(57)【要約】【課題】基板／ペプチド／脂質二重層集積体、製造方法及び関連する検出方法の提供。【解決手段】本発明は、係留ペプチドと呼ばれるペプチドを介して少なくとも１つの脂質二重層が固定された基板で構成される集積体であって、上記係留ペプチド自身が基板と結合しており、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成されるＣ末端を有しており、上記脂質二重層は、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含み、上記キレート化極性頭部は、上記係留ペプチドのＣ末端位に位置するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの金属−キレート相互作用によって上記係留ペプチドとの結合を確保することを特徴とする集積体に関する。本発明はまた、上記集積体の製造方法及び関連する検出方法に関する。【選択図】図１
2017534053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
係留ペプチドと呼ばれるペプチドを介して少なくとも１つの脂質二重層が固定された基板で構成される集積体であって、上記係留ペプチド自身が上記基板と結合しており、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成されるＣ末端を有しており、上記脂質二重層は、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含むため、上記係留ペプチドのＣ末端を構成するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの金属−キレート相互作用によって上記係留ペプチドとの結合を確保することを特徴とする集積体。
【請求項２】
上記金属カチオンは、ニッケル、ガドリニウム又は銅のカチオンであることを特徴とする請求項１に記載の集積体。
【請求項３】
上記金属カチオンはニッケルカチオンであり、上記キレート化極性頭部はニトリロ三酢酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載の集積体。
【請求項４】
上記金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分は、上記脂質二重層を形成する脂質全体の０．５〜５モル％、好ましくは１〜２モル％に相当することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項５】
上記係留ペプチドは、好ましくはそのＮ末端で、上記基板に共有結合により固定されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項６】
上記基板は金で作製されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項７】
上記係留ペプチドは、そのＮ末端にシステインを含み、上記金基板とＳ−Ａｕ結合を形成することを特徴とする請求項６に記載の集積体。
【請求項８】
上記係留ペプチドのＣ末端は、４つ、５つ又は６つの連続したヒスチジンで構成されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項９】
上記係留ペプチドのＣ末端部に位置するヒスチジンのうち２つと上記金属カチオンとの間で生じる金属−キレート相互作用によって上記係留ペプチドとの結合が確保されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項１０】
上記脂質二重層の組成は、生体膜、特に細胞膜を模倣するように選択されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項１１】
上記脂質二重層は流動的且つ連続的であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項１２】
膜タンパク質、好ましくは膜内在性タンパク質が上記脂質二重層に挿入されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項１３】
上記基板は、係留ペプチドと呼ばれるペプチドを介して脂質二重層が固定される領域を複数有しており、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成されるＣ末端を有しており、上記脂質二重層は、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含み、上記キレート化極性頭部は、上記係留ペプチドのＣ末端部に位置するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの金属−キレート相互作用によって上記係留ペプチドとの結合を確保することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の集積体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の集積体を製造する方法であって、
（ａ）基板の表面に係留ペプチドを固定する工程、
（ｂ）金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含むリポソームを上記係留ペプチドに固定する工程であって、Ｃ末端位部のヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの間で生じる金属−キレート相互作用によって固定する工程、及び、
（ｃ）融合剤を添加して、リポソーム融合及び連続した脂質二重層の形成を誘導する工程を順次有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
上記脂質二重層は、平均粒径が３０〜５００ｎｍの単層リポソームを融合して得られることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
上記リポソームはプロテオリポソームであることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
好ましくは配列番号２の融合ペプチドにより融合されることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の集積体を用いて表面プラズモン共鳴イメージングにより検出する方法であって、上記基板は金で作製されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析用基板に固定した脂質膜の技術分野に関する。なかでも、本発明は、脂質二重層を有する基板であって、基板と脂質二重層との結合が特定のペプチドにより形成される基板、該基板の製造方法、該基板のバイオチップとしての使用及び様々な分析方法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質は各生体細胞内で主要な役割を担っている。これらのタンパク質は細胞代謝及び生体信号伝達の要である。重要な機能を有するため、これらのタンパク質は好ましい治療標的である。だが、膜タンパク質が機能するには膜環境が必要なため、その再構成には依然として課題がある。この問題を解決するため、基板に固定した脂質二重層に相当する生物模倣型膜が、基礎研究の様々な分野において生体膜研究の主要モデルとして検討される。現在、膜貫通型タンパク質を含む生物模倣型膜をバイオチップ設計に組み込むことは、医薬品のハイスループットスクリーニングや迅速診断検査の開発にとって依然として重大な課題である。
【０００３】
したがって、膜バイオチップは、特に２つの主要な用途に対して有望な分析可能性を有する。バイオチップの分析領域（「アレイ」ともいう）上に存在する膜に所望の膜タンパク質（特に膜貫通受容体）を再挿入すると、
・再挿入したタンパク質の機能性に対する様々なリガンド（特にアゴニスト／アンタゴニスト）の効果を試験したり；
・チップの膜アレイに様々な受容体を挿入すれば、各受容体に対する治療分子の作用をスクリーニングしたりできる。
【０００４】
膜バイオチップの使用と関連し得るこのような用途及び分析性能にもかかわらず、膜貫通型タンパク質の再構成及び膜バイオチップの開発にとって解決すべき大きな障害は、膜内在性膜貫通型タンパク質をその固有の性質を変化させることなく挿入できる能力を提供する頑強な脂質二重層をインビトロで形成することにある。基板、特に金系基板の表面にインビトロで再構成した脂質二重層のほとんどは基板と直接接触している。すなわち、脂質二重層と基板を隔てているのは、厚さ２〜３ナノメートルの薄い水の層のみである。また、これらのいわゆる担持された脂質二重層は、固体基板上に堆積されるため取り扱いやすいとはしても、固体基板が不充分な間隔ですぐ近くに存在していることから、膜貫通型タンパク質の構造によくみられる嵩高い膜外部ドメインが原因となってこれらのタンパク質の機能的な再構成は妨げられる。また、脂質二重層と基板との間隔が不充分であると、ほとんどの場合、再挿入した膜タンパク質の移動性が失われ、基板と直接相互作用する場合がある。
【０００５】
このような問題を回避するため、従来技術では、脂質膜を基板から分離し、親水性分子スペーサを介して固体基板に固定した脂質二重層で構成される集積体を得ることを目的とする様々な解決手段が提案されてきた。
【０００６】
この目的で、柔軟な親水性分子層を介して脂質二重層を基板と結合させることにより、脂質二重層と基板との分離を確保することが提案されている。また、このような中間層は、基板と膜の間の貯水層としても作用し、再挿入したタンパク質の移動性を高めるのに充分な空間を提供する。
【０００７】
従来技術では、膜を製造するため及びバイオチップ用基板に膜を固定するための様々な方法が提案されている。ポリマー系、チオアルカン系及びタンパク質系のスペーサが検討されている。非特許文献１には、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を使用して脂質二重層と基板との結合を形成することが記載される。この方法では、特定の機能化脂質、すなわち１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリ−（エチレングリコール）−２０００−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナート］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＰＤＰ）にＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を混合して使用する。ピリジルジチオプロピオナート（ＰＤＰ）により、金表面にＳ−Ａｕ結合を形成できる。この文献では、機能化脂質の他にはＰＯＰＣしか使用していない。また、ＤＳＰＥは、得られる脂質膜の流動性に影響を与え得る飽和疎水性鎖を有する。ＰＥＧも膜タンパク質の再挿入に影響を及ぼすように思われる。
【０００８】
提案された手法の中でも、極性ペプチドをスペーサとして使用することが最も有望であり、その場合、膜タンパク質の機能的な再組込みが達成されやすいと考えられている。上記方法は、挿入されるタンパク質と同じ性質の生体適合性媒体を構成するという利点を有し、細胞骨格としての役割を果たすことができる。
【０００９】
これまで使用されてきたペプチド係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）又はスペーサは、典型的には、（１）金等の好適な基板に共有結合できる官能基（チオール官能基、ジスルフィド又はシラン等）、（２）親水性スペーサとしての役割を果たすペプチド部、及び、（３）再構成した脂質膜の近位層を形成して二重層をアンカリングできる疎水性脂質部で構成される。
【００１０】
このような第一の近位膜層は、脂質成分を含むスペーサペプチドの希釈液を基板上で自己組織化して得られる。基板との共有結合によって、近位層、ひいては二重層を安定して係留できる。その後、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ移動によってＬａｎｇｍｕｉｒ単分子膜を堆積するか又はリポソーム融合によって、膜の遠位層が、予め基板上に自己組織化して形成した近位層の疎水性脂質表面に直接形成される。上記リポソーム融合は、特に、プロテオリポソームを直接融合して、固定した浮遊二重層における膜タンパク質の再構成を促進するように選択される。
【００１１】
係留分子として使用するスペーサペプチドは、天然又は合成のチオペプチド又はチオリポペプチドから調製される。非特許文献２又は３では、リポ酸又はＮ末端位のシステインのスルフヒドリル基を介してペプチドを金基板に固定し、その後、そのＣ末端を活性化して、ジミリストイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＭＰＥ）分子に相当するリン脂質を該リン脂質の極性頭部のＮＨ２官能基を介して化学的に結合させる。この目的で、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によってチオペプチドの−ＣＯＯＨ末端基を活性化して、ＤＭＰＥのＮＨ２官能基とエステル共有結合を形成させる。しかしながら、この方法では、二重層の近位層が主にＤＭＰＥ、更にはＤＭＰＥのみで構成される必要がある。したがって、この場合、ＤＭＰＥの脂質組成を変更することはできず、所望の膜タンパク質の再構成時に大きな欠点となり得る。実際、全ての生体膜（形質膜、核膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜等）は、脂質の性質及びその割合の点で異なる組成を有することがよく知られている。また、従来技術の解決手段では、脂質二重層は、コレステロール核、又は、遠位層の形成時にリポソームを貫通する飽和疎水性酸鎖（特に、スペーサペプチドのＣ末端に固定したＤＭＰＥの脂肪族鎖）を介して、疎水的相互作用のみで近位層にアンカリングされる。この種の相互作用によって、脂質二重層の形成時にその局所的な内部崩壊が起こる場合があるため、水性媒体中で膜を取り扱う際に膜構造が部分的に破壊される場合がある。
【００１２】
また従来技術では、まず、一般的にチオリポペプチド、すなわち疎水性脂質ドメインで機能化したペプチドに相当する係留分子の希釈溶液の自己組織化プロセスによって近位層が構築される。その後、リポソーム融合によって又は自己組織化した疎水性単分子膜へのＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ堆積によって膜の遠位層が形成される。この場合、基板に吸着させただけの担持脂質二重層と比較して、疎水性近位層のアンカリングによって、得られる脂質膜の機械的安定性を向上できるとしても、このような２段階形成手順では、平坦且つ連続した二重層の形成が保証されないばかりか、アンカリング法を用いるために存在する疎水性脂質層が近位層組成の選択肢を制限してしまうため、膜の脂質組成の多用途性も保証されない。また、疎水性脂質を含む第一層を得るために使用するペプチドの合成化学は複雑なものとなる場合があり、その近位層でアンカリングされた脂質二重層の動的挙動が改変されてしまう場合がある。このように、二重層の２つの層を２つの異なる工程で形成することは、機能性を保持できるように均一な脂質環境を必要とする膜内在性膜貫通型タンパク質を再構成する上で大きな欠点となる。
【００１３】
したがって、膜貫通型タンパク質の再構成に特化した膜バイオチップの製造及び工業的用途に関する技術的な進歩は、極めて限られたものに留まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｃｏｕｔａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２００７
【非特許文献３】Ｙｉｌｄｉｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明が解決しようとする目的は、広範な種類のタンパク質の挿入に適合した広範な種類の脂質の固定、したがって様々な脂質二重層の係留に適した解決手段を提供して、特にバイオチップの開発に適した新規解決手段を提供することである。
【００１６】
また、本発明は、基板に固定した脂質二重層を形成できる簡便且つ多用途の方法であって、脂質二重層と基板との結合が頑強であり、且つ、固定した脂質二重層の組成を所望通りに変更及び調整して、膜タンパク質、特に膜内在性タンパク質をその固有の性質を変化させずに組み込むことができるように様々な脂質組成物に適したものでなければならない、方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この文脈で、本発明は、係留ペプチドと呼ばれるペプチドを介して少なくとも１つの脂質二重層が固定された基板で構成される集積体であって、上記係留ペプチド自身が上記基板と結合しており、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成されるＣ末端を有しており、上記脂質二重層は、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含むため、上記係留ペプチドのＣ末端を構成するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの金属−キレート相互作用によって上記係留ペプチドとの結合を確保することを特徴とする集積体に関する。
【００１８】
本発明においては、係留ペプチドと脂質二重層との結合を形成するのに使用される結合形態のおかげで、脂質二重層の組成を所望通りに調整できる。この脂質二重層の組成はいずれのタイプの細胞膜に相当するものであってもよいが、ただし、本発明においては、この組成は、近位脂質層（すなわち基板の近くに位置する層）の形成に使用されるであろう疎水性脂質ドメインで機能化したスペーサペプチドによってもはや制約されることはなく、固定されるであろう脂質の性質によって決定される。本発明において、脂質二重層はスペーサとして作用する係留ペプチドに、係留ペプチドのＣ末端を形成するヒスチジンの少なくとも一部のイミダゾール環と金属イオンとの間で生じる金属−キレート相互作用によって固定される。したがって、係留ペプチドのポリヒスチジン末端の一部のイミダゾールは、キレート化頭部を有する脂質に存在するキレート化部のように、存在する金属イオンに対するキレートの役割も果たす。このように形成された結合によって、従来技術の解決手段よりも優れた高い安定性及び高い頑強性を有する取扱い可能な集積体が得られる。
【００１９】
このように、脂質二重層は、基板から距離を保ったまま、係留ペプチドを介して基板に固定されており、係留ペプチドの柔軟性によって浮遊しているとみなすこともできる。
【００２０】
金属カチオンを封入したキレート化脂質としては様々なものが市販されており、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（米国アラバマ州アラバスター）から販売されている製品が挙げられ、本発明において使用してもよい。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（１４：０  ＰＥ−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩又は銅塩、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（１６：０  ＰＥ−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩又は銅塩、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（１８：０  ＰＥ−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩又は銅塩、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ＤＧＳ−ＮＴＡ）のニッケル塩、ＤＴＰＡ−ビス（ステアリルアミド）のガドリニウム塩、ビス（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）−Ｎ−Ｎ’−ジエチレントリアミン五酢酸（ビス（１４：０  ＰＥ）−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩、ビス（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）−Ｎ−Ｎ’−ジエチレントリアミン五酢酸（ビス（１６：０  ＰＥ）−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩並びにビス（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）−Ｎ−Ｎ’−ジエチレントリアミン五酢酸（ビス（１８：０  ＰＥ）−ＤＴＰＡ）のガドリニウム塩が挙げられる。
【００２１】
本発明において、上記金属カチオンは、例えば、ニッケルカチオン（Ｎｉ２＋）、ガドリニウムカチオン（Ｇｄ３＋）又は銅カチオン（Ｃｕ２＋）である。ニッケルカチオンを捕捉するニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基が、ポリヒスチジン末端を介して係留ペプチドを固定するのに最も効果的である。また、上記金属カチオンはニッケルカチオンであり、上記キレート化極性頭部はニトリロ三酢酸であることが好ましい。
【００２２】
一方、上記係留ペプチドのＣ末端は、例えば、４つ、５つ又は６つの連続したヒスチジンで構成される。上記係留ペプチドのＣ末端に位置するヒスチジンの少なくとも一部のイミダゾール基と上記金属カチオンとの間で相互作用が生じることになる。より詳細には、例えばＮｉ−ＮＴＡの場合、以下のスキーム１に示されるように、ヒスチジンの少なくとも一部のイミダゾール基の非共有電子対を有する窒素との金属−キレート型結合が形成される。
【００２３】
スキーム１
【化１】
2017534053.tif 000003
Ｍｅ＝Ｎｉである。
【００２４】
上記係留ペプチドのＣ末端部に位置するヒスチジンのうち２つと上記金属カチオンとの間で生じる金属−キレート型相互作用によって上記係留ペプチドとの結合が確保されることが好ましい。
【００２５】
本発明において、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分は小さく、脂質二重層の特性を何ら変化させることはないため、生体膜、特に細胞膜の組成を可能な限り厳密に模倣できる。上記金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分は、上記脂質二重層を形成する脂質全体の０．５〜５モル％、好ましくは１〜２モル％に相当することが有利である。金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質は、脂質二重層中に分布しており、二重層のアンカリングを確保しつつ層中で良好に分布している。
【００２６】
従来、「脂質二重層」とは、２つの脂質分子層で構成された二重脂質層であって、そのような層状構造となるように大部分がリン脂質で構成される層を意味する。この二重層は薄い極性膜を構成している。リン脂質は、極性頭部と少なくとも２つの脂肪族鎖を含む。上記極性頭部は膜表面を構成し、上記脂肪族鎖は、図１に示す通り、膜の内部を向いている。
【００２７】
「リン脂質」とは、ホスホイノシチドを包含するグリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質を意味する。上記脂質二重層は、少なくとも７０質量％、好ましくは少なくとも８０質量％、より好ましくは少なくとも９０質量％、更には１００質量％のリン脂質で構成されることが好ましい。上記脂質二重層がコレステロール等の他の天然脂質を含んではいけないという理由はない。これらの脂質は、二重層の構造に影響を与えないような量で存在することとなる。
【００２８】
本発明において、上記二重層の脂質組成は、二重層を形成するプロトコルとは独立しているため、所望通りに調整できる。多くの脂質組成物を様々な割合で使用でき、それにより様々なタイプの生体膜の組成をオーダーメードで模倣できる。金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を除き、上記脂質二重層は、例えば、以下に限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、コレステロール及びスフィンゴミエリン等の任意の脂質を単独で又は混合物として使用して構成してもよい。リン脂質（ホスホイノシチド等）、スフィンゴ脂質及びコレステロール等の様々なクラスの膜脂質を含む様々な組成の脂質二重層が得られる。また、上記脂質二重層は、膜脂質の天然抽出物から形成してもよい。挿入したいタンパク質用の人工膜が得られるように脂質二重層の組成を特異的に適合させることができれば、その天然脂質環境を保持することができ、そして確実に再挿入することができる。
【００２９】
上記脂質二重層の組成は、生体膜、特に細胞膜、とりわけ形質膜、核膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜等を模倣するように選択されることが有利である。本発明においては、流動的且つ連続的な脂質二重層を有する集積体を得ることができる。この目的で、上記脂質二重層が、少なくとも８０質量％、好ましくは少なくとも９０質量％、更に好ましくは少なくとも９５質量％の流動性脂質で形成されることが好ましい。脂質の流動性は、室温（特に２２℃）での脂肪族アシル鎖の秩序によって定義される。脂肪族鎖の配置に関して無秩序である場合（すなわち、化学的には「ゴーシュ型」配座）、脂質は流動的であるという。ある脂質の流動性は、主にそのアシル鎖の長さ、その不飽和度及び温度で決まる。例えば、不飽和アシル鎖を有するリン脂質（Ｃ１８：１等）は室温では流動状である。
【００３０】
本発明において提案された結合形態では、脂質組成物をいくらか変化させてもよい。特に、アシル鎖及び鎖長を選択でき、１以上の不飽和結合を有するアシル鎖を選択できる。
【００３１】
脂質二重層の永続的固定及び集積体の頑強性を確保するために、上記係留ペプチドは、好ましくはそのＮ末端で、上記基板に共有結合により固定されることが好ましい。高親和性相互作用、特にビオチン−ストレプトアビジン型のものも検討できる。
【００３２】
基板の性質に応じて、共有結合による様々な固定化手法を実施できる。従来技術で実施される方法を用いてもよい。例えば、ペプチドのアミン官能基（Ｎ末端位に位置するアミノ酸のアミン官能基又はリシンの側鎖のアミン官能基）の反応によって共有結合を形成してもよい。また、システインのチオール官能基との反応によって、又は、ペプチドのＮ末端のジスルフィド若しくはリポ酸の挿入によって、共有結合を形成してもよい。
【００３３】
基板の性質によっては、共有結合を形成するための反応において、基板を事前に機能化しておくことが必要な場合もある。特に基板がガラス、ポリマー、シラン処理ガラスで作製されている場合がこれにあたる。例えば、システインのチオール官能基は、マレイミド等の化学基で機能化した表面と反応できる。一方、アミン官能基は、アルデヒド、活性エステル、エポキシ等の官能基と共有結合を形成できる。このような基は、当業者に周知の方法に従って基板、特にシラン処理スライドガラスに予め導入してもよい。
【００３４】
金基板の場合、化学吸着によってＳ−Ａｕ結合を形成することで、チオール官能基との共有結合を直接形成できる。また、金基板は、散逸モニタリング型水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）及びＳＰＲｉによって分子間相互作用を検出するのに最適な基板である。また、本発明において、上記基板は金で作製されていることが好ましい。この場合、上記係留ペプチドは、そのＮ末端にシステインを含み、上記金基板とＳ−Ａｕ結合を形成することが有利である。
【００３５】
上記ペプチドは、基板へのその接着を防止する親水性構造を有することが好ましい。上記係留ペプチドの立体配座及び構造、その親水性並びに長さは、上記ペプチドを構成するアミノ酸残基の性質及び数によって制御できる。当業者であれば、上記特性を調整して、脂質二重層間を所望の間隔とし、係留ペプチドで構成される中間層の粘度を制御して膜貫通型タンパク質の機能的再挿入に必要な横方向の流動性を付与することができる。上述したＮ末端及びＣ末端のアミノ酸に加え、上記ペプチドは、リシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン及びセリン等の親水性アミノ酸から選択されるアミノ酸で構成されることが有利である。本発明において、例えば、配列番号１：ＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲＨＨＨＨのペプチド、又は、配列番号３：ＣＳＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲＨＨＨＨ若しくは配列番号４：ＣＩＫＲＥＰＦＶＡＰＡＧＬＴＰＮＥＩＤＳＴＷＳＡＬＥＫＡＥＱＥＨＡＥＡＬＲＩＥＬＫＲＱＫＫＩＡＶＬＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲＨＨＨＨのペプチドのいずれかを使用してもよい。配列番号１の係留ペプチドは、金にグラフトするためにＮ末端位にシステインを有し、且つ、金属−キレート型結合によってリポソームを固定するためにＣ末端位にポリヒスチジンタグを有するα−ラミニン（Ｐ１９）由来のペプチド断片に基づいて合成した。
【００３６】
脂質二重層に再挿入される所望のタンパク質が細胞骨格タンパク質と好ましい相互作用を示すことが分かり、そのような相互作用をもたらし得る配列が分かるならば、その配列を係留ペプチドの配列に組み込んで、タンパク質との相互作用を促進し、再挿入後のその立体配座を安定化できることが理想的である。
【００３７】
係留ペプチドの使用量は、充分に固定できるように選択する。例えば、金基板の場合、配列番号１の係留ペプチドは２．８×１０１３分子／ｃｍ２という密度で存在し、これは金基板の表面の飽和状態に相当する。上記ペプチドは基板表面に均一に分配、固定される。
【００３８】
当業者であれば、特に再挿入されるタンパク質の外部ドメインの大きさに応じて、選択したペプチド長を適合できるであろう。基板が金で作製されている場合、その後の分析で使用するＳＰＲｉ装置の感度を考慮して、相互作用が基板表面から離れすぎている場合にシグナルを失わないようにすることも必要である。
【００３９】
一般的に、従来の文献で使用されたペプチドにより形成される間隔は２ｎｍである。広範な種類の膜タンパク質を再構成するために理想的な間隔は６ｎｍである（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｓ．Ｍ．，Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｆｒｉｅｂｉｓ  Ａ．，Ｇｏｔｚ  Ｈ．，Ｈａｗｋｅｒ  Ｃ．Ｊ．，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｗ．，Ｎａｕｍａｎｎ  Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｌｌ  Ｗ．，Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｐｏｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９，４８（３７）：６８９６）。また本発明において、上記ペプチドは、基板と脂質二重層との間隔が好ましくは１〜１０ｎｍ、より好ましくは２〜７ｎｍ、特に約６ｎｍとなるように選択する。
【００４０】
本発明において、上記集積体は、脂質二重層に挿入される膜タンパク質、好ましくは膜内在性タンパク質を含んでいてもよい。タンパク質が細胞膜の脂質二重層と少なくとも１回完全に交差する場合、そのタンパク質は内在性であると言える。以下で説明する通り、膜タンパク質は、脂質二重層の形成後に導入してもよいし、その形成中に直接導入してもよい。
【００４１】
本発明によれば、上記集積体はバイオチップを形成するために使用してもよい。特に、脂質膜を模倣する脂質二重層において膜タンパク質を発現させることができ、これを無細胞的に実施できる。挿入される所望の膜タンパク質の性質に応じて、上記基板は、特に新規アゴニスト若しくはアンタゴニストを試験若しくはスクリーニングするため又は膜に対する新規治療薬を試験するための分析ツールとして使用できる。金基板を使用すると、特に表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）による測定を実施でき、この場合、試験する分子実体を事前に標識する必要はない。
【００４２】
バイオチップとして使用できるように、本発明に係る集積体は、係留ペプチドと呼ばれるペプチドを介して脂質二重層が固定される領域を複数有する基板を含むこととなる。ここで、上記係留ペプチド自身が上記基板と結合しており、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成されるＣ末端を有しており、上記脂質二重層は、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含み、上記キレート化極性頭部は、上記係留ペプチドのＣ末端部に位置するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの金属−キレート型相互作用によって上記係留ペプチドとの結合を確保する。
【００４３】
この場合、上記集積体はバイオチップに相当する。少なくとも２つ、更にそれ以上の領域（異なる分析領域又はスポットに相当）が異なる脂質二重層を有することによって、異なる分析を同時に実施できることが好ましい。係留ペプチド、二重層膜及び基板／係留ペプチド／脂質二重層集積体の製造方法の定義に関して本発明において述べた各種特徴は、上記領域のそれぞれに適用される。
【００４４】
本発明はまた、本発明に係る集積体を用いて表面プラズモン共鳴イメージングにより検出する方法であって、上記基板は金で作製されている、方法も目的とする。
【００４５】
本発明はまた、本発明に係る集積体を製造する方法であって、
（ａ）基板の表面に係留ペプチドを固定する工程、
（ｂ）金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含むリポソームを上記係留ペプチドに固定する工程であって、Ｃ末端部に位置するヒスチジンの少なくとも一部と上記金属カチオンとの間で生じる金属−キレート相互作用によって固定する工程、及び、
（ｃ）融合剤を添加して、リポソーム融合及び連続した脂質二重層の形成を誘導する工程を順次有する方法に関する。
【００４６】
本発明において、脂質二重層を基板に固定する形態は、二重脂質膜の様々な組成と適合するものであり、したがって、再挿入される膜貫通型タンパク質に応じて該組成を調整できる。
【００４７】
２つの異なる工程で脂質二重層の２層が独立して形成される従来技術に記載のプロトコルとは異なり、本発明に係る方法では２層は同時に形成される。本発明においては、二重層の２層が単一の工程で形成されるため、本方法は簡便である。二重層がその近位層でアンカリングされておらず、リポソームの組成に含まれるキレート化頭部を有する脂質の数パーセント（特に０．５〜５モル％、好ましくは１〜２モル％）のみによって係留ペプチドに固定されるため、得られる脂質二重層は動的挙動及び流動性を保持する。それゆえに、対応する脂質二重層を使用して、タンパク質を得られた平坦且つ連続した脂質二重層の存在下インビトロで無細胞的に発現させることによって、膜タンパク質を容易に再挿入できる。
【００４８】
ヒスチジンと金属−キレート型結合を形成する金属カチオンを封入したキレート化頭部を有する脂質を用いる本発明で使用される結合形態の別の利点は、この相互作用が可逆的であることである。実際、脂質二重層を除去して表面を再生し、基板を再利用できる。すなわち、タンパク質を挿入して使用した後、脂質二重層を除去して、係留ペプチドで機能化した中間基板のみを保持することができる。したがって、このような中間基板も本発明の一部である。工業的用途の場合、このように再生することで、最終的にはバイオチップ生産及び大規模試料分析のコストがかなり削減される。
【００４９】
したがって、本発明はまた、係留ペプチドと呼ばれるペプチドが、好ましくはＮ末端で、固定された中間基板であって、上記係留ペプチドは、少なくとも４つの連続したヒスチジンで構成される遊離Ｃ末端を有することを特徴とする中間基板を目的とする。本発明において記載される基板及びペプチドの特性は、この中間基板に適用される。
【００５０】
本発明において、上記脂質二重層は、ほとんどの場合、平均粒径が３０〜５００ｎｍの単層リポソームを融合して得られる。リポソームの平均粒径は、準弾性光散乱法（動的光散乱法（ＤＬＳ）ともいう）で測定されるリポソーム群の数平均粒径で定義できる。
【００５１】
「単層リポソーム」とは、単一の脂質二重層のみで構成されるリポソームを意味する。
【００５２】
このようなリポソーム融合技術によって、一体的であり、均一であり、平坦であり且つ連続した層を作製できる。リポソームは、係留ペプチドへの固定時に崩壊することはなく、無傷のままである。その後、融合ペプチドの作用でリポソームが破裂し、二重層が形成される。リポソームの開裂及び二重層の形成は、「リポソーム融合」という用語で知られる。
【００５３】
融合は、融合ペプチド、好ましくは配列番号２：ＳＧＳＷＬＲＤＶＷＤＷＩＣＴＶＬＴＤＦＫＴＷＬＱＳＫＬＤＹＫＤの融合ペプチドにより達成されることが好ましい。このペプチドは、複製時にウイルスの膜結合で必要となるＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＮＳ５Ａ）の両親媒性アルファヘリックス（ＡＨ）のＮ末端配列の３１個のアミノ酸に相当する。
【００５４】
このような融合ペプチドは、特にＣｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７，２００９及び２０１２、Ｃｏｕｔａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４及び米国特許第８，２１１，７１２号明細書に記載されており、様々な組成のリポソームを融合するために使用される。このペプチドは除去されるため、最終的な集積体では存在しない（Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。また、Ｃｏｕｔａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．の文献から、このような融合ペプチドの使用は膜タンパク質の再挿入に適合していることが示された。
【００５５】
ウイルスカプシドタンパク質（ヘマグルチニン（ＨＡ２）、ｇｐ４１（ＨＩＶ）、ｇｐ３０、ｇｐ３２、Ｐ１５Ｅ（マウス白血病ウイルス）等）に由来するペプチドといった他の融合ペプチドも検討できる。このようなペプチドの詳細については、Ａ．Ｌｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７を参照できる。
【００５６】
本発明において、上記リポソームはプロテオリポソームであってもよい。この場合、タンパク質が直接プロテオリポソームに含まれることになるため、所望のタンパク質は脂質二重層が形成されるのと同時に挿入される。
【００５７】
単層リポソームの作製は文献に記載されており、特にＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００７を参照できる。この目的で、まず、有機溶媒中で脂質混合物を形成し、その有機溶媒を、特にアルゴン雰囲気下、蒸発させることによって、選択した脂質組成物で形成された膜をガラス試験管又はフラスコの壁上に形成する。次に、この膜をバッファ溶液、特にｐＨ６〜８、理想的には７．４に緩衝化したバッファ溶液で再水和する。これら最初の２工程は、例えば１０〜３５℃、典型的には室温（特に２２℃）で実施する。例えば、ＨＥＰＥＳ又はＰＢＳバッファを使用できる。その後、多重膜ベシクルが得られたら、凍結（例えば液体窒素中）及び３０〜４０℃での解凍からなるサイクルを繰り返して変換させ、最後に押出し工程を実施して、得られる単層リポソームの大きさを調整する。
【００５８】
ほとんどの場合、１０〜３５℃の温度、典型的には室温（特に２２℃）で大気圧（特に１０１３ｈＰａ）下、
（ａ）基板の表面に係留ペプチドを固定する工程、
（ｂ）Ｃ末端位に位置するヒスチジンの少なくとも一部と金属カチオンとの間で生じる金属−キレート相互作用によって、金属カチオンを封入したキレート化極性頭部を有する脂質部分を含むリポソームを上記係留ペプチドに固定する工程、及び、
（ｃ）融合剤を添加して、リポソーム融合及び連続した脂質二重層の形成を誘導する工程を実施する。
【００５９】
通常、基板を容器内に配置し、各工程（ａ）〜（ｃ）の間にバッファ溶液（特にｐＨ６〜８、理想的には７．４に緩衝化したもの）による洗浄工程を実施しつつ、各種試薬を順次注入することにより、全ての未結合分子を除去できる。
【００６０】
工程（ａ）では、基板を係留ペプチドの水性バッファ溶液（典型的には係留ペプチドの濃度が１０ｎＭ〜１０μＭ、特に２５ｎＭ〜４μＭのもの）と接触させる。その後、リポソームを水性バッファ溶液（それらを形成するのに使用するバッファ）の懸濁液として、典型的には基板と接触している反応混合物中の濃度が５０〜２００μｇ／ｍＬとなるように、添加する。次に、融合剤を、典型的には基板と接触している反応混合物中の濃度が１０〜２０μＭとなるように、添加する。各工程（ａ）〜（ｃ）では、上述した単層リポソームの調製と同種のバッファを試薬供給溶液中で使用できる。
【００６１】
二重層を形成した後、反応媒体にカルシウムイオン等の２価カチオン（Ｃａ２＋等）又はＥＤＴＡ等のキレート化剤を例えば０．５〜５ｍＭの濃度で添加してもよく、その場合、係留ペプチドに固定した後に集積体の妨害、すなわち二重層の脱離は見られない。
【００６２】
以上より、本発明は、以下の様々な利点を組み合わせたものである。
・第一に、基板に共有結合によりグラフトされた係留ペプチドへの可逆的結合によって基板に固定された脂質二重層の機械的安定性及び頑強性。
・脂質二重層の組成を所望通りに調整して、挿入しなければならない所望の膜タンパク質に適合できるものとすることが可能。
・様々な領域を形成して、異なる脂質二重層を有する各領域からなる微細ネットワークを得ることができ、したがって関連する膜を有するバイオチップを開発することが可能。
・金基板の場合、表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）法によって多重検出を標識せずにリアルタイムで実施することが可能。
【００６３】
したがって、本発明によれば、リガンド−膜タンパク質相互作用を試験するための多用途ハイスループット分析ツールを開発できる。
【００６４】
添付の図面を参照して、以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに何ら限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明に係る集積体の模式図である。
【図２】脂質組成物がモル比７４：２４：２のＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物である場合の表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）でモニタリングした時間に対する反射率（％）を表す。
【図３】原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）（上部の画像Ａ、Ｂ及びＣ）及び光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）（下部の画像Ｄ、Ｆ、Ｅ及びＧ）による浮遊脂質二重層形成プロセスの特徴付けを表す。上部は、係留ペプチドをグラフトした後（Ａ）、ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ）を含むリポソームを添加した後（Ｂ）及び融合ペプチドを添加した後（Ｃ）の金表面のＡＦＭ画像である。下部は、非融合リポソームで被覆した表面領域の光退色から０分後（Ｄ）及び１時間後（Ｅ）の蛍光回復、並びに、融合剤を添加して脂質二重層を形成した後の表面領域の光退色から０分後（Ｆ）及び８分後（Ｇ）の蛍光回復を表す。
【図４Ａ】最終濃度３０ｎＭのヌクレオシド二リン酸キナーゼＢアイソフォーム（ＮＤＰＫ−Ｂ）の相互作用後に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下又は非存在下、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳ（３：１）で構成された脂質二重層の形成をＳＰＲｉでモニタリングした際の時間に対する反射率（％）を表す。
【図４Ｂ】１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下又は非存在下、最終濃度３０ｎＭのＮＤＰＫ−Ｂの金表面への吸着をＳＰＲｉでモニタリングした際の時間に対する反射率（％）を表す。
【図５Ａ】バイオチップ形式である場合に、係留ペプチドマトリクスを堆積した後（左画像）、５％の蛍光プローブＮＢＤ−ＰＥを組み込んだリポソームでインキュベートした後（中央画像）及びリポソーム融合した後（右画像）の金プリズムの蛍光顕微鏡画像を表す。
【図５Ｂ】バイオチップ形式である場合に、各係留ペプチド堆積領域についてＳＰＲｉでモニタリングした脂質二重層形成プロセス中の反射率（％）の変化を表す。ベースラインは、係留ペプチドを堆積した後、リポソームの注入までに記録されたシグナルに相当する。全ての堆積領域を代表するプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６６】
材料及び試薬
・脂質として、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｒ）社のものを使用した。
・ＳＰＲｉ装置（ＳＰＲｉ−Ｌａｂ＋）及び金基板に相当するプリズム（ＳＰＲｉ−ＢｉｏｃｈｉｐＴＭ）は、Ｈｏｒｉｂａ（Ｃ）社から販売されるものを使用した。
・ＨＥＰＥＳバッファ及びクロロホルムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｒ）社のものを使用した。ＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌバッファは、ＨＥＰＥＳ（１０〜２０ｍＭ）及びＮａＣｌ（０〜１５０ｍＭ）で構成されており、ｐＨ７．４に調整される。ＰＢＳバッファは、リン酸塩（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）及びＫＣｌ（２．７ｍＭ）で構成されており、ｐＨ７．４に調整される。
・リポソームの調製に使用したＭｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ及びシリンジ、ポリカーボネート膜並びにプレフィルタは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｒ）社のものである。
・準弾性光散乱（動的光散乱（ＤＬＳ））粒度分析器は、Ｍａｌｖｅｒｎ（Ｃ）社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓである。
【００６７】
略号
ＰＯＰＣ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＯＰＣ：１，２−ジオレオイル−グリセロ−３−ホスホコリン
ＮＢＤ−ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−（４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）
ＰＳ：ホスファチジルセリン
ＰＩＰ２：ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸
ＤＯＧＳ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］
ＮＴＡ：ニトリロ三酢酸
ＰＯＰＥ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
【００６８】
１．リポソームの形成
まず、選択した組成に応じてクロロホルム又はクロロホルム／メタノール混合物（体積比＝９：１）中で調製した脂質混合物を堆積させておき、その有機溶媒をアルゴン雰囲気下で蒸発させることによって、ガラス試験管の壁上に脂質膜を形成する。蒸発後の脂質の総量は１ｍｇである。
【００６９】
複数の脂質組成物を試験した。
・ＰＯＰＣ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝９８：２
・ＤＯＰＣ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝９８：２
・ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ−ビオチン及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝８８：１０：２
・ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝７４：２４：２
・ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＮＢＤ−ＰＥ（蛍光脂質）及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝７０：２３：５：２
・卵黄から抽出したＰＣ、脳から抽出したＰＳ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝６７：３１：２
・卵黄から抽出したＰＣ、脳から抽出したＰＳ、脳から抽出したＰＩＰ２及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝６７：３９：２：２
・真核細胞の形質膜の外葉の組成を模倣する５種類の脂質成分ＰＯＰＣ、スフィンゴミエリン、コレステロール、ＰＯＰＥ及びＤＯＧＳ−ＮＴＡ−（Ｎｉ）の混合物、モル比＝３７：３３：１９：９：２
【００７０】
まず、有機溶媒中で脂質混合物を形成し、その有機溶媒をアルゴン雰囲気下で蒸発させることによって、ガラス試験管の壁上に脂質膜を形成する。次いで、得られた脂質膜をＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌバッファ（ｐＨ＝７．４）又はＰＢＳバッファで水和して、脂質濃度を１ｍｇ／ｍＬとする。この工程により、二重層フラグメントが分離して、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を形成する。その後、液体窒素中での凍結及び３８℃温水浴中での解凍からなるサイクルを繰り返して（凍結６×５分、解凍６×１０分）このＭＬＶを変換させた後、押出し工程を実施する（４００ｎｍ膜を２１パス、次いで１００ｎｍ以下の膜を２１パス）。この押出し工程により、所望の大きさの大型単層ベシクル（ＬＵＶ）が作製される（Ｄｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｌ．Ｊ．Ｂｌｕｍ，Ｊ．Ｊ．Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｔ．Ｂｏｃｋｉｎｇ，Ａ．Ｉ．Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ａ．Ｐ．Ｇｉｒａｒｄ−Ｅｇｒｏｔ，ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ（２００７），Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｐ．２５−３７，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｐ．７７−７９）。
【００７１】
リポソームの大きさは、準弾性光散乱（動的光散乱（ＤＬＳ）ともいう）で制御される。
【００７２】
２．脂質二重層の形成
二重層を形成するために、まず、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した１０〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）で緩衝化した水溶液中のペプチド（初期濃度：９．７４×１０−４Ｍ（又は２．５ｍｇ／ｍＬ））を反応容器に注入して、配列番号１：ＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲＨＨＨＨの容器内の最終濃度を２５ｎＭ〜４μＭとする。配列番号１は、二重層と基板表面との結合部として作用し、そのチオール結合（Ｎ末端システイン）を介して金に固定されることになる。係留ペプチドの４μＭという濃度は、グラフトした係留ペプチドで表面が飽和される最小濃度に相当する。次いで、初期脂質濃度が１ｍｇ／ｍＬのリポソームを最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように反応容器へ注入し、ペプチド上にグラフトさせる。その後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した１０〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ＝７．４）中に溶解した配列番号２：ＳＧＳＷＬＲＤＶＷＤＷＩＣＴＶＬＴＤＦＫＴＷＬＱＳＫＬＤＹＫＤの融合ペプチドを最終濃度が１０〜２０μＭとなるように注入する。これがリポソームと相互作用し、ＬＵＶが平坦な二重層へ移行する。各堆積間に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した１０〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳワーキングバッファ（ｐＨ７．４）を使用した洗浄を行う（反応容器の容量の１０倍量）。これにより、特異的に結合していない分子を全て除去できる。
【００７３】
試験は、最終濃度が２５ｎＭ及び４μＭの係留ペプチドを用いて実施した。係留ペプチドの金表面への吸着は、表面プラズモン共鳴でモニタリングした。ＳＰＲｉ装置（ＳＰＲｉ−Ｌａｂ＋）及びプリズム（ＳＰＲｉ−ＢｉｏｃｈｉｐＴＭ）は、Ｈｏｒｉｂａ（Ｃ）社から販売されるものを使用した。最終濃度が４μＭの係留ペプチドを含む溶液とともに金表面をインキュベートすると、図２に示す通り、反射率のシグナルが０％から５％へ変化した。これはペプチドが金上に吸着したことをはっきり示している。この反射率の変化は、係留ペプチドによって表面が飽和した際に得られる最大の変化である。これは強く洗浄した後でも変わらない。
【００７４】
反射率（％）の変化値を分析すると、表面にグラフトした分子の密度を測定できる。密度は、使用した装置（ＳＰＲｉ−Ｌａｂ＋）の下記校正式を用いて見積もることができる。
【００７５】
【数１】
2017534053.tif 000004
【００７６】
式中、ΔＲは反射率の変化率（％）であり、ＬＺＣはプラズモン波の貫通深さ（１．０２×１０−４ｍｍ）であり、δｎ／δＣ比は１．９×１０−１０ｍｍ３・ｐｇ−１に設定し、ＳＰ，Ｒは屈折率単位当たりのＳＰＲ感度（％）（２．２５×１０３％・ＲＩＵ−１）であり、Γは密度（ｐｍｏｌ・ｍｍ−２）に相当する。
【００７７】
反応容器内の最終濃度が４μＭの係留ペプチドで得られた最大変化率５％（飽和シグナルに相当）について決定された係留ペプチド分子の密度は、２．８×１０１３分子／ｃｍ２である。２５ｎＭの場合、係留ペプチドの密度は２×１０１２分子／ｃｍ２であり、基板上で均一に分布しているならば、各係留分子の間隔は理論的には５．８ｎｍとなる。
【００７８】
ＮＴＡ（Ｎｉ）キレート化頭部（１８：１ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ）（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］））を有する脂質を１〜２％含むリポソームを用いて、脂質二重層を形成した。手順は、様々な脂質組成（９８％ＤＯＰＣ、９８％ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳ、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＳ（様々な比率）、ＰＣ及びＰＳの天然抽出物（様々な比率）を含む）を有する３０〜１００ｎｍの大きさのリポソームを使用して、ＰＩＰ２及び／又はコレステロールの非存在下又は存在下で試験した。キレート化脂質ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ）を含む各種脂質組成物の最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにリポソームを添加すると、図２に示す通り、反射率が大きく上昇する。これは、ＳＰＲプリズム表面の光学特性が変化したことを表す。この反射率値は洗滌後も変化しない。このように、Ｎｉ−ＮＴＡキレート化頭部は、ペプチドのポリヒスチジンタグと特異的に相互作用して、リポソームを固定できる。
【００７９】
配列番号２の融合ペプチドを添加すると、図２に示す通り、まず、反射率がわずかに上昇するが、これは、それがリポソームへ挿入されたことを表す。次に、その後シグナルが低下するが、これは、係留ペプチドを添加せずに金表面へ直接堆積させたリポソームの場合、リポソームの破裂及びプリズム表面での均一な脂質二重層の形成として解釈されてきた（Ｃｈａｈ  ａｎｄ  Ｚａｒｅ  ２００８）。図２に示すこのように特徴的なプロファイルは、上掲した全ての脂質組成物で得られた。
【００８０】
３．係留ペプチドに固定した脂質二重層の特徴付け
金表面に結合した係留ペプチドに固定した脂質二重層の形成工程について、原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）（ＮＴ−ＭＤＴ（Ｒ）社製ＳＯＬＶＥＲ−ＰＲＯ（Ｃ）（最大掃引：５０×５０×２．５μＭ±１０％、ＮＴ−ＭＤＴ（Ｒ）社製ＣＳＧ０１（剛性：０．０３ｍＮ・ｍ−１）をＡＦＭ探針として使用））及び光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）（Ｚｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１）により特徴付けを実施した。図３は、ＰＯＰＣ：ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ）（モル比＝９８：２）で形成された二重層の場合に得られた画像を示す。この例は、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．が用いた融合ペプチドが、膜を係留分子上に形成する場合（「本試験」）にも、基板上に直接形成する場合（「Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．による係留分子を用いない試験」）と同じくらい効果的であることを示すために選択した。
【００８１】
係留ペプチドと共にインキュベートする前後の表面のＡＦＭ画像（図３Ａ）は、市販の金プリズムに典型的にみられる擦り傷のある粗い表面を示す。係留ペプチドを有するプリズムを単層リポソーム懸濁液と共にインキュベートすると、ベシクルで被覆された表面が観察される（図３Ｂ）。これは、リポソームが表面に吸着したことを表す。融合ペプチドを注入すると、表面は均一に見える（図３Ｃ）。これにより、ベシクルが表面と融合し、脂質の連続層で金表面が被覆されたことが確認できる。
【００８２】
形成された脂質二重層の均一性及び流動性は、蛍光顕微鏡観察及び光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）で確認した。本例では、蛍光脂質（５モル％ＮＢＤ−ＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）のアンモニウム塩）を含むリポソームを使用した。このリポソームは、上述の通り、５モル％ＮＢＤ−ＰＥを添加して調製する。融合ペプチドを添加する前後で、表面の一部に、顕微鏡の対物レンズで集中させた強力な光線を照射した。この領域に存在するフルオロフォアは、光退色といわれる一種の破壊を受ける（図３Ｄ及び３Ｆ）。膜層内のフルオロフォアの動きが抑制されず、脂質二重層が流動的且つ連続的であれば、近傍領域に位置する蛍光分子が時間の経過とともに自由に拡散し、光退色した領域は次第に蛍光状態に戻る。融合ペプチドの添加前にＦＲＡＰ測定すると、光退色した領域は蛍光状態には戻らない（図３Ｅ）。フルオロフォアは表面上で拡散できないが、これは、表面に固定されているが融合はしていないベシクル群によりもたらされる非連続性を表す。融合剤の添加後に測定すると、光退色した領域がなくなるまで、退色領域と隣接する媒体との間で２つの群の再分布が起こる（図３Ｇ）。したがって、蛍光分子は表面上で自由に拡散し、連続的且つ均一な二重層が形成されたことが確認できる。
【００８３】
蛍光回復の動態を分析すると、脂質二重層の流動性を表す横拡散係数「Ｄ」を推定できる。測定値は２５×１０−８ｃｍ２／ｓであったが、これは、タンパク質／リガンド系を介して固定させた場合（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）と比較して、脂質二重層がより流動的であることに相当する。
【００８４】
一方、金表面に形成された脂質二重層の完全性は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼＢアイソフォーム（ＮＤＰＫ−Ｂ）を用いて確認した。このタンパク質はＰＳ分子と特異的に相互作用し、この相互作用は１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で阻害される（Ｆｒａｎｃｏｉｓ-Ｍｏｕｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比＝３：１）で構成された係留ペプチド上の二重層を形成した後にＮａＣｌの非存在下でＮＤＰＫ−Ｂを添加すると、ＳＰＲｉにより記録される反射率が上昇する。これは、上記タンパク質と二重層との特異的な相互作用を表す。１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下では上昇は見られない（図４Ａ）。なお、このタンパク質は１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でも非存在下でも金表面に吸着されることが確認された（図４Ｂ）。係留ペプチド上に浮遊する脂質二重層で表面が被覆される場合に１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で吸着が起こらないということは、金表面が完全に被覆されており、脂質二重層が一体的且つ連続的であることを意味する。このような連続性によって、上記タンパク質と金そのものとの非特異的な相互作用が防止される。
【００８５】
４．バイオチップ形式の二重層の構築
固体基板上に脂質膜を作製する際の大きな課題は、ハイスループット測定の実施可能性である。試料の脱水を伴う従来の自動化堆積法は、脂質ベシクルの堆積には適用できない。
【００８６】
上述のプロトコルに従い、圧電スポッター装置（ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ  Ｓ３、ＳＣＩＥＮＩＯＮ社（ドイツ））を用いて、本発明に係る方法の工程（ａ）〜（ｃ）の堆積を金プリズムに対して実施した。まず、係留ペプチド（０．０４〜４ｎｇ／スポット（２．５×１０１２〜２．５×１０１４分子／ｃｍ２））を堆積した。係留ペプチドで被覆した表面へのリポソーム（ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳ（モル比３：１）で構成し、５％ＮＢＤ−ＰＥ及び２％ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ）を組み込んだもの）の固定をＳＰＲｉ及び蛍光顕微鏡観察によりモニタリングした（図５Ａ及び５Ｂ）。リポソームが堆積すると、ペプチドが堆積した領域は蛍光するので、アドレス指定して堆積した係留ペプチドにリポソームが固定されたことを確認できる（図５中央画像）。この工程では、係留ペプチドの堆積毎に反射率が上昇する（図５Ｂ）。融合剤の添加後も蛍光が続くが（図５右画像）、ＳＰＲｉにより記録される反射率が低下すれば（図５Ｂ）、マイクロアドレス指定して堆積した係留スペーサペプチドの各領域上に浮遊する二重層が形成されたことを確認できる。
【００８７】
引例
Ｃｈａｈ，Ｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｎ．Ｚａｒｅ（２００８），“Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｔｔａｃｋ”，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，１０（２２）：３２０３−３２０８
Ｃｈｏ，Ｎ．−Ｊ．，Ｓ．−Ｊ．Ｃｈｏ，Ｋ．Ｈ．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｇｌｅｎｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｆｒａｎｋ（２００７），“Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａｎ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｒｅａｔｅ  ａ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒ  ｏｎ  Ａｕ  ａｎｄ  ＴｉＯ２”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２９（３３）：１００５０−１００５１
Ｃｈｏ，Ｎ．−Ｊ．，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｅｄｖａｒｄｓｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．Ｇｌｅｎｎ，Ｆ．Ｈｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｆｒａｎｋ（２００９），“Ａｌｐｈａ−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｒｕｐｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ａｓ  Ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ｂｙ  Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ−Ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｙ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８１（１２）：４７５２−４７６１
Ｃｈｏ，Ｎ．−Ｊ．，Ｃ．Ｗ．Ｆｒａｎｋ，Ｂ．Ｋａｓｅｍｏ  ａｎｄ  Ｆ．Ｈｏｏｋ（２０１０），“Ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５：１０９６−１１０６
Ｃｏｕｔａｂｌｅ，Ａ．，Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｊ．Ｃｈａｌｍｅａｕ，Ｊ．−Ｍ．Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｃ．Ｖｉｅｕ，Ｖ．Ｎｏｉｒｅａｕｘ，Ｅ．Ｔｒｅｖｉｓｉｏｌ（２０１４），“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｈｅｒｅｄ−ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｇｏｌｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，３０（１１）：３１３２−３１４１
Ｄｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｌ．Ｊ．Ｂｌｕｍ，Ｊ．Ｊ．Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｔ．Ｂｏｃｋｉｎｇ，Ａ．Ｉ．Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ａ．Ｐ．Ｇｉｒａｒｄ−Ｅｇｒｏｔ，ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ（２００７），Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｐ．２５−３７，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｐ．７７−７９
Ｆｒａｎｃｏｉｓ−Ｍｏｕｔａｌ，Ｌ．，Ｍａｒｃｉｌｌａｔ  Ｏ．ａｎｄ  Ｇｒａｎｊｏｎ  Ｔ．（２０１４），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１０５：１１０−１１８
Ｈａｒｄｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｒ．Ｎａｙａｋ，Ｓ．Ｍｕｎｉｒ  Ａｌａｍ，Ｊ．Ｇ．Ｓｈａｐｔｅｒ，Ｆ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｕｓｃｈｅｒ（２０１２），“Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：１９５０６−１９５１３
Ｌｏｒｉｎ  Ａ．，Ｂ．Ｃｈａｒｌｏｔｅａｕｘ，Ｌ．Ｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂｒａｓｓｅｕｒ（２００７），“Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｅｓ  ｄｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｖｉｒａｌｅｓ  ｄｅ  ｃｌａｓｓｅ  ｉ  ｄａｎｓ  ｌａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎａｉｒｅ”，ＢＡＳＥ，ｖｏｌ．１１，ｎｏ．４，（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｐｕｐｓ．ｕｌｇ．ａｃ．ｂｅ／１７８０−４５０７／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１７４０）
Ｒｏｂｅｌｅｋ，Ｒ．，Ｅ．Ｓ．Ｌｅｍｋｅｒ，Ｂ．Ｗｉｌｔｓｃｈｉ，Ｖ．Ｋｉｒｓｔｅ，Ｒ．Ｎａｕｍａｎｎ，Ｄ．Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ  ａｎｄ  Ｅ．−Ｋ．Ｓｉｎｎｅｒ（２００７），“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＧＰＣＲ  ｉｎｔｏ  ａ  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ”，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，４６（４）：６０５−６０８
Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．，Ｓ．Ｄｏｕｍｉａｔｉ，Ｃ．Ｌａｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｄａｖｉ，Ｆ．Ｍｅｄｄａｒ，Ｄ．Ｌａｄａｎｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｈｏｐｉｎｅａｕ（２０１１），“Ａ  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｏｎ  Ｔｏｐ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｔｏ  Ｍｉｍｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，６（４）
Ｙｌｄｉｚ，Ａ．Ａ．，Ｕ．Ｈ．Ｙｉｌｄｉｚ，Ｂ．Ｌｉｅｄｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｅ．Ｋ．Ｓｉｎｎｅｒ（２０１３），“Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ：Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ−Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１０３：５１０−５１６
Ｃｈｏ  Ｎ．−Ｊ．，Ｃｈｅｏｎｇ  Ｋ．Ｈ．，Ｇｌｅｎ  Ｊ．Ｓ．，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｗ．，米国特許第８，２１１，７１２号明細書（Ｂ２），“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ”
【図１】
2017534053.tif 000005
【図２】
2017534053.tif 000006
【図３】
2017534053.tif 000007
【図４Ａ】
2017534053.tif 000008
【図４Ｂ】
2017534053.tif 000009
【図５Ａ】
2017534053.tif 000010
【図５Ｂ】
2017534053.tif 000011
【配列表】
2017534053000001.app
【国際調査報告】
2017534053.tif 000012
2017534053.tif 000013
2017534053.tif 000014
2017534053.tif 000015
2017534053.tif 000016
2017534053.tif 000017
2017534053.tif 000018
2017534053.tif 000019