(57)【要約】  本発明は、高マンノースグリカンの有無に関して、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子を分析する方法、およびかかる方法を実行することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、ならびに
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに任意選択で
（ｃ）前記混合物中のグリカンの合計量に対する前記混合物中の高マンノースグリカンの量を算出することにより、高マンノースグリカンを含有する、前記試料中の分子の割合を定量するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に、前記試料を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させ、任意選択で、Ｆｃ領域を含む分子を、得られた混合物から単離し、ステップ（ａ）において使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料の第１の部分を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、
（ｃ）前記試料の第２の部分を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｄ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに
（ｅ）（ｂ）における前記分析の結果を（ｄ）における前記分析の結果と比較することによって、高マンノースグリカンを含有する、前記試料中の分子の有無を決定するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）が、高マンノースグリカンを含有する、前記試料中の分子の割合を定量することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドが、配列番号１の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなり、および／または
高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドが、配列番号２の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなる、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記配列の変異体が、前記配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であるか、または前記配列の８００個までの連続するアミノ酸を含む断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｆｃ領域を含む前記分子が、抗体もしくはその断片、またはＦｃ融合タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｃ領域が、アイソタイプＩｇＧであり、好ましくはヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、キメラ、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を前記エンドグリコシダーゼと接触させるステップから生じる混合物を、いずれの分析ステップよりも前に、ＩｇＧシステインプロテアーゼと接触させる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
いずれのステップにおける得られた混合物の分析も、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／または質量分析の使用により、前記混合物中の少なくとも１種の分子の分子量を決定することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子の第１のバッチに前記方法を適用することから得られた結果を、同一分子の第２のバッチに前記方法を適用することから得られた結果と比較するステップを含み、任意選択で前記分子が治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなるポリペプチド、ならびに任意選択で
（ａ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有ＩｇＧ分子を検出する手段、ならびに／または（ｂ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有ＩｇＧ分子を検出するための指示書
を含むキット。
【請求項１４】
配列番号２の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなるポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高マンノースグリカン（high-mannose glycans）の有無に関して、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子を分析する方法、およびかかる方法を実行するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＦｃ領域は、抗体およびＦｃ融合タンパク質などの重要分子の不可欠な部分である。構造的特徴付けおよび物理化学的解析を含めたＦｃ領域の特徴付けが、抗体ベースの治療薬などのかかる領域を含む製品の開発者および生産者により求められている。一次構造だけでなく、Ｆｃ領域のグリカン構造をも評価することが特に重要である。例えば、Ｆｃ領域が高マンノースグリカンを含有する抗体分子は、他のグリカン形態を含有する分子よりも、ヒトにおいてより迅速に排除されることが立証されている。高マンノースグリカンは、天然に産生するＦｃ領域では極めて稀であるが、産業的に製造される抗体のバッチではＩｇＧ分子の２０％もがかかる構造を含有し得る。したがって、このことは治療用分子の薬物動態特性に大きな影響を及ぼし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｆｃ領域の高マンノースグリカン含量はそれゆえ、製品の重要な品質属性であり、この属性を評価する信頼性のある手法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、ならびに
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに任意選択で
（ｃ）混合物中のグリカンの合計量に対する、混合物中の高マンノースグリカンの量を算出することにより、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の割合を定量するステップ
を含む方法を提供する。
【０００５】
本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料の第１の部分を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、
（ｃ）前記試料の第２の部分を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｄ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに
（ｅ）（ｂ）における分析の結果を（ｄ）における分析の結果と比較することによって、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の有無を決定するステップ
を含む方法も提供する。
【０００６】
本発明は、配列番号１の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなるポリペプチド、ならびに任意選択で（ａ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有ＩｇＧ分子を検出する手段、ならびに／または（ｂ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有ＩｇＧ分子を検出するための指示書を含むキットも提供する。キットは、配列番号２の配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなるポリペプチドも含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ヒトモノクローナル抗体であるセツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブ（Ｄ）を、ＥｎｄｏＳおよびＩｄｅＳ、ＥｎｄｏＳ４９およびＩｄｅＳ、またはＩｄｅＳ単独のいずれかで処理した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。未処理の対照も示す。
【図２−１】ＥｎｄｏＳもしくはＥｎｄｏＳ４９のどちらか一方の未処理または処理後のいずれかのセツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブ（Ｄ）のＵＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。全てのｍＡｂは、Ｆｃ断片の解像度を高めるため、ＩｄｅＳで消化した後、ＵＨＰＬＣを実施した。
【図２−２】ＥｎｄｏＳもしくはＥｎｄｏＳ４９のどちらか一方の未処理または処理後のいずれかのセツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブ（Ｄ）のＵＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。全てのｍＡｂは、Ｆｃ断片の解像度を高めるため、ＩｄｅＳで消化した後、ＵＨＰＬＣを実施した。
【図３】セツキシマブ、アダリムマブ、パニツムマブおよびデノスマブそれぞれをＥｎｄｏＳもしくはＥｎｄｏＳ４９のいずれかで処理した後に放出されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す図である。
【図４】セツキシマブ、アダリムマブ、パニツムマブおよびデノスマブの分析の結果をまとめた図である。
【図５】ＩｇＧのＦｃ領域に結合して見出される一般的なグリカン構造を示す図である。
【図６】Ｆｃ領域に結合して見出されることがある高マンノースグリカン構造を示す図である。
【０００８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｍ４９血清型ＮＺ１３１から単離されたＥｎｄｏＳ４９ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＩ６１６８８．１でも利用可能。
【０００９】
配列番号２は、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＥｎｄｏＳポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１０】
配列番号３は、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１１】
配列番号４は、推定シグナル配列を含めて、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＥｎｄｏＳのアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号５は、推定シグナル配列を含めて、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示された方法および製品は、当分野における特定のニーズに適合させて様々なかたちで利用できることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とするのであって、制限することを意図するものではないことも理解されたい。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、背景が明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「１分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及はかかる分子の２つ以上などを含む。本明細書において用語タンパク質およびポリペプチドは互換的に使用される。本明細書において用語抗体および免疫グロブリンは互換的に使用される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許明細書および特許出願明細書は、上記であろうと下記であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明は、高マンノースグリカンの有無に関して、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子を分析する方法に関する。免疫グロブリンＦｃ領域は糖タンパク質であり、このことは、免疫グロブリンＦｃ領域はそのアミノ酸残基の一部に化学的に連結（linked）したグリカンを有することを意味する。本明細書で記載されるように、いかなるグリカンも、Ｆｃ領域「上に」存在するかもしくはＦｃ領域「に結合して」いると言及されるか、または抗体分子に結合していると言及されるなら、前記グリカンが、前記領域または分子のアミノ酸に連結していることを意味する。同様に、Ｆｃ領域または抗体分子がグリカンを「含有している」と言及される場合、このことはまた、前記グリカンは前記領域分子のアミノ酸に連結していることを意味する。炭水化物のタンパク質への連結は、Ｏ連結またはＮ連結を介して生じる。Ｏ連結型炭水化物は、セリンまたはトレオニンの側鎖の酸素原子に結合する。Ｎ連結はより一般的で、糖がアスパラギン側鎖のアミド窒素原子に結合することを必要とする。抗体は、一部のＩｇＡ１およびＩｇＤ分子を例外として、Ｏ連結グリカンを一般には含有しない。したがって、特に明記のない限り、本明細書で言うグリカンはＮ連結である。
【００１５】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域は、γ鎖のＡｓｎ−２９７（Ｋａｂａｔ番号付け）に単一の保存されたＮ連結型グリコシル化部位を有する。このことは、ＩｇＧ分子全体あたり最高で２つまでのグリカンがあることを意味し、この２つのグリカンは高度に異種混交的で、かつ３０を超える様々な種類から選択され、４００を超える様々な糖型を与える。他の免疫グロブリンアイソタイプは、そのグリコシル化パターンにおいてさらにより異種混交的であり得る。例えばヒトＩｇＥは、様々な部位で重ε鎖に結合する７つのＮ連結型グリカンを有し、この部位のいくつかはＦｃ領域；Ｃε２ドメイン中のＡｓｎ−２６５に、ならびにＣε３ドメイン中のＡｓｎ−３７１およびＡｓｎ−３９４に位置する。また、非骨髄腫由来のＩｇＥは、Ｃε３ドメイン中のＡｓｎ−３８３にさらなるグリカンを有することがある。配列アライメントに基づいて、ＩｇＥのＣε２ドメイン中のＡｓｎ−２６５はＩｇＧのＡｓｎ−２９７に相当する。実際には、ＩｇＧと、ＩｇＤとＩｇＥの間で配列アライメントは、ＩｇＧ上のＡｓｎ−２９７領域が３種の免疫グロブリンアイソタイプ全てにおいて完全に保存されていることを示し、かつフォールディング、翻訳後修飾および機能において保存された役割を有し得ることを示している。
【００１６】
Ｆｃ領域上の所定のグリコシル化部位に結合している特定のグリカンは、Ｆｃ領域を含む分子がいかに製造されるかによって変わることがあり、例えば使用する細胞株によって、または他の製造条件によって変わり得る。したがって、モノクローナル抗体のバッチなどの、Ｆｃ領域を含む分子の任意の所定のバッチにおいて、多数の様々なグリカン構造が存在し、かつさらにはこのことはバッチごとに変わり得る。本明細書で開示する方法は、例えば、同一分子の様々バッチに存在する高マンノースグリカンの割合を比較するのに、品質管理の目的でＦｃ領域を含む分子を特徴付けすることに特に適している。このことは、治療用もしくは診断用抗体または治療用もしくは診断用Ｆｃ融合タンパク質の規制評価にとって特に妥当な可能性がある。
【００１７】
本発明は、高マンノースグリカン構造に関して、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子を分析する様々な方法に関する。これらの構造は、通常の動物において産生される免疫グロブリン分子のＦｃ領域上では極めて稀であるが、産業的に製造される抗体のバッチではＩｇＧ分子の２０％もがかかる構造を含有し得る。ＩｇＧのＦｃ領域に結合して見出される一般的なグリカン構造は図５に示されている。高マンノースグリカン構造は図６に示され、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＭａｎ８と一般に呼ばれる。
【００１８】
免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子を含有する任意の適切な試料を、本明細書で記載される方法により評価することができる。試料は一般には液体である。例えば、試料は血液、血清または唾液試料でよい。あるいは、試料は合成的に製造した分子のバッチから採取することもできる。その試料は、薬学的担体または希釈剤とともに、患者に投与するために製剤化することができる。
【００１９】
Ｆｃ領域は、任意の種、例えば、ヒト、サル、ウサギ、ヒツジまたはマウスなどに由来してもよいが、好ましくはヒトである。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭから選択される任意のアイソタイプからできていてよいが、好ましくＩｇＧである。Ｆｃ領域は、マウスサブクラスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ３からできていてよい。Ｆｃ領域はヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からできているのが好ましい。
【００２０】
免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子は、全抗体であってもまたはＦｃ領域を含む全抗体の断片であってよい。このような抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよい。抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体であってよい。適切な抗体の例としては、デノスマブ、アダリムマブ、パニツムマブ、セツキシマブ、トラスツズマブおよびベバシヅマブがあげられる。抗体は、二重特異性であってもよく、および／またはＦｃ領域にコンジュゲートする別の化学的部分を含んでいてもよい。例えば、抗体は抗体薬物コンジュゲートであってよい。抗体薬物コンジュゲートは、細胞毒素である治療剤にコンジュゲートした抗体を含んでいてもよい。適切な毒素としては、アヴリスタチン（avristatin）、カリケアマイシン、ＣＣ−１０６５、ドキソルビシン、メイトンシノイド、メトトレキサート（methotrexate）およびビンカアルカロイドがあげられる。
【００２１】
また、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子は、Ｆｃ融合タンパク質、つまり、免疫グロブリンＦｃ領域およびそれに共有結合している別のポリペプチドであってもよい。適切なＦｃ融合体の例としては、エタネルセプトがあげられる。
【００２２】
本明細書で開示するのは、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、ならびに
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに任意選択で
（ｃ）混合物中のグリカンの合計量に対する混合物中の高マンノースグリカンの量を算出することにより、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の割合を定量するステップ
を含む方法である。
【００２３】
ステップ（ｃ）における定量は、ステップ（ａ）の後に検出可能な、フリーの高マンノースグリカンの量を測定するステップ、またステップ（ａ）の後に他の検出可能な、フリーのグリカン形態の量も測定するステップ、およびそれぞれの量を比較するステップを一般には含むことになる。これにより、高マンノースグリカンを当初含有していた分子の割合を決定することができる。
【００２４】
任意選択で、ステップ（ａ）の前に、試料を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させることができ、任意選択でこの際に、Ｆｃ領域を含む分子を得られた混合物から単離し、ステップ（ａ）において使用する。このステップは、ステップ（ａ）の後に検出された高マンノースグリカンが単離されかつさらに特徴付けされる場合、特に有益となり得る。なぜなら、他のグリカン種がほぼ除去されているはずだからである。かかる単離および特徴付けも、本明細書で記載される方法により包含される。
【００２５】
分析対象の分子がアイソタイプＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域を含むとき、例えば分子がＩｇＧ抗体である場合、ステップ（ｂ）における分析の前に、（ａ）から得られた混合物を、ＩｇＧシステインプロテアーゼと任意選択で接触させることができる。ＩｇＧシステインプロテアーゼは、ヒンジにおいてＦｃ領域を一般には切断し、別個のＦｃ断片を生ずる。得られた混合物からこの断片を単離し、次いでステップ（ｂ）において分析することができる。Ｆｃ断片の単離により、続く分析が容易となり得る。
【００２６】
本明細書で記載されるいずれの方法においても、上記であれ下記であれ、「高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析する」とは、任意の適切な方法が、示された対象物の検出に適用可能であることを意味する。検出は一般には分子量に基づくものであってよい。溶液中のグリカンを検出するのに適切な方法としては、ＨＰＡＥ（高速陰イオン交換）、（Ｕ）ＨＰＬＣ（（超）高速液体クロマトグラフィー）および質量分析をあげることができる。質量分析、（Ｕ）ＨＰＬＣまたはＳＤＳＤ−ＰＡＧＥを使用して、高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域を含む分子を検出することができる。任意の適切な標識で標識することにより、グリカン（別の分子に結合しているかまたはフリーである）の検出が改善される。例えば、２−ＡＢ（２−アミノベンズアミド）などの蛍光体を使用することができる。標識する前に、グリカンを精製して、タンパク質、ペプチド、塩類、界面活性剤、およびいかなる付加的な汚染物質をも除去することができる。
【００２７】
使用する特定の検出方法にかかわらず、例えば、下記に記載するように、試料の一部分を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップによる結果を、同一試料の一部分を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップによる結果と比較することにより、高マンノースグリカンおよび高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域を含む分子を同定することもできる。
【００２８】
また本明細書で開示されるのは、免疫グロブリンＦｃ領域を含む分子に結合した高マンノースグリカンの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記分子の試料の第１の部分を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、
（ｃ）前記試料の第２の部分を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップ、
（ｄ）高マンノースグリカンおよび／または高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域の有無に関して、得られた混合物を分析するステップ、ならびに
（ｅ）（ｂ）における分析の結果を（ｄ）における分析の結果と比較することによって、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の有無を決定するステップ
を含む方法である。
【００２９】
分子がアイソタイプＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域を含むとき、例えば分子がＩｇＧ抗体である場合、ステップ（ｂ）における分析の前に、（ａ）から得られた混合物を、ＩｇＧシステインプロテアーゼと任意選択で接触させることができ、および／またはステップ（ｄ）における分析の前に、（ｃ）から得られた混合物を、ＩｇＧシステインプロテアーゼと接触させることができる。ＩｇＧシステインプロテアーゼは、ヒンジにおいてＦｃ領域を一般には切断し、別個のＦｃ断片を生ずる。この断片は、得られた混合物から単離し、次いでステップ（ｂ）または（ｄ）においてそれぞれ分析することができる。前記Ｆｃ断片の単離により、続く分析が容易となる。
【００３０】
ステップ（ｅ）における、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の有無の決定は、任意の適切な方法により可能である。例えば、フリーの高マンノースグリカンはステップ（ａ）から生じる混合物中に存在するが、ステップ（ｃ）から生じる混合物中には存在しない。したがって、高マンノースグリカンの存在は、ステップ（ｃ）から生じる混合物中には存在しない、ステップ（ａ）から生じる混合物中の対象物（ピーク、バンドなど）を検出することにより決定することができる。逆に、高マンノースグリカンを含有するＦｃ領域は、ステップ（ａ）から生じる混合物中に存在しないが、ステップ（ｃ）から生じる混合物中には存在することになる。したがって、高マンノースグリカンの存在は、ステップ（ａ）から生じる混合物中には存在しない、ステップ（ｃ）から生じる混合物中の対象物（ピーク、バンドなど）を検出することにより決定することもできる。ステップ（ｅ）は、例えば、ステップ（ａ）から生じる混合物中において、検出された全てのグリカンの合計に対する、検出された高マンノースグリカンの割合を算出することにより、またはステップ（ｃ）から生じる混合物中において、検出された全てのＦｃ領域の合計に対する、高マンノースグリカンを含有する検出されたＦｃ領域の割合を算出することにより、高マンノースグリカンを含有する、試料中の分子の割合を定量することを任意選択でさらに含んでいてもよい。
【００３１】
換言すれば、対象物の有無は、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドで処理した結果から、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドで処理した結果を減じることにより決定することができる（逆もまた同じである）。元試料に存在する対象物の割合は、全体の割合として、減算の後に残るものを定量することにより可能である。例えば、ＩｇＧ試料の一部分を、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドで処理し、かつ同一試料の別の部分を、高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドで処理する場合、ならびに双方の処理から得られた混合物を例えばＨＰＬＣまたは質量分析により分析する場合、後者の部分の分析にはＩｇＧのピークが存在することに比べ、前者の部分の分析にはＩｇＧのピークが存在しないことを理由として、高マンノース含有ＩｇＧに相当するピークを同定することができる。次いで、前記ピークを後者部分の分析における他のピークに対して定量して、元試料中の高マンノース含有ＩｇＧの割合を決定することができる。同一の論法が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における特定バンドの有無に適用されよう。
【００３２】
したがって、理解されるであろうように、本発明の方法を使用して、任意の所定の試料中のＦｃ領域を含む分子について特徴的なグリカンプロファイルを確立することが可能である。このプロファイルは、高マンノースグリカンを含有する分子の割合に関する情報を一般に含むことになる。このプロファイルには、例えば、特定のグリカン構造を含有する分子、特に高マンノースグリカンを含有する分子に相当する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における特定のバンドの同定、または試料の質量分析もしくはＨＰＬＣ分析におけるピークの同定が含まれる。かかるプロファイルを使用して、前記分子を産業的に製造するプロセスから特定のバッチを特徴付けることが可能である。かかるプロファイルが確立すると、そのプロファイルは、比較のために後続する方法において使用することができる。プロファイルは、本明細書で記載される方法のいずれのステップの位置でも使用可能である。例えば、ある方法は、試料を、高マンノースグリカンを切断できないポリペプチドのみと接触させるステップ、得られた混合物を分析するステップ、および前記分析の結果を本発明の方法によりあらかじめ確立されたグリカンプロファイルと比較するステップだけを含み、それにより試料中の高マンノース含有ＩｇＧの有無を決定することができる。効果的なことに、かかる方法は上述のステップ（ｃ）および（ｄ）のみを含み、ステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）および（ｂ）の結果と比較するよりはむしろ、確立されたプロファイルと比較することを含む。
【００３３】
本明細書で記載されるいずれの方法においても、試料をエンドグリコシダーゼポリペプチドと接触させるステップは、使用する特定のエンドグリコシダーゼポリペプチドにより、Ｆｃ領域上のグリカン構造の切断を可能とする任意の条件下で実行される。同様に、ＩｇＧシステインプロテアーゼを使用する場合、関連ステップは、プロテアーゼにより標的分子の切断を可能とする任意の条件下で実行可能である。適切な条件は実施例において記載されている。一般には、任意の標準緩衝剤が６．５〜８．０のｐＨで使用される。標準緩衝剤にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス、炭酸水素アンモニウム、ＭＥＳ、ＨＥＰＥおよび酢酸ナトリウムが含まれる。一般には、試料はポリペプチドと少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、好ましくは少なくとも６０分間、インキュベートされる。インキュベーションは、室温で行うのが好ましく、約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で行うのがより好ましく、約３７℃で行うのが最も好ましい。エンドグリコシダーゼポリペプチドまたはシステインプロテアーゼは、本明細書で記載される方法において使用するための固体支持体上に固定化してよい。適切な固体支持体には、アガロースビーズ、シリカビーズ、ポリスチレン、ジビニルベンゼンまたはそれらの組み合わせが含まれる。市販の例としては、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＯＲＯＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはタンパク質が表面にコンジュゲートすることができる限り、類似の樹脂である。
【００３４】
本明細書で開示される方法では、免疫グロブリンＦｃ領域に結合したＮ連結型グリカン構造を加水分解するエンドグリコシダーゼポリペプチドを利用する。換言すると、前記ポリペプチドは、前記グリカン構造が結合している分子から前記グリカン構造を切断する。例えば、エンドグリコシダーゼポリペプチドは、アイソタイプＩｇＧにおけるＦｃ領域のγ鎖のＡｓｎ−２９７（Ｋａｂａｔ番号付け）に結合したＮ連結型グリカン構造を一般に加水分解する。本明細書で使用するエンドグリコシドポリペプチドは、以下で規定されるように、免疫グロブリンＦｃ領域に結合した高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドであることも、または免疫グロブリンＦｃ領域に結合した高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチドであることもある。
【００３５】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の血清型Ｍ４９に由来するエンドグリコシダーゼは、以下ＥｎｄｏＳ４９またはＥｎｄｏＳ２という、腎炎原性で形質転換性が高い血清型Ｍ４９株である、ＮＺ１３１株から単離された。ＮＺ１３１株は、ニュージーランドにおける溶連菌感染後急性糸球体腎炎（acute post-streptococcal glomerulonephritis）症例からの臨床分離株である。発明者らは、ＥｎｄｏＳ４９はＩｇＧのＦｃ領域に結合した高マンノースグリカン、ならびにＩｇＧ上に見出される他の一般的グリカン構造を切断できることを確認した。ＥｎｄｏＳ４９のアミノ酸配列は配列番号１に示されている。高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼは、配列番号１に示される配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなり得る。配列番号１の変異体は、配列番号１の配列から異なるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１の機能的特性を保持するポリペプチドである。具体的には、変異体は、高マンノースグリカンを切断する能力を含めて、エンドグリコシダーゼ活性を有する。変異体のエンドグリコシダーゼ活性、および高マンノースグリカンを切断する変異体の能力は、当分野で公知の任意の方法を使用してアッセイできる。
【００３６】
例えば、試験ポリペプチドを、３７℃などの適切な温度で、ＩｇＧ分子の試料とインキュベートすることができる。出発原料および反応産物を、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析して、ＩｇＧ上の全てのグリカンが加水分解されたのかまたは一部のグリカンのみが加水分解されたのか判定することができる。全てのグリカンが加水分解された場合、脱グリコシル化ＩｇＧに相当する、約１５０ｋＤａの単一画分が認められる。一部のグリカンのみが加水分解された場合、グリコシル化ＩｇＧに相当する重い方の画分および脱グリコシル化ＩｇＧに相当する軽い方の画分である、約１５０ｋＤａの２つの異なる画分が存在することになる。このような状況にあるグリコシル化ＩｇＧ画分の存在から、高マンノースグリカンが切断されなかったことが示される。また、試験ポリペプチドとＩｇＧとのインキュベーションに続き、得られた混合物を、例えば質量分析を使用して直接に評価して、試験ポリペプチドが高マンノースグリカンを加水分解したかどうか判定することができるが、この高マンノースグリカンは、分子量により、得られた混合物中に存在する他のグリカン構造と区別することができる。適切な方法は実施例にも記載されている。
【００３７】
Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰＩに由来するエンドグリコシダーゼは、以下ＥｎｄｏＳという、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰＩから単離された。ＥｎｄｏＳのアミノ酸配列は、配列番号２として提供されている。本発明者らは、ＥｎｄｏＳはＩｇＧに結合した高マンノースグリカンを切断できないが、ＩｇＧ上に見出される他の一般的グリカン構造を切断できることも確認した。ＥｎｄｏＳのアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。また、配列番号４として示されているのは、推定シグナル配列を含むＥｎｄｏＳの配列である。高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼは、配列番号２もしくは４に示される配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなり得る。配列番号２の変異体は、配列番号２の配列から異なるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２の機能的特性を保持するポリペプチドである。具体的には、変異体は、エンドグリコシダーゼ活性を有するが、高マンノースグリカンを切断する能力を欠いている。同一の考察が配列番号４の変異体に適用される。変異体のエンドグリコシダーゼ活性および高マンノースグリカンを切断する変異体の能力は、例えば上に記載のように、当分野で公知の任意の方法を使用してアッセイできる。
【００３８】
タンパク質レベルでは、ＥｎｄｏＳ４９の９０ｋＤａと比較して、ＥｎｄｏＳは１０８ｋＤａである。ＥｎｄｏＳ４９はＥｎｄｏＳと４０％未満の同一性を有する。双方のポリペプチドがファミリー１８グリコシドヒドロラーゼ触媒ドメインを有する。ＥｎｄｏＳ４９においては、この活性部位は、配列番号１の残基１７９〜１８６に相当する。ＥｎｄｏＳにおいては、この活性部位は、配列番号２の残基１９１〜１９９に相当する。双方のタンパク質において、これらの残基はモチーフＤ＊＊Ｄ＊Ｄ＊Ｅを含む。配列番号１の１８６位のグルタミン酸は、ＥｎｄｏＳ４９における酵素活性に不可欠である。配列番号２の１９９位のグルタミン酸は、ＥｎｄｏＳにおける酵素活性に不可欠である。
【００３９】
本明細書で開示される方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドを任意選択で利用してもよい。一般的なＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）に由来する免疫グロブリン分解酵素で、以下ＩｄｅＳという。ＩｄｅＳはＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＡＰＩから単離された。ＩｄｅＳの配列は配列番号３として示されている。また、配列番号５として示されているのは、推定シグナル配列を含むＩｄｅＳの配列である。ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、配列番号３もしくは５に示されている配列もしくはその変異体を含むかまたはそれからなり得る。配列番号３の変異体は、配列番号３の配列から異なるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３の機能的特性を保持するポリペプチドである。具体的には、変異体は、ヒンジ領域で、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと一般的には２４９位と２５０位の間で、ＩｇＧを切断するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する。同一の考察が配列番号５の変異体に適用される。変異体のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は当分野で公知の任意の方法を使用してアッセイできる。
【００４０】
例えば、試験ポリペプチドを、３７℃などの適切な温度でＩｇＧの試料とインキュベートすることができる。出発原料および反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより次いで分析して、所望のＩｇＧ切断産物が存在するかどうか判定することができる。切断産物をＮ末端配列決定に供して、切断がＩｇＧのヒンジ領域中に生じたことを検証することができる。ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害研究によりさらに特徴付けることができる。活性は、いずれもプロテアーゼ阻害剤である、ペプチド誘導体Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２によりおよび／またはヨード酢酸により阻害されるのが好ましい。活性はＥ６４により一般的には阻害されないのが好ましい。適切な方法が実施例に記載されている。
【００４１】
配列番号１のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号１の変異体は、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同であることが好ましい。より好ましくは、変異体は、全配列にわたって配列番号１のアミノ酸配列と、アミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％相同であり、少なくとも９５％、９７％、または９９％相同であることがより好ましい。１００個またはそれ以上の、例えば１２５個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個もしくは８００個またはそれ以上の連続するアミノ酸のストレッチにわたって、アミノ酸同一性が少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％であってよい（「強い相同性」）。％同一性の点では同一の考察が、配列番号２、３、４または５の変異体にも適用される。
【００４２】
当分野における標準法を使用して相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えば初期設定で使用する、相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に報告されているように、相同性または整列配列（line up sequences）を計算することができる（（通常、初期設定において）同等な残基または対応する配列を同定するなど）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。
【００４３】
配列番号１の変異体は、配列番号１の配列に関連して単一アミノ酸もしくはアミノ酸群の置換、欠失または挿入を含んでいてもよい。例えば、最大で１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個または３０個の置換、欠失または挿入である。置換は保存的置換であることが好ましい。保存的置換では、アミノ酸が、類似の化学構造、類似の化学特性または類似の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換えられる。導入されるアミノ酸は、それにより置き換えられるアミノ酸に類似の極性、親水性、疎水性、塩基度、酸度、中性度または電荷を有してもよい。また、保存的置換では、もともと存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の位置に芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変更は当分野で周知であり、かつ下の表Ａに記載の２０個の主要アミノ酸特性に従って選択することができる。アミノ酸が類似の極性を有するとき、このことは、下の表Ｂの、アミノ酸側鎖に関するハイドロパシースケールを参照して決定することも可能である。置換、欠失または挿入に関する限りでは、同一の考察が配列番号２、３、４または５の変異体に適用される。
【００４４】
【表１】
2017500005.tif 000002
【００４５】
【表２】
2017500005.tif 000003
【００４６】
配列番号１の変異体は、配列番号１の断片を含んでいてもよい。かかる断片は、配列番号１のポリペプチドの機能的特性を維持する。断片は、少なくとも５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個または５００個のアミノ酸長であってよい。断片は、最大で１００個、２００個、２５０個、３００個、５００個、７５０個、８００個または８４０個のアミノ酸長であってよい。上記下限のいずれかと上記上限のいずれかを組み合わせて、断片のサイズに範囲を用意することができる。例えば断片は１５０個から８００個の間のアミノ酸長であってよい。断片は配列番号１の残基１７９〜１８６、すなわち、ＥｎｄｏＳ４９の活性部位を包含することが好ましい。
【００４７】
配列番号２または４の変異体は各対応する配列の断片を含んでいてもよい。かかる断片は配列番号２のポリペプチドの機能的特性を維持する。断片は、少なくとも５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個または５００個のアミノ酸長であってよい。断片は、最大で１００個、２００個、２５０個、３００個、５００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個または９５５個のアミノ酸長であってよい。上記下限のいずれかと上記上限のいずれかを組み合わせて、断片のサイズに範囲を用意することができる。例えば断片は１５０個から８００個の間のアミノ酸長であってよい。断片は配列番号２の残基１９１〜１９９、すなわち、ＥｎｄｏＳの活性部位を包含することが好ましい。好ましい断片は、配列番号２のアミノ酸１〜４０９からなり、この断片はストレプトコッカスのシステインプロテアーゼＳｐｅＢによる切断によって生じる、ＥｎｄｏＳの酵素的活性αドメインに相当する。
【００４８】
配列番号３または５の変異体は各対応する配列の断片を含んでいてもよい。かかる断片は配列番号３のポリペプチドの機能的特性を維持する。断片は、少なくとも５０個、１００個、１５０個もしくは２００個、２５０個または３００個のアミノ酸長であってよい。断片は、最大で１００個、２００個、２５０個または３００個のアミノ酸長であってよい。上記下限のいずれかと上記上限のいずれかを組み合わせて、断片のサイズに範囲を用意することができる。例えば断片は２００個から３００個の間のアミノ酸長であってよい。
【００４９】
配列番号１、２、３、４または５の変異体は、別のストレプトコッカス（Streptococcus）菌、例えばストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、または好ましくは別のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）株などの、別の生物に由来する相同ポリペプチドを含んでいてもよいが、前記相同体は対応する原ポリペプチドの機能的特性を保持する。例えば、配列番号２の変異体は、ヒツジ偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）由来、例えばＣＰ４０タンパク質；エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来、例えばＥｎｄｏＥタンパク質；またはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）（以前は、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum））由来、例えば、ＥｎｄｏＦ２タンパク質であってもよい。
【００５０】
本明細書に記載のどのポリペプチドまたは変異体のアミノ酸配列でも、天然に存在しないアミノ酸を含むように、かつ／または化合物の安定性を増大させるように改変することができる。ポリペプチドが合成手段によって製造されるとき、このようなアミノ酸を製造の間に導入してもよい。ポリペプチドはまた、合成的製造か、または組換えによる製造のいずれかの後に改変してもよい。本明細書で記載のポリペプチド、変異体または断片は、Ｄ−アミノ酸を使用して製造してもよい。このような場合、アミノ酸はＣからＮ方向の逆配列に連結される。これは、このようなポリペプチドを製造するために、当業界では一般に行われている。いくつかの側鎖改変が当業界では公知であり、ポリペプチド、変異体または断片の側鎖に対して行うことができ、本明細書で特定することができるような他の任意の必要な活性または特性を保持するポリペプチド、変異体または断片に対して行うことができる。ポリペプチドまたは変異体は化学的に改変でき、例えば、翻訳後に改変できることも理解されたい。例えば、ポリペプチドまたは変異体は、グリコシル化したり、リン酸化したりすることもでき、改変したアミノ酸残基を含むこともできる。
【００５１】
また、本明細書で記載されるのは、本発明の方法を実行するために一般に使用することができるキットである。キットは、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチド、ならびに任意選択で（ａ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有Ｆｃ領域を検出する手段、ならびに／または（ｂ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有Ｆｃ領域を検出するための指示書を含む。または、キットは、高マンノースグリカンを切断できるエンドグリコシダーゼポリペプチドおよび高マンノースグリカンを切断できないエンドグリコシダーゼポリペプチド、ならびに任意選択で（ａ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有Ｆｃ領域を検出する手段、ならびに／または（ｂ）高マンノースグリカンおよび／もしくは高マンノース含有Ｆｃ領域を検出するための指示書を含む。高マンノースグリカンを検出する手段には、標識、特に蛍光体が含まれ、この標識はグリカンに結合する。適切な蛍光体の例は２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）である。
【００５２】
以下の実施例で本発明を説明する。
【実施例】
【００５３】
材料および方法
抗体および酵素
セツキシマブ、アダリムマブ、パニツムマブおよびデノスマブはスウェーデンの薬局（Ａｐｏｔｅｋｅｔ  ＡＢ）より入手し、脱塩することにより保存剤を除去した後に使用した。ＥｎｄｏＳはＩｇＧＺＥＲＯ（商標）として市販されており、５０００Ｕバイアルを精製水（ＭｉｌｌｉＱ（商標）−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）５０μＬに溶解させた。ＥｎｄｏＳ２（すなわちＥｎｄｏＳ４９）を同様に調製した。ＩｄｅＳはＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（商標）として市販されており、２０００Ｕを精製水（ＭｉｌｌｉＱ（商標）−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）５０μＬに溶解させた。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
各ｍＡｂの試料を、ｐＨ７．４の１０ｍＭ  ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中にて３７℃で３０ｍ分間、ＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２のいずれかと別々にインキュベートした。次いでＩｄｅＳを加え、さらに１０分間コインキュベートした。試料をＬＤＳ緩衝剤と混合し、１０分間７０℃に加熱し、次いで４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ＭＥＳ緩衝剤を使用して１８０Ｖにて４０分間展開した。ｍＡｂ：エンドグリコシダーゼ：ＩｄｅＳの比は、５０：１：２であった。
【００５５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦをＰａｎａｔｅｃ−ＧｍｂＨ（ハイルブロン、ドイツ）によって実施した。手短に言えば、Ｎ−グリカンを、ｐＨ７．４の５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）中にて、３７℃で３０分間ＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２で処理することにより、４種のｍＡｂから放出させた。ｍＡｂ：エンドグリコシダーゼ比は、１０：１であった。次いで放出されたグリカン画分を限外濾過（ＮａｎｏＳｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ）に供した後、透過水の濃縮をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃよって実施した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（ブレーメン、ドイツ）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（ポジティブリフレクターモード、ＤＨＢマトリックス）を実施した。
【００５６】
ＵＨＰＬＣ
逆相クロマトグラフィーを、Ｗａｔｅｒｓ製のＡＣＱＵＩＴＹ（商標）ＢＥＨ３００Ｃ４カラム（１．７ｕｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）１２９０ＵＨＰＬＣシステム上で実施した。カラムは、６５℃にて、０．４ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡのＭＱ水でコンディショニングを行い、抗体断片は、０．１％ＴＦＡの６０％アセトニトリル／４０％イソプロパノールの緩勾配で溶出した。２８０ｎｍにて検出した。
【００５７】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
セツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブ（Ｄ）を、ＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２のいずれかを使用して脱グリコシル化した後、ＩｄｅＳ酵素を加えて消化し、ｓｃＦｃおよびＦ（ａｂ‘）２を作製した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。結果を図１に示す。４種全ての抗体について、ＥｎｄｏＳで処理したとき３０ｋＤａ付近に弱いバンドが認められたが、ＥｎｄｏＳ２で処理した際にはこのバンドは認められなかった。このことは、ＥｎｄｏＳ２処理によってより完全な脱グリコシル化に至ることを示している。
【００５８】
ＵＨＰＬＣ
セツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブ（Ｄ）を、ＥｎｄｏＳもしくはＥｎｄｏＳ２のいずれかを使用して脱グリコシル化するか、または未処理のままとした後、ＩｄｅＳ酵素を加えて消化し、ｓｃＦｃおよびＦ（ａｂ‘）２を作製した。試料をＲＰ−ＵＨＰＬＣにて分析した。結果を図２に示す。断片を十分に溶解し（図２の差し込み）、ｓｃＦＣピークをより詳細に調べた。ＦｃグリカンをＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ２を使用して除去したとき、非脱グリコシル化ｍＡｂと比べて、保持時間における明瞭なシフトが観察された。ＥｎｄｏＳ２で処理したｍＡｂをグリコシル化（未処理）Ｆｃと比較すると、これらのクロマトグラフィープロファイルは、保持時間におけるシフトは別として、極めて類似していた。しかし、ＥｎｄｏＳクロマトグラムにより、ピークの数および個々のピークの形状における差が明らかとなり、これらのことは、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ２は様々な脱グリコシル化効果を有することを示している。
【００５９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
セツキシマブ（Ａ）、アダリムマブ（Ｂ）、パニツムマブ（Ｃ）およびデノスマブをＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２のいずれかで処理した後に放出されたグリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりさらに分析した。結果を図３に示す。ＥｎｄｏＳ２処理で放出されたグリカンにより、モノクローナル抗体をＥｎｄｏＳで処理したとき検出されない高マンノース構造の放出が明らかとなった。さらにこのデータにより、ＥｎｄｏＳはＥｎｄｏＳ２と比べて、ハイブリッドグリカン構造に対する活性が低いこと（低レベルのハイブリッドグリカンが検出された）が示唆される。各酵素で得られた結果を比較することで、高マンノース構造に相当するピークを同定することが可能であり、次いでピークを定量することができた。
【００６０】
結果を図４にまとめる。この図には、各抗体について検出されたグリカン集団の合計として高マンノースグリカンの割合を特に示してある。高マンノースグリカンの基準レベルが利用できた場合、このレベルが示されている。
【００６１】
結論
本明細書で記載される方法を使用して、試験に供した４種全ての抗体の試料中で、高マンノースグリカンが検出可能かつ定量可能であった。
【図１】
2017500005.tif 000004
【図２−１】
2017500005.tif 000005
【図２−２】
2017500005.tif 000006
【図３】
2017500005.tif 000007
【図４】
2017500005.tif 000008
【図５】
2017500005.tif 000009
【図６】
2017500005.tif 000010
【配列表】
2017500005000001.app
【国際調査報告】
2017500005.tif 000011
2017500005.tif 000012
2017500005.tif 000013
2017500005.tif 000014
2017500005.tif 000015
2017500005.tif 000016