(57)【要約】  本発明は、膵内分泌細胞の製造方法およびこの方法を用いて入手された膵内分泌細胞の使用に関する。上記方法では、例えば、移植を目的として、阻害剤または因子の組み合わせを用いて、内分泌系材料の量を増加させている。【選択図】  図１
2017521089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外リプログラミング方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、インスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、（ｉ）ＰＡＸ４を含む１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理し、（ｉｉ）ＡＲＸの発現および／または機能を阻害することを含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の転写因子は、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３およびＭＡＦＡをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）で得られた前記β様細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）で得られた前記β様細胞は、成人膵島におけるインスリンタンパク質の少なくとも５％のレベルでインスリンタンパク質を産生する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＲＸの発現が阻害される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いてＡＲＸの発現が阻害される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡによってＡＲＸの発現が阻害される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
生体外リプログラミング方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、グルカゴンｍＲＮＡを発現するα様細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することを含み、
前記転写因子は、下記の組み合わせ、すなわち、
（ｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＫＸ６．１、
（ｉｉ）ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、
（ｉｉｉ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、
（ｉｖ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、ＮＤ１ならびに
（ｖ）ＭＡＦＡ
のうち１つ以上を含む、方法。
【請求項９】
生体外リプログラミング方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、ソマトスタチンｍＲＮＡを発現するδ様細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することを含み、
前記転写因子は、下記の組み合わせ、すなわち、
（ｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＤ１、
（ｉｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＮＤ１、
（ｉｉｉ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６、ＮＤ１ならびに
（ｉｖ）ＭＡＦＡ
のうち１つ以上を含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞は、前記方法を通して、ラミニン上で培養される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リプログラミングの間、前記細胞は、濃度が０〜５ｍＭのグルコースで培養される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リプログラミングの前に、接着培養で前記細胞を培養する工程を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
接着培養による前記培養は約２日間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）で供給された前記膵細胞は、ヒト膵細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）で供給された前記膵細胞は、外分泌細胞を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）で供給された前記膵細胞は、膵臓の外分泌系に富む画分に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リプログラミングは、前記転写因子で処理する前に、上皮間葉移行の阻害剤で前記細胞を前処理する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記前処理は、上皮間葉移行の阻害剤として、ＴＧＦβ１シグナル伝達経路の阻害剤を用いる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記前処理は、上皮間葉移行の阻害剤として、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（Ｒｏｃｋ）シグナル伝達経路の阻害剤を用いる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記前処理は、Ｒｏｃｋシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦβ１シグナル伝達経路の阻害剤の両方を用いる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リプログラミングは、前記転写因子で処理する前に、クロマチン修飾剤で前記細胞を前処理する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記前処理は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記前処理は、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤として、５−アザ−２’デオキシシチジンを用いる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記前処理は、前記ＨＤＡＣ阻害剤として、酪酸ナトリウムを用いる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記前処理は、クロマチン修飾剤および上皮間葉移行の阻害剤を同時に用いる、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写因子は、前記細胞内で発現する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アデノウイルスベクターを用いて、前記転写因子をコードする核酸が導入される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ、２つまたは全てを含む培地で前記細胞を培養する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ、２つまたは全てを含む培地における前記細胞の前記培養は、１つ以上の転写因子による前記細胞の前記処理と重複する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記リプログラミングは、亜鉛による処理を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記リプログラミングは、ＺｎＣｌ2による処理を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記亜鉛による処理は、前記１つ以上の転写因子による処理と同時に行われる、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
膵細胞からインスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞へのリプログラミングを向上するための亜鉛の使用であって、前記膵細胞がＰＡＸ４で処理され、且つＡＲＸの発現および／または機能が阻害される、亜鉛の使用。
【請求項３４】
前記膵細胞は、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法によって処理される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
膵細胞からインスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞へのリプログラミングを向上するためのＡＲＸ阻害剤の使用であって、前記膵細胞がＰＡＸ４で処理される、ＡＲＸ阻害剤の使用。
【請求項３６】
ラミニン上で前記細胞を培養することと組み合わされる、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
グルコース濃度０〜５ｍＭで前記細胞を培養することと組み合わされる、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記膵細胞は、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３およびＭＡＦＡでも処理される、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法によって入手された、または入手可能な膵細胞集団。
【請求項４０】
請求項１〜７および請求項１〜７に従属する限りにおいて請求項１０〜３２のいずれか１項に記載の方法によって入手された、または入手可能なβ様細胞集団。
【請求項４１】
請求項４０に記載のβ様細胞の使用を含む、患者の糖尿病の治療方法。
【請求項４２】
前記患者に前記β様細胞を移植することを含む、請求項４１に記載の治療方法。
【請求項４３】
前記細胞は、１つ以上の免疫抑制剤とともに前記患者に移植される、請求項４２に記載の治療方法。
【請求項４４】
前記糖尿病は１型糖尿病である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項４５】
請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の治療方法で用いられる、請求項３３に記載の前記細胞集団の一部または全部である膵細胞。
【請求項４６】
糖尿病治療薬剤の調製における、請求項３３に記載の前記細胞集団の一部または全部である膵細胞の使用。
【請求項４７】
前記治療は、請求項４１〜４４のいずれか１項で規定されている、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、
（ｉ）ＡＲＸ阻害剤と、
（ｉｉ）ＰＡＸ４またはこれをコードする核酸とを含み、且つ必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記請求項に規定されている１つ以上の転写因子またはこれをコードする核酸、
（ｉｖ）ラミニン、
（ｖ）ＴＧＦβ１シグナル伝達経路の阻害剤、
（ｖｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、
（ｖｉｉ）ベータセルリン、エキセンジン−４および／またはニコチンアミド、
（ｖｉｉｉ）前記方法に用いる指示書のうち１つ以上、とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵内分泌細胞の製造方法およびこの方法を用いて入手された膵内分泌細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、今や、世界の成人人口の約６％が罹患しており、世界的に蔓延する病気と認識されている。国際糖尿病連合グローバルアトラスによると、その患者数は、２０１１年には３億６千６百万人であり、２０３０年には５億５千２百万人にまで増加すると予測されている。
【０００３】
この病気には、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）という主に２つの病型が存在する。そのどちらも、ランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞数の減少に関連している。
【０００４】
Ｔ１Ｄは、活性化したＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球が膵島に浸潤し、β細胞を選択的に破壊する自己免疫疾患である。通常は幼少期および思春期に発症するが、何歳でも発症しうる。β細胞の破壊は、発症の３〜４年前に始まっており、発症時にはβ細胞塊の最大７０〜８０％がアポトーシスによって失われている。Ｔ１Ｄは、糖尿病の症例のうち５〜１０％を占める。
【０００５】
Ｔ２Ｄは、インスリン抵抗性およびβ細胞の不全が組み合わさった結果発症するものであり、一般に過体重または肥満であることに関連する。インスリンの作用不全により、グルコースおよび脂肪酸の血中濃度が上昇し、次いでβ細胞の機能が影響を受け、やがては炎症性機序によってβ細胞のアポトーシスが増加するため、その治療は特に困難である。患者の大半は中年または高齢者であるが、小児肥満症の増加に伴い、必然的にＴ２Ｄの発症年齢は低下している。
【０００６】
Ｔ１Ｄの場合、自己免疫が確立する前に病気の予防に向けて行われる免疫介入から治療法が生まれることが期待されている（ThrowerおよびBingley、２０１１）。免疫療法の標的がいくつか同定されてきているが、ワクチンの実用化試験を準備し評価するのには、いまだ大きな課題がある（Skyler、２０１３）。
【０００７】
一方、一般的には、閉ループ送達システムまたは膵島移植を重視した、インスリン療法の改善が今後の最良の方法であると受け入れられている。閉ループ送達システムを装着した患者および膵島移植を受けた患者の連続的グルコース監視データの比較により、閉ループ送達システムは、膵島移植によって達成することのできる制御レベルや低血糖時の安定した意識回復には近づき得ないことが示されている。
【０００８】
膵島移植は、主に、膵炎患者の膵臓摘出後の同系移植に関連して、１９９０年代初期から存在している（McCallおよびShapiro、２０１２）。同系膵島移植の成功率は比較的良好であるが、Ｔ１Ｄを治療するためのドナー膵島の同種異系移植は、当初から、１年後に機能している移植片は８％であるという成功率の低さに悩まされている。これは、エドモントンプロトコールが２０００年に導入されたことにより変化した。エドモントンプロトコールとは、十分に多くの膵島を移植すること、冷却虚血時間を最小限に抑えること、および免疫抑制療法を変化させること、特に、膵島細胞機能に影響を与えることが知られているステロイドの使用を回避することを重視したものである（Shapiroら、２０００）。
【０００９】
エドモントンプロトコールが確立されたことから、膵島移植は、１型糖尿病の効果的且つ実行可能な治療の選択肢となった。膵島移植は、無自覚性低血糖（hypoglycemic unawareness）に陥る危険性が低いので、１型糖尿病にとって、インスリンに代わる最良の治療法として受け入れられている。しかし、インスリン非依存性を達成するために、膵島移植には、通常、複数のドナーが必要となる（Shapiroら、２０００）。
【００１０】
ドナー膵島の不足により、インスリン産生細胞の新たな供給源および移植用の膵島の補充可能な供給（replenishable supplies）に向けた研究が推進されてきた。
【００１１】
β細胞の補充可能な供給を発展させるために考えられるいくつかの方策がある。これらの方策の一つとして、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からβ細胞系統への分化誘導によるもの、膵臓発生時に作動するシグナル伝達経路を模倣する試みによるものが挙げられる（Alipioら、２０１０；Blumら、２０１２；Choら、２０１２；D'Amourら、２００６；Jiangら、２００７；Jiangら、２００７；Kroonら、２００８；Rezaniaら、２０１１；Rezaniaら、２０１２；Schulzら、２０１２；Tateishiら、２００８）。
【００１２】
他の方策として、１つの完全に分化した成熟細胞型を他の細胞型に分化転換またはリプログラミングすることが挙げられる（Docherty、２０１１）。従って、肝臓（Ferberら、２０００；Kojimaら、２００３；Yechoorら、２００９）、骨髄（Karnieliら、２００７）、脂肪組織（Chandraら、２０１１）および臍帯由来の細胞（Wangら、２０１１）からインスリン産生細胞を生成することができる。
【００１３】
生体内（in vivo）および試験管内（in vitro）でマウスの膵外分泌細胞をリプログラミングして（Ogiharaら、２００８）、表現型的にβ細胞に類似したインスリン産生細胞にすることができる。マウスモデルに適用された上記方策の大部分は、正常な内分泌性膵臓発生（endocrine pancreatic development）にとって重要な膵臓転写因子の外因性発現を伴うものだった（Akinciら、２０１２；Limaら、２０１２）。マウスの膵臓の外分泌細胞に３つの転写因子ＰＤＸ１、ＮＧＮ３およびＭＡＦＡが発現すると、生体内において、これらの細胞はβ細胞系統に分化転換されたが（Zhouら、２００８）、同じ転写因子によって試験管内で機能性β細胞を生成することはできなかった（Akinciら、２０１２）。また、さらなる研究の結果、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４またはＩＡ−１等のさらなる転写因子（Akinciら、２０１２；Limaら、２０１２；Ogiharaら、２００８）、ならびにベータセルリン、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦ等の成長因子（Baeyensら、２００５；Zhangら、２０１２）も、試験管内で分化転換された機能性β細胞を生成するのに重要である可能性が示されている。
【００１４】
従来、試験管内において、膵島単離手順（islet isolation procedure）から得られた成人の外分泌膵臓の細胞を、どのようにして機能性β様細胞にリプログラミングできるかについて記載されている（Limaら、２０１３）。胞状細胞が培地に置かれると、遺伝系統追跡（genetic lineage tracing）によって証明されているように、胞状細胞は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を経て、単層の間葉細胞を形成する。４つの膵臓転写因子（ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４およびＭＡＦＡ）を強制発現させた後、成長因子であるベータセルリン、エキセンジン−４、ビタミン（ニコチンアミド）および転写因子のＤＮＡ結合を促進する小分子とともに培養することにより、効率的なリプログラミングが実現された。
【００１５】
該プロトコールにより、試験管内および生体内において、膵臓のα細胞と同様の方法でグルコースに応答するグルカゴン陽性細胞が主に生成されることが示された。また、これらの研究によれば、ＴＧＦ−β１およびＲｈｏキナーゼのシグナル伝達経路の阻害剤を用いてＥＭＴを抑制することにより、膵外分泌細胞から機能性インスリン産生細胞へのリプログラミングをさらに向上させることが可能であることが示された。得られた細胞をストレプトゾトシン糖尿病マウスモデルに移植したところ、グルコースに応答してインスリンを分泌し、糖尿病の発症を予防することに成功した。しかし、Limaら（２０１３）の方法によってリプログラミングされた細胞は、成体の成熟した膵島におけるインスリンレベルの１％しか発現しない。
【００１６】
それにもかかわらず、内分泌系（膵島）材料を得るための新たな方法が当該技術分野に貢献するであろうことが分かる。内分泌系（膵島）材料にはインスリン分泌β細胞が含まれるが、これに限定されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、とりわけ、膵内分泌細胞を入手するための方法、使用およびキットを提供する。従って、本発明は、とりわけ、移植に用いる内分泌系材料の量を増加させるのに有用である。
【００１８】
下記の実施例にて詳述されているように、本発明者らは、意外にも、ＡＲＸを阻害することにより、ＰＡＸ４の存在下で、ヒト外分泌由来細胞（exocrine-derived cells）からβ細胞へのリプログラミングを向上することができることを立証した。実施例では、試験管内で生成されたヒトβ細胞のグルコース感受性の機能にとって、膵臓発生の最終段階におけるＡＲＸとＰＡＸ４との調節ループ（regulatory loop）が不可欠であることが示されている。
【００１９】
本発明者らは、ヒト外分泌細胞から、１型糖尿病のための今後の細胞療法に用いられる可能性がある、成熟したグルコース応答性β様細胞に分化転換する際に、ＡＲＸの阻害が、ＰＡＸ４の過剰発現とともに、極めて重要であることを初めて立証した。
【００２０】
本発明者らは、Limaら（２０１３）のプロトコールによって生成された細胞は、成体の成熟した膵島におけるインスリンレベルの１％しか発現しないことを明らかにしている。これに反して、本明細書に記載される方法を用いて生成されたβ様細胞では、成人の細胞の約１５％というはるかに高いレベルでインスリンを産生することができることを示した。
【００２１】
特定の理論に限定されることなく、本発明者らは、成熟した膵島と、Limaらにより生成されたような分化転換／リプログラミングされた細胞との間にインスリン発現の違いが観察されたのは、後者が成体膵島と同じ成熟状態に至っていなかったからであろうと考える。
【００２２】
本発明者らは、α細胞およびβ細胞を含む他の内分泌細胞へのリプログラミングを促進する転写因子の組み合わせも確認した。
【００２３】
従来、マウスの膵臓を発達させる上で、転写因子であるＰＡＸ４とＡＲＸとの相互作用は、β細胞系統およびα細胞系統の最終的な成熟において、重要な役割を果たすことが示されている（Collombatら、２００３）。β細胞系統は、（一つには）ＰＡＸ４によってＡＲＸが阻害されることで、確立される（Collombatら、２００３）。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、開始細胞（例えば、外分泌系に富む画分（exocrine enriched fraction）からの細胞等の膵細胞）をリプログラミングすることにより、膵内分泌細胞を取得する方法を提供する。本発明において、リプログラミング方法は、細胞の分化転換方法として称されることもある。
【００２５】
本発明は、一般に、生体外（ex-vivo）リプログラミング方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、膵内分泌細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することを含む、方法に関する。
【００２６】
従って、本発明は、一般に、膵細胞を生体外でリプログラミングして内分泌細胞を形成する方法であって、１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することを含む方法に関する。
【００２７】
本発明は、一般に、膵内分泌細胞集団の入手方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、膵内分泌細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することを含む、方法を提供する。
【００２８】
前記転写因子は、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１およびＮＤ１のうち１つ以上を含む。
【００２９】
本発明の方法において、処理された細胞を特定の系統に沿って誘導する、または特定の結果を得られやすくするために、転写因子と好適な培養条件（適切な阻害剤、基質およびグルコース濃度を含む）との組み合わせを用いてもよい。その結果、膵臓の様々な種類の上皮細胞を生成することが可能になる。また、選択された転写因子を阻害しても、処理された細胞を特定の系統に沿って同様に誘導することができる。
【００３０】
本発明の一態様において、得られた細胞はβ様細胞である。
【００３１】
本発明は、生体外リプログラミング方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、β様細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、ｉ）ＰＡＸ４を含む１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理し、（ｉｉ）ＡＲＸの発現および／または機能を阻害することを含む、方法を提供する。
【００３２】
本発明は、膵細胞を生体外でリプログラミングしてβ様細胞を形成する方法であって、
ａ）ＰＡＸ４を含む１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理することと、
ｂ）ＡＲＸの発現および／または機能を阻害することとを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明は、β様細胞集団の入手方法であって、
ａ）リプログラミングされる膵細胞を供給することと、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることと、
ｃ）これによって、β様細胞を入手することとを含み、
前記リプログラミングは、（ｉ）ＰＡＸ４を含む１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理し、（ｉｉ）ＡＲＸの発現および／または機能を阻害することを含む、方法を提供する。
【００３４】
β様細胞の入手方法において、前記転写因子は、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３およびＭＡＦＡを含んでもよい。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明は、ヒト膵外分泌細胞を生体外でリプログラミングして機能性インスリン分泌β細胞にする方法であって、ＰＡＸ４で前記ヒト膵外分泌細胞を処理することと、ＡＲＸを阻害することとを含み、前記細胞は、低グルコースで、且つラミニン上で培養される方法に関する。
【００３６】
本発明は、膵細胞（外分泌細胞等）からβ様細胞へのリプログラミングを向上するためのＡＲＸ阻害剤の使用にも関する。ＡＲＸ阻害剤は、本明細書に記載されるリプログラミング方法における、因子および作用物質（factors and agents）を含む条件とともに用いられてもよい。ＡＲＸ阻害剤は、ＡＲＸの発現および／または機能を阻害することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、リプログラミングを向上させるために、亜鉛で細胞を処理する。
【００３８】
本発明は、膵細胞をリプログラミングして、グルカゴンｍＲＮＡを発現するα様細胞を入手する方法も提供する。この方法において、前記リプログラミングは、下記の組み合わせ、すなわち、
（ｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＫＸ６．１、
（ｉｉ）ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、
（ｉｉｉ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、
（ｉｖ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、ＮＤ１ならびに
（ｖ）ＭＡＦＡ
のうち１つを含む転写因子で前記膵細胞を処理することを含んでもよい。
【００３９】
本発明は、膵細胞をリプログラミングして、ソマトスタチンｍＲＮＡを発現するδ様細胞を入手する方法も提供する。この方法において、前記リプログラミングは、下記の組み合わせ、すなわち、
（ｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＤ１、
（ｉｉ）ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＮＤ１、
（ｉｉｉ）ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６、ＮＤ１ならびに
（ｉｖ）ＭＡＦＡ
のうち１つを含む転写因子で前記膵細胞を処理することを含んでもよい。
【００４０】
（出発材料の例）
本発明は、一般に、適切な細胞集団を膵細胞の表現型、特に膵内分泌細胞の表現型にリプログラミングする方法を提供する。出発細胞集団は、多能性幹細胞でも、他の幹細胞または前駆細胞でもよいが、実施例にて詳述されているように、本発明者らは、特に、膵外分泌細胞を膵内分泌細胞にリプログラミングできることを立証した。上記細胞は、好ましくは外分泌細胞である。
【００４１】
細胞は哺乳類細胞（霊長類、齧歯類、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ等）であればどれでもよいが、本発明の方法で用いられる細胞は、好ましくはヒト膵細胞、例えば、上皮細胞である。好ましい実施形態において、本発明の方法で用いられる細胞は、膵外分泌細胞を含む。本発明で用いられる外分泌細胞は、例えば、ヒトのドナー膵臓から得ることができる。
【００４２】
好ましい出発材料は、膵臓の外分泌系に富む画分（exocrine enriched fraction）（ＥＥＦ）である。ＥＥＦは、例えば、エドモントンプロトコールで用いられる膵島単離手順の副産物でもよい。ＥＥＦは、コラゲナーゼで膵臓組織を消化した後、遠心分離工程によって膵島に富む画分（islet enriched fraction）と外分泌系に富む画分とを分離する方法で得ることができる。
【００４３】
膵臓の出発材料として、導管細胞が含まれてもよい。使用前に、細胞を継代するか、さもなければ増殖させてもよい。
【００４４】
本発明の方法を実施するために、出発細胞集団は、本明細書に記載される条件下で、生体外で培養される。
【００４５】
（生成物の例）
上述のように、本明細書に開示されている方法によれば、例えば、インスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞を含む、内分泌細胞を入手することができる。β様細胞は、内因性β細胞（β細胞）の特性をある程度備えているため、インスリンｍＲＮＡの発現またはタンパク質の産生等のβ細胞のマーカーによって同定することができる。ＥＬＩＳＡを用いて、インスリンタンパク質の産生をモニターしてもよい。Ｃペプチドの産生をモニターすることにより、インスリンの産生をモニターすることができる。
【００４６】
従って、いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて入手された細胞は、インスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞である。好ましい実施形態において、β様細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態において、得られたβ様細胞は、成人膵島におけるインスリンの少なくとも５％のレベルでインスリンを発現する。例えば、得られたβ様細胞は、同じ条件下で、成人膵島におけるインスリンの少なくとも５％、６％、７％、８％、９％。１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％または３０％のレベルでインスリンを産生することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で入手されたβ様細胞は、グルコース刺激に応答してＣペプチドを産生する。
【００４８】
得られたβ様細胞は、成人膵島におけるＣペプチドの少なくとも５％、１０％または１５％のレベルでＣペプチドを産生することができる。例えば、得られたβ様細胞は、同じ条件下で、成人膵島におけるＣペプチドの少なくとも５％、６％、７％、８％、９％。１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％または３０％のレベルでＣペプチドを産生することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を用いることにより、グルカゴンｍＲＮＡを発現するα様細胞を入手することができる。α様細胞は、グルカゴンタンパク質を発現することもある。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を用いることにより、ソマトスタチンｍＲＮＡを発現するδ様細胞を入手することができる。δ様細胞は、ソマトスタチンタンパク質を発現することがある。
【００５１】
本発明における分化（およびリプログラミング）を示す他のマーカーとして、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ，ＮＫＸ６．１およびＮＤ１等の内分泌発現因子（endocrine expression factors）の内因性発現、ならびにＥ−カドヘリンおよびＥＰＣＡＭ等の上皮マーカーの発現が含まれる。さらに、細胞は、形態移行（morphological transition）を経て、より丸みを帯びた上皮形態になることがある。本発明の方法で入手された細胞は、これらのマーカーの１つ以上、または所望の細胞産物と関連した他のマーカーを有してもよい。
【００５２】
次に、本発明のいくつかの実施形態および態様について、更に詳細に論じる。本明細書の小見出しはいずれも、便宜上つけられただけであって、いかなる点においても本開示を制限することを意図するものではない。
【００５３】
（転写因子の使用）
本発明の方法において、細胞のリプログラミング処理として、１つ以上のリプログラミング転写因子による処理が含まれる。すなわち、細胞は、（外因性）転写因子の存在下で、３〜１０日間、例えば、４〜９日間または５〜８日間培養されてもよい。例えば、細胞は、転写因子とともに７日間培養されてもよい。
【００５４】
本発明の方法において、転写因子による処理には、転写因子の１つ以上を発現または供給する核酸調製物またはタンパク質調製物を細胞に導入することが含まれてもよい。
【００５５】
本発明の方法において、細胞の処理には、本明細書に記載される組み合わせの１つ以上の転写因子からなるタンパク質調製物の存在下で、細胞を培養することが含まれてもよい。上記方法がタンパク質調製物とともに細胞を培養することを含む場合、培養により、細胞に分化調節因子（differentiation modulating factors）を取り込ませることが可能になる。
【００５６】
別の実施形態において、１つ以上の転写因子による細胞の処理として、細胞内で転写因子を発現させることが含まれる。このための適切な発現ベクターの例について、以下、より詳細に説明する。
【００５７】
上記方法のいくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子による細胞の処理として、細胞と転写因子のタンパク質調製物とを接触させることが含まれる。
【００５８】
「・・・存在下で細胞を培養する」、「・・・を含む培地で細胞を培養する」、「・・・で細胞を処理する」、「・・・と細胞とを接触させる」、および「・・・を細胞に導入する」という表現は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、区別なく用いられる。
【００５９】
「細胞内で・・・を発現させる」という表現は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本発明の方法の工程において「・・・を発現する核酸を導入する」と区別なく用いられる。
【００６０】
転写因子は、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ，ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１およびＮｅｕｒｏＤ１（ＮＤ１）から選択される１つ以上の転写因子を含む。好ましい実施形態において、ヒト転写因子が用いられる。
【００６１】
ヒト転写因子ならびにそれらのタンパク質配列およびヌクレオチド配列の詳細は、下記のように示される。
【００６２】
2017521089.tif 000003
【００６３】
転写因子の組み合わせにおいて、上記方法に必要とされる細胞の種類によって、異なる転写因子が用いられることが好ましい。
【００６４】
（β様細胞の生成）
上記方法を用いてβ様細胞を入手する場合、少なくともＰＡＸ４で膵細胞を処理する。
【００６５】
β様細胞の入手方法において、膵細胞の処理に用いられる転写因子の好ましい組み合わせとして、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４（条件２９）を含む組み合わせが含まれる。
【００６６】
最も好ましいのは、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４（条件２９）からなるか、または本質的にこれらからなる転写因子の組み合わせである。β様細胞の入手方法のいくつかの実施形態において、転写因子は、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４を含むが、ＮＫＸ６．１および／またはＮＤ１を含まない。
【００６７】
（ＡＲＸの阻害）
実施例において、ヒト外分泌細胞から成熟したグルコース応答性β様細胞に分化転換する際に、ＡＲＸの阻害が、ＰＡＸ４の過剰発現とともに、極めて重要であることが初めて立証された。
【００６８】
従って、本発明の方法において、細胞のリプログラミングは、ＰＡＸ４による細胞の処理と組み合わせて、ＡＲＸの発現および／または機能の阻害を含んでもよい。細胞は、またＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４（条件２９）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる転写因子で処理されることが好ましい。
【００６９】
ヒトＡＲＸならびにそのタンパク質配列およびヌクレオチド配列の詳細は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（受託番号：Ｑ９６ＱＳ３（バージョン１２０））およびＧｅｎｂａｎｋ（受託番号およびバージョン：ＮＭ＿１３９０５８．２）で知ることができる。
【００７０】
ＡＲＸの発現および／または機能の阻害には、遺伝子の転写、ＲＮＡの成熟、ＲＮＡの翻訳、タンパク質の翻訳後修飾およびタンパク質の標的への結合を阻害することが含まれてもよい。阻害は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたは化合物である阻害剤を用いて行われてもよい。
【００７１】
遺伝子または核酸の発現に関して用いられる際の「発現」なる語は、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（ｍＲＮＡ等）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物として、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化およびエディティング等のプロセスによって修飾されるメッセンジャーＲＮＡ、さらに、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化等によって修飾されたタンパク質（ＡＲＸ等）が含まれる。
【００７２】
ＡＲＸの発現は、転写、または対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸を用いることで阻害されてもよい。アンチセンス核酸は、ＡＲＸ配列の全てまたは一部、あるいはそれと相補的な配列の全てまたは一部を含み得る。アンチセンス配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ等）またはリボザイムであり得る。好ましい実施形態において、ＡＲＸの発現は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって阻害される。ウイルスベクター等のベクターを用いて、ＲＮＡを含む核酸を細胞に形質導入することができる。
【００７３】
ＡＲＸの発現を阻害する方法については、以下に詳述する。
【００７４】
ＡＲＸの阻害は、転写因子による処理中に行われてもよい。また、ＡＲＸの阻害は、リプログラミング方法の後期に行われてもよい。例えば、ＡＲＸの阻害は、転写因子による処理の開始から０〜１日後、１〜２日後、２〜３日後、３〜４日後または４〜５日後に行われてもよい。例えば、転写因子による処理の開始から約１日後、２日後、３日後、４日後または５日後でもよい。ＡＲＸの阻害は、転写因子による処理の開始から約３日後に行われてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＲＸの阻害は、リプログラミング工程の開始から約４日後、５日後、６日後または７日後に行われてもよく、例えば、リプログラミング工程の開始から６日後に行われてもよい。
【００７５】
（亜鉛による処理）
本発明者らは、亜鉛で細胞を処理することにより、本発明のリプログラミング方法における細胞のインスリンｍＲＮＡの発現量およびＣペプチドの含有量の両方が増加することを立証した。
【００７６】
従って、好ましい実施形態において、細胞は、亜鉛で処理される。例えば、細胞は、ＺｎＣｌ2で処理されてもよい。
【００７７】
亜鉛（ＺｎＣｌ2等）は、約０．１μＭ〜約１００μＭ、例えば、約１μＭ〜約２０μＭ、約５μＭ〜約１５μＭ、約８μＭ〜約１２μＭの濃度で添加されてもよい。亜鉛（ＺｎＣｌ2等）は、好ましくは約１０μＭの濃度で添加される。
【００７８】
亜鉛（ＺｎＣｌ2等）は、リプログラミング転写因子（ＰＡＸ４等）とともに（例えば、同時に）添加されてもよい。好ましい実施形態において、亜鉛は、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４とともに添加される。
【００７９】
亜鉛（ＺｎＣｌ2等）は、ＡＲＸの阻害とともに添加されてもよい。いくつかの実施形態において、リプログラミング転写因子による処理、ＡＲＸの阻害および亜鉛による処理を全て同時に行う。
【００８０】
別の態様において、本発明は、膵細胞からβ様細胞へのリプログラミングを向上するための亜鉛の使用に関し、リプログラミングは、本明細書に記載される因子および条件を用いて行われる。
【００８１】
（他の細胞）
本明細書に記載される方法を用いて、α様細胞を入手してもよい。このような方法において、膵細胞を処理する転写因子の好ましい組み合わせとして、
ＭＡＦＡおよびＮＧＮ３；
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡおよびＰＡＸ４；
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡおよびＮＧＮ３；
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４（条件２９）；
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＫＸ６．１（条件２８）；
ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件２３）；
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件１９）；
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、ＮＤ１（条件９）；または
ＭＡＦＡ（条件４）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる組み合わせが含まれる。
【００８２】
α細胞の入手方法に用いられる転写因子の好ましい組み合わせとして、
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＫＸ６．１（条件２８）；
ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件２３）；
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件１９）；または
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１およびＮＤ１（条件９）からなる組み合わせが含まれる。
【００８３】
特に好ましい組み合わせは、
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＫＸ６．１（条件２８）；
ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件２３）；
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件１９）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる組み合わせである。
【００８４】
最も好ましいのは、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１（条件１９）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる組み合わせである。
【００８５】
好ましいα様細胞の入手方法において、転写因子は、ＮＫＸ６．１を含む。
【００８６】
本明細書に記載される方法を用いて、δ様細胞を入手してもよい。このような方法において、膵細胞を処理する転写因子の好ましい組み合わせとして、
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４およびＮＤ１（条件２７）；
ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＮＤ１（条件２５）；
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１、ＮＤ１（条件９）；または
ＭＡＦＡ（条件４）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる組み合わせが含まれる。
【００８７】
好ましいδ様細胞の入手方法において、転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１を含む。
【００８８】
内分泌細胞を入手するのに用いられるリプログラミング転写因子の別の組み合わせとして、図１Ｃに示されている組み合わせが含まれる。従って、本発明の方法には、図１Ｃに示されている組み合わせを含むか、これらの組み合わせからなるか、または本質的にこれらの組み合わせからなる転写因子の組み合わせで細胞を処理することが含まれてもよい。
【００８９】
（培養）
上記因子に加えて、本明細書に記載される、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミド、ＥＭＴ阻害剤ならびにクロマチン修飾剤（chromatin modifying agents）を含む、可溶性因子（soluble factors）（ＳＦｓ）を用いてもよい。
【００９０】
本発明の方法は、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ以上の存在下で細胞を培養することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドの全て（ＢＥＮ）の存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ以上による処理が、転写因子を用いた培養に続いて行われる。いくつかの実施形態において、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ以上を用いた培養と転写因子を用いた培養とは、部分的に重なっている。いくつかの実施形態において、細胞は、転写因子ならびにベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ以上と同時に培養される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、細胞は、ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドのうち１つ以上の存在下で、３〜１０日間、例えば、４〜７日間、好ましくは６日間培養される。ベータセルリン、エキセンジン−４および／またはニコチンアミドは、転写因子による処理の開始から０〜３日後、例えば、約１日後、２日後または３日後に添加されてもよい。細胞は、転写因子による処理と部分的に重なっている期間、ベータセルリン、エキセンジン−４および／またはニコチンアミドの存在下で培養される。限定されない実施例により、細胞は、転写因子による処理と重複して、ＢＥＮとともに６日間培養されてもよい。
【００９２】
転写因子で処理された細胞に、ベータセルリン、エキセンジン−４および／またはニコチンアミドを添加した培地を加えてもよい。いくつかの実施形態において、培地は、約１日、２日または３日ごとに交換されるが、これよりも多いまたは少ない頻度で交換することもできる。
【００９３】
上皮細胞から間葉細胞への脱分化（上皮間葉移行（ＥＭＴ））を阻害するように、細胞を前処理してもよい。従って、いくつかの実施形態において、ＥＭＴ阻害剤、例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（Ｒｏｃｋ）のシグナル伝達経路および／または形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）のシグナル伝達経路の阻害剤で細胞を処理してもよい。いくつかの実施形態において、上記阻害剤は、低分子阻害剤である。
【００９４】
これに関連して、ＥＭＴ阻害剤は、脱分化阻害剤と称されることがあり、ＥＭＴまたは脱分化を抑制する因子である。
【００９５】
Ｒｏｃｋ経路の阻害剤の例として、Ｙ２７６３２（Ｙ２）（化学名：（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロライド；Uehata, Mら（１９９７）Nature 389(6654), 990-4）が挙げられる。Ｙ２は、例えば、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）カタログ番号Ｙ０５０３から入手可能である。
【００９６】
ＴＧＦβ１経路の阻害剤の例として、ＳＢ４３１５２（ＳＢ）（化学名：（４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物；Lapingら（２００２）Molecular Pharmacology 62(1), 58-64）が挙げられる。 ＳＢは、例えば、シグマアルドリッチカタログ番号Ｓ４３１７から入手可能である。
【００９７】
別のＴＧＦβ１経路の阻害剤として、ＳＢ５０５１２４（シグマアルドリッチカタログ番号Ｓ４６９６から入手可能）が挙げられる。
【００９８】
また、１つ以上のクロマチン修飾剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤で細胞を前処理してもよい。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の例としては、５−アザ−２’デオキシシチジン（Ａｚａ）が挙げられる。ＨＤＡＣ阻害剤の例としては、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤で細胞を前処理する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、上皮間葉移行の阻害剤およびクロマチン修飾剤を同時に用いて細胞を培養／前処理する。
【０１００】
前処理は、１つ以上の転写因子で細胞を処理する前に行われる。前処理は、１〜５日間、例えば、２〜４日間、好ましくは３日間行われてもよい。
【０１０１】
前処理の期間の最後に、細胞を洗浄してから転写因子で処理してもよい。
【０１０２】
エドモントンプロトコールの実施により、膵島単離手順の副産物として、ヒトの死体から得られた組織を利用しやすくなった。この外分泌系に富む画分が培養下に置かれると、急速に脱分化して間葉単層（mesenchymal monolayer）を形成し、形成された単層は２０以上の継代によって増大する（expand）ことができる（MontgomeryおよびYebra、２０１１）。
【０１０３】
このようなヒトの外分泌系または膵島に由来する間葉細胞の再分化により、β細胞数を増加させるためのいくつかの研究が試みられている（Barら、２０１２；Davaniら、２００７；Gershengornら、２００４；Haoら、２００６；Ouziel-Yahalomら、２００６）。膵島および外分泌系の両方の細胞源からグルコース応答性インスリン産生細胞を生成することに成功したにもかかわらず、分化転換された細胞の動物モデルにおける糖尿病を救う能力は依然として不明確である。
【０１０４】
本発明の方法では、細胞は、完全に間葉状態に入ることなく、外分泌細胞から内分泌細胞に直接リプログラミングされ得る。上述のように、本発明の方法は、細胞を培養して上皮間葉移行（ＥＭＴ）の初期段階を可能にしてから、ＥＭＴが完了する前にＥＭＴを阻害することを含んでもよい。
【０１０５】
従って、本発明の方法は、転写因子による処理の前に、接着培養で細胞を培養して付着させる工程を含んでもよい。すなわち、細胞は、転写因子で処理される前に、半日から７日までの間、接着培養によって培養されてもよい。
【０１０６】
好ましい実施形態において、本明細書に記載されているように、上皮間葉移行の阻害剤（例えば、Ｒｏｃｋシグナル伝達経路の阻害剤および／またはＴＧＦβ１シグナル伝達経路の阻害剤）による前処理の前に、半日から３日までの間、膵細胞を培養してもよい。前処理の前に、膵細胞を１〜２日間、例えば、約２日間培養することが好ましい。
【０１０７】
従って、本発明のいくつかの好ましい方法は、
ａ）接着培養で膵細胞を培養することと、その後、
ｂ）前記膵細胞をリプログラミングすることとを含み、
前記リプログラミングは、（ｉ）上皮間葉移行の阻害剤で前記膵細胞を前処理した後、（ｉｉ）１つ以上の転写因子で前記膵細胞を処理し、さらに必要に応じて（ｉｉｉ）ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミドで前記膵細胞を処理することを含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる方法である。
【０１０８】
細胞は、単層に培養されることが好ましい。好ましい培養時間ならびにグルコース濃度およびラミニンの存在等の好ましい培養条件は、本明細書中別項で詳述されている。
【０１０９】
本発明の方法において、無血清培地または血清含有培地で細胞を培養してもよい。細胞は、無血清培地（ＳＦＭ）で培養されることが好ましい。細胞は、上記方法を通して、ＳＦＭで培養されてもよい。また、リプログラミングを通して、すなわち、前処理工程以降、ＳＦＭで細胞を培養してもよい。培地は、１〜３日ごと、例えば、約１日、２日または３日ごとに交換すればよい。
【０１１０】
本発明者らは、ラミニン上で細胞を培養すると、細胞のリプログラミング効率が向上することを立証した（実施例および図４参照）。従って、本発明の好ましい実施形態において、細胞は、ラミニン上で、例えば、ラミニンで被覆されたプレート上で培養される。リプログラミング工程の間、好ましくは上記方法を通して、ラミニン上で細胞を培養してもよい。
【０１１１】
上記方法に用いられるラミニンは、複数のアイソフォームを含んでもよい。例えば、ラミニンは、アイソフォームＬＡＭ−１１１を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＬＡＭ−１１１は、上記方法に用いられるラミニンの最も多いアイソフォームである。ラミニンは、例えば、Engelbreth-Holm-Swarm （ＥＨＳ）マウス肉腫から得ることができる。
【０１１２】
本発明の一態様では、ラミニンを用いることにより、膵細胞（外分泌細胞等）から内分泌細胞（β様細胞等）へのリプログラミングを向上させている。ラミニンの使用は、本明細書に記載されるリプログラミング方法で用いられる、因子および作用物質を含む条件と併用されてもよい。
【０１１３】
最近のマウスでの研究によって、グルコース代謝が、β細胞の代償性増殖の重要な制御因子であることが示された（Poratら，２０１１）。Poratらは、解糖速度に応じて増殖を調整することを含む、β細胞の増殖およびその量の恒常性維持の機構を提案している。
【０１１４】
本発明者らは、低グルコースで細胞を培養すると、β細胞へのリプログラミングがさらに向上することを立証した（実施例および図５参照）。従って、本発明の一実施形態において、細胞は、低グルコース濃度で培養される。リプログラミング工程の間、または上記方法を通して、低グルコース濃度で細胞を培養してもよい。細胞は、好ましくはリプログラミング工程を通して、低グルコース濃度で培養される。例えば、細胞は、低グルコース濃度で、約５〜１５日間または７〜１２日間、例えば、約１０日間培養されてもよい。グルコースは、リプログラミング工程で用いられる培地（ＳＦＭ等）に添加すればよい。グルコース濃度レベルは、０〜５ｍＭの間であってもよく、例えば、０．５〜４．５ｍＭ、１〜５ｍＭ、１〜４．５ｍＭ、１〜４ｍＭ、１．５〜４．５ｍＭ、１．５〜４ｍＭの間であってもよい。特に、グルコース濃度は、２〜４．５ｍＭ、２〜４ｍＭ、２〜３ｍＭの間であってもよい。一実施形態において、細胞は、グルコース濃度が約２．５ｍＭの条件で培養される。
【０１１５】
一態様において、本発明は、膵細胞（外分泌細胞等）から内分泌細胞（β様細胞等）へのリプログラミングを向上するための低グルコース培養（例えば、濃度が５ｍＭ以下）の使用を提供する。低グルコース濃度での培養は、本明細書に記載されるリプログラミング方法で用いられる、因子および作用物質を含む条件と併用されてもよい。
【０１１６】
（臨床用途および他の用途）
本発明の方法で入手された内分泌細胞（β様細胞等）を用いて、好ましくは生体内または生体外でインスリンを産生することができる。
【０１１７】
本発明の方法で入手された内分泌細胞（α様細胞等）を用いて、好ましくは生体内または生体外でグルカゴンを産生することができる。
【０１１８】
本発明の方法で入手された内分泌細胞（δ様細胞等）を用いて、好ましくは生体内または生体外でソマトスタチンを産生することができる。
【０１１９】
本発明の方法で入手された内分泌細胞（β様細胞等）は、特に、糖尿病を治療する臨床現場で有用である。
【０１２０】
本発明の方法で入手された細胞集団は、直接用いられてもよいし、場合によっては、例えば、臨床用途の細胞集団を調製する工程、または細胞集団をある種の細胞（インスリンを産生可能な細胞等）で富化する工程等のさらなる工程に供してもよい。さらに、必要に応じて、使用のために細胞集団から上皮細胞の一部分を単離してもよい。
【０１２１】
従って、本発明は、例えば、患者の糖尿病治療等の治療による治療方法に用いるために、本明細書に記載される方法で入手された内分泌細胞（特にβ様細胞）を含む。
【０１２２】
疾患を治療することに関して本明細書で用いられる「治療」なる語は、通常、疾患の進行の阻害等の所望の治療効果が達成されるヒトの治療および治療法に関し、進行速度の低下、進行速度の停止、疾患の退行、疾患の改善、および疾患の治癒を含む。予防手段としての治療（すなわち、予防法、防止策）もまた含まれる。本明細書における「予防法」が、完全な成功、すなわち完全な防護または完全な防止に制限されると理解されるべきではない。むしろ、本文脈における予防法は、特定の疾患を遅らせるか、緩和するか、または予防するのに役立つことで健康を維持する目的で、症候性疾患を検出する前に施される手段を意味する。
【０１２３】
治療される患者は、糖尿病（と診断された）患者を含む。
【０１２４】
本発明における糖尿病の治療は、１型糖尿病の治療、または、例えば、膵臓切除後のインスリン欠乏に至る他の原因の治療であってもよい。治療は、２型糖尿病の治療であってもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、治療される患者は、Ｃペプチド陰性であってもよい。
【０１２６】
それに加えて、または、その代わりに、患者は、重篤な低血糖の症状を発症しているか、または発症したことがあり、ならびに／あるいは切迫低血糖の症状を感知する能力が低くてもよい。
【０１２７】
治療に効果的な量の細胞を送達することができる。
【０１２８】
本明細書で用いられる「治療に効果的な量」なる語は、所望の治療法に従って投与される際に、低血糖を自覚する等の所望の治療効果を生じるのに効果的な受容体またはリガンドの量、または外部インスリンの必要性に依存しない、適度な恩恵／リスク比に相応な受容体またはリガンドの量に関する。
【０１２９】
従って、本発明は、本明細書に記載される方法で入手されたβ様細胞を用いる糖尿病の治療方法にも関する。
【０１３０】
本発明は、糖尿病治療薬剤の調製における、本明細書に記載される方法で入手された膵島細胞の使用にも関する。
【０１３１】
本明細書に記載される方法で入手されたβ様細胞は、患者に投与されてもよく、例えば、細胞療法に用いられてもよい。本明細書に記載される方法で入手されたβ様細胞は、患者に移植されてもよい。このような細胞は、使用前に、例えば、カプセルに入れる等の処理を行ってもよい。細胞は、外部装置内または外部容器内、あるいは埋め込み式の装置内または埋め込み式の容器内で利用されてもよい。
【０１３２】
治療は、好ましくはエドモントンプロトコールに基づくものであり、場合によっては、１つ以上（例えば、２つ）の免疫抑制剤（シロリムスおよびタクロリムス等）および／または臓器拒絶反応を防止することが意図されるモノクローナル抗体（ダクリズマブ等）とともに、膵島を患者（患者の門脈等）に注入する工程を含んでいてもよい。この特定のプロトコールは、医師の判断で行われ、この医師はまた、共通の一般的知識を用いて投与量を選択し、熟練した専門家に公知である投与法を選択する。
【０１３３】
（変異体配列（Variant sequences））
本明細書における転写因子（ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１およびＮＤ１を含む）および他の因子（ベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミド等）への言及は、上述した実施形態に加えて、例えば、内分泌細胞へのリプログラミングを含む、上記因子の特定の機能を誘導する能力を保持する配列変異体または断片（例えば、アミノ酸の長さが少なくとも２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０またはそれ以上であるタンパク質断片）も含むと理解される。
【０１３４】
例えば、ヒト以外の変異体を用いてもよい。その例としては、霊長類、齧歯類、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ由来の変異体が挙げられる。
【０１３５】
そのような変異体または断片は、本発明の方法において、例えば、細胞と転写因子のタンパク質調製物とを接触させることを含む方法、または細胞内で転写因子を発現させることを含む方法のいずれかに用いられてもよい。
【０１３６】
本明細書に記載される転写因子の代表的なアミノ酸配列と本質的な同一性があるポリペプチドまたはペプチドを用いてもよい。同様に、本発明の方法において、これらのポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列、またはそれらと本質的な同一性があるヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０１３７】
２つの配列を（ギャップも許容して）最適に整列させた際に、これらの配列が少なくとも約５０％の配列同一性を共有する場合、またはこれらの配列が明確な機能性モチーフを共有する場合、本質的な同一性があると見なす。別の実施形態において、最適に整列させた配列は、特定の領域にわたって少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を共有する場合、本質的な同一性がある（すなわち本質的に同一である）と見なされる。「同一性」なる語は、２つのポリペプチド分子の配列類似性を意味する。整列させた配列の各位置を比較することで、同一性を決定することができる。
【０１３８】
アミノ酸配列間の同一性の程度は、これらの配列が共有する位置、例えば、ある特定の領域にわたる位置における同一アミノ酸または対応するアミノ酸の数の関数である。同一性を比較するための最適な配列の整列は、当該技術分野で公知の様々なアルゴリズムを用いて行われてもよく、そのアルゴリズムは、http://clustalw.genome.ad.ipにて使用可能なClustalWプログラム、SmithおよびWaterman、１９８１、Adv. Appl. Math, 2:482による局所ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、１９７０、J. Mol. Biol., 48:443によるホモロジー整列アルゴリズム、PearsonおよびLipman、１９８８、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444による類似性探索方法、およびこれらのアルゴリズムをコンピュータ化して実装したもの（米国ウィスコンシン州マジソンのジェネティクス・コンピュータ・グループ社（Genetics Computer Group)による、ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Wisconsin Genetics Software Package）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ等）を含む。配列の同一性は、Altschulら、１９９０、J. Mol. Biol., 215:403-10に記載の（公表された初期設定を用いた）ＢＬＡＳＴアルゴリズムで決定されてもよい。例えば、全国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて（インターネットhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cqiを通じて）使用可能な「ＢＬＡＳＴ２シークエンス（BLAST 2 Sequences）」ツールを、以下の初期設定、すなわち、expect threshold 10、word size 3、matrix BLOSUM 62、gap costs existence 11、extension 1の「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを選択して用いてもよい。別の実施形態において、当業者は、所与のいずれの配列も容易に且つ適切に整列させ、目視による確認によって配列同一性および／またはホモロジーを推定することができる。
【０１３９】
（標的阻害（target inhibition）の方法および材料）
本発明におけるＡＲＸの発現の阻害は、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて行ってもよい。ＡＲＸ遺伝子の発現は、ＡＲＸ遺伝子の発現を特異的に阻害するように、細胞を低分子二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子二重鎖ＲＮＡを産生するベクターまたはコンストラクトと接触させることで（すなわちＲＮＡ干渉、つまりＲＮＡｉ）低下させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、配列が公知の遺伝子の場合は当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５７３，０９９号および米国特許第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公報ＷＯ０１／３６６４６、国際特許公報ＷＯ９９／３２６１９および国際特許公報ＷＯ０１／６８８３６）。
【０１４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンストラクトも、本発明で用いるＡＲＸ遺伝子発現の阻害剤として働くことができる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＲＸのｍＲＮＡと結合し、それによってタンパク質翻訳を防ぐか、またはｍＲＮＡの分解を高めることで、その翻訳を直接妨げるように働き、細胞中のＡＲＸタンパク質の量を低下させて、活性を低下させる。例えば、その配列のうち連続した少なくとも１０塩基の、より好ましくは少なくとも１５塩基（例えば、少なくとも２０塩基、２５塩基）の、ＡＲＸをコードするｍＲＮＡ転写産物の配列の固有領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のリン酸ジエステル法によって合成し投与することができる。アンチセンス分子の配列と標的遺伝子または標的メッセンジャーＲＮＡの配列とは、完全に相補的である必要はないが、通常は完全に相補的であることが好ましい。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するアンチセンス技術を用いる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；および米国特許第５，９８１，７３２号参照）。
【０１４１】
リボザイムも、本発明で用いるＡＲＸ遺伝子発現の阻害剤として働くことができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド化と、それに続く内ヌクレオチド鎖分解性切断（endonucleolytic cleavage）とを含む。これによって、ＡＲＸのｍＲＮＡ配列の内ヌクレオチド鎖分解性を特異的且つ効率的に触媒する人工ヘアピンモチーフまたは人工ハンマーヘッドモチーフ（hairpin or hammerhead motif）リボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断サイトは、まず、標的分子のリボザイム切断サイトを綿密に調べることで特定され、典型的には次の配列、ＧＵＡ、ＧｕＵおよびＧＵＣを含む。いったん特定されると、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る予測された二次構造等の構造的特徴について、切断サイトを含む標的遺伝子の領域に相当する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を評価することができる。候補標的の適合性もまた、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ribonuclease protection assays）を用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの形成しやすさを試験することで評価することができる。
【０１４２】
ＡＲＸの遺伝子発現の阻害剤として有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるｓｉＲＮＡおよびリボザイムのどちらも、公知の方法で調製することができる。公知の方法には、固相ホスホロアミダイト化学合成等の化学合成の技術が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の試験管内または生体内での転写によって産生することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターに組み込ませることができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内安定性および半減期を増大するための手段として導入することができる。可能性がある改変は、分子の５’末端および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列（flanking sequences）を加えること、またはオリゴヌクレチドの主鎖内のリン酸ジエステル結合の代わりにホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルを用いることを含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
（発現ベクター）
本方法が、細胞内で転写因子（ＰＡＸ４等）を発現させることを含む場合、分化因子をコードする核酸を用いて、細胞を形質移入または形質導入することを含んでもよい。
【０１４４】
一般的に言えば、当業者は、ベクターの構築および組換え遺伝子発現のプロトコールの設計を、十分行うことができる。上述した本発明の構成要素に加えて、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む、適切な制御配列を含んだ適切なベクターを選択または構築することができる。さらなる詳細については、例えば、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）第２版（Sambrookら、１９８９、コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社）またはカレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）第２版（Ausubelら編、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）社、（１９９５、および定期的な補遺）を参照する。
【０１４５】
上記因子の発現は、発現ベクターからの発現、特に哺乳類発現ベクターからの発現を含んでもよい。発現ベクターは、該因子を発現するのに適切ないかなる構造を有してもよい。理解されるように、適切なプロモーターが、特定の因子のコード領域に、作動可能に連結される。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を活性化する場合は、プロモーターに作動可能に連結される。転写因子は、好ましくはＰＡＸ４を含む。
【０１４６】
適切な発現システムは、当該技術分野で周知であり、それ自体は本発明の一部を成すことはない。核酸送達システムの特定の例が、ＷＯ２０１２／００６４４０に概説されている。
【０１４７】
ベクターは、プラスミド、コスミド、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）、および人工染色体（ＹＡＣｓ等）を含むが、これらに限定されず、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーラット白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶ等に由来するベクター）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶ等に由来するベクター）、複製可能な形態、複製欠損性形態およびそれらのガトレス形態（gutless forms）を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター等が含まれる。
【０１４８】
ウイルスベクターを産生するのに用いることができる好ましいウイルスは、レトロウイルス（Millerら、Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221、１９９２）およびレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で周知である（例えば、Naldiniら、Science, 272(5259):263-267、１９９６；Zufiereyら、Nat. Biotechnol., 15(9):871-875、１９９７；Blomerら、J. Virol., 71(9):6641-6649、１９９７；米国特許得第６，０１３，５１６号および米国特許第５，９９４，１３６号参照）。レンチウイルスベクターは、感染に長期のインキュベーション期間を要することで典型的に特徴付けられるレトロウイルスベクターの特殊なタイプである。さらに、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができる。レンチウイルスベクターは、ウイルスのうち、レンチウイルスファミリーのウイルスの核酸骨格に基づく。典型的には、レンチウイルスベクターは、ＳＩＶおよびＨＩＶ等のレンチウイルスの５’ＬＴＲ領域および３’ＬＴＲ領域を含む。レンチウイルスベクターはまた、典型的には、ＳＩＶおよびＨＩＶ等のレンチウイルスのＲｅｖ応答配列（Rev Responsive Element）（ＲＲＥ）を含む。レンチウイルスベクターの例としては、Dull, T.ら、“A Third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system”J. Virol., 72(11):8463-71（１９９８）のレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０１４９】
例えば、アデノウイルスベクターを用いて、ヒト転写因子（ＰＡＸ４等）のｃＤＮＡを保持してもよい。
【０１５０】
本明細書に記載される本発明の態様は、英国特許出願（ＧＢ１４０８５７０．８；代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９６８５４９）に記載の条件、細胞、因子、および方法とともに用いられてもよい。ＧＢ１４０８５７０．８の内容は、参照として本明細書に援用される。特に、ＧＢ１４０８５７０．８に示される実施例および実験データは、参照として本明細書に援用される。
【０１５１】
本明細書に記載される本発明の態様は、本出願と同日に提出された英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６４９０）に記載の条件、細胞、因子、および方法とともに用いられてもよい。英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６４９０）の内容は、相互参照として本明細書に援用される。特に、英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６４９０）に示される実施例および実験データは、参照として本明細書に援用される。
【０１５２】
次に、以下の非限定の図および実施例を参照しつつ、本発明についてさらに説明する。これらに鑑みて、本発明の他の実施形態が当業者には想到されるであろう。
【０１５３】
本明細書に引用した全ての参考文献の開示は、当業者が本発明を実施するために用いる限りにおいて、ここで相互参照として本明細書に具体的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】転写因子（ＴＦｓ）の組み合わせにより、ヒトの外分泌系に富む画分（ＥＥＦ）のリプログラミングを誘導する。（Ａ）ＥＥＦ細胞は、単層として２日間培養された後、ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕで３日間処理された。次に、細胞は、図示された転写因子を含むアデノウイルス（ＡＤ−ＴＦｓ）の様々な組み合わせで形質導入され、さらにＢＥＮの存在下で６日間培養された。（Ｂ）ＲＴ／ＱＰＣＲにより、インスリンｍＲＮＡレベルを測定した。（Ｃ）分化転換プロセスで用いられた異なる転写因子の組み合わせの配列である。インスリンｍＲＮＡレベルが最大となる転写因子の組み合わせは、黄色で示された。Ｎ／Ａは未処理の外分泌系に富む画分を表しており、ＳＦはＡｄ−ＴＦｓを除く可溶性因子を表している。
【図２】転写因子の４つの組み合わせにより、インスリン（図１）および内因性膵臓転写因子（ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６およびＮＫＸ６．１）の発現が誘導される。これは、外因性転写因子が外分泌系に富む画分からβ細胞へのリプログラミングまたは分化転換を誘導していることを示している。条件１は、未処理の細胞である。条件３０は、Ａｄ−ＴＦｓを除く可溶性因子で処理された細胞である。条件２０は、ＰＤＸ１／ＮＧＮ３／ＮＫＸ６．１／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。条件２４は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＫＸ６．１／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。条件２５は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。条件２９は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４で処理された細胞である。可溶性因子は、ＢＥＮ、Ｙ２、ＳＢ、５−アザ−２’デオキシシチジン（Ａｚ）および酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）である。
【図３】条件２９は、グルコース刺激性インスリン（Ｃペプチド）分泌が行われる唯一の転写因子の組み合わせである。これらのデータは、外分泌系に富む画分から機能性グルコース感受性β細胞への効率的なリプログラミングにとって、外因性ＰＡＸ４の存在が不可欠であることを示している。
【図４】ラミニン上で培養すると、ＰＤＸ１／ＮＧＮ３／ＭＡＦＡおよびＰＡＸ４の組み合わせによる外分泌系に富む画分からインスリン発現β細胞へのリプログラミングが促進される。
【図５】低グルコースで培養すると、外分泌系に富む画分からインスリン発現β様細胞への効率的なリプログラミングが促進される。
【図６】６日目にｓｉＲＮＡによって内因性転写因子ＡＲＸのノックダウンを行うと、外分泌系に富む画分の効率的なリプログラミングが促進される（図６Ｂ）。図６Ａは、実験プロトコールを示す。Ｎ／Ａは未処理の外分泌系に富む画分を表しており、ＳＦはＡｄ−ＴＦｓを除く可溶性因子を表している。ＳＣＲＢは非特異的な非標的ｓｉＲＮＡを表す。（Ｂ）はインスリンの発現、（Ｃ）はグルカゴンの発現、（Ｄ）はソマトスタチンの発現を示す。
【図７】内因性転写因子ＡＲＸのノックダウンを行うと、リプログラミングされた外分泌組織におけるグルコース感受性インスリン（Ｃペプチド）分泌が増加する。この効果は、外因性ＰＡＸ４に依存する。
【図８】リプログラミングされた膵島は、成人膵島におけるインスリンの約１５％のレベルでインスリンを発現している。リプログラミングのために、ＥＥＦ細胞は、単層として２日間培養された後、ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕで３日間処理された。次に、細胞は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４で形質導入され、さらにＢＥＮの存在下で６日間培養された。ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕの添加後６日目に、ｓｉＲＮＡによる内因性転写因子ＡＲＸのサイレンシングが行われた。
【図９】分化転換における内分泌転写因子の役割を示す。転写因子のそれぞれの組み合わせで処理した後、内分泌ホルモンであるインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンのＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行う。図１Ｃに、分化転換プロセスで用いられた異なる転写因子の組み合わせの配列を示す。データは三重反復実験（triplicate experiments）を表しており、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに対するものである。
【図１０】ＡＲＸの阻害により、β細胞の成熟が促進されるとともに、α細胞の分化が抑制される。（Ａ）未処理の細胞（Ｎ／Ａ）、ｓｉＡＲＸ非存在下で分化転換された細胞（ＲＥＰ）、ｓｉＡＲＸで分化転換された細胞（ｓｉＡＲＸ）およびＰＡＸ４非存在下で、ｓｉＡＲＸで分化転換された細胞（ｓｉＡＲＸ−ＰＡＸ４）によるＣペプチドの放出を示す。Ｃペプチドは、特定のヒトＣペプチドＥＬＩＳＡによって培地から検出された。データは三重反復実験を表している。（Ｂ）未処理の細胞、ｓｉＡＲＸ非存在下で分化転換された細胞（ＲＥＰ）、ｓｉＡＲＸで分化転換された細胞（ｓｉＡＲＸ）およびヒト膵島のそれぞれにおけるインスリン、Ｃペプチドおよびプロインスリンの含有量を示す。各ペプチドの含有量は、細胞溶解後に特定のヒトＥＬＩＳＡによって検出され、総タンパク質含有量に対して標準化された。データは三重反復実験を表している。（Ｃ）未処理の細胞、ｓｉＡＲＸ非存在下で分化転換された細胞（ＲＥＰ）、ｓｉＡＲＸで分化転換された細胞（ｓｉＡＲＸ）およびヒト膵島のそれぞれにおけるグルカゴンの含有量を示す。グルカゴンは、細胞溶解後に特定のヒトＥＬＩＳＡによって検出され、総タンパク質含有量に対して標準化された。データは三重反復実験を表している。（Ｄ）ｓｉＡＲＸ非存在下で分化転換された細胞（ＲＥＰ）およびｓｉＡＲＸで分化転換された細胞（ｓｉＡＲＸ）におけるグルカゴンおよびＣペプチドを免疫細胞化学によって示す。データは三重反復実験を表している。スケールバーは２０μｍである。
【図１１】リプログラミングされたインスリン産生細胞は、生体内でＳＴＺ誘発糖尿病を予防する。（Ａ）分化転換された細胞（Ｔｒａｎｓｄｉｆ  Ｃｅｌｌｓ）が移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、外分泌膵細胞（Ｅｘｏｃ  Ｃｅｌｌｓ）が移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたは移植されていないマウス（Ｃｔｒｌ）において、手術後３８日間にわたって、体重および血糖値を測定した。手術の１日前にストレプトゾトシンの１回量（１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。Ｔｒａｎｓｄｉｆ  Ｃｅｌｌｓはｎ＝５、Ｅｘｏｃ  Ｃｅｌｌｓはｎ＝３、Ｃｔｒｌはｎ＝２である。（Ｂ）分化転換された細胞（Ｔｒａｎｓｄｉｆ  Ｃｅｌｌｓ）が移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたは外分泌膵細胞（Ｅｘｏｃ  Ｃｅｌｌｓ）が移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよび移植されていないマウス（Ｃｔｒｌ）において、４時間の絶食期間（ｆａｓｔ）後または不断給餌（ｆｅｄ）条件下で、血清Ｃペプチドレベルを測定した。Ｔｒａｎｓｄｉｆ  Ｃｅｌｌｓはｎ＝５、Ｅｘｏｃ  Ｃｅｌｌｓはｎ＝３、Ｃｔｒｌはｎ＝２である。（Ｃ）腎臓の切除に続いて、移植された腎臓のインスリンおよびグルカゴンの免疫染色を示す。黄色の破線で示されているのは、腎臓（ｋ）と移植片との境界である。パネルａにおいて、赤色の円で示されているのは、クラスター内で観察されたグルカゴン染色の違いである。パネルｃは、この円の内側の細胞を倍率５倍で観察したものである。倍率１０倍で観察した上記円の内側の細胞（ｅ）および外側の細胞（ｆ）も示されている。パネルｄは、パネルｂの赤色の四角で示された領域内のインスリン染色を倍率５倍で観察したものである。パネルｇは、クラスターの中心に存在するインスリン陽性細胞を倍率１０倍で観察したものである。パネルａおよびｂのスケールバーは１００μｍである。パネルｃ〜ｄのスケールバーは２０μｍである。（Ｄ）分化転換された細胞が移植された腎臓におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色を示す。スケールバーは５０μｍである。倍率５倍で観察した膵島が示されている。
【図１２】分化転換された膵臓の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、生体内で、調節された方法でグルカゴンを放出する。（Ａ）移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ａ＋Ｂｕ＋４ＴＦｓ＋ＢＥＮ）および移植されていないマウス（Ｃｔｒｌ）において、１８週にわたって、血糖値を測定した。各グループの動物の数はｎ＝５である。（Ｂ）４時間の絶食期間（ｆａｓｔ）後または不断給餌（ｆｅｄ）条件下で、移植された動物の血清からグルカゴンを測定した。各グループの動物の数はｎ＝５である。（Ｃ）手術の１日前にストレプトゾトシンの１回量（１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与することにより、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを糖尿病にした。移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ａ＋Ｂｕ＋４ＴＦｓ＋ＢＥＮ）および移植されていないマウス（Ｃｔｒｌ）において、１８週にわたって、血糖値を測定した。各グループの動物の数はｎ＝５である。（Ｄ）手術の１日前に、ストレプトゾトシンの１回量（１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与することにより、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを糖尿病にした。（Ｄ）４時間の絶食期間（ｆａｓｔ）後または不断給餌（ｆｅｄ）条件下で、移植された動物の血清からグルカゴンを測定した。各グループの動物の数はｎ＝５である。なお、Ａは５−アザ−２’デオキシシチジン（Ａｚａ）を表しており、Ｂｕは酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）を表している。
【図１３】ｓｉＡＲＸでリプログラミングされた細胞の代表的な電子顕微鏡画像を示す。リプログラミングされていない細胞とは異なり、リプログラミングされた細胞は、濃密な分泌顆粒に富む（Ａ）。スケールバーは２μｍである。リプログラミングされた細胞において、異なる形態を持つ有芯小胞（dense core vesicles）の高倍率画像（ＢおよびＣ）が示されている。スケールバーは、それぞれ０．５μｍ（Ｂ）および０．１μｍ（Ｃ）である。
【図１４】ＺｎＣｌ2（１０μＭ）の非存在下または存在下で、未処理の細胞（Ｎ／Ａ）およびリプログラミングされた細胞（ｓｉＡＲＸ）における、３つの主な内分泌ホルモンであるインスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）およびソマトスタチン（ＳＳＴ）、ならびに転写因子であるＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮＥＵＲＯＤ、ＮＧＮ３およびＮＫＸ６．１のＲＴ−ｑＰＣＲ分析である。発現は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに対して標準化された。データは三重反復実験を表しており、平均±平均の標準誤差で表される。
【図１５】ＺｎＣｌ2（１０μＭ）の非存在下または存在下で、未処理の細胞（Ｎ／Ａ）およびリプログラミングされた細胞（ｓｉＡＲＸ）からの細胞抽出物のＣペプチドＥＬＩＳＡ測定を示す。Ｃペプチドレベルは、タンパク質含有量に対する発現量であり、３±ＳＤ（ｎ＝３）で表される。ＮＡを基準として***ｐ＜０．００１であり、ｓｉＡＲＸを基準として**ｐ＜０．０１である。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
（実施例）
（実施例１）
（材料および方法）
（ヒト外分泌膵臓画分の培養）
全てのヒトの組織は、適切な倫理的同意を得て入手された。ヒトの膵臓（ｎ＝４２）は、スコットランド膵島単離研究所（Scottish Islet Isolation Laboratory）（ＳＮＢＴＳ、エジンバラ（Edinburgh）、英国）において、脳死状態の成人ドナーから単離された。ドナーの平均年齢は３９．４歳（２３〜６１歳の範囲）であり、ＢＭＩは２７．２ｋｇ／ｍ2（２２〜３６．５ｋｇ／ｍ2の範囲）であった。
【０１５６】
（ＥＭＴが阻害されている培養）
膵島単離に続いて、低純度の外分泌画分をアバディーン（Aberdeen）に輸送し、直ちに、１バイアルあたりの外分泌クラスターが３００，０００という密度で、細胞を液体窒素中に凍結保存した。細胞は、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ（Gibco）、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ペイズリー（Paisley）、英国）および１０％ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）、ドーセット（Dorset）、英国）で凍結保存された。ヒト外分泌画分を解凍して、９ｃｍ2の組織培養皿（グライナー（Greiner）、ストーンハウス（Stonehouse）、英国）で平板培養し、さらに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（全てギブコより入手）および７５μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、ライフテクノロジーズ）で２日間培養した。
【０１５７】
４８時間後、ＲＰＭＩ１６４０、インスリン−トランスフェリン−セレン（ギブコ）および１％ウシ血清アルブミン（シグマ）を用いて調製し、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのＹ２７６３２、１μＭの５−アザ−２’デオキシシチジンおよび１０ｍＭの酪酸ナトリウム（全てシグマより入手）を添加した無血清培地（ＳＦＭ）で、細胞をさらに７２時間インキュベートした。次の日、膵臓転写因子をコードするアデノウイルスとともに、細胞を４時間インキュベートした。翌日、培地を、１ｎＭのベータセルリン（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D systems）、アビンドン（Abingdon）、英国）、１０ｎＭのエキセンジン−４および１０ｍＭのニコチンアミド（どちらもシグマより入手）を添加したＳＦＭに交換した。収集前のさらに６日間は、２日ごとに培地を交換した。
【０１５８】
（ＥＭＴが阻害されていない、リプログラミングのための間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を得る培養）
臨床応用のための膵島単離に続いて、低純度の外分泌画分をアバディーンに輸送し、直ちに、外分泌クラスターが３００，０００という密度で、細胞を７５ｃｍ2の組織培養フラスコ（グライナー、ストーンハウス、英国）で平板培養し、さらに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（全てギブコより入手）および７５μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ、ドーセット、英国）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、ライフテクノロジーズ、ペイズリー、英国）を用いて調製した血清完全培地（serum complete medium）（ＳＣＭ）で培養した。
【０１５９】
トリプシン（０．０５％）−ＥＤＴＡ（０．０２％）溶液（ギブコ）を用いて、７日ごとにヒト外分泌膵細胞を継代した。無血清培地（ＳＦＭ）は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）、１０μｇ／ｍｌのインスリンおよび５．５μｇ／ｍｌのトランスフェリン（どちらもロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）、ウェスト・サセックス（West Sussex）、英国より入手）を添加したＲＰＭＩ１６４０を用いて調製された。
【０１６０】
（アデノウイルスの調製）
マウスのＰＤＸ１、ＭＡＦＡ，ＮＧＮ３およびＰＡＸ４の配列（Swalesら、２０１２）をコードする組換えアデノウイルスは、Ａｄ−Ｅａｓｙ（商標）システム（アジレント・テクノロジー（Agilent Technologies）、エディンバラ、英国）を用いて調製した。ＰＤＸ１およびＮＧＮ３を含むアデノウイルスも、下流のサイトメガロウイルス促進因子（downstream CMV promoter）により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現した。ウイルスの形質導入は、ＳＦＭにおいて、ウイルスごとに感染多重度（ＭＯＩ）１００で４時間行われた。
【０１６１】
（定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
従来記載されているように（Limaら、２０１２）、ｑＲＴ／ＰＣＲを行った。２-ΔΔＣＴ法を用いて、データを分析した。統計解析は、ＰＲＩＳＭソフトウェアおよびスチューデントのｔ検定または一元配置分散分析（one-way ANOVA）、それに続くダネットのポストホックテスト（Dunnet's post-hoc test）を適宜用いて行われた。表１にＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの一覧を示す。
【０１６２】
【表１】
2017521089.tif 000004
【０１６３】
（免疫細胞化学および免疫組織化学）
表２に示された抗体を用いて、従来記載されているように（Cho, C-H, Hannan, N. Docherty, FM. Docherty, HM. Docherty, K. Vallier L.; Limaら、２０１２）、免疫細胞化学および免疫組織化学を行った。
【０１６４】
【表２】
2017521089.tif 000005
【０１６５】
（Ｃペプチド放出試験）
ヒトグルカゴン定量ＥＬＩＳＡキット（human glucagon Quantikine ELISA kit）（Ｒ＆Ｄシステムズ、アビンドン、英国）、ヒトＣペプチドＥＬＩＳＡキット（ミリポア（Millipore）、リビングストン（Livingston）、英国）、ヒトプロインスリンＥＬＩＳＡキットまたはヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（どちらもメルコディア（Mercodia）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデンより入手）を用いて、Ｃペプチドレベルを測定した。
【０１６６】
（ｓｉＲＮＡに基づくノックダウン）
特定標的低分子阻害性ＲＮＡ（specific targeting small inhibitory RNAs）のプール、またはスクランブルコントロール（ダーマコン（Dharmacon）、ラフバラ（Loughborough）、英国）を用いた形質移入により、分化転換細胞におけるＡｒｘのノックダウンを行った。製造者の取扱説明書に従い、ダーマフェクト（Dharmafect）１（ダーマコン）を用いた分化転換プロトコールの６日目に、１００ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
【０１６７】
（結果）
（転写因子（ＴＦｓ）の組み合わせにより、ヒトの外分泌系に富む画分（ＥＥＦ）のリプログラミングを誘導する）
我々は、これまでに発表したリプログラミングプロトコールにおいて（Limaら、２０１３）、６つの膵臓転写因子（ＴＦｓ）、すなわち、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１およびＮｅｕｒｏＤ１の様々な組み合わせを調査した。成熟した膵島と分化転換された細胞との間にインスリン発現の違いが観察されたのは、後者が成人膵島と同じ成熟状態に至っていなかったことを示唆していた。分化転換の結果を向上させるために、膵臓転写因子の３０の異なる組み合わせを調査した（図１Ｃ）。インスリン（図１Ａ）、グルカゴンおよびソマトスタチン（図９）の発現を測定した。
【０１６８】
下記の膵島単離によって得られた低純度の画分から直にＥＥＦ細胞を平板培養した。ＥＥＦ細胞は、単層として２日間培養された後、ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕで３日間処理された。次に、細胞は、図１Ａに示された転写因子を含むアデノウイルス（ＡＤ−ＴＦｓ）の様々な組み合わせで形質導入され、さらにベータセルリン、エキセンジン−４およびニコチンアミド（ＢＥＮ）の存在下で６日間培養された。
【０１６９】
２９の組み合わせのうち、４つが顕著なレベルのインスリン遺伝子発現をもたらした（図１の組み合わせ２０、２４、２５および２９）。４つの組み合わせの全てにおいて、内因性転写因子のレベルが増加したことにより、リプログラミングまたは分化転換が起こったことを示している（図２）。
【０１７０】
条件１は、未処理の細胞である。
【０１７１】
条件３０は、Ａｄ−ＴＦｓを除く可溶性因子（ＳＦｓ）で処理された細胞である。
【０１７２】
条件２０は、ＰＤＸ１／ＮＧＮ３／ＮＫＸ６．１／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。
【０１７３】
条件２４は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＫＸ６．１／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。
【０１７４】
条件２５は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＮｅｕｒｏＤ１で処理された細胞である。
【０１７５】
条件２９は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４で処理された細胞である。
【０１７６】
ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を用いて、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに対する内分泌ホルモンであるインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの発現をモニターした。これらの組み合わせは、図１Ｃに示されている転写因子のそれぞれの組み合わせで処理した後のものである。グルカゴン発現α細胞へのリプログラミングにはＮＫＸ６．１の添加が好ましく、ソマトスタチン発現δ細胞へのリプログラミングにはＮｅｕｒｏＤ１の添加が好ましいようである（図９）。
【０１７７】
この実験における細胞は、完全に間葉状態に入ることなく、外分泌細胞から内分泌細胞に直接リプログラミングされ得る。培地に付着する過程で上皮間葉移行（ＥＭＴ）を起こすことがあるが、これらの実験では、ＥＭＴを阻害する前に、細胞は、限られた時間（４８時間まで）しか付着しなかった。従って、これらの実験では、ＥＭＴをさらに生じさせて維持するプロセスが概ね阻害または抑制された。
【０１７８】
（ＰＡＸ４は、グルコース感受性β細胞の生成に不可欠である）
上記組み合わせのうち、組み合わせ２９だけがグルコースに応答してインスリン（Ｃペプチド）を分泌する細胞を再生することができた（図３）。これは、４つの組み合わせのなかで、ＰＡＸ４を含む唯一の組み合わせである。
【０１７９】
従って、ＰＡＸ４をＮＫＸ６．１またはＮｅｕｒｏＤのいずれかで置き換えれば同様なレベルのインスリン発現は得られたが、ＰＡＸ４の存在下においてのみ、分化転換された細胞がグルコース依存的にインスリンを分泌することができた。このことは、ＰＡＸ４がヒトの成熟したβ細胞の機能性を確立する上で重要な役割を果たすことを示している。
【０１８０】
後期β細胞マーカー（late beta cell markers）のＲＴ−ＱＰＣＲにより、組み合わせ２９（ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４、「４ＴＦ組み合わせ」とも称する）で分化転換された細胞でしかＭＡＦＡが発現しないことがさらに立証された（図２）。このことは、その発現がβ細胞の機能性の主要因であることを示している。すなわち、グルコース感受性β細胞の生成には、ＰＡＸ４を含むことが不可欠であるという結論につながる。
【０１８１】
（ラミニン被覆プレート上で増殖させると、リプログラミング効率が向上する）
次に、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４を用いて、細胞外マトリックスのリプログラミングプロトコールの効率への影響を比較した。ラミニン、フィブロネクチン、ポリリジン、Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンを比較して、相対的なインスリン発現を評価した（図４）。その結果、ラミニン被覆プレート上で増幅させると、リプログラミング効率が向上することが明らかになった。
【０１８２】
（低濃度のグルコースを含む培地で培養することにより、β細胞へのリプログラミングがさらに向上する）
異なるグルコース濃度で細胞を培養した。図５に、相対的なインスリン濃度を示す。その結果、低濃度のグルコースを含む培地で培養することにより、外分泌系に富む画分からインスリン発現β細胞へのリプログラミングがさらに向上することが明らかになった。無血清培地（ＳＦＭ）にグルコースを添加し、グルコースとともに細胞を１０日間培養した。
【０１８３】
（外因性ＰＡＸ４の存在下で内因性転写因子（ＴＦ）ＡＲＸのノックダウンを行うと、β細胞へのリプログラミング効率が向上する）
ＥＥＦ細胞は、単層として２日間培養された後、ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕで３日間処理された。次に、細胞は、ＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３／ＰＡＸ４（「ＲＥＰ」）またはＰＤＸ１／ＭＡＦＡ／ＮＧＮ３（「−ＰＡＸ４」）で形質導入され、さらにＢＥＮの存在下で６日間培養された。ＳＢ、Ｙ２、ＡｚａおよびＮａＢｕの添加後６日目に、ｓｉＲＮＡによる内因性転写因子ＡＲＸのサイレンシングが行われた（図６Ａ）。図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄに、その結果を示す。外因性ＰＡＸ４の非存在下ではなく、外因性ＰＡＸ４の存在下でのＡＲＸサイレンシングにより、ＩＮＳ（図６Ｂ）およびＳＳＴ（図６Ｃ）の産生が明らかに促進されるが、ＧＣＧの発現（図６Ｄ）には影響を及ぼさない。
【０１８４】
リプログラミングプロトコールの後期において、ｓｉＲＮＡによってＡＲＸの発現が阻害された。その結果、インスリン発現のレベルが１００倍まで増加した（図６Ｂ）。従って、ＡＲＸを阻害すると、試験管内において、高グルコース濃度に応じて、リプログラミングされた細胞によってＣペプチドの放出が増加することになる（図７）。リプログラミングされた膵島は、成人膵島におけるインスリンの約１５％のレベルでインスリンを発現する（図８）。
【０１８５】
さらに、リプログラミングカクテルからＰＡＸ４を除くと、高いグルコースレベルに応じたＣペプチドの放出が止まる。このことから、リプログラミングされたβ細胞の機能性および成熟にＰＡＸ４の作用が不可欠であることが分かる。上記研究は、試験管内で生成されたヒトβ細胞の機能にとって、膵臓発生の最終段階におけるＡＲＸとＰＡＸ４との調節ループが不可欠であることを示している。これらの実験により、外因性ＰＡＸ４の存在下で内因性ＡＲＸのノックダウンを行うと、リプログラミング効率が向上することが明らかになった。
【０１８６】
分化転換プロトコールの後期において、ｓｉＲＮＡによってＡＲＸの発現が阻害された。その結果、コントロールｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較して、インスリン発現のレベルが６０倍まで増加し、成熟したβ細胞のインスリン発現のレベルに一層近づいた（図１０Ｂ）。さらに、リプログラミングされた膵島（ＡＲＸの発現が阻害された場合）は、プロインスリン、インスリンおよびＣペプチドに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡデータによって証明されたように、成人膵島と同様の方法でプロインスリンを処理する（process）ことが示された。
【０１８７】
ＡＲＸを阻害することなくリプログラミングされた細胞は（Limaら、２０１３）、成体の成熟した膵島におけるインスリンレベルの１％しか発現しない。このような細胞は、図１０ＢにＲＥＰとして表示されている。
【０１８８】
（ＡＲＸの阻害により、β細胞の成熟を高め、α細胞の分化を低下させる）
ＲＴ−ＱＰＣＲによれば、分化プロトコールにおいて発現したＡＲＸは、外分泌由来の材料のリプログラミングにおいて、β細胞と対比してα細胞の発生（development of alpha versus beta cells）にとって有利になる場合もあることが示された。
【０１８９】
グルカゴンタンパク質レベルは、ＡＲＸの発現の阻害後、著しく下方制御（down-regulated）された（図１０Ｃ）。ヒトインスリンおよびＣペプチドに特異的なＥＬＩＳＡにより、分化転換された細胞は、効率的にインスリンを蓄えて処理することができるため、ヒト膵島に匹敵するレベルで、グルコース応答性で調節されたＣペプチドの分泌が行われることが立証された（図１０）。リプログラミングされたβ細胞の機能性および成熟におけるその役割をさらに支持するために、分化転換プロトコールからＰＡＸ４を除くと、グルコース濃度の増加に応じたＣペプチドの放出が止まった（図１０Ａ）。
【０１９０】
（リプログラミングされたインスリン産生細胞は、生体内でＳＴＺ誘発糖尿病を予防する）
リプログラミングされたインスリン産生細胞の生体内の機能は、手術の１日前にＳＴＺで糖尿病にしたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下にこれらの細胞を移植することにより、さらに確認された（図１１Ａ）。
【０１９１】
使用した細胞は、外分泌系に富む組織から得たが、この組織は、ＳＦＭで平板培養し、ＳＢ４３１５４２、Ｙ２７６３２、５−アザ−２’デオキシシチジン、酪酸ナトリウム、４ＴＦおよびＢＥＮ（ＡＲＸ阻害剤を含まない）で処理されていたものである。
【０１９２】
リプログラミングされた細胞を移植された動物は、実験過程を通じて正常な血糖値を保ち、体重も維持した。リプログラミングされていない外分泌細胞を移植された動物、または腎臓被膜下に細胞を移植されなかった動物は、体重減少に関連する血糖値の著しい上昇を示した（図１１Ａ）。
【０１９３】
移植した腎臓を３０日後に除去したところ、リプログラミングされた細胞を移植された動物の血糖値が増加した（図１１Ａ）。ヒトＣペプチドは、リプログラミングされたインスリン産生細胞を移植され、給餌されたマウスの血清中にのみ存在したが（図１１Ｂ）、絶食させた場合、血液中には存在しなかった。このことは、リプログラミングされた細胞が生体内でグルコースに応答してインスリンを放出したことを示している。移植された腎臓の免疫染色では、移植された細胞により、腎臓被膜下にクラスター状構造が形成されたことが示された。この構造の中心部は、主として強力に陽性のインスリン陽性細胞で構成されており、グルカゴン陽性細胞の大部分は、クラスターの周辺部に配置されていた（図１１Ｃ）。また、この構造のほとんどの細胞も、膵臓転写因子（ＴＦ）ＰＤＸ１に対して陽性であった（図１１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、成人の膵臓の外分泌膵細胞を機能性インスリン産生細胞にリプログラミングすることができるという結論を裏付けている。リプログラミングされた細胞は、糖尿病マウスモデルの糖尿病を改善することができるとともに、ランゲルハンス島に類似したクラスター状構造を形成することができる。
【０１９４】
（分化転換された膵臓の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、生体内で、調節された方法でグルカゴンを放出することが示された）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤは、Ａ＋Ｂｕ＋４ＴＦｓ＋ＢＥＮ（ＥＭＴ阻害剤は使用せず）を用いてリプログラムされた細胞を移植されたマウスである。移植されていないマウスをコントロールとして用いた。４時間の絶食後（ｆａｓｔ）または不断給餌（ｆｅｄ）条件下で、移植された動物の血清からグルカゴンを測定したところ、処理細胞を移植されたマウスに高濃度で存在することが確認された。
【０１９５】
手術の１日前にストレプトゾトシンの１回量を投与することにより、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを糖尿病にした。４時間の絶食後（ｆａｓｔ）または不断給餌（ｆｅｄ）条件下で、移植された動物の血清からグルカゴンを測定したところ、絶食させたマウスに高濃度で存在することが確認された。
【０１９６】
該データにより、処理された膵臓の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、生体内で、調節された方法でグルカゴンを放出したことが明らかである。
【０１９７】
（実施例２）
（方法）
（ヒト外分泌膵臓画分のリプログラミング）
ヒト外分泌画分を解凍して、９ｃｍ2の組織培養皿（グライナー、ストーンハウス、英国）で平板培養し、さらに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（全てギブコより入手）および７５μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、ライフテクノロジーズ）で２日間培養した。４８時間後、ＲＰＭＩ１６４０、インスリン−トランスフェリン−セレン（ギブコ）および１％ウシ血清アルブミン（シグマ）を用いて調製し、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのＹ２７６３２、１μＭの５−アザ−２’デオキシシチジンおよび１０ｍＭの酪酸ナトリウム（全てシグマより入手）を添加した無血清培地（ＳＦＭ）で、細胞をさらに７２時間インキュベートした。次の日、膵臓転写因子であるＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４をコードするアデノウイルスとともに、細胞を４時間インキュベートした。翌日、培地を、１ｎＭのベータセルリン（Ｒ＆Ｄシステムズ、アビンドン、英国）、１０ｎＭのエキセンジン−４および１０ｍＭのニコチンアミド（どちらもシグマより入手）を添加したＳＦＭに交換した。収集前のさらに６日間は、２日ごとに培地を交換した。
【０１９８】
特定標的低分子阻害性ＲＮＡのプール、またはスクランブルコントロール（ダーマコン、ラフバラ、英国）を用いた形質移入により、Ａｒｘのノックダウンを行った。製造者の取扱説明書に従い、ダーマフェクト１（ダーマコン）を用いたリプログラミングプロトコールの６日目に、ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）をトランスフェクトした。ＺｎＣｌ2は、１０μＭの濃度で、リプログラミングアデノウイルスおよび上記ｓｉＲＮＡとともに用いられた。
【０１９９】
（透過型電子顕微鏡）
アキュターゼ（Accutase）（商標）（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、オックスフォード（Oxford）、英国）を用いて、プレートから細胞を剥離した後、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒドで、一晩、４℃で細胞を固定した。続いて、１％四酸化オスミウムで、１時間、細胞を後固定してから、エポキシ樹脂に包埋した。次に、サンプルを、それぞれ開始濃度が７０％、９５％、および１００％のエタノール洗浄液の系列を用いて２０分間脱水した。その後、サンプルをエポキシ樹脂に包埋し、モールドの中に配置して、４８時間、６５℃で放置して重合させた。ライカウルトラカット（Leica Ultracut）Ｅ（ライカ（Leica）、ウェツラー（Wetzlar）、ドイツ）で７５〜９０ｎｍの切片を切り取り、フォームバー（formvar）／カーボンコートされたスロットグリッド上に置いた。ＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００ Ｐｌｕｓ ＴＥＭで画像を観察し、ＡＭＴウルトラビュー（UltraVue）カメラ（ウォバーン（Woburn)、マサチューセッツ、米国）を用いて撮影した。
【０２００】
（結果）
ｓｉＡＲＸを含むプロトコールに従ってリプログラミングされたヒト外分泌細胞の電子顕微鏡観察により、細胞の一方側に偏在している濃密なコア顆粒（dense core granules）が明らかになった（図１３Ａ）。このパターンは膵島β細胞に典型的なものである。
【０２０１】
より高倍率では（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）、場合によっては、非透過性のハロー（non-opaque halo）に囲まれたはっきりとした濃密なコアを有する顆粒の存在が示され、これはインスリン分泌顆粒に特徴的な性質である。これらの顆粒の濃密なコアは、インスリン−亜鉛六量体の結晶構造の存在に起因するものである。しかしながら、濃密でないコアを有し、ハローを欠いた顆粒も存在していた。
【０２０２】
培地中の亜鉛の欠乏がこれらの中間顆粒形態に寄与するものと仮定される。このことは、培地中に亜鉛を含むことで、より濃密なコア分泌顆粒が形成されるだけでなく、グルコースに対するインスリン分泌応答およびリプログラミングされた細胞のインスリン含有量を向上するということを示唆する。
【０２０３】
（亜鉛は、恐らく、ＰＡＸ４を必要とするメカニズムにより、リプログラミングされた細胞におけるインスリンｍＲＮＡレベルを上昇させる）
この仮定を検討するために、亜鉛存在下および亜鉛非存在下で細胞をリプログラミングし、ＲＴ／ＱＰＣＲで分析した。「方法」で説明したように、転写因子およびｓｉＡＲＸを用いて、細胞をリプログラミングした（ｓｉＡＲＸ）。その結果、インスリン遺伝子発現に対する亜鉛の顕著な効果が明らかにされたが、これは、部分的には、ＰＡＸ４をコードするｍＲＮＡレベルが上昇したことによるものと考えられる（図１４）。
【０２０４】
（亜鉛はリプログラムされた細胞のインスリン（Ｃペプチド）含有量を増加させる）
さらなる研究によって、亜鉛（ＺｎＣｌ2）が、リプログラミングされた（ｓｉＡＲＸ）細胞のインスリン（Ｃペプチド）タンパク質含有量を刺激する効果を有することが示された（図１５）。
【０２０５】
参考文献
Akinci, E., Banga, A., Greder, L.V., Dutton, J.R., and Slack, J.M. (2012). Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (beta) cell character using PDX1, NGN3 and MAFA. Biochem. J. 442, 539-550.
Alipio, Z., Liao, W., Roemer, E.J., Waner, M., Fink, L.M., Ward, D.C., and Ma, Y. (2010). Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 13426-13431.
Baeyens, L., De Breuck, S., Lardon, J., Mfopou, J.K., Rooman, I., and Bouwens, L. (2005). In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia 48, 49-57.
Bar, Y., Russ, H.A., Sintov, E., Anker-Kitai, L., Knoller, S., and Efrat, S. (2012). Redifferentiation of Expanded Human Pancreatic beta-Cell-derived Cells by Inhibition of the NOTCH Pathway. J. Biol. Chem. 287, 17269-17280.
Blum, B., Hrvatin, S.S., Schuetz, C., Bonal, C., Rezania, A., and Melton, D.A. (2012). Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat. Biotechnol. 30, 261-264.
Chandra, V., Swetha, G., Muthyala, S., Jaiswal, A.K., Bellare, J.R., Nair, P.D., and Bhonde, R.R. (2011). Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One 6, e20615.
Cho, C-H, Hannan, N, Docherty, FM., Docherty, HM. Docherty, K. Vallier L. Activin/TGFb signalling pathway controls hepatic and pancreatic specification of human endoderm.
Collombat, P., Mansouri, A., Hecksher-Sorensen, J., Serup, P., Krull, J., Gradwohl, G., and Gruss, P. (2003). Opposing actions of ARX and PAX4 in endocrine pancreas development. Genes Dev. 17, 2591-2603.
D'Amour, K.A., Bang, A.G., Eliazer, S., Kelly, O.G., Agulnick, A.D., Smart, N.G., Moorman, M.A., Kroon, E., Carpenter, M.K., and Baetge, E.E. (2006). Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 24, 1392-1401.
Davani, B., Ikonomou, L., Raaka, B.M., Geras-Raaka, E., Morton, R.A., Marcus-Samuels, B., and Gershengorn, M.C. (2007). Human islet-derived precursor cells are mesenchymal stromal cells that differentiate and mature to hormone-expressing cells in vivo. Stem Cells
25, 3215-3222.
Docherty, K. (2011). Reprogamming Toward Pancreas Beta Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine
Docherty, K., Bernardo, A.S., and Vallier, L. (2007). Embryonic stem cell therapy for diabetes mellitus. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 827-838.
Ferber, S., Halkin, A., Cohen, H., Ber, I., Einav, Y., Goldberg, I., Barshack, I., Seijffers, R., Kopolovic, J., Kaiser, N., and Karasik, A. (2000). Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia 6. Nat. Med. 6, 568-572.
Gershengorn, M.C., Hardikar, A.A., Wei, C., Geras-Raaka, E., Marcus-Samuels, B., and Raaka, B.M. (2004). Epithelial-to-mesenchymal transition generates proliferative human islet precursor cells. Science 306, 2261-2264.
Hao, E., Tyrberg, B., Itkin-Ansari, P., Lakey, J.R., Geron, I., Monosov, E.Z., Barcova, M., Mercola, M., and Levine, F. (2006). Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nat. Med. 12, 310-316.
Jiang, J., Au, M., Lu, K., Eshpeter, A., Korbutt, G., Fisk, G., and Majumdar, A.S. (2007). Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells 25, 1940-1953.
Jiang, W., Shi, Y., Zhao, D., Chen, S., Yong, J., Zhang, J., Qing, T., Sun, X., Zhang, P., Ding, M., Li, D., and Deng, H. (2007). In vitro derivation of functional insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Cell Res. 17, 333-344.
Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., and Efrat, S. (2007). Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells 25, 2837-2844.
Kojima, H., Fujimiya, M., Matsumura, K., Younan, P., Imaeda, H., Maeda, M., and Chan, L. (2003). NeuroD-betacellulin gene therapy induces islet neogenesis in the liver and reverses diabetes in mice. Nat. Med. 9, 596-603.
Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat. Biotechnol. 26, 443-452.
Lima, M.J., Docherty, H.M., Chen, Y., and Docherty, K. (2012). Efficient differentiation of AR42J cells towards insulin-producing cells using pancreatic transcription factors in combination with growth factors. Mol. Cell. Endocrinol. 358, 69-80.
Lima, M.J., Muir, K.R., Docherty, H.M., Drummond, R., McGowan, N.W., Forbes, S., Heremans, Y., Houbracken, I., Ross, J.A., Forbes, S.J., et al. (2013). Suppression of epithelial-to-mesenchymal transitioning enhances ex vivo reprogramming of human exocrine pancreatic tissue toward functional insulin-producing beta-like cells. Diabetes 62, 2821-2833.
Montgomery, A.M., and Yebra, M. (2011). The Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Human Pancreatic beta Cells: Inductive Mechanisms and Implications for the Cell-Based Therapy of Type I Diabetes. Curr. Diabetes Rev.
Ogihara, T., Fujitani, Y., Uchida, T., Kanno, R., Choi, J.B., Hirose, T., Kawamori, R., and Watada, H. (2008). Combined expression of transcription factors induces AR42J-B13 cells to differentiate into insulin-producing cells. Endocr. J. 55, 691-698.
Ouziel-Yahalom, L., Zalzman, M., Anker-Kitai, L., Knoller, S., Bar, Y., Glandt, M., Herold, K., and Efrat, S. (2006). Expansion and redifferentiation of adult human pancreatic islet cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 341, 291-298.
Porat, S., Weinberg-Corem, N., Tornovsky-Babaey, S., Schyr-Ben-Haroush, R., Hija, A., Stolovich-Rain, M., Dadon, D., Granot, Z., Ben-Hur, V., White, P., et al. (2011). Control of pancreatic beta cell regeneration by glucose metabolism. Cell. Metab. 13, 440-449.
Rezania, A., Bruin, J.E., Riedel, M.J., Mojibian, M., Asadi, A., Xu, J., Gauvin, R., Narayan, K., Karanu, F., O'Neil, J.J., et al. (2012). Maturation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Pancreatic Progenitors into Functional Islets Capable of Treating Pre-existing Diabetes in Mice. Diabetes
Rezania, A., Riedel, M.J., Wideman, R.D., Karanu, F., Ao, Z., Warnock, G.L., and Kieffer, T.J. (2011). Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes 60, 239-247.
Schulz, T.C., Young, H.Y., Agulnick, A.D., Babin, M.J., Baetge, E.E., Bang, A.G., Bhoumik, A., Cepa, I., Cesario, R.M., Haakmeester, C., et al. (2012). A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One 7, e37004.
Shapiro, A.M., Lakey, J.R., Ryan, E.A., Korbutt, G.S., Toth, E., Warnock, G.L., Kneteman, N.M., and Rajotte, R.V. (2000). Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen 4. N. Engl. J. Med. 343, 230-238.
Swales, N., Martens, G.A., Bonne, S., Heremans, Y., Borup, R., Van de Casteele, M., Ling, Z., Pipeleers, D., Ravassard, P., Nielsen, F., Ferrer, J., and Heimberg, H. (2012). Plasticity of adult human pancreatic duct cells by neurogenin3-mediated reprogramming. PLoS One 7, e37055.
Tateishi, K., He, J., Taranova, O., Liang, G., D'Alessio, A.C., and Zhang, Y. (2008). Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J. Biol. Chem. 283, 31601-31607.
Wang, H.S., Shyu, J.F., Shen, W.S., Hsu, H.C., Chi, T.C., Chen, C.P., Huang, S.W., Shyr, Y.M., Tang, K.T., and Chen, T.H. (2011). Transplantation of insulin-producing cells derived from umbilical cord stromal mesenchymal stem cells to treat NOD mice. Cell Transplant. 20, 455-466.
Yechoor, V., Liu, V., Espiritu, C., Paul, A., Oka, K., Kojima, H., and Chan, L. (2009). Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev. Cell. 16, 358-373.
Zhang, T., Saunee, N.A., Breslin, M.B., Song, K., and Lan, M.S. (2012). Functional role of an islet transcription factor, INSM1/IA-1, on pancreatic acinar cell trans-differentiation. J. Cell. Physiol. 227, 2470-2479.
Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., and Melton, D.A. (2008). In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature
【図１】
2017521089.tif 000006
【図２】
2017521089.tif 000007
【図３】
2017521089.tif 000008
【図４】
2017521089.tif 000009
【図５】
2017521089.tif 000010
【図６】
2017521089.tif 000011
【図７】
2017521089.tif 000012
【図８】
2017521089.tif 000013
【図９】
2017521089.tif 000014
【図１０】
2017521089.tif 000015
【図１１Ａ】
2017521089.tif 000016
【図１１Ｂ】
2017521089.tif 000017
【図１１Ｃ】
2017521089.tif 000018
【図１１Ｄ】
2017521089.tif 000019
【図１２】
2017521089.tif 000020
【図１３】
2017521089.tif 000021
【図１４】
2017521089.tif 000022
【図１５】
2017521089.tif 000023
【国際調査報告】
2017521089.tif 000024
2017521089.tif 000025
2017521089.tif 000026
2017521089.tif 000027