(57)【要約】  本願発明は、ヒト化及び脱免疫化抗エンドグリン抗体及びその抗原結合断片の組成物に関する。1つの態様は、可変重鎖、可変軽鎖又はその両方のフレームワーク領域の少なくとも１つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基において１以上の1つ以上の修飾を有する抗体に関する。別の態様は、線維症を阻害または治療する抗エンドグリン抗体に関する。
2017537084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドグリン結合抗体またはその結合断片、および薬学的に許容される賦形剤を含む、線維症を治療または抑制する際に使用するための組成物であって、前記抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾を含んでもよい配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を含み、且つ、
軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；からなる群から選択される１又は複数の修飾を含んでもよい配列番号９３として記載されたアミノ酸配列を含む；
上記組成物。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、又は９２として記載される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として記載される軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
エンドグリン結合抗体またはその結合断片、および薬学的に許容される賦形剤を含む、線維症を治療または抑制する際に使用するための組成物であって、前記抗体またはその抗原結合断片は配列番号８９として記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３として記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、上記組成物。
【請求項４】
抗体またはその結合断片が肝線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
肝線維症が肝硬変および、慢性ウイルス肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎のような関連症状からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗体またはその結合断片が腎臓線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
腎臓線維症が、慢性腎疾患、代謝症候群、ベコウレア還流尿管間腎線維症、糖尿病、糸球体腎炎または糸球体腎炎（ＧＮ）、焦点部分糸球体硬化症および膜糸球体腎炎、または中血管内皮ＧＮによって引き起こされる、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
抗体またはその結合断片が肺線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
肺線維症が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または特発性間質性肺炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ））、および拡散実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）、特発性間質性肺炎または急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
抗体またはその結合断片が腸線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体またはその結合断片が眼線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
抗体またはその結合断片が関節線維症の治療に有用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
それを必要とする対象における線維症を治療または阻害する方法であって；対象に、
配列番号８９として記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片並びに
薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物を投与し、それにより線維症を治療または阻害する、上記方法。
【請求項１４】
それを必要とする対象における線維症を治療または阻害する方法であって； 
配列番号８９として記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、且つ、
軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、
エンドグリンに結合する抗体又はその抗原結合断片
並びに
薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物を対象に投与し、それにより線維症を治療または阻害する、上記方法。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、又は９２として記載される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として記載される軽鎖可変領域とを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄ断片、可変重鎖、可変軽鎖、又はｄＡｂ断片である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体又はその抗原結合断片がさらに治療用標識で標識されている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
線維症が、肝線維症である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
肝線維症が肝硬変並びに、慢性ウイルス肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎のような関連症状からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
肝線維症が、寄生虫またはウイルスからの肝臓への慢性傷害によって引き起こされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
寄生虫またはウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または住血吸虫症である、請求項２０に記載の方法。  
【請求項２２】
線維症が、腎臓線維症である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
腎臓線維症が、慢性腎疾患、代謝症候群、ベコウレア還流尿管間腎線維症、糖尿病、糸球体腎炎または糸球体腎炎（ＧＮ）、焦点部分糸球体硬化症および膜糸球体腎炎、または中血管内皮ＧＮによって引き起こされる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
線維症が、肺線維症である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
肺線維症が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または特発性間質性肺炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、および拡散実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）、特発性間質性肺炎または急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１又は複数の線維症阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
抗エンドグリン抗体またはその抗原結合断片と、１つ以上の線維化阻害剤は、同じ部位に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗エンドグリン抗体またはその抗原結合断片と、１つ以上の線維化阻害剤は、異なる部位で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗エンドグリン抗体またはその抗原結合断片、および１つまたは複数の線維症阻害剤は、連続して投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
抗エンドグリン抗体またはその抗原結合断片、および１つまたは複数の線維症阻害剤は同時に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
抗体またはその抗原結合断片は、患者当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、または約２００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項３３】
配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法であって、
重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、
軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、
ＢＭＰシグナルが阻害される、上記方法。
【請求項３４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、又は９２として記載される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として記載される軽鎖可変領域とを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化を阻害する方法であって、ＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化が阻害される、上記方法。  
【請求項３６】
配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化を阻害する方法であって、
該重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、
該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、
ＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化が阻害される、上記方法。
【請求項３７】
抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号８８、８９、９０、９１または９２として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、または１０３として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体、またはその抗原結合断片は、エンドグリンへのＢＭＰ９の結合をブロックする、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それらのすべての開示が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月１２日に出願された米国仮出願第６２／０７８，７８８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
とりわけまた、ＣＤ１０５又はｅｄｇ−１としても知られるエンドグリンは、増殖しつつある血管内皮細胞において高レベルで発現する、ホモ二量体のＩ型膜糖タンパク質である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１６２３〜１６３４）。しかし、正常組織の血管内皮細胞も、ある程度のエンドグリンを発現させる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、同上；Ｗａｎｇら、１９９３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５４：３６３〜３７０）。ヒトエンドグリンは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）に特異的に結合することが知られており、エンドグリンについて推測されるアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β受容体の一種であるβ−グリカンに対する強い相同性を示す。
【０００３】
複数の抗エンドグリン抗体、特に、抗エンドグリンモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）については、説明されている。ｍＡｂであるＳＮ６ｊは、ヒト白血病細胞の細胞膜の糖タンパク質混合物でマウスを免疫化することから生成されたモノクローナル抗体である（Ｈａｒｕｔａ及びＳｅｏｎ、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７８９８〜７９０２）。ＳＮ６は、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。Ｃ−ＳＮ６ｊはマウス可変領域とヒト定常領域をもつＳＮ６ｊのキメラ形体である。ｍＡｂである４４Ｇ４は、ヒト白血病プレＢ細胞の全細胞懸濁液でマウスを免疫化することから生成された抗体である（Ｇｏｕｇｏｓ及びＬｅｔａｒｔｅ、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１９２５〜１９３３；１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８３６１〜８３６４）。４４Ｇ４もまた、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。ｍＡｂであるＭＪ７／１８は、炎症したマウス皮膚でラットを免疫化することから生成された抗体である（Ｇｅ及びＢｕｔｃｈｅｒ、１９９４、同上）。ＭＪ７／１８は、マウスエンドグリンを認識するｍＡｂである。ｍＡｂであるＴｅｃ−１１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞でマウスを免疫化することから生成された抗体である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１６２３〜１６３４）。Ｔｅｃ−１１は、反応性がヒトエンドグリンに制約されたマウスｍＡｂである（Ｂｕｒｒｏｗｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９５；１（１２）：１６２３−３４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化及び脱免疫化抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。このようの抗体は、精製、検出、診断、及び治療適用に用いられる。本明細書ではまた、エンドグリンの１又は複数の分子種又は変異体に結合し、且つ線維症を治療、阻害、または改善する、ヒト化及び脱免疫化抗体又はそれらの抗原結合断片も提供される。
【０００５】
エンドグリンに結合し、本明細書で説明される、ヒト化及び脱免疫化抗体並びに抗原結合断片を用いて、これに限定されないが、肺、肝臓、心臓、又は腎線維症を含む線維症を治療、阻害、または改善するために使用される。本明細書に記載のヒト化及び脱免疫化抗体および抗原結合フラグメントはまた、線維症の治療、阻害、または改善のための医薬で使用することができる。
【０００６】
本明細書では、特異的にエンドグリンに結合するヒト化抗体及び脱免疫化抗体が提供される。また、本明細書では、特異的エンドグリンリガンドＢＭＰによって結合を防止される、エンドグリンに結合するヒト化抗体および脱免疫化抗体が提供される。また、本明細書では、特異的にエンドグリンに結合し、Ｓｍａｄ  １／５／８経路の下流のシグナル伝達を阻害するヒト化及び脱免疫化抗体が提供される。
【０００７】
本明細書では、シグナル伝達経路ＢＭＰ９を阻害し、そして線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８シグナリングを中断して線維化を阻害する、エンドグリンに対する抗体が提供される。
【０００８】
本明細書では、予防、疾患または障害に関連したエンドグリンに結合し、線維化を防止する（すなわち、線維症の重症化を阻害、治療、軽減する）、本明細書に記載のヒト化及び脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、線維化を治療、阻害、または改善するための方法を提供する。
【０００９】
本明細書では、エンドグリンに特異的に結合し、線維症を治療する本明細書に記載のヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、線維症を治療、抑制、又は改善するための方法が提供される
【００１０】
本明細書では、エンドグリン受容体に結合し、ＢＭＰ９のエンドグリンへの結合をブロックする、本明細書に記載のヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、線維症を治療、抑制、又は改善するための方法が提供される。
【００１１】
本明細書では、エンドグリン受容体に結合し、Ｓｍａｄ  １／５／８シグナル伝達を阻害する、本明細書に記載のヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、線維症を治療、抑制、又は改善するための方法が提供される。
【００１２】
本明細書では、それを必要とする対象における線維症を治療または阻害する方法であって；アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含む、抗体またはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を、被験体に投与し、それにより線維症を治療または阻害される、方法が提供される。
【００１３】
本明細書では、それを必要とする対象における線維症を治療または阻害する方法であって；対象に、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、且つ、
軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片；並びに薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を、被験体に投与し、それにより線維症を治療または阻害される、方法が提供される。
【００１４】
このような方法において、抗体、又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、又は９２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。
【００１５】
このような方法において、抗原結合断片は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄフラグメント、可変重鎖、可変軽鎖またはｄＡｂ断片でありうる。抗体、またはその抗原結合断片は、さらに治療標識で標識されうる。
【００１６】
一態様において、線維症は肝線維症である。肝線維症は、これに限定されないが、肝硬変並びに、慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）  、胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎などの関連状態を含む。肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または特発線維性肺胞炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、及びびまん性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）を含むことができる。
【００１７】
いくつかの例において、肝線維症は、寄生虫またはウイルスから肝臓への慢性傷害によって引き起こされうる。寄生虫またはウイルスは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または住血吸虫症でありうる。
【００１８】
別の局面において、線維症は腎線維症である。腎線維症は、慢性腎臓病、メタボリック症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糖尿病、糸球体腎炎又は糸球体腎炎（ＧＮ）、巣状分節性糸球体硬化症および膜性腎症、または膜性増殖性糸球体腎炎（ｍｅｓａｎｇｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＧＮ）によって引き起こされ得る。
【００１９】
別の態様において、線維症は肺線維症である。肺線維症は、これに限定されないが、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性間質性肺炎または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む。
【００２０】
本明細書に記載するいずれの方法も、１つまたは複数の線維症阻害剤を投与することをさらに含んでもよい。
【００２１】
いくつかの例では、抗エンドグリン抗体、またはその抗原結合断片と１つ以上の線維化阻害剤は、同じ部位に投与される。
【００２２】
他の例は、抗エンドグリン抗体、またはその抗原結合断片と１つ以上の線維化阻害剤は、異なる部位で投与される。
【００２３】
他の例では、抗エンドグリン抗体、またはその抗原結合断片および１つまたは複数の線維症阻害剤は、連続して投与される。
【００２４】
他の例では、抗エンドグリン抗体、またはその抗原結合断片および１つまたは複数の線維症阻害剤は同時に投与される。
【００２５】
抗体またはその抗原結合断片は、患者当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、または約２００ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。
【００２６】
本願明細書において、配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法が提供される。
【００２７】
本願明細書において、配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法であって、該重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、ＢＭＰシグナルが阻害される、上記方法を提供する。
【００２８】
このような方法において、抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号８８、８９、９０、９１または９２として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、または１０３として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含みうる。
【００２９】
本願明細書において、配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化を阻害する方法であって、ＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化が阻害される、上記方法を提供する。
【００３０】
本願明細書において、配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９３として記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片と、細胞を接触させることを含む、線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化を阻害する方法であって、該重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、ＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化が阻害される、上記方法を提供する。
【００３１】
このような方法において、抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号８８、８９、９０、９１または９２として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、または１０３として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含みうる。
【００３２】
このような方法のいずれかにおいて、抗体は、エンドグリンへのＢＭＰ９の結合をブロックすることができる。
【００３３】
一態様では、本明細書で説明されるヒト化及び脱免疫化抗体並びに抗原結合断片は、任意のアイソタイプでありうる。本明細書ではまた、ＡＶＩＭＥＲ、ダイアボディー、及び重鎖二量体（ラクダ重鎖構築物及びサメ重鎖構築物を含めた）も包含される。
【００３４】
本明細書では、「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」、又は「抗体の機能的断片」という用語を互換的に用いて、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。このような用語の範囲内に包含される抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを含有するＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離ＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。加えて、この定義には、単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含む結合機能を維持する「半」抗体も包含される。本明細書にはまた、ダイアボディーなど、単鎖抗体の他の形態も包含される。
【００３５】
抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片（非共有結合により連結されたＦｖ断片並びに共有結合により連結されたＦｖ断片を含めた）、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、又はｄＡｂ断片が含まれるがこれらに限定されない、本明細書で説明される抗原結合断片のうちのいずれかでありうる。非限定的な一実施形態では、抗原結合断片が、場合によって、ヒト抗体のＦｃ部分へとさらに融合されうるｓｃＦｖである。
【００３６】
一態様では、本明細書で説明されるヒト化及び脱免疫化抗体並びに抗原結合断片を修飾することができる。例えば、一実施形態では、化合物を修飾して、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性、可溶性、バイオアベイラビリティー、又は半減期など、該化合物の薬物動態特性を変化させることができる。このような修飾には、ＰＥＧ化及び／又はグリコシル化が含まれるがこれらに限定されない。
【００３７】
本明細書で説明されるヒト化及び脱免疫化抗体並びに抗原結合断片は、従来の手段を用いて、急速送達用又は遅延送達用に製剤化することができる。非限定的な一実施形態では、急速送達が、例えば、静脈内注射を介する。非限定的な別の実施形態では、遅延送達が、例えば、皮下沈着を介する。
【００３８】
組成物は、例えば、皮下注射、皮下注射、硝子体内注射、皮内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は筋肉内注射による投与など、局所投与することもでき、部位内投与することもでき、全身投与することもできる。
【００３９】
本明細書では、本明細書で説明されるヒト化及び脱免疫化抗体並びに抗原結合断片と、許容可能な担体又は賦形剤とによる組成物が提供される。
【００４０】
本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片を用いて、多様な線維症及び線維症に伴う症状を治療することができる。加えて、本明細書で説明されるこれらのヒト化及び脱免疫化抗体並びにそれらの抗原結合断片は、線維症及び線維症に伴う症状を治療、阻害、または改善するための薬物製剤においても用いることができる。線維症はいくつかの例において肝臓線維症である。他の例において線維症は腎線維症である。さらに他の例において線維症は肺線維症である。さらに他の例において線維症は心臓線維症である。
【００４１】
本明細書では、患者に組成物を投与することにより、該患者において、エンドグリンに対する宿主免疫反応を誘導する方法であって、該組成物が、それにより特異的に認識されるエピトープに対する有効な宿主免疫反応を誘導する、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片を含む該方法が提供される。
【００４２】
本明細書では、患者に本明細書で提供する組成物を投与することを含む、対象において線維症を治療、抑制、又は改善するための方法が提供される。線維症はこれに限定されないが、等、肝臓、腎臓、肺、心臓、皮膚、腸、眼（眼）、関節を含む。一つの実施形態において線維症は肝線維症である。別の実施形態において、線維症は腎線維症である。別の実施形態において、線維症は皮膚線維症である。別の実施形態において、線維症は腸線維症である。別の実施形態において、線維症は眼線維症である。別の実施形態において、線維症は関節の線維症である。
【００４３】
本方法はさらに、線維症の一つ以上の補助的治療を含むことができる。ヒト化および脱免疫化抗エンドグリン抗体を含有する医薬組成物の投与の前、投与と同時又は投与の後に、抗線維症剤は、投与することが出来る。抗線維症剤は、薬学的組成物と同じ日に投与される場合、投与は、併用または逐次的であることができる。抗線維症剤は、ヒト化および脱免疫化抗エンドグリン抗体を含有する医薬組成物の投与と同じ部位に、又は異なる部位に投与することができる。
【００４４】
本願発明は、さらに、線維症の治療において使用するための、エンドグリン結合抗体またはその結合断片並びに薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する；ここで抗体またはその結合断片は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み；該重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；及び７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾を含んでもよい配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を含み、そして該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；及び５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含んでもよい配列番号９３として記載したアミノ酸配列を含んでおり、それによって線維症が治療又は阻害される。
【００４５】
前記抗体又は断片は配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００４６】
前記抗体又は断片は配列番号９３として記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００４７】
前記抗体又は断片は上記で記載された修飾をうけた配列番号８９として記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００４８】
前記抗体又は断片は上記で記載された修飾をうけた配列番号９３として記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００４９】
一つの好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、肝線維症の治療に使用するためのものである。
【００５０】
別の好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、腎線維症の治療に使用するためのものである。
【００５１】
別の好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、皮膚線維症の治療に使用するためのものである。
【００５２】
別の好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、腸線維症の治療に使用するためのものである。
【００５３】
別の好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、眼線維症の治療に使用するためのものである。
【００５４】
別の好ましい態様において、前記抗体又はその断片は、関節の線維症の治療に使用するためのものである。
【００５５】
抗体およびその抗原結合断片はヒト化及び脱免疫化されていてもよく、そしてこれらの特性を有する抗体の調製は、米国特許第８２２１７５３号に記載されている。
【００５６】
本明細書で提供される方法では、対象がヒト対象の場合もあり、ヒト以外の対象の場合もある。患者の健康、疾患又は状態の増悪、並びに治療の有効性に応じて、本明細書で提供される組成物並びに抗線維症剤又は抗線維症治療を、単回投与することもでき、複数回投与することもできる。治療期間の全体にわたり、療法及び治療に対する調整を行うことができる。
【００５７】
本明細書では、治療を維持すべきか、増加すべきか或いは減ずるべきか決定するために、本明細書で提供される方法のうちのいずれかの１又は複数の有効性をモニタリングする方法が提供される。
【００５８】
本出願の一実施形態は、線維症を治療、抑制、又は改善するための薬物を製剤化するのに、本発明の組成物のうちのいずれかを用いることを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、線維症の部位に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。本発明の薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、対象における、本明細書で説明される障害の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。本発明の医薬組成物の用量及び投与についての指示書は、医薬パッケージ内に組み入れることができる。
【００５９】
参照による組込み
別段に言及しない限り、本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が、参照によりその全体において組み込まれることが具体的且つ個別に示唆されたと仮定した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
米国特許第８２２１７５３号は参照によりその全体が本明細書に援用される。  
【００６１】
２０１３年９月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８２６５は、参照によりその全体が本明細書に援用されている。
【００６２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、本明細書にその全体が参照により組み込まれる配列表を含んでいる。２０１５年８月２５日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、３５８８２−７１８．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔ名前が付けられ、サイズは７４８０８バイトである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】マウスモノクローナル抗体によるキメラＴＲＣ１０５のＶＬ  ＣＤＲ（下線を付す）を、ヒト配列であるＯ２−ＶＫ１−３９のフレームワーク領域（ＦＲ）１〜３と、ヒトＪＫ４配列に由来するフレームワーク領域４（配列番号４）（すべて太字）との間に移植した、ヒト化Ｏ２−ＶＫ１−３９可変軽（ＶＬ）鎖を示す図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ヒトＦＲに対してもたらされうる変異を、配列（配列番号８６で開示される配列）の１、３、４、５、３６、４６、４７、６０、７０、７１、１００、及び１０６位において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。
【００６４】
【図２】マウスモノクローナル抗体によるキメラＴＲＣ１０５のＶＨ  ＣＤＲ（下線を付す）を、ヒト配列であるＶＨ３−１５のフレームワーク領域（ＦＲ）１〜３と、ヒトＪＨ４配列に由来するフレームワーク領域４（配列番号４２）（すべて太字）との間に移植した、ヒト化ＶＨ３−１５可変重（ＶＨ）鎖を示す図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ヒトＦＲに対してもたらされうる１又は複数の変異を、配列（配列番号８７で開示される配列）の４９、７６、７７、７８、８２ａ、８９、９４、１０８、１０９、及び１１３位において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。
【００６５】
【図３Ａ】本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖（図３Ａ；掲載の順に、それぞれ、配列番号１〜５）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。
【図３Ｂ】本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖（図３Ｂ；掲載の順に、それぞれ、配列番号３９〜４３）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。
【００６６】
【図４Ａ】本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖（図４Ａ；掲載の順に、それぞれ、配列番号１及び６９〜７２）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。
【図４Ｂ】本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖（図４Ｂ；掲載の順に、それぞれ、配列番号３９及び７３〜７５）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。
【００６７】
【図５】本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖及び超ヒト化ＶＫ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号１、３、及び７０）、並びに例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖及び超ヒト化ＶＨ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号３９、４１、及び７４）について、アミノ酸配列の配列決定及び比較を示す図である。
【００６８】
【図６】図６Ａ〜６Ｆ：ヒト化抗体及びヒト化／脱免疫化抗体を伴う、抗ＣＤ１０５抗体による競合的ＥＬＩＳＡを示す図である。多様な濃度の各抗体を、一定濃度のビオチニル化基準抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、且つ、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に捕捉されたＣＤ１０５（１００ｎｇ／ｍｌ）に結合させた。結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を介して検出した。プレートリーダー上において、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、これを、被験抗体濃度と対比してプロットした。  図６ＡはＶＫ１ＶＨ１、ＶＫ１ＶＨ２、ＶＫ２ＶＨ１及びＶＫ２ＶＨ２と比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。  図６Ｂは、ＶＫ１ＶＨ１、ＶＫ２ＡＶＨ１Ａ、ＶＫ２ＳＡＶＨ１Ｑ、ＶＫ２ＳＡＶＨ１Ｒ及びＶＫ２ＳＡＶＨ１Ｓと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。  図６ＣはＶＫ２ＡＡＶＨ１Ａ２、ＶＫ２ＡＳＶＨ１Ａ２、ＶＫ２ＡＳＶＨ１Ｑ、ＶＫ２ＳＳＶＨ１Ａ及びＶＫ２ＳＳＶＨ１Ｑと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。  図６Ｄは、ＶＫ２ＶＨ１、ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ａ、ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ｑ、ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ｒ及びＶＫ２ＡＡＶＨ１Ｓと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。  図６Ｅは、ＶＫ２ＶＨ１、ＶＫ２ＡＳＶＨ１Ａ、ＶＫ２ＡＳＶＨ１Ｒ、ＶＫ２ＡＳＶＨ１Ｓ、およびＶＫ２ＳＡＶＨ１Ａ２と比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。  図６Ｆは、ＶＫ２ＶＨ１、ＶＫ２ＳＳＶＨ１Ｑ、ＶＫ２ＳＳＶＨ１Ａ２、ＶＫ２ＳＳＶＨ１Ｒ及びＶＫ２ＳＳＶＨ１Ｓと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
【００６９】
【図７】太字で且つ下線を付したＣＤＲを伴う、ヒト化脱免疫化リード抗体重鎖可変領域（配列番号８９で開示される配列）を例示する図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、もたらされうる変異を、配列（配列番号１１６で開示される配列）の同定された位置において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。変異は、単一の突然変異としてもたらすこともでき、複数の突然変異としてもたらすこともでき、且つ、任意に組み合わされた突然変異によりもたらすこともできる。
【００７０】
【図８】太字で且つ下線を付したＣＤＲを伴う、ヒト化脱免疫化リード抗体軽鎖可変領域（配列番号９３で開示される配列）を例示する図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、もたらされうる変異を、配列（配列番号１１７で開示される配列）の同定された位置において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。変異は、単一の突然変異としてもたらすこともでき、複数の突然変異としてもたらすこともでき、且つ、任意に組み合わされた突然変異によりもたらすこともできる。
【００７１】
【図９】エンドグリンの基質結合部位へのＢＭＰ９の結合（左パネル）及びヒト化及び脱免疫化抗エンドグリン抗体のエンドグリンへの結合並びにＢＭＰ９の結合の阻害を例示する図である。
【００７２】
【図１０】疾患対照動物、アイソタイプ適合抗体で処置した動物及びＭＬ１０４３抗体で処置した動物における、ｉｎ  ｖｉｖｏ四塩化炭素誘導肝線維症モデルマウスの体重変化を例示する図である。
【００７３】
【図１１】体重及び肝臓重量を示す図である。図１１Ａは、三つのグループのための体重のグラフを提供する。図１１Ｂは、三つのグループのために肝臓重量のグラフを提供する。
【００７４】
【図１２】図１２Ａ−Ｆは、シリウスレッド染色した肝臓切片の代表的な顕微鏡写真である。図１２Ａは、疾患対照動物からの肝臓切片のｘ１００写真である。図１２Ｂは、疾患対照動物からの肝臓切片のｘ２００写真である。図１２Ｃは、アイソタイプ適合抗体で処置した動物の肝臓切片のｘ１００写真である。図１２Ｄは、アイソタイプ適合抗体で処置した動物の肝臓切片のｘ２００写真である。図１２Ｅは、ＭＬ  ０４３抗体で処置した動物の肝臓切片のｘ１００写真である。図１２Ｆは、ＭＬ  ０４３抗体で処置した動物の肝臓切片のｘ２００写真である。
【００７５】
【図１３】疾患対照動物、アイソタイプ適合抗体で処置した動物、およびＭＬ  ０４３抗体で処置した動物において肝線維化面積（％シリウスレッド陽性領域）を示すグラフである。
【００７６】
【図１４】図１４Ａ−Ｅはブレオマイシン誘発性肺線維症モデルの結果である。図１４Ａ：肺ヒドロキシプロリンは、加水分解法により定量した。図１４Ｂ：組織学的肺切片の分析は、当グループのアイデンティティを認識していない専門家によって行われた。マッソントリクローム染色を行い、アシュクロフトスコアの推定値が決定された。図１４Ｃ：ボンフェローニ多重比較試験による５つの処理群間で体重に有意差はなかった（それぞれ他のグループに対するアイソタイプ対照抗体群を比較した、ｐ＞０．０５）。図１４Ｄ：ボンフェローニ多重比較試験による５つの処理群間の生存率に有意差はなかった（それぞれ他のグループに対するアイソタイプ対照抗体群を比較した、ｐ＞０．０５）。図１４Ｅ：アシュクロフトスコア（Ashcroft score）。
【００７７】
【図１５】マウスエンドグリンにＭ１０４３抗体の結合することがＥＬＩＳＡによって確認された。
【００７８】
【図１６】エンドグリンに結合するＢＭＰ９とのビオチン化Ｍ１０４３の競合ＥＬＩＳＡ。ＢＭＰ９の希釈系列は、エンドグリンに結合するためのビオチン化Ｍ１０４３の固定濃度に対して競合させた。ラットのＩｇＧ１を陰性対照として使用した。結合したビオチン化Ｍ１０４３抗体は、ストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートおよびＴＭＢ基質を用いて検出した。
【００７９】
【図１７】ヒトＣＤ１０５へのビオチニル化ＴＲＣ２０５抗体の結合は、ＥＬＩＳＡによって確認された。
【００８０】
【図１８】競合ＥＬＩＳＡによって、ヒトＣＤ  １０５に結合することについてＴＲＣ２０５抗体と競合するヒトＢＭＰ９の能力が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
具体的な製剤又は工程パラメータは、当然ながら変化しうるので、本出願がこれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語法は、具体的な実施形態を説明することだけを目的とするものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。さらに、本発明を実施するには、本明細書で説明される方法及び材料と類似又は同等である、多数の方法及び材料を用いうることも理解される。
【００８２】
本出願に従い、当技術分野の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡの技法を用いうる。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照されたい。
【００８３】
Ｉ．抗エンドグリン抗体
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体、並びにそれらの抗原結合断片が提供される。
本明細書に記載のヒト化及び脱免疫化抗体は、それらの特異性を維持及び／又向上させながら、低下した免疫原性を示す。これらのヒト化及び脱免疫エンドグリン抗体は、線維症の治療、阻害または改善のために、ならびにエンドグリンの精製および検出、インビトロアッセイ、および線維症に罹患している対象の治療に有用である。
【００８４】
本発明者らは、特異的にエンドグリンと結合する中和抗体またはその抗原結合断片が、エンドグリンに結合し、ＴＧＦβ受容体へのＢＭＰ９の結合を阻害することができることを同定した。
【００８５】
本発明者らはまた、エンドグリンへのＢＭＰ９の結合をブロックする抗体またはその断片によってＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法を新たに記載する。
【００８６】
また、本明細書に記載されたものは、特異的にエンドグリン受容体に結合し、Ｓｍａｄ  １／５／８シグナル伝達を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することにより線維症を阻害する方法である。
【００８７】
Ａ．抗体についての用語法
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、天然の場合であれ、部分的又は完全な合成により作製された場合であれ、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインであるか、又はこれと相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も対象とする。この用語は、以下で説明される用語など、「抗原結合断片」並びに類似の結合断片についての他の互換可能な用語をさらに包含する。また、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体並びに他のヒト化抗体（ＣＤＲ修飾並びにフレームワーク領域修飾を含めた）も、この用語により意図される。
【００８８】
本明細書では以後、「抗体（単数又は複数）」という用語への参照を、本明細書で説明される抗原結合断片のうちのいずれかを包含すると考えるものとし、該用語は、必要に応じて互換可能であるものとする。
【００８９】
天然抗体並びに天然免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖並びに２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ドルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、共有結合による１つのジスルフィド結合を介して重鎖に連結されることが典型的であるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔を置いた、鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端部において、可変ドメイン（「ＶＨ」ドメイン）に続いて、複数の定常ドメイン（「ＣＨ」ドメイン）を有する。各軽鎖は、一方の端部における可変ドメイン（「ＶＬ」ドメイン）、並びにその他方の端部における定常ドメイン（「ＣＬ」ドメイン）を有するが、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並行し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並行する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとのインターフェースを形成すると考えられている。
【００９０】
本明細書で用いられる「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」、又は「合成ポリペプチド」という用語は、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその部分、又はアミノ酸配列若しくはその部分が、同等の天然配列と比較して、新規にデザインされているか、新規に合成されているか、又は修飾されている配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体又は抗原結合断片）又は合成遺伝子は、核酸配列又はアミノ酸配列の化学合成が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られている方法により調製することができる。合成遺伝子は、アミノ酸レベル又はポリヌクレオチドレベル（又はこれらの両方のレベル）で天然遺伝子とは異なることが典型的であり、合成の発現制御配列との関連で配置されることが典型的である。例えば、合成遺伝子配列は、例えば、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、欠失、又は付加により変化しており、これにより、供給源の配列とは異なる、抗体のアミノ酸配列又は配列をコードするポリヌクレオチドを提供する、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を包含しうる。合成遺伝子のポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して異なるアミノ酸を伴うタンパク質を必ずしもコードしうるわけではない；例えば、それらはまた、異なるコドンではあるが、同じアミノ酸をコードする（すなわち、ヌクレオチドの変化が、アミノ酸レベルではサイレントの突然変異を表す）コドンを組み込む合成ポリヌクレオチド配列も包含しうる。
【００９１】
抗体に関する「可変ドメイン」という用語は、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に関して用いられる抗体の可変ドメインを指す。しかし、その可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり一様に分布しているわけではない。そうではなくて、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても、可変性は、超可変領域（また、ＣＤＲとしても知られる）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存的な部分を、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と称する。修飾されていない重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、大半がβシートの立体構造をとり、且つ、３つずつのＣＤＲ（該βシート構造を連結するループ、並びに場合によって、該βシート構造の部分を形成する）を散在させる、４つずつのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲにより、併せて密接する形で近傍に保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）、６４７〜６６９ページを参照されたい）。
【００９２】
本明細書で用いられる「超可変領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合の一因となる抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、相補的な形で抗原に結合する３つの配列領域に由来するアミノ酸残基を含み、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として知られている。Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）、及び８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）、及び９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に対応することが典型的である。異なる抗体のＣＤＲは、挿入を含有する可能性があり、したがって、アミノ酸の番号付けが異なりうることが理解される。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムは、特定の残基に対する添え字（例えば、軽鎖では、ＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、及び２７Ｆ）を使用して異なる抗体間における番号付けへの任意の挿入を反映する番号付けスキームで、このような挿入に対処している。代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）、及び９１〜９６（ＣＤＲＬ３）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）、及び９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）に対応することが典型的である。
【００９３】
本明細書で用いられる「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」とは、抗原結合ポケット又は抗原結合グルーブの一部を形成するフレームワークのアミノ酸残基を指す。一部の実施形態では、フレームワーク残基が、抗原結合ポケット又は抗原結合グルーブの一部であるループを形成し、このループ内のアミノ酸残基が、抗原と接触する場合も接触しない場合もある。フレームワーク領域は一般に、ＣＤＲ間の領域を構成する。Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２３（ＦＲＬ１）、３５〜４９（ＦＲＬ２）、５７〜８８（ＦＲＬ３）、及び９８〜１０９に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜３０（ＦＲＨ１）、３６〜４９（ＦＲＨ２）、６６〜９４（ＦＲＨ３）、及び１０３〜１３３に対応することが典型的である。軽鎖のＫａｂａｔによる番号付けについて上記で論じた通り、重鎖への挿入もまた、同様の形で対処されている（例えば、重鎖では、ＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２５（ＦＲＬ１）、３３〜４９（ＦＲＬ２）、５３〜９０（ＦＲＬ３）、及び９７〜１０９（ＦＲＬ４）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２５（ＦＲＨ１）、３３〜５２（ＦＲＨ２）、５６〜９５（ＦＲＨ３）、及び１０２〜１１３（ＦＲＨ４）に対応することが典型的である。
【００９４】
ＦＲのループアミノ酸は、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖の三次元構造を検討することにより評価及び決定することができる。溶媒に接触可能なアミノ酸位置は、ループを形成し、且つ／又は抗体可変ドメインにおいて抗原を接触させる可能性が高いので、このような位置について三次元構造を解析することができる。溶媒に接触可能な位置のうちのある位置は、アミノ酸の多様性を許容することが可能であり、他の位置（例えば、構造的位置）は一般に、多様性が低度である。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造に由来する場合もあり、タンパク質モデリングに由来する場合もある。
【００９５】
抗体の定常ドメイン（Ｆｃドメイン）は、抗体の抗原に対する結合には直接関与せずに、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介して、抗体依存性細胞傷害作用への抗体の関与など、各種のエフェクター機能を呈示する。Ｆｃドメインはまた、患者への投与後において循環する抗体のバイオアベイラビリティーも増大させる。
【００９６】
それらの重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。これらは、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃドメイン）を、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと称する。異なる免疫グロブリンのクラスのサブユニットの構造並びに三次元の立体構造はよく知られている。
【００９７】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（又は「κ」若しくは「Ｋ」）及びラムダ（又は「λ」）と称する２つの明確に異なる類型のうちの１つに割り当てることができる。
【００９８】
本明細書では、「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」、又は「抗体の機能的断片」という用語を互換的に用いて、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。このような用語の範囲内に包含される抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを含有するＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離ＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。加えて、この定義には、単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含む「半」抗体も包含される。本明細書にはまた、ダイアボディーなど、単鎖抗体の他の形態も包含される。
【００９９】
「Ｆ（ａｂ’）２」部分及び「Ｆａｂ」部分は、Ｉｇを、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼで処理することにより作製することができ、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することにより生成される抗体断片を包含する。例えば、パパインは、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ及びＣＬ（軽鎖定常領域）からなる軽鎖と、ＶＨ及びＣＨγ１（重鎖定常領域内のγ１領域）からなる重鎖断片とが、ジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で連結されている、２つの相同的な抗体断片を生成させる。これらの２つの相同的な抗体断片の各々を、Ｆａｂ’と称する。ペプシンもまたＩｇＧを切断するが、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流においてであり、上記で言及した２つのＦａｂ’をヒンジ領域で連結させた、Ｆａｂ’断片よりやや大型の抗体断片を生成させる。この抗体断片を、Ｆ（ａｂ’）２と称する。
【０１００】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン並びに重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１又は複数のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端において、数個の残基が付加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨを、定常ドメインのシステイン残基（単数又は複数）が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’の呼称とする。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、それらの間にヒンジ領域のシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的な連結についても知られている。
【０１０１】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、非共有結合又は共有結合により密に会合する、１つの重鎖可変ドメイン並びに１つの軽鎖可変ドメインによる二量体からなる（当技術分野では、ジスルフィド結合により連結されたＦｖ’が説明されている；Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１２３９〜１２４５）。各可変ドメインの３つずつのＣＤＲが相互作用してこのＶＨ−ＶＬ二量体の表面上における抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々に由来するＣＤＲのうちの１又は複数の組合せにより集合的に、該抗体に抗原結合特異性が付与される。例えば、レシピエント抗体又はその抗原結合断片のＶＨ鎖及びＶＬ鎖へと導入される場合なら、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３でも、抗体に抗原結合特異性を付与するには十分でありうるであろうし、このＣＤＲの組合せを、本明細書で説明される技法のうちのいずれかを用いて、結合、アフィニティーなどについて調べることができることを理解されたい。第２の可変ドメインと組み合わせた場合より低度のアフィニティーにおいてである可能性が高いが、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含む、Ｆｖの半分）もなお、抗原を認識し、これに結合する能力を有する。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬドメイン及びＶＨドメイン）は、個別の遺伝子によりコードされるが、そこにおいてはＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；並びにＯｓｂｏｕｒｎら（１９９８）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８）単一のタンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする、合成リンカーを介する組換え法を用いてこれらを接合することもできる。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内にはまた、このようなｓｃＦｖも包含されることが意図される。完全なＩｇ（例えば、ＩｇＧ）分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成させるためには、特定のｓｃＦｖのうちの任意のＶＨ配列及びＶＬ配列を、Ｆｃ領域のｃＤＮＡ配列又はゲノム配列に連結することができる。ＶＨ配列及びＶＬ配列はまた、タンパク質化学反応法又は組換えＤＮＡ法を用いて、Ｆａｂ、Ｆｖ、又は他のＩｇ断片を生成させるのにも用いることができる。
【０１０２】
「単鎖Ｆｖ」抗体断片又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインを、単一のポリペプチド鎖内に存在させる。一部の実施形態では、Ｆｖポリペプチドが、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、該ｓＦｖが、抗原に対する結合に所望される構造を形成することを可能とする。ｓＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５ページ（１９９４）を参照されたい。
【０１０３】
「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」という用語は、ヒト由来の治療用タンパク質のクラスを指すが、抗体並びに抗体断片とは類縁でなく、Ａドメイン（また、クラスＡモジュール、補体型の反復配列、又はＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも称する）と称する、複数のモジュール型結合ドメイン並びに再使用可能な結合ドメインからなる。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるエクソンシャフリング及びファージディスプレイ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３〜１４９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）により、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された。結果として得られるタンパク質は、単一のエピトープに結合するタンパク質と比較して、アフィニティー（場合によって、ナノモル未満）及び特異性の改善を呈示しうる、複数の個別の結合ドメインを含有しうる。例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号；同第２００５／０１６４３０１号；同第２００５／００５３９７３号；及び同第２００５／００８９９３２号；同第２００５／００４８５１２号；及び同第２００４／０１７５７５６号を参照されたい。
【０１０４】
既知である２１７のヒトＡドメインの各々は、約３５アミノ酸（約４ｋＤａ）を含み、これらのドメインは、平均５アミノ酸の長さのリンカーにより隔てられている。天然のＡドメインは、主にカルシウム結合並びにジスルフィド結合の形成を介して、迅速且つ効率的に均一で安定的な構造へとフォールドする。この共通の構造に必要とされるのは、わずかに１２アミノ酸の保存的な足場モチーフである。この最終結果として、それらの各々が個別の機能を表す複数のドメインを含有する、単一のタンパク質鎖がもたらされる。これらのタンパク質の各ドメインは個別に結合し、各ドメインのエネルギー的な寄与は相加的である。これらのタンパク質は、アビディティー多量体にちなんで「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」と命名された。
【０１０５】
「ダイアボディー」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ鎖）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含む、２つの抗原結合部位を伴う低分子抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間における対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；並びにＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）においてより十分に説明されている。
【０１０６】
抗原結合ポリペプチドにはまた、例えば、ラクダ及びサメに由来する抗体などの重鎖二量体も含まれる。ラクダ抗体及びサメ抗体は、Ｖ様ドメイン及びＣ様ドメインの２本の鎖（いずれも軽鎖を有さない）によるホモ二量体対を含む。ラクダにおける重鎖二量体であるＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用する必要がないので、通常なら軽鎖に接触する重鎖の領域を、ラクダにおける親水性アミノ酸残基へと変化させることができる。重鎖二量体によるＩｇＧのＶＨドメインを、ＶＨＨドメインと称する。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称する）と、５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）によるホモ二量体を含む。ラクダでは、ＶＨ領域又はＶＨＨ領域内のＣＤＲ１、２、及び３により抗体レパートリーの多様性が決定される。ラクダＶＨＨ領域内のＣＤＲ３は、その比較的長い１６アミノ酸の長さを特徴とする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（９）：１１２９）。これは、他の多くの種の抗体のＣＤＲ３とは対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３は、平均９アミノ酸である。ラクダ可変領域のｉｎ  ｖｉｖｏにおける多様性を維持する、ラクダに由来する抗体可変領域のライブラリーは、例えば、米国特許出願第２００５００３７４２１号で開示される方法により作製することができる。
【０１０７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態には、非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体が含まれる。大部分において、ヒト化抗体は、その中のレシピエントＣＤＲのうちの１又は複数が、所望の特異性、アフィニティー、及び結合機能を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物など、ヒト以外の種の抗体（ドナー抗体）に由来するＣＤＲにより置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒトＩｇの１又は複数のＦＲアミノ酸残基も、対応する非ヒトアミノ酸残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含有する場合がある。必要な場合は、これらの修飾を施して、抗体の効能を洗練させることができる。ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、場合によっては２つである可変ドメインのうちの実質的に全部を含むことが可能であり、この中の超可変領域のうちの全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲのうちの全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列によるＦＲである。ヒト化抗体は、場合によってまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域のうちの少なくとも一部も包含しうる。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；並びにＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。
【０１０８】
ヒト化抗体はまた、その中の重鎖及び軽鎖のＣＤＲのうちの一部又は全部が、非ヒトモノクローナル抗体に由来し、該可変領域の残りの部分の実質的にすべてが、ヒト可変領域（重鎖可変領域及び軽鎖可変領域）に由来し、定常領域が、ヒト定常領域に由来する抗体も包含する。一実施形態では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域が、非ヒト抗体に由来する。さらに別の実施形態では、重鎖及び軽鎖のうちの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）が、非ヒト抗体に由来する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３による多様な組合せが非ヒト抗体に由来することが可能であり、本明細書ではこれらが意図されている。非限定的な一例では、重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域のうちの１又は複数が、マウスキメラモノクローナル抗体クローンであるＴＲＣ１０５に由来する。
【０１０９】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかな量で存在しうる可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を指向するので、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を包含しうる従来の（ポリクローナル）抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基を指向する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるものとしての抗体の特徴を示唆するものであり、何らかの特定の方法による抗体の作製を要請するものとしては見なされないものとする。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により最初に説明されたハイブリドーマ法により作製することもでき、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製することもできる。ある実施形態では、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；並びにＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）において説明されている技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーからモノクローナル抗体を単離することもできる。
【０１１０】
抗体は、飽和硫酸アンモニウム沈殿、ユーグロビン沈降法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２による）、或いは以下でより詳細に説明されるカラムなど、抗Ｉｇカラム又はプロテインＡカラム、プロテインＧカラム、若しくはプロテインＬカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーを介して、上記で言及した培養物上清又は腹水から単離及び精製することができる。
【０１１１】
本明細書で説明される組成物及び方法において用いられる例示的な抗体は、例えば、ヒト化抗体などの完全免疫グロブリン分子、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、及び単鎖結合ポリペプチド、並びにまた抗原結合断片とも称される他のポリペプチドなど、当技術分野で知られるヒト化Ｉｇ分子の部分を含めた、抗原結合部位（すなわち、パラトープ）若しくは単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含有するヒト化Ｉｇ分子の部分である。免疫グロブリン分子又はその断片を構築する場合は、可変領域又はそれらの部分を、１又は複数の定常領域又はそれらの部分に融合させるか、連結するか、又は他の形で接合して、本明細書で説明される抗体又はそれらの断片のうちのいずれかを作製することができる。これは、分子クローニング法、又は該分子をコードする核酸の直接的な合成が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られる各種の方法により達成することができる。また、本明細書で説明される例においても、これらの分子を構築するための、非限定的な例示的方法を見出すことができる。
【０１１２】
例示的な一実施形態では、本出願が、エンドグリンに結合し、且つ、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する、単鎖結合ポリペプチドを意図する。例示的な一実施形態では、本出願が、エンドグリンに結合して、且つ、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する、単鎖結合ポリペプチドを意図する。このような分子は、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域が存在することを介して、エフェクター機能を有するか、又は半減期が延長された、単鎖可変領域断片である。当技術分野では、単鎖結合ポリペプチドを調製する方法が知られている（例えば、米国特許出願第２００５／０２３８６４６号）。
【０１１３】
「生殖細胞系列の遺伝子セグメント」又は「生殖細胞系列の配列」という用語は、生殖細胞系列（生殖細胞系列がそれに由来して形成される配偶子並びにこれらの二倍体細胞）に由来する遺伝子を指す。生殖細胞系列のＤＮＡは、単一のＩｇ重鎖又はＩｇ軽鎖をコードする複数の遺伝子セグメントを含有する。これらの遺伝子セグメントは、胚細胞内に保有されるが、それらが機能的遺伝子へと構成されるまでは、重鎖及び軽鎖へと転写及び翻訳される可能性がない。骨髄においてＢ細胞が分化するときに、これらの遺伝子セグメントは、１０８通りを超える特異性を生成させることが可能な動的遺伝子システムにより無作為にシャフリングされる。これらの遺伝子セグメントの大半は、生殖細胞系列のデータベースにより公表及び収集されている。
【０１１４】
本明細書で用いられる「免疫反応性」とは、結合剤、抗体又はその断片が、アミノ酸残基の配列（「結合部位」又は「エピトープ」）に特異的であり、さらにまた、他のペプチド／タンパク質と交差反応性であっても、それらをヒトへの投与用に製剤化するレベルでは毒性でないことを指す。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下における共有結合による相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、並びにイオン性相互作用及び／又は水素結合による相互作用に起因する、２つの分子間における直接的な会合を指し、これには、塩架橋及び水架橋などの相互作用、並びに他の任意の従来の結合手段が含まれる。「優先的に結合する」という用語は、結合剤が、非類縁のアミノ酸配列に結合する場合のアフィニティーを超えるアフィニティーで結合部位に結合することを意味する。このようなアフィニティーは、非類縁のアミノ酸配列に対する該結合剤のアフィニティーの少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍であるか、１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍であるか、又は少なくとも１０００倍であることが好ましい。本明細書では、「免疫反応性」という用語と、「優先的に結合する」という用語とを互換的に用いる。
【０１１５】
本明細書で用いられる「アフィニティー」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、ＫＤとして表す。抗体のエピトープに対するアフィニティーなど、結合タンパク質のリガンドに対するアフィニティーは、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）でありうる。本明細書で用いられる「アビディティー」という用語は、２つ以上の薬剤の複合体が、希釈後の解離に対して示す抵抗性を指す。みかけのアフィニティーは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、又は当業者によく知られる他の任意の技法などの方法により決定することができる。アビディティーは、スカチャード解析、又は当業者によく知られる他の任意の技法などの方法により決定することができる。
【０１１６】
「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することが可能な、抗原又は他の高分子の部分を指す。このような結合相互作用は、１又は複数のＣＤＲの１又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化されうる。抗原の結合は、例えば、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のうち、ＣＤＲ３若しくはＣＤＲ３対、又は、場合によって、最大で６つのＣＤＲすべてによる相互作用を伴いうる。エピトープは、直鎖状のペプチド配列（すなわち、「連続」エピトープ）の場合もあり、不連続的なアミノ酸配列（すなわち、「立体構造」エピトープ又は「不連続」エピトープ）の場合もある。抗体は、１又は複数のアミノ酸配列を認識することが可能であり、したがって、エピトープは、複数の異なるアミノ酸配列を規定しうる。抗体により認識されるエピトープは、当業者によく知られるペプチドマッピング法及び配列解析法により決定することができる。結合相互作用は、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化される。ＴＲＣ１０５は、米国特許第５，９２８，６４１号；同第６，２００，５６６号；同第６，１９０，６６０号；及び同第７，０９７，８３６号においてＹ４−２Ｆ１又はＳＮ６ｊとして説明されたマウス抗体と同じ可変領域のアミノ酸配列を有するキメラ抗体である。Ｙ４−２Ｆ１及びＳＮ６ｊにより認識されるエピトープ、したがって、ＴＲＣ１０５によって認識されるエピトープは、既に同定されている。
【０１１７】
「特異的な」という用語は、抗体が、それにより認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子に対して著明な結合を示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により保有される特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、該抗原結合ドメインを保有する抗体又はその抗原結合断片は、該エピトープを保有する多様な抗原に結合することが可能である。「優先的に結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体又はそれらの断片が、非類縁のアミノ酸配列に結合する場合のアフィニティーを超えるアフィニティーでエピトープに結合し、且つ、該エピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応性の場合であっても、それらをヒトへの投与使に製剤化するレベルでは毒性でないことを意味する。一態様では、このようなアフィニティーが、非類縁のアミノ酸配列に対する該抗体又はその断片のアフィニティーの少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍であるか、１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍であるか、又は少なくとも１０００倍であることが好ましい。本明細書では、「免疫反応性」、「結合する」、「優先的に結合する」、並びに「特異的に結合する」という用語を互換的に用いる。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下における共有結合による相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、並びにイオン性相互作用及び／又は水素結合による相互作用に起因する、２つの分子間における直接的な会合を指し、これには、塩架橋及び水架橋などの相互作用、並びに従来の他の結合手段が含まれる。
【０１１８】
「保存的アミノ酸置換」という語句は、ある共通の特性に基づくアミノ酸の群分けを指す。個々のアミノ酸間における共通の特性を規定する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような解析によれば、ある群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において互いに類似し合うアミノ酸群を規定することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような形で規定されるアミノ酸群の例には、
（ｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる帯電基
（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる正帯電基
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負帯電基
（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香環基
（ｖ）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環基
（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる高分子の脂肪族の非極性基
（ｖｉｉ）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる弱極性基
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏからなる低分子残基
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪族基、並びに
（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる低分子のヒドロキシル基
が含まれる。
【０１１９】
上記で提示された群に加え、各アミノ酸残基は、その固有の群を形成することが可能であり、個々のアミノ酸により形成される群を、上記で説明した通りに当技術分野で一般的に用いられる、このアミノ酸に対する一文字及び／又は三文字の短縮形により簡潔に指し示すことができる。
【０１２０】
「保存的残基」とは、ある範囲にわたる類似のタンパク質を通じて比較的不変であるアミノ酸である。保存的残基の変化は、「保存的アミノ酸置換」について上記で説明した類似のアミノ酸による置換だけによる。
【０１２１】
「非保存的アミノ酸置換」は、上記で説明したグループ内の１個のアミノ酸が異なるグループに変化することを指す。
【０１２２】
本明細書のアミノ酸配列で用いられる「ｘ」又は「ｘａａ」という文字は、別段に具体的に言及しない限り、２０の標準的アミノ酸のうちのいずれかをこの位置に配置しうることを示唆する。ペプチド模倣体をデザインする目的では、アミノ酸配列中の「ｘ」又は「ｘａａ」を、標的配列中に存在するアミノ酸の模倣体で置換することもでき、該ペプチド模倣体の活性に干渉しない、本質的に任意の形態のスペーサーで該アミノ酸を置換することもできる。
【０１２３】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド間における配列類似性、又は２つの核酸分子間における配列類似性を指す。比較を目的として配列決定しうる、各配列内の位置を比較することにより、相同性及び同一性の各々を決定することができる。比較される配列内の同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸で占有されている場合は、該分子がその位置で同一であり、同じアミノ酸残基又は類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質及び／又は電子的性質において類似するアミノ酸残基）により同等の部位が占有されている場合は、該分子がその位置で相同である（類似する）と称することができる。相同性／類似性又は同一性の百分率としての表現は、比較される配列により共有される位置において同一であるか又は類似するアミノ酸の数の関数を指す。「非類縁」又は「非相同」である配列が共有する同一性は４０％未満であるが、本発明の配列との同一性は２５％未満であることが好ましい。２つの配列を比較するときはまた、残基（アミノ酸又は核酸）が存在しなくても、過剰な残基が存在しても、同一性及び相同性／類似性が低下する。
【０１２４】
「相同性」という用語は、類似の機能又はモチーフを伴う遺伝子又はタンパク質を同定するのに用いられる、数学的計算に基づく配列類似性の比較について述べる。本発明の核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）配列及びアミノ酸（タンパク質）配列は、例えば、他のファミリーメンバー、類縁配列、又は相同体を同定する目的で、公共のデータベースに対する検索を実施するための「探索配列」として用いることができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０によるＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて実施することができる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、スコア＝１００、ワード長＝１２のＮＢＬＡＳＴプログラムにより、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、スコア＝５０、ワード長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムにより、ＢＬＡＳＴアミノ酸検索を実施することができる。比較を目的として、ギャップを伴う配列決定を行うためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２において説明される通りに、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム及びＢＬＡＳＴプログラム）のデフォルトのパラメータを用いることができる（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１２５】
本明細書で用いられる「同一性」とは、２つ以上の配列を、配列マッチングを最大化するように、すなわち、ギャップ及び挿入を考慮に入れて配列決定するときに、これらの配列の対応する位置において同一なヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」、Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びに「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）において説明されている方法が含まれるがこれらに限定されない既知の方法により容易に計算することができる。調べる配列間に最大のマッチを与えるように、同一性を決定する方法をデザインする。さらに、同一性を決定する方法を、一般に入手可能なコンピュータプログラムにより体系化することができる。２つの配列間における同一性を決定するコンピュータプログラムによる方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））が含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ並びに他の供給源（「ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））から一般に入手可能である。同一性を決定するにはまた、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎによるアルゴリズムも用いることができる。
【０１２６】
ポリペプチドに対して適用される場合の「単離」（「実質的に純粋」と互換的に用いられる）とは、その由来又は操作により、（ｉ）発現ベクターの部分による発現産物として宿主細胞内に存在するか、又は（ｉｉ）天然においてそれが連結されているタンパク質若しくは他の化学的部分以外のタンパク質若しくは他の化学的部分に連結されているか、又は（ｉｉｉ）天然では存在しない、例えば、それが、天然では見出されない形態にあるように、それに少なくとも１つの疎水性部分を添加又は付加することを介して化学的に操作されているタンパク質である、ポリペプチド又はその部分を意味する。「単離」とはさらに、（ｉ）化学的に合成されているタンパク質、又は（ｉｉ）宿主細胞内で発現し、且つ、会合及び夾雑するタンパク質から精製されているタンパク質も意味する。該用語は一般に、天然ではそれが共に存在する他のタンパク質及び核酸から分離されているポリペプチドを意味する。ポリペプチドはまた、それを精製する目的で用いられる抗体又はゲルマトリックス（ポリアクリルアミドゲルマトリックス）などの物質からも分離されていることが好ましい。
【０１２７】
「宿主免疫反応の誘導」とは、患者が、疾病の徴候又は症状の緩和又は軽減を経験することを意味し、限定なしに述べれば、具体的に、生存の延長がこれに含まれる。本発明による方法のある好ましい実施形態では、該アンタゴニストを投与された患者において、ＩＦＮ−γを生成させるＣＤ８＋  Ｔ細胞が活性化されて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫反応が誘導される。本発明による方法のある実施形態では、該組成物を投与された患者において、ＩＦＮ−γを生成させるＣＤ４＋  Ｔ細胞が活性化されて、ヘルパーＴ細胞による免疫反応が誘導される。これらのＩＦＮ−γを生成させる活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（すなわち、ヘルパーＴ細胞）は、ＣＴＬだけでなく、Ｂ細胞を介する体液性免疫反応も誘導及び維持するのに必要な免疫的支援（例えば、サイトカインの放出を介する）をもたらす。したがって、本発明による方法のある実施形態では、該組成物を投与された患者において、抗原に対する体液性免疫反応が活性化される。一態様では、該組成物にアジュバントを添加して、免疫反応を増大させることができる。当技術分野ではアジュバントがよく知られている。
【０１２８】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化とは、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）を生成させる能力を有するＴ細胞に、１若しくは複数のサイトカインを実際に生成させるか、又はそれらによる１若しくは複数のサイトカインの生成を増大させることを意味する。「ＣＴＬ反応の誘導」とは、潜在的な細胞傷害性Ｔリンパ球に、抗原特異的な細胞傷害作用を呈示させることを意味する。「抗原特異的な細胞傷害作用」とは、がんと関連する抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用が、がんと関連しない抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用より大きいことを意味する。「細胞傷害作用」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球が、標的細胞を死滅させる能力を指す。このような抗原特異的な細胞傷害作用は、がんと関連しない抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用の少なくとも約３倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍以上でありうる。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）はまた、抗体の結合を介して細胞の殺滅を媒介するナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）の活性化も包含する。本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片は、エンドグリンへの結合を介して、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを媒介しうる。
【０１２９】
Ｂ．ヒト化抗エンドグリン抗体を作製し、発現させる方法
エンドグリンに結合するキメラモノクローナル抗体が開発されている。この抗体は、ＴＲＣ１０５（また、ｃ−ＳＮ６ｊとしても知られている）と命名されている。
【０１３０】
一態様では、キメラモノクローナル抗体であるＴＲＣ１０５抗体のＶＬ配列及びＶＨ配列（それぞれ、配列番号１及び３９）をヒト化することにより、本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片を創出した。
【０１３１】
ヒト化抗体を含めたヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作により構築されている。既に説明されている大半のヒト化免疫グロブリンは、特定のヒト免疫グロブリン鎖（すなわち、アクセプター又はレシピエント）のフレームワークと同一のフレームワークと、非ヒト（すなわちドナー）免疫グロブリン鎖に由来する３つのＣＤＲとを含んでいる。本明細書で説明される通り、ヒト化はまた、ヒト化免疫グロブリン鎖を含む抗体のアフィニティーを増大させるか又は維持するために、それにより、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク内の限定された数のアミノ酸を同定し、アクセプターではなくドナーにおけるこれらの位置のアミノ酸と同じアミノ酸であるようにこれらを選択するための基準も包含しうる。
【０１３２】
本発明は、ヒト化抗体を作製する先行手段（例として述べると、マウス抗体をＣＤＲの供給源として用いる手段）において、アフィニティーの喪失に寄与する２つの原因が、（１）マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせると、該フレームワーク内の、ＣＤＲに近接するアミノ酸が、マウスアミノ酸ではなく、ヒトアミノ酸となること；理論により拘束されることを意図せずに述べると、これらのアミノ酸の変化は、ＣＤＲをわずかながら歪ませる可能性があること（例えば、アミノ酸の変化は、ドナーのマウス抗体における静電相互作用力又は疎水性相互作用力とは異なる静電相互作用力又は疎水性相互作用力を創出する可能性があり、ＣＤＲがドナー抗体においてもたらした抗原との接触と同程度に有効な接触を、該歪んだＣＤＲはもたらさない可能性があること）であり；（２）また、ＣＤＲに近接するが、その一部ではない（すなわち、やはりフレームワークの一部である）元のマウス抗体内のアミノ酸も抗原と接触し、これがアフィニティーに寄与することである、というモデルに部分的に基づいている。抗体をヒト化すると一般に、フレームワークのアミノ酸がすべてヒトアミノ酸となるため、これらのアミノ酸は失われる。これらの問題を回避し、所望の抗原に対するアフィニティーが極めて強力なヒト化抗体を作製するために、以下の原理のうちの１又は複数を用いて、ヒト化抗体並びにそれらの抗原結合断片を構築することができる。
【０１３３】
非限定的な一原理は、例えば、通常とは異なり、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワークをアクセプターとして用いるか、又は多くのヒト抗体に由来するコンセンサスフレームワークをアクセプターとして用いるということである。例えば、マウス重鎖（又は軽鎖）可変領域を、データバンク（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ；又はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のタンパク質配列データベース）内のヒト重鎖（又は軽鎖）可変領域と対比すると、異なるヒト領域に対する相同性の程度は、大幅に、例えば、約４０％〜約６０％、約７０％、約８０％以上異なりうることが示される。ドナー免疫グロブリンの重鎖可変領域と最も相同的なヒト重鎖可変領域のうちの１つをアクセプター免疫グロブリンとして選択することにより、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンへの移行において変化するアミノ酸が減少する。ドナー免疫グロブリンの軽鎖可変領域と最も相同的なヒト軽鎖可変領域のうちの１つをアクセプター免疫グロブリンとして選択することにより、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンへの移行において変化するアミノ酸が減少する。一般に、このような技法を用いると、ＣＤＲのうちの１又は複数に近接するアミノ酸を変化させることによりそれらの立体構造を歪ませる可能性が低減される。さらに、ヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体全体の正確な形状を、ドナー抗体の形状に、より酷似させることができ、これによってもまた、ＣＤＲを歪ませる可能性が低減される。
【０１３４】
また、同じヒト抗体に由来する軽鎖及び重鎖をアクセプター配列として用いて、該ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖が互いと好ましい接触をもたらし合う可能性を向上させることもできる。代替的にまた、ヒト生殖細胞系列による異なる抗体配列に由来する軽鎖及び重鎖をアクセプター配列として用いることもでき、このような組合せを用いると、ＶＨ及びＶＬが対象のエピトープに結合するかどうかを、従来のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて容易に決定することができる。一例では、軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を併せた全体が、ドナーの軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列と極めて相同的となるヒト抗体を選択する。場合によっては、重鎖配列に、より大きな重みをつける。アクセプター免疫グロブリンをどのようにして選択するかとは関わりなく、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワークにおける少数のアミノ酸を、アクセプターではなくドナーにおけるこれらの位置のアミノ酸と同じアミノ酸となるように選択することにより、場合によっては、より高度なアフィニティーを達成することができる。当技術分野では、アフィニティー成熟の方法が知られている。
【０１３５】
ヒト化抗体は一般に、ヒト治療に用いるのに、マウス抗体又はキメラ抗体を上回る、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。抗体のエフェクター部分がヒト抗体であるため、ヒト化抗体は、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用する（例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）により、より効率的に標的細胞を破壊する）と考えられる。加えて、ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク領域又は定常領域を異物としては認識しないはずであり、したがって、このような注射抗体に対する抗体反応は、完全に異物のマウス抗体又は部分的に異物のキメラ抗体に対する抗体反応より低度なはずである。最後に、マウス抗体のヒト循環における半減期は、ヒト抗体の半減期よりはるかに短いことが知られている。ヒト化抗体の半減期は、天然のヒト抗体の半減期により近似しうると推測され、これにより、施される投与をより少数回であり、且つより低頻度とすることができる。
【０１３６】
抗体並びにそれらの抗原結合断片のヒト化は、当技術分野において知られており、本明細書でも説明される各種の方法により達成することができる。同様にまた、ヒト化抗体の作製も、当技術分野において知られており、本明細書でも説明される各種の方法により達成することができる。
【０１３７】
フレームワーク領域を修飾する方法は、当技術分野において知られており、本明細書でも意図される。変化させる１又は複数のフレームワークアミノ酸の位置の選択は、各種の基準に依存する。変化に関与するフレームワークアミノ酸を選択するための１つの基準は、ドナー分子とアクセプター分子とのアミノ酸フレームワーク残基の相対的な差違でありうる。この手法を用いる、変化に関与するフレームワークの位置の選択は、残基の決定における任意の主観的バイアス、又は該残基によるＣＤＲの結合アフィニティーへの寄与における任意のバイアスを回避する利点を有する。
【０１３８】
変化に関与するアミノ酸位置を決定するのに用いられうる別の基準は、例えば、ＣＤＲの立体構造にとって重要であるか、又はこれに寄与することが知られているフレームワーク残基の選択でありうる。例えば、カノニカルフレームワーク残基が、ＣＤＲの立体構造及び／又は構造にとって重要である。カノニカルフレームワーク残基を変化に関与する位置として標的化することを用いて、それと関連するドナーＣＤＲ配列に照らして、より適合性のアミノ酸残基を同定することができる。
【０１３９】
特定のフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の頻度は、変化に関与するフレームワークのアミノ酸位置を選択するのに用いうる別の基準である。例えば、選択されたフレームワークを、そのサブファミリー内の他のフレームワーク配列と比較することにより、１又は複数の特定の位置において低頻度で生じる残基を明らかにすることができる。存在度が低度である残基を保有する位置も同様に、アクセプター可変領域のフレームワークにおいて変化させる位置としての選択に適用可能である。
【０１４０】
変化に関与するアミノ酸位置はまた、例えば、ＣＤＲに対する近接性に基づいても選択することができる。ある文脈では、ＦＲ残基が、ＣＤＲの立体構造並びに／又は抗原との結合に関与する可能性がある。さらに、この基準は同様に、本明細書で説明される他の基準によって選択される関与性の位置を優先するのにも用いることができる。したがって、１又は複数のＣＤＲに対して近位の残基と遠位の残基とを差別化することは、変化に関与する位置の数を低減するための一方法を表す。
【０１４１】
変化に関与するフレームワークのアミノ酸位置を選択するための他の基準には、例えば、三次元空間において抗原−ＣＤＲ間インターフェースに近接して存在することが知られるか又はそのように予測されている残基、又はＣＤＲの活性を調節することが予測されている残基が含まれる。同様に、重（ＶＨ）鎖可変領域と軽（ＶＬ）鎖可変領域との間のインターフェースにおいて接触を形成することが知られているか、又はそのように予測されているフレームワーク残基も選択することができる。このようなフレームワーク位置は、ＣＤＲ結合ポケット、抗原（エピトープ）との相互作用、又はＶＨ鎖とＶＬ鎖との相互作用を調節することを介して、ＣＤＲの立体構造及び／又はアフィニティーに影響を及ぼしうる。したがって、これらのアミノ酸を選択して、結合活性をスクリーニングするための多様な集団を構築すると、ＣＤＲの立体構造に対して有害な作用を及ぼす残基を置換するか、又はフレームワークの他の位置で生じる残基の有害な作用を補正するフレームワークの変化を同定するのにこれを用いることができる。
【０１４２】
変化させるのに選択しうる他のフレームワーク残基には、溶媒と接触不可能であるアミノ酸位置が含まれる。このような残基は一般に、可変領域内に包埋されており、したがって、ＣＤＲの立体構造又はＶＨ鎖とＶＬ鎖との相互作用に影響を及ぼすことが可能である。溶媒との接触可能性は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸側鎖により創出される環境の相対的な疎水性から予測することもでき、且つ／又は既知の三次元構造データを介して予測することもできる。
【０１４３】
ドナーＣＤＲにおける関与性のアミノ酸位置、並びに変化が所望されるフレームワーク領域内の任意の関与性のアミノ酸位置を選択した後では、選択された位置のうちの一部又は全部におけるアミノ酸変化を、アクセプターの可変領域フレームワーク並びにドナーのＣＤＲをコードする核酸に組み込むことができる。変化させたフレームワーク配列又はＣＤＲ配列は、個別に作製及び検査することもでき、逐次的又は同時的に組み合わせて検査することもできる。
【０１４４】
変化させた位置のうちのいずれか又はすべてにおけるばらつきは、２０の天然アミノ酸すべて又はこれらの機能的同等物及び類似体を含め、数個から多数個の異なるアミノ酸残基の範囲にわたりうる。場合によってはまた、非天然アミノ酸も考慮することが可能であり、当技術分野ではこれらが知られている。
【０１４５】
変化させるアミノ酸位置の数及び配置の選択は柔軟であり、ドナー可変領域と比較して実質的に同じであるかこれを超える結合アフィニティーなど、所望の活性を有する改変可変領域を同定するのに意図される使用並びにこれに所望される効率に依存しうる。この点では、改変可変領域集団に組み込まれる変化の数が増大するほど、所望の活性、例えば、ドナーと実質的に同じであるか又はこれを超える結合アフィニティーを呈示する少なくとも１つの分子種を同定することがより効率的となる。代替的に、あるアミノ酸残基又はアミノ酸位置が、結合アフィニティーに大きく寄与するような経験的データ又は実際的なデータを使用者が有する場合は、これらの同定された残基又は位置の範囲内又はこれらの近傍における変化に焦点を絞る改変可変領域の限定された集団を作製することが望ましい場合がある。
【０１４６】
例えば、ＣＤＲを移植させた可変領域を所望する場合は、改変可変領域の大規模で多様な集団が、ドナーフレームワークとアクセプターフレームワークとの間の、すべての同一でないフレームワーク領域位置と、すべての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化とを包含しうる。代替的に、多様性が中間的な集団には、例えば、ヒト化抗体又は抗原結合断片のアフィニティーを増大させるすべての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化と併せて組み込まれる、同一でない近位のフレームワーク位置だけのサブセットが含まれうる。例えば、すべてのＣＤＲアミノ酸位置の対様変化を加えて組み入れることにより、上記の集団の多様性をさらに増大させることができる。これに対し、１つのフレームワークのアミノ酸位置並びに／又は１つのＣＤＲのアミノ酸位置という少数の位置において変異体残基を組み込む、所定の残基又は位置に焦点を当てる集団も同様に、改変抗体可変領域をスクリーニング及び同定する目的で構築することができる。上記の集団と同様に、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の一方又は両方における他の関与性の位置を包含するように、変化させるのに選択される位置をさらに拡大することにより、このように焦点を絞った集団の多様性をさらに増大させることもできる。数個の変化〜多数個の変化の範囲にわたる多数の他の組合せを、フレームワーク領域及びＣＤＲの一方又は両方でさらに使用することができ、これらのすべてにより、所望の活性、例えば、エンドグリンに対する結合活性を有する、ＣＤＲを移植した少なくとも１つの改変可変領域を同定するのにスクリーニングしうる、改変可変領域の集団が結果としてもたらされる。本明細書で示される教示及び指針を踏まえるなら、当業者は、フレームワーク若しくはドナーＣＤＲにおいて選択された残基位置又はそれらのサブセットのうちのいずれを変化させて、本発明の改変抗体をスクリーニング及び同定するための集団を作製しうるかを知るか、又は決定することができる。当技術分野では、アミノ酸をコードするコドンが知られている。
【０１４７】
抗体をヒト化する別の方法には、「超ヒト化」と称する方法が含まれる。超ヒト化は、非ヒト成熟抗体遺伝子によりコードされる対象可変領域のペプチド配列を得るステップと、該非ヒト抗体可変領域内の少なくとも２つのＣＤＲについて、カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットを同定するステップとを伴う。カノニカルＣＤＲ構造型とは、Ｃｈｏｔｈｉａにより命名された構造型（ＣＩＴＥ）である。Ｃｈｏｔｈｉａらは、多くの抗体のＣＤＲの最重要部分が、アミノ酸配列レベルにおける多様性の大きさにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格の立体構造を採用していることを見出した。これにより、Ｃｈｏｔｈｉａは、各鎖における各ＣＤＲについて、１個又は数個の「カノニカル構造」を定義した。各カノニカル構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントについて、ペプチド骨格のねじれ角のセットを指定する。
【０１４８】
カノニカルＣＤＲ構造型を同定した後ではまた、ヒト抗体のヒト抗体可変領域についてのペプチド配列ライブラリーも得られる。このライブラリーは、ヒト生殖細胞系列の核酸セグメントによりコードされる生殖細胞系列可変領域の配列を含有し、且つ、成熟ヒト抗体配列も包含しうる。いずれの場合にも、該方法は、ヒト可変領域配列のライブラリー内の各配列につき、少なくとも２つずつのＣＤＲのカノニカルＣＤＲ構造型（すなわち、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセット）を同定するステップを包含する。カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットを、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセットと比較（すなわち、マウスカノニカルＣＤＲ構造型を、ヒトカノニカルＣＤＲ構造型と、可変領域内の対応する位置において比較）し、且つ、非ヒト可変領域及びヒト可変領域のそれぞれの内部の対応する位置のＣＤＲ配列について、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセットが、カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットと同じであるヒト配列を選択することにより、このライブラリーから候補配列のサブセットを選択する。該方法は、候補ヒト可変領域配列に由来するフレームワーク領域と組み合わせた、非ヒト可変領域に由来するＣＤＲ配列のうちの（例えば、マウスＣＤＲのうちの）少なくとも２つを包含するキメラ分子を構築するための基盤として、これらの候補ヒト可変領域配列を用いる。構築の結果として、該キメラ抗体のフレームワーク配列は、候補ヒトフレームワーク配列と異なるように、可変領域内の対応する位置において、ヒトＣＤＲ配列の各々を置換する非ヒトＣＤＲ配列の各々を含有する。
【０１４９】
各ドメインについて、候補ヒト抗体配列の対象ＣＤＲとの類似性を２つのレベルで評価する。第１に、ＣＤＲペプチド骨格について同一の三次元立体構造が求められる。実験により決定された対象ＣＤＲの原子座標が得られることはまれであり、よって、対象ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａによるカノニカル構造型を決定し、且つ、さらなる考察により、異なるカノニカル構造を保有する候補配列を除外することにより、三次元における類似性を近似する。第２に、対象ＣＤＲと残りのヒト候補ＣＤＲとの残基間相同性を考察し、相同性が最も大きな候補配列を選択する。
【０１５０】
最も大きな相同性の選択は、対象の非ヒト可変領域と同じカノニカル構造を有する候補ヒト可変領域をランク付けするのに用いられる各種の基準に基づく。選択されるセットのメンバーをランク付けするための基準は、アミノ酸配列の同一性の場合もあり、アミノ酸の相同性の場合もあり、これらの両方の場合もある。アミノ酸の同一性とは、アミノ酸残基の位置のマッチによる単純な位置のスコアである。アミノ酸の相同性による類似性とは、特徴的な残基構造における位置の類似性による位置のスコアである。相同性は、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）、「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８９：１０９１５〜１０９１９により説明されている表及び手順に従いスコア付けすることもでき、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９６）により説明されているＢＬＯＳＵＭシリーズによりスコア付けすることもできる。そのステップは、以下の通りである。
【０１５１】
ａ）対象抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を決定する。これらは、従来のｃＤＮＡクローニング後におけるそれぞれの遺伝子に対するＤＮＡ配列決定；ポリメラーゼ連鎖反応により逆転写物から増幅されたクローニング産物、若しくは対象のハイブリドーマ細胞系のＤＮＡに対するＤＮＡ配列決定；又は精製された抗体タンパク質のペプチド配列決定など、複数の方法のうちのいずれかにより決定することができる。
【０１５２】
ｂ）Ｋａｂａｔによる番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、前出、１９９１）を、対象非ヒト抗体の重鎖配列及び軽鎖配列に適用する。対象の非ヒト抗体のＣＤＲの各々について、カノニカル構造型を決定する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）；Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）；並びにＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）において論じられている指針に照らしてペプチド配列を検討することにより、この決定を行う。
【０１５３】
ＣＤＲの各々についてカノニカル構造を決定することの際立った特色は、以下の通りである。重鎖ＣＤＲ１については、現在のところ、３つのカノニカル構造型が知られている。各カノニカル構造型の残基数が異なるため、新たな配列の割り当ては単純である。Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）において説明されている通り、Ｋａｂａｔによる番号付けを該配列に割り当てる場合、残基３１〜３５に対する番号付けは、それぞれのカノニカル構造について、以下の通りである。
１型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５。
２型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５、３５ａ。
３型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５、３５ａ、３５ｂ。
【０１５４】
重鎖ＣＤＲ２については、現在のところ４つのカノニカル構造型が知られている。いくつかの構造型の残基数は固有であり、位置５２〜５６に対するそれらの固有のＫａｂａｔによる番号付けにより容易に識別される、すなわち、
１型のカノニカル構造：５２、５３、５４、５５、５６。
４型のカノニカル構造：５２、５２ａ、５２ｂ、５２ｃ、５３、５４、５５、５６。
【０１５５】
重鎖ＣＤＲ２の２型のカノニカル構造の残基数と、重鎖ＣＤＲ２の３型のカノニカル構造の残基数とは等しく、よって、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）により論じられている通り、それらの配列内の鍵残基により識別しなければならない。これらの鍵残基を含有するセグメントに対するＫａｂａｔによる番号付けは、５２、５２ａ、５３、５４、５５である。２型のカノニカル構造は、５２ａ位においてＰｒｏ又はＳｅｒを有し、５５位においてＧｌｙ又はＳｅｒを有し、他の位置においては制約を伴わない。３型のカノニカル構造は、５４位においてＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、又はＡｓｐを有し、他の位置においては制約を伴わない。大半の場合には、適正な割り当てを決定するのにこれらの基準で十分である。加えて、２型のカノニカル構造では、フレームワーク残基７１が一般に、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＴｈｒであり、３型のカノニカル構造では、フレームワーク残基７１が一般に、Ａｒｇである。
【０１５６】
重鎖ＣＤＲ３が、ＣＤＲすべてのうちで最も多様である。ＣＤＲ３は、その一部が無作為的な性質である、リンパ球に固有の遺伝子過程により生成される。その結果、ＣＤＲ３のカノニカル構造は、予測が困難である。いずれの場合においても、ヒト生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントは、Ｋａｂａｔによる９４位で終始するが、ＣＤＲ３をコードするのは９５〜１０２位であるため、該Ｖ遺伝子セグメントは、ＣＤＲ３のどの部分もコードしない。これらの理由で、ＣＤＲ３のカノニカル構造は一般に、候補ヒト配列を選択するためには考慮されない。
【０１５７】
軽鎖ＣＤＲ１については、カッパ鎖のＣＤＲ１について、現在のところ、６つのカノニカル構造型が知られている。各カノニカル構造型の残基数は異なり、よって、新たな配列に対するカノニカル構造型の割り当ては、残基２７〜３１位に対するＫａｂａｔによる番号付けから明らかである。
１型のカノニカル構造：２７、２９、３０、３１。
２型のカノニカル構造：２７、２８、２９、３０、３１。
３型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、２８、２９、３０、３１。
４型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２８、２９、３０、３１。
５型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２８、２９、３０、３１。
６型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２８、２９、３０、３１。
【０１５８】
軽鎖ＣＤＲ２については、カッパ鎖のＣＤＲ２について知られているカノニカル構造型が１つだけであり、よって、例外的な対象抗体配列を禁じると、割り当ては自動的である。軽鎖ＣＤＲ３については、カッパ鎖のＣＤＲ３について最大６つのカノニカル構造型が説明されているが、これらのうちの３つはまれである。一般的な３つの構造型は、残基９１〜９７位に対するＫａｂａｔによる番号付けに反映されているそれらの長さにより識別することができる。
１型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７（また、９５位において必須のＰｒｏ、並びに９０位において必須のＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＨｉｓも伴う）。
３型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９７。
５型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６ａ、９７。
【０１５９】
対象非ヒト抗体のカノニカルＣＤＲ構造型を同定した後では、対象抗体と同じ組合せのカノニカル構造型を有する同じ種類の鎖（重鎖又は軽鎖）のヒト遺伝子を同定して、ヒト配列の候補セットを形成する。これらの遺伝子断片の大半は発見されており、既に、カノニカル構造型に割り当てられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５）。
【０１６０】
重鎖では、マウスカノニカル構造型に対するＣＤＲ１及びＣＤＲ２の適合性が評価され、適合しない遺伝子は除外されている。軽鎖では、先ず、対象抗体のカノニカル構造型に対する各ヒト配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の適合性を評価する。候補Ｖｋ遺伝子のＪ領域との融合体の存在を仮定し、且つ、該融合配列にＣＤＲ３のカノニカルＣＤＲ構造型を決定するための基準を適用することにより、該遺伝子の残基８９〜９５が、対象抗体と同じカノニカル構造型のＣＤＲ３を形成する可能性を評価し、適合しない配列を除外する。
【０１６１】
代替的に、対象抗体の可変ドメインが、ヒトゲノム内では得られないカノニカル構造型である場合は、カノニカル構造型が同一ではないが三次元的に類似するヒト生殖細胞系列のＶ遺伝子を、比較のために考慮することができる。以下で説明される例のうちの２つを含め、このような状況は、マウス抗体におけるカッパ鎖ＣＤＲ１について生じることが多い。マウス抗体のこのＣＤＲにおいては、６つの可能なカノニカル構造型のすべてが観察されているが、ヒトゲノムがコードするカノニカル構造は、２、３、４、及び６型だけである。これらの状況では、アミノ酸残基長が、対象非ヒト配列のアミノ酸残基長の２残基以内であるカノニカルＣＤＲ構造型を比較のために選択することができる。例えば、対象の抗体において１型のカノニカル構造が見出される場合は、２型のカノニカル構造を伴うヒトＶｋ配列を比較に用いることができる。マウス抗体において５型のカノニカル構造が見出される場合は、３型又は４型のカノニカル構造を伴うヒトＶｋ配列を比較に用いることができる。
【０１６２】
成熟し、再構成されたヒト抗体配列も、配列を比較するのに考慮することができる。このような考慮が保証されうるとすればそれは、成熟ヒト配列が、（１）生殖細胞系列と酷似する場合；（２）ヒトにおいて免疫原性でないことが知られる場合；又は（３）ヒト生殖細胞系列においては見出されないが、対象抗体のカノニカル構造型と同一のカノニカル構造型を含有する場合が含まれるがこれらに限定されない多様な状況下においてであろう。
【０１６３】
マッチするカノニカル構造型を伴う候補Ｖ遺伝子の各々についてはまた、対象配列との残基間の配列同一性及び／又は残基間の配列相同性も評価して、該候補ヒト配列をランク付けする。例えば、評価される残基は、以下の通りである：（１）カッパ（κ）軽鎖ＣＤＲのアミノ酸残基位置では、ＣＤＲ１（２６〜３２）、ＣＤＲ２（５０〜５２）、ＣＤＲ３（９１〜９６）が評価され；（２）重鎖ＣＤＲのアミノ酸残基位置では、ＣＤＲ１（３１〜３５）及びＣＤＲ２（５０〜６０）が評価される。加えてまた、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸残基９５〜１０２位も考慮されうる。
【０１６４】
先ず、対象配列と候補ヒト配列との間で同一のアミノ酸残基数により、残基間の相同性をスコア付けする。その後の転換抗体の構築に用いられるヒト配列は、スコアが最高である２５パーセントの候補配列の間から選択する。複数の候補配列の同一性スコアが同等である場合など、適切な場合は、必要に応じて、同一でないアミノ酸残基間における類似性をさらに考慮することができる。スコアには、対象の残基と目的の残基との間における、脂肪族残基対脂肪族残基、芳香族残基対芳香族残基、又は極性残基対極性残基のマッチも加味する。別の例では、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆによるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスなどのアミノ酸置換マトリックスを用いて、配列相同性の定量的評価を実施することができる。
【０１６５】
ＣＤＲ３配列のＣ末端におけるフレームワーク領域の目的配列は、既知のヒト生殖細胞系列のＪセグメントのセットから選択することができる。上述の通り、候補Ｖ遺伝子を評価する目的で指定されたスコア付けの基準を用いて、ＣＤＲ３とＪセグメントとが重複する配列位置について、各Ｊセグメントに対する残基間の相同性を評価することにより、Ｊペプチド配列を選択することができる。その後の転換抗体の構築に用いられるＪ遺伝子セグメントのペプチド配列は、スコアが最高である２５パーセントの候補配列の間から選択する。
【０１６６】
例として述べると、キメラ可変鎖は、対象の非ヒト配列に由来する少なくとも２つのＣＤＲと、候補ヒト配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。別の例では、キメラ軽鎖が、対象の非ヒト配列に由来する３つのＣＤＲと、候補ヒト配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。さらなる例では、キメラ重鎖が、対象の重鎖による少なくとも２つのＣＤＲと、候補ヒト重鎖によるフレームワーク配列とを含有するか、又はキメラ重鎖が、対象の重鎖に由来するＣＤＲの各々と、候補ヒト重鎖によるフレームワーク配列とを含有する。さらに別の例では、キメラ抗体の重鎖が、対象の非ヒト配列に由来するＣＤＲ１及び２と、ＣＤＲ３の残基５０〜６０と、候補ヒト重鎖に由来するＣＤＲの残基６１〜６５を、候補ヒト配列のフレームワーク配列と共に含有する。別の例では、キメラ重鎖配列が、対象の非ヒト配列に由来する各ＣＤＲと、対象配列に由来するフレームワーク配列２７〜３０と、候補配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。しかし、いずれの場合においても、キメラ抗体分子がそのフレームワーク配列内に含有する、候補ヒト可変領域のフレームワーク配列内のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基は１０以下である。
【０１６７】
ヒト化抗体のアフィニティーの増大を所望する場合は、転換抗体のＣＤＲ内の残基を、他のアミノ酸によりさらに置換することができる。最大１０残基を変化させうる重鎖ＣＤＲ２を除き、ＣＤＲ内で変化させるアミノ酸残基は４以下であることが典型的であり、ＣＤＲ内で変化させる残基は２以下であることが最も典型的である。アフィニティーの変化は、本明細書で説明される方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ法）など、従来の方法により測定することができる。
【０１６８】
抗体を超ヒト化する方法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８８１，５５７号においてより詳細に説明されている。
【０１６９】
当技術分野で知られている従来の技法を用いて、ヒト化抗体並びに抗原結合断片を構築及び作製することができる。加えて、特に、高レベルの発現ベクターを使用する場合は、組換えにより調製された抗体を大量に作製しうることが多い。
【０１７０】
当技術分野において知られる従来の技法を用いて、抗体を配列決定することができる。一態様では、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列を、例えば、ヒト抗体（又はその抗原結合断片）の合成配列に挿入して、非ヒト抗体によりヒト患者を治療することの有害な副作用を制限しうるヒト抗体を創出する。また、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列を合成配列、例えば、ＡＶＩＭＥＲ（商標）などの結合タンパク質に挿入して、ヒト患者に投与するための構築物を創出することもできる。治療される動物の種に応じて、このような技法を改変することができる。例えば、獣医学的治療に使用する場合は、抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質を、ヒト以外（例えば、霊長動物、ウシ、ウマなど）の治療用に合成することができる。
【０１７１】
別の態様では、本明細書で提供され、且つ、本明細書に組み込まれる技法など、当技術分野で認知されている技法を用いて、例えば、組換え法を介して、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを、抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質をコードする既存のポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。
【０１７２】
発現させる場合、発現系は、グルタミンシンターゼ遺伝子を選択マーカーとして用いるＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ）を使用する発現系である。略述すると、グルタミンシンターゼ遺伝子を選択マーカーとして用いるＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ）を用いる電気穿孔（２５０Ｖ）により、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを実施する。２ｍＭのグルタミンと共に１０％の透析ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で、野生型のＣＨＯ細胞を増殖させる。電気穿孔により、６×１０７個のＣＨＯ細胞に、直鎖化させたＤＮＡ３００μｇをトランスフェクトする。電気穿孔後、細胞を、グルタミンを伴うＤＭＥＭ中に再懸濁させ、３６×９６ウェルプレート（ウェル１個当たり５０μｌ）へと播種し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。翌日、ウェル１個当たり１５０μｌの選択培地（グルタミンを伴わないＤＭＥＭ）を添加する。約３週間後、非関与抗体を陰性対照として用いるＥＬＩＳＡにより、コロニーをスクリーニングする。＞２０μｇ／ｍｌを生成させるすべてのコロニーを２４ウェルプレートで増殖させ、次いで、２連のＴ２５フラスコで増殖させる。
【０１７３】
高レベルで生成させる場合、最も広く用いられている哺乳動物発現系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（「ｄｈｆｒ−」）チャイニーズハムスター卵巣細胞によりもたらされる遺伝子増幅手順を使用する発現系である。この発現系は、当業者によく知られている。この系は、ジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸への転換を触媒するＤＨＦＲ酵素をコードするジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ｄｈｆｒ」）遺伝子に基づく。高量の生成を達成するためには、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞に、所望のタンパク質をコードする遺伝子と併せて、機能的なＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターをトランスフェクトする。この場合、所望のタンパク質は、組換え抗体の重鎖及び／又は軽鎖である。
【０１７４】
競合的ＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）の量を増大させることにより、組換え細胞は、ｄｈｆｒ遺伝子を増幅することを介して耐性を発生させる。標準的な場合には、使用される増幅単位が、ｄｈｆｒ遺伝子のサイズよりはるかに大きく、その結果、抗体重鎖が共増幅される。
【０１７５】
抗体鎖などのタンパク質を大スケールで作製することを所望する場合、発現レベル並びに使用される細胞の安定性の両方を考慮する。長期間にわたる培養では、単一の親クローンから派生する場合であっても、増幅するうちに、組換えＣＨＯ細胞集団が、それらの特異的抗体生成に関する均一性を失う。
【０１７６】
本出願は、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド（核酸）、このようなポリヌクレオチドを含有するベクター、並びにこのようなポリヌクレオチドをポリペプチドへと転写及び翻訳するための宿主細胞及び発現系を提供する。
【０１７７】
本出願はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態にある構築物も提供する。
【０１７８】
本出願はまた、上記の１又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、コード核酸からの発現を含む該方法が本出願の態様を形成するのと同様に、それ自体として提供される、本明細書で説明される任意の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸も、本出願の態様を形成する。該核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を達成することができて簡便である。発現を介する作製の後、任意の適切な技法を用いて抗体又は抗原結合断片を単離及び／又は精製することができ、次いで、必要に応じて用いることができる。本明細書に記載の抗体は、特異性と親和を維持しながら、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を防ぐために、それらの免疫原性を減らすために念頭に置いて、特定の特徴をもって設計されている。
【０１７９】
本明細書で説明される特異的抗体、抗原結合断片、並びにコード核酸分子及びベクターは、例えば、実質的な純粋形態又は均一形態で、それらの天然の環境から単離及び／又は精製して、提供することができる。核酸の場合は、必要とされる機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外の、元の核酸又は遺伝子を含ませずに、又はこれらを実質的に含ませずに、これを提供することができる。核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もあり、且つ、完全に合成の場合もあり、部分的に合成の場合もある。当技術分野では、精製法がよく知られている。
【０１８０】
各種の異なる宿主細胞におけるクローニング系及び発現系がよく知られている。適切な宿主細胞系には、細菌、哺乳動物細胞、酵母系、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるための、当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、並びに他の多くの細胞系が含まれる。一般的な細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０１８１】
当技術分野では、大腸菌などの原核細胞における抗体及び抗体断片の発現が十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照されたい。また、培養物中の真核細胞における発現も、本明細書で説明される抗体及び抗原結合断片を作製するための選択肢として当業者に利用可能であり、近年における総説については、例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３〜５６０を参照されたい。
【０１８２】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、並びに必要に応じた他の配列を含めた、適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、例えば、ファージ又はファージミドなど、ウイルス性の場合もある。さらなる詳細については、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入並びに遺伝子発現、並びにタンパク質解析において核酸を操作するための多くの既知の技法及びプロトコールについては、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２において詳細に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら；及びＡｕｓｕｂｅｌらによる方法の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれ、当技術分野においてもよく知られている。
【０１８３】
したがって、さらなる態様は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。またさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞へと導入するステップを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技法を使用しうる。真核細胞の場合、適切な技法には、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、並びにレトロウイルス又は他のウイルス、例えば牛痘ウイルス、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、例えば、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、並びにバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。
【０１８４】
導入に続き、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすか、又はこれを可能とする。
【０１８５】
一実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込む。組込みは、標準的な技法に従う、ゲノムの組換えを促進する配列を組み入れることにより促進されうる。必要に応じて、Ｉｇエンハンサーを上流に組み入れることにより、発現を最大化させることができる。
【０１８６】
本出願はまた、上記の通りに抗体又はそれらの抗原結合断片を発現させるために、上記で言及した構築物を発現系内で用いるステップを含む方法も提供する。
【０１８７】
本出願はまた、エンドグリンに結合する、本明細書で説明される抗体又は抗原結合配列をコードする、組換えＤＮＡ分子若しくはクローニングされた遺伝子、又はそれらの縮重変異体、突然変異体、類似体、又はこれらの断片などの単離核酸にも関する。
【０１８８】
一態様では、本出願が、エンドグリンに結合する、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【０１８９】
さらなる実施形態では、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片の組換えＤＮＡ分子又はそのクローニングされた遺伝子の完全なＤＮＡ配列を、発現制御配列へと作動的に連結し、これを適切な宿主内に導入することができる。したがって、本出願は、抗体のＶＨ鎖及び／若しくはＶＬ鎖、又はこれらの部分をコードするＤＮＡ配列を含む、クローニングされた遺伝子又は組換えＤＮＡ分子により形質転換された、単細胞宿主へと拡張される。
【０１９０】
別の特色は、本明細書で開示されるＤＮＡ配列の発現である。当技術分野においてよく知られている通り、ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター内の発現制御配列へと作動的に連結し、且つ、この発現ベクターを使用して適切な単細胞宿主を形質転換することにより、ＤＮＡ配列を発現させることができる。
【０１９１】
ＤＮＡ配列を発現制御配列へとこのように作動的に連結することは、当然ながら、既に該ＤＮＡ配列の一部というわけではないにせよ、開始コドンであるＡＴＧを、該ＤＮＡ配列の上流における適正なリーディングフレーム内に施すことを包含する。
【０１９２】
ポリヌクレオチド及びベクターは、単離形態及び／又は精製形態（例えば、必要とされる機能を伴うポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の、元のポリヌクレオチドを含まないか又は実質的に含まない形態）で提供することができる。本明細書で用いられる「実質的に純粋な」並びに「実質的に〜を含まない」とは、例えば、含有する外来物質が約２０％以下であるか、含有する外来物質が約１０％以下であるか、含有する外来物質が約５％以下であるか、含有する外来物質が約４％以下であるか、含有する外来物質が約３％以下であるか、含有する外来物質が約２％以下であるか、又は含有する外来物質が約１％以下である溶液又は懸濁液を指す。
【０１９３】
本発明によるＤＮＡ配列を発現させるには、多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体のＤＮＡ配列のセグメント、染色体以外のＤＮＡ配列のセグメント、並びに合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることが可能である。適切なベクターには、ＳＶ４０ウイルスの派生物；並びに既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドであるｃｏｌ  Ｅｌ、Ｐｃｒ１、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９、並びにこれらの派生物；ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の派生物、例えば、ＮＭ９８９；並びに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、並びに線維状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｕプラスミド又はその派生物などの酵母プラスミド；昆虫細胞又は哺乳動物細胞において有用なベクターなど、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１９４】
本明細書ではまた、１又は複数のポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞も提供される。抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、ポリヌクレオチドからの発現を含む該方法が本出願の態様を形成するのと同様に、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドも、本出願の態様を形成する。例えば、該ポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を達成することができる。次いで、任意の適切な技法を用いて抗体又は抗原結合断片を単離及び／又は精製することができ、必要に応じて用いることができる。
【０１９５】
これらのベクターにおいて、任意の多種多様の発現制御配列（それに作動的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）を用いて、ＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０ウイルス、ＣＭＶウイルス、牛痘ウイルス、ポリオーマウイルス、又はアデノウイルスの早期プロモーター又は後期プロモーター；ｌａｃ系；ｔｒｐ系；ＴＡＣ系；ＴＲＣ系；ＬＴＲ系；ファージλの主要なオペレーター領域及びプロモーター領域；ｆｄコートタンパク質の制御領域；３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のプロモーター；酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）；酵母接合因子のプロモーター；並びに原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列；並びにこれらの各種の組合せが含まれる。
【０１９６】
各種の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング系及び発現系がよく知られている。適切な宿主細胞系には、細菌、哺乳動物細胞、酵母系、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるための、当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、並びに他の多くの細胞系が含まれる。一般的な細菌宿主は、例えば、大腸菌でありうる。
【０１９７】
当技術分野では、大腸菌などの原核細胞における抗体又は抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照されたい。また、培養物中の真核細胞における発現も、当業者に利用可能である（Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３〜５６０）。
【０１９８】
また、多種多様な単細胞の宿主細胞も、ＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主には、大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌株；酵母などの真菌；並びに組織培養物中のＣＨＯ細胞、ＹＢ／２０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、及びＬ−Ｍ細胞；アフリカングリーンモンキー腎細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、及びＢＭＴ１０細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）；及びヒト細胞などの動物細胞；並びに植物細胞など、よく知られた真核生物宿主及び原核生物宿主が含まれる。
【０１９９】
すべてのベクター、発現制御配列、及び宿主がＤＮＡ配列を発現させるのに同等に良好に機能するわけではないことが理解されるであろう。すべての宿主が同じ発現系と共に同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するのに不要な実験を行うことなく、適正なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択することができるであろう。例えば、ベクターを選択するときは、その中でベクターが機能しなければならないため、宿主についても考慮しなければならない。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、並びに抗生剤マーカーなど、該ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮する。当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく、適正なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択して、所望の発現を達成することができる。例えば、ベクターを選択するときは、その中でベクターが機能するため、宿主についても考慮する。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、並びに抗生剤マーカーなど、該ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮する場合がある。
【０２００】
本出願はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含む、本明細書の別の箇所で説明されるプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態にある構築物も提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択マーカー遺伝子、並びに必要に応じた他の配列を含め、適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、例えば、ファージ、ファージミドなど、ウイルス性の場合もある。さらなる詳細については、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入並びに遺伝子発現、並びにタンパク質解析において核酸を操作するための多くの既知の技法及びプロトコールについては、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２において詳細に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら；及びＡｕｓｕｂｅｌらによる方法の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
発現制御配列を選択するときは通常、各種の因子について考慮する。これらには、例えば、系の相対的な強度、その制御可能性、並びに発現させる特定のＤＮＡ配列又は遺伝子とのその適合性、特に、潜在的な二次構造に関するその適合性が含まれる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されるベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特徴、タンパク質を適正にフォールドするそれらの能力、並びにそれらの発酵に対する要件のほか、発現させるＤＮＡ配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性、並びに発現産物を精製する容易さを考慮することにより選択する。
【０２０２】
さらなる態様は、本明細書で開示される１又は複数のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。またさらなる態様は、このような１又は複数のポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入する方法である、任意の利用可能な技法を提供する。真核細胞の場合、適切な技法には、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、並びにレトロウイルス又は他のウイルス（例えば牛痘ウイルス）、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、例えば、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、並びにバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。
【０２０３】
導入に続き、例えば、１又は複数のポリヌクレオチドから１又は複数のポリペプチドを発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、１又は複数のポリヌクレオチドからの発現を引き起こすか、又はこれを可能とすることができる。誘導系を使用し、アクチベーターの添加により発現を誘導することができる。
【０２０４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込むことができる。組込みは、標準的な技法に従う、ゲノムの組換えを促進する配列を組み入れることにより促進されうる。別の実施形態では、宿主細胞内のエピソームベクター上で核酸を維持する。
【０２０５】
本明細書では、特定のポリペプチドを発現させるために、上記で言及した構築物を発現系内で用いるステップを包含する方法が提供される。
【０２０６】
これらの因子並びに他の因子を考慮すれば、当業者は、発酵により、又は大スケールの動物培養物中において、ＤＮＡ配列を発現させる各種のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを構築することができるであろう。
【０２０７】
抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、クローニングに加えて、又はクローニングではなくて、組換え／合成により調製することができる。抗体、抗原結合断片、又は結合タンパク質に適切なコドンにより、ポリヌクレオチドをデザインすることができる。一般に、その配列が発現に用いられる場合は、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全なポリヌクレオチドを構築し、完全なコード配列へと構築することができる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【０２０８】
タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的な組込みの一般的な方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２〜１８８（１９８９年４月）において説明されている。この方法を用いて、非天然アミノ酸を伴う類似体を創出することができる。
【０２０９】
上述の通り、抗体またその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列は、クローニングではなくて、合成により調製することができる。抗体又は抗原結合断片のアミノ酸配列に適切なコドンにより、ＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般に、その配列が発現に用いられる場合は、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコード配列へと構築することができる。例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＥｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【０２１０】
Ｃ．ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける免疫原性の解析
必要な場合は、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片を免疫原性について評価し、必要に応じて脱免疫化する（すなわち、１又は複数のＴ細胞エピトープを変化させることにより、抗体の免疫反応性を低下させる）ことができる。本明細書で説明されるヒト化抗エンドグリン抗体並びに抗原結合断片に存在する免疫原性及びＴ細胞エピトープについての解析は、ソフトウェア並びに特定のデータベースを用いることにより実施することができる。例示的なソフトウェア及びデータベースには、Ｃｍｂｒｉｄｇｅ、ＥｎｇｌａｎｄのＡｎｔｉｔｏｐｅにより開発されたｉＴｏｐｅ（商標）が含まれる。ｉＴｏｐｅ（商標）は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの対立遺伝子に対するペプチドの結合を解析するための、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける技術である。
【０２１１】
ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの結合を予測し、これにより、このような「潜在的なＴ細胞エピトープ」の位置についての最初のスクリーンを提供する。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、３４のヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子による結合グルーブ内の特異的な結合ポケットとの好ましい相互作用を予測する。鍵となる結合残基の位置特定は、被験抗体可変領域配列にわたり、１アミノ酸だけ重複する９ｍｅｒのペプチドをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成させることにより達成する。各９ｍｅｒのペプチドは、３４のＭＨＣクラスＩＩアロタイプの各々と対比させて調べることができ、それらのＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブとの潜在的な「フィット」及び相互作用に基づきスコア付けすることができる。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうちの＞５０％に対して平均結合スコアが高い（ｉＴｏｐｅ（商標）によるスコア付け関数で＞０．５５）ペプチドを、潜在的なＴ細胞エピトープと考える。このような領域において、ＭＨＣクラスＩＩグルーブ内部のペプチド結合のコアとなる９アミノ酸による配列を解析して、ＭＨＣクラスＩＩポケット残基（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ９）、並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との接触が可能な残基（Ｐ−１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ８）を決定する。
【０２１２】
任意のＴ細胞エピトープを同定した後で、アミノ酸残基の変化、置換、付加、及び／又は欠失を導入して、同定されたＴ細胞エピトープを除去することができる。同定されたエピトープをなお除去しながら、抗体の構造及び機能を保存するように、このような変化をもたらすことができる。例示的な変化には、保存的アミノ酸変化が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１３】
組換えＭＨＣ分子を、合成ペプチドと組み合わせた可溶性複合体を利用する技法が用いられるようになった。これらの試薬及び手順を用いて、ヒト対象又は実験動物対象に由来する末梢血試料から、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することが可能であり、多種多様なＭＨＣアロタイプに対する複数の潜在的なエピトープをスクリーニングするのには適合しないＴ細胞クローンの存在を同定することができる。
【０２１４】
Ｔ細胞の活性化についての生物学的アッセイは、依然として、被験ペプチド／タンパク質配列が免疫反応を引き起こす能力についてのリーディングをもたらす最も実践的な選択肢である。この種の手法の例には、細菌タンパク質であるスタフィロキナーゼに対してＴ細胞増殖アッセイを用いた後で、合成ペプチドを用いてＴ細胞系を刺激するエピトープマッピングを行うことが含まれる。同様に、テタヌス毒素タンパク質による合成ペプチドを用いるＴ細胞増殖アッセイの結果として、該毒素の免疫優性エピトープ領域が規定されている。一実施形態では、ヒト免疫細胞の単離サブセットを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるそれらの分化を促進し、対象の合成ペプチドの存在下において該細胞を培養し、該培養されたＴ細胞の増殖が誘導されればそれを測定することにより被験タンパク質内のＴ細胞エピトープを決定することができる。また、他の技法も用いることができる。このような技法は、細胞単離法、並びに複数のサイトカインサプリメントを伴う細胞培養物を適用して、所望の免疫細胞のサブセット（樹状細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を得ることを伴う。別の実施形態では、抗体を、単離されたヒト免疫細胞のサブセットへと添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるそれらの分化を評価し、該培養されたＴ細胞の増殖が誘導されるとそれを測定することにより、抗体におけるＴ細胞エピトープの存在を決定することができる。
【０２１５】
また、治療的関心の対象である複数のタンパク質に対するＭＨＣクラスＩＩリガンドを規定するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける技法も使用することができる。しかし、タンパク質分解性のプロセシング並びにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて免疫原性ペプチドを提示させる他の生理学的段階などのために、コンピュータベースのスキームにより規定可能なペプチドの全レパートリーのサブセットが、最終的な生物学的関与性を有しうる。したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるヒトＴ細胞活性化アッセイを用いて、ポリペプチドのタンパク質配列内で、Ｔ細胞の活性化を支援することが可能であり、これにより、このタンパク質における免疫原性の問題に最も生物学的に関与性の領域を同定することができる。本明細書で用いられる「Ｔ細胞エピトープ」とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが可能であり、Ｔ細胞を刺激することが可能であり、且つ／又はＭＨＣクラスＩＩ分子と複合したＴ細胞に結合する（測定可能な形での活性化を必ずしも伴わずに）ことも可能であるアミノ酸配列を指す。
【０２１６】
本明細書で開示される方法により、合成ペプチド又は全抗体を、それらが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されるヒトＴ細胞の増殖反応を引き起こす能力について調べる。Ｔ細胞は、よく知られた手段により全血液試料から容易に得られる、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層内に存在する。さらに、ＰＢＭＣ調製物は、生理学的比率のＴ細胞及び抗原提示細胞を含有し、したがって、それにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサロゲートの免疫反応をもたらすのに適する材料の供給源である。このようなアッセイを実施するときは、２．０に近接するか、又はこれを超える刺激指数が、増殖の誘導についての有用な測定値である。しかし、この刺激指数は、抗体又はその抗原結合断片に応じて異なる可能性があり、各抗体又はその抗原結合断片、並びに対応するペプチドライブラリーのベースラインとの関連で確立することができる。このような検査の一例では、被験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、３Ｈ−チミジンの取込みを用いる場合は、例えば、１分間当たりの放射能カウント）を、被験ペプチドと接触させていない細胞において測定されるスコアで除することにより、刺激指数（ＳＩ）を導出することができて簡便である。反応を引き起こさないペプチドは、ＳＩ＝１．０をもたらしうるが、また、０．８〜１．２の範囲にあるＳＩ値も注意するに及ばない。記録されるスコアの信頼性を保証するためには、多数の技法手順をこのようなアッセイの実施に組み込むことができる。すべての決定を少なくとも３連で行い、平均スコアを計算しうることが典型的である。計算されたＳＩ≧２．０の場合は、三連のうちの個々のスコアを、異常値データの証拠について検証することができる。被験ペプチドを、少なくとも２つの異なる濃度で細胞と接触させるときは、該濃度を、最小で２倍の濃度差の範囲にわたらせることが典型的であろう。このような濃度範囲は、アッセイに反応速度次元のオフセットをもたらし、単一時点における決定を、例えば、７日目に実施する場合に有用でありうる。一部のアッセイでは、時間経過において複数回の決定を行うことも可能であり、これらもまた、最小で２つの異なる濃度で供給されるペプチド免疫原を用いて行うことができる。同様に、それに対してドナーのＰＢＭＣ試料の大半が反応性であると予測される対照ペプチドを各アッセイプレートに組み入れることも可能である。インフルエンザウイルス赤血球凝集素ペプチド３０７〜３０９である配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号１０４）  並びにクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属ＨＳＰ  ６０ペプチドである配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ（配列番号１０５）が、このようなアッセイにおいて用いられる対照ペプチドの例である。代替的に、又は加えて、アッセイではまた、それに対してすべてのＰＢＭＣ試料が２．０を著明に超えるＳＩを呈示することが予測されるスカシガイに由来するヘモシアニンなど、強力な全タンパク質抗原も用いうるであろう。当技術分野では、このように用いられる他の対照抗原がよく知られているであろう。
【０２１７】
本明細書で開示される方法は、抗体又はそれらの抗原結合断片についてのエピトープマップであって、広範なスペクトルにわたる可能なＭＨＣアロタイプに関与する該エピトープマップを提供しうる。マップは、そのタンパク質が投与される可能性が高い患者の大半について、Ｔ細胞により駆動される免疫反応をそのタンパク質が引き起こす能力を消失させるか、又は少なくとも緩和させうる修飾のデザイン又は選択を可能とするのに十分な程度に代表的でありうる。緩和とは、非修飾タンパク質と比較した免疫反応の低減（すなわち、免疫原性の低減）（例えば、約１．５分の１、約２分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１若しくはこれを超える低減、又はこれらのうちの任意の範囲の低減）を指す場合がある。代替的に、免疫原性を低減された抗体又はそれらの抗原結合断片とは、非修飾タンパク質と比較して、それが免疫反応を誘発する能力の百分率による低減（例えば、約１％の低減、約２％の低減、約３％の低減、約４％の低減、約５％の低減、約１０％の低減、約２０％の低減、約５０％の低減、約１００％の低減、並びにこれらのうちの任意の範囲の低減）を指す場合がある。したがって、スクリーニング工程を実施するときは、ヒト集団内に現存するＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリー（ＨＬＡ−ＤＲ）のうちの少なくとも９０％を超える試料をもたらすのに十分な免疫学的多様性を有するドナーのプールから、ナイーブドナーによるＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を回収する。所与の合成ペプチド（又は抗体）に対するナイーブＴ細胞の反応を検出する場合は、実際のペプチド（又は抗体）を、複数のドナーに由来する、単離されたＰＢＭＣ調製物と接触させるが、ドナーの数（又は「ドナープール」のサイズ）は、実際的な目的で、２０未満の非類縁個体ではない可能性が高く、該ドナープール内のすべての試料は、それらのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに従って予め選択することができる。
【０２１８】
本明細書で用いられる「ナイーブドナー」という用語は、環境によってであれ、ワクチン接種によってであれ、例えば、輸血など他の手段によってであれ、本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片にいまだ曝露されていない対象を指す。
【０２１９】
Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングする場合、複数の異なる健康なドナーであるが、治療的にタンパク質を施されてはいないドナーに由来する末梢血試料からＴ細胞を供給することができる。必要な場合は、抗体を用いて１又は複数のポリペプチドの存在又は非存在を同定する、ＥＬＩＳＡなどの従来のアッセイを用いて、患者の血液試料を、特定のポリペプチドの存在について調べることができる。アッセイは、当技術分野で知られる従来の手順を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養されたＰＢＭＣを用いて実施され、且つ、該ＰＢＭＣを、抗体など、対象のタンパク質（すなわち、ライブラリー）又は全タンパク質を表す合成ペプチド分子種と接触させるステップと、適切なインキュベーション期間を追跡するステップと、細胞増殖など、Ｔ細胞活性化の誘導を測定するステップとを伴う。測定は、任意の適切な手段を介することが可能であり、例えば、実験用計器を用いて細胞物質への３Ｈの蓄積が容易に測定される３Ｈ−チミジンの取込みを用いて実施することができる。ＰＢＭＣ試料と合成ペプチド又は全タンパク質との各混合物についての細胞増殖の程度を、非処理ＰＢＭＣ試料中において見られる細胞増殖の程度と比べて検証することができる。また、それらについて増殖作用が予測されている、１若しくは複数のペプチド又は全タンパク質による処理後において見られる増殖反応も参照することができる。この点では、既知の広範なＭＨＣ制限を伴うペプチド又は全タンパク質、並びにとりわけ、ＤＰアイソタイプ又はＤＱアイソタイプに対するＭＨＣ制限を伴うペプチドエピトープを用いることが有利であるが、本発明は、このような制限ペプチド又は制限タンパク質の使用に限定されない。このようなペプチドについては、例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素ペプチド並びにクラミジア属ＨＳＰ６０ペプチドについて上記で説明した。
【０２２０】
非限定的な一例では、Ｔ細胞エピトープをマップし、その後、本明細書で説明される方法を用いてこれらを修飾することができる。エピトープマップの構築を容易とするため、合成ペプチドのライブラリーを作製する。ペプチドの各々は１５アミノ酸残基の長さであり、各々は、連鎖する次のペプチドと１２アミノ酸残基だけ重複する、すなわち、逐次的に連鎖する各ペプチドは、さらなる３アミノ酸を増分として解析に付加する。このようにして、所与の任意の隣接するペプチド対は、１８アミノ酸の連続配列としてマップされる。ナイーブＴ細胞アッセイを用いてＴ細胞マップを規定する一方法を、以下の実施例で例示する。Ｔ細胞マップを規定する方法を介して同定されるペプチドの各々は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、且つ、アッセイシステムにより検出可能な増殖バーストを引き起こすのに十分なアフィニティーで、少なくとも１つの同族ＴＣＲと係合することが可能であることが示唆される。
【０２２１】
別の非限定的な例では、抗体がプロセシングされて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、且つ、アッセイシステムにより検出可能な増殖バーストを引き起こすのに十分なアフィニティーで、少なくとも１つの同族ＴＣＲと係合するＴ細胞エピトープを生成させる可能性を評価する。
【０２２２】
本明細書で説明される分子は、組換え法の使用を含めた複数の方法のうちのいずれかにより調製することができる。本明細書で示されるタンパク質の配列及び情報を用いて、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を推測することができる。これは、例えば、ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアシリーズ［ＤＮＡｓｔａｒ  Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ］などのコンピュータソフトウェアツール又はこれに類似するコンピュータソフトウェアツールを用いて達成することができる。本明細書では、ポリペプチド又は重要な相同体、変異体、切断型、延伸型、又はこれらのさらなる改変型をコードする任意のこのようなポリヌクレオチドが意図される。
【０２２３】
本明細書では、修飾配列が、ヘルパーＴ細胞反応の誘導を（部分的に、又は完全に）低減するように、Ｔ細胞エピトープをマップ（同定）し、且つ、これらのエピトープを修飾する方法が提供される。修飾には、同様の変化を及ぼす修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンにもたらされる、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入が含まれる。当技術分野では、アミノ酸残基をコードするコドンがよく知られている。組換えＤＮＡ法を用いて、標的配列を指向する突然変異誘発を達成することが可能であり、本明細書で説明される多くのこのような技法が利用可能であり、当技術分野では、上記で説明した技法などが知られている。一般に、部位特異的突然変異誘発法がよく知られている。略述すると、オリゴヌクレオチドを指向するＰＣＲによる突然変異誘発のための一本鎖鋳型を生成させるバクテリオファージベクターを使用する。ファージベクター（例えば、Ｍ１３）は市販されており、当技術分野では、それらの使用が一般によく知られている。部位指向突然変異誘発ではまた、二本鎖プラスミドも同様に日常的に使用され、これにより、対象のポリヌクレオチドをファージからプラスミドへと導入するステップが廃される。所望の突然変異配列を保有する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、この鋳型からの修飾（所望の突然変異体）ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける合成を誘導することができ、且つ、このヘテロ二重鎖ＤＮＡを用いて、コンピテントの大腸菌を形質転換し、所望のクローンの増殖による選択及び同定を行うことができる。代替的に、プライマー対を二本鎖ベクター鎖の２つの個別の鎖へとアニールさせて、所望の突然変異（単数又は複数）を伴う、対応する相補鎖の両方を、ＰＣＲ反応において同時に合成することができる。
【０２２４】
一実施形態では、プラスミドＤＮＡ鋳型を用いる、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位指向突然変異誘発法を使用することができる。対象の挿入標的遺伝子を含有するプラスミド鋳型のＰＣＲによる増幅は、所望の突然変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて達成する。各々がベクターの対向鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、突然変異誘発グレードのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを介して、温度サイクリングにより伸長させる。オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むと、スタガードニックを含有する突然変異プラスミドが生成される。増幅された非メチル化産物をＤｐｎ  Ｉで処理して、メチル化親ＤＮＡ鋳型を消化させ、突然変異を含有する新たに合成されたＤＮＡについて選択する。大腸菌株から単離されるＤＮＡは、ＤＡＭメチラーゼによりメチル化されており、メチル化ＤＮＡ及び半メチル化ＤＮＡに特異的であるＤｐｎ  Ｉ消化を受け易い。反応生成物を高効率の大腸菌株へと形質転換して、所望の突然変異を含有するプラスミドを得る。当技術分野では、ポリペプチド内にアミノ酸修飾を導入するさらなる方法がよく知られており、これらはまた、本発明でも用いることができる。
【０２２５】
タンパク質に適する修飾には、特定の残基又は残基の組合せに対するアミノ酸置換が含まれうる。Ｔ細胞エピトープを消失させるためには、該Ｔ細胞エピトープの活性の低減若しくは消失を達成することが予測されるアミノ酸配列内の適切な地点又はアミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらす。実際には、適切な地点又はアミノ酸残基が、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブ内に備えられるポケットのうちの１つにおいてアミノ酸残基の結合が生じる地点又はアミノ酸残基と一致することが好ましい。このような修飾は、該クレフトの第１ポケット内で生じる結合を、ペプチドのいわゆる「Ｐ１」位又は「Ｐ１アンカー」位において変化させうる。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブの第１ポケットとの結合相互作用の質が、全ペプチドの全体的な結合アフィニティーの主要な決定因子であると認められている。一般に、ポケット内への収容がそれほど容易でないアミノ酸残基を組み込む置換（例えば、より親水性の残基への置換）が、アミノ酸配列のこの位置においては適切であろう。また、ペプチド内で、ＭＨＣ結合クレフト内の他のポケット領域における結合位置と一致する位置にあるアミノ酸残基についても考慮し、これらも本発明の範囲内とする。
【０２２６】
所与の潜在的なＴ細胞エピトープにおける単一のアミノ酸修飾は、１又は複数のＴ細胞エピトープを消失させうる１つの方途を表す。単一のエピトープにおける修飾の組合せを意図することができるが、これらは、個別に規定されるエピトープが互いと重複する場合に適切でありうる。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブとの関連では「ポケット残基」の位置と一致しない位置であるが、該アミノ酸配列内では任意の地点において、アミノ酸の修飾（所与のエピトープ内における単独の修飾、又は単一のエピトープ内における組合せによる修飾）をもたらすこともできる。相同的構造に関して修飾をもたらすこともでき、当技術分野で知られ、且つ、本明細書で説明されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの技法を用いて実施される構造的方法を、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて実施することもできる。変化（修飾）は、変異体分子の構造又は生物学的活性を保存することを意図しうる。このような１又は複数の代償的変化にはまた、ポリペプチドに由来する特定のアミノ酸残基の欠失又は付加（挿入）も含まれうる。加えて、分子の構造を変化させ、且つ／又は分子の生物学的活性を低減し、また、Ｔ細胞エピトープも消失させ、これにより、該分子の免疫原性を低減する修飾ももたらすことができる。本明細書では、あらゆる種類の修飾を意図する。
【０２２７】
タンパク質分子からエピトープを除去するさらなる手段は、本明細書で概観されるナイーブＴ細胞活性化アッセイのスキームを、参照によりその全体が本明細書にもまた組み込まれる、ＷＯ０２／０６９２３２において説明されるスキームに従い開発されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのツールと併せて、協同的に用いることである。該ソフトウェアは、抗原提示の過程を、ポリペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子間結合相互作用のレベルでシミュレートして、所与の任意のポリペプチド配列の結合スコアを示す。集団内に現存する主要なＭＨＣクラスＩＩアロタイプのうちの多くについて、このようなスコアを決定する。このスキームは、任意のポリペプチド配列を調べることが可能なので、ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブと相互作用する能力に関して、アミノ酸の置換、付加、又は欠失の帰結を予測することができる。結果として、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し、これにより、免疫原性のＴ細胞エピトープとして機能することが可能なアミノ酸を、それらの数を低減して含有する新たな配列構成をデザインすることができる。所与の任意の１つのドナー試料を用いる生物学的アッセイでは、評価しうるＤＲアロタイプへの結合が最大４つであるが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの過程では、＞４０のアロタイプを同時に用いて同じポリペプチド配列を調べることができる。実際に、この手法は、複数のＭＨＣアロタイプと相互作用するそれらの能力が変化している新たな配列変異体のデザインを方向づけることが可能である。当業者には明らかである通り、そこにおいて望ましくないエピトープを除去する目的を達成するための、複数の代替的な置換のセットももたらすことができるであろう。しかし、結果としてもたらされる配列は、本明細書で開示され、したがって、本出願の範囲内に収まる、特定の組成物と密接に相同であることが認識されるであろう。
【０２２８】
ＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定し、且つ、ＭＨＣクラスＩＩリガンドを欠く配列類似体をデザインするためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのツールを、エピトープマッピング、並びに、場合によって、Ｔ細胞活性化についての生物学ベースのアッセイを用いる再検査と協同させて用いる組合せ法が、本出願のさらなる方法及び実施形態である。この実施形態による一般的な方法は、以下のステップ：
ｉ）ナイーブＴ細胞活性化アッセイ、並びに対象のタンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドを用いて、Ｔ細胞を活性化させることが可能なエピトープ領域を同定するステップ、
ｉｉ）ペプチドリガンドの、１又は複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを用いて、ステップ（ｉ）において同定されたエピトープ領域を解析し、これにより、該エピトープ領域内のＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定するステップ、
ｉｉｉ）ペプチドリガンドの、１又は複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子にはもはや結合しないか、又は結合するＭＨＣアロタイプがより少数であり、これに伴うアフィニティーもより低度であるエピトープ領域（単数又は複数）内に包含されるＭＨＣリガンドの配列類似体を同定ステップ、並びに、場合によって、
ｉｖ）ナイーブＴ細胞活性化アッセイ、並びに対象のタンパク質において同定されるエピトープ領域を全体的に又は集合的に包含する合成ペプチドを用い、ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて野生型（親）配列と並列的に配列類似体を調べるステップを含む。
【０２２９】
一実施形態では、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を作製する方法が、抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定するステップと、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾するステップとを含む。
【０２３０】
別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定する工程と、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾する工程とを介して、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を作製する。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を選択する方法が、該抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定するステップと、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくともエピトープで１つのアミノ酸残基を修飾するステップと、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を選択するステップとを含む。
【０２３２】
本明細書で説明されるＴ細胞エピトープは、その領域によりさらに特徴付けることができる。このような領域は、エピトープコア、Ｎ末端、及びＣ末端を包含する。本明細書で用いられる「エピトープコア」とは、Ｔ細胞エピトープのコアとなる９ｍｅｒのアミノ酸配列を指す。該エピトープコアは、Ｎ末端及び／又はＣ末端において、コアとなる９ｍｅｒのアミノ酸配列に隣接する０、１、２、又は３アミノ酸残基をさらに包含しうる。したがって、ある実施形態では、エピトープコアが、約９アミノ酸〜約１５アミノ酸の長さの範囲でありうる。
【０２３３】
本明細書で用いられる「Ｎ末端」とは、エピトープコアのＮ末端に隣接するアミノ酸を指し、該エピトープコアのＮ末端に隣接し、且つこれの上流にある、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸を包含する。
【０２３４】
本明細書で用いられる「Ｃ末端」とは、エピトープコアのＣ末端に隣接するアミノ酸を指し、該エピトープコアのＣ末端に隣接し、且つこれの下流にある、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸を包含する。
【０２３５】
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、１又は複数の修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、２つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、３つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、４つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、５つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、６つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、７つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、８つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、９つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、１０の修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、２０までの修飾を含有する。
【０２３６】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号９３（ＶＫ１ＡＡ）として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号８９（ＶＨ１Ａ２）として示される重鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２３７】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、及び９２のいずれか１つとして示される重鎖可変領域を含むヒト化及び脱免疫化抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２３８】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、及び１０３のいずれか１つとして示される軽鎖可変領域を含むヒト化及び脱免疫化抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２３９】
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化及び脱免疫化抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、且つ、
（ｉｉ）軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はそれらの抗原結合断片が提供される。
【０２４０】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１及び９２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として示される軽鎖可変領域とを含む、ヒト化及び脱免疫化抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２４１】
本明細書では、前述の例及び実施形態に加えて、１又は複数のＴ細胞エピトープにおいて１又は複数のアミノ酸修飾を伴う修飾ヒト化及び脱免疫化抗体又はその抗原結合断片を意図する。本明細書の非限定的な一例では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープにおいて少なくとも１つの修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。本明細書の非限定的な別の例では、本明細書で説明されるＴ細胞エピトープのうちの１、２、３、４、５、６、又は７つにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。さらなる非限定的な例は、複数のＴ細胞エピトープにおいて複数のアミノ酸修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片を包含する。本明細書では、上記で説明した、任意の数の抗体又はそれらの抗原結合断片、Ｔ細胞エピトープにおける任意のアミノ酸修飾の組合せを意図する。
【０２４２】
Ｔ細胞エピトープ及びアロタイプの頻度
抗原内に見出される個々のエピトープは、特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプにより優先的に提示される可能性があり、且つ同様に、同じ抗原内の他の特異的なエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されない可能性もある。特定のエピトープが、特定のＭＣＨクラスＩＩ分子とこのように会合することは、個体のＭＨＣクラスＩＩアロタイプに依存することが示されている。また、Ｔ細胞エピトープを除去するために、抗体又はそれらの抗原結合断片を修飾するときにも、特定のエピトープの、特定のアロタイプとの会合を考慮する場合がある。このような考慮により、特定のアロタイプ（例えば、あるＭＨＣクラスＩＩアロタイプを有する特定の対象集団）に対して高度に特異的な修飾を、抗体又はその抗原結合断片に対してもたらすことが可能となりうる。１又は複数の対象のＭＨＣクラスＩＩアロタイプは、当技術分野において知られる遺伝子型決定法により容易に決定することができ、これにより、このアロタイプに合わせて抗体又はそれらの抗原結合断片を修飾するときに考慮される、Ｔ細胞エピトープの、所与のアロタイプとの会合を容易に同定することができる。Ｔ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩＩアロタイプとの会合を同定することについては、以下の実施例でより詳細に説明される。本明細書では、所与のエピトープについて同定されたＭＨＣクラスＩＩとの会合に合わせてＴ細胞エピトープを修飾した修飾抗体又はそれらの抗原結合断片が意図される。
【０２４３】
Ｄ．抗エンドグリン抗体
ＦＲ及び／又はＣＤＲをコードする核酸のすべて、並びに選択されたアミノ酸位置の変化のすべてを同時的に組み込むことは、例えば、組換え及び化学合成を含めた、当業者に知られる各種の方法により達成することができる。例えば、同時的な組込みは、例えば、アクセプター可変領域のヌクレオチド配列を、ドナーＣＤＲをコードする核酸と併せて融合させる形で化学合成し、且つ、変化可能なアミノ酸残基を保有させるために選択した位置に複数の対応するアミノ酸コドンを組み込むことにより達成することができる。
【０２４４】
本明細書で説明される方法を用いて生成される、エンドグリンに特異的に結合するヒト化及び脱免疫化抗体並びにそれらの抗原結合断片を、ＥＬＩＳＡが含まれるがこれに限定されない従来の方法を用いる、本明細書で提供されるか、又は当技術分野において知られているアッセイを用いて、エンドグリンに結合する能力について調べることができる。また、本明細書で説明される抗体のアフィニティーも、Ｂｉａｃｏｒｅ又は表面プラズモン共鳴が含まれるがこれらに限定されない従来の方法を用いて決定することができる。抗体の活性は、抗体は、実施例に記載のような競合アッセイを用いて試験され、ＢＭＰ９の機能を阻害するかどうかを決定される。例えばＳｍａｄ  １／５／８の活性を評価するための細胞シグナル伝達経路は、当技術分野で知られており、本明細書で使用するために企図される。
【０２４５】
本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片は、ＴＲＣ１０５抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列をヒト化することにより構築した。このヒト化を達成するために、ＴＲＣ１０５のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の三次元モデルを創出及び解析した。次いで、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を、ＴＲＣ１０５のＶＨ鎖及びＶＬ鎖とのそれらの相同性に基づいてそこからヒトＶＨ鎖及びＶＬ鎖を選択したヒト生殖細胞系列の配列データベースと個別に比較した。ヒト化するのに選択されたヒトＶＬ配列は、Ｏ２／Ｏ１２（ＶＫ１−３９）（配列番号２）であった。Ｏ２／Ｏ１２は、ＴＲＣ１０５との配列同一性が６５％であり、その遺伝子はヒト生殖細胞系列のレパートリーにおいて高度に発現している。ヒト化するのに選択されたヒトＶＨ配列は、ＶＨ３−１５（配列番号４０）であった。ＶＨ３−１５は、ＴＲＣ１０５との配列同一性が７０％であり、ヒト生殖細胞系列のレパートリーにおいてかなりの頻度で発現している。ＴＲＣ１０５とヒト配列との間で異なっていたアミノ酸位置を、ＴＲＣ１０５の３Ｄモデルにおいて検討し、修飾する場合にどの置換を考慮するかを決定した。３Ｄモデル解析に基づくアミノ酸の選択基準には、例えば、アミノ酸と関連する立体効果、アミノ酸の相対電荷、並びに可変重鎖及び／又は可変軽鎖内のアミノ酸の位置が含まれるがこれらに限定されない。ヒトフレームワーク領域について同定及び提起される置換を、Ｏ２及びＶＨ３−１５のヒトフレームワーク領域に組み込み、ＴＲＣ１０５のＣＤＲを、対応するＯ２及びＶＨ３−１５のヒトフレームワーク領域に移植する結果として、多数のヒト化抗体又は抗原結合断片が得られる。加えて、軽鎖のＦＲ−４は、ヒト生殖細胞系列Ｊセグメントの配列であるＪｋ４から派生させる。同様に、重鎖のＦＲ−４は、ヒト生殖細胞系列Ｊセグメントの配列であるＪＨ４から派生させる。
【０２４６】
抗体並びにそれらの抗原結合断片は、可変重（ＶＨ）鎖、可変軽（ＶＬ）鎖、これらの両方、又はこれらの結合部分を有しうる。一実施形態では、ＶＨ鎖が、配列番号４１〜４３のうちのいずれかとして示されるアミノ酸配列、又はこれらの結合部分を有する。このようなＶＨ鎖は、フレームワーク領域配列が配列番号４４〜６２のうちのいずれかとして示されうる。別の実施形態では、ＶＬ鎖が、配列番号３〜５のうちのいずれかとして示されるアミノ酸配列、又はこれらの結合部分を有する。このようなＶＬ鎖のフレームワーク領域配列は、配列番号６〜３８のうちのいずれかとして示されうる。
【０２４７】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域とを含む、抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２４８】
本明細書では、抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域とを有し；重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換；４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２４９】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４１、４２、又は４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３、４又は５として示される重鎖可変領域とを含む、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片が提供される。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。
【０２５０】
このような実施形態のうちのいずれかでは、重鎖可変領域が、７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含むことが可能であり、且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含みうる。
【０２５１】
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
【０２５２】
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２５３】
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号６６として示される重鎖可変領域ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号６７として示される重鎖可変領域ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６８として示される重鎖可変領域ＣＤＲ３、アミノ酸配列が配列番号６３として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号６４として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６５として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含みうる。
【０２５４】
一実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、はアミノ酸配列が配列番号４４として示される重鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号４５として示される重鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号４７として示される重鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号５６として示される重鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
【０２５５】
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号４４として示される重鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号４６として示される重鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号４８として示される重鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号５６として示される重鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
【０２５６】
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号６として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２０として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２８として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
【０２５７】
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号６として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２１として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２９として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
【０２５８】
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号７として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２１として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２９として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
【０２５９】
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２６０】
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域とを有し；前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換；４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２６１】
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
【０２６２】
可変ドメインのうちの実質的部分は、それらに介在するフレームワーク領域と併せて、３つのＣＤＲ領域を包含する。また、該部分は、第１のフレームワーク領域並びに第４のフレームワーク領域の一方又は両方のうちの少なくとも約５０％ずつも包含し、この５０％は、該第１のフレームワーク領域のＣ末端側の５０％、並びに該第４のフレームワーク領域のＮ末端側の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端又はＣ末端におけるさらなる残基は、天然の可変ドメイン領域とは通常関連しない残基でありうる。例えば、組換えＤＮＡ法により作製される、本明細書で説明されるヒト化エンドグリン抗体並びに抗原結合断片の構築は、クローニングステップ又は他の操作ステップを容易にする目的で導入されるリンカーによりコードされるＮ末端残基又はＣ末端残基の導入を結果としてもたらしうる。他の操作ステップには、可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディーを作製する場合）、又は以下でさらに詳細に論じられるタンパク質標識を含めたさらなるタンパク質配列へと接合するためのリンカーの導入が含まれる。
【０２６３】
アミノ酸配列が、本明細書で説明される抗体のＣＤＲ３領域として実質的に示されるヒト化エンドグリンＣＤ３領域は、エンドグリンに対する該ＣＤＲ３領域の結合を可能とする構造内に保有される。ＣＤＲ３を保有する構造とは、該ＣＤＲ３領域が、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のＶＨ抗体可変ドメイン及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する位置に配置される、抗体の重鎖配列若しくは軽鎖配列又はこれらの実質的部分の構造でありうる。
【０２６４】
本発明の非限定的な一例では、アミノ酸配列が配列番号６８として示されるＣＤＲ３を有する可変重鎖、並びに／又はアミノ酸配列が配列番号６５として示されるＣＤＲ３を有する可変軽鎖を含有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。一実施形態では、可変重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８として示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列によるＣＤＲ３の置換を除き、配列番号４０として示される。別の実施形態では、可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６５として示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列によるＣＤＲ３の置換を除き、配列番号２として示される。加えて、このようなＣＤＲ３を含有する可変領域／鎖は、例えば、上記で説明した通りに示される１又は複数のＦＲアミノ酸配列（又は１若しくは複数のさらなる修飾を含有するこのようなＦＲ）を含むことが可能であり、この場合、抗体又は抗原結合断片は、ＶＨ領域及びＶＬ領域の各々において３つずつのＣＤＲ並びに４つずつのＦＲを有し、エンドグリンに特異的な結合活性を有する。加えてまた、多様な抗体Ｊセグメントも、これらの可変領域内で置換し、可変領域内のさらなる変化をもたらすことができる。
【０２６５】
【表１】
2017537084.tif 000003
【０２６６】
さらに本明細書では、代替的に、「超ヒト化」抗エンドグリン抗体又はそれらの抗原結合断片とも称する、抗エンドグリン抗体のヒト化形も提供される。このような超ヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号７１又は７２として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号７５として示される重鎖可変領域とを含みうる。
【０２６７】
別の態様では、本出願が、そのＶＨ配列及びＶＬ配列を有する抗体のうちの少なくとも５％が、このような抗体との競合によりエンドグリンとの結合を遮断される条件下にあるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、本明細書で説明されるヒト化抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片と競合することが可能なヒト化抗体を提供する。
【０２６８】
本明細書では、エンドグリンに結合し、又はＢＭＰ９の結合を阻害する、エンドグリンの活性を調節する中和抗体又は抗原結合断片が提供される。該中和抗体は、エンドグリンに結合することにより、例えば、血管新生を阻害する。
【０２６９】
一態様では、上記で説明したヒト化抗体のうちのいずれか１つの抗原結合断片が、本明細書で説明されるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ部分を伴うｓｃＦｖ）、又はこれらの他の任意の機能的断片である。
【０２７０】
本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片は、以下でより詳細に説明される検出適用又は診断適用において有用である。
【０２７１】
本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片は、必要な場合、所望の機能性を保持しながら、該抗体の特異的な特性を変化させるようにさらに修飾することができる。例えば、一実施形態では、化合物を修飾して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性、可溶性、バイオアベイラビリティー、又は半減期など、該化合物の薬物動態特性を変化させることができる。本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片は、診断適用及び／又は治療適用で用いられる、治療用部分、検出可能部分、又はこれらの両方をさらに含みうる。
【０２７２】
本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片はまた、免疫コンジュゲートとしても用いることができる。明細書及び特許請求の範囲を目的として本明細書で用いられる免疫コンジュゲートとは、本発明によるヒト化抗エンドグリン抗体又はそれらの断片と、少なくとも１つの治療標識とからなるコンジュゲートを指す。当技術分野では、このような抗腫瘍剤が知られており、これらには、毒素、薬物、酵素、サイトカイン、放射性核種、及び光力学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。毒素には、リシンＡ鎖、突然変異体のシュードモナス属外毒素、ジフテリアトキソイド、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポリン、ゲロニン、並びにブタクサの抗ウイルス性タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。薬物には、ダウノルビシン、メトトレキサート、及びカリケアマイシンが含まれる。放射性核種には、放射性金属が含まれる。サイトカインには、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β、インターロイキン、インターフェロン、及び腫瘍壊死因子が含まれるがこれらに限定されない。光力学療法剤には、ポルフィリン並びにそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなる治療用標識が知られており、本明細書でもまた、これらが意図されている。当業者には、抗エンドグリンｍＡｂ又はそれらの断片を、少なくとも１つの抗腫瘍剤と共に複合体化する方法が知られている（すなわち、Ｇｈｅｔｉｅら、１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６３：２０９〜３４により総説されている抗体コンジュゲート）。このような方法は、分子を結合させるか又は連結するのに用いられる、複数の利用可能なヘテロ二官能性試薬のうちの１つを使用しうる。本明細書ではさらに、治療用標識などの連結分子についてのさらなる方法と共に、さらなる放射性核種も説明されている。
【０２７３】
抗体又はそれらの抗原結合断片は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することによるなど、当技術分野において各種の目的について知られる技法を用いて修飾することができる。ＰＥＧ修飾（ＰＥＧ化）は、循環時間の改善、可溶性の改善、タンパク質分解に対する耐性の改善、抗原性及び免疫原性の低減、バイオアベイラビリティーの改善、毒性の低減、安定性の改善、並びに製剤化の容易さのうちの１又は複数をもたらしうる（総説については、Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６８：１〜１８、１９９８を参照されたい）。
【０２７４】
Ｆｃ部分を含有しない抗原結合断片の場合、該断片にＦｃ部分を付加（例えば、組換えにより）して、例えば、患者に投与された場合の血液循環中における抗原結合断片の半減期を延長することができる。当技術分野では、適切なＦｃ領域の選択、並びにこのような断片を組み込む方法について知られている。その循環における半減期を延長するように、しかし、その生物学的活性は失わないように、対象のポリペプチドにＩｇＧのＦｃ領域を組み込むことは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９６，８７１号において説明されている技法など、当技術分野で知られている従来の技法を用いて達成することができる。患者に投与されたとき、血液循環中における抗原結合断片の半減期を延長させるように、抗体のＦｃ部分をさらに修飾することができる。修飾は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第７，２１７，７９８号において説明されている手段など、当技術分野における従来の手段を用いて決定することができる。
【０２７５】
また、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０９１，３２１号及び同第６，７３７，０５６号において説明される方法など、循環における抗体ベースの融合タンパク質の半減期を改善する他の方法も知られている。加えて、それらの複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが含有されないように、抗体並びにそれらの抗原結合断片を作製するか又は発現させることもできる。複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖からフコースを除去することは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が含まれるがこれらに限定されない、抗体並びにそれらの抗原結合断片のエフェクター機能を増大させることが知られている。同様に、エンドグリンに結合しうる抗体又はそれらの抗原結合断片を、それらのＣ末端において、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭ、並びに該アイソタイプのサブクラス、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全部又は一部に結合させることができる。
【０２７６】
加えて、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片はまた、それらが血液脳関門を越えることが可能となるように修飾することもできる。本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片に対するこのような修飾は、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）などの脳疾患を治療することを可能とする。抗体又は抗原結合断片などのタンパク質が、血液脳関門を越えることを可能とする例示的な修飾については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／００８２３８０号において説明されている。
【０２７７】
免疫グロブリンのグリコシル化は、それらのエフェクター機能、構造的安定性、並びに抗体生成細胞からの分泌速度に対して著明な効果を及ぼすことが示されている（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７（１９８５））。これらの特性の一因となる炭水化物基は一般に、抗体の定常（Ｃ）領域に結合する。例えば、ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７におけるＩｇＧのグリコシル化はＩｇＧが、補体依存性細胞傷害作用の古典的経路を活性化させる能力を十全化するのに必要とされる（Ｔａｏ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５（１９８９））。ＣＨ３ドメインのアスパラギン４０２におけるＩｇＭのグリコシル化は、抗体の適正な構築並びに細胞溶解活性に必要である（Ｍｕｒａｏｋａ及びＳｈｕｌｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６９５（１９８９））。ＩｇＡ抗体のＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインにおける１６２位及び４１９位などのグリコシル化部位を除去すると、細胞内分解並びに少なくとも９０％の分泌阻害がもたらされる（Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｌｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１９７（１９８８））。加えて、それらの複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが含有されないように、抗体並びにそれらの抗原結合断片を作製するか又は発現させることもできる。複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖からフコースを除去することは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が含まれるがこれらに限定されない、抗体並びに抗原結合断片のエフェクター機能を増大させることが知られている。これらの「脱フコース化」抗体並びに抗原結合断片は、複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが組み入れられるのに必要な酵素経路及び生化学経路をそれらがもはや含有しないように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は細胞系（また、フコシルトランスフェラーゼノックアウト動物、フコシルトランスフェラーゼノックアウト植物、フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞としても知られる）が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野において知られている分子クローニング法を使用する各種の系を介して作製することができる。フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞となるように操作されうる細胞の非限定的な例には、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、及びＹＢ２／０細胞が含まれる。
【０２７８】
また、可変（Ｖ）領域における免疫グロブリンのグリコシル化も観察されている。Ｓｏｘ及びＨｏｏｄは、ヒト抗体のうちの約２０％が、Ｖ領域においてグリコシル化されていることを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６６：９７５（１９７０））。Ｖドメインのグリコシル化は、Ｖ領域配列において、Ｎ結合型グリコシル化シグナルであるＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが偶然に発生することから生じると考えられているが、当技術分野では、免疫グロブリンの機能において役割を果たすと認識されていない。
【０２７９】
可変ドメインのフレームワーク残基におけるグリコシル化は、抗体による抗原との結合相互作用を変化させうる。本発明は、抗体のアフィニティーを増大させる目的で、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク又はＣＤＲにおける限定された数のアミノ酸を選択して突然変異させる（例えば、残基の置換、欠失、又は付加により）ための基準を包含する。
【０２８０】
一般に、１又は複数の突然変異を、Ｖ領域のフレームワーク、典型的には、１若しくは複数のＣＤＲ領域に隣接する領域、並びに／又は１若しくは複数のフレームワーク領域に導入することにより、所定のポリペプチド抗原に対する結合アフィニティーを調節することができる。このような突然変異は、該ポリペプチドのグリコシル化部位の配列を破壊又は創出するが、疎水性構造特性には実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換の導入を伴うことが典型的である。プロリン残基を導入する突然変異は回避することが典型的である。抗体並びにそれらの抗原結合断片のグリコシル化については、グリコシル化に関する参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５０，８６１号においてさらに説明されている。
【０２８１】
抗体又はそれらの抗原結合断片は、短期送達用に製剤化することもでき、持続（長期）送達用に製剤化することもできる。
【０２８２】
以下でより詳細に説明される通り、抗体又はそれらの抗原結合断片はまた、エンドグリンを精製するのにも用いることができ、且つ／又は試料若しくは患者におけるエンドグリンレベルを検出して、エンドグリンと関連する疾患若しくは障害を検出若しくは診断するのにも用いることができる。
【０２８３】
このような方法を用いて生成される、エンドグリンに結合するヒト化抗体、抗原結合断片、及び抗原結合タンパク質は、それらの結合アフィニティー、アビディティー、及び中和能のうちの１又は複数について調べることができる。有用なヒト化抗体、抗原結合断片、及び抗原結合タンパク質は、患者に投与して、線維症の状態、疾患、又は障害を予防、阻害、管理、又は治療するのに用いることができる。
【０２８４】
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片を同定する方法が提供される。抗体並びに抗原結合断片は、結合アフィニティー、会合速度、解離速度、及びアビディティーのうちの１又は複数について評価することができる。一態様では、抗体を、それらがエンドグリン又はその中にエンドグリン結合配列が存在するポリペプチドの活性を中和する能力について評価することができる。結合アフィニティー、会合速度、解離速度、及びアビディティーの測定は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定アッセイ）、スカチャード解析、ＢＩＡＣＯＲＥ解析などのほか、一般的に用いられ、且つ、当業者に知られている他のアッセイが含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で認知されているアッセイ（表面プラズモン共鳴法）を用いて達成することができる。
【０２８５】
エンドグリンに対する抗体の結合、並びに／又は抗体並びにそれらの抗原結合断片が、例えば、線維症を阻害する能力の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、競合的結合アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、又は当技術分野において知られる他の任意の有用なアッセイを用いて決定することができる。これらのアッセイは一般に用いられており、当業者によく知られている。
【０２８６】
非限定的な一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、エンドグリンに結合する特異的な抗体又はそれらの抗原結合断片の結合能を測定することができる。
【０２８７】
ＥＬＩＳＡなどのアッセイはまた、他の抗体又はそれらの抗原結合断片と比較して、特異性の増大を呈示する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定するのにも用いることができる。ＥＬＩＳＡなどのアッセイはまた、１又は複数のポリペプチドにわたるエピトープ、並びに１又は複数のエンドグリン分子種にわたるエピトープに結合する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定するのにも用いることができる。個別のアッセイチャンバーにおいて同時に、被験抗体又はそれらの抗原結合断片を、エンドグリンのエピトープを含有するポリペプチドの異なる分子種における１又は複数のエピトープに結合する能力についてスクリーニングして、エンドグリンに結合する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定する並列的ＥＬＩＳＡを行うことにより、特異性アッセイを実施することができる。当業者によく知られる、みかけの結合アフィニティーを測定する別の技法は、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムにより解析する）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ．Ｊ．２０００、１７：３２３〜３２９）である。標準的な測定並びに従来の結合アッセイについては、Ｈｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２００２、２８：２１７〜２２９により説明されている。
【０２８８】
実施例に記載されるように、ＴＧＦ−β受容体へのＢＭＰ９の結合の遮断を評価するための競合結合アッセイはまた、線維症を治療、抑制、又は改善するそれらの能力を評価するために使用することができる。
【０２８９】
本明細書におけるエンドグリンに対するヒト化及び脱免疫化抗体はまた、それらが、線維症を治療する能力についてアッセイすることもできる。当業者に知られている任意の適切なアッセイを用いて、このような効果をモニタリングすることができる。本明細書では、このような技法のうちのいくつかが説明されている。一例では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片を、エンドグリンに結合するそれらの能力についてアッセイする。別の例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片のアフィニティー定数を決定する。
【０２９０】
ＩＩ．組成物
本明細書で説明される化合物の各々は、許容される担体又は賦形剤と共に組み合わせて、組成物として用いることができる。このような組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて解析するか、又はｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象に投与して、開示される化合物により対象を治療するのに有用である。
【０２９１】
したがって、医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、又は当業者によく知られる他の物質を包含しうる。このような物質は非毒性であるものとし、有効成分の有効性に干渉しないものとする。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存する。
【０２９２】
本明細書で説明される方法により同定される対象のタンパク質、例えば、抗体又は抗原結合断片を含む医薬製剤は、乾燥凍結製剤又は水溶液の形態で、所望の純度を有する該タンパク質を、生理学的に許容される任意選択の担体、賦形剤、又は安定化剤（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、調製して保存することができる。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、且つ、リン酸、クエン酸、並びに他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含めた、単糖、二糖、並びに他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ナトリウムイオンなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＮＩＣＳ（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる担体、賦形剤、又は安定化剤である。
【０２９３】
本明細書に記載の組成物中に含めることができる他の試薬は、２０１３年９月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３  ／０５８２６５に意図され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。  
【０２９４】
許容される担体は、投与される患者に対して生理学的に許容可能であり、それらと共に／それらにより投与される化合物の治療特性を保持する。許容される担体並びにそれらの製剤は一般に、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０）において説明されている。例示的な１つの担体は、生理学的食塩液である。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という語句は、対象化合物を、１つの器官若しくは体内の１つの部分の投与部位から、別の器官若しくは体内の別の部分へと、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイシステムにおいて保有又は移動させることに関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料など、薬学的に許容される物質、組成物、又は媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分に適合的であり、且つ、それが投与される対象に対して傷害性でないという意味において許容可能である。また、許容される担体は、対象化合物の特異的な活性を変化させることもないものとする。
【０２９５】
本発明の一態様では、医薬投与に適合的な溶媒（水性溶媒又は非水性溶媒）、溶液、エマルジョン、分散媒体、コーティング、等張剤並びに吸収促進剤又は吸収遅延剤を含めた、薬学的に許容される組成物又は生理学的に許容される組成物が提供される。したがって、医薬組成物又は医薬製剤とは、対象における医薬使用に適する組成物を指す。医薬組成物及び医薬製剤は、本明細書で説明される量の化合物と、薬学的に許容される担体又は生理学的に許容される担体を包含する。
【０２９６】
組成物は、特定の投与経路（すなわち、全身投与経路又は局所投与経路）に適合するように製剤化することができる。したがって、組成物は、各種の経路を介して投与するのに適する担体、希釈剤、又は賦形剤を包含する。
【０２９７】
別の実施形態では、組成物中の化合物の安定性を改善するために、且つ／又は組成物の放出速度を制御するために、必要な場合は、該組成物が、許容される添加剤をさらに含みうる。許容される添加剤は、対象化合物の特異的な活性を変化させない。例示的な、許容される添加剤には、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトースなどの糖、並びにこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。許容される添加剤は、デキストロースなど、許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることができる。代替的に、例示的な、許容される添加剤には、ペプチドとの安定性を増大させ、且つ、溶液のゲル化を減少させる、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの界面活性剤が含まれるがこれらに限定されない。界面活性剤は、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に添加することができる。許容されるこのような添加剤の添加は、保管時における組成物の安定性を増大させ、且つ、保管寿命を延長する。
【０２９８】
医薬組成物は、例えば、皮下注射、皮下注射、硝子体内注射、皮内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は筋肉内注射が含まれるがこれらに限定されない注射を介して投与することができる。本明細書では、各種の注射用の組成物製剤において用いられる賦形剤及び担体が意図される。以下の説明は、例だけを目的とするものであり、組成物の範囲を限定することを意図しない。注射用組成物には、水性溶液（水に可溶性である場合）又は分散液、並びに滅菌注射溶液又は滅菌注射分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適する担体には、生理的食塩液、静菌水であるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体でありうる。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより、並びに界面活性剤を用いることにより、流体性を維持することができる。抗菌剤及び抗真菌剤には、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールが含まれる。等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール；並びに塩化ナトリウムを、組成物中に組み入れることができる。結果として得られる溶液は、そのままで用いるようにパッケージ化することもでき、乾燥凍結することもできる；乾燥凍結調製物は、その後の投与前に滅菌溶液と混合することができる。静脈内注射又は罹患部位における注射では、有効成分が、発熱物質を含まず、且つ、ｐＨ、等張性、及び安定性が適切である、非経口投与に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、並びに／又は他の添加剤も組み入れることができる。必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又はこれらの組合せを伴う適切な溶媒中に必要量で有効成分を組み込み、次いで濾過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、基盤となる分散媒体、並びに上記で列挙した成分のうちで必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体に有効成分を組み込むことにより、分散液を調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分に、既に滅菌濾過されたその溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２９９】
組成物は、従来通り、硝子体内投与することもでき、皮下投与することもでき、硝子体内インプラントを介して投与することもできる。
【０３００】
組成物は、従来通り、例えば、単位用量を注射することによるなど、静脈内投与することができる。注射では、有効成分が、発熱物質を実質的に含まず、且つ、ｐＨ、等張性、及び安定性が適切である、非経口投与に許容される水性溶液の形態でありうる。例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて、適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、並びに／又は他の添加剤も組み入れることができる。加えて、組成物は、エアゾール化を介して投与することもできる（Ｌａｈｎら、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｔ−ｃｅｌｌ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｉｒｗａｙ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｇｅｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏ．、１３４：４９〜５５（２００４））。
【０３０１】
一実施形態では、組成物を乾燥凍結して、例えば、保存時の保管寿命を延長する。組成物を、薬物又は本明細書で示される方法のうちのいずれかにおいて用いることを考慮する場合、それが、ヒト患者に投与された場合に、炎症反応又は安全でないアレルギー反応を引き起こさないように、該組成物が発熱物質を実質的に含まないことが可能であることを意図する。組成物を発熱物質について検査し、発熱物質を実質的に含まない組成物を調製することは、当業者に十分に理解されており、市販のキットを用いてこれを達成することが可能である。
【０３０２】
許容される担体は、吸収又はクリアランスを安定化させるか、増大させるか、又は遅延させる化合物を含有しうる。このような化合物には、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストランなどの炭水化物；低分子量のタンパク質；ペプチドのクリアランス若しくは加水分解を低減する組成物；又は賦形剤若しくは他の安定化剤及び／若しくは緩衝剤が含まれる。吸収を遅延させる薬剤には、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンが含まれる。また、洗浄剤も用いて、リポソーム担体を含めた医薬組成物を安定化させることもでき、その吸収を増大又は減少させることもできる。消化から保護するために、化合物を組成物と複合体化させて、それを、酸及び酵素による加水分解に対して耐性とすることもでき、該化合物を、リポソームなど、適切な形で耐性の担体中に複合体化させることもできる。当技術分野では、化合物を消化から保護する手段が知られている（例えば、治療的作用剤の経口送達用液体組成物について記載している、Ｆｉｘ（１９９６）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０〜１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９〜１３５；並びに米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい）。
【０３０３】
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されたときに、生理的に忍容され、且つ、急性胃蠕動、めまいなどのアレルギー反応又は同様の望ましくない反応をもたらさないことが典型的である分子的実体及び組成物を指す。
【０３０４】
治療用組成物との関連で用いられる「単位用量」という用語は、各単位が、必要とされる希釈剤、すなわち、担体又は媒体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質を含有する、ヒトに対する単位用量として適切な、物理的に個別の単位を指す。
【０３０５】
組成物は、用量製剤と適合する形で、且つ、治療有効量で投与することができる。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系が有効成分を使用する能力、並びに所望の結合能の程度に依存する。投与されるのに必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個人に固有である。また、初回投与及び追加投与に適するレジメンも変化しうるが、初回投与の後、後続の注射又は他の投与を介して、１時間又は複数時間の間隔で反復投与を行うことが典型的である。代替的に、血中濃度を維持するのに十分な持続的静脈内注入も意図される。
【０３０６】
一実施形態は、本明細書で説明される組成物を用いて、本明細書で説明される状態、疾患、又は障害を治療するための薬物を作製することを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、状態、疾患、又は障害の病期に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、本明細書で説明される疾患を有する対象の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。以下で説明される通り、組成物の用量及び投与についての指示書は、パッケージ内に組み入れることができる。本発明は、本明細書の上記で説明したヒト化及び脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片、並びに薬学的に許容される担体による薬物をさらに対象とする。
【０３０７】
本明細書では、エンドグリンに結合し、本明細書の別の箇所で説明した物質などの物質を包含するヒト化及び脱免疫化抗体並びにそれらの抗原結合断片による組成物が提供される。本明細書で説明される、エンドグリンに結合するヒト化及び脱免疫化抗体並びにそれらの抗原結合断片は、線維症の治療、抑制、又は改善に用いることが出来る。
【０３０８】
組成物（本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片）は、単独で投与することもでき、治療される状態に応じて、第２の組成物と組み合わせて同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。一実施形態では、第２の治療処置が、線維症阻害剤（本明細書で説明される）である。２つ以上の組成物を投与する場合、組成物は、組合せで（逐次的に又は同時的に）投与することができる。例えば、併用療法はピルフェニドン（ｐｅｒｆｍｅｄｏｎｅ）又はＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤を含むことができる。当該技術分野で認識される他の薬物または化合物は、併用療法において本明細書に記載の抗体と一緒に投与できることが理解されるであろう。組成物は、単回投与で投与することもでき、複数回投与で投与することもできる。
【０３０９】
本発明の一実施形態では、それらがヒト患者への投与について許容されるように、発熱物質を含まないように組成物を製剤化する。組成物を発熱物質について検査し、発熱物質を含まない医薬組成物を調製することは、当業者に十分に理解されている。
【０３１０】
本発明の一実施形態は、本発明の組成物のうちのいずれかを用いて、本発明による、障害を治療するための薬物を作製することを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、障害に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。本発明の薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、対象における、本明細書で説明される障害の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。本発明の医薬組成物の用量及び投与についての指示書は、医薬パッケージ内に組み入れることができる。
【０３１１】
ＩＩＩ．使用方法
本明細書では、患者（ヒト又は非ヒト）に、エンドグリンに優先的に結合するヒト化及び脱免疫化抗体又はその抗原結合断片の組成物を投与することによって患者における応答を誘導する方法が提供される。抗体が結合する結合部位は、連続的であってよい、又はコンフォメーション／不連続なエピトープであってよい。
【０３１２】
本発明の有効な応答は、患者が疾病の徴候又は症状の部分的な又は完全な軽減又は低下を経験する場合に実現され、詳細には、これらに限定することなく、生存の延長が挙げられる。予測無増悪生存時間は、再発数、疾患の病期、及び他の因子を含めた予後因子に応じて、数カ月から数年の単位で測定することができる。生存の延長は、これらに限定することなく少なくとも１カ月（ｍｏ）、少なくとも約２ｍｏｓ、少なくとも約３ｍｏｓ、少なくとも約４ｍｏｓ、少なくとも約６ｍｏｓ、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年などの期間が挙げられる。全生存も、数カ月から数年の単位で測定することができる。或いは、有効な応答は、患者の症状に変化がないままであることであってよい。適応症の治療の別の指標は、以下でより詳細に記載されている。
【０３１３】
本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片の組成物は、非治療的作用剤として（例えば、親和性精製剤として）使用することができる。一般に、そのような実施形態の１つでは、対象のタンパク質を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）樹脂又は濾紙などの当技術分野で公知の従来の方法を使用して固相上に固定化する。固定化したタンパク質を、精製される対象の標的（又はその断片）を含有する試料と接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合している標的タンパク質を除く試料中の材料の実質的にすべてを除去する適切な溶媒で洗浄する。最終的に、支持体を、グリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの標的タンパク質を放出する別の適切な溶媒で洗浄する。組成物は、精製に加えて、線維症の治療のために使用することができる。
【０３１４】
本明細書で使用される用語「接触させること」は、化合物の溶液又は組成物と生物体に由来するポリペプチド、細胞、組織又は器官が入っている液体培地を加え合わせることを指す。或いは、「接触させること」は、化合物の溶液又は組成物を、生物体から得られた血液、血清、又は血漿などの液体と混ぜ合わせることを指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用に関して、組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの別の構成成分も含んでよい。ＤＭＳＯは、化合物の取込み又は化合物の溶解を容易にする。試験化合物を含む溶液を、細胞、組織又は器官が入っている培地に加えることができる、又は、ピペットベースのデバイス又はシリンジベースのデバイスなどの送達装置を利用することによって、血液などの別の液体と混合することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に関して、接触は、例えば、組成物を任意の適切な手段によって患者に投与することによって起こりうる；薬学的に許容される賦形剤及び担体を伴う組成物は、上でより詳細に記載されている。
【０３１５】
本出願の一実施形態による「対象」（例えば、哺乳動物、例えばヒト又は霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの非ヒト動物など）は、線維症の症状を示す哺乳動物である。ある特定の状況では、患者は無症候性でありうるが、それでも線維症の臨床的な顕在化を有する。抗体又はその抗原結合断片は、治療的部分とコンジュゲートすることができる、又は治療的部分を含有する融合タンパク質であってよい。例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号８５）などのアフィニティータグは、当技術分野で慣習的なものである。
【０３１６】
本明細書において提供される抗体又はその抗原結合断片は、治療的部分及び／又はアフィニティータグとコンジュゲート又は連結することができるものである。ポリペプチドをコンジュゲート又は連結するための方法は当技術分野で周知である。化合物と標識との間を結びつけること（結合させること）は、これらに限定されないが、共有結合性の相互作用及び非共有結合性の相互作用、化学的なコンジュゲーション並びに組換え技法を含めた、当技術分野で公知の任意の手段を含む。
【０３１７】
Ａ．エンドグリンの結合及び線維症
エンドグリン（ＣＤ１０５）は、細胞表面で１８０ｋＤａのホモ二量体膜貫通タンパク質として発現される。外部ドメインは、ＴＧＦ−β１アイソフォーム及びＴＧＦ−β−３アイソフォームに高い親和性（５０ｎＭ）で結合し、ＣＤ１０５の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、ベータグリカンと７１％の配列類似性を共有する。ヒトＣＤ１０５遺伝子は、９ｑ３４染色体に位置することが蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して同定され、コード領域は、１４個のエクソンを含有し、ＴＧＦ−βに結合する能力を持つＣＤ１０５の２つの異なるアイソフォーム（Ｌ及びＳ）が特徴付けられている。細胞質尾部に１４アミノ酸を有する６００アミノ酸残基からなるＳ−ＣＤ１０５とは対照的に、Ｌ−ＣＤ１０５は、細胞質尾部に４７アミノ酸残基を有する６３３アミノ酸残基からなる。しかし、Ｌ−ＣＤ１０５が優性型である。ＣＤ１０５は、内皮細胞において、主にセリン残基及びトレオニン残基で構成的にリン酸化されており、このリン酸化は、細胞内の構成的に活性なＴＧＦ−β  ＲＩＩによるものである。ヒトＣＤ１０５のアミノ酸配列は、細胞外ドメインの露出した領域に位置するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチドを含有する。ＲＧＤペプチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、Ｉ型コラーゲン、及びフィブリノーゲンなどのＥＣＭタンパク質において見出される重要な認識構造であり、細胞表面インテグリンによって認識される。
【０３１８】
ＣＤ１０５は、増殖している内皮細胞によって発現されるＴＧＦ−β受容体ファミリーのメンバーである。内皮細胞の増殖のために正常なレベルのＣＤ１０５が必要である。ＣＤ１０５の発現は、細胞低酸素症により、低酸素誘導因子−１−α（ＨＩＦ−１−α）が産生されことによって増加し、低酸素の細胞をアポトーシスから保護する。ＣＤ１０５のいくつかの機能は、ＴＧＦ−βシグナル伝達と関連する。ＴＧＦ−βは、セリンキナーゼ、受容体Ｉ型（ＲＩ）及び受容体ＩＩ型（ＲＩＩ）からなるヘテロ二量体受容体を通じてシグナル伝達する。ＴＧＦ−βが受容体の外部ドメインに結合することにより、ＴＧＦ−β  ＲＩをリン酸化する細胞質のＲＩＩキナーゼ活性が表に現れ、次いでそれがＳｍａｄタンパク質などの下流のシグナル伝達物質（ｓｉｇｎａｌｅｒ）と相互作用しうる。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体複合体の一部を形成するが、細胞表面に独立して存在する場合もある。内皮細胞において、エンドグリンおよびＲＩ及びＲＩＩ受容体へのＴＧＦ−βの結合はＳＭＡＤ  ２及び３細胞内タンパク質のリン酸化を介して細胞増殖を阻害する（Ｎｏｌａｎ−Ｓｔｅｖａｕｘ、２０１２）。したがって、ＣＤ１０５によりＴＧＦ−β  ＲＩとＴＧＦ−β  ＲＩＩが相互作用することによってＴＧＦ−βの機能が調節され、下流のＳｍａｄタンパク質のリン酸化が修飾される。
【０３１９】
ＣＤ  １０５はまた、アクチビンＡおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−１０、−９、−７及び−２などの他の成長因子に結合する。エンドグリン、ＢＭＰレセプターＩＩ  及びＡＬＫ１からなる複合へのＢＭＰ−９の結合は、血管へ内皮細胞の増殖に必要とされるＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化の過程に重要である（すなわち、血管新生のプロセス、［Ｎｏｌａｎ  −Ｓｔｅｖａｕｘ、２０１２］）。エンドグリンに結合し、血管新生を阻害する抗体は、ＢＭＰの結合を阻害する。エンドグリンのオーファンドメインに結合するＴＲＣ１０５は競争的にＢＭＰ結合を阻害し、ＳＭＡＤ  １／５／８リン酸化を阻害し、血管新生を阻害する。阻害しない抗体ＢＭＰ結合を阻害しない抗体は、初代内皮細胞において血管新生を阻害しない。
【０３２０】
ヒト及びマウスＣＤ  １０５の配列は同一ではない。ＴＲＣ１０５は、人間のエンドグリンに結合し、結合を競合的にヒトＢＭＰを阻害します。ＴＲＣ１０５はまた、マウスエンドグリンと結合する。しかし、ＴＲＣ１０５は、マウスエンドグリンとマウスＢＭＰの結合を妨げない。抗体Ｍ１０４３がマウスエンドグリンと特異的に結合し、競争力のあるマウスＢＭＰ結合を阻害する。Ｍ１０４３は、したがって、ヒトでのＴＲＣ１０５の期待される効果を模倣するマウスモデルで使用することができる。
【０３２１】
エンドグリンを精製するためのそれらの使用に加えて、これらのヒト化及び脱免疫化抗体は、検出及び診断的な目的並びに治療目的のために有用である。本明細書において提供される抗体は、種々の線維症の状態及び疾患を治療するための医薬品の製剤化、に使用することができる。
【０３２２】
エンドグリンの活性を調節し、エンドグリンに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が作製されている。これらのマウスモノクローナル抗体は、それらの各々が全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２８，６４１号；同第６，２００，５６６号；同第６，１９０，６６０号；及び同第７，０９７，８３６号において説明されている。加えて、これらの抗体のうちの多数について、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性も裏付けられている；エンドグリンに結合するモノクローナル抗体は、エンドグリンを調節する化合物として、対象の抗体となる。しかし、マウス抗体の投与は、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の形態における免疫原性を含め、多数の限界を有するので、マウス抗体の治療的使用は実施可能ではない。
【０３２３】
「線維症」は、損傷組織における創傷治癒過程の一部として起こり得る線維性組織の異常な蓄積を指すために本明細書中で使用される。このような組織の損傷は、物理的な損傷、炎症、感染、毒素への曝露、および他の原因から生じ得る。線維症の例としては、これらに限定されないが、皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、強皮症、及び糸球体硬化を含む。他の線維性状態および疾患は、以下でより詳細に議論される。
【０３２４】
用語「線維化抑制組成物」は、線維症媒介性プロセスを阻害する組成物を指す。
【０３２５】
線維芽細胞の分化は、これに限定しないが、強皮症、ケロイド瘢痕、関節リウマチ、狼瘡、腎性線維化皮膚障害、および特発性肺線維症を含む様々な線維性疾患に関連する。それらは、マウスにおける日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）感染後の線維性病変の形成における役割を果たしており、また、自己免疫疾患に関連する線維症に関与している。線維芽細胞はまた、放射線損傷、ライム病および肺線維症に関連した病原性線維症、ならびに膵炎及び間質線維症における間質の再構築に関与している一方、このような線維芽細胞の欠如は、膵臓腫瘍および腺癌に関連している。線維症はさらに喘息患者に起こり、並びに線維細胞が筋線維芽細胞へのさらなる分化を受ける場合、慢性閉塞性肺疾患のような他の肺疾患で起こり得る。線維症は、線維芽細胞の抑制のない増殖および分化に関与する。
【０３２６】
Ｃ．ヒト化及び脱免疫化アンチエンドグリン抗体による線維症の治療、抑制または改善
ＣＤ  １０５は、ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、ＢＭＰ受容体、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）およびアクチビン受容体を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーの複数キナーゼ受容体複合体のシグナル伝達を調節するために機能する。内皮細胞において、ＴＲＣ１０５は、ＢＭＰのヒトＣＤ  １０５への結合をブロックし、ＳＭＡＤ  １／５／８経路を遮断またはダウンレギュレートする。リン酸化ＳＭＡＤ  １／５／８が減少することにより、対立しないリン酸ＳＭＡＤ  ２／３シグナルが、ヒト内皮細胞における静止表現型を復元する。
【０３２７】
これらの観察から、本願発明者は、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害エンドグリンに対する抗体が、線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８シグナリングを中断し、線維化を抑制することが出来ると考察した。線維症の過程を促進するＢＭＰシグナル伝達の重要性は、Ｍ１０４３抗体を用いたマウスモデルにおいて実証することができた。ヒトの線維症の治療には、抗体を用いたるヒト化および脱免疫化抗体ＴＲＣ２０５（配列番号８９／配列番号９３；ＩｇＧ４）を使用し、ヒト線維芽細胞においてＳＭＡＤ  １／５／８シグナル伝達を遮断して、線維症を阻害することができた。
【０３２８】
本明細書では、明細書で記載する、疾患または障害に関連したエンドグリンに結合し、線維症を防止する（すなわち、線維症の予防、治療、改善、または重症度を軽減）ヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、線維化を処置、阻害または改善するための方法を提供する。
【０３２９】
本明細書では、明細書で記載する、エンドグリンに結合し、線維症を治療するヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、治療する線維症を処置、阻害または改善するための方法を提供する。
【０３３０】
本明細書では、エンドグリン受容体に結合し、ＢＭＰ９のエンドグリンへの結合を阻害する、明細書で記載するヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、治療する線維症を処置、阻害または改善するための方法を提供する。
【０３３１】
本明細書では、エンドグリン受容体に結合し、ＳＭＡＤ  １／５／８シグナルを阻害する、明細書で記載するヒト化および脱免疫化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与することを含む、治療する線維症を処置、阻害または改善するための方法を提供する。
【０３３２】
本明細書において、「改善」、「阻害」、「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）及び「治療すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）とは、例えば、症状の停滞、生存の延長、症状の部分的または完全な改善、および部分的または完全な線維症に関連する状態、疾患または障害の根絶を指す。
【０３３３】
一実施形態において、ヒト化および脱免疫化抗体で１回の以上の用量で処理した後、プラセボによる治療に比べて、または任意の治療を受けていない対象と比較して、線維症は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％阻害される。  
【０３３４】
別の実施形態において、ヒト化および脱免疫化抗体で１回の以上の用量で処理した後、プラセボによる治療に比べて、または任意の治療を受けていない対象と比較して、線維症の症状は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％で処理した後、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％）、約９５％）、または約１００％改善することができる。
【０３３５】
「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、線維症の１つ以上の症状の解決を指します。「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）はまた、被験体における線維症が進行しない、症状の停滞を指す。
【０３３６】
ヒト化および脱免疫化抗体で１回の以上の用量で処理した後、プラセボによる治療に比べて、または任意の治療を受けていない対象と比較して、線維症に関連する疼痛は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％低減することができる。  
【０３３７】
様々な線維性状態および疾患について患者を評価する他の手段は、以下に議論される。いくつかの例では、記載した試験は、治療の程度を決定するためにほどこされてもよい。医師は、治療の継続または中止、抗体の投与量を増加または減少させる、またはそれらの任意の組み合わせについて、テストの結果に基づいて決定してもよい。  
【０３３８】
組成物は、有効な治療有効量で、すなわちエンドグリンと関連づけることができる本明細書に記載の線維症を阻害することによっていくつかの所望の治療効果をもたらすために有効な治療有効量で、任意の医学的処置に適用可能な妥当なリスク対効果比で患者に投与することができる。本組成物をヒト対象に投与するために、組成物を当業者に公知の方法体系によって製剤化することができる。治療有効量は、器官又は組織において所望の治療効果又は予防効果を少なくとも部分的に実現する量である。疾患又は障害の予防及び／又は治療的な治療をもたらすために必要なヒト化及び脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の量は、それ自体は固定されていない。投与されるヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の量は、線維症の種類、線維症の広範さ及び線維症に罹患している哺乳動物のサイズに伴って変動してよい。一実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗エンドグリン抗体の２種以上を組み合わせて患者に投与する。組合せは、抗体に随伴して投与すること、又は抗体の後に投与することを含む。
【０３３９】
「投与すること」は、本明細書では、組成物を、結果として組成物が患者の体内に存在するように患者に提供する手段と定義される。そのような投与は、これらに限定することなく、皮下投与、硝子体内投与、皮内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与（例えば、注入）による局所的、局部的又は全身的な投与を含めた任意の経路によってよい。「同時発生的な投与」は、互いの投与から比較的短い期間内に投与することを意味する；そのような期間は、２週間未満、７日未満、１日未満であってよく、同時にさえ投与してよい。
【０３４０】
組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態について、患者に対して有毒になることなく所望の治療反応を実現するために有効なある量の活性成分を得るために変動してよい。選択された投薬レベルは、使用する特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び以前の病歴、同様に医学の分野で周知の因子を含めた種々の因子に左右される。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片は、様々な投薬量で、様々な時間枠にわたって対象に投与することができる。非限定的な用量は、患者あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、又はその間の任意の整数を含む。さらに、抗体又は抗原結合断片の用量（単数又は複数）は、週２回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、６週間ごと、８週間ごと、１２週間ごと、又はその中の週の任意の組合せで投与することができる。例えば、抗体又はその抗原結合断片を４週間にわたって、週１回又は週２回投与し、その後２週間は療法なし、などの投薬サイクルも考えられている。追加的な投薬サイクルとしては、例えば、本明細書に記載の用量及び週ごとのサイクルの異なる組合せも、本発明の範囲内で考えられている。
【０３４１】
「接触させること」は、本明細書では、本明細書において提供される組成物を、本明細書に記載の細胞、器官、組織又は体液に物理的に近接させる手段と定義される。接触させることは、本明細書において提供される組成物のいずれかを全身的に、又は局所的に投与することを包含し、これらに限定することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏでの手順及び方法を包含する。「混ぜ合わせること」及び「接触させること」は本明細書では互換的に使用され、同じように定義されるものとする。
【０３４２】
応答は、患者が疾病の徴候又は症状の部分的な又は完全な軽減、又は低下、及び詳細には、これに限定することなく、生存の延長を経験する場合に実現される。予測無増悪生存時間は、再発数、疾患の病期、及び他の因子を含めた予後因子に応じて数カ月から数年の単位で測定することができる。生存の延長としては、これらに限定することなく、少なくとも１カ月（ｍｏ）、少なくとも約２カ月（ｍｏｓ．）、少なくとも約３カ月（ｍｏｓ．）、少なくとも約４カ月（ｍｏｓ．）、少なくとも約６カ月（ｍｏｓ．）、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、又はそれ以上の時間が挙げられる。全生存も、数カ月から数年の単位で測定することができる。患者の症状は、変化がないままであってよい、又は減少してよい。
【０３４３】
当技術分野における通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な組成物の有効量（ＥＤ５０）を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、組成物中に使用する化合物の用量を、所望の治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始することができ、所望の効果が実現されるまで徐々に投与量を増加させることができる。或いは、用量を一定に保つことができる。
【０３４４】
組成物は、例えば上記のものなどの任意の都合のよい経路によって患者に投与することができる。選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で、及び／又は組成物で使用することができる本発明の化合物を、下記のように又は当業者に公知の他の従来の方法によって、許容できる剤形に製剤化する。
【０３４５】
抗体は、例えば、化学的なコンジュゲーション、共有結合若しくは非共有結合、又は下でより詳細に記載されているようなコンジュゲート若しくは融合タンパク質を創出するための組換え技法などの当技術分野で公知の方法を使用して、治療的部分と組み合わせることができる。或いは、抗体及び／又は他の作用剤は、組み合わせて、同時に又は逐次的に投与するための別々の組成物にすることができる。
【０３４６】
そのような成分の毒性及び治療効果を、細胞培養物又は実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、健康な細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって、副作用を低下させるために、そのような化合物を、患部組織の部位にターゲティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０３４７】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための様々な投与量の策定において使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどなく、又は毒性なく、ＥＤ５０を含む様々な循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用する任意の化合物について、最初に細胞培養アッセイから治療有効量を推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、最大半量の阻害が実現される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度アレンジが実現されるように策定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０３４８】
エンドグリン上のエピトープを認識  （例えば、それに結合）する抗体の独特の特異性が本明細書に記載のような線維症のための治療的使用を提供する。
【０３４９】
別の態様において、方法は、被験体に本明細書に記載の抗エンドグリン抗体の有効量を投与することを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験体において線維症を阻害、治療、または改善するための方法が提供される。  
【０３５０】
肝臓（肝）線維症  
肝臓の線維症は、多くの肝疾患の病理に関与している。先に述べたように、線維症は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール依存症、住血吸虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞、毒素への曝露、および代謝障害の合併症として起こる。肝線維症は、検査を受けないでいると、肝硬変（封入された結節の存在により定義される）、肝不全、および死へと進行する。  
【０３５１】
肝臓（肝）線維症は、例えば、慢性肝傷害に対する創傷治癒反応の一部として生じる。線維症は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール依存症、住血吸虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞、毒素への曝露、および代謝性疾患の合併症として起こる。この瘢痕組織の形成は、損傷した組織をカプセル化する身体の試みを表すと考えられている。肝線維症は、正常な肝臓におけるものと定性的に区別することができる細胞外マトリックスの蓄積によって特徴付けられる。肝線維症は、検査を受けないでいると、肝硬変（封入された結節の存在により定義される）、肝不全、および死へと進行する。
【０３５２】
肝線維症は、限定されないが、硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変）、および慢性ウイルス性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、原発性硬化性胆管炎、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病のような関連状態、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、住血吸虫症並びに自己免疫性肝炎を含む。  
【０３５３】
寄生虫およびウイルス感染（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、住血吸虫症）、またはアルコール消費からの長期のストレスのような原因からの肝臓への慢性傷害は、典型的には、おそらく損傷領域をカプセル化し、損傷から残りの肝臓組織を保護するために、肝臓のリモデリングをもたらす。（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  １４：６１８−６３３，  １９９９）。肝線維症は、総コラーゲン含有量の３−１０倍の増加と高密度マトリックスによる低密度基底膜の置換を含む細胞外マトリックスの変化をもたらし、肝細胞、肝星状細胞および内皮細胞の代謝および合成機能を損なう。（Ｇｉｒｏｇｅｓｃｕ，  Ｍ．，  Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．，  １５（２）：１４９−１５９（２００６））。
【０３５４】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、共通の、しばしば「サイレントな」肝疾患である。これは、アルコール性肝疾患に似ているが、ほとんど、あるいは全くアルコールを飲まない人に起こる。ＮＡＳＨの主要な特徴は、炎症や損傷とともに、肝臓脂肪である。ＮＡＳＨを有する多くの人は健康だと感じており、彼らは肝臓に問題があることを認識しない。それにもかかわらず、ＮＡＳＨは深刻で、肝臓が恒久的に損傷を受け、もはや正常に動作することができない肝硬変につながりうる。
【０３５５】
ＮＡＳＨの治療、阻害または改善のために本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当該技術分野で認識される試験、例えばそれらは実施例１１に記載されている、を用いて評価することができる。
【０３５６】
肝硬変の治療、阻害または改善のために本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、例えば、超音波エラストグラフィ技術、腹部ＣＴスキャン、肝臓／胆管ＭＲＩ（ＭＲＣＰ）、肝炎ウイルスのための血清学的試験、自己抗体の検査、及び内視鏡（胃）を含む、当該技術分野で認識される試験を用いて評価することができる。肝硬変の重症度は、ビリルビン、アルブミン、ＩＮＲ、存在および腹水の重症度、及び脳症を使用するチャイルド・ピュースコアで分類でき、患者をクラスＡ、Ｂ又はＣに分類する。クラスＡは良好な予後を有するが、一方クラスＣは、死亡の危険性が高い。末期肝疾患（ＭＥＬＤ）スコアと小児末期肝疾患（ＰＥＬＤ）のスコアのためのモデルも肝硬変の重症度の等級付けに使用することができる。
【０３５７】
本明細書に記載の組成物は、従って本明細書に記載されているような線維性肝疾患を阻害、治療又は改善するのに有用である。  
【０３５８】
腎線維症  
肝線維症と同様に、腎線維症は、腎臓への種々の疾患および傷害に起因し得る。そのような疾患および傷害の例としては、慢性腎臓病、メタボリック症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、（糖尿病性腎症を含む）糖尿病、限定されないが巣状分節性糸球体硬化症および膜性腎症を含む糸球体腎炎（ＧＮ）ならびに膜性増殖性ＧＮを含む。
【０３５９】
代謝症候群は、インスリン抵抗性のような糖尿病の顕著な特徴、ならびに中枢または内臓肥満及び高血圧を含む一群の異常であると認識されるようになっている。ほぼすべての場合において、グルコースの調節不全が、サイトカイン放出の刺激と細胞外マトリックスの沈着の増加という結果をもたらす。慢性腎臓病、糖尿病、メタボリックシンドローム、および糸球体腎炎に寄与する他の要因には、高脂血症、高血圧、蛋白尿が含まれ、これらのすべてが腎臓へのさらなる損傷をもたらし、さらに、細胞外マトリックスの沈着を刺激する。したがって、要因にかかわらず、腎臓への傷害は、腎線維症および腎機能の同時喪失をもたらし得る（Ｓｃｈｅｎａ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｇｅｓｕａｌｄｏ，  Ｌ．，  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，  １６：  Ｓ３０−３３  （２００５）；  Ｗｈａｌｅｙ−Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｏｗｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈｙｐｅｒｔ．，  ８（８）：５４６−４８（２００６））。本明細書に記載の組成物は、従って線維性腎疾患（慢性腎疾患、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、メタボリックシンドローム）の予防、治療及び／又は改善に有用であり、そのような使用は、本明細書で企図される。
【０３６０】
腎線維症は、限定されないが、糖尿病性腎症、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糸球体腎炎又は糸球体腎炎（ＧＮ）、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、または膜性増殖性  ＧＮを含む。  
【０３６１】
糖尿病性腎症などの阻害、治療または改善のための、本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当技術分野において認識されている試験、例えば、尿中アルブミンの測定を用いて評価することができる。  
正常アルブミン尿は、尿中アルブミン排泄量  ＜３０ｍｇ／２４時間を指し、それは生理的状態である。微量アルブミン尿は、３０〜２９９ｍｇ／  ２４時間の範囲内の尿中アルブミン排泄量を指す。臨床（明白な）アルブミン尿は、尿中アルブミン排泄  ＞３００ｍｇ／２４時間を意味する。
【０３６２】
結果として生じる糸球体腎炎（ＧＮ）の治療、阻害または改善のための本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当技術分野で認識される試験、例えば、尿中タンパク質が増加し、血液中の脂肪の増加と、血液中のタンパク質を減少を伴う対象における浮腫を監視することを用いて評価することができる。尿中のタンパク質の濃度及び血液や高脂血症の浸透圧は、治療を評価するために監視することができる。
【０３６３】
膀胱尿管逆流の治療、阻害または改善のための本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当技術分野で認識される試験、例えば、核種膀胱造影（ＲＮＣ）、透視排尿膀胱尿道造影（ＶＣＵＧ）、超音波膀胱造影；及び超音波を用いて評価することができる。
【０３６４】
尿細管間質性腎線維症の治療、阻害または改善のための本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当技術分野で認識される試験、例えば、高カリウム血症、代謝性アシドーシス、および腎不全を評価するための試験を用いて評価することができる。血液を収集し、患者の約２３％が好酸球増加症を有するとして好酸球増加症について試験することができる。尿サンプルも好酸球尿症、等張尿、血尿、滅菌膿尿そして、ネフローゼ域蛋白尿について評価することができる。
【０３６５】
本明細書に記載の組成物は、従って本明細書に記載されているような線維性腎疾患の阻害、治療又は改善するのに有用である。  
【０３６６】
肺線維症  
肺線維症は、例えば、深刻な呼吸困難をもたらす傷が肺組織に形成された呼吸器疾患を指す。瘢痕形成および過剰な線維性結合組織の蓄積は、壁の肥厚をもたらし、血液中の低酸素の供給を引き起す。例示的な疾患としては、これに限定されないが、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性間質性肺炎、急性呼吸器窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む。肺線維症は、これに限定されないが、特発線維性肺胞炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性喘息、およびびまん性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）を含む。
【０３６７】
既知および特発性起源の慢性肺線維症は、治療の選択肢は限られた有効性または毒性を示し、数多の臨床的課題を提しており  （Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１１０：２７８−２８２（２００１）；  Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１４９：Ａ８７８  （１９９４））、診断の後の平均生存率はほとんど変わらない（Ｒｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒｏｃ．，７３：１０８５−１１０１（１９９８）；Ｌａｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１０８  Ｓｕｐｐｌ  ４：７５１−７６２（２０００））。既知の線維化の刺激は、放射線、吸入鉱物及び有機粒子、ガス状酸化剤、医薬品および感染性生物を含む、一方特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の臨床病理学的状態を促進する病因の同定については議論が残っている。ＩＩＰは多数の特徴を共有し、末梢肺実質を含む様々な疾患の多様な群であるが、十分に別の疾患としての指定を正当化するのに十分に異なると感じされる（Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｐａｔｈ．，  ２４：１９−３３  （２０００））。その病因は不明のままであるが、肺損傷（または複数の外傷）と続いての損傷の治癒に中心があると考えられている。線維芽細胞の病巣、活発に増殖した線維芽細胞の小さな凝集体は、傷害の前に病巣の組織を表すと考えられ、線維化の活性化され、進行中であることを示している。
【０３６８】
慢性炎症過程（サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫症）、感染、環境因子（アスベスト、シリカ、特定のガスへの曝露）、電離放射線への曝露（放射線胸の腫瘍を治療するための治療）、慢性疾患（狼瘡、関節リウマチ）、さらには特定の薬剤などを含む多くの条件によって引き起こされる肺全体の瘢痕から、慢性肺線維症は生じる。過敏性肺炎として知られている状態では、肺の線維症は、有機ダストまたは産業化学物質を吸入に対する、高められた免疫反応に続いてが起こる。この状態は、ほとんどの場合、細菌、真菌、または動物製品で汚染された粉塵の吸入に起因する。
【０３６９】
本明細書に記載の組成物は、従って本明細書に記載するような線維性肺疾患の治療、阻害、又は改善に有用である。  
【０３７０】
本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、当技術分野で認識される試験、例えば、スパイロメトリーを用いて評価することができる。修正英国医学研究評議会のアンケート（ｍＭＲＣ）またはＣＯＰＤアセスメントテスト（ＣＡＴ）は、症状の重症度を決定するために使用することができるアンケート（ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）である。ＣＡＴのスコアが、０−４０から高いスコアに及ぶ場合、より重篤な疾患である。スパイロメトリーは、気流制限の重症度を判断するために役立ちうる。これは通常、人の年齢、性別、身長と体重の予測「通常」のパーセンテージで表されるＦＥＶ１や肺活量（ＦＶＣ）に基づいている。アメリカやヨーロッパのガイドラインはどちらも、部分的にＦＥＶ１の治療勧告を基づくことを推奨していた。ＧＯＬＤガイドラインは、症状の評価と気流制限に基づいて、４つのカテゴリーに人々分割することを示唆しています。体重減少及び筋力低下、ならびに他の疾患の存在は、また評価することができる。
【０３７１】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）の症状の認識および監視は、本明細書に記載の組成物の有効性を決定するために使用することができる。胸部Ｘ線は、処理の様々な段階で利用されてもよい。
【０３７２】
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する対象には、動脈血ガス分析および胸部Ｘ線を監視のために使用することができる。
【０３７３】
心臓線維症  
心臓線維症は、これに限定されないが、うっ血性心不全、保存駆出率を有する心不全、心筋症、心機能における心筋梗塞後の欠陥；アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；緑内障；加齢黄斑変性症（ウェットＡＭＤおよび乾燥ＡＭＤ）；肺気腫、多発性硬化症を含み；  慢性喘息もまた、本明細書に記載の組成物を用いて予防、治療、または改善することができる。病的な心臓状態又は疾患は、高血圧症、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、または再狭窄であってもよい。
【０３７４】
心臓線維症の治療、抑制または改善のための、本明細書に記載の組成物の投与の有効性は、以下の１つ以上を用いて評価することができる：対象における心拍出量を測定；被験体における脳卒中の容積を測定；対象の平均収縮期吐出量を測定；被験者における収縮期血圧を測定；対象の左室駆出率を測定；被験体における脳卒中の指標を決定するステップ；被験体における心係数を決定；被験体における左心室のパーセント短縮率を測定；対象における短縮周繊維の平均速度を測定；被験体における左心室流入速度パターンを測定；被験体における肺静脈の流速パターンを測；および／または対象の僧帽弁輪のピーク拡張早期の速度を測定。
【０３７５】
本明細書に記載の試験組成物のための典型的な実験動物モデルは、圧負荷誘発性肥大、イソプロテレノール誘発性心肥大モデル、運動誘発性心肥大モデル、高塩食誘導性心肥大モデル、およびホルモン誘発心肥大モデルを含むが、これらに限定されない。
【０３７６】
本明細書に記載の組成物は、従って本明細書に記載するような心腎臓疾患を治療、阻害、又は改善するのに有用である。  
【０３７７】
皮膚傷やケロイド形成  
皮膚瘢痕及びケロイド形成は、過剰なコラーゲン沈着及び／又はコラーゲン沈着の調節不全を伴うことが知られている。傷ついた皮膚組織の正常な線維芽細胞リモデリングからのこの逸脱が厚くて見苦しい瘢痕化につながりうる。ケロイドは、部分的には、調節不全の創傷治癒とその後の高いコラーゲン沈着の結果であることが知られている。ケロイドは、正常な創傷治癒で見られる傷とは異なり、消えないかしないか、時間をかけて退行する。ケロイドは、一般的に良性の皮膚腫瘍であるが、彼らは見苦しいであり、より問題のある皮膚の変形および／または病変に蓄積しうる（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４９（５）：１４４１−１４４７（１９９６））。皮膚のコラーゲンの蓄積はまた、強皮症（線維芽細胞による皮膚組織におけるコラーゲンの過剰産生または調節不全が共通の要素である皮膚組織の肥厚や硬化の多数の条件のための一般的な用語）に関与している（Ａｋａｇｉ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１３：２４６−２５０（１９９９））。
【０３７８】
本明細書に記載の組成物は、従って、皮膚の傷跡やケロイドの形成治療、阻害、又は改善するのに有用である。
【０３７９】
併用療法
線維症を治療するために抗エンドグリン抗体が有効でありうることが理解されると思われ、本明細書では、対象を、１又は複数の追加的な線維症阻害剤を用いて治療することもできることが考えられている。
【０３８０】
用語「線維阻害剤」または「抗線維症剤」は、明細書および特許請求の範囲において、これに限定されないが、市販の阻害剤を含む化合物または分子を意味するように、本明細書で使用される。一実施形態では、1つ以上の追加の抗線維化薬または抗線維化治療は、これらに限定されないが、根本的な原因（例えば、毒素または感染性物質）の除去、炎症の抑制（例えば、コルチコステロイドなどプレドニゾン、IL-1受容体アンタゴニスト、または他の薬剤を使用して）、例えば、ガンマインターフェロンまたは抗酸化剤を用いた星状細胞活性化の下方制御、マトリックス分解の促進、または星状細胞のアポトーシスの促進を含む。
【０３８１】
Ｖ．パッケージ及びキット
さらに追加の実施形態では、本出願は、上記の化合物を用いる使用のためのキットに関する。エンドグリンに結合するヒト化及び脱免疫化抗体又は抗原結合断片をキットで提供することが可能である。キットは、任意に、1つ以上の抗線維性試薬を含むことができる。したがって、前記キットは、適切な容器手段で、エンドグリンに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を含むことになる。前記キットは、適切な容器手段でエンドグリンに結合する抗体又はその抗原結合断片を含みうる。
【０３８２】
前記キットの容器手段は、少なくとも１つの試薬を入れる、及び／又は好ましくは適切にアリコットすることが可能な少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器及び／又は他の容器手段を一般に含むことになる。前記キットは、市販用に密封された任意の試薬容器を含有するための手段を含むことが可能である。そのような容器は、注射及び／又は所望のバイアルが保持されるブロー成形プラスチック容器を含みうる。キットは、前記キット中の材料の使用のための印刷物も含むことが可能である。
【０３８３】
パッケージ及びキットは、さらに緩衝剤、保存剤及び／又は安定化剤を医薬製剤中に含むことが可能である。前記キットの各成分は個々の容器内に封入されることが可能であり、様々な容器のすべてが単一パッケージ内に存在することが可能である。発明キットは冷温貯蔵又は室温貯蔵用に設計することが可能である。
【０３８４】
さらに、前記調製物はキットの有効期間を増加させ、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む安定化剤を含有することが可能である。組成物が凍結乾燥される場合は、キットは凍結乾燥調製物を再構成するための溶液の調製物をさらに含有することが可能である。許容可能な再構成溶液は当技術分野では周知であり、例えば、薬学的に許容されるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
【０３８５】
パッケージ及びキットは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイのための１又は複数の成分をさらに含むことが可能である。本出願において試験される試料には、例えば、血液、血漿及び新鮮な又は凍結した組織切片（たとえば、肺、肝臓、腎臓、心臓など）    並びに分泌物、尿、リンパ液及びその生成物が含まれる。パッケージ及びキットは、試料を収集するための１又は複数の成分（例えば、注射器、カップ、スワブ等）をさらに含むことが可能である。
【０３８６】
パッケージ及びキットは、例えば、製品説明、投与様式及び／又は治療の指示を明記するラベルをさらに含むことが可能である。本明細書に提供されるパッケージは、本明細書に記載される組成物のうちのいずれでも含むことが可能である。前記パッケージは、線維症を治療するためのラベルをさらに含むことが可能である。
【０３８７】
用語「包装材料」とは、キットの成分を収納する物理的構造体のことである。包装材料は成分を無菌で維持することが可能であり、そのような目的に一般に使用されている材料（例えば、紙、段ボール線維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル等）で作製することが可能である。ラベル又は添付文書は適切に書かれた使用説明書を含むことが可能である。したがって、キットは、本発明のいかなる方法においてもキット成分を使用するためのラベル又は使用説明書をさらに含むことが可能である。キットは、パックされた又はディスペンサー内の化合物を、本明細書に記載される方法で前記化合物を投与するための使用説明書と一緒に含むことが可能である。
【０３８８】
使用説明書は、治療法を含む本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実行するための指示書を含むことが可能である。使用説明書は、十分な臨床エンドポイント又は起こりうるどんな有害な症状も又はヒト対象に使用するための食品医薬品局などの規制当局により要求される追加の情報の表示をさらに含むことが可能である。
【０３８９】
前記使用説明書は、「印刷物」上、例えば、キット内の若しくはキットに添付された紙若しくは厚紙上に、或いはキット若しくは包装材料に添付された、又はキットの成分を含有するバイアル若しくはチューブに貼り付けられたラベル上にあってもよい。使用説明書は、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、固体メモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスのような、コンピュータ可読媒体に含まれていてもよい。いくつかのケースでは、プログラムおよび使用説明書は、永久的であり、実質的に永久的、半永久的、または非一時凌ぎに媒体上に符号化された。
【０３９０】
本出願の化合物及び方法の実施形態は、説明的であることを目的とし限定するものではない。当業者であれば、上記教唆、特に記載された改変物を取り囲むエンドグリンに結合する抗体又は抗原結合断片の改変に関連する可能性がある教唆に照らして、エンドグリンの結合に関して天然に近い機能性を維持しつつ改変及び変動を加えることができる。したがって、記載されていることの範囲内にある開示された特定の実施形態において変化を加えうることは理解されるべきである。
【実施例】
【０３９１】
本出願は以下の非限定的実施例を参照することによりさらによく理解されうるものであり、これら実施例は本出願の例となる実施形態として提供されている。以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに完全に説明するために提供されるものであるが、決して本出願の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３９２】
（例１）
抗ＣＤ１０５ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体の作製及び結合
抗体の構築、発現及び精製
変性され、ライゲートされ、ＰＣＲ増幅されて完全長合成Ｖ領域を与える一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して、ヒト化／脱免疫化ＶＨ及びＶＫ領域遺伝子はすべて合成された。次に、組み立てられたバリアントは、ＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖のためのＡｎｔｉｔｏｐｅ社製ｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローニングされた。
【０３９３】
ヒト化／脱免疫化重及び軽鎖の組合せ（すなわち、計２４対合）すべてが、エレクトロポレーションを介してＮＳ０細胞に安定的にトランスフェクトされ、２００ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４０７）を使用して選択された。構築物ごとのメトトレキサート耐性コロニーは、ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡを使用してＩｇＧ発現レベルについて試験された。最もよく発現している系統が選択され、液体窒素下で凍結された。成功したトランスフェクション及びクローン選択はすべてのバリアントについて達成され、飽和静置培養物中のヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体バリアントの発現レベルは表１に示されている。
【０３９４】
したがって、２４のＩｇＧ１バリアントは、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１００３４−９３）上でＮＳ０細胞培養上清から精製され、予想されるアミノ酸配列に基づいて、消衰係数、Ｅｃ（０．１％）＝１．６２を使用してＯＤ２８０ｎｍにより定量された。約５００μｇの各抗体バリアントが精製され、主なバリアントは還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。手短に言えば、クーマシーブルーが主な抗体バリアントの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを染色した。１μｇの各試料はＮｕＰａｇｅ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上に充填され２００Ｖで３０分間流された。マーカーはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ（カタログ番号１６１−０７３）であった。予想されるサイズの重及び軽鎖に対応するバンドが観察され、どのレーンでもどんな汚染の証拠もなかった（データは示されていない）。
【０３９５】
ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡを使用して、ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体のエンドグリンへの結合をアッセイした。手短に言えば、ＥＬＩＳＡは、以下のステップに従って実施された。
１．Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ中１５００ｎｇ／ｍｌのＭＡＢ９８１１−０１（ポリクローナル抗エンドグリン抗体）を用いて１００μｌ／ウェルで被膜する。プレートをシール材で覆い、４℃で一晩（１６〜２４時間）インキュベートする。
２．プレートを２００μｌのＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎなし）で２回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェルのＢＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡ）を添加し、室温で６０分間インキュベートする。
４．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄する。
５．０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９７−ＥＮ）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で６０分インキュベートする。
６．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを３回洗浄する。
７．試験ウェルでは、２０、１０、４、２、１、０．５及び０．２ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中に希釈される）の抗エンドグリン抗体を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で６０分インキュベートする。陰性対照ウェルでは、アイソタイプ適合対照抗体を１００μｌ／ウェルで添加する。
８．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを３回洗浄する。
９．０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中１対１００００に希釈されたＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧを１００μｌ／ウェルですべてのウェルに添加し、室温で３０〜６０分インキュベートする。
１０．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを５回洗浄する。
１１．ＴＭＢ基質溶液の１００μｌ／ウェルを添加し、暗所で１５分間覆いなしでインキュベートする。
１２．ＴＭＢ停止溶液の１００μｌ／ウェルを添加することにより反応を停止する。
【０３９６】
試料は３通り流され、光学密度を読み取って標準曲線を構築し結合定数を決定する。統計的解析は、スチューデントｔ−検定又は他の標準検定を使用して行われる。
【０３９７】
競合ＥＬＩＳＡ
抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化キメラ抗ＣＤ１０５に対するＣＤ１０５への結合について試験された。手短に言えば、キメラ抗ＣＤ１０５は、製造業者の使用説明書に従ってマイクロビオチン化キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＢＴＡＧ−１ＫＴ）を使用してビオチン化された。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底マイクロタイタープレートは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１．５μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ１０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８１１−０１）を用いて４℃で一晩被膜された。次の日、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中１００ｎｇ／ｍｌヒトＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９７−ＥＮ）は、前被膜されたプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。変化する濃度のヒト化／脱免疫化抗ＣＤ１０５抗体のいずれか（３倍希釈液中４μｇ／ｍＬから０．００１８μｇ／ｍＬ）は、固定された濃度のビオチン化キメラ抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合され、プレートに添加された。ビオチン化キメラ抗体の結合は、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ５５１２）及びＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）を介して検出された。ＯＤ４５０ｎｍ値は、Ｄｙｎｅｒ  ＭＲＸ  ＴＣＩＩプレート読取り機上で測定された。競合解析の結果は図６に図示されている。曲線は、対数試料濃度に対するそれぞれの吸光度プロットの直線部分を通してフィットされ、前記直線の方程式を使用して、ビオチン化キメラ抗体のＣＤ１０５への結合を５０％阻害するのに必要なヒト化又はヒト化／脱免疫化抗体の濃度（ＩＣ５０）を計算した。実験内及び実験間の比較を可能にするために、ヒト化又はヒト化／脱免疫化バリアントのＩＣ５０値は、倍差の値を与えるために各プレート上に含まれた基準抗体に対して正規化された。ＩＣ５０値はキメラ抗ＣＤ１０５に相対的であり３つの実験を代表している。要約ＥＬＩＳＡデータは米国特許８２２１７５３号の表１に示されており、飽和静置培養においてアッセイされた抗体発現レベル（μｇ／ｍｌ）を含む。
【０３９８】
米国特許８２２１７５３号の表１はヒト化及びヒト化脱免疫化抗体バリアントの特徴を示した。ＩＣ５０価はキメラ抗エンドグリン抗体に相対的であり３つの実験を代表している。抗体発現レベル（μｇ／ｍｌ）は飽和静置培養においてアッセイされた。脱免疫化のレベルは、エピトープにおける変異の位置に基づいて任意目盛により表されている。従って、本願発明者らは、ヒト化および脱免疫抗エンドグリン抗体の調製に成功したことを証明している。
【０３９９】
（例２）
ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体結合のＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴：ＳＰＲ）解析
抗体のアフィニティーは、例えば、標準プロトコールを使用するＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して評価することが可能である。手短に言えば、プロテインＡはＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップに化学的にカップリングされ、約２０００ＲＵに対応する量のプロテインＡが固定化される。その後のステップは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ、ｐＨ＝７．４のランニング緩衝液において２５℃で１０Ｈｚデータ収集速度を使用して実施される。抗エンドグリン抗体（１０ｎＭ）は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上の固定化されたプロテインＡにより１０μＬ／分の流速で捕捉され、典型的には、２０、４０及び８０秒の捕捉時間で、それぞれ１３０ＲＵ、３３０ＲＵ及び５７０ＲＵに相当する抗体密度の捕捉が可能になる。起動サイクルは、流速４０μＬ／分、接触時間９０秒及び解離時間９０秒でランニング緩衝液を使用して実施される。試料サイクルは、０から４０ｎＭの範囲の濃度で組換えエンドグリンを使用して実施される。エンドグリンは、流速４０μＬ／分、接触時間５２５秒及び解離時間２５００秒で捕捉された抗体を含有するＢＩＡｃｏｒｅチップ全体を通される。８試料サイクルは、典型的には各抗体捕捉密度で実施される。前記チップの再生は、１０ｍＭグリシン  ｐＨ＝１．７を使用して実現される。データ解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ１．１を使用して実施される。捕捉抗体密度が異なるＢＩＡｃｏｒｅチップを使用して生じるシグナルは比較され、組換えエンドグリン非存在下で生じるデータを使用してアッセイ内ブランクシグナルについて調整する。データのフィッティングでは、Ｒｍａｘは、各サイクルにおける各抗体の捕捉レベルの変動を説明するために浮遊させる。各捕捉密度からのデータは、各抗体の解析中に同時にフィットさせる。ＢＩＡｃｏｒｅデータは、Ｋａ（１／Ｍｓ）、Ｋｄ（１／ｓ）、ＫＤ（Ｍ）及びＣｈｉ２（ＲＵ２）を含むキメラ、ヒト化及び脱免疫化抗エンドグリン抗体について表２に示されている。
【表２】
2017537084.tif 000004
【０４００】
（例３）
エンドグリン発現細胞上の利用可能なエピトープの抗体結合活性及び数
エンドグリン発現細胞上の利用可能なエピトープの抗体結合活性及び数は、標準プロトコールを使用するＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析を利用して評価することが可能である。
【０４０１】
手短に言えば、放射性標識されたヒト化抗エンドグリン抗体の、エンドグリン発現ＫＭ−３白血病細胞及びサブコンフルエント増殖ＨＵＶＥＣへの直接結合のＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析が実施される。精製された抗エンドグリン抗体は、Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎを使用し当業者には公知の標準法に従って１２５Ｉで個々に放射標識される。放射標識されたヒト化抗エンドグリン抗体は、ＩｇＧ分子あたりのヨウ素原子の平均数についてアッセイされる。一定量（０．１μｇ）の各１２５Ｉ標識ｍＡｂ及びエンドグリン発現ＨＵＶＥＣ細胞の２倍連続増加を使用して滴定実験は実施されて、抗原結合活性を決定する。結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄプロットの解析は、公知の方法に従って実施される。ｍＡｂ結合細胞の平衡定数及び平均最大数はこの解析により推定される。
【０４０２】
（例４）
ヒト化抗エンドグリン抗体におけるＴ細胞エピトープの同定
ヒト化可変領域の配列が、ｉＴｏｐｅ（商標）解析により試験された。ヒト化可変領域配列は重複する９〜１５ｍｅｒペプチドに分割された。可変領域配列は、コンピュータ分析によるＭＨＣクラスＩＩに対するペプチドのアフィニティーを決定するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析ツールであるｉＴｏｐｅ（商標）を使用してヒトＭＨＣクラスＩＩ（潜在的Ｔ細胞エピトープ）への乱雑な高アフィニティー結合について解析された。ｉＴｏｐｅ（商標）解析からの潜在的Ｔ細胞エピトープの頻度が最も低い配列は、ヒト化抗体の作製のためのリードとして同定される。選択されたヒト化可変領域配列は、潜在的Ｔ細胞エピトープを取り除くために変異の包含を通じて再設計されうる。変異は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減少する又は除去するためにｉＴｏｐｅ（商標）を使用して設計される。代わりに、生殖系列ヒト配列は、潜在的Ｔ細胞エピトープの部位で置換することが可能であり、又は代わりの配列が置換されうる。
【０４０３】
参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許２２１７５３号の図１９〜２３は、本願の図３Ｂに記述される軽鎖ＨｕＶＫ＿ｖ０と重鎖ＨｕＶＨ＿ｖ０を含有するヒト化抗エンドグリン抗体について９ｍｅｒペプチドの予想される結合を表している。
【０４０４】
（例５）
抗ＣＤ１０５ヒト化／脱免疫化抗体の設計
本例は、減少した免疫原性を示すヒトＣＤ１０５を標的にする治療モノクローナルヒト化脱免疫化抗体の設計を説明する。
【０４０５】
ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して同定された乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合配列（データ見せず）は、ペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合を減少する又は除去すると考えられるキーとなるＭＨＣクラスＩＩポケット位置でのアミノ酸置換を同定するためにｉＴｏｐｅ（商標）によりさらに解析された。すべての配列がＣＤＲに重なっていたために、変化（潜在的抗原接触残基）のＣＤＲ位置並びに元の及び置換アミノ酸の物理化学的特徴も検討された。ＴＣＲ接触並びにペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ−ＴＣＲ相互作用の安定化に関与する主要結合グルーブの外側の残基も置換について検討された。
【０４０６】
ＶＨＶ１では、完全にＣＤＲ内部にあり残基５１で開始する９−ｍｅｒペプチドは、乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとして同定された。ＭＨＣクラスＩＩ結合の除去の最も成功した方法は、疎水性側鎖を除去する又は親水性側鎖で置換するとＭＨＣクラスＩＩ結合が取り除かれる９−ｍｅｒの最初のアミノ酸（ポケット１又はｐ１位）を標的にすることである。しかし、この種の根本的なアミノ酸置換は抗体アフィニティーを保持するのに必ずしも成功しないことがあり、したがって、二次ポケット位置（ｐ４、ｐ６、ｐ７又はｐ９）も、単独で又は組み合わせて評価された。ｉＴｏｐｅ（商標）解析により、Ｋ５２ｂをＱ又はＲに変えることによりこのペプチドのｐ４位を標的にすると、ＭＨＣクラスＩＩ結合が著しく減少すると予想され、ｐ１でＩ５１をＡで置き換えると結合を完全に取り除くと予想されることが明らかになった（米国特許２２１７５３号の表５参照）。
【０４０７】
抗体／抗原複合体の結晶構造は、Ｉ５１は抗原とまれに接触しうるが、この位置でのＩからＡへの根本的変化（ｐ１アンカー位を破壊するための置換）はＣＤＲの全体的立体構造に影響を与える可能性があることを示唆している。したがって、この残基が溶媒曝露であり抗原と接触しないことがあるために、Ｋ５２ｂ（ｐ４アンカー位）での比較的保存された変化も含まれた。最後に、ＣＤＲの外側にある追加の変異も、ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ／ＴＣＲ相互作用に対する不安定化効果を評価するために設計された（Ｇ４９からＡ又はＳ）。米国特許２２１７５３号公報の    表６は、構築されたヒト化及びヒト化／脱免疫化バリアントＶＨ領域を収載している。対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列の配列番号は、構築物の隣に示されている。
【０４０８】
２つの乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドがＶＫＶ２及びＶＫＶ１において同定された。第一のＶ１９にｐ１アンカーを有するペプチドはＣＤＲ１に部分的に重なっており、第二のＩ４８にｐ１アンカーを有するペプチドはＣＤＲ２に重なっている。両ｐ１アンカーはＣＤＲの外側にあり、Ａへの変異によって標的にされており、この変異はＭＨＣクラスＩＩ結合を完全に取り除きうる（表７）。しかし、これらの残基は両方ともＣＤＲ１及び２の立体構造の維持に関与している可能性があり、したがって、ＭＨＣクラスＩＩ結合を著しく減少させる追加の変異が設計された（表７）。どちらの場合も、ｐ４残基は、ＴのＳへの変異により標的にされた。Ｔ２２ＳもＣＤＲの外側にあり、Ｖ１９ＡよりもＣＤＲ立体構造に影響を与える可能性は少ない。Ｔ５１はＣＤＲ２の内側にあるが、抗原と複合体化している抗体の結晶構造からの証拠によれば、この残基は抗原とはめったに接触しないことが示唆される。米国特許２２１７５３号公報の表６は、構築されたヒト化及びヒト化／脱免疫化ＶＫ領域を収載している。
【０４０９】
（例６）
この例は、Ｔ細胞エピトープを求めて抗エンドグリン抗体をスクリーニングする方法を説明している。ＭＨＣ、ポリペプチド及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性に構造基盤を与える。Ｔ細胞増殖アッセイは、抗体からプロセッシングされるポリペプチドのＭＨＣへの結合及びＴＣＲによるＭＨＣ／ポリペプチド複合体の認識を試験する。本例のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖アッセイでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞を含有する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激する。刺激は、無傷の抗エンドグリン抗体を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。刺激されたＴ細胞増殖は３Ｈチミジン（３Ｈ−Ｔｈｙ）を使用して測定され、取り込まれた３Ｈチミジンの存在は洗浄され固定された細胞のシンチレーション測定を使用して評価される。
【０４１０】
ヒト化及びヒト化／脱免疫化ＶＨ及びＶＫ領域遺伝子のすべては、アニールされ、ライゲートされ、ＰＣＲ増幅されて完全長合成Ｖ領域を与える一連の重複するオリゴヌクレオチドを使用して合成された。次に、組み立てられたバリアントは、ＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖のためのＡｎｔｉｔｏｐｅ社のｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローニングされた。
【０４１１】
抗体の精製
抗エンドグリン抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーにより、哺乳動物培養物の上清から精製された。緩衝液交換及びタンパク質濃度は、ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４を使用して行われた。抗エンドグリン抗体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＡＭｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製された。主要ピークは収集され、フィルター減菌され、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）を使用して内毒素レベル＜５ＥＵ／ｍｇを有することが明らかにされた。精製された抗体は４℃で保存される。最終濃度は、計算されたモル吸光係数を使用してＵＶ吸収により決定され、Ａ２８０  １．０＝１．６２ｍｇ／ｍＬであった。次に、各抗体はＡＩＭＶ培養液で１００μｇ／ｍＬまで希釈された。
【０４１２】
ドナーＰＢＭＣの調製及び選択
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会により与えられた認可に従って英国国立輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋ病院、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から得られる健康なコミュニティードナーバフィーコート（２４時間以内の採血由来）から単離される。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）密度遠心分離によりバフィーコートから単離され、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して枯渇される。ドナーは、Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲベースの組織分類キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することにより特徴付けられる。対照抗原のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答が、陽性対照について判定される。次に、ＰＢＭＣは凍結され必要となるまで液体窒素中で保存された。使用するのに必要になると、細胞は３７℃の水浴中で急速に解凍され、その後１０ｍｌの予め温められたＡＩＭ  Ｖ培地に移される。
【０４１３】
世界人口に現れるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく代表する２０ドナーのコホートが選択される。世界人口に現れるアロタイプに対するコホートに現れるアロタイプの解析により、＞８０％のカバレッジが達成されており、主要ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子はすべて（＞５％の頻度で世界人口に現れる個々のアロタイプ）が十分代表されていることが明らかにされた。ドナーハプロタイプの要約は図２３に与えられており、本研究で使用されるドナーアロタイプ対世界人口に存在するアロタイプの頻度の比較が行われる。
【０４１４】
各ドナー由来のＰＢＭＣは解凍され、計数され、生存率評価される。細胞は生き返らせ、４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬまでＡＩＭＶ培養液に再懸濁させた。ドナーごとに、合計で１ｍＬ増殖細胞保存液が２４ウェルプレートに添加されるバルク培養液が確立された。合計で１ｍＬの各希釈試験試料は、抗体試料あたり５０μｇ／ｍＬの最終濃度になるまでＰＢＭＣに添加された。ドナーごとに、陽性対照（１００μｇ／ｍＬ  ＫＬＨと一緒にインキュベートされた細胞）及び陰性対照（培養液のみと一緒にインキュベートされた細胞）も含まれた。最初の４ドナーでは、試験試料によるＴ細胞応答の調節について試験するために追加の対照が含まれ、ここでは試験試料及びＫＬＨがＰＢＭＣに添加された。これらの試料とＫＬＨ単独との比較を使用して、増殖に対する試験試料の効果を評価することが可能である。培養物は、３７℃で合計８日間５％ＣＯ２と一緒にインキュベートされた。５、６、７及び８日目、各ウェル中の細胞はゆっくりと再懸濁され、３つの１００μＬアリコットは丸底９６ウェルプレートの個別のウェルに移される。培養物は１００μＬ  ＡＩＭＶ培養液中１μＣｉ３［Ｈ］−Ｔｈｙ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と一緒にパルスされ、さらに１８時間インキュベートされて、その後ＴｏｍＴｅｃ  ＭａｃｈＩＩＩ細胞収穫器を使用してフィルターマット上に収穫される。ウェルごとの分あたり計数（ｃｐｍ）は、パラルクス低バックグラウンド計数モードのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上での、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）シンチレーション計数により決定される。
【０４１５】
結果は、刺激指数として表され、刺激指数（ＳＩ）は、試験抗エンドグリン抗体に合わせて測定された増殖スコア（例えば、分あたりの放射能のカウント）を、試験抗エンドグリン抗体を接触させなかった細胞で測定されたスコアで割ることにより導かれる。対照ウェルの全基本ｃｐｍは、１５０ｃｐｍのアッセイの最小閾値より上である。
【０４１６】
増殖アッセイでは、２に等しい又はよりも大きい刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２）の経験的閾値は既に確立されており、それによりこの閾値より上の増殖応答を誘導する試料は陽性と見なされる（ここでは、ボーダーラインＳＩ≧１．９０は強調されている、が含まれている）。広範なアッセイ開発及び既往研究により、これは多数の偽陽性応答を検出せずに最大感度を可能にするノイズ閾値の最小シグナルであることが明らかにされている。陽性応答は、以下の統計的経験的閾値により定義される。
【０４１７】
１．不対２試料スチューデントｔ−検定を使用してメディアム対照ウェルに対して試験ウェルのｃｐｍを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
【０４１８】
２．２より大きな刺激指数（ＳＩ≧２）、ＳＩ＝試験ウェルの平均（ｃｐｍ）／平均メディア対照ウェル（ｃｐｍ）。
【０４１９】
さらに、アッセイ内変動は、同型培養物からの生データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより評価される。
【０４２０】
抗エンドグリン抗体を用いるＥｐｉＳｃｒｅｅｎ時間経過増殖アッセイの結果は米国特許２２１７５３号公報の図２４に示されており、表形式で要約されている（米国特許２２１７５３号公報の表８）。キメラ抗体は２０ドナーのうちの４ドナー（研究コホートの２０％）において応答を刺激し、ドナー応答のうちの２つはボーダーラインであったが（ドナー１１及び１７でそれぞれ１．９２及び１．９５）、バックグラウンドとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ヒト化抗体ＶＫ１ＶＨ１は、バックグラウンドとは有意に異なっている（ｐ＜０．０５）１つのボーダーライン応答（ドナー２０で１．９１）を含む２０ドナーのうちの２ドナー（研究コホートの１０％）において応答を刺激した。ドナー１１及び２０がこれらの抗体の両方に応答し、共有されたＴ細胞エピトープが存在しうることを示唆していることは注目に値する。これとは対照的に、研究コホート中のドナーは一人も脱免疫化抗エンドグリン抗体ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２に陽性応答しなかった。対照抗原ＫＬＨを用いた結果は、陽性結果と陰性結果の間には良好な相関関係が存在していたことを明らかにしており、アッセイにおける高レベルの再現性を示している。
【０４２１】
（例７）
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）は、全抗体におけるＴ細胞エピトープの測定のための又は下により詳細に記載されているようなＴ細胞エピトープの配列位置をマッピングするためのｅｘ  ｖｉｖｏ技術である。
【０４２２】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎドナー選択
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会により与えられた認可に従って英国国立輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋ病院、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から得られる健康なコミュニティードナーバフィーコート（２４時間以内の採血由来）から単離される。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）密度遠心分離によりバフィーコートから単離され、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して枯渇される。ドナーは、Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲベースの組織分類キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することにより特徴付けられる。対照抗原、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答も陽性対照について判定される。世界人口に現れるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく代表する５４ドナーのコホートが選択される。世界人口に現れるアロタイプに対するコホートに現れるアロタイプの解析により、＞８０％のカバレッジが達成されており、主要ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子はすべて（＞５％の頻度で世界人口に現れる個々のアロタイプ）が十分代表されていることが明らかにされた。ドナーハプロタイプの要約が提供されており、本研究で使用されるドナーアロタイプ対世界人口に存在するアロタイプの頻度の比較が行われる。
【０４２３】
ドナー詳細及びハプロタイプ。ＫＬＨに対するドナー応答（ＳＩ）は２つの独立した実験において試験される。試験１は新たに単離されたＰＢＭＣで実施され、抗体は現試験では再試験である。両方の試験において同じ結果（すなわち、陽性又は陰性）を生まない応答は強調されている。基礎ｃｐｍが非常に低い（＜１５０ｃｐｍ）ドナーは解析から除外される。
【０４２４】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ解析：増殖アッセイ
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用して、キメラ、ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体の配列由来の重複ペプチドを試験する。重複ペプチドは設計される。１２アミノ酸重なっている一連の１２８×１５ｍｅｒペプチドは、１×１４ｍｅｒ及び１×１１ｍｅｒと一緒に合成され、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して５１人の健康なドナーのコホート由来の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を刺激するのに使用される。個々のペプチドは同型培養物において試験され、応答はＴ細胞増殖アッセイを使用して評価され、エピトープの正確な位置を同定する。各ドナー由来のＰＢＭＣは解凍され、計数され、生存率について評価される。細胞は室温のＡＩＭ  Ｖ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で生き返らせ、その後細胞密度を２．５×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞保存液）に調整する。ペプチドは最終濃度１０ｍＭまでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）中に溶解させる。次に、ペプチド培養保存液は、最終濃度５μＭまでＡＩＭ  Ｖ培養液に希釈することにより調製される。ペプチドごとに及びドナーごとに、平底９６ウェルプレートにおいて１００μｌのペプチド培養保存液を１００μｌの増殖細胞保存液に添加することにより、６通りの培養物が確立される。陽性対照培養物も陰性対照培養物も６通りに確立する。ドナーごとに合計で９×９６ウェルプレートが使用され、各プレートで１つの陰性対照（担体のみ）を用いて１５ペプチドを６通りに試験するのに十分である。最後のプレート上では、陽性対照が添加される。
【０４２５】
培養物は合計で６日間インキュベートされ、その後０．５μＣｉ３［Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）が各ウェルに添加される。培養物はさらに１８時間インキュベートされ、その後ＴｏｍＴｅｃ  ＭａｃｈＩＩＩ細胞収穫器を使用してフィルターマット上に収穫される。ウェルごとの分あたりの計数（ｃｐｍ）は、パラルクス低バックグラウンド計数モードのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上での、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）シンチレーション計数により決定される。
【０４２６】
増殖アッセイでは、２に等しい又はよりも大きい刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２）の経験的閾値は既に確立されており、それによりこの閾値より上の増殖応答を誘導する試料は陽性と見なされる（ここでは、ボーダーラインＳＩ≧１．９０は強調されている、が含まれている）。広範なアッセイ開発及び既往研究により、これは多数の偽陽性応答を検出せずに最大感度を可能にするノイズ閾値の最小シグナルであることが明らかにされている。陽性応答は、以下の統計的経験的閾値により定義される。
【０４２７】
１．不対２試料スチューデントｔ−検定を使用してメディアム対照ウェルに対する試験ウェルのｃｐｍを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２より大きな刺激指数（ＳＩ≧２）、ＳＩ＝試験ウェルの平均（ｃｐｍ）／平均メディア対照ウェル（ｃｐｍ）。
【０４２８】
さらに、アッセイ内変動は、同型培養物からの生データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより評価される。
【０４２９】
増殖アッセイは６通りの培養物において開始される（「調整されていないデータ」）。アッセイ内可変性が低いことを確かめるために、データは最大及び最小ｃｐｍ値（「調整されたデータ」）を除いた後も解析され、ドナー応答のＳＩは両方のデータセットを使用して比較される。調整されたデータセットと非調整データセット両方由来のドナーＳＩの詳細が作成される。Ｔ細胞エピトープは、本研究におけるすべてのペプチドに対する応答の平均頻度＋２×ＳＤ（バックグラウンド応答速度）を計算することにより同定される。この閾値より上の増殖を誘導するどんなペプチド（単数又は複数）もＴ細胞エピトープを含有すると見なされる。
【０４３０】
ペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｉＴｏｐｅ（商標）解析
増殖アッセイで陽性であるペプチドの配列は、Ａｎｔｉｔｏｐｅ社の予測ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアを使用して解析される。このソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖とＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブ内の特異的結合ポケット間の有利な相互作用を予測する。キーとなる結合残基の位置は、１つのアミノ酸が重なり長いペプチド配列にまたがる１０ｍｅｒペプチドを作製することにより決定される。各１０ｍｅｒは、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプのＡｎｔｉｔｏｐｅ社のデータベースに対して試験され、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのそのフィット及び相互作用に基づいてスコア化される。多数の対立遺伝子に対して高結合スコアを生じたペプチドはコア９−ｍｅｒを含有すると見なされる。
【０４３１】
Ｔ細胞エピトープの同定
上記のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）解析を使用して同定されるペプチドはすべて、５１人の健康なドナーに対して試験するために首尾よく合成される（５４人のドナーが最初に選択される；ドナーは、低基礎ｃｐｍ、すなわち、１５０ｃｐｍのカットオフ値よりも下であるために解析から除外されうる）。陽性応答は任意のペプチドに対してＳＩ≧２の有意な（ｐ＜０．０５）応答を生じたドナーにより定義される。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９０の有意な（ｐ＜０．０５）応答）も含まれる。非調整及び調整されたデータ解析からの出力は、アッセイ内可変性が低いこと及び陽性応答は個々のウェルの偽増殖の結果ではないことを確かめるために比較される。各解析からの結果は方法間でほとんど差を示さず、したがって、Ｔ細胞エピトープマップは調整されたデータ解析を使用して編集される。非調整と調整された解析の両方からのドナー刺激指数が作成される。Ｔ細胞エピトープは、本研究におけるすべてのペプチドに対する応答の平均頻度及び標準偏差の２倍（「バックグラウンド応答速度」と呼ばれる）を計算することにより同定される。これは５．６％であると計算され、３人又はそれ以上のドナーにおいて陽性応答を誘導する等価物である。この閾値より上の増殖応答を誘導するペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有すると見なされる。
【０４３２】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用するリードバリアントの免疫原性試験
リードバリアントは精製され、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイを使用して野生型ポリペプチドに対して比較される。ＨＬＡアロタイプの発現に従って世界人口を代表する多数の健康なドナーは、上記の通りにドナーライブラリーから選択される。ドナーは、２〜４×１０６ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを含有する別々のバルク培養物において各タンパク質を用いて刺激される。同型培養物（Ｔ芽球の）は５〜８日目にバルク培養物から取り除かれ、ＩＬ−２分泌（ＥＬＩＳＰＯＴ）と一緒の増殖が評価される。野生型とバリアント間の評価をさらに検証するために、研究コホートは、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング研究由来の応答ドナーを補充される（提供された十分な数のＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣが残っている）。
【０４３３】
リードバリアントにおける免疫原性の消失を確認するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイによるＴ細胞免疫原性の解析が以下の通りに着手される。
【０４３４】
（ｉ）健康なドナー由来のバフィーコート（世界人口に対して＞８０％ＤＲＢＩアロタイプカバレッジを有する）を使用して、生理学的レベルのＡＰＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを単離する；
（ｉｉ）各ドナーは、キーホールリンペットヘモシアニン（強力なネオ抗原）を含む陽性対照抗原に対して試験される；
（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答の検出を排除するために枯渇される；
（ｉｖ）リードバリアント及び野生型ポリペプチドは、Ｔ細胞ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する相対的能力を評価するために互いに対して比較される；
（ｖ）データは、統計的及び頻度解析を含む追加の情報により支持されるＳＩ＞２の陽性応答を有する既に確認されたアッセイパラメータを使用して解析される；
（ｖｉ）ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイからのデータは、個々の分子に対するＴ細胞応答の大きさ及び速度論に関する情報を提供する；
（ｖｉｉ）陽性応答を生じるドナー由来のどんな残っているＰＢＭＣも記録され、繰返し試験研究において使用するために利用可能である；
（ｖｉｉｉ）ドナーアロタイプと野生型ポリペプチドに対する応答及びバリアントリードに対する任意の応答間の関連について評価が行われる。
【０４３５】
（例８）
四塩化炭素誘発肝線維症モデルにおけるＭ１０４３のインビボ有効性研究
この実施例の目的は、四塩化炭素誘発肝線維症モデルにおいて、マウスエンドグリンに結合するＭ１０４３抗体が、マウスＢＭＰのマウスエンドグリンと結合を競合的に阻害する効果を調べることである。  
【０４３６】
Ｍ１０４３の重鎖可変領域  
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＭＨＷＩＫＱＱＰＧＮＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＧＮＴＫＹＮＱＫＦＮＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＫＦＧＶＧＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ（配列番号１２４）
【０４３７】
Ｍ１０４３の軽鎖可変領域  
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＬＡＶＳＰＧＥＲＶＳＩＳＣＲＡＳＥＧＶＮＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＱＰＫＬＬＩＹＩＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＴＡＴＹＦＣＱＱＳＷＮＤＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号１２５）
【０４３８】
材料および方法  
試験物質  
Ｍ１０４３抗体はトラコン（ＴＲＡＣＯＮ）ファーマシューティカルズ株式会社によって提供される。アイソタイプ適合抗体（ラットＩｇＧ１）はＢｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ社（カタログ＃ＢＥ００８８）から購入しました。投薬溶液は、アイソタイプ適合抗体又はＭ１０４３抗体のストック溶液を、ビヒクル（滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈することによって調製した。
【０４３９】
動物  
７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１７〜２１グラム）を日本ＳＬＣ（日本）から入手した。  
【０４４０】
通常の条件下で動物を飼育し、通常の食餌を与えた（ＣＥ−２；日本クレア、日本）。本研究で用いた全ての動物は、以下のガイドラインで世話をされた：
１．  福祉と動物の管理に関する法律（１０月１日環境省、法律番号１０５、１９７３）
２．  実験動物のケアと管理及び痛みの救済に関する規格（環境省のＮｏ．８８通知、２００６年４月２８日）に関連
３．  動物実験の適正な実施のためのガイドライン（日本学術会議、２００６年６月１日）
【０４４１】
環境  
動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工光と暗サイクル；光８：００から２０：００）及び空気交換の制御された条件下で特定の病原体フリー（ＳＰＦ）施設で維持された。から。施設の汚染を防止するために、実験室は高い気圧で維持した。
【０４４２】
動物の収容  
動物は、ポリカーボネートケージＫＮ−６００（夏目製作所、日本）内で、ケージ当たり最大４匹のマウスで飼育した。滅菌Ｐａｐｅｒ−Ｃｌｅａｎ（日本ＳＬＣ）を寝わらとして使用して、１週間ごとに交換した。
【０４４３】
飲食  
滅菌正常食餌をケージの上に金属製の蓋内に配置し、自由に与えた。蒸留水はまた、ゴム栓とシッパー管を備えた水ボトルから自由に与えた。水のボトルは週一回交換し、清掃し、オートクレーブ滅菌して再使用した。
【０４４４】
動物やケージ識別  
マウスは、イヤリングに刻印番号で識別された。各ケージはまた、固有の識別コードが与えられた。  
【０４４５】
ランダム化  
マウスを処置（１３日目）の開始前日にそれらの体重に基づいて、８匹のマウスの３つの群に分けた。  
【０４４６】
ＣＣｌ４−誘発性肝線維症モデルの誘導  
順化後、マウスを腹腔内にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中５％ＣＣｌ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）を１００μΙの体積で週二回（０、４、７、１１、１４、１８、２１及び２５日目）投与した。
【０４４７】
薬物投与経路  
アイソタイプ適合抗体およびＭＬ１０４３抗体を５ｍＬ／ｋｇの容量で静脈内経路により投与した。  
【０４４８】
治療用量  
アイソタイプ適合抗体およびＭＬ１０４３抗体を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で週二回マウスに投与した。  
【０４４９】
個々の体重を毎日測定した。生存率、臨床徴候およびマウスの動作は、毎日モニターした。
【０４５０】
プラズマ検体採取  
血液試料を抗凝固剤（ノボ・ヘパリン；持田製薬、日本）を用いてポリプロピレンチューブに集め、そして４℃で１５分間１，０００×ｇで遠心分離した。上清を回収し、−８０℃で保存した。
【０４５１】
組織検体採取  
新鮮及び凍結肝臓試料は、従来の技術を用いて収集した。  
【０４５２】
組織学的解析  
コラーゲン沈着を可視化するために、切片をブアン液中で前固定した左横肝臓組織のパラフィンブロックから切り出し、そしてｐｉｃｒｏ−シリウスレッド溶液（ヴァルデック、ドイツ）で染色した。線維化領域の定量分析のために、シリウスレッド染色切片の明視野画像はランダムにデジタルカメラ（ＤＦＣ２８０；ライカマイクロシステムズ、ドイツ）を用いて１００倍の倍率で捕捉し、そして５フィールド／セクションのシリウスレッド染色陽性領域は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（国立衛生研究所、ＵＳＡ）を用いて測定しました。定量は盲検様式で行われた。
【０４５３】
統計的検定  
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）上でボンフェローニ多重比較検定を用いて行った。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。結果は、平均±ＳＤとして表した。
【０４５４】
実験計画と治療  
次のように治療群を分離しました。  
【０４５５】
グループ１：疾病管理  
８匹のＣＣｌ４誘発性肝線維症モデルマウスは、２８日まで任意の処理をせずに維持した。  
【０４５６】
グループ２：アイソタイプ適合抗体  
８匹のＣＣｌ４誘発性肝線維症モデルマウスの静脈内に毎週二回、１４、１７、２１及び２４日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量でアイソタイプ適合抗体を追加したビヒクルを投与した。  
【０４５７】
グループ３：抗体Ａ  
８匹のＣＣｌ４誘発性の肝線維症モデルマウスの静脈内に毎週二回、１４、１７、２１及び２４日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量でＭ１０４３抗体を追加したビヒクルを投与した。全ての動物は２８日目に屠殺した。  
【０４５８】
【表３】
2017537084.tif 000005
【０４５９】
動物のモニタリングと犠牲  
生存率、臨床徴候および行動は、毎日モニターした。体重は治療期間中毎日記録した。動物をエーテル麻酔（和光純薬工業、日本）下で心臓穿刺を介して放血により屠殺した。
【０４６０】
結果  
体重変化および一般状態（図１０）  
アイソタイプ適合抗体および疾患対照群の間又はアイソタイプ適合抗体およびＭＬ１０４３抗体群間のいずれも有意差はなかった。  
【０４６１】
本研究では、動物のどれも一般的な条件の低下を示さなかった。  
【０４６２】
屠殺の日の体重（図１１Ａおよび表４）  
アイソタイプ適合抗体および疾患対照群の間又はアイソタイプ適合抗体およびＭＬ１０４３抗体群間のいずれも有意差はなかった。  
【０４６３】
肝臓重量（図１１Ｂおよび表４）  
アイソタイプ適合抗体群は、疾患対照群と比較して平均肝臓重量の有意な減少を示した。アイソタイプ適合抗体グループおよびＭＬ１０４３抗体群との間で平均体重に有意差は認められなかった。  
【表４】
2017537084.tif 000006
【０４６４】
組織学的解析
シリウスレッド染色（図１２Ａ〜Ｆ、図１３および表５）は、上記のプロトコルを用いて行われた。
【０４６５】
広範囲のコラーゲン沈着及び架橋線維症は、アイソタイプ適合抗体と疾患対照群の肝臓切片において明らかだった。Ｍ１０４３抗体群は、アイソタイプ適合抗体と疾患コントロール群よりも架橋線維症のより低い頻度の形成と低いコラーゲン沈着を示した。
【０４６６】
線維化面積（シリウスレッド陽性領域）の割合は有意にアイソタイプ適合抗体群と比較してのＭ１０４３抗体群で減少した（Ｐ＜０．０５）。
【表５】
2017537084.tif 000007
【０４６７】
結論  
本研究では、抗体Ｍ１０４３による治療は、シリウスレッド陽性領域によって証明されるように、コラーゲン沈着の有意な減少を示した。さらに、異常な所見は、抗体処置群で観察されなかった。これらの結果は、Ｍ１０４３抗体治療は、重大な副作用のない抗線維化効果を持っていることが示唆された。
【０４６８】
（例９）
ブレオマイシン誘発肺線維症におけるＭ１０４３とＴＲＣ１０５のインビボ有効性研究
本研究の目的は、拮抗的にマウスＢＭＰのマウスエンドグリンへの結合を阻害するＭ１０４３の効果並びにマウスエンドグリンに結合するが、マウスＢＭＰのマウスエンドグリンへの結合を阻害しない抗体ＴＲＣ１０５の効果を、ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発肺線維症のモデルで検証することである。  
【０４６９】
プロトコール  
無病原体７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは日本ＳＬＣ（日本）から入手した。０日目に、６０匹のマウスはＭｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（登録商標）（Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ，ＵＳＡ）を用いて動物あたり、５０μＬ、３ｍｇ／ｋｇの用量で生理食塩水中ブレオマイシン硫酸塩（ＢＬＭ、日本化薬、日本）の単回気管内投与により肺線維症を発症するように誘導した。
【０４７０】
ＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスは、治療開始前日に体重に基づいて１２匹のマウスの４つの群に無作為化した。  
【０４７１】
個々の体重は、実験期間中、毎日測定した。  
【０４７２】
生存、臨床徴候およびマウスの行動を毎日モニターした。  
【０４７３】
グループ：  
グループ１（疾患対照）：１２匹のＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスは、２０日目までの任意の処理をせずに維持した。  
【０４７４】
グループ２（アイソタイプ適合抗体）：１２匹のＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスの静脈内に毎週二回、７、１０、１４及び１７日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量でアイソタイプ適合抗体［ＢｉｏＥｘｃｅｌ  カタログＢＥ００８８（２５ｍｇ）のラットＩｇＧ１］を追加したビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。
【０４７５】
グループ３（Ｍ１０４３抗体）：１２匹のＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスの静脈内に毎週二回、７、１０、１４及び１７日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量でＭ１０４３を追加したビヒクルを投与した。
【０４７６】
グループ４（ＴＲＣ１０５ヒト／マウスキメラ抗体）：１２匹のＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスの静脈内に毎週二回、７、１０、１４及び１７日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量でＴＲＣ１０５を追加したビヒクルを投与した。
【０４７７】
グループ５（特発性肺線維症のためのＢＩＢＦ１１２０阻害剤−陽性対照、ベーリンガーインゲルハイム）：１２匹のＢＬＭ誘導性肺線維症モデルマウスに経口で７日目から２１日目まで一日一回１００ｍｇ／ｋｇの用量でＢＩＢＦ１１２０を追加した１％ＣＭＣを投与した。
【０４７８】
すべての群のマウスは２１日目で、以下のアッセイのために終了した。  
【０４７９】
サンプル採取および結果  
（処置の割り当てを知らない審査官による）生化学分析。肺のヒドロキシプロリンは、加水分解法により定量した。図１４Ａを参照。
【０４８０】
肺切片の組織学的分析は、グループの同定を認識していない専門家によって行われた。マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行い、アシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  Ｓｃｏｒｅ）の推定値が決定された。図１４Ｂを参照。
【０４８１】
ボンフェローニ多重比較テストによって５つの処理群間の体重に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５、互いにグループに対するアイソタイプ対照抗体群を比較）。図１４Ｃを参照。  
【０４８２】
ボンフェローニ多重比較テストによって５つの処理群間の生存率に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５、それぞれの他のグループに対するアイソタイプ対照抗体群を比較）。図１４Ｄを参照。
【０４８３】
アシュクロフトスコアは、図１４Ｅに示されている。アイソタイプ対照抗体グループと疾患コントロール群との間アシュクロフトのスコアに有意差は認められなかった。アイソタイプ対照抗体グループおよびＭＬ１０４３処置群の間のアシュクロフトのスコアに有意差は認められなかった。ＴＲＣ１０５抗体処置群におけるアシュクロフトスコアは、アイソタイプ対照抗体群よりも有意に低かった。ＢＩＢＦ１１２０処置群におけるアシュクロフトスコアによる統計的検定は、ボンフェローニの多重比較検定を用いて行ったアイソタイプ対照抗体群よりも有意に低かった。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなされる。
【０４８４】
（例１０）  
非アルコール性脂肪性肝炎のモデルにおけるＭ１０４３、ＴＲＣ１０５及びＴＲＣ２０５のインビボ有効性研究  
本研究の目的は、拮抗的にマウスＢＭＰのマウスエンドグリンへの結合を阻害するＭ１０４３の効果並びにマウスエンドグリンに結合するが、マウスＢＭＰのマウスエンドグリンへの結合を阻害しない抗体ＴＲＣ１０５及びＴＲＣ２０５の効果を、非アルコール性脂肪性肝炎のモデルで検証することである。
【０４８５】
プロトコール  
無病原体１４日妊娠Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本エスエルシー株式会社（日本）から得られる。  
【０４８６】
ＮＡＳＨは出産後にＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ、米国）の単回皮下注射、並びに生後４週間後（２８日目±２日）、高脂肪食（ＨＦＤ；日本クレア、日本）を自由給餌により雄マウスに確立される。  
【０４８７】
９週齢（６３日目±２日）で、マウスは治療開始前日に１０匹のマウスの４つの群に無作為化する。
【０４８８】
個々の体重は、治療期間中、毎日測定される。  
【０４８９】
生存、臨床徴候およびマウスの行動は毎日監視される。  
【０４９０】
グループ：  
グループ１（非罹患対照）：１０匹のマウスは自由に給餌され、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水）を毎週２回、６３、６６、７０、７３、７７、８０日目に静脈内投与する。
【０４９１】
グループ２（疾患対照）：１０匹のＮＡＳＨマウスはＨＦＤを自由給餌され、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水）を毎週２回、６３、６６、７０、７３、７７、８０日目に静脈内投与する。
【０４９２】
グループ３（ビヒクルコントロール）：１０匹のＮＡＳＨマウスに６３日目から８４日目まで一日一回１０ｍｇ／ｋｇの用量でテルミサルタンを補充された純水を経口投与する。  
【０４９３】
グループ４（抗体Ｍ１０４３）：１０匹のＮＡＳＨマウスに、抗体Ｍ１０４３を補充したビヒクルを１０ｍｇ／ｋｇの用量で週二回、６３日目、６６、７０、７３、７７、８０日目に、静脈内に投与する。  
【０４９４】
グループ５（抗体ＴＲＣ１０５）：８匹のＮＡＳＨマウスに、抗体ＴＲＣ１０５を補充したビヒクルを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週二回６３、６６、７０、７３、７７、８０日目に、静脈内投与する。  
【０４９５】
グループ６（抗体ＴＲＣ２０５）：１０匹のＮＡＳＨマウスに、抗体ＴＲＣ２０５を補充したビヒクルを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週二回６３、６６、７０、７３、７７、８０日目に静脈内投与する。  
【０４９６】
全てのグループのマウスは生後１２週で、以下のアッセイのために終了する。  
【０４９７】
サンプルの収集と分析  
以下のサンプルは、さらなる分析のために収集され、保存される：凍結した血清標本、ならびに凍結した肝臓標本及び新鮮な肝臓標本。  
【０４９８】
血清はアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼについて評価される。肝臓トリグリセリドが評価される。
【０４９９】
腫瘍壊死因子-アルファ、アルファ平滑筋アクチン、単球走化性タンパク質−１、メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤の遺伝子発現は、肝臓から得られた全ＲＮＡを用いて評価される。
【０５００】
組織学的肝臓切片の解析は、従来のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色技術を用いて行われる。  
【０５０１】
Ｈ＆Ｅ染色は、ＮＡＦＬＤ活動スコアを推定するために行われる。
【表６】
2017537084.tif 000008
【０５０２】
シリウスレッド染色  
シリウスレッド染色は、線維化領域の割合を推定するために、上記のプロトコールを用いて行われる。  
【０５０３】
免疫組織化学  
アルファ−ＳＭＡのための免疫組織化学を行う（アルファＳＭＡの半定量）。  
【０５０４】
統計的検定  
統計的検定は、ボンフェローニの多重比較検定を用いて行われる。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなす。
【０５０５】
（例１１）  
ＥＬＩＳＡは、マウスエンドグリンへＭ１０４３抗体の結合を決定するため、以下のように行われた：
Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底プレート（フィッシャー、カタログ番号ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌマウスエンドグリン（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号１３２０−ＥＮ−０２５）で一晩４度で被覆した。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄しから、室温で１時間ＰＢＳＴ／３％マーベルでブロッキングした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、そして様々な濃度（三倍連続希釈で１０μｇ／ｍｌから０．０１４μｇ／ｍｌ）の、ＰＢＳＴ／３％マーベル中のＭ１０４３または無関係ラットＩｇＧ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カタログ番号１４−４３０１）のいずれかをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体の結合は、抗ラットＩｇＧペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９０３７）及びＴＭＢ単一溶液基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号００−２０２３）を介して検出した。反応を３  Ｍ  ＨＣ１を加えて停止させ、ＯＤ４５０ｎｍ値はＤｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＴＣＩＩプレートリーダーで測定した。結合ＥＬＩＳＡの結果は、図１５に示されている。結果は、無関係のアイソタイプ適合抗体で結合は全く観察されなかったので、Ｍ１０４３抗体がマウスエンドグリンと特異的に結合することを示している。
【０５０６】
マウスエンドグリンへの結合についてラット抗体Ｍ１０４３と競合するマウスＢＭＰ９の能力は、競合ＥＬＩＳＡによって以下のように決定した：２００μｇのＭ１０４３抗体はＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋビオチン化キットで製造業者の推奨に従ってビオチン化した（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号７０４−００１０）。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌマウスエンドグリンで一晩４℃で被覆した（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号１３２０−ＥＮ−０２５）。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄しから、室温で１時間ＰＢＳＴ／３％マーベルでブロッキングした。三倍連続希釈のマウスＢＭＰ９（３０μｇ／ｍｌから０．００４μｇ／ｍｌ）又は無関係ラットＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５５６６−ＢＰ−０１０）を固定濃度のビオチン化のＭ１０４３（４０ｎｇ／ｍｌ）と混合し、プレートに加え１時間室温でインキュベートした。ビオチン化抗体の結合は、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ５５１２）とＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）を介して検出した。ＯＤ４５０ｎｍ値はＤｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＴＣＩＩプレートリーダーで測定した。この競合ＥＬＩＳＡの結果は、図１６に示されている。結果は、マウスエンドグリンへ結合について、マウスＢＭＰ９はビオチン化のＭ１０４３と競合したのに対し、無関係な分子はしなかったことを示す。
【０５０７】
（例１２）  
ＥＬＩＳＡは、ヒトＣＤ１０５に対するビオチン化ＴＲＣ２０５抗体の結合を決定するために以下のように行われた：ＴＲＣ２０５抗体（配列番号８９／配列番号９３；  ＩｇＧ４）をＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋビオチンコンジュゲーションキットを用いて製造業者の説明書に従ってビオチン化した（タイプＡ）（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社カタログ番号７０４−００１０）。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）をＰＢＳ中１．５μｇ／ｍｌマウス抗ヒトＣＤ  １０５で一晩４°Ｃで被覆した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号９８１１−０１）。次の日、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中１００ｎｇ／ｍｌヒトＣＤ  １０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１０９７−ＥＮ）を、プレコーティングしたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳＴ／２％ＢＳＡ中のビオチン化ＴＲＣ２０５抗体の三倍希釈系列（１０μｇ／ｍｌ  から０．０１４μｇ／ｍｌ）をプレートに二連で添加した。室温で１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化ＴＲＣ２０５抗体の結合をストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５５１２）とＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）を用いて検出した。ＯＤ４５０ｎｍ値はＤｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＴＣＩＩプレートリーダーで測定した。結合曲線から、ＥＣ５０値は、４６ｎｇ／ｍｌであると計算された（図１７）。  
【０５０８】
ヒトＣＤ１０５への結合についてＴＲＣ２０５抗体と競合するヒトＢＭＰ９の能力は、以下のように競合ＥＬＩＳＡによって決定した：Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６枚のウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）をコーティングしたＰＢＳにおけるＰＢＳ中１．５μｇ／ｍｌマウス抗ヒトＣＤ１０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号９８１１−０１）で一晩＋４℃でコーティングした。次の日、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中１００ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１０９７−ＥＮ）を、プレコーティングしたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ヒトＢＭＰ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号３２０９−ＢＰ−０１０）の三倍希釈系列（４１３ｎＭから０．５６ｎｍ）又は非標識ＴＲＣ２０５抗体の三倍希釈系列（４０ｎＭから０．０５ｎＭ）、或いは単一濃度の無関係の抗体（６６ｎＭ）のいずれかと固定濃度のビオチン化ＴＲＣ２０５抗体（５５ｎｇ／ｍｌ）を混合し、プレートに添加した。室温で１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化ＴＲＣ２０５抗体の結合をストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５５１２）とＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）を用いて検出した。ＯＤ４５０ｎｍ値はＤｙｎｅｘ  ＭＲＸ  ＴＣＩＩプレートリーダーで測定した。得られた競合曲線（図１８）から、ＩＣ  ５０値はＴＲＣ２０５抗体およびＢＭＰ９に対して各々１．７ｎＭ（０．２６μｇ／ｍｌ）及び１４．６ｎＭ（０．３５μｇ／ｍｌの）として算出された。
【０５０９】
（例１３）  
細胞ベースのアッセイを抗体ＴＲＣ２０５は、ヒト線維芽細胞におけるＳＭＡＤ  １／５／８のリン酸化を阻害することを実証するために行われた。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）捕捉ＥＬＩＳＡアッセイをタンパク質抽出物中のリン酸化ＳＭＡＤ１および全ＳＭＡＤ１を検出するために開発された。
【０５１０】
５０枚の高密度９６ウェルプレートを、５００ｍｇのモノクローナル抗ＳＭＡＤｌ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＃ｓｃ−８１３７８）を使用してＭＳＤにより注文被覆する。二つの異なる検出抗体は、リン酸化されたＳＭＡＤ  １／５／８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃９５１１）および全ＳＭＡＤ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃９７４３）を検出するために使用される。検出は、ＭＳＤ推奨のプロトコールおよびバッファを使用して実施される。簡単に説明すると、線維芽細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（インビトロジェン＃Ａ１１１０５０１）で剥離し、ＰＢＳで２回洗浄し、培地２５ｍｌ中２５００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。血清飢餓の３時間後に、抗体を、２５ｍｌ培地中でウェルに添加した。１時間後、２．５ｍｌのＢＭＰ９（２ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加する。３０分後、細胞を、５０ｍｌのＭＳＤ溶解緩衝液２ｘ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｒｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を補充）で溶解し、摂氏−２０度で凍結保存した。
【０５１１】
４０ｍｌの溶解物を（製造業者の説明書に従って）ＭＳＤアッセイに使用される。ＭＳＤプレートは、ＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷプレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ）で洗浄し、信号は、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読まれる。
【０５１２】
プライマリーエンドポイントは、ヒトエンドグリンと結合しない抗体で処理した線維芽細胞と比較して、抗体ＴＲＣ１０５または抗体ＴＲＣ２０５で処理した線維芽細胞との間で、ＢＭＰ−９刺激に応答して、総ＳＭＡＤ１で割ったリン酸化ＳＭＡＤ  １タンパク質の比率の変化である。
【０５１３】
（例１４）  
第３相試験は、特発性肺線維症の約６００人の患者に対して無作為に５２週間経口ピルフェニドン（一日あたり２４０３ｍｇ）、または抗エンドグリン抗体のいずれかを割り当てされる。主要エンドポイントは、５２週目の強制肺活量（ＦＶＣ）、または死亡の変化である。副次的エンドポイントとしては、例えば、６分間歩行距離、無増悪生存期間、生活の延長、呼吸困難、および／またはあらゆる原因からか、特発性肺線維症による死亡が挙げられる。他の評価は、２つの治療群間の有害事象の発生を含めることができる。
【０５１４】
本出願のある種の実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることは明白である。本発明から逸脱することなく当業者は数多くの変動、変化及び置換物を思い付くことがある。本明細書に記載される実施形態の様々な代替物を本明細書に記載される方法を実行する際に用いうることは理解されるべきである。
【図１】
2017537084.tif 000009
【図２】
2017537084.tif 000010
【図３Ａ】
2017537084.tif 000011
【図３Ｂ】
2017537084.tif 000012
【図４Ａ】
2017537084.tif 000013
【図４Ｂ】
2017537084.tif 000014
【図５】
2017537084.tif 000015
【図６Ａ】
2017537084.tif 000016
【図６Ｂ】
2017537084.tif 000017
【図６Ｃ】
2017537084.tif 000018
【図６Ｄ】
2017537084.tif 000019
【図６Ｅ】
2017537084.tif 000020
【図６Ｆ】
2017537084.tif 000021
【図７】
2017537084.tif 000022
【図８】
2017537084.tif 000023
【図９】
2017537084.tif 000024
【図１０】
2017537084.tif 000025
【図１１】
2017537084.tif 000026
【図１２】
2017537084.tif 000027
【図１３】
2017537084.tif 000028
【図１４Ａ】
2017537084.tif 000029
【図１４Ｂ】
2017537084.tif 000030
【図１４Ｃ】
2017537084.tif 000031
【図１４Ｄ】
2017537084.tif 000032
【図１４Ｅ】
2017537084.tif 000033
【図１５】
2017537084.tif 000034
【図１６】
2017537084.tif 000035
【図１７】
2017537084.tif 000036
【図１８】
2017537084.tif 000037
【配列表】
2017537084000001.app
【国際調査報告】
2017537084.tif 000038
2017537084.tif 000039
2017537084.tif 000040
2017537084.tif 000041
2017537084.tif 000042
2017537084.tif 000043
2017537084.tif 000044