(57)【要約】  本開示は、頭頸部癌における腫瘍エスケープ機構としてのＨＬＡ−Ｅに関する。本開示は、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合し、かつそれを阻害する抗体を用いて、頭頸部癌、特にＨＬＡ−Ｅを発現する頭頸部扁平上皮癌を処置する方法に関する。
2017537069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人のＨＮＳＣＣの処置または予防における使用のための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合し、かつＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する化合物。
【請求項２】
前記ＨＮＳＣＣがＯＣＳＣＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＮＳＣＣが中咽頭腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＮＳＣＣが喉頭腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＮＳＣＣが下咽頭腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個人がＨＰＶ陽性である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
個人のＨＮＳＣＣの前記処置または予防が、
ａ）ＨＮＳＣＣを有する個人がＨＰＶ陽性であるかどうかを決定するステップと、
ｂ）前記個人がＨＰＶ陽性であると決定されたときに、ＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合する前記化合物を前記個人に投与するステップと
を含む、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記個人のＨＮＳＣＣの処置または予防が、
ａ）ＨＮＳＣＣを有する前記個人からの悪性細胞によってＨＬＡ−Ｅポリペプチドが発現されるかどうかを決定するステップと、
ｂ）悪性細胞が基準レベル以上のＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現すると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を前記個人に投与するステップと
を含む、請求項１または７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
悪性細胞によってＨＬＡ−Ｅポリペプチドが発現されるかどうかを決定するステップが、前記個人からＨＮＳＣＣ細胞を含む生体サンプルを入手し、前記細胞をＨＬＡ−Ｅポリペプチドに結合する抗体と接触させ、かつＨＬＡ−Ｅを発現する細胞を検出することを含む、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
個人の癌を処置または予防する方法における使用のための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合し、かつＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する化合物であって、前記方法が、
ａ）癌を有する前記個人からの悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップと、
ｂ）癌を有する前記個人からの悪性細胞のＥＧＦＲポリペプチド状態を決定するステップと、
ｃ）前記個人からの悪性細胞によってＨＬＡ−ＥおよびＥＧＦＲポリペプチドが基準レベル以上のレベルで発現されると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物およびＥＧＦＲに結合する薬剤を含む治療レジメンを前記個人に施すステップと
を含む、化合物。
【請求項１１】
前記個人が進行性ＨＮＳＣＣを有する、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記個人からの悪性細胞が、健常者に対応する基準レベルと比較して増大したＨＬＡ−Ｅポリペプチド発現を有すると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する前記化合物が前記個人に投与される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
個人の癌を処置または予防する方法における使用のための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合し、かつＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する化合物であって、前記方法が、
ａ）前記個人が腫瘍環境中のリンパ球の存在を特徴とする癌を有するかどうかを決定するステップと、
ｂ）前記個人が腫瘍環境中のリンパ球の存在を特徴とする癌を有すると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を前記個人に投与するステップと
を含む、化合物。
【請求項１４】
ＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合する前記化合物が抗ＮＫＧ２Ａ抗体である、請求項１または７〜１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
前記抗体がヒトＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記抗体が、ヒトＦｃγ受容体への結合を低減するアミノ酸修飾を含むＦｃ操作された定常領域を含む、請求項１４または１５に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａへの結合について、配列番号２および７をそれぞれ含む重鎖および軽鎖を有する抗体と競合する、請求項１４または１５に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
前記化合物またはＮＫＧ２Ａ抗体が、配列番号２に示される配列を有する重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号７に示される配列を有する軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインとを含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、治療的に有効な量の前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む薬学的に許容可能な組成物として投与される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
前記組成物が任意の他の薬学的活性剤を含まない、請求項１９に記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、約１週間に１回から約１ケ月に１回までの投薬頻度で数回投与される、請求項１または７〜２０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２２】
ヒト患者の癌を処置する方法における使用のための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合し、かつＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する化合物であって、前記方法が、（ａ）ヒトＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する抗体、および（ｂ）ＥＧＦＲに結合する薬剤のそれぞれの有効量を前記患者に投与するステップを含む、化合物。
【請求項２３】
ＥＧＦＲに結合する前記薬剤がＥＧＦＲの生物活性を阻害する、請求項２２に記載の使用のための化合物。
【請求項２４】
ＥＧＦＲに結合する前記薬剤が、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対してＡＤＣＣを誘導する抗体である、請求項２２または２３に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
ＥＧＦＲに結合する前記薬剤がセツキシマブである、請求項２２または２４に記載の使用のための化合物。
【請求項２６】
前記癌がＨＮＳＣＣである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２７】
前記ＨＮＳＣＣがＯＣＳＣＣである、請求項２６に記載の使用のための化合物。
【請求項２８】
前記方法が少なくとも１回の投与サイクルを含み、前記サイクルが２週間の期間であり、前記少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、ヒトＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する前記抗体の単回投与が施され、かつＥＧＦＲに結合する前記抗体の２回投与が施される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２９】
前記方法が少なくとも１回の投与サイクルを含み、前記サイクルが２週間の期間であり、前記少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、ヒトＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する前記抗体の単回投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で施され、かつＥＧＦＲに結合する前記抗体の２回投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で施される、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０６７，６４２号明細書（あらゆる図面を含めて、参照によってその全体が本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１５年１０月２０日に作成された「ＮＫＧ２Ａ−ＨＮ＿ＳＴ２５」という名称の２７ＫＢサイズのファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００３】
本発明は、癌、特に頭頸部癌の処置のためのＮＫＧ２Ａ標的剤の使用に関する。また本発明は、癌の処置のためにＮＫＧ２Ａ標的剤と共に使用するのに有利な併用レジメンも提供する。
【背景技術】
【０００４】
ＮＫ細胞活性は、活性化シグナルおよび阻害性シグナルの両方を含む複雑な機構によって制御される。ＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞のＮＫ細胞媒介性の認識および死滅において重要な役割を果たすいくつかの別個のＮＫ特異的受容体が同定されている。天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）は、活性化受容体タンパク質の種類およびこれらを発現する遺伝子（ＮＫ細胞において特異的に発現される）を指す。ＮＣＲの例としては、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６が挙げられる（例えば、（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）；（非特許文献６）が参照され、これらの開示全体は参照によって本明細書中に援用される）。これらの受容体はＩｇスーパーファミリーのメンバーであり、特異的なｍＡｂによって誘導されるこれらの架橋は強力なＮＫ細胞活性化をもたらし、その結果、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増大、細胞毒性の誘発、およびリンホカインの放出、ならびに多くのタイプの標的細胞に対するＮＫ細胞毒性の活性化が生じる。
【０００５】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）およびＴ細胞（α／βおよびγ／δ）のサブセットにおいて見出される阻害性受容体である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−リガンドＨＬＡ−Ｅを発現する細胞に対する上記のリンパ球のサイトカイン放出および細胞毒性反応を制限する（例えば、（特許文献１）を参照）。またＨＬＡ−Ｅは、特定の腫瘍細胞（非特許文献７）および活性化内皮細胞（非特許文献８）によって可溶性形態で分泌されることも見出されている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を阻害する抗体は、ウイルス感染細胞に対するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞応答の応答など、ＨＬＡ−Ｅ陽性標的細胞に対するリンパ球のサイトカイン放出および細胞溶解活性を増大し得る。従って、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを阻害するが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の死滅を誘発しない治療抗体（すなわち、非枯渇抗体）は癌患者における腫瘍成長の制御を誘導し得る。
【０００６】
さらに、特定のリンパ腫、例えばＮＫ−リンパ腫などは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現を特徴とする。このような患者において、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞を標的として死滅させる治療抗体（すなわち、枯渇抗体）は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）によって腫瘍細胞を根絶可能であり得る。また抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、自己免疫性または炎症性疾患の処置における使用も示唆されている（例えば、（特許文献２）、（特許文献３）を参照）。
【０００７】
ＮＫＧ２Ａに対する種々の抗体は当該技術分野において記載されている。（特許文献４）にはヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０が記載されており、（特許文献５）にはヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９が記載されている。（非特許文献９）は、ラット抗マウスＮＫＧ２抗体２０Ｄ５（現在、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５０５１８，ＵＳＡにより市販されている）について言及しており、（特許文献６）には、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに結合すると主張されるマウス抗体３Ｓ９が記載されている。
【０００８】
頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、−  年間６００，０００件の発生率および−  ５０％の死亡率を有する。ＨＮＳＣＣの主要な危険因子は、喫煙、アルコール消費、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染である。その疫学および病態形成の知識の向上にもかかわらず、多くのタイプのＨＮＳＣＣの生存率は過去４０年間にわたってほとんど改善されていない。ＨＮＳＣＣ患者の５年間の全生存率はわずか約５０％である。タバコ、アルコール消費およびウイルス性因子は、ＨＮＳＣＣの発生の主要な危険因子である。これらの危険因子は、遺伝的感受性と共に、癌発生の多段階プロセスにおいて複数の遺伝的およびエピジェネティックな変化の蓄積をもたらし、ＨＮＳＣＣのこのような分子的発癌の理解は、ＨＮＳＣＣを処置するための標的剤の開発に使用されている。
【０００９】
ＨＮＳＣＣの処置としての免疫療法の考えは数十年間にわたり存在しており、ＨＮＳＣＣを処置する試みは、腫瘍特異的抗原のターゲティングを含んでいる。様々な固形癌に対してこのような免疫刺激性治療戦略を用いて改善がなされているが、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）患者に対するこれらの戦略の使用は遅れている。ＨＮＳＣＣの免疫療法アプローチは、ＨＮＳＣＣにより誘導されて免疫刺激の取り組みの有効性を潜在的に低下させる深刻な免疫抑制によって特に複雑化される。ＨＬＡクラスＩの発現低下など、ＨＮＳＣＣが抗腫瘍免疫応答を逃れる機構の概説は、（非特許文献１０）に提供されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９９／２８７４８号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３００９５９６５号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６０７０２８６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００８／００９５４５号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００９／０９２８０５号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３００９５９６５号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌａｎｉｅｒ（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２３−２７
【非特許文献２】Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９０：１５０５−１５１６
【非特許文献３】Ｃａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８９：７８７−７９６
【非特許文献４】Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６
【非特許文献５】Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８（５）：９５３−６０
【非特許文献６】Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１０５５−１０６０
【非特許文献７】Ｄｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；１７７：３１００−７
【非特許文献８】Ｃｏｕｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：２８０６−１４
【非特許文献９】Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９９；１９０：１８０１−１２）
【非特許文献１０】Ｄｕｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７０１６５７；２０１０：１−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、当該技術分野では頭頸部癌を有する患者に対する利益の改善が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、特に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて阻害性受容体ＮＫＧ２Ａを遮断することにより、ＮＫ細胞が頭頸部癌細胞を効果的に除去できるという本発明者らによる発見に由来する。特に、頭頸部癌では、癌が他の治療薬により処置されている場合、およびＨＰＶ陽性患者に含まれる場合でも、ＨＬＡ−Ｅは腫瘍エスケープ機構としての機能を果たす。本明細書では、頭頸部癌細胞はＮＫＧ２Ａ発現ＮＫおよび／またはＴ細胞の阻害を引き起こすレベルでＨＬＡ−Ｅを発現し、抗ＮＫＧ２Ａ抗体はこのような阻害を反転させることができると示されている。さらに、頭頸部癌細胞がＥＧＦＲ阻害薬で処置される場合でも、腫瘍細胞により発現されたＨＬＡ−ＥはＮＫおよび／またはＴ細胞による溶解を阻害し続け、このような阻害は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて反転させることができる。
【００１４】
従って、一実施形態では、個人の頭頸部癌を処置または予防する方法が提供されており、本方法は、頭頸部癌を有する個人に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を治療的に活性な量で投与するステップを含む。１つの態様では、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の処置または予防において使用するための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を含む組成物が提供される。１つの態様では、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物は、二価の様式でＮＫＧ２Ａに結合することができる抗体である。１つの態様では、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物は、非枯渇抗体（例えば、Ｆｃドメインを欠いている抗体、または１つもしくは複数のＦｃγ受容体への結合が最小限であるか、もしくは結合しないＦｃドメインを有する抗体）である。一実施形態では、個人のＨＮＳＣＣの処置または予防において使用するために、ＮＫおよび／またはＴ細胞上のＮＫＧ２Ａポリペプチドを阻害し、かつこのようなＮＫおよび／またはＴ細胞にＨＬＡ−Ｅ発現ＨＮＳＣＣ細胞を溶解させる化合物が提供される。任意選択的に、前記処置または予防は、ＮＫＧ２Ａポリペプチドを阻害する化合物の、ＨＮＳＣＣを有する個人への投与を含む。
【００１５】
一実施形態では、癌は、中咽頭腫瘍、喉頭腫瘍、口腔腫瘍、または下咽頭腫瘍である。一実施形態では、ＨＮＳＣＣは、口腔ＳＣＣ（ＯＣＳＣＣ）である。ＯＣＳＣＣは、唇、舌の前方２／３、口腔底、頬側粘膜、歯肉、硬口蓋および臼後三角の扁平上皮癌を含む。
【００１６】
一実施形態では、ＨＮＳＣＣは転移性癌である。
【００１７】
一実施形態では、個人は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性である（例えば、ヒトパピローマウイルスの存在を特徴とし、高い癌リスクまたは悪い癌予後に関連するＨＰＶ遺伝子型に陽性、ＨＰＶ１６遺伝子型に陽性、および／またはＰ１６ＩＮＫａ発現に陽性である）。
【００１８】
一実施形態では、個人は、腫瘍環境中（例えば、腫瘍組織内および／または腫瘍隣接組織内）のリンパ球の存在を特徴とする頭頸部癌を有する。
【００１９】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト患者（インビボ）においてヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの阻害活性の中和をもたらす量で投与され、任意選択的に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも２週間、任意選択的に少なくとも４週間、末梢血ＮＫおよびＴリンパ球上のＮＫＧ２Ａポリペプチドの飽和をもたらす用量で投与される。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に約４ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００２０】
一実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物（例えば、抗体）を用いる治療レジメンまたは治療過程は、癌細胞を除去するための手術前に、すなわち術前処置として、頭頸部癌を有する個人に施される。
【００２１】
任意選択的に、抗ＮＫＧＡ剤による処置前に癌のＨＬＡ−Ｅ状態を評価することができる。一実施形態では、ＨＬＡ−Ｅ＋ＨＮＳＣＣを有する患者を同定するためのＨＬＡ−Ｅ検出ステップを結合する方法が提供され、これらの患者は、その後、ＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する薬剤によって処置され得る。
【００２２】
１つの態様では、ＨＮＳＣＣを有する個人がヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物による処置に適しているかどうかを評価する方法が提供されており、本方法は、ＨＮＳＣＣを有する個人からの悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップを含み、悪性細胞においてＨＬＡ−Ｅポリペプチドが発現した（例えば、基準レベルと比較して増大したレベルで、健常者からの関連組織におけるレベルと比較して増大したレベルで、および／または（少なくとも）抗ＮＫＧ２Ａ剤から利益を得る患者のレベルに相当するレベルで顕著に発現した）という決定は、このような個人がヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物による処置に適していることを示す。
【００２３】
本明細書中の治療的使用またはＨＮＳＣＣ処置もしくは予防方法のいずれかの一実施形態では、個人のＨＮＳＣＣの処置または予防は、
ａ）ＨＮＳＣＣを有する個人からの悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップと、
ｂ）悪性細胞によってＨＬＡ−Ｅポリペプチドが発現される（例えば、少なくとも腫瘍細胞の値または割合、少なくとも中程度または強度の染色などで）と決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物をその個人に投与するステップと
を含む。
【００２４】
本明細書中の治療的使用またはＨＮＳＣＣ処置もしくは予防方法のいずれかの一実施形態では、個人のＨＮＳＣＣの処置または予防は、
ａ）ＨＮＳＣＣを有する個人における悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップと、
ｂ）悪性細胞が、基準レベルまたは基準レベルと比較して増大したレベル（例えば、健常者の基準レベルまたは抗ＮＫＧ２Ａ剤から利益を得ない個人の基準レベルと比較して増大したレベル；少なくとも抗ＮＫＧ２Ａ剤から利益を得る患者のレベルに相当する基準レベル）でＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現すると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物をその個人に投与するステップと
を含む。
【００２５】
本方法のいずれかの一実施形態では、ステップ（ａ）におけるＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態の決定は、生体サンプル中の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの発現レベルを決定し、そのレベルを、健常者または抗ＮＫＧ２Ａ剤から利益を得ない個人に相当する基準レベル（例えば、ＨＬＡ−Ｅ陽性悪性細胞の値、割合、および／または弱いもしくは不在の染色など）と比較することを含む。生体サンプルが、基準レベルと比較して増大したレベルでＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。
【００２６】
本方法のいずれかの一実施形態では、ステップ（ａ）におけるＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態の決定は、生体サンプル中の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの発現レベルを決定し、そのレベルを、基準レベル（例えば、ＨＬＡ−Ｅ陽性悪性細胞の値、割合、および／または中程度もしくは強度の細胞表面染色など）と比較することを含む。生体サンプルが、少なくとも基準レベルであるレベルでＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。
【００２７】
本方法のいずれかの一実施形態では、ステップ（ａ）におけるＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態の決定は、生体サンプル中の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの発現レベルを決定し、そのレベルを、抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置から利益を得る個人（例えば、癌、頭頸部癌を有する）に相当する基準レベル（例えば、ＨＬＡ−Ｅ陽性悪性細胞の値、割合、および／または中程度もしくは強度の細胞表面染色など）と比較することを含む。生体サンプルが、少なくとも抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置から利益を得る個人に相当する基準レベルに等しいレベルでＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。
【００２８】
任意の実施形態の１つの態様では、個人からの悪性細胞が中程度または強度のＨＬＡ−Ｅポリペプチド発現（例えば、免疫組織化学的検出アッセイにおける中程度または強度の染色）を有するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。任意の実施形態の１つの態様では、個人からの悪性細胞のかなりの割合（例えば、少なくとも約２５％、任意選択的に少なくとも５０％）がＨＬＡ−Ｅポリペプチド発現（例えば、免疫組織化学的検出アッセイにおける中程度または強度の染色）を有するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。任意の実施形態の１つの態様では、個人からの悪性細胞のかなりの割合（例えば、少なくとも約２５％、任意選択的に少なくとも５０％）がＨＬＡ−Ｅポリペプチド発現（例えば、免疫組織化学的検出アッセイにおける中程度または強度の染色）を有し、その個人の癌予後が悪い（例えば、転移性疾患、ＨＰＶ遺伝子型、侵攻性または進行性疾患）という決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。任意の実施形態の１つの態様では、個人からの悪性細胞が、ＨＬＡ−Ｅポリペプチド発現を有する細胞サブタイプ内の全細胞にわたって散在的に発現される強いシグナルによって明らかであるように高ＨＬＡ−Ｅ発現を有する（例えば、免疫組織化学的検出アッセイにおける強力な染色）という決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。
【００２９】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性である（例えば、患者におけるヒトパピローマウイルスの存在を特徴とし、高い癌リスクまたは悪い癌予後に関連するＨＰＶ遺伝子型に陽性、ＨＰＶ１６遺伝子型に陽性、および／またはＰ１６ＩＮＫａ発現に陽性である）患者において有利に使用することができる。一実施形態では、ＨＰＶ感染は、ＮＫおよび／またはＴ細胞上の活性化受容体によって認識されるリガンドの腫瘍細胞における発現の増大（例えば、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドの上方制御）、ならびに腫瘍細胞の表面におけるＨＬＡ−Ｅの発現の増大を引き起こし、従って、ＮＫＧ２Ａ遮断療法はＨＰＶ陽性の個人において特に効果的であろう。
【００３０】
一実施形態では、ＨＰＶ陽性である個人の癌を処置または予防する方法が提供され、本方法は、癌を有するＨＰＶ陽性の個人に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を治療的に活性な量で投与するステップを含む。一実施形態では、癌は固形腫瘍、例えば進行性固形腫瘍である。一実施形態では、癌は頭頸部癌である。
【００３１】
任意選択的に、個人のＨＰＶ状態は、抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置前に評価することができる。一実施形態では、頭頸部癌を有する個人を処置する方法が提供され、本方法は、
（ａ）頭頸部癌を有する個人がＨＰＶ陽性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）個人がＨＰＶ陽性であれば、治療的に活性な量の、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物によりその個人を処置する（例えば、その個人に投与する）ステップと
を含む。
【００３２】
一実施形態では、癌を有する個人を処置する方法（例えば、個人の癌の処置または予防のための、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物の使用）が提供され、本方法は、
ａ）個人が腫瘍環境中（例えば、腫瘍組織内および／または腫瘍隣接組織内）のリンパ球の存在を特徴とする腫瘍を有するかどうかを決定するステップと、
ｂ）個人が腫瘍環境中のリンパ球の存在を特徴とする腫瘍を有すると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物をその個人に投与するステップと
を含む。任意選択的に、腫瘍は固形腫瘍であり、任意選択的に、腫瘍は頭頸部癌である。
【００３３】
別の実施形態では、頭頸部癌を有する個人はＨＰＶ陰性である。一実施形態では、頭頸部癌を有するＨＰＶ陰性患者を処置する方法が提供され、本方法は、ＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物を個人に投与するステップを含む。
【００３４】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は単剤療法として投与される。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、１つまたは複数の他の抗癌剤との併用処置で投与される。
【００３５】
一実施形態では、個人の癌を処置または予防する方法が提供され、本方法は、（ａ）治療的に活性な量の、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドを阻害する化合物と、（ｂ）治療的に活性な量の、ヒトＥＧＦＲポリペプチドに結合および／またはそれを阻害する化合物とを個人に投与するステップを含む。一実施形態では、癌はＨＮＳＣＣである。一実施形態では、ヒトＥＧＦＲに結合および／またはそれを阻害する化合物は抗ＥＧＦＲ抗体である。
【００３６】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト患者（インビボ）においてヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの阻害活性の中和をもたらす有効量で投与され、任意選択的に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも２週間、任意選択的に少なくとも４週間、末梢血ＮＫおよびＴリンパ球上のＮＫＧ２Ａポリペプチドの飽和をもたらす用量で投与される。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト患者（インビボ）においてヒトＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞毒性を誘発する有効量で投与される。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト患者（インビボ）においてヒトＥＧＦＲの活性の中和をもたらす有効量で投与される。１つの態様では、併用は、特定の臨床投与レジメンに従って、特に、特定の投与量で特定の投薬スケジュールに従って（例えば、本明細書で提供される投与量で、および／または特定の投薬スケジュールに従って）投与される（または投与のためのものである）。
【００３７】
一実施形態では、個人の癌を処置または予防する方法が提供されており、本方法は、
ａ）癌を有する個人における悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップと、
ｂ）癌を有する個人における悪性細胞のＥＧＦＲポリペプチド状態を決定するステップと、
ｃ）ＨＬＡ−ＥおよびＥＧＦＲポリペプチドが、基準レベルと比較して増大したレベルで、個人からの悪性細胞の表面に発現されると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物と、ＥＧＦＲに結合および／またはそれを阻害する薬剤とを含む治療レジメンをその個人に施すステップと
を含む。
【００３８】
本明細書中の治療的使用またはＨＮＳＣＣ処置もしくは予防方法のいずれかの一実施形態では、個人のＨＮＳＣＣの処置または予防は、
ａ）ＨＮＳＣＣを有する個人における悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチド状態を決定するステップと、
ｂ）ＨＮＳＣＣを有する個人における悪性細胞のＥＧＦＲポリペプチド状態を決定するステップと、
ｃ）ＨＬＡ−ＥおよびＥＧＦＲポリペプチドが、基準レベルと比較して増大したレベルで、個人の悪性細胞の表面に発現されると決定されたときに、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物と、ＥＧＦＲに結合および／またはそれを阻害する薬剤とを含む治療レジメンをその個人に施すステップと
を含む。
【００３９】
本明細書中の方法のいずれかにおいて、ポリペプチド状態または発現（例えば、ＨＬＡ−Ｅ、ＮＫＧ２ＡまたはＥＧＦＲ）の決定は、直接的（ポリペプチドを検出することによる）または間接的（例えば、ポリペプチドをコードする核酸を検出することによる）に実行することができる。
【００４０】
ＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物（抗ＮＫＧ２Ａ剤）は、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫおよび／またはＴ細胞がＨＬＡ−Ｅ発現細胞の死滅を引き起こす能力を増大させる化合物である。任意選択的に、ＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物は、ＮＫＧ２Ａポリペプチドに結合するポリペプチド、任意選択的に抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００４１】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、そのリガンドＨＬＡ−Ｅの結合を遮断することによってＮＫＧ２Ａの阻害活性を低下させる。すなわち、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、ＨＬＡ−ＥによるＮＫＧ２Ａの結合を妨害する。配列番号２〜６のいずれか１つの重鎖および配列番号７の軽鎖をそれぞれ有する抗体は、このような抗体の一例である。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、そのリガンドＨＬＡ−Ｅの結合を遮断することなくことなくＮＫＧ２Ａの阻害活性を低下させる。すなわち、抗ＮＫＧ２Ａ剤は非競合的なアンタゴニストであり、ＨＬＡ−ＥによるＮＫＧ２Ａの結合を妨害しない。それぞれ配列番号１６および１７の重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体は、このような抗体の一例である。
【００４２】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、ＮＫＧ２Ａに対して、１つまたは複数の活性化ＮＫＧ２受容体に対するよりも著しく高い親和性で結合する抗体である。例えば、一実施形態では、薬剤は、ＮＫＧ２Ａに対して、ＮＫＧ２Ｃに対するよりも著しく高い親和性で結合する抗体である。付加的または代替的な実施形態では、薬剤は、ＮＫＧ２Ａに対して、ＮＫＧ２Ｅに対するよりも著しく高い親和性で結合する抗体である。付加的または代替的な実施形態では、薬剤は、ＮＫＧ２Ａに対して、ＮＫＧ２Ｈに対するよりも著しく高い親和性で結合する抗体である。配列番号２〜６のいずれか１つの重鎖および配列番号７の軽鎖をそれぞれ有する抗体は、実質的にＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＮＫＧ２Ｈに結合することなくＮＫＧ２Ａに結合する。
【００４３】
付加的または代替的な実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対する結合において、配列番号２〜６のいずれか１つの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体、ならびに／またはそれぞれ配列番号１６および１７の重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体と競合する。薬剤は、例えば、ヒトまたはヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体であり得る。
【００４４】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６のいずれか１つの重鎖および配列番号７の軽鎖を有するヒト化抗体である。改善された特性（例えば、より低い免疫原性、改善された抗原結合性または他の機能特性など）および／または改善された物理化学的特性（例えば、より良好な安定性など）を有するこのようなヒト化抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸置換のための例示的な相補性決定領域（ＣＤＲ）残基もしくは配列および／または部位が提供される。
【００４５】
他の実施形態では、医薬組成物およびキットならびにこれらを使用する方法が提供される。
【００４６】
これらの態様は、本明細書で提供される本発明の説明においてより詳細に記載されており、付加的な態様、特徴、および利点は、本明細書で提供される本発明の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】抗ＮＫＧ２ＡがＮＫ細胞によるＨＮＳＣＣ細胞株の認識を増強する能力を示す。表示される標的ＨＮＳＣＣ細胞株の存在下で、１０μｇ／ｍＬの飽和用量の抗ＮＫＧ２Ａの存在下または非存在下、ＮＫＧ２Ａ−ＮＫ（左側）またはＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞（右側）におけるＣＤ１０７（上側）およびＣＤ１３７（下側）ＦＡＣＳの読取りが示される。細胞株は、ＨＬＡ−Ｅ表面発現のレベルに従って左側から右側へ順序付けされる。各ドットは、健常志願者からのＰＢＭＣを表す。図１Ａは、対照および表面ＨＬＡ−Ｅレベルが低いまたは高いＫ５６２標的を示し、図１Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａが、内在性ＨＬＡ−Ｅ発現を有するＨＮＳＣＣの溶解を回復可能であることを証明する。この効果はＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞のみで見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに依存する。
【図１Ｂ】同上。
【図２】飽和用量の抗ＮＫＧ２Ａが、準最適用量の抗ＥＧＦＲ、セツキシマブ（ｃｔｘ）によって誘導されるＮＫ細胞によるＨＮＳＣＣ  ＦａＤｕ細胞に対するＡＤＣＣを増強したことを示す。
【図３Ａ】漸増用量の抗ＮＫＧ２Ａおよび漸増用量の抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）の効果を示す。図３Ａは、標的を用いない、およびＫ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスフェクタントを用いた対照において読み取られたＣＤ１０７を示す。各健常志願者は、異なる基号（円形の正方形）によって表される。十字の付いた白い記号は、０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共に同時インキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって抗ＮＫＧ２Ａが置換された状態に対応する。図３Ｂは、ＨＮＳＣＣ細胞株において読み取られたＣＤ１０７を示す。各濃度のセツキシマブについて、各濃度の抗ＮＫＧ２Ａの記号（正方形または円形）は、左側から右側へ０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌに対応する。
【図３Ｂ】同上。
【図４】種々の腫瘍部位／型の頭頸部扁平上皮癌における１＋〜３＋の範囲のＨＬＡ−Ｅ染色を示す。興味深いことに、最悪の予後を有することが一般に認識されている腫瘍型（扁桃腺）からの全てのサンプルにおいて染色は３＋であった。
【図５】種々の腫瘍の患者のＨＰＶ１６およびＰ１６状態についての詳細を示す。
【図６】腫瘍型（転移性または原発性腫瘍）をＨＰＶ１６およびＰ１６ＩＮＫＡの関数として示す。
【図７】ＨＰＶ陽性腫瘍が強力なリンパ球浸潤により特徴付けられたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、単語「含む」と共に使用されると、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は少なくとも第２のまたはそれを超えるものを意味し得る。
【００４９】
「含む」が使用される場合、これは、任意選択的に「から本質的になる」または「からなる」によって置き換えることができる。
【００５０】
ＮＫＧ２Ａ（ＯＭＩＭ１６１５５５、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される）は、転写物のＮＫＧ２グループのメンバーである（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７−１０２０）。ＮＫＧ２Ａは２５ｋｂに及ぶ７つのエクソンによってコードされ、いくらかの差別的スプライシングを示す。ＣＤ９４と一緒に、ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ細胞、α／βＴ細胞、γ／δＴ細胞、およびＮＫＴ細胞のサブセットの表面において見出されるヘテロ二量体の阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを形成する。阻害性ＫＩＲ受容体と同様に、それは、その細胞質ドメインにＩＴＩＭを有する。本明細書で使用される場合、「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子またはコード化タンパク質の任意の変異体、誘導体、またはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＮＫＧ２Ａと１つまたは複数の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有するあらゆる核酸またはタンパク質配列が包含される。ヒトＮＫＧ２Ａは、以下の配列：
【化１】
2017537069.tif 000003
の２３３のアミノ酸を３つのドメインに含み、細胞質ドメインが残基１〜７０を含み、膜貫通領域が残基７１〜９３を含み、細胞外領域が残基９４〜２３３を含む。
【００５１】
ＮＫＧ２Ｃ（ＯＭＩＭ６０２８９１、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される）およびＮＫＧ２Ｅ（ＯＭＩＭ６０２８９２、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される）は、転写物のＮＫＧ２グループの２つの他のメンバーである（Ｇｉｌｅｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：１６３−１７３）。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ受容体は、ＮＫ細胞およびＴ細胞などのリンパ球のサブセットの表面において見出される活性化受容体である。
【００５２】
ＨＬＡ−Ｅ（ＯＭＩＭ１４３０１０、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される）は、細胞表面で発現され、例えば、他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナル配列に由来する断片などのペプチドの結合によって制御される非古典的なＭＨＣ分子である。ＨＬＡ−Ｅの可溶性型も同定されている。そのＴ細胞受容体結合特性に加えて、ＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに特異的に結合することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）およびＴ細胞（α／βおよびγ／δ）のサブセットに結合する（例えば、その開示全体が参照によって本明細書中に援用されるＢｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７９５−７９９を参照）。ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ、Ｔ、またはＮＫＴ細胞クローンによる溶解から標的細胞を保護する。本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ−Ｅ」は、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子またはコード化タンパク質の任意の変異体、誘導体、またはアイソフォームを指す。また、野生型、全長ＨＬＡ−Ｅと１つまたは複数の生物学的特性または機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有するあらゆる核酸またはタンパク質配列が包含される。
【００５３】
本開示との関連において、「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」は、細胞表面においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するリンパ球系（例えば、ＮＫ−、ＮＫＴ−およびＴ細胞）の細胞を指し、これは、例えば、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ上の複合エピトープ、またはおよびＮＫＧ２Ａ単独上のエピトープを特異的に認識する抗体を用いるフローサイトメトリーによって検出することができる。また「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」は、リンパ球由来の不死細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ−９２）も含む。
【００５４】
本開示との関連において、「ＮＫＧ２Ａの阻害活性を低下させる」、「ＮＫＧ２Ａを中和する」または「ＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する」は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａが細胞内プロセスに悪影響を与えるその能力において阻害され、サイトカイン放出および細胞毒性応答などのリンパ球応答をもたらすプロセスを指す。これは、例えば、ＮＫ−またはＴ細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定することができ、このアッセイでは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球によるＨＬＡ−Ｅ陽性細胞の死滅を刺激する治療用化合物の能力が測定される。一実施形態では、抗体調製物は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞毒性の少なくとも１０％の増強、好ましくはリンパ球細胞毒性の少なくとも４０％または５０％の増強、またはより好ましくはＮＫ細胞毒性の少なくとも７０％の増強を引き起し、記載される細胞毒性アッセイが参照される。抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ−Ｅとの相互作用を低減または遮断すれば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞毒性が増大され得る。これは例えば、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞、およびＨＬＡ−Ｅを発現する標的細胞を用いて、標準的な４時間インビトロ細胞毒性アッセイにおいて評価することができる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ−Ｅを認識して、リンパ球媒介性の細胞溶解を防止する阻害性シグナル伝達の開始および伝播をもたらすため、このようなＮＫ細胞は、ＨＬＡ−Ｅを発現する標的を効率的に死滅させない。このようなインビトロ細胞毒性アッセイは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）に記載されるように、当該技術分野において周知の標準的な方法によって実行することができる。また、抗体がリンパ球を刺激してＰ８１５、Ｋ５６２細胞、または適切な腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させる能力を評価するためのクロム放出および／または他のパラメータは、Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９−１１３６；Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８７：２０６５−２０７２；Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８８：９５３−９６０；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．２００１；８：１１３１−１１３５；Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１９０：１５０５−１５１６（これらのそれぞれの開示全体は、参照によって本明細書中に援用される）に開示されている。標的細胞はＮＫ細胞の添加前に５１Ｃｒによって標識化され、次に、死滅の結果としての細胞から培地への５１Ｃｒの放出に比例するように死滅が推定される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ−Ｅへ結合するのを防止する抗体を添加すると、結果的に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａによる阻害性シグナル伝達の開始および伝播が防止される。従って、このような薬剤の添加の結果、リンパ球媒介性の標的細胞の死滅が増大される。このステップは、これにより、ＣＤ９４／���ＫＧ２Ａに誘導される負のシグナル伝達を、例えばリガンド結合の遮断によって防止する薬剤を同定する。特定の５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫエフェクター細胞はＨＬＡ−Ｅ陰性ＬＣＬ７２１．２２１標的細胞を死滅させることができるが、ＨＬＡ−Ｅ発現ＬＣＬ７２１．２２１−Ｃｗ３対照細胞についてはあまり死滅させない。対照的に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを欠いているＹＴＳエフェクター細胞は、両方の細胞株を効率的に死滅させる。従って、ＮＫエフェクター細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡによるＨＬＡ−Ｅ誘導性阻害性シグナル伝達のために、ＨＬＡ−Ｅ＋ＬＣＬ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞をあまり効率的に死滅させない。このような５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイにおいて、ＮＫ細胞が本発明に従う遮断性の抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体と共にプレインキュベートされる場合、ＨＬＡ−Ｅ発現ＬＣＬ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞は、抗体濃度に依存した方式でより効率的に死滅される。また抗ＮＫＧ２Ａ抗体の阻害活性（すなわち、細胞毒性増強能）は、いくつかの他の方法のいずれかにおいて、例えば、例えばＳｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９−１１３６（その開示は参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、細胞内遊離カルシウムに対するその効果によって評価することもできる。ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化は、例えば、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ産生）または細胞毒性マーカー（例えば、ＣＤ１０７またはＣＤ１３７動員）の増大を測定することによって評価することができる。例示的なプロトコルでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−ｙの産生は、培養下で４日後に、細胞表面および細胞質内染色ならびにフローサイトメトリーによる分析によって評価される。簡単に言うと、ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が、培養の最後の４時間に５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加される。次に、細胞は、透過処理（ＩｎｔｒａＰｒｅｐ（商標）；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＰＥ−抗ＩＦＮ−ｙまたはＰＥ−ＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による染色前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂと共にインキュベートされる。ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ｙの産生は、ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、ＩＦＮ−ｙ：ＯｐｔＥｌＡ  ｓｅｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて上清において測定される。
【００５５】
本明細書全体において、「ＨＮＳＣＣの処置」または同様のものが抗ＮＫＧ２Ａ結合剤（例えば、抗体）と関連して言及される場合は常に以下のことが意味される：（ａ）ＨＮＳＣＣを処置する方法であり、前記方法は、抗ＮＫＧ２Ａ結合剤（好ましくは、薬学的に許容可能な担体材料中）を、ＨＮＳＣＣの処置を可能にする用量（治療的に有効な量）、好ましくは本明細書で指定される用量（量）で、このような処置を必要としている個人、哺乳類、特にヒトに投与する（少なくとも１つの処置のために）ステップを含む；（ｂ）ＨＮＳＣＣの処置のための抗ＮＫＧ２Ａ結合剤の使用、または前記処置（特に、ヒトにおける）で使用するための抗ＮＫＧ２Ａ結合剤；（ｃ）ＨＮＳＣＣの処置のための医薬品を製造するための抗ＮＫＧ２Ａ結合剤の使用、抗ＮＫＧ２Ａ結合剤を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、ＨＮＳＣＣの処置のための医薬品を製造するための抗ＮＫＧ２Ａ結合剤を使用する方法、またはＨＮＳＣＣの処置のために適切な有効用量の抗ＮＫＧ２Ａ結合剤を含む医薬品；あるいは（ｄ）本出願が提出された国において特許が認められる主題に従うａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組み合わせ。
【００５６】
「生検」という用語は、本明細書で使用される場合、診断の確立などの検査の目的で組織を除去することと定義される。生検のタイプの例としては、例えばシリンジに取り付けられた針を介した吸引の適用によるもの；組織の断片の機器による除去によるもの；内視鏡を介する適切な機器を用いた除去によるもの；外科的切除、例えば病変全体の外科的切除によるものなどが挙げられる。
【００５７】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖内の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはアイソタイプにさらに分類される。例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。各四量体は２つの同一のペアのポリペプチド鎖で構成され、各ペアは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況下で最も一般的な抗体であり、研究室環境で最も容易に作製されるため、本明細書で使用される抗体の例示的な種類である。任意選択的に、抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト、または別の方法でヒトに適した抗体である。また「抗体」は、抗体のいずれかの任意の断片または誘導体も含む。
【００５８】
「特異的に結合する」という用語は、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、または単離した標的細胞の表面に存在する天然タンパク質のいずれかを用いて評価されるときに、抗体が、好ましくは、競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＮＫＧ２Ａに結合できることを意味する。特異的な結合を決定するための競合的結合アッセイおよび他の方法は当該技術分野において周知である。例えば、結合は、放射標識、質量分析などの物理的方法、または例えば細胞蛍光測定分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を用いて検出される直接もしくは間接的な蛍光標識によって検出することができる。対照の非特異的な薬剤で見られる量を超える結合は、その薬剤が標的に結合することを示す。ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する薬剤は、単独のＮＫＧ２Ａ、またはＣＤ９４との二量体としてのＮＫＧ２Ａに結合し得る。
【００５９】
抗体が特定のモノクローナル抗体「と競合する」と言われる場合、それは、組換え分子（例えば、ＮＫＧ２Ａ）または表面発現分子（例えば、ＮＫＧ２Ａ）のいずれかを用いる結合アッセイにおいて、抗体がモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、配列番号２のいずれかの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体の、ＮＫＧ２ＡポリペプチドまたはＮＫＧ２Ａ発現細胞に対する結合を低減すると、抗体は、このような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００６０】
「親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、エピトープに対する抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄによって与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定する方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）において見出すことができ、これらの参考文献は、参照によって本明細書中に完全に援用される。ｍＡｂの親和性を測定するための当該技術分野において周知の１つの標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置を用いた分析によるものなど）の使用である。
【００６１】
本明細書に関連して、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用または結合の部位を指定する。
【００６２】
「エピトープ」という用語は抗原決定基を指し、抗体が結合する抗原上の区域または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、特異的抗原結合抗体またはペプチドにより効果的に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基とを含み得る。それは、例えば、抗体または受容体と結合し得る複雑な抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造領域である。エピトープは、直線的または立体構造的／構造的であり得る。「直線的エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖配列（一次構造）上で連続するアミノ酸残基で構成されるエピトープとして定義される。「立体構造的または構造的エピトープ」という用語は、全てが連続しているわけではなく、従って、分子の折り畳み（二次、三次および／または四次構造）により互いに近接されるアミノ酸の直鎖配列の分離部を表すアミノ酸残基で構成されるエピトープとして定義される。立体構造的エピトープは、三次元構造に依存する。「立体構造的」という用語は、従って、「構造的」と互換的に使用されることが多い。
【００６３】
「薬剤」という用語は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的材料から作製される抽出物を示すために使用される。「治療薬」という用語は、生物活性を有する薬剤を指す。
【００６４】
本明細書中の目的のために、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合された抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を保持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。このような抗体は、抗原負荷に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作された」トランスジェニックマウスまたは他の動物から得ることができる（例えば、その教示全体が参照によって本明細書中に援用される、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９を参照）。また完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法、およびファージディスプレイ技術によって構築することができ、これらは全て、当該技術分野において知られている（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３を参照）。またヒト抗体は、インビトロの活性化Ｂ細胞により生成することもできる（例えば、参照によってその全体が援用される米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書を参照）。
【００６５】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域またはその一部が改変、置換または交換された抗体分子であるか、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変領域によって改変、置換または交換された抗体分子である。
【００６６】
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣ末端断片、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、εおよびμ）におけるその対応物の配列、またはその天然に存在するアロタイプを指す。他に規定されない限り、本開示の全体を通して免疫グロブリンに対して一般的に容認されたＫａｂａｔのアミノ酸番号付けが使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）。
【００６７】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、材料がその天然の状態で見出される際に通常付随される成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均質性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は実質的に精製される。
【００６８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーと、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーとに適用される。
【００６９】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態において見出されない遺伝子を発現する、あるいは改変されていなければ異常発現される、低発現される、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００７０】
本明細書に関連して、ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体という用語は、特異性および／または親和性により前記決定基に結合する抗体を示す。
【００７１】
「同一性」または「同一性の」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間のマッチの数によって決定されるようなポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（もしあれば）による２つ以上の配列の小さい方の間での同一のマッチのパーセントを測る。関連ポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。このような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
同一性を決定する方法は、試験される配列間の最大マッチを与えるように設計される。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載される。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
【００７３】
抗体の作製
抗ＮＫＧ２Ａ剤はヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の細胞外部分に結合し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面で発現されるヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の阻害活性を低下させる。一実施形態では、薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合において、ＨＬＡ−Ｅと競合する。すなわち、薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとそのリガンドＨＬＡ−Ｅとの間の相互作用を遮断する。別の実施形態では、薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合において、ＨＬＡ−Ｅと競合しない。すなわち、薬剤は、ＨＬＡ−Ｅと同時にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合することができる。抗体は、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ上の複合エピトープ、またはおよびＮＫＧ２Ａ単独上のエピトープに結合し得る。一実施形態では、抗体は、ＨＬＡ−Ｅ結合部位と少なくとも部分的に重複するＮＫＧ２Ａ上のエピトープに結合する。
【００７４】
１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体から選択される抗体である。１つの態様では、薬剤は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体に由来する定常ドメインを含む。１つの態様では、薬剤は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体から選択される抗体の断片である。１つの態様では、薬剤は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、単一ドメインＦＶ、および単鎖抗体断片から選択される抗体断片である。１つの態様では、薬剤は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、カッパボディ（ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）、ＩｇＮＡＲ；および多特異性抗体から選択される合成または半合成抗体由来の分子である。
【００７５】
好ましくは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、Ｆｃγ受容体、例えばＣＤ１６に対する実質的な特異的結合を実証しない。このような抗体は、Ｆｃ受容体に結合しないことが知られている種々の重鎖の定常領域を含み得る。１つのこのような例は、ＩｇＧ４定常領域である。ＩｇＧ４あるいは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片などの定常領域を含まない抗体断片を使用して、Ｆｃ受容体結合を回避することができる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおいて抗体のＦｃ受容体タンパク質への結合を試験することを含む、当該技術分野において知られている方法に従って評価することができる。また、Ｆｃ受容体への結合を最小限または除去するようにＦｃ部分が修飾された任意のヒト抗体タイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を使用することもできる（例えば、参照によってその開示が本明細書中に援用される国際公開第０３１０１４８５号パンフレットを参照）。Ｆｃ受容体結合を評価するためのアッセイ、例えば細胞ベースのアッセイなどは当該技術分野において周知であり、例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【００７６】
従って、本開示は、ＮＫＧ２Ａに結合する抗体または他の薬剤に関する。１つの態様では、抗体は、ヒトＮＫＧ２Ｃおよび／またはＮＫＧ２Ｅに対するよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａに結合する。
【００７７】
本開示の１つの態様では、薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を妨害することによって、例えば、ＮＫＧ２ＡによるＨＬＡ−Ｅの結合を妨害すること、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の立体構造変化を防止または誘導すること、および／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の二量体化および／またはクラスター化に影響することによって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現リンパ球のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性の阻害を低減する。
【００７８】
本開示の１つの態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃに対するよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。さらに好ましい態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃに対するよりも少なくとも１５０、２００、３００、４００、または１０，０００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。本開示の別の態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅおよび／またはＮＫＧ２Ｈ分子に対するよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。さらに好ましい態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｃおよび／またはＮＫＧ２Ｈ分子に対するよりも少なくとも１５０、２００、３００、４００、または１０，０００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。これは、例えばＢｉａＣｏｒｅ実験において測定することができ、固定化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製されるか、または生物系で産生される）の細胞外部分に結合する薬剤の能力が測定され、同じアッセイにおいて同様に生成されたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃおよび／または他のＣＤ９４／ＮＫＧ２変異体に対する薬剤の結合と比較される。あるいは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを天然に発現するか、または過剰発現（例えば、一過性または安定したトランスフェクション後）する細胞への薬剤の結合が測定され、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃおよび／または他のＣＤ９４／ＮＫＧ２変異体を発現する細胞の結合と比較され得る。抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、任意選択的に、ＣＤ９４と一緒に阻害性受容体を形成するＮＫＧ２Ａスプライス変異体であるＮＫＧ２Ｂと結合してもよい。一実施形態では、親和性は、例えば、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（その開示は、参照によって本明細書中に援用される）の実施例８に示されるようにＢｉａｃｏｒｅによって共有結合で固定化されたＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−Ｆｃ融合タンパク質への結合を評価することにより、米国特許第８，２０６，７０９号明細書に開示される方法を用いて測定することができる。
【００７９】
抗体は、例えば、ＮＫＧ２Ａ発現細胞への結合（高親和性）について、０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ、任意選択的に１〜５ｎｇ／ｍｌ、任意選択的に１〜１０ｎｇ／ｍｌ、任意選択的に１〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有することができる。ＮＫＧ２Ａ発現細胞は、例えば、ヒトＰＢＭＣ中のＮＫＧ２Ａ発現細胞であり得る。一実施形態では、ＮＫＧ２Ａ発現細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するように作製された細胞、例えば、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（その開示は参照によって援用される）の実施例１３に示されるような、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを安定して過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞である。一実施形態では、抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに対して１０−９Ｍ未満、任意選択的に１０−１０Ｍ未満、または任意選択的に１０−１１Ｍ未満、任意選択的に１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍ、任意選択的に１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有し、任意選択的に、結合親和性は二価である。親和性は、例えば、米国特許第７，９３２，０５５号明細書（その開示は参照によって援用される）に記載されるような単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃ構築物への結合について評価することができる。
【００８０】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、以下の表に示される抗体のそれぞれのＶＨおよびＶＬ領域を含むヒトまたはヒト化抗体であり得る。
【００８１】
【表１】
2017537069.tif 000004
【００８２】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、例えばＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１、ＶＨ１＿ｆ、およびＶＨ１＿４６から選択されるヒトアクセプター配列からのＶＨヒトアクセプターフレームワークと、ＪＨ６  Ｊ−セグメント、または当該技術分野で知られている他のヒト生殖系ＶＨフレームワーク配列とを含むヒトまたはヒト化抗体であり得る。ＶＬ領域ヒトアクセプター配列は、例えばＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４であり得る。
【００８３】
一実施形態では、抗体は、抗体Ｚ２７０に基づくヒト化抗体である。種々のヒト化Ｚ２７０ＶＨ鎖は配列番号２〜６（可変領域ドメインアミノ酸に下線）で示される。ヒト化Ｚ２７０ＶＨ軽鎖は、配列番号７に示される。またｈｕｍＺ２７０抗体は、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（その開示は参照によって本明細書中に援用される）にも開示される。ｈｕｍＺ２７０ＶＨ６（配列番号３）はＶＨ５＿５１に基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１（配列番号２）はＶＨ１＿１８に基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ５（配列番号４）はＶＨ５＿ａに基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ７（配列番号５）はＶＨ１＿ｆに基づき、かつｈｕｍＺ２７０ＶＨ８（配列番号６）はＶＨ１＿４６に基づいており、これらは全てＪＨ６  Ｊ−セグメントを有する。これらの抗体はそれぞれＮＫＧ２Ａへの高親和性結合を保持しており、ヒト化構築物のそれぞれのＫａｂａｔ  ＣＤＲ−Ｈ２の６つのＣ末端アミノ酸残基がヒトアクセプターフレームワークと同一であるため、抗体に対する宿主免疫応答の可能性が低い。アライメントプログラムＶｅｃｔｏｒＮＴＩを用いて、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１とｈｕｍＺ２７０ＶＨ５、−６、−７、および−８との間の以下の配列同一性を得た：７８，２％（ＶＨ１対ＶＨ５）、７９，０％（ＶＨ１対ＶＨ６）、８８，７％（ＶＨ１対ＶＨ７）、および９６，０％（ＶＨ１対ＶＨ８）。
【００８４】
１つの態様では、薬剤は、（ｉ）配列番号２〜６のいずれか、またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号７、またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む。１つの態様では、薬剤は、（ｉ）配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。配列番号２〜６のいずれかの配列を含む重鎖と、配列番号７の配列を含む軽鎖とを有する抗体はＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和するが、実質的に活性化受容体ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧＥまたはＮＫＧ２Ｈに結合しない。さらに、この抗体は、細胞表面のＮＫＧ２Ａへの結合についてＨＬＡ−Ｅと競合する。１つの態様では、薬剤は、配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列を有する重鎖に由来するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３配列を含む。本発明の１つの態様では、薬剤は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖に由来するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列を含む。
【００８５】
重鎖（可変領域に下線）
【化２】
2017537069.tif 000005
【化３】
2017537069.tif 000006
【００８６】
１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６のいずれかの残基３１〜３５（アミノ酸配列ＳＹＷＭＮ（配列番号８））に対応するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６０（アミノ酸配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹ（配列番号９））（任意選択的に、ヒト由来の６つの末端アミノ酸を含む場合には残基５０〜６６、すなわちＶＨ６重鎖の配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１０）、ＶＨ１重鎖の配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号１１）など）に対応するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２〜６のいずれかの残基９９〜１１４（Ｋａｂａｔに従うと９５〜１０２）（アミノ酸配列ＧＧＹＤＦＤＶＧＴＬＹＷＦＦＤＶ（配列番号１２））に対応するＣＤＲ−Ｈ３とを含む抗体である。一実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６６に対応する。任意選択的に、ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
【００８７】
１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号７の残基２４〜３４（アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３））に対応するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号７の残基５０〜５６（アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１４））に対応するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号７の残基８９〜９７（アミノ酸配列ＱＨＨＹＧＴＰＲＴ（配列番号１５））に対応するＣＤＲ−Ｌ３とを含む抗体である。任意選択的に、ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
【００８８】
１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６のいずれかの残基３１〜３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６０（任意選択的に、５０〜６６）に対応するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２〜６のいずれかの残基９９〜１１４（Ｋａｂａｔに従うと９５〜１０２）に対応するＣＤＲ−Ｈ３と、配列番号７の残基２４〜３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号７の残基５０〜５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号７の残基８９〜９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３とを含む抗体である。
【００８９】
１つの態様では、薬剤は、上記の抗体のいずれかが結合するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａエピトープに対して産生された完全ヒト抗体である。
【００９０】
上記の抗体を使用可能であるが、他の抗体も作製され得ることは理解されるであろう。例えば、ＮＫＧ２Ａ、好ましくは（しかし、排他的ではない）ヒトＮＫＧ２Ａの任意の断片またはＮＫＧ２Ａ断片の任意の組み合わせを免疫原として使用して、抗体を産生させることができ、抗体は、本明細書に記載されるようにＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞においてそのようにできる限り、ＮＫＧ２Ａポリペプチド内の任意の位置のエピトープを認識することができる。最も好ましくは、エピトープは、配列番号２〜６のいずれかの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体によって特異的に認識されるエピトープである。
【００９１】
１つの態様では、薬剤は、配列番号１６のアミノ酸配列をするＶＨに由来するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３配列を含む。本開示の１つの態様では、薬剤は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬに由来するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列を含む。１つの態様では、薬剤は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨに由来するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３配列と、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬに由来するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列とを含む。配列番号１６の重鎖および配列番号１７の軽鎖を有する抗体はＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和し、活性化受容体ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧＥまたはＮＫＧ２Ｈにも結合する。抗体は、細胞表面のＮＫＧ２Ａへの結合に対してＨＬＡ−Ｅと競合しない（すなわち、ＮＫＧ２Ａの非競合的アンタゴニストである）。
【化４】
2017537069.tif 000007
【００９２】
１つの態様では、薬剤は、可変重（ＶＨ）ドメイン（配列番号１６）のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６０、６２、６４、６６、および９９〜１０８と、可変軽（ＶＬ）ドメイン（配列番号１７）のアミノ酸残基２４〜３３、４９〜５５、および８８〜９６とを含み、任意選択的に、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるアミノ酸置換を有する。
【００９３】
１つの態様では、薬剤は、上記の抗体のいずれかが結合するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａエピトープに対して産生された完全ヒト抗体である。
【００９４】
上記の抗体を使用可能であるが、抗体がＮＫＧ２Ａの阻害活性の中和を引き起す限り、他の抗体もＮＫＧ２Ａポリペプチドの任意の部分を認識して、それに対して産生され得ることは理解されるであろう。例えば、ＮＫＧ２Ａ、好ましくは（しかし、排他的ではない）ヒトＮＫＧ２Ａの任意の断片またはＮＫＧ２Ａ断片の任意の組み合わせを免疫原として使用して、抗体を産生させることができ、抗体は、本明細書に記載されるようにＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞においてそのようにできる限り、ＮＫＧ２Ａポリペプチド内の任意の位置のエピトープを認識することができる。一実施形態では、エピトープは、配列番号２〜６のいずれかの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体によって特異的に認識されるエピトープである。
【００９５】
１つの態様では、薬剤は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の細胞外部分への結合において、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（その開示は参照によって本明細書中に援用される）に開示されるｈｕｍＺ２７０抗体と競合する。１つの態様では、薬剤は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の細胞外部分への結合において、米国特許第８，７９６，４２７号明細書（その開示は参照によって本明細書中に援用される）に開示されるヒト化Ｚ１９９抗体と競合する。競合的結合は、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ実験において測定することができ、ｈｕｍＺ２７０で飽和された固定化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体（例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製される、または生物系で産生される）の細胞外部分に結合するための薬剤の能力が測定される。あるいは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体を天然に発現するか、または過剰発現（例えば、一過性または安定したトランスフェクション後）する細胞（これは、飽和用量のＺ２７０と共にインキュベートされている）への薬剤の結合が測定される。一実施形態では、競合的結合は、例えば、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（その開示は、参照によって本明細書中に援用される）の実施例１５に示されるようにフローサイトメトリーによってＢａ／Ｆ３−ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ細胞への結合を評価することにより、米国特許第８，２０６，７０９号明細書に開示される方法を用いて測定することができる。
【００９６】
抗体製剤
抗ＮＫＧ２Ａ剤（例えば、抗体など）は、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬製剤中に取り込むことができ、ここで、前記製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤をさらに含み得る。一実施形態では、医薬製剤は水性製剤、すなわち水を含む製剤である。このような製剤は、通常、溶液または懸濁液である。さらなる実施形態では、医薬製剤は水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤であると定義される。同様に、「水溶液」という用語は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液であると定義され、「水性懸濁液」という用語は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液であると定義される。
【００９７】
別の実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、使用前に医師または患者によって溶媒および／または希釈剤が添加される。
【００９８】
別の実施形態では、医薬製剤は、事前に溶解することなく直ちに使用可能な乾燥製剤（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）である。
【００９９】
さらなる態様では、医薬製剤はこのような抗体および緩衝剤の水溶液を含み、ここで、抗体は１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在し、前記製剤は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【０１００】
別の実施形態では、製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、および約５．５〜約７．５からなるリストから選択される範囲内である。
【０１０１】
さらなる実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝剤のそれぞれは、代替実施形態を構成する。
【０１０２】
さらなる実施形態では、製剤は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤はキレート剤も含む。さらなる実施形態では、製剤は安定剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が参照される。
【０１０３】
ペプチド医薬製剤中に他の成分が存在することも可能である。このような付加的な成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、浸透圧調整剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）が含まれ得る。このような付加的な成分は、当然ながら、医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を与えてはならない。
【０１０４】
抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば、局所部位（例えば、皮膚および粘膜部位）、吸収を迂回する部位（例えば、動脈内、静脈内、心臓内の投与）、および吸収を伴う部位（例えば、皮膚内、皮膚下、筋肉内または腹部内の投与）において、このような処置を必要としている患者に投与され得る。医薬組成物の投与は、このような処置を必要としている患者に対して、いくつかの投与経路、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌側、舌下、頬側、口内、経口、胃および腸内、経鼻、肺（例えば、細気管支および肺胞またはその全体を通して）、上皮性、真皮、経皮、膣内、直腸、眼球（例えば、結膜を通して）、尿管、および非経口によるものであり得る。
【０１０５】
また適切な抗体製剤は、その他の既に開発された治療用モノクローナル抗体による経験を検討することにより決定することができる。Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍおよび同様の製剤などの臨床的状況において効果があることが示されているいくつかのモノクローナル抗体は、本開示の抗体と共に使用され得る。例えば、モノクローナル抗体は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および注射用滅菌水中でのＩＶ投与のために処方された、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）のいずれかの単回使用バイアル中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。ｐＨは６．５に調整される。別の実施形態では、抗体は、約２０ｍＭのクエン酸Ｎａ、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む約６．０のｐＨの製剤において供給される。
【０１０６】
悪性腫瘍の診断および処置
個人の頭頸部癌の診断、予後、監視、処置および予防において有用な方法が記載される。ＨＮＳＣＣは頭部または頸部領域に発生する扁平細胞または類基底腫瘍であり、鼻腔、副鼻腔、唇、口および口腔、唾液腺、咽頭または喉頭の腫瘍を含む。抗ＮＫＧ２Ａ剤は、例えば、中咽頭腫瘍、喉頭腫瘍、口腔腫瘍および下咽頭腫瘍の処置において特に有用であり得る。このような腫瘍は、医師、腫瘍内科医、組織病理学者および腫瘍臨床医などの腫瘍学の分野における実践者によって日常的に特定されている。またＨＮＳＣＣの処置は、その前癌病変の処置も含む。ＨＮＳＣＣの前癌病変は、例えば、異形成、過形成、白板症、紅板症、または毛舌を含み得る。
【０１０７】
ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物（例えば、抗体）は、癌細胞を除去するための手術を受けたことがないか、またはこのような手術を当期は受けていない、頭頸部癌を有する個人に投与することができる。しかしながら、癌細胞を除去するための手術を受けた患者または受けている患者にも化合物が投与され得ることは理解されるであろう。抗ＮＫＧ２Ａ化合物が、癌細胞を除去するため（例えば、ＨＮＳＣＣ細胞を除去するため）の外科的介入を受けていない個人に投与される場合、ＮＫＧ２Ａ結合化合物は、例えば、手術の約０〜３０日前に投与され得る。一実施形態では、手術前に少なくとも１回（例えば、１回、２回、３回、４回またはそれを超える）の、抗ＮＫＧ２Ａ化合物による処置の投与サイクルが施される。一実施形態では、投与サイクルは２週間〜８週間である。
【０１０８】
頭頸部癌を有する患者は、腫瘍細胞の表面におけるＨＬＡ−Ｅの発現を評価するための事前検出ステップの有無にかかわらず、抗ＮＫＧ２Ａ剤を用いて処置することができる。有利に、処置方法は、個人からの腫瘍（例えば、腫瘍細胞上）の生体サンプル中のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを検出するステップを含むことができる。生体サンプルがＨＬＡ−Ｅを発現する（例えば、基準と比較して、顕著に発現する；抗ＨＬＡ−Ｅ抗体による高レベル、高強度の染色でＨＬＡ−Ｅを発現する）という決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤による処置から強い利益を有し得る頭頸部癌を有することを示す。一実施形態では、本方法は、生体サンプル中のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドの発現レベルを決定し、そのレベルを、健常者またはＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤による処置から利益を受けない個人に対応する基準レベル（例えば、値、弱い細胞表面染色など）と比較することを含む。基準レベルと比較して増大したレベルで生体サンプルがＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを発現するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる頭頸部癌を有することを示す。任意選択的に、生体サンプル中のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの検出は、悪性ＨＮＳＣＣ細胞の表面で発現されるＨＬＡ−Ｅポリペプチドを検出することを含む。一実施形態では、生体サンプルがＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを顕著に発現するという決定は、患者が、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤で処置することができる頭頸部癌を有することを示す。「顕著に発現される」は、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドに関連する場合、所与の患者から採取された相当な数の腫瘍細胞においてＨＬＡ−Ｅポリペプチドが発現されることを意味する。「顕著に発現される」という用語の定義は正確な割合の値によって制約されないが、いくつかの例では、「顕著に発現される」と言われる受容体は、患者から採取されたＨＮＳＣＣ細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれを超えて存在するであろう。
【０１０９】
個人が、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現する頭頸部癌細胞を有するかどうかの決定は、例えば、頭頸部癌細胞を含む個人からの生体サンプルを入手（例えば、生検の実施により）し、前記細胞を、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドに結合する抗体と接触させ、かつ細胞がその表面上でＨＬＡ−Ｅを発現するかどうかを検出することを含み得る。任意選択的に、個人が、ＨＬＡ−Ｅを発現する頭頸部癌細胞を有するかどうかの決定は、免疫組織化学アッセイを実行することを含む。任意選択的に、個人が、ＨＬＡ−Ｅを発現する頭頸部癌細胞を有するかどうかの決定は、フローサイトメトリーアッセイを実行することを含む。
【０１１０】
頭頸部癌を有する患者は、患者（または患者の腫瘍）がＨＰＶ陽性であるかどうかを評価するための事前検出ステップの有無にかかわらず、抗ＮＫＧ２Ａ剤を用いて処置することができる。１つの態様では、腫瘍を有する患者が、抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置から利益を受けるかどうかを予測する方法が提供される。一実施形態では、方法は、患者がＨＰＶ陽性であるかどうかを決定することを含む。
【０１１１】
一実施形態では、ＨＮＳＣＣを有する個人がＨＰＶ陽性であるかどうかを決定するステップは、被験者において、例えば被験者からのサンプルにおいてＨＰＶ分子検出または同定することを含む。一実施形態では、ＨＰＶ分子は、被験者、例えばサンプル中のＨＰＶ核酸またはＨＰＶタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ核酸は、サンプル中の核酸のインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、または配列決定によって同定される。ＨＰＶタンパク質は、例えば、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析によって同定することができる。一実施形態では、ＨＰＶは、ｐｌ６タンパク質（ＣＤＫＮ２Ａによりコードされる）を検出するためにＩＨＣにより検出される。被験者からのサンプルは、例えば、血液または血清サンプル、または尿サンプル、または腫瘍組織（例えば、生検からの）などの組織サンプル、または頬側スワブであり得る。サンプルは新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施形態では、ＨＰＶ陽性である個人は、１６型ＨＰＶ、または任意選択的に１８型、３１型および３３型ＨＰＶに対して陽性である。任意選択的に、ＨＮＳＣＣを有する個人がＨＰＶ陽性であるかどうかを決定するステップは、１６型ＨＰＶ、および／または１８型、３１型および／または３３型ＨＰＶを検出することを含む。
【０１１２】
一般的に、任意の適切なＨＰＶアッセイ方法を使用することができる。ＦＤＡ承認ＨＰＶアッセイの例としては、Ｄｉｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ２  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  ＨＰＶＤＮＡ  Ｔｅｓｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）が挙げられ、これは、頸部検体中の１８型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡの定性的検出のために化学発光を用いるシグナル増幅核酸ハイブリダイゼーションに基づいたインビトロマイクロプレートアッセイである。別の例は、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒｖｉｓｔａ（商標）ＨＰＶ試験である。別の例は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡからのｃｏｂａｓ  ＨＰＶ試験である。さらなる例は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．からのＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶアッセイである。次に、ＨＰＶ陽性である患者を、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置に適している個人であると指定するか、または抗ＮＫＧ２Ａ剤による処置に対するレスポンダーであると指定することができ、任意選択的に、抗ＮＫＧ２Ａ剤を用いてさらに処置することができる。
【０１１３】
任意選択的に、個人は、１つまたは複数のＨＮＳＣＣ関連遺伝子マーカーの存在について評価される。ＨＮＳＣＣ関連遺伝子は、その遺伝子または関連遺伝子において異常な機能喪失または機能獲得を有し得る。抗ＮＫＧ２Ａ剤はＨＮＳＣＣ関連遺伝子における突然変異とは無関係に有用であり得る、かつ／または例えば１つもしくは複数の遺伝子マーカーに基づいて、癌予後の悪い個人における抗腫瘍応答を増強する上で有用であり得る。従って、抗ＮＫＧ２Ａ剤を使用して、ＨＮＳＣＣ関連遺伝子、例えば、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＴＰ６３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＭＹＣ、ＹＡＰ１、ＨＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＩＲＦ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＰ５３、ＣＡＳＰ８、ＰＴＥＮ、ＦＡＴ１、ＲＩＰＫ４、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＥＤ１、ＭＬＬ２、ＣＤＨ１、ＦＢＸＷ７、ＰＣＬＯ、ＲＩＭＳ２、ＲＢＩ、ＮＳＤ１、ＥＰ３００およびＮＦＥ２Ｌ２からなる群から選択される遺伝子に突然変異のあるＨＮＳＣＣを有する（または欠いている）患者を処置することができる。例示的な異常な機能獲得型ＨＮＳＣＣ遺伝子には、ＴＰ６３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＭＹＣ、ＹＡＰ１、ＨＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧまたはＮＦＥ２Ｌ２が含まれ得る。例示的な異常な機能喪失型ＨＮＳＣＣ遺伝子には、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＩＲＦ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＰ５３、ＣＡＳＰ８、ＰＴＥＮ、ＦＡＴ１、ＲＩＰＫ４、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＥＤ１、ＭＬＬ２、ＣＤＨ１、ＦＢＸＷ７、ＰＣＬＯ、ＲＩＭＳ２、ＲＢＩ、ＮＳＤ１またはＥＰ３００が含まれ得る。ＨＮＳＣＣ関連遺伝子は、Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ３３３，２６  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１１（その内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される）にも記載されている。
【０１１４】
１つの例示的な態様では、検出可能なレベルの癌細胞を有する哺乳類宿主（例えば、ヒト患者）におけるＨＮＳＣＣの進行を低下させる方法が提供され、本方法は、宿主におけるＨＮＳＣＣの進行を検出可能に低下させるのに十分な量の抗ＮＫＧ２Ａ剤（例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体）、抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物、または関連の組成物（例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸）を投与するステップを含む。
【０１１５】
癌を有するヒトを処置するため適切な処置プロトコルは、例えば、有効量のヒトＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する抗体を患者に投与することを含み、本方法は、少なくとも１回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施される、少なくとも１回の投与サイクルを含む。一実施形態では、投与サイクルは２週間〜８週間である。
【０１１６】
一実施形態では、本方法は少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルは８週間以内の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、２回、３回または４回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施される。
【０１１７】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａは、少なくとも１週間、２週間、３週間または４週間、リンパ球上のＮＫＧ２Ａ受容体を飽和させるのに有効な量で投与される。特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与（例えば、各投与）は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇで施される。
【０１１８】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、２週間に１回または４週間に１回投与される。
【０１１９】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の被験者への送達（直接投与によるか、またはその中の核酸から、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体コード化核酸配列を含むポックスウイルス遺伝子導入ベクターなどからの発現による）および本明細書中の他の方法の実施は、癌進行（特に、ＨＮＳＣＣの進行）の任意の適切な態様を低減、処置、予防、または他に改善するために使用することができる。本方法は、腫瘍成長（例えば、割合（健康なＴ細胞と比較した腫瘍細胞）、循環中の腫瘍細胞の数）、およびそれに関連する任意のパラメータまたは症状（例えば、バイオマーカー）の低減および／または改善において特に有用であり得る。癌進行のこのような態様を低減、予防、または他に改善する方法は、独立的および集合的に有利な特徴である。
【０１２０】
別の態様では、癌進行のリスクを低減する方法、開始を受けた細胞集団におけるさらなる癌進行のリスクを低減する方法、および／またはヒト患者の癌進行を低減するための治療レジメンを提供する方法が提供され、本方法は、応答（部分的または完全な応答）を達成するのに十分な量およびレジメンで患者に１つまたは複数の第１の処置（例えば、化学療法剤などの導入療法）を施し、次に、ある量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体または関連組成物を患者に投与する（または併用投与法を適用する）ことを含む。
【０１２１】
さらなる態様では、ヒト患者などの哺乳類宿主におけるＨＮＳＣＣの寛解を促進する方法が提供され、本方法は、宿主におけるＨＮＳＣＣ寛解を促進するように、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む組成物を宿主に投与することを含む。
【０１２２】
またさらなる態様では、ＨＮＳＣＣの発生のリスクを低減する、癌状態の発症までの時間を低減する、および／または初期段階に診断されたＨＮＳＣＣの重症度を低減する方法が提供され、本方法は、所望の生理学的効果を達成するように予防的に有効な量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体または関連組成物を宿主に投与することを含む。
【０１２３】
さらなる態様では、ＨＮＳＣＣと診断されたヒト患者において関連期間を超える生存の可能性を増大させる方法が提供される。別の態様では、ＨＮＳＣＣ患者の生活の質を改善する方法が提供され、本方法は、その生活の質を改善するのに有効な量の組成物を患者に投与することを含む。さらなる態様では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＨＮＳＣＣ細胞の総数が低下されるように、脊椎動物宿主中のＨＮＳＣＣ細胞の数を著しく低下させるために適用することができる。関連の意味で、ヒト癌患者などの脊椎動物においてＨＮＳＣＣ細胞を死滅させる（例えば、直接的または間接的にその死を引き起こす）方法が提供される。
【０１２４】
抗ＮＫＧ２Ａ剤（例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体）は、単独療法として、または第２の治療薬との補助的または併用投与（同時投与）として投与することができる。補助的または併用投与には、同一もしくは異なる剤形における化合物の同時投与、または化合物の別々の投与（例えば、連続投与）が含まれる。従って、抗ＮＫＧ２Ａおよび第２の治療薬は、単一の製剤において同時に投与することができる。あるいは、抗ＮＫＧ２Ａおよび第２の治療薬は別々の投与のために処方されることが可能であり、同時または連続的に投与される。第２の治療薬は、通常、その薬剤が特定の疾患または状態の処置のために単独療法で通常使用される量および処置レジメンで投与されるであろう。
【０１２５】
一実施形態では、第２の治療薬は、ＡＤＣＣを媒介する（例えば、そのＦｃドメインを介して１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６に結合する）ことができる抗体である。一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドに結合する１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨ−ＶＬペア）と、そのＦｃドメインを介して１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６に結合するＦｃドメインとを含む。一実施形態では、ＡＤＣＣを媒介する抗体は、第２の抗癌剤が方向付けられるポリペプチドを発現するヒト患者（インビボ）内のヒト腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞毒性を誘発する有効量で投与される。
【０１２６】
１つの例では、第２の治療薬は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合および／またはそれを阻害する薬剤である。
【０１２７】
一実施形態では、使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、国際公開第２００６／０８２５１５号パンフレットおよび国際公開第２００８／０１７９６３号パンフレット、国際公開第２００２／１００３４８号パンフレット、国際公開第２００４／０５６８４７号パンフレット、国際公開第２００５／０５６６０６号パンフレット、国際公開第２００５／０１２４７９号パンフレット、国際公開第２００５／１０１５１号パンフレット、米国特許第６，７９４，４９４号明細書、欧州特許第１４５４９１７号明細書、国際公開第２００３／１４１５９号パンフレット、国際公開第２００２／０９２７７１号パンフレット、国際公開第２００３／１２０７２号パンフレット、国際公開第２００２／０６６０５８号パンフレット、国際公開第２００１／８８１３８号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／３６０７４号パンフレット、国際公開第９６／４０２１０号パンフレット、国際公開第９６／２７０１０号パンフレット、米国特許出願公開第２００２０６５３９８号明細書、国際公開第９５／２００４５号パンフレット、欧州特許第５８６００２号明細書、米国特許第５，４５９，０６１号明細書または米国特許第４，９４３，５３３号明細書において記載されるような抗体である。結合および／または阻害する薬剤は、従って、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。本開示の方法において使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに含有される１つまたは複数のエピトープに対して任意の適切な親和性および／または結合活性を有し得る。好ましくは、使用される抗体は、最大で１０−８Ｍ、好ましくは最大で１０−１０Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトＥＧＦＲに結合する。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｆｃγ（例えば、ＣＤ１６）結合を保持するＦｃドメインを含む。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃドメインを含む。
【０１２８】
ｃ２２５抗体（セツキシマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））は抗ＥＧＦＲ抗体の一例であり；セツキシマブはＥＧＦ媒介性の腫瘍細胞成長をインビトロで阻害し、ヒト結腸直腸腫瘍をインビボで阻害することが実証された（２００３年に明白に承認を受けた）。それは、上皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするキメラヒト／マウスモノクローナル抗体である。ＥＧＦＲのリガンド結合の防止、ＥＧＦＲ受容体の活性化の防止、および細胞成長の中断をもたらすＥＧＦＲ経路の下流シグナル伝達の遮断などのセツキシマブの全生物活性の一部または全てを共有する他の抗ＥＧＦＲ抗体が知られている。本開示において使用するための抗体の他の例としては、ザルツムマブ（２Ｆ８、国際公開第０２／１００３４８号パンフレットおよび国際公開第０４／０５６８４７号パンフレットに記載される）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、およびマツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲを有する抗体（国際公開第２０１０／１１２４１３号パンフレット）、ネシツムマブ（ＩＭＣ−１１Ｆ８、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）またはこれらのいずれかの変異体抗体、またはこれらのいずれかと競合することができる抗体、例えば、これらのいずれかと同じエピトープを認識する抗体が挙げられる。競合は、任意の適切な技術によって決定され得る。一実施形態では、競合はＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。多くの場合、競合は、ＥＬＩＳＡ分析で決定したときに５％、１０％または２５％よりも著しく大きい相対的阻害により特徴付けられる。
【０１２９】
また、例えば、エフェクター機能（例えば、抗体依存性の細胞毒性、マスト細胞脱顆粒、および食作用など）、ならびに免疫調節性シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節など）に影響を与え得る、Ｆｃ受容体に結合するその能力を増大させる修飾を有する抗ＥＧＦＲ抗体またはＡＤＣＣを媒介する他の抗体も有利に作製され得る。典型的な修飾には、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、挿入）、および／または改変型のグリコシル化、例えばハイポフコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を含む修飾されたヒト定常領域が含まれる。このような修飾は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響を与え得る。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化（すなわち、免疫系増強）受容体であり、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（すなわち、免疫系減弱）受容体である。修飾は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上の活性化Ｆｃγ、例えばＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃドメインの結合を増大し得るか、または阻害性Ｆｃγ、例えばＦｃγＲＩＩＢへのＦｃドメインの結合を低減し得る。Ｆｃ修飾の任意の組み合わせ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；米国特許第７，５２１，５４２号明細書；米国特許第７，４２５，６１９号明細書；米国特許第７，４１６，７２７号明細書；米国特許第７，３７１，８２６号明細書；米国特許第７，３５５，００８号明細書；米国特許第７，３３５，７４２号明細書；米国特許第７，３３２，５８１号明細書；米国特許第７，１８３，３８７号明細書；米国特許第７，１２２，６３７号明細書；米国特許第６，８２１，５０５号明細書および米国特許第６，７３７，０５６号明細書において、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；国際公開第２００８／１０５８８６号パンフレット；国際公開第２００８／００２９３３号パンフレット；国際公開第２００７／０２１８４１号パンフレット；国際公開第２００７／１０６７０７号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０５／１１５４５２号パンフレット；国際公開第０５／１１０４７４号パンフレット；国際公開第０４／１０３２２６９号パンフレット；国際公開第００／４２０７２号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０７／０２４２４９号パンフレット；国際公開第０５／０４７３２７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレットおよび国際公開第０４／０６３３５１号パンフレットにおいて、ならびにＰｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示される異なる修飾の任意の組み合わせを作製することができる。
【０１３０】
抗ＥＧＦＲ抗体またはＡＤＣＣを媒介する他の抗体は変異Ｆｃ領域を含むことができ、ここで変異Ｆｃ領域は、分子が、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して増強されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれを超えるアミノ酸修飾を有する）、任意選択的に、変異Ｆｃ領域は、任意の１つまたは複数の位置２２１、２４３、２４７、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１６、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７０、３７３、３７６、３７８、３９２、３９６、３９９、４０２、４０４、４１６、４１９、４２１、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９における置換を含む。一実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、任意の１つまたは複数の位置３２９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４における置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は変異Ｆｃ領域を含むことができ、ここで変異Ｆｃ領域は、分子が、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して増強されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれを超えるアミノ酸修飾を有する）、任意選択的に、変異Ｆｃ領域は、任意の１つまたは複数の位置３２９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４における置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含む。
【０１３１】
一実施形態では、変異体または野生型Ｆｃ領域を有する抗体は、抗体のＦｃ受容体結合能力を増大させる改変されたグリコシル化パターンを有し得る。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中の抗体を発現させることによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現し、それにより改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、ならびに欧州特許１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ公報国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；国際公開第９９／５４３４２号パンフレットが参照され、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書中に援用される。一般に、改変されたグリコシル化を有するこのような抗体は、抗体が、特定の望ましい特性（非修飾抗体または天然に存在する定常領域を有する抗体と比較して増強されたＡＤＣＣおよびエフェクター細胞受容体結合活性を含むが、これらに限定されない）を生じる特定のＮ−グリカン構造を有するように「糖最適化（ｇｌｙｃｏ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」されており、マウス骨髄腫ＮＳＯおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１２：１８０−７）、ＨＥＫ２９３Ｔ発現抗体、または組換え治療抗体を産生するために一般に使用される他の哺乳類宿主細胞株によって産生される。
【０１３２】
哺乳類宿主細胞中で産生されるモノクローナル抗体は、各重鎖のＡｓｎ２９７においてＮ結合グリコシル化部位を含有する。抗体上のグリカンは、通常、分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（分岐ＧｌｃＮＡｃ）が非常に少ないか全くなく、高レベルのコアフコシル化を有する複雑な二分岐構造である。グリカン末端は、非常に少ない末端シアル酸を含有するかまたは末端シアル酸を全く含有せず、可変量のガラクトースを含有する。抗体機能に対するグリコシル化の効果の概説については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３１（１９９７）を参照されたい。多数の研究により、抗体グリカン構造の糖組成の変化は、Ｆｃエフェクター機能を改変可能であることが示される。抗体活性に寄与する重要な炭水化物構造は、アルファ−ｌ，６結合を介してＦｃ領域Ｎ結合オリゴ糖の最内部のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌａｃＮＡｃ）残基に結合されたフコース残基であると考えられる（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１３３】
歴史的に、ＣＨＯ細胞において産生される抗体は、非フコシル化された集団において約２〜６％を含有する。アルファ６−フコシルトランスフェラーゼの基質であるＧＤＰ−フコースまたはＧＤＰ糖中間体の欠損をもたらす欠損ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼを有するＹＢ２／０（ラット骨髄腫）およびＬｅｃｌ３細胞株（ＣＨＯ系のレクチン突然変異体）は、７８〜９８％の非フコシル化種を有する抗体を産生することが報告されている。他の例では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）もしくはノックアウト技術を用いて、ＦＵＴ８  ｍＲＮＡ転写物レベルを低減するため、または遺伝子発現を完全にノックアウトするために細胞を操作することができ、このような抗体は、７０％までの非フコシル化グリカンを含有することが報告されている。
【０１３４】
抗ＥＧＦＲ抗体またはＡＤＣＣを媒介する他の抗体は、例えば、Ａｓｎ２９７において糖鎖によりグリコシル化することができ、前記抗体は、そのＦｃ部分を介したＦｃγＲＩＩＩへの結合親和性の増大を示す。本発明の一実施形態では、抗体は、ＦｃｙＲＩＩＩａへの抗体結合および／またはＡＤＣＣを改善する少なくとも１つのアミノ酸修飾をＦｃ領域に含む定常領域を含むであろう。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、補助的または併用投与（同時投与）には、同一もしくは異なる剤形における化合物の同時投与、または化合物の別々の投与（例えば、連続投与）が含まれる。従って、抗ＮＫＧ２Ａおよび第２の治療薬は、単一の製剤において同時に投与することができる。あるいは、抗ＮＫＧ２Ａおよび第２の治療薬は別々の投与のために処方されることが可能であり、同時または連続的に投与される。
【０１３６】
処置方法において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および第２の治療薬は、別々に、一緒に、または連続して、または混合物中で投与することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合化合物は、第２の治療薬の投与前に投与される。例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与の約０〜３０日前に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与の約３０分〜約２週間前、約３０分〜約１週間前、約１時間〜約２時間前、約２時間〜約４時間前、約４時間〜約６時間前、約６時間〜約８時間前、約８時間〜１日前、または約１〜５日前に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与後に投与される。例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与の約０〜３０日後に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の治療薬の投与の約３０分〜約２週間後、約３０分〜約１週間後、約１時間〜約２時間後、約２時間〜約４時間後、約４時間〜約６時間後、約６時間〜約８時間後、約８時間〜１日後、または約１日〜５日後に投与される。
【０１３７】
癌を有するヒトを処置するための適切な処置プロトコルは、例えば、ＮＫＧ２Ａを阻害する抗体およびヒトＥＧＦＲに結合および／またはそれを阻害する抗体のそれぞれの有効量を患者に投与することを含み、本方法は少なくとも１回の投与サイクルを含み、少なくとも１回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され、少なくとも１回の抗ＥＧＦＲ抗体の投与が１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態では、投与サイクルは２週間〜８週間である。
【０１３８】
一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体と併用して投与される場合、抗ＮＫＧ２Ａは、少なくとも１週間、２週間、３週間または４週間、リンパ球上のＮＫＧ２Ａ受容体を中和するのに有効な量で投与される。ピコモル範囲の単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃポリペプチドに対する親和性（ＫＤ値）を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体、特に、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で６７ｐＭの単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃポリペプチドに対する親和性（ＫＤ値）を有するそれぞれ配列番号２および７の重鎖および軽鎖を有する抗体は、２週間ごとに投与される場合に、末梢血リンパ球上のＮＫＧ２Ａの中和をもたらす。
【０１３９】
一実施形態では、本方法は少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルは８週間以内の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、２回、３回または４回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され、２回、３回または４回の抗ＥＧＦＲ抗体の投与が０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施される。
【０１４０】
特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与（例えば、各投与）は、１０ｍｇ／ｋｇで施される。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の投与（例えば、各投与）は、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１〜１０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）で施される。
【０１４１】
一実施形態では、セツキシマブは４００ｍｇ／ｍ２の初期用量で投与され、その後、毎週、任意選択的に２週間に１回、２５０ｍｇ／ｍ２で投与される。一実施形態では、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ，Ａｍｇｅｎ）は、２週間ごとに６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１４２】
特定の実施形態では、併用療法により、抗ＥＧＦＲ抗体は、最大用量または認可された用量（例えば、唯一の薬剤として、または抗ＮＫＧ２Ａの不在下で）よりも低い用量での投与が可能になる。
【０１４３】
一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＥＧＦＲ抗体は以下の用量で投与される：
（ａ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＮＫＧ２Ａ抗体および１〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、２５０ｍｇ／ｍ２）の抗ＥＧＦＲ抗体；
（ｂ）１０ｍｇ／ｋｇ未満の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ）および１〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、２５０ｍｇ／ｍ２）の抗ＥＧＦＲ抗体；または
【０１４４】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、約２週間に１回または４週間に１回投与される。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は約１週間に１回投与される。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は約２週間に１回投与される。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は約４週間に１回投与される。
【０１４５】
１つの例では、方法は少なくとも１回の投与サイクルを含み、１回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され、少なくとも１回の抗ＥＧＦＲ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され、ここで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は約２週間に１回、任意選択的に４週間に１回投与され、抗ＥＧＦＲ抗体は、約１週間に１回または２週間に１回投与される。一実施形態では、投与サイクルは２週間〜８週間である。一実施形態では、投与サイクルは２週間である。
【０１４６】
１つの例では、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブであり、２週間に１回投与される。例えば、処置は少なくとも１回の投与サイクルを含み、１回の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され、少なくとも１回の抗ＥＧＦＲ抗体の投与が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で施され（任意選択的に、最初の抗ＥＧＦＲの投与のためにより高用量の抗ＥＧＦＲを用いる）、ここで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は約２週間に１回投与され、抗ＥＧＦＲ抗体は約２週間に１回投与される。
【０１４７】
一実施形態では、ＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤と、ヒトＥＧＦＲに結合（および、例えばそれに向けてＡＤＣＣを誘導する）および／またはヒトＥＧＦＲの活性を阻害する薬剤とによる処置に個人が適しているかどうかを評価する方法が提供され、本方法は、個人からの生体サンプル中のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドおよびＥＧＦＲ核酸またはポリペプチドの両方を発現する腫瘍細胞（例えば、ＨＮＳＣＣ腫瘍細胞）を検出することを含む。ＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドおよびＥＧＦＲ核酸またはポリペプチドの両方を発現する腫瘍細胞（または腫瘍細胞集団）を個人が有するという決定は、患者が、ヒトＥＧＦＲと結合し、および／またはその活性を阻害する薬剤と併用してＮＫＧ２Ａを阻害する薬剤により処置することができる癌を有することを示す。
【実施例】
【０１４８】
実施例１  −  ＮＫ細胞活性化に対する抗ＮＫＧ２Ａの用量反応の効果
ＨＮＳＣＣに対する免疫療法アプローチは、ＨＮＳＣＣによって誘導される深刻な免疫抑制によって特に複雑化され、これは、免疫刺激の取り組みの有効性を潜在的に低減する（例えば、Ｄｕｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０：１−１５を参照）。この実験の目標は、ＮＫＧ２Ａを標的とする抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＮＳＣＣ細胞を除去できるかどうかを調査することであった。
【０１４９】
ＮＫ細胞活性化に対する抗ＮＫＧ２Ａの用量反応の効果は、ＣＤ１０７およびＣＤ１３７発現の分析によって決定した。４時間のＣＤ１０７動員は、ＮＫ細胞の溶解性顆粒の放出のマーカーである（Ａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９４（１−２）：１５−２２）。２４時間のＣＤ１３７発現の増大は、ＮＫ細胞を含むいくつかのリンパ球の活性化と相関している（Ｋｏｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７（８）：２４２３−２４３２）。ＣＤ１０７およびＣＤ１３７発現の分析は、ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞または発現しないＮＫ細胞（それぞれ、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞またはＮＫＧ２Ａ−ＮＫ細胞）において実施した。抗体がＮＫＧ２Ａを標的としているとき、その効果はＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞においてのみ見られることが予想され、従ってＮＫＧ２Ａ−ＮＫ細胞は、実験における内部対照とみなすことができる。
【０１５０】
使用したエフェクター細胞は、健常志願者から新たに単離したＰＢＭＣであり、標的細胞は、ＨＮＳＣＣ細胞株、またはＨＬＡ−ＥによりトランスフェクトしたＫ５６２細胞株のクローンであった。細胞を数え、完全培地中で２日ごとに継代した。これらを１２継代まで培養下で維持した。実験の前日、細胞をカウントし、１００，０００細胞／ウェルに調整した。生存率を測定し、９０％を超えなければならなかった。
【０１５１】
Ｋ５６２細胞株は、Ｋ５６２クローンＥ６（ＨＬＡ−Ｅ陽性、ＣＤ３２低）およびＫ５６２クローンＦ７（ＨＬＡ−Ｅ陰性／低、ＣＤ３２低）であった。ヒト頭頸部癌細胞株は、ＨＬＡ−Ｅ発現に対してフローサイトメトリーによりスクリーニングした（以下の表Ｃを参照）。機能試験のために３つの細胞株を選択した：ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ−４３）、Ｈ−Ｎ（ＤＳＭＺ♯ＡＣＣ４１７）およびＣＡＬ−２７（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ４４６）。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
使用したエフェクター細胞は、健常志願者から新たに単離したＰＢＭＣであった。標的細胞はＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−ＮおよびＣＡＬ−２７）、およびＨＬＡ−ＥによりトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）であった（Ｅ：Ｔ比を２．５／１として）。読取りは、４時間におけるＣＤ１０７対２４時間におけるＣＤ１３７であった。７つのドナー（ＦａＤｕおよびＨ−Ｎ）および２つのドナー（ＣＡＬ−２７）を試験した。配列番号２にその重鎖アミノ酸配列が示され、配列番号７にその軽鎖アミノ酸配列が示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。
【０１５４】
図１Ａおよび図１Ｂは、対照または表示される標的細胞株の存在下で、１０μｇ／ｍＬの飽和用量の抗ＮＫＧ２Ａの存在下または非存在下、ＮＫＧ２Ａ−ＮＫ（左側）またはＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞（右側）において読み取られたＣＤ１０７（上側）およびＣＤ１３７（下側）ＦＡＣＳを示す。細胞株は、ＨＬＡ−Ｅ表面発現のレベルに従って左側から右側へ順序付けされる。各ドットは、健常志願者からのＰＢＭＣを表す。図１ＢはＨＮＳＣＣ細胞株を示し、抗ＮＫＧ２Ａが、内在性ＨＬＡ−Ｅ発現を有するＨＮＳＣＣ、またはＨＬＡ−ＥがトランスフェクトされたＫ５６２の溶解を回復可能であることを実証する。この効果はＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞においてのみ見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに依存する。実際、抗ＮＫＧ２Ａの効果は、中間〜高ＨＬＡ−Ｅレベルの発現を有する細胞株において見られる。
【０１５５】
抗ＮＫＧ２Ａは、阻害性受容体ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ−Ｅとの相互作用を遮断することによって、ＨＬＡ−Ｅ発現細胞株のＮＫ媒介性の溶解を誘導することができる。この効果は、ＨＬＡ−ＥによりトランスフェクトされたＫ５６２細胞株において観察されるが、ＦａＤｕおよびＣＡＬ−２７細胞株などの内在性ＨＬＡ−Ｅ発現を有するＨＮＳＣＣ細胞株において、より重要である。抗ＮＫＧ２Ａの効果の程度は、標的細胞の細胞表面におけるＨＬＡ−Ｅ発現のレベルに依存する。
【０１５６】
実施例２  −  抗ＮＫＧ２Ａにより抗ＥＧＦＲ活性のＨＬＡ−Ｅ抑制が克服され得る
上皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（また、ＥｒｂＢ−１；ヒトではＨＥＲ１）は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリー内の遍在的に発現される膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲの高発現はＨＮＳＣＣを含むほとんどの上皮性悪性腫瘍で起こり、悪い予後に関連する。天然リガンドによるその活性化は、腫瘍成長の間の細胞の増殖、浸潤、血管新生および転移の活性化を調節する細胞内シグナル伝達経路の開始を引き起す。
【０１５７】
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブは、ＥＧＦ受容体経路の発癌シグナル伝達を遮断することにより、かつＦｃγ受容体媒介性の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することによって作用すると考えられる。しかしながら、ＨＮＳＣＣでは、ＡＤＣＣは、誘導される深刻な免疫抑制によって影響され得る。同時に、ＥＧＦ受容体経路の発癌シグナル伝達の遮断は、ＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセット上の活性化受容体ＮＫＧ２Ｄにより認識されるＭＩＣＡ／ＢおよびＵＬＢＰタンパク質ファミリーの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連抗原の腫瘍細胞における転写後調節をもたらす。特に、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドであるこれらのストレス関連抗原の腫瘍細胞による発現は臨床的なＥＧＦＲ阻害薬によって低減され、従って、ＮＫおよびＴ細胞に対する腫瘍細胞の視感度が潜在的に低下され得る（Ｖａｎｔｏｕｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２３１ｒａ４９（２０１４）。
【０１５８】
この実験は、ＨＮＳＣＣにおいてＮＫ細胞を活性化する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力に対するＥＧＦＲ阻害抗体の効果を調査するために設計された。ＮＫ細胞活性化に対するセツキシマブの用量反応の効果は、エフェクター細胞として健常志願者から新たに単離したＰＢＭＣを、および標的細胞としてＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、およびＨ−Ｎ）を２．５／１のＥ：Ｔ比で用いて、ＣＤ１０７およびＣＤ１３７発現の分析によって決定した（方法の概説については実施例１を参照）。３つのドナー（４時間で読み取ったＣＤ１０７）および４つのドナー（２４時間で読み取ったＣＤ１３７）を用いて、読み取りは、４時間におけるＣＤ１０７対２４時間におけるＣＤ１３７であった。１０μｇ／ｍＬから始まる１／１０連続希釈の用量反応において、セツキシマブを試験した。１人の健常志願者について、ＮＫ細胞をＮＫＧ２Ａ＋およびＮＫＧ２Ａ−サブセットに細分した。ＨＮＳＣＣにおいてＮＫ細胞を活性化する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力に対するＥＧＦＲ阻害抗体の効果を調査するために、準最適用量のセツキシマブをさらなる試験のために選択した。０．００１μｇ／ｍＬ（１ｎｇ／ｍＬ）用量は、ＣＤ１０７およびＣＤ１３７の読取りの両方で観察されたセツキシマブ効果の出発点である。０．０１μｇ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）用量は、ほぼセツキシマブ効果のＥＣ５０である。
【０１５９】
抗ＮＫＧ２Ａおよび準最適用量のＥＧＦＲ阻害薬の複合効果は、エフェクター細胞として健常志願者から新たに単離したＰＢＭＣを、および標的細胞としてＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−ＮおよびＣＡＬ−２７）、ＨＬＡ−ＥによりトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）を２．５／１のＥ：Ｔ比で用いて、ＣＤ１０７およびＣＤ１３７発現の分析によって評価した（方法の概説については実施例１を参照）。７つのドナー（ＦａＤｕおよびＨ−Ｎ））および２つのドナー（ＣＡＬ−２７）を用いて、読み取りは、４時間におけるＣＤ１０７対２４時間におけるＣＤ１３７であった。
【０１６０】
配列番号２にその重鎖アミノ酸配列が示され、配列番号７にその軽鎖アミノ酸配列が示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は飽和用量に相当する１０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、ＥＧＦＲ阻害セツキシマブは２つの準最適用量０．００１μｇ／ｍＬまたは０．０１μｇ／ｍＬで使用した。
【０１６１】
飽和用量の抗ＮＫＧ２Ａは、準最適用量のセツキシマブにより誘導されるＨＮＳＣＣ細胞株に対するＡＤＣＣを増強した。Ｋ５６２トランスフェクト細胞株はＥＧＦ−Ｒを発現しないため、セツキシマブ依存性のＡＤＣＣはＫ５６２トランスフェクト細胞株では観察されなかった。抗ＮＫＧ２Ａ効果はＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞においてのみ見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに依存する。実際、抗ＮＫＧ２Ａの効果は、中間〜高ＨＬＡ−Ｅレベルの発現を有する細胞株（ＦａＤｕ、ＣＡＬ−２７およびＫ５６２−ＨＬＡ−ＥクローンＥ６）において見られる。図２は、ＦａＤｕ細胞について示される代表的な例である。図２において、飽和用量の抗ＮＫＧ２Ａが準最適用量のセツキシマブ（ｃｔｘ）により誘導されたＨＮＳＣＣ細胞株に対するＡＤＣＣを増強したことがわかる。
【０１６２】
実施例３  −  漸増用量の抗ＮＫＧ２Ａと漸増用量のセツキシマブの複合効果
漸増用量のＥＧＦＲ阻害抗体および漸増用量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の組み合わせの効果は、ＨＮＳＣＣ標的細胞に向けてＮＫ細胞を活性化する能力について評価した。実験により、セツキシマブが飽和用量で使用されたときでも抗ＮＫＧ２Ａ療法が依然としてＡＤＣＣを増強できるかどうか、および抗ＮＫＧ２Ａ効果が用量依存性であるかどうかを評価しようとした。
【０１６３】
簡単に言うと、使用したエフェクター細胞は、健常志願者から新たに単離したＰＢＭＣであり、標的細胞は、ＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−ＮおよびＣＡＬ−２７）、およびＨＬＡ−ＥによりトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）であり、Ｅ：Ｔ比は２．５／１であった。読取りは、２つのドナーを用いて、４時間におけるＣＤ１０７対２４時間におけるＣＤ１３７であった。配列番号２にその重鎖アミノ酸配列が示され、配列番号７にその軽鎖アミノ酸配列が示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、２つの準最適用量０．１および１μｇ／ｍＬ、ならびに飽和用量１０μｇ／ｍＬで使用した。セツキシマブは、これらの実験設定では、２つの準最適用量０．００１μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬ（約ＥＣ５０）ならびに飽和用量０．１μｇ／ｍＬで使用した。
【０１６４】
結果は、図３Ａおよび図３Ｂに示される。図３Ａは、標的を含まない対照、およびＫ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスフェクタントを有する対照におけるＣＤ１０７の読取りを示す。各健常志願者は、異なる基号（正方形または円形）によって表される。十字の付いた白い記号は、０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共に同時インキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって抗ＮＫＧ２Ａが置換された状態に対応する。ＨＬＡ−Ｅを高レベルで発現するクローンＥ６において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の効果は用量依存性であり、ＨＬＡ−Ｅ発現レベルに依存し、０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブの場合も依然として観察されることがわかる。クローンＦ７（低ＨＬＡ−Ｅ発現レベル）では、抗ＮＫＧ２Ａの効果は限られており、高用量（例えば、飽和用量）の抗ＮＫＧ２Ａは効果をさらに増強しなかった。
【０１６５】
図３Ｂは、ＨＮＳＣＣ細胞株におけるＣＤ１０７の読取りを示す。各健常志願者は、異なる基号（正方形または円形）によって表される。十字の付いた白い記号は、０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共に同時インキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって抗ＮＫＧ２Ａが置換された状態に対応する。ＨＬＡ−Ｅに対してより高レベル／より強力な染色で発現するＦａＤｕまたはＣＡＬ−２７において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の効果は用量依存性であり、ＨＬＡ−Ｅ発現レベルに依存し、０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブの場合も依然として観察されることがわかる。
【０１６６】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の効果は用量依存性であり、ＨＬＡ−Ｅ発現レベルに依存し、０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブの場合も依然として観察される。
【０１６７】
実施例４  −  ＨＬＡ−ＥはＨＰＶ１６遺伝子型を含むＨＮＳＣＣにおいて一貫して発現される
ＨＮＳＣＣ患者の腫瘍におけるＨＬＡ−Ｅの発現を研究した。サンプルは、腫瘍悪性度Ｉ〜ＩＶを有する臨床ステージＩＩＩ、ＩＶまたはＩＶＡの癌、扁平上皮癌、ＮＯＳ（１６の原発性腫瘍および４の転移性腫瘍（ＬＮ））の疾患を有する２０人の患者から得た。ブレイクダウン（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）は、口腔および／または口腔底（ｎ＝３）、喉頭（ｎ＝６）、咽頭（ｎ＝１）、舌（ｎ＝７）、扁桃腺（ｎ＝３）であった。ＨＰＶ１６遺伝子型（１４／２０陽性）およびＨＰＶＰ１６ｉｎｋａ検出（７／１４陽性）。
【０１６８】
ＨＬＡ−Ｅを染色するために５μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１抗ヒトＨＬＡ−Ｅ（３Ｄ１２）と、ＮＫＧ２Ａを染色するために５μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１抗ＮＫＧ２Ａ（Ｚ２７０）とを用いて、凍結組織切片で染色を実施し、アイソタイプ対照：５μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と比較し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）検出キット（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて検出を実行した。健康なヒト陽性対照組織（胎盤、扁桃腺およびリンパ節）、およびトランスフェクト細胞株も含めた。別個に、腫瘍サンプルにおいて腫瘍および間質のリンパ球浸潤を評価した。
【０１６９】
使用したＨＬＡ−ＥおよびＮＫＧ２Ａ染色プロトコルは次の通りである：室温にもたらす、ＰＢＳにより再水和、内在性ペルオキシダーゼをＰＢＳ中０．３％のＨ２Ｏ２で遮断、ＰＢＳ  ３×で洗浄、ＰＢＳヤギ血清５％により飽和、ＰＢＳ１００μｌ中に溶解したＡｂと共にインキュベート、ＰＢＳ  ３×で洗浄、ｅｎｖｉｓｉｏｎキット（２滴）と共にインキュベート、ＰＢＳ  ３×で洗浄、ＤＡＢ  １００μｌと共にインキュベート、Ｈ２Ｏｄによるすすぎ、ヘマトキシリン（２滴）と共にインキュベート、Ｈ２Ｏｄによるすすぎ、ＯＴＴＩＸシェイパーバス（ｓｈａｐｅｒ  ｂａｔｈ）、ＯＴＴＩＸプラスバス（ｐｌｕｓ  ｂａｔｈ）、ならびにダイアモンドスライドカッターおよび取付け具による取付け。
【０１７０】
染色０〜３のレベルのスコア化に加えて、細胞型およびシグナルの細胞局在（存在する場合）を記録した。それを、細胞局在について膜性、細胞質内または細胞外であるとして分類した。
【０１７１】
ＩＨＣスコアリングは、以下のように実施した。
０：負のシグナル
１：細胞型の＜２５〜５０％においてかすかな〜弱いシグナル
２：中程度の強さのシグナルであるが細胞型の＞５０％で発現されるか、または強度のシグナルであるが＜２５〜５０％の細胞型で発現される
３：細胞サブタイプ内の全細胞にわたって散在的に発現される強いシグナル
【０１７２】
結果は、１＋〜３＋の範囲のＨＬＡ−Ｅの散在性細胞質内染色を示した。ＨＬＡ−Ｅ染色は種々の腫瘍部位／型にわたっており、ＨＰＶＰ１６ＩＮＫＡ発現を特徴とするＨＰＶ陽性患者（ＨＰＶ１６遺伝子型を含む）およびサンプルを含んだ。
【０１７３】
図４は、種々の腫瘍部位／型において１＋〜３＋の範囲のＨＬＡ−Ｅ染色を示す。興味深いことに、最悪の予後を有することが一般に認識されている腫瘍型（扁桃腺）からの全てのサンプルにおいて染色は３＋であった。
【０１７４】
また結果は、ＨＬＡ−Ｅが、ＨＰＶ１６遺伝子型を含むＨＰＶ陽性患者において一貫して発現されることを示した。図５は、種々の腫瘍の患者のＨＰＶ１６およびＰ１６状態についての詳細を示す。最悪の予後を有することが一般に認識されている腫瘍型（扁桃腺）からの全サンプルはＨＰＶ１６陽性およびＰ１６ＩＮＫＡ陽性の両方であった。喉頭および舌腫瘍も大部分がＨＰＶ１６陽性であり、Ｐ１６ＩＮＫＡ陽性サンプルのかなりの部分をなす。図６は、腫瘍型（転移性または原発性腫瘍）をＨＰＶ１６およびＰ１６ＩＮＫＡの関数として示す。全ての転移性腫瘍はＨＰＶ１６陽性であり、全てＰ１６ＩＮＫＡ陽性でもあった。結果は、ＨＬＡ−Ｅ発現およびＨＰＶ陽性腫瘍が、図７に示されるように、強いリンパ球浸潤を特徴とすることをさらに示した。さらに、腫瘍サンプル中のリンパ球はＮＫＧ２Ａを発現し、ＨＰＶ１６陽性およびＰ１６ＩＮＫＡ陽性の両方である患者のＮＫＧ２Ａの場合に最強の染色であった。
【０１７５】
実施例５  −  単剤としてのヒト化Ｚ２７０の反復注射による癌の処置のためのヒト臨床治験
本治験の第１の目的は、手術可能な口腔の扁平上皮癌を有する患者における手術前ＩＰＨ２２０１（Ｓ２４１Ｐ突然変異を含むヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０）の抗腫瘍活性を評価することである。第２の目的は、ＩＰＨ２２０１の安全性、薬物動態、免疫原性および薬動力学（腫瘍内バイオマーカーを含む）を評価することである。
【０１７６】
試設計：
治験は、非盲検単一群の第Ｉｂ−ＩＩ相研究（導入期を含む）である。臨床的リスクが中程度または高度の測定可能なステージＩＩＩまたはＩＶａの口腔扁平上皮癌を有するこれまで未処置の患者は、１時間にわたる静脈内（ｉ．ｖ．）経路によって、２週間ごと（ｑ２ｗ）に４回の投与の静脈内単剤ＩＰＨ２２０１により処置され得る。最初の６人の患者は、ｑ２ｗで４回、４ｍｇ／ｋｇの用量のＩＰＨ２２０１を受けるであろう。４ｍｇ／ｋｇで処置される３人の最初の患者に対するＩＰＨ２２０１の最初の投与の間で、１週間の最小間隔が観察されるであろう。４ｍｇ／ｋｇで処置された最後の患者に最初の投与が行われた後、４週間の最小フォローアップ後に安全委員会に用量の上昇がより許可されれば、次の患者らは、ｑ２ｗで４回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で処置されるであろう。ＩＰＨ２２０１の最後の投与後、手術による標準的な局所領域的処置後に病理組織学的危険因子に従う補助療法（放射線療法（ＲＴ）または放射線化学療法（ＲＣＴ））が開始されるであろう。腫瘍進行の場合、局所領域的な処置は直ちに開始されるであろう。
【０１７７】
ＩＰＨ２２０１の３回目の投与前、およびＩＰＨ２２０１の最後の投与の２週間後、手術前に抗腫瘍活性が臨床的および放射線学的に評価される。ＲＥＣＩＳＴ１．１基準に従って、標的病変部において腫瘍測定を得る。ベースラインおよび手術前期間中における有効性評価のため、主要エンドポイントの評価のため、および／または手術後に再発の可能性を監視するために、同じ画像形成技術を使用する。全ての患者、および到達可能な腫瘍病変部の写真において、適切な画像形成技術による研究者の判断での評価（コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャンおよび／または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ））を実施する。
【０１７８】
ベースラインにおいて生検により新鮮腫瘍サンプルを入手し、手術時に切除検体を採取する。患者は、最初の投与サイクルの１年後まで追跡されるであろう。研究来診の終了後、局所的な慣習に従ってさらに２年間、再発および生存が研究後に記録されるであろう。
【０１７９】
本明細書において援用される刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は参照によってその全体が本明細書に援用され、かつ本明細書中の他の箇所で行われる任意の別個に提供される特定の文献の援用に関係なく、各参考文献が参照によって援用されると個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中で説明された場合と同じ程度まで（法律で許容される最大範囲まで）援用される。
【０１８０】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本発明の説明に関連して、本明細書において他に記載されない限り、または文脈により明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
【０１８１】
他に規定されない限り、本明細書において提供される全ての正確な値は、対応する概略値を代表する（例えば、特定の因子または測定に関して提供される全ての正確な例示的な値は、必要に応じて「約」によって修飾される対応する概略測定値も提供すると考えることができる）。数に関連して「約」が使用される場合、これは、規定される数の＋／−１０％に対応する値を含むと規定され得る。
【０１８２】
１つまたは複数の要素に関して「含む」、「有する」、「包含する」または「含有する」などの用語を用いて本発明の任意の態様または実施形態を本明細書中で記載することは、他に規定されない限り、または文脈により明らかに否定されない限り、その１つまたは複数の特定の要素「からなる」、「から本質的になる」、または「を実質的に含む」、本発明の同様の態様または実施形態に対する支持を提供することが意図される（例えば、本明細書において特定の要素を含むと記載される組成物は、他に規定されない限り、または文脈により明らかに否定されない限り、その要素からなる組成物も記載すると理解されるべきである）。
【０１８３】
本明細書において提供されるいずれかおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することのみが意図され、他で主張されない限り、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書中の言葉は、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されてはならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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