(57)【要約】  本発明は、治療物質を熱誘起相分離により製造される構造体へ付着する方法、並びに器具をコーティングする方法及び多層ミクロスフェアを製造する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療物質を、熱誘起相分離により製造された疎水性構造体へ付着する方法であって：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させ；
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させ；そして
ｉｉ）治療物質を該構造体に付着させること
を含む、方法。
【請求項２】
前記構造体がミクロスフェアである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記構造体が、培養培地中に完全に水浸される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記構造体が、ＰＬＧＡを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地が、ＤＭＥＭである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、血清を含有する組織培養培地であり、好ましくはここで血清がＦＢＳ又はＦＣＳである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記溶媒がアルコールである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記アルコールがエタノールである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記構造体が、該溶媒の添加の前後に、該培養培地と混合される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記構造体を、約３０℃〜約４０℃でインキュベーションすることを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記治療物質が、細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記治療物質が、ＡＰＩである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
攪拌により散在させられる静的インキュベーションの期間を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
静的インキュベーションの１時間あたり約１分間に約３００ｒｐｍでの攪拌を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法により得られた熱誘起相分離により製造される構造体。
【請求項１６】
熱誘起相分離により製造され、かつ治療物質の付着を改善するように処理された、疎水性構造体であって：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること；並びに
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させること：を含む、構造体。
【請求項１７】
プレート又はウェルの底から上行する非接着製物質の障壁を備える、細胞培養プレート又はウェル。
【請求項１８】
前記障壁が、弯曲した又は傾斜した形状を有する、請求項１７記載の細胞培養プレート又はウェル。
【請求項１９】
前記障壁が、プレート又はウェルの外側周縁にチャネルを規定する、請求項１７又は１８記載の細胞培養プレート又はウェル。
【請求項２０】
前記障壁が、ウェルの中心にある、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の細胞培養プレート又はウェル。
【請求項２１】
前記非接着性物質が、シリコーンである、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の細胞培養プレート又はウェル。
【請求項２２】
熱誘起相分離により得られた構造体により、器具をコーティングする方法であって：
ｉ）該器具を、ポリマー及び溶媒でコーティングし；
ｉｉ）ポリマー及び溶媒コーティングを有する該器具を、クエンチング流体中で、クエンチングし；そして
ｉｉｉ）コーティングを凍結乾燥する
を含む、方法。
【請求項２３】
前記構造体に治療物質を接着することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記器具が、治療物質の付着前に、アルコールと接触される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマーがＰＬＧＡである、請求項２２〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記溶媒が、炭酸ジメチルである、請求項２２〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記クエンチング流体が、液体窒素である、請求項２２〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記器具が、医療器具である、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記医療器具が、ステント又は創傷充填材である、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
請求項24〜29のいずれか一項記載の方法により得られる器具。
【請求項３１】
治療物質を含む、請求項３０記載の器具。
【請求項３２】
前記治療物質が、該器具のコーティングの外側に付着されるか、又は該コーティング内に封入される、請求項３１記載の器具。
【請求項３３】
前記治療物質が、核酸である、請求項３１記載の器具。
【請求項３４】
多層ＴＩＰＳミクロスフェアを製造する方法であって：
ｉ）多層化されたポリマー液滴を形成するために、各組成物がポリマー及び溶媒を含む、２種以上の組成物を、同軸ノズルから同時に、押し出し、該同軸ノズルが、同軸上に位置決定された少なくとも２個のサブノズルを備えること；
ｉｉ）クエンチング流体中に生じたポリマー液滴を配置し；並びに
ｉｉｉ）誘導された多層ミクロスフェアを凍結乾燥する
を含む、方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の溶液が、治療物質を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ミクロスフェアへ治療物質を付着させることを更に含む、請求項３４又は３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１種の溶液が、ＰＧＬＡを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記クエンチング流体が、液体窒素である、請求項３４〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか一項記載のプロセスにより得られる、多層ミクロスフェア。
【請求項４０】
療法において使用するための、請求項３４〜３８のいずれか一項記載のプロセスにより得られる、多層ミクロスフェア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療物質を熱誘起相分離により製造される構造体へ付着する方法、並びに器具をコーティングする方法、及び多層ミクロスフェアを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
熱誘起相分離（ＴＩＰＳ）ミクロスフェアは、先にＷＯ  ２００８／１５５５５８において説明されている。得られるミクロスフェアの構造体は、機械的強度、及び細孔サイズを選択する能力、並びにミクロスフェアが皮膚により被覆されるかどうかなどの、改善された特徴を提供する。ＴＩＰＳミクロスフェアは、組織成長を支持する新規の分解可能なスカフォールド構造体を提供し、かつ組織新生を促進する生体活性物質を送達することができる。本発明において利用されるミクロスフェアは、ＷＯ  ２００８／１５５５５８に開示されたＴＩＰＳの適用によるか、又は他の好適な方法により、製造することができる。ＷＯ  ２００８／１５５５５８の内容は、特にＴＩＰＳミクロスフェアを製造するために使用される方法に関連して、引用により本明細書中に組み込まれている。ＴＩＰＳは、均等なサイズの多孔質ミクロスフェアの迅速な形成が可能である。ＴＩＰＳミクロスフェアは、ポリマー性で生分解可能であり、かつ薬物送達適用のために治療薬が負荷されることができる。これらのミクロスフェアは、必要とされる位置に容易に送達されることができ、これらは組織腔の不規則な形状に合致することができ、これらは予測可能な分解時間を有し、これらは広範な薬物を送達することができ、並びにこれらは製造するのに費用効果が大きい。
【０００３】
細胞療法は、新たに出現した技術であるが、細胞増大、既知の細胞量の標的化された送達、及び移植後の細胞生存能の保持に関する改善を必要とする。ＴＩＰＳミクロスフェアは、細胞増大のための高度に有効な基質、侵襲性が最小の送達、並びに移植された細胞への栄養の拡散を可能にするが、送達前の細胞の脱着の必要性のない、形状適合した(conformable)分解可能なスカフォールド構造体を提供することにより、これらの問題点の解決を提供する。
【０００４】
ＴＩＰＳミクロスフェアの表面は、細胞の迅速な付着のために非常に効果的な表面の微細構造(topography)を提供する(Ahmadiら、「熱誘起相分離を使用し製造されるマイクロキャリア上の平滑筋細胞の増強された付着、成長及び移動(Enhanced Attachment, Growth and Migration of Smooth Muscle Cells on Microcarriers Produced Using a Thermally Induced Phase Separation)」、Acta Biomaterialia 2011 ; 7: 1542-1549)。臨床の観点から、ＴＩＰＳミクロスフェアへの細胞の迅速な付着は有益である。産業目的に関して、より短い付着時間は、ミクロスフェアの表面上の細胞の空間分布の改善された制御を提供する。このことは、付着された細胞の表現型の特性の、特に集密度、増殖／増大、分化及び脱離の挙動のより大きい制御を可能にする。これらの特性は、（ｉ）加工時間を短縮し、かつ産業効率を改善し、並びに（ｉｉ）治療目的で送達される細胞の投与量のより正確な定量を可能にする。
【発明の概要】
【０００５】
（発明の概要）
本発明の第一の態様に従い、熱誘起相分離により製造された疎水性構造体に、治療物質を付着する方法であって：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること；
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させること；並びに
ｉｉ）治療物質を該構造体に付着させること：を含む、方法が提供される。
【０００６】
前述の方法により得られた、付着された治療物質を有する、熱誘起相分離（ＴＩＰＳ）により製造された構造体も、提供される。
【０００７】
疎水性ポリマー由来のＴＩＰＳによる構造体の形成は一般に、疎水性で高度に多孔質の構造体を生じる。これらふたつの性質の組合せは、培養培地などの水溶液中に配置された場合に浮揚するＴＩＰＳ構造体を生じる。この特徴は、接着性治療物質、特に懸濁液中の細胞の、ＴＩＰＳ構造体の表面への、受動付着を妨害する。従って、治療物質付着の効率を最大化するために、ＴＩＰＳ構造体は、培養培地中に少なくとも部分的に水浸されることができ、このことは接着性細胞の該ミクロスフェアの表面への付着を可能にするであろう。
【０００８】
ＴＩＰＳミクロスフェアは、培養培地単独に直接配置した場合には、数時間浮揚する。ＰＬＧＡベースの構造体のエタノールによる湿潤が、先に説明されている(Mikos, A. G.ら、(1994)、「組織培養のためのポリ(L-乳酸)及びポリ(DL-乳酸コ-グリコール酸)発泡体の湿潤(Wetting of poly(L-lactic acid) and poly(DL-lactic co-glycolic acid) foams for tissue culture）」、Biomaterials 15(1), 55-58)。このＰＬＧＡベースの物質に関する認められた先行技術の湿潤技術は、この構造体のアルコール（典型的にはエタノール）中の浸漬、それに続く過剰なアルコールを除くための洗浄、その後のそれらの水溶液中の配置が関与している。このアプローチがＴＩＰＳ構造体に適用される場合は、これらは、ポリマーが可塑化されるために、急速にまとまって凝集され始め、かつこれらは分散することができない。この問題点は、単独のミクロスフェアに分散することが困難であるミクロスフェアで、特に明白である。この問題点を克服するために、驚くべきことに、ＴＩＰＳ構造体は、アルコールの添加前に、培養培地中に部分的に水浸され得ることがわかった。このことは、この構造体のまとまった凝集を防ぎ、かつそれらの溶液中での沈下と、それに続く構造体への治療物質の付着を改善する。更にこのアプローチは、必要部位への投与直前の、治療物質のＴＩＰＳ構造体との混合を可能にし、従って複雑な製造及び貯蔵手段を排除する。
【０００９】
本発明の第二の態様に従い、熱誘起相分離により製造され、かつ治療物質の付着を向上するように処理された疎水性構造体が提供され、これは：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること；
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させること：を含む。
【００１０】
本発明の第二の態様に従う方法により得られた構造体は、それが治療物質に容易に付着するように、処理されている。
【００１１】
本発明の第三の態様に従い、プレート又はウェルの底から上行する(ascending)非接着物質の障壁を備える、細胞培養プレート又はウェルが提供される。
【００１２】
本発明の第四の態様に従い、熱誘起相分離により得られた構造体により、器具をコーティングする方法であって：
ｉ）器具を、ポリマー及び溶媒を含有する混合物でコーティングすること；
ｉｉ）ポリマー及び溶媒コーティングを有する器具を、クエンチング流体中で、クエンチングすること；並びに
ｉｉｉ）コーティングを凍結乾燥すること：を含む、方法が提供される。
前記方法により得られた器具も、提供される。
【００１３】
本発明の第五の態様に従い、多層ＴＩＰＳミクロスフェアを製造する方法であって：
ｉ）多層化されたポリマー液滴を形成するために、各組成物がポリマー及び溶媒を含む、２種以上の組成物を、同軸ノズルから同時に、押し出し(express)、該同軸ノズルが、同軸上に位置決定された少なくとも２個のサブノズルを備えること；
ｉｉ）クエンチング流体中に得られるポリマー液滴を配置すること；並びに
ｉｉｉ）誘導された多層ミクロスフェアを凍結乾燥すること：を含む、方法が提供される。
前記プロセスにより得られた多層ミクロスフェアも提供される。
【００１４】
この多層ＴＰＳミクロスフェアは、治療物質を封入し、かつそれらを制御された様式で投与するために使用することができる。特に、ＴＩＰＳミクロスフェアの構造(architecture)は、製造プロセス時に使用されるポリマー及び溶媒の種類及び比率を調節することにより、制御することができる。このミクロスフェア表面の細孔は、ＴＩＰＳミクロスフェアの中心に向かって認められる大きい空洞から放射状に伸びているチャネルへと開口している。この古典的ＴＩＰＳミクロスフェアの構造体は、封入されたＡＰＩの単相制御放出を可能にする(Foongら、「クローン病瘻孔のプロスペクティブ新規治療としての抗-腫瘍壊死因子α-負荷したミクロスフェア(Anti-tumor Necrosis Factor-Alpha-Loaded Microspheres as a Prospective Novel Treatment for Crohn’s Disease Fistulae)」、Tissue Engineering 2010; 16: 855-864)。本発明者らは、驚くべきことに、複数層のポリマーからなるミクロスフェアを製造することにより、１種又は複数の治療物質が、より制御された様式で送達されることができることを認めた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の第一の態様に従い、熱誘起相分離により製造された疎水性構造体に、治療物質を付着する方法であって：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること；
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させること；並びに
ｉｉ）治療物質を該構造体に付着させること：を含む、方法が提供される。
【００１６】
得られる構造体は、引用により本明細書中に組み込まれているＷＯ  ２００８／１５５５５８に記載された、様々な治療的方法において使用することができる。本方法は、体内の必要な部位へ送達するために、治療物質を該構造体に接着することを可能にする。
【００１７】
用語「疎水性」は、当業者にとって明確な意味を有し、すなわち水への低い親和性を有することである。
【００１８】
本発明の構造体は、自立式構造体を含む、いずれか好適な構造体であることができる。好適な構造体は、コーティング及びミクロスフェアを含む。このコーティングは、器具、好ましくは医療器具へ、引き続き塗布されるか、あるいは既に付加されている(affixed)ことができる。この器具は、その上に治療物質を付着することが望ましい任意の器具であることができる。例えば、器具は、診断キット、細胞を培養する装置、チップなどの一部であることができる。好ましくは、器具は、以下に詳細に考察する医療器具である。好ましくは、本構造体はミクロスフェアである。
【００１９】
用語「ミクロスフェア」とは、均質な実質的に球形の粒子の調製品のひとつを指す。この用語は、当該技術分野において周知である。ミクロスフェアは、数多くの放射状の細孔を含むことができる。これは、細孔が、ミクロスフェアの中心部分から表面へと、好ましくは実質的にミクロスフェアの半径に平行して、広がっていることを意味する。細孔は、好ましくは管状でありかつ相互接続している。放射状の細孔は、機械的強度レベルのあるミクロスフェアを提供する。
【００２０】
本明細書において使用される用語「ミクロスフェア」は、治療物質の付着に適したサイズである球形粒子を包含してよい。好ましくは、このミクロスフェアは、走査型電子顕微鏡などの電子顕微鏡により特徴づけられた直径が約１０〜２０００μｍである。しかし、このミクロスフェアは、２、３、４、５、６、７、８又は９μｍなど、１０μｍよりも小さくてもよい。このミクロスフェアの直径は、付着されるべき治療物質の種類に応じて選択されてよい。例えば、ミクロスフェアは、吸入もしくは薬物送達において使用するためには、直径がおよそ１０〜２０μｍであってよく、あるいは組織エンジニアリングのためには、直径およそ２００〜６００μｍ、特に直径３００〜４００μｍであってよい。細孔サイズはまた、意図された用途及び必要とされる機械的強度に従い選択されることができ、かつミクロスフェアの直径に応じて選択されることができる。更に細孔は、サイズが規則的であることが好ましく、言い換えると細孔は、好ましくは実質的に同じ直径であり、すなわち細孔の直径の差は好ましくは１０％以下である。細孔ミクロスフェアは、この細孔の性質のために、良好な機械的強度を有する。
【００２１】
本構造体は、熱誘起相分離により製造される。特に、本構造体は、その開示がその全体で参照により組み入れられている、ＷＯ  ２００８／１５５５５８に開示されたいずれかの方法により製造されることができる。例えば、この構造体を形成する方法は：
ｉ）ポリマーを溶媒中に溶解し、溶液を形成する工程；
ｉｉ）この溶液をクエンチング流体中でクエンチングする工程；並びに
ｉｉｉ）得られる構造体を凍結乾燥する工程：を含むことができる。
【００２２】
本構造体は、ポリマーを含む。任意の疎水性ポリマーを使用することができるが、このポリマーは、医薬として許容され得、かつ溶媒中に完全に可溶性であることが好ましい。このポリマーは、分解性であるか又は非分解性であってよい。これは、合成であるか又は非合成であってよい。ポリマーの組合せを使用することができ、例えば、合成ポリマーは、非合成ポリマーと組合せて使用される。ポリマーの例としては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（α−ヒドロキシエステル）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリホスファジン、ポリプロピレンフマレート、ポリ（プロピレン−フマレート−コ−エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）及びポリヒドロキシ吉草酸（ＰＨＶ）が挙げられる。２種以上のポリマーのコ−ポリマー、特にＰＨＢ及びＰＨＶも、使用することができる。他のものは、ポリ（α−ヒドロキシエステル）−コ−ＰＥＧコポリマー、又はペグ化された薬物を含むコ−ポリマーが挙げられる。使用することができる天然のポリマーは、フィブリンを含む。好ましくはこのポリマーは、キトサンではない。
【００２３】
ポリマーの種類（例えば、永久(permanent)又は分解性、天然又は合成）、多孔性、機械的強度及びサイズは、構造体の用途又は選択された送達部位に応じて選択されてよい。例えば、分解性物質は、送達部位由来の組織が、この構造体の一時的スカフォールド機能に取って代わる場合に、好ましいことがある。最も好ましくは、このポリマーは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。
【００２４】
いずれか適切な溶媒を、本構造体の製造において使用することができる。溶媒は、クエンチング流体の温度よりも高い比較的高い凍結温度を有するように選択することができる。溶媒の例としては、炭酸ジメチル、クロロホルム、アセトン、ジメチルクロリド、テトラヒドロフラン及び超臨界二酸化炭素が挙げられる。
【００２５】
本構造体を形成するために使用されるクエンチング流体は、液体又は気体であることができる。クエンチング流体の例としては、液体窒素、液体酸素、液体ＣＯ2、フレオン、水、エタノール、メタノールが挙げられる。
【００２６】
前記溶液は、いずれか適切な方法を使用し、クエンチング流体に導入することができる。例えば、液滴は、シリンジ又は振動針を使用し製造することができる。あるいは、この溶液は、例えば、エアゾール噴射された又はポンプ輸送されたシステムを使用し、アトマイザーを通して噴霧されるか、又は静電力もしくは同軸空気流れを使用し、クエンチング流体へ引き寄せることができる。
【００２７】
ＷＯ  ２００８／１５５５５８に記載されたように、治療物質は、ＴＩＰＳ構造体へ封入又は混和することができる。
【００２８】
本発明の第一の態様は、先に説明したように製造されたＴＩＰＳ構造体への治療物質の付着を改善する方法に関する。
【００２９】
用語「治療物質」は、細胞；抗体もしくはそれらの機能的断片（例えば結合断片）などの、タンパク質又はペプチド；オリゴヌクレオチドを含む、核酸；単糖、二糖、多糖及びそれらの誘導体；炭水化物；原核微生物；真核微生物；又は、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む。好ましくはこの物質は、細胞又はＡＰＩである。本明細書において使用される用語ＡＰＩは、最終の医薬品において使用することができる物質を意味し、かつこれは、薬理学的活性を提供するか、もしくはそうでなければ疾患の診断(iagnosis)、治癒、軽減、治療又は予防において直接作用を有すること、又はヒトの生理機能の回復、補正もしくは修飾に直接作用を有することが意図される。
【００３０】
この治療物質の構造体への付着に加え、治療物質は、構造体内に封入されることができる。この構造体は、例えばＮａＨ2ＰＯ4、ＣａＣＯ3、Ｐ2Ｏ5、及びＡｇ2ＳＯ4を含む、例えば、ガラス、ガラス−セラミック、又はセラミックなどの、封入された添加物を更に含むことができる。
【００３１】
治療物質をＴＩＰＳ構造体に付着させる方法は、培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること、引き続き該構造体を溶媒と接触させることに関与している。
【００３２】
本明細書において部分的に水浸させるとは、その後治療物質が付着される構造体の領域が培養培地と接触するようなポイントで、構造体が、培養培地中に水浸されることを意味する。
【００３３】
用語「培養培地」は、以下の溶液を包含している：組織培養培地、血清、全血、可溶性タンパク質及び電解質を含有する食塩水、血清を含有する食塩水、代用血漿を含有する食塩水、可溶性タンパク質及び電解質を含有する水、血清を含有する水、代用血漿を含有する水、並びにそれらの混合物。培養培地は、組織培養培地、血清、又はそれらの混合物から選択されることが、好ましい。
【００３４】
組織培養培地は、当業者に容易に明らかな他の培地配合を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）、又はそれらの混合物から選択することができ、これは「無血清動物細胞培養のための培地、補充物及び基剤の調製方法(Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture)」、Alan R. Liss, New York (1984)、及び「細胞組織培養：実験手法(Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures)」、John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996において認められるものを含み、両方共それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。好ましくは、組織培養培地はＤＭＥＭである。
【００３５】
血清は、典型的にはアルブミン、グロブリン、成長促進因子及び成長阻害因子の複合溶液である。本発明において使用するための血清は、ヒト、ウシ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ウマ又はヒツジの給源から入手することができる。血清はまた、自家血清、代用血清、又はそれらの混合物から選択することもできる。好ましくは、血清は、ヒト血清又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は仔牛胎児血清（ＦＣＳ）である。
【００３６】
本構造体は、培養培地中に部分的又は完全に水浸されることができる。本構造体は、培養培地中に完全に水浸されることが好ましい。本構造体は、好ましくは約５％〜約９５％（ｖ／ｖ）血清、より好ましくは約５％〜約５０％（ｖ／ｖ）血清、より好ましくは更に約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）血清、及び最も好ましくは約１０％（ｖ／ｖ）血清を含有する組織培養培地中に水浸される。
【００３７】
本発明の方法は好ましくは、混合工程を含む。好ましくは、本構造体は、溶媒の添加前に、培養培地と混合される。好ましくは、本構造体は、培養培地と約１：１０（ｗ／ｖ）の比で混合される。混合はまた、溶媒の添加時にも生じる。本構造体と培養培地の組合せは、溶媒と混合されることが、好ましい。この混合工程は、ＴＩＰＳ構造体の表面全体が、培養培地、及び溶媒と接触することを確実にするために実行される。好ましくはこの混合工程は、ボルテックスにより実行される。好ましくは、この混合は、約５秒〜約１分間で起こる。
【００３８】
ＴＩＰＳ構造体の処理のために使用される溶媒は、酢酸、アセトン、ニトロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ピリジン、メチルエチルケトン、ＤＭＳＯ、酢酸メチル、ハロゲン化炭化水素、グリセリン、トルエン、ホルムアミド、低級アルコール及びそれらの混合物から選択されることができる。ハロゲン化炭化水素は、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロエタン及びトリクロロエタンを含むが、これらに限定されるものではない。低級アルコールは、メタノール及びエタノールを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、溶媒は低級アルコールであり、最も好ましくは、溶媒はエタノールである。
【００３９】
ＴＩＰＳ構造体を処理するために使用される溶媒は、適量、例えば、約１０％〜約１００％（ｖ／ｖ）で使用することができる。溶媒は、約１０％〜約９０％の量で使用することができる。好ましくは、溶媒は、約７０％〜１００％、又は約７０％〜９０％の量で使用される。溶媒は、本構造体を含有する培養培地へ添加される。溶媒は、当業者に明らかないずれか適切な強度又は濃度であることができる。溶媒は、約５０％、６０％、７０％又は８０％の強度に、脱イオン水中で予め希釈されることができる。
【００４０】
溶媒の構造体を含有する培養培地への添加後に、及び好ましくは得られる混合物の混合後に、この混合物は、好ましくはインキュベーションされる。インキュベーションは、ミクロスフェアの組成物に適しているいずれか適切な温度で起こり得る。好ましくは、インキュベーションは、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜約４０℃、より好ましくは約３５℃〜約３８℃で起こる。最も好ましくは、インキュベーションは、約３７℃で起こる。この混合物は、後続の治療物質の構造体への付着を可能にするいずれか適切な長さの時間、インキュベーションされ得る。好ましくは、この混合物は、約０．５時間〜約５時間、より好ましくは約０．５時間〜約４時間インキュベーションされる。この構造体は典型的には、この混合物中に約０．５〜約２時間以内に沈下される（構造体の多孔性に応じて）。
【００４１】
前述の処置の後、本構造体は、培養培地及び溶媒から除去され、かつ付着されるべき治療物質に適した新たな培養培地中に配置される。この段階において、処理された構造体は、後続の治療物質の付着のために貯蔵することができる。
【００４２】
本構造体に付着されるべき治療物質は、細胞；抗体もしくはそれらの機能的断片（例えば結合断片）などの、タンパク質又はペプチド；オリゴヌクレオチドを含む、核酸；多糖；炭水化物；原核微生物；真核微生物；又は、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む。好ましくはこの物質は、細胞又はＡＰＩである。ＡＰＩは、水溶液中に可溶性であることが好ましい。そのような例のひとつは、ドキソルビシンである。
【００４３】
本明細書において使用される用語「付着」は、任意の付着の形を包含しているが、好ましくは受動付着を指す。
【００４４】
先のように処理されかつ培養培地に配置される構造体は、治療物質の付着に適した任意の容器内に配置されてよい。好適な例としては、微量遠心チューブ、遠心チューブ及び細胞培養プレートが挙げられる。好ましくはこの容器は、細胞培養プレートである。これらの構造体は、付着されるべき治療物質との十分な接触を可能にするのに適した任意の密度で、容器に添加されてよい。好適な密度は、当業者により容易に決定することができる。
【００４５】
本構造体に付着されるべき物質が細胞である場合、細胞を含有する培養培地が、引き続き容器に添加される。細胞のＴＩＰＳ構造体の表面への付着は、容器内に播種される細胞の密度を制御することにより、制御することができる。細胞は、処理された構造体と好適な接触を可能にするために、容器のサイズに適した密度で播種されることができる。好適な密度は、当業者に公知であろう。
【００４６】
足場(anchorage)特性を示す細胞は、処理された構造体に付着することができる。特に適した足場依存性細胞としては、ミュラー幹細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、ＣＤ１３３＋前駆細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、中胚葉性血管芽細胞(mesangioblast)、筋芽細胞、筋前駆体細胞、島細胞、線維芽細胞、間葉系間質細胞、並びに樹状細胞、B細胞及びT細胞などの免疫系由来の細胞が挙げられる。
【００４７】
治療物質の構造体への添加後、これらの構造体は好ましくは、治療物質とインキュベーションされる。好ましくは、インキュベーションは、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜約４０℃、及びより好ましくは約３５℃〜約３８℃で起こる。最も好ましくは、インキュベーションは、約３７℃で、任意に５％ＣＯ2インキュベーター内で起こる。これらの構造体は、治療物質の構造体への付着を可能にするいずれか適切な時間長でインキュベーションされてよい。好ましくはこれらの構造体は、約０．５〜約２５時間、より好ましくは約１０〜約２０時間、及び最も好ましくは約１８時間インキュベーションされる。
【００４８】
インキュベーション期間中に、治療物質の最大接着を確実にするために、構造体を攪拌することが好ましい。静的インキュベーションは、攪拌の間に分散されることが好ましい。好ましくはこれらの構造体は、約１０〜約５００ｒｐｍ、好ましくは約２００〜約４００ｒｐｍ、及び最も好ましくは約３００ｒｐｍで攪拌される。好ましくは、攪拌は、インキュベーション１時間あたり約３０秒〜約２分間、より好ましくはインキュベーション１時間あたり約１分間起こる。
【００４９】
本発明の第二の態様に従い、熱誘起相分離により製造され、かつ治療物質の付着を改善するように処理される、疎水性構造体を提供し、これは：
ｉ）培養培地中に該構造体を少なくとも部分的に水浸させること；並びに
ｉｉ）引き続き該構造体を溶媒と接触させること：を含む。
【００５０】
本発明はまた、治療物質の改善された付着を可能にするように処理されているＴＩＰＳ構造体を製造する方法も提供する。処理されたＴＩＰＳ構造体を製造する方法は、治療物質の付着の工程が行われない以外は、本発明の第一の態様に関して定義されている。本発明の第二の態様に従う方法の代わりに、貯蔵又は輸送され得る処理されたＴＩＰＳ構造体の製造を生じる。治療物質は、引き続き処理されたＴＩＰＳ構造体へ付着されることができる。
【００５１】
本発明の第三の態様に従い、プレート又はウェルの底から上行する非接着性物質の障壁を備える、細胞培養プレート又はウェルが提供される。
【００５２】
プレート又はウェルの底から上行する非接着性物質の障壁を備える細胞培養プレート又はウェルの使用は、前述のインキュベーション（すなわち、ＴＩＰＳ構造体を溶媒とインキュベーションするか、又は処理されたＴＩＰＳ構造体を治療物質とインキュベーションする）期間中の、培養プレート又はウェルの中心へのＴＩＰＳ構造体の凝集を減少することができる。凝集は、インキュベーション時のＴＩＰＳ構造体の攪拌により引き起こされ得る。
【００５３】
「非接着性」により、本構造体の細胞培養プレート表面への接着を防止する物質を意味する。例としては、疎水性コーティング、シラン、シリコーン、アガロース、又はテフロン(登録商標)が挙げられる。好ましい実施態様において、非接着性物質は、シリコーンである。好ましくは、プレート又はウェルの底から上行する非接着性物質の障壁は、傾斜した形状又は弯曲した形状を有する。好ましくは、障壁は、プレート又はウェルの中心にある。この障壁は、攪拌時に使用する際に、ＴＩＰＳ構造体が、プレート又はウェルの壁と障壁の間に形成されたチャネルの周りを自在に移動するように提供された任意のサイズ及び形状であることができる。
【００５４】
この障壁は、ＴＩＰＳ構造体が、プレート又はウェルの中央で凝集を形成することを防止する限りは、任意のサイズ及び形状であることができる。好ましくは、この障壁は、弯曲した側面を有するドーム型の突起である。
【００５５】
本発明の第四の態様に従い、熱誘起相分離により得られた構造体により、器具をコーティングする方法であって：
ｉ）器具を、ポリマー及び溶媒を含有する混合物でコーティングすること；
ｉｉ）ポリマー及び溶媒コーティングを有する器具を、クエンチング流体中で、クエンチングすること；並びに
ｉｉｉ）コーティングを凍結乾燥すること：を含む、方法が提供される。
【００５６】
器具の外側及び／又は内側表面は、ＴＩＰＳにより製造されたポリマーによりコーティングされ得る。ＴＩＰＳ処理されたポリマーの製造は、引用により本明細書中に組み込まれている、ＷＯ  ２００８／１５５５５８において先に説明されている。このアプローチは、本願に従い調節することができる制御可能な性質を提供することが示されている。
【００５７】
この器具は、生物学的システム、例えば生物学的試料、細胞培養、ヒト又は動物の体などにおいて使用することが意図されている、任意の道具、装置、アプライアンス、物質又は他の品物であることができる。このような器具は、疾患又は損傷の診断、予防、モニタリング、治療又は軽減のため、解剖学的又は生理学的プロセスの研究、代替又は修飾のため、あるいは受胎の管理のために、細胞を培養するために使用することができる。好ましくはこの器具は、包帯物質、スカフォールド器具、導管、組織培養表面もしくはメンブレン、人工関節、心弁、ステント又は創傷充填材である。この器具は、最も好ましくは、ステント又は創傷充填材である。
【００５８】
「コーティングされた」により、ＴＩＰＳにより製造されたポリマーの層が、医療器具の外側又は内側表面の上に形成されることを意味する。
【００５９】
ＴＩＰＳ技術による表面コーティングは、使用される溶媒中に実質的に不溶性である生物学的物質又は合成物質で構成された器具に塗布されることができる。好適な物質としては、脱細胞化された(decellularised)マトリクス、金属、合金、プラスチック、ゴム又はガラスが挙げられる。好適な溶媒は、炭酸ジメチル、クロロホルム、アセトン、ジメチルクロリド、テトラヒドロフラン及び超臨界二酸化炭素、又は当業者に公知のＴＩＰＳ加工に適した他の溶媒を含む。
【００６０】
コーティング方法は、器具をポリマー及び溶媒混合物へ表面噴霧又は浸漬すること、引き続き凍結浴中でクエンチングし、及び溶媒が凝固するまで、凍結乾燥することに関与している様々な方法を含むことができる。溶媒の凝固に要する時間の長さは、溶媒の特性、クエンチング溶液及びコーティングの厚さに応じて変動するであろう。好ましくは、クエンチング溶液は、溶媒の凝固点を下回る凝固点を有し、かつ液体窒素、液体酸素、液体ＣＯ2、フレオン、水、エタノール、メタノール及びそれらの混合物から選択される。最も好ましいクエンチング溶液は、液体窒素である。あるいは、この器具は、ポリマー溶液又は溶媒により含浸され、その後クエンチング及び凍結乾燥される。
【００６１】
ポリマー、溶媒、又はポリマー：溶媒の比、又はクエンチング溶液の温度を調節することにより、必要に応じて特注することができる様々な表面性質を達成することができる。例えば、溶媒結晶化のために山形(chevron)様パターンを伴う１〜５μｍの細孔がばらまかれた平滑表面が、ＴＩＰＳプロセスのための無希釈のＰＬＧＡを用いて製造されるのに対し、でこぼこの相互接続された破壊された表面は、ポリマー溶液へ混合された水を用いて製造され得る。
【００６２】
コーティングの多孔性構造体の制御はまた、凝固するポリマーコーティングの凍結前面の方向を操作することにより達成可能である。これは、例えば、ポリマーコーティングされた器具を、溶媒の凝固点を下回る温度の冷たい表面上に配置することにより達成することができる。あるいは、凍結マンドレルを、各々、内側から外側へ又は外側から内側への、凍結を開始するために、ポリマー溶液でコーティングされた管状器具に又はその周囲に配置することができる。
【００６３】
この器具は、本発明の第一の態様に関連して説明されたコーティングの外側に付着されたか、又は治療物質のポリマー及び溶媒との混合によりコーティング内に封入された、先に考察されたように定義された治療物質を含むことができる。
【００６４】
このコーティング技術は、広範な物質に、迅速に非破壊性で適用可能である。特に、下記実施例において考察するように、ＴＩＰＳコーティングは、内皮細胞の付着を改善するために、金属性ステント物質に適用可能である（実施例６）。
【００６５】
本発明の第五の態様に従い、多層ＴＩＰＳミクロスフェアを製造する方法であって：
ｉ）多層化されたポリマー液滴を形成するために、各組成物がポリマー及び溶媒を含む、２種以上の組成物を、同軸ノズルから同時に、押し出し、該同軸ノズルが、同軸上に位置決定された少なくとも２個のサブノズルを備えること；
ｉｉ）クエンチング流体中に得られたポリマー液滴を配置すること；並びに
ｉｉｉ）誘導された多層ミクロスフェアを凍結乾燥すること：を含む、方法が提供される。
【００６６】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＩＰＳミクロスフェアから送達される複数の治療物質の時間的制御が、各々が送達の必要要件のために特注された特性を伴う、複数のポリマー層からなるミクロスフェアを製造することにより達成され得ることを発見した。多層ミクロスフェアの各層の特性は、各層を形成するために使用されるポリマー及び溶媒組成物の調節により特注される。使用されるポリマー及び溶媒組成物は、異なるポリマー及び／又は溶媒の使用によるか、あるいは各層を形成するために使用されるポリマーの溶媒に対する比を変更することにより、異なることができる。
【００６７】
多層ミクロスフェアを形成するために使用される方法は、ＷＯ  ２００８／１５５５５８に開示されたミクロスフェアを形成するために使用される方法を基本にしている。多層ミクロスフェアの形成の方法を定義するために使用される用語は、ＴＩＰＳミクロスフェアを形成するために使用される方法を考察する場合に定義されるものである。
【００６８】
多層化されたＴＩＰＳミクロスフェアは、中空ミクロスフェアの製造又は異なる物質の封入について当初デザインされた、異なるポリマー溶液の同軸送達に関する存在するいくつかの方法を用いて、達成することができる。これは、電気流体力学的噴霧(Pareta及びEdirisinghe、J R Soc Interface. 2006 August 22; 3(9): 573-582)、又は層流噴流破壊のための振動ノズルを組み込んでいるシステムを含む。
【００６９】
本発明の第五の態様に従う方法において、ポリマー及び溶媒を含有する２種以上の組成物は、同時に押し出され、複数層で構成されたミクロスフェアを生じ、その各々は、２種以上の組成物の配合に応じた独自の構造体を有する。
【００７０】
これらのミクロスフェアは、１個又は複数の外側層により囲まれている、氷、エントラップドガス又は非常に溶けやすい物質などの一過性の物質により形成された、中空コアを含むことができる。好ましくは、少なくとも２個の外側層が存在する。従ってこのようなＴＩＰＳミクロスフェアは、ミクロスフェアの放出及び／又は分解を制御するために使用することができる、ポリマーの個別の層を含む。
【００７１】
多層化は、時間的に異なる機械的特性を伴うミクロスフェアを提供するために使用することができ、かつ異なる層へと封入された異なる薬物の放出を制御するために使用することができる。これは、治療物質の最初の急速放出に、第二の治療物質のより長期にわたるより安定した放出が続く場合に、有益である。この治療物質は、ポリマーがミクロスフェアを形成するために使用される前に、ポリマーと混合されてよい。第一層は、迅速に分解するように設計されたポリマー（例えばグリコール酸）で構成され得、より安定して遅い放出のポリマー（例えば、ＰＬＧＡ（約８０：２０乳酸：グリコール酸又は約５０：５０乳酸：グリコール酸、純粋な乳酸、ポリカプロラクトン、ポリウレタン又はコラーゲンなどの生物学的ポリマー）を後に残す。このアプローチの緊急の適応(immediate indication)は、創傷充填材物質としてであり、この場合外側ポリマー層は、創傷の初期の非感染を促進するために抗生物質を放出し、その後炎症を弱めるために抗炎症性生物製剤を放出することができる。このＴＩＰＳミクロスフェアは、継続して組織浸潤及び治癒を促進することが証明されたそれらの有利な構造的性質を提供する。
【００７２】
本プロセスは、薬物送達、宿主免疫応答からの細胞の保護、又は生化学プロセスの細胞夾雑の防止に使用することができる、中空コア（例えば、氷、エントラップドガス又は非常に溶けやすい物質などの一過性物質により作製されたコア）、並びに非混和性で非分解性のシェル物質を作製するように拡大することができる。
【００７３】
本プロセスは、単純に共通軸上に搭載されたノズルの数を増加することにより、異なる層の数を増加するように、改変することができる。
【００７４】
本プロセスはまた、器具を非混和性ポリマー溶液で浸漬又は噴霧することにより、ポリマーの複数の層で医療器具を被覆するために、適合させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
本発明はここで、単に例として、図面を参照し、より詳細に説明される：
【図１】図１は、ＰＬＧＡから本発明に従い製造された切片化されたミクロスフェアの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。放射状の管状細孔構造体を認めることができる。
【図２】図２は、図１に示されたミクロスフェアのより高倍率のＳＥＭ画像である。
【図３】図３は、倍率（ａ）６００×及び（ｂ）４００×で、１０μｍよりも小さいミクロスフェアを示すＳＥＭ画像である。
【図４】図４は、エタノール３００μｌの添加（脱イオン水中、１＝５０％、２＝６０％、３＝７０％、４＝８０％ｖ／ｖのエタノール）前の、（ａ）無希釈血清５００μｌ中でインキュベーションされたミクロスフェア、及び（ｂ）１０％血清を含有する培養培地５００μｌ中のミクロスフェアを図示する。
【００７６】
【図５】図５は、エタノールによるＴＩＰＳミクロスフェアの湿潤は、投与量依存性であることを図示している。ＰＬＧＡミクロスフェアは、２０％ＦＢＳを含有する培地中に懸濁させ、並びにインキュベーション培養条件（３７℃、５％ＣＯ2、湿度９５％）下で、０％、３５％（ｖ／ｖ）、７０％（ｖ／ｖ）又は１００％工業用変性アルコール（９９％エタノール［ＥｔＯＨ］含有）により、３０分間、３時間及び２４時間処理した。ミクロスフェアの湿潤は、エタノール濃度及びインキュベーション期間（３０分間、３時間、及び２４時間）により左右された。７０％（ｖ／ｖ）及び１００％エタノール中でインキュベーションされたミクロスフェアは、３時間後に培地（２０％ＦＢＳ含有）中に浸漬され始めたが、３５％（ｖ／ｖ）エタノールに曝露されたものについては２４時間を必要とし、その後これらは完全に水浸された。これらのデータは、エタノール濃度及びこの溶媒への曝露時間を変更することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアの湿潤は、様々な程度に改変され得ることを明らかにしている。
【００７７】
【図６】図６は、血清タンパク質は、湿潤したＴＩＰＳミクロスフェアへ投与量依存様式で吸着することを図示している。  （Ａ）ＰＬＧＡミクロスフェアは、０％、２％、１０％又は２０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（１：１ｖ／ｖ）中に懸濁し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）により３０分間、３時間及び２４時間処理した。  （Ｂ）ミクロスフェアに吸着された血清タンパク質の総量は、各インキュベーション期間後に測定した。データポイントは、総タンパク質の平均量（ｎ＝３±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表している。＊  Ｐ≦０．０５は、湿潤条件間に差があることを示している。
【００７８】
【図７】図７は、血清タンパク質のＰＬＧＡミクロスフェアへの吸着は、予めの湿潤の程度によって決まることを図示している。  （Ａ）ＰＬＧＡミクロスフェアは、０％、２％、又は２０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（１：１ｖ／ｖ）中に懸濁し、３５％（ｖ／ｖ）又は７０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）により３０分間、３時間及び２４時間処理した。ミクロスフェアに吸着された血清タンパク質の総量は、各インキュベーション期間後に測定した。データポイントは、総タンパク質の平均量（ｎ＝３±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表している。＊  Ｐ≦０．０５は、湿潤条件間に差があることを示している。  （Ｂ）血清及びＥｔＯＨ処理したミクロスフェアを、還元剤β−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で、加熱した（９５℃）。タンパク質は、１５％アクリルアミドゲルを用い分離し、かつ硝酸銀を用い染色した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、外部対照として含んだ。
【００７９】
【図８】図８は、ＰＬＧＡ  ＴＩＰＳミクロスフェアの表面に付着することが示された細胞型を図示している。これらは、（ａ）内皮前駆細胞、（ｂ）平滑筋細胞、及び（ｃ）筋芽細胞を含む。
【図９】図９は、２時間のインキュベーション以内で、ＴＩＰＳミクロスフェアの表面に付着した間葉系幹細胞由来のヒト脂肪を示す。
【００８０】
【図１０】図１０は、静的−動的条件（１時間静的インキュベーション、その後３００ｒｐｍで１分間振盪）下でインキュベーションした場合に、最も効率的に付着した、ＬｏｗＢｉｎｄプレート内で細胞とインキュベーションしたＴＩＰＳミクロスフェアを図示している。（ａ）これは、平底ウェルの中心に向かってクラスター化しているミクロスフェアを生じる。（ｂ）プレート中の細胞化されたミクロスフェアのクラスター化は、隣接ミクロスフェア間を橋かけした細胞を生じ、ミクロスフェアの凝集を形成する（ｃ−ｄ）。プレートの底上の弯曲した低結合表面の包含は、ミクロスフェアのクラスター化を防止する（ｅ）。
【００８１】
【図１１】図１１は、（ａ）ＡＰＩ（ドキソルビシン）は、非湿潤の疎水性ミクロスフェアの表面に結合しないこと；（ｂ）ドキソルビシンは、予め湿潤したＴＩＰＳミクロスフェアの表面に良く結合すること；（ｃ）湿潤ミクロスフェアの独自のＴＩＰＳミクロスフェア構造体は無傷で有り続けること；及び、（ｄ）ＡＰＩの制御放出は、長期間認められること：を図示している。
【００８２】
【図１２】図１２は、ＴＩＰＳコーティング法を用い調製された金属表面を図示している。
【図１３】図１３は、ＴＩＰＳ微粒子によりコーティングされた地金コバルトクロム製冠血管ステントを示している。  （ａ）炭酸ジメチル中に溶解したポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の液滴を、熱誘起相分離を生じる条件下で電気スプレーによりステント上に沈着した。倍率２１０×で示す。  (b)ステント表面上に存在する個々のＴＩＰＳ微粒子を、より高倍率で示している(6840×)。
【００８３】
【図１４】図１４は、２種のポリマー溶液を送達する同軸ノズルを図示している。
【図１５】図１５は、走査型電子顕微鏡を使用し、二分割されかつ撮像した多層ミクロスフェアを図示している。このミクロスフェアは、炭酸ジメチル中７．５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡを含有する外側シェルと、炭酸ジメチル中１５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡを含有する内側コアを含む。
【００８４】
【図１６】図１６は、同軸ノズルにより送達される２種の異なるポリマーを使用し製造されたＴＩＰＳミクロスフェアを示すＳＥＭを図示している。外側ノズルから送達されたポリマーにより製造された表面上の明確な外側層の破壊は、内側ノズルから送達されるポリマーにより製造された内側層の異なる物理的性質を明らかにしている。追加の線は、２つの層の間の境界を示している。  （ａ）内側ノズル：ＤＭＣ（炭酸ジメチル）に溶解し、かつ０．４５μｍセルロースシリンジフィルターで濾過した、４％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。    外側ノズル：ＤＭＣ中に溶解した５％ＰＬＧＡポリマー（７５：２５）  ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬＧ  ７５０２  。  （ｂ−ｃ）内側ノズル：ＤＭＣ中に溶解した４％ＰＬＧＡポリマー（７５：２５）ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬＧ  ７５０２。    外側ノズル：ＤＭＣ中に溶解し、かつ０．４５μｍセルロースシリンジフィルターで濾過した、５％ＰＥＧ。  （ｄ）内側ノズル：ＤＭＣ中に溶解し、かつ０．４５μｍセルロースシリンジフィルターで濾過した、４％ＰＥＧ。    外側ノズル：ＤＭＣ中に溶解した５％ＰＬＧＡポリマー（７５：２５）ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬＧ  ７５０２。  （ｅ）内側ノズル：ＤＭＣ中に溶解した４％ＰＬＧＡポリマー（７５：２５）ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬＧ  ７５０２。    外側ノズル：ＤＭＣ中に溶解し、かつ０．４５μｍセルロースシリンジフィルターで濾過した、５％ＰＥＧ。  （ｆ−ｇ）内側ノズル：ＤＭＣ中に溶解し、かつ０．４５μｍセルロースシリンジフィルターで濾過した、５％ＰＥＧ。    外側ノズル：ＤＭＣ中に溶解した４％ＰＬＧＡポリマー（７５：２５）ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬＧ  ７５０２。
【実施例】
【００８５】
（実施例）
（実施例１：熱誘起相分離プロセスを使用するミクロスフェア（ＴＩＰＳミクロスフェア）の製造）
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）（７５：２５）(Medisorb、Alkermes社、USA)を、炭酸ジメチル（純度＞９９．９％、Sigma Aldrich社、UK)中に溶解した、ポリマーマトリクスとして使用した。ＰＬＧＡを、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）中に１：６ｗ／ｖで溶解した（０．８３３ｇ  ＰＬＧＡを、２５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内で、５ｍｌ  ＤＭＣ中に、磁気攪拌しながら、２時間溶解した）。このポリマー溶液を、様々なサイズの針穴を取り付けたシリンジから、液体窒素へと、滴下し、相分離を直ちに誘導した。ポリマー溶液の各液滴は、液体窒素温度と平衡化させ、沈下により分離し(demarked)、その後更なる液滴を添加し、加工時のミクロスフェアの集塊形成を防止した。凍結された球形を引き続き一晩凍結乾燥させ、ＴＩＰＳミクロスフェアを生じた。ＴＩＰＳミクロスフェアを、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｓｗｏｒｄ  ｒａｚｏｒ（登録商標）ブレードを用いて切片化し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による内部細孔構造の試験を可能にした。
【００８６】
この細孔構造体は、ＴＩＰＳ発泡体のような典型的構造体と、高度に相互接続していた。具体的には、ＤＭＣ溶媒は、凍結温度−１℃を有し、ポリマー溶液が液体窒素を用いて迅速に凍結される場合は、凍結溶媒の前面の結晶化のために、管状細孔が発達する。ここで意義深いことに、凍結前面は、外側から内側であり；従って図１及び２に示されるように、管状細孔の放射状の細孔構造体は、生じた比較的小さい細孔のはしご状構造体により相互接続される。
【００８７】
ミクロスフェアのサイズは、針穴のサイズに関連しており、下記表１に示したように、より小さい針穴は、より小さいミクロスフェアを生じる。
表１  針穴サイズのミクロスフェアサイズへの作用
【表１】
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【００８８】
図３は、電気スプレープロセスを用い、およそ６９０μｍの針穴サイズで作製された、１０μｍよりも小さいミクロスフェアを図示する。
【００８９】
溶媒として炭酸ジメチルを及び液体窒素中の急速クエンチングを使用するＴＩＰＳミクロスフェアの二次加工は、無希釈ＰＬＧＡ  ＴＩＰＳミクロスフェアに関する、球形の中心に向かう（熱転移の方向と平行）、溶媒結晶化の前面の前送りから製造された放射状の細孔（チャネル様）を伴う、高度に規則的な相互接続した多孔性を生じた。ポリマー溶液の温度が、溶媒の凝固点よりも低い場合及びポリマーが連続するポリマー−富相を形成するために結晶化の前面から除かれる場合、ＴＩＰＳの間に、この溶液は、溶媒の結晶化のために、ポリマー−富相とポリマー−貧相に分離される。この溶媒は昇華され、これは溶媒結晶の形状寸法の三次元フィンガープリントである細孔を残す。より高倍率で、無希釈のＰＬＧＡ  ＴＩＰＳミクロスフェアの構造体は、内部のはしご−状構造を伴う、高度に異方性のチャネル−様形態を有することが認められ、これは固−液ＴＩＰＳにより形成される発泡体の特徴的形態である。無希釈のＰＬＧＡミクロスフェア、複合のタンパク質封入されたＴＩＰＳミクロスフェアの外側は、１〜５μｍの細孔がばらまかれかつ液滴表面を横切る溶媒の最初の凍結前面のために山形様パターンで覆われた、平滑なポリマー表面を伴う、厚さ約２μｍのスキン領域からなる。一旦凍結前面が、液滴の中心へと進むと、この細孔構造体は、より規則的になり始め、相互接続し、はしご状となる。これらの球形のサイズは、針穴のサイズにより制御することができ、より小さい球形が、より狭い穴の針から製造される（表１）。これらのミクロスフェアは、一貫した液滴形成のために、単分散である。空隙が、試料中に明白であり、かつこれは手作業による液滴形成法の間の空気の捕獲に起因しており、かつ液体窒素への短い液滴距離が本試験において使用された。これらの空隙は、球形の外側表面から伸びているネック(neck)からなる。これらの空気ポケットの形成は、振動針の使用及びより最適化された加工技術により、防ぐことができるであろう。細孔及び壁のマイクロ構造体は、ポリマー濃度、充填剤投入含量、クエンチング温度及び使用される溶媒を変更することにより制御することができる。多孔性は、ポリマー濃度及び充填剤含量が減少するにつれ増加する。最大９５％の多孔性の発泡体は、ＴＩＰＳ技術を使用し達成することができる。溶媒としてのＤＭＣ及びＰＬＧＡポリマーを使用する本発明者らの方法は、わずかに濃密なスキン領域及び放射状の細孔の形成を可能にし、これにより無秩序な細孔構造体に勝る機械的特性を増強することができる。
【００９０】
電気磁気振動針の使用は、ｉ）ポリマー溶液中の粒子の分散の維持、ｉｉ）針の閉塞の防止、並びにｉｉｉ）ノズル自身の振動によるより小さいミクロスフェア（１００〜８００μｍ）の達成のために使用することができる。球形サイズの偏差は、マトリクスの密度及び表面張力によって決まるであろう。おおまかにいうと、最小の達成可能な液滴の直径は、使用されるノズル直径よりも１．５〜２倍大きい。
【００９１】
（実施例２：ＴＩＰＳミクロスフェアの湿潤）
ＴＩＰＳミクロスフェアは、以下のプロトコールを使用し「湿潤」した：
１．  およそ３０ｍｇの乾燥ＴＩＰＳミクロスフェアを、１．５ｍｌ遠心チューブに配置した。
２．  ５００μｌのウシ胎児血清（又は、組織培養培地（例えば、イーグル最小必須培地［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社Ｍ２２７９］＋１０％ウシ胎児血清）を、遠心チューブに添加した。
３．  遠心管を、２０秒間ボルテックスし、ミクロスフェアをこの溶液と混合した。
４．  エタノール（脱イオン水により５０、６０、７０及び８０％ｖ／ｖに希釈）３００μｌを、各チューブに添加した。
５．  遠心チューブを、２０秒間ボルテックスし、ミクロスフェアを溶液と混合した。
６．  遠心チューブを、３７℃のインキュベーター内に、９０分間及び２４０分間配置した。
７．  インキュベーション溶液を、遠心チューブから除去し、付着されるべき細胞に適した新鮮な培養培地と交換した。
【００９２】
図４は、エタノール３００μｌの添加（脱イオン水中、１＝５０％、２＝６０％、３＝７０％、４＝８０％ｖ／ｖのエタノール）前の、（ａ）無希釈血清５００μｌ中でインキュベーションされたミクロスフェア、及び（ｂ）１０％血清を含有する培養培地５００μｌ中のミクロスフェアを図示する。ミクロスフェアの大部分は、３７℃での９０分以内のインキュベーション時に沈下した。この作用は、６０％ｖ／ｖを上回るエタノール濃度でより顕著である。全てのミクロスフェアは、４時間以内のインキュベーションで沈下した。
【００９３】
図５は、エタノールによるＴＩＰＳミクロスフェアの湿潤は、投与量依存性であることを図示している。ＰＬＧＡミクロスフェアを、２０％ＦＢＳを含有する培地中に懸濁させ、並びにインキュベーション培養条件（３７℃、５％ＣＯ2、湿度９５％）下で、０％、３５％（ｖ／ｖ）、７０％（ｖ／ｖ）又は１００％工業用変性アルコール（９９％エタノール［ＥｔＯＨ］含有）により、３０分間、３時間及び２４時間処理した。ミクロスフェアの湿潤は、エタノール濃度及びインキュベーション期間（３０分間、３時間、及び２４時間）により左右された。７０％（ｖ／ｖ）及び１００％エタノール中でインキュベーションされたミクロスフェアは、３時間後に培地（２０％ＦＢＳ含有）中に浸漬され始めたが、３５％（ｖ／ｖ）エタノールに曝露されたものについては２４時間を必要とし、その後これらは完全に水浸された。これらのデータは、エタノール濃度及びこの溶媒への曝露時間を変更することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアの湿潤は、様々な程度に改変され得ることを明らかにしている。
【００９４】
図６は、血清タンパク質は、湿潤したＴＩＰＳミクロスフェアへ投与量依存様式で吸着することを図示している。
（Ａ）ＰＬＧＡミクロスフェアは、０％、２％、１０％又は２０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（１：１ｖ／ｖ）中に懸濁し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）により３０分間、３時間及び２４時間処理した。
（Ｂ）ミクロスフェアに吸着された血清タンパク質の総量は、各インキュベーション期間後に、微量Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイにより測定した。データポイントは、総タンパク質の平均量（ｎ＝３±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表している。＊  Ｐ≦０．０５は、湿潤条件間に差があることを示している。
【００９５】
図７は、血清タンパク質のＰＬＧＡミクロスフェアへの吸着は、予めの湿潤の程度によって決まることを図示している。
（Ａ）ＰＬＧＡミクロスフェアは、０％、２％、又は２０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（１：１ｖ／ｖ）中に懸濁し、３５％（ｖ／ｖ）又は７０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）により３０分間、３時間及び２４時間処理した。ミクロスフェアに吸着された血清タンパク質の総量は、各インキュベーション期間後に、微量Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイを使用し測定した。データポイントは、総タンパク質の平均量（ｎ＝３±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表している。＊  Ｐ≦０．０５は、湿潤条件間に差があることを示している。
（Ｂ）血清及びＥｔＯＨ処理したミクロスフェアを、還元剤β−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で、加熱した（９５℃）。タンパク質は、１５％アクリルアミドゲルを用い分離し、かつ硝酸銀を用い染色した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、外部対照として含んだ。
【００９６】
（実施例３：ＴＩＰＳミクロスフェアへの細胞付着）
細胞を、下記プロトコールを使用し、実施例１において説明した方法を用い浸潤されたＴＩＰＳミクロスフェアへ付着した：
１．  新鮮な培養培地中で湿潤したＴＩＰＳミクロスフェアを、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）ウルトラ−ローアタッチメントマルチウェルプレートのウェルへ移した。
２．  この培養培地を除去し、湿潤したミクロスフェアのみを、プレートのウェルに残した。
３．  新鮮な組織培養培地４００μｌを、ウェルに添加した。
４．  細胞１×１０5個を含有する培地１００μｌを、ウェルに添加した。
５．  プレートを、３７℃のＣＯ2インキュベーター内に配置した、軌道振盪機（ＳＴＵＡＲＴ  ＳＳＭ５）上に配置した。振盪機を、１時間に１分間につき３００ｒｐｍでプレートを攪拌するように設定した。
６．  プレートを１８時間インキュベーションし、その後細胞化されたミクロスフェアを除去した。
７．  細胞を染色し、図４に示したように蛍光顕微鏡により撮像した。
【００９７】
図８は、ＰＬＧＡ  ＴＩＰＳミクロスフェアの表面に付着することが示された細胞型を図示している。これらは、（ａ）ミュラー幹細胞、（ｂ）内皮前駆細胞、（ｃ）平滑筋細胞、（ｄ）肺上皮細胞、（ｅ）中胚葉性血管芽細胞、（ｆ）筋芽細胞を含む。
【００９８】
細胞付着及び送達は両方共、多孔性に依存している。各細胞型は、付着、播種及び分化のための異なる表面組織に適している。表２は、様々な臨床状態での好ましいサイズ範囲及び多孔性を示している。
【００９９】
表２  様々な臨床状態に関する好ましいミクロスフェアのサイズ範囲及び多孔性
【表２】
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【０１００】
先に概説した細胞付着プロトコール時の低付着プレートの使用は、非接着性細胞がミクロスフェアの代わりにプレートに接着することを防ぐ。攪拌の期間は、細胞を再懸濁し、沈下したミクロスフェアへ付着する細胞の確率を増加する。実験は、湿潤及び攪拌プロセスを使用する２時間のインキュベーション以内の、ＴＩＰＳミクロスフェアへの細胞付着を示している。図９は、２時間のインキュベーション以内で、ＴＩＰＳミクロスフェアの表面に付着した間葉系幹細胞由来のヒト脂肪を示す。
【０１０１】
（実施例４：組織培養プレートの底上の弯曲した低結合表面の包含）
ウェルの底から上行する非接着性物質の障壁を備える組織培養プレートの使用は、細胞化されたＴＩＰＳミクロスフェアの培養プレートのウェルの中心への凝集を減少することができる。凝集は、インキュベーションの動的相における培養培地のボルテックスにより引き起こされ得る。
【０１０２】
一実施態様において、組織培養プレートは、実施例３に説明した低結合組織培養プレートのウェルの中心に付着された非接着性シリコーン物質の上向きの弯曲を含む。これは、図１０に図示したように、ミクロスフェアが、一緒に凝集及び接着することを防ぐ。
【０１０３】
図１０は、静的−動的条件（１時間静的インキュベーション、その後３００ｒｐｍで１分間振盪）下でインキュベーションした場合に、最も効率的に付着したＬｏｗＢｉｎｄプレート内で細胞とインキュベーションしたＴＩＰＳミクロスフェアを図示している。（ａ）これは、平底ウェルの中心に向かってクラスター化しているミクロスフェアを生じる。（ｂ）プレート中の細胞化されたミクロスフェアのクラスター化は、隣接ミクロスフェア間を橋かけした細胞を生じ、ミクロスフェアの凝集を形成する（ｃ−ｄ）。プレートの底上の弯曲した低結合表面の包含は、ミクロスフェアのクラスター化を防止する（ｅ）。
【０１０４】
（実施例５：活性医薬成分（ＡＰＩ）のＴＩＰＳミクロスフェアへの付着）
実施例２に説明された湿潤技術は、水溶液中に可溶性の（ＡＰＩ）の、ＴＩＰＳミクロスフェアへの付着を促進することができる。
【０１０５】
ＴＩＰＳミクロスフェア１００ｍｇを、７ｍｌのプラスチック容器に入れた。このミクロスフェアを、７０％エタノールで１分間湿潤した。アルコールを除去し、ミクロスフェアを、脱イオン水５ｍｌで洗浄した。ドキソルビシン（水中０．５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを、この容器に添加した。ミクロスフェア及びドキソルビシン溶液を、ピペッティングにより混合し、軌道振盪機上で１５０ｒｐｍで攪拌しながら、室温で一晩インキュベーションした。対照の非湿潤ミクロスフェアを、同じ様式で処理した。これらのミクロスフェアは、１３０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離した。ドキソルビシンは、湿潤ミクロスフェアの表面には結合したままであったのに対し、非湿潤試料からは分離した。
【０１０６】
図１１は、（ａ）ＡＰＩ（ドキソルビシン）は、非湿潤の疎水性ミクロスフェアの表面に結合しないこと；（ｂ）ドキソルビシンは、予め湿潤したＴＩＰＳミクロスフェアの表面に良く結合すること；（ｃ）湿潤ミクロスフェアの独自のＴＩＰＳミクロスフェア構造体は無傷で有り続けること；及び、（ｄ）ＡＰＩの制御放出は、長期間認められることを図示している。
【０１０７】
（実施例６：金属スカフォールドのコーティング）
下記実施例は、金属スカフォールド（以後「スカフォールド」と称す）のコーティング方法を説明している：
１．  スカフォールド物質を、炭酸ジメチルに溶解した５ｗｔ％ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の溶液に１分間浸漬した。
２．  コーティングされたスカフォールド物質を、直ちに液体窒素の容器に入れ、ポリマー溶液のポリマー富相及びポリマー貧相への分離を生じた。
３．  凍結したコーティングされたスカフォールドを、凍結乾燥機に配置し、溶媒の除去が完了するまで、２４時間凍結乾燥した。
４．  コーティングされたスカフォールドを、走査型電子顕微鏡を用いて撮像した（図１２）。
【０１０８】
図１３は、ＴＩＰＳ微粒子によりコーティングされた地金コバルトクロム製冠血管ステントを示している。炭酸ジメチル中に溶解したポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の液滴を、熱誘起相分離を生じる条件下で電気スプレーによりステント上に沈着した。液滴を電気スプレーにより沈着させた後、工程２から図１２の方法を先に進めた。
【０１０９】
（実施例７：多層ＴＩＰＳミクロスフェアの作製）
下記方法を使用し、炭酸ジメチル中の７．５％（ｗ／ｖ）ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含有する外側シェルと、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）中に１５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡを含有する内側コアからなる多層ミクロスフェアを作製する。
１．  ＰＬＧＡの溶液（ＤＭＣ中７．５ｗｔ％又は１５ｗｔ％）を、個別の１０ｍｌシリンジに投入した。
２．  これらのポリマー溶液を含む２個のシリンジを、シリンジポンプに接続し、３ｍｌ／分の速度で、チューブを介して、同軸に位置決定された２個のサブノズルからなるステンレス鋼製の同軸ノズルを装着した、Ｎｉｓｃｏ  Ｖａｒ  Ｄクラシックオープン電磁駆動式単ノズル封入器ユニットに送達した（図１４）。この封入器ユニットは、１．８０ｋＨｚ及び振幅１００％に設定した。
３．  ポリマー液滴を、液体窒素のクエンチング浴中に収集し、容器に移し、溶媒の除去が完了するまで、２４時間凍結乾燥した。
４．  多層ミクロスフェアを、２つに分割し、走査型電子顕微鏡を用い撮像した（図１５）。
【０１１０】
図１６は、先に説明した方法を用い製造されたミクロスフェアの更なるＳＥＭ画像を図示している。
全ての引用された参考文献は、それらの全体が本明細書中に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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【図８ａ）】
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【図８ｂ）】
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【図８ｃ）】
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【図９】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
2017502041.tif 000015
【図１０（ｃ）】
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【図１０（ｄ）】
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【図１０（ｅ）】
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【図１２】
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【図１３（ａ）】
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【図１３ｂ）】
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【図１５】
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【図１６（ａ）】
2017502041.tif 000023
【図１６（ｂ）】
2017502041.tif 000024
【図１６（ｃ）】
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【図１６（ｄ）】
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【図１６（ｅ）】
2017502041.tif 000027
【図１６（ｆ）】
2017502041.tif 000028
【図１６（ｇ）】
2017502041.tif 000029
【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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