(57)【要約】  本発明は、その生体内半減期が、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の存在によって変化（増大または低下）する、タンパク質、より特には免疫グロブリンを含む、少なくともＣＨ３ドメインに１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾を有する分子を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｆｃ領域に関連してＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上におけるアミノ酸置換を含んでなるＦｃ領域を含んでなる、修飾ＩｇＧであって、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、
前記修飾ＩｇＧが、前記野生型Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して改変された半減期を有する、前記修飾ＩｇＧ。
【請求項２】
ヒトまたはヒト化ＩｇＧである、請求項１に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項１または２に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項４】
位置４３７の後にアミノ酸挿入をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項５】
前記アミノ酸挿入が、グルタミン酸である、請求項４に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項６】
ｐＨ６．０における前記修飾ＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合親和性が、ｐＨ６における前記野生型Ｆｃ領域を有する前記ＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合親和性よりも高い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項７】
ｐＨ７．４における前記修飾ＩｇＧのＦｃＲｎに対する前記結合親和性が、ｐＨ７．４における前記野生型Ｆｃ領域を有する前記ＩｇＧのＦｃＲｎに対する前記結合親和性よりも高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項８】
ｐＨ６．０における前記修飾ＩｇＧのＦｃＲｎに対するＫＤが５００ｎＭ未満であり、およびｐＨ７．４における前記ＫＤが少なくとも１０００ｎＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項９】
ｐＨ６．０における前記ＫＤが５００ｎＭ未満であり、およびｐＨ７．４における前記ＫＤが１０００ｎＭ未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１０】
ｐＨ６．０における前記ＫＤが５００ｎＭを超え、ｐＨ７．４における前記ＫＤが少なくとも１０００ｎＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１１】
前記修飾ＩｇＧが、前記野生型Ｆｃ領域を有する前記ＩｇＧと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性のｐＨ依存性の増大を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１２】
前記修飾ＩｇＧが、前記野生型Ｆｃ領域を有する前記ＩｇＧと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性のｐＨ依存性の低下を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１３】
前記修飾ＩｇＧが、（ｉ）少なくとも１つのＦｃガンマ受容体への結合、（ｉｉ）Ｃ１ｑへの結合または（ｉｉｉ）エフェクター機能からなる群から選択される少なくとも１つの属性の野生型レベルを維持する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１４】
前記Ｆｃガンマ受容体が、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩ受容体およびＦｃγＲＩＩＩ受容体からなる群から選択される、請求項１３に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１５】
前記エフェクター機能が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１６】
前記修飾ＩｇＧが、位置４３２、４３３、４３４、４３５、４３６または４３７の３つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１７】
前記修飾ＩｇＧが、位置４３２、４３３、４３４、４３５、４３６または４３７の４つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１８】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニン、もしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニン、もしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンまたはスレオニンで置換される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項１９】
位置４３３が、ヒスチジンである、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２０】
位置４３３が、アルギニン、アスパラギン、プロリン、スレオニンまたはリジンで置換される、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２１】
位置４３４が、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはチロシンで置換される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２２】
位置４３４が、アルギニンで置換される、請求項２１に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２３】
位置４３６が、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリンまたはヒスチジンで置換される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２４】
位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アスパラギン、プロリン、スレオニン、もしくはリジンで置換され；位置４３４が、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはチロシンで置換され；および位置４３６が、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリンまたはヒスチジンで置換される、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２５】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＣＸＲＨＸＣ（配列番号１１）を含んでなり、位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アスパラギン、プロリン、もしくはセリンで置換され、および位置４３６が、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはセリンで置換される、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２６】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＣＲＲＨＸＣ（配列番号１２）を含んでなり、位置４３６が、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンまたはスレオニンで置換される、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２７】
位置４３６が、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンで置換される、請求項２５に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２８】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＣＸＲＨＲＣ（配列番号１３）を含んでなり、位置４３３が、アルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンまたはアスパラギンである、請求項１８に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項２９】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＺＸＸＨＸＺを含んでなり、位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３０】
位置４３２が、グルタミン酸またはヒスチジンで置換され；位置４３３が、アルギニン、アラニン、リジン、スレオニンまたはロイシンで置換され；位置４３４が、フェニルアラニンまたはチロシンで置換され；位置４３６が、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギンまたはリジンで置換され；および位置４３７が、グルタミンまたはグルタミン酸で置換される、請求項２７に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３１】
Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、位置２５１〜２５６、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９および４２８〜４３１の任意の１つまたは複数における変異をさらに含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３２】
位置２５２におけるチロシンによる置換、スレオニン２５４による置換および位置２５６におけるグルタミン酸による置換をさらに含んでなる、請求項３１に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３３】
表１に示される、Ｎ３、ＹＣ３７−ＹＴＥ、ＹＣ５６−ＹＴＥ、ＹＣ５９−ＹＴＥ、Ｙ３−ＹＴＥ、Ｙ３１−ＹＴＥ、Ｙ１２−ＹＴＥ、Ｙ８３−ＹＴＥ、Ｙ３７−ＹＴＥおよびＹ９−ＹＴＥからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３４】
表１に示される、Ｎ３−ＹＴＥ、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ、ＳｅｒＮ３−ＹＴＥ、Ｙ５４−ＹＴＥ、Ｙ７４−ＹＴＥ、Ｙ８−ＹＴＥからなる群から選択される、位置４３２〜４３７にアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３５】
アミノ酸位置４３５にヒスチジンを有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３６】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ）ＨＲＱ（配列番号１５）を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３７】
ウイルス抗原、細菌抗原、原生生物抗原、プリオンおよび哺乳類自己抗原からなる群から選択される抗原と結合する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ。
【請求項３８】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分を含んでなるポリペプチドであって、前記ＦｃＲｎ結合部分が、野生型ＦｃＲｎ結合部分に関連してＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上におけるアミノ酸置換を含んでなり、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、
前記ポリペプチド。
【請求項３９】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンもしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンもしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンもしくはスレオニンで置換される、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＺＸＸＨＸＺを含んでなる、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ）ＨＲＱ（配列番号１５）を含んでなる、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
位置４３７の後にアミノ酸挿入をさらに含んでなり、前記アミノ酸挿入がグルタミン酸である、請求項４１または４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２３１〜４４６を含んでなる、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２１６〜４４６を含んでなる、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分に共有結合する非ＩｇＧポリペプチドを含んでなる融合タンパク質であって、前記ＦｃＲｎ結合部分が、野生型Ｆｃ領域に関連してＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上におけるアミノ酸置換を含んでなり、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、
前記融合タンパク質が、前記非ＩｇＧポリペプチドよりも長いまたは短い生体内半減期を有する、
前記融合タンパク質。
【請求項４７】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンもしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンもしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンもしくはスレオニンで置換される、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＺＸＸＨＸＺを含んでなる、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ）ＨＲＱ（配列番号１５）を含んでなる、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
位置４３７の後にアミノ酸挿入をさらに含んでなり、前記アミノ酸挿入がグルタミン酸である、請求項４９または５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２３１〜４４６を含んでなる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２１６〜４４６を含んでなる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
前記非ＩｇＧポリペプチドが、免疫修飾物質、受容体、ホルモンまたは薬物である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分にコンジュゲートされた非タンパク質作用物質を含んでなる分子であって、前記ＦｃＲｎ結合部分が、野生型Ｆｃ領域に関連してＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上におけるアミノ酸置換を含んでなり、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、
前記分子が、前記非タンパク質作用物質よりも長いまたは短い生体内半減期を有する、
前記分子。
【請求項５６】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項５５に記載の分子。
【請求項５７】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンもしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンもしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンもしくはスレオニンで置換される、請求項５６に記載の分子。
【請求項５８】
位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、位置４３２〜４３７にアミノ酸配列ＺＸＸＨＺＺを含んでなる、請求項５６に記載の分子。
【請求項５９】
位置４３２〜４３７にアミノ酸配列Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ）ＨＲＱ（配列番号１５）を含んでなる、請求項５８に記載の分子。
【請求項６０】
位置４３７の後にアミノ酸挿入をさらに含んでなり、前記アミノ酸挿入がグルタミン酸である、請求項５８または５９に記載の分子。
【請求項６１】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２３１〜４４６を含んでなる、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項６２】
前記Ｆｃ領域の前記ＦｃＲｎ結合部分が、Ｋａｂａｔの前記ＥＵ番号付与指標に従って、ＩｇＧ分子のアミノ酸残基およそ２１６〜４４６を含んでなる、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項６３】
請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子、および薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項６４】
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の修飾ＩｇＧ、ポリペプチドまたは融合タンパク質またはそのＦｃＲｎ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項６５】
請求項６４に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項６６】
クローニングベクターまたは発現ベクターを含んでなる、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６７】
請求項６４に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項６８】
請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子を含んでなるキット。
【請求項６９】
疾患、障害または感染症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子の治療有効量を投与するステップを含んでなる、前記方法。
【請求項７０】
同等の未修飾ＩｇＧ、融合タンパク質または分子よりも低用量、低頻度または少ない副作用で、前記修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、融合タンパク質または分子を投与するステップを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子の予防的有効量を対象に投与するステップを含んでなる、疾患または障害を予防する方法。
【請求項７２】
免疫応答を惹起するのに有効な量の請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子を対象に投与するステップを含んでなる、対象にワクチン接種する方法。
【請求項７３】
（ａ）請求項２〜６２のいずれか一項に記載の修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子の有効量を対象に投与するステップであって、前記修飾ヒトまたはヒト化ＩｇＧが、疾患、障害または感染症に関連する抗原に特異的に結合する、ステップと；
（ｂ）前記修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子を前記対象中の前記抗原が見られる部位に集中させるステップと；
（ｃ）前記修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子を検出するステップと
を含んでなる、対象において疾患、障害または感染症を診断、モニタリングまたは予後診断する生体内方法であって、それによってバックグラウンドまたは標準レベルを超える、前記修飾ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、ポリペプチド、融合タンパク質または分子の検出が、前記対象が前記疾患、障害または感染症を有することを示す、前記生体内方法。
【請求項７４】
ＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上にアミノ酸置換を導入するステップを含んでなる、ＩｇＧの半減期を改変する方法であって、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、
前記方法。
【請求項７５】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンもしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンもしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンもしくはスレオニンで置換される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであり；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
非ＩｇＧポリペプチドまたは非タンパク質作用物質をＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分にコンジュゲートさせるステップを含んでなる、非ＩｇＧポリペプチドまたは非タンパク質作用物質の半減期を改変する方法であって、前記ＦｃＲｎ結合部分が、野生型Ｆｃ領域に関連してＫａｂａｔのＥＵ番号付与指標に従って番号付与されている、位置４３２〜４３７の２つ以上におけるアミノ酸置換を含んでなり、
（ｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、
前記分子が、前記非タンパク質作用物質よりも長いまたは短い生体内半減期を有する、
前記方法。
【請求項７９】
（ｉ）位置４３２および４３７の両方が、システインで置換され；または
（ｉｉ）位置４３２および４３７の両方が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換される、
請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
位置４３２および４３７が、それぞれシステインで置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニンもしくはアスパラギンで置換され；位置４３４が、アスパラギンであるか、またはアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンもしくはスレオニンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであるか、またはヒスチジンで置換され；および位置４３６が、チロシンもしくはフェニルアラニンであるか、またはロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリンもしくはスレオニンで置換される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
位置４３２が、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギン酸で置換され；位置４３３が、ヒスチジンであるか、またはアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、プロリン、セリンもしくはグルタミンで置換され；位置４３４が、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換され；位置４３５が、ヒスチジンであり；位置４３６が、チロシンであるか、またはアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニンもしくはバリンで置換され；および位置４３７が、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換される、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生児Ｆｃ受容体結合が改変されて治療および診断特性が強化された分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンの治療薬としての使用は、近年劇的に増大し、薬物療法の異なる領域に拡大されている。このような用途としては、無ガンマグロブリン血症および低ガンマグロブリン血症の治療、自己免疫疾患および移植片対宿主（ＧＶＨ）疾患を治療するための免疫抑制剤として、リンパ系悪性腫瘍の治療、ならびに様々な全身性および伝染性疾患を治療するための受動免疫療法が挙げられる。また、免疫グロブリンは、例えば、画像診断法などにおける生体内診断ツールとしても有用である。
【０００３】
免疫療法および免疫診断の有効性は、循環中の免疫グロブリンの持続性によって影響され得る。例えば、免疫グロブリンのクリアランス速度は、免疫グロブリンの投与量と頻度とに直接影響を及ぼす。
【０００４】
迅速なクリアランスは、投与量および投与頻度の増大を要することがあり、次にそれは患者に悪影響を引き起こして医療コストを増大させることがある。他方、特定のその他の診断および治療手技では、免疫グロブリンの迅速なクリアランスが望ましいことがある。
【０００５】
ＩｇＧは、ヒトおよびその他の哺乳類で最も多く見られる免疫グロブリンクラスであり、様々なタイプの免疫療法および診断手技で利用される。循環中のＩｇＧ異化作用の機序は、胎盤または卵黄嚢を介した、または齧歯類では初乳を介した（トランスサイトーシスを通じた母胎間のＩｇＧ移行）、母体から胎児／新生児への受動免疫移行に関連した研究を通じて解明されている（Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：１０８７−１０９３，１９６６；Ｒｏｄｅｗａｌｄ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７１：６６６−６７０，１９７６；Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ，ｐｐ．３−２２，１９７８，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５１：２９１６−２９２７，１９７２）。
【０００６】
高親和性Ｆｃ受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）が、この移送機序に関与するとされている。ＦｃＲｎ受容体は、哺乳期ラットの十二指腸上皮の刷子縁から単離されており（Ｒｏｄｅｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９９：１５４ｓ−１６４ｓ，１９８４；Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：７３３−７３８，１９８５）、対応遺伝子がクローン化されている（Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：１８４，１９８９  ａｎｄ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，ＬＩＶ，５７１−５８０，１９８９）。マウス（Ａｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：６０７６−６０８８，１９９３）およびヒト（Ｓｔｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２３７７−２３８１，１９９４）からのＦｃＲｎをコードする遺伝子のその後のクローニングは、これらの配列のラットＦｃＲｎとの高い相同性を実証し、これらの生物種におけるＦｃＲｎが関与するＩｇＧの母胎間伝達の同様の機序が示唆された。
【０００７】
その一方で、ＩｇＧ異化作用の機序は、Ｂｒａｍｂｅｌｌのグループ（Ｂｒａｍｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０３：１３５２−１３５５，１９６４；Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：１０８７−１０９３，１９６６）によっても提案された。Ｂｒａｍｂｅｌｌのグループは、循環中のＩｇＧ分子の一部に、飽和性である特定の細胞受容体（すなわち、ＦｃＲｎ）が結合し、それによってＩｇＧが分解から保護されて、最終的に循環中にリサイクルされ；他方では、受容体に結合していないＩｇＧが分解されると提案した。提案された機序は、高ガンマグロブリン血症性または低ガンマグロブリン血症患者において観察されたＩｇＧ異化作用と一貫していた。さらに、自らの研究ならびに他の研究（例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：３２３−３３８，１９６５；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：７８−８５，１９６９を参照されたい）に基づいて、Ｂｒａｍｂｅｌｌはまた、母胎間のＩｇＧ移行およびＩｇＧ異化作用に関与する機序が、同一であるか、または少なくとも非常に密接に関係しているかのいずれかであり得ると提言した（Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：１０８７−１０９３，１９６６）。実際に、ヒンジＦｃ断片の変異は、異化作用、母胎間移行、新生児トランスサイトーシス、および特にＦｃＲｎに対する結合において、同時の変化を引き起こすことが後に報告された（Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１８（１２）：５９２−５９８，１９９７）。ＦｃＲｎは、胎盤を介した新生児への母親ＩｇＧ移行と、成人におけるＩｇＧおよびアルブミンレベルの恒常性との両方を促進することが示されている（Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６，６９０−６９６；Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８９，５７３−５７８；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，７３９−７６６；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，７１５−７２５。
【０００８】
これらの観察は、ＩｇＧ定常領域の部分が、ｗｉｔｈＦｃＲｎとの相互作用を通じて、血清中のＩｇＧ分解速度をはじめとするＩｇＧ代謝を調節することを示唆した。実際に、ＦｃＲｎに対する結合親和性の増大は、分子の血清半減期を増大させた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９−２４３４，１９９４；Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：４９３−５０２，１９９６；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：６９０−６９６，１９９６；Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５５１２−５５１６，１９９６；Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８９：５７３−５７８，１９９６）。
【０００９】
ＩｇＧＦｃおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の間の相互作用は、ＩｇＧの恒常性に必須であり、循環ＩｇＧに長い血清半減期をもたらすことがその後分かった。抗体が取り込まれると、ＦｃＲｎ受容体は、酸性（ｐＨ６．０）エンドソーム内の抗体に対する高親和性結合によって、抗体を溶原性分解から保護し、引き続いて中性細胞表面で抗体を放出して循環中に戻す。
【００１０】
マウスＩｇＧのＦｃ領域における様々な部位特異的変異誘発実験は、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用に関与する特定のアミノ酸残基の同定をもたらした（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９−２４３４，１９９４；Ｍｅｄｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：２５３３，１９９６；Ｍｅｄｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２２１１−２２１７，１９９７）。これらの研究および配列比較研究は、位置２５３のイソロイシン、位置３１０のヒスチジン、および位置４３５のヒスチジン（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｋａｂａｔ番号付与、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１  ＮＩＨ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２に準拠する）が、ヒトおよび齧歯類ＩｇＧ中で高度に保存されていることを発見し、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合におけるそれらの重要性が示唆された。ＩｇＧのリサイクルに関与するスカベンジャー機序は、高度にｐＨ依存性であり、特に約６のｐＨで、ＩｇＧのＦｃ中のヒスチジン３１０および４３５によって促進される。ｐＫａが約６〜６．５であるヒスチジンのイミダゾール側鎖は、ｐＨ７．４では中性正味電荷を有するが、より低いｐＨ環境では正電荷を得る。したがって、Ｆｃ／ＦｃＲｎ相互作用の結合親和性およびｐＨ依存性の両方が、生体内薬物動態学的機能の重要な調節因子である。
【００１１】
それに加えて、様々な文献が、分子にＦｃＲｎ結合ポリペプチドを導入することで（国際公開第９７／４３３１６号パンフレット；米国特許第５，８６９，０４６号明細書；米国特許第５，７４７，０３５号明細書；国際公開第９６／３２４７８号パンフレット；国際公開第９１／１４４３８号パンフレット）、またはＦｃＲｎ結合親和性が維持されているが、その他のＦｃ受容体に対する親和性が大幅に低下している抗体に分子を融合させることで（国際公開第９９／４３７１３号パンフレット）、または抗体のＦｃＲｎ結合ドメインに融合させることで（国際公開第００／０９５６０号パンフレット；米国特許第４，７０３，０３９号明細書）、その半減期が改変された生理学的活性分子を得る方法を記載する。
【００１２】
研究者らは、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ結合に影響を及ぼす、および／またはＩｇＧ生体内半減期を改変するＩｇＧ定常領域の変異を同定している。例えば、（Ｗａｒｄらに付与された）国際公開第９３／２２３３２号パンフレットは、ＩｇＧ定常領域の変異のためにその生体内半減期が低下している、様々な組換えマウスＩｇＧを開示する。ＦｃＲｎに対する親和性を増大または低下させるためのアミノ酸の置換、付加、または欠失によるＩｇＧ分子の調節は、国際公開第９８／２３２８９号パンフレットで開示される。最近、ＦｃＲｎの結合増大を通じて、より長い生体内血清持続をもたらす分子を得するために、ＩｇＧ  Ｆｃが改変されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５，８６−９４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３８，６００−６０５；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，６２１３−６２１６；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６，３４６−３５６；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，７６６３−７６７１）；Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９）。ＩｇＧ定常領域変性の結果として、生体内半減期が増大しているＩｇＧは、米国特許第７，０８３，７８４号明細書、米国特許第７６７０，６００号明細書、米国特許第７，７０４，４９７号明細書、米国特許第８，０１２，４７６号明細書、米国特許第８，３２３，９６２号明細書、米国特許第８，４７５，７９２号明細書、および国際公開第２００２／０６０９１９号パンフレット（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらに付与された）にも記載される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、例えば、野生型免疫グロブリンＦｃ領域と比較して、１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失）を含有する、Ｆｃ領域またはヒンジＦｃ領域などの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合する免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む、ポリペプチドおよびその他の分子を包含する。１つまたは複数のアミノ酸修飾は、免疫グロブリン定常領域、Ｆｃ領域またはそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する親和性を変化させて、ポリペプチドまたはその他の分子の血清半減期を改変する。本発明のポリペプチドおよびその他の分子は、疾患、障害または感染症の治療、予防、診断、および予後診断において用途がある。
【００１４】
より具体的には、本発明は、その生体内半減期が、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由良する）ＩｇＧ定常領域または（Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の修飾によって影響を受ける（増大または低下する）分子に関する。したがって本発明の修飾分子は、本明細書に記載されるような１つまたは複数のアミノ酸修飾を含有する、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分を含む。
【００１５】
本発明の分子は、そのＦｃＲｎに対する結合親和性を改変するように（例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入によって）修飾された、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片の存在のために改変された生体内半減期を示す。したがって本発明の分子は、同等の未修飾分子および／または同等の野性型分子と比較して、改変された生体内半減期およびＦｃＲｎに対する親和性を有する。任意選択的に、本発明の分子は、同等の未修飾分子と比較して、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ６．０および／またはｐＨ７．４）における、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合親和性の変化（増大または低下）もまた示す。
【００１６】
一態様では、本発明は、これらのアミノ酸修飾の１つまたは複数を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含有する、ＩｇＧ抗体などの免疫グロブリンに関する。その他の態様では、本発明はまた、１つまたは複数のこのようなアミノ酸修飾を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片に融合し、またはそれにコンジュゲートされ、またはそれを含有するように操作されたその他の各種免疫グロブリンまたはその断片（すなわち、非ＩｇＧ免疫グロブリン）、非免疫グロブリンタンパク質、および非タンパク質作用物質にも関する。したがって一態様では、本発明は、これらのアミノ酸修飾の１つまたは複数を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片と、このような修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片に共有結合する非ＩｇＧポリペプチドとを含有する融合タンパク質に関し、修飾ＩｇＧ定常領域またはその断片の存在は、非ＩｇＧタンパク質または分子の生体内半減期を増大または低下させる。例示的実施形態では、融合タンパク質は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分に共有結合する非ＩｇＧポリペプチドを含む。別の態様では、本発明は、これらのアミノ酸修飾の１つまたは複数を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片と、このような修飾ＩｇＧ定常領域またはその断片にコンジュゲートされた非タンパク質作用物質とを含有する分子に関し、修飾ＩｇＧ定常領域またはその断片の存在は、野性型ＩｇＧ１定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片にコンジュゲートされたものと比較して、非タンパク質作用物質の生体内半減期を増大または低下させる。例示的実施形態では、分子は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部分にコンジュゲートされた非タンパク質作用物質を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、野性型ＩｇＧ分子または断片と比較して、本発明の修飾ＩｇＧ分子またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片の生体内半減期を低下させるアミノ酸変異体は、それでもなお修飾ＩｇＧ分子が非ＩｇＧポリペプチドまたは非タンパク質作用物質にコンジュゲートされた場合に、生体内半減期の増大をもたらしてもよく、その結果、より緩慢なクリアランス速度がもたらされる。
【００１８】
本発明の分子の一実施形態では、生体内半減期は、同等の未修飾分子と比較して増大する。本発明の方法を使用した、治療および診断用ＩｇＧおよびその他の生理活性分子の生体内半減期の増大は、例えば、ワクチン、受動的免疫療法、およびその他の治療および予防法における、これらの分子の投与量および／または頻度の低下をはじめとする多くの利点を有する。
【００１９】
本発明の分子の別の実施形態では、生体内半減期は、同等の未修飾分子と比較して低下する。本発明の方法を使用した治療および診断用ＩｇＧおよびその他の生理活性分子の生体内半減期の低下は、有毒抗原を除去または中和するために使用されるＩｇＧの血清クリアランス速度の増大をはじめとする多くの利点もまた有し、自己免疫療法を提供し、または生物学的イメージングで用いられる。
【００２０】
本発明は、本発明者らによるヒトＩｇＧ分子のいくつかのＦｃ領域の変異の同定に基づき、Ｆｃ領域の変異は、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ６．０および／またはｐＨ７．４）における、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する。Ｈｉｓ４３５を含有して、本明細書で「Ｈｉｓ４３５ループ領域」と称されるヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの残基４３２〜４３７が変異の標的にされた。したがって、本発明に従った修飾ＩｇＧ定常領域を含有するＩｇＧまたはその他の分子またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片は、配列アラインメントによって判定されるように、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基４３２、４３４、４３５、４３６および／または４３７に、またはその他のＩｇＧ中の相似残基の１つまたは複数に、またはその近くに、１つまたは複数の変異を含有する。ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインはＩｇＧ定常領域内のＦｃ領域であり、図１Ｄ（配列番号２）に示され；その他のＩｇＧ分子のＦｃ領域内の相似残基は、配列アラインメントによって容易に判定され得、同様に変異部位の役割を果たしてもよい。この点において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のＨｉｓ４３５ループ領域（位置４３２〜４３７）のアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ（ＬＨＮＨＹＴ；配列番号８）であり、ヒトＩｇＧ３の相似Ｈｉｓ４３５ループ領域（位置４３２〜４３７）のアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＬＨＮＲＦＴ；配列番号７、図１Ｄ）であり、それはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の配列と異なって、ヒスチジン（Ｈ４３５）の代わりにその位置にアルギニン（Ｒ４３５）を含み、チロシン（Ｙ４３６）の代わりに位置４３６のフェニルアラニン（Ｆ４３６）を含むことに留意すべきである。さらに、ヒトＩｇＧ３中の位置４３５および４３６は、既知の対立遺伝子多様性部位に相当する（図１Ｄの網掛け囲みおよび星印を参照されたい）。既知の多様性を考慮することで、当業者は、位置４３５のヒスチジンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン中に存在する野生型アミノ酸に相当するが、ＩｇＧ３では、ＣＨ３ドメイン中のＲ４３５Ｈ置換に相当することを認識するであろう。同様に、位置４３６のチロシンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン中に存在する野生型アミノ酸に相当するが、ＩｇＧ３では、ＣＨ３ドメイン中のＦ４３６Ｙ置換に相当する。
【００２１】
Ｈｉｓ４３５ループ領域に導入されたランダムアミノ酸変異があるヒトＩｇＧ１定常領域のライブラリーが、ＦｃＲｎに対するＩｇＧの結合親和性のｐＨ依存性の変化について、スクリーニングされた。天然および変異ＩｇＧ基礎構造の両方が使用された。スクリーニング過程を通じて同定された代表的修飾ＩｇＧは、下の表Ｉに示され、下でさらに詳述される。一実施形態では、修飾ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片は、位置４３２のグルタミン酸、位置４３３のアルギニンもしくはアラニン、位置４３４のトリプトファンもしくはセリンもしくはフェニルアラニン、位置４３５のヒスチジン、位置４３６のアルギニン、および／または位置４３７のグルタミンから選択されるアミノ酸を含む、Ｈｉｓ４３５ループ領域を含有する。特定の実施形態では、本発明の分子は、残基４３２〜４３７に配列Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ／Ｙ）ＨＲＱ（配列番号１５）を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含有する。別の実施形態では、修飾ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片は、位置４３２のシステイン、位置４３３のアルギニンもしくはヒスチジンもしくはアスパラギンもしくはプロリンまたはセリン、位置４３４のアルギニンもしくはトリプトファン、位置４３５のヒスチジン、位置４３６のアルギニンもしくはイソロイシンもしくはロイシンもしくはメチオニンもしくはセリン、および／または位置４３７のシステインから選択されるアミノ酸を含む、Ｈｉｓ４３５ループ領域を含有する。特定の実施形態では、本発明の分子は、残基４３２〜４３７に配列ＣＳＷＨＬＣ（変異体「Ｎ３」；配列番号２０）を有する、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含有する。
【００２２】
１つまたは複数の異なるｐＨにおけるＦｃＲｎに対する結合親和性の変化は、ＩｇＧの生体内半減期に影響を及ぼすことが示された。対象の血清またはその他の組織内における抗体およびその他の治療薬、ならびにその他の生理活性分子の生体内半減期または持続性は、抗体（または任意のその他の薬剤分子）の投与量および頻度を決定する重要な臨床パラメータである。したがって、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片と共役する、抗体および因子をはじめとするこのような分子には、半減期における変化のために、顕著な製薬上の重要性がある。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の分子は、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含み、野性型分子または断片と比較して、ｐＨ６におけるＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する親和性を増大させるアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有する。例えば、本発明の分子は、約５００ｎＭ未満のＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する高親和性結合を示す、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含み得る。修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有するＩｇＧまたはその他の分子は、野生型分子または断片などの同等の未修飾分子よりも長いまたは短い生体内半減期のいずれかを示してもよい。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の分子は、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含み、野性型分子または断片と比較して、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を改変するアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有する。一実施形態では、例えば、本発明の分子は、約１０００ｎＭ未満のＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示す、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含み得る。別の実施形態では、例えば、本発明の分子は、約１０００ｎＭを超えるＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示す、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含み得る。任意選択的に、ｐＨ７．４における本発明の分子のＦｃＲｎに対する結合親和性は、ｐＨ７．４における野性型分子または断片のＦｃＲｎに対する結合親和性を下回る。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の分子は、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含み、野性型分子または断片などの同等の未修飾分子と比較して、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を増大させるアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有する。
【００２６】
一実施形態では、本発明の分子は、約５００ｎＭ未満のＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性、および約１０００ｎＭ未満のＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示す、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含む。任意選択的に、本発明のこの実施形態の分子は、必要ではないが、下でさらに詳述される「ａｂｄｅｇ様」特性を有してもよい（例えば、図２Ａの四分区間ＩＩＩおよび５Ｂを参照されたい）。この実施形態の分子は、野性型ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含有する分子などの未修飾分子と比較して、より短い生体内半減期を示してもよいが、必ずしもそうである必要はない。
【００２７】
別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片を含む本発明の分子は、約５００ｎＭ未満のＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性、および約１０００ｎＭを超えるが、同等の野生型分子のｐＨ７．４におけるＫＤを下回るＫＤによって特徴付けられる、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示す。任意選択的に、本発明のこの実施形態の分子は、「ＹＴＥ様」性質を有してもよいが、必ずしもそうである必要はない（例えば、図２Ａの四分区間Ｉおよび５Ｂを参照されたい）。この実施形態の分子は、野性型ＩｇＧ定常領域を含有する分子またはそのＦｃＲｎ結合断片などの未修飾分子と比較してより長い生体内半減期を示してもよいが、必ずしもそうである必要はない。
【００２８】
一態様では、本発明は、ＩｇＧ定常領域またはＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片の修飾によって、その生体内半減期が増大された、修飾Ｆｃ領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有するＩｇＧおよびその他の分子に関する。本発明の方法を使用した、治療および診断用ＩｇＧおよびその他の生理活性分子の半減期の増大は、例えば、ワクチン、受動免疫療法、ならびにその他の治療および予防法における、これらの分子の投与量および／または頻度の低下をはじめとする多くの利点を有する。いくつかの実施形態では、より長い生体内半減期を示す、本発明のこの態様の修飾ＩｇＧおよびその他の修飾分子は、ｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する高親和性結合と、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する相対的に低い親和性結合と、任意選択的に、野性型ＩｇＧと比較して増大したＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性とによって特徴付けられる。これらの修飾ＩｇＧおよびその他の分子の半減期は、ｐＩ（等電点）操作、ＰＥＧ化、およびＰａｓ化などの追加的な分子修飾によって、さらに増大され得ることが予期される。
【００２９】
別の態様では、本発明は、野性型ＩｇＧ１定常領域を含有するものなどの未修飾分子またはそのＦｃＲｎ結合断片と比較して、その生体内半減期が、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片の修飾によって低下された、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有するＩｇＧおよびその他の分子に関する。本発明の方法を使用した、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなる、治療および診断用ＩｇＧならびにその他の生理活性分子の半減期の低下は、治療的にまたは診断的に有用であるが有毒な抗体、生物製剤、およびその他の分子の迅速なクリアランスの促進、およびｐＨ依存性抗原結合を示す治療用抗体のクリアランスの促進をはじめとする多数の利点を有する。半減期の低下を示す本発明の修飾ＩｇＧおよびその他の分子は、例えば、迅速なクリアランスと毒性の低下とが重要である陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）などにおいて、イメージングのために使用されてもよい。半減期がより短い本発明のいくつかの修飾ＩｇＧは、内在性ＩｇＧ分解を促進する能力があるａｂｄｅｇとして機能してもよく、それによって破壊的抗体によって特徴付けられる特定の自己免疫疾患を改善する。いくつかの実施形態では、より短い生体内半減期を示す、本発明のこの態様の修飾ＩｇＧおよびその他の修飾分子は、ｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する高親和性結合と、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する親和性の増大と、任意選択的に、野性型ＩｇＧと比較して低下したＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性とによって特徴付けられる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＩｇＧまたはその他の分子は、ｐＨ７．４でＦｃＲｎに対する低いまたはさらに低下した結合親和性もまた示す。野生型ＩｇＧと同様に、本発明の修飾ＩｇＧまたはその他の分子は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対するより高い親和性を有する。ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性と対比された、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性の観察された違いは、ＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性が、野生型分子などの同等の未修飾分子と比較して、増大または低下しているかどうかを判定するのに利用され得る。
【００３１】
用語法
天然抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一軽（Ｌ）鎖および２つの同一重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結し、重鎖は互いに連結するが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間ではジスルフィド結合の数が異なる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記される）と、軽鎖定常領域（本明細書でＣＬと略記される）とを含んでなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインからなる重鎖定常領域（ＣＨ）とから構成される。重鎖のＣＨ１およびＣＨ２は、いわゆるヒンジ領域によって互いに隔離される。ヒンジ領域は、常態では、抗体分子中のもう一方の重鎖のヒンジ領域のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成してもよい１つまたは複数のシステイン残基を含んでなる。抗体は、抗原特異的結合部位を含んでなる可変領域と、エフェクター機能に関与する定常領域とを有する。
【００３２】
「Ｆｃ」または「Ｆｃドメイン」と称されることもある「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書の用法では、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶性断片に対応するＩｇＧ分子の部分を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結する、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端半分からなる。それは抗原結合活性は有しないが、炭水化物部分と、ＦｃＲｎ受容体をはじめとするＦｃ受容体を補完する結合部位とを含有する（下記参照）。Ｆｃ領域は、第２の定常領域ＣＨ２全体（Ｋａｂａｔ番号付与体系に準拠した、ヒトＩｇＧ１の残基２３１〜３４０）（例えば、配列番号１；図１Ｃ）と、第３の定常領域ＣＨ３（残基３４１〜４４７）（例えば、配列番号２；図１Ｄ）とを含有する。
【００３３】
「ヒンジＦｃ領域」、「Ｆｃヒンジ領域」、「ヒンジＦｃドメイン」、または「Ｆｃヒンジドメイン」という用語は、本明細書の用法では同義的に使用され、Ｆｃ領域（残基２３１〜４４７）と、Ｆｃ領域のＮ末端から伸びるヒンジ領域（残基２１６〜２３０；例えば、配列番３）とからなるＩｇＧ分子の領域を指す。ヒトＩｇＧ１ヒンジＦｃ領域のアミノ酸配列の一例は、配列番号４（図１Ｂ〜図１Ｄ）である。
【００３４】
「定常領域」という用語は、抗原結合部位を含有する可変領域である免疫グロブリンのもう一方の部分と比較して、より多数の保存アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有し、軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含有する。
【００３５】
「融合タンパク質」は、自然界では天然に連結しない第２のポリペプチドと連結する、第１のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、Ｆｃ領域またはＦｃ領域の少なくとも一部（例えば、ＦｃＲｎに対する結合をもたらすＦｃ領域の部分）をコードするアミノ酸配列と、例えば、受容体のリガンド結合ドメインまたはリガンドの受容体結合領域などの非免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸配列とを含んでなってもよい。ポリペプチドは、常態では、融合ポリペプチド中でまとめられた別々のタンパク質に存在してもよく、またはそれらは、常態では、同一タンパク質中に存在してもよいが、融合ポリペプチド中では新しい配置に置かれる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはその中でペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドの作成および翻訳によって生成されてもよい。
【００３６】
「連結した」、「融合した」または「融合」は、同義的に使用される。これらの用語は、化学的結合または組換え手段をはじめとする何らかの手段によって、２つ以上の構成要素または成分を共に連結することを指す。「インフレーム融合」または「作動可能に連結する」は、元のＯＲＦの正確な読み枠を保つ方法で連続してより長いＯＲＦを形成する、２つ以上の読み取り枠（ＯＲＦ）の連結を指す。したがって、生じる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する、２つ以上の（自然界では通常そのようには連結しない）断片を含有する単一タンパク質である。読み枠は、このようにして融合断片全体にわたり連続的になるが、断片は、例えば、インフレームのリンカー配列によって物理的または空間的に隔てられてもよい。
【００３７】
「ＦｃＲｎ受容体」または「ＦｃＲｎ」という用語は、本明細書の用法では、ヒトまたは霊長類胎盤、または卵黄嚢（ウサギ）を通じた胎児への、および小腸を通じた初乳から新生児への、母親ＩｇＧの移行に関与することが知られている、Ｆｃ受容体を指す（「ｎ」は新生児を示す）。ＦｃＲｎが、ＩｇＧ分子に結合してそれらを血清中にリサイクルすることで、一定した血清ＩｇＧレベルの維持に関与することもまた知られている。天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４分子に対するＦｃＲｎの結合は、厳密にはｐＨ依存性であり、ｐＨ６で最適結合する。ＩｇＧ３は、ｐＨ６における結合低下をもたらしてもよい、位置４３５における既知の多様性である（すなわち、ヒトＩｇＧが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４に見られるＨ４３５の代わりにＲ４３５を有する）。ＦｃＲｎは、その分子量がそれぞれおよそ５０ｋＤおよび１５ｋＤである、２つのポリペプチドのヘテロ二量体を含んでなる。５０ｋＤポリペプチドの細胞外ドメインは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩα鎖に関連し、１５ｋＤポリペプチドは、非多形性β２−ミクログロブリン（β２−ｍ）であることが示された。ＦｃＲｎはまた、胎盤および新生児腸管に加えて、生物種全体にわたり様々な組織で、ならびに様々なタイプの内皮細胞系で発現される。それはまた、成人の血管内皮、筋肉血管系、および肝類洞で発現され、内皮細胞が、ヒトおよびマウスにおける血清ＩｇＧレベル維持の最大原因であってもよいことが示唆される。ヒトＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５および配列番号６によって示される。ＦｃＲｎ活性を有するこれらの配列の相同体もまた含まれる。
【００３８】
ＩｇＧ定常領域上の「ＦｃＲｎ結合断片」は、本明細書における用法では、ＦｃＲｎ受容体と結合するＩｇＧ定常領域の断片を指す。ＩｇＧ定常領域のＦｃＲｎ結合断片は、Ｆｃ領域またはヒンジＦｃ領域を含み得、したがってそれは、ＦｃＲｎに対する結合に関与する、重鎖ＣＨ２−ＣＨ３領域またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域の部分を含み得る（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：７１５−７２５（２００７）を参照されたい。
【００３９】
「ＫＤ」（Ｋｄ、ＫＤまたはＫｄと称されることもある）は、本明細書における用法では、ＩｇＧおよびＦｃＲｎなどの２つの分子間の結合相互作用の平衡解離定数である。ＫＤは、観察された結合速度定数（ｋｏｎ）および分離速度定数（ｋｏｆｆ）から計算され得、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率に等しい。
【００４０】
「生体内半減期」という用語は、本明細書の用法では、特定タイプのＩｇＧ分子またはＦｃＲｎ結合部位を含有するその断片の、所与の動物の循環中における生物学的半減期を指し、動物に投与された量の半分が、動物の循環および／またはその他の組織から除去されるのに必要な時間によって表わされる。所与のＩｇＧのクリアランス曲線が、時間の関数として構築される場合、曲線は、通常、血管内および血管外空間の間の注入されたＩｇＧ分子の平衡に相当し、ある程度は分子の大きさによって決定される迅速なα相と、血管内空間中のＩｇＧ分子の異化作用に相当するより長いβ相がある二相性である。「生体内半減期」という用語は、実質的に、β相におけるＩｇＧ分子の半減期に相当する。
【００４１】
「単離」または「精製」抗体または融合タンパク質は、タンパク質がそれに由来する細胞または組織供給源からの細胞物質またはその他の混入タンパク質を実質的に含まず、あるいは化学的に合成される場合、化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、抗体または融合タンパク質が、それから単離されまたはそれから組換え的に生成された細胞の細胞構成要素から分離されている、抗体または融合タンパク質調製品を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体または融合タンパク質としては、（乾燥重量を基準にして）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の混入タンパク質を有する抗体または融合タンパク質調製品が挙げられる。一実施形態では、抗体または融合タンパク質が、組換え的に生成される場合、それはまた、培養液を実質的に含まず、すなわち、培養液がタンパク質調製品容量の約２０％、１０％、または５％未満に相当し得る。別の実施形態では、抗体または融合タンパク質が、化学合成によって生成される場合、それは化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことができ、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する化学物質前駆体またはその他の化学物質から分離される。したがってこのような抗体または融合タンパク質調製品は、関心のある抗体または抗体断片の他に、（乾燥重量を基準にして）約３０％、２０％、１０％、５％未満の化学物質前駆体または化合物を有する。本発明の一実施形態では、抗体は単離または精製される。任意選択的に、融合タンパク質は単離または精製される。
【００４２】
「単離」核酸分子は、核酸分子の天然原料中に存在する、その他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え技術によって生成される場合、その他の細胞物質または培養液を実質的に含まず、あるいは化学的に合成される場合、化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことができる。「単離」核酸分子は、ｃＤＮＡライブラリー中にｃＤＮＡ分子を含まない。本発明の一実施形態では、抗体をコードする核酸分子は単離または精製される。任意選択的に、融合タンパク質をコードする核酸分子は単離または精製される。
【００４３】
「宿主細胞」という用語は、本明細書の用法では、核酸分子で形質移入され、またはファージミドまたはバクテリオファージで感染された特定の対象細胞、およびこのような細胞の子孫または可能な子孫を指す。このような細胞の子孫は、後続世代において、または宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みにおいて生じ得る変異または環境の影響のために、核酸分子で形質移入された親細胞と同一でなくてもよい。
【００４４】
本明細書で言及されるＩｇＧ定常および可変領域のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１  ＮＩＨ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２）のＥＵ番号付与指標に準拠して番号付与され、配列アラインメントによって判定される、その他のＩｇＧ定常領域内の対応する残基が含まれる。図１Ａ〜Ｄは、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびその他のＩｇＧ定常領域内の対応する残基を示す。本明細書で言及されるアミノ酸の名称は、三文字または一文字記号のいずれかで略記される。
【００４５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性百分率を判定するために、最適比較目的で配列を整列させる（例えば第２のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列中にギャップを導入し得る）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列により共有される同一位置数の関数である（すなわち％同一性＝同一重複位置数／位置総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は長さが同じである。
【００４６】
２つの配列間の同一性百分率の判定は、数学的アルゴリズムを使用しても達成され得る。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７のように修正されている、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得るために、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ＝１２のＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセットで、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し得る。本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、例えばｓｃｏｒｅ＝−５０、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセットで、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し得る。比較目的で、ギャップドアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるようなギャップドＢＬＡＳＴが利用され得る。代案として、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係（Ｉｄ）を検出する反復サーチを実施し得る。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。配列比較のために利用される別の数学的アルゴリズムの非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ  １２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２、およびｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝４を使用し得る。
【００４７】
２つの配列間の同一性百分率は、ギャップ許容ありまたはなしで、上に記載されるものと類似した技術を使用して判定され得る。同一性百分率の計算では、典型的に、正確な一致のみが数えられる。
【００４８】
「約」という用語は、本明細書で数値に関して使用される場合、＋／−２０％、＋／−１０％、または＋／−５％の範囲の値を包含してもよい。
【００４９】
特定の組成物または工程段階自体が変動することもあるため、本発明は、それらに限定されないものと理解される。この明細書および特許請求の範囲における用法では、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の指示対象を含むことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠して番号付与されている、ＩｇＧ重鎖定常領域（ＩｇＧ１（配列番号５６）、ＩｇＧ２（配列番号５７）、ＩｇＧ３（配列番：５８）およびＩｇＧ４（配列番号５９））のアミノ酸配列（配列番号５６〜５９）および番号付与を示す。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵ指針」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１  ＮＩＨ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２に記載されるような、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付与を指す。図１Ａ〜Ｂは、ＣＨ１およびヒンジ領域のアミノ酸配列および番号付与を示す。図１Ｃは、ＣＨ２領域のアミノ酸配列および番号付与を示す。図１Ｄは、ＣＨ３領域のアミノ酸配列および番号付与を示す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４の間のように異なる残基は網掛けされ、既知の対立遺伝子多様性の部位は星印（＊）によって示される。図１Ｅは、β−２−ミクログロブリン（ｐ１４としてもまた知られている）との複合体を形成する、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）大型サブユニットｐ５１アミノ酸配列（配列番号５）を示す。図１Ｆは、典型的なヒトβ−２−ミクログロブリンアミノ酸配列（配列番号６）を示す。既知の対立遺伝子多様性のために、報告された配列と先行技術の配列との間にわずかな相違が存在してもよい。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図１Ｅ】図１Ｄの続きである。
【図１Ｆ】図１Ｅの続きである。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＨ６．０（ｘ軸）およびｐＨ７．４（ｙ軸）における、ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に対するＩｇＧＦｃ断片の結合親和性（ＫＤ値）によって画定される二次元空間を示す。平面は、様々な薬物動態特性と関係があってもよい四分区間に分割される。図２Ｂは、ｐＨ６．０および７．４における、選択された抗ＣＤ２０変異体に対するｈＦｃＲｎ結合を示す散布図を示す。図２Ｃは、選択された抗ＣＤ２０変異体に対するｈＦｃＲｎの結合を示す、図２Ｂからの挿入ボックスの散布図を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図３】ＨＢ２０．３  ＩｇＧおよび様々なＦｃ変異体の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を示す。全ての抗体は、約７３℃の温度でＦａｂアンフォールディングを示す。ＨＢ２０．３（黒破線）は、８３．３℃のＣＨ３Ｔｍを有し；ＨＢ２０．３ＣＨ２の変性転移（常態では約６９℃）は、おそらくＦａｂ転移内に埋没している。ＹＴＥ（濃灰色線）は、８３．３℃のＣＨ３Ｔｍ、および６５．１℃のＣＨ２を有する。Ｎ３−ＹＴＥ（黒線）およびＣｗｔＣ−ＹＴＥ（淡灰色破線）は、同様のＣＨ２およびＣＨ３転移を示し、両方の変異体でＣＨ３Ｔｍは８７．１℃にあり、ＣＨ２転移は、Ｎ３−ＹＴＥでは６２．７℃に、ＣｗｔＣ−ＹＴＥでは６２．３℃に低下する。ＳｅｒＮ３−ＹＴＥ（淡灰色線）は、５８．７℃で示される最も低い抗体のＣＨ２転移を有し、そのＣＨ３転移は、７３℃におけるＦａｂアンフォールディングによって遮蔽された。
【図４】調査された全ての配列中で示される位置の特定位置で起こる、アミノ酸の相対的発生率の図式表現としての、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーの配列解析を示す。文字が大きいほど、そのアミノ酸は調べられた配列中のその位置でより頻繁に見られる。ＣＸＸＸＸＣＥライブラリーの、およびファージＥＬＩＳＡを通じて改善されたｐＨ依存性を有すると見なされる６個のクローン（図４Ｂ）の、４回のファージパニング後に単離された５２個のファージクローン（図４Ａ）について、アミノ酸４３２〜４３７を描写するシーケンスロゴ（Ｃｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４：１１８８−１１９０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６０９７−６１００）が示される。ＺＸＸＨＸＺライブラリーの４回のファージパニング後に単離された６８個のファージクローンについて、アミノ酸４３２〜４３７（配列番号２３）のシーケンスロゴ描写が示される（図４Ｃ）。
【図５】ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーについて、ファージＥＬＩＳＡデータを示す。Ｎ３Ｅ−ＹＴＥと共にグループ分けされないＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーからの変異体のｐＨ７．４およびｐＨ６．０におけるｈＦｃＲｎ結合、ならびに配列を比較する典型的なファージＥＬＩＳＡデータが示される（図５Ａ）。ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーの４回目のパニング後に単離された個々のクローンの典型的なファージＥＬＩＳＡ結果もまた示される（図５Ｂ）。好ましい領域内のｐＨ依存性結合を示すファージクローンは丸で囲まれる。これらのクローンのいくつかは完全長ＩｇＧに変換され、ＦｃＲｎ結合について再評価された。
【図６】ｈＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスにおける、モタビズマブ変異体の薬物動態（ＰＫ）分析を示す。ｈＦｃＲｎマウスにおけるモタビズマブの野性型（●）、ＹＴＥ（■）、Ｙ３１−ＹＴＥ（▼）およびＮ３Ｅ−ＹＴＥ（▲）バージョンのＩｇＧレベルが示される（図６Ａ）。表２で試験された全ての抗体変異体のクリアランス速度が、それらのｐＨ６．０  ｈＦｃＲｎ結合親和性に対してプロットされる（図６Ｂ）。
【図７】２０２人のドナーに由来するＰＢＭＣを使用した免疫原性（Ｔ−細胞増殖アッセイ）の結果を示す。ドナーは白人のＨＬＡ多様性を反映するように選択され、１２を超えるＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプに相当する。モタビズマブ（ｗｔ）、Ｎ３モタビズマブ、緩衝液（ＰＢＳ）、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、既知の免疫原性タンパク質）が抗原として使用された。抗原は、ＰＢＭＣに添加されて１４日間培養された。Ｔ細胞増殖はＦＡＣによって測定された。データは刺激指標（ＳＩ）として報告される。試験された４群のＳＩおよび有意性を示す表が示される（図７Ａ）。個々のドナーのＳＩが見られる（図７Ｂ）。
【図８】患者由来多形核の細胞による、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ルシフェラーゼ遺伝子を含有する株ＰＡ０１：ｌｕｘ）のオプソニン作用死滅を描写する。Ｃａｍ００４  ｗｔ（黒丸）がＯＰＫを有効に促進した一方で、Ｃａｍ００４  ＹＴＥ（黒三角形）はＯＰＫを低下させた。Ｃａｍ４４０  Ｎ３（灰色四角形）は、親Ｃａｍ００４と同様のＯＰＫを有する。非特異的抗体もまた陰性対照として示される（Ｒ３４７；灰色三角形）。
【図９】４℃（黒色四角形）、２５℃（黒色菱形）、または４０℃（黒色三角形）で１ヶ月間培養された５０ｍｇ／ｍｌのＮ３変異抗体（Ｎ３モタビズマブ）の１ヶ月間にわたる安定性ストレス試験の結果を描写する。
【図１０】ｐＨ依存性抗原結合を示す抗体による抗原クリアランスの概略図である。古典的飲作用（図９Ａ）が、７．４ならびにｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する高親和性を示す抗体を使用した可能なエンドサイトーシス（図９Ｂ）と比較される。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
治療用抗体、診断抗体、およびＦｃ−融合生物製剤は、ＦｃＲｎ媒介リサイクルを活用して、所望の特性次第で、内在性ＩｇＧと同様のまたは異なり得る血清半減期を達成する。本発明は、生物学的治療および診断薬に、改善された薬物動態特性をさらに与えることで、有効性を保ちながら、より望ましい用量、投与頻度低下、またはクリアランス改善の機会を提供する。
【００５２】
本発明は、その生体内半減期が、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の存在によって変化（増大または低下）する、少なくともＣＨ３ドメインに１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾を有する分子、特にタンパク質、より特には免疫グロブリンを提供する。修正は、アミノ酸置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に現れるＩｇＧ定常および可変領域のアミノ酸残基への全ての言及は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１  ＮＩＨ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２）のＥＵ番号付与指標に準拠して番号付与されるものと理解すべきである、配列アラインメントによって判定される、その他のＩｇＧ定常領域内の対応する残基が含まれる。
【００５３】
より具体的には、本発明は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の存在によって、その生体内半減期が変化（増大または低下）した、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、または４３７の１つまたは複数アミノ酸残基に修飾を有し、および／またはＣＨ３ドメインのＨｉｓ４３５ループ領域内に、本明細書で４３７＊と称されるアミノ酸４３７および４３８の間の単一アミノ酸挿入を有する分子、特にタンパク質、より特には免疫グロブリンを提供し、そのアミノ酸置換および／または挿入は、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）における、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合親和性を変化（増大または低下）させる。残基４３７および４３８間の挿入をはじめとするこのような修飾は一般に、Ｈｉｓ４３５ループ領域内、すなわち、アミノ酸残基４３２〜４３７の修飾と称される。特定の実施形態では、これらの修飾は、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合部分が、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４に見られるＨｉｓ４３５を含有するように、残基４３５を排除し得る。特定の実施形態では、例えば、野生型分子中では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４などに見られるヒスチジン（Ｈ４３５）の代わりに、位置（Ｒ４３５）のアルギニンを含む、ヒトＩｇＧ３中の相似Ｈｉｓ４３５ループ領域の修飾は、既知の対立遺伝子多様性の部位（図１Ｄの網掛けボックスおよび星印を参照されたい）であり、これらの修飾としては、Ｈ４３５をもたらす野生型非ヒスチジン残基４３５のヒスチジンによる置換が挙げられる。一実施形態では、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合部分は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合部分であるが、それはマウス型であってもよい。ヒトまたはヒト化ＩｇＧ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ドメイン、またはその任意のサブタイプ由来の定常領域であり得る。
【００５４】
一態様では、本発明は、免疫グロブリンおよびその他の生理活性分子の生体内半減期を増大させる、製薬上の重要性に対処する。この目的を達成するために、本発明は、免疫グロブリンおよびその他の生理活性分子に生体内半減期の増大をもたらす、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有するＩｇＧおよびその他の分子を提供する。この態様では、本発明は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の存在によって生体内半減期が増大されたＩｇＧまたは（例えば、タンパク質であるが、非タンパク質作用物質であってもよい）その他の分子に関し、その中では、ＩｇＧ定常領域またはその断片が（例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入によって）修飾されて、特定ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）における、ＩｇＧ定常領域またはＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合親和性が変化（増大または低下）する。一実施形態では、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片が修飾されて、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性が、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して増大される。本発明の修飾ＩｇＧの生体内半減期は、好都合には、下の実施例でより詳細に記載されるように、ヒト遺伝子導入マウスモデルまたはカニクイザル霊長類モデルにおいて評価され得る。
【００５５】
別の態様では、本発明は、免疫グロブリンおよびＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片に共有結合するその他の生理活性分子の生体内半減期を低下させる、製薬上の重要性に対処する。この目的を達成するために、本発明は、免疫グロブリンおよびＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片に共有結合する、その他の生理活性分子に生体内半減期の低下をもたらす、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有するＩｇＧおよびその他の分子を提供する。この態様では、本発明は、修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片の存在によって生体内半減期が低下した（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧもしくはＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片に共有結合するその他の分子（例えば、タンパク質または非タンパク質作用物質）に関し、その中では、ＩｇＧ定常領域またはその断片が（例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入によって）修飾されて、１つまたは複数のｐＨにおける、ＩｇＧ定常領域またはその断片のＦｃＲｎに対する結合親和性が改変され；限定を意図しない例として、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性が維持または増大され、同時にｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性が増大される。
【００５６】
本発明のほとんどの修飾ＩｇＧは、互いにまたはそれらの未修飾または野生型対応物と比較して、生体内半減期の増大または低下を示すかどうかに関わりなく、野生型ＩｇＧ定常領域よりも高い、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示すＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含有する。
【００５７】
より一般的には、当業者は、本発明のＦｃ変異体が、それらが互いにまたはそれらの未修飾もしくは野生型対応物と比較して生体内半減期の増大または低下を示すかどうかに関わりなく、改変されたＦｃＲｎ結合特性を有してもよいことを理解するであろう。結合特性の例としては、結合特異性、平衡解離定数（ＫＤ）、解離および結合速度（それぞれＫｏｎおよびＫｏｆｆ）、結合親和性および／または結合活性が挙げられるが、これに限定されるものではない。平衡解離定数（ＫＤ）がｋｏｆｆ／ｋｏｎとして定義されることは、当該技術分野で周知である。親和力相互作用が高いほどＫＤはより低くなり、逆に親和力相互作用が低いほどＫＤはより高くなるものと理解される。しかし、場合によっては、ＫＤ値よりもＫｏｎまたはＫｏｆｆ値の方が、関連性がより高いこともある。
【００５８】
ＦｃＲｎに対するＩｇＧの結合親和性、このような結合親和性のｐＨ依存性、および生体内半減期の関係が複雑である一方、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する高親和性結合（例えば、約５００ｎＭ未満のＫＤ）を示すＩｇＧ定常領域では、例えば、（一般に、ＦｃＲｎ結合のｐＨ依存性の低下を反映して）ｐＨ７．４におけるＫＤが約１μＭ未満からナノモル濃度の範囲に低下した場合など、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性が増大するにつれて、場合によっては、修飾ＩｇＧのより短い生体内半減期が帰結し得ることが発見された（例えば、下でより詳細に考察される図２Ａの四分区間ＩＩＩおよび５Ｂを参照されたい）。
【００５９】
対照的に、一般に、ＦｃＲｎ結合のより大きいｐＨ依存性を反映する、ｐＨ６．０における高結合親和性（例えば、約５００ｎＭ未満のＫＤ）を伴う、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性の低下（例えば、ｐＨ７．４における約１μＭを超えるＫＤ）は、場合によっては、より長い生体内半減期をもたらし得る（例えば、下でより詳細に考察される図２Ａの四分区間Ｉおよび５Ｂを参照されたい）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＩｇＧおよびその他の分子は、１００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満または１０００ｎＭ未満のｐＨ６．０におけるＦｃＲｎ結合ＫＤを示す、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有する。本発明の修飾ＩｇＧは、例えば、１０ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭのｐＨ６．０におけるＦｃＲｎ結合ＫＤ値によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、本発明の修飾ＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片と比較して、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性の少なくとも１０倍の増大、少なくとも２０倍の増大、または少なくとも５０倍の増大を示す。
【００６１】
それに加えてまたは代案として、修飾ＩｇＧは、１０ｎＭ〜５０μＭである、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性を示し得る。理論による拘束は意図しないが、閾値が存在してもよいことが観察され、ｐＨ７．４における約１μＭ以上のＫＤ（例えば、ＦｃＲｎに対するより低い結合親和性を証明する、１μＭ、５μＭ１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ以上のＫＤ；すなわち、マイクロモル濃度またはミリモル濃度範囲の結合親和性）が、半減期増大（より緩慢なクリアランス）を有する修飾ＩｇＧまたはその他の分子に関連してもよい一方で、ｐＨ７．４における１μＭ未満のＫＤ（例えば、ＦｃＲｎに対するより高い結合親和性を証明する、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、８００ｎＭ、最高約１０００ｎＭのＫＤ、すなわち、ナノモル濃度範囲内の結合親和性）は、半減期低下（より迅速なクリアランス）を有する修飾ＩｇＧまたはその他の分子に関連してもよい。修飾ＩｇＧまたはその他の分子の半減期増大は、通常、しかし必ずしもそうではないが、ｐＨ６における結合の５０ｎＭ〜４００ｎＭまたは５００ｎＭのＫＤ、およびｐＨ７．４における１μＭを超えるＫＤによって特徴付けられる、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合に関連する。
【００６２】
図２Ａは、ｐＨ６．０（ｘ軸）およびｐＨ７．４（ｙ軸）における、ＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合のＫＤ値によって画定される座標平面を示す。４つの四分区間が示されるが、ＦｃＲｎ結合のｐＨ依存性と、半減期および血清クリアランスなどの様々な薬物動態特性との関係は複雑であるため、四分区間は互いに重複してもよいものと理解すべきである。
【００６３】
四分区間Ｉに分類されるＩｇＧは、（野生型よりも高い）ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する高結合親和性、およびｐＨ７．４における比較的低い結合親和性を示す。結果は、一般に、ＦｃＲｎに対する結合のより大きいｐＨ依存性であり、それは、これらのＩｇＧのより長い生体内半減期に関連してもよい。図２Ｂは、四分区間Ｉに入る代表的変異体ＩｇＧを示す。このような一変異体は、本明細書で「ＹＴＥ」と称される。ＹＴＥは、ＣＨ２ドメインの変異（すなわち、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を有するＩｇＧ定常領域を有する。ＹＴＥ変異体は、ＦｃＲｎに対して、ｐＨ６．０における結合親和性の増大と、７．４における比較的低い結合親和性とを有し、野生型ＩｇＧ定常領域と比較して、生体内半減期およびクリアランスの３〜４倍の増大を示す。この変異は、最も良く同定されたＩｇＧ半減期を増大させるものの１つであり、２００６年８月１日に発行された米国特許第７，０８３，７８４号明細書、および２００２年８月８日に公開された国際公開第２００２／０６０９１９号パンフレットに、より詳細に記載される。本発明の修飾ＩｇＧは四分区間Ｉに含まれ、したがって本明細書では「ＹＴＥ様」または「ＹＴＥ様」特性を有すると称されることもある。その構造が表Ｉに記載される、「ＹＴＥ様」特性がある本発明の代表的修飾ＩｇＧは、図２Ｂおよび２Ｃの四分区間Ｉに示されて、Ｎ３、Ｙ３１、Ｙ１２、ＹＣ３７−ＹＴＥ、ＹＣ５６−ＹＴＥ、Ｙ３−ＹＴＥ、Ｙ３１−ＹＴＥ、Ｙ１２−ＹＴＥ、Ｙ８３−ＹＴＥ、Ｙ３７−ＹＴＥ、およびＹ９−ＹＴＥが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
四分区間ＩＩに分類される本発明の修飾ＩｇＧは、ＹＴＥほどには高くない（すなわち、野生型ＩｇＧ結合親和性とより類似する）ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性と、これもまたそれほど高くないｐＨ７．４における結合親和性とを示す。野生型ＩｇＧは、四分区間ＩＩの代表的ＩｇＧである。ＹＣ５９−ＹＴＥ（表Ｉ）はまた、四分区間ＩＩにも分類されて、野生型特性を有することが予期される。
【００６５】
四分区間ＩＩＩは、ｐＨ６．０で高いだけでなく、ｐＨ７．４で野生型レベルよりも有意に高い、ＦｃＲｎに対する結合親和性を示す修飾ＩｇＧを含む。これらの分子では、ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性のｐＨ依存性がより低いことが概して観察される。ｐＨ７．４における高結合親和性は、短い生体内ＩｇＧ半減期および高いクリアランス速度において顕在化し得る。理論による拘束は意図しないが、これらの薬物動態特性は、細胞表面のその受容体に対する免疫グロブリンのより強力な結合に起因してもよく、それは次に、血清または組織中へのＩｇＧの放出を阻害してもよく、それによってＦｃＲｎ媒介リサイクルの利点が失われ、内在性ＩｇＧがリサイクルのためにＦｃＲｎを利用するのを妨げてもよく、総合的に循環中のＩｇＧレベルの低下もたらすと考えられる。半減期が低下された修飾ＩｇＧ、ならびにａｂｄｅｇ様性質があるもの（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５，１０（２３）：１２８３−１２８８）は、四分区間ＩＩＩの範囲内に入る可能性が高いことが予期される。ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増大されるＡｂｄｅｇは、内在性ＩｇＧレベルを低下させるそれらの能力を所与として、自己免疫薬物として潜在的に有用である（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５，１０（２３）：１２８３−１２８８）。ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増大される修飾ＩｇＧはまた、血清および組織から可溶性抗原を迅速に一掃する上で有用性を有してもよい。四分区間ＩＩＩに分類されて、ａｂｄｅｇ特性を示してもよい修飾ＩｇＧの例としては、Ｎ３−ＹＴＥおよびＮ３Ｅ−ＹＴＥが挙げられる（表１）。修飾ＩｇＧであるＹ５４−ＹＴＥ、ＳｅｒＮ３−ＹＴＥ、およびＹ８−ＹＴＥもまた、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合増大を示して、図２Ｂのグラフの四分区間ＩＩＩに位置する。
【００６６】
四分区間ＩＶに分類される修飾ＩｇＧは、酸性エンドソーム内のＦｃＲｎに対する結合が損なわれていることもあるため、効率的にリサイクルされなくてもよい。さらに、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する高結合親和性が、血清または組織中へのそれらの放出を妨げてもよい。
【００６７】
Ｈｉｓ４３５ループの残基４３２〜４３７領域内の修飾に加えて、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片は、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片中のその他の部位に、１つまたは複数の修飾を含み得る。換言すれば、本明細書に記載されるＨｉｓ４３５領域の変異は、安定性、特異性、結合親和性などに関するその他の望ましい特性を有するように既に操作されている、ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片またはその他の分子中に組み込まれるか、またはその上に重ね合わされ得る。例えば、定常領域またはその断片は、２００６年８月１日に発行された米国特許第７，０８３，７８４号明細書、および２００２年８月８日に公開された国際公開第２００２／０６０９１９号パンフレットに記載されるように、ＦｃＲｎに対する定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片の親和性を増大させる、アミノ酸残基２５１〜２５６、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９、および４２８〜４３１の１つまたは複数の置換によってさらに修飾され得る。１つまたは複数の追加的な修飾は、アミノ酸置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。修飾としては、例えば、１つまたは複数の表面露出残基の修飾が挙げられ、修飾は、置換される残基と類似した電荷、極性または疎水性がある残基による置換であり得る。
【００６８】
Ｈｉｓ４３５ループ領域外のＩｇＧ定常領域（または例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などのそのＦｃＲｎ結合断片）構造は、本明細書で、分子のＩｇＧ「基礎構造」または「バックグラウンド」と称されてもよく、これらの２つの用語は同義的に使用される。したがって本発明は、野生型ＩｇＧ基礎構造または変異ＩｇＧ基礎構造のいずれかに組み込まれた、Ｈｉｓ４３５ループ領域に変異がある修飾ＩｇＧを検討する。任意の変異ＩｇＧ基礎構造を利用し得る；代表的であるが、非限定的な変異ＩｇＧ基礎構造が、本明細書に記載される。下でさらに詳述される「ＹＴＥ」は、変異ＩｇＧ基礎構造の一例である。
【００６９】
本発明の免疫グロブリンまたはその他の生理活性分子の一実施形態は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、およびＦｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有して、ＣＨ２ドメイン中の位置２５１、２５２、２５４、２５５、および２５６の１つまたは複数にアミノ酸修飾を有し；より具体的には、これらの位置の１つまたは複数に置換を有する。特定の実施形態では、残基２５１はロイシンまたはアルギニンで置換され、残基２５２はチロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファンまたはスレオニンで置換され、残基２５４はスレオニンまたはセリンで置換され、残基２５５はロイシン、グリシン、イソロイシンまたはアルギニンで置換され、および／または残基２５６はセリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、アスパラギンまたはスレオニンで置換される。より具体的な実施形態では、残基２５１はロイシンで置換され、残基２５２はチロシンで置換され、残基２５４はスレオニンまたはセリンで置換され、および／または残基２５５はアルギニンで置換される。さらに別の特定の実施形態では、残基２５２はフェニルアラニンで置換されおよび／または残基２５６はアスパラギン酸で置換される。特定の実施形態では、残基２５１はロイシンで置換され、残基２５２はチロシンで置換され、残基２５４はスレオニンまたはセリンで置換され、および／または残基２５５はアルギニンで置換される。別の特定の実施形態では、残基２５２はチロシンで置換され、残基２５４はスレオニンで置換され、残基２５６はグルタミン酸で置換される（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、本明細書で「ＹＴＥ」と称される）。本明細書に記載される修飾ＩｇＧ定常領域、またはそれらのＦｃＲｎ結合断片の多くは、「ＹＴＥ」基礎構造を含む。これらの置換の任意の組み合わせが、基礎構造で使用され得る。
【００７０】
本発明の免疫グロブリンまたはその他の生理活性分子のいくつかの実施形態は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有し、位置３０８、３０９、３１１、３１２、および３１４の１つまたは複数にアミノ酸修飾を有し、より具体的には、位置３０８、３０９、３１１、３１２、および３１４の１つまたは複数に、それぞれスレオニン、プロリン、セリン、アスパラギン酸およびロイシンによる置換を有する。一実施形態では、位置３０８、３０９、および３１１の１つまたは複数にある残基が、それぞれ、イソロイシン、プロリン、およびグルタミン酸で置換される。一実施形態では、位置３０８、３０９、３１１、３１２、および３１４の１つまたは複数にある残基が、それぞれ、スレオニン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、およびロイシンで置換される。これらの置換の任意の組み合わせが、基礎構造で使用され得る。
【００７１】
本発明の免疫グロブリンまたはその他の生理活性分子のいくつかの実施形態は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有し、位置３８５、３８６、３８７、および３８９の１つまたは複数にアミノ酸修飾を有し、より具体的には、これらの位置の１つまたは複数に置換を有する。特定の実施形態では、残基３８５は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジンまたはアラニンで置換され、残基３８６は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、またはメチオニンで置換され、残基３８７は、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アラニン、またはプロリンで置換されおよび／または残基３８９はプロリンまたはセリンで置換される。より具体的な実施形態では、位置３８５、３８６、３８７、および３８９の１つまたは複数にある残基が、それぞれ、アルギニン、スレオニン、アルギニン、およびプロリンで置換される。さらに別の特定の実施形態では、位置３８５、３８６、および３８９の１つまたは複数にある残基が、それぞれ、アスパラギン酸、プロリン、およびセリンで置換される。これらの置換の任意の組み合わせが、基礎構造で使用され得る。
【００７２】
本発明の免疫グロブリンまたはその他の生理活性分子のいくつかの実施形態は、（例えば、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧに由来する）ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含有し、位置４２８にアミノ酸修飾を有する。特定の実施形態では、残基４２８はメチオニン、スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、またはセリンで置換される。一実施形態では、残基４２８はメチオニンで置換される。
【００７３】
したがって本発明の分子は、Ｈｉｓ４３５ループ領域、すなわち、残基４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、または４３７に、少なくとも１つの修飾アミノ酸残基を含有し、および／またはアミノ酸４３７および４３８の間にアミノ酸挿入を含有し、任意選択的に、残基２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、３０８、３０９、３１１、３１２、３８５、３８６、３８７、３８９、および／または４２８の１つまたは複数における置換をはじめとするが、これに限定されるものではない、上記の置換の任意の組み合わせもまた含んでもよい。
【００７４】
本発明には、半減期の増大を有する本発明の修飾免疫グロブリン、タンパク質、およびその他の生理活性分子を使用した予防法および治療法のための医薬組成物および方法が含まれる。半減期の増大を有する本発明の修飾免疫グロブリン、タンパク質、およびその他の生理活性分子を使用した診断方法もまた含まれる。
【００７５】
生体内半減期の改変に関連する変異
本発明は、ＩｇＧ定常領域またはその断片のｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する親和性を増大させ、任意選択的にＩｇＧまたはその断片のｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する親和性を改変し、それによってＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）その断片のＦｃＲｎに対する結合親和性のｐＨ依存性を改変することが発見された、ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片中のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）に関する。さらに、これらの修飾は、分子生体内半減期増大または低下のいずれかであってもよい。
【００７６】
本発明は、１つまたは複数のｐＨにおける、修飾ＩｇＧまたはその断片のＦｃＲｎに対する結合親和性に影響を及ぼす、ヒトＩｇＧのＦｃ断片のＣＨ３ドメインのＨｉｓ４３５ループ領域内のアミノ酸修飾（配列番号７または８）の同定に基づく。これらの修飾は、ＦｃＲｎに対するＩｇＧまたはその断片の結合のｐＨ依存性に改変をもたらしてもよい。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓ４３５ループ領域内のアミノ酸修飾は、ｐＨ６、ｐＨ７．４、またはｐＨ６．０および７．４の両方で、野生型ＩｇＧ定常領域によって示されるものよりも高い、ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合親和性をもたらし得る。それに加えてまたは代案として、修飾は、分子の生体内半減期に影響を及ぼしてもよい。
【００７７】
Ｈｉｓ４３５ループ領域は、アミノ酸残基４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、および４３７を含む。ＣＨ３ドメインのＨｉｓ４３５ループ領域（残基４３２〜４３７）の野性型アミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のＦｃ断片ではＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ（配列番号８）であり、ヒトＩｇＧ３ではＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号７）である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾が、ヒトＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合ドメイン、またはアミノ酸配列アライメントにより判定されるその他のＩｇＧ中のその相似残基中の残基４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、および４３７の１つまたは複数で、またはその近くで起きる。このような変異としては、アミノ酸置換ならびに欠失および挿入が挙げられる。アミノ酸挿入の例証的部位は、残基４３７および４３８の間であり、その付加位置は、本明細書で４３７＊と称される。
【００７８】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の一実施形態では、残基４３５が、（野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のように）ヒスチジンのままであり（Ｈｉｓ４３５）または（天然でＲ４３５を含有し、したがってＲ４３５Ｈ変異したＩｇＧ３のように））ヒスチジンに変異される一方で、残基４３２、４３３、４３４、４３６、または４３７の少なくとも１つは置換され、および／または位置４３７＊で挿入が起きる。一実施形態では、（ヒトＩｇＧ３で残基４３５がＲ４３５Ｈ変異を有して、Ｈｉｓ４３５である以外は）、残基４３５（Ｈｉｓ４３５）または残基４３３（Ｈｉｓ４３３）のいずれも変異しない一方で、残基４３２、４３４、４３６、または４３７の少なくとも１つは置換され、および／または位置４３７＊で挿入が起きる。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合領域は、残基４３２、４３３、４３４、４３６、４３７の１、２、３、４つ、または５つの全てに置換を有し、および／またはＨｉｓ４３５ループ領域内の位置４３７＊に挿入を有する。別の実施形態では、ＦｃＲｎ結合領域は、位置４３２、４３３、４３４、４３５、４３６または４３７の３つ以上に置換を有する。別の実施形態では、ＦｃＲｎ結合領域は、位置４３２、４３３、４３４、４３５、４３６または４３７の４つ以上に置換を有する。
【００７９】
一実施形態では、位置４３２および４３７の少なくとも１つが、システインで置換され、および残基４３３、４３４、４３５、および４３６は、それぞれ独立して、置換されまたは置換されない。特定の実施形態では、残基４３２および４３７がいずれもシステインで置換され、および残基４３３、４３４、４３５、および４３６は、それぞれ独立して、置換されまたは置換されない。
【００８０】
一実施形態では、位置４３２および４３７の少なくとも１つが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、残基４３３、４３４、４３５、および４３６は、それぞれ独立して、置換されまたは置換されない。特定の実施形態では、位置４３２および４３７のいずれもグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換され、残基４３３、４３４、４３５、および４３６は、それぞれ独立して、置換されまたは置換されない。
【００８１】
一実施形態では、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片は、Ｈｉｓ４３５ループ領域に少なくとも３つの変異を含有し、位置４３５にヒスチジンを含有する（位置４３５のヒスチジンは、野性型残基または変異型であってもよい）。（存在する場合、４３５の変異を含まない）３つ以上の変異の様々な順列のいずれもが本発明に包含され、限定なしに、以下の部位における変異が挙げられる：
位置４３２、４３３と、４３４、４３６、４３７、および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３２、４３４と、４３６、４３７、および４３７＊のいずれか１つ
位置４３２、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置４３２、４３７、および４３７＊
位置：４３３、４３４と、４３６、４３７、および４３７＊のいずれか１つ
位置４３３、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置４３３、４３７、および４３７＊
位置：４３４、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置４３４、４３７、および４３７＊
位置４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３３、４３４と、４３６、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３２、４３３、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３２、４３３、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３４、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３２、４３４、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３３、４３４、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３３、４３４、４３７、および４３７＊
位置：４３４、４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３３、４３４、４３６と、４３７および４３７＊のいずれか１つ
位置：４３２、４３３、４３４、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３３、４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３４、４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３３、４３４、４３６、４３７、および４３７＊
位置：４３２、４３３、４３４、４３６、４３７、および４３７＊。
【００８２】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の一実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインのＨｉｓ４３５ループ領域は、アミノ酸配列ＣＸＸＸＸＣ（残基４３２〜４３７；配列番号９）またはＣＸＸＸＸＣＥ（残基４３２〜４３７＊、４３７＊は挿入である；配列番号１０）を有する。ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーから作成された、様々なＨＢ２０．３ＩｇＧ変異体の代表的Ｈｉｓ４３５ループアミノ酸配列が、表１（実施例１）に示される。ヒトＦｃＲｎに対する、様々なＨＢ２０．３ＩｇＧ変異体の結合の結合データもまた示される。理論による拘束は意図しないが、２つのシステイン残基が、おそらくジスルフィドシスチンを形成することで、ループ領域に対する安定化効果を発現してもよい。２つのシステイン間の予測距離は約６．７Ａであり、それはシスチン形成と適合する範囲内（４．６〜７Ａ）にある。Ｈｉｓ４３５ループモチーフＣＸＸＸＸＣ（配列番号９）に基づく特定の実施形態では、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片のアミノ酸修飾は、位置４３２〜４３７の１つまたは複数の置換であり、位置４３２および４３７の両方がシステインで置換される。位置４３５はヒスチジンであり；位置４３３はアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニン、またはアスパラギンで置換され得、一実施形態では、位置４３３はヒスチジンである。位置４３４はアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、メチオニンまたはスレオニンで置換され得る。位置４３６はロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、またはスレオニンで置換され得る。任意選択的に、変異Ｈｉｓ４３５ループ領域は、位置４３７＊にグルタミン酸挿入を含有する。一実施形態では、位置４３２および４３７はシステインであり、位置４３３はアルギニン、プロリン、スレオニン、リジンまたはヒスチジンであり、位置４３４はアルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、またはチロシンであり、位置４３５はヒスチジンであり、位置４３６はロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリンまたはヒスチジンである（例えば、図４Ａを参照されたい）。一実施形態では、Ｈｉｓ４３５ループ領域はＣＸＲＨＸＣ（配列番号１１）であり、その中では位置４３３はアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、プロリン、またはセリンであり、位置４３６はアルギニン、イソロイシン、メチオニン、またはセリンである（例えば、図４Ｂを参照されたい）。一実施形態では、Ｈｉｓ４３５ループ領域はＣＲＲＨＸＣ（配列番号１２）であり、その中では位置４３６がロイシン、アルギニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、またはスレオニンで置換され；例えば、それはロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンで置換され得る。一実施形態では、Ｈｉｓ４３５ループ領域は、ＣＸＲＨＲＣ（配列番号１３）であり、その中では位置４３３はアルギニン、プロリン、スレオニン、リジン、セリン、アラニン、メチオニン、またはアスパラギンである。任意選択的に、これらの実施形態のいずれかでは、変異Ｈｉｓ４３５ループ領域が、位置４３７＊にグルタミン酸挿入を含有する。
【００８３】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の別の実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインのＨｉｓ４３５ループ領域がアミノ酸配列ＺＸＸＨＸＺを有し、式中、「Ｚ」は、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギン酸である（残基４３２〜４３７；配列番号１４）。この実施形態では、位置４３２の「Ｚ」によって同定されるアミノ酸は、位置４３７の「Ｚ」によって同定されるアミノ酸と同一であり得るか、またはそれは異なり得る。表１は、アミノ酸配列ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）に基づく、この変異体ライブラリーに言及する。
【００８４】
理論による拘束は意図しないが、Ｈｉｓ４３５ループ領域内への、具体的には、位置４３２および／または４３７における、荷電残基（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン）の導入（ＺＸＸＨＸＺモチーフ中のＺ残基；配列番号１４）は、細胞内のＩｇＧリサイクルのｐＨ依存性を改変してもよいことが想定される。一実施形態では、位置４３２または４３７の少なくとも１つが負荷電残基で置換され、それは位置４３５のヒスチジンと、位置４３２および／または４３７の負荷電残基との間で、塩橋の形成を促進してもよい。一実施形態では、残基４３２および４３７の１つが負荷電残基で置換され、もう１つは正荷電残基で置換され、それは、残基４３２および残基４３７の間の塩結合の形成を促進してもよい。一実施形態では、位置４３２または４３７の少なくとも１つが荷電残基で置換され；例えば、位置４３２はグルタミン酸またはヒスチジンなどの荷電残基で置換され得、位置４３７はグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンで置換され得る。例証的実施形態では、位置４３２はグルタミン酸で置換され、位置４３７はグルタミンで置換される。それに加えてまたは代案として、位置４３３はアルギニン、アラニン、リジン、スレオニン、ロイシン、セリン、プロリン、またはグルタミンで置換され；別の実施形態では、位置４３３はヒスチジンである。それに加えてまたは代案として、位置４３４はチロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンで置換される。それに加えてまたは代案として、位置４３６はアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、またはバリンで置換される。特定の実施形態では、位置４３２はグルタミン酸またはヒスチジンで置換され、位置４３３はアルギニン、アラニン、リジン、スレオニンまたはロイシンで置換され；位置４３４はフェニルアラニンまたはチロシンで置換され、位置４３６はアルギニン、ヒスチジン、アスパラギンまたはリジンで置換され、位置４３７はグルタミンまたはグルタミン酸で置換される（例えば、図４Ｃを参照されたい）。一実施形態では、位置４３３および／または４３６は正荷電アミノ酸で置換される。それに加えてまたは代案として、位置４３４は疎水性アミノ酸で置換される。
【００８５】
一実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインの変異Ｈｉｓ４３５ループ領域は、Ｅ（Ｒ／Ａ）（Ｗ／Ｓ／Ｆ）ＨＲＱ（配列番号１５）のコンセンサス配列である。位置４３２および４３７間の塩橋の導入は、（これらの位置のシスチンと比較して）Ｈｉｓ４３５ループの可撓性を増大させ、（より長い生体内半減期と共に）より大きいｐＨ依存性をもたらし得ることが想定されたが、位置４３７における荷電アミノ酸による置換でなくグルタミンによる置換は、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片のＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性に、最も一貫した増大をもたらすことが驚くことに分かった。
【００８６】
表１は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域のＨｉｓ４３５ループ領域内のいくつかの代表的変異型アミノ酸配列を示す。これらの修飾ＩｇＧ定常領域は、Ｈｂ２０．３として知られている抗ＣＤ２０ＩｇＧ中で評価された（表１）。いくつかのこれらの修飾ＩｇＧ定常領域は、実施例により詳細に記載されるように、モタビズマブ（ＮｕＭａｘ）ＩｇＧ（表２および３）中でさらに評価されて、薬物動態特性がマウスおよび／またはカニクイザル中で評価された。
【００８７】
本発明の修飾ＩｇＧの例示的な一実施形態は、本明細書で「Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ」と称されて、それは、位置４３２〜４３７＊（位置４３７および４７８の間の位置４３７＊にＧｌｕが挿入される）に配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ（ＣＳＷＨＬＣＥ；配列番号１６）を含有して、「ＹＴＥ」ＩｇＧ１定常領域基礎構造に組み込まれる（Ｔｙｒ２５２、Ｔｈｒ２５４、およびＧｌｕ２５６があるＩｇＧ１）。位置４３５のヒスチジンは、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥのＨｉｓ４３５ループ領域内の唯一のＩｇＧ１野生型残基である。野生型ＩｇＧ１および「ＹＴＥ」のいずれも（２００６年８月１日に発行された米国特許第７，０８３，７８４号明細書；２００２年８月８日に公開された国際公開第２００２／０６０９１９号パンフレット）、ｐＨ７．４においてＦｃＲｎに対する比較的低い結合親和性を示し、ＹＴＥは、ｐＨ６．０において野性型よりも有意に高いＦｃＲｎに対する結合親和性と、より長い生体内半減期とを有する（したがって図２Ｂのグラフの四分区間Ｉに入る）。他方、図２Ｂのグラフの四分区間ＩＩＩに見られるＮ３Ｅ−ＹＴＥは、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、（一般に、より低いｐＨ依存性を有する）ＦｃＲｎに対する高結合親和性を示し、ヒトＦｃＲｎマウスモデルにおいて、短い生体内半減期を示す。したがってＮ３Ｅ−ＹＴＥは、毒性抗原の除去または中和、自己免疫療法または生物学的イメージング用途における使用が意図されるＩｇＧで利用するのに適切であってもよい。位置４３７＊に追加のグルタミン酸を含まないこと以外はＮ３Ｅ−ＹＴＥと同一であるＮ３−ＹＴＥは、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥと同様の薬物動態特性を有し、図２Ｂに示される座標面の四分区間ＩＩＩに同じく見られる。本発明の修飾ＩｇＧは、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびＮ３−ＹＴＥと同様に、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方における（一般に、より低いｐＨ依存性を有する）ＦｃＲｎに対する高結合親和性、および短い生体内半減期によって特徴付けられ、任意選択的に、ａｂｄｅｇ様薬物動態特性を示してもよく；それらは内在性ＩｇＧ分解を促進する能力を有してもよく、それによって破壊的抗体によって特徴付けられる特定の自己免疫疾患を改善する。
【００８８】
短い生体内半減期を要する用途で有用であるのに加えて、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびＮ３−ＹＴＥはまた、ｐＨ６．０ではＦｃＲｎに対する高結合親和性を維持するが、ｐＨ７．４ではより低い結合親和性レベルと生体内半減期の増大を示す、その他のＩｇＧ定常領域を開発するための好都合なプラットフォームの役割も果たす。
【００８９】
したがって、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片のいくつかの実施形態では、Ｈｉｓ４３５ループ領域は、位置４３４が異なる疎水性残基で置換されてもよいこと以外、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥまたはＮ３−ＹＴＥに類似する。ＹＴＥ基礎構造に組み込まれ得るＨｉｓ４３５配列の例としては、位置４３７＊のグルタミン酸挿入ありまたはなしのＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（ＣＳＦＨＬＣ；配列番号１７）、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（ＣＳＩＨＬＣ；配列番号１８）、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ（ＣＳＬＨＬＣ；配列番号１９）が挙げられる。理論による拘束は意図しないが、位置４３４および４３６のいずれかまたは両方の疎水性残基は、ｐＨ感受性の低下をもたらしてもよいことが観察されており、これが次に生体内半減期を低下させてもよい。
【００９０】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の別の例示的実施形態は、本明細書で「Ｎ３」と称され、それは、位置４３２〜４３７（位置４３７および４３８間の挿入なし）に、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥのＹＴＥ基礎構造ではなく、野性型ＩｇＧ１定常領域基礎構造に組み込まれた配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（ＣＳＷＨＬＣ；配列番号２０）を含有する。驚くことに、変異ＹＴＥ基礎構造を除去することは、主に、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対するこの分子の結合親和性を低下させることで、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびＮ３−ＹＴＥと比較して、ＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性を復元させた。Ｎ３は、ＹＴＥで観察されたものに匹敵する、有意により長い生体内半減期およびクリアランス速度の遅延を示す。
【００９１】
しかし、半減期の増大のみが、Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用調節の臨床関連成果ではなく；エフェクター機能などのその他の生物学的活性の維持または促進、または場合によっては、阻害もまた、意図される治療用途次第で、重要であってもよい。ＹＴＥ変異は、Ｆｃγ（Ｆｃガンマ）受容体結合のわずかな低下のために、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよびオプソニン作用死滅）の低下を示す。薬物動態はＹＴＥ様であるが、エフェクター機能が強化された分子は、特定の治療用途で有用であってもよい。驚くことに、かつ有利には、Ｎ３は、観察された血清半減期の増大にさらに加えて、大きい関心事である（ＹＴＥとの比較で）追加的な生物学的特性を示す。例えば、Ｎ３は、ＦｃγＲＩＩａ、およびＣ１ｑなどのＦｃリガンドへの結合性を完全に維持する。潜在的に、Ｎ３は、野生型ＩｇＧ１よりもさらにより良いエフェクター機能を示してもよい。Ｎ３は、完全なオプソニン作用死滅（ＯＰＫ）活性と、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）とをさらに示す。より一般的には、Ｎ３は、ＨｕＦｃＲｎマウスおよびカニクイザルで実施された実験において、野生型ＩｇＧと比較して、同様のまたは改善された薬理学的特性を示すようである一方で、実質的により長い生体内半減期を示す（実施例Ｉを参照されたい）。したがって、Ｎ３は、効能がオプソニン作用死滅に依存する抗細菌モノクローナル抗体などのように、正常なエフェクター機能が望ましい臨床状況において、ＹＴＥの有用な代替物であってもよい。
【００９２】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片のいくつかのその他の代表的実施形態は、ＩｇＧ１の残基４３２〜４３７でＣＸＸＨＸＣモチーフ（配列番号２１）を、または残基４３２〜４３７＊でＣＸＸＨＸＣＥモチーフ（配列番号２２）を、Ｈｉｓ４３５ループ領域に組み込み、これらのモチーフは、それぞれＮ３Ｅ−ＹＴＥおよびＮ３−ＹＴＥを特徴付ける。これらの実施形態は、概して、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびＮ３−ＹＴＥよりも、ＦｃＲｎに対する結合親和性のより大きいｐＨ依存性および／またはより長い生体内半減期を示し、典型的に、図２Ｂに示されるグラフの四分区間Ｉの範囲内にある。ｐＨ依存性の増大は、通常、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する結合親和性の低下（すなわち、ＦｃＲｎに対する結合のより高いＫＤｐＨ７）と、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対するより高い結合親和性（すなわちＦｃＲｎに対する結合のより低いＫＤｐＨ６）とによって顕在化される。上述のように、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ；配列番号１６）中のＨｉｓ４３５ループ領域は、残基４３４（Ｔｒｐ）および４３６（Ｌｅｕ）に疎水性置換を有する。より大きいｐＨ依存性を示すいくつかの実施形態では、残基４３３、４３４、および４３６の少なくとも１つが、正荷電残基で置換される。残基４３２〜４３７＊にＣＸＸＨＸＣＥモチーフ（配列番号２２）を有し、位置４３３、４３４、および４３６の少なくとも１つで正荷電残基によって置換され、ＹＴＥ基礎構造組み込む、代表的な修飾ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）が表１に示され、本明細書でＹＣ３３−ＹＴＥ、ＹＣ８３−ＹＴＥ、ＹＣ３７−ＹＴＥ、ＹＣ５６−ＹＴＥおよびＹＣ５９−ＹＴＥと称される実施形態が含まれる。位置４３２〜４３７におけるＨｉｓ４３５ループ領域のモチーフはＣＸＲＨＲＣ（配列番号１３）であり、それは本明細書に記載される全てのモチーフと同様に、野生型基礎構造、ＹＴＥ基礎構造、または任意のその他の変異ＩｇＧ定常領域もしくはそのＦｃＲｎ結合断片に組み込まれ得る。
【００９３】
修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片のその他の代表的実施形態には、ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）モチーフが組み込まれて、ＣＸＸＸＸＣ（Ｅ）モチーフ（配列番号９／１０）を特徴付けるシスチン部分が欠如している。表１に示されるこのような一実施形態（例えば、ＩｇＧ１）は、本明細書でＹ３１−ＹＴＥと称される。Ｙ３１−ＹＴＥは、位置４３２〜４３７に、配列Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＥＲＦＨＲＱ；配列番号２５）を有する修飾Ｈｉｓ４３５ループを有し、野性型ＩｇＧ１と比較して増大された半減期を有する。ｐＨ依存性の増大を示す表１に示されるその他の実施形態としては、それぞれ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（ＥＲＹＨＴＱ；配列番号２６）およびＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＥＡＷＨＲＱ；配列番号２７）の位置４３２〜４３７における修飾Ｈｉｓ４３５ループによって特徴付けられる、Ｙ３−ＹＴＥおよびＹ１２−ＹＴＥが挙げられる。ｐＨ依存性の増大がある表１に示されるなおも別の実施形態としては、それぞれ、Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（ＨＲＦＨＬＱ；配列番号２８）、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（ＥＡＦＨＲＥ；配列番号２９）、およびＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（ＥＰＹＨＲＥ；配列番号３７）の位置４３２〜４３７における修飾Ｈｉｓ４３５ループによって特徴付けられる、Ｙ３７−ＹＴＥ、Ｙ９−ＹＴＥ、およびＹ８３−ＹＴＥが挙げられる。
【００９４】
以下の実施例で詳述されるように、抗ＣＤ２０（ＨＢ２０．３）ＩｇＧ中で評価された修飾ＩｇＧ定常領域のいくつかが、異なる可変領域に関連してＦｃＲｎに対する結合を評価するために、モタビズマブ中でさらに試験された。ＹＴＥ  ＩｇＧ定常領域基礎構造、すなわち、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ、Ｙ３−ＹＴＥ、Ｙ１２−ＹＴＥ、Ｙ３１−ＹＴＥに基づく特定の変異体中、ならびに野生型ＩｇＧ１定常領域基礎構造、すなわち、Ｎ３、Ｙ１２、およびＹ３１に基づく特定の変異体中に存在する修飾ＩｇＧ定常領域が、モタビズマブ中で試験された。ｐＨ６．０結合における、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ定常領域の結合親和性は、抗ＣＤ２０ＩｇＧとほとんど同じであることが分かった。「ＹＴＥ」基礎構造の効果もまた、モタビズマブ中で試験された。Ｍｏｔａ−Ｙ１２−ＹＴＥおよびＭｏｔａ−Ｙ３１−ＹＴＥの薬物動態特性は、それぞれ、Ｍｏｔａ−Ｙ１２−ＷＴおよびＭｏｔａ−Ｙ３１−ＷＴのものと比較された（可変領域を提供するモタビズマブ）。ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する結合親和性の増大、および結合親和性のｐＨ依存性の増大が観察され、ＹＴＥおよびＨ４３５ループ領域の両方が、ＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性に影響を及ぼすことが示唆された。モタビズマブを使用したマウスモデルにおける血清クリアランス速度もまた評価された。評価されたＩｇＧの大部分は、比較的緩慢に血清から除去され、したがってＦｃＲｎ結合を通じたリサイクルの増大が示唆された。しかし、そのＦｃＲｎに対する結合親和性のｐＨ依存性が大きく低下しているＮ３Ｅ−ＹＴＥ変異を有するＩｇＧは、血清から迅速に除去された。本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、多くの治療用途では、低下した（より緩慢な）血清クリアランスが有益であるが、いくつかの治療用途および多くの診断用途では、より迅速なクリアランスが好ましい。これらのデータは、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対するＩｇＧ定常領域の結合親和性が、ＩｇＧの血清半減期およびクリアランス速度の重要な決定要因であってもよいことを示唆する。ｐＨ７．４におけるＮ３Ｅ−ＹＴＥのＦｃＲｎに対する強力な結合（例えば、２５ｎＭのＫＤ）は、迅速な血清クリアランス速度と関連していた。しかし、ｐＨ７．４におけるＫＤが、ｐＨ７．４で１μＭ未満に低下するにつれて、ＩｇＧは半減期の増大とより緩慢なクリアランス速度を示し始める。
【００９５】
アミノ酸修飾は、当該技術分野で公知の任意の方法によって作成され得、多くのこのような方法は、当業者にとって通例かつ周知である。限定を意図しない例として、アミノ酸置換、欠失、および挿入は、任意の良く知られているＰＣＲベースの技術を使用して達成されてもよい。アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発によって生成されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００，１９８２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５を参照されたい）。ＦｃＲｎへの親和性の増大および生体内半減期の増大をもたらす変異は、本明細書に記載されるものなどの周知の日常的アッセイを使用して、容易にスクリーニングされてもよい。アミノ酸置換は、ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片の１つまたは複数の残基に導入され得、変異定常領域または断片は、バクテリオファージの表面で発現され得、それは次に、ＦｃＲｎ結合親和性の増大についてスクリーニングされる。
【００９６】
生成されると、変異型ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）その断片は、（例えば、可変部分を関心のある抗体に融合させることにより）ＩｇＧの構築で、または（例えば異種部分を融合／コンジュゲートさせることにより）Ｆｃ融合分子の構築で使用されてもよい。本発明の修飾ＩｇＧまたはＦｃ融合分子は、当業者に良く知られている方法によって作成されてもよい。簡単に述べると、このような方法としては、（例えば、ファージディスプレイまたは発現ライブラリーから単離された、またはヒトまたは非ヒト抗体に由来する可変領域）所望の特異性がある可変領域と、本明細書で提供されるような改変された半減期を有する、修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片とを組み合わせることが挙げられるが、これに限定されるものではない。代案として、当業者は、抗体またはＦｃ融合分子のＦｃ領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することで、本発明の修飾ＩｇＧまたはＦｃ融合分子を作成してもよい。
【００９７】
半減期に影響を及ぼすのに加えて、本明細書に記載されるアミノ酸修飾は、分子の（例えば、粘膜表面、またはその他の標的組織への輸送などの）生物学的利用能を変化（すなわち、増大または低下）させてもよく、具体的には、（例えば、肺の）粘膜表面または標的組織のその他の部分への分子の輸送（または濃度または半減期）を変化（すなわち、増大または低下）させる。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、肺への分子の輸送または濃度または半減期を変化（例えば、増大または低下）させる。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、分子の心臓、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱、胃、大腸または小腸、気道、リンパ節、神経組織（中枢および／または末梢神経組織）、筋肉、表皮、骨、軟骨、関節、血管、骨髄、前立腺、卵巣、子宮、腫瘍またはがん組織などへの輸送（または濃度または半減期）を変化（例えば、増大または低下）させる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、例えば、補体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および／またはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩなどの１つまたは複数のＦｃガンマ受容体への結合などであるが、これに限定されるものではない、定常領域の１つまたは複数のその他の免疫エフェクターまたは受容体結合機能を消滅させず、または改変しない。本発明の修飾ＩｇＧおよびその他の分子は、当該技術分野で通例かつ周知である方法を使用して、エフェクター機能について評価され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、定常領域の修飾ＦｃＲｎ結合断片は、免疫エフェクター機能またはその他の受容体結合を媒介する配列を含有しない。このような断片は、その生体内半減期を増大させるための非ＩｇＧまたは非免疫グロブリン分子のコンジュゲーションに特に有用であってもよい。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、（例えば、エフェクター機能を低下または増大させるために）選択的に改変される。
【０１００】
より普遍的には、本発明は、多様な診断および治療目的に良く適している修飾ＩｇＧを提供する。本発明は、それらのＦｃＲｎに対する結合に、様々なレベルのｐＨ依存性を示す修飾ＩｇＧを提供する。異なるレベルのｐＨ依存性は、異なる薬物動態特性をもたらしてもよく、またはそれらと相関し、それは次に、その他の目的よりもいくつかの目的により良く適している修飾ＩｇＧをもたらす。
【０１０１】
例えば、本明細書に記載される修飾ＩｇＧのいくつかは、それらのＦｃＲｎに対する結合の高レベルのｐＨ依存性、および観察された生体内半減期の増大と共に、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する高親和性結合を示す。本発明のこの態様の修飾ＩｇＧは、例えば、より長い生体内半減期が望ましい用途において、治療薬として用いられる場合に有用性を有する。任意選択的に、修飾ＩｇＧは、Ｆｃγ受容体およびＣ１ｑなどのＦｃ−リガンドと相互作用する能力の維持または強化、強力なオプソニン作用死滅（ＯＰＫ）活性、およびＦｃエフェクター機能（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ）を媒介する能力などのその他の改善された薬物動態特性もまた示す。
【０１０２】
対照的に、本明細書に記載される修飾ＩｇＧのいくつかは、（典型的にｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する親和性の増大の結果として）それらのＦｃＲｎに対する結合のより低レベルのｐＨ依存性、および観察された生体内半減期の低下と共に、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する高親和性結合を示す。本発明のこの態様の修飾ＩｇＧは、例えば、特定の自己免疫状態の治療などのより短い生体内半減期が望ましい用途において、治療薬として用いられる場合に有用性を有する。それらはまた、生物学的造影剤として使用されると場合など、体液または組織からの迅速なクリアランスが所望される診断用途に良く適していてもよい。
【０１０３】
本発明の別の態様は、それらの抗原に対するｐＨ依存性結合のために操作された、治療および診断用ＩｇＧの有効性を改善することを目的とする。抗体は、それらに高親和性で結合することで、標的または抗原を不活性化するのに使用され得る。次に抗体−抗原複合体は、循環から除去される。抗体媒介性のクリアランスは、抗原が、より高いｐＨ（ｐＨ７．４）ではより強力に、より低いｐＨ（ｐＨ６）ではより弱く結合するように、ｐＨ依存性の抗原結合を操作して、エンドソームの酸性環境内で抗原が放出され分解されるようにすることで改善され得る。
【０１０４】
ＩｇＧ定常領域のＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性を操作することは、抗原結合のｐＨ依存性を天然に示し、または示すように操作された免疫グロブリンにとって有利であってもよい。免疫グロブリンの抗原結合部位に対する抗原結合のｐＨ依存性改変の手段によって、血清または組織から、抗原を迅速に除去するように操作された免疫グロブリンは、（例えば、図２ＡおよびＢの四分区間Ｉに示されるｐＨ結合操作Ｆｃなどの）ｐＨ結合修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を組み込むことで、さらに改善され得る。理論による拘束は意図しないが、修飾ＩｇＧは可変領域のｐＨ依存性抗原結合を示すことが示唆され、そこでは、酸性ｐＨ（例えば、６）における抗原への結合は、中性ｐＨ（例えば、７．４）における結合と比較して顕著に低下され、ｐＨ７．４およびｐＨ６．０の両方で野性型ＩｇＧ１と比較してＦｃＲｎに対する結合親和性を増大させるｐＨ結合操作Ｆｃは、野性型ＩｇＧ１と比較して抗原をより迅速により持続的な方法で除去し得る。中性ｐＨにおける改善されたＦｃおよびＦｃＲｎ結合は、細胞表面の抗体の存在を促進し、細胞表面にＩｇＧと結合する抗原をもたらす。したがって抗体は、抗原をより効率的にエンドソーム内に引き寄せて（図９Ｂ）、そこでは抗原への結合親和性が低下して、より迅速な放出および分解がもたらされる。酸性ｐＨにおけるＦｃＲｎに対するＦｃの高親和性結合は、抗原を含まないＩｇＧを細胞表面または血清にリサイクルさせて戻し、より多くの抗原が結合および除去される。このストラテジーは、ｐＨ依存性ＩｇＧ−抗原結合（可変領域）と、ＦｃＲｎに対するｐＨ結合操作ＩｇＧ定常領域とを組み合わせる。本発明のこの態様の修飾ＩｇＧの一例は、その抗原のｐＨ依存性結合について操作され、ならびにＮ３Ｅ−ＹＴＥまたはＮ３−ＹＴＥ  ＩｇＧ定数を含むように操作されたＩｇＧである（表１）。
【０１０５】
本発明の修飾免疫グロブリン分子としては、天然にＦｃＲｎ結合領域を含有するＩｇＧ分子、ならびにその他の非ＩｇＧ免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはＦｃＲｎ結合断片を含有するように操作された免疫グロブリン断片（すなわち、非ＩｇＧ免疫グロブリンまたはその断片と、Ｆｃ領域またはＦｃヒンジ領域などのＦｃＲｎ結合領域とを含んでなる融合タンパク質）が挙げられる。いずれの場合も、ＦｃＲｎ結合ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸修飾を有して、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する定常領域断片の親和性を増大させ、任意選択的に、ＦｃＲｎに対する結合のｐＨ依存性に（増大または低下のいずれかの）影響を及ぼす。
【０１０６】
本発明の修飾ＩｇＧ定常領域は、実施例でより詳細に記載されるように、Ｈｂ２０．３抗ＣＤ２０  ＩｇＧおよびモタビズマブなどの様々な免疫グロブリン中で試験された。当業者は、薬物動態特性が強化された修飾免疫グロブリンまたはその他の分子を提供するために、本発明の修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片が、このようにして任意の免疫グロブリンまたはその他の分子に容易に組み込まれ得ることを認識するであろう。
【０１０７】
修飾免疫グロブリンとしては、特異的抗原−抗体結合アッセイ技術分野で周知の免疫測定法による判定で）（好ましくは、免疫特異的に、すなわち、非特異的結合と競合して）抗原に結合してＦｃＲｎ結合断片を含有する、任意の免疫グロブリン分子が挙げられる。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、多特異性、ヒト型、ヒト化、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含有する断片、または特定例ではＦｃＲｎ結合領域を含有するように操作されまたはそれに融合された、抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
本発明のＩｇＧ分子、およびそのＦｃＲｎ結合断片は、特定の実施形態では、ＩｇＧのＩｇＧ１サブクラスであるが、また所与の動物の任意のその他のＩｇＧサブクラスであってもよい。例えば、ヒトでは、ＩｇＧクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられる。ヒトＩｇＧ３に基づく本発明の実施形態では、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４と比較して、ヒトＩｇＧ３のＨｉｓ４３５ループ領域（位置４３２〜４３７）のアミノ酸配列が完全に保存されないことに留意すべきであり、位置４３５および４３６にそれぞれアルギニン（Ｒ）およびフェニルアラニン（Ｆ）非保存残基を有して（ＬＨＮＲＦＴ；配列番号７、図１Ｄ）、さらに位置４３５および４３６に対立遺伝子多様性を示す（図１Ｄ、星印）ことが知られている。既知の多様性を考慮して、当業者は、本発明の分子のＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン中の位置４３５のヒスチジン（Ｒ４３５Ｈ）および／または位置４３６のチロシン（Ｆ４３６Ｙ）を置換することが有利であってもよいことを認識するであろう。
【０１０９】
免疫グロブリン（および本明細書で使用されるその他のタンパク質）は、鳥類および哺乳類をはじめとする、任意の動物起源に由来してもよい。抗体は、例えば、ヒト、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであり得る。本明細書の用法では、「ヒト」抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、後述されるように、および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに付与された米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されるように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンで遺伝子組換えされて内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
【０１１０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはさらなる多特異性であってもよい。多特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよく、または異種ポリペプチドまたは固体支持物質などの異種エピトープに対して特異的であってもよい。例えば、国際公開第号９３／１７７１５パンフレット；国際公開第９２／０８８０２号パンフレット；国際公開第９１／００３６０号パンフレット；国際公開第９２／０５７９３号パンフレット；Ｔｕｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０−６９，１９９１；米国特許第４，４７４，８９３号明細書；米国特許第４，７１４，６８１号明細書；米国特許４，９２５，６４８号明細書；米国特許５，５７３，９２０号明細書；米国特許５，６０１，８１９号明細書；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３，１９９２を参照されたい。
【０１１１】
本発明の抗体としては、別の方法で修飾された、すなわち、共有結合が、抗体の抗原へ結合および／または抗イディオタイプ反応を妨げないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された誘導体が挙げられる。限定を意図しない例として、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への連結によって修飾されている抗体などが挙げられる。多数の化学修飾のいずれでも、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン代の謝合成などをはじめとするが、これに限定されるものではない、既知の技術によって実施されてもよい。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１１２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用をはじめとする、当該技術分野で公知の多種多様な技術、またはそれらの組み合わせを使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）（全てそれらの内容全体が参照により本明細書に援用される）で教示されるものをはじめとする、ハイブリドーマ技術を使用して生成され得る。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、ハイブリドーマ技術を通じて作成された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核、原核、またはファージクローンをはじめとする、単一クローンに由来する抗体を指し、それによってそれが作成される方法は指さない。
【０１１３】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を作成およびスクリーニングする方法は、当該技術分野で通例かつ周知である。非限定的な例では、関心のある抗原またはこのような抗原を発現する細胞で、マウスが免疫化され得る。例えば、マウス血清中に抗原に対して特異的な抗体が検出されるなど、免疫応答が検出されると、マウスの脾臓が採取されて、脾細胞が単離される。次に脾細胞は、周知の技術によって、任意の適切な骨髄腫細胞と融合される。限界希釈によってハイブリドーマが選択され、クローン化される。次に、ハイブリドーマクローンは、当該技術分野で公知の方法によって、抗原と結合できる抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。通常、高レベルの抗体を含有する腹水が、陽性ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に接種することで生成され得る。
【０１１４】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって作成されてもよい。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を生成する）パパインなどの酵素または（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する）ペプシンを使用した、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって作成されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、完全な軽鎖、および可変領域、重鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域を含有する。
【０１１５】
例えば、抗体はまた、当該技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して作成され得る。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を輸送するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、このようなファージが、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された、ＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの抗原結合ドメインを提示するために使用され得る。関心のある抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージは、例えば、標識抗原、または固体表面またはビーズに結合もしくは捕捉された抗原の使用など、抗原によって選択または同定され得る。これらの方法で使用されるファージは、典型的に、ｆｄおよびＭ１３をはじめとする繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに対する組換え融合タンパク質として発現される。代案として、本発明の免疫グロブリンの修飾ＦｃＲｎ結合部分は、ファージディスプレイシステムで発現され得る。
【０１１６】
抗体ファージライブラリーを使用してモノクローナル抗体を作成する方法は、当該技術分野で通例かつ周知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）；およびＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）を参照されたい。ファージディスプレイライブラリーを作成するための市販のキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳＵＲＦＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗体提示ライブラリーの作成およびスクリーニングで使用される方法および試薬の例は、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書；米国特許第６，５４５，１４２号明細書；米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，２９１，１５９ｌ号明細書；米国特許第６，２９１，１６０号明細書；米国特許第６，２９１，１６１号明細書；米国特許第６，６８０，１９２号明細書；米国特許第５，９６９，１０８号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，８０６，０７９号明細書；米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第７，１９５，８６６号明細書にある。本発明の免疫グロブリン、またはそれらの断片を作成するのに使用され得るファージディスプレイ方法の追加的な例としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０，１９９５；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６，１９９５；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２−９５８，１９９４；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８７：９−１８，１９９７；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１−２８０，１９９４；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／英国特許出願９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１  １２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；および米国特許第５，６９８，４２６号明細書；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；米国特許第５，５８０，７１７号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；米国特許第５，７５０，７５３号明細書；米国特許第５，８２１，０４７号明細書；米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；��国特許第５，５１６，６３７号明細書；米国特許第５，７８０，２２５号明細書；米国特許第５，６５８，７２７号明細書；米国特許第５，７３３，７４３号明細書；および米国特許第５，９６９，１０８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０１１７】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージに由来する抗体コード領域が単離されて、ヒト抗体、または任意のその他の所望の断片をはじめとする全抗体を作成するために使用され、例えば下で詳述されるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌をはじめとする任意の所望の宿主で発現され得る。例えば、ＰＣＴ出願国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４−８６９，１９９２；およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＪＲＩ，３４：２６−３４，１９９５；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３，１９８８（それぞれその内容全体が参照により援用される）で開示されるものなどの当該技術分野で公知の方法を使用して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に作成する技術もまた、用いられ得る。一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を作成する使用され得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および米国特許第５，２５８，４９８号明細書；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６−８８，１９９１；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９０：７９９５−７９９９，１９９３；およびＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４０，１９８８に記載されるものが挙げられる。
【０１１８】
ヒトにおける抗体の生体内使用および生体外検出アッセイをはじめとするいくつかの使用では、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体の使用が有用なこともある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域とを有する抗体など、その中で抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２，１９８５；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４  １９８６；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１−２０２，１９８９；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；および米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト生物種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有して、所望の抗原に結合する非ヒト生物種に由来する抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲ供与抗体からの対応する残基で置換されて、抗原結合が改変され、好ましくは改善される。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基との相互作用モデル化、および特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較など、当該技術分野で周知の方法によって同定される。例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３，１９８８を参照されたい。抗体は、例えば、全てそれらの内容全体が参照により本明細書に援用される、ＣＤＲ−グラフト（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１号明細書、および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリングまたは表面再構成（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８，１９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４，１９９４；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−９７３，１９９４）、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）をはじめとする、当該技術分野で公知の多様な技術を使用してヒト化され得る。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｒａ；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、ヒト抗体中の対応する配列を超可変領域��列で置換することで実施され得る。具体的には、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフトアプローチ（例えば、米国特許第６，５４８，６４０号明細書を参照されたい）、ベニアリングまたは表面再構成（米国特許第５，６３９，６４１号明細書および米国特許第６，７９７，４９２号明細書；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、鎖シャフリングストラテジー（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：８９１０−８９１５を参照されたい）、分子モデル化ストラテジー（米国特許第５，６３９，６４１号明細書）などをはじめとする、当該技術分野で周知の方法によって調合されてもよい。これらの一般的アプローチが、標準変異誘発および組換え体合成技術と組み合わされて、所望の特性がある単量体ヒト化抗体が作成されてもよい。
【０１１９】
ヒト患者の治療処置のためには、完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上に記載されるファージディスプレイ法をはじめとする、当該技術分野で公知の多様な方法によって作成され得る。それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および米国特許第４，７１６，１１１号明細書；および国際公開第９８／４６６４５号パンフレット；国際公開第９８／５０４３３号パンフレット；国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９８／１６６５４号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットを参照されたい。
【０１２０】
ヒト抗体は、また、機能性内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得る、遺伝子組換えマウスを使用して生成され得る。ヒト抗体を作成するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３，１９９５を参照されたい。ヒト抗体およびヒト型モノクローナル抗体を作成するためのこの技術、およびこのような抗体を作成するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；欧州特許第０  ５９８  ８７７号明細書；米国特許第５，４１３，９２３号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第５，９１６，７７１号明細書；および米国特許第５，９３９，５９８号明細書を参照されたい。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，５９１，６６９号明細書（全てＧｅｎＰｈａｒｍに付与された）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；および国際公開第９７／１７８５２号パンフレットもまた参照されたい。ヒト抗体を作成するためのマウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株の使用が記載されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できる。マウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株の作成、およびこれらのマウスにおいて産生される抗体は、米国特許第６，６７３，９８６号明細書；米国特許第７，０４９，４２６号明細書；米国特許第６，８３３，２６８号明細書；米国特許第６，１６２，９６３、６，１５０，５８４、６，１１４，５９８、６，０７５，１８１、６，６５７，１０３号明細書；米国特許第６，７１３，６１０および５，９３９，５９８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１０８１０号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２９９０５号明細書；米国特許出願公開第２００４／００９３６２２号明細書；米国特許出願公開第２００５／００５４０５５号明細書；米国特許出願公開第２００５／００７６３９５号明細書；および米国特許出願公開第２００６／００４０３６３号���細書でさらに考察される。代替のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．をはじめとするその他の者は、「ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ」アプローチを利用した。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，６２５，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，７７０，４２９号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；米国特許第６，２５５，４５８号明細書；米国特許第５，５９１，６６９号明細書；米国特許第６，０２３，０１０号明細書；米国特許第５，６１２，２０５号明細書；米国特許第５，７２１，３６７号明細書；米国特許第５，７８９，２１５号明細書；米国特許第５，６４３，７６３号明細書；および米国特許第５，９８１，１７５号明細書に記載される。Ｋｉｒｉｎはまた、マウスからのヒト抗体作成を実証し、その中では、大型の染色体断片、または染色体全体が微小核体融合を通じて取り込まれている。特許第６，６３２，９７６号明細書を参照されたい。それに加えて、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのｍｉｎｉｌｏｃｕｓ（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑の成果であるＫＭ（商標）マウスが作成されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体とＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖導入遺伝子とを有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。ヒト抗体はまた、インビトロ法によって誘導され得る。適切な実施例としては、ファージディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（以前のＣＡＴ）、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（以前のＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（以前のＣＡＴ））、酵母ディスプレイなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照されたい）を使用して、生体外で、未免疫ドナーからの免疫グロブリン変動（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体断片が作成され得る。ファージディスプレイは、多様な構成で実施され得、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）で概説される。いくつかのＶ−遺伝子断片起源が、ファージディスプレイのために使用され得る。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）；および米国特許第５，５６５，３３２号明細書および米国特許第５���５７３，９０５号明細書を参照されたい。上で考察されるように、ヒト抗体はまた、生体外活性化Ｂ細胞によって産生されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｍｅｄａｒｅｘ（ＮＪ）、およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）などの企業が、上に記載されるものと同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体の生産を請け負い得る。
【０１２１】
完全ヒト抗体を認識する選択されたエピトープは、「誘導される選択」と称される技術を使用して作成され得る。このアプローチでは、例えば、マウス抗体などの選択された非ヒトモノクローナル抗体を使用して、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９８８）。
【０１２２】
特定の実施形態では、修飾抗体は、生体内治療および／または予防用途を有する。このように修飾された治療および予防抗体の例としては、ＲＳＶ感染患者を治療するためのヒト化抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）モノクローナル抗体である、ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，ＭＤ）；転移性乳がん患者を治療するためのヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＣＡ）；クローン病（Ｃｒｏｎｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）患者を治療するためのキメラ抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ＰＡ）；血餅形成を予防するための血小板上の抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体である、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；急性腎臓同種移植片拒絶を予防するための免疫抑制ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体である、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の実施例は、ヒト化抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２であるＣＤＰ８６０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ，ＵＫ）；ＣＤ４と融合した抗ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗体であるＰＲＯ５４２（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ／Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ）；ヒト抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体であるＯｓｔａｖｉｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ヒト化抗ＣＭＶＩｇＧ１抗体であるＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；マウス抗ＴＮＦ−α  Ｆ（ａｂ’）２であるＭＡＫ−１９５（ＳＥＧＡＲＤ）（Ｋｎｏｌｌ  Ｐｈａｒｍａ／ＢＡＳＦ）；ＩＣ１４であるｎ抗ＣＤ１４抗体（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）；ａヒト化抗ＶＥＧＦＩｇＧ１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；マウス抗ＣＡ  １２５抗体であるＯＶＡＲＥＸ（商標）（Ａｌｔａｒｅｘ）；マウス抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であるＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体であるＢＥＣ２（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；キメラ抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体であるＩＭＣ−Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体であるＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ヒト化抗ＣＤ５２  ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）；ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  Ｍ１９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）であるキメラ抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）；ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ヒト化抗ＨＬＡ抗体であるＳｍａｒｔ  ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；放射標識（ｒａ���ｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ）マウス抗ＨＬＡ診断試薬抗体であるＯＮＣＯＬＹＭ（商標）（Ｌｙｍ−１）（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）；ヒト抗ＩＬ８抗体であるＡＢＸ−ＩＬ８（Ａｂｇｅｎｉｘ）；ヒト化ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ１１ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／Ｘｏｍａ）；ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体であるＩＣＭ３（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）；霊長類化抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；放射標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ）マウス抗ＣＤ２０抗体であるＺＥＶＡＬＩＮ（商標）（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；霊長類化抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣ）；霊長類化抗ＣＤ２３抗体であるＩＤＥＣ−１５２（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ヒト化抗ＣＤ３  ＩｇＧであるＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体である５Ｇ１．１（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ）；ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体であるＤ２Ｅ７（ＣＡＴ／ＢＡＳＦ）；ヒト化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ破片であるＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；霊長類化抗ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ヒトＣＤ４  ＩｇＧ抗体であるＭＤＸ−ＣＤ４（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ヒト化抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体であるＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＬＤＰ−０２であるヒト化抗α４β７抗体（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体であるＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体であるＡＮＴＯＶＡ（商標）（Ｂｉｏｇｅｎ）；ヒト化抗ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体であるＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）（Ｅｌａｎ）；ヒト抗ＣＤ６４（ＦｃγＲ）抗体であるＭＤＸ−３３（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｃｅｎｔｅｏｎ）；ヒト化抗ＩＬ−５  ＩｇＧ４抗体であるＳＣＨ５５７００（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；それぞれヒト化抗ＩＬ−５およびＩＬ−４抗体であるＳＢ−２４０５６３およびＳＢ−２４０６８３（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ヒト化抗ＩｇＥ  ＩｇＧ１抗体であるｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ／Ｔａｎｏｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；霊長類化抗ＣＤ２３抗体であるＩＤＥＣ−１５２（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ）；マウス抗Ｄ−１４７  ＩｇＭ抗体であるＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ）；ラット抗ＣＤ２  ＩｇＧ抗体であるＢＴＩ−３２２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／Ｂｉｏ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）；マウス抗ＣＤ３  ＩｇＧ２ａ抗体であるＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ／ＯＫＴ３（ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；キメラ抗ＣＤ２５  ＩｇＧ１抗体であるＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍ）；ヒト化抗β２−インテグリンＩｇＧ抗体であるＬＤＰ−０１（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ）；マウス抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２である抗ＬＦＡ−１（Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｅｒｉｅｕｘ／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）；ヒト抗ＴＧＦ−β２抗体であるＣＡＴ−１５２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｂ  Ｔｅｃｈ）���抗αｖβ３抗体であるｖｉｔａｘｉｎ；およびキメラ抗ＶＩＩ因子抗体であるＣｏｒｓｅｖｉｎ  Ｍ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）である。
【０１２３】
本発明の修飾ＩｇＧとしてはまた、抗原結合部位、Ｆｃ受容体結合部位、または補体結合部位などのその生理活性部位が遺伝子操作によって修飾され、野性型と比較してこのような機能が増大または低下されたＩｇＧが挙げられる。
【０１２４】
本発明は、生理活性分子および修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、本明細書で同定されるようなＨｉｓ４３５領域（残基４３２〜４３７）のアミノ酸残基中またはその近くに、１つまたは複数の修飾（すなわち、置換、欠失、または挿入）を有する融合タンパク質もまた提供する。生理活性分子は、修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片に、組換え的に融合されまたは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）され得る。任意選択的に、修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片は、アミノ酸残基２５１〜２５６、２８５〜２９０、および／またはアミノ酸残基３０８〜３１４の１つまたは複数におけるＣＨ２領域の修飾、および／またはアミノ酸残基３８５〜３８９および／または４２８〜４３１の１つまたは複数におけるＣＨ３領域の修飾などの追加的な修飾を含有してもよい。このような修飾の１つまたは複数がある定常領域またはその断片への生理活性分子の融合は、生理活性分子の生体内半減期を増大させる。
【０１２５】
生理活性分子は、当業者に公知の任意のポリペプチドまたは合成薬物であり得る。例証的実施形態では、生理活性分子は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。生理活性ポリペプチドの例としては、様々なタイプの抗体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−β）、細胞接着分子（例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２、およびＣＤ２８）、リガンド（例えば、ＴＮＦ−α，、ＴＮＦ−β、およびエンドスタチンなどの抗血管新生因子）、受容体、抗体および増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＫＧＦ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。生理活性分子はまた、細胞毒（例えば、細胞分裂阻害または細胞破壊剤）、治療薬または放射性元素（例えば、α−放射体、γ−放射体など）などの治療成分であり得る。細胞分裂阻害または細胞破壊剤の例としては、パクリタキソル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、およびそれらの類似体または相同体が挙げられるが、これに限定されるものではない。治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２６】
いくつかの態様では、ＴＮＦスーパーファミリーの構成要素（受容体またはリガンド）、ならびにこのタンパク質ファミリーに属するタンパク質のサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープは、本発明の修飾ＩｇＧに結合し、または修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片に融合される。ＴＮＦスーパーファミリーは、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」）、リンフォトキシン−α（「ＬＴ−α」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも称される）、アポ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも称される）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも称される）、ＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも称される）、ＤＲ４、ＤＲ５（Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２、またはＫＩＬＬＥＲとしてもまた知られている）、ＤＲ６、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８としてもまた知られている）、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２としてもまた知られている）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１、ＴＮＦＬ１、ＣＤ３０、ＬＴＢｒ、４−１ＢＢ、受容体およびＴＲ９をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の分子を含んでなる。
【０１２７】
本発明の修飾ＩｇＧによって結合されてもよく、または修飾ＩｇＧ定常領域に融合されてもよいポリペプチドまたは（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）それらのＦｃＲｎ結合断片の追加的な例としては、５Ｔ４、ＡＢＬ、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグリカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦ１、ＡＩＧＩ、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣｌ、ＡＲ、アロマターゼ、ＡＴＸ、ＡＸｌ、ＡＺＧＰ１（亜鉛−ａ−糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩｌ、ＢＣＲ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＢｌｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡ１、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶｌ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１−３０９）、ＣＣＬＩ１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ｍｃｃ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＥＰ−２）、ＳＬＣ、ｅｘｏｄｕｓ−２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰＩｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲＩ（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤＩＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤＨ１（Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｐ１／Ｃｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮｌＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６１ＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲＩ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラスタリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣｌ）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬＩＡ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬ８、ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−ＩＯ）、ＣＸＣＬＩ１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬ１、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、Ｅｎｇｅｌ、Ｅｄｇｅ、Ｆｅｎｎｅｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、Ｅｎｏｌａ、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ１、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ２、ＥＰＨＲＩＮＡ３、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ４、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ５、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ１、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ２、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＧ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、エストロゲン受容体、Ｅａｒｌ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮｆ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬＩ（ε）、ＦＢＬ１（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴ１（フィブロネクチン）、ＦＬＴ１、ＦＬＴ−３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬＩ（ＦＲＡ−１）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤ２、ＧＤＦ５、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＮＡＳ１、ＧＮＲＨ１、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ���０）、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＧＳＴＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ヘッジホッグ、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸｌ、ＨＳＰ９０、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、１ＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＢＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮγ、ＩＦＮＷｌ、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦＩＲ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、１ＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＤＬ−１、ＩＬＩＯ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬＩＯＲＢ、ＩＬ−１、ＩＬ１Ｒ１（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬ１Ｒ２（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ−５、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＢ（ＣＤ１３１）、ＩＬ−６、ＩＬ６ＲＡ、（ＣＤ１２６）、ＩＲ６ＲＢ（ＣＤ１３０）、ＩＬ−７、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＩＬ−８、ＣＸＣＲ１（ＩＬ８ＲＡ）、ＣＸＣＲ２、（ＩＬ８ＲＢ／ＣＤ１２８）、ＩＬ−９、ＩＬ９Ｒ（ＣＤ１２９）、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲＡ（ＣＤ２１０）、ＩＬ１０ＲＢ（ＣＤＷ２１０Ｂ）、ＩＬ−１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、１Ｌ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬＩＢ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＤＬ１Ｆ９、ＩＬＩＨＹＩ、ＩＬＩＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬＩＲＡＰ、ＩＬＩＲＡＰＬＩ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＬ１、ＩＬｌＲＬ２、ＩＬＩＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＤＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、１Ｌ４Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、１ＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（１３４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＴＢ、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣ  Ｂｏｘ  ＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＣ���−１、ＭＤＫ、ＭＩＢ１、ミッドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＳＲＩＩ、ＭＪＰ−２、ＭＫ、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−ＵＩ）、ｍＴＯＲ、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢＩ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲＮｏｇｏ６６、（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＭＥＩ（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＴＣＨ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲＩＤ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲｌｌ２、ＮＲｌｌ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺｌ、ＯＰＲＤＩ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＤＧＦ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭＩ、ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣＩ、ＰＫＣ、ＰＫＣ−β、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（Ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＲＡＲＢ、ＲＧＳ１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩ１０（ＺＮＦ１４４）、Ｒｏｎ、ＲＯＢＯ２、ＲＸＲ、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥ１（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＥＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥＩ（ＰＡｌ−Ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦＩ、ＳＨＩＰ−ｌ、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＢ１、ＳＨＢ２、ＳＨＢＧ、ＳｆｃＡＺ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰ１、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰ１０、
ＴＤＧＦ１、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩＩ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼｌｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＫＡ、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、
バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ−４、Ｗｎｔ−１、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＹＹ１、およびＺＦＰＭ２が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２８】
いくつかの態様では、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、脂質、糖脂質、多糖などの１つまたは複数の非タンパク質分子は、本発明の修飾ＩｇＧに結合し、または修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片に融合される。いくつかの態様では、腫瘍関連糖脂質抗原、（ならびにそのサブユニット、ドメイン、モチーフ、およびエピトープ；例えば、米国特許第５，０９１，１７８号明細書を参照されたい）は、本発明の修飾ＩｇＧに結合し、または修飾ＩｇＧ定常領域もしくはそのＦｃＲｎ結合断片に融合される。
【０１２９】
いくつかの態様では、修飾ＩｇＧまたは修飾ＩｇＧ定常領域または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）それらのＦｃＲｎ結合断片は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＥ、ＶＥＧＦＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＫＤＲ、ｆｉｔ−ｌ、ＦＬＫ−１Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−１、ＰＬＧＦ、ＣＥＡ、ＣＸＣＬ１３、Ｂａｆｆ、ＩＬ−２１、ＣＣＬ２１、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−１、ｂＦＧＦ、ＭＡＣ−ｌ、ＩＬ２３ｐ１９、ＦＰＲ、ＩＧＦＢＰ４、ＣＸＣＲ３、ＴＬＲ４、ＣＸＣＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）、ＳＣ１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＡＧＥ、Ｎａｖ１．７、ＧＬＰ１、ＲＳＶ、ＲＳＶＦタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、ＨＭＧＢ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ２２、ＩＣＡＭ−１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＨＤＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＧＩＴＲ、１３−アミロイド、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＧＦＢＰ３、ｃＭｅｔ、ＰＤ−１、ＰＬＧＦ、Ｎｅｐｒｏｌｙｓｉｎ、ＣＴＤ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ−１３、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−４Ｒ、ＩｇＥ、ＰＡｌ−ｌ、ＮＧＦ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡ、ｕＰＡＲｔ、ＤＬＬ−４、ａｖ１３６、ａ５１３１、インターフェロン受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＣＤ１９、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１７、第ＩＩ因子、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ、ＣＤ１９、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＰＩＶ−３、ＣＭＶ、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＥＢＶとの結合について、リガンドと競合するドメイン（例えば、エピトープ結合領域、またはリガンドドメイン）を含んでなる。
【０１３０】
本発明は、本発明の修飾ＩｇＧ定常領域をコードするヌクレオチド配列または（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片を含んでなるポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片をはじめとする、ＩｇＧなどの免疫グロブリンをコードする。代替実施形態では、ポリヌクレオチドは、生理活性分子および修飾ＩｇＧ定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなる、融合タンパク質をコードする。
【０１３１】
さらに、本発明は、ストリンジェントな、またはより低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の修飾ＩｇＧおよび融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドを含む。
【０１３２】
修飾ＩｇＧおよびそれをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、それぞれＰＣＲと組み合わされた、ジデオキシ連鎖停止法（サンガー配列決定）、およびオリゴヌクレオチドプライミングなどの一般的ＤＮＡ配列決定法をはじめとする、当該技術分野で公知の任意の方法によって得られてもよい。
【０１３３】
変異の同定
本明細書に記載されるようなＩｇＧ定常領域のＨｉｓ４３５領域のアミノ酸修飾は、当業者に知られている任意の技術を使用して導入されてもよい。アミノ酸残基４３２〜４３７中に１つまたは複数の修飾を有する、定常領域またはその断片（またはＩｇＧ定常領域もしくはそのＦｃＲｎ結合断片中のその他の部位）は、例えば、（下でさらに詳述されるように）ＦｃＲｎ受容体に対する親和性が増大している定常領域またはその断片を同定するための結合アッセイによって、スクリーニングされてもよい。ＦｃＲｎ受容体に対する定常領域またはその断片の親和性を増大させる、ヒンジＦｃ領域またはその断片中のこれらの修飾を抗体中に導入して、前記抗体の生体内半減期が増大され得る。さらに、ＦｃＲｎに対する定常領域またはその断片の親和性を増大させる、定常領域またはその断片中のこれらの修飾を生理活性分子に融合させて、前記生理活性分子の生体内半減期を増大させ、任意選択的に分子の生物学的利用能を変化（例えば、増大または低下）させ、例えば、粘膜表面（またはその他の標的組織）（例えば、肺）への輸送を増大または低下させ得る。
【０１３４】
変異誘発
変異誘発は、修飾される抗体またはその断片（例えば、ＣＨ２またはＣＨ３領域）の定常領域の配列中に、１つまたは複数の修飾を有するオリゴヌクレオチドを合成することをはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の技術のいずれかに従って実施されてもよい。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を通じて、十分な大きさおよび配列複雑度のプライマー配列を提供し、横断される欠失接合部の両側に安定二本鎖を形成して、変異体が作成できるようにする。代表的プライマーは、約１７〜約７５ヌクレオチド以上の長さであり、改変される配列接合部の両側に約１０〜約２５個以上の残基がある。１つまたは複数の位置に多様な異なる変異を導入するいくつかのこのようなプライマーを使用して、変異体のライブラリーが作成されてもよい。様々な文献によって例示されるように、部位特異的変異誘発技術は、当該技術分野で周知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７−８２，１９８７を参照されたい）。一般に、部位特異的変異誘発は、最初に、一本鎖ベクターを得る、またはその配列中に所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、二本鎖ベクターの２本の鎖を融解分離させることで実施される。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成的に調製される。次にこのプライマーは、一本鎖ベクターにアニールされて、変異を有する鎖の合成を完了するために、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ重合酵素の対象となる。このようにして、その中で１本の鎖が最初の非変異配列をコードして、第２の鎖が所望の変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適切な細胞を形質転換または形質移入して、変異配列の配置を有する組換えベクターを含むクローンが選択される。理解されるように、本技術は、典型的に、一本鎖および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発で有用な典型的なベクターとしては、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手され、それらの使用は、一般に当業者に良く知られている。二本鎖のプラスミドもまた部位特異的変異誘発で慣例的に用いられ、対象遺伝子をプラスミドからファージに輸送するステップが排除される。
【０１３５】
代案として、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの市販の熱安定性酵素によるＰＣＲ（商標）の使用を利用して、変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが増幅ＤＮＡ断片に組み込まれもよく、それは次に適切なクローニングまたは発現ベクターにクローン化され得る。例えば、ＰＣＲ（商標）媒介変異誘発手順については、それらの内容全体が本明細書に援用される、Ｔｏｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（６）：１６５６，１９８７、およびＵｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８（１）：２９−３０，３２，１９９５を参照されたい。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを用いるＰＣＲ（商標）もまた使用して、リン酸化変異原性オリゴヌクレオチドが増幅ＤＮＡ断片に組み込まれもよく、それは次に適切なクローニングまたは発現ベクターにクローン化されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６（３）：４１０−２，１９９４を参照されたい）。
【０１３６】
抗体またはその断片のＦｃ領域に配列変異を生じさせる当業者に公知のその他の方法が使用され得る。例えば、抗体またはその断片の定常領域のアミノ酸配列をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミンなどの変異誘発物質で処理して、配列変異が得られてもよい。
【０１３７】
パニング
アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する定常領域またはそれらの断片を発現するベクター、特に、ファージをスクリーニングして、ＦｃＲｎに対する親和性の増大を有する定常領域またはそれらの断片を同定し、ファージ集団から最大親和性バインダーが選択され得る。ＦｃＲｎに対する、アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する定常領域またはその断片の結合を分析するために使用され得る免疫測定法としては、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、および蛍光免疫測定法が挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなアッセイは、当該技術分野で通例かつ周知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。代表的な免疫測定法は、以下に簡単に説明される（しかし、限定は意図されない）。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析もまた使用して、ＦｃＲｎに対する、アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する定常領域またはその断片の結合およびオフ速度が判定され得る。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、表面に固定化ＦｃＲｎがあるチップからの、アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する定常領域またはその断片の結合および分離を分析することを含んでなる。
【０１３８】
配列決定
当該技術分野で公知の多様な配列決定反応のいずれかを使用して、アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する定常領域またはその断片コードするヌクレオチド配列が、直接、配列決定され得る。配列決定反応の例としては、Ｍａｘｉｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５６０，１９７７）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３，１９７７）によって開発された技術に基づくものが挙げられる。質量分析法による配列決定（例えば、国際公開第９４／１６１０１号パンフレット、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３６：１２７−１６２，１９９６、およびＧｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：１４７−１５９，１９９３を参照されたい）をはじめとする、多様な自動化配列決定手技（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９：４４８，１９９５）のいずれかを使用し得ることもまた、検討される。
【０１３９】
抗体を作成するための組換え法
本発明の抗体またはそれらの断片は、抗体合成技術分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成または組換え発現技術によって作成され得る。
【０１４０】
抗体をコードするヌクレオチド配列は、当業者が利用可能な任意の情報（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋや文献から、または通例のクローニングによって）から得られてもよい。特定の抗体またはそのエピトープ結合断片をコードする核酸を含有するクローンは入手不能であるが、抗体またはそのエピトープ結合断片の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成されて、または配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、適切な起源（例えば、抗体発現について選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する任意の組織または細胞からから作成された、または単離された抗体ｃＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリー、または例えばポリＡ＋ＲＮＡなどの核酸）から得られてもよい。次にＰＣＲ増幅によって生成される核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化してもよい。
【０１４１】
抗体のヌクレオチド配列が決定されると、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどの当該技術分野で周知のヌクレオチド配列操作法を使用して、抗体のヌクレオチド配列を操作し（例えば、いずれもその内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載される技術を参照されたい）、例えば、抗体のエピトープ結合領域に、例えば、ＦｃＲｎとの相互作用に関与する抗体のヒンジＦｃ領域に、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を導入することで、異なるアミノ酸配列を有する抗体が作成されてもよい。アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する抗体が、作成され得る。
【０１４２】
抗体の組換え発現は、抗体の配列をコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要する。抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖、あるいはその一部（任意選択的に、しかし必須でないが、重鎖または軽鎖可変領域を含有する）をコードするヌクレオチド配列が得られたら、抗体分子を作成するためのベクターが、当該技術分野で周知の技術を使用して、組換えＤＮＡ技術によって作成されてもよい。したがって、抗体を含有するヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現させることで、タンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に良く知られている方法を使用して、抗体コード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターが構築され得る。これらの方法としては、例えば、生体外組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内遺伝的組換えが挙げられる。したがって、本発明は、ＦｃＲｎとの相互作用に関与するアミノ酸残基に１つまたは複数の修飾がある、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる複製可能なベクターを提供する（例えば、国際公開第８６／０５８０７号パンフレット；国際公開第８９／０１０３６号パンフレット；および米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照されたい）。重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖および軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列、重鎖および／または軽鎖可変領域のエピトープ結合断片、または抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、発現のために、このようなベクターにクローン化されてもよい。
【０１４３】
発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞に移入し、次に形質移入細胞を従来の技術によって培養して、ＦｃＲｎへの親和性の増大および生体内半減期の増大を有する抗体が作成される。したがって、本発明は、任意選択的に異種プロモーターと作動可能に連結して、アミノ酸残基４３２〜４３７またはその他の部位に１つまたは複数の修飾を有する、抗体、定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。
【０１４４】
多様な宿主発現ベクター系を使用して、本発明の抗体分子が発現されてもよい。このような宿主発現系は、それによって関心のあるコード配列が生成され、引き続いて精製されてもよいビヒクルに相当するが、適切なヌクレオチドコード配列に形質転換または形質移入されると、本発明の抗体分子を原位置で発現してもよい細胞にもまた相当する。これらとしては、抗体コード配列を含有する、組換バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；およびタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；および哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する、組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、およびＮＳＯ細胞）が挙げられるが、これに限定されるものではない。組換え抗体分子全体の発現に好適な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、および真核細胞が、組換え体抗体分子を発現するために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用される、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞は、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：１０１，１９８６，およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２，１９９０）。
【０１４５】
細菌系では、いくつかの発現ベクターが、有利には、発現される抗体分子の意図される用途次第で選択されてもよい。例えば、抗体分子のため医薬組成物を製造するために、このようなタンパク質が大量に製造される場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を誘導するベクターが望ましくあってもよい。このようなベクターとしては、その中で、融合タンパク質が生じるように、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域と共に、フレーム内のベクターに個々にライゲートされてもよい、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１２：１７９１，１９８３）；およびｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９，１９８５およびＶａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０９，１９８９）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４６】
昆虫系では、キンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスは、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）に個々にクローン化されてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。
【０１４７】
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を使用して、本発明の抗体分子が発現されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心のある抗体コード配列は、例えば、後期プロモーターおよび三区分リーダー配列などのアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲートされてもよい。次にこのキメラ遺伝子は、生体外または生体内組換えアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主中で生存能力があり、抗体分子を発現する能力がある、組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９，１９８４を参照されたい）。特異的開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要であってもよい。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列の読み枠と同調していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の多様な起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの包含によって増大されてもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４，１９８７を参照されたい）。
【０１４８】
さらに、所望の特定の方法で、抗体配列の発現を調節し、または抗体を修飾してプロセッシングする宿主細胞株が選択されてもよい。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、抗体機能に重要であってもよい。異なる宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物を翻訳後プロセシングおよび修飾するための特徴的かつ特異的な機序を有する。発現された抗体の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主システムが選択され得る。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する、真核宿主細胞が使用されてもよい。このような哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ならびに特に、ＮＳ０細胞などの骨髄腫細胞、および関連細胞株が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらに付与された米国特許第５，８０７，７１５号明細書を参照されたい。
【０１４９】
組換え抗体の長期にわたる高収率の生成のためには、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が遺伝子操作されてもよい。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーで形質転換され得る。遺伝子操作細胞は、外来性ＤＮＡの導入に続いて富化培地中で１〜２日間増殖させ、次に、選択培地に切り替えてもよい。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定して組み込み、増殖して病巣形成できるようにして、次にそれは細胞株にクローン化され増殖され得る。この方法は、有利には、抗体分子を発現する細胞株を操作するのに使用されてもよい。このような操作細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物をスクリーニングして評価するのに、特に有用であってもよい。
【０１５０】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２，１９９２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８−１７，１９８０）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの選択系統が使用されてもよく、遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中で用いられ得る。また代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子の選択基準として使用され得る。メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５７，１９８０およびＯ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７，１９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３：８７−９５，１９９１；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６，１９９３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２，１９９３；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−２１７，１９９３；およびＭａｙ，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ，１１（５）：ｌ５５−２  １５，１９９３）；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）。組換えＤＮＡの当該技術分野で一般に公知の方法を慣例的に適用して、所望の組換え体クローンが選択されてもよく、このような方法は、例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１に記載される。
【０１５１】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（レビューについては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，１９８７，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。抗体を発現するベクター系において、マーカーが増幅可能な場合、宿主細胞培養物中に存在する阻害物質のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増大させる。増幅領域は抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２５７，１９８３）。
【０１５２】
宿主細胞は、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターとの本発明の２つの発現ベクターと共に、同時形質移入されてもよい。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有し、または両方のプラスミドの維持を確実にする異なる選択可能なマーカーを含有してもよい。代案として、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、ひいてはそれらを発現する能力がある単一ベクターが使用されてもよい。このような状況では、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために、軽鎖が重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：５２，１９８６；およびＫｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１９７，１９８０）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでなってもよい。
【０１５３】
本発明の抗体分子が組換え発現によって生成されると、それは、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、プロテインＡ精製後の特異的抗原に対するアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度などの、免疫グロブリン分子精製の技術分野で公知の任意の方法によって、または任意のその他のタンパク質精製標準技術によって精製されてもよい。さらに、本発明の抗体またはそれらの断片は、本明細書に記載される、またはさもなければ当該技術分野で公知である、精製を容易にする異種ポリペプチド配列に融合されてもよい。
【０１５４】
抗体コンジュゲート
本発明は、異種ポリペプチド（すなわち、無関係のポリペプチド；またはその一部、例えば少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）と組換え的に融合し、またはそれに化学的に結合して（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生じる抗体を包含する。融合は、直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートされた抗体はまた、当該技術分野で公知の方法を使用して、生体外免疫測定法および精製法で使用されてもよい。例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３９：９１−９９，１９９４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，４７４，９８１；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：１４２８−１４３２，１９９２；およびＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：２４４６−２４５２，１９９１を参照されたい。
【０１５５】
抗体は、ペプチドなどのマーカー配列に融合されて、精製が容易にされ得る。いくつかの実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）中で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販される。例えば、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８２１−８２４，１９８９に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用なその他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープ対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：７６７  １９８４）、および「ｆｌａｇ」タグ（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（４）：７５４−７６１，１９９４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５６】
本発明はまた、それに対して生体内半減期の増大が所望される、診断薬または治療薬または任意のその他の分子にコンジュゲートされた抗体も包含する。抗体は、例えば、所与の治療計画の判効を能定するための臨床試験手順の一部として、疾患、障害または感染症の発症または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能物質と結合させることで促進され得る。検出可能物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能物質は、当該技術分野で公知の技術を使用して、抗体に直接、または（例えば、当該技術分野で公知のリンカーなどの）中間部を介して間接的にのいずれかで、結合またはコンジュゲートされてもよい。本発明に従って、診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートされ得る金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光材料の一例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃが挙げられる。
【０１５７】
抗体は、細胞毒（例えば、細胞分裂阻害または細胞破壊剤）、治療薬または放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体など）などの治療成分にコンジュゲートされてもよい。細胞毒または細胞毒性薬としては、細胞に有害な任意の薬剤が挙げられる。例としては、パクリタキソル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５８】
さらに、抗体は、所与の生物学的反応を改変する、治療薬または薬物成分にコンジュゲートされてもよい。治療薬または薬物成分は、古典的化学治療薬に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を保持するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、国際公開第９７／３３８９９号パンフレットで開示されるような、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭＩ）、ＡＩＭＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７−１５７４，１９９４）、およびＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレット）、血栓性薬剤または血管新生阻害剤（例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン）などのタンパク質；または例えば、リンフォカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、または増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））などの生物反応修飾物質が挙げられる。
【０１５９】
このような治療薬部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は、良く知られており；例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９８５，ｐｐ．２４３−５６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９８７，ｐｐ．６２３−５３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９８５，ｐｐ．４７５−５０６）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９８５，ｐｐ．３０３−１６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．，６２：１１９−５８，１９８２を参照されたい。
【０１６０】
それにコンジュゲートされた治療成分の存在下または不在下において、単独で、または細胞毒性要素および／またはサイトカインとの組み合わせで投与される抗体またはその断片は、治療薬として使用され得る。
【０１６１】
代案として、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｅｇａｌに付与された米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記載されるように、抗体が第２の抗体にコンジュゲートされて、ヘテロコンジュゲート抗体が形成され得る。
【０１６２】
抗体はまた、固体支持体に付着されてもよく、これは、特に、標的抗原の免疫測定法または精製に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６３】
融合タンパク質を生成する方法
融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術によって、または例えば、ペプチド合成装置の使用などのタンパク質合成技術によって生成され得る。例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、自動ＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成され得る。代案として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して実施され得、それは２つの連続的遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じ、引き続いてそれはアニールされ再増幅されて、キメラ遺伝子配列が生じる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照されたい）。さらに、生理活性分子をコードする核酸は、生理活性分子がインフレームで定常領域またはその断片に連結するように、Ｆｃ領域またはその断片を含有する発現ベクターにクローン化され得る。
【０１６４】
ポリペプチドを抗体定常領域に融合またはコンジュゲートさせる方法は、当該技術分野で公知である。例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、米国特許第５，６２２，９２９号明細書、米国特許第５，３５９，０４６号明細書、米国特許第５，３４９，０５３号明細書、米国特許第５，４４７，８５１号明細書、米国特許第５，７２３，１２５号明細書、米国特許第５，７８３，１８１号明細書、米国特許第５，９０８，６２６号明細書、米国特許第５，８４４，０９５、および米国特許第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；欧州特許第３９４，８２７号明細書；国際公開第９１／０６５７０号パンフレット、国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、国際公開第９６／２２０２４号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、および国際公開第９９／０４８１３号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５−１０５３９，１９９１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６，１９８８；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００，１９９５；およびＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１３３７−１１３４１，１９９２を参照されたい。
【０１６５】
生理活性分子をコードするヌクレオチド配列は、当業者が利用可能な任意の情報から得られてもよく（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋや文献から、または通例のクローニングによって）、ＦｃＲｎへの親和性の増大がある定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載される技術を使用して生じ変異の配列解析によって判定されてもよく、またはＧｅｎｂａｎｋまたは文献から得られてもよい。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。本発明では、多様な宿主−ベクター系を使用して、タンパク質コード配列が発現されてもよい。これらとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性が様々である。使用される宿主−ベクター系次第で、いくつかの適切な転写および翻訳要素のいずれか１つが使用されてもよい。
【０１６６】
融合タンパク質の発現は、当該技術分野で公知の任意のプロモーターまたはエンハンサー要素によって制御されてもよい。融合タンパク質をコードする遺伝子の発現制御で使用されてもよいプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウイルス３’長末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２，１９８２）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９５）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３７３１，１９７８）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５，１９８３、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０もまた参照されたい）；ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含んでなる植物発現ベクター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：２０９−２１３，１９８３）、またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：２８７１，１９８１）、および光合成酵素リブロース二リン酸（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１１５−１２０，１９８４）；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母またはその他の真菌からのプロモーター要素、および組織特異性を示して遺伝子組換え動物で利用されている、以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞内で活性である、エラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，５０：３９９−４０９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞内で活性である、インスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２，１９８５）、リンパ系細胞内で活性である、免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：６４７−６５��，１９８４；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８，１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４，１９８７）、精巣、乳房、リンパ系、および肥満細胞内で活性である、マウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４５：４８５−４９５，１９８６）、肝臓内で活性である、アルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：２６８−２７６，１９８７）、肝臓内で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８，１９８７；肝臓内で活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：１６１−１７１，１９８７）、骨髄性細胞内で活性である、β−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４，１９８６；脳内乏突起膠細胞内で活性である、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２，１９８７）；骨格筋内で活性である、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６，１９８５）；神経細胞内で活性である、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：５７１−８３，１９９９）；神経細胞内で活性である、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ．，２５３：８１８−８２３，１９９８）；星状細胞内で活性である、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２（５）：６１９−６３１，１９９９；Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：５７１−８３，１９９９）、および視床下部内で活性である、性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８，１９８６）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６７】
特定の実施形態では、融合タンパク質の発現は構成的プロモーターによって調節される。別の実施形態では、融合タンパク質の発現は誘導性プロモーターによって調節される。これらの実施形態に従って、プロモーターは組織特異的プロモーターであってもよい。
【０１６８】
特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結するプロモーターと、１つまたは複数の複製起点と、任意選択的に、１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）とを含んでなるベクターが使用される。
【０１６９】
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が使用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、融合タンパク質コード配列は、例えば、後期プロモーターおよび三区分リーダー配列などのアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲートされてもよい。次にこのキメラ遺伝子は、生体外または生体内組換えアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主中で生存能力があり、抗体分子を発現する能力がある、組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９，１９８４を参照されたい）。特定の開始シグナルもまた、挿入された融合タンパク質コード配列の効率的な翻訳に必要であってもよい。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列の読み枠と同調していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の多様な起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの包含によって増大されてもよい（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４，１９８７を参照されたい）。
【０１７０】
融合タンパク質をコードする遺伝子の挿入を含有する発現ベクターは、３つの基本アプローチによって同定され得る：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、発現ベクター中の融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、挿入された融合タンパク質コード遺伝子と相同的な配列を含んでなるプローブを使用した、核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主システムは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列のベクターへの挿入によって引き起こされる、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の包埋体形成など）の存在または不在に基づいて同定および選択され得る。例えば、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列がベクターのマーカー遺伝子配列に挿入される場合、融合タンパク質挿入物をコードする遺伝子を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定され得る。第３のアプローチでは、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される遺伝子産物（すなわち、融合タンパク質）をアッセイすることで同定され得る。このようなアッセイは、例えば、生体外アッセイシステムにおける、抗生理活性分子抗体との結合などの融合タンパク質の物理的または機能的性質に基づき得る。
【０１７１】
さらに、所望の特定の方法で、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を修飾してプロセッシングする宿主細胞株が選択されてもよい。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で増大され得、したがって、遺伝子操作された融合タンパク質の発現が制御されてもよい。さらに、異なる宿主細胞は、特徴的かつ特異的な翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾の機序を有する（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）。適切な細胞株または宿主システムは、発現される外来性タンパク質の所望の修飾およびプロセッシングを確実にするように選択され得る。例えば、細菌系中の発現は非グリコシル化産物を生して、酵母中発現はグリコシル化産物を生じる。一次転写産物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用されてもよい。このような哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ならびに特に、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫などの神経細胞系（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，７３：５１−５７，１９８４）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７０４：４５０−４６０，１９８２）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽細胞腫（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：１１４４−１１４８，１９９２）ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ神経膠芽腫細胞（Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２８Ａ：６０９−６１４，１９９２）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３０：２１１０−２１１８，１９７０）、１３２１Ｎ１ヒト星細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：４８１６，１９９７）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４９：２６９，１９８４）、Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽腫星細胞腫（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，７４：４６５−４８６，１９６８）、Ａ１７２ヒト神経膠芽腫（Ｏｌｏｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：２５２３−２５２９，１９９２）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（Ｂｅｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６１：３７０−３７１，１９６８）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６５：１２９−１３６，１９７０）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：１１８４−１１９０，１９６２）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４８：２１１−２２１，１９９４）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４Ｃａｔ正常星状細胞（Ｈａａｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５３：８２７−８３３，１９８５）、Ｍｐｆフェレット脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：９５２−９６０，１９８２）、および例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの、例えば、ＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常皮質脳などの、正常��胞系（Ｒａｄａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６４６７−６４７１，１９９２）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、プロセッシング反応に異なる程度に影響を与えてもよい。
【０１７２】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の生成のためには、安定発現が好ましい。例えば、融合タンパク質を安定して発現する細胞株が遺伝子操作されてもよい。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーで形質転換され得る。遺伝子操作細胞は、外来性ＤＮＡの導入に続いて富化培地中で１〜２日間増殖させ、次に、選択培地に切り替えてもよい。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定して組み込み、増殖して病巣形成できるようにして、次にそれは細胞株にクローン化され増殖され得る。この方法は、有利には、示差的に発現されるまたは経路遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために使用されてもよい。このような遺伝子操作細胞株は、示差的に発現されるまたは経路遺伝子タンパク質の内在性活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングおよび評価するのに特に有用であってもよい。
【０１７３】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３，１９９７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７，１９８０）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの選択系統が使用されてもよく、遺伝子は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で用いられ得る。また代謝拮抗剤耐性は、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７，１９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）遺伝子を選択するための基礎として使用し得る。
【０１７４】
本発明の融合タンパク質が組換え発現によって生成されると、それは、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、プロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度などの、タンパク質精製の技術分野で公知の任意の方法によって、または任意のその他のタンパク質精製標準技術によって精製されてもよい。
【０１７５】
抗体の予防的および治療的使用
本発明は、疾患、障害、または感染症に伴う症状を予防、治療、または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類などの動物に抗体を投与することを伴う、抗体ベースの治療法を包含する。本発明の予防的および治療的化合物としては、抗体および抗体をコードする核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。抗体は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載されるような、薬学的に許容可能な組成物中で提供されてもよい。
【０１７６】
疾患、障害、または感染症の拮抗薬として機能する本発明の抗体は、疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない哺乳類などの動物に投与され得る。例えば、ウイルス抗原とその宿主細胞受容体との間の相互作用を中断または阻止する抗体は、ウイルス感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない哺乳類などの動物に投与されてもよい。
【０１７７】
ウイルスまたは細菌抗原とその宿主細胞受容体との結合を阻止しないが、ウイルスまたは細菌の複製を阻害または下方制御する抗体もまた、ウイルスまたは細菌感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、動物に投与され得る。抗体が、ウイルスまたは細菌複製阻害または下方制御する能力は、本明細書に記載される、またはさもなければ当該技術分野で公知の技術によって判定されてもよい。例えば、ウイルス複製の阻害または下方制御は、動物中のウイルス力価を検出することで判定され得る。
【０１７８】
抗体はまた、がん性細胞の増殖または転移を予防し、阻害しまたは低下させるのに使用され得る。がんの例としては、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病などの急性白血病）、新生物、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣の腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮性がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、音響神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）、重鎖病、転移、または無制御な細胞成長によって特徴付けられるあらゆる疾患または障害が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７９】
抗体はまた、炎症性疾患がある動物、特に哺乳類が経験している炎症を低下させるのに使用され得る。炎症性疾患の例としては、関節リウマチ、脊椎関節症、炎症性腸疾患、および喘息が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１８０】
抗体はまた、移植片拒絶反応を予防するのに使用され得る。抗体はまた、血餅形成を予防するのに使用され得る。さらに、免疫応答の作動薬として機能する抗体はまた、疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類などの動物に投与され得る。
【０１８１】
１つまたは複数の抗原と免疫特異的に結合する１つまたは複数の抗体は、治療薬として、局所または全身性に使用されてもよい。本発明の抗体はまた、有利には、その他のモノクローナルまたはキメラ抗体との、またはリンフォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７などの）との組み合わせで使用されてもよく、それは、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性の増大に役立つ。本発明の抗体はまた、有利には、その他のモノクローナルまたはキメラ抗体との、またはリンフォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７などの）との組み合わせで使用されてもよく、それは、例えば、免疫応答の増大に役立つ。本発明の抗体はまた、有利には、例えば抗がん剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤などの疾患、障害、または感染症を治療するのに使用される、１つまたは複数の薬物との組み合わせで使用されてもよい。抗がん剤の例としては、イスプラチン（ｉｓｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−１１、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、およびタキソールが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗ウイルス因子の例としては、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、Ｄ４Ｔ、ｄｄＣ、ｄｄＩ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、アデフォビル、エファビレンツ、デラビルジン、ネビラピン、アバカビル、およびその他のジデオキシヌクレオシドまたはジデオキシフルオロヌクレオシド）、リバビリンなどのウイルスｍＲＮＡキャッピング阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤（例えば、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビル）、アンホテリシンＢ、糖タンパク質プロセッシング阻害剤としてのカスタノスペルミン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤などのノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビルおよびオセルタミビル）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシンおよびそのアナログ）、アマンタジン、およびリマンタジンが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗炎症剤の例としては、ＣＯＸ−２阻害剤などの非ステロイド系抗炎症薬（例えば、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、フロスリド、およびＳＣ−５８６３５、およびＭＫ−９６６）、イブプロフェンおよびインドメタシン、およびステロイド（例えば、デフラザコート、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１８２】
特定の実施形態では、動物に投与される抗体は、動物の生物種と同一の生物種起源または生物種反応性である。したがって、一実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体、またはヒトまたはヒトをコードする核酸が、治療法または予防法のためにヒト患者に投与される。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、生体内半減期の半減期増大を有する免疫グロブリンが、受動免疫療法で使用される（治療法または予防法のいずれかのために）。半減期増大の理由から、受動的免疫療法または予防法は、治療薬のより低用量および／またはより低頻度の投与を使用して達成され得、より少ない副作用、より良い患者の服薬遵守、より安価な治療法／予防法などがもたらされる。
【０１８４】
特定の実施形態では、動物に投与される融合タンパク質は、動物の生物種と同一の生物種起源または生物種反応性である。したがって、一実施形態では、ヒト融合タンパク質またはヒト融合タンパク質をコードする核酸が、治療法または予防法のためにヒト対象に投与される。
【０１８５】
融合タンパク質およびコンジュゲート分子の予防的および治療的使用
本発明は、疾患、障害、または感染症に伴う症状を予防、治療、または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類などの動物に、融合タンパク質またはコンジュゲート分子を投与することを伴う、融合タンパク質に基づくおよびコンジュゲート分子に基づく治療法を包含する。本発明の予防的および治療的化合物としては、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸、およびコンジュゲート分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。融合タンパク質およびコンジュゲート分子は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載されるような、薬学的に許容可能な組成物中で提供されてもよい。
【０１８６】
疾患、障害、または感染症の拮抗薬として機能する本発明の融合タンパク質およびコンジュゲート分子は、疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない哺乳類などの動物に投与され得る。さらに、免疫応答および作動薬として機能する本発明の融合タンパク質およびコンジュゲート分子は、疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない哺乳類などの動物に投与されてもよい。
【０１８７】
１つまたは複数の融合タンパク質およびコンジュゲート分子は、治療薬として局所または全身性に使用されてもよい。本発明の融合タンパク質およびコンジュゲート分子はまた、有利には、モノクローナルまたはキメラ抗体との、またはリンフォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７などの）との組み合わせで使用されてもよく、それは、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性の増大に役立つ。本発明の融合タンパク質およびコンジュゲートされた分子はまた、有利には、モノクローナルまたはキメラ抗体との、またはリンフォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７などの）との組み合わせで使用されてもよく、それは、例えば、免疫応答の増大に役立つ。本発明の融合タンパク質およびコンジュゲート分子はまた、有利には、例えば抗がん剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤などの疾患、障害、または感染症を治療するのに使用される、１つまたは複数の薬物との組み合わせで使用されてもよい。抗がん剤の例としては、イスプラチン（ｉｓｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−１１、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、およびタキソールが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗ウイルス因子の例としては、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、Ｄ４Ｔ、ｄｄＣ、ｄｄＩ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、アデフォビル、エファビレンツ、デラビルジン、ネビラピン、アバカビル、およびその他のジデオキシヌクレオシドまたはジデオキシフルオロヌクレオシド）、リバビリンなどのウイルスｍＲＮＡキャッピング阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤（例えば、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビル）、アンホテリシンＢ、糖タンパク質プロセッシング阻害剤としてのカスタノスペルミン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤などのノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビルおよびオセルタミビル）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシンおよびそのアナログ）、アマンタジン、およびリマンタジンが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗炎症剤の例としては、ＣＯＸ−２阻害剤などの非ステロイド系抗炎症薬（例えば、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、フロスリド、およびＳＣ−５８６３５、およびＭＫ−９６６）、イブプロフェンおよびインドメタシン、およびステロイド（例えば、デフラザコート、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１８８】
抗体または融合タンパク質の投与
本発明は、本発明の抗体または本発明の抗体を含んでなる医薬組成物の有効量を対象に投与することで、疾患、障害または感染に伴う、１つまたは複数の症状の治療、予防、および改善する方法を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子を含んでなる医薬組成物の有効量を対象に投与することで、疾患、障害または感染に伴う１つまたは複数の症状の治療、予防、および改善する方法もまた提供する。一態様では、抗体または融合タンパク質またはコンジュゲート分子は、実質的に精製される（すなわち、その効果を制限しまたは望まれない副作用を生じさせる物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、対象は動物であり、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）などの哺乳類および霊長類（例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト）である。一実施形態では、対象はヒトである。
【０１８９】
例えば、リポソーム内カプセル化、微粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現する能力がある組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照されたい）、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸構築などの様々な送達系が知られており、抗体または融合タンパク質またはコンジュゲートされた本発明の分子を投与するのに利用され得る。抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート分子、または医薬組成物を投与する方法としては、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および経口経路）が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または医薬組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下投与される。組成物は、例えば、輸液またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜（例え、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収などの任意の好都合な経路によって投与されてもよく、その他の生物学的活性剤に加えて投与されてもよい。投与は、全身のまたは局所性であり得る。さらに、例えば、吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤含有製剤の使用などによる、肺投与もまた用いられ得る。例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，０１９，９６８号明細書；米国特許第５，９８５、３２０号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，９３４，２７２号明細書；米国特許第；５，８７４，０６４号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，２９０，５４０号明細書；および米国特許第４，８８０，０７８号明細書；および国際公開第９２／１９２４４号パンフレット；国際公開第９７／３２５７２号パンフレット；国際公開第９７／４４０１３号パンフレット；国際公開第９８／３１３４６号パンフレット；および国際公開第９９／６６９０３号パンフレットを参照されたい。一実施形態では、抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または医薬組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（商標）肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して投与される。
【０１９０】
本発明は、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の量を表示するアンプルまたは小袋などの密閉容器にパッケージされた、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子もまた提供する。一実施形態では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、密閉容器内の乾燥滅菌された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として提供されて、例えば、水または生理食塩水で、対象への投与に適した濃度に再構成され得る。一実施形態では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位用量で、密閉容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として提供される。凍結乾燥抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、そのオリジナル容器内で２および８℃で保存されるべきであり、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、再構成後１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間または１時間以内に投与されるべきである。代替実施形態では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示する密閉容器中の液体形態で提供される。一実施形態では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の液体形態は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌで密閉容器内に提供される。
【０１９１】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましくあってもよく；これは、例えば、限定としてではなく、注射による局所注入によって、または移植片の手段によって達成されてもよく、前記移植片は、シラスティック膜、または繊維などのメンブレンをはじめとする、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様物質である。任意選択的に、抗体または融合タンパク質を投与する際に、抗体または融合タンパク質を吸収しない材料を使用するように注意が払われる。
【０１９２】
組成物は、任意選択的に、小胞、特にリポソーム中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３，１９９０；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３  １７−３２７を参照されたい；一般に同文献を参照されたい）。
【０１９３】
組成物は、任意選択的に、制御放出または持続性の放出系内で送達され得る。当業者に公知の任意の技術を使用して、１つまたは複数の抗体、または１つまたは複数の融合タンパク質を含んでなる徐放性製剤が製造され得る。例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，５２６，９３８号明細書；国際公開第９１／０５５４８号パンフレット；国際公開第９６／２０６９８号パンフレット；Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ，”Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：１７９−１８９，１９９６；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５０：３７２−３９７，１９９５；Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：８５３−８５４，１９９７；およびＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９−７６０，１９９７を参照されたい。一実施形態では、制御放出系でポンプが使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７，１９８０；およびＳａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４，１９８９を参照されたい）。任意選択的に、高分子材料を使用して、抗体または融合タンパク質の制御放出が達成され得る（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３：６１，１９８３；ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０，１９８５；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅ���ｒｏｓｕｒｇ．，７  １：１０５，１９８９）；米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；国際公開第９９／１５１５４号パンフレット；および国際公開第９９／２０２５３号パンフレットを参照されたい）。任意選択的に、制御放出系は、治療標的（例えば、肺）の近くに配置させ得、したがって全身性用量のごく一部のみが必要である（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。
【０１９４】
その他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３，１９９０）によるレビューで考察される。
【０１９５】
本発明の組成物が、抗体または融合タンパク質をコードする核酸である特定の実施形態では、核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、それが細胞内に入るようにそれを投与することで、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号明細書を参照されたい）、または直接的注射によって、または微粒子衝撃の使用によって（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤で被覆することで、またはそれを核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４−１８６８，１９９１を参照されたい）などによって、生体内に投与されて、そのコードする抗体または融合タンパク質の発現が促進され得る。代案として、核酸は、相同組換えによって細胞内に導入され、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０１９６】
本発明は、医薬組成物もまた提供する。このような組成物は、予防または治療有効量の抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート分子と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、およびより特にはヒトで使用するために、連邦または州政府の監督官庁によって認可され、または米国薬局方またはその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、それと共に治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全および不完全、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））などのヒトにとって潜在的に有用なアジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの鉱油、動物、植物または合成起源をはじめとする、水および油などの滅菌液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の適切な担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、特に、注射液のための液体担体として用いられ得る。適切な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態を取り得る。経口製剤は、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含み得る。適切な薬学的担体の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載される。このような組成物は、患者に適切な投与形態を提供するように、適当量の担体と共に、任意選択的に精製形態で、抗体またはその断片、または融合タンパク質またはコンジュゲート分子を予防または治療有効量で含有する。製剤は、投与方法に適するべきである。
【０１９７】
一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応された医薬組成物として、日常的手技に従って調合される。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔薬を含み、注射部位の疼痛を緩和させてもよい。
【０１９８】
通常、本発明の組成物の成分は、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルまたは小袋などの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位用量剤形で、別々にまたは合わせてのいずれかで提供される。組成物が輸液によって投与される場合、それは滅菌製薬等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与に先だって混合されてもよいように、無菌注射用水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１９９】
本発明の組成物は、中性または塩形態で調合され得る。薬学的に許容可能な塩としては、塩化水素、リン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸などに由来するものなどのア二オンで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインに由来するものなどのカチオンで形成されるものなどが挙げられる。
【０２００】
疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状治療、予防または改善に有効な本発明の組成物の量は、標準臨床技術によって判定され得る。用いられる配合物の精密な用量は、投与経路、対象年齢、および疾患、障害、または感染症の重篤性に左右され、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、生体外または動物モデル（例えば、コットンラットまたはカニクイザル）試験系から誘導される用量応答曲線から外挿されてもよい。
【０２０１】
融合タンパク質では、対象に投与される治療または予防有効投与量は、約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。抗体では、対象に投与され治療または予防有効投与量は、典型的に、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ対象体重である。一実施形態では、対象に投与される用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ対象体重である。例えば、対象に投与される用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ対象体重であり得る。しかし、用量は、生体内の分子半減期が増大される程度に左右される。通常、ヒト抗体およびヒト融合タンパク質は、外来性ポリペプチドに対する免疫応答のために、その他の生物種に由来する融合タンパク質の抗体よりも、人体中で長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体またはヒト融合タンパク質は、より低用量およびより低頻度の投与が可能であることが多い。さらに、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の投与の用量および頻度はまた、例えば、脂質化などの修飾による抗体または融合タンパク質（例えば、肺内への）取り込みおよび組織透過の促進によって低下されてもよい。
【０２０２】
抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の治療または予防有効量による対象の治療は、単回治療を含み得るか、または一連の治療を含み得る。一例では、対象は、約１〜１０週間、２〜８週間、約３〜７週間、または約４、５、または６週間にわたり、週に１回、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子で治療される。いくつかの実施形態では、本発明の薬剤組成物は、１日に１回、１日に２回、または１日に３回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、週に１回、週２回、隔週１回、月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、年に２回または年に１回投与される。治療に使用される抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の有効投与量は、特定の治療過程にわたって、増大または低下してもよいことが理解される。
【０２０３】
遺伝子治療
特定の実施形態では、遺伝子治療の手段として、疾患、障害、または感染症に伴う１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するために、抗体または融合タンパク質をコードする配列を含んでなる核酸が投与される。遺伝子治療は、発現された、または発現できる核酸を対象に投与することで実施される、治療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸はそれらがコードする抗体または融合タンパク質を生成し、それは治療または予防的効果を媒介する。
【０２０４】
当該技術分野で利用できる遺伝子治療法のいずれも本発明に従って利用され得る。代表的方法は、以下に記載される。
【０２０５】
遺伝子治療法の概評については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１２：４８８−５０５，１９９３；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３：８７−９５，１９９１；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６，１９９３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２，１９９３；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７，１９９３；ＴＩＢＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５，１９９３を参照されたい。利用され得る当該技術分野で一般に公知の組換えＤＮＡ技術法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２０６】
一態様では、本発明の組成物は、抗体をコードする核酸を含んでなり、前記核酸は、適切な宿主中で抗体を発現する発現ベクターの一員である。具体的には、このような核酸は、抗体コード領域と作動可能に連結する、異種または同種プロモーターであり得るプロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性または構成的であり、任意選択的に、組織特異的である。別の特定の実施形態では、その中で、抗体コード配列および任意のその他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域で挟まれる核酸分子が使用され、したがって抗体をコードする核酸の染色体内発現が提供される（Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２−８９３５，１９８９；およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５−４３８，１９８９）。
【０２０７】
別の態様では、本発明の組成物は、融合タンパク質をコードする核酸を含んでなり、前記核酸は、適切な宿主中で融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部である。具体的には、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と作動可能に連結する、異種または同種プロモーターであり得るプロモーターを有し、前記プロモーターは誘導性または構成的であり、任意選択的に、組織特異的である。別の特定の実施形態では、その中で融合タンパク質のコード配列、および任意のその他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域で挟まれる核酸分子が利用されて、したがって融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現が提供される。
【０２０８】
対象への核酸の送達は、対象が核酸または核酸運搬ベクターに直接曝露される直接的送達、または細胞が生体外で最初に核酸で形質転換される間接的送達のいずれであってもよく、次に対象に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれ生体内または生体外遺伝子治療として知られている。
【０２０９】
特定の実施形態では、核酸配列は生体内に直接投与されてそこで発現され、コードされる産物が生成する。これは、例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、細胞内に入るようにそれを投与することで、例えば、欠陥または弱毒型レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを使用して感染させることで（米国特許第４，９８０，２８６号明細書を参照されたい）、または裸のＤＮＡの直接注射によって、または微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質または細胞表面受容体または形質移入剤で被覆することで、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中のカプセル化によって、またはそれら核に入ることが知られているペプチドに酸欠させて投与することで、それを受容体媒介性エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結させて投与すること（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照されたい）（これは受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するのに使用され得る）などの当該技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る。別の実施形態では、核酸リガンド複合体が形成され得、その中では、リガンドが融合性ウイルスペプチドを含んでなり、エンドソームを妨害して核酸がリソソーム分解を回避できるようにする。さらに別の実施形態では、核酸は、特有の受容体を標的化することで、細胞特異的取り込みおよび発現のために生体内で標的化され得る（例えば、国際公開第号９２／０６１８０パンフレット；国際公開第９２／２２６３５号パンフレット；国際公開第号パンフレット９２／２０３１６；国際公開第号パンフレット９３／１４１８８；国際公開第号パンフレット９３／２０２２１を参照されたい）。代案として、核酸は、相同組換えによって細胞内に導入され、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２−８９３５，１９８９；およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５−４３８，１９８９）。
【０２１０】
特定の実施形態では、抗体またはａ融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：５８１−５９９，１９９３を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。遺伝子治療で使用される抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列は、対象へのヌクレオチド配列の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、化学療法に耐性のある幹細胞作成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，６：２９１−３０２，１９９４にある。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３：６４４−６５１，１９９４；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３，１９９４；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：１２９−１４１，１９９３；およびＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，３：１１０−１１４，１９９３である。
【０２１１】
アデノウイルは、遺伝子治療で使用され得るその他のウイルスベクターである。アデノウイルは、遺伝子を気道上皮に送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは、気道上皮に天然に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系のその他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：４９９−５０３，１９９３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を提示する。Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：３−１０，１９９４は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入させる、アデノウイルスベクターの使用を実証する。遺伝子治療におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５，１９９２；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２２５−２３４，１９９３；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２：７７５−７８３，１９９５に見られる。一実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２１２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療利用するために提案されている（例えば、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０４：２８９−３００，１９９３，および米国特許第５，４３６，１４６号明細書を参照されたい）。
【０２１３】
遺伝子治療のための別のアプローチは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介形質移入、またはウイルス感染などの方法によって、組織培養物中の細胞に遺伝子を移入することを伴う。通常、移入する方法は、細胞に選択可能なマーカーを移入することを含む。次に細胞は、選択されて、移入遺伝子を取り込んで発現した細胞が単離される。次にこれらの細胞は、対象に送達される。
【０２１４】
この実施形態では、得られる組換え細胞の生体内投与に先だって、核酸が細胞内に導入される。このような導入は、形質移入、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、微小核体媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などをはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施され得る。外来遺伝子を細胞に導入する多数の技術が、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：５９９−６１８，１９９３；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：６１８−６４４，１９９３；およびＣｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｈｅｒ．，２９：６９−９２，１９８５を参照されたい）、受容体細胞の必要な発達的および生理学的機能が妨害されないという条件で、本発明に従って使用されてもよい。技術は、細胞によって核酸が発現され得、任意選択的に遺伝性でその細胞子孫によって発現され得るように、細胞への核酸の安定した移入を提供するべきである。
【０２１５】
得られた組換え細胞は、様々な当該技術分野で公知の方法によって対象に送達され得る。例えば、組換え血液細胞（例えば、造血幹または前駆細胞）は、静脈内投与され得る。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに左右されて、当業者によって判定され得る。
【０２１６】
遺伝子治療の目的でその中に核酸が導入され得る細胞は、あらゆる所望の利用できる細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝実質細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるような造血幹または前駆細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２１７】
一実施形態では、遺伝子治療のために使用される細胞は、対象の自己由来細胞である。
【０２１８】
その中で組換え細胞が遺伝子治療で使用される一実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫によってそれらが発現できるように細胞内に導入されて、次に、組換え細胞が、治療効果のために生体内投与される。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が使用される。単離され生体外で維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明の実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、国際公開第９４／０８５９８号パンフレット；Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ，７  １：９７３−９８５，１９９２；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２１Ａ：２２９，１９８０；およびＰｉｔｔｅｌｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．，６１：７７１，１９８６を参照されたい）。
【０２１９】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と作動可能に連結する誘導性プロモーターを含んでなり、核酸の発現は、適切な転写誘導物質の存在または不在を制御することで、制御可能である。
【０２２０】
治療的または予防的効用の特性決定および実証
本発明の抗体、融合タンパク質、およびコンジュゲート分子は、多様な方法で特性決定されてもよい。具体的には、本発明の抗体は、抗原に免疫特異的に結合する能力について、アッセイされてもよい。このようなアッセイは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：４１２−４２１，１９９２）、ビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１，チップ上（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５５−５５６，１９９３）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８６５−１８６９，１９９２）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６，１９９０；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２，１９９０；およびＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１−３１０，１９９１）で実施されてもよい（これらの参考文献のそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。抗原またはその断片に免疫特異的に結合することが同定された抗体は、次に、それらの特異的抗原親和性についてアッセイされ得る。
【０２２１】
本発明の抗体またはそれらの断片は、当該技術分野で公知の任意の方法によって、抗原に対する免疫特異性結合、およびその他の抗原との交差反応性についてアッセイされてもよい。免疫特異性結合および交差反応性を分析するのに使用され得る免疫測定法としては、数例として、ウエスタンブロットなどの技術を使用した競合および非競合アッセイシステム、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法が挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなアッセイは、当該技術分野で通例かつ周知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。代表的な免疫測定法は、以下に簡単に説明される（しかし、限定は意図されない）。
【０２２２】
免疫沈降法プロトコルは、通常、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）が添加されたＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）などの溶解緩衝液中で細胞集団を溶解させ、関心のある抗体を細胞溶解産物に添加して、４０℃で一定時間（例えば、１〜４時間）インキュベートし、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解産物に添加して、４０℃で約１時間以上インキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、ビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再懸濁することを含んでなる。関心のある抗体が、特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原への抗体の結合を増大させ、バックグラウンドを低下させるために修正され得るパラメータに関する知識を有するであろう（例えば、セファロースビーズによる細胞溶解産物の予備排除）。免疫沈降法プロトコルに関するさらなる考察は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．１６．１を参照されたい。
【０２２３】
ウエスタンブロット分析は、通常、タンパク質サンプルを調製し、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量次第で８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどのメンブレンに移し、メンブレンをブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳添加ＰＢＳ）でブロックして、メンブレンを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−ツイーン２０）中で洗浄し、メンブレンをブロック緩衝液で希釈された一次抗体（関心のある抗体）でブロックし、メンブレンを洗浄緩衝液中で洗浄し、メンブレンをブロック緩衝液で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートされた二次抗体（例えば、一次抗体を認識する抗ヒト抗体などの抗体）でブロックして、メンブレンを洗浄緩衝液中で洗浄し、抗原の存在を検出することを含んでなる。当業者は、検出シグナルを増大させて、バックグラウンドノイズを低下させるために修正され得るパラメータに関する知識を有するであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．８．１を参照されたい。
【０２２４】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆して、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能化合物にコンジュゲートされた関心のある抗体をウェルに添加して、一定時間インキュベートし、抗原の存在を検出することを含んでなる。ＥＬＩＳＡでは、関心のある抗体が検出可能化合物にコンジュゲートされる必要はない；むしろ、検出可能化合物にコンジュゲートされた（関心のある抗体を認識する）第２の抗体が、ウェルに添加されてもよい。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、ウェルを抗体で被覆してもよい。この場合、検出可能化合物にコンジュゲートされた第２の抗体は、被覆ウェルへの関心のある抗原の添加に続いて添加されてもよい。当業者は、検出シグナルを増大させるために修正され得るパラメータ、ならびに当該技術分野で公知のその他のＥＬＩＳＡのバリエーションに関する知識を有するであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １１．２．１を参照されたい。
【０２２５】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフ速度は、競合結合アッセイによって判定され得る。競合結合アッセイの一例は、増大する量の未標識抗原の存在下における、標識（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）抗原と、関心のある抗体とのインキュベーション、および標識抗原と結合した抗体の検出を含んでなる、放射免疫測定法である。抗原に対する本発明の抗体またはその断片の親和性、および結合オフ速度は、スキャッチャード分析によって飽和データから判定され得る。第２の抗体との競合はまた、放射免疫測定法を使用して判定され得る。この場合、抗原は、増大する量の未標識の第２の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートされた本発明の抗体またはその断片と共にインキュベートされる。
【０２２６】
一実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析を使用して、抗原に対する抗体の結合およびオフ速度が判定される。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、それらの表面に固定化抗体があるチップからの、抗原の結合および分離を解析することを含んでなる。
【０２２７】
本発明の抗体ならびに融合タンパク質およびコンジュゲート分子はまた、当業者に知られている技術を使用して、その宿主細胞受容体に対する抗原の結合を阻害するそれらの能力についてアッセイされ得る。例えば、抗体の存在または不在下で、ウイルス抗原の受容体を発現する細胞にウイルスを接触させて、フローサイトメトリーまたはシンチレーションカウンターによって、抗体がウイルス抗原の結合を阻害する能力が測定され得る。抗原または抗体を放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、および１２５Ｉ）または蛍光標識（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミン）などの検出可能化合物で標識し、抗原とその宿主細胞受容体の間の相互作用を検出できるようにし得る。代案として、抗原がその受容体と結合するのを阻害する抗体の能力は、無細胞アッセイによって判定され得る。例えば、無細胞アッセイでは、ウイルスまたはウイルス抗原（例えば、ＲＳＶＦ糖タンパク質）が抗体に接触され得、ウイルスまたはウイルス抗原がその宿主細胞受容体に結合するのを阻害する抗体の能力が判定され得る。任意選択的に、抗体が固体担体上に固定化されて、抗原が検出可能化合物で標識される。代案として、抗原が固体担体上に固定化されて、抗体が検出可能化合物で標識される。抗原は、部分的にまたは完全に精製されてもよく（例えば、その他のポリペプチドを部分的にまたは完全に含まない）、または細胞溶解産物の一部であってもよい。さらに、抗原は、ウイルス抗原とグルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの領域とを含んでなる融合タンパク質であってもよい。代案として、抗原は、当業者に周知の技術を使用してビオチン化され得る（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【０２２８】
本発明の抗体、融合タンパク質、およびコンジュゲート分子はまた、当業者に知られている技術を使用して、ウイルスまたは細菌複製を阻害または下方制御するそれらの能力についてアッセイされ得る。例えば、ウイルス複製は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７６：１２１５−１２２４，１９９７に記載されるような溶菌斑アッセイによってアッセイされ得る。本発明の本発明の抗体、融合タンパク質、およびコンジュゲート分子はまた、ウイルスまたは細菌ポリペプチドの発現を阻害または下方制御するそれらの能力についてアッセイされ得る。ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、およびＲＴ−ＰＣＲをはじめとするが、これに限定されるものではない、当業者に知られている技術を使用して、ウイルスまたは細菌ポリペプチドの発現が測定され得る。さらに、本発明の本発明の抗体、融合タンパク質、およびコンジュゲート分子は、シンシチウム形成を妨げるそれらの能力についてアッセイされ得る。
【０２２９】
本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、および組成物は、任意選択的に、ヒトにおける使用前に、所望の治療的または予防的活性について、生体外で、次に生体内で試験される。例えば、本発明の特定の抗体、特定の融合タンパク質、特定のコンジュゲート分子、または組成物の投与が適応されるかどうかを判定するのに使用され得る生体外アッセイは、その中で、対象組織サンプルが培養され、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物に曝露されまたは別の方法で投与されて、このような本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物の効果が組織サンプル上で観察される、生体外細胞培養アッセイを含む。様々な特定の実施形態では、疾患または障害に関与する細胞型の典型的な細胞を用いて生体外アッセイが実施されて、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物が、このような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかが判定され得る。任意選択的に、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物は、ヒトへの投与に先だって、生体外アッセイおよび動物モデル系でもまた試験される。
【０２３０】
治療法で使用される本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物は、ラット、マウス、ウシ、サル、およびウサギをはじめとするが、これに限定されるものではない、適切な動物モデル系において、それらの毒性について試験され得る。抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物の毒性のための生体内試験では、当該技術分野で公知の任意の動物モデル系が使用されてもよい。
【０２３１】
ウイルス感染症を治療または予防する効力は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物が、ウイルス複製を阻害し、ウイルス感染を阻害し、またはウイルスが宿主内で確立するのを防ぎ、またはウイルス感染症に伴う１つまたは複数の症状を予防、改善または軽減する能力を検出することで、実証されてもよい。例えば、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物の投与に続いて、ウイルス負荷の低下、１つまたは複数の症状の改善、または死亡率および／または罹患率の低下があれば、処置は治療的であると見なされる。本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物はまた、生体外および生体内アッセイで、ウイルス複製を阻害しまたはウイルス負荷低下させるそれらの能力について試験され得る。
【０２３２】
細菌感染症を治療または予防する効力は、本発明の抗体、融合タンパク質または組成物が、細菌複製を阻害するか、細菌感染症に伴う１つまたは複数の症状を予防、改善または緩和する能力を検出することで実証されてもよい。例えば、本発明の抗体、融合タンパク質、または組成物の投与に続いて、細菌数の低下、１つまたは複数の症状の改善、または死亡率および／もしくは罹患率の低下があれば、処置は治療的であると見なされる。
【０２３３】
がん治療における効力は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子または組成物が、がん性細胞の増殖または転移を阻害しまたは低下させるか、がんに伴う１つまたは複数の症状を改善または緩和する能力を検出することで実証されてもよい。例えば、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物の投与に続いて、がん性細胞の増殖または転移の低下、がんに伴う１つまたは複数の症状の改善、または死亡率および／もしく罹患率の低下があれば、処置は治療的であると見なされる。本発明の抗体、融合タンパク質または組成物は、試験管内、生体外、および生体内アッセイで、腫瘍形成を低下させるそれらの能力について試験され得る。
【０２３４】
炎症性疾患を治療する効力は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物が、動物において炎症を低下させまたは阻害するか、炎症性疾患に伴う１つまたは複数の症状を改善または軽減する能力を検出することで実証されてもよい。例えば、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物の投与に続いて、炎症の低下または１つまたは複数の症状の改善があれば、処置は治療的であると見なされる。
【０２３５】
本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物は、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５）および活性化マーカー（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、およびＳＬＡＭ）の発現を誘導する能力について、生体外および生体内で試験され得る。当業者に知られている技術を使用して、サイトカインおよび活性化マーカーの発現レベルが測定され得る。例えば、サイトカインの発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析によって、サイトカインのＲＮＡレベルを分析し、例えば、免疫沈降法と、それに続くウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡによって、サイトカインレベルを分析することで測定され得る。
【０２３６】
本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物は、生体外および生体内で、例えば、ヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ−細胞、およびナチュラルキラー細胞）などの免疫細胞の生物学的活性を調節する、それらの能力について試験され得る。本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物が、免疫細胞の生物学的活性を調節する能力は、抗原の発現を検出し、免疫細胞増殖を検出し、シグナル伝達分子の活性化を検出し、免疫細胞のエフェクター機能を検出し、または免疫細胞の分化を検出することで評価され得る。当業者に知られている技術を使用して、これらの機能が測定され得る。例えば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイおよびトリパンブルー細胞計数によってアッセイされ得る。抗原発現は、例えば、ウエスタンブロットなどの技術を使用した競合および非競合アッセイシステム、免疫組織化学的検査、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法およびＦＡＣＳ分析をはじめとするが、これに限定されるものではない、免疫測定法によってアッセイされ得る。シグナル伝達分子の活性化は、例えば、キナーゼアッセイおよび電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってアッセイされ得る。
【０２３７】
本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物はまた、疾患、障害、または感染症に罹患している、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類などの動物の生存期間を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％増大させる、それらの能力について試験され得る。さらに、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、または組成物は、疾患、障害、または感染症に罹患している、ヒトをはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類などの動物の入院期間を少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下させる、それらの能力について試験され得る。当業者に知られている技術を使用して、生体内で本発明の抗体または組成物機能が分析され得る。
【０２３８】
抗体および融合タンパク質の診断用途
本発明の標識抗体、融合タンパク質、およびコンジュゲート分子は、疾患、障害または感染症を検出、診断、またはモニターするための診断目的で使用され得る。本発明は、以下を含んでなる、疾患、障害または感染症の検出または診断を提供する：（ａ）抗原と免疫特異的に結合する１つまたは複数の抗体を使用して、対象の細胞または組織サンプル中の抗原の発現をアッセイし；および（ｂ）抗原のレベルを例えば、正常組織サンプル中のレベルなどの対照レベルと比較して、それによって対照抗原レベルと比較したアッセイされた抗原レベルの増大が、疾患、障害または感染症の徴候となる。本発明は、（ａ）抗原に結合する本発明の１つのまたは融合タンパク質またはコンジュゲートされた分子を使用して、対象の細胞または組織サンプル中で抗原の発現をアッセイし；および（ｂ）抗原のレベルを例えば、正常組織サンプル中のレベルなどの対照レベルと比較して、それによって対照抗原レベルと比較した増大が、疾患、障害または感染症の徴候となることを含んでなる、疾患、障害または感染症の検出または診断もまた提供する。したがって、融合タンパク質またはコンジュゲート分子は、リガンド、サイトカインまたは成長因子、およびヒンジＦｃ領域またはその断片などの生理活性分子を含んでなり、抗原に結合できる融合タンパク質またはコンジュゲート分子が検出される。
【０２３９】
本明細書に記載されるようなまたは当業者に知られている古典的免疫組織的方法を使用して、本発明の抗体を使用して、生物学的サンプル中の抗原レベルがアッセイされ得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１：９７６−９８５，１９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０５：３０８７−３０９６，１９８７を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用なその他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ）などの免疫測定法が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該技術分野で公知であり、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位体；ルミノールなどのルミネセンス標識；ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識などが挙げられる。
【０２４０】
例えば、当業者に知られているＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫測定法を使用して、融合タンパク質を使用して、生物学的サンプル中の抗原レベルがアッセイされ得る。
【０２４１】
本発明の一態様は、ヒトにおける疾患、障害、または感染症の検出および診断である。一実施形態では、診断は、ａ）抗原と免疫特異的に結合する標識抗体の有効量を対象に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内）投与し；ｂ）投与に続いて一定時間待機して、そこで抗原が発現される対象中の部位に、標識抗体を優先的に集中させ（非結合標識分子はバックグラウンドレベルに除去される）；ｃ）バックグラウンドレベルを判定し；およびｄ）対象中の標識抗体を検出し、バックグラウンドレベルを超える標識抗体の検出が、対象が疾患、障害、または感染症を有することを示唆することを含んでなる。この実施形態に従って、抗体は、当業者に知られているイメージングシステムを使用して検出可能である、イメージング部分で標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定システムについてあらかじめ判定された標準値と比較することをはじめとする、様々な方法によって判定され得る。
【０２４２】
別の実施形態では、診断は、ａ）抗原またはいくつかのその他の分子と結合する標識融合タンパク質またはコンジュゲート分子の有効量を対象に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内）投与し；ｂ）投与に続いて一定時間待機して、そこで抗原またはその他の分子が発現される対象中の部位に、標識融合タンパク質またはコンジュゲート分子を優先的に集中させ（非結合標識分子はバックグラウンドレベルに除去される）；ｃ）バックグラウンドレベルを判定し；およびｄ）対象中の標識融合タンパク質またはコンジュゲート分子を検出し、バックグラウンドレベルを超える標識融合タンパク質検出が、対象が疾患、障害、または感染症を有することを示唆することを含んでなる。この実施形態に従って、融合タンパク質またはコンジュゲート分子は、リガンド、サイトカインまたは成長因子、および修飾ＩｇＧまたは（例えば、Ｆｃ領域もしくはヒンジＦｃ領域などの）そのＦｃＲｎ結合断片などの生理活性分子を含んでなり、前記融合タンパク質またはコンジュゲート分子は、イメージング部分で標識されて、検出される抗原と結合できる。
【０２４３】
対象のサイズおよび使用されるイメージングシステムが、診断イメージングを作成するのに必要なイメージング部分の量を左右することは、当該技術分野で理解されるであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象では、注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次に標識抗体は、特定のタンパク質を含有する細胞部位に、優先的に蓄積される。生体内腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０２４４】
使用される標識のタイプおよび投与方法をはじめとするいくつかの変数次第で、投与に続いて、対象中の部位に標識分子が優先的に集中して、非結合標識分子がバックグラウンドレベルに除去されるようにする時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０２４５】
一実施形態では、疾患、障害または感染症のモニタリングは、例えば、初期診断後１ヶ月間、初期診断後６ヶ月間、初期診断後１年間などにわたり、疾患、障害または感染症を診断する方法を反復することで実施される。
【０２４６】
対象中の標識分子の存在は、生体内スキャニング技術分野で公知の方法を使用して検出され得る。これらの方法は、使用される標識タイプに左右される。当業者は、特定の標識を検出する適切な方法を判断できるであろう。本発明の診断法で使用されてもよい方法および装置としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２４７】
特定の実施形態では、分子は放射性同位体で標識されて、放射線応答性外科装置を使用して、患者中で検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎらに付与された米国特許第５，４４１，０５０号明細書）。別の実施形態では、分子は蛍光性の化合物で標識されて、蛍光応答性スキャニング装置を使用して患者中で検出される。別の実施形態では、分子は陽電子放出金属で標識されて、陽電子放射断層撮影を使用して患者中で検出される。さらに別の実施形態では、分子は常磁性標識で標識され、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出される。
【０２４８】
キット
本発明は、本発明の医薬組成物の成分の１つまたは複数で充填された１つまたは複数の容器を含んでなる医薬パックまたはキットもまた提供する。容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定される形式の注意書きが任意選択的に付随し得、その注意書きは、機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を反映する。
【０２４９】
本発明は、上記方法で使用され得るキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器内に、任意選択的に精製形態で、本発明の抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子を含んでなる。特定の実施形態では、本発明のキットは、対照として、実質的に単離された抗原を含有する。任意選択的に、本発明のキットは、キットに包含される抗原と反応しない対照抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子をさらに含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明のキットは、抗原に対する抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の結合を検出する手段を含有する（例えば、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、蛍光性化合物、酵素基質、放射性化合物またはルミネセンス化合物などの検出可能基質にコンジュゲートされてもよく、または第１の抗体を認識する第２の抗体が検出可能基質にコンジュゲートされてもよい）。特定の実施形態では、キットは、組換え的に生成されまたは化学的に合成された抗原を含んでもよい。キット中で提供される抗原はまた、固体担体に付着されてもよい。より具体的な実施形態では、上記キットの検出手段は、それに抗原が付着する固体担体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を含んでもよい。この実施形態では、抗原に対する抗体の結合は、前記レポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
【０２５０】
修飾ＩｇＧ定常領域またはそれらのＦｃＲｎ結合断片の半減期の生体外および生体内アッセイ
修飾ＩｇＧおよびその他の分子が修飾ＩｇＧ定常領域を構成する能力、またはそのＦｃＲｎ結合断片がＦｃＲｎに結合する能力は、本明細書で提供される実施例で例示されるものをはじめとする、様々な生体外アッセイによって特徴付けられ得る。Ｗａｒｄに付与された国際公開第９７／３４６３１号パンフレットおよびＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらに付与された国際公開第０２／０６０９１９号パンフレットもまた、様々な方法を詳細に開示して、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２５１】
例えば、ＦｃＲｎに結合する、修飾ＩｇＧまたはその断片の能力と、野性型ＩｇＧの能力とを比較するために、修飾ＩｇＧまたはその断片、および野性型ＩｇＧを放射性標識して、生体外でＦｃＲｎ−発現細胞と反応させ得る。次に細胞結合画分の放射能がカウントされて、比較され得る。このアッセイで使用されるＦｃＲｎを発現する細胞は、例えば、Ｂ１０．ＤＢＡ／２マウスの肺に由来するマウス肺毛細血管内皮細胞（Ｂ１０、Ｄ２．ＰＣＥ）、およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに由来するＳＶ４０形質転換内皮細胞（ＳＶＥＣ）をはじめとする、内皮細胞系であり得る（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４０：４５７−４６５，１９９４）。しかし、十分な数のＦｃＲｎを発現する１０〜１４日齢の哺乳期マウスから単離された腸管刷子縁などのその他の各種の細胞もまた使用され得る。代案として、選択された生物種からの組換えＦｃＲｎを発現する哺乳類細胞もまた使用され得る。修飾ＩｇＧの結合画分または野性型の結合画分の放射能をカウントした後、結合分子は、次に合成洗剤で抽出され得、単位細胞数当たりのパーセント放出が計算され比較され得る。
【０２５２】
修飾ＩｇＧまたはそれらの断片のＦｃＲｎに対する親和性は、例えば、以前記載されたように（いずれもそれらの内容全体が参照により援用される、Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：４９３−５０２，１９９６；Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５：２２９−２４０，１９９１）、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって測定され得る。この方法では、ＦｃＲｎ分子がＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａによるＣＭ５チップ）と共役され、ＢＩＡ評価２．１ソフトウェアを使用して、固定化ＦｃＲｎに対する修飾ＩｇＧの結合が特定の流量で測定されて、センサーグラムが得られ、それに基づいて、ＦｃＲｎに対する修飾ＩｇＧ、定常領域、またはそれらの断片のオンおよびオフ速度が計算され得る。
【０２５３】
修飾ＩｇＧまたはそれらの断片、および野性型ＩｇＧのＦｃＲｎに対する相対親和性はまた、単純な競合結合アッセイによっても測定され得る。未標識の修飾ＩｇＧまたは野性型ＩｇＧは、その中にＦｃＲｎが固定化された９６ウェルプレートのウェルに、異なる量で添加される。次に一定量の放射性標識野性型ＩｇＧが各ウェルに追加される。未標識の修飾ＩｇＧまたは野性型ＩｇＧの量に対して、結合画分のパーセント放射能をプロットされて、曲線の勾配から、修飾ＩｇＧまたはその断片の相対親和性が計算され得る。
【０２５４】
さらに、修飾ＩｇＧまたはそれらの断片、および野性型ＩｇＧのＦｃＲｎに対する親和性はまた、飽和試験およびスキャッチャード分析によっても測定され得る。
【０２５５】
ＦｃＲｎによる細胞全体にわたる修飾ＩｇＧまたはそれらの断片の移入は、放射性標識ＩｇＧまたそれらの断片およびＦｃＲｎ発現細胞を使用して、細胞単層の片側の放射能をもう一方の側と比較することで、生体外移入アッセイによって測定され得る。代案として、このような移入は、１０〜１４日齢の哺乳期マウスに、放射性標識された修飾ＩｇＧを給餌して、循環（または例えば、肺などの任意のその他の標的組織）への腸管を通じたＩｇＧ移入を示す、血液サンプル中の放射能を定期的にカウントすることで、生体内で測定され得る。腸を通じたＩｇＧ移入の用量依存的阻害を試験するために、放射性標識および未標識ＩｇＧの特定比率の混合物をマウスが与えられ、血漿の放射能が定期的に測定され得る（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９−２４３４，１９９４）。
【０２５６】
修飾ＩｇＧまたはそれらの断片の半減期は、本明細書で提供される方法に従って、薬物動態試験によって測定され得る（実施例セクションを参照されたい）。その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：５４２，１９９４）によって記載されるように、任意選択的にまたは代替の薬物動態試験が実施されてもよい。この方法に従って、放射性標識修飾ＩｇＧまたはそれらの断片が、マウスに静脈内注射されて、その血漿濃度が、例えば注射の３分間〜７２時間後に、時間の関数として定期的に測定された。このようにして得られたクリアランス曲線は、α相およびβ相の二相性であるべきである。修飾ＩｇＧまたはそれらの断片の生体内半減期を判定するために、β相のクリアランス速度が計算されて、野性型ＩｇＧと比較される。
【実施例】
【０２５７】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量、および手順は、本明細書に記載される本発明の範囲および趣旨に従って広義に解釈されるものと理解される。
【０２５８】
実施例Ｉ
半減期が増大された抗体におけるＦｃ／ＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性の調節
ＩｇＧＦｃと新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との間の相互作用は、ＩｇＧ恒常性に必要であり、ＩｇＧの長い血清半減期を促進する。ＦｃＲｎおよびＩｇＧは高度にｐＨ依存的に結合し、それはＩｇＧリサイクルに重要である。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ／ＦｃＲｎ親和性を改変することを目的とする多数の変異試験の標的であった。これらの研究は、非常に長時間にわたる半減期から極めて高速のクリアランスに及ぶ、不同性の生体内薬物動態（ＰＫ）特性がある変異体をもたらした。本研究では、本発明者らは、ｐＨ６．０で、ＹＴＥと比較して＞５０倍、野性型ＩｇＧと比較して＞２００倍の親和性の増大がある、ＹＴＥ変異を保有するＦｃ変異体（Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ）を単離した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０）。この変異体はまた、ヒトＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスモデルにおいて、大幅に増大されたｐＨ７．４結合を有し、極めて高速のクリアランスを示す。本発明者らは、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥを出発点として使用して、ｐＨ依存性を増大させながら、なおもｐＨ６．０結合の増大を維持するように設計された追加的なファージライブラリーを作成した。ｐＨ依存性を評価するためのファージＥＬＩＳＡの使用を通じて、本発明者らは、ｐＨ６．０親和性がＴＥ単独よりも高く、ヒト遺伝子導入ＦｃＲｎマウスモデルおよびカニクイザルの両方で生体内半減期の増大があるＹ変異体を単離できた。本発明者らの研究は、非常に高親和性で極めて高速のクリアランスをもたらし、わずかにより低い親和性で低クリアランス／半減期増大に急激に切り替わる、ＦｃＲｎ結合に対する急勾配の親和性閾値を提案する。
【０２５９】
序論
ＦｃＲｎ結合を改変することで、ＰＫパラメータを最適化する現行のアプローチは、一般に受け入れられている、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧ恒常性モデルを活用し（Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，７３９−７６６；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，７１５−７２５）、それは、（流体相飲作用を通じて内在化された）ＩｇＧ分子が酸性エンドソーム（ｐＨ６．０）中でＦｃＲｎに結合して、リソソーム中の分解からそれらを保護することを示唆する。次に、エンドソーム内のＦｃＲｎによって再利用されたＩｇＧは、循環内に戻され、中性ｐＨで細胞表面に放出されて高い血清ＩｇＧレベルを維持する。治療用抗体の血清持続を改善するために用いられる主要ストラテジーの１つは、酸性ｐＨでＦｃＲｎに対する親和性が増大するＦｃの変異体を遺伝子操作することである（Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５−６９１）。このアプローチは、いくつかの注目に値する成功をもたらし、いくつかの単離された変異体は、野性型抗体よりも＞３倍高い生体内半減期の改善を示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３８，６００−６０５；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，６２１３−６２１６；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６，３４６−３５６；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，７６６３−７６７１；Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，３２６９−３２７７）。
【０２６０】
半減期が増大したＩｇＧ分子にとって重要と見なされる１つの特性は、ｐＨ依存性を維持することである。最小のｐＨ７．４結合量を維持しながら、ＦｃＲｎに対する改善されたｐＨ６．０結合は、改善されたＰＫパラメータを得る上で不可欠と見なされる（Ｐｒｅｓｔａ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，４６０−４７０）。ＩｇＧおよびＦｃＲｎ結合の研究は、ｐＨ依存性リサイクル機序が、ｐＨ約６で形成されるＩｇＧ  ＦｃおよびＦｃＲｎの間のＨｉｓ−ＧｌｕまたはＨｉｓ−Ａｓｐ塩架橋によって促進されることを実証した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，２８１９−２８２５；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７，８６７−８７７）。（ｐＫａが約６〜６．５である）ヒスチジンのイミダゾール側鎖は、ｐＨ７．４では中性正味電荷を有するが、より低いｐＨ環境内では正電荷を得る。正荷電プロトン化ヒスチジン化学種は、ＦｃＲｎ表面の負荷電残基と塩橋とを生成し得、この相互作用が、エンドソームの結合および再利用を促進すると考えられる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ中では、Ｈｉｓ３１０およびＨｉｓ４３５がＦｃＲｎの酸性側鎖と塩架橋を形成し、ｐＨ依存性結合に不可欠である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，２８１９−２８２５）。ＦｃＲｎと相互作用するＩｇＧ  Ｆｃの３つの主要領域は、ＣＨ３にあるＨｉｓ４３５ループ、ＣＨ２にあるＨｉｓ３１０ループ、およびＣＨ２中のＭ２５２−Ｔ２５６ループである（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７，８６７−８７７）。ＣＨ２−ＣＨ３接合部のこれらの領域は、多くの場合、薬物動態（ＰＫ）特性が改変された変異体を得るために標的化される。このストラテジーを通じて、生体内半減期が増大した複数の変異体が作成された一方で（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３８，６００−６０５；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，６２１３−６２１６；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６，３４６−３５６；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，７６６３−７６７１；Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，３２６９−３２７７：Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，１７５９−１７６９）、外見上は改善された生体外ＦｃＲｎ結合特性は、生体内薬物動態の向上を必ずしももたらさなかった（Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５，８６−９４；Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，１７０９−１７１７）。さらに、マウスでは、ＦｃＲｎの親和性と半減期との間の相関関係は、ほとんど観察されなかった（Ｇｕｒｂａｘａｎｉ  ��ｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，１４６２−１４７３）。さらに、ｐＨ６．０および７．４の両方でＦｃＲｎ結合の増大があるＩｇＧは、実際には、野生型よりも短い血清半減期と、内在性ＩｇＧ分解の促進とを示し得た（Ａｂｄｅｇ）（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８）。これらの例は、ＦｃＲｎ親和性、ｐＨ依存性、および生体内クリアランス間の複雑な関係性を例証する。一般に、ｐＨ依存性を維持しながらｐＨ６．０結合を促進させることは、半減期が増大した分子をもたらし得、ｐＨ依存性のないｐＨ６．０結合の促進は、ａｂｄｅｇをもたらし得ることが理解されるが、特定の変異体によって得られる結果を支配する閾値親和性およびパラメータは知られていない。
【０２６１】
ｐＨ結合依存性の機序、およびｐＨ６．０  ＦｃＲｎ結合親和性とＩｇＧ血清半減期との間の関係性をより良く理解するために、本発明者らは、ＹＴＥ変異を含有するＦｃ基礎構造の変異誘発によって、Ｈｉｓ４３５ループを標的化した（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６，１７５０−１７５５）。最初のファージディスプレイライブラリーのスクリーニングは、ＦｃＲｎに対して極めて高い親和性があるが、ｐＨ依存性に劣るＦｃ変異体（Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ）をもたらした。変異を有するＩｇＧは、ヒトＦｃＲｎマウスモデルにおいて（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，３５２８−３５３３）、Ａｂｄｅｇ変異と類似した半減期低下を示した（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８）。この変異を出発点として使用して、本発明者らは追加的なライブラリーを設計して、ＦｃＲｎ結合の改善とｐＨ依存性の維持がある新規変異体を同定した。これらのライブラリーから同定された変異体は、ＩｇＧとして構築されて、ＦｃＲｎ結合および薬物動態パラメータについて評価された。ＦｃＲｎに対する親和性が、ＹＴＥとの対比で３〜４倍改善された変異体が特性決定され、ＰＫ特性の強化を有することが分かった。データはまた、高親和性ＦｃＲｎバインダーに対する見かけのｐＨ７．４結合閾値も示唆し、この閾値におけるより低い結合は、血清持続の増大をもたらし得るが、より強力な結合は、極めて高速なクリアランスがある分子をもたらす。
【０２６２】
材料および実験手順
試薬および図解
全ての化学薬品は分析等級であった。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入された。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入された。全てのＨＢ２０．３（抗ＣＤ２０）およびモタビズマブ（抗ＲＳＶＦタンパク質）（Ｗｕ  ａｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８，６５２−６６５）変異体は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅで作成された。組換えヒトＦｃＲｎは、以前記載されたように発現されて精製された（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０）。抗体は、ＥＵ番号付与慣例に準拠して番号付与された（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１  ＮＩＨ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２）。配列ロゴ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，６０９７−６１００）図は、Ｗｅｂｌｏｇｏを使用して作成された（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ；Ｃｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４，１１８８−１１９０）。
【０２６３】
ファージライブラリーの構築
Ｅ２１６（Ｋａｂａｔ番号付与）から開始してＦｃ  Ｃ末端までをコードするＩｇＧ１  Ｆｃ（ＣＨ２中のＹＴＥの変異を含む）ＤＮＡが、ｇ３融合物としてファージミドベクターにクローン化された。最初の挿入ライブラリーは、位置４３２、４３３、４３４、４３６、４３７にＮＮＳコドンを導入し、４３７の後に無作為化された１個のアミノ酸を挿入することで、Ｈｉｓ４３５ループ領域内に構築された。ライブラリー挿入物の作成においては、これらの位置にＮＮＳコドンを含有する逆方向プライマーが用いられた。
【０２６４】
ライブラリーは、オーバーラップＰＣＲ（ＨｉＦｉ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ｍｉｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって作成され、２．５ｋＶの電場で２００ｏｈｍの抵抗を使用して、ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に電気穿孔された。細胞は、１０ｍｌのＳＯＣ培地中で３７℃および２５０ｒｐｍで３０分間で回収され、次に、カルベニシリンおよび２％グルコースを含有する２ｘＹＴ寒天と共にＱトレー上に播種された。翌日、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを含有する２ｘＹＴ培地中に掻き取ることで、コロニーが採取された。細胞は、０．５〜１前後のＯＤに培養された。およそ１０１１Ｍの１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が導入されて、３７℃で３０分間振盪せずに、および３０分間振盪しながら培養された。引き続いて細胞は遠心分離されて、５０ｍｌの２ＹＴ／ｃａｒｂ／カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）／０．５ｍＭ  ＩＰＴＧに再懸濁され、３０℃および２５０ｒｐｍで１２〜１６時間培養された。培養終了時に、ファージはＰＥＧ６０００で沈殿されて、３ｍｌの２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０緩衝液に再懸濁された。ライブラリー作成のためのテンプレートとしてＮ３Ｅ−ＹＴＥを使用して、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーが構築された。縮重プライマーは、位置４３３、４３４、４３５、および４３６をＮＮＳコドンでランダム化させることで設計された。ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーでは、ライブラリー構築のためのテンプレートとしてＩｇＧ１Ｆｃ−ＹＴＥが使用された。変性プライマーは、固定ヒスチジンを位置４３５に保ちながら、位置４３３、４３４、および４３６をＮＮＳでランダム化させることで設計された。位置４３２および４３７では、変性コドンＳＴＥが使用されて、これらの位置にヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグルタミンのいずれかが組み込まれた。
【０２６５】
最初のＩｇＧ  ＹＴＥ／Ｆｃライブラリーのパニング
ビオチン化ＦｃＲｎを標的として、ＥＬＩＳＡベースのパニングアプローチが使用された。簡単に述べると、２μｇ／ｍｌビオチン化ヒトＦｃＲｎおよびビオチン化マウスＦｃＲｎが、（それぞれ）９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎイムノプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）の８つのウェルに被覆されて、４℃で一晩貯蔵された。次にプレートは、３％のミルクで室温で１時間ブロックされた。ウェルは、ファージが添加される前に、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）で洗浄された。０．０５％ツイーン２０および３％ミルクが添加された２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０中の１００ｍｌのファージ（６×１０１２ＰＦＵ）が、各ウェルに添加された。プレートは、３７℃で２時間培養された。ウェルは、０．０５％ツイーン２０および０．３Ｍ  ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０で２０回洗浄された。結合ファージは、１００ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４によって、３７℃で３０分間溶出された。溶出されたファージを使用して、指数関数的に成長するＴＧ１細胞培養物が再感染された。感染は、３７℃で３０分間実施された。次に感染細胞は、２ＹＴ／カルベニシリン／グルコースプレート上に播種された。翌日、細胞は、プレートから掻き取られて、次のラウンドのためにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに再度に感染された。マウスおよびヒトＦｃＲｎ上のパニングは、合計４ラウンドにわたり並行して実施された。各ラウンド後に追加的なｐＨ７．４枯渇ステップが用いられたこと以外は同様にして、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーが、スクリーニングされた（各４ラウンド）。ｐＨ７．４溶出後、ファージは、ビオチン化ＦｃＲｎで被覆されたプレート上でｐＨ７．４でさらに１時間培養され、非結合ファージが採取された。
【０２６６】
ｐＨ依存性ファージＥＬＩＳＡ
プレートは、２ｍｇ／ｍｌヒトＦｃＲｎで４℃で一晩被覆された。次にプレートは、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄されて、ｐＨ６またはｐＨ７．４のいずれかのリン酸ナトリウム緩衝液中の３％ミルクによって、室温で１時間ブロックされた。ブロック緩衝液を除去して、ｐＨ６．０または７．４のいずれかのリン酸ナトリウム緩衝液中の１０９のファージが、各ウェルに添加されて室温で培養された。１時間後、プレートは、ｐＨ６またはｐＨ７．４のナトリウムリン酸緩衝液（＋０．２％ツイーン）で３回洗浄された。次に抗Ｍ１３ＨＲＰ（１：５０００室温で３０分間）が添加されて、検出に先だって、ＴＭＢ基質で３回洗浄された。
【０２６７】
示差走査熱量分析
ＤＳＣ実験は、ＭｉｃｒｏｃａｌＶＰ−ＤＳＣスキャニングマイクロ熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を使用して実施された。ＤＳＣで使用された全ての溶液およびサンプルは、熱量計への装入に先だって、０．２２μｍフィルターを使用して濾過された。ＤＳＣ試験で使用された抗体は、分析ＳＥＣによる測定で＞９８％単量体であった。ＤＳＣ分析に先だって、全てのサンプルは、引き続くＤＳＣ実験のために、標準緩衝液（ＰＢＳ）中で徹底的に透析された。サンプル測定値から差し引かれるベースライン測定値（緩衝液対緩衝液）が得られた。透析サンプル（１ｍｇ／ｍＬ濃度）が、サンプルウェルに添加されて、ＤＳＣ測定が１℃／分の走査速度で実施された。データ解析およびデコンボリューションは、Ｍｉｃｒｏｃａｌによって提供されるＯｒｉｇｉｎ（商標）ＤＳＣソフトウェアを使用して実施された。デコンボリューション分析は、非二状態モデルを使用して実施され、１００回の反復サイクルを使用して、最良適合が得られた。
【０２６８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定
可溶性ヒトＦｃＲｎと固定化抗体変異体との相互作用は、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、表面プラズモン共鳴によってモニターされた（Ｂｒａｖｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５８，２８１−２８８）。抗体は、最初に、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）アミン共役キットを使用して、製造会社の使用説明書に従って、ＧＬＣセンサーチップと共役された。過剰な反応性エステルは、１Ｍエタノールアミンの６分間の注入によってブロックされた。抗体は、平衡測定値では＞５０００ＲＵ、動態結合実験では＜２００ＲＵの表面密度で固定化された。ヒトＦｃＲｎは、定常状態測定では２５μＬ／分、反応速度測定では７５μＬ／分の流速で、０．４５ｎＭ〜３μＭの範囲の濃度で使用された。１つのチャネルは、常に未変更のままにして、ブランク参照表面が提供された。希釈および結合実験は、０．０５％のツイーン２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４において２５℃で実施された。定常状態結合データは、１０分間にわたり収集された。抗体表面は、５ｍＭのＨＣｌの１５秒間の注入によって再生された。ヒトＦｃＲｎはまた、抗体被覆チャネルから差し引くためのブランクの役割を果たす標準チャネル上に流された。結合親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して判定された。分離定数（Ｋｄｓ）は、１：１ラングミュアまたはａ１：１ラングミュア質量移動モデルを用いて、対応する結合等温線を定常状態データに適合させることで、または動態を結合および分離に適合させることで判定される。
【０２６９】
ＨＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスおよび薬物動態分析
この試験で使用されたＨＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスは、ｍＦｃＲｎ欠損Ｂ６．１２９Ｘ１−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪとｈＦｃＲｎ  ｃＤＮＡ遺伝子組換え系統Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１ＤｃｒＴｇ（ＣＡＧ−ＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒ／ＤｃｒＪとのＦ１交雑種であった（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，３５２８−３５３３；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９７，３１５−３２２）。これらの動物中のｈＦｃＲｎの発現は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、および生体内機能アッセイによって検証されている（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９７，３１５−３２２）。
【０２７０】
性別をマッチさせた（６〜１６週齢）ＨＦｃＲｎマウスに、０日目に２．５ｍｇ／ｋｇ抗体のボーラスＩＶ用量が投与された。抗体当たり８匹のｈＦｃＲｎ  Ｔｇマウスが使用され、交互の時点で４匹のマウス（Ａ群またはＢ群）が採血された。血液サンプルは、３週間試験全体を通じて異なる時点で、毛管ピペットを使用して眼窩後方神経叢から得られた。定量的ＥＬＩＳＡを使用して、抗体の血清濃度がモニターされた。簡単に述べると、９６ウェルプレートが、２μｇ  ｍｌ−１の特異的なＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトｆ（ａｂ）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で被覆された。プレートは、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間ブロックされ、次に、適切に希釈された（より初期の時点では１：２００、その後の時点では１：５０または１：１００）血清サンプルと共にインキュベートされた。ヤギ抗ヒトＦｄ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ヒト抗体が検出された（希釈１：１００００）。製造業者の指示に従って、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．）による発色後に、４０５ｎｍにおける吸光度が測定された。予備採血マウス血清（３日前に採取された）中で１：１００に希釈された各抗体変異体について、標準曲線（１０μｇ／ｍｌで開始される）が作成された。次に、Ｐｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）中で作成された標準曲線の直線部分を使用して、血清サンプル中のヒトＩｇＧが定量化された。
【０２７１】
カニクイザル中の薬物動態分析
１６匹のメスカニクイザルが無作為化されて、３つの試験群の１つに割り当てられた。各動物に、１０ｍｇ／ｋｇで、モタビズマブ、モタビズマブ−ＹＴＥ、モタビズマブ−Ｎ３またはモタビズマブＹ３１−ＹＴＥが、１回の静脈内（ｉ．ｖ．）用量で投与された。０日目の投与前、投与の１、４、および１２時間後、および投与の２、３、４、８、１５、２２、２９、４３、５７、７１、および８５日後に、血液サンプルが採取された。モタビズマブ抗体血清濃度は、以前記載された抗モタビズマブＥＬＩＳＡを使用して判定され（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４）、試験された各変異体について、別々の標準曲線が作成された。ＳＡＳ８．０（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、各ｉ．ｖ．輸液について、ノンコンパートメント法モデルが、各動物の血清濃度データのために適合された。次に、いくつかの薬物動態学パラメータの記述統計が、計算された。
【０２７２】
結果
ＹＴＥ変異株ライブラリーからの結合改善Ｆｃ変異体の同定
以前の結果は、ＹＴＥなどの、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎ結合を改善するＩｇＧのＦｃ領域に作成されたアミノ酸変異が、カニクイザルをはじめとする実験動物中で、抗体血清半減期を大幅に増大させることを実証した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９）。しかし、ＹＴＥと、酸性および中性ｐＨの両方でＦｃＲｎ結合を促進する追加的なＨ４３５ループ（Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）変異との組み合わせは、血清半減期が極度に低下したＡｂｄｅｇ分子をもたらした（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８；Ｍｏｎｔｏｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，２７８８−２７９３）。ＹＴＥ変異が、野性型ＩｇＧと同様にｐＨ７．４で低いＦｃＲｎ結合維持する（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０）のに対し、Ａｂｄｅｇは、酸性および中性ｐＨの両方でＦｃＲｎ結合増大を有する。新規高親和性ＦｃＲｎ結合変異体を同定するために、本発明者らは、ＩｇＧのＦｃ領域にヒスチジン４３５を含有する重要なＦｃＲｎ結合部位の１つのアミノ酸を標的化し、４３５ヒスチジンを無変化のままにして、ＣＨ３のアミノ酸４３２〜４３７の間に無作為化配列を含有する、変異体ライブラリーを構築した。さらに、追加のランダムアミノ酸コドンが、位置４３７の後（４３７＊）に挿入されて、ＹＴＥ変異があるＦｃ断片中の追加的なＦｃＲｎ結合接触が、有益であると立証されるかどうかが判定された。次に多様体Ｆｃライブラリーは、Ｍ１３ファージ表面に提示されて、ｐＨ６．０緩衝液中でＥＬＩＳＡウェル内に被覆された組換えヒトＦｃＲｎタンパク質に対するＦｃＲｎ結合変異体が選択された。パニング結果の配列解析は、４３２および４３７の位置にシステインを含有するユニークな変異体群を明らかにした。次に１つの変異体Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ（表１）およびその誘導体が、ＨＢ２０．３抗ＣＤ２０ＩｇＧバックグラウンドに変換された。ＳＰＲ結合解析は、例えば、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥなどの二重システイン変異体のあるＩｇＧが、ｐＨ６．０においてＹＴＥ変異体よりも５０倍以上ＦｃＲｎ結合を改善したことを示した（表１）。しかし、ＦｃＲｎに対する変異体のｐＨ７．４における結合もまた顕著に増大して、ｐＨ結合依存性が劣った。
【０２７３】
【表１】
2017522000.tif 000003
【０２７４】
2017522000.tif 000004
【０２７５】
本発明者らは、いずれの変異がＦｃＲｎ結合に貢献したのかを理解するために、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ変異をさらに精査した。残基４３７＊（Ｎ３−ＹＴＥ）のグルタミン酸挿入の除去は、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４結合に軽微な影響を及ぼし、４３２〜４３７の配列多様性が、観察された結合改善の大部分をもたらすのに十分であることが示唆された。４３２および４３７におけるシステインの役割を評価するために、それらをセリンで置換した（ＳｅｒＮ３−ＹＴＥ）。結果として得られた変異体は、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方でＦｃＲｎ結合低下を示し、システイン間にジスルフィド結合が形成して結合にプラス方向に寄与してもよいことが示唆された。Ｌ４３２ＣとＴ４３７Ｃの間に野性型残基がある追加的な変異体（ＣｗｔＣ−ＹＴＥ）を作成して、ＦｃＲｎ結合に対してシステインが単独でどのような役割を有するのかを判定した。このコンストラクトは、親ＹＴＥコンストラクトよりもわずかに弱くＦｃＲｎと結合し、システイン変異のみでは、結合増大をもたらさないことが示唆された。ＹＴＥのｐＨ結合依存性がＨ４３５ループの変異によって改変され得るという本発明者らの観察は、以前の研究に合致し（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０；Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８）、ＦｃのＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合におけるＨ４３５およびそのループの役割を支持する。Ｎ３Ｅ−ＹＴＥからグルタミン酸挿入（Ｎ３−ＹＴＥ）およびＹＴＥ変異（Ｎ３Ｅ）を別々に除去するのに加えて、本発明者らは、両方が除去されたコンストラクト（Ｎ３）もまた作成した。Ｎ３は、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥと比較してｐＨ依存性を改善した（表１）。
【０２７６】
Ｌ４３２Ｃ、Ｔ４３７ＣはＣＨ３領域を安定化する
ＦｃＸ線構造中のＬ４３２およびＴ４３７中のＣα距離および側鎖方向は、システインへの変異に際して形成するジスルフィド結合と適合性のようである。ＹＴＥ−Ｆｃの結晶構造を使用して（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６，１７５０−１７５５）、本発明者らは、Ｌ４３２およびＴ４３７間のＣα距離が６．７Ａであると判定した。この距離は、複数の結晶構造の分析に基づいて報告されているシスチンについて観察されたＣα距離範囲（約４．６〜７Ａ）内にある（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２，５３５−５４８）。タンパク質内のジスルフィド結合形成の安定化効果は良く知られているため、本発明者らは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施して、Ｌ４３２Ｃ／Ｔ４３７Ｃを含有する変異体中で、ＣＨ３領域が安定化されているかどうかを調べた（図３）。ＨＢ２０．３のＤＳＣプロファイルは、８３．３℃のＣＨ３Ｔｍからなり、ＦａｂおよびＣＨ２ドメインのいずれも、７３℃で１つのピークとしてアンフォールディングする。ＹＴＥ  ＨＢ２０．３は、野性型とほぼ同一のＦａｂおよびＣＨ３アンフォールディングを有するが、ＣＨ２Ｔｍは６５．１℃でわずかにより低い。ＣｗｔＣ−ＹＴＥ（ＹＴＥ変異があるＬ４３２Ｃ／Ｔ４３７Ｃ）は、８７．１℃のＣＨ３Ｔｍを有し、野性型ＣＨ３よりもほぼ４℃高い。興味深いことに、ＣＨ３が大幅に安定化された一方で、ＣＨ２ＴｍではＹＴＥ−ＨＢ２０．３と比較して約３℃低下した。Ｎ３−ＹＴＥおよびＳｅｒＮ３−ＹＴＥ（４３２および４３７にシステインまたはセリンのいずれかを有することにより異なるコンストラクト）の比較は、Ｌ４３２Ｃ／Ｔ４３７Ｃによって引き起こされる著明な安定化効果をさらに例証する。ＳｅｒＮ３−ＹＴＥの最低Ｔｍは５８．７℃で、ＣＨ３Ｔｍが８０℃を十分下回るのに対し、Ｎ３−ＹＴＥのＤＳＣプロファイルはＣｗｔＣ−ＹＴＥのものとほぼ一致して、ＣＨ３Ｔｍは８７．１℃に増大する。
【０２７７】
ｐＨ結合依存性ＹＴＥ変異体の操作および選択
本発明者らは、ｐＨ６．０で高い親和性結合を維持しながらｐＨ７．４結合が低下した変異体を得る目的で、Ｈｉｓ４３５ループに新規ライブラリーを設計した。本発明者らはまた、本発明者らのファージ選択条件を修正して、パニング中で、ｐＨ依存性高親和性ＦｃＲｎバインダーのより厳密な選択ができるようにした。本発明者らは、Ｈ４３５（ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリー）を含むＣｙｓ４３２およびＣｙｓ４３７間の介在配列のランダム化によって、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥに基づいてライブラリーを作成した。中性ｐＨにおける結合を防止するために、ｐＨ６．０溶出ステップ後に、ｐＨ７．４枯渇ステップが導入された。次に、非結合ファージを使用して、増幅および特性決定のために細菌で感染された。ファージＥＬＩＳＡもまた開発して、ｐＨ依存性パニングに続いてクローンの結合を特性決定した。このアッセイでは、クローンファージを使用して、ｐＨ６．０および７．４の条件のいずれかの下で被覆ＦｃＲｎウェルに結合させた。ｐＨ６．０における結合、ならびにｐＨ６．０および７．４における結合比が、親Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびＹＴＥ保有ファージと比較された。４ラウンドのパニング後に選択されたファージクローンは、ＥＬＩＳＡ中でｐＨ結合依存性についてスクリーニングされた。ほぼ全てが、アッセイ中でｐＨ６．０におけるＹＴＥ対照と同様のまたはさらに良い、ＦｃＲｎに対する予期された高い結合を示した一方で、いくつかのクローンは、ｐＨ７．４における顕著に低下した結合、またはより高いｐＨ６．０対７．４結合比を示し、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥと比較して改善されたｐＨ結合依存性が示唆された。４ラウンドのパニング後に単離された５６個のクローンの配列解析は、Ｈｉｓ４３５が非常に豊富であることを示した（図４Ａ）。大部分のラウンド５クローンは、Ｈ４３５を含有し、ＦｃＲｎ結合中のこの位置におけるヒスチジンの重要な役割が確認された。配列解析は、これらのクローンが、４３３、４３４または４３６に正荷電残基もまた含有することを示す。ファージＥＬＩＳＡを通じて改善されたｐＨ６／７．４結合比があるラウンド４クローンの一部は、４３５に隣接する正荷電残基がなおさらに豊富であった（図４Ｂ）。
【０２７８】
位置４３２および４３７におけるシステイン残基をヒスチジンをはじめとする荷電残基で置換するために、追加的なライブラリーが設計された。Ｃｙｓ４３２およびＣｙｓ４３７はＮ３Ｅ−ＹＴＥ中にジスルフィド結合を形成する可能性が高いため、本発明者らは、システイン位置におけるＮ３Ｅ−ＹＴＥ中の硬質システインループ束縛を荷電アミノ酸で置換することが、ループ位置に、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合に有益であり得るｐＨ依存性変化を導入してもよいと推論した。仮説を試験するために、本発明者らは、Ｈ４３５を無変化（ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリー）のままにした一方で、Ｃｙｓ４３２およびＣｙｓ４３７をグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）で置換して、ランダムアミノ酸が位置４３３、４３４、および４３６にあるライブラリーを設計した。このスキームでは、「Ｚ」は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはグルタミンであり得る。グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはヒスチジン（Ｈ）は、４３２および４３７に導入されて、グルタミン酸またはアスパラギン酸およびヒスチジン間にｐＨ依存性塩橋の可能な形成ができるようにし、または局所性静電変化に対して感受性であってもよい負荷電残基の導入ができるようにしてもよい。クローニングにおける変性オリゴヌクレオチドの使用のために、グルタミン（Ｑ）もまた、これらの位置４３２および４３７でコードされた。ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーには、各パニング溶出に続く追加的なｐＨ７．４結合枯渇ステップと共に、４ラウンドのパニングが実施された。４ラウンドのパニングに続いて個々のファージクローンが配列決定され、ならびにＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーパニングおよびスクリーニングに記載されるようにして、ファージＥＬＩＳＡ中で結合スクリーニングが実施された。ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーの結果とは異なり、ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーから選択されたクローンの大部分は、ファージＥＬＩＳＡ中におけるｐＨ６．０とｐＨ７．４との高い結合比によって実証される、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥと比較して改善されたｐＨ結合依存性を示した。さらに、配列決定パターンが、ファージＥＬＩＳＡによってｐＨ依存性同定されたクローン中で明らかにされた（図４Ｃ）。ｐＨ依存性は、引き続いて、ＩｇＧへの変換時にＳＰＲ分析によって確認された（表１）。結果は、ＦｃＲｎに対する高親和性ｐＨ依存性結合を獲得したクローンでは、位置４３３および４３６には（通常はアルギニンである）正荷電アミノ酸が好ましく；位置４３４では疎水性アミノ酸、チロシン、またはフェニルアラニンが好ましいことを示した。興味深いことに、このライブラリーからのｐＨ依存性結合クローンは、それぞれ位置４３２および４３７でコードされるグルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）が非常に豊富である。結果は、Ｈ４３５の近くにおける表面帯電電位の操作が、高親和性およびｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合Ｆｃ変異体を同定するのに有効であることを示唆した。Ｈ４３５の近くにおける平衡荷電表面の適応は、ｐＨ依存性変化の影響を受け易くあってもよいこれらの位置におけるヒスチジン残基の欠如にもかかわらず、ＦｃＲｎ結合に有益なようである。
【０２７９】
ＩｇＧとしてのＦｃＲｎ結合変異体のＳＰＲ結合特性決定
ファージスクリーンにおいてｐＨ結合依存性を示した、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーからの変異体のパネルが選択されて、さらなる特性決定のために、ＩｇＧ１（ＨＢ２０．３、抗−ＣＤ２０）として発現された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒトＦｃＲｎに対する精製ｍＡｂの結合が、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で測定された。表１は、選択されたｍＡｂの配列および結合結果を要約する。ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）またはＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーのいずれかに由来する全ての試験された変異体のｐＨ７．４結合は、予期されたＮ３Ｅ−ＹＴＥと比較して低下したＦｃＲｎに対する結合と、ＹＴＥ  ＩｇＧに類似した多数の結合レベル（約５μＭ）を示した。ファージＥＬＩＳＡ中でｐＨ依存性を示したＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）変異体は、ＩｇＧとしてｐＨ依存性結合を維持したが、これらの変異体は、ｐＨ６においてＹＴＥと比較して親和性の改善を示さなかった。多数のＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）変異体は、ＹＴＥとの対比で有意なｐＨ６．０親和性改善を実際に示した一方で、ｐＨ依存性結合もまた維持した。例えば、Ｙ３−ＹＴＥ、Ｙ１２−ＹＴＥ、およびＹ３１−ＹＴＥなどの複数の変異体は、ｐＨ６．０でＹＴＥよりも３〜９倍高いＦｃＲｎに対する結合親和性を示した一方で、ｐＨ７．４における結合は、基準点と同様のままであるか、またはより弱かった。これらの結果は、クローンを選択および同定するのに使用されたライブラリーおよびパニングストラテジーの有効性を確認する。
【０２８０】
ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）クローンならびにＮ３Ｅ−ＹＴＥ変異体および誘導体のｐＨ６．０および７．４結合親和性は、四分区間にグループ化された（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ）。四分区間Ｉは、おそらく「ＹＴＥ様」特性を示す、高いｐＨ６．０結合および低いｐＨ７．４結合がある変異体を含有する。四分区間ＩＩは、おそらく「野性型様」特性を示す、低いｐＨ６．０およびｐＨ７．４結合があるクローンを含有する。四分区間ＩＩＩは、おそらく「Ａｂｄｅｇ様」特性を示す、高いｐＨ６．０および７．４結合がある抗体を含有する。四分区間ＩＶは、これらの研究では全く単離されていない、高いｐＨ７．４および低いｐＨ６．０結合物を含有する。
【０２８１】
追加的なＩｇＧバックグラウンド中のＦｃＲｎ結合：モタビズマブ
抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１バックグラウンド中で望ましいＦｃＲｎ結合特性を有することが分かった少数のクローンが追加的なＩｇＧ１バックグラウンド、モタビズマブに移行されて（Ｗｕ  ａｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８，６５２−６６５）、異なる可変領域に関連してクローンＦｃＲｎ結合特性が確認された。以前の研究が示したように、可変領域は、ｗｔ  Ｆｃバックグラウンド中のＦｃＲｎ結合変動性に寄与することができ（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，１９６８−１９７６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３９，１４６９−１４７７；Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４０，１５４５−１５５５）、本発明者らは、本発明者らの変異体のＦｃＲｎ結合特性が移転可能であることの確認を望んだ。ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリークローンＹ１２−ＹＴＥ、Ｙ３１−ＹＴＥ、およびＹ３−ＹＴＥが、モタビズマブ可変領域のあるＩｇＧとして作成された。これらのクローンならびにＹＴＥおよびＮ３Ｅ−ＹＴＥのｐＨ６．０結合は、抗ＣＤ２０バックグラウンドのものと一致する（表２）。興味深いことに、結合増大（Ｙ３１−ＹＴＥ）または結合低下（ＹＴＥ）のいずれかを伴って、クローンが異なる抗体可変領域に移行すると、ｐＨ７．４結合は変動する。さらに、Ｙ１２−ＹＴＥおよびＹ３１−ＹＴＥクローンもまた、例えば、Ｙ１２およびＹ３１などの野性型ＭｏｔａＦｃバックグラウンド（ＹＴＥを欠く）中で作成された。これらのコンストラクトは、ＦｃＲｎ結合に対するＨ４３５ループ変異単独の貢献度を示すために作成された。Ｙ１２およびＹ３１は、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎ結合の増大およびｐＨ依存性（ｐＨ７．４における低い結合）を維持しなかった。これらのデータは、Ｙ１２およびＹ３１などのＹＴＥおよびＨ４３５変異が、ｐＨ依存性結合に対して相加的効果を有することを示唆する。ｐＨ６．０で８９ｎＭのＫｄ、ｐＨ７．４で１６３０ｎＭのＫｄがあるｍＮ３は、モタビズマブバックグラウンド中で、抗ＣＤ２０バックグラウンド中と同様の結合を有した。
【０２８２】
【表２】
2017522000.tif 000005
【０２８３】
2017522000.tif 000006
【０２８４】
ヒトＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスモデルにおける血清クリアランス
次に、本発明者らは、ヒトＦｃＲｎ遺伝子組換えマウスを使用して、様々なｐＨ感受性のＦｃＲｎ結合変異体の血清クリアランスを調べた（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，３５２８−３５３３；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９７，３１５−３２２）。ＰＫ試験では、ｈＦｃＲｎ  Ｔｇマウスに、０時間目に２．５ｍｇ／ｋｇボーラスＩＶ用量が投与され、抗体注射の３０分後〜２１日後の異なる時点で採血された。マウス血清中のヒト抗体濃度は、ＥＬＩＳＡによって定量化された。
【０２８５】
表２は、モタビズマブおよびそのＦｃ変異体のＰＫ結果、最低ＤＳＣ  Ｔｍ、ならびに配列および結合特性を要約する。選択された抗体血清濃度−時間プロファイルが報告される（図６Ａ）。予期されたように、ＹＴＥ変異は、モタビズマブと比較して、血清クリアランスをおよそ２．４倍低下させた。ＹＴＥは、ｈＦｃＲｎ  Ｔｇマウスモデルにおいて、一貫して低い抗体クリアランス速度をもたらし、この変異体が、ＦｃＲｎ結合を通じたリサイクルの増大に必要かつ十分な条件を満たすことが示唆される。高親和性ｐＨ６．０結合があるがｐＨ結合依存性が欠如している変異体、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥは、モタビズマブよりも約６倍迅速な３７３ｍＬ／日／ｋｇの極度に高速な血清クリアランスを示し、ＦｃＲｎ媒介性抗体リサイクルにおけるｐＨ依存性結合の重要性が繰り返される。クローンＹ３１−ＹＴＥはまた、モタビズマブと比較して約２．４倍のクリアランス低下も示し、ＹＴＥと同レベルである。２５．２ｍＬ／日＊ｋｇのクリアランスがあるＮ３もまた、半減期延長についてＹＴＥと同レベルであった。興味深いことに、ＹＴＥの存在下または不在下で試験された全ての（Ｎ３Ｅ−ＹＴＥを除く）ｐＨ結合操作変異体は、野性型モタビズマブと比較して、血清クリアランスを有意に低下させ、薬物動態が向上された新規変異体を同定する本発明者らのアプローチが確認された（図６Ｂ）。ＰＫパラメータが改善された変異体は、モタビズマブと比較して約４〜４０倍強力である様々なｐＨ６．０親和性を有した。興味深いことに、２５ｎＭのｐＨ７．４親和性が、極めて劣るクリアランス速度（Ｎ３Ｅ−ＹＴＥ）をもたらした一方で、約１μＭ親和性のｐＨ７．４結合がある変異体は、半減期の増大をなおも示した。
【０２８６】
モタビズマブ変異体のＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合も評価された。興味深いことに、Ｎ３を除く大部分の変異体は、モタビズマブと比較して、特定のＦｃγＲに対する結合が低下した。これらの結合の変化は、いくつかの受容体に対する軽微（＜２倍の低下）から、完全に寄進された（ｏｂｌａｔｅｄ）結合（Ｙ１２−ＹＴＥの場合のように）に及んだ。興味深いことに、ＹＴＥ変異のみでさえも、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩｂ中で死去した（ｄｅｃｅａｓｅｄ）結合を引き起こし、いくつかのエフェクター機能は、ＹＴＥバックグラウンド中で低下されてもよいが、Ｎ３バックグラウンド中では低下されないことが示唆された。
【０２８７】
カニクイザルにおけるＮ３＆Ｙ３１−ＹＴＥの薬物動態
新規Ｆｃ変異体は、ｈＦｃＲｎマウスにおいて低いクリアランスを示し、次にＹ３１−ＹＴＥは、カニクイザルにおいてＹＴＥおよび野生型モタビズマブと比較された。それぞれ４匹の動物群に、モタビズマブまたはモタビズマブ−Ｆｃ変異体の単一ボーラス注射が投与され；続く８５日間にわたり、血清サンプルが採取された。以前の研究に合致して（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４）、ＹＴＥ−モタビズマブは、野生型モタビズマブとの対比で、改善された薬物動態特性を有した。Ｙ３１−ＹＴＥはまた、モタビズマブとの対比で、改善された薬物動態特性も有した（表３）。Ｙ３１−ＹＴＥ群３匹の動物は、５００〜１０００時間の間に、Ｙ３１−ＹＴＥ血清濃度に突然の低下を有し、おそらく抗薬剤抗体がＹ３１−ＹＴＥモタビズマブを排除したことが示唆された。野性型およびＹＴＥ群では、この期間内には同様の低下は見られなかった。
【０２８８】
【表３】
2017522000.tif 000007
【０２８９】
Ｎ３の免疫原性評価
Ｎ３変異が、免疫原性Ｔ細胞エピトープを導入するかどうかを評価するために、Ｎ３−モタビズマブとモタビズマブが、生体外Ｔ細胞増殖実験で比較された。２００人を超えるドナーからのＰＢＭＣは、これらの実験で使用された幅広いＨＬＡハプロタイプを表す。ＰＢＭＣは、モタビズマブ、Ｎ３−モタビズマブ、緩衝液単独、または免疫原性ＫＬＨタンパク質のいずれかと共に培養された。Ｔ細胞増殖が測定されて、結果は刺激指標（ＳＩ）として定量化され、ドナーＰＢＭＣのＴ細胞増殖が、緩衝液のみの対照のものと比較された（ＳＩ＝１）。ＫＬＨタンパク質がＳＩの有意な増大を有した一方で、モタビズマブおよびＮ３−モタビズマブはいずれも有しなかった（図７Ａ、７Ｂ）。これらのデータは、このようにして測定された際に、Ｎ３変異が低い免疫原性を有することを示唆する。
【０２９０】
ＹＴＥ変異体と比較したＮ３変異体のオプソニン作用死滅
Ｎ３およびＹＴＥとＦｃγ受容体との結合データは、Ｎ３が親Ｆｃγ受容体結合を維持する一方で、ＹＴＥはＦｃγＲ結合の低下を有することを示唆した（表２）。本発明者らは、これらの変異体の異なるＦｃγＲ結合親和性が、生体外で異なるエフェクター機能を引き起こし得るかどうかを評価し、本発明者らは、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）抗ｐｓｌ抗体Ｃａｍ００４のＹＴＥおよびＮ３変異体の両方を作成した（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ（２０１２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９（７）：１２７３−８７）。これらのコンストラクトは、患者由来の多形核細胞をエフェクターとして、ルシフェラーゼ発現シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株（ＰＡＯ１：ｌｕｘ）を標的抗体として使用して、オプソニン作用死滅アッセイ中で試験された。結果は、Ｎ３が、親抗体Ｃａｍ００４と同様のＯＰＫを示した一方で、ＹＴＥがＯＰＫの低下を有したことを示す（図８）。
【０２９１】
Ｎ３変異体の安定性
液体製剤中のＮ３モタビズマブ（５０ｍｇ／ｍｌのｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液）に、加速安定性試験が実施された。抗体製剤は４℃、２５℃、または４０℃で、１ヶ月間インキュベートされた。毎週、アリコートが採取され、ＨＰＳＥＣによって分析されて、単量体含有量ならびにあらゆる断片化または凝集が判定された。図９のデータは、時間と対比されたモノマー損失を描写し、Ｎ３変異体の１ヶ月あたりの損失が４０℃では１．２％であり、２５℃ではわずか０．３％と、かなり安定していることを示す。これらのデータは、Ｎ３変異がＦｃ領域の安定性に影響を及ぼさないことを示す。
【０２９２】
考察
ＩｇＧのＦｃ領域は、治療用抗体の効力および有効性を改変し得る変異の格好の材料を提供する。無数の異なる研究が、生体内半減期またはエフェクター機能が改変された、Ｆｃ変異体を同定している（Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５−６９１；Ｐｒｅｓｔａ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，４６０−４７０；Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３，４００５−４０１０）。広い薬物動態学的パラメータがある抗体の可能な利点としては、有効性を維持しながら、または改善さえしながら、投与頻度の低下をもたらす、特定の治療用ウインドウに適合させるためのより良い調節が挙げられる（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９）。スペクトルの対極は、半減期の低下を有するＦｃ変異体である。これらの抗体は、イメージングの明確さのために、および毒性を低下させるために、迅速なクリアランス速度が望ましい、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングなどのイメージング目的で有用であってもよい（Ｋｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＫ（ＦｃＲｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）．ｐｐ  ４１１−４３０；Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，２０４８−２０６０）。Ａｂｄｅｇは、改変されたＦｃＲｎ結合があるＦｃ変異体の第３のクラスである（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８）。内在性ＩｇＧレベルを低下させるＡｂｄｅｇの能力は、場合により、破壊的自己抗体によって特徴付けられる特定の自己免疫疾患を改善するために使用され得る（Ｋｉｌｌｏｃｋ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ７，４９６−４９６；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７，１０１５−１０２２；Ｃｈａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ｍＡｂｓ  ５，６５５−６５９  Ｅｐｕｂ）。Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用の操作に由来する、不同性生体内薬物動態予後を区別するパラメータをより良く理解するために、本発明者らは、Ｆｃファージディスプレイを使用して、高親和性バインダーを選択した。
【０２９３】
ＹＴＥバックグラウンド中で高親和性ＦｃＲｎ結合変異体を選択する本発明者らの最初の試みは、ｐＨ６において、ＦｃＲｎに対して、既に親和性が増大されたＹＴＥ変異体の＞５０倍強力な結合があるＮ３Ｅ−ＹＴＥをもたらした。位置４３７後のグルタミン酸挿入変異は、その除去時の６倍低い結合によって証明されるように、親和性の増大に寄与した（表１）。位置４３４および４３６の挿入および疎水性残基に加えて、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥは、位置４３２および４３７に２つのシステインを含有する。Ｈｉｓ４３５ループ基部におけるシステインの位置調整、それらの側鎖の近さと近接性と方向、およびこれらの変異の安定効果は、それらが互いにジスルフィド結合を形成すると本発明者らが考えるように導いた。本発明者らは、引き続いてペプチドマッピングによってこれを確認した。示差走査熱量測定は、ＣＨ２の軽微な不安定化効果という代償で得られる、ＣＨ３に対するＬ４３２ＣおよびＴ４３７Ｃの安定効果を確認する（図３）。これらのデータは、両方のシステインがループの安定性にとっておそらく重要であること、および介在配列が親和性の増大とｐＨ感受性損失との大部分をもたらすことを示す。Ｎ３Ｅ−ＹＴＥで見られた低いｐＨ依存性は、予想外ではなかった。Ｎ４３４Ｗのみが、ｐＨ６．０および７．４の両方でＦｃＲｎ結合増大を有することが報告されている（Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，７６６３−７６７１）。さらに、ＹＴＥ変異を２つの追加的なＨ４３５ループ変異と組み合わせるＭＳＴ−ＨＮ変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ）もまた、ｐＨ依存性の低下を示し、ａｂｄｅｇを生じる（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５１７１−５１８０；Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８。
【０２９４】
この最初のデータから、２つの追加的なライブラリー、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）およびＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）の作成がもたらされた。これらのライブラリーは、次にｐＨ７．４枯渇ステップでパニングされて、ｐＨ非感受性バインダーが排除され、単離されたクローンはファージＥＬＩＳＡによって評価された（図５Ａおよび５Ｂ）。ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーは、ファージＥＬＩＳＡを通じてより多くの高親和性ｐＨ依存性バインダーをもたらし、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリー中の４３２および４３７システインによって引き起こされる拘束の緩和が、ｐＨ依存性を再導入するのに有益であってもよいことが示唆された。注目すべきことに、ＣＸＸＸＸＣＥ（配列番号１０）ライブラリーは、（ＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）を欠く）残基４３７の後にグルタミン酸挿入もまた含有し、これもまた、これらのライブラリーから同定された変異体の不同性結合プロファイルの一部を説明し得た。興味深いことに、ｐＨ感受性結合と共に、ＹＴＥ単独よりも高い親和性を維持したＺＸＸＨＸＺ（配列番号１４）ライブラリーから同定された変異は、位置４３４の疎水性残基と共に、４３３、４３６のいずれか、または両方の荷電残基からなった（表１）。正荷電の増大は、これらの変異体のｐＨ依存性に寄与してもよい。
【０２９５】
変異体Ｎ３は、ＨｕＦｃＲｎマウスおよびカニクイザルにおいて、ＹＴＥと同様の薬物動態を有することが示され、さらにＹＴＥとは異なり、野生型ＩｇＧと同様にＦｃγおよびｄＣ１ｑ結合を維持する。さらにこれもまたＹＴＥとは異なり、Ｎ３は、親ＩｇＧｉｎシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰＡ０１  ｌｕｘ系と同等のＯＰＫ活性を有することが分かった（図８）。さらに、Ｎ３変異体は、貯蔵時にＦｃ領域の安定性に影響を及ぼさない。したがってＮ３は、例えば、より長い半減期と強力なエフェクター機能が望ましい、感染性因子を標的化する抗体媒介性のクリアランス用途で使用される修飾ＩｇＧとして、実用性を有することが予期される。
【０２９６】
本発明者らのデータは、ＦｃＲｎ媒介性半減期延長には、おそらく閾値レベルがあり（図６Ｂ）、この閾値を超えてもさらなるＰＫ改善がもたらされないことを示唆する。実際に、ＦｃＲｎ親和性をこの閾値を超えて過剰に増大させることは、野生型よりも短い半減期を示す、Ｎ３Ｅ−ＹＴＥまたはＭＳＴ−ＨＮのような分子をもたらし（Ｍｏｎｔｏｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，２７８８−２７９３）、通常のＩｇＧリサイクルを撹乱させてもよい（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２８３−１２８８）。意外にも、本発明者らは、１μＭ程度に低いｐＨ７．４結合がある変異体が、なおも、ＹＴＥ単独と同レベルの生体内半減期の増大を維持することを発見した（表２）。２４ｎＭのｐＨ７．４ＫＤがあるＮ３Ｅ−ＹＴＥは、極めて高速なクリアランスを示した。本発明者らは、このおよそ１μＭの閾値未満に、ｐＨ６．０における結合強化がある変異体が、ＰＫ増大、もしくは野性型よりも迅速なクリアランスを示すＡｂｄｅｇ様のいずれになるかを決定する臨界点があるようであることを提案する。
【０２９７】
ＨｕＦｃＲｎマウスにおいて最長半減期がある変異体、Ｎ３およびＹ３１−ＹＴＥは、野性型モタビズマブよりも約３倍優れたクリアランスと、約５倍長い半減期とを有した。これらの変異体は、記載される最高のＰＫ改善変異体の部類に入る（Ｐｒｅｓｔａ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，４６０−４７０）。親抗体と比較した半減期またはクリアランス速度のおよそ３〜５倍の増大は、報告された中で最大のＦｃＲｎ結合改変によって達成される改善である（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２３５１４−２３５２４；Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１５７−１５９）。カニクイザルにおける薬物動態データもまた同様に、野性型モタビズマブと対比したＹ３１−ＹＴＥおよびＮ３の改善を示した。本発明者らおよび他の研究者らのデータに照らして、純粋にＦｃＲｎ結合をさらに改変することで、３〜４倍のＰＫ増大を超えて顕著に改善する余地があるとは想像しがたい。本発明者らは、ＦｃＲｎ結合変異をｐＩ操作（Ｄａｈｉｙａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２０１２００２８３０４  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｅｂ．２，２０１２）、ＰＥＧ化（Ｊｅｖｓｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．５，１１３−１２８）、Ｐａｓ化（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６，４８９−５０１）、ｐＨ依存性抗原結合（抗原シンク効果を低下させるための）（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１２０３−１２０７；Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２３，３８５−３９２）などのＦｃＲｎ非依存性半減期延長技術と組み合わせることで、Ｆｃ含有分子のさらにより長い生体内半減期が達成され得ることを予見する。
【０２９８】
実施例ＩＩ
ｐＨ依存性抗原結合による抗体媒介性のクリアランスに依存する治療ストラテジーのための抗体形式
抗体は、それらの抗原に対するｐＨ依存性結合のために操作されている。操作抗体は、循環（ｐＨ７．４）中の抗原に結合してクリアランスを媒介するが、選別エンドソーム（ｐＨ６）中にそれを放出し、その結果、ＦｃＲｎを通じて抗体をリサイクルできるようにする一方で、後に残された抗原はエンドソーム内で分解される。
【０２９９】
ｐＨ７．４および６．０の両方でＦｃＲｎに対する高親和性がある抗体形式が、本明細書に記載される。一実施例は、同等の野生型抗体よりも短い半減期を示す、実施例Ｉに記載されるＮ３Ｅ−ＹＴＥである。Ｎ３Ｅ−ＹＴＥおよびその類似物のより短い半減期の可能な説明としては、これらの抗体が細胞表面でＦｃＲｎと結合したままであり、その結果、血清サンプル中で検出されなくてもよいことが挙げられる。それらがＦｃＲｎと複合体形成して、エンドソーム内に循環される場合、この形式は、抗原クリアランスのためにはるかにより効率的であると予測される（図１０を参照されたい）。
【０３００】
したがって、より効率的な抗体媒介性のクリアランスが想定される。生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）および低ｐＨ（ｐＨ６）の両方で、ＦｃＲｎに対して高親和性がある抗体形式は、エンドソーム区画内および細胞表面の両方でＦｃＲｎと結合してもよい。その結果、それは細胞表面の抗原に結合して、エンドソームへの内部移行を活発に媒介し、それは抗原クリアランスにとってはるかにより効率的である。さらに、抗体駆動性エンドサイトーシスは、免疫系の血清含有量のサンプリングを支持してもよい機序である（Ｋｕｏ  ＴＴ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３０：７７７−７８９）。したがって効率の増大は、本明細書に記載されるように、生理学的なｐＨにおけるＦｃＲｎ親和性を増大させることで可能になる。
【０３０１】
このような抗体の有効性は、生体内で試験され得る。臨床的関連性があるモデル系は、ＰＣＳＫ−９である。ｐＨ依存性結合のある抗ＰＣＳＫ−９抗体が知られている（Ｃｈａｐａｒｒｏ−Ｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＢＣ  ２８７：１１０９０−１１０９７）。その抗原とのｐＨ依存性結合のために操作された抗ＰＣＳＫ−９抗体の可変領域は、改変されたＦｃＲｎ結合を有する、四分区間ＩおよびＩＩＩに入る抗体基礎構造のいずれかに組み込まれ得る。場合によっては、四分区間ＩＩＩに入る構造に基づくものが好ましいこともある。このような抗体作成は、本明細書に記載される手順を使用して達成され得、野生型抗ＰＣＳＫ−９と並べて比較できるようにする。様々な時点における外来性ＰＣＳＫ９のクリアランス速度は容易に測定され得る。ｐＨ依存性結合がある任意のその他の抗体が、同様の研究のために使用され得る。このシステムは、抗体クリアランスに依存する全ての用途のために、有効性の増大を提供し、その中ではｐＨ依存性抗原結合がある抗体が遺伝子操作され得る。
【０３０２】
本明細書で引用される全ての特許、仮特許出願をはじめとする特許出願、特許文献および非特許文献をはじめとする文献、および電子的に利用できる情報（例えばＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑなどのヌクレオチド配列登録、ならびに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどのアミノ酸配列登録、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑ中の注釈付きコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参照により援用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ示された。不要な限定がそれから解釈されるべきではない。本発明は、示されて説明される正確な詳細に限定されず、当業者に明白である変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれる。
【図１Ａ】
2017522000.tif 000008
【図１Ｂ】
2017522000.tif 000009
【図１Ｃ】
2017522000.tif 000010
【図１Ｄ】
2017522000.tif 000011
【図１Ｅ】
2017522000.tif 000012
【図１Ｆ】
2017522000.tif 000013
【図２Ａ】
2017522000.tif 000014
【図２Ｂ】
2017522000.tif 000015
【図２Ｃ】
2017522000.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
2017522000.tif 000019
【図６】
2017522000.tif 000020
【図７】
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【図８】
2017522000.tif 000022
【図９】
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【図１０】
2017522000.tif 000024
【配列表】
2017522000000001.app
【国際調査報告】
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2017522000.tif 000026
2017522000.tif 000027
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