(57)【要約】第１および第２の構成成分の相互作用を促進する方法が開示され、この方法は、抗体断片およびエピトープタグの使用を含む。抗体断片は、第１の構成成分に結合され得るが、エピトープタグは、第２の構成成分に結合され得る。抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を有し得る。一局面において、第１の構成成分および第２の構成成分の相互作用を促進する方法が提供され、この方法は、ａ．第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップ；およびｂ．第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップを含み、上記抗体断片が、上記抗体断片と上記エピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、上記エピトープタグに対する結合特異性を含む。
2017518083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の構成成分および第２の構成成分の相互作用を促進する方法であって、
ａ．第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップ；および
ｂ．第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップ
を含み、
前記抗体断片が、前記抗体断片と前記エピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、前記エピトープタグに対する結合特異性を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体断片と前記エピトープタグとが、一過的に相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体断片と前記エピトープタグとが、一過的に相互作用し、前記一過的相互作用が、細胞の内部で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体断片が、前記第１の構成成分に共有結合的に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体断片が、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体断片が、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、標的タンパク質に共有結合的に結合されたエピトープタグおよびシグナルに共有結合的に結合されたＳｃＦｖを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の構成成分が、エフェクター分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の構成成分が、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、およびそれらの組み合わせから選択されるエフェクター分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の構成成分が、エフェクタータンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の構成成分が、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、およびそれらの組み合わせから選択されるエフェクタータンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の構成成分がタンパク質を含み、前記タンパク質がＤＮＡを改変する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、ＤＮＡ結合性タンパク質およびエフェクタータンパク質を含み、前記相互作用が、遺伝子発現における変化またはＤＮＡの改変を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、フルオロフォアおよびタンパク質を含み、前記相互作用が、タンパク質発現および細胞内局在化のリアルタイムモニタリングを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、相互作用してプロドラッグを活性化することができる第１の小分子および第２の小分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
抗体断片およびエピトープタグを含むキットであって、
前記抗体断片は、第１の構成成分に結合され、
前記エピトープタグは、第２の構成成分に結合され、
前記抗体断片が、前記抗体断片と前記エピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、前記エピトープタグに対する結合特異性を含む、キット。
【請求項２３】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
第１の構成成分および第２の構成成分の相互作用を促進する方法であって、
ａ．第１の構成成分に結合された足場タンパク質を提供するステップ；および
ｂ．第２の構成成分に結合された対応する結合部位を提供するステップ
を含み、
前記足場タンパク質が、前記対応する結合部位に特異的に結合して、前記足場タンパク質と前記対応する結合部位との間の相互作用を引き起こす、方法。
【請求項２５】
前記足場タンパク質が抗体模倣物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記足場タンパク質と前記対応する結合部位とが、一過的に相互作用する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記一過的相互作用が、細胞の内部で起こる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記足場タンパク質が、前記第１の構成成分に共有結合的に結合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記足場タンパク質が、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインもしくはクニッツドメインペプチド、モノボディ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの組み合わせである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の構成成分が、エフェクター分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記エフェクター分子が、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の構成成分が、エフェクタータンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の構成成分が、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、およびそれらの組み合わせから選択されるエフェクタータンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子タンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なタンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の構成成分がタンパク質を含み、前記タンパク質がＤＮＡを改変する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、ＤＮＡ結合性タンパク質およびエフェクタータンパク質を含み、前記相互作用が、遺伝子発現における変化またはＤＮＡの改変を生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、フルオロフォアおよびタンパク質を含み、前記相互作用が、タンパク質発現および細胞内局在化のリアルタイムモニタリングを可能にする、請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、相互作用してプロドラッグを活性化することができる第１の小分子および第２の小分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４４】
足場タンパク質および対応する結合部位を含むキットであって、
前記足場タンパク質は、第１の構成成分に結合され、
前記対応する結合部位は、第２の構成成分に結合され、
前記足場タンパク質が、前記対応する結合部位に特異的に結合して、前記足場タンパク質と前記対応する結合部位との間の相互作用を引き起こす、キット。
【請求項４５】
前記第１の構成成分および前記第２の構成成分が、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記エフェクター分子がヌクレアーゼである、請求項１２または３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ヌクレアーゼがＢｆｉＩである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヌクレアーゼがＢｍｒＩである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヌクレアーゼがＣｌｏ０５１である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
生物のゲノムを改変するための方法であって、
ａ．第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップであって、前記第１の構成成分がＤＮＡ結合性分子である、ステップ；および
ｂ．第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップであって、前記第２の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子である、ステップ
を含み、
前記抗体断片が、前記抗体断片と前記エピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、前記エピトープタグに対する結合特異性を含む、方法。
【請求項５２】
前記ＤＮＡ結合性分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質であり、前記エフェクター分子がエンドヌクレアーゼであり、それらの相互作用が、遺伝子発現における変化またはゲノムＤＮＡ配列もしくは塩基対の改変を誘導する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５１または５２に記載の方法に従って改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年６月１７日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６２／０１３，４２２号および２０１５年５月１９日に出願されたＵＳＳＮ６２／１６３，５６８号（これらの内容は、それらの全体が参考としてそれぞれ本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の援用
２０１５年６月５日に作成され、サイズが１ＫＢである名称「ＰＯＴＨ−００２／００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」のテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本開示の分野
本開示は一般に、部位指向的ゲノム改変のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ペプチド結合を介した共有結合的結合で、１つのタンパク質を別のタンパク質に結合させることは、分子生物学において一般的な実施である。これを実施するための１つの方法は、一方のタンパク質のＤＮＡコード配列を第２のタンパク質のコード配列の下流に付加し、それら２つの配列が単一のポリペプチドとして翻訳されるようにすることによる。しかし、この戦略に関連する１つの問題は、タンパク質が、そのタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）において、別のタンパク質に簡易的にしか連結されることができないことである。残念ながら、この様式でタンパク質を組み合わせることは、タンパク質のうちの一方または両方を不正確に折り畳ませる場合が多い。正確に折り畳まる場合であっても、一方のタンパク質が他方のタンパク質の正常な機能を物理的に干渉することに起因して、融合したタンパク質の一方または両方が非機能的であることが珍しくない。これらの問題は、２つのポリペプチド間にコードされる可撓性リンカーの使用によってある程度まで緩和され得る。しかし、多くのタンパク質融合物は、リンカー配列の使用にもかかわらず、なおも機能的ではない可能性があり、その結果、この技術に関連する問題は、未だそのままである。
【０００５】
上記融合タンパク質戦略に関する第２の問題は、このプロセスが、個々の単一のタンパク質のいずれかよりもかなり大きい１つの大きいタンパク質を創出することである。これはまた、融合したタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで所望の位置にアクセスする機能または能力を損ない得る。さらに、その代わりに、ウイルス送達方法を介して、所望の融合したタンパク質をコードするＤＮＡを細胞中に送達することが望ましい場合が多い。しかし、ウイルス送達方法は、それらが含有することができるＤＮＡの量によって制限される。大きい融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ウイルス送達ビヒクル（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）に入らない場合があり、それによって、この方法の有用性を制限する。
【０００６】
上記方法のさらなる欠点は、一過的相互作用のみが所望される場合に存在する限界である。異なる時点での２つまたはそれ超のタンパク質の機能的会合を可能にすることが、望ましいまたは有利である場合がある。これは、例えば、所与のタンパク質の複数の機能に起因し得る。トランスポザーゼタンパク質は、１つのかかる型のタンパク質である。トランスポザーゼタンパク質は、トランスポゾン認識、トランスポゾンを切り出すためのＤＮＡの切断、新たなゲノム位置へのトランスポゾン配列の移動、新たな標的部位の認識、および新たな遺伝子座においてトランスポゾンを組み込むためのＤＮＡの切断を含む、いくつかの重要なステップを実施する。かかる場合には、部位特異的ＤＮＡ結合を有する異種タンパク質を付加することによって、ゲノム中の特定の部位にトランスポザーゼを指向させることが望まれ得る。しかし、このタンパク質は、標的部位認識ステップの間にしか必要とされず、より初期の段階におけるその存在は、他のステップにとっては事実上有害であり得、その結果、融合タンパク質は実用的には適用できなかった。このように、当技術分野における上記問題のうちの１つまたは複数に取り組む方法が、当技術分野において必要とされている。本開示は、当技術分野における上述の不備のうちの１つまたは複数に取り組もうとするものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１および第２の構成成分の相互作用を促進する方法が開示され、この方法は、抗体断片およびエピトープタグの使用を含む。この抗体断片は、第１の構成成分に結合され得、エピトープタグは、第２の構成成分に結合され得る。この抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を有し得る。
【０００８】
本開示は、第１および第２の構成成分の相互作用を促進する方法であって、第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップ；および第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップを含み、この抗体断片が、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を含む、方法を提供する。この方法のある特定の実施形態では、この抗体断片とエピトープタグとは、一過的に相互作用する。この一過的相互作用は、細胞の内部で起こり得る。
【０００９】
本開示の抗体断片は、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を含み得る。あるいは、またはさらに、本開示の抗体断片は、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００１０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、この第１および第２の構成成分は、標的タンパク質に共有結合的に結合されたエピトープタグおよびシグナルに共有結合的に結合されたＳｃＦｖを含む。
【００１１】
本開示の抗体断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み得る。
【００１２】
本開示の第１の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある特定の実施形態では、この第１の構成成分は、エフェクター分子を含む。例示的なエフェクター分子には、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔｈｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のエフェクター分子は、遺伝子発現を改変することが可能であり得る。
【００１３】
本開示の第２の構成成分は、エフェクタータンパク質を含み得る。第２の構成成分がエフェクタータンパク質であるある特定の実施形態では、例示的なエフェクタータンパク質には、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のエフェクター分子は、遺伝子発現を改変することが可能であり得る。
【００１４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、このエフェクター分子は、ヌクレアーゼである。このエフェクター分子は、ＢｆｉｌＩであり得る。このエフェクター分子は、ＢｍｒＩであり得る。このエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１であり得る。このエフェクター分子は、ＦｏｋＩであり得る。
【００１５】
本開示の第２の構成成分には、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本開示の方法のある特定の実施形態では、この第２の構成成分は、遺伝子発現を改変することが可能なタンパク質を含む。この第２の構成成分は、ＤＮＡを改変するタンパク質を含み得る。
【００１６】
本開示は、抗体断片およびエピトープタグを含むキットを提供し、この抗体断片は、第１の構成成分に結合され、このエピトープタグは、第２の構成成分に結合され、この抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を含む。本開示のキットのある特定の実施形態では、この第１および第２の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１７】
本開示は、第１および第２の構成成分の相互作用を促進する方法であって、第１の構成成分に結合された足場タンパク質を提供するステップ；および第２の構成成分に結合された対応する結合部位を提供するステップを含み、この足場タンパク質が、対応する結合部位に特異的に結合して、足場タンパク質と対応する結合部位との間の相互作用を引き起こす、方法を提供する。本開示の方法のある特定の実施形態では、この足場タンパク質と対応する結合部位とは、一過的に相互作用する。この一過的相互作用は、細胞の内部で起こり得る。
【００１８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、足場タンパク質は、抗体模倣物を含み得る。
【００１９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、足場タンパク質は、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ＳＭＩＰ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み得るまたはそれからなり得る。
【００２０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、足場タンパク質は、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィリン（ａｆｆｌｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインもしくはクニッツドメインペプチド、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００２１】
本開示の足場タンパク質は、第１の構成成分に共有結合的に結合され得る。
【００２２】
本開示の第１の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。さらに、本開示の第１の構成成分は、エフェクター分子を含み得る。例示的なエフェクター分子には、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。エフェクター分子は、遺伝子発現を改変することが可能であり得る。
【００２３】
本開示の第２の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。第２の構成成分がタンパク質を含むある特定の実施形態では、このタンパク質は、遺伝子発現を改変することが可能であり得るおよび／またはＤＮＡを改変し得る。
【００２４】
本開示の第２の構成成分は、エフェクタータンパク質を含み得る。本開示の方法のある特定の実施形態では、この第２の構成成分がエフェクタータンパク質である場合、例示的なエフェクタータンパク質には、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。エフェクター分子は、遺伝子発現を改変することが可能であり得る。
【００２５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、このエフェクター分子は、ヌクレアーゼである。このエフェクター分子は、ＢｆｉｌＩであり得る。このエフェクター分子は、ＢｍｒＩであり得る。このエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１であり得る。このエフェクター分子は、ＦｏｋＩであり得る。
【００２６】
本開示は、足場タンパク質および対応する結合部位を含むキットであって、この足場タンパク質は、第１の構成成分に結合され、この対応する結合部位は、第２の構成成分に結合され、この足場タンパク質は、対応する結合部位に特異的に結合して、足場タンパク質と対応する結合部位との間の相互作用を引き起こす、キットを提供する。本開示のキットのある特定の実施形態では、この第１および第２の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００２７】
本開示の方法のある特定の実施形態によれば、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む。
【００２８】
本開示の方法のある特定の実施形態によれば、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、ＤＮＡ結合性タンパク質およびエフェクタータンパク質を含み、この第１および第２の構成成分の相互作用は、遺伝子発現における変化またはＤＮＡの改変を生じる。
【００２９】
本開示の方法のある特定の実施形態によれば、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、フルオロフォアおよびタンパク質を含み、この第１および第２の構成成分の相互作用は、タンパク質発現および細胞内局在化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）のリアルタイムモニタリングを可能にする。
【００３０】
本開示の方法のある特定の実施形態によれば、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、第１および第２の小分子を含み、相互作用してプロドラッグを活性化することが可能である。
【００３１】
本開示は、生物のゲノムを改変するための方法であって、第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップであって、この第１の構成成分がＤＮＡ結合性分子である、ステップ、および第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップであって、この第２の構成成分が、遺伝子発現を改変することが可能なエフェクター分子である、ステップを含み、この抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を含む、方法を提供する。この方法によれば、ＤＮＡ結合性分子とエフェクター分子との間の相互作用は、遺伝子発現における変化またはＤＮＡの改変を生じる。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ結合性分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質である。本開示のＤＮＡ結合性分子は、ゲノム配列内の遺伝子座（単数または複数）を特異的に標的化し得る。ある特定の実施形態では、このエフェクター分子は、エンドヌクレアーゼである。この方法によれば、ゲノムは、１つもしくは複数のゲノム配列もしくは塩基対がエンドヌクレアーゼによって分離される場合、および／または１つもしくは複数のゲノム配列もしくは塩基対が欠失、挿入、置換、反転もしくは再配置される場合、改変され得る。さらに、本開示は、本開示の方法によって改変されたゲノム配列または塩基対を含む細胞を提供する。本開示の方法によって改変された細胞は、例えば、ゲノムのゲノム配列または塩基対の欠失、挿入、置換、反転または再配置を含み得る。本開示の方法に従って改変された細胞は、例えば、その細胞のゲノム内に天然には存在しない、外因性、人工または異種の配列を含み得る。この細胞は、本開示の方法に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変され得る。ある特定の実施形態では、この細胞は、ヒト細胞でもヒト胚細胞でもない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ｐｉｇｇｙＢａｃに対するｓｃＦｖを生成するためのファージディスプレイの方法を示す図である。ウサギが、関連するＢ細胞を拡大増殖させる（ｅｘｐａｎｄ）ために、ＰＢトランスポザーゼタンパク質（ＰＢａｓｅ）で免疫化される。重鎖および軽鎖遺伝子由来の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）が、ＰＣＲによってｃＤＮＡから増幅されて、１８アミノ酸のリンカー（Ｌ）を含有する融合産物を形成する。ファージミドが産生され、ＰＢａｓｅに対してパニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増幅され、１回または２回反復される。得られたファージミドＤＮＡライブラリーは、リンカー配列と共に、Ｅ２ｃ  ＰＺＦを含有するｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター中にクローニングされる。次いで、Ｅ２ｃ−ｓｃＦｖ  Ｎ末端融合物ライブラリーが、レンチウイルスにおいて産生される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎｄ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「１つの（ａ）方法」に対する言及は、複数のかかる方法を含み、「１つの（ａ）用量」に対する言及は、１つまたは複数の用量および当業者に公知のその等価物に対する言及を含む、などである。
【００３５】
用語「約」または「およそ」とは、測定システムの限界など、その値が如何にして測定または決定されるかに一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲以内を意味する。例えば、「約」とは、当技術分野における実施に従って、１または１よりも大きい標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の最大で２０％、または最大で１０％、または最大で５％、または最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的な系またはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、または２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載される場合、特記しない限り、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を前提とすべきである。
【００３６】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の、特異的な非共有結合的相互作用を指す。相互作用が全体として特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。
【００３７】
「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子に結合し得る（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子に結合し得る（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子に結合し得る（タンパク質結合性タンパク質）。タンパク質結合性タンパク質の場合、これは、それ自体と結合し得（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）のうち１つもしくは複数の分子に結合し得る。結合性タンパク質は、１種よりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「含む」は、その組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することを意図している。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、意図した目的のために使用する場合にその組み合わせにとって何らかの本質的な重要性がある他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書に定義した要素から本質的になる組成物は、微量の混入物または不活性担体を排除しない。「〜からなる」とは、他の成分の微量の要素および実質的な方法ステップを間違いなく排除することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３９】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物をカバーする。本明細書で定義されるような本明細書の抗体の天然のまたは合成のアナログ、変異体、バリアント、対立遺伝子、ホモログおよびオルソログ（本明細書では集合的に、「アナログ」と呼ばれる）を使用することもまた、本明細書の範囲内である。従って、本明細書の一実施形態によれば、用語「本明細書の抗体」は、その最も広い意味で、かかるアナログもまたカバーする。一般に、かかるアナログでは、１つまたは複数のアミノ酸残基が、本明細書に定義されるように、本明細書の抗体と比較して、置き換え、欠失および／または付加されていてもよい。
【００４０】
「抗体断片」、およびその全ての文法的異形は、本明細書で使用する場合、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含む、インタクトな抗体の一部分として定義され、この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（即ち、抗体アイソタイプに依存してＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含まない。抗体断片の例には：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続するアミノ酸残基の１つの中断されていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書で「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」と呼ばれる）であって、（ｌ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（２）関連する重鎖部分を伴わない、１つの軽鎖可変ドメインだけを含有する単鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）関連する軽鎖部分を伴わない、１つの重鎖可変領域だけを含有する単鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を限定することなく含む、抗体断片；ならびに抗体断片から形成された多特異性または多価構造が含まれる。１つまたは複数の重鎖を含む抗体断片では、重鎖（複数可）は、インタクトな抗体の非Ｆｃ領域において見出される任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプではＣＨＩ）を含有し得、および／あるいはインタクトな抗体において見出される任意のヒンジ領域を含有し得、および／あるいは重鎖（複数可）のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列に融合したまたはそれらの中に置かれたロイシンジッパー配列を含有し得る。この用語は、単一モノマー性可変抗体ドメインを有する抗体断片を指す単一ドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）（例えば、ラクダ科動物由来）をさらに含む。かかる抗体断片の型は、当業者によって容易に理解される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープタグ」または他の言い方で「親和性タグ」とは、タンパク質またはリガンドとの特異的相互作用を可能にする短いアミノ酸配列またはペプチドを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、そのエピトープに独自の空間的コンフォメーションにある３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６または７のかかるアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８、９または１０のかかるアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当技術分野で公知であり、これには、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと引き続いて翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来である場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００４４】
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質もまた含まれる。
【００４５】
遺伝子発現の「モジュレーション」または「調節」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」またはその等価物（例えば、「作動可能に連結した（ｌｉｎｋｅｄ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）」）とは、２つまたはそれ超の分子が、一方もしくは両方の分子またはそれらの組み合わせに帰せられ得る機能に影響を与えるように相互作用することが可能であるように、互いに対して位置付けられることを意味している。
【００４７】
用語「ｓｃＦｖ」とは、単鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。このリンカーペプチドは、約５〜４０アミノ酸長または約１０〜３０アミノ酸長または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０アミノ酸長であり得る。単鎖可変断片は、完全抗体分子中に見出される定常Ｆｃ領域を欠き、従って、抗体を精製するために使用される一般的結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠く。この用語は、細胞の細胞質において安定であって細胞内タンパク質に結合し得る抗体、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）であるｓｃＦｖをさらに含む。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「単一ドメイン抗体」とは、特異的抗原に選択的に結合することができる単一モノマー性可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、一般に、重鎖抗体または一般的ＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含み、抗体全体と類似の、抗原に対する親和性を一般に有するが、より耐熱性であり、洗浄剤および高濃度の尿素に対してより安定である、約１１０アミノ酸長のペプチド鎖である。例は、ラクダ科動物または魚類の抗体由来のものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから作製され得る。
【００４９】
用語「特異的に結合する」および「特異的結合」とは、本明細書で使用する場合、種々の抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する、抗体、抗体断片またはナノボディの能力を指す。ある特定の実施形態では、特異的結合相互作用は、一部の実施形態では、約１０倍超〜１００倍超またはそれ超（例えば、約１０００倍超または１０，０００倍超）、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原との間を識別する。「特異性」とは、異なる抗原性標的と比べて１つの抗原性標的に優先的に結合する、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、例えばナノボディの能力を指すが、必ずしも高い親和性を含意しない。
【００５０】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するときに結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
【００５１】
本発明のさらなる利点は、以下の説明中に一部示され、この説明から一部明らかであり、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素および組み合わせによって実現および獲得される。上述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的であるにすぎず、特許請求された本発明を限定しないことを、理解すべきである。
【００５２】
本開示は、それらが細胞中で産生された後に、タンパク質を非共有結合的に連結するための組成物および方法を提供する。一態様では、開示された方法は、所望の効果を可能にするのに十分な期間にわたって、２つまたはそれ超の分子の一過的（一時的）相互作用を可能にする。２つまたはそれ超の分子が会合および解離する能力の結果として、重要な場合にのみ、機能的会合が可能になり得る。
【００５３】
本開示は、第１および第２の構成成分の相互作用を促進する方法を提供する。
【００５４】
本開示の方法は、第１の構成成分に結合された抗体断片を提供するステップ、および第２の構成成分に結合されたエピトープタグを提供するステップを含み得、この抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を含み得る。一態様では、この抗体断片およびエピトープタグは、この抗体断片とエピトープタグとが一過的に相互作用するように選択される。本明細書で企図する場合、この相互作用は、細胞の内部で起こる。
【００５５】
本開示の抗体断片は、第１の構成成分に共有結合的に結合され得る。この抗体断片は、当業者に理解される任意の抗体断片であり得る。一態様では、この抗体断片は、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を含み得る。一態様では、この抗体断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み得る。例えば、この方法は、標的タンパク質に共有結合的に結合されたエピトープタグおよび第２のタンパク質に共有結合的に結合されたＳｃＦｖを利用し得る。
【００５６】
本開示の方法は、第１の構成成分に結合された抗体模倣物または足場タンパク質を提供するステップ、および第２の構成成分に結合された、この抗体模倣物または足場タンパク質の対応する結合部位を提供するステップを含み得、この抗体模倣物または足場タンパク質は、この抗体模倣物または足場タンパク質の対応する結合部位に特異的に結合し得、抗体模倣物または足場タンパク質と対応する結合部位との間の相互作用を生じ得る。一態様では、この抗体模倣物または足場タンパク質および対応する結合部位は、この抗体模倣物または足場タンパク質と対応する結合部位とが一過的に相互作用するように選択され得る。本明細書で企図する場合、この相互作用は、細胞の内部で起こる。
【００５７】
本開示の抗体模倣物は、第１の構成成分に共有結合的に結合され得る。本明細書で使用する場合、用語「抗体模倣物」は、標的配列を特異的に結合し、天然に存在する抗体とは別個の構造を有する有機化合物を記載するよう意図される。抗体模倣物は、タンパク質、核酸または小分子を含み得る。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原であり得る。抗体模倣物は、優れた溶解度、組織透過、熱および酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解に対する耐性）ならびにより低い産生コストが含まれるが、これらに限定されない、抗体を超える優れた特性を提供し得る。例示的な抗体模倣物には、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー（アビディティマルチマー（ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ）としても公知）、ＤＡＲＰｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、ならびにモノボディが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本開示のアフィボディ分子は、いかなるジスルフィド架橋も伴わない、１つまたは複数のアルファヘリックスを含むまたはそれらからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含むまたはそれらからなる。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含み得る。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含み得る。
【００５９】
本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマ−Ｂクリスタリンまたはユビキチンのいずれかの曝露されたアミノ酸の改変によって産生されたタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体の親和性を機能的に模倣するが、抗体を構造的には模倣しない。アフィリンを作製するために使用される任意のタンパク質足場では、適切に折り畳まれたタンパク質分子中の、溶媒または可能な結合パートナーにアクセス可能なアミノ酸が、曝露されたアミノ酸とみなされる。これらの曝露されたアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数は、標的配列または抗原に特異的に結合するように改変され得る。
【００６０】
本開示のアフィマー分子は、特異的標的配列に対する高親和性結合部位を提供するペプチドループをディスプレイするように操作された高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、アンチパラレルベータ−シートの上部に存在するアルファ−ヘリックスを含む共通の三次構造を共有し得る。
【００６１】
本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来し得る。本開示のアフィチンは、抗原の全体または部分であり得る標的配列を選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合表面上の１つまたは複数アミノ酸配列をランダム化し、得られたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に供することによって、製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム中、またはペプチド、タンパク質、ウイルスもしくは細菌の表面上で見出され得る。本開示のある特定の実施形態では、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用され得る。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質またはその誘導体を含み得る。
【００６２】
本開示のアルファボディ分子は、細胞透過性アルファボディ（ＣＰＡＢ）とも呼ばれ得る。本開示のアルファボディ分子は、種々の標的配列（抗原を含む）に結合する小さいタンパク質（典型的には、１０ｋＤａ未満のもの）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に到達および結合することが可能である。構造的に、本開示のアルファボディ分子は、単鎖アルファヘリックス（天然に存在するコイルドコイル構造と類似）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変された１つまたは複数のアミノ酸を含むタンパク質足場を含み得る。分子の結合特異性に関わらず、本開示のアルファボディ分子は、正確なフォールディングおよび熱的安定性を維持する。
【００６３】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子のいずれか中の標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリン由来の人工タンパク質を含み得る。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその断片の代わりに使用され得る。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過および熱的安定性を実証し得る。本開示の例示的なアンチカリン分子は、およそ２０ｋＤａの質量を有する、約１８０アミノ酸を含み得る。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合されたアルファヘリックスによって対で接続されたアンチパラレルベータ−鎖を含むバレル構造を含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合されたアルファヘリックスによって対で接続された８つのアンチパラレルベータ−鎖を含むバレル構造を含む。
【００６４】
本開示のアビマー分子は、標的配列（これは抗原であってもよい）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内または別個の標的内の複数の結合部位を認識し得る。本開示のアビマーが１つよりも多い標的を認識する場合、このアビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、各々およそ３０〜３５アミノ酸の２つまたはそれ超のペプチド配列を含み得る。これらのペプチドは、１つまたは複数のリンカーペプチドを介して接続され得る。アビマーのペプチドのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメイン由来であり得る。アビマーは、ジスルフィド結合および／またはカルシウムを任意選択で含み得る強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較して、より高い熱安定性を実証し得る。
【００６５】
本開示のＤＡＲＰｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対する高い特異性および高い親和性を有する、遺伝子操作された、組換えの、またはキメラのタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質由来であり、任意選択で、アンキリンタンパク質の少なくとも３つのリピートモチーフ（反復構造単位とも呼ばれる）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きい標的相互作用表面を含む。
【００６６】
本開示のフィノマーは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメイン由来の、抗体と等しい親和性および等しい特異性で標的配列および分子に結合するように操作された、小さい結合性タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。
【００６７】
本開示のクニッツドメインペプチドは、クニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的に、本開示のクニッツドメインは、ジスルフィド−リッチなアルファ＋ベータフォールディング構造（ｆｏｌｄ）を含む。この構造は、ウシ膵トリプシン阻害剤によって例証される。クニッツドメインペプチドは、特異的タンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼ阻害剤として機能する。本開示のクニッツドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）由来）を含み得る。
【００６８】
本開示のモノボディは、単鎖抗体と匹敵するサイズの小さいタンパク質（約９４アミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）である。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列を特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つまたは複数の別個のタンパク質または標的配列を特異的に標的化し得る。好ましい実施形態では、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣する、より好ましくは、フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、ならびにそのモノボディ模倣物は、バレルを形成する７つのベータシートおよび抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側の３つの曝露されたループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンのためのあらゆる結合部位、ならびに中心のジスルフィド結合を欠く。多特異性モノボディは、ループＢＣおよびＦＧを改変することによって最適化され得る。本開示のモノボディは、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）を含み得る。
【００６９】
本開示の足場タンパク質は、第１の構成成分に共有結合的に結合され得る。本開示の足場タンパク質には、例えば、本開示の抗体模倣物が含まれる。本開示の足場タンパク質には、例えば、小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）分子、ドメイン抗体およびナノボディがさらに含まれる。
【００７０】
本開示のＳＭＩＰ分子は、標的配列または抗原に対して単一特異性である免疫グロブリン（抗体）の１つまたは複数の配列または部分を含む人工タンパク質である。本開示のＳＭＩＰは、モノクローナル抗体の使用を置換し得る。構造的に、ＳＭＩＰは、結合領域、ヒンジ領域（即ち、コネクター）およびエフェクタードメインを含む単鎖タンパク質である。ＳＭＩＰの結合領域は、改変された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。ＳＭＩＰは、二量体として、遺伝子改変された細胞から産生され得る。
【００７１】
本開示のドメイン抗体は、単一モノマー性可変抗体ドメイン（即ち、重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメイン）を含む。本開示のドメイン抗体は、抗体全体およびインタクトな抗体と同じ抗原特異性を実証する。本開示のドメイン抗体は、所望の抗原によるヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメの免疫化、および重鎖抗体をコードするｍＲＮＡの引き続く単離によって、少なくとも一部は製造され得る。
【００７２】
本開示のナノボディは、ＶＨＨ単一ドメイン抗体を含む。本開示のナノボディは、本開示の単一ドメイン抗体を含み得る。
【００７３】
本明細書で企図される種々の構成成分は、種々の異なる形態を取り得、当業者によって容易に理解され得る。例えば、この第１の構成成分または第２の構成成分は、タンパク質、小分子、フルオロフォア、シグナルペプチド、ナノ粒子、細胞構成成分、およびそれらの組み合わせから選択され得る。他の態様では、この第１の構成成分または第２の構成成分は、エフェクター分子を含み得る。このエフェクター分子は、一般に、特異的遺伝子座において所定の効果が可能な分子である。一態様では、このエフェクター分子は、転写因子（アクチベーターまたはリプレッサー）、クロマチンリモデリング因子、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、ヘリカーゼ、フルオロフォア、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一態様では、このエフェクター分子は、ＦｏｋＩであり得る。
【００７４】
一態様では、このエフェクター分子は、ヌクレアーゼを含み得る。適切なヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵ＤＮａｓｅ  Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一態様では、このエフェクター分子は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含み得る。例えば、一部の態様では、このエフェクター分子は、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＦｏｋＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｇＩ、ＢｐｍＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１から選択されるエンドヌクレアーゼを含み得る。他の態様では、このエフェクター分子は、ＰＢトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）を含み得る。
【００７５】
この第１の構成成分または第２の構成成分は、遺伝子発現を改変することが可能なタンパク質を含み得る。他の態様では、この第１の構成成分または第２の構成成分は、ＤＮＡを改変することが可能なタンパク質を含み得る。なおさらなる態様では、この第１の構成成分または第２の構成成分は、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含み得る。
【００７６】
一態様では、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、ＤＮＡ結合性タンパク質およびエフェクタータンパク質を含み得、この第１および第２の構成成分の相互作用は、遺伝子発現における変化またはＤＮＡの改変を生じる。他の態様では、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、フルオロフォアおよびタンパク質を含み得、この第１および第２の構成成分の相互作用は、タンパク質発現および細胞内局在化のリアルタイムモニタリングを可能にする。なおさらなる態様では、この第１および第２の構成成分は、それぞれ、第１および第２の小分子を含み得、この第１および第２の構成成分の相互作用は、プロドラッグを活性化する。
【００７７】
第１の構成成分に結合された抗体断片および第２の構成成分に結合されたエピトープタグを含み得るキットもまた開示され、この抗体断片は、抗体断片とエピトープタグとの間の相互作用を引き起こすのに十分な、エピトープタグに対する結合特異性を含む。このキットは、使用のための指示をさらに含み得る。この抗体断片、エピトープタグ、ならびに第１および第２の構成成分は、上記のとおりであり得る。
【００７８】
開示された系および組成物は、医薬の製造において、ならびに医薬組成物中の活性成分などの、従来の手順に従う投与によるヒトおよび他の動物の処置のために、使用され得る。
【００７９】
一態様では、検出可能な標識が使用され得る。１つまたは複数の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分は、標識された抗体の意図した使用に依存して、開示された方法において使用され得る。適切な標識、ならびにそれらを結合させる、使用するおよび検出するための技術は、当業者に明らかであり、例えば、これには、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミンならびに蛍光金属、例えば、Ｅｕまたはランタニド系列由来の他の金属）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（例えば、ルミノール（ｌｕｍｉｎａｌ）、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびそのアナログ）、放射性同位体、金属、金属キレートもしくは金属性カチオン、またはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｓｉｔｕでの画像化に使用するのに特に適した他の金属もしくは金属性カチオン、ならびに発色団および酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。他の適切な標識は、当業者に明らかであり、例えば、これには、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出され得る部分が含まれる。本明細書のかかる標識された抗体は、例えば、特異的標識の選択に依存して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ（それ自体公知のイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」などが含まれる）ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ画像化目的に使用され得る。当業者に明らかなように、別の改変は、例えば、上述の金属または金属性カチオンのうちの１つをキレートするための、キレート基の導入を含み得る。適切なキレート基には、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれるが、限定されない。さらに別の改変は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの特異的結合対の一部である官能基の導入を含み得る。かかる官能基は、結合対の片割れに結合された別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物に、即ち結合対の形成を介して、本明細書の抗体を連結させるために使用され得る。例えば、本明細書の抗体は、ビオチンにコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結され得る。例えば、かかるコンジュゲートされた抗体は、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる系において、レポーターとして使用され得る。
【００８０】
上記方法は、種々の異なる適用に使用され得る。非限定的な例には、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで一緒になるように２つのタンパク質をタグ付けすること（例えば、一方のタンパク質に共有結合的に結合されたエピトープタグおよび他方のタンパク質に共有結合的に結合された抗体断片）；遺伝子発現に影響を与えるためまたはＤＮＡを改変するために、エフェクタータンパク質にＤＮＡ結合性タンパク質を連結すること（例えば、ＦｏｋＩに連結されたｄＣａｓ９）；タンパク質発現および細胞内局在化のリアルタイムモニタリングを可能にするために、タンパク質にフルオロフォアを連結すること（例えば、標的タンパク質に連結されたＥＧＦＰ）；任意の所望の理由（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動）のために、２つのタンパク質を細胞中でごく近くに接近させること；シグナルペプチドまたは翻訳後修飾でタンパク質をタグ付けすること（標的タンパク質に共有結合的に結合されたエピトープタグおよびシグナルに共有結合的に結合されたＳｃＦｖ、またはその逆も同様である）；ユビキチン化経路を介した分解のためにタンパク質を標的化するために、Ｅ３リガーゼを付加すること；新たな細胞内局在化へとタンパク質を移動させるために、標的ペプチドまたはシグナルペプチド（例えば、小胞体保留シグナル、核局在化シグナル、核小体局在化シグナル、ミトコンドリア標的化シグナル、ペルオキシソーム標的化シグナル、分泌経路シグナル）を付加すること；ナノ粒子でタンパク質を標識すること（例えば、蛍光画像化のため）；小分子でタンパク質を標識すること（例えば、小分子治療剤を運搬または局所的に濃縮するためにタンパク質を使用する）；小分子をナノ粒子に結合させること（例えば、薬物送達のため、または小分子治療剤を濃縮するため）；２つの小分子または２つのナノ粒子を一緒にすること（例えば、プロドラッグを活性化するため）が含まれる。これらおよび多くの他の適用は、本明細書に示される特許請求の範囲によって包含され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８１】
実施例
【００８２】
ファージディスプレイは、最適な連結を提供する、ＦＬＡＧ親和性タグに対するｓｃＦｖ抗体を同定するために使用される。ｓｃＦｖ親和性における大きな多様性は、親和性選択プロセスのストリンジェンシーを制限することによって得られる。この多様性は、ＦＬＡＧ親和性タグとＦＬＡＧタグに対する親和性を有するｓｃＦｖとの間の首尾よい連結を同定するためのＰｈＤアプローチの重要な利点を示し得る。一部の例では、より速い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体は、ｓｃＦｖ−ＦＬＡＧ複合体の許容的「ゆらぎ（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」を提供し得る。ｓｃＦｖ抗体におけるほぼ徹底的な探索により、ｓｃＦｖ−ＦＬＡＧ親和性タグ複合体の可能なコンフォメーションの大きな多様性の中から選択することが可能になる。ＰｈＤ戦略は、ＦＬＡＧエピトープに対する独自の一価ｓｃＦｖの生成を通じて、かかる多様性を創出し得る。
【００８３】
ｓｃＦｖ抗体の使用を介して達成されるものなどの非共有結合的連結方法は、共有結合的連結に供される場合に生じ得る、標的タンパク質のあらゆる永続的な干渉も回避し得る、ＦＬＡＧ親和性タグとｓｃＦｖとの間の可逆的な会合を提供するｓｃＦｖに融合されたタンパク質を使用する。
【００８４】
抗ＦＬＡＧ抗体を産生するための免疫化。
【００８５】
抗体ライブラリーは、当技術分野で周知のように、免疫化したウサギから産生される。６匹のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギを、各々、２００ｐｇのＦＬＡＧ親和性タグペプチド配列＋アジュバントで免疫化し、血清を、抗体力価を決定するために、免疫化の６週間後に収集する。力価を、固定化したＦＬＡＧ親和性タグに対するＥＬＩＳＡによって決定し、最も高い力価（少なくとも１：１０００）を有する動物を、脾臓および骨髄を単離するために屠殺する。ウサギが十分な力価を生じない場合、胎児ウサギ組織由来のナイーブライブラリーを使用する。これは、再編成されていない重鎖および軽鎖遺伝子の偏りのない収集物を提供する。総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して組織から抽出し、ｃＤＮＡ合成を、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施する。
【００８６】
ｓｃＦｖ遺伝子融合物の生成。
【００８７】
ウサギ由来の重鎖および軽鎖遺伝子の発現された可変領域を単離するために、いくつかのプライマーを使用する。８つのプライマーが、カッパおよびラムダ軽鎖増幅のために使用され、５つのプライマーが、重鎖遺伝子増幅のために使用される。プライマーは、重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を連結する１８アミノ酸のリンカー配列（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ）（配列番号１）のコード配列もまた含有する。このより長いリンカー配列は、モノマー形態のｓｃＦｖ断片のより良い安定性を提供する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物は、このリンカー領域においてオーバーラップし、次いで、オーバーラップエクステンション（ＯＬＥ）ＰＣＲによってアセンブルされ得る（図１）。次いで、ＰＣＲ産物を、Ｓｆｉｌで消化し、Ｓｆｉｌ消化したｐＣｏｍｂ３Ｈとライゲーションさせ、次いで、ＤＮＡを、ゲル電気泳動によってサイズ選択する。このプラスミドは、ｐｉｌｌコートタンパク質に融合されたｓｃＦｖのファージミドディスプレイを可能にする。約５分子のｐｉｌｌファージコートタンパク質が、各ファージ粒子上に存在する。ｐＣｏｍｂ３Ｈプラスミドは、約１つまたは２つの分子が野生型ｐｉｌｌ（これはヘルパーファージによって提供される）と共に組み込まれるようなレベルで、ｓｃＦｖ−ｐｌｌｌ融合物を発現する。最大で１０１２のファージ粒子が単一の調製において生成され得るので、非常に多数のｓｃＦｖをスクリーニングできる。ＰｈＤでは、ｓｃＦｖコード配列は、タンパク質をディスプレイするファージ粒子に常に連結され、従って、引き続くＤＮＡサブクローニングは簡便に達成される。
【００８８】
ファージライブラリーの産生およびスクリーニング。
【００８９】
ライゲーションされたプラスミドＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）を、ＥＲ２５３８  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中にエレクトロポレーションする。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、５ｍＬのＳＯＣ中で３７℃で１時間振盪することによって回収する。欠陥のある複製起点を有するファージを、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて産生する。ファージ粒子を、ＰＥＧ−８０００を用いて沈殿させ、次いで、さらなる遠心分離によって単離する。このファージ調製物は、一次ライブラリーであり、「パニング」によって親和性選択される。ファージ溶出が、固定化された抗原と共に再インキュベートされ、洗浄され、再度溶出される、二重認識パニングを実施する。これは、非特異的ファージを除外するのに役立つ。各ラウンドの選択を試験するために、ファージプールを、ＰＢ抗原に対する親和性についてＥＬＩＳＡによってアッセイする。ＰＢまたはＢＳＡを、９６ウェルプレートにコーティングし、ファージと共にインキュベートし、次いで、Ｍ１３ファージコートタンパク質を認識する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗Ｍ１３抗体と共にインキュベートする。ＥＬＩＳＡ力価の増加は、各ファージプールの首尾良い親和性選択を示す。
【００９０】
ｓｃＦｖライブラリーのレンチウイルスベクターへの移入、およびＥ．ｃｏｌｉにおける拡大増殖。
【００９１】
ファージミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉに各ファージプールを感染させ、カルベニシリンで選択し、その後標準的なプラスミド調製によって、パニングの２回目のラウンド（Ｒ２）および３回目のラウンド（Ｒ３）の後に細菌から単離する。プラスミドＤＮＡを、Ｓｆｉ１で消化してｓｃＦｖコード配列を遊離させ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクター内のＥ２ｃコード配列の上流にライゲーションさせる。Ｅ２ｃコード配列は、短いリンカー配列（ＧＧＳＳＲＳＳ）（配列番号２）もまた有し、Ｅ２ｃのＮ末端部分へのｓｃＦｖライブラリーの融合物を創出する。次いで、２つの続くプラスミドライブラリー（Ｒ２およびＲ３）を、２つのレンチウイルスライブラリーの産生のために、Ａｉｍ  ２と同様に調製する。
【００９２】
レンチウイルスライブラリー産生。
【００９３】
レンチウイルス粒子の産生のために、５×１０８感染単位／ｍＬもの高いウイルス力価を生じるＬｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する。ウイルスを、製造業者の仕様書に従って産生する。ウイルス上清を、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞で力価決定し、その後、ＺｓＧｒｅｅｎｌレポーターによって生じるＦＡＣＳ蛍光によって、形質導入された細胞を計数する。
【００９４】
別の一態様では、ｓｃＦｖについてスクリーニングするための方法が開示される。この態様では、細胞質において安定なｓｃＦｖは、ｓｃＦｖとＥＧＦＰとの間の融合タンパク質を形成し、代理哺乳動物細胞株において発現させることによって、同定され得る。
【００９５】
本発明の実施は、特に指示のない限り、当業者の技術範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来の技術を使用する。
【００９６】
全ての百分率および比率は、特に指示のない限り、重量によって計算する。
【００９７】
全ての百分率および比率は、特に指示のない限り、全組成に基づいて計算する。
【００９８】
本明細書を通じて与えられる全ての最大の数的限界は、そのようなより低い数的限界が本明細書で明示的に書かれるかのように、全てのより低い数的限界を含むと理解すべきである。本明細書を通じて与えられる全ての最小の数的限界は、そのようなより高い数的限界が本明細書で明示的に書かれるかのように、全てのより高い数的限界を含む。本明細書を通じて与えられる全ての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書で明示的に書かれるかのように、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を含む。
【００９９】
本明細書に開示される寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されると理解すべきではない。その代り、特記しない限り、各々のそのような寸法は、列挙された値とその値を囲む機能的に等価な範囲との両方を意味するように意図される。例えば、「２０ｍｍ」として開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味するように意図される。
【０１００】
任意の相互参照されたまたは関連の特許または出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に排除されないか他の方法で限定されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。任意の文書の引用は、それが、本明細書で開示もしくは特許請求された任意の発明に関して先行技術であること、またはそれが単独で、もしくは任意の他の参考文献（単数または複数）との任意の組み合わせで、任意のそのような発明を教示、示唆もしくは開示しているということの承認ではない。さらに、この文書中の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文書中の同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する範囲内では、この文書中でその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態が例示および説明されてきたが、種々の他の変化および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなしになされ得ることが、当業者に明らかである。従って、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内の全てのかかる変化および改変をカバーすることが意図される。
【図１】
2017518083.tif 000003
【配列表】
2017518083000001.app
【国際調査報告】
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2017518083.tif 000009
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