(57)【要約】  本発明は、(a)配列番号1に記載されるアミノ酸配列;又は(b)配列番号1と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド、同ポリペプチドをコードする核酸、ベクター、及び宿主細胞、並びにこれらに基づく治療的処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号1に記載されるアミノ酸配列;又は(b)配列番号1と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、血中のグルコース濃度を低減するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
N末端がアセチル部分により、C末端がアミド部分により修飾されている、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤の少なくとも1つを含む医薬組成物。
【請求項５】
真性糖尿病1型、真性糖尿病2型、代謝症候群、肥満、腎症、網膜症、心血管疾患、腺機能不全、膵臓疾患、敗血症、頭蓋内疾患、及び術後ストレスからなる群から選択される、高血糖を伴う疾患又は障害の処置に用いるための、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド又は請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項６】
対象における血中グルコースレベルを低下させるのに用いるための、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド又は請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象における血漿トリグリセリド(TG)血中レベルを低下させるのに用いるための、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド又は請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項８】
血中の糖化ヘモグロビン(HbA1c)のレベルを低下させるのに用いるための、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド又は請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項9に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項10に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のポリペプチド、同ポリペプチドをコードする核酸、及び同ポリペプチドを含む組成物、並びに治療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖質代謝障害は、多くの形態で起こる。最も一般的な障害は後天性である。後天性の、又は二次性の糖質代謝異常、例えば糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡、及び低血糖は全て、中枢神経系に影響を及ぼす。末梢神経疾患の多くの形態及び変形もまた、糖尿病に見られる。糖質代謝の残りの障害は、代謝の稀な先天性の誤り(即ち遺伝的欠陥)である。
【０００３】
米国において、そして国際的にも、糖質代謝の後天性障害は、かなり一般的である。低血糖は、アルコール中毒患者及びインスリンで処置される糖尿病患者の双方の間で、神経疾患、とりわけ急性の痴呆、記憶喪失、見当識障害、鈍麻、及び昏睡の一般的な原因である。他の原因に由来する高インスリン血症は稀であるが、膵臓腫瘍が原因である可能性がある。糖尿病は、その種々の神経合併症を伴い、成体患者において処置されている最も一般的な障害の1つである。
【０００４】
糖尿病(真性糖尿病)は、最も一般的な内分泌性疾患であり、グルコース代謝の異常によって特徴付けられる。この疾患と関連した異常なグルコース代謝は、高血糖(高い血中グルコースレベル)をもたらし、最終的に、眼、腎臓、神経、及び血管が挙げられる複数の器官系の合併症を引き起こす。高血糖が持続し、又はグルコース耐性が異常な患者は一般に、糖尿病と診断されるが、最も一般的には、患者は最初に、過剰な排尿(多尿症)及び、極度の渇き(多渇症)による頻繁な飲水を呈する。これらの典型的な最初の徴候は、高血糖の浸透圧作用に起因する。
【０００５】
真性糖尿病の病因は典型的に、特に膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞の、膵臓機能障害と関連する。この機能障害は、グルコース調節ペプチドホルモンであるインスリンを産生するランゲルハンス島のベータ細胞の破壊に至ることがある。真性糖尿病は一般に、インスリン依存性のI型、これに対してインスリン非依存性のII型にカテゴリー化されてきた。
【０００６】
糖尿病の主な3つの形態は、以下の通りである:
-  I型:インスリンを産生できない体の不全に由来する。処置は通常、インスリン投与を含む。
-  II型:相対的なインスリン欠乏と組み合わされて、体がインスリンを適切に用いることができない症状に由来する。II型糖尿病となる多くの人々は、人の血中グルコースレベルが正常よりも高いが、II型糖尿病と診断される程十分に高くない場合に起こる症状であるプレ糖尿病の状態で、多くの年を過ごす。
-  妊娠糖尿病:糖尿病にこれまで罹ったことがないが、妊娠中の血中糖(グルコース)レベルが高い妊婦は、妊娠糖尿病であると言われる。妊娠糖尿病は、全妊婦の約4%を襲う。これは、II型(又は稀にI型)の進行に先行する場合がある。
-  糖尿病の多くの他の形態は、これらとは別々にカテゴリー化される。例として、インスリン分泌物の遺伝的欠陥による先天性糖尿病、嚢胞性線維症に関連した糖尿病、グルココルチコイドの高用量によって誘導されるステロイド糖尿病、及び単一遺伝子糖尿病のいくつかの形態が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、この専門用語は、疾患がよく理解されるにつれ、進化してきた。例えば、インスリン非依存性糖尿病を患っている患者において、疾患がインスリン依存型に進むこともあれば、インスリン依存型に進行しないこともあることが見出された。
【０００８】
ゆえに、患者は多くの場合、ランゲルハンス島破壊の病因の機構に関してカテゴリー化され、名称I型は目下、自己免疫的なランゲルハンス島病因を、即ちランゲルハンス島特異的な自己免疫攻撃によって引き起こされる糖尿病を指すのに用いられ、本明細書中ではそのように用いられる。用語インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)は、膵臓ベータ細胞の十分な自己免疫破壊が起こって明白な徴候が生じるステージに進んだI型糖尿病を指す。用語プレIDDMは、生検によって、又は自己免疫反応の分析によって検出され得る自己免疫症状を指し、一部の細胞が破壊に曝され得る程度にまで、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞が、特異的な自己免疫攻撃に曝されることとなる。しかしながら、プレIDDMにおいて、破壊(もしあれば)は、インスリンの投与を必要とする程度にまで進んでいない。I型糖尿病の早期ステージにおいて、明白な徴候が観察されるが、一部のランゲルハンス島機能が残存する点(「蜜月期間」として知られている)が存在し得るので、全てのI型糖尿病がIDDMとして分類されるわけではなく、そして全てのプレIDDMが明白な徴候なく現れるわけではない。
【０００９】
インスリンが不十分であることによって引き起こされる異常な代謝を伴う代謝性合併症は、数多くの器官系に影響を及ぼすことがある。最も一般的な急性の代謝性合併症は、糖尿病性ケトアシドーシスのものであり、重度の高血糖(及び、浸透圧利尿によって引き起こされる、結果として生じる血液量減少)、並びに過剰な遊離脂肪酸の放出及びケトン体の産生によって誘導される代謝性アシドーシスによって特徴付けられる。
【００１０】
ケトアシドーシスの急性代謝性合併症に加えて、糖尿病患者は、相当な罹患率及び時期尚早の死亡率を引き起こす一連の後期合併症の影響を受けやすい。アテローム性動脈硬化症は、グルコース代謝及び脂質代謝の双方における異常の結果として、一般的な集団においてよりも糖尿病患者において広範囲に、且つ初期に起こる。この血管病状は、とりわけ、冠状動脈疾患、脳卒中、及び壊疽を伴う末梢血管疾患に至ることがある。網膜症は、糖尿病の別の血管合併症である。糖尿病性網膜症は失明の主な原因であり、閉塞、出血、動脈瘤形成、及び増殖性網膜症として知られている新血管形成に進むことがある網膜毛細血管の透過性の増大によって開始される。
【００１１】
先に述べるように、血中グルコースの非常に注意深い制御は、I型糖尿病の後期合併症の改善と関連し、ベータ細胞機能の保存又は回復が、疾患の大部分の病的合併症を緩和又は除外し得ることが示唆されている。
【００１２】
糖質代謝の遺伝性障害は、稀である。ピルベートデヒドロゲナーゼ(PDH)複合体の重度の欠陥、及びペントース尿症と呼ばれる良性の化学的異常は、非常に少数(2〜6)の患者で報告された。
【００１３】
低血糖、糖尿病性ケトアシドーシス、及び高浸透圧性昏睡は全て、潜在的に致命的であるが、潜在的に治療可能な症状である。
【００１４】
WO 2011/016026において、本発明者らは、新規の分泌タンパク質、即ちPRT5、PRT6、PRT7、及びPRT8を発見した。特に、PRT8が、血中のグルコースレベルを有意に低下させることが可能であることが示された。
【００１５】
しかしながら、この度、驚くべきことに、短くしたPRT8ペプチド、即ちsbPRT8が、全長PRT8ペプチドよりも生物学的活性を向上させ、且つ血中グルコースレベルを更により有意に低下させることが可能である一方で、他のPRT8フラグメントが、実質的な活性を何ら示さなかったことが、発明者らによって見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】WO 2011/016026
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の目的は、PRT8の活性と比較して活性が向上したポリペプチド、並びに同ポリペプチドをコードする核酸、ベクター、及び細胞を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、血中の過剰グルコース(即ち高血糖)を伴う疾患又は障害の治療的処置のための方法及びsbPRT8の使用を提供することである。
【００１９】
記載が進むにつれ、本発明のこれらの及び他の用途及び目的が明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の目的は、(a)配列番号1に記載されるアミノ酸配列;又は(b)配列番号1と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供することであり、前記ポリペプチドは、血中のグルコースレベルを低下させることが可能である。特定の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなる。別の特定の実施形態において、ポリペプチドは、N末端がアセチル部分により、C末端がアミド部分により修飾されている。
【００２１】
本発明は更に、先に定義される単離されたポリペプチド、並びに薬学的に許容される担体、賦形剤、及び希釈剤の少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明は更に、対象における血中グルコースレベルを低下させるのに用いるための、治療有効量の先に記載されるポリペプチドを提供する。一部の特定の実施形態において、前記対象は、高血糖を伴う疾患又は障害を患っている。そのような疾患又は障害は、限定されないが、真性糖尿病1型、真性糖尿病2型、代謝症候群、肥満、腎症、網膜症、心血管疾患、腺機能不全、膵臓疾患、敗血症、頭蓋内疾患、及び術後ストレスから選択されてよい。
【００２３】
本発明は更に、対象における血漿トリグリセリド(TG)血中レベルを低下させるのに用いるための、治療有効量の先に記載されるポリペプチドを提供する。
【００２４】
本発明は更に、対象の血中の糖化ヘモグロビン(HbA1c)のレベルを低下させるのに用いるための、治療有効量の先に記載されるポリペプチドを提供する。
【００２５】
本発明は更に、(a)配列番号1に記載されるアミノ酸配列;又は(b)配列番号1と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子、同核酸分子を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】ストレプトゾトシン(STZ)で処置されたC57Bl/6マウスに及ぼすsbPRT8の効果を示す図である。STZを注射(50mg/kgの4日間のIP注射)してから、PRT8又はsbPRT8のいずれかで5週処置し、且つ1mg/kgのグルコース(IPGTT)をIP注射したC57Bl/6マウスにおけるグルコースレベルを示すグラフ。凡例:-◆-100μg/マウスのPRT8;-▲-20μg/マウスのsbPRT8;-■-100μg/マウスのsbPRT8;Gluc.=グルコース;T.=グルコース注射後の時間。
【図１Ｂ】ストレプトゾトシン(STZ)で処置されたC57Bl/6マウスに及ぼすsbPRT8の効果を示す図である。STZを注射(50mg/kgの4日間のIP注射)してから、PRT8又はsbPRT8のいずれかで4週処置し、且つ1mg/kgのグルコース(IPGTT)をIP注射したC57Bl/6マウスにおけるグルコースレベルを示すグラフ。凡例:-▲-100μg/マウスのPRT8;-■-100μg/マウスのsbPRT8;-◆-300μg/マウスのsbPRT8。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
WO 2011/016026は、PRT5、PRT6、PRT7、及びPRT8と名付けた新規のタンパク質を開示した。PRT8は、特に膵臓及び精巣において、そしてまた肝臓において見出された。特に、PRT8は、血中のグルコースレベルを有意に低下させることが可能であることが示された。
【００２８】
本発明において、驚くべきことに、短くしたPRT8ペプチド、即ちsbPRT8が、全長PRT8ペプチドよりも生物学的活性を向上させ、且つ血中グルコースレベルを更により有意に低下させることが可能であることが、発明者らによって見出された。
【００２９】
ゆえに、第1の態様において、本発明は、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、並びにその相同体及び誘導体を提供し、前記ポリペプチドは、血中のグルコースレベルを低下させる(即ち、血中のグルコース濃度を減少させる)。
【００３０】
用語「ポリペプチド」は、本明細書中で、ポリペプチド又はタンパク質を意味するように用いられる。ポリペプチドは、遺伝子工学的方法によって、宿主細胞内での発現により、又は任意の他の適切な手段によって、合成的に得られてよい。特に明記しない限り、ポリペプチドは一般に、天然のLアミノ酸で構成される。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、C末端にて、且つ/又はN末端にて修飾されている。特定の一実施形態において、ペプチドは以下のように修飾されている:アセチル-(ペプチド配列)-アミド。一部の他の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ビオチン基、蛍光基、又はシステイン残基から選択される1つ又は複数の基で修飾されている。
【００３２】
本発明に関連する、修飾ポリペプチド、それらのフラグメント、相同体及び誘導体に関して、配列番号1のポリペプチドの生物学的活性を保持することが理解される。ポリペプチドが、修飾されていない分子の生物学的活性と質的に類似する生物学的活性を保持するかを判定するために、例えば、修飾ポリペプチドが、同時に、又は別々に行われる実験においてアッセイされる、対応する非修飾ポリペプチドと比較される、試験管内実験、生体内実験、又は臨床実験等の1つ又は複数のアッセイが実行されてよい。
【００３３】
修飾ポリペプチド又は変形ポリペプチドは、少なくとも2つ、3つ又はそれ以上の、場合によってはアミノ酸スペーサーによって分離されたsbPRT8のコピーを含むポリペプチドであってよい。修飾ポリペプチドはまた、配列番号1との同一性の程度が、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、特に少なくとも95%であるポリペプチドであってもよい。
【００３４】
本発明によって提供されるのはまた、sbPRT8に由来するポリペプチド、例えば、1つ又は複数のアミノ酸が、保存的置換によって別のアミノ酸と置き換えられている修飾ポリペプチドである。本明細書中で用いられる「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換を指し、クラスは、自然界に見られる相同タンパク質における共通の物理化学的アミノ酸側鎖特性、及び高い置換頻度によって定義される。アミノ酸側鎖の6つの一般的なクラスがカテゴリー化されており、以下が挙げられる:クラスI(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);クラスIII(Asn、Asp、Gln、Glu);クラスIV(His、Arg、Lys);クラスV(Ile、Leu、Val、Met);及びクラスVI(Phe、Tyr、Trp)。例えば、Aspによる、クラスIIIの別の残基、例えばAsn、Gln、又はGluの置換は、保存的置換である。
【００３５】
一実施形態において、たった1つの置換が、アミノ酸配列中でなされる。別の実施形態において、2つの置換がなされる。更なる実施形態において、3つの置換がなされる。置換の最大数は、非置換配列中にアミノ酸の少なくとも70%、望ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%を残すアミノ酸の数を上回るべきでない。特定の一実施形態において、他によって置換されるアミノ酸残基が最大3つ、時々最大6つを含む置換は、保存的置換である。更なる実施形態において、1つ又は複数のアミノ酸が、Dアミノ酸、好ましくは対応するDアミノ酸と置き換えられてよい。特定の実施形態において、全てのアミノ酸はDアミノ酸である。
【００３６】
好ましい置換は、ポリペプチドの二次構造を変えると予想されない変化、即ち保存的変化である。以下のリストは、元のアミノ酸(左側)と交換され得るアミノ酸(右側)を示す。
【００３７】
元の残基  例示的な置換
Ala      Gly;Ser
Arg      Lys
Asn      Gln;His
Asp      Glu
Cys      Ser
Gln      Asn
Glu      Asp
Gly      Ala;Pro
His      Asn;Gln
Ile      Leu;Val
Leu      Ile;Val
Lys      Arg;Gln;Glu
Met      Leu;Tyr;Ile
Phe      Met;Leu;Tyr
Ser      Thr
Thr      Ser
Trp      Tyr
Tyr      Trp;Phe
Val      Ile;Leu
【００３８】
アミノ酸はまた、その必須の特徴、例えば電荷、側鎖のサイズその他に従って、グループ化されてもよい。以下のリストは、類似するアミノ酸の群を示す。好ましい置換は、以下のように、あるグループに存在するアミノ酸を、同じグループ由来のアミノ酸と交換することであろう:
1.小さな脂肪族の無極性残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
2.極性の負に帯電している残基及びそのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.極性の正に帯電している残基:His、Arg、Lys;
4.大きな脂肪族の無極性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys;
5.大きな芳香族の残基:Phe、Tyr、Trp。
【００３９】
先に詳述される好ましい保存的アミノ酸置換は、本明細書中で以下に詳述されるように、本発明のタンパク質の機能又は活性を実質的に維持する、又は増大させることが予想される。勿論、結果として生じるポリペプチドがその元の機能を保持する場合、あらゆるアミノ酸置換、付加、又は欠失が、本発明の範囲内であると考えられる。例えば、本発明のポリペプチドが、野生型ポリペプチドを認識する抗体によって依然として認識される保存的置換が、それである。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、従来の化学的方法、例えば固体相合成(例えばFMOC及びBOC技術を用いる)、及び溶液相合成によって産生されてよい。これらのタンパク質又はポリペプチドはまた、細菌細胞若しくは昆虫細胞、又は他の真核生物の生体内転写系において産生されてもよい。産生後、ポリペプチドは、これが産生された細胞から精製される。ポリペプチドの精製法及び単離法は、当業者に知られている。有利には、ポリペプチドは、第2のタンパク質、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)その他、又は配列タグ、例えばヒスチジンタグ(Hisタグ)配列との融合物として産生されてよい。融合物又はタグ付きタンパク質の使用は、精製手順を簡単にする。
【００４１】
本発明のポリペプチドはまた、例えば細胞抽出物又はリボソームを用いて、無細胞系において合成されてもよい。
【００４２】
本発明のポリペプチドは更に、その機能、親和性、又は安定性を向上させるように修飾されてよい。例えば、より大きな安定性及び/又は性能全体の向上をポリペプチドに与えるのに、環化が用いられてよい。いくつかの異なる環化法が開発されており、側鎖環化及び骨格環化が挙げられる。これらの方法は、先行技術において適切に文書化されている。環化の特定の方法が、ベンゼン環のパラ置換アミノ酸誘導体を用いることによる、両親媒性アルファヘリックスの安定化を含む。環化の別の特定の方法が、骨格環化である。骨格〜側鎖結合を含む環化の別の方法が用いられてもよい。
【００４３】
それにもかかわらず、本発明に従えば、本発明のポリペプチドは、そのN末端及び/又はC末端にて、天然に存在するアミノ酸でも合成アミノ酸でもない種々の同一の、又は異なる有機部分により伸長されてよい。そのような伸長の一例として、ポリペプチドは、そのN末端及び/又はC末端にて、Nアセチル基により伸長されてよい。
【００４４】
ポリペプチド構造を向上させるために、本発明のポリペプチドは、そのN末端を介してラウリルシステイン(LC)残基に、且つ/又はそのC末端を介してシステイン(C)残基に結合されてもよいし、ポリペプチドを免疫化用のアジュバントに連結させるのに適した他の残基に結合されてもよい。
【００４５】
別の態様において、本発明は、配列番号1に記載されるポリペプチド、並びにその任意の誘導体及び類似体をコードする単離された核酸を提供する。
【００４６】
本明細書中で用いられる用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNA)及びRNA分子(例えば、mRNA)、並びにヌクレオチド類似体を用いて生じたDNA又はRNAの類似体を含むことが意図される。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
【００４７】
用語「単離された核酸分子」は、他の核酸分子から分離され、且つ、組換え技術によって産生される場合には、他の細胞材料若しくは培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合には、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸分子を含むことが意図される。
【００４８】
本発明の範囲内の誘導体として、ポリヌクレオチド誘導体も挙げられる。ポリヌクレオチド誘導体又は核酸誘導体は、ヌクレオチド配列において記載されている、又は知られている配列と異なる。例えば、ポリヌクレオチド誘導体は、1つ又は複数のヌクレオチド置換、挿入又は欠失によって特徴付けられ得る。
【００４９】
本発明の核酸分子、即ちsbPRT8をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の技術及び本明細書中に提供される配列情報を用いて、生成され得る。
【００５０】
更に別の態様において、本発明は、配列番号1に記載されるポリペプチド、又はその任意の機能的誘導体若しくは類似体をコードする単離された核酸分子を含むベクターを提供する。前記ベクターの一実施形態において、前記核酸分子は、プロモータに作動可能に連結している。別の実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。
【００５１】
本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、核酸分子であって、これが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を含むことが意図される。ベクターは、そのようなDNA配列が、ベクターの必須の生物学的機能の喪失なく、決定可能に(in a determinable fashion)切られ得、且つDNAフラグメントが、その複製及びクローニングをもたらすようにスプライシングされ得る1つ又は少数の制限酵素部位によって特徴付けられ得る。ベクターは更に、ベクターにより形質転換された細胞の同定に用いるのに適したマーカーを含有してよい。ベクターの一タイプが「プラスミド」であり、これは、付加的なDNAセグメントがライゲートされ得る環状の二本鎖DNAループを指す。ベクターの別のタイプがウィルスベクターであり、付加的なDNAセグメントがウィルスゲノム中にライゲートされ得る。あるベクターは、これが導入される宿主細胞において自律複製が可能である(例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクター、及び哺乳類のエピソームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類の非エピソームベクター)は、宿主細胞中への導入直後に宿主細胞のゲノム中に統合され、これによって宿主ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、これが作動的に連結している遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術に有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるので、互換的に用いられてよい。しかしながら、本発明は、発現ベクター、例えばウィルスベクター(例えば、複製欠損型レトロウィルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルス)のような他の形態を含むことが意図され、これは同等の機能を果たす。
【００５２】
用語「作動的に連結している」又は「作動可能に連結している」は、一方の分子の活性又は状態の変化が、他方の分子の活性又は状態によって影響を受けるという点で、分子が互いに機能的に結合していることを意味することが意図される。ヌクレオチド配列は、注目するポリペプチド又はタンパク質をコードするDNA配列に調節配列が機能的に関連する場合に、「作動可能に連結している」。例えば、プロモータヌクレオチド配列が、注目するタンパク質をコードするDNA配列の転写を制御するならば、プロモータヌクレオチド配列は、注目するポリペプチドをコードするDNA配列に機能可能に連結している。典型的に、作動的に連結している2つのポリペプチドは、ペプチド結合を介して共有結合的に付着する。
【００５３】
別の更なる態様において、本発明は、先に記載されるベクターを含む細胞を提供し、前記ベクターは、配列番号1に記載されるポリペプチド、及びその任意の誘導体又は類似体をコードする単離された核酸分子を含む。一実施形態において、前記細胞は:植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、細菌細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される宿主細胞である。
【００５４】
用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書中で互換的に用いられる。「宿主細胞」として、異種DNAの導入によって修飾され得るあらゆる培養可能な細胞が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、転写調節タンパク質が、安定して発現され得、翻訳後修飾され得、適切な細胞内区分に局在化され得、且つ適切な転写機構と連動させられ得るものである。適切な宿主細胞の選択はまた、検出シグナルの選択によっても影響されることとなる。例えば、レポーター構築体は、先に記載されるように、転写調節タンパク質に反応した遺伝子転写の活性化又は阻害直後に選択可能又はスクリーニング可能な形質を提供することができる;最適な選択又はスクリーニングを達成するために、宿主細胞表現型が考慮されることとなる。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代又は起こり得る後代に言及することが理解される。ある修飾が、突然変異又は環境の影響のいずれかが原因で次の世代に生じ得るので、そのような後代は、実際、親細胞と同一であり得ないが、本明細書中で用いられる用語の範囲内に依然として含まれる。
【００５５】
本発明の宿主細胞として、原核生物細胞及び真核生物細胞が挙げられる。原核生物として、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌(E. coli)又はバチルス属(Bacilli)が挙げられる。形質転換に適した原核生物の宿主細胞として、例えば、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、並びにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)及びブドウ球菌属(Staphylococcus)内の様々な他種が挙げられる。真核生物細胞として、限定されないが、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞、昆虫細胞(例えば、バキュロウィルス)、哺乳類細胞、及び寄生生物、例えばトリパノソーマの細胞が挙げられる。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「酵母」は、厳密な分類学的意味の酵母、即ち、単細胞生物だけでなく、糸状菌類の酵母様多細胞菌類も含む。例示的な種として、クルイベライ・ラクティス(Kluyverei lactis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、及びトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)が挙げられ、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。本発明を実行するのに用いられ得る他の酵母が、アカパンカビ(Neurospora crassa)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、偽巣性コウジ菌(Aspergillus nidulans)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)である。
【００５７】
哺乳類の宿主細胞培養系として、確立された細胞株、例えばHeLa細胞、COS細胞、L細胞、3T3細胞、Chineseハムスター卵巣(CHO)細胞、胚性幹細胞その他が挙げられる。
【００５８】
別の更なる態様において、本発明は、単離されたポリペプチドsbPRT8を含む組成物を提供し、前記ポリペプチドは、配列番号1に記載される配列、又は先に定義されるその任意の類似体又は誘導体を含む。
【００５９】
一実施形態において、本発明において提供される任意の組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含んでよい。
【００６０】
用語「薬学的に許容される担体」とは、有効成分と反応しないあらゆる不活性な非毒性材料を意味する。担体は、製剤の所望の形態に基づいて時々選択される。担体はまた時々、薬剤の安定性を向上させるために、クリアランス速度を減速するために、徐放特性を与えるために、所望されない副作用を低減するために等、標的組織への有効成分の送達又は浸透を向上させる効果を有してもよい。担体はまた、食用の調味料と共に製剤を提供するために等、製剤を安定化させる物質(例えば防腐剤)であってもよい。担体は、従来通り用いられるあらゆるものであってよく、溶解度及び本発明の抗体との反応性の欠如等の化学物理的考慮点によって、且つ投与経路によってのみ、限定される。担体として、添加剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香料、及び薬理的に適合性のある担体が挙げられ得る。また、担体は、アジュバントであってよく、これは、定義によれば、予想可能な方法で有効成分の作用に影響を及ぼす物質である。担体の典型的な例として、(a)有効物質の有効量が、希釈剤、例えば水、生理食塩水、天然のジュース、アルコール、シロップその他の中に溶解している液体溶液;(b)カプセル(例えば、界面活性剤、潤滑剤、及び不活性フィラーを例えば含有する、通常の殻の硬い、又は殻の柔らかいゼラチンタイプ)、タブレット、ロゼンジ(有効物質は、シュークロース及びアラビアゴム若しくはトラガカントゴム等の調味料中にあり、又は有効物質は、ゼラチン及びグリセリン等の不活性ベース中にある)、及びトローチ(それぞれ、固体又は顆粒として有効剤の所定量を含有する);(c)粉末;(d)適切な液体中の懸濁液;(e)適切なエマルジョン;(f)リポソーム製剤;並びにその他が挙げられる。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の組成物はまた、場合によっては更に、付加的な有効剤、例えば、限定されないが、抗生物質、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、ホルモン、酸化防止剤、ビタミンその他を含んでもよい。
【００６２】
別の更なる態様において、本発明は、高血糖を伴う疾患又は障害、特に、真性糖尿病1型、真性糖尿病2型、代謝症候群、肥満、腎症、網膜症、心血管疾患、腺機能不全、膵臓疾患、敗血症、頭蓋内疾患、及び術後ストレスからなる群から選択される疾患又は障害の処置用の薬剤の調製のためのポリペプチドsbPRT8の使用を提供する。
【００６３】
本明細書中で呼ばれる用語「有効量」は、選択された結果を達成するのに必須の量を意味し、これは目下、障害を処置するのに必須である、sbPRT8又はその生物学的に活性のある誘導体の量を含む。
【００６４】
前記治療有効量又は投与は、処置されるべき疾患状態の重篤度及び反応に依存し、一連の処置は、1時間から数時間、1日から数日、又は、治療が成就する、若しくは疾患状態の減退が達成されるまで、続く。当業者は容易に、最適の投与量、投与方法論、及び繰返し速度を決定することができる。最適の投与量は、本発明の各ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれを含む組成物の相対効力に応じて変わり得、一般に、試験管内で、そして動物モデルの生体内で有効であることが見出されたEC50に基づいて推定され得る。当業者は容易に、測定された滞留時間に基づく投与の繰返し速度、濃度、及び利用されるポリペプチド又はタンパク質の調整を推定することができる。
【００６５】
本明細書中で用いられる用語「処置する、処置すること、又は処置」は、疾患又は障害を有する患者において疾患活性の1つ又は複数の臨床徴候(clinical indicia)を改善することを意味する。「処置」は、治療的処置を指す。
【００６６】
「患者」又は「必要としている対象」とは、障害又は疾患を克服するために、前記障害又は疾患の処置が所望されるあらゆる哺乳類、特にヒト対象を意味する。
【００６７】
通常、「治療有効量」はまた、予防目的又は治療目的、投与経路、及び患者の一般的な状態(年齢、性別、体重、及び主治医に知られている他の考慮点)と関連させて、疾患の重篤度によって決定される。
【００６８】
種々の投与法が、本発明において記載されるsbPRT8を、必要としている対象に送達するために用いられてよい。前記ポリペプチド、又は同ポリペプチドを含む組成物は、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、若しくは局所注射を介して、又は当業者によって適切であると見出されたあらゆる他の経路を通して、送達されてよい。治療的に有効であるために、本発明のポリペプチド又はタンパク質は、投与後の系における安定性を可能とするであろう方法で、調製されるべきである。
【００６９】
本明細書中で用いられる用語「障害」は、正常な機能の撹乱がある症状を指す。「疾患」は、不快感、機能障害又は苦悩を、影響を受ける人、又は当該人と接触がある人々に引き起こす、体又は心のあらゆる異常な症状である。時折、当該用語は、損傷、先天性奇形、身体障害、症候群、徴候、常軌を逸した挙動、並びに構造及び機能の異型変形物、疾患に由来する慢性的又は不変の健康欠陥を含むように広く用いられる。
【００７０】
用語「疾患」、「障害」、「症状」、及び「病気」は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００７１】
本明細書中で対象に言及する場合、前記対象は哺乳類であってもヒトであっても非ヒトであってもよい。非ヒト哺乳類として、限定されないが、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットその他が挙げられる。通常、対象はヒト、特に患者又は健常な個体である。
【００７２】
開示され、且つ記載されることについて、本発明は、本明細書中に開示される特定の実施例、プロセス工程、及び材料に限定されず、したがってプロセス工程及び材料は、幾分変化してよいことが理解されるべきである。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的で用いられており、限定することが意図されないことも理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されることとなるからである。
【００７３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられているように、単数形「a」、「an」及び「the」は、特に内容が明らかに述べない限り、複数形の指示物を含むことに留意しなければならない。
【００７４】
本明細書及び次に来る特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、文言「含む(comprise)」並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」等の変形は、述べられた整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、あらゆる他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の排除を意味しないと理解されることとなる。
【００７５】
本明細書中で用いられる「高血糖を伴う疾患又は障害」は、グルコースの過剰量が血漿中を循環する疾患又は障害を指す。これは一般に、11.1mmol/l(200mg/dl)を超えるグルコースレベルであるが、徴候は、15〜20mmol/l(約250〜300mg/dl)等の更に高い値になるまで、顕著になり始めないことがある。米国糖尿病協会(American Diabetes Association)ガイドラインに従えば、範囲が100から126の間で一貫している対象は高血糖であると考えられる一方、126mg/dl又は7mmol/l超は一般に、糖尿病であると考えられる。7mmol/l(125mg/dl)を上回る慢性的なレベルは、器官の障害をもたらすことがある。高血糖を伴う疾患又は障害として、真性糖尿病(1型及び2型)、腎症、網膜症、心血管疾患(例えば発作、心筋梗塞)、腺機能不全(例えば甲状腺、副腎、又は下垂体)、膵臓疾患、敗血症、頭蓋内疾患(例えば脳炎、脳腫瘍、脳出血、髄膜炎)が挙げられる。長い大外科手術は、一時的にグルコースレベルを増大させることがある。最近の結果からも、非絶食状態では、急性高血糖が、血漿インスリン又は遊離脂肪酸レベルから独立した形で、肝臓TG分泌物を刺激することによって、血漿トリグリセリド(TG)を増大させることが示唆されている。
【００７６】
本明細書中で用いられる「糖化ヘモグロビン」(ヘモグロビンA1c、HbA1c、A1C、Hb1c、又はHbA1cとも呼ばれる)は、主に平均血漿グルコース濃度を長期間にわたって同定するために測定されるヘモグロビンの形態である。これは、血漿グルコースへのヘモグロビンの曝露によって、非酵素的糖化経路において形成される。正常レベルのグルコースは、正常量の糖化ヘモグロビンをもたらす。血漿グルコースの平均量が増大する(高血糖)につれ、糖化ヘモグロビンの画分は予測可能に増大する。真性糖尿病において、糖化ヘモグロビンの量が多くなる程、心血管疾患、腎症、及び網膜症を伴っている。
【００７７】
以下の実施例は、本発明の態様を実行する際に発明者らによって利用された技術の代表である。これらの技術は本発明の実行にとって好ましい実施形態の例示となるが、当業者であれば、本開示を考慮して、本発明の意図される範囲から逸脱することなく数多くの改変がなされ得ることを認識するであろうと理解されるべきである。
【００７８】
特に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７９】
(比較例1)
PRT8投与と比較した、ストレプトゾトシン(STZ)で処置したC57Bl/6マウスのグルコースレベルに及ぼすsbPRT8投与の効果
以下の実験において、N末端をアセチル部分で、C末端をアミド部分(NH2)でブロックしたsbPRT8ペプチドを利用した。ストレプトゾトシン(STZ)で処置したマウスにおいて、グルコースレベルに及ぼすsbPRT8投与の効果を調査して、PRT8で得た効果と比較した。当該技術において知られるように、STZは、哺乳類における膵臓のインスリン産生ベータ細胞に対して特に毒性である化合物である。これは、医療において、ランゲルハンス島の特定の癌を処置するために用いられ、且つ医療研究において、1型糖尿病及び2型糖尿病の動物モデルを産生するために用いられている。
【００８０】
実験1:
雄C57Bl/6マウスを、Harlan Laboratories社、Jerusalem、Israelから購入した。7日間安静にした後に、マウスを50mg/kg STZで4日間、IP注射した。STZ注射の5日後に、マウスを以下のように処置した:
-  群A(対照)  -  100μg/マウスのPRT8(対照)
-  群B(処置)  -  20μg/マウスのsbPRT8(処置1)
-  群C(対照)  -  100μg/マウスのsbPRT8(処置2)
【００８１】
5週間の処置後、食物についてマウスを12時間だけ飢餓状態にさせてから、1mg/kgのグルコース溶液(IPGTT)をIP注射した。マウスの血中グルコースレベルを、グルコース注射後t=0、15、30、60、90、及び120分にて、Accucheck glucometer(Roche社)により測定した。
【００８２】
実験2:
雄C57Bl/6マウスを、Harlan Laboratories社、Jerusalem、Israelから購入した。7日間安静にした後に、マウスを50mg/kg STZで4日間、IP注射した。STZ注射の5日後に、マウスを以下のように処置した:
-  群A(対照)  -  100μg/マウスのPRT8(対照)
-  群B(処置)  -  100μg/マウスのsbPRT8(処置1)
-  群C(対照)  -  300μg/マウスのsbPRT8(処置2)
【００８３】
4週間の処置後、食物についてマウスを12時間だけ飢餓状態にさせてから、1mg/kgのグルコース溶液(IPGTT)をIP注射した。マウスの血中グルコースレベルを、グルコース注射後t=0、15、30、60、90、及び120分にて、Accucheck glucometer(Roche社)により測定した。
【００８４】
結果を図1A〜図1Bに示す。全ての処置において、グルコースレベルは、注射後、最初の30分においてピークに達した。PRT8の注射は、マウスの血中グルコースレベルの有意な低減を可能にした(実施例9も参照)が、sbPRT8の注射は、血中グルコースレベルの前記低減において、顕著に有意な驚くべき向上を示す。これらの結果は明らかに、PRT8のC末端フラグメントである配列番号1(sbPRT8)のペプチドが、全長PRT8ペプチドよりもグルコース低減活性を向上させることを実証している。類似の実験を、配列番号2(PRT8 N-ter)及び配列番号3(PRT8 C-ter)の2つの他のPRT8フラグメントにより行ったところ、sbPRT8で得られた結果に反して、有意な血中グルコースの低減は観察されなかった。
【００８５】
前述のことから、短いペプチドsbPRT8が、全長PRT8ペプチドに勝るグルコース代謝調節及び血中グルコースレベル低減の潜在性の有意な向上を示すことが結論付けられ得る。ゆえに、sbPRT8は、高血糖を伴う疾患又は障害を処置するのに重要となり得る。更に、sbPRT8は、糖化ヘモグロビンの血中レベル(HbA1cレベル)を減少させ、血漿トリグリセリド(TG)レベルを低下させるのに用いることができる。これは、双方のレベルが、血中グルコース濃度に密接に関係するからである。
【００８６】
上記の記載及び実施例は全て、説明の目的で与えられており、いかなる形であれ本発明を限定することは意図されない。
【図１Ａ】
2017502675.tif 000002
【図１Ｂ】
2017502675.tif 000003
【配列表】
2017502675000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月26日(2015.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号1に記載されるアミノ酸配列;又は(b)配列番号1と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチドであって、血中のグルコース濃度を低減するポリペプチド。
【請求項２】
N末端がアセチル部分により、C末端がアミド部分により修飾されている、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤の少なくとも1つを含む医薬組成物。
【請求項４】
真性糖尿病1型、真性糖尿病2型、代謝症候群、肥満、腎症、網膜症、心血管疾患、腺機能不全、膵臓疾患、敗血症、頭蓋内疾患、及び術後ストレスからなる群から選択される、高血糖を伴う疾患又は障害の処置に用いるための、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又は請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象における血中グルコースレベルを低下させるのに用いるための、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又は請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項６】
対象における血漿トリグリセリド(TG)血中レベルを低下させるのに用いるための、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又は請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項７】
血中の糖化ヘモグロビン(HbA1c)のレベルを低下させるのに用いるための、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又は請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項8に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項9に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【国際調査報告】
2017502675.tif 000004
2017502675.tif 000005
2017502675.tif 000006