(57)【要約】  ケロイド瘢痕の形成またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するための医薬品の製造におけるフィビュリン−５の使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療有効量のフィビュリン−５を投与し、それにより、前記ケロイド瘢痕を処置することを含む方法。
【請求項２】
ケロイド瘢痕の形成またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するための医薬品の製造におけるフィビュリン−５の使用。
【請求項３】
ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するためのフィビュリン−５。
【請求項４】
ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害する方法であって、前記線維芽細胞様細胞を有効量のフィビュリン−５と接触させ、それにより、前記ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害することを含む方法。
【請求項５】
前記接触させることがインビボで達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記接触させることがエクスビボまたはインビトロで達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞様細胞が組織に含まれる、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記線維芽細胞様細胞が初代細胞である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞様細胞が細胞株である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
有効量のフィビュリン−５と、美容的に許容されるキャリアとを含む美容用組成物。
【請求項１１】
前記ケロイド瘢痕が外傷によって引き起こされる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
前記ケロイド瘢痕が外科的手技によって引き起こされる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１３】
前記医学的状態が、疼痛、炎症および血管新生からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１４】
前記投与することが局所的に達成される、請求項１，１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与することが、皮膚上、皮下または皮内に達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィビュリン−５はインテグリンベータ結合ドメインを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法、使用、フィビュリン−５、又は組成物。
【請求項１７】
前記フィビュリン−５は全長型フィビュリン−５である、請求項１６に記載の方法、使用、フィビュリン−５、又は組成物。
【請求項１８】
前記フィビュリン−５はヒトフィビュリン−５である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、使用、フィビュリン−５、又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ケロイド瘢痕を処置するためのフィビュリン−５の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ケロイド瘢痕は、皮膚傷害後に現れ、かつ、創傷部の元の境界を越えて広がる病理学的な組織である１，２。審美的問題のほかに、ケロイド瘢痕は、ケロイド瘢痕が関節の上に生じるときには運動の範囲を制限する可能性がある（拘縮）３。一般的な集団におけるケロイドの比較的大きい有病率にもかかわらず、その形成の根底にある機構はほんの部分的にしか理解されていない。このことが多数の処置様式において反映されており、この場合、それらのどの１つの処置も広範囲に有効であることが証明されていない３，４。
【０００３】
ケロイド瘢痕は、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンを含めて、その真皮層および皮下組織層における過度な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積によって特徴づけられる５，６。ケロイド形成について、また、ケロイドから単離される線維芽細胞様細胞（ＦＬＣ）の高増殖速度についてこれまでに提案されている機構には、トランスフォーミング増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ベータ）３，７およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）４，８を含むある種のサイトカインの上昇した発現、ならびに、増殖とアポトーシス細胞死との間での不均衡９，１０がある。
【０００４】
フィビュリン−５は、多くの細胞タイプによって分泌される糖タンパク質であり、ＥＣＭの成分である。フィビュリン−５はＲＧＤモチーフを含有し、このモチーフにより、様々なインテグリンタンパク質へのその結合が可能となっている１１。この結合は、線維芽細胞の増殖、遊走およびアドヒーレンスに影響を与える細胞内シグナル伝達鎖におけるフィビュリン−５の関与を可能にしている１２〜１５。フィビュリン−５の過剰発現が、インビボでの創傷治癒を、肉芽組織の量を増大させることによって促進させることが報告された１６。フィビュリン−５は不可欠な役割を弾性繊維形成において有する１７，１８；しかしながら、ケロイド瘢痕は弾性繊維が不足している１９，２０。低いレベルのフィビュリン−５がケロイド瘢痕において報告された；これはおそらくは、この組織のＥＣＭにおけるコンドロイチン硫酸の蓄積のためであるかもしれない２０。インテグリンベータ−１が、フィビュリン−５への平滑筋細胞の接着を媒介することが示された１５。
【０００５】
さらなる背景技術には、下記のものが含まれる：
米国特許出願公開第２００４０１２６７８８号
ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＧｉｒｏ、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００６（Ｄｅｃ）、１２６（１２）：２５６３〜４
【発明の概要】
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療有効量のフィビュリン−５を投与し、それにより、前記ケロイド瘢痕を処置することを含む方法が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケロイド瘢痕の形成またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するための医薬品の製造におけるフィビュリン−５の使用が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するためのフィビュリン−５が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害する方法であって、前記線維芽細胞様細胞を有効量のフィビュリン−５と接触させ、それにより、前記ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害することを含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記接触させることがインビボで達成される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記接触させることがエクスビボまたはインビトロで達成される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記線維芽細胞様細胞が組織に含まれる。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記線維芽細胞様細胞が初代細胞である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記線維芽細胞様細胞が細胞株である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、有効量のフィビュリン−５と、美容的に許容されるキャリアとを含む美容用組成物が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ケロイド瘢痕が外傷によって引き起こされる。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ケロイド瘢痕が外科的手技によって引き起こされる。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態が、疼痛、炎症および血管新生からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが局所的に達成される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが、皮膚上、皮下または皮内に達成される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記フィビュリン−５はインテグリンベータ結合ドメインを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記フィビュリン−５は全長型フィビュリン−５である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記フィビュリン−５はヒトフィビュリン−５である。
【００２４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００２６】
【図１Ａ−１Ｆ】図１Ａ〜図１Ｆは、ケロイド切片の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）およびコラーゲンの構造を示す。図１Ａ−ケロイドサンプルにおける表皮の外観。真皮層における多量のコラーゲン沈着を認めることができる（太い矢印）。図１Ｂ−真皮層におけるコラーゲンの広い沈着を示すマッソン三色染色。図１Ｃ−瘢痕外植片を培養し、紡錘形状を有する線維芽細胞をケロイド瘢痕のすべてから単離した。図１Ｄ−細胞株Ｅおよび細胞株Ｆのペトリ皿において、遊走した細胞の間における伸長部の形成が認められた。図１Ｅ−細胞伸長部の陽性クーマシーブルー染色により、構造体のタンパク質組成が示される。図１Ｆ−これらの伸長部を形成する細胞の核位置を示す陰性ＤＡＰＩ染色。
【００２７】
【図２】図２は、フィビュリン−５またはゼラチンで被覆された表面で培養される線維芽細胞様細胞（ＦＣＬ）の増殖を示す。いくつかのＦＬＣ系統の増殖速度を７２時間〜９６時間アッセイした。すべての細胞が、フィビュリン−５またはゼラチンで事前に被覆されたウエルに播種された。細胞増殖速度における有意な低下（ｐ＜０．０５）が、すべての試験されたＦＬＣ系統について見出された（左）（それぞれの試験が５回の反復からなった）。すべての増殖実験（Ｎ＝５０）からのまとめられたサンプルでは、ゼラチンと比較して、フィビュリン−５被覆でのＦＬＣの有意な阻害が示された（右）。＊Ｐ＝０．００２。
【００２８】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｂはケロイド由来の線維芽細胞様細胞（ＦＬＣ）の接着速度を示す。図３Ａ−事前被覆物としてのフィビュリン−５またはゼラチンの存在下における、ケロイド由来の線維芽細胞様細胞（ＦＬＣ）の時間依存的な接着。ＦＬＣのＦ系統の細胞を、それぞれの被覆処置（フィビュリン−５またはゼラチン）について５回の反復により、２×１０４細胞／ウエルで置床した。細胞を、事前に被覆された表面に付着させ、細胞は約１８０分後には完全な接着に達した。ウエルを、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分および２４０分の時点でＰＢＳにより３回洗浄し、一方、陽性コントロールウエルは、洗浄されないままにした。実験全体が終了したとき、接着性細胞の量を、ＸＴＴアッセイを使用して計算した。図１Ｂ−抗ヒトＣＤ２９抗体の存在下または非存在下におけるフィビュリン−５被覆表面でのＦＬＣのアドヒーレンス。ＦＬＣのＦ細胞（２×１０４個／ウエル）を、フィビュリン−５が被覆された９０枚の６ウエルプレートに播種した。コントロール群を、０．５％のＦＢＳが補充されるＤＭＥＭ培地により１００μｌ／ウエルの最終体積で処理した。処理群を、抗ヒトＣＤ２９抗体の２０μｇ／１０６細胞を加えることを伴って同じ培地により処理した。ウエルを、９０分、１２０分、１８０分の時点でＰＢＳにより洗浄した。接着性細胞の量（％）を、ＸＴＴアッセイを使用して計算した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ケロイド瘢痕を処置するためのフィビュリン−５の使用に関連する。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００３０】
ケロイド瘢痕は、皮膚傷害後に現れる病理学的な組織で、肥厚性瘢痕よりも攻撃的である病理学的な組織である。様々なケロイド瘢痕が、線維芽細胞様細胞の増大した増殖と、細胞外マトリックス（主にコラーゲン）の蓄積とによって特徴づけられる。フィビュリン−５（多くの細胞タイプによって分泌される糖タンパク質）がこの細胞外マトリックスの成分である。
【００３１】
本発明を実施に向けて着想しているとき、本発明者らは、ケロイド瘢痕に由来する線維芽細胞様細胞（ＦＬＣ）の接着および増殖に対するフィビュリン−５の影響、ならびに、これらの活性におけるインテグリンベータ−１の役割を検討した。
【００３２】
ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に由来する細胞のフィビュリン−５処置により、このタンパク質の未だ知られていない阻害作用が明らかにされた。フィビュリン−５はまた、ケロイド瘢痕由来のＦＬＣの増殖を低下させ、かつ、それらの表面接着を低下させることができる。この影響がインテグリンベータ−１によって媒介されることが見出された。
【００３３】
本明細書中下記および下記の実施例の節において示されるように、線維芽細胞様細胞が６つのケロイド瘢痕から単離され、フィビュリン−５またはゼラチンにより被覆されたプレートで培養された。細胞を７２時間〜９６時間インキュベーションして、増殖速度を調べ、また、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分で洗浄を行いながら２４０分間インキュベーションして、接着速度を評価した。インテグリンベータ−１の役割を調べるために、抗ヒトインテグリンベータ−１（ＣＤ２９）抗体を培養培地に加えた。
【００３４】
フィビュリン−５被覆表面で培養された線維芽細胞様細胞は、ゼラチン被覆ディッシュで培養された細胞と比較して、有意に低下した増殖速度と、遅れた接着速度とを示した。フィビュリン−５が事前に被覆されたウエルに対する線維芽細胞様細胞のアドヒーレンスが抗ヒトインテグリンベータ−１（ＣＤ２９）抗体の存在下では有意に低下した。
【００３５】
したがって、これらの知見により、インテグリンベータ−１への結合を介した、ヒトケロイド由来細胞の接着および増殖に対するフィビュリン−５の極めて重要な役割が示唆され、また、フィビュリン−５が、この未だ処置されていない医学的状態のための治療法として特定される。
【００３６】
したがって、本発明の１つの局面によれば、ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害する方法であって、前記線維芽細胞様細胞を有効量のフィビュリン−５と接触させ、それにより、前記ケロイド瘢痕由来の線維芽細胞様細胞の増殖および／またはアドヒーレンスを阻害することを含む方法が提供される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、表現「ケロイド瘢痕」または表現「ケロイド」は、その成熟度に依存して、主にＩＩＩ型（早期）コラーゲンまたはＩ型（後期）コラーゲンのどちらかから構成される皮膚瘢痕の形成を示す。ケロイド瘢痕は、１型コラーゲンによってその後では徐々に置き換えられる、治癒した皮膚傷害の部位における肉芽組織（３型コラーゲン）の異常増殖の結果である。ケロイドは堅いゴム状病変部または光沢のある線維性小結節であり、ピンク色から患者の肌色にまで、または赤色から暗褐色にまで色が変化し得る。ケロイド瘢痕は良性で、感染性がなく、しかし、重度のそう痒、疼痛および組織構造における変化がときには付随する。重症の場合、ケロイド瘢痕は皮膚の動きに影響を与える可能性がある。ケロイド瘢痕が、高有色素の人種群では、白人の場合よりも１５倍の頻度で認められる。
【００３８】
ケロイドは肥厚性瘢痕と混同するべきではない：これは、肥厚性瘢痕は、元の創傷部の境界を越えて成長しない隆起した瘢痕であるからである。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケロイドは外傷によって引き起こされる。
【００４０】
いくつかの具体的な実施形態によれば、ケロイドは外科的手技の結果である。
【００４１】
より具体的には、それにもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態によれば、ケロイドは、ざ瘡、火傷、水痘、耳にピアス用の穴を開けること、引っ掻き傷、外科的切断またはワクチン接種部位によって引き起こされる皮膚傷害の結果である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、表現「線維芽細胞様細胞」または表現「ＦＬＣ」は、細胞外マトリックスおよびコラーゲン、すなわち、動物組織のための構造的枠組み（間質）を合成し、かつ、重要な役割を創傷治癒において果たす細胞のタイプを示す。線維芽細胞は動物における結合組織の最も一般的な細胞である。形態学的に、これらの細胞（ＦＬＣおよび線維芽細胞）は、細胞本体の端部から伸びる突起を有する大きい平坦な細長い（紡錘形状の）細胞である。細胞の核は平坦で、長円形である。これらの細胞により、トロポコラーゲン（これはコラーゲンの前駆体である）、および、基質、すなわち、結合組織において細胞と繊維との間の空間を満たす無定形のゲル様マトリックスが産生される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「アドヒーレンス（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）」はケロイド由来の線維芽細胞様細胞の接着速度を示す。
【００４４】
細胞アドヒーレンスをモニターする様々な方法がこの技術分野では広く知られており、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００９；５２２：２０３〜１０に非常に詳しく記載される（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。これらには、結合細胞の比色検出を用いる、Ｋｕｅｎｇ他（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８２：１６〜１９、１９８９）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に基づく付着アッセイ、ならびに、位相差顕微鏡法を用いて、接着性細胞の平坦化を測定する、ＹａｍａｄａおよびＫｅｎｎｅｄｙ（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、９９：２９〜３６、１９８４）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）の方法に基づく伸展アッセイが含まれるが、これらに限定されない。別の細胞接着アッセイが下記の実施例の節の実施例１に記載される。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「増殖」は、細胞数が細胞成長および細胞分裂の結果として増大することを示す。
【００４６】
細胞増殖をモニターする様々な方法がこの技術分野では広く知られており、これらには、手作業による細胞計数、黄色塩のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を青紫色の不溶性ホルマザン沈殿物に還元する生細胞の選択的能力に基づくＭＴＴ試験；チミジン取り込みアッセイ、ＢｒＤｕアッセイ［Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ比色キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）］；ＴＵＮＥＬアッセイ［Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ］；アネキシンＶアッセイ［ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アネキシンＶアポトーシスキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国］；細胞老化関連β−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｄｉｍｒｉ  ＧＰ、Ｌｅｅ  Ｘ他、１９９５）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「阻害する」は、化合物（例えば、フィビュリン−５など）の存在下での細胞増殖および／またはアドヒーレンスにおける少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、および、それどころか、それ以上の低下が、フィビュリン−５により処置されないコントロール細胞またはコントロールビヒクルにより処置されるコントロール細胞と比べて示される場合をいう。いくつかの実施形態によれば、コントロールは、発達段階および生物学的供給源が同じである、対をなす細胞サンプルである。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「フィビュリン−５」はＦＢＬＮ５遺伝子の発現産物を示す。この遺伝子によってコードされるタンパク質が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフおよびカルシウム結合ＥＧＦ様ドメインを含有する分泌型の細胞外マトリックスタンパク質である。このタンパク質がインテグリンベータ１結合タンパク質である。このタンパク質は内皮細胞の接着を各種インテグリンとＲＧＤモチーフとの相互作用を介して促進させる。このタンパク質は血管の発達および再構築において役割を果たしている。この遺伝子における欠陥が、常染色体優性弛緩性皮膚、常染色体劣性弛緩性皮膚Ｉ型（ＣＬタイプＩ）および加齢性黄斑変性症３型（ＡＲＭＤ３）の原因である。
【００４９】
フィビュリン−５はまた、ＵＰ５０、ＤＡＮＣＥ、ＡＲＣＬ１、ＦＩＢＬ５、ＡＤＣＬ２、ＡＲＭＤ３およびＥＶＥＣとも呼ばれる。
【００５０】
具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５は、ヒトフィビュリン−５、または、そのどのようなホモログであれ、他の非免疫原性ホモログである。獣医学的処置のために、フィビュリン−５の他のホモログを、意図された使用に依存して使用することができる。
【００５１】
具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５は短縮型形態であるが、この短縮型形態は依然として、タンパク質のＮ末端におけるインテグリンベータ１結合部位（ＲＧＤ）を含む。Ｙａｎｇｉｓａｗａ他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｓｉｇｎａｌ、２００９  Ｄｅｃ；３（３−４）：３３７〜３４７もまた参照のこと。
【００５２】
具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５は全長型フィビュリン−５である。具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５が、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＦＢＬＮ５＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ９ＵＢＸ５、ＮＰ＿００６３２０で提供される。成熟型形態は４４８アミノ酸の長さであり、配列番号１（または、これをコードする配列番号２）で提供される。
【００５３】
フィビュリン−５はそれ自体で提供され得ること、あるいは、タンパク質成分または非タンパク質成分にコンジュゲート化され得ることが理解されるであろう。そのような実施形態はインビボ用途において特に価値がある。
【００５４】
本教示に従って使用されることがある例示的な非タンパク質成分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレンｃｏ無水マレイン酸）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
そのような分子は非常に安定であり（おそらくは非タンパク質成分によってもたらされる立体障害のためにインビボでのタンパク質分解活性に対して抵抗性であり）、本明細書中下記でさらに記載されるように、安価かつ高効率である一般的な固相合成法を使用して製造される場合がある。しかしながら、組換え技術が依然として使用される場合があり、それによって、組換えペプチド産物はインビトロ修飾（例えば、本明細書中下記でさらに記載されるようなＰＥＧ化）に供されることが理解されるであろう。
【００５６】
代替において、または加えて、フィビュリン−５は、その生物学的利用能を改善するためにタンパク質成分（例えば、免疫グロブリンなど）に読み枠を合わせて融合することができる。
【００５７】
タンパク質の利用可能性を促進させるための他の関連する教示が国際公開２０１１／１３８７８５（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）に記載されることは特筆される。
【００５８】
用語「ペプチド」または用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、天然のペプチド／ポリペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）およびペプチド模倣体（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、同様にまた、ペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドで、例えば、ペプチドを体内においてより安定にする修飾、または、細胞内に浸透することをより可能にする修飾を有してもよいものを包含する。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾および残基修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための様々な方法がこの技術分野では広く知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．、１７．２章、Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、これは、全体が本明細書中に示されるかのように参照により組み込まれる）に具体的に述べられる。この点におけるさらなる詳細が本明細書中下記に提供される。
【００５９】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が、例えば、Ｎ−メチル化アミド結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、スルフィニルメチレン結合（−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキルである（例えば、メチル））、アミン結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、スルフィド結合（−ＣＨ２−Ｓ−）、エチレン結合（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン性二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、フッ素化オレフィン性二重結合（−ＣＦ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、自然界で炭素原子に存在する「通常の」側鎖である）によって置換される場合がある。
【００６０】
これらの修飾をペプチド鎖に沿った結合のいずれかにおいて、また、それどころか、同時に数カ所（２〜３）の結合において存在させることができる。
【００６１】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）が、非天然型の芳香族アミノ酸（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）など）、ナフチルアラニン、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはＯ−メチル−Ｔｙｒによって置換される場合がある。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態のペプチド／タンパク質はまた、１つまたは複数の修飾アミノ酸あるいは１つまたは複数の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質など）を含む場合がある。
【００６３】
用語“ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ”（アミノ酸）または用語“ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ”（アミノ酸）は、天然に存在する２０種のアミノ酸；多くの場合にはインビボで翻訳後修飾されるそのようなアミノ酸（これらには、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンが含まれる）；および、他の非通常型アミノ酸（これらには、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない）を包含することが理解される。そのうえ、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれ、前者を、生物学的利用能を増大させるために付加することができる。
【００６４】
具体的な実施形態によれば、線維芽細胞様細胞はフィビュリン−５とインビボで接触させられる。
【００６５】
具体的な実施形態によれば、線維芽細胞様細胞はフィビュリン−５とインビトロまたはエクスビボで接触させられる。
【００６６】
後者の選択肢によれば、細胞が（組織の一部として）ケロイドに含まれる可能性があり、または、細胞は、例えば、（小結節を伴い得る）単層を培養ディッシュにおいて形成する単離された細胞であることが可能である。
【００６７】
したがって、細胞は初代細胞培養物であることが可能である。
【００６８】
代替として、細胞は細胞株である。
【００６９】
細胞は、増殖／アドヒーレンスを阻害するために十分な期間、有効量のフィビュリン−５と接触させられる。
【００７０】
フィビュリン−５タンパク質（またはそれに由来する活性なペプチド）はそれ自体で提供することができ、または、シス作用調節エレメントのもとでフィビュリン−５をコードする核酸配列が関連の発現ベクターに連結される核酸構築物の一部として提供することができる。
【００７１】
現時点で好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物によるトランスフェクション、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）によるトランスフェクションおよび脂質に基づくシステムによるトランスフェクションなどが含まれる。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質が、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好ましい構築物がウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出またはメッセンジャーの翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在している場合を除き、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されるウイルスに適切であるポジティブ鎖プライマー結合部位およびネガティブ鎖プライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は典型的には、構築物が配置される宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列または本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド変化体のシグナル配列である。必要に応じて、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナル、同様にまた、１つまたは複数の制限部位、および翻訳終結配列を含む場合がある。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含むであろう。非ウイルス性である他のベクターを使用することができ、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。
【００７２】
細胞増殖および／または細胞接着を、例えば、インテグリンベータ１依存的様式で阻害することができる限り、少なくとも８０％、９０％または９５％の相同性（例えば、同一性）を野生型フィビュリン−５に対して有するフィビュリン−５の活性なペプチドが選択される。具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５ペプチドは、（ＲＧＤモチーフを含むタンパク質のＮ末端に見出される）インテグリンベータ１結合ドメインを含む。
【００７３】
したがって、ヒトフィビュリン−５を、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して精製または合成することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術を、フィビュリン−５をウイルスベクター（例えば、レトロウイルス）の使用などによって生じさせるために使用することができる。
【００７４】
代替において、または加えて、フィビュリン−５のタンパク質（成熟型）が、Ａｖｉｓｃｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅを含めて複数の供給者から入手可能である。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、ケロイドを有する個体またはケロイドを発達させる危険性がある個体を示す。具体的な実施形態によれば、対象は外科的手技を受けようとしているか、または外科的手技を受けたことがある。
【００７６】
具体的な実施形態によれば、対象は哺乳動物（例えば、ヒトなど）であるが、獣医学的使用もまた意図される。
【００７７】
具体的な実施形態によれば、ケロイドが１０歳〜２０歳の間の若い人で一般的であるので、対象は若年者である。
【００７８】
具体的な実施形態によれば、対象は、ケロイドに対する感受性がより大きいアフリカ系アメリカ人、アジア人またはラテンアメリカ系アメリカ人である。
【００７９】
フィビュリン−５が線維芽細胞様細胞の増殖／接着を阻害し得ることを、臨床応用に向けて利用することができる。
【００８０】
したがって、ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療有効量のフィビュリン−５を投与し、それにより、前記ケロイド瘢痕を処置することを含む方法が提供される。
【００８１】
代替において、ケロイド瘢痕の形成またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するための医薬品の製造におけるフィビュリン−５の使用が提供される。
【００８２】
代替において、または加えて、ケロイド瘢痕またはケロイド瘢痕に伴う医学的状態を処置するための、または防止するためのフィビュリン−５が提供される。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」には、状態の進行を抑止すること、実質的に阻害すること、遅らせることまたは取り消すこと、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に緩和すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「予防する」は、状態の発症を阻害することを示す。
【００８５】
ケロイド瘢痕形成に関する「予防的処置」は、ケロイド瘢痕の形成を引き起こすことが疑われる傷害、または、ケロイド瘢痕の形成を引き起こす危険性がある傷害が最近生じた部位に組成物を投与することを示すことは留意される。代替において、組成物が、ケロイド瘢痕形成が分子レベルで始まっているかもしれないが、目に見える瘢痕、または、近い将来の瘢痕形成の目に見える何らかの徴候を未だ生じさせていない時点で適用される場合がある。
【００８６】
フィビュリン−５（タンパク質または当該タンパク質をコードする核酸配列、例えば、配列番号１および配列番号２）（以降、本発明のいくつかの実施形態の「フィビュリン−５」）はそれ自体で生物に投与することができ、あるいは、フィビュリン−５が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物で生物に投与することができる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、１つまたは複数の本明細書中に記載される有効成分と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【００８８】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができるフィビュリン−５を示す。
【００８９】
以降、交換可能に使用されることがある表現「生理学的に許容されるキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は、著しい刺激を生物に引き起こさず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的特性を無効にしないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントがこれらの表現に従って含まれる。
【００９０】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性な物質を示す。賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００９１】
薬物の配合および投与のための様々な技術が、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出される場合がある（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００９２】
好適な投与経路が、例えば、経腸（例えば、経口）送達または非経口送達である場合がある。
【００９３】
具体的な実施形態によれば、フィビュリン−５が、局所的様式で、すなわち、皮膚に、例えば、罹患組織領域（すなわち、ケロイド）に投与される。
【００９４】
活性な薬剤を皮膚内に投与する様々な方法がこの技術分野では知られており、これらには、例えば、活性な薬剤を含み、かつ、皮膚の外表面に適用される皮内注入物、ゲル、液状スプレーおよびパッチが含まれる。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の皮膚内への活性な薬剤（フィビュリン−５）の投与が（皮膚に）局所的に行われる。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の皮膚内への活性な薬剤（フィビュリン−５）の投与が、例えば、対象の皮膚に適用される、有効成分を含むゲル、液状スプレーまたはパッチを使用して、非侵襲的に行われる。
【００９７】
（フィビュリン−５）を対象の皮膚内に投与するために使用することができる２つの主要なタイプの皮膚パッチが存在する。これらは、リザーバー型パッチと、マトリックス型パッチとである。リザーバー・パッチは通常、固体の薬物（活性な薬剤）と、希釈剤溶液とが満たされる構造物を含有し、または、ポリマーマトリックス内の高濃縮薬物溶液が律速物質のフィルムまたはメンブランによって取り囲まれる。マトリックス・パッチは、薬物が拡散によって外部環境に放出される均一系を形成する薬物およびポリマーを含有する。放出が続くにつれ、活性な薬剤は次第により長い距離を有し、したがって、放出するためのより長い拡散時間を必要とするので、マトリックス型パッチにおけるその速度が通常の場合には低下することには留意しなければならない。経皮薬物送達のさらなる詳細および例については、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ＭＲ．他、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３：１１５〜１２４；Ｓｃｈｅｉｎｄｌｉｎ  Ｓ．、２００４、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ｆｕｔｕｒｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ．Ｖｏｌ．４：３０８〜３１２；Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ＭＲおよびＬａｎｇｅｒ  Ｒ．、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２６：１２６１〜１２６８；Ｔａｎｎｅｒ  ＴおよびＭａｒｋｓ  Ｒ、２００８、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｒｏｕｔｅ：ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｅｎｔ．Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：２４９〜２６０を参照のこと（これらのそれぞれが本明細書によってその全体において参照により組み込まれる）。
【００９８】
フィビュリン−５を本発明の教示に従って皮膚内に投与するために使用することができる表層皮膚（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）薬物送達パッチの限定されない一例が、Ｓｅｎｔｉ  Ｇ．他、２００９、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｅｐ  ４［印刷に先立つＥｐｕｂ］に記載されている（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を皮膚に投与することが、リザーバー型パッチを使用して行われる。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を皮膚に投与することが、無傷の皮膚（例えば、破壊（ｂｒｅａｃｈ）、表皮剥離または物理的／化学的な透過化を受けていない皮膚）に対して達成される。
【０１０１】
例えば、無傷の皮膚の中に投与することを、半固体のリザーバーと、可塑性の支持用接着性輪郭部と、保護用の取り除き可能な覆いとを有する閉鎖性パッチを使用して行うことができる。
【０１０２】
半固体のリザーバーは、様々な賦形剤（例えば、脂肪、オイル（例えば、鉱油、ワセリン、植物油またはシリコーン油（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｏｉｌ））、ポリマー、ゲル化剤、懸濁化剤、安定剤、親水性溶媒、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、安定化用界面活性剤、コロイドなどおよびそれらの組合せなど）を使用するどのようなゲル、クリーム、軟膏、乳化物、懸濁物、微小粒子であっても可能である。
【０１０３】
皮膚内への活性な薬剤の送達を増大させるために、活性な薬剤は、表皮層または真皮層への送達を増大させるために設計される様々なビヒクルとともに配合され得ることには留意するべきである。そのようなビヒクルには、リポソーム、デンドリマー、ノイソーム（ｎｏｉｓｏｍｅ）、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）、ミクロエマルションおよび固体脂質ナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない（さらなる詳細については、Ｃｅｖｃ，Ｇ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ，ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ：ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１３、２５７〜３８８（１９９６）（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）；Ｋｏｇａｎ  Ａ、Ｇａｒｔｉ  Ｎ．Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ａｓ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ、Ａｄｖ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ、２００６、１２３−１２６：３６９〜３８５（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。加えて、活性な薬剤は、皮膚内への活性な薬剤の送達を高める化学的増強剤（例えば、スルホキシド、アゾン類（ａｚｏｎｅｓ）、グリコール、アルカノールおよびテルペンなど）と混合することができる（さらなる詳細については、Ｋａｒａｎｄｅ  Ｐ、Ｊａｉｎ  Ａ、Ｅｒｇｕｎ  Ｋ、Ｋｉｓｐｅｒｓｋｙ  Ｖ、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００５、１０２：４６８８〜４６９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＣ、Ｂａｒｒｙ  ＢＷ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００４、５６：６０３〜６１８；およびＳｍｉｔｈ，ＥＷ．、Ｍａｉｂａｃｈ，ＨＩ．編者、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、２００６、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓを参照のこと（これらのそれぞれが本明細書によってその全体において参照により組み込まれる））。
【０１０４】
パッチは、表皮または真皮への薬物の透過化を容易にするために設計される乳化物の中に配合されるフィビュリン−５を含む場合がある。例えば、パッチは、角質層を通って真皮内へのフィビュリン−５の透過化を容易にするために設計されるグリセリン中オイルの乳化物の中にフィビュリン−５を含む場合がある。真皮内への角質層を介した送達のために好適であるグリセリン中オイルの乳化物の限定されない一例が、米国特許出願公開第２００４００６７２４４号に記載される（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）。そのようなグリセリン中オイルの乳化物は１ミクロン未満の平均液滴サイズを示し、グリセリンの連続相と、内部相を含む少なくとも１つの植物油と、少なくとも１つの乳化用安定剤と、少なくとも１つの疎水性成分をその構造に含む少なくとも１つの生物活性化合物とを含み、ただし、この組成物は、角質層を通って真皮内への生物活性化合物の透過化を容易にする。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を皮膚に投与することが、破壊（ｂｒｅａｃｈ）された皮膚［例えば、外部の物体などにより透過化されている（例えば、破断させられている）皮膚］に対して達成される。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、皮膚の破壊が一時的に達成され（例えば、所定の短期間にわたって行われ）、皮膚内への有効成分のより良好な透過化を可能にするために設計される。
【０１０７】
皮膚の破壊を、例えば、皮膚の外側層において微小孔（例えば、微小流路）を導入することによって行うことができる。そのような微小流路は、例えば、Ｒａｄｉｏ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＲＦ）−Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ（商標）（ＴｒａｎｓＰｈａｒｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ（商標）Ｌｔｄ．）技術を使用して形成することができる［Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ｄｏｔ）ｔｒａｎｓｐｈａｒｍａ−ｍｅｄｉｃａｌ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＿ｒｆ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ］。
【０１０８】
加えて、または代替において、パッチから皮膚の表皮層への活性な薬剤（例えば、フィビュリン−５）の送達を、この技術分野で知られている物理的な増強剤（例えば、超音波、イオン泳動、電気穿孔、磁気泳動（ｍａｇｎｅｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、微小ニードルおよび連続混合など）を使用して高めることができる［例えば、Ｒｉｚｗａｎ  Ｍ、Ａｑｉｌ  Ｍ、Ｔａｌｅｇａｏｎｋａｒ  Ｓ、Ａｚｅｅｍ  Ａ、Ｓｕｌｔａｎａ  Ｙ、Ａｌｉ  Ａ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐａｔｅｎｔｓ、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｆｏｒｍｕｌ．２００９、３（２）：１０５〜２４を参照のこと（これは本明細書によってその全体が参照により組み込まれる）］。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を投与することが、皮内注射によって行われる。
【０１１０】
フィビュリン−５を、Ｍａｎｔｏｕｘ  Ｃ（１９０８）試験について記載されるような皮内注射によって対象の皮膚の皮層内に投与することができる。簡単に記載すると、フィビュリン−５を、（例えば、２６ゲージまたは２７ゲージの注射針を介して０．５ｍｌまたは１．０ｍｌのツベルクリン注射器を使用して）皮内に注入することができる。注射器を皮膚に対して４５度の角度で置くことができ、注射針の斜端が下向きの角度に置かれ、これにより、斜端が皮膚に向き合い、皮膚を完全に突き抜け、しかし、斜端は皮膚の表層よりも深くは突き抜けない。およそ０．０１ｍｌ〜０．０５ｍｌ（例えば、約０．０２ｍｌ）の体積が、小さい表層小疱を生じさせるために静かに注入される（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ’ｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｐｒａｃｔｉｃｅ、第６版、２００３）。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を投与することが、液体噴霧剤（例えば、フィビュリン−５を所定の濃度および投薬量で含む噴霧剤）を使用して行われる。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フィビュリン−５を投与することが、ゲル（例えば、フィビュリン−５を所定の濃度および投薬量で含むゲル）を使用して行われる。
【０１１３】
本明細書中に開示される方法を実施する際に有用であるインプラントが、所望量の安定化されたフィビュリン−５（例えば、非再構成ＢＯＴＯＸ．ＲＴＭ．など）を塩化メチレンに溶解された好適なポリマーの溶液に混合することによって調製される場合がある。この溶液は室温で調製される場合がある。その後、溶液をペトリ皿に移し、塩化メチレンを真空デシケータにおいて蒸発させることができる。所望されるインプラントサイズ、したがって、取り込まれたフィビュリン−５の量に依存して、フィビュリン−５を取り込む乾燥インプラントの適量が、フィビュリン−５封入インプラントディスクを形成するために鋳型において約８０００ｐ．ｓ．ｉ．で５秒間、または３０００ｐ．ｓ．ｉで１７秒間圧縮される。例えば、Ｆｕｎｇ  Ｌ．Ｋ．他、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ  ４−Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｂｒａｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８、６７２〜６８４：１９９８を参照のこと。
【０１１４】
治療有効量の決定は、とりわけ本明細書中に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１５】
本発明の方法において使用されるどのような調製物についても、治療有効量または用量は、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量を、所望された濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１１６】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力を、標準的な薬学手順によってインビトロ、細胞培養または実験動物で決定することができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して変化する場合がある。的確な処方、投与経路および投薬量が、患者の状態を考慮して個々の医師によって選定され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１１７】
投薬量および投薬間隔が、生物学的影響を誘導するために、または抑制するために十分である有効成分のフィビュリン−５（皮膚組織）レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節される場合がある。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するであろうが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要である投薬量は、個々の特性および投与経路に依存するであろう。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１１８】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与または複数回の投与であることが可能であり、１クールの処置が数日から数週間まで続くか、あるいは、治癒がもたらされるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１１９】
組成物の投与される量は当然のことながら、処置されている対象、病気の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存しているであろう。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有することがあるパックまたはディスペンサー装置（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で与えられる場合がある。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含む場合がある（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が伴う場合がある。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められる形式での容器に付随する通知によって変更される場合がある（ただし、そのような通知は、組成物の形式あるいはヒトまたは動物への投与の当該機関による承認を反映している）。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されるラベル表示のもの、または承認された製品添付文書のものである場合がある。適合し得る医薬用キャリアに配合される本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述されるように、適応症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、表示される場合がある。
【０１２１】
１つの局面によれば、フィビュリン−５が、有効量で美容用組成物に含まれる。
【０１２２】
本発明の美容用組成物は、フィビュリン−５だけでなく、美容用組成物において従来から使用される成分、例えば、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤および矯味矯臭剤、ならびにキャリアを含む補助剤などもまた含む場合がある。
【０１２３】
本発明の美容用組成物は広範囲の様々な形態で配合される場合があり、これらには、例えば、溶液、懸濁物、乳化物、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、粉末剤、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、オイル、粉末ファンデーション、乳化物ファンデーション、ワックスファンデーションおよび噴霧剤が含まれる。
【０１２４】
本発明の美容用組成物に含有される美容的に許容されるキャリアは、配合物のタイプに依存して変化する場合がある。例えば、軟膏、ペースト、クリームまたはゲルの配合物は、動物脂肪および植物脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛またはこれらの物質の混合物を含む場合がある。
【０１２５】
粉末剤または噴霧剤の配合物において、粉末剤または噴霧剤は、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末およびこれらの物質の混合物を含む場合がある。噴霧剤は、慣例的な噴射剤（例えば、クロロフルオロ炭化水素、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテル）をさらに含む場合がある。
【０１２６】
溶液および乳化物の配合物は、溶媒、可溶化剤および乳化剤を含む場合があり、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール、オイル（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール脂肪エステル、ソルビタンのポリエチレングリコールエステルおよび脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物を含む場合がある。
【０１２７】
懸濁液の配合物は、液状の希釈剤（例えば、水、エタノールまたはプロピレングリコール）、懸濁化剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル）、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらの物質の混合物を含む場合がある。
【０１２８】
石けんの配合物は、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステルの塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオナート類、ラノリン、脂肪アルコール、植物油、グリセロール、糖またはこれらの物質の混合物を含む場合がある。
【０１２９】
界面活性剤含有クレンザーの配合物は、キャリアとして、脂肪族アルコールサルファート、脂肪族アルコールエーテルサルファート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオナート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウラート、サルコシナート、脂肪酸アミドエーテルサルファート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物オイル、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルを含む場合がある。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１３１】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１３２】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１３３】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１３５】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１３６】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１３７】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３８】
参照が特定の配列表に対してなされる場合、そのような参照は、例えば、塩基置換、塩基欠失または塩基付加をもたらす配列決定時の誤り、クローニング時の誤りまたは他の変化から生じるわずかな配列変化を含むとして（ただし、そのような変化の頻度は５０ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では２００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では５００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１０００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では５０００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１００００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満である）、その相補的配列に実質的に対応する様々な配列もまた包含するものと理解すべきである。
【０１３９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１４０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１４１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１４２】
一般に、本願で使用される用語と、本発明において利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第三版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」���ａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４３】
実施例１
材料および方法
組織試料
外科的処置を新規ケロイド瘢痕のために受けた６名の患者がこの研究では登録された。この研究は、Ｒａｍｂａｍ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ施設内審査委員会によって承認された。
【０１４４】
ケロイドを、臨床的所見、病歴および解剖学的位置に基づいて診断した。診断を、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、マッソン三色染色およびレチクリン（Ｓｉｇｍａ、米国）染色による組織学的検査によって確認した。
【０１４５】
組織学的研究
ケロイド組織を外科的切除時に採取した。組織学分析のために、組織サンプルの一部を１０％ホルムアルデヒドにおいて２４時間にわたって固定処理し、パラフィンブロックに包埋し、ＬＥＩＣＡ  ＲＭ２２５５ミクロトームを用いて５μｍの厚さに切片化した。
【０１４６】
ケロイド由来ＦＬＣの単離
組織サンプルを、ＤＭＥＭ、ペニシリン（１／１００）、ストレプトマイシン（１／１００）、ＨＥＰＥＳ（１／５０）、２０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（１／１００μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０ｍｌの組織成長培地を含有する試験管において、４℃で維持して実験室に移した。組織をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で６回洗浄した。小片（５ｍｍ未満）を、上記で詳述される培地を用いてペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）または組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）で、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションした。４８時間毎に成長培地を新鮮な培地で取り替えた。線維芽細胞の遊走が認められると、細胞をトリプシン処理によって集めた。瘢痕から成長する最初の細胞を継代数１と称した。
【０１４７】
ケロイド由来ＦＬＣの特徴づけ
化学的染色剤を、ケロイド由来の伸長部を特徴づけるために使用した。ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）染色のために、細胞を６ウエルプレートで、３７℃、５％ＣＯ２において４８時間インキュベーションした。細胞を４％パラホルムアルデヒドにおいて３０分間にわたって固定処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＤＡＰＩにより１０分間染色した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００蛍光顕微鏡法によって３４０ｎｍの波長で観察した。
【０１４８】
タンパク質染色のために、細胞を６ウエルプレートで、３７℃、５％ＣＯ２において４８時間インキュベーションし、その後、４％パラホルムアルデヒドにおいて３０分間にわたって固定処理し、ＰＢＳにより洗浄した。固定処理された細胞をクーマシーブルー（Ｓｉｇｍａ、米国）により染色した。瘢痕外植片におけるフィビュリン−５の発現レベルを免疫組織化学によって求めた。
【０１４９】
ケロイド由来ＦＬＣ−増殖アッセイ
９６ウエルプレートを１００μｌのゼラチン（０．１％ｗ／ｖ）または４００ｎｇのフィビュリン−５（ＭＧＶＳ、イスラエル；レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０によってＣＨＯ細胞で産生されたもの）により４℃で一晩被覆した。ケロイド由来ＦＬＣ（２×１０３個／ウエル）を、１００μｌの成長培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）を用いてそれぞれの被覆について５回の繰り返しによりインキュベーションした。４８時間後、培地を新鮮な培地によって取り替えた。細胞を、細胞のコンフルエンスに応じて７２時間〜９６時間、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションした。インキュベーション期間が終了したとき、５０μｌのＸＴＴ試薬（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を細胞に加えた。その後、細胞をさらに３時間、完全な暗所で、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションした。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ  ｓｕｎｒｉｓｅ  ＡＴＲ  Ｆ０３９３００）を４９２／６４０ｎｍの波長で使用して読み取った。継代数が３〜５である細胞をこれらの実験のために使用した。
【０１５０】
ケロイド由来ＦＬＣ−接着試験
ケロイド由来ＦＬＣ（２×１０４個／ウエル）を上記のように、ゼラチンまたは４０μｌのフィビュリン−５により被覆された６ウエルプレートでインキュベーションし、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳにより洗浄した。ウエルを、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分および２４０分でＰＢＳにより３回洗浄し、一方、陽性コントロールウエルは、洗浄されないままにした。それぞれの洗浄の後、新鮮な成長培地をウエルに加えた。２４０分後、細胞を上記のように調製し、分析した。
【０１５１】
インテグリンベータ−１の役割を調べるために、ケロイド由来ＦＬＣをフィビュリン−５により被覆し、そして、インテグリンベータ−１の活性を阻止するために、上記のように、２０μｇ／１０６個のさらなるＦＬＣおよび抗ヒトインテグリンベータ−１（ＣＤ２９  ＭＡＢ  １７７８１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を添加して、または添加することなくインキュベーションした。ウエルを、９０分、１２０分および１８０分でＰＢＳにより洗浄した。それぞれの洗浄が終了した後、新鮮な成長培地をそれぞれのウエルに加えた。１８０分後、細胞を上記のように調製し、分析した。接着実験のために、継代数が４である細胞を使用した。
【０１５２】
統計学的分析
細胞の概算量を三連または五連で測定し、平均±ＳＤを計算した。群間の差の有意性を、平均細胞数および光学密度を比較するためにスチューデントｔ検定によって統計学的に分析した。すべての条件について平均間の差は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなした。
【０１５３】
実施例２
ケロイド外植片およびケロイド由来ＦＬＣの特徴
表１には、研究参加者およびケロイドの特徴が示される。報告された実験で使用される初代ＦＬＣ細胞株が表の左欄に示される。図１Ａ〜図１Ｆは、大きく、幅広い、伸張し、かつ密に並んだコラーゲン束を示す（図１Ａ）。マッソン三色染色（図１Ｂ）およびＨ＆Ｅ染色により、コラーゲン束の同一性が確認され、瘢痕組織から遊走した紡錘形状の形態学を伴っていた（図１Ｃ）。ＦＬＣの２つの初代細胞株（Ｅ＆Ｆ、表１）において、成長している細胞を取り囲む伸張する構造体が認められた（図１Ｄ）。これらの構造体は、１つのＦＬＣ本体から別のＦＬＣ本体にまで伸張する細長い伸長物として現れた。これらの構造体は、ＤＡＰＩではなく、クーマシーブルーによる明白な染色を示した。このことから、タンパク質性組成が示される（図１Ｄ〜図１Ｆ）。免疫化学試験により、フィビュリン−５の発現が瘢痕外植片では無視できるほどであることが明らかにされた（データは示されず）。
2017537934.tif 000002
【０１５４】
実施例３
フィビュリン−５はケロイド由来ＦＬＣの増殖を阻害する
ゼラチン被覆とともにインキュベーションされる、異なる患者に由来するＦＬＣは、異なるＦＬＣ系統については異なる増殖速度を示した（データは示されず）。細胞増殖に対するフィビュリン−５の影響を評価するために、種々の細胞株のＦＬＣをフィビュリン−５またはゼラチンによる事前被覆ディッシュに播種し、増殖速度を７２時間〜９６時間アッセイした。増殖速度における有意な低下（ｐ＜０．０５）が、すべての試験されたＦＬＣ系統に対して見出された。このことは、フィビュリン−５被覆は、ゼラチンと比較した場合、７２時間〜９６時間の期間中のＦＬＣの増殖を有意に低下させることを示している（図２）。
【０１５５】
実施例４
フィビュリン−５はインテグリンベータ−１への結合を介してケロイド由来ＦＬＣの接着を促進させる
フィビュリン−５がＦＬＣと相互作用する速度および機構を評価するために、これらの細胞の接着速度を試験した。最高の増殖速度が明らかにされたので、Ｆ細胞株に由来するＦＬＣを使用した。ゼラチンにより事前に被覆されたプレートに置床されたとき、ＦＬＣは線形的な付着速度を示した；ゼラチン被覆表面に付着する細胞は１８０分後には完全な接着に達した（図３Ａ〜図３Ｂ）。対照的に、フィビュリン−５により事前に被覆されたウエルに播種されたＦＬＣは、遅れた接着を示した。接着が、最初の９０分においては全く認められなかった；その後、接着が生じ、ついには、ゼラチンと同じプラトー状態に１８０分で達した（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【０１５６】
ＦＬＣ−フィビュリン−５相互作用におけるインテグリンベータ−１の役割を調べるために、抗ヒトＣＤ２９抗体（抗ヒトインテグリンベータ−１）をフィビュリン−５培地に加えた。インテグリンベータ−１の阻害により、フィビュリン−５事前被覆ウエルに対する接着性細胞の有意な低下が生じた（図３Ａ〜図３Ｂ）。ＣＤ２９抗体とともにウエルに播種された場合、接着性ＦＬＣが、フィビュリン−５単独で播種された細胞の有意な数の９０分での検出と比較して、１８０分後でのみ初めて検出された。
【０１５７】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１５８】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
2017537934.tif 000003
2017537934.tif 000004
【図１Ａ−１Ｆ】
2017537934.tif 000005
【図２】
2017537934.tif 000006
【図３Ａ−３Ｂ】
2017537934.tif 000007
【国際調査報告】
2017537934.tif 000008
2017537934.tif 000009