(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
差次的な遺伝子発現を分析する方法であって、以下の工程：
クローン亜集団において別個の固相微粒子支持体に付着された核酸配列の参照集団を提供する工程；
第１の細胞または組織供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドの集団および異なる細胞または組織供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドの少なくとも１つの集団を提供する工程であって、該各々の供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドが、任意の他の供給源のポリヌクレオチドによって含まれる標識と異なる光生成標識を含む、工程；
該異なる供給源の同じ遺伝子からのポリヌクレオチドが該参照核酸集団の同じ相補的な配列とハイブリダイズし、かつ該ポリヌクレオチドが、該供給源においてこれらの対応する遺伝子の相対的な発現に直接関連した比で該各々の固相支持体上に二重鎖として存在するように、該参照核酸集団と該各々の供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドの集団を競合的にハイブリダイズして、該参照核酸集団の該核酸配列と該各々の供給源のポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程；および
該各々の固相支持体に付着された該二重鎖の該光生成標識によって生成された相対的な光学シグナルに従って、該支持体を分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記参照配列集団を提供する工程がさらに以下の工程：
少なくとも１つの前記供給源から抽出されたｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドタグのレパートリーから、少なくとも１つのタグ−ｃＤＮＡ結合体の集団を形成する工程であって；
ここで、該レパートリーは、最小の交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットのメンバーからなり、ここで任意のメンバーの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが任意の他のメンバーの配列とは異なる、工程；
該タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプルを取り出す工程；および
該サンプルの該タグ−ｃＤＮＡ結合体を増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記タグ−ｃＤＮＡ結合体の集団が、前記各々の供給源から抽出されたｍＲＮＡから形成され、前記方法が、前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を形成する前に該各々の供給源由来の該ｍＲＮＡを合わせる工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、多くのタグ−ポリヌクレオチド結合体を含み、該多くのタグ−ポリヌクレオチド結合体は、前記レパートリーにおける前記オリゴヌクレオチドタグの数の１％以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記参照集団を提供する工程が、前記タグ−ｃＤＮＡ結合体の前記オリゴヌクレオチドタグと前記支持体上のそれらのそれぞれの相補体とを特異的にハイブリダイズすることによって、前記別個の固相微粒子支持体に対して該サンプルの該タグ−ｃＤＮＡ結合体を付着する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応において前記サンプルの前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を複製する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅する工程が、クローニングベクター中に前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を挿入し、そしてそれを用いて宿主細胞にトランスフェクトすることによって前記サンプルの前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を複製する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記異なる光生成標識が、異なる蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、ＦＡＣＳ分離工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、以下の工程：
値の１つ以上の所定の範囲内の値で前記相対的な光学シグナルを有する前記各々の固相支持体を別個の容器に蓄積する工程；および
該各々のポリヌクレオチドの一部のヌクレオチド配列を決定することによって該蓄積された固相支持体上の前記ポリヌクレオチドを同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
前記相対的な光学シグナルが蛍光強度の比であって、ここで前記ポリヌクレオチドの集団が２つの供給源に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドの一部が、少なくとも１０ヌクレオチドの配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定する工程が、大規模に並行サイン配列決定することによって少なくとも１万の前記ポリヌクレオチドを同時配列決定する工程を包含し、該配列決定する工程は、以下の工程：
（ａ）各支持体に結合したポリヌクレオチドの遊離末端にコード化アダプターを連結する工程であって、該コード化アダプターは、以下：
（ｉ）該遊離末端と完全に一致した二重鎖を形成する突出鎖、
（ｉｉ）最小の交差ハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチドタグであって、ここで該セットの任意のメンバーの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが該セットの任意の他のメンバーの配列とは異なる、オリゴヌクレオチドタグ、および
（ｉｉｉ）ヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位であって、その切断部位は、該認識部位とは別である、ヌクレアーゼ認識部位、
を含む、工程、
（ｂ）該コード化アダプターの該オリゴヌクレオチドタグに、標識タグ相補体を特異的にハイブリダイズさせる工程、
（ｃ）該ポリヌクレオチドの遊離末端におけるヌクレオチドの型および配列を、該タグ相補体が保有する標識に従って同定する工程、
（ｄ）該コード化アダプターの該ヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼで、フラグメントを切断し、その結果該フラグメントは、１以上のヌクレオチドだけ短くなる、工程；ならびに
（ｅ）該連結する工程、ハイブリダイズする工程、および同定する工程を、該ポリヌクレオチドの末端のヌクレオチド配列の所望の長さが決定されるまで、反復する工程、
を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子産物の相対量を決定する方法であって、以下の工程：
クローン亜集団において別個の固相微粒子支持体に付着されたＤＮＡ配列の参照ＤＮＡ集団を提供する工程；
第１の細胞または組織供給源の細胞に存在する遺伝子由来のポリヌクレオチドの集団および異なる細胞または組織供給源の細胞に存在する遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも１つの集団を提供する工程であって、該各供給源からの遺伝子由来のポリヌクレオチドは、光学シグナルを生成することができかつ任意の他の供給源の遺伝子由来のポリヌクレオチドの標識とは異なる光生成標識を有する、工程；
該ポリヌクレオチドと該参照ＤＮＡ集団をハイブリダイズして、該参照ＤＮＡの該ＤＮＡ配列と該ポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程；
該別個の固相微粒子支持体に付着された該二重鎖の該光生成標識によって生成された該光学シグナルに従って各々の固相支持体を分離する工程；および
二重鎖から得られる該光学シグナルの相対強度レベルから該遺伝子産物の相対量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
より低い相対強度を有する固相支持体を単離する工程をさらに包含し、ここで、該単離された固相支持体が、提供される総固相支持体の５％以下を構成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された固相支持体が、提供される総固相支持体の０．５％以下を構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、さらに以下の工程：
ハイブリダイスされた集団とハイブリダイズされない集団とに該ポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
差次的に発現された遺伝子を分析するためのキットであって、以下：
各々の微粒子が、該微粒子に付着された同一の一本鎖核酸分子の集団を有し、該一本鎖核酸分子が各々の微粒子上で異なっており、そして複数の細胞または組織供給源のｍＲＮＡ由来のポリヌクレオチドを含む、微粒子の混合物を含む、キット。
【請求項２０】
前記各々の核酸分子が、前記微粒子と該ポリヌクレオチドとの間に位置されるオリゴヌクレオチドタグをさらに包含し、ここで各オリゴヌクレオチドタグは、最小のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットのメンバーであり、ここで該セットの任意のメンバーの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが該セットの任意の他のメンバーの配列とは異なる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
差次的に発現された遺伝子を分析することにおける使用のための印刷された取扱説明書をさらに包含する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
少なくとも１つの前記細胞または組織供給源由来のｃＤＮＡ分子の集団をさらに包含する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
前記混合物が、少なくとも１０００の異なる微粒子を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２４】
前記混合物が、少なくとも１０４の異なる微粒子を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
各々の前記オリゴヌクレオチドタグが、１２〜６０ヌクレオチドの長さである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
各々の前記オリゴヌクレオチドタグが、１８〜４０ヌクレオチドの長さである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドタグが、２５〜４０ヌクレオチドの長さである、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９８年８月６日に提出された、同時係属中の米国特許出願番号０９/１３０,４４６号の一部継続出願であり、米国特許出願番号０９/１３０,４４６号は、１９９８年１月９日に提出された同時係属中の米国特許出願番号０９/００５,２２２号の一部継続出願である。これらの出願は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、差次的に発現された遺伝子を同定するための方法に関し、そして、より詳細には、例えば、蛍光活性化フローソーティングによって、物理的に操作され得る差次的な発現ライブラリーを提供するために、差次的に発現されたＤＮＡと固相支持体上のクローン化された参照ＤＮＡ配列とを競合的にハイブリダイズする方法に関する。
【０００３】
（背景）
ヒトゲノムを解読するためならびに疾患および宿主の差次的な遺伝子発現に関連する他の生理学的状態を支配する遺伝的な根拠を理解するために所望されることは、ＤＮＡを分析および配列決定するための改良された方法の開発の重要な原動力になっている。Ａｄａｍｓら、編、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４）。ヒトゲノムは、約１０5の遺伝子を含み、その約１５〜３０％−または約２０〜４０メガベース−が、任意の所定の組織において活性であると推定される。このような大多数の発現された遺伝子は、特に、比較的低レベルで発現される大多数の遺伝子を参照すると利用可能な技術による発現パターンにおいて変化を追跡することを困難にする：ほとんど３０％のｍＲＮＡは、各々が全体の０．５％未満で作製され、そして代表的には、細胞あたり１４コピー未満で平均化されている、何千もの別の種からなることが推測される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）。このような低量のｍＲＮＡ上での発現においてさらなる重要な変化は、大量の配列の圧倒的な量の存在下において検出することを困難であり得る。
【０００４】
種々の技術は、広範に異なる遺伝子発現を分析するために利用可能であり、これらの技術は、簡便さ、費用、および感度において広範に異なる。一般的に使用される低分解能技術は、差次的な表示、指数化、サブトラクションハイブリダイゼーション、および多数のＤＮＡフィンガープリント技術（例えば、Ｖｏｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：４４０７〜４４１４（１９９５）；Ｈｕｂａｎｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：５６４０〜５６４８（１９９４）；Ｌｉｎｇｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：９６７〜９７１（１９９２）；Ｅｒｌａｎｄｅｒら、国際特許公開  ＷＯ９５／１３３６９；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、米国特許第５,４３７,９７５号；Ｕｎｒａｕら、Ｇｅｎｅ、１４５：１６３〜１６９（１９９４）など）を含む。高分解能技術は、発現された配列タグ（ＥＳＴ）の分析（例えば、Ａｄａｍｓら、（上記に言及される）；Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  （ＳＡＧＥ）、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４８４〜４８６（１９９５）；Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１２６８〜１２７２（１９９７）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ、８８：２４３〜２５１（１９９７））；および発現された遺伝子から相補的なポリヌクレオチドを捕獲するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの微小アレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）の使用（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４６７〜４６９（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：６８０〜６８６（１９９７）；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：６１０〜６１４（１９９６）など）を含む。
【０００５】
後者の２つの高分解能技術は、遺伝子発現を分析するための潜在的な確固としたシステムとして見込みがある；しかし、両方のアプローチで注意が向けられる必要がある技術的問題がまだ存在する。微小アレイ系において、モニターされる遺伝子は、公知であり、そしてあらかじめ単離されていなければならず、これは、異なる微小アレイ、または「ＤＮＡチップ」が各々の特殊化された使用のため、および試験されるあらゆる異なる型の生物または種のために作製されなければならないことを意味する。流動で送達されたｃＤＮＡから構築された微小アレイに関しては、有意な可変性の程度（例えば、２〜５倍）は、同じハイブリダイゼーション条件下で生成されるシグナルにおいて存在し（ＡｔｌａｓTM  ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、１９９８）、そしてこの系は、容易に再使用可能ではない。合成オリゴヌクレオチドの微小アレイに関しては、このようなアレイを作製するための著しい設定費用および高価なチップ読み出し機器は、このようなシステムが多くの潜在的な使用者の財力を越えていると推定される。配列タグ系において、特別な機器は必要ないが、高価なＤＮＡシークエンサーの設置ベースが、使用され得、さらに慣用的な発現分析は、有意な配列決定試行（例えば、数千の配列決定反応またはそれ以上）を必要とし；ＩＩ型タグ生成酵素の選択が限定され；そして現在のプロトコルにおいて配列タグの長さ（９つのヌクレオチド）が独特に標識され得るｃＤＮＡの数を厳密に限定する。大きなセットの遺伝子を発現する生物（例えば、哺乳動物細胞）について、全発現遺伝子について異なる９つのヌクレオチドタグの可能性が極度に低いことが、示され得る（例えば、Ｆｅｌｌｅｒ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、第Ｉ巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１）。
【０００６】
任意の供給源由来の既知の遺伝子かまたは未知の遺伝子のいずれかの分析を可能にする遺伝子発現を分析するための簡便かつ高感度な技術についての必要性があることが、上記から明白である。このような技術の利用可能性は、医薬および科学的研究だけでなく、多数の適用分野（例えば、農作物および家畜の開発、害虫の管理、薬物の開発、診断薬、疾患管理など）においてもまた、直接の適用が見出される。
【０００７】
（発明の要旨）
従って、本発明者の発明の目的は、差示的に発現される遺伝子を同定および単離するための方法を提供すること；異なる光学的シグナルを生成する標識に基づいてポリヌクレオチドを同定および単離する方法を提供すること；多くの遺伝子の遺伝子発現を同時にプロフィールするための方法を提供すること；遺伝子発現が、任意の所定の条件下で増加するかまたは減少するか否かに従って、その遺伝子を同定および分離する方法を提供すること；希少遺伝子を同定するための方法を提供すること；ならびに遺伝子発現によって単離された多くの遺伝子を、大量に並行サイン（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列決定する方法を提供することを含むが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明は、遺伝子発現を比較されるべき細胞供給源または組織供給源由来のポリヌクレオチドの、差示的に標識された集団を提供することにより、これらの目的そして他の目的を達成する。遺伝子発現の比較において、複数の集団の差示的に標識されたポリヌクレオチドは、固相支持体上にクローニングされたの参照ＤＮＡに、競合的にハイブリダイズする。好ましくは、その固相支持体は、微小粒子であり、それは、その競合的ハイブリダイゼーション後に、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、またはその微小粒子上の標識ポリヌクレオチドにより生成される光学的シグナルに応答性のある他の分類方法により操作され得る、差示的発現のライブラリーを提供する。微小粒子上の差示的標識の相対的シグナル強度をモニターすることにより、差示的な集団における特定の遺伝子の相対的な発現の定量化が可能となる。
【０００９】
本発明の１つの局面において、目的の相対的シグナル強度を有する微小粒子の集団を、ＦＡＣＳにより単離し、そして付着したポリヌクレオチドを配列決定して、希少遺伝子または差示的に発現される遺伝子の同定を決定する。
【００１０】
好ましくは、本発明の方法を、以下の工程により実行する：ａ）クローンの亜集団における別々の固相支持体に付着される核酸配列の参照集団を提供する工程；ｂ）各々の複数の異なる細胞または組織からの発現される遺伝子のポリヌクレオチドの集団を提供する工程で、その異なる細胞または組織からの発現される遺伝子のポリヌクレオチドは、異なる光生成標識を有する、工程；ｃ）各々の複数の異なる細胞または組織からの発現される遺伝子のポリヌクレオチドの集団に、その参照集団を競合的にハイブリダイズし、参照集団の配列と各々の異なる細胞または組織からのポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程で、すなわち、そのポリヌクレオチドは、その各々の固相支持体上に、その異なる細胞または組織におけるそのポリヌクレオチドに対応する遺伝子の相対的な発現に直接的に関係する比で、二重鎖で存在する、工程。およびｄ）そこに付着される二重鎖の光生成標識により生成される、相対的な光学的シグナル検出する工程。さらに好ましくは、その方法は、検出されたその相対的な光学的シグナルに従って、それぞれの固相支持体を分類する工程を含む。好ましくは、核酸の参照集団は、分析される複数の異なる細胞または組織の遺伝子に由来する。本明細書で使用される、語句「発現された遺伝子のポリヌクレオチド」は、転写により産生される任意のＲＮＡ（特にｍＲＮＡを含む）、および任意のＲＮＡの逆転写により産生されるＤＮＡ（特にｍＲＮＡの逆転写により産生されるｃＤＮＡを含む）を含むことが意味される。
【００１１】
本発明は、差示的に発現される遺伝子を、その配列のいずれの以前の分析または知識も必要とせずに、分離および同定するための組成物、方法、およびキットを提供することにより、当該分野における欠点を克服する。本発明はまた、差示的に調節される遺伝子を、分析用の調節されない遺伝子から分離することを可能にし、それにより目的の遺伝子についての情報を得るための大多数の調節されない遺伝子の分析の必要性を排除する。
【００１２】
（定義）
オリゴヌクレオチドタグに関連して、本明細書で使用される「相補体」または「タグ相補体」とは、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして、完全に適合される二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施態様において、そのオリゴヌクレオチドタグは、二本鎖または一本鎖のいずれであるよう選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補体」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補体か、二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補体のいずれかを含むことを意味される。
【００１３】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または改変されたモノマーあるいは連鎖の直鎖状オリゴマーを含み、それらは、モノマー−モノマー相互作用（例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型塩基対形成など）の規則的なパターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。通常モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結され、少数（例えば、３〜４）のモノマー単位から、何十（例えば、４０〜６０）のモノマー単位の大きさに渡るオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字配列により表示される場合はいつも、そのヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であり、そして他に表示がない場合、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが、理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然のヌクレオチドを含むが；しかし、それらはまた非天然のヌクレオチドアナログを含む。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素によるプロセッシングが必要な場合）、通常天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされることは、当業者に明らかである。
【００１４】
二重鎖に関連して「完全に適合される」とは、二重鎖を構成するポリ−またはオリゴヌクレオチド鎖が、他のそれらと、各鎖の全てのヌクレオチドが、もう一方の鎖におけるヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対形成を起こすように、二重鎖構造を形成することを意味する。その用語はまた、使用され得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成も含む。三重鎖に関して、その用語は、三重鎖が、完全に適合される二重鎖および全てのヌクレオチドが完全に適合される二重鎖の塩基対とフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合を起こす第三の鎖からなることを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「不適合」とは、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチド対または三重体が、ワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーンおよび／または逆フーグスティーン結合を起こさないことを意味する。
【００１５】
本明細書で使用される、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシ形態（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるような）を含む、天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関連して「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載される）を含み、それらは、特異的なハイブリダイゼーションが可能である条件のみを含む。そのようなアナログは、結合特性を増強する、複雑性を減少する、特異性を増加するなどのために設計される合成ヌクレオシドを含む。
【００１６】
ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用される「配列決定」または「ヌクレオチド配列を決定すること」は、そのポリヌクレオチドの部分的配列ならびに全長配列の情報の決定を含む。つまり、その用語は、配列比較、フィンガープリンティング、および類似の標的ポリヌクレオチドについての情報のレベル化、ならびに標的ヌクレオチドにおけるヌクレオシド（通常各ヌクレオチド）の発現同定および順序付けを含む。その用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４つの型のヌクレオチドのうち１、２、または３つの同定、順序付け、および位置の決定を含む。例えば、いくつかの実施態様において、配列決定は、標的ヌクレオチド「ＣＡＴＣＧＣ」内の単一型のヌクレオチド（例えば、シトシン）の順序および位置の同定によりもたらされ得、それによって、その配列は、２進法のコード（例えば、「Ｃ−（非Ｃ）−（非Ｃ）−Ｃ−（非Ｃ）−Ｃ．．．」に対して「１００１０１．．．」など）のように表される。
【００１７】
本明細書に使用される、ヌクレオチドの集団に関する用語「複雑性」は、その集団に存在する異なる種のポリヌクレオチドの数を意味する。
【００１８】
本明細書に使用される、遺伝子に関する用語「相対的な遺伝子発現」または「相対的発現」とは、異なる細胞型または組織型の同じ遺伝子発現産物（通常、ｍＲＮＡ）の相対的な存在度をいう。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、目的の単一のまたは複数の細胞型および／または組織型における相対的な遺伝子発現の分析のための組成物、方法、およびキットを提供する。本発明の方法は、動物、植物、および真菌、細菌、マイコプラズマ、シアノバクテリア、藻類などのような微生物由来のポリヌクレオチドに適用され得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、動物、植物、または発酵プロセスに関連する微生物に由来し、最も好ましくは、脊椎動物および農業植物由来である。複数とは、通常、疾患の組織型または細胞型および健常な組織型または細胞型のような、または刺激またはストレス（例えば、栄養素、温度などの変化）に供される細胞型ならびに組織型および非ストレスまたは非刺激状態下に対応する細胞型または組織型のような、細胞型または組織型の対を含む。別の実施態様において、複数とは、異なる生物体由来の細胞および組織のような、相同遺伝子を有する細胞型または組織型の対を含み得る。複数とはまた、同じ細胞または組織（例えば、候補薬物に生物体を曝露した後の肝臓細胞、異なる発生状態での試験動物の器官細胞など）の経時的な発現パターンの比較に必要とされるような、２つ以上の細胞型または組織型を含み得る。好ましくは、複数とは、２または３つの細胞型または組織型；そしてより好ましくは、２つの細胞型または組織型である。
【００２０】
本発明の方法は、代表的にクローンの亜集団における別々の固相支持体に付着する核酸配列の参照集団を提供する工程、発現される遺伝子のポリヌクレオチドの少なくとも１つの集団を提供する工程、発現される遺伝子のポリヌクレオチドの集団に参照核酸集団をハイブリダイズする工程、および固相支持体に付着される二重鎖により生成される相対的な光学的シグナルに従って、それぞれの固相支持体を検出する、そして好ましくは分類する工程を含む。
【００２１】
図１０Ａは、微小粒子上の参照核酸集団を構築するための発明の実施態様を図示し、そして図１０Ｂは、そのような参照ライブラリーを使用して、２つの細胞集団の遺伝子発現を比較するための実施態様を図示する。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、細胞集団（１０００）および（１００２）から、従来のプロトコールを使用して抽出し（１００４）、それぞれ、ポリヌクレオチド（１００６）および（１００８）の２つの集団を与える。この抽出反応は、別々に実行され得るか、または細胞型の混合物に対して実行され得る。好ましくは、その反応は、別々に実行され、そのため２つの集団由来のｍＲＮＡの相対的な量をより容易に制御し得る。ｍＲＮＡ（１００６）およびｍＲＮＡ（１００８）の部分が、結合され（１０１０）、そしてｃＤＮＡライブラリー（１０１２）は、Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，８４６，７１９号に記載される手順に従って、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを保持するベクター内に構築される。好ましくは、ｍＲＮＡの同量の部分（すなわち等モル量）が、ｍＲＮＡの各集団から取得される。ライブラリー（１０１２）由来のベクターのサンプルを取得し、そして例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、トランスフェクションおよびクローニングなどにより増幅し、その後、ベクターに保持されるタグｃＤＮＡ結合体（１０１４）を切り出すか、またはコピーして（１０１１）、次いで単離する。次いでロードされた微小粒子を形成し、そして以下のような競合的ハイブリダイゼーションでの使用のために調整した（１０１８）。オリゴヌクレオチドタグａ、ｂ、ｃ、およびｄで示される、単離されたタグｃＤＮＡ結合体（１０１４）を、それぞれこれらのタグ相補体ａ’、ｂ’、ｃ’、およびｄ’（１０１６）を保持する微小粒子に特異的にハイブリダイズさせる。タグｃＤＮＡ結合体を、タグ相補体に連結し、この結果二本鎖タグｃＤＮＡ結合体の少なくとも一本鎖は、微小粒子に共有結合的に付着される。タグｃＤＮＡ結合体を保持する微小粒子を、タグｃＤＮＡ結合体を保持しない微小粒子から、好ましくは、蛍光活性化細胞分類装置（ＦＡＣＳ）、または類似の装置を使用して分離する。非共有結合的に付着された鎖を、融解除去し、微小粒子から分離して参照核酸集団を保持する微小粒子（１０２０）を作製する。
【００２２】
図１０ｂに図示されるように、細胞の遺伝子発現（１０５０）を、各細胞型由来のｍＲＮＡ（１０５６）および（１０５８）を別々に抽出する（１０５４）ことにより、細胞（１０５２）の遺伝子発現と、比較し得る。従来のプロトコールを使用した、ｃＤＮＡライブラリー（１０６２）および（１０６４）の構築後、一本鎖核酸プローブを、それぞれのｃＤＮＡ集団（１０６２）および（１０６４）から生成し、好ましくは、そのプローブを、光学的に識別可能な蛍光色素Ｆ（１０６８）およびＲ（１０６６）（例えば、ローダミンおよびフルオレッセイン）で標識する。等量の標識ポリヌクレオチドを混合し、そして微小粒子に保持される相補鎖にハイブリダイズ（１０７２）させて、二重鎖（１０７４）を形成させる。ハイブリダイゼーションが完了後、それによって形成される二重鎖を保持する微小粒子（１０７４）は、所定の基準（例えば、蛍光比、蛍光強度、および／またはその類似のもの）により分類され得る（１０７６）。そのような方法で、目的の亜集団が、単離され得、さらに分析され得る（例えば、そのアップレギュレートされた遺伝子またはダウンレギュレートされた遺伝子に対応する亜集団）。
【００２３】
本発明に従う分析のために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、従来のプロトコール（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるような）を使用して、目的の細胞または組織から抽出する。好ましくは、比較されるべきｍＲＮＡの集団を、参照ＤＮＡ集団へのハイブリダイゼーションに先立って、従来のプロトコール（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：６８０−６８６（１９９７）；または類似のもの）を使用して、標識ヌクレオチド三リン酸の存在下で逆転写により標識ｃＤＮＡの集団に転換する。
【００２４】
本発明の重要な特徴は、発現レベルが変化するか、または試験される他の細胞または組織の遺伝子の発現レベルと異なる遺伝子が、調節されない遺伝子か、または研究されるいかなるストレスまたは条件に対する応答においても変化される別の遺伝子から別々に分析され得ることである。以下に記載のように、好ましい実施態様において、目的の細胞または組織由来の遺伝子産物を、別々の微小粒子に対するクローンの亜集団に付着されるＤＮＡ配列からなる参照集団で競合的にハイブリダイズする。結果として、差示的な発現を示す比で標識遺伝子産物を保持する微小粒子は、操作され得、そして発現での変化を示さない比の標識遺伝子産物（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子、構造タンパク質をコードする遺伝子など）を保持する微小粒子とは別々に分析され得る。
【００２５】
本発明の別の重要な特徴は、分析される核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ転写物などのような遺伝子産物）の正体を、分析の前に知る必要がないことである。相対的な活性を決定した後、発現される遺伝子に由来するｃＤＮＡを、多くの異なる配列決定アプローチを使用して、固相支持体（好ましくは、微小粒子）上で直接的に配列決定することにより同定し得る。同定のために、ｃＤＮＡの一部のみが配列決定される必要がある。多くの場合、その部分は、９または１０個のヌクレオチドと同じくらい小さくあり得る（例えば、Ｖｅｌｃｕｅｓｃｕら（上記に引用））。好ましくは、差示的に発現される遺伝子の全体の亜集団を、ＭＰＳＳ、または同様の並行分析技術を使用して同時に配列決定する。好ましい実施態様において、これは、各々のＤＮＡ配列がクローンの亜集団における別々の微小粒子に付着されるように、ＤＮＡ配列の参照集団を提供することにより便利に達成される。本明細書で使用される、語句「クローンの亜集団」とは、目的の集団から選択される単一の種のポリヌクレオチドの複数のコピーのことをいう（例えば、遺伝子発現が分析される細胞または組織から抽出されるｍＲＮＡから構築されるｃＤＮＡライブラリー）。そのようなクローンの亜集団は、ポリヌクレオチドの別々の増幅および従来の付着化学（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）による付着を含む、多くの方法で形成され得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６））。以下により十分に説明されるように、クローンの亜集団を、好ましくは、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号およびＢｒｅｎｎｅｒら米国特許第５，８４６，７１９号（本明細書に参考として援用される）に開示される、いわゆる「固相クローニング」により形成する。要するに、そのようなクローンの亜集団を、タグＤＮＡ結合体の増幅されたサンプルを、１以上の固相支持体（例えば、別々の、かつ連結しない微小粒子）上にハイブリダイズすることによって形成し、それにより、個々の微小粒子または大きい支持体の異なる領域は、同じＤＮＡの複数の付着されたコピーを有する。
【００２６】
タグＤＮＡ結合体のＤＮＡ成分は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフラグメント、あるいは合成ＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチドのような）であり得る。好ましくは、タグＤＮＡ結合体は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）のフラグメントである。クローンの亜集団におけるｃＤＮＡまたはｇＤＮＡのコピー数は、いくつかの因子に依存する異なる実施態様において広範に変化し得、そのいくつかの因子としては、固相支持体上のタグ相補体の密度、使用される微小粒子の大きさおよび組成物、ハイブリダイゼーション反応の継続時間、タグレパートリーの複雑性、個々のタグの濃度、タグＤＮＡサンプルの大きさ、光学的シグナルの生成のための標識方法、粒子分類方法、シグナル検出系などが挙げられる。
【００２７】
これらの因子に関連する設計選択を作製するガイダンスは、本明細書に引用される参照に表示されるような、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、分子生物学、ハイブリダイゼーション技術、および関連する学問分野の文献において、容易に利用可能である。好ましくは、クローンの亜集団におけるｃＤＮＡまたはｇＤＮＡのコピー数は、微小粒子のＦＡＣＳ検出および／または分類を可能にするのに十分であり、ここで蛍光シグナルは、微小粒子に付着されるｃＤＮＡにより保持される１以上の蛍光色素分子により生成される。代表的に、この数は、フルオレッセインのような蛍光分子を使用する場合、数千（例えば、３，０００〜５，０００）ぐらいに低くあり得、ローダミン６Ｇのようなローダミン色素を使用する場合、数百（例えば、８００〜８０００）ぐらいに低くあり得る。より好ましくは、ロードされた微小粒子がはＦＡＣＳまたは類似の装置により、検出され、および／または分類される場合、クローンの亜集団は、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡの少なくとも１０4コピーのからなり；最も好ましくは、そのような実施態様において、クローンの亜集団は、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡの少なくとも１０5コピーのからなる。
【００２８】
比較するべき細胞または組織由来の標識ｃＤＮＡまたはＲＮＡを、従来のハイブリダイゼーション条件（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、（上記に引用）；ＤｅＲｉｓｉら（上記に引用）；またはＳｈａｌｏｎ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓタイトル「ＤＮＡマイクロアレイ」Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）に開示されるような）を使用して、参照ＤＮＡ集団のＤＮＡ配列に対して競合的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、光学的シグナルが、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのそれぞれ２つの標識種により生成され、それにより、相対的光学的シグナルが、それぞれの微小粒子について決定される。好ましくは、そのような光学的シグナルは、蛍光活性細胞分類装置、または類似の装置で生成され、そして測定される。それら装置は、微小粒子を分類し、そして、どの相対的な光学的シグナルが、所定の範囲の値に落ちるかを累算し得る。所望の範囲の相対的な光学的シグナルを生成するｃＤＮＡまたはＲＮＡでロードされた微小粒子は単離され得、そしてＭＰＳＳ（以下により詳細に記載される）のような、配列決定により同定され得る。
【００２９】
好ましくは、ＲＮＡ由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子のクローン亜集団は、図３ａおよび図３ｂに例示されるプロセスを使用して微粒子に付着される。初めに、図３ａに例示されるように、ｍＲＮＡ（３００）は、目的の細胞または組織供給源から従来の技法を用いて抽出され、そしてベクター（３１６）中への挿入に適切な末端を有するｃＤＮＡ（３０９）へ変換される。好ましくは、５’ビオチン（３０５）およびポリ（ｄＴ）領域（３０６）を有するプライマー（３０２）は、ｃＤＮＡ（３０９）の第一鎖が、４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、逆転写酵素で合成されるために、ｍＲＮＡ鎖（３００）とアニーリングされる。好ましくは、５−メチルデオキシシチジントリホスフェートは、ｃＤＮＡ（３０９）がプライマー（３０２）に対応する領域を除いて、半メチル化されるために、第一鎖合成におけるデオキシシトシントリホスフェートの代わりに用いられる。これは、プライマー（３０２）が支持体からｃＤＮＡを解離するために非メチル化制限部位を含むことを可能にする。プライマー（３０２）におけるビオチンの使用は、本発明に重大ではなく、そして他の分子捕捉技法、または部分（例えば、三重鎖捕捉など）が用いられ得る。プライマー（３０２）の領域（３０３）は、好ましくは、ｃＤＮＡ（３０９）の第二鎖の合成で制限部位ｒ2（３０４）の形成を生じるヌクレオチドの配列を含む。ストレプトアビジン支持体（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）など）にビオチン化ｃＤＮＡを結合することによって単離した後、ｃＤＮＡ（３０９）は、好ましくは、（Ｃの）半メチル化には非感受性で、そして部位ｒ1（３０７）を認識する制限エンドヌクレアーゼで切断される。好ましくは、ｒ1は、実質的に全てのｃＤＮＡが切断されること、および同一の規定された末端が全てのｃＤＮＡにおいて生成されることを保証する４塩基認識部位（例えば、ＤｐｎＩＩなどのような酵素に相当する）である。洗浄後、次いで、このｃＤＮＡは、ｒ2を認識する制限エンドヌクレア−ゼを用いて切断され、例えば、エタノール沈殿、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標準的な技法を用いて精製されるフラグメント（３０８）を放出する。適切な緩衝液中に再懸濁後、フラグメント（３０８）は、タグ（３１０）ならびに末端（３１２）および末端（３１４）を有するクローニング部位を保有するベクター（３１６）中へ定方向的にライゲーションされる。好ましくは、ベクター（３１６）は、クローニング部位において「スタッファー（ｓｕｔａｆｆｅｒ）」フラグメントを用いて調製され、クローニングのために完全に切断されたベクターの単離を援助する。
【００３０】
タグ−ｃＤＮＡ結合体の調製は、上記の方法に限定されないが、従来の分子生物学的技法を用いる多様な方法で、容易に達成され得る。例えば、ｃＤＮＡは、従来の方法で調製され得、そしてゲル電気泳動によって単離され得る。この方法は、ある部分ではあまり好ましくない。なぜならば、参照集団（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の大きさの分布を偏らせるからである。このタグは、アダプターのライゲーションによってか、オリゴｄＴプライマーおよびランダムプライマーを用いるＰＣＲによってか、またはＲＡＣＥ技法（Ｂｅｒｔｌｉｎｇら（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：９５−９９；Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：３４０−３５６；ＭａｒａｔｈｏｎTMＣＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって付着され得る。上記に記載のような、ベクターへのクローニングによるタグの付着は、（代表的にはほんのμｇ量を生成するにすぎないＲＡＣＥに対して）大量の参照集団を生成する能力、ならびにタグの配列を確認する能力を含む、いくつかの理由のために好ましい。
【００３１】
タグ−ｃＤＮＡ結合体のライブラリーの形成の後、宿主細胞のサンプルは、培養培地の単位容積あたりの組換え体の数を決定するために通常プレートされる。さらなるプロセシングのために得られたサンプルのサイズは、好ましくは、ライブラリー構築物において使用されるタグレパートリーのサイズに依存する。Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，８４６，７１９号およびＢｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，６０４，０９７号に教示されるように、サンプルは、好ましくは、「ダブルス（ｄｏｕｂｌｅｓ）」（すなわち、同一のタグおよび異なるｃＤＮＡを保有する二つ以上の結合体）の選択を最小化するためにタグレパートリーのサイズの約１％に等しい多くの結合体を含む。したがって、８つの語の最小クロスハイブリッド形成セットから選択された８つの４−ヌクレオチド「語」の連鎖からなるタグレパートリーのために、サイズのレパートリーは、８8、または約１．７×１０7タグである。したがって、このようなレパートリーとともに、約１．７×１０5結合体含有ベクターのサンプルは、好ましくは、図３ｂに例示されるような増幅およびさらなるプロセシングのために選択される。
【００３２】
好ましくは、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、以下の配列の要素を含むベクター（３３０）中に保有される：第１のプライマー結合部位（３３２）、制限部位ｒ3（３３４）、オリゴヌクレオチドタグ（３３６）、接合部（３３８）、ｃＤＮＡ
（３４０）、制限部位ｒ4（３４２）、および第２のプライマー結合部位（３４４）。タグ−ｃＤＮＡ結合体を含有するベクターのサンプルが得られた後、以下の工程が実施される：タグ−ｃＤＮＡ結合体が、好ましくは、５−メチルデオキシシチジントリホスフェイトの存在下において、ビオチニル化プライマー（３４８）および標識化プライマー（３４６）を用いることによって、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でベクター（３３０）から増幅される工程、その後、生じたアンプリコンが、ストレプトアビジン捕捉によって単離される工程。制限部位ｒ3は、好ましくは、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＦｅｓＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩなど、まれな切断をする（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼに対応し、これらは捕捉されたアンプリコンを、アンプリコンのｃＤＮＡ内の部位で生じる切断が最小限の確率で、支持体から遊離されることを可能にする。適切なＤＮＡポリメラーゼがｄＧＴＰとともに用いられる場合、以下の配列として例示されるジャンクション（３３８）は、ＤＮＡポリメラーゼ「ストリッピング」反応を生じ、Ｇトリプレットで停止される。
【００３３】
５’・・・ＧＧＧＣＣＣ・・・
３’・・・ＣＣＣＧＧＧ・・・
簡潔に言えば、「ストリッピング」反応において、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性（好ましくは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ）は、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７；およびＫｕｉｊｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１１２：１４７−１５５（１９９２）によって教示されるように、一本鎖のタグ−ｃＤＮＡ結合体のタグを与えるために用いられる。分類がタグとタグ相補体との間の二重鎖の形成によって達成される好ましい実施態様において、タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグは、第一に４つの天然のヌクレオチドのうち３つのみを含む語を選択することにによって、次いで、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性を有する３’→５’方向においてタグ−ｃＤＮＡ結合体由来の３つのヌクレオチド型を優先的に消化することによって一本鎖にされる。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドタグは、Ａ、Ｇ、およびＴのみを含むように設計される；したがって、（二重鎖タグ−ｃＤＮＡ結合体を含む）タグ相補体は、Ａ、Ｇ、およびＴのみからなる。遊離したタグ−ｃＤＮＡ結合体が、ｄＧＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼと処理される場合、タグの相補鎖は、第一のＧで「ストリッピング」される。この点において、ＤＮＡポリメラーゼによるｄＧの取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を平衡化し、「ストリッピング」反応を効果的に停止する。上記の記載から、当業者が、同様の目的を行う（すなわち、タグを一本鎖にする）ために、多くの代替的設計の選択をし得ることは明らかである。このような選択は、異なる酵素、タグを作りあげる語の異なる組み合わせなどの選択を含み得る。
【００３４】
「ストリッピング」反応がクエンチされる場合、結果は、一本鎖タグ（３５７）を有する二重鎖（３５６）である。単離後、工程（３５８）が、実施される：タグ−ｃＤＮＡ結合体が、微粒子に付着したタグ相補体へハイブリダイズされ、充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応が、タグ−ｃＤＮＡ結合体の相補鎖と微粒子（３６０）に付着したタグ相補体（３６２）の５’末端との間の任意のギャップを埋めるために行われ、そしてタグ−ｃＤＮＡ結合体の相補鎖は、リガーゼで処理することによってタグ相補体（３６２）の５’末端（３６３）と共有的に結合される。この実施態様は、もちろん、（例えば、Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼなどのようなキナーゼによって）タグ相補体の５’末端がリン酸化されることを必要とする。「ストリッピング」反応が、常には最初のＧで停止しないので、充填反応が好ましくは実行される。好ましくは、充填反応は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのような、５’→３’エキソヌクレア−ゼ活性および鎖置換活性を欠失したＤＮＡポリメラーゼを用いる。また好ましくは、Ｇトリプレットを超えて伸長される「ストリッピング」に備えて、４つ全てのｄＮＴＰは、充填反応に用いられる。
【００３５】
以下にさらに説明されるように、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、タグ相補体の全てのレパートリーとハイブリダイズされる。つまり、微粒子の集団の中に、レパートリー全体のあらゆるタグ配列を有する微粒子が存在する。従って、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、およそ約１％の微粒子上のみのタグ相補体とハイブリダイズする。タグ−ｃＤＮＡがハイブリダイズされた微粒子は、本明細書中で「ロードされた微粒子」といわれる。より大きい有効性のために、ロードされた微粒子は、好ましくは、さらなるプロセシングのためにロードされていない微粒子から分離される。このような分離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）か、または多数の個々の微粒子の迅速な操作および分類を可能にする同様の機器の使用によって容易に達成される。図３ｂに例示される実施態様において、蛍光標識物（例えば、ＦＡＭ（フルオレセイン誘導体、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６）））が、プライマー（３４６）を経由して付着される。
【００３６】
このタグ−ｃＤＮＡは、上記で議論された多くの工程を省略するか、または改変する手順によって微粒子上のタグ相補体へ付着され得る。例えば、ベクター（３３０）からタグ−ｃＤＮＡを増幅するかわりに、タグ−ｃＤＮＡは、微粒子上のタグ相補体への直接的な、制限消化、ストリッピング化、およびライゲーション化によって、ベクターから切断され得る。この手順は、（１）タグ−ｃＤＮＡをビオチンおよびＦＡＭで標識する工程、（２）タグ−ｃＤＮＡを増幅する工程、および（３）ストレプトアビジン捕捉によってアンプリコンを単離する工程、を省略する。所望される場合、ロードされた微粒子は、ＦＡＭ標識化プライマーとハイブリダイズすることによって単離され得る。
【００３７】
図３ｃに示すように、ＦＡＣＳ、または類似の分類（３８０）後、ロードされた微粒子（３６０）は、単離され、標識（３４５）を除去するために処理され、そして非共有的に付着した鎖をメルトオフ（ｍｅｌｔ  ｏｆｆ）するために処理される。標識（３４５）は、競合的にハイブリダイズされた鎖の標識と干渉しないように、除去されるか、または非活性化される。好ましくは、タグｃＤＮＡ結合体は、プライマー結合部位（３４４）に隣接するタグ−ｃＤＮＡ結合体を切断する制限エンドヌクレア−ゼ認識部位ｒ1（３４２）で処理され、それによって「ボトム」鎖（すなわち、微粒子にその５’遠位端を有する鎖）によって保有される標識（３４５）を除去する。
好ましくは、この切断は、突出した鎖（３８５）を有する二重鎖タグ−ｃＤＮＡ結合体（３８４）を有する微粒子（３６０）を生じる。次いで、３’−標識化アダプター（３８６）は、アニーリングされ、そして突出した鎖（３８５）にライゲーションされる。この後、ロードされた微粒子は、３’−標識によって再分類され、そして３’−標識を有する鎖はメルトオフされ、差示的に発現される遺伝子由来の変性ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを受容できるｃＤＮＡ（３９２）の共有的に付着した一本鎖を解離する。好ましくは、この３’−標識化鎖は、水酸化ナトリウム処理で、または同様の試薬を用いる処理でメルトオフされる。
【００３８】
ｇＤＮＡのクローン亜集団は、類似の様式で微粒子に付着され得る。第一に、ゲノムＤＮＡは、目的の細胞または組織供給源から従来の技法を用いて単離され、そして好ましくは、４塩基認識で認識で切断する少なくとも１つの制限エンドヌクレア−ゼ（例えば、ＤｐｎＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｔＵＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、ＴａｑαＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉなどのような）で切断される。好ましくは、この切断フラグメントは、少なくとも１つの塩基のオーバーハングを有する。あるいは、ゲノムＤＮＡフラグメントは、単離されたゲノムＤＮＡを剪断するか、または超音波処理するかによって調製され得る。次いで、タグは、タグ配列を含むプライマーを用いるランダムプライマーＰＣＲ、またはｃＤＮＡ参照集団に関する上記の記載に類似した様式でのタグを含むベクター中へのクローニングを含む、多くの方法でｇＤＮＡと連結され得る。ＦＡＭのような標識は、微粒子のローディングをモニターするために付着され得る。いくつかの例において、微粒子上への指向性の付着は、例えば、ＴＡＴＡボックス、または共通配列に相補的な配列のような共通配列を有するプライマーと共にｇＤＮＡを増幅することによって達成され得る。遺伝子発現を評価するためにｇＤＮＡ参照集団を用いる場合、ｇＤＮＡライブラリーにおいて非コード配列およびイントロンを減少することが所望され得る。例えば、約６０×１０6個の微粒子の大きなｇＤＮＡライブラリーは、プローブとしてｃＤＮＡプールを使用して、選択することによって約３０，０００〜４０，０００へ減少され得る。
【００３９】
（同定および固相クローニングのためのオリゴヌクレオチドタグ）
本発明の重要な特徴は、固相支持体（好ましくは、微粒子）に付着した参照ＤＮＡ集団を構築するためのオリゴヌクレオチドの最小クロスハイブリッド形成セットのメンバーであるオリゴヌクレオチドタグを使用することである。最小クロスハイブリッド形成セットのオリゴヌクレオチドの配列は、同一のセットのあらゆる他のメンバーの配列と、少なくとも２つのヌクレオチドだけ異なる。従って、このようなセットの各々のメンバーは、２つより少ないミスマッチを有する任意の他のメンバーの相補体と二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。オリゴヌクレオチドタグの相補体（本明細書で「タグ相補体」と言う）は、天然のヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。オリゴヌクレオチドタグが分類（同様に、参照ＤＮＡ集団の構築）に用いられる場合、タグ相補体は、好ましくは、固相支持体に付着される。オリゴヌクレオチドタグは、それらの対応するタグ相補体を用いる場合、分子、特に発現した遺伝子に由来するｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドの分類、追跡、または標識のためのハイブリダイゼーションの特異性を増強する手段を提供する。
【００４０】
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補体の最小クロスハイブリッド形成セットは、クロスハイブリッド形成が、最小化されると考えられる所望されたセットの大きさおよび程度（または言い換えれば、特異性が増大したと考えられる程度）に依存して組み合わせか、または個別にのいずれかで合成され得る。例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，６０４，０９７号に開示されたように構築した場合、最小クロスハイブリッド形成セットは、少なくとも４つのヌクレオチドによりお互いに区別される個々に合成された１０マー配列のセット（このようなセットは、３３２の最大サイズを有する）からなり得る。あるいは、オリゴヌクレオチドタグの最小クロスハイブリッド形成セットはまた、それ自身が最小クロスハイブリッド形成セットから選択されるサブユニットから、組み合わせて組立てられ得る。例えば、少なくとも３つのヌクレオチドにより相互に区別される最小クロスハイブリッド形成１２マーのセットは、３つのヌクレオチドによってお互いに各々区別される、最小クロスハイブリッド形成４マーのセットから選択される、３つのサブユニットを組み合わせることによって合成され得る。このような実施態様は、、１２マー、９3（すなわち７２９）の最大サイズセットを与える。
【００４１】
組み合わせて合成される場合、オリゴヌクレオチドタグは、その長さに沿った個々の位置でランダム化され得る。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、複数のサブユニットからなり、各サブユニットは３〜９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなり、ここで各サブユニットは、同一の最小クロスハイブリット形成セットから選択される。このような実施態様において、利用可能なオリゴヌクレオチドの数は、１タグあたりのサブユニットの数、およびサブユニットの長さに依存する。オリゴヌクレオチドタグはまた、オリゴヌクレオチドのどちらか一方の末端にさらなるヌクレオチドを有する複数のサブユニットからなり得る。さらなるヌクレオチドは、ランダムであり得るかおよび／または制限部位を含み得る。このような構造は、オリゴヌクレオチドの末端にミスマッチを有する二重鎖または三重鎖の不安定性を保証する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは少なくとも一端において、レア切断制限エンドヌクレア−ゼのための認識部位を含む。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１つの末端にＡＴリッチ制限部位（例えば、ＰａｃＩ部位）を含む。Ｂｓｐ１２０部位が、もう一方の末端に好ましい部位である。
【００４２】
１つ以上の固相支持体に付着したオリゴヌクレオチドタグの相補体は、それぞれタグを含有するポリヌクレオチドの混合物からポリヌクレオチドを分類するために用いられる。このようなタグ相補体は、ビーズ（好ましくは、微視的な）のような固相支持体の表面上か、または単一支持体の合成位置のアレイ上の特定の位置で、同一な配列の集団、または実質的に同一な配列の集団が特定の領域で生成するように、合成される。言い換えれば、ビーズの場合は各支持体の表面、またはアレイの場合は各領域の表面が、特定の配列を有するタグ相補体の１つの型のみの複製によって体化される。このようなビーズまたは領域の集団は、それぞれに異なる配列を有するタグ相補体のレパートリーを含む。オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補体に関して本明細書中で用いられる場合、用語「レパートリー」とは、固相クローニング（分類）または同定のために使用される、異なるオリゴヌクレオチドタグまたはタグ相補体の総数を意味する。レパートリーは、個別に合成されるオリゴヌクレオチドの最小クロスハイブリット形成セットのセットからなり得るか、または最小クロスハイブリット形成オリゴヌクレオチドの同一のセットからそれぞれ選択されたオリゴヌクレオチドの連結からなり得る。後者の場合、レパートリーは、好ましくは、組み合わせて合成される。
【００４３】
好ましくは、タグ相補体は、微粒子上に組み合わせて合成され、そのために各微粒子は、同一のタグ相補体の多くのコピーに付着された。以下の模範的参考に開示されたコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＧＰ）、高クロスリンク化ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどからできた微粒子を含む、広範な種々の微粒子支持体が、本発明で用いられ得る：Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第Ａ節，１１−１４７頁、第４４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；同第４，４１３，０７０号；および同第４，０４６，７２０号；およびＰｏｎ、第１９章、Ａｇｒａｗａｌ編中、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３）。さらに、微粒子支持体は、市販のヌクレオシド由来ＧＰＧ、および（例えば、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能な）ポリスチレンビーズ；磁気ビーズ誘導体；ポリエチレングリコールとグラフト化したポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭ，Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）；などを含む。微粒子はまた、Ｎｉｌｓｅｎら、米国特許第５，１７５，２７０号により開示されるようなデンドリメリック（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）構造からなり得る。一般的に、微粒子のサイズと形は、重大な意味を持たない；しかし、微粒子は、直径で数（例えば、１〜２）μｍ〜数百（例えば、２００〜１０００）μｍのサイズ範囲内が好ましい。なぜならばこれらは、最小限の試薬およびサンプルの使用法でオリゴヌクレオチドタグの大きなレパートリーの構築および操作を容易にするからである。好ましくは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）から入手可能なグリシダルメタクリレート（ｇｌｙｃｉｄａｌ  ｍｅｔａｃｒｙｌａｔｅ）（ＧＭＡ）ビーズは、本発明における微粒子として用いられる。このような微粒子は、種々のサイズにおいて有用であり、そしてタグおよび／またはタグ相補体を合成するための種々の関連群とともに入手可能である。より好ましくは、直径５μｍのＧＭＡビーズが使用される。
【００４４】
好ましい実施態様において、分類されるか、または固相支持体上にクローン化されるべきポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するように付着されたオリゴヌクレオチドタグをそれぞれ有する。この状態は、ポリヌクレオチドの集団より実質的に多いタグのレパートリーを使用することによって、およびタグ化ポリヌクレオチドの全集団からタグ化ポリヌクレオチドの十分に小さいサンプルを得ることによって達成される。このようなサンプリングの後、支持体およびポリヌクレオチドの集団が、オリゴヌクレオチドタグとそれらのそれぞれの相補体との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される場合、同一のポリヌクレオチドは、特定のビーズまたは領域上で分類する。もちろん、サンプリングされたタグ−ポリヌクレオチド結合体は、好ましくは、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミド中へのクローニング、ＲＮＡ転写など、によって）増幅され、次の分析のために十分な材料を提供する。
【００４５】
オリゴヌクレオチドタグは、本発明の特定の実施態様における２つの異なる目的のために使用される：オリゴヌクレオチドタグは、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号；および国際特許公開ＷＯ９６／４１０１１に記載されたような固相クローニングを実施するために使用される、ここで多数（例えば、数千から数十万）のポリヌクレオチドは、分析のために混合物から１つ以上の固相支持体上の同一のポリヌクレオチドのクローン亜集団へ分類され、そしてそれらは、例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開ＷＯ９７／４６７０４に開示されるような、数十から数千の数の範囲に達するアダプターをコードするようなポリヌクレオチドを同定するための標識を送達する（または許容する）ために使用される。前者の使用に関して、代表的には、多数、またはレパートリーのタグが必要とされ、そのために個々のオリゴヌクレオチドタグの合成は困難である。これらの実施態様において、このタグの組み合わせの合成が好ましい。他方、例えば、２から数十の範囲における複数の種類または亜集団の（例えば、アダプターをコードした）ポリヌクレオチドに対する標識を送達するために極端に多くのレパートリーのタグが、必要とされない場合、最小クロスハイブリダイズ形成セットのオリゴヌクレオチドタグは、個別に合成、および組み合わせで合成され得る。
【００４６】
数百から数千（またはさらに数万）のオリゴヌクレオチドを含むセットは、例えば、Ｆｒａｎｋら米国特許第４，６８９，４０５号；Ｆｒａｎｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：４３６５−４３７７（１９８３）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：１１０−１１６（１９９５）；Ｆｏｄｏｒら、国際特許公開ＷＯ９３／２２６８４；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２６（１９９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：２１７−２２７（１９９４）、Ｂｒｅｎｎａｎ、国際特許公開ＷＯ９４／２７７１９；Ｌａｓｈｋａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７９１２−７９１５（１９９５）；などに開示されるような種々の並行合成のアプローチによって直接合成され得る。
【００４７】
好ましくは、混合物におけるタグ相補体は（組み合わせで合成されていようと、個別に合成されていようと）、お互いに類似した二重鎖または三重鎖安定性を有するように選択される。従って完全にマッチしたハイブリットは、類似したまたは実質的に一致した融点温度を有する。これは、ミスマッチタグ相補鎖が、ハイブリダイゼーション工程において（例えば、ストリンジェントな条件下の洗浄によって）完全にマッチしたタグ相補鎖からもっと容易に識別されることを可能にする。組み合わせで合成されたタグ相補体のために、最小クロスハイブリダイズ形成セットは、このセットにおける全ての他のサブユニットのように二重鎖安定性へほぼ同等に寄与するサブユニットから構築され得る。このような選択を実行するための手引きは、最適なＰＣＲプライマーの選択および二重鎖安定性の算出に関する公開された技法によって提供される（例えば、Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：８５４３−８５５１（１９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：３７４６−３７５０（１９８６）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：２２７−２５９（１９９１）；など）。オリゴヌクレオチドの最小クロスハイブリダイズ形成セットは、ＧＣ含有量、ミスマッチの分布、理論的融点温度などのようなさらなる基準によってスクリーニングされ得、最小クロスハイブリット形成セットでもあるサブセットを形成する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補体は、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機）で、ホスホロアミダイト化学（例えば、以下の参考に開示される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号、Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号；など）のような標準的な化学を用いて、容易に合成される。
【００４９】
分類のためのオリゴヌクレオチドタグは、１２から６０ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、１８から４０ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得る。より好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、２５から４０ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得る。サブユニットの好ましいおよびより好ましい数に関して、それらの範囲は、以下に表され得る：
【００５０】
【表１２】
0004344086.tif 000002
最も好ましくは、分類のためのオリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり、ワトソン−クリック対合を介してタグ相補体と特異的にハイブリダイゼーションを生じる。
【００５１】
好ましくは、選別するための一本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、少なくとも１００のメンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも１０００のメンバーを含み；そして最も好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも１０，０００のメンバーを含む。
【００５２】
好ましくは、標識を送達するための一本鎖タグ相補物の長さは、８と２０との間である。より好ましくは、この長さは、９と１５との間である。
【００５３】
特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を介して生じる実施態様において、タグ配列のコードは、二重鎖形成タグと同じ原理に従う；しかし、サブユニット配列の選択にはさらなる制約が存在する。一般に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を介する第３の鎖の会合は、二本鎖標的におけるホモピリミジン−ホモプリントラック（ｔｒａｃｋ）に沿って最も安定である。通常、塩基三本鎖は、Ｔ−Ａ*ＴまたはＣ−Ｇ*Ｃモチーフにおいて形成する（ここで、「−」は、ワトソン／クリック対形成を示し、そして「*」はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す）；しかし、他のモチーフもまた、可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成は、条件および鎖の組成に依存して、第３の鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）と第３の鎖が結合するプリンに富んだ二重鎖との間での平行および逆平行の配向を許容する。特定の実施態様で所望されるような三重鎖の安定性を最大化するか、さもなければ調節するために、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドを用いるかまたはデオキシリボースヌクレオシドを用いるか）、塩基改変（例えば、メチル化シトシンなど）を選択することについては、参考文献中に広範なガイダンスが存在する。一本鎖または二重鎖タグをそれらの一本鎖の相補物または二重鎖の相補物にアニーリングするための条件は、周知である（例えば、Ｊｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：１３２３〜１３２８（１９９３）；Ｃａｎｔｏｒら、米国特許第５，４８２，８３６号など）。選別する際の三重鎖タグの使用は、その相補物にアニーリングするためにタグを曝露する、ポリメラーゼを伴なう「ストリッピング」反応を必要としない利点を有する。
【００５４】
選別するための例示的なタグライブライリーを以下（配列番号１）に示す。
【００５５】
【化１】
0004344086.tif 000003
オリゴヌクレオチドタグのフランキング領域を操作し、上記で例示されるように、都合のよいクローニングベクターへの挿入またはクローニングベクターからの除去のための制限部位を含み得る。必要に応じて、左または右のプライマーを、ビオチンを付着するように合成し（従来の試薬を使用、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから入手可能）、増幅および／または切断後の精製を容易にし得る。好ましくは、タグ−フラグメント結合体を作製するために、上記のライブラリーを従来のクローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）に挿入する。必要に応じて、タグライブラリーを含むベクターは、例えば、ＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩで完全に消化されたフラグメントの単離を容易にする、「スタッファー」領域（「ＸＸＸ・・・ＸＸＸ」）を含み得る。
【００５６】
本発明の重要な局面は、各微小粒子または各領域が、実質的に、１つの種類の付着した配列のみを有するような；すなわち、ＤＮＡ配列が、クローンの亜集団中に存在するような、例えば、ｃＤＮＡライブラリーから固相支持体上の微小粒子または別々の領域への、ＤＮＡ配列の集団の選別および付着である。この目的は、実質的に全ての異なるＤＮＡ配列が、付着した異なるタグを有することを保証することにより達成される。この条件は、次々に、分析のために十分な全体のタグ−ＤＮＡ配列の結合体のサンプルのみを採取することによりもたらされる（同一ＤＮＡ配列が異なるタグを有することが認容される。なぜなら、それは、単に、同じＤＮＡ配列が、作動中であるかまたは２回分析されることを生じるからである）。このようなサンプル採取は、このタグがＤＮＡ配列に付着された後、明白に実行され得るか（例えば、より大きい混合物から少量を採取することによって）；それは、ＤＮＡ配列およびタグをプロセスするために使用される技術の二次効果として固有に実行され得るか；またはサンプル採取は、明白およびプロセスシング工程の固有部としての両方で実行され得るかのいずれかである。
【００５７】
ｎ個のタグ−ＤＮＡ配列結合体のサンプルを、反応混合物から無作為に抽出する場合（サンプル容量を採取することによって作用し得るように）、同じタグを有する結合体を抽出する確率は、ポワソン分布（Ｐ（ｒ）＝ｅ-λ（λ）ｒ／ｒ  、ここで、ｒは同じタグを有する結合体の数であり、そしてλ＝ｎｐ、ここでｐは、所定のタグが選択される確率である）により記載される。ｎ＝１０6かつｐ＝１／（１．６７×１０7）の場合（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒらに記載される８個の４塩基のワードをタグとして用いた場合）、λ＝０．０１４９およびＰ（２）＝１．１３×１０-4である。従って、１００万個の分子のサンプルは、好ましい十分の範囲内で二本鎖の期待される数を生じる。このようなサンプルは、タグ−フラグメント結合体を含む混合物の系列希釈により容易に得られる。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、タグを分子、特にポリヌクレオチドに付着することに関する、用語「実質的に全て」は、本質的に二重鎖がないタグ−分子結合体の集団を得るために用いられるサンプル採取の手順の統計学的性質を反映することを意味する。好ましくは、少なくとも９５％のＤＮＡ配列が、唯一の付着したタグを有する。
【００５９】
好ましくは、ＤＮＡ配列は、タグライブラリーを保有する従来のクローニングベクター中にこの配列を挿入することによってオリゴヌクレオチドタグに結合する。例えば、それらの５’末端にＢｓｐ１２０Ｉ部位を有するｃＤＮＡを構築し、そしてＢｓｐ１２０Ｉおよび別の酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡまたはＤｐｎ  ＩＩ）での消化後、式Ｉのタグを保有するｐＵＣ１９に定方向で挿入し、あらゆる可能なタグ−ｃＤＮＡ対形成を含む、タグ−ｃＤＮＡライブラリーを形成し得る。サンプルを、増幅および選別のためにこのライブラリーから採取する。サンプル採取を、このライブラリーの系列希釈によってか、またはコロニーからプラスミド含有細菌宿主を単純に採集することによって達成し得る。増幅後、このタグ−ｃＤＮＡ結合体をプラスミドから切り出し得る。
【００６０】
オリゴヌクレオチドタグを、例えば、上記のように一本鎖にすることによって、特異的ハイブリダイゼーションのために調製した後、このポリヌクレオチドを、タグとそれらの相補物との間の完全に適合した二重鎖の形成に好ましい条件下で、このタグの相補的な配列を含む微小粒子と混合する。これらの条件を作製するために参考文献中に広範なガイダンスが存在する。このようなガイダンスを提供する例示的な参考文献は、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６：２２７〜２５９（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）などを含む。好ましくは、このハイブリダイゼーション条件は、完全に適合した配列のみが安定な二重鎖を形成するように十分にストリンジェントである。このような条件下で、それらのタグを介して特異的にハイブリダイズされるポリヌクレオチドが、微小粒子に付着された相補的な配列に連結され得る。最終的に、この微小粒子を、非連結性および／または非適合性タグを有するポリヌクレオチドを除去するために洗浄する。
【００６１】
タグのそれらの相補物に対するハイブリダイゼーションの特異性は、サンプル中の高いパーセントのタグが唯一であり、かつサンプル中の実質的に全てのタグの最も近接する隣接物が、少なくとも２ワードで異なる程度に十分に小さいサンプルを採取することによって、増強され得る。この後者の条件は、用いられているレパートリーの約０．１％以下のサイズである、多数のタグ−ポリヌクレオチド結合体を含むサンプルを採取することによって満たされ得る。例えば、タグが８つのワードで構築される場合、８8または約１．６７×１０7のタグおよびタグ相補物のレパートリーが産生される。上記のようなタグ−ＤＮＡ配列結合体のライブラリーにおいて、０．１％のサンプルは、約１６，７００の異なるタグが存在することを意味する。これを、微小粒子のレパートリー等価物、またはこの例においては、１．６７×１０7微小粒子のサンプル上に直接充填した場合、サンプルにされた微小粒子のほんの低密度なサブセットが充填される。好ましくは、充填された微小粒子を、ＤＮＡ配列を蛍光的に標識し、そして変性した後に、従来のプロトコルを使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）機器によって充填されていない微小粒子から分離し得る。充填し、そしてＦＡＣＳ分離した後、この標識を、この付着したＤＮＡ配列の使用または他の分析の前に切断し得る。
【００６２】
参照ＤＮＡ集団は、異なる試験集団における頻度が比較されるべきである、任意のセットのＤＮＡ配列からなり得る。好ましくは、複数の細胞中または組織中の遺伝子発現の分析における使用のための参照ＤＮＡ集団は、遺伝子発現が比較されている、細胞または組織の各々に由来するｃＤＮＡライブラリーを生成することによって構築される。これは、種々の細胞および／または組織から抽出されるｍＲＮＡをプールすることによって達成され得るか、あるいは別々に構築されたｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡをプールすることによって達成され得るかのいずれかである。あるいは、参照ＤＮＡ集団は、ゲノムＤＮＡから構築され得る。この目的は、分析されている任意の細胞中または組織中に可能に発現され得る全ての配列を含むＤＮＡ配列の１セットを得ることである。一旦、参照ＤＮＡ集団を構成するＤＮＡ配列が得られると、それらは、固相クローニングのためにオリゴヌクレオチドタグに結合しなければならない。好ましくは、このＤＮＡ配列は、上記のように、適切なタグのレパートリーを保有するベクターに挿入され、タグ−ＤＮＡ配列結合体のライブラリーを形成し得るように調製される。結合体のサンプルを、このライブラリーから採取し、増幅し、そして微小粒子上に充填する。このサンプルは、全ての異なる型のＤＮＡ配列が充填された微小粒子上に表される確率が高いように十分に大きいことが重要である。例えば、比較されている複数の細胞の中で、全体で約２５，０００個の遺伝子を発現する場合、この数の約５倍のサンプル、すなわち約１２５，０００個のタグ−ＤＮＡ配列結合体は、全ての可能なＤＮＡ配列が約９９％の確率で充填された微小粒子中に表されることを保証するように採取されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））。
【００６３】
別の実施態様において、参照集団は、細胞周期タンパク質、シグナル伝達経路タンパク質、癌遺伝子産物、腫瘍サプレッサー、キナーゼ、ホスファターゼ、転写因子、増殖因子レセプター、増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質、プロテアーゼ、細胞骨格タンパク質、膜レセプター、Ｒｂ経路タンパク質、ｐ５３経路タンパク質、代謝に関与するタンパク質、ストレスに対する細胞応答に関与するタンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ損傷および修復に関与するタンパク質、ならびにアポトーシスに関与するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の特定のセット（単数）またはセット（複数）をコードするポリヌクレオチドの１セットを含み得る。このようなポリヌクレオチドは、代表的には、固体支持体当たりに唯一の配列を有するオリゴヌクレオチドを介して固相支持体に付着されるが、このようなポリヌクレオチドはまた、各固相支持体に共通である配列（例えば、ポリアデニル化オリゴヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチドを介して固相支持体に付着され得る。
【００６４】
好ましくは、タグ−ＤＮＡ配列結合体をサンプルにした後、Ｂｒｅｎｎｅｒら（上記）に開示されるように、それらを、蛍光的に標識されたプライマーを使用してＰＣＲにより増幅し、微小粒子のタグ相補物上に充填するために有意な材料を提供し、そして充填されていない微小粒子から充填された微小粒子を区別する手段を提供する。好ましくは、このＰＣＲプライマーはまた、この蛍光標識が、研究されている細胞または組織由来の標識されたＤＮＡ鎖の競合的なハイブリダイゼーションの前に、ｃＤＮＡの末端から切断され得るように、二本鎖産物中においてレアカッティング（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰａｃＩ）の制限部位の生成を可能にする配列を含む。このような充填の後、特異的にハイブリダイズしたタグ−ＤＮＡ配列結合体を、タグ相補物に連結し、そしてこの充填された微小粒子を、ＦＡＣＳによって充填されていない微小粒子から分離する。この蛍光標識を、充填された微小粒子のＤＮＡ鎖から切断し、そして非共有結合で付着した鎖を、従来のプロトコルを使用して、熱、ホルムアミド、ＮａＯＨ、および／または同様の手段を用いて変性することによって除去する。次いで、この微小粒子は、競合的ハイブリダイゼーションのために用意される。
【００６５】
（競合的ハイブリダイゼーションおよび光生成標識）
分析されている細胞および／または組織由来の遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を単離する。この発現産物を、供給源を区別するために標識する。好ましくは、各供給源由来の産物は、任意の他の供給源の産物（例えば、唯一および区別可能な発光頻度を有する各々）により含まれる標識とは異なる標識を含む。あるいは、１つの供給源の産物は、未標識のままおかれ得る。この発現産物を、従来の技術（例えば、ＤｅＲｉｓｉら（上記）など）によって標識し得る。好ましくは、光生成標識を、抽出されたｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに組込み、またはオリゴヌクレオチドタグを、同定のために標識されたタグ相補物を提供するために付着する。蛍光標識、比色定量標識、化学発光標識、および電気発光標識を含む、多数の光生成標識が入手可能である。一般に、このような標識は、吸収頻度、発光頻度、強度、シグナル寿命、またはこのような特徴の組合せを含み得る光学シグナルを生じる。好ましくは、蛍光標識を、蛍光的に標識されたヌクレオシド三リン酸の直接的な組込みによってか、あるいは捕捉部分（例えば、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオチドタグ）の組込みによる間接的な適用によってのいずれかで、続いて蛍光シグナルを生成し得る部分（例えば、ストレプトアビジン−蛍光色素結合体または蛍光的に標識されたタグ相補物）と複合体化することによって用いる。好ましくは、蛍光標識から検出される光学シグナルは、１つ以上の特徴的な発光頻度での強度である。蛍光色素およびＤＮＡ鎖にそれらを付着させるかまたは組み込むための手段の選択は、周知である。例えば、ＤｅＲｉｓｉら（上記）、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１６９巻、１〜２５頁（１９８８）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）；ならびにＥｃｋｓｔｅｉｎ、編集者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）；Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６：２２７〜２５９（１９９１）；Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：４３４７〜４３５１（１９９５）ならびにＪｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：２４６〜２４９（１９９６）など。
【００６６】
好ましくは、光生成標識は、それらの各光学シグナルが存在する標識されたＤＮＡ鎖の量と関連し得るように、そして異なる光生成標識により生成されたこの光学シグナルが比較され得るように、選択される。蛍光標識の発光強度の測定は、この設計目的を満たす好ましい手段である。蛍光色素の所定の選択について、それらの発光強度を標識されたＤＮＡ鎖のそれぞれの量と関連付けることは、異なる色素、量子収率、発光バンド幅、吸収極大、吸収バンド幅、励起光源の性質などを含む、いくつかの因子の考慮を必要とする。蛍光強度測定を作製するための、そしてそれらを分析物の量に関連付けるためのガイダンスは、化学および分子分析に関する参考文献中で入手可能である。例えば、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、編集者、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、第２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）；Ｐｅｓｃｅら、編集者、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７０）など。本明細書中で使用されるように、用語「相対的な光学シグナル」とは、相補的な参照ＤＮＡ鎖と二重鎖を形成する、同一な配列、または実質的に同一な配列の、異なって標識されたＤＮＡ鎖の比率に関連し得る、異なる光生成標識からのシグナルの比率を意味する。好ましくは、相対的な光学シグナルは、２つ以上の異なる蛍光色素の蛍光強度の比率である。
【００６７】
多数の細胞または組織由来の標識されたＤＮＡ鎖の間の競合的ハイブリダイゼーションは、従来のハイブリダイゼーション反応において、各々の供給源由来の等量の標識されたＤＮＡ鎖を参照ＤＮＡ集団で充填された微小粒子に適用することによって実行される。競合的ハイブリダイゼーション反応に加えられた特定量の標識されたＤＮＡ鎖は、本発明の実施態様に依存して広範に変動する。このような量の選択に影響する因子は、使用される微小粒子量、使用される微小粒子型、微小粒子上の参照ＤＮＡ鎖の充填、標識されたＤＮＡ鎖集団の複雑性などを含む。ハイブリダイゼーションは、同一または実質的に同一である配列を有する、異なって標識されたＤＮＡ鎖が、同じ相補的な参照ＤＮＡ鎖にハイブリダイズするように競合するという点で競合的である。競合的ハイブリダイゼーション条件は、相補的な参照ＤＮＡ鎖と二重鎖を形成する標識されたＤＮＡ鎖の割合が、それらの各集団中の同一配列の競合するＤＮＡ鎖の量と比較したその集団中のＤＮＡ鎖の量を反映し、そして好ましくは、正比例するように選択される。従って、同一配列を有する第１および第２の異なって標識されたＤＮＡ鎖は、例えば、第１の標識されたＤＮＡ鎖が１ｎｇ／μｌの濃度で、そして第２の標識されたＤＮＡ鎖が２ｎｇ／μｌの濃度であるように、相補的な参照ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションで競合している場合、平衡状態では、参照ＤＮＡと形成された二重鎖の１／３が第１の標識されたＤＮＡ鎖を含み、そして二重鎖の２／３が第２の標識されたＤＮＡ鎖を含むことが期待される。ハイブリダイゼーション条件を選択するためのガイダンスは、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（上記）；Ｗｅｔｍｕｒ、（上記）；Ｈａｍｅｓら、編集者、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）などを含む、多数の参考文献中で提供される。
【００６８】
本発明の別の局面は、微小粒子の混合物を含む、差示的に発現された遺伝子を分析するためのキットである。ここで、各々の微小粒子は、それに付着された同一な一本鎖の核酸分子の集団を有し、この一本鎖核酸分子は、各微小粒子で異なっており、そして少なくとも１つの細胞または組織供給源のｍＲＮＡに由来するポリヌクレオチドを含む。好ましくは、上記核酸分子の各々は、さらに、上記ポリヌクレオチドと並置して、そして上記微小粒子と上記ポリヌクレオチドとの間に位置したオリゴヌクレオチドタグを含む。このキットは、さらに、上記細胞または組織供給源の少なくとも１つ由来のｃＤＮＡ分子の集団、ｃＤＮＡ集団を標識するための試薬、競合的ハイブリダイゼーションを実施するための試薬などを含む。所望される場合、キット中のｃＤＮＡ分子を、蛍光的な標識型で提供する。このキットは、競合的ハイブリダイゼーションを実施するためのさらなる成分（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液、ＰＣＲ緩衝液、および標準物質など）を含み得る。このキットは、さらに、各々の成分に対する少なくとも１つの容器またはいくつかの容器を含み得、そして差示的に発現された遺伝子を分析する際の使用のための印刷された取扱説明書を含み得る。
【００６９】
本発明はまた、それに付着されたオリゴヌクレオチドタグ相補物を有する複数の微小粒子を含む、参照集団を調製するためのキットを提供し、ここで上記オリゴヌクレオチドタグ相補物の配列は、各微小粒子で異なっている。このキットは、さらに、タグ相補物に相補的な配列を有するタグのライブラリーを含む複数のベクターを含み得る。このキットは、さらに、少なくとも１つの細胞または組織供給源、好ましくはｃＤＮＡ由来のポリヌクレオチドの集団を含み得る。ポリヌクレオチドの集団が含まれる場合、好ましくは、ポリヌクレオチドの集団は、上記複数の微小粒子から分離された容器中に含まれる。このキットはまた、参照集団を調製するための試薬、例えば、アダプター、標識、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、標識ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝液など、ならびに参照集団を調製するための印刷された取扱説明書を含み得る。
【００７０】
（上方制御された遺伝子産物および／または下方制御された遺伝子産物を有する微小粒子のフローソーティング）
標識されたポリヌクレオチドを、微小粒子上の参照集団に競合的にハイブリダイズした後、この微小粒子を、微小粒子および付着された配列の化学的および／または物理的性質に依存する多数の方法で分析および／または選別し得る。例えば、目的の微小粒子を、微小マニュピレータにより機械的に分離し得、磁気微小粒子は、磁場を調節するかまたは操作することによって選別し得、荷電した微小粒子を、電気泳動などによって操作し得る。以下の参考文献は、微小粒子を分析および／または分類する手段を選択するためのガイダンスを提供する：Ｐａｃｅ、米国特許第４，９０８，１１２号；Ｓａｕｒら、米国特許第４，７１０，４７２号；Ｓｅｎｙｅｉら、米国特許第４，２３０，６８５号；Ｗｉｌｄｉｎｇら、米国特許第５，６３７，４６９号；Ｐｅｎｎｉｍａｎら、米国特許第４，６６１，２２５号、Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖら、米国特許第４，３５４，１１４号；Ａｂｂｏｔｔら、米国特許第５，１０４，７９１号；Ｇａｖｉｎら、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４０３８３など。好ましくは、蛍光的に標識されたＤＮＡ鎖を含む微小粒子を、市販のＦＡＣＳ機器（例えば、Ｖａｎ  Ｄｉｌｌａら、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５）；Ｆｕｌｗｙｌｅｒら、米国特許第３，７１０，９３３号；Ｇｒａｙら、米国特許第４，３６１，４００号；Ｄｏｌｂｅａｒｅら、米国特許第４，８１２，３９４号など）によって、都合よく区別し、そして選別する。参照の鎖に競合的にハイブリダイズした蛍光的に標識されたＤＮＡ鎖について、好ましくは、このＦＡＣＳ機器は、複数の蛍光チャネル能力を有する。好ましくは、１つ以上の高い強度の光源（例えば、レーザー、水銀アークランプなど）での励起では、各微小粒子は、微小粒子により運ばれる各細胞または組織タイプ由来の標識されたＤＮＡ鎖の量に関連した、蛍光シグナル、通常、蛍光強度を生成する。実施例１の図１ａに示されるように、各微小粒子の蛍光強度を、二次元グラフにプロットする場合、等しい発現レベルを示す微小粒子は、グラフの対角線（１００）上かまたはその近傍である。上方制御および下方制御された遺伝子は、対角線から離れた領域（ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に出現する。このような微小粒子は、図１ｂに示されるように一方または両方の対角線から離れた領域（１１２）を囲むようにソーティングパラメーターをグラフ規定することによって、市販のＦＡＣＳ機器によって容易に選別される。従って、微小粒子は、それらの相対的な光学シグナルに従い分類され得、そして所望される場合、異なる細胞または組織供給源中での遺伝子発現における差異に対応する、所定の範囲の値内で、シグナルを生成するそれらの微小粒子を蓄積することによって、さらなる分析のために収集され得る。
【００７１】
（ポリヌクレオチドが由来する核酸配列の存在比に従う微粒子のフローソーティング）
蛍光標識されたＤＮＡ鎖を含む微粒子はまた、それらが由来する遺伝子産物の存在比に従って分類および識別され得る。核酸配列の存在比は、関連する遺伝子発現を決定するために、上記に記載される方法によって決定され得、そして微粒子に結合されたポリヌクレオチドによって生成された光学的なシグナルの強度レベルと相関され得る。より低い強度は、より珍しい核酸配列の指標である（例えば、珍しい遺伝子産物）。珍しい遺伝子は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子であり、これは、１細胞あたり約１００コピー以下で存在し、より好ましくは約５０コピー未満から約２５コピー未満まで、最も好ましくは細胞あたり約１０コピー未満である。珍しい遺伝子は、実施例９および１０に示される、低い蛍光強度を有する微粒子を収集することによって単離され得る。収集された微粒子は、代表的には、総微粒子の約５％未満、より好ましくは約２．５％、１％、〜０．５％以内、最も好ましくは約０．１％未満を含む。
【００７２】
あるいは、ハイブリダイゼーション速度は、核酸配列の存在比に比例するので、より少ない存在比の核酸配列は、細胞または組織供給源においてより低い存在比で存在する核酸配列が、ハイブリダイズされない状態で残存するハイブリダイゼーション条件を設定することによって単離され得る。適切なハイブリダイゼーション条件は、規格化されたｃＤＮＡライブラリーを産生するために使用される条件を含む（Ｐａｔａｎｊａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１９４３−１９４７（１９９１））。例えば、大量なＤＮＡ種のハイブリダイゼーションに最大期間を許容した後、ハイブリダイズしていないＤＮＡを収集することによって、珍しい遺伝子を単離し得る。
【００７３】
反復配列は、マッピングおよび多型分析をしばしば複雑にする。反復配列は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、Ａｌｕ配列のような短散在反復エレメント（ＳＩＮＥ）、サテライトＤＮＡ，ミニサテライトＤＮＡ、メガサテライトＤＮＡなどのゲノムにおける存在に起因して存在する。反復配列は、上記に記載したように、より遅くハイブリダイズするＤＮＡ種から迅速にハイブリダイズするＤＮＡ種を識別することによって、ＤＮＡ集団から除去され得る。好ましくは、ハイブリダイズしない集団は、非反復核酸配列に由来するポリヌクレオチド中に実質的に富化される。
【００７４】
本発明の別の局面は、上記に記載および使用のための印刷された指示書ように調製された微粒子を含む核酸配列の存在比について、核酸配列を分析および／または単離するためのキットである。
【００７５】
（大規模並行サイン配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ））によって識別された遺伝子の同定）
発現された遺伝子は、ＭＰＳＳによって並列して同定され得る。ＭＰＳＳは、以下の２つの技術の組み合わせである：並列処理のためにＤＮＡフラグメントをタグ化し、そして識別するための技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、国際公開第ＷＯ９６／４１０１１号）、およびＤＮＡフラグメント末端を段階的に配列決定するための別の技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，５９９，６７５号およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開第ＷＯ９７／４６７０４号）。標的ポリヌクレオチドの第１の制限エンドヌクレアーゼでの初期消化の後、制限フラグメントを、以下およびＢｒｅｎｎｅｒら、国際公開第ＷＯ９６／４１０１１号に記載されるようにオリゴヌクレオチドタグに連結し、その結果、得られたタグフラグメント結合体をサンプリングし、増幅し、そしてオリゴヌクレオチドタグの、それらのタグ相補体との特異的なハイブリダイゼーションによって分離固相支持体上で識別し得る。
【００７６】
一旦、ＤＮＡフラグメントの増幅サンプルが、固相支持体上で識別され、実質的に同一なフラグメントの均一集団を形成すると、フラグメントの末端は、好ましくは、アダプターに基づいた方法（連結、同定、および切断の反復サイクルを含むＤＮＡ配列決定（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，５９９，６７５号に記載される方法））を用いて配列決定される。さらに好ましくは、配列決定方法に使用されるアダプターの各々は、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開第ＷＯ９７／４６７０４に教示されるように、突出鎖（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ）、およびオリゴヌクレオチドの最小の交差ハイブリダイズするセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグを有する。このようなアダプターは、本明細書中で「コード化アダプター（ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｄａｐｔｏｒ）」と呼ばれる。コード化アダプターの突出鎖がフラグメントの相補的突出鎖と完全に一致した二重鎖を形成するコード化アダプターが、リガンドである。連結後、突出鎖のヌクレオチドの同一性および順序が決定されるか、あるいは標識化されたタグ相補体または連結されたアダプター上の対応タグに対する「デコーダー（ｄｅ−ｃｏｄｅｒ）」と特異的にハイブリダイズすることによって「解読」される。
【００７７】
好ましい配列決定方法は、以下からなる工程で行われる：（ａ）コード化アダプターをフラグメントの末端に連結する工程であって、このコード化アダプターは、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位は、その認識部位から分離している、工程；（ｂ）フラグメントの末端に連結されたコード化アダプターの同一性によって、フラグメントの末端の１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；（ｃ）フラグメントが１つ以上のヌクレオチド程度短縮されるように、コード化アダプターのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼでフラグメントを切断する工程；および（ｄ）フラグメントの末端の上記ヌクレオチド配列が決定されるまで、上記工程（ａ）から（ｃ）を繰り返す工程。この同定工程において、タグ相補体の連続的なセット、あるいは「デコーダー」は、フラグメントの末端に連結されたコード化アダプターに保有される各タグに特異的にハイブリダイズされる。ポリヌクレオチドの突出鎖におけるヌクレオチドの型および配列は、以下に記載されるように、特異的にハイブリダイズされるデコーダーに保有される標識およびデコーダーに由来するセットによって同定される。
【００７８】
（従来の配列決定による識別された遺伝子の同定）
微粒子によって保有される遺伝子産物は、従来のＤＮＡ配列決定プロトコルを使用して識別後（例えば、ＦＡＣＳによって）、同定され得る。このような配列決定のための適切なテンプレートは、差示的に発現された遺伝子産物を保有する識別された微粒子から開始するいくつかの異なる方法において生成され得る。例えば、単離された微粒子に付着された参照ＤＮＡは、サイクル配列決定（ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって標識された伸長産物を生成するために使用され得る（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９６／１２０３９号によって教示されるように）。この実施態様において、プライマー結合部位（４００）は、（図４ａに示されるように）参照ＤＮＡ（４０２）中にタグ相補体（４０６）に対して遠位に操作される。例えば、別のマイクロターターウェルなどに分類することによって微粒子を単離した後、差示発現された鎖を溶解する。プライマー（４０４）を加え、そして標識された伸長産物を形成するように、従来のサンガー配列決定反応を実行する。次いで、これらの産物は、配列決定にために、電気泳動などの技術よって分離される。同様の実施態様において、配列決定のテンプレートは、個々の微粒子を識別することなく産生され得る。プライマー結合部位（４００）および（４２０）は、プライマー（４０４）および（４２２）を使用するＰＣＲによってテンプレートを生成するために使用され得る。次いで、このテンプレートを含む、得られた単位複製配列は、従来の配列決定ベクター（例えば、Ｍ１３）中にクローン化される。形質移入の後、宿主をプレートし、そして配列決定のために個々のクローンを選択する。
【００７９】
別の実施態様において、図４ｂに例証されるように、プライマー結合部位（４１２）は、競合的にハイブリダイズされた鎖（４１０）中に操作され得る。この部位は、参照ＤＮＡ（４０２）中に相補鎖を有する必要はない。識別の後、参照配列（４０２）の競合的にハイブリダイズされた鎖（４１０）は溶解され、そしては、プライマー（４１４）および（４１６）を使用して、例えば、ＰＣＲによって増幅され、この参照配列（４０２）は、より容易な操作のため、ビオチンで標識化および／または誘導体化され得る。次いで、この溶解されそして増幅された鎖は従来の配列決定ベクター（例えば、Ｍ１３）にクローン化され、これは宿主をトランスフェクトするために使用され、順々にプレートされる。個々のコロニーが、配列決定のために選ばれる。
【００８０】
（実施例１：タグ化ｃＤＮＡライブラリーの構築、サンプリング、およびタグ化ｃＤＮＡの微粒子上へのローディング）
この実施例において、微粒子上にロードするためのタグ化参照ＤＮＡを調製するための好ましいプロトコルが、記載される。手短には、目的の各細胞または目的の各組織からのｃＤＮＡを調製し、そして式１のタグエレメントを含むベクターに直接的にクローン化する。好ましくは、このような細胞または組織から抽出されたｍＲＮＡを、通常同じ比率で、第１鎖合成より先に組み合わせる。ｍＲＮＡを標準的なプロトコルを使用して得、この後、第１鎖および第２鎖の合成を例示されるように実行し、そして得たｃＤＮＡを、式１のタグエレメントまたは同様のタグエレメントを含むベクターに挿入する。次いで、このタグｃＤＮＡ結合体を含むベクターを使用して、適切な宿主（代表的には、従来の細菌宿主）に形質転換し、その後、宿主培養物からの細胞サンプルをさらに拡張し、そしてベクターＤＮＡを抽出する。好ましくは、このタグｃＤＮＡ結合体をＰＣＲによってベクターから増幅し、そしてタグ相補体で誘導される微粒子上にロードするために、以下に記載されるように処理する。非共有結合的に付着した鎖を溶解した後、ｃＤＮＡを含む微粒子を、競合的にハイブリダイズされる遺伝子産物を受容するように、本発明に従って用意する。示した工程に関連する特定の手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用される）；Ａｕｓｂｅｌら、編者、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｉｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）；および分子生物学技術についての同様の手引きにおいて利用可能である。
【００８１】
約５μｇのｍＲＮＡのペレットを、１０μｌの５×ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、および１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（または同様の逆転写酵素緩衝液）、５μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５μｌの３ｄＮＴＰ／メチル−ｄＣＴＰ混合物（１０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能）、１μｌ  ＲＮａｓｉｎ、１２μｌの以下に示される０．２５μｇ／μｌの逆転写酵素プライマー、および１４．５μｌのＨ2Ｏからなる、４５μｌ（最終容量）の第１鎖プレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）中に再懸濁する。
【００８２】
【化２】
0004344086.tif 000004
転写プライマー（配列番号２）
室温下で１５分間のインキュベートした後、５ｍｌの２００Ｕ／μｌ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴを添加し、そしてこの混合液を４２℃で１時間インキュベートした。1時間のインキュベートの後、上記の混合液（総量約５０μｌ）を、氷上で、８０μｌの５×第２鎖緩衝液（９４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．９）、４５３ｍＭ  ＫＣｌ、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および５０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4）からなる、第２鎖プレミックス（容量３３６μｌ）に添加し、約３８６μｌの総反応容量を得る。別に、４μｌの０．８Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（３．２ユニット）および１０μｌの１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（１００ユニット）を組み合わせ、そしてこの組み合わせた酵素混合液を、上記の第２鎖反応混合液に添加する。その後、総反応容量を５秒間、微量遠心し、次いで１６℃で１時間および室温で１時間インキュベートし、以下の二重鎖ｃＤＮＡ（配列番号３）を得る：
【００８３】
【化３】
0004344086.tif 000005
ここでＸは、ｃＤＮＡ中のヌクレオチドを示し、ＶはＡ、Ｃ、またはＧを表し、そしてＢはＣ、Ｇ、またはＴを表す。逆転写プライマー配列は、ｃＤＮＡ中にＢｓｍ  ＢＩ部位を与えるために選択され、この酵素は、Ｂｓｍ  ＢＩでの消化に５’−ＧＣＡＴオーバーハングを生じることに留意のこと。
【００８４】
フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、このｃＤＮＡをＤｐｎ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｓｂｓ，Ｂｅｖｅｒｅｌｙ，ＭＡ）で消化するために、製造者の推奨緩衝液中に再懸濁し、次いで、アビジン化ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）上でビオチン化フラグメントを捕獲する。洗浄後、この捕獲されたフラグメントを、Ｂｓｍ  ＢＩで消化し、以下のｃＤＮＡ（配列番号４）を放出し、これをエタノールで沈殿する。
【００８５】
【化４】
0004344086.tif 000006
従来のクローニングベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ、ｐＢＣなど（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））を操作し、以下のエレメントの配列（配列番号５）を有する（これらは式１で示される配列である）。
【００８６】
【化５】
0004344086.tif 000007
Ｂｂｓ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化した後、このベクターを電気泳動によって精製し、連結のためにｃＤＮＡと合わせる。Ｂｂｓ  Ｉ消化が、ｃＤＮＡのＢｓｍ  ＢＩ−消化末端と適合する末端を生じるようにベクターを操作していることに注意のこと。連結後、適切な宿主細菌を形質転換し、そして後に使用するために培養を拡張する。
【００８７】
拡大された培養物からの宿主細胞サンプルを、挿入されたｃＤＮＡを有するベクターを保有する画分を決定するためにプレートする。その後、約１．７×１０5の挿入物含有細胞に一致する培養物のアリコートを回収し、そして別々に培養中で拡大する。これは、式Ｉに示される型のタグの約１％の貯蔵量を示す。
【００８８】
好ましくは、このタグ−ｃＤＮＡ結合体を、以下のような従来のプロトコルを使用して、ＰＣＲによってベクターから増幅する。８つの複製ＰＣＲの各々について、以下の反応成分を組み合わせる：１μｌのベクターＤＮＡ（１つのライブラリーについて１２５ｎｇ／μｌ、単一クローンについて１０9コピー）；１０μｌの１０×Ｋｌｅｎｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；０．２５μｌビオチン化２０マー「正方向」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μｌ）；０．２５μｌのＦＡＭ標識２０マー「逆方向」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μｌ）；１μｌの２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（総ｄＮＴＰ濃度１００ｍＭ）；５μｌのＤＭＳＯ；２μｌの５０×Ｋｌｅｎｔａｑ酵素；および８０．５μｌのＨ2Ｏ（総容量１００μｌについて）。ＰＣＲを、ＭＪＲ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）または同様の熱サイクラーにおいて以下のプロトコルで行う：１）９４℃、４分間；２）９４℃、３０秒；３）６７℃、３分間；４）工程２および３の８サイクル；５）９４℃、３０秒；６）６４℃、３分間；７）工程５および６の２２サイクル；８）６７℃、３分間；および９）４℃で保持。
【００８９】
８つのＰＣＲ混合液をプールし、そして室温で７００μｌのフェノールを加える。その後、組み合わせた混合溶液を２０〜３０秒間ボルテックスし、次いで、高速（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機などの機器において１４，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。この上清を除去し、そして新しいチューブ中で７００μｌのクロロホルム（２４：１のクロロホルム：イソ−アミルアルコールの混合物）と合わせ、２０〜３０秒間ボルテックスし、そして１分間遠心分離する。その後、この上清を新しいチューブに移し、そして８０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび５８０μｌのイソプロパノールと組み合わせる。２０分間の遠心分離の後、この上清を除去し、そして１ｍｌの７０％エタノールを加える。この混合液を５〜１０分間遠心分離し、その後、このエタノールを除去し、沈殿したＤＮＡをスピードバック（ｓｐｅｅｄ  ｂａｃｋ）で真空乾燥する。
【００９０】
再懸濁の後、このｃＤＮＡを、製造者の推奨プロトコルを使用して、アビジン化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）で精製し、そしてまた製造者の推奨プロトコル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍｔ）を使用して、Ｐａｃ  Ｉ（１μｇのＤＮＡあたり１ユニットの酵素）で消化する。この切断されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈殿する。タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグを、１μｇのストレプトアビジン−精製ＤＮＡあたり２ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を組み合わせることによって、一本鎖を生じる。１５０μｇのストレプトアビジン−精製ＤＮＡを２００μｌのＨ2Ｏに再懸濁し、以下の反応成分と組み合わせる。最終反応容量を３００μｌにする：３０μｌの１０ＮＥＢ緩衝液、番号２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；９μｌの１００ｍＭ  ｄＧＴＰ；３０μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット／μｌ）；および３１μｌのＨ2Ｏ。１時間、３７℃インキュベートした後、この反応溶液を、２０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加することによって停止し、そして２０分間、７５℃でこの反応溶液をインキュベートすることによって、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを不活性化する。タグ−ｃＤＮＡ結合体をフェノール／クロロホルム抽出法で精製し、そしてエタノール沈殿する。
【００９１】
タグ相補体を有する５μｍのＧＭＡビーズを、自動化ＤＮＡ合成機（Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｓｐｅｃｉａｌ／４  Ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｊｏｒｋｇａｔａｎ、Ｓｗｅｄｅｎまたは同様の装置）で、従来のホスホルアミダイド化学を使用する組み合わせ合成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって調製した。ここで、核酸を３’から５’の方に縮合する。好ましい実施態様において、２８ヌクレオチド「スペーサー」配列を合成し、次いでタグ相補体配列（タグ相補体中の全３２ヌクレオチドについて各４ヌクレオチドの８「ワード」）、および３つのＣ’ｓ配列を合成する。従って、このビーズを６３マーのオリゴヌクレオチドで誘導体化する。この「スペーサー」配列の長さは重要ではない；しかし、このビーズ表面の近傍は、タグ相補体または捕獲配列を処置するために使用される酵素の活性に影響し得る。従って、このようなプロセシングを使用する場合、このような表面効果を避けるのに十分な長さのスペーサーが望ましい。好ましくは、このスペーサーは１０〜３０ヌクレオチドである。Ｐａｃ  Ｉ部位を含む以下の配列（配列番号６）は、本発明の実施態様に使用される。
【００９２】
【化６】
0004344086.tif 000008
好ましくは、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、少なくともタグ相補体の完全なレパートリーに一致する番号のビーズ上でタグ相補体にハイブリダイズする。本発明の実施態様の場合、これは８8、または約１．６×１０7ビーズである。所定の容量におけるビーズの番号は、血球計算板器を用いて容易に推定される。
【００９３】
タグ−ｃＤＮＡ結合体のハイブリダイゼーションの前に、このタグ相補体の５’末端を、好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ処置によってリン酸化する。手短には、１００μｌのＨ2Ｏ中に懸濁された２．５×１０8のビーズを、１００μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１０μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌの１０％  ＴＷＥＥＮ  ２０、１７μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ）、および７２２μｌのＨ2Ｏと組み合わせ、最終容量を１０００μｌにする。ボルテックスしながら、２時間、３７℃でインキュベートした後、ボルテックスを続けたまま、２０分間温度を６５℃に上昇し、キナーゼを不活性化する。インキュベートの後、ビーズを遠心沈降およびそれらを０．０１％  ＴＷＥＥＮ  ２０を含む１ｍｌのＴＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）中に再懸濁することによって、２回洗浄する。
【００９４】
タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグ相補体へのハイブリダイゼーションのために、上記のように調製したタグ−ｃＤＮＡ結合体を、５０μｌのＨ2Ｏ中に懸濁し、得られた混合液を４０μｌの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液と組み合わせる。その後、この組み合わせた混合液を、従来のプロトコルを使用してＳＰＩＮ−Ｘスピンカラム（０．２２μｍ）を通して濾過し、タグ−ｃＤＮＡ結合体を含む濾液を得る（１．２５ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．２）、１．２５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５ｍｌの０．５％ＴＷＥＥＮ  ２０、１．５０ｍｌの２５％硫酸デキストラン、および０．７５ｍｌのＨ2Ｏからなる５ｍｌの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液）。１０μｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（０．０１％ＴＷＥＥＮ  ２０を含むＴＥ）中の約１．８×１０7のビーズを遠心分離し、その結果、ビーズをペレット化し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮを除去する。このビーズに、２５μｌの１×ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ＴＷＥＥＮ  ２０、３％硫酸デキストラン）を加え、この混合液をボルテックスし、ビーズを十分に再懸濁する。その後、この混合液を遠心分離し、その結果、ビーズをペレット化し、そして上清を除去する。
【００９５】
上記の濾液中のタグ−ｃＤＮＡ結合体を７５℃で３分間インキュベートし、ビーズと組み合わせる。その後、この混合液をボルテックスし、このビーズを十分に再懸濁する。得られた混合液を、約３日間（６０時間）ボルテックスしながら７５℃でさらにインキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、この混合液を２分間遠心分離し、そして上清を除去する。その後、このビーズを、５００μｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、そして０．０１％ＴＷＥＥＮ  ２０を含む、５００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液、番号２中に再懸濁する。このビーズをこの溶液中で６４℃、３０分間インキュベートする。その後、この混合液を遠心分離し、その結果、ビーズをペレット化し、そして上清を除去し、そしてこのビーズを５００μｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮに再懸濁する。
【００９６】
ロードされたビーズを、高速セルソーター、好ましくは、４８８ｎｍで作動するアルゴンイオンレーザーを装備するＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎ，ＣＯ）、または同様の装置を使用して、ロードされていないビーズから識別する。識別の後、このロードされたビーズを、以下の反応成分と合わせることによってフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応に供する：１０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．４μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１％ＴＷＥＥＮ  ２０、２μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット／ｍｌ）、および８６．６μｌのＨ2Ｏ、最終反応容量１００μｌ。ボルテックスしながら１２℃で３０分間インキュベートした後、この反応混合液を遠心分離し、その結果ビーズをペレット化し、そして上清を除去する。ペレット化されたビーズを、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１．５μｌの１％ＴＷＥＥＮ  ２０、１．５μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／１ｍｌ）、および１３１μｌのＨ2Ｏからなる連結緩衝液中に再懸濁し、最終反応容量１５０μｌを得る。この連結反応混合液をボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートする。その後、ビーズをペレット化し、そして１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄する。ビーズを４５μｌのＰＢＳ（１ｍＭのＣａＣｌ2を含む）中に再懸濁し、６μｌのプロナーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と組み合わせる。その後、この混合液を攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。遠心分離後、ロードしたビーズをＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、次いで１×ＮＥＢ  Ｄｐｎ  ＩＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で１回洗浄する。
【００９７】
ビーズにロードされたタグ−ｃＤＮＡ結合体をＤｐｎ  ＩＩで切断し、３’−標識を保有する相補的なアダプターを連結する４つの核酸突出鎖を産生する。従って、ロードされたビーズを、以下の成分からなる反応混合液に添加し、最終反応容量１００μｌを得る：１０μｌの１０×ＮＥＢ  Ｄｐｎ  ＩＩ緩衝液、１μｌの１％ＴＷＥＥＮ、４μｌのＤｐｎ  ＩＩ（５０ユニット／ｍｌ）、および８５μｌのＨ2Ｏ。この混合液をボルテックスしながら３７℃で一晩インキュベートし、その後、このビーズをペレット化し、上清を除去し、そしてこのビーズを１×ＮＥＢ緩衝液、番号３で１回洗浄する。自己連結を防ぐために、タグ−ｃＤＮＡ結合体の突出鎖を、ホスファターゼ（例えば、子ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ））で処理し、５’リン酸を除去する。従って、ロードされたビーズは、以下の成分から成る反応混合液に添加し、最終反応容量１００μｌを得る：１０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号３、１μｌの１％ＴＷＥＥＮ  ２０、５μｌのＣＩＰ（１０ユニット／μｌ）、および８４μｌのＨ2Ｏ。得られた混合液をボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズをペレット化し、１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むＰＢＳで１回洗浄し、上記に記載したようにプロナーゼで処理し、ＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、そして１×ＮＥＢ緩衝液、番号２で１回洗浄する。
【００９８】
以下の３’−標識アダプター（配列番号７）を、従来の試薬（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して調製する：
【００９９】
【化７】
0004344086.tif 000009
ここで、「ｐ」は５’リン酸基であり、そして「ＦＡＭ］は、市販されている３’リンカー基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の近傍の上位鎖（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）の最後のヌクレオチドの３’炭素に付着したフルオレッセン色素である。この連結を以下の反応混合液中で実行し、最終反応容量５０μｌを得る：５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．５μｌの１％ＴＷＥＥＮ  ２０、０．５μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍｌの３’−標識アダプター（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ）、および３６．５μｌのＨ2Ｏ。この混合液をボルテックスしながら１６℃で一晩インキュベートし、その後、このビーズを１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むＰＢＳで１回洗浄し、そして上記に記載したようにプロナーゼで処理する。この初期連結の後、アダプターとタグ−ｃＤＮＡ結合体との間に残存するニックを、以下に記載のように、キナーゼおよびリガーゼの両方で同時処置することによって塞ぐ。ロードされたビーズを以下の成分から成る反応溶液中に再懸濁する：最終反応容量の１５０μｌに対して、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１．５μｌの１％ＴＷＥＥＮ  ２０、１．５μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ、２μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ）、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ）、および１２９μｌのＨ2Ｏ。この混合液をボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズを、上記に記載したようにしてプロナーゼで処理された１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むＰＢＳで１回洗浄し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄する。
【０１００】
この標識鎖を、好ましくは、１５０ｍＭ  ＮａＯＨでの処置によって溶解した後、ビーズ上の参照ＤＮＡを、差示的発現遺伝子産物の競合的なハイブリダイゼーションのために準備する。
【０１０１】
（実施例２：微粒子に付着させた酵母参照ＤＮＡ集団の調製）
本実施例において、ＹＪＭ９２０  ＭＡＴａ  Ｇａｌ＋ＳＵＣ２  ＣＵＰ１株のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、本質的にＷｏｄｉｃｋａら（上述）により記載されるようにリッチ培地（ｒｉｃｈ  ｍｅｄｉｕｍ）培養および最小培地培養に別々に増殖させる。両方の条件下で増殖させた細胞から抽出されたｍＲＮＡを、タグ化し、採取し、増幅し、標識化し、そして微粒子上にロードした参照ｃＤＮＡ集団を樹立するために用いる。ロードした微粒子を、ＦＡＣＳにより単離し、標識を取り除き、そしてロードしたＤＮＡの非共有結合鎖を、溶解し、そして取り除く。
【０１０２】
酵母細胞を、ＹＰＤ（酵母抽出物／ペプトン／グルコース、Ｂｕｆｆｅｒａｄ、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）からなるリッチ培地または最小培地（アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、およびグルコースの、Ｂｕｆｆｅｒａｄ）のいずれかで３０℃で増殖させる。細胞密度を、二連の希釈物由来の細胞を数えることにより測定し、そして１ｍｌあたりの生細胞の数を、ｍＲＮＡ抽出のために細胞を集める直前にＹＰＤアガー上に培養物を希釈したものをプレ−ティングすることにより推定する。中間対数期の細胞（１〜５×１０7細胞／ｍｌ）を、ペレットにし、ＡＥ緩衝溶液（５０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、ドライアイス−エタノールバス中で凍結させ、そして−８０℃で保存する。
【０１０３】
ｍＲＮＡを、参照ＤＮＡライブラリー構築および競合ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡ調製の両方のために以下のように抽出する。総ＲＮＡを、総ＲＮＡを沈降する直前にクロロホルムイソアミルアルコール抽出物を添加して、Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：３０９１−３０９２（１９９０）に記載されるようなホットフェノール法を用いて凍結させた細胞ペレットから、抽出する。Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を、ＲＮＡ回収率を増加させ、有機界面からの、材料とＲＮＡの潜在的な夾雑を減少させるために、全ての有機抽出物に用いる。Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴ選択工程（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて、総ＲＮＡから精製する。
【０１０４】
リッチ培地および最小培地上で増殖させた細胞からの、各５μｇずつのｍＲＮＡを、式Ｉのタグレパートリーを含むｐＵＣ１９に、ｃＤＮＡライブラリー構築のために混合する。式Ｉのタグレパートリーを、Ｅｃｏ  ＲＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、そして同様に消化したｐＵＣ１９に挿入する。ｍＲＮＡを、第二鎖合成時の式Ｉのものと同一であるＢｓｍ  ＢＩ部位を生成する配列を含むオリゴ−ｄＴプライマーを用いる市販のキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で逆転写する。得られたｃＤＮＡを、Ｂｓｍ  ＢＩおよびＤｐｎ  ＩＩで切断し、Ｂｓｍ  ＢＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化した後にタグを含むｐＵＣ１９に挿入する。トラスフェクションおよびコロニー形成させた後、ｐＵＣ１９形質転換体の密度を、約３０，０００のタグ−ｃＤＮＡ結合体を含むサンプルを、獲得し得かつ培養物に展開し得るように決定する。あるいは、タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプルを、約３０，０００のクローンを拾うことにより得、次いで混合しそして培養物に展開する。
【０１０５】
プラスミドの標準的なミニプレップから、タグ−ｃＤＮＡ結合体を、デオキシシトシントリホスフェートを５−メチルデオキシシトシントリホスフェートで置換したＰＣＲにより増幅する。ｐＵＣ１９中の隣接する配列に特異的な以下の１９−マーの正方向プライマーおよび逆方向プライマー（配列番号８および配列番号９）を反応に用いる：
【０１０６】
【化８】
0004344086.tif 000010
ここで、「ＦＡＭ」は、アミノ結合（例えば、アミノリンカーＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を介した逆方向プライマーの５’末端に結合したフルオレセイン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＮＨＳエステルである。逆方向プライマーを、Ｎｏｔ  Ｉ部位が、二本鎖産物中に再構成されるように選択する。ＰＣＲ増幅の後、タグ−ｃＤＮＡ結合体を、アビジン結合（ａｖｉｄｉｎａｔｅ）されたビーズ（例えば、Ｍ−２８０  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ））上に単離する。
【０１０７】
洗浄後、ビーズに結合したｃＤＮＡを、Ｐａｃ  Ｉで消化し、タグ−ｃＤＮＡ結合を放出させ、オリゴヌクレオチドタグを一本鎖にするために、脱離反応を行なう。反応を終了させた後、タグ−ｃＤＮＡ結合体を、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、そして各タグ相補体が、５’ホスフェートを有するタグ相補体を有する５．５  Ｏｍ  ＧＭＡビーズと組み合わせる。ハイブリダイゼーションを、それらの相補体と完全にマッチした二重鎖を形成するタグのみが連結されるように、温度に安定なリガーゼの存在下、ストリンジェント条件下で行なう。ＧＭＡビーズを洗浄し、そしてロードしたＧＭＡビーズを、ロードしたビーズを同定するために蛍光標識したｃＤＮＡを用いるＦＡＣＳソーティングにより濃縮する。単離したビーズを蛍光標識を取り除くためにＰａｃ  Ｉで処理し、その後ビーズを非共有結合鎖を取り除くために従来のプロトコルを用いてＮａＯＨ溶液中で加熱する。数回洗浄した後、ＧＭＡビーズを、競合ハイブリダイゼーションのために用意した。
【０１０８】
（実施例３：異なる増殖条件下に曝露した酵母のアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子の単離および同定）
本実施例において、ｍＲＮＡを、各培養物中の細胞から抽出し、そして標識されたポリヌクレオチドの２つの集団を、蛍光標識ヌクレオシド三リン酸の存在下での逆転写酵素により、単回のｐｏｌｙ（ｄＴ）プライマーの伸長により産生する。次いで、等量の各々標識されたポリヌクレオチドを、競合ハイブリダイゼーションのための参照ＤＮＡ集団を有する実施例１のＧＭＡビーズと組み合わせ、その後、ビーズをＦＡＣＳにより分析し、そして対角線にのっていない領域のビーズをＭＰＳＳ分析のために集積する。
【０１０９】
蛍光ヌクレオシド三リン酸Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、別々の反応でｐｏｌｙ（ｄＴ）16プライマーを用いて、実施例１に記載したように得た、１μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡでの逆転写中にｃＤＮＡ中に組み込む。プライマーおよびＲＮＡを７０℃まで１０分間加熱した後、反応混合物を、氷上に移し、そして２００Ｕ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、および蛍光ヌクレオシド三リン酸からなる予め混合した溶液を、以下の濃度で添加する：５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；２００μＭのｄＴＴＰ；および各々１００ｍＭのＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ。４２℃で２時間インキュベーションした後、組み込まれなかった蛍光ヌクレオチドを、４７０μｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）／１  ｍＭ  ＥＤＴＡでの反応混合物の１度目の希釈、引き続いてＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いる約５μｌまでの濃縮により取り除く。両方の反応物から精製した標識ｃＤＮＡを組み合わせ、そして１０μｇのｐｏｌｙ（ｄＡ）および０．３μｌの１０％ＳＤＳを含む１１μｌの３．５×ＳＳＣ中に再懸濁する。ハイブリダイゼーションに先立って、溶液を２分間沸騰させ、そして室温まで冷却し、その後、溶液をＧＭＡビーズに添加し、そして６２℃で、約８〜１２時間インキュベートする。２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで２回洗浄後、ＧＭＡビーズを、ＮＥＢ−２緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中に再懸濁し、そして分析およびソーティングするためにＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰ  フローサイトメーター中にロードする。二次元蛍光強度等高プロットにおいて、ＧＭＡビーズは、図１ａに示すようなパターンを生じる。ソーティングパラメーターを、対角線にのっていない領域（１１２）のＧＭＡビーズを識別するように、図１ｂに示すように設定し、そしてＭＰＳＳ分析のために収集する。
【０１１０】
標識されたｃＤＮＡ鎖を、ＧＭＡビーズから溶解し、そして遠心分離により取り除く。数回洗浄した後、プライマーを式Ｉに示すプライマー結合部位にアニールさせ、そして上述したＤｐｎ  ＩＩ部位を含むＧＭＡビーズ上に二本鎖ＤＮＡを再構築するために従来の重合反応で伸長させる。Ｄｐｎ  ＩＩでの消化後、タグ−ｃＤＮＡ結合体をロードしたビーズを、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、（上述）に記載されるように、ＭＰＳＳ分析のための機器中に配置する。
【０１１１】
６４のコードアダプターの以下の１６のセット（配列番号１０〜配列番号２５）の先端鎖を、標準的な方法を用いて自動ＤＮＡ合成装置（モデル３９２Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）で各々別々に合成する。全てのアダプターについて同じである、後部鎖を別々に合成し、次いでそれぞれ先端鎖にハイブリダイズさせる。
【０１１２】
【化９】
0004344086.tif 000011
ここでＮは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、またはｄＴのいずれかであり；ｐはリン酸基であり；そして小文字で示されるヌクレオチドは、１２マーのオリゴヌクレオチドタグである。それぞれのタグは、６ヌクレオチドずつ互いに異なっている。各アダプターの等しいモル量を、１０００ｐｍｏｌ／μＬの濃度の混合物を形成するようにＮＥＢ＃２制限緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に組み合わせる。
【０１１３】
１６タグ相補体の各々を、アミノ誘導されたオリゴヌクレオチドとして別々に合成し、そしてポリエチレングリコールリンカー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を介してタグ相補体の５’末端に結合するフルオレセイン分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲより入手可能なフルオレセインのＮＨＳ−エステルを用いる）でそれぞれ標識する。タグ相補体の配列は、単に、上記に列挙したタグの１２マーの相補体である。
【０１１４】
アダプターの標的ポリヌクレオチドへのライゲーションを、５μｌのビーズ（２０ｍｇ）、３μＬのＮＥＢ  １０×リガーゼ緩衝液、５μのアダプター混合物（２５ｎＭ）、２，５μＬのＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００単位／μＬ）、および１４．５μＬの蒸留水からなる混合物中で行なう。混合物を、１６℃で３０分間インキュベートし、その後ビーズをＴＥ（ｐＨ８．０）で３回洗浄する。
【０１１５】
遠心分離してＴＥを取り除いた後、連結したアダプターの３’ホスフェートを、製造者のプロトコルを用いて、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）でポリヌクレオチド−ビーズ混合物を処理することにより取り除く。３’ホスフェートを取り除いた後、ＣＩＰを、タンパク分解性消化（例えば、プロナーゼＴＭ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｉｅｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手可能）または等価のプロテアーゼを製造者のプロトコルにしたがって用いて、不活化し得る。次いで、ポリヌクレオチド−ビーズ混合物を洗浄し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の混合物で処理し、標的ポリヌクレオチドとアダプターとの間のギャップに５’ホスフェートを付加し、そして標的ポリヌクレオチドへのアダプターのライゲーションを完全にする。次いで、ビーズ−ポリヌクレオチド混合物を、ＴＥで洗浄する。
【０１１６】
これとは別に、標識されたタグ相補体の各々を、ポリヌクレオチド−ビーズ混合物に、オリゴヌクレオチドタグとそれぞれのそれらの相補体との間にのみ完全にマッチした二重鎖が形成され得るような条件下で添加する。その後、混合物をストリンジェント条件下で洗浄し、そして蛍光シグナルの存在または不在を測定する。タグ相補体を、２５ｎＭのタグ相補体、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、からなる溶液に２０℃で添加し、１０分間インキュベートし、次いで同じ溶液（タグ相補体を除く）で、５５℃で１０分間洗浄する。
【０１１７】
４つのヌクレオチドを上述のように同定した後、コードアダプターを、ポリヌクレオチドから製造者のプロトコルを用いてＢｂｖ  Ｉを用いて切断する。最初のライゲーションおよび同定の後、ライゲーション、同定および切断のサイクルを標的ポリヌクレオチドの１６末端ヌクレオチドの配列を得るために、３回反復する。
【０１１８】
好ましくは、ハイブリダイズしたコードアダプターの分析を、ｉ）ロードした微粒子を、フローチャンバー内の平面のアレイに配置させる、ｉｉ）プロセス試薬のフローチャンバーへのプログラムされた送達を可能にする、ｉｉｉ）粒子のアレイからの光学的シグナルを同時に検出する機器で行なう。このような好ましい機器を、図２に概略図で示し、そしてさらに詳しくは、Ｂｒｉｄｇｈａｍら、国際特許公開ＷＯ９８／５３３００に開示される。手短に言えば、フローチャンバー（５００）を、ガラスプレート（５０６）中の液体注入口（５０２）および排出口（５０４）を有するキャビティを、標準的な微細加工技術（例えば、Ｅｋｓｔｒｏｍら、国際特許公開ＷＯ９１／１６９６６；Ｂｒｏｗｎ、米国特許第４，９１１，７８２号；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：１９２６−１９３２（１９９２）；など）を用いてエッチングすることにより調製する。フローチャンバー（５００）の次元は、ロードした微粒子（５０８）（例えば、ＧＭＡビーズ）が、１００，０００〜２００，０００のビーズの密接にパッキングされた平面の単層でキャビティ（５１０）に配置し得るような次元である。キャビティ（５１０）は、エッチングされたガラスプレート（５０６）（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ、米国特許第３，３９７，２７９号）上のガラスカバースリップ（５１２）のアノード結合による注入口および排出口を有する閉鎖したチャンバー内に作製する。試薬を、自動ＤＮＡおよびペプチド合成機（例えば、Ｂｒｉｄｇｈａｍら、米国特許第４，６６８，４７９号；Ｈｏｏｄら、米国特許第４，２５２，７６９号；Ｂａｒｓｔｏｗら、米国特許第５，２０３，３６８号；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、米国特許第４，７０３，９１３号；など）上で一般に用いられるマイクロプロセッサーにより制御されるバルブブロック（５２２）を介してシリンジポンプ（５１４〜５２０）からフローチャンバー中で計測される。
【０１１９】
ライゲーション、同定および切断の３サイクルを、フローチャンバー（５００）内で、約１００，０００フラグメントの各末端に１２ヌクレオチドの配列を与えるために行なう。フラグメントのヌクレオチドを、上述のコードアダプターにタグ相補体をハイブリダイズすることにより同定する。特異的にハイブリダイズするタグ相補体を、レーザー、水銀アークランプなどであり得る光源（５２６）からイルミネーションビーム（５２４）を用いてそれらの蛍光標識を励起させることにより検出する。イルミネーションビーム（５２４）は、フィルター（５２８）を通過し、そしてフローチャンバー（５００）内のコードアダプターに特異的にハイブリダイズするタグ相補体上の蛍光標識を励起させる。得られる蛍光（５３０）を、共焦点顕微鏡（５３２）により収集し、フィルター（５３４）を通過させ、そしてＣＣＤカメラ（５３６）に方向付ける。このカメラは、ワークステーション（５３８）による処理および解析のためのビーズアレイの電気的画像を作製する。好ましくは、各ライゲーションおよび切断の工程の後、ｃＤＮＡを、プロナーゼＴＭまたは類似の酵素で処理する。約０．７５単位／ｍＬのコードアダプターおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、１６℃で約２０〜３０分間、毎分約１〜２μｌの流速でフローチャンバー内を通し、その後、３’ホスフェートを、アダプターから取り除き、そしてｃＤＮＡを、１５〜２０分間、毎分１〜２μＬの流速を用いて、３７℃でフローチャンバー内を、０．０２単位／μＬのアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および７単位／μＬのＴ４  ＤＮＡキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の混合物を通過させることにより、第２鎖のライゲーションのために調製する。ライゲーションを、２０〜３０分間フローチャンバーを通過させるＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．７５単位／ｍＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により行なう。２５ｎＭの濃度のタグ相補体を、１０分間２０℃で、毎分１〜２μＬの流速でフローチャンバーを通過させ、その後、タグ相補体により運搬される蛍光標識を、イルミネートし、そして蛍光を収集する。タグ相補体を、５５℃で１０分間、毎分１〜２μＬの流速で、フローチャンバーにハイブリダイゼーション緩衝液を通すことにより、コードアダプターから溶解する。コードアダプターを、３７℃で２０分間、毎分１〜２μＬの流速で、１単位／μＬのＢｂｖ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を通過させることによりｃＤＮＡから切断する。
【０１２０】
（実施例４：フルオレセインおよびＣＹ５を用いて標識されたＤＮＡの異なる比率でロードされる微粒子のＦＡＣＳ分析）
この実施例において、異なる比率の別の仕方で標識されたｃＤＮＡの検出の感度を、単一のクローンからなる、参照ＤＮＡ集団の構築、次いで異なる蛍光染色により標識された異なる比率の相補鎖を、参照ＤＮＡ集団に競合的にハイブリダイズされることにより試験した。参照ＤＮＡ集団は、「８８．１１」と命名されたｃＤＮＡクローンからなった。これは、受託番号ＴＩＢ  ２０２のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能な、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１の発現遺伝子の８７塩基対フラグメントである。８８．１１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇライブラリーにおける多くの部分と高い相同性を有する（例えば、ｇｂＡＡ８３０６０２（９８％））。８８．１１ｃＤＮＡのみからなる参照ＤＮＡ集団を、全ての微粒子が付着された同一のタグ相補体を有するという微粒子の特別な集団が調製されることを除いて、実施例１に記載されるように調製した。この対応するオリゴヌクレオチドタグを、８８．１１ｃＤＮＡに付着した。従って、タグおよびタグ相補体の単一特異的集団のみが、実験に関与した。競合ハイブリダイゼーションの後、ロードした微粒子を、上記のＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）ＦＡＣＳ機器で分析した。
【０１２１】
８８．１１ｃＤＮＡをまた、タグ３３６を含まないことを除いて実施例１と同一のベクター（図３ｂの３３０）にクローニングした。１０μｇのベクターＤＮＡを、Ｄｐｎ  ＩＩのアイソジマーであるＳａｕ  ３Ａ（図３ｂの３４２）で完全に切断することにより線状化し、その後精製された直線ＤＮＡの２つの１μｇのアリコートを得た。各１μｇのアリコートから約２０μｇの標識された一本鎖ＤＮＡ生成物が、プライマー結合部位３３２に特異的なプライマーを用いる線状増幅の反復サイクルにより生成された。１つのアリコートにおいて、生成物を、ローダミンＲ１１０標識化ｄＵＴＰ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の取り込みにより標識化し；そしてもう一方のアリコートにおいて、生成物をＣＹ５標識化ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の取り込みにより標識化した。標識された生成物の量を、２つの生成物の７つの５μｇ量を１：１、２：１、１：２、４：１、１：４、８：１および１：８の割合で形成するために、組み合わせた。５μｇ量の標識された生成物を、別々に、６５℃で０．２％のＳＤＳを有する５０μｌの４×ＳＳＣ中で一晩、１．６×１０5の粒子（８８．１１ｃＤＮＡを結合させたＧＭＡビーズ）にハイブリダイズさせ、その後氷冷したＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（上記で定義）での１０ｍｌまでの希釈により反応を終了させた。ロードした微粒子を、遠心分離し、６５℃で１５分間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの１×ＳＳＣ中に懸濁することにより洗浄し、遠心分離し、そして５５℃で１５分間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの０．１×ＳＳＣ中に懸濁して再度洗浄した。２回目の洗浄後、微粒子を、遠心分離し、そしてＦＡＣＳ分析のために０．５ｍｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮ溶液中に再懸濁した。
【０１２２】
その結果を、図５ａ〜５ｅに示す。ここで、各図の垂直方向の軸は、ＣＹ５蛍光に対応し、そして水平方向の軸は、ローダミンＲ１１０蛍光に対応する。図５ａにおいて、相補的参照鎖にハイブリダイズした全てのＲ１１０標識化ＤＮＡまたは全てのＣＹ５標識化ＤＮＡのいずれかを有する微粒子の集団を組み合わせた。５５０および５５２の等高線は、ＦＡＣＳ機器の検出システムにより、明確に識別され、そして両方の集団の微粒子は、容易に検出可能なシグナルを産生した。図５ｂは、Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、同じ比率でハイブリダイズされる場合を示す。期待されるように、得られた等高線は、グラフの対角線上に位置し、そして非調節遺伝子について予期される位置と対応する。図５ｃ〜図５ｅは、競合ハイブリダイゼーションの３対の分析を示す：ｉ）Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、２：１の濃度比および１：２の濃度比でハイブリダイズされる、ｉｉ）Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、４：１の濃度比および１：４の濃度比でハイブリダイズされる、ならびにｉｉｉ）Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、８：１の濃度比および１：８の濃度比でハイブリダイズされる。図５ｃのデータは、２の因子によりアップレギュレートされる遺伝子またはダウンレギュレートされる遺伝子が、本実施態様において検出可能であるが、有意な重複が、調節遺伝子および非調節遺伝子により生成されるシグナル間に存在し得ることを示唆する。図５ｄおよび５ｅは、４またはそれ以上の因子により、アップレギュレートされる遺伝子またはダウンレギュレートされる遺伝子が、非調節遺伝子に関して容易
に検出可能であることを示唆する。
【０１２３】
（実施例５：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞から示差的に発現された遺伝子のＦＡＣＳ分析）
本実施例において、微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を、以下に示されるように刺激されたＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡから構築した。次いで、刺激されたＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞の両方に由来する等濃度の標識ｃＤＮＡを、実施例１に記載のように参照ＤＮＡ集団と競合的にハイブリダイズし、そして標識ｃＤＮＡを運搬する微小粒子をＦＡＣＳ装置で分析した。ＴＨＰ−１細胞をホルボール１２−ミリステート１３−酢酸（ＰＭＡ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）での処理により刺激した。
【０１２４】
ＴＨＰ−１細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．２６１４０−０３８）、１００単位（ｕｎｉｔ）／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．１５１４０−１２２）、および０．５μＭのβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｍ３１４８）を補った５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．１１３２０−０３３）を含むＴ−１６５フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｎｏ．３１５１）中で増殖した。培養は、１×１０5細胞／ｍｌを接種し、そして１×１０6の最大密度まで増殖した。培養の細胞集団の倍増時間は、約３６時間であった。細胞を以下のようにＰＭＡで処理した：フラスコからの細胞（約５×１０7細胞）を１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒモデル）し、そしてＤＭＳＯ（Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．２１９８５−０２３）中の５μｌの１．０ｍＭ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｐ−８１３９）を含む、または５μｌのＤＭＳＯ（非刺激の集団の場合）を含む５０ｍｌの新鮮培養培地（抗生物質なし）中に再懸濁し、その後この細胞を４８時間培養した。４８時間の培養の後、培地および非定着細胞を実験フラスコから吸引し（すなわち、刺激された細胞を含んでいる）、そして新鮮培地（抗生物質なし）を加えた（この新鮮培地は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｌ−４１３０）を含有している）。非刺激細胞の培養物を、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒモデル）して、ペレットを形成し、次いでこれを１０μｌのＰＢＳを含む新鮮増殖培地の５０ｍｌに再懸濁した。刺激細胞、および非刺激細胞の両方の培養物を４時間３７℃でインキュベートし、その後、細胞を以下のように回収した：培地を培養物から吸引し、そして定着した細胞を温めたＰＢＳで２回洗浄し、その後１０ｍｌのＰＢＳを添加し、そして細胞をセルスケーパーで取り出した。取り出した細胞を収集し、そしてその濃度を血球計算器で決定し、その後それらを１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒモデル）して、ペレットを形成し、これを直ちにＲＮＡ抽出のために用いた。
【０１２５】
ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ単離のためのＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０ｋｉｔ（Ｎｏ．Ｋ１５９３−０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて約５×１０6の細胞から抽出した。製造業者のプロトコールに有意な変化なく従った。微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を、実施例１に記載のように刺激細胞から抽出したｍＲＮＡから構築した。別のｃＤＮＡライブラリーを、刺激細胞および非刺激細胞から抽出したｍＲＮＡから構築した。ライブラリーのために用いたベクターは、オリゴヌクレオチドタグを含まないことを除いては、実施例１のベクターと同一であった（図３ｂの３３６）。実施例４のプロトコールに従って、ローダミンＲ１１０標識された１本鎖ＤＮＡの約２．５μｇを刺激細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから作製し、そしてＣＹ５標識された一本鎖ＤＮＡの約２．５μｇを非刺激細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから作製した。２．５μｇのアリコートの２つを混合し、そして９．３４×１０5の微小粒子上の参照ＤＮＡに対して競合的にハイブリダイズした。反応条件およびプロトコールは実施例４に記載した。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション後、この微小粒子を、上記のようにＣｙｔｏｔｎａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．のＭｏＦｌｏ  ＦＡＣＳ装置で選別した。図６は、２つの蛍光性色素について異なる蛍光強度の値を有する微小粒子の周波数の従来のＦＡＣＳカウンタープロット６００を含む。上方制御された遺伝子に対応する約１０，０００の微小粒子（図６のソートウインドウ６０２）を単離し、そして下方制御された遺伝子に対応する約１２，０００の微小粒子（図６のソートウインドウ６０４）を単離した。上記のように、標識した鎖をメルトオフ（ｍｅｌｔ  ｏｆｆ）した後、微小粒子により運搬されるｃＤＮＡを市販のＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて増幅し、製造業者の推薦するクローニングベクターにクローニングした。形質転換、宿主培養の増殖、およびプレーティングをした後、上方制御されたｃＤＮＡの８７のコロニーを選び出（ｐｉｃｋ）し、そして下方制御したｃＤＮＡの７３のコロニーを選び出した。これらのコロニーから抽出したプラスミドにより運搬されるｃＤＮＡをＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３７３モデル、自動ＤＮＡシーケンサーの従来のプロトコールを用いて配列決定した。同定した配列を表１および２に列挙した。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
【表２】
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（実施例６：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来の示差的発現遺伝子のＦＡＣＳ分析）
（実験：Ｃｏｍｐ  １１）
微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を刺激ＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡから構築した。刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡを、以下のように競合的ハイブリダイゼーションのために調製した。ＴＨＰ−１非刺激プローブライブラリー（Ｕ３Ａ−ＴＬ）およびＴＨＰ−１刺激プローブライブラリー（Ｓ３Ａ−ＴＬ）のそれぞれ２０μｇを、直線ＰＣＲ（ｌｉｎｅａｒ  ＰＣＲ）のためのベクターを調製するために５０単位のＳａｕ３Ａで消化した。このＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、ＰＣＲにより蛍光標識した。補正の目的ために、ＣＹ５およびＲ１１０の両方をそれぞれの条件を標識するために用いた。
【０１２９】
Ｕ３Ａ−ＴＬのＤＮＡをＣＹ５で標識し、そしてＳ３Ａ−ＴＬのＤＮＡをＲ１１０で標識した。簡略に言えば、反応混合物には以下を含む：８０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液；１６μｌのビオチン化プライマー（Ｂ−プライマー、１２５ｐｍｏｌｅ／：ｌ）；１６μｌのｄＮＴＰｓ（６．２５ｍＭ）；４μｇのテンプレート；１６μｌのＫｌｅｎｔａｑ酵素；６４μｌのＲ１１０  ｄＵＴＰまたは６．４μｌのＣＹ５  ｄＵＴＰ；および総容量８００μｌにするための水。この混合物を８つのアリコートに分配し、次いで、以下のプロトコールに従って３４サイクルのＰＣＲを実施した：１）９４℃３分；２）９４℃３０秒；３）６２℃３０秒；４）７２℃１分；そして５）７２℃１０分。このＰＣＲ反応物を精製し、そして着色したヌクレオチドを沈殿することにより除去した。
【０１３０】
（参照集団）
Ｃｏｍｐ１１のビーズライブラリーは、ＴＨＰ−１刺激ライブラリー由来の百万クローンの複雑性を有する２，６６７，３６９のビーズからなる。このビーズは、図３に概説で上記したように調製した。ＦＩＴＣシグナルのためのＰＭＴ２平均の開始は、１９．５であった。ビーズ上の二本鎖ＤＮＡを中度のボルテックスで、１５分間の室温（ＲＴ）での２．５ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＯＨ洗浄で変性した。変性化の効率を、２．２（すなわち、１１．３％の残余の蛍光）である残りのＦＩＴＣシグナル平均を測定することにより決定した。このビーズを０．５ｍｌの４×ＳＣＣ  ０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。
【０１３１】
（競合的ハイブリダイゼーション）
１００，０００のビーズをＣＹ５で標識した刺激プローブライブラリー（Ｓ３Ａ−ＴＬ）、およびＲ１１０で標識した同じライブラリーのそれぞれの直線ＰＣＲ産物の１０μｇでハイブリダイズした。９３６，５４２のビーズをＣＹ５刺激プローブの１０μｇおよびＲ１１０非刺激プローブの１０μｇでハイブリダイズした。このビーズを、４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終緩衝液組成物の５０μｌ中に集めた。このサンプルを３分間８０℃に熱し、プローブを添加し、そして温度を６５℃に変更した。ハイブリダイゼーションは、ボルテックスしながら１６時間持続した。このビーズを１０ｍｌのＴＥ  ＴＷＥＥＮに氷急冷した。回収したサンプルを１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回リンスし、０．５ｍｌの１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに再懸濁し、そして１５分間、６５℃で洗浄した。このビーズを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でリンスし、そして１５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５５℃で洗浄した。このサンプルをＴＥ  ＴＷＥＥＮでリンスし、そして両方のサンプルの１０，０００事象をＢＤ  ＦａｃｓＣａｌｉｂｅｒで分析した。１０，１６３ビーズ（１．１５％）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＣＹ５）を選別した。１１，９７７ビーズ（１．３５％）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＲ１１０）を選別した。このビーズをＰＣＲ反応物にプールし、ＴＡクローン化し、そしてＴＡ配列決定した。同定された配列を表３および４に列挙する。
【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
【表４】
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（実施例７：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来の示差的発現遺伝子のＦＡＣＳ分析）
（実験：Ｃｏｍｐ  １４）
別の実験において、参照ＤＮＡ集団調整物および競合的ハイブリダイゼーションを実施例６に記載のように行った。９１５０ビーズ（０．８９％）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＣＹ５）を選別した。１１０８５ビーズ（１．１５％）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＲ１１０）を選別した。同定された配列を表５および６に列挙する。
【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
【表６】
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（実施例８：刺激されたＴＨＰ−１細胞または刺激されないＴＨＰ−１細胞より示差的に発現された遺伝子のＦＡＣＳ分析）
（実験：Ｃｏｍｐ１５）
別々の実験において、刺激されたＴＨＰ−１細胞および刺激されないＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡを、実施例６に記載のように、競合的ハイブリダイゼーションのために調製した。ＴＨＰ−１刺激されたライブラリーおよびＴＨＰ−１刺激されないライブラリー（それぞれ５０％）由来の１００万クローンの複雑性を有する、２，５７０，０００ビーズからなるＣｏｍｐ１５ビーズライブラリーを除いて、実施例６に記載のように、参照ＤＮＡ集団を調製した。１３，９８８ビーズ（０．８７％）（１：１対角線から離れた最も明るいＣＹ５）を選別した。１７，３９３ビーズ（１．０８％）（１：１対角線から離れた最も明るいＲ１１０）を選別した。同定された配列を表７および８に列挙する。
【０１３６】
【表７】
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【０１３７】
【表８】
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（実施例９：刺激されたＴＨＰ−１細胞由来の希遺伝子の単離）
（実験：Ｃｏｔ３）
この実施例において、低い相対強度のビーズを収集することによって、希遺伝子（ｒａｒｅ  ｇｅｎｅ）を、刺激されたＴＨＰ−１細胞から単離する。ビーズライブラリーおよびプローブライブラリーを、ホルボールエステルで処理したＴＨＰ−１培養細胞から調製されるｍＲＮＡから構築した。６つのビーズライブラリー（１６０Ｋ複雑性）をＢＰ１１組み合せタグ化ビーズに２回ロードした。計１，２６０，０００ビーズを選別した。このビーズを充填し、連結した。ビーズ鎖の先端鎖を、室温で１５分間穏かにボルテックスしながら、２．５ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄して除去した。このビーズを、０．５ｍｌの４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。１００，０００ビーズを、５０ｎｇのＣＹ５標識化プローブ（刺激されたＴＨＰ−１細胞由来）を用いて、４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃で、一晩ハイブリダイズした。回収したサンプルを、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回すすぎ、０．５ｍｌの１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中に再懸濁し、そして６５℃で１５分間洗浄した。次いで、このビーズを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳですすぎ、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５５℃で１５分間洗浄した。９８，８８０クローンを分析し、そしてフローサイトメトリによって選別した。サンプルＣＴ００３Ｅは、ほとんどどのＣＹ５プローブにもハイブリダイズしない１２６クローンを含んだ。サンプルＣＴ００３Ｆは、対角線へ移動するのに十分なプローブを見出さなかった１５５７クローンを含んだ。これらのビーズは、本発明者らのプローブライブラリーにおいて、最も少ない頻度のコピーを含んだ。各ゲートからの５０クローン（図７を参照のこと）を配列分析のために選抜した。この同定された配列を表９に列挙する。
【０１３８】
【表９】
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（実施例１０：ヒト骨髄由来の希遺伝子の単離）
ビーズライブラリーおよびプローブライブラリーを市販の骨髄由来ｍＲＮＡから構築した。ＢＰ  １２組み合せタグ化ビーズに、６つのビーズライブラリー（１６０Ｋ複雑性）を２回ロードした。それらは、混合物２１６、２１７、２１８および２１９を形成した。計３，１５０，０００ビーズを選別した。このビーズを充填しそして連結した。混合物２１７の先端鎖をＮａＯＨで除去した。ＣＹ５ヌクレオチドを用いてＣＴ１骨髄プローブを直線状に増幅し、次いで精製した。２００，０００ビーズを、５ｎｇおよび５０ｎｇのプローブを用いて６５℃で一晩、ハイブリダイズした。５ｎＧハイブリダイゼーションから生じた１８０，０００クローンを問い合わせて、そして選別した。サンプルＣＴ００１は、ほとんどどのＣＹ５プローブもハイブリダイズしない９９６クローンを含んだ。ＣＴ００２サンプルは、対角線に移動するのに十分なプローブを見出さなかった１９９８クローンを含んだ。これらのビーズは。本発明者らのプローブライブラリーにおいて最も少ない頻度のコピーを含んだ。各ゲート由来の２００クローン（図８を参照のこと）を配列分析のために選抜した。
【０１３９】
（実施例１１：正常なヒト筋肉組識およびグルコース欠乏ヒト筋肉組識由来の示差的に発現された遺伝子のＦＡＣＳ分析）
２つの状態における筋肉組識から調製したｍＲＮＡより、ビーズライブラリーおよびプローブライブラリーを構築した：グルコース正常（基本）およびグルコース欠乏（クランプ）。グルコース正常状態由来の６つのビーズライブラリー（１６０Ｋ複雑性）を、ＢＰ  １２組み合わせタグ化ビーズにロードし、混合物２３７を形成した。計８１０，０００のビーズを選別した。このビーズを充填し、そして連結した。このビーズを、ＤｐｎＩＩ酵素を用いて消化し、そして共有結合的に付着させたＤＮＡ鎖に対して逆の鎖上で、ＦＩＴＣと共にアダプターと連結させた。混合物２１７の先端鎖をＮａＯＨで除去した。ＣＴ１グルコース正常プローブ（１３，５１０，０００複雑性）を、ＣＹ５ヌクレオチドを用いて線状に増幅し、次いで精製した。ＣＴ２グルコース星型プローブ（ｓｔａｒｒｅｄ  ｐｒｏｂｅ）（７，１３２，０００複雑性）をＲ１１０ヌクレオチドを用いて線状に増幅し、次いで精製した。２５０，０００ビーズを５ｕｇの各プローブを用いて６５℃で一晩、ハイブリダイズした。２３０，０００クローンを問い合わせ、そして選別した。サンプルＵＰ００１は、アップレギュレートされる９６８クローンを含んだ。サンプルＤＮ００１は、ダウンレギュレートされる１６５２クローンを含んだ。各ゲートからの１０００クローン（図９を参照のこと）を、配列分析のために選抜した。同定された配列を表１０および１１に列挙する。
【０１４０】
【表１０】
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【０１４１】
【表１１】
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本明細書中に言及される全ての刊行物および特許明細書は、各個々の刊行物または特許明細書が、特定のおよび個々に参考として援用されるように示されるのと同じ程度まで、本明細書中において参考として援用される。
【０１４２】
本発明は、今や十分に記載されている。多くの変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａおよび図１Ｂは、２つの異なる蛍光色素でラベルされた競合的にハイブリダイズされるＤＮＡ鎖をロードされた微小粒子のＦＡＣＳ分析を示す。
【図２】  図２は、配列決定のための制限フラグメントでロードされた微小粒子の平面アレイを観察するための、フローチャンバーおよび検出装置の略図である。
【図３Ａ】  図３Ａは、単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡへの転換、およびそのｃＤＮＡのタグ含有ベクター内への挿入のための好ましい模式図を示す。
【図３Ｂ】  図３Ｂは、ベクターからのタグｃＤＮＡ結合体の増幅、およびその増幅された結合体の微小粒子状へのロードのための好ましい模式図を示す。
【図３Ｃ】  図３Ｃは、クローニングおよび配列決定のための分類されたｃＤＮＡを単離するための好ましい模式図を示す。
【図４Ａ】  図４Ａは、ＦＡＣＳ分類により単離された差示的に発現されるｃＤＮＡのクローニングのための、代替的手順を示す。
【図４Ｂ】  図４Ｂは、ＦＡＣＳ分類により単離された差示的に発現されるｃＤＮＡのクローニングのための、代替的手順を示す。
【図５】  図５Ａ〜Ｅは、所定の比の２つの差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。
【図６】  図６は、刺激されたＴＨＰ−１細胞および刺激されないＴＨＰ−１細胞由来の差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。
【図７】  図７は、刺激されたＴＨＰ−１細胞中の低い存在度のｍＲＮＡに由来する、標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。
【図８】  図８は、ヒト骨髄中の低い存在度のｍＲＮＡに由来する、標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。
【図９】  図９は、グルコース正常筋肉組織およびグルコース飢餓筋肉組織に由来する、差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。
【図１０Ａ】  図１０Ａは、微小粒子上の参照核酸集団の構築のための、本発明の実施態様を示す。
【図１０Ｂ】  図１０Ｂは、図１０Ａの参照ライブラリーを使用して、２つの細胞集団の遺伝子発現を比較するための実施態様を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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