(57)【要約】  本発明は、微生物、単細胞生物及び糸状菌類から選択される生物から膜多糖類を生成するための方法に関し、前記方法は、前記膜多糖類を抽出する少なくとも1回の工程、及び可溶性タンパク質のより小さな規模の抽出を含み、これらは、前記生物のボールミル中での機械的処理、又は前記生物の超音波による物理学的処理によって行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物、単細胞生物及び糸状菌類から選択される生物から膜多糖類を得るための方法において、前記生物のボールミル中での機械的処理、又は前記生物の超音波による物理学的処理によって、前記膜多糖類を抽出する少なくとも1回の工程であって、可溶性タンパク質の抽出の低下が伴う工程を含む方法。
【請求項２】
機械的処理が、ガラス製ボールを備えたボールミルを、
-ボールの平均直径(dGM)が、1.5×10-3〜2.5×10-3mの範囲に及び、
-刃の末端における撹拌スピード(ν)が、5〜20m/秒の範囲に及ぶ
条件下で使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ボールミル中における機械的処理が、2〜50分、好ましくは、10〜40分の範囲に及ぶ時間をかけて実施される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ミルのボールの充填率が、60体積/体積%〜80体積/体積%、好ましくは、65体積/体積%〜80体積/体積%の範囲に及ぶ、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
物理学的処理が、超音波反応器を、
-エネルギーが、500〜5000Jの範囲に及び、
-出力が、200W〜400Wの範囲に及び、
-反応器のフィード流速が、0.150l/分〜3l/分の範囲に及ぶ
条件下で使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
超音波処理が、5〜30秒の範囲に及ぶ時間をかけて実施される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
機械的又は物理学的処理の工程に、抽出した膜多糖類の量を測定する工程が続く、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
複数回の処理の工程、好都合には、2〜10回の処理の工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1回の処理の工程に、抽出するに至った膜多糖類の量を測定する工程が続く、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数回の処理の工程を含み、少なくとも2回の処理の工程のそれぞれに、抽出するに至った膜多糖類の量を測定する工程が続く、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生物が、ラン藻類、微細藻類、細菌類及び糸状菌類から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生物が、紅藻植物門から、より具体的には、チノリモ属及びロデラ属、ラセンモ属及びドゥナリエラ属から、好ましくはチノリモ、アルスロスピラ・プラテンシス、ボツリオコッカス・ブラウニー、クリプテコディニウム・コーニイ、クロレラ・アウトトロフィカ、ナビクラ・インケルタ、及びロドソルス・マリヌスの株から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養液から可溶性多糖の画分を抽出することである工程を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
膜多糖の抽出の工程に、前記多糖類を精製する工程が続く、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
化学組成物、食品組成物、化粧用組成物又は医薬組成物中での、請求項13又は14の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【請求項１６】
組成物の、更にとりわけ、エマルジョンの増粘剤、ゲル化剤、界面活性剤、又はそうでなければ、安定化剤としての、請求項13又は14の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【請求項１７】
衛生的な植物生成物中で若しくは衛生的な植物生成物として、又は材料、特に、接着剤としての、請求項13又は14の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス、特に、藻類のバイオマスの活用の分野に関し、より具体的には、本発明は、微生物、特に、ラン藻類、微細藻類、細菌類、光合成微生物に、また糸状菌類に由来する多糖類を抽出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、真核生物であり、これらは通常単細胞であり、細胞膜及び壁により区切られている。この壁の組成及び構造は、問題になっている微細藻によって異なることがある。
【０００３】
したがって、特定の緑藻類、例として、クロレラにおいては、壁が、セルロースからなっており、極めて柔軟性を欠き、このため、この緑藻は、機械的ストレスに対して高い抵抗性を示す。
【０００４】
珪藻類のクラスに属する微細藻類の場合、壁は、被殻とも呼ばれ、結晶シリカからなる。後者は、クロレラよりも脆い。
【０００５】
最後に、その他の種も、環境攻撃から自体を保護するために、それらの細胞の周囲に多糖類のコーティングを作る。このコーティングの厚さは、時間と共に変化し、微細藻が指数関数的に成長する間は極めて薄く、次いで、静止期にはより厚くなる。静止期においては、膜多糖類の生成速度が、培養液中への可溶化速度よりも大きい。
【０００６】
バイオ精製の目的で微細藻類のバイオマスの全てを活用することを目指す場合、前記微細藻類の多様な代謝産物を分画し、単離することが必要になり、これらの代謝産物は一般に、培養液中に可溶性である。
【０００７】
したがって、主要な代謝産物は、多糖類、タンパク質及び色素である。
【０００８】
本発明が更にとりわけ標的とする微生物は、いくつかのタイプの多糖類、すなわち、細胞内多糖類、及び膜多糖類と呼ばれる細胞外多糖類を含む。
【０００９】
本発明が更にとりわけ標的とする微生物は、好ましくは、単細胞である。
【００１０】
しかし、これらの多糖類の場合、抽出の収率の問題がある。これは、微細藻類を培養する間に、膜多糖類の一部が、培養液中で、遊離し、溶解するからである。この遊離画分は、容易に回収し得る。しかしまた、結合型膜多糖類、すなわち、細胞の外側に、それらの外面上において付着している膜多糖類もある。これらの結合型膜多糖類は時に、菌体外多糖類又はEPSと呼ばれる。
【００１１】
いくつかの種、例として、チノリモ(Porphyridium cruentum)においては、結合型膜多糖類は、全ての膜多糖類のおよそ50%を構成することが予想される。
【００１２】
本出願の発端である、提示する問題は、膜多糖類を選択的に抽出すること、つまり、遊離の膜多糖類を抽出するだけでなく、細胞溶解を引き起こさずに結合型膜多糖類も培養液中に放出させることが困難であることにある。
【００１３】
更にとりわけ、本出願の発端である、提示する問題は、細胞溶解を引き起こさずに、結合型膜多糖類を培養液中に抽出することが困難であることにある。
【００１４】
実際に、これは、細胞溶解の結果、培養液中に、細胞構成要素の全部又は一部が放出され、その結果、多様な代謝産物、特に、膜多糖類の精製がより複雑になるからである。
【００１５】
バイオマス、特に、藻類から多糖類を抽出するのは既知の作業であり、例えば、US4960697は、溶解している多糖類、特に、非イオン性のグルカンを抽出するための方法を開示しており、この方法は、多糖類を沈殿させるために、二価のカチオン、次いで、水混和性の有機溶剤を使用する。
【００１６】
EP0311496は、細胞周囲及び菌体外の多糖類を化学的に生成させ、抽出するための方法を記載しており、この方法は、多糖類を、特に、セチルピリジニウムを用いて沈殿させる工程を使用する。
【００１７】
WO83/03738は、チノリモ株の微細藻を培養するための方法、及び溶液を、濃水酸化ナトリウム溶液によって塩基性化する工程と、加熱する工程と、低温条件下で塩酸溶液を添加する工程とを使用して、膜多糖類を抽出するための方法を記載している。この加水分解に、多糖類の沈殿が続き、これは、有機溶媒によって、特に、2〜3体積のエタノールを添加することによって行われる。
【００１８】
この方法により、細胞内及び細胞外の多糖類の抽出が可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】US4960697
【特許文献２】EP0311496
【特許文献３】WO83/03738
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Dubois M、Gilles KA、Hamilton JK、Rebers PA、Smith F.、「Colorimetric method for determination of sugars and related substances」、Anal. Chem. 1956年;28:350〜356頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかし、これらの方法により、バイオマスの破壊が引き起こされ、これは、多様な代謝産物を活用するという目的に適合しない。
【００２２】
本発明に従う方法により、結合型膜多糖類の抽出が可能になる。
【００２３】
したがって、本発明に従う方法により、膜多糖類を、高い収率で、細胞溶解の程度を低下させて抽出することが可能になる。
【００２４】
特に、本発明の発明対象は、微細藻類、ラン藻類、細菌類、糸状菌類及び光合成微生物に由来する多糖類の抽出である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の第1の発明対象は、生物から膜多糖類を得るための方法であり、前記方法は、前記生物のボールミル中での機械的処理、又は前記単細胞生物の超音波による物理学的処理によって、前記膜多糖類を抽出する少なくとも1回の工程であって、可溶性タンパク質の抽出の低下が伴う工程を含む。
【００２６】
更にとりわけ、この方法は、結合型膜多糖類を得ることを狙う。
【００２７】
標的とする生物は、更にとりわけ、微生物、単細胞生物及び糸状菌類から選択される。
【００２８】
前記機械的又は物理学的処理は、細胞に対して、十分に制御された機械的ストレスを生成することを可能にする任意のその他の技法により実施することができる。特に、パイプ中のキャビテーションについて言及することができ、キャビテーションは、循環する培養液中に十分な減圧を生成して、期待する機械的作用を示す振動波を生成する気泡の発生を生み出すことである。
【００２９】
本発明の第2の発明対象は、得られた可溶性多糖の画分の使用である。
【００３０】
より詳細には、本発明の発明対象は、膜多糖類を得るための方法であり、この方法は、以下の工程を、この順番で含む:
- 微生物、単細胞生物及び糸状菌類から選択される、少なくとも1つの生物を含む培養液を提供し、
- 前記培養液に対して、前記生物のボールミル中での機械的処理、又は前記単細胞生物の超音波による物理学的処理によって、前記膜多糖類を抽出する工程であって、可溶性タンパク質の抽出の低下が伴う工程を実施し、
- 前記培養液から可溶性多糖の画分を抽出し、
- 任意選択により、多糖類を含む前記画分を精製する。
【００３１】
この方法により、結合型膜多糖類の抽出が可能になる。
【００３２】
好都合なことに、前記膜多糖類を抽出する工程に、可溶性タンパク質の抽出は伴わない。
【００３３】
好ましくは、この方法は、サーキットモードで実施される。
【００３４】
本発明の目的では、表現「可溶性タンパク質の抽出の低下」は、タンパク質の抽出収率の、EPSの抽出収率に対する比と定義する、抽出の選択性が、0.7未満であることを意味するものとする。
【００３５】
本発明に従って使用する「サーキットモード」の原理を、図1に提示する。
【００３６】
サーキットモードにより、簡便な様式の連続的なデバイス上で、ある体積を「回分式」に処理することが可能になる。
【００３７】
このモードに従うと、処理しようとする培養液を、フィード槽(A)中に供給し、ここで、撹拌に付し、次いで、反応器(R)に送り、ここで、この培養液中の可溶性多糖類の濃度を増加させるが、それほど高い程度まで、この培養液の可溶性タンパク質の濃度を増加させないことが可能な処理に付す。処理の終わりに、培養液を、フィード槽に送り返し、ここで、撹拌に付す。培養液が反応器中で処理されるように、処理しようとする培養液は、反応器内にN回導入され、このことが、パス回数に相当する。
【００３８】
処理の間に生成した多様な代謝産物のアッセイを、フィード槽中で、N回の処理の終わり又は各パスの後のいずれかに行う。
【００３９】
多様な代謝産物のアッセイを、各パスの後に実施する場合、反応培養液の多糖類の濃度が増加する限り、前記培養液を反応器に送り返す。反応器に通すパス回数は一般に、1回及び10回を含めて、1〜10回である。
【００４０】
組成物の滞留時間は、反応器に通す組成物の全てのパスに相当する。
【００４１】
本発明に従う方法により、細胞を摩滅させ、したがって、細胞の完全性を顕著に改変することなく、結合型膜多糖類(又はEPS)の画分を引き離すことが可能になる。
【００４２】
この処理はまた、脱ガムとも呼ばれる。
【００４３】
本発明に従う方法により、一方では、多糖の抽出収率を、先行技術の方法と比較して増加させることが、他方では、続く、多糖の精製の操作を促進することが可能になる。
【００４４】
実際に、多糖の抽出収率を増加させ、その結果、膜多糖類の総質量に対して最高90質量%の膜多糖類を抽出することが可能になっている。
【００４５】
更に、すでに言及したように、本発明に従う方法は、細胞の完全性をわずかに改変するに過ぎない限り、その他の水溶性の、細胞の構成要素、例えば、水溶性タンパク質及びクロロフィルが、培養液内に、過剰に多量に放出されるのを阻止することも可能にする。したがって、本発明に従う方法は、細胞溶解が生じる先行技術の方法により得られる生成物よりも粘性が低い反応生成物が得られる利点を有する。
【００４６】
実際に、バイオマスのバイオ精製の視点からすれば、細胞の構成要素のそれぞれの選択的な抽出が望まれる。しかし、特定の化合物、例として、特に、培養液のその他の分子、例として、タンパク質と複合体を形成する傾向を有する膜多糖類の存在が、選択的な抽出を混乱させる恐れがある。
【００４７】
したがって、本発明に従う方法により、反応の終わりに、培養液中の水溶性多糖類の回収収率及び純度を増加させることが可能になる。
【００４８】
特に、多糖類を含有する回収培養液中のタンパク質の比率の低下に起因して、またそうでなければ、細胞からの多糖類の取出しに起因して、構成成分の精製の操作が促進され、こうして、多糖類と複合体を形成することが可能なその他の細胞化合物を回収する下流の工程が促進される。
【００４９】
本発明に従う方法は、遊離及び結合型の膜多糖類を標的とし、それらを事実上全て回収することを可能にするとみなすべきである。
【００５０】
本発明に従う方法の別の利点は、生物、特に、単細胞生物の培養液に対して、特に、生産のアウトプットにおける、微細藻類の懸濁液に対して、この方法を直接実施することができることであり、それにより、前記方法を実施するために使用する水の体積を低下させることに寄与する。
【００５１】
更にまた、この方法により、乾燥の工程を実施するのを回避することも可能になり、乾燥の工程は、当然のことながら、長時間を要する工程であり、エネルギーの観点からも金銭的な観点からも高コストの工程である。
【００５２】
本発明に従う方法の1つの変形形態に従うと、機械的又は物理学的処理の工程に、抽出した膜多糖類の量を測定する工程が続く。
【００５３】
本発明に従う方法は、処理の工程を複数回、好都合には、2〜10回含むことができる。
【００５４】
また、本発明に従う方法は、少なくとも1回の機械的又は物理学的処理の工程と、それに続く、抽出した膜多糖類の量を測定する工程とを含むこともできる。
【００５５】
抽出した膜多糖類の量を決定することを可能にする、任意の方法を実行することができる。
【００５６】
これらの方法、例として、比色分析法は、当業者の一般的な能力の一部である。
【００５７】
特に、多糖類のアッセイは、比色分析法により、フェノール及び硫酸を使用して実施する(Dubois M、Gilles KA、Hamilton JK、Rebers PA、Smith F.、「Colorimetric method for determination of sugars and related substances」、Anal. Chem. 1956年;28:350〜356頁)。
【００５８】
別の変形形態に従うと、本発明に従う方法はまた、複数回の処理の工程を含むことができ、少なくとも2回の処理の工程のそれぞれに、抽出するに至った膜多糖類の量を測定する工程が続く。
【００５９】
特に、N回目の処理の工程の終わりに測定した膜多糖類の量が、(N-X)回目の処理の工程の終わりに測定した膜多糖類の量と実質的に同一である場合に、前記方法を中断することができる;Xは、処理の総回数Nよりも小さい処理の回数であり、特に、Xは、1に等しい。
【００６０】
好都合には、本発明に従う方法は、前記培養液から可溶性多糖の画分を抽出することである工程を含む。
【００６１】
好都合には、膜多糖類を抽出する工程に、前記多糖類を精製する工程が続く。
【００６２】
本発明に従う方法では、膜多糖類を抽出する工程に、前記多糖類を精製する工程が続き得る。
【００６３】
適切な精製のプロセスを選択するのは、当業者の能力の一部であり、このプロセスは従来、pHを変化させる方法、エタノール沈殿法、及びメンブランを使用する物理的な分離から選択される。
【００６４】
本発明に従う、多糖類を抽出するための方法は、任意の生物、好ましくは、微生物から実施することができ、好ましくは、ラン藻類、微細藻類、細菌類又は糸状菌類から実施する。
【００６５】
好都合には、微細藻類の静止期の間に、すなわち、「指数関数的成長」の期間の終わり又は後で、中間の又は成熟した生理学的状況で、本発明に従う方法を実施する。
【００６６】
好ましくは、生物は、紅藻植物門から、より具体的には、チノリモ属及びロデラ属、ラセンモ属及びドゥナリエラ属から、好ましくはチノリモ、アルスロスピラ・プラテンシス(Arthrospira platensis)、ボツリオコッカス・ブラウニー(Botryococcus braunii)、クリプテコディニウム・コーニイ(Crypthecodinium cohnii)、クロレラ・アウトトロフィカ(Chlorella autotrophica)、ナビクラ・インケルタ(Navicula incerta)、及びロドソルス・マリヌス(Rhodosorus marinus)の株から選択される。
【００６７】
ボールミルを使用する方法
第1の好ましい変形形態によれば、本発明に従う方法は、その間にボールミルを使用する工程を含む。
【００６８】
ボールミルは従来、粘性の製品、例として、ペンキをホモジナイズするために、また、鉱物を粉砕するためにも使用されている。ボールミルは、処理しようとする組成物を受容することを目的とするチャンバー、例えば、蓋が閉じるボウルを含み、前記チャンバーに、ポンプを介して、処理しようとする組成物をフィードする。
【００６９】
従来、ボールミルのうちのボールが占有するボウルの体積のパーセントに相当する充填率は、50%〜80%、好ましくは、65%〜80%の範囲に及ぶ。
【００７０】
ボールを除く、チャンバーの内容物は、処理しようとする単細胞生物又は懸濁液を本質的に含む。
【００７１】
充填率を、特に、使用するボールの性質に従って調整することができる。実際に、特定の事例では、ボールが撹拌機の刃と刃の間に凝集するのを観察することができている。
【００７２】
特に、ガラスで作製されたボールの場合、ミルのボールの充填率は、好都合には、60体積/体積%〜80体積/体積%、好ましくは、65体積/体積%〜80体積/体積%の範囲に及ぶ。
【００７３】
処理しようとする培養液に適切な充填率を選択することは、当業者の能力の一部である。
【００７４】
ミル中における組成物のフィード流速は一般に、150ml/分〜200ml/分の範囲に及ぶ。処理しようとする培養液に適切なフィード流速を選択することもまた、当業者の能力の一部である。
【００７５】
ボールミルを用いる処理は一般に、18〜40℃、好ましくは、18〜25℃を含む温度で実施する。
【００７６】
方法の第1の変形形態によれば、本発明に従う方法で使用する機械的処理は、ガラス製ボールミルを、
- ボールの平均直径(dGM)が、1.5×10-3〜2.5×10-3mの範囲に及び、
- 刃の末端における撹拌スピード(ν)が、5〜20m/秒の範囲に及ぶ
条件下で使用する。
【００７７】
ボールミルの工程の終わりに、処理した組成物を回収し、次いで、前記組成物中に存在する多糖類を、抽出し、任意選択により、精製する。
【００７８】
方法の1つの実行形態によれば、単回のボールミルの工程を実施する。
【００７９】
方法の1つの好ましい実行形態によれば、ボールミル中における処理を、少なくとも2回、好ましくは、2〜10回、好都合には、3〜4回繰り返す。
【００８０】
好ましくは、ボールミル中における処理を、2〜50分、好ましくは、10〜40分の範囲に及ぶ滞留時間をかけて実施する。
【００８１】
超音波を使用する方法
この方法によれば、処理しようとする培養液を、超音波反応器にポンプで供給し、その内部で、培養液は超音波処理を受ける。
【００８２】
方法の第2の変形形態によれば、物理学的処理は、超音波反応器を、
- エネルギーが、500〜5000Jの範囲に及び、
- 出力が、200〜400Wの範囲に及び、
- 反応器のフィード流速が、0.150l/分〜3l/分の範囲に及ぶ
条件下で使用する。
【００８３】
超音波処理の工程の終わりに、処理した組成物を回収し、次いで、前記組成物中に存在する多糖類を、抽出し、任意選択により、精製する。
【００８４】
好ましくは、超音波を用いる機械的処理を、5〜30秒の範囲に及ぶ時間をかけて実施する。
【００８５】
膜多糖類の特性
また、本発明の発明対象は、本発明に従う方法に従って得られた可溶性多糖の画分の使用でもあり、前記方法は、記培養液から可溶性多糖の画分を抽出することである工程と、任意選択により、それに続く、前記多糖類を精製する工程とを含む。
【００８６】
前記膜多糖の画分は、化学組成物、食品組成物、化粧用組成物又は医薬組成物中で使用される。
【００８７】
前記膜多糖の画分は、好都合な特性、特に、質感をもたらす特性を有する。
【００８８】
前記膜多糖画分は、組成物、更にとりわけ、エマルジョンに、増粘剤、ゲル化剤、界面活性剤、又はそうでなければ、安定化剤として使用することができる。
【００８９】
したがって、前記膜多糖画分は、衛生的な植物生成物中で、又は衛生的な植物生成物として使用することができる。
【００９０】
また、前記膜多糖の画分は、材料、特に、接着剤としても使用することができる。
【００９１】
また、本発明に従って得られた膜多糖類は、オリゴ糖に分画することもできる。
【００９２】
こうして得られたオリゴ糖は、ファインケミストリーにおいて、反応体として好都合に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】上記に詳述したサーキットモードの原理を示す図である。
【図２】抽出係数を、平均ボールサイズの関数として示すグラフである。
【図３】一方で、タンパク質及び多糖類の溶解係数の曲線を示し、他方で、平均ボール直径の関数としての糖類の純度指数(IP)を示すグラフである。
【図４】若いバイオマスに対する、超音波による抽出係数を、2000J(200W)におけるパス回数の関数として示すグラフである。
【図５】中間の〜培養が進行したバイオマスに対する、超音波による抽出係数を、2000J(200W)におけるパス回数の関数として示すグラフである。
【図６】成熟したバイオマスに対する、超音波による抽出係数を、2000J(400W)におけるパス回数の関数として示したグラフである。
【図７】成熟したバイオマスに対する、超音波による抽出係数を、2000J(200W)におけるパス回数の関数として示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
続く実施例により、本発明を例示するが、それらにより、本発明の範囲が制限されることはない。
【実施例】
【００９５】
これらの実施例については全て、チノリモの培養液を使用する。このバイオマスを、10lの管状の光バイオリアクター中で培養した。
【００９６】
タンパク質(図中、「prot」と表す)を、280nmにおける吸光度により測定し、分光光度法による測定の正確性を検証するために、前記測定を、任意選択により、BCAプロトコールに従って実施するタンパク質アッセイによって補う。
【００９７】
色素、すなわち、総クロロフィル及び総カロテノイド(図中それぞれ、Chl及びPPCと表す)の定量化を、分光法によりそれぞれ678nm及び416nmにおいて実施する。
【００９８】
B-フィコエリトリン(図中、B-PEと表す)を、Bermejoプロトコールによりアッセイする。
【００９９】
1. ボールミルを使用する方法
1.1 平均ビーズ直径の関数としての抽出係数の決定
チノリモの培養液を、ガラス製ボールミル(DynoMill MutlilAb、WAB社、スイス)により、
Q:ml/分で示すフィード流速:170、
φ:ミル充填率:75%、
n:撹拌スピード:2389/分→ν:撹拌機の刃の末端におけるスピード:8m/秒
の条件下で処理した。
【０１００】
参考までに、高圧ミル(2700b)では、細胞の破壊が可能であり、したがって、溶液/安定な懸濁液中への、全て(100%)の代謝産物、したがって、全ての多糖類の放出が生じる。それぞれの代謝産物についての測定単位は、抽出係数であり、その最大(100%)が、HPミルに供した材料に関して得られた応答に相当する。
【０１０１】
ミルの工程(複数回可)の後に、遠心分離を実施し(13400×g、10分)、分析を、微細藻類の水性抽出液を構成する上清に対して実施する。
【０１０２】
結果を、図2に提示する。
【０１０３】
異なる平均直径を有するボールを用いて、ミルによる3つの処理を実施した:
a)0.625×10-3mの平均直径を有するボールを用いると、細胞の脱構造が観察され、タンパク質の選択性は最大である。多糖類を回収するには、これらのボールは適切でない。細胞の脱構造の間は、細胞のコンパートメント化が維持され、代謝産物の放出は一般に選択的である。
【０１０４】
b)1.3×10-3mの平均直径を有するボールを用いると、細胞の崩壊に類似する破壊が観察され(細胞は完全に破壊され、デブリは微細である)、タンパク質の放出、多糖類の放出が伴い、また、色素の均一な放出も伴う。全ての色素が均一に放出されることは、細胞の極度の破壊を反映し、この方法は、タンパク質と多糖類との間の選択性がより低く、この方法によっては、多糖類の選択的な抽出が可能にならない。
【０１０５】
c)2.15×10-3mの平均直径を有するボールが、細胞の代謝産物と比較した糖の選択的抽出に最も適切であり、この方法が、最も少ない細胞破壊をもたらす方法である。
【０１０６】
1.2 溶解係数及び純度指数の決定
ミルによる上記の3つの操作の終わりに、得られた結果に基づいて、タンパク質及び多糖類の溶解係数の曲線を、平均ボール直径の関数としてプロットし、図3に示し、同じグラフ上で、糖類の純度指数をプロットした。
【０１０７】
このグラフから、1.3×10-3mの平均ボール直径以降、多糖類の溶解係数は、タンパク質の溶解係数よりも大きくなり、多糖類の純度指数は、ボールのサイズと共に増加することが浮かび上がる。
【０１０８】
1.5×10-3m超の平均直径を有するボールを選択すると、膜多糖類の溶解の程度が、その他の細胞化合物、特に、タンパク質の溶解の程度よりも大きい条件が得られる。
【０１０９】
2.15×10-3mに等しい平均直径を有するボールを選択すると、膜多糖類の溶解の程度は低いが、純度指数がより高い条件が得られる。
【０１１０】
1.5×10-3m超の平均直径を有するボールを用いて、処理しようとする培養液をボールミルに通すパスを数回実施することによって、80%程度の溶解が首尾よく得られる。
【０１１１】
2. 超音波を使用する方法
使用する技術は、Synetude社が供給するSonitube(登録商標)タイプSM35/3である。これは、超音波トンネルであり、400Wの最大出力を有し、その操作周波数は35kHzである。
【０１１２】
懸濁液を、Sonitubeにポンプで供給し、そこで、超音波処理に付す(処理体積として、70mlの体積)。したがって、操作パラメータは、フィード流速、及び更に、超音波出力(200W〜400W)である。操作の間に、液体に供給されるエネルギーのかなりの部分が、熱の形で消散する。このため、懸濁液の温度を、30℃を超えないようにモニターする。
【０１１３】
各実験において、先行する段落で定義した、2700bにおいて実施するHPミルによる処理を、参照として用いる。
【０１１４】
超音波処理の工程の後に、遠心分離を実施する(13000×g、10分)。
【０１１５】
全ての分析を、微細藻類の水性抽出液を構成する上清に対して実施する。
【０１１６】
超音波については、回分式テストを実施した。
【０１１７】
A280から計算した抽出係数に存在する恐れがあり得る偏りを排除するために、生化学的タンパク質アッセイを実施した。
【０１１８】
静止期では、膜多糖類が生成するレベルが、培養液中に溶解するレベルよりも高いという知見に基づいて、超音波処理を生理学的状況が異なるチノリモの懸濁液に対して実施することを決めた。
【０１１９】
これは、若い生理学的状況では、膜多糖類が生成するレベルは、まだ低く、とにかく、培養液中に溶解するレベルよりも低いからである。
【０１２０】
a.若い生理学的状況
培養液は、3.7gの固体/lを有し、これには、1.5g/lの結合型膜多糖類及び0.3g/lの溶解型膜多糖類が含まれた。連続的パスの間のモニタリングを、図4に提示する。
【０１２１】
特定の選択性が観察される。超音波処理により、40%程度のタンパク質の放出を伴う、結合型膜多糖類の50%超の放出を達成することが可能になる。にもかかわらず、細胞の生理学的状況は、脱ガムが、比較的少量の結合型膜多糖類(1.5g/l)に対して生じることを指す。
【０１２２】
また、この生理学的状況から、高いレベルの細胞破壊も説明される。
【０１２３】
b.中間の生理学的状況、静止期の始まり
培養液は、4.5g固体/lを有し、これには、1.7g/lの結合型膜多糖類及び0.4g/lの溶解型膜多糖類が含まれた。連続的パスの間のモニタリングを、図5に提示する。
【０１２４】
培養が進行すると、結合型のEPSの量が増加する。選択的な脱ガムの現象が、結合型膜多糖類の増加に伴って促進されるように見える。実際に、膜多糖の(80%に近い)非常に満足な抽出係数を達成するのが可能になり、一方、可溶性タンパク質の放出は(<50%と)限定的である。したがって、チノリモの成熟する間の細胞壁の厚さであれば、細胞壁のより大きな部分を引き離すことが可能になるが、細胞を体系的に溶解することはないように見える。
【０１２５】
c.成熟した生理学的状況
培養液は、6.4gの固体/lを有し、これには、3.2g/lの結合型膜多糖類及び0.44g/lの溶解型膜多糖類が含まれた。この実験については、最小及び最大の操作出力、すなわち、200W及び400Wをテストした。連続的パスの間のモニタリングを、図6及び図7に提示する。
【０１２６】
このバイオマスに対しては、(<5%の)非常に弱い細胞溶解が観察される。A280の信頼性は、疑わしい場合がある(いくつかの値は、およそ0%である)が、B-PEアッセイは、信頼性があることが認められている方法であり、したがって、(極度の)溶解の指標として役立ち得る。
【０１２７】
この状況では、400Wにおける処理が、200Wにおけるよりも選択的であるように見えるであろう。実際に、抽出係数の比、すなわち、[多糖類(%)]/[B-PE(%)]は、200Wにおいては3.5であり、400Wにおいては8である。更に、400Wにおいては、(20%に近い)より広範な脱ガムが観察される。
【０１２８】
これらの実験から、適切な条件下における超音波により、微細藻類の脱ガムが可能になることがわかる。
【符号の説明】
【０１２９】
A  フィード槽
B  反応器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月13日(2017.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物、単細胞生物及び糸状菌類から選択される生物から膜多糖類を得るための方法において、前記生物のボールミル中での機械的処理、又は前記生物の超音波による物理学的処理によって、前記膜多糖類を抽出する少なくとも1回の工程であって、可溶性タンパク質の抽出の低下が伴う工程を含む方法。
【請求項２】
機械的処理が、ガラス製ボールを備えたボールミルを、
-ボールの平均直径(dGM)が、1.5×10-3〜2.5×10-3mの範囲に及び、
-刃の末端における撹拌スピード(ν)が、5〜20m/秒の範囲に及ぶ
条件下で使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ボールミル中における機械的処理が、2〜50分の範囲に及ぶ時間をかけて実施される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ミルのボールの充填率が、60体積/体積%〜80体積/体積%の範囲に及ぶ、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
物理学的処理が、超音波反応器を、
-エネルギーが、500〜5000Jの範囲に及び、
-出力が、200W〜400Wの範囲に及び、
-反応器のフィード流速が、0.150l/分〜3l/分の範囲に及ぶ
条件下で使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
超音波処理が、5〜30秒の範囲に及ぶ時間をかけて実施される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
機械的又は物理学的処理の工程に、抽出した膜多糖類の量を測定する工程が続く、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1回の処理の工程に、抽出するに至った膜多糖類の量を測定する工程が続く、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生物が、ラン藻類、微細藻類、細菌類及び糸状菌類から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生物が、紅藻植物門から、より具体的には、チノリモ属及びロデラ属、ラセンモ属及びドゥナリエラ属から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養液から可溶性多糖の画分を抽出することである工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
膜多糖の抽出の工程に、前記多糖類を精製する工程が続く、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化学組成物、食品組成物、化粧用組成物又は医薬組成物中での、請求項11の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【請求項１４】
組成物の増粘剤、ゲル化剤、界面活性剤、又はそうでなければ、安定化剤としての、請求項11の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【請求項１５】
衛生的な植物生成物中で若しくは衛生的な植物生成物として、又は接着剤中で若しくは接着剤としての、請求項11の規定に従って得られた可溶性多糖の画分の使用。
【国際調査報告】
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