(57)【要約】  治療薬が免疫寛容原性マーカー、例えばＰＤ−Ｌ１の発現を上昇させる能力を、単球、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞などの抗原提示細胞によって判定することを含む治療薬の免疫寛容原性能力の判定方法が本明細書に提供される。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ
2017506332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬の免疫寛容原性の判定方法であって、
ａ．前記治療薬をインビボで検査抗原提示細胞を含む検査試料と接触させること、
ｂ．前記治療薬と接触した前記検査抗原提示細胞によってＰＤ−１リガンドを含む少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を測定し、この中で、前記測定工程は、前記接触工程後の７２時間以内に生じること、及び
ｃ．前記検査抗原提示細胞による前記少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を適切な対照と比較すること
を含む前記方法であって、この中で、前記対照抗原提示細胞と比較した前記検査抗原提示細胞による前記少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現の上昇は、前記治療薬が免疫寛容原性であることを判定する、前記方法。
【請求項２】
前記測定工程は、前記接触工程の約２４時間後に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬はＴ細胞を含み、かつ前記検査及び対照抗原提示細胞は、前記Ｔ細胞に対して自家性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬はＴ細胞を含み、かつ前記検査及び対照抗原提示細胞は、前記Ｔ細胞に対してアロジェニックである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞は、アレルゲン及び自己抗原からなる群から選択される抗原に対して反応性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞は、自己抗原に対して反応性がある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記自己抗原は、ミエリンタンパク質、アクアポリン、または血小板糖タンパク質からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリン乏突起膠細胞タンパク質からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞は、単球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞は、Ｂ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定工程は、前記検査及び対照抗原提示細胞を免疫寛容原性マーカーに特異的な抗体とともにインキュベートすること、ならびに前記検査及び対照抗原提示細胞へ結合した抗体の量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、検出可能な標識で標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は、フローサイトメトリーによって検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫寛容原性マーカーに対する抗体及び抗原提示細胞マーカーに対する抗体を含む治療用マーカーの免疫寛容原性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬の免疫寛容原性及び／または効力の判定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在、物理化学的特性、抗原性、免疫原性、感染性及び感染または疾患に対する防護に関するアッセイなどの異なる検査方法が、治療薬の効力を測定するのに使用されている。この適用は、治療薬の性質及び検査の目的による。例えば、ワクチンの場合、効力はしばしば、標的動物種におけるまたは別の種、例えばマウスまたはラットにおける免疫応答を測定することによって判定される。
【０００３】
先行報文は、自己免疫疾患のＴ細胞免疫療法、例えば、弱毒化自己反応性Ｔ細胞による予防接種が、自己反応Ｔ細胞に対する抗イディオタイプ及び／または抗エルゴタイプの活性を上昇させることによって異常な自己免疫応答を制御するよう調節性免疫応答を誘導することを示している。自己抗原特異的Ｔ細胞の投与が独特なパラクリンシグナルを誘発することができ、当該シグナルが、自己免疫障害と関係する炎症を制御するのを支援するよう抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び／またはエフェクターＴ細胞の免疫寛容原性ネットワークを促進すると考えられている。このようなものとして、このようなＴ細胞を基にした治療薬の効力を測定することは、調節性免疫応答の誘導を測定することを必要とする。
【０００４】
治療薬、特に調節性免疫を誘導する治療薬の効力を測定することのできる高処理量の、好ましくはインビトロでのアッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
治療薬の免疫寛容原性を判定することを含む、治療薬の効力を評価する方法が本明細書に開示される。治療薬の免疫寛容原性の判定方法は概して、治療薬を、検査抗原提示細胞を含む検査試料と好ましくはインビトロで接触させる工程、治療薬と接触した検査抗原提示細胞による少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を測定する工程、及び検査抗原提示細胞による少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を適切な対照と比較する工程を含み、この中で、対照抗原提示細胞と比較した検査抗原提示細胞による少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現の上昇は、当該治療薬が免疫寛容原性であることを判定する。好ましい実施形態において、少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーは、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１を含む。好ましい実施形態において、測定する工程は、接触する工程の約２４〜７２時間後以内に、なおもより好ましくは約４８〜７２時間以内に、最も好ましくは約７２時間以内に実施される。一実施形態において、治療薬の効力は、当該治療薬の免疫寛容原性と直接相関している。
【０００６】
一実施形態において、当該治療薬は、これを必要とする患者を特定の作用因子に対して寛容化する、例えば、アレルゲンまたは自己抗原などの当該抗原に対する当該患者の免疫応答を下方制御するよう投与される。一実施形態において、当該治療薬は、アレルゲン、その寛容化エピトープ、当該アレルゲンに特異的な免疫細胞を含むワクチン、当該アレルゲンに特異的な免疫細胞の断片を含むワクチン、及び当該アレルゲンまたはその寛容化エピトープをコードする核酸からなる群から選択される。好ましくは、当該治療薬は、自己抗原、その寛容化エピトープ、当該自己抗原に特異的な免疫細胞を含むワクチン、当該自己抗原に特異的な免疫細胞の寛容化断片を含むワクチン、及び当該自己抗原またはその寛容化エピトープをコードする核酸からなる群から選択される。
【０００７】
例示的な好ましい実施形態において、当該治療薬は、自己抗原に特異的なＴ細胞を含み、この中で、当該自己抗原は好ましくは、ミエリンタンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質）、アクアポリン４、ならびに血小板膜糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ及びＩｂ−ＩＸからなる群から選択される。最も好ましくは、当該治療薬は、ミエリンタンパク質に特異的な弱毒化Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、当該Ｔ細胞ならびに当該検査及び対照抗原提示細胞はアロジェニックである。ある好ましい実施形態において、当該Ｔ細胞並びに当該検査及び対照抗原提示細胞は自家性である。
【０００８】
好ましい実施形態において、抗原提示細胞を含む検査及び／または対照試料は、単球、樹状細胞、Ｂ細胞及び／または単球、マクロファージ、樹状細胞、もしくはＢ細胞に由来する細胞株を含む。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、単球、例えば、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１などに由来する細胞株を含む。好ましくは、検査及び対照抗原提示細胞は、Ｂ細胞を含む。最も好ましくは、検査及び対照抗原提示細胞は、単球を含む。
【０００９】
一実施形態において、少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーは、ＣＤ８６などの抗原提示細胞の少なくとも１つのマーカーとの組み合わせで測定される。より好ましくは、免疫寛容原性マーカーを検出する高処理量方法、及び任意に抗原提示細胞マーカーが使用される。最も好ましくは、フローサイトメトリー分析は、抗原提示細胞上での少なくとも１つの免疫寛容原性マーカー、例えば、ＰＤ−Ｌ１、及び抗原提示細胞マーカー、好ましくはＣＤ８６の細胞表面発現を同時に検出するために使用される。
【００１０】
治療薬の免疫寛容原性を判定するためのキットも本明細書に提供され、当該キットは、免疫寛容原性マーカーに対する抗体及び抗原提示細胞マーカーに対する抗体を含む。好ましくは、当該キットは、抗体もしくは複数の抗体を検出するための検出試薬及び／または当該キットを使用するための説明書も含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、（Ａ）単独でまたは（Ｂ）ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）の存在下でインキュベートした場合の自己リンパ球（ＣＤ８６-、ｘ軸）または自己単球（ＣＤ８６、ｘ軸）による細胞表面ＰＤ−Ｌ１発現（ｙ軸）を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図２】図２は、単独で（■）または５つの独立したＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品由来の自己Ｔ細胞（□）の存在下でインキュベートした場合（ｘ軸）の、細胞表面上でのＰＤ−Ｌ１を発現する単球の割合（ｙ軸）を示す。
【図３】図３は、５つの独立したＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品由来の自己Ｔ細胞都のインキュベーション後の蛍光抗ＰＤ−Ｌ１抗体と結合した単球（ｘ軸）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数変化（ｙ軸）を示す。
【図４】図４は、（Ａ）２４時間または（Ｂ）７２時間単独でまたはアロジェニックなＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品由来のＴ細胞とインキュベートした場合の細胞表面上でＰＤ−Ｌ１を発現する免疫細胞の割合（ｙ軸）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に専門的な抗原提示細胞は、照射されたアポトーシス細胞（弱毒化自己反応性Ｔ細胞など）と相互作用する際、有意な表現型変化及び免疫寛容原性変化を受けることができる。照射された自家性白血球との曝露後、樹状細胞は、ＩＬ−１０の分泌亢進及び無感作Ｔ細胞増殖の刺激欠損を含む免疫寛容原性特徴を実証している（Ｚｈｅｎｇ  ＤＨら（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３９５（４）：５４０〜５４６）。その上、ＨＩＶによる慢性ウイルス感染は結果的に、種々の細胞型におけるＰＤ−Ｌ１の発現亢進、単球からのＩＬ−１０分泌、及びＴ細胞増殖の抑制を生じる（Ｓａｉｄ  ＥＡら（２０１０）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１６（４）：４５２〜４５９）。Ｔ細胞増殖及び機能は、例えば、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間及びＩＬ−１０ＲとＩＬ−１０の間の相互作用を遮断することによって回復し、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＩＬ−１０を包含する相互作用、これらの個々の受容体及び個々の経路における他の分子が、寛容誘導の有用なマーカーであり得ることを示唆している。
【００１３】
本明細書で使用する場合、免疫寛容原性マーカーは、その発現の上方制御が寛容化剤と接触した抗原発現細胞によって即時検出され得るタンパク質を含み得る。例えば、ＰＤ−１リガンド、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１を含む免疫寛容原性マーカーの発現は、寛容化剤との接触後２４時間、４８時間、または７２時間以内に、好ましくは、４８時間以内に、最も好ましくは２４時間以内に検出され得る。
【００１４】
多発性硬化症において、ＰＤ−Ｌ１のＡＰＣ発現低下及び炎症誘発性サイトカインの分泌亢進は、多発性硬化症患者における進行と相関している（Ｋａｒｎｉ  Ａ．ら（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（６）：４１９６〜４２０２）。逆に、ＩＦＮ−β療法を用いた多発性硬化症の治療は、単球及び樹状細胞に及ぼすＰＤ−Ｌ１発現を強く亢進し、自家性ＣＤ４  Ｔ細胞活性化を有意に阻害する（Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ  Ｂ（２００４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１７２〜１８２．）。
【００１５】
ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）は、個体の末梢血単核細胞から増殖した自家性ミエリン反応性Ｔ細胞のプールから構成された多発性硬化症（ＭＳ）のためのＴ細胞免疫療法である。本明細書で開示する場合、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品の効力は、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）曝露に応じて抗原提示細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現をモニターすることによって検査され得る。具体的には、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品との培養に応じて、ＰＤ−Ｌ１の発現は、レスポンダー単球において誘導される。
【００１６】
これらの先の見解は、治療薬の免疫寛容原性を判定するための手段としての抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカー、例えば、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１を含む免疫寛容原性マーカーの発現の検出を支持する。
【００１７】
（治療薬）
したがって、一局面において、本発明は、治療薬の免疫寛容原性の判定方法を提供する。本明細書で使用する場合、「免疫寛容原性」という用語は、特定の抗原に対して「寛容化する」または「寛容性」を誘導するための治療薬の能力を指す。「寛容性」という用語は、適応性免疫応答、例えば、特異的抗原に対するＴ細胞及び／または抗体の応答における低下を指す。特異的抗原に対する免疫応答の低下は、免疫調節細胞、例えば、抗イディオタイプの及び／または抗エルゴタイプの免疫細胞の特別なサブセットの感作及び／または応答の増強と同時であり得る。
【００１８】
当業者は、治療薬の免疫寛容原性が当該治療薬の効力と関係し得ることを認識するであろう。本明細書で使用する「効力」は、投与後に所望の効果を生じるための治療薬の能力を指す。
【００１９】
好ましい実施形態において、治療薬の所望の効果とは、特定の抗原、例えばアレルゲン、自己抗原に対する免疫応答の寛容化である。これらの実施形態において、治療薬の免疫寛容原性は、その効力と直接相関している。好ましい実施形態において、本明細書に開示する方法は、アレルゲンまたは自己抗原に対する寛容性を誘導しようとする治療薬の効力を判定するために使用する。
【００２０】
「アレルゲン」は、対象における望ましくない（例えば、１型過敏性）免疫応答（すなわち、アレルギー性応答またはアレルギー性反応）を生じることのできる何らかの物質である。アレルゲンには、植物アレルゲン（例えば、花粉、ブタクサアレルゲン）、虫アレルゲン、虫刺傷アレルゲン（例えば、ミツバチ虫刺傷アレルゲン）、動物アレルゲン（例えば、動物フケまたはネコＦｅｌ  ｄ1抗原などのペットアレルゲン）、ラテックスアレルゲン、カビアレルゲン、真菌アレルゲン、化粧料アレルゲン、薬剤アレルゲン、食物アレルゲン、塵埃、虫毒液、ウイルス、細菌などが含まれるが、これらに限定しない。食物アレルゲンには、乳アレルゲン、卵アレルゲン、ナッツアレルゲン（例えば、ピーナッツアレルゲンまたはツリーナッツアレルゲンなど（例えば、ウォルナッツ、カシューナッツなど））、魚アレルゲン、貝アレルゲン、ダイズアレルゲン、マメ科植物アレルゲン、種子アレルゲン及びコムギアレルゲンが含まれるが、これらに限定しない。虫刺傷アレルゲンには、ミツバチ穿刺、スズメバチ（ｗａｓｐ）穿刺、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）穿刺、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ  ｊａｃｋｅｔ）穿刺などであるまたはこれらと関係しているアレルゲンが含まれる。虫アレルゲンには、ハウスダストダニアレルゲン（例えば、ＤｅｒＰ１抗原）及びゴキブリアレルゲンも含まれる。薬剤アレルゲンには、抗生物質、非ステロイド系抗炎症薬、麻酔薬などであるまたはこれらと関係しているアレルゲンが含まれる。花粉アレルゲンには、草アレルゲン、樹木アレルゲン、雑草アレルゲン、花アレルゲンなどが含まれる。「アレルギーと関係しているアレルゲン」とは、単独でまたは他のアレルゲンとの組み合わせで、対象におけるアレルギー応答もしくはアレルギー反応またはアレルギー応答もしくはアレルギー反応の症状を結果的に生じる、あるいは結果的に生じると臨床医によって予測されるであろう望ましくない免疫応答を生じるアレルゲンである。
【００２１】
「自己抗原」とは、組織に対する損傷及び／または自己免疫疾患をしばしば結果的に生じる自己体液性（Ｂ細胞）またはＴ細胞仲介性免疫応答によって標的とした身体中の正常な組織構成要素である。本明細書で使用する「自己」は、同じ個体由来の細胞もしくは組織または、例えば同一のＭＨＣ／ＨＬＡハプロタイプを有する、免疫学的に互換性のある細胞もしくは組織を指す。本明細書で使用する「アロジェニックな」は、遺伝的に類似していないかつ免疫学的に互換性のない、例えば異なるＭＨＣ／ＨＬＡハプロタイプを有する細胞または組織を指す。自己抗原の非限定例としては、ミエリンタンパク質の構成要素（例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質）、アクアポリン４、血小板膜糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ及びＩｂ−ＩＸ、インスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、熱ショックタンパク質６５（ｈｓｐ６５）、膵島細胞抗原６９（ＩＣＡ６９）、膵島細胞抗原関連タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、ＧＭ２−１ガングリオシド、Ｔｅｐ６９、膵島細胞タンパク質チロシンホスファターゼ及びそれに由来する３７ｋＤａ自己抗原（ＩＡ−２を含む）、フォグリン、ヒト軟骨細胞糖タンパク質３９、コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨結合タンパク質、エズリン、ラジキシン、モエシン、ミコバクテリア熱ショックタンパク質６、デスモグレイン、β−２−ＧＰＩ、Ｋｕ（ｐ７０／ｐ８０）自己抗原もしくはその８０ｋｄサブユニットタンパク質、核内自己抗原Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）及びＲｏ（ＳＳ−Ａ）、プロテアソームβ型サブユニットＣ９、セントロソーム自己抗原ＰＣＭ−１、多発性筋炎−強皮症自己抗原（ＰＭ−Ｓｃｌ）、自己抗原ＣＥＮＰ−Ａ、Ｕ５、核小体Ｕ３−リボ核タンパク質及びＴｈ（７−２）リボ核タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ７、ｈＰｏｐ１、核マトリックス抗原由来の３６ｋｄタンパク質、甲状腺ペルオキシダーゼ及び甲状腺刺激ホルモン受容体、ヒトＴＳＨ受容体、アセチルコリン受容体、筋受容体キナーゼ、またはその他の適切な自己抗原が挙げられる。
【００２２】
当業者は、全長のアレルゲンもしくは全長の自己抗原、アレルゲンの寛容化エピトープもしくは自己抗原の寛容化エピトープ、弱毒化し得、アレルゲンもしくは自己抗原に特異的もしくは応答性がある免疫細胞を含むワクチン、アレルゲンもしくは自己抗原に特異的もしくは応答性がある免疫細胞の寛容化断片（例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、これらの誘導体など）を含むワクチン、及び核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡを含み、アレルゲン、自己抗原、これらの寛容化エピトープ、ならびに抗原もしくは自己抗原に特異的及び／もしくは応答性のある免疫細胞の寛容化断片をコードするワクチン、を含むがこれらに限定しないアレルゲンまたは自己抗原に対する寛容を誘導しようとする治療薬を容易に認識するであろう。本明細書で使用する場合、アレルゲンまたは自己抗原の寛容化エピトープにはそれぞれ、アレルゲンまたは自己抗原の断片、融合タンパク質、ペプチドミメオ型、及び変化したペプチドが含まれ得るが、これらに限定しない。
【００２３】
抗原決定基としても公知の「エピトープ」は、例えば抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって特異的に免疫系によって認識される抗原、例えば、アレルゲン、自己抗原の一部である。エピトープはしばしば、有核細胞上に認められるＭＨＣまたはＨＬＡ分子によって免疫細胞へ呈される。いくつかの実施形態において、エピトープ自体は抗原である。
【００２４】
一実施形態において、当該治療薬は、自己抗原に対する寛容を誘導しようとする。好ましい実施形態において、自己抗原は、ミエリンタンパク質、アクアポリン４、及び血小板膜糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ及びＩｂ−ＩＸからなる群から選択される。より好ましい実施形態において、当該自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、及びミエリン乏突起膠細胞タンパク質からなる群から選択されるミエリンタンパク質である。好ましくは、自己抗原に対する寛容を誘導しようとする治療薬は、弱毒化したＴ細胞を含み、この中で、当該Ｔ細胞は、自己抗原特異的である。
【００２５】
一実施形態において、治療薬の所望の効果は、特定の抗原に対する免疫応答の活性化である。このような治療薬に、病原性抗原、腫瘍抗原、病原性抗原の断片、腫瘍抗原の断片、病原性抗原をコードする核酸、及び腫瘍抗原をコードする核酸が含まれることは当該技術分野において周知である。周知の腫瘍抗原に関する非限定例としては、サイトケラチン、特に癌腫についての抗原としてのサイトケラチン８、１８及び１９、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚性抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪小球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６、筋原性肉腫の抗原としての筋特異的デスミン及びアクチン、胎盤アルカリホスファターゼ、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ならびに絨毛性細胞腫瘍及び生殖細胞腫瘍の抗原としてのα−フェトプロテイン、前立腺癌腫の抗原としての前立腺特異的抗原、結腸腺癌の癌胎児抗原、黒色腫の抗原としてのＨＭＢ−４５、ならびに神経内分泌及び神経外胚葉性腫瘍の抗原としてのクロモグラニンＡ及びシナプトフィジンが挙げられる。これらの実施形態において、治療薬の免疫寛容原性は、治療薬の効力と直接相関しておらず、代わりに、当該治療薬の免疫寛容原性がその効力と逆相関していることがあり得る。
【００２６】
（抗原提示細胞、免疫寛容原性マーカー、及び当該マーカーの測定）
本明細書に開示する場合、本明細書に開示する治療薬の免疫寛容原性の判定方法は概して、治療薬を抗原提示細胞と接触させること、及び抗原提示細胞による少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を測定することを含む。
【００２７】
先に論議したように、エピトープはしばしば、有核細胞全部に認められるＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子によって免疫細胞へ提示される。換言すれば、有核細胞はすべて、クラスＩ分子を用いた抗原提示ができる。しかしながら、いくつかのエピトープは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、及びこれらに由来する細胞株など、専門的な抗原提示免疫細胞において認められるＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子によって免疫細胞へ提示される。好ましい実施形態において、本明細書に開示する方法は、専門的な抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現を測定することを含む。好ましい実施形態において、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、またはこれらに由来する細胞株を含む抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現が測定される。より好ましくは、マクロファージ、単球、及び／またはこれらに由来する細胞株、例えば、Ｕ９３７細胞株もしくはＴＨＰ−１細胞株、最も好ましくは、単球を含む抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現が測定される。
【００２８】
二次性進行型多発性硬化症（ＳＰ−ＭＳ）に罹患している個体由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表現型を、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲ−ＭＳ）に罹患している個体または健常対照と比較する研究は、自己免疫疾患に罹患している個体由来のＡＰＣが炎症性応答へと偏向し、ＰＤ−Ｌ１発現の低下によって特色づけられ、炎症性仲介因子の分泌を高めることを示唆している（Ｋａｒｎｉ  Ａら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（６）：４１９６〜４２０２）。しかしながら、ＩＦＮ−β療法を用いた処置は、単球及びＤＣにおけるＰＤ−Ｌ１発現を強く亢進し、ＤＣをより免疫寛容原性／調節性にしており、二次培養の際に自家性ＣＤ４  Ｔ細胞活性化を誘導し損ねたことによって支持されている（Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ  Ｂら（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１７２〜１８２．）。総合すると、これらのデータは、ＳＰ−ＭＳ患者におけるＰＤ−Ｌ１発現の誘導が、ＳＰ−ＭＳ患者における機能障害となる免疫寛容原性／調節性ネットワークを回復させるのを支援し得、新規の治療目的を明らかにし得る。本明細書で開示する場合、ＰＤ−Ｌ１発現は、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）への曝露の結果として、単球において強く誘導されており、抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの誘導が、生成物の効力及び作用機序の両方の示度として機能することができることを示唆している。
【００２９】
したがって、一実施形態において、免疫寛容原性マーカーとしてのＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などの発現を測定する。一実施形態において、抗原提示細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現を測定する。他の実施形態において、ＰＤ−１リガンドの発現を、抗原提示細胞と治療薬の接触後７２時間以内に測定する。好ましくは、抗原提示細胞によるＰＤ−１リガンドの発現を、抗原提示細胞と治療薬の接触約２４時間後に測定する。抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現を検出するための、当業者に公知の種々のアッセイフォーマットがある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。非限定例として、免疫寛容原性マーカータンパク質の検出は、当該タンパク質へ結合しかつ好ましくは（例えば、放射性標識、発光標識、蛍光標識、酵素などを用いて）検出可能に標識した抗体を用いて実施され得る。抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカータンパク質の発現は、周知の方法またはアッセイ、例えば、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学、免疫蛍光、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイツイムノアッセイ、沈降反応、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動法、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、ラジオイムノアッセイ、ストリップ検査、臨床現場即時検査、及びこれらに類するものによって特異的抗体により結合した免疫寛容原性マーカーを検出することによって測定され得る。いくつかの実施形態において、自動検出アッセイを利用する。イムノアッセイの自動化方法には、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８８５，５３０号、第４，９８１，７８５号、第６，１５９，７５０号、及び第５，３５８，６９１号に説明されている方法が含まれる。いくつかの実施形態において、結果の分析及び提示も自動化する。
【００３０】
抗原提示細胞による細胞表面タンパク質、例えばＰＤ−Ｌ１を含む免疫寛容原性マーカーの発現は、蛍光標識細胞分取によって測定され得る。あるいは、サイトカインを含む免疫寛容原性マーカーの発現は、周知のイムノアッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて測定され得る。
【００３１】
感度を改善するために、複数のマーカーが所与の使用内でアッセイされ得る。特に、１つ以上の他の免疫寛容原性マーカーは、抗原提示細胞のマーカーと組み合わせてアッセイされ得る。抗原提示細胞に対する細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体または抗原提示細胞によって比較的特異的に発現する他の受容体が挙げられるが、これらに限定しない。樹状細胞についての細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮγ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体または樹状細胞によって比較的特異的に発現する他の受容体が挙げられるが、これらに限定しない。単球／マクロファージについての細胞表面マーカーの例としては、ＣＤ１４、ＣＤ３２、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ８３、ｐ５５、ＣＤ４０及びＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定しない。Ｂ細胞についての細胞表面マーカーの例としては、Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定しない。
【００３２】
組み合わせアッセイは、同時にまたは連続して実施され得る。マーカーの選択は、最適な感度を結果的に生じる組み合わせを判断するために所定の実験に基づき得る。好ましい実施形態において、抗原提示細胞の細胞表面免疫寛容原性マーカー及び細胞表面マーカーを、蛍光標識細胞分取及び／またはフローサイトメトリー分析を用いて同時に測定する。より好ましくは、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８６の細胞表面発現は、フローサイトメトリー分析によって同時に測定する。
【００３３】
好ましい実施形態において、検査試料（すなわち、治療薬と接触した抗原提示細胞）による少なくとも１つの免疫寛容原性マーカーの発現を測定する上で、検査抗原提示細胞による発現の検出されたレベルは概して、対応する及び適切な対照試料（すなわち、治療薬と接触していない、好ましくは検査抗原提示細胞と同種の抗原提示細胞）による発現の検出されたレベルと比較され得る。好ましい実施形態において、対照抗原提示細胞と比較した、検査抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現レベルにおける及び／または免疫寛容原性マーカーを発現する検査抗原提示細胞数における相対的な増大は、治療薬の免疫寛容原性及び／または効力と直接相関している。
【００３４】
検査試料抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現レベル及び／または免疫寛容原性マーカーを発現する検査抗原提示細胞の割合は、対照試料の倍数増加の点で測定され得、例えば、検出可能な発現レベル及び／または免疫寛容原性マーカーを発現する細胞の割合の３倍増加は、３の免疫寛容原性レベルとみなし得、検出可能な発現レベルの５倍増加及び／または免疫寛容原性マーカーを発現する細胞の割合は、５の免疫寛容原性レベルとみなし得、対照を上回る１０倍増加は、１０の免疫寛容原性レベルとみなし得、対照を上回る１００倍増加は、１００の免疫寛容原性レベルとみなし得るなどである。一実施形態において、治療薬の免疫寛容原性レベルが少なくとも約３、例えば少なくとも約５、例えば少なくとも約１０、例えば少なくとも約２０、例えば少なくとも約１００である場合、当該治療薬は免疫寛容原性であると判定する。
【００３５】
治療薬の免疫寛容原性を判定するためのキットも本明細書に説明する。このようなキットは典型的には、効力アッセイを実施するのに必要な２つ以上の構成要素を含む。構成要素は、化合物、試薬、容器、説明書及び／または用具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、免疫寛容原性マーカーに特異的な抗体、及び抗原提示細胞マーカーに特異的な抗体を含有し得る。このようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適したリポーター基を含有する先に説明した検出試薬も含有し得る。
【００３６】
したがって、抗原提示細胞による免疫寛容原性マーカーの発現レベルを測定するためのキットが本明細書に説明され、当該キットは、治療薬の免疫寛容原性及び／または効力を判定するのに適した結果を提供するのに有用である。キットは、例えば放射性標識、発光標識、蛍光標識、酵素などを用いて任意に検出可能に標識され得る免疫寛容原性マーカーに対する抗体を含み得る。タンパク質の検出可能な標識方法は当該技術分野で周知である。このようなキットにはさらに、抗原提示細胞のマーカーに特異的な検出試薬を含み得る。特定の治療薬の脈絡でこのような免疫寛容原性マーカーのレベルを定量化及び／または評価するための適切な比較標準を含む、評価目的のためにキットを使用するための説明書はまた、印刷形態で有利に提供され得及び／または適切な媒体に記録され得る。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：抗原提示細胞の源としてのＰＢＭＣ）
（実施例１．１：材料及び方法）
効力アッセイにおいて使用するレスポンダー細胞は、ｆｉｃｏｌｌ分離したＰＢＭＣの凍結ストックから得た。ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、培地中に再懸濁した後に、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品へ曝露した。
【００３８】
ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品は、液体窒素保管庫から取り出し、水浴中で３７℃で解凍した。試料を照射し、効力アッセイのための製剤化に際して即時使用した。レスポンダーＰＢＭＣ（１×１０6）をポリプロピレンチューブ中で３日間、単独またはＴＣＥＬＮＡ（登録商標）（１×１０6）との組み合わせのいずれかで培養した。培養１または３日後、ＣＤ１４＋ＣＤ１９−ＣＤ３−単球によるＰＤ−Ｌ１、ＣＤ９５、ＰＤ１、ＣＤ８６、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２７、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２２の発現を、フローサイトメトリーによって適宜モニターした。アイソタイプの合致したｍＡｂを使用して、ＰＤ−Ｌ１染色の特異性を確認した（データ非掲載）。
【００３９】
（実施例１．２：結果）
単球系効力アッセイは、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）がＰＤ−Ｌ１発現の誘導によって示されるレスポンダー単球に関して免疫寛容原性／調節性表現型を与えることを実証している。単球の表現型の生産性調節は結果的に、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品への曝露の結果として、単球の９０％超のＰＤ−Ｌ１発現を生じる。示すデータにおいて、単球は、ＣＤ１４発現に基づいて識別される。ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）の非存在下で、（ＰＭＢＣを単独培養した）単球は、ＰＤ−Ｌ１陽性画分において１５％以下の細胞しか実証していないようにＰＤ−Ｌ１を発現し損ねている（図１Ａ及び図２）。比較すると、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品を用いたＰＢＭＣの培養は結果的に、ＰＤ−Ｌ１を発現する単球の少なくとも６０％を生じ（図１Ｂ及び図２）、免疫寛容原性／調節性表現型の強力な誘導を示唆している。図２は、５個の独立した患者製剤へ曝露した後の単球におけるＰＤ−Ｌ１の誘導を実証している。図３は、５個の異なるＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品を用いたインキュベーション後の単球による平均蛍光強度の倍数増加を示す。総合すると、本データは、インビトロでＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品へ曝露された単球が、インビボでの製品の作用機序も示し得る調節性マーカーＰＤ−Ｌ１の発現の基本的な変化を受けることを示唆している。
【００４０】
アロジェニックな抗原提示細胞を検査する上で、製剤化及び照射されたＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品をアロジェニックなレスポンダーＰＢＭＣ集団と１：１の比で組み合わせた。２４時間及び７２時間後、培養物を収穫し、レスポンダー細胞集団におけるＰＤ−Ｌ１の発現についてフローサイトメトリーを用いて評価した。図４は、レスポンダーのみの条件及びレスポンダー＋ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）（＋Ｔｃ）条件の両方の％ＰＤ−Ｌ１発現を示す。対形成した独立の試料についてのウィルコクソン順位和検定は、２４時間及び７２時間の両方で単球におけるＰＤ−Ｌ１の発現の有意な上方制御を実証した（それぞれ、ｐ＜０．００４及びｐ＜０．００００２）ので、それぞれ図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。Ｂ細胞及びＴ細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現に関する類似の分析もＢ細胞集団における７２時間の培養でＰＤ−Ｌ１の発現の有意な誘導を示している（ｐ＜０．００３）が、いずれの時点においてもＴ細胞によるＰＤ−Ｌ１の誘導はない。
【００４１】
単球によるＰＤ−Ｌ１、ＣＤ９５、ＰＤ１、ＣＤ８６、ＬＡＧ−３の細胞表面発現及びＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２のサイトカイン発現を、照射したＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品を用いたインキュベーションの約２４時間後に分析した。検査したマーカーのうち、ＰＤ−Ｌ１発現のみが、単球によって有意に上昇した。ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品の非存在下で２４時間インキュベートした１％未満の単球は、ＰＤ−Ｌ１を発現した。対照的に、平均９７．８％の単球は、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品とともにインキュベートした２４時間後にＰＤ−Ｌ１を発現した（ｎ＝４）。
【００４２】
（実施例２：抗原提示細胞の源としての細胞株）
製剤化及び照射されたＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品由来の細胞を、Ｕ９３７またはＴＨＰ−１細胞と１：１の比で組み合わせる。２４時間後及び７２時間後、培養物を収穫し、フローサイトメトリーを用いてＵ９３７またはＴＨＰ−１細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現について評価する。Ｕ９３７またはＴＨＰ−１細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現は、ＴＣＥＬＮＡ（登録商標）製品を用いたインキュベーション後に上昇するであろうと期待される。
【００４３】
本明細書に引用する特許及び特許公開はすべて、参照により本明細書により組み込まれる。
【００４４】
ある一定の改変及び改善は、先の説明の読み取りの際に当業者に生じるであろう。このようなすべての改変及び改善は、本明細書において簡潔さ及び読みやすさの目的のために欠失しているが、以下の特許請求の範囲内に適切にある。
【図１】
2017506332.tif 000003
【図２】
2017506332.tif 000004
【図３】
2017506332.tif 000005
【図４】
2017506332.tif 000006
【国際調査報告】
2017506332.tif 000007
2017506332.tif 000008
2017506332.tif 000009