(57)【要約】  本開示は、ＮＳ３捕捉ペプチドを使用して試料中で対象の抗ＨＣＶ抗体を検出するために方法、キットおよび組成物を提供する。ある種の実施形態では、少なくとも２つのＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈ）捕捉ペプチドおよび少なくとも２つのコンジュゲートペプチド（例えば、ＮＳ３ｈコンジュゲートペプチド）が一緒に用いられ、これにより１ステップタイプのアッセイにおいて広いダイナミックレンジの対象の抗体検出が可能になる。他の実施形態では、還元剤を使用せずにＮＳ３特異的対象の抗体を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＳ３特異的対象の抗体はＮＳ３コンジュゲートペプチドの「ダブルショット」（例えば、洗浄の前と後の両方で試料に添加されるコンジュゲートペプチド）を用いて検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、
ａ）最初の生体試料を第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドおよび第１と第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドに接触させて、前記最初の生体試料、前記第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドおよび前記第１と第２のコンジュゲートペプチドを含む混合生体物質を作製するステップであって、
前記第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは：ｉ）それぞれが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；および、ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し、
前記最初の生体試料が対象の抗体を含有すると疑われており、前記対象の抗体は生体試料中で精製された形態ではないステップ、
ｂ）前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第１の捕捉複合体を形成し、前記第１のコンジュゲートペプチドが前記第１の捕捉複合体中の前記対象の抗体と結合して第１の検出可能な複合体を形成し、
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第２の捕捉複合体を形成し、前記第２のコンジュゲートペプチドが前記第２の捕捉複合体中の前記対象の抗体に結合して第２の検出可能な複合体を形成するような条件下で前記混合生体試料をインキュベートするステップ；
ｃ）前記混合生体試料を洗浄して洗浄された試料を作製するステップ；ならびに
ｄ）前記第１および／または第２の検出可能な複合体の存在を検出し、それによって前記対象における過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップ
を含み、
前記混合生体試料中の前記第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド両方の存在が、前記第１または第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドのみを使用する場合と比べて前記対象の抗体を定性的に検出するためのダイナミックレンジを広げる方法。
【請求項２】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの前記アミノ酸配列が前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの少なくとも２倍の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１と第２のコンジュゲートエピトープがＮＳ３ｈエピトープに特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼドメイン１に少なくとも９０％の配列同一性を有し、２５０アミノ酸長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼドメイン２に少なくとも９０％の配列同一性を有し、２５０アミノ酸長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの前記アミノ酸配列が前記完全長ＨＣＶヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの前記アミノ酸配列がドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）ｉ）それぞれ少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し、ｉｉｉ）生体試料中の少なくとも１つの対象の抗体に結合して捕捉複合体を形成することができる第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；および
ｂ）前記捕捉複合体中の前記対象の抗体に結合することができる第１と第２のコンジュゲートペプチド
を含むキットまたはシステム。
【請求項１１】
ｃ）前記対象の抗体を含有する前記生体試料をさらに含み、前記対象の抗体は前記生体試料中で精製された形態ではない、請求項１０に記載のキットまたはシステム。
【請求項１２】
ａ）ｉ）それぞれ少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し、ｉｉｉ）生体試料中の少なくとも１つの対象の抗体に結合して捕捉複合体を形成することができる第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；および
ｂ）前記捕捉複合体中の前記対象の抗体に結合することができる第１と第２のコンジュゲートペプチド
を含む組成物。
【請求項１３】
ｃ）前記対象の抗体を含有する前記生体試料をさらに含み、前記対象の抗体は前記生体試料中で精製された形態ではない、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、
ａ）ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３５０アミノ酸長以下である第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；
ｉｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド
に、対象の抗体を含有すると疑われている試料を接触させるステップ、ならびに
ｂ）前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記対象の抗体の少なくとも１つに特異的に結合して第１の複合体を形成し、前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記対象の抗体の少なくとも１つに特異的に結合して第２の複合体を形成するような条件下で前記試料をインキュベートするステップ、ならびに
ｃ）前記第１および／または第２の複合体の存在を検出し、それによって前記対象における過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップ
を含む方法。
【請求項１５】
前記試料中の、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドに加えて前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの存在が、前記第２のＮＳ３ｈペプチドのみを使用する場合と比べて前記対象の抗体を定性的に検出するための上のダイナミックレンジを広げる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記ドメイン１に少なくとも９０％の配列同一性を有し、２５０アミノ酸長以下である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記ドメイン２に少なくとも９０％の配列同一性を有し、２５０アミノ酸長以下である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの前記アミノ酸配列が前記完全長ＨＣＶヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがＮＳ３ヘリカーゼ天然構造を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料がＨＣＶ粒子またはこの断片を含有するとさらに疑われており、前記方法が、第３の複合体が形成され、前記第３の複合体がＨＣＶ粒子またはこの断片に結合している第１の抗ＨＣＶ抗体を含むように前記試料を前記第１の抗ＨＣＶ抗体に接触させるステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の抗ＨＣＶ抗体が抗コアＨＣＶ抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の抗ＨＣＶ抗体が固体支持体結合部分を含む、請求項２２から２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料を、前記第３の複合体中の前記ＨＣＶ粒子またはこの断片に結合する第２の抗ＨＣＶ抗体に接触させるステップをさらに含み、前記第２の抗ＨＣＶ抗体が検出可能に標識されている、請求項２２から２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の抗ＨＣＶ抗体が抗コアＨＣＶ抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第３の複合体を検出するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料を第１のＨＣＶコアペプチドに接触させるステップをさらに含み、前記第１のコアペプチドが前記対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第４の複合体を形成する、請求項１４から２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のＨＣＶコアペプチドが配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むまたはからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のＨＣＶコアペプチドが固体支持体結合部分を含む、請求項２８から２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料を第２のＨＣＶコアペプチドに接触させるステップをさらに含み、前記第２のＨＣＶコアペプチドが検出可能に標識されており、前記第２のＨＣＶコアペプチドが前記第４の複合体の一部として前記対象の抗体に結合する、請求項２８から３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第４の複合体の存在を検出するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料を固体支持体に接触させるステップをさらに含む、請求項１４から３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記固体支持体がマイクロビーズを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記固体支持体がアビジンで被覆されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料を、前記第１の複合体の一部として前記対象の抗体に結合する第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドに接触させるステップをさらに含み、前記第１の複合体の存在の前記検出が前記第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドを検出することを含む、請求項１４から３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドが、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）２００アミノ酸長以下であり；および、ｉｉｉ）検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料を、前記第２の複合体の一部として前記対象の抗体に結合する第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドに接触させるステップをさらに含み、前記第２の複合体の存在の前記検出が前記第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドを検出することを含む、請求項１４から３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドが前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが１８０アミノ酸長以下である、請求項１４に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、または前記第１のＮＳ３ペプチドが配列番号２もしくは配列番号３に９５％の同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが配列番号２または配列番号３由来の少なくとも１００連続アミノ酸を含むまたはからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、または前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが配列番号５もしくは配列番号７に９５％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが配列番号５または配列番号７由来の少なくとも３００連続アミノ酸を含むまたはからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のコンジュゲートペプチドがＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも９５％同一性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のコンジュゲートペプチドが１８０アミノ酸長以下である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のコンジュゲートペプチドが配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、または前記第１のコンジュゲートペプチドが配列番号２もしくは配列番号３に９５％の同一性を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２のコンジュゲートペプチドが前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のコンジュゲートペプチドが前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２のコンジュゲートペプチドが配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、または前記第２のコンジュゲートペプチドが配列番号５もしくは配列番号７に９５％の同一性を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの前記ドメイン１が、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型由来である、請求項１４から５３に記載の方法。
【請求項５４】
前記完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼが、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型由来である、請求項１４から５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項５６】
前記固体支持体結合部分がビオチンを含む、請求項２４および３０に記載の方法。
【請求項５７】
トリガー溶液を前記試料に添加するステップをさらに含み、前記トリガー溶液が前記検出可能な標識からのシグナルを誘発する、請求項２４および３０に記載の方法。
【請求項５８】
ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３５０アミノ酸長以下である前記第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；ならびに
ｂ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド
を含むキットまたはシステム。
【請求項５９】
第１の容器をさらに含み、前記第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが前記第１の容器の内側にある、請求項５８に記載のキットまたはシステム。
【請求項６０】
前記第１の容器には界面活性剤がないまたは実質的にない、請求項５９に記載のキットまたはシステム。
【請求項６１】
固体支持体をさらに含む、請求項５８に記載のキットまたはシステム。
【請求項６２】
前記固体支持体が微粒子を含む、請求項６１に記載のキットまたはシステム。
【請求項６３】
第２の容器をさらに含み、前記固体支持体が前記第２の容器の内側にある、請求項６１に記載のキットまたはシステム。
【請求項６４】
第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドをさらに含む、請求項５８から６３に記載のキットまたはシステム。
【請求項６５】
前記第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドが、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）２００アミノ酸長以下であり；および、ｉｉｉ）検出可能な標識を含む、請求項６４に記載のキットまたはシステム。
【請求項６６】
第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドをさらに含む、請求項５８から６５に記載のキットまたはシステム。
【請求項６７】
前記第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドが、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を有する完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および、ｉｉ）検出可能な標識を含む、請求項６６に記載のキットまたはシステム。
【請求項６８】
第２の容器をさらに含み、前記第１と第２のＮＳ３ｈコンジュゲートペプチドが前記第２の容器の内側にある、請求項６６に記載のキットまたはシステム。
【請求項６９】
前記第２の容器には界面活性剤がないまたは実質的にない、請求項６８に記載のキットまたはシステム。
【請求項７０】
第１の抗ＨＣＶ抗体をさらに含む、請求項５８に記載のキットまたはシステム。
【請求項７１】
前記第１の抗ＨＣＶ抗体が抗コアＨＣＶ抗体である、請求項７０に記載のキットまたはシステム。
【請求項７２】
前記第１の抗ＨＣＶ抗体が固体支持体結合部分を含む、請求項７０から７１に記載のキットまたはシステム。
【請求項７３】
第２の抗ＨＣＶ抗体をさらに含む、請求項７０から７２に記載のキットまたはシステム。
【請求項７４】
前記第２の抗ＨＣＶ抗体が抗コアＨＣＶ抗体である、請求項７３に記載のキットまたはシステム。
【請求項７４】
第２の容器をさらに含み、前記第２の抗ＨＣＶ抗体が前記第２の容器の内側にある、請求項７３に記載のキットまたはシステム。
【請求項７５】
ＨＣＶコア捕捉ペプチドをさらに含む、請求項５８に記載のキットまたはシステム。
【請求項７６】
前記ＨＣＶコア捕捉ペプチドが固体支持体結合部分を含む、請求項７５に記載のキットまたはシステム。
【請求項７７】
ＨＣＶ検出可能に標識されたコンジュゲートコアペプチドをさらに含む、請求項７５から７６に記載のキットまたはシステム。
【請求項７８】
ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３５０アミノ酸長以下である第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；ならびに
ｂ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド
を含む組成物。
【請求項７９】
ｃ）固体支持体；
ｄ）第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド；
ｅ）第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド；
ｆ）第１の抗ＨＣＶ抗体；
ｇ）検出可能に標識されている第２の抗ＨＣＶ抗体；
ｈ）ＨＣＶコア捕捉ペプチド；および
ｉ）検出可能に標識されたＨＣＶコアコンジュゲートペプチド
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記組成物が前記成分のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ全てを有する、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、
ａ）対象の抗体を含有すると疑われる試料を、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３エピトープをコードするアミノ酸配列を含むＮＳ３捕捉ペプチドに接触するステップであって、前記接触が還元剤を前記試料に添加しないような条件下で行われるステップ、
ｂ）前記試料を前記ＮＳ３捕捉ペプチドが前記対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第１の複合体を形成するような条件下でインキュベートするステップであって、前記インキュベートが外来性の還元剤が前記試料中に存在しない条件下で行われるステップ、および
ｃ）前記第１の複合体の存在を検出し、それによって前記対象における過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップであって、前記検出が外来性の還元剤が存在しない条件下で行われるステップ
を含む方法。
【請求項８２】
生体試料、ＮＳ３捕捉ペプチド、検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドおよび複数の対象の抗体を含む組成物を含むキット、システムまたは組成物であって、前記ＮＳ３捕捉ペプチドおよび前記コンジュゲートペプチドが少なくとも１つの対象の抗体に結合し、前記組成物に外来性還元剤がない、キット、システムまたは組成物。
【請求項８３】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、
ａ）最初の生体試料を第１のＮＳ３捕捉ペプチドと第１のコンジュゲートペプチドに接触させて、前記最初の生体試料、前記第１のＮＳ３捕捉ペプチドおよび前記第１のコンジュゲートペプチドを含む混合生体物質を作製するステップであって、
前記ＮＳ３捕捉ペプチドが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み、
前記最初の生体試料が対象の抗体を含有すると疑われており、前記対象の抗体が前記生体試料中で精製された形態ではないステップ、
ｂ）前記混合生体試料を、前記ＮＳ３捕捉ペプチドが前記対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して捕捉複合体を形成し、前記コンジュゲートペプチドが前記捕捉複合体中の前記対象の抗体に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下でインキュベートするステップ、
ｃ）前記混合生体試料を洗浄して洗浄された試料を作製するステップ、
ｄ）追加量の前記コンジュゲートペプチドまたは前記捕捉複合体中の前記対象の抗体に特異的に結合する異なるコンジュゲートペプチドを添加するステップ、
ｅ）前記検出可能な複合体の存在を検出し、それによって前記対象における過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップ
を含む方法。
【請求項８４】
前記コンジュゲートペプチドがＮＳ３ｈの少なくとも１つのエピトープに結合する、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はＮＳ３捕捉ペプチドを使用して試料中の対象の抗ＨＣＶ抗体を検出するための方法、キット、および組成物を提供する。ある種の実施形態では、少なくとも２つのＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈ）捕捉ペプチドおよび少なくとも２つのコンジュゲートペプチド（例えば、ＮＳ３ｈコンジュゲートペプチド）が一緒に用いられ、これにより１ステップタイプのアッセイにおいて広いダイナミックレンジの対象の抗体検出が可能になる。他の実施形態では、還元剤を使用せずにＮＳ３特異的対象の抗体を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＳ３特異的対象の抗体はＮＳ３コンジュゲートペプチドの「ダブルショット」（例えば、洗浄の前と後の両方で試料に添加されるコンジュゲートペプチド）を用いて検出される。
【背景技術】
【０００２】
ＷＨＯの統計によれば、世界中で１億７０００万もの人が、肝臓のウイルス感染であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。ＨＣＶに感染している人の７５−８５％が慢性感染まで進行し、これらの症例のおおよそ２０％が感染の２０年後肝硬変または肝細胞癌腫を含む慢性Ｃ肝炎の合併症を発症する。ＨＣＶ感染に対する現在推奨される治療はインターフェロンとリバビリン薬の組合せであるが、前記治療はすべての症例で効果的であるわけではなく、Ｃ型肝炎関連末期疾患では肝臓移植の必要が示される。現在、ＨＣＶ感染を予防するためのワクチンは入手可能ではなく、したがって、感染を避けるためのあらゆる予防策を講じなければならない。したがって、感度の良いＨＣＶ検出アッセイが公衆安全にとって重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示はＮＳ３捕捉ペプチドを使用して試料中の対象の抗ＨＣＶ抗体を検出するための方法、キット、および組成物を提供する。ある種の実施形態では、少なくとも２つのＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈ）捕捉ペプチドおよび少なくとも２つのコンジュゲートペプチド（例えば、ＮＳ３ｈコンジュゲートペプチド）が一緒に用いられ、これにより１ステップタイプのアッセイにおいて広いダイナミックレンジの対象の抗体検出が可能になる。他の実施形態では、還元剤を使用せずにＮＳ３特異的対象の抗体を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＳ３特異的対象の抗体はＮＳ３ｈコンジュゲートペプチドの「ダブルショット」（例えば、洗浄の前と後の両方で試料に添加されるコンジュゲートペプチド）を用いて検出される。
【０００４】
いくつかの実施形態では、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、ａ）最初の生体試料（例えば、血液、血漿、血清、精液、等）を第１と第２のＮＳ３ｈ（ＮＳ３ヘリカーゼ）捕捉ペプチドおよび第１と第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド（例えば、ＨＳ３ｈ特異的コンジュゲートペプチド）に接触させて、最初の生体試料、第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドおよび第１と第２のコンジュゲートペプチドを含む混合生体物質を作製するステップであって、第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは：ｉ）それぞれが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し（例えば、長さまたは配列の違いのような少なくとも１つのアミノ酸差を有する。）、最初の生体試料が対象の抗体を含有すると疑われており、対象の抗体は生体試料中で精製された形態ではないステップ、ｂ）第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第１の捕捉複合体を形成し、第１（または第２）のコンジュゲートペプチドが第１の捕捉複合体中の対象の抗体に結合して第１の検出可能な複合体を形成し、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第２の捕捉複合体を形成し、第２（または第１）のコンジュゲートペプチドが第２の捕捉複合体中の対象の抗体に結合して第２の検出可能な複合体を形成するような条件下で混合生体試料をインキュベートするステップ；ｃ）混合生体試料を洗浄して洗浄された試料を作製するステップ；ならびにｄ）第１および／または第２の検出可能な複合体の存在を検出し、それによって対象における過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップを含み、混合生体試料中の第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド両方の存在が、第１または第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドのみを使用する場合と比べて対象の抗体を検出する（例えば、定性的にまたは定量的に）ためのダイナミックレンジを広げる方法が本明細書では提供される。
【０００５】
ある種の実施形態では、本開示は、ａ）ｉ）それぞれが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し、ｉｉｉ）生体試料中の少なくとも１つの対象の抗体に結合して捕捉複合体を形成することができる第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドおよびｂ）捕捉複合体中の対象の抗体に結合することができる第１と第２のコンジュゲートペプチドを含むキットまたはシステムを提供する。ある種の実施形態では、キットおよびシステムは、ｃ）対象の抗体を含有する生体試料をさらに含み、対象の抗体は生体試料中で精製された形態ではない。
【０００６】
さらなる実施形態では、ａ）ｉ）それぞれが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み；ｉｉ）異なるアミノ酸配列を有し、ｉｉｉ）生体試料中の少なくとも１つの対象の抗体に結合して捕捉複合体を形成することができる第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドおよびｂ）捕捉複合体中の対象の抗体に結合することができる第１と第２のコンジュゲートペプチドを含む組成物が本明細書では提供される。ある種の実施形態では、組成物は、ｃ）対象の抗体を含有する生体試料をさらに含み、対象の抗体は生体試料中で精製された形態ではない。他の実施形態では、組成物には界面活性剤がないまたは検出できるほどにはない。
【０００７】
特定の実施形態では、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、ａ）ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも８０％または９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．９９．５％．．．または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４００または３５０または３００アミノ酸長以下（例えば、４００．．．３７５．．．３２５．．．３００．．．２７５．．．２５０．．．２２５．．．２００．．．または１８０アミノ酸長以下）である第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；ｉｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも８５％または９０％または９５％（例えば、少なくとも８５％．．．９０％．．．９４％．．．９７％．．．９９％．．．９９．５％．．．９９．９％．．．または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドに、対象の抗体を含有すると疑われている試料を接触させるステップ、ならびにｂ）第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第１の複合体を形成し、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第２の複合体を形成するような条件下で試料をインキュベートするステップ、ならびにｃ）第１および／または第２の複合体の存在を検出し、それによって対象において過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップを含む方法が本明細書では提供される。特定の実施形態では、試料中の第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドと一緒の第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの存在は、第２のＮＳ３ｈペプチドのみを使用する場合と比べて対象の抗体を定性的に検出するための上のダイナミックレンジを広げる。
【０００８】
ある種の実施形態では、ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、４００または３５０または３００または２２５アミノ酸長以下である第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド；ｂ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも８５％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドを含むキットおよびシステムが本明細書では提供される。
【０００９】
ある種の実施形態では、キットおよびシステムは、第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドがその内部にある第１の容器をさらに含む。他の実施形態では、第１の容器は界面活性剤がないまたは実質的にない。他の実施形態では、キットおよびシステムは固体支持体（例えば、微粒子）をさらに含む。他の実施形態では、キットおよびシステムは固体支持体がその内部にある第２の容器をさらに含む。さらなる実施形態では、キットおよびシステムは第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド（例えば、第１または第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドにより捕捉される対象の抗体に結合することになる。）をさらに含む。ある種の実施形態では、第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドは、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）２５０または２００アミノ酸長以下であり、ｉｉｉ）検出可能な標識を含む。追加の実施形態では、キットおよびシステムは第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド（例えば、第１または第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドにより捕捉される対象の抗体に結合することになる。）をさらに含む。ある種の実施形態では、第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドは、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を有する完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、キットおよびシステムは第１と第２のＮＳ３ｈコンジュゲートペプチドがその内部にある第２（または第３）の容器をさらに含む。特定の実施形態では、第２の容器は界面活性剤がないまたは実質的にない。
【００１０】
ある種の実施形態では、キットおよびシステムは第１の抗ＨＣＶ抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＨＣＶ抗体は抗コアＨＣＶ抗体または抗ＮＳ３もしくはＮＳ４抗体である。他の実施形態では、第１の抗ＨＣＶ抗体は固体支持体結合部分を含む。さらなる実施形態では、キットおよびシステムは第２の抗ＨＣＶ抗体をさらに含む。ある種の実施形態では、第２の抗ＨＣＶ抗体は抗コアＨＣＶ抗体である。いくつかの実施形態では、キットおよびシステムは第２の抗ＨＣＶ抗体がその内部にある第２の容器をさらに含む。ある種の実施形態では、キットおよびシステムはＨＣＶコア捕捉ペプチドをさらに含む。追加の実施形態では、ＨＣＶコア捕捉ペプチドは固体支持体結合部分を含む。他の実施形態では、キットおよびシステムはＨＣＶ検出可能に標識されたコンジュゲートコアペプチドをさらに含む。
【００１１】
ある種の実施形態では、本開示は、ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１および／またはドメイン２に少なくとも８０％または９０％（例えば、８０％．．．９０％．．．９５％．．．９９％．．．９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２５０または３５０アミノ酸長以下（例えば、２５０．．．３００．．．または３５０以下）である第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチド、ならびにｂ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３を含む完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は以下の成分：ｃ）固体支持体；ｄ）第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド；ｅ）第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチド；ｆ）第１の抗ＨＣＶ抗体；ｇ）検出可能に標識されている第２の抗ＨＣＶ抗体；ｈ）ＨＣＶコア捕捉ペプチド；およびｉ）検出可能に標識されたＨＣＶコアコンジュゲートペプチドのうちの少なくとも１つをさらに含む。特定の実施形態では、組成物はこの成分のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ全てを有する。
【００１２】
ある種の実施形態では、配列番号１−１６のいずれか１つにおけるアミノ酸配列を含むもしくはからなる少なくとも１つのペプチド、または配列番号１−１６のいずれか１つに少なくとも９５％（例えば、９５％．．．９８％．．．９９％．．．または９９．５％）の配列同一性を有するペプチドを含む組成物が本明細書では提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、ａ）対象の抗体を含有すると疑われる試料を、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３エピトープをコードするアミノ酸配列を含むＮＳ３捕捉ペプチドに接触させるステップであって、接触が外来性の還元剤（すなわち、試料中に天然には存在しない還元剤）を試料に添加しない、または存在しないような条件下で行われるステップ、ｂ）試料をＮＳ３捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第１の複合体を形成するような条件下でインキュベートするステップであって、インキュベートが外来性の還元剤が試料中に存在しないような条件下で行われるステップ、ならびにｃ）第１の複合体の存在を検出し、それによって対象において過去または現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップであって、検出が外来性の還元剤が存在しないような条件下で行われるステップを含む方法が本明細書では提供される。
【００１４】
ある種の実施形態では、生体試料、ＮＳ３捕捉ペプチド、検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドおよび複数の対象の抗体を含む組成物を含み、ＮＳ３捕捉ペプチドとコンジュゲートペプチドが少なくとも１つの対象の抗体に結合し、組成物に外来性還元剤がない、キット、システムおよび組成物が本明細書では提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、ａ）最初の生体試料を第１のＮＳ３捕捉ペプチドと第１のコンジュゲートペプチドに接触させて、最初の生体試料、第１のＮＳ３捕捉ペプチドおよび第１のコンジュゲートペプチドを含む混合生体物質を作製するステップであって、ＮＳ３捕捉ペプチドが少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼエピトープをコードするアミノ酸配列を含み、最初の生体試料が対象の抗体を含有すると疑われており、対象の抗体が生体試料中で精製された形態ではないステップ、ｂ）混合生体試料を、ＮＳ３捕捉ペプチドが対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して捕捉複合体を形成しコンジュゲートペプチドが捕捉複合体中の対象の抗体に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下でインキュベートするステップ、ならびにｃ）混合生体試料を洗浄して洗浄された試料を作製するステップ、ｄ）追加量のコンジュゲートペプチドまたは捕捉複合体中の対象の抗体に特異的に結合する異なるコンジュゲートペプチドを添加するステップ、ならびにｅ）検出可能な複合体の存在を検出し、それによって対象において過去のまたは現在のＨＣＶ感染の存在を検出するステップを含む方法が本明細書では提供される。さらなる実施形態では、コンジュゲートペプチドはＮＳ３ｈ（ＨＣＶのＮＳ３ｈヘリカーゼ）の少なくとも１つのエピトープに結合する。
【００１６】
ある種の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドのアミノ酸配列の長さは第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドの少なくとも１．５または２倍（例えば、長さは少なくとも１．５．．．３．０．．．４．０．．．５．０倍またはそれよりも長い。）である。いくつかの実施形態では、第１と第２のコンジュゲートエピトープはＮＳ３ｈエピトープに特異的である。さらなる実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼドメイン１に少なくとも８０％または９０％（例えば、８０％．．．８７％．．．９４％．．．９８％．．．９９％．．．または９５．５％）の配列同一性を有しており、２５０アミノ酸長以下である。さらなる実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼドメイン２に少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有しており、２５０アミノ酸長以下（例えば、２５０．．．２２５．．．２００．．．または１８０アミノ酸長以下）である。追加の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９０％または９５％（例えば、９０％．．．９４％．．．９６％．．．または９９％）の配列同一性を有する。ある種の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む。さらなる実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドのアミノ酸配列は完全長ＨＣＶヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する。追加の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドのアミノ酸配列はドメイン１、２および３を有する完全長ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む。さらなる実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはＮＳ３ヘリカーゼ天然構造（すなわち、変性していない構造）を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、試料はＨＣＶ粒子またはこの断片を含有しているとさらに疑われており、方法は、ＨＣＶ粒子またはこの断片に結合している第１の抗ＨＣＶ捕捉抗体を含む第３の複合体が形成されるように、試料を第１の抗ＨＣＶ捕捉抗体に接触させるステップをさらに含む。他の実施形態では、第１の捕捉抗ＨＣＶ抗体は抗コアＨＣＶ抗体である。追加の実施形態では、第１の抗ＨＣＶ抗体は固体支持体結合部分を含む。追加の実施形態では、方法は、第３の複合体中でＨＣＶ粒子またはこの断片に結合する第２の抗ＨＣＶ抗体（例えば、コンジュゲート抗体）に試料を接触させるステップをさらに含み、第２の抗ＨＣＶ抗体は検出可能に標識されている。さらなる実施形態では、第２の抗ＨＣＶ抗体は抗コアＨＣＶ抗体である。いくつかの実施形態では、方法は第３の複合体を検出するステップをさらに含む。
【００１８】
ある種の実施形態では、コンジュゲートペプチドまたはコンジュゲート抗体によるいかなる検出にも先立って、試料は洗浄される。いくつかの実施形態では、方法は試料を第１のＨＣＶコアペプチド（例えば、コア捕捉ペプチド）に接触させるステップをさらに含み、第１のコアペプチドは対象の抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合して第４の複合体を形成する。追加の実施形態では、第１のＨＣＶコアペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列または配列番号１２に９５％もしくはそれよりも多い同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはからなる。さらなる実施形態では、第１のＨＣＶコアペプチドは固体支持体結合部分を含む。
【００１９】
追加の実施形態では、方法は試料を第２のＨＣＶコアペプチド（例えば、コンジュゲートペプチド）に接触させるステップをさらに含み、第２のＨＣＶコアペプチドは検出可能に標識されており、第２のＨＣＶコアペプチドは第４の複合体の一部として対象の抗体に結合する。ある種の実施形態では、方法は第４の複合体の存在を検出するステップをさらに含む。追加の実施形態では、方法は試料を固体支持体（例えば、マイクロビーズ、等）に接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、固体支持体はアビジンまたは他の結合分子で被覆されている。
【００２０】
追加の実施形態では、方法は、第１の複合体の一部として対象の抗体に結合する第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドに試料を接触させるステップをさらに含み、第１の複合体の存在を検出するステップが第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドを検出することを含む。さらなる実施形態では、第１の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドは、ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも８０％．．．９０％．．．または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）３００．．．２００．．．または１８０アミノ酸長以下であり、ｉｉｉ）検出可能な標識を含む。
【００２１】
ある種の実施形態では、方法は第２の複合体の一部として対象の抗体に結合する第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドに試料を接触させるステップをさらに含み、第２の複合体の存在を検出するステップが第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドを検出することを含む。他の実施形態では、第２の検出可能に標識されたコンジュゲートペプチドは完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも８０％．．．９０％．．．または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。追加の実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは１８０アミノ酸長以下である。さらなる実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むもしくはからなり、または第１のＮＳ３ペプチドは配列番号２もしくは配列番号３に９０％．．．もしくは９５％の同一性を有する。追加の実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは配列番号２または配列番号３由来の少なくとも１００連続アミノ酸（例えば、少なくとも１００．．．１２５．．．または１３５）を含むまたはからなる。
【００２２】
さらなる実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９０％．．．または９５％の配列同一性を有する。ある種の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むもしくはからなり、または第２のＮＳ３捕捉ペプチドは配列番号５もしくは配列番号７に９０％．．．もしくは９５％の配列同一性を有する。追加の実施形態では、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは配列番号５または配列番号７由来の少なくとも３００．．．３５０連続アミノ酸を含むまたはからなる。
【００２３】
さらなる実施形態では、第１のコンジュゲートペプチドはＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１に少なくとも９０％．．．または９５％の同一性を有する。他の実施形態では、第１のコンジュゲートペプチドは１８０アミノ酸長以下である。他の実施形態では、第１のコンジュゲートペプチドは配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むもしくはからなり、または第１のコンジュゲートペプチドは配列番号２もしくは配列番号３に９５％の同一性を有する。追加の実施形態では、第２のコンジュゲートペプチドは完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第２のコンジュゲートペプチドは完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに少なくとも９９％の配列同一性を有する。ある種の実施形態では、第２のコンジュゲートペプチドは配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むもしくはからなり、または第２のコンジュゲートペプチドは配列番号５もしくは配列番号７に９５％の同一性を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１は、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型由来である。さらなる実施形態では、完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼは、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型由来である。他の実施形態では、対象はヒトである。追加の実施形態では、固体支持体結合部分はビオチンを含む。さらなる実施形態では、方法は、検出可能な標識からのシグナルを誘発するトリガー溶液を試料に添加するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａ：標準番号付けに従ってＨＣＶのアミノ酸１１９２−１３５６を含み、ヘリカーゼドメイン１のすべて（１２０７−１３５６）およびＮＳ３プロテアーゼのわずかな部分（１１９２０１２０７）を含むＮＳ３−Ｄ１と名付けられる例となるペプチドのアミノ酸配列を示す図である。特にＮ末端ヒスチジンタグ付（例えば、タンパク質精製のために）のＮＳ３−Ｄ１捕捉ペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を示している。図１Ｂ：標準番号付けに従ってＨＣＶのアミノ酸１１９２−１３５６を含み、ヘリカーゼドメイン１のすべて（１２０７−１３５６）およびＮＳ３プロテアーゼのわずかな部分（１１９２−１２０７）を含むＮＳ３−Ｄ１と名付けられる例となるペプチドのアミノ酸配列を示す図である。ＮＳ３−Ｄ１のビオチン化バージョン（配列番号３）（例えば、このペプチドがアビジン被覆マイクロビーズに結合できるように）を示している。図１Ｃ：アミノ酸１２０５−１３５６である「ＮＳ３−Ｄ１，ＤｅｌＮ１５」と名付けられた例となる配列を示す図である。特にＣ末端にビオチン配列が付いた例となるペプチドＮＳ３−Ｄ１，ｄｅｌＮ１５−Ｃｂｔ（ｖ２ｅ）のアミノ酸配列、配列番号１を示している。図１Ｄ：アミノ酸１２０５−１３５６である「ＮＳ３−Ｄ１，ＤｅｌＮ１５」と名付けられた例となる配列を示す図である。特にＣ末端に、標識化目的のためアクリジニル化ＢＳＡに結合するように設計されている「ＸＣ９」配列を有する例となるペプチドＮＳ３−Ｄ１，ｄｅｌＮ１５−ＸＣ９のアミノ酸配列、配列番号１３を示している。図１Ｅ：アミノ酸１２０５−１３５６である「ＮＳ３−Ｄ１，ＤｅｌＮ１５」と名付けられた例となる配列を示す図である。Ｎ末端ヒスチジンタグ付のＮＳ３−Ｄ１，ｄｅｌＮ１５のアミノ酸配列（配列番号１４）を与えている。
【図２−１】図２Ａ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。特にＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）の核酸配列（配列番号４）を示す図である。図２Ｂ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。ＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）のアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図２−２】図２Ｃ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。Ｃ末端ビオチンタグをコードするＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）−Ｃｂｔ（ｖ２ｅ）の核酸配列（配列番号６）を示す図である。図２Ｄ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。Ｃ末端ビオチンタグを含むＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）−Ｃｂｔ（ｖ２ｅ）のアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図２−３】図２Ｅ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。Ｃ末端ＸＣ９配列をコードするＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）−ＸＣ９の核酸配列（配列番号８）を示す図である。図２Ｆ：３つのドメイン全てが付いた完全長ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを含む例となるＮＳ３ｈペプチドＮＳ３−（ＤｅｌｔａＮ１５）（アミノ酸１２０５−１６５８）の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。標識化目的のためにアクリジニル化ＢＳＡに結合するように設計されたＸＣ９配列をコードするＮＳ３ｈ（ｄｅｌｔａＮ１５）−ＸＣ９のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。
【図３】図３Ａ：アミノ酸１１９２−１４５７（ＮＳ３領域）、１−１５０（コア領域）、およびＧＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（ヒスチジンタグ）の融合物である融合ペプチド９ＮＢ４５Ｈの核酸配列（配列番号１０）を示す図である。この配列は、例えば、キャリブレーターまたは対照配列として有用である。図３Ｂ：アミノ酸１１９２−１４５７（ＮＳ３領域）、１−１５０（コア領域）、およびＧＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（ヒスチジンタグ）の融合物である融合ペプチド９ＮＢ４５Ｈのアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。この配列は、例えば、キャリブレーターまたは対照配列として有用である。
【図４】３４位および４８位に欠失のあるアミノ酸１５−６８である例となるコアペプチドのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図５−１】図１−４に記載される配列の配列アライメントおよびＨＣＶのＮＳ３領域における単離物Ｐ２６６６４を示す図である。このアライメントはプロテアーゼの一部、ならびにＨＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３の位置を示している。
【図５−２】図１−４に記載される配列の配列アライメントおよびＨＣＶのＮＳ３領域における単離物Ｐ２６６６４を示す図である。このアライメントはプロテアーゼの一部、ならびにＨＳ３ヘリカーゼのドメイン１、２および３の位置を示している。
【図６】図Ａは３３核酸配列（配列番号１５）を示す。図Ｂは３３Ｃアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書で使用される用語「試料」はその最も広い意味で使用される。本明細書で使用される「生体試料」には、生体または以前の生体由来の物質の任意の量が含まれるがこれらに限定されない。そのような生体には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の動物が含まれるがこれらに限定されない。そのような物質には血液（例えば、全血またはこの成分）、血漿、血清、尿、唾液、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が含まれるがこれらに限定されない。
【００２７】
用語「抗体（Ａｂ）」（単数および複数）とは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ（単数または複数））、ポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ（複数））、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分的ヒト化；可変領域の一部が非ヒト配列由来の対応する配列により置き換えられており、改変可変領域がヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されているヒト抗体の改変可変領域を含むポリペプチド）、動物抗体（トリ（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラ、および非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、等）または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、等）を含む哺乳動物のようなしかしこれらに限定されない。）、組換え抗体、キメラ抗体（ｃＡｂ；別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結されている１つの宿主種由来の抗体の重および軽鎖可変領域のすべてまたは一部を含むポリペプチド）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド連結Ｆｖ断片（「ｓｄＦｖ」）、ｄＡｂ断片、ダイアボディ、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二機能性または二重ドメイン抗体（例えば、二重可変ドメイン抗体、またはＤＶＤ−ＩｇＧ）、ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片（または抗原的に反応性の断片）のことである。特に、抗体には免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子、すなわち、本明細書の（ｎ）においてさらに記載される分析物結合部位および本明細書においてさらに記載される変異体を含有する分子の免疫学的に活性な（または抗原的に反応性の）断片が含まれる。免疫グロブリン分子は、いかなる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスでも可能である。バイオディスプレイを使用して調製されたコンビナトリー抗体ライブラリーのスクリーニングを介して増加されたまたは改善された親和性（すなわち、ＫＤ、ｋｄまたはｋａ）を有する抗体は「親和性成熟抗体」と呼ばれる。簡潔さのために、分析物に対する抗体は「抗分析物抗体」または単に「分析物抗体」（例えば、抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗体）のいずれかであると本明細書では呼ばれることが多い。
【００２８】
本記述では、アッセイ「成分（単数および複数）」および「少なくとも１つの成分」とは、例えば、捕捉抗体、捕捉ペプチド（例えば、第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉抗体）、検出またはコンジュゲート抗体、対照、キャリブレーター、一連のキャリブレーター、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止溶液ならびに本明細書に記載される方法および当技術分野で公知の他の方法に従って、患者の尿、血清または血漿試料のような検査試料のアッセイのためのキット中に含まれることが可能な同類のもののことである。したがって、本開示の文脈では、「少なくとも１つの成分」および「成分（単数および複数）」は、本明細書に記載され、任意選択的に固体支持体上に固定化されるポリペプチドを含むことが可能である。いくつかの成分は、溶液であるまたはアッセイにおいて使用するための再構成のために凍結乾燥されることが可能である。
【００２９】
本開示のアッセイを行う際には、対照を使用するのが有用であり得る。「対照」とは、抗ＨＣＶ抗体を含有しない（「負の対照」）または抗ＨＣＶ抗体を含有する（「正の対照」）ことが分かっている組成物のことである。正の対照は既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含むことが可能である。「対照」、「正の対照」および「キャリブレーター」は、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含む組成物を指すため本明細書では互換的に使用することができる。「正の対照」を使用すればアッセイ性能特徴を確立することが可能であり、試薬（例えば、分析物）の完全性の有用な指標になる。
【００３０】
「エピトープ（単数および複数）」および「目的のエピトープ」とは、認識されて抗体またはこの抗原的に反応性の断片のような特定の結合パートナー上の相補的部位に結合することが可能な任意の分子（例えば、本明細書に記載されるＮＳ３抗原）上の部位（複数可）のことである。エピトープは、特定の結合パートナー上の相補的部位に結合することが分かっている抗原（またはこの断片）の領域の正確なアミノ酸残基で構成されている。抗原断片は１つよりも多いエピトープを含有することが可能である。
【００３１】
本明細書に記載されているアッセイ、キットおよび組成物では、アッセイの１つまたは他の成分は検出可能な標識を含むことができる。用語「標識」および「検出可能な標識」とは、抗体と分析物のような特異的な結合対のメンバー間の反応を検出可能にするために抗体または分析物のような特異的な結合パートナーに結合している部分のことであり、そのように標識されている特異的な結合パートナー、例えば、抗体または分析物は「検出可能に標識されている」と呼ばれる。標識は視覚的または機器的手段により検出可能であるシグナルを発生することが可能である。種々の標識には、色素原のようなシグナル発生物質、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物および同類のものが含まれる。標識の代表的な例には、光を発生する部分、例えば、アクリジニウム化合物および蛍光を発生する部分、例えば、フルオレセインが含まれる。他の標識は本明細書に記載されている。この点に関して、部分それ自体は検出可能に標識されていないこともあるがさらに別の部分と反応すると検出可能になることがある。「検出可能に標識されている」の使用は、後者のタイプの検出可能な標識化を包含することを意図されている。
【００３２】
「連結配列」とは、１つ以上の目的のポリペプチド配列（例えば、完全長、断片、等）に接続されている天然のまたは人工のポリペプチド配列のことである。用語「接続された」とは、目的のポリペプチド配列への連結配列の結合のことである。そのようなポリペプチド配列は好ましくは、１つ以上のペプチド結合により結合される。連結配列は約４から約５０アミノ酸の長さを有することが可能である。好ましくは、連結配列の長さは約６から約３０アミノ酸である。天然の連結配列は、アミノ酸置換、付加または欠失により改変して人工的な連結配列を作製することが可能である。例となる連結配列には以下が含まれるがこれらに限定されない：（ｉ）６つのヒスチジン残基を含有する６×Ｈｉｓタグのようなヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）は、目的のポリペプチドおよび抗体の単離および精製を促進するための連結配列として有用である。（ｉｉ）Ｈｉｓタグのようなエンテロキナーゼ切断部位は目的のタンパク質および抗体の単離および精製において使用される。多くの場合、エンテロキナーゼ切断部位は、目的のタンパク質および抗体の単離および精製においてＨｉｓタグと一緒に使用される。当技術分野では種々のエンテロキナーゼ切断部位が知られている。（ｉｉｉ）種々の配列を使用して一本鎖可変領域断片の軽鎖および／または重鎖可変領域を連結するまたは接続することが可能である。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４頁（１９９０）に見出すことが可能である。連結配列は、薬物の付着または固体支持体への付着のような追加の機能のために改変することも可能である。本開示の文脈では、ｍＡｂは、例えば、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位、または両方のような連結配列を含有することが可能である。
【００３３】
「患者」および「対象」は、トリ（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラ、ならびに非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物のような動物を指すために本明細書では互換的に使用することができる。好ましくは、患者または対象は、ＨＣＶ感染のリスクがあるヒトまたはＨＣＶに感染しているヒトのようなヒトである。
【００３４】
本明細書に記載される免疫アッセイの結果の解析では、ある一定レベルの検出をカットオフレベルとして含むのが有用であり得る。「所定のカットオフ」および「所定のレベル」とは一般に、アッセイ結果を所定のカットオフ／レベルに対して比べることにより診断／予防／治療有効性結果を評価するのに使用されるアッセイカットオフ値のことであり、所定のカットオフ／レベルは種々の臨床パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善、等）にすでに連結されているまたは関連付けられている。本開示は例となる所定のレベルを提供することができるが、カットオフ値は免疫アッセイの性質（例えば、用いられる抗体、等）に応じて変動することがあることは周知である。本明細書の開示を他の免疫アッセイに適応して、本開示に基づいてそれら他の免疫アッセイについての免疫アッセイ特異的カットオフ値を得ることはさらに十分当業者の能力の範囲内である。所定のカットオフ／レベルの正確な値はアッセイ間で変動することがあるが、本明細書に記載される相関関係は一般に適用可能であるはずである。
【００３５】
下記のように、いくつかの実施形態では検査試料の前処理を提供するのが望ましい場合がある。本明細書に記載される診断アッセイにおいて使用される「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化試薬は、検査試料中に存在するいかなる細胞も溶解させるおよび／またはいかなる分析物も可溶化させる試薬である。本明細書でさらに記載されるように、前処理はすべての試料に必要なわけではない。とりわけ、分析物（すなわち、抗ＨＣＶ抗体）を可溶化するには、試料中に存在するいかなる内在性結合タンパク質からも分析物を放出させる必要がある。前処理試薬は均一である（分離ステップを必要としない。）または不均一である（分離ステップを必要とする。）場合がある。不均一前処理試薬を使用すれば、アッセイのその次のステップに進むことに先立って、検査試料からいかなる沈殿分析物結合タンパク質も除去される。前処理試薬は任意選択的に、（ａ）１種以上の溶媒および塩、（ｂ）１種以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤および塩、または（ｅ）細胞溶解および／もしくは分析物の可溶化に適した任意の試薬もしくは試薬の組合せを含むことが可能である。
【００３６】
アッセイは厳密な品質管理も受けることができる。本明細書に記載される免疫アッセイおよびキットという文脈において「品質管理試薬」には、キャリブレーター、対照および感受性パネル（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｐａｎｅｌ）が含まれるがこれらに限定されない。「キャリブレーター」または「標準」は典型的には、抗体または分析物のような分析物の濃度の内挿のためのキャリブレーション（標準）曲線を確立するために使用される（例えば、複数のような１つ以上）。代わりに、所定の陽性／陰性カットオフに近い単一キャリブレーターを使用することが可能である。複数のキャリブレーター（すなわち、１つよりも多いキャリブレーターまたはキャリブレーター（複数可）の変化量）を、「感受性パネル」を含むように組み合わせて使用することが可能である。
【００３７】
用語「試料」、「検査試料」および「患者試料」は本明細書では互換的に使用することができる。尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球または単球の試料のような試料は、患者から得られるまま直接使用することが可能である、または本明細書で考察されるある様式でまたは当技術分野で公知である他の方法で試料の特性を改変するために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活化、試薬の添加および同類のものによりのように前処理することが可能である。好ましくは、試料は尿、血清または血漿である。
【００３８】
いくつかのアッセイでは、アッセイの較正を提供するのが望ましい場合がある。「一連の較正組成物」とは、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含む複数の組成物のことであり、組成物のそれぞれは抗ＨＣＶ抗体の濃度が他の組成物とは一連に異なる。
【００３９】
本明細書全体を通じて、ＮＳ３ｈ抗原および／または他の試薬は固体支持体または固相に結合されることができ、この用語は両方が互換的に使用されることが認められる。用語「固相」とは、不溶性であるまたはその後の反応により不溶性にすることが可能な任意の物質のことである。固相は捕捉剤を引き付け固定化するその固有の能力で選ぶことが可能である。代わりに、固相は、捕捉剤を引き付け固定化する能力を有する連結剤をこれに付着させることが可能である。連結剤は、例えば、捕捉剤それ自体に関してまたは捕捉剤にコンジュゲートされた荷電物質に関して正反対の電荷を帯びた荷電物質を含むことが可能である。一般に、連結剤は、固相に固定化（付着）されていて、結合反応を通じて捕捉剤を固定化する能力のある任意の結合パートナー（好ましくは特異的な）であることができる。連結剤は、アッセイの実施前にまたはアッセイの実施中に固相物質への捕捉剤の間接的結合を可能にする（例えば、フライタイプアッセイ上の捕捉）。固相は、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、および当業者には公知である他の構成物を含めて、例えば、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラスまたはシリコンであることが可能である。
【００４０】
本明細書に記載されるアッセイ、キットおよび組成物のある種の記述では、ＮＳ３、ＮＳ４もしくはコア抗原またはＨＣＶ抗体のいずれでも特異的結合パートナーと呼ぶのが有用である場合がある。「特異的結合パートナー」は特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的または物理的手段を通じて互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。したがって、一般的免疫アッセイの抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターと受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、および同類のものを含むことが可能である。さらに、特異的結合対は、元々の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば、分析物類似体を含むことが可能である。免疫反応性特異的結合メンバーには、単離されたものでも組換え的に産生されたものでも、抗原、抗原断片ならびにモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む抗体、ならびにこれらの複合体、断片および変異体（変異体の断片を含む。）が含まれる。特異的結合対（例えば、抗原（またはこの断片）と抗体（またはこの抗原的に反応性の断片））のメンバー間の相互作用という文脈での用語「特異的な」および「特異性」とは、相互作用の選択的反応性のことである。語句「に特異的に結合する」および類似の語句とは、所与の抗原（またはこの断片）に特異的に結合し他の実体には特異的に結合しない抗体の能力（またはこの抗原的に反応性の断片）のことである。
【００４１】
本開示は、ＮＳ３捕捉ペプチドを使用して試料中の対象の抗ＨＣＶ抗体を検出するための方法、キットおよび組成物を提供する。ある種の実施形態では、少なくとも２つのＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈ）捕捉ペプチドおよび少なくとも２つのコンジュゲートペプチド（例えば、ＮＳ３ｈコンジュゲートペプチド）が一緒に用いられ、これにより１ステップタイプのアッセイにおいて広いダイナミックレンジの対象の抗体検出が可能になる。他の実施形態では、還元剤を使用せずにＮＳ３特異的対象抗体を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＳ３特異的対象抗体はＮＳ３コンジュゲートペプチドの「ダブルショット」（例えば、洗浄の前と後の両方で試料に添加されるコンジュゲートペプチド）を用いて検出される。
【００４２】
ある種の実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはヘピカウイルス（Ｈｅｐｉｃａｖｉｒｕｓ）（例えば、ＨＣＶ）ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質の実質的にドメイン１のみ（例えば、アミノ酸１１９２−１３５６または１２０５−１３５６）で構成されており、第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはＮＳ３ヘリカーゼタンパク質の実質的に３つ全てのドメイン（例えば、アミノ酸１２０７−１６５４）で構成されている。次に、これら２種類のタンパク質は、高タイターＨＣＶ抗ＮＳ３抗体を含有する試料がドメイン１  ＮＳ３捕捉タンパク質により検出され低タイターＡｂ試料が完全長ＮＳ３ヘリカーゼペプチドにより検出されるように、１ステップ免疫アッセイフォーマット（捕捉とコンジュゲートペプチドの両方がいかなる洗浄にも先立って試料に同時にまたはだいたい同時に添加される。）において適切なレベルで添加することができる。いくつかの実施形態では、第１と第２のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドはＣ末端にビオチンを含有し（例えば、アビジン被覆ビーズに結合するように）、第２のセットの類似するかまたは同一のタンパク質はコンジュゲートタンパク質として使用されて捕捉された抗体を検出する。そのようなコンジュゲートペプチドはアクリジニル化ＢＳＡにコンジュゲートさせることができる。ある種の実施形態では、これら４つのペプチド（２つは捕捉で２つはコンジュゲート）は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質に対する抗体の検出のために１ステップタイプ免疫アッセイにおいて使用される。
【００４３】
下の実施例１に示されるように、２種類のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドを使用するおかげで、２つのＮＳ３ｈ捕捉タンパク質が一斉に使用される場合、抗体を検出するための１ステップ免疫アッセイのダイナミックレンジを広げることが可能になる。例えば、ＮＳ３ｈドメイン１タンパク質はより高い濃度の抗体を含有する試料を検出し、完全長ヘリカーゼタンパク質はより低い濃度の抗体を含有する試料を検出する。
【００４４】
一般に、１ステップ免疫アッセイは２ステップアッセイよりも感度と精度に優れている傾向があるが、１ステップフォーマットの欠点は「フック効果」である。患者試料中に高濃度の分析物を含有する試料は、捕捉および検出分子の入力を圧倒してしまい、アッセイ応答の減少をもたらし不正確に低い結果を出す。定性アッセイでは、減少した結果はカットオフを下回り誤った負の結果を生じることがある。本開示は、ある種の実施形態において、抗体の検出のための１ステップアッセイでの「フック効果」という問題を解決する。本開示は、例えば、分子量がもっと小さな２番目のタンパク質を添加することにより、例えば、抗体検出の上部ダイナミックレンジを広げることによって既知のものに改良を加える。特定の実施形態では、これによりアッセイ配置も簡略化され、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボフォーマットの安定性を改善する。
【００４５】
ある種の実施形態では、本記述の方法、キットおよび組成物は少なくとも第１のおよび／または第２のＮＳ３ｈ捕捉抗体を用いる。いくつかの実施形態では、ＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは、図１−２および５に示されているアミノ酸配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有する。そのようなアミノ酸配列（例えば、これらの図の配列またはこれらの変異体に７５％．．．８５％．．．９５％．．．または９９％の配列同一性を有する配列）のもっと長い、もっと短いまたは突然変異されたバージョンを含むこれらのペプチドの変異体も用いることができる。ある種の実施形態では、第１のＮＳ３ｈ捕捉ペプチドは主に、ＨＣＶ  ＮＳ３ｈドメイン１もしくはドメイン２のみ、またはドメイン１とドメイン２の両方で構成されている。ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの一般に認められている境界は以下の：ＮＳ３ヘリカーゼドメイン１−およそ１２０７−１３５６（１８１−３３０）；ＮＳ３ヘリカーゼドメイン２−およそ１３５７−１５０７（３３１−４８１）；およびＮＳ３ヘリカーゼドメイン３−およそ１５０８−１６５４（４８２−６２６）であることが認められている。ある種の実施形態では、追加のＮＳ３ペプチドまたはこれらの変異体は、「ＨＣＶ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｉｎ」という題の米国特許出願公開第２０１４０２７２９３３号および「ＨＣＶ  ＮＳ３  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」という題の米国特許出願公開第２０１４０２７２９３２号に提供されており、前記特許文献は両方とも、そこに開示されるＮＳ３ペプチド配列を含めて、参照によりその全体を本明細書に明確に組み込む。
【００４６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるアッセイはコア抗原に対する抗体の存在をさらに検出する。使用することができると考えられるいくつかの例となるコア抗原には、コアタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１２５）に由来する抗原が含まれる。さらに他の好ましいコア抗原は、コアタンパク質のアミノ酸残基１３４−１７１に位置するコアの脂質結合ドメイン（ＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧ；配列番号１７）にまたは、欠失または他の変化（３４および４８に欠失のある配列番号１２参照）のあるもしくはなしの１５位−６８位に由来する。したがって、コア抗原は固相支持体上に被覆しておよび／または溶液相で使用して、ヒト血清または血漿中に存在しＨＣＶのコア領域に対する抗体を捕捉することが可能である。好ましくは、そのようなコア抗原は、ＨＣＶ組合せ免疫アッセイにおいて検査試料中に存在するコア抗原の検出のために使用されるコンジュゲート抗体による検出を逃れることが可能である。したがって、検査試料中に存在し同じＨＣＶコンボアッセイフォーマットにおいても同定されると予想される抗コア抗体を検出するのと同時に検査試料中に存在する両コア抗原を検出する組合せ免疫アッセイを実施することが可能である。
【００４７】
本明細書全体を通じて認められるように、本開示の方法は一般には免疫アッセイ法である。例となる実施形態では、そのような方法は目的の分子（例えば、検査試料中に存在する特定の抗体または検査試料中に存在する可能性がある特定の抗原のような）を単離するための方法を含む。そのような単離を促進するために、目的の分子は、例えば、タグ結合パートナーに接触する精製タグを含むまたはこれに付着されている。このように精製タグとタグ結合パートナーの会合を使用して目的の分子を分子の混合物から分離することができる。精製タグは同じまたは類似する構造を有する部分を含むことが可能である。ある種の実施形態では、親和性タグのタギング部分は、任意選択的に単、二重、三重結合、芳香族炭素−炭素結合、ならびに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、およびこれらの任意の組合せを含む、線形、分岐または環状配置で単結合により直接または安定な化学結合の連結を介して機能的タグと会合させることが可能である。ある種の実施形態では、タギング部分と機能的タグの間の会合は、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素またはウレタン部分を含む。ある種の実施形態では、連結はポリアルキレン鎖、すなわち、線形または分岐配置の炭素−炭素結合を含む。他の実施形態では、連結はポリエチレングリコール部分を含むポリアルキレンオキシド鎖を含む。親和性タグの例には、ビオチン、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、亜鉛フィンガー、フッ化ポリマー、およびポリヒスチジンモチーフのようなポリペプチド配列が含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
親和性タグは、いくつかの実施形態では、親和性タグと親和性タグに引き付けられるまたは結合する官能基の結合または引力に頼ることにより、目的の分子を単離するのに有利に使用される。いくつかの実施形態では、固体基材はタグ結合パートナーで誘導体化されて、タグに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、結合パートナーは親和性基材上に固定化することができる。用語「親和性基材」は、分子の精製タグと強力で好ましくは可逆的相互作用を形成することができる結合パートナーに結合している不動のマトリックスまたは支持体を指すことが可能である。親和性基材は樹脂、ビーズ、粒子、膜、ゲルを含むことが可能である。結合パートナーは精製タグを特異的に認識するまたは結合する。特異的結合パートナーは親和性タグに依存することになるが、荷電部分ならびに受容体−リガンド、抗体−抗原、炭水化物−レクチン、およびビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン、ニュートラアビジンもしくは抗ビオチン抗体）のような結合対のうちの１つのメンバーを含む。
【００４９】
特定の実施形態では、免疫アッセイにおいて使用される抗原のいずれかもしくはすべてのＣもしくはＮ末端のいずれかはビオチン化してもよいし、または親和性タグとしてビオチン結合部分（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンまたはニュートラアビジンまたは抗ビオチン）を含んでいてもよい。これらのペプチドはビオチン化されたまたはアビジン／ストレプトアビジンコンジュゲートされたペプチドであり、捕捉抗原として働くことになる。同様に、抗原は検出標識で代わりに標識してもよく、その場合、抗原は検出抗原として働くことになる。検出および捕捉抗原は同じ基礎アミノ酸配列を有していてもよく、または代わりに異なる配列を有していてもよい。例となる実施形態では、捕捉抗原は、ビオチン結合パートナー（すなわち、アビジンまたはストレプトアビジン）を有する固体支持体へのこの結合を促進するためにＣまたはＮ末端のいずれかでビオチン化されている。例となる産生目的で、ビオチン化ペプチドは２５℃でＩＰＴＧ誘導システムを介してイー・コリＢＬ２Ｌ（ＤＥ３）細胞において組換え的に発現される。Ｃ末端またはＮ末端ビオチン化でのインサイチュビオチン化は、所望のペプチドを発現しているＨＣＶ発現プラスミドとイー・コリ由来のＢｉｒＡ遺伝子を含有する第２のプラスミドを用いてＢＬ２Ｌ（ＤＥ３）細胞を同時形質転換することにより成し遂げられる（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆ、１４：７５１−７５５頁；Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１１３８−１１４３頁）。組換えタンパク質の精製は、金属触媒酸化およびタンパク質の凝集を妨げることが明らかにされている二価陽イオンキレート剤を使用して実施される。タンパク質安定性は、ＥＤＴＡまたは関連する二価陽イオンキレート剤を精製中に使用される緩衝液および最終貯蔵緩衝液または免疫アッセイにおいて使用される緩衝液に添加すると著しく改善される。
【００５０】
ある種の実施形態では、試料中の対象の抗体の存在を判定することに加えて、アッセイは試料中の１つ以上のＨＣＶ抗原の存在も判定する。そのような実施形態では、モノクローナル抗ＨＣＶ抗体を使用して検査試料から抗原を捕捉し、次にさらにコンジュゲート抗体を使用して既に捕捉されている抗原の存在を検出するのが望ましいことになる。この試みに使用することができる抗体が数多く市販されている。具体的には、そのような抗体は好ましくは検査試料中のコア抗原の存在を判定する。コア抗原に対する抗体は当業者には公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１２０００９１９６号および米国特許出願公開第２０１４０２７２９３１号に記載される抗体を含む。前記特許文献は両方とも参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【００５１】
特定の例となる実施形態では、組合せ免疫アッセイにおいて使用される抗体は検査試料中のＨＣＶコアタンパク質またはこの断片を検出するように設計された抗体である。そのような抗体はＤＮＡ結合ドメイン、脂質結合ドメインまたは完全コアタンパク質を検出することができる。いくつかの実施形態では、免疫アッセイにおいて使用される検出抗体はコアペプチドの脂質結合ドメインに対するものである。さらに他の実施形態では、組合せアッセイにおいて使用される抗ＨＣＶコア抗体は、例えば、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−９およびＣ１１−１４であってよい（米国特許第６，７２７，０９２号；Ｍｏｒｏｔａ，ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２００９年、１５７：８−１４頁に記載されている。）。
【００５２】
本発明の特定のアッセイでは、免疫アッセイはＮＳ３ｈ特異的対象の抗体、コア抗原を少なくとも検出し、検査試料中のコア抗体も検出する。そのような実施形態では、確実に、捕捉抗原は抗コア抗体を捕捉するように設計され、好ましくは特異的なモノクローナル抗体に対する結合領域である既知のエピトープにある種の欠失または置換を含み、それにより、ＨＣＶコア抗原検出のために使用されるモノクローナル抗体がこれらの改変されたコア抗原を検出できないがにもかかわらず検査試料から完全コア抗原は検出するようにすることは、必須ではないが望ましいものとなる。捕捉抗体として使用される例となる抗コア抗体は、米国特許第６，７２７，０９２号ならびにＭｏｒｏｔａ，ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２００９年、１５７：８−１４頁に記載されている抗体ＡＯＴ３、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−９およびＣ１１−１４を含む。
【００５３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗原および抗体は、ＨＣＶにすでに感染していると疑われている検査試料中に見出される複数のＨＣＶ成分の検出のために設計された組合せ免疫アッセイにおいて免疫診断試薬として使用するために想定されている。免疫診断試薬（これらが抗体であれ抗原であれ）は、ＨＣＶのＮＳ３領域、ＨＣＶのコア抗原、ＨＣＶのＮＳ４領域またはこれらの組合せならびにこれらの領域のうちの１つ以上に対する抗ＨＣＶ抗体を含むがこれらに限定されないＨＣＶ抗原の検出のために設計された組合せ免疫アッセイにおいて使用することができるように、本明細書に記載される抗原ポリペプチドおよび抗体で構成されることになる（典型的には組み合わせて）。捕捉目的のために、免疫診断試薬を構成する抗原および／または抗体は、例えば、微粒子（例えば、磁気粒子）、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップのような固体支持体上に被覆することが可能である。この点に関して、免疫診断試薬が抗原の組合せ（例えば、異なるＨＣＶタンパク質または同じＨＣＶタンパク質の異なる断片に対するものである。）を含む場合、抗原は同じ固体支持体上に同時に被覆することが可能である、または別々の固体支持体上でも可能である。同様に、免疫診断試薬が検査試料から１つ以上の抗原を捕捉するのに使用されることになる１つ以上の抗体を含む場合、そのような抗体は同じ固体支持体上に同時に被覆することが可能である、または別々の固体支持体上でも可能である。
【００５４】
注目すべきことに、免疫診断試薬は検出可能な標識で標識することも捕捉もしくは検出を可能にする特異的パートナーで標識することもできる。例えば、標識は、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識、または同類のもののような検出可能な標識であり得る。そのような標識は下でさらに詳細に説明される。
【００５５】
さらに、本発明は本明細書に記載される免疫診断試薬を含むＨＣＶ診断キットの調製を想定しており、検査試料中のＨＣＶの存在を判定するための免疫アッセイにおける免疫診断試薬の使用のための説明書をさらに含むことができる。例えば、キットは免疫アッセイにより抗ＨＣＶ抗体（例えば、検査試料中の抗ＮＳ３ｈ抗体）について検査試料をアッセイするための説明書を含むことが可能である。ある種の実施形態は検査試料をアッセイするために化学発光微粒子免疫アッセイを用いるが、本開示の免疫アッセイにおいて使用される抗原および抗体は、検査試料中のＨＣＶの存在を判定するために当業者に公知の他のいかなる免疫アッセイフォーマットにおいても使用することができることは理解されるべきである。説明書は書面またはディスク、ＣＤ，ＤＶＤ、もしくは同類のもののようなコンピュータ可読形態でも可能である。代わりにまたはさらに、キットはキャリブレーターもしくは対照、例えば、精製された、および任意選択的に凍結乾燥された抗ＨＣＶ抗体もしくは抗原、ならびに／またはアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、組合せ免疫アッセイの捕捉成分（抗原および／または抗体）のうちの１つ以上で前々から被覆しておくことが可能なチューブ、マイクロタイタープレートまたはストリップ）、ならびに／またはそのうちのいずれか１つは濃縮溶液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）のための基質溶液もしくは停止溶液として提供することが可能であるアッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液のような緩衝液を含むことが可能である。好ましくは、キットはすべての成分、すなわち、アッセイを実施するのに必要である試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤、等を含む。特定の実施形態では、すべての成分は、免疫アッセイが固体支持体が捕捉部分（例えば、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体）の結合を可能にする薬剤で被覆されている捕捉オンザフライタイプの免疫アッセイとして実施されるようにキット中に個々に提供され、キットは個々の捕捉と検出抗原対およびビオチン化補足抗体コンジュゲートのそれぞれを１つの容器にさらに含み、第２の容器は検出抗体コンジュゲートを提供することが好ましい。アッセイを行うための説明書は、抗ＨＣＶ抗体を定量化する目的で標準曲線または参照標準を作製するための説明書も含むことが可能である。
【００５６】
抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体のような本明細書のキットまたはシステムにおいて提供されるいかなる抗体も、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識、もしくは同類のもののような検出可能な標識を組み込むことも可能である、またはキットは、抗体もしくは抗体（例えば、検出抗体）を検出するための試薬を標識するためのおよび／または分析物もしくは分析物を検出するための試薬を標識するための試薬を含むことが可能である。抗体、キャリブレーターおよび／もしくは対照は別々の容器に提供されるまたは適切なアッセイフォーマット中に、例えば、マイクロタイタープレート中に前分注しておくことが可能である。一実施形態では、２つの容器が提供される。第１の容器には、それぞれの対中の第１の抗原が所与のＨＣＶタンパク質（例えば、ＮＳ３ｈ）由来のビオチン化されている捕捉抗原であり、それぞれの対中の第２の抗原が第１の抗原と同じタンパク質由来の検出抗原であるが検出可能な標識で標識されている（例えば、第２の抗原はアクリジニル化されている。）少なくとも第１、第２および／または第３の対の抗原、ならびに検査試料から１つ以上のＨＣＶ抗原を検出するために設計された１つ以上のビオチン化抗体が提供され、第２の容器には第１の容器からビオチン化抗体により捕捉される抗原の検出のためのコンジュゲーションパートナーを形成する抗体が提供される。第１の容器中に複数のビオチン化抗体が存在する場合、コンジュゲーションパートナーを形成する複数の抗体は、単一の容器にまたはコンジュゲート抗体を検出する異なる抗原ごとに個々の容器に存在していてもよいことが想定されている。
【００５７】
ある種の実施形態では、キットは品質管理成分（例えば、感受性パネル、キャリブレーターおよび陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は当技術分野では周知であり、種々の免疫診断製品の挿入シート上に記載されている。感受性パネルメンバーは任意選択的にアッセイ性能特徴を確立するために使用され、さらに任意選択的に免疫アッセイキット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標である。
【００５８】
キットは、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬および同類のもののような、診断アッセイを行うためにまたは品質管理評価を促進するために必要な他の試薬も含むことができる。検査試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液（例えば、前処理試薬）のような他の成分もキットに含めることが可能である。キットは１つ以上の他の対照をさらに含むことが可能である。キットの成分のうちの１つ以上を凍結乾燥させることが可能であり、その場合、キットは凍結乾燥成分の再構成に適した試薬をさらに含むことが可能である。
【００５９】
キットの種々の成分は必要に応じて適切な容器、例えば、マイクロタイタープレートで提供することができる。キットは試料を保持するまたは保管するための容器（例えば、試料用の容器またはカートリッジ）をさらに含むことが可能である。必要に応じて、キットは任意選択的に反応容器、混合容器および試薬または検査試料の調製を促進する他の成分も含有することが可能である。キットは、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーンまたは同類のもののような検査試料を入手するのを手助けするための１つ以上の器具も含むことが可能である。
【００６０】
ある種の実施形態では、検出可能な標識は少なくとも１つのアクリジニウム化合物である。そのような実施形態では、キットは少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサイミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルまたはこれらの任意の組合せを含むことが可能である。検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、緩衝液、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液のような過酸化水素の供給源も含むことが可能である。免疫診断試薬中では抗体検出のための抗原は検出可能に標識することができ、そのような試薬と共に使用するためにキット中に提供されるいかなる抗体も検出可能に標識することができることは理解されるべきである。
【００６１】
ある種の実施形態では、キットは、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップのような固体支持体相を含有することが可能である。
【００６２】
本開示は、検査試料中の抗ＨＣＶ抗体または抗ＨＣＶ抗体とＨＣＶ抗原の存在、量または濃度を決定するための免疫アッセイ法を提供する。当技術分野で公知のいかなる適切なアッセイも、そのようなアッセイがＨＣＶ抗体を検出するための抗原のうちの１つ以上を使用する限りそのような方法において使用することが可能である。そのようなアッセイの例には、サンドイッチ免疫アッセイ（例えば、放射性同位元素検出（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））および酵素検出（酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチ免疫アッセイ）、競合阻害免疫アッセイ（例えば、フォワードおよびリバース）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、ＥＭＩＴ法、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）および均一化学発光アッセイ、等のような免疫アッセイを含むがこれらに限定されない。
【００６３】
特定の実施形態では、組換え抗原（例えば、ＮＳ３ｈ抗原）は捕捉試薬として（例えば、抗原のアミノ−またはカルボキシ−末端がビオチンタグを含むような抗原を使用することにより）または抗原が直接的にもしくは間接的にアクリジニウムで標識されている検出（コンジュゲート）試薬として使用することができる。間接的標識化は、ＳＭＣＣタイプのリンカーを介してタンパク質内の不対システイン残基の遊離のチオールに共有結合されているアクリジニル化ＢＳＡの使用を用いることができる。そのような間接的標識化を促進するために、本開示の免疫アッセイにおいて使用されるある種の抗原は、Ｃ末端に追加のシステイン残基を含むようにさらに改変することが容易にできる。
【００６４】
典型的には、免疫アッセイは１ステップまたは２ステップフォーマットで実施される。１ステップアッセイにおいて溶液中に形成される免疫複合体の捕捉のための固相試薬には、例えば、ビオチン化部分（例えば、ＨＣＶ抗体の捕捉のためのビオチン化抗原）を捕捉する抗ビオチンモノクローナル抗体、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンが含まれる。
【００６５】
ＳＥＬＤＩベースの免疫アッセイでは、抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原に特異的に結合する捕捉試薬は予備活性化タンパク質チップアレイのような質量分析プローブの表面に付着される。次に、抗ＨＣＶ抗体または抗原はバイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉された部分は質量分析法により検出される。代わりに、抗ＨＣＶ抗体は捕捉試薬から溶出され従来のＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）によりまたはＳＥＬＤＩにより検出することが可能である。化学発光微粒子免疫アッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＨ（登録商標）自動分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）を用いる免疫アッセイは、複数の抗原の組合せ（好ましくは、２つ以上のＮＳ３ｈ抗原）を容易に用いることができる特定の免疫アッセイの例である。受身血液凝集アッセイのような凝集アッセイも使用することが可能である。凝集アッセイでは、抗原−抗体反応は凝集またはクランピングにより検出される。受身血液凝集アッセイでは、赤血球は抗原で被覆され被覆された赤血球は凝集アッセイで使用される。
【００６６】
尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を収集する、取り扱うおよび処理するための当技術分野で周知の方法は、例えば、免疫診断試薬が複数の抗原を含む場合に本開示の実践においておよび／または抗ＨＣＶ抗体免疫アッセイキットにおいて使用される。検査試料は目的のポリペプチドに加えて、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのような部分をさらに含むことが可能である。例えば、試料は対象から得られる全血試料であって可能である。検査試料、特に全血が本明細書に記載される免疫アッセイに先立って、例えば前処理試薬を用いて処理されることが必要であるかまたは望ましいことがある。前処理が必要ではない場合でさえ（例えば、大半の尿試料）、前処理は任意選択的に単に便宜上行うことが可能である（例えば、商業プラットフォーム上のレジメンの一部として）。
【００６７】
前処理試薬は、本明細書に記載される免疫アッセイおよびキットと一緒に使用するのに適した任意の１つ以上の溶媒（例えば、メタノールおよびエチレングリコール）と塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤または（ｄ）界面活性剤と塩を含む。前処理試薬は当技術分野で公知であり、そのような前処理は、例えば、文献（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３頁（１９９０）、およびＷａｌｌｅｍａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５頁（１９９９）参照）に記載されているならびに／または市販されているＡｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）分析機器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）上でのアッセイのために使用されるように用いることが可能である。さらに、前処理は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、欧州特許出願公開第０４７１２９３号、２００６年１２月２９日提出の米国特許仮出願第６０／８７８，０１７号および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号に記載されている通りに行うことが可能である（前処理に関するその教唆について参照によりその全体を組み込む。）。前処理試薬は不均一薬剤でも均一薬剤でも可能である。
【００６８】
不均一前処理試薬を使用する場合は、前処理試薬は分析物結合タンパク質（例えば、抗ＨＣＶ抗体に結合することが可能なタンパク質または試料中に存在する抗ＨＣＶ抗体形態に結合することが可能な抗原）を沈殿させる。そのような前処理ステップは、沈殿した分析物結合タンパク質から前処理剤を試料に添加することにより形成された混合物の上澄みを分離することによりいかなる分析物結合タンパク質も取り除くことを含む。そのようなアッセイでは、いかなる結合タンパク質も欠く混合物の上澄みがアッセイでは使用され、直に抗体捕捉ステップに進む。
【００６９】
均一前処理試薬を使用する場合は、そのような分離ステップはない。検査試料と前処理試薬の全混合物を、抗ＨＣＶ抗体に対する標識された特異的結合パートナー（例えば、抗原）またはＨＣＶ抗原に対する標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体）に接触させる。そのようなアッセイのために用いられる前処理試薬は典型的には、第１の特異的結合パートナーによる捕捉前にまたは捕捉中に、前処理された検査試料混合物に希釈される。そのような希釈にもかかわらず、一定量の前処理試薬（例えば、５Ｍのメタノールおよび／または０．６のメチレングリコール）が捕捉中に検査試料混合物中にまだ存在している（または残っている。）。
【００７０】
不均一フォーマットでは、対象から検査試料が得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は抗ＨＣＶ抗体について評価されている検査試料および第１の特異的捕捉結合パートナーを含有しており、検査試料中に含有される第１の特異的捕捉結合パートナーと任意の抗ＨＣＶ抗体は第１の特異的捕捉結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体複合体を形成する。第１の特異的捕捉結合パートナーはＮＳ３抗原であってよい。同様に、本明細書で提供されるアッセイは、第２と第３の特異的捕捉結合パートナーも含有することができ、これら第２と第３の特異的捕捉結合パートナーは、検査試料中に存在する抗ＨＣＶ抗体と第２と第３の特異的捕捉結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体複合体を形成する。そのような第２、第３および第４の抗原は、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびこれらの部分からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶ抗原のうちの１つ以上であってよい。
【００７１】
さらに、免疫アッセイは、少なくとも１つのＮＳ３ｈ捕捉抗原を含むことに加えて、検査試料中に存在する抗原と抗ＨＣＶ抗体−第３または第４の特異的結合パートナー複合体を形成するように、検査試料中に見出される特異的結合パートナー（すなわち、検査試料中に見出される抗原またはＨＣＶタンパク質）と特異的な複合体を形成することになる少なくとも１つの抗ＨＣＶ捕捉抗体を含むことができる。ある種の実施形態では、この特異的結合対は検査試料中のコア抗原を検出する対であり、したがって、結合対は検査試料中の抗原（コア）の検出のための抗コア抗体である。
【００７２】
検査試料と種々の特異的結合パートナーを添加して混合物を形成する順序は変わることができる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、等の特異的捕捉結合パートナー（すなわち、抗原）と任意の抗ＨＣＶ捕捉抗体は固相上に固定化されている。さらに他の実施形態では、これらの成分はどれも固定化されていないが、代わりにすべてが同時に検査試料に添加されて固相上への捕捉を引き起こす。免疫アッセイにおいて使用される固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップのようなしかしこれらに限定されない当技術分野で公知のいかなる固相でも可能である。
【００７３】
特異的捕捉結合パートナーと検査試料中に見出されるこのそれぞれの抗ＨＣＶ抗体および任意の抗ＨＣＶ捕捉抗体（例えば、抗コア）と検査試料中に見出されるこのそれぞれのＨＣＶ抗原またはＨＣＶタンパク質の間で免疫複合体が形成された後、いかなる非結合の抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原／タンパク質も当技術分野で公知の任意の技法を使用して複合体から取り除かれる。例えば、非結合の抗ＨＣＶ抗体または抗原は洗浄により取り除くことが可能である。しかし、検査試料中に存在するすべての抗ＨＣＶ抗体および抗原がそれぞれ特異的な結合パートナーおよび任意の抗ＨＣＶ捕捉抗体により結合されるように、特異的結合パートナーおよび任意の抗ＨＣＶ抗体は、それぞれ検査試料中に存在する任意の抗ＨＣＶ抗体および抗原よりも超過して存在しているのが望ましい。
【００７４】
いかなる非結合の抗ＨＣＶ抗体および抗原も取り除かれた後、第１の特異的検出結合パートナー（例えば、コンジュゲート）を混合物に添加して、第１の特異的捕捉結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体−第１の特異的検出結合パートナー複合体を形成することによって検出が達成される。第１の特異的検出結合パートナーは、標識された抗原（例えば、ＮＳ３ｈ抗原）または抗ＩｇＧ抗体または抗ＩｇＭ抗体であってもよい。さらに、第１の特異的検出結合パートナーは上記の検出可能な標識で標識化されているか、またはこれを含有してもよい。
【００７５】
当技術分野で公知であるいかなる適切な検出可能な標識でも、検出可能な標識のうちの任意の１つ以上として使用することが可能である。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐのような）、酵素標識（西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリパーオキシダーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素および同類のもののような）、化学発光標識（アクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナンスリジニウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステルおよび同類のもののような）、蛍光標識（フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートおよび同類のもの））、ローダミン、フィコビリンタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャッピングされたセレン化カドミウム）、温度測定標識または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識が可能である。標識、標識化法および標識の検出の入門書は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に見られ、後者はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．により出版されているハンドブックとカタログの複合本である。蛍光標識はＦＰＩＡにおいて使用することが可能である（例えば、米国特許第５，５９３，８９６号、米国特許第５，５７３，９０４号、米国特許第５，４９６，９２５号、米国特許第５，３５９，０９３号および米国特許第５，３５２，８０３号参照。これら特許文献はこれにより参照によりその全体を組み込む。）。アクリジニウム化合物は均一化学発光アッセイにおいて検出可能標識として使用することが可能である（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８頁（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７頁（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１頁（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２頁（２００３）参照）。
【００７６】
例となるアクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム−９−カルボキサミドを調製するための方法はＭａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４頁（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９頁（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４頁（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１頁（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４頁（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ、Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ｐｐ．７７−１０５頁（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２頁（２００３）；ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、米国特許第５，５４３，５２４号および米国特許第５，７８３，６９９号に記載されている（これらの文献はそれぞれが前記方法に関する教唆について参照によりその全体を本明細書に組み込む。）。
【００７７】
別の例となるアクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホン酸（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．から入手可能）である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルを調製するための方法は、ＭｃＣａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１頁（１９６５）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９頁（２０００）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４頁（２０００）；および米国特許第５，２４１，０７０号に記載されている（前記文献はそれぞれが前記方法に関する教唆について参照によりその全体を本明細書に組み込む。）。そのようなアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの迅速性の点から、少なくとも１つのオキシダーゼによる分析物の酸化において生成される過酸化水素についての効率的な化学発光指示薬である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの化学発光放出の経過は迅速に、すなわち１秒未満で完了するが、アクリジニウム−９−カルボキサミド化学発光放出は２秒を超えて伸びる。しかし、アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルはタンパク質の存在下ではその化学発光特性を失う。したがって、この使用にはシグナル発生および検出中はタンパク質が存在しないことが必要である。試料中のタンパク質を分離するかまたは除去するための方法は当業者には周知であり、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化を含むがこれらに限定されない（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）参照）。検査試料から除去されるかまたは分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％が可能である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルおよびこの使用に関するさらなる詳細は、２００７年４月９日提出され、２００８年１０月９日に米国特許出願公開第２００８／０２４８４９３号として公開された米国特許仮出願第１１／６９７，８３５号に記載されている。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、脱気無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはコール酸ナトリウム水溶液のような任意の適切な溶媒に溶解させることが可能である。
【００７８】
化学発光アッセイはＡｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７頁（２００６）に記載される方法に従って実施することが可能である。いかなる適切なアッセイフォーマットでも使用することが可能であるが、マイクロプレートケミルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｔｅｎｎ．）は、少量の複数の試料のアッセイを迅速に可能にする。ケミルミノメーターには９６ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９２）を使用して複数の試薬注射器を備え付けることが可能である。それぞれの試料は別々のウェル中に添加され、続いて、用いられるアッセイのタイプによって決定される他の試薬を同時に／順次添加することが可能である。アクリジニウムアリールエステルを用いる中性または塩基性溶液中での疑似塩基の形成は、酸性化によってのように回避されるのが望ましい。次に、化学発光応答はウェルごとに記録される。これに関して、化学発光応答を記録する時間は一部、用いられる試薬と特定のアクリジニウムの添加の間の遅延に依存することになる。
【００７９】
過酸化水素は混合物中においてインサイチュで生成されるまたは上記のアクリジニウム化合物の添加前に、と同時にもしくは後に混合物に提供されるもしくは供給されることが可能である。過酸化水素は当業者には明らかであるようにいくつかの方法で、インサイチュで生成することが可能である。代わりに、過酸化水素の供給源を混合物に添加するだけで可能である。例えば、過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含有することが分かっている１つ以上の緩衝液または他の溶液で可能である。これに関しては、過酸化水素の溶液を添加するだけで可能である。少なくとも１つの塩基性溶液を試料に同時にまたは順次添加すると、抗ＨＣＶ抗体（捕捉は抗原を用いてである。）または抗原（捕捉は抗体を用いてである。）の存在を示す検出可能なシグナル、すなわち、化学発光シグナルが発生される。塩基性溶液は少なくとも１つの塩基を含有し、１０より大きいまたは等しい、好ましくは１２より大きいまたは等しいｐＨを有する。塩基性溶液の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸水素カルシウムを含むがこれらに限定されない。試料に添加される塩基性溶液の量は塩基性溶液の濃度に依存する。使用される塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者であれば試料に添加される塩基性溶液の量を簡単に決定することが可能である。
【００８０】
発生される化学発光シグナルは当業者に公知のルーチンな技法を使用して検出することが可能である。発生されるシグナルの強度に基づいて、試料中の抗ＨＣＶ抗体および／または抗原の量を定量することが可能である。具体的には、試料中の抗ＨＣＶ抗体および／または抗原の量は発生するシグナルの強度に比例する。存在する抗ＨＣＶ抗体および／または抗原の量は、発生した光の量と抗ＨＣＶ抗体および／もしく抗原についての標準曲線を比べることによりまたは参照標準と比べることにより定量することが可能である。標準曲線は、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体の連続希釈液または溶液を使用して、質量分析、重量測定法および当技術分野で公知の他の技法により作成することが可能である。
【００８１】
抗ＨＣＶ抗体および／または抗原免疫アッセイは当技術分野で公知のいかなる適切なフォーマットを使用しても行うことが可能である。一般的に言えば、ある種の実施形態では、抗ＨＣＶ抗体について検査されている（例えば、これを含有すると疑われている。）試料は捕捉抗原ならびに標識された抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＭ抗体のような少なくとも１つの検出コンジュゲートペプチドまたはコンジュゲート抗体（第２の検出抗体または第３の検出抗体で可能である。）に、同時にまたは順次およびいかなる順序でも接触させることが可能である。同様に、抗原の存在についての検査は検査試料中の抗原に結合する捕捉された抗体に接触させることが可能であり、次に結合した抗原は検出抗体により検出することができる。
【００８２】
例えば、検査試料は先ず少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原に、次に（順次）少なくとも１つの検出抗体に接触させることが可能である。代わりに、検査試料は先ず少なくとも１つの検出抗体に、次に（順次）少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原に接触させることが可能である。さらに別の代案では、検査試料は捕捉抗原および検出抗体に同時に接触させることが可能である。サンドイッチアッセイフォーマットでは、抗ＨＣＶ抗体（またはこの断片）を含有すると疑われている試料は、第１の捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体および第２の抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体の形成を可能にする条件下で、先ず少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原に接触させる。ある種のアッセイでは、同じことが繰り返されるまたは第２、第３またはそれ以上の捕捉抗原と同時に行われる。サンドイッチアッセイでは、抗原、好ましくは、少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原は、検査試料中で予測される抗ＨＣＶ抗体の最大量よりもモル過剰量で使用される。例えば、ｍＬの緩衝液（例えば、微粒子コーティング緩衝液）当たり約５μｇから約１ｍｇの抗原を使用することが可能である。
【００８３】
小分析物を測定するのに使用されることが多い競合的阻害免疫アッセイは連続および古典的フォーマットを含む。連続競合的阻害免疫アッセイでは、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原がマイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。目的の抗体（単数または複数）を含有する試料がウェルに添加されると、目的の抗体は捕捉抗原に結合する。洗浄後、既知の量の標識された（例えば、ビオチンまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））抗体がウェルに添加される。酵素標識に対する基質はシグナルを発生するのに必要である。ＨＲＰに対する適切な基質の例は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。洗浄後、標識された抗体により発生されるシグナルは測定され、試料中の抗体の量に反比例する。古典的競合的阻害免疫アッセイでは、目的の抗体に対する抗原がマイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。しかし、連続競合的阻害免疫アッセイとは違って、目的の抗体（すなわち、抗ＨＣＶ抗体）を含有する試料および標識された抗体はウェルに同時に添加される。試料中のいかなる抗体も捕捉抗原への結合を巡って標識された抗体と競合する。洗浄後、標識された分析物により発生されるシグナルは測定され、これは、試料中の分析物の量に反比例する。
【００８４】
他の実施形態では、検査試料を少なくとも１つまたは少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉抗原に接触させるに先立って、捕捉抗原を、検査試料からの第１と第２の抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体の分離を促進する固体支持体に結合させることが可能である。捕捉抗原が結合される基材は、試料からの捕捉抗原−抗ＨＣＶ抗体複合体の分離を促進するいかなる適切な固体支持体または固相でも可能である。例には、マイクロタイタープレート、試験管、多孔質ゲル（例えば、シリカゲル、アガロース、デキストランまたはゼラチン）、ポリマーフィルム（例えば、ポリアクリルアミド）、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズまたは磁気ビーズ）、フィルター／膜のストライプ（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）、微粒子（例えば、ラテックス粒子、着磁性微粒子（例えば、酸化第二鉄または酸化クロムコアおよびホモまたはヘテロポリマーコートおよび約１−１０ミクロンの半径を有する微粒子））のようなプレートのウェルを含む。基材は、抗原に結合する適切な表面親和性および検出抗体による接近を可能にする十分な多孔度を有する適切な多孔性物質を含むことが可能である。微多孔性物質が一般には好ましいが、水和状態のゼラチン状物質を使用することが可能である。そのような多孔質基材は好ましくは約０．０１から約０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚みのあるシート形態である。ポアサイズはかなり変動することがあるが、好ましくはポアサイズは約０．０２５から約１５ミクロン、さらに好ましくは約０．１５から約１５ミクロンである。そのような基材の表面は、基材への抗体の共有結合を引き起こす化学的過程により活性化することが可能である。一般的に抗原の基材への疎水性力を通じた吸着により非可逆的結合が生じる；代わりに、化学カップリング剤または他の手段を使用して抗原を基材に共有結合させることが、そのような結合が抗ＨＣＶ抗体に結合する抗原の能力を妨げない限り可能である。
【００８５】
他の実施形態では、検査試料由来の抗ＨＣＶ抗体は、予め抗原を被覆させている微粒子に結合させることが可能である。必要に応じて、それぞれに抗ＨＣＶ抗体を結合させることが可能である、本明細書に記載される１つ以上または２つ以上のＮＳ３ｈ抗原のような１つ以上の捕捉試薬は、固相の異なる物理的またはアドレス可能な位置に付着させることが可能である（例えば、バイオチップ配置でのような（例えば、米国特許第６，２２５，０４７号、国際公開第９９／５１７７３号；米国特許第６，３２９，２０９号、国際公開第００／５６９３４号および米国特許第５，２４２，８２８号参照））。捕捉試薬が固体支持体としての質量分析プローブに付着されている場合、プローブに結合している抗ＨＣＶ抗体の量はレーザー脱離イオン化質量分析により検出することが可能である。代わりに、単一カラムに１つ以上の捕捉試薬で誘導体化されている異なるビーズを充填し、それによって一か所で抗ＨＣＶ抗体を捕捉することが可能である（抗体誘導体化ビーズベースの技術、例えば、ＬｕｍｉｎｅｘのｘＭＡＰ技術（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）参照）。
【００８６】
ある種の実施形態では、抗ＨＣＶ抗体についてアッセイされている検査試料を少なくとも１つまたは少なくとも２つのＮＳ３ｈ抗原に接触させた後、混合物は第１と第２の抗原−抗ＨＣＶ抗体複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。インキュベーションは、例えば、約４．５から約１０．０までのｐＨで、約２℃から約４５℃までの温度で、および少なくとも約１分から約１８時間までもしくは約１から約２４分までの期間、または約４から約１８分間実行することが可能である。
【００８７】
ある種の実施形態では、少なくとも１つの検出抗体が用いられ検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体の形成に先立って、と同時にまたは後で少なくとも１つの検出抗体に結合させることが可能である。当技術分野で公知のいかなる検出可能な標識でも使用することが可能である（Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）を含む上の考察を参照）。検出可能な標識は直接またはカップリング剤を通じて抗体（または検出可能な標識を含むことができる抗原）に結合させることが可能である。使用可能なカップリング剤の例はＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ハイドロクロライド）であり、これはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏから市販されている。使用可能な他のカップリング剤は当技術分野では公知である。検出可能な標識を抗体に結合させるための方法は当技術分野では公知である。さらに、ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル（すなわち、９−［Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）］−１０−（３−スルフォプロピル）アクリジニウムカルボキサミド）またはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステル（すなわち、Ｎ１０−（３−スルフォプロピル）−Ｎ−（３−スルフォプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド）のような、抗体への検出可能な標識のカップリングを促進する末端基を既に含有している多くの検出可能な標識を購入するまたは合成することが可能である。
【００８８】
第１と第２（またはそれ以上）の捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／標識されたコンジュゲート抗原複合体は、標識の定量化に先立って検査試料の残りから分離することが可能であるが、分離しなくてもよい。例えば、捕捉抗原がウェルまたはビーズのような固体支持体に結合している場合、分離は液体（検査試料の）を固体支持体との接触から取り除くことにより達成することが可能である。代わりに、捕捉抗原が固体支持体に結合している場合、これを抗ＨＣＶ抗体含有試料および標識されたコンジュゲートペプチドと同時に接触させて複合体を形成し、続いて液体（検査試料）を固体支持体との接触から取り除くことが可能である。捕捉抗原が固体支持体に結合していない場合、複合体は標識の量の定量化のために検査試料から取り除かれる必要はない。
【００８９】
検出複合体（例えば、捕捉抗原／対象の抗体／標識されたコンジュゲート抗原）の形成後、複合体中の標識の量は当技術分野で公知の技法を使用して定量化することができる。例えば、酵素標識が使用される場合、標識された複合体は発色のような定量化できる反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、標識はシンチレーションカウンターを使用して定量化される。標識が蛍光標識である場合、標識を１つの色の光（「励起波長」として知られている。）で刺激しこの刺激に応答して標識により発せられる別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することにより標識は定量化される。標識が化学発光標識である場合、発せられる光を視覚的にまたはルミノメーター、ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、等を使用することによって検出することにより標識は定量化される。複合体中の標識の量が定量化された後、検査試料中の抗ＨＣＶ抗体または抗原の濃度は、例えば、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体または抗原の連続希釈液を使用して作成された標準曲線を使用することにより決定される。抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原の連続希釈液を使用すること以外、標準曲線は重量測定で、質量分析によりおよび当技術分野で公知の技法により作成することが可能である。
【００９０】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）分析機器を用いる化学発光微粒子アッセイでは、コンジュゲート希釈ｐＨは一般的には約６．０＋／−０．２であるべきであり、微粒子コーティング緩衝液は室温（すなわち、約１７から約２７℃に）維持されるべきであり、微粒子コーティング緩衝液ｐＨは約６．５＋／−０．２であるべきであり、微粒子希釈ｐＨは約６．５＋／−０．２であるべきである。固体は、約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満または約０．１０％のような約０．１１％未満のような約０．２％未満であることが好ましい。
【００９１】
市販されている抗ＨＣＶ抗体ならびに抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＭ抗体はアッセイおよびこのキットの方法において使用することが可能である。市販されている抗体にはＡｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ、Ｃａｌｉｆ．、ａｎｄ  Ｔａｉｗａｎ）およびＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な抗体が含まれる。抗ＨＣＶ抗体の調製に関しては欧州特許出願公開第２０９９８２５号も参照されたい。いかなる適切な対照組成物でも抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原免疫アッセイにおいて使用することが可能である。対照組成物は一般には抗ＨＣＶ抗体および既知の抗原および任意の望ましい添加物を含む。
【００９２】
一般に、所定のレベルは、抗ＨＣＶ抗体について検査試料をアッセイすると得られる結果を評価するためのベンチマークとして用いることが可能である。一般に、そのような比較をする際には、分析物の存在、量もしくは濃度と疾患、障害もしくは状態（例えば、子癇前症または循環器疾患）の特定の段階もしくはエンドポイントとのまたは特定の兆候との連関もしくは関連付けができるのに十分な回数および適切な条件下で特定のアッセイを行うことにより所定のレベルは得られる。典型的には、所定のレベルは参照対象（または対象の集団）のアッセイを用いて得られる。
【００９３】
特に、疾患進行および／または処置をモニターするために用いられる所定のレベルに関して、抗ＨＣＶ抗体の量または濃度は「変化なし」、「好ましい」（または「好ましく変化」）、または「好ましくない」（または「好ましくない変化」）でもよい。「上昇した」または「増加した」とは、典型的なもしくは通常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）よりも高い、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、もっと早期のまたは基線レベル）よりも高い検査試料中の量または濃度のことである。用語「低下した」または「減少した」とは、典型的なもしくは通常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）よりも低い、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、もっと早期のまたは基線レベル）よりも低い検査試料中の量または濃度のことである。用語「変化した」とは、典型的なもしくは通常のレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）を超えて、または別の基準レベルもしくは範囲（例えば、もっと早期のまたは基線レベル）を超えて変化している（増加しているまたは減少している。）試料中の量または濃度のことである。
【００９４】
抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原についての典型的なまたは通常のレベルまたは範囲は標準慣行に従って定義される。いくつかの例での抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原のレベルは非常に低くいために、いわゆる変化したレベルまたは変化は、典型的なもしくは通常のレベルもしくは範囲、または基準レベルもしくは範囲と比べた場合に、実験誤差または試料変動では説明できないいかなる純変化があるときでも起きたと見なすことが可能である。このように、特定の試料中で測定されるレベルは、いわゆる正常な対象由来の類似する試料において決定されるレベルまたはレベルの範囲と比較される。この文脈では、「正常な対象」は、例えば、検出可能な肝炎に罹っていない個人であり、「正常な」（「対照」と名付けられることもある。）患者または集団は、例えば、検出可能な肝炎を示していない患者または集団（複数可）である。さらに、抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原が日常的にはヒト集団の大多数で高レベルで見出されることはないことを考慮すると、「正常な対象」は、実質的に検出可能な増加したまたは上昇した量または濃度の抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原がない個人と見なすことが可能であり、「正常な」（「対照」と名付けられることもある。）患者または集団とは実質的に検出可能な増加したまたは上昇した量または濃度の抗ＨＣＶ抗体を示さない患者または集団（複数可）である。「一見すると正常な対象」は、抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原が評価されたことがないまたは評価されているところである対象である。分析物のレベルは、分析物が通常は検出できない（例えば、通常のレベルがゼロである、または正常な集団の約２５から約７５パーセンタイルの範囲内である。）が、検査試料では検出されるとき、ならびに分析物が検査試料中で通常のレベルよりも高く存在しているときには「上昇している」と言われる。したがって、とりわけ、本開示は、例えば、本明細書で定義される、肝炎を有するまたは有するリスクがある対象を求めるスクリーニングの方法を提供する。
【００９５】
したがって、本明細書に記載される方法を使用すれば、対象が肝炎を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを判定することも可能である。具体的には、そのような方法は、（ａ）対象由来の検査試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を決定するステップ（例えば、本明細書に記載される方法を使用して）；および（ｂ）ステップ（ａ）において決定された抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を所定のレベルと比較するステップを含み、ステップ（ａ）において決定された抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が所定のレベルに関して好ましい場合には、対象は肝炎を有していないまたはこのリスクがないと判定される。しかし、ステップ（ａ）における抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が所定のレベルに関して好ましくない場合は、対象は肝炎を有しているまたはこのリスクがあると判定される。
【００９６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用すれば、１種以上の医薬組成物を用いた処置を受けている対象において処置をモニターすることが可能である。具体的には、そのような方法は、対象が１種以上の医薬組成物を投与される前に対象由来の第１の検査試料を提供することを含む。次に、対象由来の第１の検査試料中の抗ＨＣＶ抗体（および任意選択的にＨＣＶ抗原）の濃度または量が決定される（例えば、本明細書に記載される少なくとも１つのまたは少なくとも２つのＮＳ３ｈ捕捉ペプチド法を使用して）。抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が決定された後、次に任意選択的に抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が所定のレベルと比較される。第１の検査試料において決定された抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が所定のレベルよりも低い場合、対象は１種以上の医薬組成物を用いた処置を受けない。しかし、第１の検査試料において決定された抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が所定のレベルよりも高い場合、対象は一定期間、１種以上の医薬組成物を用いた処置を受ける。対象が１種以上の医薬組成物を用いた処置を受ける期間は当業者出れば決めることが可能である（例えば、期間は約７日から約２年、好ましくは約１４日から約１年が可能である。）。
【００９７】
１種以上の医薬組成物を用いた処置の経過中、次に第２およびそれに続く検査試料が対象から入手される。検査試料の数および前記検査試料が対象から得られる時間は重要ではない。例えば、第２の検査試料は対象が１種以上の医薬組成物を初めて投与された７日後に入手してもよく、第３の検査試料は対象が１種以上の医薬組成物を初めて投与された２週間後に入手してもよく、第４の検査試料は対象が１種以上の医薬組成物を初めて投与された３週間後に入手してもよく、第５の検査試料は対象が１種以上の医薬組成物を初めて投与された４週間後に入手してもよい、等である。
【００９８】
それぞれの第２またはそれに続く検査試料が対象から入手された後、抗ＨＣＶ抗体（および任意選択的にＨＣＶ抗原）の濃度または量が第２またはそれに続く検査試料において決定される。次に、第２およびそれに続く検査試料のそれぞれにおいて決定された抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量は、第１の検査試料（例えば、最初に任意選択的に所定のレベルと比較された検査試料）において決定された抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較される。ステップ（ｃ）において決定される抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量がステップ（ａ）において決定された抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比べた場合に好ましいなら、対象の疾患は停止した、後退したまたは改善したと判定され、対象はステップ（ｂ）の１種以上の医薬組成物を投与され続けるべきである。しかし、ステップ（ｃ）で決定される濃度もしくは量がステップ（ａ）において決定された抗ＨＣＶ抗体および／もしくはＨＣＶ抗原の濃度もしくは量と比べた場合に変化していないもしくは好ましくない場合には、対象の疾患は続いている、進行しているもしくは悪化していると判定され、対象はステップ（ｂ）で対象に投与された１種以上の医薬組成物のさらに高い濃度で処置されるべきである、または対象はステップ（ｂ）で対象に投与された１種以上の医薬組成物とは異なる１種以上の医薬組成物で処置されるべきである。具体的には、対象は、前記対象の抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原レベルを減少させるまたは低下させるために対象が既に受けていた１種以上の医薬組成物とは異なる１種以上の医薬組成物で処置されることが可能である。
【００９９】
一般的には、反復検査を行う（例えば、疾患進行および／または処置への応答をモニターする。）ことができるアッセイでは、第２またはそれに続く検査試料は、第１の検査試料が対象から得られた後の適度な時期に入手される。具体的には、対象由来の第２の検査試料は、第１の検査試料が対象から得られた数分、数時間、数日、数週または数年後に入手することが可能である。例えば、第２の検査試料は、対象由来の第１の検査試料が得られた約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約１３週、約１４週、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０週、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週、約３６週、約３７週、約３８週、約３９週、約４０週、約４１週、約４２週、約４３週、約４４週、約４５週、約４６週、約４７週、約４８週、約４９週、約５０週、約５１週、約５２週、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年後の時期に対象から入手することが可能である。疾患進行をモニターするために使用される場合、上記アッセイは急性状態に罹っている対象において疾患の進行をモニターするのに使用することが可能である。重症治療状態としても知られる急性状態とは、例えば、心血管系または排泄系を含む急性の生命を脅かす疾患または他の重大な病状のことである。典型的には、重症治療状態とは病院ベースの施設（救急室、集中治療室、外傷センターまたは他の救急治療施設を含むがこれらに限定されない。）において重大な医療介入または医療補助者もしくは他の現場ベースの医療関係者による投薬を必要とする状態のことである。重症治療状態では、一般に、もっと短い時間枠、すなわち、数分、数時間または数日（例えば、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日または約７日）以内に反復モニタリングが行われ、最初のアッセイは同様に一般にもっと短い時間枠、例えば、疾患または状態の開始から約数分、数時間または数日以内に行われる。
【０１００】
アッセイは、慢性または非急性状態に罹っている対象において疾患の進行をモニターするのにも使用することが可能である。非重症治療または非急性状態とは、例えば、心血管系および／または排泄系を含む急性の生命を脅かす疾患または他の重大な病状以外の状態のことである。典型的には、非急性状態はもっと長期のまたは慢性持続時間の状態を含む。非急性状態では、反復モニタリングは一般には、もっと長い時間枠、例えば、数時間、数日、数週または数年（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約１３週、約１４週、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０週、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週、約３６週、約３７週、約３８週、約３９週、約４０週、約４１週、約４２週、約４３週、約４４週、約４５週、約４６週、約４７週、約４８週、約４９週、約５０週、約５１週、約５２週、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年）で行われ、最初のアッセイは同様に一般にもっと長い時間枠、例えば、疾患または状態の開始から約数時間、数日、数か月または数年以内に行われる。
【０１０１】
さらに、本明細書に記載されるアッセイは、第１の検査試料が尿、血清または血漿のような１つの供給源から得られる対象から得られる第１の検査試料を使用して実施することが可能である。次に、任意選択的に上のアッセイは、第２の検査試料が別の供給源から得られる対象から得られる第２の検査試料を使用して繰り返すことが可能である。例えば、第１の検査試料が尿から得られた場合、第２の検査試料は血清または血漿から得ることが可能である。第１の検査試料と第２の検査試料を使用するアッセイから得られる結果は比較することが可能である。この比較を使用すれば対象における疾患または状態の状況を評価することが可能である。
【０１０２】
さらに、本開示は、肝炎に罹りやすいまたは罹っている対象が処置から利益を得るかどうかを判定する方法にも関する。特に、本開示はＨＣＶコンパニオン診断法および製品に関する。したがって、本明細書に記載される「対象における疾患の処置をモニターする」方法はさらに任意選択的に、治療の候補を選択するまたは特定することも包含することが可能である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、肝炎を有するまたはこのリスクのある対象が治療の候補であるかどうかを判定する方法も提供する。一般には、対象は肝炎のある症状を経験したことがあるまたは肝炎を有するもしくはこのリスクがあると実際に診断されたことのあるならびに／または本明細書に記載される好ましくない濃度もしくは量の抗ＨＣＶ抗体もしくはこの断片および／もしくはＨＣＶ抗原を示している対象である。
【０１０３】
キットおよびシステム（またはこの成分）、ならびに本明細書に記載される免疫アッセイにより検査試料中の抗ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度を決定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および米国特許第５，００６，３０９号に記載されているおよび、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）より市販されている種々の自動化および半自動化システム（固相が微粒子を含むシステムを含む。）において使用するために適応させることが可能である。非自動化システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比べた場合の自動化または半自動化システム間の違いの一部は、第１の特異的結合パートナー（例えば、抗原）が付着する基材（サンドイッチ形成および分析物反応性に影響を与えることがある。）ならびに捕捉、検出および／または任意選択の洗浄ステップの長さおよびタイミングを含む。ＥＬＩＳＡのような非自動化フォーマットは試料と捕捉試薬と一緒の比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）を必要とすることがあるが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）でおおよそ１８分）であることがある。同様に、ＥＬＩＳＡのような非自動化フォーマットはコンジュゲート試薬のような検出抗体を比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）インキュベートすることがあるが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））は比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）でおおよそ４分）であることがある。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号参照、前記特許文献はこれにより参照によりその全体を組み込む。）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ．ＴＭ．ＩＩ、ならびに他のプラットフォームを含むがこれらに限定されない。さらに、アッセイ、キットおよびキット成分は他のフォーマット、例えば、電気化学的または他の携帯もしくはポイントオブケアアッセイシステム上で用いることが可能である。本開示は、例えば、サンドイッチ免疫アッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学免疫アッセイシステムに適用可能である。免疫センサならびにその製造方法および単回使用検査装置の操作は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号に記載されている。前記特許文献はこれに関するその教唆について参照によりその全体を組み込む。
【実施例】
【０１０４】
［実施例１］
異なるＨＣＶ抗体タイター検出のための単数対複数のＮＳ３ペプチドＨＣＶアッセイ
本実施例は、単一ＮＳ３ペプチド（種々のサイズおよびドメイン数を有する。）を用いるＨＣＶアッセイと、完全長ＮＳ３ヘリカーゼペプチド、およびドメイン１のみのＮＳ３ペプチドの両方を用いる組合せＨＣＶアッセイとの間の異なるＨＣＶ抗体タイター検出の比較を記述している。この研究の結果は下の表１に示されている。
【０１０５】
【表１】
2017534056.tif 000002
【０１０６】
上の表１の第２の欄では、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ抗ＨＣＶアッセイは以下の通りに行われた。第１ステップでは、１０μＬのヒト試料、９０μＬのアッセイ特異的希釈液ならびにＨＣＶ  ＮＳ３、コアおよびＮＳ４抗原で被覆された５０μＬの微粒子を反応容器に添加し、ボルテックスし、１８分間インキュベートする。このインキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、その間反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。この第１ステップ中、ＨＣＶ抗原−抗体複合体が形成され微粒子上に捕捉される。第２ステップでは、洗浄に続いて直ちに、アクリジニル化抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を含有する５０μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、４分間インキュベートさせておく。このステップ中、アクリジニウム：抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭコンジュゲートは、第１ステップにおいて形成されたＨＣＶ抗原−抗体複合体にさらに結合する。インキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。洗浄された粒子は塩基性過酸化水素含有溶液に懸濁されてアクリジニウムを活性化し、微粒子上に結合したコンジュゲートの量に比例する発光出力（相対的発光単位またはＲＬＵで）を同時測定する。結果は上の表１に報告されており、これによれば、患者試料中の抗体のタイターが高くなるのに応じて、Ｓ／ＣＯは表の上から下に向かって漸進的に高くなっている。
【０１０７】
上の表２の３番目の欄では、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ単一マーカーコアＡｇアッセイは以下の通りに行われた。第１ステップでは、１１０μＬのヒト試料、２５μＬのアッセイ特異的希釈液、ストレプトアビジン被覆微粒子を含有する５０μＬの試薬およびビオチン化抗コアＭＡｂ（Ｃ１１−７）を含有する２５μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、１８分間インキュベートする。この第１ステップの間、ビオチン：抗コアＭＡｂ：コアＡｇ複合体が形成され微粒子上に捕捉される。このインキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、その間反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。第２ステップでは、洗浄に続いて直ちに、アクリジニル化抗コアＭＡｂ（Ｃ１１−９およびＣ１１−１４）を含有する５０μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、４分間インキュベートさせておく。このステップ中、アクリジニウム：抗コアＭＡｂコンジュゲートは第１ステップにおいて形成されたビオチン：抗コアＭＡｂ：コアＡｇ複合体にさらに結合する。インキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。洗浄された粒子は塩基性過酸化水素含有溶液に懸濁されてアクリジニウムを活性化し、微粒子上に結合したコンジュゲートの量に比例する発光出力（相対的発光単位またはＲＬＵで）を同時測定する。結果は上の表１に報告されており、これによれば、これら３つの試料においては検出可能なレベルのコアＡｇは存在しない。
【０１０８】
上の表１の欄４−７では、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ単一マーカー抗体アッセイは以下の通りに行われた。第１ステップでは、１１０μＬのヒト試料、アクリジニル化ＨＣＶ抗原（ＮＳ３ｈ−Ｄ１（１１９２−１３５６）、ＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）、９ＮＢ４９（１１９２−１４５７）またはコアペプチド（１５−６８、３４および４８に欠失あり。）のいずれか）を含有する２５μＬの試薬、ストレプトアビジン被覆微粒子を含有する５０μＬの試薬およびビオチン化ＨＣＶ抗原（ＮＳ３ｈ−Ｄ１（１１９２−１３５６）、ＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）、９ＮＢ４９（１１９２−１４５７）またはコアペプチド（１５−６８、３４および４８に欠失あり。）のいずれか）を含有する２５μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、１８分間インキュベートする。この第１ステップの間、ビオチン：抗原−ＨＣＶ抗体−アクリジニウム：抗原複合体が形成され微粒子上に捕捉される。このインキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、その間反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。第２ステップでは、洗浄に続いて直ちに、洗浄溶液を含有する５０μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、４分間インキュベートさせておく。インキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。洗浄された粒子は塩基性過酸化水素含有溶液に懸濁されてアクリジニウムを活性化し、微粒子上に結合したコンジュゲートの量に比例する発光出力（相対的発光単位またはＲＬＵで）を同時測定する。結果は上の表１に報告されており、これによれば、ＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）タンパク質を利用しているアッセイは第１の２つの試料の最も低い抗体タイターを検出することが可能であるが、ＮＳ３ｈ−Ｄ１、９ＮＢ４９およびコアペプチドを使用しているアッセイは検出することができない。最も高い抗体タイターの最後の試料はＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５タンパク質またはコアペプチドを使用するアッセイでは検出することができないが、９ＮＢ４９およびＮＳ３ｈ−Ｄ１タンパク質を使用するアッセイでは検出することができる。さらに、ＮＳ３ｈ−Ｄ１タンパク質はこの最後の試料について９ＮＢ４９タンパク質よりも大きな反応性を示している。
【０１０９】
上の表１の最後の欄では、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボアッセイが行われた。重要なことに、このアッセイは、ヘリカーゼドメインの３つ全てを含有する（例えば、低タイター抗体試料を定量的におよび定性的に（ある種のカットオフを用いて）検出するために）抗原およびヘリカーゼのドメイン１のみを含有する（例えば、高タイター抗体試料を定量的におよび定性的に検出するために）抗原を含む２つの異なるタイプのＮＳ３抗原を使用する。第１ステップでは、１１０μＬのヒト試料、アクリジニル化ＨＣＶ  ＮＳ３抗原（ＮＳ３ｈ−Ｄ１（１１９２−１３５６）とＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）の両方）、およびコア抗原（１５−６８、３４および４８に欠失あり。）を含有する２５μＬの試薬、ストレプトアビジン被覆微粒子を含有する５０μＬの試薬ならびにビオチン化抗コアＭＡｂ（Ｃ１１−７）、ビオチン化ＨＣＶ  ＮＳ３抗原（ＮＳ３ｈ−Ｄ１（１１９２−１３５６）とＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）の両方）およびビオチン化コア抗原（１５−６８、３４および４８に欠失あり。）を含有する２５μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、１８分間インキュベートする。この第１ステップの間、ビオチン：抗原−ＨＣＶ抗体−アクリジニウム：抗原複合体同様にビオチン：抗ＨＣＶ  ＭＡｂ−ＨＣＶコアＡｇ複合体が形成され微粒子上に捕捉される。このインキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、その間反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。第２ステップでは、洗浄に続いて直ちに、アクリジニル化抗コアＭＡｂ（Ｃ１１−９およびＣ１１−１４）を含有する５０μＬの試薬を反応容器に添加し、ボルテックスし、４分間インキュベートさせておく。このステップ中、アクリジニウム：抗ＨＣＶ  ＭＡｂコンジュゲートはステップ１で形成されたビオチン：抗原−ＨＣＶ抗体−アクリジニウム：抗原複合体にさらに結合する。インキュベーションに続いて、微粒子は磁石を使用して反応容器の側面に隔離され、反応上澄みは取り除かれる。これに続いて微粒子は水／界面活性剤液で洗浄される。洗浄された粒子は塩基性過酸化水素含有溶液に懸濁されてアクリジニウムを活性化し、微粒子上に結合したコンジュゲートの量に比例する発光出力（相対的発光単位またはＲＬＵで）を同時測定する。結果は上の表１に報告されており、これによれば、ＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５とＮＳ３ｈ−Ｄ１タンパク質がコンボアッセイ中に組み合わされると３つの試料すべてが検出され、単一ＮＳ３タンパク質だけと比べた場合より大きな範囲の試料抗体濃度を可能にする。
【０１１０】
さらなる研究では、連続希釈シリーズの６つの高タイターＨＣＶ  Ａｂ陽性試料が、２つのＮＳ３タンパク質を利用した２つの異なる１ステップ抗ＨＣＶ  ＮＳ３アッセイにわたって検査された。下の表２に示されるＮＳ３ｈアッセイは、３つ全てのＮＳ３ヘリカーゼドメインを有するＮＳ３ｈ−ＤｅｌＮ１５（１２０５−１６５８）タンパク質を利用した。下の表２に示されるＮＳ３ｈ−Ｄ１アッセイは、ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１のみを包含するＮＳ３ｈ−Ｄ１（１１９２−１３５６）を使用した。この検査の結果は下の表２に示されている。
【０１１１】
【表２】
2017534056.tif 000003
【０１１２】
表２に示されるように、単一ＮＳ３ドメイン（Ｄ１）で構成された１ステップアッセイはより高い濃度のＡｂを検出したが、より低い濃度は検出しなかった。高抗体タイターよりもむしろより低い抗体濃度を検出する完全長ＮＳ３ｈタンパク質で構成されたアッセイではこの正反対のことが当てはまる。
【０１１３】
本出願において言及される出版物および特許はすべて参照により本明細書に組み込む。本発明の記載されている方法および組成物の種々の改変および変動は本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、主張される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、当業者に明らかである本発明を実行するための記載されている様式の種々の改変は以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図１】
2017534056.tif 000004
【図２−１】
2017534056.tif 000005
【図２−２】
2017534056.tif 000006
【図２−３】
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【図３】
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【図４】
2017534056.tif 000009
【図５−１】
2017534056.tif 000010
【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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