(57)【要約】本開示は、Ｃ末端から１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ変種または断片に関連する組成物および方法を対象とする。本開示はまた、ポリペプチド変種または断片が、完全長であるか、または任意選択でＣ末端から１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失している、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏポリペプチド変種または断片にも関する。本開示はまた、（ａ）Ｃ末端から１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ；（ｂ）リンカー、ならびに（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／もしくはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３、または（ｃ）血清アルブミンを含む融合ポリペプチドにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有する、α−ｓＫｌｏｔｈｏ；（ｂ）リンカー；ならびに（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／もしくはＣ２４４で変異を有する、ＦＧＦ２３、または（ｃ）血清アルブミンを含む融合ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＶ５６３で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＫ７９５で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＶ５６３およびＫ７９５で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが配列番号７７の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが配列番号７８の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３がＲ１７９で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３がＣ２０６で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３がＣ２４４で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３がＲ１７９で変異を有し、Ｃ２０６またはＣ２４４で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３がＲ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｃ）前記ＦＧＦ２３が以下の配列を有する、請求項１に記載の組成物：
【化１】
2017537926.tif 000103
【請求項１３】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが、配列番号７７または７８の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが、配列番号７７の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが、配列番号７８の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドリンカーが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択されるリンカーの１つまたは複数のコピーを含むアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、配列番号８０または配列番号８２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２４】
Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患を処置または予防する方法であって、
Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有する、α−ｓＫｌｏｔｈｏ；（ｂ）リンカー；ならびに（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有する、ＦＧＦ２３を含む融合ポリペプチドを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患を処置または予防する方法であって、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患が、加齢関連状態、代謝障害、高リン血症、石灰沈着症、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および筋萎縮からなる群より選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記加齢関連状態が、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記代謝障害が、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有する、α−ｓＫｌｏｔｈｏを含む、組成物。
【請求項３０】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＶ５６３で変異を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＫ７９５で変異を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏがＶ５６３およびＫ７９５で変異を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが配列番号７７の配列を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失している前記α−ｓＫｌｏｔｈｏが配列番号７８の配列を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患を処置または予防する方法であって、
Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有する、α−ｓＫｌｏｔｈｏを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患を処置または予防する方法であって、請求項２９〜３４のいずれかに記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記Ｋｌｏｔｈｏ関連疾患が、加齢関連状態、代謝障害、高リン血症、石灰沈着症、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および筋萎縮からなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記加齢関連状態が、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記代謝障害が、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、多くの生物において発現される相同なポリペプチド増殖因子のファミリーを構成する（Ornitz and Itoh, Genome Biol. 2: reviews, 3005.1-3005.12 (2001)）。脊椎動物種において、ＦＧＦは、遺伝子構造およびアミノ酸配列の両方において高度に保存されており、互いに１３〜７１％の間のアミノ酸同一性を有する。ヒトでは、２２の公知のＦＧＦファミリーメンバーが存在する（ＦＧＦ１５は、ヒトＦＧＦ１９のマウスオルトログであり、したがってヒトＦＧＦ１５は存在しない）。初期発生の間、ＦＧＦは細胞増殖、遊走、および分化を調節するが、成体の生物では、ＦＧＦは、恒常性を維持し、組織修復において機能して、損傷に対して応答する。
【０００２】
ＦＧＦは、ＦＧＦ受容体に結合し、それによって細胞表面ＦＧＦ受容体を活性化することによって増殖因子として機能する。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）は、ＦＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化、ならびにＥｇｒ−１（初期増殖応答−１）の活性化を通してシグナル伝達を活性化するチロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦはまた、ヘパリン硫酸プロテオグリカンに対して高い親和性を有する。ＦＧＦに結合すると、ヘパリン硫酸は、ＦＧＦＲの活性化を増強する。
【０００３】
α−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインを有する１３０ｋＤａのＩ型の１回膜貫通型タンパク質をコードする。α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメインは、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２と称される２つのサブドメインを含む。これらの２つのサブドメインは、細菌および植物のβ−グルコシダーゼとの配列相同性を共有する。α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメインは、膜貫通ドメインによって細胞表面に結合し得るか、または切断されて細胞外環境に放出され得る。細胞外ドメインの切断は、局所的な低い細胞外Ｃａ２＋濃度によって促進されるように思われる。
【０００４】
α−Ｋｌｏｔｈｏに加えて、α−Ｋｌｏｔｈｏの相同体であるβ−Ｋｌｏｔｈｏが同定されている（Ito et al., Mech. Dev. 98:115-9 (2000)）。β−Ｋｌｏｔｈｏもまた、細胞外ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２サブドメインを有するＩ型の１回膜貫通型タンパク質である。
【０００５】
α−Ｋｌｏｔｈｏ発現の調節は、哺乳動物において加齢関連特徴を生じることが証明されている。α−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の機能喪失変異に関してホモ接合であるマウスは、寿命の短縮、皮膚の萎縮、筋消耗、動脈硬化症、肺気腫、および骨粗鬆症を含む、ヒトの加齢に類似する特徴を発症する（Kuro-o et al., Nature, 390:45-51 (1997)）。これに対し、マウスにおいてα−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子を過剰発現させると、野生型マウスと比較して、寿命が延長して酸化的ストレスに対する抵抗性が増加する（Kurosu et al., Science 309:1829-1833 (2005)；Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 280:38029-38034 (2005)）。
【０００６】
最近の研究から、ＦＧＦ２３欠損マウスとα−Ｋｌｏｔｈｏ欠損マウスとの間に極めて類似の生物学的特徴があることが証明されており（Shimada et al., J. Clin. Invest. 113:561-568 (2004)；Yoshida et al. Endocrinology 143:683-689 (2002)）、ＦＧＦ２３とα−Ｋｌｏｔｈｏとの間の機能的クロストークを示している。これらの研究によって、その関連するＦＧＦ受容体を介した結合およびシグナル伝達の両方に関するＦＧＦ２３の必須のパートナーとしてα−Ｋｌｏｔｈｏが同定された（Urakawa et al., Nature 22:1524-6 (2007)）。α−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、腎臓、副甲状腺、および脈絡叢において主に発現される。α−Ｋｌｏｔｈｏが組織特異的に発現されることにより、ＦＧＦ２３シグナル伝達の活性化がそれらの組織に限定されると仮定される。
【０００７】
ＦＧＦ２３／α−Ｋｌｏｔｈｏと同様に、β−Ｋｌｏｔｈｏは、そのそれぞれの関連するＦＧＦ受容体を介した結合およびシグナル伝達における、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１の両方の必須のパートナーである（Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7 (2007)；Lin et al., J. Biol Chem. 282:27227-84 (2007)；およびWu et al., J. Biol. Chem. 282:29069-72 (2007)）。そのような研究はまた、組織特異的代謝活性の調節にβ−Ｋｌｏｔｈｏが関与することも証明している。β−Ｋｌｏｔｈｏは当初、脂肪組織における炭水化物および脂質代謝を調節するための補因子としてＦＧＦ２１と共に作用することが示された。β−Ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ１９と共に肝臓における胆汁酸代謝を調節し、したがって、β−Ｋｌｏｔｈｏ欠損マウスにおける胆汁合成の上昇を説明する（Ito et al., J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2202-8）。
【０００８】
米国特許第６，５７９，８５０号明細書は、α−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドを含むポリペプチドおよび組成物について記述する。ヒトおよびマウスα−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドが開示される。本特許はまた、ポリペプチドを含む組成物が、早期老化に似た症候群の処置、成体の疾患の処置、および加齢の抑制において有用であることを開示した。
【０００９】
米国特許第７，２２３，５６３号明細書は、ＦＧＦ２３ポリペプチド配列をコードする単離された核酸、またはそのような単離核酸を含む組み換え型細胞について記述している。本特許はさらに、低リン酸血症および高リン酸血症（hypophosphatemic and hyperphosphatemic disorders）、骨粗鬆症、皮膚筋炎、ならびに冠動脈疾患を診断および処置する方法に関する。
【００１０】
米国特許第７，２５９，２４８号明細書は、ＦＧＦ２１ポリペプチド配列をコードする単離核酸について記述する。本特許はさらに、肝疾患、胸腺の機能に関連する状態を診断および処置する方法、ならびに精巣の病態を処置する方法にも関する。
【００１１】
α−Ｋｌｏｔｈｏの新規人工的変種、ＦＧＦ２３、およびこれらの成分を含む融合ポリペプチドがなおも必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
２．本開示の概要
本開示は、加齢関連状態または代謝障害を、ポリペプチド、融合ポリペプチド、または可溶性ポリペプチドによって予防または処置するための方法、使用、キット、および組成物を対象とする。
【００１３】
本開示のポリペプチドは、例えばＫｌｏｔｈｏ変種、例えば任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している）を含む。もう１つの例として、ポリペプチドは、完全長であるか、または任意選択でＣ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ変種である。そのようないかなるポリペプチドもＫｌｏｔｈｏ  Ｃ末端欠失変種である。そのようなＫｌｏｔｈｏ  Ｃ末端欠失変種は、例えばＰＥＧの付加によって、および／または他のポリペプチドに融合させることによってさらに改変することができる。適した融合ポリペプチドとしては、中でもＦＧＦ２３もしくはその変種、または血清アルブミンもしくはその変種が挙げられる。このように、本開示の融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｎ末端からＣ末端の順に：（ａ）任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している）、および（ｂ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／もしくはＣ２４４で変異を有するもう１つのポリペプチド、例えばＦＧＦ２３（ＦＧＦ２３シグナルペプチドを有しない）または（ｂ）血清アルブミン、ならびに任意選択で（ｃ）（ａ）と（ｂ）の間に挟まれるリンカーを含む。このように、本開示の融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有し、任意選択で完全長であるか、またはデルタＣ−２０（Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している）であるα−ｓＫｌｏｔｈｏ変種、および（ｂ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／もしくはＣ２４４で変異を有するもう１つのポリペプチド、例えばＦＧＦ２３（ＦＧＦ２３シグナルペプチドを有しない）、または（ｂ）血清アルブミン、ならびに任意選択で（ｃ）（ａ）と（ｂ）の間に挟まれるリンカーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有する、Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している、α−ｓＫｌｏｔｈｏ（例えば、膜貫通ドメインを欠如して、任意選択でシグナルペプチドを欠如するα−Ｋｌｏｔｈｏ）、（ｂ）リンカー（例えば、約１０、約２０、約３０、または約４０アミノ酸長）、ならびに（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２３成分は、Ｃ２０６および／またはＣ２４４で変異を有する。これらの融合体のいくつかの実施形態において、α−ｓＫｌｏｔｈｏは、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有する。いくつかの実施形態において、ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０は、配列番号７７または７８によって表される（後者は変異Ｖ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅを有する）。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、α−ｓＫｌｏｔｈｏのＮ末端にシグナルペプチドを含む。様々な実施形態において、シグナルペプチドはＫｌｏｔｈｏシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号８１の太字の下線部分で表される。様々な実施形態において、リンカーは、２つのペプチドを接続することができる当技術分野で公知の任意のタイプのリンカーである。様々な実施形態において、リンカーは１つまたは複数のアミノ酸を含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１１〜１８の任意の配列、またはその任意の数もしくは組合せを含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１２の１、２、３またはそれ超のコピーを含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１２の３コピーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号７９、８０、８１、または８２によって表される。
【００１４】
本開示のポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、加齢関連状態（サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮（diminished life expectancy）、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴からなる群より選択される）、代謝障害（ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満からなる群より選択される）、高リン血症（hyperphosphatemia）、石灰沈着症、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および／または筋萎縮などのＦＧＦ２３関連、またはＫｌｏｔｈｏ関連疾患を処置または予防するために使用することができる。様々な実施形態において、本開示のＫｌｏｔｈｏ変種ポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、腎疾患を処置する様々な方法において使用することができる。
【００１５】
融合ポリペプチドのいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２３は変異している。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２３を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドのＦＧＦ２３成分は、配列番号４２もしくは４３によって、または配列番号７９〜８２のいずれかの太字部分、またはこれらのいずれかの機能的活性変種、断片、もしくは誘導体によって表される。本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４のいずれかで変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチドを含む。実施例７および８ならびに図１３および１４に示すデータは、これらの変異が凝集を低減させ、望ましくないプロテアーゼによる切断を低減させ、および産生を増加させることを示した。ＦＧＦ２３  Ｒ１７９／Ｙ１５４／Ｃ２０６／Ｃ２４４変異体は、より多くのタンパク質を産生したが、分解産物の産生は非常に少なく、ＦＧＦ２３活性を保持した。
【００１６】
様々な実施形態において、融合ポリペプチドはさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。例えば、融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏ変種［例えば、任意選択でＶ５６３および／もしくはＫ７９５での変異も有するＫｌｏｔｈｏもしくはα−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸が欠失している）、または完全長であるか、もしくは任意選択でＣ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有するＫｌｏｔｈｏもしくはα−ｓＫｌｏｔｈｏ変種］と、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片とを含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質またはその活性断片もしくは変種と、線維芽細胞増殖因子またはその活性断片もしくは変種とを含むＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドと、ＦＧＦ（ＦＧＦ２３など）と、改変Ｆｃ断片とを含む。Ｆｃ断片は、例えば、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび血清中半減期が増加した断片であり得る。ｓＫｌｏｔｈｏと、ＦＧＦ２３と、ＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）とを含む融合タンパク質は、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）と、改変Ｆｃ断片またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）とを含む。ＦＧＦ２３とＦｃＬＡＬＡとを含む融合タンパク質は、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載される。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ２３において、凝集および／またはプロテアーゼによる切断を低減させる１つまたは複数の変異を有する。
【００１９】
第一の態様において、本開示は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインまたはその活性断片もしくは変種と、線維芽細胞増殖因子またはその活性断片もしくは変種とを有する融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少した（例えば、Ｋａが減少したまたはＫｄが増加した）および／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインは、α−またはβ−Ｋｌｏｔｈｏアイソフォームのいずれかに由来し得る。さらに、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのＦＧＦ成分は、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２１、および線維芽細胞増殖因子２３に関連して主に記述するが、２３の公知のＦＧＦのいずれも本開示の実践において使用できると企図される。本出願の読者は、αまたはβの細胞外ドメインとそれぞれのヒトＦＧＦタンパク質またはその活性断片もしくは変種とのあらゆる組合せのそれぞれが、個々におよび具体的に企図されることは当然であると考えるであろう。
【００２０】
本開示に従って、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメインは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）のＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２ドメインの１つまたは両方を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインまたはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を有する。例えば、少なくとも２つの細胞外サブドメインは、少なくとも２つのＫＬ−Ｄ１ドメインのタンデムリピート、少なくとも２つのＫＬ−Ｄ２ドメインのタンデムリピート、または少なくとも１つのＫＬ−Ｄ１ドメインと少なくとも１つのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。様々な実施形態において、本開示の融合ポリペプチドは、完全長のα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の２８〜２９２位のアミノ酸、または２８〜９８２位のアミノ酸（配列番号７）を含む。もう１つの実施形態において、本開示の融合ポリペプチドは、完全長のβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の５２〜９９７位のアミノ酸を含む。
【００２１】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４位の１つまたは複数で変異を有する線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含むポリペプチド、および（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、またはＫｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインもしくはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含むポリペプチドのいずれか、および任意選択で（ｃ）リンカーを含む。実施例８ならびに図１３および１４に示す結果は、ＦＧＦ２３  Ｒ１７９／Ｙ１５４／Ｃ２０６／Ｃ２４４変異体が、より多くのタンパク質を産生するが、分解産物の産生は非常に少なく、有意なＦＧＦ２３活性を保持することを示した。
【００２２】
ＦＧＦ２３の変異の必ずしも全ての組合せが等しく有効であったわけではなかった。加えて、特定の部位での全ての変異が必ずしも等しく有効ではない。Ｓ１５５での変異は、Ｙ１５４での変異より分解産物の産生が多かった。加えて、変異Ｙ１５４Ｄは、変異Ｙ１５４ＨまたはＹ１５４Ｎより分解産物の産生がより少なかった。したがって、
【００２３】
本開示の１つの実施形態において、本開示は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む融合ポリペプチドであって、ＦＧＦ２３がＳ１５５で変異を有しない融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２４】
本開示の１つの実施形態において、本開示は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む融合ポリペプチドであって、Ｙ１５４での変異がＹ１５４Ｄである融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２５】
本開示の１つの実施形態において、本開示は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む融合ポリペプチドであって、Ｙ１５４での変異がＹ１５４Ｄであり、ＦＧＦ２３がＳ１５５で変異を有しない融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる追加の実施形態を以下に開示する。
【００２７】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、またはＫｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインもしくはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）のいずれか、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む。
【００２８】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む。
【００２９】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）変異Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ、Ｃ２０６Ｓ、およびＣ２４４Ｓを有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む。本実施形態の例を配列番号７０および７４に提供する。
【００３０】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）変異Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｃ、Ｃ２０６Ｓ、およびＣ２４４Ｓを有するＦＧＦ２３の機能的活性変種を含むポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む。本実施形態の例を配列番号７２および７６に提供する。
【００３１】
成分は、例えばペプチド結合によって化学結合またはインフレームで融合させることができる。成分はまた、リンカーによって連結してもよい。ポリペプチドリンカーの非限定的な例は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８である。そのようなリンカーは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８の少なくとも１つから最大約３０リピートを含み得る。もう１つの非限定的な実施形態において、融合体は、（２）ＦＧＦまたはその活性断片もしくは変種、および（３）改変Ｆｃ断片を含み得る。融合体の様々な成分を任意の順序で作動可能に連結させることができ；ポリペプチド（１）は、（２）または（３）のポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結させることができ；（２）のポリペプチドを、（１）または（３）のポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結させることができ；（３）のポリペプチドを、（１）または（２）のポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結させることができる。
【００３２】
本開示に従って、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメイン、線維芽細胞増殖因子、および（任意選択の）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片は、多様な方向および様式で互いに作動可能に連結させることができる。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインを、線維芽細胞増殖因子のＮ末端に作動可能に連結させることができ、あるいは、線維芽細胞増殖因子をＫｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインのＮ末端に作動可能に連結させることができる。
【００３３】
１つの実施形態において、本開示は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏとリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏとリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏとリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。さらにもう１つの実施形態において、本開示は、ヒトＦＧＦタンパク質またはその活性断片もしくは変種（例えば、シグナルペプチドを有しない）およびリンカーを提供する。１つの実施形態において、本開示は、病的障害の治療に使用するための、または処置において使用される薬剤（medicament）としての、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物を提供する。加齢関連状態または代謝障害を処置または予防するために本開示の融合タンパク質を含む医薬組成物およびその使用も同様に、本開示に包含される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２３に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２３に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００３５】
１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００３６】
１つの実施形態において、本開示は、（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４位の１つまたは複数で変異を有するポリペプチド；および（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、またはＫｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインもしくはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含むポリペプチドのいずれか、ならびに任意選択で（ｃ）リンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。そのような融合ポリペプチドは、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、および６８に開示される。
【００３７】
１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）；（２）リンカー；および（３）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）；（２）リンカー；および（３）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の融合ポリペプチドはグリコシル化されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００３８】
１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４４または配列番号４５）、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、（２）配列番号１１を含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号４３）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号７）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、（２）配列番号１１を含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号４３）またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含む融合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態において、本開示は、配列番号１９、２０、４０、または４１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の融合ポリペプチドはグリコシル化されている。
【００３９】
１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４４または配列番号４５）、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号７）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の融合ポリペプチドはグリコシル化されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００４０】
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＦＧＦタンパク質またはその活性断片もしくは変種（例えば、シグナルペプチドを有しない）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の融合ポリペプチドはグリコシル化されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００４１】
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＦＧＦタンパク質（例えば、ＦＧＦ２３）またはその活性断片もしくは変種（例えば、シグナルペプチドを有しない）；リンカー（例えば、配列番号１１を含むリンカー）；およびｓＫｌｏｔｈｏ（シグナルペプチドを有するまたは有しない）もしくはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、またはＦｃ−γ受容体（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）を含む融合ポリペプチドであって、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）がこれらの残基：Ｒ１７９、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で１つまたは複数の変異を有する、融合ポリペプチドを提供する。様々な実施形態において、変異は、Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、および／またはＣ２４４Ｓである。これらの変異はヒト、アカゲザル、ウシ、マウス、およびラットＦＧＦ２３において保存されているが、それらを変異させてもＦＧＦ２３活性を妨げない。むしろ、これらのアミノ酸を変異させると、凝集を低減させ、望ましくないプロテアーゼによる切断を低減させ、および細胞からのタンパク質産生を増加させることによって、タンパク質の質を予想外に増強する。様々な実施形態において、１つまたは複数のＦＧＦ２３変異を含む融合タンパク質は、グリコシル化されている。
【００４２】
１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号４３）、または凝集および／またはプロテアーゼによる切断を低減させる追加の変異を含む変種、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、（２）任意選択で、配列番号１１を含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４４または配列番号４５）もしくはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、またはＦｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば、唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物（例えば、筋肉内投与剤形（intra-muscular administering form））、ならびに病的な障害の治療における、または処置するための薬剤としての医薬組成物の使用、例えば筋萎縮などの加齢関連状態を処置および／または予防するための使用を提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、（１）シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号４３）、または凝集および／またはプロテアーゼ媒介切断を低減させる追加の変異を含む変種、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、（２）配列番号１１を含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号７）、またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）、またはＦｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／もしくは血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片、またはその機能的活性変種もしくは誘導体を含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば、唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物（例えば、筋肉内投与剤形）、ならびに病的な障害の治療における、または処置するための薬剤としての医薬組成物の使用、例えば筋萎縮などの加齢関連状態を処置および／または予防するための使用を提供する。１つの実施形態において、本開示は、配列番号１９、２０、４０、または４１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物（例えば、筋肉内投与剤形）、ならびに病的な障害の治療における、または処置するための薬剤としての医薬組成物の使用、例えば筋萎縮などの加齢関連状態を処置および／または予防するための使用を提供する。
【００４３】
１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有するα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４４または配列番号４５）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば、唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物（例えば、筋肉内投与剤形）、ならびに筋萎縮などの加齢関連状態を処置および／または予防するための医薬組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、シグナルペプチドを有しないα−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号７）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば、唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物（例えば、筋肉内投与剤形）、ならびに病的な障害の治療における、または処置するための薬剤としての医薬組成物の使用、例えば筋萎縮などの加齢関連状態を処置および／または予防するための医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、改変Ｆｃ断片を含む。
【００４４】
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＦＧＦタンパク質またはその活性断片もしくは変種（例えば、シグナルペプチドを有しない）と、配列番号１１を含むリンカーとを含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化または非グリコシル化）を（例えば、唯一の薬学的活性成分として）含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
本開示の融合タンパク質を含む医薬組成物、および治療におけるその使用または病的な障害治療を処置するための薬剤としての使用、例えば加齢関連状態（例えば、筋萎縮）または代謝障害（例えば、糖尿病）の処置または予防のための使用も、本開示に包含される。
【００４６】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００４７】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号４０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号４６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００４９】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５０】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号５０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５１】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号５２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５２】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５３】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５４】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５５】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５６】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５７】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５８】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００５９】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６０】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６１】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６２】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６３】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６４】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６５】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６６】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００６７】
１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ１９またはその活性断片もしくは変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。もう１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ１９またはその活性断片もしくは変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２１またはその活性断片もしくは変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有するβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。もう１つの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ２１またはその活性断片もしくは変種に（直接またはリンカーを介して間接的に）融合した、シグナルペプチドを有しないβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のｓＫｌｏｔｈｏを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００６８】
本開示は、本明細書に記述されるＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列、および核酸を含有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記述される任意のポリペプチドをコードする核酸を包含する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記述される任意の融合ポリペプチドをコードする核酸を包含する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記述される任意のＫｌｏｔｈｏまたはＫｌｏｔｈｏ変種を包含する。いくつかの実施形態において、本開示は、任意のＦＧＦもしくはＦＧＦ２３、またはＦＧＦもしくはＦＧＦ２３の変種を包含する。
【００７０】
本開示はまた、本明細書において企図されるＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのいずれかを有する組成物も提供する。本開示の組成物は、ヘパリンをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００７１】
本開示はまた、Ｋｌｏｔｈｏの変種も提供する。これらには、Ｃ末端から最大約２０個のアミノ酸が欠失している（デルタＣ−２０またはΔＣ２０）α−ｓＫｌｏｔｈｏの変種（膜貫通ドメインを欠如して、シグナルペプチドを欠如するが、Ｋｌｏｔｈｏドメイン１および２（ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２）を保持する可溶性Ｋｌｏｔｈｏ）が含まれる。ＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（α−ｓＫｌｏｔｈｏΔＣ２０）の非限定的な例を配列番号７７に提供する。様々な実施形態において、ＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０は、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５で変異を有し得る。Ｖ５６３およびＫ７９５で変異を有するＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（α−ｓＫｌｏｔｈｏΔＣ２０）の非限定的な例を配列番号７８に示す。本開示はまた、ＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０を含む融合ポリペプチドも企図する。
【００７２】
このように、本開示のポリペプチドは、例えば、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している）である。もう１つの例として、ポリペプチドは、完全長であるか、または任意選択でＣ末端から１〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸が欠失している、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ変種である。そのような任意のポリペプチドが、Ｋｌｏｔｈｏ  Ｃ末端欠失変種である。そのようなＫｌｏｔｈｏ  Ｃ末端欠失変種を、ＦＧＦ２３もしくはその変種、または血清アルブミンもしくはその変種などの他のポリペプチドに融合させることができる。
【００７３】
本開示はまた、個体における加齢関連状態を処置または予防する方法も提供する。個体（例えば、ヒト）は、加齢関連状態を処置または予防するために、例えばＫｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインもしくはその活性断片もしくは変種を有するＫｌｏｔｈｏ変種と、線維芽細胞増殖因子もしくはその活性断片もしくは変種と含む、Ｋｌｏｔｈｏ変種または融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量（therapeutically effective dose）を投与される。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。特に、本開示は、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインまたはその活性断片もしくは変種と、線維芽細胞増殖因子（またはその活性断片もしくは変種）とを有するポリペプチドまたは融合ポリペプチドの治療有効量を、個体（例えば、ヒト）に投与することを含む、筋消耗を処置または予防する方法を提供する。
【００７４】
加えて、本開示は、個体における代謝障害を処置または予防する方法を提供する。個体に、代謝障害を処置するために、例えばＫｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子（またはその活性断片もしくは変種）とを有する、本開示のポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量を投与する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。特に、β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子２１とを有する本開示の融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために有用である。
【００７５】
本開示のＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子とを有する本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量は、高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために投与される。特に、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子２３とを有する本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、高リン血症または石灰沈着症を処置するために有用である。
【００７６】
本開示のＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における慢性腎疾患または慢性腎不全を処置または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。Ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子とを有する本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量は、慢性腎疾患または慢性腎不全を処置または予防するために投与される。
【００７７】
本開示のＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体におけるがん（例えば、乳がん）を処置または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。Ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子とを有する本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量は、がんまたは乳がんを処置または予防するために投与される。
【００７８】
本開示は、医療において使用するための、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインまたはその活性断片もしくは変種とＦＧＦまたはその活性断片もしくは変種とを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。１つの実施形態において、本開示は、筋萎縮の処置または予防に使用するための、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインまたはその活性断片もしくは変種とＦＧＦまたはその活性断片もしくは変種とを含む融合ポリペプチドを提供する。本開示はまた、本開示のポリペプチドまたは融合ポリペプチド、例えば可溶性Ｋｌｏｔｈｏタンパク質またはその活性断片もしくは変種を含むポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、加齢関連状態（例えば、筋萎縮）を処置または予防する方法も提供する。
【００７９】
本開示はさらに、個体における病的障害、例えば加齢関連状態、代謝障害、高リン血症または石灰沈着症、慢性腎疾患または慢性腎不全の、治療に使用するための、薬剤としての、もしくは処置に使用するための、またはがんもしくは乳がんを予防するための、上記のペプチドおよび融合ポリペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物を提供する。加えて、本開示は、さらに病的障害の処置、特に上記の障害、好ましくは筋萎縮などの加齢関連状態の処置のための薬剤の製造における本発明のポリペプチド、核酸、または医薬組成物の使用を提供する。
【００８０】
本開示はまた、個体における加齢関連障害または代謝障害を処置または予防するためのキットも含む。キットは、使用説明書、およびＫｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子とを有する精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００８１】
本開示はまた、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを産生するためのキットも提供する。本開示のキットは、使用説明書と、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【００８２】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、（ａ）線維芽細胞増殖因子またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含むポリペプチド、および（ｂ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片またはその機能的活性変種もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変種）を含む。
【００８３】
本開示の１つの実施形態において、（ａ）のポリペプチドと（ｂ）のポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって接続される。リンカーは、１から３０回、またはそれより多く繰り返され得る。
【００８４】
本開示の１つの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８５】
本開示の１つの実施形態において、（ａ）のポリペプチドは、ペプチド結合によって前記ポリペプチドリンカーのＮ末端に接続され、（ｂ）のポリペプチドは、ペプチド結合によって前記ポリペプチドリンカーのＣ末端に接続される。
【００８６】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドはさらに、シグナルペプチドを含む。
【００８７】
本開示の１つの実施形態において、シグナルペプチドはＩｇＧシグナルペプチドである。
【００８８】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２３または線維芽細胞増殖因子２３変種（Ｒ１７９Ｑ）である。
【００８９】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子１９または線維芽細胞増殖因子２１である。
【００９０】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号５１または配列番号５３のアミノ酸配列と９５％またはそれ超同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号５１または配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【００９２】
本開示の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦｃＬＡＬＡを含む。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１−１】図１は、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのいくつかの異なる実施形態を例示する図である。表記の融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子に作動可能に連結された１つまたは複数のＫｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインを含む。１つまたは複数のＫｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインを含有するポリペプチドとしては、例えば、Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（例えば、ヒトＫｌｏｔｈｏの１〜９８２位のアミノ酸）、またはＫｌｏｔｈｏの活性断片が挙げられる。
【図１−２】図１は、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのいくつかの異なる実施形態を例示する図である。表記の融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子に作動可能に連結された１つまたは複数のＫｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインを含む。１つまたは複数のＫｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインを含有するポリペプチドとしては、例えば、Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（例えば、ヒトＫｌｏｔｈｏの１〜９８２位のアミノ酸）、またはＫｌｏｔｈｏの活性断片が挙げられる。
【図２−１】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−２】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−３】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−４】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−５】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−６】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−７】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−８】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−９】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１０】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１１】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１２】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１３】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１４】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１５】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図２−１６】図２は、本開示のいくつかのＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよびその成分（例えば、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を例示する図である。ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡ（Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含む融合タンパク質を、配列番号４６、４７、４８、および４９に記載する。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質を、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載する。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発現を表す図である。図３Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質が、抗ＦＧＦ２３抗体によるウェスタンブロッティングによって条件培地中で検出されたことを示している。図３Ｂは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって条件培地中で検出されたことを示している。図３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって分析した高度精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ融合タンパク質を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｃは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発現を表す図である。図３Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質が、抗ＦＧＦ２３抗体によるウェスタンブロッティングによって条件培地中で検出されたことを示している。図３Ｂは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって条件培地中で検出されたことを示している。図３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって分析した高度精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ融合タンパク質を示す。
【図４】図４は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下で、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド、ＦＧＦ２３ポリペプチドのみ、可溶性Ｋｌｏｔｈｏ（ｓＫｌｏｔｈｏ）ポリペプチドのみ、およびＦＧＦ２３ポリペプチドと組み合わせた可溶性Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドのいずれかを含有する条件培地で処置した細胞におけるＥｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を例示する図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ヘパリンの非存在下または存在下で、精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド、ＦＧＦ２３ポリペプチド、または可溶性Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドで処置した細胞におけるＥｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を表す図である。図５Ａは、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下でＦＧＦ２３のみ、ｓＫｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓ（１０ｎＭまたは２０ｎＭ）およびＦＧＦ２３とｓＫｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓ（１０ｎＭまたは２０ｎＭ）の組合せによって処置した細胞におけるＥｇｒ−１の活性化レベルを比較する実験の結果を示す。図５Ｂは、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−Ｈｉｓ融合体（０ｎＭ、０．６ｎＭ、１．２１ｎＭ、２．４１ｎＭ、４．８３ｎＭ、９．６５ｎＭ、および１９．３ｎＭ）によって処置した細胞におけるＥｇｒ−１ルシフェラーゼレポーター活性を示す。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞に対する、精製ｓＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドによる処置の効果を例示する図である。図６Ａは、デキサメタゾン（１００μＭ）の非存在下または存在下でＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド（２０ｎＭ）のいずれかによって処置したＣ２Ｃ１２筋細胞における筋管直径の測定を示す。図６Ｂは、ラパマイシン（４０ｎＭ）の非存在下または存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド（２０ｎＭ）による、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化を示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞に対する、精製ｓＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドによる処置の効果を例示する図である。図６Ａは、デキサメタゾン（１００μＭ）の非存在下または存在下でＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド（２０ｎＭ）のいずれかによって処置したＣ２Ｃ１２筋細胞における筋管直径の測定を示す。図６Ｂは、ラパマイシン（４０ｎＭ）の非存在下または存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド（２０ｎＭ）による、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化を示す。
【図７】図７は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す図である。
【図８】図８は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタンパク質によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す図である。
【図９】図９は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）対ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、デキサメタゾン誘発筋萎縮後の筋成長の増強におけるｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。
【図１１】この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ、ならびにＱ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、およびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す図である。
【図１２】図１２は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａのＷＴ（野生型）、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、およびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体のタンパク質の質および二量体形成を示す図である。
【図１３】図１３は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａのＷＴ、Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｙ１５４Ｈ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｙ１５４Ｎ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｓ１５５Ａ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｓ１５５Ｔ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓのタンパク質の質を示す図である。この図におけるＦＧＦ２３変種（「ＷＴ」を含む）は全て、Ｒ１７９Ｑ変異を有する。
【図１４】図１４は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡおよびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す図である。
【図１５】図１５ＡおよびＢは、様々な構築物の構築を示す図である。図１５Ａは、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２６０、約２８０、約３００、約３２０、約３４０、約３６０、約３８０、約４００、約４２０、約４４０、約４６０、約４８０個のアミノ酸のＣ末端欠失を有するｓＫｌｏｔｈｏ変種を構築するための戦略を示す。プライマーＰ５（配列番号８３）を５’プライマーとして使用した。Ｃ−２０、Ｃ−４０、Ｃ−６０・・・Ｃ−４８０（配列番号８４〜１０７）と称される一連の２４のプライマーのいずれかを使用して、Ｃ末端から約２０、約４０、約６０・・・・約４８０個のアミノ酸をトランケーションした（truncate）。ｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体の全ての中で、約２０個のアミノ酸の欠失を有するもの（ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０）のみが有効であった。このｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体とＦＧＦ２３との融合体を、図１５Ｂに示すように作製した。図１５Ｂは、ｓＫｌｏｔｈｏ（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドを構築するための戦略を示す。Ｐ５プライマーをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）においてＣ−２０プライマーと共に使用して、ｓＫｌｏｔｈｏトランケーションを有する断片を調製した。この断片を、制限エンドヌクレアーゼによって切断して、ＦＧＦ２３をコードするベクターにライゲートして、ｓＫｌｏｔｈｏ（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドを構築した。
【図１６】図１６は、ｓＫｌｏｔｈｏ変異体のＥｇｒ−１活性を示す図である。それぞれが、ｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体とＦＧＦ２３との融合体をコードするベクターを有する、様々なＨｅｋ２９３細胞から条件培地（ＣＭ）を収集した。有用な量の融合体を産生する細胞からのＣＭのみを使用した。使用した融合体は、ＣＭ１：約２０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ；ＣＭ７：約１４０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ；ＣＭ１１：約２２０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ；ＣＭ１２：約２４０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ；ＣＭ１３：約２６０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ；ＣＭ２３：約４６０個のアミノ酸（aa）がトランケーションされたｓＫｌｏｔｈｏ。陽性対照：ｓＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３の融合体を産生する細胞からの条件培地［（＋）ＣＭ］；ｓＫｌｏｔｈｏとＦＧＦ２３の精製融合体［（＋）ｃｔｒｌ］。「ｕｎＣｏｎｃ．」は、より少ないタンパク質を使用した実験を示す。陰性対照：（−）対照。ＲＬＵ、相対ルシフェラーゼ単位。この実験から、Ｃ末端から約２０個のアミノ酸の欠失によって、ｓＫｌｏｔｈｏの活性が減少することが示された。
【図１７】図１７は、ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端から約２０個のアミノ酸の欠失によって、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性が増加したことを示す図である。図１７Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏ、またはｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０およびＦＧＦ２３を含む様々な融合体の相対量のウェスタンブロットを示す。レーン１、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体。レーン２、ＦＧＦ２３−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）融合体。レーン３、ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合体。サイズマーカーも同様に示す。Ｋｌｏｔｈｏに対するポリクローナル抗体を使用した。図１７Ｂは、Ｅｇｒ−１−Ｌｕｃアッセイにおけるこれらの融合ポリペプチドの活性を示す。
【図１８】図１８は、精製タンパク質による実験を示す図であり、ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端からの約２０個のアミノ酸の欠失によってｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性が増加するという知見が繰り返し得られる。図１８Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３融合体の純度を示すタンパク質ゲルを示す（レーン２および３）。レーン１、サイズマーカー。図１８Ｂは、精製ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３融合体（ｓＫＦ−Ｔ）およびｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体（ｓＫＦ）を使用するＥｇｒ−１アッセイを示す。タンパク質のＥＣ５０も同様に示す。これらの図面および明細書において、用語ｓＫＦ−Ｔ、Ｋｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３、ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３、ｋｌｏｔｈｏ（デルタＣ−２０）−ＦＧＦ２３、α−ｓＫｌｏｔｈｏ、ΔＣ２０−ＦＧＦ２３などの用語は全て、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｃ末端から約２０個のアミノ酸がトランケーションされているα−ｓＫｌｏｔｈｏ、任意選択のリンカー、およびＦＧＦ２３を含む融合ポリペプチドを示す。
【図１９】
【発明を実施するための形態】
【００９４】
４．詳細な説明
本開示は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キット、および組成物、ならびに病的な障害の治療における、薬剤としての、または処置に使用するための前記組成物の使用を対象とする。本開示のポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質またはその活性断片もしくは変種を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子ポリペプチドまたはその活性断片もしくは変種に作動可能に連結したＫｌｏｔｈｏタンパク質またはその活性断片もしくは変種を含む。
【００９５】
本開示の融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｎ末端からＣ末端の順に：（ａ）α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から約２０個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失している）、および（ｂ）任意選択でＲ１７９で変異を有するＦＧＦ２３、および任意選択で（ｃ）（ａ）と（ｂ）の間に挟まれるリンカーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏ（例えば、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠如するα−Ｋｌｏｔｈｏ）、（ｂ）リンカー、および（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２３成分は、Ｃ２０６および／またはＣ２４４で変異を有する。これらの融合体のいくつかの実施形態において、α−ｓＫｌｏｔｈｏは、Ｖ５６３および／またはＫ７９５で変異を有する。いくつかの実施形態において、ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０は、配列番号７７または７８によって表される（後者は変異Ｖ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅを有する）。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドはさらに、α−ｓＫｌｏｔｈｏのＮ末端にシグナルペプチドを含む。様々な実施形態において、シグナルペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号８１の太字で下線の部分によって表される。様々な実施形態において、リンカーは、２つのペプチドを接続することができる当技術分野において公知の任意のタイプのリンカーである。様々な実施形態において、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１１〜１８の任意の配列、またはその任意の数もしくは組合せを含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１２の１、２、３またはそれ超のコピーを含む。様々な実施形態において、リンカーは、配列番号１２の３コピーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号７９、８０、８１、または８２によって表される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、融合体はさらに、ＦｃＲｎの結合能が減少したおよび／または血清中の安定性が増加した改変Ｆｃ断片を含む。もう１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）と、ＦｃＲｎの結合能が減少したおよび／または血清中の安定性が増加した改変Ｆｃ断片とを含む。
【００９７】
本開示の融合タンパク質またはｓＫｌｏｔｈｏは、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴を含む多様な加齢関連状態、ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満を含む代謝障害の処置および予防において有用である。
【００９８】
本開示は、物理的拘束（例えば、ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦポリペプチドがいずれもサイズが大きい）にもかかわらず、Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチドがＦＧＦ受容体の活性化において非常に有効であるという知見に少なくとも部分的に基づいている。この知見は、これらの２つのタンパク質の融合体が、ヘテロ二量体形成を妨害して、これによりタンパク質の活性を妨害する可能性があり、例えばタンパク質の結合ドメインが融合によって混乱し得ること、またはタンパク質が、共に「シス」配置に存在する場合、空間的に誤配向され得ることを考慮すると、予想外である。
【００９９】
本明細書に記述される融合ポリペプチドは、単独でまたは個別のポリペプチドとして共に投与されるＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦと比較して活性を増強する１つの治療タンパク質の投与が可能となることから、有利である。異なる２つのポリペプチド（すなわち、Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドと別個のＦＧＦポリペプチド）としてではなく１つの融合ポリペプチドとしてのＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦの使用は、ＦＧＦ受容体の活性化においてより有効である。
【０１００】
本開示の融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｎ末端からＣ末端の順に：（ａ）α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から約２０個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失している）、および（ｂ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３、および任意選択で（ｃ）（ａ）と（ｂ）の間に挟まれるリンカーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏ（例えば、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠如するα−Ｋｌｏｔｈｏ）、（ｂ）リンカー、および（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を含む。
【０１０１】
本開示の融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｎ末端からＣ末端の順に：（ａ）α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（Ｃ末端から約２０個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失している）、および（ｂ）血清アルブミン、および任意選択で（ｃ）（ａ）と（ｂ）の間に挟まれるリンカーを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または１〜最大約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏ（例えば、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠如するα−Ｋｌｏｔｈｏ）、（ｂ）リンカー、および（ｃ）血清アルブミンを含む。様々な実施形態において、血清アルブミンは、ヒト、マウス、または任意の動物起源であり得る。ヒトＫｌｏｔｈｏとマウス血清アルブミンとを含む融合体の非限定的な例を、配列番号１０８に提供する。Ｋｌｏｔｈｏおよび血清アルブミンを含む融合ポリペプチドの活性を図１９に示す。マウス血清アルブミンが実験に使用され得る１つの理由は、ヒト血清アルブミンがマウスシステムにおいてリサイクルされず、そのため半減期延長部分としての有効性を減少させ得るためである。治療ポリペプチドに関して、ヒト血清アルブミン（もしくはその変種）、およびヒトＫｌｏｔｈｏ変種（例えば、ヒトＫｌｏｔｈｏ  Ｃ末端欠失変種、またはＶ５６３および／もしくはＫ７９５で変異を有するヒトＫｌｏｔｈｏ；またはＣ末端欠失ならびにＶ５６３および／もしくはＫ７９５で変異を有するヒトＫｌｏｔｈｏ変種）を含む融合ポリペプチドを使用することが望ましいであろう。
【０１０２】
実施例９に示すように、α−ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端に様々な欠失を作製した。これらのｓＫｌｏｔｈｏ変異体は、Ｃ末端から約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２６０、約２８０、約３００、約３２０、約３４０、約３６０、約３８０、約４００、約４２０、約４４０、約４６０、約４８０個が欠失された。これらはそれぞれ、デルタＣ−２０、デルタＣ−４０、デルタＣ−６０などと称され、配列番号８４〜１０７に記載されるプライマーＣ−２０、Ｃ−４０、Ｃ−６０などを使用して産生される。実施例９に記載されるように、これらの構築物の多くは、ｓＫｌｏｔｈｏ変異体の有用な量を発現しなかった。発現したものの中で、Ｃ−２０（１としても知られる）、Ｃ−１４０（７）、Ｃ−２２０（１１）、Ｃ−２４０（１２）、Ｃ２６０（１３）、およびＣ４６０（２３）をＫｌｏｔｈｏ活性に関して試験した。タンパク質を産生する細胞からの条件培地をＥｇｒ−１アッセイにおいて使用して、相対的ルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）を測定した。Ｃ−２０は、何らかのＫｌｏｔｈｏ活性を示したが、条件培地からの野生型Ｋｌｏｔｈｏまたは精製野生型Ｋｌｏｔｈｏより低かった。他のＣ末端ｓＫｌｏｔｈｏ欠失（Ｃ１４０、Ｃ−２２０、Ｃ−２４０、Ｃ−２６０、およびＣ−４６０）は、有意なＫｌｏｔｈｏ活性を示さなかった。
【０１０３】
α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０は野生型ｓＫｌｏｔｈｏより低い活性を示したものの、ＦＧＦ２３との融合体においては前者は後者（later）よりより活性であった。
【０１０４】
言い換えれば、ｓＫｌｏｔｈｏから約２０個のアミノ酸を欠失させると、ｓＫｌｏｔｈｏの活性は減少したが、意外にもｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体の活性は増加した。これらの予想外の結果を実施例９に示す。先に述べたように、α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０は野生型α−ｓＫｌｏｔｈｏより活性が低かった。しかし、α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０−ＦＧＦ２３融合体は、α−ｓＫｌｏｔｈｏ（野生型）−ＦＧＦ２３融合体より活性である。この図に示すデータは、条件培地からのポリペプチドを使用した。次に、α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドを精製して、実験を繰り返したところ、現象が再現された。図１８は、精製ポリペプチドを使用した場合でも、α−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０−ＦＧＦ２３融合体がα−ｓＫｌｏｔｈｏ（野生型）−ＦＧＦ２３融合体より活性であることを示した。
【０１０５】
このように、約２０個のアミノ酸の欠失により、単離されたｓＫｌｏｔｈｏの活性は意外にも減少したが、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性は増加した。
【０１０６】
定義
本明細書において使用される「Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド」、「Ｋｌｏｔｈｏタンパク質」、または「Ｋｌｏｔｈｏ」は、野生型「Ｋｌｏｔｈｏ」の活性断片、誘導体、模倣体、変種、および化学修飾化合物またはそのハイブリッドを含む。Ｋｌｏｔｈｏ活性断片は、ＦＧＦポリペプチドに対する結合能を有する。一般的にＫｌｏｔｈｏ活性ポリペプチドは、少なくとも１つのＫｌｏｔｈｏサブドメイン（例えば、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２）を含有する。野生型Ｋｌｏｔｈｏは、天然において見出されるアミノ酸配列を有する。本開示において使用するために適した例としてのＫｌｏｔｈｏポリペプチドとしては、α−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号４）が挙げられる。α−Ｋｌｏｔｈｏおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号ＮＭ＿００４７９５；ＮＰ＿００４７８６、およびＮＭ＿１７５７３７；ＮＰ＿７８３８６４として見出される。Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，５７９，８５０号明細書に記載されるポリペプチドを含む。Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドとしては、マウス（ＮＰ＿０３８８５１）、ラット（ＮＰ＿１１２６２６）、ウサギ（ＮＰ＿００１０７５６９２）由来のα−Ｋｌｏｔｈｏ、およびマウス（ＮＰ＿１１２４５７）由来のβ−Ｋｌｏｔｈｏを含む、ヒト以外の他の種に由来するポリペプチドが挙げられる。α−Ｋｌｏｔｈｏを有すると予想される種としては、チンパンジー（ＸＰ＿５２２６５５）、マカク（ＸＰ＿００１１０１１２７）、ウマ（ＸＰ＿００１４９５６６２）、ウシ（ＸＰ＿００１２５２５００）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１０９８１）、およびニワトリ（ＸＰ＿４１７１０５）が挙げられる。β−Ｋｌｏｔｈｏを有すると予想される種としては、チンパンジー（ＸＰ＿５２６５５０）、マカク（ＸＰ＿００１０９１４１３）、ウマ（ＸＰ＿００１４９５２４８）、イヌ（ＸＰ＿５３６２５７）、ラット（ＸＰ＿００１０７８１７８）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１２７２２）、およびニワトリ（ＸＰ＿４２３２２４）が挙げられる。Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と実質的に同一である、すなわち、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列、またはその活性断片もしくは変種と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
本明細書において使用される「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、同じポリペプチドに本来存在しない２つまたはそれ超の異なるポリペプチドまたはその活性断片を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、２つまたはそれ超の異なるポリペプチドは、共有結合によって共に作動可能に連結され、例えばペプチド結合によって化学的に連結またはインフレームで融合される。本明細書において使用される「Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド」は、Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたはその活性断片もしくは変種からのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。融合ポリペプチドは、非限定的な例として、Ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ｓＫｌｏｔｈｏ）、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）、および（任意選択で）改変Ｆｃ断片（例えば、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片）を含み得る。このタイプの融合ポリペプチドの例を、配列番号４６〜４９に表す。もう１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）および改変Ｆｃ（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）を含む。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質は、配列番号５０、５１、５２、および５３に記載される。ＦｃＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃ断片であり、これはＡＤＣＣを誘発する効率が低下しており、ヒト補体に対する結合および活性化が弱い。Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104。
【０１０８】
「線維芽細胞増殖因子」および「ＦＧＦ」は、本明細書において互換的に使用され、ヒト対象を含む動物における細胞の増殖、遊走、分化、恒常性、組織修復、および損傷に対する応答を調節するポリペプチドを指す。ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子受容体に対する結合能を有し、ＦＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化、ならびにＥｇｒ−１（初期増殖応答−１）の活性化を含む、その活性を調節する。用語「ＦＧＦ」は、当技術分野で公知であるように、ならびにそれらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，２２３，５６３号明細書および米国特許第７，２５９，２４８号明細書に記述されているように、野生型「ＦＧＦ」の活性断片、誘導体、模倣体、変種、および化学修飾化合物またはそのハイブリッドを含む。野生型ＦＧＦは、天然において見出されるアミノ酸配列を有する。本開示と共に使用するために適している例としての線維芽細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９、配列番号３１）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１、配列番号３３）、および線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３、配列番号３５）が挙げられる。ＦＧＦポリペプチドは、マウスＦＧＦを含むヒト以外の他の種由来のポリペプチドを含む。一般的に、ＦＧＦポリペプチドは、配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３５のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有し、すなわち配列番号３１、配列番号３３、または配列番号３５のアミノ酸配列またはその活性断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。ＦＧＦ、特にＦＧＦ２３の追加の非限定的な例は、配列番号４７の１００２〜１２２８位のアミノ酸、配列番号４９の１００２〜１２２８位のアミノ酸、配列番号５１の１〜２５１位のアミノ酸、および配列番号５３の１〜２５１位のアミノ酸、ならびにこれらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超、または１００％同一である配列として提供される。これらの配列をコードするヌクレオチドを配列番号４６、４８、５０、および５２に提供する。
【０１０９】
用語「ＦＧＦ」は、完全長のポリペプチドの活性な断片を含む。その対応するＦＧＦ受容体に結合することができる活性なＦＧＦ断片は、当技術分野において公知であり、同様に本開示において使用することが企図される。当業者は、本明細書において開示される配列に基づいて、例えば、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)およびAusubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)に記述される標準的な組み換え技術を使用して、ＦＧＦの重なり合う断片を生成することができることを認識するであろう。当業者は、本明細書に示す開示に基づいて、ＦＧＦ断片の生物活性を、ＦＧＦ受容体に結合することを含めて、当技術分野において周知のおよび本明細書に記述される方法によって試験することができることを認識するであろう。同様に、必要なＦＧＦシグナル伝達機構（すなわち、ＦＧＦ受容体）を保有する細胞培養モデルに、ＦＧＦ断片をトランスフェクトさせて、その後、野生型ＦＧＦと比較したＦＧＦシグナル伝達の変化に関して試験することができる。
【０１１０】
ＦＧＦは、特に異なるＦＧＦサブファミリー間で長さおよび一次配列の両方において高度に可変性であるＮ末端およびＣ末端配列に離接するＦＧＦコア相同性ドメイン（およそ１２０アミノ酸長）との相同性に基づいて７つのサブファミリーに分類される（Goetz et al., Molecular and Cellular Biology, 2007, Vol. 27, 3417-3428）。ＦＧＦ活性ポリペプチドは、一般的に少なくとも１つのＦＧＦコア相同性ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ活性ポリペプチドは、ＦＧＦコア相同性ドメインに加えて、ＦＧＦ受容体の結合に追加の特異性を付与し得る隣接配列を含有し得る。ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３は、これらのリガンドのコア領域が他のＦＧＦと比較して高い配列同一性を共有することから（ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２１：３８％の同一性；ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２３：３６％の同一性）、ＦＧＦ１９サブファミリーに分類される。ＦＧＦ１９サブファミリーメンバーは、内分泌系のシグナル伝達分子と類似に作用して、古典的なＦＧＦでは見られない多様な生理学的プロセスを調節する（例えば、ＦＧＦ１９：エネルギーおよび胆汁酸恒常性；ＦＧＦ２１：グルコースおよび脂質代謝；ならびにＦＧＦ２３：リン酸塩およびビタミンＤ恒常性）。
【０１１１】
本明細書において使用される「線維芽細胞増殖因子受容体」および「ＦＧＦＲ」は、当技術分野で公知のＦＧＦＲ１〜４、またはそのスプライス変種（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ）のいずれか１つを指す。本開示と共に使用するために適した例としての線維芽細胞増殖因子受容体としては、線維芽細胞増殖因子受容体１９（例えば、ＦＧＦＲ４−β−Ｋｌｏｔｈｏ）、線維芽細胞増殖因子受容体２１（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−α−Ｋｌｏｔｈｏ）、および線維芽細胞増殖因子２３（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−α−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ３−α−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ４−α−Ｋｌｏｔｈｏ）が挙げられる。
【０１１２】
本明細書において使用される「細胞外ドメイン」は、細胞の外側（例えば、細胞内または膜貫通領域を含まない）に存在する膜貫通タンパク質の断片を指す。「Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメイン」、「可溶性Ｋｌｏｔｈｏ」、または「ｓＫｌｏｔｈｏ」（例えば、配列番号７、配列番号３９）は、線維芽細胞増殖因子に結合することができる、および／または線維芽細胞増殖因子に結合することによって、線維芽細胞増殖因子を線維芽細胞増殖因子受容体に結合させることができるＫｌｏｔｈｏポリペプチドの細胞外ドメインを指す。Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインは、完全長のα−Ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２）のアミノ酸残基２８〜９８２位、および完全長のβ−Ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号４）のアミノ酸残基５２〜９９７位に対応する。
【０１１３】
「Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメイン」および「Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメイン」は、本明細書において互換的に使用され、線維芽細胞増殖因子に結合することができる、および／または線維芽細胞増殖因子に結合することによって、線維芽細胞増殖因子を線維芽細胞増殖因子受容体に結合させることができるＫｌｏｔｈｏポリペプチドの細胞外ドメイン内の領域を指す。様々な実施形態において、融合体は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチド；線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチド；および任意選択で、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインは、反復される２つの相同なサブドメイン、すなわちＫＬ−Ｄ１（配列番号５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号６）を有する。ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２はそれぞれ、完全長のα−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸残基５８〜５０６位、および５１７〜９５３位に対応し、それぞれ、完全長のβ−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド（配列番号４）のアミノ酸残基７７〜５０８位および５７１〜９６７位に対応し、本開示において使用するために適している。一般的に、少なくとも１つのＫｌｏｔｈｏサブドメインを含有するポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏ活性ポリペプチドである。本開示のポリペプチドと共に使用するためのＫｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインは、配列番号５または配列番号３７のアミノ酸配列とそれぞれ実質的に同一であるアミノ酸配列を有するα−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ  ＫＬ−Ｄ１ドメインであり得る。さらに、Ｋｌｏｔｈｏ  ＫＬ−Ｄ１ドメインは、配列番号５または配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超同一であるアミノ酸配列を有し得る。Ｋｌｏｔｈｏ細胞外サブドメインはまた、配列番号６または配列番号３８のアミノ酸配列とそれぞれ実質的に同一であるαまたはβ−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。さらなる実施形態において、ＫＬ−Ｄ２ドメインは、配列番号６または配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、融合体は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメイン（例えば、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２；ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ１のタンデムリピート；ＫＬ−Ｄ２およびＫＬ−Ｄ２のタンデムリピート）を含む。
【０１１４】
本明細書において使用される「改変Ｆｃ断片」は、改変された配列を含む抗体のＦｃ断片を意味する。Ｆｃ断片は、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域の一部を含む抗体の一部である。改変Ｆｃ断片は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から誘導することができる。ＦｃＬＡＬＡは、ＡＤＣＣを誘発する効率が低下しており、ヒト補体に対する結合および活性化が弱い、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する改変Ｆｃ断片である。Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104。Ｆｃ断片に対する追加の改変は、例えば米国特許第７，２１７，７９８号明細書に記述される。例えば、様々な改変Ｆｃ断片において、（ａ）アミノ酸残基２５０位は、グルタミン酸であり、アミノ酸残基４２８位はフェニルアラニンであり、または（ｂ）アミノ酸残基２５０位はグルタミンであり、アミノ酸残基４２８位はフェニルアラニンであり、または（ｃ）アミノ酸残基２５０位はグルタミンであり、アミノ酸残基４２８位はロイシンである。いくつかの実施形態において、米国特許第７，２１７，７９８号明細書に記述されるＥＵナンバリングシステムによってアミノ酸残基を付番する場合の、アミノ酸残基２５０位および４２８位は、アミノ酸残基２５０位がグルタミン酸またはグルタミンであり、アミノ酸残基４２８位がロイシンまたはフェニルアラニンであることにより、非改変Ｆｃ融合タンパク質に存在する残基とは異なる。いくつかの実施形態において、改変Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＨ８．０よりｐＨ６．０でＦｃＲｎに対して高い親和性を有する。好ましくは、改変Ｆｃ断片は、ＦｃＲｎに対する親和性が減少しているおよび／または血清中半減期が増加している。改変Ｆｃ断片の非限定的な例としては、配列番号４７のアミノ酸１２３４〜１４５９位、配列番号４９のアミノ酸１２３４〜１４５０位、配列番号５１のアミノ酸２５７〜４８２位、および配列番号５３のアミノ酸２５７〜４７３位、ならびにこれらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超、または１００％同一である配列が挙げられる。これらの配列をコードするヌクレオチドは、配列番号４６、４８、５０、および５２に提供される。
【０１１５】
本明細書において使用される「シグナルペプチド」は、タンパク質の小胞体への翻訳後輸送を指示し、切断され得るペプチド鎖（３〜６０アミノ酸長）を意味する。本開示において使用するために適した例としてのシグナルペプチドとしては、Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチド（配列番号１９）、およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号２０）が挙げられる。産生細胞株による分泌および切断により、シグナルペプチド（例えば、配列番号１９および配列番号２０に対応するペプチドの）は切断されて除去されることに注目されたい。このように、産生細胞株によるシグナルペプチドの分泌および切断後、配列番号１９のペプチドは、配列番号４１のペプチドを生成するであろう。
【０１１６】
本明細書において使用される「リンカー」は、それらが互いに接続されるように２つまたはそれ超のポリペプチドまたは核酸を共有結合する官能基（例えば、化学またはポリペプチド）を意味する。
【０１１７】
本明細書において使用される「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を共に連結するために（例えば、Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインと線維芽細胞増殖因子２３とを連結するために）使用される１つまたは複数のアミノ酸を意味する。本開示において使用するために適したペプチドリンカーとしては、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１１８】
ポリペプチドリンカーは、これらのアミノ酸配列のいずれかの少なくとも１から最大約３０リピートを含み得る。
【０１１９】
本明細書において使用される「作動可能に連結された」は、生体分子に関連する生物機能、活性、および／または構造が少なくとも保持されるように２つまたはそれ超の生体分子を連結させることを意味する。ポリペプチドに関連して、この用語は、２つまたはそれ超のポリペプチドを連結させることによって、各ポリペプチド成分のそれぞれの個々の活性の少なくとも一部を保持する融合ポリペプチドが得られることを意味する。２つまたはそれ超のポリペプチドを直接またはリンカーによって連結してもよい。核酸に関連して、この用語は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が第二のポリヌクレオチドに結合している場合に、第一のポリヌクレオチドが、第一のポリヌクレオチドの転写を指示する第二のポリヌクレオチドに隣接して位置することを意味する。
【０１２０】
本明細書において使用される「特異的に結合する」は、自身と他の標的分子との間での非共有結合相互作用の形成に至る特定の構造を第一の分子がとることができることにより、それが曝露され得る多くの異なるタイプの分子の中から第一の分子が標的分子に結合できることを指す。第一の分子は、標的に結合して安定な複合体を形成するが、第一の分子と他の任意の非特異的分子との間の認識、接触、または複合体形成は実質的に少ない。
【０１２１】
本明細書において使用される「ポリペプチド変種」または「タンパク質変種」は、１つまたは複数のアミノ酸が、基準配列とは異なるアミノ酸に置換されているポリペプチドを指す。本明細書において以降に記述されるように、いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の特性を変化させることなく（保存的置換）、広く類似の特性を有する他のアミノ酸に置換できることは当技術分野で周知である。これらの用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が付加もしくは欠失されている、または異なるアミノ酸に置換されているポリペプチド、例えばタンパク質アイソフォームも包含する。本開示において使用するために適した線維芽細胞増殖因子２３の例としての変種は、線維芽細胞増殖因子２３変種（Ｒ１７９Ｑ）である。
【０１２２】
本明細書において使用される「医薬組成物」は、個体における疾患または障害を処置または予防するために投与され得る化合物（例えば、本開示の融合ポリペプチド）を含有する組成物を意味する。
【０１２３】
本明細書において使用される「個体」または「対象」は、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されるわけではない哺乳動物を指す。
【０１２４】
本明細書において使用される「処置する」は、疾患の発症または進行を減少、抑制、減弱、縮小、停止、または安定化させることを意味する。本開示の文脈において、本開示のポリペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴を含む多様な加齢関連状態、ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満を含む代謝障害を処置するために使用され得る。
【０１２５】
本明細書において使用される「予防する」は、対象における障害の発生の減少、または障害もしくはその関連症状を有するリスクの減少を指す。本開示の文脈において、本開示のポリペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴を含む加齢関連状態、ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満を含む代謝障害を予防するために使用され得る。予防は、完全であり得て、例えば加齢関連状態または代謝障害の完全な非存在であり得る。予防はまた、部分的であり得て、対象における加齢関連状態または代謝障害が発生する可能性が、対象が本開示を受けていない場合より低い。
【０１２６】
本明細書において使用される「疾患」は、細胞、組織、または臓器の正常な機能に障害を与えるまたは妨害する任意の状態または障害を意味する。
【０１２７】
本明細書において使用される「加齢関連状態」は、集団におけるその発生率または個体における重症度が年齢の進行と相関する任意の疾患または障害を意味する。１つの実施形態において、加齢関連状態は、その発生率が、年齢が３０〜４０歳の間のヒト個体および選択された１００，０００人超の個体集団と比較して、年齢６０歳超のヒト個体において少なくとも１．５倍高い疾患または障害である。本開示に関連する加齢関連状態としては、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２８】
本明細書において使用される「代謝障害」は、細胞におけるエネルギー産生、または細胞、組織、臓器、もしくは個体における毒素の蓄積に影響を及ぼすことによって、細胞、組織、または臓器における正常な機能に障害を与えるまたは妨害する任意の疾患または障害を意味する。本開示に関連する代謝障害としては、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２９】
「有効量（dose）」または「有効量（amount）」は、有益なまたは所望の臨床結果を達成するために十分な量である。本開示の文脈において、これは、意図される薬理学的、治療的、または予防的結果を生じるために有効なＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドまたはｓＫｌｏｔｈｏの量である。治療有効量によって、障害（例えば、加齢関連状態または代謝障害）または障害の１つもしくは複数の症状の予防または改善が得られる。治療有効量は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて変化し、これは、当業者が容易に決定することができる。
【０１３０】
本明細書において使用される「Ｋｌｏｔｈｏ核酸分子」は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする遺伝子である。例としてのヒトＫｌｏｔｈｏ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４７９５（配列番号１）として提供される。Ｋｌｏｔｈｏの追加の非限定的な例として、配列番号４７のアミノ酸１〜９８２位および配列番号４９のアミノ酸１〜９８２位、ならびにこれらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超、または１００％同一である配列が提供される。
【０１３１】
本明細書において使用される「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を指す。この一部は、好ましくは、基準核酸分子またはポリペプチドの完全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ超を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または最大３０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【０１３２】
用語「実質的に同一」は、基準アミノ酸配列（例えば、本明細書において記載される任意の１つのアミノ酸配列）、または基準核酸配列（例えば、本明細書において記載される任意の１つの核酸配列）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を指す。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸レベルで少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％または８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超同一である。
【０１３３】
本開示は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キット、および組成物、ならびに病的な障害の治療における、薬剤としての、または処置に使用するための前記組成物の使用を対象とする。いくつかの実施形態において、本開示は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドおよび融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドはさらに、線維芽細胞増殖因子、血清アルブミン（serum album）、Ｆｃ、または他のポリペプチド、またはその活性断片もしくは変種を含む。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。他の実施形態において、融合体は、改変Ｆｃ（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）に融合したＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、またはＦＧＦ２３変種Ｒ１７９Ｑ）を含む。ＦｃＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃ断片であり、これはＡＤＣＣを誘発する効率が低下しており、ヒト補体に対する結合および活性化が弱い。Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインは、αまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏアイソフォームのいずれかに由来し得る。さらに、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドのＦＧＦ成分は、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２１、および線維芽細胞増殖因子２３に関連して主に記述されているが、公知の２３個のＦＧＦまたはその活性断片もしくは変種のいかなるものも、本開示の実践に使用することができると企図される。
【０１３４】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメインは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質のＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２ドメインの１つまたは両方を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインを有する。例えば、少なくとも２つの細胞外サブドメインは、少なくとも２つのＫＬ−Ｄ１ドメインのタンデムリピート、少なくとも２つのＫＬ−Ｄ２ドメインのタンデムリピート、または少なくとも１つのＫＬ−Ｄ１ドメインと少なくとも１つのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。
【０１３５】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインまたはその活性断片もしくは変種、および線維芽細胞増殖因子（またはその活性断片もしくは変種）は、多様な方向および方法で互いに作動可能に連結させることができる。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインを、線維芽細胞増殖因子のＮ末端に作動可能に連結させることができ、あるいは線維芽細胞増殖因子を、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインのＮ末端に作動可能に連結させることができる。
【０１３６】
本開示の融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン、すなわちＫＬ−Ｄ１（配列番号５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号６）の１つまたは両方を含み得る。ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２はそれぞれ、完全長のα−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸残基５８〜５０６位および５１７〜９５３位、ならびに完全長のβ−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド（配列番号４）のアミノ酸残基７７〜５０８位および５７１〜９６７位に対応し、本開示において使用するために適している。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するα−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドのＫＬ−Ｄ１ドメイン、または配列番号３７のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するβ−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドのＫＬ−Ｄ１ドメインを有し得る。具体的に、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、配列番号５または配列番号３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超同一であるアミノ酸配列を有し得る。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するα−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドのＫＬ−Ｄ２ドメイン、または配列番号３８のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するβ−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドのＫＬ−Ｄ２ドメインを有し得る。具体的に、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、配列番号６または配列番号３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、可溶性であり、ＦＧＦ受容体に結合することができる。
【０１３８】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、および（任意選択の）改変Ｆｃ断片を接続するポリペプチドリンカーを含有し得る。適したリンカーは当技術分野で周知であり、一般的に数個のＧｌｙと数個のＳｅｒ残基を含有し、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１１）、Ｇｌｙ４Ｓｅｒポリペプチド（配列番号１２）、Ｇｌｙ（配列番号１３）、ＧｌｙＧｌｙ（配列番号１４）、ＧｌｙＳｅｒ（配列番号１５）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ（配列番号１６）、Ａｌａ（配列番号１７）、およびＡｌａＡｌａ（配列番号１８）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列の少なくとも２から最大約３０リピートを有する。
【０１３９】
ポリペプチドリンカーが本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドに存在する場合、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドを、ペプチド結合によってポリペプチドリンカーのＣ末端に接続されたＦＧＦに、ペプチド結合によってリンカーポリペプチドのＮ末端に接続することができる。あるいは、ＦＧＦを、ペプチド結合によってポリペプチドリンカーのＣ末端に接続されたＫｌｏｔｈｏの少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドに、ペプチド結合によってリンカーポリペプチドのＮ末端に接続してもよい。２つのポリペプチドを連結させるために、化学リンカーもまた使用することができる。
【０１４０】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、シグナルペプチドを含み得る。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドと共に使用するための例としてのシグナルペプチドとしては、Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチド（配列番号８）およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号９）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、またはＦＧＦ２３変種Ｒ１７９Ｑ）と改変Ｆｃ（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）との融合体を提供する。融合体はまた、任意選択でＦＧＦとＦｃ部分の間にリンカーを含み得る。融合体はまた、任意選択でシグナルペプチドも含み得る。様々な実施形態において、本開示は、これらの融合ポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、およびこれらの核酸を含有する宿主細胞を包含する。
【０１４２】
４．１．Ｋｌｏｔｈｏおよび線維芽細胞増殖因子ポリペプチド
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ＦＧＦ受容体に対する結合、ならびにＦＧＦ受容体、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化の誘導、ならびにＥｇｒ−１（初期増殖応答−１）遺伝子の活性化などの、本質的にＦＧＦと同等の生物活性を示すと予想される。ＦＧＦは、ＦＧＦ受容体に結合する分泌型ペプチド増殖因子である。ＦＧＦのアミノ酸および核酸配列は、当業者に容易に入手可能である。例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３の例としてのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号：ＮＭ＿００５１１７、ＮＭ＿０１９１１３、およびＮＭ＿０２０６３８として、ならびに本明細書においてそれぞれ配列番号３０、３２および３４に見出され得る。ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３の例としてのアミノ酸配列（amino sequence）はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号：ＮＰ＿００５１０８、ＮＰ＿０６１９８６、およびＮＰ＿０６５６８９として、ならびに本明細書において配列番号３１、３５、および３５として見出され得る。加えて、ＦＧＦは、タンパク質の発現を助ける１つまたは複数の変更、例えばＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号３６）を含み得る。
【０１４３】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質は、細胞外ドメインと短い細胞質ドメインとを有する１３０ｋＤａのＩ型１回膜貫通型タンパク質である。Ｋｌｏｔｈｏのアミノ酸および核酸配列は、当業者に容易に入手可能である。例えば、α−Ｋｌｏｔｈｏおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏの例としてのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号ＮＭ＿００４７９５およびＮＭ＿１７５７３７として、ならびに本明細書において配列番号７および８として見出され得る。α−Ｋｌｏｔｈｏおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏの例としてのアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号ＮＰ＿００４７８６およびＮＰ＿７８３８６４として、ならびに本明細書において配列番号２および４として見出され得る。
【０１４４】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子受容体に結合することができ、線維芽細胞増殖因子１９（配列番号３１）、線維芽細胞増殖因子２１（配列番号３３）、および線維芽細胞増殖因子２３（配列番号３５）、もしくはその変種（線維芽細胞増殖因子２３変種（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号３６）を含む）のいずれかに作動可能に連結されたα−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインを有する。
【０１４５】
具体的には、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子２３（配列番号３５）、もしくは線維芽細胞増殖因子２３変種（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号３６）に作動可能に連結したα−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２）を含み得る。加えて、本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子１９（配列番号３１）に作動可能に連結されたβ−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号４）を有し得る。本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子２１（配列番号３３）に作動可能に連結されたβ−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号４）を含み得る。
【０１４６】
本開示は、様々なＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ遺伝子の相同体ならびにそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。遺伝子に関連する場合の「相同体」は、それが相同体である遺伝子によってコードされるタンパク質と実質的に同じ活性／機能を有するタンパク質をヌクレオチド配列がコードすることを条件として、遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖もしくはその一部に対して実質的に同一であるヌクレオチド配列を指す。本明細書に記述される遺伝子の相同体は、推定の相同体のアミノ酸またはヌクレオチド配列と、遺伝子またはそれらによってコードされるタンパク質の配列（例えば、ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列、またはその相補鎖）との間の％同一性によって同定することができる。パーセント同一性は、例えば、目視によってまたは当技術分野で公知のもしくは本明細書に記述される様々なコンピュータープログラムによって決定され得る。配列同一性は典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、および／または他の改変に割付することによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的アミノ酸置換は典型的に、以下の群の間の置換を含む：
グリシンおよびアラニン；
バリン、イソロイシン、およびロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；
セリンおよびトレオニン；
リジンおよびアルギニン；ならびに
フェニルアラニンおよびチロシン。
このため、グリシンをアラニンに変異させることは、保存的アミノ酸置換であり、アラニンをグリシンに変異させることも同様である；バリンをイソロイシンまたはロイシンに変異させることは、イソロイシンをバリンまたはロイシンに置換すること、ロイシンをバリンまたはイソロイシンに置換することと同様に、保存的アミノ酸置換である等である。本開示は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、本明細書に開示される全てのアミノ酸配列の変種を提供する。
同一性の程度を決定するための例としてのアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを使用してもよく、確率スコアがｅ−３からｅ−１００の間であることは、近縁の配列であることを示している。
【０１４７】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号１９の融合ポリペプチドを提供する。
【０１４８】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号２０の融合ポリペプチドを提供する。
【０１４９】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号４０の融合ポリペプチドを提供する。
【０１５０】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４１の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換（substition）を含むその変種を提供する。
【０１５１】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号４６の融合ポリペプチドを提供する。
【０１５２】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４７の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１５３】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号４８の融合ポリペプチドを提供する。
【０１５４】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号４９の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１５５】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号５０の融合ポリペプチドを提供する。
【０１５６】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５１の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１５７】
１つの実施形態において、本開示は、配列番号５２の融合ポリペプチドを提供する。
【０１５８】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５３の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１５９】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５４の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６０】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５５の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６１】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５６の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６２】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５７の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６３】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５８の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６４】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号５９の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６５】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６０の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６６】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６１の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６７】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６２の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６８】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６３の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１６９】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６４の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１７０】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６５の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１７１】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６６の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１７２】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６７の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１７３】
もう１つの実施形態において、本開示は、配列番号６８の融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むその変種を提供する。
【０１７４】
本明細書において使用される用語「相同性」および「相同な」は、理論的な共通の遺伝的祖先を有するタンパク質を示すことに限定されず、遺伝的に無関係であり得るが、それにもかかわらず、類似の機能を行うおよび／または類似の構造を有するように進化しているタンパク質を含む。本明細書に記述される様々なタンパク質に対する機能的相同性は、それが相同体である対応するタンパク質の活性を有するタンパク質も包含する。タンパク質が機能的相同性を有するためには、そのアミノ酸配列に有意な同一性を有する必要はなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質は、類似または同一の活性を有することによってそのように定義される。例えば、Ｋｌｏｔｈｏ分子に関して、ポリペプチドは、ＦＧＦポリペプチドに結合する機能的特徴を有しなければならず、ＦＧＦをＦＧＦＲに結合させることができなければならない。ＦＧＦ分子に関して、ポリペプチドは、ＦＧＦＲに結合して、ＦＧＦＲの活性化（例えば、リン酸化）を引き起こす機能的特徴を有しなければならない。ＦＧＦ受容体に対するＦＧＦの結合および／またはＦＧＦシグナル伝達経路の活性化を評価するアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記述される（実施例２を参照されたい）。Ｋｌｏｔｈｏ活性（例えば、ＦＧＦポリペプチドに対する結合）を評価するアッセイも同様に当技術分野で公知であり、本明細書に記述される。構造上の相同性を有するタンパク質は、類似の三次（または四次）構造を有するとして定義され、それらをコードする遺伝子のアミノ酸同一性または核酸同一性を必ずしも必要としない。特定の状況において、構造上の相同体は、タンパク質の活性部位または結合部位のみに構造上の相同性を維持するタンパク質を含み得る。
【０１７５】
構造上および機能的相同性に加えて、本開示はさらに、本明細書に記述される様々なＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性を有するタンパク質を包含する。２つのアミノ酸配列の％同一性／相同性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、もう１つのタンパク質のアミノ酸配列と最適に整列させるために、１つのタンパク質のアミノ酸配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。１つの配列での位置が他のアミノ酸の対応する位置で同じアミノ酸残基によって占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の％同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数に１００を乗じたもの）。
【０１７６】
本明細書に記載される本開示の分子のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超同一または相同であるアミノ酸配列を有する。
【０１７７】
本明細書において記載される本開示の分子の核酸配列は、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超同一もしくは相同であるヌクレオチド配列を有する。
【０１７８】
本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するために適切な核酸分子は、ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦをそれぞれコードする核酸分子の相補体とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦヌクレオチド配列を有し得る。本明細書において使用される用語「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％またはそれ超相同であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述すると意図される。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (2001), 6.3.1-6.3.6において見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特異的な非限定的な例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でのハイブリダイゼーションの後に、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での洗浄である。
【０１７９】
４．２．本開示のＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチド
本開示のいくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたはその活性断片もしくは変種の第一のポリペプチド配列と、ＦＧＦまたはその活性断片もしくは変種をコードする第二のポリペプチド配列とを有するポリペプチド鎖を有する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【０１８０】
本開示は、配列番号１９〜２８に表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％またはそれ超相同である融合ポリペプチドを含む。配列番号１９のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種（配列番号３６）のＮ末端に連結したＫｌｏｔｈｏ細胞外ドメインを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２０のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種のＮ末端に連結したシグナルペプチドを欠如するＫｌｏｔｈｏ細胞外ドメインのＮ末端に連結したＩｇＧシグナルペプチドを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種のＮ末端に連結したＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２２のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種のＮ末端に連結したＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２３のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種のＮ末端に連結した２つのＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種のＮ末端に連結した２つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２５のアミノ酸配列は、Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインのＮ末端に連結したＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２６のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインのＮ末端に連結したＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２７のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインのＮ末端に連結したＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２８のアミノ酸配列は、２つのＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインのＮ末端に連結したＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。配列番号２９のアミノ酸配列は、２つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインのＮ末端に連結したＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【０１８１】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。配列番号７のアミノ酸配列は、シグナルペプチドを欠如するＫｌｏｔｈｏ細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。
【０１８２】
対象の融合タンパク質は本明細書において記述され、当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。例えば、本開示の融合ポリペプチドは、米国特許第６，１９４，１７７号明細書に記述されるように構築され得る。Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドの使用は、米国特許第６，５７９，８５０号明細書に記述される。ＦＧＦ核酸分子の使用は、米国特許第７，２２３，５６３号明細書に記述される。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏをコードする核酸分子は、ＰＣＲによってクローニングされ、ＦＧＦをコードする核酸分子とインフレームでライゲートされる。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。融合ポリペプチドをコードする核酸を、発現させるためにプロモーターに作動可能に連結する。次に、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現のために宿主細胞にトランスフェクトする。最終構築物の配列は、シークエンシングによって確認することができる。
【０１８４】
本開示の融合タンパク質を調製する場合、Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインをコードする核酸分子を、ＦＧＦをコードする核酸分子、および（任意選択で）改変Ｆｃ断片をコードする核酸にインフレームで融合させる。得られた核酸分子を発現させると、ＦＧＦポリペプチドに対してＮ末端で融合されているＫｌｏｔｈｏの細胞外サブドメインが得られる。Ｋｌｏｔｈｏの細胞外サブドメインがＦＧＦポリペプチドに対してＣ末端で融合されている融合体もまた、可能である。融合タンパク質を作製する方法は当技術分野で周知である。
【０１８５】
本開示の融合ポリペプチドは、１つのポリペプチドが１つのタンパク質配列またはドメイン、例えばＫｌｏｔｈｏに由来し、他方のポリペプチドがもう１つのタンパク質配列またはドメイン、例えばＦＧＦに由来する、共有結合されている少なくとも２つのポリペプチドを有する。いくつかの実施形態において、融合体はさらに、Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む。もう１つの実施形態において、本開示は、改変Ｆｃ断片に融合したＦＧＦを含む。本開示の融合ポリペプチドの、Ｋｌｏｔｈｏおよび／またはＦＧＦおよび／または（任意選択で）改変Ｆｃ断片は、当業者に周知の方法によって結合させることができる。これらの方法は化学手段および組み換え手段の両方を含む。
【０１８６】
本開示の融合ポリペプチドに組み込まれるドメインをコードする核酸は、組み換え遺伝学の分野で慣例の技術を使用して得ることができる。本開示において使用するための一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)が挙げられる。本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする核酸において、配列番号１および配列番号３によってそれぞれ表されるα−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏをコードする核酸配列が使用され得る。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする核酸において、配列番号３０、配列番号３２、および配列番号３４によってそれぞれ表されるＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、またはＦＧＦ２３をコードする核酸配列が使用され得る。本明細書に記載される本開示の分子の核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号３４に対してハイブリダイズする、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超同一もしくは相同であるヌクレオチド配列を含む。
【０１８７】
融合体の様々な成分［Ｋｌｏｔｈｏ、および／またはＦＧＦペプチドおよび／または（任意選択で）改変Ｆｃ断片］をコードする核酸配列は、多様な任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列を、プローブとのハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリからクローニングしてもよく、またはオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅技術を使用して単離してもよい。より一般的には、増幅技術を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を使用してＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ配列を増幅および単離する（例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)を参照されたい）。あるいは、重なり合うオリゴヌクレオチドを合成によって産生して、結合させて、１つまたは複数のドメインを産生することができる。ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を使用する発現ライブラリから単離することもできる。
【０１８８】
本開示に従って、融合体の様々な成分［Ｋｌｏｔｈｏ、および／またはＦＧＦ、および／または（任意選択で）改変Ｆｃ断片］は、直接、またはポリグリシンリンカーなどのアミノ酸リンカー、もしくは炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばＰＥＧなどを含む任意のタイプの化学的リンカーを含む共有結合リンカーのいずれかを介して連結することができる（例えば、Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)を参照されたい）。融合体／融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは、典型的にＣ末端からＮ末端に連結されるが、それらはＣ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端で連結することもできる。１つまたは複数のポリペプチドドメインを、本開示の融合ポリペプチド内の内部位置に挿入してもよい。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であり得る。融合ポリペプチドは、１つのタンパク質配列、例えばＫｌｏｔｈｏの細胞外サブドメインからのアミノ酸の鎖を、もう１つのタンパク質配列、例えばＦＧＦからのアミノ酸の鎖に共有結合によって連結することによって、融合タンパク質をコードする組み換え型ポリヌクレオチドを隣接して調製することによって生成され得る。融合タンパク質におけるアミノ酸の異なる鎖を、共に直接スプライシングしてもよく、または化学連結基もしくはアミノ酸連結基を介して共に間接的にスプライシングしてもよい。アミノ酸連結基は、約２００アミノ酸長またはそれ超であり得て、一般的に１〜１００アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーによる有意な二次構造要素の形成を妨げるために、プロリン残基をリンカーに組み込む。リンカーはしばしば、組み換え型融合タンパク質の一部として合成されるフレキシブルなアミノ酸サブ配列であり得る。そのようなフレキシブルリンカーは、当業者に公知である。
【０１８９】
本開示に従って、融合体のアミノ酸配列［Ｋｌｏｔｈｏの細胞外サブドメイン、および／またはＦＧＦおよび／または（任意選択で）改変Ｆｃ断片］は、ペプチドリンカーによって連結され得る。例としてのペプチドリンカーは当技術分野で周知であり、本明細書に記述される。例えば、ペプチドリンカーは一般的に、数個のＧｌｙおよび数個のＳｅｒ残基を含み、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１１）、Ｇｌｙ４Ｓｅｒポリペプチド（配列番号１２）、Ｇｌｙ（配列番号１３）、ＧｌｙＧｌｙ（配列番号１４）、ＧｌｙＳｅｒ（配列番号１５）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ（配列番号１６）、Ａｌａ（配列番号１７）、およびＡｌａＡｌａ（配列番号１８）である。具体的に、本開示の融合タンパク質において使用するためのペプチドリンカーは、フレキシブルヒンジとして作用し得る。
【０１９０】
ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦのシグナル配列は、本開示の融合タンパク質にＫｌｏｔｈｏが組み込まれる前に除去され得る。融合タンパク質のＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦのシグナル配列、例えば配列番号１９によって表されるポリペプチドが含まれ得る。しかし、そのような配列もまた省略して、異なるタンパク質のシグナル配列、例えばＩｇＧシグナル配列（配列番号９）と置き換えてもよい。一般的に、本開示の医薬組成物は、ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦの成熟型を含有する。
【０１９１】
一般的に、融合ポリペプチドへの組み込みの前に、ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦ部分の１つまたは両方のいずれかからイントロンが除外される。
【０１９２】
本開示の融合ポリペプチドは、１つまたは複数の反応性のアミノ酸側鎖に共有結合されている１つまたは複数のポリマーを含み得る。限定ではなく例として、そのようなポリマーは、１つまたは複数の遊離のシステインスルフヒドリル残基に結合させることができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、それによってタンパク質が酸化状態に曝露される場合にジスルフィド結合の形成および凝集を遮断する。加えて、本開示の融合ポリペプチドのＰＥＧ化は、半減期、溶解度、およびプロテアーゼ抵抗性の増加などの改善された特性を提供すると予想される。あるいは、本開示の融合ポリペプチドは、リジンイプシロンまたはＮ末端アミノ基などの遊離のアミノ基にポリマーを共有結合によって付加することによって改変され得る。共有結合により改変するための特定の特異的システインおよびリジンは、受容体結合、ヘパリン結合、または適切なタンパク質のフォールディングに関係しない残基である。融合ポリペプチドの生化学および／または生物活性をアッセイする方法は、特定のアミノ酸残基の改変がタンパク質の活性に所望に影響を及ぼすか否かを決定するために使用され得ることは当業者に明白である。他の類似の適した改変が企図され、当技術分野において公知である。
【０１９３】
本開示はまた、配列番号１９〜２８に表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％またはそれ超相同である融合ポリペプチドの発現にも向けられる。
【０１９４】
本開示は、（ａ）Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン、またはその機能的活性変種もしくは誘導体を含むポリペプチド；（ｂ）線維芽細胞増殖因子、またはその機能的活性変種もしくは誘導体を含むポリペプチド；および（ｃ）Ｆｃ−γ受容体に対する親和性が減少したおよび／または血清中半減期が増加した改変Ｆｃ断片を含む融合ポリペプチドを包含する。「機能的活性変種またはその誘導体」とは、対応する野生型ポリペプチドより長い、より短い、または変化したアミノ酸配列を含むが、生物活性を保持している変種または誘導体を意味する。このため、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインまたは線維芽細胞増殖因子の「機能的活性変種または誘導体」は、野生型のＫｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外サブドメインまたは線維芽細胞増殖因子より短い、より長い、または変化したアミノ酸配列を含むが、なおも野生型ポリペプチド配列の少なくとも１つの生物活性を保持する。本明細書において開示されるポリペプチドの機能活性変異体または誘導体はまた、本明細書において開示されるポリペプチドの同じアミノ酸配列を含むが、翻訳後修飾（例えば、ｐｅｇ化、メチル化、および／またはグリコシル化）が異なり得る、またはそれに付加される追加の部分もしくは要素を有し得る。様々な実施形態において、ＦＧＦ２３の変種または誘導体はＲ１７９Ｑを含む、または含まない。
【０１９５】
１つの実施形態において、機能活性変種または誘導体ポリペプチドは、本明細書において開示される配列（例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメイン、または線維芽細胞増殖因子）と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドは、本明細書に開示される配列と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ超同一である。
【０１９６】
本明細書において使用されるように、２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の％同一性は、Karlin and Altschul（PNAS USA 90:5873-5877, 1993）によって改変されたKarlin and Altschulのアルゴリズム（PNAS USA 87:2264-2268, 1990）を使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al.(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２によって実行される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によって実行される。比較目的のためにギャップを加えたアライメントを得るために、Altschul et al.(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)によって記述されるＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用する。
【０１９７】
同一性または同一とは、アミノ酸配列（または核酸配列）類似性を意味し、当技術分野で認識された意味を有する。同一性を有する配列は、同一または類似のアミノ酸（または核酸）を共有する。したがって、候補配列が基準配列に対して８５％のアミノ酸配列同一性を共有するためには、候補配列を基準配列と整列させた後、候補配列におけるアミノ酸の８５％が基準配列における対応するアミノ酸と同一であること、および／または保存的アミノ酸変化を構成することが必要である。
【０１９８】
本明細書において開示されるポリペプチドの機能的活性変種は、当初のポリペプチドまたは断片と実質的に同じ機能的活性を保持する。対立遺伝子変種および種変種などの天然に存在する機能的活性変種、ならびに天然に存在しない機能的活性変種が本発明に含まれ、例えば変異誘発技術または直接合成によって産生することができる。
【０１９９】
機能的活性変種または誘導体は、本明細書に開示されるポリペプチドから、例えば約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ超のアミノ酸残基が異なる。この比較がアライメントを必要とする場合、最大の相同性が得られるように配列を整列させる。活性が本明細書に開示されるポリペプチドと実質的に類似である限り、ポリペプチドの任意の場所で変化部位が起こり得る。
【０２００】
表現型がサイレントなアミノ酸置換を有する変種および誘導体を作製する方法に関する指針は、Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)に提供されるが、この論文は、変化に対するアミノ酸配列の許容性を調べるために２つの主な戦略が存在することを教示している。
【０２０１】
第一の戦略は、進化のプロセスでの自然選択によるアミノ酸置換の許容性を利用する。異なる種のアミノ酸配列を比較することによって、種間で保存されているアミノ酸の位置を同定することができる。例えば図５を参照されたい。これらの保存されたアミノ酸はおそらく、タンパク質機能にとって重要である。これに対し、自然選択による置換が認容されているアミノ酸の位置は、タンパク質機能にとって重要ではない位置を示している。このため、アミノ酸置換を認容する位置は、ポリペプチドの特異的結合活性を依然として維持しつつ改変することができる。
【０２０２】
第二の戦略は、タンパク質機能にとって重要な領域を同定するために、クローニングされた遺伝子の特異的位置でアミノ酸の変化を導入するために遺伝子工学を利用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（分子におけるあらゆる残基での１アラニン変異の導入）を使用することができる（Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989)）。
【０２０３】
タンパク質のアミノ酸に変異を導入する方法は当業者に周知である。例えば、Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994)；T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。変異はまた、「QuikChange（商標）部位特異的変異誘発キット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販のキットを使用して導入することもできる。ポリペプチドの機能に影響を及ぼさないアミノ酸を置き換えることによる、ポリペプチドに対するポリペプチドの機能的活性変種もしくは誘導体の生成は、当業者によって達成され得る。
【０２０４】
変種または誘導体は、例えば１つまたは複数の保存的置換を有するが、それでもなお少なくとも１つの生物活性を保持することができる。保存的置換は、アミノ酸が、類似の特性を有するもう１つのアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学の分野における当業者により、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー上の性質が実質的に不変であると予想される。一般的に、以下の群のアミノ酸は、保存的変化を表す：（１）アラニン（ａｌａ）、プロリン（ｐｒｏ）、グリシン（ｇｌｙ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、アスパラギン酸（ａｓｐ）、グルタミン（ｇｌｎ）、アスパラギン（ａｓｎ）、セリン（ｓｅｒ）、トレオニン（ｔｈｒ）；（２）システイン（ｃｙｓ）、セリン（ｓｅｒ）、チロシン（ｔｙｒ）、トレオニン（ｔｈｒ）；（３）バリン（ｖａｌ）、イソロイシン（ｉｌｅ）、ロイシン（ｌｅｕ）、メチオニン（ｍｅｔ）、アラニン（ａｌａ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）；（４）リジン（ｌｙｓ）、アルギニン（ａｒｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）；および（５）フェニルアラニン（ｐｈｅ）、チロシン（ｔｙｒ）、トリプトファン（ｔｒｐ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）。
【０２０５】
特定の例としての変種および誘導体としては、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種および誘導体、例えばＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（例えば、配列番号５または６）の少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３７５、４００、または４２５個の連続アミノ酸を含み、野生型配列（配列番号５または６に開示される）からのアミノ酸残基の差がわずか約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、または６０個超に過ぎず、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持しているポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号５または６の少なくとも約４００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号５または６の少なくとも約４００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約５０個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号５または６の少なくとも約４２５個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約２５個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号５または６の少なくとも約４２５個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１０個に過ぎないポリペプチドを含む。もう１つの例において、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９２５、９５０、または９８２個の連続アミノ酸を含み、野生型配列からのアミノ酸残基の差がわずか約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約５００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約６００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約７００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約８００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約９００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約１００個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号７の少なくとも約９００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約５０個に過ぎないポリペプチドを含む。
【０２０６】
特定の例としての変種および誘導体としては、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種および誘導体、例えば線維芽細胞増殖因子、例えばＦＧＦ１９（配列番号３１）、ＦＧＦ２１（配列番号３３）、またはＦＧＦ２３（配列番号３５）の少なくとも約１００、１２５、１５０、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０個の連続アミノ酸残基を含み、野生型配列（配列番号３１、３３または３５に開示される）からのアミノ酸残基の差がわずか約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ超に過ぎず、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。様々な実施形態において、変種または誘導体は、Ｒ１７９Ｑ変種を含み得るが、含まなくてもよい。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号３１、３３、または３５の少なくとも約１５０個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約２５個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号３１、３３、または３５の少なくとも約１７５個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約２５個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号３１、３３、または３５の少なくとも約２００個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約２５個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種もしくは誘導体は、配列番号３５の少なくとも約２２５個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約５０個に過ぎないポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的活性変種または誘導体は、配列番号３５の少なくとも約２２５個の連続アミノ酸を含み、アミノ酸残基の差がわずか約２５個に過ぎないポリペプチドを含む。
【０２０７】
４．３．本開示の融合ポリペプチドの発現
本開示の融合タンパク質を発現させるために、本明細書に記述される任意の方法によって得た、または当技術分野で公知のＤＮＡ分子を、当技術分野で周知の技術によって適切な発現ベクターに挿入することができる。例えば、二本鎖ｃＤＮＡをホモポリマーテーリング、または合成ＤＮＡリンカーの使用を伴う制限酵素による連結、または平滑末端ライゲーションによって、適したベクターにクローニングすることができる。ＤＮＡリガーゼは通常、ＤＮＡ分子をライゲートするために使用され、アルカリホスファターゼによる処置によって望ましくない結合を回避することができる。
【０２０８】
したがって、本開示は、本明細書に記述される核酸分子（例えば、遺伝子または組み換え型核酸分子コード遺伝子）を含むベクター（例えば、組み換え型プラスミドおよびバクテリオファージ）を含む。用語「組み換え型ベクター」は、それが、組み換え型ベクターが由来するネイティブまたは天然の核酸分子に含まれる配列より長い、より短い、または異なる核酸配列を含有するように変更、改変、または操作されているベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、フォスミド、または他の精製核酸ベクター）を含む。例えば、組み換え型ベクターは、本明細書において定義される調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列、および／または人工のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結されたＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。その中に含まれる遺伝子または核酸の発現を可能にする組み換え型ベクターは、「発現ベクター」と称される。
【０２０９】
真核生物宿主に関して、宿主の性質に応じて、異なる転写および翻訳調節配列が使用され得る。それらは、調節シグナルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連しているアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルス等などのウイルス起源に由来し得る。例としては、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。遺伝子の発現を調節することができるように、抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択してもよい。
【０２１０】
本明細書に記述される本開示の分子のいくつかにおいて、融合ポリペプチドの１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のＤＮＡ分子を、所望のＤＮＡを宿主細胞に組み込むことができる１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結させる。導入されたＤＮＡによって安定に形質転換されている細胞を、例えば発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーを導入することによって、選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を、発現される核酸配列に直接連結することができ、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。追加の要素も同様に、本明細書に記述されるタンパク質の最適な合成にとって必要であり得る。いずれの追加の要素を使用するかは当業者に明らかであろう。
【０２１１】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要な要因としては、ベクターを含有するレシピエント細胞を、ベクターを含有しないレシピエント細胞から認識して選択する容易さ；特定の宿主において望ましいベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」することができることが望ましいか否かが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０２１２】
ベクターを、発現のためのＤＮＡ配列を含むように構築後、例えば、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野で公知の適した多様な１つまたは複数の方法によって適切な宿主細胞に導入することができる。
【０２１３】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであり得る。真核細胞宿主の例としては、例えば、ヒト、サル、マウス、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。そのような細胞は、例えば正確なフォールディングまたはグリコシル化を含む、タンパク質の翻訳後修飾を促進する。加えて、酵母細胞もまた、本開示の融合ポリペプチドを発現させるために使用することができる。ほとんどの哺乳動物細胞と同様に、酵母細胞もまた、例えばグリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を可能にする。酵母におけるタンパク質産生のために利用することができる強いプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する、多数の組み換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母の転写および翻訳機構は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識することができ、それによってリーダー配列を有するペプチド（すなわち、プレペプチド）の分泌を可能にする。本開示の融合ポリペプチドを高収率で産生する特定の方法は、米国特許第４，８８９，８０３号明細書に記述されるようにメソトレキセートの漸増レベルを使用することによる、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）増幅の使用を通してである。得られたポリペプチドは、グリコシル化状態であり得る。
【０２１４】
１つまたは複数のベクターの導入後、宿主細胞を、ベクター含有細胞の増殖に関して選択する選択培地において通常に増殖させる。組み換え型タンパク質の精製は、当技術分野で公知の、または本明細書に記述される任意の方法、例えば抽出、沈殿、クロマトグラフィー、および電気泳動を含む任意の従来の技法によって行うことができる。タンパク質を精製するために使用され得るさらなる精製技法は、標的タンパク質に結合するモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。一般的に、組み換え型タンパク質を含有する粗調製物を、適したモノクローナル抗体が固定されているカラムの中に通過させる。タンパク質は通常、特異的抗体を介してカラムに結合するが、不純物はその中を通過する。カラムの洗浄後、例えばｐＨまたはイオン強度を変化させることによって、タンパク質をゲルから溶出させる。
【０２１５】
４．４．融合ポリペプチドの活性を評価するアッセイ
本明細書に記述されるアッセイ（実施例２を参照されたい）および当技術分野で公知のアッセイは、本開示の融合ポリペプチドのＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦ活性を検出するために使用することができる。適した活性アッセイとしては、受容体結合アッセイ、細胞増殖アッセイ、および細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。例えば、融合ポリペプチドがＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦ活性を有するか否かを決定するために使用され得る結合アッセイは、ＦＧＦ受容体に対する融合ポリペプチドの結合をアッセイすることを含む。ＦＧＦ受容体結合アッセイとしては、競合アッセイおよび非競合アッセイの両方が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例えば、ＦＧＦ受容体結合は、ＦＧＦ受容体を発現する細胞に、標識されたＦＧＦ（例えば、放射活性標識）および漸増濃度の非標識Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチドを接触させることによって検出することができる。同じ受容体に対する結合に関して競合する２つのリガンドを、細胞を含有する反応混合物に添加する。次に、細胞を洗浄して、標識ＦＧＦを測定する。非標識融合ポリペプチドの存在下でその受容体に対する標識ＦＧＦの量が減少すれば、Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチドが受容体に結合したことを示している。あるいは、Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチドを標識してもよく、細胞に対する融合ポリペプチドの直接結合を検出する。
【０２１６】
ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦ活性はまた、融合ポリペプチドが細胞応答を誘発するか否かを決定することによっても測定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ融合ポリペプチドの生物活性を検出するアッセイは、ＦＧＦ受容体を発現する細胞に融合ポリペプチドを接触させること、例えば細胞増殖またはＥｇｒ−１活性化、Ｃ２Ｃ１２細胞における筋管直径などの細胞応答をアッセイすること、ならびに融合ポリペプチドの存在下および非存在下での細胞応答を比較することを伴う。非存在下と比較して融合ポリペプチド複合体の存在下で細胞応答が増加すれば、融合ポリペプチドが生物活性を有することを示している。同様に、受容体より下流のシグナル伝達事象の増加もまた、生物活性（例えば、ＦＧＦＲ、ＦＲＳ２、ＥＲＫ１／２、ｐ７０Ｓ６Ｋ等のリン酸化など）の指標として測定することができる。
【０２１７】
４．５．医薬組成物および処置方法
本開示はまた、本開示の１つまたは複数の融合ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含有する医薬組成物にも関する。医薬組成物はさらに、ヘパリンの薬学的有効量を含み得る。そのような医薬組成物は、キットまたは容器に含めてもよい。そのようなキットまたは容器は、融合ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効期限がより長いことに関する説明書と共に包装されてもよい。任意選択で、そのようなキットまたは容器には、ヒトに投与するための製造、使用、または販売が当局によって承認されたことを反映する、薬剤または生物製剤の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって規定される形態での注意書きを添付することができる。そのような組成物は、本開示のポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含む医薬組成物を患者に投与することによって、患者、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトにおける疾患または疾患の症状（例えば、加齢関連状態または代謝障害）を処置、予防、または改善する方法において使用され得る。
【０２１８】
一般的に、本開示の医薬組成物の治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００１ｍｇ／ｋｇ；０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的に、融合ポリペプチドの治療有効量は、例えば約０．００１ｍｇ〜約０．０１ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇである。好ましくは、融合ポリペプチドの治療有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇである。
【０２１９】
融合ポリペプチドの最適な医薬製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて、当業者が決定することができる。（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.を参照されたい）。
【０２２０】
本開示の融合ポリペプチドは、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る医薬組成物として投与され得る。典型的な投与経路としては、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、皮内、および鼻腔内が挙げられ得るがこれらに限定されるわけではない。非経口投与としては、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、胸骨内の注射または注入技術が挙げられる。好ましくは、組成物は非経口投与される。より好ましくは、組成物は静脈内投与される。本開示の医薬組成物は、対象に組成物を投与した場合に、本開示のポリペプチドが生物学的に利用可能となるように製剤化することができる。組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態をとり、例えば錠剤は１つの投与単位であり得て、エアロゾル形態の本開示のポリペプチドの容器は複数の投与単位を保持することができる。
【０２２１】
医薬組成物の調製に使用される材料は、使用される量で非毒性であり得る。医薬組成物中の活性成分の最適な投与量は、多様な要因に依存することは当業者に明らかである。関連する要因としては、対象のタイプ（例えば、ヒト）、対象の全身健康状態、処置を必要とする対象の加齢関連状態または代謝障害のタイプ、多剤レジメンの一部としての組成物の使用、本開示のポリペプチドの特定の形態、投与方法、および使用される組成物が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２２】
薬学的に許容される担体またはビヒクルは微粒子であり得て、組成物は例えば錠剤または散剤の形態である。担体は液体であり得て、組成物は例えば経口シロップまたは注射可能液である。加えて担体は気体状であり得て、例えば吸入投与において有用なエアロゾル組成物を提供する。
【０２２３】
用語「担体」は、本開示のポリペプチドがそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む、水および油などの液体であり得る。担体は、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等であり得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。１つの実施形態において、対象に投与する場合、本開示のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体は無菌である。水は、本開示のポリペプチドが静脈内投与される場合の特定の担体である。食塩水溶液およびデキストロース水溶液、およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。適した薬学的担体はまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等などの賦形剤を含む。本発明の組成物は、望ましければ、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。
【０２２４】
組成物は、経口投与のために意図され、そのような場合、組成物は好ましくは固体または液体形態であり、半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態は、固体または液体のいずれかとして本明細書に考慮される形態に含まれてよい。
【０２２５】
経口投与のための固体組成物として、組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、チューインガム、ウェーハまたはその他の形態に製剤化することができる。そのような固体組成物は典型的に、１つまたは複数の不活性な希釈剤を含有する。加えて、以下の１つまたは複数が存在し得る：エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトースまたはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ等などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの着香料；ならびに着色剤。
【０２２６】
医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、これは、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油などの液体担体を含有し得る。
【０２２７】
医薬組成物は、液体形態、例えばエリキシル剤、シロップ剤、水剤、乳剤、または懸濁剤であり得る。液剤は、経口投与にとって、または注射による送達にとって有用であり得る。経口投与が意図される場合、組成物は、甘味料、保存剤、色素／着色料、および香味剤の１つまたは複数を含有し得る。注射による投与のための組成物において、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定化剤、および等張剤の１つまたは複数も同様に含めることができる。
【０２２８】
本開示の液体組成物は、それらが水剤、懸濁剤、または他の同様の形態であるか否かによらず、以下の１つまたは複数を含み得る：注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁剤として作用し得る合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。非経口組成物は、ガラス、プラスチック、または他の材料製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量（multiple-dose）バイアルに封入することができる。生理食塩水は特に明確な補助剤である。注射可能組成物は好ましくは無菌的である。
【０２２９】
医薬組成物は、適した投与量が得られるように、本開示の化合物（例えば、融合ポリペプチド）の有効量を含有する。医薬組成物は、そのそれぞれの障害に関して現在処方されている化合物の公知の有効量を含有し得る。
【０２３０】
加齢関連状態または代謝障害の予防、処置、および／または管理において有効である予防的および／または治療的レジメンにおいて使用される本開示のポリペプチドの投与経路は、当技術分野で公知の他の治療剤に関して現在規定されている投与経路に基づき得る。本開示のポリペプチドは、任意の簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通しての吸収によって投与することができる。投与は全身または局所であり得る。様々な送達系、例えば微粒子、マイクロカプセル、カプセル等が公知であり、本開示のポリペプチドを投与するために有用であり得る。本開示の１超のポリペプチドを対象に投与してもよい。投与方法としては、経口投与および非経口投与が挙げられ得るがこれらに限定されるわけではない；非経口投与としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、脳室内、髄腔内、膣内、経皮、直腸内、吸入、または耳、鼻、眼、もしくは皮膚への局所投与が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０２３１】
本開示のポリペプチドは非経口投与され得る。具体的には、本開示のポリペプチドは静脈内投与され得る。
【０２３２】
肺内投与もまた、例えばインヘラーもしくはネブライザー、およびエアロゾル化剤による製剤の使用、またはフルオロカーボンもしくは合成肺内界面活性剤の灌流によって使用することができる。本開示のポリペプチドはまた、通常の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を有する坐剤としても製剤化することができる。
【０２３３】
本開示のポリペプチドは、制御放出系で送達することができる。例えば、ポンプを使用することができる（Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201；Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507；Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574を参照されたい）。ポリマー材料もまた、本開示のポリペプチドの制御放出のために使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984；Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61; see also Levy et al., Science 1985, 228, 190；During et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105を参照されたい）。具体的には、制御放出系を、本開示のポリペプチドの標的、例えば全身用量（systemic dose）のごく一部の分画を必要とする脳の近位に配置することができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1984, pp. 115-138）を参照されたい。Langerの論評（Science 1990, 249, 1527-1533）で検討されている他の制御放出系を使用することができる。
【０２３４】
本開示のポリペプチドの制御または持続的放出を達成するために使用されるポリマー材料は、例えば米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第９９／１５１５４号パンフレット；およびＰＣＴ出願国際公開第９９／２０２５３号パンフレットに開示されている。持続的放出製剤において使用されるポリマーの例としては、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。好ましくは、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、溶出可能な不純物を含まず、保存時に安定で、無菌的で、および生分解性である。
【０２３５】
一般的に、本開示の医薬組成物の治療有効量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００１ｍｇ／ｋｇ；０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２３６】
他の実施形態において、予防および／または治療レジメンは、本開示のポリペプチドの有効量の１つまたは複数の用量（dose）を患者に投与することを含み、有効量（effective amount）の用量は、本開示のポリペプチドの少なくとも０．０１μｇ／ｍＬ〜少なくとも約４００μｇ／ｍＬの血漿中レベルを達成する。
【０２３７】
予防および／または治療レジメンは、本開示のポリペプチドの有効量の複数の用量を患者に投与することを含み、複数の用量は、本開示のポリペプチドの少なくとも０．０１μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬの血漿中レベルを維持する。予防および／または治療レジメンは、少なくとも１日、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月または９か月の間投与され得る。
【０２３８】
予防および／または治療レジメンは、１つまたは複数の追加の治療剤と併用して本開示のポリペプチドの投与を伴い得る。加齢関連状態または代謝障害の予防、処置、および／または管理のために現在使用される１つまたは複数の治療剤の推奨される用量は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; Physician’s Desk Reference (60th ed., 2006)が挙げられるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野における任意の参考文献から得ることができる。
【０２３９】
本開示は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質およびＦＧＦのアゴニスト活性が望ましい障害を処置する方法を含む。本開示はさらに、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質およびＦＧＦのアゴニスト活性が望ましい病的な障害の治療における、または処置のための薬剤としての、本開示のタンパク質、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物の使用を含む。本開示のそのような方法または使用の例としては、加齢関連状態または代謝障害が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０２４０】
本開示は、個体における加齢関連状態の処置または予防方法、ならびに個体における加齢関連状態の治療における、または処置もしくは予防するための薬剤としての、本開示のタンパク質（ポリペプチド）、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物の使用を含む。処置を必要とする個体は、加齢関連状態を処置または予防するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ヘパリンの薬理学的有効量と共に同時投与される。加齢関連状態としては、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢関連黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢関連難聴が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含有する。特定の実施形態において、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインと線維芽細胞増殖因子２３とを含有するＫｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、筋消耗の処置を必要とする個体に投与される。
【０２４１】
本開示はまた、個体における代謝障害を処置または予防する方法、および個体における代謝障害の治療における、または処置もしくは予防するための薬剤としての、本開示のタンパク質（ポリペプチド）、融合タンパク質（ポリペプチド）、核酸分子、または医薬組成物の使用にも向けられる。処置を必要とする個体は、代謝障害を処置するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）ＦｃＲｎに対する結合が減少したおよび／または血清中半減期および／または安定性が増加した改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ヘパリンの薬理学的有効量と同時投与される。この方法は、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満の処置または予防において使用され得る。特定の実施形態において、β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインと線維芽細胞増殖因子２１とを含有するＫｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、代謝障害の処置を必要とする個体に投与される。
【０２４２】
本開示はまた、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防する方法、および個体における高リン血症または石灰沈着症の治療における、または処置もしくは予防するための薬剤としての、本開示のタンパク質、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物の使用を提供する。処置を必要とする個体は、高リン血症または石灰沈着症を処置するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ヘパリンの薬理学的有効量と同時投与される。特定の実施形態において、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインと、線維芽細胞増殖因子２３と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを含有するＫｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、高リン血症または石灰沈着症の処置を必要とする個体に投与される。
【０２４３】
本開示はまた、個体における慢性腎疾患または慢性腎不全を処置または予防する方法、ならびに個体における慢性腎疾患または慢性腎不全の治療における、または処置もしくは予防するための薬剤としての、本開示のタンパク質、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物の使用を対象とする。処置を必要とする個体は、慢性腎疾患または慢性腎不全を処置するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ヘパリンの薬理学的有効量と同時投与される。いくつかの実施形態において、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含有するＫｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、慢性腎疾患または慢性腎不全の処置を必要とする個体に投与される。
【０２４４】
本開示はまた、個体におけるがんを処置または予防する方法、ならびに個体におけるがんの治療における、または処置もしくは予防するための薬剤としての、本開示のタンパク質、融合タンパク質、核酸分子、または医薬組成物の使用を提供する。処置を必要とする個体は、がんを処置するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、ヘパリンの薬理学的有効量と同時投与される。いくつかの実施形態において、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含有するＫｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、がんの処置を必要とする個体に投与される。
【０２４５】
Ｋｌｏｔｈｏ変種もしくはＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与することによって障害を処置する方法において、またはＫｌｏｔｈｏ変種もしくはＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物を治療に使用する場合、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドおよび（任意選択で）改変Ｆｃ断片は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと線維芽細胞増殖因子を有する。特定の実施形態において、Ｋｌｏｔｈｏ融合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインと、線維芽細胞増殖因子２１とを含有する。
【０２４６】
もう１つの実施形態において、融合体は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、またはＦＧＦ２３変種）と、ＦｃＲｎに対する結合が減少したおよび／または血清中の安定性が増加した改変Ｆｃ断片とを含む。このタイプの融合体は、上記の様々な疾患に使用することができ、または当技術分野で公知の任意のＦＧＦ関連疾患を処置もしくは予防するために使用することができる。融合体は、それを必要とする個体に投与することができる。
【０２４７】
融合ポリペプチド組成物は、当業者に公知のおよび本明細書に記述される任意の投与方法に従って投与することができる。特に明確な投与方法は皮下または静脈内を含む。他の有効な投与方法は、本明細書に記述される。
【０２４８】
４．６．処置の方法および有効性を評価するアッセイ
本明細書に記述される融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、加齢関連障害または代謝障害を含む多様な障害を処置するために使用することができる。いかなる特定の理論にも限定されないが、融合ポリペプチドは、ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦの調節障害が存在する障害を処置するために使用され得る。例としての障害としては、代謝障害および加齢関連障害が挙げられる。例えば、ＦＧＦ２３またはＫｌｏｔｈｏノックアウトマウスはいずれも、低い身体活動、成長遅延、筋消耗、皮膚萎縮、アテローム性動脈硬化症、短い寿命などを含む多様な類似の表現型を示す（参照により本明細書に組み込まれている、Razzaque and Lanske, J. of Endrocrinology, 194:1-10 (2007)を参照されたい）。
【０２４９】
特に、本開示の融合ポリペプチドは、筋消耗を含む加齢関連障害の処置において特に有用である。理論に拘束されたくはないが、ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３がミネラル（例えば、リン酸塩およびカルシウム）およびビタミンＤ恒常性を制御できることは、これらのタンパク質が加齢および筋萎縮を調節する手段であり得る。
【０２５０】
一方で、本開示の融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために使用され得る。例えば、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ１９は、コレステロール７−α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）を調節することによって胆汁酸恒常性を制御することが示されている。胆汁酸恒常性障害の非限定的な例は、胆汁うっ滞である。β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２１は、脂肪細胞における脂肪分解を誘発し、それによって脂肪貯蔵を低減させて、グルコース取り込みを増加させることが示されている。脂肪分解／脂肪貯蔵障害の非限定的な例は、肥満ならびに関連する代謝および心血管疾患である。
【０２５１】
ＦＧＦ２３が尿へのリン酸塩の排泄を刺激し、それによって血清中のリン酸塩レベルを低減させることができるという知見に少なくとも部分的に基づき、本開示のＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために使用することができる。例えば、患者においてＫｌｏｔｈｏの欠損が起こるＫｌｏｔｈｏのホモ接合ミスセンス変異は、重度の腫瘍性石灰沈着症および動脈石灰化を引き起こし得ることが示されている（参照により本明細書に組み込まれている、Ichikawa et al., J. Clin. Invest. 117:2684-2691 (2007)）。個体は、高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。特に、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを含有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、高リン血症または石灰沈着症を処置するために有用である。
【０２５２】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドはまた、個体における慢性腎疾患または慢性腎不全を処置または予防するために使用することができる。例えば、Ｋｌｏｔｈｏ発現は、非罹患腎臓と比較して、慢性腎不全の患者の腎臓では低減することが示されている（参照により本明細書に組み込まれている、Koh et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1015-1020 (2001)）。個体は、慢性腎疾患または慢性腎不全を処置または予防するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与する。特に、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインまたはその変種を含有するＫｌｏｔｈｏポリペプチドまたはＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、慢性腎疾患または慢性腎不全を処置するために有用である。
【０２５３】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドはまた、個体におけるがんを処置または予防するために使用することができる。例えば、Ｋｌｏｔｈｏ発現は、正常な乳がん組織（normal breast cancer tissue）と比較して、乳がん組織では低減することが示されている（参照により本明細書に組み込まれている、Wolf et al., Oncogene (2008) advance online publication）。個体は、がんまたは乳がんを処置または予防するために、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインと、線維芽細胞増殖因子と、（任意選択で）改変Ｆｃ断片とを有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物の薬理学的有効量を投与される。特に、α−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、がんまたは乳がんを処置するために有用である。
【０２５４】
加齢関連障害または代謝障害に対する本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの有効性を評価する、および／または有効量を決定する方法は、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、または他のいくつかの非ヒト）または他の動物（例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、またはハエもしくは線虫などの他の無脊椎動物）を使用する生物に基づくアッセイを含む。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、生物に１回、またはレジメンとして（規則的または不規則に）投与することができる。次に、生物のパラメータ、例えば加齢関連パラメータを評価する。目的のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドによって、基準の、例えば対照生物のパラメータと比較してパラメータの変化が起こる。他のパラメータ（例えば、毒性、クリアランス、および薬物動態に関連する）も同様に評価することができる。
【０２５５】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドは、特定の障害、例えば本明細書に記述される障害、例えば加齢関連障害、代謝障害を有する動物を使用して評価され得る。これらの障害はまた、生理に対する試験ポリペプチドの効果を観察することができる感受性のある系を提供することができる。例としての障害としては：除神経、廃用性萎縮、代謝障害（例えば、肥満障害および／またはｄｂ／ｄｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスなどの糖尿病動物）；脳、肝臓の虚血；シスプラチン／タキソール／ビンクリスチンモデル；様々な組織（異種移植）移植；トランスジェニック骨モデル；疼痛症候群（炎症および神経障害性の障害を含む）；パラコート、遺伝毒、および酸化的ストレスモデル；ならびに腫瘍Ｉモデルが挙げられる。
【０２５６】
加齢関連障害を測定するために、動物モデルは、カロリーを制限されると、変化した表現型を有する動物であり得る。例えば、Ｆ３４４ラットは、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを評価するための有用なアッセイ系を提供する。カロリーを制限されると、Ｆ３４４ラットは、０〜１０％のネフロパシー発生率を有する。しかし、自由に飼料を与えると、それらは６０〜１００％のネフロパシー発生率を有する。
【０２５７】
本開示のＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを評価するために、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを動物（例えば、Ｆ３４４ラットまたは他の適した動物）に投与して、動物のパラメータを、例えば一定期間後に評価する。動物に、飼料を自由にまたは通常に（例えば、カロリー制限下ではないが、いくつかのパラメータをそのような状態で評価することができる）与えることができる。典型的には、そのような動物のコホートをアッセイに使用する。一般的に、試験ポリペプチドが、類似の動物対象の表現型のパラメータをカロリー制限に向かう方向に影響を及ぼす場合、試験ポリペプチドは、動物における寿命の調節を有利に変化させると示され得る。そのような試験ポリペプチドは、生物のカロリー摂取を低下させる必要なく、カロリー制限の寿命調節効果の少なくとも一部、例えばそのような効果のサブセットを引き起こし得る。
【０２５８】
試験されるパラメータは、加齢関連または疾患関連パラメータ、例えば動物モデルに関連する障害の症状であり得る。例えば、試験ポリペプチドをＳＨラットに投与することができ、血圧をモニターする。好ましいことが示される試験ポリペプチドは、ポリペプチドで処置していない類似の参照動物と比較して症状の改善を引き起こすことができる。障害または加齢に関連する他のパラメータとしては、抗酸化剤レベル（例えば、抗酸化剤の酵素レベルまたは活性）、ストレス抵抗性（例えば、パラコート抵抗性）、中核温、グルコースレベル、インスリンレベル、甲状腺刺激ホルモンレベル、プロラクチンレベル、および黄体形成ホルモンレベルが挙げられ得る。
【０２５９】
加齢関連障害を処置するための本開示のポリペプチドの有効性を測定するために、Ｋｌｏｔｈｏ発現が減少した動物、例えば変異体Ｋｌｏｔｈｏを有するマウスを使用してもよい；その両方の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kuroo, et al. Nature, 390; 45 (1997)および米国特許出願第２００３／０１１９９１０号明細書を参照されたい。例えば、試験ポリペプチドを変異体マウスに投与して、加齢関連パラメータをモニターする。好ましいことが示される試験ポリペプチドは、ポリペプチドによって処置されていない類似の参照動物と比較して症状の改善を引き起こし得る。代謝障害または加齢に関連するパラメータは、体重、生殖能の獲得に関する検査、血糖値の測定、寿命の観察、皮膚の観察、歩行などの運動機能の観察等によって評価することができる。評価はまた、胸腺重量の測定、胸腔の内表面に形成された石灰化した結節のサイズの観察等によっても行うことができる。さらに、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子のｍＲＮＡまたはＫｌｏｔｈｏタンパク質の定量的決定もまた、評価にとって有用である。
【０２６０】
なお他のｉｎ  ｖｉｖｏモデルおよび生物アッセイとしては、代謝パラメータ、例えばインスリン障害、ＩＩ型糖尿病に関連するパラメータに関して動物を評価することが挙げられる。例としての代謝パラメータとしては、グルコース濃度、インスリン濃度、およびインスリン感受性が挙げられる。
【０２６１】
もう１つの例としてのシステムは、例えば動物モデルでの腫瘍を特徴とする。腫瘍は、自然発生または誘導型であり得る。例えば、腫瘍は、多様な遺伝的構成を有する、例えばｐ５３＋またはｐ５３−であり得る細胞から発生し得る。同様に、自己免疫障害を有する生物（organisms that an autoimmune disorder）、例えばＳＬＥに対して素因を有するＮＺＢマウスを使用することも可能である。骨疾患の特徴を評価するために、例えば、骨粗鬆症のモデルとして、例えば卵巣切除術を受けた動物を使用することが可能である。同様に、関節疾患に関して、モデルは、アジュバント関節炎（例えば、マウスを軟骨プロテオグリカン、高移動度群タンパク質、ブドウ球菌細胞壁材料、またはコラーゲンによって免疫することができる）に基づくことができる；腎疾患に関しては、ｋｄ／ｋｄマウスを使用することができる。認知、特に学習および記憶に関する動物モデルも同様に利用可能である。糖尿病およびその合併症の動物モデル、例えばストレプトゾトシンモデルも同様に利用可能である。卒中および虚血を評価するために、イヌのモデルを使用することができる。
【０２６２】
試験ポリペプチドが寿命の調節を変化させることができるか否かを評価するために、多数の加齢関連パラメータまたはバイオマーカーをモニターまたは評価することができる。例としての加齢関連パラメータとしては、（ｉ）細胞または生物の寿命；（ｉｉ）細胞または生物における、生物学的年齢依存的発現パターンを有する遺伝子転写物または遺伝子産物の存在または量；（ｉｉｉ）ストレスに対する細胞または生物の抵抗性；（ｉｖ）細胞または生物の１つまたは複数の代謝パラメータ（例としてのパラメータは、血中のインスリンレベル、血糖値、脂肪含有量、中核温などを含む）；（ｖ）生物に存在する細胞または細胞の組の増殖能；ならびに（ｖｉ）細胞または生物の物理的外観または行動が挙げられる。
【０２６３】
用語「平均寿命」は、生物のコホートの死亡年齢の平均値を指す。いくつかの場合、「平均寿命」は、制御された環境条件で遺伝的に同一の生物のコホートを使用して評価される。災難による死亡は廃棄する。平均寿命（例えば、ヒトの）を制御された環境条件で決定することができない場合、十分に大きい集団の信頼できる統計学的情報（例えば、保険数理表）を平均寿命として使用することができる。
【０２６４】
２つのそのような生物、例えば１つの参照生物とＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドで処置した１つの生物との間の分子の差の特徴付けを行うと、生物の生理的状態の差を明らかにすることができる。参照生物と試験生物は典型的に同じ暦年齢である。本明細書において使用される用語「暦年齢」とは、受胎、定義された胎生もしくは胎児期、またはより好ましくは出生などの予め選択された事象からの経過時間を指す。多様な基準を使用して、生物が、比較分析のために「同じ」暦年齢の生物であるか否かを決定することができる。典型的に、必要とされる精度の程度は、野生型生物の平均寿命に応じて変化する。例えば、線虫であるＣ．エレガンス（C. elegans）に関して、研究室での野生型株Ｎ２は、いくつかの制御された条件では平均約１６日生存し、同じ日齢の生物は同じ日数生存し得る。マウスに関して同齢の生物は、同じ週数または月数生存し得る。霊長類またはヒトに関しては、同じ年数（または２年、３年、または５年以内）等生存し得る。一般的に、同じ暦年齢の生物は、その種の野生型生物の平均寿命の１５、１０、５、３、２または１％以内の期間生存し得る。好ましくは、生物は成体生物であり、例えば生物は、少なくとも、平均的な野生型生物が繁殖適齢期に成熟するまでの期間生存している。
【０２６５】
生物が加齢の明白な身体的特徴を示す前に、生物のスクリーニングアッセイを実施することができる。例えば、生物は、同じ種の野生型生物の平均寿命のわずか１０、３０、４０、５０、６０、または７０％生存した成体であってもよい。代謝、免疫能、および染色体構造の加齢関連変化が報告されている。これらの変化のいずれも、試験対象（例えば、生物に基づくアッセイ）または患者（例えば、本明細書に記述される治療物質による処置の前、間、または後）に関して評価することができる。
【０２６６】
カロリー制限に関連するマーカーもまた、スクリーニングアッセイの対象生物（または処置された対象）において評価することができる。これらのマーカーは、加齢関連でなくてもよいが、それらはＫｌｏｔｈｏ経路が調節されると変化する生理的状態を示し得る。マーカーは、その量がカロリー制限動物において変化するｍＲＮＡまたはタンパク質であり得る。国際公開第０１／１２８５１号パンフレットおよび米国特許第６，４０６，８５３号明細書は、例としてのマーカーを記述している。本明細書に記述される動物の細胞に由来する、または本明細書に記述される動物モデルと類似の細胞モデルを、細胞ベースのアッセイに使用することができる。
【０２６７】
筋萎縮に対する試験ポリペプチドの効果を評価するモデルとしては、１）例えば大腿中部で右坐骨神経を切断することによる除神経に起因するラット内側腓腹筋の筋肉量の減少；２）例えば、右足首を９０度の屈曲位で固定することによる、不動に起因するラット内側腓腹筋の筋肉量の減少；３）後肢懸垂に起因するラット内側腓腹筋の筋肉量の減少（例えば、米国特許出願第２００３−０１２９６８６号明細書を参照されたい）；４）カヘキシアサイトカインであるインターロイキン−１（ＩＬ−１）による処置に起因する骨格筋萎縮（R. N. Cooney, S. R. Kimball, T. C. Vary, Shock 7, 1-16 (1997)）；および５）グルココルチコイドであるデキサメタゾンによる処置に起因する骨格筋萎縮（A. L. Goldberg, J. Biol. Chem. 244, 3223-9 (1969)）が挙げられる。
【０２６８】
例としてのＡＭＤの動物モデルとしては、滲出性（滲出性）黄斑変性を模倣するレーザー誘発マウスモデル（Bora et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100:2679-84 (2003)）；ＡＭＤの「萎縮型」に関連する特徴が起こる、カテプシンＤの変異型を発現するトランスジェニックマウス（Rakoczy et al., Am. J. Pathol., 161:1515-24 (2002)）；およびＣＮＶが起こる、網膜色素上皮においてＶＥＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウス（Schwesinger et al., Am. J. Pathol. 158:1161-72 (2001)）が挙げられる。
【０２６９】
パーキンソン病の例としての動物モデルとしては：ドーパミン作動性神経毒である１−メチル−４−フェニル  １，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）による処置によってパーキンソン病にした霊長類（例えば、米国特許出願第２００３００５５２３１号明細書およびWichmann et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:199-213 (2003)）；６−ヒドロキシドーパミン病変ラット（例えば、Lab. Anim. Sci.,49:363-71 (1999)）；およびトランスジェニック無脊椎動物モデル（例えば、Lakso et al., J. Neurochem. 86:165-72 (2003)およびLink, Mech. Ageing Dev., 122:1639-49 (2001)）が挙げられる。
【０２７０】
ＩＩ型糖尿病の例としての分子モデルとしては：Ｎｋｘ−２．２またはＮｋｘ−６．１を欠損するトランスジェニックマウス（米国特許第６，１２７，５９８号明細書）；Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ｆａ／ｆａ（ＺＤＦ）ラット（米国特許第６，５６９，８３２号明細書）；および自然に肥満を発症し、その後しばしば明白な２型糖尿病へと進行するアカゲザル（Hotta et al., Diabetes, 50:1126-33 (2001)）；ならびに２型糖尿病様インスリン抵抗性を有するドミナント−ネガティブＩＧＦ−Ｉ受容体（ＫＲ−ＩＧＦ−ＩＲ）を有するトランスジェニックマウスが挙げられる。
【０２７１】
例としての神経障害の動物および細胞モデルとしては：マウス（米国特許第５，４２０，１１２号明細書）またはウサギ（Ogawa et al., Neurotoxicology, 21:501-11 (2000)）におけるビンクリスチン誘発知覚−運動神経障害；自律神経障害の試験のためのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）−糖尿病ラット（Schmidt et al., Am. J. Pathol., 163:21-8 (2003)）；ならびに進行性運動神経障害（ｐｍｎ）マウス（Martin et al., Genomics, 75:9-16 (2001)）が挙げられる。
【０２７２】
高リン血症または腫瘍性石灰沈着症の例としての動物モデルとしては、ＫｌｏｔｈｏノックアウトマウスおよびＦＧＦ２３ノックアウトマウス（Yoshida et al., Endocrinology 143:683-689 (2002)）が挙げられる。
【０２７３】
慢性腎疾患または慢性腎不全の例としての動物モデルとしては、ＣＯＬ４Ａ３＋／−マウス（Beirowski et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994 (2006)）が挙げられる。
【０２７４】
例としてのがんの動物モデルとしては、当技術分野で公知のヌードマウスへのがん細胞または組織の移植または植え込みが挙げられる（Giovanella et al., Adv. Cancer Res. 44:69-120 (1985)）。例えば、乳がんの動物モデルとしては、乳がん細胞または組織を移植または植え込んだヌードマウス（例えば、Yue et al., Cancer Res. 54:5092-5095 (1994)；Glinsky et al., Cancer Res. 56:5319-5324 (1996); Visonneau Am. J. Path. 152:1299-1311 (1998)）が挙げられる。
【０２７５】
組成物は、対象、例えば成体対象、特に健康な成体対象または加齢関連疾患を有する対象に投与され得る。後者の場合、この方法は、例えば、加齢関連疾患の症状または他の疾患マーカーを特徴付けするために対象を評価し、それによって対象を、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病もしくは加齢関連疾患を有する、またはそのような疾患に対して素因を有すると同定することを含み得る。
【０２７６】
骨格筋萎縮
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、骨格筋萎縮を処置するために使用することができる。筋萎縮としては、多数の神経筋、代謝、免疫、および神経の障害および疾患、ならびに飢え、栄養欠乏、代謝ストレス、糖尿病、加齢、筋ジストロフィー、またはミオパシーが挙げられる。筋萎縮は加齢プロセスの際に起こる。筋萎縮はまた、筋肉の使用の低減または廃用に起因する。症状は、骨格筋組織量の低下を含む。ヒト男性では、筋肉量は５０歳から８０歳の間に１／３低下する。筋萎縮のいくつかの分子特徴は、ユビキチンリガーゼのアップレギュレーション、および筋線維タンパク質の喪失を含む（Furuno et al., J. Biol. Chem., 265:8550-8557, 1990）。これらのタンパク質の分解は、例えば、アクチンの特異的構成成分である３−メチル−ヒスチジン産生および特定の筋肉におけるミオシンを測定することによって追跡することができる（Goodman, Biochem. J. 241:121-12, 1987およびLowell, et al., Metabolism, 35:1121-112, 1986；Stein and Schluter, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 272: E688-E696, 1997）。クレアチンキナーゼ（細胞損傷マーカー）の放出（Jackson, et al., Neurology, 41: 101 104, 1991）も同様に指標であり得る。
【０２７７】
非インスリン依存性糖尿病
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、非インスリン依存性糖尿病を処置するために使用することができる。非インスリン依存性糖尿病はまた、「成人発症型」糖尿病および２型糖尿病とも呼ばれる。２型糖尿病はまた、「非肥満２型」および「肥満２型」を含む。ＩＩ型糖尿病は、（１）血中グルコースレベルを平衡して維持するために必要なインスリン量より少ない量が産生される、膵島β細胞のインスリン分泌の低減、および／または（２）体がインスリンに正常に応答することができない「インスリン抵抗性」（米国特許第５，２６６，５６１号明細書および米国特許第６，５１８，０６９号明細書）によって特徴付けされ得る。例えば、グルコース刺激インスリンレベルは典型的に、約４．０ｎｍｏｌ／Ｌ超を生じることができない（米国特許第５，２６６，５６１号明細書）。ＩＩ型糖尿病の例としての症状としては、絶食時高血糖（米国特許第５，２６６，５６１号明細書）；疲労；過剰な喉の渇き；頻尿；かすみ眼；および感染率の増加が挙げられる。ＩＩ型糖尿病の分子指標は、膵臓における島のアミロイド沈着を含む。
【０２７８】
神経障害
神経障害は、全身疾患、遺伝的状態、または運動神経、知覚神経、知覚運動神経、もしくは自律神経に影響を及ぼす毒性物質によって引き起こされる中枢および／または末梢神経の機能障害を含み得る（例えば、米国特許出願第２００３００１３７７１号明細書を参照されたい）。症状は、神経損傷の原因および罹患する特定のタイプの神経に依存して変化し得る。例えば、運動神経障害の症状としては、身体作業を行う際の不器用、または筋力低下、軽い運動後の消耗、立位または歩行困難、神経筋反射の減弱または消失が挙げられる（米国特許出願第２００３００１３７７１号明細書）。自律神経障害の症状としては、便秘、心不整脈、および体位性血圧反射の低下が挙げられる（米国特許出願第２００３００１３７７１号明細書）。知覚神経障害の症状としては、疼痛およびしびれ、手、脚、または足の刺痛、および触られたときの極度の感受性が挙げられる；網膜症の症状としては、かすみ眼、突然の失明、飛蚊症、およびちらつきが挙げられる。
【０２７９】
アルツハイマー病
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、アルツハイマー病（ＡＤ）を処置するために使用することができる。アルツハイマー病は、それによってニューロンの非可逆的喪失が起こる複雑な神経変性疾患である。アルツハイマー病は、加齢関連状態でもある神経変性疾患の単なる一例である。アルツハイマー病の臨床的特徴としては、記憶力、判断力、身体周囲の見当識、および言語の進行性の障害が挙げられる。ＡＤの神経病理学的特徴としては、領域特異的ニューロン喪失、アミロイド斑、および神経原線維タングルが挙げられる。アミロイド斑は、アミロイドペプチド（ＡｐまたはＡｐ４２としても知られる）を含有する細胞外プラークであり、これは８−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰとしても知られる）の切断産物である。神経原線維タングルは、異常に高リン酸化された微小管関連タンパク質の細線維で構成される不溶性の細胞内凝集体であり、タウアミロイド斑および神経原線維タングルは、アポトーシスによるニューロン喪失に至る二次事象に寄与し得る（Clark and Karlawish, Ann. Intern. Med. 138(5):400-410 (2003))。例えば、ｐ−アミロイドは、培養ニューロンにおいてカスパーゼ−２依存的アポトーシスを誘導する（Troy et al. J Neurosci. 20(4):1386-1392）。Ｉｎ  ｖｉｖｏ（in viva）でのプラークの沈着は、近位ニューロンのアポトーシスを類似の方法で誘発し得る。
【０２８０】
遺伝的、生化学的、生理学的、および認知基準を含む多様な基準を使用して、対象におけるＡＤを評価することができる。ＡＤの症状および診断は、医療従事者に公知である。いくつかの例としてのＡＤの症状およびマーカーを以下に示す。これらの指標およびＡＤに関連することが知られている他の指標に関する情報は、「ＡＤ関連パラメータ」として使用することができる。ＡＤ関連パラメータは、定量的または定性的情報を含み得る。定量的情報の例は、１つまたは複数の次元の数値、例えば、タンパク質の濃度または断層撮影マップである。定性的情報は、評価、例えば医師のコメントまたは二択（「はい」／「いいえ」）およびその他を含み得る。ＡＤ関連パラメータは、対象がＡＤと診断されていないこと、またはＡＤの特定の指標を有しないこと、例えばＡＤの典型ではない認知試験結果を有する、もしくはＡＤに関連しない遺伝的ＡＰＯＥ多形を有することを示す情報を含む。
【０２８１】
進行性の認知障害は、ＡＤの特徴である。この障害は、記憶力、判断力、意思決定、身体周囲の見当識、および言語力の低下として現れ得る（Nussbaum and Ellis, New Eng J. Med. 348(14):1356 35 1364 (2003)）。他の型の認知症を除外することも、ＡＤの診断を行う一助となり得る。ＡＤ患者では、ニューロンの死によって進行性の脳萎縮が起こる。イメージング技術（例えば、磁気共鳴イメージング、またはコンピューターによる断層撮影）を使用して、脳におけるＡＤ関連病変および／または脳萎縮を検出することができる。
【０２８２】
ＡＤ患者は、疾患の病理に起因する生化学的異常を示し得る。例えば、脳脊髄液中のタウタンパク質レベルは、ＡＤ患者において上昇している（Andreasen, N. et al. Arch Neurol. 58:349-350 (2001)）。
【０２８３】
アミロイドβ４２（Ａ、Ｂ４２）ペプチドレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦにおいて低減され得る。Ａｐ４２のレベルは、ＡＤ患者の血漿中で増加し得る（Ertekein-Taner, N., et al. Science 290:2303 2304 (2000)）。対象由来の試料中の生化学的異常を検出する技術は、当技術分野で公知の細胞、免疫、および他の生物学的方法を含む。一般的な指針に関しては、例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3r Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)、(Harrow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、およびそのアップデート版に記述される技術を参照されたい。
【０２８４】
例えば、抗体、他の免疫グロブリン、および他の特異的結合リガンドを使用して、生体分子、例えばＡＤに関連するタンパク質または他の抗原を検出することができる。例えば、１つまたは複数の特異的抗体を使用して、試料をプロービングすることができる。様々なフォーマット、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光に基づくアッセイ、ウェスタンブロット、およびタンパク質アレイが可能である。ポリペプチドアレイを産生する方法は、当技術分野において、例えばDe Wildt et al. (2000). Nature Biotech. 18, 989-994；Lucking et al. (1999). Anal. Biochem. 270, 103-111; Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII；MacBeath, G., and Schreiber, S.L. (2000). Science 289, 1760 to 1 763；および国際公開第９９／５１７７３Ａ１号パンフレットに記述されている。
【０２８５】
１つのアッセイにおいて、例えばポリペプチドまたは治療レジメンを評価するために、ＡＤの非ヒト動物モデル（例えば、マウスモデル）が使用される。例えば、米国特許第６，５０９，５１５号明細書は、学習および記憶の試験と共に当然使用することができるそのような１つのモデル動物を記述している。動物は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）配列を脳組織のレベルで発現し、そのため動物は生後短期間で、一般的に生後１年以内に、好ましくは生後２〜６か月以内に進行性の壊死性障害を発症する。ＡＰＰタンパク質配列を、動物または胎児期の場合は動物の祖先に、好ましくは１細胞期、受精した卵母細胞期に、一般的に約８細胞期より前に導入する。接合体または胚を、偽妊娠の雌性マウスにおいて満期まで発達させる。アミロイド前駆体タンパク質遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質の内因性の高度発現が起こり、ＡＤなどの進行性の壊死性疾患状態に著しく罹患する脳の領域である脳の皮質辺縁領域において進行性の壊死疾患が発生するような形で染色体に取り込まれるように動物の胚に導入される。罹患したトランスジェニック動物モデル壊死疾患における神経膠症および臨床発現。神経疾患の進行性の態様は、探索行動および／または自発運動行動の減少ならびにデオキシグルコース取り込み／利用の減少、および脳の皮質辺縁領域における肥大性神経膠症によって特徴付けられる。さらに、認められる変化は、一部の加齢動物において認められる変化と類似である。他の動物モデルはまた、米国特許第５，３８７，７４２号明細書；第５，８７７，３９９号明細書；第６，３５８，７５２号明細書；および第６，１８７，９９２号明細書にも記述されている。
【０２８６】
パーキンソン病
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、パーキンソン病を処置するために使用することができる。パーキンソン病は、運動機能を調節する黒質線条体のドーパミン系の変性が起こる、黒質におけるドーパミン作動ニューロンの神経変性を含む。この病態により、次に運動機能障害が起こる（例えば、Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)を参照されたい）。例としての運動症状としては、無動、前屈姿勢、歩行困難、姿勢反射障害、カタレプシー、筋固縮、および振せんが挙げられる。例としての非運動症状としては、抑うつ、意欲の欠如、消極性、認知症、および消化管機能障害が挙げられる（例えば、Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびPfeiffer, Lancet Neurol., 2:107-16 (2003)を参照されたい）。パーキンソン病は、年齢６５〜６９歳の人の０．５〜１％および年齢８０歳以上の人の１〜３％に観察されている（例えば、Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)を参照されたい）。パーキンソン病の分子マーカーとしては、芳香族Ｌアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の低減（例えば、米国特許出願第２００２０１７２６６４号明細書を参照されたい)；および黒質線条体ニューロンにおけるドーパミン含有量の減少（例えば、Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびLotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)を参照されたい）が挙げられる。一部の家族性の症例では、ＰＤは、α−シヌクレインおよびパーキン（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）タンパク質をコードする１つの遺伝子の変異に連鎖している（例えば、Riess et al., J. Neurol. 250 Suppl 1:I3 10 (2003)およびNussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)を参照されたい）。ニューロン特異的Ｃ末端ユビキチンヒドロラーゼ遺伝子のミスセンス変異もまた、パーキンソン病に関連している（例えば、Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)）。
【０２８７】
ハンチントン病
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本開示の方法または使用は、ハンチントン病を処置するために使用することができる。ハンチントン病に対するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの有効性を評価する、および／または有効量を決定する方法は、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、またはいくつかの他の非ヒト）、または他の動物（例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、またはハエもしくは線虫などの無脊椎動物）を使用する生物に基づくアッセイが挙げられる。ハンチントン病の多数の動物モデル系が利用可能である。例えば、Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000)；Ona et al. Nature 399: 263-267 (1999)、Bates et al. Hum Mol Genet. 6(10):1633-7 (1997)；Hansson et al. J. of Neurochemistry 78: 694-703；およびRubinsztein, D. C., Trends in Genetics, Vol. 1S, No. 4, pp. 202-209（ＨＤの様々な動物および非ヒトモデルに関する論評）を参照されたい。
【０２８８】
そのような動物モデルの例は、Ｒ６／２系のトランスジェニックマウス系統である（Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)）。Ｒ６／２マウスは、ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１を過剰発現する（内因性のプロモーターの制御下で）トランスジェニックハンチントン病マウスである。Ｒ６／２ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１は、長いＣＡＧ／ポリグルタミンリピート長（ＣＡＧリピート数は平均で１５０）を有する。これらのマウスは、ヒトハンチントン病の多くの特徴を有する進行性で最終的に致死性の神経疾患を発症する。ハンチントンのＮ末端部分（ＨＤエクソン１によってコードされる）によって部分的に構成される異常な凝集体は、Ｒ６／２マウスにおいて、細胞の細胞質および核においていずれも４５に観察される（Davies et al. Cell 90: 537-548 (1997)）。例えば、トランスジェニック動物におけるヒトハンチントンタンパク質は、ＣＡＧリピート数少なくとも５５、より好ましくはＣＡＧリピート数約１５０を含む遺伝子によってコードされる。これらのトランスジェニック動物は、ハンチントン病様の表現型を発症し得る。
【０２８９】
これらのトランスジェニックマウスは、生後８〜１０週間で体重増加の低減、寿命の低減、ならびに異常な歩行、安静時振せん、下肢の握り行動、および過敏症によって特徴付けされる運動障害によって特徴付けされる（例えば、Ｒ６／２系統、Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)を参照されたい）。表現型は、運動機能低下に向かって進行性に悪化する。これらのトランスジェニックマウスの脳はまた、神経伝達物質受容体（グルタミン酸塩、ドーパミン作動神経）の変化、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩（神経完全性のマーカー）濃度の減少、ならびに線条体および脳のサイズの低減などの神経化学および組織学的異常を証明する。したがって、評価は、神経伝達物質のレベル、神経伝達物質受容体レベル、脳のサイズおよび線条体のサイズに関連するパラメータを評価することを含み得る。加えて、完全長のヒトハンチントンタンパク質のトランスジェニック部分を含有する異常な凝集体が、これらの動物の脳組織（例えば、Ｒ６／２トランスジェニックマウス系統）に存在する。例えば、Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)、Davies et al. Cell 90: 537-548 (1997)、Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000)およびCha et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6480-6485 (1998)を参照されたい。
【０２９０】
本出願に記述した試験ポリペプチドまたは公知のポリペプチドの効果を動物モデルにおいて試験するために、例えば試験ポリペプチドを動物の血中に注射することによって、試験ポリペプチドの異なる濃度をトランスジェニック動物に投与する。ハンチントン病様症状を、動物において評価してもよい。例えばマウスモデルに関して上記のように、ハンチントン病様症状の進行をモニターして、試験ポリペプチドによる処置によって症状の低減または遅延が起こるか否かを決定する。もう１つのアッセイにおいて、これらの動物におけるハンチントンタンパク質凝集体の解離をモニターする。次に、動物を屠殺して、脳の切片を得る。脳切片を、トランスジェニックヒトハンチントンタンパク質、その一部、またはヒトハンチントンタンパク質を含む融合タンパク質またはその一部を含有する凝集体の存在に関して分析する。この分析は、例えば抗ハンチントン抗体によって脳組織の切片を染色すること、および抗ハンチントン抗体を認識するＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を添加すること（例えば、抗ハンチントン抗体はマウス抗ヒト抗体であり、二次抗体はヒト抗体に対して特異的である）、および蛍光顕微鏡によってタンパク質凝集体を可視化することを含み得る。
【０２９１】
ハンチントン病を評価および／またはモニターするために多様な方法が利用可能である。多様な臨床兆候および疾患の指標が公知である。ハンチントン病は、運動障害、精神障害、および認知の変化を引き起こす。これらの症状の程度、発症時の年齢、および発現は異なり得る。運動障害は、舞踏病と呼ばれる、速く無作為で舞踏状の運動を含み得る。
【０２９２】
例としての運動評価には：追跡眼球運動、サッカード開始、サッカード速度、構音障害、挺舌、指をたたく能力、回内／回外、げんこつ−手−手のひらの繰り返し（a lo fist-hand-palm）、腕の硬直、動作緩慢、最大のジストニア（体幹、上および下肢）、最大の舞踏病（例えば、体幹、顔、上および下肢）、足取り、つぎ足歩行および後方突進を含む。典型的な処置によって、例えば、１年間にわたって、Total Motor Score 4（ＴＭＳ−４）、ＵＨＤＲＳの下位尺度を変化させることができる。
【０２９３】
がん
Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドまたは融合ポリペプチドの個体への投与を提供する本発明の方法または使用は、がんを処置するために使用することができる。がんは、不適当に高いレベルの細胞分裂、不適当に低いレベルのアポトーシスまたはその両方により引き起こされる、またはそれらが起こる任意の疾患を含む。がんの例としては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管(nile duct)癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。リンパ組織増殖性障害も増殖性疾患であると考慮される。
【０２９４】
実施形態
１つの実施形態において、本開示は、Ｎ末端からＣ末端の順に（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ；（ｂ）リンカー、および（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０２９５】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、Ｖ５６３で変異を有する。
【０２９６】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、Ｋ７９５で変異を有する。
【０２９７】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、Ｖ５６３およびＫ７９５で変異を有する。
【０２９８】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、配列番号７７の配列を有する。
【０２９９】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、配列番号７８の配列を有する。
【０３００】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、Ｒ１７９で変異を有する。
【０３０１】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、Ｃ２０６で変異を有する。
【０３０２】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、Ｃ２４４で変異を有する。
【０３０３】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、Ｒ１７９で変異およびＣ２０６またはＣ２４４で変異を有する。
【０３０４】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４で変異を有する。
【０３０５】
１つの実施形態において、（ｃ）ＦＧＦ２３は、
【０３０６】
【化１】
2017537926.tif 000002
の配列を有する。
【０３０７】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、配列番号７７または７８の配列を有する。
【０３０８】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、配列番号７７の配列を有する。
【０３０９】
１つの実施形態において、（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しているα−ｓＫｌｏｔｈｏは、配列番号７８の配列を有する。
【０３１０】
１つの実施形態において、リンカーはポリペプチドリンカーである。
【０３１１】
１つの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択されるリンカーの１つまたは複数のコピーを含むアミノ酸配列を含む。
【０３１２】
１つの実施形態において、融合ポリペプチドはさらにシグナルペプチドを含む。
【０３１３】
１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号８０または配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
【０３１４】
１つの実施形態において、組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。
【０３１５】
１つの実施形態において、本開示は、本明細書に記述される任意の実施形態の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。
【０３１６】
１つの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記述される任意の実施形態の核酸を含む。
【０３１７】
１つの実施形態において、ベクターは、本明細書に記述される任意の実施形態の核酸を含む。
【０３１８】
１つの実施形態において、本開示は、Ｎ末端からＣ末端の順に（ａ）Ｃ末端から約２０個のアミノ酸が欠失しており、任意選択でＶ５６３および／またはＫ７９５での変異も有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ；（ｂ）リンカー；ならびに（ｃ）任意選択でＲ１７９、Ｃ２０６、および／またはＣ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を含む融合ポリペプチドを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、ＦＧＦ２３関連疾患を処置または予防する方法に関する。
【０３１９】
１つの実施形態において、本開示は、本明細書に記述される任意の実施形態の組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、ＦＧＦ２３関連疾患を処置または予防する方法に関する。
【０３２０】
１つの実施形態において、ＦＧＦ２３関連疾患は、加齢関連状態、代謝障害、高リン血症、石灰沈着症、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および筋萎縮からなる群より選択される。
【０３２１】
１つの実施形態において、加齢関連状態は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴からなる群より選択される。
【０３２２】
１つの実施形態において、代謝障害は、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖、および肥満からなる群より選択される。
【０３２３】
本明細書で引用する全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明はその実施形態に関連して具体的に示され、記述されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本開示の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に種々の変化を行ってもよいことは、当業者によって理解される。
【実施例】
【０３２４】
実施例１  Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの発現および精製
Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの発現
本開示のポリペプチドは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、α−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインおよびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを一時的にトランスフェクトすることにより作製した。発現されたポリペプチドを含有する条件培地を、Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３およびＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質のそれぞれの発現プラスミドの一時的なトランスフェクションにより生成した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して６−ウェルプレートにおいて行った。トランスフェクションの５時間後、トランスフェクション混合物を、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ３ｍｌで置き換えた。条件培地を、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ３ｍｌの添加７２時間後に収集した。様々な一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の条件培地の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ウェスタンブロットにより分析するか（図３Ａ）、またはクマシーブルーで染色した（図３Ｂ）。
【０３２５】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、様々な試料について実施した（レーン１、対照；レーン２、ＦＧＦ２３；レーン３、ｓＫｌｏｔｈｏ；レーン４〜６、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３）。クマシーブルー染色により、１８０ｋＤａ超のバンド（図３Ｂ、右側に矢印で示す）の高い発現が明らかとなったが、このバンドは、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクトされていない試料を含有するレーン１〜３には存在しなかった。培地に分泌されたＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの質をウェスタンブロットにより評価した（図３Ａ）。抗−ＦＧＦ２３ラットモノクローナルＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ２６２９１）を一次抗体として使用して、ウェスタンブロットによりＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドを検出した。ウェスタンブロットにより、クマシー染色ゲルにおいて観察された追加のバンドがＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドであることが確認された。ウェスタンブロットにより、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドが、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの予測分子量を有することが確認された。この分析は、Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質が発現されたことを示す。
【０３２６】
Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの精製
本開示のポリペプチドを、α−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインおよびＦＧＦ２３Ｒ１７９Ｑ変種を有するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物の条件培地から精製した。条件培地を生成するために、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓをコードする発現ベクター（２μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（polyethlinimine）（ＰＥＩ）１８ｍｌと混合したＯｐｔｉＭＥＭ１（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１０５８）１８ｍｌ中でＤＮＡ５００μｇ）を、発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｐｅ ２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１２３３８）中で１０６細胞／ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４６４ｍｌ）中で浮遊培養により増殖させたＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、培養物を増殖させた（１２０時間；３７℃  ５％ＣＯ２インキュベータ中；１２５ｒｐｍで振とう）。インキュベーション終了後、条件培地を遠心分離（１０００ｒｐｍで５分）により収集した。次に条件培地をニッケル−アガロースカラムに適用した。ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓはカラムにしっかりと結合し、これを５０ｍＭのイミダゾールで溶出させた。次に得られた精製材料をＰＢＳ中で透析し、イミダゾールを除去した。精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し（レーン１、精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ；レーン２、分子量マーカー）、クマシーブルーによる染色により分析した（図３Ｃ）。染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが予測分子量を有することが確認された。精製材料をロードしたレーンにおいて完全長のｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ以外のタンパク質に対応するバンドを検出できないこともまた、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが精製されたことを示すものであった。
【０３２７】
実施例２  Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼ
発現されたα−Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの生物学的活性を、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドがＦＧＦ２３受容体に結合すると、Ｅｇｒ−１の下流活性化、およびＥｇｒ−１プロモーターにより調節されるルシフェラーゼレポーターの発現が起こった。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、Urakawa et al. (Nature, 2006, Vol 444, 770-774)に報告された内容に基づいて構築した。４８−ウェルポリ−Ｄ−リジンプレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、トランスフェクション標準化レポーター遺伝子（ウミシイタケルシフェラーゼ）と共にＥｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトした。Ｅｇｒ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子のトランスフェクションの５時間後、トランスフェクション混合物を、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ３ｍｌに置換した。１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ３ｍｌの添加７２時間後に、条件培地を収集した。５時間後、トランスフェクション混合物を、活性を試験する試料に置換した。最初の実験において、２０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ８５３７；２ｍｇ／ｍｌの貯蔵液としてＤＭＥＭに溶解されている）の存在または非存在下で、５０％条件培地（培地のみ、またはＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３、ならびにＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質を含有する）および１％ＦＢＳを含む５０％ＤＭＥＭを、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験した（図４）。さらなる実験では、規定量の精製ポリペプチドを使用した（図５Ａおよび５Ｂ）。細胞を、Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１９４Ａ）中で２０時間溶解し、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２９４０）を使用して決定した。
【０３２８】
最初の実験において、Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチド活性は非分画条件培地において証明された。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して、これらの実験ではルシフェラーゼレポーターの発現の変化倍率を定量した（図４）。ＦＧＦ２３およびＫｌｏｔｈｏタンパク質の細胞外ドメインの組合せを含有する条件培地は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼを活性化させたが、ＦＧＦ２３のみを含有する条件培地またはＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメインのみを含有する条件培地ではＥｇｒ−１−ルシフェラーゼを活性化させなかった。融合タンパク質ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含有する条件培地は、ＦＧＦ２３またはＫｌｏｔｈｏのいずれか単独を含有する条件培地とは対照的に、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化した。これらの実験において、融合タンパク質ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含有する条件培地は、ＦＧＦ２３およびＫｌｏｔｈｏの組合せを含有する条件培地よりも有意に良好にＥｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化した。ヘパリンの存在下では、融合タンパク質ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含有する条件培地ならびにＦＧＦ２３およびＫｌｏｔｈｏの組合せを含有する条件培地による誘導が、有意に増強された。表１は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、条件培地中の様々なＦＧＦ−Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの相対発現、および様々なＦＧＦ−Ｋｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドに対応する非分画条件培地の相対活性を示す。
【０３２９】
【表１】
2017537926.tif 000003
【０３３０】
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイはまた、実施例１に記載されている精製技法を使用して条件培地から精製した規定量のタンパク質を使用して実施した。発現されたポリペプチドを含有する非分画条件培地を使用するこれまでの結果と整合することには、精製ＦＧＦ２３およびｓＫｌｏｔｈｏの組合せによる処置によりルシフェラーゼレポーター活性が得られたが、精製ＦＧＦ２３単独による処置では得られなかった（図５Ａ）。精製ＦＧＦ２３およびｓＫｌｏｔｈｏの組合せによるルシフェラーゼレポーター活性は、さらに精製ｓＫｌｏｔｈｏの用量依存的であり、この効果はヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在により増強され得る。ルシフェラーゼ活性に対するｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの効果は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、約１．２１ｎＭもの低濃度（１．２倍変化）および少なくとも最大約１９．３ｎＭ（２．４倍変化）で検出することができた（図５Ｂ）。ルシフェラーゼ活性に対するｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの活性は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で有意に増強された。ヘパリンの存在下では、ルシフェラーゼ活性に対するｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの効果は、約０．６ｎＭもの低濃度（２．０倍変化）で検出することができた。この結果は、精製ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが用量依存的にＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を誘導したこと、およびｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓによるその処置を示した。
【０３３１】
実施例３  筋肉細胞に対するＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの効果を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
発現されたＫｌｏｔｈｏ融合ポリペプチドの生物学的効果を、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞で試験した。ＩＧＦ−１、ＦＧＦ２またはｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３によるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の処置により、筋管増殖およびシグナル伝達タンパク質のリン酸化が起こった。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、６ウェルのポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン被覆プレートにおいて４０，０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地（ＤＭＥＭおよびＦ１２、３対１）、１０％ＦＢＳ、１％グルタミン；１％ペニシリン／ストレプトマイシン；１％リノール酸；０．１％ＩＴＳ：［インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｍｌ）およびセレン（５ｎｇ／ｍｌ）］に播種した。筋芽細胞がコンフルエンスに達した後（３日）、培地を分化培地（２％ウマ血清；１％グルタミン；１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＤ）に交換した。
【０３３２】
筋管直径実験に関して、コンフルエントの３日後、培地を分化培地に交換して、細胞を、分化培地中でデキサメタゾン（１００μＭ）の非存在下または存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）またはｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）で２４時間処置した。処置終了後、細胞をグルタルアルデヒド（ＰＢＳ中で５％）で固定し、多重蛍光像を収集した。筋管直径をＰｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔプログラムを使用して測定し、肥大または萎縮を測定した。
【０３３３】
シグナル伝達タンパク質のリン酸化実験に関して、コンフルエントの３日後、培地を分化培地に交換し、細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで４時間飢餓状態にし、次にラパマイシン（４０ｎＭ）の非存在下または存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）またはｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）によって３０分処置した。細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下で、ＲＩＰＡ緩衝剤中で溶解した。ウェスタンブロット分析を行い、図に示されるように異なる抗体で膜をプロービングして、Ｘ線フィルムを現像してスキャンした。
【０３３４】
この試験の結果から、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３が、対照と比較して筋管直径の増加を引き起こし、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の結果と類似のＣ２Ｃ１２筋管肥大を誘導することが示された（図５Ａ）。加えて、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２による処置は、筋管直径の測定に基づいて、デキサメタゾンにより誘導された筋管萎縮を部分的に逆転させることができた。デキサメタゾンの非存在下または存在下で、筋管の形態（筋管の厚さにより測定される）に対するｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３とＦＧＦ２の差は、観察されなかった。ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の栄養作用は統計学的に有意であった。
【０３３５】
Ｃ２Ｃ１２筋管に対する効果と整合することには、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合タンパク質のシグナル伝達により、Ｃ２Ｃ１２筋管においてｐ７０Ｓ６ＫおよびＥＲＫのリン酸化が起こったが、ＡＫＴまたはＦｏｘＯのリン酸化は起こらなかった（図５Ｂ）。シグナル伝達に対するｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３の効果はＦＧＦ２と同様であったが、ＩＧＦ−１とは異なっていた。ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３によるＥＲＫリン酸化の程度は、ＩＧＦ−１またはＦＧＦ２より低いことが観察された。ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３によるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ラパマイシン感受性であった。Ｃ２Ｃ１２細胞を必要とする実験において、ヘパリンはシグナル伝達を活性化するために必要ではなかった。これらの結果は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドがＣ２Ｃ１２筋管においてシグナル伝達を活性化させたことを示している。
【０３３６】
実施例４  ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、およびＦｃＬＡＬＡを含む融合ポリペプチド
ｓＫｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３、および抗体の改変Ｆｃ断片を使用して、様々な融合ポリペプチドを構築する。これらの改変Ｆｃ分子は、ＦｃＲｎに対する結合が変化（減少）しており、このため血清中半減期が増加している。これらはまた、改変された生物学的利用率を有し、体内の粘膜表面および他の標的への輸送が変化している。本実施例において、米国特許第７，２１７，７９８号明細書およびHessell et al. 2007 Nature 449:101-104に記述されるように、ＦＧＦ２３およびｓＫｌｏｔｈｏをＦｃＦＬＡＬＡに融合する。これらの融合ポリペプチドの様々な成分間に介在するのは、Lode et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480に記述されるようにリンカーである。これらの融合体を構築物、例えばｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入して、ＨＥＫ２９３細胞において発現させる。
【０３３７】
Ａ．ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１
以下を含む融合体を構築する：ｓＫｌｏｔｈｏ、リンカー、ＦＧＦ２３、もう１つのリンカー、およびＦｃＬＡＬＡ。ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１と称される本実施形態を、以下の配列番号４６および４７に表す。
【０３３８】
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１（開始コドンＡＴＧを１位とする）のヌクレオチド配列を、配列番号４６として表す。
【０３３９】
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列を、配列番号４７として以下に表す。
【０３４０】
この配列において、融合体の様々な成分は以下のとおりである：
ｓＫｌｏｔｈｏ：１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位；リンカー２；１２２９〜１２３３位；ＦｃＬＡＬＡ：１２３４〜１４５９位。
【０３４１】
Ｂ．ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２
ｓＫｌｏｔｈｏ、リンカー、ＦＧＦ２３、もう１つのリンカー、およびＦｃＬＡＬＡを含む融合体を構築する。この実施形態は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２と称され、配列番号４８および４９として以下に表される。
【０３４２】
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２（開始コドンＡＴＧを１位とする）のヌクレオチド配列を、配列番号４８として以下に表す。
【０３４３】
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列を、配列番号４９として以下に表す。
【０３４４】
この配列において、融合体の様々な成分は以下のとおりである：
ｓＫｌｏｔｈｏ：（ａａまたはアミノ酸）１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位；リンカー２；１２２９〜１２３３位；ＦｃＬＡＬＡ：１２３４〜１４５０位。
【０３４５】
本明細書に記述される、または当技術分野で公知の、ＦＧＦ、Ｋｌｏｔｈｏ、改変Ｆｃ断片、および（任意選択で）リンカー配列、ならびにその変種および誘導体を様々な実施形態で組み合わせることによって、他の融合ポリペプチドを構築することができる。
【０３４６】
実施例５  ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合ポリペプチド
米国特許第７，２１７，７９８号明細書に記述されるＦＧＦ２３および抗体の改変Ｆｃ断片を使用して様々な融合ポリペプチドを構築する。これらの改変Ｆｃ分子は、ＦｃＲｎに対する結合が変化（減少）しており、血清中半減期が増加している。それらは、また、生物学的利用率が改変されており、体内の粘膜表面および他の標的への輸送が変化している。本実施例において、ＦＧＦ２３は、ＦｃＬＡＬＡに融合している。これらの融合ポリペプチドの様々な成分間に介在するのは、Lode et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480に記述されるリンカーである。これらの融合体を、構築物、例えばｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入して、ＨＥＫ２９３細胞において発現させる。
【０３４７】
Ｃ．ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１
ＦＧＦ２３、リンカー、およびＦｃＬＡＬＡを含む融合体を構築する。本構築物は、ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１と称され、配列番号５０および５１として以下に表される。
【０３４８】
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１のヌクレオチド配列（開始コドンＡＴＧを１位とする）を、配列番号５０として以下に表す。
【０３４９】
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列を、配列番号５１として以下に表す。
【０３５０】
この配列において、融合体の様々な成分は以下のとおりである：
ＦＧＦ２３：（アミノ酸）１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＧｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位。
【０３５１】
Ｄ．ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２
ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含むＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１を含む融合体を構築する。
【０３５２】
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２のヌクレオチド配列（開始コドンＡＴＧを１位とする）を、配列番号５２として以下に表す。
【０３５３】
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列を、配列番号５３として以下に表す。
【０３５４】
この配列において、融合体の様々な成分は以下のとおりである：
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位。
【０３５５】
本明細書に記述される、または当技術分野で公知の、ＦＧＦ配列、改変Ｆｃ断片、および（任意選択で）リンカー配列、ならびにその変種および誘導体を様々な実施形態で組み合わせることによって、他の融合ポリペプチドを構築することができる。
【０３５６】
Ｅ．ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化：ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタンパク質によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化；およびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）対ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２の薬物動態プロファイルを決定する。
【０３５７】
図７は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｅｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を一時的にトランスフェクトして、２０μｇ／ｍｌヘパリンの非存在下または存在下で表記の条件培地と共にインキュベートする。次に、１８時間後にルシフェラーゼ活性を決定する。結果は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質がレポーター遺伝子活性を誘導することを示している。これらの誘導は、ヘパリンの存在下で有意に増強される。ｓＫＦ−Ｆｃｖ１：ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１；ｓＫＦ−Ｆｃｖ２：ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２。
【０３５８】
図８は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタンパク質によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｋｌｏｔｈｏの完全長の膜貫通型と共にＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を一時的にトランスフェクトして、表記の３０％条件培地と共にインキュベートする。次に、ルシフェラーゼ活性を１８時間後に決定する。結果は、ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質がＦＧＦ２３と類似した形でレポーター遺伝子活性を誘導することを示す。
【０３５９】
図９は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）対ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２の薬物動態プロファイルを示す。１群あたり４匹のマウスに、２ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−６ｘＨｉｓまたはＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２を皮下注射する。表記の時間に、血清試料を採取して、ＥＬＩＳＡによってＦＧＦ２３に関して分析する。血清中のＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ濃度は、２４時間の時点で上昇したままであるが、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−６×Ｈｉｓは、基底レベルに戻る。この結果は、ＦｃＬＡＬＡの添加によって、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が有意に改善されることを示している。
【０３６０】
実施例６  デキサメタゾン誘発筋萎縮後の筋成長の増強におけるｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
実験データにより、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３の筋肉内注射が、デキサメタゾン誘発筋萎縮後の筋成長を有意に増強したことが示される。本実験において、配列番号４１に対応するペプチドを使用する。
【０３６１】
図１０は、腓腹筋−ヒラメ筋−足底筋（ＧＳＰ）の絶対重量（Ａ）および％重量変化（Ｂ）を示し、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（ＫＬＯＦＧＦ）の筋肉内注射が、ｓＫｌｏｔｈｏ（ｓＫＬＯ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の筋肉内注射と比較して、デキサメタゾン（ＤＥＸ）誘発筋萎縮後の筋肉量の再成長を有意に増強したことを示している。
【０３６２】
１５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス８０匹を、体重によって各群１０匹の８群に無作為化する。４群に、ＤＥＸを含まない水（Ｗ２１ｄ）を与え、他の４群には、２．４ｍｇ／ｋｇ／日のＤＥＸを含む飲料水（Ｄ２１ｄ）を３週間与える。３週間後、ＤＥＸ処置を中止して、Ｗ２１ｄの１群およびＤ２１ｄの１群を直ちに屠殺して、ＤＥＸ処置によって誘導された筋萎縮の程度を確立した。Ｗ２１ｄまたはＤ２１ｄマウスの残りの３群をさらに１４日間（Ｒ１４ｄ）回復させて、その期間に、ＰＢＳ５０μｌ×２、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（ＫＬＯＦＧＦ；１．６ｍｇ／ｍｌ）、またはｓＫｌｏｔｈｏ（ｓＫＬＯ；１．６ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ、２日毎に右腓腹筋−ヒラメ筋−足底筋複合体に筋肉内注射した。最後の筋肉内注射の２４時間後にマウスを屠殺して、筋重量を決定し、絶対重量（Ａ）またはＷ２１ｄ＋ＰＢＳ群と比較した％変化として表記する。
【０３６３】
これらのデータは、デキサメタゾン誘発筋萎縮後の筋成長の増強におけるｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。
【０３６４】
実施例７  凝集を低減させる、望ましくないプロテアーゼによる切断を低減させる、および産生を増加させる、融合タンパク質のＦＧＦ２３部分における追加の変異
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３およびＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ融合ポリペプチドのＦＧＦ２３部分内でのいくつかの変異を調べる。これらとしては、Ｑ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４（数字はＦＧＦ２３のアミノ酸配列に基づく）が挙げられる。例としての個々の変異としては、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６ＳおよびＣ２４４Ｓが挙げられ、これらのいかなる部位での変異もＲ１７９での変異（例えば、Ｒ１７９Ｑ）と組み合わせることができる。例としての配列を、図２の配列番号５４〜６８に示す。
【０３６５】
Ｃ２０６およびＣ２４４は、二量体形成に関係すると考えられ、Ｑ１５６は、プロテアーゼ感受性部位であると本発明者らによって同定された部位である。これらのアミノ酸を他のいずれのアミノ酸に変異させても、ＦＧＦ２３活性に干渉することなく、凝集を低減させ、望ましくないプロテアーゼによる切断を低減させ、細胞からのタンパク質生成を増加させることによって、タンパク質の質を増強する。このことは、これらの３つの位置がヒト、アカゲザル、ウシ、マウス、およびラットにおいて見出されるＦＧＦ２３タンパク質において保存されていることから、予想外の結果である。この保存を、配列番号３５、１０９、１１０、１１１、および１１２の間で比較して以下に示し、Ｑ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４を太字で下線のフォントで示す。
【０３６６】
【化２】
2017537926.tif 000004
【０３６７】
これらの３つの変異がＦＧＦ２３活性を妨げないという事実を図１１に示す。この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ、ならびにＱ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４ＳおよびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥｇｒ−１レポーター遺伝子の活性化を示す。
【０３６８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｋｌｏｔｈｏの完全長の膜貫通型および表記のＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ変異体と共にＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を一時的にトランスフェクトする。次に、ルシフェラーゼ活性を１８時間後に決定する。結果は、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ（３つの独立したクローン）およびＱ１５６Ａ（３つの独立したクローン）変異体が、ＥＧＲ−１−Ｌｕｃレポーター遺伝子活性を活性化するためにＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質と等しく有効であることを示している。
【０３６９】
Ｃ２４４およびＣ２０６での変異が、ＦＧＦ２３の二量体形成および凝集を変化させることを示すデータを図１２に示す。この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａのＷＴ、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、およびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体のタンパク質の質を示す。表記のＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ発現ベクターを一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの条件培地を、ＦＧＦ２３抗体を使用してウェスタンブロットによって分析する。結果は、Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異がタンパク質の二量体形成を防止すること、およびＱ１５６Ａ変異が、タンパク質分解断片を低減させたことを示している。
【０３７０】
このように、これらのＱ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４残基は、種を超えて保存されているにもかかわらず、意外にも、ＦＧＦ２３活性を低減させることなくそれらを変異させることができ、凝集および切断を低減させ、産生を改善することによって、タンパク質の質を増強することができる。
【０３７１】
実施例８  より多くのタンパク質を産生するが、分解産物の産生がより少なく、ＦＧＦ２３活性を可能にする融合タンパク質のＦＧＦ２３部分における追加の変異
ＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ融合ポリペプチドのＦＧＦ２３部分内でいくつかの追加の変異を調べる。これらとしては、Ｙ１５４およびＳ１５５が挙げられる（番号は、ＦＧＦ２３のアミノ酸配列に基づく）。例としての個々の変異としては、Ｙ１５４Ｄ、Ｙ１５４Ｈ、Ｓ１５５Ａ、Ｓ１５５Ｔ、Ｃ２０６Ｓ、およびＳ２４４Ｓが挙げられ、これらの部位のいずれかでの変異をＲ１７９での変異（例えばＲ１７９Ｑ）と組み合わせることができる。例としての配列を配列番号６９〜７６に提供する。
【０３７２】
図１３は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａのＷＴ（Ｒ１７９Ｑ）、Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｙ１５４Ｈ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｙ１５４Ｎ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｓ１５５Ａ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ、Ｓ１５５Ｔ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓのタンパク質の質を示す。表記のＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ発現ベクターを表記の時間、一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの条件培地を、ＦＧＦ２３抗体を使用するウェスタンブロットによって分析した。結果は、ＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ／Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体が、より多くのタンパク質を産生したが、分解産物の産生はかなり少ないことを示した。この実験で使用したＦＧＦ２３変種（「野生型」を含む）は全て、Ｒ１７９Ｑ変異を有する。
【０３７３】
このように、Ｒ１７９／Ｙ１５４／Ｃ２０６／Ｃ２４４で変異を有するＦＧＦ２３を、Ｒ１７９／Ｓ１５５／Ｃ２０６／Ｃ２４４で変異を有するＦＧＦ２３と比較した場合に、Ｙ１５４での変異は、Ｓ１５５での変異より分解産物の産生がかなり少なかった。同様に、この文脈において、Ｙ１５４Ｄの変異は、変異Ｙ１５４ＨまたはＹ１５４Ｎより分解産物の産生がかなり少なかった。
【０３７４】
図１４は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡおよびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｋｌｏｔｈｏの完全長の膜貫通型と共にＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、それぞれの精製タンパク質を添加した。ルシフェラーゼ活性を１８時間後に決定した。結果は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−Ｙ１５４Ｄ／Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体が、部分的（〜５０％）活性を保持することを示した。「ＷＴ」は、Ｒ１７９Ｑ変異を有するＦＧＦ２３を示す。
【０３７５】
実施例９  ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端から約２０個のアミノ酸の欠失は、ｓＫｌｏｔｈｏの活性を減少させるが、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性を増加させる
ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端からの様々なトランケーション体を作製した。図１５ＡおよびＢは、様々な構築物の構築を示す。図１５Ａは、Ｃ末端から約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２６０、約２８０、約３００、約３２０、約３４０、約３６０、約３８０、約４００、約４２０、約４４０、約４６０、約４８０個のアミノ酸が欠失しているｓＫｌｏｔｈｏ変種を構築するための戦略を示す。プライマーＰ５（配列番号８３）を５’プライマーとして使用した。Ｃ−２０、Ｃ−４０、Ｃ−６０、・・・Ｃ−４８０（配列番号８４〜１０７）と称される一連の２４個のプライマーのいずれかを使用して、Ｃ末端から約２０個、約４０個、約６０個、・・・約４８０個をトランケーションした。全てのｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体の中で約２０個のアミノ酸の欠失を有するトランケーション体（ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０）のみが有効であった；このｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体とＦＧＦ２３の融合体を、図１５Ｂに示すように作製した。図１５Ｂは、ｓＫｌｏｔｈｏ（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドを構築する戦略を示す。Ｐ５プライマーをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）においてＣ−２０プライマーと共に使用して、ｓＫｌｏｔｈｏトランケーションを有する断片を調製した。この断片を、制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＦＧＦ２３をコードするベクターにライゲートして、ｓＫｌｏｔｈｏ（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドを構築した。
【０３７６】
ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端からの様々なトランケーション体の活性を試験した。Ｃ末端から約２０個のアミノ酸の欠失は、ｓＫｌｏｔｈｏの活性を減少させたが、この構築物は何らかの活性を保持した。図１６は、ｓＫｌｏｔｈｏ変異体のＥｇｒ−１活性を示す。それぞれがｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体とＦＧＦ２３との融合体をコードするベクターを有する様々なＨｅｋ２９３細胞から条件培地（ＣＭ）を収集した。融合体の有用な量を産生する細胞からのＣＭのみを使用した。使用した融合体は：ＣＭ１：約２０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体；ＣＭ７：約１４０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体；ＣＭ１１：約２２０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体；ＣＭ１２：約２４０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体；ＣＭ１３：約２６０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体；ＣＭ２３：約４６０個のアミノ酸のｓＫｌｏｔｈｏトランケーション体。陽性対照：ｓＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３の融合体を産生する細胞からの条件培地［（＋）ＣＭ］；ｓＫｌｏｔｈｏとＦＧＦ２３の精製融合体［（＋）ｃｔｒｌ］。「ｕｎＣｏｎｃ．」は、より少ないタンパク質を使用した実験を示す。陰性対照：（−）ｃｔｒｌ。ＲＬＵ、相対的ルシフェラーゼ単位。この実験は、Ｃ末端からの約２０個のアミノ酸の欠失がｓＫｌｏｔｈｏの活性を減少させることを示した。
【０３７７】
ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端から約２０個のアミノ酸の欠失はｓＫｌｏｔｈｏ活性を減少させたが、この欠失は、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性を増加させた。図１７は、ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端から約２０個のアミノ酸の欠失が、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性を増加させたことを示している。図１７Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏまたはｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０およびＦＧＦ２３を含む様々な融合体の相対量のウェスタンブロットを示す。レーン１、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体。レーン２、ＦＧＦ２３−ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）融合体。レーン３、ｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合体。サイズマーカーも同様に示す。Ｋｌｏｔｈｏに対するポリクローナル抗体を使用した。図１７Ｂは、Ｅｇｒ−１−Ｌｕｃアッセイにおけるこれらの融合ポリペプチドの活性を示す。
【０３７８】
図１８は、精製タンパク質による実験を示し、ｓＫｌｏｔｈｏのＣ末端から約２０個のアミノ酸を欠失させることにより、ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドの活性が増加したという知見が再度得られている。図１８Ａは、ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３融合体（レーン２および３）の純度を示すタンパク質ゲルを示す。レーン１、サイズマーカー。図１８Ｂは、精製ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３融合体（ｓＫＦ−Ｔ）およびｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３融合体（ｓＫＦ）を使用するＥｇｒ−１アッセイを示す。タンパク質のＥＣ５０も同様に示す。これらの図および明細書において、用語ｓＫＦ−Ｔ、Ｋｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３、ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ  ｃ−２０−ＦＧＦ２３、ｋｌｏｔｈｏ（デルタＣ−２０）−ＦＧＦ２３、α−ｓＫｌｏｔｈｏ、ΔＣ２０−ＦＧＦ２３等は全て、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｃ末端から約２０個のアミノ酸がトランケーションされたα−ｓＫｌｏｔｈｏ、リンカー、およびＦＧＦ２３を含む融合ポリペプチドを示す。
【０３７９】
図１９は、ｓＫｌｏｔｈｏ  ｄｅｌ（欠失）Ｃ−２０およびマウス血清アルブミンを含む融合ポリペプチドがＥｇｒ−１アッセイにおいて有効性を有することを示す。融合ポリペプチドをコードする発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、融合ポリペプチドを発現させた。
【０３８０】
図１７および１８に例証する実験に使用したｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）−ＦＧＦ２３融合体は、配列番号８０のアミノ酸配列を有すると予想されたが、融合体のアミノ酸シークエンシングにより、ＰＣＲステップによって意図せずに２つの変異、すなわちＶ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅが導入された配列番号８２のアミノ酸配列を有することが示されたことに注意すべきである。これらの２つの変異は、欠失以外は野生型ｓＫｌｏｔｈｏ配列を有するｓＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０（ｄｅｌ  ｃ−２０）には存在しない。
【０３８１】
特に定義していない限り、本明細書において使用した科学技術用語は、本開示が属する技術分野を周知する専門家によって通常理解される意味と同じ意味を有する。
【０３８２】
特に定義していない限り、具体的に詳細に記述されていない全ての方法、ステップ、技術、および操作は、当業者に明白であるように、それ自体公知の様式で実施されている。例えば標準的なハンドブックおよび本明細書において言及した一般的背景、および本明細書において引用したさらなる参考文献を参照されたい。
【０３８３】
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的であり、以下に提供される。
【０３８４】
特定の実施形態および特許請求の範囲を本明細書において詳細に開示してきたが、これは単なる例示目的のための例として開示されており、添付の特許請求の範囲、または任意の対応する将来の出願の特許請求の範囲の主題の範囲を限定する意図はない。特に、様々な置換、変更、および改変を、特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲から逸脱することなく本開示に行ってもよいことが本発明者らによって企図される。目的の核酸出発材料またはクローンの選択は、本明細書に記述される実施形態の知識を有する当業者にとって慣例的問題であると考えられる。他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内であると考えられる。後に提出された対応する出願における特許請求の範囲の書き直しは、様々な国の特許法による限定に起因し得るが、特許請求の範囲の主題を放棄すると解釈すべきではない。
【０３８５】
配列表
ヒトＫｌｏｔｈｏ核酸配列（ＮＭ＿００４７９５）（配列番号１）
タンパク質コード領域：９〜３０４７位
【０３８６】
【化３】
2017537926.tif 000005
2017537926.tif 000006
Ｋｌｏｔｈｏアミノ酸配列（ＮＰ＿００４７８６）（配列番号２）
【０３８７】
【化４】
2017537926.tif 000007
β−Ｋｌｏｔｈｏ核酸配列（ＮＭ＿１７５７３７）（配列番号３）
タンパク質コード領域：９８〜３２３２位
【０３８８】
【化５】
2017537926.tif 000008
β−Ｋｌｏｔｈｏアミノ酸配列（ＮＰ＿７８３８６４）（配列番号４）
【０３８９】
【化６】
2017537926.tif 000009
2017537926.tif 000010
ヒトＫｌｏｔｈｏドメイン１（ＫＬ−Ｄ１）アミノ酸配列（配列番号５）
【０３９０】
【化７】
2017537926.tif 000011
ヒトＫｌｏｔｈｏドメイン２（ＫＬ−Ｄ２）アミノ酸配列（配列番号６）
【０３９１】
【化８】
2017537926.tif 000012
Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン（シグナル配列を有しない）アミノ酸配列（配列番号７）
【０３９２】
【化９】
2017537926.tif 000013
Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチドアミノ酸配列（配列番号８）
【０３９３】
【化１０】
2017537926.tif 000014
ＩｇＧシグナルペプチドアミノ酸配列（配列番号９）
【０３９４】
【化１１】
2017537926.tif 000015
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ポリペプチドリンカー核酸配列（配列番号１０）
【０３９５】
【化１２】
2017537926.tif 000016
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１１）
【０３９６】
【化１３】
2017537926.tif 000017
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１２）
【０３９７】
【化１４】
2017537926.tif 000018
（Ｇｌｙ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１３）
【０３９８】
【化１５】
2017537926.tif 000019
（ＧｌｙＧｌｙ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１４）
【０３９９】
【化１６】
2017537926.tif 000020
（ＧｌｙＳｅｒ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１５）
【０４００】
【化１７】
2017537926.tif 000021
（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１６）
【０４０１】
【化１８】
2017537926.tif 000022
（Ａｌａ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１７）
【０４０２】
【化１９】
2017537926.tif 000023
（ＡｌａＡｌａ）ポリペプチドリンカーアミノ酸配列（配列番号１８）
【０４０３】
【化２０】
2017537926.tif 000024
Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチド−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号１９）
【０４０４】
【化２１】
2017537926.tif 000025
2017537926.tif 000026
ＩｇＧシグナルペプチド−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号２０）
【０４０５】
【化２２】
2017537926.tif 000027
ＫＬ−Ｄ１−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号２１）
【０４０６】
【化２３】
2017537926.tif 000028
2017537926.tif 000029
ＫＬ−Ｄ２−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号２２）
【０４０７】
【化２４】
2017537926.tif 000030
（ＫＬ−Ｄ１）２−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号２３）
【０４０８】
【化２５】
2017537926.tif 000031
（ＫＬ−Ｄ２）２−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号２４）
【０４０９】
【化２６】
2017537926.tif 000032
2017537926.tif 000033
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインアミノ酸配列（配列番号２５）
【０４１０】
【化２７】
2017537926.tif 000034
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＫＬ−Ｄ１アミノ酸配列（配列番号２６）
【０４１１】
【化２８】
2017537926.tif 000035
2017537926.tif 000036
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＫＬ−Ｄ２アミノ酸配列（配列番号２７）
【０４１２】
【化２９】
2017537926.tif 000037
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−（ＫＬ−Ｄ１）２アミノ酸配列（配列番号２８）
【０４１３】
【化３０】
2017537926.tif 000038
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−（ＫＬ−Ｄ２）２アミノ酸配列（配列番号２９）
【０４１４】
【化３１】
2017537926.tif 000039
2017537926.tif 000040
ＦＧＦ１９核酸配列（ＮＭ＿００５１１７）（配列番号３０）
タンパク質コード領域（４６４〜１１１４位）
【０４１５】
【化３２】
2017537926.tif 000041
ＦＧＦ１９アミノ酸配列（ＮＰ＿００５１０８）（配列番号３１）
【０４１６】
【化３３】
2017537926.tif 000042
ＦＧＦ２１核酸配列（ＮＭ＿０１９１１３）（配列番号３２）
タンパク質コード領域１５１〜７８０位
【０４１７】
【化３４】
2017537926.tif 000043
ＦＧＦ２１アミノ酸配列（ＮＰ＿０６１９８６）（配列番号３３）
【０４１８】
【化３５】
2017537926.tif 000044
ＦＧＦ２３核酸配列（ＮＭ＿０２０６３８）（配列番号３４）
タンパク質コード領域１４７〜９０２位
【０４１９】
【化３６】
2017537926.tif 000045
2017537926.tif 000046
ＦＧＦ２３アミノ酸配列（ＮＰ＿０６５６８９）（配列番号３５）
【０４２０】
【化３７】
2017537926.tif 000047
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）アミノ酸配列（配列番号３６）
【０４２１】
【化３８】
2017537926.tif 000048
ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏドメイン１（ｂ−ＫＬ−Ｄ１）アミノ酸配列（配列番号３７）
【０４２２】
【化３９】
2017537926.tif 000049
ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏドメイン２（ｂ−ＫＬ−Ｄ２）アミノ酸配列（配列番号３８）
【０４２３】
【化４０】
2017537926.tif 000050
β−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン（シグナルペプチドを有しない）アミノ酸配列（配列番号３９）
【０４２４】
【化４１】
2017537926.tif 000051
シグナルペプチドを有しないｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３アミノ酸配列（シグナルペプチドを有しない）（配列番号４０）
【０４２５】
【化４２】
2017537926.tif 000052
シグナルペプチドを有しないｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）（シグナルペプチドを有しない）アミノ酸配列（配列番号４１）
【０４２６】
【化４３】
2017537926.tif 000053
シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（配列番号４２）
【０４２７】
【化４４】
2017537926.tif 000054
シグナルペプチドを有しないＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号４３）
【０４２８】
【化４５】
2017537926.tif 000055
Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチドを有するｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４４）
【０４２９】
【化４６】
2017537926.tif 000056
2017537926.tif 000057
ＩｇＧシグナルペプチドを有するｓＫｌｏｔｈｏ（配列番号４５）
【０４３０】
【化４７】
2017537926.tif 000058
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１（配列番号４６）
【０４３１】
【化４８】
2017537926.tif 000059
2017537926.tif 000060
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１（配列番号４７）
【０４３２】
【化４９】
2017537926.tif 000061
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２（配列番号４８）
【０４３３】
【化５０】
2017537926.tif 000062
2017537926.tif 000063
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２（配列番号４９）
【０４３４】
【化５１】
2017537926.tif 000064
2017537926.tif 000065
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ１（配列番号５０）
【０４３５】
【化５２】
2017537926.tif 000066
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１（配列番号５１）
【０４３６】
【化５３】
2017537926.tif 000067
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２（配列番号５２）
【０４３７】
【化５４】
2017537926.tif 000068
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２（配列番号５３）
【０４３８】
【化５５】
2017537926.tif 000069
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１１５６Ｑ、Ｃ１１８３Ｓ）のアミノ酸配列（配列番号５４）
ｓＫｌｏｔｈｏ：ａａ［アミノ酸］１〜９８２位；リンカー１：アミノ酸９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：アミノ酸１００２〜１２２８位
【０４３９】
【化５６】
2017537926.tif 000070
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１１５６Ｑ、Ｃ１２２１Ｓ）のアミノ酸配列（配列番号５５）
ｓＫｌｏｔｈｏ：１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位
【０４４０】
【化５７】
2017537926.tif 000071
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１１５６Ｑ、Ｃ１１３３Ａ）のアミノ酸配列（配列番号５６）
ｓＫｌｏｔｈｏ：１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位
【０４４１】
【化５８】
2017537926.tif 000072
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１１５６Ｑ、Ｃ１１８３Ｓ、Ｃ１２２１Ｓ）のアミノ酸配列（配列番号５７）
ｓＫｌｏｔｈｏ：１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位
【０４４２】
【化５９】
2017537926.tif 000073
ｓＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３（Ｒ１１５６Ｑ、Ｃ１１８３Ｓ、Ｃ１２２１Ｓ、Ｑ１１３３Ａ）のアミノ酸配列（配列番号５８）
ｓＫｌｏｔｈｏ：１〜９８２位；リンカー１：９８３〜１００１位；ＦＧＦ２３：１００２〜１２２８位
【０４４３】
【化６０】
2017537926.tif 000074
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ；Ｃ２０６Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列（配列番号５９）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位
【０４４４】
【化６１】
2017537926.tif 000075
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列（配列番号６０）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位
【０４４５】
【化６２】
2017537926.tif 000076
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｑ１５６Ａ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列（配列番号６１）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位
【０４４６】
【化６３】
2017537926.tif 000077
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列（配列番号６２）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位
【０４４７】
【化６４】
2017537926.tif 000078
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｑ１５６Ａ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列（配列番号６３）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４８２位
【０４４８】
【化６５】
2017537926.tif 000079
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２０６Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６４）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４４９】
【化６６】
2017537926.tif 000080
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６５）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５０】
【化６７】
2017537926.tif 000081
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｑ１５６Ａ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６６）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５１】
【化６８】
2017537926.tif 000082
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２０４Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６７）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５２】
【化６９】
2017537926.tif 000083
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｑ１５６Ａ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６８）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５３】
【化７０】
2017537926.tif 000084
【０４５４】
以下の配列において、ＦＧＦ２３における特定の変異（例えば、Ｙ１５４Ｄ、Ｙ１５４Ｃ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）を下線で示す。
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号６９）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５５】
【化７１】
2017537926.tif 000085
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号７０）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５６】
【化７２】
2017537926.tif 000086
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｃ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号７１）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５７】
【化７３】
2017537926.tif 000087
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｃ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列（配列番号７２）
ＦＧＦ２３：１〜２５１位；リンカー：２５２〜２５６位；ＦｃＬＡＬＡ：２５７〜４７３位
【０４５８】
【化７４】
2017537926.tif 000088
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のヌクレオチド配列（配列番号７３）
【０４５９】
【化７５】
2017537926.tif 000089
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｄ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のヌクレオチド配列（配列番号７４）
【０４６０】
【化７６】
2017537926.tif 000090
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｃ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のヌクレオチド配列（配列番号７５）
【０４６１】
【化７７】
2017537926.tif 000091
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ、Ｙ１５４Ｃ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のヌクレオチド配列（配列番号７６）
【０４６２】
【化７８】
2017537926.tif 000092
ＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０：α−ｓＫｌｏｔｈｏΔＣ２０
【０４６３】
【化７９】
2017537926.tif 000093
２つの変異を有するＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０：Ｖ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅ（下線）を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏΔＣ２０
【０４６４】
【化８０】
2017537926.tif 000094
ＫｌｏｔｈｏデルタＣ−２０−ＦＧＦ２３：α−ｓＫｌｏｔｈｏΔＣ２０（太字でもイタリック体でもない）；リンカー（イタリック体）；ＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ（太字、イタリック体ではない）
【０４６５】
【化８１】
2017537926.tif 000095
Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３：α−ｓＫｌｏｔｈｏ（太字でもイタリック体でもない）；リンカー（イタリック体）；ＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ（太字、イタリック体ではない）
【０４６６】
【化８２】
2017537926.tif 000096
Ｋｌｏｔｈｏ（２つの変異を有する）−ＦＧＦ２３：Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチド（太字、イタリック体）；Ｖ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅ（下線）を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ（太字でもイタリック体でもない）リンカー（イタリック体）；ＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ（太字、イタリック体ではない）
【０４６７】
【化８３】
2017537926.tif 000097
Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ２３：Ｋｌｏｔｈｏシグナルペプチド（太字、イタリック体）；Ｖ５６３ＡおよびＫ７９５Ｅ（下線）を有するα−ｓＫｌｏｔｈｏ（太字でもイタリック体でもない）リンカー（イタリック体）；ＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ（太字、イタリック体ではない）
【０４６８】
【化８４】
2017537926.tif 000098
プライマー
５’プライマー
【０４６９】
【化８５】
2017537926.tif 000099
３’プライマー
【０４７０】
【化８６】
2017537926.tif 000100
2017537926.tif 000101
Ｋｌｏｔｈｏ−血清アルブミン融合体：ヒト可溶性Ｋｌｏｔｈｏおよびマウス血清アルブミン融合タンパク質：ヒトＫｌｏｔｈｏシグナルペプチド（太字、イタリック体、ＭＰＡＳ（配列番号１１６）から始まる）；ヒトＫｌｏｔｈｏ（太字でもイタリック体でもない、ＥＰＧＤ（配列番号１１７）から始まる）；リンカー（イタリック体、ＧＳＧＧ（配列番号１１３）から始まる）；マウスアルブミン（太字、下線、ＬＫＥＡ（配列番号１１４）から始まる）
【０４７１】
【化８７】
2017537926.tif 000102
【図１−１】
2017537926.tif 000104
【図１−２】
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【図２−１】
2017537926.tif 000106
【図２−２】
2017537926.tif 000107
【図２−３】
2017537926.tif 000108
【図２−４】
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【図２−５】
2017537926.tif 000110
【図２−６】
2017537926.tif 000111
【図２−７】
2017537926.tif 000112
【図２−８】
2017537926.tif 000113
【図２−９】
2017537926.tif 000114
【図２−１０】
2017537926.tif 000115
【図２−１１】
2017537926.tif 000116
【図２−１２】
2017537926.tif 000117
【図２−１３】
2017537926.tif 000118
【図２−１４】
2017537926.tif 000119
【図２−１５】
2017537926.tif 000120
【図２−１６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2017537926.tif 000126
【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2017537926.tif 000139
【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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