(57)【要約】本発明はKRS(Lysyl-tRNA  synthetase)に選択的に結合する抗KRS抗体及びこれの用途に関するもので、具体的にはヒ卜KRSに結合する抗体又はその断片、これの生産方法及びこれを含むガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患診断用組成物に関する。本発明の抗体又はその断片はヒトKRSに特異的に結合して同一なARS  familyを含む他のタンパク質と交差反応性がなく、KRS検出及び抑制ん可能であるのでKRS検出及びKRSが関連した疾患のガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患診断目的に使用することができる.
2017502672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L1、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L2、及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L3を含む抗体軽鎖可変領域(VL)及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H1，配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H2、配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H3を含む抗体重鎖可変領域(VH)を含むヒトKRSに結合する抗体又はその断片。
【請求項２】
前記抗体は軽鎖可変領域で配列番号13の137番目乃至246番目アミノ酸配列を含み、重鎖可変領域で配列番号13の1番目乃至121番目アミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とするヒトKRSに結合する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
前記抗体は配列番号13で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
前記断片はdiabody、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv及びscFvからなる群より選ばれる断片であることを特徴とする請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
請求項１の抗体又はその断片を符号化するポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは配列番号７乃至12で表示されるポリヌクレオチドむことを特徴とする請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７のベクターを含む細胞。
【請求項９】
請求項８の細胞をポリヌクレオチドが発現される条件下で培養して、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むヒトKRSに結合する抗体又はその断片の生産方法。
【請求項１０】
請求項１の抗体又はその断片を試料と接触させる段階及び前記抗体又はその断片を検出する段階を含むKRS特異的検出方法。
【請求項１１】
請求項１の抗体又はその断片を有効成分として含むガン診断用組成物。
【請求項１２】
請求項１の抗体又はその断片のガン診断用製剤製造のための用途。
【請求項１３】
下記の段階でなされる個体のガン診断方法：
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）請求項１の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内KRSタンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階。
【請求項１４】
請求項１の抗体又はその断片を有効成分として含む自己免疫疾患診断用組成物。
【請求項１５】
請求項１の抗体又はその断片の自己免疫疾患診断用製剤製造のための使用。
【請求項１６】
下記の段階でなされる個体の自己免疫疾患診断方法：
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）請求項１の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内KRSタンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階。
【請求項１７】
請求項１の抗体又はその断片を有効成分として含む炎症性疾患診断用組成物。
【請求項１８】
請求項１の抗体又はその断片の炎症性疾患診断用製剤製造のための使用。
【請求項１９】
下記の段階でなされる個体の炎症性疾患診断方法：
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）請求項１の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内KRSタンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2013年12月30日に出願された大韓民国特許出願第10-2013-0166791号を優先権主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明はKRS(Lysyl-tRNA  synthetase)に選択的に結合する抗KRS抗体及びこれの用途に関するもので、より具体的にはヒトのKRSに結合する抗体又はその断片、これの生産方法及びこれを含むガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患の診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Aminoacyl-tRNA  synthetase(ARS)は特定アミノ酸をその該当するtRNAに結合する役割をする酵素であって、高等生物の場合、アミノ酸の種類による20個の酵素の他にAIMP1(p43)、AIMP2(p38)、AIMP3(p18)などmultisynthetase  complex形成に関与する３種類を含み23種の酵素で構成されていて、multisynthetase  complexに参与する酵素の他に幾つかはfree  form形態でも存在する。しかし、最近では基本的な機能の他に特定環境下で多様な異なる活性機能を有していることが報告されているがKRS(Lysyl-tRNA  synthetase)がその内の一つである。KRSはmacrophage活性化を通じて免疫反応を誘導するものであることが明らかになり、TNF-αによって細胞外に分泌促進されたKRSはp38  mitogen  activivated  kinaseなどによる信号伝達によりmacrophage細胞のTNF-αによる活性を増加させたり、又は細胞のmigrationを促進するものと報告された。KRS又、多様な疾患に関与するものと最近明らかになっている。炎症性筋肉疾患患者からKRSに対する自己抗体が存在することが報告され、ルーゲリック病の原因になるSOD1遺伝子変異患者からKRSがこの酵素に結合して関与することが報告され、最近ではガン細胞からリン酸化したKRSがLaminin受容体の安定化に寄与するのでガン細胞の転移を促進することが報告された。このような結果からKRSは自己免疫疾患及びガン患者の血清内に存在することができ、重要な診断バイオマーカーに使用できることを示した。
【０００４】
しかしながら、KRSを始めとしたARSなどに対するバイオマーカーとしての重要性にもかかわらずARSらはタンパク質構造上類似した点が多く、動物から免疫反応により得られる抗体は他のARSにも結合する交差反応を示し、高強度のの抗体が生成されない場合が多い。本発明の抗体は優れた感度とARS間交差反応がない点で研究用ばかりでなく診断用及び産業上利用可能性が高い抗体と予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、KRSに特異的に結合する抗体を研究中、ファージディスプレー方法で製造されたライブラリーからKRSに特異的に結合する断片らを探し出してこれの配列及び結合特異性を明らかにして本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明の目的はヒトのKRSに結合する抗体又はその断片を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は前記抗体又はその断片を符号化するポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。
本発明の他の目的は前記ベクターを含む細胞を提供することである。
本発明の他の目的はヒトのKRSに結合する抗体又はその断片の生産方法を提供することである。
本発明の他の目的は抗体又はその断片を試料と接触させる段階及び前記抗体又はその断片を検出する段階を含むKRS特異的検出方法を提供することである。
本発明の他の目的は前記抗体又はその断片を有効成分として含むガン診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記抗体又はその断片を有効成分として含む自己免疫疾患診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記抗体又はその断片を有効成分として含む炎症性疾患診断用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するため本発明は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L1、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L2及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L3を含む抗体軽鎖可変領域(VL)及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H1、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H2及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H3を含む抗体重鎖可変領域(VH)を含むヒトのKRSに結合する抗体又はその断片を提供する。
【０００９】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又は断片を符号化するポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１１】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記ベクターを含むベクターを含む細胞を提供する。
【００１２】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記細胞をポリヌクレオチドが発現する条件下で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むヒトのKRSに結合する抗体又は断片の生産方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は抗体又はその断片を試料と接触させる段階及び前記抗体又は断片を検出する段階を含むKRS特異的検出方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片を有効成分として含むガン診断用組成物を提供する。
【００１５】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片のガン診断用製剤製造のための用途を提供する。
【００１６】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階、（ｂ）第１項の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内のKRSタンパク質水準を測定する段階及び（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階でなされた個体のガン診断方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片を有効成分として含む自己免疫疾患診断用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片の自己免疫疾患診断用製剤製造のための用途を提供する。
【００１９】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階、（ｂ）第１項の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内のKRSタンパク質水準を測定する段階及び（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階でなされた個体の自己免疫疾患診断方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片を有効成分として含む炎症性疾患診断用組成物を提供する。
【００２１】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は前記抗体又はその断片の炎症性疾患診断用製剤製造のための用途を提供する。
【００２２】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階、（ｂ）第１項の抗体又はその断片を利用して前記生物学的試料内のKRSタンパク質水準を測定する段階及び（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階でなされた個体の炎症性疾患診断方法を提供する。
【００２３】
以下本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L1、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L2及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L3を含む抗体軽鎖可変領域(VL)及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H1、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H2及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H3を含む抗体重鎖可変領域(VH)を含むヒトKRSに結合する抗体又はその断片を提供する。
【００２５】
ライシル-tRNA合成酵素(KRS  Lysyl-tRNA  synthetase)はライシン(Lys)とtRNAの結合を促進させる酵素でARS(aminoacyl  tRNA  synthetase)の一種である。本発明のKRSは一般的に、天然型又は再組合わせヒトKRS及びヒトKRSの非人間同族体を示す。
【００２６】
“抗体”、“抗KRS抗体”、“人間化抗KRS抗体”及び“変形人間化抗KRS抗体”、“anti-KRS  antibody”と言う用語は本明細書で最も広義の意味で用いられ具体的に単一クロン抗体（モノクローナル抗体、完全長単一クロン抗体含む）、多クローン抗体（ポリクローナル抗体）、多重特異抗体（例えば、二重特異抗体）、及び抗体断片（例えば、可変領域及び目的とする生物活性（例えば、KRSとの結合）を示す抗体の他の部分）を含む。
【００２７】
本発明の抗体はKRSと選択的に結合できるように特定アミノ酸配列が軽鎖及び重鎖CDRに含まれている抗体でモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を全て含み、好ましくはモノクローナル抗体でもある。さらに、本発明の抗体はキメラ抗体、人間化された抗体、人間抗体を全て含み、好ましくは人間抗体でもある。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体は実質的に同質抗体の集団から収得した抗体を示し、つまり、集団を構成する個々の抗体は少量で存在可能な天然的に存在する突然変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は単一抗原エピトープに極めて特異的に結合する。
【００２９】
“モノクローナル”と言う用語は抗体が実質的な相同性集団から収得できるの同じく抗体の特性を表わす言葉であって、必ずしも抗体を特定方法によって生産することではない。
【００３０】
例えば、本発明のモノクローナル抗体は文献［参照：Kohler  et  al.(1975)Nature  256:  495］に初めて記載されたハイブリドマ方法により製造できるか、又は再組合わせDNA方法（参照：米国特許第4,816,567号）により製造できる。さらに、例えば、文献［参照：Clackson  et  al.(1991)Nature  352:624-628及びMarks  et  al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597及びPresta(2005)J.Allergy  Clin.Immunol.116:731］に記述された技術を利用してファージ抗体ライブラリーから分離できる。
【００３１】
本発明の抗体は具体的にキメラ抗体を含み、この場合、重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定種から起源するか、又は特定抗体の相応する配列と同一であるか又は相同性を示すものの、残りの部分は本発明の抗体が好ましい生物学的活性（例えば、KRSとの選択的結合）を示す限り他の種から起源するか又は他の抗体の相応する配列と同一であるか又は相同性を示すものであっても拘りない［参照：米国特許第4,816,567号；及びMorrison  et  al.,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  81:6851-6855］。
【００３２】
人間化した抗体はヒト及び非ヒト（例：マウス、ラット）抗体の配列を全て含む抗体であって、一般的に、エピトープと結合する部位(CDR)を除いた残りの部分はヒト抗体のものであって、エピトープと結合する部位は非ーヒト由来の配列を含むことができる。
【００３３】
完全なヒト抗体はヒトの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指し、マウス、マウス細胞、又はマウス細胞から起源したハイブリドーマから生産するか又はファージディスプレー方法で生産できる。
【００３４】
生体から生産される天然抗体は通常的に２個の同一な軽鎖と２個の同一な重鎖で構成された約150,000ダルトンの異種四量体性糖タンパク質である。各軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合により重鎖と連結されるものの、ジスルフィド連鎖数は異なる免疫グロブリンisoformの重鎖ら間で多様である。各重鎖及び軽鎖は規則的に離隔された鎖内ジスルフィドブリッジを有している。各重鎖は一つの末端に可変ドメイン(VH)に引続き数多くの不変ドメインを有する。各軽鎖は一つの末端に可変ドメイン(VL)を有し、他の末端には不変ドメインを有するが；軽鎖の不変ドメインは重鎖の第１不変ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特別なアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖の可変ドメイン間に界面を形成するものと考えられる。
【００３５】
抗体の“可変領域”又は“可変ドメイン”は抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指称する。重鎖の可変領域は“VH”又は“VH”で記載し、軽鎖の可変領域は“VL”又は“VL”で記載する。これらドメインは一般的に、抗体の最も可変部分であって抗原結合部位を含む。
【００３６】
“超可変性(hypervariable)”とは、前記可変領域内の幾つかの配列などが抗体ら間の配列において広範囲に相異し、その特異的な抗原結晶因子らに対するそれぞれの特定抗体の結合及び特異性に直接的に関連する残基らを含む事実を指称する。
【００３７】
軽鎖及び重鎖可変領域全てにおいて超可変性は相補性結晶部位又は超可変性ループ(HVL)であって、公知された３個の文節などに集中される。CDRは文献［Kabatなど、1991,In:Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,5th  Ed.Public  Health  Service>National  Institutes  of  Health,Bethesda,MD.］における配列比較により限定される反面、HVLは文献［Chothia  and  Leナ  1987.J.Mol.Biol.196:901-917］に掲示された通り、前記可変領域の３次元構造によって構造的に限定される。カバト(Kabat)により限定されたように、CDR-L1は軽鎖可変領域で略残基24-34に、CDR-L2は略残基50-56に、CDR-L3は略残基89-97に位置し；CDR-H1は重鎖可変領域で略残基31-35に、CDR-H2は略残基50-65に、CDR-H3は略残基95-102に位置する。
【００３８】
前記重鎖及び軽鎖それぞれ内の３個のCDRなどは枠部位(FR)により分離され、前記部位は不足しがちな可変的傾向がある配列などを含む。前記重鎖及び軽鎖は可変領域のアミノ末端からカルボキシ末端まで前記FR及びCDRは下記の順で配列される：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3及びFR4。前記FRの大きいβシート配置は前記それぞれの鎖内部のCDRを相互だけでなく他の鎖からのCDRに近接させる。生成される形態は抗原結合部位に寄与するものの(Kabatなど,1991,NIH  Publ.No.91-3242,Vol.I,pages  647-669  参照)、全てのCDR残基などが抗原結合に直接関与する必要はない。
【００３９】
本発明の抗体は軽鎖及び重鎖可変領域に属する各CDRがそれぞれ特定配列を含み、KRSの特異的に結合することを特徴とし、具体的に本発明の抗体は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L1,配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L2及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)L3を含む抗体軽鎖可変領域(vL)及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H1、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H2及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性結晶部位(CDR)H3を含む抗体重鎖可変領域(VH)を含む抗体でもある。
【００４０】
本発明の抗体は好ましくは特定軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むことができ、具体的な軽鎖可変領域で配列番号13の137番目乃至246番目アミノ酸配列を含み、重鎖可変領域で配列番号13の1番目乃至121番目アミノ酸配列を含む抗体でもある。
【００４１】
本発明の抗体は最も好ましくは配列番号13で表示されるアミノ酸配列を含む抗体でもある。
【００４２】
本発明の抗体断片、断片又は“その断片”は母抗体の結合特異性の少なくとも一部を保有する、典型的に少なくとも母抗体の抗原結合の一部又は可変領域（例えば、一つ以上のCDR)を含む抗体の断片又は誘導体を含む。抗体断片の例はFab,Fab'、F(ab')2及びFv断片；ディアバディ；線形抗体；一本鎖(single-chain)抗体分子、例えば、sc-Fv；及び抗体断片から形成された多特異的抗体を含むものの、これに制限はされない。典型的に抗体断片又は誘導体は該当活性がモル基準で表現される場合、これのKRS結合活性の10%以上を保有する。好ましくは抗体断片又は誘導体は母抗体としてのKRS結合親和度の少なくとも20%,50%,70%,80%,90%,95%又は100%又はそれ以上を保有する。さらに、KRS抗体断片はこれの生物学的活性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換（抗体の保存的変異体と称す）を含む。本発明の“結合化合物”は抗体及びその断片など全てを示す。
【００４３】
Fabは一つの軽鎖及び一つの重鎖のCH1(第１不変ドメイン)及び可変領域でなされる。Fab分子の重鎖は他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００４４】
Fc領域は抗体のCH1及びCH2ドメインを含む二つの重鎖断片を含有する。二つの重鎖断片は二つ以上のジスルフィド結合によりCH3ドメインの疎水性相互作用により維持される。
【００４５】
Fab'は一つの軽鎖及びVHドメインとCH1ドメイン及びCH1とCH2ドメイン間の領域を含有し、鎖内ジスルフィド結合が二つのFab'断片の二つの重鎖間に形成されF(ab')2分子を形成するようにする一つの重鎖の一部を含有する。
【００４６】
F(ab')2は二つの軽鎖、及び鎖内ジスルフィド結合が二つの重鎖間に形成されるようにCH1  及び  CH2ドメイン間の固定領域の一部を含む二つの重鎖を含有する。従って、F(ab')2断片を二つの重鎖間のジスルフィド結合により共に維持される二つのFab'断片でなされる。
【００４７】
Fvは重鎖と軽鎖可変領域を全て含むものの、固定領域が欠如されている抗体断片である。
【００４８】
一本鎖Fv又はscFvは抗体のVH及びVLドメインを含む抗体断片を示し、ここで、これらドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、FvポリペプチドはscFvが抗原結合のため、好ましい構造を形成するようにするVH及びVLドメイン間のポリペプチドリンカーを追加して含む。scFvの概要に対しては文献［参照：Pluckthun(1994)THE  PHARMACOLOGY  OF  MONOCLONAL  ANTIBODIES.vol.113.Rosenburg  and  Moore  eds.Springer-Verlag,New  York,pp.269-315]を参照する。さらに、国際特許公開公報第  WO88/01649号及び米国特許第4,946,778号及び第5,260,203号を参照する。
【００４９】
ジアバディは二つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を意味し、ここで断片は同一なポリペプチド鎖から軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)(VH-VL)を含む。同一鎖上の二つのドメイン間にフェアリングを許容しない短いリンカーを用い、ドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制してフェアリングさせ二つの抗原結合部位を生成させる。ジアバディは例えば、ヨーロッパ特許第404,097号；WO93/11161;及び文献［Hollinger  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sei.USA,90:6444-6448(1993)］により詳細に記載されている。
【００５０】
線形抗体は一対の抗原結合部位を形成する一対の直列Fd断片(VH-CH1-VH-CH1)を含む抗体を指称する。線形抗体は例えば、文献[Zapataなど1995,Protein  Eng.8(10):1057-1062]に開示された通り、二重特異的又は単一特異的でもあり得る。
【００５１】
“ドメイン抗体”は重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域だけを含有する免疫機能性免疫グロブリン断片である。
【００５２】
幾つかの例から二つ以上のVH領域はぺプチドリンカーと共有結合して２価ドメイン抗体を生成する。２価ドメイン抗体の二つのVH領域は同一であるか又は相異した抗原を標的化することができる。
【００５３】
２価抗体は二つの抗原結合領域を含む。幾つかの例から二つの結合領域は同一な抗原特異性を有する。しかしながら、２価抗体は二特異的(bispecific)でもある。
【００５４】
本発明の抗体又はその断片は当業界に公知された方法、例えば、ファージディスプレー方法又は酵母細胞表面発現システムを用いて生成することができる。scFvを製造する方法には米国特許第  4,946,778号及び第  5,258,498号に記載された方法が用いられ、Fab.Fab'及びF(ab')2断片をを再組合わせ的に生成するための方法にはWO92/22324などに記載された方法が用いられる。
【００５５】
本発明の抗体はヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物から由来したものでもある。好ましくは前記抗体はヒト、マウス、ロバ、羊、兎、山羊、ギニピグ、ラクダ、馬又は鶏の抗体でもある。
【００５６】
ヒトの抗体はヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体であって、ヒトの免疫グロブリンライブラリーから分離された抗体又は一つ以上のヒトの免疫グロブリンに対して形質移植され、内在的免疫グロブリンは発現しない動物から分離された抗体が含まれる。（米国特許第5,939,598号参照）。
【００５７】
本発明の抗体は酵素、蛍光物質、放射線物質及びタンパク質などと接合されたものでもあり得るが、これに限定はされない。さらに、抗体に前記物質を接合する方法は当業界に公知されている。
【００５８】
本発明は前記のような本発明による抗体又はその断片を符号化するポリヌクレオチドを提供する。
【００５９】
ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド又は核酸に記載されることもあって、DNA分子など（例えば、cDNA又は遺伝体(genomic  DNA).RNA分子など（例えば、mRNA）、ヌクレオチド類似体などを用いて生成された前記DNA又はRNAの類似体（例えば、ペプチド核酸など及び非自然的に発生するヌクレオチド類似体など）及びこれらのハイブリドなどが含まれる。前記ポリヌクレオチドは単一ストランド(single-stranded)又は二重ストランド(double-stranded)にもなり得る。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは本発明の抗体又は断片を符号化するものであれば、その配列が特に制限はされないが、好ましくは配列番号７乃至12で表示されるポリヌクレオチドを含むものでもあり得る。
【００６１】
本発明の抗体又はその断片を符号化するポリヌクレオチドは当業界に公知された方法によって得られる。例えば、前記抗体の重鎖及び軽鎖の一部分又は全部をコーティングするDNA配列又は当該アミノ酸配列に基づいて当分野に公知されたオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、重合酵素連鎖反応(PCR)法などを用いて合成することができる。
【００６２】
さらに、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００６３】
本発明のベクターは本発明の抗体又はその断片の再組合わせ生産のために本発明のポリヌクレオチドの複製又は発現の目的で利用され、一般的に、シグナル配列、複製起源、一つ以上のマーカー遺伝子、インハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列中一つ以上を含む。
【００６４】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターでもあって、より好ましくは調節シーケンス、例えば、プロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むベクターでもある。
【００６５】
ベクターの一種であるプラスミド(plasmid)は外部のポリヌクレオチド断片らが結合できる線形又は円形の二重螺旋のDNA分子を意味する。ベクターの他の形態はウィルス性ベクター(viral  vector;例えば、複製ー欠乏レトロウィルス(replication  defective  retroviruses)アデノウィルスなど及びアデノ連関ウィルスなど(adenoassociated  viruses)、であって、ここで付加するDNA断片などは前記ウィルス性ゲノム内に導入できる。特定のベクターらはその中にこれらが導入できる宿主細胞（例えば、バクテリア由来及びエピソームの哺乳類ベクターを含むバクテリア性ベクターらの中での自己複製をすることができる。他のベクターら（例えば、非エビソームの哺乳動物ベクターらが宿主細胞内への導入による宿主細胞のゲノム内に統合され、さらに、それにより前記宿主ゲノムと共に複製される。
【００６６】
発現ベクターは選択されたポリヌクレオチドの発現可能なベクターの一つの形態である。一つのポリヌクレオチドシーケンスは、調節シーケンスが前記ポリヌクレオチドシーケンスの発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える場合、前記調節シーケンスに“作動可能に連結”される。前記調節シーケンスはそれが作動可能に連結された核酸の発現（例えば、水準、タイミング又は発現の位置）に影響を与える配列である。前記調節シーケンスは例えば、調節された核酸に直接的に又は一つ又はそれ以上の他の分子ら（例えば、前記調節シーケンス及び／又は前記核酸に結合するポリペプチドら）の作用を通じてその影響が及ぶようにすることができる。前記調節シーケンスにはプロモーター、インハンサー及び他の発現調節要素らが含まれる。本発明のベクターは好ましくはSfiI  siteにscFv  Insertが含まれたpCom3x(phagmid)vectorでもある。
【００６７】
一方、本発明は本発明のベクターを含む細胞を提供する。
【００６８】
本発明の細胞は本発明のポリヌクレオチドを発現する際に用いられる細胞であればその種類は特に制限されない。
【００６９】
本発明の細胞／宿主細胞は原核生物（例えば、大腸菌）、眞核生物（例えば、酵母又は他の菌類）、植物細胞（例えば、煙草又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、人間細胞、猿の細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞又は昆虫細胞）又はハイブリードマにもなれる。
【００７０】
本発明の目的に適合した原核生物はグラム陰性又はグラム陽性遺棄体、例えば、エンテロバクテリアセ(Enterobacteriaceae)、例えば、エスケリチア(Escherichia)、例えば、大腸菌、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、例えば、サルモネラチフィムリウム(Salmonella  typhimurium)、セラチア(Serratia)、例えば、セラチアマルセスカンス(Serratia  marcescans)及びシゼラ(Shigella)、及びバシリ(Bacilli)、例えば、ビ、サブチリス(B,subtilis)及びビ、リケニホルミス(B,licheniformis)、スドモナス(Pseudomonas)、例えば、ピ、エルギノサ(P.aeruginosa)及びストレプトマイセス(Streotomyces)を含む。本発明の細胞は本発明のベクターを発現可能なものであれば特に制限はされないが、好ましくは大腸菌、これに限定はされないが、例えば、大腸菌ER2537、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31,537)、大腸菌W3110(ATCC27,325)又はLacZが発現可能な大腸菌、でもあって、より好ましくは大腸菌ER2537でもある。
【００７１】
本発明の細胞として眞核生物はサカロマイセスセレビジアエ(Saccaromyces  cerevisiae)が最も広く用いられる。しかし、多くの他の属、種及び菌株、これに限定はされないが、例えば、シゾサカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces  pombe)、クロイベロマイセス宿主、例えば、ケイ、ラクチス(K,lactis)、ケイ、フラジリス(K,fragilis)(ATCC12,424)、ケイ、ブルガリクス(K,bulgaricus)(ATCC16,045)、ケイ、ウィカラミ(K,wickeramii)(ATCC24,178)、ケイ、ワルチ(K,waltii)(ATCC56,500)、ケイ、ドロソフィラリウム(K,drosophilarum)(ATCC36,906)、ケイ、テルモトレランス(K,athermotolerans)及びケイ、マルシアヌス(K,marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(EP402,226)；ピキアパストリス(Pichia  pastoris)(EP183,070)；カンジダ(Candida)；トリコテロマレエシア(Trichoderma  reesia(EP244,234))；ニュロスポラクリサ(Neurospora  crassa)；シュバニオマイセス(Schwanniomyces)、例えば、シュバニオマイセスオキシデンタリス(occidentalis)；及びフィラメント性眞菌、例えば、ニュロスポラ、ペニシリウム(Penicillium)、トリポクラジウム(Torypocladium)及びアスパラギルス(Aspergillus)宿主、例えば、エイ，ニドランス(nidulans)及びエイ，ニガー(niger)が使用可能である。
【００７２】
一方、本発明の細胞は動物細胞特に脊椎動物細胞でもある。培養（組織培養）において脊椎動物細胞の増殖は日常的な方法となり、技術らが幅広く利用可能である。これに制限はされないが、有用な哺乳動物宿主細胞の例はSV40により形質転換された猿の腎臓CV1ライン(COS-7,ATCCCRL1651)、ヒトの胚芽腎臓ライン（懸濁培養からサブクローニングされた293又は293細胞［Grahamなど、1977,J  Genvirol.36;59]）、幼いハムスタの腎臓細胞(BHK,ATCC  CCL10)、チャイニスハムスタ卵巣細胞/-DHFR"(CHO,Urlaubなど、1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  77:4216;例えば、DG44)、マウスセルロリ細胞(TM4,Mather,1980,  Biol.Reprod  23:243-251)、猿の腎臓細胞(CV1  ATCC  CCL  70)、アフリカ緑色猿の腎臓細胞(VERO-76,ATCC  CRL-1587)、ヒトの頸部ガン細胞(HELA,ATCC.CCL  2)、犬の腎臓細胞(MDCK,ATCC  CCL  34)、バファロラット肝細胞(BRL3A  ATCC  CRL  1442)、ヒトの肺細胞(W138,ATCC  CCL  75)、ヒトの肝細胞(Hep  G2.HB  8065)、マウス乳房腫瘍(MMT,060562,ATCC  CCL51),TR1細胞(Matherなど、1982,Annala  NY,Acad,Sci.383:44-68)、MRC5細胞、FS4細胞、ヒトの肝ガン細胞株(HepG2)、HEK293cell(human  embryonic  kidney  cell)及びExpi293FTMcellでもあって、好ましくはCHO  cell、HEK293  cell(human  embryonic  kidney  cell)又はExpi293FTM  cellでもある。
【００７３】
本発明の細胞は本発明のポリヌクレオチド又はこれを含むベクターで形質転換するか又は形質感染され得る培養された細胞であって、これは継続して前記宿主細胞内で発現できる。再組合わせ細胞は発現されるべきポリヌクレオチドに形質転換するか又は形質感染された細胞を指す。本発明の細胞はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むものの、調節シーケンスが前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるよう前記細胞内に導入されない限りこれを望む水準に発現しない細胞にもなれる。
【００７４】
本発明の細胞は多様な培地で培養できる。産業的に利用可能な培地、例えば、ハム(Ham's)F10(Sigma-Aldrich  Co.,St.Louis.MO)、最小必須培地(MEM、Sigma-Aldrich  Co.)RPMI-1640(Sigma-Aldrich  Co)、及びドルベコス(Dulbecco's)改質イーグル(Eagle's)培地(DMEM,Sigma-Aldrich  Co.)が細胞培養に適合している。前記培地は必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子、塩、緩衝液。ヌクレオチド、抗生剤、微量元素及びグルコース又は同等エネルギー原が追加できる。
【００７５】
本発明の培地は好ましくはSB(Bactotrytone  30g,yeast  extract  20g,MOPS  buffer  10g/L)medium,FreeStyleTM  293  Medium又はExpi293TM  Mediumでもある。
【００７６】
一方、本発明は前記細胞をポリヌクレオチドが発現される条件下で培養して軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階及び前記細胞又はこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含むヒトKRSに結合する抗体又はその断片の生産方法を提供する。
【００７７】
本発明の生産方法の細胞に対しては前記記述した通りであって、本発明の抗体を符号化するポリヌクレオチドを含めている。
【００７８】
本発明の生産方法のポリペプチドは本発明の抗体又はその断片自体でもあって、本発明の抗体又は断片の他に別のアミノ酸配列が追加して結合されたものでもある。この場合、本技術分野の通常の技術者に公知されている方法を利用して本発明の抗体又はその断片から取除くことができる。
【００７９】
前記培養は前記細胞の種類によって培地組成及び条件が異なることもあって、これは本技術分野の通常の技術者が適切に選択及び調節することができる。
【００８０】
前記抗体分子は細胞の細胞質内に蓄積されるか又は細胞から分泌されるか適切な信号配列によりぺリプラズム又は細胞の培地で標的化されることもあって、ぺリプラズム又は細胞の培地で標的化されることが好ましい。さらに、生産された抗体分子を、本技術分野の通常の技術者に公知されている方法を利用してリフォルディング(refolding)させ、機能的形態を有することが好ましい。
【００８１】
前記ポリペプチドの回収は生産されたポリペプチドの特性及び細胞の特性によって異なることもあって、これは本技術分野の通常の知識を有する者が適切に選択及び調節できる。
【００８２】
前記ポリペプチドは細胞内、周辺の細胞質空間に生産されるか又は培地内に適切に分泌できる。若し、ポリペプチドが細胞内で生産されるとこの細胞は第１段階としてタンパク質を放出するために破壊されることもある。粒子型破片、宿主細胞又は溶解された断片は例えば、遠心分離又は限外濾過により除去される。抗体が培地内に分泌される場合、このような発現システムからの上澄液を一般的に、先ず商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore  Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮させる。タンパク分解を抑制するために、プロテアーゼ抑制剤、例えば、PMSFが任意の先行段階に含まれることもあって、偶発的な汚染物の成長を防止するため抗生剤が含まれることもある。
【００８３】
細胞から製造された抗体は例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和度クロマトグラフィーを用いて精製でき、本発明の抗体は好ましくは親和度クロマトグラフィーを通じて精製できる。
【００８４】
本発明の抗体又はその断片はKRSと特異的に結合するので、例えば、特定細胞、組織、又は血清内KRS発現を検出する、KRSタンパク質を検出して定量化するための診断分析に有用である。
【００８５】
従って、本発明は第１項の抗体又はその断片を試料と接触させる段階及び前記抗体又はその断片を検出する段階を含むKRS特異的検出方法を提供する。
【００８６】
前記抗体又はその断片を“検出”するため抗体又はその断片は一般的に、検出可能moiety標識できる。
【００８７】
例えば、文献[Current  Protocols  in  Immunology,Volumes  1  and  2.1991,ColigenなどEd.Wiley-Interscience,New  York,N,Y.,Pubs]に記述された技術を利用して放射性同位元素又は蛍光表示で表示できる。放射能は例えば、シンチレーション係数(scintillation  counting)により測定でき、蛍光は蛍光系を利用して定量できる。
【００８８】
又は多様な酵素ー基質表示が利用可能で前記酵素的標識の例は猩々蠅ルシラファーゼ及び細菌ルシラファーゼ（米国特許第4,737,456号）のようなルシラファーゼ、ルシフェリン(luciferin)、2,3-ジヒドロフタラジンディオネス、マレートジヒドロゲナーゼ、ウラゼ(urase)、ホスレディシーファオキシダーゼ(HRPO)のようなファオキシダーゼ、アルカラインホスアァターゼ、βーカラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ライソザイム、サカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトース、オキシダーゼ、及びグルコース-6-ホスフェートジヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ユリカゼ及びザンチンオキシダーゼ）、ラクトファーオキシダーゼ、マイクロファーオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素を結合させる技術は例えば、文献[O'Sullivanなど、1981,Methods  for  the  Preparation  of  Enzyme-抗体Conjugates  for  use  in  Enzyme  Immunoassay,in  Methods  in  Enzyme.(J,Langone  &  H.Van  Vunakis,eds)，Academic  press,N.Y.,73;147-166]に記述されている。
【００８９】
標識は多様な公知された技術を利用して抗体に間接的に接合できる。例えば、抗体はバイオチンに接合でき、前記で言及した３種の広範囲なカテゴリーに属する任意の標識らがアビジンと、又はその反対に接合できる。バイオチンはアビジンに選択的に結合し、従って、この標識はこのような間接的方式で抗体に結合できる。又は抗体に標識の間接的結合を達成するため、抗体は小さいハプテン(hapten)（例えば、ジゴキシンと結合でき、前記にて言及した相異する類型の標識らの一つが抗ーハプテン抗体に接合できる。（例えば、抗ージオキシン抗体）従って、抗体に対する標識の間接的接合が達成できる。本発明の抗体又はその断片を競争的結合分析、直接及び間接サンドイッチ分析及びん免疫沈殿分析のような任意の公知された分析方法に用いられる。
【００９０】
本発明の抗体又はその断片は診断キットつまり、診断分析を行うための診断キットつまり、使用説明書と共に予め指定された量で試薬らの包装された組合わせに使用できる。抗体が酵素に標識された場合に、キットは基質及び発色団又は蛍光団を提供する基質前躯体として酵素により要求される補助因子を含むことができる。さらに、安定化剤、緩衝液（例えば、遮断緩衝液又は溶解緩衝液）などのような他の添加剤らが含まれ得る。多様な試薬らの相対的な量は分析の敏感度を十分に最適化させる試薬の溶液内濃度を提供するため、幅広く変化できる。試薬は溶解の際適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、一般的に、凍結乾燥された乾燥粉末として提出できる。
【００９１】
本発明の抗体により検出されるKRSはTNE-αにより細胞の外に分泌が促進されると分泌されたKRSはmacrophage細胞に結合して活性化させ、免疫反応を誘導するものと明らかにされ、結合したKRSがp38mitogen  activivated  kinaseなどによる信号伝達によりmacrophage細胞のTNF-αによる活性を増加させるか又は細胞のmigrationを促進させるものと報告された。(Park,S.G.,et  al  kim,H.J.,Min,Y.H.,choi,E.C.,Shin,Y.K.,Park,B.J.,Lee,S.W..and  Kim,S.2005  Human  lysyl-tRNA  synthetase  is  secreted  to  trigger  proinflammatory  response  2005  proc.Nati.Acad.Sci.102(18),6356-6361)KRSはさらに、多様な疾患に関与するものと最近明らかになった。炎症性筋肉疾患患者からKRSに対する自己抗体が存在することが報告(Geipi,C.,Kanterewicz,E.,Gratacos,J.,Targoff.I.N.&Rodriguez-Sanchez,J.L.Coexistence  of  two  antisynthetases  is  a  patient  with  the  antisynthetse  syndrome(1996)Arthritis  Rheum,39,692-697)されており、ルーゲリック病の原因になるSOD1遺伝子変異患者からKRSがこの酵素に結合して関与することが(Kunst,C.B.,Mezey,E.,Brownstein,M,J,&  Paiierson,D.Mutations  in  SOD1  associated  with  amyotrophic  laaterl  sclerosis  cause  novel  protein  interactions(1997)Nat.Genet.15,91-94.)；さらに、最近ではガン細胞からリン酸化されたKRSがLaminin受容体の安定化に寄与するのでガン細胞の転移を促進する(Kim,DG  et  al  Chemical  inhibition  of  prometastatic  lysyl-tRNA  synthetaselaminin  receptor  interaction.(2013)Nat  Chem.Biol.)ことが報告された。
【００９２】
従って、KRSは検出を通じて特定ガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患の診断、病気の進行状態及び治療前後の予後の評価のための診断マーカーとして使用できる。本発明によるガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患の診断、及び予後の評価は生物学的試料の中からKRSタンパク質を検出することにより行える。
【００９３】
従って、本発明は本発明の抗体又はその断片を有効成分として含むガン診断用組成物を提供する。さらに、本発明は本発明の抗体を有効成分として含む自己免疫疾患診断用組成物を提供する。さらに、本発明は本発明の抗体を有効成分として含む炎症性疾患診断用組成物を提供する。
【００９４】
従って、本発明は本発明の抗体又はその断片のガン診断用製剤製造のための用途を提供する。さらに、本発明は本発明の抗体又はその断片の自己免疫疾患診断用製剤製造のための用途を提供する。さらに、本発明は本発明の抗体又はその断片の炎症性疾患の診断用製剤製造のための用途を提供する。
【００９５】
従って、本発明は（ａ）個体かから生物学的試料を収得する段階、（ｂ）第１項の抗体又はその断片を利用して生物学的試料内KRSタンパク質水準を測定する段階及び（ｃ）前記KRSタンパク質水準を正常個体のKRSタンパク質水準と比較する段階でなされたガン、自己免疫疾患又は炎症性疾患診断方法を提供する。
【００９６】
前記生物学的試料は血液及び生物学的起源のその他の液状試料、生検標本、組織培養のような固形組織試料又はこれより由来した細胞が含まれる。より具体的に例をあげればこれに限定はされないが、組織、抽出物、細胞溶解物、全血、血漿、血清、唾、眼球液、脳脊椎液、汗、尿、乳、腹水液、滑液、腹膜液などでもある。前記試料は動物，好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトから収得することができる。前記試料は検出前に前処理することができる。例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などを含むことができる。さらに、前記試料から核酸及びタンパク質を分離して検出に使用できる。
【００９７】
前記検出に関しては前述の通りである。
【００９８】
本発明の診断方法は正常個体の生物学的試料内KRSタンパク質水準をガン、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の生物学的試料内タンパク質発現水準く比較することにより、実際の疾患発病の可否を診断することができる。つまり、ガン、自己免疫疾患又は炎症性疾患に推定される生物学的試料から本発明の抗体又はその断片を利用してKRSタンパク質水準を推定し、正常個体の生物学的試料から本発明の抗体又はその断片を利用してKRSタンパク質水準を推定して両者を比較した後、疾患が疑わしい個体のKRSタンパク質水準が正常個体のものより高いとこれを当該疾患に診断できる。
【００９９】
前記ガンはその種類が特に制限はされず、例えば、乳房ガン、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚ガン、頭部又は頸部癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、ラッパ管癌腫、子宮内膜癌症、子宮頸部癌、膣癌、陰門癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、CNS腫瘍、一次  CNSリンパ腫、脊髄腫瘍、脳間神経膠症及び脳下垂体腺腫でもあって、好ましくはLaminin  receptorに作用して転移を促進するガン腫、例えば、肺癌又は膵臓癌でもある。
【０１００】
前記自己免疫疾患は例えば、クロン氏病、紅斑病、アトピー、リューマチ、関節炎、橋本甲状腺炎、悪性貧血、エジスン氏病、第１型糖尿、ルーゲリック病、炎症性筋肉疾患（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、ルブス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能抵下症と昂進症、経皮症、ベーチェト病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエル症候群、ギリアンバレー症候群、ショーグレン症候群、乾癬、白斑症、全身性経皮症、喘息及び潰瘍性大腸炎で構成された群より選ばれるものでもあって、好ましくはリューマチ関節炎、ルゲリック病、多発性筋炎又は皮膚筋炎でもある。
【０１０１】
前記炎症性疾患はこれに制限はされないが、浮腫などのような一般的な炎症症状を含み炎症性腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、嚢胞性繊緯症、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、通風、脊椎関節病症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節病症、腸疾患脊椎炎、年少者性強直性脊椎炎、反応性関節病症、感染性関節炎、後ー感染性関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウィルス性関節炎、真菌性関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、“血管炎症候群”と関連した関節炎、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲリック肉芽腫症、リューマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節病症、仮性通風、非関節リウマチズム、精液嚢炎、腱蛸炎、痩果炎（ペニスエルボー）、神経病症性関節疾患(neuropathic  joint  disease；又は“charcot  joint”とも称す）、出血性関節症、Henoch-schoenlein紫斑病、肥厚性骨関節病症、多中心性細網組織球腫、脊柱側湾症(scoliosis)、血色素症、血色素病症、高脂蛋白血症、低減マグロブリン血症、家族性地中海熱、ベーチェット病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉鎖性肺疾患、リウマチ性関節炎、急性肺損傷、気管支肺形成損傷、第２型糖尿病、動脈硬化、アルツハイマー性痴呆、家族性寒冷自己炎症症候群、マークルウェルス症候群(Muckle  Wells  syndrome)、新生児発病多発炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節症候群、成人発症型スチール病、接触性皮膚炎、胞状奇胎、PAPA症候群、高免疫グロブリンＤ症候群、及びクリオピリン関連周期的症候群などを含む。
【０１０２】
ガン、自己免疫疾患及び炎症性疾患を診断する方法は本発明の抗KRS抗体又はその断片及びこれと特異的に結合するKRSタンパク質間に抗体−抗原反応を通じて達成できるが、本発明で用語“抗原−抗体複合体”とは、ガン自己免疫疾患及び炎症性疾患のマーカーであるKRSとこれに特異的な本願発明の抗KRS抗体を意味し、抗原−抗体複合体の形成量は検出ラーベルのシグナルの大きさを通じて定量的に測定可能である。
【０１０３】
このような検出ラーベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、レドックス分子量及び放射性同位元素からなるグループの中で選択できるが、必ずしもこれに制限はされない。検出ラーベルとして酵素が使用される場合、利用可能な酵素の例にはβグロブリニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ファーオキシダーゼ又はアルカラインホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとGDPase,RNase,グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホプラクトキナーゼ、ホスホエノルピルベートカーボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランフェラーゼ、ホスフェノールピルベートデカボキシラーゼ、β-ラタマーゼなどがあるが、これに制限はされない。蛍光物の例にはフルオレシン、イソチオシアネート、ロダミン、ピコエリテリン、ビコシアニン、アロピコシアニン、ο-プラデヒド、フルオレスカミンなどがあるが、これに制限はされない。リガンドの例にはビオチン誘導体などがあるが、これに制限はされない。発光物の例にはアクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシファラーゼなどがあるが、これに制限はされない。微小粒子の例にはコロイド金、着色されたラテックスなどがあるが、これに制限はされない。レドクスの分子の例にはアェロセン、ルテニウム着化合物、バイオロゲン、キノン、Tiイオン、ジイミド、1,4-ベンゾキノン、ヒドロキノン、K4  W(CN)8,[Os(bpy)3]2+,[RU(BPY)3]2+,[MO(CN)8]4-などが含まれるが、これに制限はされない。放射線同位元素の例には3H,14C,32P,35S,36C1,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I,186Reなどが含まれるが、これに制限はされない。
【０１０４】
本発明の一実施例ではヒトのVK3-23/VL1g遺伝子を骨格とし、CDRに無作為配列を挿入するライブラリーを構築してKRSと選択的に結合するファージを選別して抗体を分離、精製して塩基配列を分析した。
【０１０５】
本発明の一実施例で精製した抗体がKRSと結合するかウエスタンブロット法で確認した。その結果、本発明の抗体はKRSと結合することを確認した。
【０１０６】
本発明の他の一実施例では本発明の抗KRSscFv抗体とKRSの親和度を表面共鳴分析方法で測定した。その結果、本発明の抗体は平衡解離定数100nM値を有し、比較的高い親和度を示したことを確認した。
【０１０７】
本発明の他の一実施例では本発明の抗KRSscFv抗体の交叉反応性を測定した。Luminex  beadを利用して本発明の抗体とKRSを含む８種の類似タンパク質との反応性を測定した結果、本発明の抗体はKRSを除いた他のKRSタンパク質には結合しないことを確認した。
【０１０８】
本発明の他の一実施例では本発明の抗KRSscFv抗体の診断用抗体への有用性可否を実験した。本発明の抗体でコーティングされたplateを製作してKRS標準物質を濃度別に希釈して反応させ、結合可否をELISAで測定した。その結果、KRS標準物質に対して濃度依存的に抗体結合が測定されることを確認して本発明の抗体がガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患診断用に使用できることを確認した。
【０１０９】
本発明の他の一実施例では本発明の抗KRS抗体を利用して開発されたELISAキットを使用して膵臓ガン患者の血液を分析した結果、膵臓ガンの最も代表的なバイオマーカーであるCA19-9と同等な程度のKRSが発現されていることを確認し、KRSが両診断用バイオマーカーとして使用することができ、本発明の抗体が有用であることを確認した。
【０１１０】
さらに、膵臓ガンの多くのバイオマーカーの候補らと比較分析するため、multiplex  bead  Assayキットを使用して他のバイオマーカーの候補らを分析し、総合的に比較分析した結果、他のバイオマーカーに比べてKRSがCA  19-9と共に代表的なガンバイオマーカーとして使用することができ、本発明の抗体が有用であることを確認した。
【発明の効果】
【０１１１】
従って、本発明の抗体又はその断片はヒトのKRSに特異的に結合して同一なARS  familyを含む他のタンパク質と交叉反応性がなく、KRS検出及び抑制が可能であるのでKRS検出及びKRSが関連した疾患であるガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患の診断に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は本発明の抗体が目的タンパク質のKRSに結合するかを確認したウエスタンブロット実験結果である。
【図２】図２は本発明の抗体であるanti-KRSscFv  Biocon-K1の結合親和度を表面ポラズモン共鳴(SPR)で測定した結果グラフである(Kd:平衡解離定数、横軸：時間（秒）、縦軸：response  unit(RU))。
【図３】図３は本発明の抗体であるanti-KRSscFv  Biocon-K1の交叉反応性をLuminex  multiplex  Assay方法で測定した結果のグラフである（縦軸(F1)：蛍光強度(fluorescent  intensity),WRS:トリプトファニール-tRNA合成酵素、HRS：ヒスチジル-tRNA合成酵素、NRS：アスパラギニルジル-tRNA合成酵素:リシル-tRNA合成酵素:SRS：セリル-tRNA合成酵素、YRS：タイロシル-tRNA合成酵素、GRS:グリシル-tRNA合成酵素、AIMP1：ARS結合多機能タンパク質。
【図４】図４は本発明の抗体がKRSをdetectionできるかを確認するためのELISA実験結果である。（縦軸：450nm級光度、横軸：KRS標準物質の濃度(ng/ml)。
【図５】図５は本発明の抗体を使用して正常人及びガン患者において血中KRS量の検出及相互比較を確認するため、本発明の抗体が含まれたELISA方法で正常人及び膵臓ガン患者の血清から測定した結果である。（Ａ：血中KRS濃度、Ｂ：血中CA19-9濃度）。
【図６】図６は本発明の抗体を利用したKRSバイオマーカー測定が膵臓ガン診断用主要バイオマーカーで有用性があるかを確認するため、多くのバイオマーカー候補群をELISA  及びmultiplex  bead  Assay方法で測定したバイオマーカー定量値らを総合的に比較分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【０１１４】
＜実施例１＞
scFvライブラリー構築及び抗KRS  scFv
<1-1>  scFvライブラリー構築
scFvライブラリーは大韓民国特許10-0961392号に掲載された方法により構築した。
【０１１５】
ヒトのVH3-23/VL1g遺伝子を基にして相補性結晶部位に無作為配列を挿入することでライブラリーを設計使用して、ベータラクタメイズ遺伝子を選択マーカーで有するプラスミドベクターからベータラクタメイズ遺伝子のリーダー配列直後に制限酵素切断配列らを導入してpFDVプラスミドベクターを製造し、scFv遺伝子ライブラリーを挿入後大腸菌に形質感染させた後、これを培養してライブラリーを構築した。この過程を通じてライブラリー内で非正常的な停止コドン又はフレームシフトを有するscFv遺伝子配列を大部分除去してライブラリーの品質を向上させることが可能である。培養されたライブラリーから誤謬が除去された配列などを重合酵素連鎖反応で増幅した後、これよりscFv遺伝子ライブラリーを再組合わせてpComb3Xファージミドベクターに挿入して大腸菌、ER2537ストレインの大腸菌を形質感染して最終ライブラリーを獲得した。ライブラリーをカルベニシリンを含有するSB(Super  broth)培地400mLに培養し、600ナノメータにおける吸光度が0.5になったとき、1013CUFのVCSM3補助ファージを加えて80rpmで撹拌して１時間37℃で感染させた。ここで最終70ug/mLのカナマイシン抗生剤を入れて30℃、200rpmで撹拌して一夜培養してscFvが表面提示されたファージを生産した。翌朝培養液を遠心分離し、培養液内のファージを4%のポリエチレングリコール8000と3%の塩化ソジウムを添加して沈殿させた。沈殿したファージを50mLのPBS緩衝溶液に溶解させ、このような方式で再度沈殿して最終的に2mLのPBS緩衝溶液に溶解させた。これを遠心分離してこの物質を除去することによりファージscFvライブラリーを得て、一般的に、最終ファージライブラリーには1013CPU/mL以上のファージ粒子が含まれる。
【０１１６】
<1-2>抗KRSscFv選別
免疫試験管に10ug/ml濃度のKRSを添加して１時間試験管表面にタンパク質を吸着させ、牛乳粉末3%溶液を試験管に添加してKRSが吸着されない表面を保護した。試験管を空けた後、ここに牛乳粉末3%溶液に分散された1012CFUの抗体ファージライブラリーを入れて抗原と結合させた。非特異的に結合したTBST溶液で３回洗浄後残っている抗原特異的ファージ抗体を100mMトリエチルアミン溶液を利用して溶離した。
【０１１７】
溶離したファージを1.0M濃度のTris-HClバッファー(pH7.8)で中和佐瀬、ER2537大腸菌に37℃で１時間感染させて感染した大腸菌をカルベニシリンを含有するLB(Luia-Bertani)寒天培地に塗布して37℃で培養した。翌日培養した大腸菌を3mLのSBカルベニシリン培養液に懸濁して15%グリセロールを添加して一部はー80℃に保管し、残りの内50マイクロリッターを20mLのSBカルベニシリン2%ブドウ糖溶液に接種して37℃で培養した。培養液の600ナノメータ光線の吸光度が0.5になると遠心分離してバクテリアだけを分離して、これを再び20mLのSBカルベニシリン培養液に懸濁した後、1012PFU（プラグ形成単位）のVCSM13補助ファージを入れて徐々に撹拌して37℃で培養した。
【０１１８】
１時間後カナマイシン70ug/mlを添加して30℃で速やかに撹拌して(250rpm)一夜培した。翌日培養液を遠心分離してファージ粒子を含む上澄液1mLをライブラリーに使用して上記のファニング過程を繰返すことにより抗原特異的クローンを濃縮させた。
【０１１９】
＜実施例２＞
抗KRSscFv抗体発現及び精製
3-4回程度の繰返しファニング後抗体遺伝子を含む大腸菌をカルベニシリンを含有するLB寒天培地に塗布、培養して単一コロニーらを得て、これを200uL  SBカルベニシリン溶液に接種、培養後IPTGに誘導してscFvタンパク質を大腸菌のペリプラズム(periplasm)から発現した。大腸菌を40uLの1X  TES(50mM  Tris,1mM  EDTA,20%Sucrose,pH8.0)溶液に懸濁後これに0.2X  TES溶液60uLを添加して撹拌し4℃で30分以上処理して遠心分離して上澄液でフェリプラゾールを抽出した。
【０１２０】
<2-1>KRSに対して選別されたscFv抗体発現
選別されたKRSに対するscFv陽性単一コロニークローンをカルベニシリンを含有するSB培地(Bactotrytone  30g,yest  extract  20g,MOPS  buffer  10G/L)に5mlに培養してseed  cultureを始めてovernight培養後500mlカネニシリン含有SB培地に移してOD600=0.5程度になったとき、IPTGを1mMほど入れて30℃でovernight培養後scFvタンパク質を大腸菌のペリプラズムで発現した。翌日遠心分離して収得した大腸菌を1X  TES  bufferに(50mM  Tris,1mM  EDTA,20%Sucrose,pH8.0)懸濁後0.2X  TESを1.5倍添加して撹拌して遠心分離後ペリプラズムを抽出した。
【０１２１】
<2-2>選別されたscFv抗体精製
ペリプラズムから抽出したscFv抗体に最終5mM  MgSO4を加えてこれを予めPBSに平衡させたNi-NTA  beadと混合して１時間冷蔵で撹拌してNi-beadに結合させ、親和度クロマトグラフィーを行い、結合していないタンパク質をPBSで十分に洗浄した。5mM  Imidazoleが含有されたバッファーでより十分に洗浄したあと、結合したscFv抗体は200mM  Imidazole  bufferを利用して溶出した。溶出した抗体は透析して電気移動を通じて純度を確認し、BCA方法でタンパク質を定量して精製された抗体量を記録した後、一定量を分株して冷凍保管した。
【０１２２】
<2-3>免疫ブロット及びsequencing
ペリプラズムから抽出したscFv抗体は免疫ブロット技法を使用してhuman細胞から元来発現されたKRSにscFv抗体が結合するか否かの確認に使用した。50ugのHela  cell  lysateを  SDS  PAGEを通じて電気移動した後、wet  transfer方法でNitrocellulos  membraneに移して3%skim  milkでblockingはした後、抽出したscFv抗体を添加して結合させた。検出のため、結合したscFvにHRP(horseradish  peroxidase)が連結されたAnti-HA二次抗体を反応させて、基質でECL  reagentを利用して暗室でフィルーム感光した感光された帯は標準分子マーカーと比べてKRSのサイズに該当する帯を確認した。
【０１２３】
これより確認された抗原特異的抗体クロンはカベニシリンが含有されたSB培地10mlにovernight培養してplasmid  miniprep  kitを用いてplasmid  DNAを抽出してCapillary  sequencing  service(Macrogen  Co)を介して塩基配列を分析し、Kabat  protwin  sequence  databaseとIMGT(the  international  ImMunoGeneTicas  information  system)分析方法に基づきCDR配列を分析した。
【０１２４】
その結果、KRS抗原と結合してscFvの個数は総１件であって、これらの塩基配列は培養培地14であることを確認した。
【０１２５】
＜実施例３＞
抗KRSscFv抗体の親和度測定
KRS抗原に対する本発明抗体の結合親和度をProteOnTMXPR36  SPR(surface  plasmon  resonnce)バイオセンサーを利用して測定した。
【０１２６】
具体的に約10ug/mlのKRS抗原を製造社の説明書によってGLCチップ(Bio-Red  6  X  6  sensor  chip,Compact  capacity  amine  coupling  for  protein-protein  interactions)に約2,000乃至4,000反応単位に固定化させ、PBSを利用して多様な濃度で希釈した本発明の精製されたscFv抗体(500-30nM)30ulずつを25℃で50ul/minの速度でチップに注入し、抗原との相互作用を定量した。チップの表面は0.85%phosphoric  acidで再生してProteOnManagerソフトウェアーを利用して連合速度と解離速度を計算し、平衡解離定数(KD)は解離速度／連合速度の比で計算した。
【０１２７】
その結果、図２に示した通り、本発明の抗体は最大KD  100nM値を有し比較的高いKRS親和度を有することを確認した。
【０１２８】
＜実施例４＞
抗体scFv抗体交叉反応性測定
scFv抗体が他の抗原と反応性があるか否かを判断するため、Luminex  beadを利用して本発明の抗体とKRS及び他のARS  family  proteinとの交差反応性を測定した。
【０１２９】
<4-1>それぞれのproteinが結合されたLuminex  bead製造
Code  Noが他のそれぞれのbeadにproteinのamine残基を結合させるため、Bio-rad社のAmine  coupling  kitの実験過程によってcouplingを行った。先ず、1x106に該当するそれぞれのbeadを96well  filter  plateに移してactivation  bufferでvacuum  manifoldを利用して洗浄後50mg/ml  S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)と50mg/mlEDAC(1-ethy-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)を添加して常温で20分間活性化させた。活性化されたそれぞれのbeadはPBSで洗浄後純度90%以上の精製されたそれぞれの再組合わせされたARS抗原、つまり、WRS,HRS,NRS,KRS,SRS,YRS,GRS,imp1(p43)10ugを添加して常温で２時間反応させた。それぞれの  ARSに連結されたbeadはPBSで２回洗浄後、Blocking  bufferを添加して30分間常温で反応させて結合していない残基をblockingした後、PSSで２回洗浄後100ul  PSSに再び懸濁して光が遮断されたtubeに保管した。結合されたbeadの数はhemocytometerで測定して記録した。
【０１３０】
<4-2>Multiplex  Assayを利用したCross  activity測定
ペリプラズムから抽出された本発明の抗体は検体希釈液(PBST+2%BSA)に1:400濃度で希釈後96  well  filterプレートに検体希釈液で順次的に２回ずつ希釈して50ulずつ分株して抗体がないBlank  wellには検体希釈液だけを添加した。ARSが結合されたそれぞれのbead  well当り2000個beadになるようbead  mix  tubeにそれぞれ入れて検体希釈液を各well当り50ulずつ分株できる嵩ほどを入れた。bead  mix溶液を混合した後、wellに分株して暗室で１時間反応させた。反応が終ってvacumum  manifoldを利用してPBS（200ul/well）で３回洗浄後50ulAnti-(HA)-biotin２次抗体を添加して暗室で１時間追加反応させた。２次抗体と結合したbeadはPBSで３回洗浄後蛍光標識のため、SA-PE(Streptavidin-Phycoerythrin)を2ug/mlになるように添加して暗室で30分間反応させ、PBSで３回洗浄過程を経てPBS  100ulに再び懸濁した。蛍光標識されたbeadはBio-Plex（Luminex)200装備とBio-Plex  managerプログラムを利用して蛍光の強度を測定した結果値を分析してそれぞれのARSに対する抗体の結合可否を確認した。
【０１３１】
その結果、図３に示した通り、本発明の抗体は全ての濃度においてKRSを取除いた他のARS  family  proteinと反応しないことを確認した。
従って、本発明の抗体は他のタンパク質と交差反応性がないことを確認した。
【０１３２】
＜実施例５＞
精製された抗KRSscFv抗体を利用したsandwich  ELISA  pairing  test
本発明の抗体が診断用抗体への有用性可否を確認するため、KRSsandwich  ELISA  pairing  testを行った。ELISA構成中capture抗体わ本発明の抗体に使用してdetection抗体を従来製品のrabbitポレグロナール抗体でpairing  testをしてKRS標準物質に対する定量曲線が描かれるかを確認した。
【０１３３】
先ず、本発明の精製された抗体をcoating  buffer(0.1Msodium  carbonate  pH9.0)に希釈してwell当り100-400ngになるようELISA  plateに100ulずつ分株した後、常温で３時間放置した。PBSTで３回洗浄後2%BSAを含有したPBST350ulを添加して常温で１時間blockingした後、PBSTで３回洗浄した。抗体をcoatingしたplatewellに精製された再組合わせKRS標準物質を濃度別に検体希釈液に２倍ずつ希釈して100ulずつ入れて常温で１時間反応させた。反応後plateはPBSTで３回洗浄後希釈されたdetection抗体(4ug/ml)100ul添加して追加して常温で１時間反応した。検出のため、plateをPBSTで３回洗浄後HRPが連結されたanti-rabbit  IgGを入れて常温で１時間反応させて結合させた。HRPによる発色反応を確認するため、plateをPBSTで３回洗浄後HRP基質であるTMB  solution50ulを添加して10分間発色反応を確認とて2N硫酸50ul添加して発色反応を止めた後、readerを利用して450nmにおいて吸光度を測定した。
【０１３４】
その結果、図4に示した通り、再組合わせK標準物質に対してng/ml濃度に該当する標準直線が描かれることを確認した。
【０１３５】
＜実施例６＞
抗KRS抗体を利用した膵臓ガン患者の血中KRSバイオマーカー比較分析
【０１３６】
新たに開発したKRS抗体を利用して研究用ELISAキット製品開発を完了し、このキット製品を利用して血中KRSタンパク質の膵臓ガンに対するバイオマーカーとしての有用性を検証して患者血清のバイオマーカー測定に開発されたELISAキットが有用に使用できるかを確認するため、正常人と膵臓ガン患者の血清で実験を行った。
韓国の疾病管理本部韓国人体資源銀行ネットワークからIRB審議通過を得て、慶北大学病院から正常人と膵臓ガン患者の血清で実験した。血中KRSタンパク質の膵臓ガンに対するバイオマーカーとしての有用性を検証するため従来の膵臓ガンバイオマーカーであるCA19-9の血中濃度と比較して実験した。
【０１３７】
本出願人が開発したKRS  ELISAキットの始製品と商業化したCA19-9  ELISAキットは製造者の指示により進行した。具体的に抗体がコーティングされた96-wellプレートに検体希釈液を添加して１時間常温で放置して３回以上ワッシングバッファーで洗浄した。ディテックションアンチバディを各wellに添加した後、１時間常温で放置して３回以上ワッシングバッファーで洗浄した。2ndアンチバディを添加してした後、１時間常温で放置して３回以上ワッシングバッファーで洗浄した。TMB  substrateを各wellに入れて光がない常温条件で15分間放置して2N硫酸を添加し、発色反応を中断して450nmで吸光度を測定した。
【０１３８】
図５に示した通り、正常人群と比較して膵臓ガン患者群からKRSが統計的に有意性があるように増加することが分かった。このような結果は膵臓ガンの単一バイオマーカーで代表的なCA19-9の測定値と比較して見るに、KRSが膵臓ガンに対する診断バイオマーカーとして利用可能性が大きいことが分かり、本出願人が開発した抗KRS抗体が膵臓ガンの診断用抗体として優れた効果を示すことが検証できた。
【０１３９】
さらに、膵臓ガン診断においてKRSがバイオマーカーとしての重要性及び有用性を調べるため、他の候補バイオマーカーらの測定値と共に比較分析するため、多くの候補バイオマーカーらを産業化したELISAキット及びmultiplex  bead  assayキットらを購入して測定して見た。測定したバイオマーカーは全てKRS、WRS、AIMPI，CA19-9、CA125、IL-8、CEA、TNF-α、及びCEACAM-1であり、実験結果はheatmap形式で表現した。
【０１４０】
産業用ELISAキットとmultiplex  bead  assayキットの場合は、製造された社の指示により進行し、multiplex  assayは具体的にそれぞれのバイオマーカーアンチバディビードを2000ビードに該当する容量をもって最終容量3mlに合わせた後、wellに25ulずつ添加し、25ulの検体を各wellに添加した。４℃で撹拌して一夜放置した。各wellを洗浄後25ulのディテックションアンチバディーを添加して１時間30分間常温で放置した。25ulのstreptavidin-phycoerythrinを各wellに添加し、30分間常温で放置後洗浄した。プレートをLumminex  instrument(Bio-plex  200)で測定した後、Merian  Fluorescent  Intensity試料で分析した。
【０１４１】
図６に示した通り、正常人群と比べて膵臓ガン患者群からKRS膵臓ガンの単一バイオマーカーで代表的なCA19-9が統計的有意性で増加されいることを分かった。さらに、他の候補バイオマーカー測定値らと比較するに、KRSが膵臓ガンに対する診断バイオマーカーとして利用可能性が極めて高いことが分かり、本出願人が開発したKRS抗体が膵臓ガンの診断用抗体として優れた効果を示すことを検証できた。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上察した通り、本発明の抗体又はその断片をヒトのKRSに特異的に結合して、同一なARS  familyを含む他のタンパク質と交差反応性がなく、KRS検出及び抑制が可能であるのでKRS検出及びKRSが関連した疾患であるガン又は自己免疫疾患及び炎症性疾患の診断用目的に使用可能なため産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2017502672.tif 000003
【図２】
2017502672.tif 000004
【図３】
2017502672.tif 000005
【図４】
2017502672.tif 000006
【図５Ａ】
2017502672.tif 000007
【図５Ｂ】
2017502672.tif 000008
【図６】
2017502672.tif 000009
【配列表】
2017502672000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月7日(2016.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
Fc領域は抗体のCH2及びCH3ドメインを含む二つの重鎖断片を含有する。二つの重鎖断片は二つ以上のジスルフィド結合によりCH3ドメインの疎水性相互作用により維持される。
【国際調査報告】
2017502672.tif 000010
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