(57)【要約】  ピーナッツアレルギーの治療のためのＤＮＡワクチンが本明細書で提供される。前記ワクチンは、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）の管腔ドメインとインフレームで融合した１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープについてのコード配列及びＬＡＭＰの標的配列を含む。前記ワクチンは、多価分子であり得る及び／又は２つ以上のＤＮＡ構築物を含む多価ワクチンの一部として提供され得る。
2017521064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
存在する順に：
シグナル配列をコードする核酸配列；
細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする核酸配列；
ピーナッツアレルゲンドメインをコードする核酸配列であって、前記ピーナッツアレルゲンドメインが、前記ピーナッツアレルゲンについての天然シグナル配列を含まない少なくとも１つのピーナッツアレルゲンを含む、核酸配列；
膜貫通ドメインをコードする核酸配列；及び
エンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする核酸配列
を含む、単離された又は精製された核酸分子。
【請求項２】
前記シグナル配列が、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）のシグナル配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＬＡＭＰが、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮである、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記シグナル配列が、配列番号：１のアミノ酸１から２７を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記細胞小器官内安定化／輸送ドメインが、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記細胞小器官内安定化／輸送ドメインが、ＬＡＭＰの管腔ドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記細胞小器官内安定化／輸送ドメインが、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮの管腔ドメインを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記細胞小器官内安定化／輸送ドメインが、配列番号：１のアミノ酸２８から３８０を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
ピーナッツアレルゲンドメインをコードする前記核酸配列が、２つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープをコードする核酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ピーナッツアレルゲンドメインをコードする前記核酸配列が、２つ以上のピーナッツアレルゲンをコードする核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ピーナッツアレルゲンドメインをコードする前記核酸配列が、３つのピーナッツアレルゲンをコードする核酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのピーナッツアレルゲンが、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３、Ａｒａ  Ｈ３ｄｅｌ又はそれらの組合せを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのピーナッツアレルゲンドメインが、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び／又は配列番号：５のアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ピーナッツアレルゲンエピトープ又はピーナッツアレルゲンが、リンカーによって隔てられている、請求項９から１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記リンカーが、アミノ酸配列ＧＧＧＧ又はＧＧＧＧＳを含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインが、ＬＡＭＰの膜貫通ドメインを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記ＬＡＭＰが、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮである、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記膜貫通ドメインが、配列番号：１のアミノ酸１６３７から１６６０を含む、請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記エンドソーム／リソソーム標的ドメインが、ＹＸＸＯシグナルを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記ＹＸＸＯシグナルが、アミノ酸配列ＹＱＴＩ、ＹＱＲＩ、ＹＥＱＦ又はＹＨＴＬを含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７又は配列番号：８をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記核酸分子が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項２５】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２３に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の少なくとも２つの核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の３つの核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項３１】
配列番号：６をコードする核酸分子、配列番号：７をコードする核酸分子及び配列番号：８をコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２３に記載の少なくとも２つのベクターを含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２３に記載の３つのベクターを含む医薬組成物。
【請求項３４】
配列番号：６をコードする核酸配列を含むベクター、配列番号：７をコードする核酸配列を含むベクター及び配列番号：８又は配列番号：２８をコードする核酸配列を含むベクターを含有する、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ピーナッツアレルギー反応の治療又は予防における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
ピーナッツアレルギー反応の治療又は予防における使用のための、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
治療有効量の請求項１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３に記載のベクター又は請求項２７から３５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象においてピーナッツアレルギー反応を予防する又は治療する方法。
【請求項３９】
前記対象が、前記投与の前にピーナッツアレルゲンに暴露される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、ＩｇＥ応答の生成を減少させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、血漿ヒスチジンレベルを低下させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、ＩＬ−４の産生を減少させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、ＩＦＮ−γレベルを上昇させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、筋肉内注射（ＩＭ）によって前記対象に投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、皮内（ＩＤ）注射によって前記対象に投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、ＩｇＥ応答を減弱させるのに十分な量で投与する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象がヒトである、請求項３８から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記エンドソーム／リソソーム標的ドメインが、アミノ酸配列ＬＩＲＴを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年６月２３日に出願された米国特許出願第６２／０１５，９８１号の優先権を主張する。
【０００２】
開示される主題は、分子生物学及び医学の分野に関する。より詳細には、開示される主題は、ＤＮＡワクチンとしての使用のための核酸、及びピーナッツアレルギー反応に罹患している又は罹患しやすい対象を治療するためにそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アレルギー反応は、免疫系が、アレルゲンと呼ばれる無害な異物に反応する場合に起こる。食物アレルギーは、潜在的に致死的な全身性ショックであるアナフィラキシーの高い危険性のゆえに重要な公衆衛生問題である（Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３）。幼児は一般の人々よりも食物アレルギーを発症する危険性が高い（Ｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０）。生後３年の間に、小児の６〜８％が食物によって引き起こされるアレルギー反応を経験する（Ｂｏｃｋ（１９８７）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４５：５８７−５９６；Ｂｕｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：２３０−２５２；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３；２：４４６−４５６；Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８）。牛乳、卵及びピーナッツは３大食物アレルゲンであり（Ｓａｍｐｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：６３５−６４５）、５歳までに、牛乳又は卵アレルギーを有する小児の８０〜８５％がそのアレルギーから脱する（Ｈｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９：Ｓ４９０）。その一方で、ピーナッツに対しては小児の２０％しか耐性を発現しない（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７；２：３６７−３７４）。
【０００４】
食物アレルゲン、特にピーナッツへの暴露によって引き起こされるアナフィラキシーは、ヒスタミンの過剰産生を特徴とする重篤な免疫反応を生じさせ、米国のアナフィラキシー救急治療室受診の半数の原因である。ピーナッツに対するそのような極端な反応は、米国では毎年３０，０００件を超えるアナフィラキシーの事例と１００〜２００例の死亡をもたらしている。微量のピーナッツは、個々に商標が付いているが、ラベル表示されていない何千もの加工食品中で一般的に見出される。１５０万人を超えるアメリカ人がピーナッツアレルギーによる症状に苦しんでおり、症状はしばしば生涯を通じて持続する。多くが、微量に暴露したときに危険な反応を経験する。
【０００５】
ピーナッツアレルギーの症状を軽減するための処置はない。ピーナッツアレルギーに罹患している個人、及び小学校のような施設は、暴露又は経口摂取、及び潜在的に致死的なアナフィラキシー症状の発現の危険性を回避するために厳しい措置を取らねばならない。ピーナッツアレルギーの診断は、アナフィラキシーの危険性を回避するために持続的な食事監視を維持することを必要とする（Ｙｕｎｇｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＪＡＭＡ  ２６０：１４５０−１４５２）。小児の場合は、この監視が親、学校及び世話をする人によっても実施されねばならない。過去１０年間にわたって、ピーナッツアレルギーの有病率は倍増しており、成人アメリカ人の２％を占める（Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８；Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７）。枯草熱及びブタクサ花粉のような多くの他のアレルギーの症状は生命を脅かすものではないが、ピーナッツアレルギーの個体に関しては、１０００分の１個のピーナッツという少量の摂取がアナフィラキシーショックや死亡を誘発し得る（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０；Ｗｅｎｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０）。ピーナッツの偶発的な摂取は、すべての食物誘発性アナフィラキシーショックの３分の２に関連している（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３）。偶発的な摂取がアナフィラキシーを引き起こした場合、気道を広げるためにエピネフリンの注射が使用される（Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３；Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８）。
【０００６】
食物アレルギーは、個体が経口耐性を発現することができず、代わりにその後のアレルゲン暴露に感作された場合に起こる（Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４）。アレルギー患者において、アレルゲンは２型ヘルパーＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ２）を選択的に活性化し、それが、ほとんどのアレルギー症状の根底にある炎症を組織化するのを助ける、アレルギー誘発性サイトカイン、インターロイキンＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生する（Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４）。ＩＬ−４は、抗体産生Ｂ細胞にアレルゲン特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅを分泌するように指示する（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８；Ｓｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６）。中和ＩｇＧと異なり、ＩｇＥは、肥満細胞及び好酸球によって発現されるその高親和性受容体Ｆｃ−εＲＩに結合し（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０；Ｂｅｎｈａｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７）、そしてこれらの細胞を感作する。その後の暴露時に、ＩｇＥは、原因アレルゲンに結合し架橋して、肥満細胞に脱顆粒してアレルギー反応を開始させる揮発性化学物質を放出するように指示するシグナルを伝達する。
【０００７】
免疫療法、すなわち耐性を生じさせるための漸増用量のアレルゲンの投与は、アレルギー疾患の標準的な処置であるが、ピーナッツアレルギーの治療に関しては高頻度のアナフィラキシー反応のために承認されていない（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２）。さらに、免疫療法の有用性は、週１回又は２週間に１回の注射を最大３６か月間まで必要とする、治療期間の長さによって制限され、結果として成功とコンプライアンスの度合いは様々である（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２；Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３；Ｃｉｐｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４
【非特許文献２】Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３
【非特許文献３】Ｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５
【非特許文献４】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０
【非特許文献６】Ｂｏｃｋ（１９８７）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４５：５８７−５９６
【非特許文献７】Ｂｕｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：２３０−２５２
【非特許文献８】Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３；２：４４６−４５６
【非特許文献９】Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８
【非特許文献１０】Ｓａｍｐｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：６３５−６４５
【非特許文献１１】Ｈｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９：Ｓ４９０
【非特許文献１２】Ｓｋｏｌｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７；２：３６７−３７４
【非特許文献１３】Ｙｕｎｇｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＪＡＭＡ  ２６０：１４５０−１４５２
【非特許文献１４】Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８
【非特許文献１５】Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７
【非特許文献１６】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０
【非特許文献１７】Ｗｅｎｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０
【非特許文献１８】Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３
【非特許文献１９】Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３
【非特許文献２０】Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８
【非特許文献２１】Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４
【非特許文献２２】Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４
【非特許文献２３】Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８
【非特許文献２４】Ｓｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６
【非特許文献２５】Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０
【非特許文献２６】Ｂｅｎｈａｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７
【非特許文献２７】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１
【非特許文献２８】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２
【非特許文献２９】Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２
【非特許文献３０】Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３
【非特許文献３１】Ｃｉｐｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３
【発明の概要】
【０００９】
１つの態様では、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、ここでピーナッツアレルゲンドメインは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない少なくとも１つのピーナッツアレルゲンを含有する；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、単離された又は精製された核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３、Ａｒａ  Ｈ３ｄｅｌ、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンエピトープを有するＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２若しくはＡｒａ  Ｈ３の一部分、又はそれらの任意の組合せである。
【００１０】
別の態様は、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、ここでピーナッツアレルゲンドメインは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない少なくとも１つのピーナッツアレルゲンを含有する；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、１つ以上の単離された又は精製された核酸を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３、Ａｒａ  Ｈ３ｄｅｌ、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンエピトープを有するＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２若しくはＡｒａ  Ｈ３の一部分、又はそれらの任意の組合せである。
【００１１】
さらに別の態様では、対象においてアレルギー反応を低減する、除去する又は予防する方法が提供され、この方法は、ここで開示されるＤＮＡワクチンを、アレルゲン特異的ＩｇＥ応答の産生を低減する又は除去するのに十分な量で対象に投与することを含む。
【００１２】
上述の本明細書で開示される主題の特定の態様は、本明細書で開示される主題によって全体又は一部が対応し、他の態様は、以下で詳細に説明される付属の実施例及び図面と関連付けて考慮される場合、説明が進むと共に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、アレルゲン−ＬＡＭＰ１タンパク質の略図である。
【図２】図２は、アレルゲンドメイン内に３つのピーナッツアレルゲン（すべてそのネイティブな又は天然に存在するシグナル配列を欠く、ＡｒａＨ１、ＡｒａＨ２及びＡｒａＨ３）を含む核酸のベクターマップを示す。
【図３】図３は、図２の核酸によってコードされるタンパク質の概略図を示す。
【図４】図４は、本開示に従う構築物からのピーナッツアレルゲンＡｒａＨ１、Ｈ２及びＨ３の共発現を示すウェスタンブロットを表示する。
【図５】図５は、皮内（ＩＤ）又は筋肉内（ＩＭ）注射によるＡｒａ  Ｈ１−ＬＡＭＰ、Ａｒａ  Ｈ２−ＬＡＭＰ及びＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰプラスミドの組合せ又は単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰプラスミド（Ｈ１−３多価プラスミド）での免疫後のマウスにおけるＩｇＧ１抗体レベルを示す；各セットの３つのバーは以下を表す：左側のバー、免疫後４９日目；中央のバー、免疫後７０日目；右側のバー、免疫後８４日目。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、Ａｒａ  Ｈ１−ＬＡＭＰ、Ａｒａ  Ｈ２−ＬＡＭＰ及びＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰプラスミドの組合せ又は単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰプラスミドでの免疫後のマウスにおけるＩｇＧ２ａ抗体レベルを示す；Ａ）皮内（ＩＤ）注射；各セットの３つのバーは以下を表す：左側のバー、免疫後２１日目；中央のバー、免疫後３５日目；右側のバー、免疫後４９日目；及びＢ）皮内（ＩＤ）又は筋肉内（ＩＭ）注射；青色のバー、免疫後４９日目；赤色のバー、免疫後７０日目；緑色のバー、免疫後８４日目。
【図７】図７は、本明細書で示す予防試験についてのプロトコルの代表的な実施形態を示す。
【図８】図８は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ（Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌプラスミドの組合せと定義される）での免疫後のマウスにおけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルを示す。免疫プロトコル：５週齢の雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｎ＝１０匹のマウス／群）を０、７及び１４日目にＡｒａ−ＬＡＭＰ  ＤＮＡワクチン（−３、−２、−１週目）で免疫した。対照群にはＬＡＭＰだけのベクターを与えた。ＣＰＥは粗ピーナッツ抽出物と定義される。
【図９】図９は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘでの免疫及び感作後５８日目のマウスにおけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルを示す。感作プロトコル：マウスをピーナッツペースト（ＰＮ）１０ｍｇ＋コレラ毒素（ＣＴ）２０μｇで、胃内経路により（ｉ．ｇ．）、最初は０週目（Ｗ）に３回、次にＷ５まで週１回、次いでＷ６及びＷ８にＰＮ  ５０ｍｇ＋ＣＴ  ２０μｇ  ｉ．ｇ．での２回の追加免疫で感作した。
【図１０】図１０は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘでの免疫及び感作後９２日目のマウスにおけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルを示す。ＰＮ攻撃誘発前の抗体力価、５回のＰＮ−ＣＴ感作後−９２日目。感作プロトコルを継続した。
【図１１】図１１は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘでの免疫、感作及びアナフィラキシー攻撃誘発後のマウスにおけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルを示す。アナフィラキシー攻撃誘発：その後マウスをＷ１２にピーナッツペースト（ＰＮ）２００ｍｇ  ｉ．ｇ．で攻撃誘発した。
【図１２】図１２は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘの予防機構を裏付ける、免疫、感作及びアナフィラキシー攻撃誘発後のマウスにおけるＩｇＥ抗体レベルを示す。各セットの２つのバーは以下を表す：左側のバー、対照ベクター；右側のバー、Ａｒａ  Ｈ−ＬＡＭＰワクチン；単独でその他のセットのバーから分離されている左端のバーは前採血を表す。
【図１３】図１３は、図９から１２に示すデータの要約を示す。
【図１４】図１４は、図９から１２に示すデータの別の要約を示す；下の図表はデータ点を表す２つの線を示し、上の線は対照ベクターを表し、下の線はＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘを表す。
【図１５】図１５は、本明細書で示す予防試験についての代表的なプロトコルを説明する。
【図１６】図１６は、Ｂｉｏｊｅｃｔ  Ｂ２０００無針装置を用いて皮内注射（ＩＤ）によって送達した場合のＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ又は単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰプラスミドに対するＩｇＧ１（パネルＡ）、ＩｇＧ２ａ（パネルＢ）及びＩｇＥ（パネルＣ）応答を示す。２８、５７、９２、１０８、１４０及び１７１日目の時点をｘ軸に表示し、それらの各々は以下を表す３つのバーを示す：対照ベクター（左側のバー）、３つのプラスミドの組合せ（中央のバー）及び単一の複数アレルゲンプラスミド（右側のバー）。
【図１７】図１７は、本明細書で示す治療試験についてのプロトコルの代表的な実施形態を示す。
【図１８】図１８は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘでのワクチン処置前のマウスにおける血清ピーナッツ特異的ＩｇＥ抗体レベルを示す。
【図１９】図１９は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘでのワクチン処置前及び処置後のマウスにおける血清ピーナッツ特異的ＩｇＥ抗体レベルを示す。
【図２０】図２０は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ及び治療プロトコルを使用した１５週目のマウスにおけるアナフィラキシー攻撃誘発結果（症状スコア、パネルＡ；体温、パネルＢ）を示す。
【図２１】図２１は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ及び治療プロトコルを使用した１５週目の経口攻撃誘発後のマウスにおける血漿ヒスタミンレベルを示す。
【図２２】図２２は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ及び治療プロトコルを使用した１５週目のマウスにおけるＩＬ−４サイトカインレベルを示す。
【図２３】図２３は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ及び治療プロトコルを使用した１５週目のマウスにおけるＩＦＮ−γレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ここで本開示の様々な例示的実施形態を詳細に述べる。例示的実施形態についての以下の考察は、本明細書で広く開示されるように、本発明への限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。むしろ、以下の考察は、本発明の特定の態様及び特徴のより詳細な理解を読者に与えるために提供される。本発明の実施は、特に指示されない限り、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を用いる。そのような技術は文献中で十分に説明されており、これらの分野の当業者に公知であり、したがって本明細書で詳述する必要はない。同様に、薬物治療のための本発明の実施は当分野で公知の標準的なプロトコルに従うものであり、それらのプロトコルは本明細書で詳述する必要はない。
【００１５】
本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。さらに、値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに異なる指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の各々の中間値も、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されているものと理解される。任意の記載される値又は記載される範囲内の中間値と、任意の他の記載される値又は記載される範囲内の中間値との間の各々のより小さな範囲は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、範囲内に含まれるか又は除外されてもよく、上限と下限のいずれか又は両方がより小さな範囲内に含まれるか又はどちらも含まれない場合の各々の範囲も、記載される範囲内の任意の具体的に除外される限界に従って、本発明に包含される。記載範囲が上限又は下限の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる上限と下限のいずれか又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。したがって、値の範囲が提示される場合、範囲内の各々の値及び範囲内に含まれる各々の範囲も本質的に同様に列挙されること、ならびにありとあらゆる値及び値のありとあらゆる可能な範囲の具体的な言及を回避することは、それらの値及び範囲の排除ではなく、むしろ読者のための利便性、及び本開示の簡潔性のためであることが理解されるべきである。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び学術用語は、その用語が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で述べるものと同様の又は等価の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで述べる。本明細書で言及されるすべての公表文献は、それに関連して公表文献が引用される方法及び／又は材料を開示し、説明するための参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれる任意の公表文献と相いれない場合は、本開示が支配権を持つ。
【００１７】
本明細書及び付属の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態の「１つ（「ａ」、「ａｎ」）及び「その（「ｔｈｅ」）は、文脈上明らかに異なる指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「アレルゲン」への言及には複数のそのようなアレルゲンが含まれ、「試料」への言及には１つ以上の試料及び当業者に公知のその等価物が含まれる、等々である。さらに、等価の用語を使用して表すことができる用語の使用には、それらの等価用語の使用が含まれる。したがって、例えば「対象」という用語の使用は、「動物」、「ヒト」という用語、及び薬物治療を受けるものを指示するために当分野で使用される他の用語を含むことが理解されるべきである。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、構築物、組成物及び方法が、列挙される要素及び／又は工程を含むが、他の要素及び／又は工程を除外するものではないことを意味することが意図されている。構築物、組成物及び方法を定義するために使用される場合、「から基本的に成る」は、列挙される構築物、組成物及び方法に対して基本的に重要である他の要素及び工程を除外することを意味する。したがって、本明細書で定義される要素から基本的に成る組成物は、単離及び精製方法ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤等のような医薬的に許容される担体からの微量の夾雑物を除外しない。「から成る」は、微量を上回る他の成分の要素及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程を除外することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は本発明の範囲内である。
【００１９】
「キメラＤＮＡ」は、自然界でより大きな分子と結合して見出されることがない、比較的大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡのセグメントである。したがって、キメラＤＮＡがタンパク質セグメントをコードする場合、そのセグメントをコードする配列は、いかなる天然に存在するゲノム内のコード配列にも隣接していないＤＮＡによって隣接される。隣接するＤＮＡがポリペプチド配列をコードする場合、コードされるタンパク質は「キメラタンパク質」（すなわち天然には存在しないアミノ酸配列が一緒に融合されたタンパク質）と称される。対立遺伝子変異又は天然に起こる変異事象は、本明細書で定義されるキメラＤＮＡ又はキメラタンパク質を生じさせない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、任意の長さの重合形態のヌクレオチドを指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／又はそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してよく、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば一重、二重及び三重らせん分子、遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーを包含する。核酸分子はまた、修飾された核酸分子（例えば修飾された塩基、糖及び／又はヌクレオチド間リンカーを含む）も含み得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体又はペプチドミメティックの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合又は他の結合（例えばエステル、エーテル等）によって連結され得る。「ペプチド」という用語は、本明細書ではペプチド（すなわち２から約２０残基のポリアミノ酸）、ポリペプチド（すなわち約２０残基から約１００残基のペプチド）及びタンパク質（すなわち約１００個以上の残基を有するペプチド）を指すために総称的に使用される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体を含む天然及び／又は非天然アミノ酸、又は合成アミノ酸、並びにアミノ酸類似体及びペプチドミメティックのいずれかを指す。３個以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合は一般にオリゴペプチドと呼ばれる。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含するが、「ポリペプチド」は完全長未満のタンパク質であり得る。
【００２３】
「アレルゲン」という用語は、個体に反復暴露されたときアレルギー性、すなわちＩｇＥ媒介性応答を誘導することが報告されている、任意の天然に存在するタンパク質又はタンパク質の混合物を指す。アレルゲンは、アレルギー反応を惹起することができる任意の化合物、物質又は材料である。アレルゲンは通常、免疫応答を惹起することができる化合物、物質又は材料である抗原のサブカテゴリーと理解される。本発明を実施するために、アレルゲンは、中でも特に、天然又は未変性アレルゲン、改変された天然アレルゲン、合成アレルゲン、組換えアレルゲン、アレルゴイド及びこれらの混合物又は組合せから選択され得る。特に興味深いのは、ピーナッツアレルゲン、特にＩｇＥ媒介性即時型過敏症を引き起こすことができるものである。それらの化学的又は生化学的性質に関して、アレルゲンは、天然又は組換えタンパク質又はペプチド、天然又は組換えタンパク質又はペプチドのフラグメント又はトランケート型、融合タンパク質、合成化合物（化学アレルゲン）、アレルゲンを模倣する合成化合物、又は化学的もしくは物理的に改変されたアレルゲン、例えば熱変性によって改変されたアレルゲンであり得る。
【００２４】
「エピトープ」は、免疫系の成分によって特異的に認識される又は特異的に結合される、通常は短いペプチド配列又はオリゴ糖で構成される構造体である。Ｔ細胞エピトープは、一般に直鎖状オリゴペプチドであることが示されている。２つのエピトープは、同じ抗体によって特異的に結合され得る場合、互いに対応する。２つのエピトープは、両方が同じＢ細胞受容体又は同じＴ細胞受容体に結合することができ、一方の抗体のそのエピトープへの結合が他方のエピトープによる結合を実質的に妨げる（例えば他方のエピトープの約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％、５％、１％又は約０．１％未満が結合する）場合、互いに対応する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、２つの核酸コード配列は、それらの配列又はそれらの相補的配列が同じアミノ酸配列をコードする場合、互いに「対応」する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、別の配列に特定の割合（例えば少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、手作業で又は当分野で常用のソフトウェアプログラムを使用して最大限に整列した場合、２つの配列を比較すると塩基（又はアミノ酸）の割合が同一であることを意味する。
【００２７】
２つのヌクレオチド配列は、定義された長さのＤＮＡ配列にわたって少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％のヌクレオチドがマッチする場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。同様に、２つのポリペプチド配列は、定義された長さのポリペプチド配列にわたってポリペプチドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％）、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％又は９８％のアミノ酸残基がマッチする場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較することによって同定することができる。実質的に相同な核酸配列も、例えば特定の系に関して定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当分野の技術範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、４２℃で、５×ＳＳＣ及び５０％＞ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、ならびに６０℃で、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウムでの洗浄であり得る。
【００２８】
ドメイン配列の「保存的に修飾された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体という用語は、同一もしくは基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００２９】
野生型タンパク質の「生物学的に活性なフラグメント」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な等価物」及び「機能性誘導体」という用語は、活性を検出するのに適したアッセイを用いて測定した場合、野生型タンパク質の生物学的活性と少なくとも実質的に等しい（例えば有意に異ならない）生物学的活性を有する物質を意味する。例えば、輸送ドメインを含む生物学的に活性なフラグメントは、輸送ドメインを含む完全長ポリペプチドと同じ区画に共局在することができるものである。
【００３０】
細胞は、外因性又は異種核酸が細胞の内部に導入されている場合、そのような外因性又は異種核酸によって「形質転換」、「形質導入」又は「トランスフェクト」されている。
【００３１】
トランスフォーミングＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合されて）いてもよく又は組み込まれて（共有結合されて）いなくてもよい。例えば原核生物、酵母及び哺乳動物細胞では、トランスフォーミングＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核細胞では、安定に形質転換された細胞は、トランスフォーミングＤＮＡが染色体に組み込まれて、それが染色体複製を介して娘細胞によって受け継がれる細胞である。この安定性は、トランスフォーミングＤＮＡを含有する娘細胞の集団から成る細胞株又はクローンを樹立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞又は共通の祖先から派生した細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代（例えば少なくとも約１０世代）にわたってインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００３２】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律単位として機能する任意の遺伝要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ又はインビトロのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含有するウイルス又はウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子導入がアデノウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、アデノウイルスキャプシドタンパク質に関連して、アデノウイルスゲノム又はその部分及び選択された非アデノウイルス遺伝子を含有するポリヌクレオチドを指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「核酸送達ベクター」は、対象とするポリヌクレオチドを細胞に輸送することができる核酸分子である。好ましくは、そのようなベクターは、発現制御配列に作動可能に連結されたコード配列を含む。しかし、対象とするポリヌクレオチド配列は必ずしもコード配列を含まない。例えば、対象とするポリヌクレオチド配列は、標的分子に結合するアプタマーであり得る。別の例では、対象とする配列は、調節配列に結合して調節配列の調節を阻害する、調節配列の相補的配列であり得る。さらに別の例では、対象とする配列は、それ自体が（例えば細胞内で調節因子を中和除去するための）調節配列である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「核酸送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチド（例えば遺伝子又は遺伝子フラグメント、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー等）を宿主細胞に運搬することができ、上述した核酸送達ベクターに関連して生じる、任意の分子又は分子群又は巨大分子と定義される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「核酸送達」又は「核酸導入」は、導入に使用される方法に関わりなく、外因性ポリヌクレオチド（例えば導入遺伝子など）を宿主細胞に導入することを指す。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定に又は一過性に維持され得る。安定な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と適合性の複製起点を含むか又は染色体外レプリコン（例えばプラスミド）若しくは核染色体若しくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンに組み込まれることを必要とする。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される及び／又はペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「転写制御下で」又は「作動可能に連結された」は、発現制御エレメント及びコード配列の適切な並置によって制御されるポリヌクレオチド配列の発現（例えば転写又は翻訳）を指す。１つの態様では、ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写を制御し、調節する場合、発現制御配列に「作動可能に連結されて」いる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に置かれた場合、転写され、ポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと、３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及びさらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、そのような合成ＤＮＡ配列は、その配列が発現されることを意図される生物に関してコドン最適化されているものを含み得る。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常はコード配列の３’側に位置する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」は、細胞の正常なヌクレオチド配列への任意の付加又はその欠失若しくは破壊を指す。当分野で認識される方法としては、ウイルス媒介性遺伝子導入、リポソーム媒介性導入、形質転換、トランスフェクション及び形質導入、例えばウイルス媒介性遺伝子導入、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づくベクターならびにレトロウイルスに基づくベクターの使用が含まれる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「リソソーム／エンドソーム区画」は、膜内にＬＡＭＰ分子を含有する膜結合酸性液胞、抗原プロセシングにおいて機能する加水分解酵素、及び抗原の認識と提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。この区画は、エンドサイトーシス、食作用及び飲作用を含む様々な機構のいずれかによって細胞表面からインターナライズされた異物の分解、ならびに特殊な自己分解現象によってこの区画に送達された細胞内物質の分解のための部位として機能する（例えばｄｅ Ｄｕｖｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１参照）。本明細書で使用される「エンドソーム」という用語はリソソームを包含する。 
【００４２】
本明細書で使用される場合、「リソソーム関連細胞小器官」は、リゾチームを含有する任意の細胞小器官を指し、これには、ＭＩＩＣ、ＣＵＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解性顆粒、血小板密顆粒、好塩基性顆粒、バーベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソーム等が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、そのような細胞小器官は、マンノース６−リン酸受容体を欠き、ＬＡＭＰを含むが、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含んでもよく又は含まなくてもよい。総説については、例えばＢｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＤｅｌｌＡｎｇｅｌｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：１２６５−１２７８参照。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「リソソーム関連膜タンパク質」又は「ＬＡＭＰ」は、エンドソーム／リソソーム区画又はリソソーム関連細胞小器官の膜において見出されるドメインを含み、及び管腔ドメインをさらに含む任意のタンパク質を指す。例示的なＬＡＭＰには、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ６３／ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、又はそのホモログ、オルソログ、変異体（例えば対立遺伝子変異体）及び修飾形態（例えば天然に存在する若しくは遺伝子操作された１つ以上の変異を含む）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰは、例えばヒト又はマウスリソソーム関連膜タンパク質などの、哺乳動物のリソソーム関連膜タンパク質である。例示的なＬＡＭＰには、配列番号：２２、２３、２４、２５又は３０に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。開示される核酸分子に従って使用し得るＬＡＭＰペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列には、配列番号：１０、１１、１２、１３又は２９に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である任意の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「安定化ドメイン」という用語は、タンパク質を活性に保つ及び／又はその天然の立体配座に保持するのを助けるドメインを意味することが意図されている。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「輸送ドメイン」という用語は、タンパク質を細胞の特定の部分に標的化するのを助けるドメインを意味することが意図されている。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「標的ドメイン」は、本発明のキメラタンパク質を好ましい部位、例えば細胞小器官又は抗原プロセシング及びＭＨＣ  ＩＩへの結合が起こる区画に向かわせるポリペプチド配列を意味する。「標的ドメイン」は、それ自体で、細胞区画／細胞小器官への送達に必要とされる一連のアミノ酸を指す。好ましくは、標的ドメインは、アダプター又はＡＰタンパク質（例えばＡＰ１、ＡＰ２もしくはＡＰ３タンパク質など）に結合する配列である。例示的な標的ドメイン配列は、例えばＤｅｌｌＡｎｇｅｌｉｃａ，２０００に記載されている。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「エンドソーム／リソソーム標的ドメイン」は、エンドソーム／リソソーム区画又はリソソーム関連細胞小器官への送達に必要とされる一連のアミノ酸を指す。例えば、リソソームの外膜へのＬＡＭＰ輸送は、カルボキシ末端細胞質尾部内のチロシン認識配列（ＹＸＸＯ）（Ｙはチロシン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得、及びＯは大きな疎水性残基である）である、エンドソーム／リソソーム標的ドメインへのアダプタータンパク質の結合によって媒介される。例示的なチロシン認識配列には、アミノ酸配列ＹＱＴＩ、ＹＱＲＩ、ＹＥＱＦ及びＹＨＴＬが含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、インビボ核酸送達、核酸導入、核酸療法等は、外因性ポリヌクレオチドを含有するベクターをヒト又は非ヒト哺乳動物などの生物の体内に直接導入することを指し、それによって外因性ポリヌクレオチドがインビボでそのような生物の細胞に導入される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｓｉｔｕ」という用語は、核酸を標的細胞と近接させる（例えば核酸は全身投与されない）インビボ核酸送達の一種を指す。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ送達法には、核酸を部位に（例えば腫瘍又は心筋などの組織中に）直接注入すること、開放手術野を介して核酸を（１若しくは複数の）細胞又は組織と接触させること、又はカテーテルなどの医療用アクセス装置を用いて部位に核酸を送達することが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「単離された」及び「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメントが通常自然界で結合している、細胞やその他の成分から分離されていることを意味するために時として交換可能に使用される。例えばポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、通常は染色体内で結合している５’及び３’配列から分離されているものである。当業者には明白であるように、天然には存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそのフラグメントは、その天然に存在する対応物から区別するための「単離」を必要としない。さらに、「単離された」及び「精製された」という用語は、完全な単離及び完全な純粋性を意味しない。これらの用語は、ポリヌクレオチド等と結合して天然に見出される一部又はすべての他の物質からの部分的及び完全な純粋性の両方を表すために使用される。したがって、これらの用語は、ある天然に結合している物質からの単離又は精製（例えばＲＮＡからのＤＮＡの単離又は精製）、同じ一般的クラスの分子の他の物質からの単離又は精製（例えば試料中のすべてのタンパク質と比較して２０％の純度を示す特定のタンパク質）、又は任意の組合せを意味することができる。単離及び精製は、１００％を含む、約１％から約１００％の任意のレベルを意味し得る。細胞の「単離された」又は「精製された」集団は、それ自体、その集団が自然界で結合している細胞及び物質を実質的に含まない。言うまでもなく、当業者は、値の分数を含むすべての具体的な値は、各々個別の値が本明細書で列挙されることを必要とせずにこれらの範囲内に包含されることを認識する。各々の値は、簡潔さのため具体的には開示されない。しかし、読者は、ありとあらゆる具体的な値が本質的に本発明によって開示され、包含されることを理解すべてきである。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」又は「レシピエント細胞」は、個々の細胞、又は、外因性核酸分子、ポリヌクレオチド及び／又はタンパク質のレシピエントであることが所望される又はレシピエントであった細胞を指す。この用語はまた、単一細胞の子孫も包含することが意図されており、子孫は、天然、偶発的又は意図的な変異に起因して起源の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的に又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体において）でなくてもよい。標的細胞は、（例えば組織におけるように）他の細胞と接触していてもよく、又は生物の体内で循環して見出されてもよい。
【００５２】
本明細書で使用される「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子又はその部分、あるいは１つ以上の非古典的ＭＨＣ分子又はその部分に関連して抗原をその表面に提示する任意の細胞を指す。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に論じられ、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ及びフォスター抗原提示細胞などの全細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された抗原提示細胞」は、その表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、そのような細胞は、天然ではその表面に共刺激分子を有していなくてもよく、又はその表面に天然の共刺激分子に加えて付加的な人工共刺激分子を有していてもよく、又はその表面に非天然のクラスＩＩ分子を発現してもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原に結合することができ、及び免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えば腫瘍、炎症又は他の浸潤物由来のＣＴＬ株、ＣＴＬクローン及びＣＴＬが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本発明が対象とする動物を指示するために交換可能に使用される。動物という用語は、ヒト及び非ヒト動物を包含すると理解されるべきであり、これら２つを区別することを所望する場合は、ヒト及び／又は非ヒト動物という用語が使用される。いくつかの実施形態では、対象又は患者は脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ）、競技動物（例えばウマ）及び愛玩動物（例えばイヌ及びネコ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
臨床的アレルギー症状は当業者に公知であり、本明細書で網羅的に列挙する必要はない。非限定的な例としては、眼及び鼻の発赤及びかゆみ、鼻のかゆみ及び鼻水、コーチング、喘鳴、息切れ、掻痒及び組織の腫脹などの一般的な症状を伴う皮膚、眼、鼻、上下気道における反応を含む、鼻炎、結膜炎、喘息、じんま疹、湿疹が含まれる。
【００５７】
「免疫学的インビボ試験」の例は、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）、眼粘膜誘発試験（ＣＰＴ）、アレルゲンでの気管支攻撃誘発（ＢＣＡ）、及び１つ以上のアレルギー症状を観測する様々な臨床試験である。例えばＨａｕｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．３，ｐｐ７０９−７２２，Ｍａｒｃｈ  １９９３参照。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水及びエマルジョン、例えば水中油型又は油中水型エマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤などの、当分野で公知のあらゆる標準的な医薬担体を包含する。組成物は、安定剤及び防腐剤も含み得る。担体、安定剤及びアジュバントの例に関しては、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））参照。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、異常な生理的応答を予防する、矯正する及び／又は正常化するのに十分な量を意味するために本明細書で使用される。１つの態様では、「治療有効量」は、病態の臨床的に重要な特徴、例えば臨床的アレルギー症状、抗体産生、サイトカイン産生、発熱もしくは白血球数、又はヒスタミンのレベルなどを少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減させるのに十分な量である。
【００６０】
「抗体」は、特異的エピトープに結合する、抗体及びそのフラグメントを含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体（例えば二重特異性抗体）を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変領域ならびに超可変領域から成る抗体分子の構造上の部分である。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）部分を含む、パラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分であり、これらの部分は、本明細書で述べる治療方法における使用のために好ましい。
【００６１】
「口腔粘膜投与」という用語は、活性成分の局所的又は全身的作用を得るために、剤形を舌下又は口腔内のいずれか別の場所に置き、活性成分を患者の口腔又は咽頭粘膜と接触させる投与経路を指す。口腔粘膜投与経路の一例は舌下投与である。「舌下投与」という用語は、活性成分の局所的又は全身的作用を得るために剤形を舌下に置く投与経路を指す。本明細書で使用される場合、「皮内送達」という用語は、ワクチンを皮膚の真皮に送達することを意味する。しかし、ワクチンは必ずしももっぱら真皮だけに位置付けられるわけではない。真皮は、ヒト皮膚の表面から約１．０〜約２．０ｍｍの間に位置する皮膚の層であるが、個体間で及び身体の異なる部位ではある程度の量の変動がある。一般に、皮膚の表面から１．５ｍｍ深部に進むことによって真皮に達すると予想できる。真皮は、表面の角質層及び表皮と、皮下層との間に位置する。送達の方式に依存して、ワクチンは、最終的に真皮内だけに又は主として真皮内に位置し得るか、又は最終的に表皮及び真皮内に分布し得る。 
【００６２】
本明細書で使用される場合、アレルギー免疫療法、アレルギー治療又はアレルギー患者のために設計された治療介入を表す他の用語に関連して「予防する」もしくは「予防的に」という用語は、すべての患者の少なくとも２０％におけるＩｇＥ応答の予防を意味する。「予防する」という用語は、すべての患者におけるＩｇＥ媒介性疾患の発症の完全な予防を必要とせず、そのような定義は、アレルギー症状を低減させる機構を介してアレルギーを治療するための本発明の範囲外であり、当分野におけるこの用語の使用と合致しない。アレルギー治療が１００％の患者において１００％有効なわけではないことは、アレルギー免疫療法の当業者に周知であり、そのようなわけで「予防する」の絶対的な定義は本発明の文脈内では適用されない。当分野で認識されている予防の概念が本発明によって企図される。
【００６３】
大まかに言えば、本開示は、ポリ核酸、ポリアミノ酸、並びにポリ核酸及びポリアミノ酸を必要とする対象を治療する方法を提供する。ポリ核酸及びその組成物は、ポリ核酸を投与された対象の体内で防御免疫応答を誘発するピーナッツアレルゲン配列（ポリアミノ酸）の細胞内産生のための核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）ワクチンであると考えることができる。ポリ核酸は、投与された場合、ＭＨＣ−ＩＩ経路による細胞媒介性免疫応答、並びにＩｇＥ抗体、顆粒球（例えば好酸球）及び他の物質の産生に関与するＴｈ２型応答よりはむしろ、ＡＰＣ、ＮＫ細胞及びＴ細胞によるインターフェロンの産生を伴うピーナッツアレルゲン特異的１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞応答を活性化することによるＩｇＧ抗体の産生を選択的に惹起する。ある程度まで、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｉ応答の両方を生じさせることができる。しかし、本発明は、主として又は実質的にＭＨＣ−ＩＩ応答である応答を提供する。いくつかの実施形態では、免疫系は、アレルギー性ＩｇＥ／Ｔｈ２応答ではなくＩｇＧ／Ｔｈ１応答を選択して再びバランスをとる。好ましくは、核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードしない。
【００６４】
具体的には、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）キメラ構築物を利用してピーナッツアレルゲンをＭＨＣ  ＩＩ／エンドソーム経路に向かわせる新規ピーナッツアレルギーＤＮＡワクチンが本明細書で提供される。本明細書で述べる核酸分子、ベクター及び医薬組成物を含む、開示されるワクチンは、ピーナッツアレルギーに罹患している人々に、ピーナッツに対する感受性を有意に低減する又は除去する安全で低アレルゲン性の費用効率の高い療法を提供する。
【００６５】
開示される核酸は、対象に投与された場合、抗原を抗原提示細胞のリソソーム区画に隔離し、アレルギー患者においてＴｈ２からＴｈ１への応答変化を生じさせる。別の利点は、ここで開示される構築物は偶発的アレルゲン暴露を予防するように設計されていることである。アレルゲンは核酸としてコードされているので、投与後に有意の量のアレルゲンが全身的に暴露されることはない。アレルゲンは、忠実性の高いリソソーム輸送のためにＬＡＭＰ内にコードされる。リソソームにおいて、アレルゲンはタンパク質分解を受け、アレルゲンエピトープをＭＨＣ−ＩＩに暴露してヘルパーＴ細胞に提示される。したがって、ここで開示される療法を受ける対象は、遊離アレルゲンに暴露を伴わない臨床応答を示す。
【００６６】
したがって、いくつかの実施形態では、存在する順に、シグナル配列をコードする核酸配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする核酸配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする核酸配列、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然シグナル配列を含まない；膜貫通ドメインをコードする核酸配列；ならびにエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする核酸配列を含む、単離された又は精製された核酸分子が提供される。
【００６７】
本明細書で提供される単離された又は精製された核酸分子はシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列はＬＡＭＰのシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は小胞体移行配列である。例示的なＬＡＭＰシグナル配列には、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮのシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＬＡＭＰシグナル配列には、配列番号：１のアミノ酸１〜２７、配列番号：２２のアミノ酸１〜２７、配列番号：２３のアミノ酸１〜２８、配列番号：２４のアミノ酸５〜２７及び配列番号：２５のアミノ酸１〜２４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。開示される核酸分子に従って使用し得るＬＡＭＰシグナル配列をコードする例示的なヌクレオチド配列には、配列番号：１８のヌクレオチド１〜８６、配列番号：１９のヌクレオチド１〜８６、配列番号：２０のヌクレオチド１〜８６、配列番号：２１のヌクレオチド１〜８６、配列番号：１０のヌクレオチド１〜８４、配列番号：１１のヌクレオチド１〜８１、配列番号：１２のヌクレオチド１〜７２及び配列番号：１３のヌクレオチド１３〜８１に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である任意の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で述べる単離された又は精製された核酸分子は、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）をコードする配列を含む細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列をさらに含む。例えば、細胞小器官内安定化／輸送ドメインは、ＬＡＭＰの管腔ドメインを含み得る。別の実施形態では、細胞小器官内安定化／輸送ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮの管腔ドメインを含む。例示的な細胞小器官内安定化／輸送ドメインには、配列番号：１のアミノ酸２８〜３８０、配列番号：２２のアミノ酸２８〜３８１、配列番号：２３のアミノ酸２９〜３７５、配列番号：２４のアミノ酸２８〜４３３又は配列番号：２５のアミノ酸２５〜１６２に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。例示的な細胞小器官内安定化／輸送ドメインは、配列番号：１８のヌクレオチド８７〜１１４６、配列番号：１９のヌクレオチド８７〜１１４６、配列番号：２０のヌクレオチド８７〜１１４６、配列番号：２１のヌクレオチド８７〜１１４６、配列番号：１０のヌクレオチド８５〜１１２５、配列番号：１１のヌクレオチド８２〜１１４３、配列番号：１２のヌクレオチド７３〜４８６又は配列番号：１３のヌクレオチド８２〜１２９９に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００６９】
本明細書で述べる核酸分子は、ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列をさらに含む。ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列は、１つ以上のアレルゲンエピトープを含有する、１つ以上のピーナッツアレルゲンタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする核酸配列を含む。ピーナッツアレルゲンドメインは、好ましくはピーナッツアレルゲン由来の天然に存在するシグナル配列を含まない。完全長未満のピーナッツアレルゲン配列を使用する場合は、好ましくは、完全長ピーナッツアレルゲンタンパク質の１つ以上のエピトープがアレルゲンタンパク質内のそれらの天然の位置の状況で提供される。ピーナッツアレルゲンドメインは、各々が１つ以上のアレルゲンエピトープを含有する、２つ以上のアレルゲンを含み得る。さらに他の実施形態では、ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列は、３つのピーナッツアレルゲンをコードする配列を含む。特定のアレルゲンタンパク質が２つ以上のエピトープを含有することは公知である。いくつかの実施形態では、ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列は、ピーナッツアレルゲンタンパク質のアレルゲンコード領域全体（すなわちシグナル配列を欠くコード領域）又はその実質的な部分を含む。いくつかのピーナッツアレルゲンドメインは、２つ以上のエピトープをそれらの天然に存在する関係で含有する。あるいは、２つ以上の公知のピーナッツアレルゲンエピトープを１つのコード領域に融合することができる。さらに再び、例示的な実施形態では、２つ以上のピーナッツアレルゲンタンパク質又はそのアレルゲン領域がピーナッツアレルゲンドメイン内に存在する。２つ以上のエピトープが単一エピトープドメイン内に存在するように遺伝子操作されている場合、エピトープは同じ抗原タンパク質由来であり得る。いくつかの実施形態では、単離された又は精製された核酸分子は、２つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープをコードする核酸配列を含有する核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ピーナッツアレルゲンドメインをコードする核酸配列は、２つ以上のピーナッツアレルゲンをコードする核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ピーナッツアレルゲンドメインをコードする核酸配列は、３つのピーナッツアレルゲンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３、ＡｒａＨ３ｄｅｌ、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンエピトープを有するその部分、又はそれらの任意の組合せである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンドメインをコードする核酸配列は、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：２６、配列番号：１８のヌクレオチド１１４７〜２９４３、配列番号：１９のヌクレオチド１１４７〜１６００、配列番号：２０のヌクレオチド１１４７〜２６２３、配列番号：２１のヌクレオチド１１４７〜２９４９、配列番号：２１のヌクレオチド２９６２〜３４１４及び／又は配列番号：２１のヌクレオチド３４２７〜４９０２に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ａｒａ  Ｈピーナッツアレルゲンドメインは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１のアミノ酸３８３〜９８３、配列番号：１のアミノ酸９８８〜１１３８、配列番号：１のアミノ酸１１４３〜１６３４及び／又は配列番号：１のアミノ酸３８３〜１６３４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ピーナッツアレルゲンエピトープ又はピーナッツアレルゲンはリンカーによって隔てられている。例えば、リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧ又はＧＧＧＧＳを含み得る。
【００７２】
本明細書で提供される単離された又は精製された核酸分子は、膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、部分的に生体膜の両側に存在するタンパク質の十分に特徴付けられた物理的及び機能的エレメントである。一般に、膜貫通ドメインは、天然では疎水性又は親油性であり、及び生体膜においてタンパク質を固定するように機能するアミノ酸の線状配列である。そのような配列はしばしば２０〜２５残基の長さである。当業者は、そのような配列を十分に認識し、本発明における使用のために適切な膜貫通配列を容易に得る又は遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＡＭＰ、例えば、限定されることなく、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮの膜貫通ドメインを含む。開示される核酸分子に従って使用し得る膜貫通ドメインをコードする例示的なヌクレオチド配列には、配列番号：１０のヌクレオチド１１２６〜１１８８、配列番号：１１のヌクレオチド１１４４〜１２１２、配列番号：１２のヌクレオチド４８７〜５５５、配列番号：１３のヌクレオチド１３００〜１３９５又は配列番号：２９のヌクレオチド１１４１〜１２１２に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である任意の配列が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＬＡＭＰ膜貫通ドメインは、配列番号：２３のアミノ酸３７６〜３９６、配列番号：２２のアミノ酸３８２〜４０４、配列番号：２４のアミノ酸４３４〜４６６、配列番号：２５のアミノ酸１６３〜１８５又は配列番号：３０のアミノ酸３８１〜４０４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７３】
核酸分子は、エンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム／リソソーム標的ドメインは、カルボキシ末端細胞質尾部内のチロシン認識配列（ＹＸＸＯシグナル）（Ｙはチロシン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得、及びＯは大きな疎水性残基である）であり得る。いくつかの実施形態では、チロシン認識配列（ＹＸＸＯシグナル）は、アミノ酸配列ＹＱＴＩ、ＹＱＲＩ、ＹＥＱＦ又はＹＨＴＬを含む。エンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする核酸配列は、配列番号：２１のヌクレオチド５００５〜５０１６、配列番号：１０のヌクレオチド１２１３〜１２２４、配列番号：１１のヌクレオチド１２３７〜１２４８又は配列番号：１２のヌクレオチド５８０〜５９１を含み得る。いくつかの実施形態では、エンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする核酸配列は、配列番号：１３のヌクレオチド１４２０〜１４３１を含み得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、開示される核酸分子は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１又は配列番号：２７に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。本明細書で提供される開示核酸分子は、配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：２８に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み得る。
【００７５】
開示される核酸分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、単離された又は精製された核酸は、単一のキメラ核酸又は遺伝子操作された核酸上に存在する。開示される単離された又は精製された核酸のそれぞれのドメインをコードする配列は、当分野で公知の広く実施されている技術を用いて任意の順序で組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ドメインを、それらがキメラタンパク質をコードする単一オープンリーディングフレームを含むように組み合わせて配置し、前記オープンリーディングフレームは、キメラタンパク質の発現に十分な転写エレメントに作動可能に連結されている。したがって核酸は、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター等のような発現ベクターを含み得る。好ましくは、核酸は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現に適した転写エレメントを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つのプラスミド内にピーナッツアレルゲン、例えばＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３及び／又はＡｒａＨ３ｄｅｌを提供する。代表的な例として、本明細書で開示される単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３  ＬＡＭＰプラスミドは、単一プラスミド内に主要なピーナッツアレルゲン、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３を含む。単一多価ＡｒａＨ１／Ｈ２／Ｈ３ｄｅｌ  ＬＡＭＰプラスミドも本明細書で提供される。プラスミドは、単一プラスミド内に２つのピーナッツアレルゲンの組合せ、例えばＡｒａ  Ｈ１とＡｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ２とＡｒａ  Ｈ３、又はＡｒａ  Ｈ１とＡｒａ  Ｈ３の組合せも含み得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示は、各々それ自身のプラスミド上に、ピーナッツアレルゲン、例えばＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３及び／又はＡｒａＨ３ｄｅｌを提供する。代表的な例として、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ  ｖａｘ組成物は、別々のプラスミドによってコードされる主要ピーナッツアレルゲン、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌを含む。また、別々のプラスミドによってコードされるＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３を含有する組成物も本明細書で提供される。そのような場合、組成物は少なくとも２つのＤＮＡワクチンの混合物を含有し、各々のワクチンは１つのピーナッツアレルゲンの配列を含む。ワクチン構築物は、１：１、１：２、１：３、１：４、連続的に最大で１：１０まで（例えば１：５、１：６、１：７、１：８及び１：９）の比率で一緒に混合することができる。好ましい比率は１：１である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ここで開示される核酸は、宿主において免疫応答を誘導するＤＮＡワクチンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、先に述べた単離された又は精製された核酸を含有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、少なくとも２つの単離された又は精製された核酸を含有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、存在する順に、シグナル配列をコードする配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメインをコードする配列；ピーナッツアレルゲンドメインをコードする配列、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない；膜貫通ドメインをコードする配列；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列を含む、少なくとも３つの単離された又は精製された核酸を含有する。
【００８０】
さらに、本明細書で提供される核酸又はベクターを発現する宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００８１】
また、シグナル配列；細胞小器官内安定化／輸送ドメイン；ピーナッツアレルゲンドメイン、これは単一ピーナッツアレルゲン又は２つ以上のピーナッツアレルゲンを含むことができ、各々が１つ以上のピーナッツアレルゲンエピトープを含有し、及びここで少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲンについての天然に存在するシグナル配列を含まない；膜貫通ドメイン；及びエンドソーム／リソソーム標的ドメインを含むポリペプチドも本明細書で提供される。
【００８２】
本明細書で提供されるポリペプチドのいくつかの実施形態では、シグナル配列はＬＡＭＰのシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は小胞体移行配列である。例示的なＬＡＭＰシグナル配列には、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮのシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＬＡＭＰシグナル配列には、配列番号：１のアミノ酸１〜２７、配列番号：２２のアミノ酸１〜２７、配列番号：２３のアミノ酸１〜２８、配列番号：２４のアミノ酸５〜２７及び配列番号：２５のアミノ酸１〜２４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。
【００８３】
ポリペプチドは細胞小器官内安定化／輸送ドメインをさらに含む。例えば、細胞小器官内安定化／輸送ドメインはＬＡＭＰの管腔ドメインを含み得る。別の実施形態では、細胞小器官内安定化／輸送ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮの管腔ドメインを含む。例示的な細胞小器官内安定化／輸送ドメインには、配列番号：１のアミノ酸２８〜３８０、配列番号：２２のアミノ酸２８〜３８１、配列番号：２３のアミノ酸２９〜３７５、配列番号：２４のアミノ酸２８〜４３３又は配列番号：２５のアミノ酸２５〜１６２に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書で述べるポリペプチドは、ピーナッツアレルゲンドメインをさらに含む。ピーナッツアレルゲンドメインは、１つ以上のアレルゲンエピトープを含有する、１つ以上のピーナッツアレルゲンタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含む。ピーナッツアレルゲンドメインは、好ましくはピーナッツアレルゲン由来の天然に存在するシグナル配列を含まない。完全長未満のピーナッツアレルゲン配列を使用する場合は、好ましくは、完全長ピーナッツアレルゲンタンパク質の１つ以上のエピトープがアレルゲンタンパク質内のそれらの天然の位置の状況で提供される。ピーナッツアレルゲンドメインは、各々が１つ以上のアレルゲンエピトープを含有する、２つ以上のアレルゲンを含み得る。さらに他の実施形態では、ピーナッツアレルゲンドメインは３つのピーナッツアレルゲンを含む。特定のアレルゲンタンパク質が２つ以上のエピトープを含有することは公知である。いくつかのピーナッツアレルゲンドメインは、２つ以上のエピトープをそれらの天然に存在する関係で含有する。２つ以上のエピトープが単一エピトープドメイン内に存在するように遺伝子操作されている場合、エピトープは同じ抗原タンパク質由来であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３、ＡｒａＨ３ｄｅｌ、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンエピトープを有するその部分、又はそれらの任意の組合せである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、Ａｒａ  Ｈピーナッツアレルゲンドメインは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１のアミノ酸３８３〜９８３、配列番号：１のアミノ酸９８８〜１１３８、配列番号：１のアミノ酸１１４３〜１６３４及び／又は配列番号：１のアミノ酸３８３〜１６３４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ピーナッツアレルゲンエピトープ又はピーナッツアレルゲンはリンカーによって隔てられている。例えば、リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧ又はＧＧＧＧＳを含み得る。
【００８７】
本明細書で提供されるポリペプチドは膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＡＭＰ、例えば、限定されることなく、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＬＩＭＰ  ＩＩ又はＥＮＤＯＬＹＮの膜貫通ドメインを含む。例示的なＬＡＭＰ膜貫通ドメインは、配列番号：１のアミノ酸１６３７〜１６６０、配列番号：２３のアミノ酸３７６〜３９６、配列番号：２２のアミノ酸３８２〜４０４、配列番号：２４のアミノ酸４３４〜４６６、配列番号：２５のアミノ酸１６３〜１８５又は配列番号：３０のアミノ酸３８１〜４０４に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
上記ポリペプチドは、エンドソーム／リソソーム標的ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム／リソソーム標的ドメインは、カルボキシ末端細胞質尾部内にチロシン認識配列（ＹＸＸＯシグナル）（Ｙはチロシン残基であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得、及びＯは大きな疎水性残基である）を含み得る。いくつかの実施形態では、チロシン認識配列（ＹＸＸＯシグナル）は、アミノ酸配列ＹＱＴＩ、ＹＱＲＩ、ＹＥＱＦ又はＹＨＴＬを含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム／リソソーム標的ドメインは、アミノ酸配列ＬＩＲＴを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：２８に、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ここで開示される核酸分子の少なくとも１つを含有する医薬組成物が提供される。少なくとも１つのここで開示されるベクターを含有する医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：２８をコードする核酸を含むベクターを含有し得る。例えば、核酸は、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：１９又は配列番号：１８によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのここで開示される核酸分子又はベクターを含有する医薬組成物が提供される。さらに他の実施形態では、少なくとも３つのここで開示される核酸分子又はベクターを含有する医薬組成物が提供される。例えば、少なくとも３つの開示される核酸分子は、配列番号：６をコードする核酸分子、配列番号：７をコードする核酸分子及び配列番号：８をコードする核酸分子を含み得る。例示的な核酸分子には、配列番号：２７、配列番号：１９及び配列番号：１８が含まれる。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、各々がここで開示される核酸分子を含む、少なくとも２つのベクターを含有する。さらに、第一、第二及び第三のベクターを含有する医薬組成物であって、第一ベクターは配列番号：６をコードする核酸分子を含み、第二ベクターは配列番号：７をコードする核酸分子を含み、及び第三ベクターは配列番号：８をコードする核酸分子を含む、医薬組成物が本明細書で提供される。例示的な核酸配列には、配列番号：２０、配列番号：２７、配列番号：１９及び配列番号：１８が含まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ここで開示される医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含有する。本開示の核酸又はベクターは、精製された又は単離された分子として提供され得る。核酸又はベクターは、組成物の一部としても提供され得る。組成物は基本的に核酸又はベクターから構成され得、これは核酸又はベクターが、コード配列の発現に適する組成物中の唯一の核酸又はベクターであることを意味する。あるいは、組成物は本明細書で開示される核酸又はベクターを含み得る。例示的な実施形態では、組成物は、１つ以上の医薬的に許容される物質又は担体、例えば生理食塩水と共に、本明細書で開示される核酸又はベクターを含有する医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞による核酸の取込みを促進する物質を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、核酸を免疫細胞（例えばＡＰＣ又は抗原提示細胞）などの特定の細胞型に送達するのを助ける標的分子を含有する。他の実施形態では、核酸は、核酸を細胞又は組織に送達するための送達ビヒクル又は送達ベクターの一部である。好ましい実施形態では、ここで開示される製剤は、例えば生理食塩水中の、裸のＤＮＡを含有する。他の好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射によって送達される。
【００９２】
本開示はまた、ここで開示される核酸分子、ベクター及び医薬組成物を使用するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量のここで開示される核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象においてピーナッツアレルギー反応を予防する又は治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答の生成を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、血漿ヒスチジンレベルを低下させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＬ−４の産生を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＦＮ−γレベルを上昇させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、筋肉内（ＩＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、皮内（ＩＤ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答を減弱させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量のここで開示される核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象においてピーナッツアレルギー反応を予防する又は治療する方法を提供し、ここで前記対象は、投与の前にピーナッツアレルゲンに暴露されている。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答の生成を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、血漿ヒスチジンレベルを低下させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＬ−４の産生を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＦＮ−γレベルを上昇させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、筋肉内（ＩＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、皮内（ＩＤ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答を減弱させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量のここで開示される核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象においてピーナッツアレルギー反応を予防する又は治療する方法を提供し、ここで前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答の生成を減少させるのに十分な量で投与される。なおさらなる実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、血漿ヒスチジンレベルを低下させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＬ−４の産生を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＦＮ−γレベルを上昇させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、筋肉内（ＩＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、皮内（ＩＤ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答を減弱させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量のここで開示される核酸分子、ベクター又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象においてピーナッツアレルギー反応を予防する又は治療する方法を提供し、ここで前記対象は投与の前にピーナッツアレルゲンに暴露されており、ここで前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答の生成を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、血漿ヒスチジンレベルを低下させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＬ−４の産生を減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩＦＮ−γレベルを上昇させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、筋肉内（ＩＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、皮内（ＩＤ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、ベクター又は医薬組成物は、ＩｇＥ応答を減弱させるのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００９６】
他の実施形態では、前記方法は、ここで開示される核酸、ベクター、医薬組成物又はＤＮＡワクチンを、アレルゲン特異的ＩｇＧ応答の生成を誘導する又は増大させるのに十分な量で対象に投与することを含む。さらに他の実施形態では、前記方法はピーナッツアレルギー反応を予防する。さらに他の実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの臨床的アレルギー症状を低減する、除去する又は予防する。さらなる実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ピーナッツアレルギー反応を予防するために対象に予防的に投与される。なおさらなる実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ピーナッツアレルギー反応を治療するために対象に治療的に投与される。
【００９７】
ここで開示されるワクチンを使用して必要のある対象を治療する方法も、この開示によって提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上のピーナッツアレルゲンに対するアレルギー反応を発症する危険性がある又は前記アレルギー反応に罹患している対象を予防的に処置する又は治療的に処置する方法である。他の実施形態では、前記方法は、本発明によるＤＮＡワクチンを、ＡＰＣによるＤＮＡワクチンの取込み及び発現を生じさせるのに十分な量で対象に投与することを含む。本発明を特定の作用機構に限定することなく、ＤＮＡワクチンの発現は、ＡＰＣ上のコードされるアレルゲンエピトープの提示及びＩｇＧ免疫応答の発現をもたらす。
【００９８】
本発明の特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：２８をコードする核酸配列、これらの配列の少なくとも１つの一部分、及び／又は別のピーナッツアレルゲンをコードする配列を細胞に投与する。本発明の別の特定の場合は、別々のＤＮＡ構築物上に認められる少なくとも２つのピーナッツアレルゲンを組み合わせて細胞に投与する。好ましい実施形態では、細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞である。好ましくは、樹状細胞はヒト樹状細胞である。本発明は、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、電気穿孔、遺伝子銃ワクチン接種又はリポソーム媒介性移入を含む、核酸ワクチンの有効な送達方法である当分野で公知の方法によって投与され得る。
【００９９】
本発明は、細胞に投与された場合、特異的抗体応答の増大をもたらす製剤を提供する。ピーナッツアレルゲンに対する抗体応答の増大は、ＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を治療するのに有用である。ＩｇＥは、その細胞拘束性及びコグネイトアレルゲンへの結合後に生じる細胞内シグナル伝達に関連する特定の性質を有する。ＩｇＥは、Ｂ細胞がＴｈ２細胞によって分泌されるＩＬ−４を受け取った場合にピーナッツアレルゲンに対して生成される。これは、Ｂ細胞にＩｇＥクラス抗体を産生するように指示するのを助ける。Ｂ細胞による分泌後、ＩｇＥは、肥満細胞及び好酸球によって発現されるその高親和性受容体Ｆｃ−εＲＩに結合して、これらの細胞及び動物をその後のアレルゲン暴露に対して感受性にする。その結果、ピーナッツアレルゲンの経口摂取、吸入又は粘膜接触後にアレルギーの症状が引き起こされ得る。抗体の結合特性に起因して、ピーナッツアレルギー症状を低減する１つの方法は、他の抗体クラスとの競合を介してＩｇＥによる結合に利用可能な遊離アレルゲンをキレート化することであると提案されている。特に、ＩｇＧを増大させるアレルギー製剤は、アレルギー疾患を軽減するための１つの経路であると提案されている。本明細書で述べる本発明は、ＩｇＧ産生の増強を誘導し、したがって臨床的に有意の方法でＩｇＥ対ＩｇＧの比率の低下を生じさせる。
【実施例】
【０１００】
ここで本発明の例示的な実施形態を参照して本発明を説明する。以下の実施例は、本発明の構築物の構築及び活性についてのより良い理解を読者に与えることが意図されており、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０１】
一般的材料及び方法
ピーナッツアレルゲンＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３を、天然配列としてコードする遺伝子配列（対照プラスミド）、及び各々の配列をＬＡＭＰの管腔ドメインと膜貫通ドメインの間に挿入したヒトＬＡＭＰ−１とのキメラとしてコードする遺伝子配列（実験プラスミド）を作製した。以前の試験は、抗原配列をヒトでの使用のために最適化しなければならないことを示しており、したがってＲＮＡの安定性及びタンパク質発現を最大化するためにすべての不必要な又は有害なエレメント（潜在的スプライス部位、二次ＲＮＡ／ＤＮＡ構造体、二次ＯＲＦ）を除去した。ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰは配列番号：１５を含んだ。ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰは配列番号：１２を含んだ。最終的な最適化配列を化学合成し、抗生物質不含のｐＤＮＡ−ＶＡＣＣ−ｕｌｔｒａ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）のＬＡＭＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に挿入した。キメラタンパク質の発現を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクトし、その後ウェスタンブロット分析することによって各プラスミドについて測定した。リソソームへの細胞輸送を共焦点顕微鏡検査及び細胞溶解物を免疫ブロットすることによって確認した。
【０１０２】
ＡｒａＨ３ｄｅｌ遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎオンライン遺伝子設計ソフトウェアを使用してヒト使用のためにコドン最適化した。合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって製造した。この合成遺伝子をＮ  ＬＡＭＰ−Ｃ  ＬＡＭＰ遺伝子に挿入し、Ｎ  ＬＡＭＰ−ＡｒａＨ３ｄｅｌ−Ｃ  ＬＡＭＰ（配列番号：２７）を作製して、その後発現ベクターに挿入した。天然ＡｒａＨ３タンパク質の酸性及び塩基性サブユニットへのタンパク質分解プロセシングに基づいて欠失を作製した。酸性サブユニットを生成し、単一プラスミドとして使用した。
【０１０３】
単一多価構築物（配列番号：２１を含むＡｒａＨ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰ）を、優性ピーナッツアレルゲン（Ａｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２、Ａｒａ  Ｈ３）の各々をコードするＤＮＡを合成し、ＬＡＭＰ−ｖａｘ免疫ベクターに挿入することによって作製した（図２及び３）。この単一多価ピーナッツ構築物において、５アミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）をＡｒａ  Ｈ１とＡｒａ  Ｈ２の間及びＡｒａ  Ｈ２とＡｒａ  Ｈ３の間に挿入した。ウェスタンブロット分析は、Ａｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ単一多価構築物からのピーナッツアレルゲンＡｒａ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３の共発現を示した（図４）。ＡＲＡ−ＬＡＭＰ  ｖａｘ組成物は３つのプラスミドを含み、各々のプラスミドは、ｐＤＮＡＶＡＣＣ−ｕｌｔｒａ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）中に、ＬＡＭＰの管腔及び膜貫通ドメイン内に、ＬＡＭＰ−ｖａｘ免疫ベクターに挿入された単一のピーナッツアレルゲン（Ａｒａ  Ｈ１、Ｈ２又はＨ３ｄｅｌ）をコードするＤＮＡ（すなわち配列番号：１８、１９及び２０）を含有した。Ａｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘは、本明細書ではＡｒａ−Ｈ−ＬＡＭＰとも称される。各プラスミドがトランスフェクトされた細胞培養物中でキメラＡｒａ／ＬＡＭＰタンパク質を発現すること及び処置の結果としてマウスがアレルゲン特異的抗体を生成することが確認された。各ベクターの発現を、トランスフェクトされた細胞において単独で又は組み合わせて評価した。
【０１０４】
すべての動物実験は、実験動物福祉部門（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ（ＯＬＡＷ））承認施設の動物倫理委員会に従って実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＡｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ単一多価構築物又はＡｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ３プラスミド組成物のいずれかで、筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射によって免疫し、免疫応答を特徴付けた。対照マウスは、同じ濃度の空のベクター（すなわちＡｒａ−ＬＡＭＰ構築物を含まないｐＤＮＡＶＡＣＣ−ｕｌｔｒａ  ｖｅｃｔｏｒ；「対照ベクター」）で免疫した。抗原攻撃の前日に、先に記述されているように（Ｓａｌｏｇａ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１（１）：１３３−４０；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５６２４−５６３０）受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）試験のためにマウスを調製した。
【０１０５】
治療効果を判定するため、ナイーブマウスをピーナッツに感作させ、次に２週間後、Ａｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ製剤（各動物につき単一多価Ａｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド５０μｇ／ＰＢＳ  ２００μＬ又は各動物につきＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド、ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド及びＡｒａＨ３−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミドの各々５０μｇ／ＰＢＳ  ２００μＬ）を用いて２週間の間隔で３回免疫した。免疫後、ボール末端マウス給餌針を使用して週に１回８週間にわたってピーナッツペースト（ＰＮ）１０ｍｇとコレラ毒素（ＣＴ）２０μｇを投与することを介して、実験的に食物アレルギーを誘導することによってマウスをピーナッツで攻撃誘発し、アレルギー症状を採点した。
【０１０６】
予防効率を判定するため、ピーナッツナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスを０日目、１４日目及び２８日目にＡｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ（各動物につき単一多価Ａｒａ−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド５０μｇ／ＰＢＳ  ２００μＬ又は各動物につきＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド、ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミド及びＡｒａＨ３−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミドの各々５０μｇの製剤／ＰＢＳ  ２００μＬ）で３回免疫し、その後ピーナッツ抽出物とコレラ毒素で感作した（図７）。各々のワクチン接種日及びその後４２日目まで週１回、血清試料を採取した。
【０１０７】
抗原攻撃後、アレルギー症状を０〜５スケールに従って盲検で、独立した治験責任医師が採点し、ここで０は症状がないことを表し、５は死亡であった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：６３９−６４６）。ヒスタミンレベルを測定するため、攻撃誘発の３０〜４０分後の血清を採取し、検定した。光学顕微鏡検査を用いて耳試料に関して組織学的試験を実施し、全身性アナフィラキシーの結果としての肥満細胞脱顆粒の程度を測定した。
【０１０８】
マウスから週１回採血し、血清を−８０℃で保存した。マウスを犠死させ、各ワクチン製剤によって生じた免疫応答を検定して、ＩｇＧサブタイプ、ＩｇＥについての抗体レベル及びサイトカインを測定した。Ｔ細胞及びＢ細胞の免疫学的応答をＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、細胞増殖アッセイ及びサイトカインアッセイによって評価した。いずれかのワクチン製剤がアレルゲン漏出をもたらすかどうかを判定するため、血清試料をサンドイッチＥＬＩＳＡによってピーナッツアレルゲンに関して検定した。
【０１０９】
サイトカインアッセイのために、上清をＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の存在に関してＥＬＩＳＡで検定した。マッチする抗体対をＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のために使用し、製造者の指示に従って行った。マウス組換えＩＦＮ−γ及びＩＬ−４に関して標準曲線を作成した。すべての抗体及びサイトカインはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入した。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４アッセイの検出限界はそれぞれ２０ｐｇ／ｍｌ及び１０ｐｇ／ｍｌであった。
【実施例２】
【０１１０】
ＡＲＡ−ＬＡＭＰ予防試験
ピーナッツアレルゲンＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及び／又はＡｒａ  Ｈ３を含有するＤＮＡ構築物を予防的有効性に関してマウスモデルで試験した。ピーナッツアレルゲンＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３をコードする多価ＬＡＭＰプラスミド（実施例１に従って作製したＡｒａＨ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰ）を、各々のプラスミドが単一ピーナッツアレルゲンをコードする、３プラスミド混合物（実施例１に従って調製したＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ、ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ及びＡＲＡＨ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰ）と比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、単一多価ピーナッツプラスミド５０μｇ又は各個別プラスミド５０μｇのいずれかで週１回３週間にわたり、皮内（ＩＤ）又は筋肉内（ＩＭ）注射によって免疫した。最後の免疫の５週間後に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体力価をＥＬＩＳＡによって検定した。多価プラスミドは免疫原性であることが認められたが、抗体応答の大きさは、複数のプラスミド中での単一アレルゲン送達よりも低かった（図５及び６）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＭＨＣ−ＩＩ提示へのエピトープアクセスなどの抗原競合は、すべての抗原に対する免疫応答を制限し得ると考えられる。免疫後の最も強い応答は、皮内（ＩＤ）注射によって送達された複数プラスミドによるものであった。
【０１１１】
図７に示す代表的なプロトコルをさらなる予防試験に使用した。マウスを０、７及び１４日目に単一多価Ａｒａ  Ｈ−ＬＡＭＰ  ＤＮＡワクチンで免疫した（−３、−２、−１週目）。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルを免疫後に測定し、ＩｇＧ２ａレベルは、対照ベクターと比較して単一多価ワクチンに関して有意に高いことが認められた（図８）。次にマウスを、ピーナッツペースト（ＰＮ）及びコレラ毒素（ＣＴ）を用いて最初は０週目に３回、次に５週目まで週１回、次いで６週目と８週目に２回の追加免疫で感作した。５８日目（５週目）のＩｇＧ２ａ抗体レベルは、対照ベクターと比較して多価ワクチンに関して有意に高かった（図９）。２回の追加免疫後、９２日目のＩｇＧ２ａ抗体レベルも、対照ベクターと比較して単一多価ワクチンに関して有意に高かった（図１０）。ＩｇＧ２ａ抗体レベルのこの有意差は、１２週目のピーナッツペーストでの攻撃誘発後も継続した（図１１）。ＩｇＥ応答の減弱が単一多価ワクチンに関して全体を通して認められ（図１２）、多価ワクチンの予防機構を裏付けた。図１３及び１４は予防試験の要約を示す。
【０１１２】
興味深いことに、単一多価プラスミドでの細胞トランスフェクションは、すべてのＡｒａ  ｈアレルゲンが、単一アレルゲンをコードするプラスミドと同様の量で融合タンパク質を産生することを示した。したがってリンカー配列の同一性の長さを調節することは、すべてのアレルゲンの免疫原性を改善し得る。これらの結果は、卓越したインビトロ発現と広い免疫原性を有する多価アレルギープラスミドが成功裏に設計できることを示す。さらに、これらの結果は、ここで開示されるＤＮＡワクチンが対象をピーナッツアレルギーに関して予防的に処置するために使用できることを示す。
【０１１３】
Ｂｉｏｊｅｃｔ  ＩＤ送達を用いてＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ、ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ及びＡｒａＨ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰプラスミドの組合せと単一多価ＡｒａＨ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰプラスミドを比較するさらなる予防試験を、図１５に示す代表的なプロトコルに従って実施した。５週齢の雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｎ＝１０匹のマウス／群）を０、７及び１４日目（−３、−２、−１週目）にＡｒａ  Ｈ１−ＬＡＭＰ、Ａｒａ  Ｈ２−ＬＡＭＰ及びＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰプラスミドの組合せ（各々５０μｇ）又は単一多価ＡｒａＨ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰ  ＤＮＡプラスミド（５０μｇ）のいずれかで免疫した。次にマウスを、ピーナッツペースト（ＰＮ）１０ｍｇ＋ＣＴ  ２０μｇを用いて胃内経路により（ｉ．ｇ．）、最初は０週目（Ｗ）に３回、次にＷ５まで週１回、次いでＷ６及びＷ８にＰＮ  ５０ｍｇ＋ＣＴ  ２０μｇ、ｉ．ｇ．での２回の追加免疫で感作した。対照ベクター（５０μｇ）を摂取したマウスを対照として含めた。その後マウスをＷ１２、Ｗ１６及びＷ２０にＰＮ  ２００ｍｇ、ｉ．ｇ．で攻撃誘発した。免疫学的応答を測定した。
【０１１４】
図１６の結果は、単一ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ−ｖａｘ、単一ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ−ｖａｘ及び単一Ａｒａ−Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰ−ｖａｘプラスミドの組合せ及び単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３−ＬＡＭＰプラスミドの両方が、Ｂｉｏｊｅｃｔ  Ｂ２０００無針装置を用いて皮内注射（ＩＤ）によって送達された場合、強力なＩｇＧ２ａ応答を誘導することを示す。単一多価Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３  ＬＡＭＰプラスミドは、しかしながら、全体としてより強い抗体応答を誘導し、ピーナッツ特異的ＩｇＥも抑制した。
【実施例３】
【０１１５】
ＡＲＡ−ＬＡＭＰ治療試験
ここで開示されるＤＮＡワクチンの治療的処置を提供する能力を調べるための実験も実施した。代表的なプロトコルを図１７に示しており、このプロトコルでは、マウスを最初にピーナッツペースト及びコレラ毒素を用いて感作し、次にここで開示されるＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ３プラスミド（実施例１に従って作製したＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ、ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ及びＡｒａ−Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰ）組成物で処置した。図１８は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ、各々のプラスミドが単一ピーナッツアレルゲンをコードする３プラスミド混合物でのワクチン処置前の数週間のＩｇＥ抗体レベルを示す。
【０１１６】
ワクチン処置後、多価ＤＮＡワクチンを使用した場合は１５週目のＩｇＥ抗体レベルが低下した（図１９）。１５週目のアナフィラキシー攻撃誘発結果（症状スコア、図２０、パネルＡ；体温、図２０、パネルＢ；図２１）は、ＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ３プラスミド組成物の投与が、対照ベクターと比較してより重症度の低い症状及びより低い血漿ヒスタミンレベルをもたらすことを示した。加えて、より少ないアレルギー誘発性サイトカイン、ＩＬ−４がＡＲＡ−ＬＡＭＰ−ｖａｘ３プラスミド組成物の投与に関して認められ（図２２）、一方ＩＦＮ−γのレベルは対照ベクターに比べて高かった（図２３）。これらの結果は、ここで開示されるＤＮＡワクチンが治療的処置に使用できることを示す。
【０１１７】
参考文献
本明細書で言及されるすべての公表文献、特許出願、特許及び他の参考文献は、ここで開示される主題が関連する分野の技術水準を示す。すべての公表文献、特許出願、特許及び他の参考文献は、各々個別の公表文献、特許出願、特許及び他の参考文献が参照により組み込まれることが具体的及び個別に指示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。多くの特許出願、特許及び他の参考文献が本明細書で参照されるが、そのような参照は、これらの資料のいずれかが当分野における共通一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことが理解されよう。
【０１１８】
前記主題を、理解の明瞭さを目的として説明と例によってある程度詳細に述べたが、特定の変更及び修正が付属の特許請求の範囲内で実施できることは当業者に理解されよう。
【０１１９】
配列表
配列番号１  −  ＡｒａＨ−ＬＡＭＰ（又はＡｒａＨ１−Ｈ２−Ｈ３−ＬＡＭＰ）
Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ポリタンパク質キメラ構築物のコード領域のアミノ酸配列は以下のとおりである：
シグナル：（１）〜（２７）
Ｎ−ＬＡＭＰ：（２８）〜（３８０）
ＡｒａＨ１：（３８３）〜（９８３）
ＡｒａＨ２：（９８８）〜（１１３８）
ＡｒａＨ３：（１１４３）〜（１６３４）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１６３７）〜（１６７２）
【０１２０】
2017521064.tif 000003
【０１２１】
2017521064.tif 000004
【０１２２】
2017521064.tif 000005
【０１２３】
2017521064.tif 000006
【０１２４】
2017521064.tif 000007
【０１２５】
配列番号２  −  Ａｒａ  Ｈ１
（Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ポリタンパク質キメラ構築物ＡｒａＨ−ＬＡＭＰ中、及び個別のＡｒａ  Ｈ１構築物ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ中に存在する）シグナル配列を含まないＡｒａ  Ｈ１タンパク質のコード領域のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０１２６】
2017521064.tif 000008
【０１２７】
配列番号３  −  Ａｒａ  Ｈ２
（Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ポリタンパク質キメラ構築物ＡｒａＨ−ＬＡＭＰ中、及び個別のＡｒａ  Ｈ２構築物ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ中に存在する）天然シグナル配列を含まないＡｒａ  Ｈ２タンパク質のコード領域のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０１２８】
2017521064.tif 000009
【０１２９】
配列番号４  −  ポリタンパク質キメラ構築物ＡｒａＨ−ＬＡＭＰ（又はＡｒａＨ１−Ｈ２−Ｈ３−ＬＡＭＰ）中のＡｒａ  Ｈ３
Ａｒａ  Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ポリタンパク質キメラ構築物中の天然シグナル配列を含まないＡｒａ  Ｈ３タンパク質のコード領域のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０１３０】
2017521064.tif 000010
【０１３１】
配列番号５  −  個別のＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ構築物Ａｒａ  Ｈ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰ中のＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ
個別のＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ構築物中のＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌタンパク質（スプライシング部位を回避するように設計されたトランケート型；ｌｅ＝Ｘｈｏ、ｅｆ＝ＥｃｏＲＩ）のコード領域のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０１３２】
2017521064.tif 000011
【０１３３】
配列番号６  −  ＡｒａＨ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰ
ＡｒａＨ３−ＬＡＭＰ融合タンパク質のコード領域のアミノ酸配列（ＬＡＭＰは太字である；隣接するＸｈｏＩ（ＬＥ）及びＥｃｏＲＩ（ＥＦ）部位は大文字で下線を付している）は以下のとおりである：
【０１３４】
2017521064.tif 000012
【０１３５】
配列番号７  −  ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰ
Ａｒａ  Ｈ２−ＬＡＭＰ融合タンパク質のコード領域のアミノ酸配列（ＬＡＭＰは太字である；隣接するＸｈｏＩ（ＬＥ）及びＥｃｏＲＩ（ＥＦ）部位は大文字で下線を付している）は以下のとおりである：
【０１３６】
2017521064.tif 000013
【０１３７】
配列番号８  −  ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ
ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰ融合タンパク質のコード領域のアミノ酸配列（ＬＡＭＰは太字である；隣接するＸｈｏＩ（ＬＥ）及びＥｃｏＲＩ（ＥＦ）部位は大文字で下線を付している）は以下のとおりである：
【０１３８】
2017521064.tif 000014
【０１３９】
配列番号９  −  欠失Ａｒａ  Ｈ３領域
個別のＡｒａ  Ｈ３ｄｅｌ構築物には含まれないＡｒａ  Ｈ３のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０１４０】
2017521064.tif 000015
【０１４１】
配列番号１０  −  ＬＡＭＰ−２ヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８４）
安定化：（８５）〜（１１２５）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１１２６）〜（１２２７）
【０１４２】
2017521064.tif 000016
【０１４３】
配列番号１１  −  ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）ヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８１）
安定化：（８２）〜（１１４３）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１１４４）〜（１２４８）
【０１４４】
2017521064.tif 000017
【０１４５】
配列番号１２  −  ＥＮＤＯＬＹＮヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（７２）
安定化：（７３）〜（４８６）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（４８７）〜（５９４）
【０１４６】
2017521064.tif 000018
【０１４７】
配列番号１３  −  ＬＩＭＰ  ＩＩヌクレオチド配列
シグナル：（１３）〜（８１）
安定化：（８２）〜（１２９９）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１３００）〜（１４３４）
【０１４８】
2017521064.tif 000019
【０１４９】
配列番号１４  −  ＡｒａＨ１−ＡｒａＨ２−ＡｒａＨ３ヌクレオチド配列
ＡｒａＨ１：（１）〜（１８０３）
リンカー：（１８０４）〜（１８１５）
ＡｒａＨ２：（１８１６）〜（２２６８）
リンカー：（２２６９）〜（２２８０）
ＡｒａＨ３：（２２８１）〜（３７５６）
【０１５０】
2017521064.tif 000020
【０１５１】
2017521064.tif 000021
【０１５２】
2017521064.tif 000022
【０１５３】
配列番号１５  −  Ａｒａ  Ｈ１ヌクレオチド配列
【０１５４】
2017521064.tif 000023
【０１５５】
配列番号１６  −  Ａｒａ  Ｈ２ヌクレオチド配列
【０１５６】
2017521064.tif 000024
【０１５７】
配列番号１７  −  Ａｒａ  Ｈ３ヌクレオチド配列
【０１５８】
2017521064.tif 000025
【０１５９】
配列番号１８  −  ＡｒａＨ１−ＬＡＭＰヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８６）
安定化：（８７）〜（１１４６）
ＡｒａＨ１：（１１４７）〜（２９４３）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（２９４３）〜（３０６６）
【０１６０】
2017521064.tif 000026
【０１６１】
2017521064.tif 000027
【０１６２】
2017521064.tif 000028
【０１６３】
配列番号１９  −  ＡｒａＨ２−ＬＡＭＰヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８６）
安定化：（８７）〜（１１４６）
ＡｒａＨ２：（１１４７）〜（１６００）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１６０１）〜（１７１６）
【０１６４】
2017521064.tif 000029
【０１６５】
配列番号２０  −  ＡｒａＨ３−ＬＡＭＰヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８６）
安定化：（８７）〜（１１４６）
ＡｒａＨ３：（１１４７）〜（２６２３）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（２６２４）〜（２７３９）
【０１６６】
2017521064.tif 000030
【０１６７】
2017521064.tif 000031
【０１６８】
配列番号２１  −  ＡｒａＨ１−ＡｒａＨ２−ＡｒａＨ３−ＬＡＭＰ（ＡｒａＨ−ＬＡＭＰ、ＡｒａＨ１−Ｈ２−Ｈ３−ＬＡＭＰ）ヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８６）
安定化：（８７）〜（１１４６）
ＡｒａＨ１：（１１４７）〜（２９４９）
リンカー：（２９５０）〜（２９６１）
ＡｒａＨ２：（２９６２）〜（３４１４）
リンカー：（３４１５）〜（３４２６）
ＡｒａＨ３：（３４２７）〜（４９０２）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（４９０３）〜（５０１９）
【０１６９】
2017521064.tif 000032
【０１７０】
2017521064.tif 000033
【０１７１】
2017521064.tif 000034
【０１７２】
2017521064.tif 000035
【０１７３】
配列番号２２  −  ＬＡＭＰ−３（ＤＣ−ＬＡＭＰ）アミノ酸配列
シグナル：（１）〜（２７）
安定化：（２８）〜（３８１）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（３８２）〜（４１６）
【０１７４】
2017521064.tif 000036
【０１７５】
配列番号２３  −  ＬＡＭＰ−２アミノ酸配列
シグナル：（１）〜（２８）
安定化：（２９）〜（３７５）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（３７６）〜（４０８）
【０１７６】
2017521064.tif 000037
【０１７７】
配列番号２４  −  ＬＩＭＰ  ＩＩアミノ酸配列
シグナル：（５）〜（２７）
安定化：（２８）〜（４３３）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（４３４）〜（４７８）
【０１７８】
2017521064.tif 000038
【０１７９】
配列番号２５  −  ＥＮＤＯＬＹＮアミノ酸配列
シグナル：（１）〜（２４）
安定化：（２５）〜（１６２）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１６３）〜（１９７）
【０１８０】
2017521064.tif 000039
【０１８１】
配列番号２６  −  Ａｒａ  Ｈ３ｄｅｌヌクレオチド配列
【０１８２】
2017521064.tif 000040
【０１８３】
配列番号２７  −  ＡｒａＨ３ｄｅｌ−ＬＡＭＰヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８６）
安定化：（８７）〜（１１４６）
ＡＲＡＨ３ｄｅｌ：（１１４７）〜（２０６４）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（２０６５）〜（２１８１）
【０１８４】
2017521064.tif 000041
【０１８５】
2017521064.tif 000042
【０１８６】
配列番号２８  −  ＡｒａＨ３−ＬＡＭＰアミノ酸配列
シグナル：（１）〜（２７）
安定化：（２８）〜（３８０）
ＡｒａＨ３：（３８１）〜（８８４）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（８８５）〜（９１２）
【０１８７】
2017521064.tif 000043
【０１８８】
配列番号２９  −  ＬＡＭＰ−１ヌクレオチド配列
シグナル：（１）〜（８１）
安定化：（８２）〜（１１４０）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（１１４１）〜（１２５１）
【０１８９】
2017521064.tif 000044
【０１９０】
配列番号３０  −  ＬＡＭＰ−１アミノ酸配列
シグナル：（１）〜（２７）
安定化：（２８）〜（３８０）
膜貫通（ＴＭ）／細胞質（ＣＹＴＯ）：（３８１）〜（４１６）
【０１９１】
2017521064.tif 000045
【図１】
2017521064.tif 000046
【図２】
2017521064.tif 000047
【図３】
2017521064.tif 000048
【図４】
2017521064.tif 000049
【図５】
2017521064.tif 000050
【図６】
2017521064.tif 000051
【図７】
2017521064.tif 000052
【図８】
2017521064.tif 000053
【図９】
2017521064.tif 000054
【図１０】
2017521064.tif 000055
【図１１】
2017521064.tif 000056
【図１２】
2017521064.tif 000057
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2017521064.tif 000060
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2017521064.tif 000069
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