(57)【要約】  胆汁うっ滞又は線維性肝疾患などの肝疾患又は肝障害を検出し、阻害し、治療し、及び／又は予防するための組成物及び方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肝障害を治療し、阻害し、及び／又は予防する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与するステップを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがｍｉＲ−２７ａクラスター又はｍｉＲ−１８２クラスターと特異的にハイブリダイズする、方法。
【請求項２】
ｍｉＲ−２７ａクラスターと特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド及びｍｉＲ−１８２クラスターと特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがｍｉＲ−２７ａ又はｍｉＲ−１８２と特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがｍｉＲ−２７ａと特異的にハイブリダイズする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号６と少なくとも９０％相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが発現ベクターにコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンタゴｍｉｒ、タフデコイ、又はスポンジである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記肝障害が胆汁うっ滞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記肝障害が肝線維症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象における肝傷害の存在を検出する方法であって、前記方法が、前記対象からの生体試料中におけるｍｉＲ−２７ａクラスター及び／又はｍｉＲ−１８２クラスターの存在を検出するステップを含み、
健常試料からの生体試料中のレベルと比較したｍｉＲ−２７ａクラスター及び／又はｍｉＲ−１８２クラスターの量の増加が、前記対象が肝傷害を有することの指標となる、方法。
【請求項１２】
前記肝傷害が胆汁うっ滞である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，９２６号明細書に対する優先権を主張する。前述の出願は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：ＮＩＤＤＫ）から付与された助成金第Ｒ０１  ＤＫ０７９８８１号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、肝疾患及び肝障害、特に胆汁うっ滞の分野に関する。具体的には、胆汁うっ滞を治療し、阻害し、及び／又は予防するための組成物及び方法が開示される。
【背景技術】
【０００４】
本明細書全体を通じて、本発明が関係する分野の技術水準を説明するため幾つかの刊行物及び特許文献が引用される。これらの引用は、各々、全てが示されたものとして参照により本明細書に援用される。
【０００５】
胆汁うっ滞は胆汁の合成又は排泄が障害されている状態であり、多種多様な感染性、炎症性、遺伝的、中毒性、及び血管性肝疾患に共通する最終エンドポイントである。胆汁成分、特に胆汁酸の蓄積は肝臓にとって有毒であり、慢性胆汁うっ滞は、無治療の場合には進行性線維症、硬変、肝不全につながり、死亡に至る（Ｋｏｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ３８：１０４３−７１）。胆汁うっ滞は種々の感染性、閉塞性、代謝性及び発育性肝障害によって引き起こされる。従って胆汁うっ滞に対する肝臓の反応の理解が進むことは、肝疾患を有する多数の成人及び小児集団に影響を与え得る。
【０００６】
胆汁うっ滞では、肝細胞及び胆管細胞が胆汁酸、重金属、及び生体異物を含めた通常は小腸に排泄される毒素に高レベルで曝露される。当然のことながら、胆汁酸合成、胆管排泄、腸管吸収、及び肝細胞への取り込みのサイクルは、フィードバック機構によって調節される（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．，３０：１６０−７７）。これらの多くは、核内受容体転写因子（ＮＲ）が胆汁酸及び他の胆汁成分の細胞内濃度を検出する能力に基づく。肝細胞では、ＮＲは胆汁酸取り込み輸送体及び合成酵素の発現を抑制し、一方で排出遺伝子を活性化する。主として他の代謝経路に関わるＮＲもまた胆管機能に影響を与え得る；例えば、脂質質センサーＰＰＡＲγは胆汁酸合成における律速酵素であるＣＹＰ７Ａ１並びにリン脂質トランスポーターＭＤＲ３（マウスではＭｄｒ２）を調節する（Ｍａｒｒａｐｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４１：５１４−２０；Ｋｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３６９：５３９−４７）。それにも関わらず、これらの恒常性維持経路は、多くの胆汁うっ滞性疾患の状況において肝臓を保護することができない。結果として、胆汁うっ滞性損傷は胆汁性肝硬変及び肝不全に進行する。胆汁うっ滞性疾患患者の治療の進展には、胆汁の流れを調節する分子経路及び胆汁酸の慢性的上昇に対する細胞応答に関して理解を高める必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明においては、肝臓に関連する疾患又は障害（例えば、肝傷害）を阻害し、治療し、及び／又は予防する方法が提供される。詳細な実施形態において、肝臓に関連する疾患又は障害は肝線維症である。詳細な実施形態において、肝臓に関連する疾患又は障害は胆汁うっ滞である。詳細な実施形態において、本方法は、特に対象の肝臓においてｍｉＲ−２７ａクラスター及び／又はｍｉＲ−１８２クラスターを阻害する少なくとも１つの薬剤を対象に投与するステップを含む。詳細な実施形態において、本方法は、ｍｉＲ−２７ａクラスター及び／又はｍｉＲ−１８２クラスター、特にｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの阻害性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、ｓｈＲＮＡ等、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド）を投与するステップを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＡＶベクターなどの発現ベクターで投与されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】胆汁うっ滞によってｍｉＲ−２７ａ及びｍｉＲ−１８２が誘導されることを示す。８週齢Ｍｄｒ２-/-対野生型（ＷＴ）マウス、胆管結紮マウス（ＢＤＬ）対偽処置マウス（結紮後１５日）、及び胆道閉鎖症小児のヒト臨床試料又は非胆汁うっ滞性疾患対照試料において肝ｍｉＲＮＡを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって計測した。マウスｎ＝４〜６；ヒト肝試料ｎ＝８。全ての対についてｐ＜０．０５。
【図２】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）処置がＭｄｒ２欠損雄マウスに及ぼす効果を示す。ＡＳＯ２７及びＡＳＯ１８２による処置は、対照ＡＳＯと比べて高トランスアミナーゼ血症を有意に低下させた。ＡＳＯ２７による処置は肝腫大を有意に低減した。有意差は括弧で示す：＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】ＡＳＯ２７が遺伝子発現に影響を及ぼし、肝線維症を低下させることを示す。図３Ａは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定される相対転写物レベルを示す。ｎ＝６、＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。ｍｉＲ−２７標的Ｆｏｘｏ１及びＰｐａｒａは、ｍｉＲ−２７ａがインビボで遮断されると有意に上方制御され、一方、線維症関連コラーゲン４ａ１（Ｃｏｌ４ａ１）の発現は低下する。ヘテロ接合体（ｈｅｔ）：ｎ＝４〜８；突然変異体：ｎ＝６〜１０；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。
【図３Ｂ】ＡＳＯ２７が遺伝子発現に影響を及ぼし、肝線維症を低下させることを示す。図３Ｂは、ＡＳＯ２７処置Ｍｄｒ２変異マウスからの肝切片のトリクロム染色像を提供する。線維性架橋形成の質的低下が観察される。ヘテロ接合体（ｈｅｔ）：ｎ＝４〜８；突然変異体：ｎ＝６〜１０；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。
【図３Ｃ】ＡＳＯ２７が遺伝子発現に影響を及ぼし、肝線維症を低下させることを示す。図３Ｃは、血清総胆汁酸値を提供する。ヘテロ接合体（ｈｅｔ）：ｎ＝４〜８；突然変異体：ｎ＝６〜１０；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。
【図３Ｄ】ＡＳＯ２７が遺伝子発現に影響を及ぼし、肝線維症を低下させることを示す。図３Ｄは、肝ヒドロキシプロリン値がＡＳＯｃｔｒｌ処置と比べてＡＳＯ２７処置Ｍｄｒ２変異マウスにおいて低いことを示す。ヘテロ接合体（ｈｅｔ）：ｎ＝４〜８；突然変異体：ｎ＝６〜１０；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。
【図４】０、２、５、又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＡＳＯ２７で処置したＭｄｒ２変異マウスにおける一般的に使用される肝傷害の血清指標（左側のパネル）：乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｅ）（ＬＤＨ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及び胆汁うっ滞の血清指標（総ビリルビン、右側のパネル）の血清値のグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
マイクロＲＮＡは遺伝子発現を微調整する調節分子であり、幾つかの疾患の新しいバイオマーカークラスである。しかしながら、胆汁うっ滞におけるマイクロＲＮＡの役割は不明であった。本明細書では、様々な胆汁うっ滞モデルにおいて幾つかのｍｉＲＮＡが誘導されること、及び特に２つのｍｉＲＮＡが発病に強く寄与していることが発見された。より具体的には、本明細書に提供される結果は、ｍｉＲ−２３ａ／ｍｉＲ−２７ａ／ｍｉＲ−２４−１クラスター（以下、ｍｉＲ−２７ａクラスター）及びｍｉＲ−１８３／ｍｉＲ−９６／ｍｉＲ−１８２クラスター（以下、ｍｉＲ−１８２クラスター）が胆汁うっ滞性傷害及び／又は線維症に寄与することを実証している。さらに、ｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２クラスターのいずれかの阻害が進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ３）のマウスモデルにおいて胆汁うっ滞表現型を改善し、これらのｍｉＲＮＡの誘導が病因に関係することを示している。より具体的には、ｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したマウスでは、肝傷害が低下し、線維症の観察が減少した。
【００１０】
本明細書では、肝胆汁うっ滞モデル及びヒト胆道閉鎖症肝試料においてｍｉＡ−２７ａ及びｍｉＲ−１８２のマイクロＲＮＡが誘導されることが発見された。胆道閉鎖症（ＢＡ）は、未知の病因の原発性傷害がＴ細胞媒介性の進行性肝外胆管系破壊につながる乳児の線維性炎症性肝疾患である（Ｂｅｚｅｒｒａ，Ｊ．Ａ．（２００５）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ９：６４６−６５１；Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌａｎｃｅｔ  ３７４：１７０４−１７１３；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．，３５：Ｓ１１−１６；Ｍｉｅｌｉ−Ｖｅｒｇａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，３１：３７１−３８１）。胆汁うっ滞におけるこれらのマイクロＲＮＡの機能を試験するため、ｍｉＲ−２７ａ又はｍｉＲ−１８２を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを胆汁うっ滞マウスに注射した。胆汁うっ滞マウスはＭｄｒ２遺伝子に突然変異を有し、ヒトにおける進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型（ＰＦＩＣ−３）疾患を再現する進行性胆汁うっ滞性疾患を生じる。対照マウスと比較して、ｍｉＲ−２７ａ又はｍｉＲ−１８２（特にｍｉＲ−２７ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを注射したマウスでは肝傷害のエビデンスが減少し（例えば、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の低下）、線維症が減少し（組織学的に及びコラーゲン遺伝子発現レベルで）、及び総コレステロールが僅かに上昇した（なおも正常範囲内）。これらのマウスにおける遺伝子発現プロファイリングからは、星細胞活性化の低下と一致する広範な遺伝子発現の変化が明らかになる。
【００１１】
遺伝子ＩＤ：４０７０１０及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９４９５はヒトｍｉＲ−２３ａのヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９４９５は以下の前駆体配列を提供する：
【化１】
2017506638.tif 000002
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（９〜３０位及び４５〜６５位）に下線を引く）。ｍｉＲ−２３ａの成熟配列は以下である：ｇｇｇｇｕｕｃｃｕｇｇｇｇａｕｇｇｇａｕｕｕ（配列番号２）及びａｕｃａｃａｕｕｇｃｃａｇｇｇａｕｕｕｃｃ（配列番号３）。
【００１２】
遺伝子ＩＤ：４０７０１８及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９５０１はヒトｍｉＲ−２７ａのヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９５０１は以下の前駆体配列を提供する：
【化２】
2017506638.tif 000003
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（１０〜３１位及び５１〜７１位）に下線を引く）。ｍｉＲ−２７ａの成熟配列は以下である：ａｇｇｇｃｕｕａｇｃｕｇｃｕｕｇｕｇａｇｃａ（配列番号５）及びｕｕｃａｃａｇｕｇｇｃｕａａｇｕｕｃｃｇｃ（配列番号６）。
【００１３】
遺伝子ＩＤ：４０７０１２及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９４９６はヒトｍｉＲ−２４−１のヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９４９６は以下の前駆体配列を提供する：
【化３】
2017506638.tif 000004
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（７〜２８位及び４４〜６５位）に下線を引く）。ｍｉＲ−２４−１の成熟配列は以下である：ｕｇｃｃｕａｃｕｇａｇｃｕｇａｕａｕｃａｇｕ（配列番号８）及びｕｇｇｃｕｃａｇｕｕｃａｇｃａｇｇａａｃａｇ（配列番号９）。
【００１４】
遺伝子ＩＤ：４０６９５９及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６１５はヒトｍｉＲ−１８３のヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６１５は以下の前駆体配列を提供する：
【化４】
2017506638.tif 000005
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（２７〜４８位及び６６〜８７位）に下線を引く）。ｍｉＲ−１８３の成熟配列は以下である：ｕａｕｇｇｃａｃｕｇｇｕａｇａａｕｕｃａｃｕ（配列番号１１）及びｇｕｇａａｕｕａｃｃｇａａｇｇｇｃｃａｕａａ（配列番号１２）。
【００１５】
遺伝子ＩＤ：４０７０５３及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９５１２はヒトｍｉＲ−９６のヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９５１２は以下の前駆体配列を提供する：
【化５】
2017506638.tif 000006
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（９〜３１位及び５２〜７３位）に下線を引く）。ｍｉＲ−９６の成熟配列は以下である：ｕｕｕｇｇｃａｃｕａｇｃａｃａｕｕｕｕｕｇｃｕ（配列番号１４）及びａａｕｃａｕｇｕｇｃａｇｕｇｃｃａａｕａｕｇ（配列番号１５）。
【００１６】
遺伝子ＩＤ：４０６９５８及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６１４はヒトｍｉＲ−１８２のヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６１４は以下の前駆体配列を提供する：
【化６】
2017506638.tif 000007
（式中、ｍｉＲＮＡ二重鎖のストランド（２３〜４６位及び６７〜８７位）に下線を引く）。ｍｉＲ−１８２の成熟配列は以下である：ｕｕｕｇｇｃａａｕｇｇｕａｇａａｃｕｃａｃａｃｕ（配列番号１７）及びｕｇｇｕｕｃｕａｇａｃｕｕｇｃｃａａｃｕａ（配列番号１８）。
【００１７】
本発明においては、肝傷害／障害／疾患を阻害（例えば低減）し、予防し、及び／又は治療する方法が提供される。詳細な実施形態において、肝傷害／障害／疾患は線維性（例えば、線維性肝疾患）である。詳細な実施形態において、肝傷害／障害／疾患は胆汁うっ滞及び／又は胆汁うっ滞関連疾患若しくは障害である。詳細な実施形態において、本方法は、ｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２クラスターに特異的にハイブリダイズするか（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれ以上の塩基対同一性（相補性））又はそれと完全に相補的な（即ち、１００％の塩基対合（但し異なる長さは許容される））少なくとも１つの阻害性核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟又は前駆体マイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズするか又はそれと完全に相補的な配列を含み得る。詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パッセンジャー鎖ではなく、主要なマイクロＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズするか又はそれと完全に相補的である配列を含む（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２７ａについて５’−ｕｕｃａｃａｇｕｇｇｃｕａａｇｕｕｃｃｇｃ（配列番号６）又はｍｉＲ−１８２について５’−ｕｕｕｇｇｃａａｕｇｇｕａｇａａｃｕｃａｃａｃｕ（配列番号１７)を標的化し得る）。詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２に特異的にハイブリダイズするか又はそれと完全に相補的である。詳細な実施形態において、本方法は、ｍｉＲ−２７ａ及びｍｉＲ−１８２の各々に対する少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要としている対象に投与することを含む。
【００１８】
本発明の方法による胆汁うっ滞性肝傷害の治療は、胆汁うっ滞肝に関連する種々の病態、疾患、又は障害に対して幅広い適用性を有する。実際、胆汁うっ滞肝は、種々の疾患及び障害の症状及び／又は徴候である。胆汁うっ滞に関連する疾患又は障害としては、限定なしに、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、ウイルス性肝炎、胆汁うっ滞性肝炎（胆細管炎性肝炎）、アラジール症候群、ＰＦＩＣ  １〜３などが挙げられる。本発明の方法は、胆汁うっ滞及び／又は胆汁うっ滞に関連する疾患若しくは障害を治療するための少なくとも１つの他の薬剤、治療薬、又は薬物の投与をさらに含み得る。例えば、原発性胆汁性肝硬変の治療のためウルソジオールが共送達され得る。
【００１９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは直接投与されてもよく、又は送達媒体で投与されてもよい。詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター）で送達される。換言すれば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは発現ベクター内にコードされ得る。発現ベクターは、核酸コンストラクト内にコードされた配列の発現及び／又はコンストラクトの細胞内送達を可能にする。発現ベクターのプロモーターは、（短鎖）ＲＮＡ分子の発現に特に好適であり得る。かかるプロモーターの例としては、限定はされないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１）が挙げられる（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２５０２−０９を参照のこと）。詳細な実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターはＲＮＡベース又はＤＮＡベースであり得る。ウイルスベクターの例としては、限定なしに、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスが挙げられる。詳細な実施形態において、ウイルスベクターは所望の細胞型（例えば、肝細胞）を形質導入する能力を有する。詳細な実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ  ２／８）である。ＡＡＶベクターは、インビボでの肝ｍｉＲＮＡの阻害に使用することができる（Ｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  １３７：１００５−１７；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：４０３−９）。例えば、肝臓へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達にＡＡＶ  ２／８シュードタイプ組換えウイルスベクターを使用し得る。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）コンストラクトもまた、肝細胞における高効率のインビボ発現の駆動に使用し得る（Ｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  １３７：１００５−１７）。アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びそれらのハイブリッド（例えば、２、３、４、５つ、又はそれ以上の血清型のコンビナトリアルハイブリッド）からなる群から選択される血清型であってもよい。アデノ随伴ウイルスベクターは、異なるＡＡＶ由来のカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ血清型１〜１２のいずれか一つ）とゲノム（例えば、ＡＡＶ血清型２）とを有するハイブリッドＡＡＶベクターであってもよい。詳細な実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターはＡＡＶ２／８である。アデノ随伴ウイルスベクターの合成及び調製方法は当該技術分野において周知されている。他の送達媒体としては、限定なしに、脂質ベースの媒体（例えば、リポソーム）及び生分解性ポリマーミクロスフェアが挙げられる。
【００２０】
以上に記載したとおり、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｍｉＲＮＡ（成熟型又は前駆体型）に特異的にハイブリダイズするか、又はそれと完全に相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖、特に一本鎖であり得る（しかしながら一本鎖オリゴヌクレオチドがヘアピンなどの二本鎖構造を形成し得る）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には約１０〜約１００ヌクレオチド長、より典型的には約１０〜約５０ヌクレオチド、約１０〜約３０ヌクレオチド又は約１５〜約２５ヌクレオチドであり得る。詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡ、特に以上に示した配列（例えば、配列番号１〜１８のいずれか一つ）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％の相補性を有し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡ、特に以上に示した配列（例えば、配列番号１〜１８のいずれか一つ）の相補体である配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％の同一性を有し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡと相補性を有する配列の５’側又は３’側に追加のヌクレオチドを含み得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に対する相補性を有する領域の５’側又は３’側に少なくとも１、２、３、４、５、又は最大１０又は２０ヌクレオチドを含み得る。この追加のヌクレオチドが互いに相補性を有し（例えば相同性領域）、ヘアピン構造を作ってもよい。
【００２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド類似体は、例えば、アニーリング親和性、特異性、細胞及び生物におけるバイオアベイラビリティ、細胞及び／又は核輸送、安定性、及び／又は耐分解性を増加させるために用いられ得る。ヌクレオチド類似体としては、限定なしに、リン酸塩修飾を有するヌクレオチド（例えば、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸ジエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホロアリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｒｉｄａｔｅ）、モルホリノ、アミデートカルバメート（ａｍｉｄａｔｅ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリル置換を含むもの（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ（１９９５）「核酸類似体：合成及び特性（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「オリゴヌクレオチドの新規骨格置換（Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照のこと））；２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）、２’−フルオロ、２’−α−フルオロ（ｆｌｏｕｒｏ）、及び２’−Ｏ−メチルオキシエトキシなどの修飾糖類又は糖修飾を有するヌクレオチド；及びヌクレオチド模倣体、例えば、限定なしに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸、アンヒドロヘキシトール核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。ヌクレオチド類似体は、米国特許出願公開第２００５／０１１８６０５号明細書及び米国特許第５，８８６，１６５号明細書；同第６，１４０，４８２号明細書；同第５，６９３，７７３号明細書；同第５，８５６，４６２号明細書；同第５，９７３，１３６号明細書；同第５，９２９，２２６号明細書；同第６，１９４，５９８号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，１７５，００４号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，１６６，１８８号明細書；同第６，１６０，１５２号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１５３，７３７号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１４６，８２９号明細書；同第６，１２７，５３３号明細書；及び同第６，１２４，４４５号明細書に記載されている。詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−フルオロ（ｆｌｏｕｒｏ）、２’−α−フルオロ（ｆｌｏｕｒｏ）、及びホスホロチオエート骨格からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００２２】
詳細な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒ、タフデコイ（ＴｕＤ）、又はスポンジである。アンタゴｍｉｒは単一のｍｉＲＮＡ標的を含む（即ち、それはｍｉＲＮＡに相補的である）。ｍｉＲＮＡスポンジは、タンデムに配置された２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ（２０１０）１６：２０４３−２０５０（参照によって本明細書に援用される）に記載される）。ｍｉＲＮＡスポンジはｍｉＲＮＡ標的配列の中心にバルジを含み得る（即ち、バルジを有するスポンジであり得る）。ＴｕＤは、目的の成熟ｍｉＲＮＡに配列が相補的な、バルジを有するヘアピンＲＮＡであり、ＴｕＤ転写物の開裂を防ぐため中心に不対合領域（例えば、４ヌクレオチド又はそれ以上の領域（例えば、約４〜約５０ヌクレオチド、特に約４〜約１０、１５、又は２０ヌクレオチド）を備えている（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．，２０：Ｒ８５８−６１；Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７：ｅ４３；Ｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ  １９：２８０−２９３；参照によって本明細書に援用される）。ＴｕＤは、２つのｍｉＲＮＡ標的配列を取り囲む相同性領域（例えば、少なくとも約５ヌクレオチド）を含み、それにより成熟形態の２つのｍｉＲＮＡ標的配列を露出させる内部バルジを生じる。ＴｕＤはまた、タンデム配列で配置して発現させることもできる。
【００２３】
本発明においては、肝傷害（例えば、胆汁うっ滞）の存在又は肝傷害（例えば、胆汁うっ滞）の発症リスクの増加を検出する方法が提供される。詳細な実施形態において、本方法は、対象から得た生体試料においてｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２クラスター、特にｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２の存在及び／又は発現を検出するステップを含む。健常試料（例えば、胆汁うっ滞を有しない患者からの生体試料）と比較したｍｉＲ−２７ａ及び／又はｍｉＲ−１８２の量の増加は、胆汁うっ滞の存在又は胆汁うっ滞の発症リスクの増加の指標となる。詳細な実施形態において、本方法は、対象から生体試料を得るステップをさらに含む。詳細な実施形態において、マイクロＲＮＡの検出は、胆汁うっ滞の分類、診断及び／又は予後判定を可能にする（例えば、発現の増加が大きいほど、胆汁うっ滞の重症度又はリスクの増加と相関付けられる）。本発明の方法は、成熟型及び／又は前駆体型のマイクロＲＮＡの検出を含み得る。
【００２４】
本発明においては、任意のマイクロＲＮＡ検出方法を用いることができる。例えば、インサイチュ及び／又はインビトロ方法が用いられ得る。用い得る検出方法の例としては、限定なしに、生体試料の核酸分子（任意選択で単離されたもの）をプローブと接触させること、インサイチュハイブリダイゼーション、マイクロアレイ（例えば、プローブのマイクロアレイ）解析、親和性マトリックス、ノーザンブロット解析、及びＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ等）が挙げられる。ＲＮＡは分解し易いため、解析前に生体試料の核酸をＤＮＡに（例えば、逆転写によって）変換してもよい。詳細な実施形態において、この検出方法は、成熟又は前駆体マイクロＲＮＡと特異的にハイブリダイズするか（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれ以上の塩基対同一性）又はそれと完全に相補的な（即ち、１００％の塩基対合（但し異なる長さは許容される））少なくとも１つのプローブ又はプライマーの使用を含む。
【００２５】
本発明はまた、１）本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、２）少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とを含む組成物も包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは発現ベクター内にコードされ得る。詳細な実施形態において、本組成物は、ｍｉＲ−２７ａ及びｍｉＲ−１８２の各々に対する少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。かかる組成物は、胆汁うっ滞の治療のためそれを必要としている患者に治療有効量で投与され得る。本組成物は、胆汁うっ滞及び／又は胆汁うっ滞に関連する疾患若しくは障害を治療するための少なくとも１つの他の薬剤をさらに含み得る。或いは、胆汁うっ滞又は関連疾患若しくは障害を治療するための他の薬剤は、逐次的投与用及び／又は同時投与用の少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む別個の組成物中に含まれてもよい。本発明の組成物はキット内に含まれてもよい。
【００２６】
本発明の組成物は、任意の好適な経路によって、例えば、注射によるか（例えば、局所投与用（腎臓に対するもの又は腎臓内へのものを含め、直接の）又は全身投与用）、経口、経肺、局所、経鼻又は他の投与方式によって投与することができる。本組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、局所、吸入、経皮、肺内、動脈内（ｉｎｔｒａａｒｅｔｅｒｉａｌ）、直腸内、筋肉内、及び鼻腔内投与を含め、任意の好適な手段によって投与し得る。詳細な実施形態において、本組成物は静脈内投与されるか、又は肝臓に直接投与される。一般に、本組成物の薬学的に許容可能な担体は、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／又は担体の群から選択される。本組成物は、様々な緩衝剤含有物（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；及び添加剤、例えば、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含むことができる。本組成物はまた、ポリマー化合物、例えば、ポリエステル類、ポリアミノ酸類、ヒドロゲル類、ポリラクチド／グリコリド共重合体、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の粒子状製剤内、又はリポソーム内に配合することもできる。かかる組成物は、本発明の医薬組成物の成分の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。本発明の医薬組成物は、例えば液体形態で調製してもよく、又は乾燥粉末形態（例えば、後に再構成される凍結乾燥したもの）であってもよい。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」には、前段落に例示するとおりの、医薬製剤の所望の投与経路に適切であり得るあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質に対するかかる媒体の使用は当該技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が投与分子と適合しない場合を除き、医薬製剤中におけるその使用が企図される。
【００２８】
特定の患者に対する投与に好適な本発明の分子の用量及び投薬量レジメンは、患者の年齢、性別、体重、全身の医学的状態、及び阻害薬の投与理由となる具体的な病態及びその重症度を考慮して医師が決定し得る。医師はまた、投与経路、医薬担体、及び分子の生物学的活性も考慮し得る。
【００２９】
好適な医薬製剤の選択は、選択された投与方法に依存し得る。例えば、本発明の分子は、腎組織、又は腎臓を取り囲む範囲への直接的な注射によって投与されてもよい。この例では、医薬製剤は、腎組織と適合性のある媒体中に分散した分子を含む。
【００３０】
本発明の分子はまた、静脈内注射によって血流中に、又は皮下、筋肉内、くも膜下腔内、若しくは腹腔内注射によって非経口投与されてもよい。非経口注射用の医薬製剤は当該技術分野において公知である。分子の投与方法として非経口注射が選択される場合、十分な量の分子がその標的細胞に到達して生物学的効果を発揮することを確実にするための手段がとられなければならない。分子がその標的位置に到達できるようにするため、分子、又は分子を送達する医薬製剤の親油性を増加させる必要があることもある。分子の親油性を増加させる方法は当該技術分野において公知である。
【００３１】
医薬担体との均質混合物中に本発明の化合物を活性成分として含有する医薬組成物は、従来の医薬配合技法に従い調製することができる。担体は、例えば、静脈内、経口、局所、又は非経口など、投与に望ましい製剤の形態に応じて多種多様な形態をとり得る。経口剤形の分子の調製においては、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤及び溶液など）の場合に、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤など；又は経口固形製剤（例えば、散剤、カプセル及び錠剤など）の場合に、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体等、通常の医薬媒体のいずれを用いることもできる。投与が容易であるため、錠剤及びカプセルが最も有利な経口単位剤形に相当し、その場合、明らかに固形医薬担体が用いられる。必要であれば、錠剤は標準的な技法によって糖衣錠又は腸溶錠にされてもよい。非経口については、担体は通常滅菌水を含み得るが、例えば溶解を促進するため又は保存目的で他の成分が含まれてもよい。また注射用懸濁液が調製されてもよく、その場合、適切な液体担体、懸濁剤などが用いられ得る。
【００３２】
本発明の医薬製剤は、投与の容易さ及び投薬量の均一性から単位剤形で製剤化され得る。単位剤形は、本明細書で使用されるとき、治療を受けている患者に適切な医薬製剤の物理的に個別の単位を指す。各投薬量は、選択の医薬担体との関連で所望の効果を生じるように計算された分量の活性成分を含有しなければならない。適切な投薬量単位を決定するための手順は当業者に周知されている。投薬量単位は患者の体重に応じて比例して増加又は減少し得る。特定の病的状態の軽減に適切な濃度は、当該技術分野において公知のとおり、投薬量濃度曲線の計算によって決定し得る。本発明の分子の投与に適切な投薬量単位は、動物モデルにおける分子の毒性を判定することにより決定し得る。種々の濃度の医薬製剤を胆汁うっ滞を有する動物に投与することができ、その処置の結果として胆汁うっ滞及び副作用が有意に減少した結果に基づき最低及び最高投薬量を決定し得る。適切な投薬量単位はまた、他の標準療法との併用における治療の有効性を評価することにより決定してもよい。分子の投薬量単位は、症状及び疾患のより大幅な低減に従い個々に又は各療法との併用で決定し得る。
【００３３】
本発明の分子を含む医薬製剤は、例えば少なくとも１日２回又はそれ以上の適切な間隔で、病的症状が低減又は緩和されるまで投与することができ、その後投薬量は維持レベルに低減し得る。特定のケースにおける適切な間隔は、通常、患者の病態に依存し得る。
【００３４】
定義
以下の定義は、本発明の理解を助けるために提供される：
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。
【００３５】
「薬学的に許容可能」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用が連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを指す。
【００３６】
「担体」は、例えば、本発明の活性薬剤と共に投与される希釈剤、佐剤、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助薬剤又は媒体を指す。薬学的に許容可能な担体は、滅菌液、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成由来のものであり得る。好ましくは担体として、特に注射溶液用に、水又は生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液が用いられる。好適な医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；及びＲｏｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒに記載されている。
【００３７】
用語「治療する」は、本明細書で使用されるとき、患者の病態（例えば、１つ以上の症状）の改善、病態の進行の遅延等を含め、疾患に罹患している患者に利益を付与する任意のタイプの治療を指す。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」は、対象がその病態を発症する可能性の低下をもたらす、病態（例えば、胆汁うっ滞）の発症リスクを有する対象の予防的治療を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「生体試料」は、組織、組織試料、細胞試料、腫瘍試料、及び生体液（例えば、血液、尿、又は羊水）を含めた、対象、好ましくはヒト対象から得られる生物学的材料の試料を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「診断する」は、対象における疾患又は障害を検出し及び同定することを指す。この用語はまた、疾患又は障害を有することが分かっている患者の疾患又は障害の状態（進行、退縮、安定化、治療反応性等）を評価し又は判定することも包含し得る。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「予後判定」は、疾患又は障害の存在（例えば、本発明の診断方法によって決定されるとおりの）が対象の今後の健康（例えば、予測罹患率又は死亡率、胆汁うっ滞に罹る又はそのリスクの可能性）に及ぼす影響に関する情報を提供することを指す。換言すれば、用語「予後判定」は、疾患／障害の可能性の高い経過及び転帰又は疾患／障害から回復する可能性の予測を提供することを指す。
【００４２】
化合物又は医薬組成物の「治療有効量」は、特定の障害又は疾患及び／又はその症状を予防し、阻害し、又は治療するのに有効な量を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、動物、特に哺乳動物、特にヒトを指す。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「胆汁うっ滞」は、肝臓から十二指腸への胆汁の流れが遮断され又は低減／阻害される任意の病態を指す。胆汁うっ滞は、肝内（即ち、肝臓内部で起こる）又は肝外（即ち、肝臓外部で起こる）であり得る。胆汁の流れの不全は肝臓・胆管系のどこでも生じ得る。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、及び「ｍｉＲＮＡ」は、特に指示されない限り、プロセシングされていない（例えば、前駆体）マイクロＲＮＡ又はプロセシングされた（例えば、成熟）マイクロＲＮＡを指し得る。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、典型的にはその標的ｍＲＮＡとの塩基対合によって転写後遺伝子発現調節因子として働く短い内因性ＲＮＡのクラスである。概して、成熟ｍｉＲＮＡはより長いヘアピン転写物（前駆体ｍｉＲＮＡ）からＲＮアーゼＩＩＩリボヌクレアーゼによって逐次的にプロセシングされる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：４１５−４１９；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８；Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：２６５４−２６５９）。プロセシングされていない又は前駆体マイクロＲＮＡは、典型的には約７０〜約１００ヌクレオチド長のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。マイクロＲＮＡ前駆体は、ＲＮアーゼ（例えば、ダイサー、ＲＮアーゼＩＩＩ等）で消化されることによりプロセシングされ、活性（成熟）マイクロＲＮＡになり得る。成熟マイクロＲＮＡは典型的には約１７〜約２５ヌクレオチドのＲＮＡオリゴヌクレオチドである。成熟マイクロＲＮＡは前駆体から天然のプロセシング経路を介するか（例えば、インタクトな細胞又は細胞溶解物を使用して）、又は合成のプロセシング経路によって（例えば、単離されたプロセシング酵素を使用して）得ることができる。成熟マイクロＲＮＡはまた、生物学的又は化学的合成によって直接（即ち、前駆体からプロセシングされる必要なしに）作製されてもよい。マイクロＲＮＡは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、しかし典型的には一本鎖である。
【００４６】
用語「プローブ」は、本明細書で使用されるとき、精製された制限酵素消化物のように天然に存在するものであるか、それとも合成的に作製されるかに関わらず、そのプローブに相補的な配列を有する核酸とアニールする能力又はそれと特異的にハイブリダイズする能力を有するオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれも）を指す。プローブは一本鎖であっても、又は二本鎖であってもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブ供給源及び方法の用途を含めた多くの要因に依存し得る。例えば、診断適用には、オリゴヌクレオチドプローブは標的配列の複雑性に応じて典型的には約１０〜５００、約１０〜２５０、約１０〜１００、約１０〜５０、約１５〜３０、約１５〜２５、又は約１０〜２０ヌクレオチドを含有する。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の種々のストランドに相補的であるように選択され得る。これは、プローブが、一組の所定の条件下でそれぞれの標的ストランドと「特異的にハイブリダイズする」又はアニールすることが可能であるための十分な相補性を有しなければならないことを意味する。従って、プローブ配列が標的の正確な相補配列を反映する必要はなく、しかしそうであってもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプローブの５’又は３’末端に取り付けられ、プローブ配列の残りは標的鎖に相補的であってもよい。或いは、非相補的塩基又はより長い配列がプローブに散在してもよく、但しプローブ配列は標的核酸の配列に対してそれと特異的にアニーリングするのに十分な相補性を有するものとする。プローブはタグ又は標識が付加されてもよい（即ち、それが結び付いている化合物の同定を可能にする実体に取り付けられてもよい（例えば、蛍光又は放射性タグ））。
【００４７】
用語「プライマー」は、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡか又はＤＮＡの、一本鎖か又は二本鎖の、生物系から誘導されたか、制限酵素消化によって生成されたか、又は合成的に作製された、適切な環境に置かれたとき鋳型依存的核酸合成の開始剤として機能上働くことが可能なオリゴヌクレオチドを指す。適切な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子並びに適切な温度及びｐＨなどの条件と共に提供されたとき、プライマーはポリメラーゼの作用又は同様の活性によってヌクレオチドが付加されることによりその３’末端が伸長し、プライマー伸長産物を生じ得る。プライマーの長さは詳細な条件及び適用の要件に応じて様々であり得る。例えば、診断適用においては、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には約１０〜２５ヌクレオチド長又はそれ以上であり、しかしそれより大幅に長いこともあり得る。プライマーは所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分な、即ち、ポリメラーゼ又は同様の酵素による合成の開始に用いる上で適切に並んだ位置にプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な形で所望の鋳型鎖とのアニーリングが可能であるのに十分な所望の鋳型との相補性を有しなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、その他の点では相補的なプライマーの５’末端に取り付けられてもよい。或いは、非相補的塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在していてもよく、但し、プライマー配列は伸長産物合成のための鋳型−プライマー複合体を機能上提供するのに十分な所望の鋳型鎖の配列との相補性を有するものとする。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，８００，１９５号明細書及び同第４，９６５，１８８号明細書（これらの開示全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【００４９】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、用語「特異的にハイブリダイズする」は、当該技術分野で一般的に用いられる所定の条件下でかかるハイブリダイゼーションが可能となるのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連性を指す（時に「実質的に相補的」と称されることもある）。詳細には、この用語は、あるオリゴヌクレオチドと本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、そのオリゴヌクレオチドと非相補配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを実質的に除外する。種々の相補性の一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当該技術分野において周知されている。
【００５０】
例えば、指定された配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を計算する一つの一般的な式を以下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中のｂｐ数
【００５１】
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミド、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃ずつ低下する。従って、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いれば、約７５％より高い配列同一性を有する標的が観察されることになる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、主として溶液の塩濃度及び温度に依存する。一般に、プローブとその標的とのアニーリング速度を最大化するため、ハイブリダイゼーションは通常、ハイブリッドのＴｍ計算値より２０〜２５℃低い塩及び温度条件で行われる。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の程度に対して可能な限りストリンジェントでなければならない。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍより約１２  ２０℃低くなるように選択される。本発明の核酸に関して、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中５５℃で１５分間の洗浄として定義される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中６５℃で１５分間の洗浄として定義される。極めて高いストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中６５℃で１５分間の洗浄として定義される。
【００５３】
用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」又は「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、本明細書で使用されるとき、組換え産物（核酸分子又はタンパク質）をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指し得る。プロモーターは、好ましくは隣接ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現する組換え産物と比較してＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を増加させる。ある生物由来のプロモーターを利用して、別の生物に由来するＤＮＡ配列からの組換え産物の発現を増進させることができる。加えて、１つのプロモーターエレメントが、タンデムにつながった複数のＤＮＡ配列に関して発現する組換え産物の量を増加させることができる。従って、１つのプロモーターエレメントが１つ以上の組換え産物の発現を増進させることができる。多重プロモーターエレメントは当業者に周知されている。
【００５４】
用語「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）」又は「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、本明細書で使用されるとき、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指し得る。エンハンサーエレメントは、典型的にはプロモーターエレメントの上流に位置するか、又はコードＤＮＡ配列（例えば、１つ又は複数の組換え産物に転写又は翻訳されるＤＮＡ配列）の下流又はその範囲内に位置し得る。従って、エンハンサーエレメントは、組換え産物をコードするＤＮＡ配列の１００塩基対、２００塩基対、又は３００塩基対又はそれ以上上流又は下流に位置し得る。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによって得られる発現の増加を上回ってＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を増加させることができる。多重エンハンサーエレメントは、当業者には容易に入手可能である。
【００５５】
「レプリコン」は、主としてそれ自身の制御下で複製能を有する任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ又はウイルスである。レプリコンはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【００５６】
「ベクター」は、別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでも）を加えられ、その加えられた配列又はエレメントの複製をもたらし得るプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ又はウイルスなどのレプリコンである。
【００５７】
「発現オペロン」は、転写及び／又は翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどをプロセシングし得る、且つ宿主細胞又は生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントを指す。
【００５８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、本発明の配列、プライマー及びプローブを指し、２つ以上の、好ましくは３つより多いリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因並びにオリゴヌクレオチドの詳細な適用及び用途に依存し得る。
【００５９】
以下の例は本発明の例示的な実施方法を提供するものであり、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００６０】
胆汁うっ滞が肝ｍｉＲＮＡレベルの変化を誘導するという仮説を検証するため、２つの胆汁うっ滞マウスモデルで肝ｍｉＲＮＡの大規模プロファイリングを実施した：
１）胆管結紮（ＢＤＬ）モデル：胆汁うっ滞が総胆管の（結紮を用いた）物理的閉塞によって誘導される外科手術モデル。
２）Ｍｄｒ２-/-遺伝マウスモデル：このモデルは、小児肝障害進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ３）に直接類似している。Ｍｄｒ２（ヒトにおけるＭＤＲ３）は、保護性リン脂質を毛細胆管に輸送するリン脂質フリッパーゼをコードする。Ｍｄｒ２欠損では、胆汁中のリン脂質値が低いことにより、閉塞性胆汁うっ滞及び進行性胆管症が引き起こされる（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ，Ｅ．（２００１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．，２１：５５１−６２）。
【００６１】
図１は、ＢＤＬ及びＭｄｒ２-/-マウス肝の両方でｍｉＲ−１８２及びｍｉＲ−２７ａ  ｍｉＲＮＡクラスターが有意に上方制御されることを示す。重要なことに、ヒト胆汁うっ滞臨床試料（胆道閉鎖症小児）においても、年齢適合非胆汁うっ滞対照と比べて両方のクラスターのｍｉＲＮＡが上昇する（図１）。上昇の程度はマウス及びヒトの両方において同様である：ｍｉＲ−２７ａクラスターメンバーにおいて約２．５倍、及びｍｉＲ−１８２において約１０倍の増加。特に、ｍｉＲ−２７ａクラスターのｍｉＲＮＡは肝臓においてｍｉＲ−１８２クラスターのｍｉＲＮＡより豊富であった。さらに、ｍｉＲ−２７ａ（しかしｍｉＲ−２７ｂではない）が野生型マウスと比較してＭｄｒ２-/-マウスにおいて有意に豊富であることが決定された。
【００６２】
実験はまた、胆汁うっ滞肝におけるこれらのｍｉＲＮＡの誘導が胆汁酸の上昇に起因することも示している。実際、コール酸又はケノデオキシコール酸のいずれかに曝露したＨｅｐＧ２細胞では、両方のクラスターの発現が誘導される。
【００６３】
ｍｉＲＮＡは遺伝子発現の負の調節因子であり、各々が数百の遺伝子の発現を低下させ得る。本明細書で観察されるｍｉＲＮＡ誘導は、胆汁うっ滞に対する生理学的適応反応の一環であり得る。或いは、これらのｍｉＲＮＡの上昇は不適応で、疾患の進行に寄与し得る。これらの対立する二者の間を区別するため、雄Ｍｄｒ２-/-マウスにおいてｍｉＲ−２７ａ及びｍｉＲ１８２を個々に阻害した。これらのマウスに８、９、１０、及び１１週齢で２０ｍｇ／ｋｇの対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯｃｔｒｌ）、ｍｉＲ−２７ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ２７）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドｍｉＲ１８２（ＡＳＯ１８２）を腹腔内注射した。１２週目に肝組織、肝ＲＮＡ、及び血清を採取した。血清生化学から、ｍｉＲ−２７ａ又はｍｉＲ−１８２のいずれかをインビボで阻害したとき、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値の両方の低下が明らかとなり、肝臓質量及び肝臓対体重比も同様であった（図２）。肝結節形成及び線維症が低減された（図３）。これは、対照と比べてＡＳＯ２７においてＣｏｌ４ａ１遺伝子発現及び肝ヒドロキシプロリンが２分の１に減少したことによって裏付けられる。ＡＳＯ１８２による治療は中間的な効果を有した。血清中の総胆汁酸濃度について群間の有意差は認められなかったが、循環胆汁酸プールの組成に有意な差があって、これが線維症の程度の違いに（例えば、疎水性のシフトに起因して）寄与していることがあり得る。
【００６４】
この治療の有効性をさらに実証するため、Ｍｄｒ２突然変異雄に８、９、１０、及び１１週齢でＰＢＳ（０）又は２、５、若しくは１０ｍｇ／ｋｇのＡＳＯ２７を含有するＰＢＳを腹腔内注射した（処置当たりｎ＝８匹）。１２週齢でＩＡＣＵＣプロトコルに従いマウスを安楽死させ、肝組織、肝ＲＮＡ、及び血清を採取した。一般的に使用される肝傷害の血清指標（乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｅ）（ＬＤＨ）；アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ））及び胆汁うっ滞の血清指標（総ビリルビン）は、ＡＳＯ２７の用量の増加に伴い線形の用量依存的低下を示した。これらの結果は、肝傷害及び胆汁うっ滞のいずれもがｍｉＲ−２７ａクラスターの阻害によって改善されることを示している。
【００６５】
これらの結果は、ｍｉＲＮＡの操作が胆汁うっ滞性肝疾患における治療介入への新しい道となることを示している。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態の幾つかが上記に記載され、具体的に例示されているが、本発明がかかる実施形態に限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に記載されるとおりの本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、それらに様々な改良が行われ得る。
【図１】
2017506638.tif 000008
【図２】
2017506638.tif 000009
【図３Ａ】
2017506638.tif 000010
【図３Ｂ】
2017506638.tif 000011
【図３Ｃ】
2017506638.tif 000012
【図３Ｄ】
2017506638.tif 000013
【図４】
2017506638.tif 000014
【配列表】
2017506638000001.app
【国際調査報告】
2017506638.tif 000015