(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
くろずの有機溶媒抽出物の乾燥物を有効成分とするcPLA2阻害活性および／またはＯ2-産生阻害活性を有する抗炎症剤。
【請求項２】
有機溶媒抽出物が酢酸エチル抽出物である請求項１に記載のcPLA2阻害活性および／またはＯ2-産生阻害活性を有する抗炎症剤。
【請求項３】
くろずもろみ末の有機溶媒抽出物の乾燥物を有効成分とするcPLA2阻害活性および／またはＯ2-産生阻害活性を有する抗炎症剤。
【請求項４】
有機溶媒抽出物がメタノール抽出物である請求項３に記載のcPLA2阻害活性および／またはＯ2-産生阻害活性を有する抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗炎症剤に関する。さらに詳しくは、くろず（黒酢）又はくろずもろみ末（くろずもろみからくろずを除去した残渣の粉末）を原料とする抗炎症剤に関する。
本発明の抗炎症剤は、おだやかな抗炎症作用を呈し、長期間にわたってまた大量に摂取しても、副作用がほとんどなく、炎症を予防或いは治療することができる。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、生体の炎症性疾患は、病原性微生物による感染症、物理的又は化学的起炎原因による傷害、代謝異常による痛風等の正常反応性炎症と、各種のアレルギー、自己免疫疾患、間葉失調症候群等が含まれる異常反応性炎症とに区別されるが、いずれの場合も、基本的な症状及び徴候は、発熱、発赤、腫張、疼痛であり、また機能傷害を伴なうことが多い。
【０００３】
抗炎症剤（抗炎症薬）は、これらの炎症過程に拮抗するか又は炎症症状を抑制する作用を有する薬剤であり、抗ヒスタミン剤（抗アレルギー剤）、ステロイド性抗炎症剤（副腎皮質ホルモン剤）、非ステロイド性抗炎症剤、消炎酵素剤、免疫抑制剤、抗リウマチ剤、解熱性鎮痛剤等が知られている。
【０００４】
これらの抗炎症剤は、よく知られているように、おしなべて使用法が限定的である上、強い副作用を有する。例えば、ステロイド性抗炎症剤は、その抗炎症作用は強力であるが、長期間にわたって又は大量に使用すると、むくみ、ムーン・フェイス、糖尿病や胃潰瘍の悪化、各種の感染症にかかりやすくなる等の副作用を併発しやすい。しかも、その至適投与量に個人差があり、患者ごとに異なるので、投与量を決定するのは難しく、さらに投与量を誤った場合、炎症症状を促進させるという逆効果が生じることがある。また、非ステロイド性抗炎症剤の場合は、ステロイド性抗炎症剤ほどではないが、食欲不振、めまい、悪心、嘔吐、腹痛、下痢、頭痛等の副作用が生じやすく、ときには、むくみ、貧血、血圧上昇、口内炎、動悸、蛋白尿、血尿等の症状が現れることもある。その他の抗炎症剤についても、同様の副作用を起こすことが多い。このようなことから、長期間にわたりまた大量に投与しても、副作用が生じない抗炎症剤の開発は強く望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記の事情に鑑み、本発明者は、おだやかな抗炎症作用を呈し、長期間にわたって投与しても、また大量に摂取しても副作用が生じることがない、新規な抗炎症剤の開発について鋭意努力した。その結果、種々の生理活性作用を有するくろず及びくろずもろみ末に着目し、これを原料として研究し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は上記のようにしてなされたものであって、その発明としての課題は、おだやかな抗炎症作用を呈し、長期間にわたって摂取を続けても、また大量に投与しても、副作用がほとんど生じない、新規な抗炎症剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するための本発明は、くろずの有機溶媒抽出物の乾燥物を有効成分とする抗炎症剤である。
この場合の有機溶媒としては、酢酸エチルを用いることが望ましい。
【０００８】
また本発明は、くろずもろみ末の有機溶媒抽出物の乾燥物を有効成分とする抗炎症剤である。
この場合の有機溶媒としては、メタノールを用いることが望ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗炎症剤は、その原料としてくろず又はくろずもろみ末を使用する。本発明で原料とするくろずは、伝統的に、鹿児島の福山地方を中心として生産されており、最近では健康飲料ないし健康食品の原料としても注目されている。くろずは、その一般的な製法によれば、野天に並べた醸造用のカメに米麹と蒸米と水を仕込んで、太陽エネルギーの力で、糖化、アルコール発酵、酢酸発酵を同一のカメの中で進行させ、長い熟成期間を経ると、独特の風味と各種の有用成分を有するくろずもろみとなり、これを圧搾・ろ過してくろずとして生産される。
【００１０】
本発明において、くろずもろみとは、上記のようにくろず原料を発酵・熟成させた発酵物、すなわちくろずを混和している状態の発酵物のことを言う。また、くろずもろみ末とは、くろずもろみから液体であるくろずを除去した残渣を乾燥させ粉末状にしたものを言う。くろずもろみ末は、従来知られている種々の方法で製造することができ、例えば、特開昭61-58577号公報等に記載されている方法で製造したものを使用することができる。
【００１１】
くろずやくろずもろみ末には、食欲増進作用、消化吸収促進作用、殺菌力・防腐作用、漂白作用等の通常の酢が有する一般的効能の他、肩こり、五十肩、便秘、疲労、高血圧、動脈硬化、糖尿病、肥満、慢性肝炎、神経痛、リウマチ、眼底出血等に効果があると言われている。最近は、血糖、血中脂質、血清コレステロール含量を低下させる作用があることも発表されている。また、くろずの成分には、タンパク質、遊離アミノ酸、オリゴペプタイド等が含まれていることが解明されている。
【００１２】
本発明では、くろずを原料とする場合は、まずくろずを有機溶媒で抽出する。具体的には、くろずに塩基性物質、例えば水酸化ナトリウムや炭酸カリウムを添加して中和し、酢酸エチル、塩化メチレン、ベンゼン等の有機溶媒を加えて数回抽出を行なう。抽出効率の点で、酢酸エチルを使用するのが好ましい。酢酸エチルを使用する場合を例にして説明すると、次いでこの抽出液を、水層（酢酸エチル非可溶物層）と酢酸エチル層（酢酸エチル可溶物層）に分離し、酢酸エチル層を、例えば減圧下で濃縮し、乾固させる。
【００１３】
また、くろずもろみ末を原料とする場合は、すでにくろずもろみ末として製したものを使用するか又は前記のくろずもろみを圧搾しその搾り粕を乾燥粉末化したものを使用し、まず有機溶媒で抽出する。具体的には、くろずもろみ末にメタノールや酢酸エチル等の有機溶媒をを添加し、好ましくは音波破砕（sonication）を行ない、一晩程度攪拌・抽出する。抽出効率の点で、メタノールの使用が好ましい。次いでこの混液をろ過し、ろ液を、例えば減圧下で濃縮し乾固させる。
【００１４】
本発明では、このようにして得られたくろずの有機溶媒抽出物及び／又はくろずもろみ末の有機溶媒抽出物を有効成分として、抗炎症剤とする。くろずの有機溶媒抽出物とくろずもろみ末の有機溶媒抽出物は、厳密に区別する必要はなく、両者を混用してもさしつかえない。これらは、くろずの有機溶媒抽出物及び／又はくろずもろみ末の有機溶媒抽出物を単独で、又は他の抗炎症作用を有する原料を添加し、さらに製剤上慣用の賦形剤、滑沢剤、その他の助剤を加えて、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等としてもよく、また散剤又はドリンク剤としてもよい。
【００１５】
本発明の抗炎症剤の投与は、通常経口によって行なわれ、投与量は、年齢、性別、症状等によって異なるが、成人男子の場合、 1日10mg〜100mg （くろず乾燥物換算）を 1回ないし数回に分けて投与するとよい。
【００１６】
次に、本発明の薬理作用について説明する。
本発明に係る抗炎症剤の有効成分は、くろず又はくろずもろみもしくはくろずもろみ末として従来から飲食に供されている成分であって、急性毒性は存在しないことはもちろん、副作用も生じない。
【００１７】
本発明者は、くろず及び／又はくろずもろみ末の抗炎症活性の指標として、細胞質ホスフォリパーゼA2（以下、cPLA2 で表す）阻害活性とO2- の産生阻害活性を測定することにした。cPLA2 は、炎症やアレルギー反応のメディエーターであるプロシタグランジンやロイコトリエン等の前駆体であるアラキドン酸をリン脂質から特異的に遊離させる酵素である。また、cPLA2 は、別の炎症メディエターである血小板活性化因子産生律速酵素でもある。一方、白血球（リンパ球、マクロファージ、 好中球、好酸球等）は、生体感染防御の大きな役割を担っており、好中球等はO2- の産生によって細菌による感染から生体を守っている。しかし、その一方でO2- は炎症における組織障害、老化、又は発癌の原因であり、種々の疾患にも関与していると言われている。したがってO2- 産生阻害物質は、抗炎症剤をはじめ、その他さまざまな疾患の治療薬の開発に重要な役割を果たすものである。
【００１８】
以上のことから、本発明者は、くろず及びくろずもろみ末の抗炎症活性の検討を行うなうにあたり、cPLA2 阻害活性とO2- 産生阻害活性に着目し、検討することとした。
本発明の抗炎症剤の有効成分であるくろずの有機溶媒抽出物及び／又はくろずもろみ未の有機溶媒抽出物は、以下の試験例に示すように、cPLA2 の作用を阻害する働きをする。また本発明の抗炎症剤は、O2- の産生を阻害する働きをする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、試験例と実施例をもって、本発明をさらに説明する。
【００２０】
【実施例１】
＜くろずの有機溶媒抽出物の乾燥物の製造例＞
まず、くろず500lを秤取し、これに水酸化ナトリウムの適量を添加して中和した。次いで、酢酸エチル200lを加えて 3回抽出を行ない、水層から酢酸エチル層を分離し、これを減圧下で30℃で濃縮し、乾固物100gを得た。
【００２１】
【実施例２】
＜くろずもろみ末の有機溶媒抽出物の乾燥物の製造例＞
まず、くろずもろみ末100gを秤取し、これにメタノール500ml を加えて、音波破砕を行ない、一晩かけて攪拌・抽出した後ろ過し、ろ液を減圧下で30℃で濃縮し、乾固物 12gを得た。
【００２２】
【実施例３】
＜抗炎症カプセル剤の製造例＞
実施例１で製した乾燥物100gにデキストリン100g混じた粉末にエタノールを少量添加して混捏し、カプセル充填機器によってゼラチンカプセルのボディに各1g宛詰め、キャップをして、抗炎症カプセル剤を 195個製造した。
【００２３】
【実施例４】
＜抗炎症散剤の製造例＞
実施例２で製した乾燥物をさらに微粉末化し、各2gごとに分包して、くろずもろみ末の有機溶媒抽出物の乾燥物100%からなる散剤５包を製した。
【００２４】
【試験例１】
＜cPLA2 阻害活性試験＞
実施例１と実施例２で製した乾燥物の 100mgを、それぞれ、水100ml に溶解して試料溶液とした。
cPLA2 阻害活性は、 2位のアシル基を放射標識したグリセロリン脂質を基質に用いてcPLA2 反応により生成した遊離脂肪酸を、Doleの試薬で溶媒分画し、分解量を測定することにより算定した。対照には、cPLA2 を特異的に阻害するアラキドン酸トリフルオロメチルケトン（AACOCF3:Cayman chemical company）を用いた。
すなわち、4mM CaCl2、0.1%遊離脂肪酸フリーBSA を含む100mM Tris-HCl (pH9)の 200μl に前記試料溶液 2μl を添加し、37℃で20分間インキュベートした。この上に調製基質50μl(50nmol/50,000dpm/ 50μl)を添加し、37℃で20分間反応させた。この反応により遊離した[14C]-アラキドン酸をDoleの方法(Natori,Y.etal,J.Biochem.,93,631 (1983))で回収して放射活性を計数した。その結果を図１に示す。
【００２５】
＜ｃＰＬＡ２阻害活性の評価＞
図１に示すとおり、くろずの酢酸エチル抽出物とくろずもろみ末のメタノール抽出物には、対照のＡＡＣＯＣＦ３の阻害活性（ＩＣ５０＝０．１μｇ／ｍｌ）に比べて、おだやかな、ｃＰＬＡ２阻害活性が認められた。
くろずの酢酸エチル抽出物；ＩＣ５０＝５４μｇ／ｍｌ
くろずもろみ末のメタノール抽出物；ＩＣ５０＝２８μｇ／ｍｌ
一方、くろずの水層の阻害活性は低く、１００μｇ／ｍｌでも５０％阻害に満たなかった。
【００２６】
【試験例２】
＜O2- 産生阻害活性試験＞
好中球様HL60細胞をPMA (phorbolmyristateacetate) で刺激したときのO2- 産生に対する阻害効果を検討した。
O2- 産生量は、チトクロムC (cytochrome C)のO2- による還元型チトクロムC への変換を比色定量して測定した。
すなわち、ヒト骨髄性白血病由来HL60細胞を1.4%DMSOと10%FCSを添加したRPMI1640培地で 4日間培養して好中球に分化させ、4 〜5 ×106cells/mlの細胞懸濁液に調製した。この細胞懸濁液25μl にME  50倍希釈した試料溶液25μl を添加し、37℃で20分間インキュベートした。これに、4mg チトクロムC 及び200ngPMAをMEM 1ml 中に含む反応液を50μl 添加し、37℃で 1時間インキュベートした。この波長550nm の吸光度を測定し、対照波長570nm の吸光度を測定して生成した還元型チトクロムC の定量を行ない、O2- 産生阻害活性を算出した。その結果を図２に示す。
【００２７】
＜O2- 産生阻害活性の評価＞
図２に示すとおり、くろずもろみ末のメタノール抽出物には、おだやかなO2- 産生阻害活性が認められた。再現性を確認するために再度抽出、活性試験を行なった。その結果、いずれの場合も 100μg/mlで活性を示した。
【００２８】
【発明の効果】
以上詳細に説明したとおり、本発明によって得られる抗炎症剤は、cPLA2 阻害作用とO2- 産生阻害作用を奏するので、おだやかな抗炎症剤として有効である。その上、本発明に係る抗炎症剤は、長期間にわたって摂取を続けても、また大量に投与しても、副作用がほとんど生じない。したがって、本発明の抗炎症剤は、安全であるので、抗炎症作用により、リウマチ、皮膚病、肩関節周囲炎（いわゆる肩凝り）等の疾病や疾患の予防及び治療にきわめて適しており、ヒトの健康維持に大きな効果を奏するものである。
特に、長期間投与して抗炎症作用を発揮するので、健康食品ないし機能性食品としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のくろずの酢酸エチル抽出物又はくろずもろみ末のメタノール抽出物を有効成分とする抗炎症剤の細胞質ホスフォリパーゼA2阻害活性を示す。
【図２】本発明のくろずもろみ末のメタノール抽出物を有効成分とする抗炎症剤のO2- 産生阻害活性を示す。
【図１】
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【図２】
0004344030.tif 000003