(57)【要約】本発明は、酵素および特別に設計されたヌクレオチド類似体を使用して、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡならびにＲＮＡを合成する改善された方法を提供する。本発明の方法を使用して、ポリヌクレオチドの特異的配列を、水性環境において核酸鋳型を使用せずに１塩基毎にｄｅ  ｎｏｖｏで合成することができる。ヌクレオチド類似体は、非修飾の３’ＯＨを有するので、すなわち「天然の」デオキシリボースおよびリボース分子で見つかるので、類似体により生体系への組み込みに適している天然のポリヌクレオチドを得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、前記方法は、
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下、核酸鋳型の非存在下で、固体支持体に付着しているオリゴヌクレオチドをヌクレオチド類似体に曝露し、その結果前記ヌクレオチド類似体が前記オリゴヌクレオチドに組み込まれるステップを含み、
前記ヌクレオチド類似体は、阻害剤が切断可能なリンカーの切断によって除去されるまで前記阻害剤へ前記切断可能なリンカーによって結合されるヌクレオチドを含み、前記阻害剤は前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼが前記オリゴヌクレオチドへのヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチド類似体の組み込みを触媒することを立体配置的に防止する、方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチド類似体が、以下の構造
【化４】
2017525391.tif 000012
【化５】
2017525391.tif 000013
【化６】
2017525391.tif 000014
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド類似体が、以下の構造
【化７】
2017525391.tif 000015
【化８】
2017525391.tif 000016
【化９】
2017525391.tif 000017
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、以下の構造
【化１０】
2017525391.tif 000018
（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が、ポリペプトイドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害剤が、ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、直径５０Å超の巨大分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体に付着している前記核酸が、ｐＨ約６．５〜８．５を有する水溶液の存在下で前記ヌクレオチド類似体に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体に付着している前記核酸が、約３５〜３９℃の温度で水溶液の存在下で前記ヌクレオチド類似体に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体支持体が、ビーズ、ウェルまたはＰＥＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が、一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断可能なリンカーが、前記ヌクレオチド類似体から切断されるときに環状の副産物を形成する部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
天然のヌクレオチドを産生するために前記切断可能なリンカーを切断するステップと；
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下、核酸鋳型の非存在下で、前記天然のヌクレオチドを第２のヌクレオチド類似体に曝露するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ酵素に曝露するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド類似体および前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を含む水溶液を提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤が、荷電部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド類似体が、リボース糖またはデオキシリボース糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ヌクレオチド基質が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、配列番号１、配列番号３、または配列番号５と少なくとも約９０％同一のタンパク質配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、配列番号２、配列番号４、または配列番号６と少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を有する生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオチド類似体が、液滴で送達される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１０月１７日に提出された米国仮特許出願６２／０６９，０６７号および２０１４年８月１８日に提出された米国仮特許出願６２／０３８，６０４号への優先権を主張する。上記出願のそれぞれの内容は、その全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、所望の配列を持つポリヌクレオチドを、鋳型を必要とせずに（ｄｅ  ｎｏｖｏで）合成する方法および装置に関する。このように、本発明は、研究、遺伝子工学ならびに遺伝子治療用の様々な配列および様々な長さのポリヌクレオチドのライブラリを作製する能力を提供する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子工学は、遺伝物質の内容を決定するための道具および所望の遺伝物質を構築するための道具を必要としている。遺伝物質の内容を決定するための道具は、１０００ドル未満で、約１日で全ヒトゲノムを配列決定することを可能にした。（Life  Technologies、記者発表：Benchtop  Ion  Proton（商標）  Sequencer、２０１２年１月１０日を参照のこと）。対照的に、所望の遺伝物質を構築するための道具、例えば、ｄｅ  ｎｏｖｏでＤＮＡ合成するための道具は、同じ速さで改善されてこなかった。評価の基準として、過去２５年の間、核酸塩基配列決定の費用（１塩基当たり）は、１／１０，０００，０００未満に低下したが、ｄｅ  ｎｏｖｏでの小さい核酸の合成費用（１塩基当たり）は、１／１０の低下であった。ＤＮＡ合成における進歩の不足は、翻訳ゲノミクス、すなわち、それによって個々の配列変動の役割が決定され、その役割を使用して治療的処置が開発されるものの速さを現在限定している。
【０００４】
現在のところ、大部分のｄｅ  ｎｏｖｏ核酸配列は、３０年より前に開発された固相ホスホラミダイト技術を使用して合成されている。その技術は、天然（または、非天然）の核酸塩基に対応するホスホラミダイト試薬から作られる配列の連続的な脱保護および合成を含む。しかしながら、長さが２００塩基対（ｂｐ）を超える核酸は高い率の破損および副反応を経験するため、ホスホラミダイト核酸合成は長さが限定される。さらに、ホスホラミダイト合成は有毒性副産物を産生し、この廃棄物の処分が核酸合成機の利用可能性を限定し、契約オリゴ生産の費用を増加させる。（オリゴヌクレオチド合成の一年の需要は、アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフランおよびピリジンを含む、３００，０００ガロンを超える有害な化学廃棄物の原因であると推定されている。LeProustら、Nucleic  Acids  Res.、３８巻（８号）、２５２２〜２５４０頁、（２０１０年）を参照のこと、その全体を参照により本明細書に組み込む）。したがって、より効率的で費用効果があるオリゴヌクレオチド合成の方法が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Life  Technologies、記者発表：Benchtop  Ion  Proton（商標）  Sequencer、２０１２年１月１０日
【非特許文献２】LeProustら、Nucleic  Acids  Res.、３８巻（８号）、２５２２〜２５４０頁、（２０１０年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸合成の改善された方法を提供する。本発明の方法は、より速い、ｄｅ  ｎｏｖｏでのより長いポリヌクレオチドの合成を提供する。このように、本発明は、特注品の核酸を合成する全体の費用を劇的に減少させる。本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して切断可能なリンカーによって阻害剤と結合されている非修飾の３’ヒドロキシルを有するヌクレオチド類似体を組み込む、ポリヌクレオチドの鋳型非依存的合成に関する。阻害剤のため、合成は各新しい塩基の付加と同時に停止し、そこで、リンカーが切断され、阻害剤が分離され、天然に存在するヌクレオチドと本質的に同一のポリヌクレオチドが残る（すなわち、酵素によってさらなるヌクレオチド組み込みの基質と認識される）。
【０００７】
本発明は、本発明の方法を利用して、特注品のポリヌクレオチドを生産するための装置をさらに含む。本発明の装置は、水性条件およびヌクレオチド類似体の複数の供給源を提供する１つまたは複数のバイオリアクタを含む。バイオリアクタは、例えば、貯蔵槽、フローセルまたはマルチウェルプレートであることができる。固体支持体から開始して、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）または鋳型の指示なしでＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖を伸長させる他の任意の酵素の天然の活性による連続したヌクレオチド付加により、ポリヌクレオチドはリアクタ中で成長する。リンカーの切断により、天然のポリヌクレオチドが、固体支持体上に曝露される。配列が完成したら、支持体は切り離され、天然に見られるものと本質的に同等のポリヌクレオチドが残る。いくつかの実施形態において、装置は、ヌクレオチド付加後に溶液を回収し、その後のヌクレオチド付加に溶液を再使用することによってヌクレオチド類似体溶液を再利用するように設計されている。したがって、より少ない廃棄物が産生され、１塩基当たりの全体の費用は、技術水準の方法と比較して削減される。特定の実施形態において、バイオリアクタは、微小流体デバイスを含むおよび／またはインクジェット印刷技術を使用することができる。
【０００８】
終了基（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）は、例えば、荷電部分または立体化学的阻害剤を含むことができる。一般に、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素が機能的立体構造をとることを防止する大きな巨大分子を使用して、オリゴヌクレオチド合成を阻害することができる。そのような巨大分子には、ポリマー、ポリペプチド、ポリペプトイドおよびナノ粒子が挙げられ得る。巨大分子は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの活性部位への接近を物理的に遮断するのに十分大きくなければならず、反応速度論を負に変えるほど大きくあってはならない。巨大分子は、後述する種々の連結分子を使用してヌクレオチド類似体に連結することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成は、各ヌクレオチド類似体の付加の後だが、終了基を切断する前に、１つまたは複数の合成されたオリゴヌクレオチドに３’エキソヌクレアーゼを導入することを含み得る。終了基は、３’エキソヌクレアーゼが、切断されていないヌクレオチド類似体が首尾よく付加されたオリゴヌクレオチドに作用するのを遮断することができるが、阻害剤が首尾よく付加されなかったオリゴヌクレオチドは３’エキソヌクレアーゼによって除去されることになる。この様式において、本発明は、工程中の品質管理を可能にし、合成後精製の必要性を排除することができる。
【００１０】
本発明の他の態様は、以下の図および詳細な説明の考慮により当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｎ−４位で連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１ＡのｄＣＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｄＣＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｎ−６位で連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２ＡのｄＡＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｄＡＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｎ−２位で連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３ＡのｄＧＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｄＧＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｎ−３位で連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４ＡのｄＴＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｄＴＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｎ−３位で連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５ＡのｄＵＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、ｄＵＴＰおよび環状離脱分子を得ることを示す図である。
【図６】図６は、デオキシシチジンのＮ−４位に遮断Ａｓｐ−Ａｓｐ分子を接続しているシュタウディンガーリンカーを有する例示的なデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）類似体ならびにその後水性条件下でシュタウディンガーリンカーを切断してｄＣＴＰおよび脱離基を得ることを示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｎ−４位で連結された切断可能なターミネーターを有するシチジン三リン酸（ｒＣＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７ＡのｒＣＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｒＣＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｎ−６位で連結された切断可能なターミネーターを有するアデノシン三リン酸（ｒＡＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８ＡのｒＡＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｒＡＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｎ−２位で連結された切断可能なターミネーターを有するグアノシン三リン酸（ｒＧＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９ＡのｒＧＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｒＧＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｎ−３位で連結された切断可能なターミネーターを有するチミジン三リン酸（ｒＴＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０ＡのｒＴＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、「天然の」ｒＴＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｎ−３位で連結された切断可能なターミネーターを有するウリジン三リン酸（ｒＵＴＰ）類似体の種類を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１ＡのｒＵＴＰ類似体から切断可能なターミネーターを切断して、ｒＵＴＰおよび環状脱離分子を得ることを示す図である。
【図１２】図１２は、シチジンのＮ−４位に遮断Ａｓｐ−Ａｓｐ分子を接続しているシュタウディンガーリンカーを有する例示的なシチジン三リン酸（ｒＣＴＰ）類似体ならびにその後水性条件下でシュタウディンガーリンカーを切断してｒＣＴＰおよび脱離基を得ることを示す図である。
【図１３】図１３は：（ａ）切断可能なターミネーター、ｄＮ＊ＴＰ−ＯＨを含むヌクレオチド三リン酸類似体の組み込み、および（ｂ）終了させる遮断基（＊で示される）を除去し、そのために次のｄＮ＊ＴＰ−ＯＨを組み込むことが可能になることを含む、例示的な末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ポリヌクレオチド合成サイクルを示す図である。Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴである。
【図１４】図１４は、様々な数のメチレン架橋を含む切断可能なリンカーを持つ例示的なヌクレオチド類似体を示す図である。
【図１５】図１５は、システイン残基を含む切断可能なリンカーを持つ例示的なヌクレオチド類似体を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、単一のリン酸基を含む陰イオン阻害剤を持つ例示的なヌクレオチド類似体を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、２つのリン酸基を含む陰イオン阻害剤を持つ例示的なヌクレオチド類似体を示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、３つのリン酸基を含む陰イオン阻害剤を持つ例示的なヌクレオチド類似体を示す図である。
【図１７】図１７は、例示的な微小流体ポリヌクレオチド合成デバイスを示す図である。
【図１８】図１８は、本発明における使用に適する例示的なポリペプトイド阻害剤を示す図である。
【図１９】図１９は、オリゴヌクレオチド合成サイクルの間に適切に終了しなかったオリゴヌクレオチドを消化するための３’エキソヌクレアーゼの使用について記述する流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、酵素および核酸類似体を使用してポリヌクレオチド、例えばＤＮＡならびにＲＮＡを合成するための改善した方法を提供する。開示された方法を使用して、ポリヌクレオチドの特定の配列を、水性環境において核酸鋳型を使用せずに１塩基毎にｄｅ  ｎｏｖｏで合成することができる。さらに、ヌクレオチド類似体は、「天然の」デオキシリボースおよびリボース分子で見つかる非修飾の３’ヒドロキシルを有するので、阻害剤（本明細書では切断可能なリンカーを介して付着しているターミネーターまたは終了基ともいう）が塩基から除去されると、類似体は「天然の」ヌクレオチドになる。例えば、自己排除リンカーまたは修飾リン酸基を持つヌクレオチドを含む他のヌクレオチド類似体もまた使用することもできる。ほとんどの例において、遮断基は、実質的な追加の分子が残らないように設計されており、すなわち、酵素によって「天然の」ヌクレオチドとして認識される「痕跡のない」ヌクレオチドが残るように設計されている。したがって、合成の終結時に、最後の遮断基を除去したら、合成したポリヌクレオチドは、同じ配列を持つ天然に存在するポリヌクレオチドと化学的および構造的に同等になる。したがって、合成されたポリヌクレオチドが生化学的経路または代謝に干渉することになる懸念なしに、合成ポリヌクレオチドを生物系に組み込むことができる。
【００１３】
有用なオリゴ−およびオリゴデオキシヌクレオチド、特に長いオリゴヌクレオチド（＜５０００ｎｔ）を鋳型なしに酵素的に合成するために本発明のプロセスおよび類似体を使用することができる。産物は、使用されるイニシエーターによって一本鎖または部分的に二本鎖であり得る。長いオリゴヌクレオチドの合成は、高効率の組み込みおよび高効率の可逆的なターミネーター除去を必要とする。固体支持体に結合しているイニシエーターは、使用者が定義した配列の短い断片または使用者が定義した一本鎖産物が除去される汎用のイニシエーターのいずれかである短い一本鎖ＤＮＡ配列からなる。
【００１４】
一態様において、開示された方法は、市販のヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を利用して、段階的な方式でヌクレオチド類似体からポリヌクレオチドを合成する。ヌクレオチド類似体は：
ＮＴＰ−リンカー−阻害剤
の形態のものであり、そこで、ＮＴＰはヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ）であり、リンカーは塩基のピリジンまたはピリミジン間の切断可能なリンカーであり、阻害剤は、酵素が次のヌクレオチドを組み込むことを防止する基である。各ステップにおいて、新しいヌクレオチド類似体が、成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込まれ、阻害基（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｒｏｕｐ）によって、酵素がさらなるヌクレオチドを付加することが遮断される。酵素が止まったら、過剰なヌクレオチド類似体を成長中の鎖から除去することができ、阻害剤をＮＴＰから切断することができ、鎖に次のヌクレオチドを付加するために新しいヌクレオチド類似体を導入することができる。このステップを連続して繰り返すことにより、所望の長さおよび配列のヌクレオチド配列をすばやく構築することができる。ポリヌクレオチド合成にヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する長所には：１）鋳型非依存的重合において一本鎖（ｓｓ）開始プライマーを使用する３’伸長活性、２）高効率の様式でプライマーを伸長させて数千のヌクレオチドを付加する能力、および３）効率的な基質としての多種多様な修飾および置換ＮＴＰの受容、が挙げられる。加えて、本発明は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの基質であるイニシエーター配列を使用することができる。イニシエーターは、固体支持体に付着され、酵素の結合部位として用いられる。イニシエーターは、好ましくは酵素に対する汎用のイニシエーター、例えばホモポリマー配列であり、固体支持体上で再利用可能であり、形成されたオリゴヌクレオチドがイニシエーターから切断可能である。
【００１５】
本発明の方法は、合成核酸、例えば、ホスホラミダイト合成されたＤＮＡオリゴを現在使用する種々の適用に非常に適切である。例えば、本発明の方法で合成されるポリヌクレオチドは、核酸増幅用のプライマー、特異的なマーカーの検出用のハイブリダイゼーションプローブおよび遺伝子工学のためのプラスミドへの組み込みのために使用することができる。しかしながら、開示された方法は、より速い速度、および水性環境でより長い合成鎖のヌクレオチドを産生するので、開示された方法はまた、ハイスループット適用、例えば細胞内アッセイにおける遺伝的変動の発現のスクリーニングならびに合成生物学にも役に立つ。さらに、本発明の方法は、次世代適用、例えば合成読取り／書込み記憶装置としてＤＮＡを使用すること、またはＤＮＡから完全に（もしくは部分的に）合成される巨視的材料を作製することに必要とされる機能を提供することになる。
【００１６】
本発明および本明細書に述べた系は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含めたポリヌクレオチドの合成を提供する。「天然の」ヌクレオチド、例えばＤＮＡならびにＲＮＡの合成経路は、一般的な核酸塩基、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の文脈で述べられているが、本発明の方法を、汎用塩基を組み込んだヌクレオチド、例えば３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシド（deoxynucloside）および５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシド、アルファホスホロチオエート（phosphorothiolate）、ホスホロチオエートヌクレオチド三リン酸、または他の所望の特性、例えば蛍光を有するプリンもしくはピリミジンコンジュゲートを含めた、いわゆる「非天然の」ヌクレオチドに適用し得ることは理解されよう。プリンおよびピリミジン塩基の他の例には、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；ならびに、１，３，５トリアジンが挙げられる。いくつかの例において、無反応性であるが、およそ同等の塩基、すなわち、他のタンパク質、すなわち、トランスクリプターゼと反応せず、したがって配列情報の影響を塩基の構造効果から分離することができる塩基を有するヌクレオチド配列を産生することは有用であり得る。
類似体
【００１７】
本発明は、式ＮＴＰ−リンカー−阻害剤を有する、水性環境においてポリヌクレオチドを合成するためのヌクレオチド類似体を提供する。ＮＴＰ−リンカー−阻害剤形態の類似体に関して、ＮＴＰは、任意のヌクレオチド三リン酸、例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、ヌクレオチド三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）であり得る。
【００１８】
リンカーは、阻害剤をＮＴＰに連結し、切断され得る任意の分子部分であることができる。例えば、リンカーは、周囲環境のｐＨを調整することによって切断できる。リンカーはまた、所定の温度で活性化されるが、別の温度で不活性化される酵素によって切断することもできる。いくつかの実施形態において、リンカーはジスルフィド結合を含む。
【００１９】
リンカーは、例えば、光切断可能な、求核性または求電子性の切断部位を含むことができる。切断が特定の波長の光によって活性化される光切断可能なリンカーには、ベンゾイン、ニトロベラトリル、フェナシル、ピバロイル、シシル（sisyl）、２−ヒドロキシ−シンナミル（cinamyl）、クマリン−４−イル−メチルまたは２−ニトロベンジルに基づくリンカーが含まれ得る。
【００２０】
求核性切断部位の例としては、フッ化物イオン切断可能なシリコン−酸素結合または塩基性溶液中で切断できるエステルが挙げられる。求電子的に切断されるリンカーとしては、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセタール基、ならびにｐ−アルコキシベンジルエステルおよびアミドを含むことができる酸誘導切断部位が挙げられ得る。特定の態様において、図１５に示すように切断可能なリンカーは、システイン残基を含むことができる。
【００２１】
炭素における付着では、ポリメラーゼ阻害基の除去後に残りの痕跡が存在するので、リンカーは、例えば、シトシンのＮ４、チミンのＮ３もしくはＯ４、グアニンのＮ２もしくはＮ３およびアデニンのＮ６、またはウラシルのＮ３もしくはＯ４に付着させることができる。リンカーは、典型的には長さ少なくとも約１０オングストロームのオーダー、例えば、長さ少なくとも約２０オングストローム、例えば、長さ少なくとも約２５オングストロームであり、したがって、阻害剤をピリジンまたはピリミジンから十分に遠くすることができ、それにより酵素は、付着している糖骨格を介してポリヌクレオチド鎖にＮＴＰを結合できるようになる。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、成長中のヌクレオチド鎖に対して特に無反応性である環状分子を形成するので、自己環化する。
【００２２】
特定の態様において、図１４および図１６Ａ〜Ｃに示すように切断可能なリンカーは、ＮＴＰまたはジスルフィド結合の阻害剤側に、例えば、１、２、３もしくは４つのメチレン架橋を含めた様々な数のメチレン架橋を含むことができる。これらのメチレン架橋を使用して、ＮＴＰと阻害剤との間の間隙を増加させることができる。上記したように、阻害剤が、ＮＴＰと合成されたポリヌクレオチドとの結合に干渉するのを防止するために、切断可能なリンカーの長さを選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、荷電基からＮＴＰまでの距離は、次のヌクレオチド組み込みを阻害する効果に重要な役割を果たす。
【００２３】
例えば、阻害剤として荷電部分を使用するいくつかの実施形態において、荷電部分はＮＴＰから約５〜約６０結合離れることができる。いくつかの他の実施形態において、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０〜約４０結合離れることができる。いくつかの他の実施形態において、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０〜約３５結合離れることができる。いくつかの他の実施形態において、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０〜約３０結合離れることができる。いくつかの他の実施形態において、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０〜約２０結合離れている。荷電部分とＮＴＰとの間の結合の数は、追加のメチレン架橋を含むことにより増加し得る。
【００２４】
ヌクレオチド類似体は、酵素による次のヌクレオチドの結合を阻害するＮＴＰに連結された任意の部分を含むことができる。阻害基は、荷電基、例えば荷電アミノ酸であることができ、または阻害基は、周囲条件によって荷電されるようになる基であることができる。いくつかの実施形態において、阻害剤は、負に荷電しているまたは負に荷電するようになることが可能な部分を含むことができる。例えば、阻害剤は、図１６Ａ〜Ｃに示すようにリン酸基の鎖（例えば、１、２または３リン酸）を含むことができ、追加のリン酸は、阻害剤の全体の陰イオン荷電を増加させる。他の実施形態において、阻害基は正に荷電しているまたは正に荷電するようになることが可能である。いくつかの他の実施形態において、阻害剤はアミノ酸またはアミノ酸類似体である。阻害剤は、２〜２０単位のアミノ酸もしくは類似体のペプチド、２〜１０単位のアミノ酸もしくは類似体のペプチド、３〜７単位のアミノ酸もしくは類似体のペプチド、３〜５単位のアミノ酸または類似体のペプチドであることができる。いくつかの実施形態において、阻害剤は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＬｙｓ、ならびにその組み合わせ（例えば、Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＧｌｕまたはＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐなど）からなる群から選択される基を含む。ペプチドまたは基は、同じもしくは異なるアミノ酸もしくは類似体の組み合わせであることができる。特定の実施形態において、ペプチド阻害剤をアセチル化して、遊離アミノ基の誤った結合を防ぐことができる。阻害基はまた、酵素の活性部位中の残基と反応し、したがって酵素による次のヌクレオチドの結合に干渉する基を含むこともできる。阻害剤は、−ＣＯＯ、−ＮＯ２、−ＰＯ４、−ＰＯ３、−ＳＯ２、または−ＮＲ３からなる群から選択される荷電基を有することができ、各Ｒは、Ｈもしくはアルキル基であることができる。他の実施形態において、阻害剤部分は、−ＰＯ４基を含まない。
【００２５】
特定の態様において、ターミネーターまたは阻害剤は、立体化学的阻害基を含むことができる。そのような立体化学的阻害基は、ＮＴＰ−リンカー−阻害剤（すなわち、ヌクレオチド類似体）がオリゴヌクレオチドの遮断されていない３’ＯＨに組み込まれることを可能にすることができ、前記組み込みは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって触媒される。立体化学的阻害基は、組み込まれたヌクレオチド類似体の遮断されていない３’ＯＨへのヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチド類似体の組み込みを物理的に遮断することができる。立体化学的阻害剤はまた、３’エンドヌクレアーゼが、ヌクレオチド類似体に作用すること、したがって、切断されていないヌクレオチド類似体が組み込まれたオリゴヌクレオチドに作用することを遮断することもできる。
【００２６】
立体化学的阻害剤には、例えば、化学ポリマー、ナノ粒子、ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）またはタンパク質を挙げることができる。本発明の立体化学的阻害剤は、例えば、２０Å超、３０Å超、４０Å超、５０Å超、６０Å超、７０Å超、８０Å超、９０Å超、１００Å超、１１０Å超、１２０Å超、１３０Å超、１４０Å超または１５０Å超を含めた種々のサイズであることができる。好ましい実施形態において、立体化学的阻害剤は、単分散または実質的に単分散であり得る。立体化学的阻害剤は、水溶性であり、立体構造的に制限され得る（すなわち、強固な形態またはやや強固な形態）。特定の態様において、阻害剤のサイズまたは立体構造のために、立体化学的阻害剤は、関連するヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の活性部位への接近を物理的に遮断することになる。好ましい実施形態において、立体化学的阻害剤は、非天然のバイオインスパイアードポリマー、例えばポリペプトイドまたは非天然のポリペプチドを含むことができる。
【００２７】
特定の態様において、自己集合性ポリペプトイド配列を、立体化学的阻害剤として使用することができる。ペプトイドモノマーは、Ｎ−置換グリシン骨格にしばしば基づく。骨格は水素結合ドナーがないので、ポリペプトイドは容易に処理され、他方で二次構造、例えばらせんはなお形成可能である。ポリペプトイドはまた、一般に化学的ならびに熱的に安定しているが、ペプチドと同様の極性および側鎖を可能にする有益な特性も提供する。本発明による自己集合性ポリペプトイド立体化学的阻害剤は、単一のペプトイドらせんに自己集合して、特に直径０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍまたは３．５μｍを含むマイクロメーター範囲のマイクロスフェアを形成することができる。特定の態様において、立体化学的阻害剤は、Ｃ−α−分枝状側鎖、Ｎ−アリール側鎖、Ｎ−１−ナフチルエチル側鎖または安定ならせん構造を形成することができる他の形態を持つペプトイドを含むことができる。ペプトイド立体化学的阻害剤の例を図１８に示す。図１８は、本発明による立体化学的阻害剤として使用できる分枝状ポリ−Ｎ−メトキシエチルグリシンを例示する。特定の実施形態において、立体化学的阻害剤は、リンカー基、例えば、本明細書に記載の切断可能な連結基に容易に結合される反応基を含むことができる。
【００２８】
他の実施形態において、立体化学的阻害剤は、ポリマー、例えば生体適合性ポリマーを含むことができる。ポリマーは、異なるポリマーのブロックを含むことができ、その結果、水性環境に曝露された際にそのブロックが所望の巨視的構造、例えば球体を形成するよう。例えば、ポリマーが、水に添加されるとミセル構造に自己集合するように、コポリマーは、親水性および疎水性のブロックのブロックを含むことができる。いくつかの実施形態において、疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリ乳酸（ＰＬＡ）から選択することができる。親水性ブロックは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のポリアルコールを含むことができる。
【００２９】
他の実施形態において、阻害剤は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの活性を遮断するために充分なサイズのナノ粒子を含むことができる。そのようなナノ粒子は、例えば、金、銀、ケイ素、酸化セリウム、酸化鉄、二酸化チタン、窒化ケイ素、ホウ化ケイ素またはシリカ、例えば、メソ多孔性シリカを含むことができる。他の実施形態において、ナノ粒子は、炭素または半導体を含む高度に秩序化された（ｈｉｇｈｌｙ−ｏｒｄｅｒｅｄ）分子構造、例えばフラーレン、例えばバッキーボールおよびナノチューブを包含することができる。
【００３０】
立体化学的阻害剤は、阻害剤に連結されるヌクレオチドおよびヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素との適合性を提供するために荷電を有さなくても、または正もしくは負に荷電してもよく、その結果阻害剤は、ＮＴＰ類似体の５’末端における組み込み反応に干渉しない。立体化学的阻害剤は、所望の立体構造、荷電または付着部位を提供するために種々のアミノ酸残基を組み込むことができる。
【００３１】
ＮＴＰ−リンカー−阻害剤型のヌクレオチド類似体の例を図１Ａに示す。図１Ａの類似体は、糖環上に遮断されていない、非修飾３’−ＯＨを提供し、一方でジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合によってｄＣＴＰのＮ４位に連結された阻害基（−Ａｓｐ−Ａｓｐ−）を含む。全てのリンカー原子（第２の組み込み阻害部分を含む）を除去することができ、それにより新生ＤＮＡ鎖を天然のヌクレオチドに戻すことができるようにリンカーが構築される。図１Ｂに示すように、水性還元剤、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用して、−Ｓ−Ｓ−結合を切断することができ、その結果阻害剤機能が喪失する（脱遮断）。図１Ｂに示すように、自己環化リンカーを組み込むことができ、その結果ヌクレオチド合成の終結時に試薬溶液から容易に除去される環状の酸化型テトラヒドロチオフェン脱離基が生じる。
【００３２】
図１ＡのｄＣＴＰ類似体を合成する例示的なスキームを、以下のスキーム１Ａおよび１Ｂに示す：
【化１】
2017525391.tif 000002
【化２】
2017525391.tif 000003
【００３３】
スキーム１Ａおよび１Ｂと類似の方式で、ＮＴＰ−リンカー−阻害剤型のヌクレオチド類似体はまた、リンカー−阻害剤部分をアデニンのＮ６（図２）、グアニンのＮ２（図３）、チミンのＮ３（図４）またはウラシルのＮ３（図５）に付着させることによって形成することもでき、それによって「天然に存在する」ｄＮＴＰおよびデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）の類似体を提供することができる。ｄＵＴＰが幅広く使用される可能性は低いが、合成は化学に基づいて平易である。
【００３４】
本発明は、スキーム１Ａおよび１Ｂの連結化学に限定されないが、カルバミン酸、アミドまたは他の自己排除連結もまた利用することも可能である。例えば、スキーム２に示すように、ヌクレオチドはまた、シュタウディンガーリンカーで調製することもできる。
【化３】
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【００３５】
Ａｓｐ−Ａｓｐ遮断基に対するシュタウディンガーリンカー（スキーム２）で創出されるデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）類似体を図６に示す。図６に示すように、シュタウディンガーｄＣＴＰ類似体は、アジドおよびトリフェニルホスフィンの添加により水性条件で切断を受ける。上で記載し、図１〜図５に例示した通り、図６に示すシュタウディンガー類似体はまた、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えばＴｄＴを使用するヌクレオチド伸長に適している。図中では明確に示さないが、当業者は、適当な反応物と共にスキーム２を使用して、完全なｄｅ  ｎｏｖｏヌクレオチド合成に必要とされるシュタウディンガーリンカーを有する他のヌクレオチド類似体を産生することができる。図６と類似の方式で、スキーム２のヌクレオチド類似体は、シュタウディンガー部分をアデニンのＮ６、グアニンのＮ２、チミンのＮ３またはウラシルのＮ３に付着させることによって形成することができ、それによって「天然に存在する」ｄＮＴＰおよびデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）の類似体を提供する。
【００３６】
例えば図７〜図１０に示す通り、適当なリボヌクレオチド反応物を用いて開始することにより、スキーム１Ａの方法論を使用して対応するリボヌクレオチド類似体を産生することができる。図１２に示すように、例えば、ＣＴＰ類似体を含めた必要とされるリボヌクレオチド類似体を形成するために、スキーム２を使用してシュタウディンガーリンカーを含むリボヌクレオチド類似体はまた創出され得る。さらに、リボヌクレオチドの類似体の全て、すなわち、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕは、スキーム２と同様の反応を使用して形成することができる。
酵素
【００３７】
本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼを利用して、ポリヌクレオチドにヌクレオチド類似体を組み付ける。ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、関連するトランスフェラーゼおよびポリメラーゼ酵素のいくつかのファミリーが挙げられる。いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドより効率的にデオキシリボヌクレオチドを重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシリボヌクレオチドより効率的にリボヌクレオチドを重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、およそ同じ速度でリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを重合する。
本発明に特に重要（ｉｍｐｏｒｔ）なことは、ポリメラーゼ活性を有するトランスフェラーゼ、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、ヌクレオチド鎖の３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒する能力があり、それによってＤＮＡヌクレオチドの鎖長が増加する。ＴｄＴは、ＤＮＡ鎖の成長末端への１〜２つのリボヌクレオチドの付加しか触媒しないことになり、これは部位特異的ＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの構築に有用になり得る。特に、操作した大腸菌から供給される仔ウシ胸腺ＴｄＴは、本発明での使用に適しており、市販品、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）から入手可能である。仔ウシＴｄＴに対応するアミノ酸配列を、配列番号１として表１に挙げる。
【表１】
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仔ウシＴｄＴに対応するヌクレオチド配列を、配列番号２として表２に挙げる。
【表２−１】
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【表２−２】
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【００３８】
市販のＴｄＴは、本発明の方法での使用に適しているが、例えば、配列番号１と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する改変ＴｄＴを、本発明の方法で使用することができる。適当なヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する生物は、配列番号２と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号２と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号２と少なくとも９９％共通の核酸配列を含むことができる。いくつかの例において、改変ＴｄＴは、ポリヌクレオチドのより効率的な生成をもたらすか、または鎖長のより良好な制御が可能になることになる。ＴｄＴに対する他の改変は、酵素の遊離特質を変化させ、それによって水性還元剤、例えばＴＣＥＰまたはＤＴＴの必要性を減少させ得る。
【００３９】
ＲＮＡポリヌクレオチドの合成の場合、大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼのようなヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、リボヌクレオチドイニシエーターの３’末端へのリボヌクレオチドの付加を触媒することができる。他の実施形態において、大腸菌ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用により適している場合がある。大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼと大腸菌ポリ（Ｕ）ポリメラーゼとの両方とも、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、ＭＡ）から入手可能である。これらの酵素を、３’が遮断されていない可逆的ターミネーターリボヌクレオチド（ribonuclotide）三リン酸（ｒＮＴＰ）と使用して、ＲＮＡを合成することができる。特定の実施形態において、ＲＮＡは、３’遮断、２’遮断、もしくは２’−３’遮断ｒＮＴＰおよびポリ（Ｕ）ポリメラーゼまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して合成することができる。大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼならびに大腸菌ポリ（Ｕ）ポリメラーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を下に複製する。改変大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼまたは改変大腸菌ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用に適している場合がある。例えば、配列番号３と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する酵素を、本発明の方法で使用することができる。適当な酵素を発現する生物は、配列番号４と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号４と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号４と少なくとも９９％共通の核酸配列を含むことができる。あるいは、配列番号５と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する酵素を、本発明の方法で使用することができる。適当な酵素を発現する生物は、配列番号６と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号６と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号６と少なくとも９９％共通の核酸配列を含むことができる。
【表３】
2017525391.tif 000008
大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼに対応するヌクレオチド配列を、配列番号４として表４に挙げる。
【表４】
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【表５】
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大腸菌ポリ（Ｕ）ポリメラーゼに対応するヌクレオチド配列を、配列番号６として表６に挙げる。
【表６】
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【００４０】
前述の通り、ヌクレオチド類似体と結合されている阻害剤は、トランスフェラーゼ、例えば、ＴｄＴがポリヌクレオチドから遊離されないまたは他の類似体が成長中の鎖に組み込まれることを防止することになる。荷電部分により、より良好な阻害を得られるが、研究は阻害剤の特定の化学的性質が、特に重要なわけではないことを示唆している。例えば、リン酸と酸性ペプチドとの両方を使用して、酵素活性を阻害することができる。例えば、Bowersら、Nature  Methods、第６巻、（２００９年）５９３〜９５頁および米国特許第８，０７１，７５５号を参照のこと、その両方を、その全体を本明細書において参照により援用する。いくつかの実施形態において、阻害剤は、単一のアミノ酸または−（Ａｓｐ）２のようなジペプチドを含むことになるが、実験的に決定した第１のヌクレオチド組み込みならびに第２のヌクレオチド組み込みの速度に基づいて、必要とされるようにその部分のサイズおよび電荷を調整することができる。すなわち、他の実施形態は、より多くのもしくは異なる荷電アミノ酸または他の生体適合性荷電分子を使用することができる。
【００４１】
ヌクレオチド合成の他の方法を使用して、ヌクレオチジルトランスフェラーゼまたは改変ヌクレオチジルトランスフェラーゼ使用する鋳型非依存的方式で、ｄｅ  ｎｏｖｏでオリゴヌクレオチドを作ることができる。一実施形態において、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素が３’非修飾ｄＮＴＰ類似体のリン酸に対する修飾に遭遇したときにヌクレオチド付加を中断するように、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を改変することができる。このスキームは、ヌクレオチド類似体のリン酸末端を修飾する脱遮断試薬／反応を必要とし、脱遮断試薬／反応は、次のヌクレオチド組み込みのために新生鎖を解放する。この手法の好ましい実施形態は、ヌクレオチドのプリン／ピリミジン塩基の修飾が許容されるものの、リン酸（アルファ、ベータまたはガンマ）でだけ修飾されているヌクレオチド類似体を使用する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、次のヌクレオチド類似体付加の前に、３’エキソヌクレアーゼを使用して、阻害剤で適切に終了しなかったオリゴヌクレオチドを除去することが有利になり得る。特に、適切に終了したオリゴヌクレオチドだけを作るようにヌクレオチド類似体の阻害剤を選択して、ヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび３’エキソヌクレアーゼの活性を阻害することができる。この品質管理技術を使用することで、得られたオリゴヌクレオチド配列の純度が改善される。いくつかの実施形態において、そのような品質管理手段の使用は、合成後精製の必要性を打ち消すことができる。この技術は図１９に図式的に表され、そこで過剰なヌクレオチド類似体を除去するための洗浄ステップ後かつリンカー切断の前に３’エキソヌクレアーゼを導入する。図１９に示すように、そのような清掃ステップは、望ましくない長さおよび／または配列のものであるオリゴヌクレオチドの数を減少させることになる。
【００４３】
鋳型依存的でないポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用する別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して酵素を改変し、それにより各単一ヌクレオチド組み込みの後に新生鎖に堅く結合し不活性のままにし、したがって、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼが遊離試薬／条件を使用して鎖から遊離される時間まで次のどんな組み込みも防止することである。そのような改変は、可逆的ターミネーターｄＮＴＰの代わりに天然の非修飾ｄＮＴＰの使用が可能になるように選択する。遊離試薬は、高い塩緩衝液、変性剤などであり得る。遊離条件は、高温、撹拌などであり得る。例えば、ＴｄＴのループ１およびＳＤ１領域に対する突然変異が、鋳型非依存的活性からより多くの鋳型依存的活性に活性を劇的に変えることが示された。対象の特異的変異としては、それだけには限らないがΔ３３８４／３９１／３９２、デルループ１（３８６→３９８）、Ｌ３９８Ａ、Ｄ３３９Ａ、Ｆ４０１Ａ、およびＱ４０２Ｋ４０３Ｃ４０４→Ｅ４０２Ｒ４０３Ｓ４０４が挙げられる。組み込み後にＴｄＴ酵素を堅く結合する（すなわち、１回だけのターンオーバー）目的を達成するための他の手段としては、Ｋ２６１、Ｒ４３２およびＲ４５４を包含するがこれに限定されないイニシエーター鎖の３つのリン酸の結合に関与する残基への突然変異が挙げられ得る。
【００４４】
鋳型依存的でないポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用する別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して、高効率で３’遮断可逆的ターミネーターを受容するように酵素を改変することである。ほとんどの天然に存在するポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位における立体化学的制約のため、３’遮断可逆的ターミネーターを組み込まないことになる。酵素の活性部位における単一または数個いずれかのアミノ酸残基の改変は、上に記述したプロセスと完全に類似のプロセスにおいて、支持体に結合しているイニシエーターへの３’遮断可逆的ターミネーターの高効率の組み込みを可能にし得る。組み込み後に、３’可逆的終端が、脱遮断試薬／条件により除去され、したがって次の制御された伸長反応の準備が整った完全に天然の（痕跡のない）一本鎖分子が生成される。次に来るｄＮＴＰの３’−ＯＨの近くに残基があることは、ＴｄＴが、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と同程度に容易にリボヌクレオチド三リン酸を組み込む傾向を説明しており；β１とβ２との間、特にＲ３３４、ループ１およびα１３とα１４との間、特にＲ４５４を含むがこれに限定されない残基は、３’可逆的ターミネーター基の容積を収容し、それの効率的な組み込みを可能にする突然変異誘発の有望な標的である。特定の実施形態において、３’可逆的ターミネーターを収容するために作製されるこれらの残基改変を補償するにはさらなるアミノ酸変化が必要となる場合がある。鋳型依存的ポリメラーゼを使用する別の実施形態は、３’遮断または３’が遮断されていないｄＮＴＰ類似体のいずれかを、固体支持体に付着している複数のプライマー−鋳型対と共に使用することであり、鋳型は、使用者によって指定される４つの塩基のうちいずれかのポリメラーゼ媒介プライマー伸長を支持する核酸類似体である。
【００４５】
鋳型依存的でないポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用する別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して酵素を改変し、類似体特異的な様式で４つの異なるヌクレオチドのそれぞれもしくはさらに異なる修飾ヌクレオチド類似体の使用を最適化することができる。ヌクレオチド特異的またはヌクレオチド類似体特異的酵素バリアントを操作して、所望のポリヌクレオチドの合成費用をさらに減少させるＫｍの減少もしくは付加速度の向上のような所望の生化学的性状を持たせることができる。
固体状態合成
【００４６】
本発明の方法は、種々の反応条件下で実施することができるが、所望のポリヌクレオチドの順序正しい構築および回収は、ほとんどの場合、ポリヌクレオチドが成長できる固体支持体を必要とすることになる。いくつかの実施形態において、方法は、固体支持体上でのポリヌクレオチドの酵素媒介合成を包含する。上述のＮＴＰ、リンカーおよび阻害剤類似体と組み合わせて使用する場合、例えば、水性環境においてＴｄＴまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用することによりＤＮＡならびにＲＮＡの特定のポリヌクレオチド配列を構築することが可能になる。図１３に示すように、ＴｄＴを使用して、段階的な方式でポリヌクレオチド配列を伸長することにより特注品のポリヌクレオチドの段階的な構築を行うことができる。前に述べた通り、各ＮＴＰ類似体の阻害基は、酵素にヌクレオチドの付加を止めさせる。各ヌクレオチド伸長ステップ後に、リンカーを切断することにより阻害剤を除去する前に、反応物を固体支持体から洗い流し、続いて新たな反応物を添加し、サイクルが新たに開始できるようにする。
【００４７】
特定の実施形態において、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ヌクレオチド類似体伸長ステップの後かつ阻害剤切断の前に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が３’エキソヌクレアーゼに曝露されるさらなる品質管理ステップを組み込むことができる。３’エキソヌクレアーゼは、遮断されていない３’ＯＨを持つオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖を分解することができる。特定の態様において、切断されていない阻害剤（例えば、立体化学的阻害剤）は、３’エキソヌクレアーゼが、切断されていないヌクレオチド類似体を首尾よく組み込んだ鎖を分解することを物理的に遮断することができる。そのような品質管理ステップは、所望のヌクレオチド類似体を組み込みを首尾よく行っていないオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドだけを分解することができ、それにより、完成した合成した配列におけるどんな誤りも排除され、合成後配列確認の必要性が潜在的に除去される。３’エキソヌクレアーゼ曝露後の、阻害剤切断ステップを実施する前に酵素を洗い流すことができる。
【００４８】
３’エキソヌクレアーゼは、所望のヌクレオチド類似体が首尾よく付加されなかった鎖を短縮または完全に分解することによって作用することができる。所与のサイクルで酵素的に伸長できなかった鎖は、リンカー切断ステップの前に末端巨大分子−ｄＮＭＰコンジュゲートを有さないことになる。この段階で３’エキソヌクレアーゼが導入されると、「失敗」鎖は、長さが短縮されるまたはモノヌクレオチドリン酸まで潜在的に完全に分解されることになるが、完全長鎖は分解から保護され得る。長い（＞５００塩基）合成ＤＮＡの収率は、各および全てのサイクルにおいて起こる高効率の反応によって決まり；酵素的伸長と脱遮断／自己排除ステップとの両方が、定量的収率近くで起こらなければならない。伸長効率が定量的レベルより低い（すなわち、伸長されず、したがって天然の非修飾の末端ヌクレオチドを持つ鎖がある）場合、酵素的伸長ステップの後だが巨大分子ターミネーター切断ステップの前における３’エキソヌクレアーゼの導入は、新生鎖純度に肯定的な影響がある。
【００４９】
＊反対に、それらの鎖が巨大分子ターミネーターによってなお保護されており、次の伸長ステップの間に伸長することができないために脱遮断／排除ステップが、定量的レベルより低い場合、３’エキソヌクレアーゼステップは、合成の品質に影響を与えない。したがって３’エキソヌクレアーゼステップの追加による合成の品質の実際の改善は、実験的に決定することしかできないので、追加の費用およびサイクル時間の価値がある場合に判定が行われる。既存のホスホラミダイト法によって作製される長いＯＤＮの費用の多くが合成後と関係する。
【００５０】
ｎサイクルの伸長−除去−脱遮断−洗浄の終結時に、完成した全長、一本鎖ポリヌクレオチドは完全であり、固体支持体から切断され、適用、例えばＤＮＡ配列決定またはＰＣＲにその後使用するために回収することができる。あるいは、適用、例えばハイブリダイゼーション分析、タンパク質またはＤＮＡ親和性捕捉にその後使用するために完成した、全長、一本鎖ポリヌクレオチドを固体支持体に付着したままにすることができる。他の実施形態において、部分的に二本鎖のＤＮＡを、イニシエーターとして使用することができ、その結果二本鎖ポリヌクレオチドが合成される。
【００５１】
本発明の方法での使用に適している固体支持体としては、ビーズ、スライド、ペグ（ｐｅｇ）またはウェルを含めたガラスおよびシリカ支持体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、支持体を別の構造、例えばポリマーウェルプレートまたはピペットチップにつなぐことができる。いくつかの実施形態において、固体支持体は、さらなる磁気特性を有することができ、したがって磁石を使用して支持体を操るまたはある位置から除去することが可能になる。他の実施形態において、固体支持体は、シリカで被覆したポリマーであることができ、それにより自動処理に役に立つ種々の構造形状を形成することが可能になる。
合成機
【００５２】
開示した方法の効率を利用して、水相ＤＮＡ合成機を構築し、それにより実質的量の所望のポリヌクレオチドを産生することができる。一実施形態において、合成機は、記述されたＮＴＰ類似体試薬、すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの４つのウェルならびにＴｄＴをポリヌクレオチド成長をもたらすために十分な濃度で含むことになる。複数の開始配列を、例えば、実験室ロボットを使用して４つのウェルの各々に繰り返し浸漬されるように設計されている固体支持体に付着させることができる。ロボットは、ヌクレオチド付加の間に洗浄緩衝液で固体支持体をすすぎ、脱遮断薬剤に支持体を曝露することによって連結基を切断し、次の所望のヌクレオチドのウェルへ固体支持体を移動させる前に２度固体支持体を洗浄するようにさらにプログラムできる。単純なプログラミングを用いて、数時間で、有害廃棄物を実質的に減らして有用な量の所望のヌクレオチド配列を創出することが可能になる。慎重に制御された条件下での継続的合成により、数千塩基対の長さのポリヌクレオチドの合成が可能になることになる。完了したら、伸長産物を、固体支持体から遊離させ、その後完成したヌクレオチド配列として使用することができる。
【００５３】
高度に並列化された実施形態は、９６または３８４ウェルいずれかの形式のペグ（ｐｅｇ）上にある一連のイニシエーター−固体支持体からなることができ、ペグ（ｐｅｇ）は個々に格納もしくは下降させることができ、その結果ペグ（ｐｅｇ）を指標付けして、制御された方式でウェル中にある液体に接触させることができる。したがって、合成機は、無作為にアドレス可能なペグ（ｐｅｇ）デバイス、ペグ（ｐｅｇ）デバイスと同じ形式（９６または３８４間隔）の４つの酵素−ｄＮＴＰ類似体貯蔵槽、ペグ（ｐｅｇ）デバイスと同じ形式（９６または３８４間隔）のさらなる試薬貯蔵槽（洗浄、脱遮断など）、および使用者がプログラム可能な制御されている方式であるが、ランダムアクセス方式の１つの貯蔵槽からもう一方へペグ（ｐｅｇ）デバイスを移動させる輸送機構（例えば、実験室ロボット）からなることができる。内容物は、各ポリヌクレオチド合成の費用を減少させるために全ての合成プロセスを通して再使用されるので、４つの酵素−ｄＮＴＰ貯蔵槽のそれぞれの混入を避けるように注意しなければならない。
【００５４】
代替の実施形態において、試薬（例えば、ヌクレオチド類似体、酵素、緩衝液）は、固体支持体間で移動され、試薬を再利用することが可能になる。例えば、貯蔵槽ならびにポンプシステムは、オリゴヌクレオチドが形成されることになる１つまたは複数の反応器間で４つの異なるヌクレオチド類似体溶液、洗浄緩衝液および／または還元剤溶液を移動させることができる。反応器およびポンプは、慣用的なものであることができ、またはデバイスは微小流体を使用して構築することができる。無水でない（水性の）性質のプロセスであるため、水への曝露を無くすために使用されるハードウェアの設計という特別な注意を払う必要はない。合成プロセスは、蒸発の損失を制御するための予防措置だけ用いて行われ得る。高度に並列化された実施形態は、同じ整合形式の一連のウェルにつなぐことができる９６または３８４ウェルいずれかの形式のペグ（ｐｅｇ）上にある一連の一体化したイニシエーター−固体支持体からなることができる。各ウェルは実際に、適当な弁を持つ４つの酵素−ｄＮＴＰ類似体貯蔵槽およびさらなる試薬貯蔵槽（洗浄、脱遮断など）により送り込まれる反応チャンバーである。酵素−ｄＮＴＰ反応物を、各ポリヌクレオチド合成の費用を減少させるために合成プロセス全体を通して再使用するので、流体工学論理で、各伸長反応後に元の方式で酵素−ｄＮＴＰ反応物を回収するための措置を設ける。他の実施形態において、ピペットチップの系を使用して、試薬を添加し、除去することができる。
【００５５】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、微小流体デバイスおよび／またはインクジェット印刷技術を使用して合成することができる。例示的な微小流体ポリヌクレオチド合成デバイスを、例示目的で図１７に示すが、正確な縮尺ではない。調整器２５７を含む微小流体チャネル２５５は、反応チャンバー２５１に貯蔵槽２５３を結合させ、調整器２５７を含む排出チャネル２５９は、反応チャンバー２５１から廃棄物を排出することができる。ポリヌクレオチド合成のための微小流体デバイスは、例えば、チャネル２５５、貯蔵槽２５３および／または調整器２５７を含むことができる。ポリヌクレオチド合成は、微小流体の反応チャンバー２５１内で起こることができ、反応チャンバー２５１は、多数のアンカー固定され、合成されたヌクレオチドイニシエーターを含むことができ、反応チャンバー２５１は、反応チャンバー内面にアンカー固定もしくは結合されたビーズまたは他の基質を含むことができ、ＮＴＰ類似体もしくはポリヌクレオチドイニシエーターを遊離可能に結合することができる。反応チャンバー２５１は、少なくとも１つの取入れチャネルおよび１つの排出チャネル２５９を含むことができ、その結果試薬を反応チャンバー２５１に添加し、除去することができる。微小流体デバイスは、各それぞれのＮＴＰ類似体に対して貯蔵槽２５３を含むことができる。これらのＮＴＰ類似体貯蔵槽２５３の各々はまた、適当な量のＴｄＴまたは鋳型の指示なしでＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖を伸長させる他の任意の酵素を含むこともできる。さらなる貯蔵槽２５３は、リンカー／阻害剤切断および洗浄のための試薬を含有することができる。これらの貯蔵槽２５３は、別々のチャネル２５５を用いて反応チャンバー２５１と結合することができ、反応チャンバー２５１への各チャネル２５５を通る試薬の流れは、ゲート、弁、圧力調整器または他の手段を使用することにより個々に調整することができる。排出チャネル２５９を通る反応チャンバー２５１からの流れは、同様に調整することができる。
【００５６】
特定の例において、試薬、特にＮＴＰ類似体−酵素試薬は、再利用することができる。ゲート、弁、圧力調整器または他の手段を使用して逆流を誘導することにより、試薬を、それを入れた同じチャネル２５５を介して反応チャンバー２５１からそれぞれの貯蔵槽２５３に引き戻すことができる。あるいは、試薬を、独立した戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１からそれぞれの貯蔵槽２５３に戻すことができる。微小流体デバイスは、上記のゲート、弁、圧力または他の調整器２５７を操作することができる制御器を含むことができる。
【００５７】
例示的な微小流体ポリヌクレオチド合成反応は、反応チャンバー２５１に所望の酵素−ＮＴＰ類似体試薬を流すステップと；設定時間後に酵素−ＮＴＰ類似体試薬を排出チャネル２５９または戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１から除去するステップと；反応チャンバー２５１に洗浄試薬を流すステップと；洗浄試薬を、排出チャネル２５９を通して反応チャンバー２５１から除去するステップと；反応チャンバー２５１に脱遮断または切断試薬を流すステップと；脱遮断または切断試薬を排出チャネル２５９もしくは戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１から除去するステップと；反応チャンバー２５１に洗浄試薬を流すステップと；洗浄試薬を、排出チャネル２５９を通して反応チャンバー２５１から除去するステップと；反応チャンバー２５１に合成しようとする所望の配列の次のＮＴＰを含む酵素−ＮＴＰ類似体試薬を流すステップと；所望のポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返すステップとを含むことができる。所望のポリヌクレオチドが合成された後に、それを反応チャンバーアンカーまたは基質から遊離させ、排出チャネル２５９もしくは他の手段を介して回収することができる。
【００５８】
特定の態様において、ＮＴＰ類似体、ＴｄＴおよび／もしくは他の酵素を含めた試薬および化合物、ならびにリンカー／阻害剤切断および／もしくは洗浄用の試薬を、インクジェット印刷技術またはピエゾ電気ドロップオンデマンド（ＤＯＤ）インクジェット印刷技術使用して反応チャンバー内に堆積させることができる。インクジェット印刷技術を使用して液滴を形成することができ、その液滴を、空気によって反応チャンバー内に堆積させることができる。試薬液滴は、ピコリットル〜ナノリットル規模の体積を有することができる。液滴は、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、１ｋＨｚ、２ｋＨｚおよび２．５ｋＨｚを含めた種々の周波数でインクジェット印刷技術を使用して導入することができる。様々な試薬を、インクジェット印刷デバイス内部の別々の貯蔵槽に保管することができ、インクジェット印刷デバイスは、例えば、異なる反応チャンバーまたはチップ内のウェルを含めた様々な離れた位置に様々な試薬の液滴を送達することができる。特定の実施形態において、インクジェットおよび微小流体技術は、組み合わせることができ、特定の試薬および化合物をインクジェット印刷技術を介して反応チャンバーに送達し、他方で他を微小流体チャネルまたは管によって送達する。インクジェット印刷デバイスは、処理装置と結合された、少なくとも非一時的で、有形の記憶装置を含む計算デバイスによって制御することができる。計算デバイスは、例えば、タッチスクリーン、マウスもしくはキーボードを含めた入力デバイスからの入力を受信し、インクジェット印刷デバイスが試薬の液滴を堆積させる時間と場所、堆積させる試薬および／または堆積させる試薬の量を制御するように操作可能であり得る。
【００５９】
特定の例において、所望のポリヌクレオチド配列を、入力デバイスよって計算デバイスに入れることができ、計算デバイスは、上記の通り適当な順序で、適当なＮＴＰ類似体、酵素、切断試薬および洗浄試薬を連続して堆積させることにより所望のポリヌクレオチド配列を産生するために必要な反応を実行するように操作可能である。
【００６０】
合成後に、遊離した伸長産物を高分離能ＰＡＧＥによって分析して、イニシエーターが、対照と比較して予想された塩基数まで伸長されたかどうか決定することができる。回収した合成ＤＮＡの一部はまた配列決定され、合成されたポリヌクレオチドが予想された配列のものかどうか決定することもできる。
【００６１】
合成機は、比較的単純であり、ホスホラミダイト合成に必要な有毒成分を必要としないので、本発明の合成機は、研究機関、生命技術者（ｂｉｏｔｅｃｈ）および病院にとって広く利用できることになる。さらに、試薬を再使用／再利用できることは、産生される廃棄物を減少させ、消耗品の費用を減少させるのに役立つことになる。発明者らは、本方法およびシステムが、多数の適用、例えばＤＮＡ配列決定、ＰＣＲおよび合成生物学に有用であることを予想する。
参照による援用
【００６２】
他の文書、例えば特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツへの参照および引用が、本開示の全体を通じて行われた。そのような文書の全ては、全ての目的のためにその全体をここで参照により本明細書において援用する。
等価物
【００６３】
本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な改変ならびにその多くのさらなる実施形態は、本明細書に引用した科学および特許文献への言及を含めたこの文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書における主題は、その様々な実施形態およびその等価物における本発明の実施に適合し得る重要な情報、例示および指針を含有する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月10日(2017.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017525391000001.app
【国際調査報告】
2017525391.tif 000050
2017525391.tif 000051
2017525391.tif 000052
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