明の組成物は、本ペプチド−タンパク質複合物および任意選択により１つ以上のさらなる物質を必要とされる腫瘍部位に標的化するかまたは送達するために、および／または例えばＭＲＩイメージングまたは当技術分野で公知の他のイメージング技術による腫瘍取り込みの監視を促進するために役立ち得る適切な送達ビヒクル中でパッケージ化および送達され得る。例として、送達ビヒクルは、リポソームまたは他のリポソーム様組成物、例えばミセル（例えばポリマー性ミセル）など、リポタンパク質に基づく薬物担体、微粒子、ナノ粒子またはデンドリマーを含み得る。
【００９６】
リポソームは、リン脂質または他の脂質物質由来であり得、水性媒体中で分散されるモノ−またはマルチラメラ水和液晶により形成される。標的細胞に組成物を投与するかまたは送達することにおいて使用されるリポソームの具体例は、ＤＯＤＭＡ、合成コレステロール、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡまたは、リポソームを形成可能な、何らかの他の無毒性の生理学的に許容可能であり、代謝可能な脂質である。リポソーム形態中の組成物は、安定化剤、保存剤および／または賦形剤を含有し得る。リポソームを調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、その内容が本明細書中で参照により組み込まれる、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６），ｐ．３３  ｆｆ．における方法を参照。例えばポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）およびイプシロン−カプロラクトン（ε−カプロラクトン）から形成される生体分解性微粒子またはナノ粒子を使用し得る。
【００９７】
腫瘍取り込みを監視するためにペプチド−タンパク質複合物および任意選択により１つ以上のさらなる物質をパッケージ化し、および／または送達する他の手段も当業者にとって周知である。
【００９８】
本明細書中に記載の本発明の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者にとって公知であり、当業者の技術の範囲内である従来からの分子生物学および薬理学を使用する。このような技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  Ｅｄ．，（ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、（Ｈａｍｅｓ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｏｌｙｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ  ｅｄ，，１９８４）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ．；「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ」，１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９６），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，−および「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」，（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）に記載されている。
【００９９】
あらゆる先行刊行物に対する（またはそれに由来する情報）、または公知であるあらゆる事柄に対する本願中の参照は、その先行刊行物（またはそれに由来する情報）または公知の事柄が、本明細書が関連する努力傾注分野における共通の一般的知識の一部を形成するという事柄の、同意または承認または示唆の何らかの形態として解釈されず、解釈されてはならない。
【０１００】
本発明の範囲を限定するものとして全く解釈されるべきでない、次の具体例を参照してここで本発明を説明する。
【実施例】
【０１０１】
実験手順
マウス
Ｃ３ＨｅＢＦｅバックグラウンドにおいてＲＩＰ１−Ｔａｇ５トランスジェニックマウスを使用した（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，ＩＳＲＥＣ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより提供）。養子移入実験のために、Ｃ３Ｈバックグラウンドにおいて、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｋｋにより提示されるＴａｇを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するトランスジェニックであるマウス（ＴａｇＴＣＲ８と呼ばれる；Ｔ．Ｇｅｉｇｅｒ，Ｓｔ．ＪｕｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，ＵＳＡおよびＲ．Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡにより提供）を使用した。全てのマウスをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａにて特定の病原体不含状態下で維持し、全ての実験プロトコールはＡｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａにより承認された。
【０１０２】
組み換えＬＩＧＨＴ（Ｌ）およびＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ（ＬＲ）の作製
ＧＧＧリンカー（ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ複合物−配列番号６）を介して連結されるＣ末端修飾ＲＧＲペプチドＣＲＧＲＲＳＴＧ（配列番号５）を有するかまたは有しない成熟マウスＬＩＧＨＴ（配列番号３）をベクターｐＥＴ−４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｈｏ／ＢａｍＨ１部位にクローニングして、Ｎ末端Ｎｕｓ・Ｔａｇ／Ｈｉｓ・Ｔａｇ付きの可溶性融合タンパク質を発現させた。簡潔に述べると、５ｍＭ  ＥＧＴＡ存在下で２２℃にて６時間のイソプロピル−β−ｄ−グラクトピラノシド（ｇｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）誘導後、培養物を遠心し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）、１μｇ／ｍＬペプスタチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、（ｐＨ８．０）中で再懸濁し、次いで超音波処理し、その後、製造者の説明書に従い、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。４℃で一晩、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）、ｐＨ８．０中で組み換え融合タンパク質を透析した。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３０℃で２時間、Ｎｕｓ・Ｔａｇ／Ｈｉｓ・Ｔａｇを開裂させた。プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ、１μｇ／ｍＬペプスタチンおよび１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ））、塩（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）および０．００５％ＢＳＡの存在下で、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを用いて切断反応からの完全に活性のあるＬＩＧＨＴタンパク質を再精製した。クーマシー・ブリリアント・ブルー染色タンパク質ゲル上で純度を評価し、同様のサイズおよび既知の濃度のバンドと比較してバンドの強度を測定することによって濃度を決定した。
【０１０３】
腫瘍担持ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの処置
ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスを次のとおり処置した：
短期処置：２６〜２７週齢で開始して、２週間にわたり週２回、０．２ｎｇ（３０ｇマウスに対しておよそ０．０００６ｎｇ／ｇ体重と同等）または２０ｎｇ（３０ｇマウスに対しておよそ６００〜７００ｎｇ／ｇ体重と同等）のＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの１００μＬ体積中の組み換えタンパク質の静脈内（ｉ．ｖ．）注射でマウスを処置した。指定があれば、これに続いて、ＴａｇＴＣＲ８（ＣＤ８＋）Ｔ細胞の１回の養子移入を行った。４日後、マウスを屠殺し、組織学のために腫瘍を単離した。養子移入実験に対して、ＴａｇＴＣＲ８リンパ節細胞をインビトロで３日間、１０ＵのｒＩＬ−２／ｍｌおよび２５ｎＭ  Ｔａｇペプチド３６２−５６８（ＳＥＦＬＩＥＫＲＩ）で活性化した。２．５ｘ１０６個の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を１回、ｉ．ｖ注射した。短期処置計画を図１で図示する。
【０１０４】
長期処置および生存実験
全部で８週間にわたる短期計画について記載されるとおり週２回の組み換えタンパク質のｉ．ｖ．注射で２２週齢ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスを処置し、３０週間のセットエンドポイントで生存／腫瘍量を分析した。養子移入実験に対して、２．５ｘ１０６個の活性化ＴａｇＴＣＲ８  ＣＤ８＋Ｔ細胞を２回ｉ．ｖ注射した（第４週および第６週）。（ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲなしの）養子移入実験において、マウスは２回だけ養子移入を受けた。化学療法：２２週齢マウスを８週間にわたり週２回、０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲのｉ．ｖ．注射で処置し、実験全体を通じて飲水中の２０ｍｇ／ｍｌシクロホスファミド（メトロノミックな低用量）とともに同時に与えた。長期処置計画を図２で図示する。さらに、マウスをシクロホスファミドおよび／またはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲで処置し、生存を監視した（エンドポイントとして死亡）。
【０１０５】
ワクチン接種のために、マウスに対して、５０μｇフロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合した５０μｇ組み換えＴａｇタンパク質の１回の皮下注射（尾基底）で初回刺激を行った。その後、シトシン−ホスホロチオエート−グアニンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）処置群に、以前に公開されたように（Ｇａｒｂｉら、２００４）、２週間ごとに、５０μｇＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ；配列番号１４）と混合した５０μｇ組み換えＴａｇタンパク質をｉ．ｐ．注射した。チェックポイント遮断との併用療法に対して、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスを抗ＰＤ１（２５０μｇ、ｉ．ｐ．）および抗ＣＴＬＡ４（７５μｇ、ｉ．ｐ．）抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）と組み合わせてＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ（２０ｎｇ、ｉｖ、週２回）で処置した。さらに、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ／抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬ４／抗Ｔａｇワクチンの三重併用療法でマウスを処置した。
【０１０６】
組織学
腫瘍除去前に、マウスに対して２％中性緩衝ホルマリンで灌流を行った。１０％（２ｈ）および３０％スクロース中で一晩腫瘍を温置し、ＯＣＴコンパウンド中で包埋した。免疫組織化学に対して、次の抗体を使用した：抗Ｂ２２０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ８（Ｌｙ−２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ３１（Ｍｅｃ  １３．３．、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＩＣＡＭ２（３Ｃ４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗ＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ６８（ＦＡ−１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗カルポニン（ウサギモノクローナルＥＰ７９８Ｙ、Ａｂｃａｍ）、抗カルデスモン（ウサギモノクローナルＥ８９、Ａｂｃａｍ）、抗コラーゲンＩまたはコラーゲンＩＶ（ウサギポリクローナル、Ａｂｃａｍ）、Ｋｉ６７（ＰＰ６７、Ａｂｃａｍ）、ＭＥＣＡ７９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ、ＡＴＣＣ）およびαＳＭＡ（１Ａ４、Ｓｉｇｍａ）。二次検出のために、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、Ｃｙ−３またはＦＩＴＣ−複合化ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。マウス・オン・マウス（Ｍ．Ｏ．Ｍ．）キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、αＳＭＡ染色を増幅した。レクチン灌流に対して、５０μｇのＦＩＴＣ標識トマトレクチン（リコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、Ｖｅｃｔｏｒ）をマウスにｉ．ｖ．注射した。循環１０分後、マウスに対して２％中性緩衝ホルマリンを用いて心臓灌流を行い、ＯＣＴ中で腫瘍を凍結させた。血管漏出性を評価するために、１ｍｇの７０ｋＤａテキサスレッドデキストラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｉ．ｖ．注射し、１０分間循環させた。ＰＢＳで、次いで２％中性緩衝ホルマリンでマウスに対して心臓灌流を行い、ＯＣＴ中で腫瘍を凍結させた。ＴＵＮＥＬ染色（Ｒｏｃｈｅ）を使用してアポトーシスを評価した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡において画像を記録し、ＮＩＳソフトウェアモジュール（バージョン３．０）を使用して定量した。
【０１０７】
乳癌モデル
Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体にマウス乳癌細胞（５ｘ１０６個、４Ｔ１  ＡＴＣＣより）を同所性に注射した。腫瘍が触知できるようになった後、２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの週２回のｉ．ｖ．注射で２週間にわたりマウスを処置した。マウスにピモニダゾール（低酸素マーカー）およびＦＩＴＣ標識レクチンを注射した。１ｈ／１０分（それぞれピモニダゾール／レクチン）循環後、マウスに対して２％ホルマリンで灌流を行い、腫瘍を剥離し、ＯＣＴコンパウンド中で新鮮凍結を行った。血管頻度（ＣＤ３１）、血管灌流（ＣＤ３１＋レクチン−ＦＩＴＣ）の質、カルデスモン誘導および腫瘍内低酸素の頻度（ピモニダゾール染色）に対して、組織学によって腫瘍を分析した。
【０１０８】
統計
カプラン−マイヤー法によって累積生存時間を計算し、ログランク検定によって分析した。別段の指示がない限り、スチューデントｔ検定（両側）を使用した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。エラーバーは、別段の指示がない限り、ＳＤを示す。
【０１０９】
ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスモデル
腫瘍、腫瘍血管と免疫系との間の複雑な相互関係を調べるために、発明者らは、生来の解剖学的位置、緩徐な成長速度および多段階腫瘍進行に関して臨床状況を模倣する自然発生腫瘍を発現するトランスジェニックマウスモデルに焦点を当てて分析する。ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスにおいて、癌遺伝子ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原（Ｔａｇ；ＲＩＰ、ラットインスリン遺伝子プロモーター）は、膵臓のβ細胞で専ら発現され、これは、過形成性膵島から進行する、特徴がよく分かっている段階を通じた段階的な腫瘍発生、およそ１０週間でのＴａｇ発現の開始、およそ１６週間での血管新生膵島における血管形成の開始（「脈管新生切り替え」と呼ばれる）および、次いでおよそ２２週間での高度に血管が新生された固形腫瘍と、それに続くおよそ３０週での死亡につながる。
【０１１０】
実施例１
０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲによるＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの短期および長期処置
短期処置
腫瘍担持ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスに全部で４回注射した場合、０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、組織学的に判定した場合、無秩序な腫瘍血管を正常化した（図３）。
【０１１１】
図３Ａおよび３Ｂで示されるように、全体的な血管数に影響を及ぼすことなく、内径が大きいものから小さいものへの腫瘍血管のシフト（すなわち大血管の選択的損失）が観察された（血管マーカーとしてＣＤ３１を使用して判定した場合）。
【０１１２】
周皮細胞は、血管の内皮細胞を包み込む支持細胞である。無秩序な腫瘍血管の古典的特性は、腫瘍実質への周皮細胞の突出である（図３Ｃ参照）。対照的に、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置腫瘍において周皮細胞の血管への堅固な付着が観察された（図３Ｃ）。血管へのこの周皮細胞再付着は、コラーゲンＩＶの密な血管整列化を付随し、こにより、内皮細胞／周皮細胞整列化の改善に加えて、血管床の正常化も示される（図３Ｃ）。
【０１１３】
０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの注射によって、腫瘍内の血管機能も改善した。腫瘍脈管構造は特徴的に「漏出性」である。これは、赤く標識されたデキストランの溢出により明らかになり得る。本研究において、ＬＩＧＨＴ単独で処置した腫瘍は漏出性の表現型を生じさせ、一方でＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置は腫瘍血管を正常化し、漏出性がより低い表現型を生じさせた（図４）。ＦＩＴＣ標識レクチンのＩ．ｖ．注射は、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲで処置した腫瘍において、腫瘍血管を緑色に染色することも明らかにしたが、これは的確な灌流を示す。未処置の無秩序な腫瘍血管では緑色染色が観察されなかった（図４）。
【０１１４】
０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの短期処置の結果、α平滑筋（αＳＭＣ）陽性腫瘍周皮細胞におけるカルポニンおよびカルデスモンを含む、「収縮性の」血管平滑筋マーカーの発現も顕著に上昇した（図５）。対照的に、コラーゲンＩの発現は正常化血管において顕著に下方制御された（図５）。コラーゲンＩは合成マーカーであり、収縮性細胞が分泌するコラーゲンＩはより少ない。
【０１１５】
これは、正常化時の周皮細胞における表現型切り替えの最初の証拠に相当するので、注目するに値する知見である。これらのデータは、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの処置時に、正常化血管における周皮細胞が「未分化」から「分化」状態に変化することを示す。
【０１１６】
発明者らは、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲが腫瘍環境においてＴＧＦβを分泌するようにマクロファージを刺激することも示した（データは示さない）。血管の周辺で放出される低用量のＴＧＦβによって、周皮細胞表現型切り替えが引き起こされる。簡潔に述べると、これは、腫瘍常在性マクロファージをＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置腫瘍から単離し；エクスビボ精製マクロファージから上清を回収し（ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置マクロファージに特異的なＥＬＩＳＡでＴＧＦβ分泌を特定）；インビトロで周皮細胞の細胞株とともにマクロファージからの上清を温置し；抗ＴＧＦβブロッキング抗体により阻止され得るカルポニンカルデスミン発現をインビトロで判定することにより明らかになった。周皮細胞の直接的なＬＩＧＨＴ誘導によりカルポニン／カルデスミンは誘導されない（データは示さない）。
【０１１７】
０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの短期処置はまた、腫瘍内皮細胞において炎症性接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を増加させ（図６Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を促進することも示された。ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置により誘導される正常化血管は、養子移入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の遊出を増加させた（図６Ｂ）。インビトロ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入と組み合わせた０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置によって、それら単独での何れかの処置と比較して、Ｔ細胞浸潤が顕著に改善された（図６Ｂ）。
【０１１８】
長期処置
（インビトロ活性化された）抗腫瘍（抗Ｔａｇ）リンパ球の養子移入と組み合わせた０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでのＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスにおける腫瘍の長期処置は、腫瘍部位での実質的な炎症反応につながった。巨視的に：これは、非常に出血性が高い赤くて漏出性の腫瘍から外観が白い正常化血管を有する腫瘍への腫瘍外観の変化によって観察された（図７Ａ）。単回処置としての養子Ｔ細胞移入または０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの結果、第３０週でＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの生存率がおよそ３０％となり、一方で両処置様式の組み合わせは、第３０週でおよそ７０％まで生存率を上昇させた（図７Ａ）。この結果は、図６で示されるＴ細胞流入促進が実際に腫瘍担持マウスの生存率を上昇させることを示す。
【０１１９】
さらなる生存研究において、抗Ｔａｇタンパク質を用いてＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスに対してワクチン接種を行い、０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲまたはＬＩＧＨＴ単独で処置した。図７Ｂで示されるように、抗Ｔａｇワクチン接種と組み合わせたＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの処置は、実質的に、ワクチン接種単独またはＬＩＧＨＴと組み合わせたワクチン接種を上回って生存率を上昇させた。
【０１２０】
処置８週間後のアポトーシス腫瘍細胞の顕著な増加により証明されるように、０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲおよび、飲用水中のシクロホスファミドを含む低用量、メトロノミック化学療法との処置の組み合わせは、各処置単独と比較して、腫瘍細胞死滅を向上させることが示された（図８ＡおよびＢ）。これはまた、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ／シクロホスファミド併用処置の８週間後の、大きい腫瘍からより小さい腫瘍へのシフトにも反映される（図８Ｃ）。これらの結果から、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置ゆえの癌間質操作および血管正常化とともに、細胞毒性薬物が腫瘍に到達し、腫瘍細胞を死滅させることが可能であることが明らかとなる。ＲＩＰ１−Ｔａｇ腫瘍（インスリノーマ）は、通常、メトロノミックシクロホスファミド処置に対して無反応である。生存分析（図８Ｄ）から、何れかの処置単独と比較して、シクロホスファミドと組み合わせてＬＩＧＨＴ−ＲＧＲで第２２週から処置したＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの生存率の顕著な上昇が明らかになった。
【０１２１】
発明者らは、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５腫瘍への２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの注射の効果も試験し、０．２ｎｇ（データは示さない）で観察されたものと同様の効果を見出した。２μｇの注射は、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスにおいて血管死を引き起こした。
【０１２２】
実施例２
２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでのＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの短期および長期処置
短期処置
２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでのＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスにおける腫瘍の短期処置は、マーカーＭＥＣＡ７９により免疫組織化学的に認識されるように高内皮細静脈（ＨＥＶ）を付随する異所性リンパ節構造（ＣＤ４５／Ｂ２２０＋リンパ球、図９）の形成を誘導した（図９）。ＨＥＶは、活性化リンパ節および非常に炎症性が強い組織における、およびそこからの、リンパ球の大量輸送に対する戸口となる。これは、単一治療剤に反応した腫瘍におけるＨＥＶ形成の最初の証明である。
【０１２３】
具体的に、２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの短期処置後、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５腫瘍の６０〜７５％でＨＥＶ構造が観察され、Ｔ細胞およびＢ細胞が大量に浸潤したＨＥＶを腫瘍内領域が取り囲んでいた。興味深いことに、腫瘍に浸潤するＴ細胞は、ＦＡＣＳにより分析した場合、ＰＤ−１＋およびＣＴＬＡ４＋Ｔ細胞および制御Ｔ細胞も含むＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団を含む（データは示さない）。これは、Ｔ細胞プライミングおよびこれらの構造に付随する機能を改善するために、チェックポイント遮断と異所性リンパ節の誘導を組み合わせることに対する根拠を提供する。
【０１２４】
長期処置
２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲでの長期処置後、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５腫瘍は、第３０週で非常に壊死性が高く、腫瘍細胞が実質的に減少したことが分かった（図１０）。ＴＵＮＥＬシグナルの観察された上昇は、２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの抗腫瘍効果と一致して、腫瘍細胞アポトーシスの増加を示す。
【０１２５】
次いで、発明者らは、＞１２０  ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスのコホートにおいて２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲと併せた、免疫療法（抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体を使用）の効果を詳しく試験した。抗ＰＤ−１（２５０μｇ）および抗ＣＴＬＡ４（７５μｇ）抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）と組み合わせて、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ（２０ｎｇ、ｉｖ、週２回）でＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスを処置した。さらに、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ／抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬ４／抗Ｔａｇワクチンの３つの組み合わせでマウスを処置した。
【０１２６】
生存研究において、発明者らは、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ／抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４の３つの組み合わせが生存率を顕著に上昇させたことを示した（対照と比較してＰ＜０．０００１；図１１Ａ）。腫瘍特異的なワクチンでのＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置の結果、４５週齢で生存率が３０％となる（正常な寿命２６〜３２週間）（図１１Ｂ）。ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ＋ワクチン＋抗ＰＤ−１＋抗ＣＴＬＡ４で顕著に改善した生存率の結果が得られ、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの７０％が４５週で生存していた（図１１Ｂ）。この生存率の利点には、腫瘍のＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ前処置が介在し、免疫療法に対するアジュバントとして腫瘍内ＬＩＧＨＴ効果を実証する。
【０１２７】
短期（２週間）実験において、発明者らは、ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲと組み合わせた抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４二重処置の有効性が、個々の抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体での単剤処置よりも優れていたことも示した（図１２）。
【０１２８】
実施例３
マウス乳癌組織脈管構造におけるＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの効果
Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体にマウス乳癌細胞（５ｘ１０６個、４Ｔ１  ＡＴＣＣより）を同所性に注射した。腫瘍が触知できるようになった後、２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの週２回のｉ．ｖ．注射で２週間にわたりマウスを処置した。マウスにピモニダゾール（低酸素マーカー）およびＦＩＴＣ標識レクチンを注射した。１ｈ／１０分（それぞれピモニダゾール／レクチン）循環後、マウスに対して２％ホルマリンで灌流を行い、腫瘍を剥離し、ＯＣＴコンパウンド中で新鮮凍結を行った。血管頻度（ＣＤ３１）、血管灌流（ＣＤ３１＋レクチン−ＦＩＴＣ）の質、カルデスモン（収縮性周皮細胞マーカー）誘導および腫瘍内低酸素の頻度（ピモニダゾール染色）に対する組織学によって腫瘍を分析した。０．２ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲは、ＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスに対して示されるように、血管正常化の全ての態様を再現した。しかし乳癌モデルにおいて、腫瘍血管への結合親和性がより低いがゆえに、０．２ｎｇで処置したＲＩＰ１−Ｔａｇ５マウスの血管表現型を反復するためには２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲの用量が必要であった。
【０１２９】
図１３で示されるように、２０ｎｇ  ＬＩＧＨＴ−ＲＧＲ処置は、血管正常化を誘導し（全体的な血管分布の変化がなく、血管内径の縮小により明らかとなるとおり；図１３Ａ）、血管灌流を増加させ（図１３Ｂ）、周皮細胞において収縮性マーカーを誘導し（カルデスモン誘導により例示される、図１３Ｃ）、腫瘍低酸素を軽減した（図１３Ｄ）。
【０１３０】
実施例４
様々な腫瘍タイプに対する腫瘍ホーミングペプチドの結合
発明者らは、様々な脈管構造ホーミングペプチドが様々な腫瘍タイプに結合する能力を試験した。マウスにおいて、Ｂ１６メラノーマ、ルイス肺癌、４Ｔ１乳癌および同所性ｐａｎｃ０２膵臓癌に対してＲＧＲ−およびＮＧＲ含有ペプチドおよびＣＧＫＲＫおよびＣＲＥＫＡペプチドを試験した。免疫組織化学による検出を可能にするために、ペプチドをＦＡＭで標識した。
【０１３１】
Ｃ末端アミド化および６−アミノヘキサン酸スペーサーを用いてＦＡＭ標識直鎖状ペプチドを合成した（Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）。使用したＮＧＲ含有ペプチドは、ＣＮＧＲＣＧ（配列番号１５）であった。１００μｇのＦＡＭ−ペプチドを腫瘍担持マウスにｉ．ｖ．注射した（下記参照）。循環３０分後、腫瘍を回収し、血管結合を定量するために、抗ＦＩＴＣ  ＨＲＰ抗体を用いて新鮮凍結組織切片をさらに分析した。
【０１３２】
１ｘ１０６個のｐａｎｃ０２腫瘍細胞（膵臓腺癌、ＡＴＣＣ）をＰＢＳ／マトリゲル混合物中３０μＬ中でＣ５７ＢＬ／６マウスの膵臓に注射した（サバイバル手術（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ））。４週間後、マウスにＦＡＭ標識ペプチドを注射し、腫瘍内分析のために屠殺した。ルイス肺腫瘍細胞（１ｘ１０６個、ＬＬ２、ＡＴＣＣ）を皮下に接種し、第１０日にペプチドをマウスに注射した。
【０１３３】
試験した血管ホーミングペプチドは全て、試験した全ての腫瘍モデルにおいて血管に結合したことが分かった。結合強度（半定量的免疫組織化学により評価した場合）は腫瘍モデル間で異なっていた。単なる例として、行った実験において、ＣＲＥＫＡ含有ペプチドはｐａｎｃ０２腫瘍に強く結合し、一方でＣＧＫＲＫ含有ペプチドはルイス肺癌細胞に強く結合した（図１４）。したがって、ホーミングペプチドによって、腫瘍タイプに依存して、結合親和性が異なる。
【０１３４】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
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Ｇａｒｂｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｎｄｅｒ  ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４．１７２（１０）：ｐ．５８６１−９．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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