(57)【要約】  組織試料処理システム及びそれに関連する方法が開示され、説明される。組織試料処理システム（１００）は、微小流体分離システム（１１０）を含み得る。微小流体分離システム（１１０）は、キャリア流体（１０４）と組織試料（１０２）とを受容するための流体チャネル、及び複数の排出口を含み得る。流体チャネル内でのキャリア流体（１０４）及び組織試料（１０２）の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、組織試料（１０２）内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。加えて、試料処理システム（１００）は、複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連する冷凍保存システム（１２０）で、組織試料（１０２）中の、複数の排出口のうちのその少なくとも１つと関連する材料を凍結させるための冷凍保存システムを備え得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子細胞を分離する方法であって、
流体チャネルと、複数の排出口と、を有する微小流体分離システムを入手すること、及び
精子試料を前記流体チャネル内に配置すること、を含み、前記流体チャネル内での前記精子試料の流れは、前記精子試料内の材料を、サイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし、前記複数の排出口のそれぞれが、前記精子試料内の前記材料の異なるサイズ画分を受容するようになっている、方法。
【請求項２】
前記流体チャネルがらせん状形状を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小流体分離システムが、
キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口を有する取り入れ口ゾーンと、前記組織試料を受容するための組織試料取り入れ口と、
前記複数の排出口を有する排出口ゾーンと、
前記取り入れ口ゾーンと前記排出口ゾーンとの間にあり、前記キャリア流体及び前記組織試料に対して開かれている移送領域と、を備え、
前記移送領域内の交差流が、前記組織試料内の前記材料を、サイズに基づいて分離するのを容易にする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の排出口のうちの少なくとも１つに関連付けられる、前記精子試料内の前記材料は、運動していない精子細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
仕分けシステムを、前記複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連付けることを更に含み、前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つと関連付けられる前記精子試料内の前記材料は、運動していない精子細胞を含み、かつ、
前記運動していない精子細胞を、複数のアリコートに仕分けることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記仕分けシステムが、
前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる前記組織試料内の前記材料を受容するための取り入れ口と、
複数のアリコート保管チャネルと、
前記複数のアリコート保管チャネルと関連付けられ、前記複数のアリコートを前記アリコート保管チャネルに分離するのを容易にする、複数のバルブと、を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
精子試料から運動していない精子細胞を分離する方法であって、
層流条件下で精子試料を流体チャネルを通して流すことを含み、前記流体チャネル内の交差流が内側の流体流れ層内の運動していない精子細胞を分離するのを容易にし、かつ
前記内側の流体流れ層を空間的に分離することを含む、方法。
【請求項８】
前記流体チャネルがらせん状形状を備える、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記運動していない精子細胞を、前記流体チャネルの排出口内に受容することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記運動していない精子細胞を、複数のアリコートに仕分けることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のアリコートのそれぞれは、約１〜約２０個の運動していない精子細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のアリコートのそれぞれは、約１〜約１０個の運動していない精子細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のアリコートのそれぞれは単一の運動していない精子細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組織試料処理システムであって、
キャリア流体及び組織試料を含む試料流体を受容する流体チャネルと、
複数の排出口とを有し、前記流体チャネル内での前記キャリア流体及び前記組織試料の流れは、前記組織試料内の材料を、サイズに基づいて複数のサイズ画分に分離するのを容易にし、前記複数の排出口のそれぞれは、前記組織試料内の前記材料の異なるサイズ画分を受容するようになっている、微小流体分離システム、及び、
前記複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連付けられ、前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる前記組織試料内の前記材料を冷凍するための冷凍保存システム、を備える、組織試料処理システム。
【請求項１５】
前記流体チャネルがらせん状形状を備える、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記微小流体分離システムが、
前記キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口を有する取り入れ口ゾーンと、前記組織試料を受容するための組織試料取り入れ口と、
前記複数の排出口を有する排出口ゾーンと、
前記取り入れ口ゾーンと前記排出口ゾーンとの間にあり、前記キャリア流体及び前記組織試料に対して開かれている移送領域と、を備え、
前記移送領域内の交差流が、前記組織試料内の前記材料を、サイズに基づいて分離するのを容易にする、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記組織試料が精子試料を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる、前記組織試料内の前記材料は、運動していない精子細胞を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
組織試料処理システムであって、
キャリア流体及び組織試料を受容する流体チャネルと、
複数の排出口と、を有し、前記流体チャネル内での前記キャリア流体及び前記組織試料の流れは、前記組織試料内の材料を、サイズに基づいて複数のサイズ画分に分離するのを容易にし、前記複数の排出口のそれぞれは、前記組織試料内の前記材料の異なるサイズ画分を受容するようになっている、微小流体分離システム、及び、
前記複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連付けられ、前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる前記組織試料内の前記材料の複数のアリコートを仕分けするための仕分けシステム、を備える、組織試料処理システム。
【請求項２０】
前記仕分けシステムが、
前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる前記組織試料内の前記材料を受容するための取り入れ口と、
複数のアリコート保管チャネルと、
前記複数のアリコート保管チャネルと関連付けられ、前記複数のアリコートを前記アリコート保管チャネルに分離するのを容易にする、複数のバルブと、を備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記流体チャネルがらせん状形状を備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記微小流体分離システムが、
前記キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口を有する取り入れ口ゾーンと、前記組織試料を受容するための組織試料取り入れ口と、
前記複数の排出口を有する排出口ゾーンと、
前記取り入れ口ゾーンと前記排出口ゾーンとの間にあり、前記キャリア流体及び前記組織試料に対して開かれている移送領域と、を備え、
前記移送領域内の交差流が、前記組織試料内の前記材料を、サイズに基づいて分離するのを容易にする、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
前記仕分けシステムに関連付けられ、前記組織試料内の前記材料の前記複数のアリコートのうちの少なくとも１つを冷凍するための、冷凍保存システムを更に備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２４】
前記複数のアリコートのそれぞれは、約１〜約２０個の運動していない精子細胞を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２５】
前記複数のアリコートのそれぞれは、約１〜約１０個の運動していない精子細胞を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記複数のアリコートのそれぞれは単一の運動していない精子細胞を含む、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
組織試料処理システムであって、
キャリア流体及び組織試料を受容する流体チャネルと、
複数の排出口と、を有し、前記流体チャネル内での前記キャリア流体及び前記組織試料の流れは、前記組織試料内の材料を、サイズに基づいて複数のサイズ画分に分離するのを容易にし、前記複数の排出口のそれぞれは、前記組織試料内の前記材料の異なるサイズ画分を受容するようになっている、微小流体分離システム、及び、
前記複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連付けられ、前記複数の排出口のうちの前記少なくとも１つに関連付けられる前記組織試料内の前記材料のサイズ画分を濃縮するための濃縮システム、を備える、組織試料処理システム。
【請求項２８】
前記濃縮システムが、第１流体導管と第２流体導管とを備え、前記第１流体導管は、前記材料の前記サイズ画分が通過するのを妨げるサイズになっており、前記第１流体導管の流体抵抗は、前記第２流体導管の流体抵抗よりも大きく、材料の前記サイズ画分が前記第１導管に向かって流れ、前記第１導管で捕捉されるようになっている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記流体チャネルがらせん状形状を備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
前記微小流体分離システムが、
前記キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口を有する取り入れ口ゾーンと、前記組織試料を受容するための組織試料取り入れ口と、
前記複数の排出口を有する排出口ゾーンと、
前記取り入れ口ゾーンと前記排出口ゾーンとの間にあり、前記キャリア流体及び前記組織試料に対して開かれている移送領域と、を備え、
前記移送領域内の交差流が、前記組織試料内の前記材料を、サイズに基づいて分離するのを容易にする、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３１】
前記濃縮システムに関連付けられ、前記組織試料内の前記材料の前記濃縮されたサイズ画分を冷凍するための、冷凍保存システムを更に備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
前記組織試料が精子試料を含む、請求項２７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１０月２０日に出願された米国仮出願第６２／０６６，２３２号の利益を主張するものであり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
西側世界では、約８組に１組のカップルが、１年間避妊しないで性交をしても、自然妊娠に至ることができないでいる。これらのケースのほぼ半分において、男性側の精液が、世界保健機関（ＷＨＯ）による、正常精液認定の基準を下回る１つ以上の精液パラメーターを有している。非閉塞性無精子症（ＮＯＡ）は、男性の射精液内に精子が入っていないという、男性に要因がある不妊症の最も深刻な形態であるが、これは、そうした不妊症の症例の１０％に影響を及ぼしている。ＮＯＡ患者の場合には、妊娠させるには外科的な手法により精子を直接精巣から取り出すことになるが、この手法は、顕微鏡下精巣精子採取術（ｍＴＥＳＥ）と呼ばれている。このｍＴＥＳＥは、手術用顕微鏡下で、精巣の精細管を取り出す外科的手法を伴うが、それに引き続き、実質組織内の生成形成の中心となっている部分を特定するため、発生学者が顕微鏡で組織検査を実施する。精子が特定されると、組織の試料はまとめて冷凍保存され、カップルは妊娠を目指して、体外受精（ＩＶＦ）を受ける。
【０００３】
このｍＴＥＳＥによる方法は、現在の技術には大きな限界があるため、首尾よくいかないことも多い。例えば、ＩＶＦは、卵母細胞採取と精子の準備とを協調させる必要があり、時間との戦いという面があるため、ｍＴＥＳＥ術によって分離された精子が、後々使用できるように冷凍保存されていることが重要である。生検を受けたばかりの組織内で精母細胞が特定されると、現行の冷凍保存技術では必然的に、比較的大きな保存用チューブ内に大量の組織を保存することになる。その結果、組織が解凍された後、精母細胞の位置を再び特定することが困難となっている。例えば、現在のところｍＴＥＳＥ術は、精子を特定するため、顕微鏡を用いて精巣の組織試料を手作業で点検することに頼っているが、これは時間のかかる、労働集約的なプロセスである。精子を含む試料が冷凍保存され、それから解凍された後、ＡＲＴ（生殖補助医療）療法において用いることが可能となるのに先立って、精子はその位置を再び特定され、かつ他の細胞型と分離されねばならない。このプロセスは非常に非効率であり、精子が見逃されたり、見失われてしまうことも多々ある。このように、発生学者が、精巣の組織を顕微鏡で最大１２時間も覗いてみても、精子を発見しそこなうことも多々ある。精子が当初特定され、組織が体外受精用に冷凍保存されたとしても、多くの場合に精子は、組織が解凍された後で再びその力を取り戻す機会を持たない。加えて、凍結と解凍とを複数回繰り返すのは、精子が生存するためには有害であるため、この方法では、治療目的で使用するために精子を解凍する機会はたった１回しかない。これらの理由により、多くのＮＯＡ患者がｍＴＥＳＥ術を受けたとしても、その精子が再びその力を回復することがほぼないということに気づかされるだけである。こうした男性は、父として子孫を残すための他の選択肢がないという状況に追い込まれるが、そうなると、自分の精子ではなく、ドナーから提供された精子を使うという方法に訴えることも多々ある。
【０００４】
精子を隔離するために開発された微小流体装置の数少ない例は、運動可能な精子を運動しなくなった精子から分離するために、精子運動性の特性を用いるというものである。しかしながら、精巣の精子は運動しないものであり、既存の技術は、ＮＯＡの精巣組織の試料から、精子を隔離するためには好適でない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
組織試料処理システム及びそれに関連する方法が開示され、説明される。１つの態様では、組織試料処理システムは、微小流体分離システムを備え得る。微小流体分離システムは、組織試料を受容するための流体チャネルと、複数の排出口とを含み得る。流体チャネル内での組織試料の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、組織試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。加えて、試料処理システムは、複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連する冷凍保存システムで、組織試料中の、複数の排出口のうちのその少なくとも１つと関連する材料を凍結させるための冷凍保存システムを備え得る。
【０００６】
１つの態様では、キャリア流体及び組織試料を受容するための流体チャネルと、複数の排出口とを有する微小流体分離システムとを含み得る、組織試料処理システムが開示されている。流体チャネル内でのキャリア流体及び組織試料の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、組織試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。加えて、組織試料処理システムは、複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連する仕分けシステムで、組織試料内の、複数の排出口のうちのその少なくとも１つと関連する材料の複数のアリコートを仕分けるための仕分けシステムを含み得る。
【０００７】
別の１つの態様では、キャリア流体及び組織試料を受容するための流体チャネルと、複数の排出口とを有する微小流体分離システムとを含み得る、組織試料処理システムが開示されている。流体チャネル内でのキャリア流体及び組織試料の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、組織試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。加えて、組織試料処理システムは、複数の排出口のうちの少なくとも１つと関連する濃縮システムで、組織試料内の、複数の排出口のうちのその少なくとも１つと関連する材料のサイズ画分を濃縮するための濃縮システムを含み得る。
【０００８】
１つの態様では、精子細胞を分離する方法が開示されている。その方法は、流体チャネルと複数の排出口とを有する微小流体分離システムを得ることを含み得る。その方法はまた、キャリア流体を流体チャネル内に配置することをも含み得る。加えて、その方法は、精子試料を流体チャネル内に配置することを含み得る。精子は独特の形状をしており、しばしば、特に運動していない状態では、従来の方法による分離には素直に従わない。流体チャネル内でのキャリア流体及び精子試料の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、運動してない精子を含む、精子試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、精子試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。
【０００９】
別の１つの態様では、運動していない精子細胞を組織試料から分離する方法が開示されている。その方法は、層流条件下で精子試料を流体チャネルを通して流すことを含み得るが、流体チャネル内の交差流が、内側の流体流れ層内の、運動していない精子細胞を分離するのを容易にする。方法はまた、内側の流体流れ層を空間的に分離することを含み得る。
【００１０】
このように、以降の詳細な説明が一層理解され得るように、かつ、当技術分野へのこの貢献が一層評価され得るように、本発明のより重要な特徴を幾分大まかに略述した。本発明の他の特徴は、添付の図面及び特許請求の範囲と合わせた、以下の本発明の詳細な説明により明確となるか、又は本発明の実施により教示され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の１つの例による組織試料処理システムの模式図である。
【図２】本開示の別の１つの例による組織試料処理システムの模式図である。
【図３】本開示の更に別の１つの例による組織試料処理システムの模式図である。
【図４】本開示のまた更に別の１つの例による組織試料処理システムの模式図である。
【図５Ａ】本開示の１つの例による、らせん状微小流体分離システムを模式的に図示している。
【図５Ｂ】図５Ａに図示されているらせん状微小流体分離システムの内側ループの断面を、模式的に図示している。
【図６Ａ】図５Ａに図示されているらせん状微小流体分離システム内での粒子の移動を、模式的に図示している。
【図６Ｂ】図５Ａに図示されているらせん状微小流体分離システム内での粒子の移動を、模式的に図示している。
【図６Ｃ】図５Ａに図示されているらせん状微小流体分離システム内での粒子の移動を、模式的に図示している。
【図７Ａ】本開示の１つの例による、らせん状微小流体分離システムを模式的に図示している。
【図７Ｂ】本開示の１つの例による、らせん状微小流体分離システムを模式的に図示している。
【図７Ｃ】本開示の１つの例による、らせん状微小流体分離システムを模式的に図示している。
【図７Ｄ】本開示の１つの例による、らせん状微小流体分離システムを模式的に図示している。
【図８】図７Ａ〜７Ｄに図示されているらせん状微小流体分離システムの内側ループの断面を、模式的に図示している。
【図９】本開示の１つの例による、仕分け／濃縮システムの模式図である。
【図１０Ａ】本開示の１つの例による、動作中の図９の仕分け／濃縮システムを図示している。
【図１０Ｂ】本開示の１つの例による、動作中の図９の仕分け／濃縮システムを図示している。
【図１０Ｃ】本開示の１つの例による、動作中の図９の仕分け／濃縮システムを図示している。
【図１１】本開示の別の１つの例による、仕分け／濃縮システムの模式図である。
【図１２Ａ】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１２Ｂ】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１３】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１４】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１５】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１６】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１７】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１８】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図１９】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図２０】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図２１】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【図２２】本発明の１つの態様による、組織試料分離装置の性能に関する試験データを示す。
【００１２】
これらの図面は本発明の種々の態様を示すために提供され、特許請求の範囲により別様で制限されない限り、寸法、材料、構成、配置、又は比率の観点から、範囲を制限することを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
これらの代表的実施形態は、当業者による本発明の実施を可能にするよう十分詳細に記載されてはいるが、他の実施形態も実現され得ること、並びに本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に対する種々の変更をなし得ることは理解されるべきである。したがって、本発明の実施形態についての以下のより詳細な記載は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、限定ではなく例示のみを目的として、本発明の特徴及び特性を記載し、本発明の操作の最良の形態を説明し、かつ当業者による本発明の実施を十分に可能にするために、提示される。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって規定されるものとする。
【００１４】
定義
本発明の記載及び特許請求において、以下の用語を使用する。
【００１５】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別様が規定されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば「（１つの）試料」への言及は、１つ以上のかかる材料への言及を含み、「注入」への言及は、１つ以上のかかる工程を指す。
【００１６】
特定の性質又は状況に関して本明細書で使用する場合、「実質的に」とは、ばらつきが、特定の性質又は状況から測定され得る程に外れるようなものではなく、十分わずかなものであることを意味する。許容され得るばらつきの正確な程度は、場合によっては具体的な文脈に依存し得る。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「隣接する」とは、２つの構造又は要素の近接性を意味する。特に、「隣接」していると特定される要素は、当接していても又は接続していてもよい。かかる要素はまた、必ずしも互いが接触する必要なく、互いに近傍にあって（near）も、接近して（close to）いてもよい。近接性の正確な程度は、場合によっては具体的な文脈に依存し得る。
【００１８】
本明細書で使用する場合、複数の項目、構造要素、構成要素、及び／又は材料は、便宜上、共通の一覧で示され得る。しかし、これらの一覧は、あたかも一覧の各要素が、別個の独自の要素として個々に認識されるように解釈されるべきである。したがって、かかる一覧の個々の要素は、別途記載のない限り、共通の群の中でのこれらの提示のみに基づき、同じ一覧の任意の他の要素の事実上の均等物として解釈されるべきでない。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「のうちの少なくとも１つ」は、「１つ以上の」の同義語であると意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」は明示的に、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、又はそれぞれの組み合わせを含む。
【００２０】
濃度、量、及び他の数値データは、範囲の形式で本明細書で提示され得る。かかる範囲の形式は単に、便宜上及び簡潔性のために用いられることを理解されたく、かつ、範囲の限定として明示的に列挙される数値を含むだけでなく、あたかも各数値及び部分範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含されている個々の数値又は部分範囲全ても含むと柔軟に解釈されるべきである。例えば、約１〜約４．５の数的範囲は、１〜約４．５の明示的に列挙された限界だけでなく、２、３、４等の個々の数字、及び１〜３、２〜４等の副範囲も含むと解釈されるべきである。同じ原理は、「約４．５未満」等の１つの数的値のみを列挙する範囲に適用され、これは、上で列挙される値及び範囲の全てを含むと解釈されるべきである。更に、記載されている範囲の幅又は特性に関係なく、かかる解釈を適用するべきである。
【００２１】
任意の方法又はプロセスの請求項で列挙した任意の工程は、任意の順序で実行してよく、特許請求の範囲に提示される順序に限定されるべきでない。ミーンズ・プラス・ファンクション又はステップ・プラス・ファンクションの限定は、特定の請求項の限定に対し、以下の条件の全て：ａ）「〜のための手段（means for）」又は「〜のための工程（step for）」が明示的に列挙され、かつｂ）対応する機能が明示的に列挙される場合にのみ、用いられるであろう。ミーンズ・プラス・ファンクションを支える構造、材料又は動作は、本明細書における記載で明示的に列挙される。したがって、本発明の範囲は、単に本明細書で与えられる記載及び実施例ではなく、添付の特許請求の範囲及びこれらの法的均等物によってのみ決定されるべきである。
【００２２】
組織試料処理
図１は、本開示の１つの例による組織試料処理システム１００を、模式的に図示している。組織試料処理システム１００は、組織試料１０２と、必要に応じてキャリア流体１０４とを受容する、微小流体分離システム１１０を含み得る。以下に詳しく説明するように、微小流体分離システム１１０内での、組織試料１０２とキャリア流体１０４との流れは、組織試料１０２内の材料を、そのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にする。したがって、微小流体分離システム１１０は、組織試料内の（サイズに基づく）ある具体的なタイプの細胞を、他の細胞から分離するように構成され得る。１つの例では、組織試料１０２は、精子細胞（例えば、運動している精子細胞及び／又は運動していない精子細胞）を含む、精子又は精液試料を含み得る。一部のケースでは、組織試料又は試料流体は、追加された別のキャリア流体を有しない、（すなわち、キャリア流体は、自然の精液である）流体の精子試料であり得る。あるいは、所望の流体の流れを容易にするために、追加的なキャリア流体が添加され得る。微小流体分離システム１１０は、精子細胞を、組織試料内の他の細胞から分離するように、例えば、運動していない精子細胞を、赤血球（ＲＢＣ）から分離するように構成され得る。１つの態様では、微小流体分離システム１１０は、例えば、精子を生成するために潜在的に使用され得る精原幹細胞又は他の精子前駆体のような、数種類の細胞型を仕分けし得る。組織試料処理システム１００は、精子細胞を、体細胞組織細胞よりも濃縮するために用いられ得る。微小流体分離システム１１０からの出力は、その出力中の所望の細胞タイプの解像度を向上させるために、再処理１０６され得る。例えば、以下に説明するような、任意の好適なタイプの微小流体分離システム１１０が使用可能である。
【００２３】
組織試料処理システム１００はまた、微小流体分離システム１１０からの所望の出力である組織試料１０２中の材料を冷凍するための、冷凍保存システム１２０をも含み得る。冷凍保存システム１２０は、例えば液体窒素冷凍庫又は機械式冷凍庫のような、任意の好適なタイプの低温冷凍庫を含み得る。
【００２４】
図２は、本開示の別の１つの例による、組織試料処理システム２００を模式的に図示している。組織試料処理システム２００は、既に説明したのと同様に、微小流体分離システム２１０を含み得る。その場合、組織試料処理システム２００は、組織試料内の材料の、複数のアリコートを仕分けるための、仕分け及び／又は濃縮システム２３０を含み得る。例えば以下に説明するような、任意の好適な仕分け及び／又は濃縮システムを使用し得る。一般に、仕分けシステムは、組織試料内の材料（例えば、粒子又は細胞）を、アリコートに仕分けするが、そのアリコートは、所与の量（例えば、ある数量範囲）の、所望の細胞型を含み得る。濃縮システムは、望ましくない細胞を集団から除去するために、組織試料内の材料の、サイズ画分を濃縮することによって、特定の細胞型の解像度を改善する。仕分け及び／又は濃縮システム１３０は、図２の図中では単一のブロックで表されているが、仕分けシステムと濃縮システムとが、互いに独立していてもよいということは理解されるべきである。すなわち、組織試料処理システム２００には、仕分けシステム若しくは濃縮システムのいずれかが含まれていても、又はその両方が含まれていてもよい。１つの態様では、単一のシステムが、仕分けと濃縮との両方の機能を果たし得る。組織試料処理システム２００が別体の仕分けシステムと濃縮システムとを含み得るという場合に、その出力の流れは、任意の順序であり得る。例えば、仕分けシステムがその出力を濃縮システムへと送達してもよく、あるいは濃縮システムがその出力を仕分けシステムへと送達してもよい。
【００２５】
図３は、本開示の更に別の例による組織試料処理システム３００を模式的に図示している。組織試料処理システム３００は、既に説明したのと同様に、微小流体分離システム３１０と、仕分け及び／又は濃縮システム３３０とを含み得る。その場合には、組織試料処理システム３００はまた、既に説明したのと同様に、冷凍保存システム３２０をも含み得る。かくして、仕分け及び／又は濃縮システム３３０からの出力は、冷凍及び保存されるために、冷凍保存システム３２０に送達され得る。例えば、仕分け及び／又は濃縮システム３３０からの、濃縮及び／又は仕分けされた材料は、冷凍保存システム３２０へと送達されて冷凍され得る。
【００２６】
図４は、本開示の更に別の１つの例による組織試料処理システム４００を図示している。組織試料処理システム４００は、微小流体分離システム４１０と、濃縮システム４３０ａと、仕分けシステム４３０ｂと、冷凍保存システム４２０とを含み得る。図４は、本開示による、組織試料処理システムの、いくつかの具体的な態様を示している。例えば、微小流体分離システム４１０は、キャリア流体と組織試料とを受容するための流体チャネル４１１と、複数の排出口４１２ａ〜４１２ｎとを含み得る。流体チャネル４１１内でのキャリア流体及び組織試料の流れは、複数の排出口４１２ａ〜４１２ｎのうちのそれぞれ１つが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、組織試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。流体チャネル４１１は、「直線的」形状を有するように図示されているが、以下に論じるように、流体チャネルは、例えばらせん状の形状のような任意の好適な形状を有し得るということが認識されるべきである。
【００２７】
１つの態様では、流体チャネル４１１は、キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口４１４を有する取り入れ口ゾーン４１３と、組織試料を受容するための組織試料取り入れ口４１５とを含み得る。流体チャネル４１１はまた、複数の排出口４１２ａ〜４１２ｎを有する、排出口ゾーン４１６をも含み得る。加えて、流体チャネル４１１は、取り入れ口ゾーン４１３と排出口ゾーン４１６との間にある移送領域４１７を含み得る。移送領域４１７は、キャリア流体と組織試料とに対して開放されていてよい。移送領域４１７内の交差流は、組織試料内の材料を、そのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得るが、複数の排出口４１２ａ〜４１２ｎのそれぞれが、組織試料内の材料の異なるサイズ画分を受容し得るようになっている。例えば、排出口４１２ａ〜４１２ｎは、さまざまなサイズ画分を、設計パラメーターに基づいて回収するように、空間的に分離され得る。６つの排出口が図示されているが、任意の好適な数の排出口が含まれていてよい。本明細書において用いられる場合、「交差流」という用語は、流体チャネル４１１内の粒子に対して横方向に作用して、異なるサイズ画分へと材料が分離されるようにし得る流れ及び／又は力を説明するために用いられている。したがって、例えば、流体チャネル４１１内の交差流は、（例えば、直線的なチャネル形状の）流体チャネルの中に注入された流体によるものであり得、かつ／又は、（例えば、ディーン抗力を発生させるような流れである、）横方向の二次的な渦流（これについては以下に詳述する）を生み出すらせん状チャネルに沿った流れによるものであり得る。１つの態様では、らせん状形状は、実質的に平面状のらせんであり得る。あるいは、又は追加的に、流体チャネル４１１内の交差流は、チャネル沿いの、交差流流体の導入を可能にする専用の流れ取り入れ口を介して誘導され得る。
【００２８】
濃縮システム４３０ａは、排出口４１２ａ〜４１２ｎのうちの１つ以上と関連付けられて、排出口４１２ａ〜４１２ｎに関連付けられた、組織試料内の材料のサイズ画分を濃縮し得るようになっている。図４に示すように、冷凍保存ユニットは、排出口４１１ａに関連付けられている。濃縮システム４３０ａは、濃縮システム４３０ａの１つ以上の排出口と関連付けられ得る出力した材料を、仕分けシステム４３０ｂに提供するための、１つ以上の排出口（ただし、これらは具体的には図示されていない）を含み得る。したがって、ひとたび所与のサイズ画分の材料が濃縮されると、その材料は、仕分けシステム４３０ｂへと出力され、濃縮システム４３０ａから送達された組織試料内の材料の、複数のアリコートに仕分けされ得る。１つの態様では、仕分けシステム４３０ｂは、約１〜約２０個の運動していない精子細胞を、それぞれのアリコートに仕分けるために用いられ得る。更に特定の１つの態様では、仕分けシステム４３０ｂは、約１〜約１０個の運動していない精子細胞を、それぞれのアリコートに仕分けるために用いられ得る。更にまた特定の１つの、仕分けシステム４３０ｂは、１つの運動していない精子細胞を、それぞれのアリコートに仕分けるために用いられ得る。１つの態様では、組織試料処理システム４００は、濃縮システムを含んでいなくてもよい。したがって、仕分けシステム４３０ｂは、微小流体分離システム４１０の排出口４１２ａ〜４１２ｎのうちの１つ以上と関連付けられ得る。組織試料材料のアリコートは、例えば冷凍保存用チューブ又は冷凍保存用ストローのような、冷凍保存用の任意の好適な容器又はチャンバ４４０内に送達され、その中に保管され得る。さまざまな寸法のものが採用され得るが、典型的な精子細胞アリコートは、１０〜約２０００マイクロリットル、一部のケースでは５０〜５００マイクロリットル、別のケースでは約２００マイクロリットル未満であり得る。
【００２９】
冷凍保存ユニット４２０は、例えば、組織試料の材料のアリコートを有する容器４４０を受容することにより、仕分けシステム４３０ｂからの材料を受容するように構成され得る。冷凍保存ユニット４２０は、組織試料材料のアリコートを凍結するための低温冷凍庫４２１を含み得る。１つの態様では、組織試料処理システム４００は、濃縮システム又は仕分けシステムを含んでいなくてもよい。したがって、冷凍保存ユニット４２０は、微小流体分離システム４１０の排出口４１２ａ〜４１２ｎのうちの１つ以上と関連付けられ得る。
【００３０】
１つの態様では、組織試料処理システム４００は、入力された量の精子試料を、所定のアリコートに分割し、そのアリコートを、「仕分けチップ」上に設けられた冷凍保存チャンバに送達して、集められた精子集団を比較的均一に分割できる。それゆえ、流体は仕分けシステム４３０ｂに向けて送られ得るが、そこでは、精子含有流体の多数のアリコートが個別に保管され、後に、それぞれ独立に冷凍及び解凍され得る。それゆえに、組織試料処理システム４００は、精巣の組織試料を入力として受容し、精子細胞の生存性を損なうことなく、仕分けされ冷凍保存された精子を出力することが可能である。１つの態様では、保管用チャンバは、ヒトの体外受精ラボで精子を分注するために用いられる、マイクロマニピュレータとともに用いられ得る。
【００３１】
精子細胞が時間に対して敏感であることは、このようなアプローチを望ましいものとするが、それは、当初のＩＶＦ術が不首尾に終わった場合に、細胞を別々の時に解凍することが可能であるからである。多数のアリコート保管チャネルが直列に配置され、それぞれ独立に凍結及び解凍し得る、任意の数の個別のコンパートメントを提供し得る。このように、組織試料処理システム４００は、分離された精子を、個別に冷凍保存され、解凍後、ＩＶＦ用に容易に元の状態に戻し得るアリコートに分けることができる、ミクロ規模の精子冷凍保存システムであり得る。
【００３２】
１つの態様では、組織試料処理システム４００を、多数の冷凍保存用アリコートを作るため、個々の精子を集団に仕分けるのを自動化することが可能である。それゆえ、組織試料処理システム４００は、ｍＴＥＳＥ術中の、例えば、精巣の組織片を、単一の細胞に解離させ、精母細胞を、その他の体細胞型及び組織の破片から分離するような、組織処理の工程を自動化し得る。自動化されたシステムは、臨床医に、試料処理に本来かかっていた時間を節約させることができるとともに、人為的ミスを減らすことも可能となり、効率を改善し、更には一貫した結果を得ることがより可能となる。別の１つの態様では、組織試料処理システム４００は、細胞分離、仕分け、そして冷凍保存を提供する、微小流体閉鎖「システム」を備え得る。閉鎖システムは、無菌性を高め、汚染を防ぐ一方で、試料の喪失を最小化し得る。しかしながら、冷凍保存ユニット及び／又は仕分けシステムは、精子分離流体チャネルとは独立して用いられ得るということを認識すべきである。
【００３３】
１つの態様では、組織試料処理システム４００は、組織を単一の細胞に解離するための構成部品を含み得るが、それは、ヒトのｍＴＥＳＥ術用試料は、典型的には、個別の細胞ではなく組織片からなるためである。機械的なアプローチ（例えば、フィルター、速い流速に依存する空洞現象に基づく装置、及び、細胞集塊をせん断し、同時に細胞を分離可能な、横方向外側への移動用アレイに基づく変形例）を用いれば、細胞に悪影響を及ぼす可能性のある酵素の使用を回避可能である。１つの態様では、赤血球がその出力を汚染しているという場合に、細胞集団から赤血球を取り除くのを助けるために、赤血球に特異的に働く抗体を用いることが可能である。１つの態様では、組織試料処理システム４００は、入ってくる異なる組織型（例えば、精子細胞、血球細胞、又は幹細胞）を仕分けるための、使い捨てモジュールを有し得る。組織試料処理システム４００はまた、入力／出力制御部品、精子細胞計数用／画像形成用構成部品、及びソフトウェアをも含み得る。
【００３４】
組織試料処理システム４００は、閉塞性又は非閉塞性無精子症を患っている患者から抽出した精巣の精子の生検試料から、精子を分離するための現行の方法に対して、いくつかのアドバンテージを有している。例えば、精巣の組織の、自動化されたミクロ規模の流れにより、ヒューマンエラーが減少し、時間が短縮され、更に、人間の技術者により手動で、顕微鏡下において精子細胞を分離するのに必要とされる技術熟練度が減ることになる。ミクロ規模の仕分け及び冷凍保存システムはまた、多数のアリコートを個別に解凍することを可能とするが、これは現行の技術とは対照的であり、ＩＶＦの結果を改善するものである。加えて、組織試料処理システム４００によれば、現行の冷凍保存方法と比べて、精子細胞が元の状態に回復する率が高まる。それゆえ、本装置は、精子の質を保存することができる（すなわち、細胞標識化、酵素、細胞溶解のいずれもがない）。
【００３５】
組織試料処理システム４００は、任意の好適なタイプの仕分け構造又は構成を備え得る。１つの例では、流体チャネルは、分割薄流原理を用いて、運動していない精子細胞を、試料内の他の細胞破片から分離することが可能である。この技術の１つの例が、米国特許第８，５３５，５３６号に記載されており、この特許はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。別の１つの例では、流体チャネルは、サイズによる分離用のポストを流れの中に有する、横方向外側の変位アレイを備え得る。小さな粒子は、まっすぐに通過するように移動可能であるが、より大きな粒子は、片側に偏向され得る。
【００３６】
図５Ａは、らせん状の形状を有する流体チャネル５１１を有する、微小流体分離システム５１０を模式的に図示している。このデザインは、さまざまなサイズの粒子に作用する慣性による揚力と、粘着性の抗力とを有効に利用して、精子のようなミクロ規模の粒子が、分化しながら移動し、そして分離するのを実現するものである。支配的な慣性力と、らせん状のマイクロチャンネルの幾何学的な形状によるディーン回転力とが、より大きな粒子には、マイクロチャネルの内側の壁に近い位置で、１つの均衡位置を占めさせることになる。ディーン力の影響下では、より小さい粒子は、マイクロチャネルの外側の半分に移動して、２つの区別可能な粒子の流れを形成する結果となり、この粒子の流れは、２つの別々の排出口内に回収されることとなり得る。高いアスペクト比を有するチャネルによって生成された大きな揚力により、短い距離の中で、また遅い速度の流れであっても、完全な流離分離又は、濾過が実現され得る。
【００３７】
らせん状微小流体分離システム５１０は、内側取り入れ口５１４ａ、外側取り入れ口５１４ｂ、複数のループに配列された流体チャネル５１１、内側排出口５１２ａ、及び外側排出口５１２ｂを備え得る。
【００３８】
内側取り入れ口５１４ａ及び外側取り入れ口５１４ｂは、さまざまなサイズの粒子を含有する、多くの粒子で満たされた溶液を受容するように構成され、らせん状微小流体分離システム５１０の中に溶液が入るのを可能にするようなポート又はその他の接続装置に接続され得る（例えば、シリンジが繋がれるように構成され得る）。代替的な１つの実施形態では、ただ１つの取り入れ口が設けられ得るが、別の１つの実施形態では、３つ以上の取り入れ口が用いられ得る。
【００３９】
内側取り入れ口５１４ａと外側取り入れ口５１４ｂとは、複数のループ５１１状に配列されたらせん状流体チャネル５１１に、流体連結されている。図５Ｂは、らせん状流体チャネル５１１の断面図を図示している。流体チャネル５１１は、２つの第１壁５５０及び５５１、並びに２つの第２壁５５２及び５５３を有する矩形の断面を有している。第１壁５５０及び５５１は、本明細書では、マイクロチャネルの幅を画定するものとして、また、第２壁５５２及び５５３は、高さを画定するものとして、言及し得るものである。しかしながら、らせん状微小流体分離システム５１０の向きについて、なんらの特定の限定を意図してはいない。
【００４０】
内側排出口５１２ａ及び外側排出口５１２ｂは、らせん状マイクロチャネル５１１の、内側取り入れ口５１４ａ及び外側取り入れ口５１４ｂとは反対側に位置している。本明細書でより詳細に説明されるように、分離された粒子は、内側排出口５１２ａ及び外側排出口５１２ｂで、集められ、検出され、計数され、又はその他の方法で分析され得る。
【００４１】
らせん状微小流体分離システム５１０の設計パラメーターは、ディーン抗力を用いて、より小さい粒子の位置を溶液内で入れ替え、かつ、ディーン抗力と結合された慣性による揚力を用いて、より大きな粒子を溶液内で均衡させて、２つの粒径どうしの間の、完全な又はほぼ完全な分離を実現し得る。これらの力を組み合わせた効果として、粒径に基づく、区別可能な粒子の流れが結果として形成され、これらの流れが、らせん状流体チャネル５１１内の層流を利用することにより、内側排出口５１２ａ及び外側排出口５１２ｂで集められる。
【００４２】
図５Ｂは、らせん状流体チャネル５１１内を流れる粒子に作用する力を更に図示している。らせん状のチャネル内に集まる流れは、慣性による揚力（ＦＬ）、すなわち粒子を壁から遠ざけるように押す力と、ディーン抗力（ＦＤ）、すなわち横方向の二次的な渦流によって、らせん状チャネルの長さ方向に沿って生成される力との間のバランスを必要とする。このバランスは、所与の粒子タイプに対して、流れのある物理的パラメーターが、ある具体的に特定された範囲にある場合に達成され得るものである。慣性による揚力（ＦＬ）とディーン抗力（ＦＤ）は、以下の式によりそれぞれ計算可能である：
【００４３】
【数１】
2017531440.tif 000003
式中、μは、流体の粘度であり、ＵＤｅａｎは、平均ディーン速度であり、ａｐは粒子の直径であり、Ｕｍは、最大流速であり、かつ、Ｄｈは、矩形チャネルの流体力学的径である。
【００４４】
かくして、らせん状流体チャネル５１１を通って流れる流体は、径方向外側向きの遠心性の加速度を受けることになり、ディーン渦として知られる、２つのそれぞれ反対方向に回転し、それぞれチャネルの上半分と下半分とに存在する渦５５６ａ及び５５６ｂを形成することとなる。曲線のあるチャネルを流れる粒子（図５Ｂでは粒子１〜４と標識化してある）は、横断方向のディーン流れにより、抗力を受ける。粒径によるが、この抗力（ＦＤ）は、粒子をディーン渦に沿って動かし（すなわち、円運動させ）、それにより、内側又は外側のチャネル壁に向かって移動させる。このディーン抗力ＦＤに加えて、曲線のあるチャネル内の粒子は、水圧による力と慣性による揚力とを受けている。粒子に作用する純揚力（ＦＬ）は、せん断力により誘導された慣性による揚力と、壁により誘導された慣性による揚力とを組み合わせたものである。ポアズイユ流れ中、速度プロファイルの放物性は、結果として、流体のせん断力により誘導された慣性による揚力を結果として生み出し、その力は粒子に作用し、かつマイクロチャネルの中心から遠ざかる方向に向かうようになっている。粒子がマイクロチャネルの壁に向かって動くにつれて、非対称的な後流が粒子の周りに誘導されて、壁により誘導され、壁から遠ざかる方向に向かう、慣性による揚力を生み出す。これらの対向する揚力の大きさは、チャネルの断面にわたって変化し、壁により誘導された揚力がチャネル壁（例えば、内側壁５５２及び外側壁５５３）の近くでは支配的となり、せん断力により誘導された揚力は、流体チャネル５１１の中央付近で支配的となっている。したがって、粒子は、反対向きの揚力同士が均しくなり、狭い帯状を形成する位置を占める傾向がある。
【００４５】
図６Ａ〜６Ｃは、慣性による移動の原理を模式的に図示している。図６Ａは、マイクロチャネル５１１内を流れる粒子５６０を図示している。図６Ｂは、矩形のマイクロチャネル５１１の場合に、せん断力により誘導された揚力と壁により誘導された揚力とが互いに均衡する均衡位置の数が、低いＲｅの４カ所（位置５６２ａ、５６２ｂ、５６２ｃ、及び５６２ｄ）にまで減少することを示している。以下により詳細に説明するように、ディーン抗力（ＦＤ）成分を加えることにより、その４カ所の均衡位置の数は更に減少し、図６Ｃに図示されている内側マイクロチャネル壁（位置５６４）付近の、たった１つになる。
【００４６】
再びここで図５Ｂを参照すると、らせん状流体チャネル５１１内に分散した粒子は、流体チャネル５１１の上半分及び下半分にそれぞれ形成される２つのディーン渦５５６ａ及び５５６ｂのうちの片方に乗り込むことになる。ディーン抗力と慣性による揚力とは、マイクロチャネル内を１未満のＲｅで流れる中立的に浮揚性の粒子の移動を支配しがちである。流体チャネル上下の壁５５０及び５５１付近を流れる粒子（粒子３及び粒子４により図示）は、ディーン抗力ＦＤによる強い横方向の流れを感じ、マイクロチャネル内側壁５５２及び外側壁５５３へ向かって押し流される。マイクロチャネル外側壁５５３付近では、純揚力（ＦＬ）がＦＤの方向に沿って作用し、粒子（粒子２）は、そのサイズに関わらず、ディーン渦５５６ａ及び５５６ｂに従う動きを続ける。しかしながら、流体チャネル内側壁５５２付近では、ＦＬ及びＦＤが互いに逆方向に作用し、これらの力の大きさ次第で、粒子（粒子１）は均衡して集束する流れを形成するか、又はディーン渦の中で、再循環し続ける。
【００４７】
らせん状流体チャネル内を流れる粒子に作用する力、すなわちディーン抗力及び慣性による揚力、が粒径に依存することは、同じくらいの粒径を有する粒子の、集束する流れを作るために操作することが可能である。らせん状微小流体分離システム５１０のらせん状の幾何学形状は、より大きな粒子に、単一の均衡位置を、流体チャネルの内側壁５５２付近で占めさせる。他方、より小さい粒子は、ディーン流によるより大きな粘着性抗力を受け、ディーン渦５５６ａ及び５５６ｂに沿って再循環を続け、かつ、マイクロチャネル５１１の外側の半分に移動され得る。このように、らせん状微小流体分離システム５１０は、より大きな粒子の慣性による移動と、より小さい粒子に対するディーン抗力の影響力とを用いて、異なる粒径の粒子を分離することを実現する。
【００４８】
完全な粒子の分離を実現するために必要となる、らせん状マイクロチャネル５１１の長さＬｆは、以下のように書くことができる：
【００４９】
【数２】
2017531440.tif 000004
式中μは流体の粘度であり、ｈはチャネルの寸法（典型的には高さ）、ρは流体の密度であり、Ｕｍは、チャネル内の最高速度であり、ａは粒子の直径であり、かつｆＬは、粒子の揚力係数である。
【００５０】
ここで、図７Ａ〜７Ｄを参照すると、らせん状微小流体分離システム６１０の別の１つの実施形態が図示されている。この例示的ならせん状マイクロチャネル粒子セパレータ６１０は、図７Ａに図示されているように、内側取り入れ口６１４ａ、外側取り入れ口６１４ｂ、及び６個の排出口６１２ａ〜６１２ｆを備える。一部の実施形態では、１つだけの取り入れ口を用い得るということを理解すべきである。あるいは、３つ以上の取り入れ口を用い得る。更に、排出口も図のものよりも多くても少なくてもよい。らせん状微小流体分離システム６１０は、複数のループ状に配置されたらせん状流体チャネル６１１を有する。図示された実施形態では、取り入れ口６１４ａ及び６１４ｂから、複数の排出口６１２ａ〜６１２ｆまで５つのループが存在している。
【００５１】
ディーン抗力と慣性による揚力とを組み合わせた結果、流体チャネル内側壁６５２で、粒子が均衡している。粒子が均衡している位置は、これらの２つの力の比率に依存して決まる。らせん状微小流体分離システム６１０の幾何学的特性は、２つの力の割合が粒径に依存するということを利用して、分別された、集束する粒子の流れを形成する（図７Ｃ及び７Ｄの、粒径Ａ、Ｂ、及びＣの粒子の流れにより図示されている）が、その流れは、排出口６１２ａ〜６１２ｆから取り出され得る。図７Ｂに図示されているように、粒径Ａ、Ｂ、及びＣ（図８参照）を含む、多くの粒子を含んだ溶液が、内側及び／又は外側取り入れ口６１４ａ及び６１４ｂから導入される。それぞれのサイズを有する粒子は、流体チャネル６１１内で混じり合っている。らせん状流体チャネル６１１内では、粒子粒径による複数の流れに集束し始めている。図７Ｃに示すように、粒径Ａの粒子は、最大の粒子であるが、これらの粒子は、内側壁６５２に最も近い位置にある第１の流れ６６７に収束する。粒径Ａよりも小さい粒径Ｂの粒子は、粒径Ａの粒子の流れの隣にある第２の流れ６６８に集束している。粒径Ｂよりも小さい粒径Ｃの粒子は、最も外側の第３の流れ６６９に集束している。
【００５２】
複数の排出口６１２ａ〜６１２ｆの前に、粒子６６７、６６８、及び６６９の流れを、指定された排出口に方向付ける助けとなる幅広部分６６４が、位置し得る。個別の粒子の流れと流れとの間の分離は、個別の流れを複数の排出口６１２ａ〜６１２ｆで取り出す前に、らせん状流体チャネル６１１が、幅広部分６６４の中に開放されることによって向上する。図７Ｄを参照すると、複数の排出口６１２ａ〜６１２ｆは、粒子の集束した流れをそれぞれ受容するように配列されている。第１の粒子の流れ６６７は、粒径Ａの比較的大きな粒子を含むが、らせん状微小流体分離システム６１０を、排出口６１２ａから出る。第２の粒子の流れ６６８は、粒径Ｂの粒子を含むが、らせん状微小流体分離システム６１０を、排出口６１２ｂから出る。粒径Ｃの最小の粒子は、らせん状微小流体分離システム６１０を、排出口６１２ｃから出る。
【００５３】
図８は、流体チャネル６１１の断面を示し、ＦＬ及びＦＤの粒子への効果を表す。これらの力の比率（ＦＬ／ＦＤ）は、所与のサイズ（直径）の粒子がどこで均衡するかを決める（例えば、流れの中又は粒径Ａ、Ｂ、又はＣ）決定要因である。支配的な慣性による揚力は、流体チャネルの内側壁付近にある取り入れ口で無作為的に分配されていた粒子を、流れが下流に進むにつれて、位置合わせしていく。他方、有意なレベルのディーン抗力は、これらの集約された流れを、粒径に応じて、最大の粒子がチャネルの内側壁に最も近くなるように、チャネルの壁から更に遠ざけるように動かす。この結果、異なる粒子の３つの流れが展開されることになるが、これらの流れは、適切な排出口を設計することにより、独立に取り出され得る。
【００５４】
既に説明したとおり、微小流体分離システムの流体チャネルは、微小流体の慣性に基づいて材料を仕分けるためのらせん状の形状を有し得る。微小流体の慣性力は、流れと揚力を均衡させ、らせん状のチャネル内の粒子を集束させ、粒径と形状とに基づいて、異なるチャネル排出口に細胞を向けることが期待されている。このように適切な幾何学的形状と流速とを有するらせん状チャネルを用いることにより、混合液中の精子細胞を他の細胞から分離して濃縮することが可能となる。細胞及び粒子が、らせん状チャネルを通って動くにつれて、逆回転の流れが成立し、チャネル内で粒子を横方向に動かす。細胞及び粒子が、チャネルの側壁に向かって移動するにつれて、揚力が粒子を壁から遠ざけるように押し、粒子を、チャネル内の、流れと揚力が均衡する、均衡位置に動かす。チャネル内の粒子にとって、この均衡位置がどこになるのは粒子のサイズ、形状、流速、及び、らせん状チャネルの幾何学的形状次第で変化する。所与のチャネルの幾何学的形状に対して、異なる粒径と形状の粒子は、チャネル内の異なる位置で集束する。チャネルの幾何学的形状と流速とを最適化することにより、試料内のその他のさまざまな粒子に対して、どこで精子が分離され、集束するかという条件を決定し得る。なお、精子は独特のサイズと形状を有しており、そのことは、こうした方法を精製に利用する好機を、提供するものである。らせん状のチャネルを導入しているので、揚力と集束の場所は、らせんの半径によって大きく影響を受ける。このように、これらのさまざまなパラメーターを操作して、精子細胞を汚染細胞から分離するのに最適なチャネル及び流速を決定することが可能となる。
【００５５】
上に論じてきた理論的原理を用いて、精子を効果的に分離するらせん状流体チャネルを設計することが可能となる。集束に対して、慣性による揚力と、ディーン抗力との間の比率（Ｒｆ）は、以下の式で与えられ、
【００５６】
【数３】
2017531440.tif 000005
その比率は０．０８以上であり得るが、それにより、ディーン抗力（式１）が支配的なものとなる。より強い集束のためには、粒子／チャネルの寸法比（λ）は、以下の式で与えられ、
【００５７】
【数４】
2017531440.tif 000006
その比は、０．０７以上であってよい。チャネルのアスペクト比は、１以下：２〜１以下：４（高さ：幅、又は幅：高さ）である。らせん状チャネルの長さは、約２Ｌｆ以上であり得る（式３）が、それにより良好な粒子分離を保証できる。
【００５８】
１つの態様では、流体チャネルは、約２５μｍ〜約１００μｍの高さを有し得る。別の１つの態様では、流体チャネルは、約５０μｍ〜約４００μｍの幅を有し得る。更に別の１つの態様では、チャネルのアスペクト比は約０．２〜約０．５であり得る。更にまた別の１つの態様では、らせんの平均半径は約１ｃｍ〜約１６ｃｍであり得るが、等比級数状になる。更なる態様においては、流体チャネル内の流速は、約０．１ｍＬ／分〜約１ｍＬ／分であり得るが、より大きなチャネルについては、それよりも速い速度になり得る。排出口の数は、２〜１０個であり得るが、ただし、流体チャネルは、任意の好適な数の排出口を有し得る。ある特定の例では、らせん状チャネルは、最初のらせんの半径が０．７ｃｍ、最後のらせんの半径が０．８９９ｃｍであり、チャネルの幅が１５０μｍであり、チャネルの高さが５０μｍであり、４回らせん状に巻かれており、チャネルどうしの間の隙間は、３１０μｍであってよい。精子を分離するための微小流体分離システムを設計するにあたって直面する課題の１つは、理論上は球状の粒子を想定しているものの実際には不規則な、精子細胞の形状である（精子の頭部の長さは約４．７９μｍで、幅は約２．８２μｍである）。ある推測では、精子は、５μｍ直径の球としてみなし得る。解像度の推測用に、赤血球は、９μｍの直径の球として近似し得る（ＲＢＣの寸法は：直径が７．５〜８．７μｍで、厚みが１．７〜２．２μｍ）。
【００５９】
それゆえ、本開示による微小流体分離システムは、細胞のサイズと形状に頼る微小流体の慣性力アプローチに基づき得る。精子は、慣性力微小流体チャネルを用いて同じようなサイズの細胞と比較すると、長い尾部を有するために独特の挙動を示し得るが、そのことは、精子を素早く精製し集める上では役立つものである。このように、動きのない精子を赤血球やその他の汚染細胞から分離するために、らせん状チャネルを用いることが可能である。１つの態様では、分離の技術は、精子のサイズ及び／又は形状特性にフォーカスすることができる。例えば、慣性力の微小流体設計は、精子の尾部が有する「背びれ様」形状の、特定の方向に流すという特性を利用することが可能である。
【００６０】
図９は、本開示の１つの例による仕分け／濃縮システム７３０を模式的に図示している。仕分け／濃縮システム７３０は、本明細書で開示したような微小流体分離システムからの組織試料材料を受容するための取り入れ口７７０と、排出口７７０ｂとを含み得る。仕分け／濃縮システム７３０はまた、第１流体導管７７１及び第２流体導管７７２をも含み得る。第１流体導管７７１は、ある所与のサイズの粒子（例えば、組織試料材料のうちの所望のサイズ画分の細胞）がその導管を通ることができないようなサイズ又は形状であり得る。１つの態様では、第１流体導管７７１は、所望のサイズの粒子を１つ以上受容又は収容可能なサイズのトラップ部７７６ａを有し得るが、第１導管を粒子が通過するのを防ぐように構成されている小サイズ部７７６ｂ（精子に対しては１．５μｍ以下の幅を有する）をも有し得る。第１流体導管７７１の流体抵抗は、所与のサイズの粒子が第１導管に向かって流れて来て、第１導管で捕らわれるようにするように、第２流体導管７７２の流体抵抗よりも大きくなり得る。加えて、仕分け／濃縮システム７３０は、複数のアリコート保管チャネル７７３ａ、７７３ｂ（すなわち、固定化チャネル）と、アリコート保管チャネルに、保管（例えば、冷凍保存）のために、アリコートを分離するのを容易にするため、その複数のアリコート保管チャネルと関連付けられた複数のバルブ７７４ａ、７７４ｂとを含み得る。第１導管７７１から、そこに捕らわれた粒子を流し、複数のアリコート保管チャネル７７３ａ及び７７３ｂの中に流すための流体を提供するための還流ライン７７５が含まれ得る。取り入れ口、排出口、及び還流ライン７７５は、仕分け／濃縮システム７３０の動作を容易にするためのバルブ７７４ｃ〜７７４ｅをそれぞれ含み得る。バルブ付き導管７７７が、流れを制御するために含まれ得る。
【００６１】
図１０Ａ〜１０Ｃは、動作中の仕分け／濃縮システム７３０を図示している。図１０Ａは、組織試料材料がシステムに入ってくるのを可能にするために開放された、取り入れ口７７０ａのバルブ７７４ｃと、排出口７７０ｂのバルブ７７４ｄとを示す。他のバルブは全て閉めてある。そのような場合、組織試料は精子７７８ａ〜７７８ｄを含み、この精子７７８ａ〜７７８ｄを濃縮し、仕分けることが望ましい状況である。組織試料材料は、より大きな粒子用のトラップが待っている第１導管７７１に流入するか、あるいはそのようなトラップを迂回する第２導管７７２流入するかのいずれかである。しかしながら、第２導管７７２内の抵抗はより高いため、組織試料内の材料は、好んで第１流体導管７７１内に流入する。大きな粒子、例えば精子７７８ａ〜７７８ｃは、第１導管７７１内で、小サイズ部７７６ｂ（図１０Ｂ参照）により捕捉されるが、一方で小さな粒子７７９は、第１導管７７１の小サイズ部７７６ｂを通過して、排出口７７０ｂを介してシステム７３０から出られるようになっている。大きな粒子（例えば、精子７７８ｄ）を含む、第１導管７７１に流入しない任意の粒子は、トラップを迂回することが可能である。２つの流路を提供したことにより、精子７７８ａ〜７７８ｄがシステム７３０を通って流れるにつれて、それらがトラップで捕捉されるか又はトラップを迂回するかのいずれかであることが保証される。第２導管７７２は、所望の流れ抵抗（背圧）を得られるように、その長さ及び／又は断面積を調製することが可能である。一般的なガイドラインとして、設計上のパラメーターは変化し得るが、第２導管は、第１導管よりも０．３〜３倍大きい流れ抵抗を有し得る。１つの態様では、第１導管７７１のトラップ部７７６ａと、迂回の態様により、所望の数（例えば約１〜約５個）の精子が１つのトラップ内に捕捉されるように構成され得る。所望の数の精子が捕捉されると、図１０Ｂに示すように、取り入れ口バルブ７７４ｃ及び排出口バルブ７７４ｄを閉鎖して、システム７３０を通る流れをストップできる。図１０Ｃに示すように、還流ライン７７５のバルブ７７４ｅ及びアリコート保管チャネル７７３ｂのバルブ７７４ｂを開放して、精子７７８ａ〜７７８ｃを、第１チャネル７７１のトラップ部７７６ａからアリコート保管チャネル７７３ｂへと流すことが可能である。あるいは、アリコート保管チャネル７７３ａのバルブ７７４ａを開放し、バルブ７７４ｂを閉鎖して、精子をアリコート保管チャネル７７３ａに向かわせるのも可能である。バルブ７７４ａ及び７７４ｂは、１回精子を流す間に、交互に開放して、捕捉した精子の一部をアリコート保管チャネル７７３ａ及び７７３ｂに分けることが可能であるが、あるいはバルブ７７４ａ及び７７４ｂは、精子を１回流すごとに交代して開閉することも可能である。こうして、仕分け／濃縮システム７３０は、望ましくない粒子を組織試料から除去し、それにより精子を濃縮し、かつ精子をアリコートに仕分けして冷凍保存させることが可能である。なお、２つのアリコート保管チャネルしか図示されていないが、システム７３０は、任意の好適な数のアリコート保管チャネルと、関連するバルブを含み、捕捉した精子を所定の位置に回すことが可能であるということを、認識すべきである。例えば、精子を準備して、プレートの個々のウェル内に、１度に１つずつ分注することも可能である。１つの態様では、仕分け／濃縮システム７３０は、単一のトラップしか内蔵していない「チップ」として構成されることも可能である。
【００６２】
仕分け／濃縮システム７３０は、濃縮システムとして構成することが可能で、その濃縮システムは、アリコート保管チャネルを１つ省いて又は１つだけ用いて、仕分けシステムを兼用させ得る／させないことも可能であるということを認識すべきである。同様に、仕分け／濃縮システム７３０は、仕分けシステムとして構成することが可能で、その仕分けシステムは、取り入れ口７７０ａ、並びにアリコート保管チャネル７７３ａ及び７７３ｂのバルブ７７４ａ〜７７４ｃのみを操作することによって、濃縮システムを兼用させ得る／させないことも可能である。
【００６３】
図１１は、本開示の別の１つの例による仕分け／濃縮システム８３０を模式的に図示している。仕分け／濃縮システム８３０は、トラップと迂回の構成を組み込んだという点で、多くの面で図９の仕分け／濃縮システム７３０と類似している。しかしながらこの場合、仕分け／濃縮システム８３０は、直列に配置した複数のトラップと迂回とを含む。この例にはバルブが図示されていないが、仕分け／濃縮システム８３０は任意の好適な配置でバルブを含むことが可能であり、それにより、比較的大きな粒子、例えば精子を捕捉することを容易にし、既に説明したような方法、例えば連続的なバルブの開閉動作や、逆流を発生させることにより精子をトラップから取り除いて、その大きな粒子をシステム８３０から回収するのを容易にすることが可能であるということを認識すべきである。
【００６４】
本明細書で開示された構成部品は、任意の好適な材料で製造され得るが、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）材料、ポリメチルメタクロレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、及び／又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）が挙げられるが、それらに限られない。
【００６５】
１つの態様では、本明細書で開示される技術は、単一の組織試料処理システムであるが、そのシステムは、試料源が精巣の組織である場合に、体細胞や破片に対して精子を分離して濃縮するために使用可能である。別の１つの態様では、組織試料処理システムはまた、精子試料から冷凍保存用のアリコートを作製することを可能にし、後々に使用することを可能とする。他の能力には、精子を培養して、精子を倍数性に基づいて分離することも含まれる。
【００６６】
本明細書で開示される技術の、更に別の用途は、ヒト及びその他の動物の臨床的生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の分野及び生殖研究の分野に存在する。現行の、ＡＲＴ関連精子分離技術は、精子の運動性に依存して分離が行われ、そのために、典型的な分離の方法はしばしばＡＲＴでは用いられない一方で、本明細書で開示される方法は、運動している細胞を必要としないため、ＡＲＴの分野でも独特のアプローチである。例えば、精巣の組織試料からの少数の細胞を濃縮可能な、本明細書で開示される組織試料処理システムは、男性不妊症の分野における用途に幅広い関わりを用いるものである。組織試料処理システムは、生存している精子を分離することが可能であるだけでなく、他のまばらな細胞型、例えば精原幹細胞やその他の精子前駆体をも分離することが可能である。これは、ヒトの精巣の組織から精原幹細胞を分離する現行の方法が、治療的処置とは両立しない、抗体のような薬剤の使用を伴うということを考慮すると、非常に重要である。重要なことには、組織試料処理システムは、これらの細胞型を、有害な試薬を添加することなく分離し得る。生体外での精原幹細胞分化技術と合わせて用いて、組織試料処理システムは、成熟した精子細胞の培養に用いることができ、現在成熟した精子を作ることができない患者に対して不妊治療を行う場合の、選択肢を提供するものである。
【００６７】
本技術は、ＩＶＦで使用するため個々の精子を選別するためにも用いることが可能である。例えば、組織試料処理システムは、正常な倍数体の（それぞれの染色体のちょうど１つだけを含む）精子細胞を、異常な倍数体の（多すぎる又は少なすぎる１つ以上の染色体を含む）精子細胞から分離するために用いられ得る。ＩＶＦ用に正常な精子を、質量又は電荷に基づいて分離する能力は、生存する胚を作り出す可能性を高め、一染色体性又は三染色体性の胚ができる可能性を低くする。正常な精子を分離することに加えて、個々の精子の非侵襲的な保存により、それぞれの精子の生殖能力を判定するための非侵襲的な撮像が可能となり、妊娠及び誕生を成功させるために最善の潜在能力を有する精子を発生学者が選択するのを可能にし得る。
【００６８】
臨床的な目的に加えて、個々の精巣細胞型を少量の組織から分離して冷凍保存することで、生殖研究の能力を向上させることが可能である。例えば、ＮＯＡの患者は、精巣内に、特定の精子形成の中心点を示すが、現在のところ、何が１つの精細管内での精子形成を促進し、他ではそれをしないのかがはっきりとわかっていない。精細管から、特定の細胞下位集団を分離することにより、遺伝子の発現、後生的又はその他の分子分析の実施が可能となり、精子形成を命じる分子的メカニズムが明らかになる可能性を開く。精原幹細胞の分離により、マウスの組織における先端研究を補うためのヒトの組織における多能性転化のプロセスの研究を、研究者が行うことも可能になるであろう。更に、個々の精子細胞を捉えることにより、研究者が、多様な精子集団をバルクで研究するのとは異なる、個別の精子の特性を研究することが可能になり得る。
【００６９】
本発明の１つの実施形態によれば、精子細胞を分離する方法が開示される。その方法は、流体チャネルと複数の排出口とを有する微小流体分離システムを得ることを含み得る。その方法は、キャリア流体を流体チャネル内に配置することを更に含み得る。加えて、その方法は、精子試料を流体チャネル内に配置することを含み得るが、流体チャネル内でのキャリア流体及び精子試料の流れは、複数の排出口のうちのそれぞれ１つが、精子試料内の材料の異なるサイズ画分を受容するように、精子試料内の材料をそのサイズに基づいて、複数のサイズ画分に分離するのを容易にし得る。
【００７０】
方法の１つの態様では、流体チャネルはらせん状の形状を有する。方法の別の１つの態様では、微小流体分離システムは、キャリア流体を受容するためのキャリア流体取り入れ口及び組織試料を受容するための組織試料取り入れ口を有する取り入れ口ゾーンと、複数の排出口を有する排出口ゾーンと、取り入れ口ゾーンと排出口ゾーンとの間の移送領域とを備えてよく、移送領域は、キャリア流体及び組織試料に対して開かれており、移送領域内の交差流が、組織試料内の材料をサイズに基づいて分離するのを容易にする。方法の更に別の１つの態様では、複数の排出口の少なくとも１つと関連付けられる精子試料内の材料は、運動していない精子細胞を含む。１つの態様では、方法は、仕分けシステムを、複数の排出口の少なくとも１つに関連付けることを更に含んでもよく、複数の排出口のうちのその少なくとも１つと関連付けられる精子試料中の材料は、運動していない精子細胞を含み、かつ、方法は、運動していない精子細胞を複数のアリコートに仕分けることを含む。方法の１つの態様では、仕分けシステムは、複数の排出口のうちの少なくとも１つに関連付けられた組織試料の中の材料を受容するための取り入れ口と、複数のアリコート保管チャネルと、複数のアリコート保管チャネルと関連付けられる、複数のアリコートをアリコート保管チャネルに分離するのを容易にするための複数のバルブとを含んでもよい。
【００７１】
本発明の別の１つの実施形態によれば、精子試料から運動していない精子細胞を分離する方法が開示される。その方法は、層流条件下で精子試料を流体チャネルを通して流すことを含み得るが、流体チャネル内の交差流が、内側の流体流れ層内の、運動していない精子細胞を分離するのを容易にする。また、方法は内側の流体流れ層を空間的に分離することを含み得る。
【００７２】
方法の１つの態様では、流体チャネルはらせん状の形状を有してもよい。１つの態様では、方法は、運動していない精子細胞を、流体チャネルの排出口内に受容することを更に含み得る。別の１つの態様では、方法は、運動していない精子細胞を複数のアリコートに仕分けることを更に含み得る。方法の１つの態様では、複数のアリコートのそれぞれは約１〜約２０個の運動していない精子細胞を含み得る。方法の別の１つの態様では、複数のアリコートのそれぞれは約１〜約１０個の運動していない精子細胞を含み得る。方法の更に別の１つの態様では、複数のアリコートのそれぞれは単一の運動していない精子細胞を含み得る。
【００７３】
本開示の方法においては、特定の順序を要求しないが、一般的に、１つの実施形態では、方法のステップは連続的に実行され得る。
【００７４】
図１２Ａ〜２２は、本発明の１つの態様による、組織試料処理システムの性能に関する試験データを示す。特に、図１２Ａ及び１２Ｂは、高白血球（ＷＢＣ）精液から精子を分離する能力を示す。図１２Ａは、らせん状チャネルを用いて分離した後の、異なる排出口のそれぞれでの、細胞濃度測定値を示す。ＷＢＣの大半（７．５百万／ｍＬ）が、内側壁排出口で集められ、精子の大半（２．５５百万／ｍＬ）は、外側壁排出口で集められた。図２２Ｂは、８３％の精子細胞が外側壁排出口で、９４％のＷＢＣが内側壁排出口で集められたことを示す。加えて、少量のＲＢＣも、内側壁排出口で集められた。このように、らせん状チャネルによる精子分離技術は、高濃度のＷＢＣを含む精液試料に対して用いることが可能である。精液中のＷＢＣの濃度が、１００万／ｍＬに近い値であったり、それを超える値であったりした場合には、膿精液症（白血球増多症）であると考えられる。ＡＲＴ術を進める前に、精液からＷＢＣを除去すべきである。図２１は、４つの排出口それぞれの精子集団の密度を計測するための細胞集計グリッド（例えば、ＭＡＫＬＥＲ細胞計算板）の代表的な部分を示す。
【００７５】
前述の詳細な説明は、特定の代表的実施形態を参照して本発明について記載している。しかし、添付の特許請求の範囲に説明されている本発明の範囲を逸脱することなく、種々の修正及び変更を行うことができることが理解されるであろう。詳細な説明及び添付図面は、制限するものではなく、単に例示的なものとしてみなされるものとし、かかる全ての修正又は変更は、たとえあったとしても、本明細書で記載及び説明される本発明の範囲内に収まることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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