(57)【要約】ナノ粒子の表面に結合された、密集した高配向ポリヌクレオチド鎖から成る球状核酸（ＳＮＡ）は、核酸送達の典型的な課題を克服することができる。本開示は、Ｇに富むＳＮＡが、他のヌクレオチドに富むＳＮＡと比較して、数倍高い細胞内取り込みを示すことを示す。本開示は、他のナノ粒子系に適用可能であり、そのため、治療薬のナノ粒子に基づく細胞内送達のための重要な設計配慮を確立する、ＳＮＡの細胞内送達を最大にするための効率的な戦略を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドおよびドメインで官能基化されたナノ粒子であって、前記ドメインが、（ｉ）ナノ粒子に対して末梢側のポリヌクレオチドの終端に位置し、（ｉｉ）少なくとも５０％、ただし１００％未満のグアニル酸であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記ナノ粒子。
【請求項２】
ドメインがポリヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
ドメインがポリヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
ドメインがポリヌクレオチド内の内部領域に位置する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
ドメインが約２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
ドメインが少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
Ｘがデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
Ｘがアデニル酸、チミジル酸、ウリジル酸、またはシチジル酸である、請求項６または請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
Ｘが修飾ヌクレオチドである、請求項６〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
追加のポリヌクレオチドで官能基化された、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
追加のポリヌクレオチドがドメインを含んでなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
ドメインが２つ以上のグアニル酸を含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
ドメインが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のグアニル酸ヌクレオチドを含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
追加のポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
追加のポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド官能基化ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させる方法であって、
ドメインを欠くオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子と比較して、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させるドメインをさらに含んでなるように、ナノ粒子を修飾する段階、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１９】
ドメインが２つ以上のグアニル酸を含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ドメインが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のグアニル酸ヌクレオチドを含んでなるポリＧ配列を含んでなる、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ドメインがポリヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ドメインがポリヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ドメインがポリヌクレオチド内の内部領域に位置する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ドメインがポリヌクレオチドと共線的である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子が請求項１〜１７のいずれか一項に記載のナノ粒子である、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／０８３，０９２号の優先権の利益を請求するものであり、前記米国仮特許出願の開示はその全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
政府利益に関する陳述
本発明は、空軍科学研究局によって授与された助成金第ＦＡ９５５０−１１−１−０２７５号；並びにアメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｕ５４ＣＡ１５１８８０号および第Ｕ５４ＣＡ１５９３４１号を基に、政府援助を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
電子ファイルで提出された資料の参照による援用
本願は、個別の開示部分として、その全体が参照によって援用され、以下と確認される、コンピュータで読み込み可能な形式の配列表を含む：ファイル名：２０１４−１８３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；１０，０７０バイト、作成日２０１５年１１月２０日。
【０００４】
本開示は、ポリヌクレオチドで表面を官能基化された球状核酸（ＳＮＡ）ナノ粒子、および、細胞によるＳＮＡナノ粒子の取り込みに影響を与えるヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００５】
球状核酸ナノ粒子複合体（ＳＮＡ）は、直鎖状核酸と比較して根本的に異なる特性を示す、バイオナノマテリアルの１つのクラスである。ＳＮＡは、ナノ粒子コアの表面上に密に詰め込まれた高配向オリゴヌクレオチド鎖から構成される［Cutler et al., J Am Chem Soc 134: 1376-1391 (2012)］。一本鎖ＤＮＡと異なり、ＳＮＡは、それらの高い負電荷にもかかわらず、陽イオン性または親油性のトランスフェクション剤に頼らずに哺乳類細胞に自然に進入することができる［Rosi et al.,Science 312: 1027-1030 (2006)］。ＳＮＡのロバストな細胞内取り込み特性は、陽イオン性または親油性の作用剤に伝統的に付随する毒性または免疫応答を持たない[Massich et al., MolPharm 6: 1934-1940 (2009)]、細胞内診断ツール[Seferoset al., J Am Chem Soc 129:15477-15479 (2007)]および遺伝子制御ツール[Giljohannet al., J Am Chem Soc 131:2072-2073 (2009)]の開発に、可能性を与える。実際に、ＳＮＡのインビトロおよびインビボにおいて目的遺伝子を制御する能力は実証されている［Zheng et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109: 11975-11980 (2012); Jensen et al., Sci Transl Med 5, 209ra152 (2013)］。
機構研究によって、クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）がそのような構造の認識に関与する主要な細胞受容体であることが特定されており、ＳＲ−ＡへのＳＮＡの結合によって、カベオラ介在性エンドサイトーシスがもたらされる［Choi et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 110: 7625-7630 (2013)］。グアニル酸（Ｇ）に富む直鎖状核酸がＳＲ−Ａによって天然に認識されるが、これは、グアニン四重鎖として知られる二次構造に折り畳まるそれらの能力が原因であると提唱されている［Pearson et al., J Biol Chem268: 3546-3554 (1993)］。対照的に、アデニル酸（Ａ）、チミジル酸（Ｔ）、およびシチジル酸（Ｃ）の直鎖状重合体は、ＳＲ−Ａによって認識される二次構造に折り畳まれないため、天然リガンドではない［Pearson et al., J Biol Chem268: 3546-3554 (1993)］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cutler et al., J Am ChemSoc 134: 1376-1391 (2012)
【非特許文献２】Rosi etal., Science 312: 1027-1030 (2006)
【非特許文献３】Massich etal., Mol Pharm 6: 1934-1940 (2009)
【非特許文献４】Seferos etal., J Am Chem Soc 129:15477-15479 (2007)
【非特許文献５】Giljohann etal., J Am Chem Soc 131:2072-2073 (2009)
【非特許文献６】Zheng et al., Proc Natl AcadSci U.S.A. 109: 11975-11980 (2012)
【非特許文献７】Jensen et al., SciTransl Med 5, 209ra152 (2013)
【非特許文献８】Choi et al., Proc Natl AcadSci U.S.A. 110: 7625-7630 (2013)
【非特許文献９】Pearson et al., J BiolChem 268: 3546-3554 (1993)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それらの多価構造により、ＳＮＡの細胞性相互作用は、ナノ構造のサイズにだけでなく、リガンド提示にも依存している［Giljohann et al.,Nano Lett 7: 3818-3821 (2007)］。理論に束縛されるものではないが、ＳＮＡ構造がこの二次構造形成を模倣していることから、ＳＮＡは補助的なトランスフェクション剤無しに細胞に進入することができると考えられている。さらに、本開示は、オリゴヌクレオチド配列がＳＮＡのＳＲ−Ａとの相互作用および後の細胞取り込みにおいて重要な役割を担うと規定している。
【０００８】
従って、本明細書において、ドメインが、（ｉ）ナノ粒子に対して末梢側のポリヌクレオチドの終端に位置し、（ｉｉ）少なくとも５０％、ただし１００％未満のグアニル酸であるヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチドおよびドメインで官能基化されたナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、ドメインはポリヌクレオチドの５’末端に位置する。さらなる実施形態では、ドメインはポリヌクレオチドの３’末端に位置する。さらに別の実施形態では、ドメインはポリヌクレオチド内の内部領域に位置する。種々の実施形態において、ドメインは約２〜約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。さらに別の実施形態では、ドメインは少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフを含んでなる。いくつかの実施形態では、Ｘはデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｘはアデニル酸、チミジル酸、ウリジル酸、またはシチジル酸である。いくつかの実施形態では、Ｘはグアニル酸である。いくつかの実施形態では、Ｘはグアニル酸ではない。さらなる実施形態では、Ｘは修飾ヌクレオチドである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は追加のポリヌクレオチドで官能基化される。さらなる実施形態では、追加のポリヌクレオチドはドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、追加のポリヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、追加のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【００１０】
種々の実施形態において、ドメインは２つ以上のグアニル酸を含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）ヌクレオチド配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ドメインは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のグアニル酸ヌクレオチドを含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）配列を含んでなる。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、ドメインを欠くオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子と比較して、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させるドメインをさらに含んでなるようにナノ粒子を修飾する段階を含んでなる、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、ドメインは２つ以上のグアニル酸を含んでなるポリグアニル酸（ポリＧ）ヌクレオチド配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ドメインは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のグアニル酸ヌクレオチドを含んでなるポリＧ配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ドメインはポリヌクレオチドの５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ドメインはポリヌクレオチドの３’末端に位置する。さらに別の実施形態では、ドメインはポリヌクレオチド内の内部領域に位置する。いくつかの実施形態では、ドメインはポリヌクレオチドと共線的である。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【００１２】
本開示の方法のいずれも、本明細書にて開示されるオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子を用いて実行されると考えられる。
【００１３】
本開示のさらなる態様において、ポリヌクレオチドの遠位末端が少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフを含んでなる配列において終結している、ポリヌクレオチドで官能基化されたナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフはポリヌクレオチドの５’末端に位置する。さらなる実施形態では、少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフはポリヌクレオチドの３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、Ｘはデオキシリボヌクレオチドであり、さらなる実施形態では、Ｘはリボヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、Ｘはアデニル酸、チミジル酸、ウリジル酸、またはシチジル酸である。いくつかの実施形態において、Ｘが修飾ヌクレオチドであることも、本開示により企図されている。
【００１４】
種々の実施形態において、ナノ粒子は追加のポリヌクレオチドで官能基化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはＲＮＡである。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００１５】
本開示のいずれの態様または実施形態においても、ＳＮＡは正味の負電荷を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドの遠位末端（すなわち、ナノ粒子に対して官能基化された末端の逆末端）が少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフを含んでなる配列において終結するようにポリヌクレオチドを修飾する段階を含んでなり、前記修飾を欠くオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子と比較して、前記修飾を含んでなるオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の取り込みが増加される、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフはポリヌクレオチドの５’末端に位置する。さらなる実施形態では、少なくとも３つの（ＧＧＸ）モチーフはポリヌクレオチドの３’末端に位置する。さらなる実施形態では、ナノ粒子は追加のポリヌクレオチドで官能基化される。関連の実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはＲＮＡである。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／または追加のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞である。さらなる実施形態では、細胞は真核細胞である。関連の実施形態において、真核細胞はヒト細胞である。
【００１７】
本開示はまた、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、適切な条件下で標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするために標的ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的な配列を含んでなる、方法を提供する。さらなる実施形態では、追加のポリヌクレオチドは、適切な条件下で標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするために標的ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的な配列を含んでなる。関連の実施形態において、ハイブリダイゼーションは標的ポリヌクレオチドの検出をもたらす。さらに別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは標的遺伝子発現の阻害をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１ａ〜１ｂはＳＮＡの特徴付けを示している。１ａ）表は、蛍光ベースのアッセイを用いた、１０ｎｍ金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの積載の列挙である。ポリＴ  ＳＮＡは全ての核酸塩基種類の中で最高の積載を含有し、一方、ポリＡ  ＳＮＡは最低の積載を有する。１ｂ）酢酸ウラニルによるＳＮＡの染色が、ＴＥＭイメージングにより、金ナノ粒子コア（黒色）の周囲のＤＮＡオリゴヌクレオチド殻（白色）を明確に示している。殻の厚さは、蛍光ベースのアッセイから得られたオリゴヌクレオチド積載データと相関している。スケールバー＝５０ｎｍ。
【図１Ｂ】同上。
【図２】図２は動的光散乱解析を示している。１０ｎｍ  ＡｕＮＰの表面上への異なる核酸塩基種類から構成されるオリゴヌクレオチド鎖の共有結合は、流体力学的径を１０〜１５ｎｍ増加させ、これは、オリゴヌクレオチド殻が５〜８ｎｍの厚さであることを示す。
【図３】図３はＳＮＡのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを示している。ＡｕＮＰコアに対するＤＮＡオリゴヌクレオチド殻の共有結合は、殻を構成する核酸塩基種類にかかわらず、無修飾クエン酸被覆ＡｕＮＰにおける５１９ｎｍから５２４ｎｍへの、表面プラズモンピークの赤方偏移を引き起こす。
【図４Ａ】図４ａ〜４ｂはオリゴヌクレオチド積載の測定を示している。４ａ）Ｃｙ５標識ＳＮＡを用いて、ポリＡ、ポリＴ、ポリＣ、およびポリＧ  ＳＮＡの積載を定量化した。１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加によるＡｕ−チオール結合の減少は、ＡｕＮＰの表面からＣｙ５標識一本鎖ＤＮＡ（Ｃｙ５−ｓｓＤＮＡ）を遊離させ、Ｃｙ５蛍光による定量化を可能にさせる。４ｂ）Ｃｙ５部分は構成要素であるオリゴヌクレオチドの５’末端に結合している。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】図５ａ〜５ｃはＳＮＡの細胞取り込みを示している。５ａ）ポリＧ  ＳＮＡは、他の核酸塩基種類から構成されるＳＮＡよりも４〜１０倍高い、Ｃ１６６細胞との最高の結合を示す。５ｂ）ＴＥＭイメージングによって、ポリＧ  ＳＮＡは、大クラスター（＞１００／クラスター）としての細胞質ゾル全体にわたるそれらの広範な分布から明らかなように、Ｃ１６６細胞内での最高の蓄積を示す。対照的に、他の核酸塩基種類から構成されるＳＮＡは、細胞質ゾルのより狭い領域に蓄積するか、あるいは、より少ない粒子（＜２０粒子／クラスター）を含有するクラスターとして現れる。下段は上段の四角で囲まれた領域の拡大像を示している。５ｃ）ポリＧ  ＳＮＡも、ＳＲ−Ａの発現レベルの降順で、ＨａＣａＴ（不死ヒトケラチノサイト）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、およびＡ５４９（ヒト肺上皮腺癌）を含む、Ｃ１６６以外の３つの他の細胞株と、最高の結合を示す。全ての細胞型において、ポリＧ  ＳＮＡは、他の核酸塩基種類のＳＮＡよりも、３〜５倍より高い細胞との結合を示す。ポリＧ  ＳＮＡの細胞との結合は、同一細胞型において、ＳＲ−Ａの発現レベルと正に相関する。エラーバーはトリプリケート測定からの標準偏差を示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】図６ａ〜６ｂは取り込みのポリＧ殻への依存を示している。６ａ）共焦点顕微鏡により、ポリＧＱＤ−ＳＮＡ（赤色）は、ＴリッチＱＤ−ＳＮＡと比較して、Ｃ１６６細胞におけるより高い蓄積を示している。スケールバー＝１０μｍ。６ｂ）ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡ並びにＴリッチＱＤ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡで処理されたＣ１６６細胞における金およびカドミウム含量のＩＣＰ−ＭＳ解析は、ＴリッチＱＤ−ＳＮＡと比較してポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡが細胞に優先的に進入すること、および、ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡと比較してポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡが細胞に優先的に進入すること、を示している。エラーバーは３つの独立した実験からの標準偏差を示している。
【図６Ｂ】同上。
【図７Ａ】図７ａ〜７ｄは、オリゴヌクレオチド鎖の長さがＳＮＡの細胞内取り込みに影響することを示している。７ａ）オリゴヌクレオチド構成物の５’末端におけるグアニル酸（Ｇ）含量の増加は、ＳＮＡのＣ１６６細胞との細胞結合を増加させる。ポリＴ（Ｔ３０）ＳＮＡと比較した場合、最低４つのＧＧＴ反復単位がＳＮＡの細胞結合を増強するために必要である。７ｂ）オリゴヌクレオチド構成物の途中でのＧＧＴ反復単位の埋没は、細胞結合の増強を無効にする。白四角で示される配列は配列番号２７である。白三角で示される配列は配列番号２８である。他の配列は全て本明細書に記載されている。７ｃ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド構成物の５’末端におけるｄスペーサー単位（核酸塩基を有さない）の増加は、ＳＮＡの細胞結合を７５％まで低下させる。７ｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド構成物の５’末端におけるＣ３スペーサー単位（核酸塩基もリボースも有さない）の増加は、ＳＮＡの細胞結合を７５％まで低下させる。エラーバーはトリプリケート測定からの標準偏差を示す。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図８Ａ】図８ａ〜８ｆはＣＰＴ−ＳＮＡを用いたカンプトテシン分子の送達を示している。８ａ）文献の前例により、カンプトテシン分子（ＣＰＴ）の−ＯＨ基を短い二官能性リンカーによって修飾することで、カンプトテシンアジド（ＣＰＴ−Ｎ３）が形成される［Parrish et al., Bioconjugate Chem. 18:263-267 (2006)］。次に、銅を用いないクリックケミストリーによってＣＰＴ−Ｎ３をジベンゾシクロオクチル−ＤＮＡ−チオール（ＤＢＣＯ−ＤＮＡ−ＳＨ）に結合させることで、カンプトテシン−ＤＮＡ−チオール（ＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨ）が形成される。ＤＣＣ＝Ｎ’Ｎ’−ジシクロヘキソカルボジイミド、ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン、ＣＨ２Ｃｌ−２＝ジクロロメタン、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド。８ｂ）４４０ｎｍにおけるＣＰＴの蛍光発光に基づく測定により、４つ全ての核酸塩基種類のＣＰＴ−ＳＮＡが、粒子当たり５５±１５個のＣＰＴ分子を含有するが判明した。８ｃ）ＣＰＴ−ＳＮＡで処理されたＡ５４９細胞の金含量のＩＣＰ−ＭＳ解析によれば、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、試験された全ての核酸塩基種類の中で最も多い量で、細胞に進入することが可能である。ＣＰＴ−ＳＮＡ（少なくともＡｕＮＰコア）は、処理の後は細胞から離れないようである。エラーバーはトリプリケート測定からの標準偏差を示す。８ｄ）共焦点画像解析によると、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、試験された全ての核酸塩基種類のＣＰＴ−ＳＮＡの中で最も多い量で、ＣＰＴ分子（緑色）をＡ５４９細胞内に送達することが可能である。青色＝核。スケールバー＝２０μｍ。ＭＴＴアッセイ（８ｅ）およびヨウ化プロピジウム染色によって裏付けられたフローサイトメトリー解析（８ｆ）によると、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡはまた、試験された全ての核酸塩基種類のＣＰＴ−ＳＮＡの中で最も細胞傷害性である。エラーバーは４つの測定からの標準偏差を示す。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図９Ａ】図９ａ〜９ｄはＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨの合成を示している。９ａ）カンプトテシン−アジド（ＣＰＴ−Ｎ３）の１Ｈ  ＮＭＲ。９ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ解析によると、ＤＮＡ鎖の分子量は、ジベンゾシクロオクチルテトラエチレングリコールリンカー（ＤＢＣＯ−ＴＥＧ；Ｆ．Ｗ．：５７０．６；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）での修飾後に期待された量だけ増加する。ＤＢＣＯ−ＤＮＡ−ＳＨの分子量は、ＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨを形成させるための銅を用いないクリック共役によるＣＰＴ−Ｎ３（Ｆ．Ｗ．：４８７．５）との反応後に、期待された量だけさらに増加する。Ａ３０ＤＮＡのＤＢＣＯおよびＣＰＴとの結合について、代表的なスペクトルが示される。９ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより測定された分子量は期待分子量と一致する。９ｄ）４種のＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨ鎖の配列情報（表４にも示される）。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図１０】図１０はＭＴＴアッセイによる細胞生存率を示している。ＣＰＴ分子無しでは、ポリＡ  ＳＮＡ、ポリＴ  ＳＮＡ、ポリＣ  ＳＮＡ、およびポリＧ  ＳＮＡは、ＭＴＴアッセイによると、２０ｎＭ  ＳＮＡで処理されたＡ５４９細胞に対して４〜７日後に特記すべき細胞毒性を示さない。この負の対照は、ＣＰＴ−ＳＮＡによって誘導されるあらゆる観察可能な細胞毒性が、ＳＮＡ構築物ではなく、ＣＰＴ分子に由来することを示した。報告された値は、３つの独立した実験の、平均値±平均値からのＳＥを表す。
【図１１】図１１は活性化カスパーゼ３の検出についてのＥＬＩＳＡ結果を示している。様々な種類のＣＰＴ−ＳＮＡによるＡ５４９細胞の処理後、ＣＰＴ−（ＧＧＴ）１０ＳＮＡは、ＣＰＴ−Ａ３０ＳＮＡ、ＣＰＴ−Ｔ３０ＳＮＡ、およびＣＰＴ−（ＣＣＴ）１０ＳＮＡよりも、アポトーシス性シグナル伝達タンパク質であるカスパーゼ３の有意により高い活性化を誘導する。報告された値は、３つの独立した実験の、平均値±平均値からのＳＥを表す。
【図１２】図１２は、ポリＧ  ＳＮＡが、ポリＡ、ポリＴ、およびポリＣ  ＳＮＡよりも、Ｃ１６６細胞とのより高い細胞結合を示すことを示している。
【図１３】図１３はＳＮＡの細胞内取り込みを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ナノ粒子の表面に結合された、密集した高配向オリゴヌクレオチド鎖から成る球状核酸（ＳＮＡ）は、核酸送達の典型的な課題を克服することができる。ＳＮＡは、補助的なトランスフェクション剤の使用無しに５０の異なる細胞型に効率的に進入し、最小限の細胞毒性を示すことが示されている。近年、これらの構造体のエンドサイトーシスの機構が、クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）に依存していることが示された。本開示は、そのオリゴヌクレオチド鎖構成物がグアニル酸（Ｇ）に富むＳＮＡを構築することによる、ＳＲ−Ａとポリ（グアニル酸）オリゴヌクレオチド鎖との相互作用の活用に関し、細胞内へのＳＮＡの取り込みを最大にする。
【００２０】
従って、本開示は、オリゴヌクレオチドが細胞内取り込みを調節するドメインをさらに含んでなる、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の有用性を示す。本明細書で使用される場合、「ドメイン」は核酸塩基の配列であると理解される。本明細書で定義される修飾核酸塩基も、本明細書において提供されるドメインを構築すると企図される。一態様において、ドメインは、ナノ粒子上で官能基化されたオリゴヌクレオチドと共線的である。別の態様では、ドメインはナノ粒子と直接結合しており、ナノ粒子上で官能基化されたオリゴヌクレオチドとの結合を欠く。さらに別の態様では、ドメインはスペーサーを介してナノ粒子と結合しており、ナノ粒子上で官能基化されたオリゴヌクレオチドとの結合を欠く。言い換えれば、いくつかの実施形態において、ドメインは、オリゴヌクレオチドとのいかなる結合からも切り離されて、スペーサーを介してナノ粒子と結合している（そのような実施形態では、従って、スペーサーは核酸塩基を含まない）。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。従って、例えば、「Ａ」はアデニル酸であり、「Ｔ」はチミジル酸であり、「Ｃ」はシチジル酸であり、「Ｇ」はグアニル酸であり、「Ｕ」はウリジル酸である。
【００２２】
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数形の照応（plural reference）を含む。
【００２３】
本明細書で使用される場合、ＳＮＡ上で官能基化された、または標的分子としての、用語「ポリヌクレオチド」は、用語オリゴヌクレオチドと同義的に使用され、これらの用語は当該技術分野において受け入れられる意味を有する。
【００２４】
なお、さらに、用語「結合した（attached）」、「共役した（conjugated）」および「官能基化された（functionalized）」も、本明細書においては同義的に使用され、オリゴヌクレオチドまたはドメインとナノ粒子との結合を指す。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン・クリックＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、または当該技術分野において公知の他の配列特異的結合の法則に従う、２本または３本の核酸鎖間の水素結合による相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、当該技術分野において公知の様々なストリンジェンシー条件下で実行することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ポリＸ」ドメイン（「Ｘ」はグアニル酸等のヌクレオチドである）は、その長さにわたって５０％を超えるが１００％未満の「Ｘ」を含んでなる配列である。例として、３０ヌクレオチド長であるポリグアニル酸（ポリＧ）ドメインは、少なくとも１５個（ただし３０個未満）のグアニル酸ヌクレオチドから成る。従って、本明細書で使用される場合、「ポリＸ」ドメインはホモポリマー配列ではない。
【００２７】
ナノ粒子
ナノ粒子に結合したポリヌクレオチドを有するように官能基化されたナノ粒子が提供される。概して、企図されるナノ粒子は、例えば、限定はされないが、金属、半導体、リポソーム粒子、絶縁体粒子成分、およびデンドリマー（有機物対無機物）を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの高い積載能力を有するあらゆる化合物または物質を包含する。
【００２８】
従って、種々の無機材料、例えば、限定はされないが、米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載の金属、半導体材料またはセラミックス、を含んでなるナノ粒子が企図される。例えば、金属ベースのナノ粒子には本明細書に記載のものが含まれる。セラミックナノ粒子材料としては、限定はされないが、ブラッシュ石、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカ、およびジルコニアが挙げられる。ナノ粒子が生産される有機材料としては炭素が挙げられる。ナノ粒子ポリマーとしては、ポリスチレン、シリコンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテル、およびポリエチレンが挙げられる。生分解性の生体高分子（例えば、ＢＳＡ等のポリペプチド、多糖類等）、他の生体物質（例えば、炭水化物）、および／または高分子化合物も、ナノ粒子を生産する際の使用に企図される。例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８４２９（参照によってその全体が本明細書に援用される）において開示されたリポソーム粒子も企図される。例えば米国特許公開番号２０１２／０２８２１８６（参照によってその全体が本明細書に援用される）において開示された中空粒子もまた本明細書において企図される。
【００２９】
一つの実施形態において、ナノ粒子は金属性であり、種々の態様において、ナノ粒子はコロイド金属である。従って、種々の実施形態において、前記方法の実施において有用なナノ粒子としては、金属（例えば、限定はされないが、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成に適した他のあらゆる金属を含む）、半導体（例えば、限定はされないが、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆したＣｄＳまたはＣｄＳｅを含む）並びに磁性（例えば、強磁鉄鉱（ferromagnetite））コロイド物質が挙げられる。本発明の実施において有用な他のナノ粒子としては、限定はされないが、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、鋼、コバルトクロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓも挙げられる。また、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子を作製する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32,41 (1993); Henglein, Top. Curr.Chem., 143, 113 (1988); Henglein, Chem. Rev., 89,1861 (1989); Brus, Appl. Phys. A., 53, 465 (1991); Bahncmann, Photochemical Conversion and Storage of SolarEnergy (eds. Pelizetti and Schiavello 1991), page251; Wang and Herron, J. Phys. Chem., 95, 525 (1991); Olshavsky,et al., J. Am. Chem. Soc., 112, 9438 (1990); Ushidaet al., J. Phys. Chem., 95, 5382 (1992)を参照されたい。
【００３０】
実際には、複合体形成、すなわち、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを妨げない、粒子に結合したオリゴヌクレオチドを有するあらゆる適切な粒子を用いる、細胞内取り込みを増加させ遺伝子発現を阻害する方法が提供される。粒子のサイズ、形状および化学組成は、得られるオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の性質に寄与する。これらの性質としては、例えば、光学的性質、光電子工学的性質、電気化学的性質、電子工学的性質、種々の溶液中の安定性、磁気的性質、およびポアおよびチャネルのサイズ多様性が挙げられる。異なるサイズ、形状および／または化学組成を有する粒子の混合物の使用、並びに均一なサイズ、形状および化学組成を有するナノ粒子の使用が企図される。適切な粒子の例としては、限定はされないが、ナノ粒子、凝集粒子、等方性粒子（例えば、球状粒子）および異方性粒子（例えば、非球形の棒状体、四面体、角柱）、並びにコアシェル粒子、例えば、２００２年１２月２８日に出願された米国特許出願番号第１０／０３４，４５１号および２００２年１２月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号（その開示はその全体が参照によって援用される）に記載されるコアシェル粒子、が挙げられる。
【００３１】
金属、半導体および磁性ナノ粒子を作製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、Schmid, G. (ed.)Clusters and Colloids (VCH, Weinheim, 1994); Hayat,M. A. (ed.) Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications (AcademicPress, San Diego, 1991); Massart, R., IEEETransactions On Magnetics, 17, 1247 (1981); Ahmadi, T. S. et al., Science, 272,1924 (1996); Henglein, A. et al., J. Phys. Chem., 99,14129 (1995); Curtis, A. C., et al., Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 27, 1530 (1988)を参照されたい。Fattal, et al., J. Controlled Release(1998) 53: 137-143および米国特許第４，４８９，０５５号には、作製されたポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の作製が記載されている。Liu, et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126:7422-7423には、ポリ（Ｄ−グルカラミドアミン）を含んでなるナノ粒子を作製するための方法が記載されている。Tondelli, et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5425-5431には重合メチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含んでなるナノ粒子の作製が記載されており、例えばKukowska-Latallo,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:4897-4902にはデンドリマーナノ粒子の作製（星型ポリアミドアミンデンドリマー）が記載されている。
【００３２】
適切なナノ粒子はまた、例えば、テッド・ペラ社（Ted Pella, Inc.）（金）、アマシャム社（Amersham Corporation）（金）およびナノプローブス社（Nanoprobes, Inc.）（金）から市販されている。
【００３３】
また、米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載のように、本明細書に記載の材料を含んでなるナノ粒子は、市販されているか、または、溶液中の漸進的核形成から（例えば、コロイド反応によって）、もしくはスパッタ堆積等の種々の物理的および化学的な蒸着工程によって、生成することができる。例えば、HaVashi, (1987)Vac. Sci. Technol. July/August 1987, A5(4):1375-84; Hayashi, (1987) PhysicsToday, December 1987, pp. 44-60; MRS Bulletin, January 1990, pgs. 16-47を参照されたい。
【００３４】
米国特許出願第２００３０１４７９６６号においてさらに記載されているように、企図されるナノ粒子は、当該技術分野において公知の方法を用いて、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸塩−還元剤を用いて作製される。例えば、Marinakos et al.,(1999) Adv. Mater. 11: 34-37; Marinakos et al.,(1998) Chem. Mater. 10: 1214-19; Enustun & Turkevich, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 3317を参照されたい。約１４０ｎｍの分散した凝集粒子サイズを有する酸化スズナノ粒子が、真空冶金株式会社（Vacuum Metallurgical Co., Ltd.）（千葉、日本）から市販されている。種々の組成およびサイズ範囲の他の市販のナノ粒子が、例えば、ベクター・ラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Inc.）（バーリンゲーム、カリフォルニア州）から入手可能である。
【００３５】
ナノ粒子は、平均径約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均径約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均径約１ｎｍ〜約１０ｎｍのサイズ範囲を取り得る。他の態様では、ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜１５０ｎｍ、約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約５０ｎｍである。ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。方法で使用されるナノ粒子のサイズは、それらの特定の用途または適用による要件に応じて変動する。サイズの変動は、ナノ粒子のある種の物理的特徴、例えば、光学的性質または本明細書に記載されるように官能基化され得る表面積の量、を最適化するために有利に使用される。
【００３６】
オリゴヌクレオチド
用語「ヌクレオチド」またはその複数形は、本明細書で使用される場合、本明細書において考察される修飾形態または当該技術分野において公知のその他の修飾形態と互換的である。ある特定の場合では、自然発生的なヌクレオチド、および修飾ヌクレオチドを含む非自然発生的ヌクレオチドを包含する用語「核酸塩基」が、当該技術分野において使用される。従って、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、自然発生的な核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびＵを意味する。非自然発生的核酸塩基としては、例えば、限定はされないが、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン（ethanocytosin）、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、偽イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにBenner et al.、米国特許第５，４３２，２７２号およびSusan M. Freier and Karl-Heinz Altmann,1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443に記載される「非自然発生的」核酸塩基が挙げられる。また用語「核酸塩基」には、公知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、そのヘテロ環式類似体および互変異性体も包含される。さらに、自然発生的核酸塩基および非自然発生的核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Merigan, et al.）、Sanghviによる第１５章、AntisenseResearch and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu,CRC Press, 1993、Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722（特に６２２頁および６２３頁を参照、並びにConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859,Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607（これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される）において開示されるものが包含される。種々の態様において、ポリヌクレオチドはまた、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能するある特定の「ユニバーサル塩基（universal base）」を含む、核酸塩基のように機能することができるヘテロ環式化合物等の化合物を含む非自然発生的ヌクレオチドの分類である、一つまたは複数の「ヌクレオシド塩基」または「基本単位（base unit）」を含む。ユニバーサル塩基としては、３−ニトロピロール、所望により置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および所望により置換されたヒポキサンチンが挙げられる。他の望ましいユニバーサル塩基としては、当該技術分野において公知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体が挙げられる。
【００３７】
修飾ヌクレオチドは欧州特許第１０７２６７９号および国際公開第９７／１２８９６号（それらの開示は参照によって本明細書に援用される）に記載されている。修飾核酸塩基としては、限定はされないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらに、修飾塩基として、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ形クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環と置き換えられたもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン、も包含され得る。さらなる核酸塩基として、米国特許第３，６８７，８０８号に記載されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley &Sons, 1990にて開示されたもの、Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613によって開示されたもの、およびSanghvi, Y. S.,Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T.and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993によって開示されたものが挙げられる。これらの塩基のうちある特定のものは、結合親和性の増加に有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換体は、核酸の二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており、ある態様においては、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる。米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号；同���５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；同第５，７５０，６９２号および同第５，６８１，９４１号（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【００３８】
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)およびF. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (OxfordUniversity Press, New York, 1991)を参照されたい。ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方において、固相合成法が好ましい（ＤＮＡを合成する周知の方法はＲＮＡの合成においても有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素によって作製することもできる。なお、非自然発生的核酸塩基をポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号；Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al.,J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949(1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem.Soc., 127:74-75 (2005)；およびZimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685(2002)を参照されたい。
【００３９】
ポリヌクレオチド、またはその修飾形態、および本明細書において定義されるドメインで官能基化された提供されるナノ粒子は、概して、約５ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含んでなる。より具体的には、ナノ粒子は、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約１０ヌクレオチド長のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが所望の結果を達成する限りにおいて、具体的に開示されたサイズの中間の長さである全てのポリヌクレオチドで官能基化される。従って、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００またはそれ以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが企図される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子に結合したポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡがナノ粒子に結合している場合、いくつかの実施形態では、ナノ粒子に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起こり、それにより標的ポリヌクレオチドがナノ粒子に結合されるように、ＤＮＡはポリヌクレオチドの標的領域に対して十分に相補的な配列から構成される。種々の態様において、二本鎖分子が標的ポリヌクレオチドの一本鎖領域にハイブリダイズする一本鎖領域も含む限り、ＤＮＡは一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様では、ナノ粒子上で官能基化されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、二本鎖標的ポリヌクレオチドとの三重構造を形成し得る。別の態様では、一本鎖標的ポリヌクレオチドに対する、ナノ粒子上で官能基化された二本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、三重構造が形成され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ナノ粒子に結合したポリヌクレオチドがＲＮＡであると企図している。いくつかの態様では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるように、アプタマーも包含する。一般的に、アプタマーは、標的リガンドに強固に結合し、標的リガンドを慎重に区別することが可能な、核酸またはペプチド結合種である［Yan et al., RNA Biol. 6(3) 316-320 (2009)（参照によってその全体が本明細書に援用される）］。いくつかの実施形態では、アプタマーは、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）と称される手法によって得られ得る［Tuerk et al., Science 249:505−10 (1990)、米国特許第５，２７０，１６３号、および米国特許第５，６３７，４５９号（これらはそれぞれその全体が参照によって本明細書に援用される）］。例えば、限定はされないが、Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols(Edited by Mayer, Humana Press, 2009)およびCrawford et al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1): 72−79 (2003)に、核酸アプタマーの一般的な考察が見られる。ＲＮＡアプタマーの選択、ＤＮＡアプタマーの選択、標的タンパク質に共有結合可能なアプタマーの選択、修飾アプタマーライブラリーの使用、並びに、診断用薬および治療薬としてのアプタマーの使用を含むがこれらに限定はされない、アプタマーのさらなる考察が、Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 34, No. 6, 2000, pp. 1097−1113から翻訳されたKopylov et al., Molecular Biology 34(6): 940−954(2000)（その全体が参照によって本ん明細書に援用される）に提供されている。種々の態様において、アプタマーは約１０〜約１００ヌクレオチド長、または約１００〜約５００ヌクレオチド長である。アプタマーの作製および使用は当業者に公知である。
【００４３】
いくつかの態様では、複数のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に対して官能基化される。種々の態様において、複数のオリゴヌクレオチドはそれぞれ同一の配列を有し、一方、他の態様では、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドが異なる配列を有する。さらなる態様では、複数のオリゴヌクレオチドが、縦列をなして配置され、スペーサーによって隔てられている。スペーサーは本明細書の以下においてより詳細に説明される。
【００４４】
ナノ粒子への結合用に企図されるポリヌクレオチドには、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を調節するポリヌクレオチドが包含される。そのようなポリヌクレオチドには、以下に定義される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその修飾形態が包含される。従って、種々の態様において、限定はされないが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして標的ポリヌクレオチドの転写または翻訳の減少を惹起するポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズして転写を阻害する三重らせん体形成ポリヌクレオチド、および、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして翻訳を阻害するリボザイムが企図される。
【００４５】
種々の態様において、特定のポリヌクレオチドが標的とされた場合、一官能基化オリゴヌクレオチド−ナノ粒子組成物が、複数の同一転写物コピーに結合する能力を有する。一態様において、同一のポリヌクレオチドで官能基化された、すなわち、各ポリヌクレオチドが同一の長さおよび同一の配列を有する、ナノ粒子が提供される。他の態様では、ナノ粒子は同一でない２つ以上のポリヌクレオチドで官能基化され、すなわち、結合ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが、異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点において、少なくとも１つの他の結合ポリヌクレオチドと異なる。異なるポリヌクレオチドがナノ粒子に結合している態様において、これらの異なるポリヌクレオチドは、同一の単一標的ポリヌクレオチドに対して、ただし異なる位置において結合するか、あるいは、異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。
【００４６】
ドメイン
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の一部であるドメインは、ナノ粒子が細胞に取り込まれる効率に影響を与えることが示されている。従って、ドメインは、効率を増加させるか、または（ドメインの欠如により）効率を減少させる。本明細書で使用される場合、「効率」とは、細胞における／によるナノ粒子の取り込みの数、量または速度を指す。ナノ粒子が細胞を出入りするプロセスは動的なものであることから、より多くのナノ粒子を取り込むことにより、または、細胞に進入するナノ粒子をより長い期間保持することにより、効率は増加し得る。同様に、より少ないナノ粒子を取り込むことにより、または、細胞に進入するナノ粒子をより短い期間保持することにより、効率は減少し得る。
【００４７】
いくつかの態様では、ドメインはオリゴヌクレオチドの終端に位置する。いくつかの実施形態では、ドメインはオリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、さらなる実施形態では、ドメインはオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ドメインはナノ粒子に対して官能基化されていないオリゴヌクレオチドの終端に位置する。言い換えれば、これらの実施形態では、ドメインはナノ粒子表面に対して末梢側のオリゴヌクレオチドの終端に存在する。さらなる実施形態では、ドメインはナノ粒子表面に対して末梢側のオリゴヌクレオチドの終端に存在し、またドメインは他のあらゆる分子に対する結合を有さない。
【００４９】
いくつかの態様では、ドメインはオリゴヌクレオチドと隣接している／共線的である。いくつかの態様では、ドメインはオリゴヌクレオチド内の内部領域に位置する。さらなる態様では、ドメインはナノ粒子に結合した第二のオリゴヌクレオチド上に位置する。一つの態様では、ナノ粒子に対して官能基化されたオリゴヌクレオチド内に２つ以上のドメインが存在する。従って、いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの５’末端において、および／または３’末端において、および／または内部領域において、２つ以上のドメインが縦列をなして、または個別に、存在する。
【００５０】
別の態様では、いくつかの実施形態では、ドメインはオリゴヌクレオチドとは別の独立体としてナノ粒子に結合していると企図され、すなわち、いくつかの実施形態では、ドメインはオリゴヌクレオチドとは別個にナノ粒子に直接結合している。
【００５１】
さらに、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは本明細書に記載される位置のうちの一つまたは複数に位置する２つ以上のドメインを含んでなると企図される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ドメインは、細胞によるオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の取り込み効率を増加させる。種々の実施形態において、ドメインは、約２〜約１０００、または約２〜約５００、または約２〜約１００、または約２〜約５０、または約２〜約３０、または約２〜約２０、または約２〜約１０、または約５〜約１００、または約５〜約５０、または約５〜約３０、または約５〜約２０、または約５〜約１０、または約１０〜約１００、または約１０〜約５０、または約１０〜約３０、または約１０〜約２０、または約１０〜約１５、または約２０〜約１００、または約２０〜約５０、または約２０〜約４０、または約２０〜約３０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、ドメインは、１００未満、８０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５未満のヌクレオチド長である。本明細書に記載されるように、ドメインは、一連のグアニル酸ヌクレオチド（ポリＧ）を含んでなる。種々の態様において、ドメインは２つのグアニル酸を含んでなる。さらなる態様において、ドメインは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００またはそれ以上のグアニル酸ヌクレオチドを含んでなる。
【００５３】
本開示の種々の態様および実施形態において、ドメインは、グアニル酸ヌクレオチドが少なくとも約５０％であるが１００％未満である配列を含んでなる。従って、いくつかの実施形態では、ドメインは、グアニル酸ヌクレオチドが少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ドメインは、グアニル酸ヌクレオチドが５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満である配列を含んでなる。さらに別の実施形態では、ドメインは、グアニル酸ヌクレオチドが約５０％〜９９％、または約６０％〜９９％、または約６５％〜９９％、または約７０％〜９９％、または約７５％〜９５％、または約８０％〜９９％、または約８５％〜９９％、または約９０％〜約９９％、または約９５％〜約９９％である配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ドメインは、グアニル酸ヌクレオチドが９９％である配列を含んでなる。ホモポリマーグアニル酸配列、すなわち、１００％グアニル酸である配列は、本明細書におけるドメインとしての使用には企図されない。
【００５４】
従って、それぞれ上記されるドメインの可能なヌクレオチド長およびドメイン内に存在するグアニル酸ヌクレオチドの種々の割合を所与として、ドメインの残りのヌクレオチド配列（すなわち、グアニル酸ではないが、ドメインの一部であるヌクレオチド配列）は、あらゆるヌクレオチドまたはその修飾形態であることが企図される。例えば、限定はされないが、いくつかの実施形態において、ドメインは、Ｘがアデニル酸、チミジル酸、ウリジル酸、シチジル酸（またはその修飾形態）であり、ｎが約１〜約５００である、（ＧＧＸ）ｎ配列である。いくつかの実施形態において、Ｘはグアニル酸である（ただし、そのような実施形態では、ドメインはホモポリマーグアニル酸配列ではない）。いくつかの実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドおよびドメインで官能基化されたナノ粒子は、同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子よりも高い効率で、細胞に取り込まれることが企図される。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドおよびドメインで官能基化されたナノ粒子は、同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子よりも１％より効率的に、細胞に取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで官能基化されたナノ粒子は、同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子よりも、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約５５０倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、約８００倍、約８５０倍、約９００倍、約９５０倍、約１０００倍、約１５００倍、約２０００倍、約２５００倍、約３０００倍、約３５００倍、約４０００倍、約４５００倍、約５０００倍、約５５００倍、約６０００倍、約６５００倍、約７０００倍、約７５００倍、約８０００倍、約８５００倍、約９０００倍、約９５００倍、約１００００倍またはそれ以上に高い効率で、細胞に取り込まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ドメインの欠如は、細胞によるオリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の取り込み効率を減少させる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子は、ドメインを含んでなる同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されたナノ粒子よりも低い効率で、細胞に取り込まれることが企図される。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子は、ドメインを含んでなる同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されたナノ粒子よりも１％より低い効率で、細胞に取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドで官能基化されているがドメインを欠くナノ粒子は、ドメインを含んでなる同一のオリゴヌクレオチドで官能基化されたナノ粒子よりも、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約５５０倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、約８００倍、約８５０倍、約９００倍、約９５０倍、約１０００倍、約１５００倍、約２０００倍、約２５００倍、約３０００倍、約３５００倍、約４０００倍、約４５００倍、約５０００倍、約５５００倍、約６０００倍、約６５００倍、約７０００倍、約７５００倍、約８０００倍、約８５００倍、約９０００倍、約９５００倍、約１００００倍またはそれ以上に低い効率で、細胞に取り込まれる。
【００５７】
修飾オリゴヌクレオチド
前述の通り、修飾オリゴヌクレオチドはナノ粒子の官能基化用に企図される。種々の態様において、ナノ粒子上で官能基化されたオリゴヌクレオチドは、完全修飾または部分修飾されている。従って、種々の態様において、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド単位の、一つもしくは複数もしくは全ての糖、並びに／または、一つもしくは複数もしくは全てのヌクレオチド間結合は、「非自然発生的な」基で置換されている。
【００５８】
一態様において、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図している。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格で置換されている。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号、並びにNielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500（これら開示は参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【００５９】
開示されるポリヌクレオチドにおいて企図されるヌクレオチド間および非天然ヌクレオチド間の他の結合としては、以下に記載のものが挙げられる：米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号；米国特許公開第２００４０２１９５６５号；国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号；Mesmaeker et. al.,Current Opinion in Structural Biology 5:343-355 (1995)およびSusan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997)（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）。
【００６０】
オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが挙げられる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格内にリン原子を保持するもの、および、骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であると考えられる。
【００６１】
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、例えば、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びに、一つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’結合、５’−５’結合または２’−２’結合である逆転した極性を有するものが挙げられる。また、３’末端ヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち、塩基脱落（ヌクレオチドが欠如している、またはその場所にヒドロキシル基を有する）であってもよい単一の逆転したヌクレオシド残基、を含んでなる逆転した極性を有するポリヌクレオチドも企図される。塩形態、混合塩形態および遊離酸形態も企図される。
【００６２】
上記のリン含有結合の作製を教示している代表的な米国特許としては以下が挙げられる：米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）。
【００６３】
リン原子を含まない修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；フォルムアセチル（formacetyl）骨格およびチオフォルムアセチル骨格；メチレンフォルムアセチル骨格およびチオフォルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有する他の骨格が包含される。さらに他の実施形態では、ホスホロチオエート骨格およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを有するポリヌクレオチドが提供され、例えば、米国特許第５，４８９，６７７号および同第５，６０２，２４０号に記載される、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−が挙げられる。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号および同第５，６７７，４３９号（これらの開示はその全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【００６４】
種々の形態において、オリゴ内の２つの連続したモノマー間の結合は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２〜４つ、望ましくは３つの基／原子から成り、ここで、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１〜６アルキルおよびフェニルから選択される。このような結合の例示は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（続くモノマーへの結合として使用される場合はＲ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−であり；これらの中で、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨＰ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が企図され、ここで、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１〜６アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示は、Mesmaeker et. al.,1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355およびSusan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol25: pp 4429-4443において与えられる。
【００６５】
米国特許出願第２００４０２１９５６５号（この開示はその全体が参照によって本明細書に援用される）には、ポリヌクレオチドのさらに他の修飾形態が詳細に記載されている。
【００６６】
修飾ポリヌクレオチドは、一つまたは複数の置換された糖部分を含有していてもよい。ある態様では、ポリヌクレオチドは、２’位に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含んでなり、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。他の実施形態には、ｎおよびｍが１〜約１０である、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれる。他のポリヌクレオチドは、２’位に、以下：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物（intercalator）、ポリヌクレオチドの薬物速度論的特性を向上させるための基、またはポリヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含んでなる。一つの態様において、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Martin et al., 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が包含される。他の修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【００６７】
さらに他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−修飾は、アラビノ（arabino）（上方（up））位またはリボ（下方（down））位にあってもよい。一つの態様において、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾が、ポリヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に、または２’−５’連結ポリヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位に、なされてもよい。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の場所にシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号（これらの開示はその全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【００６８】
一つの態様において、糖の修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合することにより二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）が包含される。ある態様では、前記結合は、ｎが１または２である、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋しているメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基である。ＬＮＡおよびその作製は、国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【００６９】
ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチド結合
本方法での使用に企図されるオリゴヌクレオチドには、あらゆる手段を介してナノ粒子に結合したものが包含される。オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合している手段にかかわらず、結合は、種々の態様において、５’結合、３’結合、いくつかの種類の内部結合、またはこれらの結合のあらゆる組合せにより達成される。
【００７０】
結合法は当業者に公知であり、米国特許出願公開第２００９／０２０９６２９号（その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６５８２２（その全体が参照によって本明細書に援用される）には、ＲＮＡをナノ粒子に結合する方法が一般的に記載されている。
【００７１】
従って、ドメインをさらに含んでなるオリゴヌクレオチドがナノ粒子と結合している、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子が、提供される。
【００７２】
スペーサー
ある態様では、オリゴヌクレオチドおよびドメインがスペーサーを介してナノ粒子に結合しているものを含む、官能基化ナノ粒子が企図される。「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、それ自体は遺伝子発現の調節に関与しないが、ナノ粒子とオリゴヌクレオチド官能基との間の距離を増加させる働きをする、または、複数のコピーとしてナノ粒子に結合している場合、個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる働きをする、部分を意味する。従って、スペーサーは、オリゴヌクレオチドが同一の配列を有していようと、あるいは異なる配列を有していようと、個々のオリゴヌクレオチド間に縦列をなして位置していることが企図される。ドメインがナノ粒子に直接結合している本発明の態様において、ドメインは、所望により、スペーサーを介してナノ粒子に対して官能基化されている。別の態様では、ドメインは、スペーサー末端とは反対のオリゴヌクレオチドの末端上に存在する。縦列をなしているドメインがナノ粒子に対して官能基化されている態様において、スペーサーは、所望により、縦列構造のドメイン単位のいくつかまたは全ての間に存在する。一つの態様において、スペーサーは、存在する場合、有機質部分である。別の態様では、スペーサーはポリマーであり、例えば、限定はされないが、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００７３】
ある態様では、ポリヌクレオチドはスペーサーを有し、それを介してナノ粒子に共有結合している。これらのポリヌクレオチドは上記と同じポリヌクレオチドである。ナノ粒子へのスペーサーの結合の結果として、ポリヌクレオチドはナノ粒子の表面から離され、その標的とのハイブリダイゼーションにおいてより利用され易くなる。スペーサーがポリヌクレオチドである場合、スペーサーの長さは、種々の実施形態において、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、またはさらには３０ヌクレオチド超である。スペーサーは、ポリヌクレオチドがナノ粒子または標的ポリヌクレオチドに結合する能力に干渉しない、あらゆる配列を有し得る。ある態様では、ポリヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てアデニル酸、全てチミジル酸、全てシチジル酸、全てグアニル酸、全てウリジル酸、または全ていくつかの他の修飾塩基である。従って、スペーサーが全てグアニル酸から成るいくつかの態様において、スペーサーは本明細書に記載されるようなドメインとして機能することができると企図される。
【００７４】
表面密度
本明細書において提供されるナノ粒子は、種々の態様において、ナノ粒子間および単一のナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間での協同的挙動をもたらすのに十分な、ナノ粒子の表面上のポリヌクレオチドの充填密度を有する。別の態様では、ナノ粒子間の協同的挙動は、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増加させる。さらに別の態様では、細胞によるナノ粒子の取り込みは、ナノ粒子と結合したポリヌクレオチドの密度によって影響を受ける。米国特許出願公開番号第２００８／０３０６０１６号（その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されているように、ナノ粒子の表面上のポリヌクレオチドのより高い密度は、細胞によるナノ粒子の取り込みの増加と関連している。本開示は、ナノ粒子表面上のポリヌクレオチドのより高い密度によるナノ粒子の取り込みの増加が、本明細書に記載のドメインの存在との組合せにおいて働く、実施形態を提供する。例えば、限定はされないが、本明細書に記載されるようなポリＧドメインをさらに含んでなる、ナノ粒子の表面上の所与の密度のポリヌクレオチドを有するナノ粒子は、ポリＧドメインを欠く、ナノ粒子の表面上の同一密度のポリヌクレオチドを有するナノ粒子と比較して、細胞による官能基化ナノ粒子の取り込みの増加を示す。種々の態様において、ポリＧドメインをさらに含んでなる官能基化ナノ粒子の細胞による取り込みの増加は、ポリＧドメインを欠く官能基化ナノ粒子との比較で、１％である。さらなる態様において、ポリＧドメインをさらに含んでなる官能基化ナノ粒子の細胞による取り込みの増加は、ポリＧドメインを欠く官能基化ナノ粒子との比較で、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約５５０倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、約８００倍、約８５０倍、約９００倍、約９５０倍、約１０００倍、約１５００倍、約２０００倍、約２５００倍、約３０００倍、約３５００倍、約４０００倍、約４５００倍、約５０００倍、約５５００倍、約６０００倍、約６５００倍、約７０００倍、約７５００倍、約８０００倍、約８５００倍、約９０００倍、約９５００倍、約１００００倍またはそれ以上である。
【００７５】
ナノ粒子およびポリヌクレオチドの望ましい組合せのための、ナノ粒子を安定化させるのに適した表面密度およびそれを得るのに必要な条件は、実験により決定することができる。概して、少なくとも約２ｐモル／ｃｍ２の表面密度が、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を提供するのに適切である。いくつかの態様では、表面密度は少なくとも１５ｐモル／ｃｍ２である。また、ポリヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２またはそれ以上の表面密度でナノ粒子に結合している、方法も提供される。
【００７６】
オリゴヌクレオチド標的配列およびハイブリダイゼーション
いくつかの態様では、本開示は特定の核酸を標的とする方法を提供する。あらゆる種類の核酸が使用され得る。前記方法は例えば、治療的な遺伝子発現調節に使用を使用し得る（例えば、米国特許出願公開番号２００９／０２０９６２９号（この開示は参照によって本明細書に援用される）を参照されたい）。本発明の方法により標的とされ得る核酸の例としては、限定はされないが、遺伝子（例えば、特定の疾患に関連した遺伝子）、細菌性のＲＮＡもしくはＤＮＡ、ウイルス性のＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、もしくは一本鎖核酸が挙げられる。
【００７７】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）の連続ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。同様に、用語「終結コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」とは、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）の連続ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。従って、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終結コドン領域」（または「翻訳終結コドン領域」）は、官能基化ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドで効率的に標的とされ得る全ての領域である。
【００７８】
他の標的領域としては、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの一部である、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、ｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３’末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの一部である、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５’末端残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含んでなる。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自体およびキャップ部位に隣接する最初の５０個のヌクレオチドを含むと見なされる。
【００７９】
原核生物の標的核酸について、種々の態様において、前記核酸はゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。真核生物の標的核酸について、前記核酸は動物の核酸、植物の核酸、真菌の核酸、例えば酵母の核酸である。上記と同様、標的核酸はゲノムＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡである。ある態様では、標的核酸はミトコンドリア核酸である。ウイルスの標的核酸について、前記核酸はウイルスのゲノムＲＮＡ、またはウイルスのゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。
【００８０】
提供される遺伝子産物発現を阻害するための方法は、標的遺伝子産物の発現が、オリゴヌクレオチド官能基化ナノ粒子の非存在下における遺伝子産物発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害される方法を包含する。言い換えれば、提供される方法は、標的遺伝子産物の発現の本質的にあらゆる程度の阻害をもたらす方法を包含する。
【００８１】
阻害の程度は、体液試料から、または生検標本から、または当該技術分野において周知の画像処理技術によって、インビボで測定される。あるいは、阻害の程度は、通常、特定の種類のナノ粒子および特定のオリゴヌクレオチドの使用からもたらされる、インビボで予測可能な、阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて測定される。
【実施例】
【００８２】
球状核酸ナノ粒子複合体（ＳＮＡ）の配列依存的な細胞取り込みを調べた。このプロセスは、クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）との相互作用およびカベオラ介在性エンドサイトーシスによって生じる。直鎖ポリ（グアニル酸）（ポリＧ）はＳＲ−Ａに対する天然リガンドであることが知られている。下記の例では、より高いＧ含量を有するＳＮＡが他のヌクレオチドから構成されるＳＮＡよりも多量に細胞に進入可能であるかどうかを試験し、従って、ＳＮＡの細胞内部移行をオリゴヌクレオチド配列成分の関数として測定した。以下に示されるように、豊富なＧ含量を有するＳＮＡは最も高い細胞取り込みを示した。次に、小分子（カンプトテシン）をＳＮＡと化学的に結合させて薬剤−ＳＮＡ複合体を作製したところ、ポリＧ  ＳＮＡが、最大量のカンプトテシンを細胞に送達し、がん細胞において最も高い細胞毒性を有することが認められた。本明細書において提供されるデータは、球状核酸の細胞内送達を増強させるための重要な設計配慮を明らかにしている。
【００８３】
ＧリッチＳＮＡの細胞内取り込みの増強を、４つの細胞型、Ａ５４９（ヒト肺腺癌上皮）、ＮＩＨ−３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、Ｃ１６６（マウス内皮）、およびＨａＣａＴ（ヒトケラチノサイト）において調べた。さらに、配列依存的な細胞取り込みの影響を、ＤＮＡ−化学療法剤複合体を搭載したＳＮＡを設計することにより調べたところ、Ａ、Ｔ、およびＣに富んだＳＮＡとの比較で、ＧリッチＳＮＡにより、カンプトテシン化学療法的分子のＡ５４９細胞への送達およびその後の細胞毒性が増加された。
【００８４】
実施例１
ＳＮＡ上の核酸塩基種類は金ナノ粒子表面上のＤＮＡオリゴヌクレオチド殻の積載および厚さを決定する
最初に、同量の、異なる核酸塩基種類のアルキルチオールで修飾された３０塩基対長の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）（図１ａ；配列情報については下記の表１を参照）を、クエン酸被覆１０ナノメートル（ｎｍ）直径金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の水性懸濁液に添加することにより、異なる核酸塩基種類（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）から構成されるＳＮＡを作製した。Ｃに富んだＳＮＡ（ポリＣ  ＳＮＡ）およびＧに富んだＳＮＡ（ポリＧ  ＳＮＡ）を作製するために、ＴをＣおよびＧの線状重合体に沿って一定の間隔で意図的に挿入して、それぞれ（ＣＣＴ）１０および（ＧＧＴ）１０の配列を得た。ポリＣ  ＳＮＡおよびポリＧ  ＳＮＡについて、これらの設計特徴は、ｉ−モチーフ［Gehring et al.,Nature 363: 561-565 (1993)］およびグアニン四重鎖［Sen et al.,Nature 334: 364-366 (1988)］の形成により困難にされる、ポリＣ配列およびポリＧ配列を合成する際の問題を軽減する。一方、ＡおよびＴの線状重合体は安定な二次構造に自然には折り畳まれないため、Ａに富んだＳＮＡ（ポリＡ  ＳＮＡ）およびＴに富んだＳＮＡ（ポリＴ  ＳＮＡ）を作製する際に、ＡおよびＴの線状重合体を別の核酸塩基で薄める必要がない。動的光散乱測定によれば、全てのＳＮＡは２２±４ｎｍの流体力学的径を有しており、このことは、オリゴヌクレオチド殻が５〜８ｎｍの厚さであることを示唆している（図２）。厚さの変動はおそらく積載の変動によるものである（下記参照）。ＵＶ−Ｖｉｓ分光測定によれば、全てのＳＮＡはサイズにおいて概して単分散であり、オリゴヌクレオチド殻の共有結合後の局所的な屈折率の変化により、無修飾ＡｕＮＰとの比較で、表面プラズモンピークにおいておよそ４ｎｍの赤方偏移を示す（５２０ｎｍに対し５２４ｎｍ）［Kumar et al., Nat Protoc 3: 314-320 (2008)］（図３）。次に、オリゴヌクレオチドがそれらの５’末端にＣｙ５フルオロフォアを含有するＳＮＡを作製することにより、オリゴヌクレオチドの積載を核酸塩基種類の関数として測定した（図４）。３０塩基の一定のオリゴヌクレオチド長を前提として、ピリミジン塩基（すなわち、ＣおよびＴ）に富むＳＮＡは、著しくより高いオリゴヌクレオチド積載を有し、これにより、ポリＴ  ＳＮＡおよびポリＣ  ＳＮＡはそれぞれ、ＡｕＮＰ当たりおよそ１８０個のｓｓＤＮＡおよびおよそ１４０個のｓｓＤＮＡを有する。対照的に、プリン塩基に富むＳＮＡはより少ないオリゴヌクレオチド積載を有し：ポリＧ  ＳＮＡおよびポリＡ  ＳＮＡはそれぞれ、ＡｕＮＰ当たりおよそ７５個のｓｓＤＮＡおよびおよそ４５個のｓｓＤＮＡのみを有する（図１ａ）。
【表１】
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表１に列挙されるＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成されるＳＮＡを作製して、核酸塩基種類の、それらの細胞内取り込み動態および細胞内分布に対する影響を、それぞれＩＣＰ−ＭＳおよびＴＥＭを用いて調べた（図５）。図２および図３は、これらのＳＮＡの流体力学的サイズおよび吸収スペクトルに関するＤＬＳおよびＵＶ−Ｖｉｓ分光測定のデータを示す。図１におけるＴＥＭイメージングのデータはＳＮＡの形態を明らかにしている。
【００８５】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によってオリゴヌクレオチド殻を直接的に可視化するために、ＳＮＡに対する酢酸ウラニル染色プロトコルを利用した［Huxley et al., J Biophys Biochem Cytol 11: 273-296 (1961)］。積載データと一致して、ポリＴ  ＳＮＡにおけるオリゴヌクレオチド被覆は、それらの均一なオリゴヌクレオチド殻がＡｕＮＰの外周全体における乾燥厚（dry thickness）において４〜６ｎｍであることから分かるように、試験された全ての核酸塩基種類の中で最も密度が高かった（図１ｂ）。Chen et al.では、単一分子ＦＲＥＴ（ｓｍＦＲＥＴ）およびＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）を用いることで、４０塩基長の一本鎖ポリＴ  ＤＮＡ（Ｔ４０）の末端間距離が、生理的レベルの塩（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の存在下で、およそ６．６ｎｍであることが示された［Chen et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109: 799-804 (2012)］。従って、ＴＥＭ画像によって明らかにされたポリＴ  ＳＮＡの乾燥殻厚は、ポリＴ  ＤＮＡ鎖が、ＡｕＮＰの中心から離れるように放射状に延びた場合に、ＡｕＮＰの曲面によって与えられる最大積載に近づくことを示唆している。ポリＡ  ＳＮＡはたった１〜２ｎｍ厚の最も薄いオリゴヌクレオチド殻を有するのみであるが、それらの殻はそれでも均一である。それらの中間のオリゴヌクレオチド積載を所与として、ポリＣ  ＳＮＡおよびポリＧ  ＳＮＡは２〜４ｎｍ厚のオリゴヌクレオチド殻を有するが、それらの殻はポリＴ  ＳＮＡおよびポリＡ  ＳＮＡほど均一ではない。この手法は乾燥作用の影響を受け易いが、データはオリゴヌクレオチド積載研究の結果と一致している（図１ａ）。簡潔に説明すると、オリゴヌクレオチド積載およびＴＥＭイメージングのデータは、ピリミジン塩基（ＣおよびＴ）がそれらのプリン対応物（ＡおよびＧ）ｙりも弱く金表面に吸着するという文献の先例と一致しており［Demers et al., J Am Chem Soc 124: 11248-11249 (2002); Hurst et al., 78, 8313-8318(2006); Storhoff et al., Langmuir 18: 6666-6670(2002); Kimura-Suda et al., Journal of the AmericanChemical Society 125: 9014-9015 (2003); Opdahl etal., Proc Natl Acad SciU.S.A. 104: 9-14 (2007)］、これは、前者が金表面から離れるように伸び、一方、後者が表面と相互作用するという考えを裏付けるものである。
【００８６】
実施例２
ポリＧ  ＳＮＡは試験された全ての核酸塩基種類の中で最多の量で複数の哺乳類細胞種に進入する。
次に、異なる核酸塩基種類のＳＮＡの細胞内取り込み動態を誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によってモニターした。ＳＮＡの細胞内取り込みを仲介する重要な受容体であるＳＲ−Ａの発現から、Ｃ１６６細胞を選択した［Choi et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 110: 7625-7630 (2013)］（図５ａ）。２時間のインキュベーションの後、ポリＧ  ＳＮＡは、試験された全ての核酸塩基種類の中で最高レベルの細胞結合を示し、細胞当たり５×１０５個の粒子を蓄積する。ポリＧ  ＳＮＡとは対照的に、ポリＴ  ＳＮＡは、５倍超より低い細胞結合を示し、これは全ての核酸塩基種類の中で最低レベルの細胞結合である。ポリＡ  ＳＮＡおよびポリＣ  ＳＮＡは、ポリＴ  ＳＮＡおよびポリＧ  ＳＮＡとの比較で、中間レベルの細胞結合を示す。同様のデータが図１３に示される。また、ポリＧ  ＳＮＡが、ポリＡ、ポリＴ、およびポリＣ  ＳＮＡよりも、Ｃ１６６細胞とのより高い細胞結合を示すことを示している、図１２も参照されたい。ポリＧ  ＳＮＡが、ポリＧ  ＳＮＡの細胞結合の増加に関与する、組換えクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）との最高の結合を示すことが、改変ＥＬＩＳＡアッセイによって示される。
【００８７】
しかしながら、細胞と結合した金のバルク含量（bulk content）の鋭敏な定量化を可能にする手法であるＩＣＰ−ＭＳでは、ＳＮＡの細胞内分布に関するいかなる情報も与えられない。従って、ＴＥＭを利用して、ＳＮＡが細胞に進入するのか、あるいは細胞膜と結合するのみであるかを決定した（図５ｂ）。細胞と一緒に２時間インキュベーションした後、全核酸塩基種類から構成されるＳＮＡは、細胞質ゾル内または初期エンドソーム内のそれらの蓄積から分かるように、Ｃ１６６細胞に進入することが可能である。ＩＣＰ−ＭＳデータと一致して、代表的なＴＥＭ画像は、細胞の断面積当たりの粒子クラスターの数およびクラスター当たりの粒子の数（典型的にはクラスター当たり１００個超のＳＮＡ）の両方の面で、ポリＧ  ＳＮＡが全ての核酸塩基種類の中で細胞内で最も豊富であることを示している。ＴＥＭ画像は細胞内の粒子の正確な定量化を可能とはしないが、対照的に、ポリＡ  ＳＮＡ、ポリＣ  ＳＮＡ、およびポリＴ  ＳＮＡは、ポリＧ  ＳＮＡよりもかなり少ない量（クラスター当たり２０個未満のＳＮＡ）で細胞に進入する。
【００８８】
要約すると、オリゴヌクレオチド鎖構成物が３０塩基長に一定に保たれる場合、他の核酸塩基種類（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｔ）よりも高い割合のＧの組込みは、Ｃ１６６細胞へのＳＮＡの送達を最大化する。このようなＧ依存的取り込みがＣ１６６細胞に適用可能なのみであるかどうかを確かめるために、３つの他の哺乳類細胞種類、すなわちＨａＣａＴ、３Ｔ３、およびＡ５４９において、ＳＮＡの細胞内取り込み動態をさらに追跡した（図５ｃ）。これらの細胞株は、Ｃ１６６と共に、ＳＲ−Ａのある範囲の発現レベルを有し；発現レベルの降順では、それらはＨａＣａＴ、Ｃ１６６、３Ｔ３、およびＡ５４９となる［Choi et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 110: 7625-7630 (2013)］。Ｃ１６６細胞の取り込みデータと一致して、ポリＧ  ＳＮＡは、これらの細胞型において最大程度の結合を示し、他の核酸塩基種類から構成されるＳＮＡよりも４〜１０倍より高い細胞結合を示す。注目すべきことに、ポリＧ  ＳＮＡの細胞結合はまた、ＳＲ−Ａの発現レベルと正に相関しており；同濃度のポリＧ  ＳＮＡと一緒にインキュベートした場合、ＨａＣａＴ、３Ｔ３、およびＡ５４９細胞はそれぞれ、最高、中間、および最低の細胞結合を示す。従って、Ｇの組込みは、ＳＲ−Ａの発現レベルと相関するように、複数の哺乳類細胞種類へのＳＮＡの送達を最大化する。さらに、これらのデータは、核酸塩基型が一定に保たれない場合に、オリゴヌクレオチド積載が細胞内取り込み動態を決定しないことを示しており；それらのより少ないオリゴヌクレオチド積載にもかかわらず、ポリＧ  ＳＮＡはポリＴ  ＳＮＡよりも多量に細胞に進入する。
【００８９】
実施例３
コア組成にかかわらずポリＧ殻は細胞内送達を最大化する。
ポリＧ  ＳＮＡのポリＧ殻がポリＡ、ポリＴ、およびポリＣ  ＳＮＡと比較して細胞内取り込みの増加を促進することを証明するために、５ｎｍ  ＡｕＮＰまたはセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）量子ドット（ＱＤ）のいずれかである、異なるコア組成を有するＴリッチ  ＳＮＡおよびポリＧ  ＳＮＡを合成した（配列情報については表２を参照されたい）。表２に列挙されるオリゴヌクレオチドから構成される５ナノメートルＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびＱＤ−ＳＮＡを作製して、異なるコア組成のＳＮＡの細胞内取り込みに対するポリＧ殻の影響を研究した（図６）。全ての配列は２８塩基長であり、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基で終結している。ＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびＱＤ−ＳＮＡを、前述の戦略［Zhang et al., Nat Mater 12: 741-746 (2013)（その全体が参照によって本明細書に援用される）］を用いて合成した。ある一連の実験では、Ｃ１６６細胞を等濃度のＴリッチＱＤ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡで処理した。別の一連の実験では、細胞を等濃度のＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡで処理した。次に、共焦点顕微鏡を用いて、細胞に進入したＱＤの蛍光シグナルを追跡した。ＴリッチＱＤ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡで処理されたＣ１６６細胞は非常に小さな細胞内蛍光を示した。しかし、ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡで処理されたＣ１６６細胞は有意により高い細胞内蛍光（図６ａ）を示し、このことは、Ｃ１６６細胞内へのポリＧ殻を有するＳＮＡの取り込みがより高いことを示している。さらなる確認のため、ＩＣＰ−ＭＳを用いて、ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡまたはＱＤ−ＳＮＡ単独、ポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡまたはＱＤ−ＳＮＡ単独、ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡの組合せ、並びにＴリッチＱＤ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡの組合せで処理されたＣ１６６細胞内のＡｕ含量およびＣｄ含量を分析した。ポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡで処理されたＣ１６６細胞は、ＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡで処理された細胞よりも３倍より高いＡｕ含量を有する。対照的に、ポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡで処理された細胞は、ＴリッチＱＤ−ＳＮＡで処理された細胞よりも３倍より高いＣｄ含量を示す（図６ｂ）。ポリＧ  ＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびＴリッチＱＤ−ＳＮＡで処理された細胞は、Ｃｄ含量と比較してより高いＡｕ含量を有し、この傾向はＴリッチＡｕＮＰ−ＳＮＡおよびポリＧ  ＱＤ−ＳＮＡで処理された細胞では逆転している（図６ｂ）。この競合的細胞内取り込みアッセイによって、コア組成にかかわらず、ポリＧ殻を有するＳＮＡが優先的に細胞に進入することが示され、このことは、ポリＧ殻が細胞表面受容体に対してより大きな親和性を有することを示している。
【表２】
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【００９０】
実施例４
オリゴヌクレオチドの最末梢のおよそ１０塩基がＳＮＡの細胞内取り込みを決定する。
幾何学的観点から細胞内取り込み特性を特徴付けるために、ＳＮＡの細胞内取り込みに大きく寄与するＤＮＡオリゴヌクレオチドの断片を調べた。繰り返しになるが、全てのオリゴヌクレオチド構成物が３０塩基に一定に保たれた場合の（配列情報については表３を参照）ＳＮＡの細胞結合を比較した。表３に列挙されるオリゴヌクレオチドから構成されるＳＮＡを作製して、ＳＮＡの細胞内取り込みに対するヌクレオチド位置の影響を精査した（図７）。全ての配列は３０塩基長であり、最少６個のチミジル酸（Ｔ）残基を３’末端に含有する。この３’末端におけるポリ（Ｔ）モチーフは、配列に無関係な、ＡｕＮＰの表面上へのオリゴヌクレオチドのほぼ一定の積載を可能にする。オリゴヌクレオチドの断片はいかなる核酸塩基も含有せず；これらの塩基脱落領域は、ｄスペーサーＣＥホスホラミダイト（ｄ；リボース単位およびリン酸骨格の両方を有する）またはスペーサーホスホラミダイトＣ３（ｃ；リン酸骨格のみを有する）のいずれかを用いて作製した。
【００９１】
まず、細胞結合を、ポリＴ  ＳＮＡと、ＩＣＰ−ＭＳにより様々な量の５’末端におけるＧ（反復ＧＧＴ単位の形態で）および３’末端におけるＴを含有するＳＮＡとの間で、比較した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端におけるポリＴセグメントは、ＡｕＮＰの表面上へのほぼ一定のオリゴヌクレオチド積載を可能にする。概して、ＳＮＡの細胞結合は、オリゴヌクレオチド構成物の５’末端におけるＧ含量が増加するにつれて、増加する（図７ａ）。オリゴヌクレオチド構成物の５’末端における最少４つのＧＧＴ反復が細胞結合を有意に増強するのに必要であると思われ；２つのＧＧＴ反復の追加は、ポリＴ  ＳＮＡと比較して、細胞結合を実質的に増加させない。
【表３】
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【００９２】
５’末端に露出された、または鎖の中央に埋まった、ＧＧＴ反復を有するオリゴヌクレオチド（表３中の配列情報を参照）から構成されるＳＮＡの細胞結合も、比較した。Ｔ１２モチーフを５’末端上に配置してＧＧＴ反復をＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖の中央に埋めることにより、ＧＧＴ反復が５’末端に露出されている場合と比較して、およそ７０％細胞結合が減少され、ＳＮＡの細胞内取り込みに対するＧＧＴ反復の有意な影響が効果的に抑制された（図７ｂ）。これらの所見により、３０塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチド構成物の５’末端のおよそ１０塩基がＳＮＡの細胞内取り込み特性を主に決定していることが示された。より多くのＧの組込みを介したポリＴ  ＳＮＡの細胞内取り込みの増加に加えて、ポリＴ  ＳＮＡの細胞内取り込みに最も関連したＳＮＡナノ構造の部分も精査した。この目的のために、ＤＮＡオリゴヌクレオチド構成物（表３の配列情報を参照）の５’末端に様々な長さの塩基脱落スペーサーを含有するＳＮＡを構築した。これらの塩基脱落スペーサーとしては、核酸塩基を含有しないｄスペーサー（グレン・リサーチ社（Glen Research））、および核酸塩基も環構造も有さないＣ３スペーサー（グレン・リサーチ社）が挙げられる。より高い塩基脱落スペーサー含量を有するＳＮＡは、１０より多い塩基脱落スペーサー単位が５’末端に追加された場合に横ばいとなる、ポリＴ  ＳＮＡとの比較でおよそ７５％より低い細胞結合を示す（図７ｃおよび図７ｄ）。繰り返しになるが、これらのデータは、ＳＮＡナノ粒子の最末梢部に曝されたオリゴヌクレオチド鎖構成物のおよそ１／３（５’末端における合計３０個の塩基中の１０個）が、その細胞結合の決定において、幾何的に最も重要であることを示している。またそれらにより、リン酸骨格またはリボース単位ではなく、核酸塩基が、ＳＮＡの細胞結合を決定する生化学的な有効成分であることが再確認される。
【００９３】
実施例５
ポリＧ  ＳＮＡはがん細胞への小分子化学療法剤（例えばカンプトテシン）の細胞内送達を最大化させ得る。
ＩＣＰ−ＭＳ測定およびＴＥＭイメージングによって得られた実験データに加えて、薬剤含有ＳＮＡの細胞内取り込みの増加ががん細胞に対するそれらの細胞毒性の増加に対応していることを示すことにより、ポリＧ  ＳＮＡが全ての核酸塩基種類の中で最も効率的に哺乳類細胞に進入するという機能的証明も提供される。概念実証として、小分子化学療法剤であるカンプトテシン（ＣＰＴ）をオリゴヌクレオチド構成物の最末梢位置に共有結合させることにより、カンプトテシン含有ＳＮＡ（ＣＰＴ−ＳＮＡ）を作製し、その後、核酸塩基種類の関数として、がん細胞を殺傷するそれらの能力を調べた。共にＳＮＡの細胞内取り込みに必須のタンパク質であるＳＲ−Ａおよびカベオリン−１が低発現であることから、Ａ５４９ヒト肺腺癌上皮細胞（図５ｃにて考察）をモデル細胞株として選択した［Choi et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 110: 7625-7630 (2013)］。Ａ５４９細胞によるＳＮＡの中程度の細胞内取り込みを前提として、観察可能なあらゆる細胞毒性は、核酸塩基種類の関数としてのＣＰＴ−ＳＮＡの作用強度を強調する。ＣＰＴ分子をＤＮＡ鎖上に結合させるために、文献の前例に従って、ＣＰＴの−ＯＨ基をアジド含有リンカーと反応させて、カンプトテシン−アジド（ＣＰＴ−Ｎ３）を合成した［Parrish et al., Bioconjug Chem 18: 263-267 (2007)］。一方の末端にジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基を有し、他方の末端にチオール基を有する二官能性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）上にＣＰＴ−Ｎ３を直接結合させるために、銅を使用しないクリックケミストリーを利用した。得られた複合体、カンプトテシン−ＤＮＡ−チオール（ＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨ）、を次に、前述のようにＡｕＮＰの表面に共有結合させることで、ＣＰＴ−ＳＮＡを得ることができる（図８ａおよび図９）。
【表４】
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【００９４】
このアプローチを用いて、ＣＰＴ−ポリＡ  ＳＮＡ、ＣＰＴ−ポリＴ  ＳＮＡ、ＣＰＴ−ポリＣ  ＳＮＡ、およびＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡを作製した。ポリＴ  ＳＮＡおよびポリＣ  ＳＮＡのオリゴヌクレオチド積載がポリＡ  ＳＮＡおよびポリＧ  ＳＮＡのオリゴヌクレオチド積載よりも有意により高いことを前提として、ＡｕＮＰ上に官能基化された鎖として、ＣＰＴ−Ｔ３０−ＳＨ鎖を無修飾Ｔ３０−ＳＨ鎖で意図的に希釈し、ＣＰＴ−（ＣＣＴ）１０−ＳＨ鎖を無修飾（ＣＣＴ）１０−ＳＨ鎖で希釈することで、全ての核酸塩基種類から構成されるＳＮＡ上のＣＰＴ分子の同様の積載を得て、これにより、ＣＰＴ送達に対するポリＧ  ＳＮＡの細胞内取り込みの増強の影響の直接比較が可能となった。実際に、粒子当たりのカンプトテシン分子の積載は、およそ等しい（ＡｕＮＰ当たりおよそ５５±１５個のＣＰＴ分子）と測定された（図８ｂ）。次に、ＩＣＰ−ＭＳを用いて細胞と結合した金含量を測定することにより、Ａ５４９細胞によるＣＰＴ−ＳＮＡの取り込みに対する核酸塩基種類の影響を調べた。９時間および１８時間のインキュベーション後、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、他の核酸塩基種類から構成されるＣＰＴ−ＳＮＡよりも６〜９倍より高いＡ５４９細胞との結合を示す。この所見によって、ＡｕＮＰの表面上の共有結合的に官能基化されたＤＮＡオリゴヌクレオチドの１０個の最末梢塩基がＳＮＡの細胞内取り込み特性の決定において最も重要であるという結論が補強された。すなわち、ＳＮＡの末梢に配置された小分子薬剤は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞表面ＳＲ−Ａとの間の相互作用に有意に干渉しない。ＣＰＴ−ＳＮＡをＡ５４９細胞と一緒に１８時間さらにインキュベートし、新たなナノ粒子非含有培地を補充し、さらに５４時間増殖させた。７２時間後、細胞に結合している金含量は、１８時間後に細胞に結合していた金含量と同様であったが、このことは、ＣＰＴ−ＳＮＡのエキソサイトーシスがほとんどないことを暗示している（図８ｃ）。ＩＣＰ−ＭＳによるＣＰＴ−ＳＮＡのＡｕＮＰコアの追跡に加えて、４４０ｎｍにおけるＣＰＴ分子の蛍光発光を利用する共焦点画像解析によって、Ａ５４９細胞内のＣＰＴの分布を可視化した［Zamai et al., Mol Cancer Ther 2: 29-40 (2003)］。Ａ５４９細胞と共にＣＰＴ−ＳＮＡを１８時間インキュベートした後、粒子を除去し、新鮮な培地を補充し、処理の３日後および５日後にイメージングした。３日後、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、試験された全ての核酸塩基種類の中でＣＰＴの最高の細胞内蓄積を示した。５日後、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡで処理された細胞はなお最高の蛍光を示したが、蛍光はより拡散性であった（図８ｄ）。ＩＣＰ−ＭＳデータおよび共焦点画像解析データに基づけば、理論に制限されるものではないが、ＣＰＴ−ＳＮＡは、細胞内エステラーゼの作用によってＣＰＴ分子を徐々に放出し、細胞毒性効果を発揮するのに十分な期間、細胞内に残存することが企図される［Cheng et al., Bioconjug Chem 14: 1007-1017 (2003)］。これを調べるために、２０ｎＭ  ＣＰＴ−ＳＮＡ（または等価に、およそ１．１μＭ  ＣＰＴ分子）を、異なる配列で、Ａ５４９細胞と共に１８時間インキュベートし、細胞に新鮮な培地を補充し、改変ＭＴＴアッセイを用いて数日後にそれらの生存率を測定した。ＣＰＴ−ＳＮＡ処理の４日後から７日後までの間、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、他の核酸塩基種類から構成されるＣＰＴ−ＳＮＡよりも有意により細胞傷害性である。７日後、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡで処理された細胞は、他の核酸塩基種類から構成されるＣＰＴ−ＳＮＡで処理された細胞においての８０〜１００％の生存率と比較して、およそ２０％の細胞生存率しか示さない（図８ｅ）。また、負の対照として、Ａ５４９細胞を、全ての核酸塩基種類から構成される２０ｎＭのＣＰＴ非含有ＳＮＡと一緒に１８時間インキュベートしたところ、処理の７日後にはっきりした細胞毒性は観察されなかった（図１０）。これにより、ＣＰＴ−ＳＮＡ処理によって誘導された観察された細胞毒性が、ＳＮＡ構築物それ自体ではなく、結合したＣＰＴ分子によって生じることが確認された。
【００９５】
さらに、ＣＰＴ−ＳＮＡによる処理の６日後に細胞をヨウ化プロピジウムで染色して、ＣＰＴ誘導性アポトーシスを検出した。染色細胞のフローサイトメトリーは、ＣＰＴ−（ＧＧＴ）１０ＳＮＡが最も細胞傷害性であることを明らかにしている（図８ｆ）。ＣＰＴが細胞内で活性であることをさらに確かめるために、ＣＰＴによって活性化されることが知られている［Stefanis et al., JNeurosci 19: 6235-6247 (1999)］アポトーシス性シグナル伝達タンパク質である活性化カスパーゼ３の量を、５日後にＥＬＩＳＡにより細胞において測定した。ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡで処理された細胞は、ＣＰＴ−Ａ３０  ＳＮＡ、ＣＰＴ−Ｔ３０  ＳＮＡ、およびＣＰＴ−（ＣＣＴ）１０  ＳＮＡで処理された細胞よりも多量の活性化カスパーゼ３を示す（図１１）。要約すると、ポリＧ  ＳＮＡによるがん細胞へのＣＰＴの送達の増加および細胞毒性の増加から明らかなように、ＣＰＴ−ポリＧ  ＳＮＡは、他の核酸塩基種類から構成されるＣＰＴ−ＳＮＡよりも有意により強力である。この実施例によって、Ｇ依存的送達の機能的利点が強調され、より高い効率で他の治療的独立体が送達される可能性が示される。
【００９６】
結論
細胞へのＳＮＡナノ粒子複合体の取り込みを増加させるための方法が、上記の非限定例によって示される。高いＧ含量を有する三次元オリゴヌクレオチド殻を有するＳＮＡは、主にＡ、Ｔ、およびＣから構成されるＳＮＡよりも多量に、細胞によって内部に取り入れられる。さらに、ＧリッチＳＮＡを用いることで、核酸および小分子薬剤の両方の細胞内送達を増強することができる。このことは、配列組成が、濃度に加えて、ＳＮＡの細胞内送達の調整に使用することができるもう一つの調整可能な特性であることを示している。配列組成を調整するこの戦略は、所望の細胞取り込み特性を有するナノ粒子構築物の合理的設計を可能にすることから、ナノ粒子に基づく診断および治療への応用において強力な手段となる。
【００９７】
実施例６
材料および方法
以下の材料および方法を用いて上記実施例に記載されたデータを得た。
【００９８】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成
標準的な固相合成法および試薬（グレン・リサーチ社（Glen Research））を用いて、ＭＭ４８オリゴヌクレオチド合成装置（バイオオートメイション社（BioAutomation））でＤＮＡを合成した。特に記載がない限り、ＤＮＡは全て、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８カラム（バリアン社（Varian））を備えたＰｒｏＳｔａｒ  ＨＰＬＣ（バリアン社）を用いて精製した。表１はＤＮＡの詳細な配列情報を含む。
【００９９】
球状核酸（ＳＮＡ）ナノ複合体の作製
チオール化ＤＮＡを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で懸濁した１０ｎＭ  ＡｕＮＰの１ｍＬ当たり１ＯＤのＤＮＡの濃度で、１０ｎｍクエン酸被覆ＡｕＮＰに添加した。室温で１時間撹拌した後、６時間かけてＮａＣｌを徐々に添加しながら溶液を熟成させて、最終ＮａＣｌ濃度を０．５Ｍにした。５０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ  ＭＷＣＯ膜（ミリポア社）を用いたＮａｎｏｐｕｒｅ水に対する透析を介して、官能基化ＡｕＮＰを遊離ＤＮＡ鎖から分離した。ＡｕＮＰ濃度およびＤＮＡ濃度を、Ｃａｒｙ５０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（アジレント社）を用いて、それぞれ５２４ｎｍおよび２６０ｎｍにおけるそれらの吸光度を測定することにより決定した。カンプトテシン含有ＳＮＡ（ＣＰＴ−ＳＮＡ）を作製するために、この溶液を５時間かけてＮａＣｌで熟成させて、最終ＮａＣｌ濃度を０．３Ｍにした。
【０１００】
オリゴヌクレオチド積載の測定
１０マイクロリットル（μＬ）の、異なる核酸塩基種類の１０ｎＭ  Ｃｙ５標識ＳＮＡを、１００μＬの１Ｍ  ＤＴＴに添加した。この混合物を４０℃で１５分間振盪しながらインキュベートし、その後１４０００×ｇで遠心分離して、あらゆる金沈殿物を除去した。１００μＬの上清を９６ウェルプレートに入れ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオテック社（Biotek））を用いて蛍光シグナル（励起：６３３ｎｍ；発光フィルター：６６０〜７１０ｎｍ）を測定した。オリゴヌクレオチドの濃度を検量線（calibration standard curve）との比較により決定した。オリゴヌクレオチド濃度をＡｕＮＰ濃度（５２０ｎｍにおけるＵＶ−Ｖｉｓ分光測定で測定）で割ることにより、オリゴヌクレオチド積載が得られる。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド殻の可視化
２０μＬの１００ｎＭ  ＳＮＡを、炭素およびフォルムバール（formvar）（エレクトロン・マイクロスコピー・サイエンス社（Electron Microscopy Sciences））で被覆された各々のグロー放電２００メッシュ銅グリッド上にドロップキャスト（drop-cast）した。乾燥後、２０μＬの２％酢酸ウラニルをグリッド上に添加して、オリゴヌクレオチド殻を１分間染色した。濾紙片を用いて、過剰な酢酸ウラニルを吸い取り除去した。８０ｋＶのビーム電圧の、ＴＥＭモードのＨＤ−２３００（日立社）顕微鏡を用いて、乾燥グリッドをイメージングした。Ｏｒｉｕｓ  ＳＣ１０００ＣＣＤカメラ（ガタン社（Gatan））を用いて、画像を記録した。
【０１０２】
細胞取り込み動態
５×１０４細胞／ウェルの集団として２４ウェルプレート内に播種し、１２時間後、Ｃ１６６（マウス内皮）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨａＣａＴ（ヒトケラチノサイト）、またはＡ５４９（ヒト肺腺癌上皮）細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、０．３ｍＬ／ウェルのＳＮＡ（ＯｐｔｉＭＥＭ中１０ｎＭ）と一緒にインキュベートした。ＳＮＡを異なる時点で除去し、その後ＯｐｔｉＭＥＭでリンスし、血球計数器を用いた計数用にトリプシン処理し、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット化した。後のＩＣＰ−ＭＳ解析のために、細胞ペレットを、０．３ｍＬの濃ＨＮＯ３中３％ＨＣｌを用いて室温（ＲＴ）で一晩消化した。
【０１０３】
ＩＣＰ−ＭＳ
５μＬの５ｐｐｍインジウム（内部標準）および５ｍＬのマトリックス溶液（２％ＨＣｌおよび２％ＨＮＯ３）を添加した後、Ｘ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ＩＣＰ−ＭＳ（サーモフィッシャー社（ThermoFisher））によって、未処理細胞のバックグラウンド金含量の減算後、得られた溶液のＡｕ−１９７含量を測定した。報告された値は、３つの独立した実験の、平均値±平均値からのＳＥを表す。
【０１０４】
ＴＥＭ
細胞ペレットを、０．２ｍＬの、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８）中の溶融２％アガロース中で、４０℃で５分間、穏やかに混合した。細胞−アガロース混合物を、ガラスピペットを用いて室温の水中に穏やかに消す（expunge）ことで、エンローブされた（enrobed）麺状ゼリーを形成させた。このアガロースゼリー中に包埋して、１００ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド中で細胞を固定し、１％ＯｓＯ４、並びに０．９％ＯｓＯ４および０．３％Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６で染色し、全ての段階は４℃で２時間実行された。エタノールおよび酸化プロピレンで徐々に脱水した後、細胞ペレットをＥｐｏｎ８１２樹脂（エレクトロン・マイクロスコピー・サイエンス社）中に包埋した。８０ナノメートル厚の切片を２００メッシュ銅グリッド（ＥＭＳ社）上に堆積させ、８０ｋＶのビーム電圧を用いたＪＥＭ１２３０顕微鏡（ＪＥＯＬ社）下での可視化のために、２％酢酸ウラニル（ＳＰＩサプライズ社（SPI Supplies））およびレイノルズ（Reynolds）クエン酸鉛で染色した。Ｏｒｉｕｓ  ＳＣ１０００ＣＣＤカメラ（ガタン社）を用いて、画像を記録した。
【０１０５】
量子ドットＳＮＡおよび金ナノ粒子ＳＮＡの合成
ナノ粒子表面に直接ＤＮＡ鎖を共有結合させる代わりに、ＣｄＳｅ量子ドットおよび５ｎｍ金ナノ粒子をまずアジド含有両親媒性高分子で被覆し、次に、歪促進（strain−promoted）アジド−アルキン環化付加を用いてＤＮＡを高分子被覆粒子に結合させた。簡潔に説明すると、市販の疎水性リガンドキャップナノ粒子をまず、疎水性アルキル鎖並びに親水性カルボン酸塩およびアジド修飾エチレングリコール基の両方を含有する両親媒性高分子で官能基化させて、粒子を水性溶媒中に可溶化させた。次に、粒子をアジド−アルキンクリックケミストリーによって、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）終結ＤＮＡ鎖で官能基化させて、ナノ粒子の周りに密なＤＮＡ殻を生成した。
【０１０６】
カンプトテシン−アジドの調製
カンプトテシン−アジド（ＣＰＴ−Ｎ３）の調製を、以前に公開された手順［Parrish et al., Bioconjugate Chem. 18:263-267 (2006)］から、適合および改変した。乾燥器で乾燥させた、スターラーを伴う５０ｍＬ丸底フラスコに、カンプトテシン（２００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、６−アジドヘキサン酸（１７０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（８ｍｇ）、および無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）を添加した。この懸濁液を０℃に冷却し、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２２０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を不活性雰囲気下で１２時間撹拌し、室温まで温め、その後、１００ｍＬのエーテルに注いだ。このエーテル懸濁液を０℃に冷却してジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を沈殿させ、固体を減圧濾過で除去した。濾液を−４０℃に冷却し、得られた黄色沈殿物を集め、メタノールから再結晶させて、２０−Ｏ−（６−アジドヘキサノイル）カンプトテシン（１０８ｍｇ）を得た。回収したＤＣＵをメタノールで繰り返し洗浄して、さらなる生成物を得た（１２０ｍｇ；全収率２２８ｍｇ、８７％）。
【０１０７】
カンプトテシン−ＤＮＡ−チオール（ＣＰＴ−ＤＮＡ−ＳＨ）複合体の調製
全てがそれらの５’末端にジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基を有する、様々な配列の一本鎖ＤＮＡ（図９ｄ）を、ＤＢＣＯ−ＴＥＧホスホラミダイトを用いる固体合成（Glen Research, 10-1941）によって作製した。ＤＮＡ−ＤＢＣＯ複合体の精製を、１２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ（アジレント社）を用いて、３１０ｎｍにＤＢＣＯの吸光度ピークを有する画分を収集することにより、行った。銅を用いないクリックケミストリーによってＣＰＴ部分をＤＮＡに結合させるために、８０ｎｍｏｌのＤＮＡ−ＤＢＣＯおよび３ｍｇのＣＰＴ−アジド（およそ１００倍過剰）を１．５ｍＬの無水ジメチルスルホキシド中に溶解させた。反応物を４０℃で１８時間、連続的に振盪した。その後、３．５ｍＬの脱イオン水を混合物に添加して過剰ＣＰＴを沈殿させ、次に５ｍＬの酢酸エチルを添加してＣＰＴを除去した。液液抽出工程をさらに４回繰り返した。水相（ＤＭＳＯ／水中のＤＮＡ−ＣＰＴ）を凍結乾燥して生成物を回収し、その化学的同一性をＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで確認した。
【０１０８】
共焦点顕微鏡
３５ｍｍ  ＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ（ワールド・プレシジョン・インストルメンツ社（World Precision Instruments））に播種して、Ａ５４９細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中で２０ｎＭのＣＰＴ−ＳＮＡと一緒に１８時間インキュベートした。ＣＰＴ−ＳＮＡを細胞から除去し、完全ＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）で３日間または５日間置換した。処理細胞をＰＢＳでリンスして、ＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立共焦点走査型顕微鏡下でのイメージングのためにＨｏｅｃｈｓｔ核染色で染色した。ＣＰＴの励起波長および発光波長はそれぞれ３７０ｎｍおよび４４０ｎｍであった。
【０１０９】
ＭＴＴアッセイ
２４ウェルプレートにウェル当たり１０４個の細胞集団で播種し、Ａ５４９細胞を０．３ｍＬのＳＮＡ（ＯｐｔｉＭＥＭ中２０ｎＭ）と一緒に１８時間インキュベートした。その後、ＳＮＡを細胞から除去し、次に細胞を１ｍＬの完全ＤＭＥＭと共にインキュベートした。様々な期間の後、２０μＬのＭＴＴ原液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ；モレキュラープローブス社）を、３００μＬの完全ＤＭＥＭと共にプレインキュベートされた細胞の各ウェルに添加した。２時間後、３００μＬのＳＤＳ溶液（５０％ジメチルホルムアミド中２００ｍｇ／ｍＬ）をさらに各ウェルに添加し、次に、ピペッティングにより細胞を再懸濁させた。一晩のインキュベーションの後、細胞可溶化物を１４０００×ｇで１０分間遠心してあらゆる金凝集物を除去した。細胞可溶化物から収集された上清画分の６２０ｎｍにおける吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオテック社）を用いて測定した。報告された値は、３つの独立した実験の、平均値±平均値からのＳＥを表す。
【０１１０】
フローサイトメトリー
６ウェルプレートに播種して、Ａ５４９細胞を１ｍＬのＳＮＡ（ＯｐｔｉＭＥＭ中２０ｎＭ）と一緒に１８時間インキュベートした。処理後、ＣＰＴ−ＳＮＡを除去し、細胞を完全ＤＭＥＭ中で１２６時間増殖させた。次に細胞をトリプシン処理し、洗浄し、０．５ｍＬ  ＰＢＳ中に懸濁した。０．５ｍＬの３．７％パラホルムアルデヒドを、１５分間、各ウェルから得られた細胞懸濁液に添加した。２回のＰＢＳリンスの後、ＰＢＳ希釈標準溶液中の１ｍＬのヨウ化プロピジウム（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology）、ｓｃ−３５４１）染色溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて細胞を染色した。フローサイトメトリー解析の前は、染色した試料を４℃で保存し、光から保護した。ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いて１０，０００細胞の蛍光強度を測定した。
【０１１１】
化学薬品
６−アジドヘキサン酸はＥＭＤミリポア社（ビルリカ、マサチューセッツ州）から購入した。ＣｄＳｅ量子ドットはオーシャン・ナノテック社（Ocean NanoTech）から購入した。ドデカンチオール官能基化Ａｕナノ粒子はナノプローブス社（Nanoprobes）から購入した。ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルはクリックケミストリーツールズ社（Clickchemistrytools）から購入した。他の試薬は全て、シグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ＭＯ）から購入し、受取ったままの状態で使用した。
【０１１２】
動的光散乱
Ｎａｎｏ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（マルバーン・インストルメンツ社（Malvern Instruments））を用い、ＡｕＮＰの屈折率として０．４７を用いて、測定を行った。流体力学的径（ＨＤ）の測定値は数平均値から導かれる。各々のヒストグラムは、６回の反復測定後のＡｕＮＰのサイズ分布を表す。
【０１１３】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）データを、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）をマトリックス材料として採用するブルカー社製ＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計上で収集した。
【０１１４】
１Ｈ  ＮＭＲ
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをブルカー社製Ａｖａｎｃｅ  ４００  ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計上で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは重水素化溶媒中の残留水素イオンシグナルを内部標準とした。
【０１１５】
活性化カスパーゼ３の検出
Ａ５４９細胞を６ウェルプレート内に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、ＯｐｔｉＭＥＭ中２０ｎＭ  ＣＰＴ−ＳＮＡで処理した。１８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、完全ＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清および１％ストレプトマイシン／ペニシリンを添加）と共にさらにインキュベートした。６日後、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出した。活性化カスパーゼ３の相対レベルを製造業者の説明書（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ７１９０Ｓ）に従いＥＬＩＳＡにより検出した。
【図１Ａ】
2017537619.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
2017537619.tif 000021
【図８Ｂ】
2017537619.tif 000022
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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