(57)【要約】  本発明は、ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる新規なコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有し、脱離基が、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含むコンジュゲート試薬;及びこのような試薬を使用して作製されるペプチド又はタンパク質を含有するコンジュゲートの調製のための新規な方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応することができるコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有し、前記脱離基が、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含むことを特徴とするコンジュゲート試薬。
【請求項２】
nが6〜9である、請求項1に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項３】
-(CH2CH2O)n-部分が最大5kDaの分子量を有する、請求項1又は2に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項４】
前記脱離基が式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3であるか、又は式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-、若しくは-N+R2R3-P-N+R2R3-の基である(式中、Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は、独立して水素原子又はC1〜4アルキル基若しくはP基を表す)、請求項1〜3のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項５】
前記脱離基が式-SO2Pである、請求項4に記載の試薬。
【請求項６】
前記脱離基が-(CH2CH2O)n-R1(式中、R1はキャッピング基である)を含むか、又は前記-(CH2CH2O)n-基が試薬内に2つの付着点を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項７】
前記脱離基が、-S-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-S-、-O-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-O-、-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-OSO2-、-N+R2R3-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-N+R2R3-、又は式
【化１】
2017534612.tif 000139
(式中、R1はキャッピング基であり、R2及びR3の各々は、独立して水素原子又はC1〜4アルキル基を表す)
の基の1つである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項８】
前記脱離基が-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-である、請求項7に記載の試薬。
【請求項９】
R1が、水素原子、C1〜4アルキル基、場合により置換されているアリール基、又は式-CH2CH2CO2H若しくは-CH2CH2NH2の基を表す、請求項6又は7に記載の試薬。
【請求項１０】
診断薬、治療薬、若しくは標識化剤であるか、又は診断薬、治療薬、若しくは標識化剤のための結合剤である、ペイロードを担持する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１１】
官能グルーピング：
【化２】
2017534612.tif 000140
(式中、一方のLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であり、他方のLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であるか、又は別の構造の脱離基である)を含むか；又は
官能グルーピング：
【化３】
2017534612.tif 000141
(式中、1つのLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基である)
を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１２】
官能グルーピングI、I'、II、又はIII：
【化４】
2017534612.tif 000142
(式中、Wは、電子求引性基を表し；Aは、C1〜5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し；Bは、結合又はC1〜4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し；いずれか一方のLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であり、他方のLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であるか若しくは別の構造の脱離基であり、又は両方のLが共に-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基を表す)；
【化５】
2017534612.tif 000143
(式中、W及びAは、一般式Iについて定められた意味を有し、mは、0〜4であり、Lは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基である)；
〜W-CR4R4'-CR4.L.L'      (II)
(式中、Wは、一般式Iについて定められた意味を有し、(i)各R4は、水素原子又はC1〜4アルキル基を表し、R4'は、水素原子を表し、いずれかのLは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であり、L'は、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基であるか若しくは別の構造の脱離基であり、又はL及びL'が共に、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基を表す；或いは(ii)各R4は、水素原子又はC1〜4アルキル基を表し、Lは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基を表し、R4'及びL'は、共に結合を表す、のいずれかである)；
〜W-(CH=CH)p-(CH2)2-L      (III)
(式中、Wは、一般式Iについて定められた意味を有し、pは、0又は1〜4の整数を表し、Lは、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含む脱離基を表す)
を含有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１３】
一般式：
【化６】
2017534612.tif 000144
(式中、Qは、連結基を表し、Dは、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤であるか、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤である、ペイロードを表す)
を有する、請求項12に記載の試薬。
【請求項１４】
官能グルーピング：
【化７】
2017534612.tif 000145
(式中、Arは、フェニル基を表す)
を含有する、請求項12に記載の試薬。
【請求項１５】
一般式：
【化８】
2017534612.tif 000146
(式中、Qは、連結基を表し、Dは、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤であるか、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤である、ペイロードを表す)
を有する、請求項14に記載の試薬。
【請求項１６】
D-Qが、薬剤若しくはポリマー、又は薬剤及びポリマーの両方を含む、請求項13又は15に記載の試薬。
【請求項１７】
存在する場合、薬剤が細胞毒性薬であり、存在する場合、ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項16に記載の試薬。
【請求項１８】
ペプチド又はタンパク質に存在する2種の求核試薬と反応することができるコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる脱離基を含有し、前記脱離基が、コンジュゲート試薬内に2つの付着点を有するとともに、-(CH2CH2O)n1-部分(式中、n1は2以上の数である)を含むことを特徴とする、コンジュゲート試薬。
【請求項１９】
n1が5〜9である、請求項18に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項２０】
ペプチド又はタンパク質のコンジュゲーション方法であって、前記ペプチド又はタンパク質を、請求項1〜19のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬と反応させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
タンパク質が、受容体若しくはリガンド結合性タンパク質又は抗体若しくは抗体断片である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
請求項20又は21に記載の方法によって調製されるタンパク質又はペプチドコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質及びペプチドのコンジュゲーションのための新規な方法、並びに新規なコンジュゲート試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの研究調査が、広範囲の適用のためのペプチド及びタンパク質への、多種多様なペイロード、例えば診断剤、治療剤、及び標識化剤のコンジュゲーションに充てられている。タンパク質又はペプチドは、それ自体が治療的特性を有してもよい及び/又は結合性タンパク質であってもよい。
【０００３】
ペプチド及びタンパク質は治療剤としての潜在的使用を有し、コンジュゲーションはそれらの特性を改善する1つのやり方である。例えば、水溶性の合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、治療活性ペプチド又はタンパク質をコンジュゲートするために広く使用されている。これらの治療コンジュゲートは、好ましくは循環時間を延長すること及びクリアランス速度を減少すること、全身性毒性を減少させること、並びにいくつかの場合において臨床的効力の増加を提示することによって、薬物動態を変えることが示されてきた。タンパク質にポリエチレングリコール、PEGを共有結合でコンジュゲートする方法は、共通して「PEG化」として知られている。
【０００４】
結合性タンパク質、特定の抗体又は抗体断片は、頻繁にコンジュゲートされる。標的細胞及び分子の表面上の特異的マーカーのための結合性タンパク質の特異性は、それら自体で診断若しくは治療剤として又は診断及び治療剤を含み得るペイロードのための担体としてのいずれかで、それらの広範な使用をもたらしている。標識及びレポーター基、例えばフルオロフォア、放射性同位体及び酵素にコンジュゲートされているこのようなタンパク質は、標識化及び画像化（イメージング）適用における使用を見出し、一方、抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)を生成するための細胞毒性剤及び化学療法薬へのコンジュゲーションは、特定の組織又は構造、例えば特定の細胞型へのこのような薬剤の標的化送達を可能にして、正常の健常組織に対する影響を最小化し、化学療法処置に関係する副作用を著しく低減する。このようなコンジュゲートは、いくつかの疾患域において、特にがんにおいて広範な潜在的治療適用を有する。
【０００５】
タンパク質及びペプチドをコンジュゲートする多くの方法が文献に報告されている。例えば、WO95/13312は、スルホン部分を介するコンジュゲーションを記載している。おそらく、最も共通して使用される方法は、マレイミドに基づくコンジュゲート試薬の使用を伴う。このような試薬は、多くの公報、例えばWO2004/060965に記載されている。より均質の生成物をもたらす代替の手法は、Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50及びdel Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59によって記載されており、これらは、抗体を含めたタンパク質におけるジスルフィド結合を横断して架橋するために使用することができる試薬の使用を記載している。WO2005/007197は、タンパク質におけるジスルフィド結合から誘導される両方の硫黄原子とコンジュゲートする能力を有する新規なコンジュゲート試薬を使用することで新規なチオエーテルコンジュゲートを与える、タンパク質へのポリマーのコンジュゲーションのための方法を記載しており、一方、WO2009/047500は、タンパク質に付加されているポリヒスチジンタグに結合するために同じコンジュゲート試薬の使用を記載している。WO2010/010324は、タンパク質において単一の求核試薬に結合できる単官能試薬の使用を記載している。WO2013/190292、WO2014/064424、WO2014/184564及びWO2014/064423は全て、様々なコンジュゲーション試薬を使用するコンジュゲーション方法を記載している。
【０００６】
ほとんどのコンジュゲーション方法の共通の特色は、コンジュゲーション反応が、コンジュゲート試薬に存在する脱離基の損失、及び結果として得られた部分とタンパク質に存在する求核試薬との反応を伴うことである。報告されている脱離基としては、-SR、-OR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2及び-N+H2R型(式中、Rはアルキル又はアリールである)の基、並びにハロゲンが挙げられる。
【０００７】
Marculescuら、Chem. Commun. 2014、50、7139〜7142は、様々な脱離基を含有するアリールオキシマレイミドコンジュゲート試薬を開示している。他の脱離基の中でも、MeO-(CH2CH2O)2-CH2CH2-を含めた基が開示されている。同じ構造がPhD Thesis of Christina Marculescu、「Development of Novel Maleimide Reagents for Protein Modification」、University College London、2014年8月に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO95/13312
【特許文献２】WO2004/060965
【特許文献３】WO2005/007197
【特許文献４】WO2009/047500
【特許文献５】WO2010/010324
【特許文献６】WO2013/190292
【特許文献７】WO2014/064424
【特許文献８】WO2014/184564
【特許文献９】WO2014/064423
【特許文献１０】WO99/45964
【特許文献１１】WO2010/100430
【特許文献１２】GB1418984
【特許文献１３】WO2004/113394
【特許文献１４】GB1418986
【特許文献１５】US4,179,337
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50
【非特許文献２】del Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59
【非特許文献３】Marculescuら、Chem. Commun. 2014、50、7139〜7142
【非特許文献４】PhD Thesis of Christina Marculescu、「Development of Novel Maleimide Reagents for Protein Modification」、University College London、2014年8月
【非特許文献５】Smithら、J. Am. Chem. Soc. 2010、132、1960〜1965
【非特許文献６】Schumakerら、Bioconj. Chem.、2011、22、132〜136
【非特許文献７】J. Am. Chem. Soc. 110、5211〜5212
【非特許文献８】Belchevaら、J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3)、207〜226
【非特許文献９】Dreborgら  Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990)6 315〜365
【非特許文献１０】Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252
【非特許文献１１】Bioconjugate Chem. 2014、(25)460〜469
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、エチレングリコールに由来する、ある規定数の反復単位を含む新規な脱離基により、公知のコンジュゲート試薬における公知の脱離基を置き換えることによって、改善された結果が得られることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ペプチド又はタンパク質のコンジュゲーションのための方法であって、前記ペプチド又はタンパク質を、前記ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できるコンジュゲート試薬と反応させる工程を含み、前記試薬が、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有し;前記脱離基が、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できるコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有し、前記脱離基が-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは6以上の数である)を含むことを特徴とするコンジュゲート試薬は、新規であり、そのため、本発明はこのようなコンジュゲート試薬それ自体を提供する。
【００１３】
さらなる実施形態において、本発明は、ペプチド又はタンパク質のコンジュゲーションのための方法であって、前記ペプチド又はタンパク質を、前記ペプチド又はタンパク質における2種の求核試薬と反応できるコンジュゲート試薬と反応させる工程を含み、前記試薬が、前記求核試薬との反応で失われる脱離基を含有し、該脱離基がコンジュゲート試薬内に2つの付着点を有するとともに-(CH2CH2O)n1部分(式中、n1は2以上の数である)を含む方法を提供する。ペプチド又はタンパク質に存在する2種の求核試薬と反応できるコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる脱離基を含有し、前記脱離基がコンジュゲート試薬内に2つの付着点を有するとともに-(CH2CH2O)n1-部分(式中、n1は2以上の数である)を含むコンジュゲート試薬は、新規であり、そのため、本発明はこのようなコンジュゲート試薬それ自体を提供する。
【００１４】
この明細書の全体にわたって、ペプチド及びタンパク質は共に、便宜のために「タンパク質」と称され、文脈が別段に必要とする場合を除いて、「タンパク質」への言及は、タンパク質及びペプチドの両方への言及を含むと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例17の結果を示すグラフである。
【図２】実施例18の結果を示すグラフである。
【図３】実施例19の結果を示すグラフである。
【図４】実施例20の結果を示すグラフである。
【図５】実施例21の結果を示すグラフである。
【図６】実施例21の結果を示すグラフである。
【図７】実施例21の結果を示すグラフである。
【図８】実施例22の結果を示すグラフである。
【図９】実施例25の結果を示すグラフである。
【図１０】2時間の反応時間後に得られた実施例49の結果を示すグラフである。
【図１１】4時間の反応時間後に得られた実施例49の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
脱離基
本発明は、少なくとも1個の脱離基を含むコンジュゲート試薬を、タンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応させる場合、反復単位-(CH2CH2O)n-(式中、nは少なくとも6である又はn1は少なくとも2である)を含む基は公知の脱離基と比較して、及びnが少なくとも6である場合にはより少ない反復-(CH2CH2O)-単位を有する同様の脱離基と比較して、改善された脱離基として作用するという驚くべき所見に基づく。新規な脱離基には、例えば、-(CH2CH2O)n-R1(式中、R1はキャッピング基である)が含まれ得る。非常に広い範囲のキャッピング基が使用され得る。R1は、例えば、水素原子、アルキル基、特にC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、例えば場合により置換されているフェニル基、例えばトリル基であってよい。代替として、キャッピング基には、カルボキシル基又はアミン基等の官能基が含まれ得る。このようなキャッピング基は、例えば、式-CH2CH2CO2H又は-CH2CH2NH2を有することができ、-(CH2CH2O)n-鎖の末端単位を官能化することによって調製することができる。代替として、キャッピング基によって末端化される代わりに、-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-基は、化学的に2種の求核試薬と反応できる2個の脱離基の同等物が存在するように、コンジュゲート試薬内に2つの付着点を有することができる。
【００１７】
該脱離基の-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-部分は、PEG、ポリエチレングリコールに基づく。PEGは直鎖状又は分枝状であってよく、それは任意のやり方で誘導体化又は官能化することができる。nは6以上の数、例えば6、7、8、9若しくは10又はそれ以上である。例えば、nは、6から9であってよい。n1は、2以上の数、例えば2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10又はそれ以上である。例えば、n1は少なくとも4であってよいか;又はn1は少なくとも5、例えば5から9であってよいか;又はn1は少なくとも6、例えば6から9であってよい。n又はn1について特定の上限はない。n又はn1は、例えば150以下、例えば120以下、例えば100以下であってよい。例えばnは、6又は7から150、例えば6又は7から120であってよく、一方n1は、2、3、4、5、6又は7から150、例えば4、5、6又は7から150、例えば4、5、6又は7から120であってよい。脱離基のPEG部分-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-は、例えば、1から5kDaの分子量を有することができ;それは例えば1kDa、2kDa、3kDa、4kDa又は5kDaであってよい。脱離基は、所望であれば、1つ又は複数のスペーサーによって分離される2つ以上の部分-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-を含有することができる。
【００１８】
本発明によるコンジュゲート試薬における脱離基は、適当には、式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P又は-N+PR2R3であり、式中Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は、独立して、水素原子、C1〜4アルキル基又はP基を表す。脱離基-N+PR2R3は、-NPR2基のプロトン化又は四級化によって調製することができる。好ましくは、R2及びR3の各々は、C1〜4アルキル基、特にメチル基、又は特に水素原子を表す。代替として、該コンジュゲート試薬は、式-S-P-S-;-O-P-O-;-SO2-P-SO2-;-OSO2-P-OSO2-;及び-N+R2R3-P-N+R2R3-の基を含み得、式中Pは、-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-部分を含む基である。上記の通り、脱離基-N+R2R3-P-N+R2R3-は、-NPR2-P-NR2基のプロトン化又は四級化によって調製することができる。この型の特定の基としては、-S-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-S-、-O-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-O-;-SO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-SO2-;-OSO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OSO2-;若しくは-N+R2R3-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N+R2R3-、又はnではなくn1を含む対応する基が挙げられる。それらとしては、以下の型の基:
【００１９】
【化１】
2017534612.tif 000002
【００２０】
又はnではなくn1を含む対応する基を挙げることもでき、式中、-(CH2CH2O)n-又は-(CH2CH2O)n1-基は、任意の適当な連結基、例えばアルキレン基によって担持される。これらの二価の基は、2種の求核試薬と反応できる2個の脱離基と化学的に同等である。
【００２１】
2つ以上のP基が存在する場合、各Pは同じ又は異なっていてよい。好ましくは、脱離基は、式-OSO2-P-OSO2-、例えば-SO2-(CH2.CH2O)n1-CH2-CH2-SO2-、又は特にSO2Pである。
【００２２】
Pとしては、例えば、式-T-(CH2.CH2O)n-(式中、Tはリンカーである)の基が挙げられ得る。Pは、例えば、式-T-(CH2.CH2O)n-OR1を有することができる。Tは、例えば、直接結合、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、又は場合により置換されているアリール基、特に場合により置換されているフェニル基であってよい。C1〜4アルキル基であるリンカーTの存在は、コンジュゲート試薬の調製が市販のPEGの使用を一般に伴うのでしばしば好都合であり、これらは頻繁に、T基を生じさせる基によって末端化されている。
【００２３】
コンジュゲート試薬
ペイロードをタンパク質にコンジュゲートするために使用することができる多くのコンジュゲート試薬が知られており、本発明の新規なコンジュゲート試薬は、これらの公知の試薬とは、それらが含有する脱離基の性質において異なる。本発明によるコンジュゲート試薬は、本発明による新規な脱離基の少なくとも1個を含まなければならない。それには2個以上の脱離基が含まれ得る。2個以上の新規な脱離基が存在する場合、これらは同じ又は異なっていてよい。例えば、1個の脱離基は本発明による新規な脱離基であってよく、一方、別の脱離基は従来の脱離基であってよい。本発明による2個以上の新規な脱離基が存在する場合、それらは同じ又は異なっていてよく、例えばそれらは、各nが異なる部分を含有することができる。代替として、上に記述されている通り、コンジュゲート試薬は、2個の脱離基と化学的に同等であるとともに2種の求核試薬と反応できる単一の基を含有することができる。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態において、コンジュゲート試薬は、本発明による2個の脱離基を含有するか、2個の脱離基と化学的に同等であるとともに2種の求核試薬と反応できる単一の基を含有し、前記試薬は、タンパク質又はペプチドにおけるジスルフィド結合の還元によって形成される2個のチオール基と反応できる。このような試薬の使用は、有効には、タンパク質又はペプチドにおけるジスルフィド結合を架橋することによってコンジュゲートを生成する。
【００２５】
試薬の1個の基は、Smithら、J. Am. Chem. Soc. 2010、132、1960〜1965、及びSchumakerら、Bioconj. Chem.、2011、22、132〜136に記載されている通りのビス-ハロ-又はビス-チオ-マレイミド及びその誘導体に基づく。これらの試薬は、官能グルーピング:
【００２６】
【化２】
2017534612.tif 000003
【００２７】
(式中、少なくとも1つの、好ましくは各々のLは、本発明による脱離基である)
を含有する。マレイミド環の窒素原子は、ペイロード、例えば診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤、例えば下に記述されている式D-Q-の1つを担持することができる。これらの試薬は、タンパク質又はペプチドにおけるジスルフィド結合を架橋できる。
【００２８】
同様に、単一脱離基L:
【００２９】
【化３】
2017534612.tif 000004
【００３０】
を含有するマレイミドが使用され得る。この場合も同様に、マレイミド環の窒素原子は、ペイロード、例えば、下に記述されている式D-Q-の1つを担持することができる。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、コンジュゲート試薬は、官能グルーピング:
【００３２】
【化４】
2017534612.tif 000005
【００３３】
(式中、Wは、電子求引性基、例えばケト基、エステル基-O-CO-、スルホン基-SO2-、又はシアノ基を表し;Aは、C1〜5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは、結合又はC1〜4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;各Lは独立して脱離基を表し、これらの少なくとも1つ、好ましくはこれらの両方は本発明による新規な脱離基でなければならない、又は両方のLは共に本発明による脱離基を表す、のいずれかである)
を含有する。従来の脱離基を使用するこの型の試薬は、Bioconj. Chem 1990(1)、36〜50、Bioconj. Chem 1990(1)、51〜59、及びJ. Am. Chem. Soc. 110、5211〜5212に記載されている。このような基を含有する試薬がタンパク質と反応する時に、第1の脱離基Lが失われることで、式:
【００３４】
【化５】
2017534612.tif 000006
【００３５】
(式中、mは0から4である)
の官能グルーピングを含有するコンジュゲート試薬をin situで形成し、該試薬は第1の求核試薬と反応する。次いで第2の脱離基Lが失われ、第2の求核試薬との反応が発生する。官能グルーピングIを出発材料として含有する試薬を使用することの代替として、官能グルーピングI'を含有する試薬が出発材料として使用され得る。
【００３６】
好ましくは、Wはケト基を表す。好ましくは、Aは-CH2-を表し、Bは結合を表す。
【００３７】
式I及びI'の特に好ましい官能グルーピングは、式:
【００３８】
【化６】
2017534612.tif 000007
【００３９】
を有する。
【００４０】
例えば、該基は、式:
【００４１】
【化７】
2017534612.tif 000008
【００４２】
であってよい。
【００４３】
コンジュゲート試薬の別の群は、官能グルーピング:
〜W-CR4R4'-CR4.L.L'      (II)
を含有し、式中、Wは、上記で定められた意味及び好ましい意味を有し、
各R4は水素原子又はC1〜4アルキル基を表し、R4'は水素原子を表し、各Lは独立して脱離基を表すか、これらの少なくとも1つ、好ましくはこれらの両方は本発明による新規な脱離基でなければならないか、若しくは両方のLは共に本発明による脱離基を表すのいずれかであり;又は
各R4は水素原子若しくはC1〜4アルキル基を表し、Lは本発明による脱離基を表し、R4'及びL'は共に結合を表す
のいずれかである。
【００４４】
官能グルーピングI、I'又はIIを含有する試薬は、タンパク質又はペプチドにおけるジスルフィド結合を架橋できる。
【００４５】
コンジュゲート試薬の別の群としては、官能グルーピング:
〜W-(CH=CH)p-(CH2)2-L      (III)
が挙げられ、式中、Wは、上記で定められた意味及び好ましい意味を有し、pは、0又は1から4の整数、好ましくは0を表す。この型の特に好ましい試薬としては、官能グルーピング:
〜NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L      (IIIa)
が挙げられ、式中、Arは、場合により置換されているアリール基、特にフェニル基を表す。
【００４６】
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質との反応のための1つより多い官能グルーピングを含有することができる。例えば、試薬は、分子の1つの端部に式I若しくはI'の官能グルーピング又は本発明による少なくとも1個の新規な脱離基を含有する任意の他の官能グルーピング、及び本発明による新規な脱離基を含有する又はタンパク質若しくは任意の他の分子とコンジュゲートできる従来の官能グルーピングであるのいずれかである1つ又は複数の追加の官能グルーピングを分子の他所に含有することができる。このような構造は、例えばBelchevaら、J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3)、207〜226に記載されており、複数のタンパク質を含有するコンジュゲートの合成において有用である。
【００４７】
本発明の新規なコンジュゲート試薬は、公知の方法と類似した方法によって調製することができる。例えば、PEGに基づくとともに適切な官能性を担持する分子は、従来の脱離基が導入されるのと同じやり方でコンジュゲート試薬に導入することができる。例えば、アミノ又はチオール末端PEGは、マンニッヒ反応を使用して、カルボニル基を含有する化合物に導入することができる。特定の反応が、以下に続く実施例において例示されている。
【００４８】
ペイロード
コンジュゲート試薬は、ペイロード、例えば診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤を担持することができる。この場合において、式I/I'の単位を含有する試薬は、式(Ic)若しくは(Ic')(式中、Wはシアノ基を表す)、又は(Id)若しくは(Id'):
【００４９】
【化８】
2017534612.tif 000009
【００５０】
(式中、Qは連結基を表し、Dは、ペイロード、好ましくは診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤を表す)
を有することができる。好ましくは、D-Q-としては、薬剤若しくはポリマー、又は薬剤及びポリマーの両方が挙げられる。薬剤が存在する場合、それは例えば細胞毒性薬であってよく、ポリマーが存在する場合、これは好ましくはポリエチレングリコールである。
【００５１】
Dが、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤を表す場合、好ましい構造は、当然、最終的に望まれる生成物における診断剤、治療剤、又は標識化剤の構造に依存する。例えば、診断剤、治療剤、又は標識化剤と反応できる任意の官能グルーピングが存在してよい。例えば、-CO2H若しくはその反応性誘導体、-NH2、又は-OH等の官能グルーピングが存在してよい。カルボン酸基の活性化誘導体は、当技術分野においてよく知られている。例えば、カルボン酸は、H-ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性化エステル、又は酸ハロゲン化物の使用を介して活性化することができる。好ましい一実施形態において、Qは、場合により置換されているフェニル基であり、Dは、診断剤、治療剤、又は標識化剤のための結合剤、例えば-CO2H、-NH2又は-OH基である。
【００５２】
任意の適当な連結基Qが使用され得る。一実施形態において、Qは、例えば、直接結合、アルキレン基(好ましくはC1〜10アルキレン基)、又は場合により置換されているアリール又はヘテロアリール基であってよく、これらのいずれも、1個又は複数の酸素原子、硫黄原子、-NR基(式中、Rは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)、若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表す)、ケト基、-O-CO-基、-CO-O-基、-O-CO-O-、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-及び/又は-NR.CO-基によって末端化又は(アルキレン基の場合において)中断されていてよい。このようなアリール及びヘテロアリール基Qは、本発明の好ましい一実施形態を形成する。適当なアリール基としては、フェニル及びナフチル基が挙げられ、一方、適当なヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンが挙げられる。特に適当な連結基Qは、ヘテロアリール又は、特にアリール基、特にフェニル基である。Dが結合性基である場合、これらは例えば、上に記載されている通りの-CO2H、-NH2又は-OH基を含有することができる。Dが診断剤、治療剤、又は標識化剤である場合、これらは、D基への連結基、例えば-NR.CO-若しくは-CO.NR-基、例えば-NH.CO-若しくは-CO.NH-基である又はこれを含有する基を有することができる。
【００５３】
特定のD-Q-基(式中、Dは結合性基を含む)としては、以下:
【００５４】
【化９】
2017534612.tif 000010
【００５５】
(式中、Dは、結合性基、例えば-CO2H、-NH2又は-OHを表し、m及びqの各々は、1から6の整数、例えば2又は3を表し、フェニル環は、非置換、又は例えば下に記述されている置換基のいずれかによって置換されていてよい)
が挙げられる。
【００５６】
場合により置換されているアリール、特にフェニル、又はヘテロアリール基上に存在することができる置換基としては、例えば、アルキル(好ましくは、OH又はCO2Hによって場合により置換されているC1〜4アルキル、特にメチル)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、例えばフッ素又は塩素、-C≡CR、-C=CR2及び-C=CHRから選択される同じ又は異なる置換基の1つ又は複数が挙げられ、式中、各Rは独立して、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)、又はアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表す。電子求引性置換基の存在は特に好ましい。好ましい置換基としては、例えばCN、NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH及び-NR.CORが挙げられる。
【００５７】
別の実施形態において、リンカーQは分解性基を含有することができ、即ち、それは、生理学的条件下で切断される基を含有することができ、最終的にそれが結合されるタンパク質からDを分離させる。代替として、Qは、生理学的条件下で開裂可能でないリンカーであってよい。リンカーが生理学的条件下で切断される場合、それは、好ましくは細胞内条件下で開裂可能である。標的が細胞内にある場合、好ましくは、リンカーは細胞外条件に実質的に非感受性である(即ち、その結果、細胞内標的への十分な用量の治療剤の送達が禁止されない)。
【００５８】
Qが分解性基を含有する場合、これは一般に、加水分解条件に感受性であり、例えばそれは、ある特定のpH値(例えば、酸性条件)で分解する基であってよい。加水分解性/酸性条件は、例えばエンドソーム又はリソソームにおいて見出すことができる。酸性条件下で加水分解に感受性の基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニットアミド、オルトエステル及びケタールが挙げられる。加水分解条件に感受性の基の例としては:
【００５９】
【化１０】
2017534612.tif 000011
【００６０】
が挙げられる。
【００６１】
好ましい実施形態において、リンカーは
【００６２】
【化１１】
2017534612.tif 000012
【００６３】
である又はこれを含む。
【００６４】
例えば、それは:
【００６５】
【化１２】
2017534612.tif 000013
【００６６】
であってよい又はこれを含み得る。
【００６７】
リンカーQは、還元条件下での分解に感受性であってもよい。例えば、それは、チオール等の生物学的還元剤への曝露で開裂可能であるジスルフィド基を含有することができる。ジスルフィド基の例としては:
【００６８】
【化１３】
2017534612.tif 000014
【００６９】
(式中、R、R'、R''及びR'''は、各々独立して、水素又はC1〜4アルキルである)
が挙げられる。好ましい実施形態において、リンカーは
【００７０】
【化１４】
2017534612.tif 000015
【００７１】
である又はこれを含む。
【００７２】
例えば、それは
【００７３】
【化１５】
2017534612.tif 000016
【００７４】
であってよい又はこれを含み得る。
【００７５】
リンカーQは、酵素分解に感受性である基を含有することもでき、例えばそれは、プロテアーゼ(例えば、リソソーム又はエンドソームのプロテアーゼ)又はペプチダーゼによる開裂に感受性であり得る。例えば、それは、少なくとも1個、例えば少なくとも2個、又は少なくとも3個のアミノ酸残基(例えば、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、Phe-Lys)を含むペプチジル基を含有することができる。例えば、それは、1個から5個、例えば2個から4個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖であってよい又はこれを含み得る。酵素分解に感受性の基の別の例は:
【００７６】
【化１６】
2017534612.tif 000017
【００７７】
(式中、AAは、Val-Cit等プロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す)
である。
【００７８】
好ましい実施形態において、リンカーQは:
【００７９】
【化１７】
2017534612.tif 000018
【００８０】
である又はこれを含む。
【００８１】
例えば、それは
【００８２】
【化１８】
2017534612.tif 000019
【００８３】
であってよい又はこれを含み得る。
【００８４】
リンカーQは、単一のD基、又は1つより多いD基を担持することができる。複数のD基は、例えばアスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基を組み込むことができる分岐リンカーQの使用によって組み込むことができる。これは、式:
【００８５】
【化１９】
2017534612.tif 000020
【００８６】
(式中、bは1、2又は3であり、b=1はアスパルテートであり、b=2はグルタメートであり、b=3は好ましい一実施形態を表す)
の分岐要素を導入する。上記式におけるアシル部分の各々は、D基にカップリングさせることができる。上記の分岐基は、以下のように:
【００８７】
【化２０】
2017534612.tif 000021
【００８８】
-CO.CH2-基を組み込むことができる。
【００８９】
所望であれば、アスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基は、例えば:
【００９０】
【化２１】
2017534612.tif 000022
【００９１】
等、さらなるアスパルテート及び/若しくはグルタメート並びに/又は同様の残基にカップリングさせることができる。
【００９２】
上記リンカーの全ては、例えばアミド結合を介してポリマーに結合されていてよい。ポリマーは下記で論じられている。
【００９３】
式I/I'の単位を含む好ましい試薬としては:
【００９４】
【化２２】
2017534612.tif 000023
【００９５】
(式中、Q及びDは、上記で定められた意味を有する)
が挙げられる。
【００９６】
この型の特に好ましい試薬は、式:
【００９７】
【化２３】
2017534612.tif 000024
【００９８】
(式中、Arは、場合により置換されているアリール、特にフェニル基、例えば上記にリストされているものの1つを表す)
を有する。例えば、該試薬又は該試薬の前駆体は、式:
【００９９】
【化２４Ａ】
2017534612.tif 000025
【化２４Ｂ】
2017534612.tif 000026
【０１００】
(式中、Dは-CO2H、-NH2又は-OH基、特にCO2H基であり、m及びqの各々は、1から6の整数、例えば2又は3である)
であってよい。好ましくは、m及びqの一方は2であり、他方は3である。
【０１０１】
上記試薬は、官能化されることで、任意の所望のペイロードを担持することができる。例えば、式(Ig)/(Ig')に示されているNH2基、式(Ih)/(Ih')におけるカルボン酸基、若しくは式(Ii)/(Ii')におけるヒドロキシ基、又は上記の式Ijにおける対応するD基を使用することにより、ペイロードを付加させるために任意の適当な基と反応することができ、NH2基若しくはカルボン酸基がさらなるD-Q-基の一部となる;又は上記の式(If)、(If')、(Ig)、(Ig')、(Ih)、(Ih')、(Ii)、(Ii')若しくは(Ij)におけるアリール/フェニル基が、ペイロードを付加させるために使用することができる追加の適当な反応性基を担持することができる化合物が与えられる。
【０１０２】
ペイロードを担持する他の好ましいコンジュゲート試薬は、式:
D-Q-W-CR2R2'-CR2.L.L'      (IIa)
又は
D-Q-(CH=CH)p-(CH2)2-L      (IIIa)
例えば
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L      (IIIb)
を有し、式中、様々な置換基は、上記に定められた意味及び好ましい意味を有する。
【０１０３】
D又はQがポリマーを組み込む場合、コンジュゲート試薬は、WO99/45964、WO2005/007197又はWO2010/100430に記載されている基本構造を有する試薬の1つであってよく、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、ポリマー含有試薬は、上に記載されている通りの式Iの官能基を含有し、下記の式Ii:
【０１０４】
【化２５】
2017534612.tif 000027
【０１０５】
(式中、X及びX'の一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;
Qは、連結基を表し;
Wは、電子求引性基、例えばケト基、エステル基-O-CO-若しくはスルホン基-SO2-を表し;又は、X'がポリマーを表す場合、X-Q-Wは共に、電子求引性基、例えばシアノ基を表すことがあり;
Aは、C1〜5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;
Bは、結合、又はC1〜4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;
各Lは、独立して、本発明による脱離基を表すか、又は両方のLは共に、本発明による脱離基を表す)
である。
【０１０６】
関連のコンジュゲート試薬は、一般式(Ii')又は(IIa):
【０１０７】
【化２６】
2017534612.tif 000028
【０１０８】
(式中、X、X'、Q、W、A及びLは、一般式Iiについて定められた意味を有し、mは0から4を表す)
又は
X-Q-W-CR4R4'-CR4.L.L'      (IIa)
(式中、X、Q及びWは、一般式Iiについて定められた意味を有し、
各R4は水素原子又はC1〜4アルキル基を表し、R4'は水素原子を表し、各Lは独立して脱離基を表すか、これらの少なくとも1つ、好ましくはこれらの両方は、本発明による新規な脱離基でなければならないか、若しくは両方のLは共に、本発明による脱離基を表すのいずれかであり;又は
各R4は水素原子若しくはC1〜4アルキル基を表し、Lは本発明による脱離基を表し、R4'及びL'は共に結合を表す
のいずれかである)
を有する。
【０１０９】
式Ii、Ii'及びIIaにおける様々な置換基についての好ましい意味は、上記に定められた通りである。式Ii及びIi'において、好ましくは、Xはポリマーを表し、X'-Q-は水素原子を表す。ポリマーXへの連結は、加水分解的に不安定な結合、又は非不安定な結合を経ていてよい。
【０１１０】
特に好ましいポリマー性コンジュゲート試薬は、式:
【０１１１】
【化２７】
2017534612.tif 000029
【０１１２】
を有する。
【０１１３】
本発明の方法における使用のための好ましい試薬の別の群は、WO2010/010324に記載されているものに基づく。これらの試薬は、一般式:
X-[Q-W-(CH=CH)p-(CH2)2-L]q      (IIIc)
を有し、式中、X、Q、W及びLは、上記に定められた意味及び好ましい意味を有し;pは、0又は1から4の整数、好ましくは0を表し;qは、1から8の整数、好ましくは1を表す。式IIIcの特に好ましい試薬は、式:
X-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L      (IIId)
を有する。
【０１１４】
上記式の好ましい実施形態において、リンカーQ又はポリマーXのいずれかは、ペイロード、例えば診断剤、治療剤、又は標識化剤を組み込むことができる。特に貴重なのは、リンカーQ又はポリマーXのいずれかが薬剤分子を組み込む上記式の試薬であり:これらの試薬は、例えば、抗体-薬剤コンジュゲートの合成において使用することができる。
【０１１５】
任意の所望のペイロード、例えば診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤は、本発明によるコンジュゲート試薬に含まれ得る。1つ又は複数の薬剤分子、例えば細胞毒性剤又は毒素の包含が好ましい。オーリスタチン及びメイタンシノイドは、典型的な細胞毒性薬である。薬剤コンジュゲート、特に抗体薬剤コンジュゲートは、薬剤の複数のコピーを含有するべきであることが、しばしば好ましい。標識化剤(これには、造影剤が含まれると理解されるべきである)としては、例えば、放射性核種、蛍光薬剤(例えば、5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(2-アミノエチル)等のアミン誘導体化蛍光プローブ)スルホンアミド-ダンシルエチレンジアミン、Oregon Green(登録商標)488カダベリン(カタログ番号O-10465、Molecular Probes社)、ダンシルカダベリン、N-(2-アミノエチル)-4-アミノ-3,6-ジスルホ-1,8-ナフタルイミド、二カリウム塩(ルシファーイエローエチレンジアミン)、又はローダミンBエチレンジアミン(カタログ番号L-2424、Molecular Probes社)、又はチオール誘導体化蛍光プローブ、例えばBODIPY(登録商標)FL L-シスチン(カタログ番号B-20340、Molecular Probes社)が挙げられ得る。結合剤は、例えば、任意の他の所望の部分、例えば上に記述されているものの1つを結合するために次いで使用することができるキレート化剤、例えばデスフェリオキサミン若しくはビオチンであってよく、又はそれは、上記で論じられている通りの反応性基であってよい。
【０１１６】
本発明者らの同時係属出願GB1418984は、リンカーを介してメイタンシン含有ペイロードに付加されているタンパク質、ペプチド及び/又はポリマーを含むコンジュゲート、このようなコンジュゲートを形成するのに有用なコンジュゲート試薬、並びにペイロードとしての使用のためのメイタンシン含有化合物を提供している。メイタンシン含有ペイロード及び化合物は、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなる。これらのメイタンシンは本発明におけるペイロードとして使用することができ、該試薬は本発明の一態様を形成する。本発明者らの同時係属出願は以下を開示している:
【０１１７】
「本発明は、第1の態様において、少なくとも2つのメイタンシン部分(D)が架橋基(Bd)を介して互いに連結されているメイタンシン含有化合物を提供する。架橋基(Bd)は生理学的条件下で非分解性である。有利には、架橋基(Bd)は少なくとも3個の鎖炭素原子を有し、場合により、3個の鎖炭素原子に加えてポリ(エチレングリコール)スペーサーを含有する。有利には、2個のヘテロ原子は架橋基において互いに隣接していない。有利には、架橋基は、-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分(式中、bは1、2又は3であり、R1は水素及びC1〜C6アルキルから選択され、Xは任意の基である)を含まない。2つのメイタンシン部分が存在する第1の態様のメイタンシン含有化合物は、以下の式(I):
D-Bd-D      (I)
によって表すことができる。
【０１１８】
第2の態様において、本発明は、ペプチド若しくはタンパク質と反応できる官能基及び/又はポリマーと反応できる官能基を含有するコンジュゲート試薬であって、ペイロードが1個又は複数のリンカーを介して官能基に付加されており、コンジュゲーション試薬が、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを含むことを特徴とし、但し、コンジュゲート試薬が、ペプチド又はタンパク質と反応できる官能基を含む場合、ペプチド又はタンパク質と反応できる官能基にペイロードを付加させているリンカーが分解性であることを条件とする、コンジュゲート試薬を提供する。コンジュゲート試薬が、ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基を含有し、該官能基が、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含む場合、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードは、有利には、分解性リンカーを介してペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基に付加されている。コンジュゲート試薬は、場合により、ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基を含有し、官能基は、有利には、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含み、コンジュゲーション試薬が、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分、特に2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを含むこと、及びペイロードが、リンカー、特に分解性リンカーを介してペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基に付加されていることを特徴とする。該リンカーは、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチドに架橋基を連結するのに適当である。好ましくは、メイタンシン含有ペイロード(D2Bd)の架橋基(Bd)は、生理学的条件下で切断される分解性基を含む分解性リンカー(Lkd)に接続されている。該分解性基は、例えば、加水分解条件、特に酸性条件に感受性であり得;還元条件下での分解に感受性であり得;又は酵素分解に感受性であり得る。
【０１１９】
2つのメイタンシン部分が存在する第2の態様のメイタンシン含有コンジュゲート試薬は、以下の式(II):
D2Bd-Lk-F      (II)
(式中、D2Bdは、非分解性架橋基を介して互いに連結されている2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを表し、Lkはリンカー、特に分解性リンカー(Lkd)であり、Fは、ペプチド若しくはタンパク質と反応できる官能基及び/又はポリマーと反応できる官能基を表す)によって表すことができる。
【０１２０】
本発明は、ペプチド、タンパク質及び/又はポリマーのコンジュゲーションのための方法であって、前記ペプチド、タンパク質及び/又はポリマーを、本発明の第2の態様のコンジュゲート試薬と反応させる工程を含む方法を更に提供する。コンジュゲート試薬がペプチド又はポリマーと反応する場合、前記コンジュゲート試薬は、有利には、前記ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応でき、前記試薬は、有利には、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有する。
【０１２１】
本発明は、第3の態様において、リンカーを介してメイタンシン含有ペイロードに付加されているタンパク質、ペプチド及び/又はポリマーを含むコンジュゲートであって、メイタンシン含有ペイロードが、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなることを特徴とする、コンジュゲートも提供する。コンジュゲートがタンパク質又はペプチドを含む場合、タンパク質又はペプチドにペイロードを付加させるリンカーは、有利には、分解性である。本発明の第3の態様のコンジュゲートは、例えば、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチド(Ab)に、リンカー(Lk)、特に分解性リンカー(Lkd)を介して連結されているメイタンシン含有薬剤部分(D2Bd)を含むことができ、ここで、メイタンシン含有薬剤部分(D2Bd)は、非分解性架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)を含む。2つのメイタンシン部分(D)が存在する本発明の第3の態様のメイタンシン含有コンジュゲートは、以下の式(III):
D2Bd-Lk-Ab      (III)
によって表すことができる。
【０１２２】
リンカー(Lk)は、有利には、架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)を含むメイタンシン含有薬剤部分(D2Bd)を、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチド(Ab)から分離させる、生理学的条件下で開裂する分解性基を含む分解性リンカー(Lkd)である。該分解性基は、例えば、加水分解条件、特に酸性条件に感受性であり得;還元条件下での分解に感受性であり得;又は酵素分解に感受性であり得る。非分解性架橋基(Bd)は、分解性リンカーにおける分解性基が開裂する条件と同じ条件下での開裂に感受性である基を含有しない。
【０１２３】
本発明の第1の態様のメイタンシン含有化合物は、例えば、少なくとも3個の鎖炭素原子、特に少なくとも7個の鎖炭素原子、及び鎖炭素原子に加えて任意選択のポリ(エチレングリコール)単位を有する架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)、特に2つのメイタンシン部分を含む又はこれらからなることができ、但し、2個のヘテロ原子が架橋基において互いに隣接しないことを条件とし、及び架橋基は-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分(式中、bは1、2又は3であり、R1は水素及びC1〜C6アルキルから選択され、Xは任意の基である)を含まないことを条件とする。場合により、架橋基は、0個から8個のカルボニル基、特に2個から8個のカルボニル基を組み込んでいる。架橋基は、場合により、0個から4個の不飽和炭素-炭素二重結合;及び/又は0個から4個のC3〜C10アリール又はヘテロアリール基を鎖中に組み込んでいる。場合により、該鎖には、N、O及びSから選択される0個から11個、特に2個から11個の鎖ヘテロ原子が散在しており、但し、2個のヘテロ原子が互いに隣接しないことを条件とする。有利には、架橋基における鎖炭素原子は、アミン、カルボキシ、アルキン、アジド、ヒドロキシル又はチオールから選択されるペンダント型接続基で置換されている。有利には、架橋基は、鎖中に少なくとも1つのアミド連結を含む。」
【０１２４】
本発明の使用は、非常に広い範囲のペイロードの効率的なコンジュゲーションを可能にする。公知の科学技術を使用して得られる収率は、一部のペイロードについて低いことがある。例えば、PEGを含有しないペイロードへのタンパク質のコンジュゲーションは、低収率であり得、本発明の使用は、より高い収率を与えることができる。更に、コンジュゲーションは、公知の科学技術を使用する場合よりも、著しく急速に及びそれゆえにより効率的に発生させることができる。
【０１２５】
コンジュゲート試薬に存在するポリマー
上に記述されている通り、該コンジュゲート試薬を使用して、オリゴマー又はポリマー(本明細書において、便宜のために、共に「ポリマー」と称される)、特に水溶性の合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールをタンパク質にコンジュゲートすることができる。言い換えると、ペイロード(例えば、上記一般式におけるD又はX)はポリマーであってよい又はポリマーを含み得る。ポリマーは、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、例えばポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、例えばポリカルボキシメタクリルアミド、又はHPMAコポリマーであってよい。加えて、ポリマーは、酵素的又は加水分解的な分解に感受性であるポリマーであってよい。このようなポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、及びポリアミド、例えばポリ(アミノ酸)が挙げられる。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー又は構造的に定義されているコポリマー、例えばブロックコポリマーであってよく、例えばそれは、2つ以上のアルキレンオキシドから、又はポリ(アルキレンオキシド)、及びポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)若しくはポリ(アミノ酸)のいずれかから誘導されるブロックコポリマーであってよい。使用することができる多官能ポリマーとしては、ジビニルエーテル-無水マレイン酸及びスチレン-無水マレイン酸のコポリマーが挙げられる。
【０１２６】
天然に存在するポリマー、例えばキチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、デンプン、セルロース、グリコーゲン、ポリ(シアル酸)、ヒアルロン酸及びそれらの誘導体等の多糖類も使用することができる。タンパク質はポリマーとして使用することができる。これは、第1のタンパク質、例えば抗体若しくは抗体断片、又は第2のタンパク質、例えば酵素若しくは他の活性タンパク質、又はビオチン化分子に結合することができるアビジン等の足場タンパク質へのコンジュゲーションを可能にする。その上、触媒配列を含有するペプチド、例えばグリコシルトランスフェラーゼのためのO-グリカンアクセプター部位が使用される場合、それは、後続の酵素反応のための基質又は標的の組込みを可能にする。ポリグルタミン酸等のポリマーも、糖類又はアミノ酸等の天然モノマー及び酸化エチレン又はメタクリル酸等の合成モノマーから誘導されるハイブリッドポリマーのように、使用することができる。
【０１２７】
ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、これは、好ましくは、C2及び/又はC3単位を含有するものであり、特にポリエチレングリコールである。ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、単一の直鎖状鎖を含有することができるか、又はそれは、小さい若しくは大きい多くの鎖で構成される分枝形態を有することができる。いわゆるプルロニックは、PEGブロックコポリマーの重要なクラスである。これらは、酸化エチレン及び酸化プロピレンのブロックから誘導される。置換されている又はキャップドポリアルキレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコールが使用され得る。
【０１２８】
ポリマーは、例えば、WO2004/113394に記載されている方法によって生成されるコームポリマーであってよく、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ポリマーは、一般式:
(E)e-(F)f-(G)g
(式中:
Eは、存在する場合、Fに定義されている通りでない1つ又は複数のオレフィン不飽和モノマーの追加の重合によって得られ;
Fは、直鎖状、分枝状又は星形状の置換又は非置換であるとともにオレフィン不飽和部分を有する複数のモノマーの追加の重合によって得られ;
Gは、存在する場合、Fに定義されている通りでない1つ又は複数のオレフィン不飽和モノマーの追加の重合によって得られ;
e及びgは、0から500の間の整数であり;
fは、0から1000の整数であり;
D、E及びFの少なくとも1つは存在する)
を有するコームポリマーであってよい。
【０１２９】
タンパク質へのコンジュゲーションのためのポリマーは、場合により、任意の所望のやり方で誘導体化又は官能化することができる。好ましい一実施形態において、ポリマーは、例えば、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、例えば上に記述されているものの1つ、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤を結合できる結合剤を担持する。反応性基は、ポリマー末端若しくは端部基で、又はペンダントリンカーを介してポリマー鎖に沿って連結することができ;このような場合において、ポリマーは、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート又は無水マレイン酸コポリマーである。1つより多い生物学的分子を含有する多量体コンジュゲートは、相乗的及び相加的利益をもたらすことができる。所望であれば、ポリマーは、従来の方法を使用して固体支持体にカップリングさせることができる。
【０１３０】
ポリマーの最適な分子量は、当然、意図される適用に依存する。長鎖ポリマーが使用され得、例えば、数平均分子量は、最大およそ75,000g/モルまで、例えば最大50,000、40,000又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルからおよそ75,000g/モルの範囲であってよい。しかしながら、例えば、わずか2の反復単位、例えば2から50の反復単位を有する別個のPEG鎖からなる非常に小さいオリゴマーは、一部の適用に有用であり、本発明の好ましい一実施形態に存在する。例えば、2から48、例えば2から36、例えば2から24の単位を含有するポリマーが使用され得る。12、20、24、36、40又は48の反復単位を有する直鎖状又は分枝状PEGが例えば使用され得る。コンジュゲートされるべきタンパク質が、例えば悪性腫瘍、感染若しくは自己免疫疾患によって又は外傷によって引き起こされる炎症の処置における使用のため、循環を離れるとともに組織に浸透することが意図される場合、最大30,000g/モルまでの範囲のより低い分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。ポリマー-タンパク質コンジュゲートが循環にとどまることを意図される適用のため、例えば20,000〜75,000g/モルの範囲のより高い分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
【０１３１】
使用されるべきポリマーは、コンジュゲートがその意図される使用のための溶媒媒体に可溶性であるように選択されるべきである。生物学的適用のため、特に、哺乳動物への臨床治療的投与のための診断的適用及び治療的適用のため、該コンジュゲートは水性媒体に可溶性である。
【０１３２】
好ましくは、ポリマーは合成ポリマーであり、好ましくは、それは水溶性ポリマーである。水溶性ポリエチレングリコールの使用は、多くの適用にとって特に好ましい。
【０１３３】
本発明者らの同時係属出願GB1418986は、特別な構造のPEG含有リンカーの使用に関し、これらは本発明において使用され得る。その出願は、以下を開示している:
【０１３４】
「本発明は、治療剤、診断剤、又は標識化剤とのタンパク質又はペプチドのコンジュゲートを提供し、前記コンジュゲートは、タンパク質又はペプチド結合部分及びポリエチレングリコール部分を含有し;前記タンパク質又はペプチド結合部分は、一般式:
【０１３５】
【化２８】
2017534612.tif 000030
【０１３６】
(式中、Prは、前記タンパク質又はペプチドを表し、各Nuは、タンパク質又はペプチドに存在する又は付加されている求核試薬を表し、A及びBの各々は、独立して、C1〜4アルキレン又はアルケニレン鎖を表し、W'は、電子求引性基又は電子求引性基の還元によって得られる基を表す)
を有し;前記ポリエチレングリコール部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端部基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖である又はそれを含む。
【０１３７】
本発明は、タンパク質又はペプチドと反応できるとともに治療剤、診断剤、又は標識化剤及びポリエチレングリコール部分を含むコンジュゲート試薬も提供し;前記コンジュゲート試薬は、式:
【０１３８】
【化２９】
2017534612.tif 000031
【０１３９】
(式中、Wは電子求引性基を表し、A及びBは、上記で定められた意味を有し、mは0から4であり、各Lは独立して脱離基を表す)
の基を含み;前記ポリエチレングリコール部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端部基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖である又はそれを含む。
【０１４０】
本発明は、タンパク質又はペプチドを本発明によるコンジュゲート試薬と反応させる工程を含む、本発明によるコンジュゲートの調製のための方法も提供する。
【０１４１】
本発明のコンジュゲートは、式:
【０１４２】
【化３０】
2017534612.tif 000032
【０１４３】
(式中、Dは治療剤、診断剤、又は標識化剤を表し、F'は式Iの基を表し、PEGは、式-CH2CH2ORの末端部基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す)
によって模式的に表すことができる。
【０１４４】
本発明の試薬は、式:
【０１４５】
【化３１】
2017534612.tif 000033
【０１４６】
(式中、Dは治療剤、診断剤、又は標識化剤を表し、Fは式II又はII'の基を表し、PEGは、式-CH2CH2ORの末端部基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す)
によって模式的に表すことができる。官能グルーピングFは、下記で説明されている通り、タンパク質又はペプチドに存在する2種の求核試薬と反応できる。
【０１４７】
本発明のコンジュゲート及び試薬のポリエチレングリコール(PEG)部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端部基を有するペンダントPEG鎖である又はこれを含む。好ましくは、Rはメチル基又は水素原子である。
【０１４８】
PEG部分の全体的サイズは、当然、意図される適用に依存する。一部の適用のため、高分子量PEGが使用され得、例えば数平均分子量は、最大およそ75,000g/モルまで、例えば最大50,000、40,000又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルからおよそ75,000の範囲であってよい。しかしながら、より小さいPEG部分が一部の適用にとって好ましいことがある。
【０１４９】
好ましい一実施形態において、PEG部分におけるPEGの全ては、ペンダントPEG鎖に存在する。別の実施形態において、PEGは、分子の骨格に存在してもよく、これは下記でより詳細に論じられている。
【０１５０】
PEG部分と同様に、ペンダントPEG鎖のサイズは、意図される適用に依存する。一部の適用のため、高分子量ペンダントPEG鎖が使用され得、例えば数平均分子量は、最大およそ75,000g/モルまで、例えば最大50,000、40,000又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルからおよそ75,000の範囲であってよい。しかしながら、多くの適用のため、より小さいペンダントPEG鎖が使用され得る。例えば前記PEG鎖は、最大3,000g/モルまでの分子量を有することができる。しかしながら、例えば、わずか2反復単位、例えば2から50の反復単位を有する別個のPEG鎖からなる非常に小さいオリゴマーは、一部の適用に有用であり、本発明の好ましい一実施形態において前記PEG鎖として存在する。ペンダントPEG鎖は直鎖状又は分枝状であってよい。PEG鎖、例えば12、20、24、36、40又は48の反復単位を有する直鎖又は分枝鎖が例えば使用され得る。」
【０１５１】
コンジュゲーション方法
本発明による脱離基を含有するコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応してコンジュゲートを形成することができ、このような反応は、本発明のさらなる態様を形成する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、上に記載されている構造I、I'、II又はIIIの1つを有するコンジュゲート試薬(好ましいサブ構造の全てを含める)は、タンパク質又はペプチドと反応してコンジュゲートを形成する。これらの試薬の1つを使用するコンジュゲーション方法の即時生成物は、電子求引性基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、該コンジュゲーション方法は、適当な条件下で可逆的である。これは、一部の適用、例えばタンパク質の急速な放出が必要とされる場合には望ましいことがあるが、他の適用には、タンパク質の急速な放出は望ましくないことがある。そのため、電子求引性部分Wの還元によってコンジュゲートを安定化することで、タンパク質の放出を防止する部分を与えることが望ましいことがある。したがって、上に記載されている方法は、コンジュゲートにおける電子求引性基Wを還元する追加の任意選択の工程を含むことができる。還元剤として、水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用することができる他の還元剤としては、例えば、塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
【０１５２】
したがって、例えば、ケト基を含有するW部分は、CH(OH)基を含有する部分に還元することができ;エーテル基CH.ORは、ヒドロキシ基とエーテル化剤との反応によって得ることができ;エステル基CH.O.C(O)Rは、ヒドロキシ基とアシル化剤との反応によって得ることができ;アミン基CH.NH2、CH.NHR若しくはCH.NR2は、還元的アミノ化によってケトンから調製することができ;又はアミドCH.NHC(O)R若しくはCH.N(C(O)R)2は、アミンのアシル化によって形成することができる。スルホンは、スルホキシド、スルフィド又はチオールエーテルに還元することができる。シアノ基はアミン基に還元することができる。
【０１５３】
上に記載されている式I又はIIのコンジュゲート試薬を使用するという重要な特色は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化性部分として働く電子求引性官能基とクロスコンジュゲートされることである。脱離基が直接的置き換えよりもむしろクロス官能性試薬において排除される傾向があるとともに、電子求引性基がマイケル反応のための適当な活性化部分である場合、順次的な分子内ビス-アルキル化は、連続したマイケル及びレトロマイケル反応によって発生させることができる。脱離部分は、第1のアルキル化が発生することで式I'の試薬を与えた後まで曝露されない潜在的コンジュゲート二重結合を遮蔽する働きをし、ビス-アルキル化は、順次的及び相互作用的なマイケル及びレトロマイケル反応に起因する。クロス官能性アルキル化剤は、二重結合に又は脱離基と電子求引性基との間にコンジュゲートされている多重結合を含有することができる。
【０１５４】
タンパク質に結合することが、タンパク質におけるジスルフィド結合から誘導される2個の硫黄原子を介する場合、該方法は、ジスルフィド結合をin situで還元することによって実施することができ、これに続いて、還元生成物は、構造I又はIIの1つを有する試薬と反応する。好ましくは、ジスルフィド結合は還元され、任意の過剰の還元剤は、例えば緩衝剤交換によって除去された後で、コンジュゲート試薬が導入される。ジスルフィドは、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はトリス-カルボキシエチルホスフィンを用いて、従来の方法を使用して還元することができる。
【０１５５】
コンジュゲーション反応は、上に記述されている従来技術に開示されている条件を含めて、公知のコンジュゲーション方法と同様の条件下で実施することができる。例えば、構造I、I'又はIIの1つを有するコンジュゲート試薬を使用する場合、本発明によるコンジュゲーション反応は、WO2005/007197、WO2009/047500、WO2014/064423及びWO2014/064424に記載されているものと同様の反応条件下で実施することができる。該方法は、例えば、全ての反応物が可溶性である溶媒又は溶媒混合物中で実施することができる。例えば、タンパク質は、水性反応媒体中でポリマーコンジュゲート試薬と直接的に反応させることができる。この反応媒体は、求核試薬のpH要件に依存して緩衝液で処理することもできる。反応のための最適なpHは、一般には少なくとも4.5、典型的には約5.0から約8.5の間、好ましくは約6.0から7.5である。最適な反応条件は、当然、用いられる特定の反応物に依存する。
【０１５６】
水性反応媒体を使用する場合、3〜40℃の間の反応温度が一般に適当である。有機媒体(例えば、THF、酢酸エチル、アセトン)中で行われる反応は、典型的に、最大室温までの温度で行われる。好ましい一実施形態において、該反応は、例えば有機溶媒の体積により最大20%まで、典型的には有機溶媒の体積により5から20%の有機溶媒の割合を含有することができる水性緩衝液中で実施される。
【０１５７】
タンパク質は、化学量論的当量又はわずかに過剰のコンジュゲート試薬を使用して有効にコンジュゲートすることができる。しかしながら、過剰なコンジュゲート試薬を用いてコンジュゲーション反応を行うことも可能であり、これは一部のタンパク質にとって望ましいことがある。過剰の試薬は、コンジュゲートの後続の精製中に、従来の手段、例えばイオン交換又はHPLCクロマトグラフィーによって簡単に除去することができる。
【０１５８】
当然、1種より多いコンジュゲート試薬が、十分な適当な付着点を含有するタンパク質にコンジュゲートされることは可能である。例えば、2個の異なるジスルフィド結合を含有するタンパク質において、又は1個のジスルフィド結合を含有するとともにポリヒスチジンタグも担持するタンパク質において、タンパク質1分子当たり、試薬の2個の分子をコンジュゲートさせることが可能である。
【０１５９】
タンパク質
求核基を含有する任意の所望のペプチド又はタンパク質は、本発明の方法を使用してコンジュゲートすることができる。適当なタンパク質としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、転写タンパク質又は多量体タンパク質が挙げられる。
【０１６０】
以下は、本発明を使用してコンジュゲートすることができる一部の特定のタンパク質を与える。酵素としては、炭水化物特異的酵素及びタンパク分解酵素等、例えば、US4,179,337により開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。対象の特定の酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ及びグルタミナーゼが挙げられる。
【０１６１】
血液タンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、因子VII、因子VIII又は因子IX、フォンビルブランド因子、インスリン、ACTH、グルカゲン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、例えばIFN-α又はIFN-β、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体断片、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【０１６２】
対象の他のタンパク質は、ポリ(アルキレンオキシド)等のポリマーとコンジュゲートされる場合に低減されたアレルゲン性を有するような、Dreborgら  Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst.(1990) 6 315〜365によって開示されているアレルゲンタンパク質であり、その結果として、耐性誘導物質としての使用に適当である。開示されているアレルゲンに中に、ブタクサ抗原E、ミツバチ毒液及びダニアレルゲン等がある。
【０１６３】
糖ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子並びにグリコシル化されたインターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子は、免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びそれらの断片がそうであるように、対象となる。
【０１６４】
特に興味深いのは、診断及び治療目的のために臨床医学において使用される受容体及びリガンド結合性タンパク質並びに抗体及び抗体断片である。結合性タンパク質/抗体は、診断剤、治療剤、又は標識化剤、例えば放射性同位体又は細胞毒性/抗感染薬とコンジュゲートすることができる。薬剤が細胞毒性薬、例えばオーリスタチン又はメイタンシノイドである抗体-薬剤コンジュゲートの調製における本発明の使用が特に好ましい。
【０１６５】
タンパク質は、所望であれば誘導体化又は官能化することができる。特に、コンジュゲーションより前に、タンパク質、例えば未変性タンパク質は、様々な遮断基と反応させておくことで、そこの感受性基を保護することができるか;又はそれは、この発明の方法を使用する又は代替方法を使用するかのいずれかで、1つ又は複数のポリマー又は他の分子と前にコンジュゲートしておくことができる。本発明の一実施形態において、それは、本発明によるコンジュゲート試薬によって標的化することができるポリヒスチジンタグを含有する。
【０１６６】
コンジュゲート試薬が、ペプチド又はタンパク質に存在する2種の求核試薬と反応できる本発明の態様において、試薬は下記の条項における通りに定義することができる。
【０１６７】
1.ペプチド又はタンパク質に存在する2種の求核試薬と反応できるコンジュゲート試薬であって、前記求核試薬との反応で失われる脱離基を含有し、前記脱離基がコンジュゲート試薬内に2つの付着点を有するとともに-(CH2CH2O)n1部分(式中、n1は2以上の数である)を含むコンジュゲート試薬。
【０１６８】
2.n1が2から5、又は5から9である、条項1に定義されている通りのコンジュゲート試薬。
【０１６９】
3.-(CH2CH2O)n1-部分が最大5kDaまでの分子量を有する、条項1又は条項2のいずれかに定義されている通りのコンジュゲート試薬。
【０１７０】
4.前記脱離基が式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-又は-N+R2R3-P-N+R2R3-であり、式中Pは、-(CH2CH2O)n1-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は独立して水素原子又はC1〜4アルキル基又はP基を表す、先行する条項のいずれか1つに定義されている通りの試薬。
【０１７１】
5.前記脱離基が-S-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-S-、-O-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-O-、-SO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-OSO2-、-N+R2R3-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-N+R2R3-、又は式
【０１７２】
【化３２】
2017534612.tif 000034
【０１７３】
(式中、R1はキャッピング基であり、R2及びR3の各々は独立して水素原子又はC1〜4アルキル基を表す)
の基の1つである、条項1から4のいずれか1つに定義されている通りの試薬。
【０１７４】
6.前記脱離基が-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-である、条項5に定義されている通りの試薬。
【０１７５】
7.R1が水素原子、C1〜4アルキル基、場合により置換されているアリール基、又は式-CH2CH2CO2H若しくは-CH2CH2NH2の基を表す、条項5に定義されている通りの試薬。
【０１７６】
8.診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤であるペイロードを担持する、先行する条項のいずれか1つに定義されている通りの試薬。
【０１７７】
9.官能グルーピングI、I'、II又はIII:
【０１７８】
【化３３】
2017534612.tif 000035
【０１７９】
(式中、Wは電子求引性基を表し;AはC1〜5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは結合又はC1〜4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;両方のLは共に、-(CH2CH2O)n1-部分(式中、n1は2以上の数である)を含む脱離基を表す);又は
〜W-CR4R4'-CR4.L.L'(II)
(式中、Wは、一般式Iについて定められた意味を有し、(i)各R4は水素原子又はC1〜4アルキル基を表し、R4'は水素原子を表し、L及びL'は共に、-(CH2CH2O)n1-部分(式中、nは2以上の数である)を含む脱離基を表す)
を含有する、条項1から8のいずれか1つに定義されている通りの試薬。
【０１８０】
10.一般式:
【０１８１】
【化３４】
2017534612.tif 000036
【０１８２】
(式中、Qは連結基を表し、Dは、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤であるペイロードを表す)
を有する、条項9に定義されている通りの試薬。
【０１８３】
11.官能グルーピング:
【０１８４】
【化３５】
2017534612.tif 000037
【０１８５】
を含有する、条項10に定義されている通りの試薬。
【０１８６】
12.一般式:
【０１８７】
【化３６】
2017534612.tif 000038
【０１８８】
(式中、Qは連結基を表し、Dは、診断剤、治療剤、若しくは標識化剤、又は診断剤、治療剤、若しくは標識化剤のための結合剤であるペイロードを表す)
を有する、条項11に定義されている通りの試薬。
【０１８９】
13.D-Qが薬剤若しくはポリマー又は薬剤及びポリマーの両方を含む、条項10又は条項12のいずれかに定義されている通りの試薬。
【０１９０】
14.存在する場合、薬剤が細胞毒性薬であり、存在する場合、ポリマーがポリエチレングリコールである、条項13に定義されている通りの試薬。
【実施例】
【０１９１】
以下の実施例は本発明を例示する。
【０１９２】
(実施例1)
7反復単位のエチレングリコール脱離基を含むコンジュゲーション試薬2の合成。
【０１９３】
工程1:化合物1の合成。
【０１９４】
【化３７】
2017534612.tif 000039
【０１９５】
ジメチルホルムアミド(DMF、70mL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(1.50g、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の撹拌溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(3.20g、Iris Biotech社)及びトリエチルアミン(2.50mL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。19時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(2.4mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-チオ-ヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]-安息香酸化合物1が濃い清澄な無色の油として与えられた(1.77g、66%)m/z[M+H+]901。
【０１９６】
工程2:試薬2の合成。
【０１９７】
【化３８】
2017534612.tif 000040
【０１９８】
メタノール:水(18mL、9:1v/v)中1(1.32g)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(2.70g)を添加した。2.5時間後、揮発分を真空中で除去し、水をアセトニトリル(2×15mL)と共沸除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×10mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×7mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、濃い清澄な淡黄色の油1.29g、92%が与えられた。残渣の一部(700mg)を、水:アセトニトリル(1.50mL、3:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸試薬2が濃い清澄な無色の油として与えられた(524mg、68%)m/z[M+H+]965。
【０１９９】
(実施例2)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及び10kDaのPEGを含むPEG化試薬3の合成。
【０２００】
【化３９】
2017534612.tif 000041
【０２０１】
DMF(600μL)中の試薬2(14mg)の撹拌溶液を0℃にアルゴン雰囲気下にて冷却し、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)(5.5mg)及びN-メチルモルホリン(NMM)(1.5μL)を添加した。ジクロロメタン(600μL)中の10kDaのH2N-PEG-OMe(132mg)の溶液を添加した時に、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。結果として得られた溶液を5分間0℃で撹拌した後に、さらなるHATU(5.5mg)及びNMM(1.5μL)を添加した。反応溶液を0℃で2時間の間撹拌させておいた後に、室温に加温した。22時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/1、2.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(10kDa)OMe試薬3が白色の粉末として与えられた(72mg、53%)。1H NMR (600 MHz, MeOH-∂4) 3.35 (6H), 3.36 (3H), 3.40 (4H), 3.46-3.59 (10H), 3.56-3.70 (1065H, m, PEG), 3.71-3.77 (7H), 3.85-3.91 (4H), 4.76 (1H), 8.00 (2H), 8.18 (2H)。
【０２０２】
(実施例3)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びローダミンB染料を含む蛍光性コンジュゲーション試薬4の合成
【０２０３】
【化４０】
2017534612.tif 000042
【０２０４】
試薬2(38mg)及びリサミンローダミンBエチレンジアミン(20mg、Invitrogen社)を、1.5mLの無水DMF中に溶解させ、0℃に冷却した。HATU(15mg)を添加し、溶液を2分間撹拌した後に、NMM(8.7μL)を添加した。反応混合物を2時間の間0℃で撹拌した。粗反応物を高真空下で3時間の間部分濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-ローダミンB試薬4が紫色の固体として与えられた(43mg、69%)。m/z[M+H]+(1549、80%)、[M+2H]2+(783、100%)。1H NMR (600 MHz; MeOH-∂4) 1.45 (9H, s), 2.40-2.45 (8H, m), 3.40-3.46 (2H, m), 3.52-3.66 (m, PEG and CH2-Ts), 4.27 (1H, q), 8.01 (2H, d), 8.08 (1H, dd), 8.15 (2H, d), 8.66 (1H, d)。
【０２０５】
(実施例4)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬5の合成。
【０２０６】
【化４１】
2017534612.tif 000043
【０２０７】
下記の構造:
【０２０８】
【化４２】
2017534612.tif 000044
【０２０９】
を有するval-cit-PAB-MMAE塩のTFA塩(25.0mg)に、DMF(1.5mL)中の試薬2(15.6mg)の溶液を添加し、不活性窒素雰囲気下にて室温で5分間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、HATU(6.1mg)及びNMM(1.8μL)のアリコートを20分毎に添加し、合計5回添加した。1.5時間後、反応混合物を室温に加温した。2時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水及びアセトニトリル(v/v;1/1、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE試薬5が白色の粉末として与えられた(22.4mg、68%)m/z[M+2H2+]1035。
【０２１０】
(実施例5)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬6の合成
【０２１１】
【化４３】
2017534612.tif 000045
【０２１２】
工程1:化合物7の合成。
【０２１３】
【化４４】
2017534612.tif 000046
【０２１４】
DMF(4ml)中のHATU(394mg)及びDMF(4mL)中のNMM(114μL)のストック溶液を調製した。試薬2(250mg)のDMF(10mL)溶液に、H2N-dPEG-(24u)-(CO2tBu)(405mg)を添加した。混合物をDMF(5mL)で希釈し、不活性窒素雰囲気下にて室温で5分間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、HATU(1mL)及びNMM(1mL)のアリコートを10分毎に添加し、合計4回添加した。40分後、反応混合物を室温に加温した。2.5時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(2mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって生成物を単離し、有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-tブチルエステル化合物7が濃い清澄な淡黄色の油として与えられた(422mg、76%)m/z[M-(tBu)+3H3+]698.46Da。
【０２１５】
工程2:化合物8の合成。
【０２１６】
【化４５】
2017534612.tif 000047
【０２１７】
試薬7(382mg)をギ酸(5mL)中に溶解させた。反応混合物を不活性窒素雰囲気下にて室温で1時間の間撹拌した。ギ酸を凍結乾燥によって除去した。結果として得られた固体を水(1mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって生成物を単離し、有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)酸化合物8が白色の固体として与えられた(194mg、53%)m/z[M+3H3+]698.33Da。
【０２１８】
工程3:試薬6の合成。
試薬8(15mg)をDMF(0.2mL)及びval-cit-PAB-MMAE中に溶解させた。DMF(0.2mL)中のTFA塩(11mg)を添加した。混合物を0℃に冷却し、不活性雰囲気下で撹拌した。HATU(2.7mg)及びNMM(0.7mg)を引き続いて添加し、反応混合物を0℃で撹拌させておいた。追加量のHATU(2.7mg)及びNMM(0.4mg)を20分毎に添加して、合計5回添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。1時間40分後、反応を-20℃に16時間の間冷却した。反応溶液を水(0.4mL)でクエンチし、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE試薬6が濃い清澄な無色の油として与えられた(7.9mg、34%)m/z[M+2H]2+1599.98。
【０２１９】
(実施例6)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬9の合成
【０２２０】
【化４６】
2017534612.tif 000048
【０２２１】
無水DMF(400μL)中の、下記の構造:
【０２２２】
【化４７】
2017534612.tif 000049
【０２２３】
を有するval-ala-PAB-AHX-DM1の撹拌溶液(5.2mg)に、試薬2(6mg)を添加し、5分間0℃で撹拌した。HATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を引き続いて添加し、反応混合物を0℃で撹拌させておいた。20分後、追加量のHATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。2.5時間後、反応物を-20℃に16時間の間冷却した。反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-ala-PAB-AHX-DM1試薬9が清澄な無色の油として与えられた(6.5mg、74%)m/z[M+H+]2030。
【０２２４】
(実施例7)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬10の合成
【０２２５】
【化４８】
2017534612.tif 000050
【０２２６】
無水DMF(400μL)中のval-ala-PAB-AHX-DM1(5.0mg)の撹拌溶液に、試薬8(13mg)を添加し、5分間0℃で撹拌した。HATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を引き続いて添加し、反応混合物を0℃で撹拌させておいた。20分後、追加量のHATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。2.5時間後、反応物を-20℃に16時間の間冷却した。反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1試薬10が濃い黄色の油として与えられた(5.6mg、41%)m/z[M-OH+H]2+1571.5。
【０２２７】
(実施例8)
2反復単位、12反復単位のいずれかの、それぞれ1kDa、2kDa又は5kDaのポリマー性エチレングリコール脱離基、及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含む、コンジュゲーション試薬12、13、14及び15の合成。
【０２２８】
【化４９】
2017534612.tif 000051
【０２２９】
メイタンシノイド試薬ビス-mPEG(12u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 12、ビス-mPEG(1kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 13、ビス-mPEG(2kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 14及びビス-mPEG(5kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 15を、実施例7において試薬10について記載されているものと類似したやり方で、実施例1における化合物1の合成のためのアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)の代わりにチオール2-(2-メトキシエトキシ)エタンチオール、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトドデカ(エチレングリコール)、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール1kDa)、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール2kDa)及びアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール5kDa)をそれぞれ使用して合成した。
【０２３０】
(実施例9)
2反復単位、12反復単位のいずれかの、それぞれ1kDa、2kDa又は5kDaのポリマー性エチレングリコール脱離基、及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含む、コンジュゲーション試薬17、18、19及び20の合成。
【０２３１】
【化５０】
2017534612.tif 000052
【０２３２】
オーリスタチン試薬ビス-mPEG(12u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE17、ビス-mPEG(1kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE18、ビス-mPEG(2kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE19及びビス-mPEG(5kDa)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE20を、実施例5において試薬6について記載されているものと類似したやり方で、実施例1における化合物1の合成のためのアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)の代わりにチオール2-(2-メトキシエトキシ)エタンチオール、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトドデカ(エチレングリコール)、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール1kDa)、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール2kDa)及びアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトポリ(エチレングリコール5kDa)をそれぞれ使用して合成した。
【０２３３】
(実施例10)
メイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬21の合成
【０２３４】
【化５１】
2017534612.tif 000053
【０２３５】
工程1:化合物22の合成。
【０２３６】
【化５２】
2017534612.tif 000054
【０２３７】
DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(41mg)、その後、NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(19μL)を添加した。溶液を室温に加温しておき、22時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(1mL)中に溶解させ、ジクロロメタン:メタノール(100:0v/vから80:20v/v)で溶出する順相カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去することで、Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]が無色の油として与えられた(84mg、67%)。ピペリジン(49μL)を、DMF(2mL)中の化合物Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](74mg)の溶液に、アルゴン雰囲気下で添加し、結果として得られた溶液を室温で22時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をヘキサン(3×0.7mL)で摩砕した。有機溶媒を毎回デカンテーションし、結果として得られた残渣を真空中で乾燥させることで、L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]化合物22が白色の固体として与えられた(61mg、97%)。m/z[M+H]+(1097、10%)、[M+2H]2+(1035、100%)。
【０２３８】
工程2:化合物23の合成。
【０２３９】
【化５３】
2017534612.tif 000055
【０２４０】
DMF(550μL)中の化合物22(26.6mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、これにHATU(10.5mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、DMF(550μL)中の試薬2(32mg)の溶液を添加した。結果として得られた溶液を5分間0℃で撹拌した後に、NMM(2.9μL)及びHATU(10.5mg)を添加した。反応溶液を0℃で2時間の間撹拌させておいた後に、室温に加温し、更に3.5時間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水及びアセトニトリル(v/v;1/1、1.2ml)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]が無色の油として与えられた(30.5mg、55%)。1H NMR (400 MHz, MeOH-∂4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.83 - 4.71 (1H, m), 4.58 (1H, dd, ), 3.92 - 3.83 (6H, m), 3.78 - 3.56 (140H, m), 3.57-3.51 (6H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.41 (2H, t), 2.24 - 2.13 (1H, m), 2.10 - 1.98 (1H, m), 1.45 (9H, s); m/z [M+Na]+ (2243, 50%), [M+H]+ (2221, 40%), [M+Na+2H]3+ (747,100%)。
【０２４１】
ジクロロメタン(2mL)中のビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、これにトリフルオロ酢酸(500μL)を添加し、結果として得られた溶液を1.5時間の間撹拌した。反応混合物を室温に加温しておき、更に1時間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/1、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]化合物23が無色の油として与えられた(20mg、68%)。1H NMR (400 MHz, MeOH-∂4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.81 - 4.72 (1H, m), 4.59 (1H, dd), 3.92 - 3.84 (6H, m), 3.67 - 3.50 (146H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.48 (2H, t), 2.26 - 2.15 (1H, m), 2.15 - 2.03 (1H, m); m/z [M+H]+ (2165, 55%), [M+2H]2+ (1083, 60%), [M+2H+Na]3+ (729, 100%)。
【０２４２】
工程3:試薬21の合成
DMF(600μL)中の化合物23(15.0mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した。HATU(2.9mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(600μL)中のval-ala-PAB-AHX-DM1(9.2mg)及びNMM(0.8μL)の溶液を添加した。5分後、追加量のHATU(2.9mg)及びNMM(0.8μL)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。3時間後、追加量のHATU(0.7mg)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。更に2時間後、反応物を-20℃で16時間の間貯蔵した。反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-ala-PAB-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]化合物21が濃い清澄な無色の油として与えられた(14.3mg、64%)。1H NMR (600 MHz, MeOH-∂4) (選択した特徴的シグナル) 5.69 (1H, dd,), 6.59 (1H, dd), 6.68 (1H, s), 6.69 (1H, d), 7.10 (1H, s), 7.28 (2H, d), 7.57 (2H, d), 8.01 (2H, d), 8.16 (2H, d); m/z [M-AHX-DM1]+ (2422, 40%)。
【０２４３】
(実施例11A)
7反復単位のポリマー性脱離基及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬24の合成
【０２４４】
【化５４】
2017534612.tif 000056
【０２４５】
DMF(500μL)中の化合物23(12.4mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した。HATU(2.4mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(500μL)中のval-cit-AHX-DM1(化合物47、6.4mgの代わりにAHX-DM1を使用して、化合物50と類似したやり方で作製された)及びNMM(0.7μL)の溶液を添加した。5分後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。2時間後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。更に1時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]24が濃い清澄な無色の油として与えられた(9.6mg、53%)。m/z[M-H2O]+(3148、8%)、[M-H2O]2+(1575、40%)、[M-H2O]3+(1050、100%)、1036[M-NHCO-H2O]3+。
【０２４６】
(実施例11B)
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬25の合成
【０２４７】
【化５５】
2017534612.tif 000057
【０２４８】
試薬25を、実施例11Aの試薬24と類似したやり方で、化合物23及びval-cit-PAB-MMAE TFA塩から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(24u)-OMe]25を無色の油として単離した。m/z[M+H]+(3270、12%)、[M+2H]2+(1636、50%)、[M+3H]3+(1091、100%)。
【０２４９】
(実施例12)
7反復単位ポリマー性エチレングリコール脱離基及びデスフェリオキサミンを含む、画像化及びキレート化適用のためのコンジュゲーション試薬27の合成
【０２５０】
【化５６】
2017534612.tif 000058
【０２５１】
工程1:化合物28の合成。
【０２５２】
【化５７】
2017534612.tif 000059
【０２５３】
DMF(2mL)中の21-(Boc-アミノ)-4,7,10,13,16,19-ヘキサオキサヘンエイコサン酸(50mg、Sigma-Aldrich社)の溶液に、アルゴン雰囲気下にて室温で、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(73mg)を添加し、溶液を0.5時間の間撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(2mL)中のデスフェリオキサミンメシレート(87mg、Sigma-Aldrich社)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(29μL)の溶液を添加した。24時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから50:50v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって直接精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、BocNH-PEG(6u)-デスフェリオキサミン化合物28が白色の固体として与えられた(50mg、46%)m/z[M+Na]+(1019、50%)、[M+H]+(997、95%)、[M+2H]2+(499、100%);1H NMR (600 MHz; MeOH-δ4) 1.28-1.38 (7H, m), 1.43 (9H, s), 1.49-1.55 (6H, m), 1.60-1.67 (5H, m), 2.09 (3H, s), 2.41-2.47 (6H, m), 2.76 (4H, t), 3.14-3.19 (6H, m), 3.21 (2H, t), 3.50 (2H, t), 3.57-3.65 (27H, m), 3.70-3.73 (2H, t)。
【０２５４】
工程2:化合物29の合成。
【０２５５】
【化５８】
2017534612.tif 000060
【０２５６】
ジクロロメタン(DCM)(3mL)中の化合物28(49mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(TFA)(750μL)を添加した。溶液を室温に加温しておいた。1時間後、トルエン(2mL)を反応混合物に添加し、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸(2mL)中に溶解させ、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、残りのTFAを除去し、NH2-PEG(6u)-デスフェリオキサミン化合物29が白色の固体として与えられ(44mg、定量的収量)、任意のさらなる精製をせずに次の工程で使用した:m/z[M+H]+(897、100%)、[M+2H]2+(449、100%)。
【０２５７】
工程3:試薬27の合成。
DMF(750μL)中の試薬2(17mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した後に、HATU(8.0mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、DMF(750μL)中の化合物29(23mg)及びNMM(2.1μL)の溶液を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。追加量の試薬2、HATU及びNMMを4時間かけて添加した。更に15時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから50:50v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(6u)-デスフェリオキサミン試薬27が清澄な無色の油として与えられた(20.6mg、49%)m/z[M+H]+(1844、95%)、[M+2H]2+(922、100%)、[M+3H]3+(615、100%)。
【０２５８】
(実施例13)(比較)
トシル脱離基及びデスフェリオキサミンを含む、画像化及びキレート化適用のためのコンジュゲーション試薬30の合成
【０２５９】
【化５９】
2017534612.tif 000061
【０２６０】
DMF(2.5mL)中の化合物29(43mg)の溶液に、NMM(6μL)を添加し、溶液を0.5時間の間室温で撹拌した。これに、DMF(700μL)中の公知の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(29mg、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の溶液を添加した。追加のNMMを反応混合物に、1時間後、2時間後、19時間後、23時間後及び25時間後(合計で15.6μL)に添加した。26時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホン-プロパノイル-ベンズアミドPEG(6u)-デスフェリオキサミン試薬30が清澄な無色の油として与えられた(19mg、29%)m/z[M+H]+(1379、98%)、[M+2H]2+(690,100%);1H NMR (600 MHz; MeOH-δ4) 1.28-1.36 (7H, m), 1.48-1.55 (6H, m), 1.59-1.65 (5H, m), 2.09 (3H, s), 2.40-2.46 (6H, m), 2.50 (6H, s), 2.74-2.78 (4H, m), 3.14-3.17 (5H, m), 3.55-3.61 (23H, m), 3.62-3.70 (12H, m), 3.75-3.80 (2H, m), 4.09-4.14 (1H, m), 7.44 (4H, d), 7.55 (2H, d), 7.62 (4H, d), 7.82 (2H, d)。
【０２６１】
(実施例14)
ヘキサPEG-ジスルホン脱離基及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬31の合成
【０２６２】
【化６０】
2017534612.tif 000062
【０２６３】
工程1:化合物32の合成。
【０２６４】
【化６１】
2017534612.tif 000063
【０２６５】
DMF(40mL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(542mg、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の撹拌溶液に、ヘキサ(エチレングリコール)ジチオール(400μL)及びCs2CO3(2.4g)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。40時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(4mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ヘキサPEG-ジチオエーテルプロパノイル-安息香酸化合物32が白色の固体として与えられた(180mg、33.1%)m/z[M+Na+]525。1HNMR (600 MHz, CDCl3) 2.72-2.78 (4H, m, CH2-S), 2.95-3.04 (4H, m),  3.65-3.72(18H, m, PEG), 4.76 (1H, m), 8.11 (2H, d), 8.21 (2H, d)。
【０２６６】
工程2:化合物33の合成。
【０２６７】
【化６２】
2017534612.tif 000064
【０２６８】
ヘキサPEG-ジスルホンプロパノイル-安息香酸化合物33を、実施例1における試薬2について記載されているものと類似したやり方で、化合物1の代わりに化合物32を使用して合成した。
【０２６９】
工程3:化合物34の合成。
【０２７０】
【化６３】
2017534612.tif 000065
【０２７１】
ヘキサPEG-ジスルホンプロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-tブチルエステル化合物34を、実施例5における化合物7について記載されているものと類似したやり方で、化合物2の代わりに化合物33を使用して合成した。
【０２７２】
工程4:化合物35の合成。
【０２７３】
【化６４】
2017534612.tif 000066
【０２７４】
ヘキサPEG-ジスルホンプロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-酸化合物35を、実施例5における化合物8について記載されているものと類似したやり方で、化合物7の代わりに化合物34を使用して合成した。
【０２７５】
工程5:試薬31の合成。
【０２７６】
メイタンシノイド試薬ヘキサPEG-ジスルホンプロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 31を、実施例7における試薬10について記載されているものと類似したやり方で、化合物8の代わりに化合物35を使用して合成した。
【０２７７】
(実施例15)(比較)
トシル脱離基及びローダミンB染料を含むコンジュゲーション試薬36の合成
【０２７８】
【化６５】
2017534612.tif 000067
【０２７９】
工程1:化合物37の合成。
【０２８０】
【化６６】
2017534612.tif 000068
【０２８１】
4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(12u)-酸化合物37を、実施例5における試薬8について記載されているものと類似したやり方で、試薬2の代わりに公知の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)を使用して合成した。
【０２８２】
工程2:試薬36の合成。
【０２８３】
4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(12u)-ローダミンB試薬36を、実施例3における試薬4について記載されているものと類似したやり方で、試薬2の代わりに化合物37を使用して合成した。
【０２８４】
(実施例16)
7反復単位のポリマー性脱離基、アリール脱離基及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬38の合成
【０２８５】
【化６７】
2017534612.tif 000069
【０２８６】
工程1:化合物39の合成。
【０２８７】
【化６８】
2017534612.tif 000070
【０２８８】
ジメチルホルムアミド(DMF、8mL)中の公知の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(200mg、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の撹拌溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(142mg)及びNMM(264μL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。19時間後、揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣をアセトニトリル(800μL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、モノ-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-モノ-(トシルメチル)プロパノイル)安息香酸化合物39が濃い清澄な無色の油として与えられた(132mg、47%)m/z[M+H+]701.1。
【０２８９】
工程2:試薬40の合成。
【０２９０】
【化６９】
2017534612.tif 000071
【０２９１】
メタノール:水(5mL、9:1v/v)中の化合物39(116mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(305mg)を添加した。75分後、揮発分を真空中で除去し、水をアセトニトリル(3×15mL)で共沸的に除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×10mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×7mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、濃い清澄な淡黄色の油が与えられた。残渣を水:アセトニトリル(800μL、1:4v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(3-((2-ヘプタ(エチレングリコール)メトキシエチル)スルホニル)-2-(トシルメチル)プロパノイル)安息香酸化合物40が濃い清澄な無色の油として与えられた(103mg、78%)m/z[M+H+]733.2。
【０２９２】
工程3:試薬38の合成
val-cit-PAB-MMAE.TFA塩(25.0mg)に、DMF(1.5mL)中の試薬40(11.8mg)の溶液を添加し、不活性雰囲気下にて室温で5分間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、HATU(6.1mg)及びNMM(1.8μL)のアリコートを、5時間の期間をかけて添加し、合計5回添加した。1.5時間後、反応混合物を室温に加温した。6時間後、揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/4、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、モノ-mPEG(7u)スルホン-モノ-(トシルメチルプロパノイル-ベンズアミド-)-val-cit-PAB-MMAE試薬38が鮮やかな白色の粉末として与えられた(13.0mg、44%)m/z[M+2H2+]919.3。
【０２９３】
(実施例17)
試薬3を使用する還元Fabジスルフィド結合でのPEG化、及び公知のPEG化試薬4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(10kDa)-OMe41(Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)との比較
【０２９４】
【化７０】
2017534612.tif 000072
【０２９５】
Fab(5.71mg、トラスツズマブのパパイン消化によって生成されたPBS中2.33mg/mL)の鎖間ジスルフィドを、0.5Mのジチオスレイトール(DTT)水溶液50μLを添加すること及び22℃で1時間の間インキュベートすることによって還元した。次いで、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で平衡化されたPD10カラムを使用して還元剤を除去し、還元Fabを同じ緩衝剤で1.24mg/mLに更に希釈した。試薬3及び41を独立して、超純水中に10mg/mLで溶解させ、還元Fabの別々の溶液に、Fabに対してPEG試薬1.5モル当量で添加した。ペグ化反応を22℃で進行させておき、その上で、2時間及び4時間後にSDS-PAGE分析のために試料を採取した。
【０２９６】
ペグ化Fabへの%変換を、SDS-PAGEバンド密度に基づき、ImageQuant(商標)システム(GE Healthcare社)を使用して概算した。結果は、FabへのPEG化試薬3(黒色棒線)対試薬41(白色棒線)のコンジュゲーションの程度を比較する図1に示されている。試薬3との反応は、2時間及び4時間でそれぞれ、ペグ化Fabへの63%及び83%の変換を与えた。試薬41に関して、変換は2時間及び4時間でそれぞれ35%及び51%であった。これらのデータは、試薬3が、試薬41より迅速に反応して、より短い時間枠において、より大量のペグ化Fabを生成することを示している。
【０２９７】
(実施例18)
試薬3を使用するインターフェロン-アルファジスルフィド結合でのPEG化、及び公知のPEG化試薬41との比較
インターフェロンα-2a(IFN)(4mL、20mMのトリスpH8.0、約100mMのNaCl、プロテアーゼ阻害剤、1mMのEDTA、10%グリセロール中0.93mg/mL)を、Zeba(商標)スピン5mLカラムを使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4に緩衝剤交換した。IFNをDTT(25mM)で30分間22℃にて処理することによって還元した。PBSを用いてpH7.4で平衡化されたPD10脱塩用カラムを使用して、還元体を除去した。試薬3及び41(IFNスルフィド当たり1.5当量)をIFN(0.7mg/mL)に4℃でコンジュゲートした。反応混合物の試料をSDS-PAGEによって1時間、2時間及び4時間のインキュベーション後に分析した。PEG化IFNへの%変換を、SDS-PAGEバンド密度に基づき、ImageQuant(商標)システム(GE Healthcare社)を使用して概算した。結果は、ポリマー性エチレングリコール脱離基を有する蛍光試薬4及びポリマー性脱離基が欠如している類似した試薬41のコンジュゲーション効率を比較する図2において示されている。試薬3は、試薬41に関する同等の時点に比較して、より速く反応し、より大量のIFN-PEG(10kDa)-OMe(およそ35kDaに対応するバンド)を生成した。
【０２９８】
(実施例19)
ポリマー性エチレングリコール脱離基を有する蛍光試薬4及びポリマー性脱離基が欠如している類似した試薬36のコンジュゲーション効率の比較
実施例17に記載されているものと同様のコンジュゲーション方法を使用して、試薬4及び36を別々に100%のMeCN中に、それぞれ1.53mg/mL及び1.67mg/mLで、コンジュゲーションより前に溶解させた。Fab溶液(1.24mg/mL、PBS中0.475mL)に、1.5当量に対応する試薬4又は試薬36(18μL)を添加した。反応を22時間22℃で進行させておき、試料を反応中にSDS-PAGE分析のために採取した。ローダミンコンジュゲートFabへの%変換を、SDS-PAGEバンド密度に基づき、ImageQuant(商標)システム(GE Healthcare社)を使用して概算した。結果は、試薬1.5当量で、試薬4(黒色棒線)及び試薬36(白色棒線)を使用するローダミンコンジュゲートFabへの変換を比較する図3に示されている。試薬4は、各時点でコンジュゲートFabへのより高い変換を与えた。
【０２９９】
(実施例20)
ポリマー性エチレングリコール脱離基を有する細胞毒性試薬5の抗体コンジュゲーションと、ポリマー性脱離基が欠如している類似した試薬42(4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE)との比較。
試薬42をWO2014064423内に記載されている通りに合成した。
【０３００】
試薬5及び42の両方を、WO2014064423に記載されている実施例と類似した方法を使用して、抗体トラスツズマブにコンジュゲートした。簡潔には、トラスツズマブ(5.2mg/mL)をトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で40℃にて1時間の間還元した。次いで、鎖間ジスルフィド結合当たり試薬5又は42のいずれか1.5モル当量を用いる抗体のコンジュゲーションを、DMF中に試薬5及び試薬42の両方を1.6mMの最終濃度まで溶解させることによって実施した。抗体溶液を4.21mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。試薬5及び42を抗体の別々のアリコートに添加した。反応物における最終抗体濃度を4mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で調整した。各溶液を穏やかに混合し、22℃で22時間の間インキュベートした。16及び22時間で、アリコートを採取し、N-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)で1時間の間22℃にて処理し、次いで、HICによって分析した。4の薬剤対抗体比(DAR)での生成物の%変換を、HICクロマトグラムからの、280nmで測定された吸光度ピークの%面積に基づいて決定し、結果は、抗体への試薬5(黒色棒線)及び42(白色棒線)のコンジュゲーションの比較を示す図4に示されている。図4における結果は、DAR4コンジュゲートの6%が、試薬42を用いて22時間後に生成されたが、試薬5は、DAR4コンジュゲートの78%を22時間後に与えたことを示している。
【０３０１】
(実施例21)
全てがポリマー性エチレングリコール脱離基を有する細胞毒性試薬5、6及び10とポリマー性脱離基が欠如している類似した試薬42、43及び44との、抗体コンジュゲーションの比較
試薬43をWO2014064423内に記載されている通りに合成し、試薬44をWO2014064424内に記載されている通りに合成した。
【０３０２】
(a)細胞毒性試薬43(4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)及び試薬5の抗体コンジュゲーションの比較。
抗体(5mgスケール)との細胞毒性試薬43のコンジュゲーションのために使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと同じであり、以下の差異があった:
試薬43及び5を3.2mMのMeCN溶液として調製した。反応溶液のアリコートを0.5、1、2、4及び22時間後に採取し、N-アセチル-L-システイン(1時間22℃で)での処理によってクエンチし、HICによって分析した。これらのコンジュゲーション反応の結果は、22時間にわたる試薬5及び試薬43のためのコンジュゲーション(平均DAR)速度を比較する時間経過分析である図5に示されている。図5において、生成物形成速度は、試薬5の方が試薬43に関するよりもかなり速かったことが分かる。HICを使用して各反応混合物から、DAR4種を精製し、SDS-PAGEによって分析した。SDS-PAGE分析から、各試料について存在する半抗体種の%を染色ゲルのImageQuant(商標)分析によって決定し、結果は、Table 1(表1)に示されており、ここで、試薬43から調製されたコンジュゲートは、試薬5から生成されたコンジュゲートのほぼ2倍の量の半抗体種を有していた。これは、試薬5から生成されたコンジュゲートが有意により多くの重鎖間共有結合を有していること、及び非コンジュゲート抗体の構造により似ていることを示している。
【０３０３】
【表１】
2017534612.tif 000073
【０３０４】
(b)細胞毒性試薬44(4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1)及び試薬10の抗体コンジュゲーションの比較。
抗体(3.8mgスケール)との細胞毒性試薬44のコンジュゲーションに使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと同じであった。反応溶液のアリコートを16及び22時間後に採取し、N-アセチル-L-システインでの処理によってクエンチした。各アリコートをHICによって分析し、DAR4生成物への%変換を決定した。結果は、抗体への試薬10(黒色棒線)及び44(白色棒線)のコンジュゲーションの比較である図6に示されている。試薬10は、16時間後及び22時間後の両方で、より多くのDAR4生成物を与えたことが分かる。
【０３０５】
(c)細胞毒性試薬43(4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)及び試薬6の抗体コンジュゲーションの比較。
抗体(1mgスケール)との細胞毒性試薬6のコンジュゲーションのために使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと類似しており、以下の差異があった:試薬6を3.2mMのMeCN溶液として調製し、反応物におけるMeCN濃度は5%であった。反応溶液のアリコートを4時間後に採取し、N-アセチル-L-システインでの処理によってクエンチし、分析HICによって分析し、存在するDAR4生成物の%を決定した。結果は、抗体への試薬6(黒色棒線)及び43(白色棒線)のコンジュゲーションの比較である図7に示されている。試薬6(黒色棒線)は、4時間後に試薬43(白色棒線)よりも有意により多くのDAR4生成物を与えたことが分かる。
【０３０６】
(実施例22)
ポリマー性エチレングリコール脱離基を有する細胞毒性試薬12とポリマー性脱離基のない類似した試薬44との、抗体コンジュゲーションの比較
抗体(1mgスケール)との細胞毒性試薬12のコンジュゲーションのために使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと同じであった。反応溶液のアリコートを4時間後に採取し、N-アセチル-L-システインでの処理によってクエンチし、HICによって分析した。結果は、抗体に対する試薬44(白色棒線)及び12(黒色棒線)のコンジュゲーションの比較である図8に示されている。図8において、試薬12は、試薬44と比較して、4時間後に有意により高い収率のDAR4生成物を与えたことが分かる。
【０３０７】
(実施例23)
ポリマー性エチレングリコール脱離基を有する細胞毒性試薬14、15及び31とポリマー性脱離基がない類似した試薬44との、抗体コンジュゲーションの比較。
抗体(1mgスケール)との細胞毒性試薬14、15及び31のコンジュゲーションのために使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと同じであった。反応溶液のアリコートを4時間後に採取し、N-アセチル-L-システインでの処理によってクエンチした。各アリコートをHICによって分析し、存在するDAR4生成物の%を決定した。試薬14、15、31及び44を用いるコンジュゲーションについての結果は、Table 2(表2)に表示されており、ここで、試薬14、15及び31は、試薬44に比較して、4時間後に2倍を超えるの量のDAR4生成物を与えたことが分かる。
【０３０８】
【表２】
2017534612.tif 000074
【０３０９】
(実施例24)
抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲートを試薬21、24及び25から、WO2014064423及びWO2014064424に記載されているものと類似した方法によって調製した。簡潔には、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンを使用して40℃で1時間の間、抗体(トラスツズマブ又はブレンツキシマブ)を還元した。次いで、鎖間ジスルフィド結合当たり試薬1.5モル当量を用いる抗体のコンジュゲーションを、アセトニトリル又はDMFのいずれかに1.6mMの最終濃度まで試薬を溶解させることによって実施した。抗体溶液を4.21mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。試薬を抗体に添加し、反応物における最終の抗体濃度を4mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で調整した。各溶液を穏やかに混合し、22℃でインキュベートした。抗体薬剤コンジュゲート生成物を、各コンジュゲートのために疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。
【０３１０】
(実施例25)
pH6.6及び7.9で試薬3を使用する、ヒスチジンタグ付けインターフェロン-アルファのPEG化
試薬3を用いる、8-ヒスチジンタグを有するインターフェロンα-2a(IFN)のコンジュゲーションを、2.5mg/mLにてpH6.6又はpH7.9のいずれかで実施し、酢酸ナトリウムpH5.3又はリン酸ナトリウムpH8.0を、リン酸ナトリウムpH7.4とそれぞれ混合することによって達成した。試薬3をIFN当たり1、1.5及び2当量で使用した。結果として得られた反応混合物を22時間の間22℃でインキュベートし、4時間で中間分析した。反応混合物をSDS-PAGEによって分析し、結果は、図9に示されている。図9において、レーンMはNovex Protein Standardsを示し;レーン1はpH5.4でのIFNを示し;レーン2はpH8.0でのIFNを示し;レーン3〜5は、それぞれ1、1.5及び2当量の試薬3からの、4時間でpH6.6でのコンジュゲート生成物を示し;レーン6は、1.5当量の試薬3からの、4時間、pH7.9でのコンジュゲート生成物を示し;レーン7〜9は、それぞれ1、1.5及び2当量の試薬3からの、22時間でpH6.6でのコンジュゲート生成物を示し;レーン10は、それぞれ1.5当量の試薬3からの、22時間でpH7.9でのコンジュゲート生成物を示す。
【０３１１】
(実施例26)
ジスルフィド架橋試薬45の合成
【０３１２】
【化７１】
2017534612.tif 000075
【０３１３】
工程1:化合物46の合成。
【０３１４】
【化７２】
2017534612.tif 000076
【０３１５】
ジメチルホルムアミド(DMF)(400μL)中の式:
【０３１６】
【化７３】
2017534612.tif 000077
【０３１７】
のアミノヘキサン酸メイタンシン(AHX-DM1).TFA塩(29.4mg)の撹拌溶液に、DMF(200μL)中の4-(N-Boc-アミノ)-1,6-ヘプタン二酸ビス-ペンタフルオロフェニルエステル(10.2mg)の溶液を添加した。溶液を0℃に冷却した後にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(13.5μL)を添加した。溶液を室温に加温しておき、18.5時間の間撹拌した。反応溶液を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(N-boc-アミノ)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物46(推定定量的収量、29.7mg)が白色の固体として与えられたm/z[M+2H-2(H2O)-NHCO]2+844(100%)、[M+H]+1767。
【０３１８】
工程2:細胞毒性ペイロード47の合成。
【０３１９】
【化７４】
2017534612.tif 000078
【０３２０】
化合物46(推定定量的収量、29.7mg)をギ酸(700μL)中に溶解させ、溶液を室温で1.5時間の間を撹拌した。揮発分を真空中で除去し、残渣を、緩衝剤A:緩衝剤B50:50v/v%混合物(1.5mL、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)中に溶解させることによってトリフルオロ酢酸塩に変換した。溶液を室温で5分間撹拌した後に、溶媒を凍結乾燥によって除去した。該方法を反復することで、4-(アミノ)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物47がオフホワイトの固体として与えられた(18.0mg、2つの工程で60%)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO)]2+794(100%)、[M+H]+1667。
【０３２１】
工程3:化合物48の合成。
【０３２２】
【化７５】
2017534612.tif 000079
【０３２３】
特許(EP0624377A2)に記載されている手順に従って化合物48を合成することで、前に報告されているものと一致する分光データを有する白色の固体を与えた。
【０３２４】
工程4:化合物49の合成。
【０３２５】
【化７６】
2017534612.tif 000080
【０３２６】
DMF(500μL)中の化合物48(20.0mg)及びDMF(400μL)中のHATU(40.0mg)のストック溶液を調製した。DMF(700μL)中の化合物47(14.0mg)の撹拌溶液に、化合物48ストック溶液(126.9μL)及びHATUストック溶液(77.8μL)のアリコートを添加した。反応溶液を0℃に冷却した後にDIPEA(4.11μL)を添加した。溶液を0℃で50分間撹拌した後に、化合物48ストック溶液(126.9μL)、HATUストック溶液(77.8μL)及びDIPEA(4.11μL)のさらなるアリコートを添加した。溶液を40分間0℃で撹拌した。反応溶液を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(Fmoc-val-cit-アミド)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物49(推定定量的収量、16.9mg)がオフホワイトの固体として与えられたm/z[M+2H-2(H2O)]2+1055(100%)。
【０３２７】
工程5:化合物50の合成。
【０３２８】
【化７７】
2017534612.tif 000081
【０３２９】
DMF(500μL)中の化合物49(推定定量的収量、16.9mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(3.04μL)を添加した。反応溶液を室温で1.5時間の間撹拌した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(val-cit-アミド)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物50がオフホワイトの固体として与えられた(8.8mg、2つの工程で55%)m/z[M+2H]2+962(100%)。
【０３３０】
工程6:細胞毒性ペイロード47を含むジスルフィド架橋試薬45の合成。
DMF(100μL)中の化合物8(13.5mg)、DMF(200μL)中のHATU(10.0mg)、及びDMF(94.2μL)中のNMM(5.83μL)のストック溶液を調製した。DMF(80μL)中の50(1.8mg)の撹拌溶液に、化合物23ストック溶液(16.5μL)及びHATUストック溶液(20.2μL)のアリコートを添加した。反応溶液を0℃に冷却した後に、NMMストック溶液(5μL)のアリコートを添加した。溶液を0℃で1時間の間撹拌させておいた後に室温に加温した。3.5時間後、反応溶液を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-アミド)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1試薬45が固体として与えられた(1.5mg、42%)m/z[M+4H-2(H2O)]4+992(100%)、[M+3H-2(H2O)]3+1321、[M+2H-2(H2O)]2+1982。
【０３３１】
(実施例27)
細胞毒性ペイロード47含むジスルフィド架橋試薬51の合成。
【０３３２】
【化７８】
2017534612.tif 000082
【０３３３】
工程1:試薬51の合成。
【０３３４】
DMF(200μL)中のHATU(10mg)及びDMF(94.2μL)中のNMM(5.83μL)のストック溶液を調製した。化合物23(5.4mg)を、DMF(254μL)中の化合物50(3.6mg)の溶液中に、撹拌しながら溶解させた。撹拌溶液に、HATUストック溶液(40μL)のアリコートを添加した。溶液を0℃に冷却した後に、NMMストック溶液(10μL)のアリコートを添加した。50分後、HATUストック溶液(6.67μL)及びNMMストック溶液(1.67μL)のさらなるアリコートを添加した。反応溶液を0℃で更に20分間撹拌し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって直接精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬51がオフホワイトの固体として与えられた(3.8mg、53%)m/z[M+4H-(H2O)-NHCO]4+1003(100%)、[M+3H-2(H2O)-NHCO]3+1331、[M+2H-2(H2O)]2+2017。
【０３３５】
(実施例28)
細胞毒性ペイロード47を含むジスルフィド架橋試薬56の合成。
【０３３６】
【化７９】
2017534612.tif 000083
【０３３７】
工程1:化合物57の合成。
【０３３８】
【化８０】
2017534612.tif 000084
【０３３９】
DMF(200μL)中のヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、6.6mg)のストック溶液を調製した。DMF(500μL)中の細胞毒性ペイロード47(10mg)の撹拌溶液に、Fmoc-val-ala-PAB-PNP(3.7mg)、及びHOBtストック溶液(2μL)のアリコートを添加した。反応溶液を0℃に冷却した後に、DIPEA(2.14μL)を添加した。次いで、反応溶液を室温で18時間の間撹拌した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1試薬57が与えられた。
【０３４０】
工程2:化合物58の合成。
【０３４１】
【化８１】
2017534612.tif 000085
【０３４２】
ビス-メイタンシノイド化合物アミン-val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物58を、化合物50について記載されているものと類似したやり方で、化合物49の代わりに化合物57を使用して合成した。
【０３４３】
工程3:試薬56の合成。
ビス-メイタンシノイド試薬ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-[NH-PEG(24u)-OMe]-[val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1]56を、試薬51について記載されているものと類似したやり方で、化合物50の代わりに化合物58を使用して合成した。
【０３４４】
(実施例29)
細胞毒性ペイロードAHX-DM1を含むジスルフィド架橋試薬59の合成。
【０３４５】
【化８２】
2017534612.tif 000086
【０３４６】
無水DMF(400μL)中のval-cit-AHX-DM1(5.0mg)の撹拌溶液に、試薬8(13mg)を添加し、5分間0℃で撹拌した。HATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を引き続いて添加し、反応混合物を0℃で撹拌させておいた。20分後、追加量のHATU(2.62mg)及びNMM(0.44mg)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。2.5時間後、反応物を-20℃に16時間の間冷却した。反応溶液を真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-AHX-DM1試薬59が濃い黄色の油として与えられた(5.6mg、41%)m/z[M-OH+H]2+1571.5。
【０３４７】
(実施例30)
ジスルフィド架橋試薬45を使用する抗体薬剤コンジュゲート60;ジスルフィド架橋試薬51を使用する抗体薬剤コンジュゲート61及びジスルフィド架橋試薬56を使用する抗体薬剤コンジュゲート62の生成
抗体薬剤コンジュゲートを、WO2014064423及びWO2014064424に記載されているものと類似した方法によって調製した。簡潔には、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンを使用して40℃で1時間の間、抗体(トラスツズマブ又はブレンツキシマブ)を還元した。次いで、鎖間ジスルフィド結合当たり試薬(即ち、45、51又は56)1.5モル当量を用いる抗体のコンジュゲーションを、アセトニトリル又はDMFのいずれかに1.6mMの最終濃度まで試薬を溶解させることによって実施した。抗体溶液を4.21mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。試薬を抗体に添加し、反応物中の最終の抗体濃度を4mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で調整した。各溶液を穏やかに混合し、22℃でインキュベートした。抗体薬剤コンジュゲート生成物を、各コンジュゲートについて疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製することで、定義されている薬剤対抗体比(DAR)を用いる生成物が与えられた。試薬45、51及び56についてのDAR4生成物への%変換は、それぞれ、HICによって決定された通りの30%、65%及び40%であった。
【０３４８】
(実施例31)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びフッ素化アリールリンカーを含むPEGコンジュゲーション試薬63の合成。
【０３４９】
【化８３】
2017534612.tif 000087
【０３５０】
工程1:化合物64の合成:
【０３５１】
【化８４】
2017534612.tif 000088
【０３５２】
ホルムアルデヒド(37%溶液)(144μL)、ピペリジン(14.4μL)、及び塩酸ピペリジン(134mg)を、無水エタノール(1.5mL)中の4-アセチル-2-フルオロ安息香酸(200mg)及び4-メチルベンゼンチオール(272mg)の混合物に添加した。反応混合物を還流しながら2.5時間の間加熱し、この時間中に、さらなる一分量のホルムアルデヒド(37%溶液)(144μL)を添加した(1.5時間後)。次いで、反応混合物を室温に冷却し、終夜撹拌した。追加の量のホルムアルデヒド(37%溶液)(288μL)及びピペリジン(14.4μL)を添加し、反応混合物を還流下で更に8時間の間加熱した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、終夜撹拌した。揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水:アセトニトリル(800μL、1:3v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-(メチルベンゼンスルフィドプロパノイル)-2-フルオロ-安息香酸化合物64が薄いオレンジ色の結晶として与えられた(196.0mg、39%)m/z[M+H]+454.20Da;1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.35 (6H, s, OMe), 3.20-3.30 (4H, m, CH2), 3.70-3.80 (1H, m, CH), 7.10 (4H, d, Ar-H), 7.15 (4H, d, Ar-H), 7.20 (1H, s, Ar-H), 7.35 (1H, d, Ar-H), 7.90 (1H, t, Ar-H)。
【０３５３】
工程2:化合物65の合成:
【０３５４】
【化８５】
2017534612.tif 000089
【０３５５】
メタノール:水(2.0mL、9:1v/v)中の化合物64(75mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(304mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。2時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×5.0mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×5mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、ビス-(トシルプロパノイル)-2-フルオロ-安息香酸化合物65が白色の粉末として与えられた(84.0mg、98%)m/z[M+H]+519.15Da。
【０３５６】
工程3:化合物66の合成:
【０３５７】
【化８６】
2017534612.tif 000090
【０３５８】
DMF(2.0mL)中の化合物65(75mg)の溶液に、Et3N(240μL、アクロスオーガニクス)及びMeO-PEG-(7u)-SH(154mg、Iris Biotech社)を添加した。反応物を不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。6時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水:アセトニトリル(2.0mL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-スルフィド-プロパノイル-2-フルオロ-安息香酸化合物67が無色の油として与えられた(101mg、78%)m/z[M+H]+919.45Da。
【０３５９】
工程4:化合物67の合成:
【０３６０】
【化８７】
2017534612.tif 000091
【０３６１】
メタノール:水(2.0mL、9:1v/v)中の化合物66(80mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(160mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。3時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×4mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×5mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた油を水中に溶解させ、凍結乾燥することで、ビス-mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-2-フルオロ-安息香酸化合物67が清澄な無色の油として与えられた(82mg、95%)m/z[M+H]+983.26Da。
【０３６２】
工程5:化合物63の合成:
【０３６３】
DMF(200μL)中のHATU(40.0mg、Novabiochem)及びDMF(200μL)中のNMM(11.8μL、アクロスオーガニクス)のストック溶液を調製した。化合物67(25.0mg)のDMF(800μL)溶液に、H2N-PEG(24u)-OMe(23.4mg、Iris Biotech社)を添加した。結果として得られた反応混合物を室温で不活性窒素雰囲気下に撹拌した。HATU(40.0μL)及びNMM(40.0μL)のアリコートを10分毎に添加して、合計3回添加し、HATU(80.0μL)及びNMM(80.0μL)の残りのアリコートを30分の時点で添加した。60分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-2-フルオロ-ベンズアミド-PEG(24u)試薬63が清澄な無色の油として与えられた(17.5mg、40%)m/z[M+3H]3+684.94Da。
【０３６４】
(実施例32)
7反復単位のエチレングリコールアミノ脱離基を含むPEGコンジュゲーション試薬68の合成。
【０３６５】
【化８８】
2017534612.tif 000092
【０３６６】
工程1:化合物69の合成。
【０３６７】
【化８９】
2017534612.tif 000093
【０３６８】
DMF(1.6mL)中のHATU(632mg、Novabiochem)及びDMF(1.6mL)中のNMM(183μL、Acros Organics社)のストック溶液を調製した。4-(3-トシル-2-(トシルメチル)プロパノイル)安息香酸(199mg、BioVectra社)のDMF(4.0mL)溶液に、H2N-PEG(24u)-CO2tBu(400.0mg、Iris Biotech社)を添加した。結果として得られた反応混合物を室温で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。HATU(320μL)及びNMM(320μL)のアリコートを10分毎に添加し、合計5回添加した。120分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水:アセトニトリル(2.0mL、1:3v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-(トシルプロパノイル)-ベンズアミド-PEG(24u)-tブチルエステル化合物69が清澄なオレンジ色の油として与えられた(184mg、33%)m/z[M+Na+H]2+853.43Da、[M-(tBu)+2H]2+814.83Da。
【０３６９】
工程2:化合物68の合成。
DMF(500μL)中の69(32mg)の溶液に、無水炭酸ナトリウム(24.1mg、Fisher Scientific社)及びMeO-PEG-(7u)-NH2(19mg、Iris Biotech社)を添加した。反応物を室温で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。18時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-アミノ-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-tブチルエステル試薬68が清澄な無色の油として与えられた(15.0mg、38%)m/z[M+2H]2+1026.09Da、[M+3H]3+665.45Da。
【０３７０】
(実施例33)
マレイミド単位、7反復単位のエチレングリコール脱離基を含むコンジュゲーション試薬70の合成。
【０３７１】
【化９０】
2017534612.tif 000094
【０３７２】
工程1:化合物71の合成。
【０３７３】
【化９１】
2017534612.tif 000095
【０３７４】
3,4-ジブロモフラン-2,5-ジオン(300mg、Sigma Aldrich社)を酢酸(4.0mL、Fisher Scientific社)中に溶解させ、これに、CO2tBu-PEG-(24u)-NH2(705mg、Iris Biotech社)を添加した。反応物を75℃で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。3時間後、反応物を室温で撹拌し、21時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水及びアセトニトリル(v/v;1/1、4.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ジブロモ-マレイミド-PEG(24u)-tブチルエステル化合物71がオフホワイトの不透明な固体として与えられた(427mg、51%)m/z[MH-(tBu)]2+692.68Da。
【０３７５】
工程2:化合物70の合成。
DMF(1.5mL)中の71(250mg)の溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(186mg、Iris Biotech社)及びトリエチルアミン(145μL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。急速に沈殿させたトリエチルアミンヒドロブロミドを、DMF(1.0mL)とともに反応混合物中に再溶解させ、30分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をギ酸(3mL、Sigma Aldrich社)中に溶解させ、反応混合物を不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。30分後、トリフルオロ酢酸(50μL、Acros Organics社)を添加し、60分後、より多くのトリフルオロ酢酸(300μL)を添加した。100分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.5mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-マレイミド-PEG(24u)-酸試薬70がワックス質の黄色の固体として与えられた(146mg、43%)m/z[MH3]3+646.28Da。
【０３７６】
(実施例34)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬72の合成。
【０３７７】
【化９２】
2017534612.tif 000096
【０３７８】
工程1:化合物73の合成。
【０３７９】
【化９３】
2017534612.tif 000097
【０３８０】
ジメチルホルムアミド(DMF、5.0mL)中の4-(3-トシルプロパノイル)安息香酸(99mg、Bioconjugate Chem. 2014、(25)460〜469)の撹拌溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(170mg、Iris Biotech社)及びトリエチルアミン(250μL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。さらなる一分量のトリエチルアミン(120μL)を、反応混合物に4時間後に添加した。揮発分を真空中で95.0時間後に除去し、結果として得られた残渣を水/アセトニトリル(2mL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、mPEG(7u)-スルフィド-プロパノイル-安息香酸化合物73が白色の固体として与えられた(200mg、126%、残りの溶媒とともに)m/z[M+H]+(533)。
【０３８１】
工程2:化合物74の合成。
【０３８２】
【化９４】
2017534612.tif 000098
【０３８３】
メタノール:水(5.5mL、9:1v/v)中の73(200mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(320mg)を添加した。4.5時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(4×3mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×3mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、濃い清澄な油が与えられた。残渣を水:アセトニトリル(1.0mL、4:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-安息香酸試薬74が白色の固体として与えられた(90mg、60%)m/z[M+H]+(565)。
【０３８４】
工程3:化合物72の合成。
無水DMF(500μL)中のval-cit-PAB-MMAE(30mg)の撹拌溶液に、化合物73(11mg)を添加し、5分間0℃で撹拌した。HATU(9.95mg)及びNMM(4.26μL)を引き続いて添加し、反応混合物を0℃で撹拌させておいた。0.5時間後及び2時間後、追加量のHATU及びNMMを添加し、更に2.0時間後、反応溶液を次いで真空中で濃縮し、次いで、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE試薬72がオフホワイトの固体として与えられた(15.0mg、46%)m/z[M+H]+(1671)。
【０３８５】
(実施例35)
7反復単位のエチレングリコール脱離基及びフランリンカーを含むコンジュゲーション試薬75の合成。
【０３８６】
【化９５】
2017534612.tif 000099
【０３８７】
工程1:試薬76の合成
【０３８８】
【化９６】
2017534612.tif 000100
【０３８９】
DMF(3.0mL)中のN,N-ジメチルメチレンイミニウムヨージド(407mg)の懸濁液に、5-アセチルフラン-2-カルボン酸(169mg)を添加した。反応混合物を125℃に加熱し、不活性雰囲気下で90分間撹拌した。一分量の反応混合物(1.0mL)に、mPEG-(7u)-SH(325mg)及びEt3N(363μL)を添加した。反応混合物を室温で不活性雰囲気下にて90分間撹拌した。揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-スルフィド-プロパノイル-フラン-2-カルボン酸試薬76が淡黄色の油として与えられた(119mg、36%)。使用された初期の反応混合物の1/3分量に基づく収率算出。1H NMR (400 MHz, DMSO) 2.60-2.70 (4H, m, CH2), 2.80-2.90 (4H, m, CH2), 3.24 (6H, s, OMe), 3.40-3.60 (m, PEG), 3.90-3.95 (1H, m, CH), 7.36 (1H, d, Ar-H), 7.69 (1H, d, Ar-H)。
【０３９０】
工程2:試薬77の合成
【０３９１】
【化９７】
2017534612.tif 000101
【０３９２】
メタノール:水(1.0mL、9:1v/v)中の76(30.0mg)の溶液に、Oxone(登録商標)(62.1mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。反応混合物を室温で不活性雰囲気下にて120分間撹拌した。粗反応混合物を真空中で濃縮した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×5.0mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×5.0mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、ビス-mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-フラン-2-カルボン酸試薬77が清澄な無色の油として与えられた(31.0mg、97%)。m/z[M+H]+955.28Da。
【０３９３】
工程3:試薬75の合成
DMF(200μL)中のHATU(51.5mg)及びDMF(200μL)中のNMM(15.0μL)のストック溶液を調製した。ビス-mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-フラン-2-カルボン酸77(31.0mg)のDMF(500μL)溶液を、H2N-PEG(24u)-OMe(29.5mg、Iris Biotech社)のDMF(500μL)溶液に添加した。結果として得られた反応混合物を、室温で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。HATU(40μL)及びNMM(40μL)のアリコートを、時間0分、10分、30分で添加し、HATU(80μL)及びNMM(80μL)のアリコートを90分で添加した。120分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(1.0mL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)-スルホン-プロパノイル-フラン-2アミド-PEG(24u)-OMe試薬75が清澄な無色の油として与えられた(9.6mg、18%)。m/z[M+2H]2+1012.76Da。
【０３９４】
(実施例36)
7反復単位のエチレングリコールスルフィド脱離基を含むコンジュゲーション試薬78の合成。
【０３９５】
【化９８】
2017534612.tif 000102
【０３９６】
DMF(8.0mL)中の1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-トシル-2-(トシルメチル)プロパン-1-オン(400mg)の溶液に、Et3N(708μL、Acros Organics社)及びMeO-PEG-(7u)-SH(905mg、Iris Biotech社)を添加した。反応物を不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。48時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(2.0mL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物79が清澄な無色の油として与えられた(322mg、43%)m/z[M+H]+873.49Da。
【０３９７】
(実施例37)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基を含むコンジュゲーション試薬79の合成。
【０３９８】
【化９９】
2017534612.tif 000103
【０３９９】
メタノール:水(500μL、9:1v/v)中の化合物78(20.0mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(42.2mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。3時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(800μL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物79が清澄な無色の油として与えられた(19.5mg、91%)m/z[M+H]+936.86Da。
【０４００】
(実施例38)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基及びフェノールエステルリンカーを含むコンジュゲーション試薬80の合成。
【０４０１】
【化１００】
2017534612.tif 000104
【０４０２】
工程1:化合物81の合成:
【０４０３】
【化１０１】
2017534612.tif 000105
【０４０４】
DMF(400μL)中のmPEG(24u)-COOH(38.4mg、Iris Biotech社)の溶液に、HATU(26.1mg)及びDIPEA(12.0μL)を添加した。反応物を不活性窒素雰囲気下にて室温で5.0分間撹拌した。この混合物に、DMF(100μL)中に溶解させた化合物79(20.0mg)を添加した。反応物を不活性窒素雰囲気下にて室温で、更に42時間の間撹拌した。42時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(800μL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物81が清澄な無色の油として与えられた(15.4mg、34%)m/z[M+2H-mPEG(7u)断片]2+824.34Da。
【０４０５】
工程2:化合物80の合成:
メタノール:水(500μL、9:1v/v)中の化合物81(14.0mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(13.1mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。230分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物80が清澄な無色の油として与えられた(12.7mg、88%)m/z[M+3H]3+679.16Da。
【０４０６】
(実施例39)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基、非芳香族リンカー及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬82の合成。
【０４０７】
【化１０２】
2017534612.tif 000106
【０４０８】
工程1:化合物83の合成:
【０４０９】
【化１０３】
2017534612.tif 000107
【０４１０】
メタノール(50.0mL)中の3-ブロモ-2-(ブロモメチル)プロピオン酸(1.32g、Alfa Aesar社)の撹拌溶液に、室温で、破砕された水酸化ナトリウムペレット(428mg、Fisher Scientific社)を添加した。混合物を、固体が溶解するまで加熱した。ベンゼンスルフィン酸(1.76g、Sigma Aldrich社)のナトリウム塩を添加し、反応混合物を不活性窒素雰囲気下で還流させた。4.0時間後、反応混合物を室温に冷却し、終夜不活性窒素雰囲気下で撹拌した。20時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、0.5Mの水酸化ナトリウム(30mL)中に溶解させ、ジエチルエーテル(3×10.0mL)で洗浄した。水性画分を37%塩酸で酸性にし、白色の沈殿物が与えられた。沈殿物をBuchner濾過によって回収し、残余分を蒸留水(3×20.0mL)で洗浄し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物83が白色の粉末として与えられた(632mg、32%)m/z[M+H]+369.08Da;[M+Na]+391.04Da。
【０４１１】
工程2:化合物84の合成:
【０４１２】
【化１０４】
2017534612.tif 000108
【０４１３】
ジメチルホルムアミド(2.0mL)中の化合物83(111mg)の撹拌溶液に、室温で、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(428mg、Iris Biotech社)及びトリエチルアミン(251μL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。20時間後、粗反応混合物を水(1.0mL)で希釈し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物84が清澄な無色の油として与えられた(154mg、64%)m/z[M-PEG-(7u)]+473.05Da。
【０４１４】
工程3:化合物85の合成:
【０４１５】
【化１０５】
2017534612.tif 000109
【０４１６】
メタノール:水(1.5mL、9:1v/v)中のビス-mPEG(7u)-スルフィド-プロパン酸(65.0mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(151mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。3.0時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(800μL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物85が清澄な無色の油として与えられた(41.7mg、59%)m/z[M+H]+860.91Da。
【０４１７】
工程4:化合物82の合成:
DMF(200μL)中のHATU(26.4mg)及びDMF(200μL)中のNMM(7.6μL)のストック溶液を調製した。化合物83(12.0mg)のDMF(200μL)溶液を、NH2-Val-Cit-PAB-MMAE(21.5mg、Concortis社)のDMF(400μL)溶液に添加した。結果として得られた反応混合物を、室温で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。HATU(80μL)及びNMM(80μL)のアリコートを、時間0分及び40分で添加し、合計2回添加した。180分後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(1.0mL、1:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬82が白色の粉末として与えられた(13.6mg、50%)。m/z[M+2H]2+983.45Da。
【０４１８】
(実施例40)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基及び非芳香族リンカーを含むコンジュゲーション試薬86の合成。
【０４１９】
【化１０６】
2017534612.tif 000110
【０４２０】
工程1:化合物87の合成。
【０４２１】
【化１０７】
2017534612.tif 000111
【０４２２】
トルエン(250μL)中の化合物84(15.0mg)の撹拌溶液に、室温で、mPEG-(23u)-OH(19.7mg、Iris Biotech社)、トリフェニルホスフィン(5.43mg、Sigma Aldrich社)及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル(4.1μL、Sigma Aldrich社)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。30分後、追加のトリフェニルホスフィン(5.43mg、Sigma Aldrich社)及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル(4.10μL、Sigma Aldrich社)を添加した。反応混合物を不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。1.0時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(700μL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物87が清澄な無色のワックスとして与えられた(18.5mg、54%)m/z[M-PEG-(7u)]+750.19Da。
【０４２３】
工程2:化合物86の合成。
メタノール:水(1.0mL、9:1v/v)中の化合物87(14.5mg)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(14.7mg、Sigma-Aldrich社)を添加した。3.0時間後、反応混合物を脱脂綿(1.5cmのプラグ)に通して濾過した。粗生成物を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物86が清澄な無色のワックスとして与えられた(7.1mg、47%)m/z[M+3H]3+629.91Da。
【０４２４】
(実施例41)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基及びポリエチレングリコールスペーサーを含む二官能性コンジュゲーション試薬88の合成。
【０４２５】
【化１０８】
2017534612.tif 000112
【０４２６】
DMF(2.0mL)中のHATU(448mg)及びDMF(2.0mL)中のNMM(129μL)のストック溶液を調製した。アミノ-PEG-(11u)-アミン(64.1mg、Iris Biotech社)のDMF(500μL)溶液を、4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(250mg)のDMF(2.0mL)溶液に添加した。結果として得られた反応混合物を、室温で不活性窒素雰囲気下にて撹拌した。HATU(800μL)及びNMM(800μL)のアリコートを時間0分で添加し、HATU(200μL)及びNMM(200μL)のアリコートを時間50分で添加し、合計2回添加した。2.0時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(1.0mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬88が清澄な無色の油として与えられた(200mg、69%)。m/z[M+H]2+1219.5Da[M+2H]3+813.35Da、[M+3H]4+610.28Da。
【０４２７】
(実施例42)
7反復単位のエチレングリコールスルホン脱離基及びスルホン酸側鎖を含むコンジュゲーション試薬89の合成。
【０４２８】
【化１０９】
2017534612.tif 000113
【０４２９】
ジメチルホルムアミド(500μL)中の3-(N-(3-スルホプロピル)-4-(3-トシル-2-(トシルメチル)プロパノイル)ベンズアミド)プロパン酸(Click Chemistry Tools LLC社、20.0mg)の撹拌溶液に、室温で、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(30.2mg、Iris Biotech社)及びトリエチルアミン(23.6μL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。3.5時間後、粗中間体生成物を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去した。
【０４３０】
結果として得られた清澄な無色の残渣を、メタノール:水(750μL、9:1v/v)中に溶解させ、溶液をOxone(登録商標)(52.1mg、Sigma-Aldrich社)に添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。4.5時間後、粗生成物を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(98:2v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物89が清澄な無色の油として与えられた(4.71mg、14%)m/z[M+H]2+579.67Da、[M+H2O]2+588.17Da。
【０４３１】
(実施例43)
コンジュゲーション試薬63、68及び70を使用する、還元Fabジスルフィド結合でのPEG化。
パパイン消化によって生成されたトラスツズマブのFabに、1MのDTTストック溶液(25μL、最終濃度10mM)を添加し、ボルテックスを使用して還元混合物を簡単に混合し、22℃で1時間の間インキュベートした。次いで、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤pH7.5、150mMのNaCl、20mMのEDTAで平衡化されたPD10カラム(GE Healthcare社)を使用して、還元体を除去した。還元Fabを1.2mg/mLに、同じ緩衝剤で更に希釈した。試薬63、68及び70を独立してアセトニトリル中に0.719mMで溶解させ、還元Fabの別々の溶液に添加した(Fab当たり1.5当量試薬)。PEG化反応を22℃で進行させておき、その上で、22時間後のHIC HPLC分析のために試料を採取した。各反応混合物のHIC HPLC分析は、試薬63、68及び70についてPEG化Fabへの%変換が、それぞれ95%、90%及び90%であることを示した。
【０４３２】
(実施例44)
部分的に還元されたトラスツズマブへの、試薬72のコンジュゲーション。
20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(20mMのEDTA;150mMのNaCl)中のトラスツズマブ(3.5mg、5.2mg/mL)を、40℃に15分間加温した。トラスツズマブに、2.08mMのTCEP(28μL)を添加し、結果として得られた混合物を40℃で1時間の間インキュベートした。1時間後、TCEP処理されたトラスツズマブを22℃に冷却した。一分量のトラスツズマブ溶液(3.2mg、0.64mL、5.0mg/mL)を、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(20mMのEDTA;150mMのNaCl)(0.12mL)で希釈した。3つのバイアルに希釈mAb溶液(1mg、238μL)を投入した。試薬72の溶液(3.2mM)をDMF中で調製した。試薬溶液(12.5μL、mAb当たり6.0当量)を別々のバイアルに添加し、反応物を混合し、次いで22℃でインキュベートした。22時間で、反応試料を、HIC分析より前にN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)でクエンチした。HIC HPLC分析は、試薬72でコンジュゲートされたトラスツズマブの平均DARが4.5であることを示した。
【０４３３】
(実施例45)
トラスツズマブへの試薬82及び86のコンジュゲーション。
同一のプロトコールを使用して、試薬82及び86の両方を抗体トラスツズマブにコンジュゲートした。簡潔には、緩衝剤(20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH8.4)中のトラスツズマブ(5.2mg/mL)を、TCEP(6当量)にて40℃で1時間の間還元した。次いで、鎖間ジスルフィド結合当たり試薬82又は86のいずれか1.5モル当量を用いる抗体のコンジュゲーションを、40℃で実施した。これは、アセトニトリル(各反応物において5%v/vアセトニトリル)中の試薬82又は試薬86のいずれかの添加によって達成した。抗体溶液を4.0mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH8.4で希釈した。各溶液を穏やかに混合し、40℃で22時間の間インキュベートした。22時間で、反応物をN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)で1時間の間22℃で処理した。引き続いて、反応物を分析HICによって分析した。試薬82及び86を利用する生成物への%変換を、HICクロマトグラムからの、280nmで測定された吸光度ピークの%面積に基づき決定した。試薬82及び86について、生成物の%変換値は、それぞれ100%及び50%であった。
【０４３４】
(実施例46)
コンジュゲーション試薬75、79及び80及び試薬89を使用する、還元Fabジスルフィド結合のPEG化。
試薬75、79、80及び89を、実施例43内のコンジュゲーション試薬63、68及び70について記載されているものと同様の方式でFabtrastにコンジュゲートした。22時間のコンジュゲーション反応に続いて、試料をSDS-PAGEによって還元及び非還元条件下で分析した。試薬の各々を用いるPEG化Fabtrastの%変換を、InstantBlue(商標)で染色されたゲルを使用するImageQuant(商標)LAS 4010システム(GE Healthcare社)を使用してバンド密度測定から概算した。試薬75、79、80及び89について、%変換値は、それぞれ90%、20%、75%及び40%であった。
【０４３５】
(実施例47)
それぞれ3又は5のいずれかの反復単位のポリマー性エチレングリコール脱離基及びオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬90(比較)及び91(比較)の合成。
【０４３６】
【化１１０】
2017534612.tif 000114
【０４３７】
オーリスタチン試薬ビス-mPEG(3u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE90及びビス-mPEG(5u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE91を、実施例4における試薬5について記載されているものと類似したやり方で、実施例1における化合物1の合成のためのアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)の代わりにチオール2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]-エタンチオール及び2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-チオールをそれぞれ使用して合成した。
【０４３８】
(実施例48)
単一の7反復単位のエチレングリコール脱離基及び24単位PEGを含むPEG化試薬92の合成。
【０４３９】
【化１１１】
2017534612.tif 000115
【０４４０】
モノ-mPEG(7u)スルホン-(メチル-アクリロイル)-ベンズアミド-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]試薬92の合成を、Nature Protocols(2006、1、2241〜2252)に従って、実施例10における化合物23を使用して実施した。
【０４４１】
(実施例49)
細胞毒性試薬90(比較)、91(比較)、及びポリマー性エチレングリコール脱離基を有する5の、抗体コンジュゲーションの比較。
トラスツズマブ(1mgスケール)との細胞毒性試薬90、91及び5のコンジュゲーションのために使用された反応条件は、実施例20について上に記載されているものと同じであり、コンジュゲーション反応中の溶媒としてDMFの代わりに1.25%v/vのMeCNを使用した。反応溶液のアリコートを2時間後及び4時間後に採取し、各々をN-アセチル-L-システインでの処理によってクエンチした。各アリコートをHICによって分析し、%DAR生成物プロファイルを決定した。試薬90、91及び5を用いるコンジュゲーションの結果は、Table 3(表3)並びに図10(2時間)及び図11(4時間)に表示されている。本発明による試薬を使用する場合に得られる結果は、生成物の均質性がかなり高く、生成物が主に所望のDAR4コンジュゲートであることにおいて、比較試薬を使用して得られる結果に比較して、有意に改善されていることが分かる。
【０４４２】
【表３】
2017534612.tif 000116
【０４４３】
(実施例50)
試薬92を使用する、還元Fabジスルフィド結合でのPEG化。
試薬92を還元Fabに、実施例17に記載されているものと同じ条件を使用してコンジュゲートした。引き続いて、反応物をSDS-PAGEによって分析したところ、主要な生成物PEG化Fabは、分子量タンパク質標準に対して49kDaで観察された。
【０４４４】
(実施例51)
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬93の合成
【０４４５】
【化１１２】
2017534612.tif 000117
【０４４６】
工程1:化合物94の合成。
【０４４７】
【化１１３】
2017534612.tif 000118
【０４４８】
Boc-L-Glu(135mg)及び(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(724mg)を無水DMF(4mL)中に溶解させ、0℃で窒素雰囲気下にて1.25時間の間撹拌した。次いで、この溶液を、DMF(3mL)中のH2N-PEG(12u)-Me(685mg)及びNMM(180μL)の溶液に添加した。次いで、溶液をN2下で4時間の間撹拌した。次いで、溶液を0〜4℃、窒素雰囲気下で4.5時間の間撹拌した。さらなるBOP(241mg)及びNMM(60μL)を添加し、反応混合物を24時間の間4℃で放置した。揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから65:35v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去した。該材料を、酢酸エチル:メタノール(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーによって再精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Boc-Glu-[PEG(12u)-Me]2化合物94が無色の油として与えられた(450mg)。m/z[M+H]+(1331、100%)、[M+2H]2+(665、100%)。
【０４４９】
工程2:化合物95の合成。
【０４５０】
【化１１４】
2017534612.tif 000119
【０４５１】
化合物94(450mg)をDCM(25mL)中に溶解させ、これに、TFA(2.5mL)を添加した。溶液を室温で5時間の間撹拌した。この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから60: 40v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2TFA化合物95が清澄な無色のガムとして与えられた(320mg)m/z[M+Na]1+(1253.0、10%)[M+H]2+(616.8、100%)。
【０４５２】
工程3:化合物96の合成
【０４５３】
【化１１５】
2017534612.tif 000120
【０４５４】
無水DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)の撹拌溶液に、HATU(37mg)を添加した。反応混合物を0℃で窒素雰囲気下にて1時間の間撹拌し、次いで、DMF(1mL)中の化合物95(103.5mg)及びNMM(19μL)の溶液に添加した。追加のDMF(1mL)を添加した。撹拌反応物を放置することで室温に5時間かけて加温した。揮発分を真空中で除去した。結果として得られた淡黄色の油を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから50:50v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物96(173mg)が白色ペーストとして与えられた。m/z[M+1]+(1638、100%)及び[M+Na]+(1660、57%)。
【０４５５】
工程4:化合物97の合成
【０４５６】
【化１１６】
2017534612.tif 000121
【０４５７】
無水DMF(3.2mL)中の化合物96(173mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(104mL)を添加した。溶液を室温でアルゴン下にて1.5時間の間撹拌した。揮発分を真空中で除去し、残渣をヘキサンで反復して摩砕した。生成物を真空中で乾燥させることで、L-Glu-(OtBu)-L-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物97(152mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(1416.7、85%)、[M+2H]2+(708.5、100%)、[M+Na]1+(1438.7、30%)。
【０４５８】
工程5:化合物98の合成
【０４５９】
【化１１７】
2017534612.tif 000122
【０４６０】
無水DMF(3mL)中の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(114mg)の撹拌溶液に、HATU(51mg)を添加した。反応混合物を0℃で0.5時間の間撹拌し、次いで、DMF(2mL)中のL-Glu(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2(152mg)の溶液に添加し、さらなるDMF(1mL)、その後NMM(15μL)で洗浄した。反応混合物を0〜15℃で3.5時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから55:45v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物98(161mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(2366.7、100%)、[M+2H]2+(1184.0、80%)[M+H2O]3+(795.5、100%)。
【０４６１】
工程6:化合物99の合成
【０４６２】
【化１１８】
2017534612.tif 000123
【０４６３】
無水DCM(6mL)中の化合物98(58mg)の撹拌溶液に、TFA(6mL)を添加した。反応混合物を室温で2時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去し、水(25mL)中に溶解させ、凍結乾燥することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OH)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2化合物99(160.6mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(2306.8、90%)、[M+2H]2+(1153.0、100%)。
【０４６４】
工程7:試薬93の合成
試薬93を、実施例11Aの試薬24と類似したやり方で、化合物99及びval-cit-PAB-MMAE TFA塩から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(val-cit-PAB-MMAE)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]293を無色の油として単離した(69%)。m/z[M+H]1+(3410.4、90%)、[M+2H]2+(1706.2、60%)、[M+3H]3+(1137.2、85%)、[M+4H]4+(852.8、70%)。
【０４６５】
コンジュゲーション試薬93を用いるブレンツキシマブのコンジュゲーションを、実施例21内に記載されている通りに、16時間の間実施した。分析HICからの結果は、DAR4生成物への変換が67%であったことを示している。
【０４６６】
(実施例52)
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬100の合成
【０４６７】
【化１１９】
2017534612.tif 000124
【０４６８】
試薬100を、実施例11Aの試薬24と類似したやり方で、化合物23の代わりに化合物20Bを使用し、val-cit-AHX-DM1の代わりにval-cit-PAB-MMAE TFA塩を使用して合成した。
【０４６９】
【化１２０】
2017534612.tif 000125
【０４７０】
化合物20Bを、実施例10における化合物23と類似したやり方で、H2N-PEG(24u)の代わりにH2N-PEG(12u)-トリ(m-dPEG(24u)を使用して作製した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(12u)-トリ(m-dPEG(24u))]100を無色の油として単離した。m/z[M+2H]2+(3166、20%)、[M+3H]3+(2111、50%)、[M+4H]4+(1583、100%)。
【０４７１】
コンジュゲーション試薬100を用いるブレンツキシマブのコンジュゲーションを、実施例21内に記載されている通りに、16時間の間実施した。分析HICからの結果は、DAR4生成物への変換が65%であったことを示している。
【０４７２】
(実施例53)
2種のオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬101の合成
【０４７３】
【化１２１】
2017534612.tif 000126
【０４７４】
工程1:化合物102の合成。
【０４７５】
【化１２２】
2017534612.tif 000127
【０４７６】
無水DMF(18mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(2g)の撹拌溶液に、HOBt(666mg)及びDIC(768μL)を添加した。反応混合物を0℃で10分間、次いで2.5時間室温で撹拌した。H-L-Glu-(OtBu)-OH(1.19g)及びDIPEA(2.46mL)を添加し、反応混合物を18時間の間室温で撹拌した。反応混合物を水(100mL)で希釈し、希釈HClを添加することによってpH2.0に酸性化した。水性層をEtOAc(3×100mL)で抽出し、有機相を合わせ、水(2×50mL)及び飽和ブライン溶液(1×50mL)で洗浄した。EtOAc層をNa2SO4で2時間の間脱水し、次いで、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。生成物を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから80:20v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって単離した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH 102(875mg)が白色の固体として与えられた。m/z[M+H]1+(610.8、85%)、[M+Na]1+(633.1、55%)、[2M+Na]+(1243.2、55%)。
【０４７７】
工程2:化合物103の合成。
【０４７８】
【化１２３】
2017534612.tif 000128
【０４７９】
無水DMF(5mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH(510mg)及びNH2-PEG(24u)-OMe(1g)の撹拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(44μL)及びHATU(48mg)を添加した。反応混合物を0℃で10分間、次いで16時間室温で撹拌した。溶液を真空中で2mLに濃縮し、残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから83:17v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物103(644mg)が白色のペーストとして与えられた。m/z[M+H]1+(1681.0、40%)、[M+Na]1+(1704.0、30%)及び[M+2H]2+(841.4、55%)。
【０４８０】
工程3:化合物104の合成。
【０４８１】
【化１２４】
2017534612.tif 000129
【０４８２】
無水DMF(900μL)中のFmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe(193mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(34μL)を添加し、反応混合物を1時間室温で撹拌した。溶液を真空中で濃縮乾固し、残渣をEt2O(2×2.5mL)で摩砕した。生成物を真空中で乾燥させることで、H-L-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物104(166mg)がオフホワイトの固体として与えられた。
【０４８３】
工程4:化合物105の合成。
【０４８４】
【化１２５】
2017534612.tif 000130
【０４８５】
試薬105を、実施例10の化合物23と類似したやり方で、化合物104及び4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe105を無色の油として単離した。m/z[M+H]1+(2407.2、25%)、[M+Na]1+(2429.4、70%)。
【０４８６】
工程5:化合物106の合成。
【０４８７】
【化１２６】
2017534612.tif 000131
【０４８８】
試薬106を、実施例10の試薬23と類似したやり方で、化合物105から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-(OH)-Glu-(OH)-PEG(24u)-OMe106を無色の油として単離した。m/z[M+H]1+(2294.2、20%)、[M+Na]1+(2317.4、10%)及び[M+2Na]2+(1217.4、100%)。
【０４８９】
工程6:試薬101の合成。
無水DMF(1.5mL)中の化合物106(28mg)、val-cit-PAB-MMAE TFA塩(31mg)及びHATU(14mg)の撹拌溶液に、N-メチルモルホリン(7μL)を添加し、反応混合物を0℃で5時間の間撹拌した。溶液を水(1mL)で希釈し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%TFA及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%TFA(100:0v/vから60:40v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-ビス-[Glu-(val-cit-PAB-MMAE)]-PEG(24u)-OMe化合物101(36mg)が白色の固体として与えられた。m/z[M+2H]2+(2252.7、20%)、[M+3H]3+(1501.6.7、40%)及び[M+4H]4+(1126.6、100%)。
【０４９０】
コンジュゲーション試薬101を用いるブレンツキシマブのコンジュゲーションを、実施例21内に記載されている通りに、16時間の間実施した。分析HICからの結果は、DAR4生成物への変換が56%であったことを示している。
【０４９１】
(実施例54)
2種のオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬107の合成。
【０４９２】
【化１２７】
2017534612.tif 000132
【０４９３】
工程1:化合物108の合成。
【０４９４】
【化１２８】
2017534612.tif 000133
【０４９５】
無水DMF(6mL)中のBoc-L-Glu(OH)-OH(51.6mg)の撹拌溶液に、BOP(277mg)を添加した。溶液を0℃で20分間撹拌した後に、MeO-PEG(24)-NH2(500mg)、その後NMM(69μL)を添加した。4時間後、追加量のBOP(92mg)及びNMM(23μL)を添加した。更に2.5時間後、反応混合物を-20℃で18時間の間貯蔵した後に、真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、白色の固体が与えられた(373mg)。ギ酸(6mL)を固体に添加し、結果として得られた混合物を不活性雰囲気下で60分間撹拌した後に、真空中で濃縮した。残渣を95%水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(約6mL)中に溶解させ、終夜凍結乾燥することで、TFA・H2N-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物108がオフホワイトの固体として与えられた(330mg)。m/z[M+2H]2+(1144、5%)、[M+3H]3+(763、35%)、[M+4H]+(573、100%)。
【０４９６】
工程2:化合物109の合成。
【０４９７】
【化１２９】
2017534612.tif 000134
【０４９８】
無水DMF(18mL)中のFmoc-Glu(OtBu)-OH(2g)の撹拌溶液に、0℃で、HOBt(666mg)及びDIC(768μL)を添加した。反応混合物をRTに加温しておき、2時間後、Glu(OtBu)-OH(1.19g)及びDIPEA(2.46mL)を添加した。20時間の間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-OH、化合物109が白色の固体として与えられた(1.03g)。m/z[2M+H]+(1221、15%)、[M+H]+(611、60%)、[M-tBu+H]+(554、65%)、[M-2tBu+H]+(499、100%)。
【０４９９】
工程4:化合物110の合成。
【０５００】
【化１３０】
2017534612.tif 000135
【０５０１】
無水DMF(10mL)中の化合物108(330mg)の撹拌溶液に、化合物109(100mg)を添加した。次いで、0℃で、HATU(156mg)及びNMM(45μL)を添加し、結果として得られた溶液を5分間撹拌した後に、NMM(3μL)及びHATU(11mg)を更に添加した。反応溶液を更に20分間撹拌させておいた後に、室温に加温し、その上、撹拌を更に4時間の間続けた。この時間の後、追加量のHATU(51mg)及びNMM(15μL)を添加した。更に1.5時間後、混合物を-20℃で18時間の間貯蔵した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物110が、白色の固体として与えられた(193mg)。m/z[M+3H]3+(961、20%)、[M-tBu+4H]4+(707、100%)、[M-2tBu+4H]4+(693、85%)、[M+5H]5+(577、75%)。
【０５０２】
工程5:化合物111の合成。
【０５０３】
【化１３１】
2017534612.tif 000136
【０５０４】
無水DMF(1.5mL)中の111(193mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(20μL)を添加した。90分後、さらなる量のピペリジン(13μL)を添加し、反応物を更に90分間撹拌した後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。溶媒を高真空下で除去し、結果として得られた残渣をヘキサン中で摩砕した。残渣を高真空下で30分間更に乾燥させた後に、緩衝剤A:緩衝剤B(2mL、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)の50:50混合物中に溶解させ、終夜凍結乾燥することで、TFA・H2N-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物111が淡青色の固体として与えられた(186mg)。m/z[M+3H]3+(887、20%)、[M+4H]4+(666、100%)、[M+5H]5+(533、30%)。
【０５０５】
工程6:化合物112の合成。
【０５０６】
【化１３２】
2017534612.tif 000137
【０５０７】
無水DMF(1.5mL)中の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(71mg)の撹拌溶液に、HATU(28mg)を添加した。混合物を0℃に冷却し、不活性雰囲気下で30分間撹拌した。無水DMF(2.5mL)中の111(186mg)の溶液、その後HATU(22.9mg)及びNMM(14.7μL)を添加し、混合物をRTに加温しておいた。
【０５０８】
3時間後、追加量の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(18mg)、HATU(50.8mg)及びNMM(15μL)を添加した。更に1.5時間後、さらなる量の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(9mg)、HATU(51mg)及びNMM(15μL)を添加した。反応混合物を更に8時間の間撹拌し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって2回精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、112が淡黄色の油として与えられた(推定定量)。m/z[M+4H]4+(902、60%)、[M-tBu+4H]4+(888、60%)、[M-2tBu+4H]4+(874、45%)、[M-tBu+5H]5+(711、100%)。
【０５０９】
工程7:化合物113の合成。
【０５１０】
【化１３３】
2017534612.tif 000138
【０５１１】
ギ酸(2mL)を112に不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を60分間撹拌した後に、真空中で濃縮した。該材料を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０５１２】
有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、113が無色の油として与えられた(28.1mg)。m/z[M+3H]3+(1165、5%)、[M+4H]4+(874、65%)、[M+5H]5+(699、100%)。
【０５１３】
工程7:試薬107の合成。
無水DMF(270μL)中の113(15mg)の撹拌溶液に、HATU(4mg)を添加した。混合物を0℃に冷却し、不活性雰囲気下で20分間撹拌した。無水DMF(300μL)中のval-Cit-PAB-MMAE(12mg)の溶液、その後HATU(2.5mg)及びNMM(2μL)を添加し、混合物をRTに加温しておいた。4時間20分後、追加量のHATU(3.3mg)及びNMM(0.9μL)を添加した。反応混合物を更に2時間の間撹拌した後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。RTに加温すると、HATU(3.3mg)及びNMM(0.9μL)を撹拌溶液に添加した。4.5時間後、追加量のHATU(1.6mg)及びNMM(0.5μL)を添加し、反応物を更に2.5時間の間撹拌させておいた後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。該材料を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、107が白色の固体として与えられた(13.8mg)。m/z[M+4H]4+(1426、5%)、[M+5H]5+(1141、70%)、[M+6H]6+(951、100%)、[M+7H]7+(815、20%)。
【０５１４】
コンジュゲーション試薬107を用いるブレンツキシマブのコンジュゲーションを、実施例21内に記載されている通りに、17時間の間実施した。分析HICからの結果は、DAR4生成物への変換が61%であったことを示している。
【図１】
2017534612.tif 000147
【図２】
2017534612.tif 000148
【図３】
2017534612.tif 000149
【図４】
2017534612.tif 000150
【図５】
2017534612.tif 000151
【図６】
2017534612.tif 000152
【図７】
2017534612.tif 000153
【図８】
2017534612.tif 000154
【図９】
2017534612.tif 000155
【図１０】
2017534612.tif 000156
【図１１】
2017534612.tif 000157
【国際調査報告】
2017534612.tif 000158
2017534612.tif 000159
2017534612.tif 000160