(57)【要約】  本発明は、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療するための、抗菌効果の提供が不十分な量の抗菌剤、非常に低濃度の生理学的に許容される二価金属イオン、並びに理学的に許容される高分子を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌剤、生理学的に許容される二価金属イオン、及び生理学的に許容される高分子を含む組成物であって、ここで、抗菌剤がビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物又はそれらの任意の組み合わせから選択され；生理学的に許容される二価金属イオンは、Ｚｎ、Ｃｕ及びＳｎからなる群から選択される、上記組成物。
【請求項２】
抗菌剤がクロルヘキシジン又はその塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗菌剤がクロルヘキシジンであり、クロルヘキシジンが組成物中に０．００１重量％〜１重量％、好ましくは０．００２重量％〜０．５重量％、より好ましくは０．００４重量％〜０．０１重量％の量で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
抗菌剤が、組成物中に、口腔内の細菌を効果的に死滅させる又はその増殖を阻害するには不十分な量で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
二価金属イオン及び／又は二価金属イオンキレートの生理学的に許容される塩が、組成物中に、０．０１重量％〜０．５重量％、０．０１重量％〜０．０４９重量％、０．０１重量％〜０．０４重量％、０．０１重量％〜０．１９重量％、又は０．０１重量％〜０．１５重量％の量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
生理学的に許容される高分子が、組成物中に０．１重量％〜２重量％の量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
生理学的に許容される高分子が、多糖類又は多糖類誘導体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
生理学的に許容される高分子が、キトサン又はキトサン誘導体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
キトサン又はキトサン誘導体が、抗菌効果を与えるのには不十分な量で組成物中に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
−抗菌剤が、ビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物又はそれらの任意の組み合わせから選択され、組成物中に０．００１重量％〜１重量％の量で存在し；
−生理学的に許容される二価金属イオンが、Ｚｎ、Ｃｕ又はＳｎであり、組成物中に０．０１重量％〜０．５重量％の量で存在し；ならびに
−生理学的に許容される高分子は、組成物中に０．１重量％〜２重量％の量で存在する多糖類又は多糖類誘導体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
生理学的に許容される高分子が、組成物中に０．１重量％〜２重量％の量で存在するキトサン又はキトサン誘導体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療するための、抗菌効果の提供が不十分な量の抗菌剤、非常に低濃度の生理学的に許容される二価金属イオン、並びに理学的に許容される高分子を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
口臭は、嫌な臭気がする息である。この臭気は、原因に応じて周期的に襲ってくる、又は持続的である場合がある。口臭は、主に、口腔内の天然の細菌叢を形成するいくつかの細菌、特に舌の後部の陰窩及び歯周ポケットに位置する細菌によって引き起こされる。上記細菌は、嫌気性代謝によって揮発性硫黄化合物を生成し、これは主に、硫化水素及びメチルメルカプタンであり、不快な臭いを生じさせる。
【０００３】
亜鉛イオンは、ある種の抗菌活性を有し、ある程度、口腔内の揮発性硫黄化合物の生成を減少させることは当該技術分野において周知である。例えば、クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム及びさらにはキトサンのような抗菌剤は、揮発性硫黄化合物の生成を減少させ、それによって不快な臭気を減少させるために示唆され、調査されている。
【０００４】
Ｙｏｕｎｇら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ  ２００３；１１１：４００−４０４）は、亜鉛、クロロヘキシジン又は塩化セチルピリジニウムによる、経口的に生成された揮発性硫黄化合物の阻害、及びその濃度の効果を開示している。
【０００５】
Ｒｏｌｄａｎら  （Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００４；３１：１１２８−１１３４）は、揮発性硫黄化合物及び唾液細菌数に対する様々なクロルヘキシジンによるマウスリンス製剤の比較効果を開示している。
【０００６】
Ｖｅｒｋａｉｋら（Ｊ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ２０１１；３９：２１８−２２４）は、インビトロで経口バイオフィルムに対する練り歯磨き製剤中の天然抗菌剤の有効性を開示している。
【０００７】
ＮＯ  ３０７１６８は、亜鉛イオンの抗揮発性硫黄化合物効果が、主に硫化水素生成に向けられ、口臭の不完全な除去を解明するメチルメルカプタンの生成に対してはるかに少ない程度であることを開示している。しかしながら、亜鉛イオンと低濃度の特定のカチオン性抗菌剤の組み合わせを使用した場合、この組み合わせは相乗的な方法で硫化水素とメチルメルカプタンの形成を阻害した。
【０００８】
口腔内の微生物フローラは、免疫系において、及び我々が摂取する栄養を分解する際に、重要な役割を果たす微調整された保護系であり、さらに消化系をバランスのとれた状態に維持する役割も担っている。抗菌剤からの抗菌活性に起因するこの繊細な系におけるシフトは、菌類の増殖、口の渇き、下痢などにつながる可能性がある。上記剤はまた、歯の染色を引き起こし得る。
【発明の概要】
【０００９】
本発明に至る研究において、本発明者は、驚くべきことに、非常に低い濃度の生理学的に許容される二価金属イオン及び生理学的に許容される高分子と、抗菌効果を提供するには不十分な量の抗菌剤とを合せることによって、組成物は、口腔内の微生物フローラに何ら干渉もなく、相乗的な方法で硫酸ガスを減少させることを検出した。この組成物は、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療することが示された。
【００１０】
亜鉛ロゼンジは、一般的な風邪の治療法として提案されている（Ｅｂｙ  ＩＩＩら、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ２０１０；７４：４８２−９２）。これは、まだ議論の余地があり、この目的のために使用される亜鉛濃度は、本発明の組成物よりもはるかに高く、抗菌及び／又は抗ウイルス効果によって引き起こされる可能性がある。したがって、明らかな抗菌効果がないにもかかわらず、喉の痛みに対して有効であることが判明した本発明は、非常に驚くべきことであり、予想外である。これについての作用機序はまだ不明である。
【００１１】
したがって、本発明は、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みの予防及び／又は治療において、より安全であり、より効果的な組成物であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】対照の割合における硫化水素量を示す。対照は、システインでリンスした後にガスクロマトグラフで測定された硫化水素の量である。０．００４９％の濃度のクロルヘキシジン単独の結果は、１時間後に１２％、２時間後に８％、３時間後に７％の硫化水素ガスの減少を示す。濃度０．０４９％のＺｎ2+と組み合わせた濃度０．００４９％のクロルヘキシジンの結果は、１時間後に３９％、２時間後に２６％、３時間後に１７％の硫化水素ガスの減少を示す。濃度０．０４９％のＺｎ2+及び０．１％のキトサンと組み合わせた濃度０．００４９％のクロルヘキシジンの結果は、１時間後に５８％、２時間後に４１％、３時間後に３２％の硫化水素の減少を示す。
【００１３】
【図２Ａ】全唾液の好気性菌及び嫌気性菌の培養を示す。  ｉ）ウェル中の２０μｌの溶液Ａ（０．００４９％ＣＨＸ＋０．０４９％Ｚｎ2+＋０．１％キトサン）を伴う完全唾液の好気性培養は、阻害を示さない。  ｉｉ）ウェル中の２０μｌの溶液Ａを伴う全唾液の嫌気性培養は、阻害を示さない。
【図２Ｂ】全唾液の好気性菌及び嫌気性菌の培養を示す。  ｉｉｉ）ウェル中の２０μｌの溶液Ｂ（０．０２５％ＣＨＸ＋０．３％Ｚｎ2+）を伴う完全唾液を嫌気性培養は、１０ｍｍの阻害ゾーンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的は、正常な口腔微生物フローラにおける最小限の阻害作用を有する、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを引き起こす揮発性硫黄ガスに対して最大の阻害効果を示す組成物を提供することである。したがって、本発明は、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療するための、抗菌効果を提供するには不十分な量の抗菌剤、非常に低濃度生理学的に許容される二価金属イオン、及び生理学的に許容される高分子を含む組成物を提供する。
【００１５】
ビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物などの抗菌剤は、現在、抗菌効果を提供するために経口組成物中で使用される。
【００１６】
本発明者は、驚くべきことに、抗菌効果を提供するには不十分な量の抗菌剤、非常に低濃度の生理学的に許容される二価金属イオン、及び生理学的に許容される高分子を組み合わせることによって、組成物が、口腔内の硫黄ガスを減少させる能力を有することを検出し、口臭、臭い息、口渇又は喉の痛みを予防及び／又は治療することができる。
【００１７】
さらに、驚くべきことに、キトサンは、わずかに酸性の条件下で、亜鉛及びクロルヘキシジンとともに非常に低い濃度で相乗効果を発揮することが確認された。
【００１８】
キトサンは、天然に存在する高分子であるキチンの脱アセチル化に由来する多糖類であり、セルロースの次に最も豊富な高分子である。正確な抗菌メカニズムはいまだに未知であるが、キトサンは、生体適合性及び生分解性であり、ある程度の抗菌効果を有することが示されている。しかしながら、キトサンはまた、負に荷電した表面及び構造に結合する強い生体接着特性を有する。
【００１９】
本発明の一実施形態において、抗菌効果を実証することはできず、したがって、本発明の組成物におけるキトサン又はその誘導体の効果は、抗菌剤、例えば、クロルヘキシジンに結合することによる効果を増強すると考えられ、揮発性硫黄組成物が形成される負に荷電された表面上の細菌にそれを接近させ、抗菌剤、例えば、クロルヘキシジンを、ＳＨ結合を切断すると考えられているその作用を発揮させるために亜鉛に結合する。
【００２０】
Ｚｎに関するキトサンの効果は、キトサンが粘膜及び負に帯電された歯の表面に結合し、それによって口腔内での亜鉛の存在及び効果を延長すると考えられる。
【００２１】
実験１において、３つの異なる組成物を試験し、以下の組み合わせを含む：
−組成物１：濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
−濃度が０．０４９重量％であるＺｎ2+と組み合わせた、濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
−濃度が０．０４９重量％であるＺｎ2+及び濃度が０．１重量％のキトサンと組み合わせた、濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
【００２２】
実施例１及び図１から分かるように、組成物３は、揮発性硫黄化合物の減少において最も効果的であることが明らかに示される。１時間後に５８％、２時間後に４１％、３時間後に３２％の減少が達成された。これは、溶液２と比較して、それぞれ１９％、１５％及び１５％の効果の増加である。溶液１と比較すると、効果の差は、それぞれ４６％、３３％及び２５％であった。
【００２３】
組成物３に記載されるクロルヘキシジン、Ｚｎ2+及びキトサンの組み合わせは、組成物１及び２と比較して相乗効果を有することが示された。実施例２において、抗菌作用を示すには不十分な濃度である、濃度が０．０４９重量％であるＺｎ2+及び濃度が０．１重量％であるキトサンと組み合わせた、濃度が０．００４９重量％のクロルヘキシジンを含む、実施例１における組成物３は、口腔内細菌フローラには何ら影響も与えなかった。
【００２４】
実施例１において、クロルヘキシジンは、抗菌剤として試験されているが、ビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物又はそれらの任意の組み合わせから選択される任意の薬剤又はその塩を利用することができる。
【００２５】
生理学的に許容される二価金属イオンとして、Ｚｎの代わりにＣｕ又はＳｎを選択することができる。上記金属イオンは、塩、キレート又はそれらの任意の混合物の形態で存在することができる。
【００２６】
キトサン以外の多糖類又は多糖類誘導体のような生理学的に許容される高分子を本発明の組成物に利用することができる。
【００２７】
安息香酸、グリシン又はこれらの任意の混合物の群から選択される、ｐＫａが２〜６の範囲である、生理学的に許容される有機酸は、単独で又は生理学的に許容される高分子と組み合わせて使用することができる。
【００２８】
組成物のｐＨは、約２．５〜約９．０、好ましくは約２．５〜約６．５の範囲であり得る。
【００２９】
組成物は、少なくとも１種のフッ化物源をさらに含んでもよい。少なくとも１つのフッ化物源は、組成物中に約０．００５重量％〜２．５重量％の量で存在することができる。少なくとも１つのフッ化物源は、可溶性の無機フッ化物塩、可溶性の有機フッ化物塩、ＨＦ、又はそれらの任意の混合物であってもよい。実施例２において、溶液Ａ及びＢを、抗菌作用を提供する能力について試験した。口腔由来の微生物をペトリディッシュ上で培養し、以下のものに供した：
溶液Ａ：クロルヘキシジン（０．００４９重量％）、Ｚｎ2+（０．０４９重量％）及びキトサン（０．１重量％）を含む。
溶液Ｂ：クロルヘキシジン（０．０２５重量％）及びＺｎ2+（０．３重量％）を含む。
【００３０】
表１及び図２のｉ）とｉｉ）に示される試験の結果は、クロルヘキシジン（０．００４９重量％）、Ｚｎ2+（０．０４９重量％）及びキトサン（０．１重量％）を含む溶液Ａが、２種の真菌株であるＣ．アルビカンス及びＣ．パラプシルを除いて、微生物の増殖を阻害しなかったことを示す。しかしながら、上記真菌株は、硫黄ガスの生成に関与していない。
【００３１】
クロルヘキシジン（０．０２５重量％）及びＺｎ2+（０．３重量％）を含む溶液Ｂは、表１及び図２（ｉｉｉ）から分かるように増殖を阻害する。
【００３２】
したがって、本発明の組成物の技術的効果は、ガスを中和することによって硫黄ガスを減少させることとして説明することができる。その背景にある機構は、抗菌剤が硫黄ガスのＳ−Ｈ結合を切断すると考えられる；Ｚｎ及びおそらくキトサンもまた硫黄を硫化物に沈殿させ、それを飲み込んで、次に排泄する。口腔の細菌／微生物フローラは、抗菌剤の濃度が低いために無傷のままである。
【００３３】
実施例３において、本発明の組成物は、試験被験者が最初のリンスの数時間後に不快感から救済されたことから、咽の痛みに対しても効果があることが示される。この効果の背景にあるメカニズムは不明である。
【００３４】
したがって、本発明の一態様は、抗菌剤、生理学的に許容される二価金属イオン及び生理学的に許容される高分子を含む組成物に関し、抗菌剤は、ビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物又はそれらの任意の組み合わせから選択されてもよく；生理学的に許容される二価金属イオンは、Ｚｎ、Ｃｕ及びＳｎからなる群から選択されてもよい。
【００３５】
本明細書中で使用するとき、「抗菌剤」は、微生物を死滅させる又は微生物の増殖を阻害する薬剤を指す。組成物のさらなる実施形態において、抗菌剤は、クロルヘキシジン又はその塩であり得る。クロルヘキシジンは、組成物中に、０．００１重量％〜１重量％、好ましくは０．００２〜０．５重量％、より好ましくは０．００４〜０．０１重量％の量で存在することができる。
【００３６】
組成物のさらなる実施形態において、抗菌剤は、組成物中に、口腔内の細菌を効果的に死滅させる又は細菌の増殖を効果的に阻害するには不十分な量で存在し得る。
【００３７】
本明細書中で使用するとき、「抗菌効果を提供するには不十分な量」とは、微生物を死滅させる又は微生物の増殖を阻害することができない薬剤の濃度又は用量を指す。
【００３８】
組成物の１つ以上の実施形態において、二価金属イオン及び／又は二価金属イオンキレートの生理学的に許容される塩は、０．０１重量％〜０．５重量％の量で、又は０．０１重量％〜０．０４９重量％の量で、又は０．０１重量％〜０．０４重量％の量で存在し得る。
【００３９】
組成物の１つ以上の実施形態において、二価金属イオン及び／又は二価金属イオンキレートの生理学的に許容される塩は、組成物中に、０．０１重量％〜０．１９重量％、又は０．０１重量％〜０．１５重量％の量で存在し得る。さらに、生理学的に許容される二価金属イオンは、塩、キレート又はそれらの任意の混合物の形態で存在してもよい。
【００４０】
組成物の１つ以上の実施形態において、生理学的に許容される高分子は、組成物中に０．１重量％〜２重量％の量で存在してもよく、さらに、カプセル化された形態、微粒子の形態、又はナノ粒子の形態、又はそれらの任意の混合物であってもよい。生理学的に許容される高分子は、高分子が約３〜７のｐＨで水溶液中にカプセル化され得るカプセル化形態であってもよい。さらに、生理学的に許容される高分子は、多糖類又は多糖類誘導体であってもよい。生理学的に許容される高分子は、キトサン又はキトサン誘導体であってもよい。キトサン又はキトサン誘導体は、抗菌効果を提供するには不十分な量で組成物中に存在し得る。
【００４１】
組成物の一実施形態において、組成物は、水溶液又はゲルであり得る。組成物の一実施形態において、組成物は、約２．５〜６．５のｐＨを有し得る。組成物の一実施形態において、抗菌剤は、ビス−ビグアニド及び第４級アンモニウム化合物又はそれらの任意の組み合わせから選択されてもよく、組成物中に０．００１重量％〜１重量％の量で存在してもよい；生理学的に許容される二価金属イオンは、Ｚｎ、Ｃｕ又はＳｎであってもよく、組成物中に０．０１重量％〜０．５重量％の量で存在してもよい；生理学的に許容される高分子は、多糖類又は多糖類誘導体であってもよく、組成物中に０．１重量％〜２重量％の量で存在してもよい。
【００４２】
さらなる一実施形態において、生理学的に許容される高分子は、組成物中に０．１％〜２％の量で存在し得るキトサン又はキトサン誘導体であってもよい。
【００４３】
一実施形態において、組成物は、口臭を予防及び／又は治療する。
【００４４】
一実施形態において、組成物は、臭い息を予防及び／又は治療する。
【００４５】
一実施形態において、組成物は、口渇を予防及び／又は治療する。
【００４６】
一実施形態において、組成物は、喉の痛みを予防及び／又は治療する。
【００４７】
一実施形態において、組成物は、ウイルス感染又は細菌感染によって引き起こされる喉の痛みを予防及び／又は治療する。
【００４８】
一実施形態において、組成物は、約１０〜１２０秒間、口腔内に維持され、次に口から排出され得る。
【００４９】
一実施形態において、組成物は、約１０〜１２０秒間、うがいされ（ｇｕｒｇｌｅｄ）、次に口から排出され得る。
【００５０】
理解を明瞭にするために、例示及び実施例によって本発明をある程度詳細に完全に記載してきたが、当業者には、本発明を、条件、処方及びそれらの他のパラメータの幅広くかつ均等な範囲で修飾又は変更することにより、同じことが可能であること、並びに、このような修飾又は変更は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されていることは明らかである。
【実施例】
【００５１】
実施例１：試験被験者における口の悪臭（Ｈ2Ｓ）測定
本実験で試験される組成物は以下の通りであった：
組成物１：濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
組成物２：濃度が０．０４９重量％であるＺｎ2+と組み合わせた、濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
組成物３：濃度が０．０４９重量％であるＺｎ2+及び濃度が０．１重量％であるキトサンと組み合わせた、濃度が０．００４９重量％であるクロルヘキシジン。
【００５２】
試験日に、試験被験者（３人の被験者）は、朝食後の通常の口腔衛生の日常的作業を控えるように指示された。口の悪臭は、６ｍＭのＬ−システイン溶液（ｐＨ７．２）の５ｍｌを用いて、３０秒間リンスをすることにより被験者に導入された。次に、被験者は、１分３０秒の間、口を閉じたままにし、その後、ガスクロマトグラフのオートインジェクターの出口に接続された１０ｍｌのシリンジを用いて、口の息を吸引することによりベースラインの口の息サンプルを記録した。次に、揮発性硫黄化合物Ｈ2Ｓを直接測定した。この手順の直後に、試験溶液（組成物１〜３）のうちの１つの１０ｍｌを用いて被験者を１分間リンスし、溶液を吐き出させた。システインリンス及び口の息の分析を、それぞれの溶液を用いて、リンスの１時間後、２時間後及び３時間後に繰り返した。試験期間中、飲食及び喫煙は認められなかった。
【００５３】
結果
結果を図１に見ることができ、濃度が０．０４９％であるＺｎ2+と濃度が０．１％であるキトサンと組み合わせた、濃度が０．００４９％のクロルヘキシジンを含む溶液が、揮発性硫黄化合物の減少に最も有効であることが実証され、この場合、１時間後に５８％の減少、２時間後に４１％の減少、３時間後に３２％の減少が達成され、Ｚｎ２＋と組み合わせたクロルヘキシジンを含む溶液と比較して、それぞれ、１９％、１５％及び１５％の増加である。クロルヘキシジンのみを含む溶液と比較して、パーセンテージ効果の差は、それぞれ４６％、３３％及び２５％であった。
【００５４】
実施例２：ＣＨＸ（０．０２５％）及びＺｎ2+（０．３％）からなる溶液（Ｂ）と比較したＣＨＸ（０．００４９％）及びＺｎ2+（０．０４９％）及びキトサン（０．１％）からなる溶液（Ａ）の微生物試験
口腔由来の微生物をペトリディッシュ上で培養し、以下：
溶液Ａ：ＣＨＸ（０．００４９重量％）及びＺｎ2+（０．０４９重量％）及びキトサン（０．１重量％）、並びに
溶液Ｂ：ＣＨＸ（０．０２５重量％）及びＺｎ2+（０．３重量％）
に共し、それじれ、ディッシュの中央のウェルにそれぞれ付着させた。阻害活性は、ウェル周囲の阻害ゾーンとして測定することができた（図２ｉｉｉ参照）。試験結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
Ａｄ．２と８。０．５ｍｌの刺激されていない全唾液のサンプルを滅菌した目盛り付き試験管に回収した。実験室では、サンプルを分散させ（６０秒のボルテックス）、連続希釈し、５％ヒツジ血液、０．０００５％ヘミン及び０．００００３％メナジオンを添加したトリプチカーゼダイズ寒天（ＢＢＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）上には播種した。
【００５７】
各寒天は、溶液Ａ又はＢのいずれかで満たされた、中心の標準化されたウェルを含めた：
・２０μｌの溶液Ａ（０．０４９％ＣＨＸ＋０．０４９％Ｚｎ2+＋０．１％キトサン）をウェルに供給した。
・２０μｌの溶液Ｂ（０．０２５％ＣＨＸ＋０．３％Ｚｎ2+）をウェルに供給した。
【００５８】
その後、それらを以下の通りにインキュベートした：
Ａｄ．３。嫌気性インキュベーション：嫌気性チャンバー（９０％Ｎ2、５％Ｈ2、５％ＣＯ2）（Ａｎｏｘｏｍａｔ，ＷＳ９０００；Ｍａｒｔ；Ｌｉｃｈｔｅｎｖｏｏｒｄｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒ）中、３７℃にて７〜１４日間インキュベートする。
Ａｄ．８。好気性インキュベーション：好気的に３７℃で２４〜４８時間インキュベートする。
【００５９】
残りを選択培地上で以下の通りに培養した：
Ａｄ．１。Ｓ．ミュータンス、Ｍｉｔｉｓ−ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ−ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ寒天プレート上で３日間、上記の通り嫌気性菌培養。Ｓ．ミュータンスは、小さなムコイドコロニーとして同定された。
Ａｄ．２。大腸菌、大気中、３７℃にて３日間、エオシン・メチレン・ブルー寒天（ＥＭＢ寒天）上で培養した。コロニーは暗い中心と緑色の金属光沢を有する。
Ａｄ．４。Ｅ．ファエシウム。Ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ−ａｚｔｒｅｏｎａｍ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ（ＣＡＡ）（Ｆｏｒｄら、１９９４）上で３日間、３７℃、空気中でインキュベートする。
Ａｄ．５。Ｓ．アウレウス。スタフィロコッカス寒天プレート上で３７℃にて３日間空気中でインキュベートし、ＤＮＡ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）上のＤＮＡを分解するそれらの能力によりＳ．エピデルミディスと区別する。
Ａｄ．６。カルビカンス。Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｔ寒天プレート上で３日間、空気中で３７℃にて培養する。それらは、光沢のないクリーミーなホワイトピンク色、又はピンク色のコロニーとして同定された。
Ａｄ．７。Ｃ．パラプシル。Ｓａｂｏｕｒａｕｄのデキストロース寒天上で３日間、空気中で３７℃にて培養する。
Ａｄ．９．Ａ．ａ。Ａ．ａ．の選択的単離のためのトリプチカーゼダイズ血清バシトラシン−バンコマイシン（ＴＳＢＶ）培地上で３〜５日間嫌気培養（上述）した（Ｓｌｏｔｓ  １９８２）。
【００６０】
結果：
表１及び図１ｉ）（好気性菌培養）及びｉｉ）（嫌気性菌培養）に示される試験の結果は、クロルヘキシジン（０．００４９重量％）、Ｚｎ2+（０．０４９重量％）及びキトサン（０．１重量％）を含む溶液Ａが、２種の真菌株であるＣ．アルビカンス及びＣ．パラプシルを除いて、微生物の増殖を阻害しなかったことを示す。しかしながら、上記真菌株は、硫黄ガスの生成に関与していない。クロルヘキシジン（０．０２５重量％）及びＺｎ2+（０．３重量％）を含む溶液Ｂは、表１及び図２ｉｉｉ）から分かるように、阻害ゾーンの伸長（ｍｍ）として測定される増殖を阻害する。
【００６１】
実施例３：本発明の組成物を用いたマウス／喉のリンスは喉の痛みにプラスの効果を有した喉の痛みを患っている５人の試験被験者は、本発明の組成物を含む溶液で、１日２回（朝及び夕方）、彼らの口／喉をリンスし／うがいした。リンス／うがい後、溶液を吐き出した。
【００６２】
溶液は、濃度が０．０４９％であるＺｎ2+と濃度が０．１％であるキトサンを組み合わせた、濃度が０．００４９％であるクロルヘキシジンを含む。
被験者１は、２日間、喉の痛みを患っていた。
被験者２は、１日間、喉の痛みを患っていた。
被験者３は、２日間、喉の痛みを患っていた。
被験者４は、３日間、喉の痛みを患っていた。
被験者４は、１日間、喉の痛みを患っていた。
【００６３】
結果
１日２回のうがいにより２日以内に、喉の痛みの全ての症状は、残り全ての試験被験者において消失した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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