(57)【要約】遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の患者の急性発作を治療するための方法であって、当該方法によって、組換え体Ｃ１エステラーゼ抑制剤の初回用量および２回目用量は、それぞれ、患者当たり５０ＩＵ／ｋｇ体重で、患者に静脈内投与され、これにおいて、初回用量および２回目用量は２４時間以内に投与される。組み換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列およびヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤と比較して修飾された炭水化物構造を有する。急性症状の軽減並びに再発および／または新たな発作症状の減少は、当該方法の使用によって達成される。
2017506676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の急性発作を治療する方法であって、前記方法は：
前記患者において５０ＩＵ／ｋｇ体重の組換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤の初回用量を前記患者に静脈内投与すること；および
前記初回用量の投与後、前記患者に５０ＩＵ／ｋｇ体重の組換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤の２回目用量を前記患者に静脈内投与することにより、前記患者のＨＡＥの急性発作を治療すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記初回用量は、前記患者におけるＨＡＥの発作の開始から５時間以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２回目用量は、前記初回用量を投与後、少なくとも４時間で投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記初回用量および前記２回目用量は、２４時間以内に投与される、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２回以下の用量を２４時間以内に投与する、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は複数の発作部位を有する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発作部位は、末梢、腹部、顔面、口腔咽頭、または喉頭である請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発作部位は、末梢である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発作部位は、腹部である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記発作部位は、顔面である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記発作部位は、口腔咽頭である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記発作部位は、喉頭である請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者は、発作と関連する生命を脅かす症状を有する、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発作は、１００ｍｍの視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）で、少なくとも５０ｍｍの重症度評価を有する、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者は、症状の軽減の開始が初回投与から４時間以内に起こり、軽減の程度が２回目投与より前にＶＡＳスコアで２０ｍｍ未満減少する個体であり、および／または、ここでＶＡＳスコアの減少は連続する２つの時点に基づいて測定される、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者は、発作症状が初回投与後に持続する個体である、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み換え体Ｃ１阻害剤は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列およびヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤と比較して修飾された炭水化物構造を有する、請求項１〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換え体Ｃ１阻害剤は、トランスジェニックウサギの乳から精製される請求項１〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え体Ｃ１阻害剤は、ｒｈＣ１ＩＮＨである、請求項１〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記初回投与および２回目投与は、患者によって自己投与される、請求項１〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年２月２８日に提出された米国仮特許出願第６１／９４６，６７７に対する３５ＵＳＣ１１９（ｅ）の利益を主張し、すべての目的のため、当該全体の参照によって本明細書に援用される。
［背景］
ヒトＣ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）は、Ｃ１エステラーゼ阻害剤としても知られており、セリンプロテアーゼ阻害剤のスーパーファミリーの物質である。米国特許７，０６７，７１３には、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（ｒｈＣ１ＩＮＨ）の乳中における組換え体Ｃ１阻害剤の産生を開示する。その特許は、またＣ１阻害剤（または当該組換え体調製物）が、ＨＡＥ患者または免疫抑制を必要とする患者を治療するのに有用であることも示す。
【０００２】
ＨＡＥは、稀な、潜在的に生命を脅かす疾患であり、常染色体優性遺伝疾患であると理解されている。Ｃ１エステラーゼ阻害剤欠乏を伴う遺伝性血管性浮腫は、組織腫脹の再発性発作によって特徴づけられる。例えば、ＨＡＥ発作は、顔面、末梢、咽頭／喉頭、消化（ＧＩ）管／腹部または泌尿生殖器の腫れの再発エピソードとして示すことができる。ＨＡＥ発作に苦しむ患者は、激しい痛み、障害、膨満感、吐き気、等にも苦しむことになり、入院、または学校、仕事、および社会的相互作用ならびに睡眠の中断の経験を必要とするかもしれない。急性発作は予測不可能であり、明白な引き金なしに頻繁に発生する。急性ＨＡＥ発作の患者の症状の軽減を達成する方法のための技術を必要とする。
［概要］
本発明は、ヒトの患者においてＨＡＥの急性発作の新規な治療法の発見に、部分的に基づく。本願に記載される方法および投与計画は、ＨＡＥ患者の生存に有利、場合によっては重要であるかもしれない。投与計画の恩恵を受け得る患者のグループは、生命を脅かすＨＡＥの症状を有する個人、組換え体Ｃ１抑制剤の初回投与後４時間でＨＡＥ発作の症状からの軽減を経験しない患者、および組換え体Ｃ１抑制剤の初回投与後にわずかな軽減（ＶＡＳスコアの２０ｍｍ未満の減少）のみを経験する患者、を除外せずに含む。
【０００３】
本願に記載される一態様は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の患者における急性発作を治療するための方法である。当該方法は、組換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤の初回用量を、５０ＩＵ／ｋｇ患者の体重で患者に静脈内投与し、初回用量の投与後に、組換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤の２回目用量を５０ＩＵ／ｋｇ患者の体重で患者に静脈内投与し、それによってＨＡＥ患者における急性ＨＡＥの発作を治療することを含む。
【０００４】
いくつかの実施形態において、初回用量は、患者においてＨＡＥ発作の発病から５時間以内に投与される。更なる実施形態において、２回目用量は、初回投与後、少なくとも４時間で投与される。更なる実施形態において、初回用量および２回目用量は２４時間以内で投与される。更なる実施形態において、２回以下の用量が２４時間以内に投与される。
【０００５】
いくつかの実施形態において、当該方法は、複数のＨＡＥ発作部位を有する患者に実施される。発作部位は、末梢、腹部、顔面、口腔咽頭および／または喉頭であってもよい。更なる実施形態において、ＨＡＥ発作は、患者の生命を脅かす症状の形態で明示される。更なる実施形態において、発作は、１００ｍｍの視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）で、少なくとも５０ｍｍの重症度評価を有してもよい。
【０００６】
いくつかの実施形態において、当該方法は、患者に実施され、症状の軽減の開始は、初回投与から４時間以内に起こり、軽減の程度は、２回目投与より前にＶＡＳスコアで２０ｍｍ未満減少する。ＶＡＳＳスコアの減少は、場合によっては、連続する２つの時点に基づいて測定されてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、患者において実施され、患者のＨＡＥ発作の症状は、初回投与後および２回目投与より前まで続く。
いくつかの実施形態において、本願に記載される組み換え体Ｃ１阻害剤は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列、およびヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼ阻害剤と比較して修飾された炭水化物構造を有する。更なる実施形態において、組換え体Ｃ１阻害剤は、トランスジェニック哺乳類の乳から精製される。更なる実施形態において、組換え体Ｃ１阻害剤は、ｒｈＣ１ＩＮＨである。
【０００８】
本願に記載されるいずれかの実施形態において、組換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤の初回および２回目投与は、患者によって自己投与されてもよい。
他の態様において、本願で提供されるのは、ＨＡＥを治療する方法であり、方法は、Ｃ１阻害剤を含む組成物を投与することを含み、当該方法において症状の大幅な軽減が４時間以内に達成される。本願に記載される他の態様は、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含む急性ＨＡＥ発作に苦しむ患者を治療する方法であり、当該方法において治療は、急性ＨＡＥ発作の症状から患者を大幅に楽にし、１２時間、または好ましくは２４時間、またはより好ましくは４８時間、またはさらに好ましくは７２時間以内に症状が再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）することはない。さらに、１２時間、より好ましくは２４時間、またはより好ましくは４８時間、またはさらに好ましくは７２時間以内の新たな急性ＨＡＥ発作はないと好ましい。
【０００９】
本願に記載される他の態様において、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含むＨＡＥ患者の治療方法であり、当該方法において、治療は、ＨＡＥ症状の大幅な軽減を提供するが、患者のＤ−ダイマーレベルは大幅に上昇しない。より好ましくは、Ｄ−ダイマーレベルはＣ１阻害剤組成物の投与から少なくとも７日間にわたって大幅に上昇しない。
【００１０】
更なる実施形態において、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含むＨＡＥ患者の治療方法であり、当該方法において、治療は、ＨＡＥ症状の大幅な軽減を提供するが、血栓塞栓症の危険性は大幅に増加しない。治療は、好ましくは、深部静脈血栓症の危険性を大幅に増加させない。
【００１１】
上記実施形態のそれぞれに、Ｃ１阻害剤組成物を、粘膜下または皮下の１つ以上の発作部位を有する患者に投与することができる。好ましい実施形態において、Ｃ１阻害剤は、ｒｈＣ１ＩＮＨなどの組換え体Ｃ１阻害剤である。上記態様のそれぞれにおいて、組成物は、単回投与、または複数回投与、好ましくは単回投与で投与される。組成物は、２５〜１００ＩＵ／ｋｇで、より好ましくは約５０ＩＵ／ｋｇで、最も好ましくは５０ＩＵ／ｋｇで投与される。
【００１２】
上記実施形態において、Ｃ１阻害剤は、ＨＡＥ症状の軽減を提供するために好ましくは投与される。好ましい実施形態において、それらの症状の一つは、ＨＡＥによる組織腫脹である。Ｃ１阻害剤組成物を、ＨＡＥまたは急性ＨＡＥ発作に苦しむ患者に投与することができる。他の態様および実施形態を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の研究に登録された患者に投与されるｒｈＣ１ＩＮＨ投与数（単回投与対２回投与）によるＨＡＥ発作の内訳を示す円グラフ。ｒｈＣ１ＩＮＨの単回投与は、９３％の発作に投与されるのに対し、ｒｈＣ１ＩＮＨの２回投与は、７％の発作に投与された。
【図２】実施例１に記載される研究のためにｒｈＣ１ＩＮＨ治療患者における応答と再発率（ｒｅｌａｐｓｅ  ｒａｔｅｓ）を示すグラフ。これらの研究のために、応答は、持続性を伴う、４時間以内の症状の軽減の開始として定義された。持続性は、ＶＡＳスコアの２０ｍｍ以上の減少を達成する軽減の程度に関する。
【図３】実施例１に記載されるｒｈＣ１ＩＮＨ治療後、３日以内の発作症状の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓ）、または新たな発作症状の数を示すグラフ。
【図４】Ｄ−ダイマー濃度のベースライン中央値を示すグラフであり、実施例２に参照されるＨＡＥ患者では正常なレベルから上昇した。
【図５】正常のＤ−ダイマー濃度レベルと比較して、プラセボ患者対ｒｈＣ１ＩＮＨ患者の時間毎の中央値Ｄ−ダイマー濃度の変化を示すグラフ（実施例２）。
【図６】正常のＤ−ダイマー濃度レベルと比較して、粘膜下または皮下の発作部位を有したプラセボ患者のＤ−ダイマー濃度を示すグラフ（実施例２）。
【図７】正常のＤ−ダイマー濃度レベルと比較して、粘膜下または皮下の発作部位を有したｒｈＣ１ＩＮＨ患者のＤ−ダイマー濃度を示すグラフ（実施例２）。
【図８】正常のＤ−ダイマー濃度レベルと比較して、複数の発作部位対単一の発作部位を有する患者のＤ−ダイマー濃度を示すグラフ（実施例２）。
【図９】ｒｈＣ１ＩＮＨ対プラセボを投与された患者のＤ−ダイマー濃度を示すグラフ（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［詳細な説明］
Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）欠乏症を伴う遺伝性血管性浮腫は、組織腫脹の再発性発作（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ａｔｔａｃｋｓ）によって特徴付けられる。組換え体ヒトＣ１ＩＮＨ（ｒｈＣ１ＩＮＨ）は、ＨＡＥ患者における血管性浮腫症状の改善に効果的である。治療は、少なくとも１２時間、２４時間、４８時間または７２時間以内で高い応答率を生じさせ、再発（ｒｅｌａｐｓｅｓ）はないという結果になる。治療は、４時間以内に大幅な軽減または軽減の開始を提供する。更なる実施形態において、ｒｈＣ１ＩＮＨの単回投与は、急性ＨＡＥ発作の治療における持続性および耐久性のある応答を提供する。他の実施形態において、方法は、投与毎に５０ＩＵ／ｋｇ患者の体重で組換え体Ｃ１阻害剤の初回用量を患者に投与し、初回用量後、組換え体Ｃ１阻害剤の２回目用量を投与することを含む。本願に記載される方法において、本願に記載される組換え体Ｃ１阻害剤を用いる治療は、Ｄ−ダイマーレベルの上昇、血栓塞栓症、深部静脈血栓症などの副作用は生じず、またはこれらの副作用の危険性は存在しない。
【００１５】
本願に記載される一つの態様は、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含む遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）患者の治療方法であり、当該方法において、症状の大幅な軽減は４時間以内に達成される。本願に記載される他の態様において、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含む急性ＨＡＥ発作に苦しむ患者を治療する方法であり、当該方法において、治療は急性ＨＡＥ発作による症状の患者を大幅に楽にし、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間以内の症状の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）は実質的にない。さらに、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間以内の新たな急性ＨＡＥ発作がないと好ましい。
【００１６】
本願に記載される他の態様は、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含むＨＡＥ発作に苦しむ患者を治療する方法であり、当該方法において、治療はＨＡＥ症状の大幅な軽減を提供するが、患者のＤ−ダイマーレベルは実質的に上昇しない。一実施形態において、Ｃ１阻害剤組成物の投与から少なくとも７日間にわたって大幅に上昇しない。他の実施形態において、患者のＤ−ダイマーレベルは、治療後少なくとも７日間を通じて治療の時から４０００ｕｇ／Ｌより低いまま、３０００ｕｇ／Ｌより低いまま、２５００ｕｇ／Ｌより低いままである。
【００１７】
本願に記載される更なる態様は、Ｃ１阻害剤を含む組成物を患者に投与することを含むＨＡＥ発作に苦しむ患者を治療する方法であり、当該方法において、治療はＨＡＥ症状の大幅な軽減を提供するが、患者の血栓塞栓症の危険性は実質的に上昇しない。治療はさらに、深部静脈血栓症の危険性を大幅に増加させない。
【００１８】
上記実施形態のそれぞれに、Ｃ１阻害剤組成物を、粘膜下または皮下の１つ以上の発作部位を有する患者に投与することができる。一実施形態において、Ｃ１阻害剤は、ｒｈＣ１ＩＮＨである。本願に記載される上記態様のそれぞれにおいて、組成物は、単回投与、または複数回投与、好ましくは単回投与で投与される。組成物は、２５〜１００ＩＵ／ｋｇで、より好ましくは約５０ＩＵ／ｋｇで、または５０ＩＵ／ｋｇで投与される。投与は好ましくは静脈内に投与される。
【００１９】
上記実施形態において、Ｃ１阻害剤組成物は、ＨＡＥ発作からの症状の軽減を提供するため、すなわち、ＨＡＥによる組織腫脹の大幅な減少を誘導するために好ましくは投与される。
［Ｃ１阻害剤遺伝子］
Ｃｌ阻害剤ｃＤＮＡ配列は、２２個のアミノ酸シグナル配列を含む５００個のアミノ酸のタンパク質をコードすることが示された（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：４２９２−４３０１）。Ｃ１阻害剤の全ヒトゲノム配列は知られており、遺伝子は７個のイントロンを含むことを示す（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：１６３）。本願の参照において記載されるいずれかの原型の配列の対立遺伝子性、同族性（ｃｏｇｎａｔｅ）および、誘導される変異型を発現するトランスジェニック哺乳類は、本発明に含まれる。当該変異型は、通常、公知のＣ１阻害剤遺伝子とアミノ酸レベルで実質的な配列同一性を示す。当該変異型は、通常、厳しい条件下、公知の遺伝子にハイブリダイズする、または公知の遺伝子の一つによってコードされるポリペプチドに抗体と共に交差反応する。ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列の他の例は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から利用できる。Ｃ１阻害剤遺伝子のさらなるクローン配列を必要とする限り、クローン配列は、公知のＣ１阻害剤配列を用いて、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー（好ましくはヒト）から得られてもよい。
［導入遺伝子の設計］
導入遺伝子は、導入遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺に対して組換え体Ｃ１阻害剤の発現を標的に設計される。基本的なアプローチは、外因性ＤＮＡ断片の発現を促進するために効果的なシグナル配列、および制御配列を用いてタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ断片を操作可能に結合することを伴う。通常、制御配列は、プロモーター、およびエンハンサーを含む。ＤＮＡ断片は、ゲノム、ミニ遺伝子（除去される一つ以上のイントロンを有するゲノム）、ｃＤＮＡ、ＹＡＣ断片、２つの異なるＣ１阻害剤遺伝子のキメラ、またはそれらのいずれかのハイブリッドであることができる。ゲノム配列への組み込みは、一般的により高いレベルの発現につながる。
【００２０】
ゲノムの構成において、すべてのイントロン配列を保持する必要はない。例えば、いくつかのイントロン配列は、ＤＮＡ操作および続くマイクロインジェクションを促進するより小さい導入遺伝子を得るために除かれることができる。Ａｒｃｈｉｂａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９０／０５１８８（全ての目的のために完全に当該明細書において参照によって包含される）を参照されたい。いくつかのイントロンの除去は、場合によっては、発現レベルを高めるためにも役立つ。翻訳後修飾が実質的に完了することを確実にするために、発現レベルを減少させるように一つ以上のイントロンの除去が望まれてもよい。いくつかの、または全ての非コーディングエクソンを削除することも可能である。いくつかの導入遺伝子において、Ｃ１阻害剤をコードする配列において選択されたヌクレオチドは、蛋白質分解的切断部位を除くために変異される。トランスジェニック哺乳類によって生成されるＣ１阻害剤の使用目的は、通常、ヒトへの投与であり、Ｃ１阻害剤配列をコードするＤＮＡ断片を得る種は、好ましくはヒトである。同様に、使用目的が獣医用の治療（例えば、馬、犬または猫）である場合、ＤＮＡ断片は、同じ種からであると好ましい。プロモーターやエンハンサーなどの制御配列は、乳腺において発現されるだけの、または少なくとも優先的に発現される遺伝子（乳腺特異的遺伝子など）からである。プロモーターやエンハンサーの源として好ましい遺伝子は、β−カゼイン、κ−カゼイン、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−ラクトグロブリン、ホエイプロテイン酸、およびα−ラクトアルブミンを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、常にではないが、通常、同じ乳腺特異的遺伝子から得られる。好ましくはこの遺伝子は、導入遺伝子が発現されることになる哺乳類と同じ種の哺乳類からである。ヒト遺伝子からの発現制御配列など他の種からの発現制御配列も使用することができる。シグナル配列は、乳腺からＣ１阻害剤の分泌を行うことができなければならない。適切なシグナル配列は、分泌される蛋白質をコードする哺乳類遺伝子に由来されることができる。Ｃ１阻害剤の天然のシグナル配列が適している。当該シグナル配列に加えて、シグナル配列の好ましい源は、プロモーターおよびエンハンサーが得られる遺伝子と同じ遺伝子からのシグナル配列である。必要に応じて、追加の調節配列は、発現レベルを最適化するために導入遺伝子に含まれる。当該配列は、５’隣接領域、５’転写されるが翻訳されない領域、イントロン配列、３’転写されるが翻訳されない領域、ポリアデニル化部位、３’隣接領域を含む。当該配列は、プロモーターおよびエンハンサーが得られる乳腺特異的遺伝子、または発現されるＣ１阻害剤遺伝子のどちらかから通常得られる。当該配列を含むことは、真の乳腺特異的遺伝子および／または真のＣ１阻害剤遺伝子の発現を刺激する遺伝的環境を生成する。この遺伝的環境は、いくつかの場合において（例えば、牛αＳ１−カゼインなど）、転写される遺伝子の高発現をもたらす。代替的に、３’隣接領域、および、非翻訳領域は、β−グロビン遺伝子、またはウイルス遺伝子のような他の異種の遺伝子から得られる。Ｃ１阻害剤遺伝子または他の異種の遺伝子からの３���および５’非翻訳領域を含むことは、転写の安定性も向上させることができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、約０．５、１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂの５’隣接配列は、発現されるＣ１阻害剤遺伝子からの約１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂの３’隣接配列と組み合わせて乳房特異的遺伝子から含まれる。タンパク質がｃＤＮＡから発現される場合、プロモーターおよびコード配列の間にイントロン配列を含むために有利である。イントロン配列は、プロモーターが得られる乳腺特異的遺伝子領域の最初のイントロンからの（介在配列からの）５’部分から、およびＩｇＧ介在配列またはＣ１阻害剤遺伝子の介在配列からの３’部分から形成されるハイブリッド配列であると好ましい。ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／０８２１６（すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）を参照。Ｃ１阻害剤ｃＤＮＡを発現するための他の好ましい導入遺伝子は、ｐＢＣｌベクターキットに基づかれ、インビトロジェン（カールスバッド（Ｃａｌｓｂａｄ），カリフォルニア州）から市販されている。ｐＢＣｌベクターは、ヤギβ−カゼインプロモーターおよびヤギβ−カゼイン遺伝子を含み、いくつかのエクソンおよびイントロン、並びに３’非翻訳配列を含む。ｐＢＣｌの特有のＸｈｏ挿入部位へのＣ１阻害剤ｃＤＮＡの挿入は、ヤギβ−カゼインのエクソンおよびイントロン配列が隣接されるＣ１阻害剤ｃＤＮＡ配列を含むキメラＲＮＡを生成するだろう。しかしながら、このキメラＲＮＡ分子の適切なスプライシングに対して、Ｃ１阻害剤ｃＤＮＡ配列のみが翻訳される。
【００２２】
ゲノム配列からＣ１阻害剤タンパク質を発現するために好ましい挿入遺伝子は、コード配列全体をコードするゲノムＣ１阻害剤配列、およびシグナルペプチド、３’ＵＴＲ、および３’隣接配列を含み、Ｃ１阻害剤タンパク質を十分に直接発現させるために制御配列を含む５’アルファＳＩカゼインに操作可能に連結される。
【００２３】
ＤＮＡ配列情報は、少なくとも一つ、多くの場合いくつかの生物において上記に列挙される乳腺特異的遺伝子の全てに利用可能である。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，５２６−５３２（１９８１）（α−ラクトアルブミンラット）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，８６８５−８６９７（１９８４）（ラット  ＷＡＰ）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，７０４２−７０５０（１９８５））（ラット  β−カゼイン）；Ｙｕ−Ｌｅｅ＆Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１０７９４−１０８０４（１９８３）（ラット  γ−カゼイン））；Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２，７３５−７４２（１９８７）（α−ラクトアルブミン  ヒト）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，３８９（１９８４）（ウシ  αＳ１およびＫカゼインｃＤＮＡｓ）；Ｇｏｒｏｄｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６６，８７−９６（１９８８）（ウシ  βカゼイン）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，３９５−４０１（１９８８）（ウシ  Ｋカゼイン）；Ｂｒｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８，４８−５５（１９７７）（ウシ  αＳ２カゼイン）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６１，８５−９０（１９８７），Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３６９，４２５−４２９（１９８８），Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，６７３９（１９８９）（ウシ  βラクトグロブリン）；Ｖｉｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６９，６０９−６２０（１９８７）（ウシ  α−ラクトアルブミン）を参照（すべての目的のためにそれらの全体の参照によって援用される）。
【００２４】
様々な乳蛋白質遺伝子の機能と構造は、Ｍｅｒｃｉｅｒ＆Ｖｉｌｏｔｔｅ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７６，３０７９−３０９８（１９９３）によって再調査される（すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）。付加的な配列データが必要とされ得る範囲では、すでに得られた領域に隣接する配列は、プローブとして存在する配列を用いて容易にクローン化されることが可能である。異なる生物からの乳腺特異的制御配列は、公知の同族のヌクレオチド配列、またはプローブのような同族タンパク質に対する抗体を用いて当該生物から、スクリーニングライブラリーによって同様に得られる。
【００２５】
乳腺に対する組換え体タンパク質の発現を標的とするためにαＳ１−カゼイン制御配列を用いる総合戦略および典型的な導入遺伝子は、ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／０８２１６、およびＷＯ９３／２５５６７により詳細に記載される（すべての目的のためにそれらの全体の参照によって援用される）。他の乳腺特異的遺伝子からの制御配列を用いる導入遺伝子の例も記載されている。例えば、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１７９−１８３（１９８８）およびＷＯ８８／００２３９（１９８８）（羊の発現用β−ラクトグロブリン制御配列）；Ｒｏｓｅｎ，  ＥＰ２７９，５８２およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６，１０２７−１０４１（１９８８）（マウスの発現用β−カゼイン制御配列）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，１１８３（１９８７）（マウスの発現用ＷＡＰ制御配列）；ＷＯ８８／０１６４８（１９８８）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，４３−４８（１９８９）（マウスの発現用α−ラクトアルブミン制御配列）を参照（すべての目的のための当該全体の参照によって援用される）。
【００２６】
上述の導入遺伝子は、非ヒト哺乳類に導入される。マウス、ラット、ウサギなどの齧歯動物、羊などの羊のような動物（ｏｖｉｎｅｓ）、ヤギなどヤギのような動物（ｃａｐｒｉｎｅｓ）、豚などの豚のような動物（ｐｏｒｃｉｎｅｓ）、牛、バッファローなどのウシ亜科の動物などを含む、ほとんどの非ヒト哺乳類が適している。ウシ亜科の動物は、乳を大量に生産するという利点を提供し、一方、マウスは、形質転換および繁殖の容易さという利点を提供する。ウサギは、これらの利点の良い妥協点を提供する。ウサギは約１４％のタンパク質含有量で一日あたり１００ｍｌの乳をもたらすことができ（Ｂｕｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，１４０（１９９０）（すべての目的のための当該全体の参照によって援用される）、さらにマウスと同じ原理および同様の施設を用いて、操作および繁殖されることができる。ハリモグラおよびダックビル（ｄｕｃｋｂｉｌｌ）カモノハシなどのような非胎生哺乳類は、通常用いられない。
【００２７】
形質転換のいくつかの方法において、導入遺伝子は、受精卵の前核に導入される。マウスおよびウサギなどのいくつかの動物の受精は、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行われ、受精卵子は摘出される。他の動物において、特にウシは、生動物または畜殺場動物から卵子を取除き、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で卵子を受精させると好ましい。ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／０８２１６を参照されたい。体外受精は、導入遺伝子が移植のために細胞周期の最適な段階で（Ｓ期までに）実質的に同調細胞に導入されることを可能にする。導入遺伝子は通常マイクロインジェクションによって導入される。ＵＳ４，８７３，２９２を参照されたい。受精卵は、その後、約１６〜１５０個の細胞を含み着床前胚が得られるまで体外培養する。１６〜３２個の細胞の胚は桑実胚と呼ばれる。３２個より多い細胞を含む着床前胚は胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は、６４個の細胞段階で、通常、卵割腔の発達を示す。着床前の段階に受精卵を培養するための方法は、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，４１４（１９８４）；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，マウス胚の操作：Ａ  実験室マニュアル，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，６８０（１９８５）（ウサギ胚および豚胚）；Ｇａｎｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１，２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒｏａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６，９４７−９５３（１９８８）（ヒツジ胚）ａｎｄ  Ｅｙｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５，７１５−７２０（１９８９）；Ｃａｍｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２，７７９−７８５（１９８４）；ａｎｄ  Ｈｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．臨床繁殖学２７，５９６８（１９８７）（ウシ胚）に記載される（すべての目的のためにそれらの全体の参照によって援用される）。時々、着床前胚は移植保留期間冷凍保存される。着床前胚は、偽妊娠メスの卵管に移植され、導入遺伝子が組み込まれると発達の段階に依存して、トランスジェニックまたはキメラ動物の誕生をもたらす。キメラ哺乳類は、真の生殖細胞系トランスジェニック動物を形成するために繁殖されることができる。
【００２８】
代替的に、導入遺伝子は胚性幹細胞（ＥＳ）に導入されることができる。これらの細胞は、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養される着床前胚から得られる。Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９  ２５５−２５８（１９８４）（すべての目的のため当該全体の参照によって援用される）。導入遺伝子は、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって当該細胞に導入されることができる。ＥＳ細胞は、相同組換えを介して特定の染色体の位置に導入遺伝子を導入するのに適している。例えば、Ｃ１阻害剤をコードする導入遺伝子を、内因性制御配列に操作可能に連結されることになるゲノム位置に導入することができ、乳腺におけるコード配列の発現を行うことができる。形質転換されたＥＳ細胞は非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わされる。ＥＳ細胞は、胚に、およびいくつかの胚にコロニーをつくり、結果的に生じるキメラ動物の生殖細胞を形成、または生殖細胞に貢献する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４６８−１４７４（１９８８）を参照されたい（すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）。代替的に、ＥＳ細胞は、除核受精卵母細胞への移植核の源として使用されることができ、トランスジェニック哺乳類を生じさせる。更なる実施形態において、トランスジェニック動物、好ましくは、非ヒト哺乳類は、Ｃ１阻害剤を発現することができる導入遺伝子を含み、核移植を含む方法によって生成される。種々の型の細胞を、卵母細胞に移植するための核ドナーとして使用することができる。ドナー細胞を、未分化から完全に分化された範囲の分化の様々な段階で、静止細胞および増殖細胞の両方など、様々な細胞周期段階で、成体、胎児、または胚性細胞などのような、Ｃ１阻害剤導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の全ての組織から得ることができ、および体細胞組織または生殖細胞組織のいずれかから得ることができる。（ＷＯ９７／０７６６９、ＷＯ９８／３０６８３、ＷＯ９８／３９４１６参照。すべての目的のためにそれらの全体の参照によってそれぞれ援用される）。
【００２９】
代替的に、ドナー核は、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養された細胞から得られ、ドナー核へのＣ１阻害剤導入遺伝子は、Ｃａ−リン酸トランスフェクション、マイクロインジェクションまたはリポフェクションのような、従来の方法を使用して導入され、続いて、導入遺伝子または導入遺伝子の特異的挿入の存在が選択またはスクリーニングされる（ＷＯ９８／３７１８３およびＷＯ９８／３９４１６参照、すべての目的のためにそれらの全体の参照によってそれぞれ援用される）。ドナー核は、電気的もしくは化学的誘導された融合によって（ＷＯ９７／０７６６９、ＷＯ９８／３０６８３、ＷＯ９８／３９４１６のいずれか一つを参照）、またはマイクロインジェクションによって（ＷＯ９９／３７１４３、すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）、卵母細胞に導入される。移植された卵母細胞は、続いて胚に成長するように培養され、続いて偽妊娠雌動物の卵管に移植され、トランスジェニック子孫の誕生につながる（ＷＯ９７／０７６６９、ＷＯ９８／３０６８３、およびＷＯ９８／３９４１６参照）。
【００３０】
形質転換の他の方法は、所望の導入遺伝子を導入するために（レトロ）ウイルスに基づくベクターを使用する。当該ベクターの例は、Ｙｅｅらによって記載の通りレトロウイルスベクター（ＶＳＶ−Ｇ偽型）由来の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ＶＳＧ−Ｇ）ＭｏＭＬＶを含む（１９９４，ＭＥｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３：９９−１１２、すべての目的のため当該全体の参照によって援用される）。非ヒト哺乳類、好ましくはウシの受精前の第２減数分裂の中期ＩＩで停止される卵母細胞は、Ｃｈａｎらによって記載の通り、トランスジェニック子孫の生産のために、当該ＶＳＶ−Ｇ偽型ベクターを用いて感染する（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４０２８−１４０３３、すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）。代替的に、遺伝子組み換え動物の生産の代わりに、限定される器官、好ましくは、乳腺は、医薬品タンパク質を作成する目的のためにレトロウイルス感染によって形質転換される。乳房上皮細胞に感染させるために、非ヒト乳腺にＣ１阻害剤をコードする配列を運ぶ注入レトロウイルスベクターは、これらの動物の乳にＣ１阻害剤タンパク質の産生を可能にする（Ａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６８４０−６８４４，すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）。
【００３１】
２つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の産生のために、導入遺伝子を、単一の導入遺伝子と同じ手順を用いて同時に導入することができる。
代替的に、導入遺伝子を、別の動物に最初に導入することができ、その後、その動物を繁殖することによって同じゲノムに組み込むことができる。代替的に、最初のトランスジェニック動物を、導入遺伝子の一つを含むように生産される。その後、２つ目の導入遺伝子を、その動物からの受精卵または胚性幹細胞に導入する。いくつかの実施形態において、さもなければ約５０ｋｂを超えるだろう長さの導入遺伝子を、重複断片として構成する。当該重複断片は、受精卵や胚性幹細胞に同時に導入され、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で相同組換えを受ける。Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９２／０３９１７参照（すべての目的のために当該全体の参照によって援用される）。
【００３２】
本願に記載されるトランスジェニック哺乳類は、上述のようにそれらのゲノムにおいて少なくとも１つの導入遺伝子を含む。ある細胞段階での導入遺伝子の導入は、通常、トランスジェニック動物およびそれらの子孫をもたらし、それらの生殖細胞および体細胞（体細胞変異をうけている数個の細胞の可能性を除く）の全ては実質的にそれらのゲノムに導入遺伝子を含む。後期での導入遺伝子の導入は、モザイク動物またはキメラ動物につながる。しかしながら、それらの生殖細胞系列に導入遺伝が組み込まれたいくつかの当該動物は、それらの体細胞および生殖細胞の全てにおいて実質的に導入遺伝子を含む形質転換体を生産するために繁殖されることができる。乳腺細胞のウイルス形質転換はトランスジェニック哺乳類をもたらし、当該トランスジェニック哺乳類において導入遺伝子は乳腺細胞にのみ存在する。当該哺乳類は、将来の世代に当該生殖細胞系列を伝達しない。
【００３３】
導入遺伝子は、少なくとも主に乳腺にＣ１阻害剤蛋白質をコードするＤＮＡ断片の発現を目的とする。Ｃ１阻害剤は、少なくとも１００、５００、１０００、２０００、５０００、または１０，０００、２０，０００、または５０，０００μｇ／ｍｌの高いレベルで分泌されることができる。本願に記載されるトランスジェニック哺乳類は、実質的に健康を示す。乳腺組織以外の組織でのＣ１阻害剤蛋白質の二次発現は、有害な影響を引き起こすのに十分な程度まで起こらない。さらに、外因性Ｃ１阻害剤タンパク質は、十分な効率で乳腺から分泌され、分泌器官の動きを妨げる沈着物による問題は生じない。
【００３４】
トランスジェニック哺乳類は乳を生産し始めることができる年齢で、当然、天然の動物とは異なる。トランスジェニックウシでは、当該年齢は生来約２歳半の年齢で、ホルモン刺激を用いて６か月の年齢であり、一方、トランスジェニックマウスでは、当該年齢は約９〜１１週齢である。もちろん、種のメスメンバーのみ、乳の生産に役立つ。しかしながら、トランスジェニックのオスは、メスの子孫を繁殖するためにも価値がある。トランスジェニックのオスからの精子は、続く体外受精およびメスの子孫の発生のために冷凍保存されることができる。乳または他の源からのタンパク質のＦ．リカバリー  トランスジェニック成体の雌の哺乳類は、外因性Ｃ１阻害剤タンパク質を高濃度で含む乳を生産する。
【００３５】
乳からのＣ１阻害剤の精製は、遠心分離によって形質転換乳の脱脂、および脂肪の除去、続いて、高速遠心分離、続いて、デッド−エンドろ過（例えば、連続して減少するフィルターサイズを用いることによるデッドエンドろ過など）もしくはクロスフローろ過によるカゼインの除去、またはクロスろ過による直接的なｃａｓｉｎｏの除去によって行われることができる。必要な場合、タンパク質を、当該特徴的な物理化学的性質のために乳から精製することができる（一般参照  範囲、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２））Ｐｒｏｇｒａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６（１−３）：３０３−３５０；Ｐｉｌａｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２０：３７−４３，Ｒｅｂｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，．（１９７７）Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．７９：４５−５０，Ａｌｓｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９６：１０７−１  １４，Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２：１１５５−１  １６０）。精製条件は、非ヒトトランスジェニック哺乳類の内因性Ｃ１阻害剤からヒトＣ１阻害剤を好ましくは分離すべきである。
【００３６】
陽イオン、陰イオン、および金属親和性クロマトグラフィーを、乳または組換え体細胞培養物または天然源などのような他の源から、ヒトＣ１阻害剤タンパク質の精製のために全て使用することができる。いくつかの方法は、１つより多いこれらのステップを使用し、いくつかの方法は、全ての３つのステップを使用する。ステップを、任意の順序で行うことができるけれども、好ましい順序は、陽イオンクロマトグラフィー、続いて陰イオンクロマトグラフィー、続いて金属イオン親和性クロマトグラフィー行うことである。
【００３７】
陽イオンクロマトグラフィーを、例えばセファロース（商標）ビッグビーズ、またはカルボキシメチルセルロースを用いて行うことができる。低塩ローディングバッファー（例えば、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０２Ｍ塩化ナトリウムなど）が使用される。ヒトＣ１阻害剤を、より高い塩濃度（例えば、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍの塩化ナトリウムなど）で溶出できる。ヒトＣ１阻害剤を含む溶出液は、その後、陰イオンクロマトグラフィーの対象になる。陰イオンカラムのマトリックスは、セルロース、デキストラン、アガロースまたはポリスチレンなどの物質であることができる。リガンドは、例えばエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または四級アンモニウム官能基であることができる。陰イオン交換カラムの強度は、リガンドのイオン化状態に関する。四級アンモニウムリガンドを有するものなどの強いイオン交換カラムは、永続的な正電荷を有する。ＤＥＡＥおよびＰＥＩのような弱い陰イオン交換カラムにおいて、正電荷の存在は、カラムのｐＨに依存する。陰イオン交換カラムは、ヒトＣ１阻害剤のｐｉを超えるｐＨで低塩バッファーを用いて一般的にロードされる。カラムを、低塩バッファーで数回、結合しないタンパク質を溶出するために洗浄する。結合しているタンパク質を、その後、塩濃度を増加させたバッファーを用いて溶出する。
【００３８】
ＱセファロースＦＦは、他の陰イオン交換カラムと比較して比較的安価であり、ラージスケール精製に適している比較的大きいビーズサイズを有するので、陰イオン交換カラムに好ましい。特定の条件下、ヒトＣ１阻害剤を、ウサギＣ１阻害剤、またはウサギの乳で発見される他のタンパク質を溶出することなく、ＱセファロースＦＦから溶出することができる。ヒト酸性α−グルコシダーゼのＱセファロースＦＦへの良好な結合を得るために、カラムを、低塩で（例えば、５０ｍＭ未満のリン酸ナトリウムバッファーなど）プレ平衡化する。バッファーのｐＨは、カラムへのヒトＣ１阻害剤の良好な結合を得るために、約７．０±１．０であるべきである。ヒトＣ１阻害剤は、その後、増加させた塩濃度で、ステップワイズ溶出またはグラジエント溶出によって溶出される。ステップワイズ溶出は、ラージスケールの精製により適している。多くのロードされたヒトＣ１阻害剤は、１ステップで（約０．２５Ｍの塩で）ＱＦＦカラムから比較的高い純度で溶出されることができる。
【００３９】
金属アフィニティークロマトグラフィーは、セファロースのようなマトリックス、および銅、亜鉛、ニコル、コバルトおよびカルシウムなどの結合される金属イオンを用いて構築される。イミノジ酢酸などの有機キレート基も使用することができる。カラムは、比較的高い濃度、例えば０．２Ｍより高い濃度で存在する非キレート塩（例えば、塩化ナトリウム）を用いて約ｐＨ６〜８で平衡化される。これらの条件の下で、タンパク質を夾雑している残渣は、カラムに結合し、一方、ヒトＣ１阻害剤は、カラムに結合しないので、容易に溶出されることができる。
【００４０】
典型的な精製手順は、実施例に記載される。この手順は、Ｃ１阻害剤調製物を提供し、全ての夾雑物に関して少なくとも９８％または９９％の純度（ｗ／ｗ）で、０．５％、０．１％、または０．０５％未満のウサギＣ１阻害剤（ｗ／ｗ）を含む。
【００４１】
付加的な精製は、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは９９．８％、最も好ましくは９９．９％の純度のＣ１阻害剤調製物を得るために用いられる。
［医薬組成物］
いくつかの方法において、乳または他の源から精製されるＣ１阻害剤は、医薬組成物として、医薬担体と共に、精製された形態で投与される。好ましい形態は、意図された投与方法および治療適用に依存する。医薬担体は、患者にポリペプチドを提供するのに適しているいくつかの互換性のある非毒性の物質であることができる。滅菌水、アルコール、油脂、ワックス、および不活性固体は、担体として使用されてもよい。薬学的に許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤および同類のものは、医薬組成物に含まれてもよい。医薬組成物の阻害剤濃度は、約０．１重量％未満、通常、少なくとも１重量％〜２０重量％程度またはそれを超える濃度など、広く変化することができる。
【００４２】
医薬組成物は、好ましくは、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射または点滴によって、または髄腔内もしくは頭蓋内投与によって、非経口投与される。好ましい実施形態において、静脈内点滴によって投与される。非経口投与の適切な製剤は、当該技術において公知であり、通常は液体製剤である。
［実施例］
本願に記載される実施例および実施形態は、例示を目的とするだけであり、そのことを考慮すると、種々の修飾または変化は当業者に提示され、本出願の精神および範囲内に、並びに特許請求の範囲内に含まれることになるだろう。
実施例１
検査でＨＡＥの確定診断がなされ、静脈内ｒｈＣ１ＩＮＨ（５０ＩＵ／ｋｇ）を用いて治療される患者（１３歳以上）からのデータを、２つの無作為対照試験およびそれらのオープンラベル延長試験から集めた。患者は、５時間未満の症状の発症が観察され、提示および５０ｍｍ以上のベースライン視覚的アナログスケールスコア（重度）を示した（ＶＡＳ；Ｒｅｉｄｌ  ＭＡ  Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３，１１０（４）：２９５−９、参照によって本明細書に援用される）。無作為対照試験のひとつにおいて、患者は、生命を脅かす症状のための救急薬として、または初回投与後４時間で軽減されなかった場合、２回目のｒｈＣ１ＩＮＨ投与を受けることが可能である。他の無作為対照試験において、患者は、２回目投与を許可されなかった。オープンラベル延長試験において、ｒｈＣ１ＩＮＨの２回目投与は、治験責任医師の判断で臨床応答に基づいて許可された。
【００４３】
１２７人の患者は４つの臨床試験のコースにおいて一つ以上の発作のためにｒｈＣ１ＩＮＨを５０ＩＵ／ｋｇを受けた。１２１人の患者は、ｒｈＣ１ＩＮＨの２回目投与を受けることができた。応答、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）および再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）データは、全ての解剖学的部位での全ての発作のために結合された。応答は、４時間以内の持続的な治療で４時間以内に軽減し（連続する２つの時点でＶＡＳスコア２０ｍｍ以上）、持続前の追加の投与、または救急薬はない、として定義された。再発（Ｒｅｌａｐｓｅ）は、全ての患者の２４時間の追跡調査データを用いて決定され、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）または新たな発作症状は、全ての患者の３日間の追跡調査データを用いて決定された。
【００４４】
図１は、急性ＨＡＥ発作に投与されたｒｈＣ１ＩＮＨ投与回数を示す。発作の９３％は、ｒｈＣ１ＩＮＨの単回投与で治療された。発作の７％は、ｒｈＣ１ＩＮＨの２回投与で治療された。
【００４５】
図２は、ｒｈＣ１ＩＮＨ治療患者の応答と再発率（ｒｅｌａｐｓｅ  ｒａｔｅｓ）を示す。応答は、持続的で４時間以内の症状の軽減の開始として定義された。２つの無作為対照試験および２つのオープンラベル延長試験の患者は、ｒｈＣ１ＩＮＨで治療後、血栓性または血栓塞栓性事象なく、アナフィラキシー反応はなく、中和抗体の誘導はない。
【００４６】
図３は、ｒｈＣ１ＩＮＨで治療後３日以内の発作の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓ）数、または新たな発作症状の数を示す。９３％の患者において、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓ）または新たな発作症状はなかった。
【００４７】
この調査に基いて、ｒｈＣ１ＩＮＨでの治療は、４時間以内に軽減を開始する発作数として評価され、高い応答率をもたらすことが明らかになった。４時間以内に軽減を開始する多くの発作は、単回ｒｈＣ１ＩＮＨ投与で効果的に治療された。いくつかの発作は、２回のｒｈＣ１ＩＮＨ投与を必要した。４時間以内に軽減する発作は、２４時間以内に重大に再発（ｒｅｌａｐｓｅｓ）は起こらなかった。ｒｈＣ１ＩＮＨ治療の３日以内の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）または新たな発作症状は低かった。さらに、ｒｈＣ１ＩＮＨの単回投与は、急性ＨＡＥ発作の治療において、持続性および永続性の応答を提供した。
実施例２
血栓塞栓性事象（ＴＥＥ）は、組み換え体ヒトＣ１ＩＮＨではなくいくつかの血漿由来Ｃ１ＩＮＨで報告されている（ｒｈＣ１ＩＮＨ；１０００投与を超える）。この研究は、ＴＥＥの監視、およびＤ−ダイマーフィブリン分解産物の評価（Ｄ−ダイマーレベル）および深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の危険性を含む急性ＨＡＥ発作のためのｒｈＣ１ＩＮＨの安全性および有効性を評価した。
【００４８】
急性ＨＡＥ発作の７４人の患者は、３：２に無作為に選ばれ、５０ＩＵ／ｋｇのｒｈＣ１ＩＮＨまたはプラセボを受けた。Ｄ−ダイマーレベルを（２５番目〜７５番目四分位数を中央値として提示）、薬物注入前、薬物注入後２時間、７日に評価した。ＤＶＴの危険性を、Ｗｅｌｌｓ予測ルールを用いて評価した。Ｗｅｌｌｓ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２０００：８３：４１６−２０。Ｄ−ダイマー濃度は、ベースライン（例えば、開始から５時間未満で、試験薬を投与する前など）、試験薬の静脈内投与後２時間および７時間（発作が回復した後）で集められた血液サンプルによって評価された。２５０μｇ／Ｌ以下の値は、正常値（例えば、参照標準）と考慮される。
【００４９】
患者および研究デザイン；これはＨＡＥ患者の急性血管性浮腫発作の治療における、生理食塩水と比較してｒｈＣ１ＩＮＨの有効性および安全性を評価するための、無作為化、二重盲検、プラセボ（生理食塩水）対照試験、多施設試験、多国試験であった。７５人の患者（１３歳以上、米国およびカナダ以外の１８歳以上）は、ＨＡＥであると検査で確定診断されており、対象となる血管性浮腫発作の治療のための、ｒｈＣ１ＩＮＨ（８４ｋｇ未満の患者に５０ＩＵ／ｋｇ、８４ｋｇ以上の患者に４２００ＩＵ）または生理食塩水の静脈内投与の二重盲検を受けるために、一元的（３：２）に無作為化した。患者は、（ｉ）発作部位が末梢（四肢）、腹部、顔面、および／または咽頭−喉頭であり；（ｉｉ）これらの発作の開始は、臨床への提示前５時間未満であり；および（ｉｉｉ）患者の発作の全体的な重症度は、１００ｍｍの視覚的アナログスケールで少なくとも５０ｍｍであるとされる場合に治療に適格であった（Ｒｅｉｄｌ  ＭＡ，Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３，１１０（４）：２９５−９）、参照によって本明細書に援用される）。複数の対象となる発作部位を有する患者にとって、主な発作部位は、ベースラインで最も高いＶＡＳスコアを有する部位と定義された。
【００５０】
血栓症の危険性評価：全ての無作為化患者は血栓性事象を臨床的に監視された。深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の危険性は、Ｗｅｌｌｓ予測ルール（Ｗｅｌｌｓ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２０００：８３：４１６−２０）を用いることによって評価され、投与後上昇したスコアを有する患者は、ＤＶＴを除外するために末端超音波検査をする必要があった。患者は、（臨床的に示される場合は、超音波を含む）血栓性事象が進行しうるために、Ｄ−ダイマーレベルにおける注入後の増加を評価された。
【００５１】
血漿試料収集：Ｄ−ダイマーレベルの決定のために、クエン酸血液試料をベースラインで（例えば、発症から５時間未満で試験薬の静脈内注入前）、試験薬の静脈内注入後２時間で、および７日で（発作が回復した後）収集した。全ての分析では、救急薬を受けた後のいくつかの評価のために、食塩溶液を受けるために無作為化された患者は、救急薬としてｒｈＣ１ＩＮＨも受け、食塩溶液治療グループから、ｒｈＣ１ＩＮＨ治療グループへ転換された。
【００５２】
Ｄ−ダイマー測定：血漿中のＤ−ダイマーレベルを、中央研究室で測定した（正常範囲＜５４０μｇ／Ｌ）。
患者の人口統計：適格な急性ＨＡＥ発作を呈する７５人の患者は、試験薬を受けるために参加した：４４人の患者を、５０ＩＵ／ｋｇのｒｈＣ１ＩＮＨに無作為化し、３１人を、生理食塩水に無作為化し：ｒｈＣ１ＩＮＨ治療に無作為化された１人の患者は、治療されず、分析に含まれなかった。
【００５３】
患者の内訳、主要統計、およびＨＡＥ発作頻度、および適格な発作の重症度は、表１において治療グループによって要約された。患者の人口統計およびベースライン特性は、治療グループ間で一般的に類似していた。ベースラインでの発作の重症度は、１００ｍｍＶＡＳスケールを用いた患者によって評価されるように、両グループ間で類似していた（平均ｒｈＣ１ＩＮＨグループ７３．５ｍｍ、対、生理食塩水グループ７７．３ｍｍ）。主な発作部位も、ｒｈＣ１ＩＮＨグループおよび生理食塩水グループで類似していた（ｒｈＣ１ＩＮＨグループの４４％、対、生理食塩水グループの４５％で末梢部位、ｒｈＣ１ＩＮＨグループの３７％、対、生理食塩水グループの３９％で腹部部位）。
【００５４】
深部静脈血栓症の危険性：患者のいずれもが、Ｗｅｌｌｓ予測ルールスコアに基づくＤＶＴの危険性を上昇しないということが認定された。ｒｈＣ１ＩＮＨグループの３９人の患者および生理食塩水グループの３０人の患者において記録された全てのスコアは、低く、−２〜０の範囲であり、患者は、ＤＶＴを有する可能性が非常に低いことが示された。Ｗｅｌｌｓスコアが０である２人の患者（１人はｒｈＣ１ＩＮＨ、１人は生理食塩水）に対する超音波は腹部および下肢深部静脈の両方においてＤＶＴの証拠は有さず正常であった。
【００５５】
Ｄ−ダイマーレベル：Ｄ−ダイマーレベル（中央値［２５〜７５番目四分位数］として提示）を、３つの時間点（ベースライン、ｒｈＣ１ＩＮＨ注入後２時間、およびｒｈＣ１ＩＮＨ治療後７日）で評価した。さらなる分類を、主な発作部位型（粘膜下：腹腔および口腔咽頭−喉頭、対、皮下：顔面および末梢）、重症度（中程度：主な発作部位のＶＡＳ  ５０ｍｍ〜７５ｍｍ；重度  主な発作部位のＶＡＳ  ７６以上）、および単一、対、複数の影響部位、によって評価することによって行った。
【００５６】
全体の中央値Ｄ−ダイマーレベルは、ベースラインでの患者において上昇した（２１４９［４８０−５１０５］μｇ／Ｌ、正常範囲＜５４０μｇ／Ｌ）（表２）。Ｄ−ダイマーレベルは、全ての患者において、ｒｈＣ１ＩＮＨ、または生理食塩水それぞれにおいて治療後２時間で上昇を続け、中央値レベルの２４６９（６４３〜５８２７）μｇ／Ｌレベルになった。治療後７日で両治療グループのＤ−ダイマーレベルは、正常に近いレベルに戻った。そのことは、中央値Ｄ−ダイマーレベルが、ｒｈＣ１ＩＮＨ、または生理食塩水のそれぞれを用いて治療後２時間および７日で、両グループ間で統計的に違わないことに注目すべきである。両治療グループ間でベースラインからの平均変化も、２時間（ｒｈＣ１ＩＮＨ：１４５μｇ／Ｌ；生理食塩水：１９２μｇ／Ｌ）および７日（ｒｈＣ１ＩＮＨ：−２４０１μｇ／Ｌ；生理食塩水：−１９２３μｇ／Ｌ）において２つの治療グループ間で同様であり、このことは、ｒｈＣ１ＩＮＨが、ＨＡＥ患者においてＤ−ダイマー産生に影響を与えなかったことを示す。
【００５７】
ＨＡＥ発作は、皮膚、腸および上気道に影響を与える皮下または粘膜下浮腫として提示する。Ｄ−ダイマーレベルは、皮下または粘膜下が主な発作部位であることに基づく患者集団において評価された（表３）。中央値Ｄ−ダイマーレベルは、皮下発作を有する患者と比較して、粘膜下発作の患者では、ベースライン時（ｐ＝０．００２７４）、および治療後２時間（ｐ＝０．０１２６）で、少なくとも３倍高かった。全集団においてみられるように、ｒｈＣ１ＩＮＨ治療は、投与後の両時間点でＤ−ダイマーレベルに対する明らかな影響はなかった。個々の発作部位（例えば、顔面、末梢、腹部、咽頭−喉頭）でのＤ−ダイマーレベルの比較は、更に評価されなかった。
【００５８】
主な発作部位での重症度は、ベースラインで中程度（ＶＡＳ  ５０ｍｍ以上、７５ｍｍ未満）、または重度（ＶＡＳ  ７５ｍｍ以上）に分類された。全体的に、ベースラインの中央値Ｄ−ダイマーレベルは、中程度（１６７４［５９３−５２４１］μｇ／Ｌ）および重度（２３２０［２６０−５５５０］μｇ／Ｌ）の発作を有する患者と同様であった（表４）。ｒｈＣ１ＩＮＨで治療された重度の発作は、治療後７日で、生理食塩水で治療された重度の発作より（５６０［２７３−４０５６］μｇ／Ｌ）、低いＤ−ダイマー値（２８０［１０９−９２５］μｇ／Ｌ）を有する傾向があった。
【００５９】
多くのＨＡＥ発作は、単一の部位に孤立した症状を示すけれども、いくつかの発作は、同時に複数の解剖学的部位で示してもよい。このため、Ｄ−ダイマーレベルが、複数の影響部位の存在によって影響を受けたかどうかも決定された。６４人の患者は、単一部位の発作を報告し、１０人の患者は、複数の部位の発作を報告した。ベースラインで中央値Ｄ−ダイマーレベルは、単一部位の発作を有する患者（４５６８［２０６５〜２４６３４］）よりも複数の影響部位を有する患者（９５５５［４３１５〜１３３００］μｇ／Ｌ）で高くなった。治療後２時間で、Ｄ−ダイマーレベルは、単一部位よりも複数の発作部位を有する患者でさらにより上昇した（５０４０［８１２−１１０４５］μｇ／Ｌ対２２９４［６１５−５０６５］μｇ／Ｌ）。治療後７日で、Ｄ−ダイマーレベルは、両グループ間で正常に戻った。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
【表２】
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【００６２】
【表３】
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【００６３】
【表４】
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【００６４】
結果は、図４〜図９に更に要約される。Ｄ−ダイマーレベルは、寛解の時間と比較してＨＡＥ発作中に上昇した。しかしながら、Ｄ−ダイマーレベルの上昇は、ｒｈＣ１ＩＮＨ治療と関連しなかった。血栓塞栓症は、ｒｈＣ１ＩＮＨ治療では観察されなかった。
【００６５】
全ての参照、特許、出願中の特許出願、および本出願を通して引用された公開特許は、参照によって、明示的に本明細書に援用される。特に記述がない限り、本願で使用される専門用語は、当業者によって理解される従来の使用に従う。分子生物学の一般的な用語の定義は、標準テキスト（例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，オックスフォード大学によって出版  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ブラックウェルサイエンス社（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ）によって出版，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ出版社によって出版（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．），１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に明らかにされてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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