(57)【要約】  本発明は、操作されてpH感受性抗原結合を示す抗TNFa抗体に関する。本発明は、好ましくは抗TNFa抗体アダリムマブ（Humira(商標))又はその生物学的に活性な変種及びフラグメントに関し、この場合、本来のアダリムマブ抗体又はその変種若しくはフラグメントは、当該可変領域内のアミノ酸配列の改変によって操作される。具体的には、本発明は、1つ以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基によって置換することによってCDRドメインが改変される、アダリムマブ又はその生物学的に活性な変種若しくはフラグメントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体アダリムマブの軽鎖及び重鎖可変領域又は同じ若しくは同様の生物学的活性を有するその変種を含む、pH依存性抗原結合を示すヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、当該軽鎖及び/又は重鎖可変領域のCDRドメインの少なくとも1つが前記CDRドメイン内の1つ以上のアミノ酸のヒスチジン残基による置換によって変異されることによって、バイオレイヤー干渉分光法（Octet Red）で測定して、非変異アダリムマブのそれぞれの抗原解離速度（Kdis）pH6/pH7比と比較して少なくとも5倍高いKdis速度比のpH依存性抗原結合を引き出した変異アダリムマブ又はアダリムマブ変種が生成されている、前記ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
当該変異抗体又はその抗原結合フラグメントが低下した抗原結合親和性を有し、前記親和性が非変異アダリムマブの結合親和性の少なくとも1%である、請求項１に記載の変異アダリムマブ。
【請求項３】
以下から成る群から選択されるCDR3重鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
VSYHSTASSLDY（配列番号:12）、
VSYLSTAHHLDY（配列番号:13）、
VSYHSTAHHLDY（配列番号:14）、
VHYHSTASSLDY（配列番号:31）。
【請求項４】
以下から成る群から選択されるCDR1軽鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
RASQGIRNHLA（配列番号:15）、
RASQGIRNHHA（配列番号:16）。
【請求項５】
以下から成る群から選択されるCDR2軽鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
AAHTLQS（配列番号:32）。
【請求項６】
以下から成る群から選択されるCDR3軽鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
HHYHRAPYT（配列番号:17）、
QHYHRAPYH（配列番号:18）、
QRHNRAPYT（配列番号:38）。
【請求項７】
以下を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
請求項３に記載のCDR3重鎖配列、及び
請求項４に記載のCDR1軽鎖配列。
【請求項８】
以下を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
請求項３に記載のCDR3重鎖配列、及び
請求項６に記載のCDR3軽鎖配列。
【請求項９】
以下を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
請求項３に記載のCDR3重鎖配列、
請求項５に記載のCDR2軽鎖配列、及び
請求項６に記載のCDR3軽鎖配列。
【請求項１０】
以下を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
請求項３に記載のCDR3重鎖配列、
請求項４に記載のCDR1軽鎖配列、及び
請求項６に記載のCDR3軽鎖配列。
【請求項１１】
以下から成る群から選択される可変軽鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
（i）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:28）、
（ii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:29）、
（iii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQH YHRAPYHFGQ GTKVEIK（配列番号:30）、
（iv）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:33）、
（v）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNHAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:34）、
（vi）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:35）、
（vii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR HNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:36）、
（viii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA AHTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:37）。
【請求項１２】
以下から成る群から選択される可変重鎖配列を含む、請求項１又は２に記載の変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント：
（i）EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:25）、
（ii）
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:26）、及び
（iii）
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVH YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:39）。
【請求項１３】
請求項１１に記載の可変軽鎖配列及び請求項１２に記載の可変重鎖配列を含む、変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒト抗体アダリムマブの軽鎖及び重鎖可変領域又は同じ若しくは同様の生物学的活性を有するその変種を含む、pH依存性抗原結合を示すヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、当該軽鎖及び/又は重鎖可変領域のCDRドメインの少なくとも1つが、前記CDRドメイン内の1つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することによって変異されることによって、顕著なpH依存性抗原結合を引き出した変異アダリムマブが生成されており、前記変異アダリムマブが、可変重鎖配列、EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:25）、及び可変軽鎖配列、DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:27）を含む、前記ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ヒト抗体アダリムマブの軽鎖及び重鎖可変領域又は同じ若しくは同様の生物学的活性を有するその変種を含む、pH依存性抗原結合を示すヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、当該軽鎖及び/又は重鎖可変領域のCDRドメインの少なくとも1つが、前記CDRドメイン内の1つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することによって変異されることによって、顕著なpH依存性抗原結合を引き出した変異アダリムマブが生成されており、前記変異アダリムマブが、可変重鎖配列、EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:26）、及び可変軽鎖配列、DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:28）、又は可変軽鎖配列、DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:29）を含む、前記ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
配列番号:11によって規定されるヒト重鎖IgG1定常領域を含む、請求項１−１５のいずれか1項に記載のヒト抗体。
【請求項１７】
前記IgG1定常領域のFc部分が1つ以上のアミノ酸の位置で変異されて、改変されたFcRn結合を示す各抗体を生じている、請求項１６に記載のヒト抗体。
【請求項１８】
ヒトカッパ定常領域を含む、請求項１６又は１７に記載の完全なヒト抗体。
【請求項１９】
細胞傷害性化学薬剤に直接的若しくは間接的に連結され、又はサイトカインと組換えにより融合された、請求項１−１８のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、抗体-薬剤複合物。
【請求項２０】
請求項１−１８のいずれか1項に記載のヒト抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１９に記載の抗体-薬剤複合物若しくは抗体サイトカイン融合タンパク質を、医薬的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤とともに含む、炎症疾患、自己免疫疾患又は癌疾患の治療に適切な医薬組成物。
【請求項２１】
TNFa誘発炎症疾患、自己免疫疾患又は癌疾患の治療用医薬の製造で使用される、請求項１−１８のいずれか1項に記載のヒト抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１９に記載の抗体-薬剤複合物若しくは抗体サイトカイン融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は操作されてpH感受性抗原結合を示す抗TNFa抗体に関する。好ましくは、本発明は抗TNFa抗体アダリムマブ（Humira(商標)）又はその生物学的に活性な変種及びフラグメントを対象とし、ここで、本来のアダリムマブ抗体又はその変種若しくはフラグメントは当該可変領域内のアミノ酸の改変によって操作される。特に本発明はアダリムマブ又はその生物学的に活性な変種若しくはフラグメントに関し、当該CDRドメインは、１つ以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基によって置換することによって改変される。得られた改変抗TNFa抗体は、抗原媒介IgGクリアランスの改善及び総血清半減期の延長を示す改善された薬物動態特性を引き出す。
【背景技術】
【０００２】
抗体薬（mAb）は、多くの疾患（例えば炎症疾患、自己免疫疾患又は腫瘍学系疾患）に対して少なくとも重要な治療選択肢を提供すると考えられている。2012年には、腫瘍学及び抗炎症性疾患の多様な標的に対して米国市場ではFDAが承認する40のmAbが存在し、生物製剤市場の約38.5%のシェアを占めた。約246億ドルの売上げは、全生物製剤で最高収益に分類される抗体薬の役割を証明している（Aggarwal, 2009, Aggarwal, 2014）。
抗体薬に関して、種々の生物学的成果は、天然に存在する4つのクラスの相互作用パートナー（抗原、胎児性Fc受容体（FcRn）、Fc受容体（FcγR）、及び補体系因子）との相互作用プロフィールによって決定される（Chan and Carter, 2010）。機能及び特異性の追加または改善を目指す抗体の最適化のためにいくつかの方法が報告されている（Beck et al, 2010）。抗体内部には操作に委ねることができる2つの構造的特色が存在する。第一に、抗原との相互作用を媒介する可変領域（Fv）、第二に抗体リサイクルに必要な又は免疫細胞との相互作用を媒介する定常フラグメント（Fc）である。
種々の抗原（例えばサイトカイン及び増殖因子）に対して多数の作用メカニズムが存在し、例えば可溶性リガンドを遮断しそれによってそれぞれの受容体との相互作用を妨害するか、又は受容体そのものを遮断する（Chan and Carter, 2010）。それぞれの抗原に対する特異性及び結合親和性の向上によってしばしば評価されるFv操作を目指し機能の改善に多くの努力が注ぎ込まれた（Beck et al, 2010）。抗体の有効性を高める1つの方法は、親和性成熟によってFv-抗原相互作用を強化することである。ここでは、分子ライブラリーをスクリーニングするディスプレー技術の使用が優れた親和性を示す変種の単離を可能にする。
【０００３】
定常フラグメント（Fc）及びその連結物を調整して、免疫又は抗体リサイクルの成果を改変することができる。改変Fcにより媒介される免疫機能のよくある例は、抗体の有効性の強化及び投薬量の軽減のための取り組みである、抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）及び補体依存細胞傷害（CDC）の強化である。
さらに別の方法が探求され、前記には抗体の直接的若しくは間接的武装又は多価抗体の特異性の調整が含まれる（Carter 2011）。
Fc機能の重要な1つの局面は、ヒト免疫グロブリン1（IgG1）の長期血清半減期を決定する抗体リサイクルにおけるその決定的役割と合致する。液相ピノサイトーシスによる細胞吸収後に、IgG1のFc部分はpH依存態様で胎児性Fc受容体（FcRn）と相互作用し、前記受容体は酸性化エンドソーム内の抗体捕捉をもたらす（Kuo and Aveson, 2011）。そこから、抗体はリサイクルされて循環に戻り、したがって細胞内異化作用から防御されうる。3アミノ酸の置換によって、FcRn結合親和性が強化された種々の変異Fc種が生成され、カニクイザルの実験で血清半減期が4倍まで延長したリサイクル率増加について試験された（Dall’Acqua et al, 2006）。
大半の抗体は高度に効率的な抗原遮断を示すが、抗体薬の開発プロセスには以下のように十分に対処できない欠点が存在する。：
−多くの抗体薬で、血漿中でのその寿命の間に抗原結合部位はただ1つの抗原分子としか結合しない（Igawa et al, 2010）。
−抗原は通常in vivoで持続的に産生されるので、抗体注射の用量及び頻度は2つの注射の間の抗原合成速度に左右される（Igawa et al, 2010）。
−高い抗体製造コスト及び大量の投与（トシリクマブ治療：8mg/kg/月（i.v.）（Maini et al, 2006）；アダリムマブ療法：2週間毎に40mg（19,272ドル/人/年（Schabert et al. 2013）。
−抗体が可溶性標的と結合するときは“抗体バッファリング”作用が生じ、当該抗原が結合している間は抗原の分解が妨げられる。遊離抗原プールが抗原-抗体複合体の可逆的解離から定着し、したがってin vivo永続性を長期化させる（O'Hear and Foote, 2005；Finkelman et al, 1993）。
【０００４】
抗体薬のこれらの欠点を考慮すると、高用量及び/又は頻繁な投与を必要としないで治療応答をもたらすより有効な分子が希求される（Chapparo-Riggers et al, 2012）。
このような目標を達成するための1つの可能性は、新規な又は十分に確立され承認されている抗体の可変領域及び場合によって定常領域の特異的操作である。1つのアプローチは、pH感受性抗原結合を示す抗体の開発である。抗体と他のタンパク質との結合境界面におけるヒスチジンの合理的或いはコンビナトリアルな取り込みは、pH依存性結合の操作に一般的に用いうることが示された（Sarkar et al., 2002；Chaparro-Riggers et al., 2012；Ito et al., 1992；Igawa et al., 2010；Igawa et al., 2013；Murtaugh et al., 2011；Gera et al., 2012）。pH感受性結合の根拠は、ミクロ環境における低pH値の結果としてプロトン化されるヒスチジンの感受性から生じる。詳しく言えば、ヒスチジンは、生理学的pH範囲でプロトン化されるために結合に際してpKaの変化を受ける必要がある（Murtaugh et al., 2011）。結合境界面でのヒスチジン側鎖のプロトン化は静電気的相互作用を変化させるか、又は結合親和性におけるpH依存性相違をもたらす立体配座の変化を誘引しうる（Gera et al., 2012）。結合平衡の安定した静電気的及び非静電気的成分は結合感受性を決定する（Murtaugh et al., 2011）。
【０００５】
抗原結合部位へのpH感受性の取り込みは抗原結合サイクル数を増加させることができる。これに関して、pH依存性抗体は、血漿pH（pH7.4）において同様に高い又は低い十分な親和性でそれらの抗原と結合し、さらに酸性pH（pH6）では結合の低下を示し（Chaparro-Riggers et al., 2012；Igawa et al, 2010）、酸性エンドソーム内ではその抗原結合部位からより迅速でかつ増強された当該抗体の解離を生じ、それによって血漿へ戻るリサイクル及び抗原媒介クリアランスの低下を可能にする。
可溶性標的と結合する通常の抗体のFcRn媒介リサイクルでは（図1a）、抗体-抗原複合体は、エンドソームトラフィッキング経路（Roopenian and Akilesh, 2007）によりリサイクルされて細胞外間隙に戻される。対照的に、pH感受性抗体は、エンドソーム内酸性化（pH＜6.5）の間に抗体-抗原複合体からそれらの抗原を遊離させる（Roopenian and Akilesh, 2007）。結果として、遊離抗体は循環へリサイクルされるが、抗原は分解経路に入る（Chaparro-Riggers et al., 2012, Igawa et al, 2010）。
pH感受性結合は、したがって抗体と別の抗原との相互作用を可能にし、各抗体分子当たり複数の抗原分子の中和を可能にする。pH感受性はまた、例えば受容体結合に際して膜結合標的に対処しこれを内在化させ分解する抗体の半減期を延長することができる。これに関して、pH感受性は、抗体がエンドソーム内酸性化の間に遊離されるときに抗体半減期を延長することができる。
【０００６】
タンパク質のpH切り替え操作を目的とするいくつかの異なる方法が発表された。全ての単一アミノ酸残基（例えばCDR領域内）をヒスチジン（His）に変異させるHisスキャンニングは、単一置換変種の特徴解析及び有効な変異の識別を可能にする。これらの置換を組み合せることによる新規な変種の作出は、pH依存性結合の強化をもたらすことができる（Murtaugh et al., 2011；Chaparro-Riggers et al., 2012；Igawa et al, 2010）。構造に基づくモデリングによってヒスチジンを置換するときpH感受性に寄与することができる残基を識別することは、ヒスチジンスキャンニング手法で必要な労力及び時間を最小限にするために役立ちうる。結合及びpH切り替えの合理的設計に重要な残基の正確な着想を得るために、結晶構造が要求される（Sarkar et al., 2002）。大きな分子ライブラリーからpH感受性変種を単離するためには、コンビナトリアルヒスチジンスキャンニングライブラリーの手法は、in vitroスクリーニング技術（例えばファージディスプレー又は酵母ディスプレー）を必要とする。Murtaughと共同研究者はラマのVHH抗体ライブラリーを設計した。彼らは、オリゴヌクレオチド指定変異誘導を用い、それによって結合境界面の全ての残基をヒスチジン残基及び親のVHH抗体の野生型残基の両方について調べることを可能にした。M13-ファージディスプレーライブラリー（多様性約1012）のスクリーニングに対して、単離変種は、pH7.4で35−91nMのKD及びpH5.4で結合親和性の約104倍の低下を示した（Murtaugh et al. 2011）。
リサイクルされた遊離抗体は別の抗原と結合することができるので、pH依存性抗原結合は単一抗体分子が繰り返し複数の抗原と結合することを可能にし、ひるがえって、通常のアプローチでは単一抗体は抗原とただ1回結合できるだけである。
したがって、抗体の血漿及び血清濃度に対応してより有効である利用可能な抗体を作製することは普遍的な要望であり、前記は、抗体薬の種々の細胞性作用部位に対応してpH感受性を取り付けることによって達成できる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は抗TNFa抗体アダリムマブ（Humira(商標)）の変異形を提供し、ここで、前記変異は、本来の非変異抗体アダリムマブの重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（CDR）における、当該抗体の1つ以上のアミノ酸残基のヒスチジン残基による置換から成る。アダリムマブのCDRの一部の規定位置へヒスチジン残基を導入することによって、元々の抗体を非変異抗体と比較してはるかにpH感受性又はpH依存性にさせる。興味深いことには、ヒスチジン変異抗体は結合親和性の顕著な低下（KDが10倍以上）を示すが、本発明の変異抗体は、親の非変異バージョンと比較して治療的には顕著に有効であり、抗体投薬量又は抗体投与間隔を軽減させ、したがって治療コストを顕著に減少させる可能性をもたらす。
アダリムマブ又はその生物学的に活性な変種及びフラグメントのCDRの本来のアミノ酸残基を入替えることによる本発明のヒスチジン残基導入の成功は、pH感受性及び結合親和性に関する所望の結果という点では日常的ルール又は観念的考察には合わないことが、本発明によって示された。
したがって、アダリムマブのヒスチジン変異バージョンは、以下の場合には特に治療的に有効であることが見出された：pH依存性抗原結合が、非変異アダリムマブの抗原解離速度（Kdis）pH6/pH7比と比較して5−20倍高い対応するKdis速度比をもたらし、さらに変異アダリムマブの結合親和性が、非ヒスチジン変異アダリムマブの結合親和性の1−25%、好ましくは1−15%、より好ましくは2-12%である。
【０００８】
したがって、本発明は、pH依存性抗原結合を有し、ヒト抗体アダリムマブ又は同じ若しくは同様の生物学的活性を有するその変種の軽鎖及び重鎖可変領域を含むヒト抗TNFa抗体を提供し、ここで、当該軽鎖及び/又は重鎖可変領域のCDRドメインの少なくとも1つは、前記CDRドメイン内の1つ以上のアミノ酸のヒスチジン残基による置換によって変異され、それによい変異アダリムマブ又はアダリムマブ変種を生じ、前記は、バイオレイヤー干渉分光法（Octet Red）又は他の同等な方法で測定したとき、非変異アダリムマブのそれぞれの抗原解離速度（Kdis）pH6/pH7比と比較して少なくとも5、10、15又は10倍高いKdis速度比のpH依存性抗原結合を引き出されている。
さらに別の実施態様では、本発明はそれぞれの変異アダリムマブを提供し、ここで当該変異抗体又はその抗原結合フラグメントは抗原結合親和性の低下を有し、低下は、非変異アダリムマブの結合親和性の好ましくは1−15%、それぞれ1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%又は15%である。
本発明はアダリムマブから派生したヒト抗TNFa抗体を提供し、ここで、親のアダリムマブのCDR内の1つ以上の本来のアミノ酸残基はヒスチジン残基によって置換されていた。興味深いことに、アダリムマブの最も有効なヒスチジン変異バージョンは、可変軽鎖内、特に軽鎖のCDR1及びCDR3ドメインにヒスチジン変異を含む。好ましいヒスチジン変異アダリムマブバージョンは、さらに別の又は単独でヒスチジン変異CDR3重鎖を含む。
【０００９】
したがって、本発明は、以下から成る群から選択されるCDR3重鎖配列を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントを提供する：
VSYHSTASSLDY（配列番号:12）
VSYLSTAHHLDY（配列番号:13）
VSYHSTAHHLDY（配列番号:14）
VHYHSTASSLDY（配列番号:31）、及び
VX1YX2STAX3X4LDY（配列番号:40）（式中X1はS又はHであり、X2はL又はHであり、X3はS又はHであり、さらにX4はS又はHであり、ここで少なくともX1又はX2又はX3又はX4はHである）。
【００１０】
本発明は、さらに以下から成る群から選択されるCDR3軽鎖配列を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントを提供する：
HHYHRAPYT（配列番号:17）
QHYHRAPYH（配列番号:18）
QRHNRAPYT（配列番号:38）
X1HYHRAPYX2（配列番号:19）（式中、X1はQ又はHであり、さらにX2はT又はHである）、
X1X2X3X4RAPYX5（配列番号:41）（式中、X1はQ又はHであり、X2はR又はHであり、X3はY又はHであり、X4はN又はHであり、さらにX5はT又はHであり、ここで少なくともX1又はX2又はX3又はX4又はX5はHである）。
【００１１】
本発明は、さらに以下から成る群から選択されるCDR1軽鎖配列を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントを提供する：
RASQGIRNHLA（配列番号:15）
RASQGIRNHHA（配列番号:16）
RASQGIRNX1X2A（配列番号:42）（式中、X1はY又はHであり、X2はL又はHであり、ここで少なくともX1又はX2はHである）。
【００１２】
本発明は、さらに以下から成る群から選択されるCDR2軽鎖配列を含む変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントを提供する：
AAHTLQS（配列番号:32）。
本発明のある実施態様では、ヒスチジン変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントは、上記及び特許請求の範囲に規定するCDR3重鎖配列、並びに上記及び特許請求の範囲に規定するCDR1軽鎖配列を含む。
本発明のさらに別の実施態様では、ヒスチジン変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントは、上記及び特許請求の範囲に規定するCDR3重鎖配列及びCDR3軽鎖配列を含む。
本発明のさらに別の実施態様では、ヒスチジン変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントは、上記及び特許請求の範囲に規定するCDR3重鎖配列、CDR2軽鎖配列、及びCDR3軽鎖配列を含む。
本発明の別の実施態様では、ヒスチジン変異アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントは、上記及び特許請求の範囲に規定するCDR3重鎖配列、CDR1軽鎖配列、及びCDR3軽鎖配列を含む。
【００１３】
本発明者らは、ヒスチジン変異アダリムマブの好ましいバージョンは以下の軽鎖可変領域の1つを含むことを見出した：
（i）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:28）；
（ii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:29）；
（iii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQH YHRAPYHFGQ GTKVEIK（配列番号:30）；
（iv）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:33）；
（v）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNHAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:34）；
（vi）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:35）；
（vii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR HNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:36）；
（viii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA AHTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:37）；
（ix）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHX1AWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:20）（式中、X1はL又はHである）；
（x）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCX1H YHRAPYX2FGQ GTKVEIK（配列番号:21）（式中、X1はL又はHであり、さらにX2はT又はHである）；
（xi）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCHH YHRAPYX1FGQ GTKVEIK（配列番号:22）（式中、X1はT又はHである）；
（xii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCX1H YHRAPYHFGQ GTKVEIK（配列番号:23）（式中、X1はQ又はHである）；
（xiii）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHX1AWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCX2H YHRAPYX3FGQ GTKVEIK（配列番号:24）（式中、X1はL又はHであり、さらにX2はQ又はHであり、さらにX3はT又はHである）；
（xiv）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NX1X2AWYQQKP GKAPKLLIYA AX3TLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCX4X5 X6X7RAPYX8FGQ GTKVEIK（配列番号:43）（式中、X1はY又はHであり、X2はL又はHであり、X3はS又はHであり、X4はQ又はHであり、X5はR又はHであり、X6はY又はHであり、X7はN又はHであり、X8はT又はHであり、ここで少なくともX1又はX2又はX3又はX4又はX5又はX6又はX7又はX8はHである）。
【００１４】
本発明者らはさらに、ヒスチジン変異アダリムマブの好ましいバージョンは以下の重鎖可変領域の1つを含むことを見出した：
（i）EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:25）；
（ii）
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:26）；
（iii）
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVH YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:39）；
（iv）
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVX1 YX2STAX3X4LDY WGQGTLVTVS S（配列番号:44）（式中、X1はS又はHであり、X2はL又はHであり、X3はS又はHであり、X4はS又はHであり、ここで少なくともX1又はX2又はX3又はX4はHである）。
本発明の好ましいヒスチジン変異アダリムマブは、上記に規定の可変軽鎖のいずれか、及び上記に規定の可変重鎖ドメインのいずれか1つを含む。
【００１５】
本発明の第一の好ましい実施態様は、それぞれヒスチジン変異に付された、以下を含むアダリムマブである：
重鎖配列：EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:25）、
及び
軽鎖配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:27）。
【００１６】
本発明の第二の好ましい実施態様は、それぞれヒスチジン変異に付された、以下を含むアダリムマブである：
重鎖配列：EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:26）
及び
軽鎖配列：DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:28）。
【００１７】
本発明の第三の好ましい実施態様は、それぞれヒスチジン変異に付された、以下を含むアダリムマブである：
重鎖配列：EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:26）
及び
軽鎖：DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQH YHRAPYHFGQ GTKVEIK（配列番号:29）。
【００１８】
ヒスチジン変異アダリムマブ抗体又はその変種若しくはフラグメントはさらに、ヒト重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含むことができる。
ある実施態様では、それらは、ヒトIgG、好ましくはヒトIgG1（例えば配列番号:11によって規定される）又はIgG2重鎖定常領域を含む。
本発明の別の実施態様では、それらは、ヒトカッパ軽鎖定常領域を含む。
本発明の別の実施態様では、本発明のヒスチジン変異アダリムマブバージョンは、ヒト重鎖定常領域、好ましくはIgG1を含み、この場合、当該Fc部分は、本来のアミノ酸残基の他の天然アミノ酸残基（当該抗体とFcRnとの結合を媒介する（増加又は低下させる））による置換によって1つ以上のアミノ酸の位置で変異されている。
本発明のヒスチジン変異アダリムマブ抗体を、他のポリペプチド又はタンパク質（例えばサイトカイン）と組換え体融合によって結合させるか、又は化学物質（例えば細胞傷害性実体）と化学的連結によって（好ましくはリンカー分子を介して）結合させて抗体-薬剤-複合物（ADC）を形成することができる。そのような抗体融合タンパク質又は抗体薬剤複合物を生成する技術及び方法は、当業界で良く確立されている。
【００１９】
本発明はまた、炎症疾患、自己免疫疾患又は癌疾患の治療に適切な医薬組成物を提供し、前記は、ヒスチジン変異抗TNFa抗体アダリムマブ又はその変種若しくは抗原結合フラグメント、又はそれぞれの抗体-薬剤複合物若しくは抗体サイトカイン融合タンパク質を医薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む。
最後に本発明は、そのようなヒスチジン変異アダリムマブ又はその生物学的に有効でかつ活性を有する変種若しくはフラグメント、又はそのADC若しくは融合タンパク質の、TNFa誘発炎症疾患、自己免疫疾患又は癌疾患治療用医薬の製造のための、下記に詳細に規定する使用を提供する。
【００２０】
本発明のヒスチジン変異アダリムマブバージョンは以下の有益な特性及び機能を示す：
−アダリムマブ結合部位は、TNFα-結合に際しもはや長期にわたって遮断されない；
−アダリムマブは標的抗原との顕著に改善されたpH感受性結合を示す。
−sTNFαは、FcRnを介するリサイクル中に、酸性化エンドソーム内でヒスチジン変異アダリムマブによってはるかに効率的に遊離させることができる。
−膜結合標的（mTNFα）との結合に際して、抗体の排除につながるmTNFα-アダリムマブ複合体の受容体媒介内在化及びリソソーム分解の開始を回避し又は低下させることができる。
−pH依存性標的結合を示すTNFα結合抗体の薬物動態の改善。
−pH感受性抗体変種は、親抗体の可変領域内のアミノ酸配列を改変することによって当該親アダリムマブから誘導される。
−pH感受性のアダリムマブへの取り込みは、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸のヒスチジンによる置換によって確立される。
−アダリムマブのpH感受性は、親アダリムマブのpH6/pH7.4における動態パラメーター（KD、Kdis）間の比率と比較したときその比率増加と一致する。
−これに関して、本発明のアダリムマブ抗体は当該抗原を複数回中和することができる。
−したがって、治療効果を延長でき、当該抗体の投与頻度の軽減及び/又は低用量投与が許容されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】可溶性抗原の結合におけるa）通常の抗体とb）pH依存性抗体の提唱されている相違（イガワらの文献（Igawa et al., 2010）から改変）。
【図２】アダリムマブの可変領域のアミノ酸配列。相補性決定領域は赤色の枠で強調されている。a）重鎖の可変領域（VH）。b）軽鎖の可変領域（VL）。
【図３】親VHとアラインメントされた7つの固有のVH変種のタンパク質配列。固有配列は、重鎖ライブラリーアプローチから3ラウンドのスクリーニング後に単離された。親VH配列が一番上に示され、親VHと異なる残基は変種毎に強調されている。
【図４Ａ】親VLと38の固有のVL変種（軽鎖ライブラリーから3ラウンドのスクリーニング後に単離）のタンパク質配列アラインメント（1−3パーツ）の第一のパーツ。親VL配列が一番上に示され、親VLと異なる残基は変種毎に強調されている。
【図４Ｂ】親VLと38の固有のVL変種（軽鎖ライブラリーから3ラウンドのスクリーニング後に単離）のタンパク質配列アラインメント（1−3パーツ）の第二のパーツ。親VL配列が一番上に示され、親VLと異なる残基は変種毎に強調されている。
【図４Ｃ】親VLと38の固有のVL変種（軽鎖ライブラリーから3ラウンドのスクリーニング後に単離）のタンパク質配列アラインメント（1−3パーツ）の第三のパーツ。親VL配列が一番上に示され、親VLと異なる残基は変種毎に強調されている。
【図５】アダリムマブ及びrhTNFαとのpH依存性結合を示す3変種のOctet Redセンサーグラム。結合は、pH7.4で0.26nM−2nMの範囲のrhTNFα濃度で実施され、解離はpH7.4で実施された。カイネティクス結合定数は、Octet 8.0ソフトを用いてグローバルフィッティングにより決定された。
【図６】アダリムマブ及びpH依存性結合を示す3変種のOctet Redセンサーグラム。結合は、pH7.4で0.26nM−2nMの範囲のrhTNFα濃度で実施され、解離はpH6で実施された。オフレートは、Octet 8.0ソフトを用いてグローバルフィッティングによりPSV#1、PSV#2及びPSV#3について決定された。アダリムマブのオフレートはグローバルフィッティングを用いることによって得られた。
【図７】アダリムマブ及びpH依存性結合を示す3変種（PSV#1、PSV#2、PSV#3）のOctet Redセンサーグラム。アダリムマブはrhTNFαの迅速な結合を示し、pH6の解離工程中には強固な結合を維持する。対照的に、pH依存性結合変種は、pH6の解離工程中のrhTNFαの迅速な遊離後にはpH7.4で可逆的rhTNFα結合を示す。13nMのrhTNFαとの結合は200秒間測定され、解離は400秒間実施された。2回の結合サイクルの後で、最後の解離工程はpH7.4で実施され、より遅いrhTNFαの遊離を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
腫瘍壊死因子α（TNFα）：
TNFαはサイトカインであり、前記は、例えばいくつかの細菌感染に対して防御応答を開始することによって免疫応答で中心的役割を果たす。前記は正常な炎症では複雑なネットワークで機能し、さらにまた類リンパ組織の発達に必要とされる（Tracey et al., 2008）。
多くの異なる細胞がTNFαを産生し、いくつかを列挙すれば、マクロファージ、T細胞、マスト細胞及び顆粒球が含まれる。TNFαは、可溶性（sTNF）及びトランスメンブレンTNFα（mTNFα）を含む包括的用語である。メタロプロテアーゼTNF-アルファ-変換酵素（TACE）によるトランスメンブレンTNFα（26kDaのモノマーのホモトリマー）のタンパク分解切断後に、可溶性のホモトリマーが細胞によって放出される（Wajant et al., 2003）。両形態（sTNFα又はmTNFα）は、2つの別個の受容体、TNF受容体1（TNFR1）及びTNF受容体2（TNFR2）と相互作用する。両受容体はそれらの細胞内発現プロフィール及びシグナリングメカニズムが相違する。相互作用ネットワークの複雑度は、mTNFαそれ自体が両TNF受容体のリガンド又は受容体のどちらかとして作用できるとき増大する（Wajant et al., 2003）。
病的状態の間にTNFαの発現が高まれば、罹患区画内の慢性炎症及び発症に至りうる下流のメカニズムが惹起及び媒介される（Tracey et al., 2008）。自己免疫疾患におけるTNFα活性の共通の結果は、免疫細胞の補充の調整、細胞増殖、細胞死及び免疫調節である。他の作用、例えばマトリックス分解及び破骨細胞形成はより疾患特異的であり、当該罹患組織の異なる細胞タイプと関係しうる（Tracey et al., 2008（概説）；Choy & Panayi, 2001；Feldmann, 2002；Schottelius et al., 2004）。
TNFαは、例えば慢性関節リウマチ、クローン病及び尋常性乾癬の発症事象の調節で特に重要な役割を有し、さらに他のサイトカイン（例えばIL-1β及びIL-6）を迅速に誘発する（Tracey et al., 2008）。いくつかの炎症性自己免疫疾患で、抗TNFα抗体薬によるTNFα遮断におけるプラスの臨床応答成果は、過剰なTNFα暴露と疾患の発症との間のつながりを裏付けた（Aggawal, 2003；Tracey et al., 2008）。
【００２３】
アダリムマブ：
アダリムマブ（その商品名HUMIRA(商標)でも知られている）はTNFαに対する完全にヒトの148kDa IgG1カッパモノクローナル抗体であり、前記は最初ファージディスプレーによって開発された（Abbott Laboratories, 2014）。2002年の市場投入から、アダリムマブは2012年の米国市場では46億ドルに達する巨大な取引を達成した（Aggarwal, 2014）。アダリムマブは、ナノモルに近い高親和性でTNFαと結合し、それによってTNFαとp55及びp75細胞表面受容体（TNFR1及びTNFR2）との相互作用を遮断する（Abbott Laboratories, 2014）。
アダリムマブはまたmTNFαと高親和性で結合するので、さらに別の作用態様は、逆シグナリングメカニズムでのアポトーシス又はサイトカイン抑制及びCDC又はADCC媒介細胞殺滅を含む（以下で概説されている：Tracey et al., 2008；及びHoriuchi et al, 2010）。
アダリムマブ（及びその変種）のアミノ酸配列並びにその薬理学的特性及び治療特性は例えばWO 97/029131に開示されている。
【００２４】
アダリムマブの完全な軽鎖配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC（配列番号:1）
アダリムマブ軽鎖配列、可変領域（VL）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK（配列番号:2）
アダリムマブVL CDR1配列：
RASQGIRNYLA（配列番号:3）
アダリムマブVL CDR2配列：
AASTLQS（配列番号:4）
アダリムマブVL CDR3配列：
QRYNRAPYT（配列番号:5）
【００２５】
アダリムマブの完全な重鎖配列：
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K（配列番号:6）
アダリムマブ重鎖配列、可変領域（VH）：
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS S（配列番号:7）
アダリムマブVH CDR1配列：
DYAMH（配列番号:8）
アダリムマブVH CDR2配列：
AITWNSGHIDYADSVEG（配列番号:9）
アダリムマブVH CDR3配列：
VSYLSTASSLDY（配列番号:10）
【００２６】
アダリムマブヒト重鎖IgG1定常領域：
ASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K（配列番号:11）            
【００２７】
アダリムマブは、いくつかの医療処置（例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及びクローン病）のために多くの国で承認されている。
したがって、本発明のヒスチジン変異アダリムマブバージョンはまた、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及びクローン病の治療に適用できるが、TNFaによって誘発又は惹起される他の疾患の治療にもまた適用しうる。後者には自己免疫疾患の他に癌疾患が含まれうる。
【００２８】
抗体の選別：
本発明のアダリムマブの適切なTNFα抗体バージョン及びそのフラグメントの選別は、当業界で良く確立された公知の方法及び技術によって、例えばファージディスプレーライブラリーによるヒスチジン置換によって、又は酵母表面ディスプレーによるコンビナトリアルヒスチジン置換ライブラリーから達成できる。詳細は実施例のセクションで提供される。
【００２９】
用語、定義、詳細
“抗体”又は“免疫グロブリン”という用語は本発明にしたがってもっとも広い意味で用いられ、特に、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成される多価抗体（例えば二特異性抗体）、及び抗体フラグメント（それらが所望の生物学的活性を有する限り）をカバーする。それらの定常領域のアミノ酸配列に応じて、無傷の抗体又は全抗体を種々のクラスに割り当てることができる。無傷の抗体には5つの主要なクラス（IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM）が存在し、これらのうちのいくつかは、さらに“サブクラス”（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類することができる。本発明の抗体について好ましい主要なクラスはIgGであり、より詳細にはIgG1及びIgG2、もっとも好ましくはIgG1である。
本発明の“抗体フラグメント”は無傷の抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例にはFab、Fab’、F(ab’)2、Fv及びFcフラグメント、ジアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成される二特異性及びマルチ特異性抗体が含まれる。
本発明の“全又は完全な”抗体は、抗原結合可変領域の他に軽鎖定常ドメイン（CL）及び重鎖定常ドメイン（CH1、CH2及びCH3）を含む抗体である。
【００３０】
本発明の抗体の“Fc”領域は、IgG1又はIgG2抗体主要クラスの原則としてCH2、CH3及びヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、CH1領域をCH2-CH3領域とともに束ねる約15アミノ酸残基の一団である。
“Fab”フラグメントはまた軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（CH1）を含み、ただ１つの抗原結合部位を有する。
“Fab’”フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されていることによりFabフラグメントと異なり、前記付加は当該抗原のヒンジ領域に由来する1つ以上のシステイン残基を含む。
本発明の“F(ab’)2”抗体はFab’フラグメント対として生成され、前記は当該フラグメント間にヒンジシステインを有する。
本発明の“単鎖Fv”又は“scFv”抗体フラグメントは抗体のV及びVドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖として存在する。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに当該VH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、前記リンカーはscFvが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。
本発明の抗体の“可変ドメイン”は、フレームワーク領域（通常はFR1からFR4）の他にCDRドメイン（通常はCDR1、CDR2及びCDR3）（前記は“超可変領域”と称される）を含む。
【００３１】
本明細書で用いられるとき、“超可変領域”又は“CDR”は、抗原結合に必要な抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的には“相補性決定領域”又は“CDR”由来のアミノ酸残基を含む（例えば以下である：軽鎖可変ドメインの残基24−34（L1）、50−56（L2）及び89−97（L3）並びに重鎖可変ドメインの31−35（H1）、50−65（H2）及び95−102（H3）、及び/又は“超可変ループ”由来の残基（例えば軽鎖可変ドメインの残基26−32（L1）、50−52（L2）及び91−96（L3）並びに重鎖可変ドメインの26−32（H1）、53−55（H2）及び96−101（H3））（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987））。
特段の指示がなければ、本発明の抗体分子内のアミノ酸の位置はKabatにしたがって番号が付与される。
“フレームワーク領域”又は“FR”残基は、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本発明の“抗体変種”には、親抗体と比較してアミノ酸配列は改変されているが、標的抗原に対する結合親和性は同じであるか又は変化している抗体が含まれる。抗体変種は、可変ドメイン（CDRドメインを含む）及び/又は抗体の定常領域内の指定の位置の1つ以上のアミノ酸残基の置換又は欠失又は付加により親抗体と異なり、そのために抗体のある種の特性、例えば結合親和性及び/又は受容体機能（例えばADCC、FcRn結合及びその他）が改変される。更なる改変を含まない本発明のヒスチジン変異抗体は、本発明の“抗体変種”とは言わない。本発明の抗体変種は、置換、欠失又は付加されるアミノ酸残基の指定位置に応じて、親抗体と比較して80−99%、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%の配列相同性を示す。アダリムマブの抗体変種は例えば〜に開示されている。
【００３２】
“融合タンパク質”という用語は、上記に規定した1つ以上の生物学的分子から成る天然又は合成分子を指し、この場合、異なる特異性を有する2つ以上のペプチド系又はタンパク質系（糖タンパク質を含む）分子が、場合によって化学的リンカー又はアミノ酸リンカー分子によって一緒に融合される。連結は、C-N融合又はN-C融合（5’−＞3’方向）によって、好ましくはC−N融合によって達成される。本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体又は抗体変種と別のタンパク質又はポリペプチド（好ましくはサイトカイン）との前記の融合である。
本発明によれば“抗体-薬剤複合物（ADC）”という用語は、本発明の抗体（好ましくは完全な抗体）及び好ましくは細胞傷害性化学物質で構成される免疫複合物を指す。前記成分は、特定のリンカーによって互に化学的に結合される。本発明の抗体は、（好ましくはその重鎖定常領域内で）1つ以上のアミノ酸の位置で改変でき、そのために当該リンカーと及び/又は細胞傷害性のペイロード薬剤との適切な連結をもたらすことができる。そのようなADCを生成する方法及び技術は当業界で周知である。
本発明の“Fc受容体”という用語は、液性応答を免疫系の細胞性活性に連携させる免疫グロブリンのFc領域に対する受容体（FcR）を意味する。それら受容体の機能を基準にして、FcRの2つの大まかなグループを以下のように区別することができる：抗体エフェクター機能を引き起こすもっぱら白血球により発現されるものもの、及び上皮細胞表面又は内皮細胞表面を貫通する免疫グロブリンの輸送を主として媒介するもの。ADCCは、標的結合抗体（IgG又はIgA又はIgEクラスに属する）とある種のFc受容体（FcR）との相互作用を介して惹起される。ヒトIgG1を必要とするADCCは、そのFc部分のグリコシル化プロフィール及びFcγ受容体の多形性に大きく左右される。“FcRn”という用語は特定の胎児性Fc受容体を意味し、前記受容体は酸性pH（＜6.5）でIgGと結合するが、中性pH又は中性以上のpHではIgGと結合しない。前記受容体は血清中のIgG抗体の半減期延長に必要である。
【００３３】
“サイトカイン”という用語は、1つの細胞集団によって放出される、細胞間媒介因子として別の細胞に作用するタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモン（例えば血管内皮増殖因子（VEGF）、インテグリン、トロンボポイエチン（TPO）、神経増殖因子（例えばNGFβ）、血小板増殖因子、形質転換増殖因子（TGF）（例えばTGFα及びTGFβ）、エリスロポイエチン（EPO）、インターフェロン（例えばIFNα、INFβ及びIFNγ）、コロニー刺激因子（例えばM-CSF、GM-CSF及びG-CSF）、インターロイキン（例えばIL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12）及びTNF-α又はTNF-β）である。
“生物学的/機能的に有効な”又は“治療的に有効な（量）”という用語は、in vivo又はin vitroで生物学的な機能又は生物学的機能の変化を引き起こし、さらに哺乳動物（好ましくはヒト）の疾患又は異常の治療に指定の量で有効である薬剤/分子を指す。
“医薬的治療”という用語は、当該工程に関して本発明を実施する多様な様式を意味する。例えば、本発明の薬剤は、同時に、連続的に又は別々に投与することができる。さらにまた、当該薬剤は、投与と投与の間に1つ以上の時間間隔内で別々に投与できる。本発明の治療組成物は、生理学的に耐えうる担体を本明細書に記載の適切な薬剤とともに含み、前記薬剤は活性成分として当該組成物内に溶解又は分散されている。
【００３４】
本明細書で用いられているように、“医薬的に許容できる”という用語は、望ましくない生理学的作用（例えば吐き気、めまい、胸やけなど）を生じることなく哺乳動物に投与できる物質である組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。その中に溶解又は分散された活性成分を含む薬理学的組成物の調製は当業界では周知であり、処方により限定されるものではない。典型的には、そのような組成物は注射可能な調製物として流動溶液又は懸濁物として調製されるが、しかしながら、使用前には溶液又は懸濁物又は流動物のために適切な固体形を調製してもよい。調製物はまた乳化させてもよい。活性成分は賦形剤と混合でき、当該賦形剤は活性成分と医薬的に許容され適合性を有し、さらに本明細書に記載の治療方法での使用のために適切な量で存在する。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及び前記の組み合わせである。加えて、所望の場合には、組成物は微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤など、当該活性成分の有効性を強化できるものを含むことができる。本発明の治療組成物はその中に医薬的に許容できる当該成分の塩を含むことができる。
本発明のヒスチジン変異アダリムマブバージョンは、承認され市販されている非ヒスチジン変異アダリムマブ（HUMIRA(商標)）と同じ疾患及び異常の治療に適切であり、それらは、慢性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎及び慢性尋常性乾癬であり、この場合、当該薬剤は好ましくは皮下注射によって投与される。
市販薬と同様に、本発明のヒスチジン変異アダリムマブは、単独で又は治療を補助する他の薬剤と組み合わせて用いることができる。前記他の薬剤は、例えばメトトレキセート、DMARDS、グルココルチコイド、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、及び/又は鎮痛剤である。
HUMIRA(商標)の標準的投与レジメンは、通常は単回投与として毎週40mgである。本発明のヒスチジン変異アダリムマブバージョンは、先に指摘したように、HUMIRA(商標)より顕著に強力なpH依存性を示し、したがってHUMIRA(商標)の推奨用量のわずかに10−90%、詳しくは用いられるヒスチジン変異アダリムマブバージョンのそれぞれのKdis値に応じて10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及び90%に合致する用量で投与できる。
【００３５】
参考文献
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【実施例】
【００３６】
［実施例１］
アダリムマブから誘導されるpH感受性抗TNFα抗体の選別
酵母表面ディスプレーによるコンビナトリアルヒスチジン置換ライブラリーから抗TNFα抗体フラグメントの選別：予め組み立てた3ヌクレオチド構築ブロックを用いることによって、アダリムマブの重鎖及び軽鎖を基にした2つの抗体ライブラリーをGeneart社（Regensburg）により合成した。合成中に親残基又はヒスチジン残基をサンプル採取し、それによってヒスチジンのサンプリングを重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（CDR）に制限した。大半のアダリムマブライブラリーメンバーは、3つのCDR全てにわたって散在する3つのヒスチジン残基を有していた（図2）が、変種もまた合成され、前記は多かれ少なかれヒスチジン置換を有していた（0から約20の範囲）。理論的多様性：重鎖ライブラリー約10,000変種、軽鎖変種約3000変種。
EBY100酵母株（Fab抗体フラグメントの共有結合による酵母表面ディスプレーを可能にする）で、両ライブラリーをギャップ修復クローニングによりプラスミドベクターで別々にサブクローニングした（Boder and Wittrup, 1997）。対応する親鎖は重鎖又は軽鎖ライブラリーでペアを形成し、得られた2つのライブラリーを別々に蛍光活性化細胞仕分け（FACS）によってスクリーニングした。続いてpH感受性アダリムマブ変種を保有する細胞を、特異的染色及び選別手法を用い3ラウンドのスクリーニングで濃縮した（ここでは説明しない）。
pH7.4で組換えヒトTNFα（rhTNFα）と可逆的な高親和性結合（ナノモルに近い範囲内のKD）を示すFabフラグメントを選別した（前記選別は、rhTNFαがpH6で30分以内に放出された後で一度実施した）。pH依存性態様でrhTNFαと結合する変種の3ラウンドの選別後に、単離された単一クローンの配列分析は、特異的なヒスチジン置換パターンを保有する変種を明示した（図3及び4に提示）。1つの変異ホットスポットが重鎖配列データセットのCDR3領域内に認められた。2つの変異スポットが、軽鎖配列データセットのCDR-L1及びCDR-L3内で認められた。多数存在する（分析配列セット内の発生率：N＞1重鎖及び軽鎖配列変種）のみを更なるプロセッシング及び特徴解析のために選別し、表1及び表2に示される8つの軽鎖候補及び3つの重鎖候補を得た。
【００３７】
表1：3ラウンドのスクリーニング後に単離された38の単一クローンにおいて多数存在する（N＞1）3つの重鎖配列
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【００３８】
表2：3ラウンドのスクリーニング後に単離された98の単一クローンにおいて多数存在する（N＞1）8つの軽鎖配列
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【００３９】
多数存在するVH/VL変種の可変領域を親アダリムマブ配列とともに、完全長のIgG1κ分子の哺乳動物細胞（HEK293及びExpi293）での発現を可能にするベクターでクローニングした。重鎖及び軽鎖変種の考えられる全ての組み合わせを哺乳動物細胞で共同発現させた。ここでは、24の重鎖及び軽鎖変種の組み合わせを、合致する親鎖を有する重鎖又は軽鎖の変種から誘導した11のIgG種とともに発現させた。固定抗体による最初のOctet Red実験は、pH7.4でrhTNFαと結合させた後にpH6又はpH7.4における弁別的な解離態様を査定した。pH7.4での高親和性結合（pH7.4における結合/解離）及びpH6における抗原の迅速な遊離（pH7.4における結合/pH6における解離）についてのそれらの結合プロフィールにしたがって10変種を選別した。更なる特徴解析のために、抗体を粗上清からタンパク質A精製により精製し、最後に緩衝液をPBSに交換した。更なるOctetアッセイは、pH7.4における結合の相違及びpH6におけるrhTNFαの遊離の相違を明らかにした。
続いて、3変種（図3、4のID：VH#2＋VL#9：PSV#1、VH#2＋VL#16：PSV#2及びVH#1＋VL#14：PSV#3）をOctet Redでの最後の特徴解析のために選別した。
いくつかのアダリムマブにおける結合の特徴をOctet Red実験で分析した。重鎖及び軽鎖の種々の変異体の他に種々の重鎖及び軽鎖変種の組み合わせが、pH7.4での結合親和性及びpH6での解離速度に影響を与えることが示された。
重鎖のLeu98His及び軽鎖のTyr32His、Leu33Hisを含むいくつかの変異の組み合わせによってPSV#3を作製した。軽鎖変異、Gln89His、Arg90His及びAsn92HisによってPSV#2の軽鎖を作製した。変異Arg90His、Asn92His及びThr97HisによってPSV#1の軽鎖を作製した。PSV#1及びPSV#2の両方で、Ser100.His及びSer100.cHisの変異によって重鎖を作製した。（図3及び4a−cに示した配列はKabatの番号付けにしたがって番号を付した。この目的のために、Clustal Wを用いることによって、変種の配列を親配列とともにアラインメントし、Kabatの番号付け規則を考慮した番号付けを実施した。）
図5及び6にOctet Red測定の代表的なセンサーグラムを示し、表4にアダリムマブ、PSV#1、PSV#2及びPSV#3の算出動態パラメーターの対応する平均値（N＝3）を示す。
【００４０】
表3：アダリムマブ及びpH依存性結合変種のrhTNFαに対するpH7.4及びpH6における結合動態。pH7.4におけるアダリムマブ、PSV#1、PSV#2及びPSV#3の結合速度（kon）、解離速度（kdis）及び結合親和性（KD）。解離速度はまたpH6でも決定した。実験は25℃で実施し、各実験について3組の平均値を示す（ただしアダリムマブはpH6では2組で測定）。図7及び8に当該データに対応する代表的なセンサーグラムを示す。
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【００４１】
親アダリムマブはpH7.4で高い親和性でrhTNFαと結合し、このことは文献（Kaymakcalan et al., 2009）でも示された。3変種について、kdis値の増加は結合親和性の低下を生じるが（KDで10−24倍の低下）、しかしながら3桁範囲のピコモル結合親和性でのTNFαとの相互作用はなお非常に強固な結合を示す（図5及び表3）。
抗体のpH感受性の査定のためにOctet Red測定を再度実施した。FcRn媒介リサイクルということでは、抗体有効性の改善は、pH7.4の循環中でのTNFαとの強固な結合及び酸性エンドソーム中でのその迅速な放出を要求する。酸性エンドソーム内でのTNFαの遊離を判定するために、pH7.4でrhTNFαを結合させた後でpH6における解離を測定した（図6及び表3）。pH6とpH7.4の解離速度比を決定した。全変種がpH6の解離で顕著な増加を示した（アダリムマブのkdis比（pH6/pH7.4）6に対してpH6で59−160倍のkdisの増加）（表3）。
追加のある実験は、pH6での解離後に、pH7.4でPSV#1、PSV#2及びPSV#3がrhTNFαと可逆的に結合する能力に向けられた。pH6でのインキュベーションがTNFα結合能力を不可逆的に変化させることがないことを担保するために、2サイクルの結合（pH7.4）及び遊離（pH6）を実施した（図7）。図8に示すように、TNFαがpH6で遊離された後、PSV#1、PSV#2及びPSV#3は可逆的に結合することができる。対照的に、アダリムマブはpH6でのインキュベーション中に強固な結合を維持する。
【００４２】
［実施例２］
変異体のin vivo特徴分析
親IgG構築物及びその変異体のヒトTNFαのPKに対する作用をヘテロ接合型トランスジェニックヒトFcRnマウス176系とともにホモ接合型マウス32系で精査した。前者の系統は、投与されるIgG構築物間におけるPKの相違の精査により適切であったが、一方、後者のマウス系統はより良好なFcRn防御を提供し、より長い半減期（ヒトで予想されるものにより近い）を提供した。前記のより長期のスカベンジャーの残留は、TNFαのクリアランスに対するより優れた当該抗体の影響の判定を可能にした。
ヒトTNFα及びスカベンジャーを予め定めた割合でSCにより投与した。全スカベンジャー及び全hTNFαの両者の血漿濃度プロフィールを精査した。pH依存性hTNFα結合は、当該サイトカインのクリアランスの上昇及びスカベンジャーのクリアランスの減少をもたらすと予測された。
選択した組織をマウスから収集し、スカベンジャー及び標的サイトカインの分布を精査した。この試験では親IgGを参照化合物として用いた。
当該in vitro及びin vivoデータセットを、物理化学的特性とin vivo薬物動態、FcRn親和性とin vivo薬物動態及び組織分布との間の相関性の確立のために用いた。
当該相関性を用いて、血漿及び組織における薬物動態の特徴分析及びシミュレーションを可能にする生理学依拠薬物動態（PBPK）モデルを構築した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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