(57)【要約】  本開示は、診断試験用の、生物学的サンプルからの胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）の調製方法に関する。
2017521091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を濃縮する方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルを密度分離にかけて、ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を得るステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）において得た前記ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を用いる磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）にかけて、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を得るステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において得た、前記ＭＡＣＳでソートした細胞集団中の細胞を、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬で蛍光標識して、蛍光標識細胞集団を得るステップ；および
（ｄ）ステップ（ｃ）において得た前記蛍光標識細胞集団を、フローサイトメトリーによってソートして、ｆＮＲＢＣを選択することによって、ｆＮＲＢＣが濃縮された細胞集団を得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）は、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用し、ステップ（ｃ）は、少なくとも２つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）は、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用し、ステップ（ｃ）は、少なくとも３つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の前記少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、核染色剤を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を単離するための顕微操作をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ネガティブ選択ステップを含まない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において得た前記ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、ステップ（ｂ）の前にネガティブ選択にかける、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において得た、前記ＭＡＣＳでソートした細胞集団を、ステップ（ｃ）の前にネガティブ選択にかける、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネガティブ選択はネガティブ免疫選択である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ネガティブ免疫選択は、
（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；
（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ３２；
（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、場合によりＣＤ４５；
（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、場合によりＣＤ５６；
（ｅ）樹状細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および
（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１４またはＣＤ３３
から選択される１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を利用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルからｆＮＲＢＣを濃縮する方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルを密度分離にかけて、ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を得るステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）において得た前記ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、少なくとも２つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を用いるＭＡＣＳにかけて、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を得るステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において得た、前記ＭＡＣＳでソートした細胞集団に顕微操作を実行して、個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を単離するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ネガティブ選択ステップを含まない、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）において得た前記ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、ステップ（ｂ）の前にネガティブ選択にかける、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において得た、前記ＭＡＣＳでソートした細胞集団を、ステップ（ｃ）の前にネガティブ選択にかける、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ネガティブ選択はネガティブ免疫選択である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ネガティブ免疫選択は、
（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；
（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ３２；
（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、場合によりＣＤ４５；
（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、場合によりＣＤ５６；
（ｅ）樹状細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および
（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１４またはＣＤ３３
から選択される１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を利用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプルは母体血液である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記母体血液は、妊娠約４週から約３８週の間に採取される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記母体血液は、妊娠約６週から約２０週の間に採取される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１個のｆＮＲＢＣの正体を胎児細胞として確認することをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または得ることができる、ｆＮＲＢＣが濃縮された細胞集団。
【請求項２８】
母体血液から濃縮された、（ａ）少なくとも２、少なくとも５、もしくは少なくとも１０個の、かつ／または（ｂ）最大１５、最大２５、もしくは最大３５個のｆＮＲＢＣを含有する、ＦＡＣＳでソートした細胞集団。
【請求項２９】
（ａ）少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００の、かつ／または（ｂ）最大１５０、最大２５０、または最大３５０のＦＡＣＳ事象を含有する、請求項２８に記載の、ＦＡＣＳでソートした細胞集団。
【請求項３０】
固定されていない、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の、細胞集団。
【請求項３１】
胎児異常について、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の細胞集団由来の少なくとも１個のｆＮＲＢＣを分析することを含む、胎児異常を検出する方法。
【請求項３２】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って、ｆＮＲＢＣを、前記分析の前に濃縮することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記胎児異常について単一のｆＮＲＢＣを分析することを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記胎児異常について一群のｆＮＲＢＣを分析することを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記分析の前に全ゲノム増幅を実行することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析の前にゲノムのサブセットを増幅することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析は定量ＰＣＲを含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記分析はマイクロアレイ上で実行される、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｆＮＲＢＣを胎児細胞として確認することをさらに含む、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
確認が、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析、遺伝的フィンガープリンティング、または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析を実行することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
確認が、ｆＮＲＢＣ  ＤＮＡを母系ＤＮＡと比較することを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
確認が、ｆＮＲＢＣ  ＤＮＡを、母系ＤＮＡおよび父系ＤＮＡの両方と比較することを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９９３６５９号明細書の優先権の利益を主張し、この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
胎児に起こり得る染色体異常および遺伝的異常を検出する出生前診断の実践により、両親および保育者は、素因のモニタリングおよび疾患または症状の早期の処置を開始することが可能となる。出生前診断の実践は、胎児の起こり得る染色体異常および遺伝的異常を検出するように確立されているので、両親および保護者による、情報に基づいた決定が可能となる。生命に係わる種々の染色体異常（異数性２１、１８、１３、Ｘ、Ｙ）のうち、第２１染色体の全てまたは一部の余分なコピーの存在によって引き起こされるダウン症候群は、精神遅滞の最も一般的な遺伝的原因であり、女性が出生前診断を求める主たる理由となっている（Pierce B. Genetics: A conceptual approach (W.H. Freeman and company, 2008), 3d edition; Driscoll and Gross, 2009, N Engl J Med. 360:2556-62）。報告によると、細胞遺伝学的障害は、生存出生の約１％、３５歳を超える女性の妊娠では２％、そして第１三半期の自然流産ではおおよそ５０％で生じる（Thompson and Thompson Genetics in Medicine, sixth edition, chapter 9）。報告によると、１００万人の生存出生集団中の単一遺伝子欠損の発生率は、約０．３６％である（Thompson and Thompson Genetics in Medicine, sixth edition, chapter 9）。
【０００３】
血清のＰＡＰＰ−Ａ（妊娠関連血漿タンパク質Ａ）、遊離β−Ｈｃｇ（遊離βヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）の定量化、および項部透過像の超音波検査を包含する好ましい第１三半期スクリーニングによれば、ダウン症候群の検出率が約９０％であるが、有意な５％の偽陽性率がなおざりになっている（Nicolaides et al., 2005, Ultrasound Obstet Gynecol 25:221-26）。第１三半期のスクリーニング研究のメタアナリシス（Evans et al., 2007, Am J Obstet Gynecol 196:198-05）は、実際には、達成可能な有病正診率（sensitivity）が、報告されるよりも有意に低い（約８０〜８４％）可能性があると結論した。
【０００４】
染色体異常および単一遺伝子障害の決定的な検出は、柔毛膜柔毛サンプリング、羊水穿刺、または臍帯サンプリングによって得られる胎児組織の核型分析によって可能である。ダウン症候群等の症状の危険性を最小にするために、これらの試験は、一組のスクリーニング基準によって胎児染色体異常のリスクが最も高いと同定された女性になされる。この群は、通常、母体年齢が３５歳以上であり、かつ妊娠の第１三半期および／または第２三半期中に実行される胎児の超音波検査および／または母体血清マーカースクリーニング試験への応答が異常である妊娠を含む（Nicolaides et al., 2005, Ultrasound Obstet Gynecol 25:221-26）。しかしながら、これらの手順は、非常に侵襲性であり、熟練した専門家を必要とし、そして胎児損失（最大１％）および／または母体合併症のリスクが重大である傾向がある（Mujezinovic et al., 2007, Obstet Gynecol 110:687-94、Tabor et al., 1986, Lancet 1:1287-93、Buscaglia et al., 1996, Prenat Diagn 16:375-76）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＡＣＯＧ）によるガイドライン（ACOG Practice bulletin Clinical Management Guidelines for Ob-Gyns, No. 7, Jan 2007）は遺伝的異常が予想される全ての母親を試験するように会員に勧めているが、これは、胎児の遺伝的状態の特定の診断に安全に導くことができる非侵襲性の技術の必要が満たされていないことを示している。
【０００５】
数十年間、非侵襲性の代替法の探索は、通常胎盤関門を通過して母体循環系中に入る、胎児遺伝物質の単離、同定、および以降の分析に注目していた。１８９３年の母体血液中の胎児細胞の検出、およびその後の母体血液中の胎児細胞なしの（cell-free）ＤＮＡの検出についての先駆的な報告（Purwosunu et al., 2006, Taiwanese J. Obstet Gynecol 45(1): 10-20の表１参照）以来、胎児細胞の、または無細胞の胎児遺伝物質の分析に基づく２つの見込みのあるアプローチが、相当な関心を集めてきた。
【０００６】
「無細胞」胎児ＤＮＡは、母体血液中で比較的豊富であり、母体血漿中の総無細胞ＤＮＡの５〜１０％を構成する（Hahn et al., 2011, Expert Reviews in Molecular Medicine 13: e16）。次世代シーケンシング技術の出現で実行可能となった無細胞ＤＮＡベースの出生前試験は最初に、２０１１年に米国で商用化され、少なくとも４つのそのようなアッセイが現在商品化されている。現在まで、無細胞ＤＮＡ試験法は、性別同定、異数性検出、および父系ＤＮＡ中に存在する突然変異を可能にしているが、より細かい遺伝的分析、例えば微小欠失または微小挿入の検出は可能でない（例えば、Simpson, 2013, Fertility and Sterility 99:1 124-1134参照）。さらに、稀であるけれども、偽陽性を含む不正確な試験結果が報告されてきた（Simpson, 2013, Fertility and Sterility 99(4): 1124-1134、Dugo et al., 2014, J Prenat Med. 8(1-2): 31-35参照）。
【０００７】
無細胞胎児ＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、無傷の胎児細胞により、染色体異常の検出、および胎児の遺伝的状態のより完全な評価に重要である完全な胎児遺伝物質へのアクセスを実現することができる（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85）。いくつかの重大な課題が、信頼性の高い胎児細胞単離法の開発を妨げてきた。単離の主な制限となるのは、母体血液中の循環性胎児有核細胞数の少なさであり、胎児細胞は、母体血液１ｍＬあたり１〜２個（Bianchi et al., 1997, Am J Hum Genet 61 (4): 822-829）から母体血液１ｍＬあたり２〜６個（Krabchi et al., 2001, Clin Genet 60:145-150）にしか及ばないと推定されている。但し、異数性の妊娠においては、その数は最大６倍大きいことが報告されている（Krabchi et al., 2006, Clin Genet 69:145-154、およびBianchi et al., 1997, Am J Hum Genet 61 (4): 822-829）。この数を大局的に見ると、血中での胎児細胞の、母親細胞に対する比率は、１０５中１個から１０９中１個と推定され（Purwosunu et al., 2006, Taiwanese J. Obstet Gynecol 45(1): 10-20、Simpson, 2013, Fertility and Sterility 99(4): 1124-1134参照）、１ｍＬの母体血液中のそれぞれ１〜６個の胎児細胞について、おおよそ４．２〜５．４×１０９個の成体赤血球、１．１６〜８．３×１０３個の好中球、２〜９．５×１０５個の単球、１〜４．８×１０６個のリンパ球、１．３３〜３．３３×１０８個の血小板、最大４．５×１０５個の好酸球、および最大２×１０５個の好塩基球が存在する（web2.iadfw.net/uthman/blood_cells.htmlにてアクセス可能なUthman, Blood Cells and the CBCから得た数）。
【０００８】
母体血液中の種々の胎児細胞（栄養芽層、リンパ球、有核赤血球、および造血幹細胞；Bianchi, 1999, Br J Haematol 105:574-83参照）のうち、赤芽球としても知られている有核赤血球（ＮＲＢＣ）は、信頼性が高い出生前アッセイに所望される特性の過半数を有する。胎児ＮＲＢＣ（ｆＮＲＢＣ）は、寿命および増殖能力が限られており（したがって、ある妊娠から別の妊娠まで持続しない）、単核であり、胎児染色体の代表的な相補体を有しており、そして母体血液中に絶えず存在する（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Kavanagh et al., 2010, J Chromat B 878:1905-11、Bianchi, 1999, Br J Haematol 105:574-83、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35、Bianchi and Lo, 2010, in Genetic Disorders and the Fetus: Diagnosis, Prevention and Treatment, Sixth Edition, Ch. 30, pp. 978-1000 (Milunsky and Milunsky eds.)）。胎児赤血球生成の研究により、最初に卵黄嚢（原始赤芽球を産生する原始赤血球生成）中に生じること、続いて胎児肝臓および骨髄（完全（definitive）赤芽球を産生する）中に生じることの２つの異なるプロセスが同定されている（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85）。原始赤芽球および完全赤芽球の両方が母体循環系において検出される。原始赤芽球は、出産日まで残存する完全型によって次第に置き換えられる主たる第１三半期の細胞型である（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35）。
【０００９】
母体血液中の胎児細胞の最も広範な研究は、複数年の、複数のセンターにまたがったＮＩＦＴＹ  Ｔｒｉａｌであった。これは、胎児異常を診断するために胎児細胞を単離する有用性および実現可能性を評価するように設計された。関係する４つのセンターは、胎児細胞を母体血液から単離して、単離細胞を、染色体特異的プローブによる蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析しようと試みた（Bianchi et al., 2002, Prenat Diagn 22:609-615）。Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと表される４つのセンターは全て、母親細胞を枯渇させる予備的ステップとして密度勾配分離を用いて、次いで様々な方法を用いて、ＦＩＳＨ用の胎児細胞を得た。センターＡでは、密度分離に続いて、細胞固定、抗ＣＤ１４抗体および抗ＣＤ１５抗体を用いるＭＡＣＳ、ならびに抗ＨｂＦ（胎児ヘモグロビン）を用いるＦＡＣＳによるネガティブ選択が行なわれた。センターＢでは、密度勾配分離に続いて、細胞固定、ならびに、ポジティブ選択用の抗ＨｂＦ抗体、ネガティブ選択用の抗ＣＤ４５または抗ＨｂＡ（成体ヘモグロビン）によるＦＡＣＳを用いる同時ネガティブポジティブ選択が行なわれた。センターＣでは、密度勾配分離に続いて、抗ＣＤ１４抗体および抗ＣＤ４５抗体を用いるＭＡＣＳ、抗ＣＤ７１抗体を用いるＦＡＣＳによるネガティブ選択、ならびに細胞固定が行なわれた。センターＤでは、密度勾配分離に続いて、細胞固定、および抗ＣＤ７１抗体による、ＭＡＣＳを用いるポジティブ選択が行なわれた。男性胎児細胞中のＸ染色体およびＹ染色体の一般的な検出率は、症例の僅か４１．１％であり、偽陽性率（すなわち、女性胎児細胞中のＸ染色体およびＹ染色体の検出）は１１．１％であった。異数性の全体的な検出率は７４．４％であり、推定偽陽性率は、０．６％から４．１％の間であった。Bianchi et al., 2002, Prenat Diagn 22:609-615参照。ＭＡＣＳベースの方法は、ＦＡＣＳベースの方法よりも良好な回収率および検出を実現するといわれた（Bianchi and Lo, 2010, in Genetic Disorders and the Fetus: Diagnosis, Prevention and Treatment, Sixth Edition, Ch. 30, pp. 978-1000 (Milunsky and Milunsky eds.)）。ＮＩＦＴＹ  Ｔｒｉａｌの寄稿者の１人は、アプローチは、「忍耐を要し、回収率が一定でなく、そして情報無しの割合が許容できなかった」と述べた（Simpson, 2013, Fertility and Sterility 99(4): 1124-1134）。
【００１０】
胎児細胞を単離するために、遠心分離、濾過、横置換法、磁気泳動、レクチン結合、誘電泳動、顕微操作およびレーザー捕捉、ならびに顕微解剖が挙げられる他の種々のアプローチが利用されている。より高速のスループット法、例えば微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）およびオートメーション化された細胞濃縮法も利用されている（Kavanagh et al., 2010. J Chromat B 878:1905-11、Kilpatrick et al., 2004, J Obstet Gynecol 190:1571-81、Seppo et al, 2008, Prenat Diagn 28:815-21、Talasaz et al., 2009, PANS 106:3970-75, 2009、Kumo et al., 2010, 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. 3-7 October 2010, Groningen, The Netherlands; pp. 1583-1585、Cheng et al., 2011, J Clin Lab Anal 25:1-7、Choolani et al., 2012, Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology 26:655-667）。これらもまた、首尾一貫しない結果をもたらしてきた（Simpson, 2013, Fertility and Sterility 99(4): 1124-1134）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ゆえに、胎児ＤＮＡの下流の遺伝的分析を可能にする単純な、信頼性が高い胎児細胞単離技術の必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
３．概要
本開示は、胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）がかなり少数派である混合細胞集団からのｆＮＲＢＣの濃縮および単離を可能にする単離技術の開発に基づく。したがって、本開示は、ｆＮＲＢＣが高度に濃縮された細胞調製物、およびそのような濃縮細胞集団を生成する方法を提供する。
【００１３】
本開示は、典型的には液体培地中で実行されて、生物学的サンプル、例えば母体血液、または母体血液のｆＮＲＢＣ濃縮細胞画分からｆＮＲＢＣを濃縮（そして、場合によっては単離）するための、ポジティブ選択法の使用に部分的に基づくものである。母体血液は典型的に、妊娠期間のおよそ４週目から始まる期間内に採取される。
【００１４】
ポジティブ選択法は、典型的には１つまたは複数のポジティブ免疫選択ベースのステップを含み、生物学的サンプルから他の細胞型、例えば母体リンパ球または赤血球を枯渇させる１つまたは複数の他の方法と共に用いられてよい。そのような他の方法として、ネガティブ選択および細胞密度分離技術が挙げられる。
【００１５】
典型的には、ネガティブ選択法は、ｆＮＲＢＣに特異的に結合しないが、生物学的サンプル中に存在し得る１つまたは複数の他の細胞型に結合する抗体を利用する１つまたは複数のネガティブ免疫選択ステップを伴う。
【００１６】
ｆＮＲＢＣの濃縮細胞が調製されると、調製物それ自体が診断試験にかけられてもよいし、付加的な単離技術（例えば顕微操作）が、診断試験用に個々のｆＮＲＢＣを選択するのに利用されてもよい。細胞が胎児細胞であることを確かめるために、ｆＮＲＢＣの１個または複数個が、確認技術、例えばショートタンデムリピート（「ＳＴＲ」）分析にかけられてよい。
【００１７】
一部の態様において、本開示は、ｆＮＲＢＣを調製する方法であって、ｆＮＲＢＣを含む生物学的サンプルをポジティブ選択にかけることを含む方法を提供する。ポジティブ選択は好ましくは、ポジティブ免疫選択、および場合により１つまたは複数の付加的なポジティブ選択基準を含む。ポジティブ免疫選択は典型的に、（ａ）液体培地中で生物学的サンプルを１つまたは複数のポジティブ免疫選択抗体（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のポジティブ免疫選択抗体）と接触させるステップであって、このポジティブ免疫選択抗体は、生物学的サンプルにおいて１つまたは複数の他の細胞型と比較して選択的にｆＮＲＢＣに結合する、ステップと；（ｂ）前記ポジティブ免疫選択抗体に結合した細胞を選択するステップとを含む。前述のポジティブ選択ステップが組み込まれ得るポジティブ選択の実例となる実施形態が、節５．３、６、７．３、および７．５に記載される。
【００１８】
ある態様において、少なくとも１つのポジティブ免疫選択抗体は、ｆＮＲＢＣ有核前駆体細胞の表面上に存在する抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するＣＤ７１または他の表面抗原と結合しない。一部の実施形態において、ポジティブ免疫選択抗体は４Ｂ９であり、またはｆＮＲＢＣ有核前駆体細胞の表面への結合に関して４Ｂ９と競合する抗体である。ポジティブ選択用の他のマーカーとして、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａとしても知られている）、ＣＤ３６、ＣＤ７１、および核染色剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＬＤＳ７５１、ＴＯ−ＰＲＯ、ＤＣ−Ｒｕｂｙ、およびＤＡＰＩ）が挙げられ得る。例えばＭＡＣＳを用いるポジティブ選択の後にＦＡＣＳを用いるポジティブ選択が続く、複数のポジティブ選択プロセスが用いられてよく、それぞれ、１つ、２つ、３つ、またはさらにそれ以上のポジティブ選択（例えば、ポジティブ免疫選択）試薬、例えば先に同定される、マーカーに対する抗体、または核染色剤を利用する。
【００１９】
ポジティブ選択は、ネガティブ選択、典型的にはネガティブ免疫選択と共に用いられてよい。ネガティブ免疫選択は、（ａ）液体培地中で生物学的サンプルをネガティブ免疫選択抗体と接触させるステップであって、ネガティブ免疫選択抗体は、ｆＮＲＢＣと比較して選択的に生物学的サンプル中の他の細胞と結合する、ステップと；（ｂ）前記ネガティブ免疫選択抗体に結合しなかった細胞を選択するステップとを含むことができる。前述のネガティブ選択ステップが組み込まれ得るネガティブ選択の実例となる実施形態が、節５．３、６、７．２、および７．５に記載される。
【００２０】
ネガティブ選択は、実行されるならば、ポジティブ選択の前に、後に、またはポジティブ選択と同時に実行されてよい。好ましくは１つまたは複数の造血細胞表面マーカーに対する、１つまたは複数のネガティブ免疫選択抗体が用いられてよい。例示的な細胞表面マーカーとして、以下が挙げられる：（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、例えばＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８；（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３２；（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、例えばＣＤ４５；（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、例えばＣＤ５６；（ｅ）樹状細胞表面マーカー、例えばＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、例えばＣＤ１４またはＣＤ３３。特定の実施形態において、２つ、３つ、４つ、５つ、またはさらにそれ以上のネガティブ免疫選択抗体が、１つ、２つ、またはそれ以上のネガティブ選択プロセスで用いられる。
【００２１】
免疫選択ステップは、例えば抗体がコーティングされた磁気ビーズを用いる、磁気分離、またはフローサイトメトリーを利用してよい。フローサイトメトリー技術は、例えば蛍光活性化細胞ソーターの使用を介して、正確な分離を実現することができ、これは、精巧さ、例えば多色チャンネル、低角度オブチューズ光散乱検出チャネル（low angle and obtuse light scattering detecting channel）、インピーダンスチャンネルその他の度合いを変えることができるものである。したがって、本明細書中で用いられる用語「フローサイトメトリー」は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を包含する。
【００２２】
ｆＮＲＢＣの濃縮を向上させるために、前濃縮プロセス、例えば密度分離が、ポジティブ選択の前に用いられてよい。例示的な前濃縮プロセスが、節５．２および７．１に記載される。
【００２３】
ｆＮＲＢＣの濃縮細胞が調製されると、調製物それ自体が診断アッセイにかけられてもよいし、付加的な単離技術（例えば顕微操作、固体表面上での細胞の捕捉）が、診断試験用に個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣのプールを選択するのに利用されてもよい。一部の実施形態において、付加的な単離技術（例えば顕微操作）は、細胞を濃縮するのに利用される蛍光標識、ｆＮＲＢＣ中のヘモグロビンの存在（ソーレー帯フィルターによって検出可能）、およびｆＮＲＢＣの形態的特徴を活用してよい（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35）。顕微操作のための例示的なアプローチが、節５．４および７．６に記載される。
【００２４】
本開示はさらに、本明細書中に記載される方法によって単離される個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を含む、本明細書中に記載される方法によって調製される、または得ることができるｆＮＲＢＣの調製物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、ｆＮＲＢＣを含有する、ＦＡＣＳでソートされた細胞集団を提供する。例示的な、ＦＡＣＳでソートされた集団が、節５．５に記載される。
【００２５】
ｆＮＲＢＣは、例えば多胎妊娠または胎児異常の存在を判定する、胎児診断試験に用いられてよい。試験され得る異常の例として、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース４−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第Ｘ因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱（Ｘ）症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ＸＸＸ症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖６−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病Ａ、血友病Ｂ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、１６ｐ１１．２欠失、１６ｐ１１．２重複、ミトコンドリア欠損、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、１ｐ３６欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症（因子ａ）、無精子症（因子ｂ）、無精子症（因子ｃ）、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、３−メチルクロトニル補酵素Ａカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、Ｔ細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ（フィンランド型）、ならびに多発性内分泌腫瘍が挙げられる。
【００２６】
診断アッセイは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）アッセイであってもよいし、タンパク質（例えば、抗体ベースの）アッセイであってもよいし、組織学的アッセイであってもよいし、それらの組合せであってもよい。ＤＮＡアッセイの例として、ＦＩＳＨアッセイ、ＰＣＲアッセイ、およびＤＮＡ配列決定アッセイが挙げられる。ＲＮＡアッセイの例として、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよびＦＩＳＨアッセイが挙げられる。核酸へのアクセスを容易にするために、ｆＮＲＢＣは、診断試験を実行する前に、溶解されてもよいし、透過性にされてもよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質アッセイは、マイクロアレイ上で実行されてもよい。分子診断試験のための実例となる技術が、節５．７に記載される。
【００２７】
診断アッセイは、胎児細胞として診断される細胞または細胞集団の正体を確認するための分子確認技術の前であっても、同時であっても、後であってもよい。例示的な確認技術が節５．６に記載される。
【００２８】
本明細書中に記載される方法は、例えば特定の診断を確かめるために、または妊娠の変化もしくは胎児の状態を検出するために、所与の妊娠中に一回または複数回、実行されてよい。
【００２９】
本開示の方法を実践するのに有用なキットが節５．８に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
４．図面の簡単な説明
【図１】例示的なｆＮＲＢＣの単離および下流の分析の研究フローを示す図である。ｆＮＲＢＣの単離について、好ましいワークフローは、節７．１に記載される、細胞密度勾配上での母体血液からの単核細胞の単離、節７．３に記載される、ポジティブ選択（例えば、磁気活性化細胞ソーティングを用いた、４Ｂ９ポジティブ細胞の濃縮）の利用（節７．２のネガティブ選択、例えばＣＤ４５枯渇ステップが、有っても無くてもよく、これは任意である）、およびＣＤ２３５＋、核染色、４Ｂ９ポジティブ細胞のソーティングを含む。ｆＮＲＢＣの濃縮後、個々の細胞が、例えば、本明細書中に記載される方法に従って、下流の細胞遺伝学的分析および／または分子分析のために、本出願に記載されるような形態または染色に基づいて、選択されてよい。ワークフローは、節７に概説される組合せプロトコルのいずれかを活用するように適合されてよい。
【図２】図２は、図１に概説されるワークフローの特定の実施形態を示す図である。
【図３−１】図３は、ｆＮＲＢＣを母体血液から単離するための、本明細書中に開示される方法を利用した、例示的なＦＡＣＳデータセットを示す図である。図３Ａは、細胞型を区別するために細胞の光散乱特性を用いた、ＦＳＣ（Ｘ軸）およびＢＳＣ（Ｙ軸）の相関測定値を示す。図３Ｂは、リンパ球および単球のサブゲートである。Ｘ軸はＣＤ２３５ａ染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。上部右側の四分の一区分は、核ＤＣ−ＲｕｂｙおよびＣＤ２３５ａ  ＰＥ（グリコホリン−ａ）ポジティブである事象を含有する。これらの細胞は、下流の分析のために、例えば核酸増幅用のＰＣＲチューブ中に、または顕微操作用のスライド上に直接的にソートされてよい。
【図３−２】図３は、ｆＮＲＢＣを母体血液から単離するための、本明細書中に開示される方法を利用した、例示的なＦＡＣＳデータセットを示す図である。図３Ｃは、ＣＤ２３５ａ＋領域のサブゲートである。図３Ｄは、図３Ａ〜図３Ｃに示される異なるゲーティングレベルにて選択された細胞の例示的な分布を示す。Ｘ軸はＡＦ  ４８８染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。上部右側の四分の一区分は、核ＤＣ−Ｒｕｂｙおよび４Ｂ９  ＡＦ  ４８８についてポジティブである事象を含有する。これらの細胞は、下流の分析のために、例えば核酸増幅用のＰＣＲチューブ中に、または顕微操作用のスライド上に直接的にソートされてよい。
【図４】Ｘ染色体およびＹ染色体ハイブリダイゼーションプローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析されて、ＤＡＰＩで対比染色されたｆＮＲＢＣを示す図である。
【図５】男性胎児を妊娠中の女性の末梢血から単離された細胞を示す図である。細胞は、ＸプローブおよびＹプローブでハイブリダイズされて、核染色剤ＤＡＰＩで対比染色された。
【図６】男性胎児を妊娠中の女性の末梢血から単離された細胞を示す図である。細胞が、ＸプローブおよびＹプローブでハイブリダイズされて、核染色剤ＤＡＰＩで対比染色された。
【図７−１】図７Ａは、細胞型を区別するために細胞の光散乱特性を用いた、ＦＳＣ（Ｘ軸）およびＢＳＣ（Ｙ軸）の相関測定値を示す図である。図７Ｂは、リンパ球および単球のサブゲートを示す図である。Ｘ軸はＣＤ２３５ａ染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。上部右側の四分の一区分は、核ＤＣ−ＲｕｂｙおよびＣＤ２３５ａ  ＰＥ（グリコホリン−ａ）ポジティブである事象を含有する。
【図７−２】図７Ｃは、ＣＤ２３５ａ＋領域のサブゲートを示す表である。Ｘ軸はＡＦ  ４８８染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。上部右側の四分の一区分は、核ＤＣ−Ｒｕｂｙおよび４Ｂ９  ＡＦ  ４８８についてポジティブである事象を含有する。図７Ｄは、ゲーティングのそれぞれ異なるレベルの統計量を示す図である。
【図８】図８Ａは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってソートされた４Ｂ９ネガティブ細胞画分の細胞型を区別するために細胞の光散乱特性を用いた、ＦＳＣ（Ｘ軸）およびＢＳＣ（Ｙ軸）の相関測定値を示す図である。図８Ｂは、４Ｂ９ネガティブ細胞画分からのリンパ球のＦＡＣＳサブゲートを示す図である。Ｘ軸はＡＦ  ４８８染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。
【図９】図９Ａは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってソートされた４Ｂ９ポジティブ細胞画分の細胞型を区別するために細胞の光散乱特性を用いた、ＦＳＣ（Ｘ軸）およびＢＳＣ（Ｙ軸）の相関測定値を示す図である。図９Ｂは、４Ｂ９ポジティブ細胞画分からのリンパ球のＦＡＣＳサブゲートを示す図である。Ｘ軸はＡＦ  ４８８染色を表し、Ｙ軸はＤＣ−Ｒｕｂｙ染色を表す。
【図１０】図１０は、男性の血液中の、胎児肝細胞のスパイク混合物からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１０Ａは、精製された男性ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。図１０Ｂは、女性の胎児肝細胞から精製されたＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。図１０Ｃは、濃縮後にＦＡＣＳでソートされた４Ｂ９ポジティブ画分のＦＡＭ分析を示す。
【図１１】図１１は、男性の血液中の、胎児肝細胞のスパイク混合物からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１１Ａは、精製された男性ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。図１１Ｂは、女性の胎児肝細胞から精製されたＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。図１１Ｃは、濃縮後にＦＡＣＳでソートされた４Ｂ９ポジティブ画分のＶＩＣ分析を示す。
【図１２】図１２は、男性の血液中の、胎児肝細胞のスパイク混合物からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１２Ａは、精製された男性ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。図１２Ｂは、女性の胎児肝細胞から精製されたＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。図１２Ｃは、濃縮後にＦＡＣＳでソートされた４Ｂ９ポジティブ画分のＮＥＤ分析を示す。
【図１３】図１３は、男性の血液中の、胎児肝細胞のスパイク混合物からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１３Ａは、精製された男性ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。図１３Ｂは、女性の胎児肝細胞から精製されたＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。図１３Ｃは、濃縮後にＦＡＣＳでソートされた４Ｂ９ポジティブ画分のＰＥＴ分析を示す。
【図１４】図１４は、男性の血液中の、胎児肝細胞のスパイク混合物の４Ｂ９ポジティブ画分からのＦＡＭ  ＳＴＲ産物の、単離されたキャピラリー電気泳動の図である。パネルは、Ｄ１０Ｓ１２４８マーカーの２つの主要な寄与因子の対立遺伝子（Ａ、Ｃ）および２つの主要でない対立遺伝子（Ｂ、Ｄ）、ならびにＤ１３Ｓ３１７マーカーの２つの主要な寄与因子の対立遺伝子（Ｆ、Ｇ）および１つの主要でない対立遺伝子（Ｅ）を示す。
【図１５−１】図１５は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１５Ａおよび図１５Ｂは、サンプル細胞のＦＡＭ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図１５−２】図１５は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１５Ｃは、母系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。図１５Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図１６−１】図１６は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１６Ａおよび図１６Ｂは、サンプル細胞のＶＩＣ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図１６−２】図１６は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１６Ｃは、母系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。図１６Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図１７−１】図１７は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１７Ａおよび図１７Ｂは、サンプル細胞のＮＥＤ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図１７−２】図１７は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１７Ｃは、母系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。図１７Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図１８−１】図１８は、男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１８Ａおよび図１８Ｂは、サンプル細胞のＰＥＴ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図１８−２】男性胎児を妊娠して７週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１８Ｃは、母系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。図１８Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図１９】図１９は、男性胎児を妊娠して９週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図１９Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。図１９Ｂは、サンプル細胞のＦＡＭ分析を示す。図１９Ｃは、父系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２０】図２０は、男性胎児を妊娠して９週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２０Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。図２０Ｂは、サンプル細胞のＶＩＣ分析を示す。図２０Ｃは、父系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。
【図２１】図２１は、男性胎児を妊娠して９週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２１Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。図２１Ｂは、サンプル細胞のＮＥＤ分析を示す。図２１Ｃは、父系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図２２】図２２は、男性胎児を妊娠して９週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２２Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。図２２Ｂは、サンプル細胞のＰＥＴ分析を示す。図２２Ｃは、父系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図２３−１】図２３は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２３Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。図２３Ｂは、サンプル細胞のＦＡＭ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２３−２】図２３は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２３Ｃは、サンプル細胞のＦＡＭ分析を示す。図２３Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＦＡＭ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図２４−１】図２４は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２４Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。図２４Ｂは、サンプル細胞のＶＩＣ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２４−２】図２４は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２４Ｃは、サンプル細胞のＶＩＣ分析を示す。図２４Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＶＩＣ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２５−１】図２５は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２５Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。図２５Ｂは、サンプル細胞のＮＥＤ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２５−２】図２５は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２５Ｃは、サンプル細胞のＮＥＤ分析を示す。図２５Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＮＥＤ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【図２６−１】図２６は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２６Ａは、母系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。図２６Ｂは、サンプル細胞のＰＥＴ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。均一長の短いダッシュによって形成された円は、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を同定する。
【図２６−２】図２６は、男性胎児を妊娠して１２週の女性の末梢血から単離された４Ｂ９細胞からのＳＴＲ産物のキャピラリー電気泳動の図である。図２６Ｃは、サンプル細胞のＰＥＴ分析を示す。図２６Ｄは、父系ゲノムＤＮＡのＰＥＴ分析を示す。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成された円は、母親プロファイルおよび父親プロファイルの両方において見出される対立遺伝子を同定する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
５．詳細な説明
５．１．定義
抗体とは、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置決めされる少なくとも１つの抗原認識部位によって、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドその他に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で用いられる用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、またはその単一鎖、抗体を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる改変された構成をも包含し、例えば、限定されないが、単鎖（ｓｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、ヒト、ラクダ科動物、またはサメのドメイン抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖＮＡＲおよびビスｓｃＦｖが挙げられる（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136参照）。抗体は、任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体が挙げられ、抗体は、任意の特定のクラスである必要もない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは様々なクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに、例えば、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＡ１、およびｌｇＡ２といったサブクラス（アイソタイプ）に分割され得る。「抗体」はまた、ソーティングおよび検出を容易にするように修飾された前述の各抗体／免疫グロブリンタイプのいずれをも包含し、例えば５．３．５．節に記載されている。
【００３２】
本明細書中で用いられる、抗体の抗原結合部分とは、所与の抗原（例えば標的Ｘ）に特異的に結合する能力を保持する無傷の抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって実行され得る。結合断片の例が、用語「抗原結合部分」内に包含される。
【００３３】
生物学的サンプルとは、ｆＮＲＢＣが存在する、または存在すると推測されるサンプルである。特定の実施形態において、生物学的サンプルは、ｆＮＲＢＣが濃縮された母体血液またはその画分（例えば、母体の無核赤血球が枯渇された画分）である。母体血液は典型的に、妊娠の４週目、５週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１６週目、２０週目、２４週目、３０週目、もしくは３８週目に、または前述の実施形態のいずれか２つの間の期間中、例えば４〜３８週、４〜１０週、４〜１６週、４〜２４週、５〜１６週、５〜２４週、５〜３８週、６〜１２週、６〜１６週、６〜３０週、６〜２０週、８〜３８週等の間に１回もしくは複数回、採取される。ｆＮＲＢＣ濃縮用の母体血液を採取するのに最適な妊娠期間は、妊娠約６週〜約２０週である。この期間中、原始胎児赤血球および完全胎児赤血球の両方が母体循環系中に存在するので、本開示の方法によって濃縮されるｆＮＲＢＣの量が最大にされる。母体血液は、単胎妊娠由来のものであっても多胎妊娠（例えば、双子、三つ子、四つ子）由来のものであってもよく、一方の性別（雄性または雌性）のｆＮＲＢＣを含んでいても両方の性別のｆＮＲＢＣを含んでいてもよい。他のタイプの生物学的サンプルは、血漿、柔毛膜柔毛サンプリング（ＣＶＳ）生検由来の細胞、もしくは経皮的臍帯血サンプリング由来の細胞、またはそれらの画分である。本明細書中で用いられる「生物学的サンプル」は、ｆＮＲＢＣの濃縮または単離に用いられる試薬、例えばバッファ、抗体および核染色剤を含み得る。
【００３４】
抗体に関して本明細書中で用いられる競合とは、第１の抗体がその同種エピトープと結合する結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下では検出可能に減少するように、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分が結合するのに十分に類似した様式でそのエピトープに結合することを意味する。代替的に、第２の抗体がそのエピトープに結合することもまた、第１の抗体の存在下で検出可能に減少することが真であってもよく真である必要もない。すなわち、第１の抗体がそのエピトープに結合するのを第２の抗体が阻害することがなくとも、第２の抗体がそのエピトープに結合するのを第１の抗体が阻害し得る。しかしながら、各抗体が、他の抗体の、その同種のエピトープまたはリガンドと結合することを、同程度であるか、より大きい程度であるか、より小さい程度であるかに拘らず、検出可能に阻害する場合、これらの抗体は互いに、それらの各エピトープの結合について「交差競合」するといわれる。競合する抗体または交差競合する抗体の両方が、本開示によって包含される。
【００３５】
ネガティブ選択とは、混合細胞集団からの、目的の標的細胞以外の細胞の枯渇を指す。ネガティブ選択は、標的細胞には無い（または検出不可能な）マーカーに基づいてよい。ネガティブ選択は、他の基準、例えば、サイズ、形態、または他の物理的特性に基づいてもよい。
【００３６】
ネガティブ免疫選択とは、抗体、例えば、目的の標的細胞以外の１つまたは複数の細胞型に選択的に結合するが、標的細胞に特異的に結合しない抗体を利用した細胞の枯渇を指す。
【００３７】
ネガティブ免疫選択抗体とは、ネガティブ免疫選択に用いられ得る抗体であり、例えば、標的細胞以外の１つまたは複数の細胞型上または細胞型内に存在するが、標的細胞には存在しないマーカーに結合する抗体である。抗体は、細胞表面上のマーカーに結合してもよいし、内部マーカーに結合してもよいが、好ましくは、固定の必要性を回避するように、マーカーは表面マーカーである。
【００３８】
ポジティブ選択とは、混合細胞集団からの、目的の標的細胞を含有する細胞の（例えば、濃縮および／または単離目的のための）選択を指す。ポジティブ選択は、標的細胞上または標的細胞内に存在するマーカーに基づいてよい。一部の実施形態において、マーカーは、標的細胞が単離または濃縮されることになる集団（例えば生物学的サンプル）（例えば、標的細胞がｆＮＲＢＣである場合、母体血液または母体血液の画分）中の（標的細胞以外の）１つまたは複数の細胞型には存在しない（または検出不可能である）。更なる実施形態において、マーカーは、標的細胞が単離または濃縮されることになる集団中の目的の標的細胞以外のあらゆる細胞型には存在しない（または検出不可能である）。ポジティブ選択は、他の基準、例えば、サイズ、形態、または他の物理的特性に基づいてもよい。
【００３９】
ポジティブ免疫選択とは、抗体、例えば、目的の標的細胞上または標的細胞内に存在するマーカーに結合し、これによりポジティブ選択に有用である抗体を利用した細胞の選択を指す。
【００４０】
ポジティブ免疫選択抗体とは、ポジティブ免疫選択に用いられ得る抗体であり、例えば、標的細胞上または標的細胞内に存在するマーカーに結合する抗体である。一部の実施形態において、抗体は、標的細胞に選択的に結合するが、標的細胞が存在する細胞集団中に存在し得る１つまたは複数の他の細胞型に特異的に結合しない。抗体は、細胞表面上のマーカーに結合してもよいし、内部マーカーに結合してもよいが、好ましくは、固定の必要性を回避するように、マーカーは表面マーカーである。
【００４１】
特定の細胞に対する選択的結合とは、混合細胞集団（例えば生物学的サンプル）中の少なくとも１つの細胞型内または細胞型上に存在するが、集団中の他の少なくとも１つの細胞型には存在しない（または検出不可能な）マーカーへの抗体の特異的結合または優先的結合を指す。一例として、細胞型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥを含有する混合細胞集団において、抗体が細胞型Ａ、または細胞型ＡおよびＥにのみ特異的に結合するならば、その抗体は、細胞型Ａ、または細胞型ＡおよびＥにそれぞれ選択的に結合するといわれる。
【００４２】
抗体は、他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合力をもって、より容易に、かつ／またはより長い持続期間結合するならば、標的に特異的に結合する、または優先して結合する。例えば、ｆＮＲＢＣ上に存在するマーカーに特異的に、または優先して結合する抗体は、このマーカーに、他のマーカーに結合するよりも大きな親和性、結合力をもって、より容易に、かつ／またはより長い持続期間結合する抗体である。特異的結合または優先的結合は、排他的な結合を必ずしも必要とするわけではない（しかし、これを含んでいてもよい）。通常、「結合」への言及は優先的結合を意味するが、これは必然ではない。
【００４３】
５．２．前濃縮
ｆＮＲＢＣの濃縮を向上させるために、以下に記載される、ポジティブ選択ステップ、および場合による選択ステップに先立つ前濃縮ステップが実行されてもよい。例示的な前濃縮プロセスが、以下に記載される。
【００４４】
密度分離とは、細胞のサイズ、形状、および密度に応じて、細胞の分離を可能にする技術である。密度勾配は、遠心管において、種々の密度の溶液を積層して、管の底に密度の端部があることによって形成される。細胞は通常、ショ糖または他の不活性炭水化物のゆるやかな勾配上で、比較的低い遠心分離速度でも分離する。
【００４５】
非連続的密度勾配遠心分離が、末梢血単核細胞を顆粒白血球および赤血球から単離するのに一般的に用いられる。例えば、いわゆるＦｉｃｏｌｌ密度分離において、血液全体がＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標）をおおって積層されてから遠心分離される。赤血球、顆粒白血球、および一部の単核細胞が細胞ペレットに沈降する一方で、残存する単核細胞が、Ｆｉｃｏｌｌ血漿界面に沈降する。Ｆｉｃｏｌｌを利用した例示的な密度分離プロセスが、７．１節に記載される。
【００４６】
代替的に、成体赤血球が、生物学的サンプルからの枯渇のために凝集されてよく、これによりｆＮＲＢＣを含有する単核細胞画分の濃縮が可能となる。抗凝固処理済み血液が管内で沈降するようにされれば、白血球の前方の赤血球沈殿物、および白血球リッチ血漿層が、１．５時間以上の後に取り除かれ得る。赤血球は、赤血球の凝集する自然な傾向のため、白血球よりも速く沈殿する。凝集試薬を加えることによって赤血球の沈殿を速めることが可能である。例示的な凝集試薬として、非イオンポリマー、例えば多糖類および合成ポリマーがある。一部の実施形態において、このポリマーは、分子量６０，０００〜５００，０００のデキストラン、分子量３６０，０００のポリビニルピロリドン、および分子量２０，０００のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）である。凝集試薬は、生物学的サンプル含有バッファに加えられてもよい。
【００４７】
５．３．ｆＮＲＢＣ濃縮
本開示の方法は、ｆＮＲＢＣの濃縮および／または単離のための１つまたは複数のポジティブ選択プロセスを伴い、典型的には、ｆＮＲＢＣに結合する抗体を用いる、少なくとも１つのポジティブ免疫選択ステップを伴う。ポジティブ免疫選択は、生物学的サンプルから、ｆＮＲＢＣ以外の１つまたは複数の細胞型、例えば母体リンパ球を枯渇させるためにネガティブ選択（例えばネガティブ免疫選択）と一緒に用いられてよい。
【００４８】
ポジティブ免疫選択を実践するために、ポジティブ免疫選択抗体が、生物学的サンプルに加えられる。ＮＲＢＣに結合するのに必要な抗体量は、試験分離および分析を実行することによって、実験に基づいて決定され得る。細胞および抗体は、複合体が形成されるのに十分な期間、一般的には少なくとも約５分間、より一般的には少なくとも約１０分間、一般的には１時間以下、より一般的には約３０分間以下の間、インキュベートされる。
【００４９】
生物学的サンプルはさらに、本明細書中に記載される追加のポジティブ選択試薬および／またはネガティブ選択試薬と、同時に、または順次、インキュベートされてよい。
【００５０】
細胞は、特定の抗体調製物によって分離される。蛍光色素標識抗体が、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気選択用の磁性粒子、特に高勾配磁気選別（ＨＧＭＳ）その他に有用である。例示的な磁気分離装置が、国際公開第９０／０７３８０号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３号明細書、および欧州特許第４３８，５２０号明細書に記載されている。
【００５１】
この選択および／またはネガティブ選択は、他のオートメーション化された方法、例えば限外濾過またはマイクロ流体分離を用いて実行されてよい。
【００５２】
５．３．１．ポジティブ選択
本開示のポジティブ選択試薬は、生物学的サンプル中のｆＮＲＢＣを、当該サンプル中の他の少なくとも１つの細胞型から区別するのに用いられ得るあらゆる試薬であってよい。
【００５３】
ｆＮＲＢＣ濃縮のための好ましいアプローチが、液体培地中で実行されるポジティブ免疫選択法の使用である。典型的に、ポジティブ免疫選択法は、ポジティブ免疫選択抗体を利用する。ある態様において、複数のポジティブ免疫選択抗体が、ポジティブ免疫選択手順に用いられる。
【００５４】
したがって、一部の態様において、本開示は、ｆＮＲＢＣを調製する方法であって、ｆＮＲＢＣを含む生物学的サンプルをポジティブ免疫選択にかけることを含み、前記ポジティブ免疫選択は、（ａ）液体培地中で生物学的サンプルをポジティブ免疫選択抗体と接触させるステップであって、ポジティブ免疫選択抗体は、生物学的サンプル中の１つまたは複数の他の細胞型と比較して選択的にｆＮＲＢＣに結合する、ステップと；（ｂ）前記ポジティブ免疫選択抗体に結合した細胞を選択するステップとを含む、方法を提供する。
【００５５】
５．３．２．ポジティブ選択のマーカーおよび抗体
ｆＮＲＢＣ用のポジティブ選択マーカーとして、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａとしても知られている）、「ｉ」抗原、ＣＤ３６、ＣＤ７１、および核マーカーが挙げられる。下流の分析が細胞固定を容認する場合（例えばＦＩＳＨ）、胎児ヘモグロビンがポジティブ選択マーカーであってよい。
【００５６】
マーカー、グリコホリンＡ、「ｉ」抗原、ＣＤ３６、ＣＤ７１、および胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、このマーカーに対する抗体を用いて選択（例えば、ソート、または濃縮）されてよい。
【００５７】
母体赤血球と対照的に、ｆＮＲＢＣは有核であり、核色素、例えばＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＬＤＳ７５１、ＴＯ−ＰＲＯ、ＤＣ−Ｒｕｂｙ、およびＤＡＰＩを用いて選択され得る。
【００５８】
一部の実施形態において、ｆＮＲＢＣは、モノクローナル抗体４Ｂ９を用いて選択される。抗体４Ｂ９を産生するハイブリドーマは、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６６６  ｆＮＲＢＣの下で、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されている（Ｈｏｌｌｍａｎｎらの米国特許第７，８５８，７５７号明細書および米国特許第８，５６３，３１２号明細書参照）。他の実施形態において、ｆＮＲＢＣは、ｆＮＲＢＣの表面への結合に関して４Ｂ９と競合する抗体を用いて選択される。一例として、モノクローナル抗体４Ｂ８は、ｆＮＲＢＣへの結合に関して４Ｂ９と競合する（Ｈｏｌｌｍａｎｎらの米国特許第７，８５８，７５７号明細書および米国特許第８，５６３，３１２号明細書参照）。
【００５９】
ｆＮＲＢＣに結合する更なる抗体は、Ｈｏｌｌｍａｎｎらに記載される方法を用いて作製され得る。ｆＮＲＢＣへの結合に関して４Ｂ９と競合する能力は、競合アッセイを用いて試験され得る。競合アッセイの一例において、４Ｂ９抗体が、その標的抗原を（例えば、胎児肝細胞から）単離するのに用いられ、標的抗原は、固体表面上、例えばマイクロウェルプレート上に付着する。ＥＬＩＳＡバッファ中の段階希釈液中のビオチン化非標識４Ｂ９または候補競合抗体（「試験」抗体）の亜飽和量の混合物がウェルに加えられて、プレートが穏やかな振盪と共に１時間インキュベートされる。プレートは洗浄され、ＥＬＩＳＡバッファ中に希釈されたＨＲＰコンジュゲートされたストレプトアビジンが各ウェルに加えられ、プレートは１時間インキュベートされる。プレートが洗浄され、結合した抗体が、基質（例えば、ＴＭＢ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｄ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）の添加によって検出される。反応は、停止バッファ（例えば、Ｂｉｏ  ＦＸ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｄ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）の添加によって終了され、吸光度が、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて、６５０ｎｍにて測定される。これ以外にも、抗原を単離する代わりに、ｆＮＲＢＣ全体が用いられてもよい。一手法において、第１の蛍光色素（例えばＦＩＴＣ）にコンジュゲートされた１マイクログラム／ｍｌの４Ｂ９が、１×１０５個の胎児肝細胞を含有するマイクロタイターウェルに加えられる。第２の蛍光色素（例えばフィコエリトリン）にコンジュゲートされた試験抗体は、１０マイクログラム／ｍｌから０．００１マイクログラム／ｍｌの濃度に下げて滴定される（１〜２個の５段階希釈液）。平均蛍光強度が、両方の抗体について測定される。試験抗体が基準抗体と同じ濃度かそれよりも低い濃度で加えられた場合に、基準抗体のＭＦＩが少なくとも５０％引き下げられれば、試験抗体は４Ｂ９と競合するといわれる。一部の実施形態において、ＭＦＩは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％引き下げられる。競合アッセイについての他のフォーマットが、当該技術において知られており、利用されてよい。
【００６０】
５．３．３．ネガティブ選択
典型的に、本開示のネガティブ選択法は、ｆＮＲＢＣを認識しない１つまたは複数の試薬を利用する。ある態様において、試薬は、ネガティブ免疫選択抗体である。
【００６１】
したがって、ネガティブ免疫選択は、（ａ）液体培地中で生物学的サンプルをネガティブ免疫選択抗体と接触させるステップであって、ネガティブ免疫選択抗体は、ｆＮＲＢＣと比較して選択的に生物学的サンプル中の他の細胞に結合する、ステップと；（ｂ）前記ネガティブ免疫選択抗体に結合しなかった細胞を選択するステップとを含むことができる。ネガティブ選択は、実行されるならば、ポジティブ免疫選択の前に、後に、またはポジティブ免疫選択と同時に実行されてよい。
【００６２】
５．３．４．ネガティブ選択マーカーおよび抗体
ネガティブ選択試薬は、生物学的サンプル中のｆＮＲＢＣ以外の細胞をｆＮＲＢＣから分離するのに用いられ得るあらゆる試薬であってよい。
【００６３】
試薬は、好ましくは、母親細胞、すなわち成熟細胞の細胞表面上に存在するが、ｆＮＲＢＣの細胞表面上に存在しない抗原に結合する抗体である。別の実施形態において、ネガティブ免疫選択抗体は、抗ＣＤ４５抗体を含む。好ましくは１つまたは複数の造血細胞表面マーカーに対する、１つまたは複数のネガティブ免疫選択抗体が用いられてよい。例示的な細胞表面マーカーとして、以下が挙げられる：（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、例えばＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８；（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３２；（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、例えばＣＤ４５；（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、例えばＣＤ５６；（ｅ）樹状細胞表面マーカー、例えばＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、例えばＣＤ１４またはＣＤ３３。特定の実施形態において、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つのネガティブ免疫選択抗体が用いられる。
【００６４】
５．３．５．抗体標識化
好都合にも、本開示のポジティブ選択プロセスおよびネガティブ選択プロセスに用いられる抗体および核染色剤は、他の細胞型からのｆＮＲＢＣの選択および分離を可能にするように修飾されてよい。修飾された抗体は、ソーティングおよび検出を可能にするあらゆる分子または物質、例えば、磁気ビーズまたは蛍光色素を備えてよい。特定の実施形態において、抗体は、比色分子、蛍光部分、化学発光部分、抗原、酵素、検出可能なビーズ（磁気ビーズまたは高電子密度（例えば金）ビーズ等）、または別の分子に結合する分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に結合する。
【００６５】
蛍光色素は、蛍光活性化細胞ソーターに用いられてよい。多色分析が、ＦＡＣＳと共に、または免疫磁気分離およびフローサイトメトリーの組合せで、利用されてよい。多色分析は、複数の表面抗原に基づく細胞の分離を目的とするものである。多色分析に用いられる蛍光色素として、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセインおよびＴｅｘａｓレッドが挙げられる。ネガティブの呼称は、染色のレベルが、アイソタイプ適合ネガティブコントロールの輝度以下であることを示す。薄暗いの呼称は、染色のレベルが、ネガティブ染色のレベルに近くてもよいが、アイソタイプ適合コントロールよりも明るいことを示す。本開示のポジティブ免疫選択抗体は、好ましくは、ｆＮＲＢＣが存在する生物学的サンプル、例えば母体血液中に存在し得るｆＮＲＢＣに関しては「明るい」と呼称し、１つまたは複数の他の細胞型に関しては「ネガティブ」または「薄暗い」と呼称する。本開示のネガティブ免疫選択抗体は、好ましくは、ｆＮＲＢＣが存在する生物学的サンプル、例えば母体血液中に存在し得るｆＮＲＢＣに関しては「ネガティブ」または「薄暗い」と呼称し、１つまたは複数の他の細胞型に関しては「明るい」と呼称する。
【００６６】
一実施形態において、免疫選択抗体は、磁性試薬、例えば超常磁性微粒子（微粒子）に直接的に、または間接的にコンジュゲートする。磁性粒子への直接的なコンジュゲート形成は、当該技術において知られているように、種々の化学連結基の使用によって達成される。抗体は、側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基、およびヘテロ機能架橋試薬によって微粒子に結合し得る。実体に連結するための多数のヘテロ機能化合物が利用可能である。好ましい連結基として、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）があり、抗体上に反応性スルフヒドリル基、および磁性粒子上に反応性アミノ基を有する。
【００６７】
これ以外にも、免疫選択抗体は、磁性粒子に間接的に結合する。抗体は、ハプテンに直接的にコンジュゲートし、ハプテン特異的な第２のステージ抗体が、粒子にコンジュゲートする。適切なハプテンとして、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンその他が挙げられる。タンパク質へのハプテンのコンジュゲート法が、当技術分野において知られており、そのようなコンジュゲート用のキットが市販されている。
【００６８】
蛍光標識として、ローダミン、ランタニドリン光体、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」を表す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、ならびにフルオレサミンが挙げられ得る。
【００６９】
酵素による標識として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼが挙げられ得る。
【００７０】
化学発光標識または化学ルミネッサ、例えばイソルミノール、ルミノール、およびジオキセタン。
【００７１】
他の検出可能な部分として、ビオチン、ジゴキシゲニン、または５−ブロモデオキシウリジン等の分子が挙げられる。
【００７２】
一部の実施形態において、免疫選択抗体が、選択または検出のために直接的に修飾されずに、一次抗体として用いられる。例えば磁気ビーズまたは蛍光色素への付着によって修飾されている二次抗体が、一次抗体に結合した細胞を選択または検出するために用いられてもよい。
【００７３】
５．３．６．選択技術
免疫選択ステップは、例えば抗体がコーティングされた磁気ビーズを用いる、磁気分離、またはフローサイトメトリーを利用してよい。フローサイトメトリー技術は、例えば蛍光活性化細胞ソーターの使用を介して、正確な分離を実現することができ、これは、精巧さ、例えば多色チャンネル、低角度オブチューズ光散乱検出チャネル、インピーダンスチャンネルその他の程度を変えることができるものである。
【００７４】
種々の態様において、磁気分離（例えばＭＡＣＳ）およびフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）の両方が、ｆＲＮＢＣの濃縮に用いられる。ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳはそれぞれ、ネガティブ選択に用いられてもよいし、ポジティブ選択に用いられてもよいし、両方に用いられてもよい。一部の実施形態において、ＭＡＣＳによるポジティブ選択および／またはネガティブ選択が、ＦＡＣＳによるネガティブ選択および／またはポジティブ選択の前に利用される。したがって、本開示は、（Ａ）ＭＡＣＳによるネガティブ選択、（Ｂ）ＭＡＣＳによるポジティブ選択、（Ｃ）ＦＡＣＳによるネガティブ選択、および（Ｄ）ＦＡＣＳによるポジティブ選択のあらゆる組合せを含む、ｆＮＲＢＣを濃縮する方法を提供する。実施形態の例示的な組合せが、（１）Ａ、次にＢ、次にＤ；（２）Ａ、次にＤ；（３）Ａ、次にＢ、次に同時にＣ＋Ｄ；（４）Ａ、次に同時にＣ＋Ｄ；（５）Ｂ、次にＤ；および（６）Ｂ、次に同時にＣ＋Ｄである。前述の選択ステップはそれぞれ、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の試薬、例えば抗体、および、ポジティブ選択の場合には核染色剤を利用してよい。
【００７５】
好都合にも、抗体は、標識、例えば磁気ビーズおよび蛍光色素とコンジュゲートされて、他の細胞型からのｆＮＲＢＣの分離が簡略化される。蛍光色素が、蛍光活性化細胞ソーターに用いられてよい。多色分析が、ＦＡＣＳと共に、または免疫磁気分離およびフローサイトメトリーの組合せで、利用されてよい。多色分析は、複数の表面抗原に基づく細胞の分離を目的とするものである。多色分析に用いられる蛍光色素として、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセインおよびＴｅｘａｓレッドが挙げられる。ネガティブの呼称は、染色のレベルが、アイソタイプ適合ネガティブコントロールの輝度以下であることを示す。薄暗いの呼称は、染色のレベルが、ネガティブ染色のレベルに近くてもよいが、アイソタイプ適合コントロールよりも明るくてもよいことを示す。本開示のポジティブ免疫選択抗体は、好ましくは、ｆＮＲＢＣが存在する生物学的サンプル、例えば母体血液中に存在し得るｆＮＲＢＣに関しては「明るい」と呼称し、１つまたは複数（一部の実施形態において、全て）の他の細胞型に関しては「ネガティブ」または「薄暗い」と呼称する。本開示のネガティブ免疫選択抗体は、好ましくは、ｆＮＲＢＣが存在する生物学的サンプル、例えば母体血液中に存在し得るｆＮＲＢＣに関しては「ネガティブ」または「薄暗い」と呼称し、１つまたは複数の他の細胞型に関しては「明るい」と呼称する。
【００７６】
一実施形態において、免疫選択抗体は、磁性試薬、例えば超常磁性微粒子（微粒子）に直接的に、または間接的にコンジュゲートする。磁性粒子への直接的なコンジュゲート形成は、当技術分野において知られているように、種々の化学連結基の使用によって達成される。抗体は、側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基、およびヘテロ機能架橋試薬によって微粒子に結合し得る。実体に連結するための多数のヘテロ機能化合物が利用可能である。好ましい連結基として、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）があり、抗体上に反応性スルフヒドリル基、および磁性粒子上に反応性アミノ基を有する。
【００７７】
これ以外にも、免疫選択抗体は、磁性粒子に間接的に結合する。抗体は、ハプテンに直接的にコンジュゲートし、ハプテン特異的な第２のステージ抗体が、粒子にコンジュゲートする。適切なハプテンとして、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンその他が挙げられる。タンパク質へのハプテンのコンジュゲート法が、当技術分野において知られており、そのようなコンジュゲート用のキットが市販されている。
【００７８】
ポジティブ免疫選択法を実行するために、ポジティブ免疫選択抗体が、生物学的サンプルに加えられる。ＮＲＢＣに結合するのに必要な抗体量は、試験分離および分析を実行することによって、実験に基づいて決定され得る。細胞および抗体は、複合体が形成されるのに十分な期間、一般的には少なくとも約５分間、より一般的には少なくとも約１０分間、一般的には１時間以下、より一般的には約３０分間以下の間、インキュベートされる。
【００７９】
生物学的サンプルはさらに、本明細書中に記載される付加的なポジティブ免疫選択抗体および／またはネガティブ免疫選択抗体とインキュベートされてよい。標識細胞は、特定の抗体調製物に従って分離される。蛍光色素標識抗体が、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気選択用の磁性粒子、特に高勾配磁気選別（ＨＧＭＳ）その他に有用である。例示的な磁気分離装置が、国際公開第９０／０７３８０号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３号明細書、および欧州特許第４３８，５２０号明細書に記載されている。
【００８０】
ポジティブ免疫選択および／またはネガティブ免疫選択は、他のオートメーション化された方法、例えば限外濾過またはマイクロ流体分離を用いて実行されてよい。
【００８１】
本開示の方法は、好ましくは、液相での１つまたは複数のポジティブ免疫選択ステップにより、そして、可溶性フォーマットの、すなわち固体表面上に固定されていない１つまたは複数のポジティブ免疫選択抗体により実行される。本開示の方法は、ポジティブ抗体および／または免疫選択抗体が固体表面に結合されている、１つまたは複数のステップを組み込むように適合され得る。細胞捕捉用の、固体表面上への４Ｂ９の固定は、例えば、２０１１年１１月１４日に出願され、２０１３年５月１６日に米国特許出願公開第２０１３／０１２２４９２号明細書として公開された米国特許出願公開第１３／２９５，５３２号明細書に記載されており、この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００８２】
５．４．下流の単離技術
ポジティブ選択（そして、場合によってはネガティブ選択）の後、ｆＮＲＢＣが、固体表面（例えば、ポジティブ免疫選択抗体結合細胞を捕捉するために４Ｂ９または二次抗体等のポジティブ免疫選択抗体を有する）上での捕捉、または物理的技術、例えば顕微操作によって単離され得る。
【００８３】
ポジティブ免疫選択抗体に付着した検出可能な部分が、胎児ＮＲＢＣを同定して単離するのに用いられてよい。顕微操作は、顕微鏡下で、または他の視覚強化もしくは視覚支援により実行されてよい。顕微操作は、オートメーション化されたプロセスにより、またはマニュアルの顕微操作装置を用いて、実行されてよい。例えば、顕微操作は、単一のｆＮＲＢＣまたは複数のｆＮＲＢＣを選択することも単離することもできる。例えば、１、５、１０または２０個の細胞の群が、顕微操作によって単離されて、１、５、１０または２０個の細胞の個々のサンプルチューブ内に入れられてよい。一部の実施形態において、１〜２０個の細胞、例えば、１〜５個の細胞、１〜１０個の細胞、５〜２０個の細胞、または５〜１０個の細胞の、１、２、３、４、または５つの群が、顕微操作によって単離される。
【００８４】
一部の実施形態において、付加的な単離技術（例えば顕微操作）は、細胞を濃縮するのに利用される蛍光標識、ｆＮＲＢＣ中のヘモグロビンの存在（ソーレー帯フィルターによって検出可能）、およびｆＮＲＢＣの形態的特徴を活用してよい（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35）。
【００８５】
５．５．ｆＮＲＢＣの集団
本開示はさらに、本明細書中に記載される方法によって調製される、または得ることができるｆＮＲＢＣの調製物を提供する。例示的な調製物として、ｆＮＲＢＣを含む細胞の集団が挙げられる。
【００８６】
一部の実施形態において、細胞の集団は、６節に記載されるワークフローのいずれによっても、母体血液、例えば妊娠約４週から約３８週の間に、または妊娠約６週から約２０週の間に採取された母体血液から得られる、または得ることができる。一部の実施形態において、ワークフローは、ポジティブ濃縮および／またはネガティブ濃縮の、間に入るＭＡＣＳステップの有無に拘らず、密度勾配分離およびフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）を伴う。
【００８７】
ある態様において、集団はおおよそ１０、２５、５０、１００、２００、３００、５００もしくは１，０００個の細胞、またはＦＡＣＳ「事象」を含み、あるいは集団は、同様に、前述の値のいずれかの対間、例えばおおよそ２５〜２００、おおよそ５０〜５００、おおよそ１０〜３００、おおよそ５０〜１，０００個の細胞、またはＦＡＣＳ「事象」等の範囲であるいくつかの細胞またはＦＡＣＳ「事象」を含む。好ましくは、細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、もしくは少なくとも２０％はｆＮＲＢＣであり、またはＦＡＣＳ「事象」の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、もしくは少なくとも２０％は、ｆＮＲＢＣに相当する。一部の実施形態において、集団中のｆＮＲＢＣ、またはｆＮＲＢＣに相当するＦＡＣＳ「事象」のパーセンテージは、同様に、前述の値のいずれか２つの間、例えば、２％〜２０％、５％〜１０％、５％〜２０％、３％〜１５％等の範囲である。
【００８８】
ｆＮＲＢＣは、原始ｆＮＲＢＣであっても、完全ｆＮＲＢＣであっても、両方の混合物であってもよい。一部の実施形態において、原始ｆＮＲＢＣと完全ｆＮＲＢＣの比率は、妊娠約６週から約２０週の間の母体血液中で見られる比率である。ｆＮＲＢＣは、抗体、例えば本明細書中に記載されるポジティブ免疫選択抗体の１つもしくは複数に結合されていてもよいし、抗体を有さなくてもよい。そのような抗体を有さないｆＮＲＢＣは、例えば、ポジティブ免疫選択抗体を細胞から剥がすことによって調製され得る。
【００８９】
ｆＮＲＢＣが母体血液サンプルから調製される場合、集団中の残存細胞は典型的に、妊娠期間中の母体血液中に存在する１つまたは複数の細胞型である。母親細胞は、抗体、例えば本明細書中に記載されるネガティブ免疫選択抗体の１つまたは複数に結合されてもよいし、さらにポジティブ免疫選択抗体の１つまたは複数に結合されてもよいし、抗体を有さなくてもよい。そのような抗体を有さない母親細胞は、例えば、あらゆる結合抗体を細胞から剥がすことによって調製され得る。
【００９０】
５．６．ｆＮＲＢＣの確認
例えば、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析を用いて遺伝的プロファイルを得ることを含む遺伝的フィンガープリント法が、本明細書中に記載される方法によって単離されるｆＮＲＢＣを胎児細胞と確認するために用いられ得る。単離細胞から得たプロファイルを、母親細胞、および場合により父親細胞から得たプロファイルと比較することによって、単離細胞が胎児細胞であることが確認され得る。遺伝的プロファイルを得る適切なキットが市販されている。例えば、ｆＮＲＢＣが何であるかを確認するために用いられ得るＰｒｏｍｅｇａのＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ  ＳＴＲキットおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０がそれぞれ、ＳＴＲプロファイルおよびＳＮＰプロファイルを得るのに用いられてよい。一部の実施形態において、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）が、分析に利用可能な遺伝物質の量を増大させるのに用いられる。
【００９１】
５．７．下流の分析
調製物は、例えば多胎妊娠または胎児異常の存在を判定する、胎児診断試験に用いられてよい。試験され得る異常の例として、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース４−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第Ｘ因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱（Ｘ）症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ＸＸＸ症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖６−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病Ａ、血友病Ｂ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、１６ｐ１１．２欠失、１６ｐ１１．２重複、ミトコンドリア欠損、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、１ｐ３６欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症（因子ａ）、無精子症（因子ｂ）、無精子症（因子ｃ）、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、３−メチルクロトニル補酵素Ａカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、Ｔ細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ（フィンランド型）、ならびに多発性内分泌腫瘍が挙げられる。
【００９２】
診断アッセイは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）アッセイであってもよいし、タンパク質（例えば、抗体ベースの）アッセイであってもよいし、組織学的アッセイであってもよいし、それらの組合せであってもよい。ＤＮＡアッセイの例として、ＦＩＳＨアッセイ、ＰＣＲアッセイ、およびＤＮＡ配列決定アッセイが挙げられる。ＲＮＡアッセイの例として、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよびＦＩＳＨアッセイが挙げられる。核酸へのアクセスを容易にするために、ｆＮＲＢＣは、診断試験を実行する前に、溶解させてもよいし、透過性にさせてもよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質アッセイは、マイクロアレイ上で実行されてもよい。実例となる方法が、以下に記載される。
【００９３】
一部の実施形態において、単細胞または２から４個もしくはそれ以上の細胞の群が、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）によって増幅されて、分析に十分な核酸が提供されてよい。５個以上の胎児ＮＲＢＣを含有する細胞の群であれば、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を用いずに分析され得る。ＷＧＡは、個体の細胞または細胞の群の全ゲノムの増幅を指す。例えば、全ゲノムは、単細胞（すなわち、単細胞全ゲノム増幅（ＳＣＷＧＡ））の遺伝物質を用いて増幅され得る。
【００９４】
染色体異常、単一遺伝子異常、対立遺伝子変異、および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、本開示の方法によって生成された溶解胎児ＮＲＢＣ由来の染色体または核酸を用いて、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多重アニーリングおよびループ化による増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、およびＤＮＡ配列決定を含む種々の方法のいずれによっても検出可能である。ＰＣＲ技術は、単純なＰＣＲ増幅技術であっても、定量ＰＣＲであっても、リアルタイムＰＣＲであっても、逆転写酵素ＰＣＲ技術であってもよい。他の有用な遺伝的分析技術として、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、およびＤＮＡマイクロアレイでの分析が挙げられる。例えば、胎児ＮＲＢＣは、出生前染色体マイクロアレイで分析されてよい。
【００９５】
ハプロタイプは、一染色体上に一緒に、かつ隣接する位置に起こる対立遺伝子の組合せである。ハプロタイプは、単一遺伝子座上に、またはいくつかの遺伝子座上に見出され得る。ハプロタイプは、染色体全体の至る所に起こり得る。ハプロタイプは、いかなる数の組換え事象を含んでいてもよい。ハプロタイプは、一組の関連する単一ヌクレオチド多型を指してもよい。
【００９６】
正常な（例えば、野生型の）ヌクレオチド配列から単一ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）の変異があった場合に、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が生じる。例えば、単一ヌクレオチド多型が、対立遺伝子変異をもたらし得る。所与の対立遺伝子が、単一ヌクレオチド多型によって、または複数のヌクレオチド変化によって定義され得る。
【００９７】
制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）は、ＤＮＡの相同配列における差異である。この多型は、特定の制限酵素または制限酵素の組合せを用いて、ＤＮＡの消化後に見出される断片長の差異によって検出され得る。ＲＦＬＰは、ゲル電気泳動またはサザンブロットによって判定され得る。
【００９８】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、蛍光プローブを、蛍光プローブの核酸配列に相補的な、固定された核酸配列の一部に結合させることによって実行される。ＦＩＳＨは、より大きな核酸配列内で核酸配列が出現する特定の位置にて、ＲＮＡまたはＤＮＡ内の標的核酸配列に蛍光タグを付けるために用いられ得る。例えば、ＦＩＳＨは、染色体上の標的配列にタグを付けるために用いられ得る。蛍光プローブは、蛍光顕微鏡を用いて見ることができる。
【００９９】
ＰＣＲは、２つのプライマーを用いて、特定の核酸配列の１つまたは複数のコピー（すなわち、アンプリコン）を増幅するのに用いられる。ＰＣＲ法は容易に利用可能であり、遺伝病を診断するのに一般的に用いられている。
【０１００】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものであり、核酸配列の総コピー数または相対コピー数を増幅すると同時に定量化するのに用いられる。ｑＰＣＲの一例として、リアルタイムＰＣＲがある。リアルタイムＰＣＲにおいて、ＰＣＲに由来する核酸コピー数または相対数が、リアルタイムで検出される。ｑＰＣＲによって生成されるコピーの数または相対数は、蛍光色素によって発生するシグナルを用いて検出かつ定量化され得る。
【０１０１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡ分子をＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）に転写してこのＤＮＡを増幅することによって、ＲＮＡ分子を検出する、または特定のＲＮＡ配列（例えばｍＲＮＡ）の発現レベルを判定するために用いられ得る方法である。ＲＴ−ＰＣＲは、ワンステッププロセスまたはツーステッププロセスによって実行され得る。
【０１０２】
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ）は、ゲノム全体のスケールで起こる染色体コピー数変異を判定するのに用いられるマイクロアレイ技術である。アレイＣＧＨは、試験ゲノムを正常な（例えば野生型）ゲノムと比較して、比較的小さな（例えば２００塩基対）構造変異ですらも検出する。例えば、アレイＣＧＨは、欠失、増幅、切断点、または異数性を検出することができる。アレイＣＧＨはまた、発癌の素因を検出するのに用いられ得る。
【０１０３】
多重アニーリングおよびループ化による増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）は、全ゲノム増幅法である。ＭＡＬＢＡＣは、単細胞の全ゲノム増幅に用いられ得る。ＭＡＬＢＡＣは、準線形的にゲノムを増幅し、かつあるＤＮＡ配列の優先増幅を回避するのに用いられ得る。ＭＡＬＢＡＣにおいて、アンプリコンが相補的な端部を有し、これらがアンプリコン中にループを形成するので、アンプリコンの指数関数的コピーを妨げ得る。アンプリコンループは、増幅バイアスを妨げ得る。ＭＡＬＢＡＣは、単一のｆＮＲＢＣを用いて胎児異常を診断するのに適用されてもよいし、単一のｆＮＲＢＣを用いて発癌の胎児素因を同定するのに用いられてもよい。
【０１０４】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、胎児異常を検出するのに用いられ得る一群の高スループット配列決定技術である。ＮＧＳ（例えば大規模並列シーケンシング）は、単細胞と同じくらい小さな細胞サンプルを用いて、核酸配列の大きなストレッチまたは全ゲノムを配列決定する。例えば、ＮＧＳにおいて、多くの比較的小さな核酸配列が、小さなセグメントのライブラリ由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルから同時に配列決定（すなわち、リード）され得る。リードはその後、再構成されて、染色体の大きな核酸配列または完全な核酸配列が同定され得る。例えば、ＮＧＳにおいて、５００，０００もの配列決定操作が同時にランされ得る。ＮＧＳは、単細胞の、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）の形態である。例えば、従来のＰＣＲを伴う場合、ＭＡＬＢＡＣがＮＧＳに用いられ得る。
【０１０５】
大規模並列処理特徴シーケンシング（ＭＰＳＳ）は、ＮＧＳの一例である。ＭＰＳＳは、１７〜２０塩基対のシグネチャプライマー配列からのｍＲＮＡ転写物を識別する。ＭＰＳＳは、サンプル中のｍＲＮＡ転写物を同定し、かつこれを定量するのに利用され得る（Brenner et al., 2000, Nature biotechnology 18(6): 630-634, 2000）。
【０１０６】
ポロニーシーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。ポロニーシーケンシングは、何百万もの固定化ＤＮＡ配列を同時に読むのに用いられ得る。ポロニーシーケンシングは、非常に正確である（エラー率が低い）ことが見出されたマルチプレックス配列決定技術である（Shendure et al., 2004. Nature Reviews Genetics 5(5): 335-344, 2004、Shendure et al., 2008, Nature Biotech 26(10): 1135-1145）。
【０１０７】
４５４パイロシーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。４５４パイロシーケンシングは、ルシフェラーゼを利用して、発生期のＤＮＡに加えられる個々のヌクレオチドを検出するものである。４５４パイロシーケンシングは、油溶液中の水の小滴内に含有されるＤＮＡを増幅する。水の各小滴が、プライマーコーティングされたビーズに付着した１つのＤＮＡテンプレートを含有する（Vera et al., 2008, Molecular Ecology 17(7): 1636-1647）。
【０１０８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングにおいて、ＤＮＡ分子およびプライマーが、スライドに付着する。ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼによって増幅されて、ＤＮＡコロニー（ＤＮＡクラスタ）が形成される（Shendure et al., 2008, Nature Biotech 26(10): 1135-1145、Meyer et al., 2010, Cold Spr Hbr Protocols 2010(6): pdb-prot 5448）。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドのライゲーションおよび検出によるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）は、ＮＧＳの別の例である。ＳＯＬｉＤシーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシング法である。ＳＯＬｉＤシーケンシングは、何千もの小さな配列リードをランダムに同時に生成して、配列決定用の固体支持体上にＤＮＡ断片を固定する（Shendure et al., 2008, Nature Biotech 26(10): 1135-1145、Meyer et al., 2009, New Biotechnology 25(4): 195-203）。
【０１１０】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシングは、ＤＮＡ重合中に放出される水素イオンを検出する、合成による配列決定法である。デオキシリボヌクレオチド三リン酸が、配列決定されるべきテンプレートＤＮＡ鎖を含有するマイクロウェル中に導入される。ｄＮＴＰが、リーディングテンプレートヌクレオチドと相補的である場合、ｄＮＴＰは相補的なＤＮＡ鎖中に組み込まれて、水素イオンが放出される（Quail et al., 2012, BMC Genomics 13(1): 341）。
【０１１１】
ＤＮＡナノボールシーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。ＤＮＡナノボールシーケンシングは、生物、例えば新たに発見された生物等の全ゲノム配列を決定するのに用いられ得る。ゲノムＤＮＡの小断片が、ローリングサークル複製を用いて増幅されて、ＤＮＡナノボールが形成される。ＤＮＡ配列はその後、蛍光プローブをガイドとして用いてライゲーションされ得る（Ansorge et al., 2009, New Biotechnology 25(4): 195-203、Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81）。
【０１１２】
Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシングは、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅を必要としない直接配列決定アプローチである。ＤＮＡが剪断されて、ポリＡ尾部が付けられてから、オリゴ（ｄＴ）によりフロー細胞の表面にハイブリダイズされる。何十億もの分子がその後、同時に配列決定され得る（Pushkarev et al., 2009, Nature Biotechnology 27(9): 847-850）。
【０１１３】
単分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングは、ＮＧＳの別の例である。ＳＭＲＴシーケンシングは、合成による配列決定アプローチである。ＤＮＡが、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）と呼ばれる小さなウェル様コンテナ中で合成される。ＺＭＷの底部に付着した未修飾ポリメラーゼが、溶液中に自由に流れる蛍光標識ヌクレオチドと協働して、ＤＮＡを配列決定するのに用いられる。ヌクレオチドがＤＮＡ鎖中に組み込まれると、蛍光標識がヌクレオチドから切り離される（Flusberg et al., 2010, Nature methods 7(6): 461-465）。
【０１１４】
ウルトラディープシーケンシングは、多くのテンプレートコピーから核酸配列が決定される回数に言及する。ウルトラディープシーケンシングは、稀な突然変異を含有するかもしれない比較的小さな標的核酸配列を増幅することによって、稀な遺伝的突然変異を同定するのに用いられ得る。
【０１１５】
ＤＮＡマイクロアレイは、複数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するのに用いられ得る。ＤＮＡマイクロアレイはまた、ゲノムの遺伝子型複数領域に用いられ得る。例えば、出生前染色体マイクロアレイ（ＣＭＡ）が、コピー数変異、例えば染色体の異数性を検出するのに用いられ得る。出生前ＣＭＡは、染色体の全てまたは一部の欠失または重複を検出し得る。
【０１１６】
５．８．キット
本開示はさらに、本開示のポジティブ免疫選択法に有用な１つまたは複数の抗体であって、先の５．３．２節に記載されるような抗体を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは抗体４Ｂ９を含む。抗体は、検出可能な部分、例えば、ビオチンまたは蛍光部分に付着し得る。抗体がビオチン化されるならば、キットはアビジンコンジュゲートされた検出試薬（すなわち、抗体）を含んでいてもよい。
【０１１７】
キットはまた、１つまたは複数のネガティブ免疫選択抗体、例えば先の５．３．４節に記載される標的に対する抗体を含んでいてもよい。ネガティブ免疫選択抗体は好ましくは、ポジティブ免疫選択抗体に付着する検出可能部分と区別可能である検出可能部分に付着する。
【０１１８】
キットはまた、ｆＮＲＢＣのより良好な選択のための核染色剤を含んでいてもよい。
【０１１９】
ｆＮＲＢＣの濃縮用抗体を用いるのに有用なバッファ等は、当該技術において周知であり、エンドユーザによって調製されてもよいし、キットの構成要素として提供されてもよい。キットはまた、ポジティブコントロール組織サンプルおよびネガティブコントロール組織サンプル、例えば、ポジティブコントロールとしての胎児肝細胞および／またはネガティブコントロールとしての成体血液もしくは成体血液の細胞成分を含有する固体支持体を含んでいてもよい。
【０１２０】
キットはまた、胎児細胞診断に適した１つまたは複数の試薬、例えば先の５．７節に記載される診断法を実行するのに適した試薬を含んでいてもよい。例示的な実施形態において、試薬として、例えばＰＣＲもしくは配列決定用の、プライマー、および／または、場合により、例えば胎児細胞異常の検出用の、プローブが挙げられる。
【０１２１】
６．例示的なワークフロー
図１および図２は、ｆＮＲＢＣの濃縮および／または単離のための一部の例示的なワークフローを示す。本開示の方法は、図１もしくは図２に表される完全な一ワークフロー、またはｆＮＲＢＣを濃縮または単離するのに適したワークフローからのステップの組合せを伴ってもよい。
【０１２２】
図１を参照すると、例示的なワークフローが、前濃縮ステップ（３）から始まり、濃縮（４）が続く。前濃縮は、５．２節または７．１節の方法に従って実行され得る。濃縮は、例えば５．３節、７．２節、および７．３節に記載される、磁気細胞ソーティングを用いたポジティブ選択および／またはネガティブ選択を伴ってよい。結果として生じた細胞集団は、（ｉ）直接的にソートされ（４ｂ）、かつ分析され（７）、（ｉｉ）顕微操作されて、個々のｆＮＲＢＣもしくはｆＲＮＢＣのプールが単離され（４ａ）、かつ分析され（７）、（ｉｉｉ）蛍光染色され（５）、フローサイトメトリーにかけられ（６）、直接的にソートされ（６ｂ）、かつ分析（７）され、または（ｉｖ）フローサイトメトリーにかけられ（６）、顕微操作されて、個々のｆＮＲＢＣもしくはｆＮＲＢＣのプールが単離され（６ａ）、分析される（７）。顕微操作は、７．６節に記載されるように実行されてよい。分析は、ｆＮＲＢＣの、胎児のものであるかの確認（例えば、５．６節に記載される）を試験すること、および／または下流の分析、例えば、多胎妊娠または胎児異常（例えば、５．７節に記載される）について試験することを伴ってよい。ｆＮＲＢＣゲノムは、確認および／または下流の分析の前に、全ゲノム増幅にかけられてよい。同じ核酸サンプル（細胞から直接抽出されたもの、または増幅、例えば全ゲノム増幅後のもの）は、確認および下流の分析の両方に用いられてよい。前濃縮（３）および濃縮（４）は、７節に記載される例示的なプロトコルのいずれの組合せ＃１〜＃１８も使用することができる。フローサイトメトリーを伴うワークフローについて、濃縮された（例えば、磁気的にソートされた）細胞集団は、フローサイトメトリーの前に、例えば７節に記載されるように、蛍光染色されてよい。染色は、直接的に標識された免疫選択抗体および／または核色素（例えば、５．３．５節に記載される）を利用してもよいし、標識されている二次抗体を利用してもよい。一部の実施形態において、磁気ソーティングに用いられる一次抗体を標識するのに二次抗体が用いられる。一部の実施形態において、一次抗体は４Ｂ９である。一部の実施形態において、フローサイトメトリーは、ｆＮＲＢＣの選択用の少なくとも２つまたは少なくとも３つの試薬、例えば、以下のいずれか２つまたは３つ全てを利用する：４Ｂ９抗体、抗ＣＤ２３５ａ抗体、および核染色剤。ポジティブ選択が用いられるならば、モノクローナル抗体４Ｂ９は、ポジティブ選択試薬として用いられ得る。ネガティブ選択が用いられるならば、抗ＣＤ４５抗体は、ネガティブ選択試薬として用いられ得る。
【０１２３】
また、図１を参照すると、別の例示的なワークフローが、前濃縮ステップ（３）から始まり、蛍光染色（５）およびフローサイトメトリー（６）が続く。フローサイトメトリーの後に直接ソーティング（６ｂ）および分析（７）が続いてもよいし、個々のｆＮＲＢＣまたはｆＲＮＢＣのプールを単離する顕微操作（６ａ）および分析（７）が続いてもよい。顕微操作は、７．６節に記載されるように実行されてよい。分析は、ｆＮＲＢＣの、胎児のものであるかの確認（例えば、５．６節に記載される）を試験すること、および／または下流の分析、例えば、多胎妊娠または胎児異常（例えば、５．７節に記載される）について試験することを伴ってよい。ｆＮＲＢＣゲノムは、確認および／または下流の分析の前に、全ゲノム増幅にかけられてよい。同じ核酸サンプル（細胞から直接抽出されたもの、または増幅、例えば全ゲノム増幅後のもの）は、確認および下流の分析の両方に用いられてよい。フローサイトメトリーの前に、前濃縮された細胞集団は、例えば本節に記載されるように、蛍光染色されてよい。染色は、直接的に標識された免疫選択抗体および／または核色素（例えば、５．３．５節に記載される）を利用してもよいし、標識されている二次抗体を利用してもよい。一部の実施形態において、フローサイトメトリーは、ｆＮＲＢＣの選択用の少なくとも２つまたは少なくとも３つの試薬、例えば、以下のいずれか２つまたは３つ全てを利用する：４Ｂ９抗体、抗ＣＤ２３５ａ抗体、および核染色剤。
【０１２４】
図２を参照すると、例示的なワークフローが、例えば７．１節に記載される、Ｆｉｃｏｌｌ分離ステップから始まり、例えば５．３節、７．２節、および７．３節に記載される、磁気細胞ソーティング（ネガティブおよび／またはポジティブ）が続き、（Ａ）ＦＩＳＨ、（Ｂ）個々のｆＮＲＢＣもしくはｆＲＮＢＣのプールを単離する顕微操作、または（Ｃ）ＦＮＲＢＣをソートするＦＡＣＳが続く。ＦＡＣＳの後に顕微操作が続いてもよい。顕微操作（Ｂ）は、７．６節に記載されるように実行されてよい。顕微操作の後、選択されたｆＮＲＢＣは、胎児のものであるか確認されてよく（例えば、５．６節に記載される）、かつ／または下流の分析、例えば、多胎妊娠または胎児異常（例えば、５．７節に記載される）についての試験にかけられてよい。ｆＮＲＢＣゲノムは、確認および／または下流の分析の前に、全ゲノム増幅にかけられてよい。同じ核酸サンプル（細胞から直接抽出されたもの、または増幅、例えば全ゲノム増幅後のもの）は、確認および下流の分析の両方に用いられてよい。Ｆｉｃｏｌｌ分離および磁気細胞ソーティングステップは、７節に記載される例示的なプロトコルのいずれの組合せ＃１〜＃１８も利用することができる。ＦＡＣＳソーティングを伴うワークフローについて、磁気的にソートされた細胞集団は、ＦＡＣＳの前に、例えば７節に記載されるように、蛍光染色されてよい。染色は、直接的に標識された免疫選択抗体および／または核色素（例えば、５．３．５節に記載される）を利用してもよいし、標識されている二次抗体を利用してもよい。ある態様において、二次抗体が、ＦＡＣＳ分析のための磁気ソーティングに用いられる一次抗体を標識するのに用いられる。一部の実施形態において、一次抗体は、４Ｂ９である。一部の実施形態において、ＦＡＣＳソーティングは、ｆＮＲＢＣの選択用の少なくとも２つまたは少なくとも３つの試薬、例えば、以下のいずれか２つまたは３つ全てを利用する：４Ｂ９抗体、抗ＣＤ２３５ａ抗体、および核染色剤。磁気ソーティングがポジティブ選択に用いられるならば、モノクローナル抗体４Ｂ９は、ポジティブ選択試薬として用いられ得る。磁気ソーティングがネガティブ選択に用いられるならば、抗ＣＤ４５抗体は、ネガティブ選択試薬として用いられ得る。
【０１２５】
ｆＮＲＢＣの分析を伴う前述の各ワークフローの一部の実施形態において、ｆＮＲＢＣゲノムは、染色体コピー数について分析される。染色体コピー数は、ＦＩＳＨによって分析されてもよいし、細胞から増幅されたＤＮＡの定量によって、例えば、全ゲノム増幅または定量ＰＣＲによって分析されてもよい。
【０１２６】
７．例示的なプロトコル
７．１節の密度分離プロトコル、７．２節のネガティブ選択プロトコル、および／または７．３節のポジティブ選択プロトコルの種々の組合せが、ｆＮＲＢＣおよび母親細胞、例えば母体血液を含むサンプルからＮＲＢＣを濃縮するのに用いられる。例えば、以下のプロトコルの組合せが、本開示の範囲内である。濃縮の後、濃縮されたＮＲＢＣは、更なる分析のために、例えば７．４節に記載される蛍光染色にかけられてよい。分析の前に、ＮＲＢＣはさらに、ＦＡＣＳによって、例えば図１および図２に示されるワークフローを利用することによって、濃縮されてよい。
【０１２７】
組合せ＃１：密度分離プロトコル＃１とポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１２８】
組合せ＃２：密度分離プロトコル＃１とポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１２９】
組合せ＃３：密度分離プロトコル＃２とポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１３０】
組合せ＃４：密度分離プロトコル＃２とポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１３１】
組合せ＃５：密度分離プロトコル＃３とポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１３２】
組合せ＃６：密度分離プロトコル＃３とポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１３３】
組合せ＃７：密度分離プロトコル＃１と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１３４】
組合せ＃８：密度分離プロトコル＃１と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１３５】
組合せ＃９：密度分離プロトコル＃２と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１３６】
組合せ＃１０：密度分離プロトコル＃２と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１３７】
組合せ＃１１：密度分離プロトコル＃３と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃１。
【０１３８】
組合せ＃１２：密度分離プロトコル＃３と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃２。
【０１３９】
組合せ＃１３：密度分離プロトコル＃１とポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４０】
組合せ＃１４：密度分離プロトコル＃２とポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４１】
組合せ＃１５：密度分離プロトコル＃３とポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４２】
組合せ＃１６：密度分離プロトコル＃１と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４３】
組合せ＃１７：密度分離プロトコル＃２と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４４】
組合せ＃１８：密度分離プロトコル＃３と、ネガティブ選択プロトコル＃１と、ポジティブ選択プロトコル＃３。
【０１４５】
７．１．密度分離
７．１．１．密度分離プロトコル＃１
以下の例示的な密度分離プロトコル＃１は、本開示の方法に用いるのに適している：
１．ある量の密度分離媒体を、多孔質バリアが管内に配置された遠心管、例えばＬｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）管に加える。多孔質バリアの下方において管を媒体で満たすために、管を、例えば２３０×ｇにて１分間、遠心分離する。管に加える媒体の量は、遠心分離後の多孔質バリアの下方における管の部分を満たすのに十分な量であるべきである。遠心分離後、もし残っていれば、多孔質バリアよりも上方にある媒体は全て捨てる。多孔質バリアの無い遠心管が、本開示の方法において密度分離に用いられてもよいが、多孔質バリアを有する遠心管を用いれば、サンプルが媒体と混合するのが妨げられ、不連続勾配が維持され、かつ分離が向上する。
２．ある量の血液を遠心管に加える。血液を処理して、例えば血液を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ  ７．２等のバッファで希釈して、分離の向上を補助してよい。ゆえに、遠心管に加える血液を処理してよく、例えばバッファで希釈する。
３．管を遠心分離して、例えば管を１０００×ｇにて２０分間遠心分離することによって、多孔質バリアの上方に、プラズマ層および濃縮された細胞画分を形成させる。
４．多孔質バリアの上方にある全て（血漿、ＰＢＭＣその他）を第２の遠心管に移す。
５．洗浄バッファ、例えば、ＰＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２を第２の遠心管に加えて混合する。その後、第２の遠心管を、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
６．ペレットを乱すことなく、上澄みを完全に吸引除去する。
７．ペレットを洗浄バッファで再懸濁させる。
８．再懸濁したペレットを遠心分離して細胞を再びペレット化させる。
９．ペレットを乱すことなく、上澄みを完全に吸引除去する。
【０１４６】
洗浄ステップ５〜９は、密度分離媒体および血漿を濃縮細胞から取り除いて、以降の処理ステップの収率を向上させることができる。
【０１４７】
７．１．２．密度分離プロトコル＃２
ステップ２の後にリンスステップ２．１を加えることによって改変された密度分離プロトコル＃１が、密度分離プロトコル＃２である：
２．１  ステップ２において遠心管に加えられた血液を含有したコンテナに洗浄バッファを加えてから、洗浄バッファを遠心管に加える。
【０１４８】
このリンスステップ２．１は、ｆＮＲＢＣの収率を増大させることができる。
【０１４９】
７．１．３．密度分離プロトコル＃３
ステップ４を以下のステップ４と入れ替えることによって改変された密度分離プロトコル＃２が、密度分離プロトコル＃３である：
４．血漿層を遠心管から取り除いて、捨てる。多孔質バリアの上方に残留する液体を第２の遠心管に移す。
【０１５０】
洗浄ステップ５〜９の前に血漿層を取り除いて、より純粋な濃縮細胞集団を提供することができる。
【０１５１】
７．２．ネガティブ選択
本開示の一部の実施形態において、ｆＮＲＢＣおよび母親細胞を含むサンプルが、母親細胞のサンプルを枯渇させるネガティブ選択にかけられる。一部の実施形態において、ネガティブ選択は、抗ＣＤ４５抗体に結合したマイクロビーズによる磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を利用する。
【０１５２】
７．２．１．ネガティブ選択プロトコル＃１
以下の例示的なネガティブ選択プロトコル＃１が、本開示の方法に用いるのに適している：
１．密度分離プロトコル＃１〜＃３のいずれか１つに由来する最終ペレットを、ＭＡＣＳランニングバッファ、例えばａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で再懸濁させる。
２．サンプルを、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
３．上澄みを完全に吸引除去する。
４．細胞ペレットをＭＡＣＳランニングバッファ中に再懸濁させる。
５．ＣＤ４５マイクロビーズ（すなわち、抗ＣＤ４５抗体に付着したマイクロビーズ）をサンプルに加え、混合してインキュベートすることでＣＤ４５マイクロビーズを母親細胞に結合させる。
６．ＭＡＣＳランニングバッファをサンプルに加えて混合する。その後、サンプルを、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。上澄みを完全に吸引除去する。
７．ペレットをＭＡＣＳランニングバッファ中に再懸濁させる。
８．ＭＡＣＳカラムをメーカーの説明書に従って用いて、細胞を磁気的にソートして、ＣＤ４５ネガティブ画分およびＣＤ４５ポジティブ細胞画分を得る。
【０１５３】
ステップ１〜３は、残留洗浄バッファを細胞から取り除く。洗浄ステップ６は、結合していないＣＤ４５マイクロビーズをサンプルから取り除く。
【０１５４】
７．３．ポジティブ選択
本開示の一部の実施形態において、ｆＮＲＢＣおよび母親細胞を含むサンプルが、抗体４Ｂ９を用いたポジティブ選択にかけられる。
【０１５５】
７．３．１．ポジティブ選択プロトコル＃１
以下の例示的なポジティブ選択プロトコル＃１が、本開示の方法に用いるのに適している：
１．ネガティブ選択プロトコル＃１によって得られたｆＮＲＢＣを含む懸濁液から始めるならば、懸濁液を、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して細胞をペレット化させて、上澄みを完全に吸引除去する。密度分離プロトコル＃１〜＃３のいずれかに由来する細胞ペレットから始めるならば、ステップ２から始める。
２．ペレットをＭＡＣＳランニングバッファ中に再懸濁させる。
３．ＦｃＲブロッキング試薬、例えばＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて、よく混合する。ＦｃＲブロッキング試薬は、非特異的なＦｃレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
４．ビオチン化された４Ｂ９を加える；インキュベートすることで、ビオチン化された４Ｂ９をｆＮＲＢＣに結合させる。
５．ＭＡＣＳランニングバッファをサンプルに加える；例えば３００×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
６．上澄みを完全に吸引除去する。
７．ＭＡＣＳランニングバッファをサンプルに加えて、サンプルを、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
８．上澄みを完全に吸引除去する。
９．ペレットをＭＡＣＳランニングバッファ中に再懸濁させる。
１０．ＦｃＲブロッキング試薬をサンプルに加えて、ステップ１１における非特異的なＦｃレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
１１．抗ビオチンマイクロビーズをサンプルに加える；インキュベートすることで、マイクロビーズは、ビオチン化された４Ｂ９に結合することができる。
１２．ＭＡＣＳランニングバッファをサンプルに加えて、混合する。その後、サンプルを、例えば４５０×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。上澄みを完全に吸引除去する。
１３．ＭＡＣＳランニングバッファをサンプルに加える。
１４．ＭＡＣＳカラムをメーカーの説明書に従って用いて、細胞を磁気的にソートして、４Ｂ９ポジティブ画分および４Ｂ９ネガティブ画分を得る。
【０１５６】
ステップ５〜８は、結合していないビオチン化４Ｂ９をサンプルから取り除く。洗浄ステップ１２は、結合していない抗ビオチンマイクロビーズをサンプルから取り除く。
【０１５７】
７．３．２．ポジティブ選択プロトコル＃２。
ビオチン化４Ｂ９を、非コンジュゲート型４Ｂ９と入れ替え、かつ抗ビオチンマイクロビーズを抗ＩｇＭマイクロビーズと入れ替えることによって改変されたポジティブ選択プロトコル＃１が、ポジティブ選択プロトコル＃２である。
【０１５８】
７．３．３．ポジティブ選択プロトコル＃３
非コンジュゲート型４Ｂ９（ＩｇＭモノクローナル抗体）とインキュベートし、洗浄して非結合型４Ｂ９抗体を取り除き、４Ｂ９でコーティングされた細胞をヤギ抗マウスＩｇＭマイクロビーズと結合させてから洗浄し、結果として生じた細胞を再懸濁させて遠心分離することによって、４Ｂ９＋細胞が選択される。遠心分離の後、上澄みを破棄して、ペレットをＰＢＳ等のバッファ中に再懸濁させる。
【０１５９】
７．４．染色
本開示の一部の実施形態において、本開示に従って調製されたｆＮＲＢＣを含むサンプルが蛍光染色されて、例えばＦＡＣＳによる、視覚化、ソーティング、および／または単離されたｆＮＲＢＣの選出が可能となる。
【０１６０】
７．４．１．染色プロトコル＃１
以下の例示的な染色プロトコル＃１が、ｆＮＲＢＣを含むサンプルを蛍光染色するのに用いられ得る：
１．先の組合せ＃１〜＃１８のいずれか１つに従って調製された４Ｂ９ポジティブ画分を、例えば４００×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
２．上澄みを吸引除去する。
３．蛍光マスター混合物をサンプルに加えてインキュベートする。マスター混合物は、先に記載されるプロトコルのいずれかに従って濃縮されたｆＮＲＢＣを検出するのに適した標識マーカー、例えばストレプトアビジンＡｌｅｘａ  ４８８および／またはヤギ抗マウスＩｇＭ  Ａｌｅｘａ  ４８８、ならびに核マーカー、例えばＨｏｅｃｈｓｔを含有する。
４．バッファ、例えば０．５％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳをサンプルに加えて、細胞を洗浄する。
５．サンプルを、例えば４００×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
６．上澄みを吸引除去する。
７．ペレットを適切なバッファ、例えば１×ＰＢＳ中に再懸濁させる。
【０１６１】
７．４．２．染色プロトコル＃２
以下の例示的な染色プロトコル＃２もまた、ｆＮＲＢＣを含むサンプルを蛍光染色するのに用いられ得る：
１．先の組合せ＃１〜＃１８のいずれか１つに従って調製された４Ｂ９ポジティブ画分を、例えば４００×ｇにて１０分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
２．ペレットをバッファ、例えば１×ＰＢＳ中に再懸濁させる。
３．ＦｃＲブロッキング試薬を加えて、ステップ４における非特異的なＦｃレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
４．非コンジュゲート型４Ｂ９をサンプルに加える；サンプルをインキュベートすることで、４Ｂ９はｆＮＲＢＣに結合することができる。
５．蛍光マスター混合物をサンプルに加えてインキュベートする。マスター混合物は、ｆＮＲＢＣを検出するのに適した標識マーカー、例えばＣＤ２３５ａ−ＰＥおよび／またはヤギ抗マウスＩｇＭ  Ａｌｅｘａ  ４８８、ならびに核マーカー、例えばＤＣルビーを含有する。
６．バッファ、例えば１×ＰＢＳをサンプルに加えて、細胞を洗浄する。
７．サンプルを、例えば３００×ｇにて５分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
８．上澄みを吸引除去する。
９．ペレットを適切なバッファ、例えば１×ＰＢＳ中に再懸濁させる。
【０１６２】
先のプロトコルにおいて用いられる適切な試薬の容量および濃度、温度、混合時間、遠心分離時間、遠心分離力、ならびに具体的な試薬が、当業者よって選択され得る。同様に、当業者であれば、プロトコルの基本的な操作を変更することなく、洗浄ステップが加えられても、先のプロトコルから省略されてもよいことを理解するであろう。
【０１６３】
７．５．下流の分析のための調製
ｆＮＲＢＣを含有する元の生物学的サンプル、または先に記載される方法ステップのいずれかによってｆＮＲＢＣが濃縮されたサンプルは、ｆＮＲＢＣを濃縮または単離するための更なる処理にかけられてよい。
【０１６４】
適切には、オートメーション化された細胞分離技術が用いられる。そのような技術の例として、限定されないが、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、限外濾過、マイクロフルイディクス、またはこれらの方法の２つ以上のあらゆる組合せが挙げられる。ＦＡＣＳは、ｆＮＲＢＣをさらに濃縮または単離するために、ＦＡＣＳ機器メーカーによって提供される標準的な手順および説明書を用いて実行されてよい。本明細書中に記載される方法に従ってｆＮＲＢＣを単離するのに用いられ得る例示的なＦＡＣＳゲーティング、および結果として生じたデータセットが、図３および図７に示される。
【０１６５】
ｆＮＲＢＣはまた、マニュアルの方法、例えば顕微操作によって単離されてもよい。当該技術において知られている、または以下の７．６節に記載される顕微操作技術を用いて、個々のｆＮＲＢＣが選出または単離され得る。
【０１６６】
濃縮の後、細胞は、下流の分析、例えばゲノムＤＮＡのショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析、ＤＮＡフィンガープリント法、染色体コピー数の分析、ならびに／または胎児細胞であることの確認、胎児異常もしくは疾患の診断、および胎児特性の試験のための他の方法にかけられてもよい。
【０１６７】
７．６．顕微操作による細胞選出
細胞の単離のために、市販のマイクロマニピュレータが、逆位相コントラスト顕微鏡に取り付けられる。顕微鏡は、種々の対物レンズ、蛍光フィルター、カメラ、モニタ、およびジョイスティックで操作されるマイクロマニピュレータプラットホームが装備される。顕微操作は、３本の直線軸（Ｘ、ＹおよびＺ方向）で構成される。
【０１６８】
ポジティブ選択された画分から得られ、かつ種々の抗体で蛍光染色された細胞が、予めクリーニングされた顕微鏡のスライド上に置かれて、キャピラリー先端部にある開口部の直径がｆＮＲＢＣのサイズに構成された滅菌キャピラリー管によって単離される。蛍光染色は、胎児細胞を認識する、４Ｂ９（Zimmermann et al., 2013, Exp Cell Res 319:2700-2707）、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ７１、抗グリコホリンＡ、および抗ｉ抗原（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35、Calabrese et al., 2012, Clin Genet. 82(2):131-9）から選択される１つまたは複数の抗体に対応してよい。例えばＦＩＳＨを実行するために、細胞が固定されるならば、報告によると非常に特異的な原始胎児赤芽球識別子である抗イプシロングロビン（Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35、Choolani et al., 2001, Blood 98:554-7）が用いられてよい。
【０１６９】
蛍光染色ステップ中に用いられる各抗体は、それ専用の、顕微鏡の特異的な蛍光フィルターに対応し、接眼レンズを通して視覚化され、かつ／または波長に依存してモニタリングされる。
【０１７０】
蛍光マーカーに加えて、ｆＮＲＢＣの選択基準は、ヘモグロビン含有量（Ｓｏｒｅｔフィルターによって検出可能である）および形態的特徴であってもよい。原始ｆＮＲＢＣは、核に対する細胞質の比率が高く、かつサイズが比較的大きい（Huang et al., 2011, J Cell Biochem. 112:1475-85、Choolani et al., 2003, Mol Hum Repro 9:227-35）という顕著な形態的特徴を有する。
【０１７１】
所望の形態、核対細胞比、および蛍光染色パターンを有する細胞が、マイクロマニピュレータによって手動で選び出されて、下流の分析用の０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブ内に入れられる。
【０１７２】
記載される例示的なプロトコルは、以下の表１に示されるｆＮＲＢＣを含有する濃縮細胞集団を得るために用いられた。
【０１７３】
【表１】
2017521091.tif 000003
【０１７４】
（実施例１）
８．密度分離＋ＭＡＣＳによって母体血液から単離したｆＮＲＢＣのＦＩＳＨ分析
男性胎児を妊娠した５から１６週目の４０人の女性から得た母体末梢血サンプルを、密度分離プロトコル＃３およびポジティブ選択プロトコル＃２に従って処理して、ｆＮＲＢＣを含有する磁気細胞分離「スープ」（ＭＣＳＳ）を得た。細胞をスライドに固定して、ＦＩＳＨを用いて分析し、Ｘ染色体およびＹ染色体を同定した。
【０１７５】
スライドを顕微鏡下で見て、１サンプルにつき、Ｙ染色体を有する少なくとも５個の細胞を手動でカウントした。各サンプル中に存在するＹ染色体を有する細胞の平均数を判定する目的で、４０サンプルのうち１０サンプルをランダムに選択した。スライド全体を顕微鏡下でスキャンして、Ｙプローブをそれぞれ手動でカウントした。１０サンプルのそれぞれにおいてカウントしたｆＮＲＢＣ数を表２に示す。平均で、１サンプルあたり２４個のｆＮＲＢＣがカウントされた。
【０１７６】
【表２】
2017521091.tif 000004
【０１７７】
Ｘ染色体およびＹ染色体についてプロービングしたサンプル８由来の細胞の顕微鏡写真を図４に示す。
【０１７８】
密度分離およびＭＡＣＳを用いて母体血液から単離した胎児細胞の他の説明用のＦＩＳＨ画像を、図５および図６に示す。
【０１７９】
（実施例２）
９．胎児肝臓中のｆＮＲＢＣの特徴付け
フレッシュな、または凍結した単核胎児肝細胞を、妊娠期間の範囲が様々なドナーから得、液体窒素中に保存した。細胞は、対応する分析証明書のある承認ＩＲＢドナープログラム下で、外部ソースにより処理された。
【０１８０】
フレッシュな単核男性細胞を、ネガティブコントロールとして種々のドナーから得た。
【０１８１】
胎児肝臓単核細胞および男性単核細胞を、密度勾配分離を用いて処理した。一部の研究においては、ｆＮＲＢＣを含有する密度勾配画分の後に、ＭＡＣＳを用いた４Ｂ９によるポジティブ選択が続き、ＭＡＣＳでソートした４Ｂ９ポジティブ画分を、ＦＡＣＳによってソートした。他の研究においては、ｆＮＲＢＣを含有する密度勾配画分は、間に入るＭＡＣＳ選択プロセスなしで、ＦＡＣＳによりソートした。ＦＡＣＳソーティングに先立ち、４Ｂ９およびヤギ抗マウスＩｇＭ二次抗体、抗ＣＤ２３５ａ、ならびにＤＣ−Ｒｕｂｙを用いて、細胞を蛍光染色した。
【０１８２】
ＦＡＣＳソーティングは、様々なゲート領域（リンパ球および単球、ＣＤ２３５ａ＋、ならびにトリプルポジティブ（ＤＣＲｕｂｙ＋、４Ｂ９＋、ＣＤ２３５ａ＋）細胞）についての事象数、親画分に対する割合（％）、および総数に対する割合（％）を分析した。両方のサンプル型について観察したトリプルポジティブな事象の数は、以下の通りである：胎児肝細胞は、ソートした総事象の２０〜４５パーセントの範囲であり、男性細胞は０．０２〜０．１０パーセントの範囲であった。
【０１８３】
細胞を、対応する蛍光フィルターを備える顕微鏡でソートして視覚化した。胎児肝臓および男性単核細胞の分析により、細胞形態、核対細胞比、および蛍光染色パターンに基づく細胞の特徴付け、ならびにｆＮＲＢＣを含有する、ＦＡＣＳでソートした細胞集団の品質管理措置（quality control measure）の確立が可能となった。
【０１８４】
（実施例３）
１０．密度分離＋ＭＡＣＳ＋ＦＡＣＳによって混合細胞集団から単離した胎児肝臓ｆＮＲＢＣのＳＴＲ分析
本実施例は、スパイク実験を介して、本開示の方法がｆＮＲＢＣの濃縮を可能にすることを実証する。
【０１８５】
１０．１．混合細胞集団からの４Ｂ９＋濃縮細胞集団の調製
女性の４０００個の胎児肝細胞を、密度勾配遠心分離を介した単核細胞単離の前に、無関係な男性対象由来の正常な男性血液２５ｍＬ中に加えた。
【０１８６】
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離プロトコル＃２によって調製した。結果として生じた細胞集団を、ポジティブ選択プロトコル＃２に従ってポジティブ選択にかけた。
【０１８７】
細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８およびＤＣ−Ｒｕｂｙで染色してから、Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００細胞ソーターを用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってソートした。
【０１８８】
図８Ａは、４Ｂ９ネガティブ細胞画分のＦＳＣおよびＢＳＣの相関測定値を示しており、細胞型の分化が示される。図８Ｂは、４Ｂ９ネガティブ細胞画分由来のＦＳＣ対ＢＳＣに基づくリンパ球ゲートの細胞亜集団を示しており、有核細胞型および４Ｂ９細胞型が観察される。４Ｂ９陽性細胞画分が、図９Ａおよび図９Ｂに表される。図９Ｂは、上部右側の四分の一区分の有核４Ｂ９陽性細胞を示す。無核の４Ｂ９陽性細胞が、下部右側の四分の一区分に位置する。
【０１８９】
図９Ｂ中の上部の四角内にゲートインした事象（４Ｂ９ポジティブ：４３．５３％）を、ＳＴＲ分析用の０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブ中にソートして、この領域内に位置する細胞型を同定した。
【０１９０】
１０．２．４Ｂ９＋細胞画分の下流の分析
２３個のＳＴＲ遺伝子座および性特異的アメロゲニン多型遺伝子座の蛍光検出用のＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）５色キットを用いて、４Ｂ９＋画分のＳＴＲ（ショートタンデムリピート）分析を実行した。
【０１９１】
図１０〜図１３は、男性ゲノムＤＮＡ、胎児肝臓ゲノムＤＮＡ、および４Ｂ９ポジティブソーテッド画分の電気泳動図であり、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、およびＰＥＴについての、標識遺伝子座のピークが示される。
【０１９２】
図１０〜図１３に示される各チャンネル（それぞれＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、およびＰＥＴ）において、男性ゲノムＤＮＡ、胎児肝臓ゲノムＤＮＡ、および４Ｂ９ポジティブ画分について、ＳＴＲプロファイルを得た。
【０１９３】
図１０〜図１３中の４Ｂ９ポジティブ画分（下側のパネル）は、単離、濃縮、およびＦＡＣＳソーティングの後に、単離した細胞の大部分が胎児起源のものであったことを証明する。４Ｂ９ポジティブ画分についてのプロファイルは、男性肝プロファイルおよび胎児肝プロファイルの両方で構成された；しかしながら、主要な寄与因子は、胎児プロファイルであった。
【０１９４】
細胞のこの混合集団のプロファイルは、２つの異なる寄与因子に由来する大ピークおよび小ピークを含有した。対立遺伝子の存在、およびそれらのピークの以降の高さに基づいて、主要な寄与因子と主要でない寄与因子とを判定した。
【０１９５】
図１４は、４Ｂ９ポジティブ画分由来のＦＡＭチャンネルからの２つのマーカーを表す。ここで、マーカーＤ１０Ｓ１２４８が４つの対立遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を含有することが観察された。対立遺伝子ＡおよびＣが４つのピークの中で最も高く、かつ胎児起源である一方、対立遺伝子ＢおよびＤが、４つのピークの中で最も低く、かつ男性起源である（図１０参照）。マーカーＤ１３Ｓ３１７は、３つの対立遺伝子（Ｅ、Ｆ、およびＧ）しか含有しない。ここで、男性肝細胞および胎児肝細胞は、Ｆにて共通の対立遺伝子を共有し、最も高いピークがもたらされた。２番目に高いピークは胎児起源のＧであり、最も低いピークは男性起源のＥである。ゆえに、図１４は、胎児プロファイルが４Ｂ９ポジティブ画分由来のプロファイルの主要な寄与因子であったことを証明する。
【０１９６】
加えて、図１０は、性特異的遺伝子座アメロゲニン（ＡＭＥＬ）を含有し、これは、男性サンプルについて単一のＸ、ならびに女性サンプルについてＸおよびＹを含有する。４Ｂ９画分はＹ遺伝子座の存在を示さず、４Ｂ９ポジティブ画分の大部分が胎児細胞であり、男性細胞ではなかったことが重ねて強調される。
【０１９７】
本実施例は、少数の胎児肝細胞を、有意に多い数の雄性細胞中にスパイクした場合に、本明細書中に記載される単離法および濃縮法を用いて回収した細胞の大部分が胎児細胞であることを証明する。
【０１９８】
（実施例５）
１１．種々のプロトコルによって母体血液から単離したｆＮＲＢＣのＳＴＲ分析
１１．１．密度分離＋ＭＡＣＳによって母体血液から単離したｆＮＲＢＣのＳＴＲ分析
男性胎児または女性胎児のいずれかを妊娠した４から１４週目の４０人の女性から得た母体末梢血サンプルを、密度分離プロトコル＃１、ネガティブ選択プロトコル＃１、およびポジティブ選択プロトコル＃１に従って処理して、各サンプルについてＭＣＳＳをもたらした。サンプルを、染色プロトコル＃１に従って染色した。その後、４Ｂ９タグ付き細胞は、各ＭＣＳＳから選出してプールし、２３個のＳＴＲ遺伝子座および性特異的アメロゲニン多型遺伝子座の蛍光検出用のＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）ＳＴＲキットを用いて分析し、胎児性であることを確かめた。胎児の対立遺伝子を、サンプルの１００％で同定した。
【０１９９】
図１５〜図１８は、妊娠期間が７週目の、男性胎児を妊娠した女性から得た母体末梢血から処理したサンプルのＳＴＲ分析を示す。細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ  ＡＦ  ４８８、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ４８８、およびＨｏｅｃｈｓｔによるポジティブ選択後に蛍光染色した。手動で選出した１０個のプール細胞の２セットをＳＴＲ分析に用いた。図１５〜図１８に示される電気泳動図の４つのチャンネルのそれぞれにおいて、４つのＳＴＲプロファイルがある。全部にわたって、４つのプロファイルは以下の通りである：単離した４Ｂ９ポジティブ画分ＡおよびＢ（それぞれ）、母系ゲノムＤＮＡ、ならびに父系ゲノムＤＮＡ。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成した円は、母親プロファイルと父親プロファイル間で共有される単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された対立遺伝子を示す。均一長の短いダッシュによって形成した円は、単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を示す。
【０２００】
１１．２．密度分離＋ＭＡＣＳ＋ＦＡＣＳによって母体血液から単離したｆＮＲＢＣのＳＴＲ分析
１１．２．１．密度分離プロトコル＃２、ポジティブ選択プロトコル＃２、およびＦＡＣＳによって単離したｆＮＲＢＣ
ＳＴＲ分析を、密度分離プロトコル＃２、ポジティブ選択プロトコル＃２、およびＦＡＣＳによって、ネガティブ選択なしで処理した、妊娠女性由来の母体血液サンプルに実行した。図１９〜図２２は、妊娠期間が９週目の、男性胎児を妊娠した女性から得た母体末梢血から処理したサンプルのＳＴＲ分析を示す。細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ、ＣＤ２３５ａ、およびＤＣ−Ｒｕｂｙによるポジティブ選択後に蛍光染色し、ＦＡＣＳでソートし、手動で選出し、ＳＴＲ分析用に一緒にプールした。合計８個の細胞を選出した。図１９〜図２２の全部にわたって、３つのプロファイルが示される：母体ゲノムＤＮＡ、単離４Ｂ９ポジティブ画分、および父系ゲノムＤＮＡ。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成した円は、母親プロファイルと父親プロファイル間で共有される単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された対立遺伝子を示す。均一長の短いダッシュによって形成した円は、単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を示す。
【０２０１】
１１．２．２．密度分離プロトコル＃３、ポジティブ選択プロトコル＃２、およびＦＡＣＳによって単離したｆＮＲＢＣ
ＳＴＲ分析を、密度分離プロトコル＃３、ポジティブ選択プロトコル＃２、およびＦＡＣＳによって、ネガティブ選択なしで処理した、妊娠女性由来の母体血液サンプルに実行した。図２３〜図２６は、妊娠期間が１２週目の、男性胎児を妊娠した女性から得た母体末梢血から処理したサンプルのＳＴＲ分析を示す。細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ、ＣＤ２３５ａ、およびＤＣ−Ｒｕｂｙによるポジティブ選択後に蛍光染色し、ＦＡＣＳでソートし、ＳＴＲ分析用の０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブ中に直接ソートした。合計３５事象をソートした。チューブＡ〜Ｃは１０事象を含有し、チューブＤは５事象を含有した。図２３〜図２６の全部にわたって、４つのプロファイルが示される：母系ゲノムＤＮＡ、４Ｂ９ポジティブ画分から単離した２つの別々の反応物（それぞれチューブＣおよびＤ）、および父系ゲノムＤＮＡ。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成した円は、母親プロファイルと父親プロファイル間で共有される単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された対立遺伝子を示す。均一長の短いダッシュによって形成した円は、単離４Ｂ９ポジティブ画分において見出された、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を示す。
【０２０２】
（実施例６）
１２．単離したＮＲＢＣのフィンガープリンティング分析
母体末梢血の１００サンプルを、密度選択プロトコル＃３およびポジティブ選択プロトコル＃２に従って処理して、ＭＣＳＳをもたらした。ＭＣＳＳの細胞を、染色プロトコル＃２に従って染色した。その後、４Ｂ９タグ付き細胞を、ＦＡＣＳによって他の細胞および残渣から単離した。ＤＣ−Ｒｕｂｙ、ＣＤ２３５ａ、および４Ｂ９のトリプルポジティブな細胞を、スライド上にソートした。単細胞を顕微操作によって選出し、形態および蛍光に基づいてグレード分けした。
【０２０３】
全体で、２３５個の細胞を、ＷＧＡ、および単一ヌクレオチド多型プロファイルに基づくフィンガープリンティング分析用の１００母体血液サンプルから選択した。また、母親細胞を、ＷＧＡおよびフィンガープリンティング分析にもかけた。フィンガープリンティング分析は、母体血液から単離した２３５個の細胞中２３０個（すなわち、細胞の９７．３％）を胎児細胞と確認し、そして少なくとも１つの胎児細胞を、各母体血液サンプルから単離したと確認した。
【０２０４】
１３．特定の実施形態
本開示は、以下の具体的な実施形態によって例示される。
１．胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を調製する方法であって、ｆＮＲＢＣを含む生物学的サンプルをポジティブ免疫選択にかけることを含み、前記ポジティブ免疫選択は、
（ａ）液体培地中で生物学的サンプルを第１の抗体と接触させるステップであって、第１の抗体は、生物学的サンプル中の他の細胞（例えば、１つまたは複数の他の細胞型）と比較して選択的にｆＮＲＢＣに結合する、ステップと；
（ｂ）前記第１の抗体に結合した細胞を選択するステップと
を含む、方法。
２．生物学的サンプルをネガティブ免疫選択にかけることをさらに含み、前記ネガティブ免疫選択は、
（ａ）液体培地中で生物学的サンプルを第２の抗体と接触させるステップであって、第２の抗体は、ｆＮＲＢＣと比較して選択的に生物学的サンプル中の他の細胞と結合する、ステップと；
（ｂ）前記第２の抗体に結合しなかった細胞を選択するステップと
を含む、実施形態１の方法。
３．ポジティブ免疫選択は、ネガティブ免疫選択の前に実行される、実施形態２の方法。
４．ネガティブ免疫選択は、ポジティブ免疫選択の前に実行される、実施形態２の方法。
５．ポジティブ免疫選択およびネガティブ免疫選択は、同時に実行される、実施形態２の方法。
６．第１の抗体は、ｆＮＲＢＣ有核前駆細胞の表面上に存在する抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するＣＤ７１または他の表面抗原と結合しない、実施形態１から５のいずれか１つの方法。
７．第１の抗体は４Ｂ９であるか、またはｆＮＲＢＣ有核前駆細胞の表面への結合に関して４Ｂ９と競合する抗体である、実施形態６の方法。
８．複数の第１の抗体が用いられる、実施形態１から７のいずれか１つの方法。
９．ポジティブ免疫選択は、オートメーション化された方法を用いて実行される、実施形態１から８のいずれか１つの方法。
１０．オートメーション化された方法は、細胞ソーティング、限外濾過、またはマイクロ流体分離である、実施形態９の方法。
１１．第２の抗体は：
（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；
（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３２；
（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、場合によりＣＤ４５；
（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、場合によりＣＤ５６；
（ｅ）樹状細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および
（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１４またはＣＤ３３
から選択される細胞表面マーカーに対するものである、実施形態２から１０のいずれか１つの方法。
１２．複数の第２の抗体が用いられる、実施形態２から１１のいずれか１つの方法。
１３．複数の第２の抗体は、以下の細胞表面マーカーの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つに対する抗体を含む、実施形態１２の方法：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２３、ＣＤ１４、ＣＤ３２、およびＣＤ３３。
１４．ネガティブ免疫選択は、オートメーション化された方法を用いて実行される、実施形態２から１３のいずれか１つの方法。
１５．オートメーション化された方法は、細胞ソーティング、限外濾過、またはマイクロ流体分離である、実施形態１１の方法。
１６．密度分離法を用いてｆＮＲＢＣを濃縮することをさらに含む、実施形態１から１５のいずれか１つの方法。
１７．密度分離法は、前記ポジティブ免疫選択の前に実行される、実施形態１６の方法。
１８．顕微操作によってｆＮＲＢＣを単離することをさらに含む、実施形態１から１７のいずれか１つの方法。
１９．顕微操作は、ポジティブ免疫選択の後に実行される、実施形態１８の方法。
２０．生物学的流体は、血液、血漿、尿、または柔毛膜柔毛サンプリング（ＣＶＳ）生検もしくは経皮的臍帯血サンプリング由来の細胞の懸濁液を含む、実施形態１から１９のいずれか１つの方法。
２１．生物学的サンプルは、母体血液を含む、実施形態２０の方法。
２２．母体血液は、妊娠約５週目から約３８週目の妊娠中の対象から採取された母体血液サンプル由来である、実施形態２１の方法。
２３．実施形態１から２２のいずれか１つの方法によって調製される、または得ることができるｆＮＲＢＣの調製物。
２４．ｆＮＲＢＣに診断アッセイを実行することをさらに含む、実施形態１から２２のいずれか１つの方法。
２５．ｆＮＲＢＣを診断する方法であって、実施形態２３のｆＮＲＢＣの調製物に診断アッセイを実行することを含む方法。
２６．診断アッセイは、多胎妊娠の存在を判定するためのものである、実施形態２４または２５の方法。
２７．診断アッセイは、胎児異常の存在を判定するためのものである、実施形態２４または２５の方法。
２８．胎児異常は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース４−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第Ｘ因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱（Ｘ）症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ＸＸＸ症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖６−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病Ａ、血友病Ｂ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、１６ｐ１１．２欠失、１６ｐ１１．２重複、ミトコンドリア欠損、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、１ｐ３６欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症（因子ａ）、無精子症（因子ｂ）、無精子症（因子ｃ）、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、３−メチルクロトニル補酵素Ａカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、Ｔ細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ（フィンランド型）、ならびに多発性内分泌腫瘍である、実施形態２７の方法。
２９．診断アッセイは核酸アッセイである、実施形態２４から２８のいずれか１つの方法。
３０．核酸アッセイはＤＮＡアッセイであり、場合により、ＤＮＡアッセイはマイクロアレイ上で実行される、実施形態２９の方法。
３１．核酸アッセイは、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、またはＤＮＡ配列決定アッセイである、実施形態２９または３０の方法。
３２．核酸アッセイはＲＮＡアッセイであり、場合により、ＲＮＡアッセイは、マイクロアレイ上で実行される、実施形態２９の方法。
３３．ＲＮＡアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイまたはＦＩＳＨアッセイである、実施形態３２の方法。
３４．診断試験を実行する前に、ｆＮＲＢＣを溶解させ、または透過性にさせることをさらに含む、実施形態２９から３３のいずれか１つの方法。
３５．診断アッセイはタンパク質検出アッセイであり、場合により、タンパク質検出アッセイはマイクロアレイ上で実行される、実施形態２４から２８のいずれか１つの方法。
３６．タンパク質は抗体を用いて検出される、実施形態３５の方法。
３７．診断アッセイは組織学的アッセイである、実施形態２４から２８のいずれか１つの方法。
３８．診断試験用の胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）の調製方法であって、
（ａ）場合により、それぞれが胎児細胞表面を有する１個または複数個のｆＮＲＢＣ、およびそれぞれが母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと；
（ｂ）密度分離法によって複数の母親細胞の第１の部分から１個または複数個のｆＮＲＢＣを濃縮することによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣおよび残存する第１の数の母親細胞を含む第１の懸濁液を生成するステップと；
（ｃ）第１の懸濁液を、第１の分離可能な粒子に結合した第１の抗体とインキュベートするステップであって、第１の抗体は、母親細胞の母親細胞表面上に存在するが、ｆＮＲＢＣの胎児細胞表面上に存在しない第１の抗原と、第１の抗体が第１の抗原と結合する条件下で結合して、第１の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第１の粒子−細胞複合体を第１の懸濁液から分離して取り除くことによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣおよび残存する第２の数の母親細胞を含む第２の懸濁液を生成するステップと；
（ｄ）第２の抗体を第２の懸濁液に加えるステップであって、第２の抗体は、ｆＮＲＢＣの胎児細胞表面上に存在する第２の抗原と結合し、第２の抗原は、母親細胞表面上に存在しない、ステップ、第２の懸濁液を、第２の抗体が第２の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第２の抗体−細胞複合体を生成するステップ、ならびに第２の懸濁液から第２の抗体−細胞複合体を分離することによって、診断試験用の１個または複数個のｆＮＲＢＣを含む第３の懸濁液を生成するステップと
を含む調製方法。
３９．第１の抗体は抗ＣＤ４５抗体を含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４０．第２の抗体は、ｆＮＲＢＣ有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するＣＤ７１または他の表面抗原と結合しない、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４１．第２の抗体は４Ｂ９である、実施形態４０に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４２．ｆＮＲＢＣの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４３．ｆＮＲＢＣの細胞成分は、直接的に、または間接的に染色される、実施形態４２に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４４．顕微操作によって１個または複数個のｆＮＲＢＣを単離することをさらに含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４５．オートメーション化された分離技術によってｆＮＲＢＣを単離し、またはさらに濃縮することをさらに含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４６．オートメーション化された分離は、細胞ソーティング、限外濾過、およびマイクロ流体分離技術からなる群から選択される方法によって実行される、実施形態４５に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４７．ｆＮＲＢＣは、１個または複数個の原始赤芽球を含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４８．ｆＮＲＢＣは、１個または複数個の完全赤芽球を含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
４９．生物学的流体は、血液、血漿、尿、または柔毛膜柔毛サンプリング（ＣＶＳ）生検もしくは経皮的臍帯血サンプリング由来の細胞の懸濁液を含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５０．生物学的流体は母体血液を含む、実施形態４４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５１．母体血液は、妊娠約５週目から約３８週目の妊娠中の対象から採取された血液サンプル由来である、実施形態５０に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５２．第２の抗体は、検出可能な標識が標識されている、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５３．検出可能な標識は、蛍光標識、酵素標識、放射性同位元素標識、または化学反応性の連結剤を含む、実施形態５２に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５４．濃縮したｆＮＲＢＣを溶解させて、１つまたは複数の核酸を含む溶解ｆＮＲＢＣを生成することと、１つまたは複数の核酸配列を分析することと、それらによって胎児異常または対立遺伝子変異を示す核酸配列の有無を判定することとをさらに含む、実施形態４０に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５５．多胎妊娠の存在を判定することをさらに含む、実施形態４０に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５６．１つまたは複数の核酸配列の分析は、染色体異常を検出することを含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５７．胎児異常は単一遺伝子の異常を含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５８．胎児異常は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
５９．１つまたは複数の核酸配列の分析は、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、またはＤＮＡ配列決定法によって実行される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６０．１つまたは複数の核酸配列の分析は、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲによって実行される、実施形態５９に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６１．１つまたは複数の抽出された核酸の分析は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって実行される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６２．１つまたは複数の抽出された核酸の分析は、多重アニーリングおよびループ化による増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）によって実行される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６３．胎児異常は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース４−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第Ｘ因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱（Ｘ）症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ＸＸＸ症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖６−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病Ａ、血友病Ｂ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、１６ｐ１１．２欠失、１６ｐ１１．２重複、ミトコンドリア欠損、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、１ｐ３６欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症（因子ａ）、無精子症（因子ｂ）、無精子症（因子ｃ）、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、３−メチルクロトニル補酵素Ａカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、Ｔ細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ（フィンランド型）、ならびに多発性内分泌腫瘍からなる群から選択される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６４．単離したｆＮＲＢＣ中のタンパク質または代謝産物の有無を検出することをさらに含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６５．単離したｆＮＲＢＣ中のタンパク質または代謝産物のレベルを検出することをさらに含む、実施形態３８に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６６．１つまたは複数の核酸の分析は、次世代シーケンシング技術またはウルトラディープシーケンシングを含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６７．１つまたは複数の核酸はＤＮＡマイクロアレイで分析される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６８．１つまたは複数の核酸は出生前染色体マイクロアレイで分析される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
６９．胎児異常は制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）によって検出される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７０．胎児異常は微小欠失または微小重複を含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７１．ｆＮＲＢＣは、正常なテロメア長範囲と比較して長さが増加または減少したテロメアを含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７２．１つまたは複数の核酸の分析は、ｆＮＲＢＣの核酸のストレッチを配列決定することを含む、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７３．ｆＮＲＢＣの核酸のストレッチは、次世代シーケンシング技術または大規模並列シーケンシングによって配列決定される、実施形態７２に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７４．胎児異常は発癌の素因である、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７５．癌は、乳癌、脳癌、肝癌、急性リンパ芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、気管支癌、急性または慢性のリンパ球性腫瘍または顆粒球性腫瘍、急性脊髄性白血病、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、類表皮癌、島細胞腫瘍、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群の腫瘍、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫瘍、多形性膠芽腫、毛様細胞腫瘍、頭部癌、過形成、奇形腫、過形成性角膜神経腫瘍、上皮内癌、腸神経節細胞腫、髄様癌、転移性皮膚癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、粘膜神経腫、菌状息肉腫、脊髄異形成症候群、骨髄腫、頚部癌、神経芽細胞腫、骨原性肉種、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、神経組織癌、甲状腺癌、局所的な皮膚病変、副甲状腺癌、クロム親和性細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、細網細胞肉腫、およびウィルム腫瘍からなる群から選択される、実施形態５４に従う、ｆＮＲＢＣの調製方法。
７６．胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法であって、
（ａ）場合により、それぞれ胎児細胞表面を有する１個または複数個のｆＮＲＢＣ、およびそれぞれ母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと；
（ｂ）密度分離法によって複数の母親細胞の第１の部分から１個または複数個のｆＮＲＢＣを濃縮することによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣおよび残存する第１の数の母親細胞を含む第１の懸濁液を生成するステップと；
（ｃ）第１の懸濁液を、第１の回収可能な粒子に結合した第１の抗体とインキュベートするステップであって、第１の抗体は、母親細胞の細胞表面上に存在するが、ｆＮＲＢＣの細胞表面上に存在しない第１の抗原と、第１の抗体が第１の抗原と結合する条件下で結合して、第１の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第１の粒子−細胞複合体を第１の懸濁液から分離して取り除くことによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣおよび残存する第２の数の母親細胞を含む第２の懸濁液を生成するステップと；
（ｄ）第２の回収可能な粒子に結合した第２の抗体を第２の懸濁液に加えるステップであって、第２の抗体は、ｆＮＲＢＣの細胞表面上に存在する第２の抗原と結合し、抗原は、母親細胞の細胞表面上に存在しない、ステップ、第２の懸濁液を、第２の抗体が第２の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第２の粒子−細胞複合体を生成するステップ、第２の懸濁液から第２の粒子−細胞複合体を分離するステップ、ならびに第２の粒子−細胞複合体から細胞を放出させて再懸濁させることによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣを生成するステップと；
（ｅ）物理的技術によってｆＮＲＢＣの１個または複数個を単離するステップと
を含む方法。
７７．第２の抗体は、ｆＮＲＢＣ有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するＣＤ７１または他の表面抗原と結合しない、実施形態７６に従う、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法。
７８．第２の抗体は４Ｂ９である、実施形態７６に従う、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法。
７９．第１の抗体は抗ＣＤ４５抗体を含む、実施形態７６に従う、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法。
８０．ｆＮＲＢＣの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態７６に従う、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法。
８１．物理的技術は顕微操作である、実施形態７６に従う、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離する方法。
８２．胎児異常を検出する方法であって、
（ａ）場合により、それぞれが胎児細胞表面を有する１個または複数のｆＮＲＢＣ、およびそれぞれが母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと；
（ｂ）密度分離法によって複数の母親細胞の第１の部分から１個または複数のｆＮＲＢＣを濃縮することによって、１個または複数のｆＮＲＢＣおよび残存する第１の数の母親細胞を含む第１の懸濁液を生成するステップと；
（ｃ）第１の懸濁液を、第１の回収可能な粒子に結合した第１の抗体とインキュベートするステップであって、第１の抗体は、母親細胞の細胞表面上に存在するが、ｆＮＲＢＣの細胞表面上に存在しない第１の抗原と、第１の抗体が第１の抗原と結合する条件下で結合して、第１の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第１の粒子−細胞複合体を第１の懸濁液から分離して取り除くことによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣおよび残存する第２の数の母親細胞を含む第２の懸濁液を生成するステップと；
（ｄ）第２の回収可能な粒子に結合した第２の抗体を第２の懸濁液に加えるステップであって、第２の抗体は、ｆＮＲＢＣの細胞表面上に存在する第２の抗原と結合し、第２の抗原は、母親細胞の細胞表面上に存在しない、ステップ、第２の懸濁液を、第２の抗体が第２の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第２の粒子−細胞複合体を生成するステップ、第２の懸濁液から第２の粒子−細胞複合体を分離するステップ、ならびに第２の粒子−細胞複合体から細胞を放出させて再懸濁させることによって、１個または複数個のｆＮＲＢＣを含む第３の懸濁液を生成するステップと；
（ｅ）１個または複数個のｆＮＲＢＣを分析することによって、胎児異常の有無を判定するステップと
を含む方法。
８３．第２の抗体は、ｆＮＲＢＣ有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球細胞上に存在するＣＤ７１または他の表面抗原と結合しない、実施形態８２に従う、胎児異常を検出する方法。
８４．第２の抗体は４Ｂ９である、実施形態８２に従う、胎児異常を検出する方法。
８５．第１の抗体は抗ＣＤ４５抗体を含む、実施形態８２に従う、胎児異常を検出する方法。
８６．ｆＮＲＢＣの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態８２に従う、胎児異常を検出する方法。
８７．胎児異常は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース４−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第Ｘ因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱（Ｘ）症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ＸＸＸ症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖６−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病Ａ、血友病Ｂ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、１６ｐ１１．２欠失、１６ｐ１１．２重複、ミトコンドリア欠損、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、１ｐ３６欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症（因子ａ）、無精子症（因子ｂ）、無精子症（因子ｃ）、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、３−メチルクロトニル補酵素Ａカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、Ｔ細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ（フィンランド型）、ならびに多発性内分泌腫瘍からなる群から選択される、実施形態８２に従う、胎児異常を検出する方法。
８８．生物学的サンプルから胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣ）を濃縮する方法であって、
（ａ）生物学的サンプルを密度分離にかけて、ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を得るステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）において得たｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を用いる磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）にかけて、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）において得た、ＭＡＣＳでソートした細胞集団中の細胞を、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬で蛍光標識して、蛍光標識細胞集団を得るステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）において得た蛍光標識細胞集団を、フローサイトメトリーによってソートして、ｆＮＲＢＣを選択することによって、ｆＮＲＢＣが濃縮された細胞集団を得るステップと
を含み、
実施形態８８の方法は、場合によりさらに、
（ｅ）場合により、物理的方法、例えば顕微操作によって、個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を単離するステップと；
（ｆ）場合により、例えば遺伝的フィンガープリンティングによって、ｆＮＲＢＣが胎児であることを確認するステップと
である、ステップ（ｅ）および／または（ｆ）を含む、方法。
８９．ステップ（ｂ）は、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択剤を利用し、ステップ（ｃ）は、少なくとも２つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用し、場合により、ステップ（ｂ）における少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、ステップ（ｃ）における少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬と同じ標的を選択する（例えば、両方が同じ標的に対する抗体である）、実施形態８８の方法。
９０．ステップ（ｂ）は、少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用し、ステップ（ｃ）は、少なくとも３つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を利用し、場合により、ステップ（ｂ）における少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、ステップ（ｃ）における少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬と同じ標的を選択する（例えば、両方が同じ標的に対する抗体である）、実施形態８８の方法。
９１．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、実施形態８８から９０のいずれか１つの方法。
９２．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、実施形態８８から９１のいずれか１つの方法。
９３．ステップ（ｃ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、実施形態８８から９２のいずれか１つの方法。
９４．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、実施形態８８から９３のいずれか１つの方法。
９５．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、核染色剤を含む、実施形態８８から９４のいずれか１つの方法。
９６．個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を単離するための顕微操作をさらに含む、実施形態８８から９５のいずれか１つの方法。
９７．ネガティブ選択ステップを含まない、実施形態８８から９６のいずれか１つの方法。
９８．ステップ（ａ）において得たｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、ステップ（ｂ）の前にネガティブ選択にかける、実施形態８８から９６のいずれか１つの方法。
９９．ステップ（ｂ）において得た、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を、ステップ（ｃ）の前にネガティブ選択にかける、実施形態８８から９６のいずれか１つの方法。
１００．ネガティブ選択は、ネガティブ免疫選択である、実施形態９８または９９の方法。
１０１．ネガティブ免疫選択は、
（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；
（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３２；
（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、場合によりＣＤ４５；
（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、場合によりＣＤ５６；
（ｅ）樹状細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および
（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１４またはＣＤ３３
から選択される１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を利用する、実施形態１００の方法。
１０２．生物学的サンプルからｆＮＲＢＣを濃縮する方法であって、
（ａ）生物学的サンプルを密度分離にかけて、ｆＮＲＢＣ含有細胞画分を得るステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）において得たｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、少なくとも２つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬を用いるＭＡＣＳにかけて、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）において得た、ＭＡＣＳでソートした細胞集団に顕微操作を実行して、個々のｆＮＲＢＣまたはｆＮＲＢＣの群を単離するステップと
を含む方法。
１０３．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体４Ｂ９を含む、実施形態１０２の方法。
１０４．ステップ（ｂ）の少なくとも１つのｆＮＲＢＣポジティブ選択試薬は、抗ＣＤ２３５ａ抗体を含む、実施形態１０２または１０３の方法。
１０５．ネガティブ選択ステップを含まない、実施形態１０２から１０４のいずれか１つの方法。
１０６．ステップ（ａ）において得たｆＮＲＢＣ含有細胞画分を、ステップ（ｂ）の前にネガティブ選択にかける、実施形態１０２から１０４のいずれか１つの方法。
１０７．ステップ（ｂ）において得た、ＭＡＣＳでソートした細胞集団を、ステップ（ｃ）の前にネガティブ選択にかける、実施形態１０２から１０４のいずれか１つの方法。
１０８．ネガティブ選択は、ネガティブ免疫選択である、実施形態１０６または１０７の方法。
１０９．ネガティブ免疫選択は、
（ａ）Ｔリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；
（ｂ）Ｂリンパ球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３２；
（ｃ）ｐａｎリンパ球マーカー、場合によりＣＤ４５；
（ｄ）ＮＫ細胞表面マーカー、場合によりＣＤ５６；
（ｅ）樹状細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１１ｃまたはＣＤ２３；および
（ｆ）マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりＣＤ１４またはＣＤ３３
から選択される１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を利用する、実施形態１０８の方法。
１１０．生物学的サンプルは母体血液である、実施形態８８から１０９のいずれか１つの方法。
１１１．母体血液は、妊娠約４週から約３８週の間に採取される、実施形態１１０の方法。
１１２．母体血液は、妊娠約６週から約２０週の間に採取される、実施形態１１１の方法。
１１３．実施形態８８から１１２のいずれか１つの方法によって得られる、または得ることができる、ｆＮＲＢＣが濃縮された細胞集団。
１１４．母体血液から濃縮された、（ａ）少なくとも２、少なくとも５、もしくは少なくとも１０個の、かつ／または（ｂ）最大１５、最大２５、もしくは最大３５個のｆＮＲＢＣを含有する、ＦＡＣＳでソートした細胞集団。
１１５．（ａ）少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００の、かつ／または（ｂ）最大１５０、最大２５０、または最大３５０のＦＡＣＳ事象を含有する、実施形態１１４の、ＦＡＣＳでソートした細胞集団。
１１６．固定されていない、実施形態１１３から１１５のいずれか１つの細胞集団。
１１７．胎児異常について、実施形態１１３から１１６のいずれか１つの細胞集団由来の少なくとも１個のｆＮＲＢＣを分析することを含む、胎児異常を検出する方法。
１１８．実施形態１から１１２のいずれか１つの方法に従って、ｆＮＲＢＣを、前記分析の前に濃縮することをさらに含む、実施形態１１７の方法。
１１９．胎児異常について単一のｆＮＲＢＣを分析することを含む、実施形態１１７または１１８の方法。
１２０．胎児異常について一群のｆＮＲＢＣを分析することを含む、実施形態１１７または１１８の方法。
１２１．前記分析の前に全ゲノム増幅を実行することを含む、実施形態１１９または１２０の方法。
１２２．前記分析の前にゲノムのサブセットを増幅することを含む、実施形態１１９または１２０の方法。
１２３．分析は定量ＰＣＲを含む、実施形態１１７から１２２のいずれか１つの方法。
１２４．分析はマイクロアレイ上で実行される、実施形態１１７から１２２のいずれか１つの方法。
１２５．ｆＮＲＢＣを胎児細胞として確認することをさらに含む、実施形態１１７から１２４のいずれか１つの方法。
１２６．確認が、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析、遺伝的フィンガープリンティング、または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析を実行することを含む、実施形態１２５の方法。
１２７．確認が、ｆＮＲＢＣ  ＤＮＡを母系ＤＮＡと比較することを含む、実施形態１２５または１２６の方法。
１２８．確認が、ｆＮＲＢＣ  ＤＮＡを、母系ＤＮＡおよび父系ＤＮＡの両方と比較することを含む、実施形態１２５または１２６の方法。
【０２０５】
種々の特定の実施形態が例示され、かつ説明されてきたが、種々の変更が、本開示の本質および範囲から逸脱することなくなされてもよいことが理解されるであろう。
【０２０６】
１４．参考文献の引用
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文献が、全ての目的について、参照によって組み込まれることが個々に示されている場合と同じ範囲まで、全ての目的について、それらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中に組み込まれる参考文献の１つまたは複数の教示と本開示との間に矛盾がある場合には、本明細書の教示が意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【国際調査報告】
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