(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンおよび有効量のアジュバントからなる哺乳動物用ワクチン組成物であって、該アジュバントが、全組成物の１容量％〜４０容量％の量のスクアレンまたはスクアランまたはその混合物、全組成物の５容量％〜４０容量％の量のグリセロール、および全組成物の０.１％〜４.０％の量の界面活性剤のみからなり、その界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノリート３５（ＤＡＣ）、ソルビタンモノオレエートポリオキシエチレンおよびソルビタンオレエートから選択されることを特徴とする、哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項２】
アジュバントが、スクアレンを全組成物の２容量％〜２０容量％の量で、グリセロールを全組成物の１０容量％〜３０容量％の量で、および、ソルビタン誘導の界面活性剤を全組成物の０.１５％〜１.６％の量で含有する、請求項１記載の哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項３】
アジュバントが、スクアレンを全組成物の３容量％〜７容量％の量で、グリセロールを全組成物の１５容量％〜２５容量％の量で、および、ソルビタン誘導の界面活性剤を全組成物の０.１８％〜０.２２％の量で含有する、請求項１記載の哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、アジュバントがさらに医薬上許容されるｐＨ緩衝液を含有する、哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項５】
医薬上許容されるｐＨ緩衝液がリン酸緩衝食塩水である請求項４記載の哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項６】
不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンおよび有効量のアジュバントからなる哺乳動物用ワクチン組成物であって、該アジュバントが、全組成物の１容量％〜４０容量％の量のスクアレンまたはスクアランまたはその混合物、全組成物の５容量％〜４０容量％の量のグリセロール、０．１％〜２．０％の重量／容量濃度のアルミニウム塩、および全組成物の０.１％〜４.０％の量の界面活性剤のみからなり、その界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノリート３５（ＤＡＣ）、ソルビタンモノオレエートポリオキシエチレンおよびソルビタンオレエートから選択されることを特徴とする、哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項７】
不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンおよび有効量のアジュバントからなる哺乳動物用ワクチン組成物であって、該アジュバントが、全組成物の１容量％〜４０容量％の量のスクアレンまたはスクアランまたはその混合物、全組成物の５容量％〜４０容量％の量のグリセロール、０．１％〜２．０％の重量／容量濃度の水酸化アルミニウム、および全組成物の０.１％〜４.０％の量の界面活性剤のみからなり、その界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノリート３５（ＤＡＣ）、ソルビタンモノオレエートポリオキシエチレンおよびソルビタンオレエートから選択されることを特徴とする、哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項８】
ワクチンがＡ型インフルエンザのサブユニットワクチンである請求項１記載の哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項９】
医薬上許容される緩衝液中における不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンおよび有効量のアジュバントからなる哺乳動物用ワクチン組成物であって、該アジュバントが、全組成物の３容量％〜７容量％の量のスクアレン、全組成物の１５容量％〜２５容量％の量のグリセロール、０．１％〜２．０％の重量／容量濃度のアルミニウム塩、および全組成物の０.１８％〜０.２２％の量の界面活性剤のみからなり、その界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノリート３５（ＤＡＣ）、ソルビタンモノオレエートポリオキシエチレンおよびソルビタンオレエートから選択されることを特徴とする、哺乳動物用ワクチン組成物。
【請求項１０】
アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである請求項９記載の哺乳動物用ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物用ワクチンの抗原性を増大させるのに有用な新規アジュバントおよびそれを用いた哺乳動物用ワクチン組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、スクアレンまたはスクアランまたはその混合物、グリセロールおよび界面活性剤を利用した新規アジュバントおよびそれを用いた哺乳動物用ワクチン組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
疾患に対する抗体を哺乳動物（特に、ヒト）の生体内に生成させるために用いられるワクチンは、大きく４つに分類される。これらは、生菌ワクチン、死菌または不活化ワクチン、サブユニットワクチンおよびトキソイドである。このグループのうち、生菌ワクチンが宿主に最も強い免疫応答を生じさせる。これらの生菌ワクチンは、一般的には、弱毒化されているので、通常関係する疾患を発生させることなく、それらの抗原に対して長期間の免疫応答を生じさせることができる。
【０００３】
死菌ワクチンは、宿主の免疫系に提示する抗原性因子を不活化しない化学的または他の手段によって不活化される。死菌ワクチンの例としては、百日咳ワクチンおよび非経口ポリオ生ワクチンが挙げられる。
【０００４】
いくつかの疾患ベクターについては、たとえ病原体を死滅させても、レシピエントにおける望ましくない効果の発生を防止することはできない。このような場合、この試剤は、それら自体では病原性を有しないサブユニットまたはサブフラクションに断片化しなければならない。かかるサブユニットワクチンの例としては、いくつかのインフルエンザワクチン、ならびに、いくつかの実験的なヘルペスウイルスワクチンおよび肝炎ワクチンが挙げられる。
【０００５】
最後に、トキソイドワクチンは、病原体によって分泌されるトキシンを非毒性化し、次いで、このトキシンに対する免疫応答を刺激するために他の抗原性因子と同様に用いるものである。破傷風トキソイドが、このようなワクチンの一例である。
【０００６】
残念ながら、サブユニットワクチンおよびトキソイドワクチンが宿主において長期間持続する免疫を誘起するのに充分な抗原を供給することは稀である。それゆえ、非生ワクチンおよび特に高精製サブユニットワクチンによって誘発された免疫は、わずか１〜２年しか持続しない。
【０００７】
非生ワクチンの免疫原性を強化するために、様々なアジュバントが報告されてきた。その中には、鉱油、水および乳化剤、ならびに結核死菌からなる完全フロイントアジュバントがある。哺乳動物用に入手できる多くのアジュバントの中で、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムを含み、広くヒトに用いられているものは、ほんのわずかである。数種類のアジュバントは、局所的または全身性の激しい反応を引き起こすことから、ヒトへの使用が認可されてこなかった。それらのいくつか（例えば、鉱油を含有する完全フロイントアジュバント）は代謝不可能であり、また、実験用動物において癌を引き起こすことから、発癌性を有する可能性が考えられる。それゆえ、ワクチン（特に、現在のところ入手可能なサブユニットワクチンおよび開発中のワクチン）の作用を増強させることができる有効かつ安全なアジュバントが必要とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の目的は、ワクチンの抗原性を増大させるのに有用な新規アジュバントを、不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンまたはトキソイドと組み合わせてなる哺乳動物用ワクチン組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のアジュバントは、スクアレン、グリセロールおよび界面活性剤の混合物からなる。さらに詳しくは、このアジュバントは、これら成分を哺乳動物用ワクチンと組み合わせた組成物の形で用いられ、スクアレンを全組成物の約１％〜約４０％の量で、グリセロールを全組成物の約５％〜約４０％の量で、および、界面活性剤を全組成物の約０.１％〜約４.０％の量で含有する。ここに記載した百分率（％）は、特に断らない限り、各成分の容量％を表し、以下の記載から容易に理解されるように、全組成物の残りの百分率（％）は、ワクチンそれ自体、または、ワクチンならびに任意成分であるアルミニウム塩および／または緩衝液に由来する。
【００１０】
より好ましい本発明の態様では、アジュバントのスクアレン成分は全組成物の約２％〜約２０％の量で含有され、グリセロールは全組成物の約１０％〜約３０％の量で含有され、界面活性剤は全組成物の約０.１５％〜約１.６％の量で含有される。より一層好ましい本発明の態様では、アジュバントのスクアレン成分は全組成物の約３％〜約７％の量で含有され、グリセロールは全組成物の約１５％〜約２５％の量で含有され、界面活性剤は全組成物の約０.１８％〜約０.２２％の量で含有される。
【００１１】
「スクアレン」という用語は、メルク・インデックス（Merck Index）第11版の第1383頁に（すべてＥ）-２,６,１０,１５,１９,２３-ヘキサメチル-２,６,１０,１４,１８,２２-テトラコサヘキサエンとして記載の化合物を表すが、シナセン（Sinacene）およびスプラエン（Supraene）という名称も用いられる。スクアランは、やはりメルク・インデックス（Merck Index）第11版の第1383頁に２,６,１０,１５,１９,２３-ヘキサメチルテトラコサン、ペルヒドロスクアレン、ドデカヒドロスクアレンおよびスピナカン（Spinacane）として記載されており、ここに記載のアジュバント混合物のスクアレン成分に代えて、または、該成分との混合物として用いることができる。
【００１２】
本発明の組成物に用いてもよい界面活性剤としては、ポリソルベート（Polysorbate）２０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート６０、スパン（Span）８０Rソルビタンオレエート［アイ・シー・アイ・アメリカズ（ICI Americas）の製品、ウィルミントン、デラウェア州］、クレモファー（CremophorR）界面活性剤［バスフ・コーポレイション（BASF Corporation）製、パルシッパニー、ニュージャージー州］、およびポリソルベート８０（ソルビタンモノ-９-オクタデセノエートポリ（オキシ-１,２-エタンジイル）誘導体、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ-オレエート、ソルビタンモノ-オレエートポリオキシエチレン、ソルレート（Sorlate）、特にトゥイーン（Tween）８０として知られ、ソルビトールおよびソルビトール無水物の１モルあたり約２０モルのエチレンオキシドと共重合したソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステルを表す）が挙げられるが、これらに限定されることはない。本発明に用いるのに好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
【００１３】
これらアジュバントのグリセロール成分が、１,２,３-プロパントリオール、グリセリンまたはトリヒドロキシプロパンとしても知られる市販のアルコールを意味することは、当業者の理解するところである。
【００１４】
本発明のアジュバントは、さらに所望により、１種またはそれ以上の医薬上許容されるアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウム）を、約０.１％〜約２.０％、好ましくは約０.３％〜約０.７％、最も好ましくは約０.５％の濃度（ｗ／ｖ）で含有してもよい。好ましいアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。
【００１５】
本発明のアジュバントは、さらに所望により、１種またはそれ以上の医薬上許容されるｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス（Tris）-ＨＣｌ、クエン酸-リン酸緩衝液、トリシン（Tricine）緩衝液、ヘペス（Hepes）およびマレイン酸緩衝液）を含有してもよい。最終溶液が実質的な等張性状態で保持されるのであれば、ＰＢＳ緩衝液中の塩化ナトリウムに代えて、他の塩類（例えば、ＫＣl）を用いることができる。これらの緩衝液は、好ましくは、アジュバント混合物をｐＨ６.０〜８.０で維持するために用いられる。
【００１６】
本発明のアジュバントは、好ましくは、無菌成分から製造するか、または、公知の加熱または濾過手段によって滅菌する。アジュバント混合物は、４℃で保存すればよい。アジュバントが無菌でなければ、４℃で３日間より長い期間にわたる保存は推奨されない。ミクロ流動化（microfluidized）、音波処理または均質化に付した本発明のアジュバント原液は、好ましくは−２０℃またはそれ以下の温度で凍結保存することができる。
【００１７】
本発明の組成物に用いられるアジュバントは顕著な免疫調節活性を示すが、これら化合物のアジュバント効果は免疫応答を調節するそれらの能力の直接的な結果であると考えられる。さらに、これらアジュバントの成分は反応原性を有する可能性がないので、ワクチン用アジュバントとして用いる場合のそれらの適性がより一層増大する。また、これらアジュバントは、市販の注射剤に見られる公知の注射可能な材料から構成されていることに留意すべきである。
【００１８】
本発明の組成物に用いられるワクチンは、利用される特定のワクチンに対して処方された任意の方法（好ましくは、筋肉内注射または皮下注射）で投与することができる。それらは、獣医学用またはヒト用のいずれのワクチンにも用いることができ、例えば、不活化された完全ワクチンまたはサブユニットワクチンおよびトキソイドが挙げられる。さらに、採用されるワクチンは、バクテリア、リケッチアおよびウイルスといった病原体に対する免疫を生じさせるために用いるものである。適当なヒト用ワクチンとしては、例えば、インフルエンザ、ポリオ、アルボウイルス感染症、腸チフスおよびパラチフス、エコルクラ（ekolcra）、ペスト、百日咳、発疹チフス、ロッキー山赤斑熱、Ｂ型インフルエンザ、多価の肺炎球菌多糖体、髄膜炎菌Ｃ群に対する完全ワクチンおよびサブユニットワクチン、ならびに、新しく開発されたヒト二倍体細胞狂犬病ワクチンおよび肝炎ワクチンが挙げられる。
【００１９】
適当な獣医学用ワクチンとしては、例えば、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウマ脳髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病、ネコ汎白血球減少症、ネコ鼻気管炎、ネコカリチウイルス、感染性ウシ鼻気管炎、３型パラインフルエンザ、ウシのウイルス性下痢、ウシアデノウイルス、仮性狂犬病、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、イヌアデノウイルス、イヌジステンパーウイルスおよびイヌパラインフルエンザに対する完全ワクチンおよびサブユニットワクチン、ならびに、腺疫、ブルセラ症、ビブリオ症、レプトスピラ症、クロストリジウム感染症、サルモネラ症、大腸菌症、アナプラスマ症、パスツレラ感染症、ヘモフィルス感染症、エリジペロスリックスなどに対する完全ワクチンおよびサブユニットワクチン、バクテリンおよびトキソイドが挙げられる。さらに、将来のワクチン、特にウイルスおよびバクテリアのサブユニットタイプのワクチンは、おそらく弱い免疫源でありうるので、それらが適当な許容されるアジュバントによる強化を必要とすることは充分に予期されるところであり、本発明のシステムは非常に適すると思われる。
【００２０】
ここに開示された有効なアジュバントをワクチンと共に用いる利点は重要である。免疫系のいくつかの小部分を調節することによって、アジュバントは体液性免疫の免疫反応性を増大させることができ、その結果、アジュバントと共に受容体に投与されるワクチン製剤に含有される抗原性材料に対する抗体産生が強化される。このような強化は、もちろん、不活化された完全ワクチンならびに特にサブユニットワクチンおよびトキソイドの多くに見られるように免疫剤が弱い免疫源であっても、より長期間にわたってより強力な免疫レベルを与える。抗原に対する免疫応答がこのように強化されることは、この効果の直接的な結果であり、免疫力の弱い抗原性材料を用いることができ、それゆえ、免疫感作に対するストレスを招く激しい宿主反応の可能性を減少させるという別の利点を有する。これは、青少年のワクチン接種において特に重要である。さらに、精製抗原の投与量を減少させても、免疫感作をより成功裏に、かつ、より安全に行えることに加えて、ワクチン生産をより経済的に、かつ、より便利に行うことができる。
【００２１】
本発明の組成物は、アジュバント材料を抗原希釈剤に溶解または懸濁し、次いで、適当な容量のアジュバント溶液および抗原溶液を適当な抗原希釈率で組み合わせることによって調製される。抗原希釈剤は、当該分野における従来品（例えば、リン酸緩衝食塩水、最少必須培地、ペプトンなど）である。
【００２２】
本発明のアジュバントは、それらの最終濃度より高い濃度で混合し、その後、使用または保存の前に、ワクチンおよび所望により緩衝液で希釈すればよい。無菌のアジュバント成分を用いるか、または、場合によっては、滅菌濾過を用いることが好ましい。その結果得られたアジュバント成分の組合せは、次いで、選択されたワクチンと混合する前に、好ましくはホモゲナイザーを用いて、混合物の均質化を確実に行うのに適当な速度および時間で、例えば、約１〜約１０分間という時間で、充分に均質化される。
【００２３】
さらに詳しくは、本発明のアジュバントは、例えば、以下の工程によって製造しうる。
１）すべてのアジュバント成分をまず約３７℃の温度にする。
２）緩衝液（用いる場合）、スクアレン成分およびグリセロール成分を混合し、室温にする。この混合物を室温で約１５分間放置する。
３）次いで、界面活性剤成分を混合物に撹拌しながら添加する。次いで、かかるアジュバント成分の全混合物をオートクレーブにかけ、音波処理し、無菌の均質なアジュバント混合物を生成させる。音波処理は、氷浴中、ヒート・システムズ（Heat Systems）のプローブタイプの音波処理機で、ほぼＮｏ.６に設定して行えばよい。全音波処理時間は、少なくとも５分間が推奨される。この時間は分割され、約３０秒間の音波処理パルスを付加した後、アジュバント混合物を氷上で１５秒間放置する。このタイプの音波処理に対して、より徹底的で好ましい代替物として、０.２２μｍのフィルターを通過するまで、アジュバント混合物をミクロ流動化または均質化してもよい。必要なら、次いで、ここに記載のアルミニウム塩をアジュバント組成物に撹拌しながら添加してもよい。
４）次いで、ウイルスワクチンまたはワクチン原液を所望の投与量にしたがってアジュバント混合物に添加する。
５）次いで、アジュバント／ワクチンの組合せを穏やかに混合する。最終的な混合物を所望の容量にするために、混合の間に追加量の緩衝液を添加してもよい。
【００２４】
実施例１
本発明のアジュバントおよび比較アジュバントを調製し、1993年度フィジシャンズ・デスク・リファレンス（Physician's Desk Reference）第47版の第2578頁に記載のワイス-アイエルスト（Wyeth-Ayerst）1993年型インフルエンザウイルス三価ワクチンと混合した。ワクチン中に存在する３種類の株、すなわちＡ／ベイジン（Beijing）／32／92、Ａ／テキサス／36／91およびＢ／パナマ／45／90の各々の赤血球凝集素１.５μｇを、６匹の雌７週齢ＣＤ-１マウスのグループに与えた。各マウスには、０.２ｍｌのワイス-アイエルスト・ワクチンを筋肉内注射した。接種後２８日目に、マウスから採血し、赤血球凝集反応阻害法によって、その血清をＡ／ベイジン成分に対する抗体について分析した。下記の表１に、各グループの６匹のマウスについての幾何平均力価として表した各々の結果を示す。ここに記載のアジュバントおよび比較アジュバントを所望の容量にするために、適当量のＰＢＳ緩衝液を用いたことに留意すべきである。
【００２５】
使用したアジュバントは、以下のとおりである。
アジュバントＮｏ.１）５％スクアレン、５％グリセロールおよび０.２％トゥイーン８０を含有するアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.１）シンテクス・ラボラトリーズ（Syntex Laboratories）によって用いられる、シンテクス・アジュバント・マイクロ流動化製剤用の賦形剤。このアジュバントは、５％スクアレン、１.２５％プルロニック（Pluronic）Ｌ-１２１（バスフ・ワイアンドッテ・コーポレイション（BASF Wyandotte Corp.）から市販品を入手可能）および０.２％トゥイーン８０からなる。比較アジュバントＮｏ.２）５％スクアレン／０.２％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.３）５％スクアレン／１.０％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.４）５％スクアレン／２.０％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.５）５％スクアレン／４.０％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.６）５％スクアレン、０.２％レシチン、０.２％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.７）５％スクアレン、５％グリセロール、０.５％レシチンからなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.８）５％スクアレン、０.２％ポヴィドン（Povidone）、０.２％トゥイーン８０からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＮｏ.９）ＰＢＳ緩衝液中にワクチンのみ。
【００２６】
【表１】
0004344017.tif 000002
【００２７】
実施例２
付加的なアジュバント試験は、カニクイザルのグループを用いて行った。３匹のサルからなる各グループに、以下に記載のアジュバントと５０：５０の割合で混合した０.５ｍｌのワイス-アイエルスト（Wyeth-Ayerst）1993年型インフルエンザウイルス三価ワクチン（1993年度フィジシャンズ・デスク・リファレンス（Physician's Desk Reference）第47版の第2578頁に記載）を接種した。最初のワクチン接種から２８日後に、これらのサルを同じ接種物で追加免疫した。２８日目および４２日目に各サルから５ｍｌの血液を採取し、クレアチニンホスホキナーゼ（ｃｐｋ）分析を行った。その結果は、３匹のサルからなる各グループについて、下記の表２に示す。上記のように、以下に記載のアジュバント／ワクチンの組合せを所望の容量にするために、適当量のＰＢＳ緩衝液を用いた。
【００２８】
試験したアジュバント混合物
アジュバントＡ：５％スクアレン、２０％グリセロールおよび０.２％トゥイーン８０からなる本発明のアジュバント混合物。
比較アジュバントＡ：ＰＢＳ緩衝液中にワクチンのみを含有するワクチン混合物。
比較アジュバントＢ：２ｍｇのコレステロールヘミスクシネート（ＣＨＳ）またはコレステリルハイドロジェンスクシネートリポソーム（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）［セントルイス、ミズーリ州］から市販品（カタログ番号Ｃ６０１３）を入手可能）からなるアジュバント混合物。
比較アジュバントＣ：５％スクアレン、３０％プロピレングリコールおよび０.２％トゥイーン８０を含有するアジュバント混合物。
【００２９】
【表２】
0004344017.tif 000003