(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩ：
【化２５】
0004377583.tif 000033
を有する化合物であり、そして以下の化合物：
【表３】
0004377583.tif 000034
の１つから選択される、化合物またはその薬学的に受容可能な塩。
【請求項２】
神経変性疾患、発作における再灌流／虚血または心筋虚血および心臓発作からなる群より選択される疾患を処置するための組成物であって、該組成物は、治療的に有効量の、式ＩＩ：
【化２６】
0004377583.tif 000035
を有し、以下のうちの１つから選択される化合物またはその薬学的に受容可能な塩を含む、組成物：
【表４】
0004377583.tif 000036
。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、ここで前記疾患は、神経変性疾患、発作における再灌流／虚血または心臓発作から選択される、組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物であって、ここで前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンティングトン病、大脳虚血または外傷性損傷、グルタミン酸神経毒性もしくは低酸素症によって引き起こされる神経変性疾患から選択される、組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の組成物であって、ここで前記疾患は、発作における再灌流／虚血または心筋虚血または心臓発作から選択される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本願は、２０００年、１２月５日に出願された米国仮特許出願６０／２５１，４０９に対する優先権を主張し、その内容を本明細書中で参考として援用する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、プロテインキナーゼのインヒビター、特に、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼファミリーのメンバーである、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のインヒビターに関する。ＪＮＫをコードする多数の異なる遺伝子およびアイソフォームがある。ＪＮＫファミリーのメンバーは、環境ストレスおよび炎症誘発性サイトカインに対する応答でのシグナル伝達を調節し、そして多数の異なる障害の媒介において役割を有することに関係があるとされている。本発明はまた、これらのインヒビターを生成するための方法に関連する。本発明はまた、本発明のインヒビターを含む薬学的組成物、ならびに種々の障害の処置および予防においてこれらの組成物を利用する方法を提供する。
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物細胞は、細胞外シグナル調節化キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼおよびｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を含む、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼファミリーのメンバーによって媒介される、活性のシグナル伝達カスケードによる細胞外刺激に応答する。ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、増殖因子、サイトカイン、ＵＶ照射、およびストレス誘導因子を含む、種々のシグナルによって活性化される。ＭＡＰＫは、セリン／スレオニンキナーゼであり、そしてこれらの活性化は、活性化ループにおけるＴｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒセグメントでのスレオニンおよびチロシンの二重リン酸化によって生じる。ＭＡＰＫは、転写因子を含む、種々の基質をリン酸化し、この転写因子は、次に特定のセットの遺伝子の発現を調節し、このようにして、刺激に対する特異的な応答を媒介する。
【０００４】
１つの特に興味深いキナーゼファミリーは、ＪＮＫとしてもまた公知のｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端プロテインキナーゼである。３つの異なる遺伝子、Ｊｎｋ１、Ｊｎｋ２、Ｊｎｋ３は、同定されており、そして少なくとも１０の異なるＪＮＫのスプライシングアイソフォームが、哺乳動物細胞に存在する［Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：２７６０−７０（１９９６）］。ＪＮＫファミリーのメンバーは、炎症誘発性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β））ならびにアニソマイシン、ＵＶ照射、低酸素、および浸透圧ショックを含む環境ストレスによって活性化される［Ｍｉｎｄｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１３３３：Ｆ８５−Ｆ１０４（１９９７）］。
【０００５】
ＪＮＫの下流への基質は、転写因子、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｅｌｋ１、ｐ５３および細胞死ドメインタンパク質（ＤＥＮＮ）を含む［Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：２５８６−９１（１９９８）］。各々のＪＮＫアイソフォームは、異なる親和性でこれらの基質に結合し、このことは、インビボでの異なるＪＮＫの基質特異性によるシグナル伝達経路の調節を示唆する（Ｇｕｐｔａら、前出）。
【０００６】
他のＭＡＰＫに加えてＪＮＫは、癌、トロンビン誘導血小板凝集、免疫不全障害、自己免疫疾患、細胞死、アレルギー、骨粗鬆症、および心臓疾患に対する細胞応答の媒介において役割を有することに関与するとされている。ＪＮＫ経路の活性化に関連する治療の標的は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性関節リウマチ、喘息、変形性関節症、虚血、癌および神経変性疾患を含む。
【０００７】
様々な報告が、肝臓疾患または肝性虚血の発症に関連するＪＮＫ活性化の重要性を詳述してきた［Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：３２６−９（１９９９）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２０：２０１−４（１９９７）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１９４２−５０（１９９８）；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：１０２２−３０（１９９８）］。それ故、ＪＮＫのインヒビターは、種々の肝性障害の処置に有用であり得る。
【０００８】
心臓血管疾患（例えば、心筋梗塞または鬱血性心不全）におけるＪＮＫについての役割はまた、ＪＮＫが種々の形態の心臓ストレスに対する肥厚性応答を媒介することが示されると報告されてきた［Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３：１６７−７８（１９９８）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：１７３１−７（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８０５０−６（１９９７）；Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１６２−７３（１９９６）；Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７８：９４７−５３（１９９６）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：５０８−１４（１９９６）］。
【０００９】
ＪＮＫカスケードはまた、ＩＬ−２プロモーターの活性化を含む、Ｔ細胞活性化において役割を果たすことが、実証されてきた。従って、ＪＮＫのインヒビターは、病理学的免疫応答を変更することにおいて治療的価値を有し得る［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３１７６−８７（１９９９）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３８６７−７７（１９９８）；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：９４１−５３（１９９７）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９８９−９４（１９９６）］。
【００１０】
種々の癌におけるＪＮＫ活性化についての役割もまた確立されており、癌におけるＪＮＫインヒビターの潜在的使用を示唆する。例えば、構成的に活性化されたＪＮＫは、ＨＴＬＶ−１媒介性腫瘍形成に関連する［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１３５−４２（１９９６）］。ＪＮＫは、カポジ肉腫（ＫＳ）において役割を果たし得、これはなぜならば、ＫＳ細胞でのｂＦＧＦおよびＯＳＭの増殖効果が、ＪＮＫシグナル伝達経路のこれらの活性化によって媒介されると考えられるからである［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７９８−８０４（１９９７）］。ＫＳ増殖に関与するとされる他のサイトカインの他の増殖効果（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ−６およびＴＮＦα）もまた、ＪＮＫによって媒介され得る。加えて、ｐ２１０  ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞におけるｃ−ｊｕｎ遺伝子の調節は、ＪＮＫの活性に対応し、このことは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のための処置におけるＪＮＫインヒビターについての役割を示唆する［Ｂｌｏｏｄ  ９２：２４５０−６０（１９９８）］。
【００１１】
ＪＮＫ１およびＪＮＫ２は、種々の組織中で広範に発現される。対照的に、ＪＮＫ３は、脳ならびにより少ない程度で心臓および精巣において選択的に発現される［Ｇｕｐｔａら、前出；Ｍｏｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：６７−７８（１９９５）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３５：４７−５７（１９９６）］。ＪＮＫ３は、カイニン酸によって誘導されるニューロンのアポトーシスに関連付けられており、グルタミン酸神経毒性の病原におけるＪＮＫの役割を示す。成人のヒト脳において、ＪＮＫ３発現は、ＣＡ１、ＣＡ４における錐体のニューロンの小集団、ならびに海馬の鉤状回領域、ならびに新皮質の第３層および第５層に局在化される［Ｍｏｈｉｔら、前出］。急性低酸素症を有する患者のＣＡ１ニューロンは、正常患者の脳組織由来の海馬のニューロンの最小の散在性細胞質染色と比較して、強い核のＪＮＫ３免疫反応性を示した［Ｚｈａｎｇら、前出］。従って、ＪＮＫ３は、海馬におけるＣＡ１ニューロンの低酸素損傷および虚血性損傷に関与するようである。
【００１２】
加えて、ＪＮＫ３は、アルツハイマー病において損傷を受け易いニューロンとともに免疫化学的に同時局在する［Ｍｏｈｉｔら、前出］。ＪＮＫ３遺伝子の破壊は、発作の活性、ＡＰ−１転写活性および海馬のニューロンのアポトーシスにおける効果を含む、興奮毒性のグルタミン酸レセプターアゴニストのカイニン酸に対するマウスの耐性を生じ、このことは、ＪＮＫ３シグナル伝達経路が、グルタミン酸神経毒性の病原における重大な成分であることを示す［Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９：８６５−８７０（１９９７）］。
【００１３】
これらの発見に基づいて、ＪＮＫシグナル伝達（特に、ＪＮＫ３のシグナル伝達）は、アポトーシス誘導神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、癲癇および発作、ハンティングトン病、外傷性脳損傷）ならびに虚血性脳卒中および出血性脳卒中の範囲に関与するとされている。
【００１４】
新しい証拠によって現在、密接に関連するＪＮＫ１アイソフォームおよびＪＮＫ２アイソフォームはまた、下流のアポトーシスへの影響において役割を果たすことが示唆されている。［Ｔｏｕｒｎｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：８７０−８７４（２０００）；Ｍｉｅｌｋｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、９１：４７１−４８３（１９９９）］。それ故、これらのアイソフォームもまた、脳卒中および他のアポトーシス関連疾患を処置するための潜在的に重要な標的である。例えば、３つ全てのＪＮＫアイソフォーム（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３）が、ヒトおよびげっ歯類の成体の脳において発現される。ＪＮＫ３は、上記のように、海馬において局在化され、ここでＪＮＫ１およびＪＮＫ２は、脳の他の区分において発現される。［Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ、７６：１０２５−１０３７（１９９４）；Ｇｕｐｔａら、前出；Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６９：１５６−１６０（１９９４）］。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２を発現する細胞において、Ｊｎｋ１遺伝子の破壊は、Ｊｎｋ２遺伝子の破壊よりもより著しいｃ−Ｊｕｎキナーゼ活性における減少を生じた。しかし、ストレス誘導アポトーシスに対する完全な保護のために、これらの遺伝子の両方が、ノックアウトされるべきであった。［Ｔｏｕｒｎｉｅｒら、前出］。これらの発見の観点において、ＪＮＫ１標的およびＪＮＫ２標的の両方に対して活性であるインヒビターを見出すことが、特に所望される。
【００１５】
ＪＮＫ活性化に関連する種々の状態の処置において有用なＪＮＫ特異的インヒビターを開発するための高度なまだ対処されていない医療のニーズ、特に、これらの状態の大部分のための、現在利用可能な比較的不十分な処置選択肢を考えることが残っている。
【００１６】
ＭＡＰＫを阻害する薬剤（例えば、ｐ３８インヒビター）を同定および開発するために多くの研究がなされてきた。例えば、ＷＯ  ００／３１０６３、ＷＯ  ９８／５２９３７、ＷＯ  ９８／２７０９８およびＷＯ  ９５／３１４５１を参照のこと。しかし、本発明者らの知識では、他の関連するＭＡＰＫに対比して、１つ以上のＪＮＫについて特異的に選択的なＭＡＰＫインヒビターは、示されていない。さらに、本発明者らは、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の両方に対してか、または３つ全ての前述のＪＮＫアイソフォームに対して活性であるインヒビターを知らない。
【００１７】
従って、未だ、ＪＮＫ活性化と関連する種々の状態の処置において有用な、ＪＮＫ１インヒビター、ＪＮＫ２インヒビターおよびＪＮＫ３インヒビターを含む、有効なＪＮＫのインヒビターを開発する大きな必要がある。
【００１８】
（発明の要旨）
本発明の化合物およびこれらの薬学的組成物が、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のインヒビターとして有効であることがここで見出されている。これらの化合物は、一般式Ｉを有し：
【００１９】
【化５】
0004377583.tif 000002
ここで、Ｇは、水素またはＣ１〜３アルキルから選択される小さな基であり、Ｑは、ピリジンまたはピリミジンであり、そしてＲ１〜Ｒ３は、以下に定義されるようなものである。これらの化合物は、ＪＮＫの３つのアイソフォーム（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３）に対して良好な活性、およびｐ３８キナーゼに対して比較的低い活性を示す選択的ＪＮＫインヒビターである。それ故、この化合物は、ＪＮＫ媒介疾患、特に、３つ全てのＪＮＫアイソフォームが関与するとされる神経変性疾患を処置するために有用である。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の化合物は一般式Ｉを有し：
【００２１】
【化６】
0004377583.tif 000003
ここで：
Ｒ１は、水素、ＣＯＮＨ２、Ｔ（ｎ）−Ｒ、またはＴ（ｎ）−Ａｒ１から選択され；
Ｒは、脂肪族基または置換脂肪族基であり；
ｎは０以上であり；
Ｔは、Ｃ（＝Ｏ）、ＣＯ２、ＣＯＮＨ、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ、ＣＯＣＨ２、またはＣＨ２であり；
Ｒ２は、水素、−Ｒ、−ＣＨ２ＯＲ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ＝Ｏ、−ＣＨ２ＳＲ、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＮＨＲ、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ）２、−ＣＨ＝Ｎ−ＯＲ、−ＣＨ＝ＮＮＨＲ、−ＣＨ＝ＮＮ（Ｒ）２、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＲ、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯ２Ｒ、−ＣＨ＝ＮＮＨＳＯ２Ｒ、−アリール、−ＣＨ２（アリール）、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣＯＲ、−ＣＨ２ＮＨＣＯＮＨＲ、−ＣＨ２ＮＨＣＯＮ（Ｒ）２、−ＣＨ２ＮＲＣＯＲ、−ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＣＨ２ＣＯＮＨＲ、−ＣＨ２ＣＯＮ（Ｒ）２、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＨ２（ヘテロシクリル）、または−（ヘテロシクリル）から選択され；
Ｒ３は、水素、−Ｒ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、アラルキル、またはアリールオキシアルキルから選択され；
Ｇは、水素またはＣ１〜３アルキルであり；
Ｑ−ＮＨは、
【００２２】
【化７】
0004377583.tif 000004
であり；
ここでＱ−ＮＨのＨは、必要に応じて、Ｒ、ＣＯＲ、Ｓ（Ｏ）２Ｒ、またはＣＯ２Ｒによって置換され；
Ａは、ＮまたはＣＨであり；
Ａｒ１は、アリール、置換アリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ここでＡｒ１は、必要に応じて、０〜３個のヘテロ原子を含む、部分的に不飽和化されたか、または完全に不飽和化された５〜７員環に縮合され；
ここで、存在する場合は、縮合環を含む、Ａｒ１における各置換可能な炭素原子は、ハロ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｎ（Ｒ）２、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＣＯＮＨＲ、ＮＨＣＯＮ（Ｒ）２、ＮＲＣＯＲ、ＮＨＣＯ２Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮ（Ｒ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｒ、ＳＯＮＨ２、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＨＲ、またはＮＨＳ（Ｏ）２Ｒによって、必要に応じてかつ独立して置換され、そして、ここで縮合環における各飽和化された炭素は、さらに＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ、＝ＮＮＲ２、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＮＨＣＯＲ、＝ＮＮＨＣＯ２Ｒ、＝ＮＮＨＳＯ２Ｒ、または＝ＮＲによって、必要に応じてかつ独立して置換され；そして
ここで、Ａｒ１における各置換可能な窒素原子は、必要に応じて、Ｒ、ＣＯＲ、Ｓ（Ｏ）２Ｒ、またはＣＯ２Ｒによって置換される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、特に示されない限り、次の定義を適用するべきである。本明細書で使用される場合、用語「脂肪族」は、直鎖、分枝鎖または環式のＣ１〜Ｃ１２の炭化水素、好ましくは、完全に飽和されたか、または１つ以上の単位の不飽和を含む１〜６の炭素を意味する。例えば、適切な脂肪族基は、置換もしくは非置換の直鎖、分枝鎖または環式のアルキル、アルケニル、アルキニル基およびこれらのハイブリッド（例えば、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニル）を含むべきである。単独またはより大きな部分の一部として用いられる、用語「アルキル」および「アルコキシ」は、１〜１２個の炭素原子を含む直鎖および分枝鎖の両方をいう。単独またはより大きな部分の一部として用いられる、用語「アルケニル」および「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含む直鎖および分枝鎖の両方を含む。用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」および「ハロアルコキシ」は、１個以上のハロゲン原子と置換され得る場合のアルキル、アルケニルまたはアルコキシを意味する。用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。用語「ヘテロ原子」は、Ｎ、ＯまたはＳを意味し、そして任意の酸化された形態の窒素および硫黄、ならびに４級形態の任意の塩基性窒素を含む。
【００２４】
単独または「アラルキル」におけるような大きな部分の一部として用いられる、用語「アリール」は、５〜１４員を有する芳香族環基（例えば、フェニル、ベンジル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシルおよび２−アントラシル、ならびに複素環式芳香族基またはヘテロアリール基（例えば、２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−オキサジアゾリル、５−オキサジアゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ピリミジル、３−ピリダジニル、３−ピリダジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、５−テトラゾリル、２−トリアゾリル、５−トリアゾリル、２−チエニル、もしくは３−チエニル））をいう。
【００２５】
アリール基はまた、炭素環式芳香族環またはヘテロアリール環が、１つ以上の環に縮合される、縮合多環式芳香族環系を含む。例としては、テトラヒドロナフチル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、ベンゾジアゼピニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキノリニル、イソインドリル、アクリジニル、ベンゾイソキサゾリルなどが挙げられる。本明細書中で使用される場合、１つ以上の炭素環式芳香族環および／もしくはヘテロアリール環がシクロアルキルまたは非芳香族ヘテロシクリルに融合される基（例えば、インダニルもしくはテトラヒドロベンゾピラニル）もまた、用語「アリール」の範囲内に含まれる。
【００２６】
用語「複素環式環」または「ヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）」とは、環に１つ以上のヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、または硫黄）を含む非芳香族環をいう。この環は、五員環、六員環、七員環または八員環および、または別の環に縮合させた環（例えば、シクロアルキルまたは芳香族環）であり得る。実施例としては、３−ｌＨ−ベンズイミダゾール−２−オン、３−１−アルキルベンズイミダゾール−２−オン、２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロピラニル、３−テトラヒドロピラニル、４−テトラヒドロピラニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリノ、３−モルホリノ、４−モルホリノ、２−チオモルホリノ、３−チオモルホリノ、４−チオモルホリノ、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、４−チアゾリジニル、ジアゾロニル、Ｎ−置換ジアゾロニル、１−フタルイミジニル、ベンゾキサン、ベンゾトリアゾール−１−イル、ベンゾピロリジン、ベンゾピペリジン、ベンゾキソラン、ベンゾチオラン、およびベンゾチアンが挙げられる。
【００２７】
本発明の化合物は、部分的に飽和した、または完全に不飽和の、五員環〜七員環（ゼロ〜３つのヘテロ原子を含む）に縮合されている環を含み得る。このような縮合環は、芳香族環または非芳香族環の単環式環であり得、これらの例としては、上記のアリールおよび複素環式環が挙げられる。
【００２８】
アリール基（炭素環式および複素環式）またはアルキル基（例えば、ベンジルまたはフェネチル）は、１つ以上の置換基を含み得る。アリール基の不飽和炭素原子における適切な置換基の例としては、ハロゲン、−Ｒ、−ＯＲ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＲ、保護されたＯＨ（例えば、アシルオキシ）、フェニル（Ｐｈ）、置換されたＰｈ、−ＯＰｈ、置換された−ＯＰｈ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＨＣＯＮＨＲ、−ＮＨＣＯＮ（Ｒ）２、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮ（Ｒ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＳＯＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ２ＮＨＲ、または−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ（ここで、Ｒは、脂肪族または置換された脂肪族である）が挙げられる。
【００２９】
脂肪族または非芳香族複素環式環は、１つ以上の置換基を含み得る。脂肪族または非芳香族複素環式環の飽和炭素における適切な置換の例としては、不飽和炭素（例えば、芳香族環）についての上記に掲載される置換基および以下が挙げられる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ、＝ＮＮＲ２、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＮＨＣＯＲ、＝ＮＮＨＣＯ２Ｒ、＝ＮＮＨＳＯ２Ｒ、または＝ＮＲ。
【００３０】
芳香族環または非芳香族の複素環式環における置換可能な窒素は、必要に応じて、置換される。窒素における適切な置換基としては、Ｒ、ＣＯＲ、Ｓ（Ｏ）２Ｒ、およびＣＯ２Ｒ（ここで、Ｒは、脂肪族または置換された脂肪族である）が挙げられる。
【００３１】
本明細書に記載される化合物のカルボン酸またはエステル部分の、等配電子的置換または生物学的に等配電子的（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）な置換は、本発明の範囲内にある。アイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）（これは、親のカルボン酸またはエステルと類似の生物学的特性を有する新規の化合物を作製するための原子または原子群の交換から生じる）は、当該技術分野において公知である。生物学的配電子的な置換は、物理化学または位相幾何学に基づいている。カルボン酸に対する等配電子的な置換の例は、ＣＯＮＨＳＯ２（アルキル）（例えば、ＣＯＮＨＳＯ２Ｍｅである。
【００３２】
本発明の特定化合物が、互変異性形態または水和物形態（化合物のこのような形態の全てが、本発明の範囲内にある）で存在し得ることは、当業者にとって明らかである。他に述べられない限り、本明細書中に示される構造はまた、この構造の全ての立体化学的形態；すなわち、各々の不斉中心に対するＲ立体配置およびＳ立体配置を含むことを意味する。従って、単一の立体化学的異性体、ならびに本発明の化合物の鏡像異性体およびジアステレオマーの混合物は、本発明の範囲内にある。他に述べられない限り、本明細書中に示される構造はまた、１つ以上の同位体的に富化された原子の存在下でのみ異なる、化合物を含むことを意味する。例えば、本発明の構造（重水素または三重水素による水素の置換、または１３Ｃ−もしくは１４Ｃ−富化された炭素による炭素の置換を除いて）は、本発明の範囲内にある。このような化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析的ツールまたはプローブとして有用である。
【００３３】
本発明の好ましい化合物は、以下の特徴の１つ以上、およびより好ましくは全てを有する：
（ａ）Ｒ１は、水素、Ｔ（ｎ）−ＲまたはＴ（ｎ）−Ａｒｌより選択される；
（ｂ）Ｒ２は、水素、−Ｒ、−ＣＨ２ＯＲ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２（複素環）、−ＣＨ２（置換されたヘテロシクリル）、−（ヘテロシクリル）、または−（置換されたヘテロシクリル）より選択される；
（ｃ）Ｒ３は、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、またはアラルキルより選択される；そして／あるいは
（ｄ）Ｇが、水素またはメチルである。
【００３４】
【化８】
0004377583.tif 000005
本発明の１実施形態は、Ｑがピリミジン環である、処方物Ｉの化合物（上記の処方物ＩＩによって代表される）に関係する。別の実施形態は、Ｑがピリミジン環である、処方物Ｉの化合物（上記の処方物ＩＩＩによって代表される）に関係する。
【００３５】
Ｒ１基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フェニル、シクロへキシル、ピリジル、ナフチル、およびキノリニル（これらの各々は、必要に応じて置換され得る）。Ｒ２基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水素、メチル、アルコキシメチル（例えば、メトキシメチル、メトキシエトキシメチルおよびエトキシメチル）、ベンジルオキシメチル、およびヘテロシクリルメチル（例えば、ピペリジン−１−イルメチル、モルホリン−４−イルメチル、およびテトラヒドロキシフラン−３−イルメチル）（これらの各々は、必要に応じて置換される。Ｒ３基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フェニルおよびベンジル（これらの各々は、必要に応じて置換される）。
【００３６】
以下の表１は、Ｑがピリミジンである、処方物ＩＩの化合物の例を示す。
【００３７】
【表１】
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本発明の化合物は、一般に、以下の一般的なスキームによって、および実施例によって示されるような、アナログ化合物に関して当業者に公知の方法によって調製され得る。
【００３８】
【化９】
0004377583.tif 000012
上記のスキームＩは、ＧおよびＲ２が各々水素である、本発明の化合物を調製するために用いられ得る合成スキームを示す。Ｏｘｏｎｅ（登録商標）は、ペルオキシ一硫酸カリウムである。例示的目的のために、化合物３から化合物５を調製する工程は、シクロへキシル基としてＲ１およびベンジル基としてＲ３を導入する。他のＲ１基およびＲ３基が、他のＲ１アミンおよびＲ３の他のブロミドなどを使用する類似の様式において導入され得ることは、当業者に理解される。
【００３９】
【化１０】
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上記のスキームＩＩは、Ｒ２が水素であり、Ｇが水素以外のものである本発明の化合物を調製するために用いられ得る、合成スキームを示す。
【００４０】
【化１１】
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上記のスキームＩＩＩは、Ｇが水素であり、Ｒ２が水素以外のものである本発明の化合物を調製するための、合成スキームを示す。上記のスキームが、Ｑがピリミジン環である化合物への経路を記載する一方、Ｑがピリミジン環である化合物が類似の様式において調製され得ることは、当業者にとって明らかである。
【００４１】
【化１２】
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上記のスキームＩＶは、ピリミジン環が合成の最後に作製される（工程ｄ）、本化合物の調製の別の経路を示す。
【００４２】
【化１３】
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上記のスキームＶは、本発明の化合物の調製のための代替の経路を示し、ここで、Ｒ２は水素以外である。この反応および標準的な生産状態の後、化合物３４および化合物３６を、精製することなく次の段階で使用した。化合物３５をカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物３７を分取用ＨＰＬＣによって精製した。この経路は、化合物３７について図示されるが、この一般的なアプローチは、他のＧおよびＲ１−Ｒ３基を有する化合物の調製に適用可能であることが、当業者によって理解される。
【００４３】
本発明の化合物は、全部で３つのＪＮＫアイソフォーム（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３）の驚くほど強力なインヒビターであることが見出された。本発明の化合物と最も密接に関係する先行技術の化合物との間の有意な差異は、以下に記載されるように、改善されたＪＮＫ１阻害およびｐ３８活性に対するＪＮＫについての選択性に存在することが見出された。
【００４４】
本発明のＪＮＫインヒビターの活性は、インビトロ、インビボ、または細胞株にてアッセイされ得る。インビトロアッセイは、活性化ＪＮＫのキナーゼ活性かまたはＡＴＰアーゼ活性のいずれかの阻害を測定するアッセイを含む。例えば、下記の試験実施例を参照のこと。代替のインビトロアッセイは、そのインヒビターがＪＮＫに結合する能力を定量化し、そして結合するより前にそのインヒビターを放射標識し、インヒビター／ＪＮＫ複合体を単離し、そして結合した放射標識の量を測定することによってか、または新しいインヒビターを、公知の放射リガンドに結合したＪＮＫとともにインキュベートする、競合実験をすることによってのいずれかで、測定され得る。当業者は、任意のタイプまたはアイソフォームのＪＮＫを使用し得、それは、どのＪＮＫのタイプまたはアイソフォームが阻害されるかに依存する。
【００４５】
ＪＮＫインヒビターまたはその薬学的な塩は、動物またはヒトに投与するための薬学的組成物へと処方され得る。ＪＮＫ媒介状態を処置または予防するために効果的な量のＪＮＫインヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含むこれらの薬学的組成物が、本発明の別の実施形態である。
【００４６】
用語「ＪＮＫ媒介状態］は、本明細書中で使用される場合、ＪＮＫが役割を果たすことが公知である、任意の疾患または他の有害状態を意味する。このような状態としては、限定しないが、以下が挙げられる：炎症性疾患、自己免疫疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、癌、感染症、神経変性疾患、アレルギー、発作における再灌流／虚血、心臓発作、脈管形成障害、臓器低酸素症、血管過形成、心肥大、トロンビン誘発血小板凝集およびプロスタグランジンエンドペルロオキシダーゼシンターゼ−２に関連する状態。
【００４７】
本発明の化合物によって処置または予防され得る炎症性疾患としては、限定しないが以下が挙げられる：急性膵炎、慢性膵炎、喘息、アレルギーおよび成人呼吸窮迫症候群。
【００４８】
本発明の化合物によって処置または予防され得る自己免疫疾患としては、限定しないが以下が挙げられる：糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴズ病、自己免疫性胃炎、糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、アトピー性皮膚炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬または対宿主性移植片病。
【００４９】
本発明の化合物によって処置または予防され得る破壊性骨障害としてとしては、限定しないが以下が挙げられる：骨粗しょう症、変形性関節症および多発性骨髄腫に関連する骨障害。
【００５０】
本発明の化合物によって処置または予防され得る増殖性疾患としては、限定しないが以下が挙げられる：急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性黒色腫、カポージ肉腫、多発性骨髄腫およびＨＴＬＶ−１媒介腫瘍形成。
【００５１】
本発明の化合物によって処置または予防され得る脈管形成障害としては、限定しないが以下が挙げられる：固形腫瘍、眼性血管形成、乳児血管腫。本発明の化合物によって処置または予防され得る感染症としては、限定しないが以下が挙げられる：敗血症、敗血症性ショックおよび細菌性赤痢。
【００５２】
本発明の化合物によって処置または予防され得るウイルス性疾患としては、限定しないが以下が挙げられる：急性肝炎感染（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎を含む）ＨＩＶ感染およびＣＭＶ網膜炎。
【００５３】
本発明の化合物によって処置または予防され得る神経変性疾患としては、限定しないが以下が挙げられる：アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、発作、ハンティングトン病、外傷性脳損傷、虚血性発作および出血性発作、大脳虚血、または外傷性損傷、急性低酸素症、虚血またはグルタミン酸神経毒性を原因とする神経変性疾患（誘導性神経変性疾患を含む）。
【００５４】
「ＪＮＫ媒介状態」はまた、発作における再灌流／虚血、心臓発作、心筋虚血、臓器低酸素症、血管過形成、心臓肥大、肝虚血、肝臓疾患、うっ血性心不全、病的な免疫応答（例えばＴ細胞活性化およびトロンビン誘発血小板凝集を原因とする免疫応答）。
【００５５】
さらに、本発明のＪＮＫインヒビターは、誘発性の炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）タンパク質の発現を阻害し得る。それゆえに、本発明の化合物によって処置され得る他の「ＪＮＫ媒介状態」としては、以下が挙げられる：水腫、痛覚脱失（消失）症、熱および痛み（例えば神経筋の痛み、頭痛、癌の痛み、歯の痛み、および関節炎の痛み）。
【００５６】
本発明の化合物はまた、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（特にＳｒｃおよびＬｃｋ）のインヒビターとして有用である。これらのキナーゼの一般的評論について、ＴｈｏｍａｓおよびＢｒｕｇｇｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１３，５１３；ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＮｉｕ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）７７，８１；ＴａｔｏｓｙａｎおよびＭｉｚｅｎｉｎａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２０００）６５，４９を参照のこと。従って、これらの化合物は、１つ以上のＳｒｃファミリーキナーゼ活性によって影響されることが公知である疾患または状態を処置するために有用である。このような疾患または状態としては、以下が挙げられる：高カルシウム血症、再狭窄、高カルシウム血症、骨粗しょう症、変形性関節症、骨転移の対症療法、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、狼瘡、対宿主性移植片病、Ｔ細胞媒介過敏症疾患、橋本甲状腺炎、ギヤン−バレー症候群、慢性閉塞性肺障害、接触皮膚炎、癌、パジェット病、ぜん息、虚血障害または再灌流障害、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎。Ｓｒｃ活性によって影響される疾患としては、特に以下が挙げられる：高カルシウム血症、骨粗しょう症、変形性関節症、癌、骨転移の対症療法およびパジェット病。Ｌｃｋ活性によって影響される疾患としては、特に以下が挙げられる：自己免疫疾患、アレルギー、慢性関節リウマチおよび白血病。式ＩＩおよび式ＩＩＩの化合物（ここで、Ｒ１はアリールである）は、Ｓｒｃファミリー（特に、ＳｒｃまたはＬｃｋ）に関連する疾患を処置するために特に有用である。
【００５７】
本発明の化合物に加えて、本発明の化合物の薬学的に受容可能な誘導体またはプロドラッグもまた、上記で確認された障害を処置または予防するための組成物にて利用され得る。
【００５８】
「薬学的に受容可能な誘導体またはプロドラッグ」は、レシピエントへの投与の際に、本発明の化合物あるいはその阻害活性代謝産物、または残渣を、直接的または間接的のいずれかで提供し得る、本発明の化合物の任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、エステル塩または他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体またはプロドラッグは、このような化合物を哺乳動物に投与した場合に（例えば、経口投与される化合物を、血液中に、より容易に吸収させることによって）、親種に対して、本発明の化合物のバイオアベイラビリティーを上昇させるか、または、生物学的区画（例えば、脳またはリンパ系）への親化合物の送達を増強する、誘導体またはプロドラッグである。
【００５９】
本発明の化合物の薬学的に受容可能なプロドラッグとしては、限定されないが以下が挙げられる：エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩およびスルホン酸エステル。
【００６０】
本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩としては、薬学的に受容可能な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基から誘導された塩が挙げられる。適切な酸性塩の例としては、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に受容可能ではないが、本発明の化合物およびその薬学的に受容可能な酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において利用され得る。
【００６１】
適切な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書中に開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基）の四級化（ｑｕａｔｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ）を想定する。水溶性産物または油溶性産物あるいは水分散性産物または油分散性産物が、このような四級化（ｑｕａｔｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ）によって得られ得る。
【００６２】
これらの薬学的組成物中に使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、限定しないが、以下が挙げられる：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂。
【００６３】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、鼻に、頬に、膣に、または移植レザバーを介して投与され得る。用語「非経口的」は、本明細書中で使用される場合、以下を包含する：皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包、胸骨下、髄腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内への、注射技術または注入技術。好ましくは、この組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に、投与される。
【００６４】
本発明の組成物の滅菌した注射可能形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて、当該分野において公知の技術に従って処方され得る。この滅菌した注射可能な調製物はまた、無毒な薬学的に受容可能な希釈剤または溶媒中の、滅菌した注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であり得る。利用し得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の間に、水、リンガー溶液、および塩化ナトリウム等張液が存在する。さらに、滅菌した不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として慣習的に利用される。この目的のために、刺激性の低い任意の不揮発性油（合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む）が、利用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、特に、それらのポリオキシエチル化型では、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油）であるので、注射可能な調製物において有用である。これらの油溶液または油懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または長鎖アルコール分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に受容可能な投薬形態の処方物において一般に使用される）同様の分散剤を含み得る。薬学的に受容可能な固体、液体、または他の投与形態の製造において一般的に使用される他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤）またはバイオアベイラビリティー増強剤もまた、処方目的のために使用され得る。
【００６５】
任意の経口的に受容可能な投与形態にて、経口投与し得る本発明の薬学的組成物としては、限定しないが、以下が挙げられる：カプセル、錠剤、水性懸濁液または水溶液。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、代表的に添加される。カプセル形態での経口投与に関して、有用な希釈材としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用に必要とされる時、活性成分は、乳化剤および懸濁剤と併用される。所望であるなら、特定の甘味料、矯味矯臭剤または着色料もまた、添加し得る。
【００６６】
あるいは、本発明の薬学的組成物は、直腸投与のために坐剤の形態として投与され得る。これらは、適切な非刺激性の賦形剤と薬剤を混合することによって調製され得、ここで賦形剤は、室温において固体であるが、直腸温度では液体であり、従って賦形剤は直腸において薬物を放出するために融解する。このような材料として、カカオ脂、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００６７】
本発明の薬学的組成物はまた、特に処置の標的が、局所的な適用によって容易に接近可能な領域または器官（目の疾患、皮膚の疾患、または腸管下部の疾患が挙げられる）を含む場合、局所的に投与され得る。適切な局所的処方物は、これらの各領域または各組織に対し、容易に調製される。
【００６８】
腸管下部に対する局所的な適用は、直腸坐剤処方物（上を参照のこと）または適切な浣腸剤処方物としてもたらされ得る。局所的な経皮パッチはまた、使用され得る。
【００６９】
局所的な適用のために、この薬学的組成物は、適切な軟膏として処方され得、ここで軟膏は、１つ以上のキャリア中に懸濁されまたは溶解されている活性成分を含有する。本発明の化合物の局所投与のためのキャリアは、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、この薬学的組成物は、適切なローション剤またはクリームとして処方され得、ここでローション剤またはクリームは、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されまたは溶解されている活性成分を含有する。適切なキャリアとして、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう（ｃｅｔｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｗａｘ）、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
眼科の使用のために、薬学的組成物は、等張の、ｐＨが調整された滅菌食塩水中に微粉化された懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウム物のような保存薬を有するもしくは有さない、等張の、ｐＨが調整された滅菌食塩水中に溶液として、処方され得る。あるいは、眼科の使用のために、薬学的組成物は、ワセリンのような軟膏中に処方され得る。
【００７１】
本発明の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、薬学的処方の分野で周知の技術に従って調製され、かつベンジルアルコールあるいは他の適切な保存薬、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用する、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００７２】
単回の投薬形態を生成するためのキャリア材料と組み合され得るＪＮＫインヒビターの量は、処置される対象、投与の特定の様式に依存して変わる。好ましくは、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日のインヒビターの投薬量が、これらの組成物を受容する患者に対し投与され得るように、組成物は、処方されるべきである。
【００７３】
任意の特定の患者のための具体的な投薬量および処置レジメンは、種々の要因に依存することが理解され、ここで要因として、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性、食事、投与時間、排出の速度、薬物の組合せ、および処置する医師の判断ならびに処置される特定の疾患の重症度が挙げられる。インヒビターの量はまた、組成物中の特定の化合物に依存する。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、ＪＮＫに媒介される状態を処置または予防するための方法を提供し、ここでこの方法は、上記された薬学的組成物の一つを患者に投与する工程を包含する。用語「患者」は、本明細書中において使用する場合、動物、好ましくはヒトを意味する。
【００７５】
好ましくは、この方法は、以下の群から選択される状態を処置または予防するために使用される：炎症性の疾患、自己免疫疾患、骨破壊障害、増殖性障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、感染性疾患、変性疾患、神経変性疾患、アレルギー、発作における再灌流／虚血、心臓発作、脈管形成障害、器官の低酸素症、血管過形成、心臓肥大、およびトロンビン誘導型血小板凝集、または上記された特定のいずれかの疾患もしくは障害が挙げられる。
【００７６】
処置されるかまたは予防されるべきＪＮＫに媒介される特定の状態に依存して、この状態を処置または予防するために通常投与される、付加的な薬物が、本発明のインヒビターとともに投与され得る。例えば、化学療法剤または他の抗増殖性因子が、増殖性の疾患を処置するために本発明のＪＮＫインヒビターと組み合され得る。
【００７７】
これらの付加的な薬剤は、ＪＮＫインヒビターを含有する組成物から、複数の投薬量レジメンの一部として、別々に投与され得る。または、これらの薬剤は、単一の組成物中のＪＮＫインヒビターとともに混合される、単一投薬形態の一部であり得る。
【００７８】
本明細書中に記載された発明がより完全に理解され得るために、以下の実施例が、示される。これらの実施例は、例示の目的としてのみ示され、いかなる方法によっても本発明を限定すると解釈されないことが理解される。
（実施例１）
【００７９】
【化１４】
0004377583.tif 000017
（４−［１−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−メタンスルファニル（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆａｎｙｌ）−ピリミジン）
攪拌棒を備えた２５ｍＬ丸底フラスコに、４００ｍｇ（２．０４ｍｍｏｌ、１．００当量）の２−（２−メタンスルファニル−ピリミジン−４−イル）−マロンアルデヒド（Ｂｒｏｗｎら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．３３（１０）、２２９１−２２９８、１９８０に従って得られた）、４００ｍｇの２，４−ジフルオロフェニルヒドラジン（２．７８ｍｍｏｌ、１．３６当量）および１０ｍＬのメタノールを入れた。得られた溶液を、６５℃で１２時間攪拌し、ついで、黄色い油状物へと濃縮し、この黄色い油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２、１５×１ｃｍ）により精製し、黄色い泡状物として生成物３１５ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ、収率５０．７％）を得た。
【００８０】
（実施例２）
【００８１】
【化１５】
0004377583.tif 000018
（４−［１−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−メタンスルホニル−ピリミジン）
メタノールと水との１：１混合物２０ｍＬ中の３１５ｍｇの４−［１−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−メタンスルホニル−ピリミジン（１．０４ｍｍｏｌ、１当量）の攪拌した溶液に、単一部分として５００ｍｇのＯｘｏｎｅ（登録商標）を加えた。反応混合物を、１２時間、２５℃で攪拌し、ついでＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分けた。水層を、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて２度洗浄し、そして有機層（ｏｒｇａｉｎｃ  ｌａｙｅｒ）を合わせて、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥した。溶液を、黄色の固形物を得るために濃縮し、これをさらなる精製なしに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ８．８０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ａｒ）、８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ａｒ）、８．３１（１Ｈ，ｓ，Ａｒ），７．９０−７．８９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ａｒ）、７．０７−７．０３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、３．３９（３Ｈ，ｓ，ＳＣＨ３）ｐｐｍ。
【００８２】
（実施例３）
【００８３】
【化１６】
0004377583.tif 000019
（シクロヘキシル−｛４−［１−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−ピリミジン−２−イル｝−アミン）
攪拌棒を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した２６５ｍｇ（０．７８７ｍｍｏｌ、１当量）の４−［１−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−メタンスルホニル−ピリミジンを入れた。攪拌した溶液に、１００μＬのシクロヘキシルアミン（８６．７ｍｇ、０．８７４ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。得られた溶液を、８５℃に加熱し、１２時間攪拌した。次いで、オレンジ色の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２と水の間で分けた。水層に対し、２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて２度抽出を行い、有機質層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥し、そして濃縮し黄色の油状物とした。ここで、この黄色の油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ、  Ｒｆ＝０．２）によって精製し、泡状物として３５ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ、収率１２．５％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ８．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ａｒ）、８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ａｒ）、８．１１（１Ｈ，ｓ，Ａｒ）、７．８３−７．７９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ）、６．９７−６．９４（２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、６．６４（１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ａｒ）、５．０４（１  Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＮＨ）、３．８２−３．８０（１Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ），２．０１−１．９７（３Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ）、１．７０−１．６７（２Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ）、１．５９−１．５７（１Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ）、１．３７−１．３５（２Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ）、１．２０−１．１６（２Ｈ，ｍ，ｃｙ−Ｈｘ）ｐｐｍ。  ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：３５６．１５。
【００８４】
（実施例４）
【００８５】
【化１７】
0004377583.tif 000020
（１−（２−メチルスルファニル−ピリミジン−４−イル）−プロパン−２−オン）
−７８℃のＴＨＦ（１００ｍＬ）中の（５．２３ｇ、３８．０ｍｍｏｌ）およびフェナントロリン（１０ｍｇ）の攪拌した溶液に、リチウムジイソプロピルアミンリチウムの溶液（シクロヘキサン中１．５Ｍ）を、すべての水が破壊され、溶液が黒みがかるまで（約１ｍＬ）、滴下した。次いで、さらなるリチウムジイソプロプリアミン（３０．４ｍＬ）を、５分にわたりゆっくりと加えた。１５分後、−７８℃で、溶液を、０℃に加温し、そして１５分後に−７８℃に再冷却した。次いで、ＴＨＦ（１５ｍＬ）（ＴＨＦは、４モレキュラーシーブを用いて１時間乾燥した）中のＮ−メトキシ−Ｎ−アセトアミド（４．７２ｍＬ、４５．６ｍｍｏｌ）溶液を、滴下漏斗（ｄｒｏｐｆｕｎｎｅｌ）を通して２０分にわたって滴下して加えた。２５分後、−７８℃において、溶液を、０℃に加温し、３０分間攪拌した。この溶液を、希薄なＨＣｌ（１Ｍ、１００ｍＬ）の中に注ぎ、Ｅｔ２Ｏ（３×２００ｍＬ）を用いて抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）によって、生成物（４．７５ｇ、２６．１ｍｍｏｌ、収率６９％）を得た。
（実施例５）
【００８６】
【化１８】
0004377583.tif 000021
（Ｎ−［１−メチル−２−（２−メチルスルファニル−ピリミジン−４−イル）−エチリデン］−Ｎ’−フェニル−ヒドラジン）
封管中の乾燥ＥｔＯＨ（２ｍＬ）中の１−（２−メチルスルファニル−ピリミジン−４−イル）−プロパン−２−オン（１８２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびフェニルヒドラジン（９９μＬ、１．００ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液を、１５分間、１００℃に加熱した。反応物を、真空中で濃縮して黄色いペースト状の粗生成物を得た。
【００８７】
【化１９】
0004377583.tif 000022
（４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−メチルスルファニルピリミジン）
上記で調製した精製していないペースト状物に、ジメチルホルムアミジド−ジメトキシアセタール（ＤＭＦ−ＤＭＡ、１．３３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を、封管中で３日間、１００℃に加熱した。この溶液を、冷却し、そしてＨ２Ｏ（１５ｍＬ）中に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機抽出物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１５ｍＬ）で洗浄し、ブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）によって、生成物を得た（２２５ｍｇ、０．８００ｍｍｏｌ、８０％）。
【００８８】
（実施例６）
【００８９】
【化２０】
0004377583.tif 000023
（２−メタンスルホニル−４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリミジン）
メタノール（８ｍＬ）中の４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−メチルスルファニル−ピリミジン（２２５ｍｇ、０．８００ｍｍｏｌ）を攪拌した溶液に、周囲温度で、２０分間にわたりＨ２Ｏ（８ｍＬ）中のＯｘｏｎｅ（登録商標）（１．４８ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）溶液を滴下して加えた。１６時間後、この溶液を、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）中に注ぎそしてＣＨ２Ｃｌ２（４×２５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた抽出物を、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして濃縮して生成物（２３９ｍｇ、０．７６０ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【００９０】
（実施例７）
【００９１】
【化２１】
0004377583.tif 000024
（［４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリミジン−２−イル］−フェニルアミン）
２−メタンスルホニル−４−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリミジン（３８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびアニリン（ニート（ｎｅａｔ）、１００μＬ）の混合物を、１００℃で１５時間加熱した。揮発性の成分を、加温しながら窒素の流れの下で蒸発させた。メタノールからの再結晶によって、５８％の収率で生成物を得た（２３ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）。
【００９２】
（実施例８）
【００９３】
【化２２】
0004377583.tif 000025
（４−グアニジノ−ベンゼンスルフォンアミド）
４−アミノベンゼンスルホンアミド（３０ｍｍｏｌ、１当量）、シアナミド（１．３ｇ、３１ｍｍｏｌ、１．０３当量）、および４Ｎ  塩化水素を含むジオキサン（８ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）を、１０分間室温で攪拌し、そして８０℃で１８時間加熱した。この混合物を、水（３０ｍＬ）およびジエチルエーテル（５０ｍＬ）で希釈した。水層を、エーテル（３０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして有機層（ｏｒｇａｎｉｃ  ｌａｌｙｅｒ）を、廃棄した。水層を、６Ｎ  ＨＣｌ水溶液（６ｍＬ）を用いて中和し、そして酢酸エチル（５０ｍＬ）を用いて希釈した。水層を、酢酸エチル（５０ｍＬ）を用いて４回抽出した。合わせた有機層を、固体の化合物を得るために減圧下で濃縮し、この固体の化合物を、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄して、淡黄色の表題化合物を得た。この化合物を、ＬＣ／ＭＳおよびＨＰＬＣを用いて特徴付けた。
【００９４】
（実施例９）
【００９５】
【化２３】
0004377583.tif 000026
（３−ジメチルアミノ−１−（５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロペノン）
１−（５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−エタノン（１０ｍｍｏｌ）を、アセトリニトリル（５ｍＬ）およびＤＭＦ−ＤＭＡ（２ｍＬ）中に溶解し、そして１８時間還流した。溶媒を、取り除き、そしてエーテル（２０ｍＬ）を用いて粉砕し、そしてこの黄色の固体を、濾過し、エーテル（１０ｍＬ）を用いて洗浄して、表題の化合物を得た。
【００９６】
（実施例１０）
【００９７】
【化２４】
0004377583.tif 000027
（４−［４−（５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−ベンゼンスルホンアミド）
３−ジメチルアミノ−１−（５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−プロペノン（０．２ｍｍｏｌ）および４−グアニジノ−ベンゼンスルホンアミド（０．２ｍｍｏｌ）を含むアセトリニトリル（０．２５ｍＬ）を、２４時間加熱還流し、得られた混合物を、メタノール（３ｍＬ）で希釈した。スラリーを、濾過しそして固形物を、メタノール（２ｍＬ）で洗浄し、窒素の下で乾燥して表題の化合物を得た。Ｍ＋Ｈ（４０７．０）；ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝３．１６８。ＨＰＬＣ分析を、ＨＰ１１００  ＨＰＬＣを用いて行い、そして８分間分析法（ｅｉｇｈｔ  ｍｉｎｕｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を以下のように行った：（０分、１０％Ｂ；１分、３０％Ｂ；５分、９０％Ｂ；６．５分、９０％Ｂ；６．７分  １０％Ｂ）、ここでＡは０．０１％ＴＦＡを含む水であり、そしてＢは、０．０１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。分析用カラムは、ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ、３０×１００ｍｍであり、流速１ｍＬ／分とし、ダイオード（ｄｉｏｄｏ）光線検出器（３００ｎｍ、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、２２０ｎｍおよび２１０ｎｍの５波長をモニターした）を２５℃で使用した。
【００９８】
（ＪＮＫ３タンパク質のクローニング、発現および精製）
クエリ（問い合わせ）（ｑｕｅｒｙ）として公開されたＪＮＫ３α１のｃＤＮＡを使用するＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索で、ヒトＪＮＫ３α１に対する全体のコード配列を含むＥＳＴクローン（＃６３２５８８）を同定した。ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位でｐＥＴ１５−Ｂ発現ベクターにクローニングするために、このｃＤＮＡに制限酵素認識部位を導入するために使用した。このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させた。発現させた全長タンパク質（メチオニン  １−グルタミン  ４２２）の乏しい溶解度に起因して、４０位のセリン残基（セリン  ４０）で開始するＮ末端短縮型のタンパク質を産生した。この短縮は、ＪＮＫ１タンパク質およびＪＮＫ２タンパク質のセリン２に対応し、そしてメチオニン（開始）残基およびグリシン残基により先行される。このグリシン残基は、発現ベクターにクローニングするためのＮｃｏＩ部位を導入するために付加した。さらに、系統的なＣ末端短縮を、ＰＣＲにより実施し、回折品質結晶を生じる構築物を同定した。このような構築物の１つは、ＪＮＫ３α１のアミノ酸残基セリン４０−グルタミン酸４０２をコードし、そしてＭｅｔ残基およびＧｌｙ残基によって先行される。
【００９９】
この構築物を、プライマーとして以下のデオキシオリゴヌクレオチド：
【０１００】
【数１】
0004377583.tif 000028
（順方向プライマー（開始コドンに下線を付す））（配列番号：１）
および
【０１０１】
【数２】
0004377583.tif 000029
（逆方向プライマー（終止コドンに下線を付す））（配列番号：２）
を使用するＰＣＲによって調製し、そしてＤＮＡ配列決定法によって確認した。コントロール実験は、この短縮型ＪＮＫ３タンパク質が、インビトロで上流キナーゼＭＫＫ７を用いて活性化させた場合、ミエリン塩基性タンパク質に対して同等のキナーゼ活性を有することを示した。
【０１０２】
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ＪＮＫ３発現構築物を用いて形質転換し、そしてこの細胞が対数期（ＯＤ６００約０．８）になるまで振盪フラスコで１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＬＢ中で３０℃で増殖させた。イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を、最終濃度０．８ｍＭまで添加し、そしてこの細胞を、２時間後、遠心分離によって回収した。
【０１０３】
ＪＮＫ３を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを、１０容積／ｇの溶解緩衝液（１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、各々１μｇ／ｍｌのＥ−６４およびロイペプチンを含む、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２））に再懸濁した。細胞を、マイクロフリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用して氷上で溶解し、そして１００，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。この１００，０００×ｇの上清を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて１：５に希釈し、そして４℃でＳＰ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カチオン交換クロマトグラフィー（カラム容積：２．６×２０ｃｍ）により精製した。この樹脂を、５カラム容積の緩衝液Ａで洗浄し、続いて、５０ｍＭのＮａＣｌを含む５カラム容積の緩衝液Ａで洗浄した。結合したＪＮＫ３を、７．５カラム容積の線形勾配の５０〜３００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。ＪＮＫ３は、１５０〜２００ｍＭのＮａＣｌの間で溶出した。
【０１０４】
（ＪＮＫ３の活性化）
５ｍｇのＪＮＫ３を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＡＴＰを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）において、０．５ｍｇ／ｍｌになるまで希釈した。ＧＳＴ−ＭＫＫ７（ＤＤ）を、１：２．５のＧＳＴ−ＭＫＫ７：ＪＮＫ３のモル比で添加した。２５℃で３０分間のインキュベーション後、反応混合物を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）において限外濾過により５倍濃縮し、１０ｍｌに希釈し、そしてさらなる１ｍＭのＡＴＰを添加した。この手順を３回繰り返して、ＡＤＰを除去し、そしてＡＴＰを補充した。最終的なＡＴＰの添加は５ｍＭであり、そして混合物を４℃で一晩インキュベートした。
【０１０５】
活性化されたＪＮＫ３／ＧＳＴ−ＭＫＫ７（ＤＤ）の反応混合物を、透析または限外濾過によって、５ｍＭ  ＤＴＴおよび５％グリセロール（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）内に交換した。この反応混合物を、１．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）で調整し、そしてＲａｉｎｉｎ  Ｈｙｄｒｏｐｏｒｅカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（２５℃）によって精製した。ＧＳＴ−ＭＫＫ７および不活性化したＪＮＫ３は、これらの条件下では結合せず、その結果、１．１〜０．０５Ｍのリン酸カリウム勾配を流速１ｍｌ／分で６０分にわたって展開する場合、二重にリン酸化されたＪＮＫ３が、単一にリン酸化されたＪＮＫから分離される。活性化したＪＮＫ３（すなわち、二重にリン酸化されたＪＮＫ３）を、０．２５〜１ｍｇ／ｍｌで、−７０℃で保存した。
【０１０６】
（ＪＮＫ阻害アッセイ）
化合物を、分光光度法連結酵素アッセイによるＪＮＫ３の阻害についてアッセイした。このアッセイにおいて、固定された濃度の活性化したＪＮＫ３（１０ｎＭ）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸、２００μＭ  ＮＡＤＨ、３０μｇ／ｍＬピルビン酸キナーゼ、１０μｇ／ｍＬ乳酸デヒドロゲナーゼ、および２００μＭ  ＥＧＦレセプターペプチドを含む０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を含む緩衝液内で、ＤＭＳＯに溶解した種々の濃度の強力なインヒビターを共に、３０℃で１０分間インキュベートした。このＥＧＦレセプターペプチドは、配列
【０１０７】
【数３】
0004377583.tif 000030
を有し、そしてＪＮＫ３触媒化キナーゼ反応内のホスホリルアクセプターである。この反応を、１０μＭ  ＡＴＰの添加によって開始し、そしてこのアッセイプレートを、分光光度計のアッセイプレート区画に挿入し、これを、３０℃で維持した。３４０ｎｍでの吸光度の減少を、時間の関数としてモニタリングした。インヒビター濃度の関数としての速度データを、競合的阻害速度論モデルに当てはめて、Ｋｉを決定した。
【０１０８】
ＪＮＫ１アッセイおよびＪＮＫ２アッセイを、類似の様式で実施した。
【０１０９】
（昆虫細胞内でのｐ３８キナーゼのクローニング）
ヒトｐ３８キナーゼの２つのスプライス改変体（ＣＳＢＰ１およびＣＳＢＰ２）を、同定した。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、テンプレートとしてＨｅＬａ細胞ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ＣＳＢＰ２  ｃＤＮＡのコード領域を増幅するために使用した。このポリメラーゼ連鎖反応産物を、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。バキュロウイルス転移ベクター（ｐＶＬ−（Ｈｉｓ）６−ｐ３８）を、プラスミドｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）内の相補部位にｐＥＴ１５ｂ−（Ｈｉｓ）６−ｐ３８のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをサブクローニングすることによって構築した。
【０１１０】
発現されたタンパク質のＤＮＡ配列決定およびＮ末端配列決定によって確認されるように、このプラスミドｐＶＬ−（Ｈｉｓ）６−ｐ３８は、ｐ３８のＮ末端にインフレームで融合された２３残基のペプチド（
【０１１１】
【数４】
0004377583.tif 000031
、ここでＬＶＰＲＧＳは、トロンビン切断部位を表す）からなる組換えタンパク質の合成に指向した。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞の単層培養物（ＡＴＣＣ）を、Ｔフラスコ中の１０％ウシ胎仔血清を補充したＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中、２７℃で維持した。対数期でのＳｆ９細胞を、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、オートグラファ核多角体ウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の線形ウイルスＤＮＡおよび転移ベクターｐＶＬ−（Ｈｉｓ）６−ｐ３８で同時トランスフェクトした。個々の組換えバキュロウイルスクローンを、１％低融点アガロースを使用するプラークアッセイによって精製した。
【０１１２】
（組換えｐ３８キナーゼの発現および精製）
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ−３６８）Ｈｉｇｈ−ＦｉｖｅＴＭ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２７℃で振盪フラスコ内においてＥｘｃｅｌ−４０５無タンパク質培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の懸濁液中で増殖さした。１．５×１０６細胞／ｍｌの密度の細胞を、５の感染多重度で上記に記載された組換えバキュロウイルスを用いて感染させた。組換えｐ３８の発現レベルを、ウサギ抗ｐ３８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫ブロット法によってモニタリングした。この細胞集団を、ｐ３８の発現レベルが最大に達する、感染後７２時間で回収した。
【０１１３】
（Ｈｉｓ）６タグ化ｐ３８を発現する細胞由来の凍結細胞ペーストを、５容量の緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロールおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）で解凍した。マイクロフリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）での細胞の機械的な破壊後、この溶解物を、３０分間、３０，０００×ｇで遠心分離した。この上清を、２〜４ｍｇの予期されるｐ３８につき１ｍｌの樹脂の比率で、ＴａｌｏｎＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）金属親和性樹脂と共に３〜５時間、４℃でバッチ様式でインキュベートした。この樹脂を、５００×ｇで、５分間遠心分離することによって沈殿させ、そして緩衝液Ａを用いてバッチ様式で緩やかに洗った。この樹脂を、スラリー化し、そしてカラム（約２．６×５．０ｃｍ）に注ぎ、そして緩衝液Ａ＋５ｍＭイミダゾールを用いて洗った。
【０１１４】
この（Ｈｉｓ）６−ｐ３８を、緩衝液Ａ＋１００ｍＭイミダゾールを用いて溶出し、続いて２リットルの緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）に対して４℃で一晩透析した。このＨｉｓ６タグを、１ｍｇのｐ３８につき１．５ユニットのトロンビン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の添加および２０℃で２〜３時間のインキュベーションにより除去した。このトロンビンを、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦの添加によってクエンチし、次いで、サンプル全体を、２ｍｌのベンズアミジンアガロース（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）カラムにロードした。
【０１１５】
フロースルー画分を、緩衝液Ｂ＋０．２ｍＭ  ＰＭＳＦで前もって平衡化した２．６×５．０ｃｍ  Ｑ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに直接的にロードした。このｐ３８を、緩衝液Ｂ内の０．６Ｍ  ＮａＣｌまでの２０カラム容積の線形勾配を用いて溶出した。この溶出されたタンパク質のピークをプールし、そして４℃で一晩、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５％グリセロール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に対して透析した。
【０１１６】
この透析されたタンパク質を、３〜４ｍｌまでＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、そして２．６×１００ｃｍ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。このタンパク質を、３５ｍｌ／時間の流速で溶出した。この主要なピークをプールし、２０ｍＭ  ＤＴＴに調整し、１０〜８０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして−７０℃でアリコートで凍結させるか、または即座に使用した。
【０１１７】
（ｐ３８の活性化）
ｐ３８を、２０℃で３０分間、緩衝液Ｂ＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  Ｎａ２ＶＯ４内で０．００５ｍｇ／ｍｌのＤＤ二重変異ＭＫＫ６と０．５ｍｇ／ｍｌのｐ３８を合わせることによって活性化した。次いで、この活性化混合物を、１．０×１０ｃｍ  ＭｏｎｏＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、そして緩衝液Ｂ内で１．０Ｍ  ＮａＣｌまでの線形２０カラム容積の勾配を用いて溶出させた。この活性化されたｐ３８は、ＡＤＰおよびＡＴＰの後に溶出した。この活性化したｐ３８のピークを、プールし、そして緩衝液Ｂ＋０．２ｍＭ  Ｎａ２ＶＯ４に対して透析し、ＮａＣｌを除去した。この透析されたタンパク質を、４．０Ｍのストック溶液の添加によって１．１Ｍリン酸カリウムに調整し、緩衝液Ｄ（１０％グリセロール、２０ｍＭβ−グリセロリン酸、２．０ｍＭ  ＤＴＴ）＋１．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４で前もって平衡化した１．０×１０ｃｍ  ＨＩＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｈｙｄｒｏｐｏｒｅ）カラム上にロードした。このタンパク質を、緩衝液Ｄ＋５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４までの２０カラム容積の線形勾配を用いて溶出した。二重リン酸化ｐ３８は、主要ピークとして溶出し、そして緩衝液Ｂ＋０．２ｍＭ  Ｎａ２ＶＯ４に対する透析のためにプールした。この活性化されたｐ３８を、−７０℃で保存した。
【０１１８】
（ｐ３８阻害アッセイ）
（Ａ．ＥＧＦレセプターペプチドのリン酸化の阻害）
このアッセイを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）の存在下で実行する。代表的なＩＣ５０の決定のために、上記の全ての化合物および活性化されたｐ３８（５μＭ）を含む、ストック溶液を調製した。このストック溶液を、バイアルにアリコート化した。固定された容量のＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ中のインヒビター（反応におけるＤＭＳＯの最終濃度は、５％である）を、各々のバイアルに導入し、混合し、室温で１５分間インキュベートキュベートする。ＥＧＦレセプターペプチド、ＫＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ（ｐ３８触媒化キナーゼ反応におけるホスホリルアクセプター）を、２００μＭの最終濃度まで各々のバイアルに添加する。このキナーゼ反応を、ＡＴＰ（１００μＭ）を用いて開始し、そしてバイアルを３０℃でインキュベートする。３０分後、この反応を、等量の１０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でクエンチする。
【０１１９】
このリン酸化したペプチドを、ＨＰＬＣ分析によって定量化する。非リン酸化ペプチドからのリン酸化ペプチドの分離を、各々０．１％ＴＦＡを含む、水およびアセトニトリルの二成分の勾配を用いて、逆相カラム（Ｄｅｌｔａｐａｋ、５μｍ、Ｃ１８  １００Ｄ、部品番号０１１７９５）上で達成する。ＩＣ５０（５０％の阻害を生じるインヒビターの濃度）を、インヒビター濃度に対して残存する活性％をプロットすることによって決定する。
【０１２０】
（Ｂ．ＡＴＰａｓｅ活性の阻害）
このアッセイを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、１０％グリセロールおよび１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  緩衝液（ｐＨ７．６）の存在下で実行する。代表的なＫｉの決定のために、活性化されたｐ３８反応のＡＴＰａｓｅ活性についてのＡＴＰに対するＫｍを、インヒビターの非存在下、および２つの濃度のインヒビターの存在において決定する。Ｋｉを、インヒビターおよびＡＴＰ濃度の関数としての速度データから決定する。上記の構成成分の全ておよび活性化されたｐ３８（６０ｎＭ）を含む、ストック溶液を調製する。このストック溶液を、バイアルにアリコート化する。固定された容量のＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ中のインヒビター（反応におけるＤＭＳＯの最終濃度は、２．５％である）を、各々のバイアルに導入し、混合し、室温で１５分間インキュベートする。この反応を、種々の濃度のＡＴＰを添加することによって開始し、次いで、３０℃でインキュベートする。３０分後、この反応を５０μｌのＥＤＴＡ（０．１Ｍ、最終濃度）、ｐＨ８．０でクエンチする。ｐ３８のＡＴＰａｓｅ活性の産物、ＡＤＰを、ＨＰＬＣ分析によって定量化する。
【０１２１】
ＡＴＰからＡＤＰの分離を、以下の組成の二重溶媒勾配を使用する逆相カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ、ＬＣ−１８、３μｍ、部品番号５−８９８５）で達成する：溶媒Ａ−０．１Ｍリン酸緩衝液（８ｍＭ硫酸水素テトラブチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，カタログ番号Ｔ−７１５８）を含む）、溶媒Ｂ−３０％メタノールを含む溶媒Ａ。
【０１２２】
表２は、ＪＮＫｐおよび３８阻害アッセイにおいての選択された化合物の活性を示す。２．０マイクロモル濃度未満のＫｉを有する化合物を「Ａ」と評価し、２．０と１０マイクロモル濃度の間のＫｉを有する化合物を「Ｂ］と評価し、１０マイクロモル濃度より高いＫｉを有する化合物を「Ｃ」と評価する。最後のカラムは、本化合物の選択性の尺度としてのＪＮＫ３活性に対するｐ３８の比率を示す。
【０１２３】
【表２】
0004377583.tif 000032
表２から理解され得るように、本発明の化合物は、ＪＮＫの３つのアイソフォーム（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３）に対する良好な活性を有する。ｐ３８／ＪＮＫ３の比率から理解され得るように、本化合物は、ｐ３８に対して活性がはるかに低く、ＪＮＫに対する良好な選択性を提供する。代表的な化合物について、ＪＮＫに対する阻害活性は、ｐ３８に対する阻害活性より最大２または３オーダー大きい活性であると推定される。対照的に、より大きなＧ置換基（例えば、Ｇがフェニルまたは４−フルオロ−フェニルである場合）を有する化合物は、ｐ３８に対してさらにより活性であり、そしてＪＮＫ酵素に対するより乏しい選択性を有する。
【０１２４】
本発明者らが本発明の多くの実施形態を記載するが、本発明者らの基本的な実施例は変更され、本発明の化合物および方法を使用する他の実施形態を提供し得ることは明白である。従って、本発明の範囲は、特定の実施形態よりも、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定され、これらの実施形態が例として示されていることが理解される。