(57)【要約】  本発明は、微細藻類、有利には、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子であり、ＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する遺伝子を有するＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属の微細藻類を化学的限定培地で培養するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子であり、ＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号で寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する遺伝子を有する微細藻類株を培養するための方法であって、
前記株を、
−  多量元素として、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム、有利には六水和物型の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化カルシウム、有利には二水和物型の塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、および窒素源；
−  微量元素として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化コバルト六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、および硫酸ニッケル六水和物（ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）；
−  ビタミンとして、ビオチン、チアミン、コバラミンすなわちビタミンＢ１２、およびパントテン酸塩すなわちビタミンＢ５；および
−  炭素源；
を含む限定培地中で、５×１０６ないし５×１０８細胞／ｍＬ、有利には１０７ないし１０８細胞／ｍＬの株濃度に達するために十分な時間培養する第１の工程と、
１つまたはそれ以上の炭素源濃縮溶液を、一度にまたは連続的に、前記培地へ添加する第２の工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記塩化ナトリウムの濃度が２ないし８ｇ／Ｌ、前記塩化マグネシウムの濃度が０．６ないし１．４ｇ／Ｌ、前記炭酸水素ナトリウムの濃度が０．１４ないし０．２６ｇ／Ｌ、前記窒素源の濃度が１．７ないし３．１ｇ／Ｌ、前記リン酸水素カリウムの濃度が０．３ないし０．７ｇ／Ｌ、前記塩化カルシウムの濃度が１．４ないし２．６ｇ／Ｌ、前記塩化鉄（ＩＩＩ）の濃度が０．０１６ないし０．０２４ｇ／Ｌ、前記ホウ酸の濃度が０．０４６ないし０．７４ｇ／Ｌ、前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの濃度が０ないし０．０８ｇ／Ｌ、前記塩化マンガン（ＩＩ）四水和物の濃度が０．００１ないし０．０２ｇ／Ｌ、前記塩化亜鉛の濃度が０．０００１ないし０．０００８ｇ／Ｌ、前記塩化コバルト六水和物の濃度が０．００００５ないし０．０００５ｇ／Ｌ、前記硫酸銅五水和物の濃度が０．００００７ないし０．００４ｇ／Ｌ、前記硫酸ニッケル六水和物の濃度が０．０００５ないし０．００３ｇ／Ｌ、前記ビオチンの濃度が０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、前記チアミンの濃度が０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、前記コバラミンの濃度が０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、および前記パントテン酸塩の濃度が０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩化ナトリウムの濃度が４ないし６ｇ／Ｌ、前記塩化マグネシウムの濃度が０．８ないし１．２ｇ／Ｌ、前記炭酸水素ナトリウムの濃度が０．１６ないし０．２４ｇ／Ｌ、前記窒素源の濃度が１．９ないし２．９ｇ／Ｌ、前記リン酸水素カリウムの濃度が０．４ないし０．６ｇ／Ｌ、前記塩化カルシウムの濃度が１．６ないし２．４ｇ／Ｌ、前記塩化鉄（ＩＩＩ）の濃度が０．０１８ないし０．０２２ｇ／Ｌ、前記ホウ酸の濃度が０．０４８ないし０．７２ｇ／Ｌ、前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの濃度が０．０１５ないし０．０６ｇ／Ｌ、前記塩化マンガン（ＩＩ）四水和物の濃度が０．００２ないし０．０１ｇ／Ｌ、前記塩化亜鉛の濃度が０．０００１５ないし０．０００６ｇ／Ｌ、前記塩化コバルト六水和物の濃度が０．００００７ないし０．０００３ｇ／Ｌ、前記硫酸銅五水和物の濃度が０．０００９ないし０．００３６ｇ／Ｌ、前記硫酸ニッケル六水和物の濃度が０．０００７ないし０．００２８ｇ／Ｌ、前記ビオチンの濃度が１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌ、前記チアミンの濃度が１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌ、前記コバラミンの濃度が１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌ、および前記パントテン酸塩の濃度が１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記窒素源が、硝酸塩、グルタミン酸塩、アンモニウム塩、または尿素であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記炭素源が、１つ（またはそれ以上）の炭水化物、１つ（またはそれ以上）の酢酸塩、１つまたはそれ以上のアルコール、または１つまたはそれ以上の複合分子、またはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の工程において、前記炭素源の濃度が１０ｍＭないし５００ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養の条件が従属栄養性または混合栄養性であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つまたはそれ以上の窒素源および／またはリン源および／または多量元素源、および／または微量元素源、および／またはビタミン源、有利には窒素源およびリン源の濃縮溶液を、一度にまたは連続的に、前記培地へ添加する第３の工程を含んでなることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の工程において、前記濃縮溶液が、炭素源、窒素源およびリン源を同時に含む溶液（「Ｃ／Ｎ／Ｐ濃縮溶液」ともいう）であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液が、８９１：２６：１の比に関連して、一定量の炭素に対し、２倍までまたは２分の１までの量の窒素、および／または２倍までまたは２分の１までの量のリンを含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液が、８９１：５２：１、８９１：２６：１および８９１：１３：１、４４５：２６：１、４４５：１３：１および４４５：６．５：１、１７８２：１０４：１、１７８２：５２：１および１７８２：２６：１から選択されるモル比、好ましくは８９１：２６：１のモル比を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩化ナトリウムの濃度が５ｇ／Ｌ、前記塩化マグネシウムの濃度が１ｇ／Ｌ、前記炭酸水素ナトリウムの濃度が０．１９ｇ／Ｌ、前記窒素源（ＫＮＯ３）の濃度が２．４ｇ／Ｌ、前記リン酸水素カリウムの濃度が０．５ｇ／Ｌ、前記塩化カルシウムの濃度が１．９ｇ／Ｌ、前記塩化鉄（ＩＩＩ）の濃度が０．０２ｇ／Ｌ、前記ホウ酸の濃度が０．０６ｇ／Ｌ、前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの濃度が０．０３ｇ／Ｌ、前記塩化マンガン（ＩＩ）四水和物の濃度が０．００４５ｇ／Ｌ、前記塩化亜鉛の濃度が０．０００３ｇ／Ｌ、前記塩化コバルト六水和物の濃度が０．０００１５ｇ／Ｌ、前記硫酸銅五水和物の濃度が０．００１８ｇ／Ｌ、前記硫酸ニッケル六水和物の濃度が０．００１４ｇ／Ｌ、前記ビオチンの濃度が０．００００１５ｇ／Ｌ、前記チアミンの濃度が０．００８ｇ／Ｌ、前記コバラミンの濃度が０．０００１３ｇ／Ｌ、前記パントテン酸塩の濃度が０．００２７ｇ／Ｌ、および前記炭素源の濃度が３０．００ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有する微細藻類株であり、前記遺伝子がＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号で寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する微細藻類株を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法で培養することを特徴とする、ＤＨＥＡの生産方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有する微細藻類であり、前記遺伝子がＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号で寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する微細藻類のバイオマスであって、密度が少なくとも５０ｇ／Ｌを超える、好ましくは１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌを超える、さらに好ましくは２７０ｇ／Ｌの乾燥物であることを特徴とするバイオマス。
【請求項１５】
ＤＨＥＡの濃度が、少なくとも５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌを超え、好ましくは２０ｇ／Ｌを超え、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌを超えることを特徴とする、請求項１４に記載のバイオマス。
【請求項１６】
ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡの濃度が、総脂肪酸含有量の１％未満、好ましくは総脂肪酸含有量の０．８％未満であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載のバイオマス。
【請求項１７】
小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有する微細藻類であり、前記遺伝子がＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号で寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する微細藻類のバイオマスであって、密度が少なくとも５０ｇ／Ｌを超える、好ましくは１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌを超える、さらに好ましくは２７０ｇ／Ｌの乾燥物であり、場合により、任意にＤＨＥＡの濃度が、少なくとも５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌを超え、好ましくは２０ｇ／Ｌを超え、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌを超え、場合により、ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡの濃度が、総脂肪酸含有量の１％未満、好ましくは０．８％未満であるバイオマスを得るための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
生産されたバイオマスを回収する、脂質を抽出する、および場合により、回収された脂質からＤＨＥＡを抽出するダウンストリーム工程をさらに含んでなることを特徴とする、請求項１〜１３、または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＨＥＡエステルの形態で生産されたＤＨＥＡを精製する工程をさらに含んでなることを特徴とする、請求項１〜１３、１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有する微細藻類を培養するための方法に関する。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。本明細書で、この株は「ＣＣＡＰ株１１０４／３」とも称される。
【０００２】
有利には、本発明の方法は、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有するクリプテコディニウム属の微細藻類株に関する。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書で、「本発明に関わる微細藻類」との表現は、微細藻類、有利には小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有するクリプテコディニウム属の微細藻類を示す。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。
【０００４】
同様に、「株」とは本発明に関わる天然の微細藻類株のみではなく、前記天然株の変異体も意味する。「変異体」は、元の株に由来する生物を意味し、その遺伝形質は、自然処理によって、または当業者がランダム変異（ＵＶなど）を起こすことができる、当業者に公知の物理化学的方法、すなわち遺伝子工学的方法によって改変されている。
【０００５】
「化学的限定培地」は、各成分が既知である培地を意味する。正確には、本発明は、それらの各成分が決まった濃度ではない、濃縮もしくは複合有機物、例えば酵母抽出物もしくはその他のタンパク質複合体、またはペプトンのようなその他の有機物、または無機海塩のようなその他の濃縮無機物、またはその他の複合成長剤を含まない培地に関する。
【０００６】
「高細胞密度」は、少なくとも５０ｇ／Ｌか、またはそれを超える培地中のバイオマス濃度を意味する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
さらに詳細には、本発明は、本発明に関わる微細藻類を化学的限定培地中で培養するための方法に関し、この方法によって、本発明に関わる微細藻類株の高密度産生が可能になる。
【０００８】
本発明の方法によって、高バイオマス密度を得ること、およびこのように培養した本発明に関わる微細藻類の脂質、さらに詳細にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＥＡ）量の濃縮がさらに可能になる。
【０００９】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のうち、オメガ３シリーズ（ω３−ＰＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡまたはω３  Ｃ２０：５）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＥＡまたはω３  Ｃ２２：６）、ならびにオメガ６シリーズ（ω６−ＰＵＦＡ）、特にアラキドン酸（ＡＲＡもしくはＡＡまたはエイコサテトラエン酸もしくはω６  Ｃ２０：４）のような特定の高不飽和脂肪酸は、栄養的に重要であることが認識されており、治療に応用できる可能性が高い。
【００１０】
必須栄養素であることが認識されているＤＨＥＡは、細胞の正常かつ機能的な発生に必要であり、様々な生化学的過程と機能に決定的な役割を果たしている。ＤＨＥＡは、細胞膜に取り込まれることによって、中枢神経系の発生と網膜の機能に必須のものとなり、視覚と記憶に関わる機構の取得と十分な維持に重要な役割を果たしている。ＤＨＥＡはまた、有効成分として、有効成分のベクターとして、または前駆体として医薬品または医薬組成物にも用いられる。「前駆体」は、この前駆体から、それよりも多かれ少なかれ複雑な他の分子が合成される可能性のある分子を意味する。
【００１１】
ＤＨＥＡを医薬品として使用する場合には、純粋な状態の分子を用意する必要がある。例えばドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の混入を最少にする必要がある。後者の２分子は、微細藻類からしばしばＤＨＥＡと共に産生される。食品または医薬品に応用可能な規制要件に適合した純度をもつ産物が、可能であれば容易に低コストで得られるようにこの精製を促進するためには、ＤＨＥＡが主要なＰＵＦＡであり、ＥＰＡまたはＤＰＡのような分子の含有量が非常に低い油から開始することが望ましい。
【００１２】
現在、医薬品産業および食物に使用されているＤＨＥＡは、主に魚油から得られている。
【００１３】
微細藻類油から得られた、例えばバイオリアクター培養由来のＤＨＥＡを用いることによって、通常用いられる油、例えば魚油の、重金属、殺虫剤およびポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）のような汚染物質の混入可能性の問題、ならびにこのような油が有し得る臭気、および酸化に対する不安定さなどの問題を避けられる。
【００１４】
現在、微細藻類は、特定の種が大量の脂質、特に多価不飽和脂肪酸を蓄積または分泌可能であることから、現在多くの産業プロジェクトの主題となっている。
【００１５】
クリプテコディニウム属の微細藻類は、ＤＨＥＡを多く含み、ＤＰＡ、ＥＰＡおよびその他のＰＵＦＡの含有量が少ない油を産生することが知られている［Ｍｅｎｄｅｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ＤＨＥＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，２１：１９９−２１４］。したがってこの油に含まれるＤＨＥＡは、例えばオーランチオキトリウム属またはシゾキトリウム属タイプのヤブレツボカビから得た油に含まれるＤＨＥＡ、または魚油に含まれるＤＨＥＡに比較して、精製が容易である。
【００１６】
このように、本発明に関わる微細藻類から産生された油は、医薬品および栄養補給食品へ応用するための、およびＤＨＥＡエステル、例えばエチルエステルの形態で使用するための、ＤＨＥＡの産生に特に適している。
【００１７】
微細藻類による工業規模での脂肪酸産生を実現するためには、産生から利益を得るために幾つかの要因を考慮しなければならない。これらの要因として以下が挙げられる：
−  原料および設備の費用（それらの購入またはリースおよびメンテナンス）、および労務；
−  産生への技術的要求：例えば、前培養および培養工程の数と技術的困難、培養のオンラインでのモニタリング、および培養から得たバイオマスを処理して、生産物に価値を与える工程；
−  培養から得た生産物の品質、再現性および収率；
−  培養によって生成した排水の処理。
【００１８】
本発明に関わる微細藻類の培養を従属栄養性または混合栄養性の条件で行うために、現在従来技術において一般的に用いられている培地は、著しい量の濃縮有機物（複合有機物とも称される）を含む。「濃縮」または「複合」有機物は、混合物の形態にみえる未精製有機物を意味し、その混合物の様々な成分の正確な組成および濃度はよく知られておらず、制御されておらず、バッチごとに大きく変動し得る。濃縮または複合有機物の例として、酵母抽出物またはタンパク質の加水分解反応産物であるペプトンが挙げられる。
【００１９】
これらの培地は濃縮無機物（錯塩とも称される）、すなわち混合物の形態にみえる未精製無機物を含んでもよく、その濃度および正確な組成は、バッチごとに大きく変動する可能性があり、制御されていない。例としては、海塩に言及してよいであろう。
【００２０】
問題を単純にするため、本明細書で用いる表現「複合培地」は、濃縮もしくは複合有機物または濃縮もしくは複合無機物または両方を含む培地を示す。
【００２１】
幾つかの論文には、本発明に関わる微細藻類株を用いた、複合培地中でのＤＨＥＡの高細胞密度産生について記載されている。
【００２２】
Ｄｅ  Ｓｗａａｆ  ＭＥら［（２００３）Ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍａｒｉｎｅ  ａｌｇａ  Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８１：６６６−６７２  ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．１０５１３］は、例えば以下の複合培地：１０ｇ／Ｌの酵母抽出物；２５ｇ／Ｌの海塩；８ｇ／Ｌの炭素源、前記炭素源は酢酸ナトリウムである、について記載している。著者らは、脂質が豊富で（６１％）、それ自体がＤＨＥＡを３１％含む、１０９ｇ／Ｌのバイオマス（乾燥物）の流加発酵法による産生について記載している。このような条件下で得られる最大の生産性は、１時間に１リットルの培地あたり３８ｍｇのＤＨＥＡである。これとは反対に、著者らは、微細藻類による多糖の分泌に関連する培養の粘性が、工業規模での培養の実施を妨げ得る問題についても記載している。
【００２３】
ＷＯ２００１／００４３３８号には、酵母抽出物と海塩とを含む複合培地中の主要炭素源として酢酸を用いる、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉの培養法について記載されている。この方法によれば、１４０時間のうちに、その３１％がＤＨＥＡである１２．３ｇ／Ｌの脂質を含む、４５ｇ／Ｌのバイオマスへの到達が可能になる。
【００２４】
ＥＰ０６２２４６３号には、主要炭素源および窒素源としてそれぞれグルコースおよび酵母抽出物を含む複合培地中での、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉの連続培養法について記載されている。流加法における、０．２１ｇ／Ｌ／ｈのバイオマス（乾燥物）の生産性と、０．０１ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＥＡの生産性について記載されている。
【００２５】
しかしながら、油および／またはその他の対象分子の産生過程において、本発明に関わる微細藻類を培養するための複合培地の使用には、以下のような課題もある：
−  最終産物を得るための、バイオマスの後処理（ＤＳＰ）に関して、さらなる費用がかかる、
−培地の組成を完全に制御することができないため、バッチごとの原料によって培養過程が再現できない、
−  複合培地の組成を特徴付けることに限界があるため、産物の履歴管理に限界がある、
−  化学的限定培地の使用に比較してさらなる費用が発生する。実際に、酵母抽出物タイプの培地は、無機窒素、ミネラル、ビタミン混合物タイプよりもさらに高価である。
【００２６】
高細胞密度を達成するために複合培地を使用することによって、ミネラル、タンパク質のような微細藻類に利用されない物質や、微細藻類の増殖を阻害する物質（有機酸など）などの培地中への蓄積も誘導される。実際に、複合培地は通常微細藻類によって完全には消費されず、その内容物は必要な成分を得るためのものである。使用されない画分は培地中に蓄積する。このことは、特に高細胞密度法において、後処理工程、例えばバイオマスの乾燥工程、および限外濾過工程のような精製工程において課題となり得る。
【００２７】
正確な組成が不明である複合培地の使用は、方法にさらなる課題を与える。実際に、複合培地に含まれる有機窒素、ミネラルまたはビタミンは、微細藻類の代謝に影響を与え、その増殖や対象分子の産生に影響を与える可能性がある。
【００２８】
このような原料の正確な組成が保証されていない場合、原料は、供給者によって、正確な製品番号によって、またバッチごとに変動することが考えられる。したがって、所望の最終産物の組成の再現性は、バッチごとに変動し得る。このことは、複合培地中の培養によって得られたバイオマス由来の最終産物の標準化に関して障害となる。
【００２９】
最後に、複合培地の正確な組成が完全に明らかではないことから、産物の履歴管理と品質管理は限定される可能性がある。しかしながら、特に産物の医薬品への応用が予想される場合、産物の履歴管理と品質管理は重要であり、必須であるともいえる。
【００３０】
同様に、一般的方法では、本発明に関わる微細藻類の培養を従属栄養性または混合栄養性の条件で行うために、現在従来技術において用いられている複合培地は、著しい量の海塩を含む可能性もあり、その組成は標準化されていないため、このような培地は供給者によって、製品番号によって、またバッチごとに変動する。このため、不明確な培地を用いた培養法の再現は困難にもなり得る。
【００３１】
油および／またはその他の対象分子の産生方法において微細藻類を培養するための、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の大量使用によって、投資と廃液処理の点からかなりの追加費用が必要となり、副産物の価値が限定される。実際に塩化物イオンは、培養装置、例えば前記培養装置に用いられているステンレス鋼を劣化させる原因となり得る。この結果、塩化物イオンに対してより抵抗性があるが、さらに高価な特定の合金を使用しなければ、産生用の機器が早期に劣化することになる。どちらの場合にも、投資費用は大幅に高くなる。
【００３２】
さらに、塩化ナトリウム（またはその他のナトリウム塩、特に硫酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウム）の大量使用により、廃液処理、特に水の淡水化のための大幅な追加費用が必要となる。
【００３３】
最後に、油の抽出後に残ったバイオマスから構成される油粕タイプの副産物に過剰なナトリウム塩が含まれると、特に動物の飼料としての価値を与えることが難しくなる。
【００３４】
これらの塩を、精製ミネラル由来の既知のミネラルの混合物に置き換えることによって、方法のより良い制御と、原料のより良い履歴管理が可能になる。
【００３５】
このような塩、特に海塩を既知の混合物に置き換えることによって、培地中のＮａＣｌの量を大きく減少させ、その株が厳密に必要とする量に調整される可能性があるため、培地中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に関する課題が少なくなる。
【００３６】
本発明に関わる微細藻類株を培養するための化学的限定培地の処方は、幾つかの文献に記載されている。１９５７年に、ＰｒｏｖａｓｏｌｉとＧｏｌｄは、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ株のための、最初のいわゆる「合成」培地を発表した［Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ，Ｌ．，Ｊ．Ｊ．Ａ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｄｒｏｏｐ：Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｍａｒｉｎｅ  ａｌｇａｅ．Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．２５，３９２−４２８（１９５７）］。
【００３７】
その日以来、別のグループもその課題について発表した。１９９３年には、Ｎｅｒａｄが、今日、株のコレクションを保存するためによく用いられているＡ２Ｅ６培地の作製について報告しており（ＡＴＣＣ４６０）［Ｎｅｒａｄ  ＴＡ（１９９３）Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｉｓｔｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ  ＡＴＣＣ  Ｍｅｄｉｕｍ：４６０  Ａ２Ｅ６  Ｍｅｄｉｕｍ］、その処方はＡＴＣＣウェブサイトから入手できる。
【００３８】
さらに最近では、ＵＳ２００８／００３２３５２  Ａ１号に、特に塩化物イオンの濃度を低下させることを目的とした化学的限定培地を用いる、従属栄養性培養法について記載されている。
【００３９】
しかしながら、合成培地中での、本発明に関わる微細藻類株の増殖について記載した従来技術では、高細胞密度の達成に成功していない。得られるバイオマス濃度は、培地１リットルあたりの乾燥物として、５０ｇ未満である。
【００４０】
したがって、従来技術に記載されているこれらの培地は、高濃度（５０ｇ／Ｌを超える）のバイオマスの産生よりも、株の維持に適していると考えられるため、方法の工業化には適していないと思われる。
【００４１】
このように、その組成が十分明確でかつ制御されており、再現性があって、高細胞密度の達成が可能になる合成培地の提供が、なお必要とされている。
【００４２】
本発明に関わる微細藻類株を、複合培地を使用せず、産生される脂肪酸の収率を最大にする至適な条件下で培養する一方で、後処理を容易にし、方法とその再現性の制御を改善し、価値連鎖を通して履歴管理と品質管理を改善することによって発酵産生費用を抑制することが望ましい。
【００４３】
このことは、原料の品質管理と方法の再現性が決定的なパラメータとなる医薬品への応用に関して特に重要であり、一方で、培地と方法を制御することによってＤＨＥＡが高度に濃縮された油を得ることが可能になるため、精製工程が容易になる。
【００４４】
特に、本発明に関わる微細藻類株を培養するための方法であって、複合培地、特に海塩の使用を大幅に減らす、さらには除去することが可能な方法の提供が望ましい。
【００４５】
本発明との関連では、工業的なＤＨＥＡ産生に十分なバイオマスおよび脂質の密度を得ることが望ましい。したがって、例えば、５０ｇ／Ｌを超える濃度の乾燥物、好ましくは１５０ｇ／Ｌを超える、さらに好ましくは２００ｇ／Ｌを超える濃度の乾燥物を得ることが望ましい。
【００４６】
高細胞密度のみではなく、工業規模のＤＨＥＡ産生に十分なＤＨＥＡ量を得ることが望ましい。ＤＰＡのようなその他のＰＵＦＡの割合が、少なくとも５％未満、好ましくは少なくとも２％未満、さらに好ましくは少なくとも１％未満、さらになお好ましくは０．８％未満、有利には少なくとも０．５％未満、または少なくとも０．１％未満、最も有利には好ましくは少なくとも０．０１％未満であることが望ましい。
【００４７】
これらは、本発明が達成しようとする目的の幾つかである。
【００４８】
このように、本出願人は、本発明に関わる微細藻類株の高細胞密度培養に適応させた化学的限定培地を開発した。開発した方法は、特に複合培地を用いた従来技術と同等か、それを超えるバイオマス濃度を達成すると共に、後者の培養と競合する生産性の保持を可能にする。
【００４９】
本発明の化学的限定培地の使用は、特に、培地中に含まれる各成分の量の制御を可能にする。
【００５０】
したがって、化学的限定培地を用いることにより、本発明者らは、本発明に関わる微細藻類の高細胞密度培養のための新規な方法を開発した。
【００５１】
さらに、本発明の特定の実施形態によれば、この培養法を用いることで、株の代謝を、改善されたＤＨＥＡ産生へと向けることが可能になる。このことは、栄養素の供給、特に炭素、窒素およびリン酸塩源の供給を制御することによって達成され得る。この方法によって、本発明者らは、本発明に関わる微細藻類株によって産生された脂質中のＤＨＥＡの含有量を、複合培地中の培養に比較して、少なくとも３０％、さらには５０％を超えるまで増大させる一方で、その他のＰＵＦＡの濃度を、有利には少なくとも５％未満、さらに有利には１％未満、好ましくは少なくとも０．８％未満の低い値にて維持することに成功した。
【００５２】
本発明の方法によってこのように産生された油は、ＤＨＥＡが高度に濃縮されたものとなり、このため、先行技術の方法に比較して著しく改善されている。
【００５３】
さらに、後処理の費用も従来技術の方法に比べて少なくなっている。
【００５４】
このように、本出願人は、一般に濃縮または複合培地を含まず、濃縮または複合無機物、特に海塩を含まない、化学的限定培地の開発に成功した。
【００５５】
本発明の培地は、本発明に関わる微細藻類株の培養を可能にし、微細藻類による高密度バイオマス産生を可能にし、これは例えば、少なくとも５０ｇ／Ｌを超える、好ましくは１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌを超える、さらに好ましくは２７０ｇ／Ｌの乾燥物であってよい。
【００５６】
本発明の方法によって調製した培養中のＤＨＥＡ濃度は、例えば少なくとも５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌを超え、好ましくは２０ｇ／Ｌを超え、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌを超えてよく、一方でその他のＰＵＦＡの産生は、例えば総脂肪酸含有量の１％未満、好ましくは総脂肪酸含有量の０．８％未満を維持してよい。
【００５７】
このように本発明は、微細藻類株、有利には小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有するクリプテコディニウム属の微細藻類株に関する。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。
【００５８】
ＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されている参照株のＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉは、論文に記載されるように、クレイド２に属する：［Ｐｒａｂｏｗｏ  ＤＡ，Ｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｏ，ａｎｄ  Ｓｕｄａ  Ｓ．ＤＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．（ＤＩＮＯＰＨＹＣＥＡＥ）ＦＲＯＭ  ＯＫＩＮＡＷＡ  ＰＲＥＦＥＣＴＵＲＥ，ＪＡＰＡＮ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｓｕｐｐｌ．，ｐｐ．１８１−１９１  （２０１３）］。
【００５９】
本発明に関わる微細藻類の限定されない例として、以下の種の株が挙げられる。Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  Ｄ３１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＳＳ２−２、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＳＺ１３−３、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＳＺ１３−２、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＳＺ１３−１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番：Ｍ６４２４５）、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＦＪ８２１５０１）、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＯＫＩ５−１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＳＺ７−１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＩＳＧ４０−１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＩＳＫ１−２、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ種  ＩＳＫ１−１、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＤＱ２４１７３７）、または本出願者によってＣＣＡＰに寄託された株、すなわちＣＣＡＰ１１０４／３の番号によって寄託されたＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、ＣＣＡＰ１１０４／５の番号によって寄託されたＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、もしくはＣＣＡＰ  １１０４／４の番号によって寄託されたＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ。
【００６０】
以下の表１に、様々な株の、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子のパーセント類似性を示す。上記株の該遺伝子は、ＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。
【００６１】
【表１】
2017525373.tif 000002
【００６２】
このように本発明は、本発明に関わる微細藻類株を、従属栄養性または混合栄養性の条件で、化学的限定培地中で培養するための方法に関する。この培養法によって、高密度のバイオマス、高密度の脂質、特にＤＨＥＡが得られる一方で、ＤＰＡの含有量を低く維持することが可能になる。
【００６３】
本発明に関わる微細藻類株は、本出願人によって開発された化学的限定培地中で増殖できる。
【００６４】
本発明は、少なくとも多量元素、微量元素およびビタミンを含んでよく、これに炭素源が追加されていてもよい、微細藻類用の化学的限定培地に関する。
【００６５】
さらに詳細には、本発明の培地は、多量元素として、炭素源に加え、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、有利には六水和物型（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）の塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、有利には二水和物型（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）の塩化カルシウム、塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、および、例えば硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）のような硝酸塩、またはグルタミン酸塩、またはアンモニウム塩、または尿素であってよい窒素源を含んでよい。
【００６６】
本発明によれば、塩化ナトリウムは、２ないし８ｇ／Ｌ、好ましくは４ないし６ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００６７】
本発明によれば、リン酸水素カリウムは、０．３ないし０．７ｇ／Ｌ、好ましくは０．４ないし０．６ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００６８】
本発明によれば、塩化マグネシウムは、０．６ないし１．４ｇ／Ｌ、有利には０．８ないし１．２ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００６９】
本発明によれば、炭酸水素ナトリウムは、０．１４ないし０．２６ｇ／Ｌ、有利には０．１６ないし０．２４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７０】
本発明によれば、窒素源は、１．７ないし３．１ｇ／Ｌ、有利には１．９ないし２．９ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７１】
本発明によれば、塩化カルシウムは、１．４ないし２．６ｇ／Ｌ、有利には１．６ないし２．４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７２】
本発明によれば、塩化鉄（ＩＩＩ）は、０．０１６ないし０．０２４ｇ／Ｌ、有利には０．０１８ないし０．０２２ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７３】
本発明によれば、ホウ酸は、０．０４６ないし０．７４ｇ／Ｌ、有利には０．０４８ないし０．７２ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７４】
同様に、本発明の培地は、微量元素として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化コバルト六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、および硫酸ニッケル六水和物（ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）を含んでよい。
【００７５】
本発明によれば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムは、０．０１ないし０．０８ｇ／Ｌ、有利には０．０１５ないし０．０６ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７６】
本発明によれば、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物は、０．００１ないし０．０２ｇ／Ｌ、有利には０．００２ないし０．０１ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７７】
本発明によれば、塩化亜鉛は、０．０００１ないし０．０００８ｇ／Ｌ、有利には０．０００１５ないし０．０００６ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７８】
本発明によれば、塩化コバルト六水和物は、０．００００５ないし０．０００５ｇ／Ｌ、有利には０．００００７ないし０．０００３ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００７９】
本発明によれば、硫酸銅五水和物は、０．００００７ないし０．００４ｇ／Ｌ、有利には０．０００９ないし０．００３６ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８０】
本発明によれば、硫酸ニッケル六水和物は、０．０００５ないし０．００３ｇ／Ｌ、有利には０．０００７ないし０．００２８ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８１】
同様に、本発明の培地は、ビオチン、チアミン、コバラミンすなわちビタミンＢ１２、およびパントテン酸塩すなわちビタミンＢ５のような、ビタミン類を含んでよい。
【００８２】
本発明によれば、ビオチンは、０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、有利には１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８３】
本発明によれば、チアミンは、０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、有利には１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８４】
本発明によれば、コバラミンは、０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、有利には１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８５】
本発明によれば、パントテン酸塩は、０．５×１６−６ないし１．５×１０−４ｇ／Ｌ、有利には１×１０−６ないし１×１０−４ｇ／Ｌの濃度であってよい。
【００８６】
本発明によれば、限定培地は炭素源を含んでよい。本発明の限定培地に使用できる代表的な炭素源は、１つ（またはそれ以上）の炭水化物、１つ（またはそれ以上）の酢酸塩、１つまたはそれ以上のアルコール、または１つまたはそれ以上の複合分子であってよい。有利には、炭素源は複数の炭素源の混合物であってよい。例えば、コムギ由来の、トウモロコシもしくはジャガイモ由来のデンプンの生体内変換による産物、特にデンプン加水分解物が挙げられ、これらは、本発明によって使用可能な炭素基質を構成する小分子からなる。
【００８７】
本発明の限定培地に使用できる炭水化物の例としては、サッカロース（またはショ糖）、ラクトース、デンプン、アミロース、アミロペクチン、セルロースまたはその誘導体、グリコーゲン、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、エリトルロース、リボース、リボフラノース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、グルコース、グルコピラノース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、ガラクトピラノース、タロース、プシコース、フルクトース、フルクトフラノース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、２−デオキシリボフラノース、トレハロース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラフィノース、ゲンチアノース、寒天、ヒアルロン酸、オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）が挙げられる。
【００８８】
酢酸塩の例としては、酢酸ナトリウムまたは酢酸が挙げられる。
【００８９】
アルコールの例としては、エタノールまたはグリセロールが挙げられる。
【００９０】
本発明によれば、炭素源は、好ましくはグリセロールであってよい。
【００９１】
本発明によれば、炭素源の濃度は１０ｍＭないし５００ｍＭであってよい。しかしながら当業者であれば、炭素源の濃度を、その性質によって、かつ培養する株の必要によって適合させることができる。例えば、グルコース、グリセロールおよびエタノールの濃度は、２００ないし５００ｍＭであってよい。炭素源が酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムまたは酢酸である場合、その本発明の培地中の濃度は１０ないし１００ｍＭであってよい。
【００９２】
本発明の改良形態によれば、化学的限定培地は、前記の炭素源を添加した、前記成分のみからなってよい。
【００９３】
本発明はまた、微細藻類株、有利には小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有するクリプテコディニウム属の微細藻類を培養するための方法にも関する。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。この方法は、少なくとも、前記株を前記限定培地中で、５×１０６ないし５×１０８細胞／ｍＬ、有利には１０７ないし１０８細胞／ｍＬの株濃度に達するために十分な時間培養する第１の工程と、少なくとも、１つまたはそれ以上の炭素源濃縮溶液を、一度にまたは連続的に培地へ添加する第２の工程とを含むことを特徴とする。有利には、本発明によれば、炭素源濃縮溶液は第１の工程で用いる炭素源と同じかまたは異なる炭素源を含む溶液からなってよい。
【００９４】
本発明によれば、５×１０６ないし５×１０８細胞／ｍＬ、有利には１０７ないし１０８細胞／ｍＬの株濃度に達するために十分な時間は、２４時間ないし１６８時間、有利には２４時間ないし９６時間であり得る。しかしながら当業者は、培地中の細胞濃度を定期的に分析することによって、５×１０６ないし５×１０８細胞／ｍＬの株濃度に達するために十分な時間を容易に決定できる。培養の進行をモニターするため、当業者は、例えばＭａｌａｓｓｅｚチャンバーまたはＢｅｃｋｍａｎ（登録商標）ブランドの「Ｚ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）」のような粒子カウンターを用いた細胞計数のような、培地中の細胞濃度を測定するためのいずれかの方法を用いてよい。
【００９５】
本発明の方法の第２の工程は、第１工程の培養中に細胞によって消費された炭素源を補うことを目的とする。
【００９６】
本発明の改良形態によれば、該方法は、１つまたはそれ以上の窒素源および／またはリン源および／または多量元素源、および／または微量元素源、および／またはビタミン源、有利には窒素源および／またはリン源の濃縮溶液を、一度にまたは連続的に培地へ添加する第３の工程を含んでよい。
【００９７】
本発明のこの改良形態によれば、この第３の工程は、第１の工程の培養中に細胞によって消費された窒素、リン、多量元素、微量元素および／またはビタミン源を補うことを目的とする。
【００９８】
本発明の別の改良形態によれば、第２の工程および第３の工程は逆にしてもよい。
【００９９】
本発明のさらに別の改良形態によれば、前記方法は、濃縮溶液が、炭素源、窒素源およびリン源を同時に含む溶液（「Ｃ／Ｎ／Ｐ濃縮溶液」ともいう）であってよい、１つの第２工程のみを含む。
【０１００】
実際に本発明者らは、炭素源、窒素源およびリン源を同時に含むが、その炭素／窒素／リン原子のモル濃度比が完璧に明確にされた溶液を第２工程に加えることで、培養中の株の代謝を、ＤＨＥＡの形成へ優先的に向けられることを示すことができた。本発明者らは、多数の培養実験と様々な条件下での試験を実施した後、窒素およびリンを限定することで、これが可能になることを示した。
【０１０１】
リンが窒素および炭素に対して限定されており、窒素が炭素に対して限定されている、炭素、窒素およびリン原子のモル比が明確な栄養素溶液の形態で、追加の基質を添加すると、細胞によるＤＨＥＡ産生を増大させることができる。
【０１０２】
したがって本発明によれば、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液は、８９１：２６：１の比に関連して、同量の炭素に対し、２倍までまたは２分の１までの量の窒素、および／または２倍までまたは２分の１までの量のリンを含んでよい。
【０１０３】
したがって、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液は、以下のモル比：８９１：５２：１、８９１：２６：１および８９１：１３：１、４４５：２６：１、４４５：１３：１および４４５：６．５：１、１７８２：１０４：１、１７８２：５２：１および１７８２：２６：１において用いてよい。
【０１０４】
好ましくは、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液のモル比は８９１：２６：１であってよい。
【０１０５】
明らかに、本発明の方法では第２の工程および第３の工程を、これらの工程を最初に行った順番に関わらず、１回以上反復してよい。
【０１０６】
当業者は、培養の進行に従って、添加の量および頻度を決定できる。培養開始時、化学的限定培地中の成分は、前記のように、培養する株に必要なすべての栄養素を満たすことが可能である。培養が５×１０６ないし５×１０８の細胞密度、さらに詳細には１０７ないし１０８細胞／ｍＬの細胞密度に達した段階で、炭素基質を添加してよい。さらに本方法の実施形態によれば、前記の化学的に限定された栄養素溶液の添加は、培養が５×１０６ないし５×１０８の細胞密度、さらに詳細には１０７ないし１０８細胞／ｍＬの細胞密度に達した際に行ってよい。これらの栄養素溶液は、特に窒素またはリン源を構成する。
【０１０７】
本発明によれば、培地のｐＨは３ないし９、有利には４ないし８であってよい。
【０１０８】
同様に、本発明によれば、培養温度は１５ないし３５℃、好ましくは２０ないし３０℃であってよい。
【０１０９】
本発明によれば、培養の間の溶解酸素濃度は、４％ないし４０％、有利には５％ないし３０％に調整されてよい。
【０１１０】
もちろん、微細藻類株の培養に必要であり、特に本発明に関わるものであり、当業者に公知である、その他のいずれかの補助剤を、本発明の方法に従って添加してもよい。例えば消泡剤、例えばフランスのＣｏｇｎｉｓから入手できる２００ｐｐｍ  Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ  １５３Ｋ（登録商標）を、培養の間に添加してもよい。
【０１１１】
本発明に関わる株は、前記方法に従って培養した後、それに続いて考えられるいずれかの使用のために回収されてよい。好ましくは、本発明に関わる株は、含有される脂質、特にＤＨＥＡを抽出するために用いてよい。ＤＨＥＡを含む選択的な脂質の抽出方法は当業者に公知であり、例えば以下の論文：Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９）［Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７］に記載されている。
【０１１２】
本発明の方法によって、その株のＤＨＥＡ生産性が、少なくとも０．０２ｇ／Ｌ／ｈ、好ましくは少なくとも０．０３ｇ／Ｌ／ｈ、さらに好ましくは少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／ｈ、さらに好ましくは少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈであり得るバイオマスを得ることが可能になる。
【０１１３】
同様に、本発明の方法は、その株の、該方法に由来する脂肪酸中のＤＰＡ含有量が、３％未満、好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満、さらになお好ましくは０．１％未満、実際には０．０１％未満であり得るバイオマスを得ることが可能になる。
【０１１４】
本発明はまた、本発明に関わる株が、先に定義したような培地中で培養されることを特徴とする、ＤＨＥＡの産生方法にも関する。
【０１１５】
本発明の方法によって得られたバイオマスは、株に含有される油を分離できる、他のいずれかの公知の方法に付されてよい。
【０１１６】
例えば発酵後、得られたバイオマスは、必要に応じて約２５０ｇ／Ｌに濃縮できる。この工程の目的は、次の工程で蒸発させる水分量を減らすために、本発明に関わる株のバイオマスを濃縮することである。バイオマスは遠心分離によって濃縮できる。適用可能な人工重力の強度は４０００ｇを超える。遠心分離の沈降物から回収されたバイオマスは、最小２５０ｇ／Ｌに濃縮されてよい。主に培地からなる液体は廃棄してよい。
【０１１７】
濃縮工程に続く乾燥工程の目的は、機械的な油抽出工程のための遠心分離沈降物を調製することである。このために乾燥工程は、相対的水分レベルが３ないし５％（乾燥物が９５ないし９７％）である乾燥物を得るために、水分を除去する工程であってよい。この乾燥工程は、例えばシリンダー乾燥機の技術を通して、または当業者に公知のその他の方法によって実施されてよい。乾燥工程のパラメータは、発酵スラッジの相対的な水分含有量によって最適化できる。さらに乾燥パラメータは、シリンダー温度（３ｂａｒを超える蒸気圧を制御する）と、シリンダー上のスラッジとの接触時間（シリンダー回転速度、２Ｈｚ）との相関によっても最適化できる。
【０１１８】
前記の乾燥工程によって得られた乾燥物に含まれる油は、当業者に公知のすべての方法によって、例えば従来の押し出しプレス技術によって抽出できる。この機械的抽出（プレス工程）は、一般に、ノズルによって閉じられたケージドバレルに圧力をかけるウォームから構成されるプレスによって実施できる。この装置により、いわゆる「コールドプレス」油が得られるか、または加熱カラーシステムを用いた場合には、「ホットプレス」油が得られる。どのような場合にも、機械的に回収した油が溶媒と接触することはない。乾燥物の機械的プレスによって、色の濃い油画分と、３ないし５％の残りの油を含む油粕が得られる。この段階で、油粕に由来するすべての脂質を除去できるため、発酵中に産生されたすべての油を回収できる。油粕は次に、さらなる溶媒抽出工程に付される。
【０１１９】
プレス工程から回収したプレス油は、油に縣濁したバイオマスのプレスによって出てきた微細な固体粒子（微粒子）を除去するため、遠心分離のような従来の方法によって浄化できる。こうして、浄化した油が得られる。
【０１２０】
微粒子は、乾燥物から得たプレス油の約５％であってよい。微粒子中に存在する油は、油粕中に残った油のように、溶媒抽出によって回収できる。
【０１２１】
浄化した油は、当業者に公知の方法に従い、基本培地中のエタノールエステル交換によって、脂肪酸エチルエステルへと処理できる。したがって、脂肪酸はエステル交換のグリセロール残基から分離できる。次にグリセロールは、水洗によって除去できる。エチルエステル中に残った水分は、一般に、例えばＲｏｔａｖａｐｏｒ（登録商標）を用いた減圧蒸留によって蒸発させることができる。
【０１２２】
いったん水を遊離させると、脂肪酸エチルエステルは、例えば分子蒸留のような当業者に公知の方法によって分離できる。一般にはこの工程の間に、３つの画分が得られる：
−  中鎖および長鎖脂肪酸エチルエステル（カプリン酸エチルエステルすなわちＣ１０：０−ＥＥからオレイン酸エチルエステルすなわちＣ１８：１ｎ９−ＥＥまで）からなる軽量画分、
−  超長鎖エチルエステル（ＤＨＥＡエチルエステルすなわちＤＨＡ−ＥＥ）からなる重量画分；および
−  培養方法により、濃縮色素（αカロチンおよびβカロチン）からなる画分。
【０１２３】
分子蒸留工程の後、ＤＨＡ−ＥＥの純度は９８％を超え得る。
【０１２４】
本発明の方法によって産生されたＤＨＡ−ＥＥは、１％未満、さらには０．５％未満のＤＰＡ  ｎ６を含み得る。したがってＤＨＡ−ＥＥは、治療薬の医薬組成物中の成分として直接用いることができる。
【０１２５】
本発明はまた、小サブユニット１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を有する微細藻類のバイオマスにも関する。前記遺伝子はＣＣＡＰ（藻類原生動物カルチャーコレクション）にＣＣＡＰ  １１０４／３の番号によって寄託されているＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株の同遺伝子と少なくとも９６％の遺伝的類似性を有する。前記バイオマスは本発明の方法によって得ることができ、密度が少なくとも５０ｇ／Ｌを超える、好ましくは１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌを超える、さらに好ましくは２７０ｇ／Ｌの乾燥物であり、さらにＤＨＥＡ濃度が少なくとも５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌを超え、好ましくは２０ｇ／Ｌを超え、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌを超え、かつ場合により、ＰＵＦＡ濃度が、総脂肪酸含有量の１％未満、好ましくは総脂肪酸含有量の０．８％未満であることを特徴とする。
【０１２６】
本発明のその他の利点および特色は、以下に記載する実施例および添付の図面によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、本発明の方法に従い、炭素源濃縮溶液を添加した本発明の化学的限定培地中で培養して得られた結果を、濃縮培地中での培養と比較して示した図である（実施例１）。図１Ａは、試験中の乾燥物産生量の進展を示す。図１Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。
【図２】Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、本発明の方法に従い、炭素源濃縮溶液と窒素およびリン源濃縮溶液とを添加した本発明の化学的限定培地中で培養して得られた結果を、濃縮培地中での培養と比較して示した図である（実施例２）。図２Ａは、試験中の乾燥物産生量の進展を示す。図２Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。
【図３】Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、本発明の方法に従い、炭素源濃縮溶液、ならびに、特に窒素およびリンを含む多量元素、微量元素およびビタミン濃縮溶液を添加したことで、使用した限定培地に最初に含まれた成分の量の２倍を供給し、添加後にミネラルおよびビタミンの総供給量を、最初の量の３倍とする（「３×」総量）ことが可能になった、本発明の化学的限定培地中で培養して得られた結果を、濃縮培地中での培養と比較して示した図である（実施例３）。図３Ａは、試験中の乾燥物産生量の進展を示す。図３Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。
【図４】Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、本発明の方法に従い、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液を添加した本発明の化学的限定培地中で培養して得られた結果を、濃縮培地中での培養と比較して示した図である（実施例４）。図４Ａは、試験中の乾燥物産生量の進展を示す。図４Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。
【図５】Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、本発明の方法に従い、特に窒素およびリンを含む多量元素、微量元素およびビタミン濃縮溶液と、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液とを添加した本発明の限定培地中で培養して得られた結果を示した図である（実施例５）。図５Ａは、試験中の乾燥物産生量の進展を示す。図５Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）の、本発明の方法による、炭素源濃縮溶液を添加した本発明の化学的限定培地中での培養
【０１２９】
Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を、専用のコンピュータ制御された自動システムによって使用する１ないし５Ｌの発酵槽（バイオリアクター）内で培養した。酸（Ｈ２ＳＯ４）を加えて、システムのｐＨを調整した。培養温度は２８℃に設定した。撹拌は、２つの撹拌インペラ、ＲｕｓｈｔｏｎおよびＨＴＰＧ４を用いて行った。培地中に溶解した酸素の圧力は、撹拌速度（２００〜８００ｒｐｍ）、空気流速（０．６〜１．６ｖｖｍ）および酸素流速（０〜１．６ｖｖｍ）により、培養の間にわたって調節した。自動制御システムに組み込まれた調節パラメータにより、ｐＯ２を２５％ないし３５％に維持することが可能であった。
【０１３０】
総バイオマス濃度は、乾燥質量の測定（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターを用いて濾過した後、１０５℃のオーブン内で最低でも２４時間乾燥させ、秤量した）によってモニターした。
【０１３１】
総脂質およびＦＡＭＥ含有量の分析は、古典的文献に記載される方法に従って行った［Ｆｏｌｃｈ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９５７  Ｍａｙ；２２６（１）：４９７−５０９］。
【０１３２】
培養は本発明の限定培地中で行った。その組成を以下の表２に示す。
【０１３３】
【表２】
2017525373.tif 000003
【０１３４】
この化学的限定培地は、その各成分に「１×」参照濃度を定めている。
【０１３５】
７１２．３ｇ／Ｌのグリセロールを含む有機炭素源濃縮溶液は、発酵槽内の測定されたグリセロール濃度が１０ｇ／Ｌの閾値よりも低くなった際の、培地へのグリセロールの供給を可能にする。これにより、グリセロール濃度は１０ｇ／Ｌないし６０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０ｇ／Ｌないし５０ｇ／Ｌに保たれる。
【０１３６】
対照を、８．７ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．７５ｇ／ＬのＫＮＯ３、５ｇ／Ｌの海塩および３０ｇ／Ｌのグリセロールから構成される濃縮培地中で培養した。対照培養のための第１濃縮溶液は、濃縮ＫＮＯ３および酵母抽出物から構成される。これらを添加することにより、最初は１×量であったＫＮＯ３および酵母抽出物を３×量に増大できる。７１２．３ｇ／Ｌのグリセロールを含む有機炭素源濃縮溶液は、発酵槽内の測定されたグリセロール濃度が１０ｇ／Ｌの閾値よりも低くなった際の、培地へのグリセロールの供給を可能にする。これにより、グリセロール濃度は１０ｇ／Ｌないし６０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０ｇ／Ｌないし５０ｇ／Ｌに保たれる。
【０１３７】
この試験の間に得られた結果を図１に示す。
【０１３８】
図１Ａは、試験中の乾燥物産生量、および乾燥物産生量に基づいた脂質産生量（％脂質／ＤＭ）の進展を、濃縮培地中の培養と本発明の培地（１×無機培地）中の培養とを比較した、時間の関数として示す。
【０１３９】
２３６時間の培養後、本発明の培地では６７．４ｇ／Ｌのバイオマスが得られ（比較した濃縮培地では１７４．３ｇ／Ｌ）、脂質含有量は約１５．９％であった（比較した濃縮培地では１３．７％）。
【０１４０】
図１Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは微量（＜１％、好ましくは＜０．８％）であることに特に留意されたい。
【０１４１】
さらに、脂質中のＤＨＥＡの含有量は、濃縮培地における３９．７％と比較して、３０．４％に上った。
【０１４２】
このように、本発明の培地中での株の増殖は、炭素源濃縮溶液の添加によって高細胞密度を達成し、バイオマスは５０ｇ／Ｌを超えたが、対照の濃縮培地と同等の成績は得られなかった。
【０１４３】
実施例２：Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）の、本発明の方法による、炭素源濃縮溶液と窒素およびリン源濃縮溶液とを添加した本発明の限定培地中での培養
【０１４４】
本実施例の結果を図２に示す。
【０１４５】
実施例１の記載と同様の方法で、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を発酵槽内で培養したが、追加で濃度６４．０ｇ／ＬのＫＮＯ３と濃度４．３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４を含むミネラル濃縮溶液を供給した。これにより、窒素およびリンの最初の量を増大させ、生産性を維持して、増殖を継続させることが可能になる。このミネラル濃縮溶液の添加は、培養の細胞密度が３×１０７細胞／ｍＬに達した後か、または培養開始後９２時間目に１回行った。
【０１４６】
実施例１に記載するように、対照は複合培地中で培養した。
【０１４７】
本実施例の条件下で、細胞密度および細胞の脂質含有量は、３３０時間の培養後、複合培地の結果に近くなった（図２Ａ）。
【０１４８】
本発明の培地では１６８．６ｇ／Ｌのバイオマスが得られ（比較した濃縮培地では２１０ｇ／Ｌ）、脂質は約１０％であった。
【０１４９】
図２Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは微量（＜１％、好ましくは＜０．８％）であることに特に留意されたい。さらに、ＤＨＥＡの量は複合培地において得られた特性と同等であり、濃縮培地でのＤＨＥＡが３９．７％であったのに対し、４０．４％であった。
【０１５０】
このように、本発明の培地中での株の増殖は、炭素源濃縮溶液の添加と窒素およびリン源濃縮溶液の添加との組み合わせによって、対照の濃縮培地に近い高細胞密度を達成し、脂質中のＤＨＥＡ含有量は、対照の濃縮培地のものと同等になった。
【０１５１】
実施例３：Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）の、本発明の方法による、炭素源濃縮溶液、ならびに、特に窒素およびリンを含む多量元素、微量元素およびビタミン濃縮溶液を添加した、本発明の限定培地中での培養
【０１５２】
本実施例の結果を図３に示す。
【０１５３】
実施例２の記載と同様の方法で、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を発酵槽内で培養したが、ミネラル濃縮溶液を改変した。
【０１５４】
本実施例において、ミネラル濃縮溶液は、最初の培地に含まれるすべてのミネラルおよびビタミンから構成されている。この添加により、最初の培地に含まれたミネラルおよびビタミンの量の２倍を供給し、添加後にミネラルおよびビタミンの総供給量を、最初の量の３倍とする（「３×」総量）ことが可能になった。
【０１５５】
実施例１に記載するように、対照は複合培地中で培養した。
【０１５６】
ミネラルおよびビタミンの供給を進行させることによって、ＤＨＥＡの含有量が３２．６％である脂質を１８％含む、２７４．６ｇ／Ｌの乾燥物を得ることができた（図３ＡおよびＢを参照）。
【０１５７】
このように、実施例３の条件は、濃縮培地および実施例２の無機培地によって得られた成績を上回った。
【０１５８】
図３Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは微量（＜１％、好ましくは＜０．８％）であることに、特に留意されたい。
【０１５９】
さらに、脂質中のＤＨＥＡの含有量は、濃縮培地における３９．７％と比較して、３２．８％に上った。
【０１６０】
このように、本発明の培地中での株の増殖は、炭素源濃縮溶液の添加と、特に窒素およびリンを含む多量元素、微量元素およびビタミン濃縮溶液の添加との組み合わせによって、対照の濃縮培地よりも高い高細胞密度を達成し、脂質中のＤＨＥＡ含有量は、対照の濃縮培地のものに近くなった。
【０１６１】
実施例４：Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）の、本発明の方法による、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液を添加した本発明の限定培地中での培養
【０１６２】
本実施例の結果を図４に示す。
【０１６３】
実施例２の記載と同様の方法で、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ（ＣＣＡＰ株１１０４／３）を発酵槽内で培養した。
【０１６４】
この手順は、濃縮溶液の性質に関連して改変した。本実施例では、「Ｃ／Ｎ／Ｐ栄養素溶液」と称される溶液の添加の形で、さらなる基質が添加される。この栄養素溶液には、炭素基質（グリセロール）、無機窒素源（ＫＮＯ３）および無機リン源（Ｋ２ＨＰＯ４）が含まれる。この栄養素溶液の炭素、窒素およびリン原子のモル比は規定されており、８９１：２６：１である。この比は本発明者らによって調整されたものであり、窒素およびリンを限定することで、代謝をＤＨＥＡの産生へ優先的に向ける。
【０１６５】
実施例１に記載するように、対照は濃縮培地中で培養した。
【０１６６】
Ｃ／Ｎ／Ｐ溶液を８９１：２６：１のモル比において添加することによって、ＤＨＥＡの含有量が５９．３％である脂質を８％含む、２５１．２ｇ／Ｌの乾燥物を得ることができた（図４ＡおよびＢを参照）。
【０１６７】
このように本発明の実施形態によれば、化学的限定培地中の培養の間に炭素、窒素およびリン源を供給することによって、脂質中のＤＨＥＡ含有量を５９．３％の値まで増大させられる。この成績は、無機培地または濃縮培地を問わず、従来技術に記載されたすべての成績を上回った。この成績により、実施例１、２および３に記載された方法の改善も可能になった。
【０１６８】
図４Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは微量（＜１％、好ましくは＜０．８％）であることに、特に留意されたい。
【０１６９】
さらに、脂質中のＤＨＥＡの含有量は、濃縮培地における３９．７％のＤＨＥＡと比較して、５９．３％に上った。
【０１７０】
したがって、実施例１、２および３を比較すると、炭素、窒素およびリン源（モル比が８９１：２６：１のＣ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液）の制御された供給によって、ＤＨＥＡが著しく濃縮された油が得られると同時に、高密度と生産性を維持することが可能になる。
【０１７１】
実施例の結果を検討した上での結論
本発明に関わる微細藻類株を本発明により培養することで、ＤＨＥＡが豊富でＤＰＡが少ない脂質を含むバイオマスを大量に産生することが可能になる。
【０１７２】
実際に、従属栄養性または混合栄養性の条件で本発明の方法を用いることにより、５０ｇ／Ｌ乾燥物を超えないとしても、少なくともそれに同等であり、２５０ｇ／Ｌ乾燥物を超える可能性もあるバイオマス濃度が得られる。この乾燥物は１０％を超える脂質を含み、この含有量は、潜在的に６０％の脂質まで上昇し（図３Ａ）、ＤＨＥＡの含有量は５９％を超える（図４Ｂ）。
【０１７３】
概して、本発明の方法によって得られたＤＨＥＡの量は、少なくとも従来技術に記載される濃縮培地を用いて得られた量と同等であった。例えば実施例２の結果は、バイオリアクター内での本発明の限定培地を用いた培養によって４０．４％のＤＨＥＡが得られ（表１）、対照培養（複合培地）では３９．７％のＤＨＥＡが得られたことを示している。
【０１７４】
その他の望ましくないＰＵＦＡ、特にＤＰＡは、概して脂肪酸の３％未満であり、０．０１％未満ともなった。
【０１７５】
本発明の方法によれば、ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは概して微量（＜１％、好ましくは＜０．８％）である。
【０１７６】
実施例５：Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株（ＣＣＡＰ株１１０４／３）の、本発明の方法による、特に窒素およびリンを含む多量元素、微量元素およびビタミン濃縮溶液と、Ｃ／Ｎ／Ｐ型濃縮溶液とを添加した本発明の限定培地中での培養
【０１７７】
実施例１と同様の条件で、培養した。
【０１７８】
培養は本発明の限定培地中で行った。その組成を以下の表３に示す。
【０１７９】
【表３】
2017525373.tif 000004
【０１８０】
本実施例において、ミネラル濃縮溶液は、最初の培地に含まれるすべてのミネラルおよびビタミンから構成されており、それ以外にはＫＮＯ３およびＫＨ２ＰＯ４を用いて培地を充実させ、それらの添加後にミネラルおよびビタミンの総供給量は最初の量の３倍となる（「３×」総量）。さらに、「Ｃ／Ｎ／Ｐ栄養素溶液」と称される溶液の添加の形で、さらなる基質が添加される。この栄養素溶液には、炭素基質（グリセロール）、無機窒素源（ＫＮＯ３）および無機リン源（Ｋ２ＨＰＯ４）が含まれる。この栄養素溶液の炭素、窒素およびリン原子のモル比は規定されており、４４５：１３：１である。この比は窒素およびリンを限定するように調整されたものであり、代謝をＤＨＥＡの産生へ優先的に向ける一方で、良好な生産性を維持するために十分な触媒活性が得られる状態にバイオマスを維持する。
【０１８１】
実施例１に記載するように、対照は濃縮培地中で培養した。
【０１８２】
ミネラル濃縮溶液、ビタミン濃縮溶液、およびＣ／Ｎ／Ｐ溶液を４４５：１３：１のモル比において添加することによって、ＤＨＥＡの含有量が３７％である脂質を１８％含む、２７５ｇ／Ｌの乾燥物を得ることができた（図５ＡおよびＢを参照）。
【０１８３】
このように、本発明のこの実施形態によれば、化学的限定培地を用いた培養中に、一方でミネラルおよびビタミンを供給し、他方で炭素、窒素およびリン源を供給することによって、脂肪酸の蓄積およびＤＨＥＡの含有量に関して満足な成績と、良好な生産性とを得ることが可能になる。
【０１８４】
図５Ｂは、培養終了時にＣＣＡＰ株１１０４／３に含まれていた油の脂質特性を示す。ＤＨＥＡ以外のＰＵＦＡは微量（＜１％）であることに特に留意されたい。
【図１】
2017525373.tif 000005
【図２】
2017525373.tif 000006
【図３】
2017525373.tif 000007
【図４】
2017525373.tif 000008
【図５】
2017525373.tif 000009
【国際調査報告】
2017525373.tif 000010
2017525373.tif 000011
2017525373.tif 000012
2017525373.tif 000013
2017525373.tif 000014
2017525373.tif 000015
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