(57)【要約】  磁性粒子（１００）は、５００ｎｍ以下の粒径（１３４）を有し、コア（１１０）およびそのコア（１１０）を取り囲み被包する高分子コーティング（１２０）を含む。コア（１１０）は、Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｓｍ、Ｙｂ、Ｄｙ、ＧｄまたはＥｒおよびＮｂなどの少なくとも１種類の金属の金属、金属合金、または金属酸化物を含む。磁性粒子（１００）は、多結晶粒子であり、室温で、ゼロより大きい保磁力およびゼロより大きい残留磁気を有するスーパースピングラス磁性材料である。これらのスーパースピングラス磁性材料の磁気モーメントは、室温より高く、低磁場では、温度と共に増加する。前駆体金属塩からのその場での加水分解／沈殿方法を使用して、高分子被包磁性粒子（１００）を形成する。
2017539080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子において、
磁気コアおよび高分子コーティング、
を含み、
前記磁気コアは、Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｎｂ、Ｓｍ、Ｌｎ、Ｙｂ、Ｄｙ、ＧｄまたはＥｒからなる群より選択される少なくとも１種類の金属の金属、金属合金、または金属酸化物を含み、
前記磁気コアは、超常磁性である多結晶粒子であって、合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する多結晶粒子を含み、
前記高分子コーティングは前記磁気コアを取り囲み、
前記磁性粒子は、室温で、ゼロより大きく３００Ｏｅ未満の保磁力、ゼロより大きく１２ｅｍｕ／ｇ未満の残留磁気を示し、
前記磁性粒子の粒径が５００ｎｍ以下である、磁性粒子。
【請求項２】
前記磁気コアの多結晶粒子が同じ結晶相である、請求項１記載の磁性粒子。
【請求項３】
前記磁性粒子の磁気モーメントが、温度が室温を超えて上昇するにつれて、増加する、請求項１または２記載の磁性粒子。
【請求項４】
前記粒子が、室温で５０ｅｍｕ／ｇ超かつ１００ｅｍｕ／ｇ未満の飽和磁化を有する、請求項１から３いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項５】
合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する前記多結晶粒子が、軟磁性材料である、請求項１から４いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項６】
前記保磁力が３０Ｏｅと５０Ｏｅの間である、請求項１から５いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項７】
前記残留磁気が３ｅｍｕ／ｇと１０ｅｍｕ／ｇの間である、請求項１から６いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項８】
前記高分子コーティングが、ポリ（エチルメタクリレート）、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリチオール、およびポリメルカプト酸、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から７いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項９】
前記コアが前記粒子の少なくとも６０質量％を占める、請求項１から８いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項１０】
前記磁性粒子の直径が１０から２００ｎｍである、請求項１から９いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項１１】
前記高分子コーティングの平均厚が１０ｎｍから２５０ｎｍである、請求項１から１０いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項１２】
カルボキシレート、アミノ、メチル、メチレン、チオール、無水物、リン酸、スルホン酸、およびホスファチドからなる群より選択される表面官能基をさらに有する、請求項１から１１いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項１３】
前記磁気コアがＦｅ3Ｏ4から作られている、請求項１から１２いずれか１項記載の磁性粒子。
【請求項１４】
磁性粒子を製造する方法であって、
金属前駆体、酸化剤または還元剤、高分子源、および塩基性化合物を含む溶液を形成する工程、および
前記溶液の温度を少なくとも５０℃に上昇させて、コアおよび該コアを取り囲み被包する高分子コーティングを有する磁性粒子を形成する工程、
を有してなる方法。
【請求項１５】
前記磁性粒子が、重合反応を行わずに形成される、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、２０１４年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０６７６３４号の米国法典第３５編第１１９条の下での優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、広く、磁性ナノ粒子を製造する方法に関し、より詳しくは、例として、タンパク質、細胞、およびウイルスの単離のための、また診断用途および細胞培養法のための、高分子被包磁性ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００３】
磁性粒子またはビーズが、核酸とタンパク質並びにウイルスと全細胞の抽出および精製を含む適用範囲のバイオテクノロジー分野で使用されている。使用中、標的媒体（例えば、ＤＮＡ）が粒子の表面に結合し、その際に、その媒体を磁気的に操作できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、磁場に対する強力な応答、制御された粒径、組成、均一性、結晶構造、および表面化学を有する磁性粒子を合成し、提供するための低コストで効率的な手法を提供することが都合よいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施の形態において、本開示は、５００ｎｍ以下の粒径を有し、磁気コアおよびそのコアを取り囲み被包する高分子コーティングを含む磁性粒子を提供する。そのコアは、Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｓｍ、Ｌｎ、Ｙｂ、Ｄｙ、ＧｄまたはＥｒおよびＮｂなどの少なくとも１種類の金属の金属、金属合金、または金属酸化物を含む。この磁気コアは、室温で、ゼロより大きい保磁力およびゼロより大きい残留磁気を有するスーパースピングラス磁性材料である多結晶粒子である。前駆体金属塩からのその場での加水分解／沈殿方法を使用して、どのような重合反応も行わずに、高分子被包磁性粒子を形成する。
【０００６】
磁性粒子を製造する方法は、金属前駆体、酸化剤または還元剤、高分子源、および塩基性化合物を含む溶液を形成する工程、およびその溶液の温度を少なくとも５０℃に上昇させて、コアおよびそのコアを取り囲み被包する高分子コーティングを有する磁性粒子を形成する工程を有してなる。
【０００７】
本開示の主題の追加の特徴および利点は、以下の詳細な説明に述べられており、一部は、その説明から当業者に容易に明白となるか、または以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付図面を含む、ここに記載されたような本開示の主題を実施することによって認識されるであろう。
【０００８】
先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、本開示の主題の実施の形態を提示しており、請求項に記載されたような本開示の主題の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供することが意図されていることを理解すべきである。添付図面は、本開示の主題のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、本開示の主題の様々な実施の形態を図示しており、説明と共に、本開示の主題の原理および作動を説明する働きをする。その上、図面および説明は、単なる例示を意味しており、請求項の範囲をどのようにも限定することも意図していない。
【０００９】
本開示の特別な実施の形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号により示されている、以下の図面と共に読まれたときに、最もよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】１つの実施の形態による磁性粒子の概略図
【図２】異なる表面官能化高分子を使用した磁性粒子のＴＥＭ顕微鏡写真
【図３】異なる磁気特性の温度（Ｋ）に対する磁場（χ）を示すグラフ（http://electrons.wikidot.com/magnetism-iron-oxide-magnetiteから）
【図４】超常磁性Ｆｅ3Ｏ4に関する温度に対する磁気モーメントのプロット（J. Mohapatra, et. al., RSC Adv., 2015, 5, 14311から）
【図５】ＭＮＰの実施の形態に関する温度に対する磁化率（χ）を示すプロット
【図６】ＭＮＰの別の実施の形態に関する温度に対する磁化率（χ）を示すプロット
【図７】実施の形態における３つのＭＮＰのＸ線粉末回折計測を示す図。ａは実施例１からのＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4であり、ｂは実施例１からのＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4であり、ｃは実施例２からのＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4である。
【図８】磁性材料の性質を示すヒステリシスループ
【図９】ＭＮＰの実施の形態において磁場（Ｏｅ）に対して磁気モーメント（ｅｍｕ／ｇ）をプロットした測定ヒステリシスループ
【図１０】ＭＮＰの実施の形態において磁場（Ｏｅ）に対して磁気モーメント（ｅｍｕ／ｇ）をプロットした測定ヒステリシスループ。図１０は、図９と同じデータを示しているが、詳細が分かるように引き伸ばされている。
【図１１】様々な実施の形態による磁性粒子の合成を示す流れ図
【図１２】様々な実施の形態による表面官能化された磁性粒子の説明図
【図１３】ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子（正方形）および市販の磁性ビーズ（白丸）に関する時間の経過による相対吸光度のデータにより示される、応答時間を示すグラフ
【図１４】Ａ〜Ｆは、Ｆｅ、Ｏ、ＣおよびＳｉを含む元素の位置を示す、ＰＥＭＡ被包Ｆｅ3Ｏ4粒子のＳＴＥＭ顕微鏡写真
【図１５】Ａ〜Ｅは、ＰＥＩ被包Ｆｅ3Ｏ4粒子のＴＥＭ顕微鏡写真
【図１６】例示の磁性粒子の表面電荷を特徴付けるプロット
【図１７】懸濁された磁性粒子に関する時間に対する相対光学密度（ＯＤ）のプロット
【図１８】ＤＮＡが表面に結合したものとしていないものの、例示の磁性ナノ粒子の元素のスペクトル画像のハイパーマップ
【図１９】磁性ナノ粒子を使用したＤＮＡ精製を確認するゲル電気泳動結果のデジタル画像
【図２０】例示の磁性ナノ粒子のＤＮＡ結合能を示すプロット
【図２１】ＭＮＰの実施の形態を使用して生じたＤＮＡサイズ選択に関するデータを示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここで、その実施の形態のいくつかが添付図面に示されている、本開示の主題の様々な実施の形態を詳しく参照する。図面に亘り、同じまたは同様の部分を称するために、同じ参照番号が使用される。
【００１２】
１つの磁性粒子１００が、図１に断面で概略示されている。粒子１００は、磁気コア１１０およびそのコアを完全に取り囲み被包するコーティング１２０を含む。コア１１０は外面１１２を有する。コーティング１２０は、コーティング１２０の内面１２４に沿って、コア１１０の外面と直接物理的に接触している。磁性粒子１００は磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とも称される。この高分子コーティングは磁気コアを取り囲む。
【００１３】
前記コアは、多結晶無機磁性材料から作られる。そのコアの多結晶またはナノ多結晶特徴が、図２Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに見られる。図２は、表面官能化磁性粒子のＴＥＭ顕微鏡写真を示しており、いくつかの実施の形態（Ａ）ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4、（Ｂ）ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4、（Ｃ）ＰＭＡＡ−Ｆｅ3Ｏ4、および（Ｄ）ＰＳＳＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4を含む。図２から分かるように、実施の形態において、磁性粒子は結晶構造を示している。図２Ａに特に明白なように、磁気コアは、個々の小さい粒子または結晶から作られた塊または球体に見える。その上、結晶は均一である。すなわち、結晶は全く同じ結晶相である（例えば、図７参照）。結晶は合体して（２を超える単結晶が互いに直接接触している）、高分子シェル内に収容された結晶のコアまたは塊を形成している。
【００１４】
磁性は、磁気特性および磁気現象を記載するための用語である。従来のバルク材には、６つのタイプの磁性がある：反磁性、常磁性、強磁性、フェリ磁性、反強磁性、およびスピングラス型挙動。ナノ粒子を含む全ての微粒子系において、異なる種類の磁性粒子間相互作用が存在し、その相互作用の強度はそれらの体積濃度により変わる。これらの性質が、一部、図３〜６に示されている。例えば、Ｆｅ3Ｏ4などの磁性材料は、温度依存性の磁気特性を示し得る。図３は、異なる磁気特性の温度（Ｋ）に対する磁場（χ）を示すグラフである（http://electrons.wikidot.com/magnetism-iron-oxide-magnetiteから）。線３１０は、強磁性材料の磁気特性をプロットしている。線３１２は、常磁性材料の磁気特性をプロットしており、線３１４は、反強磁性材料の磁気特性をプロットしている。強磁性材料（３１０）および常磁性材料（３１２）は、温度の上昇と共に減少する磁化率（χ）を示している。反強磁性材料も、室温より高く温度が上昇するにつれて、減少する磁化率を示す。
【００１５】
理論により制限されないが、これは、温度上昇により、鉄鋼材内の電子の整列が乱れるからであろう。温度上昇により、電子はより無作為に配向されるようになり、これにより、図３に示されるように、磁気モーメントが減少する。温度が低下するにつれて、キュリー点で（３１１で示される）、強磁性材料が「凝固し」、その材料内で電子が整列するので、材料が著しくより磁性になる。同様に、常磁性材料において、磁性は、線３１２に示されるように、温度の上昇と共に減少する。そして、反強磁性材料は、材料の磁性が温度の上昇と共に減少する前に、３１３で示されるネール点でピーク磁性を示す。このネール点は、それより高い温度では、反強磁性材料が常磁性となる、すなわち、熱エネルギーが、材料内の巨視的磁気秩序を破壊するのに十分に大きくなる温度である。ネール点は、強磁性材料のキュリー温度と似ている（https://en.wikipedia.org/wiki/N%C3%A9el_temperatureから）。
【００１６】
磁性材料の粒径が臨界サイズに到達したときに、超常磁性が生じる。臨界サイズは材料による。例えば、Ｆｅ3Ｏ4の臨界サイズは約２９〜３６±０．５ｎｍである。γ−Ｆｅ2Ｏ3の臨界サイズは３０ｎｍである。磁性材料が臨界的に小さいサイズに到達すると、各粒子は単「磁区」または一個の電子として扱うことができる。これらの単磁区フェロまたは強磁性（ＦＭ）ナノ粒子において、磁化は、容易軸に対して平行または逆平行に整列することと考えられ、この軸は、自発磁化のエネルギー的に起こりやすい方向である。十分に小さい単磁区粒子について、エネルギー障壁は、エネルギー揺らぎが異方性エネルギーを克服でき、場が印加されていない場合でさえも、一方の容易軸から他方に粒子の磁化を自発的に逆にできるほど小さくなる。それゆえ、そのようなＦＭナノ粒子は単一磁気単位として扱うことができ、これらは、自由かつ無作為に常磁性のように揺らぎ、よって、超常磁性と呼ばれる。例えば、図４は、超常磁性Ｆｅ3Ｏ4材料に関する温度に対して磁気モーメントをプロットしたグラフを示している（J. Mohapatra, et. al., RSC Adv., 2015, 5, 14311から得た）。重ねて、温度が上昇するにつれて、磁場の不在下で（ＺＦＣ）、磁性が低下する。磁場の存在下（ＦＣ）で温度が低下すると、磁性が増加する。
【００１７】
磁化率は、無次元量である記号χにより表される。Ｍは磁気モーメントであり、その単位はｅｍｕ／ｇである。磁化率（χ）と磁気モーメント（Ｍ）との間の関係は、式１により表され、式中、χは磁化率であり、Ｍは磁気モーメントであり、Ｈは印加磁場である：
【００１８】
【数１】
2017539080.tif 000003
【００１９】
したがって、図３および図４に示されるように、χおよびＭは、同じ傾向があるが、異なる単位および値を有する。表１は、温度変化による異なるタイプの磁性材料の典型的な挙動を示している。例えば、Ｍはｅｍｕ／ｇ＝Ａ・ｍ2／ｋｇの質量磁化（Ｍg）であり；Ｈ＝１Ｏｅ＝１×１０3／（４π）Ａ／ｍ。式１から、材料の磁化率を以下のように誘導することができるχ＝Ｍg４π×１０-3ρ。ρは材料の密度（ｍ3／ｋｇ）である。
【００２０】
【表１】
2017539080.tif 000004
【００２１】
図５および図６は、ＭＮＰの２つの実施の形態に関する温度に対する磁化率（χ）を示すプロットである。図５は、ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4からの測定であり、図６は、ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4からの測定である。図５および図６から分かるように、実施の形態において、ＭＮＰは、常磁性、強磁性、反強磁性または超強磁性のみだけで記載できない温度依存性挙動を示す。ＭＮＰは、実施の形態において、反強磁性のように、温度が室温（ケルビンで約３００度である）までずっと上昇するにつれて、磁気モーメントが増加し続ける。しかしながら、磁化率の値は、それぞれ、ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4およびＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4について、３０〜４２および１０〜２２であり、これらは、表１の従来の反強磁性よりも３桁大きい。すなわち、磁性粒子の磁気モーメントは、温度が室温を超えて上昇するにつれて、増加する。低温（２〜３５０Ｋ）でのＭＮＰの２つの実施の形態の磁化率傾向は、従来の磁性に近似できず、ほとんどの超常磁性マグネタイトも同様である。実験温度範囲において最大値に到達したという兆候はなく、これは、全ての試料についてのブロッキング温度（ＴＢ）が、室温の３００Ｋよりもずっと高いことを示している。
【００２２】
この挙動は、実施の形態において、ＭＮＰの実際の適用に関連する。例えば、核酸とタンパク質並びにウイルスと全細胞の抽出および精製を含む実験は、磁気モーメントが強化された粒子から恩恵を受ける。使用中、標的媒体（例えば、ＤＮＡ）は粒子の表面に結合し、それを磁気的に操作することができる。これらの使用は、一般に、ＤＮＡ融解温度などの、室温以上の温度で行われる。実施の形態において、ＭＮＰは、他の磁性材料と比べて、室温および３５０Ｋ（７７℃）までで、増加した磁気モーメントまたは磁化率を示す。
【００２３】
ＭＮＰの磁気コアの小さい個々の合体結晶は、実施の形態において、直径が１５ｎｍ未満、または直径が３０ｎｍ未満、または直径が５０ｎｍ未満である。個々の磁気結晶は超常磁性である。通常、超常磁性粒子は、溶液またはマトリクス中に十分に分散されている場合、ゼロの残留磁気（磁場が除去された後に、材料中に残留する残留磁気）およびゼロの保磁力（飽和後に磁化をゼロに減少させるのに必要な逆磁場）を示す。その上、一部には、実施の形態においてＭＮＰを製造するために使用される方法のために、高分子シェル中に埋め込まれたまたは捕捉された粒子は、一緒に塊になる。ナノ多結晶材料は一緒に塊になるまたは合体するので、個々の合体結晶間にあるレベルの相互作用がある。磁力（Ｆｍ）が、式２および式３に記載されており、式中、ｍは粒子の磁気モーメントであり、Ｂは印加磁場であり、Ｖｍは粒子の体積であり、Δχは粒子と周りの媒体との間の磁化率の差であり、▽は勾配、ベクトルｍの大きさの変化および単位距離当たりのＢであり、μ0は定数４π×１０-7（ＴｍＡ-1）である。
【００２４】
【数２】
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【００２５】
【数３】
2017539080.tif 000006
【００２６】
この集団挙動または相互作用により、粒子にある程度の残留磁気および保磁力が生じる。これらのＭＮＰの磁気コア内のナノ結晶または多結晶は、密接に接触している。それらは、高分子コーティング内で、一緒に塊になっているか合体している。それらが互いにとても近いので、磁気コア内のナノ結晶の界面間に強力な交換結合および磁気秩序がある。これにより、異方性エネルギーの低下がもたらされ、これにより、式４にしたがって、これらの粒子の全磁気モーメントが増加する。
【００２７】
【数４】
2017539080.tif 000007
【００２８】
文献（J. Mohapatra, et. al. RSC Adv., 2015, 5. 14311）によれば、集合ナノ粒子に関する飽和磁化（Ｍｓ）が、報告された単一のナノ結晶対応物のものと比べて、より高いことが分かった。一方で、［Ｆｅ3+］tet［Ｍ2+、Ｆｅ3+］octＯ4などのスピネル構造酸化物のＭｓ値は、Ｍ2+カチオン磁気モーメントの大きさに強く依存する。何故ならば、対向回転の四面体および八面体部位にあるＦｅ3+イオンにより、Ｆｅ3+イオンの正味のモーメントがゼロになるからである。したがって、ドープされるＭ2+および磁気結合の制御を使用して、高Ｍｓ材料を必要とする用途のために高Ｍｓ材料を設計することができる。
【００２９】
ナノ粒子を含む全ての微粒子系において、異なる種類の磁性粒子間相互作用が存在し、その相互作用の強度はそれらの体積濃度により変わる。通常、低濃度の粒子および十分に高い温度の場合、粒子間相互作用は取るに足らないので、超常磁性（ＳＰＭ）挙動のみが観察される。しかしながら、粒子濃度が増加し、粒子間距離が減少すると、粒子間相互作用は無視できなくなり、集団挙動が観察される。十分に強力な相互作用では、磁性ナノ粒子集合体は、まとまった原子スピングラス系のものと似たスーパースピングラス（ＳＳＧ）特性を示し得る。濃度がさらに増加し、それでも、物理的パーコレーション未満では、十分に強力な相互作用を経験して、超強磁性（ＳＦＭ）状態を形成し得る。
【００３０】
図７は、実施の形態における３つのＭＮＰのＸ線粉末回折計測を示す。ａは実施例１からのＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4であり、ｂは実施例１からのＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4であり、ｃは実施例２からのＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4である。図７は、磁性粒子の組成および結晶構造を示しており、全てのＭＮＰが、逆立方スピネル結晶構造を有する純粋なＦｅ3Ｏ4であることを示している。図２Ｄの形態は、図２Ａの結晶構造とは非常に異なるように見えるが、ＸＲＤ（図７）は、単結晶サイズに対応してピーク幅がわずかに異なる、同じ純粋なＦｅ3Ｏ4結晶構造を有することを示している。
【００３１】
図８は、流束密度（Ｙ軸）に対してＸ軸に磁化力Ｈをプロットした、磁性材料の性質を示すヒステリシスループである。磁性材料の性質は、ヒステリシスループから測定することができる。８１０は飽和であり、８１１は残留磁気であり、８１２は保磁力であり、８１３は反対方向の飽和である。
【００３２】
図９および図１０は、図８に示されたような、ヒステリシスループにおける、ＭＮＰの実施の形態において磁場（Ｏｅ）に対して磁気モーメント（ｅｍｕ／ｇ）をプロットしたグラフである。図１０は、図９と同じデータを示しているが、詳細が分かるように引き伸ばされている。保磁力測定は、図１０のプロットから得て、下記の表２に示されている。表２に示された全ての測定は、室温で行った。
【００３３】
【表２】
2017539080.tif 000008
【００３４】
実施の形態において、ＭＮＰは、表２に示されるような、残留磁気および保磁力を有する。実施の形態における磁性粒子は超常磁性を示すので（磁気コアを形成するために集まった結晶またはナノ結晶は小さく、各粒子が単磁区と考えられるほどの臨界サイズのものである）。磁気コア内の単磁区は、０．５ｎｍから２００ｎｍのサイズに及ぶことがあり、例えば、０．５、１、２、５、１０、５０、１００または２００ｎｍと、それらのいずれかの間の範囲も含まれる。これらの小さい単結晶磁区は超常磁性である。
【００３５】
これらの粒子間磁気相互作用により、測定可能な残留磁気および保磁力（表２に示されるような）がもたらされる。この残留磁気および保磁力は、集団挙動と考えられる。超常磁性および集団挙動のこの組合せは、「スーパースピングラス」磁気挙動として知られていることである。スーパースピングラス粒子は、高い磁気モーメントを示し、超常磁性粒子のみと比べて、より強力な磁気応答を与える。実施の形態において、ここに提供されるＭＮＰは、０Ｏｅ（Ｏｅ＝１／４π×１０3Ａ／ｍ）超の保磁力、または０から３００Ｏｅの保磁力、または０と３００Ｏｅの間の任意の範囲、例えば、３０から１５０Ｏｅの範囲の保磁力を有する、スーパースピングラス、多結晶またはナノ多結晶、磁性粒子を含む。例として、粒子の保磁力は、以下のいずれの間の範囲も含む、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０または３００Ｏｅであることがある。実施の形態において、ここに提供されるＭＮＰは、超常磁性である多結晶粒子であって、合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する多結晶粒子を含む。これらのスーパースピングラス多結晶またはナノ多結晶磁性粒子は、ゼロより大きい、またはゼロから１２の範囲、またはゼロと１２の間の任意の範囲、例えば、３から１０（ｅｍｕ／ｇ）の範囲の磁気モーメント残留磁気（ｅｍｕ／ｇ）を有する。その上、実施の形態において、ＭＮＰは高い飽和磁化（ｅｍｕ／ｇ）を示す。例えば、実施の形態において、ＭＮＰは、室温で７０ｅｍｕ／ｇよりも飽和または飽和磁化を示す。より高い磁化は、速い磁気応答を与えることができる。そして、室温で高い磁化を有すると、これらの材料は室温でより速い磁気応答を有することができる。
【００３６】
磁気コアのスーパースピングラス特性の結果として、磁性粒子は、低いがゼロではない保磁力（例えば、３００Ｏｅ未満）および高い磁化（例えば、少なくとも５０ｅｍｕ／ｇ）を示す。軟磁性材料は、非常に低い（またはゼロの）保磁力および高い飽和磁化により特徴付けられる（Osaci Mihaela, “ Study about the possibility to control the superparamagnetism-superferromagnetism transition in magnetic nanoparticle system”, Journal of magnetism and magnetic materials, 2013, 343, 189-193）。軟磁性材料は、容易に磁化され消磁される材料である。それらは、典型的に、１０，０００Ａｍ-1より大きい固有保磁力を有し、「硬質」と考えられる（Introduction to Magnetism and Magnetic Materials, 2nd Edition, By David C. Jiles）。これらの特徴により、これらのＭＮＰが軟磁性材料になる。軟磁性材料は、容易に磁化され消磁される材料である。軟磁性材料は、飽和まで磁化し、２５℃で比較的弱い磁場において極性の反転を経験する。使用に際して、粒子の高い磁化は、迅速な磁気応答および高い磁気分離効率を促進する。この粒子の高い結合能によって、より効率的かつ経済的な材料の利用が可能となり、それによって、検定当たりの所定の容器容量内でより多数の試料を処理することができる。実施の形態において、コア材料は超常磁性およびスーパースピングラス磁性を示す。
【００３７】
実施の形態において、ＭＮＰは、マサチューセッツ州、ウォルサム所在のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から得られるＭ−２８０およびＭ−４５０ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））などのナノサイズの超常磁性材料を含有する他の市販の材料とは異なる。公表された研究（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3433070/で入手できる、Xu, et al., Simultaneous, single particle, magnetization and size measurements of micron sized, magnetic particles J Magn Materi. 2012 Dec 1; 324(24):  4189-4199）によれば、これらのビーズはゼロの保磁力、ゼロの残留磁気を示し、飽和磁化値は、それぞれ、Ｍ−２８０およびＭ−４５０について、１０ｅｍｕ／ｇおよび１９ｅｍｕ／ｇである。室温（Ｔ＝３００Ｋ）で、実施の形態において、ＭＮＰは、より高い飽和磁化（５０＜Ｍｓ＜１００ｅｍｕ／ｇ）、ゼロではない保磁力およびゼロではない残留磁気を示す一方で、市販の製品は、ゼロの保磁力およびゼロの残留磁気を示す。理論により限定する意図はないが、他の磁性粒子は、それらが中に埋め込まれるマトリクスにより隔離されているので、残留磁気および保磁力がこのようにないのであろう。低濃度の粒子および十分に高い温度の場合、スーパースピングラス磁気特性が可能にならない取るに足らない粒子間相互作用のために、超常磁性挙動のみが観察される。
【００３８】
前記コア材料は、金属、金属合金、または金属酸化物、並びにその組合せを含むことがある。例示のコア材料は酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）であるが、コアは、１種類以上の遷移金属（Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＣｕおよびＦｅ）および／または１種類以上のランタノイド、すなわち、Ｓｍ、Ｌｎ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｇｄ、Ｅｒ、およびＮｂを含む、金属、金属合金、または金属酸化物を含んでよい。一例において、磁気コアは、ホウ素またはアルミニウムが添加された酸化鉄から作られる。さらなる例示のコア材料としては、酸化コバルト、酸化ニッケル、ＣｕＦｅ2Ｏ4、ＮｉＦｅ2Ｏ4、ＭｎＦｅ2Ｏ4、またはＭｇＦｅ2Ｏ4などのスピネル組成物、およびＮｉＦｅまたはＮｉＣｏＦｅなどの金属間組成物が挙げられる。実施の形態において、磁気コアは前記粒子の少なくとも６０質量％を占める。
【００３９】
磁気コアに加え、ＭＮＰは、高分子材料または高分子材料の混合物を含む。その高分子の分子は、架橋していてもいなくてもよい。適切な高分子としては、ポリ酸、ポリアルコール、およびポリアミンが挙げられる。
【００４０】
例示の高分子材料としては、ポリ（エチルメタクリレート）、またはエチレン−無水マレイン酸共重合体（ＰＥＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）、４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体（ＰＳＳＭＡ）、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリチオール、ポリメルカプト酸、並びにそれらの混合物および共重合体が挙げられる。実施の形態において、ポリ（メタクリル酸）または４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体のナトリウム塩溶液が使用されることがある。
【００４１】
図１に示されたように、コア１１０は磁気コアサイズ１３６を有し、磁性ビーズまたはＭＮＰ１００は粒径１３４を有する。実施の形態において、コアのサイズは、約１０から２５０ｎｍに及び、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００または２５０ｎｍであり、それらのいずれか２つの間の範囲が含まれる。実施の形態において、実際に測定された磁気コアサイズが表２に報告されており、直径が１８〜２３０ｎｍに及ぶが、他の磁気コアサイズも考えられる。
【００４２】
「粒径」または「ビーズサイズ」という用語は、磁性ビーズ、またはＭＮＰに関連する最大線寸法を記載するために使用される。例えば、球状粒子の場合、粒径は直径である。楕円形粒子の場合、粒径は粒子の「長さ」である。複数の磁性粒子１００の例示の平均粒径は、約２０ｎｍから５００ｎｍに及ぶことがあり、例えば、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｍであってよく、所定の材料バッチについて、上述した値のいずれか２つの間の範囲に亘り定義されることがある。粒径の開示された範囲内の磁性ナノ粒子を提供することにより、粒子の懸濁液は、より大きい（５００ｎｍ超）粒子の欠点である、粒子の望ましくない沈降がなく、許容される結合能を与えるのに十分である。
【００４３】
コーティング１２０は、そのコーティングの内面１２４とそのコーティングの外面１２２との間の平均最短距離として定義される厚さ１３２を有する。実施の形態において、そのコーティングは、例えば、コーティングを形成するために使用される方法に応じて、実質的に均一な厚さまたは変厚を有することがある。コーティング１２０の例示の平均厚は、約１０ｎｍから２５０ｎｍに及ぶことがあり、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００または２５０ｎｍであってよく、それらのいずれか２つの間の範囲が含まれる。
【００４４】
いくつかの実施の形態において、磁性粒子１００は、実質的に球形状であることがある。しかしながら、以下に限られないが、非対称形状または回転楕円体などの他の形状も、ここでは考えられる。実施の形態において、開示された磁性ナノ粒子は、少なくとも３ｇ／ｃｍ3、例えば、３、３．５または４ｇ／ｃｍ3の粒子密度を有する。さらなる実施の形態において、開示された磁性ナノ粒子は、４ｇ／ｃｍ3超の粒子密度を有する。実施の形態において、磁性ナノ粒子は、少なくとも１０ｍ2／ｇ、例えば、１０〜２０ｍ2／ｇの表面積を有する。
【００４５】
実施の形態において、磁性粒子を製造する方法は、溶液中で、可溶性金属前駆体、酸化剤または還元剤、高分子源、および塩基性化合物を組み合わせる工程を有してなる。この方法は、高分子シェルを形成するための重合反応を行わずに行われる。その溶液は、水溶液または非水溶液であってよい。実施の形態において、合成は、不活性雰囲気（すなわち、無酸素雰囲気）中で行われる。例示の非水溶媒としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、および他の極性または非極性溶媒、並びにそれらの混合物が挙げられる。例示の溶液組成物が表３に纏められている。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
ＭＮＰ合成のための溶液は、例えば、２、５、１０、２０、３０または４０質量％と、それらのいずれかの間の範囲を含む、４０質量％までの金属前駆体、例えば、２、５、１０、２０、３０、４０または５０質量％と、それらのいずれかの間の範囲を含む、５０質量％までの酸化剤または還元剤、例えば、２、５、１０、２０または３０質量％と、それらのいずれかの間の範囲を含む、３０質量％までの高分子、および例えば、１、２、５または１０質量％と、それらのいずれかの間の範囲を含む、１０質量％までの塩基性化合物を含み得る。
【００４８】
例示の金属前駆体としては、金属硫酸塩、金属硝酸塩、金属塩化物、金属過塩化物、金属炭酸塩、および金属アセチルアセトネートなどの金属塩が挙げられる。実施の形態において、金属塩はＭ2+塩、すなわち、鉄塩の場合には、硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、酢酸鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）2）、シュウ酸鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（Ｃ2Ｏ4））、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ2）、過塩素酸鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（ＣｌＯ4）2）、炭酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＣＯ3）、および鉄（ＩＩ）アセチルアセトネート（［ＣＨ3ＣＯＣＨ＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ3］2Ｆｅ）などの第一鉄塩である。実施の形態において、金属前駆体は、Ｍ2+塩であり、より高い酸化状態のイオンを含まない、すなわち、Ｍ3+またはＭ4+部分を含まない。
【００４９】
前記金属前駆体および前記高分子源の混合物は、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3）、硝酸カリウム（ＫＮＯ3）、またはトリメチルアミンオキシド（（ＣＨ3）3ＮＯ）などの酸化剤をさらに含が、他の酸化剤を使用してもよい。溶液中、Ｍ2+前駆体は、酸化剤によってＭ3+に部分的に酸化される。
【００５０】
酸化剤の代用として、還元剤を使用してもよい。そのような実施の形態において、前記金属前駆体および前記高分子源の混合物は、ヒドラジン、有機酸アルカリ塩（クエン酸ナトリウム）、アルコール、またはケトンなどの還元剤をさらに含む。溶液中で、Ｍ2+前駆体は、還元剤によって、Ｍ1+に部分的に還元されるか、またはＭ0に完全に還元される。
【００５１】
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）などの塩基性化合物を前記溶液に添加すると、混合物のｐＨが上昇し、これにより、金属が加水分解されて、水酸化物、例えば、Ｆｅ（ＯＨ）2が形成され、少なくとも５０℃（例えば、５０℃から１００℃）までの溶液温度の上昇と共に、その水酸化物が酸化物（Ｆｅ3Ｏ4）に転化される。他の例示の塩基性化合物としては、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、および水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、または水酸化コリンなどのいくつかの有機塩基が挙げられ、それらは水酸化物供与体である。一旦、水酸化物が脱加水分解されたら、その高分子は酸化物粒子の表面に付着する。
【００５２】
実施の形態において、ＭＮＰ合成を描写する概略図が、図１１に示されている。図１１は、第一鉄塩またはＭ2+塩などの金属塩１１１０の組合せを示している。この金属塩は、酸化剤の存在下で、無酸素雰囲気中で、適切な高分子と組み合わされる。４つの適切な高分子が図１１に示されており、それらは、Ｉ）エチレン−無水マレイン酸共重合体またはＰＥＭＡ；ＩＩ）ポリエチレンイミンまたはＰＥＩ；ＩＩＩ）ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）溶液またはＰＭＡＡ；およびＩＶ）４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体ナトリウム塩またはＰＳＳＭＡを含み、その後、塩基性化合物が添加されて、ＭＮＰが形成される。
【００５３】
実施の形態において、このその場での合成により、適切なレベルの粒子凝集体が得られ、それにより、個別の粒子、または集まって磁気コア（図２に示されるような）を形成する個別の粒子を形成し、これらは、集団挙動を形成するのに十分に凝集しまたは集まり、まだナノスケールの寸法を有しつつ、保磁力および残留磁気を示す。特に、コアおよびコーティングの両方とも、高分子重合を行わずに、例えば、加水分解および沈殿（例えば、結晶化）により、溶液から誘導される。
【００５４】
その得られた磁性粒子おいて、高分子コーティングは、粒子の総質量の約２から４０質量％を占めることがある。例えば、そのコーティングは、全粒子質量の２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０質量％を占めることがあり、それらのいずれかの間の範囲も含まれることがある。このように、コアは、粒子の総質量の６０から９８質量％を占めることがある。
【００５５】
実施の形態において、１つ以上の官能基Ｒを粒子表面に含ませることができる。例示の官能基としては、カルボン酸／カルボキシレート基、イミン／アミノ基、メチル基、メチレン基、チオール基、無水物基、リン酸基、スルホン酸／スルホネート基、スルホンアミドまたはホスファチド基が挙げられる。図１２に示された実施の形態のＲ基は、例えば、アミノ基である。
【００５６】
磁性粒子材料を使用して、生体分子に結合し、結合した生体分子を磁力で分離することができる。次いで、結合した分子は、例えば、適切な緩衝剤の使用により、可逆的に放出させることができる。磁気コア、ＰＥＩシェルおよび様々な例示の官能基を含む磁性粒子が、図１２に概略示されている。ＰＥＩシェルを有するＭＮＰの走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の顕微鏡写真が、図２Ｂに示されている。
【００５７】
実施の形態において、本開示は、磁気コアおよび高分子コーティングを有する磁性粒子であって、その磁気コアが、Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｎｂ、Ｓｍ、Ｌｎ、Ｙｂ、Ｄｙ、ＧｄまたはＥｒからなる群より選択される少なくとも１種類の金属の金属、金属合金、または金属酸化物を含み、その磁気コアは、超常磁性である多結晶粒子であって、合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する多結晶粒子を含み、高分子コーティングが磁気コアを取り囲み、磁性粒子が、室温で、ゼロより大きく３００Ｏｅ未満の保磁力（または保磁力が３０Ｏｅと１５０Ｏｅの間であり）およびゼロより大きく１２ｅｍｕ／ｇ未満の残留磁気を示し、その磁性粒子が５００ｎｍ以下の粒径を有する、磁性粒子を提供する。実施の形態において、磁気コアの多結晶粒子は同じ結晶相であり、磁性粒子の磁気モーメントは、温度が室温を超えて増加するにつれて増加する。実施の形態において、合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する磁性粒子の多結晶粒子は、軟磁性材料である。実施の形態において、室温で、保磁力は３０Ｏｅと１５０Ｏｅの間である、または残留磁気は、３ｅｍｕ／ｇと１０ｅｍｕ／ｇの間である。実施の形態において、高分子コーティングは、ポリ（エチルメタクリレート）、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリチオール、およびポリメルカプト酸またはその組合せからなる群より選択される。実施の形態において、そのコアは、粒子の少なくとも６０質量％を占める。実施の形態において、その磁性粒子の直径は１０から２５０ｎｍである。実施の形態において、高分子コーティングの平均厚は、１０ｎｍと２５０ｎｍの間の平均厚を有する。実施の形態において、磁性粒子は、カルボキシレート／カルボン酸、アミノ／イミン、メチル、メチレン、チオール、無水物、リン酸、スルホネート／スルホン酸、スルホンアミド、およびホスファチドからなる群より選択される表面官能基を有する。実施の形態において、磁気コアはＦｅ3Ｏ4から作られている。
【００５８】
実施の形態において、本開示は、磁性粒子を製造する方法であって、金属前駆体、酸化剤または還元剤、高分子源、および塩基性化合物を含む溶液を形成する工程、およびその溶液の温度を少なくとも５０℃に上昇させて、スーパースピングラスコアおよびそのコアを取り囲み被包する高分子コーティングを有する磁性粒子を形成する工程を有してなる方法も提供する。実施の形態において、その溶液は水性である。実施の形態において、その溶液中の金属対高分子の質量比は、１：０．０５から１：２０に及ぶ。実施の形態において、磁性粒子は、重合反応を行わずに形成される。
【実施例】
【００５９】
磁性粒子およびその合成の追加の態様が、以下の非限定的実施例に開示されている。
【００６０】
実施例１．  エチレン−無水マレイン酸共重合体からのカルボキシレートアニオン被包ＭＮＰの合成（ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4）
１Ｌの反応槽内の１００ｍＬの脱イオン水中にＰＥＭＡ粉末（０．６ｇ、ＭＷ＝１００，０００〜５００，０００）を分散させた。次いで、窒素雰囲気下で、激しく撹拌しながら、この反応槽に２５０ｍＬのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ溶液（１０．５ｇ）を加え、その後、８０ｍＬの２ＭのＫＮＯ3を加えた。窒素パージを行いつつ、激しく撹拌しながら、反応槽を３０℃に加熱した。温度が３０℃に到達したときに、１５０ｍＬの１ＭのＮａＯＨを滴下した。ＮａＯＨの添加後、その溶液を９０℃に加熱し、２時間に亘り９０℃に維持した。
【００６１】
次いで、熱源を切り、溶液を２５℃に自然に冷ませた。磁石を使用して、溶液からＰＥＭＡ被包Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を収集し、脱イオン水で洗浄した。そのナノ粒子を脱イオン水中に再分散させ、２５℃で貯蔵した。
【００６２】
ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子の時間の経過による相対吸光度のデータ（正方形）により示されるように、応答時間が図１３に示されている。市販の磁性ビーズに関するデータ（白丸）も図１３に示されている。
【００６３】
実施例２．  ポリエチレンイミンからのイミノおよびアミノ基被包ＭＮＰの合成（ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4）
この実施例では、窒素雰囲気下において、激しく撹拌しながら、３２０ｍＬの脱イオン水中に５．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを溶かし、その後、４０ｍＬの２ＭのＫＮＯ3を加え、４０ｍＬの１ＭのＮａＯＨを滴下した。ＮａＯＨの添加後、反応槽に２００ｍＬの４ｇ／ＬのＰＥＩ（ＭＷ＝６００〜６００，０００）溶液を加え、その溶液を９０℃に加熱し、２時間に亘り９０℃に維持した。
【００６４】
次いで、熱源を切り、溶液を２５℃に自然に冷ませた。磁石を使用して、溶液からＰＥＩ被包Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を収集し、脱イオン水で洗浄した。そのナノ粒子を脱イオン水中に再分散させ、２５℃で貯蔵した。
【００６５】
実施の形態において、高分子の分子量および／または鉄：高分子の質量比を変えることによって、ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4粒子のサイズおよび形態を制御した。実施の形態において、鉄：高分子の質量比（例えば、Ｆｅ：ＰＥＩ）は、１：０．２５から１：４、例えば、１：０．２５、１：０．３３、１：０．５、１：１、１：２、１：３または１：４に及ぶことがあり、それらのいずれの間の範囲も含まれる。
【００６６】
図１４Ａ〜Ｆは、ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4粒子の組成および構造を示すＳＴＥＭの顕微鏡写真である。走査型透過電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）は、電子ビームを使用して試料を撮像する技術である。約１〜２Åの画像解像度が、極薄試料に入射する高エネルギー電子により与えられる。非常に優れた画像解像度が得られるだけでなく、加えて、結晶相、結晶方位（回折モード実験を使用して）を特徴付け、元素マップを作成し（ＥＤＳまたはＥＥＬＳを使用することにより）、元素コントラストを強調した画像を得る（暗視野モード）ことが可能である。これらは全て、正確に配置されたｎｍサイズの区域から達成することができる。試料は、炭素被覆銅グリッド上に炭素担持ナノ粒子のエチルアルコール懸濁液を落とし、その後、室温で溶媒を蒸発させることによって調製した。測定は、２００ｋＶでＦＥＩ  Ｔｉｔａｎ  Ｇ２  ８０−２００  Ｃｈｅｍｉ−ＳＴＥＭ電子顕微鏡により行った。白黒の特許図面では見えないが、これらの研究は、元素のケイ素および炭素が磁気コアの外面にあることを示している。
【００６７】
前記粒子のサイズおよび形態が、図１５Ａ〜ＥのＳＥＭ画像に示されている。試料Ａ〜Ｅについて、様々なＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4粒子に関する、平均粒径、高分子の分子量、および鉄対高分子の質量比が、表４に纏められている。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
実施例３．  ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）溶液からの疎水性基を持つカルボキシレート被包ＭＮＰの合成（ＰＭＡＡ−Ｆｅ3Ｏ4）
ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）溶液からナノ粒子を合成した。この実施例において、窒素雰囲気下において、激しく撹拌しながら、１Ｌの反応槽内の３００ｍＬの脱イオン水に１０．５ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを溶かし、その後、８０ｍＬの２ＭのＫＮＯ3を加え、８０ｍＬの１ＭのＮａＯＨを滴下した。激しく撹拌しながら、反応槽を５０℃に加熱した。
【００７０】
温度が５０℃に到達したときに、反応槽に２２ｍＬの３．４質量％のＰＭＡＡ（ＭＷ＝９，５００）水溶液を加えた。次いで、その混合物を９０℃に加熱し、２時間に亘り９０℃に維持した。
【００７１】
次いで、熱源を切り、溶液を２５℃に自然に冷ませた。磁石を使用して、溶液からＰＭＡＡ被包Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を収集し、脱イオン水で洗浄した。そのナノ粒子を脱イオン水中に再分散させ、２５℃で貯蔵した。
【００７２】
実施例４．  （４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体）ナトリウム塩溶液からのスルホン酸基を持つカルボキシレート被包ＭＮＰの合成（ＰＳＳＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4）
この実施例では、窒素雰囲気下において、激しく撹拌しながら、１Ｌの反応槽内の３００ｍＬの脱イオン水に２１ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを溶かし、その後、１６０ｍＬの２．０ＭのＫＮＯ3を加え、１２０ｍＬの２ＭのＮａＯＨを滴下した。激しく撹拌しながら、反応槽を５０℃に加熱した。
【００７３】
温度が５０℃に到達したときに、窒素パージを行いつつ、激しく撹拌しながら、反応槽に５ｍＬの２５％のＰＳＳＭＡ（ＭＷ＝２０，０００）を滴下した。次いで、その混合物を９０℃に加熱し、２時間に亘り９０℃に維持した。
【００７４】
次いで、熱源を切り、溶液を２５℃に自然に冷ませた。磁石を使用して、溶液からＰＳＳＭＡ被包Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を収集し、脱イオン水で洗浄した。そのナノ粒子を脱イオン水中に再分散させ、２５℃で貯蔵した。
【００７５】
実施例５．  超電導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）磁気測定
ＳＱＵＩＤ磁力計（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＭＰＭＳ  ＸＬ−５）を使用して、乾燥粉末試料に磁気測定を行った。−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの範囲に亘り磁場を循環させることによって、磁場（Ｈ）を印加した状態において、２９８Ｋ（室温）で磁化（Ｍ）を測定した。ＭＮＰ試料（実施例１〜４）の飽和磁化、保磁力、および残留磁気が、図９および図１０にプロットされている。選ばれたナノ粒子材料の粒径、磁化、および保磁力（Ｈc）の概要が表２に纏められており、これは、強力な粒子間相互作用によるスーパースピングラス磁性の集団挙動を示している。低磁場での磁気モーメントに対する温度依存性を、ゼロ磁場冷却モードおよび磁場冷却モードにより測定した。最初に、磁場をゼロにし、次いで、試料を２Ｋの要求温度に冷却し、約１Ｏｅの低磁場を印加し、次いで、室温超（３００〜３５０Ｋ）までの加温モードでの測定を開始する。ＺＦＣ後、温度を２Ｋに冷却しながら、磁場を維持しつつ測定を行い、試料の磁気モーメントを記録する。図５および図６は、それぞれ、ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4およびＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4の磁気モーメントに対する温度依存性である。２〜３００Ｋおよび２〜３５０Ｋの温度におけるＭＮＰの磁気モーメント値の傾向の両方とも、従来の磁性に近似できず、ほとんどの超常磁性マグネタイトも同様である。図５および図６において、それらは、温度上昇による類似の上昇傾向を示している。実験温度範囲において最大値に到達したという兆候はなく、これは、全ての試料についてのブロッキング温度（ＴB）が、３００Ｋよりもずっと高いことを示している。
【００７６】
実施例６．  ＭＮＰの組成および結晶構造
磁性粒子の組成および結晶構造を、Ｘ線粉末回析（ＸＲＤ）装置を使用して評価し、その結果が図７に報告されている。ＸＲＤの結果は、全てのＭＮＰが、逆立方スピネル結晶構造を有するＦｅ3Ｏ4であることを示した。すなわち、結晶の全てが同じ相であった。
【００７７】
実施例７．  高分子被包ＭＮＰの表面電荷評価
磁性粒子上のカルボキシル基などの表面電荷基の存在を、トルイジンブルーＯ（ＴＢＯ）技術を使用して評価した。この方法は、緩衝剤調製、染色、および測定を含む。
【００７８】
ｐＨ＝１１の緩衝剤は、２６ｍＬの０．２ＭのＨＣｌと混合された１００ｍＬの０．２ＭのＮａＣｌを含む。ｐＨ＝２の緩衝剤は、４５ｍＬの０．１ＭのＮａＯＨと混合された１００ｍＬの０．０５ＭのＮａＨＣＯ3を含む。トルイジンブルーＯ染色溶液は、０．０５％の濃度でｐＨ＝１１の緩衝剤中に溶けたトルイジンブルーＯ（ＴＢＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）粉末を含む。
【００７９】
染色および測定工程において、２．０ｍｌのＡｘｙｇｅｎ管に２０μｌまたは５０μｌの磁性粒子または対照ビーズの懸濁液を加えた。その管を、１２管ＩＭＡＧ磁気分離装置に入れた。粒子を管の側面に引き付け、透明な上清を除去し、この管に１ｍｌの水を加えた。次いで、管を分離装置から取り出し、遠心分離機にかけて、粒子を再懸濁させた。次いで、管を分離装置に戻した。粒子の沈降後、透明な上清を除去し、０．５ｍｌの０．０５％のＴＢＯ染色溶液を管に加え、遠心分離機にかけて、染色のために粒子を再懸濁させた。染色後、上述した標準的な洗浄過程を使用して、粒子を水で３回洗浄した。洗浄後、１ｍｌのｐＨ＝２の緩衝剤を加えて、結合した染料を溶出した。溶出後、管を磁気分離装置に戻した。粒子の沈降後、６３０ｎｍでのＯＤ測定のために、上清を採取した。
【００８０】
ｐＨ＝２の緩衝剤中の１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌに及ぶＴＢＯ濃度を使用して、最終的な溶出溶液中の染料濃度の計算のために標準曲線を作成した。図１６は、ＴＢＯ技術を使用した表５に示されるような、選ばれた高分子被包ＭＮＰの表面電荷特徴付けである。ＴＢＯ結合（Ｙ軸）が、ｍｇ／ｍｇの磁性ＮＰで測定されている。図１７は、水溶液中の懸濁時間に対する相対光学密度のプロットであり、溶液中に懸濁された粒子の濃度の減少を示している。ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4（５０〜１００ｎｍ）磁性粒子（図１７の丸により示される、表５の試料ｂ）およびＰＭＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4（４０〜６０ｎｍ）磁性粒子（図１７の三角形により示される、表５の試料ｃ）は、２時間後に少なくとも８０％が懸濁されたままであり、これは、図１７の正方形により示される市販のミクロン規模（１０〜２０質量％の磁気相）のビーズと比べて遜色ない。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
実施例８．  全血からのＤＮＡの単離
ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4およびＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4粒子を使用して、全血からＤＮＡを単離した。円錐管に、４０μｌの磁性粒子（１０ｍｇ／ｍＬの原料濃度）、１５ｍＬの溶解緩衝剤、次いで、５ｍＬの全血を加え、逆さにして混合した。次いで、この混合物を、中速で５分間に亘り室温においてロッカー装置で混合した。次いで、この管を３分間に亘り５０ｍＬの磁気分離装置に置いて、磁性粒子を円錐管の側面に完全に付着させた。上清を除去し、５ｍＬの溶解緩衝剤を加えた。この管を手で穏やかに３回逆さにした。管を１分間に亘りインキュベーションした。次いで、管を１分間に亘り再び磁気分離装置に置いた。再び上清を除去した。溶解細胞含有物を有する磁性ビーズを含有するペレットが管内に残った。ＤＮＡを精製するために、管に２０μｌのプロテイナーゼＫ溶液を加え、円を描くように振り混ぜ、次いで、１０分間に亘り６０℃でインキュベーションした。溶液を５〜１０分間に亘り室温に冷ませた。次いで、この混合物に３ｍＬの１００％のＩＰＡおよび３ｍＬのプロテアーゼ緩衝剤を加えた。次いで、混合物を手で穏やかに旋回させた。ＤＮＡを含有する磁性粒子を含有するペレットが形成された。次いで、管を２分間に亘り磁気分離装置に置いた。上清を除去した。洗浄するために、２ｍＬの洗浄緩衝剤１を加え、３０秒間に亘り手で旋回させ、管を１分間に亘り磁気分離装置に置き、再び上清を除去した。１ｍＬの洗浄緩衝剤２を管に加え、１分間に亘り室温でインキュベーションすることによって、第２の洗浄工程を行い、次いで、上清を除去した。
【００８３】
ＰＥＩ−Ｆｅ3Ｏ4粒子へのＤＮＡ結合の前（図１８のＡ、ＢおよびＣ）と後（図１８のＤ、ＥおよびＦ）の炭素、鉄、酸素、窒素およびリンを画像化するハイパーマップスペクトルが、図１８に示されている。図１８から分かるように、ＤＮＡのＭＮＰへの結合後に、ＮおよびＰが存在した。測定は、ＨＶ  ２００．０ｋＶで行った。
【００８４】
磁性粒子からＤＮＡを除去するために、管に１ｍＬの溶出緩衝剤を加え、１５分間に亘り６０℃でインキュベーションした。次いで、精製ＤＮＡを含有する上清を除去し、清浄な１．７ｍＬのＤＮａｓｅを含まない微小遠心管に入れた。これらの方法を使用して、５ｍＬのウシ全血から、１６０〜１８０μｇの収量のｇＤＮＡが、純度（Ａ260／Ａ280）＝約２．２で得られた。
【００８５】
図１９は、ＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4を使用した、全血からのゲノムＤＮＡ精製へのＭＮＰの適用を示している。１×のＴＢＥ緩衝剤中の１％アガロースゲルでＤＮＡを展開させた。図１９は、超らせんゲノムＤＮＡ（レーン２〜６）、Ｅｃｏ  Ｒ１制限酵素消化から生じたゲノムＤＮＡ断片（レーン８〜１３）、およびＰｓｔ  Ｉ制限酵素消化から生じたゲノムＤＮＡ断片（レーン１４〜１８）に関する染色ゲルのデジタル画像である。全ての消化は３７℃で４時間に亘り行った。ＭＮＰ−１およびＭＮＰ−２は、別々の合成からの同じＰＥＭＡ−Ｆｅ3Ｏ4を使用した２つの異なるバッチを表し、ＡおよびＢは、全血からの複製ゲノムＤＮＡ単離体を表す。*ＭＮＰ−０は、１８ヶ月に亘り−２０℃で貯蔵した全血から単離したゲノムＤＮＡを表し、単離したゲノムＤＮＡの安定性を示す。
【００８６】
実施例９．  ＰＣＲからのＤＮＡの単離（ＰＣＲ産物の精製）
ＭＮＰを水中１０ｍｇ／ｍＬで提供した。１０ｍＬのＭＮＰを、円を描くように振り混ぜ、次いで、１３．３ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ  ＤＮＡ結合緩衝剤中に再懸濁させて、７．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に到達した。ＰＣＲプレートの個々のウェルに２０μｌのＭＮＰを分配した。精製すべきＰＣＲ産物を、円を描くように穏やかに振り混ぜ、既に２０μｌのＭＮＰ懸濁液を収容している各ウェルに２０μｌのＰＣＲ産物を分配した。この溶液をピペットで取り１０回ほど混ぜた。この混合物を５分間に亘り室温でインキュベーションして、ＤＮＡをＭＮＰに結合させた。ＩＭＡＧ９６Ｐ磁気分離装置（カリフォルニア州、フォスターシティー所在のＡｘｙｇｅｎから得られる）にＰＣＲプレートを置いた。次いで、上清を除去した。次いで、ＤＮＡ結合粒子を１５０μｌの７０％エタノール中で洗浄して、このエタノール洗浄物を３０秒間インキュベーションした。エタノールを除去した。このエタノール洗浄工程を繰り返した。ＰＣＲプレートを室温で乾燥させながら、このプレートをＩＭＡＧ９６Ｐ装置内に留めた。次いで、各ウェルに４０μｌの溶出緩衝剤または水を加え、３０秒間に亘り室温でインキュベーションした。次いで、この溶液を混合して、磁性粒子を再懸濁させた。次いで、ＰＣＲプレートをＩＭＡＧ９６Ｐ装置に戻して、上清が透明に見えるようになるまで、ＭＮＰを捕捉させた。次いで、ＰＣＲ産物を含有する上清を除去した。
【００８７】
（Ａ）ＰＣＲ産物の精製検定におけるＭＮＰのＤＮＡ結合能が、図２０に示されている。６つの図示された検定（１）〜（６）の各々について、最も左の棒は出発ＤＮＡ濃度を表し、真ん中の棒は開示されたＭＮＰのデータを表し、最も右の棒は市販のキットからのデータを表している。精製後の溶出ＤＮＡの量を比べると、開示されたＭＮＰ材料は、一貫して、８０〜９０％の収率で、市販製品に優っている。ＰＣＲ産物の精製検定は、２マイクロリットルの出発ＤＮＡ材料、４０マイクロリットルの溶出緩衝剤、および２０マイクロリットルの７．５ｍｇ／ｍＬの磁性ナノ粒子に基づく。
【００８８】
図２１を参照して、ＶDNA対Ｖ緩衝剤＋ＭＮＰ比を変えることにより、特定のサイズ範囲内のＤＮＡを選択的に精製することが可能になる。ここに用いたように、例えば、０．４／０．２は、最大サイズのＤＮＡを除去するために、結合緩衝剤中の０．４部の磁性粒子に、１部のＤＮＡ溶液を最初に加えることを意味する。次いで、その上清を結合緩衝剤中の０．２部の磁性粒子と混ぜ合わせて、標的ＤＮＡを粒子に結合させ、上清中により小さいサイズのＤＮＡおよび汚染物質を残す。ＰＣＲ産物のサイズは５３８ｂｐである。
【００８９】
ここに開示された磁性粒子は、抗体、ウイルス、タンパク質、薬剤などを含む、細胞、細胞成分、または細胞生産物の分離、単離および／または精製のためなどのバイオプロセスに使用してよい。例として、磁性粒子は、エンドソーム、膜画分、ミトコンドリア、リボソーム、細胞内小器官などの分離、単離および／または精製に使用してよい。
【００９０】
さらなる例として、磁性粒子は、無細胞胎児ＤＮＡ、ＰＣＲ産物ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、細菌ＲＮＡまたはＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなどを含む核酸の精製に使用してよい。全血、血漿、血清、軟膜、骨髄、羊水、髄液、他の体液（例えば、唾液、のど、頬、膣または喉のぬぐい液）、毛包、糞便、尿、組織、採取したてまたは凍結試料、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、および植物試料などの様々な生物学的起源から核酸、並びにペプチドおよびタンパク質が得られるであろう。
【００９１】
粒状磁性材料で精製された核酸は、（非侵襲的）出生前スクリーニング、癌検査、ウイルスまたは細菌検出／診断、献血者スクリーニング、臓器提供者マッチング、遺伝性疾患の遺伝病研究、系統的試験、民族性試験、ヒト白血病抗原（ＨＬＡ）試験、農業、または遺伝／ゲノム／エピゲノム研究などの様々な用途に使用できる。磁性粒子の表面に吸着されたペプチドまたはタンパク質は、ＥＬＩＳＡまたは化学発光検定のための標的分子として使用してよい。
【００９２】
ここに用いたように、名詞は、特に明記のない限り、複数の対象を指す。それゆえ、例えば、「磁性粒子」への言及は、特に明記のない限り、そのような「磁性粒子」を２つ以上有する例を含む。
【００９３】
「含む」という用語は、包含するがそれに限定されないこと、すなわち、包括的であり排他的ではないことを意味する。
【００９４】
「随意的」または「必要に応じて」は、続いて記載された事象、状況、または要素が、生じ得るまたは生じ得ないことを意味し、またその説明が、その事象、状況、または要素が生じる例、および生じない例を含むことを意味する。
【００９５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、としてここに表現できる。そのような範囲が表現された場合、例は、その１つの特定の値から、および／または他方の特定の値まで、を含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により、近似として表現されている場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。範囲の各端点は、他方の端点に関してと、他方の端点とは関係なくの両方で有意であることがさらに理解されよう。
【００９６】
特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程を特定の順序で行うことを要求していると考えることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順序を実際に挙げていない場合、または工程を特定の順序に限定すべきであることが、請求項または説明に他に具体的に述べられていない場合、どのような特定の順序も暗示されることは決して意図されていない。いずれか１つの請求項のいずれの挙げられた１つまたは多数の特徴または態様も、いずれか他の請求項におけるいずれの他の挙げられた特徴または態様と組み合わされ得るまたは並べ替えられ得る。
【００９７】
ここでの列挙は、特定の様式で機能するように「構成された」または「適合された」構成要素を称することも留意のこと。この点に関して、そのような構成要素は、意図する用途の列挙とは対照的に、構造的列挙である場合、特定の性質を具体化する、または特定の様式で機能するように「構成されている」または「適合されている」。より詳しくは、構成要素が「構成されている」または「適合されている」様式に対するここでの言及は、その構成要素の既存の物理的状態を示し、それゆえ、その構成要素の構造的特徴の明確な列挙と解釈すべきである。
【００９８】
特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程は、移行句「含む」を使用して開示されることがあるが、移行句「からなる」または「から実質的になる」を使用して記載されることがあるものを含む代わりの実施の形態が暗示されることを理解すべきである。それゆえ、例えば、磁気コアおよび高分子シェルを含むナノ粒子の代わりの実施の形態は、ナノ粒子が磁気コアおよび高分子シェルからなる実施の形態、およびナノ粒子が磁気コアおよび高分子シェルから実質的になる実施の形態を含む。
【００９９】
本開示の精神および範囲から逸脱せずに、本発明の技術に様々な改変および変更を行えることが、当業者に明白であろう。本発明の技術の精神および実体を含む開示された実施の形態の改変、組合せ、下位の組合せおよび変更が当業者に想起されるであろうから、本発明の技術は、付随の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内に全てを含むと考えるべきである。
【０１００】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【０１０１】
実施形態１
磁性粒子において、
磁気コアおよび高分子コーティング、
を含み、
前記磁気コアは、Ｂ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｎｂ、Ｓｍ、Ｌｎ、Ｙｂ、Ｄｙ、ＧｄまたはＥｒからなる群より選択される少なくとも１種類の金属の金属、金属合金、または金属酸化物を含み、
前記磁気コアは、超常磁性である多結晶粒子であって、合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する多結晶粒子を含み、
前記高分子コーティングは前記磁気コアを取り囲み、
前記磁性粒子は、室温で、ゼロより大きく３００Ｏｅ未満の保磁力、ゼロより大きく１２ｅｍｕ／ｇ未満の残留磁気を示し、
前記磁性粒子の粒径が５００ｎｍ以下である、磁性粒子。
【０１０２】
実施形態２
前記磁気コアの多結晶粒子が同じ結晶相である、実施形態１に記載の磁性粒子。
【０１０３】
実施形態３
前記磁性粒子の磁気モーメントが、温度が室温を超えて上昇するにつれて、増加する、実施形態１または２に記載の磁性粒子。
【０１０４】
実施形態４
前記粒子が、室温で５０ｅｍｕ／ｇ超かつ１００ｅｍｕ／ｇ未満の飽和磁化を有する、実施形態１から３いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１０５】
実施形態５
合体してスーパースピングラス磁気コアを形成する前記多結晶粒子が、軟磁性材料である、実施形態１から４いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１０６】
実施形態６
前記保磁力が３０Ｏｅと１５０Ｏｅの間である、実施形態１から５いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１０７】
実施形態７
前記残留磁気が３ｅｍｕ／ｇと１０ｅｍｕ／ｇの間である、実施形態１から６いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１０８】
実施形態８
前記高分子コーティングが、ポリ（エチルメタクリレート）、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、４−スチレンスルホン酸−マレイン酸共重合体、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリチオール、およびポリメルカプト酸、またはそれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１から７いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１０９】
実施形態９
前記コアが前記粒子の少なくとも６０質量％を占める、実施形態１から８いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１１０】
実施形態１０
前記磁性粒子の直径が１０から２５０ｎｍである、実施形態１から９いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１１１】
実施形態１１
前記高分子コーティングの平均厚が１０ｎｍから２５０ｎｍである、実施形態１から１０いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１１２】
実施形態１２
カルボン酸／カルボキシレート、アミノ／イミン、メチル、メチレン、チオール、無水物、リン酸、スルホン酸／スルホネート、スルホンアミド、およびホスファチドからなる群より選択される表面官能基をさらに有する、実施形態１から１１いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１１３】
実施形態１３
前記磁気コアがＦｅ3Ｏ4から作られている、実施形態１から１２いずれか１つに記載の磁性粒子。
【０１１４】
実施形態１４
磁性粒子を製造する方法であって、
金属前駆体、酸化剤または還元剤、高分子源、および塩基性化合物を含む溶液を形成する工程、および
前記溶液の温度を少なくとも５０℃に上昇させて、コアおよび該コアを取り囲み被包する高分子コーティングを有する磁性粒子を形成する工程、
を有してなる方法。
【０１１５】
実施形態１５
前記溶液が水性である、実施形態１４に記載の方法。
【０１１６】
実施形態１６
前記溶液中の金属対高分子の質量比が１：０．０５から１：２０に及ぶ、実施形態１４に記載の方法。
【０１１７】
実施形態１７
前記磁性粒子が、重合反応を行わずに形成される、実施形態１４から１６いずれか１つに記載の方法。
【符号の説明】
【０１１８】
１００    磁性粒子
１１０    コア
１１２    コアの外面
１２０    コーティング
１２２    コーティングの外面
１２４    コーティングの内面
１３２    コーティングの厚さ
１３４    粒径
１３６    磁気コアサイズ
【図１】
2017539080.tif 000012
【図２Ａ】
2017539080.tif 000013
【図２Ｂ】
2017539080.tif 000014
【図２Ｃ】
2017539080.tif 000015
【図２Ｄ】
2017539080.tif 000016
【図３】
2017539080.tif 000017
【図４】
2017539080.tif 000018
【図５】
2017539080.tif 000019
【図６】
2017539080.tif 000020
【図７】
2017539080.tif 000021
【図８】
2017539080.tif 000022
【図９】
2017539080.tif 000023
【図１０】
2017539080.tif 000024
【図１１】
2017539080.tif 000025
【図１２】
2017539080.tif 000026
【図１３】
2017539080.tif 000027
【図１４Ａ】
2017539080.tif 000028
【図１４Ｂ】
2017539080.tif 000029
【図１４Ｃ】
2017539080.tif 000030
【図１４Ｄ】
2017539080.tif 000031
【図１４Ｅ】
2017539080.tif 000032
【図１４Ｆ】
2017539080.tif 000033
【図１５Ａ】
2017539080.tif 000034
【図１５Ｂ】
2017539080.tif 000035
【図１５Ｃ】
2017539080.tif 000036
【図１５Ｄ】
2017539080.tif 000037
【図１５Ｅ】
2017539080.tif 000038
【図１６】
2017539080.tif 000039
【図１７】
2017539080.tif 000040
【図１８Ａ】
2017539080.tif 000041
【図１８Ｂ】
2017539080.tif 000042
【図１８Ｃ】
2017539080.tif 000043
【図１８Ｄ】
2017539080.tif 000044
【図１８Ｅ】
2017539080.tif 000045
【図１８Ｆ】
2017539080.tif 000046
【図１９】
2017539080.tif 000047
【図２０】
2017539080.tif 000048
【図２１】
2017539080.tif 000049
【国際調査報告】
2017539080.tif 000050
2017539080.tif 000051
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