(57)【要約】  間葉系幹細胞の増殖のための無血清培地は、ＦＧＦ、ＴＧＦ−βおよびリポタンパク質を含む。
2017506511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞を培養するための無血清培地であって、
（ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；
（ｂ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）；および
（ｃ）リポタンパク質；
を含む、培地。
【請求項２】
前記培地が１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬの濃度でリポタンパク質を含む、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記培地の前記リポタンパク質成分が、以下の：
（ａ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）；
（ｂ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；
（ｃ）中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）；および
（ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；
の１つまたはそれ以上を含む、請求項１から２のいずれかに記載の培地。
【請求項４】
ＬＤＬを含む、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
前記ＬＤＬが：
（ａ）大きい浮揚性ＬＤＬ（Ｉｂ  ＬＤＬ）粒子；
（ｂ）小さく密なＬＤＬ（ｓｄ  ＬＤＬ）粒子；および
（ｃ）リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））；
の１つまたはそれ以上あるいはすべてを含む、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
直径１５ｎｍから３０ｎｍのＬＤＬ粒子を含む、請求項４または５に記載の培地。
【請求項７】
ＶＬＤＬを含む、請求項３に記載の培地。
【請求項８】
直径３０ｎｍから８０ｎｍのＶＬＤＬ粒子を含む、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
前記培地の前記ＦＧＦ成分がＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）であり、必要に応じて１から１０ｎｇ／ｍＬの濃度である、任意の先行する請求項に記載の培地。
【請求項１０】
前記培地のＴＧＦβ成分がＴＧＨβ−１であり、必要に応じて１から２０ｎｇ／ｍＬの濃度である、任意の先行する請求項に記載の培地。
【請求項１１】
前記培地がさらに、基本培地を含むかまたは基本培地に基づく、任意の先行する請求項に記載の培地。
【請求項１２】
前記培地がさらに、デキサメタゾン、ヒト血清アルブミン、および／またはインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）を含む、任意の先行する請求項に記載の培地。
【請求項１３】
前記培地が他の増殖因子を含まない、任意の先行する請求項に記載の培地。
【請求項１４】
間葉系幹細胞、例えば、ヒト間葉系幹細胞を培養する方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の培地中で該幹細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項１５】
（ａ）ヒト幹細胞を、請求項１から１３のいずれかに記載の（ｂ）培地中に含む、組成物。
【請求項１６】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪生成細胞、または血管形成細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
医薬品に使用するための請求項１から１３のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
【請求項１８】
骨組織、血管組織、軟骨組織、または脂肪組織の形成における使用のための、請求項１から１３のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地の成分として血清を用いない幹細胞の増殖のための培地、この培地を利用する方法、およびこの培地を用いて生産された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、種々の細胞型に分化し得る多能性細胞であり、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞(chondrocytes)（軟骨細胞(cartilage cells)）および脂肪細胞(andipocytes)（脂肪細胞(fat cells)）を包含する。この能力は、生存する動物の特定の細胞および組織、ならびに組織培養で増殖したそれらの対応物について示されてきた。
【０００３】
ＭＳＣは、細胞ベースの薬剤発見のための価値ある資源および多くのヒトの疾患のための潜在的な治療法である。移植片対宿主疾患、多発性硬化症、クローン病、１型糖尿病、骨折および骨関節炎を含む病気を治療するためのＭＳＣの潜在性は、現在臨床背景で試験されている。
【０００４】
ＭＳＣは総骨髄単核細胞のほんの０．００１〜０．０１％を構成すると推定されており、したがって、この集団は、基礎的な生物学的または臨床学的適用について充分な数を得るために広範なインビトロでの細胞培養の拡大を必要とする。現在の臨床学的適用はおよそ１億個の細胞量を使用する。
【０００５】
再生医療と細胞療法の現在の情勢は、細胞処理技術の驚異的な増加が来たるべき年にあることを示唆している。これは、治療目的のために使用される成体および胚性幹細胞、ならびに体細胞に関する。加えて、薬物スクリーニング用途における幹細胞および誘導多機能性幹細胞の増大した使用は、細胞処理技術の要求が多いに増加することに合致する。
【０００６】
これらのＭＳＣの単離および培養は、ほとんどの場合、動物製品、特にウシ胎児血清（ＦＢＳ）の使用に頼っている。
【０００７】
幹細胞は、特定の増殖条件を必要とする。現在では、骨髄から誘導されたＭＳＣが血清含有培地内で単離され、培養され、そして分化される。
【０００８】
実質的に、研究室培養において増殖されるすべての哺乳類細胞は増殖培地にＦＢＳの存在を必要とし、細胞の付着および増殖のために必要なホルモンおよび成長因子を提供する。これは、現在治療的使用のための研究下のヒト細胞（例えば、成体と胚性幹細胞と他の体細胞）を含む。ＦＢＳは、食肉加工産業で得られた胎児の仔ウシの血液から採取され、そして一般に、増殖培地に１０容量％の濃度で添加される。その結果、幹細胞の供給は、それらを増殖させるための適切な培地の入手可能性に依存している。
【０００９】
この技術は、数十年間首尾よく適用され、そしてＦＢＳは、タンパク質の複合混合物および胎児血液に存在する高レベルの成長刺激因子のために、最も一般に用いられる増殖培地添加物である。しかし、ＦＢＳの使用に関する問題があり、そのいくつかを以下に示す：
１．細胞療法のレシピエントに対する疾患伝染のリスク
２．処理技術者および医療関係者に対する疾患伝染のリスク
３．製品の不確実かつ季節的な入手性
４．−２０℃での低温貯蔵の必要性
５．著しいバッチ間変動性
６．増大した要求のための予期される主要なサプライチェーンの問題。
【００１０】
ヒトの治療のために生産される細胞におけるＦＢＳの使用に関する主な関心は、レシピエントに対する感染材料の伝染のリスクである。加えて、処理技術者および医療スタッフによるこれらの材料の取り扱いに関する重大なリスクがある。このリスクは、一般に狂牛病として知られる伝染性ウシスポンジ様脳症（ＢＳＥ）の発生と、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）に感染するヒトに対する関連リスクのため、近年まさに深刻になってきた。今日まで、ＢＳＥは、欧州、北米および世界の多くの他の地域におけるウシで発見されてきた。ヒトの治療のための細胞の増殖に使用するために今や承認されるほとんどすべてのＦＢＳは、オーストラリア産およびニュージーランド産であり、それらはまだＢＳＥフリーである。
【００１１】
世界中のウシの群れにおけるＢＳＥの発生はまた大きな供給問題に繋がり、そしてこれには将来細胞療法の有効性に重大な影響を及ぼすことが予測される。現在、血清のこの限られた供給は、一般に研究室および研究用途には充分である。しかし、これらの研究室および研究用途のいくつかは、中規模または大規模に生産される市販製品の生産に向けられている。現在、一般的使用に承認される幹細胞技術のための適用はない。そのため、幹細胞技術が一般的使用に開放される場合、血清の供給がこの要求に応ずるのに実に充分でないものとなると予想され得る。
【００１２】
全くのところ、細胞療法製品がちょうど２つの大きな兆候に承認されるとき、承認済のＢＳＥフリーなＦＢＳの世界的な供給全体が、製造の初年以内に消費されることが予期される。このため、細胞療法が規制当局の承認を得て使われると、ＦＢＳ非含有の増殖培地の驚異的で先例のない需要が生じる。明らかに、幹細胞増殖培地の供給が幹細胞技術の適用における限定的な要因となる。
【００１３】
加えて、ＦＢＳは不均質な混合物であり、血清バッチ間での再生産性とパフォーマンスの欠落を導く。血清は、多くの未同定であるかまたは定量化されていない構成成分を含み、それ故「規定され」ておらず、合成的に再生され得ない。結果として、血清の組成はバッチ間で変動し、細胞培養の実験または他の使用のために標準化することを困難にさせる。さらに、ＭＳＣは接着性細胞集団であり、現在、組織培養プラスチックに接着するこの能力は大部分がＦＢＳに依存する。
【００１４】
全くのところ、ＦＢＳの構成成分の多くが細胞の付着、増殖および分化に影響するので、これらのパラメータの制御またはこれらのパラメータに関する細胞の特定の必要性の研究は、血清の使用によって排除される。さらに、血清のいくつかの構成成分は、特定細胞型の増殖に対して抑制的であり、ある程度、その増殖効果を弱め得、最適以下の増殖を生じる。
【００１５】
ＦＢＳの不均質な性質によって引き起こされる増殖特徴の変動性により、血清バッチ間での再生産性が欠落し、そして増殖、および細胞ベースの製品および治療品の製造に問題が生じる。これは、特に、一貫した（したがって、信頼性のある）出発材料を用いて操作することが前提とされる、適正製造規範（Good Manufacturing Protocols）（ＧＭＰ）下で製造される製品についての場合である。
【００１６】
さらに、治療上かつ規制上の見地から、ＦＢＳの存在は、これが動物性病原体の移動を導くので理想的ではない。血清は、医療用途に承認される一方で、ウイルスを含み得、これは、実験の結果に影響を及ぼし得るか、または培養細胞がヒトにおける移植が意図される場合に潜在的な健康に有害なものを提供し得る。さらに、規制上の観点から、臨床背景における動物由来製品の使用は、感染性因子の伝染のリスクだけでなく、免疫応答を引き起こす可能性のためからも、所望されていない。
【００１７】
このため、血清を添加する必要のない、幹細胞の普及および／または生産のための増殖培地のニーズが存在する。このような新たな増殖培地は、好ましくは比較的簡単かつ容易に大量生産されるべきである。
【００１８】
その結果、培養培地からＦＢＳを取り除き、かつＭＳＣを生体外で拡大し得る所定の無血清培地の開発についての試みが行われてきた。
【００１９】
ＷＯ２０１１／１１１７８７は、無血清または低血清培養によって生産される、免疫抑制性能を維持する間葉系幹細胞を含有する細胞調製物を開示する。間葉系幹細胞を含む細胞調製物を生産するための方法が記載されており、この方法は、間葉系幹細胞が、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１種のリン脂質および少なくとも１種の脂肪酸を含有する培養培地中で増殖される、増殖工程；および増殖工程後の間葉系幹細胞が、免疫抑制能が維持または改善される間葉系幹細胞についてスクリーニングされる、スクリーニング工程を含む。
【００２０】
ＷＯ９８／１０４６８１は、添加物混合物、構成成分混合物、ビタミン混合物、無機塩混合物、およびアミノ酸混合物を含む無血清の規定の細胞培養培地を開示する。この規定培地は、線維芽細胞（特に軟骨細胞）を培養するために有用であるとして開示されている。さらに、軟骨細胞の分化を増強し、かつ腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）を用いる軟骨特異的マトリックスの合成を増強する方法、およびＴＧＦ−βおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の組み合わせを用いる軟骨細胞の分化を増強する方法が開示されている。
【００２１】
ＭＳＣのための他の培地が提案されている。ＷＯ２００５／１１３７５１は、無血清培地中でのＭＳＣの拡大を記載し；この培地は高度に複雑であり、そしていくつかは、とりわけｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βを含有し得る。ＵＳ２０１０／０２７９４１２はまた無血清培地を記載し、これはＦＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦ、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、およびビタミンＣを含有し得る。Chaseら、Stem Cell Research ＆ Therapy 2010, 1:8は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＰＤＧＦを含有する、ヒトＭＳＣのための無血清培地を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、上記に対する少なくとも代替物となりかつ従来技術にて同定される１つまたはそれ以上の問題を好ましくは解決し、または少なくとも改善する、幹細胞の増殖のための培地および方法を提供することである。特定の実施形態の目的は、血清を添加する必要がなく、それ故容易に入手し得かつ比較的高価ではない、ＭＳＣの増殖のための培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって、本発明は、以下を含む幹細胞を培養するための無血清培地を提供する：
（ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；
（ｂ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）；および
（ｃ）リポタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、１０％ＦＢＳ中で単離され、プレーティングから１８時間後のｂＦＧＦの存在下無血清条件下で再付着したＭＳＣの相対的付着の程度を示す。組織培養フラスコをフィブロネクチン（ＦＮ；黒）、ヒアルロン酸（ＨＡ；青）、ビトロネクチン（ＶＮ；赤）またはラミニン（ＬＮ；緑）でプレコーティングし、そして細胞を無血清条件下で接着させた。コントロールとして、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）付着因子の存在なしの無血清プレーティング、および１０％ＦＢＳ（灰）が挙げられる。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図２】図２は、１０％ＦＢＳ中で単離され、無血清条件に対してｂＦＧＦの存在下無血清条件下で再付着したＭＳＣの増殖を示す。組織培養フラスコをＦＮ（黒）、ＨＡ（青）、ＶＮ（赤）またはＬＮ（緑）でプレコーティングし、そして細胞を無血清条件下で接着させた。細胞数を５日後に得た。コントロールとして、ＥＣＭ付着因子の存在なしの無血清プレーティング、および１０％ＦＢＳ（灰）が挙げられる。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図３】図３は、１０％ＦＢＳ中で単離され、３継代（Ｐ）にわたってＦＧＦを含む無血清条件下で再付着したＭＳＣの付着の程度を示す。ＭＳＣをＥＧＦの存在下の組織培養フラスコ上（赤）、またはＦＮでプレコーティングした組織培養プラスチック上（紫）、またはＥＧＦの存在下でフィブロネクチンコーティングしたプラスチック上（緑）に付着させ、３日毎に継代した。コントロールとして、ＥＣＭ付着因子の存在なしの無血清プレーティング（青）、および１０％ＦＢＳ（黒）が挙げられる。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図４】図４は、１０％ＦＢＳ中で単離され、２日間、ＦＮでプレコーティングした組織培養フラスコ上の無血清条件下で再付着したＭＳＣの増殖を示す。次いで、細胞を増殖因子の存在下で培養し、そして５日毎に継代した。コントロールとして、増殖因子なしの無血清プレーティング、および１０％ＦＢＳが挙げられる。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図５Ａ】図５は、１０％ＦＢＳ中で単離され、２日間、ＦＮでプレコーティングした組織培養フラスコ上の無血清条件下で再付着したＭＳＣの増殖を示す。次いで、細胞を、５日間、ＰＧＥ２、コレステロールまたはリポタンパク質の存在下でＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）を含む無血清培地中で培養した。コントロールとして、増殖因子なしの無血清プレーティング、１０％ＦＢＳが挙げられる（Ａ）。次いで、細胞を、リポタンパク質の存在下で培養し、３継代について５日毎に継代し、コントロールとして、リポタンパク質なしの無血清プレーティングが挙げられる（Ｂ）。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図５Ｂ】図５は、１０％ＦＢＳ中で単離され、２日間、ＦＮでプレコーティングした組織培養フラスコ上の無血清条件下で再付着したＭＳＣの増殖を示す。次いで、細胞を、５日間、ＰＧＥ２、コレステロールまたはリポタンパク質の存在下でＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）を含む無血清培地中で培養した。コントロールとして、増殖因子なしの無血清プレーティング、１０％ＦＢＳが挙げられる（Ａ）。次いで、細胞を、リポタンパク質の存在下で培養し、３継代について５日毎に継代し、コントロールとして、リポタンパク質なしの無血清プレーティングが挙げられる（Ｂ）。結果は、ｎ＝２で生物学的に３反復を行ったものである。
【図６Ａ】図６は、ＭＳＣを、ＦＧＦ２を含む無血清（ＳＦ）培地中で、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で、骨髄から単離して、無血清ＭＳＣ単離のための適切な細胞外マトリックスを決定する実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（ＣＦＵ；図６Ａ）および細胞数（図６Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。さらなる骨髄を、種々の濃度のフィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上に播種し、必要なフィブロネクチン至適濃度を決定した。ＣＦＵ数（図６Ｃ）および細胞収量（図６Ｄ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図６Ｂ】図６は、ＭＳＣを、ＦＧＦ２を含む無血清（ＳＦ）培地中で、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で、骨髄から単離して、無血清ＭＳＣ単離のための適切な細胞外マトリックスを決定する実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（ＣＦＵ；図６Ａ）および細胞数（図６Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。さらなる骨髄を、種々の濃度のフィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上に播種し、必要なフィブロネクチン至適濃度を決定した。ＣＦＵ数（図６Ｃ）および細胞収量（図６Ｄ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図６Ｃ】図６は、ＭＳＣを、ＦＧＦ２を含む無血清（ＳＦ）培地中で、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で、骨髄から単離して、無血清ＭＳＣ単離のための適切な細胞外マトリックスを決定する実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（ＣＦＵ；図６Ａ）および細胞数（図６Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。さらなる骨髄を、種々の濃度のフィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上に播種し、必要なフィブロネクチン至適濃度を決定した。ＣＦＵ数（図６Ｃ）および細胞収量（図６Ｄ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図６Ｄ】図６は、ＭＳＣを、ＦＧＦ２を含む無血清（ＳＦ）培地中で、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはヒアルロン酸（ＨＡ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で、骨髄から単離して、無血清ＭＳＣ単離のための適切な細胞外マトリックスを決定する実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（ＣＦＵ；図６Ａ）および細胞数（図６Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。さらなる骨髄を、種々の濃度のフィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上に播種し、必要なフィブロネクチン至適濃度を決定した。ＣＦＵ数（図６Ｃ）および細胞収量（図６Ｄ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図７Ａ】図７は、ＭＳＣを、フィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上で、および／またはＥＧＦの存在下で、骨髄から単離した実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（図７Ａ）および細胞数（図７Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図７Ｂ】図７は、ＭＳＣを、フィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック上で、および／またはＥＧＦの存在下で、骨髄から単離した実施例の結果を示す。コロニー形成単位数（図７Ａ）および細胞数（図７Ｂ）を初代培養の終わりに決定した。コントロールとして、１０％ＦＢＳ存在下または非コーティング組織培養プラスチック上のＭＳＣ単離が挙げられる。
【図８】図８は、ＭＳＣを、表１に記載のような増殖因子を含む無血清培地中で、フィブロネクチン（６μｇ／ｍＬ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で単離した実施例の結果を示す。細胞を各継代の終わりにトリプシン処理し、フィブロネクチンコーティングプラスチック上に播種した。コントロール細胞を１０％ＦＢＳ中組織細胞プラスチック上に播種した。
【図９】図９は、ＭＳＣを、表３に記載のような増殖因子を含む無血清培地中で、フィブロネクチン（６μｇ／ｍＬ）でプレコーティングした組織培養プラスチック上で単離した実施例の結果を示す。細胞を各継代の終わりにトリプシン処理し、フィブロネクチンコーティングプラスチック上に播種した。コントロール細胞を１０％ＦＢＳ中組織細胞プラスチック上に播種した。
【図１０】図１０は、第３継代、第６継代および第９継代の終わりに、表３に記載のような条件７および８を用いて、無血清培地中で単離したＭＳＣの表面特徴付けの実施例の結果を示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。
【図１１ａ】図１１は、第３継代の初めに、無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けの実施例の結果を示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がトルジンブルー染色およびＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に４反復を行ったものである。
【図１１ｂ】図１１は、第３継代の初めに、無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けの実施例の結果を示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がトルジンブルー染色およびＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に４反復を行ったものである。
【図１１ｃ】図１１は、第３継代の初めに、無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けの実施例の結果を示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がトルジンブルー染色およびＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に４反復を行ったものである。
【図１２ａ】図１２は、第７継代の初めに無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けを示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に３反復を行ったものである。
【図１２ｂ】図１２は、第７継代の初めに無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けを示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に３反復を行ったものである。
【図１２ｃ】図１２は、第７継代の初めに無血清培地中で単離したＭＳＣの分化特徴付けを示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣが脂肪生成をすることができることがオイルレッドＯ陽性小胞の存在により示され（ａ）、アラジリンレッド染色および陽性カルシウムアッセイがＭＳＣが骨形成をすることができることを確認し（ｂ）、軟骨生成がＧＡＧタンパク質の定量によって確認された（ｃ）。結果は、生物学的に３反復を行ったものである。
【図１３】図１３は、第３継代の初めに、無血清培地中で単離したＭＳＣの血管形成分化特徴付けを示す。１０％ＦＢＳ培地中で培養したＭＳＣをコントロールとして用いた。ＭＳＣをヒト臍帯血管内皮細胞（human umbilical vascular endothelial cells）（ＨＵＶＥＣ）と共培養し、形成された血管の数を定量した。結果を、ＨＵＶＥＣ単独により形成された血管の数を１００％とした場合のパーセントとして表す。結果は、ｎ＝４で生物学的に４反復を行ったものである。
【図１４Ａ】図１４は、無血清培地中で培養したＭＳＣのインビボでの骨組織への分化を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、無血清培地中で培養したＭＳＣのインビボでの骨組織への分化を示す。
【図１５】図１５は、無血清培地中で培養したＭＳＣのインビボでの骨組織への分化を示す。
【図１６Ａ】図１６は、無血清培地および血清含有培地を用いて、低酸素条件および正常酸素条件下で増殖したＭＳＣの増殖動態および細胞形態を示す。図１６Ａは、ＭＳＣの増殖動態を示す。図１６Ｂは、培養ＭＳＣの細胞形態を示す。図１６Ｃは、骨髄の４つの異なる試料からの細胞の予測収量を示す。
【図１６Ｂ】図１６は、無血清培地および血清含有培地を用いて、低酸素条件および正常酸素条件下で増殖したＭＳＣの増殖動態および細胞形態を示す。図１６Ａは、ＭＳＣの増殖動態を示す。図１６Ｂは、培養ＭＳＣの細胞形態を示す。図１６Ｃは、骨髄の４つの異なる試料からの細胞の予測収量を示す。
【図１６Ｃ】図１６は、無血清培地および血清含有培地を用いて、低酸素条件および正常酸素条件下で増殖したＭＳＣの増殖動態および細胞形態を示す。図１６Ａは、ＭＳＣの増殖動態を示す。図１６Ｂは、培養ＭＳＣの細胞形態を示す。図１６Ｃは、骨髄の４つの異なる試料からの細胞の予測収量を示す。
【図１７】図１７は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの骨形成分化を示す。培養１１日目。平均±ＳＤ、ｎ＝４ドナー。スケールバー：５００μｍ。＊＊：Ｐ≦０．０５。
【図１８】図１８は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの脂肪生成分化を示す。平均±ＳＤ、ｎ＝４ドナー、スケールバー：５００μｍ、＊：Ｐ≦０．５。
【図１９】図１９は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの軟骨形成分化を示す。培養１８日目。平均±ＳＤ、スケールバー：５００μｍ、ｎ＝３ドナー。
【図２０】図２０は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの血管形成促進能を示す。平均±ＳＤ、スケールバー：２００μｍ、ｎ＝４ドナー。
【図２１】図２１は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの免疫原性の程度を示す。平均±ＳＤ、ｎ＝３  ＭＳＣドナー対１  ＭＬＲドナー。統計：ｔ検定；＊＊：Ｐ＜０．０５。
【図２２】図２２は、低酸素条件および正常酸素条件下で、無血清培地対血清含有培地中で培養したＭＳＣの表面細胞マーカー表現型を示す。平均±ＳＤ、ｎ＝３ドナー（Ｐ３）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の利点は、幹細胞および組織培養物、特に間葉系細胞、特にヒト細胞および組織の増殖に適している、完全にＦＢＳ非含有の（すなわち無血清の）増殖培地である培地の生産を可能とすることである。
【００２６】
さらに、本発明の培地は、骨髄から単離された細胞を直接増殖するのに適しており、すなわち、このような単離された細胞は、血清含有培地中でのインキュベーションまたは増殖を最初に必要とすることなく、増殖のために本発明の培地に直接置くことができる。
【００２７】
本発明の培地のさらなる利点は、低酸素条件下、その中で培養された細胞が優れた増殖動態を呈し得ることである。
【００２８】
本発明の培地を細胞増殖に用いるさらなる利点は、そのような使用が、先行技術の血清ベースの培地と比べて細胞の収量を増大させ得ることである。本発明の培地により、製造者が、以前に用いられた条件下よりずっと高い収量の（少なくとも１０倍多い）細胞を得られる可能性がある。したがって、一用量当たりの生産コストが約９０％減少する。結果、本発明の培地中の細胞の増殖特性の増大に加えて、この培地は、臨床試験および使用のためのＭＳＣベースの製品の製造に従事する臨床品製造機関の競争を改善する可能性も有する。現在、ＧＭＰに準拠した条件下での臨床使用に必要な多数のＭＳＣを生産するコストは、再生医療を開発中の企業の主要な関心事の１つである。
【００２９】
さらに、この規定培地は、全体的に、拡張可能なようにＧＭＰに準拠した基準で製造され得、そして使用のためのヒト細胞の増殖に使用するのに適している。したがって、本発明のこの無血清培地は、インビトロでの細胞培養研究の過程でより高い再現性を可能とする。
【００３０】
結果、本発明の培地のいくつかのさらなる利点は、以下のとおりである：
−製造者はＦＢＳ供給の不確実性の制約を受けない
−原料の全てがＧＭＰ供給者から調達され得るので、疾患伝達のリスクが除かれる
−血清ベースの増殖培地で見られたバッチ変動の問題が解消し、さらに、無血清培地は規定の組成を有するので、製造者または研究者が血清ロットを「バッチテスト」する必要がなくなる。
【００３１】
従って、無血清培地の使用は、細胞療法が実験使用から臨床使用まで進展するにつれて、規制機関に対し重大な安心感を与える。それはまた、特に、生産工程当たりの細胞の収量が低いために単一の臨床用量の生産コストが非常に高価な治療用途のＧＭＰ培養細胞について、ＭＳＣの大規模生産のコストを劇的に低減する。
【００３２】
培地はまた、上皮成長因子（ＥＧＦ）を、適切には１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２〜５０ｎｇ／ｍＬまたは２〜２５ｎｇ／ｍＬの濃度で含み得る；特定の例では、ＥＧＦは約１０ｎｇ／ｍＬで培地中に存在する。培地はまた、フィブロネクチンを、適切には１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２４μｇ／ｍＬの濃度で含み得る。
【００３３】
本発明の培地中にＥＧＦおよびフィブロネクチンを含む利点は、使用中に、このような培地は骨髄から直接採取される試料からコロニー形成単位（ＣＦＵ）当たり最も多くの細胞を生じたという注目すべき点から生じる。
【００３４】
リポタンパク質は複合粒子であり、これは、コレステロール、リン脂質およびトリグリセリドを体中に輸送する。それらは、最大から最小までで（密度が最も低いものから最も高いものまでで）、カイロミクロン（ＵＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む。これらは、当該分野で認識され、周知でありかつ理解され、そしてさらなる定義なしに文献中で広範に使用されている用語である。
【００３５】
したがって、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、そのようなリポタンパク質粒子の分類および範囲をいい、その大きさは、直径が一般に約１５ｎｍからかまたは約１８ｎｍから、約３０ｎｍまでまたは約２５ｎｍまでである（レーザーベースの方法がこの測定のために用いられ得る）。ＬＤＬ粒子は、典型的には、まさにおおよそ８０〜１００の付随タンパク質と共に、１つのアポリポタンパク質Ｂ−１００分子（Ａｐｏ  Ｂ−１００）を含有する。各ＬＤＬは典型的には、リノレエートとして知られる多価不飽和脂肪酸と、数百から数千（約１５００が平均として一般に引用される）のエステル化および非エステル化コレステロール分子とからなる高疎水性コアを有する。このコアはまた、種々の数のトリグリセリドおよび他の脂肪を有し得、リン脂質および非エステル化コレステロールの殻、ならびにＡｐｏ  Ｂ−１００の１コピーによって包囲され得る。一般に用語ＬＤＬは当該分野で知られ、上記で定義したパラメータ内にある粒子を包含するが、いくつかの特異的ＬＤＬ粒子は、直径がおおよそ２２ｎｍであり、約３００万ダルトンの質量を有する。典型的な人体では、ＬＤＬ粒子は可変数の脂肪酸分子を含むので、ＬＤＬ粒子の質量およびサイズの分布がある。
【００３６】
超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）は、一般に、Ａｐｏ  Ｂ−１００、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＥ、コレステロール、コレステリルエステルおよびトリグリセリドを含有する。それは血中を循環するにつれて、ＶＬＤＬは他の成分を捕捉し得、そしてこの変化および他の変化は、ＶＬＤＬを他のリポタンパク質の形態に経時的に変換し得る。また、用語ＶＬＤＬは当該分野で周知であり、そして典型的にはＶＬＤＬ粒子は、約３０〜約８０ｎｍの直径を有する。体内で、ＶＬＤＬは、内因性産物を輸送する傾向があり、これは、例えば、外因性産物を輸送する傾向のあるカイロミクロンと対照的である。
【００３７】
中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）粒子は、１コピーのＡｐｏＢ−１００に加えて多コピーのレセプターリガンドＡｐｏＥを含有する傾向があり、一般に直径が約２５〜３５ｎｍである。最後に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子は、最高密度でありかつ最小サイズであり、一般に直径が約７または８から約１１または１２ｎｍである。
【００３８】
培地は、以下の１つまたはそれ以上または全部を含み得る：
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）；
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；
中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）；
超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；および
カイロミクロン。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、培地はＬＤＬまたはＶＬＤＬを含む。以下の実施例にさらに詳細に記載されるような使用において、ＬＤＬを含有する培地およびＶＬＤＬを含有する培地が、より良好な細胞増殖を与え、かつ所望の形態を有する細胞の増殖を促進した。
【００４０】
好ましくは、培地はＬＤＬを含み、これは、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：
大きい浮揚性ＬＤＬ（ｌｂ  ＬＤＬ）粒子、
小さく密なＬＤＬ（ｓｄ  ＬＤＬ）粒子、および／または
リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））。
【００４１】
リポタンパク質は、他の手段では容易に供給できないコレステロールおよびリン脂質を供給するため、必須であると考えられる。適切なレベルのリポタンパク質は１μｇ／ｍＬまたはそれ以上、２μｇ／ｍＬまたはそれ以上、５μｇ／ｍＬまたはそれ以上および別に１００μｇ／ｍＬまで、８０μｇ／ｍＬまで、または６０μｇ／ｍＬまでである。特定の例では、濃度は約４μｇ／ｍＬおよび約４０μｇ／ｍＬであった。
【００４２】
以下により詳細に記載する実施例では、増大した数のコロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−ｆ）が、ＶＬＤＬまたはＬＤＬを含有する培地を用いて得られた。ＣＦＵ−ｆ自体を含む細胞の形態もまた、ＶＬＤＬまたはＬＤＬが存在した場合に改善された。ＨＤＬを含有した培地を用いて、ＣＦＵ−ｆは密な細胞クラスターを含み、ここではいくつかの突起（outgrowth）が生じた。これは、ウシ胎児血清を含有する培地で単離した場合に見られるＣＦＵ−ｆでは典型ではない。逆に、ＶＬＤＬまたはＬＤＬのいずれかを含有する培地を用いて得られたＣＦＵ−ｆが分散した形態を有し、これは、ＭＳＣと関連した典型的なＣＦＵ−ｆ形態とより密に近似していた。
【００４３】
これに加えて、以下により詳細に記載する本発明のさらなる実施例において、我々は、１）フィブロネクチンの無血清培地処方物への添加が付着因子でのプレコーティングの必要性をなくすか、および２）またはフィブロネクチンが無血清培地処方物での骨髄からのＭＳＣの単離および増殖のために全く必要とされるのかを評価した。フィブロネクチンの存在下または非存在下で本発明の培地中で培養されたＭＳＣでは、ＣＦＵ−ｆの数または続く増殖率のいずれでも、観察可能な差異は見られなかった。このことは、無血清培地処方物が（例えば骨髄からの）ＭＳＣの単離または増殖のために付着因子を必要としないことを示している。
【００４４】
培地のＦＧＦ成分は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３；好ましくは以下の１つまたはそれ以上：ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９およびＦＧＦ１０；最も好ましくは、培地は、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を含む。好ましくは、ＦＧＦは、０．５ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上、１ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上、５０ｎｇ／ｍＬまで、３０ｎｇ／ｍＬまで、２０ｎｇ／ｍＬまで、１０ｎｇ／ｍＬまで、あるいはこれらの範囲の任意の組合せの濃度で存在する。１〜２０ｎｇ／ｍＬの濃度が特に適している。特定の例では、約５ｎｇ／ｍＬが首尾よく用いられた。培地のＴＧＦβ成分は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２およびＴＧＦβ−３、好ましくはＴＧＦβ−１。好ましくは、ＴＧＦβは、０．５ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上、１ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上、５０ｎｇ／ｍＬまで、３０ｎｇ／ｍＬまで、２０ｎｇ／ｍＬまで、１０ｎｇ／ｍＬまで、あるいはこれらの範囲の任意の組合せの濃度で存在する。１〜２０ｎｇ／ｍＬの濃度が特に適している。特定の例では、約５ｎｇ／ｍＬが首尾よく用いられた。
【００４５】
無血清培地はまた、必須ミネラル、塩およびビタミンを提供することを目的として、基本培地（これもまた無血清である）を含み得るか、またはこれに基づき得る。基本培地は当該分野で周知であり、そして１つのこのような培地は最小必須イーグル培地−α改変（ＭＥＭ−α）である。他のこのような基本培地は、STEMCELL Technologies SARL, FranceおよびStemCells, Inc, USAから入手可能であり、なお他のものも当業者に知られ、本発明の無血清培地における使用に適している。
【００４６】
培地はまた適切に他の成分、例えば、デキサメタゾン、ヒト血清アルブミンおよび／またはインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）を含み得る。特定の培地は、ＭＥＭ−α中に１％ＩＴＳ、１０ｎＭデキサメタゾン、５０ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含む。培地は、他の基本培地に基づき得るかまたはこれを含み得る。さらに、培地は他のまたはさらなる増殖因子を含まないものであってもよい。
【００４７】
本明細書中の他に記載の使用に加えて、培地は、ドナー、特にヒトドナーから細胞を単離するために用いられ得る。培地はまた、血清含有条件で単離および／または増殖した細胞を無血清へと変換するために使用され得る。したがって、例えば、本発明の培地の存在下で細胞を培養することを含む工程によって、細胞（例えば、ヒト細胞）は、任意の培地または条件を用いて単離され得、次いで、無血清条件下で増殖するように変換され得る。
【００４８】
本発明はまた、本発明の培地中で幹細胞を培養する方法を提供し、この方法は、培地中で幹細胞をインキュベートする工程を含む。この方法を用いて培養された細胞は、１つまたはそれ以上の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。有利には、本発明の培地で増殖したＭＳＣは、骨形成、軟骨形成、脂肪生成および／または血管形成能を保持する。本発明の培地の存在下のおよび／またはその中で培養された細胞、特にＭＳＣは、有利には、免疫抑制特性を有し得る。
【００４９】
したがって、本発明はまた、本発明の培地で培養された幹細胞を提供する。好ましくは、幹細胞は間葉系幹細胞であり、ずっとより好ましくは、細胞は、骨形成、軟骨形成、脂肪生成および／または血管形成細胞である。
【００５０】
同様に、本発明はまた、上記骨形成、軟骨形成、脂肪生成および／または血管形成細胞の集団を提供する。
【００５１】
本発明はまた、例えば医薬品としての使用のための、本発明の培地中の幹細胞を提供する。本発明はさらに、スクリーニング用途（例えば薬物スクリーニング）における使用のための、本発明の培地中の幹細胞を提供する。
【００５２】
医薬品としての使用のための本発明の培地中の幹細胞を供給する利点は、幹細胞の初期単離から当該幹細胞または単離した幹細胞から増殖した細胞の移植まで進むのに必要とされるのが１つの増殖培地であることである。言い換えれば、単離または移植工程のために別の培地が必要とされない。このことは、幹細胞または幹細胞株を生産し使用する過程を顕著に簡素化する。さらに、このことは、これらの培地を１つの汎用の無血清培養培地に置き換えることにより、多数の一般に血清ベースの培養培地に関連する感染のリスクを低減する。
【００５３】
好ましくは、本発明の培地中の幹細胞は、以下の組織の１つまたはそれ以上の形成における使用のためのものである：
（ａ）骨組織；
（ｂ）血管組織；
（ｃ）軟骨組織；および／または
（ｄ）脂肪組織。
【００５４】
有利なことに、無血清培養ＭＳＣのインビボでの骨組織への分化は、ＭＳＣが血清含有培地で培養したコントロール実験よりも優れていた。
【００５５】
本発明を以下の特定の実施例および添付の図面を参照して説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
図１は、初期実験の結果を示す。この実験では、無血清環境下で付着する１０％血清の存在下で単離したＭＳＣを支持する４つの付着因子の能力を、１８時間後に調べた。因子は以下であった：ヒアルロン酸（ＨＡ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、ラミニン（ＬＮ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ２、ＦＧＦ２）の存在下で付着したＭＳＣの増殖もまた、６日後に評価した。結果は、無血清環境中で１８時間後、ビトロネクチン（０．５μｇ／ｍＬ）が最適にＭＳＣ付着を支持したことを示した（図１）が、フィブロネクチン（６μｇ／ｍＬ）は、６日後ビトロネクチン（０．５μｇ／ｍＬ）と同様のＭＳＣ収量を示した（図２）。ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）もまた、継代を行った後ＭＳＣ付着を増加した（図３）。
【００５７】
無血清基本培地処方物を、歯髄幹細胞の低血清細胞培養を記載する文献（Tarleら、2010）に基づいて選択した。基本培地は、ＩＴＳ（１％、BD）、アスコルビン酸（１０ｍＭ、Sigma Aldrich）、デキサメタゾン（１０ｎＭ、Sigma Aldrich）、ヒト血清アルブミン（５０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１％、Gibco）およびＭＥＭ−α（Gibco）で構成された。次いで、ＭＳＣ増殖に対する種々の増殖因子の効果を調べた。ＭＳＣを無血清基本培地中４８時間、フィブロネクチンコーティング組織培養プラスチック上に付着させた。
【００５８】
アスコルビン酸はビタミンＣ源である。ＭＥＭ−αは最小必須培地処方物および緩衝液である。それはまた、とりわけ、アミノ酸を提供し、栄養素である。デキサメタゾンはステロイドであり、エストロゲン様因子であり、ＨＳＡはタンパク質源であり、そしてＩＴＳはインスリン、トランスフェリン（鉄源）およびセレン酸を提供する。
【００５９】
基本培地を以下のように構成した：
【００６０】
【表１Ａ】
2017506511.tif 000003
【００６１】
５日目、１０日目、および１５日目での３継代にわたるＭＳＣ増殖に対するＦＧＦ２／ＦＧＦ４およびＦＧＦ７（１、５および１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＤＧＦａａ／ＰＤＧＦａｂおよびＰＤＧＦｂｂ（１、５および１０ｎｇ／ｍＬ）の効果を調べた。図４は、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ４（５ｎｇ／ｍＬ）およびＰＤＧＦａｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）が無血清培地中でＭＳＣ増殖をいかに増加したかを実証する。
【００６２】
ＭＳＣ生存度および増殖をさらに増強するために、リポタンパク質を無血清基本培地に添加した。血清の存在下で単離したＭＳＣを、ＦＧＦ２を含有する無血清培地中、フィブロネクチンコーティング組織培養プラスチック上に播種した。最初に、トリプシン処理後のＭＳＣ生存度を支持するために、種々の因子をスクリーニングした。ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍｌ）を含有する無血清培地中のＭＳＣ増殖に対するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２；５０μｇ／ｍＬ）、コレステロール（３０μｇ／ｍＬ）およびリポタンパク質（４μｇ／ｍＬ）の効果を調べた。リポタンパク質低密度（４０μｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）がＭＳＣ増殖を増加させることが示された。これに対し、ＰＧＥ２およびコレステロールは阻害効果を有した（図５ａ）。リポタンパク質は、ＦＧＦ２を含有する無血清培地中で３継代にわたりＭＳＣ増殖を増加したので（図５ｂ）、これを無血清培地処方物に添加した。
【００６３】
最初に、３つの骨髄からＭＳＣを単離し、適切な付着基質を決定した。ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびフィブロネクチンをスクリーニングした。フィブロネクチンは、より多くのコロニー形成単位を生じ（図６Ａ）、第１継代の終わりに最も多い細胞数を生じた（図６Ｂ）。次いで、さらなる骨髄ドナーをスクリーニングして、至適フィブロネクチン濃度を決定した。好ましい濃度として６μｇ／ｍＬを選択した（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【００６４】
ＭＳＣ単離および付着におけるＥＧＦの役割を調べるため、５つの骨髄を試験した。ＭＳＣを、ＥＧＦの存在下のフィブロネクチンコーティングプラスチック上、またはＥＧＦの存在下組織培養プラスチック上、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で単離した。結果は、骨髄ドナー間の変動性を示したが、フィブロネクチンがＭＳＣ付着のためにこの特定の場合に必要であったと結論付けられた（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００６５】
ＭＳＣ増殖に対する増殖因子の効果を評価するため、４つの骨髄を、表１に示すように、無血清基本培地中で、フィブロネクチンコーティング組織培養プラスチック上に播種した。
【００６６】
【表１】
2017506511.tif 000004
【００６７】
第１継代後のＭＳＣ収量は条件間で差異を示さなかったが、第３継代後、条件１〜６は累積集団倍加において減少した。条件７、８および９は、これらの条件全てにわたり定常した増加を示した（図８、骨髄１、２および３）。これらの培養からの細胞の収量を表２に示す（注：従って、表２中の培地１および２は、表１中の培地７および８にそれぞれ対応する）。
【００６８】
【表２】
2017506511.tif 000005
【００６９】
さらに、無血清培地は、５人のドナーからのＭＳＣの単離および増殖を促進するのにＦＢＳより優れ、増殖が第１０継代まで維持されることが示された。さらに、ＭＳＣ収量は、ＦＢＳで増殖した培養物に比べて、無血清培地で第３継代の終わりには１０倍多く、第６継代の終わりでは１００倍まで多くなった。
【００７０】
ＭＳＣ増殖をさらに評価するために、追加の骨髄を、表３に示すような無血清基本培地中で、フィブロネクチンコーティング組織培養プラスチック上に播種した。
【００７１】
【表３】
2017506511.tif 000006
【００７２】
第一継代後のＭＳＣ収量は、条件間では見かけ上差異を示さなかったが、第２継代後は、条件５および６は、累積集団倍加において減少した。条件７、８、９、１０および１１は、集団倍加において定常した増加を示したが、追加ＰＤＧＦａｂ（条件１０および１１）は、条件７および８に比べてＭＳＣ収量を増加しなかった（図９）。
【００７３】
ＭＳＣ表面表現型特徴付けを陽性マーカーおよび陰性マーカーの検出用抗体パネルを用いて行った。この分析を第３継代、第６継代および第９継代の終わりに行った。図１０は、１０％ＦＢＳ中で培養したＭＳＣに比べて無血清培地（条件７および８）中で培養したＭＳＣでは、表面マーカー発現の標準パネルにおいて差異がないことを示す。さらに、ＭＳＣマーカーのＣＤ９０、ＣＤ７３またはＣＤ１０５は、第３継代、第６継代および第９継代で陽性のままであった。しかし、無血清条件７および８で培養したＭＳＣは、血清培養細胞に比べてより高いＣＤ１４６発現を示し、これは継代にわたって保持された。
【００７４】
ＭＳＣ表現型をさらに調べるために、ＭＳＣを、第３継代の開始時に、脂肪生成、骨形成、および軟骨形成のアッセイ中で播種した。図１１は、異なるＭＳＣ培養物が脂肪細胞（図１１ａ）、骨細胞（図１１ｂ）または軟骨細胞（図１１ｃ）を形成する能力に差異がないことを示す。
【００７５】
ＭＳＣ表現型安定性を調べるために、ＭＳＣを、第７継代の初めに、脂肪生成、骨形成、および軟骨形成のアッセイ中で再度播種した。図１２は、ＭＳＣはそれらが後の継代後に分化する能力を維持し、脂肪細胞（図１２ａ）、骨細胞（図１２ｂ）または軟骨細胞（図１２ｃ）を形成するのに異なる培養物間で差異がないことを示す。
【００７６】
異なるＭＳＣ培養物の血管形成能を調べるために、第３継代の初めのＭＳＣをマトリゲル上でヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と共培養した。４時間後、形成した血管数を定量した。ＭＳＣ培養物による血管形成因子の分泌をさらに評価するために、２日齢ＭＳＣ培養物からのＭＳＣ培地を同様のマトリゲル上のＨＵＶＥＣに添加した。
【００７７】
図１３は、ＥＧＦありまたはなしのｂＦＧＦおよびＴＧＦβ−１を含有する無血清培地中で培養したＭＳＣが、１０％ＦＢＳ中で培養したＭＳＣよりも多くの血管を形成することを示す。さらに、これらの培養物からの培地がまた血管形成を支持した。よって、これは、これらの無血清培養物による血管形成因子の放出を示唆する。
【００７８】
図１４および１５は、無血清培地中で培養したＭＳＣのインビボでの骨組織への分化を示す。生成した骨組織は、ＭＳＣを血清含有培地中で培養したコントロール実験のものよりも優れていた。
【００７９】
低酸素条件下でのＭＳＣの培養が細胞収量を増加するか、かつ／または骨髄由来無血清ＭＳＣの特徴を維持するかを調べるために、以下の調査を含む無血清培地の完全な特徴付けを行った：増殖動態、細胞形態、三系統分化能、表面表現型、血管形成促進能および免疫学的特性。これらの実験の結果を図１６に示す。この結果は、低酸素培養の無血清培地細胞が優れた増殖動態を有し、またコントロールの血清含有培地を用いて培養した細胞よりも大きな細胞収量を生じることを実証する。
【００８０】
（実施例２）
（目的および方法）
骨髄由来ＭＳＣの増殖、分化、細胞形態および表面マーカー表現型に対する種々のリポタンパク質を含む本発明の培地の効果を評価するために、および無血清培地との使用について、付着因子、すなわちフィブロネクチンの必要性を評価するために、以下を行った。
【００８１】
（培地調製）
リポタンパク質研究のために、以下を含有する無血清（ＳＦ）培地を調製した：リポタンパク質なし（Ｎｏ  ｌｉｐｏ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。既存の他のリポタンパク質はカイロミクロンおよび中間密度リポタンパク質であるが、それらは当時市販されていなかったため本研究では評価しなかった。
【００８２】
（ＭＳＣ培養）
ＭＳＣを、４０×１０６ヒト骨髄単核細胞／Ｔ−１７５をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２にて培養することにより、ＳＦ培地中のプラスチック接着に基づき、骨髄から単離した。細胞が８０〜９０％のコンフルエンスに到達したら、それを継代培養した。ＭＳＣを、第３継代（Ｐ３）の終わりに増殖動態、三系統分化および表面マーカー表現型を評価することにより評価した。リポタンパク質研究のために、種々のリポタンパク質のうちの１つを８０ｎｇ／ｍＬで含むようにＳＦ培地を改変し、そしてこれらの細胞を、フィブロネクチンでプレコーティングしたＴ１７５フラスコ上に播種する。記載したフィブロネクチン研究のために、ＬＤＬを含有する標準ＳＦ培地（標準処方）を使用し、そして細胞を、フィブロネクチンなし、フィブロネクチンプレコーティングあり、または培地自体にフィブロネクチン添加ありで、Ｔ１７５フラスコ上に播種した。
【００８３】
ＳＦ細胞の継代のために、培地を吸引し、１つのＴ１７５フラスコ当たりに５ｍＬのＴｒｙｐＬＥを添加した。フラスコを室温にて１０分間インキュベートし、剥離について顕微鏡下で観察した。一旦細胞が剥離すると、５ｍＬの培地を添加し、細胞懸濁液を５０ｍＬ遠沈管に移し、４００×ｇにて５分間遠心分離した。細胞を第３継代（Ｐ３）まで増殖させ、その時点で、それらを三系統分化研究のために用いたか、または評価およびフローサイトメトリー分析のために用いた。
【００８４】
細胞試料のフローサイトメトリー分析を以下に概説するように実施した。５０ｍＬ試験管中で１ｍＬのマウス血清を４９ｍＬのＤ−ＰＢＳに添加することにより、ブロッキング溶液を調製した。ＦＡＣＳ緩衝液は、Ｄ−ＰＢＳ中に調製した２％ＨＳＡ溶液であった。
【００８５】
（ＭＳＣ染色）
１×１０５細胞（１００μＬ）を氷上の９６ウェルプレートの８ウェルの各々（各抗体につき１つおよび非染色細胞につき１つ）中にピペットで分注した。次いで、プレートを４００ｇにて４℃で４分間遠心分離した。上清を、細胞ペレットをかき乱さないように注意深く吸引し、５０μＬのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、溶液をピペッティングすることによりペレットを再懸濁した。試料をブロッキング溶液中で１時間インキュベートした。ブロッキング後、プレートを前と同様に遠心分離し、適宜抗体を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。試料を暗所中、４℃で４５分間抗体と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーション後、試料をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後最終的に２００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、ＦＡＣＳ管に移した。BD FACS Canto IIを用いてマーカー発現を評価する１０分前に、Sytox Red生存度染料もまた１：１０，０００の最終希釈度で試料に添加した。
【００８６】
（結果）
ＣＦＵ−ｆアッセイを、骨髄単核細胞（ＭＮＣ）を１×１０６  ＭＮＣ／１０ｃｍ２の密度で６ウェルプレート中に３連で播種することにより行った。１０日目に、細胞を予め冷却した９５％メタノールを用いて固定し、２％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。次いで、試料をＰＢＳで洗浄し、画像化した。ＨＤＬ群は密集したＣＦＵ−ｆを含有したのに対し、ＶＬＤＬ群およびＬＤＬ群は分散したコロニーを含有した。
【００８７】
ＭＳＣを骨髄から単離し、上記の種々のリポタンパク質を有するかまたは有さないＳＦ培地中、フィブロネクチンプレコーティング組織培養プラスチック上に直接プレーティングした。ＶＬＤＬ含有群およびＬＤＬ含有群でＣＦＵ−ｆ数の増加が観察された（ＨＤＬと比べて約３〜５倍）。
【００８８】
ＭＳＣマーカーＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を評価し、同じ濃度で用いたそれらのイソタイプコントロールに対して標準化した。これらのマーカーの等価の発現が観察された。さらに、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１およびＷ８Ｂ２を評価した。これらは、ＳＦ培養ＭＳＣ中で維持されることが以前に示されたマーカーであり、血清の存在下で喪失されるかまたは大きく減少する。これらのマーカーの発現はドナー間で大きく変動したが、異なるリポタンパク質に曝露したＭＳＣまたはそれらの非存在下のＭＳＣでは変化は観察されなかった。
【００８９】
ＭＳＣを骨髄から単離し、フィブロネクチンでのプレコーティングなし、フィブロネクチンでのフラスコのプレコーティングあり、または培地処方物自体へのフィブロネクチン添加ありで、組織培養プラスチック上に直接プレーティングした。システム中にフィブロネクチンの存在があるかまたはないかで、それが培地中に含まれるかまたは別のプレコーティング工程として用いられるかどうかで、ＣＦＵ−ｆが形成する能力において差異は観察されなかった。
【００９０】
（結論）
上記研究は、無血清中の異なる特異的リポタンパク質の比較および付着因子としてのフィブロネクチンの必要性の評価のために設計した。
【００９１】
ＨＤＬ含有ＳＦ培地の存在下のＣＦＵ−ｆは、細胞突起がまばらで密な細胞クラスターを有するＣＦＵ−ｆを形成した。逆に、ＶＬＤＬ含有ＳＦ培地またはＬＤＬ含有ＳＦ培地を用いて単離したＭＳＣは、分散したコロニーを有するＣＦＵ−ｆを形成した。ここでは、主として細胞は単細胞として見られた。ＶＬＤＬおよびＬＤＬは動脈における細胞への脂肪の輸送に関与し、これは、なぜこれらの群が、より分散したより健常な外観のＣＦＵ−ｆを形成する細胞を有したかを示し得る。しかし、Ｐ３の細胞の全てが互いに対して同様の細胞形態を有し、これは、リポタンパク質の１つの必要性がＭＳＣ（この場合、骨髄由来）の初期単離にあるのみであることを示し得る。ＶＬＤＬまたはＬＤＬのいずれかを含有する群においてＣＦＵ−ｆ数の増加があった。各継代の終わりの細胞収量と共にこれらのＣＦＵ−ｆ数を適用することで、増殖曲線を算出した。リポタンパク質群間でドナー内差異は観察されず、増殖動態におけるドナー間差異は複数のＭＳＣドナーと一致した。
【００９２】
ＭＳＣに対するリポタンパク質の効果をさらに調べるために、三系統分化アッセイを実施した。軟骨形成を、ＤＮＡ含量に対して標準化した硫酸化グリコサミノグリカンレベルのレベルを測定することにより評価した。これらの結果に基づいて、全ての群間で統計学的差異が観察されなかった。同様に、細胞の骨形成能を評価した。標準の骨形成培地中で１０日間細胞を培養し、形成した鉱物化マトリックスの指標としてカルシウムレベルを測定することにより、骨形成を評価した。これらの群内では統計学的差異が観察されなかった。オイルレッドＯで染色した場合に赤く染色する脂肪形成を測定することにより、脂肪生成を評価した。骨形成および軟骨形成と同様に、種々のリポタンパク質を用いて培養したＭＳＣの脂肪生成能において統計学的差異はなかった。
【００９３】
それらの三系統能に加えて、ＭＳＣは、それらのＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ７３の共発現により特徴付けられる。これに加えて、我々は、ＳＦ培養ＭＳＣが、ＣＤ２７１、ＣＤ１４６およびＷ８Ｂ２の発現を維持することを観察した。これらは、典型的には、インビトロでの培養の間に早期に喪失されるか顕著に減少するインビボでのＭＳＣを示すマーカーである。全てのリポタンパク質処理細胞は、９５％を上回るＭＳＣマーカーＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０の発現を維持した。ＣＤ２７１、ＣＤ１４６およびＷ８Ｂ２の発現もまた、全ての群で維持されたが、非常にレベルの変動があった。しかし、種々のリポタンパク質の存在によるこれらのマーカーのドナー内差異がなかったことは注目に値する。
【００９４】
上記結果に基づくと、リポタンパク質は、ＭＳＣの表面マーカー発現、増殖動態、または三系統分化能に効果を有さないようである。しかし、リポタンパク質の存在は、骨髄からのＭＳＣの初期単離にとって重要であると思われる。ＨＤＬ含有ＳＦ培地中で樹立したコロニーは、密集したコロニーを有し、これはストレスを受けているようであり、通常のＣＦＵ−ｆ形態を維持していない。さらに、ＶＬＤＬまたはＬＤＬにおいて単離された場合、得られたＣＦＵ−ｆの収量は増加した。上記データに基づくと、ＶＬＤＬまたはＬＤＬは、ＨＤＬに比べて無血清培地での使用により適しているようである。
【００９５】
この研究の最終目的は、所有の無血清培地においてフィブロネクチンがＭＳＣ培養物の単離および樹立に必要であるかどうかを決定することであった。ＳＦ培地中のフィブロネクチンの配合もまた、付着因子で培養表面をプレコーティングするという標準的な実施との対比において含めた。これを、フィブロネクチンなしの組織培養プラスチック、フィブロネクチンでプレコーティングした組織培養プラスチック、および最後に培地自体にフィブロネクチンを配合した組織培養プラスチックの直上にある骨髄から単離した細胞のＣＦＵ−ｆ数および増殖動態を調べることにより、評価した。ＭＮＣ計数に対して標準化した、骨髄から単離したＣＦＵ−ｆ数において差異は観察されなかった。同様に、ＭＳＣ培養物の増殖動態は、フィブロネクチンの存在または非存在により影響を受けなかった。これは、本発明の無血清培地中のＭＳＣの単離または増殖に付着因子が必要ではないことを示している。
【００９６】
したがって、本発明は、培地の成分として血清を用いない幹細胞の増殖のための培地、この培地を利用する方法、およびこの培地を用いて生産された細胞を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月14日(2016.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞を培養するための無血清培地であって、
（ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；
（ｂ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）；および
（ｃ）リポタンパク質；
を含む、培地。
【請求項２】
前記培地が１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬの濃度でリポタンパク質を含む、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記培地の前記リポタンパク質成分が、以下の：
（ａ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）；
（ｂ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；
（ｃ）中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）；および
（ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；
の１つまたはそれ以上を含む、請求項１から２のいずれかに記載の培地。
【請求項４】
ＬＤＬを含む、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
前記ＬＤＬが：
（ａ）大きい浮揚性ＬＤＬ（Ｉｂ  ＬＤＬ）粒子；
（ｂ）小さく密なＬＤＬ（ｓｄ  ＬＤＬ）粒子；および
（ｃ）リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））；
の１つまたはそれ以上あるいはすべてを含む、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
直径１５ｎｍから３０ｎｍのＬＤＬ粒子を含む、請求項４または５に記載の培地。
【請求項７】
ＶＬＤＬを含む、請求項３に記載の培地。
【請求項８】
直径３０ｎｍから８０ｎｍのＶＬＤＬ粒子を含む、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
前記培地の前記ＦＧＦ成分がＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）である、請求項１から８のいずれかに記載の培地。
【請求項１０】
前記培地の前記ＦＧＦ成分が、１から１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）である、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
前記培地のＴＧＦβ成分がＴＧＦβ−１である、請求項１から１０のいずれかに記載の培地。
【請求項１２】
前記培地のＴＧＦβ成分が、１から２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦβ−１である、請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
前記培地がさらに、基本培地を含むかまたは基本培地に基づく、請求項１から１２のいずれかに記載の培地。
【請求項１４】
前記培地がさらに、デキサメタゾン、ヒト血清アルブミン、および／またはインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の培地。
【請求項１５】
前記培地が他の増殖因子を含まない、請求項１から１４のいずれかに記載の培地。
【請求項１６】
間葉系幹細胞を培養する方法であって、請求項１から１５のいずれかに記載の培地中で該幹細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項１７】
前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）ヒト幹細胞を、（ｂ）請求項１から１５のいずれかに記載の培地中に含む、組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪生成細胞、または血管形成細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬品に使用するための請求項１から１５のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
【請求項２１】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項２０に記載の幹細胞。
【請求項２２】
骨組織、血管組織、軟骨組織、または脂肪組織の形成における使用のための、請求項１から１５のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
【請求項２３】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項２２に記載の使用のための幹細胞。
【国際調査報告】
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