(57)【要約】  本発明は、遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出する核酸を含む組成物、試薬キット、およびその用途、ならびに個体における細胞増殖性異常を検出し、または個体の疾患の程度を等級付けする方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＦ１８０およびセプチン９遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含む組成物。
【請求項２】
前記核酸は、ＲＮＦ１８０の少なくとも１５個のオリゴヌクレオチド長セグメントを含み、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記試薬は、亜硫酸水素塩である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含む、試薬キット。
【請求項８】
患者の生体試料を収容するための容器を含む、請求項７に記載の試薬キット。
【請求項９】
前記試薬キットの使用および結果の解釈の説明を含む、請求項７に記載の試薬キット。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の、個体における細胞増殖性異常を検出するための試薬キットの製造における用途。
【請求項１１】
前記細胞増殖性異常は癌である、請求項１０に記載の用途。
【請求項１２】
前記癌は、胃癌である、請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
個体における細胞増殖性異常を検出する方法であって、前記個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０およびセプチン９遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより、個体における細胞増殖性異常を検出することを含む方法。
【請求項１４】
試薬を使用して、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換すること、前記試薬で処理したセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子またはそのセグメントを増幅酵素およびプライマーと接触させ、前記処理した遺伝子またはセグメントを増幅させ増幅生成物を生成するか、または増幅させないこと、プローブを用いて増幅生成物を検出すること、および前記増幅物が存在するか否かに基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度を確定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーは、ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントを含み、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
癌および健常ＤＮＡをテンプレートとして用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体の生体試料は、細胞系、組織切片、組織生検／パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞、またはその組み合わせより選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体の生体試料は、血漿である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞増殖性異常は癌である、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌は、胃癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含み、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けする組成物の、個体の疾患の程度を等級付けする試薬キットの製造における用途。
【請求項２５】
前記組成物は、セプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸をさらに含み、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより疾患の程度を等級付けする、請求項２４に記載の用途。
【請求項２６】
前記核酸は、ＲＮＦ１８０の少なくとも１５個のオリゴヌクレオチド長セグメントを含み、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の用途。
【請求項２７】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む、請求項２６に記載の用途。
【請求項２８】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む、請求項２７に記載の用途。
【請求項２９】
前記組成物は、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む、請求項２４に記載の用途。
【請求項３０】
前記試薬は、亜硫酸水素塩である、請求項２９に記載の用途。
【請求項３１】
前記疾患の程度は、３つのレベルにわかれ、第１のレベルは健常、第２のレベルは炎症、第３のレベルは癌である、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の用途。
【請求項３２】
前記炎症は胃炎であり、かつ前記癌は胃癌である、請求項３１に記載の用途。
【請求項３３】
前記胃炎は、発癌しにくい胃炎と発癌しやすい胃炎とにさらに等級付けできる、請求項３２に記載の用途。
【請求項３４】
前記発癌しにくい胃炎は、表層性胃炎である、請求項３３に記載の用途。
【請求項３５】
前記発癌しやすい胃炎は、萎縮性胃炎と腸上皮化生のある胃炎とにさらに等級付けできる、請求項３３に記載の用途。
【請求項３６】
前記胃癌は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ期胃癌にさらに等級付けできる、請求項３２に記載の用途。
【請求項３７】
個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けすることを含む、個体の疾患の程度を等級付けするための方法。
【請求項３８】
前記個体から単離した生体試料におけるセプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより疾患の程度を等級付けすることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試薬を使用して、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換すること、前記試薬で処理したセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子またはそのセグメントを増幅酵素およびプライマーと接触させ、前記処理した遺伝子またはセグメントを増幅させ増幅生成物を生成するか、または増幅させないこと、プローブを用いて増幅生成物を検出すること、および前記増幅物が存在するか否かに基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度を確定することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プライマーは、ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントを含み、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
癌および健常ＤＮＡをテンプレートとして用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記個体の生体試料は、細胞系、組織切片、組織生検／パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞、またはその組み合わせより選ばれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記個体の生体試料は、血漿である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患の程度は、３つのレベルにわかれ、第１のレベルは健常、第２のレベルは炎症、第３のレベルは癌である、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む核酸。
【請求項４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件またはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む、請求項４８に記載の核酸。
【請求項５０】
ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するプライマーおよび／またはプローブとして用いられる、請求項４８または４９に記載の核酸。
【請求項５１】
請求項４８または４９に記載の核酸を含み、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む、組成物。
【請求項５２】
前記試薬は、亜硫酸水素塩である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
請求項５１〜５２のいずれか１項に記載の組成物を含む、試薬キット。
【請求項５４】
患者の生体試料を収容するための容器を含む、請求項５３に記載の試薬キット。
【請求項５５】
前記試薬キットの使用および結果の解釈の説明を含む、請求項５３に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査に関し、具体的には、遺伝子組成物およびこの遺伝子組成物を個体における細胞増殖性異常の検出または疾患程度の等級付けに用いることに関する。
【０００２】
本願は、２０１４年８月８日に提出された、名称を「細胞増殖性異常検出用または疾患程度等級付け用の遺伝子組成物およびその用途」とし、出願番号を２０１４１０３８９８９５２とする発明特許出願の優先権を要求する。
【背景技術】
【０００３】
例えば癌などの細胞増殖性異常性疾患は、公衆衛生の主な難題であり、米国においては、癌で死亡する人の数は死亡者総数の約２５％を占める。中でも、胃癌は世界で４番目に多く診断されている癌であり、あらゆる癌の中で死亡率が２番目に高く、世界有数の健康の敵とみなされている。特に、中国を含む多くのアジア諸国で、胃癌は各種悪性腫瘍の中でも首位となっており、罹患率および死亡率とも高い。
【０００４】
胃炎は、胃粘膜炎症の総称であり、成人においてよく見られ、病因の多くは、胃の刺激であり、不適切な飲食、ウイルスおよび細菌感染、薬物刺激などにより誘発される可能性があるが、比較的容易に是正し治療することができる。
【０００５】
しかしながら、胃炎の症状と胃癌の症状は、一般に混同しやすく、日常生活において多くの人が胃炎を胃癌であると誤認し、一日中心配で不安になり、重篤な疾患ではないにもかかわらず、心理的な作用によって悪化を続ける。胃癌を胃炎と誤り、同じものであり大したことがないと勘違いし、治療の最適なタイミングを逃してしまう人もいる。
【０００６】
そのため、健常、胃炎および胃癌を区別するための、感度が高く特性が高い検出方法が緊急に求められており、特に感度および特異性が高く、かつ無痛の検出方法が緊急に求められている。
【０００７】
生物工学の継続的な発展に伴い、遺伝子検査を利用して疾患を診断する方法が、広く注目されている。中でも、ＤＮＡメチル化は、エピジェネティクスの重要な構成部分であり、正常な細胞機能の維持においてだけでなく、癌および炎症の発生においても重要な働きをしており、すなわち、メチル化状態の改変は、癌および炎症を引き起こす重要な要素であり、こうした変化は、ゲノム全体のメチル化の度合いの低下およびＣｐＧアイランド局所のメチル化の度合いの異常な上昇を含み、これによりゲノムの不安定および耐病性遺伝子の不発現をもたらす。耐病性遺伝子のうち活性を有する対立遺伝子が失活した場合、癌および炎症が発生する確率が高まる。そのため、メチル化の研究は、癌および炎症の早期予測、分類、等級付けおよび予後の評価に新しい依拠を提供し、現在注目を集めている研究テーマの１つとなっている。
【０００８】
【発明の概要】
【０００９】
そのため、本発明は、ＤＮＡメチル化の程度を検出することにより、個体における細胞増殖性異常を検出し、または疾患の程度（例えば胃および胃炎）を等級付けするための遺伝子組成物、試薬キットおよびその用途、ならびにこの試薬キットに基づき検査を行う方法を提案する。
【００１０】
それに対応し、本発明の第１の側面により、ＲＮＦ１８０およびセプチン９遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含む組成物を提供する。
【００１１】
典型的には、前記核酸は、ＲＮＦ１８０の少なくとも１５個のオリゴヌクレオチド長セグメントを含み、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
いくつかの好ましい実施態様により、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む。
【００１３】
さらに好ましくは、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む。
【００１４】
典型的には、前記組成物は、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む。前記試薬は、亜硫酸水素塩であることが好ましい。
【００１５】
本発明の第２の側面により、上記組成物を含む試薬キットをさらに提供する。
【００１６】
典型的には、前記試薬キットは、患者の生体試料を収容するための容器を含む。
【００１７】
かつ、前記試薬キットは、試薬キットの使用および結果の解釈の説明を含んでもよい。
【００１８】
本発明の第３の側面により、個体における細胞増殖性異常を検出するための試薬キットの製造における前記組成物の用途をさらに提供する。
【００１９】
典型的には、前記細胞増殖性異常は癌である。前記癌は、胃癌であることが好ましい。
【００２０】
本発明の第４の側面により、個体における細胞増殖性異常を検出する方法をさらに提供する。前記方法は、前記個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０およびセプチン９遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより、個体における細胞増殖性異常を検出することを含む。
【００２１】
典型的には、前記方法は、試薬を使用して、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換すること、前記試薬で処理したセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子またはそのセグメントを増幅酵素およびプライマーと接触させ、前記処理した遺伝子またはセグメントを増幅させ増幅生成物を生成するか、または増幅させないこと、プローブを用いて増幅生成物を検出すること、および前記増幅物が存在するか否かに基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度を確定することをさらに含む。
【００２２】
典型的には、前記プライマーは、ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントを含み、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む。
【００２３】
好ましくは、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む。
【００２４】
中でも、人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングするか、または、癌および健常ＤＮＡをテンプレートとして用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングすることが好ましい。
【００２５】
典型的には、前記個体の生体試料は、細胞系、組織切片、組織生検／パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞、またはその組み合わせより選ばれる。
【００２６】
前記個体の生体試料は、血漿であることが好ましい。
【００２７】
いくつかの好ましい実施態様により、前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定される。
【００２８】
典型的には、前記細胞増殖性異常は癌である。前記癌は、胃癌であることが好ましい。
【００２９】
それに対応し、本発明のもう１つの側面により、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含み、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けする組成物の、個体の疾患の程度を等級付けする試薬キットの製造における用途を提供する。
【００３０】
本発明のいくつかの好ましい実施態様により、前記組成物は、セプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸をさらに含み、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより疾患の程度を等級付けする。
【００３１】
典型的には、前記核酸は、ＲＮＦ１８０の少なくとも１５個のオリゴヌクレオチド長セグメントを含み、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
好ましくは、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む。
【００３３】
さらに好ましくは、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む。
【００３４】
典型的には、前記組成物は、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む。前記試薬は、亜硫酸水素塩であることが好ましい。
【００３５】
典型的には、前記疾患の程度は、３つのレベルにわかれ、第１のレベルは健常、第２のレベルは炎症、第３のレベルは癌である。いくつかの好ましい実施態様において、前記炎症は胃炎であり、かつ前記癌は胃癌である。前記胃炎は、発癌しにくい胃炎と発癌しやすい胃炎とにさらに等級付けできることが好ましい。前記発癌しにくい胃炎は、表層性胃炎である。前記発癌しやすい胃炎は、萎縮性胃炎と腸上皮化生のある胃炎とにさらに等級付けできることがさらに好ましい。前記胃癌は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ期胃癌にさらに等級付けできることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明のもう１つの側面により、個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けすることを含む、個体の疾患の程度を等級付けする方法を提供する。
【００３７】
典型的には、前記方法は、前記個体から単離した生体試料におけるセプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより疾患の程度を等級付けすることをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施態様において、前記方法は、試薬を使用して、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換すること、前記試薬で処理したセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子またはそのセグメントを増幅酵素およびプライマーと接触させ、前記処理した遺伝子またはセグメントを増幅させ増幅生成物を生成するか、または増幅させないこと、プローブを用いて増幅生成物を検出すること、および前記増幅物が存在するか否かに基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度を確定することをさらに含む。
【００３９】
典型的には、前記プライマーは、ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントを含み、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む。
【００４０】
好ましくは、前記ＲＮＦ１８０のヌクレオチド長セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含む。
【００４１】
中でも、人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングするか、または、癌および健常ＤＮＡをテンプレートとして用いて前記プライマーおよびプローブをスクリーニングすることが好ましい。
【００４２】
典型的には、前記個体の生体試料は、細胞系、組織切片、組織生検／パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞、またはその組み合わせより選ばれる。
【００４３】
前記個体の生体試料は、血漿であることが好ましい。
【００４４】
いくつかの好ましい実施態様により、前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定される。
【００４５】
典型的には、前記疾患の程度は、３つのレベルにわかれ、第１のレベルは健常、第２のレベルは炎症、第３のレベルは癌である。
【００４６】
本発明のもう１つの側面により、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む核酸をさらに提供する。
【００４７】
前記核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件またはストリンジェントな条件でハイブリダイズした配列およびその相補配列を含むことが好ましい。
【００４８】
いくつかの好ましい実施態様において、前記核酸は、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するプライマーおよび／またはプローブとして用いられる。
【００４９】
本発明のもう１つの側面において、前記核酸を含み、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む組成物をさらに提供する。前記試薬は、亜硫酸水素塩であることが好ましい。
【００５０】
本発明のもう１つの側面により、上記組成物を含む試薬キットをさらに提供する。典型的には、前記試薬キットは、患者の生体試料を収容するための容器を含む。かつ、前記試薬キットは、試薬キットの使用および結果の解釈の説明を含んでもよい。
【００５１】
本願において、実験を介して、胃炎および胃癌におけるＲＮＦ１８０遺伝子のメチル化の程度に比較的大きな差異が存在し、ＲＮＦ１８０は、健常者群、慢性表層性胃炎群、慢性萎縮性胃炎（慢性胃炎に腸上皮化生を併発）群、胃癌群ＩからＩＶ期における含有量が徐々に増加し、Ｃｔ値が徐々に低下することがわかった。陽性率も、同様の順序で健常者群から胃癌群まで徐々に上昇するため、本願は、試料中のＲＮＦ１８０遺伝子のメチル化の程度を測定することにより胃癌および胃炎を等級付けする方法を提供し、これにより、非侵襲的で、迅速な胃癌および胃炎のスクリーニング方法を提供する。
【００５２】
セプチン９およびＲＮＦ１８０をともに結合して胃癌を検出し、胃癌のステージ（Ｉ−ＩＶ）に関連する。ＲＮＦ１８０は、さらに胃炎を検出することができ、健常群、胃炎群および胃癌群にわけ、３群の間には、いずれも統計学的な有意差が認められる。かつ、ＲＮＦ１８０は、さらに胃炎のうち腸上皮化生がある胃炎と腸上皮化生がない普通の胃炎を区別して検出することができ、腸上皮化生があるＲＮＦ１８０は１００％陽性であり、普通の胃炎は約２７％陽性である。
【００５３】
出願人は、年齢の増加に伴い、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量が高くなる傾向を示すが、高齢者は、いずれも多少ともある程度の胃炎があり、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量の上昇が年齢の要素によるものなのか、胃炎の要素によるものなのかを区別するのが難しく、胃炎と胃癌の検査の特異性および信頼性に大きな影響をもたらしていることをさらに発見している。そのため、この要素を考慮し、検査中にセプチン９を同時に加えるため、セプチン９遺伝子で年齢および胃炎の影響の要素を無視することができ、セプチン９を用いて胃癌の検出を確認することができる。具体的には、約４０％の胃癌は、セプチン９およびＲＮＦ１８０で同時に陽性であり、両者で同時に陽性であることを判断基準とし、９０％の特異性を達成することができる。セプチン９のメチル化検出は、ＲＮＦ１８０を単独で使用してメチル化検出したときに特異性に欠けるという課題を克服し、補填することができ、細胞増殖性異常の存在をさらに如実に表すことができる。かつ、いくつかの具体的な実施態様により、一部の胃癌はＲＮＦ１８０が陰性であるが、セプチン９が陽性であり、セプチン９は、この一部の胃癌を検出することができ、感度を約３％増加させることができる。セプチン９のメチル化検出は、ＲＮＦ１８０を単独で使用してメチル化検出したときに感度に欠けるという課題を克服し、補填することができ、細胞増殖性異常の存在をさらに如実に表すことができる。そのため、セプチン９とＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを併用して胃炎および胃癌を等級付けすることにより、感度および特異性をいずれも高めることができる。
【００５４】
最後に、リアルタイムＰＣＲを用いて血漿試料中のＤＮＡを解析する方法は、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーの同じ時間での２チャンネル検出を実現するのに便利であり、かつリアルタイムＰＣＲのサイクル閾値（Ｃｔ）値に基づき、試料が陽性を呈するか否かを迅速かつ敏捷に判断することができ、非侵襲性の迅速な癌および炎症の等級付け方法を提供する。
【００５５】
別段の定義がある場合を除き、本明細書における関連する技術的、科学的用語は、本分野内の技術要員が通常理解する意味と同じである。実験または実際の応用において、これと相似したまたは同じ方法および材料を用いることができるが、本文では、以下の文において材料および方法について記述する。矛盾がある場合には、本明細書に含まれる定義を基準とし、また、材料、方法および例は、説明のためのものにすぎず、制限性を有するものではない。
【００５６】
本発明のその他の特徴および長所については、次の具体的な説明および請求の範囲により詳細に記述する。
【００５７】
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本発明の上記およびその他の特徴は、図面およびその詳細な記述を以下に結合することによりさらに説明する。理解すべきことは、これらの図面は、本発明に基づくいくつかの例示的な実施態様を示しているにすぎないため、本発明の保護範囲に対する制限であるとみなすべきではない。特に説明がある場合を除き、図面は、必ずしも比例したものではなく、類似する記号は類似する部材を表す。
【００５９】
【図１】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出において、ＲＮＦ１８０の４セットのプライマーおよびプローブがいずれもセプチン９の測定に影響を及ぼさないことを示す。
【００６０】
【図２】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出で胃癌の陽性結果が相補することを示す。
【００６１】
【図３】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の胃癌、胃炎および健常者のＣｔ平均値の棒グラフを示す。
【００６２】
【図４】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の胃癌、胃炎および健常者のＣｔ値の散布図を示す。
【００６３】
【図５】健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期においてβ−アクチンのＣｔ値が安定していることを示す。
【００６４】
【図６】健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期におけるＲＮＦ１８０のｄＣｔ値を示す。
【００６５】
【図７Ａ】健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌のＲＳ１９陽性率の比較を示す。
【図７Ｂ】胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期のＲＳ１９陽性率の比較を示す。
【図７Ｃ】健常者、胃炎、胃癌のＲＳ１９のｄＣｔ平均値の棒グラフを示す。
【００６６】
【図８Ａ】ＲＮＦ１８０メチル化含有量と年齢の関係図を示す。
【図８Ｂ】セプチン９およびＲＮＦ１８０の結合が胃癌検出の特異性および感度を改善する概略図を示す。
【００６７】
【図９】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃癌の感度および特異性を示す。
【００６８】
【図１０】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）の感度および特異性を示す。
【００６９】
【図１１】セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃炎（すべて）の感度および特異性を示す。
【００７０】
【発明を実施するための形態】
【００７１】
別段の説明がある場合を除き、本願の実施は、通常の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および遺伝学技術を用い、いずれも本分野の通常の技術手段の範囲内にある。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，１９８４版）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ叢書（米国学術出版社）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７版，定期的に更新）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら，１９９４版）などの文献において、こうした技術について詳細に説明している。本願において使用するプライマー、プローブおよび試薬キットは、本分野で公知の標準技術を用いて製造することができる。
【００７２】
別段の定義がある場合を除き、本願で使用する技術・科学用語は、本発明が属する分野の普通の技術要員の通常の理解と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）は、本願において使用している複数の用語について、当業者のために一般的なガイドラインを提供している。
【００７３】
定義
【００７４】
本願の「疾患の程度を等級付けする」とは、検出結果に基づき疾患の程度を確定し、これにより等級付けすることを示す。本願により、ＤＮＡメチル化の程度に基づき、健常と癌の２つの等級に区分することができ、すなわち、個体における癌を検出することができる。本願により、ＤＮＡメチル化の程度に基づき、健常、炎症および癌の３つの等級に区分することができることが好ましい。例えば、患者の試料で測定されたＤＮＡメチル化の程度に基づき、健常、胃炎および胃癌の３つの等級に区分することができ、胃炎は、さらに表層性胃炎および萎縮性胃炎に区分することができる。
【００７５】
本願の「癌」とは、あらゆる悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、または悪性細胞分裂もしくは悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｕｒ）、または制御されない、もしくは不適切な細胞増殖を有するあらゆる疾患状態を示し、それらを含み、かつ制御されない、または不適切な細胞増殖を特徴とするあらゆる疾患を含むが、それらに限定されない。
【００７６】
本願の「胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）」および「胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）」は、同じ意味を有し、かつ胃または胃細胞の癌を示す。これらの癌は、胃の内層（粘膜）に発生するものであってもよく、胃の幽門部、胃体部または噴門部（下部、中部および上部）に発生する腺癌であってもよい。
【００７７】
本願の「胃癌ステージ」とは、胃癌の臨床病理ステージ基準に基づき、胃癌を４期にわけることができることをいう。胃癌ステージは、原発腫瘍（Ｔ）、リンパ節転移の状況（Ｎ）および遠隔転移の状況（Ｍ、左鎖骨上リンパ節転移、血行性転移および腹膜播種を含む）の３つの指標に関する。「Ｉ期」とは、リンパ節転移がない表層型胃癌、または腫瘍がすでに筋層に浸潤しているが１つの領域の１／２を超えていないものをいう。「ＩＩ期」とは、第１群リンパ節転移がある表層癌、Ｔ２癌（腫瘍が胃壁筋層に浸潤しているが、大きさが１つの領域の１／２を超えていない）およびＴ３癌（腫瘍が胃壁漿膜層に浸潤している、または漿膜層に浸潤していないが、病変がすでに１つの領域の１／２を超えており、１つの領域を超えていない）をいい、リンパ節転移がないＴ３癌もこのステージに属す。「ＩＩＩ期」とは、第２群リンパ節転移がある各種の大きさの腫瘍、または第１群リンパ節転移のみがあるか、もしくはリンパ節転移がなく、腫瘍の大きさがすでに１つの領域を超えているものをいう。「ＩＶ期」とは、第３群リンパ節転移または遠隔転移を伴うものすべてをいい、腫瘍の大きさを問わず、いずれもこのステージに属す。
【００７８】
本願の「胃癌細胞」とは、胃癌の特徴を有する細胞を示し、かつ前癌細胞を含む。
【００７９】
本願の「前癌」とは、癌細胞に変換する早期段階にある、または癌細胞に変換する傾向がある細胞を示す。このような細胞は、癌細胞の特徴を有する１種類または複数種の表現型性状を表すことがある。
【００８０】
本願の「胃炎」とは、なんらかの病因によって引き起こされる胃粘膜炎症を示し、常に上皮損傷および細胞再生を伴う。胃炎は、最もよく見られる消化系疾患の１つであり、一般に、臨床症状発症の急激さによって急性胃炎および慢性胃炎にわかれる。慢性胃炎は、一般に、次の数種のタイプにわかれる。炎症病変が比較的浅く、胃粘膜表面の層に限られる（３分のを超えない）場合、「表層性胃炎」というが、胃の潰瘍まで発展すると、「潰瘍性胃炎」となる。炎症病変が胃粘膜の全層に及び、胃腺体萎縮を伴う場合、「萎縮性胃炎」である。萎縮性胃炎患者のうち、病理生検で胃粘膜に「結腸型不完全型腸上皮化生」および「異型増殖症」の両方の病変がみつかった場合、胃癌に発展する可能性がある。腸上皮化生とは、正常時にはあるべきではない小腸または結腸の腺体が胃粘膜腺体に現れることをいい、すなわち腸腺が胃内に遷移する。腸上皮化生の数が多いほど、萎縮の程度も重くなる。表層性胃炎および潰瘍性胃炎は、「軽度の胃炎」と総称することができ、「萎縮性胃炎」および「腸上皮化生性胃炎」は重度の胃炎と総称することができる。
【００８１】
本願における「バイオマーカー」とは、疾患の指標因子または予測因子とすることができる遺伝子などの物質、疾患に関連する変量の測定をいう。疾患の存在またはリスクは、バイオマーカーというパラメータから推断でき、疾患自体を測定する必要がない。
【００８２】
本願における「核酸」、「核酸配列」などは、ポリヌクレオチドをいい、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または化学的なあらゆるＤＮＡ類またはＲＮＡ類の物質も含む。「ｃＤＮＡ」とは、自然に生成されたｍＲＮＡから複製されるＤＮＡをいう。「ｇＤＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡをいう。これらの物質を組み合わせてもよい（すなわち、一部がｇＤＮＡ、一部がｃＤＮＡの組換え核酸）。
【００８３】
本願における「操作可能に結合」、「操作可能に連結」とは、核酸配列を機能上結合することをいう。
【００８４】
本願における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「高度にストリンジェント」とは、プローブがその標的配列とハイブリダイズする条件をいい、典型的には、核酸の複雑な混合物中をいう。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境によって異なる。比較的長い配列は、比較的高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細なガイドラインは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，生化学と分子生物学技術−核酸プローブハイブリダイゼーションの「ハイブリダイゼーション原理と核酸試験戦略の回顧」を参照することができる。通常、ストリンジェントな条件は、限定されたイオン強度ｐＨ下で、特定の核酸の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い。Ｔｍの温度（限定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度において）の下で、５０％の標的と相補するプローブは、均衡に標的配列とハイブリダイズする。不安定化剤を増加することによりストリンジェントな条件を実現することもできる。選択的または特定なハイブリダイゼーションに対し、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの２倍とし、１０倍が好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、次のとおりである。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳの溶液において、摂氏４２度でハイブリダイズするか、または５×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳの溶液において、摂氏６５度でハイブリダイズした後、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液において摂氏６５度で洗浄する。
【００８５】
かつ、核酸がコードするポリペプチドが実質的に相似する場合、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができない核酸であっても、実質的に相似する。こうした状況の下で、典型的には、核酸は中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする。例として、「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％ホルムアミド、１Ｍの塩化ナトリウムおよび１％のＳＤＳの溶液において、摂氏３７度でハイブリダイズし、かつ１×ＳＳＣの溶液において摂氏４５度で洗浄することを含む。当業者は、明らかに、先行技術において、同じストリンジェント度を得る条件を取得するガイドラインを得ることができる。ＰＣＲについて、摂氏３６度前後の温度は、典型的に低度にストリンジェントな増幅に適しているが、プライマーの長さに基づき、アニーリング温度の範囲は、摂氏３２度から摂氏４８度の間にある。高度にストリンジェントなＰＣＲ増幅は、一般に、摂氏６２度におけるものであるが、プライマーの長さおよび特異性に基づき、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションのアニーリング温度の範囲は、摂氏５０度から摂氏６５度の間にある。高度にストリンジェントおよび低度にストリンジェントな増幅のサイクル条件について、典型的には、摂氏９０〜９５度での持続変性段階３０秒から２分間、持続アニーリング段階３０秒から２分間、摂氏約７２度での持続伸長段階１から２分間を含む。低度および高度にストリンジェントな増幅反応に関するツールおよびガイドラインは、先行技術において得ることができる。
【００８６】
本願における「オリゴヌクレオチド」とは、２個または２個以上のヌクレオチドからなる分子、好ましくは３個以上のヌクレオチドからなる分子をいい、その正確な大きさは多くの要素により、これらの要素は、逆にオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途によって決まる。いくつかの具体的な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１０個のヌクレオチドから１００個のヌクレオチドの長さを含んでもよい。いくつかの具体的な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１０個のヌクレオチドから３０個のヌクレオチドの長さを含んでもよく、または２０および２５個のヌクレオチドの長さを有してもよい。いくつかの特定の具体的な実施態様において、これらの長さよりも短いオリゴヌクレオチドも適している。
【００８７】
本願の「プライマー」とは、核酸鎖と相補するプライマー伸長生成物の合成を誘発可能な条件の下で、すなわちヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下かつ適した温度およびｐＨ下で、合成開始点とすることができるオリゴヌクレオチドを示し、精製された制限消化物において自然に存在するものであるか、合成して生成されたものであるかは問わない。プライマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、誘発剤の存在下で必要な伸長生成物の合成をもたらすのに十分な長さを有する必要がある。プライマーの適切な長さは、温度、プライマーの由来、用いる方法などを含む複数の要素によって決まる。例えば、診断および予後の応用のために、標的配列の複雑さに基づき、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常、少なくとも約１０、または１５、または２０、または２５以上のヌクレオチドを含有するが、さらに少ないヌクレオチドまたはさらに多くのヌクレオチドを含有してもよい。プライマーの適切な長さの確定に関与する要素は、当業者が熟知しているものである。
【００８８】
本願の「プライマー対」とは、標的ＤＮＡ分子の逆鎖とハイブリダイズする、またはフランキングと連結する、増幅するヌクレオチド配列の標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズするプライマー対を示す。
【００８９】
本願の「プライマーサイト」とは、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡまたはその他の核酸の領域を示す。
【００９０】
本願の「プローブ」は、核酸配列に関する場合、その通常の意味で使用し、所定の条件下で、標的配列とハイブリダイズでき、かつこの標的配列の存在の検出に用いることができる選択的核酸配列を示す。当業者は、いくつかの状況の下で、プローブをプライマーとすることも、プライマーをプローブとすることもできることを理解すべきである。
【００９１】
本願の「ＤＮＡメチル化」とは、メチル基をシトシン（Ｃ）の５位に添加することをいい、これは、通常（ただし必須ではない）、ＣｐＧ（シトシンの後がグアニンである）ジヌクレオチドの場合における。本文で用いる「増加したメチル化の程度」または「著しいメチル化の程度」とは、ＤＮＡ配列中に少なくとも１つのメチル化したＣヌクレオチドが存在し、正常な対照試料（例えば、非癌細胞または組織試料から抽出されたＤＮＡ試料またはＤＮＡ残基のメチル化に対して処理を行ったＤＮＡ試料）中の対応Ｃが非メチル化されていることをいい、いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＣをメチル化することができ、対照ＤＮＡ試料中のこれらの位置のＣは非メチル化されている。
【００９２】
実施形態において、複数の異なる方法を、ＤＮＡメチル化の改変の検出に用いることができる。ＤＮＡメチル化を検出する方法は、例えば、サザンまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析を用いたメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）測定、メチル化特異性またはメチル化感受性のＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、メチル化感受性のモノヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ）、高解像度融解（ＨＲＭ）解析、バイサルファイトシーケンシング、パイロシーケンシング、メチル化特異性一本鎖配座解析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）、メチル化特異性変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＭＳ−ＤＧＧＥ）、メチル化特異性融解曲線解析（ＭＳ−ＭＣＡ）、メチル化特異性変性高速液体クロマトグラフィー（ＭＳ−ＤＨＰＬＣ）、メチル化特異性マイクロアレイ（ＭＳＯ）がある。これらの測定は、ＰＣＲ解析、蛍光を用いた定量解析またはサザンブロッティング解析としてもよい。
【００９３】
本願の「メチル化測定」とは、ＤＮＡ配列内の１個または複数個のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を確定するあらゆる測定をいう。
【００９４】
本願の「生体試料」または「試料」は、生検および剖検試料などの組織切片、ならびに組織学的目的のために得られる冷凍切片、またはこれらの試料の処理後のあらゆる形式を含む。生体試料は、血液および血液成分または生成物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）、痰または唾液、リンパおよび舌組織、初代培養物、外植体および変換された細胞などの培養された細胞、糞便、尿液、胃生検組織などを含む。生体試料は、通常、真核生物から得られ、前記真核生物は、哺乳動物であっても、霊長類であっても、ヒトの個体であってもよい。
【００９５】
本願の「生検」とは、診断または予後の評価のために組織試料を取り出すプロセスをいい、組織試料自体のこともいう。本分野ですでに知られているあらゆる生検技術は、本発明の診断および予後の方法に用いることができる。用いる生検技術は、評価する組織タイプ（例えば、舌、結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血球、胃組織など）などの要素によって決まる。代表的な生検技術は、摘除生検、摘出生検、針生検、切開生検および骨髄生検を含むが、これらに限定されず、結腸内視鏡検査を含んでもよい。複数の生検技術は、当業者が公知のものであり、少ない実験を行うことによりこれらの技術の中から選択して使用することができる。
【００９６】
本願の「単離した」核酸分子とは、通常、この単離した核酸分子に関連するその他の核酸分子から単離された核酸分子を示す。そのため、「単離した」核酸分子は、単離した核酸が由来する生物体を有さないゲノムにおいて自然にフランキングがこの核酸の１個または２個の末端に連結した配列（例えば、ＰＣＲまたは制限的核酸エンドヌクレアーゼによって消化され生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡセグメント）のような核酸分子を含むが、これらに限定されない。通常、このような単離した核酸分子をベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に導入し、融合核酸分子の操作または生成を便利にする。また、単離した核酸分子は、例えば組換えまたは合成した核酸分子などの人工的な核酸分子を含んでもよい。例えば、核酸ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー）または制限消化されたゲノムＤＮＡを含有するゲル（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミド）の一部における数百から数百万のその他の核酸分子に存在する核酸分子は、単離した核酸として認められていない。
【００９７】
本願の「細胞」は、単離されていてもよく、細胞群体中、または培養物中に含まれていてもよく、生きた個体中に含まれていてもよく、哺乳動物細胞であってもよく、ヒトの細胞であってもよい。同様に、「組織」は、いかなる数の細胞を含んでもよく、生きた個体中に含まれていてもよく、その中から単離されていてもよい。
【００９８】
本願の「精製された」または「基本的に精製された」は、核酸またはポリペプチドについて用いる場合、これらの自然環境において単離された核酸またはポリペプチドを示し、これらが所定の試料中の全核酸またはポリペプチドまたは有機化学物の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を占めるようにする。本文において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によりタンパク質の純度を評価することができる。アガロースゲルおよびＥｔＢｒ染色により核酸の純度を評価することができる。
【００９９】
本願の「検出」とは、生体試料中のマーカーまたはマーカーの改変（例えば、マーカーのメチル化状態の改変または核酸またはタンパク質配列の発現レベル）を観察するあらゆるプロセスを示し、実際上にマーカーまたはマーカーの改変が検出されたかは問わない。言い換えれば、マーカーが存在しない、または感度レベルよりも低いと測定された場合でも、試料のマーカーまたはマーカーの改変を探測する行為が「検出」である。検出は、定量、半定量または非定量観察であってもよく、１個または複数個の対照試料の比較に基づいてもよい。本文で公開する結腸癌の検出は、前癌細胞の検出を含み、前記前癌細胞は、胃癌細胞への発展を開始し、または胃癌細胞に発展している、または胃癌細胞に発展する傾向が増加していると理解すべきである。胃癌の検出は、可能性のある死亡率または疾患条件の可能性のある予後の検出をさらに含んでもよい。
【０１００】
本願の「相同性」、「同一性」および「相似性」とは、２個の核酸分子の間の配列相似性を示す。各配列中の位置を比較して「相同性」、「同一性」または「相似性」を測定することができ、比較の目的のために、前記配列を照合することができる。比較する配列における同じ位置が同じ塩基で占められている場合、前記分子は、この位置において同じである。同じサイトが同じまたは相似するアミノ酸（例えば、空間的性質または帯電性において相似している）残基で占められている場合、前記分子は、この位置において相同である（相似している）といえる。相同性／相似性または同一性の百分比の発現とは、比較する配列が共有する位置における相同である、または相似するアミノ酸の数の関数をいう。「無関係である」または「非相同である」配列は、本発明の配列と４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。２個の配列を比較するとき、残基（アミノ酸または核酸）の欠失または余剰な残基の存在も、同一性および相同性／相似性を低下させる。具体的な実施形態において、２個またはさらに多くの配列またはサブ配列について、以下に記載するデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定するか、または例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））がオンラインで提供する手動比対および肉眼検査により測定し、比較ウィンドウまたは指定領域上で最大の対応性を比較し照合するときに、これらの配列の所定の領域での同一性が約６０％、または約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である場合、基本的に、または著しく相同である、相似する、または同一であることが認められる。この定義は、配列の相補物の測定に関するものでもあり、またはそれに用いることができる。そのため、本文の背景で許容される程度で、例えば、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ二本鎖体中に自然に存在する、または相補鎖における１本または２本の形式で自然存在することができると予測できる場合、所定の標的配列またはその多様体と相補するヌクレオチド配列自体が、標的配列と「相似する」とみなされ、かつ「相似する」核酸配列に関する場合、一本鎖配列、その相補配列、二本鎖の鎖複合体、同じ、または相似するポリペプチド生成物をコード可能な配列、および上記いずれかの許容されるあらゆる多様体を含む。相似性は、単一核酸鎖配列の解析の場合に限定する必要があり、例えば、細胞中の特定のＲＮＡ配列またはコード配列の発現の検出および定量を含むことができる。この定義は、欠失および／または添加を有する配列、ならびに置換を有する配列をさらに含む。実施形態において、同一性または相似性は、長さが少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１０、２１、２２、２３、２４、２５以上であるヌクレオチドの領域上、または長さが約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５を超える、もしくは約１００��を超えるヌクレオチドの領域上とすることができる。
【０１０１】
本願の「増幅」とは、核酸の１個の具体的な遺伝子座から複数個のコピーを得るプロセスを示し、前記核酸は、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。複数の既知の手段におけるいずれか１種を用いて増幅を実現することができ、前記手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写に基づく増幅および鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
本願の「標準増幅条件」とは、増幅反応混合物の基本成分および循環条件をいい、前記循環条件は、テンプレート核酸の変性、オリゴヌクレオチドプライマーとテンプレート核酸のアニーリング、およびポリメラーゼのプライマーの伸長により増幅生成物を生成する複数個の循環を含む。
【０１０３】
本願の「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、変性、プライマーとのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼとの伸長の循環が、標的ＤＮＡ配列のコピー数を約１０６倍以上に増幅するために用いられる技術を示す。核酸を増幅するために用いられるポリメラーゼ連鎖反応のプロセスは、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照することができる。
【０１０４】
本願の「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」とは、ＰＣＲ反応系中に蛍光基を加え、蛍光シグナルの蓄積を用いてＰＣＲプロセス全体をリアルタイムにモニタし、最後に、標準曲線によって未知のテンプレートを定量解析する方法を示す。このＰＣＲ技術において、サイクル閾値という重要な概念があり、Ｃｔ値ともいう。ＣはＣｙｃｌｅを表し、ｔはｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（閾値、臨界値）を表し、Ｃｔ値の意味は、各反応管内の蛍光シグナルが設定閾値に達するときに経た循環数である。例えば、蛍光閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の設定方法は次のとおりである。ＰＣＲ反応前の１５個サイクルの蛍光シグナルを蛍光バックグラウンドシグナルとし、蛍光閾値の既定値（デフォルト）を３〜１５サイクルの蛍光シグナルの標準偏差の１０倍と設定する。
【０１０５】
本願の「リアルタイムＰＣＲのｃｕｔ  ｏｆｆ値」とは、ある１つのバイオマーカーに対する試料陰陽性を判断する臨界Ｃｔ値を示す。本願のいくつかの具体的なリアルタイム方式により、「臨界Ｃｔ値（Ｃｕｔ  Ｏｆｆ値）は、一定数量の試料データにより、統計学的処理に基づき得られたもの」であり、この臨界Ｃｔ値は、必要な感度または特異性の要求により異なる。概述において、この臨界Ｃｔ値についてさらに例を挙げて説明する。
【０１０６】
本願の「感度」とは、一定の癌症試料において癌が検出される割合を示し、その計算式は、感度＝（検出された癌／すべての癌）であり、「特異性」とは、一定の健常者試料において健常が検出される割合を示し、その計算式は、特異性＝（検出されなかった陰性／全陰性）である。
【０１０７】
本願の「標識」または「検出可能な部分」は、ビームスプリッター、光化学、生化学、免疫化学、化学またはその他の物理的手段により検出できる成分である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて常用される酵素）、ビオチン、ジゴキシンまたはハプテンおよび検出可能なものとして製造可能なタンパク質があり、例えば、放射性標識をペプチドに入れるか、またはペプチドと特異性反応する抗体の検出に用いる。
【０１０８】
複数の異なる方法を用いて核酸分子を検出することができる。核酸検出方法は、例えば、ＰＣＲおよび核酸ハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含む。具体的には、標的核酸を増幅可能なオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）をＰＣＲ反応に用いることができる。ＰＣＲ方法は、通常、次のステップを含む。試料を得て、前記試料から核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両者）を単離し、前記核酸を、１種または複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、前記プライマーは、テンプレート核酸を増幅発生させることができる条件の下で、特異的にテンプレート核酸とハイブリダイズする。テンプレート核酸の存在下で、増幅生成物を生成する。核酸増幅および増幅生成物検出の条件は、当業者が既知のものである。基礎ＰＣＲ技術に対する複数の改良がすでに開発されており、アンカードＰＣＲ、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むが、これらに限定されない。増幅反応におけるプライマー対は、テンプレート核酸の対応する鎖とアニーリングする必要があり、かつ互いに適切な距離を保つべきであり、ポリメラーゼが有効に領域を超えて重合できるようにし、例えば電気泳動を用いて増幅生成物を容易に検出できるようにする。例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）などのコンピュータプログラムを用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができ、相似する融解温度を有するプライマーの設計に役立つ。通常、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１０〜３０または４０または５０個のヌクレオチド（例えば、長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、  ２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである）であるが、オリゴヌクレオチドプライマーは、さらに長くてもさらに短くてもよく、適切な増幅条件を用いさえすればよい。
【０１０９】
通常、検出可能な標識を用いて増幅生成物またはハイブリダイゼーション複合体の検出を実現する。用語「標識」は、核酸に関する場合、検出可能な物質を核酸にカップリング（すなわち、物理的に結合）することによる核酸直接標識、および検出可能な物質を直接標識した別の試薬と反応させることによる核酸間接標識を含むことを意図する。検出可能な物質は、各種酵素、補欠分子族、蛍光材料、化学発光材料、生物発光材料および放射性材料を含む。適切な酵素の実例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子族複合体の実例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。適切な蛍光材料の実例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを含む。化学発光材料の実例は、ルミノールを含む。生物発光材料の実例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびイクオリンを含む。間接標識の実例は、ビオチンを用いて核酸を末端標識し、蛍光標識したストレプトアビジンを用いてこの核酸を検出することを含む。
【０１１０】
概述
【０１１１】
本願は、セプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子を併用することにより癌を検出する方法、ならびに対応する組成物、試薬キットおよび核酸配列を提供し、非侵襲地の方式で、高速かつ敏捷に癌を診断し検出する。具体的な実施態様により、癌において、特に胃癌において、セプチン９およびＲＮＦ１８０の併用は、検出の感度または特異性を大幅に向上させることがわかる。
【０１１２】
本願は、ＲＮＦ１８０遺伝子を用い、好ましくはセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子を併用することにより、疾患の程度を等級付けする方法、ならびに対応する組成物、試薬キットおよび核酸配列をさらに提供し、非侵襲性の方式で、高速かつ敏捷に癌および炎症を等級付けし、特に胃癌および胃炎を等級付けする。
【０１１３】
下記のものは、本願の組成物、試薬キット、核酸配列および検出方法の実施例である。上文で提供した一般的な記述を考慮し、複数のその他の実施態様を実施可能であることを理解することができる。
【０１１４】
第１の実施形態において、生体試料中の細胞増殖性異常を診断または検出する組成物を公開し、前記組成物は、セプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含む。具体的には、前記組成物は、セプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸配列を含むだけでなく、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸配列をさらに含む。
【０１１５】
本願は、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含み、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けする、個体の疾患の程度を等級付けする組成物をさらに公開する。好ましくは、前記組成物は、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列を含むだけでなく、セプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列をさらに含む。
【０１１６】
以下、先ずセプチン９遺伝子について紹介する。ヒトセプチン９遺伝子（ＭＬＬセプチン様融合タンパク質、ＭＬＬセプチン様融合タンパク質ＭＳＦ−Ａ、Ｓｌｐａ、Ｅセプチン、Ｍｓｆ、セプチン様タンパク質卵巣／乳腺セプチン（Ｏｖ／Ｂｒセプチン）およびセプチンＤ１ともいう）は、コンティグＡＣ０６８５９４．１５．１．１６８５０１内の染色体１７ｑ２５に位置し、セプチン遺伝子ファミリーのメンバーである。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３は、セプチン９のＣｐＧを豊富に含むプロモーター領域の配列を提供する。
【０１１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３配列は次のとおり示される。
【０１１８】
ＣＧＴＴＡＣＣＣＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＴＡＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＣＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＡＣＧＣＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＡＣＴＡＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＴＴＣＡＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＣＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＡＧＴＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＧＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ
【０１１９】
セプチン遺伝子ファミリーのメンバーは、小胞輸送から胞質分裂にわたる複数の細胞機能に関連する。セプチン９を破壊する作用は、不完全な細胞分裂をもたらし、セプチン９およびその他のタンパク質はすでに癌原遺伝子ＭＬＬの融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）として示されており、このことは、腫瘍発生における作用を表す。
【０１２０】
セプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の連続配列より選ばれるものに等しい、または相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも９個塩基長セグメントを含む。
【０１２１】
１つの具体的な実施態様により、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列は、以下に示すＲＮＦ１８０のプロモーター領域ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０に等しい、または相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含んでもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭｉ００１１１３５６１ｃｈｒ５１６３４９７１５３−６３４９７７５８に対応する。下線は「転写開始点」を示す。
【０１２２】
いくつかの好ましい実施態様により、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０の配列に基づき、プライマーおよびプローブを設計することができる。ＰＣＲ増幅のプライマーおよびプローブとして適した配列は、あらゆる適切な長さを含んでもよく、例えば、少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでもよく、または少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５個または５０個を超えるヌクレオチドを含んでもよい。これらの具体的な実施態様において、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列またはその相補配列と約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相似性を有してもよい。
【０１２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０（転写開始点の−２３４ｂｐから＋３７２ｂｐ）
【０１２４】
ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴ
【０１２５】
好ましくは、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列は、以下に示すＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１に等しい、または相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含む。
【０１２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１（転写開始点の−１６７ｂｐから＋１３５ｂｐ）
【０１２７】
ＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣ
【０１２８】
さらに好ましくは、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するための核酸配列は、以下に示すＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２に等しい、または相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列を含んでもよい。
【０１２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２（転写開始点の−４３ｂｐから＋１３５ｂｐ）
【０１３０】
ＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣ
【０１３１】
そのため、ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーを設計し、ＲＮＦ１８０遺伝子プロモーター領域（転写開始点の−２３４ｂｐから＋３７２ｂｐ）のＤＮＡメチル化の検出に用いることができ、検出するプロモーター領域は転写開始点の−１６７ｂｐから＋１３５ｂｐであることが好ましく、検出するプロモーター領域は転写開始点の−４３ｂｐから＋１３５ｂｐであることがさらに好ましく、検出に用いるアンプリコンの大きさの小範囲は、６６ｂｐから１３０ｂｐである。
【０１３２】
例えば、いくつかの具体的な実施態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２（転写開始点の−４３ｂｐから＋１３５ｂｐ）を標的領域として、ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内にメチル化が存在するか否かを検出するためのプライマーおよびプローブを設計する。そのため、出願により、複数セットのプローブおよびプライマーの組み合わせを設計し、各セットのプローブおよびプライマーの組み合わせの性能には、違いが存在する可能性がある。そのため、高速なプライマーおよびプローブをスクリーニングするため、本願は、次のステップにより、人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いて、癌（例えば胃癌）および健常なＤＮＡをテンプレートとして、設計した複数セットのプローブおよびプライマーの組み合わせをスクリーニングする。
【０１３３】
１．ＲＮＦ１８０遺伝子プロモーター領域のプライマーおよびプローブを設計する。
【０１３４】
２．人工メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを設計する。
【０１３５】
３．人工メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを用いてプライマーおよびプローブをスクリーニングし、人工メチル化ＤＮＡには増幅があり、人工非メチル化は増幅を示さない。
【０１３６】
４．健常な白血球ＤＮＡから抽出したＤＮＡを用いてプライマーおよびプローブをスクリーニングする。
【０１３７】
５．健常者の白血球ＤＮＡにおいて増幅がない、または増幅が少ない場合、ヒト胃癌組織から抽出したＤＮＡを用いてプライマーおよびプローブをスクリーニングする。
【０１３８】
６．臨床研究段階の健常な血漿から抽出したＤＮＡでプライマーおよびプローブをスクリーニングする。
【０１３９】
７．臨床研究段階で健常な血漿において増幅がない、または増幅が少ない場合、胃癌患者から抽出したＤＮＡを用いてプライマーおよびプローブをスクリーニングする。
【０１４０】
上記スクリーニングにより、次の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９をプライマーおよびプローブとして構築した。
【０１４１】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １  （１８０Ｆ７）  ５’−ＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＧＧＧＴＣ−３’
【０１４２】
プローブ：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２  （１８０Ｐ７）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１４３】
Ｒｅｄ−ＡＡＣＧＣＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣ−ＢＨＱ２−３’
【０１４４】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３  （１８０Ｒ７）  ５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＧ−３’
【０１４５】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０１４６】
プローブ：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ５  （１８０Ｐ２）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１４７】
Ｒｅｄ−ＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧ−ＢＨＱ２−３’
【０１４８】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ６  （１８０Ｒ２）  ５’−ＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧ−３’
【０１４９】
プローブ：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７  （１８０Ｐ１４）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１５０】
Ｒｅｄ−ＣＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０１５１】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ８  （１８０Ｒ１３５）  ５’−ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣ−３’
【０１５２】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ９  （１８０Ｒ１４）  ５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡ−３’
【０１５３】
さらに、出願人は、スクリーニングした上記プライマーおよびプローブにより、少なくとも１つのプライマーおよびプローブの組み合わせを設計し、中でも次の４つの組み合わせが好ましい。
【０１５４】
Ａ、プライマーおよびプローブの組み合わせ１（アンプリコン６６ｂｐ、転写開始点の−４３ｂｐから＋２３ｂ）
【０１５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １  （１８０Ｆ７）  ５’−ＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＧＧＧＴＣ−３’
【０１５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２  （１８０Ｐ７）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１５７】
Ｒｅｄ−ＡＡＣＧＣＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣ−ＢＨＱ２−３’
【０１５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３  （１８０Ｒ７）  ５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＧ−３’
【０１５９】
Ｂ、プライマーおよびプローブの組み合わせ２（アンプリコン８６ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋９１ｂｐ）
【０１６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０１６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ５  （１８０Ｐ２）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１６２】
Ｒｅｄ−ＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧ−ＢＨＱ２−３’
【０１６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ６  （１８０Ｒ２）  ５’−ＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧ−３’
【０１６４】
Ｃ、プライマーおよびプローブの組み合わせ３（アンプリコン１３０ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋１３５ｂｐ）
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０１６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７  （１８０Ｐ１４）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１６７】
Ｒｅｄ−ＣＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０１６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ８  （１８０Ｒ１３５）  ５’−ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣ−３’
【０１６９】
Ｄ、プライマーおよびプローブの組み合わせ４（アンプリコン９１ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋９６ｂｐ）
【０１７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０１７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７  （１８０Ｐ１４）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０１７２】
Ｒｅｄ−ＣＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０１７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ９  （１８０Ｒ１４）  ５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡ−３’
【０１７４】
次に、上述したこれらのプライマーおよびプローブの組み合わせと上記遺伝子配列の結合点（そのうち同じ形状の下線は対応部分を示す）についてさらに説明する。
【０１７５】
Ａ、プライマーおよびプローブの組み合わせ１（アンプリコン６６ｂｐ、転写開始点の−４３ｂｐから＋２３ｂｐ）
【０１７６】
ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧ
【０１７７】
結合点の概要：
【０１７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １（１８０Ｆ７）５’−ＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＧＧＧＴＣ−３’
【０１７９】
ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣ
ＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣ
【０１８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２（１８０Ｐ７）５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ−
ＡＡＣＧＣＴＣＧＡＡＣＴ
ＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣ−ＢＨＱ２−３’
【０１８１】
ＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧ
【０１８２】
５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＧ−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３（１８０Ｒ７）
【０１８３】
ＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴ
【０１８４】
Ｂ、プライマーおよびプローブの組み合わせ２（アンプリコン８６ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋９１ｂｐ）
【０１８５】
ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧ
【０１８６】
ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣ
結合点の概要：
【０１８７】
ＢＨＱ２−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ５（１８０Ｐ２）
【０１８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４（１８０Ｆ２４）５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ−ＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧ−ＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧ
【０１８９】
ＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧ
【０１９０】
５’−ＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧ−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ６（１８０Ｒ２）
【０１９１】
ＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴ
【０１９２】
Ｃ、プライマーおよびプローブの組み合わせ３（アンプリコン１３０ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋１３５ｂｐ）
【０１９３】
ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧ
【０１９４】
ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣ
結合点の概要：
【０１９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４（１８０Ｆ２４）５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７（１８０Ｐ１４）５’−ＣＧＴＣＧＧＡＧ
【０１９６】
ＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧ
【０１９７】
ＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０１９８】
ＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧ
ＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧ
【０１９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ８（１８０Ｒ１３５）
【０２００】
５’−ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣ−３’
【０２０１】
ＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴ
【０２０２】
Ｄ、プライマーおよびプローブの組み合わせ４（アンプリコン９１、転写開始点の＋５ｂｐから＋９６ｂｐ）
【０２０３】
ＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＧ
【０２０４】
ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣ
結合点の概要：
【０２０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４（１８０Ｆ２４）５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７（１８０Ｐ１４）５’−ＣＧＴＣＧＧＡＧ
【０２０６】
ＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧ
【０２０７】
ＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０２０８】
ＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧ
【０２０９】
５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡ−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ９（１８０Ｒ１４）
【０２１０】
ＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴ
【０２１１】
いくつかの具体的な実施態様において、前記組成物は、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換する試薬をさらに含む。例えば、この試薬は亜硫酸水素塩であってもよい。
【０２１２】
いくつかの具体的な実施態様において、前記細胞増殖性異常は癌である。例えば、前記細胞増殖性異常は胃癌である。
【０２１３】
いくつかの具体的な実施態様において、前記疾患の程度は、３つのレベルにわかれ、第１のレベルは健常、第２のレベルは炎症、第３のレベルは癌である。好ましくは、前記炎症は胃炎であり、かつ前記癌は胃癌である。
【０２１４】
さらに、本願の上文において記述または提案した用途について、第２の実施形態において、第１の実施形態において公開した生体試料を診断または検出する組成物を含む試薬キットを公開する。この組成物に対する記述は、第１の実施形態と類似しており、ここでは再び繰り返さない。
【０２１５】
こうした試薬キットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数個の容器に密封収容されたベクターを含んでもよく、各容器に、前記方法において使用する１つの独立素子をいずれも含む。例えば、容器は、標識を検出可能である、またはその可能性があるプローブを含んでもよい。
【０２１６】
典型的には、本願の試薬キットは、患者の生体試料を収容するための容器および／または試薬キットの使用および結果の解釈の説明を含み、具体的には、本願の試薬キットは、企業およびユーザの角度から見て必要な材料を含み、患者の生体試料を収容するための容器、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器および包装中に挿入する取扱説明書を含む。前記成分を特定の治療または非治療用途に用いることを説明するため、容器上にラベルを使用してもよく、さらに上文に記載したように、体内または体外で使用することを説明してもよい。
【０２１７】
本願の試薬キットは、複数の実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器、前記容器上のラベル、および前記容器内の成分を含む試薬キットである。前記成分は、セプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を検出するための核酸を含み、前記容器上のラベルは、前記成分を用いて試料のＤＮＡのメチル化の程度を評価するために用いることができることを明記し、本試薬キットをいかにして使用するかについて説明する。この試薬キットは、説明、および組織試料を製造し、本願の組成物を試料に用いる材料をさらに含んでもよい。この試薬キットは、例えば、亜硫酸水素塩など、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換するための試薬を含んでもよい。
【０２１８】
第３の実施形態において、個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０およびセプチン９遺伝子ならびにそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより、個体における細胞増殖性異常を検出することを含む、個体における細胞増殖性異常を検出するための方法を公開する。
【０２１９】
本願は、個体から単離した生体試料におけるＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果により疾患の程度を等級付けすることを含む、個体の疾患の程度を等級付けするための方法をさらに公開する。好ましくは、前記方法は、前記個体から単離した生体試料におけるセプチン９遺伝子およびそのセグメントのうち少なくとも１つの標的領域内のメチル化の程度を確定し、ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化検出結果を総合することにより疾患の程度を等級付けすることをさらに含む。
【０２２０】
典型的には、本願の方法は、試薬を用いて、遺伝子の５位がメチル化していないシトシン塩基をウラシル、またはハイブリダイズ性能の面において検出可能にシトシンとは異なる他の塩基に変換するステップをさらに含む。
【０２２１】
ＤＮＡの亜硫酸水素塩は、既知のＣｐＧメチル化状態の評価に用いるツールに修飾する。真核細胞のＤＮＡにおいて、５−メチルシトシンは、最もよく見られる共有結合塩基修飾である。例えば、転写の調整、遺伝ブロッティングおよび腫瘍の発生において作用する。そのため、５−メチルシトシンを遺伝情報成分として確認することは、相当大きな意義を有する。しかしながら、５−メチルシトシンとシトシンは同じ塩基対形成挙動を有するため、５−メチルシトシンは、測定によって同定することができない。また、例えば、ＰＣＲ増幅プロセスにおいて、５−メチルシトシンがもつエピジェネティクス情報が完全に失われる。
【０２２２】
ＤＮＡにおける５−メチルシトシンの存在の解析に最もよく用いられる方法は、亜硫酸水素塩とシトシンの特異反応に基づくものであり、これによりその後のアルカリ加水分解の後、シトシンが対形成挙動上チミンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、重要なことは、これらの条件の下、５−メチルシトシンは修飾されないことを保つことである。その結果、当初のＤＮＡは、この方式で変換され、本来そのハイブリダイゼーション挙動上シトシンと区別できなかったメチルシトシンが、唯一残ったシトシンとして、通常の既知の分子生物学技術、例えば、増幅およびハイブリダイゼーションで検出することができるようになる。これらすべての技術は、いずれも異なる塩基対形成特性に基づき、現在、充分に利用することができる。
【０２２３】
そのため、典型的には、本願は、亜硫酸水素塩技術と１種または複数のメチル化測定の併用を提供し、セプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子配列内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を確定するために用いる。ゲノムのＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていても、メチル化されていなくてもよい（または、それぞれ上・下メチル化（ｕｐ−ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）という）。しかしながら、本発明の方法は、例えば、血液または糞便中の低濃度腫瘍細胞など、異質な生体試料の解析に適している。そのため、こうした試料中のＣｐＧ位置のメチル化状態を解析するとき、当業者は、定量測定法を用いて、メチル化状態ではなく、特定のＣｐＧ位置におけるメチル化レベル（例えば、百分比、部数、割合、比例または程度）を確定することができる。それに対応して、メチル化状况またはメチル化状態という用語は、ＣｐＧ位置におけるメチル化の程度を反映した値をいうと考えるべきである。明確な説明がある場合を除き、用語「超メチル化」または「上メチル化」は、メチル化レベルが特定の臨界値を超えることをいうと考えるべきであり、前記臨界値は、所定の母集団の平均値または中央値のメチル化レベルの値を表すものであってもよく、または最適化された臨界レベルであることが好ましい。本文における「臨界」とは、「閾値」をいってもよい。本発明の上文、下文において、次の配列より選ばれる遺伝子またはゲノム配列内の、またはそれと関係する（例えば、プロモーターまたは調節領域内）のすべてのＣｐＧ位置にとって、用語「メチル化した」、「超メチル化した」または「上メチル化した」は、メチル化レベルが臨界値ゼロ（０）％（またはその同等値）よりも高いメチル化を含むと考えるべきであり、前記配列は、上記セプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子配列である。
【０２２４】
いくつかの実施態様において、本願の方法は、具体的には、前記試薬で処理したセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子またはそのセグメントを増幅酵素およびプライマーと接触させ、前記処理した遺伝子またはセグメントを増幅させ増幅生成物を生成するか、または増幅させないこと、プローブを用いて増幅生成物を検出すること、および前記増幅物が存在するか否かに基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度を確定することを含む。
【０２２５】
かつ、典型的には、前記接触または増幅は、少なくとも１種の次から選ばれる方法を適用することを含む。耐熱ＤＮＡポリメラーゼを前記増幅酵素として使用する。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠乏したポリメラーゼを使用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。標識を検出可能な増幅生成物を有する核酸分子を生成する。
【０２２６】
すなわち、好ましくは、ＰＣＲ方式を用いてメチル化の程度を測定し、「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ技術」（Ｅａｄｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６，１９９９）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ  ＴＭ（メチル化感受性のモノヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１，１９９７）、メチル化特異性ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６，１９９６；米国特許５，７８６，１４６）およびメチル化したＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」；Ｔｏｙｏｔａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３０７−１２，１９９９）などの測定方法が、セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の程度の測定に用いられる。
【０２２７】
中でも、「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」測定は、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ＿）技術を使用した高スループット定量メチル化測定であり、ＰＣＲステップの後、さらなる操作を必要としない（Ｅａｄｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６，１９９９）。簡単に言えば、「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」方法は、ゲノムＤＮＡの混合試料で開始し、この混合試料は、標準操作（亜硫酸水素塩プロセスでメチル化していないシトシン残基をウラシルに変換する）に基づき、亜硫酸水素ナトリウム反応においてメチル化依存の配列差異のプールに変換される。その後、「バイアスのある（ｂｉａｓｅｄ）」反応（既知のＣｐＧジヌクレオチドを重ねるＰＣＲプライマーを用いる）において蛍光に基づくＰＣＲを行う。増幅プロセスレベルおよび蛍光検出プロセスレベルにおいて、配列の差をもたらすことができる。
【０２２８】
「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」測定は、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化モデルの定量試験として用いることができ、配列区分は、プローブハイブリダイゼーションレベルで発生する。この定量方式において、特定の推定メチル化サイトが重なる蛍光プローブの存在下で、ＰＣＲ反応は、メチル化特異の増幅を提供する。ＤＮＡ量の入力に用いる無バイアス対照は、次の反応により提供する。プライマーおよびプローブは、いずれもいかなるＣｐＧジヌクレオチドを覆わない。「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」方法は、「ＴａｑＭａｎ＿」、「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ＿」など、適したあらゆるプローブとともに用いることができる。
【０２２９】
ＴａｑＭａｎ＿プローブは、蛍光「リポーター」および「クエンチャー」分子二重標識であり、相対的に高いＧＣ含有量領域に特異に設計されており、ＰＣＲサイクルにおいて、順方向または逆方向のプライマーよりも約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ＿プローブは、ＰＣＲアニーリング／延伸ステップにおいて、充分なハイブリダイゼーションを保つ。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて酵素が新しい鎖を合成するときに、最終的にアニーリングしたＴａｑＭａｎ＿プローブに接する。Ｔａｑポリメラーゼ５’〜３’エンドヌクレアーゼ活性は、その後、ＴａｑＭａｎ＿プローブを消化してそれに替わり、蛍光リポーター分子を釈放してリアルタイム蛍光検出システムを用いてその現在クエンチされていないシグナルを定量検出するために用いられる。
【０２３０】
「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」解析に用いられる典型的な試薬（例えば、「蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ」に基づく試薬キットにおいて探し出すことができる）は、特定の遺伝子（または亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）に用いるＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ＿またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ＿プローブ、最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼを含んでもよいが、これらに限定されない。
【０２３１】
かつ、具体的には、好ましい実施形態において、前記方法は、次のステップを含む。
【０２３２】
第１のステップにおいて、解析する組織試料を得る。この由来は、例えば、細胞系、組織切片、生検組織、パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞、および可能性のあるそのすべての組み合わせのあらゆる適した由来である。好ましくは、ＤＮＡの前記由来は、糞便または体液であり、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、単離した血球、血液から単離した細胞より選ばれる。
【０２３３】
その後、前記試料からゲノムＤＮＡを単離する。先行技術におけるいかなる標準手段によって単離してもよく、市販されている試薬キットを使用することを含む。簡単に言えば、目的ＤＮＡが細胞膜の中に包まれているとき、この生体試料は、必ず破砕され、酵素、化学または機械手段で分解されていなければならない。その後、例えば、プロテインキナーゼＫの消化により、タンパク質およびその他の汚染物を取り除く。次いで、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機抽出またはＤＮＡを固相支持物に結合するなど、各種方法により実現することができる。方法の選択については、時間、費用および必要なＤＮＡの量を含む複数の要素の影響を受ける。
【０２３４】
前記試料ＤＮＡが細胞膜の中に包まれていない場合（例えば、血液試料由来の循環ＤＮＡ）、先行技術におけるＤＮＡを単離および／または精製する標準的な方法を用いてもよい。これらの方法は、例えば塩化グアニジニウムまたは尿素などのカオトロピック塩などのタンパク質分解試薬、またはドデカンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化シアンなどの洗浄剤を用いることを含む。その他の方法は、エタノール沈殿またはプロパノール沈殿、遠心による真空濃縮などを含むが、これらに限定されない。当業者は、例えば限外濾過などのフィルタなどの装置、ケイ素表面または膜、磁性粒子、ポリスチレン粒子、ポリスチレン表面、正電荷を帯びた表面、および陽性電荷を帯びた膜、帯電膜、帯電表面、帯電転換膜、帯電転換表面を用いてもよい。
【０２３５】
核酸が抽出されたら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを解析に用いる。
【０２３６】
前記方法の第２のステップにおいて、前記ゲノムＤＮＡ試料を処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。これは、本文でいう「前処理」または「処理」として理解されるべきである。
【０２３７】
これは、好ましくは亜硫酸水素塩試薬処理により実現する。用語「亜硫酸水素塩試薬」とは、ここで公開するメチル化および未メチル化の区分に用いることができるＣｐＧジヌクレオチド配列など、亜硫酸水素塩、亜硫酸水素塩（ｄｉｓｕｌｆｉｔｅ）、重亜硫酸塩またはその組み合わせを含む試薬をいう。前記処理は、本分野において既知のものである（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、参照することによりその全体を本文に併合する）。好ましくは、この亜硫酸水素塩処理は、変性溶剤の存在下で行い、前記変性溶剤は、ｎーアルキルグリコール、特にジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行うが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記変性溶剤は、１％から３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。この亜硫酸水素塩反応は、例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８，−テトラメチルクロマン２−カルボン酸などのクロマン誘導体、または例えば没食子酸などのトリヒドロキシ安息香酸およびその誘導体などの除去剤の存在下で行う（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照、参照することによりその全体を本文に併合する）。この亜硫酸水素塩変換は、好ましくは３０℃から７０℃の反応温度下で行い、反応中の温度は短時間で８５℃超まで増加させる（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照、参照することによりその全体を本文に併合する）。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡは、好ましくは定量前に精製を行う。これは、例えば限外濾過など、先行技術のうちいかなる既知の方法で行ってもよいが、これに限定されず、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ＾（ＴＭ）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＾（ＴＭ）製）により行うことが好ましい。
【０２３８】
前記方法の第３のステップにおいて、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドおよび増幅酵素を用いて、処理済のＤＮＡのセグメントを増幅する。同じ反応容器において同時に数種のＤＮＡセグメントの増幅を行ってもよい。通常、この増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う。好ましくは、前記増幅生成物の長さは、１００〜２，０００塩基対である。
【０２３９】
セプチン９遺伝子およびそのセグメントのメチル化の検出については、例えば次のようなセプチン９に対するプライマーおよびプローブを用いる。
【０２４０】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １４  ＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ
【０２４１】
プライマー：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １５  ＣＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＡＴ
【０２４２】
プローブ：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １６  ＧＡＡＣＣＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＣＧＣＧ
【０２４３】
ＲＮＦ１８０遺伝子およびそのセグメントのメチル化の検出については、ＲＮＦ１８０に対する前記スクリーニング方法でスクリーニングするプライマーおよびプローブを用いる。例えば、１つの好ましい実施態様において、上記プライマーおよびプローブの組み合わせ１、２、３、４のうちのいかなる組み合わせを用いてもよい。
【０２４４】
得られたセグメントを増幅することにより、直接または間接的に検出可能なラベルをもつことができる。好ましくは、ラベルは蛍光ラベル、放射性核種または付着可能な分子セグメントの形式である。
【０２４５】
前記方法の第４のステップにおいて、処理前のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を確定するため、前記方法の第３のステップで得た増幅生成物を解析する。
【０２４６】
第４のステップにおいて、増幅生成物の検出は、リアルタイム検出プローブにより行う。本発明において、各種商業用リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、先行技術の標準操作に基づき、リアルタイムＰＣＲの検出を行うことができる。いくつかの具体的な実施態様により、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）において、リアルタイムＰＣＲの検出を行う。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート２５〜４０ｎｇおよび３００〜６００ｎＭプライマー、１５０〜３００ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、５０〜４００ｕＭの各ｄＮＴＰ、１〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲにより最終的な２ｕｌ〜１００ｕｌの体積まで緩衝する。８５〜９９℃で３〜６０分間持続し、プレサイクルで試料を増幅し、直後に５０〜７２℃で１〜３０秒間の３５〜５５サイクルのアニーリングを行い、４５〜８０℃で５〜９０秒間アニーリングし、８５〜９９℃で５〜９０秒間変性する。
【０２４７】
メチル化したＲＮＦ１８０遺伝子およびセプチン９遺伝子のみがセグメント上で増幅が観測されることにより、５−メチルシトシンを含むＲＮＦ１８０およびセプチン９プロモーター領域との特異性のプローブを用いて前記遺伝子セグメントを検出する。かつ、いくつかの具体的な実施態様において、βアクチンをＰＣＲの内部基準として、βアクチン配列と相補するプライマーを用いてβアクチンアンプリコンを生成し、かつ特定のプローブを用いてβアクチンアンプリコンを検出する。各試料は、少なくとも１回のリアルタイムＰＣＲを行い、いくつかの具体的な実施態様において、２回のリアルタイムＰＣＲ検出を行う。
【０２４８】
前記方法の第５のステップにおいて、それぞれ前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を現し、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定されており、また次のステップをさらに含む。Ａ）測定する試料のセプチン９に対応するＰＣＲ  Ｃｔ値とセプチン９の予め設定したｃｕｔ値（すなわち、臨界Ｃｔ値）とを比較し、これによりセプチン９遺伝子に基づく解析結果が陽性であるか否かを確定する。Ｂ）測定する試料のＲＮＦ１８０に対応するＰＣＲ  Ｃｔ値とＲＮＦ１８０の予め設定したｃｕｔ値とを比較し、これによりＲＮＦ１８０遺伝子に基づく解析結果が健常であるか、胃炎であるか、胃癌（陽性）であるかを確定する。ｃ）前記Ａ）およびＢ）ステップの結果を総合し、前記試料の最終解析結果が健常であるか、胃炎であるか、胃癌（陽性）であるかを確定する。
【０２４９】
本願の具体的な実施態様により、一定数の胃癌試料および健常試料のセプチン９およびＲＮＦ１８０の平均Ｃｔ値に基づき、セプチン９およびＲＮＦ１８０に対する胃癌、胃炎および健常の臨界Ｃｔ値を確定する。いくつかの好ましい実施態様において、セプチン９の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の測定に用いる試薬キットは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社（ドイツ）より購入されたため、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓの説明書により、セプチン９臨界Ｃｔ値は４５Ｃｔであると確定することができる。ＲＮＦ１８０の臨界Ｃｔ値は、一定数の胃癌試料、胃炎および健常試料のＲＮＦ１８０の平均Ｃｔ値に基づき確定される。かつ、ＲＮＦ１８０の臨界Ｃｔ値は、さらに実際に必要な感度に関係し、感度の要求が高いほど、選んだ臨界Ｃｔ値が大きくなる。
【０２５０】
かつ、本願は、異なる方法を用いてＣｔ値を解析することができる。例えば、ΔＣｔまたはｄＣＴを用いて、アクチンＣｔをＰＣＲ内部対照とし、セプチン９ＣｔからアクチンＣｔを減算してセプチン９のｄＣＴ値を得る。同様に、ＲＮＦ１８０ＣｔからアクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得る。それに対応して、ΔＣｔまたはｄＣＴを検出基準として用いる場合、前記方法の第５のステップにおいて、それぞれ前記セプチン９およびＲＮＦ１８０の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を現し、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値により確定されており、また次のステップをさらに含む。Ａ）測定する試料のセプチン９に対応するＰＣＲΔＣｔ値とセプチン９の予め設定したΔｃｕｔ値（すなわち、臨界Ｃｔ値）とを比較し、これによりセプチン９遺伝子に基づく解析結果が陽性であるか否かを確定する。Ｂ）測定する試料のＲＮＦ１８０に対応するＰＣＲΔＣｔ値とＲＮＦ１８０の予め設定したΔｃｕｔ値とを比較し、これによりＲＮＦ１８０遺伝子に基づく解析結果が健常であるか、胃炎であるか、胃癌（陽性）であるかを確定する。ｃ）前記Ａ）およびＢ）ステップの結果を総合し、前記試料の最終解析結果が健常であるか、胃炎であるか、胃癌（陽性）であるかを確定する。
【０２５１】
上記内容を総合すると、本願は、以上記載した組成物、核酸配列、試薬キットおよびその用途、ならびに上記検出方法により、それぞれを併用してセプチン９およびＲＮＦ１８０遺伝子ならびにそのセグメントのメチル化した核酸配列の検出に用いることにより、癌検出の感度および特異性、特に胃癌検出の感度および特異性が向上するようにし、これにより検出結果の正確さおよび信頼性を保証する。かつ、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを併用して胃炎および胃癌を等級付けすることを実現し、これにより疾患の等級付けの感度および特異性がいずれも向上するようにする。
【０２５２】
次に具体的な実施例について詳細に説明する。
【実施例】
【０２５３】
実施例１：プライマーおよびプローブのスクリーニング
【０２５４】
いくつかの具体的な実施態様により、セプチン９の遺伝子ＤＮＡ配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の測定に用いる試薬キットは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社（ドイツ）より購入されたため、直接、試薬キットの説明書により、セプチン９の遺伝子試験に対するプライマーおよびプローブを得ることができる。ＲＮＦ１８０遺伝子については、複数セットのプローブおよびプライマーの組み合わせを設計し、各セットのプローブおよびプライマーの組み合わせの性能には、違いが存在する可能性がある。そのため、次の実施例において、プローブおよびプライマーについてスクリーニングを行った。
【０２５５】
本実施例において、先ず人工メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを用いてＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブについてスクリーニングを行った。本実施例は、次のステップを含む。
【０２５６】
先ず、ＲＮＦ１８０の各種プライマーおよびプローブを設計し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２までより選ばれるものに等しい、相補する、または中程度にストリンジェントな条件もしくはストリンジェントな条件でハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドおよびその相補配列であればよい。
【０２５７】
次いで、人工メチル化したオリゴヌクレオチド配列および人工非メチル化のオリゴヌクレオチド配列をテンプレートとし、異なるプローブおよびプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ増幅を行った。本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０２５８】
最後に、ＰＣＲ試験結果により、次の４セットの適切なプライマーおよびプローブをスクリーニングした。
【０２５９】
プライマーおよびプローブの組み合わせ１  （アンプリコン６６ｂｐ、転写開始点の−４３ｂｐから＋２３ｂｐ）
【０２６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １  （１８０Ｆ７）  ５’−ＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＧＧＧＴＣ−３’
【０２６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２  （１８０Ｐ７）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０２６２】
Ｒｅｄ−ＡＡＣＧＣＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣ−ＢＨＱ２−３’
【０２６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３  （１８０Ｒ７）  ５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＧ−３’
【０２６４】
プライマーおよびプローブの組み合わせ２  （アンプリコン８６ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋９１ｂｐ）
【０２６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０２６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ５  （１８０Ｐ２）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０２６７】
Ｒｅｄ−ＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧ−ＢＨＱ２−３’
【０２６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ６  （１８０Ｒ２）  ５’−ＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧ−３’
【０２６９】
プライマーおよびプローブの組み合わせ３  （アンプリコン１３０ｂｐ、転写開始点の＋５ｂｐから＋１３５ｂｐ）
【０２７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０２７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７  （１８０Ｐ１４）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０２７２】
Ｒｅｄ−ＣＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０２７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ８  （１８０Ｒ１３５）  ５’−ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣ−３’
【０２７４】
プライマーおよびプローブの組み合わせ４  （アンプリコン９１、転写開始点の＋５ｂｐから＋９６ｂｐ）
【０２７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ４  （１８０Ｆ２４）  ５’−ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’
【０２７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ７  （１８０Ｐ１４）  ５’−ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ
【０２７７】
Ｒｅｄ−ＣＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴ−ＢＨＱ２−３’
【０２７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ９  （１８０Ｒ１４）  ５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡ−３’
【０２７９】
結論：人工メチル化オリゴヌクレオチドテンプレートは増幅があり、人工非メチル化オリゴヌクレオチドテンプレートは増幅がなく、プライマーおよびプローブの設計が正確であることが示された。４セットのプライマーおよびプローブは、いずれもメチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートを区別し、ＲＮＦ１８０試験におけるプライマーおよびプローブとして用いることができる。異なるプローブおよびプライマーの組み合わせでは、効果は異なるが、以上の４セットのプローブは、いずれもＲＮＦ１８０試験におけるプライマーおよびプローブとして適している。
【０２８０】
次いで、癌および健常ＤＮＡをテンプレートとして用い、ＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブをさらにスクリーニングした。
【０２８１】
４例の胃癌（Ｓ１〜Ｓ４）、２例の腸癌（Ｃ１〜Ｃ２）、２例の肺癌（Ｌ１〜Ｌ２）、１例の血液の癌（Ｊｕｒｋａｔ）および１例の健常者（ＷＢＣ）の試料を得た。４例の胃癌、２例の腸癌、２例の肺癌、１例の血液の癌および１例の健常者のゲノムＤＮＡを抽出した。Ｊｕｒｋａｔ細胞ゲノムＤＮＡは陽性対照として、健常ＤＮＡは陰性対照として用いられた。すべての癌試料は、ＢｉｏＣｈａｉｎ社から入手した。ヒト健常試料は、ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社から入手した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべてのヒト試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０２８２】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０２８３】
次いで、上記前処理済の４例の胃癌、２例の腸癌、２例の肺癌、１例の血液の癌および１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料中に、上記４セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブセットを加え、４セットのＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験およびセプチン９ＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０２８４】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０２８５】
最後に、それぞれ４例の胃癌、２例の腸癌、２例の肺癌、１例の血液の癌および１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値、ならびに４例の胃癌、２例の腸癌、２例の肺癌、１例の血液の癌および１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した（図１に示すとおり）。図１は、セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出において、ＲＮＦ１８０の４セットのプライマーおよびプローブがいずれもセプチン９の測定に影響を及ぼさないことを示し、横座標ＳＣ＿ｓｅｔ１〜４は、プライマーおよびプローブセット１〜４を示し、各セットの棒は、左から右に、順番にＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｌ１、Ｌ２、ＪｕｒｋａｔおよびＷＢＣを示し、縦座標は、セプチン９のＣｔ値であり、Ｓ１〜Ｓ４は４例の胃癌を、Ｃ１〜Ｃ２は２例の結腸癌を、Ｌ１〜Ｌ２は２例の肺癌を、Ｊｕｒｋａｔは１例の血液の癌（陽性対照）を、ＷＢＣは１例の健常者（陰性対照）を示す。
【０２８６】
ＲＮＦ１８０遺伝子のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値から、ＲＮＦ１８０は癌ＤＮＡにおいて高度の増幅があり、健常ＤＮＡは低度の増幅があることがわかる。ＲＮＦ１８０プライマーおよびプローブの特異性は、癌ＤＮＡと健常ＤＮＡを区別することができる。ＲＮＦ１８０の異なるプライマーおよびプローブの組み合わせは、効果が異なる。血液の癌Ｊｕｒｋａｔ細胞のＤＮＡは、ＲＮＦ１８０の極めて高度な増幅がある。
【０２８７】
Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値から、図１に示すように、ＲＮＦ１８０プライマーおよびプローブは、多元検出において、セプチン９の検出に対して影響がないことがわかる。セプチン９のプライマーおよびプローブは、癌ＤＮＡと健常ＤＮＡを区別することができ、ＲＮＦ１８０の影響を受けない。ＲＮＦ１８０の異なるプライマーおよびプローブの組み合わせは、いずれもセプチン９の測定に影響しない。血液の癌Ｊｕｒｋａｔ細胞のＤＮＡは、ＲＮＦ１８０の極めて高度な増幅があるが、セプチン９の増幅はない。ＲＮＦ１８０およびセプチン９は、異なる癌においてメチル化が共通性を有するが、特殊性も有する。
【０２８８】
上記実施例により、本願で設計するＲＮＦ１８０の４セットのプローブおよびプライマーは、いずれも癌ＤＮＡおよび健常ＤＮＡを区別することができる。また、次の実施例において、上記プローブおよびプライマーを用いて、さらに健常者、胃炎患者および胃癌患者の生物試料におけるＤＮＡメチル化の程度を比較し解析する。具体的には、リアルタイムＰＣＲの結果を用いて疾患の程度を等級付けできるようにするため、先ず、一定量の試料を解析して異なる感度および特異性により必要な疾患の程度を等級付けするリアルタイムＰＣＲとしてのＣｔの臨界値、すなわちＣｕｔ値を確定する。次の実施例において、胃癌患者、胃炎患者および健常な個体の生物試料に反応するセプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ程度に対応するＣｔ値を検出し、これにより疾患の程度の等級付け（胃癌、胃炎および健常）のために判断臨界値、すなわち臨界Ｃｕｔ値を提供する。
【０２８９】
実施例２：ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化ＤＮＡ多元検出の胃癌患者血漿の初歩的な臨床結果
【０２９０】
１０例の胃癌患者および１１例の健常者の試料を得た。かつ、１０例の胃癌患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡを抽出した。すべての癌試料は、ＢｉｏＣｈａｉｎ社から入手した。ヒト健常試料は、ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社から入手した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０２９１】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０２９２】
次いで、上記前処理済の１０例の胃癌患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験およびセプチン９ＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０２９３】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０２９４】
最後に、それぞれ１０例の胃癌患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値、ならびに１０例の胃癌患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定し、下表１〜３に示すとおりであった。
【０２９５】
表１：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の１０例の胃癌患者
【０２９６】
【表１】
2017525977.tif 000003
【０２９７】
表２：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の６例の健常者
【０２９８】
【表２】
2017525977.tif 000004
【０２９９】
表３：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の５例の健常者
【０３００】
【表３】
2017525977.tif 000005
【０３０１】
ＲＣ１およびＲＣ２はいずれも参照。ＲＮＦ１８０およびセプチン９のＰＣＲのＣｔ値は、いずれも４５を臨界値とし、４５超は健常、４５未満は癌陽性である。「／」はＣｔ値が４５を超えることを示す。
【０３０２】
セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出において、Ｃｔ値は、４５未満のものは胃癌陽性であり、セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ検出の陽性結果を総合し、陽性結果に相補させる。１０例の胃癌患者の診断結果は、いずれも陽性であった。胃癌の感度は１００％に達した。１１例の健常者陰性において、１０例の陰性が検出され、特異性は９１％に達した。
【０３０３】
表１における１０例の胃癌患者のＲＮＦ１８０およびセプチン９のＰＣＲのＣｔ値を棒グラフの形式で表し、図２に示すとおりである。図２の横座標は１０例の胃癌であり、縦座標はセプチン９およびＲＮＦ１８０のＣｔ値である。
【０３０４】
セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ検出の陽性結果を総合し、すなわちセプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ検出の陽性結果を相補し、胃癌の感度は１００％に達した。セプチン９およびＲＮＦ１８０の陽性結果は、胃癌診断の上で相補するものである。
【０３０５】
実施例３：ＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化ＤＮＡ多元検出で、胃癌、胃炎、健常者を等級付けする
【０３０６】
本実施例は、次のステップを含む。
【０３０７】
先ず、４２例の胃癌患者、１４例の胃炎患者および１１例の健常者の血漿を得た。かつ、癌、胃炎患者および健常者のゲノムＤＮＡを抽出した。すべての癌試料は、ＢｉｏＣｈａｉｎ社から入手した。ヒト健常試料は、ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社から入手した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３０８】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３０９】
次いで、上記前処理済の４２例の胃癌患者、１４例の胃炎患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験およびセプチン９ＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３１０】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３１１】
最後に、それぞれ４２例の胃癌患者、１４例の胃炎患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値、ならびに４２例の胃癌患者、１４例の胃炎患者および１１例の健常者のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。次いで、測られたＣｔ値により統計学的解析を行った。図３および図４は、それぞれセプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元検出の胃癌、胃炎および健常者のＣｔ平均値の棒グラフおよび散布図を示す。横座標は、左から右に、それぞれ１１例の健常者におけるＲＮＦ１８０遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値、１４例の胃炎患者におけるＲＮＦ１８０遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値、４２例の胃癌患者におけるＲＮＦ１８０遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値、１１例の健常者におけるＳｅｔｐｔｉｎ９遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値、１４例の胃炎患者におけるＳｅｔｐｔｉｎ９遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値、４２例の胃癌患者におけるＳｅｔｐｔｉｎ９遺伝子メチル化の程度のＣｔ平均値を表す。＊は、有意な差を、＊＊は非常に有意な差を、＊＊＊は極めて非常に有意な差を示す。
【０３１２】
以上の図から、ＲＮＦ１８０検出において、胃癌と胃炎のＣｔ値の間に非常に有意な差があり、健常者と胃炎のＣｔの間に有意な差があり、健常者と胃癌のＣｔの間に極めて非常に有意な差があることがわかり、疾患の程度の等級付け（胃癌、胃炎および健常）のために判断臨界値、すなわちＣｕｔ値を提供する。これによっても、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果によって疾患の程度を等級付けすることがで、例えば、胃癌、胃炎、健常者を等級付けできることが示される。セプチン９検出において、胃癌と胃炎のＣｔ値の間に有意な差があり、健常者と胃癌のＣｔの間に有意な差があった。
【０３１３】
この実施例において、セプチン９がＣｔ値４５を臨界値とし、ＲＮＦ１８０がＣｔ値４５を臨界値とする場合、胃癌検出の感度は８３．３％、胃炎検出の感度は６４．３％、完全に健常の特異性は９０．９％である。セプチン９がＣｔ値４５を臨界値とし、ＲＮＦ１８０がＣｔ値３９以下を胃癌とし、Ｃｔ値３９〜４５を胃炎とする場合、胃癌の感度は７８．６％、胃炎の感度は２８．３％、完全に健常の特異性は９０．９％である。
【０３１４】
上記実験結果は、本発明のＲＮＦ１８０およびセプチン９のメチル化ＤＮＡ多元検出により、疾患の程度を等級付けすることができ、例えば胃癌、胃炎、健常者を等級付けできることを示す。
【０３１５】
実施例４：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出で、健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期を等級付けする
【０３１６】
１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３１７】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３１８】
次いで、上記前処理済の１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３１９】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３２０】
最後に、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期のゲノムＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定し、図５に示すとおりであった。図５から、健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の病状が重くなるのに伴い、β−アクチン（ＡＣＴＢ）のＣｔ値の平均値が近くなるため、β−アクチンのＣｔ値が安定していることがわかる。β−アクチンＣｔは、ＰＣＲの内部基準、すなわち内部対照とすることができる。
【０３２１】
かつ、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定し、図６に示すとおりであった。かつ、ＲＮＦ１８０Ｃｔからβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た。図６において、縦座標はＲＮＦ１８０のｄＣｔ値またはΔＣｔ値である。
【０３２２】
同様に、セプチン９ＣｔからアクチンＣｔを減算してセプチン９のｄＣＴ値を得た。ｄＣｔ値が低いほど、メチル化の程度が高くなる。
【０３２３】
図６から、健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の病状が重くなるのに伴い、ＲＮＦ１８０のｄＣｔ値が低くなり、メチル化の程度が高くなることがわかる。
【０３２４】
上記実験結果は、Ｃｔ値またはｄＣｔ値を用いて健常者、胃炎および胃癌を等級付けできるだけでなく、Ｃｔ値またはｄＣｔ値を用いて胃炎をさらに等級付けでき、例えば、胃炎を軽度の胃炎（表層性を含む）および重度の胃炎（腸上皮化生および萎縮を含む）に等級付けし、かつＣｔ値またはｄＣｔ値を用いて胃癌をさらに等級付けでき、例えば、胃癌を胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期に等級付けできることをさらに証明する。
【０３２５】
実施例５：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の、健常、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌および胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の陽性率。
【０３２６】
１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生（３例の萎縮および３例の腸上皮化生を含む）、７４例の胃癌（１９例の胃癌Ｉ期、２０例ＩＩ期、２２例ＩＩＩ期、１０例ＩＶ期を含む）の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３２７】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３２８】
次いで、上記前処理済の１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、７４例の胃癌（１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期を含む）のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３２９】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３３０】
最後に、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、７４例の胃癌（１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期を含む）のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、７４例の胃癌（１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期を含む）のゲノムＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者、３１例の表層、６例の萎縮／腸上皮化生、７４例の胃癌（１９例の胃癌Ｉ期、２０例のＩＩ期、２２例のＩＩＩ期、１０例のＩＶ期を含む）のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。β−アクチンＣｔを内部対照とした。ＲＮＦ１８０Ｃｔからβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た。ｄＣｔ＜１０の場合、疾患陽性と認定した。
【０３３１】
図７Ａは、健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌のＲＳ１９陽性率比較を示す。縦座標は陽性率であり、横座標は、左から右へ、それぞれ健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌である。図７Ａから、健常者、表層、萎縮／腸上皮化生、胃癌の病状が重くなるのに伴い、陽性率が高くなることがわかる。
【０３３２】
図７Ｂは、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期のＲＳ１９陽性率比較を示す。縦座標は陽性率であり、横座標は、左から右へ、それぞれ胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期であり、図７Ｂから、胃癌Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の病状が重くなるのに伴い、陽性率が高くなることがわかる。
【０３３３】
図７Ｃは、健常者、胃炎、胃癌のＲＳ１９のｄＣｔ平均値棒グラフを示す。図７Ｃは、実施例２の結果をさらに検証し、ＲＮＦ１８０検出において、胃癌と胃炎のｄＣｔ値の間に非常に有意な差があり、健常者と胃炎のｄＣｔの間に有意な差があり、健常者と胃癌のｄＣｔの間に極めて非常に有意な差がある。この実験結果によって、ＲＮＦ１８０のメチル化検出結果によって疾患の程度を等級付けすることができ、例えば、胃癌、胃炎、健常者を等級付けできることが再度検証された。
【０３３４】
かつ、ＲＮＦ１８０メチル化は、腸上皮化生を併発した慢性胃炎において、重要な意義を有する。一般に、慢性萎縮性胃炎および腸上皮化生を併発した慢性胃炎は、より発癌しやすいと考えられており、病理生検で腸上皮化生を併発した慢性胃炎と確定診断された３例の試料において、血中のＲＮＦ１８０含有量がいずれも上昇し、Ｃｔ値が著しく下降し、平均はＣｔ７．９であり、陽性率は１００％（３／３）であったが、慢性萎縮性胃炎の陽性率は３３％（１／３）であり、普通の慢性表層性胃炎の陽性率２７％に近かった（表４を参照）。ＲＮＦ１８０陽性の普通の慢性表層性胃炎患者において（２７％）、生検を行った場合、腸上皮化生の割合が上昇する可能性があることが予想される。
【０３３５】
表４：３例の腸上皮化生および３例の慢性萎縮のＲＮＦ１８０のｄＣＴ値
【０３３６】
【表４】
2017525977.tif 000006
【０３３７】
そのため、ＲＮＦ１８０は、さらに胃炎のうち腸上皮化生がある胃炎と腸上皮化生がない普通の胃炎を区別して検出することができ、腸上皮化生があるＲＮＦ１８０は１００％陽性であり、普通の胃炎は約２７％陽性である。
【０３３８】
実施例６：セプチン９およびＲＮＦ１８０の結合による胃癌検出の特異性および感度の改善
【０３３９】
１５例の健常者、３７例の胃炎および７４例の胃癌患者の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３４０】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３４１】
次いで、上記前処理済のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３４２】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３４３】
最後に、１５例の健常者、３７例の胃炎および７４例の胃癌患者のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、上記ＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、上記ＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。アクチンＣｔを内部対照とした。ＲＮＦ１８０Ｃｔ値からβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得て、Ｓｅｔｐｔｉｎ９Ｃｔ値からβ−アクチンＣｔ値を減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た。
【０３４４】
年齢の増加に伴い、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量が高くなる傾向を示し、年齢は横座標であり、ＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を縦座標として図８Ａを得た。高齢者は、いずれも多少ともある程度の胃炎があり、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量の上昇が年齢の要素によるものなのか、胃炎の要素によるものなのかを区別するのが難しい。これは、胃癌の検査の特異性および信頼性に大きな影響をもたらす。図８Ａに示すように、高齢段階で、慢性胃炎（菱形）および胃癌（正方形）は一部が交わり、胃癌の検出に影響を及ぼす。
【０３４５】
Ｓｅｔｐｔｉｎ９のｄＣＴ値を横座標とし、ＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を縦座標として図８Ｂを得た。図８Ｂに示すように、セプチン９のｄＣＴの臨界値を１４、ＲＮＦ１８０のｄＣＴの臨界値を１０と選択する場合、左側のブロック内の点は、セプチン９の検出結果が陽性を呈し、かつＲＮＦ１８０の検出結果も陽性を呈することを表す。右側のブロックは、セプチン９の検出結果が陰性を呈し、かつＲＮＦ１８０の検出結果が陽性を呈することを表す。本実施例について、選択したセプチン９およびＲＮＦ１８０が同時に陽性であり、一部の胃癌の特異性を高めており、約３９％（２９／７４）の胃癌が９０％符合率（２９／３２）に達しており、ＲＮＦ１８０に対する胃炎および年齢のマイナスの影響を有効排除している。そのため、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを併用することにより、ＲＮＦ１８０の特異性が高くないこと（年齢、胃炎）の胃癌診断に対するマイナスの影響を少なくし、胃癌検出の特異性を高め、胃癌検出の感度を増加させることができる。
【０３４６】
かつ、感度の面において、２例の胃癌は、ＲＮＦ１８０が陰性であったが、セプチン９が陽性であり、セプチン９は感度を２．７％（２／７４）増加させることができた。そのため、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを１つに結合して検出を行う場合、胃癌検出の特異性および感度を改善することができる。
【０３４７】
上記内容を総合すると、年齢の増加に伴い、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量が高くなる傾向を示すが、高齢者は、いずれも多少ともある程度の胃炎があり、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量の上昇が年齢の要素によるものなのか、胃炎の要素によるものなのかを区別するのが難しい。これは、胃癌の検査の特異性および信頼性に大きな影響をもたらす。セプチン９遺伝子が年齢および慢性胃炎の影響を受ける要素は無視することができるため、セプチン９を用いてＲＮＦ１８０の胃癌に対する検出を確認することができる。
【０３４８】
実施例７：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃癌の感度および特異性。
【０３４９】
１５例の健常者および７４例の胃癌患者の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３５０】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３５１】
次いで、上記前処理済の１５例の健常者および７４例の胃癌患者のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３５２】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３５３】
最後に、１５例の健常者および７４例の胃癌患者のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および７４例の胃癌患者のゲノムＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および７４例の胃癌患者のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。アクチンＣｔを内部対照とした。ＲＮＦ１８０Ｃｔからβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た（図９に示すとおり）。図９は、臨界値がそれぞれ１０および１５であるときの胃癌検出の感度および特異性、ならびにＲＯＣ曲線をさらに示す。
【０３５４】
そのため、図９の表が示すように、ｄＣｕｔ値を１０と選ぶ場合、感度は７４％であり、特異性は８７％であるが、ｄＣｕｔ値を１５と選ぶ場合、感度は８４％であり、特異性は７３％である。そのため、ｄＣｕｔ値、またはＣｕｔ値は、選択した感度および特異性により変化することができる。感度および特異性の実際の要求を総合的に考慮し、ｄＣｕｔ値を１０とすることが好ましい。
【０３５５】
実施例８：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）の感度および特異性。
【０３５６】
１５例の健常者および３３例の胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３５７】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３５８】
次いで、上記前処理済の１５例の健常者および３３例の胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）者のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３５９】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３６０】
最後に、１５例の健常者および３３例の胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および３３例の胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）のゲノムＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および３３例の胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。β−アクチンＣｔを内部対照とした。ＲＮＦ１８０Ｃｔからβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た（図１０に示すとおり）。図１０は、臨界値がそれぞれ１０、１５、２０であるときの胃炎（慢性、表層性、潰瘍性）検出の感度および特異性、ならびにＲＯＣ曲線をさらに示す。
【０３６１】
そのため、図１０の表が示すように、ｄＣｕｔ値を１０と選ぶ場合、感度は３０％であり、特異性は８７％であるが、ｄＣｕｔ値を１５と選ぶ場合、感度は６４％であり、特異性は８０％であり、ｄＣｕｔ値を２０と選ぶ場合、感度は７３％であり、特異性は７３％である。そのため、ｄＣｕｔ値、またはＣｕｔ値は、選択した感度および特異性により変化することができる。感度および特異性の実際の要求を総合的に考慮し、ｄＣｕｔ値を１５とすることが好ましい。
【０３６２】
実施例９：セプチン９およびＲＮＦ１８０のメチル化ＤＮＡ多元（ＲＳ１９）検出の健常、胃炎（すべて）の感度および特異性。
【０３６３】
１５例の健常者および３７例の胃炎（すべて）の試料を得た。各試料におけるゲノムＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの抽出は、先行技術におけるあらゆる標準手段を用いて行ってもよく、具体的には、本実施例において、すべての試料ＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０３６４】
次いで、前記ゲノムＤＮＡ試料を前処理し、５’位のメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミンに変換されるようにするか、またはハイブリダイゼーション挙動上、シトシンの別の塩基に用いない。本実施例においては、亜硫酸水素塩試薬処理によりこの前処理を実現した。亜硫酸水素塩ＤＮＡの修飾は、ＥＰｉ  ｐｒｏＣｏｌｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０３６５】
次いで、上記前処理済の１５例の健常者および３７例の胃炎（すべて）のゲノムＤＮＡ試料中に、上記第２セットのＲＮＦ１８０のプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ  １８０ＰＣＲ試験を行い、セプチン９、β−アクチンのプライマーおよびプローブを加え、ＲＮＦ１８０ＰＣＲ試験、セプチン９ＰＣＲ試験およびβ−アクチンＰＣＲ試験を多元的に検出した。セプチン９ＰＣＲ試薬およびβ−アクチンＰＣＲ試薬は、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入した。亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３６６】
本実験例において採用したＰＣＲ増幅条件は、次のとおりである。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置（７５００Ｆａｓｔ）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇおよび４５０ｎＭプライマー、２２５ｎＭプローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、２００ｕｍの各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２および２ＸＰＣＲ緩衝液により最終的な３０ｕｌの体積をなす。９４℃を２０分間保ち、プレサイクルで試料を増幅し、直後に６２℃で５秒間の４５サイクルのアニーリングを行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性した。
【０３６７】
最後に、１５例の健常者および３７例の胃炎（すべて）のゲノムＤＮＡ試料の、Ｓｅｔｐｔｉｎ９遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および３７例の胃炎（すべて）のゲノムＤＮＡ試料の、β−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。かつ、１５例の健常者および３７例の胃炎（すべて）のゲノムＤＮＡ試料の、ＲＮＦ１８０遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。β−アクチンＣｔを内部対照とした。ＲＮＦ１８０Ｃｔからβ−アクチンＣｔを減算してＲＮＦ１８０のｄＣＴ値を得た（図１１に示すとおり）。図１１は、臨界値がそれぞれ１０、１５、２０であるときの胃炎（すべて）検出の感度および特異性、ならびにＲＯＣ曲線をさらに示す。
【０３６８】
そのため、図１１の表が示すように、ｄＣｕｔ値を１０と選ぶ場合、感度は３２％であり、特異性は８７％であるが、ｄＣｕｔ値を１５と選ぶ場合、感度は６２％であり、特異性は８０％であり、ｄＣｕｔ値を２０と選ぶ場合、感度は７０％であり、特異性は７３％である。そのため、ｄＣｕｔ値、またはＣｕｔ値は、選択した感度および特異性により変化することができる。感度および特異性の実際の要求を総合的に考慮し、ｄＣｕｔ値を１５とすることが好ましい。
【０３６９】
上記内容を総合すると、実験を介して、胃炎および胃癌におけるＲＮＦ１８０遺伝子のメチル化の程度に比較的大きな差異が存在し、ＲＮＦ１８０は、健常者群、慢性表層性胃炎（一般慢性胃炎および潰瘍性胃炎を含む）群、慢性萎縮性胃炎（慢性胃炎に腸上皮化生を併発）群、胃癌群ＩからＩＶ期における含有量が徐々に増加し、Ｃｔ値が徐々に低下することがわかった。陽性率も、同様の順序で健常者群から胃癌群まで徐々に上昇するため、本願は、試料中のＲＮＦ１８０遺伝子のメチル化の程度を測定することにより胃癌および胃炎を等級付けする方法を提供し、これにより、非侵襲的で、迅速な胃癌および胃炎のスクリーニング方法を提供する。
【０３７０】
かつ、年齢の増加に伴い、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量が高くなる傾向を示すが、高齢者は、いずれも多少ともある程度の胃炎があるため、末梢血中でメチル化したＲＮＦ１８０遺伝子含有量の上昇が年齢の要素によるものなのか、胃炎の要素によるものなのかを区別するのが難しく、胃炎と胃癌の検査の特異性および信頼性に大きな影響をもたらしている。そのため、この要素を考慮し、検査中にセプチン９を同時に加えるため、セプチン９遺伝子で年齢および胃炎の影響の要素を無視することができ、セプチン９を用いて胃癌の検出を確認することができる。具体的には、約４０％の胃癌は、セプチン９およびＲＮＦ１８０で同時に陽性であり、両者で同時に陽性であることを判断基準とし、９０％の特異性を達成することができる。かつ、いくつかの具体的な実施態様により、一部の胃癌はＲＮＦ１８０が陰性であるが、セプチン９が陽性であり、セプチン９は、この一部の胃癌を検出することができ、感度を約３％増加させることができる。そのため、セプチン９とＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを併用して胃炎および胃癌を等級付けすることにより、感度および特異性をいずれも高めることができる。そのため、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーを１つに結合して検出を行う場合、胃癌検出の特異性および感度を改善することができる。
【０３７１】
最後に、リアルタイムＰＣＲを用いて血漿試料中のＤＮＡを解析する方法は、セプチン９およびＲＮＦ１８０の２つのバイオマーカーの同じ時間での２チャンネル検出を実現するのに便利であり、かつリアルタイムＰＣＲのサイクル閾値（Ｃｔ）値に基づき、試料が陽性を呈するか否かを迅速かつ敏捷に判断することができ、非侵襲性の迅速な癌および炎症の等級付け方法を提供する。
【０３７２】
明細書において記載されているすべての発表文献および特許出願は、本発明の関連分野内の技術要員のレベルであることを表明する。すべての発表文献および特許出願は、引用の方式により本文において結合され、各発表文献および特許出願は、具体的に、単独に明記されているように、引用の方式により本文において同様に結合される。これらの発表文献および特許出願を記載していることのみによって、これらが本願に対する先行技術文献であると理解することはできない。
【０３７３】
ここで本発明の各側面および実施例を公開しているが、その他の側面および実施例も、当業者にとって自明なものである。ここで公開している各側面および実施例は、説明の目的のために用いられるにすぎず、制限の目的のためのものではない。本発明の保護範囲および主旨は、特許請求の範囲によってのみ確定される。
【０３７４】
別段の明確な指摘がある場合を除き、本文において用いる用語および略称、ならびにその変形は、オープン形式のものであり、制限的なものではないと解釈すべきである。一部の実例において、「１つまたは複数」、「少なくとも」、「が、これらに限定されない」のような拡張的な語彙および略称またはその他の類似の用語の出現は、こうした拡張的な用語の例における意図または狭める必要がない可能性があると理解すべきである。
【図１】
2017525977.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017525977.tif 000022
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