(57)【要約】  成分としてポリペプチドＩＭＰＩα（野生型を含む）および／またはポリペプチドＩＭＰＩα融合体、ならびに少なくとも１つの抗生物質化合物、特にアミノ配糖体抗生物質、および／または少なくとも１つの殺菌化合物を含む組成物であって、ポリペプチド、少なくとも１つの抗生物質および少なくとも１つの殺菌化合物は組成物中に、組合せで耐性細菌に対して相乗効果を示す濃度で存在する、組成物。
2017521495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分としてポリペプチドＩＭＰＩα（野生型を含む）および／またはポリペプチドＩＭＰＩα融合体、ならびに少なくとも１つの抗生物質化合物、特にアミノ配糖体抗生物質、および／または少なくとも１つの殺菌化合物を含む組成物であって、前記ポリペプチド、前記少なくとも１つの抗生物質化合物および／または前記少なくとも１つの殺菌化合物は前記組成物中に、組合せで耐性細菌に対して相乗効果を示す濃度で存在する、組成物。
【請求項２】
前記ＩＭＰＩαが、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特に８０％、特に少なくとも９０％もしくはさらに９５％相同性を有するポリペプチドであるまたは配列番号２のポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα融合体の群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα融合体の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物において適切なポリペプチド。
【請求項５】
感染が疑われるもしくは診断されるとすぐに、または手術の前、間、もしくは後に予防的に、患者の細菌負荷を減少させることにより、細菌感染の治療に使用するための、タンパク質昆虫メタロプロテイナーゼインヒビターＩＭＰＩαの野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％相同性、特に８０％、９０％もしくは９５％または１００％相同性を有するポリペプチドを含む組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの抗生物質化合物および／または殺菌化合物に対して少なくとも部分的に耐性である細菌によって少なくとも部分的に引き起こされる細菌感染の治療における請求項５の使用のための、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの殺菌化合物または少なくとも１つの抗生物質化合物が、
−  単独適用の際の阻害用量よりも低い用量、または最大許容用量までのより高い用量で投与され、
−  ＩＭＰＩαと本質的に同時に、または個々の投薬スキーム、頻度、および治療期間で、特に、ＩＭＰＩα適用は継続される治療中断を伴って、別々に投与される、
さらなる殺菌化合物、特に少なくとも１つの抗生物質化合物および／または少なくとも１つの殺菌化合物との組合せにおける請求項５に記載の使用のための、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
患者の細胞にトランスフェクトし、これらの細胞において前記ポリペプチドを発現させることによる感染の治療のための、請求項１から４に記載の組成物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項９】
コーティングまたは滅菌装置、特にインプラントのための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物または請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
注射、吸入または局所的適用に適切な、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物のポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つの殺菌化合物および／または少なくとも１つの抗生物質化合物をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐性細菌の増殖を阻害する、分子、核酸、ペプチドおよびタンパク質の組合せに、ならびにプロテアーゼ活性、病原体の増殖およびバイオフィルムの形成を阻害する、ペプチドまたは核酸、および分子およびタンパク質とのその組合せの使用に関する。より具体的には、本発明は、微生物または真菌起源のプロテアーゼのあるスペクトルに対する活性、特に、サーモリシン、炭疽中性プロテアーゼ５９９（ｎｐｒ５９９）、シュードリシン（pseudolysin）、およびオーレオリシン（aureolysin）を含めたメトジンシン（metzincin）ファミリー、特に、プランクトンフリーかつ凝集形態での細菌増殖、および細菌性バイオフィルムの形成に対する活性を示す、分子、核酸、ペプチドおよびタンパク質の組合せに、ならびに核酸、ペプチド、および分子およびタンパク質とのその組合せの使用に関する。本発明は、抗菌活性の付加的な分子を含む組成物を含めた、分子、核酸、ペプチドまたはタンパク質を含む医薬組成物にさらに関する。また、本発明は、細菌または真菌感染症とそれらの症状を予防および／または治療するために、オーレオリシン、バシロリシン（bacillolysin）、シュードリシン、ビブリオリシン（vibriolysin）、および炭疽ｎｐｒ５９９などの分泌型または膜結合型の細菌性プロテアーゼの各タンパク質分解活性を阻害することによりそれらの毒性効果の低減、ならびに、バイオフィルム保護または耐性細菌を抗生物質の効果に感受性にすることを含む、これらのペプチドまたは核酸、および分子およびタンパク質とのその組合せを使用する方法に関する。本発明は、細菌感染の任意の段階、特に早期段階で、これらのペプチドまたは核酸、ならびに分子およびタンパク質とのその組合せを使用することにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染についての現行の標準的な治療は、主に抗生物質に頼っている。しかしながら、特定の条件下では、抗生物質の使用により、耐性細菌株の出現または選択が引き起こされる。いっそう悪いことには、いくつかの細菌株は、抗生物質の全パネルに対する抵抗性を発生させる能力がある。その結果、細菌ビルレンスを標的とする新しいコンパニオン化合物を開発するために幾つかのプログラムが始められている。
【０００３】
ほとんどの抗生物質の作用機序は、細胞壁合成、ＤＮＡ複製およびタンパク質合成などの細菌プロセスの鍵となる成分の合成または組立を防ぐことによる細菌増殖サイクルの破壊に頼っている。抗生物質は、病原体が、１つまたはさらに複数の抗生物質に対して耐性とならない限り、高度に有効である。今日では、多耐性細菌は、主要な臨床上の問題および健康上の脅威（ヘルスケア関連感染、ＨＡＩ）になっている。抗生物質耐性微生物に起因する感染により、有意により高い罹患率、より長期の入院、死亡率の増加およびヘルスケアコストの増加が引き起こされる。特に、いわゆる「ＥＳＫＡＰＥ」病原体（フェカリス菌（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）、アシネトバクターバウマニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびエンテロバクター（Enterobacter）属種）は、院内の患者への主な害を代表している。毎年合衆国の成人の入院患者の間で約４４０，０００の推定ＨＡ感染が、毎年９８億ドルの追加のヘルスケアコストを生じさせている（Zimlichmanら、2013）。
【０００４】
多くの院内感染は、全ての病院内感染の１０％の原因となる緑膿菌（pseudomonas aeruginosa）によって引き起こされる（Aloushら、2006）。この微生物によって引き起こされる感染は、しばしば生命にとって危険であり、また抗微生物剤に対するその低い感受性および治療の間の抗生物質抵抗性の頻繁な出現に起因して治療することが困難である。これらの株は、セファロスポリン、カルベニシリン、コリスチン、ゲンタマイシン、ポリミキシン、キノロンおよびストレプトマイシンのようなごく少数の抗生剤に対して感受性である（Sivanmaliappanら、2011）。それらの顕著な薬剤抵抗性は、抗微生物剤に曝露後の抵抗性のデノボ出現および、耐性緑膿菌（P.aeruginosa）の患者から患者への汚染から生じる。実質的に、染色体ＡｍｐＣセファロスポリナーゼの抑制；異なる分子クラス（クラスＡ、クラスＤオキサシリナーゼおよびクラスＢカルバペネム加水分解酵素に属する、カルベニシリナーゼおよび拡大スペクトルβラクタマーゼ）の、プラスミドまたはインテグリン媒介性βラクタマーゼの産生；外膜透過性の減少（ＯｐｒＤタンパク質の欠損）；広い基質プロファイルを有する活性な流出システムの過剰発現；アミノ配糖体修飾酵素（ホスホリルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼおよびアデニリルトランスフェラーゼ）の合成；ならびにトポイソメラーゼＩＩおよびＩＶ決定キノロン抵抗性の構造上の変化のような微生物抵抗性の全ての公知の機構が観察され得る。厄介なことに、これらの機構は、しばしば同時に発生し、活性化し、それによって多耐性の表現型が与えられていることから、この微生物を病院中で制御しにくくしている（Stratevaら、2009）。ＵＳ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｉｌａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍからのデータによると、緑膿菌（P.aeruginosa）は院内肺炎の二番目に最も一般的な原因（１７％）であり、尿路感染の三番目に最も一般的な原因であり（７％）、手術部位感染の四番目に最も一般的な原因であり（８％）、血流から七番目に最も頻繁に単離される病原体であり（２％）および全ての部位からの全体で五番目に最も一般的な単離体である（９％）（El Solhら、2009）。より重要なことに、その細菌は、入院患者において肺炎を引き起こす最も一般的な多種薬剤耐性グラム陰性病原体である。
【０００５】
細菌感染の治療をサポートするために、細菌性ビルレンス因子は、細菌感染の症状を低減させるための標的となっている。細菌性病原性を維持するために必須であるために、ビルレンス因子は、とりわけ環境の脅威および宿主防御機構に対する抵抗性、増殖能力、宿主への付着性、組織特異性、および栄養源へのアクセス性を促進する。種々の細菌性およびしばしば株特異的な成分が、関与し、それらの多くは宿主に有害である。ビルレンス因子の協調した機能は、株の攻撃性を決定する。多くのケースにおいて、ビルレンス因子は、分泌されるタンパク質または酵素であり、時には非常に特異的な機能を示す。例えば、毒性が最も高い細菌性ビルレンス因子の１つは、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）により分泌される、いわゆるラムダ−トキシン（軽鎖）である。亜鉛依存性プロテアーゼは、サーモリシン様プロテアーゼ（ＴＬＰ：トロポニン）ターゲティングシナプス小胞融合タンパク質であり、体重の１キログラム当たり８ナノグラムと低い致死量で重篤な神経毒性効果を引き起こす（Lebrunら、2009）。ＴＬＰは多くの微生物種中に存在し、多くのＴＬＰは幾つかの重篤な細菌感染に関与する鍵となる病原性因子と考えられる。例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）からのラムダ−トキシンは、様々なヒト免疫防御タンパク質を分解する。ビブリオ種からのビブリオリシンおよび緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からのシュードリシンは、ヒトにおいて潜在的に致死的な血液毒である。さらにまた、炭疽菌（Bacillus anthracis）も、強力なメタロプロテアーゼを備えている。
【０００６】
シュードシリン（Pseudosysin）、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン、および炭疽ｎｐｒ５９９は、哺乳動物および多くの無脊椎動物が特異的なインヒビターを欠く、メタロプロテイナーゼのＭ４またはメトジンシンファミリーに属している。これらのプロテアーゼは、おそらく敗血症、易出血性組織出血（hemorrhagic tissue bleeding）、壊死および血管透過性の上昇などの重篤な感染症に関連する多くの病理学的症状の発端となる（Chungら、2006）。胃潰瘍および消化性潰瘍ならびに胃癌のような重篤な疾患は、少なくとも部分的には病原体Ｍ４メタロプロテイナーゼの影響で生じる（Schmidtchenら、2003、Smithら、1994）。
【０００７】
一部のビルレンス因子は、ドラッグデザインおよび治療的介入のための推定上の標的として最近認識された。多くの新しく発見された合成のまたは天然の小有機化合物は抗ビルレンス活性を示し、一方、細菌トキシンを中和する抗体は産業における現行の抗ビルレンス戦略の焦点となっている。このアプローチの例は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）タイプＩＩＩ分泌系（ＴＴＳＳ）の機能を阻害するＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）ＰＥＧ化、組換え抗シュードモナス（Pseudomonas）ＰｃｒＶ抗体Ｆａｂ’断片（ＫＢ００１）である（Millaら、2013）。ＰＥＧ化は、血清半減期を拡大し、標的部位で緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により分泌されるプロテアーゼ（たいていはシュードリシン）による不活性化に対して保護する。肺炎予防についての臨床第Ｉ／ＩＩ相トライアルは、現在進行中である。別の例は、Ｋｅｎｔａ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＫＢＳＡ３０１であり、黄色ブドウ球菌（S.aureus）外毒素に対して高度に特異的な完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡに対して活性である。
【０００８】
シュードリシンのインヒビターも、同定され、公開された。シュードリシンインヒビターが、バイオフィルム形成および維持に干渉できることが想定された。したがって、全ての公開されたインビトロ試験を、緑膿菌（pseudomonas a.）のバイオフィルム干渉試験として行った。細菌ストレプトマイセスタナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）によって産生される化合物である、Ｎ−メルカプトアセチル−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−アミド（Ｋ（ｉ）＝４１ｎＭ）（Cathgart G.R.ら、2011）、ホスホラミドン、およびその誘導体タロペプチン（talopeptin）、ホスフォノマダイト、フェナントロリン、およびキナゾリンベースの小分子（Khanら、2009）は、全て宿主のシュードリシンを標的とするが、宿主の生理的なＭ４ファミリー関連プロテアーゼも標的とする。例えば、ホスホラミドンは、内在性タンパク質であるエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を阻害する。これらの副作用は、おそらくこれらの化合物がいずれもこれまでに臨床トライアルにおいてさらに調査されていない主な理由である。
【０００９】
Ｃａｔｈｇａｒｔら（２０１１）は、いくつかのシュードリシンインヒビターが既に形成された緑膿菌（pseudomonas a.）バイオフィルムを減少できるが、一方、プランクトン緑膿菌（pseudomona a.）が前記インヒビターによってまったく影響されないことを観察した。彼らは、前記インヒビターがゲンタマイシンまたはシプロフロキサシンのような抗生物質と組み合わせる場合にバイオフィルムを完全に溶解できること、および双方（インヒビターおよび抗生物質）が高用量で適用されることをさらに観察した。
【００１０】
Ｐｏｐｏｖら（Popov S.G.ら、2005）は、マウスにおいて抗生物質化合物（シプロフロキサシン、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ）およびメタロプロテアーゼインヒビター様フェナントロリンおよびホスホラミドンの同時適用における実験の結果を公開した。彼らは、動物を細菌胞子に曝した直後ではなく一または二日遅延させて適用される場合のみ、２つのメタロプロテイナーゼインヒビターが感染株において追加の阻害を発揮することを見出した。しかしながら、インヒビター組合せの即時適用は、プロフロキサシン単独を適用することと比較して、生じた違いはほんのわずかであった。さらに、著者らは、シュードリシンインヒビター単独を適用すること（すなわち、並行した抗生物質なしで）は、効果がないことを観察した。これらの観察は、バイオフィルムの形成が開始され、シュードリシンが放出される場合に、Ｍ４プロテアーゼインヒビターの治療効果が、遅発型感染段階に限定されると一般的に予期されていることを反映している。これらの段階で、（双方とも高用量の）インヒビターおよび抗生物質は、細菌増殖の強い阻害を示すことが予想される。
【００１１】
サーモリシン様酵素を特異的に阻害する特定のペプチドは、昆虫メタロプロテイナーゼインヒビターＩＭＰＩαである。ＩＭＰＩαは、元々免疫されたハチノスツヅリガ（G.mellonella）の幼虫の血リンパにおいて発見され、それから精製された（Weddeら、1998）。その活性部分は６９個のアミノ酸を含み、分子内システイン結合と７６６７．７Ｄａの分子量を含む。その分子は、サーモリシン、バシロリシンおよびシュードリシンに対してそれぞれ０．６２、０．８６および８１．６６ｎＭにすぎないＩＣ６０を有することが報告されている。ＩＭＰＩαはヒトメタロ−マトリックスプロテアーゼＭＭＰ１、２、３、７、８、および９に対して試験され、それらのうちＭＭＰ１およびＭＭＰ２だけが無視できる程度の阻害を示した。この比較により、活性部位ループがＩＭＰＩα中３３位のアミノ酸〜４０位のアミノ酸の間に存在し、切断部位が３７位のアミノ酸（アスパラギン）と３８位のアミノ酸（イソロイシン）との間に含まれることがさらに推測された。メタロプロテイナーゼの他の公知のタンパク質インヒビターは、Ｍ４プロテアーゼファミリーのプロテイナーゼを阻害しない。ＩＭＰＩαを細菌、特に大腸菌（E.coli）において組換え的に産生できることが示された。真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、トランスジェニック植物および動物は、組換え産生のための供給源としても機能し得る。あるいは、分子の化学合成および無細胞組換え産生が、ＩＭＰＩαを産生する手段であるだろう。
【００１２】
Ｖｉｌｃｉｎｓｋａｓ  Ａ（２０１１）は、総説"Anti-Infective therapeutics from the lepidopteran model host Galleria mellonella"Current Pharmaceutical Design 17(13), 1240-124において、オオハチミツガのハチノスツヅリガ（the greater wax moth Galleria mellonella）の幼虫は、ヒト病原体のための代理代替モデル宿主としておよび抗生物質のインビボ試験または病原体の変異体ライブラリーのための全動物ハイスループット系（whole-animal-high-throughput-system）として使用するといずれも成功することを開示している。加えて、広域性の抗微生物ペプチドおよびタンパク質が、この昆虫において、過去十年間の間に、同定されており、その中のいくつかが鱗翅目（Lepidoptera）に特異的に思われる。免疫関連エフェクター分子の兵器は、細菌、真菌または双方に対して強力な活性を示すペプチドおよびタンパク質を包含し、その新しい抗感染治療剤としての可能性が現在探究されている。特に興味深いのは、ハチノスツヅリガ（G.mellonella）において発見されている昆虫メタロプロテイナーゼインヒビター（ＩＭＰＩ）である。ＩＭＰＩは、敗血症、易出血性組織出血、ネクローシスおよび血管透過性の増強などの重篤な症状の原因となるヒト病原体のいくつかの顕著なビルレンスおよび／または病原性因子を含めた、サーモリシン様微生物メタロプロテイナーゼに対して特異的かつ強力な活性を示す。抗生物質と病原体関連タンパク分解酵素のインヒビターの組合せにより相乗的な治療効果が得られるとの証拠が利用可能であるので、ハチノスツヅリガ（G.mellonella）からのＩＭＰＩおよび抗微生物ペプチドは、新しい薬物の合理的なデザインのため有望なテンプレートを提供し得る。抗感染剤としての昆虫由来遺伝子コード化抗微生物化合物の可能性および制約が考察される。
【００１３】
Ａｎｊａ  Ｃｌｅｒｍｏｎｔらは、Biochemical Journal Aug 2004, 382 (1) 315-322、"Cloning and expression of an inhibitor of microbial metalloproteinases from insects contributing to innate immunity"の論文において、最初のＩＭＰＩ（昆虫からのメタロプロテイナーゼのインヒビター）が、オオハチミツガのハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）中で同定されたことを開示している。彼らは、このＩＭＰＩをコードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現を報告している。ＩＭＰＩ  ｍＲＮＡは、ハチノスツヅリガ（G.mellonella）幼虫を細菌に曝した後のサブトラクティブおよび抑制性ＰＣＲ分析から、誘導された転写物中に同定された。体液性免疫応答の間のＩＭＰＩの誘導された発現はリアルタイムＰＣＲによって確認され、未処理の幼虫と比較して免疫化したものにおいてＩＭＰＩ  ｍＲＮＡの５００倍多量まで記録された。ＩＭＰＩ配列はメタロプロテイナーゼの組織インヒビターまたはメタロプロテイナーゼの他の天然インヒビターのものと類似性を共有し、また組換えＩＭＰＩはサーモリシン様メタロプロテイナーゼを特異的に阻害するが、マトリックスメタロプロテイナーゼは阻害しない。これらの結果は、ＩＭＰＩがハチノスツヅリガ（G.mellonella）体液性免疫応答の間に誘導され、プロセシングされて、病原体関連サーモリシン様メタロプロテイナーゼを不活化する新規タイプの免疫関連タンパク質を提示するとの仮説をサポートする。
【００１４】
Ｒ．Ｃａｌｄｗｅｌｌらは、2003 Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res 67A: 1-10, 2003において"Significant occurrences of arterial restenosis remain a complicating factor of endovascular stent implantation"について報告している。マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（ＭＭＰＩ）であるＧＭ６００１の、３１６Ｌステンレススチールに対するポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）吸収性コーティングへの取り込みは、平滑筋細胞が殖え遊走する速度を減少させる手段として提案される。コーティングは溶媒蒸発技術を使用して製作され、その表面は非接触プロフィルメトリー（noncontacting profilometry）および走査型電子顕微鏡によって特徴づけられる。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによって決定されるＰＬＧＡの十分な分解が起こり、適切な量のＧＭ６００１をコーティングから７日間以内に放出した。４２日目での累積的なＧＭ６００１放出は、コーティング内の実際のＧＭ６００１含有量の７７．８±１．４％であると決定された。ＧＭ６００１を含有するコーティングは、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）のインビトロ細胞増殖の速度を、わずか４および７日後に金属性基質と比較してそれぞれ３０．７および３７．４％、減少させた。しかしながら、細胞数に対して標準化されたＭＭＰ−２活性は、ＧＭ６００１放出コーティングと金属基質との間で統計学的に異なっていなかった。掻爬創傷傷害アッセイ（scrape wound injury assay）を使用して、ＨＡＳＭＣの遊走が２１．４％まで減少され、ＧＭ６００１が金属性基質のみと比較してＰＬＧＡコーティングから放出されることが示された。これらの結果は、金属基質の吸収性コーティングからＭＭＰＩを放出することにより、正常な細胞制御を保持する取組みにおいて全体ＭＭＰ活性を維持しつつ、ＨＡＳＭＣが殖え遊走する速度が減少させることを示唆する。
【００１５】
Ａ．Ｖｉｌｃｉｎｓｋａｓらは、Entomological Research 37 (Suppl. I) (2007) A79に、"The greater wax moth Galleria mellonella as a mini-host model for human pathogens and as a reservoir of novel peptide antibiotics"を開示している。ＩＭＰＩは、ヒト病原体のビルレンス因子である、微生物メタロプロテイナーゼの特異的なインヒビターを表す。ＩＭＰＩは、第二世代抗生物質の開発のための標的として同定されている顕著なサーモリシン様メタロプロテイナーゼ、例えば、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシンおよびビブリオリシンを強く阻害する（Clermontら、2004）。サーモリシン様微生物メタロプロテイナーゼは、病的発生の間に十分に確立された役割を果たし、病的な症状、例えば、血管透過性の増加、出血性浮腫、および敗血性傷害を引き起こすので、ＩＭＰＩは新規ペプチド抗生物質のデザインのための有望なテンプレートを提示する（Weddeら、2007）。
【００１６】
要約すると、最も知られているＭ４プロテアーゼインヒビターが、単独であろうと抗生物質との組合せであろうと、後の段階でのみ、抵抗性細菌に対して活性を発揮することが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、ＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体および少なくとも１つのさらなる殺菌化合物、またはＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードする核酸、またはそれらと殺菌化合物の組合せを含む、化合物組合せを提供することが本発明の課題であり、これらは細菌感染、特に少なくとも１つの抗生物質に部分的にもしくは完全に対抗する細菌が関与する感染に、感染の任意の段階で、および特に早期段階での治療において効率的である。本発明の別の態様は、ＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体、またはこれらのペプチドを発現する、ＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードする核酸、ならびに場合により細菌感染、特に部分的もしくは完全耐性細菌が関与する感染を、感染の任意の段階で、および特に早期段階で治療する少なくとも１つのさらなる殺菌化合物の使用を含む。
【００１８】
本発明の根底にある目的は請求項１に記載の組成物を適用することによって達成される。１つまたは複数の独立請求項に従属する請求項は、本発明の特定の実施形態に関係している。「含む」という用語は、新規事項を追加することなく、「からなる」で置きかえることができることが理解される。
【００１９】
本発明の一実施形態において、成分としてポリペプチドＩＭＰＩα（野生型を含めた）および／またはポリペプチドＩＭＰＩα融合体、ならびに少なくとも１つの抗生物質化合物、特にアミノ配糖体抗生物質、および／または少なくとも１つの殺菌化合物を含む組成物であって、ポリペプチド、少なくとも１つの抗生物質化合物および／または少なくとも１つの殺菌化合物は組成物中に、組合せで耐性細菌に対して相乗効果を示す濃度で存在する、組成物が含まれる。
【００２０】
本発明の組成物は、別の実施形態において、耐性細菌に対して有効なＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体をコードする核酸を、場合により、少なくとも１つの殺菌化合物および／または少なくとも１つの抗生物質化合物との組合せで含む。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα融合体からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の主題はまた、本発明の組成物において適切なポリペプチドであって、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、および配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα融合体からなる群から選択されるポリペプチドである。
【００２３】
本発明の主題はまた、感染が疑われるもしくは診断されるとすぐに、または手術の前、間、もしくは後に予防的に、患者の細菌負荷を減少させることにより、細菌感染を治療するための、特に少なくとも１つの抗生物質化合物または殺菌化合物に対して少なくとも部分的にまたは完全に耐性である細菌によって引き起こされる細菌感染を治療するための、タンパク質昆虫メタロプロテイナーゼインヒビターＩＭＰＩαの野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％相同性、特に８０％、９０％もしくは９５％または１００％相同性を有するポリペプチドの使用である。
【００２４】
本発明の実施形態において、ポリペプチドは、さらなる殺菌化合物、特に少なくとも１つの抗生物質化合物および／または少なくとも１つの殺菌化合物との組合せにおいて使用され、少なくとも１つの殺菌化合物または少なくとも１つの抗生物質化合物は、
−  単独適用の際の阻害用量よりも低い用量、または最大許容用量までのより高い用量で投与され、
−  ＩＭＰＩαと本質的に同時に、または個々の投薬スキーム、頻度、および治療期間、特に、ＩＭＰＩα適用は継続される治療中断（treatment break）を伴って別々に投与される。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、１つまたは複数の殺菌化合物および／または抗生物質化合物に対して耐性である細菌によって少なくとも部分的に引き起こされる細菌感染を治療するために使用される。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態において、組成物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、患者の細胞にトランスフェクトし、これらの細胞において前記ポリペプチドを発現させるのに使用される。
【００２７】
本発明のなお別の実施形態において、組成物のポリペプチドは、コーティングまたは滅菌装置、特にインプラントのために使用することができる。それは、他の殺菌化合物との組合せで有利に使用することができる。
【００２８】
本発明の主題は、注射、吸入または局所的適用に適切な本発明の組成物のポリペプチドを含有する医薬組成物でもある。
【００２９】
医薬組成物の一実施形態において、医薬組成物は、さらに少なくとも１つの殺菌化合物および／または少なくとも１つの抗生物質化合物を含むことができる。
【００３０】
本発明の主題は、１つまたは複数の抗生物質化合物および／または殺菌化合物に対して耐性である細菌によって引き起こされる患者の感染の治療における使用のための、特に１つまたは複数の抗生物質化合物および／または殺菌化合物に対して耐性である細菌によって引き起こされる感染の早期治療における使用のための本発明の組成物でもある。
【００３１】
本明細書において使用される場合、以下の用語は、そうではないことが明示的に述べられない限り、以下の意味を有する。
【００３２】
「装置」という用語は、臨床設定に使用される装置、特に患者と接触される装置、および特に、背側から胴体側に移され、血液、血清、リンパなどのような体液、または患者の体の内側に位置付けられるよう指定されるインプラントと、一時的にまたは永久的に接触される装置を含む。装置は、ステント、カテーテル、静脈カニューレ、ペースメーカー、人工関節および骨、生分解性および永続性薬物沈着物、パッチおよびデブリードマン、ならびに歯科用充填材および歯冠を含む。
【００３３】
「患者」という用語は、性別、年齢、ゲノムプロファイル、民族または既往症に関係なく、細菌に感染したまたは細菌感染する傾向にあるヒトを含む。患者には、細菌に感染した全ての動物、特に家畜（domestic animal）、例えば、鳥類および魚類、ならびにイヌおよびネコのようなコンパニオン動物を含めた、家畜（farm animal）も含まれる。
【００３４】
「ｗｔＩＭＰＩα」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、より大きな前駆体分子であるＩＭＰＩから内因的に切断される、全長ＩＭＰＩ分子のＮ末端断片から構成されるタンパク質を指す。
【００３５】
「ｍｔＩＭＰＩα」または「Ｍｕｔｅｉｎ  ＩＭＰＩα」という用語は、配列番号２（ｗｔＩＭＰＩα）と少なくとも７０％、特に８０％、９０％、９５％相同であるが同一ではないアミノ酸配列を有し、かつ、１０００ｎＭ未満のＩＣ５０、特に１００ｎＭ未満のＩＣ５０でＭ４プロテアーゼファミリーの少なくとも１つのプロテアーゼを阻害するアミノ酸配列を有する全ての組換えタンパク質または合成タンパク質を含み、アミノ酸配列  配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４にリストされるものなどのアミノ酸ストレッチ３５から３９において単独で変異させたものが含まれる。
【００３６】
「Ｍ４プロテアーゼ」という用語は、ペプチダーゼのＭＥＲＯＰＳオンラインデータベース（http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=M4）に与えられる定義を指す。
【００３７】
本明細書に使用される「生物学的に活性」という用語は、ｗｔＩＭＰＩαあるいは１０００ｎＭ未満のＩＣ５０、特に１００ｎＭ未満もしくは約１０ｎＭのＩＣ５０でのサーモリシンまたはＭ４プロテアーゼファミリーの別のプロテアーゼの阻害を実証するｍｔＩＭＰＩαを指す。
【００３８】
「ＩＭＰＩα」という用語は、化学的に修飾されてもよい、生物学的に活性なｍｔＩＭＰＩαおよびｗｔＩＭＰＩαを含むものとする。
【００３９】
「ＩＭＰＩα融合体」という用語は、より大きなペプチドまたはタンパク質の部分である、生物学的に活性なＩＭＰＩαを含むものとする。
【００４０】
「耐性細菌」という用語は、１つまたは複数の抗生物質化合物または殺菌化合物に曝露後に生存することができる、細菌の種のいくつかの部分集団を指す。複数の抗生物質化合物または殺菌化合物に対して耐性である細菌は、多種薬剤耐性（ＭＤＲ）と考えられる。
【００４１】
感染の「早期段階」という用語は、診断前に、感染の非特異的な症状のみが顕在化するまたはさらには予防的である場合、すなわち、感染のリスクが想定される、および症状が顕在化しない場合の感染の診断を意味する。感染の早期段階に、細菌は、なおも指数関数的に低い濃度にありまたは対数増殖期にあり、まだ大きく広がったバイオフィルムを形成していない。感染の早期段階に適用される治療は、早期治療とよばれる。
【００４２】
「抗生物質化合物」という用語は、微生物を殺すまたは微生物の増殖を阻害する剤を意味する。
【００４３】
特に、抗生物質化合物は、アミノ配糖体抗生物質であり、例えば、以下のものである。
【００４４】
【表１】
2017521495.tif 000003
【００４５】
「殺菌化合物」という用語は、細菌を殺す物質を意味する。殺菌剤は、例えば、消毒剤、防腐剤、または抗生物質である。
【００４６】
「相乗的な」という用語は、それら個々の効果と異なるまたはその効果の和よりも高い効果を奏するシステムにおける複数の要素の相互作用を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】（ａ）１．０００、（ｂ）５００、（ｃ）２５０および（ｄ）１２５ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシンの存在下でＭ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（４５μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（長い破線）および非存在下（短い破線）での緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＤＳＭ番号５００７１）の増殖曲線の比較を示す図である。
【図２】異なるゲンタマイシン濃度（８，０００；４，０００；２，０００；１，０００；５００；２５０；１２５；６２．５ｎｇ／ｍｌ；ＮＢ培地）の存在下、Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（ａ）なしおよび（ｂ）Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩαの存在下（４５μＭ；ＮＢ培地番号５）における緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＤＳＭ番号５００７１）の増殖曲線を示す図である。
【図３】４５（黒色、ひし形記号）および２０（暗灰色、三角）μＭ  ＩＭＰＩαの存在下ならびにＩＭＰＩαの非存在下（灰白色、水平バー）（ＮＢ培地番号５）、異なるゲンタマイシン濃度（８０００；４０００；２０００；１０００；５００；２５０；１２５；６２．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下、（ａ）１２時間後（ｂ）２４時間後（ｃ）３６時間後および（ｄ）４８時間後における緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＤＳＭ番号５００７１）の増殖曲線を示す図である。
【図４】集塊中に遊離して懸濁したバイオフィルムの形成が、ストレスの多い環境条件（例えば、緩衝液へのゲンタマイシンＧｍの付加；パネルＡ（６２．５ｎｇ／ｍｌ）およびパネルＢ（１２５ｎｇ／ｍｌ））を克服するために緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により使用される成功した戦略であることを示す図である。昆虫メタロプロテアーゼインヒビター（ＩＭＰＩα）とインキュベートされる場合、バイオフィルム形成は妨げられる（それぞれ、パネルＣおよびＤで６２．５および１２５ｎｇ／ｍｌ  Ｇｍ用量）。
【図５】（ａ）１，０００、（ｂ）５００、および（ｃ）２５０ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシンの存在下でＭ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（２５μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（長い破線）および非存在下（短い破線）での緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＶＢ７６２３、気管分泌物からの臨床分離株）の増殖曲線の比較を示す図である。
【図６】低い濃度のゲンタマイシン（破線）で、緑膿菌（P.aeruginosa）培養物ＶＢ７６２３の増殖速度は、全身ストレス応答の一部であろう、ＮＢ培地における２６時間後の増殖を増強するように見えることを示す図である。
【図７】非常に低い濃度のゲンタマイシンで、緑膿菌（P.aeruginosa）培養物ＶＢ７６２３の増殖速度に影響がないことを示す図である。さらに、ストレス応答は、観察できなかった。
【図８】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（２５μＭ、ＮＢ培地番号５）の存在下（暗灰色、三角）および非存在下（灰白色、水平バー）、異なるゲンタマイシン濃度（８０００；４０００；２０００；１０００；５００、２５０、１２５、６２．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下、（ａ）１２時間後（ｂ）２４時間後（ｃ）３６時間後および（ｄ）４８時間後における緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）培養物（気管分泌物からの臨床分離株ＶＢ７６２３、４ＭＲＧＮ株［ＥＵＣＡＳＴ］として評価される）の増殖曲線を示す図である。
【図９】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（７３μＭ；ＮＢ培地番号５）および異なるゲンタマイシン濃度（３２；８；４；２；１；０，５；０，２５；０，１２５μｇ／ｍｌ）の存在下（下側の四角）および非存在下（上側の四角）、４８時間後９６ウェルプレートにおける緑膿菌（P.aeruginosa）（気管分泌物からの臨床分離株ＶＢ７６２３、４ＭＲＧＮ株［ＥＵＣＡＳＴ］として評価される）の増殖の間のピオベリジン（pyoveridine）（環状灰白色構造、すなわち、プレートウェル中の暗灰色背景）の発生の比較を示す図である。ピオベリジンは、ＩＭＰＩおよびゲンタマイシンの同時存在下、０，１２５μｇ／もの低いゲンタマイシン濃度においてさえ発現されない。
【図１０】１２５ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシンの存在下でＭ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（７３μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（長い破線）および非存在下（短い破線）での緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＶＢ７６２３、気管分泌物からの臨床分離株）の増殖曲線の比較を示す図である。
【図１１】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩα（７３μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（暗色の太線）および非存在下（短い破線）、異なるゲンタマイシン濃度（５００；２５０；１２５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ）の存在下での緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＶＢ７６２３、気管分泌物からの臨床分離株）の増殖曲線の比較を示す図である（陽性対照は灰色）。
【図１２】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩ（７３μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（暗灰色）および非存在下（灰白色）、異なるゲンタマイシン濃度（３２；８；４；２；１μｇ／ｍｌ；５００；２５０；１２５；６２．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下、（ａ）１２時間、（ｂ）２４時間、（ｃ）３６時間、（ｄ）４８時間後における緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＶＢ７６２３、気管分泌物からの臨床分離株、４ＭＲＧＮ株［ＥＵＣＡＳＴ］として評価される）の増殖曲線の比較を示す図である。
【図１３】患者の気管分泌物から単離された緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）株ＶＢ７６２３の耐性記録を示す図である。株は、多耐性グラム陰性株（４ＭＲＧＮ  ［ＥＵＣＡＳＴ］）として評価された。
【図１４】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩαの存在下（黒色線）および非存在下（灰色線）、ゲンタマイシンまたは任意の他の抗生物質の使用なしでの緑膿菌（P.aeruginosa）培養物（ＶＢ７６２３、気管分泌物からの臨床分離株）の増殖曲線の比較を示す図である。ＩＭＰＩα濃度は、（ａ）２５μＭ；ＮＢ培地番号５および（ｂ）６０μＭ；ＮＢ培地番号５である。
【図１５】Ｍ４−メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩ（６０μＭ；ＮＢ培地番号５）の存在下（黒色輪郭四角）および非存在下（二重輪郭四角）、４８時間後９６ウェルプレートにおける緑膿菌（P.aeruginosa）（気管分泌物からの臨床分離株ＶＢ７６２３、４ＭＲＧＮ株［ＥＵＣＡＳＴ］として評価される）の増殖の間のプランクトン性バイオフィルムおよびピオベリジン（ウェル中の灰色）の発生の比較を示す図である。ピオベリジン（灰色）はＩＭＰＩαの存在下でより少なく分泌され、このケースで、プランクトン性バイオフィルムも観察することができない。
【図１６】フルオロフォア（ａ）ピオケリンおよび（ｂ）ピオベリジンの励起および発光スキャンを示す図である。双方の分子は、ビルレンスのため必須であり、クオラムセンシングの際に発現される。差スペクトルを、培養培地を遠心分離することおよび培地に対する上清を測定することにより取得した。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明者らは、例えば、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα、および例えば、配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有するＩＭＰＩα融合体を適用することにより、感染の任意の段階で、特に少なくとも１つのさらなる殺菌化合物との組合せが適用される場合は驚くべきことに本発明の組成物が感染の早期段階で適用されるときに、耐性細菌の増殖が減少および停止されることを発見した。この観察は驚くべきことであり、その理由は、ＩＭＰＩαが、高い細菌濃度でのみ、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）についてのケースのようなバイオフィルム形成の間または後に、放出される、Ｍ４プロテアーゼ活性、例えば、サーモリシン、シュードリシン、オーレオリシン、ビブリオリシン、バシロリシンおよびｎｐｒ５９９に干渉するからである。したがって、非耐性細菌における幾つかの刊行物が示唆するように、Ｍ４プロテアーゼインヒビターは、バイオフィルム増殖後にのみ細菌と干渉すると予想するべきである。
【００４９】
しかしながら、発明者らは、ＩＭＰＩαおよびＩＭＰＩα融合体またはその殺菌化合物との組合せが、まったく非付着性の細菌を含有する溶液中の耐性細菌の増殖を、遅延、停止またはさらに反転することを発見した。本実験において、バイオフィルム形成およびそれ故プロテアーゼ放出が、まだ開始されていないことを目視検査により配慮した。より正確には、細菌増殖の遅延が、細菌増殖動態がなおも時間の対数関数に従う場合に、いわゆる「後期ｌｏｇ」（後期対数）期の間に、かなり早期に開始されることが観察された。
【００５０】
発明者らは、ＩＭＰＩαおよびＩＭＰＩα融合体または少なくとも１つの殺菌化合物とのその組合せが、効果的にバイオフィルム形成を耐性細菌株についてさえも妨げることも発見した。
【００５１】
さらに、発明者らは、ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体と抗生物質との組合せが、抗生物質濃度に関係なく、感染の段階で、相乗的に耐性細菌の増殖を常に阻害することを発見した。阻害性の抗生物質用量より低い用量においてさえも、ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体は、細菌増殖に干渉する。
【００５２】
発明者らは、例えば、ビルレンス因子の合成に関与することが知られている、緑膿菌（P.aeruginosa）シデロホアピオベルジン（siderophore pyoverdine）の合成が、ＩＭＰＩαおよび抗生物質ゲンタマイシンによって相乗的に阻害されることを観測した。
【００５３】
したがって、本発明の主題は、ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体および少なくとも１つのさらなる殺菌化合物を含有する組成物、および患者を治療するための、または装置、特にインプラントを防御するための、部分的にまたは完全に耐性またはさらに多耐性株の細菌、例えば、多耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）に対する、任意のＩＭＰＩαの単独での、または抗生物質化合物もしくは他の殺菌化合物との組合せでの使用である。このＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体の使用は特に有利であり、その理由は、並行して抗生物質を適用しなくても、または非常に低い用量の抗生物質をともに用いても殺菌性であるからである。ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体は、早期段階を含めた感染の任意の段階で、プランクトン性である、単離された固着性であるまたはバイオフィルムを形成する細菌に影響を及ぼすために使用され得る。したがって、抗生物質に対して耐性である細菌は、ＩＭＰＩαにより依然として影響される。さらに、ＩＭＰＩαは、例えば、低い拡散速度または薬物の能動的流出を誘導する機構に関連する急速な希釈または低い薬物流入に起因して抗生物質濃度が低い、患者の体の領域中で抗生物質と相乗的に作用することができる。したがって、本発明によるＩＭＰＩαおよびＩＭＰＩα融合体、ならびに殺菌化合物との組合せを使用すると、これらの領域は、抗生物質が阻害性濃度より低い濃度であるために、これに曝されたことに対して細菌が抵抗性を発生させることで応答する可能性がある領域とはなり得ない。
【００５４】
バイオアベイラビリティ、安定性、有効性などの生物学的特性または化学的特性を改善するために、側鎖に、またはＮ末端および／もしくはＣ末端に化学修飾などの付加的な修飾を示すＩＭＰＩαエレメントを有するＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体の使用がさらに意図される。その修飾によって、検出可能標識、例えば、化学発光構成要素、ポリペプチド中のアミノ酸の１つまたは複数の側鎖における１つまたは複数の放射性同位元素、発色反応を起こすことができる酵素等を提供することもできる。例えば、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを連結させるためにシステインを付加することができ、またはペプチドへのポリマーのカップリングのためにはリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはチロシンのような他のアミノ酸を使用することもできるであろう。別の例として、トリペプチド配列ＮＸＴもしくはＮＸＳまたはそれらの断片の挿入が挙げられ（ＸはＰ以外の任意のアミノ酸を指定している）、これらの配列はグリコシル化要素を付加する、細胞の酵素によって認識され得る。適切かつ臨床的に許容可能な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリサリチル酸（ＰＳＡ）が含まれる。
【００５５】
本発明によるＩＭＰＩα融合体は、ＩＭＰＩαおよび生理学的機能を有する少なくとも１つポリペプチド、特にＩＭＰＩβ、抗体もしくは抗体断片、リポカリン、アンキリン、フィブロネクチン、トランスフェリン、テトラネクチン、アドネクチン、アルブミン、ウテログロビン、またはプロテインＡなどのスキャフォルド、トランスフェリンなどの機能性ペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの診断用途に有用なペプチド、またはテクニカルサーフェスへの固定を可能にするヘキサヒスチジンなどのペプチドタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む。
【００５６】
ＧＳＴには３つのスーパーファミリー（細胞質性、ミトコンドリア性、およびＭＡＰＥＧ）が存在する：ＧＳＴの細胞質性スーパーファミリー由来のクラスは４０％を超える配列相同性を有する一方、他のクラス由来のものは２５％未満を有し得る。細胞質性ＧＳＴはそれらの構造に基づいて１３クラス、すなわち、アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ゼータ、シータ、ミュー、ニュー、パイ、シグマ、タウ、ファイ、およびオメガに分類される。ミトコンドリア性ＧＳＴはクラスカッパに入る。ミクロソーム性ＧＳＴのＭＡＰＥＧスーパーファミリーはＩ〜ＩＶと指定されたサブグループから構成され、これらの間のアミノ酸配列は２０％未満の同一性を共有する。ヒト細胞質性ＧＳＴはアルファ、ゼータ、シータ、ミュー、パイ、シグマ、およびオメガのクラスに属し、一方でＭＡＰＥＧスーパーファミリーのクラスＩ、ＩＩ、およびＩＶに属する六種類のアイソザイムが存在することが知られている：
【００５７】
【表２】
2017521495.tif 000004
【００５８】
ＩＭＰＩα融合体は、ＩＭＰＩαとポリペプチドとの間に１〜１００アミノ酸のリンカーも含み得る。
【００５９】
本発明の別の主題は、患者に投与され、細胞によってそれらの細胞質に取り込まれ、ここで細胞タンパク質発現機構がＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体を核酸鋳型から発現させる、ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体をコードする、核酸、特に一本鎖ＲＮＡである。融合されたエレメントが組み立てられたおよび翻訳後に修飾されたＩＭＰＩα融合タンパク質のシグナルペプチド誘導性分泌物を含む、ＩＭＰＩα融合体をコードする核酸が好ましい。分泌されると、ＩＭＰＩα融合タンパク質は、患者に直接的に適用されるＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合タンパク質に類似する様式で作用する。
【００６０】
本発明による核酸は、分解に抵抗するおよび送達が改善されるために修飾されてもよい。有用な修飾には、ＬＮＡ（ロックド核酸）またはＰＮＡ（ペプチド核酸）、およびリン酸ジエステルまたはホスホロチオエート修飾骨格が含まれる。医薬組成物中の核酸投与のための特異的な製剤には、リポソームが含まれる。
【００６１】
本発明によるＩＭＰＩαを含むポリペプチドまたは融合ポリペプチドの使用は、メタロプロテイナーゼのＭ４またはメトジンシンファミリー、特にサーモリシン、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン、Ｍｓｐペプチダーゼ、Ｍｐｌペプチダーゼ、または炭疽ｎｐｒ５９９の細菌性トキシンを分泌する能力がある微生物に感染したヒトまたは動物などの患者を治療することを含む。
【００６２】
本発明の別の態様において、抗生物質または他の殺菌化合物、およびＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体の同時使用は、早期段階を含めた感染の任意の時間に提供される。同時適用は、抗生物質とＭ４プロテアーゼインヒビターの適用の間の遅延、異なる適用頻度または異なりかつ個々に変化する投薬を伴う投薬スキームを含み得る。これらの薬物適用スキームにより、患者にとって有益であるまたは適用を促進することが証明され得る。
【００６３】
本発明による使用のため適する殺菌化合物には、例えば、http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_antibioticsなどにリストされる全ての抗生物質が含まれる。それらには、抗シュードモナス（Pseudomonas）−ＰｃｒＶ抗体Ｆａｂ’断片（ＫＢ００１、Ｋａｌｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、および黄色ブドウ球菌（S.aureus）外毒素に対して高度に特異的な完全ヒトＩｇＧ１抗体（ＫＢＳＡ  ３０１、Ｋｅｎｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）のような抗体がさらに含まれる。
【００６４】
本発明の主題は、適切な医薬組成物におけるＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体またはＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードするセクションを含む核酸の使用、および患者に同時に常に適用されるように、特に単一の医薬組成物において抗生物質との組合せで細菌感染を治療するための、その使用でもある。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、一種の医薬組成物における抗生物質もしくは他の殺菌の化合物の使用および別々の医薬組成物におけるＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体またはＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードするセクションを含む核酸の使用を含む。別々の実体は患者を治療するために有利である可能性があり、その理由は互いに比較して用量を独立して経時的に変化させることならびに個々の投与の頻度を変化させることができるからである。２つの組成物の遅延適用は、生じる副作用を妨げることまたはそれらの強さを制限することに有益である可能性がある。別々の実体は、さらに特定の分子組合せに必要とされ得る、異なる製剤を選択することができるとのさらなる利点を示す。
【００６６】
本発明の主題は、ＩＭＰＩαおよび殺菌化合物の双方についての組合せ最大用量などの特定の投薬スキームでもある。別の投薬スキームは、ＩＭＰＩαおよび殺菌化合物の組合せが依然として活性である、阻害性用量より低い用量にまですら、殺菌化合物の適用される用量をある時間の間減少させることを含み得る。このような一時的な用量レジメンの利益は、化合物に対する抵抗性の発生と対決することであろう。
【００６７】
ＩＭＰＩαまたはＩＭＰＩα融合体は、医薬組成物を形成するため成分と組み合わされてもよい。その医薬組成物は水と生理学的濃度の塩、溶解剤もしくは分散剤、抗酸化剤、またはリポソームなどの粒子形成性ミセルを含み得る。ガラス製またはプラスチック製のバイアルまたはシリンジにこの医薬組成物を充填してもよい。その医薬組成物はその乾燥または凍結乾燥を助ける添加剤、例えば、シクロデキストリンまたは多糖類、特に二糖類、を含んでもよい。
【００６８】
ＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体またはＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードする核酸と殺菌化合物との組合せは、適切な医薬組成物を使用して、非経口投与、経口投与、または局所投与されてもよい、あるいは、医薬が患者の創傷に溶出する、パッチまたは創傷デブリードマンに付着させてもよい。
【００６９】
ＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体またはＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体をコードする核酸と殺菌化合物との組合せは、患者に埋込むために適切な生分解性容器に投与されてもよく、あるいは、装置に付属するもしくは含まれるリザーバーは、装置が、標的細菌の負荷量が高いことが分かっている領域中に位置するように、能動的にもしくは受動的に配置されるＩＭＰＩαもしくはＩＭＰＩα融合体を含有してもよい。
【実施例】
【００７０】
１．マイクロタイタートレー培養における細胞外ＤＮＡの測定
発明者らは、ｅＤＮＡ（細胞外ＤＮＡ）をトラッキングするための方法を、文献中に見出される部分的に類似する手順および条件から導入し、まとめ、改変した。
【００７１】
ゲンタマイシンに部分的に耐性である、参照株  緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ＤＳＭ番号５００７１；ＭＩＣ  ８ｍｇ／リットル）を、臨床分離株の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＤＳＭ番号１９８８０）と並行して研究して、ＩＭＰＩの存在および非存在下で経時的にｅＤＮＡ蓄積を評価した。最初に、株を、ＮＢ培地（栄養ブロス番号４）中で終夜３７℃培養し、定常期まで増殖させた。これらの細菌から、５μｌを使用して、ＮＢ培地（２００μｌ）を含有する９６ウェル黒色平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。ＮＢ培地は、二倍濃縮されたＮＢ培地（２ｘ；１００μｌ）を１００μｌのＴＢＳ緩衝液で希釈したもの（陰性対照）またはあらかじめＴＢＳ中に溶解された、ＩＭＰＩで希釈した培地（１００μｌ；陽性対照）のいずれかを含有していた。１ウェルごとのＩＭＰＩの最終濃度は、それぞれ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ  ５００７１およびＤＳＭ  １９８８０での実験について３５μＭであった。緑膿菌（P. aeruginosa）の凝集物中の細胞外ＤＮＡおよび膜−傷害性（死）細菌を染色するため、ＢＯＢＯ−３染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１μＬの１ｍｍストック溶液を増殖実験の開始時に５ｍＬ培養物に加えた（暗所でインキュベーション）。ＢＯＢＯ−３はＤＮＡに結合する膜−不透過性の蛍光色素（λｅｘ５７０、λｅｍ６０２）であり、したがって、細胞外ＤＮＡを特異的に染色する、そのイメージを、シナジーＨ４プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して９６ウェルマイクロプレートのウェルにおいて高解像度領域スキャン（９９Ｘ９９ポイント）により４８時間取得した。
【００７２】
２．ＭＩＣ決定およびＯＤ測定
ゲンタマイシンＭＩＣ（最小阻止濃度）値を、培地としての栄養ブロスでの標準二倍マイクロタイターブロス希釈プロトコールを使用して決定した。緑膿菌（P. aeruginosa）参照株ＤＳＭ番号：５００７１および患者の気管分泌物から単離された２つの抗生物質耐性臨床単離株（緑膿菌（P. aeruginosa）ＶＢ７６２３およびＶＢ７４４４）の中間対数期（Midexponential phase）の培養物を、試験した。臨床単離体の抗微生物剤感受性試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎによって行われた。典型的には、８μｇ／ｍｌから０．０６２５μｇ／ｍｌの間のゲンタマイシン濃度を選択して細菌増殖を推定し、ＭＩＣ値を決定した。さらに、昆虫メタロプロテアーゼインヒビターＩＭＰＩの存在および非存在下で６００ｎｍでのＯＤ（光学密度）を調査した。細菌増殖におけるＩＭＰＩの影響を評価するために、２０から７５μＭの間のＩＭＰＩの最終濃度を使用した。細菌増殖を、３７℃で４８時間にわたりモニターした。全てのＭＩＣ値を、トリプリケートとして行った。
【００７３】
引き続く表は、後続の配列プロトコールにプリントされている配列をリストする。先導する番号はヌクレオチド配列についての配列番号を表し、これに引き続く記載されない偶数番号は各ペプチド配列の配列番号を表す。
【００７４】
【化１】
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【００７５】
配列
【００７６】
【化２−１】
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【００７７】
【化２−２】
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【００７８】
【化２−３】
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【００７９】
【化２−４】
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【００８０】
【化２−５】
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【００８１】
【化２−６】
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【００８２】
【化２−７】
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【００８３】
【化２−８】
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【００８４】
【化２−９】
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【００８５】
【化２−１０】
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【００８６】
【化２−１１】
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【００８７】
【化２−１２】
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【００８８】
【化２−１３】
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【００８９】
【化２−１４】
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【００９０】
【化２−１５】
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【００９１】
【化２−１６】
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【００９２】
【化２−１７】
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【００９３】
【化２−１８】
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【００９４】
【化２−１９】
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【００９５】
【化２−２０】
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【００９６】
【化２−２１】
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【００９７】
【化２−２２】
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【００９８】
【化２−２３】
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【００９９】
【化２−２４】
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【０１００】
【化２−２５】
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【０１０１】
【化２−２６】
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【０１０２】
【化２−２７】
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【０１０３】
【化２−２８】
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【０１０４】
【化２−２９】
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【０１０５】
【化２−３０】
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【０１０６】
【化２−３１】
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【０１０７】
【化２−３２】
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【０１０８】
【化２−３３】
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【０１０９】
【化２−３４】
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【０１１０】
【化２−３５】
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【０１１１】
【化２−３６】
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【０１１２】
【化２−３７】
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【０１１３】
【化２−３８】
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【０１１４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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