(57)【要約】サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤とブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤との併用により、軟骨変性及び全身外傷性炎症を軽減、阻害及び／または防止する方法を提供する。ＣＤＫ９阻害剤とＢＲＤ４阻害剤の併用は、同種異系移植片の保存時に、軟骨変性及び軟骨生存性損失を低減、阻害及び／または防止するために用いることができる。ＣＤＫ９阻害剤とＢＲＤ４阻害剤の併用を傷害後の介入治療として用いて、将来的に軟骨変性及び変形性関節症に至る急性細胞応答を低減、阻害及び／または防止することができる。2017531007.tif 000014
2017531007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨変性及び／または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の軟骨変性及び／または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善する段階を含む、前記方法。
【請求項２】
外傷後変形性関節症の発症及び／または進行を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の外傷後変形性関節症を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善する段階を含む、前記方法。
【請求項３】
前記対象が軟骨組織に外傷を受傷したことがある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が関節手術を受けたことがある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤を前記対象に投与することにより、前記対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善する段階を含む、前記方法。
【請求項６】
重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善する段階を含む、前記方法。
【請求項７】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、急性反応段階で最初に同時投与され、外傷受傷後の１つ以上の初期応答遺伝子の転写活性化を抑制及び／または阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の初期応答遺伝子が、ＩＬ−１β、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３及びＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、外傷受傷後、約７２時間以内に最初に同時投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、損傷または傷害後、約１０日以内に前記対象に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、１０日間にわたって投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、複数回投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が損傷した軟骨組織の修復手術を受けたことがある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が骨軟骨外植片を移植されたことがある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨軟骨外植片が軟骨同種異系移植片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、手術と同時に、または手術前に同時投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、手術後２４時間以内に同時投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、全身に同時投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、静脈内に同時投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、傷害を受けた軟骨組織部位に直接、同時投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、マトリックスから送達される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤＫ９阻害剤が低分子有機化合物である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤＫ９阻害剤がフラボピリドールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＲＤ４阻害剤が低分子有機化合物である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方が、個々の阻害剤の治療量以下の用量または非有効用量で投与される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
骨軟骨外植片の変性を抑制、防止もしくは阻害する、及び／または保存期間中の軟骨細胞死を低減、防止もしくは阻害する方法であって、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を含んでいる溶液中に骨軟骨外植片及び／または軟骨細胞を保存する段階を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記骨軟骨外植片が同種異系移植軟骨である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤＫ９阻害剤が低分子有機化合物である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤＫ９阻害剤がフラボピリドールである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＢＲＤ４阻害剤が低分子有機化合物である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａから選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記骨軟骨外植片が、前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶液が、有効量以下である前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方を含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を含んでいる溶液中の骨軟骨外植片を含む、組成物。
【請求項３６】
前記骨軟骨外植片が同種異系移植軟骨である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＣＤＫ９阻害剤が低分子有機化合物である、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＣＤＫ９阻害剤がフラボピリドールである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＢＲＤ４阻害剤が低分子有機化合物である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａから選択される、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記骨軟骨外植片が、前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記溶液が、有効量以下である前記ＣＤＫ９阻害剤及び前記ＢＲＤ４阻害剤の一方または両方を含む、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１４日出願の米国仮出願第６２／０６３，８３９号に対して米国特許法１１９（ｅ）条に基づく利益を主張するものであり、目的を問わずその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＡＲ０６３３４８、及び国防総省によって与えられた認可番号ＰＲＭＲＰ  ＩＩＲＡ  ＰＲ１１０５０７に基づく政府支援で行われた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。
【０００３】
分野
サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤とブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤との併用により、軟骨変性及び全身外傷性炎症を低減、阻害及び／または防止する方法を提供する。ＣＤＫ９阻害剤とＢＲＤ４阻害剤の併用は、同種異系移植片の保存時に、軟骨変性及び軟骨生存性損失を低減、阻害及び／または防止するために使用することができる。ＣＤＫ９阻害剤とＢＲＤ４阻害剤の併用を傷害後の介入治療として用いて、将来的に軟骨変性及び変形性関節症に至る急性細胞応答を低減、阻害及び／または防止することができる。
【背景技術】
【０００４】
背景
大量の炎症誘発性ストレス及び細胞ストレスは、軟骨細胞の炎症反応を誘導し、軟骨マトリックスを破壊するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びアグリカナーゼの上方調節をもたらす。これらの異化経路の慢性的な調節解除は、変形性関節症の原因であると疑われている。炎症源に関係なく、下流のシグナルはすべて、あらゆる初期応答遺伝子の転写を活性化する共通の機構に集約される。この調節ポイントは、転写因子サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）とそのＴ型サイクリンパートナーによって制御される。長年にわたり、転写活性化の律速段階は、転写因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）の遺伝子プロモーターへの動員であると考えられてきた。しかしながら、初期応答遺伝子に関する最近の研究によると、基底状態及び非刺激状態で、Ｐｏｌ  ＩＩはすでにプレアセンブリされているが、プロモーターで一時停止していることがわかった（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９，１３８：１２９−４５（非特許文献１）；Ｚｉｐｐｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９，１３８：１１２２−３６（非特許文献２））。初期応答遺伝子の急速な活性化は、シグナル誘導によるＣＤＫ９のプロモーターへの動員の結果であり、それがＰｏｌ  ＩＩをリン酸化する。ＣＤＫ９によるリン酸化は、コンフォメーションの変化を誘導し、それによりＰｏｌ  ＩＩは独占的な伸長（ｐｏｓｓｅｓｓｉｖｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）に入り、完全長ｍＲＮＡを効率的に転写することができる（Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｙｉｋ，ＭＭＢＲ  ２００６，７０（３）：６４６−６５９（非特許文献３））。ＣＤＫ９が誘導性遺伝子の転写活性化の共通機構を制御しているとすれば、ＣＤＫ９は多様な細胞ストレス（例えばスポーツに伴う傷害）による望ましくない炎症反応を阻害する有効な標的である。本発明は、薬学的ＣＤＫ９阻害剤、例えば、フラボピリドール、ならびにその類似体及び塩が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト関節軟骨細胞の主要な炎症性遺伝子を効果的に抑制できるという発見に部分的に基づいている。炎症反応の効果的な抑制は、軟骨修復に一般に使用される骨軟骨外植片の貯蔵寿命の延長を可能にするとともに、外傷後変形性関節症の軟骨破壊を防止する上で治療的意味を有する。
【０００５】
重度の戦闘外傷、例えば爆発物から受けたものは人体に破壊的な損傷を引き起こし、その結果、劇的な組織欠損、火傷、肢体損傷及び出血性ショックをもたらす。このような重度の多発外傷に対する反応として、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）と呼ばれる全身反応を挙げることができる。ＳＩＲＳは、全身にわたって重篤な炎症反応を誘導する炎症誘発性サイトカインの過度な産生の結果である。局所炎症の制御により、創傷治癒が促進される一方、ＳＩＲＳの重篤な炎症反応により、多臓器障害及び多臓器不全などの致命的事象のリスクが著しく増加する。ＳＩＲＳ誘導性の臓器障害または死亡リスクを理由に、多発外傷後の損傷の外科治療が延期される場合が多い。その結果、回復が遅れ、関連する医療費が増加する。ＳＩＲＳの発症を効果的に防止する、またはＳＩＲＳの転帰を大幅に改善する薬理学的な剤はなく、そのような薬物の開発が急務である。現在の抗炎症治療は個々のサイトカイン及び経路を標的としているが、ＳＩＲＳには、あまりに多くのサイトカイン及び経路が関与していることもあり、有効ではない。
【０００６】
ＳＩＲＳの問題は、炎症反応の活性化に起因していることから、ＳＩＲＳを防止する従来の方法は多数の個々の炎症性シグナルまたは経路のうちの１つまたはいくつかを標的としていた。これらの研究から得た結果は、ほとんどの場合期待外れである。重度の外傷性障害はあまりに多くの炎症性シグナル及び経路を活性化させるため、経路間に著しいクロストークが生じ、このような個別単位のアプローチは有効ではない。多様な炎症性シグナルは何十もの異なる細胞表面受容体と、細胞内シグナル伝達経路の複雑なネットワークを経由して伝播し、更に何千もの炎症性メディエーター遺伝子を活性化させる細胞核へと伝達される。さらに悪いことには、炎症性受容体及びシグナル伝達経路は、複数段階での重複及びクロストークを有する。したがって、いかなる特定の炎症性受容体／メディエーター、シグナル伝達経路、または細胞型のみを標的とする単剤も、ＳＩＲＳを防止することができない。また、既知の炎症性メディエーター及び経路すべてを同時に標的とする混合薬を処方することも非実用的である。加えて、ＳＩＲＳの初期の過大な炎症誘発性反応は、外傷後、急速に活性化されるため、理想的な抗ＳＩＲＳ剤もまた、同様に迅速に作用できる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９，１３８：１２９−４５
【非特許文献２】Ｚｉｐｐｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９，１３８：１１２２−３６
【非特許文献３】Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｙｉｋ，ＭＭＢＲ  ２００６，７０（３）：６４６−６５９
【発明の概要】
【０００８】
概要
一態様では、軟骨変性及び／または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の軟骨変性及び／または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを含む。更なる態様では、外傷後変形性関節症の発症及び／または進行を低減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の外傷後変形性関節症を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを含む。様々な実施形態において、対象は軟骨組織に外傷を受傷している。様々な実施形態において、外傷は初期応答遺伝子の急性過剰発現を誘導する。様々な実施形態において、対象は関節外科手術を受けたことがある。一態様では、重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤を対象に投与することにより、対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを含む。関連する態様では、重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を軽減、防止、阻害、緩和及び／または改善することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、例えば急性全身性炎症、更に多臓器系不全へと至る外傷を受傷している場合がある。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、急性反応段階で最初に同時投与され、外傷受傷後の１つ以上の初期応答遺伝子の転写活性化を低減及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上の初期応答遺伝子は、ＩＬ−１β、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３及びＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ）からなる群から選択される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、外傷受傷後、約７２時間以内、約４８時間以内、約２４時間以内、例えば、約２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１時間またはそれ未満の時間内に最初に同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、損傷または傷��後約１０日以内に対象に投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、１０日間にわたって投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、複数回投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、傷害後３日連続して毎日投与される。様々な実施形態において、対象は、損傷した軟骨組織を修復するための手術を受けたことがある。様々な実施形態において、対象は、骨軟骨外植片の移植を受けたことがある。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は、軟骨同種異系移植片である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、手術と同時に、または手術前に同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、手術後、約７２時間以内、約４８時間以内、約２４時間以内、例えば、約２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１時間またはそれ未満の時間内に最初に同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、全身に同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、静脈内に同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、傷害を受けた軟骨組織部位に直接、同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、マトリックスから送達される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤はフラボピリドールである。様々な実施形態において、請求項１〜１６のいずれかで、ＢＲＤ４阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＢＲＤ４阻害剤は、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａから選択される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方は、個々の阻害剤の治療量以下の用量または非有効用量で投与される。
【０００９】
別の態様では、骨軟骨外植片の変性を低減、防止もしくは阻害する及び／または保存期間中の軟骨細胞死を低減、防止もしくは阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を含んでいる溶液中に骨軟骨外植片及び／または軟骨細胞を保存することを含む。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は同種異系移植軟骨である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤はフラボピリドールである。様々な実施形態において、ＢＲＤ４阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＢＲＤ４阻害剤は、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａから選択される。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される。様々な実施形態において、溶液は、有効量以下であるＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方を含む。
【００１０】
更なる態様において、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を含んでいる溶液中の骨軟骨外植片を含む組成物を提供する。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は同種異系移植軟骨である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤はフラボピリドールである。様々な実施形態において、ＢＲＤ４阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、ＢＲＤ４阻害剤は、ＪＱ１及びＧＳＫ５２５７６２Ａから選択される。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される。様々な実施形態において、溶液は、有効量以下であるＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の一方または両方を含む。様々な実施形態において、組成物はキット内に包装されている。
【００１１】
定義
「サイクリン依存性キナーゼ９」または「ＣＤＫ９」という用語は、サイクリン依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーを指す。ＣＤＫファミリーは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ｃｄｃ２８及び分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）  ｃｄｃ２の遺伝子産物と極めて類似しており、重要な細胞周期調節因子として公知である。ＣＤＫ９は多タンパク質複合体ＴＡＫ／Ｐ−ＴＥＦｂの構成物であることがわかっており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが開始する転写の伸長因子であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大サブユニットのＣ末端ドメインをリン酸化することにより機能する。ＣＤＫ９はその調節因子のサブユニットであるサイクリンＴまたはサイクリンＫと複合体を形成して、これらによる調節を受ける。ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質は、このタンパク質及びサイクリンＴと相互作用することが見出された。構造的に「ＣＤＫ９」とは、次のような核酸及びポリペプチドの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間ホモログを指す。（１）ＣＤＫ９核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２６１．３を参照）によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、４００、またはそれ以上のアミノ酸領域にわたって、または完全長のアミノ酸にわたって、約９０％超のアミノ酸配列同一性、例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）ＣＤＫ９ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２５２．１）のアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起される抗体（例えば、ポリクローナル抗体）、またはＣＤＫ９核酸（例えば、本明細書に記載のＣＤＫ９ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、及びそれらの保存的修飾変異体と結合する；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＣＤＫ９タンパク質及びその保存的修飾変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズする；（４）ＣＤＫ９核酸（例えば、本明細書に記載のＣＤＫ９ポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のＣＤＫ９ポリペプチドをコードするＣＤＫ９ポリヌクレオチド）に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、またはそれ以上のヌクレオチドにわたって、または完全長のヌクレオチドにわたって、約９０％超、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。当業者は、ＣＤＫ９ホモログの知見に基づいて、より置換が許容される残基位置を容易に決定することができる。例えば、種間で保存されるアミノ酸残基は、置換または欠失の許容性が低い。同様に、種間で保存されないアミノ酸残基は、置換または欠失に対して許容性が高く、ＣＤＫ９タンパク質の機能が保持される。
【００１２】
「ブロモドメイン含有４」または「ＢＲＤ４」という用語は、有糸分裂期の染色体と会合する、マウスタンパク質ＭＣＡＰのホモログを指し、ヒトＲＩＮＧ３タンパク質、すなわちセリン／スレオニンキナーゼを指す。ＢＲＤ４は、クロマチン標的化に関与し得る保存配列モチーフである２つのブロモドメインを含む。構造的に「ＢＲＤ４」とは、次のような核酸及びポリペプチドの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間ホモログを指す。（１）ＢＲＤ４核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４２９９．２（短い転写産物変異体）及びＮＭ＿０５８２４３．２（長い転写産物変異体）を参照）によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、４００、またはそれ以上のアミノ酸領域にわたって、または完全長のアミノ酸にわたって、約９０％超のアミノ酸配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）ＢＲＤ４ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５１１４．１（短い転写産物変異体）及びＮＰ＿４９０５９７．１（長い転写産物変異体））のアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起される抗体（例えば、ポリクローナル抗体）、またはＢＲＤ４核酸（例えば、本明細書に記載のＢＲＤ４ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、及びそれらの保守的修飾変異体と結合する；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＢＲＤ４タンパク質及びその保存的修飾変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズする；（４）ＢＲＤ４核酸（例えば、本明細書に記載のＢＲＤ４ポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のＢＲＤ４ポリペプチドをコードするＢＲＤ４ポリヌクレオチド）に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、またはそれ以上のヌクレオチドにわたって、または完全長のヌクレオチドにわたって、約９０％超、好ましくは約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。当業者は、ＢＲＤ４ホモログの知見に基づいて、より置換が許容される残基位置を容易に決定することができる。例えば、種間で保存されるアミノ酸残基は、置換または欠失の許容性が低い。同様に、種間で保存されないアミノ酸残基は、置換または欠失に対して許容性が高く、ＢＲＤ４タンパク質の機能が保持される。
【００１３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００１４】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、α−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基が結合している化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００１５】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている一般に知られている３文字記号または１文字記号により参照される場合がある。同様にヌクレオチドも、一般に是認されている１文字コードにより参照される場合がある。
【００１６】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重により、機能的に同一である多数の核酸がいずれかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されているすべての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、そのコドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、これは保存的修飾変異の１種である。本明細書でポリペプチドをコードする核酸配列はいずれも、核酸の可能なサイレント変異すべても表す。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることを理解されよう。したがって、各記載の配列には、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異を暗に含む。
【００１７】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列内の単一アミノ酸またはごく一部のアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、その変更によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換される場合、「保存的修飾変異体」であることを当業者は理解されよう。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的修飾変異体は、多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に付加されるものであり、これらを排除するものではない。
【００１８】
以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニンＩ、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；及び
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００１９】
２つ以上のポリペプチド配列に関する文脈で、「同一」または「同一性」パーセント及びその変形例は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手作業でのアラインメント及び目視検査を用いて測定されるような、比較域または指定された領域にわたる最大対応性を比較及びアラインメントしたとき、配列が同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを指定された割合（％）（すなわち、指定された領域（または指定されていない場合は参照配列全体）にわたって、少なくとも６０％の同一性、場合により少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）で有する場合、配列は「実質的に同一である」。本発明は、本明細書に記載のＣＤＫ９と実質的に同一のポリペプチドを提供する。任意で、少なくとも約５０のアミノ酸長である領域にわたって、またはより好ましくは、１００〜５００または１０００以上のアミノ酸長である領域にわたって、または完全長の配列にわたって同一性が存在する。
【００２０】
２つ以上のポリペプチド配列に関する文脈で、「類似性」または「類似性パーセント」という用語及びその変形は、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手作業でのアラインメント及び目視検査を用いて測定されるような、比較域または指定された領域にわたる最大対応性を比較及びアラインメントしたとき、上記８種の保存的アミノ酸置換で規定される同一性または類似性であるアミノ酸残基を指定された割合（％）（すなわち、指定された領域にわたって、６０％、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の類似）で有する２つ以上の配列または部分配列を指す。類似性が１００％未満であるが、指定された割合（％）の少なくともいずれかの類似性を有する配列は、「実質的に類似している」と呼ぶ。任意で、少なくとも約５０のアミノ酸長である領域にわたって、またはより好ましくは、少なくとも約１００〜５００または１０００以上のアミノ酸長である領域にわたって、または完全長の配列にわたって、この同一性が存在する。
【００２１】
配列を比較するには、通常１つの配列を参照配列として利用し、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを利用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することも、別のパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性が百分率で算出される。
【００２２】
「比較域」という用語及びその変形例は、２つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較し得るような、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか１つのセグメントに対する言及を含んでいる。比較のための配列アラインメント方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅ  ｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、各種アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：２２６４−２２６８（１９９０）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実施により、または手作業によるアラインメント及び目視検査により行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照）。
【００２３】
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントの決定に適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが挙げられ、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（インターネットサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致する、またはそれを満たす、長さＷの短い単語を検索配列中に特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず特定する。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。この最初の近傍ワードヒットは、それらを含む長いＨＳＰを探す検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する程度にまで、各配列の両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合には、パラメーターＭ（一致する残基対に関する報酬スコア；常に０より大きい）及びＮ（不一致の残基に対するペナルティスコア；常に０より小さい）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワードヒットの拡張は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Ｘだけ低くなった場合；１つ以上の負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長３及び期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）のアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性に関する統計分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の尺度の１つは、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間での一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、被験核酸と参照核酸との比較による最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合に、核酸は参照配列と類似していると見なされる。標準ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターは、期待閾値１０（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（ＰＮＡＳ，８７：２２６４−２２６８（１９９０）の確率モデルによる）、ワードサイズ２８、１／−２の報酬とペナルティ（０．５または１／−２の比を９５％で保存性である配列に使用）及び線形ＧＡＰコストを有する。
【００２５】
「有効量」という用語は、症状（複数可）の主観的緩和または臨床医もしくは他の適任の観察者によって指摘される客観的に識別可能な改善のいずれかが得られる量（ここではＣＤＫ９阻害剤の量）である。有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すれば、当業者が十分に行える範囲である。通常、本発明の１つ以上のポリペプチドの併用の効果的なまたは有効な量は、最初に低用量または少量のポリペプチドまたは組成物を投与し、その後、投与する用量または投与量を徐々に増加させ、有毒な副作用が最小限であるか、またはそれなしに、望ましい効果が治療対象に観察されるまで、必要に応じて第２または第３の医薬を追加することにより決定する。本発明の併用投与のための適切な用量及び投薬スケジュールの決定に適用した方法は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，前掲；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  （ＰＤＲ），６８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４，ＰＤＲ  Ｎｅｔｗｏｒｋ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，２００６，前掲；及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｗｅｅｔｍａｎ，２００５，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ．，ａｎｄ  ｉｎ  Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，３１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．，１９９６，Ａｍｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｎ，に記載されており、各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
「治療量以下の用量または量」または「非有効用量または非有効量」は同義であり、投与された薬理学的活性剤の用量または対象での薬理学的活性剤の実際のレベルのいずれかとして、それ自体、目的の薬理学的効果を誘発する（例えば、抗炎症効果を得る）には機能的に不十分であるか、またはその特定の薬理学的な剤について確立された治療的用量よりも定量的に少ない、薬理学的活性剤（複数可）の用量を指す（例えば、当業者が考慮する参考文献に公開されているもの、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６８ｔｈ  Ｅｄ．，２０１４，ＰＤＲ  ＮｅｔｗｏｒｋまたはＢｒｕｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌに公開されている薬理学的な剤の用量）。「治療量以下の用量」は、相対的に（すなわち、従来から投与されている、薬理学的活性剤の量のうちのパーセント量（１００％未満）として）定義することができる。例えば、治療量以下の用量は、従来投与されている薬理学的活性剤の量の約１％〜約７５％であり得る。いくつかの実施形態では、治療量以下の用量は、従来投与されている薬理学的活性剤の量の約７５％、５０％、３０％、２５％、２０％、１０％またはそれ未満であり得る。
【００２７】
「治療すること」及び「治療」という用語ならびにその変形は、用語が適用される疾患もしくは病状（例えば、軟骨変性）のいずれか、またはそのような疾患もしくは病状の１つ以上の症状の治癒を促進する、発症を遅延させる、進行を遅延もしくは後退させる、緩和もしくは予防することを指す。治療すること及び治療は、治療的及び予防的両方の治療レジメンを含む。
【００２８】
「対象」、「患者」または「個体」という用語は同義であり、いずれかの哺乳動物、例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、家庭内の哺乳動物（例えば、イヌ科、ネコ科）、農業用哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）、及び研究用哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「投与」は局所投与及び全身投与を指し、例えば、経腸、非経口的、肺、及び外用／経皮投与を含む。本明細書に記載される方法に使用される化合物（例えば、ＣＤＫ９阻害剤、例えば、フラボピリドール、ならびにその類似体及び塩）の投与経路としては、例えば、対象への、経口（ｐｅｒ  ｏｓ（Ｐ．Ｏ．））投与、経鼻または吸入投与、坐剤としての投与、表面接触、経皮的送達（例えば、経皮パッチによる）、髄腔内（ＩＴ）投与、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、もしくは皮下（「ｓｃ」）投与、または徐放性デバイス（例えば、ミニ浸透圧ポンプ、デポー製剤等）の埋め込みが挙げられる。非経口及び経粘膜を含む、あらゆる経路（例えば、経口、経鼻、経膣、直腸、または経皮）による投与が可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、イオン泳動及び頭蓋内が挙げられる。他の送達様式としては、リポソーム型製剤の使用、静脈注入、経皮パッチ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「全身投与」及び「全身に投与される」という用語は、化合物または組成物が循環系を介して、薬学的作用の標的部位を含む身体部位に送達されるように、化合物または組成物を哺乳動物に投与する方法を指す。全身投与としては、経口、鼻腔内、直腸及び非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮的及び皮下などの、消化管経由以外の）投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「同時投与」または「併用投与」という用語は、例えば、化合物（例えば、ＣＤＫ９阻害剤、例えば、フラボピリドール、ならびにその類似体及び塩）及び／またはその類似体、ならびに他の活性剤に関して使用される場合、化合物及び／または類似体と活性剤を、両方が生理作用を同時に達成できるように投与することを指す。ただし、２つの薬剤は一緒に投与される必要はない。ある特定の実施形態では、一方の薬剤の投与は、他方の投与より前に実施することができる。生理作用が同時であるためには、必ずしも両方の薬剤が同時に血中に存在している必要はない。しかしながら、ある特定の実施形態では、同時投与の結果、通常は、いずれかの所与の用量において、有意な割合（例えば、２０％以上、好ましくは３０％または４０％以上、より好ましくは５０％または６０％以上、最も好ましくは７０％または８０％または９０％、またはそれ以上）の最大血清中濃度で体内（例えば、血漿内）に両方の薬剤が同時に存在する。例えば、様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤は、共同所有及び同時係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５１６１０号に記載のように、１つ以上の成長因子に結合された１つ以上の軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のモノマーを含むタンパク質複合体またはタンパク質足場と共に同時投与される。
【００３２】
「投与させる」という表現は、医療従事者（例えば、医師）または対象の医療的ケアを管理する人物がとる行為であって、問題となる薬剤（複数可）／化合物（複数可）の対象への投与を管理及び／または許可する行為を指す。投与させることは、診断及び／または適切な治療レジメンまたは予防的レジメンの決定、及び／または対象のために特定の薬剤（複数可）を処方することを伴い得る。こうした処方には、処方箋様式を立案すること、診療記録に注釈をつけることなどを含めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】抗炎症治療の方法を示している。Ｃｄｋ９は、初期炎症反応遺伝子を活性化するための律速段階を制御している。様々な炎症性刺激があり、例えば、ＩＬ−１β、ＬＰＳ及びＴＮＦはその対応する細胞表面受容体及び異なる細胞内メディエーター／経路を経由するシグナルを活性化し、最終的に、すべてではないがほとんどの初期炎症反応遺伝子を転写するＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩのＣｄｋ９依存性活性化に集約される。したがって、Ｃｄｋ９キナーゼ活性、またはＢｒｄ４を介したプロモーターへの動員を標的にすることは、炎症源に関係なく、すべての炎症性遺伝子の活性化を効果的に遮断するには理想的である。フラボピリドール及びＪＱ１はそれぞれ、小分子のＣｄｋ９阻害剤及びＢｒｄ４阻害剤である。
【図２】図２Ａは、３〜６ｎＭのＫｄを有する小分子（ＭＷ＝４０２）のＣｄｋ９キナーゼ阻害剤であるフラボピリドールの構造を示している。図２Ｂは、Ｂｒｄ４がアセチル化ヒストンと結合して、Ｃｄｋ９をプロモーターへ動員することを防止する、小分子のＢｒｄ４阻害剤（ＭＷ＝４５６）であるＪＱ１の構造を示している。
【図３】ＩＬ−１β応答の完全な抑制を達成するためのフラボピリドール及びＪＱ１の最小併用投与量の決定法を示している。赤色の曲線は、ＩＬ−１β応答が完全に抑制される併用薬物用量を示す。併用治療は、フラボピリドール及びＪＱ１の必要投与量を６０及び２５０ｎＭに低減した。これは、１００％の抑制を達成するために必要な各薬物個々の用量の約２０〜２５％である。結果は４個体のドナー由来の健康なヒト軟骨細胞から得たものであり、ＤＯＥはＪＭＰ  １１．０統計ソフトウェアを使用して実施した。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ＣＤＫ９／ＢＲＤ４阻害剤が複数の異化サイトカインに対する軟骨細胞応答を抑制することを示している。炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β及びＴＮＦ）によるｉＮＯＳ及びＣｏｘ２の誘導には、ＢＲＤ４及びＣＤＫ９活性を必要とする。サイトカイン処理群のｍＲＮＡ発現が１００％（青色バー）となるように正規化し、サイトカインに加えＣＤＫ９／ＢＲＤ４阻害剤を与えた群と比較した（＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊：ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】Ｃｄｋ９の阻害が、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、複数の上流の炎症性シグナルを遮断することを示している。Ａ）フラボピリドールによるＣｄｋ９の阻害は、複数の炎症性刺激に対して有効である。ヒト初代軟骨細胞（ｎ＝３ドナー）を、３００ｎＭのフラボピリドールとともに、またはそれを伴わずに、３種類の炎症性刺激因子（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、ＬＰＳまたはＴＮＦのいずれか）で５時間処理した。誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量し、初期応答遺伝子の指標とした。各刺激単独によるｉＮＯＳの誘導を適宜、１００％（１番目のバー）に設定し、フラボピリドールで共処理した対応する試料と比較した。
【図５Ｂ】Ｃｄｋ９の阻害が、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、複数の上流の炎症性シグナルを遮断することを示している。Ｂ）ｓｉＲＮＡによって媒介されるＣｄｋ９の減少は、ｉＮＯＳの誘導を抑制する。Ｃｄｋ９に対するｓｉＲＮＡまたは対照としてのＧＦＰを備えるレンチウイルス粒子を軟骨細胞に形質導入した。５日後、細胞をＩＬ−１βで５時間処理して、ウェスタン分析（挿入図）及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ分析のために採取した。
【図５Ｃ】Ｃｄｋ９の阻害が、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、複数の上流の炎症性シグナルを遮断することを示している。パネルＣ）は、フラボピリドール及びＪＱ１の両方がＩＬ−６によって誘導される炎症反応を抑制することを示している。上記すべての実験で、各データポイントは異なる３人のヒトドナーからの平均＋／−標準偏差であった（＊／＊＊ｐ＜０．０５）。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、Ｃｄｋ９の阻害が、機械的傷害で誘導された炎症及びアポトーシスから軟骨外植片を保護することを示している。ウシ軟骨外植片（直径６ｍｍｘ高さ３ｍｍ、ｎ＝６）に３０％歪み／秒の単一の圧縮荷重を加えた後、３００ｎＭのフラボピリドールを含む培地または含まない培地に入れた。Ａ）傷害後２４時間にわたってＩＬ−６のｍＲＮＡの発現をｑＰＣＲで測定した（Ｃ＝対照、Ｉ＝機械的傷害）。傷害はＩＬ−６のｍＲＮＡを誘導したが、誘導はＣｄｋ９阻害剤によって防止された。Ｂ）Ｃｄｋ９の阻害は、軟骨外植片の傷害によって誘導されるアポトーシスを防止する。機械的傷害を受けた軟骨外植片（ｎ＝３ドナー）を、フラボピリドールがある、またはない状態で培養し、組織学試験のための処理をした。アポトーシス細胞は、ＴＵＮＥＬ染色（ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出し、全細胞中（ＤＡＰＩ染色）の比率として計算した。傷害はアポトーシス細胞集団を増加させたが、この影響は試験された全時点でＣｄｋ９の阻害により抑制された（＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ】Ｃｄｋ９の阻害が、下流の初期炎症反応遺伝子の活性化を全体的に、かつ効果的に抑制することを示している。Ａ）初代ヒト軟骨細胞（ｎ＝２）を、フラボピリドール（Ｆ）及び／若しくはＪＱ１（Ｊ）がある、またはない状態で１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで５時間処理した。全トランスクリプトームをマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で分析した。発現遺伝子のうち、８７３個はＩＬ−１βにより１．５倍超、誘導されていた（レーン１を５と比較）。これら８７３個の遺伝子それぞれの正規化された強度をヒートマップに示した。フラボピリドール及び／またはＪＱ１による処理は、これらの遺伝子の大部分を抑制した。
【図７Ｂ】Ｃｄｋ９の阻害が、下流の初期炎症反応遺伝子の活性化を全体的に、かつ効果的に抑制することを示している。Ｂ）Ｃｄｋ９阻害剤によるＩＬ−１β誘導性遺伝子の極めて効果的な抑制。Ｃｄｋ９阻害剤によって抑制される誘導性遺伝子の数を、最大誘導からの抑制率に基づいて、４つの四分区間に分類した。大部分の遺伝子の誘導は、Ｃｄｋ９阻害剤によって強く抑制された。フラボピリドール及びＪＱ１両方による併用治療は、本来の投与量（２５０：６０ｎＭ）の約２０〜２５％で最大の相乗効果を示した。これは、併用薬物治療が、総投与量及び潜在的オフターゲット効果の低減に有益であることを示している。
【図８Ａ】軟骨細胞の異化遺伝子がＣＤＫ９及びＢＲＤ４阻害剤によって抑制されたことを示している。炎症性サイトカインによるマトリックス分解プロテアーゼの誘導には、ＢＲＤ４及びＣＤＫ９活性を必要とする。ＢＲＤ４、ＣＤＫ９活性の阻害は、ＭＭＰ及びＡＤＡＭＴＳ４のサイトカイン誘導性発現をほぼ完全に抑制した。
【図８Ｂ】軟骨細胞の異化遺伝子がＣＤＫ９及びＢＲＤ４阻害剤によって抑制されたことを示している。炎症性サイトカインによるマトリックス分解プロテアーゼの誘導には、ＢＲＤ４及びＣＤＫ９活性を必要とする。ＢＲＤ４、ＣＤＫ９活性の阻害は、ＭＭＰ及びＡＤＡＭＴＳ４のサイトカイン誘導性発現をほぼ完全に抑制した。
【図９−１】ＣＤＫ９の阻害が、炎症誘発性サイトカイン及び異化遺伝子の傷害誘導性の上方調節を防止することを示している。Ａ）軟骨外植片の傷害及び薬物治療、ならびにその後の試験の模式図である。Ｂ〜Ｅ）傷害後２４時間以内の軟骨外植片（Ｃ＝無傷の対照、Ｉ＝傷害あり）での、フラボピリドールよる炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素遺伝子の抑制を示す。
【図９−２】ＣＤＫ９の阻害が、炎症誘発性サイトカイン及び異化遺伝子の傷害誘導性の上方調節を防止することを示している。Ｆ）傷害後２４時間以内の軟骨外植片（Ｃ＝無傷の対照、Ｉ＝傷害あり）での、フラボピリドールよる炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素遺伝子の抑制を示す。Ｇ〜Ｈ）フラボピリドールは同化遺伝子アグリカン及びコラーゲン２Ａの発現には影響を及ぼさない。すべての値は、ｎ＝６個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった（＊ｐ＜０．０５）。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＣＤＫ９の阻害が、アポトーシスメディエーターのｍＲＮＡ発現を減少させることを示している。フラボピリドールは、アポトーシス促進性遺伝子ｐ５３、Ｂｃｌ−２及びＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現を抑制する。すべての値は、ｎ＝６個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、ＣＤＫ９の阻害が、傷害誘導性のアポトーシスから軟骨細胞を救済することを示している。Ａ）フラボピリドールによる治療は、軟骨細胞アポトーシスを防止する。指定した時間に、軟骨外植片を組織学的検査及びＴＵＮＥＬ染色のために処理した。傷害は軟骨外植片でのアポトーシスを増加させたが、フラボピリドールはアポトーシスの細胞集団を減少させた。結果は、ｎ＝３個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった（＊ｐ＜０．０５）。Ｂ）フラボピリドールは、軟骨細胞の生存性を増強する。傷害後５日目に軟骨外植片を生死判別染色で染色した。傷害は細胞生存性を減少させたが、細胞はフラボピリドールによって救済された。結果は、ｎ＝６個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった（＊ｐ＜０．０５）。
【図１２】傷害誘導性のマトリックス分解から軟骨が保護されることを示している。機械的傷害を受けた軟骨外植片をフラボピリドールで５日間処理した。培地へ放出されるＧＡＧ量をジメチルメチレンブルーによる染色結合アッセイで測定した。結果を外植片の湿潤重量に基づいて正規化した。ＧＡＧ放出の増加が示すように、傷害は軟骨変性を引き起こした。３００ｎＭのフラボピリドールの存在下で、ＧＡＧの放出レベルはベースラインに戻った。結果は、ｎ＝６個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった（＊ｐ＜０．０５）。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ＣＤＫ９の阻害が、傷害を受けた軟骨の機械的特性を保持することを示している。軟骨外植片を傷害後４週間培養した。軟骨圧縮特性を一軸圧縮での応力緩和試験によって評価した。１０％の緩和弾性率、瞬間弾性率、及び粘性係数を示している。フラボピリドールによる処理は、傷害を受けた外植片及び無傷の外植片両方の圧縮特性を増強した。結果は、ｎ＝６個体のドナーから得た平均＋／−標準偏差であった。各図内で、文字が共通していない平均は互いに有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
【図１４】ＣＤＫ９の阻害が、傷害が誘導する軟骨の剛性損失を減少させることを示している。Ｙｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０１４）６６（６）：１５３７−４６に記載のように、マウスの右膝に傷害を与えた（ｎ＝６）。左の膝は、無傷の対照として利用した。フラボピリドール（２．５ｍｇ／ｋｇ）及びＪＱ１（１７ｍｇ／ｋｇ）を、傷害後、３日連続して腹腔内注射により投与した。７日目に、動物の膝を採取して、外側（Ｌ）及び内側（Ｍ）大腿骨顆で原子間力顕微鏡法により軟骨の弾性を測定した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．（２０１５）４８（８）：１３６４−７０の記載と同様）。傷害は軟骨の弾性損失を誘導したが、この損失は併用薬物処置により減少した。外傷後変形性関節症の非侵襲性マウスモデルは、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．（２０１５）２３（１０）：１６２７−３８にも記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
１．緒言
ＣＤＫ９及びＢＲＤ４活性の複合阻害が、多発外傷またはＳＩＲＳを防止、軽減及び／または緩和すること、傷害（例えば、外傷及び／または外科的傷害）後の軟骨及び保存中の軟骨（例えば、同種異系移植片）を保持することに使用できるという発見に部分的に基づく方法を提供する。阻害性核酸及び阻害性化合物（例えば、フラボピリドール、ＪＱ１、ＧＳＫ５２５７６２Ａ、ならびにその類似体及び塩）を含む、当技術分野で既知であるＣＤＫ９及びＢＲＤ４阻害剤のいかなる併用も本方法に使用することができる。
【００３５】
多様な刺激が炎症を誘導する可能性があり、そのうちのいくつかは関節炎薬（例えば、ＩＬ−１アンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、抗酸化剤）として個別に研究されている。その主眼は、応答遺伝子の転写が発生しないように経路を阻害することであった。これらの既存の研究はいずれも転写過程に対処するものではない。本発明は部分的に、これらの経路すべてが、初期応答遺伝子の転写伸長のためのＣＤＫ９及びＢＲＤ４の複合活性化に集約されるという発見に基づいている。ＣＤＫ９及びＢＲＤ４の複合阻害による転写伸長の阻害は、初期応答炎症性遺伝子に限定され、またＣＤＫ９及びＢＲＤ４の複合阻害はハウスキーピング遺伝子の転写に影響を及ぼさないため、短期的に細胞または組織を損傷することがない。ＣＤＫ９及びＢＲＤ４阻害の複合的な利点は、すべての炎症性刺激を原因とする炎症性遺伝子の転写伸長を減少させることである。様々な実施形態において、ＣＤＫ９及びＢＲＤ４は、例えば、小分子薬（例えば、フラボピリドール及び他の既知のＣＤＫ９阻害剤；ＪＱ１、ＧＳＫ５２５７６２Ａ及び他の既知のＢＲＤ４阻害剤、ならびにその類似体及び塩）及び／または阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）により、特異的かつ可逆的に阻害することができる。
【００３６】
症候性変形性関節症（ＯＡ）は、臓器レベルで荷重を支える関節の末期不全と定義することができる（１）。ＯＡの病因は依然として完全には解明されていないが、関節傷害が多くの場合、経時的にＯＡへと進行することは十分に立証されている（２）。関節内骨折を引き起こす高エネルギーの関節外傷は、多くの場合、関節変性及び外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）の急激な発症をもたらす（３）。はるかに頻度の高い、関節への低エネルギー外傷でさえ、軟骨及び関節変性の緩慢な進行を起こし、長年を経て症候性ＰＴＯＡに至ることになる（２）。例として、米国での年間膝傷害総数９００，０００のうち（４）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓによると、一般集団での前十字靱帯（ＡＣＬ）の傷害は２００，０００と推定されており（５）、これには軍人患者のＡＣＬ再建２５００〜３０００を含む（６）。際立ったことに、これらのＡＣＬ傷害患者のうち約５０％は、１０〜２０年の無症候性誘導期の後に膝のＰＴＯＡを発症する（７）。５０歳未満のＮＦＬ引退者では、一般集団の相当する男性よりも５倍、関節炎を患う可能性が高く、引退者の約８０％はほぼ１日中、持続的な関節の痛みがあると報告しており、５０歳以上のＮＦＬ引退者の２３％超は関節置換術を経験していた。
【００３７】
無症候性誘導期間には関節の痛みがないにもかかわらず、骨及び軟骨の進行性悪化は、外傷性関節損傷の直後から発現し始める。膝関節または股関節のＯＡの場合、無症候性の軟骨変性期は、数年または数十年も持続する可能性がある（８）。関節症にかかった関節に痛みが生じる頃には、多くの場合、軟骨損傷の広がりとともに完全に軟骨が損失した領域が生じる。通常のＯＡ患者がクリニックで診察を受ける頃には、無痛性の「早期ＯＡ」病状が伸展した結果、すでに広範な関節損傷が発生している。この後期段階では、関節変性の根本原因の治療はもはや不可能であり、損傷は不可逆的である。現在のＯＡ治療は、付随する関節の痛みには対処するが、関節機能を改善したり、基礎病理を改めたりすることはない。このような対症的治療が最終的に役立たなくなると、痛みなく歩行するには侵襲性外科関節置換術しか残された治療法はない。前十字靱帯（ＡＣＬ）裂傷のような関節外傷が最終的にＯＡに至るという根拠は豊富にあるが（９〜１１）、現在の臨床治療ではこのような傷害時点でＯＡの将来的な発症を防止する手段がない。現在では、臨床治療は、直接的痛み及び関節の膨張の低減、ならびに通常の関節運動の回復を目的としている。最も一般的な推奨事項は、氷を当てる、弾性包帯を用いて関節を静かに圧迫する、及び鎮痛剤（例えばアスピリン、アセトアミノフェンまたはイブプロフェン）を服用することである。重要なことに、これらの治療はＯＡの発症に対処していない。ＯＡの発生率は、患者がＡＣＬの外科再建術を受けたことがあるかどうかには無関係である（７、１２）。これは、慢性的な関節不安に加えて、傷害事象がＯＡの病因を引き起こす役割を有することを示唆している。
【００３８】
関節が衝撃時に受ける機械的な損傷は組織に即座に影響し、細胞死及び関節組織への物理的損傷は衝撃からミリ秒以内に発生する。その後、直後の機械的損傷が急性の細胞応答を誘発するが、これは数分から数時間の時間単位内で発生する（１３）。急性応答期は、負傷した関節組織からの、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αを含む、炎症性メディエーターの放出を特徴とする（１３、１４）。これによって、初期応答遺伝子（すなわち炎症性遺伝子）の転写活性化が生じて、マトリックス分解酵素、例えばＭＭＰ、コラゲナーゼ、アグリカナーゼ及びカテプシンの産生増加に至る。マトリックスの酵素分解は、以下を含む段階的な破壊事象を介して、ＯＡに寄与する。
（１）軟骨の剛性及び弾力の減少により、軟骨細胞の機械的ストレスが増加する、
（２）軟骨の透水率が増加し、間質液の喪失及び溶質（すなわち分解酵素、プロテオグリカン）の拡散増加をもたらす、
（３）残存する軟骨マトリックス構造が酵素消化の影響を受けやすくなる、
（４）軟骨下骨板が肥厚化する、
（５）骨梁への構造変化、ならびに
（６）骨棘及び異所骨の形成（８）。
【００３９】
治療介入域が傷害直後に存在し、その期間に急性細胞応答を減衰させると、マトリックス分解酵素の産生を減少させ、それによって外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を発症する可能性が減少すると我々は考えている。
【００４０】
全身炎症反応を減衰させる方法の一つは、これらの複数の炎症性因子を制御する共通機構を標的とすることである。そこで我々は初期応答遺伝子すべての転写伸長を制御する、単一の保存的機構を細胞核内において特定した。この共通機構の阻害は、すでに臨床試験段階にある小分子薬を用いることで可能である。この全く新しい治療方法を重度の外傷患者に適用することで、ＳＩＲＳの影響が低減され、外傷医療班による迅速な患者の安定化と傷害の治療が可能になり、救命及び医療費削減に多大な可能性をもたらす。
【００４１】
初期応答遺伝子の転写活性化は、傷害に対する急性細胞応答の重要な段階である。初期応答遺伝子の転写活性化は、傷害事象後、数分から数時間の時間単位で発生する。大部分の初期応答遺伝子は、プロモーター上のすでにアセンブリされた転写複合体と、転写伸長段階に入る直前で待機しているＲＮＡポリメラーゼ複合体によって、即刻「活性化」されて転写される。最近のＣｅｌｌ誌で、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓらは、初期応答遺伝子の転写伸長の律速段階がサイクリン依存性キナーゼ−９（ＣＤＫ９）の動員であることを簡潔に実証した（１５）。炎症性遺伝子転写の場合、ＣＤＫ９は、ＮＦκＢによって転写複合体に動員される（１６、１７）。重要なことに、ＣＤＫ９キナーゼ活性は、初期応答炎症性遺伝子の転写進行に必要とされ、またこの調節機構は初期応答遺伝子間で保存されている（１８）。したがって、ＣＤＫ９キナーゼ活性及びＢＲＤ４活性の複合阻害は、関節傷害後の急性炎症反応を阻害する新しい分子標的である。
【００４２】
重度の外傷後の多数の病状及び病源により、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を引き起こす可能性がある。従来の抗炎症薬は、上流の炎症性シグナル伝達網の特定の分岐点のみ、または何百もの炎症性メディエーター遺伝子の１つのみを標的としているため、ＳＩＲＳに対して効果がない（図１を参照）。例えば、コルチコステロイド、ＴＬＲ４アンタゴニスト、ＴＮＦ及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ブラジキニン、血小板活性化因子受容体アンタゴニスト及び抗凝固薬（抗トロンビンＩＩＩ）がすべて研究されたが、臨床試験で有意な利点を示さなかった。本方法は、全身性炎症を抑制するためにＣｄｋ９及びＢｒｄ４を同時に阻害する。本発明では、Ｃｄｋ９及びＢｒｄ４を同時に阻害することにより、すべての初期炎症反応遺伝子を活性化するための律速段階及びボトルネックを遮断する。この方法の利点は２つある。まず、刺激が起こすシグナル伝達経路に関係なく、上流の炎症性刺激すべてに対して有効である。次に、大部分の下流の炎症反応遺伝子の発現を効率的に抑制する。したがって、Ｃｄｋ９の阻害は、炎症反応全般を遮断し、重度外傷後の全身性炎症を調節するはるかに優れた方法となる。
【００４３】
２．利益を受け得る対象
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の併用療法から利益を受け得る対象は一般に急性全身性炎症をもたらす外傷及び／または軟骨組織への傷害を受傷しているか、または差し迫って受ける可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、例えば軟骨組織に損傷を与える傷害（例えば、外傷）を受傷している場合がある。いくつかの実施形態では、対象は、例えば急性全身性炎症、及び場合により多臓器系不全に至る外傷を受傷している場合がある。対象はまた、例えば、損傷した軟骨組織を修復する及び／または骨軟骨外植片を移植するための手術を受けるかまたは受けたことがある場合がある。
【００４４】
様々な実施形態において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の併用療法は、軟骨組織への損傷または傷害の約１０日後以内に、例えば、軟骨組織への損傷または傷害後の約９、８、７、６、５、４、３、２または１日後以内に対象に投与される。様々な実施形態において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の併用療法は、軟骨組織への損傷もしくは傷害後または外傷を受傷後、約７２時間、約４８時間または約２４時間以内に、例えば、軟骨組織への損傷もしくは傷害後または外傷を受傷後、約２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間、またはそれ未満以内に最初に対象に投与される。
【００４５】
３．ＣＤＫ９及びＢＲＤ４の阻害剤
一般に、ＣＤＫ９、例えば、ＮＰ＿００１２５２．１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドの活性を阻害または低減することによって、軟骨の変性及び／または外傷後変形性関節症の発症または進行を防止、低減、遅延または阻害する。
【００４６】
ａ．低分子有機化合物
ｉ．ＣＤＫ９阻害剤
ＣＤＫ９はサイクリン依存性キナーゼファミリーのメンバーであり、このファミリーの大部分のタンパク質は細胞周期進行を調節する。過去２０年にわたり、癌の細胞周期進行を停止する抗増殖剤としてＣＤＫ阻害剤が精力的に研究されてきた。また多数のＣＤＫ阻害剤が第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験段階である（１９、２０）。細胞周期進行を調節する大部分のＣＤＫタンパク質とは異なり、ＣＤＫ９は主に、ＲＮＡ合成及び転写伸長を調節すると考えられている（２１）。ＣＤＫ９に対して比較的良好な特異性を有する小分子阻害剤があり、これにはフラボピリドールならびにその類似体及び塩が含まれる。フラボピリドールの市販製剤は、Ａｌｖｏｃｉｄｉｂと呼ばれている。フラボピリドールのＩＵＰＡＣ名は、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン）である。フラボピリドールの構造を以下に示す。
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【００４７】
フラボピリドールは、ＣＤＫ９のＡＴＰ結合ポケットとの高親和性（Ｋｄ＝３ｎＭ〜６ｎＭ）の相互作用によって、ＣＤＫ９キナーゼ活性を阻害する（２２、２３）。ＣＤＫ９キナーゼ活性の阻害は、転写伸長を妨げることにより初期応答遺伝子の転写活性化を防止する（１５）。フラボピリドールの全身投与は十分に忍容性があり、フラボピリドールを用いた臨床試験で難治性慢性リンパ球性白血病の治療に成功している（２４〜２６）。近年では、Ｓｅｋｉｎｅらが、関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデルにフラボピリドールの抗増殖効果を利用している。その結果、フラボピリドールが滑膜過形成を減少させ、関節リウマチを効果的に防止することを実証した（２７）。抗関節炎効果は可逆的であり、フラボピリドール治療を中止すると、滑膜過形成は再開し、ＲＡは急速に進行した。
【００４８】
使用できる他のＣＤＫ阻害剤としては、例えば、限定されないが、４−（３，５−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアゾ）−フェノール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号２３８８１１）、２−（ピリジン−４−イル）−１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジノン、ＰＨＡ−７６７４９１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号２１７７０７）、ならびに以下に記載のもの、例えば、国際公開ＷＯ２０１２／１０１０６６（ピリジンビアリールアミン化合物）；ＷＯ２０１２／１０１０６５（ピリミジンビアリールアミン化合物）；ＷＯ２０１２／１０１０６４（Ｎ−アシルピリミジンビアリール化合物）；ＷＯ２０１２／１０１０６３（Ｎ−アシルピリジンビアリール化合物）；ＷＯ２０１２／０６６０７０（３−（アミノアリール）−ピリジン化合物）；ＷＯ２０１２／０６６０６５（フェニル−ヘテロアリールアミン化合物）；ＷＯ２０１１／０１２６６１（ピリジン及びピラジン誘導体）；ＷＯ２０１１／０７７１７１（４−フェニルアミノ−ピリミジン誘導体）；ＷＯ２０１０／０２０６７５（ピロロピリミジン化合物）；ＷＯ２００８／０７９９３３（ヘテロアリール−ヘテロアリール化合物）；ＷＯ２００７／１１７６５３（ＣＤＫ９−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤）；ＷＯ２００６／０２４８５８（４−アリールアゾ−３，５−ジアミノ−ピラゾール化合物）；ＷＯ２００６／０２１８０３（プリン及びピリミジンＣＤＫ阻害剤）、及び米国特許公開２０１２／０２２５８９９；２０１２／０１９６８５５；２０１２／０１４２６８０；２０１０／０１６０３５０；２０１０／０２４９１４９；２０１０／００７６０００；２０１０／００３５８７０；２０１０／０００３２４６；２００９／０３２５９８３；２００９／０３１８４４６；２００９／０３１８４４１；２００９／０２７０４２７；２００９／０２５８８８６；２００９／０２１５８０５；２００９／０２１５８０５；２００９／０１３７５７２；２００８／０１２５４０４；２００７／０２７５９６３；２００７／０２２５２７０；２００７／００７２８８２；２００７／００２１４５２；２００７／００２１４１９；及び２００６／０２６４６２８が挙げられ、そのすべてが、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ｉｉ．ＢＲＤ４阻害剤
Ｃｄｋ９のキナーゼ活性を直接の標的として炎症を抑制することに加え、ブロモドメインタンパク質Ｂｒｄ４による活性遺伝子プロモーターへの動員を遮断する新しいクラスの小分子阻害剤が、有効なＣｄｋ９阻害剤として近年発見された（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，１０６７−１０７３）。化合物ＪＱ１（図２及び以下）は、Ｂｒｄ４が活性化初期応答遺伝子のプロモーター近傍の染色体でアセチル化ヒストンを結合することを防止するブロモドメイン阻害剤である。これによって、ＪＱ１は、Ｂｒｄ４によるＣｄｋ９の動員を間接的に妨害するとともに、動物モデルで広域抗炎症薬として有望な可能性を示している（Ｂｅｌｋｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０，３６７０−３６７８）。本明細書の我々のデータでは、炎症性メディエーターの低減及び防止に関して、Ｃｄｋ９阻害剤とＢｒｄ４阻害剤間の強力な相乗効果を実証している。
【００５０】
使用できる他のＢＲＤ４及びブロモドメイン阻害剤としては、これに限定されないが、例えば、米国特許公開２０１４／０２９６２４６、２０１４／０２９６２４３、２０１４／０２４３３２２、２０１４／０２４３３２１、２０１４／０２４３２８６、２０１４／００４４７７０、２０１２／０２０８８００及び２０１２／０１５７４２８；ならびに国際公開ＷＯ２０１４／１４３７６８、ＷＯ２０１４／１６０８７３、ＷＯ２０１４／１２８０６７、ＷＯ２０１４／０２６９９７、ＷＯ２０１４／０９５７７５、ＷＯ２０１４／０９５７７４、ＷＯ２０１４／０４８９４５、ＷＯ２０１４／１２８０７０；及びＷＯ２０１４／１２８１１１に記載されているものが挙げられる。好適なブロモドメイン阻害剤は、ＢＲＤ４活性を選択的にまたは特異的に阻害する。使用するさらなるＢＲＤ４阻害剤は、例えば、Ｓｃｈｕｌｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２０１４  Ｓｅｐ  ２９．ＰＭＩＤ：２５２６６５６；Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．２０１４  Ｊｕｌ  １３；７：１４；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｘｕｅ  Ｙｅ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２０１４  Ｊｕｎ；３５（６）：５２８−３２；及びＭｕｖｖａ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１４  Ｊｕｌ  ２９；１０（９）：２３８４−９７に記載されている。
2017531007.tif 000004
ＪＱ１  −  Ｂｒｄ４を標的とする。
【００５１】
ｂ．阻害性核酸
ＣＤＫ９遺伝子発現及びＢＲＤ４遺伝子発現を並行して、または同時に減少させることまたは阻害することは、阻害性核酸（例えば、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなど）の使用によるものを含む、当技術分野のいずれかの方法を使用して達成することができる。阻害性核酸は、相補的な核酸配列と特異的に結合できる一本鎖の核酸であり得る。適切な標的配列と結合することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡの二重鎖または三重鎖が形成される。このような阻害性核酸は、「センス」方向または「アンチセンス」方向のいずれでもあり得る。例えば、Ｔａｆｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００６）１３：８６３−８１；Ｍａｈａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ（２００５）２：３−２８；Ｓｃａｎｌｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００４）５：４１５−２０；及びＳｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）２１：１４５７−６５を参照のこと。
【００５２】
一実施形態では、阻害性核酸は、ＣＤＫ９、ＢＲＤ４またはＣＤＫ９及びＢＲＤ４の両方をコードする標的核酸配列または部分配列に特異的に結合することができる。このような阻害性核酸の投与は、ＣＤＫ９及びＢＲＤ４の活性を、また結果的には軟骨変性を減少させる、または阻害することができる。ＣＤＫ９をコードするヌクレオチド配列は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種で既知である（例えば、ＮＭ＿００１２６１．３）。ＢＲＤ４をコードするヌクレオチド配列は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種で既知である（例えば、ＮＭ＿０１４２９９．２→ＮＰ＿０５５１１４．１短鎖アイソフォーム；及びＮＭ＿０５８２４３．２→ＮＰ＿４９０５９７．１長鎖アイソフォーム）。既知のＣＤＫ９及びＢＲＤ４ヌクレオチド配列から、適した阻害性核酸を誘導することができる。
【００５３】
１．アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、阻害性核酸はアンチセンス分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４をコードするｍＲＮＡのコーディング鎖（センス鎖）に対して相補的（すなわちアンチセンス）である比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、ＲＮＡをベースとするが、これはＤＮＡをベースとすることもできる。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、その安定性を増加させるために修飾される。
【００５４】
理論に束縛されないが、これらの比較的短いオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡとの結合は、内因性ＲＮＡｓｅによるメッセージの分解を引き起こす二本鎖ＲＮＡの伸長を誘導すると考えられている。加えて、オリゴヌクレオチドは、メッセージのプロモーター近傍で結合するように特異的に設計されることがあり、この状況下では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは更にメッセージの翻訳を妨害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能する特定の機構に関係なく、細胞または組織への投与により、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４をコードするｍＲＮＡの分解が可能である。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４の発現及び／または活性を減少させる。
【００５５】
オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物、またはその誘導体もしくは修飾型であり得、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を向上させるために塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖の位置で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、他の補足群、例えばペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的とするもの）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８８／０９８１０を参照）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照）の横断を促進する作用物質、ハイブリダイゼーションを誘導する切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照）を含み得る。この目的で、オリゴヌクレオチドを他の分子とコンジュゲートすることができる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含むが、これに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分を含み得る。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含むが、これに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含み得る。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性のペプチド様の主鎖を含むこともできる。このような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーと称されており、例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０及びＥｇｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点は、ＤＮＡ主鎖が中性であるため、培地のイオン強度とは本質的に関係なく、相補的なＤＮＡと結合できることである。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドジチオエート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸主鎖を含む。
【００５９】
更に別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、この鎖は、通常のユニットとは異なり互いに平行に伸びている（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。
【００６０】
オリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準的方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成器（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されているもの）の使用により合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎら（１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを、制御された多孔質ガラスポリマー支持体等の使用によって作製することができる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）。
【００６１】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、当業者によって容易に行うことができる。ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４をコードする核酸配列を考慮して、当業者は標的とする核酸配列と結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができ、またこのオリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ系で試験して、それらがＣＤＫ９をコードするｍＲＮＡと結合するとともに、ｍＲＮＡの分解を媒介することを確認することができる。ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４をコードする核酸と特異的に結合し、分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するためには、オリゴヌクレオチドによって認識される配列が、阻害するＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４に対して固有であるか、または実質的に固有であることが好ましい。例えば、コード配列全体で頻繁に繰り返される配列は、特定のメッセージを特異的に認識して分解するオリゴヌクレオチドの設計には、理想的な選択でない場合がある。当業者は、オリゴヌクレオチドを設計して、そのオリゴヌクレオチドの配列を、一般公開データベースに寄託されている核酸配列と比較し、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４に対して特異的であるか、または実質的に特異的であることを確認することができる。
【００６２】
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するため、いくつかの方法が開発されている。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注入することができ、または目的の細胞を標的とするように設計された修飾済みアンチセンス分子（例えば、標的細胞表面に発現した受容体または抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体と結合されたアンチセンス）を全身に投与することができる。
【００６３】
しかしながら、ある特定の場合に内因性ｍＲＮＡ上の翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難な場合がある。したがって、別の方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下で配置される組み換えＤＮＡ構築物を利用している。例えば、ベクターが細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を開始するように、ｉｎ  ｖｉｖｏ導入することができる。そのようなベクターは、転写されて目的のアンチセンスＲＮＡを産生できる限り、エピソーム型のままであっても、または染色体に組み込まれていてもよい。このようなベクターは、当技術分野で標準的な組み換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞の複製及び発現に使用される、プラスミド、ウイルスまたはその他の当技術分野で既知のものであってよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞で作用する、当技術分野で既知のいずれかのプロモーターによるものであり得る。そのようなプロモーターは、誘導性であっても構成的であってもよい。そのようなプロモーターとしては、これに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピート内に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）等が挙げられる。任意の種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを使用して、組織部位に直接導入できる組み換えＤＮＡ構築物を調製することができる。あるいは、目的の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ、その場合、投与は別の経路（例えば、全身）によって達成することができる。
【００６４】
２．低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子の発現を特異的に遮断できる二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は本来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的かつ転写後に遺伝子発現を遮断する現象に適用される用語である。ＲＮＡｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の阻害に有用な方法を提供する。ＲＮＡｉ構築物には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及びｉｎ  ｖｉｖｏで切断されてｓｉＲＮＡを形成できる他のＲＮＡ種を含むことができる。また、本明細書でのＲＮＡｉ構築物には、細胞内でｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡを形成する転写物、及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを産生できる転写物を誘発できる発現ベクター（「ＲＮＡｉ発現ベクター」）が含まれる。
【００６５】
ＲＮＡｉ発現ベクターは、構築物が発現される細胞内でｓｉＲＮＡ部分を産生するＲＮＡを発現（転写）する。そのようなベクターは、（１）遺伝子発現の調節役割を有する遺伝子要素（複数可）、例えば、プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、これらと操作可能に連結された、（２）転写されて二本鎖ＲＮＡを産生する「コード」配列（細胞内でアニーリングされてｓｉＲＮＡを形成する２つのＲＮＡ部分、またはプロセッシングによりｓｉＲＮＡ化できる単一のヘアピンＲＮＡ）、及び（３）適切な転写開始及び停止配列のアセンブリを含んでいる転写ユニットを含む。プロモーター及び他の調節要素の選択は一般に、目的とする宿主細胞に応じて異なる。
【００６６】
ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理的条件下で、遺伝子を阻害するｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分のヌクレオチド配列（すなわち、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４をコードする核酸配列）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する程度に天然ＲＮＡと類似していればよい。したがって、本発明は、遺伝子突然変異、株多型または進化による多様化により予想され得る配列の変化を許容できるという利点がある。標的配列とＲＮＡｉ構築物配列の間で許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中に１つ、または１０塩基対中に１つ、または２０塩基対中に１つ、または５０塩基対中に１つを超えない数である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央でのミスマッチは最も致命的であり、標的ＲＮＡの切断が事実上、消滅する場合がある。対照的に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性にさほど寄与しない。
【００６７】
配列同一性は、当技術分野で既知の配列比較及びアラインメントアルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１及びその引用文献を参照）によって、及び例えばＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）でデフォルトパラメーターを使用して実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるヌクレオチド配列間の相違パーセントの計算によって最適化することができる。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子部分との間の配列同一性は９０％超、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または更には１００％の配列同一性であることが好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域を、標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に決定することができる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーション後に洗浄）。
【００６８】
ＲＮＡｉ構築物の製造は、化学合成法によって、または組み換え核酸技術によって実施することができる。処理した細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはｉｎ  ｖｉｖｏ転写を媒介でき、またはクローン化ＲＮＡポリメラーゼはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用することができる。ＲＮＡｉ構築物は、例えば、細胞内ヌクレアーゼに対する感受性を低減するため、バイオアベラビリティを向上させるため、製剤特性を改善するため、及び／またはその他の薬物動態学的特性を変化させるために、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドに修飾を含んでもよい。例えば、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾することができる。ＲＮＡ構造の修飾を調整して、ｄｓＲＮＡに対する全体的な応答を回避しながら、特異的な遺伝子阻害を可能にすることができる。同様に、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することができる。ＲＮＡｉ構築物は酵素的に、または部分的な／完全な有機合成によって産生でき、修飾されたリボヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素または有機合成によって導入することができる。
【００６９】
ＲＮＡ分子の化学的修飾方法をＲＮＡｉ構築物の修飾に適用することができる（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：７７６−７８０；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照）。単に例示として、ＲＮＡｉ構築物の主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジンを含有するオリゴマーまたは糖修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−配置）によって修飾することができる。
【００７０】
二本鎖構造は、１本の自己相補的ＲＮＡ鎖または２本の相補的ＲＮＡ鎖によって形成することができる。ＲＮＡ二本鎖の形成は、細胞内部でも外部でも開始することができる。ＲＮＡは、細胞当たり少なくとも１コピーの送達が可能である量で導入することができる。高用量（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）の二本鎖物質はより有効な阻害を生じ得る一方で、特定の用途には低用量も有用であり得る。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域と対応するヌクレオチド配列が遺伝子阻害の標的であるという点で配列特異的である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、対象のＲＮＡｉ構築物は「低分子干渉ＲＮＡ」すなわち「ｓｉＲＮＡ」である。この核酸は約１９〜３０ヌクレオチド長であり、更により好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長、例えば、長い二本鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ「ダイシング」により生成される断片に対応する長さである。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を動員して、その複合体を特異的配列との対合により標的ｍＲＮＡに誘導すると理解されている。その結果、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。
【００７２】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知である数多くの技術を使用して得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当技術分野で既知の方法を使用して、化学合成または組み換え産生することができる。例えば、短いセンス及びアンチセンスＲＮＡオリゴマーを合成してアニーリング処理し、各末端に２−ヌクレオチドオーバーハングをもつ二本鎖ＲＮＡ構造を形成することができる（Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９８：９７４２−９７４７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ，２０：６８７７−８８）次いでこの二本鎖ｓｉＲＮＡ構造を、以下に記載するような、最適な受動的取り込みまたは送達系いずれかによって細胞に直接導入することができる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構築物は、例えば酵素ダイサーの存在下で、長い二本鎖ＲＮＡがプロセッシングされることによって生成することができる。一実施形態では、ショウジョウバエのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が使用される。本実施形態では、ｄｓＲＮＡをショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と混合することにより、組み合わせを得る。この組み合わせは、ｄｓＲＮＡがプロセッシングされて、約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子になる条件下で維持される。
【００７４】
このｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知の数多くの技術を使用して精製することができる。例えば、ゲル電気泳動を使用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。あるいは、非変性的方法、例えば非変性カラムクロマトグラフィーを使用してｓｉＲＮＡを精製することができる。加えて、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離法、抗体を用いたアフィニティー精製を使用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。
【００７５】
ある特定の好適な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一本の鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。ただし、これは２〜４ヌクレオチド長であってもよい。より好ましくは、３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、一方の鎖は３’オーバーハングを有し、他方の鎖は平滑末端であるか、またはオーバーハングも有する。オーバーハングの長さは、鎖ごとに同一であっても異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性を更に強化するために、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。一実施形態では、プリンヌクレオチド、例えばアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含めることによってＲＮＡを安定化させる。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換が許容され、これはＲＮＡｉの効率に影響を及ぼさない。２’ヒドロキシルがないことは、組織培地中でのオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を大幅に増強し、ｉｎ ｖｉｖｏで有益であり得る。
【００７６】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、長い二本鎖ＲＮＡの形態である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は４００〜８００塩基長である。二本鎖ＲＮＡは細胞内で消化され、例えば、細胞中にｓｉＲＮＡ配列が産生される。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長い二本鎖ＲＮＡの使用は、おそらく、配列非依存性ｄｓＲＮＡ反応によって引き起こされ得る有害作用のため必ずしも実用的ではない。そのような実施形態では、局所送達系及び／またはインターフェロンの効果を低減する薬剤の使用が好ましい。
【００７７】
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構造（ヘアピンＲＮＡと称する）の形態である。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することも、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することもできる。哺乳動物細胞での遺伝子サイレンシングのために、そのようなヘアピンＲＮＡを作成して使用する例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，２００２，１６：９４８−５８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−９；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２００２，８：８４２−５０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２，９９：６０４７−５２）に記載されている。好ましくは、そのようなヘアピンＲＮＡは、目的遺伝子の持続的で安定した抑制を確実にするため、細胞内または動物内で遺伝子操作される。細胞内でヘアピンＲＮＡがプロセッシングされることにより、ｓｉＲＮＡを産生できることは当技術分野で既知である。
【００７８】
更に他の実施形態では、プラスミドを使用して、二本鎖ＲＮＡを例えば、転写産物として送達する。このような実施形態では、プラスミドは、ＲＮＡｉ構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖それぞれに対する「コード配列」を含むように設計される。コード配列は、例えば、逆方向のプロモーターと隣接する同じ配列であっても、またはそれぞれが別々のプロモーターの転写制御下にある２つの独立した配列であってもよい。コード配列の転写後、相補的ＲＮＡ転写物が塩基対合し、二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００７９】
ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０に、導入遺伝子の双方向転写により、真核細胞において同じ導入遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写物両方を産生するための例示的なベクターが記載されている。それに従い、ある特定の実施形態では、本発明は以下の固有の特徴を有する組み換えベクターを提供する。このベクターは、目的のＲＮＡｉ構築物の導入遺伝子を挟んで反対方向に配置された、２つの重複転写単位を有するウイルス性レプリコンを含み、この２つの重複転写単位は、宿主細胞の同じ導入遺伝子断片から、センス及びアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を産生する。
【００８０】
ＲＮＡｉ構築物は、標的核酸配列と同一であるか、または実質的に同一である長鎖の二本鎖ＲＮＡ、または標的核酸配列の一領域のみ同一であるか、または実質的に同一である短鎖の二本鎖ＲＮＡのいずれをも含み得る。長鎖または短鎖ＲＮＡｉ構築物を作製して送達する例示的な方法は、例えば、ＷＯ０１／６８８３６及びＷＯ０１／７５１６４で参照することができる。
【００８１】
特定の遺伝子または特定の遺伝子ファミリーを特異的に認識する例示的なＲＮＡｉ構築物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択に関して上記で詳細に概説した方法を使用して選択することができる。同様に、ＲＮＡｉ構築物の送達方法としては、上記で詳細に概説したアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達方法が挙げられる。
【００８２】
３．リボザイム
いくつかの実施形態では、阻害性核酸はリボザイムである。ｍＲＮＡ転写物を触媒により切断するように設計されたリボザイム分子も、ｍＲＮＡの翻訳防止に使用することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５及び米国特許第５，０９３，２４６号を参照）。部位特異的認識配列の位置でｍＲＮＡを切断するリボザイムを特定のｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する領域をフランキングすることにより決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は以下の２塩基配列、すなわち５’−ＵＧ−３’を標的ｍＲＮＡが有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は当技術分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１に詳細に記載されている。
【００８３】
本発明のリボザイムはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と称する）、例えばテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に天然に存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈ及び共同研究者により広範に記載されているもの（Ｚａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３；ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６）を含む。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの切断を行う８つの塩基対活性部位を有している。本発明は、８つの塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【００８４】
アンチセンスの方法と同様に、リボザイムは、（例えば、安定性、標的性等を改善するため）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に送達することができる。好ましい送達方法は、トランスフェクトされた細胞が十分量のリボザイムを生成し、標的メッセージを破壊して翻訳を阻害するように、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下で、リボザイムを「コード」するＤＮＡ構築物を使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるため、効率を得るには低い細胞内濃度が必要である。
【００８５】
ＤＮＡ酵素には、アンチセンス技術及びリボザイム技術両方の機構的特徴の一部が組み込まれている。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとほぼ同様に、特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムとほぼ同様に、触媒性であり、標的核酸を特異的に切断するように設計される。
【００８６】
現在、ＤＮＡ酵素には２つの基本タイプがあり、そのいずれもＳａｎｔｏｒｏ及びＪｏｙｃｅにより同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を参照）。１０〜２３のＤＮＡ酵素は、２本のアームを接続するループ構造を含む。２本のアームが、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を提供する一方、ループ構造は生理学的条件下で触媒機能を提供する。
【００８７】
簡潔には、標的核酸を特異的に認識して切断する理想的なＤＮＡ酵素を設計するために、当業者は固有の標的配列を最初に特定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して概説したものと同じ方法を使用して行うことができる。好ましくは、固有のまたは実質的に固有の配列は、約１８〜２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチ領域である。Ｇ／Ｃ含量が多いと、ＤＮＡ酵素と標的配列との間でより強力な相互作用が確保される。
【００８８】
ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素をメッセージに標的化する特異的なアンチセンス認識配列は、ＤＮＡ酵素の２本のアームを含み、ＤＮＡ酵素ループが２本の特異的アーム間に配置されるように分割される。
【００８９】
ＤＮＡ酵素の製造方法及び投与方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。同様に、ＤＮＡリボザイムのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ送達方法には、上で詳細に概説したＲＮＡリボザイムの送達方法を含む。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、安定性の改善及び耐分解性の改善のため、ＤＮＡ酵素を場合により修飾できることを当業者は理解されよう。
【００９０】
４．製剤及び投与
治療用途において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤を組み合わせて、軟骨組織に外傷を受けた個体、軟骨組織の修復手術を受けた個体、及び／または軟骨同種異系移植片の移植を受けた個体に投与することができる。１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の組み合わせを含む組成物は、望ましくない炎症を抑制して、症状及び／または合併症を解消する、または少なくとも部分的に阻止する十分量で患者に投与される。これを達成する十分量を「治療的有効量」と定義する。この用途のための有効量は、例えば、阻害剤組成物、投与様式、治療される疾患のステージ及び重症度、患者の全身健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存することになる。ＣＤＫ９及びＢＲＤ４活性の阻害剤を組み合わせて慢性投与または急性投与し、軟骨変性及び外傷後変形性関節症を軽減、阻害、または防止することができる。ある特定の場合には、１種以上のＣＤＫ９活性の阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４活性の阻害剤を、例えば、軟骨変性及び／または外傷後変形性関節症の発症のリスクがある、または発症の疑いがある対象に予防的に投与するのに適している。
【００９１】
あるいは、ＣＤＫ９タンパク質をコードする１つ以上の配列の発現を阻害するＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばアンチセンス核酸、低分子干渉核酸（すなわち、ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはＣＤＫ９の発現または活性を遮断するペプチドをコードする核酸を患者に導入して、阻害を達成することができる。米国特許第５，５８０，８５９号には、核酸がコードする遺伝子の発現を得るため、細胞への裸の核酸の注入を利用することについて記載されている。
【００９２】
本発明のＣＤＫ９阻害剤またはエンハンサー組成物の治療的有効量は一般に、初期投与の場合（すなわち治療的投与または予防的投与の場合）、７０ｋｇの患者に対して約０．１μｇ〜約１０ｍｇ以下の範囲のＣＤＫ９阻害剤及び／またはＢＲＤ４阻害剤であり、通常は約１．０μｇ〜約１ｍｇ以下、例えば、特にＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤を同時投与するときは約１０μｇ〜約０．１ｍｇ（１００μｇ）の範囲である。ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、一緒にすれば有効である場合と、個々のＣＤＫ９阻害剤及び／またはＢＲＤ４阻害剤の量は有効ではない場合とがある。通常は低用量を最初に投与して、望ましい有効な用量に達するまで徐々に増加する。軟骨変性及び／または外傷後変形性関節症に伴う症状を評価することにより、その用量を患者の反応及び病状に応じて数週間から数か月にわたり引き続き反復投与することができる。
【００９３】
予防的使用の場合、投与は、軟骨変性及び／または外傷後変形性関節症を発症するリスクのある対象または発症の疑いがある対象に与えられるものである。治療的投与は、外科手術及び／もしくは同種異系移植処置と並行して、ならびに／または外傷もしくは手術後早急に開始することができる。多くの場合、少なくとも症状が実質的に緩和されるまで、更にそれ以降の期間、引き続き反復投与する。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、外傷を受けた後の１０日以内、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１日以内、例えば、２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間以内に同時投与される。いくつかの実施形態では、対象は損傷した軟骨組織を修復する手術を受けたことがある。いくつかの実施形態では、対象は、骨軟骨外植片、例えば軟骨同種異系移植片の移植を受けたことがある。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、手術と同時に、または手術前に同時投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、手術後の１０日以内、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１日以内、例えば、２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間以内に同時投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、１０日間にわたって、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１日間にわたって同時投与される。様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は、必要に応じて、２日ごと、毎日、または毎日２回、同時投与される。
【００９４】
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の治療的または予防的処置での併用は、全身（例えば、非経口的、外用、経口、経皮的）または局所（例えば、病巣内）投与を目的とする。好ましくは、組成物は経口投与用に製剤化される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、鼻腔内に、吸入で、皮下に、皮内に、または筋肉内に投与される。組成物はまた、経口投与にも適している。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁されたＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の溶液を含む、非経口的投与用組成物を提供する。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％の生理食塩水、０．３％のグリシンまたは他の適切なアミノ酸、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来的な周知の滅菌技術によって殺菌することも、または濾過滅菌することもできる。得られた水溶液は、そのまま使用するため包装しても、または凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を投与前に無菌液と混合してもよい。組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じて薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含むことができる。
【００９５】
ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４の阻害剤の一方または両方が低分子有機化合物である実施形態では、化合物（例えば、フラボピリドール、ＪＱ１、ＧＳＫ５２５７６２Ａ）及び／またはその類似体は、経口、非経口（静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、デポーＩＭ、皮下（ＳＱ）及びデポーＳＱ）、舌下、経鼻（吸入）、髄腔内、経皮的（例えば、経皮パッチによる）、外用、イオン泳動、または直腸投与することができる。通常、脳への送達（例えば、血液脳関門の通過）を容易にするように剤形を選択する。注目される点として、この状況において本明細書に記載する化合物は脳に容易に送達される。化合物の送達に適した剤形は、当業者に既知である。
【００９６】
様々な実施形態において、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤は静脈内に同時投与される。ＣＤＫ９阻害剤がフラボピリドールである実施形態では、当技術分野で報告されている濃度及び計画に従って投薬することができる。例えば、様々な実施形態で、フラボピリドールは、適宜、約１０〜約１０５ｍｇ／ｍ２の濃度範囲で、１〜４時間にわたる注入送達で静脈内投与される。例えば、Ｒａｍａｓｗａｍｙ，ｅｔ  ａｌ，．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ．（２０１２）３０（２）：６２９−３８；Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．（２００９）１１３（１２）：２６３７−４５；及びＢｙｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．（２００７）１０９（２）：３９９−４０４を参照のこと。様々な実施形態において、ＪＱ１は、ナノモル濃度、例えば１０〜５０００ｎＭ、例えば５０〜１０００ｎＭ、例えば５０〜５００ｎＭで投与することができる。様々な実施形態において、ＪＱ１は、約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、Ｔｒａｂｕｃｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｊｕｌ  ９，ＰＭＩＤ  ２５００９２９５；及びＳｐｉｌｔｏｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；６３：１７５−９を参照のこと。
【００９７】
治療的有効量の化合物を含有する組成物が提供される。化合物は、好ましくは好適な医薬製剤、例えば経口投与用の錠剤、カプセルもしくはエリキシルに、または非経口投与用の無菌液もしくは懸濁液に製剤化される。通常、上記の化合物は、当技術分野で周知の技術及び手順を使用して、医薬組成物に製剤化される。
【００９８】
これらの活性剤（例えば、フラボピリドール及び／またはその類似体）は、「本来の」形態で、または必要に応じて、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体等の形態で投与することができる。ただし、塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体が、好適に薬学的に有効である、例えば本方法（複数可）で有効な場合に限る。活性剤の塩、エステル、アミド、プロドラッグ及び他の誘導体は、有機合成化学分野の当業者に既知であり、例えば、Ｍａｒｃｈ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｎ．Ｙ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載された標準手順を用いて調製することができる。
【００９９】
このような誘導体の製剤化方法は、当業者に既知である。例えば、いくつかの送達剤のジスルフィド塩が、ＰＣＴ公開ＷＯ２０００／０５９８６３に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、治療的ペプチド、ペプトイドまたは他の模倣体の酸性塩は、通常は好適な酸との反応を伴う従来の方法を使用して遊離塩基から調製することができる。一般に、塩基形態の薬物をメタノールまたはエタノールなどの極性有機溶媒に溶解して、それに酸を添加する。生じる塩は沈殿するか、またはより低極性の溶媒を添加して溶液から抽出することができる。酸付加塩の調製に適した酸には、限定されないが、有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、オロチン酸等、ならびに無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の両方が含まれる。酸付加塩を好適な塩基で処理して遊離塩基に再変換することができる。本明細書の活性剤の、ある特定の特に好ましい酸付加塩には、塩酸または臭化水素酸を用いて調製できるようなハロゲン塩が含まれる。対して、本発明の活性剤の塩基性塩の調製は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミン等の薬学的に許容される塩基を用いて同様に調製される。ある特定の実施形態では、塩基性塩には、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩及び銅塩が含まれる。
【０１００】
塩形態の塩基性薬物を調製する場合、対イオンのｐＫａが、薬物のｐＫａより少なくとも約２ｐＨ低いことが好ましい。同様に、塩形態の酸性薬物を調製する場合、対イオンのｐＫａが、薬物のｐＫａより少なくとも約２ｐＨ高いことが好ましい。この場合、対イオンにより、溶液のｐＨが最大ｐＨより低いレベルで塩平衡に到達することが可能になり、その時点の塩の溶解性が遊離酸または遊離塩基の溶解性を上回る。活性医薬成分（ＡＰＩ）と酸または塩基でのイオン化基のｐＫａ単位の差に関する一般法則は、プロトン移動をエネルギー的に有利にすることを意図している。ＡＰＩと対イオンのｐＫａに有意差がない場合、固体複合体が形成され得るが、水性環境では速やかに不均化を起こす（例えば、薬物及び対イオン個々の要素に分解する）ことができる。
【０１０１】
好ましくは、対イオンは薬学的に許容される対イオンである。好適な陰イオン塩形態には、限定されないが、酢酸塩、安息香酸塩、ベンジル酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、リン酸塩及び二リン酸塩、サリチル酸塩及び二サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエトヨウ化物、吉草酸塩等が含まれ、対して、好適な陽イオン塩形態には、これに限定されないがアルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛等が含まれる。
【０１０２】
様々な実施形態において、エステルの調製には通常、活性剤の分子構造中に存在するヒドロキシル基及び／またはカルボキシル基の官能基化を伴う。ある特定の実施形態では、エステルは通常、遊離アルコール基のアシル置換誘導体、例えば式ＲＣＯＯＨのカルボン酸に由来する部分であり、式中、Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキルである。エステルは、必要に応じて従来の水素化分解法または加水分解法を用いて遊離酸に再変換することができる。
【０１０３】
当業者に既知であるか、または関連文献に記載された技術を用いて、アミドを調製することもできる。例えば、アミドは好適なアミン反応物を使用してエステルから調製しても、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応により無水物もしくは酸塩化物から調製してもよい。
【０１０４】
ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の医薬製剤中の濃度は、広範に、すなわち約０．１重量％未満、通常は約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上にまで変更することができ、選択される特定の投与様式に従って、主に液量、粘度等によって選択される。
【０１０５】
ＣＤＫ９阻害剤及び／またはＢＲＤ４阻害剤はまた、特定の組織、例えば軟骨組織との抱合体を標的として設計できる、リポソームを介して投与することもできる。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、薄板状層等を含む。これらの調製物において、送達されるペプチド、核酸または有機化合物は、リポソームの一部として、単独で、または例えば目的の細胞で優勢な受容体と結合する分子、もしくは他の治療用組成物とともに組み込まれる。したがって、目的のペプチド、核酸、小分子または複合体を充填したリポソームを、損傷または傷害のある病変、例えば、軟骨組織、関節、傷害病変に誘導した後に、その場所で選択されたＣＤＫ９阻害剤及び／またはＢＲＤ４阻害剤組成物を送達することができる。本発明に使用するリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、一般に中性及び負電荷のリン脂質類及びステロール、例えばコレステロールを含む。脂質の選択は一般に、リポソームのサイズ、血流中でのリポソームの酸不安定性（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）及び酸安定性を考慮して決定する。リポソームの調製には、例えば、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号及び第４，８３７，０２８号に記載されているような、様々な方法を利用できる。
【０１０６】
様々な標的薬剤を使用したリポソームの標的化は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び第４，６０３，０４４号を参照）。目的の細胞に対する標的化のために、リポソームに組み込まれるリガンドには、例えば、標的細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。ＣＤＫ９阻害剤及び／またはＢＲＤ４阻害剤を含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与様式、送達される複合体、及び治療する疾患のステージに応じて異なる用量で、静脈内に、局所（例えば、病巣内）に、外用等で投与することができる。
【０１０７】
固体組成物には従来の非中毒性固体担体を使用でき、これには、例えば、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。経口投与の場合、薬学的に許容される非中毒性組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば、前に列挙した担体などのいずれか、及び一般的に１０〜９５％の活性成分、すなわち１種以上の複合体を、より好ましくは濃度２５％〜７５％で組み込むことによって形成する。
【０１０８】
エアロゾル投与の場合、阻害剤は界面活性剤及び噴射剤と一緒に好適な形態で供給されることが好ましい。ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の典型的な比率は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１％〜１０％である。界面活性剤は、言うまでもなく、非中毒性でなければならず、好ましくは噴射剤に溶解性でなければならない。そのような薬剤の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含んでいる脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸及びオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば混合グリセリドまたは天然グリセリドを使用してもよい。界面活性剤は、組成物重量の０．１〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を構成する。組成物の残部は通常、噴霧剤である。必要に応じて、例えば経鼻送達用レシチンと同様の担体を含むこともできる。
【０１０９】
有効な治療は、臨床医により測定された、または患者が報告した、観察される症状の減少（例えば、痛み、腫脹、関節可動性）によって示される。あるいは、特定のＣＤＫ９活性及び／またはＢＲＤ４活性のレベルを検出する方法を使用することができる。ＣＤＫ９活性及び／またはＢＲＤ４活性を検出する標準的アッセイを本明細書に記載する。ここでも、有効な治療は、ＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４の活性の実質的な低減によって示される。本明細書で使用される場合、ＣＤＫ９活性及び／またはＢＲＤ４活性の「実質的な低減」とは、試験用試料を無処置対照群と比較した場合の、少なくとも約３０％の低減を指す。好ましくは、低減は少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％であり、及び最も好ましくはＣＤＫ９及び／またはＢＲＤ４活性レベルが、処置された哺乳動物からの試料において、無処置対照群と比較して少なくとも約９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９活性及び／またはＢＲＤ４活性は完全に阻害される。
【０１１０】
５．ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤を含むマトリックス
様々な実施形態において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の組み合わせを、マトリックスまたはデポー内に含有することができる。マトリックスは、軟骨病変または骨病変の部位に組成物を送達するための送達ビヒクルとして、１容積で供給することができる。マトリックスはまた、軟骨修復及び再生が生じ得る好適な足場を提供する。一実施形態では、マトリックスは生体吸収性または生分解性である。
【０１１１】
様々な実施形態において、マトリックスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に適しており、かつＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤の存在下で、軟骨修復または骨修復を容易にする特徴を備えるいずれかの材料から形成することができる。マトリックスは、合成ポリマー及び／または基質を含むが、これらに限定されない材料から形成することができる。好ましい基質は、天然ポリマー及びプロテオグリカンを含む。天然ポリマーとしては、限定されないが、コラーゲン、エラスチン、レチクリン、及びその類似物が挙げられ、プロテオグリカンとしては、限定されないが、いずれかのグリコサミノグリカン含有分子が挙げられる。特に好ましいグリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロナンが挙げられる。他の好ましい基質としては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい合成ポリマーとしては、ポリ（乳酸）及びポリ（グリコール酸）が挙げられる。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、マトリックスはコラーゲンを含む。例えば、マトリックスは乾重量でマトリックスの約２０％〜約１００％のコラーゲン、例えば乾重量でマトリックスの約５０％〜約１００％のコラーゲン、例えば乾重量でマトリックスの約７５％〜約１００％のコラーゲンを含有し得る。
【０１１３】
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤との使用に適したマトリックスは、軟骨病変または骨病変の修復での使用に適した、スポンジ、膜、フィルムまたはゲルを含めた、いかなる形態の材料も含むことができる。一実施形態では、好適な修復マトリックスとしては、脱灰骨マトリックス、合成骨移植片代用物、自家移植片組織、同種異系移植片組織及び／または異種移植片組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、骨移植片として、例えば脊髄移植片として使用するために処方される。
【０１１４】
ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤とマトリックスを会合させるのに適した方法には、軟骨修復物または骨修復物が、その部位の軟骨または骨の修復及び／または再生に有効であるように、阻害剤をマトリックスとともに軟骨修復部位または骨修復部位に送達できる、いずれかの方法が含まれる。そのような会合方法としては、マトリックス内への組成物の懸濁、マトリックス表面上の組成物の凍結乾燥、及び担体／送達製剤を含有する組成物のマトリックス内への懸濁が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤を、軟骨病変に産物を配置する前にマトリックスと会合させることも（すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏでの組成物とマトリックスの会合）、あるいは最初にマトリックスを病変に移植し、続いて１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤をマトリックス内部へ、もしくはマトリックス表面へ注入してマトリックスと会合させることもできる（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組成物とマトリックスの会合）。
【０１１５】
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の組み合わせには、組成物のマトリックスとの会合を増強する、病変部位の適切な細胞及び組織への組成物の送達を増強する、及び病変部位での組成物中の因子の放出の制御を助ける、追加の送達製剤または担体を含有することができる。本明細書で使用される場合、好適な送達製剤には、被治療動物での軟骨誘導組成物の半減期を増加させる化合物を含む担体が含まれる。好適な担体としては、ポリマー徐放性ビヒクル、生分解性移植片、リポソーム、細菌、ウイルス、油、細胞、エステル及びグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、マトリックスは生体吸収性または生分解性である。
【０１１６】
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤の組み合わせは、軟骨病変部位または骨病変部位で、ＩＩ型コラーゲン産生軟骨細胞に対する細胞浸潤、細胞増殖、血管新生及び細胞分化のうちの１つ以上を誘導するのに有効である濃度でマトリックス中に存在する。１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び／または１種以上のＢＲＤ４阻害剤は個々に、非有効濃度で存在し得る。様々な実施形態において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤は、その併用が、軟骨病変部位または骨病変部位で軟骨修復及び／または再生を誘導するのに有効である濃度でマトリックス中に存在する。当業者は、組成物により提供されるタンパク質の種類及び数、ならびに使用する送達ビヒクルに応じて、組成物中のタンパク質及び／または核酸分子の濃度を調節することができる。
【０１１７】
マトリックスはまた、組成物中の１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤に非共有的に結合され、それによって成長因子の放出速度を変更する１つ以上の物質を含有することができる。そのような物質には、限定されないが、いずれかの基質または他のポリマー物質を含む。本明細書で使用される場合、基質は、天然ポリマー及びプロテオグリカンを含む、非生体マトリックスの結合組織と定義する。天然ポリマーとしては、コラーゲン、エラスチン、レチクリン及びその類似体が挙げられるが、これらに限定されない。プロテオグリカンには、限定されないがグリコサミノグリカン含有分子のいずれかを含み、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロナンが挙げられる。好ましい基質としては、タイプＩコラーゲン、タイプＩＩコラーゲン、タイプＩＩＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン及びヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい他のポリマー物質としては、ポリ（乳酸）及びポリ（グリコール酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
更なる実施形態では、マトリックスは、軟骨病変部位の軟骨形成を更に増強するために提供される、１種類以上の細胞を含むことができる。そのような細胞としては、繊維軟骨細胞、軟骨細胞、間葉前駆体、及び軟骨細胞前駆体として機能できる他のいずれかの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞を、上記方法のいずれかによって、組成物及びマトリックスと会合させることができる。
【０１１９】
本発明のいくつかの態様において、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤を含むマトリックスは、少なくとも１つの骨マトリックスタンパク質を更に含む。本明細書で使用される場合、「骨マトリックスタンパク質」は、骨マトリックスを形成する微小コラーゲン繊維及び基質からなる成分またはそれと会合する成分である、当技術分野で既知のいずれかのタンパク質群である。様々な実施形態において、マトリックスは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、成長因子タンパク質及び／または軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のメンバーである骨マトリックスタンパク質を含む。骨マトリックスタンパク質にはまた、限定されないが、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポンチン、マトリックスＧＬＡタンパク質（ＭＧＰ）、バイグリカン、デコリン、プロテオグリカン−コンドロイチン硫酸ＩＩＩ（ＰＧ−ＣＳ  ＩＩＩ）、骨酸性糖タンパク質（ＢＡＧ−７５）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）及び／またはフィブロネクチンを含むことができる。好ましくは、本発明の産物との使用に適した骨マトリックスタンパク質には、オステオカルシン、オステオネクチン、ＭＧＰ、ＴＳＰ、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ及びカテプシンＬ前駆体のうち１つ以上を含む。一実施形態では、少なくとも１つの骨マトリックスタンパク質には、少なくともオステオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ及びカテプシンＬ前駆体を含む。特に好適な骨マトリックスタンパク質はＭＧＰであり、より好ましくはオステオネクチンであり、最も好ましくはＴＳＰである。
【０１２０】
１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤を含むマトリックスは、血管及び無血管軟骨組織両方の断裂及び区域性欠損の両方を含む、軟骨の様々な欠損を修復するために有用である。産物は、硝子質（例えば、関節性）及び／または繊維軟骨（例えば、半月板）の欠損を修復するのに特に有用である。例えば、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＣＤＫ９阻害剤を含むマトリックスは、半月板の放射状断裂、半月板の三重バケツ柄状（ｔｒｉｐｌｅ  ｂｕｃｋｅｔ  ｈａｎｄｌｅ）断裂、半月板の無血管領域の縦断裂、または半月板の区域性病変の修復促進に使用される。
【０１２１】
軟骨欠損及び骨欠損（すなわち、病変）は、様々な形状、サイズ及び位置で生じる可能性があるため、１種以上のＣＤＫ９阻害剤及び１種以上のＢＲＤ４阻害剤を含むマトリックスは、治療する患者の軟骨または骨の特定の欠損に十分に適合する形状及びサイズである。好ましくは、軟骨欠損または骨欠損の修復に使用される場合、マトリックスは、患者に治療的利点を与えるのに適している幾何学的形状を欠損部位に実現する。そのような治療的利点は、軟骨欠損または骨欠損の修正と関連する患者の健康及び幸福度の何らかの改善であってよく、好ましくは、治療的利点には、軟骨または骨の自然な構造が少なくとも部分的に回復するような欠損の修復を含む。マトリックスは、軟骨病変または骨病変に直接留置または移植することができる。
【０１２２】
６．組成物及びキット
関連する態様において、本発明は、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害剤及びブロモドメイン含有４（ＢＲＤ４）阻害剤を含んでいる溶液中の骨軟骨外植片（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ軟骨組織）及び／または軟骨細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、骨軟骨外植片は同種異系移植軟骨である。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ９阻害剤は、低分子有機化合物、例えば、フラボピリドールまたはその類似体及び塩である。いくつかの実施形態では、ＢＲＤ４阻害剤は、低分子有機化合物、例えばＪＱ１、ＧＳＫ５２５７６２Ａまたはその類似体及び塩である。いくつかの実施形態では、骨軟骨外植片は、ＣＤＫ９阻害剤及びＢＲＤ４阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される。様々な実施形態において、溶液は水溶液、例えば生理学的に等張な溶液である。いくつかの実施形態では、溶液は、約１００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、例えば約３００ｎＭ、または以下の範囲の濃度でフラボピリドールを含む。いくつかの実施形態では、溶液は、約１００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、例えば約３００ｎＭ、または以下の範囲の濃度でＪＱ１及び／またはＧＳＫ５２５７６２Ａを含む。溶液がＣＤＫ９阻害剤（例えば、フラボピリドール）及びＢＲＤ４阻害剤（例えば、ＪＱ１及び／またはＧＳＫ５２５７６２Ａ）の組み合わせを含むとき、一方または両方の化合物は非有効濃度、例えば、約１００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、例えば約３００ｎＭの範囲の７５％、５０％または２５％の濃度であり得る。溶液は、本明細書に記載する付加的な薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、組成物はパッケージ化されたキットとして提供される。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は、例示のために記載し、特許請求する発明を限定するためではない。
【０１２４】
実施例１
炎症性刺激下の軟骨細胞におけるＣＤＫ９及びＢＲＤ４の阻害
材料及び方法
軟骨細胞の処理。初代軟骨細胞を、ＩＲＢ承認を得た健康なヒトドナーの軟骨から単離し、１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で培養した。統計実験計画はＪＭＰ  １０．０ソフトウェアを使用して実施し、各薬物単独のまたは併用での、ＩＬ−１β誘導型ｉＮＯＳ転写の完全阻害に要する最小濃度を特定した。炎症性刺激として１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βまたは１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αのいずれかで５時間、軟骨細胞を処理し、以下のような５群の組み合わせで薬物を加えた。
１）薬物なし、サイトカイン刺激なし（対照群）
２）薬物なし、刺激あり（刺激群）
３）ＪＱ１、刺激あり（Ｊ群）
４）フラボピリドール、刺激あり（Ｆ群）
５）ＪＱ１及びフラボピリドール、刺激あり（ＪＦ群）。
各細胞を採取してＲＮＡを抽出した。
【０１２５】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを軟骨細胞（ｎ＝３ドナー）から抽出した。Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して最初のｃＤＮＡ鎖を合成した後、変換したｃＤＮＡ試料を遺伝子に特異的なプローブを備える７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって３つ組で増幅し、１８ｓのｒＲＮＡに対して正規化を行った。
【０１２６】
マイクロアレイ分析。上記の５群の軟骨細胞（ｎ＝２ドナー）から抽出した全ＲＮＡで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ解析を実施した。最初に、刺激群で発現レベルが対照群のものより５倍高い遺伝子を選抜し、発現を薬物（ＪＱ１、フラボピリドールまたは両方）により抑制した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアで、一元配置ＡＮＯＶＡにより５群間で有意差を示した遺伝子を特定した。差次的に調節された遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅに入力し、古典的経路での変化を評価した。
【０１２７】
結果を図３、４及び７に示す。フラボピリドール及びＪＱ１によるＣＤＫ９及びＢＲＤ４の阻害は、炎症誘発性遺伝子及び異化遺伝子のパネルを効果的に抑制した。ＪＱ１及びフラボピリドールの併用は、薬物用量の低減時（例えば、個々の薬剤では治療量以下または非有効）でも、同等のまたはより良好な炎症反応抑制を達成し、相乗的相互作用を示した。Ｂｒｄ４及びＣｄｋ９は、共通する機構経由だけでなく、個々の機構も経由した初期応答炎症性遺伝子の転写を調節する。
【０１２８】
実施例２
外傷誘導性全身炎症反応の転写制御
膝外傷後のＣｄｋ９の阻害は、局所炎症反応の防止に極めて効果的であり、更に外傷後変形性関節症の防止に効果的である（Ｙｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１４）６６，１５３７−１５４６）。ＳＩＲＳ及び外傷性全身性炎症の治療方法は、我々の外傷性膝傷害の研究を、例えば複数の長骨骨折などの、全身性炎症の主要な危険因子である他の整形関連外傷に発展させたものである。全身性炎症は、骨折治癒を大幅に遅延させ、医療費を増加させる（Ｂａｓｔｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）８９，６６９−６７３）。したがって、ＳＩＲＳに対する効果的な治療は、整形外傷を有する患者に利益をもたらし得る。後述のように、我々のデータは、ＣＤＫ９単独の阻害、及びＣｄｋ９とＢｒｄ４の同時阻害が、多数の免疫学的攻撃から生じる初期炎症反応遺伝子の活性化を効果的に抑制し、かつ炎症が誘導する二次的な健康への影響を防止することを明示している。
【０１２９】
Ｃｄｋ９の阻害は、複数の上流の炎症性シグナルを遮断する。Ｃｄｋ９が炎症性遺伝子活性化の共通のボトルネックを調節することを実証するため、ヒト初代軟骨細胞を、異なる細胞表面受容体及びシグナル伝達経路を活性化するＩＬ−１β、リポ多糖体（ＬＰＳ）、ＴＮＦ（図５Ａ）またはＩＬ−６（図５Ｃ）という４種類の炎症誘発性刺激によって個別に処理した（図１を参照）。次に、初期炎症性遺伝子誘導型の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡ誘導を判定した。結果は、フラボピリドールによるＣｄｋ９の阻害が、４種の炎症性刺激すべてによるｉＮＯＳ誘導を著しく抑制することを示した（図５Ａ及びＣ）。更に、Ｃｄｋ９のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンでもＩＬ−１βの処理によるｉＮＯＳ誘導が防止されたことから、観察された効果はＣｄｋ９によって特異的に媒介されるものであった（図５Ｂ）。ｉＮＯＳに加えて、４種の刺激が他の炎症性サイトカイン及び異化遺伝子、例えば複数のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のｍＲＮＡも誘導したが、その誘導はすべてフラボピリドールによって抑制されることを示した（Ｙｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１４）６６，１５３７−１５４６）。最後に、Ｃｄｋ９の阻害は、機械的傷害（図６Ａ）及び付随するアポトーシス（図６Ｂ）の影響下に置かれる軟骨外植片からのＩＬ−６のｍＲＮＡ誘導を防止した。これは、Ｃｄｋ９の阻害が、炎症及び傷害の有害作用から軟骨を保護することを示している。
【０１３０】
要約すると、Ｃｄｋ９の単独阻害及びＣｄｋ９とＢｒｄ４の同時阻害により、ＩＬ−１β、ＬＰＳ、ＴＮＦ、ＩＬ−６及び機械的傷害を含む、多様なシグナルに応答した炎症性遺伝子の転写を防止する。これらのデータは、ストレス応答における転写活性化の中心的役割を立証するとともに、この方法が重度外傷後のＳＩＲＳ阻害にも功を奏し得ることを強く示している。Ｃｄｋ９の阻害は、大部分の下流の炎症反応遺伝子の活性化を効果的に抑制する。次に我々は、炎症反応遺伝子の広域活性化に対するＣｄｋ９阻害の効果を実証するためにマイクロアレイスクリーニングを実施した。培養液中の初代ヒト軟骨細胞を、フラボピリドール及び／またはＪＱ１の存在下または非存在下で、炎症性刺激であるＩＬ−１βとともに５時間処理した。マイクロアレイは、全トランスクリプトーム内に、ＩＬ−１βにより１．５倍超誘導された遺伝子を８７３個検出した。相対的な遺伝子発現レベルのヒートマップ表示は、ＪＱ１及びフラボピリドールがこの８７３個の遺伝子の異なった集団を選択的に抑制することを示した（図７Ａ、レーン２及び３の比較）。本来の用量の約２０〜２５％のＪＱ１及びフラボピリドールの同時処理では、相乗効果が観察され、無処理試料に最もよく類似した遺伝子発現プロファイルを示した（図７Ａ、レーン４及び５の比較）。これらのデータは、抗炎症治療に対するフラボピリドールとＪＱ１両方の使用による相乗的かつ相補的効果の利点を明示している。
【０１３１】
本結果はまた、初期応答遺伝子の誘導抑制におけるＣｄｋ９阻害剤の有効性及び程度も実証している。例えば、ＩＬ−１β誘導性遺伝子８７３個のうち半数近くの誘導は、フラボピリドールによって、その最大誘導値の少なくとも７５％未満のレベルまで抑制された（図７Ｂ、黄色）。８７３個の遺伝子のうち、フラボピリドールによりまったく抑制されなかったのは、わずか約５％であった（図７Ｂ、灰色）。更に、フラボピリドールとＪＱ１との間に強い相乗性が見られた。２つの薬物による同時処置は、６０ｎＭのフラボピリドール及び２５０ｎＭのＪＱ１に投与量を低減した場合でも（図３及び７Ｂ）、２５０ｎＭのフラボピリドールまたは１２００ｎＭのＪＱ１の投与量で単独処理した場合と比較して良好な抑制を達成した。投与量の低減は、潜在的なオフターゲット効果を最小化する。更に、我々のマイクロアレイデータでは、誘導性遺伝子のみがＣｄｋ９阻害による影響を受ける一方で、非誘導性遺伝子及びハウスキーピング遺伝子は影響を受けないことが実証された。これは、Ｃｄｋ９の阻害は、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、本実験の短期間内にオフターゲット効果が最小限であったことを示している。総合すると、本明細書及び公開データ（Ｙｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１４）６６，１５３７−１５４６）に記載の結果は、Ｃｄｋ９阻害剤が単独で及びＢｒｄ４阻害剤との併用で、大部分の炎症性遺伝子転写を遮断する抗炎症剤として有効であることを示している。
【０１３２】
我々のデータは、Ｃｄｋ９の阻害が、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、ＳＩＲＳ治療用の従来の抗炎症剤とは差別化された、実現可能な抗炎症方法であるという強力な根拠を示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣｄｋ９阻害は、複数の上流の炎症性シグナルを遮断するだけでなく、大部分の下流の炎症反応遺伝子の誘導も抑制する。第２に、ｉｎ  ｖｉｖｏのＣｄｋ９阻害は、単独で及びＢｒｄ４阻害との併用で、我々のマウス膝傷害モデルの組織炎症及び異化反応を低減している。最も重要なことに、ＬＰＳ誘導性の全身性炎症マウスモデルを使用して、Ｃｄｋ９の阻害が、全身性炎症マーカーＩＬ−６の血漿レベルを著しく抑制することを立証している。総合すると、これらのデータは、Ｃｄｋ９の阻害が、単独で及びＢｒｄ４の阻害との併用で、重度の外傷から生じるＳＩＲＳを防止して治療するための実現可能な方法であることを強固に裏付けるものである。
【０１３３】
引用文献
2017531007.tif 000005
2017531007.tif 000006
2017531007.tif 000007
2017531007.tif 000008
【０１３４】
実施例３
ＣＤＫ９の阻害は、軟骨外植片での機械的傷害で誘導される炎症、アポトーシス及びマトリックスの分解を防止する
本実施例では、ウシ軟骨外植片を用いて、単一衝撃傷害モデルでのＣＤＫ９阻害剤フラボピリドールの治療的可能性を検討した。傷害誘導性の炎症反応及び異化反応、軟骨細胞アポトーシスならびに軟骨マトリックス変性の活性化を防止するフラボピリドールの能力を判定した。
【０１３５】
要約
関節傷害は、外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）に至る場合が多い。外傷に対する急性傷害反応は、炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素の産生を誘導し、それは軟骨細胞アポトーシスを促進し、軟骨を変性させ、ＰＯＴＡの発症可能性を高める。最近の研究では、傷害反応遺伝子の転写活性化のための律速段階がサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）によって制御されることがわかっており、ゆえにＣＤＫ９は傷害反応を制限する興味深い標的となっている。そこで我々は、機械的傷害を受けた軟骨外植片において、ＣＤＫ９の阻害が、傷害反応を抑制する効果を判定した。ウシ軟骨外植片を、１００％／秒で歪み３０％の単一の圧縮荷重により損傷させた後、ＣＤＫ９阻害剤フラボピリドールにより処理した。急性傷害反応を評価するために、炎症誘発性サイトカイン、異化酵素及びアポトーシス遺伝子のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定し、ＴＵＮＥＬ染色により軟骨細胞の生存性及びアポトーシスを測定した。長期的転帰に関しては、溶解性グリコサミノグリカンの放出によって、ならびに瞬間弾性率及び緩和弾性率を用いて機械的特性を決定することによって軟骨マトリックスの分解を評価した。本データは、傷害誘導性の炎症性サイトカイン及び異化遺伝子の発現をＣＤＫ９阻害剤が著しく低減することを示した。ＣＤＫ９阻害剤はまた、軟骨細胞アポトーシスを減衰させて、軟骨マトリックスの分解を低減させた。最後に、傷害を受けた外植片の機械的特性が、ＣＤＫ９阻害剤によって保持された。この結果から、機械的衝撃、すなわち急性傷害反応から、それに続く軟骨細胞アポトーシス及び軟骨マトリックスの分解の誘導に至る連鎖的事象を結びつける時間的プロファイルが得られる。したがって、ＣＤＫ９は、ＰＴＯＡの発症を防止または遅延させる、膝外傷後の傷害反応の潜在的な疾患修飾薬である。
【０１３６】
材料及び方法
軟骨外植片−仔ウシ（約２か月齢、ｎ＝４０関節、性別不明）の後膝関節を、屠殺後１日以内に現地屠殺場（Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ）から入手した。６ｍｍの生検パンチを関節面の荷重領域に対して垂直に挿入し、各大腿骨顆から、６〜８の円筒状軟骨外植片を採取した。次に、個別仕様のジグを使用して、外植片を約３ｍｍ厚に切り揃えた（関節面は無傷なまま、深層を平坦に切る）。外植片をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（１Ｘ１０４ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１Ｘ１０４μｇ／ｍｌ）を補充した高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度９５％にて２４時間培養した。
【０１３７】
単一衝撃によるｅｘ  ｖｉｖｏ傷害モデル−２４時間の回復及び平衡化期間後、軟骨外植片に単一衝撃による機械的傷害を与えた。各外植片の正確な厚みをカリパスにより測定した後、関節面を上向きにして、個別仕様の一軸荷重チャンバーに配置した。油圧材料試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ８５１１．２０）で、２０ｍｍ径のステンレス鋼プラテンを外植片表面に降ろして、０．５Ｎ（約１７．７ｋＰａ）の予荷重をかけた。この０．５Ｎの予荷重ステップを、無傷の対照を含む全外植片に施した。骨顆で外植片が採取された場所の位置的差異に起因する潜在的ばらつきを回避するために、後で比較する際、２つの隣接する外植片を対照と傷害の対として意図的に対応させた。予荷重後に、１００％／秒で歪み３０％の単一圧縮を与えた後、即座に解放するようにＩｎｓｔｒｏｎをプログラムした。単一の衝撃荷重後、外植片を半分に薄く切り、秤量した。外植片の片半分を３ｍｌの培地に置き、残りの半分を３００ｎＭのフラボピリドール（Ｓｉｇｍａ）を含有した培地に置き、種々の時間、培養した（図９Ａを参照）。培地は１日おきに変え、新たにフラボピリドールを添加した。その後、外植片及び培地に、後述する更なる処理及び分析を施した。
【０１３８】
定量的リアルタイムＰＣＲ−傷害後２時間、６時間、及び２４時間で、外植片を液体窒素中で凍結し、凍っている間に乳棒と乳鉢で粉砕した。十分に軟骨マトリックス成分を除去するためにＱｉａｚｏｌ試薬を用いてＲＮＡを２回抽出した以外は、製造業者の指示に従って、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡの量及び質をＮａｎｏｄｒｏｐ−２０００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）で測定した。各試料からの全ＲＮＡのうち２．５ｕｇを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた逆転写に使用した。定量的リアルタイムＰＣＲを７９００ＨＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にて３つ組で実施し、個々のｍＲＮＡ発現を測定した。結果を１８ｓのｒＲＮＡ（カタログ番号４３１９４１３Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）に対して正規化し、２−ΔΔＣＴ法を使用して、対照に対するｍＲＮＡ発現の倍率変化として算出した。個々のウシ遺伝子に使用したプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより作製された個別仕様であった。
【０１３９】
軟骨細胞生存性−機械的傷害の５日後に外植片の生存細胞及び死細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキット（カタログ番号Ｌ３２２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色した。生存細胞と死細胞の割合（％）は、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００倒立型蛍光顕微鏡及び２０ｘ対物レンズを使用して、取得した外植片（試料群ごとにｎ＝６）の断面画像のランダムな３領域で細胞数を計数することによって決定した。
【０１４０】
アポトーシス細胞の染色−傷害後１日、３日及び５日で、外植片を４％のパラホルムアルデヒドで２４時間固定して、７５％のエタノールに移した後、組織学的分析のため切片化した。アポトーシスのインサイチュー検出は、ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して５ｕｍ厚の外植片断面全体に対して実施した。このキットは、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ組み換え酵素（ｒＴｄＴ）を使用して、３’−ＯＨ  ＤＮＡ末端にフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰを触媒的に組み込むことにより、アポトーシス細胞の断片化したＤＮＡを測定する。核はＤＡＰＩで対比染色した。切片を蛍光顕微鏡に載せて調べた。アポトーシス細胞（ｎ＝３の異なるドナー）の割合（％）を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）の数を計数することにより測定し、対総細胞（ＤＡＰＩ）比で算出した。ＤＮａｓｅＩとともにインキュベートした切片を陽性対照として使用する一方、緩衝液のみとともにインキュベートしたものを陰性対照として使用した。
【０１４１】
ＧＡＧの放出−傷害後５日で培地を収集して、グリコシルアミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（ＧＡＧ）の量を、標準物質としてコンドロイチン硫酸を用いたジメチル−メチレンブルー（ＤＭＭＢ）比色分析法によって測定した。培地へ放出されたＧＡＧ総量を算出して、外植片の湿潤重量（傷害日に測定）に対して正規化した。
【０１４２】
軟骨の機械的特性−ＣＤＫ９の阻害が、傷害後の軟骨外植片の機械的特性を保持するかどうかを試験するため、傷害を受けた外植片及び対照の外植片を、フラボピリドールを含む培地または含まない培地で４週間、培養した。機械的検査システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５６５、Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して、一軸圧縮での応力緩和試験により、軟骨試料の圧縮特性を評価した。試験前に、皮膚生検パンチを使用して直径３ｍｍ、厚さ２ｍｍの圧縮試料を作製した後、リン酸緩衝生理食塩水に入れ、１６ｍｍのステンレス鋼プラテン下の中央に置いた。プラテンと軟骨試料との接触を示す、０．２Ｎの予荷重が観察されるまで、プラテンを徐々に下げた。次に、１５サイクルの５％歪みによって試料を予備調整した。予備調整を含む、歪みはすべて１秒当たり１０％の歪み速度で負荷した。予備調整の直後に試料に１０％の圧縮歪みを与えた。歪みを１０％のまま一定に保ち、荷重を３８０秒間記録した。歪み１０％の負荷を終えたら、圧縮歪みを２０％に増加して一定に保ち、更に５３０秒間、荷重を記録した。圧縮特性：前述の粘弾性の標準線形ソリッドモデルに従って（Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，２００６）、データ解析ソフトウェア（ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１３ａ、Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して、個々の応力緩和曲線から、瞬間弾性率、緩和弾性率及び粘性係数を算出した。この機械的試験及びモデルは、軟骨の粘弾性挙動を概算する上での単純性及び精度を理由に選択した。６ドナーから新たに単離された（０日目）ウシ軟骨外植片の圧縮特性を測定し、傷害後４週の試料と比較するためのベースライン値とした。
【０１４３】
統計解析−すべての測定値は平均＋／−標準偏差で表した。遺伝子発現の変化は、ＳＰＳＳ  １６．０ソフトウェアによる一元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。ｍＲＮＡの倍率変化を、異なる処置群間の試料を比較する変数として使用した。最少有意差の事後分析を、有意水準Ｐ＜０．０５で実施した。
【０１４４】
有意水準をＰ＜０．０５とし、ＪＭＰ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン１１．２．０）を使用して、一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの事後検定の併用により圧縮特性の変化を分析した。
【０１４５】
結果
ＣＤＫ９の阻害は傷害誘導性の炎症誘発性遺伝子及び異化遺伝子を抑制する−ＣＤＫ９は炎症性遺伝子活性化の律速段階を制御しており（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｚｉｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤＫ９阻害は、外因的に付加される炎症誘発性サイトカインの異化作用の影響から軟骨細胞及び軟骨を保護することを以前に示している（Ｙｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、膝傷害で起こり得るものと類似した、直接的な衝撃による傷害を受ける軟骨でのＣＤＫ９阻害の効果は検討されていなかった。我々は、機械的傷害を受けた軟骨でのＣＤＫ９の阻害が炎症反応を防止し、それにより軟骨細胞及び軟骨マトリックスに対するその後の有害作用を軽減するという仮説を立てた。我々の仮説を検証するために、ウシ軟骨外植片に歪み率３０％で衝撃荷重を加えることにより、機械的な傷害を与えた（図９Ａ）。この規模の荷重は、軟骨細胞アポトーシス及び軟骨マトリックスの分解を誘導する（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｄ’Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｅｍｂｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍｏｒｅｌ  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，２００４；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｗａｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。傷害を受けた外植片をＣＤＫ９阻害剤フラボピリドールの存在下または非存在下で種々の時間培養した。傷害を受けた外植片で誘導された炎症性サイトカイン及び異化遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定して、無傷の対照と比較した。フラボピリドールの添加は、傷害によるサイトカインｍＲＮＡの誘導を低減した（図９Ｂ及びＣ、灰色バー）。この効果は、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現で最も顕著であった。ＩＬ−６のｍＲＮＡは試験された全時点で傷害により有意に誘導され（図９Ｂ、白抜きバー）、かつＩＬ−６の誘導はフラボピリドールによって顕著に抑制された（図９Ｂ、灰色バー）。類似の傾向がＩＬ−１βで観察された（図９Ｃ）が、これは統計的有意性に達しなかった。これらのデータは、予測通りに、軟骨外植片でのＣＤＫ９の阻害が、機械的傷害に応答した炎症性サイトカインの誘導を抑制することを示している。
【０１４６】
次に、炎症性サイトカインによって誘導され、軟骨マトリックスを分解する異化遺伝子ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３、ならびにＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡ発現の傷害誘導性変化を検討した。結果は、傷害が全時点でＭＭＰ−１及びＡＤＡＭＴＳ４の発現を有意に誘導し、また２時間の時点でＭＭＰ−１３の発現を有意に誘導した（図９Ｄ〜Ｆ、白抜きバー）ことを示した。ＣＤＫ９の阻害は、試験された全時点で、傷害を受けた試料での上記遺伝子の誘導を効果的に防止した（図９Ｄ〜Ｆ、灰色バー）。対照的に、同化遺伝子アグリカン及びＣｏｌ２ａ１のｍＲＮＡ発現は、フラボピリドールの有無を問わず、傷害に影響されなかった（図９Ｇ〜Ｈ）。総合すると、これらの結果は、ＣＤＫ９の阻害が、軟骨マトリックスを分解する傷害誘導性異化メディエーターを抑制した一方で、同化遺伝子の基礎値は試験された全時点で傷害またはＣＤＫ９阻害の影響を受けないことを示している。
【０１４７】
ＣＤＫ９の阻害は傷害誘導性の軟骨細胞アポトーシスを低減する−機械的傷害はまた、炎症反応の誘導以外に、軟骨外植片の軟骨細胞アポトーシスも引き起こす（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｄ’Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｅｍｂｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）ことから、我々は、外植片傷害モデルを使用して、アポトーシスに対するＣＤＫ９阻害の効果を調べた。アポトーシス過程で中心となる３つの選択された遺伝子（Ｐ５３、Ｂｃｌ−２及びＰＴＥＮ）のｍＲＮＡ発現を、傷害後２４時間の軟骨外植片で検討した。Ｐ５３は、ＤＮＡ損傷が回復不能である場合にアポトーシスを開始し（Ａｍａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、Ｂｃｌ−２は抗アポトーシス因子の基礎メンバーであり（Ｃｚａｂｏｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＰＴＥＮはアポトーシスの重要な調節因子である（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。機械的傷害自体は、Ｐ５３、Ｂｃｌ−２及びＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現に有意な変化を与えなかったが（図１０、白抜きバー）、フラボピリドールは傷害群及び無傷群の両方でこれらのアポトーシスメディエーターの発現を有意に減少させた（図１０、灰色バー）。
【０１４８】
このアポトーシスメディエーターの基礎値の減少がきっかけとなり、我々は傷害を受けた軟骨外植片のアポトーシス軟骨細胞数を自ら測定するに至った。傷害後１日、３日、及び５日に採取した異なる３ドナーからの軟骨外植片をＴＵＮＥＬ染色法により検討し、各試料の核の総数に対するアポトーシス細胞比を測定した。結果は、傷害がアポトーシス軟骨細胞の割合（％）を傷害後１日で約２０％、傷害後３日で約６０％増加させることを示した（図１１Ａ）。対照的に、ＣＤＫ９の阻害は、試験された全時点で、傷害を受けた外植片のアポトーシス細胞の割合（％）を有意に低減させた（図１１Ａ）。これらの結果は、傷害後５日に採取した軟骨外植片の生死染色データにより更に実証された（図１１Ｂ）。生死染色は、傷害が生存軟骨細胞の数を約８０％から約５５％へと有意に減少させたことを示した（図１１Ｂ、白抜きバー）。フラボピリドールによる処理は、傷害を受けた外植片の細胞生存性を増強し、無傷の外植片の細胞生存性には有意な影響を与えなかった（図１１Ｂ、灰色バー）。総合すると、上記の結果は、ＣＤＫ９の阻害が、軟骨外植片の傷害誘導性アポトーシスを減少させるとともに、衝撃傷害後の軟骨細胞生存性を増強することを示している。
【０１４９】
ＣＤＫ９の阻害は傷害誘導性の軟骨マトリックスの分解を防止する−傷害誘導性の異化反応はマトリックス分解酵素の上方調節をもたらすことから、我々は次にＣＤＫ９の阻害が、傷害後の軟骨マトリックスの分解を防止し得るかどうかを調べた。軟骨外植片を傷害後に、３００ｎＭのフラボピリドールの存在下または非存在下で５日間連続して培養した。培地を採取し、培地に放出されたＧＡＧ含量をマトリックス分解の指標として測定した。ＧＡＧ放出は傷害時に有意に増加した（図１２、白抜きバー）が、フラボピリドールで処理した試料では、傷害を受けた軟骨によるＧＡＧ放出は、無傷の対照のベースラインよりも増加することはなかった。この結果は、ＣＤＫ９の阻害が、機械的傷害誘導性の軟骨マトリックスの分解及びプロテオグリカン放出を減衰させることを示している。
【０１５０】
ＣＤＫ９の阻害は傷害後の軟骨外植片の機械的特性を保持する−個々の６ドナーから新たに単離された軟骨の圧縮特性を測定し、その平均値を図１３の点線によって示した。４週間の培養後、軟骨外植片の圧縮特性は、傷害を受けた無処置試料と比較した場合、フラボピリドールで処理した試料では、１０％の緩和弾性率、１０％の瞬間弾性率及び１０％の粘性係数の増加を示す（図１３）。類似の結果は、２０％歪みの応力緩和曲線から算出された弾性率及び粘性係数でも観察された（図示せず）。傷害を受けた軟骨試料と無傷の軟骨試料の両方で、圧縮特性に対するフラボピリドールの正の効果が観察されたが、フラボピリドールで処理した場合、傷害を受けた軟骨試料と無傷の軟骨試料との間で、いずれの圧縮特性にも有意差は観察されなかった。傷害を受けた無処理の軟骨試料は、全群中で最低の圧縮特性を呈したが、フラボピリドールの非存在下で傷害を受けた軟骨試料と無傷の軟骨試料との間に有意差はなかった。興味深いことに、フラボピリドールで処理した軟骨試料は、無処理の無傷の対照よりも大きい緩和弾性率を呈した。更に、フラボピリドールで処理された傷害を受けた軟骨試料はまた、無処置の無傷の対照よりも大きい瞬間弾性率及び粘性係数を有する。これらの結果は、フラボピリドールがｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された軟骨試料の圧縮特性に有益な影響を及ぼすことを示している。
【０１５１】
考察
この研究は、傷害後の軟骨外植片の生物学的及び機械的特性に対するＣＤＫ９阻害の効果を圧縮荷重によって検討した。この傷害モデルは、最初の２４時間以内に炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素の有意な誘導を引き起こした（図９）。アポトーシス遺伝子がこの期間内に変化することはなかった（図１０）が、アポトーシス軟骨細胞は傷害後１日で外植片に検出でき、５日後にピークに達した（図１１）。傷害はまた、ＧＡＧの放出により測定される軟骨マトリックスの分解を加速した（図１２）。しかしながら、フラボピリドールによるＣＤＫ９阻害はこのような変化すべてを抑制し、天然軟骨のものと類似した機械的特性を維持し（図１３）、その結果、物理的傷害及びそれに続く炎症反応の有害作用から軟骨細胞及び軟骨を効果的に保護した。
【０１５２】
ＯＡの高発生率は、外傷性膝傷害及びそれによる外傷期間後ＯＡ（ＰＴＯＡ）と関係する。傷害からＰＴＯＡが発症する病理は不明なままであるが、いくつかの一連の証拠は、この過程での炎症反応の関与を示唆している。ＡＣＬ傷害後２４時間以内のヒト関節に、高レベルの炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６が検出されている（Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｋｏらは、炎症及び付随するサイトカイン活性の調節不全が、ＯＡにおける同化と異化間のバランスの乱れに寄与している可能性が高いことを実証している（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，２００４）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究で、炎症誘発性サイトカイン、特にＩＬ−１βはＯＡにおける関節軟骨の破壊に関与していた（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，２００４；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。軟骨において、軟骨細胞は、異化遺伝子及び同化遺伝子の発現を調節不全にする炎症誘発性サイトカインの主標的である。サイトカイン刺激性の軟骨細胞は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びアグリカナーゼＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５などの様々なマトリックス分解酵素を産生する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｎｉｓｈｉｍｕｔａ  ａｎｄ  Ｌｅｖｅｎｓｔｏｎ，２０１２）。これらのデータはすべて、炎症反応の軟骨マトリックスの分解への関与を意味する。この研究での我々の結果は、ＣＤＫ９の阻害が、炎症性反応及び異化反応遺伝子の誘導を防止することから、傷害誘導性損傷の新規標的であることを明確に示している。
【０１５３】
軟骨細胞の同化遺伝子発現に対する機械的傷害の影響は、依然として議論の余地がある。Ｉｌ−１βは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞のＣｏｌ２ａ１の発現を抑制することが報告されている（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかしながら、他のＯＡに関する研究は、変形性関節症の軟骨では、通常の軟骨と比較して、アグリカン及びＣｏｌ２ａ１遺伝子の発現及び生合成が増強されることを示している（Ｂａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。我々の結果から、最初の２４時間で、傷害を受けた軟骨において同化遺伝子発現の有意な変化はないことが示された。これは、Ｃｏｌ２ａ１を含む多くの同化遺伝子は後期ＯＡでのみ増強されることを示した、全層軟骨を用いた大規模な発現プロファイリング研究によって裏付けられている（Ａｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｊｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。更に重要なことに、我々の結果は、フラボピリドールには機械的傷害後、最初の２４時間で同化遺伝子発現に対する有害な副作用がないことを実証している。
【０１５４】
軟骨への機械的傷害は、軟骨細胞アポトーシスをもたらす。Ｄ’Ｌｉｍａらは、３０％の歪みを負荷して軟骨外植片に傷害を与え、対照群でのアポトーシスが４％のみであったのと比較して、９６時間で３４％のアポトーシス軟骨細胞を確認した（Ｄ’Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。同様に、我々の外植片傷害モデルも軟骨細胞アポトーシスに至り、２４時間で約２０％のアポトーシス軟骨細胞を、７２時間後に６０％超のアポトーシス細胞を検出している（図１１Ａ）。軟骨の傷害及び軟骨細胞アポトーシスが軟骨変性に至ることを考慮すると、これを遮断するように設計された薬物の開発はＰＴＯＡの発症防止に有益であり得る（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｄ’Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。例えば、機械的傷害を受けた軟骨外植片をカスパーゼ阻害剤で処理すると、アポトーシスの５０％減少が見られた（Ｄ’Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかしながら、数時間内の急性傷害反応、例えば炎症性サイトカイン及び異化遺伝子の誘導と、通常は傷害後数日で引き続いて起こる、その後のアポトーシスとの間の相関性に焦点を当てた研究はほとんどなかった。ＩＬ−１β及びＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカインは、多様な一連の細胞内シグナル伝達経路、例えばＪＮＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＮＦ−ｋＢ（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を活性化し、更にｐ５３（Ａｍａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＢＣＬ−２（Ｃｚａｂｏｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）及びＰＴＥＮ（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）のような種々のアポトーシス促進性遺伝子の発現を誘導する能力を有する。軟骨細胞において、ＪＮＫ及びｐ３８シグナル伝達経路は、傷害反応にアポトーシス促進性であると考えられている（Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。本研究で得た結果から、炎症性サイトカイン及び異化遺伝子の誘導から、それに続く軟骨細胞アポトーシスの誘導に至る、軟骨への機械的傷害後に生じる連鎖的事象を結びつける時間的プロファイルが得られる。重要なことに、フラボピリドールによる治療は、傷害反応の初期段階を効果的に遮断し、それによって軟骨へのその後の損傷を防止する。
【０１５５】
この研究での抗アポトーシス特性とは対照的に、フラボピリドールは、多くの癌細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている。特に、フラボピリドールは本来、急速に分裂する細胞（例えば癌）での細胞周期進行を抑制することによる抗増殖特性で知られていた（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｎ，２０１０）。これは、細胞周期を直接調節する他のＣＤＫに対するフラボピリドールのオフターゲット抑制効果による。したがって我々は、通常は分裂しない成熟した軟骨細胞（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）はフラボピリドールの抗増殖効果に対して感受性が低いと考えている。
【０１５６】
フラボピリドールは、培養４週後の傷害を受けた軟骨外植片の圧縮粘弾性特性に対して有益な効果を及ぼす。具体的には、フラボピリドールで処理された傷害を受けた軟骨試料と無傷の軟骨試料はいずれも、傷害を受けた無処置試料と比較して、初期圧縮時（瞬間弾性率）、及び長期的な静的圧縮中に平衡に達したとき（緩和弾性率）の剛性が増加した。瞬間弾性率及び緩和弾性率の増加はそれぞれ、軟骨細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の維持、及びＥＣＭの弾性剛性の維持と関連している可能性が高い。更に、フラボピリドールで処理された傷害を受けた試料は、処置試料での粘性係数の増加により証明されたように、傷害を受けた無処置試料と比較して、圧縮後に平衡に向かう緩和の低速化を呈する。粘性係数の増加はＥＣＭでのＧＡＧの保持と関連する可能性が高く、これが圧縮時の軟骨からの水の移動を阻止する。全体として、フラボピリドールによる治療は、培養した軟骨試料の粘弾性、圧縮特性を、無培養の天然軟骨試料で観察される値と近似する値に維持するのに役立つ（図１３）。フラボピリドールは、傷害後のｉｎ  ｖｉｖｏの、ならびに培養中のｉｎ  ｖｉｔｒｏの軟骨の機械的特性を保持することができる。
【０１５７】
傷害を受けた軟骨外植片と無傷の対照外植片との間に機械的特性の差がないことは、この研究の予想外の発見であった。フラボピリドールなしで培養された傷害を受けた外植片は、全処置群のうち最低の瞬間弾性率及び粘性係数を有したものの、傷害のある試料と無傷の試料との差に統計的有意性はなかった（Ｐ＞０．０５）。未成熟軟骨の長期培養中に生じることで知られる軟骨変性及びＧＡＧの損失（Ｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）が、無処理の無傷の軟骨外植片で観察される軟骨の圧縮特性の損失を引き起こした可能性がある。より短期の培養期間後の試験用試料は、傷害を受けた軟骨と無傷の軟骨との間に大きな差を示し得ると推測される。
【０１５８】
要約すると、我々のデータは、軟骨外植片での、機械的傷害により誘導される炎症誘発性サイトカインの抑制及び軟骨細胞アポトーシスの防止におけるＣＤＫ９阻害の有効性を初めて実証した。加えて、我々のデータは、フラボピリドールが軟骨マトリックスの分解を防止し、傷害後にその機械的特性を保持するために有効な薬剤であることを明確に示している。このように、フラボピリドールによるＣＤＫ９の阻害は、膝関節外傷後のＰＴＯＡを防止または遅延させるために効果的な方法を提供する。
【０１５９】
実施例３の引用文献
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【０１６０】
本明細書に記載する実施例及び実施形態は説明のみを目的としており、それに照らした種々の変形または変更は、当業者に想定されるものであり、本明細書の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び他の特許出願は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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