(57)【要約】  ここに開示されるのはがん細胞又は腫瘍微小環境にあるその周りの正常組織における所定のｍｉＲＮＡの差次的発現を検出するための方法及び組成物である。本開示は、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡを含む任意の細胞性ＲＮＡ分子の検出のための自動で高感度の特異的方法を記載する。該技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）サンプル中のＲＮＡ分子の検出のためのプローブデザイン並びに自動化された形でのプローブの使用を含む。
2017506913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡに特異的なＸ個の一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含むプローブセットを含み、Ｘ≧２であり、該プローブは標的ＲＮＡ内のＸ個の別個の部分を標的にし、各２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされ、検出可能部分は、シグナル増幅のための反応性色原体コンジュゲート系に結合するように適合化されている、明視野インサイチューハイブリダイゼーションのためのシステム。
【請求項２】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが、それぞれ長さが１５から３０のヌクレオチド、２０から５０のヌクレオチド、４０から８０のヌクレオチド、２０から１００のヌクレオチド、又は２０から２００のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが、少なくとも二つの検出可能部分、少なくとも三つの検出可能部分、少なくとも四つの検出可能部分、又は 少なくとも五つの検出可能部分にそれぞれコンジュゲートされる、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
Ｘ＝３である、請求項１から３の何れか一項に記載のシステム。
【請求項５】
Ｘ＝４である、請求項１から３の何れか一項に記載のシステム。
【請求項６】
検出可能部分がハプテンを含む、請求項１から５の何れか一項に記載のシステム。
【請求項７】
ハプテンがジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
反応性色原体コンジュゲート系がチラミド−ハプテンコンジュゲートを含む、請求項１から６の何れか一項に記載のシステム。
【請求項９】
プローブがそれぞれ、プローブの２０塩基対当たり少なくとも一つの検出可能部分を含む、請求項１から８の何れか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段を更に含む、請求項１から９の何れか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段が、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる手段を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
標的マイクロＲＮＡを可視化する手段を更に含み、検出可能部分が反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロＲＮＡを示している、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
標的マイクロＲＮＡを可視化する手段が明視野顕微鏡を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
マイクロＲＮＡ標的の明視野インサイチュー検出のためのシステムにおいて、
標的マイクロＲＮＡに特異的な一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含む標的プローブであって、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブがプローブの３’端又は５’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされている標的プローブと；
シグナル増幅に効果的な反応性色原体コンジュゲート系であって、標的プローブの検出可能部分に結合するように適合化されている反応性色原体コンジュゲート系と
を含むシステム。
【請求項１５】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが１５から３０のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
プローブが、プローブの３’端に配された第一検出可能部分とプローブの５’端に配された第二検出可能部分とを含む、請求項１４又は１５に記載のシステム。
【請求項１７】
検出可能部分がハプテンを含む、請求項１４から１６の何れか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
ハプテンがジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
反応性色原体コンジュゲート系がチラミド−ハプテンコンジュゲートを含む、請求項１４から１８の何れか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段を更に含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段が、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
標的マイクロＲＮＡを可視化する手段を更に含み、検出可能部分が反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロＲＮＡを示している、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
標的マイクロＲＮＡを可視化する手段が明視野顕微鏡を含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
標的ＲＮＡに対して発色性に染色がなされた複数の細胞を含むスライドであって、請求項１から２３の何れか一項に記載のシステムを使用して作製されているスライド。
【請求項２５】
サンプルを抗原回収試薬と接触させる工程； 
プローブがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で請求項１から２３の何れか一項に記載のシステムのプローブとサンプルを接触させる工程；
サンプルをすすいで未結合プローブを除去する工程；及び
検出可能部分を可視状態にすることにより標的ＲＮＡを検出する工程
を含む、明視野インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２６】
細胞形態を保つ条件を使用する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
プローブセットがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的ＲＮＡに特異的なプローブとサンプルを接触させる工程であって、プローブセットがＸ個の一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含み、Ｘ≧２であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは標的ＲＮＡ内のＸ個の別個の部分を標的にし、各２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされている工程；
第一酵素にコンジュゲートされた第一抗検出可能部分抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体がＸ個の一意的ＲＮＡプローブに特異的である工程；
反応性色原体コンジュゲートにサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲートを第一抗検出可能部分抗体と周囲の組織に結びつける工程；及び
第二酵素にコンジュゲートされた第二抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗体が反応性色原体コンジュゲートに対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的ＲＮＡを示す工程
を含む、インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２８】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的ＲＮＡに特異的な２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブとサンプルを接触させる工程であって、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが、５’端か３’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされ、長さが１５から３０のヌクレオチドである工程；
第一酵素にコンジュゲートされた第一抗検出可能部分抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体が２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブに特異的である工程；
反応性色原体コンジュゲートにサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲートを第一抗検出可能部分抗体に結びつける工程；及び
第二酵素にコンジュゲートされた第二抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗体が反応性色原体コンジュゲートに対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的ＲＮＡを示す工程
を含む、インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２９】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが二つの検出可能部分とコンジュゲートされている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
検出可能部分がジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
第一ハプテンがプローブの３’端に位置させられ、第二ハプテンがプローブの５’端に位置させられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
反応性色原体コンジュゲートがチラミド色原体コンジュゲートを含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この開示は、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡを含む任意の細胞性ＲＮＡ分子の自動化された高感度で特異的な検出方法に関する。該技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）サンプル中のＲＮＡ分子の検出のためのプローブ設計並びに自動化方式でのプローブ使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムは、多様な細胞機能を調節する千を超える短い（１７−２４塩基）ノンコーディングマイクロＲＮＡ分子をコードしている。これらの機能の幾つかは、細胞増殖、運動性、及び免疫監視を含み、腫瘍形成に関与していることが知られている。驚くことではないが、多くのマイクロＲＮＡが乳がん、結腸直腸がん、肺がん、及び前立腺がんを含む様々な疾患に対する強力な予後及び／又は予測バイオマーカーとなるであろうことを数多くの臨床研究が示唆している。しかしながら、それらの短い配列長のため、これらの潜在的なバイオマーカー標的の検出に対して技術的な障害が存在する：短いプローブは可視シグナルを生じさせるために著しい増幅技術を必要とするので（ｉ）限られた標的配列がプローブ長と続く標的特異性、並びに（ｉｉ）検出感度を制限し；最後に（ｉｉｉ）低分子マイクロＲＮＡ標的は組織中で安定性が少ない場合がある（リボヌクレアーゼ感度の増加及び／又は細胞性成分への架橋の制限）。
【０００３】
マイクロＲＮＡは、主に翻訳を阻害し、及び／又はｍＲＮＡ分解を促進することによってタンパク質発現を調節する（Lin He及びGregory J. Hannon Nat. Rev. Genetics 5, 522-531）。ｍＲＮＡの５０％以上が一又は複数のｍｉＲＮＡによって調節されると推定され、単一のｍｉＲＮＡが数個から数十の遺伝子を調節しうる。ｍｉＲＮＡは多くの生理的及び病理過程において機能することが証明されている。ｍｉＲＮＡは腫瘍抑制因子又は癌遺伝子として機能しうる（Esquela-Kerscher等 Nat. Rev. Cancer 6, 259-269.）。
【０００４】
商業的に利用できる幾つかのＲＮＡ検出技術がある。ヴェンタナメディカルシステムズ社には、市販の検出化学品（ＩＳＨ ｉＶＩＥＷブループラス検出キットカタログ番号：７６０−０９７）と共にＦＦＰＥＴ中の自動カッパ（カッパＤＮＰプローブカタログ番号：４９５−５２４）及びラムダ（ラムダＤＮＰプローブカタログ番号：６６４−６９３）軽鎖ｍＲＮＡ発現のための製品がある。この技術は２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ又は増幅（例えば、チラミドシグナル増幅）を使用しない。アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス（ＡＣＤ）には、そのＲＮＡＳｃｏｐｅ技術を用いたｍＲＮＡの手動検出のための幅広い製品群がある。ハイブリダイゼーション後に分岐ＤＮＡ技術によって媒介された広範な増幅が、シグナルを検出のために十分に増幅させるために使用される。分岐ＤＮＡ増幅後に色原体インサイチューハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）と蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の双方の検出がＡＣＤによって提案されている。この技術は、ヴェンタナ・ディスカバリー機器によって提供される限られた部分的な自動化を伴い、手動で主に使用される。ここに開示される技術によって克服される実質的な制約は、それが、最小３００塩基のＲＮＡ標的長を必要とすることである；従って、ＡＣＤ技術は、マイクロＲＮＡ標的を検出することができない。Ｅｘｉｑｏｎ社はマイクロＲＮＡ検出のためにロックド核酸オリゴヌクレオチドプローブを提供する；該技術はプローブデザインと合成に限られており、如何なる特定の手動又は自動検出能力（色原体又はフルオロフォア発現又は沈着）ももたらさない。
【発明の概要】
【０００５】
この開示は、組織、特にホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）中の、分泌性因子のメッセンジャーＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡを含む全てのＲＮＡ種のインサイチュー検出のための、新規で高感度の完全に自動化されたアッセイを記載する。検出可能部分（例えばハプテン）で標識された２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ標的分子に対するインサイチューハイブリダイゼーションのプローブとして使用できることが発見された。そのプローブは、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ、又はリボプローブと比較して標的ＲＮＡ分子に対して増加したインサイチュー結合親和性を有しており、よって増加したアッセイ感度を提供することが発見された。更に、２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが組織染色の点でＲＮＡプローブより又は更にはＤＮＡプローブよりも優れたヌクレアーゼ耐性を有していることが発見された。
【０００６】
而して、新技術によって与えられる二つの利益は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ又はＲＮＡプローブよりもＲＮＡ標的に対してより高親和性を有していることと、メチル基がＲＮアーゼ及び他のリボヌクレアーゼに対する耐性を付与することである。特定の実施例では、ｍｉＲＮＡに対するプローブが開発された。幾つかの実施態様では、各ｍｉＲＮＡプローブは、直接合成されたか（ＤＮＰ）又はアミン修飾とついでハプテン化ＮＨＳを使用する何れかの二つのハプテンで標識される。
【０００７】
本技術は、堅牢で効率的なツールで、がん細胞又は腫瘍微小環境におけるそれらの周囲の正常組織中でのある種のｍｉＲＮＡの差次的発現を探索することを可能にしようとするものである。このツールでそのようなことを可能にすると、本技術は、がんの診断と治療のための効果的なツールとして使用可能となる。
【０００８】
本開示では、より長いＲＮＡ標的の検出のために設計された修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブと高感度のチラミド−ハプテン／銀検出を含む、新しいＲＮＡ検出技術を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中のマイクロＲＮＡ標的の自動検出に採用した。
【０００９】
例証的な実施態様では、組織サンプル中の標的ＲＮＡを検出するための方法が開示される。該方法は、サンプルを抗原回収試薬と接触させ；サンプルを、プローブがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で標識された合成２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブと接触させ；未結合プローブを除くようにサンプルをすすぎ；標的ＲＮＡの近位に複数の増幅標識を沈着させるようにサンプルを増幅試薬に接触させ；標的ＲＮＡの近位に検出可能標識を沈着させるようにサンプルを検出試薬に接触させ；検出可能標識を可視化することにより標的ＲＮＡを検出することを含む。一実施態様では、標識された合成２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブは、約２０から約２００、約２０から約１００ヌクレオチド長である。他の実施態様では、該方法は、細胞形態を保つ条件を使用する。
【００１０】
また開示されるのは、ここに開示されたプローブ又はプローブセットの一又は複数を含むキットである。場合によっては、キットは更なる試薬、例えばシグナル増幅試薬（例えば、反応性色原体コンジュゲート系試薬）を含みうる。
【００１１】
本発明の方法は一を超える（例えば、２、３、４等の）異なった標的の検出を可能にしうる。幾つかの実施態様では、異なった検出可能な標識及び／又は検出系は、それぞれが単一のサンプル中で個々に検出されうるように標的のそれぞれに対して使用されうる。任意の適切な検出可能な標識及び／又は検出系が使用されうる。
【００１２】
より特定的には、本発明は明視野インサイチューハイブリダイゼーションのためのシステムを特徴付ける。幾つかの実施態様では、該システムは、標的ＲＮＡに特異的なＸ個の一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含むプローブセットを含み、ここで、Ｘ≧２（例えば、Ｘ＝２、Ｘ＝３、Ｘ＝４、Ｘ＝５等）であり、該プローブは標的ＲＮＡ内のＸ個の個別の部分を標的とする。各２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされうる。検出可能部分は、シグナル増幅のための反応性色原体コンジュゲート系（例えばチラミド色原体コンジュゲート系）に結合するように適合化されうる。幾つかの実施態様では、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは、それぞれ長さが１５から３０のヌクレオチド、２０から５０のヌクレオチド、４０から８０のヌクレオチド、２０から１００のヌクレオチド、又は２０から２００のヌクレオチドを含む。
【００１３】
幾つかの実施態様では、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは、それぞれ少なくとも二つの検出可能部分、少なくとも三つの検出可能部分、少なくとも四つの検出可能部分、又は少なくとも五つの検出可能部分とコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、検出可能部分はハプテンを含む。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む。幾つかの実施態様では、反応性色原体コンジュゲート系は、チラミド−ハプテンコンジュゲート、又は他の適当なコンジュゲート系を含む。幾つかの実施態様では、プローブはそれぞれプローブの２０塩基対当たり少なくとも一つの検出可能部分を含む。
【００１４】
幾つかの実施態様では、該システムは、標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段を更に含む。幾つかの実施態様では、標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段は、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系は色を発する。幾つかの実施態様では、該システムは標的マイクロＲＮＡを可視化する手段を更に含み、ここで、検出可能部分は反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が標的マイクロＲＮＡを示す。幾つかの実施態様では、標的マイクロＲＮＡを可視化する手段は明視野顕微鏡を含む。
【００１５】
本発明はまたマイクロＲＮＡ標的の明視野インサイチュー検出のためのシステムを特徴付ける。幾つかの実施態様では、該システムは、標的マイクロＲＮＡに特異的な一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含む標的プローブであって、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブがプローブの３’端又は５’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされている標的プローブと；シグナル増幅に効果的な反応性色原体コンジュゲート系であって、標的プローブの検出可能部分に結合するように適合化されている反応性色原体コンジュゲート系とを含む。
【００１６】
幾つかの実施態様では、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは１５から３０のヌクレオチドを含む。幾つかの実施態様では、プローブは、プローブの３’端に配された第一検出可能部分とプローブの５’端に配された第二検出可能部分とを含む。幾つかの実施態様では、検出可能部分はハプテンを含む。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む。幾つかの実施態様では、反応性色原体コンジュゲート系はチラミド−ハプテンコンジュゲートを含む。
【００１７】
幾つかの実施態様では、システムは標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段を更に含む。幾つかの実施態様では、標的マイクロＲＮＡを可視状態にする手段は、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する。幾つかの実施態様では、該システムは標的マイクロＲＮＡを可視化する手段を更に含み、検出可能部分は反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロＲＮＡを示している。幾つかの実施態様では、標的マイクロＲＮＡを可視化する手段は明視野顕微鏡を含む。
【００１８】
本発明はまた標的ＲＮＡに対して発色性に染色がなされた複数の細胞を含むスライドを特徴付け、該スライドは、ここに開示されたシステム（例えば、標的マイクロＲＮＡに特異的な一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含む標的プローブ、一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブのプローブセット等々）を使用して作製される。
【００１９】
本発明はまた明視野インサイチューハイブリダイゼーション法を特徴付ける。幾つかの実施態様では、該方法は、サンプルを抗原回収試薬と接触させる工程；プローブがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下でここに開示されたプローブ又はプローブセットとサンプルを接触させる工程；サンプルをすすいで未結合プローブを除去する工程；及び検出可能部分を可視状態にすることにより標的ＲＮＡを検出する工程を含む。
【００２０】
幾つかの実施態様では、該方法は、プローブセットがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的ＲＮＡに特異的なプローブとサンプルを接触させる工程であって、プローブセットがＸ個の一意的２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを含み、Ｘ≧２であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが標的ＲＮＡ内のＸ個の別個の部分を標的にし、各２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが少なくとも一つのハプテンにコンジュゲートされている工程；第一酵素にコンジュゲートされた第一抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体がＸ個の一意的ＲＮＡプローブに特異的である工程；反応性色原体コンジュゲート系（例えばチラミド−ハプテンコンジュゲート又は任意の他の適当なコンジュゲート）にサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲート系の第一抗ハプテン抗体に結合する工程（チラミドハプテンコンジュゲートがまた組織に結合する）；第二酵素にコンジュゲートされた第二抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗ハプテン抗体が反応性色原体コンジュゲート系に対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的ＲＮＡを示す工程を含む。
【００２１】
幾つかの実施態様では、該方法は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブがサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的ＲＮＡに特異的な２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブとサンプルを接触させる工程であって、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブが少なくとも一つのハプテンにコンジュゲートされ、長さが１５から３０のヌクレオチドである工程；第一酵素にコンジュゲートされた第一抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体が２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブに特異的である工程；反応性色原体コンジュゲート系（例えばチラミド−ハプテンコンジュゲート又は任意の他の適当なコンジュゲート）にサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲート系の第一抗ハプテン抗体に結合する工程；第二酵素にコンジュゲートされた第二抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗ハプテン抗体が反応性色原体コンジュゲート系に対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的ＲＮＡを示す工程を含む。
【００２２】
幾つかの実施態様では、２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブは二つのハプテンとコンジュゲートされている。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含む。幾つかの実施態様では、第一ハプテンがプローブの３’端に位置させられ、第二ハプテンがプローブの５’端に位置させられる。
【００２３】
幾つかの実施態様では、該方法は、その内容の全体がここに援用されるヴェンタナメディカルシステムズ社に譲渡された２０１２年２月１３日に出願され、ＵＳ２０１２０２１４１９５（’１９５）として公開された米国特許出願第１３／３７２０４０号に記載された２＋２系を利用する固定を含む。
【００２４】
例えばＭＣＦ−７異種移植片組織の染色に対する固定の影響を詳細に説明する図５−９を参照のこと。図５−９に詳細に示されたデータは、’１９５特許出願に記載されクレームされた２＋２法を利用する室温及び様々な他の温度における影響を示している。簡単に述べると、’１９５特許出願に開示された一般的方法は、組織サンプルのホルマリン固定によって例証されたアルデヒド固定の方法であって、第一の期間の間、第一の温度でアルデヒド溶液と組織サンプルを適用、浸漬又は別の接触をさせ、ついで第二の期間の間、第一の温度より高い第二の温度まで組織サンプルの温度を上昇させることを含む方法を提案している。
【００２５】
’１９５特許出願に詳細に記載されここで適用されるように、一般に組織サンプルの第二の温度は第一の温度よりも高い。組織サンプルの温度の上昇は、組織サンプルの温度を第二の温度まで急速に又は突然に上昇させることを含みうる。サンプル温度の上昇は、根底にあるサンプル反応性を尚も保ちながら架橋を増加させるためになされる。別法では、第二の温度への組織サンプルの上昇は、組織サンプルを第二の温度の溶液に浸漬することによって達成され得、ここで、その溶液は同じ又は異なったアルデヒド溶液でありうる。第二の温度は、典型的には周囲温度より高く、より典型的には約２２℃より高く、更により典型的には約２２℃より高い温度から少なくとも約５０℃までであり、更により典型的には約２２℃より高い温度から約４５℃までである。第二の期間は内在的分子及び構造の実質的に完全な架橋を起こさせるのに効果的である。第二の期間は変動しうるが、典型的には１５分を超える時間から少なくとも約５時間までの範囲であり、典型的には約１時間から約４時間までであり、更により典型的には約２時間から約３時間までである。温度の上昇に使用される速度及び方法は、マイクロＲＮＡ／ＲＮＡのような分解の傾向がある生体分子及び翻訳後修飾の最適な保存が達成されるように設計される。’１９５特許出願を参照のこと。
【００２６】
第一の期間は組織厚に応じて変動しうるが、４ｍｍ厚までのＡＳＣＯ ＣＡＰガイドラインでは、典型的には約１５分から約４時間までの範囲であり、より典型的には１５分より長く、約３時間まで、更により典型的には約１時間から約２時間までである。より厚いサンプルでは、第一の期間は拡散速度に支配されるであろうことが認められる。第一の温度は、少なくとも−２０℃から約１５℃まで、典型的には少なくとも０℃から約１５℃まで、より典型的には少なくとも０℃から約１０℃まで、更により典型的には約３℃から約５℃までである。
【００２７】
’１９５特許出願に開示された方法のある実施態様は、第一の温度の第一のアルデヒド溶液を組織サンプルに適用し、ついで第二のアルデヒド溶液を組織サンプルに適用することを含む。第二のアルデヒド溶液は第一のアルデヒド溶液とは異なっていてもよい。例えば、溶液は異なった濃度のものであり得、又は第二のアルデヒド溶液は第一のアルデヒドとは異なったアルデヒドを含んでいてもよい。アルデヒドは、典型的には低級アルキルアルデヒド、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又はその組合せである。
【００２８】
’１９５出願において述べられているように、２＋２法は従来の既存の方法に対して少なくとも３つの改善を提供する。第一に、低温環境下でホルマリンを組織片中に浸透させることによって酵素活性を顕著に低下させることができる。第二に、組織サンプル温度を速く上昇させて架橋速度を増大させることによって、室温で観察されるであろうよりも迅速に細胞成分が所定位置に「ロック」される。この組合せは、この技術を既存の方法より優れたものにし、ＦＦＰＥ組織において修飾状態を保存することを始めて可能にする。第三に、これは、広い範囲の修飾状態及び酵素に適用可能であると信じられる一般的な方法である。他の方法は特定のセットの修飾酵素をターゲットにするが、この方法は全ての修飾酵素を迅速に無能にし、よって一般的な細胞状態をゴールドの標準的な室温手順よりも更に良好に保存する。’１９５特許の教示は、
ｉ．本発明は特定の生体分子のセット又は特定の翻訳後修飾を含んでいる生体分子に限定されないので、この方法は任意の生体分子又は修飾状態の保存のための一般的方法であると考えられる。よって、この発明は多量の生体分子及び特定の翻訳後修飾を含む生体分子を高品質で保存することができる。（段落００２１）
と続く。
【００２９】
従って、同じ効果が本発明の方法に備わっていると考えられる。
【００３０】
本開示の前述並びに他の特徴は、添付図面を参照して進む次の詳細な説明から更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
次の図面はカラーで提出される。
【００３２】
【図１】２’−Ｏ’メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造の例を示す。
【００３３】
【図２】本発明のプローブを検出する方法の概略図を示す。
【００３４】
【図３】アッセイにおいて２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを使用するための例示的な工程を示すフローチャートを示す。
【００３５】
【図４Ａ−Ｂ】ＭＣＦ−７異種移植片組織を示す。図４Ａはバックグラウンド染色を樹立するためにコントロールとしてスクランブルプローブを使用して染色されたサンプルである。図４ＢはｍｉＲ−２００ｃプローブでの染色を示す。
【図４Ｃ−Ｄ】図４ＣはｍｉＲ−２１プローブでの染色を示し、図４ＤはｍｉＲ−２５プローブでの染色を示す。ｍｉＲ−２１が最も暗い染色を示し、ｍｉＲ−２００ｃが続き、ついでｍｉＲ−２５であった。スクランブルプローブは実質的なバックグラウンドを生じなかった。結果は、ここに記載されたプローブ及び方法を使用してＦＦＰＥＴ中においてｍｉＲＮＡを半定量的に検出することができることを示している。
【００３６】
【図５】染色に対する固定の影響を試験するために、ＭＣＦ−７異種移植片組織を収集し、直ぐに様々な条件下で室温又は冷１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）中に入れた。図５−９は（Ａ）ネガティブコントロールのスクランブルプローブ、（Ｂ）ｍｉＲ−２１プローブ、及び（Ｃ）ｍｉＲ−２００ｃプローブのｍｉＲＮＡ染色の顕微鏡写真を示す。図５は、室温の１０％ＮＢＦを２４時間、使用する固定を示す。
【図６】図６は４℃のＮＢＦを２時間と続いて４５℃のＮＢＦを２時間、使用する固定を示す。
【図７】図７は４℃のＮＢＦを４時間と続いて４５℃のＮＢＦを２時間、使用する固定を示す。
【図８】図８は４℃のＮＢＦを６時間と続いて４５℃のＮＢＦを２時間、使用する固定を示す。
【図９】図９は４℃のＮＢＦを２４時間と続いて４５℃のＮＢＦを２時間、使用する固定を示す。図５−９から、これらの特定のマイクロＲＮＡに対する最善のシグナル・ノイズ比は「２＋２」（図６）又は「４＋２」（図７）の何れかの固定法で処理されたサンプルに対して見ることができることが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．用語
他に説明されない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、開示された発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明らかに別のものを示していない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は（ｏｒ）」なる語は、明らかに別のものを示していない限り、「及び（ａｎｄ）」を含むことが意図される。「含む（comprising）」は「含む（including）」を意味する。よって、「Ａ又はＢを含む（comprising A or B）」は、「Ａを含む（including A）」又は「Ｂを含む（including B）」又は「Ａ及びＢを含む（including A and B）」を意味する。
【００３８】
開示の実施態様の実施及び／又は試験のための適切な方法と材料は以下に記載される。このような方法と材料は例示だけのためのものであり、限定することを意図していない。ここに記載されたものと同様又は均等の他の方法と材料も使用することができる。例えば、本開示が関連する技術分野においてよく知られた一般的な方法は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される、例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Press, 2001；Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992（及び追補版2000）；Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4版, Wiley & Sons, 1999；Harlow及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990；及びHarlow及びLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を含む、様々な一般文献及びより特定の文献に記載されている。
【００３９】
ここで述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、全ての目的のためにその全体が出典明示により援用される。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が優先するであろう。
【００４０】
ここに記載されたものと同様又は均等の方法と材料を開示された技術を実施し又は試験するために使用することができるが、好適な方法と材料が以下に記載される。材料、方法、及び実施例は例示のためだけのものであり、限定することを意図していない。
【００４１】
開示の様々な実施態様のレビューを容易にするために、次の特定の用語の説明が提供される。
【００４２】
抗体：  少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原（例えばＣＤ７９ａタンパク質）のエピトープに特異的に結合するポリペプチド。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体の断片を含む。抗体は、酵素、ハプテン、又はフルオロフォアのような検出可能標識とコンジュゲートされ又は標識等されうる。
【００４３】
検出可能標識（又は検出可能部分）：  他の分子（例えば核酸プローブ）にその分子の検出を容易にするために直接的又は間接的にコンジュゲートされる化合物又は組成物。標識の特定の非限定的な例は、蛍光及び蛍光発生部分、発色性部分、ハプテン、アフィニティタグ、及び放射性同位元素を含む。標識は、直接的に検出可能（例えば光学的に検出可能）であるか又は間接的に検出可能（例えば、順に検出可能である一又は複数の更なる分子との相互作用を介して）でありうる。ここに開示されたプローブの文脈で例示的な標識は以下に記載される。核酸を標識するための方法と様々な目的に有用な標識の選択におけるガイダンスは、例えばSambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)及びAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences （1987，改訂版を含む）において検討されている。
【００４４】
検出可能標識は、発色性、蛍光、リン光及び／又は発光分子、ある物質を他の物質に転化させて（例えば無色の物質を有色の物質に転化させるか又はその逆により、あるいは沈殿物を生成するか又はサンプルの濁度を増加させることによって）検出可能なシグナルをもたらす触媒（例えば酵素）、更なる検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用して抗体−ハプテン結合相互作用を通して検出されうるハプテン、及び常磁性及び磁性分子又は材料を含みうる。検出可能標識の特定の例は、酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はβ−グルクロニダーゼ；フルオロフォア、例えばフルオレセイン、発光団、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ色素、レゾルフィン、及びローダミン（蛍光分子の多くの更なる例は、The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, ORに見出すことができる）；ナノ粒子、例えば量子ドット（その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第６８１５０６４号、同第６６８２５９６号及び同第６６４９１３８号）；金属キレート、例えば放射性又はＧｄ３＋のような常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート；及びリポソーム、例えば捕捉蛍光分子を含むリポソームを含む。検出可能標識が酵素を含む場合、検出可能な基質、例えば色原体、蛍光発生化合物、又は発光（luminogenic）化合物が、検出可能なシグナルを生じさせるために酵素との組合せで使用される（多種多様なこのような化合物が例えばLife Technologies, Carlsbad, CAから市販されている）。 
【００４５】
別法では、酵素を金属組織検出スキームで使用することができる。幾つかの例では、金属組織検出法は、水溶性金属イオンと酵素の酸化還元不活性基質と組合せて、アルカリホスファターゼのような酵素を使用することを含む。基質は酵素によって酸化還元活性剤に転換され、酸化還元活性剤が金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる（例えば米国特許第７６４２０６４号；同第７６３２６５２号を参照；その各々が出典明示によりここに援用される）。他の例では、金属組織検出法は、再び検出可能な沈殿物を形成するために水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共にオキシド−レダクターゼ酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）を使用することを含む（例えば、その全体が出典明示によりここに援用される米国特許第６６７０１１３号を参照）。ハプテンは抗体によって結合されうる小分子である。例示的なハプテンは、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、及びフルオレセインを含む。更なるハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペン（triperpene）、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン及びシクロリグナンハプテン、例えばその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第７６９５９２９号に開示されたものを含む。
【００４６】
ハイブリダイゼーション：  ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡ間の二つのストランドの相補領域間に塩基対を形成し、それによって二本鎖分子を形成すること。特定のストリンジェンシーの度合いを生じるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質及びハイブリダイズする核酸配列の組成と長さに応じて変動するであろう。一般に、ハイブリダイゼーションの温度とハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（例えばＮａ＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。ハイブリダイゼーションバッファー中のハイブリダイゼーションを減少させる化学物質（例えばホルムアミド）の存在もまたストリンジェンシーを決定するであろう（Sadhu等, J. Biosci. 6:817-821, 1984）。特定のストリンジェンシーの度合いを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook等, (1989) Molecular Cloning, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (第9及び11章)において検討されている。ＩＳＨに対するハイブリダイゼーション条件はまたLandegent等, Hum. Genet. 77:366-370, 1987；Lichter等, Hum. Genet. 80:224-234, 1988；及びPinkel等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9138-9142, 1988において検討されている。
【００４７】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）：  組織の一部又は切片において（インサイチュー）、あるいは組織が十分に小さい（例えば植物種、ショウジョウバエ胚）ならば全組織において（ホールマウントＩＳＨ）、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を局在化させるために標識された核酸プローブのハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中の核酸の存在又は分布を決定する方法。ＤＮＡ ＩＳＨは、例えば、染色体完全性を評価し及び／又はサンプル中の遺伝子コピー数を決定する医療診断における使用のように、染色体の構造を決定するために使用することができる。ＲＮＡ ＩＳＨは、組織切片又はホールマウント内のｍＲＮＡと他の転写物を測定し局在化する。
【００４８】
ＩＳＨでは、サンプル細胞及び組織が通常処理されて、標的核酸を所定位置に固定し、標的分子へのプローブの接近性を増大させる。検出可能に標識されたプローブは高温で標的配列にハイブリダイズし、ついで過剰のプローブが洗い流される。溶液パラメータ、例えば温度、塩及び／又は洗浄剤濃度を操作して、あらゆる同一でない相互作用を取り除くことができる（例えば、その結果、正確な配列一致物のみが結合したまま残るであろう）。ついで、標識されたプローブは局在化され、それぞれオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法又は免疫組織化学的検査の何れかを使用して、組織中で潜在的に定量される。ＩＳＨはまた二つ以上のプローブを使用することができ、それらは典型的には二以上の核酸を同時に検出するために異なって標識される。
【００４９】
単離された：  「単離された」生物学的成分（例えば、核酸分子、タンパク質、又は細胞）は、例えば他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞など、該成分が生じる調製物、生物の細胞、又は生物自体中の他の生物学的成分から実質的に分離され又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子及びタンパク質を含む。該用語はまた宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸分子及びタンパク質を包含する。幾つかの例では、ここで開示された核酸プローブは、単離された核酸プローブである。
【００５０】
プローブ：  標的核酸分子（例えばゲノム標的核酸分子）とハイブリダイズすることができ、標的にハイブリダイズされると、直接的又は間接的に検出することが可能である核酸分子。従って、プローブは、標的核酸分子の検出と、幾つかの例では定量を可能にする。特定の例では、プローブは標的核酸分子の一意的に特異的な核酸配列に相補的な少なくとも二つのセグメントを含み、よって標的核酸分子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができる。一般的に、少なくとも一つのセグメント又はセグメントの一部がひとたび標的核酸分子にハイブリダイズすれば（そしてそのままであれば）、プローブの他の部分は、標的中のその他の部分の同族結合部位へのハイブリダイズが物理的に制約されうる（必要ではないが）（例えば、そのような他の部分はその同族結合部位からあまりにも遠く離れている）；しかし、プローブ中に存在する他の核酸分子は互いに結合することができ、よってプローブからのシグナルを増幅させる。プローブは、「標識された核酸プローブ」と称され得、これは、プローブを検出可能にする検出可能部分又は「標識」にプローブが直接的又は間接的に結合されていることを示している。
【００５１】
サンプル：  被験体から得られたＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、又はその組合せを含む検体。例としては、限定されないが、染色体調製物、末梢血、尿、唾液、組織生検、微細針吸引、外科検体、骨髄、羊水穿刺サンプル、及び剖検材料を含む。一例では、サンプルはゲノムＤＮＡを含む。幾つかの例では、サンプルは、例えば顕微鏡スライド上に置くことができる、細胞遺伝学的調製物である。特定の例では、サンプルは直接使用されるか、又は例えば固定（例えばホルマリンを使用）によって、使用前に操作されうる。
【００５２】
配列同一性：  二以上の核酸配列間の同一性（又は類似性）は、配列間の同一性又は類似性によって表される。配列同一性は同一性パーセントによって測定されうる；パーセントが高いと、配列はより同一である。配列類似性は類似性パーセント（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）によって測定されうる；パーセントが高いと、配列はより類似している。
【００５３】
比較のための配列のアラインメント法は当該分野でよく知られている。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson及びLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988；Higgins及びSharp, Gene, 73:237-44, 1988；Higgins及びSharp, CABIOS 5:151-3, 1989；Corpet等, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988；Huang等 Computer Appls. in the Biosciences 8:155-65, 1992；及びPearson等, Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul等, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考察を提供する。
【００５４】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Altschul等, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連した使用に対して、国立バイオテクノロジーセンター及びインターネットを含む幾つかのソースから入手可能である。更なる情報はＮＣＢＩのウェブサイトに見出すことができる。
【００５５】
ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用されうる一方、ＢＬＡＳＴＰがアミノ酸配列を比較するために使用されうる。二つの比較される配列が相同性を有しているならば、指定された出力ファイルは相同性領域を整列配列として提示するであろう。二つの比較される配列が相同性を有していないならば、指定された出力ファイルは整列配列を提示しないであろう。
【００５６】
ＢＬＡＳＴ様アラインメントツール（ＢＬＡＴ）をまた核酸配列を比較するために使用してもよい（Kent, Genome Res. 12:656-664, 2002）。ＢＬＡＴは、Ｋｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Santa Cruz, CA）及びインターネット（genome.ucsc.edu）を含む幾つかのソースから入手可能である。
【００５７】
ひとたび整列されれば、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が双方の配列に提示されている位置の数をカウントすることによって、一致数が決定される。配列同一性パーセントは、一致数を、特定された配列に規定される配列の長さか又は分節された長さ（例えば特定された配列に規定された配列からの１００の連続ヌクレオチド又はアミノ酸残基）の何れかによって割り、ついで得られた値に１００を乗ずることによって、決定される。例えば、１５５４ヌクレオチドを有する試験配列と整列されたときに１１６６の一致を持つ核酸配列は、試験配列と７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は小数第２位で四捨五入される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は７５．１に四捨五入される一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は７５．２に四捨五入される。長さの値は常に整数であろう。他の例では、次のように特定された配列からの１５の連続ヌクレオチドと整列する２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、その特定された配列に対して７５パーセントの配列同一性（つまり、１５÷２０＊１００＝７５）を有する領域を含む。
【００５８】
被験体：  任意の多細胞脊椎生物、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、獣医学的被験体）。
【００５９】
標的核酸配列又は分子：  核酸分子の定まった領域又は特定の部分、例えばゲノムの一部（例えば遺伝子又は興味ある遺伝子を含む哺乳動物ゲノムＤＮＡの領域）。標的核酸配列が標的ゲノム配列である例では、そのような標的は、例えば、細胞遺伝学的命名法に従い、染色体上の特定の位置を参照することにより；遺伝子地図上のその位置を参照することにより；仮想的又は集合したコンティグを参照することにより；その特異的配列又は機能により；その遺伝子又はタンパク質名により；又はゲノムの他の遺伝子配列の中からそれを一意的に特定する任意の他の手段により、（例えば、正常細胞内で）染色体上のその位置により定義することができる。幾つかの例では、標的核酸配列は哺乳動物ゲノム配列（例えばヒトゲノム配列）である。
【００６０】
幾つかの例では、標的核酸配列（例えばゲノム核酸配列）の変化は、疾患又は病態と「関連する」。幾つかの例では、標的核酸配列の検出を、疾患又は病態に関してサンプルの状態を推論するために使用することができる。例えば、標的核酸配列は２つ（又はそれ以上の）区別可能な形態で存在し得、第一の形態は疾患又は病態の非存在と相関し、第二（又は異なる）形態は疾患又は病態の存在と相関する。二つの異なる形態は、例えばポリヌクレオチド多型などによって、定性的に区別することができ、及び／又は二つの異なる形態は、例えば細胞内に存在する標的核酸配列のコピー数などによって、定量的に区別することができる。
【００６１】
一意的に特異的な配列：  生物の一倍体ゲノムに一度だけ存在する核酸配列（例えば、少なくとも２０ｂｐ（例えば少なくとも２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ又はそれ以上）の配列）。特定の例では、一意的に特異的な核酸配列とは、標的核酸と１００％の配列同一性を有する標的核酸からの核酸配列であり、標的核酸を含む特異的一倍体ゲノムに存在する任意の他の核酸配列に対して有意な同一性を持たない。
【００６２】
ベクター：  ベクターに対して天然型ではない他の（外来の）核酸配列のための担体として働く任意の核酸。適切な宿主細胞に導入されると、ベクターはそれ自身（よって、外来の核酸配列）を複製し得、又は外来核酸配列の少なくとも一部を発現しうる。一文脈では、ベクターは、複製（例えば生産）及び／又は標準的な組換え核酸技術（例えば制限酵素消化）を使用する操作の目的で興味ある核酸配列がその中へ導入（例えば、クローニング）される直鎖状又は環状核酸である。ベクターは、宿主細胞内で複製することを可能とする核酸配列、例えば複製起点などを含みうる。ベクターはまた一又は複数の選択マーカー遺伝子及び当該分野で知られている他の遺伝的要素を含みうる。一般的なベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ、ＹＡＣ）、及びこれらの型のベクターの一を超える特徴を取り込んだハイブリッドを含む。典型的には、ベクターは、標的核酸配列の挿入を容易にする一又は複数の一意的制限部位（及び幾つかの場合にはマルチクローニングサイト）を含む。
【００６３】
ＩＩ．詳細なプローブデザイン：
２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチド（２’ＯＭｅ）は、ＦＦＰＥ組織中の任意のＲＮＡ標的のインサイチュー検出のためのプローブとして少しの望ましい性質を有している：１）２’ＯＭｅプローブはＤＮＡ又はＲＮＡプローブよりもＲＮＡに対して高い親和性を有している；２）２’ＯＭｅプローブはヌクレアーゼに耐性である；３）化学合成中のカップリング効率がＤＮＡより高いので、完全長産物の収量がより高い。以下、図１には、ここに記載された２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドの例示的な構造が示されている。ｍＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡ標的に対して、８０ヌクレオチド（ｎｔ）長の２’ＯＭｅプローブを、プローブ当たりのハプテン数と特異性をバランスさせるために選択した。各８０ｎｔ２’ＯＭｅプローブは、化学合成によって２０ヌクレオチド毎に一つのハプテンを導入することによって５つのハプテンを含んでいる。一つの２’ＯＭｅプローブでＲＮＡ標的を検出することができるが、我々は、一つのＲＮＡ標的に対して３つの独立した２’ＯＭｅプローブの混合物を使用すると特異性を犠牲にすることなく検出感度を更に増大させることを実験的に決定した。各ＲＮＡ標的に対して、６つの２’ＯＭｅプローブを選択し、合成を試みた。合成された６つの中から最良の３つを選択することによって、低収量、低配列特異性、又は他の予見できない問題を軽減することができた。殆どの標的に対して、６つの内の任意の３つのプローブを互換的に使用することができることが見出された。あるＲＮＡ標的に対しては、２つ又は３つの８０ｎｔプローブだけが選択される。
【００６４】
ｍＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡ標的に対して６つのプローブのセットを効果的に選択するために、バイオインフォマティックスツールセットを構築して全プロセスを半／自動化した。バイオインフォマティックスツールは、入力の一つとして配列ファイル又はＧｅｎＢａｎｋ ＩＤの何れかを取込み、後者の場合、ソフトウェアがＧｅｎＢａｎｋから直接、配列を検索する。ついで、ツールは反復データベース検索を実行し、任意の反復配列を、これら配列がゲノム中に非常に豊富であるとしてマスクする。反復をマスクしないと、得られるプローブは望まれないバックグラウンド（特異性の欠如）を生成するであろう。ついで、ツールは、反復データベース検索によってマスクを避ける予め定められたＧＣ量及び融解温度範囲で、全ての潜在的なプローブを生成した。また、ＲＮＡの特定の領域が標的とされる場合の配列中の範囲及び出力形式等々のような他の入力を取り込むためにツールを使用した。再び、ツールは全ての生成されたプローブを取込み、興味あるローカルゲノム、ｍＲＮＡ、及びＥＳＴデータベースに対してショートオリゴヌクレオチドのために設計された特殊なＢＬＡＳＴＮ検索を実施し、ヒット数及び関連ＢＬＡＳＴビットスコア及びｅ値（「ＮＳＥ」）に基づいて、プローブを選択し又は廃棄した。残りの配列をフォールディング構造予測解析に供した。プローブを、優れたオープンソースのＲＮＡ分子フォールディングソフトウェアであるＲＮＡｆｏｌｄで折り畳み、ヘアピン構造又は低ΔＧ（カットオフ−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を持つプローブを更なる検討から除外した。６つのプローブを残りのプールから化学合成のために選択した。
【００６５】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成機ＭｅｒＭａｄｅモデル１９２を用いて合成した。８０ｎｔ長の３０プローブのセットは仕上げるのに約４８時間かかる。合成のスケールは通常５０ｎＭであったが、これは、ここに記載された濃度でＦＦＰＥＴの約５百万スライドを染色するのに十分なプローブをつくり出す。
【００６６】
合成された２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブの品質は、成功したＩＳＨアッセイに対する決定因子の一つであった。幾つかの手順が合成機からの２’ＯＭｅオリゴヌクレオチドプローブの品質を向上させたことが発見された：１）Ｇ５０カラムを通しての精製；２）導入されたハプテンの数が設計と一致しているかどうかを決定するためのスペクトル測定；及び３）プローブのサイズ分布を分析するためのゲル電気泳動。８０ｎｔの２’ＯＭｅプローブのＧ５０カラム精製の収率は、５０−９０％の範囲で、平均が約６５％であった。成功したプローブは、例えば５ＤＮＰを持つ８０ｎｔの２’ＯＭｅプローブに対して、＋／−１０％の予想ハプテン負荷を含んでおり、スペクトル測定に基づく計算した数はプローブ分子当たり４．５−５．５ＤＮＰの範囲にあるべきである。
【００６７】
幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して９９％−１００％の間の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して９５％−１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して９０％−１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して８０％−１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、２’ＯＭｅプローブは標的ＲＮＡ配列に対して７５％−１００％の配列同一性を有する。
【００６８】
本発明は標的ＲＮＡを可視状態にする手段をまた特徴とする。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視状態にする手段は、プローブに特異的な検出試薬にプローブを接触させる工程を含む。検出試薬は当該分野でよく知られている。例えば、検出試薬は、コントロールプローブに結合する抗体又は他のプローブを含みうる。検出試薬は、プローブの第一標識を可視状態にする分子（例えば酵素、基質、タグ）を含みうる。検出試薬は、プローブを可視状態にするのに効果的な複数の試薬（例えば、一を超える抗体、酵素、基質、色原体等々）を含みうる。幾つかの実施態様では、検出試薬は色を発する。更なる検出試薬（標識、タグ、酵素、基質、色原体、抗体等々）はここに更に開示される。本発明はまた標的ＲＮＡを可視化する手段を特徴とし、ここで、プローブ（例えば、検出可能部分）は検出試薬によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が標的ＲＮＡを示している。標識されたプローブを可視化する手段は当業者によく知られている。例えば、幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、顕微鏡（例えば、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、倒立顕微鏡）を含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、ルミノメーターを含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、放射検出機（例えば、ガンマカウンター等）を含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、分光計を含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、リアルタイムＰＣＲ機を含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、シンチレーション及び／又はルミネセンスカウンターを含む。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡを可視化する手段は、比色計を含む。標的ＲＮＡを可視化する他の手段は当該分野で知られている。
【００６９】
本発明が如何なる理論や機構にも制約されることを望まないが、本発明のプローブは、効果的なハイブリダイゼーションに必要とされるプローブ濃度を減じることを可能にし得、例えばハイブリダイゼーション及び十分なシグナルに必要とされるプローブが少ないと考えられる。よって、本発明のシステムはアッセイのコストを低減させるのに役立ちうる。
【００７０】
開示された方法は自動化することができる。自動ＩＨＣ及び／又はＩＳＨのためのシステムは市販されており、例えばＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＵＬＴＲＡスライド染色システム、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＸＴスライド染色システム、及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＸＴスライド染色システム（ヴェンタナメディカルシステムズ, Tucson, AZ）、ＢＯＮＤ−ＭＡＸ及びＢＯＮＤ−ＩＩＩスライドステイナー（Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL）、及びＩＱ Ｋｉｎｅｔｉｃスライドステイナー（Biocare Medical, Concord, CA）である。ヴェンタナメディカルシステムズ社は、その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５６５０３２７号；同第５６５４２００号；同第６２９６８０９号；同第６３５２８６１号；同第６５８２９６２号；同第６８２７９０１号及び同第６９４３０２９号を含む、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示する多くの米国特許の譲受人である。
【００７１】
開示された方法において使用されうる色原体の非限定的な例は、（限定されるものではないが）当業者によく知られたもの、例えばその双方の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号及び２０１３年６月５日出願の米国仮特許出願第６１／８３１５５２号に記載されたものを含む。
【００７２】
ここに開示された核酸プローブは、例えば標的核酸分子の検出を可能にするために、一又は複数の標識を含みうる。インサイチューハイブリダイゼーション手順のような様々な応用では、核酸プローブは標識(例えば、検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、サンプル中のプローブ（特に結合した又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを作り出すために使用されうる分子又は材料である。よって、標識された核酸分子は、サンプル中の（標識された一意的に特異的な核酸分子が結合し又はハイブリダイズした）標的核酸の存在又は量（例えば、遺伝子コピー数）の指標を提供する。具体例が提供されるが、開示は特定の標識の使用には限定されない。
【００７３】
一又は複数の核酸分子（例えば、開示されたプローブ）に関連した標識は直接的に又は間接的に検出することができる。標識は、（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外線周波数の光子を含む）光子の吸収、放出及び／又は散乱を含む、任意の既知の又は未発見の機構により検出することができる。検出可能な標識は、有色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、ある物質を他の物質に変換させて、（例えば無色の物質を有色の物質に変換させるか又はその逆によって、あるいは沈殿物をつくるか又はサンプル濁度を増大させることによって）検出可能な差をもたらす触媒（例えば酵素）、抗体結合相互作用によって検出することができるハプテン、及び常磁性及び磁性分子又は材料を含む。
【００７４】
蛍光分子（又は蛍光色素）の特定の例がここに記載される。多数の蛍光色素が、当業者に知られており、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから選択することができ、例えば、The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照のこと。核酸分子（例えば一意的に特異的な結合領域）に結合され（例えば、化学的にコンジュゲートされ）うる特定のフルオロフォアの例は、（その全体が出典明示によりここに援用される）Ｎａｚａｒｅｎｋｏ等の米国特許第５８６６３６６号に提供されており、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジンと誘導体、例えばアクリジンとアクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリンと誘導体、例えばクマリンと７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（7-amino-4-trifluoromethylcouluarin）（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンと誘導体、例えばエオシンとエオシンイソチオシアネート；エリスロシンと誘導体、例えばエリスロシンＢとエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインと誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４‐メチルウンベリフェロン；オルト‐クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンと誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及び１−ピレン酪酸スクシンイミジル；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンと誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキ��ローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアは、およそ６１７ｎｍで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk及びHeyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997；J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、並びにＧＦＰ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（リサミン）ＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（その全体が出典明示によりここに援用されるLee等の米国特許第５８００９９６号に記載）及びそれらの誘導体を含む。例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Carlsbad, CA）から入手可能なものと、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素シリーズ（例えば、米国特許第５６９６１５７号、同第６１３０１０１号及び同第６７１６９７９号に記載）、ＢＯＤＩＰＹ色素シリーズ（ジピロメテンボロンジフルオリド色素（dipyrrometheneboron difluoride dyes）、例えば、米国特許第４７７４３３９号、同第５１８７２８８号、同第５２４８７８２号、同第５２７４１１３号、同第５３３８８５４号、同第５４５１６６３号及び同第５４３３８９６号に記載）、カスケードブルー（米国特許第５１３２４３２号に記載されるスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びマリーナブルー（米国特許第５８３０９１２号）を含む（その開示はその全体が出典明示によりここに援用される）、当業者に知られている他のフルオロフォアもまた使用することができる。上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶などの蛍光ナノ粒子、例えば、量子ドット（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手される；その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第６８１５０６４号；同第６６８２５９６号；及び同第６６４９１３８号も参照）でありうる。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び／又は電気的特性を有する微細粒子である。半導体ナノ結晶に一次エネルギー源が照射されると、半導体ナノ結晶で使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数のエネルギー二次放出が生じる。この放出は、特定の波長の有色光又は蛍光として検出することができる。異なるスペクトル特性を持つ半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６６０２６７１号に記載されている。半導体ナノ結晶は、例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用されるBruchez等, Science 281:2013-2016, 1998；Chan等, Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６２７４３２３号に記載された技術によって、様々な生体分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）又は基質に結合されうる。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される、例えば米国特許第６９２７０６９号；同第６９��４２５６号；同第６８５５２０２号；同第６７０９９２９号；同第６６８９３３８号；同第６５００６２２号；同第６３０６７３６号；同第６２２５１９８号；同第６２０７３９２号；同第６１１４０３８号；同第６０４８６１６号；同第５９９０４７９号；同第５６９０８０７号；同第５５７１０１８号；同第５５０５９２８号；同第５２６２３５７号及び米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公開番号第９９／２６２９９号に開示されている。その異なるスペクトル特性に基づいて識別可能である半導体ナノ結晶の別個の集団を製造することができる。例えば、その組成、サイズ又はサイズと組成に基づいて異なる色の光を発する半導体ナノ結晶を製造することができる。例えば、サイズに基づいて異なった波長（５６５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍ、又は８００ｎｍの発光波長）で発光する量子ドットは、ここに開示されたプローブにおける蛍光標識として適しているが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Carlsbad, CA）から入手可能である。
【００７５】
更なる標識は、例えば、放射性同位元素（３Ｈなど）、Ｇｄ３＋などの放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、及びリポソームを含む。
【００７６】
核酸分子（例えば、開示されたプローブ）と共に使用することができる検出可能な標識はまた酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、又はβ-ラクタマーゼを含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、色原体、蛍光発生化合物、又は発光性（luminogenic）化合物を、酵素と組み合わせて使用することができ、検出可能なシグナルを生成する（多くのそうした化合物が、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）。発色性化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ファストブルー、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
【００７７】
あるいは、酵素は金属組織学的検出スキームで使用されうる。例えば、銀インサイチューハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノムの標的核酸配列の同定及び局在化についての金属組織学的検出スキームを含む。金属組織学的検出方法は、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼ等の酵素を使用することを含む。基質は酵素により酸化還元活性剤に変換され、その酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、それに検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照）。金属組織学的検出方法には、また、オキシドレダクターゼ酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用し、再び検出可能な沈殿物を形成することを含む。（例えば、米国特許第６６７０１１３号を参照）。
【００７８】
非限定的な例では、開示された核酸プローブは、ハプテン分子（例えば、ニトロ芳香族化合物（例えば、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ））、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン等々）で標識される。開示されたプローブを標識するために適した更なるハプテンは、ニトロピラゾール、３−ヒドロキシキノキサリン、チアゾールスルホンアミド、ニトロケイ皮酸、ロテノン、７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸、ベンゾジアゼピン、又はベンゾフランハプテン（例えば、出典明示によりここに援用される国際公開第２０１２／００３４７６号を参照）を含む。（例えば、標識されたプローブ中への導入を容易にするために）ハプテン及び他の標識をｄＮＴＰにコンジュゲートさせるための方法は当該技術分野でよく知られている。手順の例については、例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５２５８５０７号、同第４７７２６９１号、同第５３２８８２４号、及び同第４７１１９５５号を参照のこと。実際、数多くの標識されたｄＮＴＰが、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Carlsbad, CA）から市販されている。標識は、ｄＮＴＰ上の任意の位置、例えば、リン酸（例えば、α、β又はγリン酸）や糖へ直接的又は間接的に結合させることができる。
【００７９】
標識された核酸分子の検出は、ゲノム標的配列に結合したハプテンで標識された核酸分子を一次抗ハプテン抗体と接触させることによって達成することができる。一例では、一次抗ハプテン抗体（例えば、マウス抗ハプテン抗体）が酵素で直接的に標識される。他の例では、酵素にコンジュゲートされた二次抗抗体がシグナル増幅のために使用される。ＣＩＳＨでは、発色基質が添加され、ＳＩＳＨでは、銀イオン及び参照特許／出願で概説されたような他の試薬が添加される。
【００８０】
幾つかの例では、プローブは、酵素（重合）反応を使用して一又は複数の標識ｄＮＴＰを導入することにより標識される。例えば、（例えばプラスミドベクターに組込まれた）開示された核酸プローブは、（例えば、ビオチン、ＤＮＰ、ジゴキシゲニン等を使用する）ニックトランスレーションによって、又はターミナルトランスフェラーゼでのランダムプライマー伸長（例えば、３’末端テーリング）によって、標識することができる。幾つかの例では、核酸プローブは、ＤＮＡポリメラーゼＩのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）に対する比率が出発原料の１００％を超えて生成するように修正されている修正ニックトランスレーション反応によって標識される。特定の例では、ニックトランスレーション反応は、ＤＮＡポリメラーゼＩをＤＮａｓｅＩに対して、少なくとも約８００：１の比率で、例えば、少なくとも２０００：１、少なくとも４０００：１、少なくとも８０００：１、少なくとも１００００：１、少なくとも１２０００：１、少なくとも１６０００：１など、例えば約８００：１から２４０００：１の比率で含み、反応は、実質的に等温の温度で、例えば約１６℃から２５℃（例えば室温）で一晩（例えば、約１６−２２時間）実施される。プローブがプローブセット（例えば、複数のプラスミド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のプラスミド）に含まれる場合、プラスミドは、標識反応（例えば、ニックトランスレーション又は修正ニックトランスレーション）を実施する前に、等モル比で混合されうる。
【００８１】
他の例では、化学的標識手順を用いることもできる。開示された核酸プローブを含む、核酸の酵素標識のために、多数の試薬（ハプテン、フルオロフォア、及び他の標識ヌクレオチドを含む）や他のキットが市販されている。当業者には明らかなように、プローブの標識化の点で、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション反応での使用に対して、上に開示された標識及び検出手順の任意のものが適用可能である。例えば、ＡｍｅｒｓｈａｍのＭＵＬＴＩＰＲＩＭＥ（登録商標）ＤＮＡ標識システム、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な様々な特定の試薬及びキット、又は任意の他の類似の試薬又はキットを使用して、ここに開示される核酸を標識することができる。特定の例では、開示されたプローブは、ハプテン、リガンド、蛍光部分（例えば、フルオロフォア又は半導体ナノ結晶）、色原体部分、又は放射性同位元素で直接的又は間接的に標識することができる。例えば、間接標識では、標識はリンカー（例えば、ＰＥＧ又はビオチン）を介して核酸分子に結合させることができる。プローブ核酸分子を標識するために使用できる更なる方法は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０１５８７７０号に提供されている。
【００８２】
ハプテンの更なる例は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第８８４６３２０号と関連特許（例えば米国特許第７６９５９２９号；米国仮出願第６０／８５６１３３号）に記載されている。
【００８３】
本発明を如何なる理論又は機構にも限定することは望まないが、チラミド−ハプテンコンジュゲートの性能はハプテン自体に関連しているかも知れないと思われる。例えば、ハプテンは、反応性チラミド−中間体の生成及び／又は試薬の全体の性能に（例えば予期せぬ形で）影響を及ぼしうる。
【００８４】
本発明を如何なる理論又は機構にも限定することは望まないが、どのハプテンがチラミド増幅系と最も良好に作用するかは必ずしも予測できないと考えられる。
【００８５】
マイクロＲＮＡは非常に短いので、マイクロＲＮＡの検出には単一プローブの使用が必要となるであろうことが予想される。チラミド−ハプテン増幅系及び‘２−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブがマイクロＲＮＡ標的を検出するのに十分に強いことが驚いたことに発見された。
【００８６】
ＩＩＩ．ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションとチラミド−色原体検出の詳細：
ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴスライドにマウントされたホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）を脱パラフィン処理し、ＣＣ１試薬及びプロテアーゼ３（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：７６０−２０２０）を使用して抗原回復させた。回復後、一滴（１００μＬ）のハプテン標識２’Ｏ−メチル修飾合成実験アンチセンス又はコントロールスクランブルプローブをスライド上に分配し、８分間８０℃で変性させ、標的ＲＮＡに対して８０ヌクレオチドのプローブでは７５℃で２時間、あるいはｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）に対して２５ヌクレオチドのプローブでは４５℃で２時間、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、ＲＮＡ８０ヌクレオチドプローブでは７５℃で８分間、ＥＺ Ｐｒｅｐ（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：９５０−１０２）を使用して３回洗浄し、あるいはｍｉＲＮＡに対して２５ヌクレオチドプローブでは４５℃で４分間２Ｘ ＳＳＣを使用して４回洗浄し、非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去した。
【００８７】
一連の増幅は明視野顕微鏡でｍｉＲＮＡを（例えば発色的に）検出するのに有利であることが発見された。検出ではチラミド−色原体コンジュゲートが使用された。検出化学に関する開示について出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号が参照される。チラミド−色原体コンジュゲートの沈着を触媒するために抗ハプテンＨＲＰコンジュゲートを含む一段の増幅方策の使用は、識別可能なシグナルを生成しなかった。ここで図２には、検出アプローチを説明する概略図が示される。特に、標的２０は、ハプテン２２で標識されたプローブ２１によって検出される。ついで、酵素２４にコンジュゲートされた抗ハプテン抗体２３がサンプルに接触させられて、抗体２３がプローブ２１に結合し、酵素２４を標的２０に結合させる。酵素２４はチラミド−ハプテンコンジュゲート２５の沈着を触媒する。複数のチラミド−ハプテンコンジュゲート２５が標的２０の近くでサンプルに結合し、よって標的２０に関連するシグナルを実質的に増幅させる。ついで、第二の酵素コンジュゲート抗ハプテン抗体２６がサンプルに接触させられ、チラミド−ハプテンコンジュゲート２５への結合が許容される。ついで、第二の酵素２７が、チラミド−色原体コンジュゲートの沈着、銀沈着（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：７８０−００１）、又は所望される任意の他の色原体を触媒するために使用されうる。最終の色原体沈着は、シグナル２０と比較した増幅レベルが非常に大きいので、矢印２８として示される。
【００８８】
ここで図３には、アッセイにおいて２’−Ｏ−メチルＲＮＡプローブを使用するための例示的工程を示すフローチャートが示される。ＦＦＰＥＴサンプル３１の脱パラフィンの後に、検出のためのＲＮＡの回復３２（例えばマイルドなＣＣ１又はＣＣ２）、標的へのプローブのハイブリダイズ３３、ストリンジェンシーでの洗浄３４、シグナルの増幅３５、及び色原体の検出３６が続く。
【００８９】
各ハプテン化プローブの増幅と検出は次の通りに達成された。内在性組織ペルオキシダーゼ活性を、一滴のＰＯ阻害剤（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：７６０−４１４３）を三回分配し、反応を１２分間インキュベートすることによって、不活化させた。数回の洗浄後、一滴のＴＳＡブロック（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：７６０−４１４２）をスライド上に分配し、４分インキュベートした後、一滴のＨＲＰコンジュゲート抗ハプテンモノクローナル抗体（２．５ｕｇ／ｍｌ、アビジン希釈剤プラスＢ５ブロッカー，パーツ番号９００４０中で調製）を分配した；混合物を２８分インキュベートした。
【００９０】
チラミド媒介ハプテン増幅は、スライド上に一滴のチラミド−ハプテンコンジュゲートとついで一滴のＴＳＡ−Ｈ２Ｏ２（ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ＃：７６０−４１４１）を分配し、反応物を３２分間インキュベートすることによって、達成された。十分な洗浄後、もう一滴のＴＳＡブロックとついで２８分間インキュベートされた一滴の同族抗ハプテンＨＲＰコンジュゲート抗体が分配された。洗浄後、このＨＲＰコンジュゲートが製造者（ヴェンタナメディカルシステムズカタログ＃：７８０−００１）によって示された通りに銀色原体付着を触媒した。ついで、ヘマトキシリンＩＩ及びブルーイング試薬を使用して組織核を染色した；ついで、スライドを、勾配アルコールを使用して脱水し、カバーガラスをつけた。
【００９１】
ＩＶ．方法と結果
記載された自動化技術は、以下に簡単に記載されるモジュール化されたデザインを有している。
【００９２】
１）ガラススライド上のホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）サンプルを処理して、ワックスを除去し、架橋タンパク質を変性させ、限られた量のプロテアーゼを用いてプローブ及び検出試薬の浸透を可能にする。
【００９３】
２）ハプテン標識プローブがハイブリダイゼーションバッファー中で標的にハイブリダイズされ、ストリンジェントな洗浄が続いて遊離プローブが除去される。
【００９４】
３）ＨＲＰコンジュゲート抗ハプテンマウスモノクローナル抗体がハイブリダイズされたプローブと共にインキュベートされ、ついで、十分な洗浄がなされて、プローブ上のハプテンに結合しなかった抗体が除去される。
【００９５】
４）チラミド増幅工程はハプテン標識チラミド化合物を用いて実施され、遊離のチラミドは洗浄除去される。
【００９６】
５）第二のＨＲＰコンジュゲート抗ハプテンマウスモノクローナル抗体がチラミド反応によって沈着されたハプテンと共にインキュベートされ、結合していない過剰の抗体が洗浄除去される。
【００９７】
６）インサイチュー結合ＨＲＰは銀又は代替の色原体沈着を触媒し、シグナルがＲＮＡ発現の検出及び半定量のためにスライド上に顕微鏡下で可視化される。
【実施例】
【００９８】
実施例１
アレイ定量と一致したマイクロＲＮＡ ＩＳＨ染色
既知の濃度を有する組織中のｍｉＲＮＡを半定量的に検出するためにプローブを使用することができることを樹立するために、ＭＣＦ−７異種移植片を分析した。ｍｉＲＮＡプローブは、Fix等 Cancer Genomics & Proteomics 7:261-278によるレポートに基づいて選択された。著者は、ポリフェノン−６０を用いて又は用いないで処理されたＭＣＦ−７培養細胞から８７１のヒトｍｉＲＮＡの特性を明らかにし定量するためにマイクロＲＮＡマイクロアレイを使用した。ＭＣＦ−７組織は、ｍｉＲ−２００ｃ（これは、サンプル当たり１００００−２００００コピーを有すると報告された）、ｍｉＲ−２１（これは、サンプル当たり＞２００００コピーを有すると報告された）、ｍｉＲ−２５（これは、サンプル当たり５０００−１００００コピーを有すると報告された）に対してアッセイされた。
【００９９】
ＭＣＦ−７細胞において様々なレベルで発現された４つのマイクロＲＮＡ標的に対して向けられたＤＮＰ標識（５’及び３’端）された２２塩基の２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを合成し、修正ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ増幅検出キット及び銀検出と組み合わせた；十分に自動化された染色アッセイが、ＶＥＮＴＡＮＡ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴＲ機器を使用して達成された。プローブ及び新規検出系は、ＭＣＦ−７異種移植片ＦＦＰＥ組織中の各マイクロＲＮＡ標的の感度がよく特異的な検出を触媒した。結果は図４に示されており、図４Ａはバックグラウンド染色を樹立するためにコントロールとしてスクランブルプローブを使用して染色されたサンプルである。図４ＢはｍｉＲ−２００ｃプローブでの染色を示し；図４ＣはｍｉＲ−２１プローブでの染色を示し；図４ＤはｍｉＲ−２５プローブでの染色を示す。刊行物の結果と一致して、ｍｉＲ−２１が最も暗い染色を示し、ｍｉＲ−２００ｃが続き、ついでｍｉＲ−２５であった。スクランブルプローブは実質的なバックグラウンドを生じなかった。結果は、ここに記載されたプローブと方法を使用してｍｉＲＮＡをＦＦＰＥＴ中において半定量的に検出することができることを示している。注目すべきは、染色の感度を変更するように検出を更に増幅させ又は示されたものより少なく増幅させることができることである。
【０１００】
ある勾配の細胞質マイクロＲＮＡシグナルが正常な固定された異種移植片組織において観察されたが（組織周辺に強いシグナル；組織中心に行くほど弱いシグナル）、これは、マイクロＲＮＡ検出に対する固定の影響を示唆している。より一様なシグナルパターンが「２＋２」固定ＭＣＦ−７異種移植片組織を使用して観察されたが、これは、この新規固定方法の有用性がマイクロＲＮＡ標的を含むように拡張されるかも知れないことを示唆している。
【０１０１】
染色に対する固定の影響を試験するために、ＭＣＦ−７異種移植片組織を収集し、様々な条件下で即座に室温に又は冷１０％ＮＢＦ中に配した。図５−９は、（Ａ）ネガティブコントロールのスクランブルプローブ、（Ｂ）ｍｉＲ−２１プローブ、及び（Ｃ）ｍｉＲ−２００ｃプローブのｍｉＲＮＡ染色の顕微鏡写真を示す。図５は、２４時間の間、室温１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）を使用する固定を示す。２４時間の室温スライドは、処理プロトコルが’１９５出願に開示されたものと比較される所望の標準である。’１９５出願の図５を参照のこと。組織染色に対する固定の影響を扱うこのセクションの目的のために、’１９５出願に開示される一般的な検討がここに提供される。
【０１０２】
’１９５特許出願に開示されたように、該方法の第一工程は、サンプルの実質的に断面全体にわたる組成物の実質的に完全な拡散を可能にするのに効果的な条件下で組織サンプルを固定組成物に供することである。第一工程の効果的な温度範囲は−２０℃より高い温度から少なくとも１５℃まで、好ましくは０℃より高い温度から典型的には約１０℃の上部温度まで、更により典型的には約３℃から約５℃までである。実験を伴う実施例では、温度は典型的には約４℃であった。
【０１０３】
’１９５特許出願の教示によれば、温度が増加すると、架橋速度が増大する。そしてこの最初の処理工程は、架橋の初期化に関連する影響を最小にしながら組織サンプルの断面全体にわたる固定組成物の実質的に完全な拡散に関連する有益な性質をバランスさせることを試みる。しかしながら、拡散はまた温度の増加と共に増加するため、与えられたサンプルでは、架橋速度の増加に関連する任意の有害な影響を最小にしながら拡散速度を最大にすることは有益性を増大させるようであることが知見された。
【０１０４】
教示は、組織サンプル中への固定組成物の拡散は、サンプルの実質的に断面全体にわたる組成物の拡散に効果的な時間の間、一般的に続くことを続ける。最初の処理工程の期間は、約１５分から約４時間まで、最も典型的には１５分より長い時間から約３時間までの範囲であり、良好な結果は、典型的には約１．５時間から約２時間、固定組成物拡散工程を実施することによって得られる。
【０１０５】
’１９５特許出願はまた第二処理工程に関連する温度が典型的には周囲温度より高く、例えば約２２℃より高いことを教示している。その出願に記載された実験を伴う実施例では、温度は典型的には周囲温度より高く少なくとも５５℃まで、より典型的には約３５℃から約４５℃までであったが、この温度範囲が比較的速い組織架橋を可能にするのに十分に架橋速度を増加させたためである。第二処理工程の期間は、１５分より長い時間から少なくとも約５時間の範囲であり、より典型的には少なくとも約１時間から約４時間であり、より典型的には約２時間から約３時間までである。’１９５出願中のある開示された実験を伴う実施例が実施され、そこでは、第二処理工程は４５℃で１．５時間の間であった。
【０１０６】
例として’１９５特許出願において、そこの図４Ａ及び４Ｂは同出願の図３Ｇ及び３Ｈの拡大画像である。図４Ｂに対するそこの矢印は、これらの例示的実施態様に対して４℃で１０％ホルマリン固定溶液中での２時間の予浸を使用してつくられた画像に対しての結果の拡大された詳細を示している。組織形態は、４℃で１０％ホルマリン固定溶液中での２時間の予浸を使用してつくられた組織サンプルに対してより良好であることが示されている。４℃で１０％ホルマリン固定溶液中での２時間の予浸に供せられなかった組織サンプルでは、ホルマリンは内部に拡散しなかった−４℃で１０％ホルマリン固定溶液中での２時間の予浸を使用してつくられた組織サンプルの形態（図４Ｂ）ほど保存されていない組織サンプルの形態（図４Ａ）を参照のこと。前記は’１９５特許出願に詳細に記載されここで適用された２＋２法の簡単な説明及び教示である。
【０１０７】
図６は２時間の４℃のＮＢＦと続く２時間の４５℃のＮＢＦを使用する固定を示し；図７は４時間の４℃のＮＢＦと続く２時間の４５℃のＮＢＦを使用する固定を示し；図８は６時間の４℃のＮＢＦと続く２時間の４５℃のＮＢＦを使用する固定を示し；図９は２４時間の４℃のＮＢＦと続く２時間の４５℃のＮＢＦを使用する固定を示す。図５−９から、これら特定のマイクロＲＮＡに対する最良のシグナル・ノイズ比は、「２＋２」（図６）又は「４＋２」（図７）固定法の何れかで処理されたサンプルで見ることができるようである。
【０１０８】
均等
【０１０９】
別途定義されない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語はこの技術の属する分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。
【０１１０】
ここに例証的に記載された本技術は、ここに特に開示されていない任意の要素又は要素群、限定又は限定群がない状態で好適に実施されうる。よって、例えば、「含む（comprising）」「含む（including）」、「含む（containing）」等の用語は広く限定なしに読まれるべきである。加えて、ここで用いられる用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定するものではなく、示され記載された特徴の任意の均等物又はその一部を除外するというそのような用語及び表現の使用を意図するものではないが、請求された本技術の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。
【０１１１】
よって、ここに提供された材料、方法、及び実施例は好ましい態様の代表的なもので、例示的であり、本技術の範囲に対する限定は意図されていないことが理解されるべきである。
【０１１２】
本技術はここで広くかつ上位概念的に記載された。上位概念の開示に入るより狭い種概念及びサブジェネリック分類のそれぞれが本技術の一部をまた構成する。これは、削除される材料がここに特に記載されているかどうかにかかわらず、上位概念から任意の主題事項を除外する否定的限定又は条件付きで本技術の上位概念的記載を含む。
【０１１３】
また、本技術の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本技術がマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点からもまたそれについて記載されていると認識するであろう。
【０１１４】
ここで述べられた全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、それぞれが個々に出典明示により援用されるかの如く、同じ範囲で、その全体が出典明示により明示的に援用される。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先するであろう。
【０１１５】
他の態様は次の特許請求の範囲内に記載される。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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