(57)【要約】扁桃摘出後の上皮組織再生を促進するための組成物及び方法を開示する。特に、本発明は、ヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子を含む組成物、及び扁桃摘出術、例えば口蓋、咽頭または舌扁桃摘出などでの扁桃組織の外科切除で生じた創傷の上皮組織再生を促進する術後処置におけるその使用に関する。加えて、場合によっては扁桃摘出と併用される手技であるアデノイド切除後にも、アデノイド組織の外科切除に起因する創傷の治癒を促進するためにＨＢ−ＥＧＦを用いることができる。2017537067.tif 000004
2017537067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
扁桃摘出後の対象の処置方法であって、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＢ−ＥＧＦがヒトＨＢ−ＥＧＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＢ−ＥＧＦが上皮細胞増殖を刺激することによって、前記扁桃摘出で生じた手術創の上皮化を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象の処置が、前記扁桃摘出によって生じた手術創の治癒を加速させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象の処置が、前記扁桃摘出によって生じた手術創における上皮層の厚さを増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象の処置が、前記扁桃摘出によって生じた手術創における上皮化の速度を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記扁桃摘出によって生じた手術創に前記組成物を局所投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
マイクロニードル注入によって前記組成物を投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記創傷に前記組成物を噴霧することによって前記組成物を投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物を経口投与、非経口投与、または表面投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記扁桃摘出によって生じた手術創の部位の付近に前記組成物を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤、または別の成長因子で前記対象を処置する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
新生血管形成を減少させる物質、または新生上皮の接着性を向上させるもしくは新生上皮の剥離を減少させる物質で前記対象を処置する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質が口蓋舌筋または口蓋咽頭筋の収縮を減少させ、それによって前記新生上皮の下にある筋系からの剥離が減少する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記担体が、水溶液、ゲル、ローション、バーム、またはペーストからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象に治療有効投与量の前記ＨＢ−ＥＧＦを複数回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
創傷の少なくとも部分的な治癒をもたらすのに十分な期間、前記対象に複数サイクルの処置を施す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記期間が少なくとも２〜５日間である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記期間が少なくとも１週間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記期間が少なくとも２週間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
創傷の完全な治癒をもたらすのに十分な期間、前記対象に複数サイクルの処置を施す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が徐放性製剤を含む、または徐放デバイスを用いて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
単回投与量のＨＢ−ＥＧＦを前記対象に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記扁桃摘出が口蓋、咽頭、または舌扁桃摘出である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アデノイド切除を実施する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記アデノイド切除によって生じた手術創を、ＨＢ−ＥＧＦを含む治療有効量の前記組成物で処置する段階をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アデノイド切除によって生じた前記手術創に前記組成物をマイクロニードル注入によって投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アデノイド切除によって生じた前記創傷に前記組成物を噴霧することによって前記組成物を投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アデノイド切除によって生じた前記手術創の部位の付近に前記組成物を投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＢ−ＥＧＦが、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＢ−ＥＧＦが、アデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖を刺激可能である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＢ−ＥＧＦが、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＢ−ＥＧＦが、アデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖を刺激可能である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＨＢ−ＥＧＦが、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＢ−ＥＧＦが、アデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖を刺激可能である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＨＢ−ＥＧＦが、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象の扁桃摘出によって生じた手術創における上皮細胞増殖の刺激方法であって、前記対象に有効量のＨＢ−ＥＧＦを投与する段階を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記ＨＢ−ＥＧＦの投与が、前記手術創における上皮層の厚さを増加させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＨＢ−ＥＧＦの投与が、前記創傷における上皮化の速度を増加させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
対象のアデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖の刺激方法であって、前記対象に有効量のＨＢ−ＥＧＦを投与する段階を含む、前記方法。
【請求項４０】
前記ＨＢ−ＥＧＦの投与が、前記手術創における上皮層の厚さを増加させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＢ−ＥＧＦの投与が、前記創傷における上皮化の速度を増加させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記アデノイド切除によって生じた手術創に前記組成物を局所投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
マイクロニードル注入によって前記組成物を投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記創傷に前記組成物を噴霧することによって前記組成物を投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物を経口投与、非経口投与、または表面投与する、請求３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記アデノイド切除によって生じた手術創の部位の付近に前記組成物を投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
扁桃摘出またはアデノイド切除に起因する対象の手術創を処置するのに用いるための、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、扁桃摘出及び術後処置に関する。特に、本発明は、ヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む組成物、ならびに上皮組織再生及び創傷治癒を促進するための扁桃摘出の術後処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の背景技術の説明は本発明の理解を容易にすることのみを意図する。その説明は、言及する内容のいずれも本出願の優先日の時点で共通一般知識の一部である、または共通一般知識の一部であったと肯定または自認するものではない。
【０００３】
米国及び欧州では年間１００万件を超える扁桃摘出が行われている（Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  １６０（５）：８１４−８１９（非特許文献１）；  Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｌ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００９  （１１）：  １−２５（非特許文献２）；  Ｌａｆｏｒｔｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｓｅｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：  ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ａｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｄａｙ  ｃａｓｅｓ？  ＯＥＣＤ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｏｎ  Ｗｏｒｋ  Ｐａｃｋａｇｅ  ＩＩ（非特許文献３））。かなりの割合の患者が扁桃摘出後出血（ＰＴＨ）を経験している。ＰＴＨは術後２４時間以内に発生した場合、一次と定義することができ、術後２４時間よりも後に出血が発生した場合、二次と定義することができる。
【０００４】
二次ＰＴＨは扁桃摘出後の最も一般的な合併症であり、医療制度の大きな負担である。ＰＴＨ率の減少はほとんど進展していない。米国及び欧州における大規模な試験では二次ＰＴＨについて２〜３％の発生率を挙げているが（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ７９（８）：６４０−６４２，  ６４４，  ６４６  各所（非特許文献４）；  Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１１（８）：  １３５８−１３６１（非特許文献５）；  Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｌａｎｃｅｔ．  ３６４（９４３５）：６９７−７０２（非特許文献６）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｏｔｏｌ．  １０７（８）：７１１−７１５（非特許文献７））、より高いＰＴＨ率を報告している研究もある（Ｂｌａｋｌｅｙ  （２００９）  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １４０（３）：２８８−２９０（非特許文献８）；  Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｅｕｒ．  Ａｒｃｈ．  Ｏｔｏｒｈｉｎｏ  ｌａｒｙｎｇｏｌ．  ２６６（７）：  １０１１−１０１５（非特許文献９）；  Ｓａｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２１（１２）：２５５３−２５６０（非特許文献１０））。扁桃摘出後、患者の１０％が救急科を受診し、最大１５％が観察のために再入院している。ＰＴＨの患者の５０％が出血を抑制するための手術的介入を必要とし、実施されているすべての扁桃摘出の３．１％を占める。米国では、ＰＴＨの１回の発症によるその個人の扁桃摘出にかかる費用の増加は２５００ドルを超える（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １２４（７）：  １５５４−１５５６（非特許文献１１）；  Ｓｅｓｈａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １５０（４）：５７４−５８１（非特許文献１２））。
【０００５】
扁桃摘出後には生傷が口腔内に残り二次治癒する。二次ＰＴＨは痂皮がその下にある創傷から剥離するのが早すぎることに起因し、これはおそらく下層の感染または脱水によって早められると理論づけられているが（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１２（８  Ｐｔ．  ２  Ｓｕｐｐｌ．  １００）：３５−３６（非特許文献１３））、この理論には論争がないわけではない。この治癒プロセスはよく理解されておらず、この分野では将来の研究の指針となる動物モデルが不足している（Ｇｙｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＯＲＬ  Ｊ．  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｓｐｅｃ．  ７５（３）：  １２３−１３２（非特許文献１４））。現在では、合併症の発症前にＰＴＨの可能性を予防または軽減するために利用可能な処置が存在しない。
【０００６】
したがって、出血を予防しアウトカムを改善するためのより優れた扁桃摘出の術後処置に対する必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  １６０（５）：８１４−８１９
【非特許文献２】Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｌ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００９  （１１）：  １−２５
【非特許文献３】Ｌａｆｏｒｔｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｓｅｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：  ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ａｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｄａｙ  ｃａｓｅｓ？  ＯＥＣＤ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｏｎ  Ｗｏｒｋ  Ｐａｃｋａｇｅ  ＩＩ
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ７９（８）：６４０−６４２，  ６４４，  ６４６
【非特許文献５】Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１１（８）：  １３５８−１３６１
【非特許文献６】Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｌａｎｃｅｔ．  ３６４（９４３５）：６９７−７０２
【非特許文献７】Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｏｔｏｌ．  １０７（８）：７１１−７１５
【非特許文献８】Ｂｌａｋｌｅｙ  （２００９）  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １４０（３）：２８８−２９０
【非特許文献９】Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｅｕｒ．  Ａｒｃｈ．  Ｏｔｏｒｈｉｎｏ  ｌａｒｙｎｇｏｌ．  ２６６（７）：  １０１１−１０１５
【非特許文献１０】Ｓａｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２１（１２）：２５５３−２５６０
【非特許文献１１】Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １２４（７）：  １５５４−１５５６
【非特許文献１２】Ｓｅｓｈａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １５０（４）：５７４−５８１
【非特許文献１３】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１２（８  Ｐｔ．  ２  Ｓｕｐｐｌ．  １００）：３５−３６
【非特許文献１４】Ｇｙｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＯＲＬ  Ｊ．  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｓｐｅｃ．  ７５（３）：  １２３−１３２
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、上皮組織再生及び創傷治癒を促進するための扁桃摘出の術後処置にＨＢ−ＥＧＦが有用であるという発見に基づいている。
【０００９】
一態様において、本発明は、扁桃摘出（例えば口蓋、咽頭もしくは舌扁桃摘出）またはアデノイド切除に起因する対象の手術創を処置するのに用いるためのＨＢ−ＥＧＦを含む組成物を含む。一実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦはヒトＨＢ−ＥＧＦである。ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦは配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも約７０〜１００％の配列同一性を有する配列を含むそのバリアントを含むが、この範囲内の任意の一致率、例えば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％などの配列同一性が含まれ、ＨＢ−ＥＧＦバリアントはＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させ、上皮細胞増殖及び創傷治癒を促進することができる。組成物は薬学的に許容可能な添加物をさらに含み得る。ある実施形態において、組成物は抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤、及び別の成長因子からなる群から選択される１種以上の追加の作用物質をさらに含む。他の実施形態において、組成物は、新生血管形成を減少させる、新生上皮の接着性を増加させる、または新生上皮の剥離を減少させる１種以上の物質をさらに含む。一実施形態において、組成物は下層にある筋（例えば口蓋舌筋、口蓋咽頭筋、扁桃柱、舌根、または軟口蓋）の収縮を減少させる作用物質を含み、それによって新生上皮の下にある筋系からの剥離が減少する。
【００１０】
別の態様において、本発明は扁桃摘出後の対象の処置方法を含み、この方法は対象にＨＢ−ＥＧＦを含む治療有効量の組成物を投与することを含む。ＨＢ−ＥＧＦは、上皮細胞増殖を刺激すること、上皮化の速度を増加させること、及び手術創の上皮層の厚さを増加させることによって、手術創の治癒を加速させるように作用し得る。
【００１１】
ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物の「治療有効投与量」または「治療有効量」は、本明細書に記載するように投与した場合、有益な治療反応、例えば扁桃摘出後の創傷治癒の改善などをもたらす量を意図する。扁桃摘出後の創傷治癒の改善には、創傷が治癒する速度の増加、創傷を出血しやすくさせる新たな血管が形成する量の減少、または創傷の治癒の間もしくは後の残った瘢痕もしくはケロイドもしくは壊死組織形成の程度の軽減が含まれ得る。加えて、治療有効投与量または治療有効量は扁桃摘出後出血を軽減または予防し得る。
【００１２】
組成物中に含まれるＨＢ−ＥＧＦはプロＨＢ−ＥＧＦであってもよく、成熟ＨＢ−ＥＧＦであってもよい。ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦは配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも約７０〜１００％の配列同一性を有する配列を含むそのバリアントを含むが、この範囲内の任意の一致率、例えば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％などの配列同一性が含まれ、ＨＢ−ＥＧＦバリアントはＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させ、上皮細胞増殖及び創傷治癒を促進することができる。
【００１３】
ある実施形態において、この方法は、対象を１種以上の他の薬剤または作用物質、例えば限定はしないが、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤、及び別の成長因子などで処置することをさらに含む。他の実施形態において、この方法は、新生血管形成を減少させる、新生上皮の接着性を増加させる、または新生上皮の剥離を減少させる１種以上の物質で対象を処置することをさらに含む。一実施形態において、この方法は、下層にある筋（例えば口蓋舌筋、口蓋咽頭筋、扁桃柱、舌根、または軟口蓋）の収縮を減少させる作用物質で対象を処置することをさらに含み、それによって新生上皮の下にある筋系からの剥離が減少する。
【００１４】
ある実施形態において、単回投与量のＨＢ−ＥＧＦまたは複数回の治療有効投与量のＨＢ−ＥＧＦを対象に投与する。対象に治療有効投与量のＨＢ−ＥＧＦを複数回投与する場合、ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物を毎日、例えば１日１回、１日２回、または１日３回投与してよい。あるいは、ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物を間欠的に、例えば、週１回もしくは２回または隔週で投与してもよい。
【００１５】
ある実施形態において、扁桃摘出に加えて対象にアデノイド切除を実施し、アデノイド切除によって生じた手術創もＨＢ−ＥＧＦを含む治療有効量の組成物で処置する。
【００１６】
対象の扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた手術創を処置するために任意の適切な投与様式が用いられ得る。ある実施形態において、組成物を経口投与、非経口投与、または表面投与する。他の実施形態では組成物を手術創に局所投与する。例えば、組成物はマイクロニードル注入、創傷への組成物の噴霧によって、または表面ペーストとして投与され得る。ウォッシュ、うがい薬、またはリンスとして組成物を経口投与してもよい。あるいは、組成物を手術創の部位の付近に投与してもよい。
【００１７】
別の態様において、本発明は対象の扁桃摘出によって生じた手術創における上皮細胞増殖を刺激する方法を含み、この方法は対象に有効量のＨＢ−ＥＧＦを投与することを含む。ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦの投与により、手術創における上皮層の厚さ及び／または創傷における上皮化の速度が増加する。
【００１８】
別の態様において、本発明は対象のアデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖の刺激方法を含み、この方法は対象に有効量のＨＢ−ＥＧＦを投与することを含む。ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦの投与により、手術創における上皮層の厚さ及び／または創傷における上皮化の速度が増加する。
【００１９】
本明細書の開示に鑑みて、当業者は本発明のこれらの及び他の実施形態を容易に考え付くであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図１Ａは対照４日目を示し、肉芽組織（矢印）及び上皮端（×印）の領域を示す。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図１Ｂは処置４日目を示し、肉芽（矢印）及び上皮端（×印）の領域を示す。肉芽層及び上皮創傷端は処置群においてより大きいことが認められた。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図１Ｃは対照７日目を示し、下にある線維層からの上皮剥離を示す。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。上皮剥離は処置群において小さく（高さ及び幅）、上を覆う上皮の層はより厚いことが認められた。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図２Ａは対照９日目を示し、開放創における血管新生の領域を示す。上皮端（×印）が創傷中央に接近し、創傷の底部の紡錘形細胞が整列して収縮している（星印）。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図２Ｂは処置９日目を示し、閉鎖創における新生血管形成（矢印）の領域を示す。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図２Ｃは対照１２日目を示し、上皮被覆されていない創傷の領域及び新生血管形成（矢印）の領域を示す。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、対照群と処置群とを比較する代表的な組織画像を示す。図２Ｄは処置１２日目を示し、上皮化した創傷を示す。基底膜がない（矢印）ことが元は開放創であった領域であることを示している。スケールバー＝１０μｍ（倍率１０×）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本発明の実施には、特に断らない限り、医学、薬理学、化学、生化学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を当業者の技能範囲内で利用する。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｋ．Ｊ．  Ｌｅｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ：  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／  Ｍｅｄｉｃａｌ，  １０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１２）；  Ｅ．Ｎ．  Ｍｙｅｒｓ  Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ：  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ：  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔ  （Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００８）；  Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｔｈｅ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，  Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，  ａｎｄ  Ｍａｒｃｏ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｅｒｔ  ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９９）を参照。
【００２２】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許及び特許出願は、上記または下記にかかわらず、その全内容を参照により本明細書に援用する。
【００２３】
Ｉ．定義
本発明を説明するにあたって、以下の用語を用い、以下に記載するように定義するものとする。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「ａ  ｗｏｕｎｄ（創傷）」と言った場合には２つ以上の創傷が含まれ、他も同様である。
【００２５】
「創傷」は、上皮、結合組織、及び筋組織を含めた、器官または組織の構造における破壊または不連続である。創傷の例としては、皮膚創傷、打撲傷、潰瘍、褥瘡、擦り傷、裂傷、切り傷、刺し傷、乾癬創傷、鼓膜穿孔、角膜剥離及び角膜破裂ならびに火傷が挙げられるが、これらに限定されない。創傷は外科手術（例えば扁桃摘出またはアデノイド切除）によって生じる場合もあり、扁桃またはアデノイドの部分または全切除後の治癒中の領域をいう場合もある。
【００２６】
「表面」適用は、創傷の表面に対する有効成分の非全身的局所投与のことをいう。
【００２７】
用語「ヘパリン結合性上皮成長因子」、「ヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子」及び「ＨＢ−ＥＧＦ」は同じ意味で用い、任意の形態のＨＢ−ＥＧＦを包含し、未成熟プロタンパク質形態及びプロタンパク質のタンパク質分解プロセスによって生成される様々な活性形態を含み、ＨＢ−ＥＧＦの膜結合型及び可溶性形態、ならびにＨＢ−ＥＧＦ生物活性を保持する（例えばＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させる、または上皮細胞増殖及び創傷治癒を促進する）生物学的に活性な断片、バリアント、アナログ、及びこれらの誘導体を含む。ＨＢ−ＥＧＦという用語には、内因的に生じる哺乳類ヘパリン結合性上皮成長因子、対立遺伝子ヘパリン結合性上皮成長因子、ヘパリン結合性上皮成長因子の機能保存誘導体、機能活性ヘパリン結合性成長因子断片、及び哺乳類ヘパリン結合性上皮成長因子ホモログ、例えばヘパリン結合性成長因子様成長因子などが含まれる。ＨＢ−ＥＧＦは、活性の向上、安定性の増加、より高い産生量、またはより良好な溶解性を示すＨＢ−ＥＧＦの変異型も含む。任意により、ヘパリン結合性上皮成長因子を含む組成物は、ＨＢ−ＥＧＦの２種以上のタイプ、誘導体またはホモログを含有してもよい。
【００２８】
本発明の方法に用いるＨＢ−ＥＧＦは天然であっても、組換え技術により入手しても、合成的に生成してもよく、任意の起源に由来してよい。ＨＢ−ＥＧＦの未成熟プロタンパク質形態及びプロタンパク質のタンパク質分解プロセスによって生成されるＨＢ−ＥＧＦの様々な活性形態について、代表的なヒトＨＢ−ＥＧＦ配列を配列番号１〜４に示す。その他の代表的な配列は米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに記載されており、多数の異なる種に由来するＨＢ−ＥＧＦ配列が含まれている。例えば、ＮＣＢＩエントリー：受領番号：Ｌ１７０３２、Ｌ１７０３、ＮＰ＿００１９３６、ＮＭ＿００１９４５、ＮＰ＿０３７０７７、ＮＰ＿９９０１８０、ＮＰ＿００１１３７５６２、ＮＰ＿０３４５４５、ＮＰ＿００１１０４６９６、ＮＰ＿００１０９３８７１、ＸＰ＿００３８２９２４１、ＸＰ＿００５４２５４２６、ＮＰ＿００１２４４３９８、ＸＰ＿０１４１２６４４７、ＸＰ＿０１４１３１９３７、ＸＰ＿０１３９９８９４１、ＸＰ＿００５５２３５０４、ＸＰ＿００５６１７３３６、ＸＰ＿００５６１７３３５、ＸＰ＿００５６１７３３４、ＸＰ＿００５６１７３３３、ＸＰ＿８４８６１４、ＸＰ＿０１３９１４９０１、ＸＰ＿０１３８２１０６１、ＸＰ＿０１３８０９９８４、ＸＰ＿００５３８２０８８、ＸＰ＿００５３８２０８７、ＸＰ＿００５５０３７１３、ＸＰ＿００５３２７３４０、ＸＰ＿００５３５６０１４、ＸＰ＿００５２３８９３５、ＸＰ＿０１３０４７２７０、ＸＰ＿０１２９９６６９４、ＸＰ＿０１０８６９５２８、ＸＰ＿００５０６５３１８、ＸＰ＿００３４７７１９６、ＸＰ＿０１２９５６１５４、ＸＰ＿００４８４１９１７、ＸＰ＿００４７４４８７１、ＸＰ＿０１２８７５７９４、ＸＰ＿００４６９６７１８、ＸＰ＿００４６５２４８６、ＸＰ＿００２９３７７７３、ＸＰ＿００４６１００５２、ＸＰ＿００４５８６５３４、ＸＰ＿００４５８６５３３、ＸＰ＿０１２６９７５６６、ＸＰ＿００３７８２１８６、ＸＰ＿０１２６０４５４８、ＸＰ＿００４６８６８５５、ＸＰ＿０１２５０１８６３、ＸＰ＿０１２５０１８６２、ＸＰ＿０１２５０１８６１、ＸＰ＿００４３９７８４９、ＸＰ＿００２１９０９３１、ＸＰ＿００４２８０３３１、ＸＰ＿００３７５６６７６、ＸＰ＿００４６４３２８９、ＸＰ＿００４４７７８９３、ＸＰ＿００３２６６５１１、ＸＰ＿０１２３２７０１７、ＸＰ＿０１２００６０１６、ＸＰ＿０１２００６０１５、ＸＰ＿０１２００６０１４、ＸＰ＿０１２００６０１３、ＸＰ＿００４００８９１２、ＸＰ＿０１１７１４６４６、ＮＰ＿００１１５８６３９、及びＮＰ＿００１２７３２２０を参照。これらの配列（本出願の出願日までに登録されたもの）をすべて参照により本明細書に援用する。これらの配列のいずれか、またはその生物学的に活性な断片、もしくはそれ対して少なくとも約７０〜１００％の配列同一性を有する配列を含むそのバリアント（この範囲内の任意の一致率、例えば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％などの配列同一性を含む）を、本明細書に記載のＨＢ−ＥＧＦを含む組成物を作製するために用いることができる。加えて、ＨＢ−ＥＧＦは翻訳後修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化などを含み得る。本発明を実施するために任意のＨＢ−ＥＧＦ源を用いることができるが、特に処置を受ける対象がヒトの場合には、ＨＢ−ＥＧＦはヒト起源に由来することが好ましい。
【００２９】
「機能保存バリアント」は、タンパク質の全体的な構造及び機能を変化させることなく所定のアミノ酸残基が変化したタンパク質であり、あるアミノ酸と類似の特性（例えば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するものとの置換が含まれるがこれに限定されない。類似の特性を有するアミノ酸は当該技術分野において公知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリシンは親水性塩基性アミノ酸であり、互換性があり得る。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンで置換され得る。
【００３０】
「新生血管形成を減少させる物質」には、限定はしないが抗血管形成因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質、例えば組換えヒト化抗体であるベビクジマブ（ｂｅｖｉｃｕｚｉｍａｂ）；ベビクジマブ（ｂｅｖｉｃｕｚｉｍａｂ）の断片であるラニビズマブ；アプタマーであるペガプタニブ；ＶＥＧＦ受容体の結合ドメインを含む組換え融合タンパク質であるアフリベルセプト；抗血管新生活性を有するフラボノイドであるゲニステイン；ファルネシルトランスフェラーゼのインヒビターであるロルナファルニブ（ｌｏｒｎａｆａｒｎｉｂ）など、及び新生血管形成を減少させる任意の他の物質を含めた、生物学的及び／または非生物学的物質が含まれ得る。
【００３１】
「新生上皮の接着性を向上させる、または剥離を減少させる物質」には、限定はしないが、任意の様式で（例えば表面にまたは注入によって）施される糊または接着剤、及び熱処理した塩化カルシウムを含めた生物学的及び／または非生物学的物質が含まれる。この用語は、ヘミデスモソームまたはそのサブコンポーネントの分解を抑える、または制限する物質も包含するが、これは上皮とその下にある基底膜との接着の媒介を助ける。「新生上皮の接着性を向上させる、または剥離を減少させる物質」には、下層にある筋（例えば口蓋舌筋及び口蓋咽頭筋、扁桃柱、または舌根または軟口蓋）の筋収縮を減少させて新生上皮の「搾り出し」を緩和する生物学的または非生物学的物質も含まれ得るが、これには限定はしないが一酸化窒素、カルシウム阻害剤及びトロポニンＣインヒビターが含まれ、これらはクロスブリッジ形成及び力発生を阻害する。
【００３２】
用語「対象」には脊椎動物及び無脊椎動物の両方が含まれ、限定はしないが、ヒトならびに非ヒト哺乳類、例えばチンパンジー及び他の類人猿ならびにサル種を含めた非ヒト霊長類などを含む哺乳類；実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、及びチンチラなど；家庭動物、例えばイヌ及びネコなど；家畜、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ及びウシなど；ならびに鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどを含めた家禽、野鳥及び狩猟鳥などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、対象の「処置」または対象の疾患もしくは容態を「処置する」とは、疾患または容態の臨床症状、例えば創傷治癒の障害または遅れなどを軽減または緩和することを意味する。
【００３４】
扁桃摘出後の創傷治癒を「促進する」、「亢進する」、または「改善する」とは一般に、創傷が治癒する速度を増加させること、または創傷の治癒の間または後の残った瘢痕もしくはケロイドもしくは壊死組織の程度を軽減させることを意味する。
【００３５】
「有効量」または「治療有効量」とは、ＨＢ−ＥＧＦ、または新生血管形成を減少させる物質、または新生上皮の接着性を増加させる物質、または筋（例えば口蓋舌筋及び口蓋咽頭筋、扁桃柱もしくは舌根もしくは軟口蓋）の収縮を減少させ、下層の筋系からの新生上皮の剥離を減少させる物質の量であって、上皮細胞増殖、上皮再生、または創傷治癒を亢進するのに十分な量を意味する。例えば、活性作用物質の有効量は、２００μｇ／ｍｉを超えるＨＢ−ＥＧＦの局所レベル（例えば穿孔、創傷、もしくは瘢痕領域における）または全身レベルとなる量とすることができる。あるいは、作用物質の有効量は、作用物質がない場合よりも穿孔もしくは創傷の治癒が早くなる、または瘢痕もしくは壊死組織形成が軽減される量である。有効量は、ＨＢ−ＥＧＦの局所及び／または全身レベルを、活性作用物質または薬剤の投与前のＨＢ−ＥＧＦレベルの少なくとも１０〜２００％、少なくとも５０〜１００％、または少なくとも６０〜８０％、またはこれらの範囲内の任意のパーセント、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、もしくは２００％などだけ増加させるのに十分な活性作用物質または薬剤の量または投与量をいう場合もある。
【００３６】
治療有効量は、例えば扁桃摘出後の創傷治癒が促進される、または瘢痕形成が軽減されるという点で、対象において臨床的に有意な反応を改善する、または示すことができる。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床的に有意な創傷治癒または瘢痕形成状態を改善するのに十分である。
【００３７】
ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦのインヒビターの送達、または血管新生を減少させる、もしくは新生上皮の接着性を増加させる物質の送達に関する場合の「構造体」としては、任意のスキャホールド、ポリマー、構築体、組立体、装着材、支持体、ディスク、ブロック、コーティング、層、アバットメント、裏材、デバイス、または発泡体が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、送達に用いられ得る患者自身の組織、壊死組織片、または移植片も含む。ある実施形態において、構造体は完全に形成された状態、または相転移もしくは構造体を改質する他の変化を経る状態で施される。例えば、粘稠液体が送達の構造体として用いられるが、これは液体状のままであってもよく、創傷への適用後に固体状態を形成してもよい。
【００３８】
ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦのインヒビターの送達、または血管新生を減少させる、もしくは新生上皮の接着性を増加させる他の上述した物質の送達に関する場合の「ビヒクル」としては、任意のポリマー、薬剤、担体、器具、操作、媒質、装置、機器、機械、ガジェット、ツール、ウィジェット、道具または用具が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ビヒクル」は、任意の可溶性担体または添加物のこともいい、限定はしないが生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びこれらの組合せが含まれる。製剤は投与様式に適したものとするべきである。当該技術分野において公知の好適な製剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ａｎｄ  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．に見出すことができる。
【００３９】
「上皮」は体の内部及び外部表面の被覆のことをいい、脈管及び他の小腔の内張りを含む。上皮は少量の接着物質によって結合した細胞からなる。上皮は重なっている層の数及び表層細胞の形状に基づいて複数の種類に分類される。本文脈中では、扁桃摘出後またはアデノイド切除後の創傷領域を覆う細胞の表層のことをいう。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の５０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００４１】
別の値とは「実質的に異なる」値は、２つの値の間に統計的に有意な差があることを意味することができる。当該技術分野において公知の任意の好適な統計的方法を用いて、差が有意であるか否かを評価することができる。
【００４２】
「統計的に有意な」差は、少なくとも９０％の信頼区間、より好ましくは９５％信頼区間で有意性が確認されることを意味する。
【００４３】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「ポリペプチド」は、自然発生もしくは合成アミノ酸ポリマー、または限定はしないがアミノ及び／またはイミノ分子を含む化合物を含めたアミノ酸様分子を含む任意の化合物のことをいう。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「ポリペプチド」の使用によって特定の大きさを意味することはなく、これらの用語を同じ意味で用いる。例えば、アミノ酸の１種以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、自然発生及び非自然発生（例えば合成）両方による置換結合及び当該技術分野において公知の他の修飾を有するポリペプチドがこの定義に含まれる。したがって、合成オリゴペプチド、二量体、多量体（例えば縦列反復直線結合ペプチド）、環状、分枝状分子などがこの定義に含まれる。この用語は、１種以上のペプトイド（例えばＮ置換グリシン残基）及び他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子も含む。（ペプトイドの説明については、例えば米国特許第５，８３１，００５号；５，８７７，２７８号；及び５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ７（７）：４６３−４７３；ならびにＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７−９３７１を参照。）本発明で用いるのに適したペプチドの長さとしては、限定はしないが、３〜５残基の長さ、６〜１０残基の長さ（もしくはこの間の任意の整数）、１１〜２０残基の長さ（もしくはこの間の任意の整数）、２１〜７５残基の長さ（もしくはこの間の任意の整数）、７５〜１００（もしくはこの間の任意の整数）のペプチド、または１００残基を超える長さのポリペプチドが挙げられる。本発明において有用なポリペプチドは典型的に、目的の用途に適した最大長を有することができる。好ましくは、ポリペプチドは約４０〜３００残基の長さである。一般に、当業者であれば本明細書の教示に鑑みて最大長を容易に選択することができる。さらに、本明細書に記載のペプチド及びポリペプチド、例えば合成ペプチドは、標識または他の化学的部分などの追加の分子を含み得る。こうした部分は、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との相互作用、及び／または上皮細胞増殖の刺激、及び／または創傷治癒をさらに亢進し得る、及び／またはＨＢ−ＥＧＦ安定性もしくは送達をさらに向上させ得る。
【００４４】
したがって、ポリペプチドまたはペプチドと言った場合、１種以上の非自然発生アミノ酸を含む本発明のアミノ酸配列の誘導体も含む。第１ポリペプチドまたはペプチドは、（ｉ）第２ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドから誘導された第１ポリヌクレオチドによってコードされるか、または（ｉｉ）第２ポリペプチドもしくはペプチドに対して本明細書に記載するように配列同一性を示す場合、第２ポリペプチドまたはペプチド「から誘導」されている。配列同一性（または一致率）は後述のようにして決定することができる。誘導体は、誘導される元の配列に対して、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは約８５％〜９９％（またはこの間の任意の値）の一致率を示す。こうした誘導体はポリペプチドまたはペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含むことができる。
【００４５】
アミノ酸誘導体は、ポリペプチドまたはペプチドが所望の活性を維持する（例えば上皮細胞増殖及び創傷治癒を促進する）限り、元の配列への修飾、例えば（概して性質を保存した）欠失、追加及び置換などを含むこともできる。こうした修飾は、部位特異的変異誘発によるように意図的であってもよく、タンパク質を産生する宿主の変異、またはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるなど偶発的であってもよい。さらに、次の効果、すなわちＥＧＦ受容体に対する親和性及び／または特異性の増加、上皮細胞増殖及び／または創傷治癒の亢進、ならびに細胞プロセスの促進のうち１つ以上を有する修飾が行われてよい。
【００４６】
「断片」は完全な全長配列及び構造の一部のみからなる分子を意味する。断片は、ポリペプチドのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、及び／または内部欠失を含むことができる。特定のタンパク質またはポリペプチドの活性断片は、一般に全長分子の少なくとも約５〜１４の連続したアミノ酸残基を含むことになるであろうが、全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続したアミノ酸残基を含んでもよく、全長分子の少なくとも約２０〜５０、６０〜９０、もしくはこれよりも多くの、または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むことができる。ただし、当該断片が本明細書で定義した生物活性、例えばＨＢ−ＥＧＦ活性（例えばＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させ、上皮細胞増殖及び／または創傷治癒を促進する能力）などを保持する場合に限る。
【００４７】
「実質的に精製」とは一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド組成物）を単離して、物質がその存在するサンプルの大部分の割合を占めるようにすることをいう。実質的に精製された成分は、サンプル中で典型的に、サンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を占める。対象とするポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製する技術は当該技術分野において公知であり、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度による沈降法が挙げられる。
【００４８】
ポリペプチドに関する場合、「単離」は、述べられている分子が、その分子が本来見出される生物全体から分離され別個である、または同じタイプの他の生体巨大分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。用語「単離」は、ポリヌクレオチドに関しては、本質的には通常関連する配列の全部または一部が存在しない核酸分子；または自然に存在しているが関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子のことである。
【００４９】
「薬学的に許容可能な添加物または担体」は、任意により本発明の組成物中に含めてよく、患者に対して有害な毒性作用をほとんど引き起こさない添加物のことをいう。
【００５０】
「薬学的に許容可能な塩」としては、アミノ酸塩、無機酸で調製される塩、例えば塩化物塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物塩、及び硝酸塩など、もしくは上記のいずれかの対応する無機酸形態から調製される塩、例えば塩酸塩など、または有機酸で調製される塩、例えばリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、サリチル酸塩及びステアリン酸塩、ならびにエストリン酸塩、グルセプチン酸塩及びラクトビオン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容可能なカチオンを含有する塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、リチウム塩、及びアンモニウム塩（置換アンモニウム塩を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
「相同性」は２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の一致率のことをいう。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、分子の所定の長さにわたって、配列が少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で用いる場合、実質的に相同とは特定の配列に対して完全な同一性を示す配列のこともいう。
【００５２】
一般に、「同一性」は２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致のことをいう。一致率は、配列をアラインメントし、２つのアラインメントした配列間の正確な一致数を数え、短い方の配列の長さで割って得られた結果に１００を掛けることによる２つの分子間での配列情報の直接比較によって求めることができる。容易に利用可能なコンピュータプログラム、例えばペプチド解析用のＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  ４８９，  １９８１の局所相同性アルゴリズムを応用したＡＬＩＧＮ，  Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  Ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３  ３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣなどを用いて解析に役立てることができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能）、例えばＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムで利用可能であるが、これらもＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに基づいている。これらのプログラムは、製造者が推奨し、上述したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されている既定のパラメータで容易に用いられる。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する一致率は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ相同性アルゴリズムを既定のスコアリングテーブル及び６ヌクレオチド位のギャップペナルティを用いて決定することができる。
【００５３】
本発明との関係における一致率確認の別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．  Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）によって配布されているＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを用いることである。このパッケージ一式からＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができ、スコアリングテーブルに既定のパラメータ（例えば１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ延長ペナルティ、及び６のギャップ）を用いる。生成されるデータの「Ｍａｔｃｈ」値が「配列同一性」を表す。配列間の一致率または類似性を計算する他の好適なプログラムは当該技術分野において一般に公知であり、例えば別のアラインメントプログラムにはＢＬＡＳＴがあり、既定のパラメータで用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは次の既定のパラメータを用いて使用可能である：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし：ｓｔｒａｎｄ＝両方；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝重複なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は容易に入手可能である。
【００５４】
あるいは、相同な領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）で消化して、消化された断片の大きさを測定することによって相同性を決定することもできる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えばその特定の系に対して設定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の設定は当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（上記）を参照。
【００５５】
本明細書において核酸分子について記載するのに用いる場合、「組換え」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドで、起源または操作が理由で本来関連するポリヌクレオチドの全部または一部に関連しないものを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して用いる場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般に、対象とする遺伝子をクローニングして形質転換生物で発現させるが、これについては以下でさらに説明する。宿主生物は発現条件下で外来性遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００５６】
用語「形質転換」は、宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの挿入のことをいい、挿入に用いられる方法によらない。例えば、直接取込み、形質導入またはｆ接合が含まれる。外来性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えばプラスミドとして保持され得るか、または代替として、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００５７】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」及び単細胞集団として培養された微生物または高等真核細胞を意味する他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡの受容株として用いることができる、または用いられた細胞のことをいい、形質移入された元の細胞独自の子孫を含む。
【００５８】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列（または「制御因子」）の制御下におかれた場合に、生体内で転写（ＤＮＡの場合）される、及びポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５′（アミノ）末端の開始コドン及び３′（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定することができる。コード配列としては、限定はしないがウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列はコード配列の３′側に位置し得る。
【００５９】
典型的な「制御因子」としては、転写プロモーター、転写エンハンサー因子、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３′側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５′側に位置する）、及び翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
「動作可能に連結した」とは、述べられている構成要素が通常の機能を果たすように構成されている要素の配置のことをいう。したがって、コード配列に動作可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にコード配列の発現を引き起こすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限りコード配列に付近接している必要はない。したがって、例えば、プロモーター配列とコード配列との間に介在して、翻訳はされないが転写される配列が存在することができるが、それでもプロモーター配列はコード配列に「動作可能に連結」しているとみなすことができる。
【００６１】
「によってコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列について、ポリペプチド配列またはその一部が、核酸配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含有することをいう。
【００６２】
「発現カセット」または「発現構築体」は、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を誘導することができるアセンブリのことをいう。発現カセットは一般に、上述したような制御因子、例えば目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）に（その転写を誘導するように）動作可能に連結したプロモーターなどを含み、多くの場合、ポリアデニル化配列も含む。本発明のある実施形態において、本明細書に記載の発現カセットはプラスミド構築体内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築体は、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築体が一本鎖ＤＮＡとして存在することが可能となるシグナル（例えばＭ１３複製開始点）、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、及び「哺乳類」複製開始点（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス複製開始点）も含み得る。
【００６３】
「精製ポリヌクレオチド」は、対象とするポリヌクレオチドまたはその断片で、そのポリヌクレオチドが本来関連するタンパク質を実質的に含まない、例えば約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上は含有しないものをいう。対象とするポリヌクレオチドを精製する技術は、当該技術分野において公知であり、例えばカオトロピック剤によるポリヌクレオチドを含有する細胞の破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に従う沈降によるポリヌクレオチド（複数可）及びタンパク質の分離が挙げられる。
【００６４】
用語「形質移入」は、細胞による外来性ＤＮＡの取込みのことをいうために用いる。外来性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞は「形質移入」されている。複数の形質移入技術が当該技術分野において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｇｅｎｅ  １３：  １９７を参照。そのような技術を用いて１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。この用語は遺伝物質の安定的な取込み及び一過性の取込み両方のことをいい、ペプチド結合型または抗体結合型ＤＮＡの取込みを含む。
【００６５】
「ベクター」は核酸配列を標的細胞に移入することができる（例えばウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、及びリポソーム）。一般に、「ベクター構築体」、「発現ベクター」、及び「遺伝子移入ベクター」は、対象とする核酸の発現を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築体を意味する。したがって、この用語はウイルスベクターに加えてクローニング及び発現ビヒクルを含む。
【００６６】
用語「バリアント」、「アナログ」及び「ミューテイン」は、参照分子の生物学的に活性な誘導体で、所望の活性、例えばＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させ、上皮細胞増殖及び／または創傷治癒を促進する能力などを保持するものをいう。一般に、用語「バリアント」及び「アナログ」は、元の分子に対して、元のポリペプチド配列及び構造に１つ以上のアミノ酸の追加、置換（一般に性質が保存される）、及び／または欠失がある化合物で、これらの修飾が生物活性を消失させないものに限り、参照分子に対して以下に定義するように「実質的に相同」であるものをいう。一般に、こうしたアナログのアミノ酸配列は、２つの配列をアラインメントした場合、参照配列に対して高度な配列相同性、例えば５０％超、一般には６０％〜７０％超、より具体的には８０％〜８５％以上、例えば少なくとも９０％〜９５％以上などのアミノ酸配列相同性を有することになる。多くの場合、アナログは同じ数のアミノ酸を含むが、本明細書で説明する置換を含むことになるであろう。用語「ミューテイン」は、限定はしないがアミノ及び／またはイミノ分子のみを含む化合物を含めた１種以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチド、アミノ酸の１種以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、自然発生及び非自然発生（例えば合成）両方による置換結合及び当該技術分野において公知の他の修飾を有するポリペプチド、環状、分枝状分子などをさらに含む。この用語は、１種以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）及び他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子も含む。（ペプトイドの説明については、例えば米国特許第５，８３１，００５号；５，８７７，２７８号；及び５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  （２０００）  ７：４６３−４７３；ならびにＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９２）  ８９：９３６７−９３７１を参照。）ポリペプチドアナログ及びミューテインの作製方法は当技術分野において公知であり、以下でさらに説明する。
【００６７】
上で説明したように、アナログは一般に性質が保存される置換、すなわち側鎖に関連があるアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。具体的には、アミノ酸は一般に、（１）酸性―アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性―リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性―アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）無電荷極性―グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、及びチロシンの４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族アミノ酸に分類されることもある。例えば、ロイシンとイソロイシンもしくはバリンとの、アスパラギン酸とグルタミン酸との、スレオニンとセリンとの独立した置換、またはあるアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様の保存的置換は、生物活性に大きな影響を及ぼさないと合理的に予想可能である。例えば、対象とするポリペプチドは、分子の所望の機能がそのまま残る限り、最大約５〜１０個の保存的または非保存的アミノ酸置換、または最大約１５〜２５個の、もしくは５〜２５の間の任意の整数の保存的または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者であれば、当技術分野において公知のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ及びＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照して、対象とする分子の変化に耐えることのできる領域を容易に特定し得る。
【００６８】
用語「から誘導される」は、本明細書において分子の起源を特定するために用いるが、分子を作製する方法を限定する意図はなく、例えば、化学合成または組換え手段によることができる。
【００６９】
指定の配列「から誘導される」ポリヌクレオチドは、指定のヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち同一または相補的な、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチド配列のことをいう。誘導されるポリヌクレオチドは対象とするヌクレオチド配列から必ずしも物理的に誘導される必要はなく、ポリヌクレオチドが誘導される領域（複数可）における塩基の配列から得られる情報に基づく任意の様式で生成してよく、化学合成、複製、逆転写または転写が挙げられるがこれらに限定されない。そのため、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス方向のいずれをも示し得る。
【００７０】
ＩＩ．本発明を実施する様式
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されず、そのため当然変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、本発明の特定の実施形態のみを記述する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないと理解されたい。
【００７１】
本明細書に記載のものと類似または等価な複数の方法及び材料を本発明の実施に用いることができるが、本明細書には好ましい材料及び方法を記載する。
【００７２】
本発明は、ＨＢ−ＥＧＦを用いて口腔上皮における組織再生及び創傷治癒を促進することができるという発見に基づいている（実施例１を参照）。扁桃摘出術、例えば口蓋、咽頭または舌扁桃摘出などでの扁桃組織の外科切除で生じた創傷の上皮組織再生を促進する術後処置においてＨＢ−ＥＧＦを用いることができる。  加えて、場合によっては扁桃摘出と併用される手技であるアデノイド切除後にも、アデノイド組織の外科切除に起因する創傷の治癒を促進するためにＨＢ−ＥＧＦを用いることができる。
【００７３】
本発明の理解をさらに深めるために、扁桃摘出またはアデノイド切除後の治癒を促進するＨＢ−ＥＧＦの使用に関するより詳細な説明を以下に提供する。
【００７４】
Ａ．ＨＢ−ＥＧＦ
上で説明したように、本発明の方法は、扁桃摘出またはアデノイド切除後のＨＢ−ＥＧＦの術後投与を含む。本発明の実施においてＨＢ−ＥＧＦの任意の形態が用いられ得るが、ＨＢ−ＥＧＦの未成熟プロタンパク質形態及びプロタンパク質のタンパク質分解プロセスによって生成されるＨＢ−ＥＧＦの様々な活性形態が含まれ、ＨＢ−ＥＧＦの膜結合型及び可溶性形態、ならびにＨＢ−ＥＧＦ生物活性を保持する（例えば上皮細胞増殖及び創傷治癒を促進する）生物学的に活性な断片、バリアント、アナログ、及びこれらの誘導体が含まれる。
【００７５】
本発明の方法に用いるＨＢ−ＥＧＦは天然であっても、組換え技術により入手しても、合成的に生成してもよく、任意の起源に由来してよい。ＨＢ−ＥＧＦの未成熟プロタンパク質形態及びプロタンパク質のタンパク質分解プロセスによって生成されるＨＢ−ＥＧＦの様々な活性形態について、代表的なヒトＨＢ−ＥＧＦ配列を配列番号１〜４に示す。その他の代表的な配列は米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに記載されており、多数の異なる種に由来するＨＢ−ＥＧＦ配列が含まれている。例えば、ＮＣＢＩエントリー：受領番号：Ｌ１７０３２、Ｌ１７０３、ＮＰ＿００１９３６、ＮＭ＿００１９４５、ＮＰ＿０３７０７７、ＮＰ＿９９０１８０、ＮＰ＿００１１３７５６２、ＮＰ＿０３４５４５、ＮＰ＿００１１０４６９６、ＮＰ＿００１０９３８７１、ＸＰ＿００３８２９２４１、ＸＰ＿００５４２５４２６、ＮＰ＿００１２４４３９８、ＸＰ＿０１４１２６４４７、ＸＰ＿０１４１３１９３７、ＸＰ＿０１３９９８９４１、ＸＰ＿００５５２３５０４、ＸＰ＿００５６１７３３６、ＸＰ＿００５６１７３３５、ＸＰ＿００５６１７３３４、ＸＰ＿００５６１７３３３、ＸＰ＿８４８６１４、ＸＰ＿０１３９１４９０１、ＸＰ＿０１３８２１０６１、ＸＰ＿０１３８０９９８４、ＸＰ＿００５３８２０８８、ＸＰ＿００５３８２０８７、ＸＰ＿００５５０３７１３、ＸＰ＿００５３２７３４０、ＸＰ＿００５３５６０１４、ＸＰ＿００５２３８９３５、ＸＰ＿０１３０４７２７０、ＸＰ＿０１２９９６６９４、ＸＰ＿０１０８６９５２８、ＸＰ＿００５０６５３１８、ＸＰ＿００３４７７１９６、ＸＰ＿０１２９５６１５４、ＸＰ＿００４８４１９１７、ＸＰ＿００４７４４８７１、ＸＰ＿０１２８７５７９４、ＸＰ＿００４６９６７１８、ＸＰ＿００４６５２４８６、ＸＰ＿００２９３７７７３、ＸＰ＿００４６１００５２、ＸＰ＿００４５８６５３４、ＸＰ＿００４５８６５３３、ＸＰ＿０１２６９７５６６、ＸＰ＿００３７８２１８６、ＸＰ＿０１２６０４５４８、ＸＰ＿００４６８６８５５、ＸＰ＿０１２５０１８６３、ＸＰ＿０１２５０１８６２、ＸＰ＿０１２５０１８６１、ＸＰ＿００４３９７８４９、ＸＰ＿００２１９０９３１、ＸＰ＿００４２８０３３１、ＸＰ＿００３７５６６７６、ＸＰ＿００４６４３２８９、ＸＰ＿００４４７７８９３、ＸＰ＿００３２６６５１１、ＸＰ＿０１２３２７０１７、ＸＰ＿０１２００６０１６、ＸＰ＿０１２００６０１５、ＸＰ＿０１２００６０１４、ＸＰ＿０１２００６０１３、ＸＰ＿００４００８９１２、ＸＰ＿０１１７１４６４６、ＮＰ＿００１１５８６３９、及びＮＰ＿００１２７３２２０を参照。これらの配列（本出願の出願日までに登録されたもの）をすべて参照により本明細書に援用する。これらの配列のいずれか、またはその生物学的に活性な断片、もしくはそれ対して少なくとも約７０〜１００％の配列同一性を有する配列を含むそのバリアント（この範囲内の任意の一致率、例えば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％などの配列同一性を含む）を、本明細書に記載のＨＢ−ＥＧＦを含む組成物を作製するために用いることができる。加えて、ＨＢ−ＥＧＦは翻訳後修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化などを含み得る。本発明を実施するために任意のＨＢ−ＥＧＦ源を用いることができるが、特に処置を受ける対象がヒトの場合には、ＨＢ−ＥＧＦはヒト起源に由来することが好ましい。
【００７６】
本発明の様々な実施形態において、完全なＨＢ−ＥＧＦプロタンパク質（配列番号１）またはこの２０８アミノ酸プロタンパク質の切断によって得られる任意の生物学的に活性なポリペプチドが本明細書に記載の方法に用いられ得る。ＨＢ−ＥＧＦの生物学的に活性な断片は一般に、全長ＨＢ−ＥＧＦプロタンパク質の少なくとも約４０〜２００の連続したアミノ酸残基を含むことになるであろうが、全長分子の少なくとも約６０〜１００の連続したアミノ酸残基を含んでもよく、全長分子の少なくとも約７０〜９０、もしくはこれよりも多くの、または４０アミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。ただし、当該断片が生物活性、例えばＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させる能力などを保持する場合に限る。加えて、ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドは扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた手術創における上皮細胞増殖及び治癒を促進し得る。ある実施形態においては、配列番号２〜４からなる群から選択されるポリペプチドを創傷の術後処置に用いる。
【００７７】
本発明の方法に有用な組成物は、任意の種に由来するＨＢ−ＥＧＦのバリアントをはじめとしたＨＢ−ＥＧＦの生物学的に活性なバリアントを含み得る。そのようなバリアントは天然ポリペプチドの所望の生物活性を保持するはずであり、そのためバリアントを含む医薬組成物は、対象に投与した場合に天然ＨＢ−ＥＧＦを含む医薬組成物と同様の治療効果をもたらす。すなわち、バリアントポリペプチドは、天然ＨＢ−ＥＧＦについて観察されるのと同様の形で医薬組成物中の治療有効成分として働くことになるであろう。バリアントポリペプチドが所望の生物活性を保持し、それゆえに医薬組成物中の治療有効成分として働くかどうかを判断する方法が当該技術分野において利用可能である。バリアントポリペプチドの創傷治癒に対する効果を評価するための本明細書に記載のアッセイ（実施例１を参照）をはじめとして、天然ＨＢ−ＥＧＦの活性を測定するために特異的に設計されたアッセイを用いて生物活性を測定することができる。加えて、生物学的に活性な天然ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドに対して産生される抗体のバリアントポリペプチドに結合する能力について試験することができ、有効に結合していれば、ポリペプチドは天然ＨＢ−ＥＧＦのものと類似の構造を有することを示す。
【００７８】
天然または自然発生ＨＢ−ＥＧＦの好適な生物学的に活性なバリアントは、上で定義したようなＨＢ−ＥＧＦポリペプチドの生物学的に活性な断片、アナログ、ミューテイン、及び誘導体とすることができる。例えば、ＨＢ−ＥＧＦのアミノ酸配列バリアントは、対象とする天然ペプチドをコードするクローニングしたＤＮＡ配列中に変異を導入することによって調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列変更の方法は当該技術分野において公知である。例えばＷａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，  ｅｄｓ．  （１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７−３８２；  ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；米国特許第４，８７３，１９２号；及びこれらの中で引用されている参照文献を参照。これらを参照により本明細書に援用する。対象とするペプチドの生物活性を損なわない適切なアミノ酸置換についての教示は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得るが、これを参照により本明細書に援用する。保存的置換、例えばあるアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸との置換などが好まれ得る。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、及びＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
残基置換、欠失、または挿入によって変更することのできるＨＢ−ＥＧＦの領域についての教示は、当該技術分野において見出すことができる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９（４）：２５４１−２５４９、Ｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２２（４）：２５３−６０、Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３（１２）：１９３５−１９４６、Ｎａｎｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２０（２）：３７６−８２、Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７  （９）：６２０５−６２１２、Ｍｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０（３）：１０１５−１０１９、Ｌｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １（１）：６７−７８、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（２４）：１８２８４−１８２９０、Ｈｏｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３７５（４）：５０６−５１１、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．  ４０（２）：２１３−２３０、Ｄａｖｉｓ−Ｆｌｅｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １９（２）：１２７−１４３、及びＳｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ９（４）：２４４−２５０に説明されている構造／機能の関係及び／または結合試験を参照。これらの全内容を参照により本明細書に援用する。
【００８０】
ＨＢ−ＥＧＦのバリアントを構築する際に、バリアントが所望の活性を保有し続けるように修飾を行う。当然ではあるが、バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡに行われるいかなる変異によっても配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、また、二次ｍＲＮＡ構造となるおそれのある相補的領域を形成しないことが好ましい。
【００８１】
ＨＢ−ＥＧＦの生物学的に活性なバリアントは一般に、比較の基準の役割を果たす参照ＨＢ−ＥＧＦペプチド分子のアミノ酸配列（例えばプロＨＢ−ＥＧＦ（配列番号１）またはプロタンパク質のタンパク質分解プロセスによって生成されるＨＢ−ＥＧＦの成熟形態（配列番号２〜４））に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％以上、最も好ましくは少なくとも約９８％〜９９％以上のアミノ酸配列同一性を有することになるであろう。バリアントは、例えばわずか１〜１５アミノ酸残基だけ、わずか１〜１０残基、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、さらには１アミノ酸残基などだけ異なり得る。
【００８２】
２つのアミノ酸配列の最適アラインメントに関して、バリアントアミノ酸配列の連続したセグメントは、参照アミノ酸配列に対して、同じ数のアミノ酸、追加のアミノ酸残基、または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に用いられる連続したセグメントは、典型的に少なくとも８個の連続したアミノ酸残基を含むことになり、１０、１２、１３、１７、３６、４０、５０、６０、７０またはこれよりも多くのアミノ酸残基であり得る。保存残基置換またはギャップに関連する配列同一性の補正を行うことができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを参照）。対象とする天然ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、天然ポリペプチドとわずか１〜２０アミノ酸だけ異なり得るが、わずか１〜１５、わずか１〜１０、例えば６〜１０、またはわずか５、加えてわずか４、３、２、さらには１アミノ酸残基だけ異なるといった場合が含まれる。
【００８３】
ＨＢ−ＥＧＦ活性を有するポリペプチドの正確な化学構造は複数の因子に左右される。分子内にイオン性のアミノ基及びカルボキシル基が存在するので、特定のポリペプチドは酸性もしくは塩基性塩として、または中性形態で得られ得る。好適な環境条件に置いた場合に生物活性を保持するこうしたすべての調製物が、本明細書で用いる場合のＨＢ−ＥＧＦ活性を有するポリペプチドの定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分（グリコシル化）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた誘導体化によって付加され得るか、または他の副次的な分子、例えば脂質、リン酸基、アセチル基、メチル基、もしくはピログルタミル基などが付加され得る。糖類との結合によっても付加され得る。ある態様ではこうした付加は産生宿主の翻訳後プロセシングシステムによって行われ、他ではそのような修飾はインビトロで導入され得る。いずれにせよ、そのような修飾は、ポリペプチドのＨＢ−ＥＧＦ活性が損なわれていない限り、本明細書で用いるＨＢ−ＥＧＦポリペプチドの定義に含まれる。そのような修飾は、様々なアッセイにおいて、ポリペプチドの活性の向上または減少いずれかによって、活性に定量的または定性的な影響を及ぼし得ることが予想される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元、または他の誘導体化によって修飾してもよく、ポリペプチドを切断して活性を保持する断片を得てもよい。活性を損なわないこうした変化によって、そのポリペプチド配列が本明細書で用いる場合の対象とするＨＢ−ＥＧＦポリペプチドの定義から除外されることはない。
【００８４】
ＨＢ−ＥＧＦバリアントの調製及び使用に関しては、当該技術分野から十分な教示が得られる。ＨＢ−ＥＧＦバリアントの調製において、天然ＨＢ−ＥＧＦヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの修飾によって、本発明の方法に用いられる医薬組成物の治療有効成分としての使用に適したバリアントが得られるかは、当業者であれば容易に判断することができる。さらに、組換えＨＢ−ＥＧＦは、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、及びＰｒｏＳｐｅｃ  （Ｎｅｓｓ−Ｚｉｏｎａ，  Ｉｓｒａｅｌ）から市販もされている。
【００８５】
Ｂ．ＨＢ−ＥＧＦの製造
ＨＢ−ＥＧＦは、任意の好適な様式（例えば組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）及び様々な形態（例えば天然、変異、グリコシル化、リン酸化、脂質化、融合、標識化など）で調製することができる。ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドとしては、自然発生ポリペプチド、組換え製造ポリペプチド、合成製造ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せによって製造されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドを調製する手段は当該技術分野においてよく理解されている。ポリペプチドは実質的に純粋な形態（すなわち他の宿主細胞タンパク質または非宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）に調製されることが好ましい。
【００８６】
一実施形態において、組換え技術を用いてポリペプチドを生成する。当業者であれば、標準的手法及び本明細書の教示を用いて、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。オリゴヌクレオチドプローブを公知の配列に基づいて設計し、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを探査するために用いることができる。その後、標準的な技術、及び例えば遺伝子を全長配列の所望の部分で切断するために用いられる制限酵素を用いて、配列をさらに単離することができる。同様に、公知の技術、例えばフェノール抽出などを用いて、対象とする配列を含有する細胞及び組織から直接これを単離し、配列にさらなる操作を行って所望の切断を得ることができる。ＤＮＡを取得及び単離するために用いる技術の説明については、例えば、上述したＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照。
【００８７】
ポリペプチドをコードする配列は、例えば、公知の配列に基づいて合成的に製造することもできる。所望する特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンでヌクレオチド配列を設計することができる。完全な配列は一般に、標準的な方法によって調製された完全なコード配列に組み立てられる重なり合ったオリゴヌクレオチドから構築される。例えばＥｄｇｅ  （１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照。
【００８８】
組換え技術を用いてポリペプチドをコードする配列が容易にクローニングされ、その後、所望のアミノ酸のコドンが得られる適切な塩基対（複数可）の置換によって、この配列にインビトロで変異誘発を行うことができる。こうした変化は、単一のアミノ酸の変化をもたらすわずか１塩基対だけを含んでもよく、複数の塩基対変化を包含してもよい。あるいは、ミスマッチ二重鎖の融解温度未満の温度で親ヌクレオチド配列（一般にＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）にハイブリダイズするミスマッチプライマーを用いて変異を引き起こすことができる。プライマー長及び塩基組成を比較的狭い制限内に収め、変異塩基を中央に配置しておくことによって、プライマーを特異的とすることができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９０）  ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８３）  １００：４６８を参照。ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長を引き起こし、生成物をクローニングし、変異ＤＮＡを含有するクローンをプライマー伸長鎖の分離によって取得し選別する。変異プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いて選別を行うことができる。この技術は複数点変異の生成にも適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９８２）  ７９：６４０９を参照。
【００８９】
いったんコード配列を単離及び／または合成したら、発現のために任意の好適なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。（実施例も参照。）本明細書の教示から明らかとなるように、欠失または変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、様々な組合せで動作可能に連結する発現構築体を作製することによって、修飾ポリペプチドをコードする様々なベクターを生成することができる。
【００９０】
多数のクローニングベクターが当業者にとって公知であり、適切なクローニングベクターの選択は好みの問題である。クローニング用組換えＤＮＡベクター及びそれにより形質転換することができる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びウシ乳頭腫ウイルス（哺乳類細胞）が挙げられる。一般に、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ＆  ＩＩ（上記）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ（上記）を参照。
【００９１】
昆虫細胞発現系、例えばバキュロウイルス系などを用いることもでき、当業者にとっては公知であり、例えばＳｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  １５５５  （１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料及び方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキット形態で市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。
【００９２】
植物発現系を用いて本明細書に記載のＨＢ−ＥＧＦポリペプチドを製造することもできる。一般に、そのような系ではウイルスベースのベクターを用いて植物細胞に異種遺伝子を形質移入する。そのような系の説明については、例えば、Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  （１９９６）  ５：２０９−２２１；及びＨａｃｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９４）  １３９：１−２２を参照。
【００９３】
Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９３）  ６７：４０１７−４０２６及びＳｅｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９３）  ７４：１１０３−１１１３に記載されているような、ウイルス系、例えばワクシニアベースの感染／形質移入系なども本発明に有用となるであろう。この系では、まずインビトロで細胞にバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を形質移入する。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを有する鋳型のみを転写するという点で鋭敏な特異性を示す。感染後、Ｔ７プロモーターによって誘発される対象とするＤＮＡを細胞に形質移入する。細胞質中でワクシニアウイルス組換え体から発現されるポリメラーゼは形質移入ＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮＡはその後宿主の翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡ及びその翻訳産物（複数可）の高レベルな一過性細胞質生産を提供する。
【００９４】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、この発現構築体を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞内でＲＮＡに転写されるように、遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）、及び任意によりオペレーター（本明細書では一括して「制御」因子と呼ぶ）の制御下に置くことができる。コード配列は、シグナルポリペプチドまたはリーダー配列を含有してもよく、しなくてもよい。本発明においては、自然発生シグナルポリペプチド及び異種配列の両方を用いることができる。リーダー配列は翻訳後プロセシングで宿主によって除去されてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；第４，４２５，４３７号；第４，３３８，３９７号を参照。そのような配列としては、ＴＰＡリーダー及びミツバチメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
宿主細胞の成長に関するタンパク質配列の発現の調節を可能とする他の調節配列も望ましい場合がある。そのような調節配列は当業者にとって公知であり、例としては、調節化合物の存在を含めた化学的または物理的刺激に反応して、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。他の種類の調節要素、例えばエンハンサー配列もベクター中に存在してよい。
【００９６】
制御配列及び他の調節配列はベクターへの挿入前にコード配列に結合させてよい。あるいは、制御配列及び適切な制限部位をすでに含有する発現ベクターにコード配列を直接クローニングすることができる。
【００９７】
場合によっては、適切な方向で制御配列に結合し得るように、すなわち適切なリーディングフレームを維持するために、コード配列の修飾が必要なこともある。変異体またはアナログは、タンパク質をコードする配列の一部の欠失によって、配列の挿入によって、及び／または配列中の１つ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。ヌクレオチド配列を修飾する技術、例えば部位特異的変異誘発などは当業者にとって公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（上記）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（上記）を参照。
【００９８】
その後、発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換する。複数の哺乳類細胞株が当該技術分野において公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば限定はしないがチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ｖｅｒｏ２９３細胞などが挙げられる。同様に、細菌宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．などが本発現構築体に有用となる。本発明において有用な酵母菌宿主としては、とりわけＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏ  ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターとともに用いる昆虫細胞としては、とりわけＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００９９】
選択した発現系及び宿主に応じて、対象とするタンパク質が発現される条件下において上記の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を成長させることによって、本発明の融合タンパク質を産生する。適切な成長条件の選択は当業者の技能範囲内である。
【０１００】
一実施形態において、形質転換細胞は周囲の培地中にポリペプチド産物を分泌する。タンパク質産物の分泌を向上させる特定の調節配列をベクター中に含めることができ、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列、インターフェロン（γもしくはα）シグナル配列、または公知の分泌タンパク質由来の他のシグナルポリペプチド配列を用いる。その後、本明細書に記載の様々な技術によって、例えば限定はしないがヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの標準的な精製技術を用いて、分泌ポリペプチド産物を単離することができる。
【０１０１】
あるいは、細胞は溶解するが組換えポリペプチドは実質的に完全な状態を保つ化学的、物理的または機械的手段を用いて、形質転換細胞を破壊する。細胞内タンパク質は、ポリペプチドの漏出が生じるように細胞壁または膜から構成成分を除去することによって、例えば界面活性剤または有機溶媒の使用によっても得ることができる。そのような方法は当業者にとって公知であり、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  （Ｓｉｍｏｎ  Ｒｏｅ，  Ｅｄ．，  ２００１）に記載されている。
【０１０２】
例えば、本発明で用いる細胞の破壊方法としては、音波処理または超音波処理；攪拌；液体または固体押出；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧衝撃；トリプシン、ノイラミニダーゼ及びリゾチームなどのプロテアーゼを含めた溶菌酵素での処理；アルカリ処理；ならびに界面活性剤及び溶媒、例えば胆汁酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトン、ＮＰ４０及びＣＨＡＰＳなどの使用が挙げられるが、これらに限定されない。細胞を破壊するためにどの技術を用いるかは概して好みの問題であり、ポリペプチドが発現される細胞型、培養条件及び用いたあらゆる前処理に依存することになるであろう。
【０１０３】
細胞の破壊後、一般に遠心分離によって細胞片を除去し、限定はしないがカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの標準的な精製技術を用いて、細胞内で産生されたポリペプチドをさらに精製する。
【０１０４】
例えば、本発明の細胞内ポリペプチドを得る一方法は、抗体（例えば既製の抗体）を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィー、またはレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるなどのアフィニティー精製を伴う。特に好ましいレクチン樹脂はマンノース部分を認識するものであり、例えば限定はしないがＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン（ＧＮＡ）、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡまたはレンチルレクチン）、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡまたはエンドウレクチン）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓアグルチニン（ＮＰＡ）及びＡｌｌｉｕｍ  ｕｒｓｉｎｕｍアグルチニン（ＡＵＡ）から誘導される樹脂などである。好適なアフィニティー樹脂の選択は当業者の技能範囲内である。アフィニティー精製後、上記の技術のいずれかによるなど、当該技術分野において公知の従来技術を用いてポリペプチドをさらに精製することができる。
【０１０５】
ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドは、例えばペプチド分野の当業者にとって公知のいくつかの技術のいずれかによって簡便に化学合成することができる。例えば、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｗ．  Ｃ．  Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．  Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０００）；Ｎ．  Ｌｅｏ  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００５）；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｈｏｗｌ  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １ｓｔ  ｅｄ．，  ２００５）；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｔｈｅ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，  Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，  ａｎｄ  Ｍａｒｃｏ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｅｒｔ  ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９９）を参照。これらを参照により本明細書に援用する。
【０１０６】
一般に、こうした方法では成長中のペプチド鎖への１つ以上のアミノ酸の連続的な付加を用いる。通常は、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを好適な保護基によって保護する。保護したまたは誘導体化したアミノ酸は、その後、不活性固体支持体に結合させるか、または溶液中で用いるかのいずれかとすることができ、アミド結合の形成を可能とする条件下で、相補的な（アミノまたはカルボキシル）基が適切に保護されている、配列における次のアミノ酸を付加する。その後、新たに付加したアミノ酸残基から保護基を除去してから、次のアミノ酸（適切に保護した）を付加し、以下同様に行う。所望のアミノ酸を連結させて適切な配列とした後、残ったあらゆる保護基（及び固相合成法を用いた場合はあらゆる固体支持体）を順次または同時に除去して最終ポリペプチドを得る。この基本手順の簡単な修正によって、例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護トリペプチドと適切に保護されたジペプチドとを結合させ、脱保護後、ペンタペプチドを形成することによって、成長鎖に２つ以上のアミノ酸を一度に付加することが可能である。例えば、固相ペプチド合成法についてはＪ．  Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ  １９８４）及びＧ．  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｖｏｌ．  ２，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０），  ｐｐ．  ３−２５４；また、古典的溶液合成についてはＭ．  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４）及びＥ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｅｄｓ．，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １を参照。これらの方法は一般に比較的小さい、すなわち最大約５０〜１００アミノ酸の長さのポリペプチドに用いられるが、より大きなポリペプチドにも適用可能である。
【０１０７】
典型的な保護基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｚｌ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどが挙げられる。
【０１０８】
典型的な固体支持体は架橋ポリマー支持体である。これらにはジビニルベンゼン架橋スチレン系ポリマー、例えばジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレンコポリマー、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレンコポリマー及びジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーを挙げることができる。
【０１０９】
他の方法、例えば同時多重ペプチド合成法などによっても、ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドを化学的に調製することができる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８５）  ８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照。
【０１１０】
Ｃ．医薬組成物
ＨＢ−ＥＧＦは、薬学的に許容可能な１種以上の添加物を任意により含む医薬組成物に製剤化することができる。例示的な添加物としては、限定はしないが炭水化物、無機塩、抗菌剤、酸化防止剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、及びこれらの組合せが挙げられる。注入用組成物に適した添加物としては、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、及び界面活性剤が挙げられる。炭水化物、例えば糖、誘導体化糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖及び／または糖ポリマーなどが添加物として存在し得る。具体的な炭水化物添加物としては、例えば単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；及びアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどが挙げられる。添加物としては、無機塩または緩衝剤、例えばクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム及びこれらの組合せなどを挙げることもできる。
【０１１１】
本発明の組成物は、微生物の生育を防止または阻止するための抗菌剤も含むことができる。本発明に好適な抗菌剤の非限定例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びこれらの組合せが挙げられる。
【０１１２】
酸化防止剤も組成物中に存在することができる。酸化防止剤は酸化を防止し、それによってＨＢ−ＥＧＦまたは調製物の他の成分の劣化を防止するために用いられる。本発明で用いるのに適した酸化防止剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム及びこれらの組合せが挙げられる。
【０１１３】
界面活性剤が添加物として存在することができる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート、例えば「Ｔｗｅｅｎ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ８０」など、ならびにプルロニック、例えばＦ６８及びＦ８８（ＢＡＳＦ，  Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）など；ソルビタンエステル；脂質、例えばレシチン及び他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質（ただしリポソーム形態でないことが好ましい）、脂肪酸ならびに脂肪酸エステルなど；ステロイド、例えばコレステロールなど；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；ならびに亜鉛及び他のそのような好適なカチオンが挙げられる。
【０１１４】
酸または塩基が添加物として組成物中に存在することができる。用いることのできる酸の非限定例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定はしないが水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フメル酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｕｍｅｒａｔｅ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【０１１５】
組成物中のＨＢ−ＥＧＦの量（例えば薬物送達システム中に含有される場合）は複数の要因に依存して変化するが、組成物が単位投与量の形態または容器（例えばバイアル）にある場合、最適には治療有効投与量となるであろう。治療有効投与量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントをもたらすのかを決定するために、組成物の量を増加させて繰り返し投与することによって、実験的に決定することができる。
【０１１６】
組成物中のあらゆる個々の添加物の量は、添加物の性質及び機能ならびに組成物の特定の必要性に依存して変化することになるであろう。典型的には、個々の添加物の最適量は定型的な実験を通して、すなわち、様々な量（少量から多量の範囲）の添加物を含有する組成物を調製し、安定性及び他のパラメータを調べて、有意な悪影響を及ぼすことなく最適な性能が得られる範囲を決定することによって求められる。しかし、一般に、添加物（複数可）は約１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜約９８重量％、より好ましくは約１５重量％〜約９５重量％の添加物の量で組成物中に存在することになるであろうが、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。こうした上述の医薬品添加物は、他の添加物とともに、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  （１９９５）、”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，  ５２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  Ｍｏｎｔｖａｌｅ，  ＮＪ  （１９９８）、及びＫｉｂｂｅ，  Ａ．Ｈ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ２０００に記載されている。
【０１１７】
組成物はすべてのタイプの製剤、特に注入に適したもの、例えば使用前に溶媒で再構成することのできる粉末または凍結乾燥体、加えて、即注入可能な溶液または懸濁液、使用前にビヒクルと組み合わせる乾燥不溶性組成物、ならびに乳濁液及び投与前に希釈する原液を包含する。注入前に固体組成物を再構成するのに適した希釈剤の例としては、注入用静菌水、５％ブドウ糖水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びこれらの組合せが挙げられる。液体医薬組成物については、溶液及び懸濁液が想定される。別の好ましい組成物としては、経口、表面、または局所送達用のものが挙げられる。
【０１１８】
本発明の医薬調製物は、意図する送達及び使用の様式に応じて、シリンジ、埋め込みデバイス、マイクロニードル注入システムなどに入れることもできる。好ましくは、本明細書に記載のように調製されたＨＢ−ＥＧＦを含む組成物は、計量済みまたは包装済み形態の単位剤形、すなわち単回投与に適切な本発明の複合物または組成物の量である。
【０１１９】
本発明の組成物は任意により、１種以上の追加の作用物質、例えば扁桃摘出もしくはアデノイド切除によって生じた創傷を処置するための他の薬剤、または対象の容態もしくは疾患を処置するために用いられる他の医薬品などを含んでよい。ＨＢ−ＥＧＦ及び術後創を処置するための１種以上の他の薬剤、例えば限定はしないが鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、抗炎症剤、新生血管形成を減少させる物質、新生上皮の接着性を増加させる物質、新生上皮の剥離を減少させる物質、または他の成長因子、もしくは創傷治癒を促進する他の作用物質などを含む配合調製物が特に好ましい。あるいは、ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物とは別個の組成物中にこのような作用物質を含有させ、ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物と同時、その前、またはその後に共投与することができる。
【０１２０】
Ｄ．投与
ＨＢ−ＥＧＦによる少なくとも１回の治療有効サイクルの処置が、創傷を処置するために対象に施されることになるであろう。「治療有効サイクルの処置」とは、扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた手術創に対する個体の処置に対して、施された場合に有益な治療反応をもたらす１サイクルの処置を意味する。術後創治癒を改善するＨＢ−ＥＧＦによる１サイクルの処置を特に対象とする。扁桃摘出またはアデノイド切除後の創傷治癒の改善には、創傷が治癒する速度の増加、創傷を出血しやすくさせる新たな血管が形成する量の減少、または創傷の治癒の間もしくは後の残った瘢痕もしくはケロイドもしくは壊死組織形成の程度の軽減が含まれ得る。加えて、治療有効投与量または治療有効量は術後出血を軽減または予防し得る。
【０１２１】
ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ及び／または１種以上の他の治療薬、例えば手術創を処置するための他の成長因子もしくは薬剤もしくは作用物質、または他の医薬品などを含む組成物の治療有効投与量を複数回投与することになる。本発明の組成物は、典型的には経口的に、注入（皮下、静脈内、もしくは筋肉内）によって、点滴によって、表面に、または局所的に投与されるが、必ずしもこれらに限らない。別の投与様式、例えば動脈内、経肺、経皮、皮内、経粘膜、経直腸、膣内なども企図する。
【０１２２】
本発明による調製物は局所処置にも好適である。特定の実施形態では、例えば、扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた創傷の処置のためのＨＢ−ＥＧＦの局所送達に、本発明の組成物を用いる。創傷の表面上または創傷の付近に直接組成物が投与され得る。例えば、組成物はマイクロニードル注入、創傷への組成物の噴霧によって、または表面ペーストとして投与され得る。組成物を創傷被覆材に添加してもよい。あるいは、ウォッシュ、うがい薬、またはリンスとして組成物を経口投与してもよい。創傷治癒の必要な部位がＨＢ−ＥＧＦの標的となるように特定の調製物及び適切な投与の方法を選択する。
【０１２３】
医薬調製物は投与の直前に溶液または懸濁液の形態とすることができるが、別の形態、例えばシロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリックス、座薬などとしてもよい。ＨＢ−ＥＧＦ及び他の作用物質を含む医薬組成物は、当該技術分野において公知の医学的に許容可能な方法に従って、同じまたは異なる投与経路を用いて投与され得る。
【０１２４】
別の実施形態では、ＨＢ−ＥＧＦ及び／または他の作用物質を含む医薬組成物を予防的に、例えば扁桃摘出後出血を予防するために投与する。そのような予防的使用は、扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた創傷の治癒機能に障害のある、または治癒が遅れている容態を患う対象にとって特に有益となる。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、ＨＢ−ＥＧＦ及び／または他の作用物質を含む医薬組成物は、徐放性製剤形態、または徐放デバイスを用いて投与される製剤形態である。そのようなデバイスは当該技術分野において公知であり、例えば経皮パッチ、及び非徐放性医薬組成物で徐放効果を得るために、様々な投与量において連続した定常的な形で長時間にわたる薬物送達をもたらすことのできる小型埋め込みポンプが挙げられる。
【０１２６】
本発明は、複合物または組成物中に含有されたＨＢ−ＥＧＦでの処置に反応を示す容態を患う患者に、本明細書に規定のＨＢ−ＥＧＦを含む複合物を投与する方法も提供する。この方法は、好ましくは医薬組成物の一部として提供される治療有効量の複合物または薬物送達システムを、本明細書に記載の様式のいずれかによって投与することを含む。この投与方法を用いて、ＨＢ−ＥＧＦによる処置に反応を示す任意の容態が処置され得る。より具体的には、本明細書に記載の組成物は扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた創傷の処置に有効である。
【０１２７】
当業者であれば、どの容態をＨＢ−ＥＧＦで効果的に処置することができるか認識しているであろう。実際に投与される投与量は、年齢、体重、及び対象の全身状態、ならびに処置中の容態の重症度、医療従事者の判断、及び投与されている複合物に応じて変化することになる。治療有効量は、当業者であれば決定することができ、個々の症例それぞれにおける特定の要件に適合したものとなる。投与されるＨＢ−ＥＧＦの量は、ＨＢ−ＥＧＦの特定の形態（例えば成熟ＨＢ−ＥＧＦまたはプロＨＢ−ＥＧＦ）の効力ならびに創傷の上皮化及び治癒に対するその効果の大きさ、ならびに投与経路に依存することになる。
【０１２８】
本明細書に記載のように調製した（この場合もまた医薬調製物の一部として提供されることが好ましい）ＨＢ−ＥＧＦは、単独で、または術後創を処置するための１種以上の他の治療薬、例えば限定はしないが鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、抗炎症剤、新生血管形成を減少させる物質、新生上皮の接着性を増加させる物質、新生上皮の剥離を減少させる物質、もしくは他の成長因子、もしくは創傷治癒を促進する他の作用物質、または臨床医の判断、患者の要求などに依存する様々な投与スケジュールに従って特定の容態もしくは疾患を処置するために用いられる他の医薬品などと組み合わせて投与することができる。具体的な投与スケジュールは当業者にとって公知であるか、定型的な方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投与スケジュールとしては、限定はしないが１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、及びこれらの任意の組合せの投与が挙げられる。好ましい組成物は１日２回以上の投与を必要としないものである。
【０１２９】
ＨＢ−ＥＧＦは他の作用物質の前、それと同時、またはその後に投与することができる。他の作用物質と同時に供給する場合、ＨＢ−ＥＧＦは同じまたは異なる組成物で供給することができる。したがって、ＨＢ−ＥＧＦ及び１種以上の他の作用物質は併用療法によって個体に提供することができる。「併用療法」とは、治療を受けている対象に物質の組合せの治療効果がもたらされるような対象への投与を意味する。例えば、併用療法は、特定の投与計画に従って、ＨＢ−ＥＧＦを含むある投与量の医薬組成物、及び少なくとも１種の他の作用物質、例えば創傷を処置するための別の成長因子または薬剤などを含むある投与量の医薬組成物を投与することによって行われ得るが、これらの投与量は併せて治療有効投与量を構成する。同様に、ＨＢ−ＥＧＦ及び１種以上の他の治療薬は少なくとも１回の治療投与量で投与することができる。別々の医薬組成物の投与は、治療を受けている対象にこれらの物質の組合せの治療効果がもたらされる限り、同時にまたは別々に（すなわち同じ日にいずれかの順で順次、または異なる日に）行うことができる。
【０１３０】
Ｅ．キット
本発明はまた、ＨＢ−ＥＧＦ及び任意により扁桃摘出またはアデノイド切除によって生じた創傷を処置するための１種以上の他の薬剤、例えば限定はしないが鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、抗炎症剤、新生血管形成を減少させる物質、新生上皮の接着性を増加させる物質、新生上皮の剥離を減少させる物質、または他の成長因子、もしくは創傷治癒を促進する他の作用物質などを含む組成物が入っている１つ以上の容器を含むキットも提供する。組成物は液体形態とすることもでき、凍結乾燥することもできる。組成物に適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックをはじめとした様々な材料から形成することができる。容器は滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は皮下注射針で刺し通すことのできる栓を有する静注液バッグまたはバイアルであり得る）。
【０１３１】
キットは、薬学的に許容可能な緩衝剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、またはブドウ糖液などを含む第２の容器をさらに含むことができる。また、他の薬学的に許容可能な製剤溶液、例えば緩衝剤など、希釈剤、フィルター、注射針、及びシリンジまたは他の送達デバイスをはじめとして、エンドユーザーに有用な他の材料も含むことができる。送達デバイスは組成物で充填済みであってもよい。
【０１３２】
キットは、本明細書に記載する扁桃摘出創の術後処置の方法を記載した説明書を含む添付文書も含むことができる。添付文書は未承認の添付文書草案とすることもでき、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認された添付文書とすることもできる。
【実施例】
【０１３３】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は、例示目的のみのために提供し、決して本発明の範囲を限定することを意図してはいない。
【０１３４】
用いる数値（例えば、量、温度など）については、正確性を確保するように努めたが、ある程度の実験誤差及び偏差が当然許容されるべきである。
【０１３５】
実施例１
扁桃摘出後の二次出血：マウス舌モデルでの上皮剥離及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子を用いた予防の可能性
扁桃摘出後の創傷治癒及び扁桃摘出後出血（ＰＴＨ）をもたらす要因は十分に解明されてはいない。本研究ではマウスモデルにおける口腔創傷治癒を評価し、成長因子（ＧＦ）がＰＴＨに対する潜在的な予防手段となり得るかどうか調査することを試みた。
【０１３６】
方法
すべての動物研究はＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験動物ケア管理委員会によって承認された。すべての実験に用いたすべてのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｆｌｏｒｉｄａ，  ＵＳＡ）から購入した６〜１０週齢の雌ＣＢＡ／ＣＡＪ（１５〜２５ｇ）マウスであった。すべての外科的介入は、吸入イソフルランを導入には３〜４％、維持には１〜２％で用いて実施した。
【０１３７】
舌創傷の形成
吸入麻酔の投与後、創傷を形成するための２ｍｍのパンチ生検（Ｍｉｌｔｅｘ，  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，  Ｎ．Ｊ．）を用いて画一化した創傷を、顕微鏡可視化の下で、各マウスの舌前部、外側縁上の尖部の付近に舌筋系の深さまで形成した。
【０１３８】
処置群
マウスを混合されない形で処置群及び対照群の２つの群にランダム化した。各群は４２匹のマウスを含み、１日目から１４日目まで毎日３匹のマウスを屠殺した。
【０１３９】
処置群マウスにはＨＢ−ＥＧＦ（５μｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｓｐｅｃ  Ｂｉｏ）を筋肉内注射により創傷の底部に毎日投与した。対照群マウスには滅菌生理食塩水を筋肉内注射により創傷の底部に毎日投与した。両群への注入は手技の日の０日目から始めてデータ収集の終わりの１４日目まで毎日実施した。すべてマウスにおいて、マウスが麻酔から回復する底部への注入の直後に、ＨＢ−ＥＧＦまたは生理食塩水を浸漬させたゲルフォームを創傷内に配置した。
【０１４０】
動物の屠殺及び組織の採取
屠殺及び組織採取スケジュールは処置及び対照群で同じとした。両群において、手技後の最初の日である１日目から始めて１４日目まで毎日３匹のマウスを屠殺した。麻酔下での頚椎脱臼によって屠殺を行った。屠殺の直後に、組織学的検査のために治癒中の創傷を含む舌を切除してホルマリン中に固定した。
【０１４１】
組織学的検査
以前に公表された技術（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ．  ２１（９−１０）：  １４８３−１４９４；Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １２０（１０）：２０６１−２０７０；これらを参照により本明細書に援用する）に従って、舌サンプルに対して組織学的検査を行った。簡潔に述べると、４ｍｍのパンチ生検を用いて、創傷領域を組織サンプルの中央として創傷領域全体を採取した。舌創傷の平面に垂直に切片を切り出した。
【０１４２】
創傷の評価
各創傷の顕微鏡写真を作成した。写真をコード化し、写真を評価する本発明者らを、組織画像が処置群のものか、または対照群のものかに対して、及び互いの反応に対して盲検化した。各創傷を以下の基準に基づいて評価した。
−創床の開閉、
−上皮の厚さ、
−ケラチンの厚さ、
−肉芽組織の厚さ、
−新生血管形成の存在、
−下層の基底膜からの上皮の剥離、ならびに
−紡錘形細胞の増殖及び収縮。
【０１４３】
その後、写真のコード化を解除して結果を組み合わせた。
【０１４４】
統計解析
ＳＴＡＴＡ  １３．１ソフトウェアを用いて統計解析を行った。平均値の比較について対応のある両側ｔ検定を用いて厚さの差異を解析し、ピアソンのカイ二乗検定を用いて生検後の所与の日数での上皮剥離、創傷閉鎖及び創傷再開放を比較した。
【０１４５】
結果
プロトコールは狂いなく実施した。結果を図１Ａ〜１Ｄ及び図２Ａ〜２Ｄに示し、表１にまとめる。対照群と比較して、ＨＢ−ＥＧＦを注入した実験群における創傷は、統計的に有意ではなかったが（ｐ＝０．２５）創傷閉鎖前の肉芽組織の厚さの増加（３３μｍに対して４７μｍ）、創傷閉鎖前の上皮の厚さの増加（３０μｍに対して２２０μｍ、ｐ＝０．０４）、創傷閉鎖前のケラチンの厚さの増加（１０μｍに対して２８μｍ、ｐ＜０．００１）、早期の紡錘形細胞増殖（８日目に対して４日目）、下層の組織から上皮が剥離する頻度の低下（１００％に対して５９％、ｐ＝０．００３）、新生血管形成の遅延（８日目に対して９〜１０日目）、及び創傷再開放の頻度の低下（４８％に対して８％、ｐ＜０．００１）を示した。
【０１４６】
口腔内の筋肉上のケラチノサイトによる創傷治癒の段階は以下である。
−炎症期
−肉芽組織
−上皮の増殖及び移動
−創傷収縮
−新生血管形成
−リモデリング
【０１４７】
【表１】
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＊有意な結果を太字で示した。
【０１４８】
考察
１．上皮剥離及び創傷収縮が二次ＰＴＨをもたらす要因の可能性がある。
２．ＨＢ−ＥＧＦで処置したマウスの口腔創傷の方が、より大きな上皮及びケラチンの厚さ、低頻度の上皮剥離、低頻度の創傷再開放、ならびに新生血管形成前の早期の創傷閉鎖を示した。
３．組織が治癒する際の創床の新生血管形成はＰＴＨのリスクを増加させ得る。新生血管形成の最大潜在性に新生血管がさらされると、保護されていない表面には上皮剥離及び創傷収縮が生じる。ＨＢ−ＥＧＦ処置サンプルではこれは起こらなかった。
４．したがって、ＨＢ−ＥＧＦによる処置はＰＴＨを防止または軽減し得る。
【０１４９】
実施例２
扁桃摘出後のヘパリン結合性上皮成長因子の局所送達
扁桃摘出が行われる際には生傷が口腔内に残される。創床には筋及び若干のリンパ系組織があることが多い。この創傷はその後数日にわたって肉芽形成してから上皮化する。新生血管形成は創傷において上皮層が成熟する前に発生するという仮説が立てられる。これによりこの時点で創傷の二次出血が生じる（扁桃摘出後約５〜１０日目）。本技術は、創傷の上皮化を加速させるためにＨＢ−ＥＧＦを局所送達し、その結果、新生血管形成段階前にこの層を成熟させることを意図しており、これにより二次出血のリスクが軽減される。
【０１５０】
手術後、ＨＢ−ＥＧＦを他の生物活性物質（例えば上皮の接着を促進する、または血管新生を減少させる物質）とともにまたは単独で含有する局所的に施される送達ビヒクルを、創傷に直接施すことができる。ＨＢ−ＥＧＦは２回以上施すことができる。ビヒクルは生体吸収性であってよく、ＨＢ−ＥＧＦを長時間にわたって放出し得る。術後痛を軽減するために局所麻酔剤をＨＢ−ＥＧＦと併せて投与してもよい。
【０１５１】
実施例３
マイクロニードル注入によるヘパリン結合性上皮成長因子の送達
手術及び止血を行った後、ＨＢ−ＥＧＦを含有するマイクロニードル注入システムを創傷上に配置し、それによってマイクロニードルでＨＢ−ＥＧＦを創傷中に送達させることができる。マイクロニードル自体は生体吸収性であってよく、長時間にわたってＨＢ−ＥＧＦを他の生物活性物質（例えば上皮の接着を促進する、または血管新生を減少させる物質）とともにまたは単独で放出し得る。
【０１５２】
実施例４
創傷の付近へのヘパリン結合性上皮成長因子の局所送達
手術後、ＨＢ−ＥＧＦを他の生物活性物質（例えば上皮の接着を促進する、または血管新生を減少させる物質）とともにまたは単独で含有する送達ビヒクルを、扁桃摘出で生じた創傷中に、またはその付近に注入することができる。ビヒクルは生体吸収性であってよく、ＨＢ−ＥＧＦを長時間にわたって放出し得る。
【０１５３】
実施例５
ヘパリン結合性上皮成長因子の非経口送達
手術後、ＨＢ−ＥＧＦを他の生物活性物質（例えば上皮の接着を促進する、または血管新生を減少させる物質）とともにまたは単独で含有する送達ビヒクルを、ＨＢ−ＥＧＦが創傷に局在化してそこで作用するような非経口または他の全身経路を含めた非経口経路を介して患者に施すことができる。
【０１５４】
実施例６
ヘパリン結合性上皮成長因子の経口送達
手術後、ＨＢ−ＥＧＦを他の生物活性物質（例えば上皮の接着を促進する、または血管新生を減少させる物質）とともにまたは単独で含有する送達ビヒクルを、ＨＢ−ＥＧＦが創傷に施されてそこで作用するように、ウォッシュ、うがい薬、リンス、または表面ペーストとして経口経路を介して患者に施すことができる。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態を例示及び説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更を行うことができると理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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