(57)【要約】  本出願は概して、出血及び／または凝固性低下を予防または治療する必要のある個体における出血及び／または凝固性低下の予防方法または治療方法、ならびにこのような方法における使用のための組成物に関する。当該方法は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａ（スーパーＦＶａなど）の、単独でのまたはＦＶＩＩａ、好ましくはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）または活性の高くなったもしくは半減期の長くなった別のＦＶＩＩａなど）との併用での投与を含む。併用投与する場合、ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、出血または凝固性低下を治療または予防することを必要とする対象、例えば、血友病のような遺伝的障害あるいは後天性出血性障害あるいは出血性卒中もしくは出血性ショック、外傷、手術または月経困難症などの出血または凝固性低下と関係する他の容態に罹患している対象、あるいはＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸなどの凝血原に対する阻害性抗体を産生する個体、あるいは直接的なＸａもしくは直接的なトロンビン阻害因子もしくは新規の経口抗凝固薬（ＮＯＡＣ）などの過剰量の抗凝固薬を投与されたことのある個体、あるいは説明されたことのない出血を示している個体における出血または凝固性低下を治療または予防するのに使用する際に、相乗的な有益性を誘発する。また、本発明は、例えば、炎症性障害または敗血症疾患の治療における、例えばＡＰＣの過剰産生（重度の損傷及び／または出血性ショックなどを通じて）またはＡＰＣもしくは他の抗凝固療法の結果として、ＡＰＣと関係する出血を予防、治療または逆転させるための、スーパーＦＶａ単独あるいはＦＶＩＩａまたは他の凝血原もしくは止血支持薬との併用に関する。【選択図】図１
2017500372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の第Ｖａ因子（ＦＶａ）の単独での、あるいはＦＶａとの組み合わせで投与する場合、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）またはトロンビン生成に及ぼす相乗効果を任意に誘発する別の凝血原もしくは止血支持薬との関連における投与を含む、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固の促進方法またはその治療投与計画。
【請求項２】
有効量の第Ｖａ因子（ＦＶａ）の単独での、あるいは第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）またはＦＶａとの組み合わせで投与する場合、トロンビン生成に及ぼす相乗効果を任意に誘発する別の凝血原もしくは止血支持薬との関連における投与を含む、出血と関係する疾患または容態に罹患しているまたは発症する危険にある個体における有害な出血の予防方法または治療方法あるいはその治療投与計画。
【請求項３】
第Ｖａ因子（ＦＶａ）の単独でのあるいは第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）またはＡＰＣ仲介性もしくはＡＰＣ誘発性もしくはＡＰＣ関連出血を治療もしくは阻害するための別の凝血原もしくは止血支持薬との組み合わせでの使用方法であって、ＡＰＣは、内在的に産生されまたは外来的に投与される、前記方法。
【請求項４】
ＦＶａは、単独で投与される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
投与される前記ＦＶａは、スーパーＦＶａである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＦＶａは、経口的に、注射を介して（例えば、皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、吸入によって、または局所的にから選択される手段によって投与される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、併用投与される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、経口的に、注射を介して（例えば、皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、吸入によって、または局所的にから選択される手段によって投与される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第Ｈ因子、新鮮凍結血漿、及びフォンウィルブランド因子から選択される別の凝血原または止血支持薬の投与を含む、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療される対象は、ＡＰＣ関連またはＡＰＣ誘発性またはＡＰＣ仲介性出血に罹患しているまたは発症の危険にある、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＰＣ関連またはＡＰＣ誘発性またはＡＰＣ仲介性出血は、ＡＰＣまたは合成小分子または生物製剤などの抗凝固薬の投与に依拠する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＰＣ関連またはＡＰＣ誘発性またはＡＰＣ仲介性出血は、出血性発作もしくは出血性ショック、外傷、手術または月経困難症に依拠する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療される個体は、異常な出血と関係する遺伝的障害に罹患している、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝的障害は血友病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝的障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブランド病、及び血友病Ｃのうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記個体は、後天性凝固障害に罹患している、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記後天性凝固障害は、凝血因子の反復投与あるいは第ＶＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子などの血液凝固因子に対する自己免疫性、あるいは肝疾患、凝固因子の、または臨床下用量、臨床用量もしくは過剰用量の直接的なＸａもしくはトロンビン阻害因子もしくは他の新規の経口抗凝固薬（ＮＯＡＣ）などの抗凝固薬の凝固因子の合成低下と任意に関係するものの結果である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記個体は、異常な出血を呈するまたは月経困難症、出血性発作、外傷、手術もしくは別の侵襲性手順の結果としての出血の危険にあるまたは説明されていない出血を呈する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、同じ組成物中に含有される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、異なる組成物中に含有される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第ＶＩＩａ因子は、ＰＣＣ濃縮物（ＦＥＩＢＡ、３因子ＰＣＣまたは４因子ＰＣＣなど）中に、あるいは第ＶＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び／もしくは第Ｘ因子（ならびに／またはこれらの活性のある形態）を含有する活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）中に含有される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、同時に投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、別個に投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記別個の投与は、同じまたは異なる回数で果たされ得、かついずれかの順序で果たされ得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、投与する場合、出血の治療もしくは予防に及ぼす相乗効果及び／またはトロンビン生成を相乗的に促進することもしくはトロンビン生成に及ぼすＡＰＣの効果を逆転させることによる凝固亢進を誘発する、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＶａは、ＡＰＣ分解に対して耐性がある、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＦＶａは、前記１つ以上の突然変異を欠失する以外の点では同一のＦＶａポリペプチドよりもＡＰＣに対する耐性を前記ＦＶａに与える１つ以上の天然のまたは遺伝的に操作された突然変異を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＦＶａは、突然変異Ａｒｇ３０６Ｇｌｎ、Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ６７９Ｇｌｎならびに／もしくは位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基の導入のうちの１つまたは全部を、分子内ドメイン間ジスルフィド架橋の形成ならびに／または突然変異Ｇ１４９１Ｐ、Ｍ１７３６Ｖ及びＳｅｒ２１８３Ａｌａのうちの１つもしくは全部とともにまたは伴わずに含むスーパーＦＶａである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＦＶａは、突然変異Ａｒｇ３０６Ｇｌｎ、Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ６７９Ｇｌｎの各々を含みかつ、分子内ドメイン間ジスルフィド架橋の形成、ならびに／または突然変異Ｇ１４９１Ｐ、Ｐ１７３６Ｖ及びＳｅｒ２１８３Ａｌａの各々を伴ってまたは伴わずに、位置６０９及び１６９１においてシステイン残基をさらに含むスーパーＦＶａである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＦＶａは、ＦＶａをＡＰＣ耐性にする１つ以上の天然の突然変異または多型（例えば、ライデン突然変異、ケンブリッジ突然変異、または香港突然変異）を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記天然の突然変異は、アミノ酸位置３０６及び５０６のうちの１つまたは両方にあり、好ましくはＡｒｇ３０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ５０６Ｇｌｎである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＦＶａは、ＡＰＣ切断に対する耐性をＦＶａに与える、位置３０６、５０６、６７９、１４９１、１６９１、１７３６及び２１８３から選択される１つ以上の部位における突然変異を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
予防有効量または治療有効量のＦＶａ及びＦＶＩＩａを含む、異常な出血または凝固性低下に罹患しているまたは発症する危険にある患者への投与のための組成物。
【請求項３４】
前記組成物は投与すると、出血の治療もしくは予防及び／またはトロンビンの生成を促進することによる凝固に及ぼす相乗効果を誘発する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＦＶａは、ＡＰＣ分解に対して耐性がある、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＦＶａは、前記１つ以上の突然変異を欠失する以外は同一のＦＶａポリペプチドよりもＡＰＣに対する耐性をＦＶａに与える１つ以上の天然のまたは遺伝的に操作された突然変異を含有する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＦＶａは、突然変異Ａｒｇ３０６Ｇｌｎ、Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ６７９Ｇｌｎならびに／または位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基の導入のうちの１つまたは全部を、分子内ドメイン間ジスルフィド架橋の形成、ならびに／または突然変異Ｇ１４９１Ｐ、Ｍ１７３６Ｖ及びＳｅｒ２１８３Ａｌａのうちの１つもしくは全部を伴ってもしくは伴わずに含むスーパーＦＶａである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＦＶａは、ＡＰＣ切断に対する耐性をＦＶａに与える１つ以上の天然の突然変異または多型（例えば、ライデン突然変異、ケンブリッジ突然変異、または香港突然変異）を含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記天然の突然変異は、アミノ酸位置３０６及び５０６のうちの１つまたは両方にあり、好ましくはＡｒｇ３０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ５０６Ｇｌｎである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＦＶａは、ＡＰＣ切断に対する耐性をＦＶａに与える、位置３０６、５０６、６７９、１４９１、１６９１、１７３６及び２１８３から選択される１つ以上の部位における突然変異を含む、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
経口的に、注射を介して（皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、吸入によってまたは局所的にから選択される経路による投与に適している、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
凝固に及ぼす相乗効果または出血の予防を誘発する必要のある個体へ投与すると、トロンビンの生成を相乗的に促進すること、または血餅の耐性を回復させること、または血餅溶解時間を延長すること、またはトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化を回復させることによって凝固に及ぼす相乗効果または出血の予防を誘発することとができる、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
ＴＡＦＩ及び誘導体、トラネキサム酸、アミノカプロン酸、ε−アミノカプロン酸アミカル、ε−アミノカプロン酸、アプロチニン、及びこれらの組み合わせなどの抗線溶薬の使用を含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項４４】
前記ＡＰＣは、炎症性障害、敗血症、創傷治癒、または核放射線への曝露に依拠する疾患の治療において投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項４５】
ＦＶａは、配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含みかつ、位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基間の分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項４６】
ＦＶａは、配列番号４と少なくとも９５％同一の配列を含みかつ、位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基間の分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項４７】
ＦＶａは、配列番号４を含みかつ、位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基間の分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項４８】
ＦＶＩＩａは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項４９】
ＦＶＩＩａは、配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項５０】
ＦＶＩＩａは、配列番号２を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項５１】
ＦＶａは、配列番号４を含みかつ、ＦＶＩＩａは、配列番号２または亢進したインビボでの安定性もしくは活性を有するそのバリアントを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項５２】
スーパーＦＶａまたは他のＡＰＣ耐性ＦＶａの単独でのまたは新規経口抗凝固薬（ＮＯＡＣ）との組み合わせにおける使用を含む、ＮＯＡＣと関係する、ＮＯＡＣによって誘発されるまたはＮＯＡＣによって仲介される出血関連容態の予防療法または治療療法。
【請求項５３】
前記ＮＯＡＣは、直接的なＦＸａ阻害因子及び／またはトロンビン阻害因子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＮＯＡＣは、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ダビガトラン、またはこれらの組み合わせである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
血栓性障害または血栓性発作を治療または予防するのに使用する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）の使用を含む、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
トロンビン生成または止血能を相乗的に改良するために、スーパーＦＶａまたは他のＡＰＣ耐性ＦＶａと組換えＦＶＩＩａ、組換えＦＩＸａ、組換えＦＸａ、プロトロンビン複合体濃縮物、またはこれらの組み合わせとの併用を含む、出血関連容態を治療するための併用療法。
【請求項５８】
前記ＮＯＡＣは、直接的な第Ｘａ因子阻害因子及び／またはトロンビン阻害因子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮＯＡＣは、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ダビガトラン、またはこれらの組み合わせである、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記スーパーＦＶａまたは他のＡＰＣ耐性ＦＶａバリアントは、臨床下用量、臨床用量、または過剰用量のＮＯＡＣに依拠する出血を予防する、請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ＮＯＡＣを用いて治療されたことのある患者における手術のための予防を含む、出血性発作もしくは出血性ショック、外傷または手術を治療または予防するのに使用する、請求項５２〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
配列番号４を含むＦＶの活性化された形態をコードする、分離した核酸分子。
【請求項６３】
請求項６２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項６４】
ＦＶ産生に適した条件下で請求項６２の宿主細胞を培養すること、ならびにＦＶの前記活性化された形態を任意に分離及び精製することを含む、ＦＶの活性化された形態の組換え産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、これらのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１３年１１月４日出願の「出血または凝固性低下と関係する容態の治療または予防のための併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｏｒ  Ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）」という表題の米国仮出願第６１／８９９，５４４号、及び２０１４年２月２６日出願の「出血または凝固性低下と関係する容態の治療または予防のための併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｏｒ  Ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）」という表題の米国仮出願第６１／９４４，９１５号に対する優先権を請求する。
【０００２】
（本発明における政府の権利）
本発明は、米国衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＮＩＨ助成金ＨＬ０２１５４４及びＨＬ１０４１６５の下での米国政府の支援でなされた。米国政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
（本発明の分野）
本出願は概して、治療有効量の第Ｖａ因子（ＦＶａ）、好ましくは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）耐性ＦＶａ、例えば、スーパーＦＶａを単独で、あるいは第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、好ましくは組換えＦＶＩＩａ、より好ましくはｒｈＦＶＩＩａ、例えば（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））、または組換えＦＶＩＩａの別のバリアント、例えば、改良した半減期もしくは高まった活性を呈するもの、あるいは別の凝血原もしくは止血支持薬を投与することによって、出血及び／または凝固性低下を予防または治療することを必要とする個体において出血及び／または凝固性低下を予防または治療するための方法及びこのような方法における使用のための組成物に関し、この中で、当該併用は好ましくは単独でこれを必要とする対象へ投与した場合に、ＦＶａもしくはＦＶＩＩａまたは他の凝血原もしくは止血支持薬に対するトロンビン生成に及ぼす相乗効果を誘発する。また、本発明は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａの単独での使用、あるいはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などのＦＶＩＩａ、またはそれらの他のバリアント、例えば、改良された半減期もしくは活性を保有するもの、または過剰量のＡＰＣ生成もしくは投与による出血を治療もしくは予防するための別の凝血原もしくは止血支持薬との併用に関する。
【背景技術】
【０００４】
出血性障害、特に凝固因子における先天性欠損または後天性欠損は典型的には、因子の置き換えによって治療される。出血性障害は先天的または後天的であり得る。凝固障害には、凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）もしくは凝固第ＩＸ因子（血友病Ｂ）の欠乏症を包含するＸ連鎖劣性障害である血友病、及びフォンウィルブランド因子の重度の欠乏症を包含する稀有な出血性障害であるフォンウィルブランド病が含まれる。血友病Ｃとは、第ＸＩ因子の欠乏症に起因する、より軽度の形態の血友病である。血友病Ｃは通常、無症候性であるが、因子置き換え療法が手術中に必要とされることがある。
【０００５】
後天性凝固障害は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォンウィルブランド因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子のような血液凝固因子に対する阻害性抗体（しばしば「阻害因子」と呼ばれる）に起因する可能性があり、このような阻害因子は、外来的に注入されたＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸに対して、または自己免疫の設定において生じることができる。
【０００６】
後天性凝固障害は、疾患過程の結果としての出血の先行履歴を持たない個体においても生じることがある。例えば、後天性凝固障害は、このような急性外傷の止血性障害、抗凝固薬の投与、感染、または肝疾患（任意に凝固因子の合成低下と関係するもの）に起因し得、これらはすべて、凝固因子の合成低下と関係している。例えば、後天性凝固障害は、可溶性トロンボモジュリン及びその断片のレベルの亢進と関係する疾患または遺伝的突然変異により得る（その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｇｄｏｗｎ  Ｊ，Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ  ＲＪ，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ，Ｂａｇｌｉｎ  ＴＰ，トロンボモジュリンにおける成熟前終止コドン（ｐ．Ｃｙｓ５３７Ｓｔｏｐ）から結果的に生じる遺伝的出血性障害（Ａ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）．Ｂｌｏｏｄ．２０１４  ９月１８日号；１２４（１２）：１９５１〜６．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０２−５５７５３８を参照されたい）。
【０００７】
外傷は、４５歳未満の人々における主たる死因であり、出血はこれらの数時間以内の死亡のほぼ半分を占める（その開示が全体として参照により本明細書に明白に組み込まれるＣｏｔｈｒｅｎ  ＣＣら．  Ｗｏｒｌ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００７；３１：１５０７〜１５１１を参照されたい）。外傷性出血及び外傷性凝固障害は、プロテインＣ（ＰＣ）の過度の活性化によって仲介され、これが順に重要な凝固因子分子である活性化型（ａ）ＦＶを分解する（それらの開示が本明細書において参照により明白に組み込まれるＤａｎｉｅｌ  Ｆｒｉｔｈ及びＫａｒｉｍ  Ｂｏｈｉ；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  ２０１２，１８：６３１〜６３６、ならびにＣｈｅｓｅｂｒｏ  ＢＢら．２００９；Ｓｈｏｃｋ；３２：６５９〜６６５を参照されたい）。大量の血液成分の注入以外に、有効な凝固因子の置き換えは利用可能ではない。
【０００８】
出血の危険上昇は、種々の抗凝固薬を用いた療法を受けている患者においても観察されており、出血の危険を低下させる止血支持薬についての全身レベルのまだ対処されていない必要性がある。具体的には、第Ｘａ因子（ＦＸａ）またはトロンビンを直接的に阻害する新規の抗凝固薬（ＮＯＡＣ）に起因する出血に対して利用可能な有効な治療はない［１，２］。ＮＯＡＣは、静脈の血栓塞栓症の治療及び予防、ならびに心房細動の設定における発作の予防のためにますます処方されており、近い将来、ワーファリンに取って代わると期待されている。このことはなぜなら、ＮＯＡＣが、ワーファリンに必要なプロトロンビン回数による頻繁な患者モニタリング及び用量調整の必要なく、ワーファリンと比較して少なくとも等しい効能を実証したからである［３〜８］。しかしながら、ワーファリンを用いた場合、主要なまたは臨床的に関連する出血は、ＮＯＡＣを用いた治療の結果であり、両方が約５〜１５％の致死率で約５％／年の速度で出血を生じる［３〜８］。ワーファリン誘発性出血については、血漿製剤またはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）の投与が、止血を達成するのに有効である［９，１０］が、ＮＯＡＣ誘発性出血に対する抗体は現に利用可能ではない。ＮＯＡＣ関連出血のある患者における血漿製剤またはＰＣＣを用いた介入は概して、有効ではないと認知されている。データは、血漿製剤またはＰＣＣがインビトロでの止血パラメータの部分的かつ一致していない矯正しか実証していない、及び動物モデルにおいてほとんどまたはまったく低下を出血していない、インビトロでの試験、動物モデル及び健常なヒトボランティアに限定されている［２］。その上、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を用いた介入は、血友病患者及び阻害因子における制御を出血するのについて認可しており、しばしば、外傷性出血または手術による出血についての適応外使用をし［１１，１２］、ＮＯＡＣ誘発性及びワーファリン誘発性出血に有効ではないように見える。ＮＯＡＣへ曝露した健常ボランティアにおいて、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を用いてインビトロでの止血パラメータのわずかな矯正しか達成されず［１３］、皮膚生検を受けているワーファリンを用いて治療した患者において、止血に及ぼす効果は何ら存在しなかった［１４］。
【０００９】
それゆえ、出血の危険及び、出血エピソードに関する適切な予防または制御は、これらのクラスの薬剤について主たる懸念を残している。ＮＯＡＣと関係する出血を逆転させる臨床的選択肢がないことは、新規の特異的対抗策へと研究を駆り立ててきた。このようにして、直接的なトロンビン阻害因子結合型ａＰＴＴ伸長物［１５］とダビガトラン特異的ヒト化モノクローナル抗体フラグメントａＤａｂｉ−Ｆａｂとを短縮するトロンビン二重突然変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの逆転特性が近年報告された［１６］。直接的なＦＸａ阻害因子を結合する能力を保有している触媒として不活性のＦＸａは、健常ボランティアにおいて臨床的に開発中である［１７］。
【００１０】
その上、ＮＯＡＣの共通の副作用としての出血について有効な及び／または認可された治療は現にない。血漿製剤であるｒｈＦＶＩＩａもプロトロンビン複合体濃縮物も出血を救出するための臨床的な効能を実証してこなかったが、利用可能なその他の治療がない絶望的な状況にもかかわらず頻繁に使用されている。
【００１１】
出血性発作もしくは出血性ショック、重度の損傷、または手術前後などにおける他の重度の出血状況についても有効な治療はない。
【００１２】
血友病は、血友病Ａまたは血友病Ｂとしてそれぞれ公知のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸのいずれかの欠乏症を特徴とする。重症血友病は、自発性の関節、筋肉及び頭蓋内での出血が顕著であるのに対し、軽度または中程度の血友病における出血は通常、外傷または手術などの止血の努力とともに生じるに過ぎない。１９６０年代よりも前では、血友病患者は通常、幼児として死亡した。安全な凝固因子調製物の出現に伴い、寿命の中央値は一般的な人口にいまや匹敵し（１）、高齢の血友病患者の数の増加は、凝固因子置き換え療法の戦略を最適化して血友病性関節症の負担などの出血に固有の併存症を低下させるための新たな必要性を顕出させてきた。
【００１３】
血友病Ａ患者及びＦＶＩＩＩ阻害因子患者についての従来の療法は、組換えＦＶＩＩＩまたは凝血原迂回薬、例えば、ＦＥＩＢＡまたは組換えＦＶＩＩａのような治療薬によって達成される。有効だが、当該療法を非有効にする阻害性抗体の開発は、普遍的に生じている。また、ＦＶＩＩＩ阻害因子患者の治療のための治療薬としてのＦＶＩＩａ及びＦＥＩＢＡは、半減期が極めて短いので、頻繁な静脈内投与を必要とする。
【００１４】
実際、血友病患者のおよそ３０％は、外来的に投与されるＦＶＩＩＩに対して中和する阻害性抗体を発達させており（２）、このことは、患者をＦＶＩＩＩ治療またはＦＩＸ治療に対して不応性にしておくので、療法の最も壊滅的な合併症である。阻害因子を根絶するための免疫寛容誘導（ＩＴＩ）は、最長２年間（６か月間の中央値）かかる可能性があり、症例のおよそ７０％しか成功しない（３）。この期間中及びＩＴＩが成功しなかった場合のその後の寿命の間、患者は、致死的出血になりやすく、生活の質が貧弱な、衰弱させる関節症を発症する危険性が高い（４）。
【００１５】
ＦＶＩＩａ系凝固因子調製物は、損傷部位での内在性のＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａ、及びＦＸＩａ仲介性トロンビン増幅についての必要性を迂回することを通じて出血を救出することによって、阻害剤を用いて患者を治療するために開発された。超生理学的レベルにおいて、ＦＶＩＩａは、組織因子（ＴＦ）依存性経路を介したＦＸの直接的な活性化を基にして、または血小板表面上のＴＦとは無関係に、トロンビン生成を加速させる（５，６）。
【００１６】
特性を実証し、血友病Ａのマウスモデル（ｖｏｎ  Ｄｒｙｇａｌｓｋｉ  Ａら．ＪＴＨ  ２０１４；１２：３６３〜３７２）における、及び抗ＦＶＩＩＩ抗体を野生型マウスへ注射して出血を引き起こす後天性血友病Ａのマウスモデルにおける出血を制御することができた。スーパーＦＶａの効果は、ｒｈＦＶＩＩａと併用した場合に高まった。
【００１７】
本発明は、これらの必要性に対処し、出血と関係する容態の治療のための新規の療法及び治療処方計画を提供する。
【発明の概要】
【００１８】
安全で、簡便でかつ有効な、出血性障害を治療するための改良された治療薬及び治療投与計画についての必要性がある。また、例えばＡＰＣの過剰発現もしくは過剰活性化またはＡＰＣなどの抗凝固薬硫酸化多糖の投与の結果として、ＡＰＣ関連出血を有効に治療または予防する療法及び治療用組成物についての必要性がある。本発明は、このような問題を緩和するためのこのような改良された治療投与計画及び当該治療投与計画における使用のための新規の組成物を提供する。
【００１９】
後に論議するように、本発明者らは、血友病における止血を強力に標準化する操作されたＦＶａバリアントであるスーパーＦＶａが、止血支持製剤のための基準に適合しており、重度の損傷またはＮＯＡＣの治療と関係する出血のついて有益であり得るという仮説を立てた。スーパーＦＶａは、Ａ２ドメインとＡ３ドメインの間の操作されたジスルフィド結合（Ｃｙｓ６０９〜Ｃｙｓ１６９１）（ＦＶ（Ａ２−ＳＳ−Ａ３））により、野生型ＦＶａと比較して高い比活性を有しており、その生物学的活性は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）切断部位（Ａｒｇ５０６／３０６／６７９Ｇｌｎ）の突然変異及び、Ｓｅｒ２１８３Ａｌａの突然変異によるＡｓｎ２１８１におけるグリコシル化部位の除去によって増強される。これらの修飾の結果として、スーパーＦＶａは、他のＦＶａバリアントと比較して血友病血漿における優れた止血特性を用いてＡＰＣ失活に対して非常に耐性があることがわかり、血友病マウスモデルにおける出血を効率的に予防した（ｖｏｎ  Ｄｒｙｇａｌｓｋｉ  Ａら，操作された第Ｖａ因子突然変異体による血友病における改良された止血（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆａｃｔｏｒ Ｖａ ｍｕｔａｎｔ）．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ；２０１４；１２：３６３〜３７２）。その上、複数の阻害因子を用いた血友病血漿において、スーパーＦＶａは驚くべきことに、トロンビン生成と血栓溶解の長期化とに及ぼすｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせにおける相乗効果を呈した（Ｂｈａｔ  Ｖ．及びｖｏｎ  Ｄｒｙｇａｌｓｋｉ  Ａら；未公開データ）。その上、スーパーＦＶａはまた、ヒトＡＰＣ処理した血漿の止血パラメータを回復させるのに効率的であるのに対し、ｒｈＦＶＩＩａまたはＰＣＣは、野生型マウスにおける尾部クリップまたは肝臓裂傷後のＡＰＣ誘発性出血及び死亡を抑止する（ｖｏｎ  Ｄｒｙｇａｌｓｋｉ  Ａら；操作されたＦＶａは抗凝固薬野生型活性化プロテインＣによって誘発される出血を予防する（Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＦＶＡ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ；２０１４，８月１５日号；９（８）：ｅ１０４３０４（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０４３０４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１４））。本明細書で論議するように、スーパーＦＶａは、ＮＯＡＣを用いて刺激したヒト血漿における優れた止血特性、及びＮＯＡＣを用いて治療したマウスにおける有意な出血低下を実証した。その上、本明細書で提供するように、スーパーＦＶａの止血支持特性は、例えばＰＣＣまたはｒｈＦＶＩＩａまたはＦＩＸａまたはＦＸａと併用した場合、高まった。
【００２０】
これらの観察を基に、本発明者らは、血友病における及びＡＰＣ誘発性出血における止血を強力に標準化する操作されたＦＶａバリアントとしてのスーパーＦＶａが、ＦＸａ阻害因子などのＮＯＡＣによって誘発される出血を改善し得る止血支持製剤についての基準に適合するであろうと結論付けた。それゆえ、一態様において、本発明は、スーパーＦＶａもしくは他のＡＰＣ耐性ＦＶａ単独の使用または経口抗凝固薬（ＮＯＡＣ）との併用を含む、ＮＯＡＣと関係する、ＮＯＡＣによって誘発されるまたはＮＯＡＣによって仲介される出血関連容態を予防または治療するための療法を提供する。
【００２１】
加えて、それを基に、本発明は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａの単独での使用、あるいはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などのＦＶＩＩaと組み合わせ、または別のそのバリアント、例えば、過剰量のＡＰＣ生成またはＡＰＣもしくは抗凝固薬投与または合成小分子及び生物製剤による出血を治療または予防するための改良された半減期または活性を有するものとの併用に一部関する。
【００２２】
また、本発明は、例えば、炎症性障害、敗血症、創傷治癒、及び／または核放射線への曝露による疾患に罹患している個体におけるＡＰＣ関連出血を逆転させまたは阻害するための、スーパーＦＶａ単独のまたはＦＶＩＩａとの併用における投与に関する。
【００２３】
本発明の目的は、高い血液凝固の必要のある対象、例えば遺伝性および後天性出血性障害、または阻害因子による血友病、または止血性障害、または説明されていない出血に罹患している対象を治療するための、ＦＶａ単独でのまたはＦＶＩＩａとの組み合わせにおける使用を含む、新規の治療投与計画を提供することである。好ましくは、ＦＶａは、１つ以上の天然の突然変異（例えば、ライデン突然変異、ケンブリッジ突然変異、または香港突然変異）または、ＡＰＣに対して耐性とする（突然変異を欠失している他の同一のＦＶａポリペプチドよりもＡＰＣに対して耐性がある）遺伝子操作された突然変異を含有する。天然の突然変異は好ましくは、アミノ酸位置３０６及び５０６、好ましくはＡｒｇ３０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ５０６Ｇｌｎのうちの１つまたは両方にある。遺伝的に操作された突然変異は好ましくは、位置３０６、５０６、６７９、１４９１、１６９１、１７３６及び２１８３の複数の位置で生じ、ＡＰＣ切断に対する耐性をＦＶａに与える。
【００２４】
より好ましくは、ＦＶａは、ＦＶａ、特にＡＰＣに耐性を与える特異的突然変異を有する「スーパーＦＶａ」であり、すなわち、突然変異Ｒ３０６Ｑ、Ｒ５０６Ｑ、Ｈ６０９Ｃ、Ｒ６７９Ｑ、欠失８１０〜１４８９、Ｇ１４９１Ｐ、Ｅ１６９１Ｃ、Ｍ１７３６Ｖ、及びＳ２１８３Ａのうちの１つまたは全部であり、Ｃ６０９とＣ１６９１の間の分子内ドメイン間ジスルフィド架橋の形成を伴いまたは伴わない。最も好ましくは、スーパーＦＶａは、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ５０６Ｑ、Ｈ６０９Ｃ、及びＲ６７９Ｑにおける突然変異ならびに／またはＧ１４９１Ｐ、Ｅ１６９１Ｃ、Ｍ１７３６Ｖ、及びＳ２１８３Ａにおける突然変異を有しており、Ｃ６０９とＣ１６９１の間の分子内ドメイン間ジスフリド架橋の形成、及びアミノ酸８１０〜１４８９の欠失（野生型ＦＶａに対する）を伴いまたは伴わない。
【００２５】
また、好ましくは、ＦＶＩＩａは、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））またはＦＶＩＩａの別のバリアント、好ましくは、例えばポリエチレングリコールを含む水溶性ポリマーなど、半減期を延長することが公知の部分に対する突然変異誘発及び／または結合の結果として、半減期及び／または活性型が高まったものである。このような組み合わせを用いた本発明の組み合わせ及び治療投与計画は、トロンビンの生成を相乗的に促進することによって出血または血友病などの凝固性低下を治療するための現に利用可能な治療投与計画に対する凝固、すなわち、凝血に及ぼす相乗効果を誘発することが発見された。
【００２６】
より具体的には、本発明の目的は、ＦＶＩＩａを伴うまたは伴わない有効量のＦＶａの投与を含む、血液凝固または出血の低下もしくは予防を促進することを必要とする個体における当該血液凝固または出血の低下もしくは予防の促進方法を提供することである。好ましくは、相対的な薬用量は、トロンビンの生成を相乗的に促進することによって凝固または凝血に及ぼす相乗的な効果を誘発する（本発明の組み合わせが凝固性低下または出血を治療または予防する上で使用される例示的な徴候の治療のための例示的な企図された投与計画は後述する）。
【００２７】
本発明の別の目的は、有効量のＦＶａ単独またはＦＶＩＩａと組み合わせた投与からなる、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固の促進方法を提供することであり、すなわち、この中で、投与される唯一の血液凝固促進薬はＦＶａ、好ましくはスーパーＦＶａまたは他のプロテアーゼ耐性ＦＶａ、及びＦＶＩＩａである。
【００２８】
本発明の別の目的は、ＦＶａ、好ましくはスーパーＦＶａ（高度にＡＰＣ耐性であるよう突然変異されている）単独、またはともにトロンビン生成を相乗的に促進するｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））とともに、または他のＦＶＩＩａとの組み合わせで、及び任意に他の活性薬または凝血原もしくは止血支持薬、例えばＦＸＩ、ＦＸＩＩ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＨ、新鮮凍結血漿、及びフォンウィルブランド因子または先に列挙した因子の活性化形態、またはペントサンポリスルファート（ＰＰＳ）、フコイダン、Ｎ−アセチル−ヘパリン（ＮＡＨ）、Ｎ−アセチル−デ−Ｏ−硫酸化ヘパリン（ＮＡ−ｄｅ−ｏ−ＳＨ）、デ−Ｎ−硫酸化ヘパリン（Ｄｅ−ＮＳＨ）、デ−Ｎ−硫酸化アセチル化ヘパリン（Ｄｅ−ＮＳＡＨ）、過ヨウ素酸酸化ヘパリン（ＰＯＨ）、化学的に硫酸化されたラミナリン（ＣＳＬ）、化学的に硫酸化されたアルギン酸（ＣＳＡＡ）、化学的に硫酸化されたペクチン（ＣＳＰ）、硫酸デキストラン（ＤＸＳ）及びヘパリン誘導性オリゴ糖（ＨＤＯ）などの非抗凝固性硫酸化多糖（ＮＡＳＰ）とともに投与することを含む、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固の促進方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、有効量のＦＶａの単独でのまたはＦＶＩＩａ、好ましくはスーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせにおける投与を含む、出血を予防することまたは血液凝固を促進することを必要とする個体における出血の予防方法または血液凝固の促進方法を提供することであり、この中で、ＦＶａ単独またはＦＶＩＩａとの組み合わせは、経口的に、注射を介して（皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、吸入によって、または局所的にから選択される手段によって投与される。
【００３０】
本発明の別の具体的な目的は、異常な出血と関係する全身性障害に罹患している個体における血液凝固の促進方法を提供することである。一実施形態において、本発明は、出血と関係する全身性障害、例えば、血友病またはより具体的には血友病Ａ、血友病Ｂ、及びフォンウィルブランド病に罹患している個体における血液凝固の促進方法を提供する。
【００３１】
本発明の別の目的は、血液凝固を促進することを必要とする個体、例えば、血液凝固因子（ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、プロトロンビン、トロンボモジュリン、プロテインＣ及びプロテインＳ、アンチトロンビン、ホモシステイン、またはリポタンパク質（ａ））が、非存在である、正常レベルよりも低く存在するまたは遺伝的突然変異もしくは多型により機能障害を伴って正常レベルで存在する全身性凝固障害、あるいは後天性凝固障害、例えば、ＦＶＩＩＩ、フォンウィルブランド因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子などの血液凝固因子に対する自己免疫性を与える後天性凝固障害、あるいは阻害因子による血友病、あるいは肝疾患に起因するものなどの止血性障害、任意に凝固因子の合成低下と関係するもの、あるいは説明されていない出血に罹患している個体における血液凝固の促進方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の具体的な目的は、出血を予防するまたは血液凝固を促進する必要のある個体における出血の予防方法または血液凝固の促進方法を提供することであり、この中で、当該個体は、外傷、歯科手順もしくは別の侵襲性手順の結果として出血を有しておりまたは出血の危険にあり、あるいは、説明されていない出血を呈している。治療された対象は、例えば出血性発作もしくは出血性ショック、外傷、手術または月経困難症によるＡＰＣ関連もしくはＡＰＣ誘発性もしくはＡＰＣ仲介性出血に罹患し得、またはこれらを発症する危険にあり得る。
【００３３】
本発明の別の目的は、相乗的に有効量のＦＶａ及びＦＶＩＩａの投与を含む、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固の促進方法を提供することであり、この中で、当該ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、同じ組成物または異なる組成物において含有され、ともにまたは別個に、同じ回数または異なる回数で、及びいずれかの順序で投与される。典型的には投与は、凝固及びトロンビン生成に及ぼす所望の相乗効果を達成するよう同じ時にまたは近似してなされる。相乗性のため、投与は、当該治療方法において使用するＦＶＩＩａ及び特定のＦＶａ、好ましくは本発明によるスーパーＦＶａについてのインビボでの半減期（Ｔ１／２）に依存する。スーパーＦＶａまたは別のＦＶａ、例えばＦＶａバリアント、例えば安定性の高まったもしくは半減期の長くなったものについてのＴ１／２は、公知の方法によって測定され得る。ＦＶＩＩａについてのＴ１／２は、約２．５時間である。このＴ１／２を基に、及びその予測されたＴ１／２を基に、スーパーＦＶａは好ましくは、ＦＶＩＩａの４×Ｔ１／２内で、好ましくはＦＶＩＩａの１×Ｔ１／２内で投与され、すなわち、約１０時間〜約２．５時間ごとに投与される。
【００３４】
本発明の具体的な目的は、有効量のＦＶａ単独またはＦＶＩＩａと組み合わせた投与を含む、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固の促進方法を提供することである。ＦＶａは好ましくは、ＡＰＣ分解に対して耐性があり、例えば、ＦＶａは、１つ以上の天然のまたは遺伝的に操作された突然変異を欠失するその他の点では同一のＦＶａよりもＡＰＣに対する大きな耐性をＦＶａに与える当該１つ以上の突然変異を含有する。さらにより好ましくは、ＦＶａは、突然変異Ａｒｇ３０６Ｇｌｎ、Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ６７９Ｇｌｎのうちの１つまたは全部ならびに／あるいは位置６０９及び／または１６９１におけるシステイン残基の導入（当該システイン残基間に挿入された分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を有する及び有さない）を含むスーパーＦＶａであり、ならびに／あるいは当該突然変異体は、ＦＶａにＡＰＣ耐性を与える１つ以上の天然の突然変異（例えば、ライデン突然変異）、例えば、位置５０６における置換突然変異、好ましくはＡｒｇ５０６Ｇｌｎを含み、ならびに／あるいは当該ＦＶａ突然変異体は、ＡＰＣ切断及び／またはＳｅｒ２１８３Ａｌａ突然変異の突然変異によるＡｓｎ２１８１におけるグリコシル化部位の除去に対する耐性をＦＶａに与える位置３０６（例えば、ケンブリッジ置換Ａｒｇ３０６Ｔｈｒ、香港置換Ａｒｇ３０６Ｇｌｙまたは、好ましくはＡｒｇ３０６Ｇｌｎ）、５０６、６７９、及び１７３６から選択される１つ以上の部位における突然変異を含む。最も好ましくは、スーパーＦＶａは、配列番号４と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または同一でありかつ位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基間に分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を含む配列を含む。
【００３５】
また、当該ＦＶＩＩａは、野生型あるいはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などのバリアントｈＦＶＩＩａあるいは突然変異誘発及び／またはポリエチレングリコール及びこれに類するものなどの水溶性ポリマーなどのインビボでの半減期または活性を高める部分の結合の結果としての高い活性及び／または長い半減期を有する別のＦＶＩＩａバリアントであり得る。好ましくは、ＦＶＩＩａは、配列番号２と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または同一の配列を含む。
【００３６】
本発明の別の目的は、血液凝固を促進する必要のある個体における血液凝固を促進するための本発明の治療投与計画における使用のための組成物、すなわち、組成物が予防効果または治療効果のある量のＦＶａをＦＶＩＩａとともにまたはＦＶＩＩａなしで含む、異常な出血または凝固性低下に罹患しているまたはこれらを発症する危険にある患者への投与のための組成物を提供することである。好ましくは、当該ＦＶａ及びＦＶＩＩａが併用投与される場合、当該ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、トロンビンの生成を相乗的に促進することによって出血の治療もしくは予防及び／または凝固亢進に及ぼす相乗効果を誘発する。特定の実施形態において、当該組成物は、これを必要とする個体へ投与する場合、トロンビンの生成を相乗的に促進すること、または血餅の耐性を回復させること、または血餅溶解時間を延長することによって、あるいはトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化を回復させることによって、凝固または出血の予防に及ぼす相乗的な効果を誘発することができる。
【００３７】
好ましい実施形態において、当該組成物中のＦＶａは、ＡＰＣ分解に対して耐性のあるものであり、例えば、１つ以上の天然のまたは遺伝的に操作された突然変異を欠失する以外は同一のＦＶａポリペプチドよりもＡＰＣに対するより多くの耐性をＦＶａに与える当該１つ以上の突然変異を含有する。好ましくは、当該ＦＶａは、突然変異Ａｒｇ３０６Ｇｌｎ、Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ及びＡｒｇ６７９Ｇｌｎのうちの１つまたは全部を含むスーパーＦＶａであり、ならびに／あるいは位置６０９及び／または１６９１におけるシステイン残基を含むよう突然変異し、当該２つのシステイン間に挿入された分子内ドメイン間ジスルフィド架橋は存在し及び存在せず、ならびに／あるいはＦＶａにＡＰＣ耐性を与える１つ以上の天然の突然変異（例えば、ライデン突然変異）を含有し、例えば、ライデン突然変異は、５０６と付番されたアミノ酸位置にあり（成熟タンパク質における）、好ましくはＡｒｇ５０６Ｇｌｎであり、ならびに／あるいは当該ＦＶａは、ＡＰＣ切断に対する耐性をＦＶａに与える位置３０６、５０６、６７９、及び１７３６から選択される１つ以上の部位における突然変異を含み、ならびに／あるいは当該ＦＶａは、Ｓｅｒ２１８３Ａｌａ突然変異など、グリコシル化を変化させる突然変異を含有する。最も好ましくは、当該スーパーＦＶａは、配列番号４と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または同一でありかつ位置６０９及び１６９１におけるシステイン残基間の分子内ドメイン間ジスルフィド架橋を含む配列を含む。
【００３８】
また、当該ＦＶＩＩａは好ましくは、ｒｈＦＶＩＩａ、例えば、野生型またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）もしくは別のバリアントなど改善された活性及び／もしくは半減期を有するバリアントを含む。好ましくは、ＦＶＩＩａは、配列番号２と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または同一の配列を含む。好ましい実施形態において、これらの組成物は、経口的に、注射を介して（例えば、皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、または局所的にから選択される経路による投与に採用される。
【００３９】
本発明の具体的な目的は、トロンビン生成または止血の能力を相乗的に改良するために、スーパーＦＶａまたは他のＡＰＣ耐性ＦＶａと、組換えＦＶＩＩａ、組換えＦＩＸａ、組換えＦＸａ、プロトロンビン複合体濃縮物、またはこれらの組み合わせとを含む、出血関連容態を治療するための併用療法を提供することである。
【００４０】
本発明の別の具体的な目的は、血栓性障害及び血栓性発作の治療及び予防のためにリバロキサバン及びアピキサバン及びエドキサバン、またはこれらの組み合わせなどの直接的なＸａ阻害因子、ならびにダビガトランなどの直接的なトロンビン阻害因子などの近年開発された新規の経口抗凝固薬（ＮＯＡＣ）の使用、ならびにスーパーＦＶａとのＫｃｅｎｔｒａ（商標）の併用を任意にさらに含むことによって誘発される出血を予防及び／または低下させることである。
【００４１】
関連する態様において、本発明は、スーパーＦＶａもしくは他のＡＰＣ耐性ＦＶａバリアントを単独または組換えＦＶＩＩａもしくは他の止血支持薬（例えば、３因子ＰＣＣ、４因子ＰＣＣ、活性化ＰＣＣ、ＦＥＩＢＡ、新鮮凍結血漿、ＦＶａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）との併用治療薬として提供して、臨床下用量、臨床用量及び／または過剰量のＮＯＡＣによる出血に対する対策を提供する。
【００４２】
加えて、本発明は、スーパーＦＶａの単独での使用または他の治療薬（例えば、組換えＦＶＩＩaもしくは他の止血支持薬（例えば、３因子ＰＣＣ、４因子ＰＣＣ、活性化ＰＣＣ、ＦＥＩＢＡ、新鮮凍結血漿、ＦＶａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）との併用を提供して、出血性発作もしくは出血性ショック、外傷または手術などの他の徴候における出血を予防または治療し、これにはＮＯＡＣ（例えば、直接的な第Ｘａ因子阻害因子及び／またはトロンビン阻害因子）を用いてすでに治療された患者における手術のための予防を含む。
【００４３】
本発明の別の目的は、出血エピソード及び出血関連容態の治療及び予防における薬剤単独を上回って改良された効能を提供するための、ＦＶＩＩａ、ＦＸ及びＦＸａ、ＦＩＸ及びＦＩＸａ、プロトロンビナーゼ複合体濃縮物（ＰＣＣ）、３因子ＰＣＣ、４因子ＰＣＣ、活性化ＰＣＣ、第８因子迂回活性（ＦＥＩＢＡ）、新鮮凍結血漿、ならびにＦＶまたはスーパーＦＶａもしくは他のＦＶａバリアントを有するＦＶａを含む相乗的組成物及びその使用を提供することである。
【００４４】
別の目的は、ＮＯＡＣを含有する血漿におけるｒｈＦＶＩＩａまたはプロトロンビン複合体濃縮物及びスーパーＦＶａの相乗性を実証することである。
【００４５】
本発明のさらに別の目的は、配列番号４を含むＦＶの活性化形態をコードする単離した核酸分子、当該単離した核酸分子、例えば配列番号４を含む宿主細胞、ならびに当該単離した核酸を含む宿主細胞をＦＶ生成に適した条件下で培養することと任意にＦＶの当該活性化形態を単離及び精製することとを含むＦＶの活性化形態の組換え生成方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１のＡ及びＢは、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示す実験を含有している。トロンビン生成は、固定した濃度のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２５ｎｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下での漸増濃度のスーパーＦＶａを補充したＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。（Ａ）ｒｈＦＶＩＩａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）での漸増濃度のスーパーＦＶａにおけるＥＴＰの代表例。（Ｂ）ｒｈＦＶＩＩａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での漸増濃度のスーパーＦＶａを用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。
【図２】図２のＡ及びＢは、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示す実験結果を含有している。トロンビン生成は、固定した濃度のスーパーＦＶａ（０．５９μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下での漸増濃度のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を補充したＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。（Ａ）スーパーＦＶａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）における漸増濃度のｒｈＦＶＩＩａにおけるＥＴＰの代表例。（Ｂ）スーパーＦＶａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）におけるｒｈＦＶＩＩａの漸増濃度を用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）、スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。
【図３】図３のＡ及びＢは、抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害因子）含有の正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示す実験の結果を含有している。トロンビン生成は、１．２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を補充した正常ヒト血漿におけるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）として測定した。（Ａ）固定した用量のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２５ｎｇ／ｍｌ）濃度の非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での漸増濃度のスーパーＦＶａによるトロンビン生成。（Ｂ）固定した用量のスーパーＦＶａ濃度の非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での漸増濃度のｒｈＦＶＩＩａによるトロンビン生成。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。
【図４】図４のＡ及びＢは、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び高い力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害因子）を有する患者の血漿におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示す実験の結果を含有している。トロンビン生成は、（Ａ）ＵＣＳＤ血友病治療センターにおいてみられた２名の患者由来の阻害因子含有血漿試料または（Ｂ）３名の異なる患者由来の阻害因子含有市販血漿試料におけるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）として測定した。ＥＴＰは、２つの異なる濃度のスーパーＦＶａもしくはｒｈＦＶＩＩａまたはこれらの組み合わせで測定した。阻害因子力価はＢＵで表す。プールしたＮＨＰは対照として機能した。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。ＢＵ（ベセスダ単位）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図５】図５のＡ及び５のＢは、急性関節出血についての、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症患者の血漿におけるスーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））で処置した高力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体の相乗効果を示す実験の結果を含有している。血漿試料は、２名の患者由来のそれぞれ６４Ｕ／ｍＬのＢＵ力価（患者Ａ）及び３２Ｕ／ｍｌ（患者Ｂ）を含有する９０μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａの注入直前（白色円）及び５分後（白色正方形）に得た。トロンビン生成は、エクスビボで血漿試料へ添加された漸増濃度のスーパーＦＶａによりＥＴＰ（上パネル）またはピーク高（下パネル）として測定した。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。ＢＵ（ベセスダ単位）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図６】図６は、ＧＭＡ８０１５抗ＦＶＩＩＩのベセスダ力価を含有している。ＦＶＩＩＩ阻害活性は、Ｂａｒｒｏｗ及びＬｏｌｌａｒ，ＪＴＨ，２００６に説明されるプロトコルによるナイメーヘン・ベセスダアッセイの変法により測定した。５０％ＦＶＩＩＩ活性は、０．０３１μｇ／ｍｌのＧＭＡ８０１５で残存していた。このことは結果的に、３２,３００ＢＵ／ｍｇのＧＭＡ８０１５を生じる。
【図７】図７は、アイソタイプ抗体を有する及び有さない正常ヒト血漿におけるトロンビンの生成を示す。トロンビン生成は、１．２５μｇ／ｍｌのアイソタイプ抗体の存在下または非存在下での正常のプールしたヒト血漿における内在性トロンビン能（ＥＴＰ）としてプールした正常ヒトにおいて測定し、曲線下面積（上パネル）及びピーク高（下パネル）として表した。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図８】図８のＡ及び８のＢは、トロンビン生成を測定する実験の結果を含有している。パネルＡ及びＢにおける実験において、これはそれぞれ、Ａ）正常ヒト血漿を用いて及びＢ）ｒｈＡＰＣの存在下でのｒｈＦＶａまたはｒｈスーパーＦＶａを補充したネズミＢａｌｂ／ｃ血漿を用いて測定した。トロンビン生成は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した（ｎ＝４〜６）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【図９】図９のＡ〜Ｃは、ａＰＴＴ矯正を示す。パネルＡ）における実験において、ａＰＴＴ凝固時間は、ａ）１０ｎＭのｒｈＡＰＣの存在下での漸増濃度のｒｈＦＶａまたはｒｈスーパーＦＶａの存在下でのヒト血漿中で測定し（ｎ＝４）、パネルＢ）において、ａＰＴＴ凝固時間は、１０ｎＭのｒｈＡＰＣ及び１ｎＭのｒｈＦＶａバリアントにおける単一のデータ地点として図示しており、パネルＣ）において、ａＰＴＴ凝固時間は、ｒｈＦＶａバリアントの存在下でのネズミ血漿において検出した（ｎ＝１０）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【図１０】図１０は、組換えネズミＡＰＣのＢａｌｂ／Ｃマウスへの静脈内注射後のＦＶａバリアントを用いたａＰＴＴ矯正を示す。マウスに塩類溶液またはｒｍＡＰＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。２分後、血液を後眼窩で収集し、全血のＡＰＴＴを即時測定した。ＡＰＣを注射した２群のマウスにおいて、全血は、スーパーＦＶａまたは野生型ＦＶａのいずれかを用いてエクスビボで刺激し（白色三角形１Ｕ／ｍＬ、白色円０．５Ｕ／ｍＬ、黒色三角形０．０５Ｕ／ｍＬ）、両方のバリアントによるＡＰＴＴ矯正の程度を測定した。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【図１１】図１１のＡ〜Ｃは、ネズミ尾部クリップモデルにおけるスーパーＦＶａによるＡＰＣ誘発性出血の矯正を示す実験の結果を含有している。野生型マウスに漸増用量のｒｈＡＰＣまたは塩類溶液を静脈内注射した。スーパーＦＶａを２つの濃度でＡＰＣの２分前に静脈内注射した。尾部クリップ後の出血は、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける血液の損失として表す。パネル（Ａ）は、２０分間中の血液の損失を示し、尾部クリップの（Ｂ）１回目１０分後及び（Ｃ）２回目１０分後へと分けられたのが図示されている。誤差棒はＳＥＭを表す。＊は統計的有意性を示す。（ｐ値＜０．０５）。
【図１２】図１２は、尾部クリップ及び肝裂傷後の出血パターンの直接的な比較を示す実験の結果を含有している。ＦＶＩＩＩ欠損マウスに塩類溶液（２００μＬ）またはｒｈＦＶＩＩＩ（５０Ｕ／ｋｇ、２００μＬ）を静脈内注射し、尾部クリップまたは肝裂傷へ供した。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに基線値用に塩類溶液を注射した。２０分間中にマウスの全群における血液の損失は、両モデルにおいて測定した。
【図１３】図１３のＡ〜Ｃは、肝裂傷後のスーパーＦＶａの投与によるＡＰＣ誘発性出血の矯正を実証する実験の結果を示す。マウスに塩類溶液または１．２５ｍｇ／ｋｇの血漿由来ヒトＡＰＣを静脈内注射した。スーパーＦＶａを３．５ｍｇ／ｋｇでＡＰＣの２分前に静脈内注射した。肝裂傷後の出血は、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける血液の損失として表す。２０分間の（Ａ）血液の損失及び（Ｂ）生存。（Ｃ）損傷後の１回目の１０分（上パネル）及び２回目の１０分（下パネル）へと分けた失血。誤差棒はＳＥＭを表す。＊は統計的有意性を示す（ｐ値＜０．０１）。＾ＡＰＣを注射した１３匹のマウスのうちの４匹は、損傷後の１回目の１０分間で死亡した（白色円）。さらに３匹のマウスはそれぞれ２回目の１０分間の間に死亡した（白色長方形）ので、下パネルから除外する。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．０１以下）。
【図１４】図１４のＡ及びＢは、ｒｈＡＰＣ血漿及び用量応答によるトロンビン生成の抑制を示す実験の結果を含有している。トロンビン生成は、増加するｒｈＡＰＣの存在下でのＡ）正常ヒト血漿及びＢ）マウス血漿において測定した。トロンビン生成は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。
【図１５】図１５のＡ及び１５のＢは、ａＰＴＴを示す実験の結果を含有している。ｒｈＡＰＣ及び用量応答による血漿におけるａＰＴＴ凝固時間の長期化。ａＰＴＴは、増大する濃度のｒｈＡＰＣによる補充後のＡ）正常ヒト血漿及びＢ）ネズミ血漿において測定した（ｎ＝２〜５）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。
【図１６】図１６のＡ及び１６のＢは、ヒト血漿におけるトロンビン生成のＡＰＣ誘発性減少の救出を示す。トロンビン生成は、正常ヒト血漿においてＡ）曲線下面積（ＡＵＣ）及びＢ）ｒｈＡＰＣの存在下でのピーク高として測定した。トロンビン生成の救出のために、スーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａを単独または組み合わせのいずれかで適用した。
【図１７】図１７は、正常ヒト血漿に及ぼす抗ＦＶＩＩＩ抗体の効果を研究するために実施した血餅溶解アッセイの結果を含有している。抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、５μｇ／ｍｌを超える抗体がＴＡＦＩａ阻害因子（ＣＰＩ）対照のレベルへと血餅溶解時間を短縮するのに十分であることを示した。
【図１８】図１８のＡ及び１８のＢは、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度を使用して、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含む正常ヒト血漿の血餅溶解に及ぼすｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの効果を個々に及び組み合わせにおいて評価した血餅溶解アッセイの結果を含有している。当該図に示すように、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａは、それぞれ２μｇ／ｍｌ及び約２〜５μｇ／ｍｌのより高濃度で１０μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩ抗体とともにインキュベートした正常ヒト血漿における血餅溶解時間の延長を個々に示した。
【図１９】図１９のＡ及びＢは、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａを併用した血餅溶解アッセイの結果を含有している。当該図に示すように、血餅溶解時間は、２桁まで低下した濃度のｒｈＦＶＩＩａにおける正常血漿のレベルまで延長するのが観察され、スーパーＦＶａにおいては、１桁を超えて低下し、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含有する正常ヒト血漿（ＮＨＰ）の血餅溶解時間を矯正することに及ぼすｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの両方の相乗効果を実証した。
【図２０】図２０のＡ及び２０のＢは、リバロキサバンを用いて処理したＮＨＰにおけるスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの相乗効果を示す。トロンビン生成は、２００ｎＭのリバロキサバンの存在下でのＮＨＰにおけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。ｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）単独による、スーパーＦＶａ（４００ｎＭ）単独によるまたは固定した用量のｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）及び増加する用量のスーパーＦＶａ（６．２５〜４００ｎＭ）の組み合わせによるトロンビン生成の逆転に及ぼす効果を研究した。（Ａ）代表例。（Ｂ）３〜５回の独立した実験に由来する組み合わさった結果としてのＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。２μｇ／ｍＬのｒｈＦＶＩＩａは、９０μｇ／ｋｇの注入後の期待した血漿濃度に対応する。赤色の点はリバロキサバンの非存在下でのＮＨＰにおけるＥＴＰを表す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２１】図２１のＡ及び２１のＢは、アピキサバンで処置したＮＨＰにおけるスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの相乗効果を示す。トロンビン生成は、２００ｎＭのアピキサバンの存在下でのＮＨＰにおけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。ｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）単独による、スーパーＦＶａ（４００ｎＭ）単独による、または固定した用量のｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）及び増加する用量のスーパーＦＶａ（６．２５〜４００ｎＭ）の組み合わせによるトロンビン生成の逆転に及ぼす効果を研究した。（Ａ）代表例。（Ｂ）３〜５回の独立した実験からの組み合わせた結果としてのＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。２μｇ／ｍＬにおけるｒｈＦＶＩＩａは、９０μｇ／ｋｇの注入後の期待される血漿濃度に対応する。赤色の点は、アピキサバンの非存在下でのＮＨＰにおけるＥＴＰを表す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２２】図２２のＡ及び２２のＢは、リバロキサバンを用いて処理したＮＨＰにおけるスーパーＦＶａ及び増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）の相乗効果を示す。トロンビン生成は、２００ｎＭのリバロキサバンを補充した正常ヒト血漿におけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。増大する濃度（０．０８〜１．３５Ｕ／ｍＬ）におけるＫｃｅｎｔｒａ（商標）単独でのまたはスーパーＦＶａ（５０ｎＭ）との組み合わせにおけるトロンビン生成の逆転に及ぼす効果を研究した。（Ａ）５０ｎＭ濃度のスーパーＦＶａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）での増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）におけるＥＴＰの代表例。（Ｂ）スーパーＦＶａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）を用いて達成されるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。１．３５Ｕ／ｋｇのＫｃｅｎｔｒａ（商標）は、最高推奨用量（５０Ｕ／ｋｇ）の注入後の期待される血漿濃度に対応する。青色の点は、リバロキサバンの非存在下での正常ヒト血漿のＥＴＰを表す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２３】図２３のＡ及び２３のＢは、アピキサバンで処理したＮＨＰにおけるスーパーＦＶａ及び増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）の相乗効果を示す。トロンビン生成は、１００ｎｇ／ｍｌのアピキサバンを補充した正常ヒト血漿におけるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）として測定した。（Ａ）５０ｎＭ濃度のスーパーＦＶａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）での増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）におけるＥＴＰの代表例。（Ｂ）スーパーＦＶａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）を用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）。１．３５Ｕ／ｋｇのＫｃｅｎｔｒａ（商標）は、最高推奨用量（５０Ｕ／ｋｇ）の注入後の期待される血漿濃度に対応する。青色の点は、アピキサバンの非存在下での正常ヒト血漿のＥＴＰを表す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２４】図２４のＡ及び２４のＢは、リバロキサバンまたはアピキサバンを用いて処理したＮＨＰにおけるＫｃｅｎｔｒａ（商標）及び増大する濃度のスーパーＦＶａの相乗効果を示す。トロンビン生成は、（Ａ）２００ｎＭのリバロキサバン及び（Ｂ）２００ｎＭのアピキサバンの存在下での増大する濃度のスーパーＦＶａ（１．２５〜４００ｎＭ）と組み合わせたＫｃｅｎｔｒａ（１．３５Ｕ／ｍＬ）を補充したＮＨＰにおけるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）として測定した。１．３５Ｕ／ｋｇのＫｃｅｎｔｒａ（商標）は、最高推奨用量（５０Ｕ／ｋｇ）の注入後の期待される血漿濃度に対応する。青色の点は、リバロキサバンまたはアピキサバンの非存在下でのＮＨＰのＥＴＰを表す。黒色の点は、リバロキサバンまたはアピキサバンの存在下でのＫｃｅｎｔｒａ（１．３５Ｕ／ｍＬ）単独を含有するＮＨＰのＥＴＰを表す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２５】図２５のＡ、Ｂ及びＣは、スーパーＦＶａと組み合わせたｒｈＦＶＩＩａの注射後の出血矯正が、ＦＶＩＩＩによる出血矯正と類似していることを示す。ＦＶＩＩＩ欠損マウスに塩類溶液、ｒｈＦＶＩＩＩ、増加する用量のスーパーＦＶａ、ｒｈＦＶＩＩａ、またはスーパーＦＶａと組み合わせたｒｈＦＶＩＩａを静脈内注射した（１単位＝プロトロンビナーゼアッセイにおける２０ｎＭの野生型ＦＶａの活性）。出血は、尾部クリップ後２０分間測定し、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表した。誤差棒はＳＥＭを表す。Ａ）塩類溶液、ｒｈＦＶＩＩＩ及び増加する用量のスーパーＦＶａもしくはｒｈＦＶＩＩａ、Ｂ）低用量またはＣ）中程度の用量のスーパーＦＶａもしくはｒｈＦＶＩＩａを単独で及び組み合わせで注射したマウスにおける失血。
【図２６】図２６のＡ及び２６のＢは、ＮＨＰにおけるリバロキサバンの用量滴定を示す。増大する濃度のリバロキサバンを補充したＮＨＰにおけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。（Ａ）代表例。（Ｂ）増大する濃度のリバロキサバンを用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）の増大する抑制。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２７】図２７のＡ及び２７のＢは、ＮＨＰにおけるアピキサバンの用量滴定を示す。トロンビン生成は、増大する濃度のアピキサバンを補充したＮＨＰにおけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。（Ａ）代表例。（Ｂ）増大する濃度のアピキサバンを用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）の増大する抑制。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２８】図２８のＡ及び２８のＢは、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて刺激したＮＨＰにおける血餅安定化に及ぼすｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせにおけるスーパーＦＶａの相乗効果を示す。血餅溶解時間は、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて刺激したＮＨＰにおけるトロンビン誘発性フィブリン血餅形成後のｔ−ＰＡ仲介性線維素溶解によって測定した。（Ａ）増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａは、スーパーＦＶａ（０．３７ｎＭ）の非存在下（白色円）または存在下（白色正方形）で添加した。（Ｂ）増大する濃度のスーパーＦＶａをｒｈＦＶＩＩａ（０．３７ｎＭ）の非存在下（白色円）または存在下（白色正方形）で添加した。ＣＰＩの非存在下（白色の上向き三角形）または存在下（白色の下向き三角形）で阻害因子を含有しないＮＨＰの血餅溶解時間は、対照実験を表す。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。ジャガイモ塊茎由来のカルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＣＰＩ）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧３）。
【図２９】図２９のＡ及び２９のＢは、スーパーＦＶａ、ｒｈＦＶＩＩａ、ｍＦＶＩＩａ及びこれらの組み合わせの注射後の出血矯正を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＦＶＩＩＩに対する抗体を静脈内注射し（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、出血を尾部クリップ後２０分間測定し、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表した。（Ａ）失血は、塩類溶液、増加する用量のスーパーＦＶａもしくはｒｈＦＶＩＩａ及びｒｈＦＶＩＩａ及び低濃度のスーパーＦＶａの組み合わせの静脈内注射によって測定した。（Ｂ）失血は、増加する用量のｍＦＶＩＩａならびにｍＦＶＩＩａ及び低濃度のスーパーＦＶａの組み合わせの静脈内注射によって測定した。誤差棒はＳＥＭを表す。１単位＝プロトロンビナーゼアッセイにおける２０ｎＭの野生型ＦＶａの活性。ＮＳ（有意性なし）。
【図３０】図３０は、異なる濃度のｒｈＦＶＩＩａまたはｍＦＶＩＩａの注射後の出血矯正の比較を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＦＶＩＩＩに対する抗体を静脈内注射し（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、出血は、尾部クリップ後２０分間測定し、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表す。失血は、塩類溶液、増加する用量のｍＦＶＩＩａまたはｒｈＦＶＩＩａの静脈内注射後に測定した。誤差棒はＳＥＭを表す。
【図３１】図３１は、正常に対する平均血餅溶解時間を長期化させるｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａ単独または組み合わせにおける最小濃度を示す。（Ａ）抗体を含有しないＮＨＰの血餅溶解時間に対する抗ＦＶＩＩＩ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で刺激したＮＨＰにおける血餅溶解時間の長期化（±１０％）。それぞれ、正常ヒト血漿の平均血餅溶解時間は約１０５分であり（ｎ＝３、ＳＥＭ±６．４）、ｒｈＦＶＩＩＩを含有するＦＶＩＩＩ欠乏性血漿の平均血餅溶解時間は約９５分であった（ｎ＝３、ＳＥＭ±７．５）。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）。
【図３２】図３２は、ネズミ尾部クリップモデルにおけるスーパーＦＶａ及びＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）単独または組み合わせのいずれかによるリバロキサバン誘発性出血の矯正を示す。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにリバロキサバンまたは塩類溶液を静脈内注射した。スーパーＦＶａまたは／及びＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をリバロキサバン注射の３０分後に静脈内注射した。尾部クリップ後の出血を２０分間におけるマウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表す。
【図３３】図３３のＡ及びＢは、ネズミ尾部クリップモデルにおけるスーパーＦＶａまたはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によるアピキサバン誘発性出血の矯正を示す。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにアピキサバン（パネルＡにおける２０ｍｇ／ｋｇまたはパネルＢにおける８ｍｇ／ｋｇ）または塩類溶液を静脈内注射した。スーパーＦＶａまたはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をリバロキサバン注射の３０分後に静脈内注射した。尾部クリップ後の出血は、２０分間におけるマウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表す。
【図３４】図３４のＡ及びＢは、スーパーＦＶａを用いて外傷性出血をインビボで治療することができることを示す。Ａ）血友病ＡマウスをＡＰＣ活性を遮断するＡＰＣに対する抗体ＳＰＣ５４（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した（Ｂｕｒｎｉｅｒ  Ｌ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．抗体ＳＰＣ−５４は、ネズミプロテインＣ系の一過性のインビボでの遮断を提供する（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＳＰＣ−５４  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２０１３  Ａｐｒ；  ５０（４）：２５２〜８）。血友病ＡマウスにおけるＡＰＣ活性を遮断すると、出血が野生型Ｂａｌｂｃマウスにおいて観察されるレベルへと低下したのに対し、加熱で失活したＳＰＣ５４抗体は何ら効果がなかった。Ｂ）ＳＰＣ５４抗体による出血の低下は、スーパーＦＶａによって達成されるものまたはＦＶＩＩＩによる血友病Ａマウスの処置と同じであった。このことは、血友病における出血が、出血を仲介する内在性ＡＰＣの活性化を外傷及びショックが引き起こす急性外傷性凝固障害の別の例であることを示唆している。ＡＰＣの阻害は、遮断抗体ＳＰＣ５４またはＡＰＣ耐性スーパーＦＶａのいずれかによって出血を低下させる。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ分解に耐性のあるＦＶａの単独でのまたはＦＶＩＩａと併用した投与を含む、凝固性低下を治療もしくは予防しならびに／または出血を予防及び治療することを必要とする個体において凝固性低下を治療もしくは予防するならびに／または出血を予防及び治療するための新規の治療投与計画を提供し、好ましくは、ＦＶＩＩａはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））である。また、本発明は、血液凝固亢進の必要のある対象へ投与可能な医薬組成物を提供し、この中で、血液凝固亢進についてのこのような必要は、いずれかの出血性障害もしくは出血性容態、例えば遺伝的容態、例えば血友病、後天性出血性障害、月経困難症または損傷、外傷などの事象、もしくは手術の結果としての事象、または過剰の出血を結果として生じ得る侵襲的手順により生じ得る。好ましい実施形態において、本発明によって治療可能な出血性障害には、ＡＰＣ関連もしくはＡＰＣ誘発性もしくはＡＰＣ仲介性出血性障害、例えば、過剰のＡＰＣ産生（重症の損傷及び出血性ショックから結果的に生じるなど）または合成によるもしくは生物学的凝固薬の投与に起因する障害が含まれる。
【００４８】
さらに本発明は、例えばＡＰＣの過剰産生（重度の損傷及び出血性ショックから結果的に生じるなど）による、またはＡＰＣ療法中の、例えば、血小板減少症、播種性血管内凝固または敗血症などの炎症性障害の治療中のＡＰＣ関連、ＡＰＣ誘発性またはＡＰＣ仲介性出血を予防、治療または逆転させるためのスーパーＦＶａの単独でのまたはＦＶＩＩＩａとの組み合わせでの使用方法を提供する。
【００４９】
本発明をより良好に説明するために、以下の定義を提供する。
【００５０】
「対象」または「個体」によって含まれるのは、ヒトならびに、チンパンジーならびに他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含むがこれらに限定しない他の霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜、イヌ及び猫などの飼育哺乳類動物、マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯類を含む実験動物、ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジに似ている鳥類、アヒル、ガチョウ、ならびにこれらに類するものを含む鳥類を含むがそれらに限定しない、脊椎動物亜門のうちの任意のメンバーである。当該用語は、特定の齢を示していない。したがって、成体及び新生個体の両方が網羅されるよう企図されている。本明細書に説明する本発明は、先の脊椎動物種のうちのいずれかにおける使用に企図されている。しかしながら、ある好ましい実施形態において、当該対象または個体とは、ヒト、例えば、遺伝性または後天性出血性障害に罹患している対象、あるいは、損傷、外傷、月経困難症などの容態に罹患している、手術または出血を生じるもしくは望ましくない出血の危険性を高める他の侵襲的手順を受けている人である。
【００５１】
「外傷性出血」という用語（「外傷の結果としての出血」または「外傷に起因する出血」と互換可能に使用する）は、損傷に起因する出血を指す。外傷性出血を引き起こす損傷（または外傷）は、重症度において変わり得る。外傷性損傷の非限定例としては、擦過傷、血腫、打撲傷、裂傷、切開、穿刺創、圧挫傷及び銃創が挙げられる。外傷性出血には外失血及び内失血がある。内出血はしばしば、有意な身体損傷後に生じるが、あまり重症ではない損傷の後にまたは数時間もしくは数日ほど遅延した後に生じる可能性もある。内出血を生じることのできる外傷または損傷には２つの主要な種類、すなわち、及び鈍的外傷及び穿通性外傷がある。鈍的外傷は、身体部分が何か他のものと通常高速で衝突すると生じる。鈍的外傷の結果として、当該身体の内部にある血管は、剪断力及び／または鈍的物体によって引き裂かれまたは挫滅され得る。鈍的外傷の非限定例としては、自動車事故、身体的暴行、及び転倒が挙げられるが、これらに限定しない。穿通性外傷は、外来物体が身体を貫通して、１つ以上の血管に穴が開くと生じる。穿通性外傷の非限定例としては、銃創もしくは爆発創、刃傷、鋭利な物体への転倒が挙げられるが、これらに限定しない。ほぼいかなる器官または血管も外傷によって損傷を受け及び内出血を生じる可能性がある。外傷による内出血の最も深刻な源には、内出血を伴う頭部外傷（頭蓋内出血）、肺周辺の出血（血胸）、心臓周辺の出血（心膜血腫及び心タンポナーデ）、体中心近くの大きな血管（動脈、上大静脈及び下大静脈、ならびにこれらの主要な枝分かれ）における裂傷、及び肝臓もしくは脾臓の裂傷または他の軟質器官の穿孔など腹部に対する外傷が含まれるが、これらに限定しない。本出願の目的のために、外傷性出血は、動物モデル、すなわち外傷性尾部切除または肝裂傷へ供する野生型マウス（図１１及び図１３を参照されたい）あるいは外傷による迅速な出血が一部または全部においてＡＰＣ誘発性外傷性凝固障害によって仲介される、外傷性尾部切除へ供する血友病マウス（図３４を参照されたい）を用いてインビボで研究する。外傷性出血に罹患している患者は、本明細書に開示するように、治療を受けて当該患者の血液凝固を適切に支援し得る。
【００５２】
「患者」という用語は、本発明の治療投与計画によって予防または治療することのできる容態に罹患しているまたは当該容態に罹患しやすい生体を指し、ヒト及び動物の両方を含む。
【００５３】
「ａＰＣＣ濃縮物」という用語は、ＦＶＩＩ、プロトロンビン（ＦＩＩ）、ＦＩＸ及び／またはＦＸ（及びこれらの活性化形態）などの因子を含有する、ＦＥＩＢＡなどの活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）を指す。
【００５４】
「第Ｖａ因子」及び「ＦＶａ」という用語は、「第Ｖ因子」（または「ＦＶ」）、好ましくはヒトＦＶａの活性化形態を意味する。本明細書で使用する場合、ＦＶａ及びＦＶには、野生型ＦＶ配列（ＮＭ＿０００１３０．４、ＮＰ＿００１２１．２）及びＦＶのすべての公知の多型（第Ｖ因子の公知の多型を要約しているｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｌｏｃｕｓＩｄ＝２１５３を参照されたい）が含まれる。例えば、ＦＶには、位置Ａｓｐ２２２２、Ｇｌｕ２２１７、Ａｌａ２２１３、Ｉｌｅ２２０４、Ａｒｇ２２０２、Ｐｈｅ２２００、Ｉｌｅ２１９７、Ｌｙｓ２１８５、Ｇｌｕ２１７９、Ａｓｐ２１７５、Ｇｌｕ２１６３、Ｖａｌ２１６２、Ｔｈｒ２１５４、Ｌｙｓ２１５１、Ｍｅｔ２１４８、Ｔｈｒ２１３４、Ｔｈｒ２１３４、Ｌｅｕ２１２８、Ａｒｇ２１０８、Ｌｅｕ２１０３、Ｌｅｕ２１０３、Ｐｈｅ２０８７、Ｓｅｒ２０８６、Ｓｅｒ２０８５、Ｇｌｎ２０８１、Ｍｅｔ２０７２、Ｐｒｏ２０６９、Ｃｙｓ２０６６、Ａｒｇ２０５５、Ｇｌｕ２０２９、Ｔｈｒ２０２６、Ａｓｎ２０１０、Ｇｌｎ２００１、Ｈｉｓ１９８３、Ｇｌｎ１９７５、Ｉｌｅ１９７２、Ａｌａ１９５５、Ｓｅｒ１９４９、Ｓｅｒ１９４４、Ｇｌｙ１９３０、Ｌｙｓ１９２４、Ｐｒｏ１９１０、Ａｒｇ１９０８、Ｔｈｒ１８９８、Ｔｈｒ１８９８、Ａｌａ１８９４、Ｍｅｔ１８７４、Ｐｒｏ１８６３、Ｇｌｙ１８５３、Ｈｉｓ１８４５、Ｖａｌ１８４１、Ｇｌｙ１８３５、Ｇｌｙ１８３４、Ｉｌｅ１８３３、Ｌｅｕ１８３０、Ｍｅｔ１８２０、Ｌｅｕ１８１８、Ｐｒｏ１８１６、Ｔｙｒ１８１３、Ｍｅｔ１８１１、Ｈｉｓ１８０６、Ｔｈｒ１７９５、Ｔｒｐ１７９２、Ｓｅｒ１７９０、Ａｒｇ１７８９、Ｔｙｒ１７８３、Ｐｈｅ１７７６、Ｖａｌ１７７０、Ｍｅｔ１７６４、Ｍｅｔ１７６２、Ｉｌｅ１７５５、Ｌｙｓ１７５３、Ｌｅｕ１７４９、Ｉｌｅ１７４５、Ｌｅｕ１７４４、Ａｒｇ１７２６、Ｇｌｙ１７２２、Ｇｌｙ１７１７、Ｓｅｒ１７１６、Ｔｙｒ１７０８、Ｇｌｕ１６８７、Ｔｈｒ１６８５、Ｓｅｒ１６８０、Ｇｌｙ１６７４、Ｈｉｓ１６７３、Ｐｒｏ１６６７、Ｓｅｒ１６６５、Ａｌａ１６６４、Ａｒｇ１６５９、Ｌｅｕ１６４１、Ｌｅｕ１６２４、Ｖａｌ１６１８、Ｔｙｒ１６１５、Ｔｙｒ１６１５、Ａｓｐ１６１２、Ａｓｐ１６０５、Ｇｌｎ１５９８、Ａｓｎ１５７５、Ａｓｎ１５５９、Ａｒｈ１５５５、Ｖａｌ１５５４、Ａｓｐ１５４７、Ｔｙｒ１５４６、Ｖａｌ１５４４、Ｇｌｕ１５３０、Ｉｌｅ１５２３、Ａｓｐ１５２１、Ａｓｐ１５１８、Ｓｅｒ１５１６、Ｌｅｕ１５０３、Ａｓｎ１４９９、Ｇｌｎ１４７６、Ｓｅｒ１４６９、Ｐｒｏ１４６、Ｓｅｒ１４５５、Ｉｌｅ１４５４、Ｌｅｕ１４５１、Ｐｒｏ１４４９、Ｔｈｒ１４４５、Ｔｈｒ１４３７、Ｖａｌ１４３６、Ｇｌｎ１４３５、Ｓｅｒ１４３０、Ａｓｎ１４２３、Ｍｅｔ１４０９、Ａｓｐ１４０７、Ｐｒｏ１４０４、Ｌｅｙ１３９７、Ｓｅｒ１３７６、Ａｓｎ１３７４、Ａｓｐ１３６９、Ｔｈｒ１３６５、Ｐｒｏ１３６１、Ａｓｐ１３６０、Ｍｅｔ１３５５、Ｇｌｙ１３５３、Ｌｅｕ１３５２、Ａｓｎ１３３８、Ｐｈｅ１３３４、Ｌｅｕ１３３０、Ｈｉｓ１３２７、Ｐｒｏ１３２３、Ｉｌｅ１３２１、Ｇｌｎ１３１８、Ｇｌｙ１３１７、Ｌｅｕ１３１６、Ｌｅｕ１３０３、Ｐｈｅ１２８９、Ｌｅｕ１２８５、Ｔｈｒ１２８４、Ｈｉｓ１２８２、Ｐｒｏ１２７８、Ｌｅｕ１２７６、Ｌｅｕ１２７１、Ｓｅｒ１２６８、Ｌｅｕ１２６７、Ｓｅｒ１２５９、Ｌｅｕ１２５３、Ｌｅｕ１２４９、Ｔｈｒ１２４７、Ｈｉｓ１２４６、Ｐｒｏ１２４２、Ｓｅｒ１２３６、Ａｓｐ１２３４、Ｐｒｏ１２３０、Ｇｌｙ１２２７、Ｓｅｒ１２２３、Ｇｌｎ１２１９、Ｔｈｒ１２１１、Ｈｉｓ１２１０、Ｌｅｕ１２０８、Ｐｒｏ１２０６、Ｓｅｒ１２００、Ｔｈｒ１１９４、Ｐｒｏ１１８８、Ｖａｌ１１８５、ｔｒｐ１１８２、Ｈｉｓ１１７９、Ｓｅｒ１１７４、Ｔｈｒ１１６８、Ｓｅｒ１１６２、Ａｒｇ１１６１、Ａｓｐ１１６０、Ｔｙｒ１１５９、Ｍｅｔ１１５６、Ｇｌｕ１１５２、Ｓｅｒ１１４９、Ｓｅｒ１１４８、Ｈｉｓ１１１４、Ｐｒｏ１１３５、Ａｓｐ１１３４、Ｐｒｏ１１３１、Ｐｒｏ１１２２、Ｇｌｎ１１１０、Ｇｌｙ１１０９、Ｓｅｒ１１０４、Ｌｅｕ１０８６、Ｔｈｒ１０８５、Ａｓｐ１０８１、Ｔｈｒ１０８０、Ａｓｎ１０７４、Ｈｉｓ１０７１、Ｓｅｒ１０６７、Ｌｙｓ１０６５、Ｇｌｕ１０５４、Ｌｅｕ１０５１、Ｇｌｎ１０２４、Ｇｌｙ１０１６、Ａｓｐ１０１４、Ｇｌｎ１０１３、Ｌｙｓ１０００、Ａｌａ９８１、Ａｒｇ９８０、Ｐｒｏ９７５、Ａｓｎ９６９、Ａｌａ９６７、Ｔｈｒ９６６、Ａｓｐ９６１、Ｉｌｅ９５９、Ｔｙｒ９５６、Ｓｅｒ９５５、Ｓｅｒ９５１、Ｌｅｕ９４９、Ｇｌｙ９４５、Ｇｌｎ９３６、Ｌｙｓ９２５、Ｐｒｏ９１８、Ｔｈｒ９１５、Ｓｅｒ９１２、ｔｒｐ９０７、Ａｒｇ９０５、Ｍｅｔ９０４、Ｓｅｒ９０２、Ｐｒｏ９０１、Ｓｅｒ９００、Ｖａｌ８９０、Ｌｙｓ８７７、Ｌｙｓ８６９、Ｇｌｙ８６７、Ｈｉｓ８６５、Ｌｙｓ８５８、Ｐｈｅ８５７、Ｇｌｙ８５３、Ａｒｇ８４８、Ａｓｎ８２１、Ａｓｎ８１７、Ｇｌｙ８１５、Ｐｒｏ８０９、Ｇｌｎ８０２、Ｐｒｏ７９８、Ａｌａ７９７、Ｇｌｎ７９５、Ａｓｎ７８９、Ｓｅｒ７８１、Ｐｒｏ７８０、Ｓｅｒ７７９、Ｇｌｙ７７４、Ｉｌｅ７７２、Ｓｅｒ７６７、Ｐｈｅ７６４、Ｇｌｕ７６３、Ｇｌｙ７６１、Ｌｅｕ７５３、Ａｓｎ７４５、Ｓｅｒ７４２、Ａｓｎ７４１、Ａｒｇ７４０、Ｉｌｅ７３６、Ａｌａ７３２、Ｓｅｒ７２０、Ｇｌｕ７１９、Ｇｌｕ７１４、Ａｒｇ７１２、Ｈｉｓ７１０、Ａｒｇ７０７、Ｔｈｒ７０２、Ｐｈｅ６９６、Ｇｌｕ６９０、Ｐｒｏ６８６、Ｐｈｅ６７９、Ｌｙｓ６７８、Ｌｙｓ６７４、Ｓｅｒ６７２、Ｐｒｏ６７０、Ｓｅｒ６６９、Ｍｅｔ６６６、Ｔｈｒ６６４、Ａｓｐ６５６、Ｔｈｒ６５２、Ａｒｇ６４７、Ｔｈｒ６４２ｍ  Ｌｅｙ６４１、Ｔｈｒ６４０、Ｌｙｓ６３５、Ｇｌｙ６２８、Ｉｌｅ６２４、Ｔｈｒ６２３、Ｇｌｎ６１８、Ｖａｌ６０８、Ｇｌｕ５９５、Ｔｙｒ５９２、Ｇｌｙ５９１、Ｇｌｕ５７２、Ａｓｎ５５４、Ｇｌｕ５５３、Ｇｌｎ５４５、Ｌｅｕ５２２、Ａｒｇ５１３、Ｌｙｓ４８４、Ｔｙｒ４８１、Ｔｈｒ４６４、Ｓｅｒ４６１、Ａｓｎ４６０、Ｇｌｕ４５８、Ｔｙｒ４５５、Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４３４、Ｉｌｅ４３３、Ａｒｇ４２８、Ｌｙｓ４１４、Ｍｅｔ４１３、Ａｓｎ４１０、Ｖａｌ３９４、Ｌｙｓ３９２、Ｇｌｎ３８６、Ａｓｎ３８５、Ａｒｇ３７６、Ａｓｐ３７���、Ｍｅｔ３７１、Ａｌａ３６９、Ａｓｐ３６２、Ｉｌｅ３５４、Ｐｈｅ３５３、Ａｒｇ３４５、Ａｒｇ３４１ｍ  Ａｓｎ３３５、Ｌｙｓ３３２、Ｃｙｓ３２９、Ｉｌｅ３２４、Ｇｌｎ３２１、Ｐｒｏ３１３、Ｌｙｓ３０５、Ａｓｎ２９７、Ｔｈｒ２９５、Ｓｅｒ２９３、Ｌｕｅ２８８、Ｔｈｒ２８７、Ｇｌｕ２７７、Ｌｅｕ２７６、Ｖａｌ２７５、Ｇｌｎ２７４、Ａｓｎ２７２ｍ  Ｐｈｅ２６７、Ｓｅｒ２６２、Ｌｅｕ２５７、Ｈｉｓ２５０、Ｔｈｒ２４６、Ｐｒｏ２４３、Ｇｌｎ２１０、Ｔｈｒ２０６、Ｐｒｏ１８９、Ｇｌｙ１８８、Ｓｅｒ１８４、Ｇｌｕ１８０、Ｉｌｅ１７９、Ｈｉｓ１７５、Ｈｉｓ１７０、Ｐｒｏ１６６、Ｇｌｕ１５１、Ａｒｇ１４６、Ｖａｌ１４２、Ａｌａ１４１、Ｍｅｔ１３８、Ａｌａ１３５、Ｐｈｅ１３３、Ｓｅｒ１２３、Ｇｌｎ１１５、Ｌｅｕ１１０、Ｐｒｏ１０９、Ａｓｐ１０７、Ｉｌｅ９７、Ａｓｐ９６、Ｇｌｙ９５、Ｖａｌ９４、Ｔｙｒ９１、Ｌｅｕ８５、Ｉｌｅ８２、Ｇｌｎ７９、Ｔｙｒ６９、Ａｒｇ４６、Ａｌａ３８、Ａｌａ３７、Ｖａｌ３６、Ａｌａ２８、Ｇｌｙ１５、Ｇｌｙ４（ＮＰ＿０００１２１．２の野生型配列に対する）におけるアミノ酸を変化させる一塩基多型（ＳＮＰ）のうちの１つ以上を含むことができる。本発明の好ましい実施形態において、ＦＶａは、スーパーＦＶａまたは本明細書に開示する他のバリアントなどのＡＰＣ耐性を当該ＦＶａに与える突然変異を含む。また、本発明の好ましい実施形態において、ＦＶａは、当該タンパク質の他の特性の物理的安定性を改良する化学的修飾（例えば、ペグ化）を含み得る。本出願の目的のために、「第Ｖ因子」及び「第Ｖａ因子」には当該因子の野生型、血漿由来形態、ライデン型及びケンブリッジ型のＦＶならびにＦＶａの形態が含まれることは理解されるべきである。
【００５５】
本明細書の「スーパーＦＶａ」という用語は、血中での高い特性、例えば高い共因子安定性、高い比活性及び／または長い半減期を有するよう修飾したＦＶａ分子もしくはこのフラグメントまたはそれらのバリアントを指す。ＦＶａ共因子安定性を高める修飾の非限定例としては、ジスルフィド対を形成して分子を安定化させるシステイン残基の導入、ＦＶＩＩＩａについて近年実証されたように（第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインの非共有結合性安定化は血友病Ａマウス血管損傷モデルにおける効能を高める（Ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ａ２  ｄｏｍａｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｄｅｌｓ）．Ｌｉｌｌｅｙ  Ｌｅｏｎｇ，Ｄｅｒｅｋ  Ｓｉｍ，Ｃｈａｎｄｒａ  Ｐａｔｅｌ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｔｒａｎ，Ｐｅｒｒｙ  Ｌｉｕ，Ｅｌｅｎａ  Ｈｏ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｈｉｒｏｎａｏ  Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．Ｆａｙ，及びＪｏｈｎ  Ｅ．Ｍｕｒｐｈｙ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１４（印刷中）（ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０２−５５５６５６））を参照されたい）、引き付ける静電気的相互作用を導入し、対向する静電気的相互作用を除去し、及び／または疎水性相互作用を導入するＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、及び／またはＣ２ドメインの界面における突然変異が挙げられるが、それらに限定しない。ＦＶａの比活性を高める修飾の例としては、ジスルフィド対または突然変異を形成するシステイン残基の導入、及びＡ２−Ａ３界面の突然変異、ａ１ドメインを含むＦＸへの高い親和性結合を提供することが公知のＦＶＩＩＩの配列の導入など、ＦＸａに対するＦＶａの親和性を高める変化を形成するが挙げられるが、これらに限定しない。循環中のＦＶａの半減期を延長する修飾の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーもしくはマルチマー、Ｆｃ受容体融合ドメイン、アルブミン融合、または循環中の半減期を長期化し得るもしくはクリアランス機序を低下させ得る他の公知の構造など合成によるまたは化学的な修飾の部位特異的組み込みの導入が挙げられるが、これに限定しない。
【００５６】
特定の実施形態において、スーパーＦＶａは、本明細書に開示する特異的な突然変異など、ＡＰＣの不活性化に対する耐性、好ましくは高度のＡＰＣ耐性を当該タンパク質に与える突然変異の組み合わせを含む。好ましくは、スーパーＦＶａは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む。この配列は、成熟ＦＶａタンパク質（プレプロ配列を有さない）を含む。明らかになるために、このタンパク質は、野生型ヒトＦＶに対する以下の変化を有する。すなわち、８１２〜１４９１の配列は欠失している（Ｂドメインから）。元の全長のＦＶ配列付番を基にしたこの欠失以外の変化すべてについて、スーパーＦＶａは好ましくは、以下の突然変異、すなわちＲ３０６Ｑ、Ｒ５０６Ｑ、Ｒ６７９Ｑ、Ｈ６０９Ｃ、Ｅ１６９１Ｃ（１０１１）、Ｓ２１８３１Ａ（１５０３）を含む。
【００５７】
【化１−１】
2017500372.tif 000003
【００５８】
【化１−２】
2017500372.tif 000004
【００５９】
より好ましくは、スーパーＦＶａは、下記の配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。この配列は、成熟ＦＶａタンパク質（プレプロ配列を有さない）を含む。明らかになるために、このタンパク質は、野生型（ｗｔ）ヒトＦＶ（ＮＭ＿０００１３０．４、ＮＰ＿０００１２１．２）に対する以下の変化を有する。すなわち、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ５０６Ｑ、Ｈ６０９Ｃ、Ｒ６７９Ｑ、位置８１０〜１４８９におけるアミノ酸の欠失、Ｇ１４９１Ｐ、Ｅ１６９１Ｃ、Ｍ１７３６Ｖ、Ｓ２１８３Ａであり、複数のシステイン残基は、位置６０９及び１６９１で導入され、このことは分子内ドメイン間ジスルフィド架橋の形成を可能にする。元の全長のＦＶ配列付番（アミノ酸位置８１０〜１４８９は欠失している）を基にしたこの欠失以外の変化すべてについて、スーパーＦＶａは好ましくは、以下の突然変異、すなわちＲ３０６Ｑ、Ｒ５０６Ｑ、Ｈ６０９Ｃ、Ｒ６７９Ｑ、Ｇ１４９１Ｐ、Ｅ１６９１Ｃ、Ｍ１７３６Ｖ、及びＳ２１８３Ａを含む。
【００６０】
【化２−１】
2017500372.tif 000005
【００６１】
【化２−２】
2017500372.tif 000006
【００６２】
「第ＶＩＩａ因子」または「ＦＶＩＩａ」という用語は、第ＶＩＩ因子の活性化した形態を意味する。これには特に、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と呼ばれるＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋによって販売されているＦＶＩＩａ製品が含まれる。加えて、ＦＶＩＩａには、例えば、突然変異のため、及び／またはＰＥＧもしくはアシル基など半減期の改良された実体の付加もしくは結合の結果として、野生型と比較してより長い半減期または高い活性を有する組換えＦＶＩＩａの他のバリアントが含まれる。それゆえ、本明細書で使用する場合、ＦＶＩＩａには、野生型ＦＶＩＩａならびに、高い活性または安定性を有するこの配列のバリアント、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端及び／または内部の欠失、部位突然変異を含む、ならびに／あるいは１つ以上の安定化基または他の官能基を含む、切り詰められた形態についての配列が含まれる。ヒトＦＶＩＩａポリペプチドの配列は以下に示す。
【００６３】
【化３】
2017500372.tif 000007
【００６４】
ヒトプロＦＶＩＩポリペプチド（プレプロタンパク質（ヒト）である凝固因子ＶＩＩアイソフォームＮＰ＿０００１２２．１に対応）の配列は以下に示す。
【００６５】
【化４】
2017500372.tif 000008
【００６６】
「第ＩＸａ因子」または「ＦＩＸａ」という用語は、「第ＩＸ因子」の活性化された形態を意味する。これには、活性化のためにＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａに対する機能的依存性の低下したＦＩＸａ及びＦＩＸの変異体及びバリアントが含まれる。例えば、Ｙ２５９Ｆ、Ｋ２６５Ｔ、Ｙ３４５Ｔ、Ｖ１８１Ｉ、Ｒ３３８Ａ及び／またはＩ３８３Ｖにおける突然変異を有するＦＩＸである。Ｃｈａｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１２０８９〜９４（１９９８）、Ｍｉｌａｎｏｖら，Ｂｌｏｏｄ  １１９（２）：６０２〜６１１（２０１２）、Ｑｕａｄｅ−Ｌｙｓｓｙら，Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｎｄｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｓ１：０１３（２０１２）を参照されたく、それらの開示は参照により本明細書に明白に組み込まれる。それゆえ、本明細書で使用する場合、ＦＩＸａには、野生型ＦＩＸａについての配列ならびに活性または安定性の亢進したこの配列の突然変異体及びバリアント、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端及び／または内部の欠失、部位突然変異を含む、ならびに／あるいは１つ以上の安定化基または他の官能基を含む切り詰められた形態、例えば、糖バリアントが含まれる（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１１（９)：１６９９〜１７０６（２０１３）を参照されたい）。
【００６７】
「第Ｘａ因子」または「ＦＸａ」という用語は、「第Ｘ因子」の活性化された形態を意味する。これには、ＦＸａ及びＦＸの突然変異体及びバリアントが含まれる。例えば、位置１６、１７及び／または１８（キモトリプシン付番による）突然変異を有するＦＸ及びＦＸａである。またＦＸａが包含するのは、野生型ＦＸａよりも半減期は長いが、凝固に関する過剰な活性化は生じないＦＸａＩ１６Ｌである。例えば、Ｉｖａｎｃｉｕら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２９：１０２８〜１０３３（２０１１）を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。それゆえ、本明細書で使用する場合、ＦＸａには、野生型ＦＸａについての配列ならびに活性または安定性または特異性の亢進したこの配列の突然変異体及びバリアント、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端及び／または内部の欠失、部位突然変異を含む、ならびに／あるいは１つ以上の安定化基または他の官能基を含む切り詰められた形態が含まれる。
【００６８】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａ、好ましくはスーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を用いた「治療有効周期の治療」という用語は、投与すると、例えば、手術、損傷の結果として、またはＡＰＣの過剰発現または療法中のＡＰＣの投与に起因する、出血性障害に罹患しているまたは出血性障害もしくは出血性容態を発症する危険にある個体の治療に関して陽性の治療応答をもたらす治療の周期として企図される。好ましくは、当該治療は、トロンビン生成に影響することまたはＡＰＣもしくは他の抗凝固薬の抗凝固性効果を逆転させることによって、凝血または凝固またはＡＰＣ関連出血に及ぼす相乗効果を誘発する。
【００６９】
「陽性の治療応答」とは、本発明による治療を受けている個体が出血性障害の１つ以上の症状における改良を呈するものであり、凝血時間の短縮及び出血の減少及び／または因子置き換え療法についての必要性の低下のような改良を含む。好ましくは、当該投与は、例えば、後に論議するような及び作業実施例に示すようなＡＰＣ投与の結果として、トロンビン生成を促進することまたはトロンビン生成の除去を予防することによって凝血または凝固に及ぼす効果、より好ましくは相乗効果を誘発する。
【００７０】
「凝血原」は、血餅形成を開始または加速させることのできる任意の因子または試薬を指す。凝血原には、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、組織因子、ＦＶＩＩａ、及びトロンビン、ならびにＦＶＩＩＩａ、ＦＸＩＩＩａ、及びトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）、活性化型ＴＡＦＩ（ＴＡＦＩａ）、ならびに第ＶＩＩ因子、ＦＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸ（及びこれらの活性化形態）を含み得るＦＥＩＢＡなどの活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）からなる群から選択される凝血因子などの内在性または外来性凝固経路の任意の活性化因子が含まれる。凝血を促進する他の試薬には、プレカリクレイン、ポリホスファート、ａＰＴＴ開始因子（すなわち、リン脂質及び接触活性化因子を含有する試薬）、ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ時間）、トラネキサム酸またはε−アミノカプロン酸などの抗線維素溶解薬、及びトロンボプラスチン（ＰＴ及びｄＰＴ用）が含まれる。凝血原試薬として本発明の方法において使用することのできる接触活性化因子には、微粒子化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、カオリンまたはこれらに類する当業者に公知のものが含まれる。凝血原は、粗天然抽出物、血液試料または血漿試料、分離及び実質的に精製された、合成の、または組換えのものに由来し得る。凝血原には、天然の凝血因子または生物学的活性を保有する（すなわち、凝血を促進する）そのフラグメント、バリアント、類似体または変異タンパク質が含まれ得る。
【００７１】
「バリアント」、「類似体」及び「変異タンパク質」という用語は、本明細書に説明する出血性障害の治療における凝血活性などの所望の活性を保有する基準分子の生物学的に活性のある誘導体を指す。本発明において、ＦＶａのバリアントは、結果として生じるバリアントまたは変異タンパク質のＡＰＣ分解を阻害する１つ以上の天然のまたは遺伝的に操作された突然変異を含有する。概して、天然分子に対する１つ以上のアミノ酸の付加、置換（概して天然に保存的）及び／または欠失によって天然のポリペプチド配列及び構造とは異なるポリペプチド（例えば、ＦＶａポリペプチドまたはＦＶＩＩａポリペプチド）に関する「バリアント」及び「類似体」という用語は、当該修飾が生物学的活性を破壊しない限り、先に定義したように基準分子に対して「実質的に相同的」である。概して、このようなバリアントまたは類似体のアミノ酸配列は、基準配列に対する高度の配列相同性、例えば、２つの配列を整列させると、少なくとも９０％〜９５％以上など、５０％超、概して６０％〜７０％超、さらにより特別には８０％〜８５％以上のアミノ酸配列相同性を有する。しばしば、類似体は、同数のアミノ酸を含むが、本明細書に説明するような置換を含む。追加的に、例えば、ＦＶａ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、及びＦＸのバリアントは、同じアミノ酸配列を含有する生物学的に活性のある誘導体を含むが、バリアントの生物学的活性に影響することなく、当該バリアントの物理的特性を改良する化学的修飾、例えば、共有結合性修飾、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合）、ＨＥＳ化（ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の結合）、ＸＴＥＮ化（ＸＴＥＮ（あるポリペプチド）の結合）、ＨＳＡ化（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）、ＰＡＳ化（小さな残基であるＰｒｏ、Ａｌａ及びＳｅｒ（ＰＡＳ）を含む拡大した水力学的体積を有するポリペプチド鎖の結合）、グルタミン酸化（ポリグルタミン酸の結合）などを含む。
【００７２】
「変異タンパク質」という用語はさらに、アミノ分子及び／またはイミノ分子のみを含む化合物、アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、置換した結合及び当該技術分野で公知の他の修飾を有するポリペプチド、天然及び非天然（例えば合成）の両方の、環化した、分枝鎖分子ならびにこれらに類するものを含むがこれらに限定しない１つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチドを含む。当該用語はまた、１つ以上のＮ置換したグリシン残基（「ペプトイド」）及び他の合成アミノ酸または合成ペプチドを含む分子を含む（例えば、ペプトイドに関する説明については、米国特許第５，８３１，００５号、第５，８７７，２７８号、及び第５，９７７，３０１号、Ｎｇｕｙｅｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３〜４７３、ならびにＳｉｍｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７〜９３７１を参照されたい）。好ましくは、当該類似体または変異タンパク質は、ある活性に対する別の活性について、例えば、天然分子に対する凝血活性について少なくとも同じまたは高いまたは低い活性または選択性を有する。ポリペプチド類似体及び変異タンパク質の作製方法は、当該技術分野において公知であり、下記にさらに説明する。
【００７３】
先に説明したように、類似体には、天然で保存的な置換、すなわち、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換も含まれる。具体的には、アミノ酸は概して、４つのファミリー、すなわち（１）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非帯電性極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンへと分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは時には、芳香族アミノ酸と分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの、アスパラギン酸のグルタミン酸との、トレオニンのセリンとの分離された置き換え、あるいはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の保存的置き換えが生物学的活性に及ぼす主要な効果を有さないことはかなり予測可能である。例えば、関心対象のポリペプチドには、当該分枝の所望の機能が未処置のままである限り、約５〜１０の保存的または非保存的アミノ酸置換、あるいは最多約１５〜２５の保存的または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数が含まれ得る。当業者は、当該技術分野で周知のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓプロット及びＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットに対する参照によって変化に耐えることのできる関心対象の分子の複数の領域を容易に判断し得る。
【００７４】
「断片」が企図するのは、未処置の全長の配列及び構造の一部のみからなる分子である。ポリペプチドの断片には、天然のポリペプチドのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、及び／または内部の欠失を含むことができる。特定のタンパク質の活性のある断片には概して、全長の分子の少なくとも約５〜１０の連続したアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続したアミノ酸残基、及び最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０もしくはそれより多くの連続したアミノ酸残基、または５つのアミノ酸と全長配列の間の任意の整数を含むが、但し、問題の断片が、本明細書に定義するような凝血活性などの生物学的活性を保有していることを条件とする。
【００７５】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドのまたは２つのポリペプチド部分の間の％同一性を指す。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、当該配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を当該分枝の規定した長さにわたって呈する場合に、互いに「実質的に相同的」である。本明細書で使用する場合、実質的に相同的は、指定した配列に対する完全な同一性を示す配列も指す。
【００７６】
概して、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの実際のヌクレオチド対ヌクレオチドのまたはアミノ酸対アミノ酸の対応性を指す。％同一性は、２つの分子間の配列を整列させること、当該２つの整列した配列（基準配列及び基準配列に対する未知の％同一性を有する配列）間の一致に関する実際の数を計数すること、基準配列の長さによって除すること、及びその結果に１００を乗じることによる当該配列の情報の直接的な比較によって判定することができる。ＡＬＩＧＮなどの容易に利用可能なコンピュータプログラムは、分析において支援するために使用することができる（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，タンパク質配列及び構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５（付録３）：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ワシントンＤ．Ｃ．、ペプチド分析についてはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ,Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを適合させる））。ヌクレオチド配列同一性を判定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ第８版（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マディソン市）において入手可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰのプログラムであり、これらはまたＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依拠する。これらのプログラムは、製造元によって推奨されかつ先に参照したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに説明される既定パラメータを用いて容易に利用される。例えば、基準配列に対する特定のヌクレオチド配列の％同一性は、６つのヌクレオチド位置の既定スコア化表及びギャップを用いたＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて判定することができる。
【００７７】
本発明の脈絡において％同一性を確立する別の方法は、エジンバラ大学によって著作権を取得され、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ社（カリフォルニア州マウンテンビュー市）によって分配されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この日と揃えのパッケージから、既定パラメータをスコア化表に使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用することができる（例えば、１２のギャップ開放罰則、１のギャップ伸長罰則、及び６のギャップ）。生じたデータから、「合致」値は「配列同一性」を反映する。配列間の％同一性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは概して、当該技術分野に公知であり、例えば、別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、既定パラメータを用いて使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下の既定パラメータ、すなわち遺伝暗号＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ値＝６０、期待値＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０配列、選択＝高スコア、データベース＝非冗長的、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用することができる。これらのプログラムの詳細は容易に入手可能である。
【００７８】
核酸分子を説明するために本明細書で使用する「組換え」は、その起源または操作の性質によって自然に結合するポリヌクレオチドの全部または一部と結合していないゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス性起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。
【００７９】
本発明における出血を治療または予防するのに使用する方法及び組成物はさらに、ＦＶａ単独またはＦＶＩＩａとの組み合わせに加えて、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ、ＦＶＩＩａ、及びフォンウィルブランド因子、などの１つ以上の他の因子または凝血因子、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）、抗線溶薬（例えば、アミカル、トラネキサム酸、εアミノカプロン酸、アプロチニン、及びこれらに類するもの）の投与を含み得、これらは、時には出血を予防するために血友病及び他の出血性障害において使用される（例えば、抜歯中に使用されるなど）。
【００８０】
後に開示する血餅溶解データは、ＦＶＩＩａとスーパーＦＶａの間の相乗性がトロンビン生成における欠陥により血友病において損失されている線維素溶解に対する血餅の耐性を回復させることを実証している。ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａ相乗性は、身体の天然の抗線溶因子のうちの１つであるトロンビン活性化線溶阻害因子（「ＴＡＦＩ」）の活性化を回復させる。したがって、（１）血餅の耐性を回復させまたは血餅溶解時間を延長することは、トロンビン生成に加えてＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａ相乗性の機能的効果の別の手段であり、（２）血餅の耐性を回復させまたは血餅溶解時間を延長することは、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性が出血をなぜ低下させるのかに関する機序の統合した部分であり、ならびに（３）後者により、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性を抗線溶因子またはＴＡＦＩと組み合わせて、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性による出血の低下に及ぼす効果を増幅させることは有利であり得る。
【００８１】
凝血因子、例えば、ＦＶａ、好ましくはスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａ、好ましくはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の用量は、組み合わせにおいて、出血を治療または予防しかつ凝固を高めるのに有効な量である。好ましくは、これらの２つのポリペプチドの相対的な薬用量は、トロンビンの生成を促進することによって凝血または凝固に及ぼす相乗効果を誘発する。
【００８２】
本明細書における「相乗的有効量」は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ分解に対して非常に耐性のあるスーパーＦＶａの相対量、及び組み合わせにおいて有益な効果または相乗効果を誘発する、すなわち、トロンビンの生成を相乗的に促進することによってこれらの部分単独のうちのいずれかの相加効果よりも大きなＦＶＩＩａ、好ましくはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の量を指す。本発明において、相乗性は、ＥＴＰの増加、例えば少なくとも０．５倍の増大、より好ましくは少なくとも１倍の増大、さらにより好ましくは追加の約１．５ないし２〜２，５倍または３．０倍のＥＴＰの増加、及び標準化した血餅溶解時間を考慮するとともにこれらの部分によって生じた増大に対するピーク高の約２〜３倍の増大を基にしたＦＶＩＩＩ阻害性抗体を含有するまたは欠失する正常ヒト血漿において実証されている。また、本明細書における「相乗的有効量」は、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ分解に対して非常に耐性のあるスーパーＦＶａの相対量、及び身体の天然抗線溶薬のうちの１つであるトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化を亢進または回復させるのに十分なＦＶＩＩａの量を指す。したがって、本明細書における相乗性は同様に、トロンビン生成を相乗的に誘発すること、血餅の耐性を回復させること、血餅溶解時間を延長することを含み得またはそれに代わるものとしてこれらを指す（このことは、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性がなぜ血友病における出血を低下させるのか、及びＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａを抗線溶薬またはＴＡＦＩと組み合わせてＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性による出血の低下に及ぼす効果を増幅させることがなぜ有利であり得るのかに関する機序の１つの統合した部分である）。ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａ相乗性は、身体の天然の抗線溶薬のうちの１つであるトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化を回復させる。したがって、血餅の耐性を回復させることまたは血餅溶解時間を延長することは、トロンビン生成に加えてＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性の機能的な効果に関する手段である。
【００８３】
後に示す実験結果を基に、血餅の耐性を回復させることまたは血餅溶解時間を延長することは、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性が血友病における出血を低下させる理由及びそれに基づいて、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａの相乗性を抗線溶薬またはＴＡＦＩと組み合わせることが、ＦＶＩＩａ／スーパーＦＶａ相乗性による出血の低下に及ぼす相乗効果をさらに増幅させ得る理由であると考えられている。
【００８４】
この理解を用いて、本出願は概して、好ましくは相乗効果量のＦＶａ、好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａ、すなわち好ましくは本明細書に説明するスーパーＦＶａなどのＡＰＣ耐性ＦＶａ及びＦＶＩＩａ、好ましくはｒｈＦＶＩＩａ（例えばＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））あるいは組換えＦＶＩＩａの別のバリアント、好ましくは改良された半減期もしくは亢進した活性を呈するもの、または別の凝血原もしくは止血支持薬の投与を含む治療投与計画による、出血及び／または凝固性低下を予防または治療する必要のある個体における出血及び／または凝固性低下の予防方法または治療方法、ならびにこのような方法における使用のための組成物に関し、この中で、当該組み合わせは、トロンビン生成を必要とする対象へ単独で投与する場合にＦＶａもしくはＦＶＩＩａまたは他の凝血原もしくは止血支持薬に対するトロンビン生成に及ぼす相乗効果を誘発する。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「凝固性低下」という用語は、１つ以上の凝固因子の遺伝的または後天性欠乏症及び／または個体の血漿が１つ以上の標準的な凝固性検査における異常な凝血特性を明らかにする容態を指す。特に、凝固性低下は、血餅を形成する能力の変化の結果として過剰なまたは長い出血を結果として生じ得る凝血の低下または欠乏を指す。
【００８６】
また、本発明は、例えば過剰量のＡＰＣ生成または抗凝固薬もしくはＡＰＣ投与による出血を治療または予防するための、ＦＶａ、好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａの単独またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などのＦＶＩＩａ、またはその別のバリアントとの組み合わせでの使用に関する。本明細書で使用する場合、本発明者らは、本発明のＦＶａが単独でまたはＦＶＩＩＩａとの組み合わせでトロンビン生成のＡＰＣ誘発性低下を阻害または逆転させ、それに基づいて、過剰量のＡＰＣ生成（重度の損傷及び出血性ショックから結果的に生じるなど）またはＡＰＣもしくは他の凝固薬の投与に起因する出血に罹患している対象を治療しあるいは当該出血を予防するために使用され得ることを実証した。
【００８７】
本発明の方法及び組成物は特に、対象、例えば、ヘパリン、ワーファリンもしくはジクマロールなどのクマリン誘導体、ＴＦＰＩ、ＡＴ  ＩＩＩ、ＡＰＣ、狼瘡抗凝固薬、線虫抗凝固薬ペプチド（ＮＡＰｃ２）、ＦＶＩＩａ阻害因子、活性部位遮断型ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）、活性部位遮断型ＦＩＸａ（ＦＩＸａｉ）、ＦＩＸａ阻害因子、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、エノキサパリン、及びラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含むＦＸａ阻害因子、活性部位遮断型ＦＸａ（ＦＸａｉ）、ＡＰＣ及び誘導体を含むＦＶａもしくはＦＶＩＩＩａの阻害因子、可溶性トロンボモジュリン、ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、もしくはキシメラガトランを含むトロンビン阻害因子を含むがこれらに限定しない抗凝固薬を用いて治療した対象における抗凝固薬の効果を逆転させるために使用され得る。ある実施形態において、対象における抗凝固薬は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、フォンウィルブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）へ結合する抗体または抗体フラグメントを含むがこれらに限定しない凝血因子を結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。抗体または抗体フラグメントに対する代替例として、抗凝固薬は、凝固タンパク質へ結合し、それによりその活性化または別の凝固タンパク質もしくは細胞表面との相互作用を阻害する小分子薬様分子であり得る。
【００８８】
追加的に、特定の態様において、本発明の方法及び組成物は、血液凝固因子（ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、プロトロンビン、トロンボモジュリン、プロテインＣ及びプロテインＳ、アンチトロンビン、ホモシステイン、またはリポタンパク質（ａ）など）が非存在であり、正常レベルよりも低く存在し、または多型の遺伝的突然変異による機能障害を伴って正常レベルで存在する遺伝的凝固障害に罹患している個体を治療するために使用され得る。特に、治療される対象は、例えば、血液凝固因子の合成低下、シャペロンタンパク質（類）の突然変異、異常な翻訳後プロセシング、タンパク質溶解性分解、高いクリアランス、血液凝固因子に対する抗体または血液凝固因子の活性化障害に起因する後天性または遺伝的凝固障害に罹患し得る。ある態様において、後天性または遺伝的凝固障害または出血障害において影響されている血液凝固因子は、ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはＦＸである。他のある態様において、後天性または遺伝的出血障害は、可溶性トロンボモジュリン及びその断片の高いレベルと関係する遺伝的突然変異から生じる。例えば、トロンボモジュリンにおけるＣｙｓ５３７終止突然変異は、プロテインＣの正常な活性化よりも高く仲介する可溶性トロンボモジュリンの高いレベルを結果として生じ、したがって、ＡＰＣ仲介性出血を結果として生じる（Ｌａｎｇｄｏｗｎら，Ｂｌｏｏｄ  ２０１４  １２４（１２）：１９５１〜６（２０１４）を参照されたく、その開示は本明細書において参照により明白に組み込まれる）。
【００８９】
また、本発明の方法は、ＦＶＩＩＩが欠失している対象を治療するために使用され得、当該方法はさらに、ＦＶＩＩＩまたは凝血原迂回薬を投与することをさらに含み得る。適切なＦＶＩＩＩ製剤はすべて、市販の血漿由来ＦＶＩＩＩ製剤及び組換えＦＶＩＩＩ製剤である。適切な迂回薬は、ＦＥＩＢＡ  ＶＨ  Ｉｍｍｕｎｏ（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，オーストリア国ウイーン市）またはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国）または別のＦＶＩＩａバリアントもしくは変異タンパク質など、活性化プロトロンビン複合体濃縮物である。当該患者は、ＦＶＩＩＩに対する阻害性抗体も有し得る。典型的には、阻害性患者は、ＦＥＩＢＡまたはｒｈＦＶＩＩａなど、迂回薬を用いて治療する。このような阻害性患者は、５ＢＵを超える高い力価応答または０．５ＢＵと５ＢＵの間の低い力価応答のいずれかを有し得る。臨床目的のため、抗体応答の程度は、ベセスダ単位（ＢＵ）の阻害因子力価を得ることのできる機能的阻害因子アッセイの実施を通じて定量化することができる。高い力価応答に関する国際血栓止血学会（ＩＳＴＨ）の定義は５ＢＵを超えており、低い力価応答に関するＩＳＴＨの定義は０．５ＢＵと５ＢＵの間である。ＦＶＩＩＩに対する抗体応答の程度は、Ｋａｓｐｅｒ  Ｃ  Ｋら（１９７５）予稿集：ＦＶＩＩＩ阻害因子のより均一な手段（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：Ａ  ｍｏｒｅ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）．ＴＨＲＯＭＢ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４（２）：６１２において説明されているものなど、機能的阻害因子アッセイを用いて定量化することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、治療した対象は、ＦＩＸが欠失し得、当該方法はさらに、ＦＩＸを投与することを含み得る。すべての市販の組換えＦＩＸ製剤及び血漿由来ＦＩＸ製剤は適し得、ＦＩＸがＢｅｂｕｌｉｎ  ＶＨ（登録商標）ＦＩＸ複合体（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，オーストラリア国ウイーン市）であることを含む。本発明の本実施形態において、患者は、ＦＩＸに対する阻害性抗体を有し得、ＦＩＸ阻害因子は、Ｋａｓｐｅｒ（上述）によって説明されたようなａＰＴＴアッセイによって定量化され得る。適宜、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））及び／またはＦＥＩＢＡもＦＩＸ欠乏性対象へ投与される。
【００９１】
本発明において使用するＦＶａ及びＦＶＩＩａ組成物は、好ましくは、臨床用途に適した形態においてこれらの因子を製剤化すること及び／または貯蔵安定性を維持することにおいて適するように当該技術分野で公知の１つ以上の賦形剤を含有する。例えば、本発明における使用のためのＦＶａ（好ましくはＡＰＣ耐性ＦＶａ）及び／またはＦＶＩＩａ（好ましくはｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）））含有組成物は、「レミントン：医薬の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」，第１９版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、「医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」，第５２版，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）、及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，医薬賦形剤のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ），第３版，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ワシントンＤ．Ｃ．，２０００において説明されるなど１つ以上の医薬として許容されるものを含む。例示的な賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌薬、抗酸化物質、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定しない。注射液組成物に適した賦形剤には、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、及び界面活性剤が含まれる。糖などの炭水化物、アルジトールなどの誘導体化した糖、アルドン酸、エステル化した糖、及び／または糖ポリマーは、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース、及びこれらに類するものなどの単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、及びこれらに類するものなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、及びこれらに類するものなどの多糖類、ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、及びこれらに類するものなどのアルジトールが挙げられる。賦形剤には、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせなどの無機塩または緩衝液も含むことができる。
【００９２】
本発明の組成物における好ましい賦形剤または担体は、ＣａＣｌ２、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン、及び前述の組み合わせを含み得る。
【００９３】
本組成物中に含有されるＦＶａ及びＦＶＩＩａの量は、いくつかの因子に依拠して変化し得るが、最適には、本組成物が単位剤形または容器（例えば、バイアル）中にあるときにトロンビンの生成を相乗的に促進することによって出血の阻害及び凝固の促進に及ぼす相乗効果を誘発する治療有効量である。
【００９４】
本発明の組成物は、止血薬、他の血液因子、または容態または疾患について対象を治療するのに使用する他の薬剤などの１つ以上の追加の薬剤を任意に含み得る。特に好ましいのは、ＦＸＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ、及びフォンウィルブランド因子などの１つ以上の血液因子を含む化合した調製物である。調製物には、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）及び／または第ＸＩＩ因子も含まれ得る。このような組成物には、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、及びカリクレインを含むがこれらに限定しない内在性凝固経路の活性化因子、または組織因子、トロンビン、及びＦＸａを含むがこれらに限定しない外来性凝固経路の活性化因子など、他の止血支持薬も含み得る。
【００９５】
ＦＶａ及びＦＶＩＩａのうちの１つまたは両方をそれぞれ含む１つの組成物または複数の組成物は典型的には、経口的に、注射を介して（皮下的に、静脈内にまたは筋肉内に）、注入によって、または局所的であるが必ずしもそうではない。当該医薬調製物または医薬組成物は、投与の直前に液体の溶液または懸濁液の形態であることができるが、シロップ剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、カプセル剤、散剤、ゲル剤、マトリックス剤、坐剤、またはこれらに類するものなどの別の形態もとり得る。肺、直腸、経皮、経粘膜、髄腔内、心周囲、動脈内、脳内、眼内、腹膜内などの追加の投与様式も企図される。個々の医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の医学的に許容し得る方法に従って同じまたは異なる投与経路を用いて投与され得る。
【００９６】
典型的には、ＦＶａ及びＦＶＩＩａは、互いに対して同時に投与され、同じまたは異なる組成物中にあり得る。しかしながら、記載するように、これらの部分は異なる回数で投与され得、このような投与はいずれかの順序で果たされ得る。本出願に含有する情報を基に、当業者は、所望の効果、好ましくは、例えば、遺伝的障害、後天性容態の結果、または過剰のＡＰＣ生成もしくはＡＰＣ投与の結果として、出血の予防または治療に及ぼす相乗効果を達成するための適切な薬用量を選択することができる。薬用量及び薬用量投与計画は、治療する具体的な出血性障害、治療する対象の年齢及び健康状態、果たされるその他の治療ならびにこれらに類するものなどの因子に依拠する。
【００９７】
本発明の組み合わせが凝固性低下または出血を治療または予防する上で使用される異なる徴候についての例示的な投薬計画を下記に示す。これらの投与計画が例示的であるよう企図されており、適切な投薬計画及び本発明によって治療可能な出血容態に徹底しているわけではないことは理解されるべきである。
【００９８】
【表１】
2017500372.tif 000009
【００９９】
（例示的な投薬計画）
【０１００】
１）急性出血
急性出血に対する最適応答まで、低用量、中程度の用量または高用量のスーパーＦＶａの単独でのあるいは、同時にまたは交互に反復して、低用量、中程度の用量または高用量のＦＶＩＩａまたはａＰＣＣまたはＰＣＣまたは３因子ＰＣＣまたは４因子ＰＣＣまたはＦＥＩＢＡまたは新鮮凍結血漿の単回投与との組み合わせでの単回用量非経口投与。投薬間隔は、同時にまたは交互に２時間ごと〜４時間ごと〜８時間ごと〜１２時間ごと〜２４時間ごと〜４８時間ごと〜７２時間ごとに及び得る。
【０１０１】
２）急性出血
１時間当たり０．０００１〜２７００μｇ／体重ｋｇのスーパーＦＶａの単独でのまたは低用量、中程度の用量もしくは高用量のＦＶＩＩａもしくはａＰＣＣの単回用量注入との組み合わせにおける連続的注入または連続的非経口投与。ＦＶＩＩａまたはａＰＣＣまたはＰＣＣまたは３因子ＰＣＣまたは４因子ＰＣＣまたはＦＥＩＢＡまたは新鮮凍結血漿についての投薬間隔は、急性出血に対する最適応答まで２時間ごと〜４時間ごと〜８時間ごと〜１２時間ごと〜２４時間ごと〜４８時間ごと〜７２時間ごとに及び得る。
【０１０２】
３）急性出血
ＦＶライデン製剤またはＦＶケンブリッジ製剤またはＦＶＩＩＩ製剤またはＦＩＸ製剤またはＦＸ製剤との組み合わせにおける１）または２）と同じ。ＦＶＩＩＩ製剤またはＦＩＸ製剤またはＦＸ製剤については、急性出血に対する最適応答まで体重１ｋｇ当たり約１〜３００単位における単回用量の注入または非経口投与。投薬間隔は、同時にまたは交互で、２時間ごと〜４時間ごと〜８時間ごと〜１２時間ごと〜２４時間ごと〜４８時間ごと〜７２時間ごとに及び得る。
【０１０３】
４）出血予防または出血防護
低用量、中程度の用量もしくは高用量でのスーパーＦＶａの単独または低用量、中程度の用量もしくは高用量の単回用量のＦＶＩＩａもしくはａＰＣＣもしくはＰＣＣもしくは３因子ＰＣＣもしくは４因子ＰＣＣもしくはＦＥＩＢＡもしくは新鮮凍結血漿との同時または交互の組み合わせにおける単回用量非経口投与。予防上の使用のための投薬間隔は、同時または交互で８時間ごと〜１２時間ごと〜２４時間ごと〜４８時間ごと〜７２時間ごと〜毎週に及び得る。
【０１０４】
本発明のある態様において、スーパーＦＶａは、種々の出血性障害及び出血性容態、例えば、血友病、外傷性出血及びＮＯＡＣ誘発性出血のための単一療法として投与される。これらの容態を治療するための単一療法としてのスーパーＦＶａについての例示的な投与計画及び範囲は以下に提供する。
【０１０５】
阻害因子を伴う血友病において、スーパーＦＶａの用量は、約４〜２０００Ｕ／ｋｇまたは約０．０１〜８．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約４０〜２００Ｕ／ｋｇまたは約０．１〜０．８ｍｇ／ｋｇである。
【０１０６】
急性外傷性凝固障害において、スーパーＦＶａの用量は、約２０〜１０，０００Ｕ／ｋｇまたは約０．０６〜３５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２００〜１０００Ｕ／ｋｇまたは約０．６〜３．５ｍｇ／ｋｇである。
【０１０７】
ＮＯＡＣ仲介性出血において、スーパーＦＶａの用量は、約４０〜２００Ｕ／ｋｇまたは約０．１〜０．８ｍｇ／ｋｇである。
【０１０８】
投薬は、１０分、２０分、３０分または６０分にわたる単回ボーラスまたはボーラス注入であり得る。投薬は、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、または出血エピソードもしくは凝固障害を解消するのに必要な限り連続的注入であり得る。投薬は、単回ボーラスあるいは、出血性エピソードもしくは凝固障害を解消するのに必要とする限り、または予防のためのもしくは防護のための治療として使用する場合、無限に、２時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１０時間ごと、１日２回、１日１回、隔日、週２回、または週１回反復するボーラス注入であり得る。
【０１０９】
本発明の他の態様において、スーパーＦＶａは、種々の出血性障害及び出血性容態、例えば、血友病、外傷性出血及びＮＯＡＣ誘発性出血のために、併用療法において他の医薬として活性のある薬剤とともに投与される。併用療法において使用する場合のスーパーＦＶａについての例示的な投薬計画及び範囲は、以下に提供する。
【０１１０】
例えば、併用療法において使用する場合、スーパーＦＶａの用量は、急性外傷性凝固障害を治療するためには約４〜２０Ｕ／ｋｇまたは０．０１〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０４〜２Ｕ／ｋｇまたは約０．００１〜０．００８ｍｇ／ｋｇ、急性外傷性凝固障害を治療するためには約２０〜１００Ｕ／ｋｇまたは０．０６〜０．３５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約２〜１０Ｕ／ｋｇまたは約０．０００６〜０．０３５ｍｇ／ｋｇ、あるいは臨床用量のＦＶＩＩａ（９０μｇ／ｍｌ）または高臨床用量のＦＶＩＩａ（２７０μｇ／ｍｌ）または臨床用量のＦＥＩＢＡ（２５〜５０Ｕ／ｋｇ）と併用する場合、ＮＯＡＣ仲介性出血を治療するためには約４〜２０Ｕ／ｋｇまたは０．０１〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０４〜２Ｕ／ｋｇまたは約０．００１〜０．００８ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１１１】
あるいは、阻害因子を伴う血友病及び／またはＮＯＡＣ誘発性出血を治療するために、約４０〜２００Ｕ／ｋｇもしくは０．１〜０．８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約４〜２０Ｕ／ｋｇもしくは約０．０１〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．４〜２Ｕ／ｋｇもしくは約０．００１〜０．００８ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０４〜０．２Ｕ／ｋｇもしくは約０．０００１〜０．０００８ｍｇ／ｋｇの用量のスーパーＦＶａが、約９０〜２７０μｇ／ｍｌ、好ましくは約９〜２７μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．９〜２．７μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．００９〜０．２７μｇ／ｍｌのＦＶＩＩａ、または約２５〜５０Ｕ／ｋｇ、好ましくは２．５〜５．０Ｕ／ｋｇ、より好ましくは約０．２５〜０．５Ｕ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０２５〜０．０５Ｕ／ｋｇのＦＥＩＢＡ、または約１〜１００Ｕ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜１０Ｕ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１Ｕ／ｋｇ、最も好ましくは約０．００１〜０．１Ｕ／ｋｇのＰＣＣとともに投与され得る。
【０１１２】
加えて、外傷性凝固障害を治療するために、約２００〜１０００Ｕ／ｋｇまたは約０．６〜３．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２０〜１００Ｕ／ｋｇまたは約０．０６〜０．３５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２〜１０Ｕ／ｋｇまたは約０．００６〜０．０３５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．２〜１Ｕ／ｋｇまたは約０．０００６〜０．００３５ｍｇ／ｋｇの用量のスーパーＦＶａが、約９０〜２７０μｇ／ｍｌ、好ましくは約９〜２７μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．９〜２．７μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．００９〜０．２７μｇ／ｍｌのＦＶＩＩａ、あるいは約２５〜５０Ｕ／ｋｇ、好ましくは約２．５〜５．０Ｕ／ｋｇ、より好ましくは約０．２５〜０．５Ｕ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０２５〜０．０５Ｕ／ｋｇのＦＥＩＢＡ、あるいは約１〜１００Ｕ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜１０Ｕ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜１Ｕ／ｋｇ、最も好ましくは約０．００１〜０．１Ｕ／ｋｇのａＰＣＣとともに投与され得る。
【０１１３】
本発明のさらに他の態様において、スーパーＦＶａを包含する併用療法には、スーパーＦＶａならびに第二の医薬として活性のある薬剤、例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＥＩＢＡ、及びａＰＣＣの交互の投薬も含む。例えば、スーパーＦＶａは、臨床用量のＦＶＩＩａの１時間後、２時間後、４時間後または６時間後に投与され、ＦＶＩＩａについての天然の「洗い流し期間」を使用して、スーパーＦＶａとの相乗性についてＦＶＩＩａの濃度を低下させ得る。
【０１１４】
本発明はまた、スーパーＦＶａ、好ましくは配列番号４と９０％の配列同一性を有するスーパーＦＶａ、より好ましくは配列番号４と９５％の配列同一性を有するスーパーＦＶａ、及び最も好ましくは配列番号４のスーパーＦＶａをコードする分離した核酸を包含するよう理解される。また、本発明には、スーパーＦＶａをコードする分離した核酸を含有する宿主細胞、例えば、細菌、酵母、哺乳類動物細胞を含む。したがって、本発明は、当該核酸を含有する宿主細胞をＦＶ産生に適した条件下で培養すること、及び当該活性化形態のＦＶを任意に分離及び精製することを含む、配列番号４のスーパーＦＶなどの活性化形態のＦＶの組換え産生方法をさらに含むよう理解されるべきである。
【０１１５】
本発明は、詳細に説明してきた。本発明及びその本質的な利益をさらに説明するために、本発明者らによって実施した実験を論議する以下の実施例を提供する。
【実施例】
【０１１６】
（作業実施例）
（実施例において使用する材料及び方法）
（材料）
阻害因子（ベセスダ単位（ＢＵ）において指定した力価）含有及び非含有のプールした正常ヒト血漿及びヒトＦＶＩＩＩ欠乏性患者由来の血漿をＧｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ（米国ケンタッキー州オーバーランドパーク市）から購入した。加えて、血漿及び臨床情報は、重症ＦＶＩＩＩ欠乏症（１％未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル）及び阻害因子（インフォームドコンセントを得た後でカリフォルニア大学サンディエゴ校（ＵＣＳＤ）における血友病治療センターに規則的に来院するナイメーヘンアッセイ（１７）を用いた臨床研究によってＢＵにおいて測定した力価）を有する２名の患者から得た。患者の守秘義務保護、検体及びデータ獲得方法は、ＵＣＳＤ治験審査委員会によって認可された。血液は、９：１の血液／抗凝固薬の容積比で３．８％のクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）へと採血し、即時加工した。血漿を収集し、２６００×ｇで１５分間の遠心分離の後−８０℃で凍結した。以下の試薬、すなわち、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国インディアナ州サウスベンド市）製のトロンビン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国カリフォルニア州サンディエゴ市）製のヒルジン、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のトウモロコシトリプシン阻害因子（ＣＴＩ）、Ｓｙｎａｐｓｅ  ＢＶ（）製のトロンビン標準物質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏによって分配）、Ｂａｃｈｅｍ（スイス国ブーベンドルフ自治体）製の基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、組換えヒト組織因子（ＴＦ）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ（米国デラウェア州ニューアーク市）製のデイドイノビン、Ｇｒｅｅｎ  ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（米国バーモント州バーリントン市）製のマウス抗ヒトＦＶＩＩＩ（ＧＭＡ８０１５）及びアイソタイプ抗体（ＧＭＡ６５０）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ（デンマーク国バグスバード地区）製の組換えヒトＦＶＩＩａであるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ（米国アラバマ州アラバスター市）から購入して説明のとおり（１８）調製したリン脂質ベシクル（８０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）、２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ））を使用した。
【０１１７】
（タンパク質調製）
組換えスーパー第Ｖ因子（スーパーＦＶ）（分子量１７４ｋＤａ）は、Ｂドメイン欠失型Ｓ２１８３Ａ  ＦＶプラットフォーム上で作製し、説明のとおり（１６）抗ＦＶ３Ｂ１及びＨＶ５１０１モノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせによって安定したトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の条件培地から精製した。スーパーＦＶタンパク質濃度は、ＦＶε１％＝１６．９（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ウィスコンシン州マディソン市）を用いてアミノ酸組成及び１７４ｋＤａの分子量を基に算出）を用いた２８０ｎｍにおける吸光度及び製造元の説明書によるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって測定した。スーパーＦＶタンパク質はプロトロンビナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）中で３７℃で２０分間２ｎＭトロンビンを用いて活性化した。活性化は、１．１モル当量のヒルジンの添加によって終止した。
【０１１８】
（活性化プロテインＣ（ＡＰＣ））
ヒト組換えまたは血漿由来ＡＰＣ、及びネズミ組換えＡＰＣを異なる実験において示すように使用した。ＡＰＣのヒト源については、組換えヒト（ｒｈ）ＡＰＣ（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、米国インディアナ州インディアナポリス市）を使用し、製造元の説明者により再構成した。組換えネズミＡＰＣは、先に説明したとおり購入及び調製した（５）。
【０１１９】
（トロンビン生成アッセイ）
内在性トロンビン能（ＥＴＰ）アッセイは、説明したとおり（１９）実施した。簡潔には、ＣＴＩ、ＴＦ、ＰＣＰＳベシクル及び凝固因子を補充した血漿検体を３７℃で当該血漿とともにプレインキュベートした。トロンビン生成は、ＨＢＳ／０．５％ＢＳＡ中のＣａＣｌ２及びＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの添加によって開始した。最終反応混合物は、１００μＬの総容積中に５０％血漿、０．２ｐＭ  ＴＦ、４μＭ  ＰＣＰＳベシクル、０．７２５μＭ  ＣＴＩ、０．５ｍＭ  Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ及び７．６ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有していた。いくつかの実験において、１．２５μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩ抗体を血漿へ添加し、ＥＴＰをプレインキュベーションの１時間後に測定した。蛍光は、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて３６０／４６０ｎＭの励起／発光波長で測定した。蛍光時間経過データは、説明されるとおり（２０）、ｎＭのトロンビンへと変換した。曲線下面積（ＡＵＣ）及びピーク高として定義するＥＴＰは、ＯｒｉｇｉｎソフトウェアまたはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて測定した。
【０１２０】
ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿へ添加したＦＶＩＩＩ抗体についてのＢＵ力価は、ナイメーヘン・ベセスダアッセイ（Ｂａｒｒｏｗ及びＬｏｌｌａｒ、ＪＴＨ  ２００６，４：２２２３〜２２２９）の変法を用いて測定した。簡潔には、抗体を０．０５％のトゥイーン８０含有ＨＢＳ中で連続希釈し、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）を補充しておいたプールした正常血漿と１：１で混合した。検体を３７℃で２時間インキュベートした後、ＡＰＴＴ  ＸＬ試薬（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）を用いてａＰＴＴによってアッセイした。標準曲線は、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿への正常血漿の連続希釈をＨＢＳＴと１：１で混合して３７℃で２時間インキュベートしてから得た。％ＦＶＩＩＩ活性は、抗体のｍｇ／ｍｌに対してプロットし、５０％の残余活性を１ＢＵ／ｍｌとして定義した。加えて、内在性トロンビン能（ＥＴＰ）アッセイは、説明したとおり（３）実施した。簡潔には、ＦＶａ突然変異体または塩類溶液を、ＨＢＳ中の１．４５μＭトウモロコシトリプシン阻害因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０μＭリン脂質ベシクル（説明（６）のとおり調製した８０％ホスファチジルコリン、２０％ホスファチジルセリン、０．２ｐＭ可溶性組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、及び０．４ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（トロンビン基質、Ｂａｃｈｅｍ））を補充したヒトまたはネズミ血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、マウス源、５０％（ｖ／ｖ））へ添加した。混合後、１００μＬを３７℃のＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃマイクロタイタープレートへと移して、蛍光をモニターした（３６０ｎｍでの励起／４６０ｎｍでの発光、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））。蛍光時間経過データは、説明のとおり（７）、ｎＭトロンビンへと変換した。曲線下面積として定義するＥＴＰは、Ｐｒｉｓｍ  ５．０４（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて測定した。
【０１２１】
（ＦＶＡ失活アッセイ）
ＦＶａのＡＰＣ仲介性失活は、ＥＴＰアッセイ及びａＰＴＴ凝血アッセイにおいて分析した。ＦＶａ突然変異体は、ヒト及びネズミＢａｌｂ／ｃ血漿中の等容積の組換えヒトＡＰＣ（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））または緩衝液のいずれかとともにインキュベートした。
【０１２２】
（ａＰＴＴ凝血アッセイ）
血漿（５０μＬ）を５０μＬのａＰＴＴ試薬（ＡＰＴＴ−ＸＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）と混合し、組換えヒトＡＰＣまたは緩衝液のいずれかを含有するＦＶａの存在下で３７℃で３分間インキュベートした。ＨＢＳ、０．５％ＢＳＡ中の５０ｍＭ  ＣａＣｌ２の２５μＬの添加後、ＳＴ４凝固計（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を用いて凝血時間を記録した。
【０１２３】
（エクスビボでのａＰＴＴ凝血アッセイ）
組換えネズミＡＰＣを尾部注射によってＢａｌｂ／ｃマウスへ静脈内投与し、２分後、２０μＬのクエン酸ナトリウム（３．８％）を事前に充填したシリコン処理した毛細管（７５μＬ）中に後眼窩血を採取した。全血のａＰＴＴを即時実施し、それにより５０μＬン血液を５０μＬのａＰＴＴ試薬（ＡＰＴＴ−ＸＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）と混合して、３７℃でＦＶａまたは緩衝液の存在下で３分間インキュベートした。ＨＢＳ、０．５％ＢＳＡ中の１３０ｍＭ  ＣａＣｌ２の２５μＬの添加後、ＳＴ４凝固計（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を用いて凝血時間を記録した。
【０１２４】
（尾部クリップ出血アッセイ）
マウスを３％のイソフルランで麻酔し、温度制御した加温パッド（３７℃）上に置き、尾部の遠位部を直径１．５ｍｍで切断した後、尾部を事前に規定した容積の３７℃の塩類溶液（０．９％ＮａＣｌ）中に２０分間浸漬した。出血及び血餅安定性に及ぼす効果を試験するため、１０分後にチューブを交換して、１回目の１０分間及び２回目の１０分間について別個に血液を収集した。失血は、２％酢酸による赤血球の溶解後の塩類溶液中のヘモグロビン濃度によって判定し、４９０ｎｍにおける吸光度によって測定した。規定した血液容積に由来するヘモグロビン標準物質を用いて、失血を４６％のヘマトクリットを推定して算出し、μＬ／体重ｇで表した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの複数の群に等容積（２００μＬ）のスーパーＦＶａまたは塩類溶液を注射して２分後にｒｈＡＰＣ（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））の静脈内注射をした。ＡＰＣ注射の直後に尾部切断を実施した。試薬はすべて滅菌済みの注射用０．９％塩化ナトリウム（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ）中に希釈した。
【０１２５】
（肝裂傷出血アッセイ）
マウスを３％イソフルオランで麻酔し、腹部を胸骨下鈍的正中線切開によって開腹した。肝臓を動態化して、滅菌ガーゼ上へと外在化した後、左肝葉を規定の１０ｍｍ小刀で切断し、これは結果的に完全な腹部及び背部の裂傷を生じた。裂傷直後、塩類溶液（３７℃、１３ｍＬ）で満たした小さな秤量皿（８ｃｍ径）へとマウスを平伏に位置取り、麻酔チャンバーへと移して、加温パッド（３７℃）上に安置した。麻酔を３％イソフルオランで維持し、皿を１０分後に交換して、１回目の１０分間及び２回目の１０分間について別個に血液を収集した。失血は、尾部クリップモデルについて説明した通り判定した。複数の群のＢａｌｂ／ｃマウスに等容積（２００μＬ）のスーパーＦＶａまたは塩類溶液を静脈（尾部静脈）内注射した２分後に、血漿由来ヒトＡＰＣの静脈内注射をした直後に肝裂傷を施した。試薬はすべて、滅菌済み注射用０．９％塩化ナトリウム中（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ）に希釈した。
【０１２６】
（統計分析）
両側のスチューデントのｔ検定を用いて、適宜統計的な有意性を評価した。０．０５以下のｐ値を統計的に有意とみなした。
【０１２７】
（実施例１）
本実施例は、結果が図１のＡ及び１のＢに含まれる実験に関する。これらの実験はＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示す。これらの実験において、トロンビン生成は、固定した濃度のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２５ｎｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下で増大する濃度のスーパーＦＶａを補充したＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。当該図におけるパネル（Ａ）は、ｒｈＦＶＩＩａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）での増大する濃度のスーパーＦＶａにおけるＥＴＰの代表例である。パネル（Ｂ）は、ｒｈＦＶＩＩａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のスーパーＦＶａを用いて達成したＥＴＰ（内在性トロンビン能）の量（上パネル）及びピーク高（下パネル）を図示する。当該図において、誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。これらの結果は、ＥＴＰ及びピーク高に及ぼすならびにそれを基にしてトロンビン生成に及ぼす組み合わせの相乗効果を統計的に実証した。
【０１２８】
（実施例２）
本実施例は、結果が図２のＡ及び２のＢに含まれる実験に関する。これらの実験は、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果をさらに示す。本実験において、トロンビン生成は、固定した濃度のスーパーＦＶａ（０．５９μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下での増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を補充したＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＥＴＰ及びピーク高として測定した。パネル（Ａ）は、スーパーＦＶａの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）での増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａにおけるＥＴＰの代表例を含んでいる。パネル（Ｂ）は、スーパーＦＶａの非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａを用いて達成したＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）を示す。また、誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。これらの結果は、ＥＴＰ及びピーク高に及ぼす、ならびにそれを基にしてトロンビン生成に及ぼす組み合わせの相乗効果も統計的に実証する。
【０１２９】
（実施例３）
本実施例は、結果が図３のＡ及び３のＢに含まれる実験に関する。これらの実験は、抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害因子）含有の正常ヒト血漿中でのＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果をさらに実証する。また、トロンビン生成は１．２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を補充した正常ヒト血漿におけるＥＴＰ（上パネル）及びピーク高（下パネル）として測定した。パネル（Ａ）は、固定した用量のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２５ｎｇ／ｍｌ）濃度の非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のスーパーＦＶａを用いたトロンビン生成を示す。パネル（Ｂ）は、固定した用量のスーパーＦＶａ濃度の非存在下（黒色曲線）または存在下（赤色曲線）での増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａを用いたトロンビン生成を示す。内在性トロンビン能（ＥＴＰ）。スーパーＦＶａ（ＳＦＶａ）。また、誤差棒は、平均の標準誤差を表す（ｎ≧５）。これらの結果は、ＥＴＰ及びピーク高に及ぼす、ならびにそれを基にしてトロンビン生成に及ぼす組み合わせの相乗効果も統計的に実証する。
【０１３０】
（実施例４）
本実施例は、結果が図４のＡ及び４のＢに含まれる実験に関する。これらの実験は先天性のＦＶＩＩＩ欠乏症及び高い力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害因子）を有する患者の血漿中でのＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果をさらに実証する。特に、スーパーＦＶａ及び／またはｒｈＦＶＩＩａの凝血原効果も、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び阻害因子を有する患者において試験した。高い力価の阻害因子（検体ＢＵ−力価＝両方の患者について６４、市販の検体ＢＵ−力価＝４１、１５０及び２８０）を有する患者由来の２つの臨床的に収集した及び３つの市販の血漿検体のＥＴＰを基線で、スーパーＦＶａまたはｒｈＦＶＩＩａ、あるいは両方の組み合わせの2つの異なる濃度の存在下で試験した。結果をＮＨＰのＥＴＰと比較した（図４のＡ／Ｂ）。ｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａは、5つの患者検体全部におけるＥＴＰ及びピーク高を高めた。ＥＴＰ及びピーク高は、４０ｎＭのｒｈＦＶＩＩａ（治療濃度のｒｈＦＶＩＩａ）及び３．３ｎＭのスーパーＦＶａを用いて刺激した血漿間で比較可能であった。因子置換に対する個体間応答にもかかわらず、ＥＴＰ及びピーク高は、ｒｈＦＶＩＩａ（４０ｎＭ、治療濃度）及びスーパーＦＶａ（３．３ｎＭ）を組み合わせると患者検体全部において顕著に亢進し、いずれかの因子単独と比較して約１．５〜３倍の増加を実証した。ｒｈＦＶＩＩａの濃度を３．３ｎＭのスーパーＦＶａの存在下で４０ｎＭから２ｎＭまで２０倍ほど低下させると、ＥＴＰ及びピーク高に及ぼす効果は、４０ｎＭのｒｈＦＶＩＩａとの併用療法に匹敵するままであった。しかしながら、２ｎＭのみのｒｈＦＶＩＩａの存在下でスーパーＦＶａの濃度を３０ｎＭまで高めると、いくつかの患者検体におけるＥＴＰ及び／またはピーク高はさらに高まるように見えた。臨床収集検体において効果は最も顕著であり、因子の組み合わせを用いて、ＥＴＰは、正常なプールした血漿のＥＴＰに匹敵した（図４のＡ）。
【０１３１】
これらの結果は、（ＥＴＰ及びピーク高の上昇によって証明されるように）凝固または凝血及びトロンビン生成に及ぼす組み合わせの相乗効果を統計的に実証している。
【０１３２】
（実施例５）
本実施例は、結果が図５に含まれる実験に関する。特に、スーパーＦＶａの効果はまた、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び高い力価の阻害因子を有する２名の異なる患者において、急性関節または筋肉出血に対して９０μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａを用いた治療の直前及び５分後に直接試験した（患者Ａ，ＢＵ＝６４、患者Ｂ，ＢＵ＝３２）。ｒｈＦＶＩＩａを用いた治療は結果的に、両患者における基線を超えるＥＴＰ及びピーク高の約１．５〜２倍の亢進を生じた。患者血漿への増大濃度のスーパーＦＶａのエクスビボでの添加は結果的に、ｒｈＦＶＩＩａ注入の前及び５分後に収集した血漿におけるＥＴＰ及びピーク高の追加の約３倍の亢進を生じた（図５）。ＥＴＰは患者Ａについては１０ｎＭのスーパーＦＶａで平衡状態に達したが、ピーク高は達しなかった。
【０１３３】
これらの実験は、急性関節出血に対してｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を用いて治療した、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び高い力価の抗ＦＶＩＩＩ抗体を有する患者の血漿においてスーパーＦＶａの相乗効果を示している。血液検体は、９０μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａの注入直前（黒色曲線）及び５分後（赤色曲線）で得た。ＢＵ−力価＝６４Ｕ／ｍｌ。トロンビン生成は、血漿検体へエクスビボで添加した増大する濃度のスーパーＦＶａを用いてＥＴＰ（上パネル）またはピーク高（下パネル）として測定した。これらの結果は、凝固または凝血に及ぼす組み合わせの相乗効果ならびに検出したＥＴＰ及びピーク高に基づいたトロンビン生成を統計的に実証する。
【０１３４】
（実施例６）
本実施例は、結果が図８のＡ及びＢに含まれる凝血実験に関する。本実験において、トロンビン生成は、Ａ）ネズミＢａｌｂ／ｃ血漿及びＢ）ｒｈＡＰＣの存在下でｒｈＦＶａまたはｒｈスーパーＦＶａを補充した正常ヒト血漿において測定した。トロンビン生成は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した（ｎ＝４〜６）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【０１３５】
（実施例７）
本実施例は、結果が図９のＡ，９のＢ及び９のＣに含まれる実験に関する。これらの実験において、ａＰＴＴ矯正が実証されている。特に、図９に示すように、ａＰＴＴ凝血時間は、Ａ）１０ｎＭのｒｈＦＰＣの存在下で増大する濃度のｒｈＦＶａまたはｒｈスーパーＦＶａの存在下でヒト血漿において測定され（ｎ＝４）、図９のＢにおいて、ａＰＴＴ矯正は、１０ｎＭのｒｈＡＰＣ及び１ｎＭのｒｈＦＶａバリアントにおける単一のデータ地点として図示しており、図９のＣにおいて、ａＰＴＴ矯正は、ｒｈＦＶａバリアントの存在下でのネズミ血漿を用いて示す（ｎ＝１０）。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【０１３６】
（実施例８）
本実施例は、結果が図１０に含まれる実験に関する。本実験において、ａＰＴＴ矯正は、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの組換えネズミＡＰＣの静脈内注射後にＦＶａバリアントを用いて実証されている。マウスに塩類溶液またはｒｍＡＰＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。２分後、血液を後眼窩で収集し、全血のａＰＴＴを即時測定した。ＡＰＣを注射したマウスからなる２群において、全血をスーパーＦＶａまたは野生型ＦＶａのいずれかを用いてエクスビボで刺激し（白色三角形１Ｕ／ｍＬ、白色円０．５Ｕ／ｍＬ、黒色三角形０．０５Ｕ／ｍＬ）、両バリアントを用いたａＰＴＴ矯正の程度を測定した。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．００１未満）。
【０１３７】
（実施例９）
本実施例は、結果が、ネズミ尾部クリップモデルにおけるスーパーＦＶａによるＡＰＣ誘発性出血の矯正を実証する図１１のＡ及び１１のＢに含まれる実験に関する。野生型マウスに増加する用量のｒｈＡＰＣまたは塩類溶液を静脈内注射した。スーパーＦＶａは、２つの濃度のＡＰＣの２分前に静脈内注射した。尾部クリップ後の出血は、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表す。図１１のＡは、２０分間の失血を示し、図１１のＢは、これを１回目の１０分間へ分けたものを示し、図１１のＣは、尾部クリップ後の２回目の１０分間が図示されているのを示す。誤差棒はＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値＜０．０５）。
【０１３８】
（実施例１０）
本実施例は、結果が図１２に含まれる実験に関する。本実験は、尾部クリップ及び肝裂傷後の出血パターンを直接比較する。ＦＶＩＩＩ欠損マウスに、塩類溶液（２００μＬ）またはｒｈＦＶＩＩＩ（５０Ｕ／ｋｇ、２００μＬ）を静脈内注射し、尾部クリップまたは肝裂傷へ供した。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスへ塩類溶液を基線値用に注射した。２０分間のマウス全群における失血を両モデルにおいて測定した。
【０１３９】
（実施例１１）
本実施例は、肝裂傷後のスーパーＦＶａによるＡＰＣ誘発性出血の矯正を示す図１３のＡ〜Ｃに結果が含まれる実験に関する。これらの実験において、マウスに塩類溶液または１．２５ｍｇ／ｋｇの血漿由来ヒトＡＰＣを静脈内注射した。スーパーＦＶａは、３．５ｍｇ／ｋｇのＡＰＣの２分前に静脈内注射した。肝裂傷後の出血は、マウス１グラム当たりの血液μｌにおける失血として表す。図１３の（Ａ）は失血を示し、図１３のＢは２０分間の生存を示し、図１３のＣは、損傷後の１回目の１０分間（上パネル）及び２回目の１０分間（下パネル）へ分けた失血を示す。ＡＰＣを注射した１３匹のマウスのうちの４匹は、損傷後の１回目の１０分間の間に死亡した（白色円）。さらに３匹のマウスはそれぞれ、２回目の１０分間の間に死亡し（白色長方形）、それゆえ、下パネルから除外した。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。＊は、統計的有意性を示す（ｐ値はすべて０．０１以下）。
【０１４０】
（実施例１２）
本実施例は、結果が図１４のＡ及びＢに含まれる実験に関する。本実験は、ｒｈＡＰＣ決勝によるトロンビン生成の浴性及び用量応答を示す。本実験において、トロンビン生成は、１４Ａ）正常ヒト血漿及び１４Ｂ）マウス血漿において、ｒｈＡＰＣの増大の存在下で測定した。トロンビン生成は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。
【０１４１】
（実施例１３）
本実施例は、結果が図１５のＡ及びＢに含まれる実験に関する。本実験は、ｒｈＡＰＣによる血漿中のａＰＴＴ凝血時間の長期化及び用量応答を示す。本実験において、ａＰＴＴは、１５Ａ）正常ヒト血漿及び１５Ｂ）ネズミ血漿において、増大する濃度のｒｈＡＰＣ（ｎ＝２〜５）による補充後に測定した。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。
【０１４２】
（実施例１４）
本実施例は、結果が図１６のＡ及び１６のＢに含まれる実験に関し、本実験は、ヒト血漿におけるトロンビン生成のＡＰＣ誘発性低下の救出を実証する。本実験において、トロンビン生成は、ｒｈＡＰＣの存在下でＡ）曲線下面積（ＡＵＣ）及びＢ）ピーク高として正常ヒト血漿において測定した。トロンビン生成の救出のため、スーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａを単独または組み合わせのいずれかにおいて適用した。
【０１４３】
図１６に含まれる結果は、増大する濃度で含まれるｒｈＦＶＩＩａが単独で、トロンビン生成に何ら効果を及ぼさなかったのに対し、スーパーＦＶａは、トロンビン生成を正常ヒト血漿のそれに至るレベルまで矯正したことを示している。加えて、本実験は、痕跡量のｒｈＦＶＩＩａ（１００ｎｇ／ｍＬ）のスーパーＦＶａへの添加が、正常ヒト血漿をおよそ５０％上回ってトロンビン生成を高めることを示した。
【０１４４】
本実験は、ｒｈＦＶＩＩａとスーパーＦＶａとの組み合わせが、ヒト血漿におけるＡＰＣによって抑制されていたトロンビン生成を相乗的に高めたという説得力のある証拠を提供する。トロンビン生成を正常まで矯正するｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせにおけるスーパーＦＶａの最低最適濃度範囲は果たされなかったが、これらの結果を基に判定され得る。
【０１４５】
（実施例１５）
本実施例は、結果が図１７〜１９及び２８に含まれる実験に関する。
【０１４６】
図１７に含まれる実験は、正常ヒト血漿に及ぼす抗ＦＶＩＩＩ抗体の効果を試験するために実施した血餅溶解アッセイの結果を示す。抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、５μｇ／ｍｌ超の抗体がＣＰＩ対照のレベルまで血餅溶解時間を短縮するのに十分であることを示した。
【０１４７】
図１８は、血餅溶解アッセイの結果を含んでおり、当該アッセイにおいて、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度を使用して、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの効果を個々にかつ、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子による正常ヒト血漿の血餅溶解に及ぼす相乗的な様式で試験した。図１８に示すように、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａは個々に、それぞれ２μｇ／ｍｌ及び約２〜５μｇ／ｍｌというより高濃度で、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩ抗体とともにインキュベートした正常ヒト血漿における血餅溶解時間の延長を示した。
【０１４８】
図１９は、血餅溶解アッセイを含んでおり、当該アッセイにおいて、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａを組み合わせで使用した。図１９のデータによって示すように、血餅溶解時間は、低濃度のｒｈＦＶＩＩａで正常血漿のレベルまで２桁の程度ほど亢進し、スーパーＦＶａにおいては、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含む正常ヒト血漿の血餅溶解時間を矯正する上で、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの両方の相乗効果を実証する程度の桁を超えるほど亢進することが観察された。
【０１４９】
図２８は、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて刺激した正常ヒト血漿（ＮＨＰ）に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの単独での及び組み合わせでの効果を試験するために実施した血餅溶解アッセイの結果を示す。血餅溶解時間は、４０ｎＭのｒｈＦＶＩＩａ（治療血漿濃度、図２８のＡ）または３．３３ｎＭのスーパーＦＶａ（図５のＢ）で正常まで回復するのが観察された。しかしながら、血餅溶解時間を標準化するのに必要なｒｈＦＶＩＩａの濃度は、痕跡量のスーパーＦＶａ（０．３７ｎＭ）の存在下で１００倍ほど（約０．４ｎＭまで）低下することができた（図２８のＡ／Ｂ）。類似の結果は、本実験をＦＶＩＩＩ欠乏性血漿（ＦＶＩＩＩｄＰ）において実施した場合に得た（データ非表示）。
【０１５０】
図３１は、ＮＨＰにおいて期待されるものへ血餅溶解時間を標準化するのに必要な、ｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａ単独でのまたは組み合わせにおける濃度を示す。概して、ＮＨＰの平均血餅溶解時間に到達するのに必要な濃度は、併用した場合、各因子について約１０〜１００倍低かった。
【０１５１】
（結果及び分析）
（１．ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるトロンビン生成に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの効果）
本発明者らは、スーパーＦＶａがヒトＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるＥＴＰをおよそ２倍増加させることを実証している（その開示が全体として参照により本明細書に明白に組み込まれるｖｏｎ  Ｄｒｙｇａｌｓｋｉ  Ａら，ＪＴＨ  ２０１４；１２：３６３〜３７２）。ｒｈＦＶＩＩａトロビン生成の存在下でのスーパーＦＶａの潜在的な相加効果または相乗効果を研究するために、増大する濃度のスーパーＦＶａ単独またはｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせでのＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるトロンビン生成を評価した。増大する濃度のスーパーＦＶａは結果的に、ＥＴＰ及びピーク高の約２．５倍の増加を生じた。９０μｇ／体重ｋｇ（約２μｇ／ｍＬ）のＦＶＩＩａの静脈内投与後の治療血漿レベルに期待されるよりも約１００倍低い、２５ｎｇ／ｍＬの固定用量でのＦＶＩＩａの添加は結果的に、スーパーＦＶａの全濃度（０．００７〜５．２８μｇ／ｍＬ）でＥＴＰ及びピーク高の追加の約２．５倍の増加を生じた。最高濃度のスーパーＦＶａ（５．２８μｇ／ｍＬ）において、ＦＶＩＩａの存在下でのピーク高は、スーパーＦＶａ単独で達成することができるものを上回って約５倍まで上がった（図１）。加えて、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿において観察されるトロンビン生成までの時間差は、ＦＶＩＩａの存在下で抑止された（図１）。
【０１５２】
その後、低用量の固定したスーパーＦＶａ（０．５９μｇ／ｍＬ）の存在下でのトロンビン生成に及ぼす増大する濃度のＦＶＩＩａの潜在的な相加効果または相乗効果の相互の関連性を、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿におけるトロンビン生成を用いて測定した。スーパーＦＶａの存在下で各濃度のｒｈＦＶＩＩａにおいてＥＴＰ及びピーク高の約２倍の増加が特記され、時間差は抑止された（図２）。
【０１５３】
（２．ＦＶＩＩＩ阻害性抗体含有正常ヒト血漿におけるトロンビン生成に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの効果）
正常ヒト血漿におけるＦＶＩＩＩ阻害性抗体（阻害因子）の存在下で、スーパーＦＶａ単独のまたはｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせでの凝血原効果をさらに評価するために、トロンビン生成の最大抑制についての抗ＦＶＩＩＩであるＧＭＡ８０１５の最適濃度をまず判定し、１．２５μｇ／ｍｌであることを見出した（図７を参照されたい）。両方、ｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａ単独は、トロンビン生成の抑制を克服することができ、およそ１．５〜２倍と、基線と比較してＥＴＰ及びピーク高を増大させた。特筆すべきことに、ｒｈＦＶＩＩａを用いた効果は、２００ｎｇ／ｍＬで平衡状態に達したように見え、これは、９０μｇ／ｋｇの静脈内投与後の通常の治療用血漿濃度の約１０％である。痕跡量のｒｈＦＶＩＩａ（約１％の通常の治療濃度に対応する２５ｎｇ／ｍＬ）を増大する濃度のスーパーＦＶａと組み合わせた場合、または痕跡量のスーパーＦＶａ（０．５９μｇ／ｍＬ、ＦＶの通常の血漿濃度約１０μｇ／ｍＬ）を増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａと組み合わせた場合のいずれかにおいて、ＥＴＰ及びピーク高は有意に増大した（図３）。組み合わせは両方とも、ＥＴＰの追加の約１．５〜２倍の増加、及びピーク高の約２〜３倍の増加を生じた。アイソタイプ抗体を含有する及び含有しない正常ヒト血漿におけるトロンビン生成は類似しており、抗体の種類は、トロンビン生成に干渉しないことを示した（図７を参照されたい）。
【０１５４】
（３．先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び阻害因子を有する患者由来の血漿におけるトロンビン生成に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの効果）
スーパーＦＶａ及び／またはｒｈＦＶＩＩａの凝血原効果も先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び阻害因子を有する患者において研究した。高い力価の阻害因子を有する患者由来の３つの市販の血漿検体の及び２つの臨床収集血漿検体（市販の検体ＢＵ−力価＝４１、１５０及び２８０、臨床検体ＢＵ−力価＝両方の患者について６４）のＥＴＰを基線で、２つの異なる濃度のスーパーＦＶａ、ｒｈＦＶＩＩａ、または両方の組み合わせの存在下で評価した。結果は、正常ヒト血漿のＥＴＰと比較した（図４）。ｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａは、５つの患者検体全部においてＥＴＰ及びピーク高を亢進した。ＥＴＰ及びピーク高は、２μｇ／ｍＬのｒｈＦＶＩＩａ（およそ期待された治療濃度のｒｈＦＩＩａ）で刺激した血漿と０．５９μｇ／ｍＬのＥＴＰにおけるスーパーＦＶａで刺激した血漿の間で比較可能であり、ピーク高は、ｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）及びスーパーＦＶａ（０．５９μｇ／ｍＬ）を組み合わせた場合、特に亢進した。因子置換に対する個体間の応答にもかかわらず、当該組み合わせは、いずれかの因子単独と比較して約１．５〜３倍のＥＴＰまたはピーク高の亢進を達成した。特筆すべきことに、ｒｈＦＶＩＩａの濃度が２μｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまで２０倍低下した場合、当該組み合わせによる効果は損なわれなかった。ＥＴＰ及びピーク高は、ＦＶＩＩａを１００ｎｇ／ｍＬに維持しながらスーパーＦＶａの濃度が１．７６μｇ／ｍＬまで高まった場合、さらに高まるように見えた（図４）。臨床収集した検体において効果は最も顕著であり、因子の組み合わせを用いて、ＥＴＰは正常のプールされた血漿のＥＴＰに匹敵した（図４のＢ）。
【０１５５】
スーパーＦＶａの効果も、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏症及び高い力価の阻害因子（ＢＵ＝６４）を有する患者のうちの１名に由来する臨床収集した血漿において、急性関節出血について９０μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａを用いた治療の直前及び５分後に直接研究した。ｒｈＦＶＩＩａを用いた患者の治療は結果的に、基線ラインを上回ってＥＴＰ及びピーク高の約１．５倍の亢進を生じた。増大する濃度のスーパーＦＶａの患者血漿へのエクスビボでの添加は結果的に、基線及びｒｈＦＶＩＩａを用いた治療後に収取した検体におけるＥＴＰ及びピーク高の追加の約３倍の亢進を生じた（図５）。ＥＴＰは、１．７６μｇ／ｍＬのスーパーＦＶａで平衡状態に達したが、ピーク高は達しなかった。特筆すべきことに、この患者の血漿を２μｇ／ｍＬのｒｈＦＶＩＩａ単独またはスーパーＦＶａとの組み合わせにおいてエクスビボで刺激すると、ＥＴＰ及びピーク高についての値は、ｒｈＦＶＩＩａの注入後に得た値に対応していた（図４のＢ）、このことは、インビトロでの実験については、２μｇ／ｍＬのＦＶＩＩａの濃度が、注入後の治療濃度として安全に提唱することができることを確証している。
【０１５６】
（４．ヒト及びネズミ血漿におけるｒｈＡＰＣの存在下でのＥＴＰ及び凝血時間の矯正に及ぼすスーパーＦＶａの効果）
ネズミ及びヒト血漿におけるヒトＡＰＣによって最大限に抑制されるＥＴＰを再構成するスーパーＦＶａの能力に取り組むために、血漿をＡＰＣの存在下でスーパーＦＶａまたはＦＶａで刺激した。ヒト及びネズミ血漿におけるＥＴＰの最大抑制についてのＡＰＣの最適濃度を、ヒト血漿またはネズミ血漿において用量応答によってそれぞれ５ｎＭまたは１００ｎＭであると測定した（図１４）。スーパーＦＶａのみがヒトまたはネズミ血漿において、ＦＶａが効果を示さない濃度で約９０〜１００％までＥＴＰを回復させた（図８）。凝血時間のＡＰＣ誘発性長期化を標準化するスーパーＦＶａの能力に取り組むために、ａＰＴＴ短縮に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶａの効果をヒトＡＰＣの存在下で研究した。これらの実験に先立って、約１００秒間までのａＰＴＴの長期化についてのＡＰＣの最適濃度はヒトまたはネズミ血漿においてそれぞれ、１０ｎＭまたは２５ｎＭであると測定された（図１５）。スーパーＦＶａ及びＦＶａは両方とも、ａＰＴＴを用量依存的に標準化した。しかしながら、ヒト血漿において、スーパーＦＶａは、ＦＶａと比較して１００倍低い濃度でａＰＴＴを標準化した（図９のＡ）。０．０５Ｕ／ｍＬのＦＶａバリアントにおいて、スーパーＦＶａはａＰＴＴを完全に矯正したのに対し、ＦＶａはａＰＴＴを約１００〜８０秒しか短縮しなかった（図９のＢ）。類似の発見は、ネズミ血漿において明白だった。５Ｕ／ｍＬのＦＶａバリアントにおいて、スーパーＦＶａはａＰＴＴを完全に矯正したのに対し、ＦＶａはａＰＴＴを約１００〜７０秒しか短縮しなかった（図９のＣ）。
【０１５７】
（５．Ｂａｌｂ／ｃマウスへのｒｍＡＰＣの静脈内投与後の凝血時間の矯正に及ぼすスーパーＦＶａの効果）
エクスビボでの全血ａＰＴＴアッセイにおいて、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内注射と比較したｒｈＡＰＣの静脈内注射（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、塩類溶液を用いた平均３０秒からＡＰＣを用いた平均６７秒まで凝血時間は２倍になった（塩類溶液：ｎ＝３１、ｒｍＡＰＣ：ｎ＝１６、ｐ＝０．０００１）ＡＰＣ注射後に即時採血した全血へのスーパーＦＶａのエクスビボでの添加は、ａＰＴＴを平均３０秒まで標準化した（ｎ＝１１、ｐ＝０．０００５）のに対し、ＦＶａのエクスビボ出の添加は、有意な効果を示し損ねた（平均ａＰＴＴ：５０、ｎ＝１１、ｐ＝０．２）。ＦＶａバリアントの効果は、濃度依存的であるように見え、スーパーＦＶａとＦＶａの間の全血ａＰＴＴ矯正における差は、ＦＶａバリアントが低濃度で採用された場合に最も顕著に表れた（０．０５Ｕ／ｍＬ、ｎ＝８）。ＦＶａバリアントの濃度の増大とともに、差はあまり明白ではなくなった（０．５または１Ｕ／ｍＬ、ｎ＝３）（図１０）。
【０１５８】
（６．Ｂａｌｂｃマウスにおける尾部クリップ後の急性ＡＰＣ誘発性出血のスーパーＦＶａによる効率的な予防）
ＡＰＣを用いて処置したＢａｌｂ／ｃマウスにおける出血低下についてのスーパーＦＶａのインビボでの効能を測定するために、失血をまず従来の尾部切断モデルにおいて測定した。血液は、尾部クリップ後の１回目の１０分間及び２回目の１０〜２０分間について個別に収集して、初回出血を後期再出血と識別した。顕著な出血を結果的に生じるＡＰＣの用量は、インビボでの用量によって１．２５ｍｇ／ｋｇであると測定した。組み合わせた２０分の出血期の間、失血は、塩類溶液を用いた平均３．４μＬ／ｋｇからＡＰＣを用いた平均２７μＬ／ｋｇまで増加した（ｐ＝０．００７）（図１１のＡ）。ＡＰＣ注射の２分前のスーパーＦＶａを用いた保護は、失血を用量依存的に減少させた。５Ｕ／ｍＬで、平均失血の２１μＬ／ｋｇまでの緩徐な減少が観察されたのに対し、２５Ｕ／ｍＬでは、９．２μＬ／ｋｇまでの平均失血の有意な減少（ｐ＝０．０４）が達成された（図１１のＡ）。
【０１５９】
ＡＰＣ後の失血は持続的であり、尾部クリップの１回目及び２回目の１０分間で類似していた（それぞれ平均１３．７μＬ／ｋｇ及び１３．２μＬ／ｋｇ）。スーパーＦＶａは、両時期の間、失血を十分に等しく減少させた。スーパーＦＶａ（２５Ｕ／ｍＬ）のより多量の用量が失血を１回目及び２回目の１０分間の間にそれぞれ平均４．３μＬ／ｋｇ及び４．８μＬ／ｋｇまで有意に抑制した（ｐ値はすべて０．０５以下）（図１１のＢ／Ｃ）。
【０１６０】
（７．微小循環実質性器官出血を研究するための重要なエンドポイントとしてのマウスにおける肝裂傷の実行可能性）
肝裂傷は、急性外傷性器官損傷後の微小血管仲介性実質性大量出血に関する重要な情報を提供するので、ラット、ウサギ及びブタなどのより大きな動物における出血モデルとして頻繁に使用されている(８〜１０)。対照的に、尾部クリップ後の出血は、より大きな動脈及び静脈の完全な切除後の出血パターンをより真似ている。両モデルにおける出血パターンは異なり得、相補的な情報を提供し得る。しかしながら、マウスにおいては肝裂傷はほとんど実施されておらず、小動物における手術介入及び腹部血液収集に関する技術的な問題に依拠して普遍的に確立されてはいない。本発明者らは、Ｂａｊａｊら（１１）から改変した手術アプローチを確立し、それにより、肝臓を腹部正中線切開後に外在化し、左肝葉を１０ｍｍ長の雌で切断して裂傷を作った後、当該マウスを塩類溶液（３７°）へと平伏した位置におけるマウスを用いて血液収集を行った。
【０１６１】
当該モデルの実行可能性及び検証を、尾部クリップモデルにおいて出血素因を確立した血友病マウスにおいて、尾部クリップ後の結果を肝裂傷後の結果と比較することによって実施した。両モデルにおいて、２０分後の平均失血は類似していた（肝裂傷４０μＬ／ｇ、尾部クリップ３５．７μＬ／ｇ）。しかしながら、失血に関する平均の標準誤差（ＳＥＭ）、標準偏差（ＳＤ）及び個体間範囲は各々、尾部クリップモデルと比較して肝裂傷モデルにおいて約４倍減少していた（図１２）。ＳＥＭ、ＳＤ、及び範囲はそれぞれ、５から１．７、２０から４．９、及び６１．１から１４．６μＬ／ｇへ減少していた。ｒｈＦＶＩＩＩ（５０Ｕ／ｋｇ）を用いて処置すると、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける失血に匹敵する有意な出血の低下が各モデルにおいて達成された。ＦＶＩＩＩ処置した血友病マウス及び塩類溶液処置した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける平均失血はそれぞれ、肝裂傷モデルにおいて２５μＬ／ｇ及び２９μＬ／ｇ（対未処置の血友病マウス４０μＬ／ｇ、ｐ＜０．０００１）であり、尾部クリップモデルにおいては９．７μＬ／ｇ及び４．２μＬ／ｇであった（対未処置の血友病マウス３５．７μＬ／ｇ、ｐ＝０．００２）。失血における低い個体間の差は、肝裂傷モデルにおける統計的有意性を得るために必要な動物の個体数を顕著に減少させることができた（肝裂傷マウス２６個体、尾部クリップマウス３９個体）（図１２）。これらの結果を総合すると、本発明者らは、マウスにおける肝裂傷がマウスにおける止血を研究するための有区汚な代替モデルであると判断した。
【０１６２】
（８．Ｂａｌｂｃマウスにおける肝裂傷後の急性ＡＰＣ誘発性出血のスーパーＦＶａによる効率的な治療）
肝裂傷モデルにおけるＡＰＣで処置した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける出血低下のためのスーパーＦＶａのインビボでの効能を測定するために、マウスにスーパーＦＶａ（２５Ｕ／ｍＬ）または塩類溶液のいずれかを静脈内注射した後、静脈内ＡＰＣ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ＡＰＣ及びスーパーＦＶａの投与は、尾部出血モデルにおける最適な結果を生じる条件に基づいていた（図１１）。尾部クリップ後のように、肝裂傷後の２０分間の平均失血は、塩類溶液（２９．５μＬ／ｇ、ｐ＝０．００７）を注射したマウスと比較して、ＡＰＣ（４０μＬ／ｇ）を注射したマウスにおいて有意に減少し、スーパーＦＶａを用いた処置は、平均失血を基線値まで有意に減少させた（２９μＬ／ｇ、ｐ＝０．０２）（図１３のＡ）。肝裂傷後の１回目の１０分間の間の平均失血は、ＡＰＣ注射後に顕著であり（３５．１μＬ／ｇ対塩類溶液２２．５μＬ／ｇ、ｐ＜０．０００１）、尾部クリップ後よりも有意に高かった（３５．１μＬ／ｇ対１３．７μＬ／ｇ、ｐ＜０．０００１）。それゆえ、尾部クリップモデルとは対照的に、わずかにより多量の出血しか２回目の１０分間の間に観察されなかった。１回目の１０分間の間のＡＰＣによって誘発される過剰な出血は、５４％の死亡率と関係していた。スーパーＦＶａを用いた処置は、１回目の１０分間の間に平均失血を３５．１μＬ／ｇから、対照野生型マウスにおける基線で観察される失血（２２．５μＬ／ｇ）と等価の２３．２μｌ／ｇへと矯正した（ｐ＝０．００１）だけでなく、出血誘発性死亡も抑止した（図１１）。
【０１６３】
（９．ヒト血漿におけるトロンビンのＡＰＣ誘発性減少に関する救出）
図１６における実験は、増大する濃度でのｒｈＦＶＩＩａが単独ではトロンビン生成に何ら効果を及ぼさなかったが、スーパーＦＶａはトロンビン生成を正常ヒト血漿のそれに至るレベルまで矯正したことを示す。対照的に、痕跡量のｒｈＦＶＩＩａ（１００ｎｇ／ｍＬ）をスーパーＦＶａへ添加すると、トロンビン生成が正常ヒト血漿をおよそ５０％上回って高まった。
【０１６４】
これらの実験は、ｒｈＦＶＩＩａとスーパーＦＶａとの組み合わせが、ヒト血漿におけるＡＰＣによって抑制されたトロンビン生成を相乗的に高めるという確かな証拠を提供する。用量発見研究は、トロンビン生成を正常レベルへ矯正するために、ｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせでスーパーＦＶａの最低最適濃度範囲を判定するのに有効であり得る。
【０１６５】
（１０．血餅溶解アッセイ結果）
正常ヒト血漿に及ぼす抗ＦＶＩＩＩ抗体の効果を研究するために、まず血餅溶解アッセイを実施した（図１７）。抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、５μｇ／ｍｌ超の抗体がＣＰＩ対照のレベルまで血餅溶解時間を短縮するのに十分であることを示した。１０μｇ／ｍｌ抗体濃度は、ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの効果を個々に、ならびにＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含有する正常ヒト血漿の血餅溶解に及ぼす相乗的な様式で研究する上でさらに使用した。
【０１６６】
ｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａは個々に、それぞれ２μｇ／ｍｌ及び約２〜５μｇ／ｍｌというより高濃度で抗ＦＶＩＩＩ抗体１０μｇ／ｍｌとともにインキュベートした正常ヒト血漿における血餅溶解時間の延長を示した（図１８）。しかしながら、それらの両方を併用した場合、血餅溶解時間は、低濃度のｒｈＦＶＩＩａで正常血漿のレベルまで２桁の程度まで、スーパーＦＶａにおいては１桁を超えるほど延長することを観察した（図１９）。本結果は、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含有する正常ヒト血漿の血餅溶解時間を矯正することに及ぼすｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの両方の相乗効果を明確に示唆している。図１８におけるＣＰＩ、阻害因子及び最高濃度のｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａのいずれかを含有する血漿試料を陰性対照として使用し、血餅溶解時間の延長がこれらの因子のうちのいずれかに実際に依拠しており、凝固カスケードのその他の構成要素が理由ではないことを示した。
【０１６７】
その上、さらに、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を単独で及びｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａとの組み合わせで含有する正常ヒト血漿の血餅溶解時間を矯正することは、ＦＶＩＩＩｄＰにおける血餅溶解時間を矯正するよう相乗的に作用することが示された（図２８）。
【０１６８】
（１１．ＦＶＩＩＩｄＰ及びＦＶＩＩＩ阻害性抗体含有ＮＨＰにおける血餅溶解に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの効果）
血餅の安定性を１０μｇ／ｍＬの抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＧＭＡ８０１５）及びＦＶＩＩＩｄＰを含有しているＮＨＰにおけるｔ−ＰＡ誘発性血餅溶解時間として試験した。抗体の濃度は、抗体力価のおよそ１０５分後〜７５分後の血餅溶解時間の最大の短縮に基づいていた（データ非表示）。抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下での血餅溶解時間は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化の抑制を生じるので、対照として使用するＣＰＩの存在下での血餅溶解時間と類似していた。ＮＨＰ及びＦＶＩＩＩｄＰにｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａを個々にまたは組み合わせて補充した。抗ＦＶＩＩＩ抗体含有ＮＨＰにおいて、増大する濃度のｒｈＦＶＩＩａまたはスーパーＦＶａは、血餅溶解時間の延長する長期化を実証した（図５）。血餅溶解時間は、４０ｎＭのｒｈＦＶＩＩａ（治療血漿濃度、図２８のＡ）または３．３３ｎＭのスーパーＦＶａ（図５Ｂ）において正常に回復した。血餅溶解時間を標準化するためのｒｈＦＶＩＩａの濃度は、痕跡量のスーパーＦＶａの存在下で約０．４ｎＭまで１００倍ほど低下することができた（０．３７ｎＭ）（図２８Ａ及び２８Ｂ）類似の結果は、本実験をＦＶＩＩＩｄＰにおいて実施した場合に得られた（データ非表示）。
【０１６９】
（実施例１６）
以下の材料及び方法を本実施例において使用した。
【０１７０】
（材料）
正常なプールしたヒト血漿（ＮＨＰ）をＧｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ（米国カンザス州オーバーランドパーク市）から購入した。以下の試薬、すなわちリバロキサバン（Ｘａｒｅｌｔｏ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、独国レーヴァークーゼン市）、アピキサバン（Ｅｌｉｑｕｉｓ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ、米国ニュージャージー州プリンストン市）、４因子ＰＣＣ（Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）、ＣＳＬ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、米国ペンシルベニア州キングオブプリンシア地区），組換えヒト組織因子（ＴＦ）（Ｄａｄｅ  Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、米国デラウェア州ニューアーク市）、トウモロコシトリプシン阻害薬（（ＣＴＩ）及びトロンビン（両方ともＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、米国インディアナ州サウスベンド市））、トロンビン標準物質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、米国ニュージャージー州パーシッパニー地区）、基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、スイス国ブーベンドルフ市）、組換えヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード地区）を使用した。リン脂質ベシクル（８０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）、２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ））はＡｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ（米国アラバマ州アラバスター市）から購入し、説明されているとおり調製した［１８］。
【０１７１】
（タンパク質調製）
組換えスーパーＦＶ（分子量１７４ｋＤａ）をＢドメイン欠失Ｓ２１８３ＡＦＶプラットフォーム上に作製し、説明されているとおり、抗ＦＶ３Ｂ１及びＨＶ５１０１モノクローナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせによって安定したトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の条件培地から精製した［１９］。スーパーＦＶタンパク質濃度は、製造元の説明書により、ＦＶε１％＝１６．９（アミノ酸組成を基にして算出）を用いた２８０ｎｍでの吸光度ならびにＤＮＡＳＴＡＲ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、ウィスコンシン州マディソン市）及びＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国インディアナ州サウスベンド市）を用いた１７４ｋＤａの分子量によって測定した。スーパーＦＶタンパク質は、プロトロンビナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）中で３７℃で２０分間、２ｎＭトロンビンを用いて活性化した。活性化は、１．１モル当量のヒルジンの添加によって終止した。
【０１７２】
（トロンビン生成アッセイ）
トロンビン生成または内在性トロンビン能（ＥＴＰ）アッセイは、説明されているとおり実施した［２０］。簡潔には、ＣＴＩ、ＴＦ、ＰＣＰＳを補充した血漿試料をリバロキサバン、アピキサバン、Ｋｃｅｎｔｒａ（登録商標）、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはスーパーＦＶａの存在下または非存在下で３７℃のベシクル中で血漿とともにプレインキュベートした。トロンビン生成は、ＨＢＳ／０．５％ＢＳＡ中のＣａＣｌ２及びＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの添加によって開始した。最終反応混合物は、１００μｌの総容積中の５０％血漿、０．７２５μＭ  ＣＴＩ、０．２ｐＭ  ＴＦ、４μＭ  ＰＣＰＳベシクル、０．５ｍＭ  Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ、７．６ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有していた。リバロキサバン、アピキサバン、Ｋｃｅｎｔｒａ（登録商標）、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはスーパーＦＶａの濃度は、結果の節において及び図の凡例において示す。蛍光は、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて３６０／４６０ｎＭの励起／発光波長において測定した。蛍光時間経過データは、説明されているとおり、ｎＭトロンビンへ変換した［２１］。曲線下面積（ＡＵＣ）として定義するＥＴＰ、及びピーク高は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて測定した。
【０１７３】
（結果）
ＮＯＡＣであるリバロキサバン及びアピキサバンの存在下でのＮＨＰ中でのトロンビン生成に及ぼすスーパーＦＶａ及びＦＶＩＩａの効果。
【０１７４】
リバロキサバンまたはアピキサバンをＮＨＰへ添加すると、ＥＴＰの最適な抑制が両薬剤についての用量滴定後に２００ｎＭの濃度で到達した（図２０及び図２１）。この濃度は、経口投与後のヒトにおいて達成したピーク血漿濃度に近似している［２２，２３］。阻害因子（９０μｇ／ｋｇ）を有する血友病患者についての最適な認可された用量におけるヒトにおける静脈内投与後の期待されるピーク血漿濃度に対応する２μｇ／ｍＬのｒｈＦＶＩＩａも、高濃度（４００ｎＭ）のスーパーＦＶａも、リバロキサバンまたはアピキサバン（２００ｎＭ）のいずれかを用いて抑制されたＮＨＰのＥＴＰを増強することはできなかった（図２０及び図２１）。しかしながら、リバロキサバンまたはアピキサバンの存在下での増大する濃度のスーパーＦＶａ（６．２５〜４００ｎＭ）とのｒｈＦＶＩＩａ（２μｇ／ｍＬ）の組み合わせは、基線を上回ってＥＴＰを約２倍、ピーク高を約１．５倍高めた。最大平衡状態効果は、２５〜５０ｎＭのスーパーＦＶａの濃度で到達し、より高濃度のスーパーＦＶａを用いてＥＴＰまたはピーク高にさらなる増大はなかった（図２０及び図２１）。
【０１７５】
ＮＯＡＣであるリバロキサバン及びアピキサバンの存在下でのＮＨＰ中でのトロンビン生成に及ぼすスーパーＦＶａ及びＫｃｅｎｔｒａ（商標）の効果。
【０１７６】
４因子ＰＣＣ  Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）は、ワーファリン誘発性出血の逆転のために認可され有効であり［９］、またしばしば、有効性に関する臨床的証拠のないＮＯＡＣ誘発性出血について適応外使用される。本発明者らはそれゆえ、リバロキサバンまたはアピキサバンのいずれかの存在下でのＮＨＰにおけるトロンビン生成アッセイを用いて、Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）単独またはスーパーＦＶａとの組み合わせの効果を研究した。Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）をＮＨＰへ、最高推奨用量（５０Ｕ／ｋｇ）の静脈内注入後の期待される血漿濃度（１．３５Ｕ／Ｍｌ）に近似する濃度で添加すると、Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）は単独では、リバロキサバンまたはアピキサバン（２０ｎＭ）のいずれかによって抑制されるトロンビン生成を亢進することはできなかった（図２２及び図２３）。しかしながら、ＥＴＰ及びピーク高に及ぼす相乗効果は、Ｋｃｅｎｔｒａ（商標）をスーパーＦＶａと組み合わせると観察された。固定した濃度（５０ｎＭ）のスーパーＦＶａで、リバロキサバンまたはアピキサバン（２００ｎＭ）の存在下で増大する濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）（０．０８〜１．３５Ｕ／ｍｌ）は、基線を超えて約４倍までＥＴＰ及び約２倍までピーク高を亢進した（図２２及び図２３）。同様に、固定した濃度のＫｃｅｎｔｒａ（商標）（１．３５Ｕ／ｍｌ）で、ＮＨＰへのスーパーＦＶａ（１．２５〜４００ｎＭ）の力価は、ＥＴＰ及びピーク高を両方とも、リバロキサバンまたはアピキサバン（２００ｎＭ）の存在下で基線を超えて約４倍まで亢進した（図２４）。
【０１７７】
（実施例１７）
以下の材料及び方法を本実施例に使用した。
【０１７８】
（動物）
説明する動物プロトコルはすべて、スクリップス研究所の動物実験委員会によって認可されたように実施した。ＦＶＩＩＩ欠損マウス（Ｂａｌｂ／ｃ背景）のいくつかの出血対は、Ｄａｖｉｄ  Ｌｌｌｉｃｒａｐ博士の寛大な贈呈品であった。８週齢以上の両性別のマウスを尾部出血アッセイに使用した。
【０１７９】
（ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける出血アッセイ）
マウスに麻酔をし、温度制御された加温パッド（３７℃）の上に置き、尾部の遠位部を１．５ｍｍ径で切断した後、尾部を事前に規定しておいた容積の３７℃の塩類溶液（０．９％ＮａＣｌ）中に２０分間浸漬した。失血は、２％酢酸を用いた赤血球溶解の後の塩類溶液中のヘモグロビン濃度によって判断し、４０５ｎｍでの吸光度によって測定した。規定した血液容積に由来するヘモグロビン標準物質を用いて、失血を、４６％のヘマトクリット値と仮定して算出し、μＬ／体重ｇで表した。ＦＶＩＩＩ欠損マウスの群に尾部切断前２分以内に等容積（２００μＭ）の注射用滅菌塩類溶液（０．９％、Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ．）、ｒｈＦＶＩＩＩ２００単位／ｋｇＦＶＩＩＩ（Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ、米国ニューヨーク州ニューヨーク市）、スーパーＦＶａ、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード市）またはスーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａの組み合わせを静脈内注射した（後眼窩）。薬剤はすべて、注射用の０．９％滅菌塩化ナトリウム（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ．）中に希釈した。ＦＶＩＩＩを用いる場合、ＦＶａバリアント投薬は、プロトロンビナーゼ共因子活性を基にし、それにより２０ｎＭの野生型ＦＶａの活性（ＦＶ血漿濃度に近似）を１単位として定義した。
【０１８０】
（統計分析）
スチューデントのｔ検定、または出血についてはクラスカル・ウォリスに続いて両側マン・ホイットニー検定を用いて、適宜、統計的有意性を評価した。０．０５以下のｐ値を統計的に有意とみなした。
【０１８１】
（結果）
スーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａを組み合わせることによる、ＦＶＩＩＩ欠損真数における急性尾部出血の効率的な処置。
【０１８２】
血友病における出血低下のための、スーパーＦＶａ単独での、及びｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせにおけるインビボでの効能を測定するために、２０分間の出血期中の失血をＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける尾部切断モデルにおいて測定した。スーパーＦＶａは、用量依存的様式で失血を有意に低下させた。最低用量のスーパーＦＶａ（１０Ｕ／ｋｇ）を注射したマウスにおける平均失血は、塩類溶液（２５．９μＬ／ｇ対２６．３μＬ／ｇ）と類似していたが、より多量の用量の注射で有意に改良した。平均失血は、４０及び２００Ｕ／スーパーＦＶａ  ｋｇにおいて９．７及び２．５μＬ／ｇまで低下した（ｐ＝０．００５）。最高用量のスーパーＦＶａ（２００μ／ｋｇ）で達成した失血の低下は、ｒｈＦＶＩＩＩ（２．９μＬ／ｇ）とは識別不能であった。既に報告したように、ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおけるｒｈＦＶＩＩａを用いた出血低下は、血友病患者において使用されるよりも１０〜１００倍多量で達成され得るに過ぎない（２１）。塩類溶液（２５．９μＬ／ｇ）と比較すると、１ｍｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａ（ヒトにおけるよりも約１０倍高い用量）及び３ｍｇ／ｒｈＦＶＩＩａ  ｋｇの注射後の平均失血は、１６．８μＬ／ｇ（ｐ＝０．１）及び７．２μＬ／ｇ（ｐ＝０．００３）まで低下し、これは、ｒｈＦＶＩＩＩ（２．９μＬ／ｇ、ｐ＝０．０３）とは有意に異なったままであった。低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のｒｈＦＶＩＩａを、出血の低下をまだ実証していなかった１０Ｕ／ｋｇの濃度でスーパーＦＶａと組み合わせると、１６．７μＬ／ｇから１０．２μＬ／ｇまでの平均失血の有意な減少が特記された（ｐ＝０．０５）。３ｍｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａを中程度の用量のスーパーＦＶａ（４０Ｕ／ｋｇ）と組み合わせると、出血は、ｒｈＦＶＩＩＩで観察されたものと類似して抑止された。平均失血は、ｒｈＦＶＩＩａを単独で用いた７．２μＬ／ｇから両分子を組み合わせた１．６μＬ／ｇまで減少した（ｐ＝０．０１）。組み合わせにおいて、これらの結果は、ＦＶＩＩＩ欠損真数における出血低下に及ぼすｒｈＦＶＩＩａ及びスーパーＦＶａの相乗効果を示唆している（図２５のＡ〜Ｃ）。
【０１８３】
スーパーＦＶａ及びｒｈＦＶＩＩａを組み合わせることによるＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける急性尾部出血の効率的な処置
【０１８４】
ＦＶＩＩＩ単独でのまたはｒｈＦＶＩＩａとの組み合わせでのいずれかのＦＶＩＩＩについての阻害因子の存在下で出血を低下させるスーパーＦＶａの効能をさらに明瞭にするために、２０分間の出血期の間の失血は、抗ＦＶＩＩＩ抗体（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したＢａｌｂ／ｃマウスにおける尾部切断モデルにおいて判断した。マウスにおける抗体のべセスダ単位を３５±２ＢＵ／ｍｌであると概算した。出血の有意な用量依存性低下は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスモデルにおける本発明者らの先行研究と合致するスーパーＦＶａを用いて観察された。低用量のスーパーＦＶａ（１０Ｕ／ｋｇ）が対照の塩類溶液注射したマウス（それぞれ１９．４７μＬ／ｇ対３０．９μＬ／ｇ）よりも有意な出血低下を示さなかったが、高用量のスーパーＦＶａ（４０Ｕ／ｋｇ）は、塩類溶液と比較して出血を有意に減少させた（９．９７μＬ／ｇ、ｐ＝０．００５）。同様に、低用量のｒｈＦＶＩＩａ（１ｍｇ／ｋｇ）は、出血を有意に減少させることはできなかった（２２．１８μＬ／ｇ）が、高用量の３ｍｇ／ｋｇ  ｒｈＦＶＩＩａは、出血を有意に減少させた（７．１３μＬ／ｇ、ｐ＝０．０００５）。低用量のスーパーＦＶａ（１０Ｕ／ｋｇ）とｒｈＦＶＩＩａ（１ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは互いに、有意な様式で出血を１０．７７μＬ／ｇ（ｐ＝０．００３）まで相乗的に減少させた（図２９）。本発明者らはさらに、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて処置したＢａｌｂ／ｃマウスの出血低下における効果を検査するために、本発明者らの実験室で精製したｍＦＶＩＩａを用いた。低濃度のｍＦＶＩＩａ（２０μｇ／ｋｇ）では、失血は塩類注射マウスとは有意に異なって。有意ではなかった（２７．２μｌ／ｇ）。しかしながら、９０μｇ／ｋｇ（ヒトにおけるｒｈＦＶＩＩａの治療量と類似の薬用量）では、有意な出血低下が観察された（８．７７μｌ／ｇ、ｐ＝０．０００９）。本発明者らが、低用量のスーパーＦＶａ（１０Ｕ／ｋｇ）及びｍＦＶＩＩａ（２０μｇ／ｋｇ）を組み合わせると、失血は、塩類注射マウスと比較して１６．１５μｌ／ｇまで有意に低下した（ｐ＝０．０１４１）（図２９のＡ／Ｂ）。
【０１８５】
本研究はまた、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて処置したＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｈＦＶＩＩａ及びｍＦＶＩＩａによる出血を低下させるのに必要な薬用量を直接比較することでも役に立ち（図３０）、このことは、ＦＶＩＩＩに対する阻害因子を含有する患者における出血合併症を治療する上で、スーパーＦＶａとｒｈＦＶＩＩａの相乗的関係の概念に関する証明を提供した。
【０１８６】
（結論）
出血の危険上昇は、種々の抗凝固薬を用いた療法を受けている患者において観察され、出血の危険性を低下させる止血支持薬についてのまだ対処されていない必要性がある。いくつかの臨床試験においては、野生型（ｗｔ）ＡＰＣ療法は、重症の出血に関する高い危険と関係していた。炎症性損傷及びＡＰＣが有益である疾患に関するほとんどの動物モデルにおいて、ＡＰＣの細胞保護効果は、ＡＰＣ療法の保護効果の原因であるのに対し、その抗凝固効果は必要でも寄与してもいなかった。したがって、出血に関する野生型ＡＰＣの抗凝固活性及び関連する危険性は、潜在的な新規の野生型ＡＰＣ療法についての制限因子であり得る。ＡＰＣの細胞保護活性に影響しない野生型ＡＰＣ抗凝固薬特異的対策または逆転薬の利用可能性は、非常に所望であろう。
【０１８７】
本発明者らは、血友病における止血を強力に標準化する操作されたＦＶａバリアントであるスーパーＦＶａが、野生型ＡＰＣ誘発性出血を低下させ得る止血支持生物製剤についての基準を満たすという仮説を立て、ここに本発明者らはこの仮説を検査した。スーパーＦＶａは、Ａ２ドメインとＡ３ドメインの間の操作されたジスルフィド結合（Ｃｙｓ６０９〜Ｃｙｓ１６９１）（ＦＶ（Ａ２−ＳＳ−Ａ３））に依拠して、野生型ＦＶａと比較して高い比活性を有し、その生物学的アッセイは、ＡＰＣ切断部位の突然変異（Ａｒｇ５０６／３０６／６７９Ｇｌｎ）によって、及びグリコシル化（Ｓｅｒ２１８３Ａｌａ）を変化させる突然変異によって増強される。スーパーＦＶａは、野生型ＡＰＣに対する耐性があることが発見され、止血特性を標準化され、野生型ＦＶａよりもはるかに効率的に血友病マウスモデルにおける出血を予防した。
【０１８８】
ａＰＴＴ凝血アッセイにおいて、スーパーＦＶａ及び野生型ＦＶａの両方は、野生型ＡＰＣを用いて凝血を長期化する場合、凝血時間を用量依存的に標準化した（ａＰＴＴ＞１００秒）。しかしながら、スーパーＦＶａは、野生型ＦＶａと比較して１００倍低い濃度でａＰＴＴを標準化した。ヒトまたはネズミのいずれかの血漿を用いるトロンビン生成アッセイにおいては、スーパーＦＶａは、野生型ＦＶａが効果を示さない濃度でトロンビン生成を完全に回復させた。
【０１８９】
エクスビボでの全血ａＰＴＴアッセイにおいて、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるネズミ組換え野生型ＡＰＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉｖ）注射は、凝血時間が３０秒から約６０秒まで２倍になった（ｎ＝４０）。全血へのスーパーＦＶａ（１ｎＭ）の添加は、ａＰＴＴ凝血時間を有意に標準化したのに対し、野生型ＦＶａは、有意な効果を示し損ねた。
【０１９０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける尾部クリップ出血モデルにおいて、ヒト組換えまたは血漿由来野生型ＡＰＣの注射（静脈内）は、１．２５ｍｇ／ｋｇで有意な出血を誘導し、平均失血は、塩類溶液を用いた３．４μＬ／ｇからＡＰＣ処理を用いた２７μＬ／ｇまで増加した。野生型ＡＰＣ投与の２分間前に注射したスーパーＦＶａ（静脈内、３．５ｍｇ／ｋｇ）は、出血を９．２μＬ／ｇまで有意に減少させた（ｎは１群当たり約１０匹）。
【０１９１】
別の出血モデルにおいて、肝裂傷は、急性器官損傷後の微小血管仲介性出血に関する重要な情報を提供するので使用した。血友病におけるマウス対対照マウスの解剖学的特徴及び検証について対照マウスにおいて使用するモデルの適応及び技術的改変の後、このモデルは、出血の信頼できる評価を提供し、尾部クリップ出血モデルと比較して、失血に関する個体間範囲が４倍低下した。ヒト野生型ＡＰＣの注射（静脈内）は、失血を２９μＬ／ｇから４９μＬ／ｇまで上昇させ、過剰量の出血は、約４０％の死亡率と関係していた。スーパーＦＶａは、野生型ＡＰＣ誘発性出血を２０分後に２９μＬ／ｇまで有意に減少させ、出血誘発性死亡を抑止した。
【０１９２】
顕著なことに、尾部クリップモデル及び肝裂傷モデルにおける出血パターンは、失血が損傷後の１回目及び２回目の１０分間に別個に判定された場合、異なっていた。尾部クリップモデルにおいて、尾部クリップ後の１回目及び２回目の１０分間の野生型ＡＰＣ誘発性出血及びスーパーＦＶａは、両相の間に失血を低下させた。肝裂傷モデルにおいて、ほとんどの失血は、損傷直後に生じ、２回目の１０分間の失血は、あまり顕著ではなかった。しかしながら、このモデルにおいて、スーパーＦＶａは、１回目の１０分間相の間に全体的に失血を矯正し、２回目の１０分間相の間に出血を完全に防止した。
【０１９３】
それゆえ、本発明者らの結果は、ＦＶａ、特にスーパーＦＶａがＡＰＣ関連出血を阻害または防止するのに使用され得ることを実証している。これに関して、重症出血は、概して抗凝固療法の頻繁な合併症であり（３２）、ＡＰＣ療法とともに報告されており（２１）、放射線損傷の軽減などの重要な徴候について野生型ＡＰＣの臨床的発達を複雑にし得る（３３）。ここで、本発明者らは、操作されたＦＶａバリアントであるスーパーＦＶａが、野生型ＡＰＣによって誘発される出血についての効率的な止血支持性逆転薬であることを実証している。
【０１９４】
本明細書で説明する場合、ＡＰＣ誘発性出血のための出血逆転薬としてのスーパーＦＶａの効果を研究するために、本発明者らは、用量応答による単回静脈内投与後のマウスにおける出血を誘発するためのＡＰＣの最適用量が１．２５ｍｇ／ｋｇであることを確立した。尾部クリップ後の個体間出血変化をできるだけ最善に克服するために必要なことを考慮すると、最適なＡＰＣ投薬は尾部クリップモデルにおいて確立されており、肝裂傷へその後適用された。両方の出血モデルにおいて、スーパーＦＶａは、ＡＰＣを用いて処置したマウスにおいて失血を有意に低下させた。１回目の１０分間以内の大量失血は、約５０％の死亡率と関係していた。顕著なことに、スーパーＦＶａは、ＡＰＣ処置を有さないマウスにおける失血と類似の有意な出血保護を提供しただけでなく、出血誘発性死亡も抑止した。
【０１９５】
スーパーＦＶａがＡＰＣ誘発性出血を防止する機序は、プロトロンビナーゼ複合体内でのＦＶａ活性補強と一致している。プロトロンビナーゼ複合体におけるＦＶａの存在は、トロンビン生成速度をおよそ１０,０００倍まで高めることは十分に説明されている（３６，３７）。しかしながら、ＦＶａはまた、Ａｒｇ５０６におけるタンパク質分解切断後のＡｒｇ３０６でのより緩徐な切断を介してＡＰＣによって迅速に失活する。Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（別名ＦＶライデン型）など、これらの失活切断部位の突然変異は、ＦＶａ共因子活性の半減期を延ばす。ＦＶａ及び特にＦＶａにＡＰＣ失活耐性を与える突然変異は、血友病患者及びマウスにおける研究から臨床的出血がそれていることを軽減することができる。ＦＶライデン型突然変異はいまや、血友病患者及び血友病マウスにおける疾患修飾因子であると許容されている（３４，３８）、その上、血友病マウスへのＦＶａの薬理学的投与は、凝固特性を改良すること（３４）ならびに出血及び失血がスーパーＦＶａによって非常により効率的に抑止されることを実証した。
【０１９６】
それゆえ、本発明者らは、スーパーＦＶａが、急性外傷性凝固障害における、重症敗血症及び、急性放射線損傷などの高いＡＰＣを結果的に生じ得る他の容態の治療における、介入に対する主要な懸念である野生型ＡＰＣ誘発性出血の防止及び逆転において有効であることを実証している（３３）。本発明者らの知見は、トロンビン生成の過程における最後の工程を構成するプロトロンビナーゼ複合体における共因子活性に依拠する止血支援役としてのスーパーＦＶａの有用性を示唆している。スーパーＦＶａによるＦＶａ活性の増強は、重症外傷性出血または複数の治療選択肢が生命を守る止血手段のためのいまだ対処されていない臨床的必要性とともに存在する新規の抗凝固薬を用いた出血など、重症の出血を治療する上で関連している。
【０１９７】
したがって、要約すると、本発明者らの結果は、スーパーＦＶａが単一療法として、または野生型ＡＰＣ誘発性出血の防止及び逆転における他の凝血原との組み合わせにおいて有効であるという確かな証拠を提供する。血友病における止血を改良することに加えて、スーパーＦＶａは、野生型ＡＰＣによって出血が誘発される２つの異なるマウスモデルにおける出血に対して保護する。すなわち、スーパーＦＶａは、出血が重傷な危険である状況における止血支持薬として使用すべきである。
【０１９８】
以下の参考文献は、本特許出願において引用される。これらの参考文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
（参考文献）
１．Ｄａｒｂｙ  ＳＣ，Ｋａｎ  ＳＷ，Ｓｐｏｏｎｅｒ  ＲＪ，Ｇｉａｎｇｒａｎｄｅ  ＰＬ，Ｈｉｌｌ  ＦＧ，Ｈａｙ  ＣＲ，Ｌｅｅ  ＣＡ，Ｌｕｄｌａｍ  ＣＡ，及びＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ．英国におけるＨＩＶに感染していなかった血友病Ａ患者または血友病Ｂ患者における死亡率、平均余命、及び死因（Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｒａｔｅｓ，ｌｉｆｅ  ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｐｅｏｐｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｗｈｏ  ｗｅｒｅ  ｎｏｔ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ）．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０（３）：８１５〜２５．
２．Ｇｏｕｗ  ＳＣ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｏｍ  ＪＧ，Ｌｊｕｎｇ  Ｒ，Ｅｓｃｕｒｉｏｌａ  Ｃ，Ｃｉｄ  ＡＲ、Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ−Ｄｏｎａｄｅｌ  Ｓ，ｖａｎ  Ｇｅｅｔ  Ｃ，Ｋｅｎｅｔ  Ｇ，Ｍａｋｉｐｅｒｎａａ  Ａ，Ｍｏｌｉｎａｒｉ  ＡＣら．重症血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ因子生成物及び阻害因子の発生（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６８（３）：２３１〜９．
３．Ｈａｙ  ＣＲ，ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ  ＤＭ，及びＳｔｕｄｙ  ＩＩＴ．国際免疫寛容試験の主要結果：無作為化した用量の比較（Ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｙ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｓｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（６）：１３３５〜４４．
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５．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｍ，Ｍｏｎｒｏｅ  ＤＭ，及びＲｏｂｅｒｔｓ  ＨＲ．活性化第ＶＩＩ因子は活性化血小板の表面上における第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を活性化する：高用量の活性化第ＸＩＩ因子の作用機序に関する概念（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＩＸ  ａｎｄ  Ｘ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：  ｔｈｏｕｇｈｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ）．Ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ＆  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ：  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．１９９８；９（付録１）（Ｓ６１〜５．
６．ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  Ｃ，及びＭａｎｎ  ＫＧ．第ＶＩＩ依存性凝固経路の調節：難治性出血性障害における組換え第ＶＩＩａ因子の有効性についての理論的解釈（Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ：  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．２０００；２６（４）：３６７〜７２．
７．Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｊ，Ｄｏｎｆｉｅｌｄ  ＳＭ，ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ  ＤＭ，Ｇｒｉｎｇｅｒｉ  Ａ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＳＡ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｊ，Ｂｅｒｎｔｏｒｐ  Ｅ，及びＧｒｏｕｐ  ＦＳ．阻害因子によって複雑化した血友病における迂回薬の無作為化した比較：ＦＥＩＢＡ  ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ比較（ＦＥＮＯＣ）試験（Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：  ｔｈｅ  ＦＥＩＢＡ  ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ（ＦＥＮＯＣ）Ｓｔｕｄｙ）．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９（２）：５４６〜５１．
８．Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｊ，Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏ  Ｅ，及びＫｅｉｔｈ  Ｈｏｏｔｓ  Ｗ．阻害因子における臨床上の問題（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２０１０；１６（付録５）（５４〜６０．
９．ｄｅ  Ｐａｕｌａ  ＥＶ，Ｋａｖａｋｌｉ  Ｋ，Ｍａｈｌａｎｇｕ  Ｊ，Ａｙｏｂ  Ｙ，Ｌｅｎｔｚ  ＳＲ，Ｍｏｒｆｉｎｉ  Ｍ，Ｎｅｍｅｓ  Ｌ，Ｓａｌｅｋ  ＳＺ，Ｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｗｉｎｄｙｇａ  Ｊら．阻害因子を伴う血友病患者における関節出血の治療のための組換え第ＶＩＩａ類似体（バトレプタコグアルファ［活性型］）：無作為化比較試験（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ａｎａｌｏｇ（ｖａｔｒｅｐｔａｃｏｇ  ａｌｆａ  ［ａｃｔｉｖａｔｅｄ］）  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｊｏｉｎｔ  ｂｌｅｅｄｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：  ＪＴＨ．２０１２；１０（１）：８１〜９．
１０．Ｍｏｓｓ  Ｊ，Ｓｃｈａｒｌｉｎｇ  Ｂ，Ｅｚｂａｎ  Ｍ，及びＭｏｌｌｅｒ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｔ．速効性組換えＦＶＩＩａ類似体の安全性及び薬物動態の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＦＶＩＩａ  ａｎａｌｏｇｕｅ，ＮＮ１７３１，ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍａｌｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ．２００９；７(２)：２９９〜３０５．
１１．Ｓｐｉｒａ  Ｊ，Ｐｌｙｕｓｈｃｈ  Ｏ，Ｚｏｚｕｌｙａ  Ｎ，Ｙａｔｕｖ  Ｒ，Ｄａｙａｎ  Ｉ，Ｂｌｅｉｃｈｅｒ  Ａ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｍ，及びＢａｒｕ  Ｍ．第ＶＩＩＩ因子に対する阻害因子を伴う血友病Ａ患者におけるペグ化リポソームとともに製剤化した第ＶＩＩａ因子の安全性、薬物動態及び効能−非盲検探索性クロスオーバー第Ｉ／ＩＩ相試験（Ｓａｆｅｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ−ａｎ  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ，ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ，ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ，ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ）．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２０１０；１６(６)：９１０〜８．
１２．Ｍｉｌａｎｏｖ  Ｐ，Ｉｖａｎｃｉｕ  Ｌ，Ａｂｒｉｓｓ  Ｄ，Ｑｕａｄｅ−Ｌｙｓｓｙ  Ｐ，Ｍｉｅｓｂａｃｈ  Ｗ，Ａｌｅｓｃｉ  Ｓ，Ｔｏｎｎ  Ｔ，Ｇｒｅｚ  Ｍ，Ｓｅｉｆｒｉｅｄ  Ｅ，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｔｔｒｕｍｐｆ  Ｊ．操作された第ＩＸ因子バリアントはマウスにおけるＦＶＩＩＩを迂回して血友病Ａ表現型を矯正する（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙｐａｓｓ  ＦＶＩＩＩ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（２）：６０２〜１１．
１３．Ｉｖａｎｃｉｕ  Ｌ，Ｔｏｓｏ  Ｒ，Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ  Ｐ，Ｐａｖａｎｉ  Ｇ，Ｋｉｍ  Ｈ，Ｓｃｈｌａｃｈｔｅｒｍａｎ  Ａ，Ｌｉｕ  ＪＨ，Ｃｌｅｒｉｎ  Ｖ，Ｐｉｔｔｍａｎ  ＤＤ，Ｒｏｓｅ−Ｍｉｒａｎｄａ  Ｒら．酵素前駆体様第Ｘａ因子バリアントは血友病における凝固欠損を矯正する（Ａ  ｚｙｍｏｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９（１１）：１０２８〜３３．
１４．Ｔｏｓｏ  Ｒ，Ｚｈｕ  Ｈ，及びＣａｍｉｒｅ  ＲＭ．第Ｘ因子酵素前駆体からプロテアーゼ状態への立体配座切り替えはエキソサイト発現及びプロトロンビナーゼ集合を仲介する（Ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｅｘｏｓｉｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８；２８３（２７）：１８６２７〜３５．
１５．Ｍａｎｎ  ＫＧ，Ｊｅｎｎｙ  ＲＪ，及びＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ  Ｓ．凝血酵素複合体の集合及び発現における共因子タンパク質（Ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８８；５７（９１５〜５６．
１６．Ｇａｌｅ  ＡＪ，Ｘｕ  Ｘ，Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ＪＬ，Ｇｅｔｚｏｆｆ  ＥＤ，及びＧｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．活性化プロテインＣによる凝固第Ｖａ因子の失活の機序の解明を可能にするドメイン間の操作されたジスルフィド結合（Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｖａ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００２；１１（９）：２０９１〜１０１．
１７．Ｌｕｓｈｅｒ  ＪＭ  ＫＣ，Ｇｒｅｅｎ  Ｄ．後天性血友病（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ：Ｅｘｃｅｒｐｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．；１９９５．
１８．Ｍｅｓｔｅｒｓ  ＲＭ，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡ，及びＧｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．抗凝固活性に必須なヒト活性化プロテインＣ（残基３９０〜４０４）の配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ３９０〜４０４）  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１；２６６（３６）：２４５１４〜９．
１９．Ｒａｄｔｋｅ  ＫＰ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ，Ｒｉｃｅｂｅｒｇ  Ｊ，及びＧａｌｅ  ＡＪ．ジスルフィド結合で安定化する第ＶＩＩＩ因子は第ＶＩＩＩａ因子の活性を長期化して全血凝血アッセイにおける効能を改良した（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｈａｓ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ．２００７；５(１)：１０２〜８．
２０．Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｇｉｅｓｅｎ  Ｐ，ＡｌＤｉｅｒｉ  Ｒ，Ｒｅｇｎａｕｌｔ  Ｖ，ｄｅ  Ｓｍｅｄ  Ｅ，Ｗａｇｅｎｖｏｏｒｄ  Ｒ，Ｌｅｃｏｍｐｔｅ  Ｔ，及びＢｅｇｕｉｎ  Ｓ．較正した自動トロンボグラム（ＣＡＴ）：凝固性亢進及び凝固性低下についての普遍的な所定の検査（Ｔｈｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（ＣＡＴ）：ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒ−  ａｎｄ  ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌａｂｉｌｉｔｙ）．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．２００２；３２（５〜６）：２４９〜５３．
２１．Ｂｅｒｎａｒｄ  ＧＲ，Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＬ，Ｌａｔｅｒｒｅ  ＰＦ，ＬａＲｏｓａ  ＳＰ，Ｄｈａｉｎａｕｔ  ＪＦ，Ｌｏｐｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ａら．重症敗血症についての組換えヒト活性化プロテインＣの効能及び安全性（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｓｅｐｓｉｓ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００１  ３月号；３４４（１０）：６９９〜７０９．
２２．Ｋｅｒｓｃｈｅｎ  ＥＪ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，Ｃｏｏｌｅｙ  ＢＣ,  Ｙａｎｇ  ＸＶ，Ｓｏｏｄ  Ｒ，Ｍｏｓｎｉｅｒ  ＬＯら．非抗凝固性活性化プロテインＣによる内毒血症及び敗血症の死亡率低下（Ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ  ａｎｄ  ｓｅｐｓｉｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｎ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００７  １０月号；２０４（１０）：２４３９〜４８．
２３．Ｍｏｓｎｉｅｒ  ＬＯ，Ｙａｎｇ  ＸＶ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．最小の抗凝固活性、正常な細胞保護活性、及びトロンビン活性化線溶阻害因子依存性細胞保護機能の保存を備えた活性化プロテインＣ突然変異体（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｎｏｒｍａｌ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  １１月号；２８２（４５）：３３０２２〜３３．
２４．Ｇａｌｅ  ＡＪ，Ｘｕ  Ｘ，Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ＪＬ，Ｇｅｔｚｏｆｆ  ＥＤ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．活性化プロテインＣによる凝固第Ｖａ因子の失活の機序に関する解明を可能にするドメイン間で操作されたジスルフィド結合（Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｖａ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００２  ９月号；１１（９）：２０９１〜１０１．
２５．Ｂｕｒｎｉｅｒ  Ｌ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．ＳＰＣ−５４抗体はネズミプロテインＣ系のインビボでの一過性遮断を提供する（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＳＰＣ−５４  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｓｙｓｔｅｍ）．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２０１３  ４月号；５０（４）：２５２〜８．
２６．ＭＥＳＴＥＲＳ  Ｒ，ＨＯＵＧＨＴＥＮ  Ｒ，ＧＲＩＦＦＩＮ  Ｊ．抗凝固活性に必須のヒト活性化プロテインＣ（残基３９０〜４０４）の配列の同定（ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｃ（ＲＥＳＩＤＵＥＳ  ３９０−４０４）  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＦＯＲ  ＩＴＳ  ＡＮＴＩＣＯＡＧＵＬＡＮＴ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１  １９９１年１２月２５日号；２６６（３６）：２４５１４〜９．
２７．Ｈｅｍｋｅｒ  Ｈ，Ｇｉｅｓｅｎ  Ｐ，ＡｌＤｉｅｒｉ  Ｒ，Ｒｅｇｎａｕｌｔ  Ｖ，ｄｅ  Ｓｍｅｄ  Ｅ，Ｗａｇｅｎｖｏｏｒｄ  Ｒら．凝固性亢進及び凝固性低下についての普遍的な所定の検査（Ｔｈｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（ＣＡＴ）：  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒ−  ａｎｄ  ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌａｂｉｌｉｔｙ）．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．２００２，２００２年９〜１２月号；３２（５〜６）：２４９〜５３．
２８．Ｌｕ  Ｇ，ＤｅＧｕｚｍａｎ  Ｆ，Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈ  Ｓ，Ｋａｒｂａｒｚ  Ｍ，Ａｂｅ  Ｋ，Ｌｅｅ  Ｇら．（Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｄｏｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３，２０１３年４月号；１９（４）：４４６〜＋．
２９．Ｋａｒａｋａｙａ  Ｋ，Ｕｃａｎ  Ｈ，Ｔａｓｃｉｌａｒ  Ｏ，Ｅｍｒｅ  Ａ，Ｃａｋｍａｋ  Ｇ，Ｉｒｋｏｒｕｃｕ  Ｏら．実験的肝裂傷における新たな止血薬であるアンカファード止血薬の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ  Ａｎｋａｆｅｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｔｏｐｐｅｒ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．２００９  ２００９；２２（３）：２０１〜６．
３０．Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ  Ｓ，Ｌｅｍａｒｉｅ  Ｃ，Ｐｅｎｇ  Ｈ，Ｇａｎｏｐｏｌｓｋｙ  Ｊ，Ｓｈｅｋ  Ｐ，Ｂｌｏｓｔｅｉｎ  Ｍ．（Ｓｕｒｆａｃｅ−ａｔｔａｃｈｅｄ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｃａｒｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．２０１２  ２０１２年１月号；７２（１）：１３６〜４２．
３１．Ｂａｊａｊ  Ｍ，Ｏｇｕｅｌｉ  Ｇ，Ｋｕｍａｒ  Ｙ，Ｖａｄｉｖｅｌ  Ｋ，Ｌａｗｓｏｎ  Ｇ，Ｓｈａｎｋｅｒ  Ｓら．ＫＤ１−Ｌ１７Ｒバリアントの繊維素溶解を選択的に阻害するためのヒト組織因子経路阻害因子２のクーニッツドメイン１（ＫＤ１）の操作（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｋｕｎｉｔｚ  Ｄｏｍａｉｎ  １（ＫＤ１）  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−２  ｔｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ  ＯＦ  ＫＤ１−Ｌ１７Ｒ  ＶＡＲＩＡＮＴ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１  ２０１１年２月号；２８６（６）：４３２９〜４０．
３２．Ｊａｓｕｊａ  ＧＫ，Ｒｅｉｓｍａｎ  ＪＩ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＲ，Ｂｅｒｌｏｗｉｔｚ  ＤＲ，Ｈｙｌｅｋ  ＥＭ，Ａｓｈ  ＡＳら．自動データを用いた主要出血の識別：抗凝固性を改良するための退役軍人業務試験（ＶＡＲＩＡ）の結果（Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍａｊｏｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄａｔａ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  ｓｔｕｄｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  （ＶＡＲＩＡ））．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３  １月号；１３１（１）：３１〜６．
３３．Ｇｅｉｇｅｒ  Ｈ，Ｐａｗａｒ  ＳＡ，Ｋｅｒｓｃｈｅｎ  ＥＪ，Ｎａｔｔａｍａｉ  ＫＪ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｉ，Ｌｉａｎｇ  ＨＰら．トロンボモジュリン−活性化プロテインＣ経路の薬理学的ターゲティングは放射線毒性を緩和する（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｉｔｉｇａｔｅｓ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２  ７月号；１８（７）：１１２３〜９．
３４．Ｓｃｈｌａｃｈｔｅｒｍａｎ  Ａ，Ｓｃｈｕｅｔｔｒｕｍｐｆ  Ｊ，Ｌｉｕ  ＪＨ，Ｆｕｒｌａｎ  Ｆｒｅｇｕｉａ  Ｃ，Ｔｏｓｏ  Ｒ，Ｐｏｎｃｚ  Ｍら．ライデン型第Ｖ因子はネズミ血友病モデルにおけるインビボでの止血を改良する（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｍｏｄｅｌ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ．２００５  １２月号；３（１２）：２７３０〜７．
３５．Ｍｅｉ  Ｂ，Ｐａｎ  Ｃ，Ｊｉａｎｇ  Ｈ，Ｔｊａｎｄｒａ  Ｈ，Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  Ｙら．血友病Ａちりょうのための完全に活性のある長時間作用型ペグ化第ＶＩＩＩ因子の合理的な設計（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ，ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）．Ｂｌｏｏｄ．２０１０  ７月１５日；１１６（２）：２７０〜９．
３６．Ｍａｎｎ  ＫＧ，Ｊｅｎｎｙ  ＲＪ，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ  Ｓ．凝血酵素複合体の集合及び発現における共因子タンパク質（Ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８８；５７：９１５〜５６．
３７．Ｎｅｓｈｅｉｍ  ＭＥ．アンチトロンビンＩＩＩとトロンビンの間のヘパリン触媒性反応の動態を説明する単純な速度の法則（Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｒａｔｅ  ｌａｗ  ｔｈａｔ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８３  １２月１０日号；２５８（２３）：１４７０８〜１７．
３８．Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ  Ｍ，Ｌｉｐｐｉ  Ｇ．（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０  ２月号；１２５（２）：１１９〜２３．
【０１９９】
実施例１６及び１７において引用した参考文献。
１  Ｍａｊｅｅｄ  Ａ，Ｓｃｈｕｌｍａｎ  Ｓ：新たな経口抗凝固薬における出血及び対策（Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｄｏｔｅｓ  ｉｎ  ｎｅｗ  ｏｒａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０１３；２６：１９１〜２０２．
２  Ｓｉｅｇａｌ  ＤＭ，Ｃｕｋｅｒ  Ａ：Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｊｏｒ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ２０１３；３５：３９１〜３９８．
３  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＳＪ，Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ  ＭＤ，Ｙｕｓｕｆ  Ｓ，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ  Ｊ，Ｏｌｄｇｒｅｎ  Ｊ，Ｐａｒｅｋｈ  Ａ，Ｐｏｇｕｅ  Ｊ，Ｒｅｉｌｌｙ  ＰＡ，Ｔｈｅｍｅｌｅｓ  Ｅ，Ｖａｒｒｏｎｅ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｓ，Ａｌｉｎｇｓ  Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ  Ｄ，Ｚｈｕ  Ｊ，Ｄｉａｚ  Ｒ，Ｌｅｗｉｓ  ＢＳ，Ｄａｒｉｕｓ  Ｈ，Ｄｉｅｎｅｒ  ＨＣ，Ｊｏｙｎｅｒ  ＣＤ，Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ  Ｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ Ｒ−ＬＳＣａ：心房細動患者におけるダビガトラン対ワーファリン（Ｄａｂｉｇａｔｒａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６１：１１３９〜１１５１．
４  Ｐａｔｅｌ  ＭＲ，Ｍａｈａｆｆｅｙ  ＫＷ，Ｇａｒｇ  Ｊ，Ｐａｎ  Ｇ，Ｓｉｎｇｅｒ  ＤＥ，Ｈａｃｋｅ  Ｗ，Ｂｒｅｉｔｈａｒｄｔ  Ｇ，Ｈａｌｐｅｒｉｎ  ＪＬ，Ｈａｎｋｅｙ  ＧＪ，Ｐｉｃｃｉｎｉ  ＪＰ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＲＣ，Ｎｅｓｓｅｌ  ＣＣ，Ｐａｏｌｉｎｉ  ＪＦ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＳＤ，Ｆｏｘ  ＫＡ，Ｃａｌｉｆｆ  ＲＭ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ＲＡ：  非弁膜性心房細動におけるリバロキサバン対ワーファリン（Ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎｖａｌｖｕｌａｒ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５：８８３〜８９１．
５  Ｇｒａｎｇｅｒ  ＣＢ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＪＨ，ＭｃＭｕｒｒａｙ  ＪＪ，Ｌｏｐｅｓ  ＲＤ，Ｈｙｌｅｋ  ＥＭ，Ｈａｎｎａ  Ｍ，Ａｌ−Ｋｈａｌｉｄｉ  ＨＲ，Ａｎｓｅｌｌ  Ｊ，Ａｔａｒ  Ｄ，Ａｖｅｚｕｍ  Ａ，Ｂａｈｉｔ  ＭＣ，Ｄｉａｚ  Ｒ，Ｅａｓｔｏｎ  ＪＤ，Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ  ＪＡ，Ｆｌａｋｅｒ  Ｇ，Ｇａｒｃｉａ  Ｄ，Ｇｅｒａｌｄｅｓ  Ｍ，Ｇｅｒｓｈ  ＢＪ，Ｇｏｌｉｔｓｙｎ  Ｓ，Ｇｏｔｏ  Ｓ，Ｈｅｒｍｏｓｉｌｌｏ  ＡＧ，Ｈｏｈｎｌｏｓｅｒ  ＳＨ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｊ，Ｍｏｈａｎ  Ｐ，Ｊａｎｓｋｙ  Ｐ，Ｌｅｗｉｓ  ＢＳ，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｎｄｏｎ  ＪＬ，Ｐａｉｓ  Ｐ，Ｐａｒｋｈｏｍｅｎｋｏ  Ａ，Ｖｅｒｈｅｕｇｔ  ＦＷ，Ｚｈｕ  Ｊ，Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ  Ｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ＡＣａ：心房細動患者におけるアピキサバン対ワーファリン（Ａｐｉｘａｂａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５：９８１〜９９２．
６  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＳＪ，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ  Ｊ，Ｊｏｙｎｅｒ  Ｃ，Ｄｉｅｎｅｒ  ＨＣ，Ｈａｒｔ  Ｒ，Ｇｏｌｉｔｓｙｎ  Ｓ，Ｆｌａｋｅｒ  Ｇ，Ａｖｅｚｕｍ  Ａ，Ｈｏｈｎｌｏｓｅｒ  ＳＨ，Ｄｉａｚ  Ｒ，Ｔａｌａｊｉｃ  Ｍ，Ｚｈｕ  Ｊ，Ｐａｉｓ  Ｐ，  Ｂｕｄａｊ  Ａ，Ｐａｒｋｈｏｍｅｎｋｏ  Ａ，Ｊａｎｓｋｙ  Ｐ，Ｃｏｍｍｅｒｆｏｒｄ  Ｐ，Ｔａｎ  ＲＳ，Ｓｉｍ  ＫＨ，Ｌｅｗｉｓ  ＢＳ，Ｖａｎ  Ｍｉｅｇｈｅｍ  Ｗ，Ｌｉｐ  ＧＹ，Ｋｉｍ  ＪＨ，Ｌａｎａｓ−Ｚａｎｅｔｔｉ  Ｆ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｈｅｒｍｏｓｉｌｌｏ  Ａ，Ｄａｎｓ  ＡＬ，  Ｍｕｎａｗａｒ  Ｍ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｍ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｊ，Ｌｅｗｉｓ  Ｇ，Ａｆｚａｌ  Ｒ，Ｙｕｓｕｆ  Ｓ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ＡＳＣａ：  心房細動患者におけるアピキサバン（Ａｐｉｘａｂａｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６４：８０６〜８１７．
７  Ｐｒｉｎｓ  ＭＨ，Ｌｅｎｓｉｎｇ  ＡＷ，Ｂａｕｅｒｓａｃｈｓ  Ｒ，ｖａｎ  Ｂｅｌｌｅｎ  Ｂ，Ｂｏｕｎａｍｅａｕｘ  Ｈ，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  ＴＡ，Ｃｏｈｅｎ  ＡＴ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ，Ｄｅｃｏｕｓｕｓ  Ｈ，Ｒａｓｋｏｂ  ＧＥ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＳＤ，Ｗｅｌｌｓ  ＰＳ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  Ｅ：  症候性静脈血栓塞栓症の治療のための経口リバロキサバン対標準療法：アインシュタイン−ｄｖｔ及びｐｅ無作為化試験のプールした分析（Ｏｒａｌ  ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ：  Ａ  ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｉｎｓｔｅｉｎ−ｄｖｔ  ａｎｄ  ｐｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｉｅｓ）．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｊ  ２０１３；１１：２１．
８  Ｓｃｈｕｌｍａｎ  Ｓ，Ｋｅａｒｏｎ  Ｃ，Ｋａｋｋａｒ  ＡＫ，Ｍｉｓｍｅｔｔｉ  Ｐ，Ｓｃｈｅｌｌｏｎｇ  Ｓ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｈ，Ｂａａｎｓｔｒａ  Ｄ，Ｓｃｈｎｅｅ  Ｊ，Ｇｏｌｄｈａｂｅｒ  ＳＺ，Ｇｒｏｕｐ  Ｒ−ＣＳ：  急性静脈血栓塞栓症の治療におけるダビガトラン対ワーファリン（Ｄａｂｉｇａｔｒａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）. Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６１：２３４２−２３５２．
９  Ｑｕｉｎｌａｎ  ＤＪ，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ  ＪＷ，Ｗｅｉｔｚ  ＪＩ： 大量出血患者におけるビタミンＫアンタゴニストの急な逆転のための４因子プロトロンビン複合体濃縮物（Ｆｏｕｒ−ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｕｒｇｅｎｔ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｊｏｒ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１３；１２８：１１７９〜１１８１.
１０  Ｐａｂｉｎｇｅｒ Ｉ, Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｂ, Ｋａｌｉｎａ Ｕ, Ｋｎａｕｂ Ｓ, Ｎａｇｙ Ａ, Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ Ｈ, Ｇｒｏｕｐ ＢＰＮＡＲＳ： 救急抗凝固性逆転のためのプロトロンビン複合体濃縮物（ベリプレックスｐ／ｎ）前向き多国籍臨床試験（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ （ｂｅｒｉｐｌｅｘ ｐ・ｎ） ｆｏｒ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅｒｓａｌ：  Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）. Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００８；６：６２２〜６３１．
１１  Ｌｉｐｐｉ  Ｇ，Ｆａｖａｌｏｒｏ  ＥＪ，Ｃｅｒｖｅｌｌｉｎ  Ｇ：  大量外傷後出血：  疫学、原因、臨床的特徴、及び治療管理（Ｍａｓｓｉｖｅ  ｐｏｓｔｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ：  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｃａｕｓｅｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２０１３；３９：８３〜９３．
１２  Ｌｏｇａｎ  ＡＣ，Ｇｏｏｄｎｏｕｇｈ  ＬＴ：  適応外設定における効能及び安全性に関する証拠の評価（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｖｉｉａ：  Ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｆｆ−ｌａｂｅｌ  ｓｅｔｔｉｎｇ）．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ２０１０；２０１０：１５３〜１５９．
１３  Ｍａｒｌｕ Ｒ，Ｈｏｄａｊ  Ｅ，Ｐａｒｉｓ  Ａ，Ａｌｂａｌａｄｅｊｏ  Ｐ，Ｃｒａｃｏｗｓｋｉ  ＪＬ，Ｃｒａｃｋｏｗｓｋｉ  ＪＬ，Ｐｅｒｎｏｄ  Ｇ：  ダビガトラン及びリバロキサバンの抗凝固活性に及ぼす非特異的逆転薬の効果：健常ボランティアにおける無作為化クロスオーバーエクスビボ試験（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｄａｂｉｇａｔｒａｎ  ａｎｄ  ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ：  Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１２；１０８：２１７〜２２４．
１４  Ｓｋｏｌｎｉｃｋ  ＢＥ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＤＲ，Ｋｈｕｔｏｒｙａｎｓｋｙ  ＮＭ，Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ＡＥ，Ｃａｒｒ  ＭＥ：  健常対象者におけるｒｆｖｉｉａを有するワーファリンの逆転に及ぼす探索性研究（Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｆｖｉｉａ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１６：６９３〜７０１．
１５  Ｔａｎａｋａ  ＫＡ，Ｇｒｕｂｅｒ  Ａ，Ｓｚｌａｍ  Ｆ，Ｂｕｓｈ  ＬＡ，Ｈａｎｓｏｎ  ＳＲ，Ｄｉ  Ｃｅｒａ  Ｅ：  トロンビン突然変異体ｗ２１５ａ／ｅ２１７ａと直接的なトロンビン阻害因子の間の相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｗ２１５ａ/ｅ２１７ａ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ２００８；１９：４６５〜４６８．
１６  Ｓｃｈｉｅｌｅ  Ｆ，ｖａｎ  Ｒｙｎ  Ｊ，Ｃａｎａｄａ  Ｋ，Ｎｅｗｓｏｍｅ  Ｃ，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ  Ｅ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｎａｒ  Ｈ， Ｌｉｔｚｅｎｂｕｒｇｅｒ  Ｔ：  ダビガトランに特異的な対策：機能的及び構造的特徴づけ（Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｄｏｔｅ  ｆｏｒ  ｄａｂｉｇａｔｒａｎ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）．Ｂｌｏｏｄ  ２０１３；１２１：３５５４〜３５６２．
１７  Ｌｕ  Ｇ，ＤｅＧｕｚｍａｎ  ＦＲ，Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈ  ＳＪ，Ｋａｒｂａｒｚ  ＭＪ，Ａｂｅ  Ｋ，Ｌｅｅ  Ｇ，Ｌｕａｎ  Ｐ，Ｈｕｔｃｈａｌｅｅｌａｈａ  Ａ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｍ，Ｃｏｎｌｅｙ  ＰＢ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＤＲ，Ｓｉｎｈａ  Ｕ：  凝固第Ｘａ因子の直接的および間接的阻害因子による抗凝固の逆転に特異的な対策（Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｄｏｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｘａ）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１３；１９：４４６〜４５１．
１８  Ｍｅｓｔｅｒｓ  ＲＭ，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ：  抗凝固活性に必須のヒト活性化プロテインＣ（残基３９０〜４０４）の配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃ（ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ３９０〜４０４）  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１；２６６：２４５１４〜２４５１９．
１９  Ｇａｌｅ  ＡＪ，Ｘｕ  Ｘ，Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ＪＬ，Ｇｅｔｚｏｆｆ  ＥＤ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ：  活性化プロテインＣによる凝固第Ｖａ因子の失活の機序に関する解明を可能にするドメイン間の操作されたジスルフィド結合（Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｖａ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃ）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ ：  ａ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００２；１１：２０９１〜２１０１．
２０  Ｒａｄｔｋｅ  ＫＰ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ，Ｒｉｃｅｂｅｒｇ  Ｊ，Ｇａｌｅ  ＡＪ：  ジスルフィド結合で安定化した因子ＶＩＩＩは全血凝血アッセイにおける第ＶＩＩＩａ因子活性を長期化して効能を改良する（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｖｉｉｉ  ｈａｓ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｖｉｉｉａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：  ＪＴＨ  ２００７；５：１０２〜１０８．
２１  Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｇｉｅｓｅｎ  Ｐ，ＡｌＤｉｅｒｉ  Ｒ，Ｒｅｇｎａｕｌｔ  Ｖ，ｄｅ  Ｓｍｅｄ  Ｅ，Ｗａｇｅｎｖｏｏｒｄ  Ｒ，Ｌｅｃｏｍｐｔｅ  Ｔ，Ｂｅｇｕｉｎ  Ｓ：  較正した自動トロンボグラム（ｃａｔ）：凝固性亢進及び凝固性低下についての普遍な所定の検査（Ｔｈｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（ｃａｔ）：  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒ−  ａｎｄ  ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌａｂｉｌｉｔｙ）．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ２００２；３２：２４９〜２５３．
２２  Ｆｒｏｓｔ  Ｃ，Ｎｅｐａｌ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ａ，Ｂｙｏｎ  Ｗ，Ｂｏｙｄ  ＲＡ，Ｙｕ  Ｚ，Ｓｈｅｎｋｅｒ  Ａ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＹＣ，Ｍｏｓｑｕｅｄａ−Ｇａｒｃｉａ  Ｒ，Ｌａｃｒｅｔａ  Ｆ：  健常対象者における第Ｘａ因子阻害因子アピキサバンの複数回経口投与の安全性、薬物動態及び薬力学（Ｓａｆｅｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒａｌ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ａｐｉｘａｂａｎ，ａ  ｆａｃｔｏｒ ｘａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）．Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１３；７６：７７６〜７８６．
２３  Ｋｕｂｉｔｚａ  Ｄ，Ｂｅｃｋａ  Ｍ，Ｍｕｅｃｋ  Ｗ，Ｚｕｅｈｌｓｄｏｒｆ  Ｍ：  経口的直接的第Ｘａ因子阻害因子であるリバロキサバン（湾部５９〜７９３９）は、ナプロキセンとの臨床的に関連する相互作用を有していない（Ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ（ｂａｙ  ５９〜７９３９）−ａｎ  ｏｒａｌ，ｄｉｒｅｃｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｘａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｈａｓ  ｎｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎａｐｒｏｘｅｎ）．Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００７；６３：４６９〜４７６．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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