(57)【要約】  本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドが、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（２位〜８位）の反対側の部位に存在し；かつｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖が、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾ヌクレオチドが、１１ヌクレオチド長分離されている。本発明の他の態様は、治療での使用に適したこれらのｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物；および、例えば、様々な病状の治療のために、これらのｄｓＲＮＡ剤の投与によって標的遺伝子の発現を抑制する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖が、１４〜４０のヌクレオチドを有し、前記ｄｓＲＮＡ剤が、式（Ｉ）：
【化１】
2017525705.tif 000079
で表され、
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’が、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１が、前記アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（２位〜８位）の反対側の部位にある熱不安定化ヌクレオチドであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’が、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、およびｑ１が、それぞれ独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、およびｑ７が、それぞれ独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｑ２およびｑ６が、それぞれ独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５が独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
ｎ２、ｎ４、およびｑ４が、それぞれ独立に、０〜３ヌクレオチド長である、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤。
【請求項２】
ｎ４、ｑ２、およびｑ６がそれぞれ１である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３】
ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６がそれぞれ１である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４】
Ｔ１’およびＴ３’が、１１ヌクレオチド長離間している、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５】
Ｃ１が、前記アンチセンス鎖の５’末端の５位〜８位の反対側の部位にある、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項６】
前記センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、かつｎ４が１である場合は、Ｃ１が、前記センス鎖の５’末端の１４位〜１７位にある、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項７】
Ｔ１’が、前記アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２が１である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項８】
Ｔ３’が、前記アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６が１である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項９】
Ｔ１が、前記センス鎖の切断部位にある、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１０】
前記センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、かつｎ２が１である場合は、Ｔ１が、前記センス鎖の５’末端の１１位にある、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１１】
Ｔ２’が、前記アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位にあり、ｑ４が１である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１２】
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’がそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１３】
Ｃ１が、
前記アンチセンス鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；
以下からなる群から選択される脱塩基修飾：
【化２】
2017525705.tif 000080
；および
以下からなる群から選択される糖修飾：
【化３】
2017525705.tif 000081
（式中、Ｂが、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２が独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；かつＲ３が、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）からなる群から選択される熱不安定化修飾を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１４】
前記熱不安定化修飾が、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；かつ、任意選択により、前記ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基が、２’−デオキシ核酸塩基である、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１５】
前記熱不安定化修飾が、ＧＮＡまたは
【化４】
2017525705.tif 000082
である、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１６】
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’が、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルから選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１７】
Ｔ１がＤＮＡである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１８】
Ｔ１’が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１９】
Ｔ２’が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２０】
Ｔ３’が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２１】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、または２’−ａｒａ−Ｆで修飾されている、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２２】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つの異なる修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２３】
２’−Ｆ修飾を一切含まない、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２４】
前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ以上のブロックを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２５】
前記センス鎖が、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖が、１６〜１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離された２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２７】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、１５〜３０のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２８】
前記センス鎖が、１９〜２２のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、１９〜２５のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２９】
前記センス鎖が、２１のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、２３のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３０】
１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３１】
前記アンチセンス鎖の３’末端における３’オーバーハング、および前記アンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３２】
前記センス鎖の５’末端における５’オーバーハングを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３３】
二重鎖の前記アンチセンス鎖の５’末端の１位におけるヌクレオチドが、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３４】
前記アンチセンス鎖の５’末端からの第１、第２、および第３の塩基対の少なくとも１つがＡＵ塩基対である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３５】
少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３６】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、前記センス鎖の３’末端に付加されている、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３７】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、２価または３価の分岐リンカーによって付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３８】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが：
【化５】
2017525705.tif 000083
である、請求項３７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３９】
標的遺伝子の発現を抑制することができるｄｓＲＮＡ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖が、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
前記センス鎖が、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、かつ少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（２位〜８位）の反対側の部位に存在し；かつ
前記アンチセンス鎖が、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾ヌクレオチドが、１１ヌクレオチド長分離されている、ｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４０】
前記センス鎖が、前記センス鎖の切断部位におけるエンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４１】
前記アンチセンス鎖が、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する第３の修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記第３の修飾ヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位にある、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４２】
前記熱不安定化ヌクレオチドが、前記センス鎖の５’末端の１４位〜１７位にある、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４３】
２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する前記２つの修飾ヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４４】
前記エンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドが、前記センス鎖の５’末端の１１位にある、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４５】
２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する前記第３の修飾ヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の５’末端の１０位にある、請求項４１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４６】
前記熱不安定化ヌクレオチドが、
前記アンチセンス鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；
以下からなる群から選択される脱塩基修飾：
【化６】
2017525705.tif 000084
；および
以下からなる群から選択される糖修飾：
【化７】
2017525705.tif 000085
（式中、Ｂが、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２が独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；かつＲ３が、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）からなる群から選択される修飾を含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４７】
２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する前記修飾ヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルから独立に選択される修飾を含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４８】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、または２’−ａｒａ−Ｆで修飾されている、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４９】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つの異なる修飾を含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５０】
２’−Ｆ修飾を一切含まない、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５１】
前記センス鎖が、１９〜２２のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、１９〜２５のヌクレオチドを有する、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５２】
前記センス鎖が、２１のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、２３のヌクレオチドを有する、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５３】
前記アンチセンス鎖の３’末端における３’オーバーハング、および前記アンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５４】
少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５５】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、２価または３価の分岐リンカーによって付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５６】
単独で、または薬学的に許容され得る担体もしくは賦形剤と組み合わせて、先行する請求項のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項５７】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、先行する請求項のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤を、前記標的遺伝子の発現を抑制するのに十分な量投与するステップを含む、方法。
【請求項５８】
前記ｄｓＲＮＡ剤が、皮下投与又は静脈内投与によって投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
先行する請求項のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤を投与することによって、対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法。
【請求項６０】
前記投与するステップが、筋肉内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、静脈内投与、皮下投与、脳脊髄投与、またはこれらの組み合わせを含む投与手段によって行われる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法であって：前記ポリヌクレオチドが前記対象の前記特定の標的に送達されるように、先行する請求項のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ剤を皮下投与によって前記対象に送達するステップを含む、方法。
【請求項６２】
式（Ｉ）が、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）をさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項６３】
式（Ｉ）が、前記アンチセンス鎖または前記センス鎖の５’末端におけるホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合によって連結された２’−デオキシチミジンをさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、それぞれ参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１４年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／０９３，９１９号明細書、２０１４年１１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，７４４号明細書、および２０１４年８月２０日出願の米国仮特許出願第６２／０３９，５０７号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、標的遺伝子の発現の阻害に有利な特定のモチーフを含むＲＮＡｉ二重鎖剤、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物に関する。加えて、本発明は、例えば、様々な疾患の処置のために、これらのＲＮＡｉ二重鎖剤を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止できるという観察を説明するためにＦｉｒｅおよび同僚によって最初に作成された語である（非特許文献１）。短鎖ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む様々な生物における遺伝子特異的な翻訳後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能の研究の新たなツールを提供する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼによって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られているが、この活性のタンパク質成分はいまだ未知である。
【０００４】
良好な遺伝子サイレンシング特性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づいた薬物の開発に必要である。ＲＮＡｉの最初のステップは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化であり、この活性化には、ｄｓＲＮＡの二重鎖のセンス鎖の分解が必要である。センス鎖は、二重鎖領域の中央にあるＡｒｇｏｎａｕｔｅ  ２によって切断される最初のＲＩＳＣ基質として機能することが知られていた。センス鎖の切断された５’末端および３’末端の断片がエンドヌクレアーゼＡｇｏ２から除去された直後に、ＲＩＳＣが、アンチセンス鎖によって活性化される（非特許文献２）。
【０００５】
センス鎖の切断が阻害されると、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断が妨げられると考えられていた（非特許文献３）。Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒらが、センス鎖のＡｇｏ２切断部位への２’−Ｏ−Ｍｅリボースの取り込みが、ＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡｉを阻害することを示した（非特許文献４）。同様の効果が、ホスホロチオエート修飾で観察され、センス鎖の切断が、哺乳動物における効率的なＲＮＡｉに必要であることを示した。
【０００６】
Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙらが、他の部位および修飾の中で、Ａｇｏ２切断部位における２’−Ｆ修飾残基を含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、無修飾ｓｉＲＮＡと比較して適合したサイレンシングを得た（非特許文献５）。しかしながら、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙの修飾は、モチーフ特異的ではない、例えば、１つの修飾が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方にピリミジン残基が存在すれば、一切の選択性なしに全てのピリミジンに２’−Ｆ修飾を含む；従って、これらの教示に基づくと、センス鎖の切断部位における特定のモチーフ修飾が遺伝子サイレンシング活性に対して実際の効果を有し得るかは不明である。
【０００７】
Ｍｕｈｏｎｅｎらが、センス鎖またはアンチセンス鎖のＡｇｏ２切断部位に２つの２’−Ｆ修飾残基を含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、このｓｉＲＮＡ二重鎖が許容されることを見出した（非特許文献６）。しかしながら、Ｍｕｈｏｎｅｎの修飾も配列特異的であり、例えば、それぞれの特定の鎖に対して、Ｍｕｈｏｎｅｎの修飾は、一切の選択性なしに全てのピリミジンまたは全てのプリンを修飾するだけである。
【０００８】
Ｃｈｏｕｎｇらが、２’−ＯＭｅによる選択的修飾または２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、およびホスホロチオエート修飾の様々な組み合わせを含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、血清中のｓｉＲＮＡをＳｕｒ１００５８に対して安定させた（非特許文献７）。Ｃｈｏｕｎｇは、アンチセンス鎖の切断部位における残基は、ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、２’−ＯＭｅで修飾するべきではないことを示唆した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、ｓｉＲＮＡ遺伝子治療の遺伝子サイレンシングの有効性を改善するためにｉＲＮＡ二重鎖剤が現在要望されている。本発明は、この要望に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、標的遺伝子の発現の阻害に有利な、任意選択で少なくとも１つのリガンドがコンジュゲートする、ｄｓＲＮＡ剤の有効なヌクレオチドまたは化学モチーフ、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）によって表される：
【化１】
2017525705.tif 000002
【００１２】
式（Ｉ）では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾を含む。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を含む。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’の少なくとも１つは、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を含む。
【００１３】
Ｃ１は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位にある熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位のヌクレオチドと対を形成するセンス鎖の位置にある。一例では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、脱塩基修飾；二重鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば、２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る熱不安定化修飾を有する。一実施形態では、Ｃ１は、（ｉ）アンチセンス鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；（ｉｉ）以下からなる群から選択される脱塩基修飾：
【化２】
2017525705.tif 000003
；および（ｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾：
【化３】
2017525705.tif 000004
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）からなる群から選択される熱不安定化修飾を有する。一実施形態では、Ｃ１の熱不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；任意選択により、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基が、２’−デオキシ−核酸塩基である。一例では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、ＧＮＡまたは
【化４】
2017525705.tif 000005
である。
【００１４】
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総計を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定する方法は、当業者に公知である。この修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位置での修飾、または非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、もしくはリボース糖の２’位置と同様または同等のヌクレオチドの主鎖の修飾であり得、かつ２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体嵩高さをヌクレオチドに提供する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一実施形態では、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態では、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである。一実施形態では、Ｔ２’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態では、Ｔ３’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００１５】
ｎ１、ｎ３、およびｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長である。
【００１６】
ｎ５、ｑ３、およびｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長である。
【００１７】
ｎ４、ｑ２、およびｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０である。
【００１８】
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【００１９】
ｎ２およびｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長である。
【００２０】
あるいは、ｎ４は、０〜３ヌクレオチド長である。
【００２１】
一実施形態では、ｎ４は０であり得る。一例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１である。別の例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１であり、センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００２２】
一実施形態では、ｎ４、ｑ２、およびｑ６はそれぞれ１である。
【００２３】
一実施形態では、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６はそれぞれ１である。
【００２４】
一実施形態では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位にあり、ｎ４は１である。一実施形態では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
【００２５】
一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位で始まる。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しい。
【００２６】
一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位で始まる。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しい。
【００２７】
例示的な実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位から始まり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まる。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位から始まり、ｑ６は１に等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まり、ｑ２は１に等しい。
【００２８】
一実施形態では、Ｔ１’およびＴ３’は、１１ヌクレオチド長離間している（即ち、Ｔ１’とＴ３’ヌクレオチドは数えていない）。
【００２９】
一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にある。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しく、修飾は、２’位にある、または２’−ＯＭｅリボースよりも小さい立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
【００３０】
一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にある。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しく、修飾は、２’位にある、または２’−ＯＭｅリボースの立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
【００３１】
一実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位にあり、ｎ２は１である。例示的な一実施形態では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位にあるセンス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１である。
【００３２】
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位から始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位であり、ｑ４は１である。
【００３３】
例示的な一実施形態では、Ｔ１は、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、例えばセンス鎖の５’末端の１１位にある、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１であり；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しく、そしてＴ１’の修飾は、リボース糖の２’位置にある、または２’−ＯＭｅリボースよりも小さい立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にあり；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位に位置し、ｑ４は１であり；そしてＴ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しく、そしてＴ３’の修飾は、２’位置にある、または２’−ＯＭｅリボースの立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
【００３４】
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位で始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位で始まり、ｑ４は２である。
【００３５】
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位で始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位で始まり、ｑ４は１である。
【００３６】
一実施形態では、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００３７】
一実施形態では、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００３８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
【００３９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００４０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
【００４１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００４２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
【００４３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００４４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意選択により、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加のＴＴを有する。
【００４５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意選択により、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加のＴＴを有し；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００４６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
【００４７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００４８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。
【００４９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００５０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。
【００５１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【００５２】
このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端リン酸（５’−Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’−ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’−ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、または５’デオキシ５’−Ｃ−マロニル（
【化５】
2017525705.tif 000006
）であり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５−ＶＰ）である場合は、５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ異性体（即ち、トランス−ビニルホスフェート、
【化６】
2017525705.tif 000007
）、または５’−Ｚ−ＶＰ異性体（即ち、シス−ビニルホスフェート、
【化７】
2017525705.tif 000008
）のいずれか、またはこれらの混合物であり得る。
【００５３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
【００５４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｐを含む。
【００５５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳを含む。
【００５６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｅ−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｚ−ＶＰを含む。
【００５７】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳ２を含む。
【００５８】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’デオキシ５’−Ｃ−マロニルを含む。
【００５９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００６０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００６１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００６２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００６３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００６４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００６５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００６６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００６７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００６８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００６９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００７０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００７１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００７２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００７３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００７４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００７５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００７６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００７７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００７８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００７９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００８０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００８１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００８２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００８３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００８４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００８５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００８６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００８７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００８８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００８９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００９０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００９１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００９２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００９３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００９４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
【００９５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【００９６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００９７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【００９８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【００９９】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％が修飾される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の５０％が修飾される場合は、ｄｓＲＮＡ剤中に存在する全てのヌクレオチドの５０％が、本明細書に記載のように修飾を含む。
【０１００】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、または２’−ａｒａ−Ｆで修飾されている。
【０１０１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、少なくとも２つの異なる修飾を含む。
【０１０２】
一実施形態では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングをさらに含む。一例では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における３’オーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を含む。別の例では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’オーバーハングを有する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−Ｆ修飾を一切含まない。
【０１０４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ以上のブロックを含む。一例では、センス鎖は、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む。一例では、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックは、１６〜１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離されている。
【０１０５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、１５〜３０のヌクレオチドを有する。一例では、センス鎖は、１９〜２２のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、１９〜２５のヌクレオチドを有する。別の例では、センス鎖は、２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、２３のヌクレオチドを有する。
【０１０６】
一実施形態では、二重鎖におけるアンチセンス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの第１、第２、および第３の塩基対の少なくとも１つが、ＡＵ塩基対である。
【０１０７】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズしてその発現をＲＮＡ干渉によって阻害するための標的ＲＮＡに対して１００％相補的である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％相補的である。
【０１０８】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、前記熱不安定化ヌクレオチドの少なくとも１つは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。式（Ｉ）によって表されるｄｓＲＮＡに関連する本明細書に記載の実施形態および態様のそれぞれは、熱不安定化ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡにも適用することができる。
【０１０９】
熱不安定化ヌクレオチドは、例えば、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在し得る。アンチセンス鎖は、立体的要求が高い２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含む。好ましくは、立体的要求が高い２’−ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸は、１１ヌクレオチド長離間している。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１１０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価の分岐リンカー、例えば：
【化８】
2017525705.tif 000009
によって付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に付加される。
【０１１１】
例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端におけるリン含有基；（ｉｉ）センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾；ならびに（ｉｉｉ）センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端におけるリガンド、例えば、ＡＳＧＰＲリガンド（例えば、１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体）を含み得る。例えば、このリガンドは、センス鎖の３’末端に存在し得る。
【０１１２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１１９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２２】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２３】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２４】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２５】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２６】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２７】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２８】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１２９】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１３０】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’-Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１３１】
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０１３２】
特定の一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；および
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１７位、１９位、および２１位（５’末端から数えて）における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位〜１６位、１８位、および２０位における２’−ＯＭｅ修飾を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、２１位、および２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位〜８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位、および２２位における２’Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、アンチセンス鎖を有する。
【０１３３】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位（５’末端から数えて）における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つヌクレオチドのオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、アンチセンス鎖を含む。
【０１３４】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、１０位、および１２位〜２１位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、７位及び９位における２’−Ｆ修飾、ならびに１１位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位〜６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１３５】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、１０位、１２位、１４位、および１６位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位、９位、１１位、１３位、および１５位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位〜４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１３６】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜９位および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに１０位および１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１３７】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、および１３位における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位〜７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位〜１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１３８】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、および１９位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、４位、６位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、および１９位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾、ならびに２４位および２５位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における４つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１３９】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位および９位〜１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、８位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１４０】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位および９位〜１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１４１】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）１９ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜４位、６位、および１０位〜１９位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに５位および７位〜９位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２１位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド１９位と２０位との間、およびヌクレオチド２０位と２１位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
【０１４２】
一実施形態では、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位、センス鎖の５’末端から数えて１５位、センス鎖の５’末端から数えて２１位、又はこれらの位置の組み合わせに熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１４３】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、１１ヌクレオチド長分離された、立体的要求が高い２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい２つの修飾核酸を含む。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１４４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の切断部位におけるエンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドをさらに含む。一例では、エンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１１位にある。
【０１４５】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する第３の修飾ヌクレオチドをさらに含み、この第３の修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位にある。例えば、第３の修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端の１０位にある。
【０１４６】
熱不安定化ヌクレオチドの実施形態は、式（Ｉ）におけるＣ１について上述された様々な実施形態と同様である。立体的要求の高い２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい修飾核酸の実施形態は、式（Ｉ）におけるＴ１’、Ｔ２’、およびＴ３’について上述された様々な実施形態と同様である。上記の式ＩのｄｓＲＮＡ剤についての長さ、オーバーハング、追加の修飾、およびリガンド結合を説明する実施形態が、ここでは適切である。
【０１４７】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。一実施形態では、本発明はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的電子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。
【０１４８】
本発明はさらに、対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用される、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤に関する。この対象は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトであり得る。
【０１４９】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、センス鎖の切断部位の近傍にエンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または２’−Ｆ）を含む。例えば、エンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１１位にある。切断部位の近傍に存在するエンドヌクレアーゼ感受性修飾は、切断部位の感受性に影響を与え得る。例えば、切断部位の近傍の熱不安定化修飾は、その切断部位にエンドヌクレアーゼ感受性を提供し得る。アンチセンス鎖は、１１ヌクレオチド長分離された立体的要求の高い２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい２つの修飾核酸を含む。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１５０】
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を皮下投与又は静脈内投与によって対象の特定の標的に送達するための方法をさらに提供する。本発明は、前記ｄｓＲＮＡ剤を皮下投与又は静脈内投与によって対象の特定の標的に送達するための方法に使用される本発明のｄｓＲＮＡ剤をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度で評価されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性に対する、センス鎖の１７位における異なる修飾の影響を示すチャートである：（Ａ）親ＡＳ鎖と対合する非Ｆセンス鎖を用いてｍＴＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ；（Ｂ）非Ｆ  ＡＳ鎖と対合する非Ｆセンス鎖を用いてｍＴＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ；（Ｃ）親ＡＳ鎖と対合する非Ｆセンス鎖を用いてＡＮＧ、ＡｐｏＣ３、およびＴＴＲＳＣを標的とするｓｉＲＮＡ。
【図２】図２は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度で評価される、センス鎖の１６位〜１８位に亘る熱不安定化ＧＮＡ修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性に対する位置の影響を示すチャートである。
【図３】図３は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度で評価される、ｍＴＴＲ、ＡｐｏＣ３、ＴＴＲＳＣ、およびＴＭＰを標的とするｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性に対するアンチセンス鎖の２位における修飾の影響を示すチャートである。
【図４】図４は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度で評価される、ｍＴＴＲ、ＡｐｏＣ３、およびＴＴＲＳＣを標的とするｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性に対するアンチセンス鎖の１４位における修飾の影響を示すチャートである。
【図５】図５は、２．５ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与後のマウスにおけるｍＴＴＲサイレンシングを示すグラフである。
【図６】図６は、親２ＰＳ（ＡＤ−４３５２７）および６ＰＳ（ＡＤ−５７７２７）に対する非Ｆ  ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−６１３９８およびＡＤ−６４２７３の容量反応：単回ＳＣ投与、投与の９６時間後に測定されたタンパク質レベルを示すチャートである。
【図７】図７は、非Ｆ  ＡＤ−６１３９８を親モチーフ：ＡＤ−５７７２７と比較した、マウスでの１ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡのＱＷ  ＳＣ投与後の血漿中のｍＴＴＲタンパク質の減少を示すチャートである。
【図８】図８は、非Ｆ設計を親モチーフ：ＡＤ−６０４９０と比較した：マウス（ｎ＝３／群）での３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与後のＴＭＰＲＳＳ６  ｍＲＮＡのサイレンシングを示すチャートである。
【図９】図９は、非Ｆ設計を親モチーフ：ＡＤ−６０４９０と比較した：マウス（ｎ＝３／群）での３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与の７日後のＴＭＰＲＳＳ６  ｍＲＮＡのサイレンシングを示すグラフである。
【図１０】図１０は、親化合物ＡＤ−５７７２７と比較した、２つのモチーフ、モチーフ１およびモチーフ２の活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の結果を示している。
【図１１】図１１は、ｍＴＴＲを標的とするｓｉＲＮＡのサイレンシング活性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価を示している。
【図１２】図１２は、投与の７日後に肝臓が活性（ｍＲＮＡ）について評価された、安定性強化コンジュゲート化学（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＳＥＣ−Ｃ）での活性の強化を示している。
【図１３】図１３は、親化合物と比較した、新たなモチーフ（モチーフ１および２）での活性の約４倍の改善を示すチャートを示している。
【図１４】図１４は、３つ全ての配列でのモチーフ１およびモチーフ２の著しく改善された期間を示すチャートを示している。
【図１５】図１５は、ｈＡＡＶ  １×１０１１ＧＣ／マウス、３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与でのＡｐｏＣ３−ＧａｌＮＡｃ３  ＳＡＲの結果を示すグラフを示している。
【図１６】図１６は、Ａｇｏ２が付加されたｓｉＲＮＡ、および５’−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）、安定したリン酸を模倣した修飾リン酸の模式図を例示している。５’−ホスホネートは、細胞質Ｃｌｐ１キナーゼによって付加され、Ａｇｏ２付加のための重要なアンカーとして機能する。
【図１７】図１７は、５’−ＶＰの存在が、一般にｉｎ  ｖｉｖｏ活性をどのように改善するか示すチャートを示している。４つの異なるＡｐｏＢ配列に対して評価を行った。３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与の７日後のＬＤＬレベルを、（５’−ＶＰ修飾を含むまたは含まない）４つのコンジュゲートについて分析した。
【図１８】図１８は、内因性リン酸化を促進する、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）およびメチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）を含む、ＰＳ結合を置換し、かつより安定した化学を提供することができる異なる化学修飾を示している。
【図１９】図１９は、２’−ＯＭｅ−ＭｅＰｈｏｓ、２’−ＯＭｅ−ＰＳ、ｄＮ（ＰＳ２）、および２’Ｆ−ＰＳを含む、末端修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価のチャートを示している。１０ｎＭおよび０．１ｎＭ（ｎ＝４）でのマウス初代肝細胞のトランスフェクションを、２つのＡｐｏＢコンジュゲートに対して行った。
【図２０】図２０は、アンチセンス５’末端の僅かな変化が、どのようにｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を著しく改善するかを示す２つのチャートを示している。左側のチャートは、アンチセンス鎖の１位にある２’Ｆ−ＰＳが、５’Ｐ依存性配列の活性を改善することができることを示している（３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与で、Ｆ９活性を３日目に測定した）。右側のチャートは、ＶＰと同様に、親に対して、ｄＮ（ＰＳ）２によって約３倍改善された効力を示している（１０ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与で、ＬＤＬを、ＡｐｏＢについて３日目に測定した）。
【図２１】図２１Ａおよび図２１Ｂは、（アンチセンス鎖の５’末端における）５’−ＯＨ修飾を含むＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡと５’−Ｅ−ＶＰ修飾を含むＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較するＳＡＲ分析を示している。図２１Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションマウスの肝細胞での結果を示している。図２１Ｂは、単回投与（ＳＣ投与）の３日後のＬＤＬのレベルを示している。
【図２２】図２２は、ｍＴＴＲおよびＦ９  ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに対する５’−Ｅ−ＶＰ修飾と５’−Ｚ−ＶＰ修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の比較の結果を示している。この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションマウスの初代肝細胞から得た。
【図２３】図２３は、Ｆ９  ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに対する５’−Ｅ−ＶＰ修飾と５’−Ｚ−ＶＰ修飾のｉｎ  ｖｉｖｏ比較の結果を示している（単回ＳＣ投与）。
【図２４】図２４〜図２４Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＴＥＮサイレンシングアッセイにおけるマウス初代幹細胞での（Ａ）５’−ＯＨ、（Ｂ）５’−Ｃ−マロニル、および（Ｃ）５’−リン酸ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡに対する用量反応曲線を示すグラフである。全ての値は、３連の実験から得た。
【図２５】図２５は、ラット肝トリトソームでインキュベートされた５’−ＯＨ、５’−Ｃ−マロニル、および５’−リン酸ｓｉＲＮＡの酵素安定性の結果を示している。ｓｉＲＮＡ標的配列は、表１０に示されている。データは、未処置対照に対して正規化した。
【図２６】図２６は、マウス初代幹細胞からのＡｇｏ２の免疫沈降によって、およびＡｇｏ２付加一本鎖のＲＴ−ＰＣＲ増幅によって決定された５’−ＯＨ、５’−Ｃ−マロニル、および５’−リン酸ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ付加（アンチセンス鎖の５’修飾）の結果を示している。内因性ｍｉＲ１２２のレベルを対照として決定した。ｓｉＲＮＡ標的配列は、表１０に示されている。
【図２７】図２７は、１つの（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドで修飾されたｓｉＲＮＡを用いたＴＴＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを示すグラフである。ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、マウス初代幹細胞での１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとの２４時間のインキュベーション後に測定した。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価し、ＰＢＳ処置細胞に対して正規化した。全てのデータ点は、４つの測定の平均とした。
【図２８】図２８Ａは、１つの（Ｓ）−ＧＮＡ塩基対で修飾されたｓｉＲＮＡを用いたＴＴＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを示すグラフである。ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、マウス初代幹細胞での１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとの２４時間のインキュベーション後に測定した。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価し、ＰＢＳ処置細胞に対して正規化した。全てのデータ点は、４つの測定の平均とした。図２８Ｂは、１つの（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ここではＧＮＡ：ＲＮＡ−塩基対として対合したミックスおよびマッチ二重鎖（ｍｉｘ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈ  ｄｕｐｌｅｘ）を示している。
【図２９】図２９は、マウス血清中のＴＴＲのｉｎ  ｖｉｖｏレベルを示すグラフである。動物に、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡを単回投与した。投与前または投与後の指定の時間に、動物から採血し、血清サンプルを、４５０ｎｍでの読み取りのためにＨＲＰ−コンジュゲート抗体および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを利用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定した。全てのサンプルを２連で測定し、各データ点は、各コホート（ｎ＝３）内のマウスの平均である。
【図３０】図３０は、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルのｉｎ  ｖｉｖｏ定量を示すグラフである。動物に、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡを単回投与した。投与後の指定の時間に、全肝ホモジネートでＲＮＡ抽出を行った。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、対照転写物としてＧＡＰＤＨを用いるΔΔＣｔ法で、ＲＴ−ｑＰＣＲによって上述のように評価し、そしてＰＢＳ処置動物に対して正規化した。暗色のバーは、２１日目の結果を示し；白色のバーは、７日目の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
本発明者らは、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２位および１４位に２’−ＯＭｅ修飾を有すると、ｄｓＲＮＡ剤の遺伝子サイレンシング活性を抑制することを見出した。アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の特定の位置の２’−ＯＭｅ修飾よりも立体的嵩高さが小さい化学修飾を非リボース、非環状、または主鎖における２’位または同等の位置に導入することにより、ｄｓＲＮＡ剤は、遺伝子サイレンシング活性を取り戻すことができた。本発明者らはまた、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位でセンス鎖に熱不安定化ヌクレオチドを導入すると、遺伝子サイレンシング活性が改善されと断定した。
【０１５３】
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は完全に修飾することができる。ｄｓＲＮＡ剤は、任意選択により、例えばセンス鎖上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドとコンジュゲートする。得られるｄｓＲＮＡ剤は、効果的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシング活性を示す。
【０１５４】
従って、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１２〜４０のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。例えば、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチド長さ、１７〜３７のヌクレオチド長さ、２５〜３７のヌクレオチド長さ、２７〜３０のヌクレオチド長さ、１７〜２３のヌクレオチド長さ、１７〜２１のヌクレオチド長さ、１７〜１９のヌクレオチド長さ、１９〜２５のヌクレオチド長さ、１９〜２３のヌクレオチド長さ、１９〜２１のヌクレオチド長さ、２１〜２５のヌクレオチド長さ、または２１〜２３のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。
【０１５５】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域は、１２〜４０のヌクレオチド対の長さとすることができる。例えば、二重鎖領域は、１４〜４０のヌクレオチド対の長さ、１７〜３０のヌクレオチド対の長さ、２５〜３５のヌクレオチド対の長さ、２７〜３５のヌクレオチド対の長さ、１７〜２３のヌクレオチド対の長さ、１７〜２１のヌクレオチド対の長さ、１７〜１９のヌクレオチド対の長さ、１９〜２５のヌクレオチド対の長さ、１９〜２３のヌクレオチド対の長さ、１９〜２１のヌクレオチド対の長さ、２１〜２５のヌクレオチド対の長さ、または２１〜２３のヌクレオチド対の長さとすることができる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７のヌクレオチド対の長さから選択される。
【０１５６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、鎖の３’末端、５’末端、または両末端にｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含む。オーバーハングは、１〜１０のヌクレオチド長さ、１〜６のヌクレオチド長さ、例えば、２〜６のヌクレオチド長さ、１〜５のヌクレオチド長さ、２〜５のヌクレオチド長さ、１〜４のヌクレオチド長さ、２〜４のヌクレオチド長さ、１〜３のヌクレオチド長さ、２〜３のヌクレオチド長さ、または１〜２のヌクレオチド長さとすることができる。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長い結果、または同じ長さの２本の鎖がシフトした結果として起こり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。第１の鎖と第２の鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって接続することができる。
【０１５７】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、２’−糖修飾、例えば、２−Ｆ、２’−Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、または非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。
【０１５８】
本発明のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における５’または３’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、この２つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖に存在する。
【０１５９】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、全体の安定性に影響を与えずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を高めることができる１つのオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有しても良いし、またはこの逆であっても良い。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端のヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に拘束されるものではないが、非対称な、アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスに付加されるガイド鎖を好む。例えば、１つのオーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を有する。
【０１６０】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有し得る。
【０１６１】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６２】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６４】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にあり、ｄｓＲＮＡの一端は平滑であるが、他端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンスの３’末端にある。任意選択により、ｄｓＲＮＡは、リガンド（好ましくは、受容体リガンド、即ち、ＡＳＧＰＲリガンド）をさらに含む。
【０１６５】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み：センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端のヌクレオチド（１位）から始まり、前記センス鎖の１位〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端のヌクレオチドから始まり、少なくとも８つのリボヌクレオチドが、センス鎖の１位〜２３位と対合して二重鎖を形成する位置にあり；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドが、センス鎖と対合せず、最大６つの連続した３’末端のヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、これにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングが形成され；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、これにより１０〜３０のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングが形成され；少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端のヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性が得られるように整列されたときにアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、これによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間にかなりの二重鎖領域が形成され；そして前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現が減少するように、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり；そしてセンス鎖が、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドが、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも２５、最大で２９のヌクレオチド長を有するセンス鎖、および最大で３０のヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、５’末端の１１位に酵素分解されやすい修飾ヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にあり；前記センス鎖の前記３’末端と前記アンチセンス鎖の前記５’末端が平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖が、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、二重鎖領域が少なくとも２５ヌクレオチド長であり、前記ｄｓＲＮＡ剤が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現が減少するように、前記アンチセンス鎖が、前記アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断が、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡに優先的に生じ、これにより哺乳動物での標的遺伝子の発現が減少する。任意選択により、ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドをさらに含む。
【０１６７】
一実施形態では、センス鎖は、５’末端の１１位に酵素分解されやすい修飾ヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６８】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’−ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
【０１６９】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「脱リン酸」リンカー（“ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ”ｌｉｎｋｅｒ）での大量の置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
【０１７０】
核酸がサブユニットの重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、または１０のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在しても良いし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在しても良いし、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。５’末端または両末端は、リン酸化されても良い。
【０１７１】
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、または両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハングの全てまたは一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の２’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０１７２】
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、または２’−フルオロで修飾される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。
【０１７３】
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチルもしくは２’−フルオロ、非環状核酸、または他のものであっても良い。
【０１７４】
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシから選択される２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。
【０１７５】
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）ヌクレオチド、または２’−ａｒａ−Ｆヌクレオチドで修飾される。
【０１７６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、式Ｉに示されているように、特にＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域における交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用される「交互モチーフ」または「交互パターン」という語は、各修飾が１つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する１つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ、３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
【０１７７】
交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても良いし、または異なっていても良い。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチドの１種類の修飾を表す場合、交互パターン、即ち、１つおきのヌクレオチドの修飾は、同じでも良いが、センス鎖またはアンチセンス鎖はそれぞれ、交互モチーフ、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」、または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」などの内部の修飾のいくつかの可能性から選択することができる。
【０１７８】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしている、センス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するようなシフトであっても良いし、この逆のシフトでも良い。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖におけるアンチセンス鎖と塩基対を形成した場合、センス鎖における交互モチーフが、センス鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフが、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の３’から５’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で始まり得る。別の例として、センス鎖における交互モチーフは、センス鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフは、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の３’から５’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まり得るため、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な、または部分的なシフトが存在する。
【０１７９】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの位置のどのヌクレオチドにも存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得る；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖における交互パターンに存在し得る；あるいはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンにおける両方のヌクレオチド間結合の修飾を含む。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。
【０１８０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の３つのヌクレオチドのうちの２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。好ましくは、これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
【０１８１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された２〜１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１〜１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記センス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８２】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、もしくは１４のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、もしくは１２のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８７】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８８】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１８９】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、もしくは４つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０１９０】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１〜１０の末端位置の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一方の末端または両末端におけるホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって連結することができる。
【０１９１】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のそれぞれの二重鎖の１〜１０の内部領域の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを、センス鎖の５’末端から数えて、８位〜１６位の二重鎖領域にあるホスホロチオエート、メチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって連結することができ；ｄｓＲＮＡ剤は、任意選択で、１〜１０の末端位置の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含み得る。
【０１９２】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（５’末端から数えて）における１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９４】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９５】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９７】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９８】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０１９９】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２００】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０１】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０２】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位〜５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０４】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２０位と２１位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０５】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２０位と２１位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位と２２位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０７】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位と２２位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０８】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２２位と２３位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２０９】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２３位と２３位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
【０２１０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、標的とのミスマッチ、二重鎖内のミスマッチ、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、または二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁または同様の分析を用いることもできる）を促進する傾向に基づいてランク付けすることができる。解離の促進に関しては、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシンである）。ミスマッチ、例えば、非正準な対合または正準以外の対合（本明細書の他の部分に記載）は、正準な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。
【０２１１】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択することができるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合もしくは正準以外の対合、またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。
【０２１２】
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、ンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、または３つの塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
【０２１３】
本発明者らは、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置におけるジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、および／又はホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’末端への４’修飾および／または５’修飾ヌクレオチドの導入が、ヌクレオチド間結合に立体的影響を与えることができ、従ってヌクレオチド間結合をヌクレアーゼから保護するまたは安定させることを見出した。
【０２１４】
一実施形態では、５’修飾ヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、５’アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’アルキル化ヌクレオシドは、５’メチルヌクレオシドである。５’メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。
【０２１５】
一実施形態では、４’修飾ヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’アルキル化ヌクレオシドは、４’メチルヌクレオシドである。４’メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。あるいは、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の４’−Ｏ−アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。
【０２１６】
一実施形態では、５’アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’アルキル化ヌクレオシドは、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。
【０２１７】
一実施形態では、４’アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。４’アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。
【０２１８】
一実施形態では、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。
【０２１９】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖配列は、式（Ｉｓ）によって表される：
【化９】
2017525705.tif 000010
式中：
Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、アンチセンスｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側に位置する熱不安定化ヌクレオチド（例えば、非環状ヌクレオチド、例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ、ミスマッチ、脱塩基、またはＤＮＡ）であり；
Ｔ１は、２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖における２’位置又は同等の位置における化学修飾を含むヌクレオチドを表し；例えば、Ｔ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択され；
ｎ１またはｎ３は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５は、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４は、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり、そして
ｎ２は、０〜３ヌクレオチド長である。
【０２２０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の１９、２０、２１、または２２のヌクレオチド長を有するセンス鎖配列は、式（Ｉｓ）によって表され：
【化１０】
2017525705.tif 000011
式中：
Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、アンチセンスｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側に位置する熱不安定化ヌクレオチド（例えば、非環状ヌクレオチド、例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ、ミスマッチ、脱塩基、またはＤＮＡ）であり；
Ｔ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１またはｎ３は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５は、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４は、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり、そして
ｎ２は、０〜３ヌクレオチド長である。
【０２２１】
一実施形態では、式（Ｉｓ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングをさらに含む。一例では、式（Ｉｓ）のｄｓＲＮＡ剤は、５’オーバーハングを含む。
【０２２２】
一実施形態では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４位、１５位、１６位、または１７位における１つの熱不安定化ヌクレオチドを含む。例えば、Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ）、ミスマッチ、脱塩基、またはＤＮＡである。特定の一例では、Ｃ１はＧＮＡである。
【０２２３】
一実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルを含む。
【０２２４】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖（Ｉｓ）を含み、Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ）、ミスマッチ、脱塩基、またはＤＮＡであり；Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、または２’−Ｆ−５’−メチルを含む。
【０２２５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖配列は、式（Ｉａ）によって表され：
【化１１】
2017525705.tif 000012
式中：
Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する非リボース、非環状、または主鎖における２’位または同等の位置における化学修飾を含むヌクレオチドを表し；例えば、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択され；
ｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｑ３またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｑ２またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【０２２６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖配列は、式（Ｉａ）で表され：
【化１２】
2017525705.tif 000013
式中：
Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｑ３またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｑ２またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【０２２７】
一実施形態では、式（Ｉａ）のｄｓＲＮＡは、１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングをさらに含む。一例では、式（Ｉａ）のｄｓＲＮＡは、３’オーバーハングを含む。
【０２２８】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
【化１３】
2017525705.tif 000014
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡまたはＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングを有する。
【０２２９】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
【化１４】
2017525705.tif 000015
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡまたはＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１５〜３０のヌクレオチドを有し：
【化１５】
2017525705.tif 000016
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチドＧＮＡであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンスの３’末端に１〜６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。
【０２３１】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１９〜２３のヌクレオチドを有し：
【化１６】
2017525705.tif 000017
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチドＧＮＡであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は独立に、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；
ｎ１、ｎ３、ｑ１、またはｑ３は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２、ｑ４、またはｑ５は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンスの３’末端に２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
【化１７】
2017525705.tif 000018
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、センスの５’末端に１〜１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する。
【０２３３】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
【化１８】
2017525705.tif 000019
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、センスの５’末端に１〜６ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する。
【０２３４】
一実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し：
【化１９】
2017525705.tif 000020
式中：
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを表し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡもしくはＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを表し；
ｎ１、ｎ３、またはｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３、またはｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２、またはｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０であり；
ｎ２またはｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長であり：
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；かつ
このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に１〜１０ヌクレオチド長の５’オーバーハング、およびアンチセンスの５’末端に１〜１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。
【０２３５】
熱不安定化修飾
ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位でセンス鎖に熱不安定化修飾を導入してｄｓＲＮＡ二重鎖の解離または溶解の性質を強める（二重鎖の結合の自由エネルギーを減少させる）ことによってＲＮＡ干渉を最適化することができる。この修飾は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域における二重鎖の解離または溶解の性質を強めることができる。
【０２３６】
熱不安定化修飾は、脱塩基修飾；対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば、２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る。
【０２３７】
例示的な脱塩基修飾は、以下の通りである：
【化２０】
2017525705.tif 000021
【０２３８】
例示的な糖修飾は、以下の通りである：
【化２１】
2017525705.tif 000022
【０２３９】
「非環状ヌクレオチド」という語は、例えば、リボースの炭素（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、もしくはＣ１’−Ｏ４’）間の結合が全く存在しない、かつ／またはリボースの炭素若しくは酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、もしくはＯ４’）の少なくとも１つが、単独でまたは組み合わせでヌクレオチドに存在しない非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、以下の通りであり、
【化２２】
2017525705.tif 000023
式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキル；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である。「ＵＮＡ」という語は、糖の全ての結合が除去されてアンロック「糖」残基が形成されている、アンロック非環状核酸を指す。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’間の結合（即ち、Ｃ１’とＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素の共有結合）が除去された単量体も含む。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（即ち、Ｃ２’とＣ３’炭素間の炭素−炭素の共有結合）が除去される（参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６  （１７）：２０５９  （１９８５）；およびＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９  （２００９）を参照されたい）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック塩基対形成に影響を与えることなく、主鎖のより高い柔軟性を提供する。非環状ヌクレオチドは、２’−５’または３’−５’結合によって連結することができる。
【０２４０】
「ＧＮＡ」という語は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似したポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリセロール単位からなるためその「主鎖」の組成が異なるグリコール核酸を指す：
【化２３】
2017525705.tif 000024
【０２４１】
熱不安定化修飾は、熱不安定化ヌクレオチドとｄｓＲＮＡ二重鎖内の対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ（即ち、非相補的な塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。当分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであるヌクレオチド間で起こり得る、即ち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖における修飾とは無関係のそれぞれのヌクレオチドからの核酸塩基間で起こり得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、２’−デオキシ核酸塩基である少なくとも１つの核酸塩基をミスマッチ対合中に含み；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖中にある。
【０２４２】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）、およびミスマッチ修飾のさらなる例は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレットに詳細に記載されている。
【０２４３】
熱不安定化修飾は、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低下又は喪失したユニバーサル塩基、およびリン酸修飾を含み得る。
【０２４４】
対抗する鎖における塩基と水素結合を形成する能力が低下した又は完全に喪失した核酸塩基修飾を、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレットに記載されているｄｓＲＮＡ剤二重鎖の中心領域の不安定化について評価した。例示的な核酸塩基修飾は、次の通りである：
【化２４】
2017525705.tif 000025
【０２４５】
天然のホスホジエステル結合と比較してｄｓＲＮＡ二重鎖の熱安定性を低下させることが知られている例示的なリン酸修飾は、次の通りである：
【化２５】
2017525705.tif 000026
【０２４６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ、および２’−ＯＭｅを伴う、かつＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを伴う）を含み得る。例えば、２’−５’結合の修飾は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、もしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用することができる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を阻害するためにセンス鎖の５’末端で使用することができる。
【０２４７】
別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、Ｌ糖（例えば、Ｌリボース、２’−Ｈ、２’−ＯＨ、および２’−ＯＭｅを含むＬ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、もしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用することができる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を阻害するためにセンス鎖の５’末端で使用することができる。
【０２４８】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）で表される少なくとも２つの二重鎖を含む多量体であり、前記二重鎖はリンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、前記多量体は、リガンドをさらに含む。ｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０２４９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）で表される３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、前記二重鎖は、リンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。ｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０２５０】
一実施形態では、式（Ｉ）で表される２つのｄｓＲＮＡ剤は、５’末端で互いに結合され、その３’末端の一方または両方が、任意選択で、リガンドによってコンジュゲートされる。ｄｓＲＮＡはそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡはそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０２５１】
様々な刊行物に、多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、このようなｓｉＲＮＡは全て、本発明のｄｓＲＮＡと共に使用することができる。このような刊行物としては、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７８５８７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、同第２００７／１１７６８６号、同第２００９／０１４８８７号、および同第２０１１／０３１５２０号が挙げられる。
【０２５２】
１つ以上の糖質部分のｄｓＲＮＡ剤に対するコンジュゲーションを含むｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、ｄｓＲＮＡ剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体（好ましくは環状）で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子が炭素原子である環系であっても良いし、または複素環系、即ち１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、または１つ以上の二重結合を含んでも良い。
【０２５３】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、もしくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込みまたは連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を可能にする。
【０２５４】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートし、この担体は、環状基または非環状基であり得；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２５５】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、任意選択で、１つ以上のリガンドとコンジュゲートしても良い。リガンドは、３’末端、５’末端、または両末端でセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に付着することができる。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートすることができる。
【０２５６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、５’リン酸化されるか、または５’末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合する修飾を含む。適切な修飾としては：５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホラミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（即ち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意のさらなる組み合わせが挙げられる。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に配置することができる。
【０２５７】
リガンド
多種多様な物質が、本発明のオリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい部分は、直接的にまたは介在テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
【０２５８】
好ましい実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、または寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞もしくは器官の区画、組織、器官、または体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
【０２５９】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｕｂｂａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびこれらの誘導体（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。
【０２６０】
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。
【０２６１】
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
【０２６２】
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
【０２６３】
リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、もしくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであっても良い。表２に、標的リガンドおよびそれらの関連する受容体のいくつかの例を示す。
【０２６４】
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０２６５】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であっても良い。
【０２６６】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であっても良い。
【０２６７】
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
【０２６８】
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
【０２６９】
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。
【０２７０】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、好ましくは、この親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆行できないほど強力ではない。
【０２７１】
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに対して弱く結合するかまたは全く結合しないため、コンジュゲートが、好ましくは腎臓に分布する。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用することができる。
【０２７２】
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）もが挙げられる。
【０２７３】
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディアである。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。
【０２７４】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定められた３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約５〜５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸長さであっても良い。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅから構成される）であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によってコードされても良い（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸長さ〜約４０のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進する��めに修飾する、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびＲＧＤ含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。この種のリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
【０２７５】
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであっても良い（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０２７６】
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン−様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、およびカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、または環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基であり、かつ／またはＣ末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。ｉ±３位、またはｉ±４位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
【０２７７】
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバミン酸結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
【０２７８】
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖クラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。
【０２７９】
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケチアル（ｐｏｌｙｋｅｔｙａｌ）、オルトエステル、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
【０２８０】
ＰＫモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。ＰＫモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。
【０２８１】
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適用可能である。
【０２８２】
本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日出願の同第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日出願の同第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日出願の同第１１／１１５，９８９号明細書、および２００７年１１月２１日出願の同第１１／９４４，２２７号明細書に記載されている。
【０２８３】
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、または一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、またはＰＫ調節特性を有しても良い。好ましい実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
【０２８４】
リガンドは、様々な位置、例えば３’末端、５’末端、および／または内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。前記モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドまたはテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、前記「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー（即ち、リガンドが結合されていない）、例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。
【０２８５】
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
【０２８６】
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方または両方の鎖に結合することができる。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。
【０２８７】
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、およびホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。
【０２８８】
ＲＮＡ干渉の分野におけるあらゆる適切なリガンドを使用することができるが、このようなリガンドは、典型的には、糖質、例えば、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【０２８９】
リガンドを核酸にコンジュゲートさせるリンカーは、上述のリンカーを含む。例えば、リガンドは、一価、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）誘導体であっても良い。
【０２９０】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、次の式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）の何れかに示されている構造を含む二価および三価の分岐リンカーにコンジュゲートする：
【化２６】
2017525705.tif 000027
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０〜２０を表し、反復単位は、同じであっても良いし、または異なっていても良く；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏを表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終了させることができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化２７】
2017525705.tif 000028
、またはヘテロシクリルを表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、リガンドを表す；即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；かつ
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。
【０２９１】
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、式（ＶＩＩ）のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤と共に使用すると特に有用である：
【化２８】
2017525705.tif 000029
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
【０２９２】
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
【化２９】
2017525705.tif 000030
【化３０】
2017525705.tif 000031
【０２９３】
定義
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、および「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる作用剤と互換的に使用される。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡも標的とすることができる。
【０２９４】
本明細書で使用される「ＲＮＡｉを媒介する」という句は、標的ＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする能力を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉ機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ、例えば、２１〜２３のヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤を使用すると考えられる。
【０２９５】
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定した特異的な結合が生じるような十分な相補性を示すために使用される語である。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下、即ち、アッセイもしくは治療の場合の生理的条件下、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが行われる条件下、オリゴマー化合物の非標的配列への特異的な結合を回避するために十分な相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には、少なくとも５つのヌクレオチドが異なる。
【０２９６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤が、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」である、例えば、標的ＲＮＡとｄｓＲＮＡ二重鎖剤とがアニーリングして、例えば、厳密に相補的な領域におけるワトソン−クリック型塩基対のみからなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な内部領域（例えば、少なくとも１０のヌクレオチド）を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１つのヌクレオチドの違いを特異的に識別する。この場合、ｄｓＲＮＡ剤は、厳密な相補性が、１つのヌクレオチドの違いがある領域（例えば、７つのヌクレオチド以内）で見られる場合にのみＲＮＡｉを媒介する。
【０２９７】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という語は、例えば、１００未満、２００未満、３００未満、または４００未満のヌクレオチドの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
【０２９８】
「ＢＮＡ」という語は、架橋化核酸（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を指し、制限されたまたは隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’−エンド糖パッカリング（Ｃ３’−ｅｎｄｏ  ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を有する５、６員、さらには７員の架橋構造を含み得る。この架橋は、典型的には、リボースの２’位置、４’位置に含めて、２’，４’−ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）を得た。ＢＮＡヌクレオチドの例としては、以下のヌクレオシドが挙げられる：
【化３１】
2017525705.tif 000032
【０２９９】
「ＬＮＡ」という語は、ロック核酸を指し、制限されたまたは隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、同じリボース糖の２’ヒドロキシルを４’炭素に結合する追加の架橋（例えば、メチレン架橋またはエチレン架橋）で修飾れている。例えば、この架橋は、リボースを以下の３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ）高次構造に「ロック」することができる：
【化３２】
2017525705.tif 000033
【０３００】
「ＥＮＡ」という語は、エチレン架橋核酸を指し、制限されたまたは隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。
【０３０１】
本明細書の「切断部位」は、ｉＲＮＡ剤を利用することによってＲＩＳＣ機構によって切断させる標的遺伝子又はセンス鎖における骨格結合を意味する。そして、標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも１つまたは少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖の場合、切断部位は、センス鎖自体が、ＲＮＡｉ機構によって切断されるべき標的であとすると、切断されるセンス鎖の骨格結合である。切断部位は、当分野で公知の方法、例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （２００４）  ４３２，１７３−１７８に詳述されている５’−ＲＡＣＥアッセイを用いて決定することができる。当分野で十分に理解されているように、２１ヌクレオチド長の２つの鎖（これらの鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する１９の連続した塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む円錐状二本鎖ＲＮＡｉ剤（ｃｏｎｉｃａｌ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｉ  ａｇｅｎｔ）の切断部位領域は、センス鎖の５’末端の９位〜１２位に一致する。
【０３０２】
「ハロ」という語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のあらゆるラジカルを指す。「アルキル」という語は、任意選択でＮ、Ｏ、またはＳを挿入しても良い、指示数の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖であり得る飽和および不飽和非芳香族炭化水素鎖（これらには、限定されるものではないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが含まれる）を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は、基が、その中に１〜１０（全てを含む）の炭素原子を有し得ることを示す。「アルコキシ」という語は、−Ｏ−アルキルラジカルを指す。「アルキレン」という語は、二価アルキル（即ち、−Ｒ−）を指す。「アルキレンジオキソ」という語は、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−の二価種を指し、Ｒは、アルキレンを表す。「アミノアルキル」という語は、アミノで置換されたアルキルを指す。「メルカプト」という語は、−ＳＨラジカルを指す。「チオアルコキシ」という語は、Ｓ−アルキルラジカルを指す。
【０３０３】
「アリール」という語は、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香族環系を指し、各環の０、１つ、２つ、３つ、または４つの原子が置換基によって置換されても良い。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」または「アラルキル」という語は、アリールで置換されたアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という語は、アリールで置換されたアルコキシを指す。
【０３０４】
本明細書で使用される「シクロアルキル」という語は、３〜１２の炭素、例えば、３〜８の炭素、および、例えば、３〜６の炭素を有する飽和および部分飽和環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意選択で置換されても良い。シクロアルキル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【０３０５】
「ヘテロアリール」という語は、単環式の場合には１〜３のヘテロ原子、二環式の場合には１〜６のヘテロ原子、または三環式の場合には１〜９のヘテロ原子を有する芳香族の５〜８員環単環式、８〜１２員環二環式、または１１〜１４員環三環式環系を指し、前記へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にはそれぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９のヘテロ原子）、各環の０、１つ、２つ、３つ、または４つの原子は、置換基で置換されても良い。ヘテロアリル基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリニル、およびチアゾリルなどが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロアラルキル」という語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
【０３０６】
「ヘテロシクリル」という語は、単環式の場合には１〜３のヘテロ原子、二環式の場合には１〜６のヘテロ原子、または三環式の場合には１〜９のヘテロ原子を有する非芳香族の５〜８員環単環式、８〜１２員環二環式、または１１〜１４員環三環式環系を指し、前記へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にはそれぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９のヘテロ原子）、各環の０、１つ、２つ、または３つの原子は、置換基で置換されても良い。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル（ｔｒｉｚｏｌｙｌ）、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
【０３０７】
「オキソ」という語は、炭素に結合したときにカルボニルを形成し、窒素に結合したときにＮ−オキシドを形成し、硫黄に結合したときにスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０３０８】
「アシル」という語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキルカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらの何れも、置換基でさらに置換されても良い。
【０３０９】
「置換された」という語は、所与の構造における１つ以上の水素ラジカルの特定の置換基のラジカルでの置換を指し、この特定の置換基としては、限定されるものではないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族が挙げられる。置換基は、さらに置換され得ることを理解されたい。
【０３１０】
切断可能連結基
切断可能連結基は、細胞外で十分安定しているが、標的細胞に入ると切断されてリンカーが一緒に保持する２つの部分を放出する、連結基である。本発明によるｄｓＲＮＡ剤の好ましい実施形態では、切断可能連結基は、対象の血液中または第２の基準条件下（例えば、血液または血清に存在する条件を模倣または実現するように選択することができる）よりも、標的細胞内または第１の基準条件下（例えば、細胞内の条件を模倣または実現するように選択することができる）において、少なくとも１０倍以上、好ましくは、少なくとも１００倍速く切断する。
【０３１１】
切断可能連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内において、より行き渡る、またはより高いレベルもしくは活性で存在する。このような分解剤の例としては、還元によって酸化還元性切断可能連結基を分解することができる、例えば、細胞内に存在する、酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤、例えば、メルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されるか、もしくは基質特異性を有しない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を生じさせる、例えば、５以下のｐＨにすることができるエンドソームまたは作用剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であっても良い）、およびホスファターゼとしての機能を果たすことによって酸性切断可能連結基を加水分解または分解することができる酵素が挙げられる。
【０３１２】
切断可能連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、これにより、リガンドから細胞内へ、または細胞の所望の区画内にカチオン性脂質を放出する切断可能連結基を有する。
【０３１３】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である、切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基の種類は、標的とされる細胞によって異なり得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞でより効率的に切断する。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および睾丸の細胞が挙げられる。
【０３１４】
ペプチダーゼが豊富な細胞型、例えば、肝細胞および滑膜細胞を標的とする場合は、ペプチド結合を含むリンカーを使用することができる。
【０３１５】
一般に、候補の切断可能連結基の適合性は、候補連結基を切断する分解剤（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、血中での、または他の非標的組織と接触しているときの切断に抵抗する能力について候補の切断可能連結基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の相対的な切断のしやすさを決定することができ、この第１の条件は、標的細胞内の切断を示すために選択され、この第２の条件は、他の組織または体液、例えば、血液もしくは血清中での切断を示すために選択される。無細胞系、細胞、細胞培養物、器官もしくは組織培養物、または動物全体で評価を行うことができる。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して細胞内（または細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下）で少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く切断する。
【０３１６】
酸化還元性切断可能連結基
切断可能連結基の１つのクラスは、本発明によるｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、還元または酸化時に切断される酸化還元性切断可能連結基である。還元的に切断可能な連結基の一例として、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）が挙げられる。候補の切断可能連結基が適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか否か、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用剤と共に使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法を確認することができる。例えば、候補は、細胞、例えば、標的細胞で観察され得る切断速度を模倣する当分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはた他の還元剤と共にインキュベートすることによって評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するために選択される条件下でも評価することができる。好ましい一実施形態では、候補化合物は、血中では最大で１０％切断する。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して、細胞内（または細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下）では少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内培地を模倣するように選択される条件下で標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定して、細胞外培地を模倣するように選択される条件と比較することができる。
【０３１７】
リン酸系切断可能連結基
リン酸系切断可能連結基は、本発明によるｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、リン酸基を分解または加水分解する作用剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する作用剤の一例として、細胞内の酵素、例えば、ホスファターゼが挙げられる。リン酸塩系の連結基の例としては、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−が挙げられる。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
【０３１８】
酸性切断可能連結基
酸性切断可能連結基は、本発明によるｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸性切断可能連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ以下）のｐＨの酸性環境において、または一般酸として機能し得る作用剤、例えば、酵素剤によって切断する。細胞において、特定のｐＨの低い細胞小器官、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸性切断可能連結基に切断環境を提供することができる。酸性切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられる。酸性切断可能な基は、一般式：−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい一実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酵素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、または第３級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはｔ−ブチルである場合である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
【０３１９】
エステル系連結基
エステル系切断可能連結基は、本発明によるｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、細胞内の酵素、例えば、エステラーゼおよびアミダーゼによって切断される。エステル系切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン基、アルケニレン基、およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル系切断可能連結基は、一般式：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０３２０】
ペプチド系切断連結基
ペプチド系切断可能連結基は、本発明によるｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、細胞内の酵素、例えば、ペプチダーゼおよびプロテアーゼによって切断される。ペプチド系切断可能連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合である。ペプチド系切断可能連結基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質が生成するアミノ酸間に形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチド系切断基は、一般に、ペプチドおよびタンパク質が生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチド系切断可能連結基は、一般式：−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。本明細書で使用される「糖質」は、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、もしくは環状でも良い）を有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質自体；または、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、もしくは環状でも良い）をそれぞれ有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４〜９の単糖単位を含むオリゴ糖）、ならびに多糖、例えば、スターチ、グリコーゲン、セルロース、および多糖ガムが挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５および上記の（好ましくはＣ５〜Ｃ８）糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５〜Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
【０３２１】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。一実施形態では、本発明はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。
【０３２２】
本発明はさらに、対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用される、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトであり得る。
【０３２３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、緩衝液に溶解して投与される。
【０３２４】
一実施形態では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物は、対象に投与するために製剤することができる。製剤されるｓｉＲＮＡ組成物は、様々な状態をとることができる。一部の例では、この組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、および／または無水（例えば、８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の水）である。別の例では、ｓｉＲＮＡは、水相、例えば、水を含む溶液に溶解される。
【０３２５】
水相および結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に水相の場合）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得る微粒子）に含めることができる。一般に、ｓｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載される意図する投与法に適合するように製剤される。例えば、特定の実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの次の方法によって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、および他の自己集合。
【０３２６】
ｓｉＲＮＡ調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、またはｓｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｓｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
【０３２７】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、別のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、第２の遺伝子または同じ遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる第２のｓｉＲＮＡを含む。なお他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるｓｉＲＮＡ種を含み得る。このようなｓｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる。
【０３２８】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の作用剤）を含む。例えば、ウイルス疾患、例えば、ＨＩＶの治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、公知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含む。別の例では、癌治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含み得る。
【０３２９】
本発明によるｄｓＲＮＡ剤の投与に使用することができる例示的な製剤が以下に記載される。
【０３３０】
リポソーム。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡを用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）調製物は、送達するために膜分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルに製剤することができる。本明細書で使用される「リポソーム」という語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層で構成された両親媒性脂質からなる小胞を指す。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層小胞および多層小胞を含む。水性部分は、ｓｉＲＮＡ組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、この水性外部は、典型的にはｓｉＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、有効成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜に構造的に類似しているため、リポソームが組織に接触すると、リポソーム二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との一体化が進むと、ｓｉＲＮＡを含む内部水性成分が、細胞内に送達され、そこで、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームは、特異的に標的化され、例えば、ｓｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
【０３３１】
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗剤に溶解され、これにより、ミセルが脂質成分で形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質または脂質コンジュゲートとすることができる。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ｓｉＲＮＡ調製物が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基が、ｓｉＲＮＡと相互作用して、ｓｉＲＮＡの周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、洗剤が、例えば、透析によって除去され、ｓｉＲＮＡのリポソーム調製物が得られる。
【０３３２】
必要に応じて、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）とすることができる。ｐＨを、凝縮に適するように調整することもできる。
【０３３３】
送達ビヒクルの構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を包含する安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを形成するための方法のさらなる詳細が、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソームの形成は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７；  米国特許第４，８９７，３５５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理および凍結融解と押し出しを含む（例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）比較的均一な凝集体が望ましい場合は、微小流動化を使用することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４）。このような方法は、ｓｉＲＮＡ剤調製物をリポソームの中にパッケージングするために容易に適合される。
【０３３４】
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体を形成するのではなく、核酸分子を取り込む。核酸分子および脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体が形成されるのではなく反発が起きる。とは言え、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために使用される。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）  ２６９−２７４）。
【０３３５】
１つの重要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０３３６】
リポソームをｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入する他の方法の例として、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；同第９３／２４６４０号パンフレット；同第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０３３７】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的には原形質膜と効率的に融合することができないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれるため、ｓｉＲＮＡをマクロファージに送達するために使用することができる。
【０３３８】
リポソームのさらなる利点としては：天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性かつ生体分解性であること；リポソームが、種々の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、内部区画内に取り込まれたｓｉＲＮＡを代謝および分解から保護できること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）が挙げられる。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事項は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水中体積である。
【０３３９】
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用して脂質−核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この脂質−核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、結果としてｓｉＲＮＡを送達することができる（例えば、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７、ならびにＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用が記載されている米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０３４０】
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を生きた組織培養細胞に送達するための有効な作用剤であり、この組織培養細胞は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られる複合体の正味荷電も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜に融合し、そして機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に有効に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
【０３４１】
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２種類のうちの１種類の脂質にコンジュゲートして、化合物、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）を含むカルボキシスペルミンを含め、様々な部分にコンジュゲートしたものを含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０３４２】
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に含められて製剤されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体を含む（Ｇａｏ，  Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって形成されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこのようなリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを実現すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号明細書および同第９６／３７１９４号明細書に記載されている。
【０３４３】
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームには、他の製剤よりもいくつかの利点が存在する。このような利点は、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、およびｓｉＲＮＡを皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ｓｉＲＮＡを上皮細胞に送達するために、そしてｓｉＲＮＡの皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を促進するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は実証されている（例えば、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０  ａｎｄ  ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０３４４】
非イオン性リポソーム系もまた、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における実用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。ｓｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
【０３４５】
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に形成することができる。このような変形性は、リポソームの平均半径よりも小さい孔にリポソームが進入するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの１種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、ｓｉＲＮＡを皮膚内のケラチノサイトに送達するために、例えば、皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適当な経皮勾配の影響下で、直径がそれぞれ５０ｎｍ未満の一連の微孔を通って通過しなければならない。加えて、脂質の特性により、このようなトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚の孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得ると共に、多くの場合、断片化されずに標的に到達することができ、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
【０３４６】
本発明に適用可能な他の製剤は、２００８年１月２日出願の米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日出願の同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日出願の同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日出願の同第６１／０４７，０８７号明細書；および２００８年５月８日出願の同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットにも、本発明に適用可能な製剤が記載されている。
【０３４７】
界面活性剤。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。界面活性剤は、製剤、例えば、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記）において幅広い用途が見出されている。ｓｉＲＮＡ（または前駆体、例えば、プロセシングしてｓｉＲＮＡにすることができるより大きなｄｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤される。多数の異なる種類の天然および合成の両方の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３４８】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、この界面活性剤分子は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、その構造によって２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスのうち最も一般的なメンバーである。
【０３４９】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに負の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、石鹸、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、硫酸アルキルおよび硫酸エトキシル化アルキル、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスのうち最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０３５０】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに正の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスのうちで最も使用されるメンバーである。
【０３５１】
界面活性剤分子が、正または負のいずれの電荷も有する能力がある場合、この界面活性剤分子は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
【０３５２】
薬物製品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３５３】
ミセルおよび他の膜状製剤。説明を容易にするために、このセクションにおけるミセルおよび他の製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）組成物は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、特定の種類の分子集合体として定義され、この分子集合体では、両親媒性分子の全ての疎水性部分が内側を向き、親水性部分が周囲の水相に接触するように両親媒性分子が球体構造に構成されている。環境が疎水性である場合は、反対の構成で存在する。
【０３５４】
経皮膜を通る送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液とアルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩とミセル形成化合物との混合によって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩と同時または添加後に、添加することができる。混合ミセルは、実質的にあらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合が行われる。
【０３５５】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物が、少なくとも３種類のミセル形成化合物と混合されて混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と少なくとも１種類のミセル形成化合物と混合され、次いで、残りのミセル形成化合物を添加して激しく混合することによって調製される。
【０３５６】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定させて、細菌の増殖から保護することができる。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは、ミセル形成成分と共に添加しても良い。等張剤、例えば、グリセリンを、混合ミセル組成物の形成後に添加しても良い。
【０３５７】
ミセル製剤を噴霧として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴霧剤を充填する。加圧下の噴霧剤は、ディスペンサー内で液体の形態である。水相と噴霧剤相とが１つになる、即ち、１つの相のみが存在するように、成分比が調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば、計量弁によってディスペンスする前にディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品のディスペンス量が、計量弁から微細な霧状で噴霧される。
【０３５８】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用しても良い。
【０３５９】
必須成分の特定濃度を、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔からの吸収では、多くの場合、注射による投与または胃腸管を介した投与の投与量を、例えば、少なくとも２倍または３倍に増量するのが望ましい。
【０３６０】
粒子。説明を容易にするために、このセクションにおける粒子、製剤、組成物、および方法は、主に修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、無修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）調製物は、粒子、例えば、微粒子の中に含めることができる。微粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって製造することもできる。
【０３６１】
医薬組成物
本発明のｉＲＮＡ剤は、医薬用途のために製剤することができる。本発明はさらに、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容され得る組成物は、単独で、あるいは１種以上の薬学的に許容され得る担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に製剤される、前述の実施形態の何れかの１種以上のｄｓＲＮＡ剤を治療有効量、含む。
【０３６２】
医薬組成物は、以下のように適合された投与を含め、固体または液体の形態で投与されるように特別に製剤することができる：（１）例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液、または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、および体内吸収用の錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペーストの経口投与；（２）例えば、滅菌液もしくは懸濁液、または徐放製剤として、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、もしくは硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または放出制御パッチもしくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、フォームとして膣内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；あるいは（８）鼻内投与。皮下または点滴法を用いる送達は、特に有利であり得る。
【０３６３】
本明細書で使用される「治療有効量」という句は、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比で、動物の細胞の少なくとも亜集団においてある程度の望ましい治療効果を得るのに有効な、本発明の化合物を含む化合物、材料、または組成物の量のことである。
【０３６４】
「薬学的に許容され得る」という句は、本明細書では、妥当な効果／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症が発生することなく、ヒトおよび動物の組織に接触させるのに適した、正当な医学的判断の範囲内である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために利用される。
【０３６５】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」という句は、目的の化合物をある器官または体の一部から別の器官または体の一部への運搬または輸送に関与する薬学的に許容され得る材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））、もしくは材料を被包する溶媒を意味する。各担体は、製剤の他成分と適合性であって、患者に有害でないという点で「許容可能」ではなければならない。薬学的に許容され得る担体として役立ち得る材料の一部の例として：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、マグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび座薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（１０）グリコール、例えば、ポリエチレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天：（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬ；（２２）医薬製剤に利用される他の無毒適合物質が挙げられる。
【０３６６】
この製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の任意の方法で調製することができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療を受ける者および投与の特定の方式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果が得られる化合物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、有効成分の約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。
【０３６７】
特定の実施形態では、本発明の製剤としては、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物；および本発明の化合物からなる群から選択される賦形剤が挙げられる。特定の実施形態では、上述の製剤は、本発明の化合物を経口投与可能にする。
【０３６８】
ｉＲＮＡ剤調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、またはｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
【０３６９】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、および任意選択で１種以上の補助成分と結合させるステップを含む。一般に、この組成物は、本発明の化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、または両方を均一に密着させて結合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製する。
【０３７０】
場合によっては、薬物の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉注射による薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水に溶けにくい結晶または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。次に、薬物の吸収速度は、結晶のサイズおよび結晶の形態に依存し得る溶解速度によって決まる。あるいは、非経口投与される剤形（ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍ）の遅延吸収は、油性ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成される。
【０３７１】
本発明による化合物は、他の医薬品との類似性によって、ヒトまたは動物用の薬物に使用される任意の便利な方法で投与するために製剤することができる。
【０３７２】
「治療」という語は、予防、療法、および治癒も包含するものとする。この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト、および他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジ；ならびに一般的な家禽およびペットを含む、治療を必要とするあらゆる動物である。
【０３７３】
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、細胞に送達される外来性ＤＮＡ鋳型により、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞で産生される。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３２８，４７０号）、または定位注入（例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照されたい）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容され得る希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得る、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写単位を含み得、１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の上鎖を含む転写物を産生し、もう１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の下鎖を含む転写物を産生する。鋳型が転写されると、ｄｓＲＮＡ剤が産生され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤の断片にプロセシングされる。
【０３７４】
送達経路
本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤または本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、異なる送達経路を用いて対象に送達することができる。ｉＲＮＡを含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路としては：静脈、皮下、局所、直腸、肛門、膣、鼻、肺、眼が挙げられる。
【０３７５】
本発明のｉＲＮＡ分子および／またはｄｓＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に含めることができる。このような組成物は、典型的には、１種以上のｉＲＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」という語は、医薬品投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および作用剤の使用は、当分野で周知である。あらゆる従来の媒体または作用剤が活性化合物と適合性でない場合を除き、その組成物中での使用が想定される。補助活性化合物を組成物に含めても良い。
【０３７６】
本発明の組成物は、局所治療または全身治療が望ましいか否か、および治療される領域に基づいて様々な方式で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻、経皮を含む）、経口、または非経口とすることができる。非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または気管支内もしくは脳室内投与が挙げられる。
【０３７７】
投与の経路および部位は、標的化を強めるために選択することができる。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉内への筋肉注射は、論理的な選択であろう。肺細胞は、ｉＲＮＡを噴霧形態で投与することによって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングして、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。
【０３７８】
用量
一態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を対象（例えば、ヒト対象）に投与する方法を取り上げる。別の態様では、本発明は、対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用される、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤に関する。この方法または医療での使用は、（ａ）二本鎖部分が、１４〜４０ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長である、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、外来性または病原体標的ＲＮＡ）に対して相補的である、かつ、任意選択により、（ｃ）少なくとも１つの１〜５ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤の単位用量を投与するステップを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、０．５ｍｇ未満、０．１ｍｇ未満、０．０５ｍｇ未満、０．０１ｍｇ未満、０．００５ｍｇ未満、０．００１ｍｇ未満、０．０００５ｍｇ未満、０．０００１ｍｇ未満、０．００００５ｍｇ未満、または０．００００１ｍｇ未満であり、かつ体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６のコピー）、または体重１ｋｇ当たり１５００ｎｍｏｌ未満、７５０ｎｍｏｌ未満、３００ｎｍｏｌ未満、１５０ｎｍｏｌ未満、７５ｎｍｏｌ未満、１５ｎｍｏｌ未満、７．５ｎｍｏｌ未満、１．５ｎｍｏｌ未満、０．７５ｎｍｏｌ未満、０．１５ｎｍｏｌ未満、０．０７５ｎｍｏｌ未満、０．０１５ｎｍｏｌ未満、０．００７５ｎｍｏｌ未満、０．００１５ｎｍｏｌ未満、０．０００７５ｎｍｏｌ未満、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
【０３７９】
規定量は、疾患または障害、例えば、標的ＲＮＡに関連した疾患または傷害を治療または予防するのに有効な量とすることができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。一部の実施形態では、用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、または０．１ｍｇ未満とすることができる。
【０３８０】
一部の実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２日に１回未満、４日に１回未満、８日に１回未満、または３０日に１回未満投与される。別の実施形態では、単位用量は、一定の頻度では投与されない（例えば、定期的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回で投与することができる。
【０３８１】
一実施形態では、有効量は、他の従来の治療様式で投与される。一実施形態では、対象は、ウイルス感染している患者であり、治療様式は、ｄｓＲＮＡ剤以外、例えば、ｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症であり、有効量のｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤が、例えば、外科介入後、例えば、血管形成術と組み合わせて投与される。
【０３８２】
一実施形態では、対象に、初回量および１回以上の維持量のｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤にプロセシングすることができるより大きなｄｓＲＮＡ剤、またはｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤をコードするＤＮＡ、またはその前駆体）が投与される。１または複数の維持量は、初回量と同じ、または初回量よりも少なくする、例えば、初回量の半分とすることができる。維持療法は、１日に付き体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１５ｍｇの範囲、例えば、１日に付き体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．００１ｍｇ、または０．００００１ｍｇの１または複数の用量を用いて対象を治療するステップを含み得る。維持量は、例えば、２日に１回以下、５日に１回以下、１０日に１回以下、または３０日に１回以下投与される。さらに、治療法は、一定期間継続することができ、この期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって異なり得る。特定の実施形態では、用量を、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以上に１回、例えば、５日もしくは８日に１回投与することができる。治療後、患者の状態の変化および病態の症状の緩和について、患者を監視することができる。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合は増量しても良いし、あるいは、疾患の状態の症状の緩和が観察された場合、疾患の状態が軽減された場合、または不所望の副作用が観察された場合は減量しても良い。
【０３８３】
有効量は、必要に応じて、または特定の状況下で適切と見なされる場合、単回または２回以上の投与で投与することができる。反復または頻繁な注入を容易にしたい場合は、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、または関節内）、またはレザバーの植え込みを提案することができる。
【０３８４】
一実施形態では、組成物は、複数のｄｓＲＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤種は、天然の標的配列に関しては、別の種とオーバーラップも隣接もしていない配列を有する。別の実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ剤種は、異なる天然の標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対立遺伝子特異的である。
【０３８５】
本明細書に記載される本発明のｄｓＲＮＡ剤は、哺乳動物、特に大きい動物、例えば、非ヒト霊長類またはヒトに様々な方法で投与することができる。
【０３８６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、または拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、くも膜下、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻、尿道、または眼内である。投与は、対象によって、または別の人間、例えば、医療提供者によって行うことができる。薬物治療は、測定した用量で、または測定した用量を送達するディスペンサで行うことができる。選択される送達方式は、以下に詳細に説明される。
【０３８７】
本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ剤の直腸投与または送達のための方法、組成物、およびキットを提供する。
【０３８８】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法に使用される本発明のｄｓＲＮＡ剤に関する。
【０３８９】
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の実施形態は、標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。この方法は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の、前述の任意の実施形態におけるｄｓＲＮＡ剤を投与するステップを含む。本発明はさらに、標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。好ましい一実施形態では、本発明はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。
【０３９０】
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を細胞に供給するステップを含む、前記細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、ヘプシジン、活性化プロテインＣ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ  Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
【０３９１】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法に使用される本発明のｄｓＲＮＡ剤に関する。
【０３９２】
本発明が、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらの実施例は、さらなる限定と解釈されるべきものではない。本出願で言及される全ての参照文献、出願中の特許出願、および公開特許の開示内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
【実施例】
【０３９３】
実施例１：ｓｉＲＮＡ二重鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング
細胞の培養およびトランスフェクション：
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞またはラットＨ．ＩＩ．４．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の大気で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によりプレートから剥離させた。１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）を、９６ウェルプレートの５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖が入っている各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクションを行った。約２×１０４  Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、２４時間または１２０時間インキュベートしてから、ＲＮＡを精製した。単回投与実験を、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験を、１０ｎＭの最終二重鎖濃度の最大投与量で８倍、４倍の段階希釈を用いて行った。
【０３９４】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ  ＃：６１０−１２）を用いた全ＲＮＡの単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中で溶解し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度を全過程で同じとした）。１０μｌの磁気ビーズおよび８０μｌの溶解／結合緩衝液の混合物を丸底プレートに添加し、１分間混合した。磁気ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズをかく乱せずに上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに添加し、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを、１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加し、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁気上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を取り出し、別の９６ウェルプレートに添加した。
【０３９５】
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
１回の反応に付き、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＴＮＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および１．６μｌのＨ２Ｏを含むマスターミックスを５μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラーを用いて、２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃に保持するステップによって作製した。
【０３９６】
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルの０．５μｌのＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ（ヒト）  Ｃａｔ＃４３０８３１３（げっ歯類））、０．５μｌのＴＴＲ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃ＨＳ００１７４９１４＿ｍ１（ヒト）ｃａｔ＃Ｒｎ００５６２１２４＿ｍ１（ラット））、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ  ４８０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）で行った。特段の記載がない限り、各二重鎖を、少なくとも２つの別個のトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
【０３９７】
相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭ  ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを使用する４パラメーターフィットモデルを用いて計算し、同じ用量範囲もしくはそれ自体の最低用量に対して、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または未処置細胞に対して正規化した。ＩＣ５０を、個々のトランスフェクションおよび組み合わせに対して計算し、１つのＩＣ５０を両方のトランスフェクションからのデータに対してフィットさせた。
【０３９８】
本発明の様々なモチーフ修飾を有する例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の遺伝子サイレンシングの結果が、以下の表に示されている。
【０３９９】
実施例２．ＲＮＡ合成および二重鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成：
全てのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機またはＡＢＩ  ３９４合成機で合成した。特段の記載がない限り、オリゴヌクレオチドの合成には、市販の制御された孔を有するガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｌ）−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。２’−Ｆ  ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。全てのホスホラミダイトは、１０％  ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で使用した。１６分のカップリング／リサイクリング時間を使用した。活性化物質は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）に溶解したＰＡＤＳ（２％）を使用した。
【０４００】
リガンドコンジュゲート鎖を、対応するリガンドを含む固体支持体を用いて合成した。例えば、配列の３’末端の糖質部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ用）の導入は、対応する糖質固体支持体で合成を開始することによって達成した。同様に、３’末端のコレステロール部分を、コレステロール支持体で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分は、前述の実施例で説明されたものから選択されるテザーを介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールに連結してヒドロキシプロリノール−リガンド部分を得た。次いで、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を、コハク酸リンカーを介して固体支持体に結合する、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホラミダイトに変換して、所望の糖質コンジュゲート構成要素を得た。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した対応するホスホラミダイトまたは固体支持体で合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー支持体を、３８．６μｍｏｌ／グラムの付加（ｌｏａｄｉｎｇ）で社内で作製した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー支持体も、４２．０μｍｏｌ／グラムの付加で社内で作製した。
【０４０１】
所望の位置、例えば、配列の５’末端での、選択されたリガンドのコンジュゲーションは、特段の記載がない限り、標準的なホスホラミダイト結合条件下で、対応するホスホラミダイトを成長中の鎖に結合させることによって達成した。固体結合オリゴヌクレオチドに対する、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化物質の存在下での無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍのホスホラミダイト溶液の１５分間の長時間の結合を行った。（１）に報告されているように標準的なヨウ素水を用いて、または１０分の酸化待ち時間でコンジュゲートオリゴヌクレオチドをｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いる処理によって、ヌクレオチド間亜リン酸塩のリン酸塩への酸化を行った。ホスホロチオエートは、硫黄転移試薬、例えば、ＤＤＴＴ（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、およびまたはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて、亜リン酸塩からホスホロチオエートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、社内で合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの結合時間は１６分とした。
【０４０２】
２．脱保護−Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成の完了後、支持体を１００ｍｌガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物を用いて、５５℃で６．５時間、塩基とリン酸基を脱保護すると同時にオリゴヌクレオチドを支持体から切断した。ボトルを氷上で短時間冷却し、次いで、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）で洗浄した。次いで、混合物の容量をロトバップで約３０ｍＬにまで減らした。次いで、この混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックにより真空下で乾燥させた。
【０４０３】
３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍｌのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）、またはピリジン−ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、反応を５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調整し、精製までフリーザーで保存した。
【０４０４】
４．分析
オリゴヌクレオチドは、精製の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、緩衝液とカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートしたリガンドの性質によって決まる。
【０４０５】
５．ＨＰＬＣの精製
リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。非コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、社内で充填されたＴＳＫゲルカラム上のアニオン−交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１０％ＣＨ３ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）とした。完全長オリゴヌクレオチドを含む分画をプールし、脱塩し、そして凍結乾燥させた。ＯＤが約０．１５の脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μｌになるまで水で希釈し、次いで、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアルにピペットで移した。最後に、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析した。
【０４０６】
６．ｓｉＲＮＡの調製
ｓｉＲＮＡの調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと冷却して室温にした。二重鎖の完全性をＨＰＬＣ分析によって確認した。
【０４０７】
実施例３：ＡＮＧＰＴＬ３  ｓｉＲＮＡに対する様々な化学修飾を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏサイレンシング活性
細胞培養およびトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の大気で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によりプレートから剥離させた。１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）を、９６ウェルプレートの５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖が入っている各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクションを行った。約２×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、２４時間または１２０時間インキュベートしてから、ＲＮＡを精製した。特段の記載がない限り、単回投与実験は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験は、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０００５ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００００５ｎＭ、および０．００００１ｎＭの最終二重鎖濃度で行った。
【０４０８】
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１回の反応に付き、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏを含むマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて次のステップ：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃に保持によって作製した。
【０４０９】
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルのマスターミックス（０．５μｌのＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＡＮＧＰＴＬ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃Ｈｓ００２０５５８１＿ｍ１）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含む）に添加した。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてＡＢＩ  ７９００ＨＴ  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。要約表に特段の記載がない限り、各二重鎖を２つの別個のトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
【０４１０】
相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを使用する４パラメータフィットモデルを用いて計算し、同じ用量範囲もしくはそれ自体の最低用量に対してＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または未処置細胞に対して正規化した。負のコントロールとして使用されるＡＤ−１９５５配列は、ルシフェラーゼを標的とし、以下の配列を有する：
センス鎖：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ；
アンチセンス鎖：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ。
【０４１１】
上記の様々な実施形態を組み合わせて別の実施形態を作成することができる。本明細書で言及される全ての米国特許、公開米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられるものとする。様々な特許、特許出願、および公開特許出願の概念を利用してなお別の実施形態を作成する必要がある場合は、実施形態の態様を変更することができる。
【０４１２】
上記の詳細な説明を鑑みて、これらおよび他の変更を実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される語は、以下の特許請求の範囲を本明細書および添付の特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきものではなく、このような特許請求の範囲に付与される等価物の全範囲における全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。
【０４１３】
実施例４：ｓｉＲＮＡの化学修飾および修飾ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏサイレンシング
センス鎖の設計
リガンドの設計およびコンジュゲーション部位
センス鎖を、親化合物と同様に３’位置でＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートした。
【０４１４】
センス鎖の１１位
推定切断部位におけるセンス鎖の１１位（センス鎖が２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が２３ヌクレオチド長である場合は、ＡＳの１１位の反対側）を、ヌクレアーゼ感受性修飾（例えば、ＤＮＡ）で修飾した。多数の異なるコンジュゲートについての統計分析によるデータは、この位置の重要性を示唆している。
【０４１５】
センス３’領域（１６位〜１８位）の熱不安定化
この領域は、熱不安定化修飾、例えば、ＧＮＡまたは反対側のＡＳ鎖に対するミスマッチで修飾された。１６位または１７位の修飾が、最も影響が大きいようである。図１および表１は、この位置／領域およびｉｎ  ｉｔｒｏ有効性に対する熱不安定化の影響を強調している。親鋳型設計に相当する有効なノックダウンを、ＧＮＡまたは他の熱不安定化修飾、例えば、脱塩基（Ｙ３４）またはアンチセンス鎖に対するミスマッチで得た。他方、サイレンシングの低下は、２’−ＯＭｅ修飾、または反対側のＡＳ鎖に相補的なＤＮＡ修飾で一般に観察された。
【０４１６】
【表１】
2017525705.tif 000034
【０４１７】
【化３３】
2017525705.tif 000035
【０４１８】
図２および表２は、３’領域（１６位〜１８位）における熱不安定化修飾ＧＮＡの位置による影響を示した。この結果は、１６位および１７位のＧＮＡ修飾は、親設計と同様に優れた有効性を示したが、１８位のＧＮＡは活性の低下を示したことを示している。
【０４１９】
【表２】
2017525705.tif 000036
【０４２０】
【表３】
2017525705.tif 000037
【０４２１】
アンチセンス鎖の設計
ＡＳの２位
この位置は、２’−ＯＭｅを含む立体的要求の高い２’−修飾による影響を受けるＡＳ鎖における位置の移動および大きいコンジュゲートのデータセットの統計分析によって特定した。しかしながら、本発明者らは、ＤＮＡ、場合によってはＲＮＡを含むいくつかの修飾、および２’位置に立体的嵩高さをもたらさない他の修飾が、非Ｆ設計の文脈で十分に許容され得ることを見出した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイレンシング研究による結果が、図３および表３に要約され、２位におけるＤＮＡおよびＲＮＡは一般に、親鋳型の設計と同様に非Ｆ設計の活性を維持するが、２’−ＯＭｅは一般に、十分には許容されず、活性の低下をもたらすことを示唆している。
【０４２２】
ＡＳの１４位
この位置は、２’−ＯＭｅを含む立体的要求の高い２’−修飾による影響を受けるＡＳ鎖における位置の移動および大きいコンジュゲートのデータセットの統計分析によって特定した。しかしながら、ＤＮＡ、場合によってはＲＮＡを含むいくつかの修飾、および２’位置に立体的嵩高さをもたらさない他の修飾が、非Ｆ設計の文脈で十分に許容され得ることが見出された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイレンシング研究による結果が、図４および表４に要約され、１４位におけるＤＮＡおよびＲＮＡは一般に、親鋳型の設計と同様に非Ｆ設計の活性を維持するが、２’−ＯＭｅは一般に、十分には許容されず、活性の低下をもたらすことを示唆している。
【０４２３】
【表４】
2017525705.tif 000038
【０４２４】
【表５】
2017525705.tif 000039
【０４２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
ｍＴＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ
動物（ｎ＝３／群）に、２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを単回投与し、ＦＶＩＩ血清タンパク質レベルを、投与前、投与の４日後、７日後、１３日後、２２日後、２９日後、および３６日後に測定した。図５は、親化合物ＡＤ−５７７２７と比較した、２つの非Ｆ  ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−６１３９８および６４２７３についてのＦＶＩＩタンパク質の濃度−時間プロフィールを示している。図６では、親化合物と比較した、３つの異なる投与レベルでの２つの非Ｆ  ｓｉＲＮＡについての、投与から９６時間後のｍＴＴＲタンパク質の減少が示されている。図７では、４２日までの繰り返し−投与計画（１ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ）（合計６回の投与）についての、ｍＴＴＲ血清タンパク質の減少のプロフィールが示されている。
【０４２６】
全体として、これらの研究は、非Ｆ  ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−６１３９８およびＡＤ−６４２７３３が、親鋳型の設計と同様のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および効力を示したことを示唆している。
【０４２７】
ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｓｉ  ＲＮＡ
【０４２８】
【表６】
2017525705.tif 000040
【０４２９】
これの結果は、修飾の正確な位置およびセンス鎖とＡＳ鎖との組み合わせによって非Ｆ設計のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が異なることを示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、非Ｆ化合物が、親化合物と同様の効力／有効性を有していたと示唆するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで最も活性が高いことが分かっている非Ｆ化合物ＡＤ−６４６０４はなお、親ＡＤ−６０９４０よりも有効性が著しく低かった（図８を参照）。
【０４３０】
非Ｆ設計のさらなる改善を行って、表７に要約されているように評価した。図９は、３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与の７日後の肝臓でのＴＭＰＲＳＳ６のｍＲＮＡのサイレンシングを示している。
【０４３１】
【表７】
2017525705.tif 000041
【０４３２】
図９に示されているように、改善により、親（ＡＤ−６０９４０）に相当するｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有する少なくとも１つの非Ｆ化合物（ＡＤ−６５１０５）が得られた。この化合物は、６位および１１位にＤＮＡを有するセンス鎖、ならびに２位にＲＮＡ、１０位および１４位にＤＮＡを有するアンチセンス鎖を含む。
【０４３３】
モチーフの設計
モチーフを設計する場合は、親化合物に使用される同じ手順を用いて、センス鎖を、３’位置のＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートした。本発明の実施形態に従って追加のモチーフを設計した。代表的な配列が表８に列記されている。
【０４３４】
【表８】
2017525705.tif 000042
【０４３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果
図１０に示されているように、３つの標的、２つのモチーフ、即ち、モチーフ１（センス鎖およびアンチセンス鎖に６つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾；センス鎖の５’末端からのセンス鎖の７位および９位〜１１位における４つの２’−Ｆ修飾、ならびにアンチセンス鎖の５’末端からのアンチセンス鎖の２位、６位、１４位、および１６位における４つの２’−Ｆ修飾）およびモチーフ２（センス鎖およびアンチセンス鎖に６つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾；センス鎖の５’末端からのセンス鎖の７位および９位〜１１位における４つの２’−Ｆ修飾、ならびにアンチセンス鎖の５’末端からのアンチセンス鎖の２位、６位、８位〜９位、１４位、および１６位における６つの２’−Ｆ修飾）を表す１０全ての配列が、親化合物ＡＤ−５７７２７と比較して活性に統計的に有意な改善を有することが分かった。
【０４３６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価
ｓｉＲＮＡの標的サイレンシングをｑＰＣＲによって評価した。ｍＴＴＲを標的とするモチーフの能力を評価した。動物（ｎ＝３／群）に、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを単回投与し、図１１に示されているように、まず投与前、そして７日後および２２日後に肝臓のレベルを評価した。
【０４３７】
図１２は、安定性強化コンジュゲート化学（ＳＥＣ−Ｃ）での活性の強化を示し、投与の７日後に肝臓を活性（ｍＲＮＡ）について評価した。動物に、３ｍｇ／ｋｇを単回（ＳＣ）投与した。データは、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対するモチーフの影響を実証している。
【０４３８】
図１３は、投与の７日後に評価されたデータを用いて親化合物と比較した、新たなモチーフ（モチーフ１および２）での活性の改善（約４倍の活性の改善）を示している。このデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対するモチーフの影響を実証している。数倍の改善は、全ての配列で一貫している。
【０４３９】
図１４は、３つ全ての配列での期間の著しい改善を示し、これは、新たなモチーフが期間の向上をもたらすことを実証している。
【０４４０】
図１５は、ｈＡＡＶ  １×１０１１ＧＣ／マウス、３ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与でのＡｐｏＣ３−ＧａｌＮＡｃ３  ＳＡＲの結果を示している。
【０４４１】
実施例５：アンチセンス鎖の５’末端でのＶＰおよびＰＳ２修飾
以下に、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）を含むオリゴヌクレオチドの合成、およびオリゴヌクレオチドの５’末端のホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合によって連結された２’−デオキシチミジンを含むオリゴヌクレオチドの合成の例示的なプロトコルが説明される。当業者であれば、これらの同じまたは類似の技術を使用して類似のオリゴヌクレオチドを合成できることを理解されよう。当業者に公知の他の合成技術を使用しても、これらおよび類似のオリゴヌクレオチドおよび修飾を合成および調製することができ、このような合成技術としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｗｈｉｔｔａｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐ−ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｐ−Ｃ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，”  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４９：６９８４−８７  （２００８）；Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ５’−Ｄｅｏｘｙ−５’−ｍｅｔｈｙｌｉｄｙｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７（３５）：６２３９−４２  （１９９６）；および米国特許出願公開第２０１３／００８４５７６号明細書に開示されている合成技術が挙げられる。
【０４４２】
５’−ビニルホスホネートを含むオリゴヌクレオチドの合成のプロトコル
ピバロイルオキシメチル−（ＰＯＭ）−保護ＶＰの導入
【化３４】
2017525705.tif 000043
カップリングおよび酸化：アミダイトのカップリングを、活性化のためのアセトニトリル中、０．２５Ｍ  ５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールを用いて標準的な合成条件下で行った。３−（ジメチルアミノメチレン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）のいずれかを用いる標準的なチオレーションプロトコルを行って、ホスファイトトリエステルをホスホロチオエート結合に変換した。ビニルホスホネート構成要素が、５’位置にＤＭＴ保護基を含まないため、最終脱トリチルステップを省いた。
【０４４３】
脱保護および切断：合成後に、ビニルホスホネート含有オリゴヌクレオチドを、６０℃で５時間または３５℃で１６時間、１〜２．５％のメチルアミン溶液４０体積％が添加された、水性ＮＨ３およびＥｔＯＨの３：１混合物中で脱保護した。
【０４４４】
エチル保護ＶＰの導入
【化３５】
2017525705.tif 000044
カップリングおよび酸化：アミダイトのカップリングを、活性化のためのアセトニトリル中、０．２５Ｍ  ５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールを用いて標準的な合成条件下で行った。３−（ジメチルアミノメチレン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）のいずれかを用いる標準的なチオレーションプロトコルを行って、ホスファイトトリエステルを酸化し、ホスホロチオエート結合を誘導した。ビニルホスホネート構成要素が、５’位置にＤＭＴ保護基を含まないため、最終脱トリチルステップを省いた。
【０４４５】
脱保護および切断：アセトニトリル（ＡＣＮ）およびピリジン（Ｐｙｒ）５０：１（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、３×１０−８ｃｍ（３オングストローム）の分子篩を添加してこの混合物物を可能な限り乾燥させた。この混合物に、ＡＣＮ／Ｐｙｒ溶液１３５ｍＬごとに３．５ｍＬ（５ｇ）のヨードトリメチルシラン（ＴＭＳＩ）を添加した。この溶液は、新しく調製しなければならず、その最大保存可能期間は１日である。次に、１：１（ｖ／ｖ）のアセトニトリル−トリエチルアミン中、０．５Ｍ  メルカプトエタノール溶液を調製し、３×１０−８ｃｍ（３オングストローム）の分子篩を添加した。５’−ＶＰ含有オリゴヌクレオチドが合成カラム内の樹脂上にある状態で、ＴＭＳＩ溶液を約５〜１０ＣＶでゆっくりと添加し、１５分間反応させた。このステップを２回繰り返し、総曝露時間を約４５分とした。続いて、樹脂をＡＣＮで広範囲に洗浄し、次いでカラムに対して約５〜１０カラム体積のメルカプトエタノール溶液を流し、１０分間反応させた。このステップを１回繰り返し、総曝露時間を２０分とした。ＡＣＮでの別の広範囲な洗浄の後に、支持体結合オリゴヌクレオチドを、標準的な条件を用いて脱保護し、支持体から切断した。
【０４４６】
オリゴヌクレオチドの５’末端のホスホロジチオエート結合によって連結された２’−デオキシチミジンを含むオリゴヌクレオチドの合成のプロトコル
【化３６】
2017525705.tif 000045
カップリングおよび酸化：ホスホラミダイト溶液を、０．１５Ｍ濃度の乾燥アセトニトリル中、製造者のプロトコルに従って市販のｄＴ−チオホスホロラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から調製した。カップリングを、アセトニトリル中、０．２５Ｍ  ５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールを用いて標準的な合成条件下で、１７分間の総カップリング時間に亘って行った。キャッピングステップを、この合成サイクルから省いた。試薬の送達および反応時間を３×１０分に延長することによって、３−（ジメチルアミノメチレン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）を用いて酸化（チオレーション）を行った。最終脱トリチルステップを、標準的な合成条件を用いて行った。
【０４４７】
脱保護および切断：（カラム上の）固体支持体を、ＡＣＮ中、０．５Ｍ  ピペリジンで洗浄してから（２×１５分の曝露時間）、樹脂を適切な容器に移して標準的な条件下で処置し（例えば、３：１の水性ＮＨ：ＥｔＯＨ溶液、６０℃で５時間または３５℃で１６時間）、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、脱保護した。
【０４４８】
オリゴヌクレオチド合成プロセスの残りの手順は、実施例２に記載の手順に類似している。
【０４４９】
図１６は、Ａｇｏ２が付加されたｓｉＲＮＡの模式図を例示している。一般に、５’−リン酸機能化ｓｉＲＮＡ（ＥＳＣ化学）は、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す。例えば、試験した約８０％の配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされると改善された固有の効力を示し、そして約３０％が、約１０倍のＩＣ５０効果を示している。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、５’−リン酸は、エンド／リソーム区画（ｌｙｓｏｍｅ  ｃｏｍｐａｔｍｅｎｔ）で急激に消失する。安定したリン酸を模倣した修飾リン酸、５’−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）も、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に付加されて図１６に示されている。このホスホネートは、Ｍｅｒｃｋによって最初に設計された。
【０４５０】
本発明の一実施形態は、効力の改善のための５’末端修飾（ＲＩＳＣ付加）に関する。この末端修飾は、安定したリン酸模倣体を提供し、内因性リン酸化を促進する。
【０４５１】
図１７は、４つの異なるＡｐｏＢ配列の評価に基づいて、５’−ＶＰの存在が、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をどのように改善するかを示すチャートを示している。３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与の７日後のＬＤＬレベルを、（５’−ＶＰ修飾を含むまたは含まない）４つのコンジュゲートについて分析した。チャートから分かるように、ＥＤ５０の３倍の改善が、特定のＡｐｏＲ配列で見られる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの利点が、ＡｐｏＣ３、Ｔｍｐｒｓｓｒ６、およびＴＴＲを含む追加の化合物／標的で確認された。ＡｐｏＢ配列は、表９に列記されている。
【０４５２】
【表９】
2017525705.tif 000046
【０４５３】
図１８は、内因性リン酸化を促進する、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）およびメチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）を含む、ＰＳ結合を置換することができる異なる化学修飾を示している。修飾ｓｉＲＮＡは、恐らくＡＳ鎖の第１のヌクレオチドにおける２’ＯＭｅ修飾による干渉のために、一般にＣｌｐ１キナーゼにとって良好な基質ではない。しかしながら、２’−ＯＭｅ修飾は、ホスホロチオエート結合と共に、エキソヌクレアーゼ保護に望ましい。２’−ＯＭｅ修飾の、例えば２’Ｆでの置換、およびＰＳ結合の修飾は、代謝安定性を維持したままエキソヌクレアーゼ保護を促進することができる。
【０４５４】
図１９は、２’−ＯＭｅ−ＭｅＰｈｏｓ、２’−ＯＭｅ−ＰＳ、ｄＮ（ＰＳ２）、および２’Ｆ−ＰＳを含む末端修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価のチャートを示している。チャートに示されているように、ｄｎ（ＰＳ２）結合および２’Ｆ−ＰＳは、親（２’ＯＭｅ−ＰＳ）に対して改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示した。特に、ｄｎ（ＰＳ）２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトリトソーム（ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）アッセイで安定していたが、２’Ｆ−ＰＳは、代謝障害（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を示した。１０ｎＭおよび０．１ｎＭ（ｎ＝４）でのマウス初代肝細胞のトランスフェクションを、２つのＡｐｏＢコンジュゲートに対して行った。
【０４５５】
図２０は、アンチセンス５’末端の僅かな変化が、どのようにｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を著しく改善できるかを示す２つのチャートを示している。図２０Ａは、アンチセンス鎖の１位にある２’Ｆ−ＰＳが、５’Ｐ依存性配列の活性を改善することができることを示し、図２０Ｂは、５’−ＶＰと同様に、親に対して、ｄＮ（ＰＳ）２によって約３倍改善された効力を示している。
【０４５６】
実施例６：５’−ＶＰ修飾およびｓｉＲＮＡ活性に対する評価
ピバロキシメチル保護基を用いた５’ビニルホスホネートホスホラミダイトの合成：
【化３７】
2017525705.tif 000047
スキーム１の試薬および反応条件：（ａ）Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン、ＤＣＭ、０℃；（ｂ）ＮａＨ、テトラ（ピバロイルオキシメチル）ビスホスホネート、ＴＨＦ、−７８℃、続いて０℃で撹拌、７０％（ＥおよびＺ異性体）（ｃ）ギ酸：水、１：１、２４時間、シリカカラムクロマトグラフィーによって、またはＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）によって分離されたＥおよびＺ異性体；（ｄ）２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール、ＡＣＮ、６時間、室温、６５％。
【０４５７】
テトラ（ピバロイルオキシメチル）−ビス−ホスホネート（Ｘ）の合成
【化３８】
2017525705.tif 000048
テトラメチルメチレンビスホスホネート（１２０ｇ、０．５１ｍｏｌ）、ＮａＩ（３０８ｇ、２ｍｏｌ）、クロロメチルピバレート（３８７ｇ、２．５ｍｏｌ）、およびアセトニトリル（４００ｍｌ）を混合して、一晩潅流させた。５％メタノールを含むＥｔＯＡｃ中でのＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、生成物の生成を確認した。反応混合物をエーテル（１０００ｍｌ）で希釈し、水（２×１０００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ３で乾燥させ、そして蒸発させた。固形残留物を冷ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させて淡黄色固体として１４８ｇ（４５％）のＸを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ３）：δ  ５．７３−５．６３（ｍ，８Ｈ），２．６５（ｔ，２Ｈ），１．２２（ｓ，３６Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ３）：δ  １８．６１．
【０４５８】
化合物２の調製
【化３９】
2017525705.tif 000049
１５０ｍＬの無水ジクロロメタン中、化合物１（３．０ｇ、８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（ＤＭＰ）（１．４当量；４．７ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間、次いで室温で３時間撹拌した。ＴＬＣにより、生成物の生成を確認した。次いで、反応混合物を１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３と飽和ＮａＨＣＯ３（１：１）の２００ｍｌの溶液に添加し、続いて２００ｍｌの酢酸エチルを添加した。粗アルデヒドを酢酸エチルで抽出し、減圧下で乾燥させて濃縮した。この粗アルデヒドは、一切の精製なしで次のステップで使用した。
【０４５９】
収率＝２．８７ｇｍ（９７％）；ＮＭＲにより約７０％の純度；ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ３７１。
【０４６０】
化合物３の調製
【化４０】
2017525705.tif 000050
テトラポリオキソメタレート（ＰＯＭ）−ビスホスホネートナトリウム塩の溶液を、１４ｍｌのＴＨＦ中、ビスホスホネート（Ｘ）（１２．６ｇｍ、２０ｍｍｏｌ）を−７８℃の２０ｍＬのＴＨＦ中のＮａＨ（０．５８ｇ、２４ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加して１５分間撹拌することによって調製した。
【０４６１】
４０ｍＬの無水ＴＨＦ中、アルデヒド２（２．８６ｇ）の溶液を、上記のように調製された−７８℃のＰＯＭ−ビスホスホネートナトリウム塩溶液に滴加した。反応混合物を、−７８℃で１時間撹拌し、次の１時間は０℃で撹拌し、そして室温でさらに１時間撹拌した。ＴＬＣにより、生成物（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン  ７：３）の生成を確認した。粗反応混合物を３００ｍｌの飽和塩化アンモニウムに添加し、３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、ＥｔＯＡｃ＝２０〜１００％）によって精製し、７２％の収率で、Ｅ／Ｚ異性体（８８／１２）の混合物として化合物３（４．０ｇ）を得た。
【０４６２】
化合物４の調製
【化４１】
2017525705.tif 000051
２００ｍＬのＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ：ｖ）中、３（４ｇ、５．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣにより、生成物（ＭｅＯＨ：ＣＨ２ＣＬ２＝５：９５）の生成を確認した。
【０４６３】
この溶液を、減圧下で濃縮し、残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した（ＭｅＯＨ：ＣＨ２ＣＬ２＝７：９３、ｖ：ｖ）。画分をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、緩液Ａ＝水中、０．０５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中、０．０５％ＴＦＡ；２５分間の勾配５〜９５％）で試験して、２つの異性体（ＥおよびＺ異性体）の純度を確認した：Ｅ異性体は、１４．１分で溶出し、Ｚ異性体は１４．９分で溶出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーからの最初の画分は、ＥおよびＺ異性体を含み、残りの画分は、Ｅ異性体であった。ＥおよびＺ異性体の混合物を含む画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。４−Ｅ異性体２．３ｇが得られ、７１％の収率であった。
【０４６４】
Ｅ異性体：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  ８．９８（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝２３．７，１７．２，５．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝２１．６，１７．１，１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７７（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５７（ｍ，５Ｈ），４．３２（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝５．５，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１８Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  １８．２９．
【０４６５】
Ｚ異性体：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  ９．５０（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄｄ，Ｊ＝５４．４，１３．３，８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．８，１３．３，１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６９−５．５８（ｍ，５Ｈ），５．２２（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝７．１，５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝５．３，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１８Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  １８．７５．
【０４６６】
化合物５の調製
【化４２】
2017525705.tif 000052
ＡＣＮ（４０ｍＬ）中、化合物４−Ｅ異性体（２．１ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）とエチルチオテトラゾール（０．４６ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．３１１ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（０．１５％ＴＥＡ中、２：８）中でのＴＬＣにより、生成物の生成を確認した。反応混合物を、濾過し、濃縮し、そしてシリカカラムにロードした。サンプルを、ＴＥＡ（０．１５％）を含むヘキサン中、２０％〜１００％ＥｔＯＡｃで溶出して、白い泡として化合物５を得た（１．７５ｇ、６２％）。
【０４６７】
Ｅ異性体：
．２０（ｍ，１Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），２．７３−２．６４（ｍ，２Ｈ），２．１４（ｓ，１Ｈ），１．２４−１．１４（ｍ，３０Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  １５１．７９（ｄ，Ｊ＝７１．３Ｈｚ），１８．０７（ｄ，Ｊ＝５４．０Ｈｚ）．
【０４６８】
Ｚ異性体：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  ９．０２（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄｄｄｄ，Ｊ＝５３．７，１３．１，９．７，７．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄｄ，Ｊ＝７．０，３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．７０−５．５２（ｍ，５Ｈ），５．４１（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０６−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９３−３．５６（ｍ，４Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｍ，２Ｈ），２．１４（ｓ，１Ｈ），１．３３−１．１１（ｍ，３０Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）：δ  １５０．８１（ｄ，Ｊ＝１４１．４Ｈｚ），１５．１７．
【０４６９】
５’−ビニルホスホネートを含むオリゴヌクレオチドの合成のプロトコル
ビニルホスホネート単量体および５’−ＶＰ修飾オリゴヌクレオチドの合成を、文献（参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎらに付与された国際公開第２００８／１００４４７号パンフレット；Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ，”  Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４  （２０１２）；Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３：２９９３−３０１１  （２０１５））の手順と同様に行った。簡単に述べると、５’−リン酸は、エチルエーテルによって保護され、次いでこのエチルエーテルによって保護されたリン酸に、２段階の脱保護を行う：（１）無水条件下での固体支持体上のＴＭＳ−Ｉ、および（２）５’−ＶＰ修飾オリゴヌクレオチドを得るための標準的なオリゴヌクレオチド脱保護。このプロセスは、実施例５にも記載されている。
【０４７０】
ｓｉＲＮＡ活性に対する代謝安定性（Ｅ−）および（Ｚ−）５’−ビニルホスホネートの影響
５’−リン酸化アンチセンス鎖を有する二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への効率的な付加を促進して、強いＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを誘発する。従って、合成ｓｉＲＮＡのＣｌｐ１キナーゼによる内因性５’−リン酸化が、ＲＩＳＣ付加および鎖選択にとって極めて重要である（Ｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＲＮＡ  ｋｉｎａｓｅ  ｈＣｌｐ１  ｉｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ３’  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｅｘｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：２２２−２２６  （２００７））。代謝安定性結合を有するリン酸類似体を、抗ウイルス剤としてのヌクレオシド修飾（Ｃｈｅｎ  ｅｔらに付与された国際公開第２００８／１００４４７号パンフレット）、対応する非リン酸化ｓｉＲＮＡ、特に一本鎖ｓｉＲＮＡに対する遺伝子サイレンシング活性を改善するためのｓｉＲＮＡの５’末端修飾（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ，”  Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４  （２０１２）；Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３：２９９３−３０１１  （２０１５））に使用した。
【０４７１】
この実施例では、二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるリン酸類似体の影響を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で評価した。
【０４７２】
この実施例に使用されるｓｉＲＮＡ配列は、以下の表に示されている。
【０４７３】
【表１０】
2017525705.tif 000053
【０４７４】
【表１１】
2017525705.tif 000054
【０４７５】
Ｅ−およびＺ−ジオメトリを有する５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）の二本鎖ｓｉＲＮＡ活性に対する影響を比較した。この結果は、化学修飾されたｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、天然のリン酸を十分に模倣した５’−トランス−（Ｅ−）ＶＰで改善することができるが、５’−シス−（Ｚ−）ＶＰは、有効性の改善を示さなかったことを示し、Ｚ異性体が、天然のリン酸を十分に模倣していないことを示唆している。
【０４７６】
図２１Ａおよび図２１Ｂは、（アンチセンス鎖の５’末端における）５’−ＯＨ修飾を含むＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡと５’−Ｅ−ＶＰ修飾を含むＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較するＳＡＲ分析を示している。図２１Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションマウスの肝細胞での結果を示している。図２１Ｂは、単回投与（ＳＣ投与）の３日後のＬＤＬのレベルを示している。図２１Ｂの結果は、５’−Ｅ−ＶＰで修飾されたＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡが活性の改善を示したことを実証している。
【０４７７】
図２２は、ｍＴＴＲおよびＦ９  ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに対する５’−Ｅ−ＶＰ修飾と５’−Ｚ−ＶＰ修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の比較の結果を示している。この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションマウスの初代肝細胞から得た。図面に示されているように、５’−Ｅ−ＶＰで修飾されたｓｉＲＮＡコンジュゲートは、維持されたまたは改善された効力を示したが、５’−Ｚ−ＶＰで修飾されたｓｉＲＮＡコンジュゲートは、効力の低下を示した。
【０４７８】
図２３は、Ｆ９  ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに対する５’−Ｅ−ＶＰ修飾と５’−Ｚ−ＶＰ修飾のｉｎ  ｖｉｖｏ比較の結果を示している（単回ＳＣ投与）。この結果は、５’−Ｅ−ＶＰで修飾されたｓｉＲＮＡコンジュゲートは、５’−ＯＨ対照に対して改善された遺伝子サイレンシング活性を示したが、５’−Ｚ−ＶＰで修飾されたｓｉＲＮＡコンジュゲートは、５’−ＯＨ対照の活性と同様の活性を示したことを実証している。
【０４７９】
これらの図面の結果は、アンチセンス鎖の５’−リン酸化が、効率的なＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングに望ましいことを示している。化学修飾されたｓｉＲＮＡの効力は、天然のリン酸を十分に模倣した５’−トランス−ビニルホスホネート（５’−Ｅ−ＶＰ）で改善することができる。
【０４８０】
実施例７：５’−Ｃ−マロニル修飾およびｓｉＲＮＡ活性に対する評価
５’−Ｃ−マロニルヌクレオチドの合成およびｓｉＲＮＡの５’末端への組み込み
一般的な実験条件：全ての感湿反応は、アルゴン雰囲気下、無水条件で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、プレパックＲｅａｄｙＳｅｐ  Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯシリカゲルカラムを用いてＴｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  （Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）  Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈシステムで行った。エレクトロスプレーイオン化−高分解能質量分析（ＥＳＩ−ＨＲＭＳ）スペクトルを、ポジティブモード（毛細管＝３０００ｋＶ、コーン＝３５、源温度＝１２０℃、および脱溶媒和温度＝３５０℃）で直接フローインジェクションを用いてＷａｔｅｒｓ（ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）  Ｑ−Ｔｏｆ  ＡＰＩ−ＵＳ分光計で記録した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚ（１Ｈ）および１２６ＭＨｚ（１３Ｃ）で、Ｖａｒｉａｎ分光計（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）において室温で記録し、ｐｐｍ単位の化学シフトは、残留物溶媒ピークに対してであった。結合定数は、ヘルツで示された。信号分割パターンは、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、カルテット（ｑ）、広域信号（ｂｒ）、またはマルチプレット（ｍ）として表した。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、陽子分離モードで１６２ＭＨｚで記録され、化学シフトは、外部Ｈ３ＰＯ４（８０％）に対してであった。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳを、６０℃で、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）６１３０単一四重極ＬＣ／ＭＳシステムで行った。緩衝液Ａは、Ｈ２Ｏ中、１００ｍＭ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）および１６．３ｍＭ  トリエチルアミン（ＴＥＡ）からなり、緩衝液Ｂは、１００％メタノールとした。
【０４８１】
【化４３】
2017525705.tif 000055
スキーム２の試薬および条件：（ａ）塩化ベンジルオキシメチルアセタール（ＢＯＭ）、ＤＢＵ、ＤＭＦ、３０分、０℃、定量的（参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｐｕｒａｍｙｃｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  ７７：２１７−２２５  （２００９）；Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｐｕｒａｍｙｃｉｎ，”  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１１：２３９３−２３９６  （２００９））；（ｂ）ヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウム、ＤＭＦ、１５分間、室温、９２％；（ｃ）ナトリウムメトキシド、マロン酸ジメチル、１，２−ＤＭＥ、２４時間、還流、９２％；（ｄ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２雰囲気下、ｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（１０：１、ｖ／ｖ）、０．０５当量ギ酸、１２時間、室温、９８％（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ａｌｅｉｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｐｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＯＭ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｕｒｉｄｉｎｅ  ｕｒｅｉｄｏ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ，”  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．５３：３７５８−３７６２  （２０１２））；（ｅ）ＮＥｔ３−３ＨＦ、ＴＨＦ、ＴＨＦ、４８時間、室温、８８％；（ｄ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、１８時間、室温、５６＆；（ｇ）１Ｍ  水性ピペリジン、２４時間、室温；次いで、３０％水性アンモニア／エタノール（３：１、ｖ／ｖ）、３６時間、室温、定量的、Ｚ＋＝ピペリジニウム。
【０４８２】
Ｎ３−ベンジルオキシメチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（２）の合成
２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（１、２０ｇ、５３．７ｍｍｏｌ）を、既に報告された手順の変形に従って２（２６．５ｇ、定量的）に変換した。
【０４８３】
Ｎ３−ベンジルオキシメチル−５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（３）の合成
化合物２（１０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、２０ｇ（４０．６ｍｍｏｌ）のヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウムを添加した。この混合物を、室温で１５分間撹拌した。メタノール（２００ｍＬ）を反応に加え、この混合物をさらに１５分間撹拌した。溶媒を蒸発乾固し；残留物を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３の５％溶液で洗浄し、続いて水洗した。有機層を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして蒸発乾固した。粗残留物を、溶出液としてヘキサン中、０〜５０％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、白い泡として３（１１．２ｇ、９２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｍ，５Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８７  （ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５５（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｓ，３Ｈ），０．１２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６１．７，１５０．７，１４０．２，１３８．０，１２８．２，１２７．４，１２７．３，１０１．６，８７．９，８３．３，８０．８，７２．７，７１．０，７０．１，５７．６，２５．６，１７．７，６．２，−４．７，−４．８．
【０４８４】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ２４Ｈ３５ＩＮ２ＮａＯ６Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値は６２５．１２０７であり；実測値は：６２５．１２０５である。
【０４８５】
Ｎ３−ベンジルオキシメチル−５’−デオキシ−５’−Ｃ−（ジメチルマロニル）−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（４）の合成
ナトリウムメトキシド（２ｇ、３３ｍｍｏｌ）を、乾いた丸底フラスコに入れ、マロン酸ジメチル（１２ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）および無水１，２−ジメトキシエチレン（ＤＭＥ、１００ｍＬ）を添加し、この混合物を還流させた。化合物３（１０ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリルで２回共蒸発させた後に、７０ｍＬの無水ＤＭＥに溶解し、マロン酸ジメチルおよびナトリウムメトキシドの還流液に添加した。還流を２４時間続けた。この反応混合物を室温まで冷却し、メタノール（５０ｍＬ）を添加して反応を停止させた。溶媒および揮発性物質を真空中で蒸発させた。粗残留物を、溶出液としてヘキサン中、０〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、無色油として化合物４（９．２ｇ、９２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．６６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｍ，５Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．７６（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｍ，１Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），２．３７−２．０９（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，３Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６９．１，１６８．８，１６１．９，１５０．６，１４０．４，１３８．０，１２８．１，１２７．４，１２７．３，１０１．３，８８．６，８８．５，８１．３，８０．９，７３．１，７１．０，７０．０，５９．７，５７．５，５２．５，４８．０，３１．５，２５．６，１７．７，−４．７６，−５．０６．
【０４８６】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ２９Ｈ４２Ｎ２ＮａＯ１０Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値は６２９．２５０６であり；実測値は：６２９．２５０８である。
【０４８７】
５’−デオキシ−５’−Ｃ−（ジメチルマロニル）−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン（５）の合成
化合物４（８．７ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）を６６０ｍＬのイソプロパノール／水（１０：１、ｖ／ｖ）に溶解し、０．９ｇの１０％Ｐｄ／ｃを添加し、続いて２７ｍＬ（０．７ｍｍｏｌ）のギ酸を添加した。フラスコの空気を真空下で除去し；反応フラスコを、水素で流し、標準圧力の素雰囲気下、室温で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトによって濾過し、エタノールですすいだ。濾液を収集して、蒸発乾固した。粗残留物を、溶出液としてＤＣＭ中、０〜５％ＭｅＯＨを用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。適切な画分をプールし、蒸発乾固して白い泡として５（６．７ｇ、９８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３８（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），２．２４−２．０７（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６９．２，１６８．９，１６３．０，１５０．４，１４１．２，１４１．２，１０２．１，８７．７，８１．２，８０．９，７３．１，５７．５，５２．５，５２．４，５２．３，４８．０，３１．６，２５．６，１７．７，−４．８，−５．１．
【０４８８】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ２１Ｈ３４Ｎ２ＮａＯ９Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値は５０９．１９３１であり；実測値は：５０９．１９２９である。
【０４８９】
５’−デオキシ−５’−Ｃ−（ジメチルマロニル）−２’−Ｏ−メチルウリジン（６）の合成
化合物５（６．７ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の１５０ｍＬの無水ＴＨＦ中、トリエチルアミン−三フッ化水素（１１ｍＬ、２０２．５ｍｍｏｌ）と共に室温で４８時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させて、元の体積の３分の２にした。残留物を、溶出液としてＤＣＭ中、０〜１０％ＭｅＯＨを用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。適切な画分をプールし、蒸発乾固して白い泡として６（４．５ｇ、８８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３７（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．７２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｍ，１Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｍ，３Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），２．２５−２．０７（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６９．２，１６９．０，１６３．０，１５０．３，１４１．０，１０２．０，８７．４，８１．６，８０．８，７１．９，５７．６，５２．５，５２．４，４８．０，３１．９．
【０４９０】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ１５Ｈ２０Ｎ２ＮａＯ９（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値は３９５．１０６７であり；実測値は：３９５．１０７０である。
【０４９１】
５’−デオキシ−５’−Ｃ−（ジメチルマロニル）−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−Ｏ−（Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（７）の合成
化合物６（３．０ｇ、８ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリルで３回共蒸発させ、次いで真空下で、Ｐ２Ｏ５で一晩乾燥させた。乾燥残量物を、６０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解し；ジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．２ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。アルゴン雰囲気下での１時間の撹拌後、さらに１．０ｍＬ（４．０ｍｍｏｌ）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加し、撹拌をさらに１８時間続けた。反応混合物を、１５０ｍＬのＤＣＭで希釈し、２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして濾過によって除去した。溶媒を真空中で蒸発させ、粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。溶出液は、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ３（６６：３３：１、ｖ／ｖ／ｖからヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ３  ３３：６６：１、ｖ／ｖ／ｖへのステップグラジエント）とした。適切な画分をプールし、蒸発乾固し、無水アセトニトリルで共蒸発させ、そして高真空下で乾燥させて、白い泡として７（３．２ｇ、５６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオ異性体の混合物）：δ  ８．９７（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２３−３．８０（ｍ，４Ｈ），３．７７−３．５９（ｍ，８Ｈ），３．４５−３．４１（ｍ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．４４−２．３１（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．００（ｍ，１２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオ異性体の混合物）：δ  １５１．８，１５１．６．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ，ジアステレオ異性体の混合物）：δ  １７０．６，１７０．２，１６３．８，１５１．３，１４１．３，１１９．６，１０３．０，１０２．９，８９．６，８９．２，８２．９，８２．５，８２．４，８１．８，８１．３，８１．２，７５．３，７５．２，７５．１，７５．０，５９．８，５９．７，５９．３，５９．１，５８．９，５８．８，５３．３，５３．２，４９．５，４９．４，４４．２，４４．１５，４４．１，４４．０，３３．０，２５．０，２４．９，２４．８，２１．０，２０．９．
【０４９２】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ２４Ｈ３８Ｎ４Ｏ１０Ｐ（Ｍ＋Ｈ）＋に対する計算値は５７３．２３２６であり；実測値は：５７３．２３２１である。
【０４９３】
５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル−２’−Ｏ−メチルウリジン，ピペリジニウム塩（８）の合成
化合物６（０．１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、１Ｍ  水性ピペリジン（１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）と共に室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させて、残留物を、３０％アンモニア／エタノール（３：１、ｖ／ｖ）の混合物に溶解し、室温で３６時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させて、無色油として８（定量的）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．７５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，６Ｈ），２．２７−２．０６（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．５４（ｍ，８Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  １７９．５，１７９．２，１６８．０，１５３．０，１４２．５，１０３．１，８８．５，８３．７，８３．３，７２．７，５８．９，５５．９，４５．３，３４．７，２３．０，２２．２．
【０４９４】
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（Ｍ＋Ｈ）＋：Ｃ１３Ｈ１７Ｎ２Ｏ９に対する計算値は３４５．０９２９であり；実測値は：３４５．０９１９である。
【０４９５】
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ−３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置に付与された合成サイクルに基づいて修正合成サイクルを用いて該装置で合成した。アセトニトリル中、０．２５Ｍ  ５−（Ｓ−エチルチオ）−１Ｈ−ヘテロゾールの溶液を活性剤として使用した。ホスホロラミダイト溶液は、無水アセトニトリル中、０．１５Ｍとした。酸化剤は、ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ中、０．０２Ｍ  Ｉ２とした。ピリジン中、０．１Ｍ  Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−イル）メタンイミドアミド（ＤＤＴＴ）を硫化剤として使用した。脱トリチル化試薬は、ＤＣＭ中、３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）とした。５’−リン酸化合物の場合は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ化学リン酸化試薬（カタログ番号：１０−１９０２−０２）を、５’−一リン酸の導入のために使用した。自動合成の完了後、固体支持体を、アセトニトリル中、０．１Ｍ  ピペリジンで１０分間洗浄し、次いで無水アセトニトリルで洗浄し、そしてアルゴンで乾燥させた。次いで、オリゴヌクレオチドを、支持体から手動で分離し、３０％ＮＨ４ＯＨ／エタノール（３：１、ｖ／ｖ）の混合物を用いて５５℃で６時間、または４０％メチルアミン（０．５ｍＬ／μｍｏｌの固体支持体）を用いて６０℃で１５分間脱保護した。溶媒を濾過によって収集し、支持体をＤＭＳＯ（１．５ｍＬ／μｍｏｌの固体支持体）ですすいだ。
【０４９６】
５’−Ｃ−マロニル固体支持オリゴヌクレオチドをまず、１Ｍ  水性ピペリジン（１．５ｍＬ／μｍｏｌの固体支持体）で、室温で２４時間処置し、溶液を濾過し、そして蒸発乾固した。残留物を、３０％ＮＨ４ＯＨ／エタノール（３：１、ｖ／ｖ、２ｍＬ／μｍｏｌの固体支持体）の混合物物に溶解し、室温で３６時間振盪し、次いで蒸発乾固した。粗オリゴヌクレオチドを、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５／５０％（ｖ）アセトニトリル中、０．２２Ｍ〜０．４２Ｍ  ＮａＣｌＯ４のリニアグラジエントを用いて、室温で１２０〜１５０分間アニオン交換ＨＰＬＣによって精製した。全ての一本鎖を、８５％ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）の純度を超えるまで精製し、次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でカスタムパックされたＡＰ−２ガラスカラム（２０×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、滅菌ヌクレアーゼフリー水で溶出した。ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーションを、ｐＨ７．４、１×ＰＢＳ緩衝液中、２０μＭの最終濃度まで等モル量の相補鎖を混合し、そして９５℃で５分間水槽で加熱し、続いて室温まで冷却することによって行った。
【０４９７】
５’−Ｃ−マロニル修飾の遺伝子サイレンシング活性および安定性に対する評価
二本鎖ＲＮＡの５’−リン酸化は、ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングをもたらす、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体への効率的な付加に望ましい。内因性または外因性ｓｉＲＮＡは、一般に、細胞質キナーゼによって容易にリン酸化され、殆どの場合、合成５’−一リン酸の存在を必要としない。しかしながら、化学修飾されたｓｉＲＮＡの場合には、代謝安定性５’−リン酸模倣体は、より高い安定性、ＲＩＳＣ付加の増加、およびより強力な遺伝子サイレンシングをもたらし得る。
【０４９８】
この実施例では、固相合成を用いて化学修飾されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に修飾ヌクレオチドとして組み込まれた５’−Ｃ−マロニル部分の影響を評価した。５’−Ｃ−マロニルは、５’−一リン酸ジアニオンに類似した生理的ｐＨのジアニオンとして存在し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子サイレンシング活性、代謝安定性、およびアンチセンス鎖における５’−Ｃ−マロニル基を含むｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ付加を評価し、そして対応する５’−リン酸化および非リン酸化対応物と比較した。
【０４９９】
細胞培養およびトランスフェクション
マウス初代肝細胞を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入して、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加されたＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地で培養した。１ウェルに付き４．９μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３８４ウェルプレートの個々のウェルに望ましい濃度の５μＬの各ｓｉＲＮＡ二重鎖に添加することによってトランスフェクションを行った。混合物を、室温で２０分間インキュベートし、そして５，０００細胞を含む４０μＬの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡの単離の前に細胞を２４時間インキュベートした。同様の手順を、１０，０００，０００細胞のトランスフェクションのために続けた。２０ｎＭ〜７５ｐＭまたは５０ｎＭ〜１８７．５ｐＭの範囲の８つの６倍段階希釈を用いて用量反応実験を行った。
【０５００】
ＲＮＡの単離
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。細胞を、１ウェルに付き３μＬのビーズを含む７５μＬの溶解／結合緩衝液で溶解し、静電気シェーカーで１０分間混合した。緩衝液を、製造者のプロトコルに従って調製した。洗浄ステップは、磁気プレート支持体を用いてＢｉｏｔｅｋ  ＥＬ４０６で自動で行った。ビーズを、緩衝液Ａで１回（９０μＬ）、緩衝液Ｂで１回、そして緩衝液Ｅで２回洗浄し、これらの洗浄の間に吸引ステップを行った。
【０５０１】
ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成を、ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で達成した。反応１回あたり１μＬの１０×緩衝液、０．４μＬの２５×ｄＮＴＰ、１μＬのランダムプライマー、０．５μＬの逆転写酵素、０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および６．６μＬの水の混合物を各ウェルに加えた。プレートを密封し、静電気シェーカーで１０分間撹拌し、次いで３７℃で２時間インキュベートした。続いて、プレートを８０℃で８分間揺動した。
【０５０２】
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ）の１ウェルあたり０．５μＬのマウスＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４３０８３１３）、０．５μＬのマウスＡｐｏＢまたはＰＴＥＮ  ＴａｑＭａｎプローブ（それぞれ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：Ｍｍ０１５４５１５６＿ｍ１およびＭｍ０１２１２５３２＿ｍ１）、および５μＬのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）を含むマスターミックスにｃＤＮＡ（２μＬ）を添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲを行った。それぞれの二重鎖および濃度を、４つの生物学的レプリケートで試験した。相対的な倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭ  非特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞で行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０値を、ＸＬＦｉｔを用いる４−パラメーターフィットモデルを用いて計算した。
【０５０３】
【表１２】
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【０５０４】
トリトソーム（ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）安定性のアッセイ
ラット肝トリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、カスタム製品ＰＲ１４０４４）を室温で解凍し、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０で０．５単位／ｍＬに希釈した。サンプルを、微小遠心管内で１００μＬの０．５単位／ｍＬ  産生ホスファターゼトリトソームを２５μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡを混合することによって調製した。３７℃および３００ｒｍに設定されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒでの４時間または２４時間のインキュベーション後、３００μＬのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ溶解ローディング緩衝液および１２．５μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  内部標準ｓｉＲＮＡを各サンプルに加えた。時間０のサンプルを、１００μＬの０．５単位／ｍＬ  酸性ホスファターゼトリトソームを２５μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡサンプル、３００μＬのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ溶解ローディング緩衝液、および１２．５μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  内部標準ｓｉＲＮＡと混合することによって調製した。ｓｉＲＮＡを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｌａｒｉｔｙ  ＯＴＸ  Ｓｔａｒｔｅｒキットを用いて各時点（０時間、４時間、２４時間）のサンプルから抽出した。次いで、サンプルを、５００μＬのヌクレアーゼフリー水で再懸濁し、そして５０μＬのサンプルをＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０５０５】
ＲＩＳＣ免疫沈降およびＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ｓｉＲＮＡトランスフェクトマウス初代幹細胞（１０，０００，０００細胞）を、プロテーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ）で溶解した。溶解物の濃度を、タンパク質ＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。各反応で、２ｍｇの全溶解物を使用した。抗Ａｇｏ２抗体を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した（Ｃｌｏｎｅ番号：２Ｄ４）。対照マウスＩｇＧを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｓｃ−２０２５）から購入した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗体を沈降させた。Ａｇｏ２関連ｓｉＲＮＡおよび内因性ｍｉＲ１２２を、Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ  ＲＴによって測定し、続いて既に公表されている方法に基づいてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析を行った。
【０５０６】
５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルウリジン（ｍａｌｏｎｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）とヒトＡｇｏ２  ＭＩＤドメインとの間の相互作用の計算によるシミュレーション
ｈＡｇｏ２  ＭＩＤ（アミノ酸４３２−５７８；残基４４０−５７２が電子密度で分解されている）とＵＭＰ（ＰＤＢ  ＩＤコード３ＬＵＪ）との間および完全長ｈＡｇｏ２とｍｉＲ−２０ａ（ＰＤＢ  ＩＤコード  ４Ｆ３Ｔ）との間の複合体の有用な結晶構造の認識モードにより、５’末端リン酸の認識が非常に類似していることが明らかにされた。２つの構造間の差異は、完全長Ａｇｏ２との複合体では、ＰＩＷＩドメイン（Ａｒｇ−８１２）の残基が５’−リン酸の認識に寄与するという点だけである。従って、ＵＭＰ：ＭＩＤ複合体は、５’−マロニルウリジンとｈＡｇｏ２  ＭＩＤドメインとの間の相互作用のモデリングの基礎として使用された。ＵＭＰ：ＭＩＤ複合体の３次元座標を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）で検索した。プログラムＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ（バージョン１．５．３）を用いて、結晶構造の全ての水分子を削除し、そして５’−リン酸基を５’−Ｃ−マロニル部分に変換した。次いで、水素原子を付加し、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルウリジンのジオメトリおよびその向きならびにｈＡｇｏ２  ＭＩＤドメインの５’−リン酸ポケットにおけるＨ−結合／非結合総合作用を、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａで実施されたように、Ａｍｂｅｒ力場（標準的なアミノ酸および非標準的な残基それぞれのｆｆ１２ＳＢおよびＧａｓｔｅｉｇｅｒ電荷）で最適化した。
【０５０７】
図２４Ａ〜図２４Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＴＥＮサイレンシングアッセイにおけるマウス初代幹細胞での（Ａ）５’−ＯＨ、（Ｂ）５’−Ｃ−マロニル、および（Ｃ）５’−リン酸ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡについての用量反応曲線を示すグラフである。全ての値は、３連の実験から得た。
【０５０８】
図２５は、ラット肝トリトソームでインキュベートされた５’−ＯＨ、５’−Ｃ−マロニル、および５’−リン酸ｓｉＲＮＡの酵素安定性の結果を示している。ｓｉＲＮＡ標的配列が、表１０に示されている。これらのｓｉＲＮＡを、トリトソームの存在下、０．４ｍｇ／ｍＬ（約５ｍＭ）の濃度で４時間および２４時間のそれぞれでインキュベートした。完全長鎖のパーセントをＨＰＬＣによって決定した。データを、未処置対照に対して正規化した。
【０５０９】
図２６は、マウス初代幹細胞からのＡｇｏ２の免疫沈降によって、およびＡｇｏ２付加一本鎖のＲＴ−ＰＣＲ増幅によって決定された５’−ＯＨ、５’−Ｃ−マロニル、および５’−リン酸ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ付加（アンチセンス鎖における５’修飾）の結果を示している。内因性ｍｉＲ１２２のレベルを対照として決定した。ｓｉＲＮＡ標的配列は、表１０に示されている。ｓｉＲＮＡ７、８、および９を、１０ｎＭで細胞にトランスフェクトした。アンチセンス鎖のレベルは、ｎＭ  ｓｉＲＮＡ鎖／細胞溶解物１ｍｇで示されている。
【０５１０】
これらの図面の結果は、５’−Ｃ−マロニル  ｓｉＲＮＡが、対応する５’−リン酸化および非リン酸化対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子サイレンシング、高レベルのＡｇｏ２の付加を維持または改善し、かつｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に大幅に改善された代謝安定性を付与したことを示している。コンピューターによるモデリング研究により、ｈＡｇｏ２  ＭＩＤの５’−リン酸結合ポケット内への５’−Ｃ−マロニル基の有利な適合を示した。従って、５’−Ｃ−マロニル、代謝安定性５’−リン酸生物学的等価体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）が、治療用ｓｉＲＮＡの使用において優れた生体模倣性を有する。
【０５１１】
実施例８：トリアルキルアルミニウムまたはジアルキル亜鉛を用いる５’−Ｃ−アルキルヌクレオシドの立体選択的合成のプロセス
軽度のアルキル求核試薬の５’−ヌクレオシドアルデヒドへの付加による５’−Ｃ−アルキルヌクレオシドの合成のための一般的なスキーム
【化４４】
2017525705.tif 000057
Ｒ＝ＴＢＳ、任意の保護基、または任意の置換基
Ｘ＝Ｈ、Ｆ、ＯＭｅ、ＯＭＯＥ、ＯＮＭＡ、ＯＰＧ（ＰＧ−任意の保護基）、ＯＲ’’（Ｒ’’−任意のアルキル基）
Ｂ＝非保護または保護Ｕ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｇ、または任意の修飾核酸塩基
Ｒ’＝Ｍｅまたは任意のアルキル置換基
あるいは、ＡｌＲ’３またはＺｎＲ’２（上のスキーム２に記載されている）の代わりに、ＳｎＲ’４、ＴｉＲ’４、ならびにＬｉおよびＭｇを除く様々な他の金属を、この反応スキームにおけるＲ’基と共に使用することができる。
【０５１２】
スキーム３
無水−閉環（ａｎｈｙｄｒｏ−ｒｉｎｇ  ｃｌｏｓｕｒｅ）による５’−アルキルヌクレオシドのエピマーの立体特異的相互変換の一般的なスキーム
【化４５】
2017525705.tif 000058
Ｒ＝ＴＢＳ、任意の保護基、または任意の置換基
Ｘ＝Ｈ、Ｆ、ＯＭｅ、ＯＭＯＥ、ＯＮＭＡ、ＯＰＧ（ＰＧ−任意の保護基）、ＯＲ’’（Ｒ’’−任意のアルキル基）
Ｂ＝非保護または保護Ｕ、Ｔ、Ｃ、または任意の修飾ピリミジン核酸塩基
Ｒ’＝Ｍｅまたは任意のアルキル置換基
ＬＧ＝ＯＭ、ＯＴ、または任意の良好な脱離基
ＬＧＸ’＝ＭｓＣｌ、ＴｓＣｌ、または任意の強酸性クロロ無水物（ｓｔｒｏｎｇ  ａｃｉｄ  ｃｈｏｒｏａｎｈｙｄｒｉｄｅ）もしくは無水物
塩基＝ＤＢＵまたは任意の塩基試薬
溶媒＝ＴＨＦ、ジオキサン、または任意の水混和性有機溶媒
【０５１３】
スキーム４
Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンを用いるピリミジン５’−アルデヒド２ａ〜ｄの合成
【化４６】
2017525705.tif 000059
【０５１４】
５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−５’−オキソ−ウリジン２ａ。Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（４０．７ｇ、９６ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、無水ＤＣＭ（６００ｍＬ）中、３’−ＯＴＢＳ保護ウリジン１ａ（２９．８ｇ、８０ｍｍｏｌ）の撹拌冷却（０℃）溶液に添加した。冷却槽を取り除き、混合物を室温で４時間撹拌し、その後は、ＴＬＣでは原料アルコール１ａを観察できなかった。この混合物を０℃に冷却し、チオ硫酸ナトリウムの１０％溶液（２５０ｍＬ）と重炭酸ナトリウムの飽和溶液（３５０ｍＬ）の激しく撹拌された混合物に注いだ。室温で４５分間の撹拌後に、かなりの沈殿が生じた。この沈殿物を濾過し、固体をＤＣＭ（２００ｍＬ×２）で洗浄した。濾液を分液漏斗に入れ、有機層を分離して、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過漏斗からの固体を、エルレンマイヤーフラスコに移して、アセトン（４５０ｍＬ）を添加し、この懸濁的を１５分間撹拌し、濾過し、そして固体をアセトン（２００ｍＬ×２）で洗浄した。アセトン抽出物を蒸発させ、残留物をＤＣＭ抽出物と混合し、溶媒を蒸発させ、残留物をＡＣＮ−アセトン１：１混合物（２００ｍＬ）に溶解し、溶媒を再び蒸発させ、そして固形残留物を真空中で乾燥させて粗アルデヒド２ａ  ２７．６ｇ（９３％）を得た。アルデヒド含有量約７１％（ＡＣＮ−ｄ３中、Ｈ１  ＮＭＲのＣＨＯ／ＮＨ比で決定される）を、さらなる精製なしで次のステップで使用した。生成物を、アルゴン雰囲気下、−２０℃で、目立った分解なしで保存することができた。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１５（ｓ，６Ｈ）；０．９３（ｓ，９Ｈ）；３．３７（ｓ，３Ｈ）；３．６２−３．６８（ｍ，２Ｈ）；３．８１（ｄｄ，Ｊ＝４．６，５．９Ｈｚ，１Ｈ）；４．４８（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ）；４．５９（ｄｄｄ，Ｊ＝０．４，３．４，４．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．７０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；５．９４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；９．１７  （ｂｓ，１Ｈ）；９．６８（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，１Ｈ）．
【０５１５】
２’−５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−フルオロ−５’−オキソ−ウリジン２ｂを、無水ＤＣＭ（５５０ｍＬ）中、１ｂ（１３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＰ（１９．５ｇ、４６ｍｍｏｌ）から同様に調製した。室温で一晩撹拌した後に、混合物を冷却し、クエンチし、そしてＤＣＭで抽出して、表題の生成物２ｂを約６０％含む粗アルデヒド１２．７ｇ（９３％）を得た。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１３（ｓ，３Ｈ）；０．１４（ｓ，３Ｈ）；０．９２（ｓ，９Ｈ）；４．４１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝４．９，６．０，１３．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．１５（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，４．９，５２．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．６８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８９（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１８．３Ｈｚ，１Ｈ）；７．５５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；９．２６  （ｂｓ，１Ｈ）；９．６４（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ）．
【０５１６】
５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−５’−オキソ−チミジン２ｃを、無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）中、１ｃ（１７．９ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＰ（２５．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）から同様に調製した。０℃で３時間撹拌した後に、混合物をクエンチし、そしてＤＣＭで抽出して、表題の生成物２ｃを約６３％含む粗アルデヒド２０．０ｇ（量）を得た。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１３５（ｓ，３Ｈ）；０．１４０（ｓ，３Ｈ）；０．９２（ｓ，９Ｈ）；１．８５（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ）；２．０８−２．２４（ｍ，２Ｈ）；４．３８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）；４．７５（ｄｔ，Ｊ＝２．２，５．７Ｈｚ，１Ｈ）；６．２４（ｄｄ，Ｊ＝６．２，７．９Ｈｚ，１Ｈ）；７．５５（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）；９．１８（ｂｓ，１Ｈ）；９．６５（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，１Ｈ）．
【０５１７】
Ｎ−アセチル−５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−５’−オキソ−シチジンを、無水ＤＣＭ（６００ｍＬ）中、１ｄ（３３．１ｇ、８０ｍｍｏｌ）およびＤＭＰ（４０．７ｇ、９６ｍｍｏｌ）から同様に調製した。室温で４時間撹拌した後に、混合物をクエンチし、そして２ａの場合と同様に処置して、生成物２ｄの約５６％を含む粗アルデヒド３３．２ｇ（１００％）を得た。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１０８（ｓ，３Ｈ）；０．１１７（ｓ，３Ｈ）；０．９２（ｓ，９Ｈ）；２．１４（ｓ，３Ｈ）；３．４４（ｓ，３Ｈ）；３．９０−３．９４（ｍ，１Ｈ）；４．４９−４．５２（ｍ，２Ｈ）；５．９２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．３３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．１０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；９．１３（ｂｓ，１Ｈ）；９．７２（ｓ，１Ｈ）．
【０５１８】
Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンを用いるプリン５’−アルデヒド２ｅ〜ｆの合成、「無水クエンチ（ｗａｔｅｒ−ｆｒｅｅ  ｑｕｅｎｃｈ）」
【化４７】
2017525705.tif 000060
Ｎ−ベンゾイル−５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−５’−オキソ−アデノシン２ｅ。Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（２０．４ｇ、４８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、無水ＤＣＭ（３００ｍＬ）中、３’−ＯＴＢＳ保護アデノシン１ｅ（２０．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）の撹拌冷却（０℃）溶液に添加した。冷却槽を取り除き、混合物を室温で３時間撹拌し、その後は、ＴＬＣでは原料アルコール１ｅを観察できなかった。イソプロピルアルコール（０．６１ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１時間撹拌を続けた。溶媒を真空中で除去し、酢酸エチル（２２０ｍＬ）を添加し、続いてヘキサン（１５０ｍＬ）を、撹拌しながら４時間かけてゆっくりと添加した。この混合物を、室温で一晩撹拌し、濾過し、そして固体を、酢酸エチル−ヘキサン（１：１）の混合物で２回洗浄した。濾液を真空中で乾燥させて、残留物を、乾燥アセトニトリル（３００ｍＬ）で共蒸発させた。アセトニトリル（１００ｍＬ）を添加して懸濁液にし、この懸濁液を一晩撹拌し、濾過し、そして固体をアセトニトリルで２回洗浄した。濾液を真空中で蒸発させて白い泡沫状残留物を得て、これを高真空下で乾燥乾燥させて、表題の生成物２ｅを約５４％含む粗アルデヒド２０．２ｇ（１００％）を得て、これを、さらなる精製なしで次のステップで使用した。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１８８（ｓ，３Ｈ）；０．１９０（ｓ，３Ｈ）；０．９７（ｓ，９Ｈ）；３．３４（ｓ，３Ｈ）；４．４９（ｄｄ，Ｊ＝４．３，６．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．５１（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ）；４．９０（ｄｄ，Ｊ＝３．０，４．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）；７．５４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；７．６１−７．６７（ｍ，１Ｈ）；７．９７−８．０３（ｍ，２Ｈ）；８．４４（ｓ，１Ｈ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；９．５０（ｂｓ，１Ｈ）；９．８２（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ）．
【０５１９】
Ｎ−イソブチリル（ｉｓｏｂｕｔｕｒｙｌ）−５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−５’−オキソ−グアノシン２ｆを、無水ＤＣＭ（３００ｍＬ）中、１ｆ（１９．３ｇ、４０ｍｍｏｌ）およびＤＭＰ（２０．４ｇ、４８ｍｍｏｌ）から同様に調製した。室温で３時間撹拌した後に、イソプロピルアルコール（０．６１ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１時間撹拌を続けた。溶媒を真空中で除去し、酢酸エチル（２２５ｍＬ）を添加し、続いてヘキサン（１５０ｍＬ）を、撹拌しながら３０分かけてゆっくりと添加した。この混合物を、室温で５時間撹拌し、濾過し、そして固体を、酢酸エチル−ヘキサン（１：１．５）の混合物で２回洗浄した。濾液を真空中で乾燥させて、残留物を、トルエン（２５０ｍＬ）と乾燥アセトニトリル（２５０ｍＬ）の混合物で共蒸発させ、さらにアセトニトリル（２５０ｍＬ）で蒸発させた。白い泡状残留物を、高真空中で蒸発させて、表題の生成物２ｆを約５３％含む粗アルデヒド２１．５ｇを得て、これを、さらなる精製なしで次のステップで使用した。
主要構成要素の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  ０．１６７（ｓ，３Ｈ）；０．１７５（ｓ，３Ｈ）；０．９５（ｓ，９Ｈ）；１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１．１９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；２．６６−２．７７（ｍ，１Ｈ）；３．３１（ｓ，３Ｈ）；４．３１（ｄｄ，Ｊ＝４．３，７．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．４８（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．６９（ｄｄｄ，Ｊ＝０．４，２．４，４．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．０１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）；８．０３（ｓ，１Ｈ）；９．４５（ｓ，１Ｈ）；９．７９（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；１２．０５（ｂｓ，１Ｈ）．
【０５２０】
軽度のＭｅ−求核試薬をヌクレオシド５’−アルデヒドへの立体選択的添加
ａ．一般的な観察
立体選択性の求核塩基依存性：以下の表に示されているように、５’−Ｍｅピリミジンヌクレオシドの（Ｓ）−エピマーは、（ＡｌＭｅ３についての表に示されているように）トリメチルアルミニウムを用いて高レベルの立体選択性で合成することができ、５’−Ｍｅプリンの（Ｓ）−エピマーは、（ＺｎＭｅ２についての表に示されているように）ジメチル亜鉛を用いて立体選択的に合成することができる。
【化４８】
2017525705.tif 000061
【０５２１】
【表１３】
2017525705.tif 000062
【０５２２】
【表１４】
2017525705.tif 000063
【０５２３】
立体選択性の溶媒依存性：表に示されているように、５’−Ｍｅピリミジンヌクレオシドの（Ｓ）−エピマーは、（ＡｌＭｅ３についての表に示されているように）ＴＨＦ中、トリメチルアルミニウムを用いて高レベルの立体選択性で合成することができ、５’−Ｍｅプリンの（Ｓ）−エピマーは、（ＺｎＭｅ２についての表に示されているように）非配位性溶媒中、ジメチル亜鉛を用いて立体選択的に合成することができる。プリン立体異性体の等モル混合物を、（Ａ誘導体の場合は）ＴＨＦ中、または（Ｇ誘導体の場合は）非配位性溶媒（ＤＣＭ）中、トリメチルアルミニウムで得ることができる。
【化４９】
2017525705.tif 000064
【０５２４】
【表１５】
2017525705.tif 000065
【０５２５】
【表１６】
2017525705.tif 000066
【０５２６】
立体選択性の２’−置換への依存性：配位およびより大きい２’−ＯＭｅ置換基は、より小さい非配位２’−Ｆまたは２’−Ｈよりも優れた選択性を付与した。
【化５０】
2017525705.tif 000067
【０５２７】
ｂ．５’−オキソ−ヌクレオシドのトリメチルアルミニウムとの反応の手順
【化５１】
2017525705.tif 000068
５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−ウリジン３ａおよび５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−ウリジン４ａ。無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、表題の化合物（２５．３ｇ、≦６８ｍｍｏｌ）を約６８％含む粗アルデヒド２ａの溶液を、アルゴン雰囲気下、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、１０２ｍＬ、２０４ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）の撹拌冷却（０℃）混合物に、カニューレによって約１５分かけてゆっくりと添加した。冷却槽を取り除き、この混合物を、室温で１７時間撹拌しい、０℃に冷却し、塩化アンモニウムの飽和水溶液と２０％リン酸の１：１混合物５００ｍＬの慎重な添加によって反応を停止させ、続いて４００ｍｌの酢酸エチルを添加した。有機層を分離し、飽和塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして溶媒を真空中で除去して２５．６ｇの粗残留物を得た。ヘキサン中、１％のトリエチルアミンを含む酢酸エチルのグラジエント（５０％〜９０％）を用いた３３０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈシリカゲルカラムでの残留物のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、３ａ（１７．５ｇ、６７％）および３ａと４ａの混合物（１．２５ｇ、５％）を得た。この混合物を、１５ｍＬの温酢酸エチルに溶解し、続いて１５ｍＬのヘキサンをゆっくりと添加した。この混合物を室温まで冷却し、一晩撹拌し、沈降物を濾過し、酢酸エチル−ヘキサン１：２混合物で洗浄し、そして乾燥させて、純粋４ａ（０．８１ｇ、結晶化で６５％、反応で３％）を得た。
３ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０８（ｓ，６Ｈ）；０．８７（ｓ，９Ｈ）；１．１４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）；３．３３（ｓ，３Ｈ）；３．６８（ｄｄ，Ｊ＝１．８，４．４Ｈｚ，１Ｈ）；３．７６−３．８４（ｍ，２Ｈ）；４．２７（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’）；５．１７（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；５．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；８．０５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；１１．３（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −４．９５；−４．８２；１７．７８；２０．０５；２５．６１；５７．５６；６４．７３；７０．５７；８２．６１；８５．８３；８７．９６；１０１．７９；１４０．１９；１５０．４８；１６３．０８．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１７Ｈ３０Ｎ２Ｏ６Ｓｉ＋Ｈ］＋に対する計算値：３８７．１９５１；実測値：３８７．１９６２．４ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０９（ｓ，６Ｈ）；０．８８（ｓ，９Ｈ）；１．１０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；３．２８（ｓ，３Ｈ）；３．６４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，４．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４’）；３．７７（ｄｔ，Ｊ＝４．６，６．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５’）；３．８６（ｄｄ，Ｊ＝４．８，６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’）；４．４０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’）；５．１６（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；５．６７（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；７．８９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；１１．３６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．６０；０．６９；２３．１９；２５．１９；６２．８４；７１．５０；７４．４８；８７．１０；９０．４７；９４．８０；１０７．６９；１４５．９３；１５６．１１；１６８．３７．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１７Ｈ３０Ｎ２Ｏ６Ｓｉ＋Ｈ］＋に対する計算値：３８７．１９５１；実測値：３８７．１９６０．
【０５２８】
５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−フルオロ−ウリジン３ｂおよび５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−フルオロ−ウリジン４ｂを、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、表題の化合物（１．８０ｇ、≦５ｍｍｏｌ）を約５５％含む粗アルデヒド２ｂの溶液を、アルゴン雰囲気下、０℃で、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、８ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温で一晩撹拌することによって同様に調製した。粗残留物（１．８８ｇ）を、ヘキサン中、１％のトリエチルアミンを含む５０％の酢酸エチルを用いた８０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈシリカゲルカラムでクロマトグラフィーにかけて、小さい中間混合画分（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）と共に３ｂ（０．８８ｇ、４７％）および４ｂ（０．１７ｇ、９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０８８（ｓ，３Ｈ）；０．０９４（ｓ，３Ｈ）；０．８６（ｓ，９Ｈ）；１．１９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；３．７２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．７５−３．８３（ｍ，１Ｈ）；４．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝４．４，６．８，１８．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’）；５．０６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．４，４．４，５３．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’）；５．２０（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；５．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．９１（ｄｄ，Ｊ＝２．３，１６．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；７．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；１１．４（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）：δ  −４．８４；−４．５３；１８．７５；２０．７０；２６．１４；６６．０２；７１．２９；７１．４２；８７．９８；８８．５０；８８．７７；９３．２０；９４．７１；１０２．５８；１４１．３７；１５１．４１；１６３．７４．１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）：δ  −２０７．６０（ｄｔ，Ｊ＝１６．６，５３．１Ｈｚ，１Ｆ）．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１６Ｈ２７ＦＮ２Ｏ５Ｓｉ＋Ｈ］＋に対する計算値：３７５．１７５２；実測値：３７５．１７４４．４ｂ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０９６（ｓ，３Ｈ）；０．１０２（ｓ，３Ｈ）；０．８７（ｓ，９Ｈ）；１．１１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）；３．７４−３．７８（ｍ，１Ｈ）；３．８４−３．９４（ｍ，１Ｈ）；４．４３（ｄｔ，Ｊ＝４．８，１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’）；５．１０（ｄｔ，Ｊ＝４．２，５２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’）；５．２１（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；５．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．９４（ｄｄ，Ｊ＝４．０，１５．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；７．８９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；１１．４（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  −４．５６；−４．１０；１９．１１；１９．８９；２６．４５；６７．６７；７０．６２；７０．７４；８８．２８；８８．５５；８９．９９；９２．８９；９４．４０；１０３．３９；１４２．７１；１５２．２８；１６５．６７．１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）：δ  −２０８．２８（ｄｔ，Ｊ＝１４．３，５２．８Ｈｚ，１Ｆ）．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１６Ｈ２７ＦＮ２Ｏ５Ｓｉ＋Ｈ］＋に対する計算値：３７５．１７５２；実測値：３７５．１７６０．
【０５２９】
５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−チミジン３ｃおよび５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−チミジン４ｃを、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、表題の化合物（１．２１ｇ、≦３．４ｍｍｏｌ）を約６０％含む粗アルデヒド２ｃの溶液を、アルゴン雰囲気下、０℃で、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、６ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温で一晩撹拌することによって同様に調製した。粗残留物（１．２１ｇ）を、ヘキサン中、１％のトリエチルアミンを含む酢酸エチルのグラジエント（８０％〜１００％）を用いたシリカゲルフラッシュカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ８０ｇおよび２４ｇ）で２回連続してクロマトグラフィーにかけた。分離されたエピマーを含む画分を引き離し、そして中間混合画分を混合して第２のカラムクロマトグラフィーにかけた。小さい中間混合画分と共に０．６５ｇ（５２％）の３ｃおよび０．１１ｇ（９％）の４ｃが得られた。
３ｃ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０７（ｓ，６Ｈ）；０．８６（ｓ，９Ｈ）；１．１３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；１．７６（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ）；２．０１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．０，６．０，１３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’Ａ）；２．１３（ｄｄｄ，Ｊ＝５．９，７．７，１３．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’Ｂ）；３．５８（ｔ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４’）；３．７４−３．８３（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’）；４．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’）；５．０２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；６．１５（ｄｄ，Ｊ＝６．０，７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；７．８４（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；１１．２７（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  −４．５８；−４．３９；１２．７２；１８．６３；２０．６５；２６．２０；４１．１４；６７．５５；７３．９４；８５．９７；９７．７４；１１１．０６；１３７．８９；１５１．７６；１６５．１０．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１７Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓｉ＋Ｎａ］＋に対する計算値：３９３．１８２２；実測値：３９３．１８２５．４ｃ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０８１（ｓ，３Ｈ）；０．０８４（ｓ，３Ｈ）；０．８７（ｓ，９Ｈ）；１．１０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；１．７６（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ）；１．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝１．７，５．５，１３．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’Ａ）；２．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，９．０，１３．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’Ｂ）；３．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．６，４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４’）；３．７３（ｄｔ，Ｊ＝４．９，６．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５’）；４．４９（ｄｔ，Ｊ＝１．４，５．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’）；５．０３（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）；６．１５（ｄｄ，Ｊ＝５．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’）；７．６６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；１１．２９（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＡＣＮ−ｄ３）：δ  −４．５２；−４．２５；１２．６７；１８．５５；２０．２１；２６．１９；４１．１０；６８．２６；７２．４６；８６．０７；９２．３５；１１１．２７；１３７．７５；１５１．８３；１６５．０９．ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ［Ｃ１７Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓｉ＋Ｈ］＋に対する計算値：３７１．２００２；実測値：３７１．１９９２．
【０５３０】
Ｎ−アセチル−５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−メチル−シチジン３ｄを、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、表題の化合物（２．８０ｇ、≦６．８ｍｍｏｌ）を約５６％含む粗アルデヒド２ｄの溶液を、アルゴン雰囲気下、０℃で、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、１２ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温で一晩撹拌することによって同様に調製した。粗残留物（３．０３ｇ）を、ヘキサン中、酢酸エチルのグラジエント（７０％〜１００％）を用いたシリカゲルフラッシュカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ８０ｇおよび４０ｇ）で２回連続してクロマトグラフィーにかけて、３ｄとそれ以上分離されなかった４ｄの混合物を含む０．６０ｇの極性の高い画分と共に、１．０９ｇ（３７％）の極性の低い（Ｓ）−エピマー３ｄを得た。
３ｄ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０５（ｓ，６Ｈ）；０．８５（ｓ，９Ｈ）；１．２１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；２．０９（ｓ，３Ｈ）；３．４３（ｓ，３Ｈ）；３．７０−３．７６（ｍ，２Ｈ）；３．７７−３．８５（ｍ，１Ｈ）；４．２１（ｄｄ，Ｊ＝４．８，７．０Ｈｚ，１Ｈ）；５．１９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）；５．８３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．１８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．５８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；１０．９０（ｓ，１Ｈ）．
【０５３１】
註：Ｎ−アセチルシチジンは、トリエチルアミンの存在下、シリカゲルカラム上であまり安定しないため、不均化してＮ−脱保護およびＮ−ジアセチル化誘導体を形成する傾向にある。従って、異性体３ｄと４の分離には、トリエチルアミンを一切使用しなかった。しかしながら、トリエチルアミンの添加は、ＴＬＣでの異性体のより良い分離に有用である。
【０５３２】
Ｎ−ベンゾイル−５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−アデノシン３ｅおよびＮ−ベンゾイル−５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−アデノシン４ｅを、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中、表題の化合物（１６．９ｇ、≦３４ｍｍｏｌ）を約５０％含む粗アルデヒド２ｅの溶液を、アルゴン雰囲気下、０℃で、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、５１ｍＬ、１０２ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温で一晩撹拌することによって同様に調製した。粗残留物（１５．９ｇ）を、ヘキサン中、酢酸エチルのグラジエント（７０％〜１００％）を用いたシリカゲルフラッシュカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ２２０ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、精製されたエピマーの混合物（約１：１）：８．５２ｇ、４９％を得た。これらの異性体を、プレップによってさらに分離した。Ｇｉｌｓｏｎ  ＰＬＣ  ２０２０精製システムを用いるＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ：１ｇの混合物を注入し、２５ｍＭ  重炭酸トリエチルアンモニウムおよび６５％アセトニトリルを用いてイソクラティック法で溶出した。ＨＰＬＣ純度が９５％を超える適切な画分をプールし、そして蒸発乾固して、０．１５ｇの３ｅ（９７％を超える乾燥度）および０．２５ｇの４ｅ純粋立体異性体を得た。
３ｅ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．１２４（ｓ，３Ｈ）；０．１２６（ｓ，３Ｈ）；０．９１（ｓ，９Ｈ）；１．１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；３．３２（ｓ，３Ｈ）；３．８１−３．９０（ｍ，２Ｈ）；４．４０（ｄｄ，Ｊ＝４．９，５．７Ｈｚ，１Ｈ）；４．５４（ｄｄ，Ｊ＝３．２，４．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．１９（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）；６．１６（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．５５（ｔ  ｓｐｌｉｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．６４（ｔ  ｓｐｌｉｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）；８．０３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）；８．０５（ｓ，１Ｈ）；８．７６（ｓ，１Ｈ）；８．８０（ｓ，１Ｈ）；１１．２３（ｓ，１Ｈ）．４ｅ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．１４６（ｓ，３Ｈ）；０．１４７（ｓ，３Ｈ）；０．９３（ｓ，９Ｈ）；１．１０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；３．２５（ｓ，３Ｈ）；３．７５（ｄｄ，Ｊ＝１．１，５．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．８９（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）；４．６０（ｄｄ，Ｊ＝４．５，７．４Ｈｚ，１Ｈ）；４．６３（ｄｄ，Ｊ＝１．２，４．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．３２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）；６．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．５５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．６４（ｔ  ｓｐｌｉｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．０３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）；８．０５（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ）；８．７６（ｓ，１Ｈ）；８．７７（ｓ，１Ｈ）；１１．２３（ｓ，１Ｈ）．
【０５３３】
Ｎ−イソブチリル−５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−グアノシン３ｆおよびＮ−イソブチリル−５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−グアノシン４ｆを、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、表題の化合物（１．６３ｇ、≦３．４ｍｍｏｌ）を約５３％含む粗アルデヒド２ｆの溶液を、アルゴン雰囲気下、−７８℃で、ＡｌＭｅ３（ヘプタン中、２Ｍ、１０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）と無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温で一晩ゆっくりと（槽内で）加温することによって同様に調製した。粗残留物（１．５９ｇ）を、クロロホルム中、メタノールのグラジエント（０〜４％）を用いたシリカゲルフラッシュカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ４０ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、０．１４ｇの極性の低い（Ｒ）−異性体４ｆ、０．３６ｇの３ｆと４ｆの中間混合物、および０．２５ｇの極性の高い（Ｓ）−異性体３ｆを得た。中間画分を、クロロホルム中、３％のメタノールを用いて第２のイソクラティックカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ４０ｇ）で分離して、さらなる０．２０ｇの４ｆおよび０．１６ｇの３ｆを得た。３ｆ：０．３４ｇ（２３％）および４ｆ：０．４１ｇ（２７％）の全収率。
３ｆ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．１０（ｓ，３Ｈ）；０．１１（ｓ，３Ｈ）；０．８９（ｓ，９Ｈ）；１．１１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）；１．１２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；２．７７（ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．２９（ｓ，３Ｈ）；３．７６（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．７９−３．８７（ｍ，１Ｈ）；４．２０（ｄｄ，Ｊ＝４．８，６．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．４４（ｄｄ，Ｊ＝２．６，４．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．１２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．８８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）；８．３６（ｓ，１Ｈ）；１１．６１（ｓ，１Ｈ）；１２．１０（ｓ，１Ｈ）．４ｆ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．１２（ｓ，３Ｈ）；０．１３（ｓ，３Ｈ）；０．９０（ｓ，９Ｈ）；１．０８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；１．１１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）；２．７６（ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．２５（ｓ，３Ｈ）；３．６６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．７６（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．３６（ｄｄ，Ｊ＝４．６，７．８Ｈｚ，１Ｈ）；４．５４（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．１６（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）；８．３２（ｓ，１Ｈ）；１１．６０（ｓ，１Ｈ）；１２．１０（ｓ，１Ｈ）．
【０５３４】
ｃ．プリン５’−オキソ−ヌクレオシドのジメチル亜鉛との立体選択的反応の手順
Ｎ−ベンゾイル−５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−アデノシン３ｅ。無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、表題の化合物（１．６９ｇ、≦３．４ｍｍｏｌ）を約５５％含む粗アルデヒド２ｅの溶液を、アルゴン雰囲気下、ＺｎＭｅ２（トルエン中、２Ｍ、６ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）と無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）の撹拌冷却（−７８℃）混合物に約２０分かけてゆっくりと滴加した。この溶液を、室温まで一晩かけて（槽内で）ゆっくりと加温し、０℃に冷却し、１０％リン酸の慎重な添加によってクエンチした。有機層を分離し、５％塩水で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、粗残留物（１．５７ｇ）を、ヘキサン中、酢酸エチルのグラジエント（７０％〜１００％）を用いた４０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈシリカゲルカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、約９０％のジアステレオマー純度の３ｅ（０．９６ｇ、５５％）を得た。この化合物を、５ｍＬのジエチルエーテルに溶解し、そしてヘキサン（４ｍＬ）を、撹拌しながらゆっくりと添加し、結晶化を誘発した。この混合物を室温で一晩撹拌し、濾過し、固体を、エーテル−ヘキサン１：２混合物で２回洗浄して、約９７％ジアステレオマー純度の０．６９ｇ（結晶化で７３％）の３ｅを得た。
【０５３５】
Ｎ−イソブチリル−５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−グアノシン３ｆを、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、表題の化合物（１．６３ｇ、≦３．４ｍｍｏｌ）を約５３％含む粗アルデヒド２ｆの溶液を、アルゴン雰囲気下、−７８℃で、ＺｎＭｅ２（トルエン中、２Ｍ、８．５ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）と無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合物に添加し、続いて室温まで一晩かけて（槽内で）ゆっくりと加温することによって同様に調製した。３ｆと４ｆを約３：１の比で含む粗残留物（１．５６ｇ）を、クロロホルム中、２％のメタノールを用いたシリカゲルフラッシュカラム（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ４０ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、４ｆと３ｆの０．１３ｇの混合物を得、続いて０．４８ｇ（３２％）の純粋３ｆを得た。
【０５３６】
ｄ．５’−アルキル−エピマーの立体特異的相互変換
【化５２】
2017525705.tif 000069
５’−（Ｓ）−Ｃ−メチル−５’−Ｏ−メシル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−ウリジン５ａ。塩化メタンスルホニル（５．５ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）中、（Ｓ）−エピマー（３ａ）（８．３２ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５．８ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）撹拌溶液に約５分かけて滴加した。冷却槽を取り除き、この混合物を室温で４８時間撹拌し、０℃に冷却し、そして重炭酸ナトリウムの飽和溶液（２００ｍＬ）の慎重な添加によってクエンチした。冷却槽を取り除き、この混合物を室温で１時間激しく撹拌し、有機層を分離し、１０％リン酸で連続的に洗浄し、５％塩水で２回洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そして残留物を高真空下で乾燥させて、オレンジ色の泡として実質的に純粋な５ａ（９．７９ｇ、９８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０９（ｓ，３Ｈ）；０．１０（ｓ，３Ｈ）；０．８７（ｓ，９Ｈ）；１．４２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；３．２０（ｓ，３Ｈ）；３．３３（ｓ，３Ｈ）；３．８６（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ）；３．８９（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ）；４．２９（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）；４．９１（ｄｔ，Ｊ＝６．４，１１．３Ｈｚ，１Ｈ）；５．６８（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８６（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．６５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；１１．４２（ｓ，１Ｈ）．
【０５３７】
６，９−エポキシ−２Ｈ，６Ｈ−ピリミド［２，１−ｂ］［１，３］オキサゾシン−２−オン−７，８，１０−トリヒドロ−９−（Ｒ）−メチル−８−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−７−メトキシ−［６Ｒ−（６α，７α，８α，９α）］６ａ。無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中、メシレート５ａ（２．３３ｇ、５ｍｍｏｌ）とＤＢＵ（１．５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下、６０℃で２７時間撹拌し、０℃に冷却し、酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加し、続いて５％水性ＮａＣｌ（８０ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、５％ＮａＣｌと１０％水性リン酸の１：１の混合物で洗浄し、続いて５％ＮａＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム、そして飽和ＮａＣｌで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を真空中で除去して、粗無水生成物６ａ（１．５７ｇ）を得、この粗無水生成物６ａを、３０ｍＬのジエチルエーテルで４５分間還流し、室温まで冷却し、２時間撹拌し、白い沈降物を濾過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、そして乾燥させて０．８８ｇ（４８％）の純粋６ａを得た。
６ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．０６（ｓ，３Ｈ）；０．７（ｓ，３Ｈ）；０．８４（ｓ，９Ｈ）；１．３６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）；３．２９（ｓ，３Ｈ）；４．１３（ｄｄ，Ｊ＝０．８，６．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．２７（ｓ，１Ｈ）；４．３２（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；４．６２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）；５．７８（ｓ，１Ｈ）；５．８９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．９５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −５．２２；−４．８１；１６．７９；１７．９１；２５．５９；５７．９３；７１．４２；８１．７７；８６．３３；９１．１６；９６．２４；１０９．０９；１４２．５８；１５６．２９；１７０．６７．
【０５３８】
５’−（Ｒ）−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］−２’−Ｏ−メチル−ウリジン４ａ（５ａから）。ＴＨＦ（５０ｍＬ）中、メシレート５ａ（３．７２ｇ、８ｍｍｏｌ）とＤＢＵ（２．４ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）と水（１０ｍＬ）の溶液を、アルゴン雰囲気下、６７時間還流した。溶媒を真空中で除去し、残留物を、酢酸エチル（１２０ｍＬ）と、８０ｍＬの５％ＮａＣＬと３０ｍＬの１０％リン酸の混合物とに分け、有機層を分離し、５％ＮａＣＬで２回洗浄し、続いて飽和ＮａＣｌで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、粗残留物（３．０４ｇ）を、３０ｍＬのジエチルエーテルと１５ｍＬのヘキサンの混合物で１時間還流し、室温まで冷却し、一晩撹拌し、白い沈降物を濾過し、エーテル−ヘキサン１：１の混合物で２回洗浄して２．３２ｇ（７５％）の４ａを得た。
【０５３９】
この実施例に記載されたプロセスは、オリゴヌクレオチドおよび小分子を含む、任意の治療用途（例えば、抗ウイルスおよび抗腫瘍用途）のための様々な５’−アルキルヌクレオシドの合成に使用することができる。
【０５４０】
実施例９：ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’末端への４’および５’修飾ヌクレオチドの導入によるＰＯ、ＰＳ、またはＰＳ２の立体阻害（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）
本発明者らは、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置におけるジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、および／またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’末端への４’修飾および／または５’修飾ヌクレオチドの導入が、ヌクレオチド間結合に立体効果を付与することができ、従ってヌクレオチド間結合がヌクレアーゼから保護するまたは安定させることを見出した。
【０５４１】
この実施例では、選択された位置に４’−Ｏ−メチル化または５’−メチル化ヌクレオチドを含むＦ７  ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子サイレンシング活性を評価し、この結果を表１１に示す。
【０５４２】
【表１７】
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【０５４３】
【表１８】
2017525705.tif 000071
【０５４４】
【表１９】
2017525705.tif 000072
【０５４５】
【表２０】
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【０５４６】
実施例１０：ｓｉＲＮＡ二重鎖におけるグリコール核酸（ＧＮＡ）のキラリティー依存性活性
ｓｉＲＮＡ二重鎖の化学修飾は、これらの分子をヌクレアーゼ分解に対して安定させるため、それらの細胞内への取り込みを促進するため、ならびに活性ＲＩＳＣの形成及びＲＮＡｉ媒介標的サイレンシングに影響を与えるために必要である。ｓｉＲＮＡ二重鎖の特定の位置に組み込まれる熱不安定化修飾は、ＲＩＳＣ付加中の鎖バイアス（ｓｔｒａｎｄ  ｂｉａｓ）および／またはセンス鎖解離を改善することによって効力の増大をもたらし得る。
【０５４７】
この実施例では、３炭素非環状核酸類似体、グリコール核酸（ＧＮＡ）を、ｓｉＲＮＡ二重鎖との関連で評価した。ＧＮＡ含有ｓｉＲＮＡ二重鎖を合成した。（Ｓ）−ＧＮＡオリゴマーは、典型的なＲＮＡ  Ａ型二重鎖に対して構造類似性を有すると共に、Ａ／Ｔ−リッチ配列内のＤＮＡではなくＲＮＡと交差対合するホモ二重鎖を形成した。（Ｓ）−または（Ｒ）−ＧＮＡを含むｓｉＲＮＡ二重鎖の熱安定性及びヌクレアーゼ耐性を調べた。Ｘ線結晶学を用いた構造研究により、ＲＮＡ二重鎖内でのこれらのＧＮＡ置換基の影響についてのさらなる知見が得られた。ＧＮＡ含有ｓｉＲＮＡ二重鎖のキラリティー依存性遺伝子サイレンシング活性を、生物学的研究で検査した。
【０５４８】
【表２１】
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【０５４９】
【表２２】
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【０５５０】
【表２３】
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【０５５１】
【表２４】
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【０５５２】
【表２５】
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【０５５３】
この結果は、図２７〜図３０に示されている。
【０５５４】
図２７は、１つの（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドで修飾されたｓｉＲＮＡを用いたＴＴＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを示すグラフである。ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、マウス初代幹細胞での１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとの２４時間のインキュベーション後に測定した。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価し、ＰＢＳ処置細胞に対して正規化した。全てのデータ点は、４つの測定の平均とした。図２７は、１つの（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドの組み込みのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉＲＮＡ活性への影響を示している。
【０５５５】
図２８Ａは、１つの（Ｓ）−ＧＮＡ塩基対で修飾されたｓｉＲＮＡを用いたＴＴＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを示すグラフである。ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、マウス初代幹細胞での１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとの２４時間のインキュベーション後に測定した。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価し、ＰＢＳ処置細胞に対して正規化した。全てのデータ点は、４つの測定の平均とした。図２８Ｂは、１つの（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ここではＧＮＡ：ＲＮＡ−塩基対として対合したミックスおよびマッチ二重鎖を示している。図２８は、１つの（Ｓ）−ＧＮＡ塩基対の組み込みのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉＲＮＡ活性への影響を示している。
【０５５６】
図２９は、マウス血清中のＴＴＲのｉｎ  ｖｉｖｏレベルを示すグラフである。動物に、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡを単回投与した。投与前または投与後の指定の時間に、動物から採血し、血清サンプルを、４５０ｎｍでの読み取りのためにＨＲＰ−コンジュゲート抗体および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを利用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定した。全てのサンプルを２連で測定し、各データ点は、各コホート（ｎ＝３）内のマウスの平均である。図２９は、ＧＮＡ−修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖を用いるマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングの血清ＴＴＲレベルへの影響を例示している。
【０５５７】
図３０は、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルのｉｎ  ｖｉｖｏ定量を示すグラフである。動物に、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡを単回投与した。投与後の指定の時間に、全肝ホモジネートでＲＮＡ抽出を行った。ＴＴＲ  ｍＲＮＡを、対照転写物としてＧＡＰＤＨを用いるΔΔＣｔ法で、ＲＴ−ｑＰＣＲによって上述のように評価し、そしてＰＢＳ処置動物に対して正規化した。図３０は、ＧＮＡ−修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖を用いるマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングの肝ｍＲＮＡレベルへの影響を例示している。
【０５５８】
上記の図面に示されている結果は、ＧＮＡの組み込みにより、得られる二重鎖の位置依存性熱不安定化をもたらすことを実証している。不安定化の程度は、ヌクレオチド依存性であり；ＡまたはＵヌクレオチドの置換では、ＧまたはＣヌクレオチドのＧＮＡ置換と比較して遥かに小さいΔＴＭとなった。ｓｉＲＮＡ二重鎖のｓｅｅｄ領域への１つのＧＮＡヌクレオチドの組み込みは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＴＲ  ｍＲＮＡのノックダウンと同様のレベルとなった。加えて、ｓｅｅｄ領域内にＧＮＡ塩基対を含むｓｉＲＮＡ、ならびにミックスおよびマッチ二重鎖は、対応する親ｓｉＲＡよりも高いレベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを実証した。
【０５５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングは、１つのＧＮＡ置換を含む二重鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果に十分に相関していた。ＧＮＡの２つの置換は、１つの置換のｓｉＲＮＡと比較した場合、ｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性の低下をもたらした。
【０５６０】
本明細書で言及した米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願公開、および非特許刊行物の全てが、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、特許出願、および刊行物の概念を利用する必要がある場合は、実施形態の態様を変更することができる。
【０５６１】
これらおよび他の変更を、上記の詳細な説明を踏まえて実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定すると解釈するべきではなく、全ての可能な実施形態およびこのような特許請求の範囲を可能にする等価物の全ての範囲を含むと解釈するべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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