(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基のＣ１位を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１において、塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを保持する組換えベクター。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＤＮＡ又は請求項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞。
【請求項５】
宿主細胞が線維芽細胞株である請求項４記載の形質転換細胞。
【請求項６】
請求項４又は５記載の形質転換細胞を培養し、該培養物中に請求項１記載のＤＮＡがコードする（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを生成蓄積させ、同培養物から前記ポリペプチドを採取することを特徴とするガラクトース転移酵素の製造法。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの存在下、ガラクトース供与体をβ−Ｄ−キシロース残基に作用させるステップを少なくとも含む、β−Ｄ−キシロース残基のＣ４位特異的ガラクトシル化方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基のＣ１位を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラクトース転移酵素及びそれをコードするＤＮＡに関し、詳しくは、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン−タンパク質結合部位の合成に関与する、ヒト由来のガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース  β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
複合糖質は、主に細胞表面に糖タンパク質、糖脂質及びプロテオグリカンの糖成分として存在し、細胞外からの成長／分化因子によって引き起こされる細胞シグナルに対しての、認識分子、共−受容体、及び調節因子として働いている。
【０００３】
プロテオグリカンには、異なるコアタンパク質、異なる種類、数、及び長さを有するグリコサミノグリカン（GAGs）を含んでなる陰性電荷に富んだ様々な種類が存在し、細胞表面のみではなく、様々な組織の細胞外マトリックスにも存在する（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York (1980)）。特徴的に硫酸化されたGAG鎖を含むプロテオグリカンの多様性は、細胞種それぞれの特定の態様によって生じ、分化の段階におけるプロテオグリカンの厳密に調節された発現パターンは、細胞増殖／分化（Mol.Cell.Biochem.,1(2),211-28 (1973)）、組織の発達及び分化（Science 260(5104),103-6 (1993)）、ウイルスやバクテリアの感染（J.Virol.,63(1),52-8 (1989), Infect.Immun.,65(1),1-8 (1997)）の調節におけるプロテオグリカンの役割を示唆している。
【０００４】
プロテオグリカンの硫酸化GAGsの生合成は、コアタンパク質中のセリン残基へのキシロースの付加から始まり、その後２個のガラクトース残基、そしてグルクロン酸残基の付加が連続的に起こる（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York(1980)）。
【０００５】
上述の共通の結合構造にN-アセチルグルコサミンが結合するか、あるいはN-アセチルガラクトサミンが結合するかによって、ヘパリン／ヘパラン硫酸が形成されるか、あるいはコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸が形成されるかのいずれかが決定される。そして、連続した個々の糖の転移は、特定の糖転移酵素によって触媒されるが、グルクロン酸転移酵素ＩのcDNA（J.Biol.Chem.,273(12),6615-6618 (l998), J.Biol.Chem.,274(12),7857-7864 (1999)）以外の遺伝子は未だに単離されていない。
【０００６】
また、キシロースにガラクトース残基を転移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース  β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）については、同酵素を欠失したCHOの変異体の研究（J.Biol.Chem.,262(25),12189-95 (1987)）、又はデルマタン硫酸プロテオグリカンの生合成の遺伝的疾患の観察の臨床事例の研究（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-1346 (1990)）により、その性質がある程度調べられている。また、同酵素は、抽出、部分精製がなされているが（J.Biol.Chem.,250(13), 5200-5207(1975)、J.Biol.Chem.,244(10), 2790-2798 (1969)）、未だ実質的に均一なまでには精製されておらず、詳細な性質や一次構造は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、キシロースにガラクトース残基を転移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース  β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡを単離し、精製された同酵素を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）sqv-3遺伝子を使用した発現配列タグ（EST(s): expressed sequence tag(s)）のBLAST解析（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-979 (1999)）に基づき、複合糖質の共通の結合構造（GlcAβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Xylβ1-O-Ser（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York (1980)）の生合成に関与するヒトのガラクトース転移酵素ＩをコードするcDNAクローンを単離した。そして、cDNAクローン産物の基質特異性をインビトロで確認し、また、このcDNAを含む発現ベクターをガラクトース転移酵素Ｉを欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）の変異株に導入してGAGの発現回復を確認した。かくして、前記ｃＤＮＡがガラクトース転移酵素Ｉをコードすることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記性質を有する、ガラクトース転移酵素（以下「本発明酵素」ともいう）である。
（１）作用
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。
（２）基質特異性
ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトース残基を転移しない。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残基。
【００１０】
本発明のガラクトース転移酵素の好ましい態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵素である。
（３）ミカエリス定数
約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを受容体とした場合）
【００１１】
本発明のガラクトース転移酵素の具体的態様は、ヒト由来であるガラクトース転移酵素である。
【００１２】
本発明のガラクトース転移酵素としてより具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであるガラクトース転移酵素が挙げられる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１３】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう）を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１４】
上記ＤＮＡとして具体的には、配列番号１において、塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
さらに本発明は、前記ＤＮＡを保持する組換えベクターを提供する。
本発明はまた、前記ＤＮＡ又は前記組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を提供する。宿主細胞としては、線維芽細胞株が挙げられる。
本発明はさらに、前記形質転換細胞を培養し、該培養物中に前記ポリペプチドを生成蓄積させ、同培養物から前記ポリペプチドを採取することを特徴とするガラクトース転移酵素の製造法を提供する。
また本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供する。
【００１５】
以下、上記性質を有するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース  β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）を、単に「ガラクトース転移酵素」又はXGalT-1ということがある。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、以下特にことわりがない限り、Galはガラクトースを、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを、GAGはグリコサミノグリカンを、CHOはチャイニーズハムスター卵巣細胞を、D-MEMはダルベッコ改変イーグル最少必須培地を、FCSはウシ胎児血清を、PBSはリン酸緩衝生理食塩液を、GAPDHはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを、kbはキロベースペアを、bpはベースペアを、HPLCは高性能液体クロマトグラフィーを、NMRは核磁気共鳴を、p-Nph-β-D-Xylはp-ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを、XGalT-1はガラクトース転移酵素Ｉ（UDP-D-ガラクトース：D-キシロースβ-1,4-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）を、それぞれ示す。
【００１７】
＜１＞本発明酵素
本発明酵素は、下記性質を有するガラクトース転移酵素である。
【００１８】
（１）作用
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。
（２）基質特異性
ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトース残基を転移しない。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残基。
【００１９】
本発明のガラクトース転移酵素の好ましい態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵素である。
（３）ミカエリス定数
約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを受容体とした場合）
なお、測定条件によってミカエリス定数の値が多少変化することは当業者の常識である。従って、ここで示したミカエリス定数の値はあくまで指標であり、当業者にとって実質的に同一であろうと認識される範囲のミカエリス定数の値が包含されると理解されたい。
【００２０】
本発明のガラクトース転移酵素として具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであるガラクトース転移酵素が挙げられる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００２１】
この中でも、（ａ）のポリペプチドが好ましい。
なお本明細書中において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいことを示す。
【００２２】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするDNAの多形や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、本発明酵素に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、本発明酵素に包含されるものである。
【００２３】
なお本明細書における「数個のアミノ酸」とは本発明酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示す。
【００２４】
ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性は、後記実施例に示すように、p-Nph-β-D-Xylへのガラクトースの転移反応を利用した測定方法を用いることによって測定できる。よって当業者であれば、本発明酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００２５】
本発明酵素は、もともとはヒトcDNAをマウスの線維芽細胞であるマウスＬ細胞で発現させることにより得られたものであるが、他の宿主を用いた遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたポリペプチドも当然に包含される。
【００２６】
本発明酵素は、本発明によりそのアミノ酸配列や性質が開示されたので、天然物からの単離・精製や、化学合成等によって製造することも可能であるが、後述の本発明DNAを用いて製造することが好ましい。本発明DNAを用いた本発明酵素の製造方法については後述する。なお本発明酵素は、必ずしも単独のポリペプチドでなくてもよく、必要により融合タンパク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明酵素のポリペプチドと他のポリペプチド、例えばプロテインＡ、を含む融合ポリペプチドが例示される。
【００２７】
本発明酵素は、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有する限り、ポリペプチドのみからなるものであってもよいし、糖鎖等を有していてもよい。
【００２８】
本発明酵素はβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する作用を有しているので、キシロース残基のＣ４位特異的ガラクトシル化や糖鎖等の合成に利用できる。
【００２９】
＜２＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００３０】
この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAが好ましい。
上記ＤＮＡとして具体的には、例えば配列番号１において塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
【００３１】
上記配列番号１記載の塩基配列を有するDNAは、もともとはヒト由来のものであるが、その由来は限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたDNAも当然に包含される。
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するDNAも本発明DNAに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００３２】
本発明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA又はRNAも包含される。さらに本発明DNAは、本発明酵素をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖またはRNA鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００３３】
本発明ＤＮＡは、後記実施例に示すように、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）のsqv-3遺伝子の、動物細胞におけるホモログをデータ・ベース検索し、見出されたヒト発現配列タグ（expressed sequence tag）に相当するヒトｃＤＮＡとして単離されたものであり、XGalT-I遺伝子と命名した。
【００３４】
具体的には、前記タグに基づいて作製したオリゴヌクレオチド、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、ヒト由来のmRNA又はcDNAライブラリーを鋳型とするポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）を行い、本発明ＤＮＡの一部を取得する。次に、得られたＤＮＡの塩基配列に基づいて、5'RACEにより5'-末端領域を取得する。その際に用いられるプライマーとしては、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
上記のようにして得られる増幅産物をプローブに用い、ヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすると、本発明ＤＮＡを含むクローンが得られる。
【００３６】
上記のようにして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列の一例を、配列表の配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
本発明ＤＮＡは、上記のようにして得られたものであるが、本発明ＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによってヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから、あるいは前記塩基配列にもとづいて作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりcDNAライブラリーまたは染色体ＤＮＡライブラリーから、単離することもできる。前記プライマーとしては、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３７】
尚、染色体ＤＮＡから本発明ＤＮＡを得た場合には、イントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンを含むＤＮＡであっても、本発明ＤＮＡに包含される。
【００３８】
本発明ＤＮＡは、ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号４１〜１０２１からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。
【００３９】
本発明ＤＮＡを導入した細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から同ポリペプチドを採取することによって、本発明酵素を製造することができる。
【００４０】
本発明ＤＮＡを導入した細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換プラスミドを構築し、この組換プラスミドを細胞に移入することによって得ることができる。ここで用いる本発明DNAは、本発明DNAである限りにおいて特に限定されないが、配列番号１における塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列を含むDNAが好ましい。
【００４１】
細胞としては、大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付加されていない本発明酵素を得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖が付加しうるため、糖鎖を含むポリペプチドの形態で得ることも可能である。
【００４２】
本発明を導入する宿主細胞として具体的には、例えばマウスの線維芽細胞であるＬ細胞が挙げられる。また、ベクターとしては、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)、pMIKneo、pCD-SA等が挙げられる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４３】
本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００４４】
本発明ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran method)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）を用いてトランスフェクションを行う方法がある。
【００４５】
培養物からの本発明酵素の採取は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００４６】
本発明酵素の抽出方法として具体的には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４７】
本発明ＤＮＡを発現させると、本発明酵素は細胞の膜画分に局在する。また、本発明ＤＮＡを、本発明酵素の一部、例えばN-末端の53アミノ酸を欠く本発明酵素と他のポリペプチドとの融合タンパク質として、可溶性の形態で発現させると、同融合タンパク質は細胞質中に局在する。尚、N-末端の53アミノ酸を欠く本発明酵素をコードするＤＮＡは、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００４８】
抽出液からの本発明酵素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４９】
精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析し、前記＜１＞で説明した本発明酵素の物性と比較することにより、本発明酵素の製造が確認できる。
【００５０】
本発明によりクローニングされたXGalT-I遺伝子は、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）のsqv-3遺伝子を使用した発現配列タグのBLAST解析により、β4-ガラクトース転移酵素ファミリーに属するであろうと考えられた。sqv-3遺伝子は、C. elegansの糖質の一部を合成する、保存された糖質付加経路の構成要素をコードする一遺伝子として特定された遺伝子であり、陰門の陥入に必要な遺伝子である（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3),968-73 (1999)）。
【００５１】
ところで、sqv-3は、ほ乳類及びニワトリのβ4-ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列の相同性から、ガラクトースβ1,4-N-アセチルグルコサミンの結合を形成するβ1,4ガラクトース転移酵素であると考えられていた（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999))。しかし、XGalT-I遺伝子から予測されたアミノ酸配列は、他のほ乳類のβ4-ガラクトース転移酵素よりもsqv-3と高い相同性を有していることから、XGalT-I遺伝子は、糖脂質や糖タンパク質中のGal-β-1,4GlcNAc（又はGlc）構造の合成に関与する公知のβ4-ガラクトース転移酵素とは異なるβ4-ガラクトース転移酵素をコードしていると考えられた。そして予測されたとおり、XGalT-I遺伝子は、プロテオグリカンのグリコサミノグリカンとタンパク質の結合部の生合成に関与するガラクトース転移酵素Ｉをコードしていることが基質特異性の分析によって明らかとなった。本発明は、グリコサミノグリカンの生合成に関与するβ4-ガラクトース転移酵素の遺伝子をクローニングした初めての例である。
【００５２】
また、種々の組織におけるXGalT-I遺伝子の発現をノザンブロッティングにより解析したところ、遍在的な発現パターンを示した。このことは、同遺伝子産物は普遍的な重要性を有していることを示唆している。細胞増殖におけるプロテオグリカンの発現促進及び抑制効果が明らかとされているため（Cell,64(4), 841-8 (1991)、Science, 252(5013),1705-8 (1991)、Cell,83(3),357-60 (1995)）、プロテオグリカンのGAGの役割の重要性がますます認識されてきている。C. elegansにおけるsqv-3遺伝子の欠失の所見は、ほ乳類組織における形態形成及び成長におけるその対応遺伝子産物の特別な重要性を強く示唆している。従って、C. elegansの遺伝子及びほ乳類の糖鎖生物学的研究の連携により、プロテオグリカンのGAGの生物学的重要性及び機能的メカニズムのより深い理解が促進されることが期待される。
【００５３】
また、XGalT-I遺伝子は、早老症（progeroid syndrome）患者において、その遺伝子の異常が報告されており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-1346 (1990)）、本発明ＤＮＡは、このような疾患の遺伝子治療のツールとして利用できることが期待される。また、本発明ＤＮＡ、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、上記のような遺伝子疾患の検出等に利用できることが期待される。
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５４】
はじめに、以下の実施例で用いた試薬及び細胞について説明する。
UDP-Gal、p-ニトロフェニル-β-D-キシロピラノシド(p-Nph-β-D-Xyl)、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(p-Nph-β-D-Gal)、p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-ガラクトサミニド(p-Nph-β-D-GalNAc)、p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド(p-Nph-β-D-GlcNAc)およびp-ニトロフェニル-α-D-キシロピラノシド(p-Nph-α-D-Xyl)は、シグマ(Sigma；St.Louis, MO)より購入した。また、[α-32P]dCTPはICN(Costa Mesa, CA)より購入した。ヘパラン硫酸に特異的なモノクローナル抗体(HepSS-1)は、生化学工業株式会社より購入した。
【００５５】
以下の実施例に用いたマウスの線維芽細胞であるＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1)は、7.5％ウシ胎児血清(FCS)を添加したD-MEM（Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium）中で、37℃、５％ CO2条件下で生育させた。Ｌ細胞は、Memorial Sloan Kettering Cancer CenterのA.Albino博士より恵与された。CHO変異株pgsB-761（ガラクトース転移酵素Ｉ-欠損）（J.Biol.Chem.,262(25),12189-95 (1987)）は、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）より入手し、10％ FCSを添加したF-12K培地（Life Technologies, Inc.）中で生育させた。
【００５６】
【実施例１】
ヒト・ガラクトース転移酵素(XGalT-1)遺伝子のクローニング
（１）線虫sqv-3遺伝子に対するホモログの検索
線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）において、sqv-3は、ヒトや脊椎動物のβ1,4 ガラクトース転移酵素（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999)）群ファミリーのアミノ酸配列に類似しており、陰門の陥入や卵母細胞の分化に必要であると報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3),968-73 (1999)）。動物細胞における sqv-3遺伝子の類似体を見出すために、ケノルハブディティス・エレガンスsqv-3遺伝子のコード配列（GenBank, accession number AJ005867）から推定されるアミノ酸配列について、データ・ベース検索を行った。データ・ベース検索は、The National Center for Biotechnology Information(NCBI)の発現配列tag（expressed sequence tag）データ・ベース（dbEST）に対し、tBLASTnアルゴリズムを用いて行った。その結果、４つのヒト発現配列tag（GenBank, accession number AI040029, AA100869, AA442547およびT82170）が見つかった。
【００５７】
（２）sqv-3ヒトホモログｃＤＮＡの単離
見い出されたtagに相当するｃＤＮＡを単離するために、下記塩基配列を有するプライマーを合成し、ヒト大腸癌細胞株 Lovoから調製した全RNAを鋳型として用いた逆転写ポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行った。ＰＣＲは、以下の条件：94℃で１分間、次いで（94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間）を２５サイクル、次いで72℃で１分間、で行った。
【００５８】
（センスプライマー）
4GT5GSP1 5'-GGCATCCTGCTGCTCTCCAA-3'（配列番号３）（配列番号１において塩基番号644-663に相当)
（アンチセンスプライマー）
4GT3GSP1 5'-GCCACTCCACATCCTGTCAG-3'（配列番号４）（配列番号１において塩基番号1126-1107に相当）
【００５９】
その結果、重複するいくつかの部分長cDNAクローンが得られた。これらのうち、583塩基対のcDNAは、pCR 2.1-TOPOベクター（Invitrogen, San Diego, CA）にクローン化した。
【００６０】
次に、上記ｃＤＮＡの5'-末端領域を取得するために、5'RACEキット（Life Technologies, Inc.）を用い、同キットの説明書に従って、RACE（rapid amplification of cDNA ends）を行った。すなわち、ヒトLovo細胞株由来の0.4μgの全RNAと、配列番号５に示す塩基配列（5'-CAGGTGGCGAAATGTCTT-3'、配列番号１において塩基番号814-797に相当）からなる遺伝子特異的プライマー１（gene-specific primer 1；GSP1）を用いて、最初のcDNA鎖合成を行った。続いて、Nested PCRを、アダプタープライマーと、配列番号６に示す塩基配列（5'-CCCCAGAAGCGGTTGGACAT-3'、配列番号１において塩基番号708-689に相当）からなる遺伝子特異的プライマー２（gene-specific primer 2；GSP2）を用いて行った。その結果、Kozakの規則（Cell, 44, 283-292 (1986)）に適合する開始コドンを有する、679bpの断片が得られた。
【００６１】
（３）ハイブリダイゼーションによるヒトcDNAライブラリーのスクリーニング
上記のようにして得られた5'RACE産物（配列番号１において塩基番号29-687に相当）を、MegaprimeTM DNAラベリングシステム（MegaprimeTM DNA labeling system；Amersham）を用いて32P-ラベルし、ヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-37（Sloan-Kettering Cancer CenterのL. J. Old博士より恵与）cDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。SK-MEL-37細胞cDNAライブラリー由来の約4×105のEscherichia coli MC1061/P3を、コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーションは、GeneScreen Plus membrane（NEN）を用いて行った。その結果、５個の独立した陽性クローンが得られた。
【００６２】
上記の陽性クローンからｃＤＮＡを取り出し、ABI PRISM 310遺伝子解析装置(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて、ジデオキシ・ターミネーション法（dideoxy termination method）により塩基配列を決定したところ、３個のクローンは全オープンリーディングフレームを含んでいた。決定された塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。AUG開始コドンの位置はコザック（Kozak)のコンセンサス配列（Cell, 44, 283-292 (1986)）に従って決定された。
【００６３】
こうしてクローニングされた遺伝子を、XGalT-1遺伝子と命名した。同遺伝子は、327アミノ酸から構成されるタンパク質をコードし、その分子量は37,405ドルトンと計算された。
【００６４】
上記タンパク質には、一つの強力なN-リンク糖鎖結合部位が存在している。KyteとDoolittle 法（J.Mol.Biol.,157, 105-132 (1982)）によって決定された疎水性（hydropathy）は、アミノ末端部位の（Val31-Ala58）に渡る28アミノ酸残基の顕著な疎水性領域が一カ所あることを示しており、今までクローニングされてきた多くの他の糖転移酵素と同様に、２型膜貫通構造を持つタンパク質と推定された（図１）。
【００６５】
同定されたcDNAの一次構造と、ヒトβ4-ガラクトース転移酵素Ｉ（β4GalT-1）と略記；GenBank accession number X14085）（Biochem.Biophys.Res.Commun.,157(2), 657-63 (1988)）の構造を比較すると、327アミノ酸のうち82残基（25%）が同一であることが明らかとなった。同様な結果は、この新しくクローン化された遺伝子とこれまでクローン化されてきた他のヒトβ4-ガラクトース転移酵素（β4GalT-II,III,IV,V,and VI）（J.Biol.Chem.,272(51), 31979-91 (1997) 、J.Biol.Chem.,273(45),29331-40 (1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95(2), 472-7 (1998)）、J.Biol.Chem.,273(22),13570-7 (1998)、Glycobiology 8(5),517-26 (1998)）との間にも見出された。対照的に、この遺伝子は、線虫のsqv-3遺伝子と38%のホモロジー（327アミノ酸中127残基）を有していることは、この遺伝子がヒトにおけるsqv-3のオーソログ（異なる種における対応する遺伝子。進化的に同じ起源を持ち、同様な構造と機能を持つ他の種の遺伝子）であることを示唆してる。これらの結果は、この新しくクローン化された遺伝子産物がβ4-ガラクトース転移酵素遺伝子ファミリーの新規な一員であることを示している。
【００６６】
【実施例２】
ヒト・ガラクトース転移酵素（XGalT-1）の製造及び性質
＜１＞XGalT-1遺伝子産物の酵素活性
（１）XGalT-1発現ベクターの構築
ヒトsqv-3オーソログであるガラクトース転移酵素の活性を測定するために、前記のクローン化されたcDNAをL細胞に導入し、発現産物を調製した。
【００６７】
まず、前記cDNAを発現させるための発現ベクターを、次のようにして構築した。XhoI部位を有する5'プライマー 5'-CTCGAGACGATGTTCCCCTCGCGGAGG-3'（配列番号７）(配列番号１において塩基番号38-58に相当)、及び、SpeI部位を有する3'プライマー 5'-TCTAGAAGCTCAGCTGAATGTGCACCA-3'（配列番号８）（配列番号１において塩基番号1027-1007に相当）をプライマーとし、クローニングされたcDNA断片を鋳型に用いたPCRにより、XGalT-1のオープンリーディングフレームをコードするcDNA断片を調製した。PCR産物を、pMIKneoベクター（東京医科歯科大学の丸山  和夫博士より恵与）のXhoI部位およびSpeI部位に挿入し、XGalT-1発現ベクターpMIKneo-XGalT-1を得た。尚、pMIKneoは、マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含み、SRαプロモーターを含んでいる。
【００６８】
次に、N-末端の53アミノ酸を欠くXGalT-1を発現させるための発現ベクターを、以下のようにして構築した。EcoRI部位を有する5'プライマー 5'-CAGCTCGAATTCTCTGGGGACGTGGCCCGG-3'（配列番号９）（配列番号１において塩基番号200-217)、及び、XhoI部位を有する3'プライマー 5'-TGTCCACTCGAGTCAGCTGAATGTGCACCA-3'（配列番号１０）（配列番号１において塩基番号1024-1007に相当）をプライマーとし、クローニングされたcDNA断片を鋳型に用いたPCRにより、N-末端の53アミノ酸を欠くXGalT-1をコードするＤＮＡ断片を調製した。PCR産物をEcoRIとXhoIで消化し、pCD-SAベクター（理化学研究所の辻  崇一博士より恵与）のこれらの制限酵素部位にサブクローニングし、pCDSA-XGalT-1を得た。pCD-SAベクターは、SRαプロモーターを含んでいる。pCD-SAのEcoRIとXhoIに挿入されたＤＮＡ断片は、同プロモーターによりプロテインＡ（protA）との融合タンパク質として発現する。
【００６９】
（２）XGalT-1遺伝子産物の調製
(i)不溶性のXGalT-1（膜画分）の調製
トランスフェクションの少なくとも48時間前に、マウスの線維芽細胞であるマウスＬ細胞3×106個を10cmのディッシュにまいた。DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran method)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）により、XGalT-1遺伝子発現ベクターpMIKneo-XGalT-1(4μg)をＬ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で48時間培養した後、トリプシンで細胞をはがして回収した。得られた細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄後、1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)を含有する氷冷したPBS中で、窒素キャビテーション装置（nitrogen cavitation apparatus；Parr Instrument Co.）を用いて400psi、30分間、細胞溶解させた（Cancer Res.,49, 6258-6264 (1989)）。低速遠心により核を除去し、上清を４℃、100,000gで１時間遠心分離した。沈殿物を氷冷した100mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に再懸濁させた。
【００７０】
上記のようにして得られた細胞溶解抽出液を、 UDP-[14C]Galを供与体とし、いろいろな受容体基質を使ったガラクトース転移酵素活性の測定に供した。ガラクトース転移酵素活性は、Lugemwaらの方法（J.Biol.Chem., 271(32),19159-65 (1996)）を若干改変して行った。アッセイ混合液(25μl)は、1μlのMe2SO、15mM MnCl2、50mM KCl、1％ Triton X-100、100mM MES緩衝液(pH6.0)、0.6mM UDP-Gal、5,000dpm/μl UDP-[14C]Gal（Du Pont-New England Nuclear）、1μgの酵素溶液及び2mMの基質を含有する。37℃で30分間インキュベートした後、1mlの水を添加することにより反応を終了させ、Sep-Pak C18カートリッジ(Waters)にアプライした。カートリッジを10mlの水で洗浄し、5mlのメタノールで溶出させた。メタノール溶出液中の[14C]Galの量は、液体シンチレーションカウンター(Beckman)で測定した。結果を表１に示す。活性は、１分間当りに1mgの酵素タンパク質が転移するGalの量(nmol)で示した。
【００７１】
【表１】
0004377987.tif 000002
【００７２】
その結果、グリコサミノグリカン糖鎖形成のプライマーである、p-Nph-β-D-Xylに対しては確実な転移酵素活性がみられた。しかし、通常糖タンパク質や糖脂質でガラクトース転移酵素の基質となるはずのp-Nph-β-D-GlcNAcを含む、他の全ての基質は、全く受容体とならなかった。尚、XGalT-1の代わりに偽遺伝子(mock)を導入した細胞からの抽出液ではほとんど酵素活性を示さなかった。
【００７３】
p-Nph-β-D-Xyl基質でのおおよそのKm値は3.4 mMであった。これらの結果は発現タンパク質がガラクトース転移酵素Ｉ（UDP-D-ガラクトース: D-キシロースβ-1,4-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ; EC 2.4.1.133)（J.Biol.Chem.,250(13), 5200-7 (1975)）であることを示唆している。同様な結果は、下記の可溶性の融合酵素（XGalT-1-protA）によっても得られている。
【００７４】
(ii)可溶性のXGalT-1の調製
上記と同様にして、DEAE-デキストラン法により、pCDSA-XGalT-1（4μg）をＬ細胞(10cmディッシュ)にトランスフェクトし、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で16時間培養した。その後、培地を無血清ITS（インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸）培地（Becton Dickinson）に置換し、さらに32時間培養した。トランスフェクションの48時間後に培養培地を回収し、Molcut-L（ミリポア）を用いて100倍に濃縮し、100mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に対して透析し、可溶性酵素（XGalT-1-protA）溶液を得た。
【００７５】
NMR分析用のサンプルを調製するために、可溶性酵素をIgG-セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてさらに精製し、酵素が結合したビーズを酵素源として用いた。具体的には、100倍に濃縮した培養培地25μlを、IgG-セファロース 10μlと共に４℃で一晩インキュベートした。遠心により回収したビーズを100mM MES緩衝液(pH6.0)で洗浄し、この緩衝液に再懸濁させた。
【００７６】
＜２＞XGalT-1反応産物の解析
ガラクトース転移酵素反応生成物を同定するために、可溶性融合酵素 XGalT-1-protAを酵素源として用い、p-Nph-β-D-Xylを[14C]Galでアイソトープラベルした。生成した標識産物[14C]Galβ1-4Xylβ1-p-Nph １μgを、50mM Tris-HCl(pH7.3)、50mM NaClおよび20μgのβ-ガラクトシダーゼ（E. coli由来；Boehringer Mannheim）を含有する200μlの溶液に溶解し、37℃で７時間インキュベートした。その結果、前記標識産物の99%以上は分解された。
【００７７】
一方、前記標識産物[14C]Galβ1-4Xylβ1-p-Nphを、結合様式に特異的なβ-ガラクトシダーゼを用いて処理した。具体的には、100mM NaClおよび100μg/ml BSAを含有する50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）100μl中で、1μgの標識産物を20mUのdiplococcal（双球菌由来）β-ガラクトシダーゼ(Boehringer Mannheim)で、37℃、23時間消化することにより行った。消化産物を1mlの水で希釈して、上述のようにSep-Pak C18カートリッジを用いて分離し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、標識産物は、末端β-1,4ガラクトース結合構造の加水分解を特異的に触媒するdiplococcalβ-ガラクトシダーゼ分解でも完全に切断された。
【００７８】
上記の結果は、XGalT-1-protA融合タンパク質が、UDP-Galからガラクトースをβ-1,4結合構造を持つ受容体への転移を触媒することを示している。
【００７９】
＜３＞XGalT-1反応産物の構造決定
反応生成物のβ-1,4-結合を確定するために、酵素源としてIgG-Sepharoseに固定化したXGalT-1-protA融合タンパク質を用い、反応産物を大量に調製した。
【００８０】
50μlの酵素結合IgG-セファロース、2.7mgのp-Nph-β-D-Xyl、10μlのMe2SO、15mM MnCl2、50mM KCl、1% Triton X-100、100mM MES緩衝液（pH6.0）および75mM UDP-Galを含有する250μlの混合液中で反応を行った。反応物の生成は、エタノール／ピリジン／n-ブタノール／酢酸／水(100：10：10：3：30)の溶媒系を用いた高速薄層クロマトグラフィーによりモニターし、終了するまで24時間行った。反応産物は、上述のようにSep-Pak C18カートリッジを用いて精製し、さらにDevelosil ODS HG-5カラム（4.6mmφx250mm；Nomura Chemical）を用いたHPLC（Jasco 880-PUポンプおよびMD915検出器を使用）により精製した。カラムへの過剰負荷を避けるため、４回に分けてサンプルを負荷した。溶出は300nmの吸光度によりモニターした。溶離液として10％アセトニトリル水溶液(溶液Ａ)と30％アセトニトリル水溶液(溶液Ｂ)を用い、次の濃度勾配により行った。なお流速は1ml/分、温度40℃で行った。
【００８１】
0〜 2分  溶液Ｂの0％〜30％の直線濃度勾配
2〜30分  溶液Ｂ30％で保持
30〜40分  溶液Ｂの30％〜100％の直線濃度勾配
【００８２】
主要な産物を含む画分を回収し、NMRによる解析に用いた。NMRによる解析の前に、サンプルをD2O(99.9 atom ％ D)に溶解し、減圧乾燥し、最終的に600μlのD2O(99.96 atom％ D)に溶解した。
【００８３】
プロトン核磁気共鳴（1H NMR）スペクトル(600 MHz)は、JEOL JMNα-600（日本電子製）を用いて、25℃で測定した。D2Oを測定溶媒、t-ブタノール(δ1.23)を内部標準とし、1D、1D-HOHAHA、NOE差スペクトルおよびCOSYはppmで記録した。FABMSデータは、m-ニトロベンジルアルコールをマトリックスとして用い、JEOL MSTATION（日本電子製）を用いて記録した。
【００８４】
FAB MS（高速原子衝撃質量分析）によって、434m/z(M+1)と456m/z(M+Na+)でのシグナルから、その生成物の分子量は433であると決定された。これは、出発物質Xylβ1-p-Nphのガラクトース結合生産物と帰属できる。
【００８５】
1H-NMR スペクトルは、p-ニトロフェニル部分と２個のグリコシル残基（の存在を）示した。糖成分の全てのシグナルは、それぞれのアノマー位のシグナル（δ=4.49とδ=5.25）で照射した1D-HOHAHAスペクトルとCOSYによって同定された（図２）。p-Nph-β-D-Xyl部分の構造は出発分子のスペクトルとの比較から確定された。ガラクトース残基の（スピン）結合定数(J1,2=7.7 Hz, J2,3=9.9 Hz, J3,4=3.7 Hz, J4,5=0 Hz)は、このガラクトシドがβ-ピラノシドであることを示している。ガラクトシドの結合はNOE差スペクトルによって決定された。Gal H1への照射により、強いNOE（相互作用）がXyl H-4, GalH-3及びGal H-5位で観測され、また Xyl H-4への照射により、Gal H-1（スペクトル）が強く増加された。これらのことから、生成物の構造はGalβ1-4Xylβ1-p-Nph（Eur.J.Biochem.,247(3),1083-90 (1997)）であることが示された。
【００８６】
＜３＞グリコサミノグリカン欠損変異細胞におけるクローン化XGalT-1によるグリコサミノグリカン合成の回復
本発明の酵素が、in vivoにおいてグリコサミノグリカンの生合成に関わっていることを確認するために、変異CHO細胞 pgsB-761（ガラクトース転移酵素Ｉ-欠損）に、pMIKneo-XGalT-1を一過性に導入（トランスフェクト）した。そのトランスフェクト細胞を、ヘパラン硫酸に特異的なHepSS-1モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで分析した。
【００８７】
2×106個のCHO pgsB-761細胞を10cmディッシュにまき、翌日、45μlのLipofectamineTM試薬（Life Technologies, Inc.）を用い、その試薬の説明書に従って10μgのプラスミドDNAをトランスフェクトした。３日後、細胞を0.5mM EDTAおよび0.25％トリプシンを含有するPBSではがし、約1×106個の細胞を、1:25に希釈したHepSS-1モノクローナル抗体（40μg/ml）と共に、氷中で30分間インキュベートした。２回洗浄した後、1:200に希釈した、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合ヤギ抗マウスIgM(μ鎖特異的)(Zymed Laboratories)で細胞を染色した。氷中で30分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、Cell QuestTMバージョン3.1fソフトウエアを用いたFACSCalibur(Becton Dickinson)によって解析した。
【００８８】
その結果、約50%の細胞がモノクローナル抗体HepSS-1によって染色されるが、偽遺伝子(mock)を導入した細胞は陰性であった（図３）。このことは、本発明のＤＮＡは、グリコサミノグリカン鎖形成を促進するガラクトース転移酵素Ｉをコードする遺伝子であることを示している。
【００８９】
＜４＞各種組織におけるXGalT-1遺伝子の発現の解析
XGalT-1の遺伝子発現を解析するために、cDNAの全長フラグメントをプローブとして使い、ノーザンブロット解析を行った。
【００９０】
Human Multiple Tissue Northern BlotTM（Clontech Laboratories）を用い、その説明書に従って、ゲル精製した[α-32P]dCTP-標識XGalT-1 cDNA、またはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH)をプローブとして、各種ヒト成人組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）由来のポリA+ RNAに対してノーザンブロッティングを行った。ブロットをイメージングプレートに露出させ、BAS2000イメージングアナライザー(富士写真フィルム)で解析した。
【００９１】
その結果、XGalT-1遺伝子は、調べた限りの全てのヒト組織に発現しており、1.8 kbの転写産物（mRNA）が検出された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明酵素は、プロテオグリカンやグリコサミノグリカンの製造ツールとして有用である。本発明ＤＮＡは、本発明ポリペプチドの大量調製ツールとして有用である。また、本発明酵素の遺伝子異常や発現が低下した疾患患者への遺伝子治療への応用も期待される。
【００９３】
本発明の組換えベクターは、本発明酵素の大量調製ツール、遺伝子治療等に有用である。また、本発明の形質転換細胞は、本発明酵素の大量調製ツールとして有用である。
【００９４】
【配列表】
0004377987.tif 000003
【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトガラクトース転移酵素（XGalT-1）タンパク質のハイドロパシープロット。
【図２】  本発明の酵素標品のプロトン核磁気（1H NMR）共鳴スペクトルを示す図。
Ａ：クローン化されたcDNA産物によって調製された生成物の構造。
Ｂ：ガラクトース残基およびキシロース残基について測定した1H ケミカルシフト(ppm)および1H-1Hカップリング定数(Hz)を要約して示す。
【図３】  XGalT-1発現ベクターでトランスフェクトしたCHO変異株pgsB-761細胞のフローサイトメトリー分析を示す図。薄い線はモノクローナル抗体を用いた結果を、実線は対照を示す。
Ａ：CHO-K1細胞（陽性対照）
Ｂ：pgsB-761細胞（陰性対象）
Ｃ：cDNAを含まないベクターMIKneoを導入したXGalT-1欠損CHO変異株pgsB-761細胞。
Ｄ：XGalT-1 cDNAを含むpMIKneoを導入したpgsB-761細胞。
【図１】
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【図２】
0004377987.tif 000018
【図３】
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