(57)【要約】  本発明は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ−２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含む、リンパ球を増殖させるための組成物に関する。本発明はさらに、臨床的に有用なリンパ球集団を作製する方法に関し、前記方法は、少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料、特に、組織試料または体液試料を得て、所望により身体試料中の細胞を分離する工程、インビトロで身体試料を培養して試料中のリンパ球を増殖および／または刺激する、前記培養がＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１の使用を含む、工程、ならびに、所望により培養試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在を決定する工程、を含む。本発明はまた、免疫療法および臨床的に有用なリンパ球集団に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ−２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含む、リンパ球を増殖させるための組成物。
【請求項２】
２種または３種のサイトカインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
液状である、特に細胞培地である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記液体組成物中のＩＬ−２の濃度が１０Ｕ／ｍｌ〜６０００Ｕ／ｍｌの範囲内、好ましくは５００Ｕ／ｍｌ〜２０００Ｕ／ｍｌの範囲内、より好ましくは８００Ｕ／ｍｌ〜１２００Ｕ／ｍｌの範囲内である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＩＬ−１５の濃度が、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＩＬ−２１の濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３〜請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料、特には組織試料または体液試料を得て、所望により前記身体試料中の細胞を分離する工程、
ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を使用してインビトロで前記身体試料を培養して前記試料中のリンパ球を増殖および／または刺激する工程、及び
所望により培養試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在を決定する工程
を含む、臨床的に有用なリンパ球集団を作製する方法。
【請求項８】
前記臨床的に有用なリンパ球が、腫瘍反応性リンパ球、病原体反応性リンパ球および自己免疫反応性リンパ球から選択され、好ましくは腫瘍反応性リンパ球から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記身体試料が、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ節  肝臓、胸水、胸郭、腹腔、滑液、腹膜、腹膜後隙、胸腺、および腫瘍からなる群より選択される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記身体試料が末梢血から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物、特にヒトが、腫瘍疾患に罹患している哺乳動物、腫瘍疾患を発症するリスクを有する哺乳動物、感染症に罹患している哺乳動物、感染症を発症するリスクを有する哺乳動物、自己免疫疾患に罹患している哺乳動物、自己免疫疾患を発症するリスクを有する哺乳動物から選択される、請求項７〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インビトロ培養工程が、リンパ球が検出可能になるまでＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む培地中でインキュベーションすることを含む第一増殖工程を含む、請求項７〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一増殖工程のインキュベーションの時間が、６時間〜１８０日間の範囲内、好ましくは４〜１０日間の範囲内、より好ましくは６〜８日間の範囲内、最も好ましくは約７日間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インビトロ培養が、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１に加えてフィーダー細胞および／またはＣＤ３に対する抗体を含む培地中でインキュベーションすることを含む第二増殖工程を含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フィーダー細胞：リンパ球の比が、１：１〜１：１００の範囲内、好ましくは１：２〜１：５０の範囲内、より好ましくは１：５〜１：２０の範囲内、最も好ましくは約１：１０である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一増殖工程が細胞培養にＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を同時点で添加することを含む、請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一増殖工程が細胞培養にＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のうちの少なくとも１つを異なる時点で別々に添加することを含む、請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
最初にＩＬ−２１が添加され、特にＩＬ−１５が次に添加され、その後ＩＬ−２が添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
最初にＩＬ−１５が添加され、特にＩＬ−２１が次に添加され、その後ＩＬ−２が添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記臨床的に有用なリンパ球集団が単クローン性、少クローン性または多クローン性のいずれかである、請求項７〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一増殖工程の培地および／または前記第二増殖工程の培地が、少なくとも１つの増殖抗原を含む、請求項１２〜請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
増殖抗原がＴＡＡの断片、特に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含むペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記インビトロ培養工程が、リフォーカス細胞を含む培地中でのインキュベーションを含むリフォーカス工程をさらに含む、請求項１２〜請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
リフォーカス工程の時間が、１〜６日間の範囲内、好ましくは１〜３日間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
リフォーカス細胞：リンパ球の比が、１：１〜１：１００の範囲内、好ましくは１：５〜１：１０の範囲内である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養工程が、プロモーター化合物を添加して特定のリンパ球亜群、特にガンマ−デルタＴ細胞（γδ−Ｔ細胞）、の増殖を促進させることを含む、請求項７〜請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
増殖した細胞培養物から前記臨床的に有用なリンパ球集団を単離することをさらに含む、請求項７〜請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記臨床的に有用なリンパ球の存在を検査する工程が評価用抗原を使用することを含む、請求項７〜請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
評価用抗原が、培養された試料と同じ哺乳動物由来の細胞（自己細胞）、特に腫瘍細胞、少なくとも部分的に遺伝的に一致している同種細胞、特に腫瘍細胞、及び導入遺伝子として臨床的に有用な抗原を発現する細胞から選択される形で培養試料に提示される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記臨床的に応答性のリンパ球の存在の検査が、リンパ球を少なくとも１つの臨床的に有用な抗原と接触させ、サイトカイン産生（特にＩＮＦγ産生）、細胞増殖、細胞毒性、シグナル伝達および／または細胞内リン酸化のいずれか１つにおける変化を決定することを含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
身体試料が哺乳動物から入手される、請求項７〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法に従って、臨床的に有用なリンパ球集団を得るかまたは作製する工程；および
臨床的に有用なリンパ球集団を前記哺乳動物に投与する工程
を含む、前記哺乳動物における感染症、腫瘍疾患、または自己免疫疾患を治療または予防するための免疫療法。
【請求項３２】
腫瘍疾患がグリア芽腫および膵がんから選択される、請求項３１に記載の免疫療法。
【請求項３３】
臨床的に有用なリンパ球集団が、
前記哺乳動物におけるがん細胞の退縮をもたらし；
前悪性病変から悪性病変への推移を妨げ；
腫瘍細胞もしくは前悪性細胞の急速な老化をもたらし；
自己抗原陽性細胞の除去をもたらし；
病原体の殺傷、増殖停止もしくは封じ込めをもたらし；
がん幹細胞を妨害し；且つ／又は
がん細胞、もしくは自己抗原を発現する細胞の増殖停止を誘導する、請求項３１または請求項３２に記載の免疫療法。
【請求項３４】
医学的処置における使用のための、特に、感染症、自己免疫疾患または腫瘍疾患を治療または予防するための、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記使用が、請求項７〜請求項３１のいずれか一項に記載の方法を用いて臨床的に有用なリンパ球集団を作製することを含む、請求項３４に記載の使用のための組成物。
【請求項３６】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を含み、さらに、ＴＣＲを刺激する成分（特にＯＫＴ３）、共刺激分子、フィーダー細胞および少なくとも１つの臨床的に有用な抗原の配列を含むペプチドのうち少なくとも１つを含んでもよい、免疫療法、特に腫瘍疾患の治療、で使用するためのキット。
【請求項３７】
Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞から選択され、前記Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞またはＣＤ４＋−Ｔ細胞）、特にＴＨ１細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＤ８＋−Ｔ細胞）、特にＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または末梢性メモリー細胞（ＴＰＭ細胞）、ガンマ−デルタＴ細胞（γδ−Ｔ細胞）、ＮＫ−Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、ダブルネガティブＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞）から選択される、請求項７〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法によって得られる臨床的に有用なリンパ球。
【請求項３８】
組織、特に腫瘍もしくは感染組織もしくは炎症組織、への進入を促進する分子（例えばＣＸＣＲ３）を発現するリンパ球；および
長期メモリー（特にＣＤ１１７およびｃ−ｋｉｔ）、抗原特異的免疫応答の活性化、特に４−１ＢＢ、溶解性免疫細胞応答、特にＣＤ１０７ａ、のいずれかのマーカーが豊富であるリンパ球
から選択される、請求項３６または請求項３７に記載の臨床的に有用なリンパ球。
【請求項３９】
Ｔ細胞前駆体、ＴＣＭおよび／またはＴＰＭを含む、医薬用途に有用なリンパ球の組み合わせの形成を促進する分子およびサイトカインを発現し、
臨床的に有用なリンパ球の増殖を促進する分子およびサイトカインを発現し、
ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−１７およびそれらの任意の組み合わせから選択されるサイトカインを産生し、
ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞である、
請求項７〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法によって得られるリンパ球。
【請求項４０】
請求項７〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法によって得られる、臨床的に有用なリンパ球集団。
【請求項４１】
臨床的に有用なリンパ球集団を含む、請求項７〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法によって得られるリンパ球集団。
【請求項４２】
以下の特徴のうちの一つまたは複数によって特徴付けられる請求項４１に記載のリンパ球集団：
Ｔ細胞の総数に対してのＴｒｅｇの割合が５％未満、好ましくは３％未満である；
ＴＨ細胞の総数に対してのＴＨ１細胞の割合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である、
ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数に対してのＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の割合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である、
Ｔ細胞の総数に対しての４−１ＢＢ＋Ｔ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である、
Ｔ細胞の総数に対してのＣＤ１１７＋Ｔ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である、
Ｔ細胞の総数に対してのＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である；および
Ｔ細胞の総数に対してのγδＴ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である。
【請求項４３】
以下の特徴のうちの一つまたは複数によって特徴付けられる請求項４１または請求項４２に記載のリンパ球集団：
Ｔ細胞の総数に対しての前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも３％である；
Ｔ細胞の総数に対してのセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）の割合が少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％である；
Ｔ細胞の総数に対しての末梢性メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）の割合が少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％である；および
Ｔ細胞の総数に対してのエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％  より好ましくは少なくとも５％である。
【請求項４４】
以下の特徴のうちの一つまたは複数によって特徴付けられる、請求項４１〜請求項４３のいずれか一項に記載のリンパ球集団：
多量体可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体または細胞内サイトカイン産生によって決定される、Ｔ細胞の総数に対する臨床的に有用なＴ細胞の割合が、少なくとも０．１％である；
抗原刺激後の細胞内サイトカイン産生の値が、抗原刺激無しの場合の標準偏差の少なくとも２倍である；および
抗原刺激後のＣＤ１０７ａ誘導の値が、抗原刺激無しの場合の標準偏差の少なくとも２倍である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のサイトカイン組成物を用いて臨床的に有用なリンパ球集団を作製する方法を含む、能動細胞免疫療法に関する。本発明はさらに、サイトカイン組成物および作製された臨床的に有用なリンパ球に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国において、がんは依然として最も一般的な死因の一つである。例えば、合衆国およびドイツでは、がんは２番目に多い死因であり、死亡数はそれぞれ、５６０，０００人（２００９）および２１８，０００人（２０１０）である。この一連の疾患を検出および治療する能力における改善にもかかわらず、多くのがんの生存率は低いままである。
【０００３】
がん疾患の中で、膵がんは、合衆国およびスウェーデンにおけるがんによる死亡原因の第４位であり、改善の兆候が見られない。膵がんが診断されるまでに、患者の過半数は局所進行がんまたは転移性疾患により不治となっており、対症療法しか残されていない。生存期間中央値（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）は約６ヶ月間である。腫瘍が切除可能であることで疾患治癒の可能性があるのは、患者の約１５〜２０％に限られる。ほとんどのがんと同様、膵がんは早期の全身的な治療介入を必要とする全身性疾患である。多くの他の種類のがんと比較して、膵がんは、化学療法および放射線に強い抵抗性を示す。膵がんの予後不良の改善において意味のある大きな進歩を遂げるためには、新たな代替法およびより効率的な治療コンセプトの発見が不可欠である。膵がん生物学は、腫瘍進行および転移性を可能にする局所免疫抑制および全身免疫抑制の両方と関連がある。
【０００４】
最も頻度が高い進行性神経膠腫であるグリア芽腫の状況も同様であり、発生率は合衆国において２〜３／１００．０００である。グリア芽腫は、全ての頭蓋内腫瘍の１２〜１５％を占め、組織球性腫瘍の５０〜６０％を占める。新たな治療レジメンによって、全生存期間中央値（ｍｅｄｉｕｍ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）が延長された（放射線療法単独による１２．１ヵ月と比較して、放射線＋テモゾロミドを用いて１４．６ヵ月）。今までのところ、グリア芽腫を有する患者または膵がんを有する患者に対し、ロバストで且つ臨床的に有効な免疫療法プロトコルを開発しようという企図では、失敗が続いている。このようながんを治療するための１つのアプローチは、腫瘍による抑制を克服すること、ならびに／または、抗腫瘍性の細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導すること、である。
【０００５】
能動細胞免疫療法（ＡＣＩ）と称される新たな治療分野は、最も有望な進展の１つである。がん免疫療法は、受動免疫療法か能動免疫療法のいずれかであり得る。受動療法は、サイトカイン、腫瘍特異的抗体または免疫細胞を含む免疫調節剤の養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）に基づく。これらの物質または細胞がその後患者に投与されることにより、抗腫瘍作用が惹起される。一般的に、これらの療法は、免疫記憶を生じさせないため、長期点滴に基づく治療を必要とする。一方、能動免疫療法は、身体のそれ自身の免疫細胞を用いて、抗原特異的な抗腫瘍効果を促進させる目的で、患者の免疫系を刺激する。さらに、能動免疫療法は、微小残存病変および腫瘍再発を防ぎ得る、永続性のある抗腫瘍反応を生み出すことに努める。
【０００６】
腫瘍を標的としたＴ細胞（腫瘍反応性Ｔ細胞）を用いた臨床的に有用な長期寛解が、メラノーマを有する患者において達成された（２、３）。画期的な論文によって、最近、患者自身のＴ細胞が患者自身の腫瘍細胞、すなわち患者自身の「個人の（ｐｒｉｖａｔｅ）」変異を標的とする場合に、がん治療における最良且つ永続的な応答が達成されることが示された（４）。このような有望な結果は、上皮腫瘍を有する患者においても、すなわち、上皮がんにおける変異エピトープを標的とするＴ細胞の適応移植（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって、得られた（５）。これらのアプローチは通常、腫瘍病巣からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の回収または末梢血からのＴ細胞の回収に依存している。
【０００７】
ＣＴＥＰ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙの最近の報告により、末梢血由来の腫瘍反応性Ｔ細胞およびＴＩＬの増殖に関するプロトコルが要約された。
【０００８】
この研究は、産物の一致性およびＴ細胞産物の効率的な収率に特に重点を置いた、ＴＩＬ療法またはＴ細胞に基づく療法の使用のための指針に従うものであった。メラノーマを標的とするＴ細胞の一致性および収率は共に、生物学的製剤、すなわち、ＣＤ４０ＬまたはＰＤ−１を標的とする療法と併せて、Ｔ細胞に基づく戦略ががん治療の主流に入ることを可能にするであろう現在の方法論を用いることで、達成可能であると思われる。
【０００９】
最小限に培養されたＴＩＬが、臨床用途のための最も効果的な表現型およびプロファイルを提供するものと見られる（１１）。２４ウェルプレート内で増殖され、免疫エフェクター機能と、さらに、ＩＬ−２、同種フィーダー細胞およびＯＫＴ３を用いた増殖について試験された、エキソビボ活性化された自己Ｔ細胞の使用が、今日までに最も成功を収めているアプローチであった（９、１２、１３）。
【００１０】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋腫瘍抗原（ＴＡＡ）を標的とするＴ細胞が、ＧＭＰ条件下で末梢血から作製され、後の患者の治療のために製剤化された。これは、自己のＣＤ４＋Ｔ細胞（１４〜１６）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（１７）を用いて達成され、そのいくつかはＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を標的とした（１８）。これは、末梢循環中には十分なＴ細胞前駆体が存在することから、がんを有さない健常患者由来のＰＢＭＣにおいても可能である。標的対象療法（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）のためのＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを作製する様々なＴ細胞増殖法（１９）が記述された。これは、抗腫瘍性リンパ球による患者の免疫系のクローン再増殖が、がん退縮を誘導し自己免疫も誘導することが示されたことから、非常に興味深い（２０）。
【００１１】
増殖培地製剤も、能動免疫療法の成功に関連し得る。飢餓によって、Ｔ細胞介在性免疫応答が影響を受け、飢餓誘導性免疫抑制、さらにある種のＴ細胞サブセットの増殖も誘導され得ることが、研究によって示された。この機構はレプチンによって仲介されると思われ（２１）、レプチンは、Ｂ細胞発生および後のＢ細胞応答も調節する（２２）。これにより、抗原提示を増強する、栄養分感知経路（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ）（すなわち、樹状細胞におけるＧＣＮ２）の発見がもたらされた（２３）。より最近の研究では、サイトカインによって駆動されるＴ細胞増殖（ＴＩＬまたはＡＣＴのエキソビボ増殖におけるもの等）が外来アミノ酸に依存すること、および、サイトカイン、すなわちＩＬ−７、がアミノ酸輸送体発現に関連する遺伝子を発現上昇させたこと、が示された。従って、増殖培地要求物の改変は、Ｔ細胞増殖に使用されるそれぞれのサイトカイン混合物によって形作られ（２４）、培地中のアミノ酸についても同様であり、両方の要素が臨床的に意味のあるＴ細胞の成熟および分化に影響を与えることになる。
【００１２】
臨床（抗腫瘍）効果は、Ｔ細胞に基づく治療法に応答している患者からの生体外由来と定義される、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋によって定義される、ＣＤ８＋およびセントラルメモリー細胞によって仲介されると思われる。このようなＴ細胞の表現型は、生体外で増殖されたＴ細胞集団によって、および養子移入後の宿主因子によって、決定される。がん細胞を標的とする多様なＴ細胞集団は、有効な免疫応答、例えば、長期メモリーＴ細胞、さらにまた、（がん）標的細胞に即座に応答して抗腫瘍性免疫応答を引き起こし得るＴ細胞、例えば、グランザイムおよびパーフォリン等の細胞溶解性分子を発現する高分化型Ｔ細胞に有益であり得る（２５、２６）。長期メモリーの免疫記憶は、テロメア長によって測定され得る、増加能および半減期の増加によって、部分的に決定される（２７、２８）。
【００１３】
（メラノーマ）特異的ＴＩＬまたはＴ細胞クローンのどの段階がインビボ移植に最良であるかについては、インビトロおよびインビボにおける遺伝子発現の差異、ならびに個々の患者における示差的なサイトカイン環境が原因で、比較的にほとんど知られていない。個々の表現型だけでなく、分化型Ｔ細胞プール補充するであろうセントラルメモリーＴ細胞の長期の免疫学的記憶の提供と共に、免疫エフェクター機能（高分化型ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）Ｔ細胞の急速な送達と関連した、異なる表現型も、Ｔ細胞の増殖に適した選択であり得る。
【００１４】
Ｔ細胞の枯渇および機能喪失へのより高度な変化を示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（ＰＤ１＋、および／またはＬＡＧ−３、４−１ＢＢ＋である傾向がある（２９））の富化も示し得る、Ｔ細胞上の活性化／枯渇マーカー、すなわちＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびまたは４−１ＢＢの発現も、同様に意義があると思われる。
【００１５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の好適な標的であることが知られていた。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、がん検査抗原（ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ）であり（３６、３７）、多数の腫瘍において発現される。例えば、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａにおいて、５０のグリア芽腫病巣がＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質発現についてスクリーニングされ、グレード３およびグレード４のＧＢの３５％がＮＹ−ＥＳＯ−１陽性であることが分かった。膵がん病巣のスクリーニングによって、より少ない数のＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質＋特に転移性病巣において２０％の範囲内のがん病巣が示された。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とするＴ細胞において明白な「非特異的」反応性無しに悪性細胞および精巣においてのみ発現されると思われるため、末梢血由来の腫瘍反応性Ｔ細胞を増殖するためにＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とすることは標的の「安全な選択」であると思われる（３６）。これは、抗腫瘍性リンパ球による患者の免疫系のクローン再増殖が、がん退縮、および潜在的リスクである自己免疫（２０）を誘導することが示されたことから、非常に興味深い。ＮＹＥＳＯ−１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性を増加させるためのＤＮＡメチル化剤の使用とともに（３９、４０）、ＧＢにおける、およびＧＢ幹細胞における標的候補として、いくつかの研究において試験されている（３８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
この技術的現状に鑑みて、本発明の目的は、免疫療法における改良法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は特に、サイトカインであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）および／またはインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を含む組成物がリンパ球、特に臨床的に有用なリンパ球、の優れた刺激および増殖をもたらすという知見に基づいている。サイトカイン混合物による増殖および刺激の方法は高感度であり、試料中の開始濃度が非常に低い場合であっても臨床的に有用なリンパ球集団の作製を可能にする。
【００１８】
従って、第一の態様によれば、本発明は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ−２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含む、リンパ球を増殖させるための組成物を提供する。
【００１９】
このサイトカイン組成物を用いて、本発明者らは、抗原編集された（ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｄｉｔｅｄ）リンパ球集団を作製するための新規の方法を定めることができた。従って、第二の態様によれば、本発明は、
少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料（ｂｏｄｙ  ｓａｍｐｌｅ）、特に、組織試料または体液試料を得て、所望により身体試料中の細胞を分離する工程、
インビトロで身体試料を培養して試料中のリンパ球を増殖および／または刺激する工程であって、前記培養がＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１の使用を含む、前記工程、
ならびに、所望により培養試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在を決定する工程、
を含む、臨床的に有用なリンパ球集団を作製する方法を提供する。
【００２０】
本発明の第二の態様の方法は、臨床的に有用なリンパ球集団を含む、リンパ球集団の形成をもたらす。
【００２１】
第三の態様によれば、本発明は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞から選択される、第二の態様による方法によって得られる臨床的に有用なリンパ球を提供する。
【００２２】
第四の態様によれば、本発明は、臨床的に有用なリンパ球集団を含む、本発明の第二の態様による方法によって得られるリンパ球集団を提供する。
【００２３】
本発明の第二の態様による方法を用いて得られる臨床的に有用なリンパ球集団は、細胞免疫療法に特に有益である。
【００２４】
第五の態様によれば、本発明は、本発明の第二の態様による臨床的に有用なリンパ球集団を作製する工程と、臨床的に有用なリンパ球集団を前記哺乳動物に投与する工程とを含む、哺乳動物における腫瘍疾患、感染症または自己免疫疾患を治療または予防するための免疫療法を提供し、ここで前記身体試料は前記哺乳動物から得られる。
【００２５】
第六の態様によれば、本発明は、医学的処置で使用するための、特に、感染症、自己免疫疾患または腫瘍疾患を治療および予防するための、本発明の第一の態様による組成物を提供する。
【００２６】
従って、第七の態様によれば、本発明は、医学的処置で使用するための、特に、感染症、自己免疫疾患または腫瘍疾患を治療または予防するためのキットを提供する。ここで前記キットは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１、ならびに、所望により、ＴＣＲを刺激する成分の少なくとも１つ、特に、ＯＫＴ３、共刺激分子、フィーダー細胞、および少なくとも臨床的に有用な抗原のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ゾレドロン酸と組み合わせたサイトカイン混合物ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を用いたＰＢＭＣの増殖から得られた試料の、フローサイトメトリー解析の結果を表す３つのグラフを示している。試料はグラフの上部に示される異なる時点で採取した。測定されたシグナルは、Ｙ軸方向のＣＤ３シグナルおよびＸ軸方向のＴＣＲγδシグナルである。γδＴ細胞は方形領域に見られる。元々着色していた画像（ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ  ｃｏｌｏｒｅｄ  ｉｍａｇｅ）では、グレースケールで重複シグナルの強度を示している。方形領域内の細胞の割合が上部に示される。
【図２】図２は、ＰＲＤＭ２ペプチドの存在下でサイトカイン混合物を用いて増殖されたＰＢＭＣから得られたリンパ球の、フローサイトメトリー解析の結果を示している。左の大パネルはリンパ球増殖の開始時の試料の結果を示しており、右パネルは刺激から１８日後の試料の結果を示している。細胞シグナルはＣＤ４／ＣＤ８マーカーに基づいて分離される。右側の小パネルはリンパ球およびＣＤ３＋細胞のゲーティングを示している。
【図３】図３は、図２と同じ試料のフローサイトメトリー解析を示している。ＩＦＮ−γマーカーおよびサイズによる細胞シグナルの分離（側方散乱光ＳＳＣ）。
【図４】図４は、サイトカイン混合物ならびにＩＮＯ８０ＥおよびＵＣＨＬ３による刺激を用いたＰＢＭＣの増殖の試料に対する、フローサイトメトリーの結果を示している。細胞シグナルは、リンパ球（４ａ）、ＣＤ３＋（４ｂ）についてゲーティングされ、次いで、ＣＤ８およびＣＤ４シグナル（４ｃ）に基づいて分離される。
【図５】図５は、ＩＮＯ８０ＥまたはＵＣＨＬ３による刺激後のダブルネガティブ且つＣＤ８＋の集団におけるＩＦＮ−γ産生を示している。
【図６】図６は、サイトカイン混合物ならびにＩＮＯ８０ＥおよびＵＣＨＬ３ペプチドを用いて増殖されたＰＢＭＣ細胞の解析を示している。ＩＮＯ８０Ｅで刺激された細胞を、サイトカインＣＤ１０７ａ（６ｄ）、ＣＤ１２７（６ｅ）およびＣＤ１１７（６ｆ）の産生について解析した。
【図７】図７ａ〜図７ｆは、サイトカイン混合物およびＣＭＶｐｐ６５による刺激を用いたＰＢＭＣの増殖の結果を示している。
【図８】図８は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を用いて増殖された細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ解析の結果を示している：図８ａおよび図８ｃは、それぞれ０日目および１８日目に刺激されなかった。図８ｂおよび図８ｄは、それぞれ０日目および１８日目にＮＹ−ＥＳＯ−１で刺激された。
【図９】図９は、０日目および１８日目における再度のサバイビンによる刺激後の、グリア芽腫を有する患者から得られたＰＢＭＣから増殖された細胞のサイトカイン産生を示している。測定されたサイトカインはＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αである。図９ａはＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの結果を示しており、図９ｂはダブルネガティブＴ細胞サブセットの結果を示しており、図９ｃはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの結果を示している。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーを用いた、リンパ球の表現型ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の解析を示している。再度、リンパ球は、０日目、およびサイトカイン混合物を用いた１８日間の増殖後に測定される。
【図１１】図１１は、ＣＤ４＋細胞（ＴＨ１／ＴＨ２）およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型に対する増殖の効果の解析を示している。
【図１２】図１２は、ＨＰＶを有する患者の末梢血から増殖された細胞によるサイトカインＣＤ１０７ａ発現の解析を示している。図１２ａはＨＰＶ  Ｌ１ペプチド刺激後のＣＤ１０７ａ発現を示しており、図１２ｂはポジティブコントロールを示しており、図１２ｃは刺激無し（培地）の結果を表す。ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲーティング過程が図１２ｄ〜図１２ｆに示される。
【図１３】図１３は、サイトカイン無し、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはＩＬ−７、ならびにＩＬ−２およびＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンによる刺激を用いて増殖されたリンパ球のＩＦＮ−γ産生を表す２つのグラフを示している。
【図１４】図１４は、サイトカイン無し、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはＩＬ−７、ならびにＩＬ−２およびＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−３ａ、またはＣＭＶｐｐ６５による刺激を用いて増殖されたリンパ球のＩＦＮ−γ産生を表す３つのグラフを示している。
【図１５】図１５は、Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）がサイトカイン混合物を用いたＴ細胞の増殖の前および後に特定されたことを決定する、フローサイトメトリー解析を示している。左から右に：Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞に対しゲーティングされ、次に、活性化Ｔ細胞上のＩＬ−２受容体の高発現を示すＣＤ２５ｈｉｇｈに対してゲーティングされた。次に、前記細胞はＩｌ−２Ｒ（高ＣＤ１２５）細胞に対しゲーティングされ、ＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）およびＦｏｘｐ３（細胞内）の発現について試験された。
【図１６】図１６は、ＣＤ８＋サブセットにおけるＰＤ−１＋Ｔ細胞の割合を決定しているフローサイトメトリー解析を示している。
【図１７】図１７は、増殖されたリンパ球によりペプチド１〜１２でパルスされた自家Ｂ細胞の特異的溶解を示している。
【図１８】図１８は、腫瘍関連抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の存在下でＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１によって駆動される増殖の前のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示している。まず、ＣＤ３＋Ｔ細胞がゲーティングされ、次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しゲーティングされる。
【図１９】図１９は、腫瘍関連抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の存在下でＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１によって駆動される増殖の前のＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示している。まず、ＣＤ３＋Ｔ細胞がゲーティングされ、次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しゲーティングされる。
【図２０】図２０は、腫瘍浸潤性の、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を用いてインビトロで培養された、インキュベーション１週間目のリンパ球培養物の画像を示している。
【図２１】図２１は、放射能（Ｃｒ５１）標識および放出を用いた、自己腫瘍細胞に対する増殖されたリンパ球の細胞毒性アッセイの、機能的模式図の概要を示している。
【図２２】図２２は、グリア芽腫を有する患者から得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球の、フローサイトメトリー解析の結果を示している。図３（Ａ）は、基本表現型ＣＤ８＋（左パネル）、ＣＤ４＋（右パネル）およびダブルネガティブＴ細胞（右パネル）について別々に、特定の表現型：前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、末梢性メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および分化型エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）への、１６のＴＩＬ由来の増殖されたＴＩＬにおけるＴ細胞表現型の分布を示している。個々のデータ点は、基本表現型に基づく特定の表現型の割合を表す。データは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１が、Ｔ細胞前駆体だけでなく、長期の免疫保護を与え得る長期メモリー表現型を有するＴＩＬを増殖させることを示している。図２２（Ｂ）は、Ｔ細胞活性化マーカーおよびＴ細胞枯渇マーカーの発現を示している。結果は、基本表現型ＣＤ８＋（左パネル）、ＣＤ４＋（右パネル）およびダブルネガティブＴ細胞（右パネル）に従って、（Ａ）と同様に分類される。個々のデータ点は、基本表現型に基づくＸ軸上に示されるマーカーを発現する細胞の割合を表す。ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）は「幹細胞」関連マーカーであり、長期メモリーを有するＴ細胞を示し、ＣＤ１０７ａは最近のＴ細胞脱顆粒のマーカーである。データは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１中で増殖されたＴＩＬが、長期の免疫細胞記憶および免疫監視を可能にさせるマーカー（例えばｃ−ｋｉｔ）を発現することを示している。
【図２３】図２３は、膵がんを有する患者の腫瘍組織から増殖されたリンパ球（ＴＩＬ）のフローサイトメトリー分析の結果を示している。左のパネルは、前駆体（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、末梢性メモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および分化型エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）へのＣＤ４＋Ｔ細胞の分布を示している。右のパネル  ＣＤ８＋細胞の分布。データは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１が、Ｔ細胞前駆体だけでなく、長期の免疫保護を与え得る長期メモリー表現型を有するＴＩＬを増殖させることを示している。
【図２４】図２４は、Ｔ細胞活性化マーカーおよびＴ細胞枯渇マーカー（４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、以下参照）に関する、膵がんを有する患者の腫瘍組織から増殖されたリンパ球（ＴＩＬ）の、フローサイトメトリー分析の結果を示している。結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋表現型ＣＤ４＋（上段パネル）、ＣＤ８＋（中段パネル）、ＤＮ（下段パネル）に従って分類される。個々のデータ点は、基本表現型に基づくＸ軸上に示されるマーカーを発現する細胞の割合を表す。データは、強力な抗腫瘍反応および最近の抗原暴露を示す広範囲のマーカーを発現するＴＩＬを示している。ＣＤ１２７分子（ＩＬ−７Ｒ）は強力なＴ細胞生存因子を仲介する。
【図２５】図２５は、ＰＣＲに基づくアプローチによって決定された、膵がんを有する患者の腫瘍組織から増殖されたＴ細胞のＴＣＲ長分布を示している。
【図２６】図２６は、グリア芽腫病巣由来の増殖されたリンパ球における、ＣＤ４＋、ＣＤ８またはＤＮ  Ｔ細胞における、細胞内サイトカイン産生アッセイの結果を示している。図７Ｂのグラフは、刺激後にサイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生するＴ細胞の割合を示している。図１２Ａは、ＰＭＡ／イオノマイシン（ポジティブコントロール）による最大刺激および培地のみによるバックグラウンドを示している。図７Ｂは、腫瘍関連抗原、すなわちＥＧＲｖｒＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビン、に由来する合成ペプチドによる刺激の結果を示している。データは、グリア芽腫を有する患者由来のＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１増殖されたＴＩＬが、通常共有される腫瘍関連抗原に低頻度で反応するＴ細胞を含有することを示している。
【図２７】図２７は、膵がん病巣由来の増殖されたリンパ球における、ＣＤ４＋、ＣＤ８またはＤＮ  Ｔ細胞における、細胞内サイトカイン産生アッセイの結果を示している。図８Ａのグラフは、ＣＤ４＋（左）、ＣＤ８＋（中央）およびＤＮサブセット（右）における、腫瘍関連抗原、すなわちメソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、による刺激後の、サイトカインＩＦＮγ（上段パネル）およびＴＮＦα（下段パネル）を産生するＴ細胞の割合を示している。図８Ｂは、ＮＹ−ＥＳＯ−１刺激を用いたフローサイトメトリー解析の例を示している。ＣＤ３＋、次いでＣＤ８＋に対しゲーティングしたＴ細胞は、ＩＦＮγ産生（上段ボックス）またはＴＮＦα産生（下段ボックス）と比較した、側方散乱光（ＳＳＣ）におけるものである。これは、膵がんを有する患者由来のＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１増殖されたＴＩＬが、通常共有される腫瘍抗原、すなわちＮＹ−ＥＳＯ−１に対し強力な反応性を示すことを示している。
【図２８】図２８は、自己腫瘍細胞による刺激後の、グリア芽腫病巣由来の増殖されたリンパ球における、ＣＤ４＋、ＣＤ８またはＤＮ  Ｔ細胞における、細胞内サイトカイン産生アッセイの結果を示している。図９Ａのグラフは、自己腫瘍細胞による刺激後の、ＣＤ４＋左パネル、ＣＤ８＋（中段パネル）およびＤＮ  Ｔ細胞（右パネル）についての、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生するＴ細胞の割合を示している。図９Ｂは、自己腫瘍細胞で刺激された細胞のフローサイトメトリー解析の例を示している。ＣＤ３＋、次いでＣＤ４＋（上段ボックス）またはＣＤ８＋（下段ボックス）に対しゲーティングしたＴ細胞は、ＩＦＮγ産生（上段ボックス）またはＴＮＦα産生（下段ボックス）と比較した、側方散乱光（ＳＳＣ）におけるものである。これは、グリア芽腫を有する患者由来のＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１増殖されたＴＩＬが、自己腫瘍細胞に対し強力な反応性を示すことを示している。
【図２９】図２９は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて増殖されたリンパ球のＴＮＦα産生を測定する、細胞内サイトカイン産生アッセイの結果を示している。上段パネルはポジティブコントロール（最大刺激）を示している。中段パネルは、自己腫瘍細胞に応答した、ＣＤ４＋ゲーティングした増殖されたＴ細胞のサイトカイン産生の結果を示している（左：全てＴＩＬ、右：ＶＢ２＋Ｔ細胞に対しゲーティングされたＴＩＬ）。下段パネル：ＴＩＬ集団全体（左）およびＶＢ２＋ＴＩＬ（右）におけるバックグラウンド産生。データは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１  ＴＩＬにおける優先的に増殖されたＴＣＲ  ＶＢファミリー（ここでは、ＴＣＲ  ＶＢ２）が自己腫瘍細胞を対象としていることを示している。
【図３０】図３０は、刺激後の、膵腫瘍組織から増殖されたリンパ球におけるＩＮＦγのレベルを示している。ＴＩＬ＋腫瘍は、自己腫瘍細胞による増殖されたリンパ球の刺激に耐える。ＴＩＬ＋ＯＫＴ３は、ＣＤ３抗体によるリンパ球の刺激に耐える。Ｗ６／３２はＣＤ８＋ＴＩＬを遮断する抗体である。抗体Ｌ２４３はＣＤ４＋ＴＩＬを遮断する。データは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１増殖されたＴＩＬが、患者の自己腫瘍に特異的であることを示している。
【図３１】図３１は、自己腫瘍細胞に対する、グリア芽腫を有する患者由来の増殖されたＴＩＬの、細胞溶解反応の解析の結果を示している。Ｘ軸上の数字は腫瘍細胞に対するＴＩＬの比を表す。Ｙ軸上のパーセンテージは、放射能放出によって測定された、増殖されたＴＩＬによる処理の４時間後の、殺傷された腫瘍細胞の数を表す。
【図３２】図３２は、自己腫瘍細胞に対する、グリア芽腫を有する患者由来の、増殖された単クローン性Ｔ細胞および／または優先的に増殖されたＴＩＬの、細胞溶解反応の解析の結果を示している。Ｘ軸上の数字は腫瘍細胞に対するＴＩＬの比を表す。Ｙ軸上のパーセンテージは、放射能放出によって測定された、増殖されたＴＩＬによる処理の４時間後の、殺傷された腫瘍細胞の数を表す。
【図３３】図３３は、自己腫瘍細胞に対する、膵がんを有する患者由来の増殖されたＴＩＬの、細胞溶解反応の解析の結果を示している。Ｘ軸上の数字は腫瘍細胞に対するＴＩＬの比を表す。Ｙ軸上のパーセンテージは、放射能放出によって測定された、増殖されたＴＩＬによる処理の４時間後の、殺傷された腫瘍細胞の数を表す。これらのＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１増殖されたＴＩＬは、非常に集束したＴＣＲレパートリーを示し、自己腫瘍細胞に対し強力な細胞傷害反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らは、インターロイキンであるＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組み合わせが、リンパ球による免疫療法を顕著に改善することを発見した。１つの大きな利点は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種を組み合わせた組成物を用いた、患者由来のリンパ球の増殖および刺激が、臨床的に有用なリンパ球、特にＴ細胞、の作製に特に有利である点である。
【００２９】
本発明によれば、「臨床的に有用な（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）リンパ球」は、臨床的に有用な抗原と特異的に相互作用する。臨床的に有用なリンパ球には３つのグループ、すなわち、腫瘍反応性リンパ球、感染症反応性リンパ球および自己免疫疾患反応性リンパ球、がある。
【００３０】
「臨床的に有用なリンパ球」は、抗原編集（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｄｉｔｅｄ）リンパ球とも称される。臨床的に有用なという用語はまた、リンパ球のサブグループに対しても使用される。特に好ましい臨床的に有用なリンパ球は、臨床的に有用なＴ細胞または抗原編集Ｔ細胞である。
【００３１】
本発明による「臨床的に有用な抗原」は、疾患に関与する抗原である。従って、臨床的に有用な抗原は、腫瘍関連抗原ＴＡＡ、病原体関連抗原（ＰＡＡ）または自己抗原であり得る。腫瘍反応性リンパ球はＴＡＡと特異的に相互作用する。感染症反応性リンパ球はＰＡＡと特異的に相互作用し、自己免疫疾患反応性リンパ球は自己抗原と特異的に相互作用する。
【００３２】
本発明によれば、「抗原」（Ａｇ）は、それぞれ適応免疫応答の受容体、ＴＣＲまたは抗体の標的としての機能を果たす、あらゆる構造体である。抗原は、特に、タンパク質、多糖類、脂質、およびその部分構造（ペプチド等）である。脂質および核酸は、タンパク質または多糖類と組み合わされた場合に、特に抗原性を示す。
【００３３】
「病原体関連抗原」（ＰＡＡ）とは、細菌、ウイルスおよび他の微生物等の病原体の、莢膜、細胞壁、鞭毛および毒素等の部分を指す。
【００３４】
「自己抗原」は通常、ある個体由来の、同一個体の免疫系によって認識される、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質複合体である。この作用は通常、自己免疫疾患を引き起す。
【００３５】
本発明による「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣＩ分子もしくはＭＨＣＩＩ分子または非古典的ＭＨＣ分子によって提示される抗原である。本明細書で使用される場合、ＴＡＡには、腫瘍細胞の表面上のみに見られる「腫瘍特異的抗原」が包含され、正常細胞の表面上にあるものは含まれない。
【００３６】
実施例に示されるように、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組み合わせによって、患者から得られた身体試料中の臨床的に有用なリンパ球の増加を特異的に誘導することが可能である。本発明による方法は、臨床的に有用なリンパ球を増殖するための簡易なプロトコルを提供する。前記プロトコルは、樹状細胞を必要としないことから、技術の現状におけるプロトコルと比較して特に有益である。さらに、本発明者らは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種を組み合わせたサイトカイン混合物による増殖後に得られたリンパ球集団が、臨床応用に有利なある組成のリンパ球を含有することを示すことができた。例えば、前記組成は、ＴＨ１ヘルパーＴ細胞を高い割合で含み、ＴＨ２ヘルパーＴ細胞はほとんど含まない。さらなる利点は、増殖されたリンパ球集団の治療効果の抑制を引き起こし得る調節性Ｔ細胞の有意な増殖が無い点である。
【００３７】
従って、第一の態様によれば、本発明は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ−２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含む、リンパ球を増殖させるための組成物を提供する。
【００３８】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、それぞれ４つのαヘリックス束を有する、サイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ−２は、主にＴ細胞に対するその直接的な作用を介して、免疫系、寛容性および免疫性の重要な機能において、重要な役割を果たす。ＩＬ−２は、Ｔ細胞の増加ならびにエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞への分化を誘導する。
【００３９】
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２に構造的に類似したサイトカインである。ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β鎖から構成される複合体に結合し、それを介してシグナル伝達する。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の、活性化および増加を誘導し（３０）、また、ＣＤ８＋Ｔ細胞に有利な、抗原の非存在下でメモリー細胞を維持するための生存シグナルを提供し、単球を活性化する。ＩＬ−１５は、腫瘍関連免疫抑制の阻害からの保護に加えて、免疫エフェクターＴ細胞の増加をむしろ駆動するものと見られる（３１）。
【００４０】
ＩＬ−２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む免疫系の細胞に対し強力な調節作用を有するサイトカインである。ＩＬ−２１は、ＣＤ２８＋  ＣＤ１２７ｈｉ  ＣＤ４５ＲＯ＋表現型を有するセントラルメモリー型Ｔ細胞を富化し、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ）を増強する。ＩＬ−２１は、Ｔ細胞を、それらの分化および成熟の初期段階に維持し得る（３５）。
【００４１】
本発明によれば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種を組み合わせた組成物は、「サイトカイン混合物」とも称される。
【００４２】
本明細書で使用される「インターロイキン２」または「ＩＬ−２」とは、配列番号１によって定義されるヒトＩＬ−２およびその機能的等価物を指す。ＩＬ−２の機能的等価物には、ＩＬ−２の機能を残しているＩＬ−２の関連下部構造または融合タンパク質が包含される。従って、ＩＬ−２の定義は、配列番号１に対し少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するあらゆるタンパク質を含む。１３４個のアミノ酸を有し、１５ｋＤａの分子量を有する単鎖の非グリコシル化ポリペプチド鎖として大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）内で産生された組換えヒトＩＬ−２が、プロスペック社（Ｐｒｏｓｐｅｃ）からＣＹＴ−２０９として、凍結乾燥形態で市販されている。
【００４３】
本明細書で使用される「インターロイキン１５」または「ＩＬ−１５」は、ヒトＩＬ−１５およびその機能的等価物を指す。ＩＬ−１５の機能的等価物には、ＩＬ−１５の機能を残しているＩＬ−１５の関連下部構造または融合タンパク質が包含される。従って、ＩＬ−１５の定義は、配列番号２に対し少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するあらゆるタンパク質を含む。１１４個のアミノ酸（およびＮ末端メチオニン）を有し、１２．８ｋＤａの分子量を有する単鎖の非グリコシル化ポリペプチド鎖として大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）内で産生された組換えヒトＩＬ−１５が、プロスペック社からＣＹＴ−２３０として、凍結乾燥形態で市販されている。
【００４４】
本明細書で使用される「インターロイキン２１」または「ＩＬ−２１」は、ヒトＩＬ−２１およびその機能的等価物を指す。ＩＬ−２１の機能的等価物には、ＩＬ−２１の機能を残しているＩＬ−２１の関連下部構造または融合タンパク質が包含される。従って、ＩＬ−２１の定義は、配列番号３に対し少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するあらゆるタンパク質を含む。１３２個のアミノ酸を有し、１５ｋＤａの分子量を有する単鎖の非グリコシル化ポリペプチド鎖として大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）内で産生された組換えヒトＩＬ−２１が、プロスペック社からＣＹＴ−４０８として、凍結乾燥形態で市販されている。
【００４５】
本明細書で使用される「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されていることが好ましい、あらゆる数のあらゆる種類のアミノ酸、好ましくは自然発生的なアミノ酸、から構成され得る。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個、または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。さらに、ペプチドの長さに上限は無い。しかし、本発明によるペプチドは、５００のアミノ酸長を超過しないことが好ましく、３００のアミノ酸長を超過しないことがより好ましく；２５０のアミノ酸長を超過しないことがさらにより好ましい。
【００４６】
従って、用語「ペプチド」には、通常２〜１０のアミノ酸長を有するペプチドを指す「オリゴペプチド」、および、通常１０超のアミノ酸長を有するペプチドを指す「ポリペプチド」が包含される。
【００４７】
用語「タンパク質」は、少なくとも６０個、少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を有するペプチドを指す。
【００４８】
本発明による用語「融合タンパク質」は、別々のタンパク質／ペプチドを元々はコードしていた２つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡまたは配列の連結を通じて作製された、タンパク質に関する。前記遺伝子は、同一の生物または異なる生物において自然発生的であり得、あるいは、合成ポリヌクレオチドであり得る。
【００４９】
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターによって説明される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度が、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，  Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａ／．，  ２０００，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １６：  ２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意パラメーターは、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。「最長の同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの結果（ｔｈｅｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られた）は、同一性パーセントとして使用され、以下の通りに算出される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント内のギャップの総数）
【００５０】
「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である、移行語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法工程を除外しない。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、通常それに付随する不純物を除いて、クレームに明記されていないあらゆる要素、工程、または成分を除外する。句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」が、プリアンブルの直後ではなく、クレームのボディの節内に見られる場合、前記句はその節に記載された要素のみを限定し；他の要素は全体としてクレームから除外されない。移行句「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求の範囲に記載されている発明の、明記された材料または工程「および基本的な新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」にクレームの範囲を限定する。「『から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）』クレームは、『からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）』形式で記載される閉鎖クレームと、『を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）』形式で作成される完全開放クレームとの、中間を占める。」
【００５１】
「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」または「クローン増殖（ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、本明細書で使用される場合、もとは単一の細胞に由来する娘細胞の産生を意味する。リンパ球のクローン増殖では、全ての子孫は同じ抗原特異性を共有する。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、第一の態様による組成物は２種または３種のサイトカインを含む。さらなるサイトカインが、本発明による組成物によって提供される増殖結果に干渉し得る。
【００５３】
あるいは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組み合わせに加えて使用される他のサイトカインは、リンパ球集団に良い影響を与え得る。従って、本発明の第一の態様の組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１に加えて、より多くのサイトカインを含有し得る。例は、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＩＬ−３２である。ＩＬ−１βは、特異的抗原との最初の接触後の、初回抗原刺激、エフェクターＢ細胞またはＴ細胞への分化に関与している。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、樹状細胞の刺激および／または初回抗原刺激に関与している。ＩＬ−１２はＴＨ１応答に関与している。ＩＬ−１８はγδ−Ｔ細胞を刺激する。ＩＬ−１７およびＴＮＦαは炎症誘発性の作用をする。ＩＬ−３２も、長期防御免疫応答に有利な、炎症誘発性の作用をする。
【００５４】
第一の態様の一実施形態によれば、組成物はＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む。前記組成物はＩＬ−２およびＩＬ−２１も含み得る。あるいは、前記組成物はＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含み得る。サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のうちの２つで既に臨床的に有用なリンパ球集団を得るのに十分であり得るが、組成物に３つ全てのサイトカインを使用することが好ましい。
【００５５】
さらなる実施形態によれば、第一の態様の組成物は液状である。特に、前記組成物は細胞培地である。本発明によれば、あらゆる公知の細胞培地が可能である。細胞培地の例としては、合成培地、血清、血漿もしくは全血由来の培地、またはそれらの任意の組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【００５６】
さらなる実施形態によれば、液状組成物中のＩＬ−２の濃度は１０〜６０００Ｕ／ｍｌの範囲内である。国際単位（Ｕ）は、量またはＩＬ−２の標準的な尺度である。濃度は、ＣＴＬＬ−２細胞の増加を誘導するその能力によって決定される。１０Ｕ／ｍｌ未満の濃度は低濃度であり過ぎるため、いかなる有意な効果も達成できない。６０００Ｕ／ｍｌを超える濃度は細胞毒性効果を有し得る。ＩＬ−２の濃度は、５００〜２０００Ｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましい。ＩＬ−２の濃度は、８００〜１１００Ｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。実施例に示されるように、最良の結果は約１０００Ｕ／ｍｌの濃度で達成された。
【００５７】
第一の態様のさらなる実施形態によれば、ＩＬ−１５の濃度は０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。前記濃度範囲はＩＬ−２と同じ有理数に従う。０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度は、いかなる有意な影響も細胞に与えないと考えられている。１００ｎｇ／ｍｌを超える濃度は細胞毒性効果を有し得る。ＩＬ−１５の濃度は２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。最も好ましい濃度は約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００５８】
更なる実施形態では、ＩＬ−２１の濃度は０．１ｎｇ／ｍｌ〜の範囲内、好ましくは２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
【００５９】
本発明によれば、サイトカインのうちの１つのこれらの濃度範囲のいずれも、その他のサイトカインの濃度範囲のいずれとも組み合わせることができることを理解されたい。
【００６０】
一実施形態によれば、前記組み合わせはＩＬ−１５およびＩＬ−２１の混合物を含む。前記混合物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内のＩＬ−１５およびＩＬ−２１のそれぞれを含むことが好ましい。ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、前駆体、メモリーおよびエフェクター集団内の特にリンパ球サブセットに対して、相乗効果を提供し得る。
【００６１】
第一の態様の一実施形態によれば、前記組み合わせは、８００〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２、ならびに５〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む。別の実施形態によれば、前記組成物は、約１０００Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２、ならびに約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む。
【００６２】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組成物は、リンパ球組成物中、特に患者の試料中の、臨床的に有用なリンパ球の増殖を促進するのに特に有益である。実施例に示されるように、本発明者らは、患者の試料から特に臨床的に有用なリンパ球を作製するための方法を開発した。
【００６３】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組成物は、リンパ球組成物中、特に患者の試料中の、臨床的に有用なリンパ球の増殖を促進するのに特に有益である。実施例に示されるように、本発明者らは、ＰＤ１およびＬＡＧ３＋Ｔ細胞の頻度を減少させる方法を開発し、ここで、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３発現は、抗原を経験したＴ細胞のマーカーとしてではなく、Ｔ細胞枯渇のマーカーとして働く。
【００６４】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組成物は、リンパ球組成物中、特に患者の試料中の、臨床的に有用なリンパ球の増殖を促進するのに特に有益である。実施例に示されるように、本発明者らは、抗原を経験したＴ細胞のマーカーとしての、４−１ＢＢ発現の頻度を増加させる方法を開発した。
【００６５】
従って、第二の態様によれば、本発明は、
少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料、特に、組織試料または体液試料を得て、所望により身体試料中の細胞を分離する工程、
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種を使用することを含む、インビトロで身体試料を培養して試料中のリンパ球を増殖および／または刺激する工程、及び
所望により培養試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在を決定する工程
を含む、臨床的に有用なリンパ球集団を作製する方法を提供する。
【００６６】
ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種は、上記で定義された濃度で使用されることが好ましい。３つ全てのサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１が、一緒に使用されることが好ましい。
【００６７】
実施例に示されるように、前記方法は、腫瘍反応性リンパ球、自己免疫疾患反応性リンパ球または感染症反応性リンパ球の集団を作製するのに使用することができる。第二の態様の方法によって作製されたリンパ球集団は、腫瘍反応性リンパ球集団であることが好ましい。
【００６８】
リンパ球は一般的に、種々の異なるＴリンパ球を含む。これらのリンパ球の中には、臨床的に有用な抗原、特に、腫瘍関連抗原、感染症関連抗原または自己免疫疾患関連抗原と相互作用するための適切な受容体を有するリンパ球が存在し得る。本発明による方法を用いることで、この臨床的に有用なリンパ球が特に、強力に増殖される。しかし、臨床的に有用な抗原に対し特異性を有していない他のリンパ球も、本発明による方法において増殖される。
【００６９】
従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む組成物を用いた身体試料由来の細胞の培養の結果は、臨床的に有用なリンパ球集団を含むリンパ球集団の形成をもたらす。本発明の第二の態様による方法において、培養試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在の決定は、可能であるが必須ではない工程である。増殖されたリンパ球集団を検証するのに有用な工程は、実際に、治療法（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として使用することができる。
【００７０】
身体試料は、リンパ球を含有するいかなる身体部分からも採取することができる。身体試料の例は、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ節、肝臓胸水、胸郭、腹腔、滑液（ｓｙｎｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）、腹膜、腹膜後隙、胸腺、および腫瘍である。
【００７１】
腫瘍由来のリンパ球試料は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とも称される。「ＴＩＬ」は、本明細書で使用される場合、「腫瘍浸潤リンパ球」の略称である。ＴＩＬは、腫瘍内、腫瘍上または腫瘍周辺に位置するあらゆる種類のリンパ球である。ＴＩＬは、腫瘍内および腫瘍周辺に位置するあらゆる種類のリンパ球である。
【００７２】
腫瘍におけるそれらの局在性によって、ＴＩＬは、腫瘍関連抗原を経験済みであり得る。従って、臨床的に有用なリンパ球、特に腫瘍反応性リンパ球は、本発明による方法を用いて増殖抗原無しで増殖させることができる。
【００７３】
末梢血由来の試料は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とも称される。疾患の種類に応じて、様々な身体試料が好適であり得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物、例えば、限定はされないが、マウスおよびハムスター等の齧歯目の哺乳類、ならびに、ウサギ等のウサギ目（ｏｒｄｅｒ  Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳類、を指す。哺乳類は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目の哺乳類であることが好ましい。哺乳類は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（雌ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目の哺乳類、または、ウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（ｏｒｄｅｒ  Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳類であることがより好ましい。哺乳類は、霊長目、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄ）、もしくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄ）の哺乳類（サル）、または真猿亜目（ｏｒｄｅｒ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）の哺乳類（ヒトおよび類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００７５】
第二の態様の一実施形態によれば、身体試料が採取される哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、腫瘍疾患を有し得るか、または腫瘍疾患を発症すリスクを有し得る。腫瘍疾患を発症するリスクは、高リスク、中程度のリスクおよび低リスクを含む。そのような前がん状態にある哺乳動物は、例えば、顕微鏡検査下で異常に見え、外見上正常に見えるその対応物におけるよりもがんが生じる可能性が高い、形態学的に異型の組織である、前がん病変を有する。
【００７６】
さらに、哺乳動物は、感染症を有し得るか、または感染症を発症するリスクを有し得る。感染症を発症するリスクには、高リスク、中程度のリスクおよび低リスクが含まれる。哺乳動物はまた、自己免疫疾患を有し得るか、または自己免疫疾患を発症するリスクを有し得る。自己免疫疾患を発症するリスクには、高リスク、中程度のリスクおよび低リスクが含まれる。例えば、宿主のある特定の遺伝子変異（ＩＦＮγ受容体欠損、またはサイトカイン（例えばＩＬ−１２またはＩＦＮγ）に対する抗体の獲得）の後に、細胞内感染（ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＴＢ、ＨＰＶ）を発症する、高リスク。中程度のリスクは、副腎皮質ステロイドを用いた免疫抑制、またはＴＮＦαもしくはＴＮＦα受容体を標的とする試薬を用いた患者の処置であるだろう。低リスクは、他の病原体による同時感染、または大手術中の免疫適格の一時的な低減であり得る。同様の例は、多発性硬化症、まれな神経系疾患（例えば、ナルコレプシー）、リウマチ様関節炎、ならびに胃腸管系と関連した慢性自己免疫疾患の、遺伝子マーカーと関連した様々な臨床症状である。
【００７７】
哺乳動物が腫瘍疾患に罹患している、または腫瘍疾患を発症する可能性が高い場合、好ましい身体試料は末梢血または腫瘍それ自体である。実施例に示されるように、末梢（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）および腫瘍由来のリンパ球は、強力な抗腫瘍特性を生じさせるための本発明による方法によって処理され得る。疾患が自己免疫疾患である場合、好ましい身体試料は末梢血である。さらに、疾患が感染症である場合も、好ましい身体試料は末梢血である。実施例に示されるように、臨床的に有用なリンパ球は、これらの場合、末梢血から増殖され得る。理論に拘束されるものではないが、末梢血は臨床的に有用な抗原（例えば腫瘍上の、または感染の）と接触したことがあるリンパ球を含有すると仮定される。
【００７８】
リンパ球を増殖および／または刺激するためのインビトロにおける身体試料の培養は、一つまたは複数の下位工程を含み得る。従って、ある実施形態では、インビトロ培養は、リンパ球が検出可能になるまでの、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む培地中でのインキュベーションを含む第一増殖工程を含む。
【００７９】
本発明による「検出可能な」とは、リンパ球が、例えば、特に顕微鏡法によって、可視となることを意味する。リンパ球は通常、５×１０３細胞／ｍｌの濃度に達すると、標準的な光学顕微鏡法を用いて検出可能となる。
【００８０】
リンパ球の検出は、ある特定の閾値を超えるリンパ球の存在を検出するのに好適な、当該技術分野において公知のあらゆる方法を含み得る。第一増殖工程は、サイトカイン混合物による細胞の刺激と共に、細胞増殖を穏やかに誘導するという目的を有する。
【００８１】
第一増殖工程のインキュベーションの時間は、６時間〜１８０日間の範囲内である。インキュベーション時間の広い範囲は、第一に、異なるドナー由来の試料が非常に異なった挙動をし得るという事実によるものである。また、異なる身体試料由来のリンパ球が非常に異なる成長速度を有するということが示された。例えば、グリア芽腫または膵がんの腫瘍に直接由来するリンパ球は、非常に異なった増殖をする。膵がん由来のリンパ球は、２〜５日以内に既に検出可能である。グリア芽腫由来のリンパ球は、１〜２週間後に初めて検出可能となる。従って、他の身体試料由来のリンパ球は、検出可能となるのにさらに長い時間がかかり得る。
【００８２】
第一増殖工程のインキュベーション時間は４日間〜１０日間の範囲内であることが好ましい。末梢血細胞を用いて、約７日間のインキュベーション時間が他の増殖の結果に特に有益であることが示された。しかし、上記の通り、試料に依存して、４日間のみの増殖でも十分である場合があり、あるいは一方で、約１０日間またはそれ以上必要である場合もある。実施例に示されるＰＢＭＣを用いての良好な結果により、６〜８日間の範囲内、特に約７日間のインキュベーション時間が好ましい。
【００８３】
本発明の一実施形態によれば、第一増殖工程の培地は少なくとも１つの増殖抗原を含む。増殖抗原は公知の、臨床的に有用な、抗原またはその断片、変異体もしくはバリアントである。本明細書で使用される「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換により参照配列と異なるアミノ酸配列と定義される。増殖抗原はＴＡＡ、ＰＡＡおよび自己抗原から選択されことが好ましい。
【００８４】
本発明による方法は、複数の増殖抗原コピーを含むことが好ましい。増殖抗原コピーの数が増加すると、臨床的に有用なリンパ球、特にＴ細胞の増殖速度が増加する。
【００８５】
本発明のある実施形態において、第一増殖工程の培地は複数の増殖抗原を含む。複数の増殖抗原は、公知の臨床的に有用な抗原および臨床的に有用な抗原の一つまたは複数の変異体を包含することが好ましい。抗原それ自体の代わりに、抗原を提示するＭＨＣクラスＩ／ペプチド、特にペプチドも、変異され得る。増殖抗原としての臨床的に有用な抗原またはＭＨＣクラスＩ分子の一つまたは複数の野生型、バリアントまたは変異体の使用は、名目上の臨床的に有用な抗原に対し反応性である、様々なリンパ球、特にＴ細胞をもたらす。
【００８６】
第二の態様による方法の好ましい実施形態によれば、身体試料は腫瘍であり、増殖抗原は培養に使用されない。
【００８７】
腫瘍試料中の細胞を分離する前に、腫瘍組織を２回洗浄することが好ましい。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施形態では、第一増殖工程の培地は複数の増殖抗原を含む。複数の抗原を有することによって、Ｔ細胞産物は、刺激性抗原の使用に関連するＶβ使用によって示されるように、より多様なＴ細胞受容体レパートリーで反応する。
【００８９】
本発明の別の好ましい実施形態、第一増殖工程の培地は複数の増殖抗原を含む。末梢血由来Ｔ細胞の刺激は、細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）によって定義される、多様なエピトープを認識するＴ細胞をもたらす。ナイーブＴ細胞が血液から選択され、そのような抗原で刺激された場合、多様な抗原エピトープが認識されるという結果をもたらす。
【００９０】
これは、より限定された数の、または標準的な数のエピトープを認識する傾向にある予備刺激Ｔ細胞または腫瘍由来Ｔ細胞とは対照的である。
【００９１】
増殖抗原の選択は、治療される疾患に依存する。具体的には、増殖された臨床的に有用なリンパ球集団が腫瘍疾患に対して使用される場合、第一増殖工程に添加される増殖抗原はＴＡＡであることが好ましい。あるいは、治療される疾患が感染症である場合、第一増殖工程に添加される増殖抗原はＰＡＡである。さらに、臨床的に有用なリンパ球集団が自己免疫疾患の治療に使用される場合、増殖抗原は自己抗原であることが好ましい。
【００９２】
第一増殖工程における増殖抗原は、初期に既に細胞混合物中の臨床的に有用なリンパ球の刺激をもたらし、それにより、サイトカイン混合物と共に、臨床的に有用なリンパ球の増殖を増強すると考えられている。この刺激は、抗原活性化または抗原編集（ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｄｉｔｉｎｇ）とも称される。
【００９３】
第一増殖工程の後に、第二増殖工程が続いてもよく、前記第二増殖工程では、細胞がＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択されるサイトカインのうちの少なくとも２種に加えて、フィーダー細胞および／またはＣＤ３に対する抗体と一緒にインキュベートされる。フィーダー細胞およびＣＤ３に対する抗体を用いた増殖は、技術の現状において説明されている。フィーダー細胞は細胞成長の向上をもたらすと考えられている。フィーダー細胞は、増殖しない、または僅かしか増殖しない被照射細胞である。フィーダー細胞は、培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）中で接触する細胞の数を増加させ、さらに、増殖および拡張中の細胞培養物を養う。フィーダー細胞が、照射されたＰＢＭＣ中に存在することが好ましい。同種フィーダー細胞は、増殖された臨床的に有用なリンパ球で治療される哺乳動物とは異なる生物に由来する。自己フィーダー細胞は治療される哺乳動物に由来する。
【００９４】
ＣＤ３に対する抗体は、ＯＫＴ３と定義される抗体であることが好ましい。ＯＫＴ３は、免疫グロブリンＩｇＧ２ａアイソタイプのマウスモノクローナル抗体である。ＯＫＴ３の標的であるＣＤ３は、成熟Ｔ細胞上にのみ存在する多分子複合体である。Ｔ細胞、ＯＫＴ３および単球の間の相互作用によって、インビトロにおけるＴ細胞活性化が引き起こされる。
【００９５】
フィーダー細胞は、ＣＤ３およびサイトカインのＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１と組み合わせて使用されることが好ましい。第二の態様による方法の一実施形態によれば、フィーダー細胞：リンパ球の比は１：１〜１：１００の範囲内である。フィーダー細胞：リンパ球の割当量（ｒａｔｉｏｎ）は、１：２〜１：５０の範囲内であることが好ましい。実施例に示されるように、非常に低い割合のフィーダー細胞でも、臨床的に有用なリンパ球、特に臨床的に有用なＴ細胞の強力な増殖に十分である。
【００９６】
実施例において、１：１０の比は、リンパ球の成長および増殖を支援するのに十分である。従って、１：５〜１：２０の範囲内の値は異なる結果をもたらさないであろうと考えられる。少数のフィーダー細胞は少なくとも２つの利点を有する。第一に、紛れとなる細胞シグナルが少なくなり、それにより、より均一で信頼できる増殖結果が得られる。第二に、フィーダー細胞をより少なくすることで、前記方法によって得られる免疫療法産物中の、すなわち臨床的に有用なリンパ球集団中の、外来性物質がより少なくなる。
【００９７】
第二増殖工程は、所望により、培地中に増殖抗原も含む。臨床的に有用な抗原または断片が第二増殖工程の培地に添加されないことが好ましい。
【００９８】
本発明の第二の態様の好ましい実施形態によれば、前記方法はリフォーカス工程を含む。リフォーカス工程は、リフォーカス細胞（ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を含む培地中での培養を含む。リフォーカス細胞は、身体試料が採取される哺乳動物、特にヒトに由来する細胞である。従って、リフォーカス細胞は、少なくとも１つのリフォーカス抗原（ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ）で処理された自己細胞である。本明細書で定義されるいかなる増殖抗原も、リフォーカス抗原として使用できる。前記方法において、一つまたは複数のリフォーカス抗原は、一つまたは複数の増殖抗原と同一であることが好ましい。
【００９９】
リフォーカス細胞は、リフォーカス抗原と一緒に、少なくとも３０分間、またはそれ以上、例えば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間培養された細胞である。リフォーカスしながらインキュベーションした後、リフォーカス細胞は少なくとも４０Ｇｙで照射される。前記細胞は、少なくとも４５Ｇｙで、またはそれ以上で、例えば少なくとも５０Ｇｙで、照射されることが好ましく、５５Ｇｙの強度が特に好ましい。この処理により、抗原特異的Ｔ細胞は、より効率的に、増殖され、腫瘍、病原体または自己免疫細胞を認識し、がん細胞または前がん病変に対する保護を与え得る。
【０１００】
リフォーカス工程の時間は、１〜６日間の範囲内であり、好ましくは１〜３日間である。リフォーカス工程は短めでもよいが、リフォーカス工程は増殖された臨床的に有用なリンパ球、特に、末梢血から増殖された臨床的に有用なリンパ球の収率に有意な向上をもたらす。
【０１０１】
また、リンパ球の数と比較したリフォーカス細胞の数はやや少ない。具体的には、リフォーカス細胞：リンパ球の比は１：１〜１：１００の範囲内である。リフォーカス工程が第一増殖工程の直後に行われ、その後第二増殖工程が続いた場合に、最良の結果が達成されることが分かっている。培養工程の順序は、臨床的に有用なリンパ球集団、特にＴ細胞の作製に特に有用である。
【０１０２】
前記方法の一実施形態によれば、第一増殖工程は、細胞培養物へＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を同時添加することを含む。同時添加のために、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の混合物を調製し、それを細胞培地に添加することが可能であり、あるいは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は別々にではあるが同時に細胞培地に添加される。実施例に示されるように、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の同時適用は、増殖されたリンパ球集団の好ましいリンパ球組成物をもたらす。
【０１０３】
増殖されたリンパ球集団の組成を変化させるために、本発明の方法では、第一増殖工程において細胞培地にＩＬ−２１のみを最初に添加することが可能である。ＩＬ−２１の添加後、ＩＬ−１５およびＩＬ−２が同時にまたは別々に添加され得る。ＩＬ−１５が２番目に添加され、ＩＬ−２が最後に添加されることが好ましい。別の実施形態では、ＩＬ−１５が最初のサイトカインとして添加され、その後、ＩＬ−２およびＩＬ−２１が同時添加されるか、または、ＩＬ−２およびＩＬ−２１が別々に添加される。例えば、ＩＬ−２１が２番目に添加され、ＩＬ−２が最後に添加される。
【０１０４】
第一増殖工程および／または第二増殖工程の培地は、少なくとも一つの増殖抗原を含み得る。増殖抗原は、例えば、公知のＴＡＡの断片であり得る。増殖抗原として可能なＴＡＡは、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ腫瘍抗原、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）−１、ＴＲＰ−２、ＶＥＧＦＲ−２、およびいくつかのＭＡＧＥファミリーのタンパク質、テロメラーゼ、ｐ５３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、メソテリン、癌胎児抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）、サバイビン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦ、ＣＡＭＰＡＴＨ１抗原、ＣＤ２２、ＣＡ−１２５、ムチン−１、α−１−ゲトプロテイン（ｇｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡである。
【０１０５】
ＴＡＡの断片は特にペプチドである。このようなペプチドは、例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含むペプチドであり得る。
【０１０６】
配列番号４は公知の腫瘍関連抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸配列である。配列番号５は公知の腫瘍関連抗原サバイビンのアミノ酸配列である。配列番号６は公知の腫瘍関連抗原メソテリンのアミノ酸配列である。配列番号７は腫瘍関連抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列である。
【０１０７】
増殖抗原は、例えば、公知のＰＡＡの断片であり得る。増殖抗原であり得るＰＡＡは、例えば、ＣＭＶｐｐ６５、またはＥＢＶ（ＥＢＮＡ−３、ＥＢＮＡ−１）、ＨＰＶ−１６／３３Ｅ６、Ｅ７またはＬ１である。ＰＡＡの断片は特にペプチドである。このようなペプチドは、例えば、それぞれ公知の病原体関連抗原であるＣＭＶｐｐ６５、ＥＢＮＡ−３、ＥＢＮＡ−１、およびＨＰＶ−Ｌ１のアミノ酸配列である、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含むペプチドであり得る。
【０１０８】
増殖抗原は、例えば、公知のＰＡＡの断片であり得る。増殖抗原であり得る自己抗原は、例えば、ＰＲＤＭ２、ＵＣＨＬ３、ＩＮＯ８０Ｅ、ＳＬＣ１２Ａ６、およびリーリンである。ＰＡＡの断片は特にペプチドである。このようなペプチドは、例えば、それぞれ自己抗原のＰＲＤＭ２、ＩＮＯ８０Ｅ、ＵＣＨＬ３、およびデオキシリボヌクレアーゼＢのアミノ酸配列である、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含むペプチドであり得る。
【０１０９】
さらなるサイトカイン等の追加成分を、培養工程中に、特に第一増殖工程中もしくは第二増殖工程中またはリフォーカス工程中に、添加してもよい。
【０１１０】
さらに、プロモーター化合物を、培養工程で、特に第一増殖工程もしくは第二増殖工程またはリフォーカス工程で、添加してもよい。プロモーター化合物は第一増殖工程で添加されることが好ましい。本明細書で使用されるプロモーター化合物は、増殖プロセスにおいて特定のリンパ球サブセットの増殖を引き起こす化合物である。好ましいプロモーター化合物はゾレドロン酸である。ゾレドロン酸はγδＴ細胞の増殖を促進する。さらに好ましいプロモーター化合物は、Ｂ細胞の増殖を促進するものである。
【０１１１】
一実施形態によれば、培養工程に、特に第一増殖工程もしくは第二増殖工程またはリフォーカス工程に、共刺激化合物が添加される。共刺激化合物は、例えば、Ｔ細胞シグナルを仲介するＣＤ２８のリガンドである。Ｔ細胞シグナルを仲介するＣＤ２８のリガンドの例は、Ｂ７スーパーファミリーのメンバー、特に、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）である。
【０１１２】
第二の態様による方法の一実施形態によれば、増殖されたリンパ球試料中の臨床的に有用なリンパ球の存在の検査は、評価用抗原（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）の使用を含む。
【０１１３】
前記検査のために、リンパ球集団が評価用抗原と一緒にインキュベートされる。評価用抗原は、増殖抗原の定義下にある抗原であり得る。例えば、公知の臨床的に有用な抗原またはその断片が評価用抗原としてリンパ球集団の培地に添加され、リンパ球が刺激される。インキュベーション期間の後、臨床的に有用なリンパ球の活性化を示すパラメーターが測定される。
【０１１４】
評価用抗原は、ＭＨＣＩ複合体に結合した形態のリンパ球に添加されることが好ましい。例えば、評価用抗原は、ＭＨＣデキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）に結合したリンパ球に提示され得る。ＭＨＣデキストラマーは、ブドウ糖骨格に結合した蛍光標識されたＭＨＣ多量体である。
【０１１５】
多量体ＭＨＣ構造の使用には、複数の抗原コピーが単一のリンパ球に提示されることで、評価用抗原によるシミュレーション（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が増加し得るという利点がある。あるいは、公知の臨床的に有用な抗原が、導入遺伝子として臨床的に有用な抗原を発現する細胞の形態で、評価用抗原として培養試料に提示され得る。さらに、細胞表面上の臨床的に有用な抗原を増殖されたリンパ球に提示する、少なくとも部分的に遺伝的に一致している同種細胞が添加され得る。
【０１１６】
臨床的に有用なリンパ球の存在を示すパラメーターは、例えば、一つまたは複数のサイトカインの産生、特に、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦαの産生であり得る。臨床的に有用なリンパ球の存在を示すさらなるパラメーターは、細胞増殖の増加、細胞毒性の増加、細胞情報伝達および／または細胞内リン酸化の増加である。これらのパラメーターの決定は、当該技術分野において公知であり、実施例で例示される。
【０１１７】
好ましくは、公知の臨床的に有用な抗原に由来する評価用抗原の使用に加えて、治療される哺乳動物に特異的な臨床的に有用なリンパ球についても検査し得る。このために、増殖されたリンパ球と同じ哺乳動物に由来する細胞、特に腫瘍細胞が、評価用抗原の提示に使用される。これらの自己細胞を評価用提示抗原として用いて、必ずしも公知の臨床的に有用な抗原である必要はない臨床的に有用な抗原に特異的な、臨床的に有用なリンパ球の存在が検証され得る。
【０１１８】
本発明の第二の態様によるある実施形態では、培養試料に提示される評価用抗原は、培養試料と同じ哺乳動物に由来する細胞（自己細胞）、特に腫瘍細胞、少なくとも部分的に遺伝的に一致している同種細胞、特に腫瘍細胞、または導入遺伝子として臨床的に有用な抗原を発現する細胞から選択される形態をとる。
【０１１９】
さらなる実施形態によれば、臨床的に有用なリンパ球の存在の検査法は、リンパ球を少なくとも１つの評価用抗原と接触させ、サイトカイン産生、特にＩＦＮ−γもしくはＴＮＦαの産生、細胞増殖、細胞毒性、シグナル伝達および／または細胞内リン酸化のうちのいずれか１つにおける変化を決定することを含む。
【０１２０】
これらのパラメーターの試験は、フローサイトメトリーおよび細胞選別と組み合わせることができる。従って、臨床的に有用なリンパ球集団、特に腫瘍反応性リンパ球集団を増殖されたリンパ球集団から単離することも可能である。単離された臨床的に有用なリンパ球集団は、さらに培養してもよいし、免疫療法に直接使用してもよい。
【０１２１】
本発明の第二の態様の方法は、臨床的に有用なリンパ球集団を含む、リンパ球集団の形成をもたらす。増殖されたリンパ球集団に含まれる臨床的に有用なリンパ球は、あらゆる種類のリンパ球であり得る。
【０１２２】
リンパ球には、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞が包含される。一実施形態によれば、臨床的に有用なリンパ球はＢ細胞である。一実施形態によれば、臨床的に有用なリンパ球はＮＫ細胞である。
【０１２３】
第三の態様によれば、本発明は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞である、第二の態様による方法によって得られる臨床的に有用なリンパ球を提供する。
【０１２４】
Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞またはＣＤ４＋−Ｔ細胞）、特にＴＨ１細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＤ８＋−Ｔ細胞）、特にＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）または末梢性メモリー細胞（ＴＰＭ細胞）、γ−δＴ細胞（γδ−Ｔ細胞）、ＮＫ−Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、ダブルネガティブＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−  Ｔ細胞）から選択されることが好ましい。
【０１２５】
一実施形態によれば、臨床的に有用なリンパ球は、組織、特に腫瘍、または感染組織もしくは炎症組織への進入を促進する分子（例えばＣＸＣＲ３）を発現するリンパ球である。さらなる実施形態によれば、臨床的に有用なリンパ球は、あらゆる長期メモリーマーカー、特にＣＤ１１７およびｃ−ｋｉｔ、ならびに、溶解性免疫細胞応答マーカー、特にＣＤ１０７ａに富んだリンパ球である。説明された通り、増殖されたリンパ球集団は、臨床的に有用なリンパ球を含有するだけでなく、臨床的に有用な抗原を認識しない他のリンパ球も含有する。
【０１２６】
第二の態様による方法によって得られた培養物中の臨床的に有用な他のリンパ球は、治療効果に関与すると考えられる。第三の態様の一実施形態によれば、本発明は、免疫療法を含む医薬用途に有用なリンパ球の組み合わせの形成を促進する分子およびサイトカインを発現する第二の態様による方法によって得られたリンパ球に関する。医薬用途に有用なリンパ球の組み合わせは、Ｔ細胞前駆体、ＴＣＭ、ＴＳＣＭおよび／またはＴＰＭ細胞を含むことが好ましい。
【０１２７】
一実施形態によれば、第二の態様による方法によって得られたリンパ球は、臨床的に有用なリンパ球の増殖を促進する分子およびサイトカインを発現する。さらなる実施形態によれば、第二の態様による方法によって得られたリンパ球は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１７およびこれらの任意の組み合わせから選択されるサイトカインを産生する。一実施形態によれば、リンパ球はＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞である。
【０１２８】
第四の態様によれば、本発明は、臨床的に有用なリンパ球集団を含む、本発明の第二の態様による方法によって得られるリンパ球集団を提供する。
【０１２９】
リンパ球集団は、臨床的に有用なリンパ球集団から成り得る。臨床的に有用なリンパ球集団は、単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、少クローン性（ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ）または多クローン性（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）であり得る。
【０１３０】
ある実施形態では、臨床的に有用なリンパ球集団は、多クローン性であり、複数の抗原または同一抗原の異なるエピトープに反応する。臨床的に有用なリンパ球集団は、様々な抗原に反応することが好ましい。
【０１３１】
複数の抗原に反応するリンパ球、特にＴ細胞は、前悪性細胞、腫瘍細胞および病原体の再発のリスクを防ぐことにより、免疫回避のリスクを減少させ得る。
【０１３２】
第四の態様によるリンパ球集団は、免疫療法に有益な、様々なリンパ球表現型、特にＴ細胞表現型の組成を有する。
【０１３３】
リンパ球集団における調節性Ｔ細胞の割合は低い。調節性Ｔ細胞は、リンパ球集団の治療的機能を抑制することが知られている。第四の態様の一実施形態によれば、リンパ球集団において、Ｔ細胞の総数に対するＴｒｅｇの割合は５％未満、好ましくは３％未満である。
【０１３４】
さらに、リンパ球集団中のＴＨ細胞の過半数はＴＨ１表現型を含む。本発明の一実施形態によれば、ＴＨ細胞の総数に対するＴＨ１細胞の割合は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％である。
【０１３５】
ＣＸＣＲ３＋細胞の割合の増加を示すことができたように、リンパ球集団において、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は増加される。本発明の一実施形態によれば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数に対するＣＸＣＲ３＋細胞の割合は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％である。
【０１３６】
さらに、リンパ球集団は、例えば４−１ＢＢ＋表現型によって特定される、最近その抗原と接触したことがある、増加したＴ細胞数を含み得る。第四の態様の一実施形態によれば、Ｔ細胞の総数に対する４−１ＢＢ＋Ｔ細胞の割合は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である。一実施形態によれば、Ｔ細胞の総数に対するＣＤ１０７＋細胞の割合は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である。ＣＤ１１７＋Ｔ細胞は、長期メモリー集団と関連付けられている。
【０１３７】
ＣＸＣＲ３＋表現型のＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに、組織への浸潤性と関連付けられており、そのため、がんに対する免疫療法に特に有益であり得る。さらに、リンパ球集団は、十分な割合のＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−細胞を含み得る。これらのダブルネガティブＴ細胞は、補助受容体ＣＤ４＋またはＣＤ８＋依存であることから抗原標的に対し高度に特異的であり、炎症性サイトカインを産生する。従って、これらのダブルネガティブＴ細胞は細胞傷害性である。
【０１３８】
一実施形態によれば、リンパ球集団は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％の、Ｔ細胞の総数に対するある割合のＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−細胞を含む。さらなる実施形態によれば、リンパ球集団におけるＴ細胞の総数に対するγδＴ細胞の割合は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である。γδＴ細胞は、ストレスを受けた細胞、形質転換細胞、感染細胞、例えばＣＭＶ＋標的細胞を認識する作用を有する。γδＴ細胞は、ウイルスにより形質転換された細胞も交差認識する。
【０１３９】
一実施形態によれば、リンパ球集団は以下の特徴を含む：
Ｔ細胞の総数に対するＴｒｅｇの割合が５％未満、好ましくは３％未満である；
ＴＨ細胞の総数に対するＴＨ１細胞の割合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である、
ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数に対するＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の割合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である、
Ｔ細胞の総数に対する４−１ＢＢ＋Ｔ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である、
Ｔ細胞の総数に対するＣＤ１１７＋Ｔ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％である、
Ｔ細胞の総数に対するＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である；および
Ｔ細胞の総数に対するγδＴ細胞の割合が少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である。
【０１４０】
一実施形態によれば、リンパ球集団において、Ｔ細胞の総数に対する前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）の割合は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも３％である。セントラルメモリーＴ細胞は、Ｔ細胞治療の成功に関わることが既に示された。
【０１４１】
セントラルメモリー細胞は、治療に有益ないくつかのサイトカインを産生し、良好な記憶応答をもたらす。しかしながら、セントラルメモリー細胞は組織に十分に浸潤しない。ある実施形態では、Ｔ細胞の総数に対する末梢性メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）の割合は、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％である。末梢性メモリー細胞は、高いサイトカイン産生を示し、組織に十分に浸潤する。従って、これらの細胞ががんに対する免疫療法に特に有用である。
【０１４２】
また、高分化型Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）も組織に進入することができる。さらに、これらの細胞は、治療に有用なサイトカインの産生を示す。一実施形態によれば、Ｔ細胞の総数に対するエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）の割合は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である。Ｔ細胞の総数に対する前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）の割合は、少なくとも１％であり得る。前記割合は少なくとも２％であることが好ましく、少なくとも３％であることがより好ましい。前駆Ｔ細胞は、サイトカイン産生のみを示し、かろうじて組織に進入する。しかし、これらの細胞は生涯の記憶効果を有する復帰Ｔ細胞（ｒｅｖｅｒｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ）であってもよい。
【０１４３】
第五の態様によるリンパ球集団は、さらに、評価用抗原刺激無しの場合の標準偏差の少なくとも２倍である値を有する、評価用抗原による刺激後の細胞内サイトカイン産生を特徴とし得る。さらに、評価用抗原による刺激は、評価用抗原刺激無しの場合の標準偏差の少なくとも２倍である、ある値のＣＤ１０７ａ誘導をもたらす。
【０１４４】
これらのパラメーターにより、リンパ球集団および／または臨床的に有用なリンパ球集団は、がん、感染症および自己免疫疾患の治療に有用な免疫療法産物である。
【０１４５】
第五の態様によれば、本発明は、哺乳動物における腫瘍疾患、感染症または自己免疫疾患を治療または予防するための免疫療法を提供する。前記免疫療法は、本発明の第二の態様による臨床的に有用なリンパ球集団を作製する工程、および、臨床的に有用なリンパ球集団を前記哺乳動物に投与する工程を含み、ここで、身体試料は前記哺乳動物から得られる。感染症は、あらゆる公知の病原体に関連するあらゆる公知の感染症であり得る。
【０１４６】
本発明による腫瘍疾患は、あらゆるがん、例えば、急性リンパ球性がんのいずれか、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管がん、関節のがん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、子宮頸がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、腹膜、網、腸間膜のがん、膵がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、軟部組織がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がん、ならびに、例えば、食道がん、胃がん、膵がん、胃がん、小腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、口腔がん、結腸がん、および肝胆道がん等の消化管がんであり得る。好ましいがんはグリア芽腫および膵がんである。
【０１４７】
臨床的に有用なリンパ球に対する免疫効果を回避するために、がん患者はＴ細胞の投与前に「条件付け（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）」されてもよい。条件付け（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）は３つの目的を有する。１つ目は注入されたリンパ球集団のためのより大きな空間を与えることであり、２つ目は有害エフェクターを取り除くことであり、３つ目はＴ細胞の急速な増殖および生存に有利であり得る増殖因子の産生、すなわち、自己のＩＬ−７およびＩＬ−１５の産生を増加させることである。
【０１４８】
臨床的に有用なリンパ球は、薬剤的に許容できる担体と混合されることで、医薬組成物を形成し得、これも本開示の範囲内である。ある実施形態では、臨床的に有用なリンパ球は、対象に対し自家性であり得、すなわち、臨床的に有用なリンパ球が治療を必要としている対象から得られ、その後、同一対象に投与される。
【０１４９】
自己細胞の対象への投与は、非自己細胞の投与と比較した場合に、宿主細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。あるいは、宿主細胞は同種細胞であり、すなわち、前記細胞が第一対象から得られ、第一対象とは異なるが同じ種の第二対象に投与される。例えば、臨床的に有用な同種リンパ球は、ヒトドナーに由来し、ドナーと異なるヒトレシピエントに投与され得る。
【０１５０】
本明細書で開示される方法を実施するため、有効量の本明細書に記載の臨床的に有用なリンパ球、またはその組成物が、治療を必要としている対象（例えば、ヒトがん患者、感染症に罹患している患者、自己免疫疾患に罹患している患者）に、例えば静脈内投与等の適切な経路を介して、投与され得る。前記細胞は注射、カテーテル等によって導入され得る。所望であれば、追加の薬剤（例えば、サイトカイン）も同時導入または連続導入され得る。前記細胞またはその組成物のいずれも、有効量で対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、有効量とは、投与後に対象に望ましい治療効果を与える、各々の作用剤（例えば、前記細胞またはその組成物）の量を指す。本明細書に記載の前記細胞または組成物の量が所望の治療効果を達成したかどうかの判定は、当業者には明らかであるだろう。例えば、参考文献２〜５を参照されたい。有効量は、当業者によって認識される通り、治療されている特定の状態、状態の重症度、個々の患者パラメーター、例えば、年齢、身体状態、大きさ、性別および体重、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、具体的な投与経路、ならびに、医療実施者（ｈｅａｌｔｈ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）の知識および専門知識の範囲内である同様の要因に依存して、変動する。いくつかの実施形態において、有効量は、対象における所望の疾患または障害の、症状を緩和、軽減、寛解、改善、低減し、または、進行を遅延させる。
【０１５１】
「投与」とは、当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを用いた、本明細書に記載の細胞または医薬組成物を含む組成物の対象への物理的な導入を指す。
【０１５２】
腫瘍反応性リンパ球集団の投与は、腫瘍付近への局所的な、または腫瘍内への、患者への導入であることが好ましい。あるいは、腫瘍反応性リンパ球集団は血液回路に投与される。他の臨床的に有用なリンパ球は血液回路に加えられることが好ましい。
【０１５３】
本発明の一実施形態によれば、対象は、キログラム体重当たり、少なくとも約、４×１０６、４．５×１０６、５×１０６、５．５×１０６、６×１０６、６．５×１０６、７×１０６、７．５×１０６、８×１０６、８．５×１０６、９×１０６、９．５×１０６、１０×１０６、１２．５×１０６、１５×１０６、２０×１０６、２５×１０６、３０×１０６、３５×１０６、４０×１０６、４５×１０６、５０×１０６、６０×１０６、７０×１０６、８０×１０６、９０×１０６個の細胞（必要に応じて他の範囲に拡大されたい）を含む、ある用量の臨床的に有用なリンパ球を投与される。
【０１５４】
第五の態様の臨床的に有用なリンパ球集団による免疫療法は、
哺乳動物におけるがん細胞の退縮をもたらし；
前悪性病変から悪性病変への推移を妨げ；
腫瘍細胞もしくは前悪性細胞の急速な老化をもたらし；
自己抗原陽性細胞の除去をもたらし；
病原体の殺傷、増殖停止もしくは封じ込めをもたらし；
がん幹細胞を妨害し；および／または
がん細胞、もしくは自己抗原を発現する細胞の増殖停止を誘導する。
【０１５５】
第六の態様によれば、本発明は、医学的処置で使用するための、特に、感染症、自己免疫疾患または腫瘍疾患を治療および予防するための、本発明の第一の態様による組成物を提供する。
【０１５６】
第六の態様の一実施形態によれば、前記用途は、本発明の第二の態様による方法を用いた臨床的に有用なリンパ球集団の作製を含む。
【０１５７】
第六の態様による組成物の一実施形態によれば、前記用途は、本発明の第五の態様による免疫療法を含む。上記で論じた通り、サイトカイン混合物の特定のサイトカインは、必ずしも同時に使用される必要はなく、異なる時点で添加されてもよい。
【０１５８】
第七の態様によれば、本発明は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む、医学的処置で使用するための、特に、感染症、自己免疫疾患または腫瘍疾患を治療または予防するための、キットを提供する。キットはさらに、ＴＣＲを刺激する成分の少なくとも１つ、特にＯＫＴ３、共刺激分子、フィーダー細胞および臨床的に有用な抗原のアミノ酸配列を含むペプチドを含んでいてもよい。キットは上述の成分の全てを含むことが好ましい。
【０１５９】
本発明はさらに以下の実施例によって定義される。
【実施例】
【０１６０】
実施例１：末梢血単核球を用いたリンパ球増殖プロトコル
Ａ）材料および機器
ｉ）機器
２４ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社（ＢＤ）、ＲＥＦ３５３５０４）
滅菌メス
滅菌ピンセット
Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（組織ホモジネート装置）（ＢＤ、カタログ番号３４０５８８）
Ｍｅｄｉｃｏｎ、５０μｍ、（ＢＤ、カタログ番号３４０５９１）
Ｆｉｌｃｏｎｓ、２００μｍ（ＢＤ、カタログ番号３４０６１３）
層流フード（クラス２バイオセイフティフード）
低温フリーザー、−８０℃
冷蔵庫
遠心機
【０１６１】
ｉｉ）消耗品
手袋（ラテックス）
実験用白衣
滅菌遠心管、１５ｍＬ
ピペットのチップ
ピペットエイド
廃棄物入れ
【０１６２】
ｉｉｉ）試薬
ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社、ＲＥＦ  ６１８７０−０４４）
Ｃｅｌｌｇｒｏ（セルジェニクス社（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、カタログ番号２０８０１−０１００）
プールヒトＡＢ血清（イノベイティブリサーチ社（Ｉｎｎｏａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＩＰＬＡ−ＳｅｒＡＢ−１３４５８）。
ウシ胎児血清（ギブコ社、ＲＥＦ：２６１４０−０７９）。
抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、（バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、カタログ番号３１７３０４）。
ヒトＩＬ−２（プロスペック社（Ｐｒｏｓｐｅｃ）、カタログ番号ＣＹＴ−２０９−ｂ）。
ヒトＩＬ−１５（プロスペック社、カタログ番号ｃｙｔ−２３０−ｂ）。
ヒトＩＬ−２１（プロスペック社、カタログ番号ｃｙｔ−４０８−ｂ）
ＰＥＳＴ（抗生物質）
アンホテリシン
【０１６３】
Ｂ）手順
アフェレーシスをＮＹ−ＥＳＯ−１で準備刺激された健常ドナーに対して行った。血液成分の分離後、白血球を含有する産物をその他から隔てた。細胞を、５％プールヒトＡＢ血清、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１を含むＣｅｌｌｇｒｏ中に懸濁させる。培地はさらに、増殖抗原として１０μｍｏｌ  ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを含有した。からの細胞の濃度。末梢血由来のリンパ球の増殖は、目的の抗原でパルスされた被照射自己ＰＢＭＣによる刺激工程を含んでいた。このために、自己ＰＢＭＣを室温で１０ｍＭ  ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで２時間パルスし、次に５５Ｇｙで照射した。７日目に、パルスされた被照射自己ＰＢＭＣをリンパ球培養液に加え、上記で定義された濃度のサイトカインと共に５％ヒトプールＡＢ血清を添加した新鮮な培地中で再懸濁した。１０日目に、５％プールヒトＡＢ血清およびサイトカインを添加したＣｅｌｌｇｒｏを用いて、細胞を増殖させた。ＯＫＴ３抗体を、１：１０（フィーダー細胞：Ｔ細胞の比）の被照射フィーダー細胞（５５Ｇｙ）、ペプチドおよびサイトカインを加えた上記の同一培地中３０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。培養の１７〜２０日目に、細胞は分析のために回収されるか、または、患者へ移植される。
【０１６４】
実施例２：末梢血単核球を用いたリンパ球増殖プロトコル
実施例２の手順は、ドナーがＮＹ−ＥＳＯ−１によるワクチン接種を受けた患者であったこと以外、実施例１の手順と同じである。
【０１６５】
実施例３：末梢血単核球を用いたリンパ球増殖プロトコル
実施例３は、ドナーが、腫瘍により既にＴＡＡ  ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現されていた患者であること以外、実施例１と同じである。
【０１６６】
実施例４：γδＴ細胞はサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を用いて増殖されたリンパ球において富化され得る
ゾレドロン酸が５μＭｏｌの濃度で細胞培養物に添加されたという差異を有する、実施例１に記載されたプロトコルに従って、増殖が実行される。ゾレドロン酸はＴＣＲγδＴ細胞の増殖を促進することが知られている。図１に示されるように、この実験設定により、頻度および絶対数の両方におけるＴＣＲγδＴ細胞の強力な増加がもたらされる。図１には、異なる時点における増殖培養物のフローサイトメトリー画像が示される。従って、増殖の１日目に、３．６８％の細胞がＴＣＲγδを保有している。２日目に既に僅かな増加がある。際立ったことに、増殖の７日後には、ほぼ５０％のＴ細胞がγδサブセットである。
【０１６７】
実施例５：サイトカイン混合物を用いたリンパ球の増殖はダブルネガティブＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を誘導する。
リンパ球をナルコレプシーを有する患者から得た。増殖抗原としてＰＲＤＭ２ペプチドを用い、刺激したこと以外は実施例１に記載と同様に、増殖を行った。培養細胞を１日目および１８日目にＴ細胞表現型について試験した。図２は、これらの試料のフローサイトメトリーの結果を示している。結果において、まず、リンパ球が選別され、次いで、ＣＤ３＋リンパ球が選別される。これらの細胞は次に、ＣＤ４およびＣＤ８の存在についてさらに解析される。パネルから、１日目以降、１３％のみの細胞がダブルネガティブ状態であることが分かる。過半数の細胞はＣＤ４＋である。サイトカイン混合物を用いた１８日間の増殖後は、９２％の細胞がダブルネガティブ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）Ｔ細胞である。
【０１６８】
さらに、ＰＲＤＭ２ペプチド刺激後の増殖されたリンパ球のＩＦＮ−γ産生の誘導が試験される。図３に示されるように、１日目は、０．８９％のみの細胞がＰＲＤＭ２刺激後にＩＦＮ−γを産生する。対照的に、１８日目の試料は、サイトカインを産生するＰＲＤＭ２に特異的なＴ細胞集団の有意な増加を示す。Ｔ細胞の大部分がＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−状態であるため、これにより、増殖プロトコルが臨床的に有用なダブルネガティブＴ細胞の形成をもたらすことが示される。
【０１６９】
実施例６：選別されたデキストラマー細胞は、ペプチドおよびタンパク質抗原を搭載した自己ＥＢＶ−ＬＣＬに応答してＩＦＮ−γを産生する
ナルコレプシーを有する２人の異なる患者から得られた血液を用い、再度ＰＲＤＭ２を増殖ペプチドとして用いて、実施例１による増殖プロトコルを実行した。患者につき２つの異なる設定において、ＤＮＡｓｅＢまたはＰＲＤＭ２ペプチドを培地中のサイトカイン混合物に添加した。ＭＨＣ拘束され、ＰＲＤＭ２またはＤＮＡｓｅＢを標的とするＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞および通常のＣＤ８＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーで選別し、それらが自然に処理および提示されたエピトープを認識するかどうかを試験した。同一患者由来のＴ細胞をペプチドまたは組換えタンパク質でパルスし、ＩＦＮ−γ産生を測定した。実験の結果を表１にまとめる。
【０１７０】
【表１】
2017525754.tif 000002
【０１７１】
測定値はＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。この実験は、特異的抗原と組み合わせたＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物が、臨床的に有用なＴ細胞、特に末梢血中の抗原に特異的なＴ細胞を増殖させることができることを示している。Ｔ細胞はいわゆるＤＮ  ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞集団に優先的に属し得、これらのＴ細胞は高度に機能的に活性であり、ＩＦＮ−γを産生し、生物学的および医学的に意義のある標的を認識する。
【０１７２】
実施例７：サイトカイン混合物および腫瘍関連抗原を用いて増殖されたリンパ球の解析
増殖抗原としてＮＹ−ＥＳＯ−１の代わりにＩＮＯ８０ＥおよびＵＣＨＬ３を使用したことを除いて、実施例１に記載と同様に増殖手順を実行した。１８日間の増殖の後、細胞を、フローサイトメトリーによって解析されるＩＮＯ８０ＥまたはＵＣＨＬ３で刺激した。フローサイトメトリーの結果を図４および図５に示す。図４Ａは、側方散乱および前方散乱によって分離された細胞のシグナルを示している。リンパ球は黒色の楕円で示されるようにゲーティングされる。選別されたリンパ球は次にＣＤ３の存在について再度選別される。ＣＤ３＋細胞を、ＣＤ８およびＣＤ４の存在または非存在による分離によって、さらに解析した。この実験では、４１％の細胞がＣＤ８＋であり、２９．６％がＣＤ４＋であり、２６．５％がダブルネガティブである。ダブルネガティブおよびＣＤ８＋を次に、標的抗原ＩＮＯ８０ＥおよびＵＣＨＬ３による刺激後のＩＦＮ−γ産生について試験した。Ｔ細胞がＭＨＣクラス１／ペプチド複合体を用いて客観的に測定されることに留意されたい。図５Ａに示される結果によれば、ＣＤ８＋細胞の１．４％がＩＮＯ８０Ｅ刺激後にＩＦＮ−γを産生し、ダブルネガティブＴ細胞の０．５６％も刺激後にＩＦＮ−γを産生する（図５Ｂ参照）。図５に示されるように、同様の結果がＵＣＨＬ３活性化について得られ、ＣＤ８＋細胞の０．３４％がＩＦＮ−γを産生する。また、ダブルネガティブ細胞の０．４５％がＩＦＮ−γを産生する（図５Ｄ参照）。
【０１７３】
ＩＮＯ８０Ｅで刺激された細胞をサイトカイン産生についてさらに解析した。図６Ａ〜図６Ｃは再度、ＣＤ８＋  ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のゲーティングを示している。ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）およびＣＤ１１７を産生する細胞の解析が図６Ｄ〜図６Ｆに示される。灰色のシグナルはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団全体（抗原特異性に関係なく）を表し、黒色のシグナルは抗原特異的であるＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を表す。解析は、ＴＡＡ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞毒性と関連したマーカーであるＣＤ１０７ａ、およびＣＤ１２７（Ｉｌ−７Ｒ受容体、生存シグナルを仲介）を発現するが、幹細胞様特性を有するＴ細胞のマーカーであるＣＤ１１７は発現しないことを示している。
【０１７４】
実施例８：サイトカイン混合物およびＣＭＶｐｐ６５ペプチドを用いたＰＢＭＣの増殖
ＰＢＭＣをグリア芽腫を有する患者から得て、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドを組み合わせた以外は実施例１に従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて増殖させた。この実験は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物と組み合わせたＣＭＶｐｐ６５ペプチド刺激が高親和性抗原特異的Ｔ細胞の強力な増殖をもたらすことを示している（四量体解析）。結果を図７Ａ〜図７Ｄに示す。ＡＰＣ−ＣＭＶ  ｂｚｗ．  ＰＥ−ＣＭＶおよび（ｕｎｄ）ＦＩＴＣ−ＣＭＶは、ｉ）同一のＭＨＣクラスＩ−ＨＬＡ−０２０１分子、ｉｉ）同一のペプチドを表す。ただし、ＭＨＣ分子は変異型である。唯一の差異は、ＭＨＣ分子における変異であり、これにより、異なる親和性を有するＴ細胞が検出される。ＣＭＶ四量体は異なる変異がなされている。ＡＰＣ−ＣＭＶ（中間の親和性、２４５位における変異；ＰＥ−ＣＭＶ（高親和性）および（ｕｎｄ）ＦＩＴＣ−ＣＭＶ（野生型、比較的低親和性）の間。データは、高親和性Ｔ細胞受容体が結合することを可能にするのみである変異型四量体が、高親和性Ｔ細胞（ならびに低親和性および中間の親和性を有するＴ細胞）を検出することを示している。高親和性Ｔ細胞は、より強力な免疫エフェクター機能を仲介し、腫瘍細胞および／または病原体の除去においてより優れていると考えられる。
【０１７５】
実施例９：サイトカイン混合物およびＮＹ−ＥＳＯ−１を用いた末梢血由来リンパ球の増殖後の腫瘍反応性Ｔ細胞の頻度解析
ＰＢＭＣを膵がんを有する患者から得た。実験は実施例１に記載と同様に実行した。図８は、０日目および１８日目における増殖の試料のフローサイトメトリー解析を示している。１日目では、ＮＹ−ＥＳＯ−１刺激後のＩＦＮ−γ産生はたった１．８５であるが、１８日目ではこの濃度は９．２５へと大幅に増加する（図８Ｂおよび図８Ｄ参照）。従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞の数は増殖中に大幅に増加する。
【０１７６】
実施例１０：がんを有する患者由来の末梢血からのサバイビン反応性Ｔ細胞の増殖
ＰＢＭＣをグリア芽腫を有する患者から得て、公知のＴＡＡサバイビンを共に用いる以外は実施例１に従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて増殖させた。再度、細胞を、１日目および１８日間の培養後にフローサイトメトリーを用いて解析した。解析の前に、増殖された細胞をサバイビンで刺激した。細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびダブルネガティブＴ細胞に分類した。これらのグループにおいて、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの濃度を測定した。図９ＡはＣＤ４＋細胞についての結果を示しており、図９Ｂはダブルネガティブについての結果を示しており、図９ＣはＣＤ８＋細胞についての結果を示している。結果は以下の通りにまとめることができる：時点０（Ｔ０）においては、サイトカイン産生によって定義される検出可能なＴ細胞応答は存在しない。対照的に、１８日間の増殖後は、サバイビン特異的Ｔ細胞の存在を立証する、サバイビンによる刺激に応答した強力なサイトカイン産生が見られる。これに関して、Ｔ細胞応答は通常、サバイビンに対しての誘導が非常に困難であることを留意する必要がある。
【０１７７】
実施例１１：増殖されたリンパ球の表現型解析
ＰＢＭＣをグリア芽腫を有する患者から得た。増殖は実施例１に記載と同様に実行した。０日目および１８日目の試料を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の存在によって解析した。結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。この実験において、細胞を以下のグループに分類した。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７についての陽性シグナル（グラフの右上部分）は前駆細胞を表す。ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−（右下）はセントラルメモリー細胞である。ＣＣＲ７−を有するＣＤ４５ＲＡ陽性シグナル（左上領域）はエフェクター細胞であり、両領域における陰性シグナル（左下領域）は末梢性メモリー細胞である。図１０Ａおよび図１０Ｂの比較において示されるように、セントラルメモリー細胞の数が、サイトカイン混合物を用いた増殖により、強く増加する（すなわち３．７２から２１．１に）ことは明らかである。末梢性メモリー細胞の数はわずかに増加し、一方、エフェクター細胞の数は強く減少する。前駆細胞の数は６５．４から５７．４にほんの僅か減少する。従って、本発明によるサイトカイン混合物を用いた増殖はセントラルメモリーＴ細胞を富化する。
【０１７８】
実施例１２：様々なＴＡＡと共にＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて増殖した後の、様々なＴ細胞サブセットの分化解析
膵がんを有する患者由来のＰＢＭＣを、実施例１に従って、様々な抗原：メソテリンの細胞表面結合部分であるＧＰＩ、サバイビンおよびＮＹ−ＥＳＯ−１をで処理した。結果を以下の表２にまとめる：
【０１７９】
【表２】
2017525754.tif 000003
【０１８０】
最初の欄で、解析されるＴ細胞サブセットが示される：ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４−且つＣＤ８−。２番目の欄で、抗原刺激が定義される。最後の欄で、異なる実験の０日目および１８日目における、セントラルメモリー、前駆体、分化型エフェクター細胞および末梢性メモリー細胞の割合が示される。これによると、メソテリン等のいくつかの抗原が、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋によって定義される前駆細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋によって定義されるセントラルメモリー細胞の増殖を特に駆動する。
【０１８１】
実施例１３：前駆Ｔ細胞の富化およびｃ−ｋｉｔ発現
グリア芽腫を有する患者由来のＰＢＭＣを、抗原（ＥＧＲｖＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビン）のペプチドを用いて、実施例１のプロトコルに従って増殖させた。細胞を、フローサイトメトリーにより解析される同じペプチドで刺激した。結果を表３にまとめる。
【０１８２】
【表３】
2017525754.tif 000004
【０１８３】
数字は、時点０（増殖開始）と比較した、１８日目の時点における、それぞれの抗原についての、親ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはダブルネガティブ表現型におけるＴ細胞集団の割合である。抗原およびｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の強い発現と関連した、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋によって定義される前駆Ｔ細胞サブセットの富化が検出される。Ｃ−ｋｉｔは幹細胞様特性を有するＴ細胞のマーカーである。ＣＤ１１７＋Ｔ細胞は長期メモリー集団の提供と関連付けられている。刺激されたＴ細胞において細胞毒性／脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａが強力に誘導されることも観察される。
【０１８４】
実施例１４：サイトカイン混合物およびＴＡＡペプチドを用いる増殖プロトコルは４−１ＢＢおよびＴＩＭ−３陽性Ｔ細胞をもたらす
ＰＢＭＣを膵がんを有する患者から得て、実施例１に従って増殖させた。再度、ＴＡＡペプチドをＧＰＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびサバイビンから得た。フローサイトメトリーを用いて、様々なマーカーの存在を検査した。マーカーは、４−１ＢＢ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ１およびＴＩＭ３である。結果を表４にまとめる。
【０１８５】
【表４】
2017525754.tif 000005
【０１８６】
表４において、Ｔ０は、増殖前（Ｔ０）の、第２欄において定義される個々のサブセットの濃度を表す。Ａｇは、１８日間の抗原刺激およびサイトカインで駆動される増殖を表す。４−１ＢＢの値およびＴＩＭ３の値は、抗原を経験したＴ細胞を示す。実験および細胞サブセットのいくつかにおいて、特に４−１ＢＢ＋Ｔ細胞が強く増加されることが分かる。例えばＣＤ４＋サブセットにおいて、ＮＹ−ＥＳＯ−１による刺激は、４−１ＢＢ＋Ｔ細胞において２００倍の増加をもたらす（０．０３から５，９６）。
【０１８７】
実施例１５：グリア芽腫を有する患者の末梢血から増殖されたリンパ球における細胞マーカーの詳細な解析
実験を、それぞれＥＧＶＲＶＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンを用いて、実施例１のプロトコルに従って行った。結果を表５にまとめる。
【０１８８】
【表５】
2017525754.tif 000006
【０１８９】
再度、リンパ球はＣＤ４またはＣＤ８＋の存在により分離される。表中の数字は、Ｔ０または１８日間の増殖後（Ａｇ）における、表中の第二欄に列挙される個々のマーカーについて陽性の細胞の割合を指す。再度、ほとんどの患者において、４−１ＢＢ＋Ｔ細胞の強い誘導が見られる。
【０１９０】
実施例１６：膵がんを有する患者およびグリア芽腫を有する患者から増殖されたリンパ球の解析
ＰＢＭＣを、膵がんを有する患者およびグリア芽腫を有する患者から得た。実施例１によるプロトコルを用いてリンパ球を増殖させた。リンパ球培養物を種々のマーカーに対するフローサイトメトリーによって解析する。結果を表６に示す。
【０１９１】
【表６】
2017525754.tif 000007
【０１９２】
第一欄には、どのリンパ球亜群が選別されたかが示される。第二欄には、試験された各マーカーが列挙される。マーカーが列挙されていない場合、この行は、細胞の総数に対する、選別マーカーＣＤ３＋およびＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはダブルネガティブを有する細胞の総数の割合を表す。再度、Ｔ０は増殖前の培養物を表し、ＴＨは１８日目における回収の時点を表す。数字は、それぞれ第２欄または第１欄における選択されたマーカーを有する細胞の割合を表す。増殖後のＣＤ４＋細胞の過半数がＴＨ１陽性であることに留意する必要がある。膵がんでは、数字は、２２．２％から９２．１％のＣＤ４細胞へと増加する。グリア芽腫では、結果は少しだけはっきりせず、９．６４％から６８．１％のＣＤ４細胞である。同様に、さらに、増殖後のＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＸＣＲ３＋の強い発現があり、膵臓では９６．８％、グリア芽腫では８５．５％である。従って、ＣＤ８＋細胞のほぼ全てがＣＸＣＲ３＋である。さらに、高分化型Ｔ細胞から前駆体またはセントラルメモリーＴ細胞サブセットへの変化が留意される。
【０１９３】
図１１は、膵がん患者由来の試料中のＴＨ１７、ＴＨ１、ＴＨ１＊およびＴＨ２を測定するための実験のフローサイトメトリーのグラフを示している。まず、細胞はＣＣＲ６に対しゲーティングされ、次にそれぞれＣＣＲ３およびＣＣＲ４に対しゲーティングされる。
【０１９４】
実施例１７：ある特定の抗原による刺激の非存在下における、これらの抗原に特異的なメモリーＴ細胞の増殖
膵がんを有する患者由来のＰＢＭＣを、腫瘍関連抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を用いて、実施例１に従って、増殖させた。得られた細胞を以下の腫瘍関連抗原で４時間刺激した：ＣＭＶ、ＥＢＮＡ−３ａ、ＩＮＯ８０Ｅ、メソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビンおよび（ｕｎｄ）ＵＣＨＬ３。フローサイトメトリーを用いて、サイトカイン産生Ｔ細胞の割合を測定した。様々なＴ細胞サブセット（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋およびダブルネガティブ）についての数字が表７に示される。以下のサイトカインを試験した：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ。興味深いことに、ＮＹ−ＥＳＯ−１による刺激だけでなく、増殖プロセスで使用されなかった他の抗原による刺激も、サイトカイン産生Ｔ細胞、従って腫瘍反応性Ｔ細胞をもたらした。また、ウイルス標的の抗原（ＣＭＶおよびＥＢＮＡ−３ａ）による刺激も、これらの標的に特異的なＴ細胞の存在を示す、サイトカインを産生するＴ細胞をもたらした。
【０１９５】
【表７】
2017525754.tif 000008
【０１９６】
実施例１８：ＨＰＶ  Ｌ１特異的増殖の後の細胞毒性
この実施例では、重篤なＨＰＶ疾患（ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５６）を患う患者から末梢血を得た。ＨＰＶ  Ｌ１ペプチドならびにＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含むサイトカイン混合物を用いて刺激を行った。１８日間の増殖の後、細胞をＬ１ペプチドで刺激し、フローサイトメトリーで測定した。この結果を図１２に示す。図１２Ｄ〜図１２Ｆは、それぞれリンパ球ＣＤ３＋およびＣＤ８＋に対するゲーティングを示している。図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃにおいて、長方形は、抗原特異的な脱顆粒／細胞毒性マーカーであるサイトカインＣＤ１０７ａを発現する細胞を示す領域を示している。図１２ＡはＬ１ペプチドを用いて得られた結果であり、図１２Ｂはポジティブコントロールを用いて得られた結果であり、図１２Ｃはネガティブコントロールとして培地のみを用いて得られた結果である。これから、ＣＤ１０７ａを産生する細胞の割合が０．７７から２．２３に増加している。
【０１９７】
実施例１９：サイトカイン混合物および腫瘍抗原を用いて増殖されたＴ細胞は自己腫瘍細胞を認識する
グリア芽腫を有する患者由来のＰＢＭＣを、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドおよびＣＭＶｐｐ６５ペプチドで刺激した。グリア芽腫を有する患者由来の末梢血を、２つの設定において刺激性ペプチドがＮＹ−ＥＳＯ−１またはＣＭＶｐｐ６５であった実施例４のプロトコルに従って処理した。再度、１８日後に、刺激用の様々な抗原または自己腫瘍細胞を用いてサイトカイン産生アッセイを行った。ペプチドおよびサイトカイン混合物を用いたＴ細胞の抗原特異的増殖が、刺激性標的を対象としたＴ細胞の増殖をもたらし、さらにまた、患者自身の自己腫瘍細胞を対象としたＴ細胞の増殖ももたらすことが分かった。この反応性は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびサイトカインを用いたＴ細胞の増殖前には存在しなかった。データを表８にまとめる。数字は親Ｔ細胞集団内に存在するＴ細胞の割合を表す。
【０１９８】
【表８】
2017525754.tif 000009
【０１９９】
実施例２０：２つの異なるサイトカイン混合物およびＴＡＡ刺激を用いたリンパ球増殖の比較
膵がんを有する患者由来の末梢血を得て、実施例４のプロトコルに従って処理した。様々な実験設定において、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンをサイトカイン混合物と共に使用した。さらに、サイトカインの添加無しで、またはＩＬ−７およびＩＬ−２の組み合わせを用いて、同じ実験を行った。１８日間の増殖の後、細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンペプチド混合物による刺激後のそれらのＩＦＮ−γ産生について試験した。結果を図１３に示す。図１３は、他のサイトカイン組成物またはサイトカイン無しと比較した、ＩＬ−２、ＩＬ１５およびＩＬ−２１を用いた増殖後の、ＩＦＮ−γ産生の強い増加、およびそれによる、抗原特異的リンパ球の濃度の強い増加を示している。
【０２００】
実施例２１：２つの異なるサイトカイン混合物およびＴＡＡ刺激を用いたリンパ球増殖の比較
実施例２０による実験を、ウイルス抗原ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−３ａおよびＣＭＶｐｐ６５を用いて繰り返した。結果を図１４にまとめる。図１４は、他のサイトカイン組成物またはサイトカイン無しと比較した、ＩＬ−２、ＩＬ１５およびＩＬ−２１を用いた増殖後の、ＩＦＮ−γ産生の強い増加、およびそれによる、抗原特異的リンパ球の濃度の強い増加を示している。
【０２０１】
実施例２２：サイトカイン混合物を用いたＴｒｅｇ増殖の解析
ＰＢＭＣ由来のＴ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物の存在下で培養し、Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）を、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞の増殖の前および後に同定した。結果を図１５に示す。図１５では、左から右に：Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞に対するゲーティング、次いで、活性化Ｔ細胞上のＩＬ−２受容体の高発現を示すＣＤ２５ｈｉｇｈに対するゲーティングが示される。次に、前記細胞を、Ｉｌ−２Ｒ（高ＣＤ１２５）細胞に対しゲーティングされ、ＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）およびＦｏｘｐ３（細胞内）の発現について試験した。Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ１２７ネガティブと定義される。Ｔｒｅｇの数は最初低く（ＣＤ４＋Ｔ細胞中０．０７％）、Ｔ細胞増殖後はさらに低くなった（０．０１％）。データは、ＩＬ−２が強いＴｒｅｇ増殖を駆動すると知られていることから、サイトカイン混合物がＴ細胞増殖においてより優れていることを示しており、また、Ｔｒｅｇ増殖を阻止する一方で抗腫瘍Ｔ細胞を増殖させる、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の組み合わせの相乗効果も明示している。
【０２０２】
実施例２３：増殖後のＶＢファミリー分布の解析
Ｔ細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原と共にサイトカイン混合物ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１を用いて２１日間増殖させた。フローサイトメトリー解析を、増殖前（Ｔ０＝時点０）および増殖後（ＴＨ＝回収時（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｈａｒｖｅｓｔ））に実行した。サイトカイン単独で刺激されたＴ細胞は対照として働く。結果を表９にまとめる。ＧＲｅｘフラスコ内で増殖されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＶＢ７．２ファミリーの強い優先的な増殖、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞（これもＧＲｅｘフラスコ内で増殖）におけるＶＢ１３．２ファミリーの強い優先的な増殖に注目されたい。データは、抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）の存在が個々のＴＣＲ  ＶＢファミリーの優先的な増殖を駆動することを示しており、また、抗原（サイトカインのみによるものではない）によって駆動される反応の多様性も示している。集束した、なお多様なＴＣＲ  ＶＢファミリーが、多様な抗標的Ｔ細胞応答を示す。
【０２０３】
【表９】
2017525754.tif 000010
【０２０４】
実施例２４：ＣＤ８＋細胞におけるＰＤ１マーカー
Ｔリンパ球をＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１およびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド混合物を用いて増殖させた。上段パネル：前、下段パネル：サイトカイン／ＴＡＡ増殖（＝Ｔ細胞をＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の存在下で培養した）の後。フローサイトメトリー解析をＴ細胞刺激の前および後に行った。左から右に：ｉ）リンパ球に対するゲーティング、ｉｉ）ＣＤ３＋Ｔ細胞に対するゲーティング、ｉｉｉ）ＣＤ４／ＣＤ８に対するゲーティング。上段右：ＣＤ８＋活性化Ｔ細胞（３７％のＴ細胞）上のＰＤ１発現。サイトカイン／ＴＡＡで増殖されたＴ細胞は、ＣＤ４ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ１発現の減少を示す。データは、サイトカイン／ペプチドで増殖されたＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ１＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことを示しており、これは、これらの増殖されたＴ細胞が、より長い寿命を示し、それ故腫瘍細胞に対する優れた有効性を示し得ることを意味する。
【０２０５】
実施例２５：複数の抗原
ＨＰＶ３３由来のＬ１タンパク質由来の１２の個々のペプチドからなるペプチド混合物を、サイトカイン混合物と共に使用して、ＨＰＶ＋病変を有する患者由来のＴ細胞を刺激した。２１日目に、Ｔ細胞を、各々のペプチドを標的とした細胞毒性について試験した。ここでは、自己ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞を採取し、ペプチド１〜１２でパルスし、次いで、標準的なＣｒ５１アッセイを行った。このアッセイは特定の標的を殺傷するＴ細胞の能力を測定する。結果を図１６に示す。
【０２０６】
ドナーＡ由来のＴ細胞はペプチド１１および１２を強く認識する。ｄＢ由来のＴ細胞は、ペプチド１１に対する強い反応性を有して、ペプチド７〜１２を強く認識した。これらのデータは、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１サイトカイン混合物およびペプチドを用いたＴ細胞の増殖によって、ｉ）細胞傷害性Ｔ細胞の発生、および、ｉｉ）Ｔ細胞応答が多様であり、異なる一連の個々のペプチド種にフォーカスされること、がもたらされることを示している。これは、ペプチド／サイトカイン混合物で刺激されたＴ細胞が、優先的に細胞傷害性であり得、また、いくつかのエピトープを標的にし得ることを意味しており、これによって、前記Ｔ細胞は、異なる一連のペプチド種を表面上に提示する腫瘍細胞またはウイルス感染細胞の認識においてより多様となる。
【０２０７】
実施例２６：ＰＢＭＣのサイトカインおよびＮＹ−ＥＳＯ−１で駆動される増殖の前および後のＣＤ１１７発現
ＰＢＭＣを腫瘍関連抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の存在下でＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１混合物を用いて増殖させた。細胞を増殖前（図１８）および増殖後（図１９）にフローサイトメトリーで解析した。まず、ＣＤ３＋Ｔ細胞がゲーティングされ、次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しゲーティングされる。ＣＤ１１７＋細胞を次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞（上段）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（下段パネル、左）に対して検出する。中段パネル：前駆物質Ｔ細胞を表す、高い集団密度のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を有するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７発現（中段パネル）。右：ＣＤ１１７＋Ｔ細胞（青色標識）がＣＤ８＋Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞に存在しており；ＣＤ１１７＋Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおける様々なＴ細胞集団において見つけることができる。データは、Ｔ細胞の「幹性（ｓｔｅｍ−ｎｅｓｓ）」の存在のマーカーであるＣＤ１１７発現が様々なＴ細胞サブセットに存在していることを示している。ＣＤ１１７＋Ｔ細胞は長期のＴ細胞記憶の供給源を提供するのに有益である。
【０２０８】
まず、ＣＤ３＋Ｔ細胞がゲーティングされ、次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しゲーティングされる。ＣＤ８＋Ｔ細胞（上段）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（下段パネル、左）における、非常に強い発現および高頻度のＣＤ１１７＋細胞。中段パネル：前駆Ｔ細胞を表す、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞において高い集団密度を有するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７発現（中段パネル）。右：ＣＤ１１７＋Ｔ細胞（青色標識）が、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−Ｔ細胞（エフェクター）における末梢性エフェクターＴ細胞に存在している。ＣＤ８４Ｔ細胞；ＣＤ１１７＋Ｔ細胞がＴ細胞前駆体ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋集団に見られる。データは、Ｔ細胞の「幹性」の存在のマーカーであるＣＤ１１７発現が様々なＴ細胞サブセットに存在していることを示している。ＣＤ１１７＋Ｔ細胞は長期のＴ細胞記憶の供給源を提供するのに有益である。また、サイトカイン混合物が長期の免疫細胞記憶を引き起こすＣＤ１１７＋Ｔ細胞を強く増殖させ、また、ＣＤ１１７＋Ｔ細胞が前駆Ｔ細胞に存在することで、長期の腫瘍免疫応答が確実となることが示される。
【０２０９】
実施例２７：グリア芽腫からのＴＩＬ培養物の増殖
この実施例は、機能試験および免疫療法のための膵がん由来のＴＩＬを培養するための手順を説明する。
【０２１０】
材料、機器および消耗品については、実施例１を参照されたい。
【０２１１】
患者から得られた腫瘍組織を滅菌容器に入れた。前記組織を、滅菌メスを用いて１〜２ｍｍ３の小片に切り分けた。組織片を２４ウェルプレートのウェルに１ウェル当たり１小片で入れた。１０％ヒトＡＢ血清を含有するＣｅｌｌｇｒｏを用いて細胞培地を調製した。この培地の中に、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を、ＩＬ−２については１０００ｕ／ｍｌ、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のそれぞれについては１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように、添加する。さらに、ＰＥＳＴおよびアンホテリシンを培地に添加した。１ｍｌの培地を各ウェルに添加し、細胞培養物を３７℃で７日間インキュベートした。並行して、健常ドナー由来のＰＢＭＣを１０％ヒトＡＢ血清を含有するＣｅｌｌｇｒｏ中で培養した。ＰＢＭＣの濃度を測定し、１０６／ｍｌの濃度に調整した。次に、ＰＢＭＣを５５Ｇｙで１８分間照射した。照射後、ＯＫＴ３を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加した。この培養物をＯＫＴ３含有フィーダー細胞と称する。ＴＩＬ培養の１０日目に、１００μｌのＯＫＴ３含有フィーダー細胞培養物を２４ウェルプレートの各ウェルに添加する。従って、各ウェル内の培養物は、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および総数１０６個のフィーダー細胞となる。ＴＩＬ：フィーダー細胞の比は約１：１０である。
【０２１２】
実施例２８：膵がんからのＴＩＬ培養物の増殖
患者から得られた腫瘍組織を滅菌容器に入れた。前記組織を、滅菌メスを用いて１〜２ｍｍ３の小片に切り分けた。組織片を２４ウェルプレートのウェルに１ウェル当たり１小片で入れた。１０％ヒトＡＢ血清を含有するＣｅｌｌｇｒｏを用いて細胞培地を調製した。この培地の中に、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を、ＩＬ−２については１０００ｕ／ｍｌ、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のそれぞれについては１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように、添加する。さらに、ＰＥＳＴおよびアンホテリシンを培地に添加した。１ｍｌの培地を各ウェルに添加し、細胞培養物を３７℃で４日間インキュベートした。並行して、健常ドナー由来のＰＢＭＣを１０％ヒトＡＢ血清を含有するＣｅｌｌｇｒｏ中で培養した。ＰＢＭＣの濃度を測定し、１０６／ｍｌの濃度に調整した。次に、ＰＢＭＣを５５Ｇｙで１８分間照射した。照射後、ＯＫＴ３を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加した。この培養物をＯＫＴ３含有フィーダー細胞と称する。ＴＩＬ培養の１０日目に、１００μｌのＯＫＴ３含有フィーダー細胞培養物を２４ウェルプレートの各ウェルに添加する。従って、各ウェル内の培養物は、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および総数１０６個のフィーダー細胞を含有する。ＴＩＬ：フィーダー細胞の比は約１：１０である。
【０２１３】
実施例２９：組織から癌化細胞株を作製するための手順
膵臓腫瘍組織を術後に直接得て、滅菌容器に入れた。腫瘍組織を、滅菌メスを用いて１〜２ｍｍ３の小片に切り分けた。各組織片を２４ウェルプレートのウェルに移す。１０％ウシ胎児血清を含有する１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに添加する。７日目および１４日目に培地を交換した。これは培地が除去され、同じ種類の新鮮な培地に置き換えられたことを意味する。腫瘍細胞が超高密度に達した際、培養物を６ウェルプレートに移した。
【０２１４】
実施例３０：フィーダー細胞添加の正しい時点の決定
リンパ球濃度が非常に低いときにフィーダー細胞が添加された場合、フィーダー細胞の添加によって腫瘍浸潤リンパ球の良好な増殖がもたらされないことが分かった。図２０Ａは、１週間のインキュベーションのリンパ球培養物を示している。いくつかのリンパ球は検出可能であるが、リンパ球濃度は増殖基準線未満である。図２０Ｂおよび図２０Ｃは、２週間のインキュベーション後の同じリンパ球培養物を示している。ここで、検出することができるリンパ球の数が、この増殖基準線を越えて増加した。フィーダー細胞はこの工程で添加され得る。図１Ｄ、ＥおよびＥは、フィーダー細胞の添加から４日後、１週間後および２週間後の培養物を示している。前記図では、図Ｄの画像から図Ｆの画像へと、リンパ球の数が大幅に増加していることが見て取れる。図Ｆでは、リンパ球が集まって培養物中の腫瘍細胞を攻撃していることが見て取れる。
【０２１５】
実施例３１：グリア芽腫から得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球の表現型および活性化／枯渇マーカー発現の解析
腫瘍組織を１６人のグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例１のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、前記組織から増殖させた。
【０２１６】
Ａ）
増殖された細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を標的とする抗体を用いて、それらのＣＤ４／ＣＤ８表現型についてフローサイトメトリー分析で解析した。
【０２１７】
結果を表１０にまとめる。
【０２１８】
【表１０】
2017525754.tif 000011
【０２１９】
データは、各々の腫瘍から増殖できたＴＩＬが、大部分、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含有していることを示している。患者に依り、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＤＮ  Ｔ細胞のいずれか１つが過半数を占める。しかし、ＣＤ４＋が最も頻繁に過半数を占めていることが分かった。表はまた、サイトカイン混合物が様々なＣＮＳ腫瘍組織構造由来のＴ細胞を増殖可能であることも示している（第４欄「診断」を参照）。
【０２２０】
Ｂ）
増殖された細胞を、それらの特定の表現型（前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、末梢性メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、または分化型エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−））、ならびに、基本表現型ＣＤ８＋、ＣＤ４＋およびダブルネガティブＴ細胞における活性化／枯渇マーカーの発現について、フローサイトメトリー分析で解析した。ＴＩＬ集団のフローサイトメトリー分析に使用した抗体を表１１にまとめる。
【０２２１】
【表１１】
2017525754.tif 000012
【０２２２】
結果を図２２Ａおよび図２２Ｂにまとめる。ＣＤ８＋、ＣＤ４＋またはＤＮ  Ｔ細胞の過半数が、効果的な抗がん反応および長期免疫記憶に不可欠であることが示されているセントラルメモリーＴ細胞サブセットに存在している。結果は、ＤＮ−Ｔ細胞の平均して強い増殖を示している。このサブセットは、高度に活性化されており、親和性Ｔ細胞受容体を有する。また、長期の免疫監視機構に有利な長期メモリーＴ細胞応答を与えるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋前駆Ｔ細胞サブセットの強い増殖が観察される。
【０２２３】
報告された、Ｔ細胞における４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３またはＴＩＭ−３の発現（図３Ｂ参照）は、抗原／腫瘍特異的なＴ細胞を示している。前記実施例は、サイトカイン混合物が、有益な臨床応答と関連付けられている、メモリー（セントラルメモリー）Ｔ細胞サブセットに主に存在するＴＩＬを増殖させることを示しており、また、抗原特異性と関連したマーカーを有するＴＩＬが増殖されることも示している。
【０２２４】
実施例３２：膵がんから得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球の表現型および活性化／枯渇マーカー発現の解析
腫瘍組織を１７人の膵がん患者から得た。表１２は、患者の年齢、性別、試料および組織診断の種類をまとめている。
【０２２５】
【表１２】
2017525754.tif 000013
【０２２６】
ＴＩＬを、実施例２８のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、前記組織から増殖させた。ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を標的とする抗体を用いる、ＣＤ４／ＣＤ８表現型。
【０２２７】
Ａ）
増殖された細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を標的とする抗体を用いて、それらのＣＤ４／ＣＤ８表現型についてフローサイトメトリー分析で解析した。結果を表１３にまとめる。
【０２２８】
【表１３】
2017525754.tif 000014
【０２２９】
増殖された細胞を、基本表現型ＣＤ８＋およびＣＤ４＋におけるそれらの特定の表現型（前駆Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、末梢性メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、または分化型エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−））について、フローサイトメトリー分析で解析した。結果を図２３および図２４にまとめる。
【０２３０】
ＣＤ８＋、ＣＤ４＋またはＤＮ  Ｔ細胞の過半数が、効果的な抗がん反応および長期免疫記憶に不可欠であることが示されているセントラルメモリーＴ細胞サブセットに存在している。結果は、ＤＮ−Ｔ細胞の平均して強い増殖を示している（データ未記載）。このサブセットは、高度に活性化されており、親和性Ｔ細胞受容体を有する。また、長期の免疫監視機構に有利な長期メモリーＴ細胞応答を与えるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋前駆Ｔ細胞サブセットの強い増殖が観察される。
【０２３１】
報告された、Ｔ細胞における４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３またはＴＩＭ−３の発現（図２４参照）は、抗原／腫瘍特異的なＴ細胞を示している。前記実施例は、サイトカイン混合物が、有益な臨床応答と関連付けられている、メモリー（セントラルメモリー）Ｔ細胞サブセットに主に存在するＴＩＬを増殖させることを示しており、また、抗原特異性と関連したマーカーを有するＴＩＬが増殖されることも示している。
【０２３２】
実施例３３：膵がんを有する患者の腫瘍組織から増殖されたＴ細胞のＴＣＲ長の解析
腫瘍組織を１７人の膵がん患者から得た。ＴＩＬを、実施例２８のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、前記組織から増殖させた。ＰＣＲに基づくアプローチを用いて、ＴＣＲ長を測定した。ＴＣＲファミリーの「通常の」イメージは、Ｔ細胞受容体の長さのガウス分布である。単一のピークは個々のＴＣＲファミリーにおける単クローン性を示唆している。図２５に示されるデータは、自己腫瘍標的に対し焦点を置かれていることを示唆して、ＴＩＬ組成物が単クローン性または多クローン性であることを示しており、サイトカイン混合物は、集束したＴＣＲレパートリーの増殖を助ける。
【０２３３】
実施例３４：グリア芽腫を有する患者から得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球におけるサイトカイン産生の解析
腫瘍組織をグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例１のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。増殖されたリンパ球を腫瘍関連抗原、すなわちＥＧＲｖｒＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンに由来するペプチドで刺激し、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαのうちのいずれか１つを産生する細胞の割合を測定した。
【０２３４】
結果を図２６Ｂに示す。比較のために、最大刺激がポジティブコントロールとしてＰＭＡ／イオノマイシン（ｉｎｏｎｏｍｙｃｉｎ）を用いて試験され、バックグラウンドシグナルが培地のみを用いて測定される（ネガティブコントロール）。結果は、増殖されたＴ細胞がこれらの通常共有される腫瘍抗原を認識することを示している。従って、サイトカイン混合物は、臨床的に意義があり、臨床応答と関連付けられている、腫瘍抗原に反応性の、グリア芽腫由来のＴ細胞を増殖させる。
【０２３５】
実施例３５：膵がんを有する患者から得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球におけるサイトカイン産生の解析
腫瘍組織を膵がん患者から得た。
【０２３６】
ＴＩＬを、実施例２７のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。増殖されたリンパ球を腫瘍関連抗原、すなわちＥＧＲｖｒＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはサバイビンに由来するペプチドで刺激し、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαのうちのいずれか１つを産生する細胞の割合を測定した。結果を図２７Ａに示す。図２７Ｂは、ＮＹ−ＥＳＯ−１についてのフローサイトメトリー解析の画像を示している。結果により、増殖されたＴ細胞がこれらの通常共有される腫瘍抗原を認識することが確認される。従って、サイトカイン混合物は、臨床的に意義があり、臨床応答と関連付けられている、腫瘍抗原に反応性の、膵臓腫瘍由来のＴ細胞を増殖させる。
【０２３７】
実施例３６：グリア芽腫を有する患者から得られたＴＩＬから増殖されたリンパ球におけるサイトカイン産生および自己刺激の解析
腫瘍組織をグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例２７のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。増殖されたリンパ球を自己腫瘍細胞で刺激した。結果を図２８Ａに示す。図２８Ｂはフローサイトメトリー解析の画像を示している。結果により、増殖されたＴ細胞が自己腫瘍細胞を認識することが確認される。従って、サイトカイン混合物は、自己腫瘍細胞、従って患者自身の変異に反応性の、グリア芽腫由来のＴ細胞を増殖させる。
【０２３８】
実施例３７：膵がんにおけるＴＣＲの使用と自己腫瘍細胞の認識の関連付け
腫瘍組織をグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例２７のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。増殖されたリンパ球を自己腫瘍細胞で刺激した。ＴＩＬをまずＣＤ３＋Ｔ細胞に対しゲーティングし、次にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しゲーティングした。個々のＶβファミリーの頻度を、ＴＣＲ  ＶＢ抗体パネルを用いて検査した。このＴＣＲパネルはヒトＴＣＲレパートリーの約７５％を網羅しており、そのため、全てのＴＣＲ  Ｖβファミリーが十分に捕捉されない可能性がある。ＴＣＲ  Ｖβファミリー分布は、１０％を超え得るＴＣＲ  ＶＢ２を除いて、各ファミリーにおいて約２〜６％である。表１４は、グリア芽腫を有する患者由来のＴＩＬにおけるＶβ−２ファミリーの優先的な増殖を示している。
【０２３９】
【表１４】
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【０２４０】
表１４のデータは、個々のＴＣＲ  ＶＢがＴＩＬにおいて優先的に増殖されることを示している。クローン性は配列決定によってのみ検討することができるといことに留意されたい。サイトカイン混合物が個々の患者における様々なＴＣＲ  Ｖβファミリーを増殖することに留意されたい。これは、膵がんを有する患者においてだけでなく、グリア芽腫を有する患者においても当てはまる。また、いくつかのＴＩＬが単一または２つのＶＢファミリーから構成され、抗原駆動性Ｔ細胞増殖プロセスを示唆する、高度に集束したＴＣＲ  ＶＢ増殖を示すことも留意されたい。優先的に増殖されることが示されたいくつかのＴＩＬは、単クローン性であることが示された。従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物は、患者自身の腫瘍細胞を標的とする、集束したＴ細胞応答を拡張させる。
【０２４１】
実施例３８：膵がんにおけるＴＣＲの使用と自己腫瘍細胞の認識の関連付け
腫瘍組織を膵がん患者から得た。ＴＩＬを、実施例２８のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。
【０２４２】
ＴＣＲ  Ｖβ抗体と組み合わせてＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を用いて、フローサイトメトリーによって、細胞を染色した。前記パネルはＴＣＲ  ＶＢレパートリー全体の７５％までを網羅している。ある特定のＴ細胞ファミリーがこのパネルに網羅されていない２５％に属する場合、前記Ｔ細胞ファミリーはこのパネルによって捕捉されない。結果を表１５にまとめる。
【０２４３】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【０２４４】
自己腫瘍細胞（単一細胞懸濁液）へのＴＩＬの暴露の３日後に、ＩＦＮγ産生が測定される。高レベルのＩＦＮγ産生は自己腫瘍細胞を用いた後にのみ見られる（図３５参照）。ＩＦＮγ産生はＷ６／３２に対する抗体（ＣＤ８＋ＴＩＬを阻止）によって完全に阻止される。対照として、ＣＤ４＋ＴＩＬを阻止する抗体Ｌ２４３は反応性を阻止することができず、増殖された細胞リンパ球における反応性Ｔ細胞は全てＣＤ８＋である。データは、サイトカイン混合物が、非常に集束した、膵がんを有する患者由来の自己腫瘍細胞を特異的に認識する、ＴＩＬを増殖させることを示している。膵がんを有する患者由来のＴＩＬにおける単クローン性ＴＣＲファミリー：ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩｌ−２１は、個々のＴＣＲ  ＶＢファミリーを優先的に増殖させ、Ｔ細胞ファミリーのそのような優先的な増殖は、抗原特異性および集束した抗腫瘍反応性と関連する。これらの優先的に増殖されたＶＢファミリーのいくつかは、単一のＴＣＲ  ＶＢ鎖によって定義される、単クローン性Ｔ細胞を含有する。このような単クローン性ＴＣＲ増殖は、集束した抗がん反応を示す。機能的反応解析は、単クローン的に増殖されたＴＩＬが自己腫瘍細胞を認識することを示した。
【０２４５】
実施例３９：自己腫瘍細胞に対するグリア芽腫を有する患者由来の増殖されたＴＩＬの細胞溶解反応の解析
腫瘍組織をグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例２８のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。自己腫瘍細胞を実施例２９のプロトコルに従って作製した。自己腫瘍細胞を放射能標識し、増殖されたＴＩＬと一緒に４時間培養する。腫瘍細胞の殺傷によって、後に測定される放射能の放出が引き起こされる。前記方法の原理を図２１に示す。腫瘍細胞に対するＴＩＬの比に依存した細胞毒性効果が確認される結果が図３１に示される。データは、サイトカイン混合物が自己腫瘍細胞に対して強い細胞毒性を有するＴＩＬを増殖させることを示している。
【０２４６】
あるいは、増殖された単クローン性Ｔ細胞および／または優先的に増殖されたＴＩＬを、同じ試験を用いて、それらの細胞毒性について試験した。結果を図３２に示す。表１６は、これらの免疫応答が自己腫瘍細胞を特異的に標的としていることを示している。データは、サイトカイン混合物が自己腫瘍に対する、細胞傷害反応を含む特異的反応性を有するＴＩＬを増殖させることを示している。
【０２４７】
Ｂ）
並行した実験において、自己腫瘍細胞を、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−２のサイトカイン混合物を用いてグリア芽腫から増殖されたＴＩＬと一緒に、３日間インキュベートした。インキュベーションの後、ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡで測定した。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞が腫瘍反応に関与しているかどうかを確認するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞に影響を与えるＭＨＣクラスＩ抗原反応（Ｗ６／３２）を阻止する抗体、または、ＣＤ４＋Ｔ細胞に影響を与えるＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ反応）を阻止する抗体を使用した。結果を表１６にまとめる。
【０２４８】
【表１６】
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【０２４９】
ＩＦＮγ産生の欠如を示したＴＩＬは、標準的なＣＲ５１放出アッセイで測定された場合、強い細胞傷害性を有した。データは、ＴＩＬが特異的に自己腫瘍細胞に対してＩＦＮγを産生することを示している。
【０２５０】
実施例４０：自己腫瘍細胞に対する膵がんを有する患者由来の増殖されたＴＩＬの細胞溶解反応の解析
腫瘍組織を膵がん患者から得た。ＴＩＬを、実施例２８のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。自己腫瘍細胞を実施例２９のプロトコルに従って作製した。自己腫瘍細胞を放射能標識し、増殖されたＴＩＬと一緒に４時間培養する。腫瘍細胞の殺傷によって、後に測定される放射能の放出が引き起こされる。前記方法の原理を図７に示す。比較のために、および対照として、自己（メラノーマ）ＴＩＬ系を使用した。細胞毒性効果が確認される結果を図３３に示す。データは、サイトカイン混合物が膵がんを有する患者由来のＴＩＬも増殖させることを示している。これらのＴＩＬは、ＴＣＲ使用に基づいて、高度にフォーカスされており、自己腫瘍に対して細胞傷害反応を含む特異的な反応性を示す。
【０２５１】
実施例４１：ＣＸＣＲ３発現ＣＤ４＋細胞分布の解析
腫瘍組織をグリア芽腫患者から得た。ＴＩＬを、実施例２７のプロトコルに従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のサイトカイン混合物を用いて、腫瘍組織から増殖させた。Ｔ細胞の機能およびホーミングを定義したマーカー発現について、細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【０２５２】
解析の結果を表１７にまとめる。Ｔｈ１細胞およびＣＸＣＲ３は増殖前は１０％未満であった。データは、サイトカイン混合物がＣＤ８＋細胞がＣＸＣＲ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から本質的に成るＴ細胞産物をもたらすことを示している。この表現型は腫瘍組織に進入することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞はほぼ全てがＴＨ１特性を有する。ＴＨ１特性（ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生）は抗腫瘍反応の向上をもたらす。また、強い自己免疫性反応および腫瘍反応と関連しており、また、腫瘍組織へのより良好な侵入を可能にするマーカーＣＸＣＲ３を発現するＴ細胞サブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ）Ｔ細胞も存在する。
【０２５３】
【表１７】
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【０２５４】
実施例４２：膵がんを有する患者由来のＴＩＬによる通常共有される腫瘍抗原の認識
１５の重複ペプチドとしてのＴＡＡをＴＩＬと一緒に３日間インキュベートし、ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡで測定した。さらに、抗原反応を、ＣＤ８＋Ｔ細胞に影響を与えるＭＨＣクラスＩ抗原反応（Ｗ６／３２）を阻止する抗体、または、ＣＤ４＋Ｔ細胞に影響を与えるＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ反応、Ｌ２４３）を阻止する抗体によって阻止した。各試料におけるＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）を表１８に示す。抗ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞を阻止）または抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋を阻止）Ｔ細胞による阻止によって示される、抗原特異的であるＴＩＬにおけるＩＦＮγ産生。結果から、ＴＩＬが、膵がんを有する患者由来の、通常共有されるがん抗原、特に、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはメソテリンに対して、ＩＦＮγを産生することが確認される。
【０２５５】
【表１８】
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【０２５６】
本明細書に記載される本発明の多くの変更形態および他の実施形態が、上記の明細書および関連図面において提供される教示の利益を有する、本発明が属する分野の当業者に想起される。従って、本発明が開示された特定の実施形態に限定されないこと、ならびに、変更形態および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図されることを理解されたい。特定の用語が本明細書で使用されているが、それらの用語は一般的且つ説明的な意味においてのみ使用され、限定を目的としない。
【０２５７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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