(57)【要約】  本発明は、膵島細胞集団の入手または増殖に関する方法および材料、ならびにこれらの方法によって入手された膵島細胞の糖尿病治療などにおける使用を提供する。本発明では、増殖および脱分化のプロセスにおいて転写因子を用い、その後再分化が行われる。
2017518765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖された膵細胞集団を産生する方法であって、
（ｉ）出発膵細胞集団を提供することと、
（ｉｉ）前記出発膵臓集団の増殖および脱分化を促進する第１条件下で該出発膵細胞集団を培養することと、
（ｉｉｉ）再分化を誘導する第２条件下で、工程（ｉｉ）で得た細胞を培養することと、
（ｉｖ）これによって、増殖された再分化膵細胞集団を入手すること、とを含み、
前記第２条件は、細胞を外因性ＫＬＦ４で処理することを含む、方法。
【請求項２】
前記出発膵細胞集団が、少なくともβ細胞と、さらに膵臓上皮細胞の少なくとも別の１種を含んだ混合細胞集団を含むヒト膵臓材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記出発膵細胞集団が、膵島に富むヒト膵臓画分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖された再分化膵細胞集団が、インスリン発現細胞である膵細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１条件が、接着培養の使用を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２条件が、懸濁培養の使用を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２条件が、血清含有培地の使用を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｉｉｉ）の培養が、４日以上行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２条件が、ＫＬＦ４または細胞内でＫＬＦ４を発現する核酸で細胞を処理することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、アデノウイルスベクターを用いて細胞に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２条件が、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＡＸ６、ＩＡ-１、およびＧＡＴＡ４からなるリストから選択される１つ以上の外因性因子、またはこれらのうちのいずれかを発現する核酸で細胞を処理することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２条件が、ＫＬＦ４処理後に、ＦＯＸＡ１またはＦＯＸＡ２の１つ、あるいはこれらのいずれかを発現する核酸で細胞を処理することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２条件が、亜鉛で処理することを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって入手した、または入手可能な、増殖された再分化膵細胞集団。
【請求項１５】
次のマーカー、すなわち、ＩＮＳ、ＳＳＴのうち少なくとも１つ、最も好ましくはＩＮＳを発現する細胞を含む、請求項１４に記載の集団。
【請求項１６】
入手された前記細胞集団のうち、前記細胞の少なくとも５０％がＥＣＡＤなどの上皮マーカーを発現する、請求項１４または１５に記載の集団。
【請求項１７】
膵臓由来間葉系間質細胞の再分化を誘導するための、ＫＬＦ４またはこれをコードする核酸の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法における、請求項１７に記載のＫＬＦ４またはこれをコードする核酸の使用。
【請求項１９】
患者の糖尿病を治療する方法であって、該方法は、インスリンを発現することができる膵細胞の使用を含み、膵島細胞が請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細胞集団の一部または全てである、治療方法。
【請求項２０】
前記膵細胞を前記患者に移植することを含む、請求項１９に記載の治療方法。
【請求項２１】
前記細胞を、１つ以上の免疫抑制剤とともに前記患者に移植する、請求項２０に記載の治療方法。
【請求項２２】
前記糖尿病が１型糖尿病である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の治療方法において用いられる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細胞集団の一部または全てである、膵細胞。
【請求項２４】
糖尿病の治療用薬剤の調製における、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細胞集団の一部または全てである、膵細胞の使用。
【請求項２５】
前記治療が、請求項１９〜２２に記載されている、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、
（ｉ）ＫＬＦ４またはこれをコードする核酸を含み、かつ、場合によっては、
（ｉｉ）ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＡＸ６、ＩＡ-１、およびＧＡＴＡ４から選択される１つ以上の転写因子、またはこれらをコードする核酸と、
（ｉｉｉ）該方法で用いる指示書、のうちの１つ以上、とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島細胞集団の入手または増殖に関する方法および材料、ならびに該方法によって入手された膵島細胞の糖尿病治療などにおける使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、今や、世界の成人人口の約６％が罹患しており、世界的に蔓延する病気と認識されている。国際糖尿病連合グローバルアトラスによると、その患者数は、２０１１年には３億６千６百万人であり、２０３０年には５億５千２百万人にまで増加すると予測されている。
【０００３】
この病気には、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）という主に２つの病型が存在する。そのどちらも、ランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞数の減少に関連している。
【０００４】
Ｔ１Ｄは、活性化したＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球が膵島に浸潤し、β細胞を選択的に破壊する自己免疫疾患である。通常は幼少期および思春期に発症するが、何歳でも発症しうる。β細胞の破壊は、発症の３〜４年前に始まっており、発症時にはβ細胞塊の最大７０〜８０％がアポトーシスによって失われている。Ｔ１Ｄは、糖尿病の症例のうち５〜１０％を占める。
【０００５】
Ｔ２Ｄは、インスリン抵抗性およびβ細胞の不全が組み合わさった結果発症するものであり、一般に過体重または肥満であることに関連する。インスリンの作用不全により、グルコースおよび脂肪酸の血中濃度が上昇し、次いでβ細胞の機能が影響を受け、やがては炎症性機序によってβ細胞のアポトーシスが増加するため、その治療は特に困難である。患者の大半は中年または高齢者であるが、小児肥満症の増加に伴い、必然的にＴ２Ｄの発症年齢は低下している。
【０００６】
Ｔ１Ｄの場合、自己免疫が確立する前に病気の予防に向けて行われる免疫介入から治療法が生まれることが期待されている（ＴｈｒｏｗｅｒおよびＢｉｎｇｌｅｙ，２０１１）。免疫療法の標的がいくつか同定されてきているが、ワクチンの実用化試験を準備し評価するのには、いまだ大きな課題がある（Ｓｋｙｌｅｒ，２０１３）。
【０００７】
一方、一般的には、閉ループ送達システムまたは膵島移植を重視した、インスリン療法の改善が今後の最良の方法であると受け入れられている。閉ループ送達システムを装着した患者および膵島移植を受けた患者の連続的グルコースモニターデータの比較により、閉ループ送達システムは、膵島移植によって達成することのできる制御レベルには近づき得ないことが示されている。
【０００８】
膵島移植は、主に、膵炎患者の膵臓摘出後の同系移植に関連して、１９９０年代初期から存在している（ＭｃＣａｌｌおよびＳｈａｐｉｒｏ，２０１２）。同系膵島移植の成功率は比較的良好であるが、Ｔ１Ｄを治療するための提供膵島の同種異系移植は、当初から、１年後に機能している移植片は８％であるという成功率の低さに悩まされている。
【０００９】
これは、エドモントンプロトコールが２０００年に導入されたことにより変化した。エドモントンプロトコールは、十分に多くの膵島を移植することと、冷却虚血時間を最小限に抑えることと、免疫抑制療法を変化させること、特に、膵島細胞機能に影響を与えることが知られているステロイドの使用を回避することとを重視したものである（Ｓｈａｐｉｒｏら，２０００）。２０００年のエドモントンプロトコールの導入により、ヒト提供膵島の移植によって、重篤な低血糖を減少させるとともに、外因性インスリン要求性を顕著に減少させ、一時的であってもインスリン非依存性状態へと導くことが可能であることが明らかにされた。
【００１０】
免疫抑制のさらなる改善によって、臨床における膵島移植が著しく発展し、２０１３年の終わりまでに７５０人を越えるＴ１Ｄ患者が移植を受けている。経時的な生着不全についての懸念はいまだ存在しているが、１年成功率は高い（ＭｃＣａｌｌおよびＳｈａｐｉｒｏ，２０１２）。Ｃペプチド陰性であって、重篤な低血糖の症状を発症したことがあり、切迫低血糖の症状を感知する能力の低い患者が優先される。
【００１１】
前記の通り、エドモントンプロトコールの成功は、部分的には大量の膵島（＞１１，０００ＩＥＧ／Ｋｇ）の移植によるものであり、これを達成可能な最良の方法は、多くの場合、複数の提供者（平均２〜３人）から提供された膵島を用いることである。本プロトコールは、大量の提供膵島を入手可能であることに依拠したものであるため、提供材料の不足が重大な問題となる。
【００１２】
したがって、インスリン分泌β細胞を含む（しかしこれに限定されるものではない）膵島材料を提供する新規の方法が、当該分野に寄与することがわかる。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、とりわけ、増殖された膵島細胞の集団を入手するための方法、使用、およびキットを提供する。したがって、本発明は、とりわけ、移植に用いる膵島材料の量を増加させるのに有用である。
【００１４】
ヒト膵島を、長期にわたり接着培養条件下に置くと、膵島中心から線維芽細胞様細胞が遊走することが、以前から知られている（Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４）。この細胞は、増殖して単層を形成することができ、２０継代を越えて培養が可能である。膵島を単一細胞として分散させて播いた場合も同様である（Ｒｕｓｓら，２００８）。線維芽細胞様単層の形成は、インスリンおよび他の内分泌系ホルモンを含む上皮マーカーの消失および間葉系マーカーの獲得を伴い、このことは、膵島が、上皮間葉変換（ＥＭＴ）特性を有する過程を経て脱分化することを示唆している（Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４）。さらに、線維芽細胞様細胞は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の細胞表面マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ７３）を発現しており、線維芽細胞様細胞を誘導して、破骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞へ再分化させることができる。
【００１５】
本発明者は、以前に、４種の膵臓転写因子、すなわちＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４を組み合わせて用いることで、ヒト外分泌性富化細胞（human exocrine-enriched cells）を機能性β様細胞に効率的にリプログラムすることができるということを示している（Ｌｉｍａら，２０１３）。機能性β様細胞を産生する本プロトコールは、ＴＧＦβ１およびＲｈｏキナーゼ阻害剤を組み合わせて用いてＥＭＴを抑制した場合にのみ機能する。他の転写因子が、膵細胞のリプログラムを行う場合もある（Ｚｈａｎｇら，２０１２；Ｊｏｎｇｈｙｅｏｂら，２０１３）。
【００１６】
下記実施例においてより詳細に述べるように、本発明者は、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（ＫＬＦ４）が、予想外に、間葉上皮変換（ＭＥＴ）、すなわち上述したＥＭＴ脱分化プロセスの逆方向のプロセスを誘導することができるということを示した。
【００１７】
ＭＥＴは、上皮マーカーの上方制御（upregulation）および間葉系マーカーの下方制御（down-regulation）によって明らかにされる。
【００１８】
続いて、本発明者は、脱分化した膵臓組織におけるＭＥＴ誘導能により、β細胞由来の間葉系間質細胞と腺房細胞由来の間葉系間質細胞とが、内分泌系および外分泌系へと脱分化する能力という点で機能的に同等であることを示すことができた。
【００１９】
本発明者は、ＭＥＴによって産生されたβ様細胞がインスリンを再び発現することを示した。最初に分化した膵島に富む細胞集団に存在する他の内分泌系マーカーおよび外分泌系マーカーも、元通りとなる。これらの知見は、例えば生体外で脱分化され増殖されたβ細胞などの細胞を、再びβ細胞へ分化させることが可能になると期待させるものである。
【００２０】
これらの知見は、１型糖尿病の治療に対する細胞療法の取り組みに関し重要な意味を持つ。なぜなら、膵島単離手順で残る膵島または膵臓組織の脱分化、増殖、および再分化によって、移植用の膵島を潜在的に無限に供給することができるからである（Ｍｕｉｒら，２０１４）。この結果は、ヒトにおける移植に適した、補充可能なβ細胞集団に対して必要とされる要件の多くに応えることができる可能性を有している。
【００２１】
このように、一態様において、本発明は、例えば本明細書で述べる方法において、ＫＬＦ４を用いた膵臓由来間葉系間質細胞の脱分化（または、特に再分化）の誘導に関する。
【００２２】
Ｙｏｒｉら（２０１０）は、以前に、Ｅカドヘリン遺伝子の発現に対するＫＬＦ４の効果について述べており、ＫＬＦ４が哺乳類上皮細胞におけるＥＭＴを防ぐ役割を担っていると結論づけ、乳癌におけるＫＬＦ４の転移抑制的な役割を示唆している。しかしながら、ＫＬＦ４を用いて膵臓由来間葉系間質細胞を再分化させることを教示または示唆する発表はなされていなかった。
【００２３】
したがって、本明細書では、例えば膵島細胞などの膵細胞を増殖する（expansion）方法を開示する。
【００２４】
より具体的には、本発明の方法は、膵細胞の生体外における増殖を含んでもよい。本方法は、脱分化／ＥＭＴおよび増殖の工程、それに続くＭＥＴ／再分化の工程を含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、本方法では、脱分化した膵細胞を単層中で数千倍に増殖し、その後再分化を誘導することが可能である。
【００２６】
一態様において、本発明は、膵細胞集団の増殖方法を提供し、該方法は、
ａ）増殖および脱分化を促進する条件下で膵細胞集団を培養することと、その後に
ｂ）再分化を誘導することと、
ｃ）再分化した膵細胞を入手すること、とを含む。
【００２７】
本発明はまた、膵細胞を入手する方法を提供し、該方法は、
ａ）膵臓の膵島細胞集団を提供することと、
ｂ）増殖および脱分化を促進する条件下で膵細胞集団を培養することと、その後に
ｃ）再分化を誘導することと、
ｄ）これによって、再分化した膵細胞を入手すること、とを含む。
【００２８】
本発明はまた、増殖された膵細胞集団の産生方法を提供し、該方法は、
（ｉ）出発膵細胞集団（starting pancreatic cell population）を提供することと、
（ｉｉ）出発膵島集団の増殖および脱分化を促進する第１条件下で出発膵細胞集団を培養することと、
（ｉｉｉ）再分化を誘導する第２条件下で、工程（ｉｉ）で得た細胞を培養することと、
（ｉｖ）これによって、増殖された再分化膵細胞集団を入手すること、とを含む。
【００２９】
本発明はまた、膵細胞、または膵細胞集団の入手方法を提供し、該方法は、膵臓由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）の分化を誘導することを含む。
【００３０】
本発明はまた、培養で増殖させた後に膵細胞の再分化を誘導する方法を提供する。
【００３１】
上記の方法および使用（例えば、上述した「第２条件」）における再分化は、ＫＬＦ４（例えば、外因性ＫＬＦ４）存在下で細胞を培養することで誘導することができる。
【００３２】
したがって、本発明はまた、脱分化した膵細胞におけるＭＥＴの誘導方法を提供し、該方法は、ＫＬＦ４である転写／分化因子を発現または提供する核酸調製物またはタンパク質調製物を細胞内に誘導することを含む。
【００３３】
（出発材料）
実施例においてより詳細に述べるように、本発明者は、インスリン陽性β細胞由来またはアミラーゼ陽性腺房細胞由来の間葉系間質細胞のどちらもが、Ａｄ−ＫＬＦ４による誘導を受けて、内分泌系マーカーおよび外分泌系マーカーを発現し、脂肪系および骨形成系へと分化することができるという全ての間葉系間質細胞集団に共通の特徴を有するようになるという点で、機能的に同等であるということを初めて示した。
【００３４】
実施例は、残る膵島または外分泌組織のどちらも、治療に役立つ増殖細胞集団を提供するのに有用であり得ることを明らかにしている。
【００３５】
本発明の方法で用いる細胞は、外分泌系膵細胞および／または内分泌系膵細胞を含んでいてもよい。本発明の方法で用いる細胞は、パッセンジャー間質細胞（passenger stromal cells）を含んでいてもよい。
【００３６】
細胞は、いずれの哺乳類細胞（例えば、霊長類、齧歯類、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコなど）であってもよいが、好ましくは、本発明の方法で用いる細胞は、ヒト膵細胞、例えば上皮細胞などである。好ましい実施形態において、本発明の方法で用いる細胞は、膵島細胞を含む。本発明で用いる膵島細胞は、例えば、ヒトドナー膵臓（human donor pancreases）から得ることができる。
【００３７】
好ましい出発材料は、膵臓の膵島に富んだ（Islet enriched）画分（ＩＥＦ）である。本発明の方法で用いることができる膵島細胞集団は、通常、ベータ細胞（β細胞）を含み、さらに膵臓のアミラーゼ陽性腺房細胞などの腺房細胞、アルファ細胞（α細胞）、および他種上皮細胞を含む場合がある。
【００３８】
出発細胞集団は、本明細書で述べる本発明の方法を実行するための条件下で、生体外にて培養される。
【００３９】
細胞がいったん脱分化すると、これらの細胞は無期限に継代することができるため、死者からの新しい組織が不要となり、これにより本発明で用いる膵細胞が補充可能に供給される。
【００４０】
（本方法で入手可能な細胞）
本方法の好ましい産物は、インスリンｍＲＮＡを発現するβ様細胞である再分化膵島細胞であるか、または再分化膵島細胞を含む。産物は、他の膵臓上皮細胞を含んでいてもよい。上記の通り、本発明者は、β細胞および腺房細胞のどちらからの子孫細胞（descendants）も、ＫＬＦ４によってβ様細胞へと再分化させることができるということを示した。このことは、全ての種類の上皮細胞（潜在性パッセンジャー間質細胞を含む）からの子孫細胞をβ様細胞へと再分化させることができるということを示唆している。
【００４１】
本発明者がその特徴を調べた再分化β様細胞は、天然β細胞に比べてインスリンｍＲＮＡの発現量が少なかったが、それでも、これらの細胞は、例えば糖尿病における治療的介入に依然として有用であると評価されるであろう。特に、補充可能なインスリン産生細胞源は、糖尿病の治療において重要な進歩である。
【００４２】
他の実施形態において、本方法の好ましい産物は、ソマトスタチンｍＲＮＡを発現するδ様細胞である再分化膵島細胞であるか、または再分化膵島細胞を含む。δ様細胞は、ソマトスタチンタンパク質を産生し得る。他の膵臓上皮細胞が、本発明の方法によって入手されてもよい。
【００４３】
他の実施形態において、本方法の好ましい産物は、グルカゴンｍＲＮＡを発現するα様細胞である再分化膵島細胞であるか、または再分化膵島細胞を含む。α様細胞は、グルカゴンタンパク質を産生し得る。
【００４４】
他の態様において、本発明は、本明細書で述べる方法で入手された、または入手可能な膵細胞または膵細胞集団を提供する。さらに、治療法、例えば糖尿病を治療する方法におけるこれらの使用を提供する。
【００４５】
次に、本発明のこれらの実施形態および態様ならびに他の実施形態および態様について、更に詳細に論じる。本明細書の小見出しはいずれも、便宜上つけられただけであって、いかなる点においても本開示を制限することを意図するものではない。
【００４６】
（脱分化）
本明細書で述べる方法の脱分化工程は、上皮間葉変換（ＥＭＴ）と称する場合もある。
【００４７】
上記説明したように、ＥＭＴは、通常は増殖せず非可動な上皮細胞が、増殖および可動の表現型で特徴付けられる間葉細胞（本明細書においては間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）と称することもある。）へと変換されるプロセスである。したがって、ＥＭＴは、上皮ユニットを分解し、間葉細胞の形成における変換のために上皮を再構築するプロセスである。
【００４８】
ＥＭＴによって得られる間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）は、高い増殖能力を有するが、ホルモンは産生しない。このような細胞およびＥＭＴを識別するのに用いるマーカーについては、本明細書中別項でより詳細に説明する。脱分化および増殖を促進するのに適した培養条件についても、本明細書中別項でより詳細に説明する。
【００４９】
（再分化）
本明細書において、再分化は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、分化または間葉上皮変換（ＭＥＴ）と称される場合がある。
【００５０】
ヒト膵島由来ＭＳＣｓを、血清を含む培地から血清を含まない培地へ移すと、該細胞は上皮様細胞クラスターを形成し、少量の内分泌系ホルモンを再発現することが、以前に示されている（Ｄａｖａｎｉら，２００７；Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４）。この効果は、可溶性因子を添加することで、またはＥＭＴシグナル経路の成分を標的とすることで、高めることができる（Ｂａｒら，２００８；Ｂａｒら，２０１２；Ｏｕｚｉｅｌ−Ｙａｈａｌｏｍら，２００６）。
【００５１】
ＫＬＦ４の過剰発現により、ヒト膵細胞種のＭＥＴおよび再分化が開始されるということが、本発明者によって初めて示された。ＭＥＴは、脱分化の逆方向のプロセスである。
【００５２】
遺伝系統追跡（Genetic lineage tracing）研究によって、β細胞由来またはアミラーゼ陽性腺房細胞由来の間葉細胞は、ＫＬＦ４によって、内分泌系および外分泌系のどちらにも再分化させることができるということが明らかにされた。
【００５３】
したがって、本発明の方法は、ＭＥＴを誘導することによる再分化の工程を含む。この工程は、上皮細胞への再分化、より具体的には上述した膵細胞種への再分化を含む。
【００５４】
好ましい実施形態において、本方法は、β細胞への再分化を誘導することを含む。
【００５５】
（ＫＬＦ４の有用性）
本方法において、再分化の誘導は、１つ以上の転写因子を発現または提供する核酸調製物またはタンパク質調製物を細胞内に導入することを含む。特に、再分化の誘導は、ＫＬＦ４を発現または提供する核酸調製物またはタンパク質調製物を細胞内に導入することを含む。
【００５６】
本方法において、再分化の誘導は、１つ以上の転写因子存在下で細胞を培養することを含む。特に再分化の誘導は、ＫＬＦ４存在下で細胞を培養することを含む。本方法が、タンパク質調製物とともに細胞を培養することを含む場合、培養することで、細胞が転写因子を取り込むことが可能になる。
【００５７】
本方法のある実施形態において、再分化の誘導は、細胞をＫＬＦ４のタンパク質調製物と接触させることを含む。
【００５８】
別の実施形態においては、再分化の誘導は、細胞中にＫＬＦ４を発現させることを含む。
【００５９】
「…存在下で細胞を培養する」、「…を含む培地中で細胞を培養する」、「…で細胞を処理する」、「細胞を…と接触させる」、および「…を細胞に導入する」という表現は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、区別なく用いられる。
【００６０】
「細胞中に…を発現させる」という表現は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本発明の方法の工程において「…を発現する核酸を導入する」と区別なく用いられる。
【００６１】
細胞内でＫＬＦ４をコードした核酸を発現させるのに適した発現ベクターの例について、本明細書でより詳細に論じる。
【００６２】
細胞は、１つ以上の転写因子（例えばＫＬＦ４）とともに、２日間〜１０日間以上、例えば２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間、培養されてもよい。好ましい実施形態において、細胞は、転写因子とともに、４日間以上培養される。
【００６３】
１７種のＫｒｕｐｐｅｌ様因子の１つである転写因子ＫＬＦ４は、Ｃ末端に位置し、それぞれが高度に保存されたＨ／Ｃ結合によって隔てられている３つのＣｙｓｔ Ｈｉｓ２ジンクフィンガーで特徴付けられるタンパク質ファミリーのメンバーである。
【００６４】
ヒトＫＬＦ４の核酸配列およびタンパク質配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋのＮＭ＿００４２３５．４、ＮＰ＿００４２２６．３、およびＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４３４７４（バージョン１３２）で入手できる。
【００６５】
ＫＬＦ４は、発生における最終分化からのプロセス、多能状態の維持、および癌の進行に関わっていることが示されている。特に、ＫＬＦ４は、ヒト体細胞をｉＰＳ細胞へリプログラムする役割を果たしていることが示されている。
【００６６】
ＭＥＴは、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、およびｃ−Ｍｙｃを含む転写因子カクテルを用いてマウス線維芽細胞からｉＰＳ細胞を発生させる際の、早期の必須プロセスであると考えられている（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，２００６；Ｌｉら，２０１０；Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら，２０１０）。ＫＬＦ４は、ＭＥＴプロセスにおいて重要であり得る。他の転写因子の非存在下でＫＬＦ４を過剰発現させると、上皮マーカーは著しく上方制御を受けた（Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら，２０１０）。さらに、ＫＬＦ４は、Ｅカドヘリンプロモーターが結合し（Ｋｏｏｐｍａｎｓｃｈら，２０１３；Ｙｏｒｉら，２０１０）、ＳＬＵＧ（Ｌｉｎら，２０１２；Ｌｉｕら，２０１２）およびＪＮＫ１（Ｔｉｗａｒｉら，２０１３）を含むＥＭＴに不可欠な遺伝子の重要な制御因子として働くことが示されている。ＫＬＦ４は、ＥＭＴを経た細胞において著しく下方制御を受ける（Ｌｅｈｅｍｂｒｅら，２００８；Ｔｉｗａｒｉら，２０１３）。
【００６７】
しかしながら、本発明においては、本発明者によって明らかにされた系統特異的分化によって、β細胞または他の膵細胞が、ＭＥＴに必要な経路を標的としながら多能性およびそれに関するリスクを回避することで、補充可能に供給される。
（本方法に有用な他の転写因子）
本発明の方法は、培養中の膵島細胞集団に転写因子を発現または提供することで実行される。２つ以上の転写因子が、再分化試薬として、発現されてもよいし提供されてもよい。この試薬は、ＫＬＦ４からなるものであってもよいし、本質的にＫＬＦ４からなるものでもよいし、２つ以上の転写因子を含んでもよい。
【００６８】
例えば、本発明の方法において（再）分化を誘導する際に、ＫＬＦ４を他の転写因子と組み合わせて用いてもよい。該因子は、膵臓組織由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）におけるＭＥＴの開始、成熟、および／または安定化に影響を与え得る。
【００６９】
ＫＬＦ４と組み合わせて用いてもよい因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＡＸ６、ＩＡ−１、およびＧＡＴＡ４からなるリストから選択され得る。
【００７０】
本文脈における「組み合わせ」は、１つまたは複数の因子をＫＬＦ４と同時にまたは順番に使用することのどちらも含む。
【００７１】
したがって、試薬は、これらの因子のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、または１２個をＫＬＦ４と組み合わせたものからなるかまたは本質的にそれらからなるものであってもよい。
【００７２】
好ましい試薬の１つは、ＫＬＦ４＋ＦＯＸＡ１である。
【００７３】
別の好ましい試薬は、ＫＬＦ４＋ＦＯＸＡ２である
どちらの場合も、この組み合わせを順番に用いるのが好ましい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＫＬＦ４と組み合わせて用いる転写因子は、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。本方法のいくつかの実施形態において、転写因子はＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４を含むが、ＮＫＸ６．１および／またはＮＤ１を含まない。
【００７５】
（培養条件の例）
単離されたヒトランゲルハンス島は、懸濁培養において増殖することなく、長期間、機能的ユニットとして維持することができる（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，１９７６；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９７９）。
【００７６】
前述の通り、ヒト膵島を接着培養条件下に置くと、ＭＳＣｓが発生する。培養増殖間葉系間質細胞は、多様な表現型および機能的な特性を示す、異種混交細胞集団（heterogeneous population of cells）からなり（Ｚａｎｉｎｉら，２０１１）、この異種混交性の程度は、細胞が由来する組織、提供者、および種、単離技術、培養プロトコール、使用培地、ならびに継代数に依存する（Ａｎｋｒｕｍら，２０１４；Ｊａａｇｅｒら，２０１４）。
【００７７】
膵島を培養下におく際に、ＭＳＣｓの由来に関して議論が生じる場合がある。マウスでの遺伝系統追跡研究によって、β細胞は、培養中に脱分化するが、増殖はせず、培養から排除されるということが示された（Ｃｈａｓｅら，２００７；Ｍｏｒｔｏｎら，２００７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，２００７）。しかしながら、遺伝的に追跡された培養ヒトβ細胞は、脱分化し、複製する（Ｌｉｍａら，２０１３；Ｒｕｓｓら，２００８；Ｒｕｓｓら，２００９）。ＭＳＣｓ集団は、脱分化した上皮細胞からＥＭＴのプロセスを経て生じる以外に、パッセンジャー間質細胞からも生じると考えられる。
【００７８】
このことに関係なく、増殖および脱分化を促進する条件についての本発明の実施形態は、好ましくは接着培養条件下で細胞集団を培養することを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、細胞は、ラミニンアイソフォームＬＮ１１１、ＬＮ２１１、ＬＮ３３２、ＬＮ４１１、ＬＮ４２１、ＬＮ５１１、およびＬＮ５２１などのラミニン上で培養される。ラミニンアイソフォームは、ＬＮ５１１またはＬＮ５２１であってもよく、例えばＬＮ５２１である。
【００８０】
増殖工程において、細胞は、血清を含む培地中で培養されてもよい。例えば、細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養されてもよい。
【００８１】
細胞は、長期間、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、またはそれ以上の期間、増殖および分化を促進する条件下で増殖させてもよい。細胞は、長期間、例えば４０日のうち５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日まで、増殖および分化を促進する条件下で増殖させてもよい。細胞は、５〜７日毎に継代されてもよい。
【００８２】
細胞は、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍に増殖するまで、この条件下で培養されてもよい。
【００８３】
細胞がいったん脱分化すると、これらの細胞は無期限に継代することができるため、死者からの新しい組織が不要となる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、再分化は、少ない継代数で誘導されてもよい、すなわち、細胞は、再分化するまでに数回だけ、例えば１〜８回、継代されてもよい。細胞は、再分化が誘導されるまでに、例えば１〜６回、２〜５回、または２〜３回継代されてもよい。細胞は、再分化が誘導されるまでに、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、または８回、継代されてもよい。細胞は、再分化の誘導前に、８回未満、例えば５回未満、継代されてもよい。
【００８５】
本発明者は、懸濁培養によって再分化を向上することができるということを示した。より具体的には、ＫＬＦ４を形質転換した後に懸濁培養することで、コントロールであるＡＤＧＦＰアデノウイルスを用いて形質転換した細胞に比べて、Ｅｃａｄ、Ｅｐｃａｍの発現が向上され、ビメンチンおよびＳＬＵＧの発現が抑制されることが、実施例によって示された（図５）。Ｐｄｘ１、ＮＧＮ３、アミラーゼ、およびＣＫ１９は、全て、懸濁培養下で向上される（図５）。分化状態をモニターするための他の細胞マーカーについて、以下でより詳細に論じる。
【００８６】
本発明者はまた、懸濁培養下での再分化によって、外分泌系および内分泌系の遺伝子発現を維持することができる、すなわち、再分化の一過的性質を克服するということを示した（実施例２；図１６）。
【００８７】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、再分化の誘導は、懸濁培養下で実行される。あるいは、再分化は、接着培養下で実行されてもよい。細胞は、ラミニン上、例えばラミニンコートされたプレート上で培養されてもよい。細胞は、本方法を通して、ラミニン上で培養されてもよい。例えば、細胞は、ラミニンアイソフォームＬＮ５２１を含むか、ＬＮ５２１からなるか、または本質的にＬＮ５２１からなるラミニン上で培養されてもよい。
【００８８】
再分化工程において、細胞は、血清を含まない培地中で、例えば、１％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、および６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩを用いて培養されてもよい。
【００８９】
細胞は、懸濁培養下／接着培養下において、２〜１０日以上、例えば２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間、インキュベートされてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、細胞は、懸濁培養下において、約６〜１０日間、例えば８日間、インキュベートされる。
【００９０】
好ましい実施形態において、細胞は、転写因子による処理の後、約０〜３日間、例えば１日間、２日間、または３日間、懸濁培養下におかれる。好ましくは、細胞は、転写因子（例えばＫＬＦ４を含む）による処理の後、約１日間懸濁培養下におかれる。
【００９１】
他の実施形態において、細胞は、転写因子による処理の後、約０〜３日間、例えば１日間、２日間、または３日間、接着培養下におかれる。細胞は、転写因子（例えばＫＬＦ４を含む）による処理の後、約１日間接着培養下におかれてもよい。
【００９２】
本発明の別の態様は、脱分化（ＭＥＴ）を向上するための懸濁培養条件の使用である。分化は、本明細書で述べるような因子および条件を用いて実行される。
【００９３】
（細胞種マーカー）
本発明の方法において誘導されたＥＭＴおよびＭＥＴは、マーカーおよび形態学的変化を用いて、評価しかつモニターすることができる。ＭＥＴは、上皮マーカーの上方制御および間葉系マーカーの下方制御によって明らかにされ、一方、ＥＭＴは、間葉系マーカーの上方制御および上皮マーカーの下方制御によって明らかにされる。細胞種間の形態学的変化を用いてもよい。
【００９４】
本発明における再分化もまた、内分泌系ホルモン、内分泌系転写因子、膵細胞種への分化を示す腺房マーカーおよび管マーカーの上方制御によって明らかにされる。
【００９５】
代表的なマーカーおよび変化について、以下で説明する。これらのマーカーおよび変化のうち、１つ以上を用いてＭＥＴ／分化をモニターしてもよい。
【００９６】
本発明の方法で入手された膵島細胞は、上方制御された上皮マーカー、下方制御された間葉系マーカー、形態学的変化、上方制御された内分泌系ホルモン、内分泌系転写因子、腺房マーカー、および管マーカーを含む、ＭＥＴに関連するマーカーを１つ以上発現していてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、入手された細胞集団の細胞のうち、少なくとも４０％、少なくとも４５％、特に、少なくとも５０％が、間葉系マーカーに対する分化関連マーカー（例えば上皮マーカー）を発現する。いくつかの実施形態において、入手された細胞集団の細胞のうち、少なくとも４０％、少なくとも４５％、特に、少なくとも５０％が、分化関連マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、本プロセスによって入手された細胞のうち、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％が、ＥＣＡＤを発現する。好ましい実施形態において、入手された細胞のうち、少なくとも約５０％がＥＣＡＤを発現する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で入手された細胞は、インスリンを産生することができるβ様細胞を含む。β様細胞は、ＭＥＴに関連する（さらにインスリンの発現にも関連する）１つ以上のマーカーまたは変化を発現してもよい。いくつかの実施形態において、入手された細胞は、ソマトスタチンを発現するδ様細胞を含む。本発明の方法によって、他の膵臓上皮細胞が入手されてもよい。
【００９９】
いずれの場合でも、例えばリアルタイム定量ＰＣＲを用いて遺伝子発現をモニターすることで、これらのマーカーをモニターすることができる。あるいは、免疫細胞化学、例えば蛍光免疫細胞化学によって、形態学的変化およびマーカーのタンパク質分布を評価することができる。
【０１００】
上皮マーカーは、ＥカドヘリンおよびＥＰＣＡＭを含む。
【０１０１】
間葉系マーカーは、ビメンチン、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、Ｓｎａｉ２（ＳＬＵＧ）およびＺｅｂ−１を含む。
【０１０２】
ＭＥＴにおいて起こる他の変化は、形態学的変化を含む。ＭＥＴの間、細胞は、より丸みのある上皮形態へと変換される。
【０１０３】
膵細胞種への分化に対する他のマーカーは、腺房マーカーであるアミラーゼ、および管マーカーであるＣＫ１９を含む。
【０１０４】
さらに、内分泌系ホルモンであるインスリン（ＩＮＳ）（またはＣペプチド）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、およびグルカゴン（ＧＣＧ）は、膵臓内分泌系細胞への分化に対するマーカーである。具体的には、Ｃペプチドまたはインスリンはβ細胞のマーカーであり、ＳＳＴはδ細胞のマーカーであり、ＧＣＧはα細胞のマーカーである。
【０１０５】
内分泌系転写因子であるＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＰＤＸ１（発達中のβ細胞または成熟したβ細胞に存在する転写因子）も、分化マーカーとして働き得る。
【０１０６】
（亜鉛による処理）
本発明者は、細胞を亜鉛で処理することにより、インスリンｍＲＮＡの発現量およびリプログラム中の細胞におけるＣペプチド含有量の両方が上昇することを示した。
【０１０７】
したがって、好ましい実施形態において、細胞は亜鉛で処理される。例えば、細胞は、ＺｎＣｌ2で処理されてもよい。亜鉛（例えばＺｎＣｌ2）は、転写因子ＫＬＦ４と同時に添加されてもよい。
【０１０８】
亜鉛（例えばＺｎＣｌ2）は、約０．１μＭ〜約１００μＭ、例えば約１μＭ〜約２０μＭ、約５μＭ〜約１５μＭ、約８μＭ〜約１２μＭの濃度で添加されてもよい。好ましくは、亜鉛（例えばＺｎＣｌ2）は、約１０μＭの濃度で添加される。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、膵細胞の分化（ＭＥＴ）を向上するための亜鉛の使用に関し、分化は、本明細書に述べるような因子および条件を用いて実行される。
【０１１０】
（さらなる方法および条件）
実施例１におけるＫＬＦ４の効果は一過性であり、このことは、他の因子または条件を有効に適用することで、ＭＥＴのプログラムが完了され、細胞が上皮状態に維持され得るということを示唆している。このことは、ｉＰＳ細胞へのＯＳＫＭ介在性（OSKM-mediated）リプログラムの際に起こる事象（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，２００６）によく似ており、３つの連続した段階、すなわち開始段階、成熟段階、および安定化段階が確認されている（Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら，２０１０）。ほとんどの研究において、ＫＬＦ４およびある程度のｃ−Ｍｙｃが、開始段階の重要な促進要因であることが示唆されている。同様に、脂肪細胞への分化が誘導された３Ｔ３Ｌ１細胞において、ＫＬＦ４は３０分以内に発現され、誘導開始後約２時間で最大量に達する。ＫＬＦ４は、主要な分化因子であるＣ/ＥＢＰβおよびＰＰＡＲγ２の上流で働いているようである（Ｂｉｒｓｏｙら，２００８）。この非常に早期に見られる発現の一過性パターンは、３Ｔ３Ｌ１細胞においてＫＬＦ４がＭＥＴ促進に果たしている役割と矛盾しない。
【０１１１】
本発明者は、懸濁培養を用いることで、一過性を克服することができるということを示した（実施例２）。
【０１１２】
細胞は、ＫＬＦ４による処理に加えて、他の因子で処理されてもよく、例えばＫＬＦ４の効果を安定化させる（すなわち細胞を上皮状態に維持する）、本明細書で述べるような条件下で培養されてもよい。細胞を他の因子で処理し、かつ／または例えば細胞をβ様細胞へ優先的に再分化させる条件下で培養してもよい。
【０１１３】
例えば、細胞は、この目的のために、ＡＲＸの発現および／または機能の阻害剤で処理されてもよい。細胞は、この目的のために、転写因子であるＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４で処理されてもよい。細胞は、この目的のために、低グルコース濃度で培養されてもよい。細胞は、懸濁培養の代わりに、ラミニン上で培養されてもよい。このような処理の好ましい条件は、本明細書中別項で詳述する。
【０１１４】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、本方法は、
ａ）膵臓膵島細胞集団を提供することと、
ｂ）増殖および脱分化を促進する条件下で膵細胞集団を培養することと、その後に
ｃ）（ｉ）ＫＬＦ４を含み、さらにＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４を含んでいてもよい１つ以上の転写因子で細胞を処理することと、場合によっては
ｉ．細胞をベータセルリン、エキセンジン−４および／またはニコチンアミドとともに培養することと、
ｉｉ．ＡＲＸの発現および／または機能の阻害剤で細胞を処理すること、
とによって再分化を誘導することと、
ｄ）これらによって、再分化した膵細胞を入手することと、を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。
【０１１５】
工程（ｃ）は、低グルコース濃度で実行されてもよい。工程（ｉ）および工程（ｉｉ）は、懸濁培養下で実行されてもよい。
【０１１６】
好ましい培養時間ならびにグルコース濃度および再分化培養などの培養条件は、本明細書中別項で詳述する。代表的な方法を、図１３に詳述する。
【０１１７】
本発明の方法において、細胞の再分化は、ＡＲＸの発現および／または機能の阻害を含んでもよい。好ましくは、細胞は、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４を含むか、これらからなるか、本質的にこれらからなる転写因子でも処理される。
【０１１８】
本方法において、亜鉛（例えばＺｎＣｌ2）は、転写因子（例えばＫＬＦ４およびＰＡＸ４）とともに添加されてもよい。例えば、亜鉛は、ＫＬＦ４、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４とともに添加されてもよい。
【０１１９】
亜鉛（例えばＺｎＣｌ2）は、ＡＲＸを阻害するのと同時に添加されてもよい。いくつかの実施形態において、転写因子による処理、ＡＲＸの阻害、および亜鉛による処理は、すべて同時に行われる。
【０１２０】
ヒトＡＲＸの詳細ならびにそのタンパク質配列およびヌクレオチド配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（受託番号：Ｑ９６ＱＳ３（バージョン１２０））およびＧｅｎｂａｎｋ（受託番号およびバージョン：ＮＭ＿１３９０５８．２）で知ることができる。
【０１２１】
ＡＲＸの発現および／または機能の阻害は、遺伝子の転写、ＲＮＡの成熟、ＲＮＡの翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質の標的への結合を阻害することを含んでもよい。阻害は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたは化合物である阻害剤を用いて行われてもよい。
【０１２２】
遺伝子または核酸の発現に関して用いられる際の「発現」なる語は、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、およびエディティングなどのプロセスによって修飾されるメッセンジャーＲＮＡ、および、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化などによって修飾されたタンパク質（例えばＡＲＸ）を含む。
【０１２３】
ＡＲＸの発現は、転写、または対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸を用いることで阻害されてもよい。アンチセンス核酸は、ＡＲＸ配列の全てまたは一部、あるいはそれと相補的な配列の全てまたは一部を含み得る。アンチセンス配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであり得る。好ましい実施形態において、ＡＲＸの発現は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって阻害される。ウイルスベクターなどのベクターを用いて、ＲＮＡを含む核酸を、細胞内に形質導入することができる。いくつかの実施形態において、細胞はｓｉＲＮＡを用いて形質導入される。ＡＲＸの発現を阻害する方法は、本明細書中別項で、より詳細に論じる。
【０１２４】
ＡＲＸの阻害は、転写因子（例えばＫＬＦ４を含む）による処理中に実行されてもよい。例えば、ＡＲＸの阻害は、転写因子による処理の開始から０〜１日後、１〜２日後、２〜３日後、３〜４日後または４〜５日後、５〜６日後または６〜７日後に実行されてもよい。例えば、転写因子による処理の開始から約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日後でもよい。ＡＲＸの阻害は、転写因子による処理の開始から約６日後、または７日後に実行されてもよい。ＡＲＸの阻害は、再分化工程の開始から約６日後、または７日後に実行されてもよい。
【０１２５】
本発明の方法は、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドのうち１つ以上の存在下で細胞を培養することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドの全て（ＢＥＮ）の存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドのうち１つ以上による処理が、転写因子との培養に続いて行われる。いくつかの実施形態において、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドのうち１つ以上との培養と転写因子との培養は、部分的に重なっている。いくつかの実施形態において、細胞は、転写因子、ならびにベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドのうち１つ以上と同時に培養される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミドのうち１つ以上の存在下で、３〜１０日間、例えば５〜９日間、好ましくは約８日間、培養される。
【０１２７】
ベータセルリン、エキセンジン−４、および／またはニコチンアミドは、転写因子による処理の開始から、約１日後、２日後、または３日後（好ましくは１日後）などの、例えば０〜３日後に添加されてもよい。好ましくは、細胞は、転写因子による処理と部分的に重なっている期間、ベータセルリン、エキセンジン−４、および／またはニコチンアミドの存在下で培養される。例えば、細胞は、転写因子による処理と重複して、８日間ＢＥＮとともに培養されてもよい。
【０１２８】
細胞は、転写因子による処理後、例えば転写因子による処理から約１日後、ベータセルリン、エキセンジン−４、および／またはニコチンアミドを添加した培養液に懸濁されてもよい。
【０１２９】
最近のマウスでの研究によって、グルコース代謝が、β細胞の代償性増殖の重要な制御因子であることが示された（Ｐｏｒａｔら，２０１１）。Ｐｏｒａｔらは、解糖速度に応じて増殖を調整することを含む、β細胞の増殖およびその量の恒常性維持の機構を提案している。
【０１３０】
細胞は、低グルコース濃度で培養されてもよい。細胞は、再分化工程を通して、低グルコース濃度で培養されてもよい。例えば、細胞は、約５〜１５日間または６〜１２日間、例えば８日間、低グルコース濃度で培養されてもよい。
【０１３１】
グルコース濃度レベルは、０〜５ｍＭの間であってもよく、例えば０．５〜４．５ｍＭ、１〜５ｍＭ、１〜４．５ｍＭ、１〜４ｍＭ、１．５〜４．５ｍＭ、１．５〜４ｍＭの間であってもよい。特に、グルコース濃度は、２〜４．５ｍＭ、２〜４ｍＭ、２〜３ｍＭ、の間であってもよい。一実施形態において、細胞は、グルコース濃度が約２．５ｍＭの条件で培養される。
【０１３２】
一態様において、本発明は、細胞を（例えばβ様細胞へ）再分化させるＫＬＦ４の効果を安定化させるための低グルコース培養（例えば濃度が５ｍＭ以下）の使用を提供する。低グルコース濃度培養は、本明細書で述べるリプログラムの方法で用いられる因子および試薬を含む条件と併用されてもよい。
（治療および他の有用性）
本発明の方法で入手された膵島細胞（例えばβ様細胞を含む）を用いることで、好ましくは生体内または生体外において、インスリンを産生してもよい。
【０１３３】
本発明の方法で入手された膵島細胞（例えばα様細胞を含む）を用いることで、好ましくは生体内または生体外において、グルカゴンを産生してもよい。
【０１３４】
前記の通り、エドモントンプロトコールの成功は、部分的には大量の膵島（＞１１，０００ＩＥＧ／Ｋｇ）の移植によるものであり、これを達成可能な最良の方法は、多くの場合、複数の提供者（平均２〜３人）から提供された膵島を用いることである。本明細書で述べる方法によって、たった１人から提供され、培養で増殖された大量の同種異系ＭＳＣｓを再分化させ、多くの糖尿病患者を治療するのに用いることが可能になり得る。本明細書で述べる方法を用いて、臨床的に有効な数のβ様細胞を産生してもよい。
【０１３５】
したがって、本発明の方法で入手された膵島細胞（例えばβ様細胞を含む）は、特に、糖尿病を治療する臨床現場において有用である。
【０１３６】
本方法で入手された細胞集団は、直接用いられてもよいし、場合によっては、例えば臨床用途の細胞集団を調製する工程、または細胞集団をある種の細胞（例えばインスリンを産生可能な細胞）で富化する工程など、さらなる工程に供してもよい。さらに、上皮細胞の一部分を、要求に応じて集団から単離してもよい。
【０１３７】
したがって、本発明は、治療法による治療方法、例えば糖尿病患者を治療する方法で用いるために、本明細書で述べる方法で入手された膵島細胞を含む。
【０１３８】
疾患を治療することに関して本明細書で用いられる「治療」なる語は、通常、疾患の進行の阻害などの所望の治療効果が達成されるヒトの治療および治療法に関し、進行速度の低下、進行速度の停止、疾患の退行、疾患の改善、および疾患の治癒を含む。予防手段としての治療（すなわち予防法、防止策）もまた含まれる。本明細書における「予防法」が、完全な成功、すなわち完全な防護または完全な防止に制限されると理解されるべきではない。むしろ、本文脈における予防法は、特定の疾患を遅らせるか、緩和するか、または予防するのに役立つことで健康を維持する目的で、症候性疾患を検出する前に施される手段を意味する。
【０１３９】
治療される患者は、糖尿病（と診断された）患者を含む。
【０１４０】
本発明における糖尿病の治療は、１型糖尿病の治療、または、例えば膵臓切除後などの、インスリン欠乏に至る他の原因の治療であってもよい。治療は、２型糖尿病の治療であってもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、治療される患者は、Ｃペプチド陰性であってもよい。
【０１４２】
それに加えて、または、その代わりに、患者は、重篤な低血糖の症状を発症しているか、または発症したことがあり、ならびに／あるいは切迫低血糖の症状を感知する能力が低くてもよい。
【０１４３】
治療に効果的な量の膵島細胞を、送達することができる。
【０１４４】
本明細書で用いられる「治療に効果的な量」なる語は、所望の治療法に従って投与される際に、低血糖を自覚するなどの所望の治療効果を生じるのに効果的な受容体またはリガンドの量、または外部インスリンの必要性に依存しない、適度な恩恵／リスク比に相応な受容体またはリガンドの量に関する。
【０１４５】
したがって、本発明はまた、本明細書で述べる方法で入手された膵島細胞を用いる糖尿病の治療方法に関する。
【０１４６】
本発明はまた、糖尿病の治療用薬剤の調製に用いるために、本明細書で述べる方法で入手された膵島細胞の使用に関する。
【０１４７】
本明細書で述べる方法で入手された膵島細胞は、患者に投与されてもよく、例えば、細胞療法に用いられてもよい。本明細書で述べる方法で入手された膵島細胞は、患者に移植されてもよい。このような細胞は、使用前に、例えばカプセルに入れるなどの処理を行ってもよい。細胞は、外部装置内または外部容器内、あるいは埋め込み式の装置内または埋め込み式の容器内で利用されてもよい。
【０１４８】
好ましくは、治療は、エドモントンプロトコールに基づくものであり、場合によっては１つ以上（例えば２つ）の免疫抑制剤（例えばシロリムスおよびタクロリムス）および／または臓器拒絶反応を防止することが意図されるモノクローナル抗体（例えばダクリズマブ）とともに膵島を患者に注入する工程、例えば患者の門脈に注入する工程を含んでいてもよい。この特定のプロトコールは、医師の判断で行われ、この医師はまた、共通の一般的知識を用いて投与量を選択し、熟練した専門家に公知である投与法を選択する。
【０１４９】
（改変体（Variants））
本明細書におけるＫＬＦ４および他の因子への言及は、上述した実施形態に加えて、例えばＫＬＦ４によるＭＥＴの誘導を含む、該因子の特定の機能を実行する能力を保持する配列改変体または断片（例えばアミノ酸長が少なくとも２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、またはそれ以上である断片）も含むと理解される。
【０１５０】
例えば、ヒト以外の改変体を用いてもよい。その例としては、霊長類、齧歯類、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ由来の改変体が挙げられる。
【０１５１】
そのような改変体または断片のいずれも、本発明の方法において、例えば、細胞をＫＬＦ４および／または他の因子と接触させることを含む方法、または細胞内にＫＬＦ４および／または他の因子を発現させる方法のいずれかの方法において、用いてもよい。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、本発明で用いられるＫＬＦ４は、アドジーン社（Addgene）のプラスミド１９７７０内のｃＤＮＡから入手されてもよい。
【０１５３】
アドジーン社のプラスミド内のｃＤＮＡにコードされているタンパク質と本質的な同一性がある、または本明細書において提供されるＫＬＦ４の代表的なアミノ酸配列と本質的な同一性がある、ポリペプチドまたはペプチドが用いられてもよい。同様に、これらのポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列、またはそれらと本質的な同一性があるヌクレオチド配列が、本発明の方法において用いられてもよい。
【０１５４】
２つの配列を（ギャップも許容）最適に整列させた際に、これらの配列が少なくとも約５０％の配列同一性を共有する場合、またはこれらの配列が明確な機能性モチーフを共有する場合、本質的な同一性があると見なす。別の実施形態において、最適に整列させた配列は、特定の領域にわたって少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を共有する場合、本質的な同一性がある（すなわち本質的に同一である）と見なされる。「同一性」なる語は、２つのポリペプチド分子の配列類似性を意味する。整列させた配列の各位置を比較することで、同一性を決定することができる。
【０１５５】
アミノ酸配列間の同一性の程度は、これらの配列が共有する位置、例えばある特定の領域にわたる位置における同一アミノ酸または対応するアミノ酸の数の関数である。同一性を比較するための最適な配列の整列は、当該技術分野で公知の、様々なアルゴリズムを用いて行われてもよく、そのアルゴリズムは、ｈｔｔｐ:／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｉｐにおいて使用可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２による局所ホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８：４４３によるホモロジー整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４による類似性探索方法、およびこれらのアルゴリズムをコンピュータ化して実装したもの（米国ウィスコンシン州マジソンのジェネティクス・コンピュータ・グループ社（Genetics Computer Group)による、ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Wisconsin Genetics Software Package）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなど）を含む。配列の同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０に記載の、（公表された初期設定を用いた）ＢＬＡＳＴアルゴリズムで決定されてもよい。例えば、全国バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）を通じて（インターネットｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｑｉを通じて）使用可能な「ＢＬＡＳＴ２シークエンス（Blast 2 Sequenses）」ツールを、以下の初期設定の「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを選択して用いてもよい：ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ １０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３；ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ ６２；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １。別の実施形態において、当業者は、所与のいずれの配列も容易にかつ適切に整列させ、目視による確認によって配列同一性および／またはホモロジーを推定することができる。
【０１５６】
（阻害方法（Methods of inhibition））
本発明におけるＡＲＸ発現の阻害は、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて行ってもよい。ＡＲＸ遺伝子の発現は、ＡＲＸ遺伝子の発現を特異的に阻害するように、細胞を低分子二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子二重鎖ＲＮＡを産生するベクターまたはコンストラクトと接触させることで（すなわちＲＮＡ干渉、つまりＲＮＡｉ）低下させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、配列が公知の遺伝子の場合は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５７３，０９９号および米国特許第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公報ＷＯ０１／３６６４６、国際特許公報ＷＯ９９／３２６１９、および国際特許公報ＷＯ０１／６８８３６）。
【０１５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンストラクトも、本発明で用いるＡＲＸ遺伝子発現の阻害剤として働くことができる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＲＸのｍＲＮＡと結合し、それによってタンパク質翻訳を防ぐかまたはｍＲＮＡの分解を高めることで、その翻訳を直接妨げるように働き、細胞中のＡＲＸタンパク質の量を低下させて、活性を低下させる。例えば、その配列のうち連続した少なくとも１０塩基の、より好ましくは少なくとも１５塩基（例えば少なくとも２０塩基、２５塩基）の、ＡＲＸをコードするｍＲＮＡ転写産物の配列の固有領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば従来のリン酸ジエステル法によって合成し投与することができる。アンチセンス分子の配列と標的遺伝子または標的メッセンジャーＲＮＡの配列とは、完全に相補的である必要はないが、通常は完全に相補的であることが好ましい。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するアンチセンス技術を用いる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；および米国特許第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【０１５８】
リボザイムも、本発明で用いるＡＲＸ遺伝子発現の阻害剤として働くことができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド化と、それに続く内ヌクレオチド鎖分解性切断（endonucleolytic cleavage）とを含む。これによって、ＡＲＸのｍＲＮＡ配列の内ヌクレオチド鎖分解性を特異的かつ効率的に触媒する人工ヘアピンモチーフまたは人工ハンマーヘッドモチーフ（hairpin or hammerhead motif）リボザイム分子は、本発明の範囲内において有用である。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断サイトは、まず、標的分子のリボザイム切断サイトを綿密に調べることで特定され、典型的には次の配列、ＧＵＡ、ＧｕＵ、およびＧＵＣを含む。いったん特定されると、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る予測された二次構造などの構造的特徴について、切断サイトを含む標的遺伝子の領域に相当する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を評価することができる。候補標的の適合性もまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ribonuclease protection assays）を用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの形成しやすさを試験することで評価することができる。
【０１５９】
ＡＲＸの遺伝子発現の阻害剤として有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるｓｉＲＮＡおよびリボザイムのどちらも、公知の方法で調製することができる。公知の方法には、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成などの、化学合成の技術が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の試験管内（in vitro）または生体内（in vivo）での転写によって産生することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターに組み込ませることができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内安定性および半減期を増大するための手段として導入することができる。可能性がある改変は、分子の５’末端および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列（flanking sequences）を加えること、またはオリゴヌクレチドの主鎖内のリン酸ジエステル結合の代わりにホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルを用いることを含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
（発現ベクター）
本方法が、細胞内に分化因子（例えばＫＬＦ４）を発現させることを含む場合、分化因子をコードする核酸を用いて、細胞を形質移入または形質導入することを含んでもよい。
【０１６１】
一般的に言えば、当業者は、ベクターの構築および組換え遺伝子発現のプロトコールの設計を、十分行うことができる。上述した本発明の構成要素に加えて、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜含む、適切な制御配列を含んだ適切なベクターを選択または構築することができる。さらなる詳細については、例えば、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社）またはカレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）第２版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）社，（１９９５，および定期的な補遺）を参照する。
【０１６２】
分化因子の発現は、発現ベクターからの発現、特に哺乳類発現ベクターからの発現を含んでもよい。発現ベクターは、該因子を発現するのに適切ないかなる構造を有してもよい。理解されるように、適切なプロモーターが、特定の因子のコード領域に、作動可能に連結される。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を活性化する場合は、プロモーターに作動可能に連結される。好ましくは、転写因子はＫＬＦ４である。
【０１６３】
適切な発現システムは、当該技術分野において周知であり、それ自体は本発明の一部を成すことはない。核酸送達システムの特定の例が、ＷＯ２０１２／００６４４０に概説されている。
【０１６４】
ベクターは、プラスミド、コスミド、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えばＹＡＣｓ）を含むが、これらに限定されず、例えば、レトロウイルスベクター（例えばモロニーラット白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するベクター）、レンチウイルスベクター（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、複製可能な形態、複製欠損性形態およびそれらのガトレス形態（gutless forms）を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどが含まれる。
【０１６５】
ウイルスベクターを産生するのに用いることができる好ましいウイルスは、レトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．，１５（３）：２１６〜２２１，１９９２）およびレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３〜２６７，１９９６；Ｚｕｆｉｅｒｅｙら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（９）：８７１〜８７５，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，７１（９）：６６４１〜６６４９，１９９７；米国特許得第６，０１３，５１６号および米国特許第５，９９４，１３６号を参照のこと）。レンチウイルスベクターは、感染に長期のインキュベーション期間を要することで典型的に特徴付けられるレトロウイルスベクターの特殊なタイプである。さらに、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができる。レンチウイルスベクターは、ウイルスのうち、レンチウイルスファミリーのウイルスの核酸骨格に基づく。典型的には、レンチウイルスベクターは、ＳＩＶおよびＨＩＶなどのレンチウイルスの５’ＬＴＲ領域および３’ＬＴＲ領域を含む。レンチウイルスベクターはまた、典型的には、ＳＩＶおよびＨＩＶなどのレンチウイルスのＲｅｖ応答配列（Rev Responsive Element、ＲＲＥ）を含む。レンチウイルスベクターの例としては、Ｄｕｌｌ， Ｔ．ら，“Ａ Ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２（１１）：８４６３〜７１（１９９８）のレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０１６６】
例えば、アデノウイルスベクターを用いて、ヒトＫＬＦのｃＤＮＡを保持してもよい。代表的なベクターは、アドジーン社のプラスミド１９７７０（ａｄ−ＫＬＦ４）である。転写因子が、１つ以上の発現ベクターから共発現されてもよいということは、理解されるであろう。
【０１６７】
本明細書で述べる本発明の態様は、英国特許出願（ＧＢ１４０８５５８．３；代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９６８５５６）に記載の条件、細胞、因子、および方法とともに用いられてもよい。ＧＢ１４０８５５８．３の内容は、参照として本明細書に援用される。特に、ＧＢ１４０８５５８．３に示される実施例および実験データは、参照として本明細書に援用される。
【０１６８】
本明細書で述べる本発明の態様は、本出願と同日に提出された英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６５０８）に記載の条件、細胞、因子、および方法とともに用いられてもよい。英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６５０８）の内容は、相互参照として本明細書に援用される。特に、英国特許出願（代理人参照：ＳＭＫ／ＧＢ６９９６５０８）に示される実施例および実験データは、参照として本明細書に援用される。
【０１６９】
次に、以下の非限定の図および実施例を参照しつつ、本発明についてさらに説明する。これらに鑑みて、本発明の他の実施形態が当業者には想到されるであろう。
【０１７０】
本明細書に引用した全ての参考文献の開示は、当業者が本発明を実行するために用いる限りにおいて、ここで相互参照として本明細書に具体的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】膵島に富む膵細胞は、線維芽細胞様の単層を形成し、接着細胞培養において脱分化する。  Ａ：０日目から６継代までの培養において撮影した位相コントラスト画像。組織培養において１継代から９継代までに収集された細胞における、内分泌系マーカー、上皮マーカー、間葉性マーカー（Ｂ）および多能性マーカー（Ｃ）のＱＲＴ ＰＣＲ解析。データは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを基準として表したものを示す。
【図２】ＫＬＦ４の過剰発現により、上皮マーカーの上方制御および間葉系マーカーの下方制御とともに、形態学的変化が誘導される。  膵島に富む膵細胞クラスターを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養し、接着させ、増殖させた。６継代目（０日）に、細胞をＡｄ−ＫＬＦ４で形質導入し、Ａｄ−ＥＧＦＰ処理した細胞と比較した。Ａ：Ａｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰによる感染後の各時点における形態学的変化を示す位相コントラスト画像。形質導入していない細胞（ＵＴＲ）と比較すると、細胞は、経時的に形態が変化し、外見がより上皮細胞らしくなり、また線維芽細胞らしくなくなっていった。Ｂ：ＱＲＴ／ＰＣＲによる遺伝子発現の確認のために、各時点において細胞を収集した。データは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として表した（ｎ＝３）。ボンフェローニのポストホックテスト（Bonferroni post hoc test）により二要因ＡＮＯＶＡ（two-way ANOVA）を行い、処理群とＡｄ−ＥＧＦＰとを比較した。全ての解析において、*Ｐ＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。膵島に富んだ画分（ＩＥＦ）由来の間葉系間質細胞をＡｄ−ＫＬＦ４を用いて形質導入すると、上皮マーカーであるＥカドヘリンおよびＥｐ−Ｃａｍが増加し、間葉系間質細胞マーカーであるビメンチン、α平滑筋アクチン、およびＳＮＡＩＬ２がＺＥＢ１の増加を伴って減少する。同様のデータは、コントロールであるＡｄ−ＧＦＰでも得られた（データは示さず）。このことは、Ａｄ−ＫＬＦ４が、間葉上皮変換（ＭＥＴ）を刺激しているということを示唆している。Ｃ：Ａｄ−ＫＬＦ４およびコントロールによる形質導入後４日目における、上皮マーカーであるＥカドヘリンおよび間葉系マーカーであるビメンチンの免疫細胞化学染色。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。
【図３】ＫＬＦ４の過剰発現により、内分泌系マーカーおよび外分泌系マーカーの両方の再発現が誘導される。  膵島に富む膵細胞クラスターを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養し、接着させ、増殖させた。６継代目に、細胞をＡｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰで形質導入した。Ａ．遺伝子発現の確認のために、各時点において細胞を収集し、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として（ｎ＝３）、平均値±ＳＥＭで表した。免疫細胞化学のために、４日目にサンプルの固定も行った。Ｂ：アミラーゼおよびＣＫ１９染色。Ｃ：ＣペプチドおよびＥカドヘリン、またはクロモグラニンＡおよびＥカドヘリンの染色。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。Ｄ：多能性マーカーの経時的遺伝子発現。ボンフェローニのポストホックテストにより、全てのＱＲＴ ＰＣＲ解析に対して二要因ＡＮＯＶＡを行い、処理群とＮＡとを比較した。全ての解析において、Ｐ*＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。
【図４】Ｌｅｎｔｉ−ＫＬＦ４処理された細胞において、ＫＬＦ４の効果は一過性であり、Ａｄ−ＫＬＦ４処理された細胞のアポトーシスを誘導する。  脱分化した６継代目の膵島に富む膵細胞を、ｌｅｎｔｉ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ（ＫＬＦ４）およびｌｅｎｔｉ ｅｍＧＦＰ（ｅｍＧＦＰ）で形質導入し、各時点で収集した。Ａ：重要な膵臓マーカーおよび上皮マーカーの経時的遺伝子発現。遺伝子発現の確認のために、各時点において細胞を収集し、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。ボンフェローニのポストホックテストにより、全てのＱＲＴ ＰＣＲ解析に対して二要因ＡＮＯＶＡを行い、処理群とｌｅｎｔｉ−ＧＦＰとを比較した。全ての解析において、Ｐ*＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。Ｂ：開裂カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）は、Ａｄ−ＫＬＦ４処理細胞においてＥカドヘリン（ＥＣＡＤ）と共発現するが、Ａｄ−ＥＧＦＰ処理細胞では共発現しない。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。Ｃ：細胞をＡｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰで形質導入し、４日目に固定した。ＴＵＮＥＬアッセイを行い、その後、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。１回の処理につき１５００より多い核を数え、アポトーシスを起こしたと特定された細胞の全ての細胞に対する割合を計算した。
【図５】懸濁培養によって、Ａｄ−ＫＬＦ４の効果が向上する。  脱分化した６継代目の膵島に富む膵細胞を、Ａｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰ ＫＬＦ４で形質導入し、接着細胞培養条件下で一晩培養した。その後、細胞を、さらに４日間、そのまま接着条件下におくか、またはアキュターゼ（accutase）で剥離させて懸濁に移行させた。Ａ：培養５日目における、処理間の位相コントラスト比較。Ｂ：上皮マーカーおよび間葉系マーカーのＱＲＴ ＰＣＲおよび遺伝子発現解析のためにサンプルを収集し、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。ダンネットのポストホックテスト（Dunnett post hoc test）により、全てのＱＲＴ ＰＣＲ解析に対して一要因ＡＮＯＶＡ（one-way ANOVA）を行い、処理群とＡｄ−ＥＧＦＰコントロールとを比較した。必要であれば、対応のないｔ検定を行った。全ての解析において、Ｐ*＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。ＧＣＧに対するＡｄ−ＧＦＰの特異な効果は、再現できなかった。
【図６】β細胞由来のＭＳＣｓおよび腺房細胞由来のＭＳＣｓは、脂肪細胞系および骨芽細胞系へと分化させることができる。  系統を追跡した腺房細胞由来細胞およびβ細胞由来細胞を、６週間の培養で増殖させた。増殖させたｄｓＲｅｄ+間葉系間質細胞をＦＡＣＳを用いて選別し、さらに２ヶ月培養した。（Ａ）ＤＡＰＩを用いて対比染色した選別後のｄｓＲｅｄ+細胞の形態。選別後の腺房細胞由来間葉系間質細胞（ＡＭＹ−ｄｓＲＥＤ  ＭＳＣｓ）およびβ細胞由来間葉系間質細胞（ＩＮＤ−ｄｓＲｅｄ  ＭＳＣｓ）を、市販の脂肪細胞分化カクテル上で１０日間培養し、脂肪滴を染色した（ＬｉｐｉｄＴｏｘ）。（Ｂ）あるいは、市販の骨芽細胞分化カクテル上で１４日間培養し、オステオカルシンを染色した。
【図７】Ａｄ−ＫＬＦ４は、ＩＮＳ−ｄｓＲｅｄ ＭＳＣｓの内分泌系および外分泌系への分化を誘導する。  Ａ：ＦＡＣＳを用いて選別し、増殖させたＩＮＳ−ｄｓＲＥＤ ＭＳＣｓを、Ａｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰで形質導入し、サンプルを免疫細胞化学のために固定して、Ｅカドヘリン、クロモグラニンＡ、およびＣＫ１９を染色した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。Ｂ：ＱＲＴ ＰＣＲおよび遺伝子発現の確認のためにサンプルを収集し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。Ａｄ−ＫＬＦ４形質導入細胞とＡｄ−ＥＧＦＰ形質導入細胞との間で、対応のないｔ検定を行った。全ての解析において、Ｐ*＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。
【図８】Ａｄ−ＫＬＦ４は、ＡＭＹ−ｄｓＲｅｄ ＭＳＣｓの内分泌系および外分泌系への分化を誘導する。  Ａ：ＦＡＣＳを用いて選別し、増殖させたＡＭＹ−ｄｓＲＥＤ ＭＳＣｓを、Ａｄ−ＫＬＦ４またはＡｄ−ＥＧＦＰで形質導入し、サンプルを免疫細胞化学のために固定して、アミラーゼ、クロモグラニンＡ、およびＣＫ１９を染色した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。Ｂ：ＱＲＴ ＰＣＲおよび遺伝子発現のためにサンプルを収集し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。Ａｄ−ＫＬＦ４形質導入細胞とＡｄ−ＥＧＦＰ形質導入細胞との間で、対応のないｔ検定を行った。全ての解析において、Ｐ*＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。
【図９】未処理のＩＥＦ由来ＭＳＣｓ細胞における内因性ＫＬＦ４の発現、およびＡｄ−ＫＬＦ４で形質導入した細胞における外因性ＫＬＦ４の発現。外因性ＫＬＦ４の発現量は、Ｄ２に最大となり、その後Ｄ１０まで減少する。細胞は、Ａｄ−Ｋｌｆ４で、またはＡｄ−Ｋｌｆ４なしで形質導入され、４日目に免疫細胞化学のために固定された。Ａ：形質導入していない細胞（ＮＡ）におけるＫｌｆ４染色（ＦＩＴＣ露光時間＝１９７８ｍｓ）。Ｂ：Ａｄ−Ｋｌｆ４処理後のＫｌｆ４染色（ＦＩＴＣ露光時間＝４７３ｍｓ）。Ｃ：形質導入後の培養の各時点におけるマウスＫｌｆ４遺伝子発現であり、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として表した（ｎ＝３）。Ｄ：形質導入後４日目に行った、異なるＦＩＴＣ露光時間でのＫｌｆ４染色およびＥカドヘリン（ＥＣＡＤ）染色。スケールバー＝２０μｍ。
【図１０】Ｅカドヘリン（ＥＣＡＤ）陽性細胞は、血清存在下でのａｄ−ＫＬＦ４処理後に、より広範囲に広がる。
【図１１】Ｒｈｏ−キナーゼの阻害は、再分化を向上しない。Ａ：膵島に富む膵細胞を、Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２（２０μＭ）の存在下および非存在下で、ａｄ−Ｋｌｆ４で処理した。感染後１０日目までにサンプルを収集し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として遺伝子発現を測定した（ｎ＝３）。ダンネットのポストホックテストにより、一要因ＡＮＯＶＡを行い、処理群を比較した。全ての解析において、*Ｐ＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。Ｂ：Ｅカドヘリンおよび開裂カスパーゼ３のために、６日目にサンプルを固定して透過処理を行った。
【図１２】ラミニンアイソフォーム５１１および５２２は、膵島由来のＭＳＣｓの付着を向上する。膵島由来のＭＳＣｓは、富化された膵細胞に完全に付着するようになったが、再分化を促進することはない。Ａ：カバーガラスを、ラミニンアイソフォームＬＮ１１１、ＬＮ２１１、ＬＮ３３２、ＬＮ４１１、ＬＮ４２１、ＬＮ５１１、およびＬＮ５２１でプレコートし、その後、膵島由来の間葉系間質細胞を添加した。細胞を播いてから８時間後、およびａｄ−Ｋｌｆ４による感染から４日後に、位相コントラスト画像を撮影した。スケールバー＝１００μｍ。Ｂ：カバーガラスを４日目に固定し、Ｅカドヘリン（ＥＣＡＤ）、Ｃペプチド（ＣＰＥＰ）、および開裂カスパーゼ３を染色した。ＬＮ５２１のデータを、代表的なデータとして示す。矢印は開裂カスパーゼ３染色を示す。スケールバー＝２０μｍ。Ｃ：ラミニンアイソフォーム上でＡｄ−Ｋｌｆ４によって形質導入された細胞を、インスリン（ＩＮＳ）、アミラーゼ（ＡＭＹ）、ＣＫ１９、およびＥＣＡＤの発現の確認のＱＲＴ−ＰＣＲのために、４日目に収集した。データはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６０ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａを基準として、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。ダンネットのポストホックテストにより、一要因ＡＮＯＶＡを行い、処理群を非添加群（ＮＡ）と比較した。全ての解析において、*Ｐ＜０．０５  **Ｐ＜０．０１  ***Ｐ＜０．００１である。
【図１３】継代した膵臓ＭＳＣｓを組織培養皿に播き、ＫＬＦ４およびリプログラムする転写因子で形質導入する。形質導入から１日後、細胞を懸濁培養下におき、ベータセルリン、エキセディン−４、およびニコチンアミドの存在下でさらに８日間培養する。６日目に、懸濁培養細胞をｓｉＡＲＸで形質導入する。その８日間、グルコース濃度を２．５ｍＭに維持する。
【図１４】ＫＬＦ４の発現は、ｅＧＦＰの発現よりも速く減少する。
【図１５】アポトーシスを克服するためのプロトコール。実施例２で用いるプロトコールを説明する。これは、好ましい懸濁培養のプロトコールを表す。
【図１６】懸濁培養がＭＥＴを向上し、内分泌系遺伝子発現および外分泌系遺伝子発現は維持される。
【図１７】ｓｉＡｒｘでリプログラムされた細胞の代表的な電子顕微鏡画像。リプログラムされていない細胞とは異なり、リプログラムされた細胞は、濃密な分泌顆粒に富む（Ａ）。スケールバー＝２μｍ。リプログラムされた細胞における異なる形態を持つ有芯小胞の高倍率画像（ＢおよびＣ）。スケールバー＝０．５μｍ（Ｂ）および０．１μｍ（Ｃ）。
【図１８】ＺｎＣｌ2（１０μＭ）非存在下または存在下における、未処理細胞（Ｎ／Ａ）およびリプログラムされた細胞（ｓｉＡＲＸ）における３つの主な内分泌系ホルモンであるインスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）およびソマトスタチン（ＳＳＴ）、ならびに転写因子であるＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ＮＥＵＲＯＤ、ＮＧＮ３、およびＮＫＸ６．１のＲＴ−ｑＰＣＲ解析。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに対して、発現を正規化した。データは三連の実験（triplicate experiments）の代表値であり、平均±平均の標準誤差で表される。
【図１９】ＺｎＣｌ2（１０μＭ）非存在下または存在下における、未処理細胞（Ｎ／Ａ）およびリプログラムされた細胞（ｓｉＡＲＸ）からの細胞抽出液のＣペプチドＥＬＩＳＡ測定。Ｃペプチド量は、タンパク質含量に対する発現量であり、３±ＳＤ（ｎ＝３）で表される。ＮＡを基準にして***ｐ＜０．００１であり、ｓｉＡＲＸを基準として**ｐ＜０．０１である。
【実施例】
【０１７２】
（要約）
ヒトの、膵島に富む膵細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養し、脱分化させて増殖させた。得られたＭＳＣｓの集団を、ＫＬＦ４を含むアデノウイルス（ａｄ−ＫＬＦ４）で形質導入し、２〜１０日間インキュベートした。リアルタイム定量ＰＣＲによって、遺伝子発現を評価した。形態学的変化およびタンパク質の分布を、免疫細胞化学によって評価した。
【０１７３】
ａｄ−ＫＬＦ４による処理によって、上皮遺伝子であるＥカドヘリンおよびＥＰＣＡＭが再発現した。このことは、形質導入から最大で４８時間後に、間葉系マーカーであるビメンチン、ｓｎａｉ２、およびα−ＳＭＡの発現が減少することと関連していた（全てｐ＝＜０．００１）。分化した膵細胞のマーカーも上方制御され、インスリンは８９１．２％（ｐ＝＜０．０００１）、アミラーゼは１１１７．９％（ｐ＝０．００２）、ＣＫ１９は３８４４％（ｐ＝０．００２）上方制御されたものが含まれていた。内分泌系転写因子であるＮＧＮ３、ＭａｆＡ、Ｎｋｘ６．１、およびＮｅｕｒｏＤ１は、全て顕著に上方制御されていた。
【０１７４】
Ｅカドヘリン、インスリン、アミラーゼ、およびＣＫ１９が染色された細胞が、ａｄ−ＫＬＦ４処理から９６時間後に蛍光免疫細胞化学で観察されたが、コントロール細胞では観察されなかった。遺伝子系統の追跡によって、これらの細胞のうち少なくともいくつかはβ細胞由来であることが確認された。これらの知見は、細胞外で脱分化し、増殖したβ細胞を、ＭＥＴを直接促進することで再分化させることが可能になると期待させるものである。
【０１７５】
（実施例１）
（材料および方法）
（ヒトの膵島に富む膵臓画分の培養）
ヒトの組織は全て、倫理的同意を得て入手された。スコットランド膵島単離研究所（the Scottish Islet Isolation Laboratory）（ＳＮＢＴＳ、エジンバラ、英国）において、脳死状態の成人提供者の膵臓から、ＧＭＰ条件下でヒト膵島を単離した。ヒトへの移植に用いない膵島に富む画分および外分泌系に富む画分をアバディーンに輸送し、すぐに、細胞を、７５cm2組織培養フラスコ（グライナー（Greiner）、ストーンハウス、英国）に密度が３×１０5のクラスターとして播き、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム（全てギブコより入手）、および７５ｍｍｏｌ／Ｌのｂ−メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich）、ドーセット、英国）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（Gibco）、ライフ・テクノロジー（Life Technologies）、ペイズリー、英国）を用いて調製した血清含有培地（ＳＣＭ）で培養した。トリプシン０．０５％およびＥＤＴＡ（０．０２％：ギブコ）を用いて、５〜７日毎に細胞を継代した。
【０１７６】
接着細胞培養を用いて行われた実験においては、１ｃｍ2あたり２．８×１０4個の細胞を播種し、一晩接着後、ＳＣＭをＨＥＰＥＳを含まないＳＣＭに交換した。懸濁培養を必要とする実験においては、接着培養のコントロ−ルと同じ細胞密度で、超低接着プレート（コーニング（Corning））に１ｃｍ2あたり３．１３×１０4個の細胞を播種した。１％ＢＳＡならびに１０μｇ／ｍＬのインスリン、５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、および６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩを用いて、血清を含まない培地（ＳＦＭ）を調製した。
【０１７７】
ラミニンアイソフォームＬＮ１１１、ＬＮ２１１、ＬＮ３３２、ＬＮ４１１、ＬＮ４２１、ＬＮ５１１、およびＬＮ５２１を、スウェーデン、ストックホルムのバイオラミナＡＢ（Biolamina AB）より入手した。
（ＫＬＦ４のウイルスベクター）
マウスＫＬＦ４をコードするプラスミドを、アドジーンのプラスミドリポジトリを通じて入手した（アドジーン・プラスミド１９７７０、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）。該プラスミドを、大腸菌ベクターを用いて増殖し、ピュアリンク（Purelink）（商標）ハイピュア・プラスミド・フィルター精製キット（HiPure Plasmid Filter Purification Kit）（インビトロジェン（Invitrogen）、カタログ番号：１１４７５６５）を用いて単離、精製した。続いて、ＰａｃＩエンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを線状にし、ＨＥＫ２９３Ａ細胞系を用いて増幅した。ウイルス粒子を抽出し、使用前に力価を調べた。ｐＡｄ−ＥＧＦＰも、アドジーンより入手した。アデノウイルス依存性形質導入を、ＳＦＭ中、２５回の多重感染で行った。
【０１７８】
ヒトＫＬＦ４のｃＤＮＡをｐＬｅｎｔｉ６に挿入し、Ｌｖ−ＣＭＶ−ｅｍＧＦＰをコントロールとして、Ｌｖ−ＣＭＶ−ｈＫＬＦ４−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰを作成した。
【０１７９】
（遺伝系統の追跡）
以前に述べたように、遺伝系統の追跡を行った（Ｌｉｍａら，２０１３）。
【０１８０】
（蛍光活性化された細胞の選別）
選別に用いる細胞を、１０分間、ステムプロ（StemPro）（登録商標）アキュターゼ（Accutase）（登録商標）（ライフ・テクノロジー、ペイズリー、英国）中でインキュベートし、その後、ピペッティングによってクラスターをばらばらにした。次いで、細胞を、７０μｍのセルストレーナーに通し、フィコエリスリン５９３／４０フィルターを用いたＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）セルソーター（Cell Sorter）でｄｓＲｅｄ陽性細胞を選別した。次に、集めたｄｓＲｅｄ陽性細胞画分を、さらなる実験に供する前に、さらに８週間、接着培養で増殖させた。
【０１８１】
（脂肪細胞系および骨芽細胞系への分化）
腺房および膵島に由来するｄｓＲｅｄ選別細胞を、２２×２２ｍｍのカバーガラス上に２×１０4個の細胞密度で播種した。該細胞を、ステムプロ骨形成分化培地（StemPro Osteogenesis differentiation medium、ライフ・テクノロジー）存在下で２０日間、またはステムプロ脂肪生成培地（StemPro Adipogenesis medium、ライフ・テクノロジー）存在下で１０日間、培養した。
【０１８２】
（定量ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡをトリゾール（TRIzol）（登録商標）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理した後（どちらもライフ・テクノロジー）、１サンプルあたり１μｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。センシミックス（SensiMix）ＩＩプローブキット（バイオライン（Bioline）、ロンドン、英国）およびタックマン（TaqMan）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステム（Applied Biosystems）ペイズリー、英国）を用い、製造者の説明書に従って、ｑＲＴ−ＰＣＲ用混合物を調製した。ｃＤＮＡを、ロシュ（Roche）のライトサイクラー（LightCycler）４８０（登録商標）を用いて、５０サイクル増幅した。サンプルを用いた実験を三連で行い、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび／または６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３ａ）に対して正規化した。２-ΔΔＣＴ法（Ｂｒｏｄｓｋｙら，１９９９）を用いて、データを解析した。グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）ソフトウェアを用いて統計解析を行い、スチューデントのｔ検定または一要因／二要因ＡＮＯＶＡ、それに続くダンネットのポストホックテストを適宜用いた。
【０１８３】
【表１】
2017518765.tif 000003
【０１８４】
（蛍光免疫細胞化学）
２２×２２ｍｍまたは１３ｍｍ円形カバーガラス上で細胞を培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、氷冷メタノール中で透過処理を行った。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、トリトン（Triton）Ｘ−１００を含むトリス緩衝生理食塩水中、１０％のヤギ血清（ギブコ）を用いて１時間ブロックした。細胞を、適切な一次抗体と一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、二次抗体として、１：４００に希釈したアレクサ・フルオロ（Alexa Fluor）（登録商標）４８８Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはアレクサ・フルオロ（登録商標）５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とインキュベートした。その後、カバーガラスを洗浄し、ＤＡＰＩを含むベクタシールド（VECTASHIELD）（登録商標）ハードセット・マウンティング培地を用いてスライドに載せた。ツァイス（Zeiss）のアクシオ・イメージャー（Axio Imager）Ｍ２を用いて蛍光画像を撮影し、アクシオ・ビジョン（AxioVision）ソフトウェアを用いて照合した。用いた抗体を表２に示す。
【０１８５】
【表２】
2017518765.tif 000004
【０１８６】
（ＴＵＮＥＬアッセイ）
２２×２２ｍｍのカバーガラス上に細胞を播種し、２４時間後にＡｄ−ＫＬＦ４で感染させた。ＵＶ光に１時間暴露した細胞を、ポジティブコントロールとして用いた。アポタグ・フルオレセイン・ダイレクト・インサイチュ・アポトーシス検出キット（ApopTag Fluorescein Direct In Situ Apoptosis Detection kit）（ミリポア（Millipore）、ワトフォード、英国）を用い、製造者の説明書に従って、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ依存性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを行った。細胞数のカウントは、スライド１枚あたり少なくとも７００個の核を含む２枚のスライドにわたって、無作為に選択された１０の領域で行った。ツァイスのアクシオ・イメージャーＭ２蛍光顕微鏡のＦＩＴＣチャンネルを用いて、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を識別した。
（ｓｉＲＮＡに基づくノックダウン）
分化転換細胞におけるＡｒｘのノックダウンを、特定標的小分子阻害ＲＮＡ（specific targeting small inhibitory RNAs）のプール、またはスクランブルコントロール（ダーマコン（Dharmacon）、ラフバラ、英国）を用いたトランスフェクションによって行った。製造者の説明書に従って、ダーマフェクト（Dharmafect）１（ダーマコン）を用いた分化転換のプロトコールの６日目に、１００ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトさせた。
【０１８７】
（結果）
（新たに単離された膵島に富む膵細胞は接着細胞培養中にＥＭＴを経る）
実験に用いた膵島に富む膵細胞（ＩＥＰＣ）は、単離した施設によって膵島の純度が８３％であると示されており、培養前には上皮様のクラスターからなっていた。ジチゾン染色によって、この純度の高さが確認された（図１Ａ）。
【０１８８】
プラスチックの培養皿に播くと、膵島クラスターは培養皿に付着した。２４時間以内に、線維芽細胞様細胞がクラスターから遊走を開始し、培養皿全体にわたって広がる増殖性の単層を形成した（図１Ａ）（Ｇａｌｌｏら，２００７）。この単層は、継代を繰り返すことが可能であった。
【０１８９】
接着細胞培養の初期に、Ｃペプチド陽性細胞が広範囲に広がり、上皮マーカーであるＥカドヘリンと共染色されたが、ビメンチン陽性細胞が膵島内に存在しているものの、ビメンチンとは共染色されなかった。培養１０日目には、Ｃペプチド染色細胞およびグルカゴン染色細胞は少なくなり、グルカゴンの場合は、ビメンチンと共染色されたが、Ｃペプチドとは共染色されなかった（図１Ｂ）。培養の６継代目（約４週間）には、細胞集団は、間葉系間質細胞の単層に類似していた（図１Ａ）。細胞培養初期に、腺房細胞、管細胞、および間葉系間質細胞を含む他の種類の細胞が存在することは、それぞれ、アミラーゼ、ＣＫ１９、およびビメンチンを染色することで確認された（データは示さず）。
【０１９０】
以前の研究（Ｂｅａｔｔｉｅら，１９９７；Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４）と一致して、培養中、経時的に、膵臓マーカーおよび上皮マーカー（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＤＸ１、Ｅカドヘリン、およびＥｐＣＡＭ）は、間葉系マーカー（ビメンチンおよびＳＮＡＩ２（ＳＬＵＧ））の増加を伴いつつ、急激に減少した（図１Ｂ）。これは、細胞が急激な脱分化を受けたという考えに一致するものであった。
【０１９１】
本発明者は、以前に、これらの線維芽細胞様細胞は、間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）に特徴的な表面抗原を発現し、そのＭＳＣｓの特質に一致して、脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞へ分化させることができる（Ｌｉｍａら，２０１３）ということを示している。
【０１９２】
遺伝系統追跡によって、この間葉系の単層は、部分的に、インスリン発現β細胞の上皮間葉変換（ＥＭＴ）に由来するものであることが確認された（図６）。
【０１９３】
本発明者は、新規に播いた膵島において、多能性マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧ）の（ＥＳ細胞に比べると）弱い発現を検出したが、この発現は細胞がＥＭＴを経ると急激に減少し、他の報告（Ｗｈｉｔｅら，２０１１）にあるような、５継代目あたりの一過性の増加も見られなかった（図１Ｃ）。
【０１９４】
（接着培養におけるＫＬＦ４の過剰発現はＭＥＴおよび膵細胞種への再分化を誘導する）
膵島由来のＭＳＣｓでは、免疫細胞化学によって明らかにされたように、核ＫＬＦ４の染色レベルは低かった（図９Ａ）。Ａｄ−ＫＬＦ４は、膵島由来のＭＳＣｓに効率的に取り込まれ（図９Ｂ）、マウス特有ＫＬＦ４遺伝子発現が急激に上方制御されて２日目に最大となり、その後、８日目までに検出不可能な量まで下がっていった（図９Ｃ）。血清存在下では、Ａｄ−ＫＬＦ４は、凝集を伴う顕著な形態学的変化を誘導し、多くの細胞がより丸みのある上皮形態へと変換される（図２Ａ）。上皮マーカーであるＥカドヘリン（ＥＣＡＤ）および上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）の遺伝子発現は、顕著なレベルまで急速に上方制御されて４日目に最大となり、その後６日目にかけて減少した（図２Ｂ）。Ｅカドヘリンが、Ａｄ−ＫＬＦ４形質導入細胞において広範囲に広がっていることが免疫細胞化学によって示されており、陽性細胞はより上皮らしい形態を示していた（図２Ｃ）。
【０１９５】
反対に、間葉系マーカーであるビメンチンおよびα−ＳＭＡ、ならびに転写抑制因子であるＳｎａｉ２の遺伝子発現は、２日目には顕著に下方制御され、その後、さらなる培養でベースラインに向かって増加する（図２Ｄ）。これは、Ｅカドヘリン染色陽性細胞において、ビメンチンの核周辺での再配置を伴っていた（図２Ｃ）。初期の研究（Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４）の知見とは対照的に、培地から血清を除くと、Ｅカドヘリン陽性細胞の数は顕著に減少した（図１０）。要するに、これらのデータは、Ａｄ−ＫＬＦ４処理に応じて起こるＭＥＴの発生に一致する。
【０１９６】
上皮マーカーの上方制御に加え、ＫＬＦ４の過剰発現によって、内分泌系ホルモンであるインスリンおよびソマトスタチン（図３Ａ）ならびに発達中のβ細胞または成熟したβ細胞に存在する膵臓転写因子（ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１、およびＭＡＦＡ）（図３Ａ）が顕著に増加した。興味深いことに、グルカゴンの発現は増加しなかった（図３Ａ）。
【０１９７】
腺房マーカーであるアミラーゼおよび管マーカーであるＣＫ１９の発現量も、顕著に増加した（図３Ｂ）。Ｃペプチド陽性細胞が、免疫細胞化学によって観察されることはまれであったが、汎内分泌系マーカーであるクロモグラニンＡは、Ａｄ−ＫＬＦ４処理後、ずっと見られた（図３Ｃ）。また、免疫細胞化学によって、Ａｄ−ＫＬＦ４処理細胞においては、アミラーゼおよびＣＫ１９の両方を染色した細胞の多くで、アミラーゼおよびＣＫ１９が広範囲に染色されるが、Ａｄ−ＫＬＦ４未処理細胞では染色されないということが明らかになった。同様のアミラーゼおよびＣＫ１９の共発現は、外分泌系に富む細胞の脱分化の際にも観察された（Ｈｏｕｂｒａｃｋｅｎら，２０１１；Ｌｉｍａら，２０１３）。Ａｄ−ＫＬＦ４はまた、多能性因子であるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２の一過性の増加も刺激した（図３Ｃ）。ＫＬＦ４がＮＡＮＯＧの発現を調節し（Ｃｈａｎら，２００９；Ｚｈａｎｇら，２０１０）、一方、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４が間葉系マーカーであるＳＮＡＩ１およびビメンチンの発現を抑制することから、このことは予想外ではなかった。これらの知見は、ＫＬＦ４に誘導されて、ＩＥＦ由来ＭＳＣｓが膵細胞種へ再分化することと一致する。
【０１９８】
ＫＬＦ４効果の一過的性質は、部分的には、非組み込み型のアデノウイルスベクターを使用したことによるものであると考えられた。これに対処するため、本発明者は、宿主ゲノムに組み込まれる、ヒトＫＬＦ４を過剰発現するレンチウイルスベクターを作成した。Ｌｅｎｔｉ−ＫＬＦ４は、Ｅカドヘリン、インスリン、アミラーゼ、およびＣＫ１９の発現増加を誘導したが、グルカゴンの発現増加は誘導しなかった。しかしながら、Ａｄ−ＫＬＦ４コンストラクトで見られたように、これらのマーカーの発現増加は一過的であった（図４Ａ）。これらのデータは、外因性ＫＬＦ４はＭＥＴプロセスを開始させることができるが、上皮の表現型をさらに成熟させかつ安定化させるには他の因子が必要であろうということを一括的に示唆している。Ａｄ−ＫＬＦ４感染細胞においてアポトーシスマーカーであるＣＡＳＰ３およびＥ−ｃａｄの共染色が観察されたことで、これらの因子の必要性を支持するいくらかの証拠が提供されたが（図４Ｂ）、一方、アポトーシスの後期を測定するＴＵＮＥＬアッセイによって、Ａｄ−ＫＬＦ４処理後にアポトーシス細胞の数が顕著に多くなることが明らかになった（図４Ｃ）。
【０１９９】
（懸濁培養で細胞間の接触を促進するとＫＬＦ４による再分化の誘導が向上される）
本発明者は、次に、新規に形成される上皮細胞の生存を促進するように細胞培養環境を調整することで、再分化が向上されると仮定した。初期の実験は、解離された多能性幹細胞のアポトーシスを防ぐのに以前から効果的であり（Ｏｈｇｕｓｈｉら，２０１０）、膵臓外分泌系細胞の脱分化を抑制する（Ｌｉｍａら，２０１３）Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ）Ｙ２７６３２とともにＡｄ−ＫＬＦ４を用いて処理することを含んでいた（Ｂｕｄｄら，１９９３）。しかしながら、処理群間で遺伝子発現に顕著な違いは観察されず（図１１）、したがって、Ｒｈｏキナーゼの阻害は、再分化を向上しない。
【０２００】
本発明者は、次に、ヒト基底膜においてβ細胞と相互作用することが知られているラミニンアイソフォーム（Ｂａｎｅｒｊｅｅら，２０１２）を含む異なるラミニンアイソフォームを用いて培養皿をコーティングすることで、Ａｄ−ＫＬＦ４依存性再分化が向上されるかどうかを検討した。新規に播かれた膵島由来のＭＳＣｓは、ほんの８時間後にラミニンアイソフォームＬＮ５１１およびＬＮ５２１に完全に付着したが（図１２Ａ）、一方、他のアイソフォームへの付着およびガラスへの付着は、著しく長い時間がかかった（たっぷり２４時間）。Ａｄ−ＫＬＦ４形質導入から４日後、ＬＮ５２１コーティングでは優れた付着性が観察されたが、他のアイソフォームでは観察されなかった（図１２Ｂ）。しかしながら、ラミニンアイソフォームのいずれも、インスリン、アミラーゼ、ＣＫ１９、およびＥカドヘリンのＡｄ−ＫＬＦ４による発現を向上しなかった（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。
【０２０１】
血清を含まない培地での懸濁培養によって、膵島由来のＭＳＣｓおよび外分泌系由来のＭＳＣｓの再分化を向上できるということが、以前に示されている（Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら，２００４；Ｒｏｏｍａｎら，２０００）。５日間の懸濁培養によって、上皮様クラスターが形成されるが（図５Ａ）、上皮マーカーおよび間葉系マーカーの発現に対して検出可能な効果はなかった（図５Ｂ）。単層培養においては、Ａｄ−ＫＬＦ４は、上皮マーカー（ＥＣＡＤ；ＥＰＣＡＭ）の発現を増加させ、続いて、その条件下では間葉系マーカー（ビメンチンおよびＳＮＡＩ２（ＳＬＵＧ））の著しい減少も観察される懸濁培養下にＡｄ−Ｋｌｆ４処理細胞をおくと、この効果が著しく向上された（図５Ｂ）。
【０２０２】
インスリン、ソマトスタチン、Ｐｄｘ１、ＮＧＮ３、アミラーゼ、およびＣＫ１９のＡｄ−ＫＬＦ４依存的な発現は、全て、懸濁培養下で向上された（図５Ｂ）。Ａｄ−ＫＬＦ４は、懸濁培養下でのグルカゴンの発現には効果がなかった（図５）。
【０２０３】
これらの結果は、Ａｄ−ＫＬＦ４の、ＭＥＴを誘導する能力ならびに内分泌系膵臓系統および外分泌系膵臓系統への再分化を誘導する能力を、懸濁培養が向上するということを示唆している。しかしながら、培養皿に付着したままの細胞に見られるように、Ａｄ−ＫＬＦ４の効果は一過性であった。
【０２０４】
（β細胞由来のＭＳＣｓおよび腺房細胞由来のＭＳＣｓはＡｄ−ＫＬＦ４処理後に内分泌系統および外分泌系統のどちらにも再分化する）
ＭＥＴを経る膵島由来のＭＳＣｓを、一過的ではあるが誘導する能力によって、膵島由来のＭＳＣｓおよび腺房由来のＭＳＣｓの再分化可能性に関する重要な疑問を呈する機会が与えられた。間葉系間質細胞集団の起源を位置づけるために、インスリンプロモーターまたはアミラーゼプロモーターの制御下にＣｒｅリコンビナーゼを含むアデノウイルス、およびＣＭＶ駆動ｄｓＲＥＤレポーターと、その前にｌｏｘ部位で挟まれた（floxed）発現を妨げる停止カセットを含むレンチウイルスベクターを用いて、遺伝系統の追跡を行った（Hｏｕｂｒａｃｋｅｎら，２０１１；Ｌｉｍａら，２０１３）。細胞を脱分化させて、数回継代した後、ｄｓＲｅｄ陽性細胞をフローサイトメトリーで選別し、増殖させて、インスリン陽性β細胞（ＩＮＳ−ｄｓＲｅｄ間葉系間質細胞）またはアミラーゼ陽性腺房細胞（ＡＭＹ−ｄｓＲｅｄ間葉系間質細胞）のいずれかに由来するほぼ均一な（＞９４％）ＭＳＣｓ集団を得た（図６Ａ）。その後、本発明者は、β細胞または腺房細胞に由来するＭＳＣｓを、脂肪細胞系統および骨芽細胞系統へと分化誘導することができるということを、初めて明らかにすることができた（図６Ｂおよび図６Ｃ）。さらに、Ａｄ−ＫＬＦ４は、Ｅカドヘリン、インスリン、ソマトスタチン、ＣＫ１９、およびアミラーゼを発現する（グルカゴンは発現しない）ＩＮＳ−ｄｓＲｅｄ間葉系間質細胞およびＡＭＹ−ｄｓＲｅｄ間葉系間質細胞を等しい効率で誘導することができた（図７および図８）。これらの結果は、β細胞由来のＭＳＣｓおよび腺房細胞由来のＭＳＣｓが、長期培養後に、内分泌系統および外分泌系統のどちらにも分化する能力を有していることを示す。
【０２０５】
継代数が少ない細胞は、より効率的に再分化し得る。
【０２０６】
（転写因子を用いた処理によってＫＬＦ４の作用によるβ細胞の表現型が安定化され得る）
継代した膵臓ＭＳＣｓを組織培養皿に播き、ＫＬＦ４ならびにリプログラム転写因子であるＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３およびＰＡＸ４で形質導入する。形質導入してから１日後、細胞を懸濁培養下におき、ベータセルリン、エキセンジン−４、およびニコチンアミド（ＢＥＮ）存在下でさらに８日間培養する。６日目に、懸濁培養細胞をｓｉＡＲＸで形質導入する。８日間、グルコース濃度は２．５ｍＭを維持する。
【０２０７】
（実施例２）
（ＫＬＦ４の発現はｅＧＦＰよりも急激に低下する）
ＧＤＤＰＨおよびＲＰＬ１３Ａに対するＫＬＦ４の発現を、Ａｄ−ＫＬＦ４処理後に上述の通り測定した。ＫＬＦ４の発現を、同じくアデノウイルスに導入されたｅＧＦＰコントロールの発現と比較した。
【０２０８】
図１４は、ＫＬＦ４の発現がｅＧＦＰコントロールよりも急激に低下することを示す。これにより、ＫＬＦ４の一過的な発現は、送達方法（アデノウイルス）に起因するものではないということが明らかにされた。ＫＬＦ４は、恐らく、アポトーシスを刺激することで、ある特定の負の効果を細胞に及ぼしている可能性が高い。
【０２０９】
（培養条件（図１５））
細胞を１ｃｍ2あたり３×１０5の密度で播き、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ中で１日培養した。２４時間後、細胞を血清を含まない培地（ＳＦＭ）中でインキュベートした。ＫＬＦ４またはｅＧＦＰをコードするアデノウイルスとともに、細胞を４時間インキュベートし、２５回の多重感染（ＭＯＩ）を行った。血清を含まない培地を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩと交換した。
【０２１０】
懸濁培養−アデノウイルス感染から１日後、細胞をアキュターゼを用いて剥離し、コーニングＵＬＡプレートに移した。感染から２日後、４日後、６日後、および８日後に収集する前に、４時間、細胞を接着プレートに付着させた。
【０２１１】
接着培養−感染から１日後、培地を交換した。感染から２日後、４日後、６日後、および８日後に、サンプルを収集した。
【０２１２】
（懸濁培養はＭＥＴを向上させる）
懸濁培養を用いると、細胞の凝集および接合部を形成するベルトの形成が促進された。懸濁培養によって、ＫＬＦ４のＭＥＴに対する一過的な効果、特に増加を続ける上皮マーカーに対する一過的な効果が克服された。ビメンチンレベルは、この時間経過の間、低下したままであった（図１６Ａ）。
【０２１３】
（内分泌系および外分泌系の遺伝子発現は維持された）
ＫＬＦ−４導入後の内因性の外分泌系因子および内分泌系因子の発現を測定した。これらの因子の発現は、接着培養と比較して、懸濁培養下で維持されていた（図１６Ｂ）。
【０２１４】
（実施例３）
（方法）
（ヒト外分泌系膵臓画分のリプログラム）
ヒト外分泌系画分を解凍して、９ｃｍ2の組織培養皿（グライナー（Greiner）、ストーンハウス、英国）に播き、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（全てギブコより入手）、および７５μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、ライフ・テクノロジー）中で２日間培養した。４８時間後、細胞をＲＰＭＩ１６４０、インスリン−トランスフェリン−セレン（ギブコ）、および１％のウシ血清アルブミン（シグマ）を用いて調製し、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのＹ２７６３２、１μＭの５−アザ−２’デオキシシチジン、および１０ｍＭの酪酸ナトリウム（全てシグマより入手）を添加した血清を含まない培地（ＳＦＭ）中でさらに７２時間インキュベートした。次の日、細胞を、膵臓転写因子であるＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＰＡＸ４をコードするアデノウイルスとともに、４時間インキュベートした。翌日、培地を、１ｎＭのベータセルリン（Ｒ＆Ｄシステム（R&D systems）、アビンドン、英国）、１０ｎＭのエキセンジン−４、および１０ｍＭのニコチンアミド（どちらもシグマより入手）を添加したＳＦＭに交換した。収集前のさらなる６日間は、２日毎に培地を交換した。
【０２１５】
ＡＲＸのノックダウンを、特定標的小分子阻害ＲＮＡのプール、またはスクランブルコントロール（全て、英国ラフバラのダーマコンより入手）を用いたトランスフェクションにより行った。製造者の説明書に従って、ダーマフェクト１（Dharmafect 1、ダーマコン）を用いたリプログラムのプロトコールの６日目に、ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）をトランスフェクトさせた。
【０２１６】
ＺｎＣｌ2を１０μＭの濃度で、リプログラムアデノウイルスおよびｓｉＡＲＸとともに用いた。
【０２１７】
（透過型電子顕微鏡）
アキュターゼ（商標）（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、オックスフォード、英国）を用いて、細胞をプレートから剥離し、続いて、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒドで、一晩、４℃で固定した。続いて、１％四酸化オスミウムで１時間、細胞を後固定し、その後、エポキシ樹脂に包埋した。次に、サンプルを、それぞれ開始濃度が７０％、９５％、および１００％のエタノール洗浄液の系列を用いて２０分間脱水した。次いで、サンプルをエポキシ樹脂に包埋し、モールドの中に置いて、６５℃で４８時間放置して重合させた。ライカウルトラカット（Leica Ultracut）Ｅ（ライカ（Leica）、ウェツラー、ドイツ）で７５〜９０ｎｍの切片を切り取り、フォームバー（formvar）／カーボンコートされたスロットグリッド上に置いた。ＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００ Ｐｌｕｓ ＴＥＭで画像を観察し、ＡＭＴウルトラビュー（UltraVue）カメラ（ウォバーン（Woburn)、マサチューセッツ、米国）を用いて撮影した。
【０２１８】
（結果）
ｓｉＡＲＸを含むプロトコールに従ってリプログラムされたヒト外分泌系細胞の電子顕微鏡観察によって、細胞の一方側に向いている（図１７Ａ）濃密なコア顆粒（dense core granules）の存在を明らかにしたが、このパターンは膵島β細胞に典型的なものである。
【０２１９】
より高倍率では（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）、場合によっては非透過性のハロー（non-opaque halo）に囲まれたはっきりとした濃密なコアを有する顆粒の存在が示され、これはインスリン分泌顆粒に特徴的な性質である。これらの顆粒の濃密なコアは、インスリン−亜鉛六量体の結晶構造の存在に起因するものである。しかしながら、濃密でないコアを有し、ハローを欠いた顆粒も存在していた。
【０２２０】
本発明者は、培地中の亜鉛の欠乏が、これらの中間顆粒形態に寄与し得ると仮定した。このことは、培地中に亜鉛を含むことで、より濃密なコア分泌顆粒が形成されるだけでなく、グルコースに対するインスリン分泌応答およびリプログラムされた細胞のインスリン含有量を向上するということを示唆する。
【０２２１】
（亜鉛は、恐らく、ＰＡＸ４を必要とするメカニズム機構によって、リプログラムされた細胞におけるインスリンｍＲＮＡレベルを上昇させる）
この仮定を検討するために、亜鉛存在下および亜鉛非存在下で細胞をリプログラムし、ＲＴ／ＱＰＣＲで解析した。「方法」で説明したように、転写因子およびｓｉＡＲＸを用いて、細胞をリプログラムした（ｓｉＡＲＸ）。この結果によって、インスリン遺伝子発現に対する亜鉛の顕著な効果が明らかにされたが、これは、部分的には、ＰＡＸ４をコードするｍＲＮＡレベルが上昇したことによるものと考えられる（図１８）。
【０２２２】
（亜鉛はリプログラムされた細胞のインスリン（Ｃペプチド）含有量を増加させる）
さらなる検討によって、亜鉛（ＺｎＣｌ2）が、リプログラムされた（ｓｉＡＲＸ）細胞のインスリン（Ｃペプチド）タンパク質含有量を刺激する効果を有することが示された（図１９）。
【０２２３】
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【図１Ａ】
2017518765.tif 000005
【図１Ｂ】
2017518765.tif 000006
【図１Ｃ】
2017518765.tif 000007
【図２Ａ】
2017518765.tif 000008
【図２Ｂ】
2017518765.tif 000009
【図２Ｃ】
2017518765.tif 000010
【図３Ａ】
2017518765.tif 000011
【図３Ｂ】
2017518765.tif 000012
【図３Ｃ】
2017518765.tif 000013
【図３Ｄ】
2017518765.tif 000014
【図４Ａ】
2017518765.tif 000015
【図４Ｂ】
2017518765.tif 000016
【図４Ｃ】
2017518765.tif 000017
【図５Ａ】
2017518765.tif 000018
【図５Ｂ】
2017518765.tif 000019
【図６】
2017518765.tif 000020
【図７Ａ】
2017518765.tif 000021
【図７Ｂ】
2017518765.tif 000022
【図８】
2017518765.tif 000023
【図９】
2017518765.tif 000024
【図１０】
2017518765.tif 000025
【図１１】
2017518765.tif 000026
【図１２ＡＢ】
2017518765.tif 000027
【図１２Ｃ】
2017518765.tif 000028
【図１２Ｄ】
2017518765.tif 000029
【図１３】
2017518765.tif 000030
【図１４】
2017518765.tif 000031
【図１５】
2017518765.tif 000032
【図１６】
2017518765.tif 000033
【図１７】
2017518765.tif 000034
【図１８】
2017518765.tif 000035
【図１９】
2017518765.tif 000036
【国際調査報告】
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2017518765.tif 000038
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