(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから材料を直接抽出する方法であって、以下：
サンプルを提供する工程；
選択された領域での活性化の際にのみ、その選択された領域に該サンプルに対する接着性の性質を提供する特性を有する輸送フィルムを提供する工程；
該輸送フィルムと該サンプルとの間の２−２０ミクロンの距離を維持するように、該サンプルと該輸送フィルムを並列させる工程；
該サンプルからの抽出のための材料の少なくとも一部分を同定する工程；
該サンプルに隣接する該輸送フィルム内の体積を活性化し、それによって、活性化された部分が該輸送フィルムと該サンプルとの間の距離にまたがり、そして該サンプルの材料の少なくとも一部分に接着するように、該輸送フィルム上に予め選択されたビーム径の放射線ビームを指向する工程；
該輸送フィルムと該サンプルの材料の少なくとも一部分との間の接着が維持されている間に、該サンプルから該輸送フィルムを分離し、それによって該サンプルの材料の少なくとも一部分が該サンプルの残りの部分から抽出される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載のサンプルから材料を直接抽出する方法であって、以下：
前記輸送フィルムが、ポリエステルフィルムと、その下部表面に設けたレーザ照射により活性化するコーティングとからなるものであり、そのような輸送フィルムを提供する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載のサンプルから材料を直接抽出する方法であって、以下：
前記輸送フィルムを提供する工程が、前記ポリエステルフィルムの上部表面に不活性の裏打ち基板を提供する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、移動表面において組織サンプルからの細胞材料の直接抽出を行うレーザ捕獲顕微分析（ＬＣＭ）に関する。本明細書における開示は、引き続いて行われる分析のために単離されたサンプルセグメントを簡単に収集できるフォーマットで、選択された組織サンプルをフィルムマトリクスへと単離することに関する。
【０００２】
本出願は、１９９６年１０月９日に出願された、Ｌａｎｃｅ  Ａ．  Ｌｉｏｔｔａらの、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｕｎｄｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ」というタイトルのＰＣＴ／ＵＳ  ９６／１６５１７を基礎として優先権を主張する。本出願はまた、１９９７年２月７日に出願された、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｕｎｄｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ」（出願人の１５５２８０−３１４）というタイトルの米国特許仮出願番号第６０／０３６，９２７号を基礎として優先権を主張する。これら両出願を、完全に記載されているかのように本明細書において参考として援用する。
【０００３】
（発明の背景）
レーザ捕獲顕微分析（ＬＣＭ）は、「Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｍａｇａｚｉｎｅ」（１９９６年１１月８日および１９９７年１１月２１日）に記載されている。要約すると、ＬＣＭは、通常、組織サンプル上の同定された細胞材料に接着するための活性化可能なコーティングを有する輸送基板を配置することを含む。例えば、透明で、熱的に活性化可能な接着フィルム（例えば、ＥＶＡポリマー）の大きな（数ｃｍ2）片を、ガラス製の顕微鏡用スライド上に設けられた、標準的な（乾燥された）組織病理学的切片（厚さ５〜１５μｍ）の上部組織表面の近傍に並置する。
【０００４】
通常、顕微鏡下での検査によって、マイクロディセクションのために組織サンプルの同定された細胞材料が一旦選択されると、その後、基板が活性化される（通常、レーザビームでパルスされる）。光エネルギーがプラスチックフィルムによって吸収され、小さな領域においてこのフィルムが溶解する。その後、活性化可能なコーティングが微視的な組織成分上およびその周囲に流れて、冷却中のフィルムが、組織サンプルの同定された細胞材料にしっかりと接着される。同じスライド上の他の標的領域が、同様に処理され得る。
【０００５】
引き続いて、フィルムがスライドから持ち上げられると、選択された組織が、一連のスポットにおいてフィルムに接着して持ち上げられ、他の組織はスライド上に残る。残念ながら、同定された細胞材料をスライド上に分散して配置すると、同定された細胞材料は、輸送基板上に分散して分布される。
【０００６】
その後、通常の場合、フィルムを適切な試薬（例えば、組織の構造タンパク質を消化するプロテイナーゼＫ）に浸すことにより、選択された一連のスポットをフィルムから取り出す（これは、引き続いて分析されるＤＮＡまたはＲＮＡの分子を放出する（例えば、ＰＣＲおよびゲル電気泳動を使用する））。１つの標的を所定の試薬溶液（すなわち、特異的な「分子抽出緩衝液」）へと特定的に移動させるために、移動された組織スポットおよびその下に付着したフィルムを、メスまたはハサミを用いて手で切除するか、または、精密なパンチ／ダイスを用いて打ち抜いてキュベットに直接移動させることができる。
【０００７】
この技術の発展と共に、改良への要求が起こっている。従って、本明細書の以下の部分において、本発明者らは、ＬＣＭの要件を特定し、その後これらの要件に対する解決方法を提案する。レーザ捕獲顕微分析についての要件を記載するにあたって、本発明者らが本発明を特許請求することを理解されたい。言うまでもないが、解決すべき問題の認識、ならびに、問題が一旦認識された後に得られたこの問題に対する解決方法が、本発明の一部を構成し得る。
【０００８】
ＬＣＭにおいて、潜在的には、次第により小さなスポットサイズ（例えば２５ミクロン以下）へと移行する、研究上の大きな必要性（最終的には臨床上の必要性）が存在する。このことは、病理学的標本または細胞学的標本内で特定の細胞の分子修飾を研究するための、選択された単一の細胞または細胞小器官の移動につながる。このことは、２つの技術上の問題を提起する：
１）正確な標的化、および、顕微鏡観察に基づく特定の細胞へのフィルムの接着、ならびに、
２）分子抽出緩衝液に移動されたフィルムの隣接する領域を最小化することによる、移動の特異性の維持。
【０００９】
ＬＣＭにおいて、フィルム内のスポットは、試料上の位置に対応する位置に、大まかに、不規則に配置される。より小さなスポットサイズの試料を抽出する場合に起こる問題は、取り出されたフィルム片または移動表面上にそれらの小さな試料を見つけることである。試料の抽出された部分を正確に切除し得るように、正確な位置が要求される。正確な切除を行うことで、低密度の非特異的な組織付着により、フィルムの周辺領域からの汚染を最小にしつつ、標的組織が完全に回収される。
【００１０】
ＬＣＭを開示された技術に限定すると、格納位置の正確なコンピュータ制御および座標の格納が現実的であり得る。しかし、このコンピュータ制御は、移動プロセスの視覚的観察の信頼性を失い得、複雑且つ高価であり得る。さらに、コンピュータ位置は、テープをスライドから持ち上げた際にテープが歪曲する場合等の、多くの場合に正確さを欠き得る。
【００１１】
同定された細胞材料の周辺の領域における、標的化されなかった組織のフィルムへの非特定的な移動が、別の問題として存在する。標的化された組織のスポットサイズが減少するにつれ、この非特定的な移動が、次第に重要になっている。理想的には、レーザによって照射されて標的化された領域の外側の組織は、スライドから取り出す際にフィルムに接着させるべきではない。任意の所望されない組織の接着は、所望される組織との、試料の汚染を生じる。使用される標的スポットがより小さくなるにしたがって、混入組織（ｓｔｒａｙ  ｔｉｓｓｕｅ）の許容可能量が比例的に小さくなる。
【００１２】
極めて小さなサンプルとの接触領域を達成し得ると推定すると、移動表面の処理方法について問題が起こる。具体的には、標的部位における組織上で、活性化可能な移動表面の小さなスポットを位置決めすること、小さな活性化された移動表面を組織から取り出すこと、ならびに、単離され、標的化された細胞をキュベット内へ配置すること、または、標的化されなかった組織エレメントによって汚染されることなく特異的に同定可能な様態でそれらを格納することが、問題となる。
【００１３】
要件を記載したが、ここで本発明者らは解決方法に注目する。
【００１４】
（発明の要旨）
組織サンプル上のランダムな位置からのＬＣＭ同定された細胞材料を、輸送基板上の指定された位置へと集めるための方法および装置が、都合に応じてさらなる処理を可能にする。輸送基板は、同定された細胞材料を受け取るための、同定されたマッピング位置を有している。少なくとも１つの選択的に活性化可能なコーティングのセグメントが、輸送基板の組織サンプルに並ぶ面上のマッピング位置に配置される。輸送基板およびサンプルが相対的に移動されることにより、マッピング位置にある選択的に活性化されるコーティングを、抽出したい組織サンプルの同定された細胞材料に対して並ぶように配置させる。その後、選択的に活性化するコーティングを活性化して押し付けるか、あるいは押し付けてから活性化することにより、同定された細胞材料に接着するための接着性領域を輸送基板上に形成する。輸送基板を組織サンプルから除去する際、同定された細胞材料はマッピング位置において輸送基板に接着する。
【００１５】
第１の実施形態において、選択的に活性化される材料の個々の小片またはコーティングが、輸送膜上に配置される。例えば、選択的に活性化可能なコーティングが、膜の個別片の中心に配置され、サンプルに対して曝露される。膜の各異なる片を、そのコーティングされた中心部においてレーザにより個別に活性化する。レーザ作動中または作動後における組織への位置並べは、加圧プレートを用いることによって行われる。
【００１６】
別の実施形態において、膜を保持するために、例えば選択的に活性化可能なコーティング片が等間隔で中心に位置された連続的なリール状テープなどの、透明な基板を含む連続的なストリップを用いる。その後、透明基板の連続的なストリップを漸進的に進めることにより、活性化可能なコーティングの中心が顕微鏡視野の中心にくるようにする。並んで設けられたバーコードまたはその他の光学的に符号化された識別子が、個々の輸送されるサンプルを同定する役割を果たし得る。
【００１７】
サンプル回収は、レーザ加熱の前または後において、輸送基板を顕微鏡視野の中心で組織と接触するように保持するように作動される、加圧プレートを包含し得る。レーザ加熱およびサンプルからの選択された物質への付着後に、加圧プレートは持ち上げられ、局所的に活性化されたコーティングを有する輸送基板が、接着した組織とともに組織サンプルから分離される。このプロセスが順に繰り返されることにより、輸送基板が再び進められ、次の輸送基板片（清浄な）が視野の中心に置かれ、組織表面に押圧され、レーザで活性化される。この繰り返しは輸送基板を進めるだけでなく、ターゲットとする（接着した）組織を、再現性よく標本スライドから離して持ち上げるための力をも加える。輸送基板が次の清浄な（未使用の）スポットまで進められた後、かつ膜が標本表面上に押圧される以前において、顕微鏡のステージおよび輸送基板が平行移動（ｘおよびｙ方向に）されることにより、次の組織ターゲットが顕微鏡視野の中心にくるようにする。
【００１８】
輸送基板を選択的にコーティングされたスポットとともに用いる場合、基板は、活性化コーティングの局所領域をパンチングまたは切り出しあるいは剥離することにより、残りの基板テープから局所的に除去され得る。これにより、接着した同定された細胞材料が、輸送基板の小片に局所化された状態にされる。これらの輸送基板の小片は、さらなる処理および分子分析のために特定のチャンバまたは容器内に配置される。
【００１９】
別の実施形態において、選択的に活性化可能なコーティングの個々の片は、中央の共通支持部に取り付けられここから突出した、屈曲可能な支柱アレイの端部に設けられる（例えば車輪または櫛状構造など）。選択的に活性化可能なコーティングを端部に有する各支柱は、輸送基板として機能し、顕微鏡視野の中心を通って順にインデックス送りする。支柱の端部は加圧プレートとして機能し、支柱の端部の活性化可能なコーティングにて組織に接触する。選択的に活性化可能なコートは、支柱が屈曲されたときに（例えばソレノイドなどにより）作動させられる（ディジーホィールプリンタと同様に、１度に１スポーク）。活性化後、支柱上にかかる力が取り除かれることにより、同定された細胞材料が接着された状態のスライドを支柱が持ち上げることを可能にする。その後、支柱アレイは膜片が定位置にくるように次の支柱をインデックス送りし、ステージは次の組織ターゲットに移動され、次の支柱が新しいターゲットと接触するように配置される。
【００２０】
このアプローチの別の変形例は、櫛形状のアレイを用いることである（すなわちターゲット膜スポットが、「ディジーホィール」の半径方向のスポークによってではなく、アレイ軸に対して垂直な平行スポークによって線形キャリッジに取り付けられた線形アレイ状である）。小さなスポット状の膜が各櫛の歯の端部に配置される。小さなソレノイドが歯を屈曲させることにより、その端部（加圧プレートとして作用する）が視野の中央で組織と接触するようにする。レーザ加熱後、ソレノイド力を取り除き、歯がその非屈曲位置に戻る（膜に組織が接着された状態でスライドを持ち上げる）そして、櫛を線形にインデックス送りすることにより、膜の異なる歯／片が視野の中央に来て異なる組織ターゲットが定位置に移動されるようにする。櫛の基部上の標識によってサンプルを同定し得る。この技術により、非常に小さくかつ精密なサンプル抽出が可能になる。
【００２１】
接着性膜が屈曲可能支柱の形態である加圧プレートに接合される場合は、同定された細胞材料が付着したところの支柱を折り取り、この折り取った部分を回収およびさらなる処理用のためにカプセルに入れる。
【００２２】
上述の回収技術のすべてにおいて、接着性スポットを基板から取り外すための他の手段も存在する（例えばプルタブおよび剥離、基板と接着性スポットとの間の接合用の特定の溶媒など）。これらの改良はすべて、精密に間隔をあけられた（線形状または角度的な分離）小さなサイズのターゲット膜スポットを取り除くための手段を提供する。このような小さなサイズのターゲット膜スポットは、顕微鏡観察下において既にこの位置に平行移動された標本のターゲット部位において、光学的視野の中央に容易に正確に配置され得る。サンプルには隣接する基板上の同定用の標識が提供されることができるので、サンプルは、一連の被移送物中からセルタイプに応じて個別に分離されあるいは分類されその基板から取り除かれるまでの間、シーケンシャルな被移送物のアレイとして（ディジーホィール、櫛、またはテープ基板のストリップ）としてコンパクトに格納できる。
【００２３】
さらに別の実施形態において、連続的であり中央に細長く存在する選択的に活性化可能なコーティングを有する、連続的な輸送基板片が提供される。この連続膜片が、狭い選択的に活性化可能なコーティング部分において、細長い（膜移動の方向の）加圧プレートにより組織と接触状態におかれることにより、（小さい）接触面積を規定する。この技術により、接着剤の別個のスポットを、膜の移動方向において視野の中央に対して位置合わせする問題を回避することができる。テープの細長い接着性の部分が視野を通過し、かつ静止している加圧プレートが視野に対して整列しているかぎり−−どちらも穏当な要件である−−位置合わせは満足される。このアプローチは、ａ）膜およびターゲット領域の取り扱いおよび位置合わせに起因する複雑さや、ｂ）膜の基本的な接着性質を越えた開発を必要としたり、ｃ）専用のテープカセット（例えば加圧プレートなどがビルトインされた）の開発を必要とすることなく、接着性膜の組織上における小さな接触領域を可能にするという利点を有する。
（好適な実施形態の説明）
図１を参照して、フィルム片レーザー捕捉顕微解剖装置Ａを説明する。ステッパモーター１４は、供給リール１６を駆動して、コーティングされたテープ１８を送出する。コーティングされたテープ１８は、第１のガイドバー２０、第２のガイドバー２２を通り、テープストップ機構２４へと移動する。テープストップ機構２４は、下側（サンプルＳが最終的に回収される側）からコーティングされたテープ１８に当接するストップバー２６と、ソレノイド駆動されるテープストッププランジャー２８とを含む。テープ切断ナイフ３０によって、サンプルＳを含有したテープをさらなる処理のために小片に切断することができる。
【００２４】
スライド３２はサンプルＳを含有する。このサンプルは、サンプルＳの組織３６と不規則に混合された所望のサンプルセクション３４を含む。サンプルＳから所望のサンプルセクション３４を正確に単離することが、本開示の目的である。
【００２５】
このような単離を行うためには、サンプルＳを可視化しなければならない。ここに示されるように、スライド３２の下側から見上げる方向の逆向き光路を有する顕微鏡Ｍを目Ｅで模式的に示す。従来同様、スライド３２は、Ｘ方向３８およびＹ方向４０に輸送可能なステージに搭載される。
【００２６】
最後に、所望のサンプルセクション３４にあるサンプルＳを視野内でセンタリングした後、サンプルＳの所望のサンプルセクション３４をコーティングされたテープ１８上に収集する必要がある。この収集において、コーティングされたテープ１８は、レーザー光源４２によって活性化される。この活性化後または活性化中、コーティングされたテープ１８上の活性化されたコーティングは、所望のサンプルセクション３４にあるサンプルＳに接触させられる。このコーティングされたテープ１８と所望のサンプルセクション３４との接触または隣接は、プレッシャプレートＰによって行われる。プレッシャプレートＰは、コーティングされたテープ１８の非コーティング側１７に当接し、これにより、テープを動かして所望のサンプルセクション３４にあるサンプルＳに並置させる。所望のサンプルセクション３４の接着は、コーティングされたテープ１８のコーティング側に対して起こる。
【００２７】
送出されるコーティングされたテープ１８上の供給リール１６間において一定の張力を保つことが所望され得る。従って、テープ引張り装置４４が提供される。この装置が任意に省略可能であることが理解される。
【００２８】
コーティングされたテープ１８が所望のサンプルセクション３４に接着した後、テープを移動させる。通常の状況下では、テープは、テープは所望のサンプルセクション３４に対して、サンプルＳの組織の残りの部分からサンプルセクションを切断するのに十分な接着性を有する。
【００２９】
図２Ａ〜図２Ｆを参照して、本装置を示す一連の模式図が示されている。図２Ａにおいて、図示された供給リール１６は、コーティング側１９がスライド３２上のサンプルＳに接触した状態のコーティングされたテープ１８を有する。予め活性化されているので、コーティングされたテープ１８は、この時点で、サンプルＳの所望のサンプルセクション３４に接着する。図２Ａおよび図２Ｆを見ると、プレッシャプレートＰが退避されていることが分かる。
【００３０】
図２Ｂを参照して、ガイド２２の周りでテープ１８を引っ張っている力４８によって、サンプルセクション３４はスライドから持ち上げられるとともに、テープの非コーティング側１７によってプランジャー２８を変位させて、これにより、サンプル３４がＰの下側から動かされる際に、テープ１８のコーティング側およびサンプル３４がストップバー２６に接触しないようにし、テープが供給リール１６から遠ざかる方向に引っ張られる。ステッパモーター１４によって、測定された量のコーティングされたテープ１８が供給リール１６から引き出される。この測定量の限界に達したとき、ステッパモーター１４はフリーズし、コーティングされたテープ１８をテープ切断ナイフ３０によって切断する準備状態となる。当然、ステッパモーター１４がコーティングされたテープ１８の送出を正確に制御するので、テープ切断ナイフ３０によって切断される全長に対して所望のサンプルセクション３４が位置決めされる。
【００３１】
従って、輸送基板が、同定された細胞性物質を受け取る同定されたマッピングされた位置を有することが理解される。
【００３２】
図２Ｃにおいて、テープセグメント５０が切断され除去されている。さらに、テープ停止メカニズム２４が作動している。その結果、コーティングされたテープ１８の端部の、Ｐからの位置は固定されており、上記端部は、圧力プレートＰがスライド方向にテープを反らせたときに次の視覚化されたサンプルを収集するように配置される。
【００３３】
図２Ｄを参照すると、スライド３２および従ってサンプルＳが新しい位置に移動していることが理解される。この新しい位置において、別の所望のサンプル部３４が、ｘ方向３８およびｙ方向４０へのスライド３２の移動によりピックアップされるように中央に位置づけられている。
【００３４】
最後に、図２Ｅを参照すると、圧力プレートＰが、コーティングされたテープ１８のコーティング面１９を近接させる。ステッピングモータ１４は、もはや停止しておらず、スライド３２方向にテープを反らせるために必要な弛緩量を提供する。再び、レーザ光焦点レンズ４６を介した、レーザ光源４２によるコーティング面１９の活性化が起こる。
【００３５】
図２Ｆを参照すると、説明したサイクルが反復する準備ができている。図２Ａを参照して上記で見られたものと同一のサイクル状態を図２Ｆに示す。
【００３６】
図２Ａ〜図２Ｅの動作を考慮すると、選択された活性化コーティングの少なくともセグメントが、組織サンプルに並置した状態で輸送基板側に配置され、これがマッピングされた位置となる。さらに、そして所望のサンプルセクション３４を収集する間に、輸送基板とサンプルとが相対的に移動して、選択的に活性化されたコーティングを、抽出されるべき組織サンプルの同定された細胞材料に対して並置的に、マッピングされた位置に配置する。その後、選択的に活性化されるコーティングが活性化されて押し付けられるか、または押し付けられて活性化されて、同定された細胞材料に付着する接着性領域を、輸送基板上に形成する。輸送基板が組織サンプルから除去されると、同定された細胞材料が、マッピングされた位置において、輸送基板に付着する。
【００３７】
コーティングされたテープ１８がいくつかの異なる構造を有し得ることが理解される。図４を参照すると、コーティングされたテープ１８Ａが、例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標）などのポリエステルフィルムから構成されていることが示されている。コーティングされたテープ１８Ａは、テープのコーティング面１９上に配置された、離散して間隔のあいたコーティングスポット５２を有する。さらに、スプロケット５６と組合わされてテープを精密に位置づけるスプロケット孔５４が示されている。互いに異なる、離散して間隔のあいたコーティングスポット５２の各々は、コーティング中心においてレーザにより別々に活性化される。レーザ作動中またはレーザ作動後の組織に対する並置は、圧力プレートを用いて行われる。
【００３８】
図５を参照すると、透明基板を含む連続ストリップが、フィルムを保持するために用いられている。透明基板の連続ストリップ、またはコーティングされたテープ１８Ｂは、活性化可能コーティングの中央ストリップ５８を有する。隣接するバーコード６０または他の光符号化識別子が、輸送された個々のサンプルを同定するように作用する。これらのサンプルは、活性化可能コーティングの連続中央ストリップ５８沿いのいずれかの位置にあり得、または均等に間隔をあけられ得る。
【００３９】
図１１を参照すると、コーティングされたテープ１８が利用されている場合、選択的にコーティングされたスポットまたは離散して間隔のあいたコーティングスポット５２を有する輸送基板が同様に用いられ得る。基板は、活性化されたコーティングの局部領域をパンチングまたはカットオフすることにより、基板テープの残りの部分から局部的に除去され得る。
【００４０】
図１１を参照すると、パンチングされたフィルム部分６４上の所望のサンプル部分３４を分離するパンチ６２が示されている。このことは、取り付けられた同定された細胞材料または所望のサンプル部分３４を、パンチングされたフィルム部分６４上の、輸送基板の小片に局部化されたままにする。輸送基板のこれらの小片は、さらなる処理および分子分析のために、特定のチャンバまたは試験管６６などの容器に入れられ得る。
【００４１】
図６を参照すると、さらなる実施形態が示されている。この場合、活性化可能コーティング６８が、コーティングされたテープ１８Ｃ上の引張りタブ７０に取り付けられている。明らかなように、引張りタブ７０の除去により、活性化コーティング６８に集まったサンプルもまた同様に除去される。
【００４２】
サンプルを収集し、その後テープに連結したサンプルを保管する必要性があり得ることが理解されるべきである。従って、図７を参照すると、コーティングされたテープ１８Ｄが巻取りロール７２に集まっている状態が示されている。同時に、カバーテープ７４が残りのサンプルを覆い、テープの間に挟まった状態で残りのサンプルの保存を補助する。収集されたサンプルはこのように保存され得る。
【００４３】
図８を参照すると、本発明の別の実施形態が示される。選択的に活性可能なコーティング７６の個々の片が、スポークアレイ７８（これらは、中心の共通の支持体（例えば、中心ハブ８０）に結合しかつそこから突出する）の末端で取り付けられる。スポークアクチュエーター８２は、スポークアレイ７８の各スポーク７９を選択的に押し下げる。図８を参照すると、各末端でその選択的に活性可能なコーティングを有する各スポークは、輸送基板として機能し、そして中心ハブ８０から顕微鏡の視野の中心を介して連続的に指標を付けられる。スポークの末端は、圧力プレートとして役立ち、これはスポークの末端で、組織と、活性可能なコーティングとを接触する。選択的に活性可能なコートは、例えばソレノイドによって、スポークが歪められた場合に作動され得る（１回で１個のスポーク、デイジーホイールプリンターと類似）。活性後、スポーク上の力は除去され、そしてこのスポークは指標を付けられ、このスポークが、スポークに接着された同定された細胞材料と共にスライドから離昇することが可能となる。その後、スポークアレイは、次の片のフィルムを所定の位置へ指標を付け、そしてステージは次の組織標的へと移動され得る。
【００４４】
図８において、中心ハブ８０が使用される。コームのような構造と同様に、すなわち可撓性の裏打ち（ｂａｃｋｉｎｇ）が基板支持体のために使用され得る。
【００４５】
図９を参照すると、このアプローチの好ましい変異体は、コーム状アレイ８０を使用することである（すなわち、標的フィルムスポットは、線形アレイ形態であって、これは、「デイジーホイール」の放射状スポークよりも、アレイ軸に垂直である平行スポークによって線形カートリッジに結合されている）。活性可能なコーティング８８の小さなスポットは、各コームフィンガー８４の末端の底面に配置される。小さなソレノイド８６はこのフィンガーを歪ませ、従って、その末端（これは圧力プレートとして機能する）は、視野の中心のサンプルＳにおける組織に接触する。
【００４６】
レーザー加熱後、このソレノイドの力が除去され、フィンガーはその歪められていない状態へ回復し（スライドを離昇し、組織はフィルムに接着される）、このコームは、線形的に指標を付けられ、従って、フィルムの異なるフィンガー／片は視野の中心にあり、そして、異なる組織標的は所定の位置へ移動され得る。コーム基部上の光学式マーク９０は、サンプルを同定し得た。この技術は、非常に小さなそして正確なサンプル抽出を可能にする。
【００４７】
図１０および１２（ここで接着性フィルムは、スポークの形態で圧力プレートに結合されている）を参照すると、同定された細胞材料を有するスポーク７９は分解され得、そしてこの分解されたスポーク部品９２は、回収およびさらなる処理のために、容器（例えば試験管６６）カプセルへ配置される。分解する工程は、その長さに沿って、好都合な位置で、破砕機ソレノイド９４によってなされ得る。
【００４８】
本発明および公知の技術を用いて、視覚化および不可欠なレーザー捕獲顕微分析（ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を分離することが、可能である。図１３Ａを参照すると、スライド３２が示され、これは、顕微鏡Ｍによって見られるサンプルＳを有する。スライド３２は、ｘ−移動矢印９８およびｙ−移動矢印９９によって指標を付けられたステージ９６上に取り付けられる。
【００４９】
図１３Ｂを参照すると、典型的なサンプルＳは、ｘ1，ｙ1〜ｘ4，ｙ4のように、多数のサンプル配置を含むことが理解され得る。これらのステージ配置は、観察で示される場合、一般的にこのようなステージを提供される従来のコンピュータメモリに配置される。
【００５０】
図１３Ｃを参照すると、レーザー捕獲顕微分析が次いで遠く離れていることが分かる。詳細には、図２の装置（フィルムストリップレーザー捕獲顕微分析装置Ａによって概略的に示される）が、ｘ1，ｙ1〜ｘ4，ｙ4でのサンプル（図１３Ｂを参照）を連続的に集めるプロセスで示される。
【００５１】
現代の生物科学のさらなる進歩と共を用いて、回収サンプルは、より小さなサンプルまで及ぶことが理解される。例えば、レーザー捕獲顕微分析の技術を使用して、１個の細胞のサイズ（約５ミクロンから１ミクロンまで）までのサンプルまたは非細胞性標的を回収することが可能である。このような小さなサンプルと共に、対応して縮小された分析体積が要求される。さらに、いくつかの分析のための試薬は、非常に高価であり；サンプルおよび使用される試薬が少なくなるほど、より経済的な試験となる。レーザー捕獲顕微分析は、非常にこのような状況に適用可能である。
【００５２】
元来、レーザー活性化は、最適な回析限界（すなわち、約１ミクロン）に低下する、複合組織スライド上のエレメントの標的化を可能にする。さらに、フィルムおよび基板の各々の移動後の正確な位置により、複数の小さい組織エレメントは正確に濃縮され得、その結果、これらは、以降の正確なプロセシング（例えば、分子分析）を可能にするのに十分に均質な物質を含む。
【００５３】
読者は、濃縮が、サンプルとテープとの間の接触が活性化前に生じない場合に最良に行なわれることに留意する。先に蓄積された物質の正確かつ精密な追跡が行なわれることを推定して、先にテープに収集されたサンプルは、現在収集されるサンプルにより物理的に影響を与えられない。同時に、後に収集されたこのサンプルは、先に収集されたサンプルと近接する。基板の近接部分に、この収集を繰り返すことにより、分析されるべき特定の細胞の濃縮が、このような細胞がたとえ、インサイチュで自然に濃縮されない場合でも、生じ得る。
【００５４】
これをより理解するために、選択された細胞領域は重ならないことが好ましい。重なりが生じる場合、サンプルは損失され得る。さらに、不正確な収集により、利用されるギャップが変化して、収集パラメーターの予測可能性に影響を及ぼし得る。例えば、レーザー照射の線量測定が、変化し得る。
【００５５】
レーザー捕獲顕微分析の概念が発達するにつれ、さらに小さいサンプルの正確な標的化が必要されている。驚くことに、サンプルＳから幾分短い距離（約５ミクロン以下）で間隔を開けられたコーティングされたテープ１８上に、レーザーエネルギーを指向することにより、非常に正確なサンプル収集が生じ得る。
【００５６】
この捕獲についての２つの所見が成された。第一に、活性化可能なコーティングの厚さが、１００ミクロンの好ましい範囲である場合、テープとサンプルとの間の間隔は、２〜２０ミクロンの広い範囲で、５〜１５ミクロンの中程度の範囲で、そして好ましくは約１０ミクロンであり得る。２０〜２００ミクロンの範囲の活性化可能なフィルムの厚さが、使用され得る。実施限界として、厚さは、コーティングが活性化された場合に、所望の接着性の効果を有するのに十分であるべきである。実施限界として、現在、コーティングは１０ミクロンを超えるべきであると考えられている。
【００５７】
図１４Ａについて言及すると、スライド３２は、サンプルＳと共に示される。選択された細胞材料Ｃは、先に可視化されている。スライド３２およびサンプルＳに覆い被さり、そのサンプルに対するよう、下方に位置付けされたコーティングされた側面１９を含むコーティングされたテープ１８が示される。
【００５８】
さらに、コーティングされたテープ１８の、コーティングされた側面１９での小さくかつ正確に焦点を合わせられたレーザー活性化は、スライド３２およびサンプルＳを通って、コーティングされた側面１９上へ生じる。従って、図１４Ｂについて言及すると、レーザー光源Ｌは、スライド３２、サンプルＳを通って、コーティングされた側面１９上へ通過することが示される。図１４Ｂの破線に概略的に示されるように、レーザー光源Ｌは、反対方向から入射し得ることが理解される。
【００５９】
コーティングされた側面１９は、局所的に活性化され、そして寸法が膨張する。活性化領域１１２は、拡張されたカラム１１４で、およびサンプルを曝露された部位１１６で、下方に拡張し、選択された細胞材料Ｃを固定する。
【００６０】
レーザー光源Ｌが消された後に、活性化された表面および標的化された組織が、非標的化領域からテープにより取り出される時に、拡張されたカラム１１４は縮小し、続いて、コーティングされた側面１９の元来のプロフィールに戻る。この時、選択された細胞材料Ｃを有する拡張されたカラム１１４を収縮することにより、サンプルＳから分離される（図１４Ｃを参照のこと）。
【００６１】
図１４Ｄについて言及すると、この系のいくつかのさらなる利点が示される。第一に、コーティングされたテープ１８が輸送され得、その結果、コーティングされたテープの新しいセグメントがスライド３２上のサンプルＳの標的化部分を覆う。第二に、新しいスライド３２Ａが導入され得；従って、異なるスライドからのいくつかの異なるサンプルＳが、選択された細胞材料Ｃの収集および濃縮に利用され得る。従って、そして図１４Ｅについて言及すると、２つのスライド３２および３２Ａからの組織は、結果的にコーティングされたテープ１８上に並んで存在する。
【００６２】
最終的に、本明細書に説明された収集は、元来のサンプルには見出されない物質の濃縮という結果になる。
【００６３】
これは、選択後に探索された細胞材料が、元来インサイチュで散乱されるか、または均質に分散されるが、しかし意義深く分析されるために特定の閾値量で濃縮される必要がある場合に、特に重要である。
【００６４】
本発明者らは、先の特許請求の範囲において、用語「並んで（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）」を使用する。この用語は、サンプルの選択された部分への輸送基板の接触または非接触の両方を包含するために使用される。詳細に、そして「並んで」が使用される場合、基板は、活性化時に選択された細胞材料が形成され得るように、サンプルに十分近接することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、供給リール、レーザ活性化システム、活性化したコーティングを押し出すためのプレッシャープレート、および別個のフィルムセクションを生成するための切断機構と、そのフィルム上に含まれる試料の選択された部分とを含むＬＣＭを実現する機構の透視図である。
【図２Ａ】  図２Ａ〜２Ｅは、スライドに載せられた試料から選択されたサンプルを連続的に取り出す動作の一連の側面図であり、図２Ａは、プレッシャープレートがスライドとの接触から引き出され、コーティングがスライドで選択された試料に付着する、輸送フィルムを示す。
【図２Ｂ】  図２Ａ〜２Ｅは、スライドに載せられた試料から選択されたサンプルを連続的に取り出す動作の一連の側面図であり、図２Ｂは、サンプルの選択された部分をスライドから引き出すようにテープが進められる、図２Ａの装置を示す。
【図２Ｃ】  図２Ａ〜２Ｅは、スライドに載せられた試料から選択されたサンプルを連続的に取り出す動作の一連の側面図であり、図２Ｃは、次の連続するサンプルを受け取るように、テープが完全に進められた状態を示す。
【図２Ｄ】  図２Ａ〜２Ｅは、スライドに載せられた試料から選択されたサンプルを連続的に取り出す動作の一連の側面図であり、図２Ｄは、次のサンプル断片の回収の前に、進められたテープが把持された状態を示す。
【図２Ｅ】  図２Ａ〜２Ｅは、スライドに載せられた試料から選択されたサンプルを連続的に取り出す動作の一連の側面図であり、図２Ｅは、活性化可能なコーティングを、サンプルの次の連続して選択された部分に押し出すプレッシャープレートを示す。
【図３】  図３は、下側の長手軸に対して平行に配置されたテープと、装置のサンプル回収ポイントのＸおよびＹ方向移動を可能にする、スライドに関する横断方向の移動を有するプレッシャープレートとを示す模式図である。
【図４】  図４は、供給リールからのフィルムが、サンプルの回収用の、選択的に活性化可能なコーティングの、別々で別個であり、等間隔に間隔をあけられたスポットを含む、本発明による輸送テープの第１の実施形態の平面図である。
【図５】  図５は、サンプルへの押し付けのための選択的に活性化可能なコーティングの別々の中央ストリップを用いる輸送テープの第２の実施形態の平面図である。
【図６】  図６は、剥離可能なセクションと、剥離可能なセクション上に活性化可能なコーティングとを有するテープの平面図である。
【図７】  図７は、カバーリング層を有するテープを示し、且つ、テープの回収のための輸送基板またはカバーリング層のいずれかの上のマーカーコーディングの位置を示す、側面透視図である。
【図８】  図８は、パッドと、試料から選択されたサンプルの回収のための選択的に活性化可能なコーティングとを有する円状スポーク装置の透視図である。
【図９】  図９は、指示したサンプルを回収するように、連続する櫛のタイン（ｔｉｎｅ）を個別的に動作させることによって、サンプルを回収する、一般的な櫛形の構成を有するタインの直線状スポークアレイの透視図である。
【図１０】  図１０は、活性化可能なコーティングを組織サンプルに押し付けるように輸送基板を通じて動くスポークと、スポークの端部に位置付けられた活性化可能なコーティングとを示すスポークの詳細図である。
【図１１】  図１１は、テープから回収バイアルへと抽出されたサンプルを示す。
【図１２】  図１２は、回収バイアルにテープから回収されたサンプルを示す。
【図１３Ａ】  図１３Ａは、メモリに位置付けられる可視化の結果で、サンプルが可視化される装置を示す。
【図１３Ｂ】  図１３Ｂは、図１３Ａのスライドを示し、選択された細胞材料の位置を模式的に示す。
【図１３Ｃ】  図１３Ｃは、図１３Ａの装置によって準備されたメモリを用いるレーザ捕獲顕微分析を遠隔管理するように活性化された装置に送られる図１３Ａのスライドを示す。
【図１４Ａ】  図１４Ａ〜１４Ｅは、非接着レーザ捕獲顕微分析におけるコーティングの活性化を示し、図１４Ａは、ギャップ分だけ標的組織から後退している輸送基板の１つの側面上の、選択的に活性化されたコーティングを示す。
【図１４Ｂ】  図１４Ａ〜１４Ｅは、非接着レーザ捕獲顕微分析におけるコーティングの活性化を示し、図１４Ｂは、コーティングを活性化し、活性化されたコーティングが、同定された細胞材料の試料に向かって下方に拡張するように、レーザーエネルギーが組織サンプルを通じて選択的に活性化されたコーティングへと方向付けられた状態を示す模式図である。
【図１４Ｃ】  図１４Ａ〜１４Ｅは、非接着レーザ捕獲顕微分析におけるコーティングの活性化を示し、図１４Ｃは、輸送基板への細胞材料の接着および選択的に活性化されたコーティングの収縮後の輸送基板ならびに選択的に活性化されたコーティングを示す。
【図１４Ｄ】  図１４Ａ〜１４Ｅは、非接着レーザ捕獲顕微分析におけるコーティングの活性化を示し、図１４Ｄは、図１４Ｃの輸送基板と、基板の下に位置付けられた新しい異なるスライドおよび組織サンプルとを示す。
【図１４Ｅ】  図１４Ａ〜１４Ｅは、非接着レーザ捕獲顕微分析におけるコーティングの活性化を示し、図１４Ｅは、２つの異なるスライドからのサンプルを有する輸送基板を示し、ここに示す回収は、選択された材料が２つの別々のサンプルに含まれているにも関わらず、選択された細胞材料の効果的な集中を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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