(57)【要約】本出願は一般に、新規の抗ＤＰＥＰ３抗体またはその免疫反応性断片と、これらを含む抗体薬物コンジュゲートを含む組成物であって、がんおよびその任意の再発または転移を処置、診断、または予防するための組成物に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞頻度の低減を含む、がんの処置のためのこのような抗ＤＰＥＰ３抗体または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。本明細書では、新規の抗ＤＰＥＰ３抗体および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の誘導体を含む、新規の抗ＤＰＥＰ３抗体および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と、これを使用して増殖性障害を処置する方法とが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＰＥＰ３を発現する腫瘍始原細胞に結合する抗体。
【請求項２】
内部移行抗体である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
ＤＰＥＰ３タンパク質におけるエピトープに結合する単離抗体であって、該エピトープが、配列番号３のＥ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、およびＥ３７９からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む単離抗体。
【請求項４】
前記エピトープが、（１）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５（３）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（４）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（５）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（６）Ｒ２４２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（７）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（８）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（９）Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１０）Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１１）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（１２）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（１３）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１４）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１５）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１６）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１７）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８；（１８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２；（１９）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｋ３７５；（２０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｅ３７９；（２１）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２２）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｋ３７５；（２３）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（２４）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（２５）Ｅ２１７、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（２６）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（２７）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（２９）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（３０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（３１）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５；（３２）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３３）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９、（３４）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（３５）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３６）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（３７）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３９）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（４０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；または（４１）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５を含む、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項５】
前記エピトープが、Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９を含む、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項６】
ＤＰＥＰ３タンパク質におけるエピトープに結合する単離抗体であって、該エピトープが、配列番号３のＲ４６、Ｒ４８、Ｒ５４、およびＳ５５からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む単離抗体。
【請求項７】
前記エピトープが、（１）Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４；（２）Ｒ４６、Ｒ４８、Ｓ５５；（３）Ｒ４６、Ｒ５４、Ｓ５５；または（４）Ｒ４８、Ｒ５４、Ｓ５５を含む、請求項６に記載の単離抗体。
【請求項８】
前記エピトープが、Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４、Ｓ５５を含む、請求項６に記載の単離抗体。
【請求項９】
ＤＰＥＰ３タンパク質におけるエピトープに結合する単離抗体であって、該エピトープが、配列番号３のＱ２４８、Ｓ３８０、Ｓ３８４、およびＶ３８６からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む単離抗体。
【請求項１０】
前記エピトープが、（１）Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６；（２）Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｑ２４８；（３）Ｓ３８０、Ｖ３８６、Ｑ２４８；または（４）Ｓ３８４、Ｖ３８６、Ｑ２４８を含む、請求項９に記載の単離抗体。
【請求項１１】
前記エピトープが、Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６、Ｑ２４８を含む、請求項９に記載の単離抗体。
【請求項１２】
腫瘍始原細胞に結合する、請求項３から１１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１３】
内部移行抗体である、請求項３から１１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１４】
ＤＰＥＰ３に特異的に結合し、
配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または
配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または
配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または
配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または
配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または
配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または
配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または
配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または
配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または
配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または
配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または
配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または
配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または
配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または
配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または
配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または
配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または
配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または
配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または
配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または
配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または
配列番号１０５のＶＬおよび配列番号１０７のＶＨ；または
配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または
配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または
配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または
配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または
配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または
配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または
配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または
配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または
配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または
配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または
配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または
配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または
配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または
配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または
配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または
配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または
配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または
配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または
配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または
配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ
を含む抗体と結合について競合する単離抗体。
【請求項１５】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、または組換え抗体、またはこれらの断片である、請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項１６】
内部移行抗体である、請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項１７】
ＶＨおよびＶＬを含むヒト化抗体であり、該ＶＬが、配列番号２３２のＣＤＲＬ１、配列番号２３３のＣＤＲＬ２、および配列番号２３４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２３８のＣＤＲＬ１、配列番号２３９のＣＤＲＬ２、および配列番号２４０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２４４のＣＤＲＬ１、配列番号２４５のＣＤＲＬ２、および配列番号２４６のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２５０のＣＤＲＬ１、配列番号２５１のＣＤＲＬ２、および配列番号２５２のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２５６のＣＤＲＬ１、配列番号２５７のＣＤＲＬ２、および配列番号２５８のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２６２のＣＤＲＬ１、配列番号２６３のＣＤＲＬ２、および配列番号２６４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬが、配列番号２６８のＣＤＲＬ１、配列番号２６９のＣＤＲＬ２、および配列番号２７０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有する、請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項１８】
ＶＬおよびＶＨを含むヒト化抗体であり、該ＶＨが、配列番号２３５のＣＤＲＨ１、配列番号２３６のＣＤＲＨ２、および配列番号２３７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ）を有するか；または該ＶＨが、配列番号２４１のＣＤＲＨ１、配列番号２４２のＣＤＲＨ２、および配列番号２４３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；または該ＶＨが、配列番号２４７のＣＤＲＨ１、配列番号２４８のＣＤＲＨ２、および配列番号２４９のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；または該ＶＨが、配列番号２５３のＣＤＲＨ１、配列番号２５４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５５のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；または該ＶＨが、配列番号２５９のＣＤＲＨ１、配列番号２６０のＣＤＲＨ２、および配列番号２６１のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；または該ＶＨが、配列番号２６５のＣＤＲＨ１、配列番号２６６のＣＤＲＨ２、および配列番号２６７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；または該ＶＨが、配列番号２７１のＣＤＲＨ１、配列番号２７２のＣＤＲＨ２、および配列番号２７３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する、請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項１９】
ＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２３２のＣＤＲＬ１、配列番号２３３のＣＤＲＬ２、および配列番号２３４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２３５のＣＤＲＨ１、配列番号２３６のＣＤＲＨ２、および配列番号２３７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するヒト化抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２３８のＣＤＲＬ１、配列番号２３９のＣＤＲＬ２、および配列番号２４０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２４１のＣＤＲＨ１、配列番号２４２のＣＤＲＨ２、および配列番号２４３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２４４のＣＤＲＬ１、配列番号２４５のＣＤＲＬ２、および配列番号２４６のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２４７のＣＤＲＨ１、配列番号２４８のＣＤＲＨ２、および配列番号２４９のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２５０のＣＤＲＬ１、配列番号２５１のＣＤＲＬ２、および配列番号２５２のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２５３のＣＤＲＨ１、配列番号２５４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５５のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２５６のＣＤＲＬ１、配列番号２５７のＣＤＲＬ２、および配列番号２５８のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２５９のＣＤＲＨ１、配列番号２６０のＣＤＲＨ２、および配列番号２６１のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２６２のＣＤＲＬ１、配列番号２６３のＣＤＲＬ２、および配列番号２６４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２６５のＣＤＲＨ１、配列番号２６６のＣＤＲＨ２、および配列番号２６７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体；またはＶＬおよびＶＨを含み、該ＶＬが、配列番号２６８のＣＤＲＬ１、配列番号２６９のＣＤＲＬ２、および配列番号２７０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、該ＶＨが、配列番号２７１のＣＤＲＨ１、配列番号２７２のＣＤＲＨ２、および配列番号２７３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する抗体である、請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項２０】
ＤＰＥＰ３に結合するヒト化抗体であって、配列番号２１６に示される全長軽鎖および配列番号２１７に示される全長重鎖；または配列番号２１８に示される全長軽鎖および配列番号２１９に示される全長重鎖；または配列番号２２０に示される全長軽鎖および配列番号２２１に示される全長重鎖；または配列番号２２２に示される全長軽鎖および配列番号２２３に示される全長重鎖；または配列番号２２４に示される全長軽鎖および配列番号２２５に示される全長重鎖；または配列番号２２４に示される全長軽鎖および配列番号２２６に示される全長重鎖；または配列番号２２７に示される全長軽鎖および配列番号２２８に示される全長重鎖；または配列番号２２９に示される全長軽鎖および配列番号２３０に示される全長重鎖を含むヒト化抗体。
【請求項２１】
ペイロードへとコンジュゲートさせた、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸または請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
［式中、
ａ）Ａｂは、抗ＤＰＥＰ３抗体を含み；
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄは、薬物を含み；
ｄ）ｎは、約１〜約２０の整数である］
のＡＤＣまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項２６】
Ｄが、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項２５に記載のＡＤＣ。
【請求項２７】
Ａｂが、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体である、請求項２５に記載のＡＤＣ。
【請求項２８】
細胞毒素を細胞へと送達する方法であって、該細胞を、請求項２５から２７のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させるステップを含む方法。
【請求項２９】
請求項２５から２７のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む医薬組成物。
【請求項３０】
がんを処置する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体へと投与するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、および子宮内膜がんから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、卵巣がんである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんが、卵巣漿液性癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが、卵巣漿液性乳頭状癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体へと、少なくとも１つのさらなる治療用部分を投与するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞集団における腫瘍始原細胞を低減する方法であって、腫瘍始原細胞と、腫瘍始原細胞以外の腫瘍細胞とを含む腫瘍細胞集団を、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣと接触させるステップを含み、これにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減する方法。
【請求項３７】
前記接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照出願
本出願は、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／９１５，３２１号の利益を請求し、この出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによるＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書により援用される。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年１２月１１日に作成され、sc3401pct_S69697_1050WO_SEQL_121114.txtという名称であり、264,346バイトのサイズである。
【０００３】
本出願は一般に、新規の抗ＤＰＥＰ３抗体またはその免疫反応性断片と、これらを含む抗体薬物コンジュゲートを含む組成物であって、がんおよびその任意の再発または転移を処置、診断、または予防するための組成物に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞頻度の低減を含む、がんの処置のためのこのような抗ＤＰＥＰ３抗体または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞および前駆細胞の分化および増殖は、正常な進行中の過程であって、器官形成の間の組織の成長、細胞の修復、および細胞の置きかえを支援するように協調して作用する過程である。系は、適切なシグナルだけが、生物の必要に基づき発せられることを確実にするように、緊密に調節されている。細胞の増殖および分化は、損傷した細胞もしくは死滅しつつある細胞の置きかえ、または成長に必要な場合に限り正常に生じる。しかし、多様なシグナル伝達化学物質の過少もしくは過剰、微小環境の変化の存在、遺伝子の変異、またはこれらの組合せを含む多くの因子により、これらの過程の破壊が誘発される場合がある。正常な細胞の増殖および／または分化が破壊されると、がんなどの増殖性疾患を含む、多様な障害がもたらされる可能性がある。
【０００５】
がんのための従来の治療的処置は、化学療法、放射線療法、および免疫療法を含む。これらの処置は、有効でないことが多く、手術による切除は、実行可能な臨床的代替法を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、患者が、第一選択の処置を受け、その後、再発する症例において、特に明白である。このような症例では、侵襲性であり、治癒不可能であることが多い、難治性腫瘍が生じる頻度が高い。多くの充実性腫瘍についての全体的生存率は、再発、腫瘍の再発、および転移を防止する既存の治療の失敗に少なくとも部分的に起因して、大部分が何年もの間不変のままである。したがって、増殖性障害のための、よりターゲティングされ、強力な治療を開発する必要は依然として大きい。本発明は、この必要に応じるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
広範な態様では、本発明は、ヒトＤＰＥＰ３タンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供する。ある特定の実施形態では、ＤＰＥＰ３タンパク質は、腫瘍始原細胞上で発現する。他の実施形態では、本発明の抗体は、ＤＰＥＰ３に結合し、ＤＰＥＰ３上のエピトープに結合する抗体と結合について競合する。
【０００７】
本発明の特定の態様では、本発明の抗体は、ＤＰＥＰ３タンパク質におけるエピトープに結合し、この場合、エピトープは、配列番号３のＥ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、およびＥ３７９からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む。例えば、このようなエピトープは、（１）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５（３）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（４）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（５）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（６）Ｒ２４２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（７）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（８）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（９）Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１０）Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１１）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（１２）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（１３）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１４）Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１５）Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１６）Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（１７）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８；（１８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２；（１９）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｋ３７５；（２０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｅ３７９；（２１）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２２）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｋ３７５；（２３）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（２４）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（２５）Ｅ２１７、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（２６）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（２７）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２；（２８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｅ３７９；（２９）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（３０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５；（３１）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５；（３２）Ｅ２１７、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３３）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９、（３４）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（３５）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３６）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｅ３７９；（３７）Ｅ２１７、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３８）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ３７２、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（３９）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｋ３７５、Ｅ３７９；（４０）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｅ３７９；または（４１）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５；または（４２）Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５  Ｅ３７９を含みうる。
【０００８】
本発明の他の特定の態様では、本発明の抗体は、ＤＰＥＰ３タンパク質内のエピトープに結合し、この場合、エピトープは、配列番号３のＲ４６、Ｒ４８、Ｒ５４、およびＳ５５からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む。例えば、このようなエピトープは、（１）Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４；（２）Ｒ４６、Ｒ４８、Ｓ５５；（３）Ｒ４６、Ｒ５４、Ｓ５５；（４）Ｒ４８、Ｒ５４、Ｓ５５；または（５）Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４、Ｓ５５を含みうる。
【０００９】
本発明の他の特定の態様では、本発明の抗体は、ＤＰＥＰ３タンパク質におけるエピトープに結合し、この場合、エピトープは、配列番号３のＱ２４８、Ｓ３８０、Ｓ３８４、およびＶ３８６からなる群から選択される、３つまたはこれを超える残基を含む。例えば、このようなエピトープは、（１）Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６；（２）Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｑ２４８；（３）Ｓ３８０、Ｖ３８６、Ｑ２４８；（４）Ｓ３８４、Ｖ３８６、Ｑ２４８；または（５）Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６、Ｑ２４８を含みうる。
【００１０】
本発明の他の特定の態様では、抗体は、ＤＰＥＰ３に特異的に結合し、配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または
配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または
配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または
配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または
配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または
配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または
配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または
配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または
配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または
配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または
配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または
配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または
配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または
配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または
配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または
配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または
配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または
配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または
配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または
配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または
配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または
配列番号１０５のＶＬおよび配列番号１０７のＶＨ；または
配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または
配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または
配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または
配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または
配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または
配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または
配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または
配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または
配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または
配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または
配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または
配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または
配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または
配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または
配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または
配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または
配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または
配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または
配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または
配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨを含む抗体と結合について競合する。本発明の一部の態様では、抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、または組換え抗体、またはこれらの断片である。本発明の他の態様では、上記の配列を含む抗体は、内部移行抗体である。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明は、ＤＰＥＰ３に結合し、配列番号１８９に示される３つの可変軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）；および配列番号１９１に示される３つの可変重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）；または配列番号１９３に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号１９５に示される３つのＣＤＲＨ；または配列番号１９７に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号１９９に示される３つのＣＤＲＨ；または配列番号２０１に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号２０３に示される３つのＣＤＲＨ；または配列番号２０５に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号２０７に示される３つのＣＤＲＨ；または配列番号２０９に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号２１１に示される３つのＣＤＲＨ；または配列番号２１３に示される３つのＣＤＲＬおよび配列番号２１５に示される３つのＣＤＲＨを含む抗体と結合について競合するヒト化抗体を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、ヒト化抗体は、ＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＬは、配列番号２３２のＣＤＲＬ１、配列番号２３３のＣＤＲＬ２、および配列番号２３４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２３８のＣＤＲＬ１、配列番号２３９のＣＤＲＬ２、および配列番号２４０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２４４のＣＤＲＬ１、配列番号２４５のＣＤＲＬ２、および配列番号２４６のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２５０のＣＤＲＬ１、配列番号２５１のＣＤＲＬ２、および配列番号２５２のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２５６のＣＤＲＬ１、配列番号２５７のＣＤＲＬ２、および配列番号２５８のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２６２のＣＤＲＬ１、配列番号２６３のＣＤＲＬ２、および配列番号２６４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有するか；またはＶＬは、配列番号２６８のＣＤＲＬ１、配列番号２６９のＣＤＲＬ２、および配列番号２７０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有する。
【００１３】
本発明の別の態様では、ヒト化抗体は、ＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＨは、配列番号２３５のＣＤＲＨ１、配列番号２３６のＣＤＲＨ２、および配列番号２３７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ）を有するか；またはＶＨは、配列番号２４１のＣＤＲＨ１、配列番号２４２のＣＤＲＨ２、および配列番号２４３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；またはＶＨは、配列番号２４７のＣＤＲＨ１、配列番号２４８のＣＤＲＨ２、および配列番号２４９のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；またはＶＨは、配列番号２５３のＣＤＲＨ１、配列番号２５４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５５のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；またはＶＨは、配列番号２５９のＣＤＲＨ１、配列番号２６０のＣＤＲＨ２、および配列番号２６１のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；またはＶＨは、配列番号２６５のＣＤＲＨ１、配列番号２６６のＣＤＲＨ２、および配列番号２６７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有するか；またはＶＨは、配列番号２７１のＣＤＲＨ１、配列番号２７２のＣＤＲＨ２、および配列番号２７３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態では、ヒト化抗体は、ＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬは、配列番号２３２のＣＤＲＬ１、配列番号２３３のＣＤＲＬ２、および配列番号２３４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨは、配列番号２３５のＣＤＲＨ１、配列番号２３６のＣＤＲＨ２、および配列番号２３７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２３８のＣＤＲＬ１、配列番号２３９のＣＤＲＬ２、および配列番号２４０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２４１のＣＤＲＨ１、配列番号２４２のＣＤＲＨ２、および配列番号２４３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２４４のＣＤＲＬ１、配列番号２４５のＣＤＲＬ２、および配列番号２４６のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２４７のＣＤＲＨ１、配列番号２４８のＣＤＲＨ２、および配列番号２４９のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２５０のＣＤＲＬ１、配列番号２５１のＣＤＲＬ２、および配列番号２５２のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２５３のＣＤＲＨ１、配列番号２５４のＣＤＲＨ２、および配列番号２５５のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２５６のＣＤＲＬ１、配列番号２５７のＣＤＲＬ２、および配列番号２５８のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２５９のＣＤＲＨ１、配列番号２６０のＣＤＲＨ２、および配列番号２６１のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２６２のＣＤＲＬ１、配列番号２６３のＣＤＲＬ２、および配列番号２６４のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２６５のＣＤＲＨ１、配列番号２６６のＣＤＲＨ２、および配列番号２６７のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する；または抗体はＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、配列番号２６８のＣＤＲＬ１、配列番号２６９のＣＤＲＬ２、および配列番号２７０のＣＤＲＬ３を含む３つのＣＤＲＬを有し、かつ、ＶＨが、配列番号２７１のＣＤＲＨ１、配列番号２７２のＣＤＲＨ２、および配列番号２７３のＣＤＲＨ３を含む３つのＣＤＲＨを有する。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＥＰ３に結合するヒト化抗体であって、配列番号２１６に示される全長軽鎖および配列番号２１７に示される全長重鎖；または配列番号２１８に示される全長軽鎖および配列番号２１９に示される全長重鎖；または配列番号２２０に示される全長軽鎖および配列番号２２１に示される全長重鎖；または配列番号２２２に示される全長軽鎖および配列番号２２３に示される全長重鎖；または配列番号２２４に示される全長軽鎖および配列番号２２５に示される全長重鎖；または配列番号２２４に示される全長軽鎖および配列番号２２６に示される全長重鎖；または配列番号２２７に示される全長軽鎖および配列番号２２８に示される全長重鎖；または配列番号２２９に示される全長軽鎖および配列番号２３０に示される全長重鎖を含むヒト化抗体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、本明細書で開示される抗体を、ペイロードへとコンジュゲートさせた、抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲートも提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３抗体のうちのいずれか１つの重鎖アミノ酸配列または軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を対象とする。別の実施形態では、本発明は、このような核酸を含有するベクターまたはこのような核酸を発現する宿主細胞を対象とする。
【００１８】
本発明の、適合性の抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は一般に、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ［式中、Ａｂは、ＤＰＥＰ３に結合する抗体を含み；Ｌは、任意選択のリンカーであり；Ｄは、薬物であり；ｎは、約１〜約２０の整数である］を含む。特に好ましい実施形態では、Ｄは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣを含む医薬組成物もさらに提供される。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、卵巣がん（例えば、卵巣漿液性癌または卵巣漿液性乳頭状癌）、肺がん、乳がん、および子宮内膜がんなどのがんを処置する方法であって、本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は、がんを処置する方法であって、本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣを投与するステップを含み、被験体へと、少なくとも１つのさらなる治療用部分を投与するステップをさらに含む方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、腫瘍細胞集団における腫瘍始原細胞を低減する方法であって、腫瘍始原細胞と、腫瘍始原細胞以外の腫瘍細胞とを含む腫瘍細胞集団を、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣと接触させる（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）ステップを含み、これにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減する方法も提供する。
【００２２】
本明細書ではさらに、細胞毒素を細胞へと送達する方法であって、細胞を、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣと接触させるステップを含む方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、選択された患者由来異種移植（ＰＤＸ：ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）腫瘍における全トランスクリプトームシーケンシングであって、ＳＯＬｉＤプラットフォーム（図１Ａ）またはＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（図１Ｂ）を使用して解析される全トランスクリプトームシーケンシングにより決定される、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、選択された患者由来異種移植（ＰＤＸ：ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）腫瘍における全トランスクリプトームシーケンシングであって、ＳＯＬｉＤプラットフォーム（図１Ａ）またはＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（図１Ｂ）を使用して解析される全トランスクリプトームシーケンシングにより決定される、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、卵巣ＰＤＸ腫瘍亜型における、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定される、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、多様な腫瘍型を有する患者に由来する全腫瘍検体（黒色ドット）において、または正常組織（白色ドット）において、ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｏｒｉｇｅｎｅアレイにより決定される、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図３】図３は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベースから導出される、卵巣腫瘍、肺腫瘍、および皮膚腫瘍、ならびに正常組織における、ＤＰＥＰ３のｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図４−１】図４は、本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体の多様な特徴であって、アイソタイプ、ＤＰＥＰ３に対するアフィニティー、ならびにＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３のオルソログに対する交差反応性を含む特徴についての表形式の表示を示す図である。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図４−４】同上
【図５Ａ−１】図５Ａ〜５Ｄは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のアミノ酸配列および核酸配列を提示する図である。図５Ａおよび５Ｂは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の、軽鎖可変領域（図５Ａ）および重鎖可変領域（図５Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号２１〜２１５、奇数）を示す図である。図５Ｃは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜２１４、偶数）を示す図である。図５Ｄは、例示的なヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号２１６〜２３０）を示す図である。
【図５Ａ−２】同上
【図５Ａ−３】同上
【図５Ａ−４】同上
【図５Ｂ−１】図５Ａ〜５Ｄは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のアミノ酸配列および核酸配列を提示する図である。図５Ａおよび５Ｂは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の、軽鎖可変領域（図５Ａ）および重鎖可変領域（図５Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号２１〜２１５、奇数）を示す図である。図５Ｃは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜２１４、偶数）を示す図である。図５Ｄは、例示的なヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号２１６〜２３０）を示す図である。
【図５Ｂ−２】同上
【図５Ｂ−３】同上
【図５Ｂ−４】同上
【図５Ｃ−１】図５Ａ〜５Ｄは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のアミノ酸配列および核酸配列を提示する図である。図５Ａおよび５Ｂは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の、軽鎖可変領域（図５Ａ）および重鎖可変領域（図５Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号２１〜２１５、奇数）を示す図である。図５Ｃは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜２１４、偶数）を示す図である。図５Ｄは、例示的なヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号２１６〜２３０）を示す図である。
【図５Ｃ−２】同上
【図５Ｃ−３】同上
【図５Ｃ−４】同上
【図５Ｃ−５】同上
【図５Ｃ−６】同上
【図５Ｃ−７】同上
【図５Ｃ−８】同上
【図５Ｃ−９】同上
【図５Ｃ−１０】同上
【図５Ｃ−１１】同上
【図５Ｃ−１２】同上
【図５Ｃ−１３】同上
【図５Ｄ−１】図５Ａ〜５Ｄは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のアミノ酸配列および核酸配列を提示する図である。図５Ａおよび５Ｂは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の、軽鎖可変領域（図５Ａ）および重鎖可変領域（図５Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号２１〜２１５、奇数）を示す図である。図５Ｃは、例示的なマウス抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜２１４、偶数）を示す図である。図５Ｄは、例示的なヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号２１６〜２３０）を示す図である。
【図５Ｄ−２】同上
【図５Ｅ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｆ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｇ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｈ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｉ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｊ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図５Ｋ】図５Ｅ〜５Ｋは、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体である、ＳＣ３４．２（図５Ｅ）、ＳＣ３４．１１（図５Ｆ）、ＳＣ２７．１４（図５Ｇ）、ＳＣ３４．２５（図５Ｈ）、ＳＣ３４．２８（図Ｉ）、ＳＣ３４．３８（図５Ｊ）、およびＳＣ３４．８７（図５Ｋ）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の、注釈されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従い番号付けされる）であって、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）法を使用して導出したアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、多様なＢＲ  ＰＤＸ腫瘍亜集団およびＯＶ  ＰＤＸ腫瘍亜集団におけるＤＰＥＰ３タンパク質発現を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、フローサイトメトリーを使用して、多数の抗ＤＰＥＰ３抗体が、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に結合する能力を示す図であり、ここで、結果は、ヒストグラムとして示され、黒色の実線は、ＤＰＥＰ３を過剰発現する細胞への、表示の抗体の結合を、アイソタイプ対照（グレーの影）と比較して指し示す。
【図７Ｂ】図７Ｂ〜７Ｄは、特異的抗ＤＰＥＰ３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、アイソタイプ対照を使用する染色（グレーの影）と比較して決定される通り、腫瘍始原細胞（黒色の実線）の表面上のＤＰＥＰ３タンパク質の発現を、卵巣腫瘍細胞集団の３つの亜型における非腫瘍形成性細胞（破線）と比較して示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｂ〜７Ｄは、特異的抗ＤＰＥＰ３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、アイソタイプ対照を使用する染色（グレーの影）と比較して決定される通り、腫瘍始原細胞（黒色の実線）の表面上のＤＰＥＰ３タンパク質の発現を、卵巣腫瘍細胞集団の３つの亜型における非腫瘍形成性細胞（破線）と比較して示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｂ〜７Ｄは、特異的抗ＤＰＥＰ３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、アイソタイプ対照を使用する染色（グレーの影）と比較して決定される通り、腫瘍始原細胞（黒色の実線）の表面上のＤＰＥＰ３タンパク質の発現を、卵巣腫瘍細胞集団の３つの亜型における非腫瘍形成性細胞（破線）と比較して示す図である。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、免疫組織化学検査（図８Ａ）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図８Ｂ）により測定される、高悪性度卵巣漿液性癌についての組織マイクロアレイ内のＤＰＥＰ３の発現を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、免疫組織化学検査（図８Ａ）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図８Ｂ）により測定される、高悪性度卵巣漿液性癌についての組織マイクロアレイ内のＤＰＥＰ３の発現を示す図である。
【図９】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、複数の抗ＤＰＥＰ３−サポリン抗体薬物コンジュゲートが、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へと内部移行し、サポリン細胞毒素の送達を媒介することにより細胞を死滅させる能力を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、部位特異的抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲートについての、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）解析（図１０Ａ）および解析用疎水性相互作用クロマトグラフィー（図１０Ｂ）を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、部位特異的抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲートについての、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）解析（図１０Ａ）および解析用疎水性相互作用クロマトグラフィー（図１０Ｂ）を示す図である。
【図１１】図１１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、複数の抗ＤＰＥＰ３−ＰＢＤ１抗体薬物コンジュゲートが、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へと内部移行し、ＰＢＤ細胞毒素の送達を媒介することにより細胞を死滅させる能力を示す図である。
【図１２】図１２は、抗ＤＰＥＰ３−ＰＢＤ１抗体薬物コンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＤＰＥＰ３を発現する卵巣ＰＤＸ腫瘍（ＯＶ２７ＭＥＴ）の体積を、ＤＰＥＰ３を発現しない卵巣腫瘍（ＯＶ８７ＭＥＴ）と比較して低減する能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、多くの異なる形態で実施されうる。本明細書では、本発明の原理について例示する、本発明の非限定的な例示的実施形態が開示される。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される内容を限定するとはみなさないものとする。本開示の目的では、全ての配列識別受託番号（identifying  sequence  accession  number）は、そうでないことが言及されない限り、ＮＣＢＩ基準配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース内および／またはＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースにおいて見出すことができる。
【００２５】
驚くべきことに、ＤＰＥＰ３は、多数の腫瘍型についての生物学的マーカーであることが見出されており、この関連は、このような腫瘍の処置のために利用することができる。また、ＤＰＥＰ３は、腫瘍形成性細胞と関連し、それらを阻害するかまたは消失させるのに効果的に利用しうることも予測外に見出されている。下記でより詳細に記載される腫瘍形成性細胞は、従来の多くの処置に対する抵抗性を呈示することが公知である。先行技術の教示とは対照的に、開示される化合物および方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服する。
【００２６】
本発明は、抗ＤＰＥＰ３抗体（抗体薬物コンジュゲートを含む）と、様々なＤＰＥＰ３関連がんの予後、診断、治療診断（theragnosis）、処置、および／または防止におけるそれらの使用であって、任意の特定の作用機構または特異的にターゲティングされる細胞構成要素もしくは分子構成要素に関わらない使用とを提供する。
【００２７】
Ｉ  ＤＰＥＰ３生理学
ジペプチダーゼ３（ＤＰＥＰ３；ＭＢＤ３としてもまた公知である）とは、ジペプチダーゼタンパク質のＤＰＥＰファミリーに由来する、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカリング型膜タンパク質であって、多様なジペプチド、ならびにアミド様連結を含有する一部の抗生物質（例えば、ベータ−ラクタムおよびペネム）の加水分解性代謝に関与するタンパク質である。マウスＤＰＥＰ３は、グルタチオン切断生成物である、シスチニル−ビス−グリシンを切断することが示されている（Habibら、ＰＭＩＤ：１２７３８８０６）。代表的なＤＰＥＰ３タンパク質オルソログは、ヒト（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９Ｈ４Ｂ８．２［配列番号４］、ＮＰ＿０７１７５２．３［配列番号５］）、チンパンジー（ＮＰ＿００１２６６９５６）、アカゲザル（ＮＰ＿００１８０９８５）、ラット（ＮＰ＿００１００８３８４［配列番号１０］）、およびマウス（ＮＰ＿０８２２３６［配列番号８］）を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
ヒトでは、ＤＰＥＰ３遺伝子は、第１６染色体上の、約２ｋＢｐにわたる、１０のエクソンであって、類縁の遺伝子であるＤＰＥＰ２との頭尾クラスター（head  to  tail  cluster）内のエクソンからなり、タンパク質レベルで約７５％の同一性を共有する。ＤＰＥＰ３遺伝子座の転写からは、２つの公知のＲＮＡ転写物である、５１３アミノ酸のプレタンパク質（ＮＰ＿０７１７５２．３）をコードする、１．７６ｋＢｐ（ＮＭ＿０２２３５７）の、長い成熟転写物と、５１２アミノ酸のプレタンパク質（ＮＰ＿００１１２３２３０）をコードする、１．７５ｋＢｐ（ＮＭ＿００１２９７５８）の、選択的スプライシングされた短い成熟転写物とがもたらされる。２つの長い転写物に加えてまた、ＤＰＥＰ３プレタンパク質の代替的な変化形であって、短いリーダー配列を有し、４８８アミノ酸を含む変化形ももたらされている（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９Ｈ４Ｂ８．２、配列番号４）。長い５１２アミノ酸のアイソフォームおよび５１３アミノ酸のアイソフォームに関しては、提起されるリーダー配列は、約６０アミノ酸残基を含むが、短い４８８アミノ酸のＤＰＥＰ３分子では、リーダー配列は、３５アミノ酸を含む。各場合には、プレタンパク質の分泌シグナルペプチド（６０または３５アミノ酸）が除去されて、４５３アミノ酸の成熟タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９Ｈ４Ｂ８．２、配列番号３）がもたらされ、次いで、これが、さらにプロセシングされて、最後の２５アミノ酸が除去され、成熟タンパク質が、ＧＰＩアンカーを介して、細胞膜へと連結される。成熟ＤＰＥＰ３の残りの細胞外ドメインは、４２８アミノ酸（配列番号３のＡ１〜Ｓ４２８）を含む。そうでないことが指し示されない限りにおいて、ＤＰＥＰ３抗原の全ての残基（例えば、エピトープ成分について）の番号付けは、配列番号３に基づく。
【００２９】
ＤＰＥＰ３タンパク質とは、それらの全てが、酵素機能のために亜鉛共因子を必要とする、ペプチダーゼＭ１９ファミリーのメンバーである。少なくとも、マウス精巣生殖細胞において、触媒性複合体が、ジスルフィド連結されたホモ二量体として形成される（Yoshitakeら、２０１１年：ＰＭＩＤ：２１７２４２６６）。本明細書で示される場合以外では、ヒトＤＰＥＰ３タンパク質の機能および発現についての情報は限定されている。マウスＤＰＥＰ３タンパク質発現は、精巣に限定されることが報告されており、グルタチオン切断生成物である、シスチニル−ビス−グリシンを切断することが示されている（Habibら、ＰＭＩＤ：１２７３８８０６）。ＤＰＥＰ３とがんとの機能的な連関または関連について、本発明者らに公知の報告は公表されていない。
【００３０】
ＩＩ  がん幹細胞
現行のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性細胞とを含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生する能力を有さず、免疫不全状態のマウスへと、過剰細胞数で移植する場合でもなお、腫瘍を増殖可能な形で形成することが不可能である。本明細書ではまた「腫瘍始原細胞」（ＴＩＣ）とも称し、腫瘍の細胞集団のうちの０．１〜４０％（より典型的には０．１〜１０％）を占める腫瘍形成性細胞は、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）および腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）として互換的に言及される、両方の腫瘍永続細胞（ＴＰＣ）を包含する。
【００３１】
ＣＳＣは、正常組織における細胞階層を支える正常幹細胞と同様に、多系列分化の能力を維持しながら、無際限に自己複製することが可能である。ＣＳＣは、腫瘍形成性子孫細胞および非腫瘍形成性子孫細胞の両方を発生させることが可能であり、継代単離と、単離された少数のＣＳＣの、免疫不全状態のマウスへの継代移植とにより裏付けられる通り、親腫瘍の異質性の細胞組成を完全に再現しうる。
【００３２】
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、初代移植片における腫瘍の成長を促進する能力を有する。しかし、ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣとは異なり、親腫瘍の細胞異質性を再現することが可能ではなく、少数の高度に精製されたＴＰｒｏｇの、免疫不全状態のマウスへの継代移植により裏付けられる通り、有限数の細胞分裂だけが可能なことが典型的であるため、後代の移植片における腫瘍形成の再開においてそれほど効率的でもない。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇおよび後期ＴＰｒｏｇへと分けることもでき、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞アーキテクチャーを再現するそれらの異なる能力により識別することができる。いずれも、腫瘍を、ＣＳＣと同程度に再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の特徴を再現する能力が、後期ＴＰｒｏｇより大きい。前出の差異にも拘らず、一部のＴＰｒｏｇ集団は、まれな機会には、通常はＣＳＣに帰せられる自己再生能を獲得し、それら自体がＣＳＣとなる場合があることが示されている。
【００３３】
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期ＴＰｒｏｇおよび後期ＴＰｒｏｇの両方）；および（ｉｉ）腫瘍浸潤細胞、例えば、ＣＳＣに由来し得、バルクの腫瘍（the  bulk  of  a  tumor）を含むことが典型的な、線維芽細胞／間質細胞、内皮細胞、および造血細胞など
の非腫瘍形成性細胞よりも高い腫瘍形成性を呈示し、比較するとより静止状態である。従来の治療およびレジメンが、大部分、腫瘍を減量し、かつ、迅速に増殖している細胞を攻撃するようにデザインされていることを踏まえると、ＣＳＣは、従来の治療およびレジメンに対して、より速く増殖しているＴＰｒｏｇおよび、非腫瘍形成性細胞など、他のバルク腫瘍細胞集団より抵抗性が大きい。ＣＳＣを従来の治療に対して比較的化学療法抵抗性とする他の特徴は、多剤抵抗性輸送体の発現の増加、ＤＮＡ修復機構の増強、および抗アポトーシス性遺伝子の発現である。標準的な化学療法では、持続的な腫瘍の成長および再発を実際に促進するＣＳＣを標的としないため、ＣＳＣにおけるこれらの特性は、進行期の新生物を伴う患者の大半には長期にわたる利益を確実にする、標準的な腫瘍処置レジメンの失敗の鍵となる原因を構成する。
【００３４】
驚くべきことに、ＤＰＥＰ３の発現は、多様な腫瘍形成性細胞集団と関連することが発見された。本発明は、腫瘍形成性細胞をターゲティングするために特に有用であり得、腫瘍形成性細胞をサイレンシングするか、感受性にするか、中和するか、頻度を低減するか、遮断するか、抑止するか、これに干渉するか、これを減少させるか、妨げるか、抑制するか、制御するか、枯渇させるか、和らげるか、これに影響する（mediate）か、減らすか、再プログラム化するか、消失させるか、または他の形で阻害し（まとめて、「阻害し」）、これにより、増殖性障害（例えば、がん）の処置、管理、および／または防止を容易とするのに使用しうる抗ＤＰＥＰ３抗体を提供する。有利なことに、本発明の新規の抗ＤＰＥＰ３抗体は、好ましくは、被験体へと投与されると、ＤＰＥＰ３決定基の形態（例えば、表現型の決定基または遺伝子型の決定基）に関わらず、腫瘍形成性細胞の頻度または腫瘍形成性を低減するように選択することができる。腫瘍形成性細胞頻度の低減は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害または根絶；（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大、または再発を制御すること；（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持、または増殖を中断させることの結果として生じる場合もあり；（ｉｖ）腫瘍形成性細胞の生存、再生、および／または転移を他の形で妨げることにより生じる場合もある。一部の実施形態では、腫瘍形成性細胞の阻害は、１または複数の生理学的経路の変化の結果として生じうる。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害によるのであれ、それらの潜在力の修飾（例えば、分化の誘導またはニッチの破壊による）によるのであれ、腫瘍形成性細胞が、腫瘍環境または他の細胞に影響を及ぼす能力に他の形で干渉することによるのであれ、腫瘍形成、腫瘍の維持および／または転移ならびに再発を阻害することにより、ＤＰＥＰ３関連障害のより有効な処置を可能とする。
【００３５】
腫瘍形成性細胞の頻度の低減を評価するのに使用しうる方法は、サイトメトリー解析または免疫組織化学解析、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を介する方法（Dyllaら、２００８年、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２；お
よびHoeyら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）を含むがこれらに限定されない。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析は、分画された腫瘍細胞または分画されていない腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置された腫瘍および非処置の腫瘍に由来する）を、コロニー形成を促進する固体媒体上で培養し、成長するコロニーをカウントおよび特徴づけすることにより実施することができる。代替的に、腫瘍細胞を、液体媒体を含有するウェルを伴うプレートへと系列希釈し、各ウェルを、コロニー形成について、陽性または陰性と、接種後任意の時点においてであるが、好ましくは、接種の１０日超後にスコア付けすることもできる。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈は、非処置対照または選択された治療剤へと曝露された腫瘍からの腫瘍細胞を、系列希釈して免疫不全状態のマウスへと移植し、その後、各マウスを、腫瘍形成について、陽性または陰性としてスコア付けすることにより実施する。スコア付けは、植え込まれた腫瘍が検出可能となった後の任意の時点になされ得るが、移植の６０日後またはこれを超える日数後に行うことが好ましい。腫瘍形成性細胞の頻度を決定する限界希釈実験の結果についての解析は、ポアソン分布統計を使用して、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍を発生させる能力の如何など、所定の明確なイベントの頻度を評価して行うことが好ましい（Fazekasら、１９８２年、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）。
【００３８】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学検査はまた、腫瘍形成性細胞頻度を決定するのにも使用することができる。いずれの技法も、当技術分野で認知された細胞表面タンパク質または細胞表面マーカーであって、腫瘍形成性細胞について富化されることが公知の細胞表面タンパク質または細胞表面マーカーに結合する、１または複数の抗体または試薬（ＷＯ２０１２／０３１２８０を参照されたい）を用いる。当技術分野で公知の通り、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ））はまた、腫瘍形成性細胞を含む多様な細胞集団を特徴付けるか、単離するか、精製するか、これらについて富化するか、これらについて分取するのにも使用することができる。フローサイトメトリーでは、混合された細胞集団を懸濁させた流体の流れを、１秒間当たり最大数千個の粒子の物理的特徴および／または化学的特徴を測定することが可能な電気的検出装置に通すことにより腫瘍形成性細胞レベルを測定する。免疫組織化学検査は、組織試料を、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する、標識された抗体または試薬で染色することにより、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける（例えば、組織切片において）腫瘍形成性細胞の視覚化を可能とするという点で、さらなる情報をもたらす。
【００３９】
本発明の抗体は、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介式区分、またはＦＡＣＳなどの方法により、腫瘍形成性細胞の集団または亜集団を同定するか、特徴づけするか、モニタリングするか、単離するか、区分するか、または富化するために有用でありうる。ＦＡＣＳは、特異的細胞表面マーカーに基づき、９９．５％を超える純度で細胞亜集団を単離するのに使用される、信頼できる方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴づけおよび操作のための他の適合性の技法は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、同１２／６６９，１３６、および同１２／７５７，６４９において確かめることができる。
【００４０】
ＣＳＣ集団と関連し、ＣＳＣを単離するかまたは特徴付けるのに使用されているマーカーを下記に列挙する：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ｅｅｄ、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、Ｎａｎｏｇ、ＮＢ８４、ネスチン、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、オンコスタチンＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｓｍａｒｃＡ５、Ｓｏｘ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、トランスフェリン受容体、ＴｒｋＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１、およびβ−カテニン。例えば、Schulenburgら
、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、同２００８／０１７５８７０、同２０１０／０２７５２８０、同２０１０／０１６２４１６、および同２０１１／００２０２２１を参照されたい。
【００４１】
同様に、ある特定の腫瘍型のＣＳＣと関連する細胞表面表現型の非限定的な例は、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋のほか、当技術分野で公知の、他のＣＳＣ表面表現型を含む。例えば、Schulenburgら、２０１０年、前掲；Visvaderら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３を参照されたい。本発明に関して特に興味深いのは、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型を含むＣＳＣ調製物である。
【００４２】
マーカーまたはマーカー表現型に適用される場合の「陽性」、「低（ｌｏｗ）」、および「陰性」という発現レベルについては、以下の通りに定義する。本明細書では、陰性の発現（すなわち、「−」）を伴う細胞を、さらなる蛍光発光のチャネル内で他の目的のタンパク質についても標識する、完全な抗体染色カクテルの存在下で、蛍光チャネルにおける発現が、アイソタイプ対照抗体により観察される発現の第９５百分位数未満であるか、またはこれと等しい細胞と定義する。当業者は、陰性イベントを定義するためのこの手順を、「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ」染色または「ＦＭＯ」染色と称することを十分に理解する。本明細書では、上記で記載したＦＭＯ染色手順を使用する発現が、アイソタイプ対照抗体により観察される発現の第９５百分位数を超える細胞を、「陽性」（すなわち、「＋」）と定義する。本明細書で定義される通り、「陽性」と広く定義される細胞の多様な集団が存在する。上記で記載した通り、観察される抗原の平均発現が、ＦＭＯ染色を使用してアイソタイプ対照抗体により決定される第９５百分位数を上回るなら、細胞を、陽性と定義する。観察される平均発現が、ＦＭＯ染色により決定される第９５百分位数を上回り、かつ、第９５百分位数から１標準偏差以内にあれば、陽性細胞は、発現が低度な細胞（すなわち、「ｌｏ」）と称することができる。代替的に、観察される平均発現が、ＦＭＯ染色により決定される第９５百分位数を上回り、かつ、第９５百分位数を、１標準偏差を超えて上回るなら、陽性細胞は、発現が高度な細胞（すなわち、「ｈｉ」）と称することができる。他の実施形態では、第９９百分位数を、陰性ＦＭＯ染色と陽性ＦＭＯ染色との間の分界点として使用しうると好ましく、特に好ましい実施形態では、百分位数は、９９％を超える場合もある。
【００４３】
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋マーカー表現型およびすぐ上で例示されたマーカー表現型を、標準的なフローサイトメトリー解析および細胞分取法と共に使用して、ＴＩＣ細胞もしくはＴＩＣ細胞集団および／またはＴＰＣ細胞もしくはＴＰＣ細胞集団を、さらなる解析のために、特徴付けるか、単離するか、精製するか、または富化することができる。
【００４４】
したがって、本発明の抗体が腫瘍形成性細胞の頻度を低減する能力は、上記で記載した技法およびマーカーを使用して決定することができる。場合によって、抗ＤＰＥＰ３抗体は、腫瘍形成性細胞の頻度を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、なおまたは３５％低減しうる。他の実施形態では、腫瘍形成性細胞の頻度の低減は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のオーダーでありうる。ある特定の実施形態では、開示される化合物は、腫瘍形成性細胞の頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、なおまたは９５％低減しうる。腫瘍形成性細胞の頻度の任意の低減は、新生物の腫瘍形成性、永続性、再発、および侵襲性の対応する低減を結果としてもたらす可能性があることが十分に理解される。
【００４５】
ＩＩＩ  抗体
Ａ．抗体の構造
許容された用語法および番号付けシステムを含む抗体および変異体ならびにこれらの誘導体については、例えば、Abbasら（２０１０年）、「Cellular  and  Molecular  Immunology」６版、W.B.  Saunders  Company；またはMurpheyら（２０１１年）、「Janeway's  Immunobiology」、８版、Garland  Scienceにおいて広範に記載されている。
【００４６】
本明細書で使用される「抗体」または「無傷抗体」とは、共有結合的ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用により併せて保持された、２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を指すことが典型的である。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）からなる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域を含み、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体の場合、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と称する３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは、第４のドメインであるＣＨ４を有する）。ＩｇＧクラス、ＩｇＡクラス、およびＩｇＤクラスでは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとは、プロリンおよびシステインに富む、可変長（様々なＩｇＧサブクラスでは、約１０〜約６０アミノ酸）のセグメントである、可撓性のヒンジ領域により隔てられている。軽鎖および重鎖のいずれにおける可変ドメインも、約１２またはこれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域により定常ドメインへと結合されており、重鎖はまた、さらなる約１０アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対合システイン残基により形成される、鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。
【００４７】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および霊長動物化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体、組換え作製抗体、イントラボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそれらの変異体を含む合成抗体、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）などの免疫特異的抗体断片、ならびにＦｃ融合および他の改変を含むこれらの誘導体、ならびに、それが、決定基との優先的会合または結合を呈示する限りにおいて、他の任意の免疫反応性分子を含む。さらに、文脈上の制約によりそうでないことが指示されない限りにおいて、用語は、抗体の全てのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）および全てのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）もさらに含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμにより表記されることが典型的である。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明らかに識別可能な２つの種類のうちの１つへと割り当てることができる。
【００４８】
抗体の可変ドメインは、抗体によって、アミノ酸組成の大幅な変動を示し、主に、抗原の認識および抗原への結合に関与する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷のＩｇＧ抗体が、２つの結合性部位を有する（すなわち、ＩｇＧ抗体は、二価である）ように、抗体結合性部位を形成する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、可変性が極めて大きな３つの領域であって、超可変領域、またはより一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称し、４つのそれほど可変でない領域であり、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知の領域により枠づけられ、隔てられた領域を含む。ＶＨ領域とＶＬ領域との間の非共有結合的会合により、抗体の２つの抗原結合性部位のうちの１つを含有するＦｖ断片（「可変断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）」を表わして）が形成される。遺伝子操作により得ることができるｓｃＦｖ断片（単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を表わして）は、単一のポリペプチド鎖内で、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とをペプチドリンカーで隔てて会合させる。
【００４９】
本明細書で使用される、アミノ酸の、各ドメイン、各フレームワーク領域、および各ＣＤＲへの割当ては、そうでないことが言及されない限り、Kabatら（１９９１年）、「Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest」（５版）、US  Dept.  of  Health  and  Human  Services、PHS、NIH、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Chothiaら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Chothiaら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；MacCallumら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはDubel編（２００７年）、「Handbook  of  Therapeutic  Antibodies」、３版、Wily-VCH  Verlag  GmbH  and  Co.またはAbM(Oxford  Molecular/MSI  Pharmacopia)により提示されている番号付けスキームのうちの１つに準拠しうる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（「Ｃｏｎｔａｃｔ」としても知られている）およびＡｂＭにより定義されるＣＤＲであって、Ａｂｙｓｉｓウェブサイトのデータベース（後掲）から得られるＣＤＲを含むアミノ酸残基を、下記に示す。
【表１】
2017500028.tif 000002
【００５０】
抗体配列内の可変領域およびＣＤＲは、当技術分野で開発された一般的規則（例えば、Kabatによる番号付けシステムなど、上記で示したような）に従い同定することもでき
、配列を、公知の可変領域のデータベースに照らしてアライメントすることにより同定することもできる。これらの領域を同定するための方法については、KontermannおよびDubel編、「Antibody  Engineering」、Springer、New  York、NY、２００１年；およびDinarelloら、「Current  Protocols  in  Immunology」、John  Wiley  and  Sons  Inc.、Hoboken、NJ、２０００年において記載されている。抗体配列の例示的なデータベースにつ
いては、Retterら、Nucl.  Acids  Res.、３３巻（データベース特集号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４頁（２００５年）において記載されている通り、www.bioinf.org.uk/abs（Department  of  Biochemistry  &  Molecular  Biology  University  College  London、London、EnglandのA.C.  Martinにより維持されている）における「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト、およびwww.vbase2.orgにおけるＶＢＡＳＥ２ウェブサイトにおいて記載されており、これらを介してアクセスすることができる。配列は、Kabat、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏ
ｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）による配列データを、ＰＤＢによる構造データと統合する、Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析することが好ましい。Dr.  Andrew  C.  R.  Martinによる著書の章である「Protein  Sequence  and  Structure  Analysis  of  Antibody  Variable  Domains」、「Antibody  Engineering  Lab  Manual」（
ウェブサイトbioinforg.uk/absでもまた入手可能な、Duebel,  S.およびKontermann,  R.編、Springer-Verlag、Heidelberg、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７）
を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従い使用されうるＣＤＲを同定するために開発された一般的規則をさらに含む。本明細書に添付される図５Ｅ〜図５Ｋは、いくつかの例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域の注釈におけるこのような解析の結果を示している。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で示される全てのＣＤＲは、Kabatらに準拠す
るＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトに従い導出される。
【００５１】
本発明で論じられる重鎖定常領域のアミノ酸位置について、番号付けは、配列決定された最初のヒトＩｇＧ１であることが報告されている、骨髄腫タンパク質であるＥｕのアミノ酸配列について記載する、Edelmanら、１９６９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA
、６３巻（１号）：７８〜８５頁において最初に記載された、Ｅｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎによるＥｕインデックスはまた、Kabatら、１９９１年（前掲）において
も示されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」または「ＥＵインデックス」という用語は、Kabatら、１９９１年（前掲）で示される、ＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１であるＥｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に使用される番号付けシステムも、Kabatら（前掲）において同様に示されている。本発明に適合性の、例示的なカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を、すぐ下に示す。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：１）。
【００５２】
同様に、本発明に適合性の、例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列も、すぐ下に示す。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号：２）。
【００５３】
開示される定常領域配列またはこれらの変異体（variation）もしくは誘導体は、それ
自体として使用される場合もあり、本発明の抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣへと組み込まれる場合もある、全長抗体をもたらすように、標準的な分子生物学的技法を使用して、開示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域と作動可能に会合させることができる。
【００５４】
より一般に、本発明の抗体または免疫グロブリンは、関与性の決定基を特異的に認識するかまたはこれと会合する、任意の抗体から作り出すことができる。本明細書で使用される「決定基」または「標的」とは、特定の細胞、細胞集団、または組織と同定可能な形で関連するか、あるいは特定の細胞内もしくは細胞上、特定の細胞集団内もしくは細胞集団上、または特定の組織内もしくは組織上で特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー、または因子を意味する。決定基または標的は、形態的性格の場合もあり、機能的性格の場合もあり、生化学的性格の場合もあり、表現型であることが好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、決定基は、特異的細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特異点における細胞または特定のニッチにおける細胞）が差次的に発現する（過剰発現または過少発現する）タンパク質である。本発明の目的では、決定基は、異常ながん細胞上で差次的に発現することが好ましく、ＤＰＥＰ３タンパク質、あるいはそのスプライス変異体、アイソフォーム、相同体もしくはファミリーメンバー、またはその特異的ドメイン、特異的領域、もしくは特異的エピトープのうちのいずれかを含みうる。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原決定基」、または「免疫原」とは、免疫応答性動物へと導入されると免疫応答を刺激することが可能であり、免疫応答により産生される抗体により認識される、任意のタンパク質またはその任意の断片、領域、もしくはドメインを意味する。本明細書で想定されるＤＰＥＰ３決定基の存在または非存在を使用して、細胞、細胞亜集団、または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞、またはＣＳＣ）を同定することができる。
【００５５】
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋またはジスルフィド結合：鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合が存在する。当技術分野で周知の通り、鎖間ジスルフィド結合の位置および数は、免疫グロブリンのクラスおよび種に従い変化する。本発明は、抗体の任意の特定のクラスまたはサブクラスに限定されるわけではないが、本開示全体で、ＩｇＧ１免疫グロブリンを、例示的な目的のために使用するものとする。野生型ＩｇＧ１分子内には、１２の鎖内ジスルフィド結合（各重鎖上に４つずつ、および各軽鎖上に２つずつの）および、４つの鎖間ジスルフィド結合が存在する。鎖内ジスルフィド結合は一般に、いくぶん保護されており、鎖間結合よりも還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面上に配置されており、溶媒に接触可能であり、通例、比較的容易に還元される。重鎖間には２つの鎖間ジスルフィド結合が存在し、各重鎖からそのそれぞれの軽鎖へは、１つの鎖間ジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に不可欠ではないことが裏付けられている。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、Ｆａｂの動きを容易とする可撓性と共に、構造的支持をもたらす、鎖間ジスルフィド結合を形成する、重鎖におけるシステインを含有する。重鎖／軽鎖ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合が、残基Ｃ２２６およびＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に配置されるのに対し、ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖（重鎖／軽鎖）との間のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上部ヒンジ領域におけるＣ２２０との間で形成される。
【００５６】
Ｂ．抗体の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々な方法を使用して産生することができる。
【００５７】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
当技術分野では、多様な宿主動物によるポリクローナル抗体の産生が周知である（例えば、HarlowおよびLane（編）、「Antibodies:  A  Laboratory  Manual」、（１９８８年）、CSH  Press；ならびにHarlowら（１９８９年）、「Antibodies」、NY、Cold  Spring  Harbor  Pressを参照されたい）。ポリクローナル抗体を作製するために、免疫応答性動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類等）を抗原タンパク質または細胞または抗原タンパク質を含む調製物で免疫する。ある期間の後で、ポリクローナル抗体含有血清は、動物から採血するか、またはこれを屠殺することにより得る。血清は、動物から得られた形態で使用することもでき、免疫グロブリン画分または単離抗体調製物をもたらすように、抗体を、部分的または完全に精製することもできる。
【００５８】
抗原の任意の形態、または抗原を含有する細胞もしくは調製物を使用して、決定基に特異的な抗体を生成することができる。「抗原」という用語は、広義で使用され、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメイン、または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全体を含む、選択された標的の任意の免疫原性断片または決定基を含みうる。抗原は、単離全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、それらの表面上で抗原の少なくとも一部を発現する細胞による免疫）、または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分だけによる免疫）でありうる。抗原は、遺伝子改変細胞内で産生することができる。上述の抗原のうちのいずれかを、単独で使用することもでき、当技術分野で公知の、１または複数の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用することもできる。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの場合もあり、非ゲノムＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）の場合もあり、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしうる。アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、およびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターを含むがこれらに限定されない、任意のベクターを用いて、細胞を形質転換することができ、この細胞において抗原を発現する。
【００５９】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体の使用を想定する。「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量で存在しうる可能な変異（例えば、天然に存在する変異）を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である。
【００６０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらのいくらかの組合せを含む、多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、An,  Zhigiang（編）、「Therapeutic  Monoclonal  Antibodies:  From  Bench  to  Clinic」、John  Wiley  and  Sons、１版、２００９年；Shireら（編）、「Current  Trends  in  Monoclonal  Antibody  Development  and  Manufacturing」、Springer  Science  +  Business  Media  LLC、１版、２
０１０年；Harlowら、「Antibodies:  A  Laboratory  Manual」、Cold  Spring  Harbor
Laboratory  Press、２版、１９８８年；Hammerlingら、「Monoclonal  Antibodies  and  T-Cell  Hybridomas」、５６３〜６８１頁（Elsevier、N.Y.、１９８１年）においてより詳細に記載されている、ハイブリドーマ技法および生化学的技法および遺伝子操作技法などの技法を使用して産生することができる。決定基に特異的に結合する、多数のモノクローナル抗体の生成後、特に適切な抗体は、例えば、決定基に対するアフィニティーまたは内部移行の速度に基づく、多様なスクリーニングプロセスにより選択することができる。特に好ましい実施形態では、本明細書で記載される通りに産生されたモノクローナル抗体は、供給源抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的に対するアフィニティーを改善し、細胞培養物におけるその産生を改善し、そのｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫原性を低減し、多重特異性構築物を創出するように、改変することもできる。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングについてのより詳細な記載は、下記および付属の実施例で提示する。
【００６１】
３．ヒト抗体
抗体は、完全ヒト抗体を含みうる。「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生される抗体および／または下記で記載されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を指す。
【００６２】
一実施形態では、組換えヒト抗体は、ファージディスプレイを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。一実施形態では、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ  ｃＤＮＡおよびヒトＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成した、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーである。
【００６３】
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウスへと導入することによっても作製することができる。チャレンジすると、遺伝子再配列、アセンブリー、および完全ヒト抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトにおいて認められるものと酷似する抗体の生成が観察される。この手法は、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；同５，５４５，８０６；同５，５６９，８２５；同５，６２５，１２６；同５，６３３，４２５；同５，６６１，０１６；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および同６，１５０，５８４；ならびにLonbergおよびHuszar、１９９５年、ＰＭＩＤ：７４９４１０９において記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このようなＢリンパ球は、新生物性障害を患う個体から回収することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫することもできる）の不死化を介して調製することもできる。例えば、Coleら、「Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy」、Alan  R.  Liss、７７頁（１９８５年）；Boernerら、１９９１年、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。他のモノクローナル抗体と同様に、このようなヒト抗体は起源抗体として使用され得る。
【００６４】
４．導出抗体
上記で記載した通りに、供給源抗体を生成し、選択し、単離したら、それらをさらに変化させて、薬学的特徴（pharmaceutical  characteristic）が改善された抗ＤＰＥＰ３抗体をもたらすことができる。供給源抗体は、所望の治療特性を有する導出抗体（derived  antibody）をもたらすように、公知の分子操作技法を使用して、改変するか、または変化させることが好ましい。
【００６５】
４．１  キメラ抗体およびヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、ＤＰＥＰ３に免疫特異的に結合し、本開示の目的では、「供給源」抗体と考えられうる、マウスモノクローナル抗体を含む。選択された実施形態では、本発明に適合性の抗体は、供給源抗体の定常領域および／または抗原結合性アミノ酸配列の任意選択の改変により、このような「供給源」抗体から導出することができる。ある特定の実施形態では、供給源抗体内の選択されたアミノ酸を、欠失、変異、置換、組込み、または組合せにより変化させる場合、抗体は、供給源抗体から「導出」される。別の実施形態では、「導出」抗体は、供給源抗体の断片（例えば、１もしくは複数のＣＤＲまたは重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体）を、派生抗体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）をもたらすように、アクセプター抗体配列と組み合わせるか、またはアクセプター抗体配列へと組み込んだ抗体である。これらの「導出」抗体は、下記で記載される標準的な分子生物学的技法を使用して、例えば、決定基に対するアフィニティーを改善するか；抗体の安定性を改善するか；細胞培養における産生および収率を改善するか；  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫原性を低減するか；毒性を低減するか；活性部分のコンジュゲーションを容易とするか；または多重特異性抗体を創出するなどの目的で生成することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはＰＥＧ化）により、供給源抗体から導出することもできる。
【００６６】
一実施形態では、本発明のキメラ抗体は、少なくとも２つの異なる種または抗体のクラスに由来するタンパク質セグメントであって、共有結合的に結合されたタンパク質セグメントから導出されたキメラ抗体を含む。「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、鎖(複数可)の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内、ならびにこのような抗体の断片における対応する配列と同一または相同である構築物を対象とする（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Morrisonら、１９８４年、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。一部の好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域に作動可能に連結された、選択されたマウス重鎖可変領域およびマウス軽鎖可変領域の全てまたは大半を含みうる。他の特に好ましい実施形態では、抗ＤＰＥＰ３抗体は、本明細書で開示されるマウス抗体から「導出」することができる。
【００６７】
他の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属するが、抗体の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体に由来する「ＣＤＲグラフト」抗体である。ヒトにおける使用のために、１または複数の選択された齧歯動物ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）を、ヒトアクセプター抗体へとグラフトし、ヒト抗体の天然に存在するＣＤＲのうちの１または複数を置きかえることができる。これらの構築物は一般に、被験体による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、完全な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）をもたらす利点を有する。特に好ましい実施形態では、ＣＤＲグラフト抗体は、マウスから得られた１または複数のＣＤＲであって、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたＣＤＲを含む。
【００６８】
「ヒト化」抗体は、ＣＤＲグラフト抗体と類似している。本明細書で使用される「ヒト化」抗体とは、１または複数の非ヒト抗体（ドナー抗体または供給源抗体）から導出された１または複数のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、レシピエントヒト抗体の可変領域の１または複数のＦＲ内の残基を、非ヒト種のドナー抗体に由来する、対応する残基で置きかえたヒト化抗体へと、「復帰変異」を導入することができる。このような復帰変異を使用して、グラフトされたＣＤＲ(複数可)の適切な三次元構造を維持し、これにより、アフィニティーおよび抗体の安定性を改善する一助とすることができる。限定せずに述べると、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物を含む、多様なドナー種に由来する抗体を使用することができる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに精緻化するように、レシピエント抗体またはドナー抗体で見出されない、新たな残基を含みうる。本発明に適合性のＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体は、下記の実施例８で示される通りに提供される。
【００６９】
当技術分野で認知された多様な技法を使用して、本発明に従うヒト化構築物を提供するのに、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するのかを決定することができる。適合性のヒト生殖細胞系列配列の編集、およびそれらのアクセプター配列としての適性を決定する方法については、例えば、それらの各々がその全体において本明細書に組み込まれる、Tomlinson,  I.  A.ら（１９９２年）、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：７７６〜７９８頁；Cook,  G.  P.ら（１９９５年）、Immunol.  Today、１６巻：２３７〜２４２頁；Chothia,  D.ら（１９９２年）、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：７９９〜８１７頁；およびTomlinsonら（１９９５年）、EMBO  J、１４巻：４６２８〜４６３８頁において開示されている。また、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供する、Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリー（ＶＢＡＳＥ２：Retterら、Nucleic  Acid  Res.、３３巻；６７１〜６７４頁、２００５年）（Tomlinson,  I.  A.ら、MRC  Centre  for  Protein  Engineering、Cambridge、UKにより編集されている）も、適合性のアクセプター配列を同定するのに使用することができる。加えて、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４において記載されている、ヒトコンセンサスフレームワーク配列もまた、本教示に従い使用されうる、適合性のアクセプター配列であることが判明し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、供給源抗体およびアクセプター抗体のＣＤＲカノニカル構造についての解析と並び、マウス供給源フレームワーク配列との相同性に基づき選択される。次いで、当技術分野で認知された技法を使用して、導出抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の導出配列を合成することができる。
【００７０】
例を目的として述べると、ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体ならびに関連する方法については、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および同５，６９３，７６２において記載されている。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、１９８６年、ＰＭＩＤ：３７１３８３１；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および同７，０８７，４０９を参照されたい。
【００７１】
ＣＤＲグラフト抗体可変領域またはヒト化抗体可変領域の、ヒトアクセプター可変領域に照らした配列同一性または配列相同性は、本明細書で論じられる通りに決定することができ、そのようなものとして測定される場合、好ましくは、少なくとも６０％または６５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９３％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を有する、別のアミノ酸残基で置換するアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはこれを超えるアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度を、置換の保存的性格について補正するように、上方に調整することができる。
【００７２】
付属の図５Ａおよび５Ｂで提示される、注釈を施されたＣＤＲ配列およびフレームワーク配列は、所有権のあるＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに準拠して定義されることが十分に理解される。しかし、本明細書で論じられ、図５Ｅ〜５Ｋで示される通り、当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ、またはＭａｃＣａｌｌｕｍらのほか、Ｋａｂａｔらによっても提示される定義に従い、ＣＤＲをたやすく同定しうる。そのようなものとして、上記のシステムのうちのいずれかに従い導出される１または複数のＣＤＲを含む、抗ＤＰＥＰ３ヒト化抗体は、明確に本発明の範囲内に入る。
【００７３】
４．２  部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒素または他の抗がん剤とのコンジュゲーションを容易とするように操作することができる（下記でより詳細に論じられる）。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製物は、細胞毒素の抗体上の位置および薬物対抗体比（ＤＡＲ）に照らしたＡＤＣ分子の均質な集団を含むと有利である。本開示に基づけば、当業者は、本明細書で記載される部位特異的に操作された構築物をたやすく作り出すことができる。本明細書で使用される「部位特異的抗体」または「部位特異的構築物」とは、重鎖内または軽鎖における少なくとも１つのアミノ酸を、少なくとも１つの遊離システインをもたらすように、欠失させるか、変化させるか、または置換した（好ましくは別のアミノ酸で）、抗体またはその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」とは、部位特異的抗体と、不対合システイン(複数可)へとコンジュゲートさせた少なくとも１つの細胞毒素または他の化合物とを含むＡＤＣを意味するように理解するものとする。ある特定の実施形態では、不対合システイン残基は、不対合鎖内残基を含む。他の好ましい実施形態では、遊離システイン残基は、不対合鎖間システイン残基を含む。操作抗体は、多様なアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤの抗体であることが可能であり、これらのクラス内で、抗体は、多様なサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗体でありうる。ＩｇＧ構築物について、抗体の軽鎖は、各々が、好ましい実施形態では、ＩｇＧ１重鎖内のＣ２２０残基の欠如に起因して不対合でありうる、Ｃ２１４を組み込んでいるカッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプのいずれかを含みうる。
【００７４】
一実施形態では、操作抗体は、鎖内システイン残基または鎖間システイン残基の、少なくとも１つのアミノ酸の欠失または置換を含む。本明細書で使用される「鎖間システイン残基」が、抗体の軽鎖と重鎖との間、または抗体の２つの重鎖の間の、天然のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を意味するのに対し、「鎖内システイン残基」とは、同じ重鎖内または同じ軽鎖内で別のシステインと天然で対合したシステイン残基である。一実施形態では、欠失させるかまたは置換した鎖間システイン残基は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与する。別の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合に関与する。典型的な実施形態では、軽鎖が、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと対合し、１つの重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、相補性重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと対合する、抗体の相補性構造のために、軽鎖内または重鎖内の単一のシステインが変異または欠失すれば、操作抗体内に、２つの不対合システイン残基が結果としてもたらされる。
【００７５】
一部の実施形態では、鎖間システイン残基を欠失させる。他の実施形態では、鎖間システインを、別のアミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸）で置換する。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、トレオニン、またはグリシン）残基または親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）残基による置きかえを結果としてもたらしうる。特に好ましい実施形態では、鎖間システインを、セリンで置きかえる。
【００７６】
本発明により想定される一部の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、軽鎖（カッパまたはラムダのいずれか）上にあり、したがって、遊離システインを重鎖上に残す。他の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、重鎖上にあり、遊離システインを軽鎖定常領域上に残す。アセンブリーがなされると、無傷抗体の軽鎖内または重鎖内のいずれかの単一のシステインの欠失または置換は、２つの不対合システイン残基を有する部位特異的抗体を結果としてもたらすことが十分に理解される。
【００７７】
特に好ましい一実施形態では、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ）の２１４位におけるシステイン（Ｃ２１４）を、欠失させるかまたは置換する。別の好ましい実施形態では、ＩｇＧ重鎖上の２２０位におけるシステイン（Ｃ２２０）を、欠失させるかまたは置換する。さらなる実施形態では、重鎖上の２２６位または２２９位におけるシステインを、欠失させるかまたは置換する。一実施形態では、重鎖上のＣ２２０を、セリンで置換して（Ｃ２２０Ｓ）、所望の遊離システインを、軽鎖内にもたらす。別の実施形態では、軽鎖内のＣ２１４を、セリンで置換して（Ｃ２１４Ｓ）、所望の遊離システインを、重鎖内にもたらす。このような部位特異的構築物は、実施例１５で提供される。これらの好ましい構築物の概要を、すぐ下の表２［表中、全ての番号付けは、Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、変化を伴わない「野生型」または天然の定常領域配列を表し、デルタ（Δ）は、アミノ酸残基の欠失を指示する（例えば、Ｃ２１４Δとは、２１４位におけるシステインを欠失させたことを指し示す）］に示す。
【表２】
2017500028.tif 000003
【００７８】
本明細書で開示される、薬物ローディングの部位および化学量論が定義された抗体−薬物コンジュゲートを生成するための戦略は、抗体の保存的な定常ドメインの操作を主に伴うので、全ての抗ＤＰＥＰ３抗体へも広く適用可能である。抗体の各クラスおよび各サブクラスのアミノ酸配列および天然のジスルフィド架橋については、十分に記載されているので、当業者であれば、過度の実験なしで、多様な抗体の操作構築物をたやすく作り出すことができ、したがって、このような構築物は、本発明の範囲内にあるものとして明示的に想定される。
【００７９】
４．３  定常領域の改変およびグリコシル化の変化
本発明の選択された実施形態はまた、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または改変であって、限定せずに述べると、薬物動態の変化、血清中半減期の延長、結合アフィニティーの増加、免疫原性の低減、産生の増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の改変を含むがこれらに限定されない、好ましい特徴を伴う化合物を結果としてもたらす、アミノ酸残基の置換、変異、および／または改変を含む、置換または改変も含みうる。
【００８０】
Ｆｃエフェクター機能が改善された化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ならびにＦｃＲｎ）との間の相互作用に関与するアミノ酸残基の変化により生成することができ、これにより、細胞傷害作用の増大および／または血清中半減期の延長など、薬物動態の変化をもたらすことができる（例えば、RavetchおよびKinet、Annu.  Rev.  Immunol、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Capelら、Immunomethods、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびde  Haasら、J.  Lab.  Clin.  Med.、１２６巻：３３０〜４１頁（１９
９５年）を参照されたい）。
【００８１】
選択された実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基（例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号；同第ＷＯ０４／０２９２０７号；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照されたい）を改変すること（例えば、置換すること、欠失させること、または付加すること）により生成することができる。このような実施形態に関して、Ｆｃ変異体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける半減期であって、５日間を超える、１０日間を超える、１５日間を超える、好ましくは、２０日間を超える、２５日間を超える、３０日間を超える、３５日間を超える、４０日間を超える、４５日間を超える、２カ月間を超える、３カ月間を超える、４カ月間を超える、または５カ月間を超える半減期をもたらしうる。半減期の延長は、高血清中力価を結果としてもたらし、これにより、抗体の投与頻度を低減し、かつ／または投与される抗体の濃度を低減する。ヒトＦｃＲｎへのｉｎ  ｖｉｖｏにおける結合、およびヒトＦｃＲｎへの高アフィニティー結合性ポリペプチドの血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する、トランスジェニックマウスまたはトランスフェクトされたヒト細胞系においてアッセイすることもでき、変異体Ｆｃ領域を伴うポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイすることもできる。ＷＯ２０００／４２０７２では、ＦｃＲｎへの結合を改善するかまたは低下させた抗体変異体について記載されている。例えば、また、Shieldsら、J.  Biol.  Chem.、９巻（２号）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）も参照されたい。
【００８２】
他の実施形態では、Ｆｃの変化は、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の増強または低減をもたらしうる。当技術分野で公知の通り、ＣＤＣとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣとは、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃＲに結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いて、細胞毒素により標的細胞を殺滅することを可能とする、細胞傷害作用の形態を指す。本発明の文脈では、ＦｃＲへの結合アフィニティーを「変化させた」抗体変異体であって、親抗体もしくは非改変抗体と比較して、または天然配列のＦｃＲを含む抗体と比較して、結合が増強または低下した抗体変異体が提供される。結合の低下を提示するこのような変異体は、感知可能な結合をほとんどまたは全く保有することが可能でなく、例えば、当技術分野で周知の技法により決定される場合、ＦｃＲへの結合は、例えば、天然配列と比較して０〜２０％である。他の実施形態では、変異体は、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して、結合の増強を呈示する。Ｆｃ変異体のこれらの種類は、開示される抗体の有効な抗新生物特性を増強するように使用すると有利でありうることが十分に理解される。さらに他の実施形態では、このような変化は、結合アフィニティーの増加、免疫原性の低減、産生の増加、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位について）、結合特異性の改変、食作用の増加；および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体：ＢＣＲ）の下方調節などをもたらす。
【００８３】
さらに他の実施形態は、１または複数の操作された糖形態、例えば、グリコシル化パターンの変化またはタンパク質（例えば、Ｆｃドメインにおける）へと共有結合的に結合させた炭水化物組成の変化を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Shields,  R.  L.ら（２００２年）、J.  Biol.  Chem.、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁を参照されたい。操作された糖形態は、エフェクター機能を増強もしくは低減すること、抗体の標的に対するアフィニティーを増加させること、または抗体の産生を容易とすることを含むがこれらに限定されない、様々な目的に有用でありうる。エフェクター機能の低減が所望される、ある特定の実施形態では、分子を、非グリコシル化形態を発現するように操作することができる。１または複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらして、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させうる置換が周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０、および同６，３５０，８６１を参照されたい）。逆に、１または複数のさらなるグリコシル化部位において操作することにより、エフェクター機能の増強または結合の改善を、Ｆｃ含有分子へと付与することもできる。
【００８４】
他の実施形態は、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体、または二分枝型ＧｌｃＮＡｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化組成を変化させたＦｃ変異体を含む。このようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。操作された糖形態は、当業者に公知の任意の方法により生成することができ、例えば、操作された発現株または変異体の発現株を使用することにより生成することもでき、１または複数の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））との共発現により生成することもでき、多様な生物または多様な生物に由来する細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現させることにより生成することもでき、Ｆｃ領域を含む分子を発現させた後で、炭水化物(複数可)を修飾することにより生成することもできる（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２を参照されたい）。
【００８５】
４．４  断片
本発明を実施するのにどのような形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択するのかに関わらず、その抗体の免疫反応性断片を、それら自体で、または抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従い使用しうることが十分に理解される。「抗体断片」は、無傷抗体の少なくとも一部を含む。本明細書で使用される抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合性断片を含み、「抗原結合性断片」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片であって、選択された抗原もしくはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合するか、もしくはこれと反応するか、または断片が由来する無傷抗体と、特異的抗原結合について競合するポリペプチド断片を指す。
【００８６】
例示的な部位特異的断片は、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。加えて、活性部位特異的断片は、抗原／基質または受容体と相互作用し、それらを、無傷抗体の場合と同様の様式で改変する（いくぶん効率は低下する可能性があるが）その能力を保持する、抗体の一部を含む。このような抗体断片は、１または複数の遊離システインを含むようにさらに操作することができる。
【００８７】
他の実施形態では、抗体断片とは、Ｆｃ領域を含み、無傷抗体内に存在する場合のＦｃ領域と通常関連する生物学的機能であって、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合などの機能のうちの少なくとも１つを保持する断片である。一実施形態では、抗体断片とは、無傷抗体と実質的に同様のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を断片へと付与することが可能な、少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列へと連結された、抗原結合性アームを含みうる。
【００８８】
当業者によりよく認識される通り、断片は、分子的操作により得ることもでき、無傷抗体もしくは無傷抗体鎖または完全抗体もしくは完全抗体鎖の化学的処理または酵素的処理（パパインまたはペプシンなど）を介して得ることもでき、組換え手段により得ることもできる。抗体断片のより詳細な記載については、例えば、「Fundamental  Immunology」、W.  E.  Paul編、Raven  Press、N.Y.（１９９９年）を参照されたい。
【００８９】
４．５  多価構築物
他の実施形態では、本発明の抗体およびコンジュゲートは、一価の場合もあり、多価（例えば、二価、三価など）の場合もある。本明細書で使用される「価数」という用語は、抗体に関連する、潜在的な標的結合性部位の数を指す。各標的結合性部位は、１つの標的分子または標的分子上の特異的位置もしくは特異的遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合性部位は、単一の抗原上の位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が、１つを超える標的結合性部位を含む（多価の）場合、各標的結合性部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある（例えば、異なるリガンドに結合する場合もあり、異なる抗原に結合する場合もあり、同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合する場合もある）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照されたい。
【００９０】
一実施形態では、抗体は、Millsteinら、１９８３年、Nature、３０５巻：５３７〜５３９頁において記載されている通り、２つの鎖が異なる特異性を有する、二重特異性抗体である。他の実施形態は、三重特異性抗体など、さらなる特異性を伴う抗体を含む。他のより精緻化された、適合性の多重特異性構築物およびそれらの作製法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５、ならびにＷＯ９４／０４６９０；Sureshら、１９８６年、Methods  in  Enzymology、１２１巻：２１０頁；ＷＯ９６／２７０１１において示されている。
【００９１】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合する場合もあり、標的分子ならびに固体支持材料上の異種ポリペプチドなどの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合する場合もある。好ましい実施形態は、２つの抗原だけに結合する（すなわち、二重特異性抗体である）が、本発明にはまた、三重特異性抗体など、さらなる特異性を伴う抗体も包含される。二重特異性抗体はまた、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおいて抗体のうちの一方をアビジンへとカップリングさせ、他方をビオチンへとカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞が、望ましくない細胞を標的とするよう提案されており（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）、ＨＩＶ感染症の処置が提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０において、多数の架橋法と共に開示されている。
【００９２】
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体を養子免疫遺伝子治療で活用して、腫瘍を処置することができる。一実施形態では、本発明の抗体（例えば、ＳｃＦｖ断片）を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成することができる。「ＣＡＲ」とは、本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体またはその免疫反応性断片（例えば、ＳｃＦｖ断片）を含むＥＣＤ、膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインから構成される融合タンパク質である。一実施形態では、ＤＰＥＰ３を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とするように、被験体の免疫系を刺激するために、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞を、がんを患う被験体へと導入することができる。好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞受容体複合体、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来する細胞内ドメインを介する、抗原依存性の一次活性化を開始するための配列である、一次細胞質シグナル伝達配列を開始する細胞内ドメインを含む。他の好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲは、二次的シグナルまたは共刺激シグナルを開始する細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、およびグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体に由来する細胞内ドメインを含む（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＵＳ／２０１４／０２４２７０１を参照されたい）。
【００９３】
さらに他の実施形態では、当業者に周知の方法を使用して、所望の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）特異性を伴う抗体可変ドメイン（抗体−抗原間結合性（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位）を、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインなど、免疫グロブリン定常ドメイン配列へと融合させる。
【００９４】
５．組換えによる抗体の産生
抗体およびその断片は、抗体産生細胞から得られる遺伝子材料および組換え技術を使用して、産生または改変することができる（例えば、BergerおよびKimmel、「Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques」、「Methods  in  Enzymology」、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；SambrookおよびRussell（編）（２０００年）、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」（３版）、NY、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press；Ausubelら（２００２年）、「Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology」、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照されたい）。
【００９５】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に存在する場合もあり、細胞溶解物中に存在する場合もあり、部分的に精製された形態または実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸または細胞内タンパク質から分離されるとき、「単離」されるか、または実質的に純粋とされる。本発明の核酸は、例えば、一本鎖であれ、二本鎖であれ、ＲＮＡ、ＲＮＡであれ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、およびこれらの人工的変異体（例えば、ペプチド核酸）であることが可能であり、イントロンを含有する場合もあり、含有しない場合もある。好ましい実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【００９６】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技法を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記の実施例で示される通りに調製されるハイブリドーマ）により発現する抗体では、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）抗体では、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収することができる。
【００９７】
ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換することができる。これらの操作では、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域または可撓性のリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片へと作動的に連結する。この文脈で使用される「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片を、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列が、インフレームにとどまるように結合させることを意味する。
【００９８】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換することができる。当技術分野では、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabatら（１９９１年）（前掲）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域でありうるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。例示的なＩｇＧ１定常領域を、配列番号２に示す。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することができる。
【００９９】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換することができる。当技術分野では、ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabatら（１９９１年）（前掲）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。これに関して、例示的な適合性のカッパ軽鎖定常領域を、配列番号１に示す。
【０１００】
本明細書では、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」、または「配列相同性」を呈示するある特定のポリペプチド（例えば、抗原または抗体）が想定される。「相同な」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を呈示しうる。他の実施形態では、「相同な」ポリペプチドは、９３％、９５％、または９８％の配列同一性を呈示しうる。本明細書で使用される場合の、２つのアミノ酸配列の間のパーセント相同性とは、２つの配列の間の同一性パーセントと同義である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）であり、２つの配列の最適なアライメントのために導入することが必要な、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較と、２つの配列の間の同一性パーセントの決定とは、下記の非限定的な例で記載される数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１０１】
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E.  MeyersおよびW.  Miller（Comput.  Appl.  Biosci.、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））によるアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけのいずれかを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能である）におけるＧＡＰプログラムへと組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch（J.  Mol.  Biol.、４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
【０１０２】
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列はさらに、公開データベースに照らした検索を実施する「クェリー配列」として使用して、例えば、類縁の配列を同定することもできる。このような検索は、Altschulら（１９９０年）、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜１０頁によるＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本発明の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップ処理を施したアライメントを得るには、Altschulら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁において記載されている、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを活用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。
【０１０３】
同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる場合もあり、非保存的アミノ酸置換で異なる場合もある。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖を有する、別のアミノ酸残基で置換するアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはこれを超えるアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度を、置換の保存的性格について補正するように、上方に調整することができる。非保存的アミノ酸を伴う置換が存在する場合も、好ましい実施形態では、配列同一性を呈示するポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能または活性を保持する。
【０１０４】
本明細書ではまた、本発明の核酸に対する「配列同一性」、「配列類似性」、または「配列相同性」を呈示する核酸も想定される。「相同な配列」とは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を呈示する核酸分子の配列を意味する。他の実施形態では、核酸の「相同な配列」は、基準核酸に照らして９３％、９５％、または９８％の配列同一性を呈示しうる。
【０１０５】
本発明はまた、上記で記載したこのような核酸であって、プロモーター（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４を参照されたい）；および真核細胞分泌経路の他の転写調節エレメントおよびプロセシング制御エレメントに作動可能に連結されうる核酸を含むベクターも提供する。本発明はまた、これらのベクターを保有する宿主細胞および宿主発現系も提供する。
【０１０６】
本明細書で使用される「宿主発現系」という用語は、本発明の核酸またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを生成するように操作されうる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系は、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで形質転換されるか、またはこれらをトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトされた酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）；または哺乳動物細胞もしくはウイルスのゲノムに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞）を含むがこれらに限定されない。宿主細胞には、２つの発現ベクター、例えば、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクターを共トランスフェクトすることができる。
【０１０７】
当技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、同４，９１２，０４０、同４，７４０，４６１、および同４，９５９，４５５を参照されたい。宿主細胞はまた、多様な特徴（例えば、改変糖形態またはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）を伴う抗原結合性分子の産生を可能とするようにも操作することができる。
【０１０８】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定的な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定的に発現する細胞系は、本発明のうちの、当技術分野で認識された標準的な技法および形態の部分を使用して操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞には、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択マーカーを形質転換することができる。当技術分野で周知の選択系のうちのいずれかであって、ある特定の条件下で発現を増強するのに効率的な手法をもたらす、グルタミンシンセターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含む選択系を使用することができる。ＧＳ系は、全体または部分において、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７、およびＥＰ０３３８８４１、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および同５，８７９，９３６との関連で論じられる。安定的な細胞系を開発するための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１０９】
本発明の抗体を、組換え発現または本開示される他の技法のうちのいずれかにより産生したら、当技術分野で公知の方法により精製または単離しうるが、これは、本発明の抗体を、同定し、その天然環境から分離および／または回収し、抗体の診断的使用または治療的使用に干渉する夾雑物から分離することを意味する。単離抗体は、組換え細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。
【０１１０】
これらの単離調製物は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション、およびアフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーなど、当技術分野で認知された多様な技法を使用して精製することができる。
【０１１１】
６．産生後の選択
どのようにして得られるにせよ、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、例えば、頑健な成長、高い抗体産生、および目的の抗原に対する高アフィニティーなど、所望の抗体特徴を含む所望の特徴について、選択し、クローニングし、さらに、スクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、細胞培養で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やすこともでき、同系免疫不全状態の動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで増やすこともできる。当業者には、ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択し、クローニングし、増やす方法が周知である。所望の抗体を同定したら、当技術分野で認知された、一般的な分子生物学的技法および生化学的技法を使用して、関与性の遺伝子材料を、単離し、操作し、発現させることができる。
【０１１２】
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）により産生した抗体のアフィニティーは、中程度（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）でありうる。アフィニティーを増強するには、抗体ライブラリーを構築し（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、ランダム変異を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、導入することにより）、抗原に対して高アフィニティーの抗体を、これらの二次ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを使用することにより）再選択することにより、アフィニティー成熟をｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができる。ＷＯ９６０７７５４では、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製するための方法について記載されている。
【０１１３】
ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリーをファージ上または酵母上で合成し、ライブラリーを、目的の抗原またはその抗体結合性部分についてスクリーニングし、抗原に結合するファージまたは酵母を単離し、そこから抗体または免疫反応性断片を得る、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを含むがこれらに限定されない、多様な技法を使用して、抗体を選択することができる（Vaughanら、１９９６年、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Sheetsら、１９９８年、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Boderら、１９９７年、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Pepperら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーを作り出すためのキットは、市販されている。また、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに使用されうる他の方法および試薬も存在する（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびBarbasら、１９９１年、ＰＭＩＤ：１８９６４４５を参照されたい）。このような技法は、多数の候補抗体のスクリーニングを可能とし、配列の比較的容易な操作（例えば、組換えシャッフリングによる）をもたらすと有利である。
【０１１４】
ＩＶ  抗体の特徴
選択された実施形態では、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、例えば、頑健な成長、高い抗体産生、および、下記でより詳細に論じられる、所望の部位特異的抗体の特徴を含む、好適な特性について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。他の場合、抗体の特徴は、特定の抗原（例えば、特異的ＤＰＥＰ３アイソフォーム）または標的抗原の免疫反応性断片を、動物への接種のために選択することにより、付与することができる。さらに他の実施形態では、選択された抗体は、上記に記載した通り、アフィニティーまたは薬物動態など、免疫化学的特徴を増強または精緻化するように操作することができる。
【０１１５】
Ａ．中和抗体
選択された実施形態では、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」または「中和」抗体でありうるが、これは、抗体は、決定基と会合し、直接、またはリガンドもしくは受容体など、決定基の結合性パートナーとの会合を防止し、これにより、そうでなければ、分子の相互作用から生じる、生物学的応答を中断させることにより、前記決定基の活性を遮断または阻害しうることを意味する。例えば、標的分子の活性により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける競合的結合アッセイにおいて測定される通り、過剰な抗体により、決定基へと結合した結合パートナーの量が、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超えて低減される場合、中和抗体またはアンタゴニスト抗体は、決定基の、そのリガンドまたは基質への結合を実質的に阻害する。活性の改変は、当技術分野で認知された技法を使用して直接測定することもでき、変化した活性が下流に及ぼす影響（例えば、腫瘍形成または細胞の生存）により測定することもできることが十分に理解される。
【０１１６】
Ｂ．内部移行抗体
発現したＤＰＥＰ３タンパク質の実質的な部分は、腫瘍形成性細胞表面との会合を維持し、これにより、開示される抗体またはＡＤＣの局在化および内部移行を可能とするという証拠が存在する。好ましい実施形態では、このような抗体を、内部移行すると細胞を死滅させる、１または複数の薬物へと、会合またはコンジュゲートさせる。特に好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣは、内部移行部位特異的ＡＤＣを含む。
【０１１７】
本明細書で使用される「内部移行する」抗体とは、関連する抗原または受容体へと結合すると、細胞により取り込まれる（任意の細胞毒素と共に）抗体である。治療的適用では、内部移行は、それを必要とする被験体において、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じることが好ましい。内部移行されるＡＤＣの数は、抗原発現細胞、とりわけ、抗原を発現するがん幹細胞を死滅させるのに十分でありうる。場合によっては、細胞毒素またはＡＤＣの全体としての効力に応じて、単一の抗体分子の細胞への取込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある特定の薬物は、抗体へとコンジュゲートさせた少数の毒素分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である程度に、高度に強力である。抗体が、哺乳動物細胞へと結合すると、内部移行するのかどうかは、当技術分野で認知された多様なアッセイであって、下記の実施例で記載されるアッセイを含むアッセイにより決定することができる。抗体が細胞へと内部移行するかどうかを検出する方法はまた、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８においても記載されている。
【０１１８】
Ｃ．枯渇化抗体
他の実施形態では、本発明の抗体は、枯渇化抗体である。「枯渇化」抗体という用語は、好ましくは、細胞表面上または細胞表面近傍において、抗原に結合し、細胞の死滅を誘導するか、促進するか、または引き起こす（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞傷害剤の導入によって）抗体を指す。好ましい実施形態では、選択された枯渇化抗体を、細胞毒素へとコンジュゲートさせる。
【０１１９】
枯渇化抗体は、定義された細胞集団におけるＤＰＥＰ３発現細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を死滅させうることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団は、富化、区分、精製、または単離された腫瘍形成性細胞であって、がん幹細胞を含む腫瘍形成性細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団は、がん幹細胞を含む、全腫瘍試料を含む場合もあり、異質性の腫瘍抽出物を含む場合もある。本明細書の教示に従い、標準的な生化学的技法を使用して、腫瘍形成性細胞の枯渇をモニタリングおよび定量することができる。
【０１２０】
Ｄ．結合アフィニティー
本明細書では、特異的決定基、例えば、ＤＰＥＰ３に対する結合アフィニティーが高い抗体が開示される。「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離定数または見かけのアフィニティーを指す。本発明の抗体は、解離定数であるＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、≦１０−７Ｍである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合しうる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に、抗原に高アフィニティーで特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合に、抗原に著しい高アフィニティーで特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のＫＤは、≦１０−９Ｍであり、オフ速度は、約１×１０−４／秒である。本発明の一実施形態では、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、決定基に、約１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍの間のＫＤで結合し、さらに別の実施形態では、≦２×１０−１０ＭのＫＤで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、または５×１０−１５Ｍ未満である抗体を含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、決定基、例えば、ＤＰＥＰ３に免疫特異的に結合する、本発明の抗体の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）は、少なくとも１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも２×１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０５Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０６Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌ秒−ｌ、少なくとも５×１０７Ｍ−ｌ秒−ｌ、または少なくとも１０８Ｍ−ｌ秒−ｌでありうる。
【０１２２】
別の実施形態では、決定基、例えば、ＤＰＥＰ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）は、１０−ｌ秒−ｌ未満、５×１０−ｌ秒−ｌ未満、１０−２秒−ｌ未満、５×１０−２秒−ｌ未満、１０−３秒−ｌ未満、５×１０−３秒−ｌ未満、１０−４秒−ｌ未満、５×１０４秒−ｌ未満、１０−５秒−ｌ未満、５×１０−５秒−ｌ未満、１０−６秒−ｌ未満、５×１０−６秒−ｌ未満、１０−７秒−ｌ未満、５×１０−７秒−ｌ未満、１０−８秒−ｌ未満、５×１０−８秒−ｌ未満、１０−９秒−ｌ未満、５×１０−９秒−ｌ未満、または１０−１０秒−ｌ未満でありうる。
【０１２３】
結合アフィニティーは、当技術分野で公知の多様な技法、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二重分極干渉法、静的光散乱、動的光散乱、等温滴定熱量測定、ＥＬＩＳＡ、分析超遠心分離、およびフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【０１２４】
Ｅ．ビニングおよびエピトープマッピング
本明細書で使用される「ビニング」という用語は、それらの抗原結合特徴と、それらが互いと競合するのかどうかとに基づき、抗体を「ビン」へと群分けするのに使用される方法を指す。ビンについての初期決定は、エピトープマッピングおよび本明細書で記載される他の技法により、さらに精緻化および確認することができる。しかし、抗体の、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示される抗体の治療的な潜在力を示しうる情報がもたらされることが十分に理解される。
【０１２５】
より具体的に述べると、当技術分野で公知であり、本明細書の実施例で示される方法を使用することにより、第１の基準抗体（またはその断片）が、第２の被験抗体（すなわち、同じビン内にある）との結合について競合するのかどうかを決定することができる。一実施形態では、基準抗体を、ＤＰＥＰ３抗原と、飽和条件下で会合させ、次いで、１または複数の被験抗体がＤＰＥＰ３に結合する能力を、標準的な免疫化学的技法を使用して決定する。被験抗体が、ＤＰＥＰ３に、基準抗ＤＰＥＰ３抗体と同時に、実質的に結合することが可能であれば、被験抗体は、基準抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、被験抗体が、ＤＰＥＰ３に、同時に、実質的に結合することが可能でないなら、被験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または基準抗体が結合するエピトープと近接する（少なくとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、被験抗体は、抗原結合について競合し、基準抗体と同じビン内にある。
【０１２６】
開示される抗体の文脈で使用される場合の「競合する」または「競合抗体」という用語は、抗体間の競合であって、試験される被験抗体または免疫機能的断片が、基準抗体の共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにより決定される競合を意味する。このようなアッセイは、固体表面または細胞へと結合する精製抗原（例えば、ＤＰＥＰ３またはそのドメインもしくは断片）、標識されていない被験抗体、および標識された基準抗体の使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験抗体の存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通例では、被験抗体を過剰に存在させ、かつ／または最初に結合させる。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例で提示される。通例では、競合抗体が過剰に存在する場合、競合抗体は、基準抗体の共通抗原への特異的結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。場合によって、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、またはこれを超えて阻害される。
【０１２７】
逆に、基準抗体を結合させる場合、基準抗体は、続いて添加される被験抗体（すなわち、抗ＤＰＥＰ３抗体）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害することが好ましい。場合によって、被験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、またはこれを超えて阻害される。
【０１２８】
一般に、ビニングまたは競合的結合は、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、プレシピチン反応（precipitin  reaction）、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどのイムノアッセイなど、当技術分野で認知された多様な技法を使用して決定することができる。当技術分野では、このようなイムノアッセイは、ルーチンであり、周知である（Ausubelら編（１９９４年）、「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」、１巻、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  Yorkを参照されたい）。加えて、交差遮断アッセイも使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；ならびにHarlowら（１９８８年）、「Antibodies,  A  Laboratory  Manual」、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Ed  HarlowおよびDavid  Laneを参照されたい）。
【０１２９】
競合的阻害（および、それゆえに、「ビン」）を決定するのに使用される他の技術は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法；または例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはマルチプレックス型ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用するフローサイトメトリービーズアレイを含む。
【０１３０】
Ｌｕｍｉｎｅｘとは、大スケールのマルチプレックス化された抗体の対合を可能とする、ビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイでは、抗体対の、標的抗原への同時的な結合パターンを比較する。対の一方の抗体（捕捉ｍＡｂ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに結合するが、この場合、各捕捉ｍＡｂは、異なる色のビーズに結合する。他方の抗体（検出ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイでは、抗体の、抗原への同時的な結合（対合）について解析し、対合プロファイルが類似する抗体をまとめて群分けする。検出ｍＡｂのプロファイルと、捕捉ｍＡｂのプロファイルとが類似すれば、２つの抗体は、同じエピトープまたは近縁のエピトープに結合することが指し示される。一実施形態では、試験される抗体のパネルにおける任意の特定の抗体と最も緊密に相関する抗体を同定するように、ピアソン相関係数を使用して、対合プロファイルを決定することができる。好ましい実施形態では、抗体対についてのピアソンの相関係数が、少なくとも０．９であれば、被験／検出ｍＡｂは、基準／捕捉ｍＡｂと同じビン内にあることが決定される。他の実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７、または０．８９である。さらなる実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、または１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２において記載されている。１００の（またはこれを超える）異なる種類のビーズを同時に解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原表面および／または抗体表面がもたらされる結果として、抗体エピトーププロファイリングのスループットおよび分解能の、バイオセンサーアッセイを凌駕する改善がもたらされる（Millerら、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０１３１】
「表面プラズモン共鳴」とは、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。
【０１３２】
他の実施形態では、被験抗体が、基準抗体との結合について「競合する」のかどうかを決定するのに使用しうる技法は、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層と、内部基準層とから反射された白色光の干渉パターンを解析する光学的解析法である、「バイオレイヤー干渉法」である。バイオセンサーチップへと結合した分子の数の任意の変化により、リアルタイムで測定されうる、干渉パターンのシフトが引き起こされる。このようなバイオレイヤー干渉アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤマシンを使用して、以下の通りに実行することができる。基準抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップへと捕捉し、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロッキングし、ベースラインを収集する。次いで、単量体の組換え標的タンパク質を、特異的抗体（Ａｂ１）で捕捉し、チップを、対照としての同じ抗体（Ａｂ１）を伴うウェル内、または異なる被験抗体（Ａｂ２）を伴うウェル内に浸漬する。対照のＡｂ１との結合レベルを比較することにより決定される、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ１とＡｂ２とは、「競合」抗体であると決定する。Ａｂ２とのさらなる結合が観察されたら、Ａｂ１とＡｂ２とは、互いと競合しないと決定する。このプロセスは、９６ウェルプレートにおける固有のビンを表す抗体の全ての行（full  row  of  antibodies）を使用し
て、固有の抗体の大規模なライブラリーをスクリーニングするように拡張することもできる。好ましい実施形態では、基準抗体が、被験抗体の、共通の抗原への特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害すれば、被験抗体は、基準抗体と競合する。他の実施形態では、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。
【０１３３】
競合抗体群を包含するビンを定義したら、さらなる特徴づけを実行して、ビンにおける抗体が結合する抗原上の特異的なドメインまたはエピトープを決定することができる。ドメインレベルのエピトープマッピングは、Cochranら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５０９
９７６３により記載されているプロトコールの変法を使用して実施することができる。ファインエピトープマッピングとは、抗体が結合する決定基のエピトープを含む抗原上の特異的なアミノ酸を決定するプロセスである。「エピトープ」という用語は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体により認識され、これが特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。ある特定の実施形態では、エピトープまたは免疫原性決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など、化学的に活性の表面分子団を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。ある特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。
【０１３４】
抗原が、ＤＰＥＰ３などのポリペプチドである場合、エピトープは一般に、連続アミノ酸およびタンパク質の三次フォールディングにより並置される非連続アミノ酸（「コンフォメーションエピトープ」）の両方から形成されうる。このようなコンフォメーションエピトープでは、相互作用点は、直鎖としては互いから隔てられたタンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（場合によって、「直鎖状」エピトープまたは「連続」エピトープと称する）は、タンパク質が変性しても保持されることが典型的であるのに対し、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、タンパク質が変性すると失われることが典型的である。抗体エピトープは、固有の空間的コンフォメーションにおいて、少なくとも３個のアミノ酸、例えば、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、またはこれより多くを含むことが典型的である。当技術分野では、エピトープ決定法または「エピトープマッピング」法が周知であり、本開示と共に、開示される抗体が結合するＤＰＥＰ３上のエピトープを同定するのに使用することができる。
【０１３５】
適合性のエピトープマッピング技法は、アラニン走査変異体、ペプチドブロット（Reineke（２００４年）、Methods  Mol  Biol、２４８巻：４４３〜６３頁）、またはペプチド切断解析を含む。加えて、エピトープの切出し、エピトープの抽出、および抗原の化学修飾などの方法（Tomer（２０００年）Protein  Science、９巻：４８７〜４９６頁）も用いることができる。他の適合性の方法は、本明細書に付随する実施例１０に示されるような酵母ディスプレイ法を含む。他の実施形態では、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としてもまた公知の、改変支援プロファイリング（Modification-Assisted  Profiling）（ＭＡＰ）により、各抗体の、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する結合プロファイルの類似性に従い、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体を類別する方法（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）がもたらされる。この技術は、特徴づけにより、遺伝子的に識別可能な抗体に焦点を当てうるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能とする。ＭＡＰを使用して、本発明のＤＰＥＰ３抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群へと分取しうることが十分に理解される。
【０１３６】
下記の実施例１０でより詳細に論じられる通り、上記の方法を使用して、３つの例示的なＤＰＥＰ３抗体（ＳＣ３４．２、ＳＣ３４．２８、およびＳＣ３４．１０）のエピトープを決定した。ＳＣ３４．２抗体は、Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、およびＥ３７９（配列番号３に従い番号付けされた）からなる群から選択される、ヒトＤＰＥＰ３アミノ酸残基を含む、コンフォメーショナルエピトープに結合することが見出された。さらに、残基の各々は、多かれ少なかれ、エピトープの定義に関与しうる一方で、抗体は、無傷でないエピトープまたは部分的に形成されたエピトープとも会合しうることが十分に理解される。したがって、本発明は、Ｅ２１７、Ｒ２４２、Ｑ２４８、Ｑ３７２、Ｋ３７５、およびＥ３７９からなる群から選択される、３つまたはこれを超えるアミノ酸残基を含むエピトープに結合するかもしくはこれと会合する抗体、または結合性抗体と競合する任意の抗体を明示的に包含する。より具体的には、本発明は、すぐ下の表３に示される特定の残基の組合せのうちのいずれかを含むエピトープ［配列中、Ｘは、配列番号３に従う残基の番号付けを伴う、任意の天然に存在するアミノ酸を含む］に結合する抗体を包含する。
【表３−１】
2017500028.tif 000004
【表３−２】
2017500028.tif 000005
【０１３７】
ＳＣ３４．１０抗体は、Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４およびＳ５５（配列番号３に従い番号付けされた）からなる群から選択される、ヒトＤＰＥＰ３アミノ酸残基を含む、コンフォメーショナルエピトープに結合することが見出された。上記の通り、残基の各々は、多かれ少なかれ、エピトープの定義に関与しうるが、抗体は、無傷でないエピトープまたは部分的に形成されたエピトープと会合しうることが十分に理解される。したがって、本発明は、Ｒ４６、Ｒ４８、Ｒ５４およびＳ５５からなる群から選択される、３つまたはこれを超えるアミノ酸残基を含むエピトープに結合するかもしくはこれと会合する抗体、または結合性抗体と競合する任意の抗体を明示的に包含する。より具体的には、本発明は、すぐ下の表４に示されるエピトープ１〜５［配列中、Ｘは、配列番号３に従う残基の番号付けを伴う、任意の天然に存在するアミノ酸を含む］のうちのいずれかに結合する抗体を包含する。
【表４】
2017500028.tif 000006
【０１３８】
ＳＣ３４．２８抗体は、Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６、Ｑ２４８（配列番号３に従い番号付けされた）からなる群から選択される、ヒトＤＰＥＰ３アミノ酸残基を含む、コンフォメーショナルエピトープに結合することが見出された。この場合、（ｉ）ヒトＤＰＥＰ３のアミノ酸配列と、カニクイザルＤＰＥＰ３のアミノ酸配列とについての比較解析；および（ｉｉ）２つのＤＰＥＰ３オルソログの各々に対するｈＳＣ３４．２８のアフィニティーの差違についての比較解析により、Ｖ３８６およびＱ２４８並びに従来マッピングされている残基もエピトープの一部を形成することが指し示された。ここでもまた、残基の各々は、多かれ少なかれ、エピトープの定義に関与しうるが、抗体は、無傷でないエピトープまたは部分的に形成されたエピトープと会合しうることが十分に理解される。したがって、本発明は、Ｓ３８０、Ｓ３８４、Ｖ３８６およびＱ２４８からなる群から選択される、３つまたはこれを超えるアミノ酸残基を含むエピトープに結合するかもしくはこれと会合する抗体、または結合性抗体と競合する任意の抗体を明示的に包含する。より具体的には、本発明は、すぐ下の表５に示されるエピトープ１〜５［配列中、Ｘは、配列番号３に従う残基の番号付けを伴う、任意の天然に存在するアミノ酸を含む］のうちのいずれかに結合する抗体を包含する。
【表５】
2017500028.tif 000007
【０１３９】
抗原上の所望されるエピトープを決定したら、例えば、本発明に記載される技法を使用して、エピトープを含むペプチドで免疫することにより、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。代替的に、発見プロセスにおいて、抗体を生成および特徴づけすることにより、特異的ドメイン内または特異的モチーフ内に配置された所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、抗原への結合について競合する抗体を見い出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づき、抗体をビニングするためのハイスループットプロセスについては、ＷＯ０３／４８７３１において記載されている。当技術分野では、ビニング法またはドメインレベルの方法またはエピトープマッピング法であって、酵母上における抗体の競合または抗原断片の発現を含む他の方法が周知である。
【０１４０】
Ｖ  抗体コンジュゲート
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体を、薬学的活性部分または診断用部分とコンジュゲートさせて、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）または「抗体コンジュゲート」を形成することができる。「コンジュゲート」という用語は、広義で使用され、会合法に関わらず、任意の薬学的活性部分または診断用部分の、本発明の抗体との共有結合的会合または非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態では、会合は、抗体のリシン残基またはシステイン残基を介してなされる。特に好ましい実施形態では、薬学的活性部分または診断用部分は、１または複数の部位特異的遊離システイン(複数可)を介して、抗体へとコンジュゲートさせることができる。開示されるＡＤＣは、治療目的および診断的目的で使用することができる。
【０１４１】
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒素または他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞および／またはＤＰＥＰ３を発現する細胞）へと送達することができる。本明細書で使用される「薬物」または「弾頭」という用語は、互換的に使用することができ、生物学的に活性な分子もしくは化合物または検出可能な分子もしくは薬物であって、下記で記載される抗がん剤を含む分子または化合物を意味する。「ペイロード」は、任意選択のリンカー化合物と組み合わせた薬物または弾頭を含みうる。コンジュゲート上の弾頭は、ペプチド、タンパク質、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性薬剤へと代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、低分子、結合剤、模倣剤、合成薬、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含みうる。有利な実施形態では、開示されるＡＤＣは、結合させたペイロードを、比較的非反応性、非毒性の状態で、標的部位へと向けてから、ペイロードを放出し、活性化する。ペイロードのこの標的放出（targeted  release）は、ペイロードの安定的なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１または複数のシステインを介する）と、ＡＤＣ調製物の比較的均質な組成であって、毒性種の過剰コンジュゲートを最小化する組成とにより達成することが好ましい。腫瘍部位へと送達されたら、ペイロードを大部分放出するようにデザインされた薬物リンカーとカップリングさせた本発明のコンジュゲートは、所望されない非特異的毒性を実質的に低減する。これは、腫瘍部位には、比較的高レベルの活性細胞毒素をもたらす一方で、ターゲティングされない細胞および組織の曝露を最小化し、これにより、治療指数の増強をもたらすので有利である。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態は、治療用部分（例えば、細胞毒素）によるペイロードを含む一方で、診断剤および生体適合性の修飾剤など、他のペイロードも、開示されるコンジュゲートによりもたらされる標的放出から利益を得ることが十分に理解される。したがって、例示的な治療用ペイロードを対象とした任意の開示はまた、文脈によりそうでないことが指示されない限りにおいて、本明細書で論じられる診断剤または生体適合性の修飾剤を含むペイロードへと適用可能でもある。選択されたペイロードは、抗体へと共有結合的に連結することもでき、非共有結合的に連結することもでき、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法に応じて、多様な化学量論的モル比を呈示する。本発明のコンジュゲートは、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎまたは薬学的に許容されるその塩［式中、
ａ）Ａｂは、抗ＤＰＥＰ３抗体を含み；
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄは、薬物を含み；
ｄ）ｎは、約１〜約２０の整数である］
により表すことができる。
【０１４３】
当業者は、上述の式に従うコンジュゲートは、多数の異なるリンカーおよび薬物を使用して作り出すことができ、コンジュゲーション法は、構成要素の選択に応じて変化することを十分に理解する。そのようなものとして、開示される抗体の反応性の残基（例えば、システインまたはリシン）と会合する、任意の薬物または薬物リンカー化合物は、本明細書の教示に適合性である。同様に、選択された薬物の、抗体への部位特異的コンジュゲーションを可能とする、任意の反応条件も、本発明の範囲内にある。前出にも拘らず、本発明の特に好ましい実施形態は、本明細書で記載される通り、マイルドな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用する、薬物または薬物リンカーの、遊離システインへの選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび夾雑物が少なく、したがって、毒性が小さい、より均質な調製物をもたらす傾向がある。
【０１４４】
本明細書の教示に適合性の例示的なペイロードを下記に列挙する。
【０１４５】
Ａ．治療剤
本発明の抗体は、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤（debulking  agent）、化学療法剤、放射線療法剤、ターゲティング抗がん剤、生物学的応答調節物質、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤、および免疫療法剤を含むがこれらに限定されない、抗がん剤などの治療用部分または薬物である、薬学的活性部分へとコンジュゲートさせるか、連結するか、融合させるか、または他の形で会合させることができる。
【０１４６】
好ましい、例示的な抗がん剤（これらの相同体および誘導体を含む）は、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリケアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラセンジオン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）などのメイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テノポシド、テトラカイン、および上記のうちのいずれかの、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体を含む。
【０１４７】
さらなる適合性の細胞毒素は、ドラスタチン、ならびにモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を含むオーリスタチン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、またはイプシロン−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）などのアマニチン、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）などのＤＮＡ副溝結合剤、修飾ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）または二量体ＰＢＤ、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）であるシスプラチンなどのアルキル化剤、メアヤマイシン類似体またはメアヤマイシン誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７で示されるＦＲ９０１４６４）などのスプライシング阻害剤、エポチロン類似体およびパクリタキセルなどの微小管結合剤、ならびにカリケアマイシンおよびエスペラミシンなどのＤＮＡ損傷剤、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、およびダカルバジン（decarbazine）などの代謝拮抗剤、ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどの抗有糸分裂剤、ならびにダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシンなどのアントラサイクリン、ならびに上記のうちのいずれかの、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体を含む。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の抗体を、抗ＣＤ３結合性分子と会合させて、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、それらに腫瘍形成性細胞をターゲティングさせることができる（ＢｉＴＥ技術：例えば、Fuhrmannら、Annual  Meeting  of  AACR、抄録５６２５号（２０１０年）を参照されたい）。
【０１４９】
さらなる実施形態では、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートさせた治療用放射性同位元素を含みうる。このような実施形態と適合性でありうる例示的な放射性同位元素は、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔを含むがこれらに限定されない。また、他の放射性核種、とりわけ、エネルギー範囲を６０〜４，０００ｋｅＶとする放射性核種も、診断剤および治療剤として利用可能である。
【０１５０】
ある特定の特に好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣは、弾頭として、ＰＢＤ、および薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体を含みうる。ＰＢＤとは、ＤＮＡの副溝に共有結合的に結合し、核酸の合成を阻害することにより、抗腫瘍活性を発揮するアルキル化剤である。ＰＢＤは、最小限の骨髄抑制を呈示しながら、強力な抗腫瘍特性を有することが示されている。本発明に適合性のＰＢＤは、複数種類のリンカー（例えば、遊離スルフヒドリルを伴うマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して、抗体へと連結することができ、ある特定の実施形態では、二量体の形態（すなわち、ＰＢＤ二量体）である。開示される抗体へとコンジュゲートさせうる、適合性のＰＢＤ（および任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、同７，０４９，３１１、同７，１８９，７１０、同７，４２９，６５８、同７，４０７，９５１、同７，７４１，３１９、同７，５５７，０９９、同８，０３４，８０８、同８，１６３，７３６、同２０１１／０２５６１５７、ならびにＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、およびＷＯ２０１４／０５７０７４において記載されている。本発明に適合性のＰＢＤ化合物はすぐ下に示される。
【化１】
2017500028.tif 000008
【化２】
2017500028.tif 000009
【０１５１】
本発明の抗体はまた、生物学的応答調節物質へとコンジュゲートさせることもできる。例えば、特に好ましい実施形態では、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（または別の細胞傷害性ＲＮａｓｅ）、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Takahashiら、１９９４年、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）、およびＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）などのアポトーシス剤；血栓剤（thrombotic  agent）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン；リンホカイン、例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）を含みうる。
【０１５２】
Ｂ．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、低分子、フルオロフォア、または放射性同位元素でありうる、診断剤または検出剤、マーカーまたはレポーターへとコンジュゲートさせる。標識された抗体は、過剰増殖性障害の発症または進行をモニタリングするのに有用な場合もあり、開示される抗体を含む特定の治療の有効性を決定する（すなわち、治療診断）か、または将来の処置コースを決定する、臨床試験手順の一部として有用な場合もある。このようなマーカーまたはレポーターはまた、選択された抗体の精製、抗体アナリティックス（例えば、エピトープへの結合または抗体のビニング）、腫瘍形成性細胞の分離もしくは単離、または前臨床手順もしくは毒性研究において有用な場合もある。
【０１５３】
このような診断、解析、および／または検出は、抗体を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼを含む多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチン（streptavidinlbiotin）およびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクォリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；多様な陽電子放出断層撮影において使用される陽電子放出金属、非放射性の常磁性金属イオン、および放射性標識されるか、または特異的な放射性同位元素へとコンジュゲートさせた分子を含むがこれらに限定されない検出用物質にカップリングさせることにより達成することができる。当技術分野では、このような実施形態では、適切な検出法が周知であり、多数の市販供給元からたやすく入手可能である。
【０１５４】
他の実施形態では、抗体またはその断片を、ペプチドまたはフルオロフォアなどのマーカー配列または化合物へと融合またはコンジュゲートさせて、免疫組織化学検査、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの精製手順または診断手順または解析手順を容易とすることができる。好ましい実施形態では、マーカーは、それらのうちの多くが市販されているヒスチジンタグであって、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）により提供されているヒスチジンタグなどのヒスチジンタグを含む。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Wilsonら、１９８４年、Cell、３７巻：７６７頁）および「ｆｌａｇ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
Ｃ．生体適合性の修飾剤
選択された実施形態では、本発明の抗体を、抗体特徴を、所望の通りに、調整するか、変化させるか、改善するか、または緩和するのに使用されうる、生体適合性の修飾剤とコンジュゲートさせることができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体または融合構築物は、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または類似する生体適合性のポリマーなど、比較的高分子量のポリマー分子に結合させることにより生成することができる。当業者は、ＰＥＧを、抗体に特異の特性（例えば、半減期を調整しうる）を付与するように選択しうる、多くの異なる分子量および分子立体配置（molecular  configuration）で得られ得ることを十分に理解する。ＰＥＧは、多官能性リンカーを伴うかまたは伴わずに、ＰＥＧの、前記抗体または抗体断片のＮ末端またはＣ末端へのコンジュゲーションにより、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、抗体または抗体の断片もしくは誘導体へと結合させることができる。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、結果としてもたらされる生物学的活性の喪失が最小限の誘導体化を使用することができる。コンジュゲーションの程度は、ＰＥＧ分子の、抗体分子への最適なコンジュゲーションを確保するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析で緊密にモニタリングすることができる。反応しなかったＰＥＧは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。同様にして、開示される抗体は、抗体または抗体断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定にするか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの半減期を長くするように、アルブミンへとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、その技法が周知であり、例えば、ＷＯ９３／１５１９９、同ＷＯ９３／１５２００、およびＷＯ０１／７７１３７；ならびにＥＰ０４１３，６２２を参照されたい。当業者には、他の生体適合性のコンジュゲートも明らかであり、本明細書の教示に従い、たやすく同定することができる。
【０１５６】
Ｄ．リンカー化合物
多数のリンカー化合物を使用して、本発明の抗体を、関与性の弾頭へとコンジュゲートさせることができる。リンカーは、抗体上の反応性の残基（好ましくは、システインまたはリシン）および選択された薬物化合物と単に共有結合的に結合する必要がある。したがって、選択された抗体の残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的または他の形の）をもたらすのに使用しうる、任意のリンカーが、本明細書の教示に適合性である。
【０１５７】
多数の適合性のリンカーは、求核性である還元システインおよび還元リシンに結合しうると有利である。還元システインおよび還元リシンを伴うコンジュゲーション反応は、チオール−マレイミド反応、チオール−ハロゲノ（ハロゲン化アシル）反応、チオール−エン反応、チオール−イン反応、チオール−ビニルスルホン反応、チオール−ビスルホン反応、チオール−チオスルホネート反応、チオール−ピリジルジスルフィド反応、およびチオール−パラフルオロ反応を含むがこれらに限定されない。本明細書でさらに論じられる通り、チオール−マレイミドによるバイオコンジュゲーションは、その急速な反応速度およびマイルドなコンジュゲーション条件に起因して、最も広く使用されている手法のうちの１つである。この手法に関する１つの問題は、レトロマイケル反応、およびマレイミド連結されたペイロードの、抗体からの喪失、または、例えば、ヒト血清アルブミンなど、血漿中の他のタンパク質への移動の可能性である。しかし、好ましい実施形態では、本明細書の実施例１４および１６で示される、選択的還元および部位特異的抗体を使用して、コンジュゲートを安定化させ、この所望されない移動を低減することができる。チオール−ハロゲン化アシル反応は、レトロマイケル反応をおこす可能性がなく、したがって、より安定なバイオコンジュゲートをもたらす。しかし、チオール−ハロゲン化物反応は一般に、マレイミドベースのコンジュゲーションと比較して反応速度が緩徐であり、したがって、望ましくない薬物対抗体比をもたらしそれほど効率的ではない。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、別の一般的なバイオコンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの急速な交換をおこす結果として、混合型ジスルフィドおよびピリジン−２−チオンの放出をもたらす。混合型ジスルフィドは、還元性の細胞環境において切断され、ペイロードを放出することが可能である。バイオコンジュゲーションにおいてより大きな関心を集めつつある他の手法は、それらの各々が本明細書の教示に適合性であり、本発明の範囲内に明示的に含まれる、チオール−ビニルスルホン反応およびチオール−ビスルホン反応である。
【０１５８】
好ましい実施形態では、適合性のリンカーは、細胞外環境において、ＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、ＡＤＣを、水性媒体中で自由に可溶性にかつ単量体状態に保つ。細胞への輸送または送達の前に、ＡＤＣは、安定であり、無傷を維持する、すなわち、抗体の薬物部分への連結を維持することが好ましい。リンカーは、標的細胞の外部では、安定であるが、細胞の内部では、ある効率的な速度で切断または分解されるようにデザインされている。したがって、有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能とし；（ｉｉｉ）安定および無傷を維持する、すなわち、コンジュゲートが、そのターゲティング部位へと送達または輸送されるまで、切断または分解されず；（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害効果（一部の場合、任意のバイスタンダー効果を含む）、細胞殺滅効果、または細胞増殖抑制効果を維持する。ＡＤＣの安定性は、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣ、ならびにＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分離／解析技法など、標準的な解析技法により測定することができる。上記で示した通り、抗体と薬物部分との共有結合的結合は、リンカーが２つの反応性官能基、すなわち、反応的な意味における二価性を有することを要請する。ＭＭＡＥおよび部位特異的抗体など、２つまたはこれを超える機能的部分または生物学的活性部分を結合させるのに有用な、二価のリンカー試薬は公知であり、それらの結果として得られるコンジュゲートをもたらす方法も記載されている。
【０１５９】
本発明に適合性のリンカーは、切断型リンカーおよび非切断型リンカーとして広く分類することができる。酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断型リンカー、およびジスルフィドリンカーを含みうる、切断型リンカーは、標的細胞へと内部移行し、細胞内部のエンドソーム−リソソーム経路において切断される。細胞毒素の放出および活性化は、ヒドラゾン連結またはオキシム連結など、酸不安定性の化学的連結の切断を容易とする、エンドソーム／リソソーム酸性区画に依拠する。リソソーム特異的プロテアーゼ切断部位を、リンカー内に操作する場合、細胞毒素は、それらの細胞内標的の近傍に放出される。代替的に、混合型ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞の還元的環境内では選択的に切断されるが、血流中の酸素に富む環境内では切断されないので、細胞傷害性ペイロードを細胞内に放出させる手法をもたらす。対比を目的として述べると、アミド連結されたポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する、適合性の非切断型リンカーは、標的細胞における、リソソームによる、ＡＤＣの分解の間に、毒性ペイロードを遊離させる。いくつかの点で、リンカーの選択は、コンジュゲート、特定の適応症および抗体標的内で使用される、特定の薬物に依存する。
【０１６０】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム内環境またはエンドソーム内環境またはカベオラ内環境）内に存在する切断因子により切断可能なリンカーを含む。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼ酵素または細胞内プロテアーゼ酵素により切断される、ペプチジルリンカーでありうる。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子は、それらの各々が、ジペプチドの薬物誘導体を加水分解する結果として、標的細胞の内部で活性薬物の放出をもたらすことが公知である、カテプシンＢおよびカテプシンＤならびにプラスミンを含みうる。カテプシンＢは、がん性組織内で高度に発現することが見出されているので、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンＢにより切断可能な、例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５において記載されている。具体的な好ましい実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５において記載されているペプチジルリンカーなど、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー、またはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞におけるタンパク質分解による治療剤の放出を使用する１つの利点は、コンジュゲートさせると、薬剤は、典型的に弱められ、コンジュゲートの血清中安定性は典型的に高いことである。
【０１６１】
他の実施形態では、切断型リンカーは、ｐＨ感受性である。ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能なことが典型的である。例えば、リソソーム内で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；同５，８２４，８０５；同５，６２２，９２９を参照されたい）。このようなリンカーは、血液中の中性ｐＨ条件下などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似的ｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回ると不安定である。
【０１６２】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。当技術分野では、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成されうるジスルフィドリンカーを含む、様々なジスルフィドリンカーが公知である。さらに他の具体的実施形態では、リンカーは、マロン酸リンカー（Johnsonら、１９９５年、Anticancer  Res.、１５巻：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１２９９〜１３０４頁）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１３０５〜１２頁）である。
【０１６３】
特に好ましい実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７において示される）では、適合性のペプチジルリンカーは、
【化３】
2017500028.tif 000010
［式中、アステリスクは、薬物への結合点を指し示し、ＣＢＡは、抗ＤＰＥＰ３抗体であり、Ｌ１は、リンカーであり、Ａは、Ｌ１を、抗体上の反応性の残基へと接続する接続基（connecting  group）（必要に応じて、スペーサーを含む）であり、Ｌ２は、共有結合であるか、または、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、自壊型リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は、切断型リンカーである］を含む。
【０１６４】
Ｌ１は、好ましくは、切断型リンカーであり、リンカーを切断へと活性化させるための誘因と称することができる。
【０１６５】
Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変化しうる。これらの基は、それらの切断特徴であって、コンジュゲートを送達する部位における条件により指定されうる特徴に基づいて選択される。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、また、ｐＨの変化（例えば、酸不安定性または塩基不安定性）、温度の変化、または照射の際の変化（例えば、光不安定性）により切断可能なリンカーも使用することができる。本発明ではまた、還元条件下または酸化条件下で切断可能なリンカーも使用することができる。
【０１６６】
Ｌ１は、連続アミノ酸配列を含みうる。アミノ酸配列は、酵素による切断のための標的基質であることが可能であり、これにより、薬物の放出を可能とする。
【０１６７】
一実施形態では、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態では、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
【０１６８】
一実施形態では、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−［式中、−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれ、アミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す］として表すことができる。ジペプチド内のアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せでありうる。リンカーが、カテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシンにより媒介される切断のための作用部位でありうる。
【０１６９】
加えて、カルボキシル側鎖官能基またはアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、ＧｌｕおよびＬｙｓのそれぞれでは、ＣＯおよびＮＨは、この側鎖官能基を表しうる。
【０１７０】
一実施形態では、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−［式中、Ｃｉｔは、シトルリンである］
から選択される。
【０１７１】
ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−
から選択されることが好ましい。
【０１７２】
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
【０１７３】
一実施形態では、Ｌ２が存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。一実施形態では、Ｌ２は、酵素活性のための基質であり、これにより、薬物の放出を可能とする。
【０１７４】
一実施形態では、Ｌ１が、酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素により、Ｌ１とＬ２との間の結合が切断される。
【０１７５】
Ｌ１とＬ２とは、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合により接続することができる。
【０１７６】
Ｌ２に接続するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来する場合もある。
【０１７７】
Ｌ２に接続するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来する場合もある。
【０１７８】
Ｌ２に接続するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来しうる。
【０１７９】
「アミノ酸側鎖」という用語は、（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンなど、天然に存在するアミノ酸；（ｉｉ）オルニチンおよびシトルリンなど、希少なアミノ酸；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、天然に存在するアミノ酸の合成類似体および合成誘導体；ならびに（ｉｖ）全ての鏡像異性体、ジアステレオマー、異性体富化形態、同位体標識（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）形態、保護形態、およびこれらのラセミ混合物に見出される基を含む。
【０１８０】
一実施形態では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２とは一緒になって、基：
【化４】
2017500028.tif 000011
［式中、アステリスクは、薬物位置または細胞傷害剤位置への結合点を指し示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を指し示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは、０〜３である］を形成する。フェニレン環は、任意選択で、本明細書で記載される、１つ、２つ、または３つの置換基により置換される。一実施形態では、フェニレン基は、任意選択で、ハロ、ＮＯ２、Ｒ、またはＯＲにより置換される。
【０１８１】
一実施形態では、Ｙは、ＮＨである。
【０１８２】
一実施形態では、ｎは、０または１である。好ましくは、ｎは、０である。
【０１８３】
Ｙが、ＮＨであり、ｎが、０である場合、自壊型リンカーを、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称することができる。
【０１８４】
別の特に好ましい実施形態では、リンカーは、自壊型リンカーを含むことが可能であり、ジペプチドは併せて、下記：
【化５】
2017500028.tif 000012
［式中、アステリスクは、選択された細胞傷害性部分への結合点を指し示し、波線は、抗体へとコンジュゲートさせうる、リンカーの残りの部分（例えば、スペーサー−抗体間結合セグメント）への結合点を指し示す］
に例示される、−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。酵素によるジペプチドの切断の際に、自壊型リンカーは、下記：
【化６】
2017500028.tif 000013
［式中、Ｌ＊は、切断されたばかりのペプチジル単位を含む、リンカーの残りの部分の活性化形態である］
に示される線に沿って進行する、遠隔部位の活性化がなされると、保護された化合物（すなわち、細胞毒素）の完全な放出を可能とする。薬物の完全な放出により、所望の毒性活性の維持が確保される。
【０１８５】
一実施形態では、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは、直接的に接続される。例えば、Ｌ１が、連続アミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基へと直接的に接続しうる。
【０１８６】
別の実施形態では、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体とは、間接的に接続される。
【０１８７】
Ｌ１とＡとは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合により接続することができる。
【０１８８】
下記でより詳細に論じられる通り、本発明の薬物リンカーは、遊離システインを含むシステイン上の反応性チオール求核試薬へと連結されることが好ましい。この目的のために、抗体のシステインは、ＤＴＴもしくはＴＣＥＰなどの様々な還元剤または本明細書で示されるマイルドな還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。他の実施形態では、本発明の薬物リンカーは、リシンへと連結されることが好ましい。
【０１８９】
リンカーは、抗体上の求核官能基との反応のために、求電子官能基を含有することが好ましい。抗体上の求核基は、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合は、糖ヒドロキシル基または糖アミノ基を含むがこれらに限定されない。アミン基、チオール基、およびヒドロキシル基は、求核基であり、リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子基であって、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステルなどの活性エステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｖ）ハロアセトアミドなどの、アルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物；ならびに（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含み、これらのうちの一部が、以下：
【化７】
2017500028.tif 000014
の通りに例示される求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能である。
【０１９０】
特に好ましい実施形態では、部位特異的抗体と薬物−リンカー部分との間の接続は、部位特異的抗体の遊離システインのチオール残基、およびリンカー上に存在する末端マレイミド基を介する。このような実施形態では、抗体と薬物−リンカーとの間の接続は、
【化８】
2017500028.tif 000015
【０１９１】
［式中、アステリスクは、薬物−リンカーの残りの部分への結合点を指し示し、波線は、抗体の残りの部分への結合点を指し示す］
である。この実施形態では、Ｓ原子は、部位特異的遊離システインに由来することが好ましい。他の適合性のリンカーに関して述べると、結合性部分は、活性化残基と反応させて、所望のコンジュゲートをもたらしうる、末端ヨードアセトアミドを含む。いずれにせよ、当業者であれば、開示される薬物−リンカー化合物の各々を、本開示の観点で適合性の抗ＤＰＥＰ３部位特異的抗体とたやすくコンジュゲートさせうる。
【０１９２】
Ｅ．コンジュゲーション
多数の周知の異なる反応を使用して、薬物部分および／またはリンカーを、選択された抗体へと結合させうることが十分に理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を利用する多様な反応を用いて、所望の部分をコンジュゲートさせることができる。特に好ましい実施形態は、下記で詳細に論じられる１または複数の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の、溶媒へと曝露されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションにより生成することができる。さらに他の実施形態は、Ｎ末端のトレオニン残基およびセリン残基の活性化であって、次いで、開示されるペイロードを抗体へと結合させるのに使用されうる活性化を含む。選択されたコンジュゲーション法は、抗体へと結合させた薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数をもたらすように調整することが好ましい。
【０１９３】
当技術分野では、治療用化合物を、システイン残基へとコンジュゲートさせるための多様な方法が公知であり、当業者には明らかである。塩基性条件下では、システイン残基を脱プロトン化して、求核試薬であるチオレートを生成させ、これを、マレイミドおよびヨードアセトアミドなど、ソフトな求電子試薬と反応させることができる。一般に、このようなコンジュゲーションのための試薬は、システインのシステインチオールと直接反応して、コンジュゲートタンパク質を形成する場合もあり、リンカー−薬物と反応して、リンカー−薬物中間体を形成する場合もある。リンカーの場合、当業者には、有機化学反応、条件、および試薬を用いる複数の経路であって、（１）本発明のタンパク質のシステイン基の、リンカー試薬との反応であって、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成する反応に続く、活性化化合物との反応と；（２）化合物の求核基の、リンカー試薬との反応であって、共有結合を介して薬物−リンカー中間体を形成する反応に続く、本発明のタンパク質のシステイン基との反応とを含む経路が公知である。当業者には、前出から明らかな通り、本発明では、二官能性リンカーが有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基(複数可)への共有結合的連結のためのチオール修飾基と、化合物への共有結合的連結または非共有結合的連結のための、少なくとも１つの結合部分（例えば、第２のチオール修飾部分）を含みうる。
【０１９４】
コンジュゲーションの前に、抗体を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。他の実施形態では、リシンの、２−イミノチオラン（トラウト試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、またはＳＡＴ（ＰＥＧ）４を含むがこれらに限定されない試薬との反応であって、アミンのチオールへの転換を結果としてもたらす反応により、さらなる求核基を抗体へと導入することができる。
【０１９５】
このようなコンジュゲーションに関して述べると、システインチオールまたはリシンアミノ基は、求核性であり、リンカー試薬上または化合物−リンカー中間体上または、薬物上の求電子基であって、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステルなどの活性エステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどの、アルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物；；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、およびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）スルフィド交換を介するピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む求電子基との共有結合を形成するように反応することが可能である。化合物上またはリンカー上の求核基は、リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することが可能な、アミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、およびアリールヒドラジド基を含むがこれらに限定されない。
【０１９６】
好ましい標識化試薬は、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびホスホロアミダイトを含むが、他の官能基もまた使用することができる。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、システインのチオールと反応して、化合物と反応性のチオエーテルを生成させる、マレイミド、ヨードアセトイミド、またはハロアセチル／アルキルハロゲン化物、アジリジン（aziridne）、アクリロイル誘導体の使用を含む。また、遊離チオールの、活性化ピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）も、コンジュゲートを作製するのに有用である。マレイミドを使用することが好ましい。
【０１９７】
上記で指し示した通り、リシンもまた、本明細書で示されるコンジュゲーションを実行する反応性残基として使用することができる。求核性リシン残基は一般に、アミン反応性のスクシンイミジルエステルによりターゲティングする。最適な数の、脱プロトン化されたリシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、約１０．５であるリシンアンモニウム基のｐＫａを下回らなければならず、そのため、反応の典型的なｐＨは、約８〜９である。カップリング反応のための一般的な試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳエステルである。同様な反応をおこす他の適合性の試薬は、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含み、これもまた、ＡＤＣをもたらすのに、本明細書における教示と共に使用することができる。リシンを活性化したら、上述の連結基の多くを使用して、弾頭を抗体へと共有結合的に結合することができる。
【０１９８】
当技術分野ではまた、化合物を、トレオニン残基またはセリン残基（好ましくは、Ｎ末端残基）へとコンジュゲートさせるための方法も公知である。例えば、過ヨウ素酸酸化により、アルデヒド形態へと選択的かつ迅速に転換しうるカルボニル前駆体を、セリンまたはトレオニンの１，２−アミノアルコールから導出する方法が記載されている。アルデヒドの、本発明のタンパク質へと結合させる化合物中のシステインの１，２−アミノチオールとの反応により、安定的なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端のセリン残基またはトレオニン残基におけるタンパク質を標識化するのに特に有用である。
【０１９９】
特に好ましい実施形態では、反応性のチオール基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超える遊離システイン残基を導入することにより、選択された抗体（またはその断片）へと導入すること（例えば、１または複数の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製すること）ができる。このような部位特異的抗体または操作抗体は、少なくとも部分的に、本明細書で示される操作遊離システイン部位(複数可)および／または新規のコンジュゲーション手順をもたらすことに起因して、安定性および実質的な均質性の増強を呈示するコンジュゲート調製物を可能とする。コンジュゲーション部位をもたらすのに、抗体の鎖内または鎖間のジスルフィド結合の各々を完全還元または部分還元する（かつ、本発明に完全に適合性である）、従来のコンジュゲーション法と異なり、本発明は加えて、ある特定の、調製された遊離システイン部位の選択的還元と、薬物−リンカーの遊離システイン部位への方向づけとをもたらす。操作部位および選択的還元により促進されるコンジュゲーションの特異性により、所望の位置における、高百分率の部位指向性コンジュゲーション（site  directed  conjugation）が可能となる。軽鎖定常領域の末端領域内に存在するコンジュゲーション部位など、これらのコンジュゲーション部位の一部は、他の遊離システインと交差反応する傾向があるので、効果的にコンジュゲートさせるのが典型的に困難であることは重要である。しかし、分子的操作および結果として得られる遊離システインの選択的還元を介して、効率的なコンジュゲーション率を得ることができ、これにより、望ましくない高ＤＡＲ夾雑物および非特異的毒性が大幅に低減される。より一般に、操作構築物、および開示される、新規のコンジュゲーション法であって、選択的還元を含むコンジュゲーション法により、薬物動態および／または薬力学が改善されたＡＤＣ調製物がもたらされ、潜在的には、治療指数の改善がもたらされる。
【０２００】
部位特異的構築物は、遊離システイン(複数可)を提示するが、これは、還元されると、求核基であり、上記で開示された求電子基など、リンカー部分上の求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能である、チオール基を含む。好ましい本発明の抗体は、鎖間または鎖における還元可能な不対合システイン、すなわち、このような求核基をもたらすシステインを有する。したがって、ある特定の実施形態では、還元された不対合システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物−リンカーの末端マレイミド基またはハロアセトアミド基との反応は、所望のコンジュゲーションをもたらす。このような場合において、抗体の遊離システインは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。各遊離システインは、これにより、理論的には、反応性チオール求核試薬を提示する。このような試薬が適合性であるが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に公知の多様な反応、条件、および試薬を使用して実行しうることが十分に理解される。
【０２０１】
加えて、操作抗体の遊離システインを選択的に還元して、部位指向性コンジュゲーションの増強、および望ましくない、潜在的に毒性の夾雑物の低減をもたらしうることも見出された。より具体的には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質内の分子内相互作用および分子間相互作用をモジュレートし、選択された還元剤（好ましくは、比較的マイルドな）と共に、本明細書で示される通りに、遊離システインを選択的に還元し、部位特異的コンジュゲーション（site-specific  conjugation）を容易とするのに使用しうることが見出されている。本明細書で使用される「選択的還元」または「〜を選択的に還元すること」という用語は、互換的に使用することができ、操作抗体内に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することのない、遊離システイン(複数可)の還元を意味するものとする。選択された実施形態では、これは、ある特定の還元剤により実行することができる。他の好ましい実施形態では、操作された構築物の選択的還元は、還元剤（マイルドな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。「選択的コンジュゲーション」という用語は、選択的に還元された操作抗体の、本明細書で記載される細胞毒素とのコンジュゲーションを意味するものとすることが十分に理解される。これに関して、このような安定化剤の、選択された還元剤と組み合わせた使用により、抗体重鎖上および抗体軽鎖上のコンジュゲーションの程度、ならびに調製物のＤＡＲ分布により決定される、部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善することができる。
【０２０２】
任意の特定の理論により束縛されることを望まないが、このような安定化剤は、所望されるコンジュゲーション部位において、静電的微小環境をモジュレートし、かつ／またはコンフォメーション変化をモジュレートするように作用することが可能であり、これにより、比較的マイルドな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）が、所望の遊離システイン部位におけるコンジュゲーションを容易としうる。このような剤（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋（水素結合および静電相互作用を介する）を形成することが公知であり、タンパク質間相互作用を、好適なコンフォメーション変化を引き起こすことも可能であり、かつ／または好適でないタンパク質間相互作用を低減することも可能な、安定化効果を付与するような様式でモジュレートしうる。さらに、このような剤は、還元後における、所望されない分子内（および分子間）システイン間結合の形成を阻害し、これにより、操作部位特異的システインを、薬物へと結合させる（好ましくはリンカーを介して）、所望のコンジュゲーション反応を容易とするようにも作用しうる。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合の著明な還元をもたらさないので、その後のコンジュゲーション反応は、当然ながら、遊離システイン上の比較的少数の反応性チオール（例えば、好ましくは、抗体あたり２つの遊離チオール）へと駆動される。既に示した通り、これにより、本明細書で示される通りに作り出されたコンジュゲート調製物中の、非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルが大幅に低減される。
【０２０３】
選択された実施形態では、本発明に適合性の安定化剤は一般に、塩基性のｐＫａを有する、少なくとも１つの部分を伴う化合物を含む。ある特定の実施形態では、部分は、一級アミンを含むが、他の好ましい実施形態では、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の好ましい実施形態では、アミン部分は、三級アミンまたはグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態では、アミン部分は、アミノ酸を含むが、他の適合性の実施形態では、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態では、アミン部分は、タンパク質構成性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態では、アミン部分は、非タンパク質構成性アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態では、適合性の安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン、およびシステインを含みうる。加えて、適合性の安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを伴う窒素含有ヘテロ環を含みうる。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、適合性の安定化剤は、約７．５を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を伴う化合物を含み、他の実施形態では、対象のアミン部分は、約８．０を超えるｐＫａを有し、さらに他の実施形態ではアミン部分は、約８．５を超えるｐＫａを有し、さらに他の実施形態では、安定化剤は、約９．０を超えるｐＫａを有するアミン部分を含む。他の好ましい実施形態は、アミン部分が、約９．５を超えるｐＫａを有する安定化剤を含むが、ある特定の他の実施形態は、約１０．０を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を呈示する安定化剤を含む。さらに他の好ましい実施形態では、安定化剤は、約１０．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態では、安定化剤は、約１１．０を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１１．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を含む。さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１２．０を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１２．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を含む。当業者は、標準的な技法を使用して、関与性のｐＫａをたやすく計算または決定することができ、選択された化合物を、安定化剤として使用する適用可能性を決定するのに使用しうることを理解する。
【０２０５】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わせると、部位特異的遊離システインに向けた標的化コンジュゲーションに特に有効であることが示されている。本発明の目的では、適合性の還元剤は、操作抗体の天然のジスルフィド結合を有意に破壊しないコンジュゲーションのために、還元された部位特異的遊離システインを生成する、任意の化合物を含みうる。選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされるこのような条件下で、活性化薬物リンカーは、大部分、所望の部位特異的遊離システイン部位への結合へと制限される。マイルドな条件をもたらすように、比較的低濃度で使用される、比較的マイルドな還元剤または還元剤（relatively  mild  reducing  agents  or  reducing  agents）が、特に好ましい。本明細書で使用される「マイルドな還元剤」または「マイルドな還元条件」という用語は、操作抗体に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊せずに、遊離システイン部位(複数可)においてチオールをもたらす還元剤（任意選択で、安定化剤の存在下における）によりもたらされる、任意の剤または状態を意味するものとする。すなわち、マイルドな還元剤またはマイルドな還元条件は、タンパク質の天然のジスルフィド結合を有意に破壊せずに、遊離システイン(複数可)を効果的に還元する（チオールをもたらす）ことが可能である。所望の還元条件は、選択的なコンジュゲーションに適切な環境を確立する、多数のスルフヒドリルベースの化合物によりもたらすことができる。好ましい実施形態では、マイルドな還元剤は、１または複数の遊離チオールを有する化合物を含みうるが、特に好ましい実施形態では、マイルドな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明に適合性の還元剤の非限定的な例は、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール、および２−ヒドロキシエタン−１−チオールを含む。
【０２０６】
上記で示した選択的還元プロセスは、遊離システインへ向けた標的化コンジュゲーションに特に有効であることが十分に理解される。これに関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位へのコンジュゲーションの程度（本明細書では、「コンジュゲーション効率」と定義する）は、当技術分野で容認された多様な技法により決定することができる。薬物の、抗体への、部位特異的コンジュゲーションの効率は、標的コンジュゲーション部位（本発明では、軽鎖のＣ末端上の遊離システイン）上のコンジュゲーションの、他の全てのコンジュゲート部位と比べた百分率を評価することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、薬物の、遊離システインを含む抗体への、効率的なコンジュゲートをもたらす。一部の実施形態では、標的コンジュゲーションの、他の全てのコンジュゲーション部位と比べた百分率により測定される場合の、コンジュゲーション効率は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはこれを超える。
【０２０７】
さらに、コンジュゲーションが可能な操作抗体は、抗体が作製または保存されるときに、ブロックまたはキャッピングされるスルフヒドリル基を含む、遊離システイン残基を含有しうることが十分に理解される。このようなキャップは、スルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲートの形成を防止または阻害する、小分子、タンパク質、ペプチド、イオン、および他の材料を含む。場合によって、コンジュゲートさせていない操作抗体は、同じ抗体上または異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含みうる。本明細書で論じられる通り、このような交差反応性は、作製手順において、多様な夾雑物をもたらしうる。一部の実施形態では、操作抗体は、コンジュゲーション反応の前に、脱キャップ（uncapping）が求められる場合がある。具体的な実施形態では、本明細書の抗体は、キャップが外され、コンジュゲーションが可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。具体的な実施形態では、本明細書の抗体を、天然に存在するジスルフィド結合を攪乱または再構成しない脱キャップ反応にかける。大半の場合に、脱キャップ反応は、通常の還元反応（還元または選択的還元）の間に生じることが十分に理解される。
【０２０８】
Ｆ．ＤＡＲ分布および精製
本発明の部位特異的抗体とのコンジュゲーションの利点のうちの１つは、狭いＤＡＲ分布を含む、比較的均質なＡＤＣ調製物を作り出す能力である。これに関して、開示される構築物および／または選択的なコンジュゲーションは、薬物と操作抗体との間の化学量論比についての、試料中のＡＤＣ種の均質性をもたらす。上記で簡略に論じた通り、「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」という用語は、薬物の抗体に対するモル比を指す。一部の実施形態では、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して、実質的に均質でありうるが、これは、調製物中に、特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を伴う部位特異的ＡＤＣの主要な種であって、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関してもまた一様な種が存在することを意味する。本発明のある特定の実施形態では、部位特異的抗体または選択的な還元およびコンジュゲーションの使用により、所望の均質性を達成することが可能である。他の好ましい実施形態では、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた、部位特異的構築物の使用により達成することができる。さらに他の特に好ましい実施形態では、調製物は、解析用クロマトグラフィー技法または調製用クロマトグラフィー技法を使用して、さらに精製することができる。これらの実施形態の各々では、ＡＤＣ試料の均質性を、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）、またはキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の多様な技法を使用して解析することができる。
【０２０９】
ＡＤＣ調製物の精製に関して述べると、標準的な医薬調製法を援用して、所望の純度を得られることが十分に理解される。本明細書で論じられる通り、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、混合物中の化合物を、薬物ローディング値により分離しうる。場合によってまた、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）または混合式クロマトグラフィー（ＭＭＣ）も、特異的薬物ロードを伴う種を単離するのに使用することができる。
【０２１０】
開示されるＡＤＣおよびその調製物は、薬物と抗体部分とを、抗体の立体配置と、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法とに応じて、多様な化学量論モル比で含みうる。ある特定の実施形態では、ＡＤＣ当たりの薬物ローディングは、１つ〜２０の弾頭を含みうる（すなわち、ｎは、１〜２０である）。他の選択された実施形態は、１つ〜１５の弾頭の薬物ローディングを有するＡＤＣを含みうる。さらに他の実施形態では、ＡＤＣは、１つ〜１２の弾頭、または、より好ましくは、１つ〜１０の弾頭を含みうる。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＤＣは、１つ〜８つの弾頭を含む。
【０２１１】
理論的な薬物ローディングは、比較的高量でありうるが、遊離システインの交差反応性および弾頭の疎水性などの実際的な制限から、凝集物および他の夾雑物のために、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の作製は制限される傾向にある。すなわち、例えば、＞６の高薬物ローディングは、ある特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失を引き起こしうる。このような懸案事項を検討すれば、本発明により提供される実際的な薬物ローディングは、コンジュゲート当たりの薬物１つ〜８つの範囲にわたることが好ましく、すなわち、この場合、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの薬物を、各抗体へと共有結合的に結合させる（例えば、ＩｇＧ１であるが、他の抗体は、ジスルフィド結合の数に応じて、異なるローディング容量を有しうる）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、約２、４、または６であり、特に好ましい実施形態では、ＤＡＲは、約２を含む。
【０２１２】
本発明により提供される、比較的高レベルの均質性にも拘らず、開示される組成物は、実際には、ある範囲の薬物化合物であって、１つ〜８つ（ＩｇＧ１の場合）の薬物化合物を伴うコンジュゲートの混合物を含む。そのようなものとして、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、この場合、成分である抗体の大半は、１または複数の薬物部分へと共有結合的に連結され（選択的還元のコンジュゲート特異性にも拘らず）、薬物部分は、多様なチオール基により抗体へと結合させることができる。すなわち、コンジュゲーション後、本発明のＡＤＣ組成物は、異なる薬物ロード（例えば、ＩｇＧ１抗体当たりの薬物１つ〜８つ）を、多様な濃度で（遊離システインの交差反応性により主に引き起こされる、ある特定の反応夾雑物と共に）伴うコンジュゲートの混合物を含む。選択的還元および作製後精製を使用して、コンジュゲート組成物を、それらが大部分、単一の、主要な、所望されるＡＤＣ種（例えば、２の薬物ローディングを有する）を含有し、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物ローディングを有する）は比較的低レベルとする点（point）へと駆動することができる。平均ＤＡＲ値は、全体としての組成物（すなわち、併せた全てのＡＤＣ種）に対する薬物ローディングの加重平均を表す。用いる定量法における固有の不確定性、および商業的環境における、副次的なＡＤＣ種を完全に除去することの困難のために、許容可能なＤＡＲ値または規格は、平均、範囲、または分布（すなわち、２±０．５の平均ＤＡＲ）として提示されることが多い。好ましくは、測定された平均ＤＡＲを、範囲（すなわち、１．５〜２．５の）内で含む組成物であれば、医薬環境で使用される。
【０２１３】
したがって、ある特定の好ましい実施形態では、本発明は、平均ＤＡＲが、１±０．５、２±０．５、３±０．５、４±０．５、５±０．５、６±０．５、７±０．５、または８±０．５の組成物を含む。他の好ましい実施形態では、本発明は、２±０．５、４±０．５、６±０．５、または８±０．５の平均ＤＡＲを含む。最後に、選択された好ましい実施形態では、本発明は、２±０．５の平均ＤＡＲを含む。ある特定の好ましい実施形態では、範囲または偏差は、０．４未満でありうることが十分に理解される。したがって、他の実施形態では、組成物は、１±０．３、２±０．３、３±０．３、４±０．３、５±０．３、６±０．３、７±０．３、もしくは８±０．３の平均ＤＡＲ、２±０．３、４±０．３、６±０．３、もしくは８±０．３の平均ＤＡＲ、なおより好ましくは、２±０．３もしくは４±０．３の平均ＤＡＲ、なおまたは２±０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態では、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが、１±０．４、２±０．４、３±０．４、４±０．４、５±０．４、６±０．４、７±０．４、または８±０．４であり、比較的低レベル（すなわち、３０％未満）の副次的ＡＤＣ種を伴う組成物を含む。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の副次的ＡＤＣ種を伴う、２±０．４、４±０．４、６±０．４、または８±０．４の平均ＤＡＲを含む。特に好ましい実施形態では、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の副次的ＡＤＣ種を伴う、２±０．４の平均ＤＡＲを含む。さらに他の実施形態では、主要なＡＤＣ種（例えば、２のＤＡＲ）は、他のＤＡＲ種に対して測定する場合、６５を超える濃度で、７０％を超える濃度で、７５％を超える濃度で、８０％を超える濃度で、８５％を超える濃度で、９０％を超える濃度で、９３％を超える濃度で、９５％を超える濃度で、なおまたは９７％を超える濃度で存在する。
【０２１４】
下記の実施例で詳述される通り、コンジュゲーション反応に由来するＡＤＣ調製物における、抗体当たりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡ、および電気泳動など、従来の手段により特徴づけることができる。また、抗体当たりの薬物を単位とするＡＤＣの定量的分布も決定することができる。ＥＬＩＳＡにより、特定のＡＤＣ調製物における抗体当たりの薬物の平均値を決定することができる。しかし、抗体当たりの薬物の分布値は、抗体−抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界により、識別が不可能である。また、抗体−薬物コンジュゲートを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイでは、薬物部分が、重鎖断片もしくは軽鎖断片、または特定のアミノ酸残基など、どこで、抗体へと結合しているのかも決定されない。
【０２１５】
ＶＩ  診断法およびスクリーニング
Ａ．診断法
本発明は、増殖性障害を検出、診断、またはモニタリングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法、および患者に由来する細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、がんを処置するか、またはその進行をモニタリングするために、がんを有する個体を同定するステップであって、患者または患者から得られた試料（ｉｎ  ｖｉｖｏ試料またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料のいずれか）を、本明細書で記載される抗体と接触させることと、抗体の、試料中の結合した標的分子もしくは遊離標的分子との会合の存在もしくは非存在またはレベルを検出することとを含むステップを含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書で記載される検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、抗体の、試料中の特定の細胞との会合により、試料が腫瘍形成性細胞を含有しうることを表わすことができることから、がんを有する個体を、本明細書で記載される抗体で効果的に処置しうることが指し示される。
【０２１７】
試料は、多数のアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合的結合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析、およびフローサイトメトリーアッセイにより解析することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適合性の治療診断アッセイまたは診断アッセイは、当技術分野で認知されたイメージング技法またはモニタリング技法、例えば、磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波などを含みうる。
【０２１８】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体を使用して、患者試料（例えば、血漿または血液）中の特定の決定基（例えば、ＤＰＥＰ３）のレベルを検出および定量することができ、次にはこれを使用して、関与性の決定基と関連する増殖性障害を検出、診断、またはモニタリングすることができる。関連の実施形態では、本発明の抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて、循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量することができる（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態では、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含みうる。
【０２１９】
本発明のある特定の実施形態では、ベースラインを確立するように、治療またはレジメンの前に、開示される抗体を使用して、被験体における腫瘍形成性細胞、または被験体に由来する試料中の腫瘍形成性細胞を評価するかまたは特徴づけることができる。他の例では、処置された被験体に由来する試料に由来する腫瘍形成性細胞を評価することができる。
【０２２０】
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態では、抗体は、決定基と相互作用することにより、腫瘍細胞の機能または活性を変化させる化合物または薬剤（例えば、抗体またはＡＤＣ）を同定するために、試料をスクリーニングするのに使用することができる。一実施形態では、腫瘍細胞を、抗体またはＡＤＣと接触させ、抗体またはＡＤＣを、診断目的を含むがこれらに限定されない目的でこのような細胞を同定するか、このような細胞をモニタリングして、処置の有効性を決定するか、または細胞集団をこのような標的発現細胞について富化するために、腫瘍を、ある特定の標的（例えば、ＤＰＥＰ３）を発現する細胞についてスクリーニングするのに使用することができる。
【０２２１】
さらに別の実施形態では、方法は、腫瘍細胞を、被験薬剤または被験化合物と、直接的または間接的に接触させるステップと、被験薬剤または被験化合物により、決定基が会合した腫瘍細胞の活性または機能、例えば、細胞の形状もしくは生存率の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、細胞の呼吸、ミトコンドリア活性、膜の完全性、成熟、増殖、生存率、アポトーシス、または細胞死がモジュレートするかどうかを決定するステップとを含む。直接的な相互作用の１つの例は、物理的相互作用であるが、間接的相互作用は、例えば、組成物の、媒介分子に対する作用を含み、続いて、言及される実体（例えば、細胞または細胞培養物）に対して作用する。
【０２２２】
スクリーニング法は、任意選択で、例えば、培養ディッシュ上、試験管上、フラスコ上、ローラーボトル上、またはプレート上の所定の位置に配置されたまたは置かれた細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含みうる、ハイスループットスクリーニングを含む。ロボット式または手動式のハイスループット法により、化学的相互作用をプローブし、短時間で多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。例えば、フルオロフォアまたはマイクロアレイを介して、分子シグナルを活用する技法（MocellinおよびRossi、２００７年、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）、および非常に迅速な速度で情報を処理する自動式解析を活用する技法（例えば、Pinhasovら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０を参照されたい）が開発されている。スクリーニングされうるライブラリーは、例えば、低分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリー、およびアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
【０２２３】
ＶＩＩ  医薬調製物および治療的使用
Ａ．製剤および投与経路
本発明の抗体またはＡＤＣは、当技術分野で認知された技法を使用して、多様な方法で製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできるが、他のものは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体を含有するように製剤化することもできる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、当技術分野で周知の賦形剤、ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含み、医薬調製物における使用のための商業的供給元から入手可能でありうる（例えば、Gennaro（２００３年）、「Remington：  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy  with  Facts  and  Comparisons：  Drugfacts  Plus」、２０版、Mack  Publishing;  Anselら（２００４年）、「Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  Systems」、７版、Lippencott  Williams  and  Wilkins;  Kibbeら（２０００年）、「Handbook  of  Pharmaceutical  Excipients」、３版、Pharamaceutical  Pressを参照されたい）。
【０２２４】
適切な、薬学的に許容される担体は、比較的不活性であり、抗体の投与を容易としうる物質であるか、または活性化合物を、作用部位へと送達するのに薬学的に最適化された調製物へと加工する一助となりうる物質を含む。
【０２２５】
このような薬学的に許容される担体は、製剤の形態、粘稠度、粘度、ｐＨ、等張性、安定性、容量オスモル濃度、薬物動態、タンパク質の凝集、または溶解度を変化させうる剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、封入剤、および皮膚浸透増強剤を含む。担体のある特定の非限定的な例は、食塩液、緩衝食塩液、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびこれらの組合せを含む。全身投与用の抗体は、経腸投与用に製剤化することもでき、非経口投与用に製剤化することもでき、局所投与用に製剤化することもできる。実際、３種類の製剤全てを同時に使用して、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口薬物送達用および経口薬物送達用の賦形剤ならびに製剤は、「Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy」（２０００年）、２０版、Mack  Publishingに示されている。
【０２２６】
経腸投与に適する製剤は、硬質ゼラチンカプセル剤または軟質ゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティングされた錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤、およびこれらの制御放出形態を含む。
【０２２７】
非経口投与（例えば、注射による）に適する製剤は、水性または非水性で、等張性で、発熱物質非含有で、滅菌の液体（例えば、液剤、懸濁剤）であって、有効成分を、溶解するか、懸濁するか、または他の形で提供した（例えば、リポソーム内または他の微粒子内に）液体を含む。このような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液（または他の関与性の体液）と等張性とする溶質など、他の薬学的に許容される担体をさらに含有しうる。賦形剤の例は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などを含む。このような製剤における使用に適する、等張性の、薬学的に許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液を含む。
【０２２８】
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合性の製剤は、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度または抗体濃度を含みうる。ある特定の選択された実施形態では、抗体濃度またはＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬを含む。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬを含む。
【０２２９】
本発明の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、それを必要とする被験体に、経口経路、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、非経口経路、鼻腔内経路、筋内経路、心内経路、脳室内経路、気管内経路、口腔内経路、直腸内経路、腹腔内経路、皮内経路、局所経路、経皮経路、および髄腔内経路、またはこれら以外では、植込みもしくは吸入による経路を含むがこれらに限定されない、多様な経路によって投与することができる。対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、およびエアゾール剤を含むがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと製剤化することができる。適切な製剤および投与経路は、意図される適用および治療レジメンに従い選択することができる。
【０２３０】
Ｂ．投与量
特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期、および投与回数は、特定の個体に依存するほか、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的な検討事項にも依存する。投与頻度の決定は、主治医などの当業者が、処置される状態および状態の重症度、処置される被験体の年齢および全般的健康状態などの検討に基づき下すことができる。投与頻度は、治療コースにわたり、選択された組成物および投与レジメンの有効性についての評価に基づき調整することができる。このような評価は、特異的な疾患、障害、または状態についてのマーカーに基づき行うことができる。個体ががんを有する実施形態では、これらは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定；ｘ線もしくは他のイメージング技法による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善；本明細書で記載される方法に従い同定される、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）もしくは抗原についての測定；増殖性細胞もしくは腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持；新生物性細胞の増殖の低減；または転移の発症の遅延を含む。
【０２３１】
本発明のＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、多様な範囲で投与することができる。これらは、投与当たり約５μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；投与当たり約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重；投与当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。他の範囲は、投与当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重および投与当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。ある特定の実施形態では、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２３２】
選択された実施形態では、上記ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、投与当たり約１０μｇ／ｋｇ体重、２０μｇ／ｋｇ体重、３０μｇ／ｋｇ体重、４０μｇ／ｋｇ体重、５０μｇ／ｋｇ体重、６０μｇ／ｋｇ体重、７０μｇ／ｋｇ体重、８０μｇ／ｋｇ体重、９０μｇ／ｋｇ体重、または１００μｇ／ｋｇ体重で投与される（好ましくは、静脈内）。他の実施形態は、投与当たり約２００μｇ／ｋｇ体重、３００μｇ／ｋｇ体重、４００μｇ／ｋｇ体重、５００μｇ／ｋｇ体重、６００μｇ／ｋｇ体重、７００μｇ／ｋｇ体重、８００μｇ／ｋｇ体重、９００μｇ／ｋｇ体重、１０００μｇ／ｋｇ体重、１１００μｇ／ｋｇ体重、１２００μｇ／ｋｇ体重、１３００μｇ／ｋｇ体重、１４００μｇ／ｋｇ体重、１５００μｇ／ｋｇ体重、１６００μｇ／ｋｇ体重、１７００μｇ／ｋｇ体重、１８００μｇ／ｋｇ体重、１９００μｇ／ｋｇ体重、または２０００μｇ／ｋｇ体重で、ＡＤＣの投与を含みうる。他の好ましい実施形態では、開示されるコンジュゲートは、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態では、コンジュゲートは、投与当たり１２ｍｇ／ｋｇ体重、１４ｍｇ／ｋｇ体重、１６ｍｇ／ｋｇ体重、１８ｍｇ／ｋｇ体重、または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与することができる。さらに他の実施形態では、コンジュゲートは、投与当たり２５ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、３５ｍｇ／ｋｇ体重、４０ｍｇ／ｋｇ体重、４５ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、５５ｍｇ／ｋｇ体重、６０ｍｇ／ｋｇ体重、６５ｍｇ／ｋｇ体重、７０ｍｇ／ｋｇ体重、７５ｍｇ／ｋｇ体重、８０ｍｇ／ｋｇ体重、９０ｍｇ／ｋｇ体重、または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与することができる。本明細書の教示によれば、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察、ならびに標準的な医療技法および生化学的技法および測定に基づき、多様なＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣに適する投与量をたやすく決定しうる。
【０２３３】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７において開示されている通り、体表面積（ＢＳＡ）の計算に立脚しうる。周知の通り、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、患者の身体の表面積により表される被験体のサイズについての尺度をもたらす。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができ、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができる。また、当技術分野で認知された技法および経験的な技法を使用して、適切な投与量を決定しうることも十分に理解される。
【０２３４】
抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、具体的なスケジュール投与することができる。一般に、有効用量の上記ＤＰＥＰ３コンジュゲートを、被験体へと、１回または複数回にわたり投与する。より特定すると、有効用量の上記ＡＤＣは、被験体へと、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて、または１カ月に１回未満投与する。ある特定の実施形態では、有効用量の上記ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣを、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、または数年間を含む期間にわたって、複数回投与することができる。さらに他の実施形態では、開示される抗体またはＡＤＣの投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もあり、なおまたは１年間もしくは数年間が経過する場合もある。
【０２３５】
ある特定の好ましい実施形態では、コンジュゲート抗体を伴う処置コースは、選択された薬物生成物の、数週間または数カ月間の期間にわたる、複数回の投与を含む。より具体的に述べると、本発明の抗体またはＡＤＣは、毎日１回、隔日１回、４日ごとに１回、毎週１回、１０日ごとに１回、隔週１回、３週間ごとに１回、毎月１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、１０週間ごとに１回、または３カ月ごとに１回投与することができる。これに関して、患者の応答および臨床的慣行に基づき、投与量を変化させることもでき、投与間隔を調整することもできることが十分に理解される。
【０２３６】
投与量およびレジメンはまた、開示される治療用組成物について、１回または複数回の投与を施された個体において、経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書で記載される通りに作製された治療用組成物を、投与量を漸増させて施すことができる。選択された実施形態では、投与量は、それぞれ、経験的に決定されるかまたは観察される副作用または毒性に基づき、段階的に増加させることもでき、段階的に低減するかまたは減じることもできる。選択された組成物の有効性を評価するには、既に記載されている通り、具体的な疾患、障害、または状態についてのマーカーを追跡することができる。がんでは、これらは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定；ｘ線もしくは他のイメージング技法を介する腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善；本明細書で記載される方法に従い同定される、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）もしくは腫瘍形成性抗原についての測定；疼痛もしくは麻痺の軽減；腫瘍と関連する発話、視覚、呼吸、または他の障害の改善；食欲の増進；または容認された検査により測定される生活の質の上昇もしくは生存の延長を含む。当業者には、投与量が、個体、新生物性状態の種類、新生物性状態の病期、新生物性状態が個体における他の場所へと転移し始めたかどうか、ならびに過去に使用された処置および現在使用されている処置に応じて変化することが明らかである。
【０２３７】
Ｃ．組合せ療法
組合わせ両方は、がんを防止または処置するのに有用であり、がんの転移または再発を防止するのにも有用である。本明細書で使用される「組合せ療法」は、少なくとも１つの抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および少なくとも１つの治療用部分（例えば、抗がん剤）を含む組合せであって、好ましくは、がんの処置において、（ｉ）単独で使用される抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、もしくは（ｉｉ）単独で使用される治療用部分、もしくは（ｉｉｉ）抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣを追加せずに別の治療用部分と組み合わせた治療用部分の使用を凌駕する治療的相乗作用を有するか、または測定可能な治療効果を改善する組合せの投与を意味する。本明細書で使用される「治療的相乗作用」という用語は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣと１または複数の治療用部分との組合せであって、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣと１または複数の治療用部分との組合せの相加効果を超える治療効果を有する組合せを意味する。
【０２３８】
開示される組合せによる所望の転帰は、対照またはベースラインの測定値との比較により定量される。本明細書で使用される「〜を改善する」「〜を増加させる」または「〜を低減する」などの相対的な用語は、本明細書で記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書で記載される抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣの非存在下であるが、標準治療による処置など、他の治療用部分(複数可)の存在下の対照個体（または複数の対照個体）における測定値などの、対照と比べた値を指し示す。代表的な対照個体は、処置される個体と同じ形態のがんに罹患する個体であって、処置される個体とほぼ同じ年齢の個体である（処置される個体における病期と、対照個体における病期とが同等であることを確保するように）。
【０２３９】
治療への応答の変化または改善は一般に、統計学的に有意である。本明細書で使用される「有意性」または「有意」という用語は、２つまたはこれを超える実体の間にランダムでない関連が存在する確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるのかないのか、または「有意性」があるのかないのかを決定するために、「ｐ値」を計算することができる。使用者により定義されたカットオフ点を下回るｐ値は、有意であるとみなされる。０．１未満であるかもしくはこれと等しいｐ値、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意であるとみなすことができる。
【０２４０】
相乗作用的治療効果は、単一の治療用部分または抗ＤＰＥＰ３抗体もしくはＡＤＣにより引き出される治療効果、あるいは所与の組合せの抗ＤＰＥＰ３抗体もしくはＡＤＣまたは単一の治療用部分により引き出される治療効果の総和の少なくとも約２倍大きい効果の場合もあり、少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい、または少なくとも約２０倍大きい、または少なくとも約５０倍大きい、または少なくとも約１００倍大きい効果の場合もある。相乗作用的治療効果はまた、単一の治療用部分または抗ＤＰＥＰ３抗体もしくはＡＤＣにより引き出される治療効果、あるいは所与の組合せの抗ＤＰＥＰ３抗体もしくはＡＤＣまたは単一の治療用部分により引き出される治療効果の総和と比較して、少なくとも１０％の治療効果の増加として観察される場合もあり、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、またはこれを超える治療効果の増加として観察される場合もある。相乗効果はまた、治療剤を組み合わせて使用する場合に、それらの投与の低減を可能とする効果でもある。
【０２４１】
組合せ療法を実施するには、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣおよび治療用部分(複数可)を、被験体へと、単一の組成物により同時に投与することもでき、２つまたはこれを超える別個の組成物として、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して、同時に投与することもできる。代替的に、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣによる処置は、治療用部分による処置に、例えば、数分間〜数週間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。一実施形態では、上記治療用部分および抗体またはＡＤＣの両方を、互いから約５分間〜約２週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、上記抗体の投与と、上記治療用部分の投与との間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もある。
【０２４２】
組合せ療法は、毎日１回、２回、または３回、隔日１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごとに１回などの多様なスケジュールで、状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまで投与することもでき、持続的に投与することもできる。抗体および治療用部分(複数可)は、隔日または隔週で投与することもでき、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣによる一連の処置を施すのに続き、さらなる治療用部分による１または複数の処置を施すこともできる。一実施形態では、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、１または複数の治療用部分と組み合わせて、短い処置サイクルにわたり投与する。他の実施形態では、組合せ処置は、長い処置サイクルにわたり投与する。組合せ療法は、任意の経路を介して投与することができる。
【０２４３】
一部の実施形態では、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、多様な第一選択のがん処置と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および細胞傷害剤（例えば、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン（ironitecan）、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキサート、およびペメトレキセド）、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分の使用を含む。
【０２４４】
別の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、ビノレルビン；ゲムシタビン；例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのタキサン；イリノテカン（irinotican）；またはペメトレキセド）の使用を含む。
【０２４５】
一実施形態では、例えば、ＢＲ−ＥＲＰＲがん、ＢＲ−ＥＲがん、またはＢＲ−ＰＲがんの処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣおよび「ホルモン療法」として記載される１または複数の治療用部分の使用を含む。本明細書で使用される「ホルモン療法」とは、例えば、タモキシフェン；ゴナドトロピンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン（luteinizing  releasing  hormone）（ＧｎＲＨまたはＬＨＲＨ）；エベロリムスおよびエキセメスタン；トレミフェン；またはアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、またはフルベストラント）を指す。
【０２４６】
別の実施形態では、例えば、ＢＲ−ＨＥＲ２の処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびトラスツズマブまたはａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、ならびに、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、ペルツズマブおよび／またはドセタキセル）の使用を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、例えば、転移性乳がんの処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびタキサン（例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）、ならびに、任意選択で、さらなる治療用部分(複数可)、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシン）および／またはエリブリンの使用を含む。
【０２４８】
別の実施形態では、例えば、転移性乳がんもしくは再発性乳がんまたはＢＲＣＡ変異乳がんの処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびメゲストロール、ならびに、任意選択で、さらなる治療用部分(複数可)の使用を含む。
【０２４９】
さらなる実施形態では、例えば、ＢＲ−ＴＮＢＣの処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブ、およびベリパリブ）、ならびに、任意選択で、さらなる治療用部分(複数可)の使用を含む。
【０２５０】
別の実施形態では、例えば、乳がんの処置では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびシクロホスファミド、ならびに、任意選択で、さらなる治療用部分(複数可)（例えば、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵ、および／またはメトトレキサートの使用を含む。
【０２５１】
別の実施形態では、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびアファチニブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、エルロチニブおよび／またはベバシズマブ）の使用を含む。
【０２５２】
別の実施形態では、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびエルロチニブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、ベバシズマブ）の使用を含む。
【０２５３】
別の実施形態では、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびセリチニブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分の使用を含む。
【０２５４】
別の実施形態では、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびクリゾチニブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分の使用を含む。
【０２５５】
別の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびベバシズマブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルもしくはパクリタキセルなどの、タキサン；および／または白金類似体）の使用を含む。
【０２５６】
別の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびベバシズマブ、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、ゲムシタビンおよび／または白金類似体）の使用を含む。
【０２５７】
一実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）類似体、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどの、タキサン）の使用を含む。
【０２５８】
一実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）類似体、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどの、タキサン、ならびに／またはゲムシタビンおよび／もしくはドキソルビシン）の使用を含む。
【０２５９】
特定の実施形態では、白金抵抗性腫瘍を処置するための組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、ならびにドキソルビシンおよび／またはエトポシドおよび／またはゲムシタビンおよび／またはビノレルビンおよび／またはイホスファミドおよび／またはロイコボリン調整（leucovorin-modulated）５−フルオロウラシルおよび／またはベバシズマブおよび／またはタモキシフェン、ならびに、任意選択で、１または複数の他の治療用部分の使用を含む。
【０２６０】
別の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびＰＡＲＰ阻害剤、および、任意選択で、１または複数の他の治療用部分の使用を含む。
【０２６１】
別の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびベバシズマブ、および、任意選択で、シクロホスファミドの使用を含む。
【０２６２】
組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、および変異遺伝子もしくは変異タンパク質または発現の異常な遺伝子もしくはタンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１）を含む腫瘍に対して有効な化学療法部分を含みうる。
【０２６３】
Ｔリンパ球（例えば、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ））は、悪性腫瘍に対する宿主防御において重要な役割を果たす。ＣＴＬは、腫瘍関連抗原の、抗原提示細胞上での提示により活性化する。能動的特異的免疫療法とは、患者に、公知のがん関連抗原に由来するペプチドをワクチン接種することにより、がんに対するＴリンパ球応答を増進するのに使用されうる方法である。一実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣ、およびがん関連抗原（例えば、メラニン細胞系統特異的抗原であるチロシナーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、またはｇｐ７５）に対するワクチンを含みうる。他の実施形態では、組合せ療法は、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣの投与を、自家ＣＴＬまたは自家ナチュラルキラー細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖、活性化、および養子再導入と共に含みうる。ＣＴＬの活性化はまた、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を増強する戦略により促進することもできる。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞の動員および樹状細胞交差プライミングの活性化を促進する。一実施形態では、組合せ療法は、抗原提示細胞の単離と、このような細胞の、刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）による活性化と、腫瘍関連抗原によるプライミングと、次いで、抗原提示細胞の、患者への養子再導入であって、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣおよび、任意選択で１または複数の異なる治療用部分(複数可)の使用と組み合わせた養子再導入を含みうる。
【０２６４】
本発明はまた、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣの、放射線療法との組合せも提供する。本明細書で使用される「放射線療法」という用語は、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内に局所的に誘導するための任意の機構であって、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放射などの機構を意味する。また、放射性同位元素を、腫瘍細胞への指向性送達を使用する組合せ療法も想定され、本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３抗体との組合せで使用することもでき、本明細書で開示される抗ＤＰＥＰ３抗体によるコンジュゲートとして使用することもできる。放射線療法は、パルスで、約１〜約２週間の期間にわたり投与することが典型的である。任意選択で、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
【０２６５】
他の実施形態では、抗ＤＰＥＰ３抗体またはＡＤＣは、下記で記載される抗がん剤のうちの１または複数と組み合わせて使用することができる。
【０２６６】
Ｄ．抗がん剤
本明細書で使用される「抗がん剤」または「化学療法剤」という用語は、「治療用部分」の１つのサブセットであり、「治療用部分」とは、「薬学的活性部分」として記載される薬剤のサブセットである。より特定すると、「抗がん剤」とは、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用しうる任意の薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、ターゲティング抗がん剤、生物学的応答調節物質、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤、および免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。上記で論じた、選択された実施形態では、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことが可能であり、投与の前に抗体と会合させうることが十分に理解される。ある特定の実施形態では、開示される抗がん剤を、抗体へと連結して、本明細書で開示されるＡＤＣをもたらす。
【０２６７】
また、抗がん剤でもありうる「細胞傷害剤」という用語は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を低下させるかもしくは阻害し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。その物質は、生物に由来する天然に存在する分子（または合成により調製される天然生成物）であることが典型的である。細胞傷害剤の例は、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、ジフテリア（Diptheria）毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属内毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａによる阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓによる阻害剤、ミトゲリン（mitegellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、それらの断片および／または変異体を含む、細胞外膵臓ＲＮアーゼなどの細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）を含むがこれらに限定されない。
【０２６８】
抗がん剤は、がん性細胞、またはがん性となる可能性がある細胞もしくは腫瘍形成性の後代を発生させる可能性がある細胞（例えば、腫瘍形成性細胞）を阻害するか、または阻害するようにデザインされた、任意の化学的薬剤を含みうる。このような化学的薬剤は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内プロセスを対象とすることが多く、したがって、一般に成長および分裂が迅速ながん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、これにより、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。このような薬剤は、組合せで、例えば、ＣＨＯＰ製剤において投与されることが多く、最も有効であることが多い。ここでもまた、選択された実施形態では、このような抗がん剤を、開示される抗体へとコンジュゲートさせることができる。
【０２６９】
本発明の抗体と組み合わせて（または本発明の抗体へとコンジュゲートさせて）使用しうる抗がん剤の例は、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamine）、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エレウテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジインであるジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カンホスファミド、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（cyclosphosphamide）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファルニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ラパマイシン、ロドルビシン、ソラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤（anti-adrenal）、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン（nitraerine）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖複合体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド���イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤であって、細胞増殖を低減する阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体を含むがこれらに限定されない。この定義にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であって、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤などの抗ホルモン剤のほか；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体も含まれる。
【０２７０】
特に好ましい抗がん剤は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号：５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号：３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号：１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号：４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号：８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））など、市販の化合物または臨床で利用可能な化合物を含む。さらなる市販の抗がん剤、または臨床で利用可能なさらなる抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、���ピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有）、アルブミンで操作されたパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル（chloranmbucil）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、およびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；カペシタビン（ＸＥＲＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（タモキシフェンクエン酸塩であるＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）を含む）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェンクエン酸塩）ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン（formestanie）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
【０２７１】
「薬学的に許容される塩」または「塩」という用語は、分子または高分子の有機塩または無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成されうる。例示的な塩は、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩（acid  phosphate）、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩（gentisinate）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））を含むがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、または他の対イオンなど、別の分子の包接を伴いうる。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化する、任意の有機部分または無機部分でありうる。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に１つを超える帯電原子を有しうる。複数の帯電原子が、薬学的に許容される塩の部分である場合、塩は、複数の対イオンを有しうる。よって、薬学的に許容される塩は、１もしくは複数の帯電原子および／または１もしくは複数の対イオンを有しうる。
【０２７２】
「薬学的に許容される溶媒和物」または「溶媒和物」とは、１または複数の溶媒分子と、分子または高分子との会合を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例は、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンを含むがこれらに限定されない。
【０２７３】
他の実施形態では、本発明の抗体またはＡＤＣを、現在臨床試験中であるかまたは市販されている、多数の抗体（または免疫療法剤）のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。開示される抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シキスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ズリゴツマブ、デュシギツマブ（dusigitumab）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ（imgatuzumab）、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ランブロリズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（nofetumomabn）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＤＸ−１１０５、およびＭＥＤＩ４７３６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用することができる。
【０２７４】
他の特に好ましい実施形態は、がん治療について承認された抗体であって、リツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パチツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンを含むがこれらに限定されない抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合性のさらなる抗がん剤をたやすく同定することが可能である。
【０２７５】
Ｅ．放射線療法
本発明はまた、抗体またはＡＤＣの、放射線療法（すなわち、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内に局所的に誘導するための任意の機構であって、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放射などの機構）との組合せも提供する。また、放射性同位元素を、腫瘍細胞への指向性送達を使用する組合せ療法も想定され、開示される抗体またはＡＤＣを、ターゲティング抗がん剤または他のターゲティング手段との関連で使用することもできる。放射線療法は、パルスで、約１〜約２週間の期間にわたり投与することが典型的である。放射線療法は、頭頸部がんを有する被験体には、約６〜７週間にわたり投与することができる。任意選択で、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
【０２７６】
ＶＩＩＩ  適応
本発明は、本発明の抗体およびＡＤＣの使用であって、新生物性障害、炎症性障害、血管新生性障害、および免疫障害、ならびに病原体により引き起こされる障害を含む多様な障害の診断、治療診断、処置、および／または予防のための使用を提供する。特に、処置の鍵となる標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態であるが、血液悪性腫瘍も、本発明の範囲内にある。ある特定の実施形態では、本発明の抗体を使用して、特定の決定基（例えば、ＤＰＥＰ３）を発現する腫瘍または腫瘍形成性細胞を処置する。処置される「被験体」または「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本明細書で使用される通り、その用語は明示的には、任意の哺乳動物種を含むものとする。
【０２７７】
本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、良性の場合もあり、悪性の場合もあり；充実性腫瘍の場合もあり、他の血液新生物の場合もあり、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、自律神経節腫瘍（autonomic  ganglia  tumor）、膀胱がん（扁平上皮癌および移行上皮癌）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（fibrogenesis  imperfecta  ossium）、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、胃がん、消化器疾患、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、腺障害、頭頸部がん、視床下部がん、腸がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、マクロファージ障害、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質細胞障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん（子宮頸癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）を含むがこれらに限定されない群から選択することができる。
【０２７８】
他の好ましい実施形態では、開示される抗体およびＡＤＣは、以下の亜型：小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がんまたは扁平上皮小細胞肺がん）を含む肺がんを処置するときに、とりわけ有効である。選択された実施形態では、抗体およびＡＤＣは、限局期疾患を呈示する患者に投与することもでき、伸展期疾患を呈示する患者に投与することもできる。他の好ましい実施形態では、開示されるコンジュゲート抗体を、難治性患者（すなわち、初期治療のコースの間またはこれを完了した直後にその疾患が再発する難治性患者）；感受性の患者（すなわち、その再発が一次治療後２〜３カ月超である患者）；または白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）および／またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、またはカバジタキセル）に対する抵抗性を呈示する患者へと投与する。
【０２７９】
特に好ましい実施形態において、開示される抗体およびＡＤＣは、卵巣漿液性癌および卵巣漿液性乳頭状癌を含む卵巣がんの処置において有効である。
【０２８０】
本発明はまた、良性腫瘍または前がん性腫瘍を示す被験体の防止的処置または予防的処置も提供する。特定の種類の腫瘍または増殖性障害も、本発明の抗体を使用する処置から除外されない。
【０２８１】
ＩＸ  製品
本発明は、１または複数の容器を含む、医薬パックおよび医薬キットを含み、この場合、容器は、１回または複数回の投与分の、本発明の抗体またはＡＤＣを含みうる。ある特定の実施形態では、パックまたはキットは、単位投与量を含有するが、これは、所定量の組成物であって、例えば、１または複数のさらなる薬剤、および、任意選択で、１または複数の抗がん剤を伴うかまたは伴わずに、本発明の抗体またはＡＤＣを含む組成物を意味する。
【０２８２】
本発明のキットは一般に、適切な容器内に、本発明の抗体またはＡＤＣによる、薬学的に許容される製剤を含有し、任意選択で、同じ容器内または異なる容器内に、１または複数の抗がん剤を含有する。キットはまた、診断または組合せ療法のための、他の薬学的に許容される製剤またはデバイスも含有しうる。診断用デバイスまたは診断用計器の例は、増殖性障害と関連する細胞またはマーカー（このようなマーカーの完全なリストについては、上記を参照されたい）を検出、モニタリング、定量、またはプロファイリングするのに使用しうるデバイスまたは計器を含む。特に好ましい実施形態では、デバイスを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照されたい）。さらに他の好ましい実施形態では、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含みうる。本発明により想定されるキットはまた、本発明の抗体またはＡＤＣを、抗がん剤または診断剤と組み合わせるのに適する試薬も含有しうる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９を参照されたい）。
【０２８３】
キットの構成要素を、１または複数の溶液で提供する場合、溶液は、非水性溶液の場合もあるが、水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キットにおける製剤はまた、適切な液体を添加すると再構成されうる、乾燥粉末(複数可)または凍結乾燥形態として提供することもできる。再構成のために使用される液体は、別個の容器内に含有されうる。このような液体は、注射用の静菌水、リン酸緩衝食塩液、リンゲル液、またはデキストロース溶液など、滅菌の、薬学的に許容される緩衝剤または他の希釈剤を含みうる。キットが、本発明の抗体またはＡＤＣを、さらなる治療剤(複数可)または薬剤(複数可)と組み合わせて含む場合、溶液は、モル等量の組合せであらかじめ混合することもでき、１つの構成要素を他の構成要素に対して過剰としてあらかじめ混合することもできる。代替的に、本発明の抗体またはＡＤＣ、および任意選択による任意の抗がん剤または他の薬剤は、患者への投与の前は、区別可能な容器内に、個別に維持することもできる。
【０２８４】
キットは、１または複数の容器、および容器(複数可)内、容器(複数可)上における表示もしくは添付文書、または容器(複数可)と関連する表示もしくは添付文書であって、封入された組成物が、えり抜きの疾患状態を診断または処置するために使用されることを指し示す表示または添付文書を含みうる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器(複数可)は、滅菌アクセスポートを含みうる、例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下注射用注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある。
【０２８５】
一部の実施形態では、キットは、抗体および任意選択による任意の構成要素を患者に投与するための手段、例えば、１または複数の注射針もしくはシリンジ（あらかじめ充填されるかまたは空の）、点眼器、ピペット、または他のこのような器具であって、それにより製剤を被験体へと注入もしくは導入するか、または身体の疾患領域へと適用する器具を含有しうる。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を、市販用の密閉容器（close  confinement）であって、例えば、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器であり、所望のバイアルおよび他の器具を入れて保持するプラスチック容器などの密閉容器に収納するための手段も含むことが典型的である。
【０２８６】
Ｘ  その他
本明細書でそうでないことが定義されない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要請されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で提示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、２．０〜３．０の範囲は、２．０、３．０、および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０２８７】
当技術分野では一般に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、および化学の技法が周知であり、一般に使用されている。本明細書で、このような技法との関連で使用される用語法はまた、当技術分野でも一般に使用されている。そうでないことが示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書を通して引用される、多様な参考文献において記載されている、従来の方法に従い実施される。
【０２８８】
ＸＩ  参考文献
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、ヌクレオチド配列の寄託、ならびに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列の寄託、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、注釈を施されたコード領域からの翻訳を、例えば、含む）についての完全な開示は、特定の参考文献との関連で「参照により組み込まれた」という語句が使用されているのかいないのかに関わらず、参照により組み込まれる。前出の詳細な記載および後続の実施例は、理解の明確さのためだけに与えられる。そこから不要な限定がなされるわけではないものと理解されたい。本発明は、示され、記載される、正確な詳細に限定されるわけではない。特許請求の範囲により定義される本発明には、当業者に明白な変化も含まれる。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される内容を限定するとはみなさないものとする。
【０２８９】
ＸＩＩ  配列表の概要
本出願には、多数の核酸配列およびアミノ酸配列を含む配列表が添付されている。以下の表６は、含まれる配列についての概要を提示する。
【表６−１】
2017500028.tif 000016
【表６−２】
2017500028.tif 000017
【０２９０】
上記の表６はさらに、図５Ａおよび５Ｂで描出される例示的なＣＤＲと関連する配列番号を同定するのにも使用することができる。図５Ａおよび５Ｂは、各重鎖可変領域（ＣＤＲＨ）配列および軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ）配列についての３つのＫａｂａｔ  ＣＤＲを描示し、上記の表３は、選択されるヒト化抗体について、軽鎖の各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３、ならびに重鎖の各ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３へと適用されうる配列番号の指定を提示する。例えば、ｈＳＣ３４．２軽鎖（配列番号１８９）は、図５Ａに示されるＣＤＲＬ１（配列番号２３２）（すなわち、ＳＡＳＱＧＩＴＮＹＬＮ）を含む。同様にまた、ｈＳＣ３４．２軽鎖のＣＤＲＬ２（配列番号２３３）も、図５Ａに示される通り（すなわち、ＹＴＳＲＬＨＳ）である。同じＣＤＲ配列はまた、付属の配列表にも提示される。
【実施例】
【０２９１】
ＸＩＩＩ  実施例
このように一般的に記載された本発明は、例示を目的として提示されるものであり、本発明を限定することを意図されるものではない、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解される。実施例は、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すように意図されるものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍の圧力である。
【０２９２】
ＰＤＸ腫瘍細胞型は、略号に続く数で表示され、特定の腫瘍細胞系を指し示す。被験試料の継代数は、試料表示に添付されるｐ０〜ｐ＃［表示中、ｐ０は、患者の腫瘍から直接得られた非継代試料を示し、ｐ＃は、試験の前に腫瘍をマウスを通して継代した回数を示す］で指し示す。本明細書で使用される、腫瘍型および亜型の略号は、以下の表７に示す。
【表７−１】
2017500028.tif 000018
【表７−２】
2017500028.tif 000019
【０２９３】
（実施例１）
全トランスクリプトームシーケンシングを使用する、差次的ＤＰＥＰ３発現の同定
がん患者において存在するときの、充実性腫瘍の細胞異質性を特徴付け、特定の表現型マーカーを使用するＴＩＣの同定の一助とし、臨床的に関与性の治療標的を同定するために、当技術分野で認知された技法を使用して、大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを開発および維持した。ＰＤＸ腫瘍バンクは、多数の個別の腫瘍細胞系を含み、元は、様々な悪性の充実性腫瘍に罹患したがん患者から得られた腫瘍細胞の、複数回の継代により、免疫不全状態のマウスにおいて増殖させた。早期継代のＰＤＸ腫瘍は、それらの天然環境における腫瘍を表し、イリノテカン（すなわち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））などの治療剤に応答することから、腫瘍の成長および現行の治療に対する抵抗性を駆動する根底的な機構に対する、臨床的に関与性の洞察がもたらされる。
【０２９４】
ＰＤＸ腫瘍細胞系からＲＮＡを生成させるため、腫瘍を、それらが８００〜２，０００ｍｍ３に達した後で、マウスから摘出し、当技術分野で認知された酵素消化技法（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）を使用して、単一細胞懸濁物へと解離させた。えり抜きの解離させたＰＤＸ腫瘍細胞調製物から、マウス細胞を枯渇させ、それらによる、ＴＩＣ亜集団のマーカーであるＣＤ４６ｈｉおよびＣＤ３２４＋（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ２０１３／０２６０３８５、同２０１３／００６１３４０、および同２０１３／００６１３４２を参照されたい）の発現に基づき分取した。ヒトＥｐＣＡＭを発現する細胞であって、ＣＤ４６ｈｉ／ＣＤ３２４＋表現型を伴う細胞（すなわち、ＴＩＣ）、またはヒトＥｐＣＡＭを発現する細胞であって、ＣＤ４６ｌｏ／−／ＣＤ３２４＋表現型を伴う細胞（すなわち、ＮＴＧ細胞）を、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞分取器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＦＡＣＳにより単離し、製造業者の指示に従い、ＲＬＴｐｌｕｓ  ＲＮＡ溶解緩衝液中で溶解した。次いで、溶解物を、−８０℃で保存し、ＲＮＡ抽出のために融解した。融解させたら、販売元の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを抽出し、次いで、ここでもまた、製造業者のプロトコールおよび推奨される計器設定を使用して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、定量した。結果として得られる全ＲＮＡ調製物を、遺伝子シーケンシングおよび遺伝子発現解析により評価した。
【０２９５】
適格な高品質のＲＮＡに対する全トランスクリプトームシーケンシングは、２つの異なるシステムを使用して実施した。一部の試料は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）４．５システム、またはＳＯＬｉＤ  ５５００ｘｌ次世代シーケンシングシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して解析した。他の試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００または２５００次世代シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して解析した。
【０２９６】
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム解析は、低投入総ＲＮＡのためにデザインされた、ＡＢＩ製の改変全トランスクリプトームプロトコール、またはＯｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して、１ｎｇの全ＲＮＡ試料から生成したｃＤＮＡを用いて実施した。結果として得られるｃＤＮＡライブラリーを断片化し、バーコードアダプターを付加して、シーケンシングの実行の間に、断片ライブラリーの、異なる試料からのプーリングを可能とした。ＳＯＬｉＤプラットフォームにより生成されたデータは、３４，６０９の遺伝子（公開されているヒトゲノムについてのＮＣＢＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｈｇ１９．２を使用して、ＲｅｆＳｅｑ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４７により注釈を施された）へとマッピングされ、大半の試料中のＲＮＡレベルについての検証可能な測定値をもたらした。ＳＯＬｉＤプラットフォームによるシーケンシングデータは名目上、遺伝子のエクソン領域へとマッピングされたＲＰＭ（１００万個あたりのリード（ｒｅａｄ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））計量またはＲＰＫＭ（１００万個あたりのキロ塩基あたりのリード（ｒｅａｄ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））計量を使用して、転写物発現値として表されており、基礎的遺伝子発現解析を、ＲＰＭ＿ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔまたはＲＰＫＭ＿Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔとして正規化し、数え上げることを可能とする。
【０２９７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ全トランスクリプトーム解析は、５ｎｇの全ＲＮＡを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と共に使用して生成したｃＤＮＡを用いて実施した。結果として得られるｃＤＮＡは、断片化し、バーコード処理した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからのシーケンシングデータは名目上、遺伝子のエクソン領域へとマッピングされたＦＰＭ（１００万個あたりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））計量またはＦＰＫＭ（１００万個あたりのキロ塩基あたりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））計量を使用して、断片発現値として表されており、基礎的遺伝子発現解析を、ＦＰＭ＿ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔまたはＦＰＫＭ＿Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔとして正規化し、数え上げることを可能とした。
【０２９８】
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトームシーケンシングの結果は、ＢＲ３６  ＰＤＸ細胞系およびＯＶ１０６ＭＥＴ  ＰＤＸ細胞系のＴＩＣ腫瘍細胞亜集団におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの発現の、正常で主要な不可欠の臓器組織であって、結腸組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織、卵巣組織、および膵臓組織を含む組織と比較した上昇を示した（図１Ａ）。同様に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ全トランスクリプトームシーケンシングも、ＯＶ２７のＴＩＣ腫瘍細胞亜集団におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの発現の、ＮＴＧ集団、ならびに結腸組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織、卵巣組織、膵臓組織、皮膚組織、脾臓組織、胃組織、および気管組織を含む正常組織と比較した上昇を示した（図１Ｂ）。ヒト乳腺腫瘍およびヒト卵巣腫瘍におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ発現の上昇を同定することにより、この抗原が、潜在的な診断標的および／または免疫療法標的としてのさらなる評価に適うことが指し示された。
【０２９９】
（実施例２） 
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する、腫瘍におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの発現
腫瘍細胞におけるＤＰＥＰ３の発現を確認するために、業界の標準的なプロトコールに従い、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを、多様なＰＤＸ細胞系に対して実施した。製造業者の指示に従い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、実施例１で記載した通りに調製された１ｎｇのＲＮＡを、ｃＤＮＡへと転換した。次いで、ＤＰＥＰ３特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用してあらかじめ増幅されたｃＤＮＡ材料を、後続のｑＲＴ−ＰＣＲ実験のために使用した。
【０３００】
正常組織（ＮｏｒｍＴｏｘまたはＮｏｒｍ）における発現を、ＯＶ−Ｓ／ＰＳ  ＰＤＸ細胞系における発現と比較した（図２Ａ；各ドットは、各個別の組織またはＰＤＸ腫瘍細胞系の平均相対発現を表し、水平方向の直線は、幾何平均を表す）。下記でより詳細に論じられる通り、ＯＶ−Ｓ／ＰＳ腫瘍の亜集団では、高度なＤＰＥＰ３の発現が観察された。ＤＰＥＰ３を発現する正常組織は、精巣、後根神経節、胃、小腸、メラニン細胞、脳、Ｂ細胞、脂肪組織、好中球、および単球を含む。「ＮｏｒｍＴｏｘ」とは、臓器の正常組織による以下の試料：動脈、静脈、後根神経節、血管平滑筋細胞、脾臓、気管、皮膚、腎臓、胃、肝臓、肺、食道、小腸、副腎、骨格筋、膵臓、心臓、および結腸であって、抗体薬物コンジュゲート治療剤の文脈で、毒性の危険性が大きな試料を表す。「Ｎｏｒｍ」と称する正常組織の別のセットは、正常組織による以下の試料：卵巣、乳房、精巣、子宮、甲状腺、末梢血単核球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球、正常骨髄、胸腺、脂肪、唾液腺、脳、前立腺、およびメラニン細胞であって、抗体薬物コンジュゲート治療剤の文脈で、毒性の危険性が小さな試料を表す。
【０３０１】
解析を、原発性ヒト腫瘍試料ならびに正常組織試料のより大きな群へとさらに拡張するために、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）ｑＰＣＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３８４ウェルアレイを使用して、上記で記載した通りに、同じＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。このアレイは、１８の異なる充実性腫瘍型にわたる、遺伝子発現の比較であって、各腫瘍型についての、複数の患者由来の試料を伴う比較を可能とする。多様な全腫瘍検体におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの発現レベル（黒色ドット）を、β−アクチンに対して正規化し、解析される各腫瘍型について、正常組織における発現（白色ドット）と比べてプロットした。増幅されなかった検体には、実験プロトコールにおける増幅の最終サイクルを表す、４５のサイクルカウント値（Ｃｔ）を割り当てた。各ドットは、単一の組織検体を表し、幾何平均値を黒線として表す。ＤＰＥＰ３の、マッチさせた正常組織と比べた過剰発現は、ＢＲ腫瘍、ＥＮ腫瘍、およびＯＶ腫瘍において認められた（図２Ｂ）。副腎、子宮頸部、結腸、食道、腎臓、肝臓、リンパ節、膵臓、前立腺、甲状腺、膀胱、および子宮を含む他の正常試料は、ＤＰＥＰ３の発現を欠いた（データは示さない）。
【０３０２】
これらのデータにより、ＤＰＥＰ３は、ＢＲ腫瘍、ＥＮ腫瘍、およびＯＶ腫瘍において発現し、これらの適応症における抗体ベースの治療剤の開発のための良好な標的でありうることが裏付けられる。
【０３０３】
（実施例３）
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓによる、腫瘍におけるＤＰＥＰ３発現
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）として公知の、腫瘍試料および正常試料の大規模な公に入手可能なデータセットを使用して、多様な腫瘍におけるＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの過剰発現を確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームによるエクソンレベル３の発現データは、ＴＣＧＡ  Ｄａｔａ  Ｐｏｒｔａｌ（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp）からダウンロードし、解析し、各遺伝子の個別のエクソンに由来するリードを統合して、マッピングされたリード１００万当たりエクソンのキロ塩基当たり単一値のリード（ＲＰＫＭ）を生成した。図３は、ＤＰＥＰ３発現が、ＯＶ腫瘍型、ＳＫ腫瘍型、ＬＵ−ＳＣＣ腫瘍型、およびＬＵ−Ａｄ腫瘍型のサブセットにおいて、ＴＣＧＡにおける正常組織試料と比較して上昇することを示す。これらのデータにより、実施例１および２における全トランスクリプトーム解析およびｑＲＴ−ＰＣＲ解析によるかつての観察であって、ＯＶ腫瘍、ＳＫ腫瘍、およびＬＵ腫瘍では、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡの上昇を見出しうるという観察が確認されることから、抗ＤＰＥＰ３抗体は、これらの腫瘍に有用な治療剤でありうることが指し示される。
【０３０４】
（実施例４）
組換えＤＰＥＰ２タンパク質および組換えＤＰＥＰ３タンパク質のクローニング
ヒトＤＰＥＰ３タンパク質およびヒトＤＰＥＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ断片
ヒトＤＰＥＰ３（ｈＤＰＥＰ３）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．Ｑ９Ｈ４Ｂ８．２）に関して、本発明で要請される、全ての分子材料および細胞材料を生成するために、全長ｈＤＰＥＰ３のオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０３７２４３［配列番号６］）をコードするｃＤＮＡクローンを購入した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。このｃＤＮＡクローンを、成熟ｈＤＰＥＰ３タンパク質またはその断片を発現する構築物に対する、全ての後続の操作のために使用した。
【０３０５】
ｈＤＰＥＰ３タンパク質に対する免疫反応性抗体または免疫特異性抗体を生成するために、ｈＤＰＥＰ３タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であって、受託物ＮＰ＿０７１７５２による残基Ａ６１〜Ｓ４８８を含むＥＣＤを、ヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２  Ｆｃタグのいずれかと、インフレームで融合させたキメラ融合遺伝子を生成した。これは、以下の通りになされた。ｈＤＰＥＰ３のＥＣＤをコードするＤＮＡ断片を、ｈＤＰＥＰ３  ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し、標準的な分子技法を使用して、ＣＭＶ駆動型発現ベクターへと、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、かつ、ヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２  Ｆｃ  ｃＤＮＡののいずれかの上流に、インフレームでサブクローニングした。ＣＭＶ駆動型ｈＤＰＥＰ３発現ベクターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および／またはＣＨＯ−Ｓ細胞において、高レベルの一過性発現を可能とする。ポリエチレンイミンポリマーを、トランスフェクト試薬として使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁培養物もしくは付着培養物または懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ｈＤＰＥＰ３−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質またはｈＤＰＥＰ３−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質のいずれかをコードする発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの３〜５日後、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒおよびＮｉｃｋｅｌ−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム、またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかをそれぞれを使用して、ｈＤＰＥＰ３−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質またはｈＤＰＥＰ３−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質を、澄明化した細胞上清から精製した。
【０３０６】
交差反応性研究用のｈＤＰＥＰ２タンパク質を生成するために、ヒトＤＰＥＰ２（ｈＤＰＥＰ２）タンパク質の主要部分をコードするｃＤＮＡクローンを、Ｏｒｉｇｅｎｅから購入したが、このクローンの翻訳産物についての、ｈＤＰＥＰ２のＲｅｆＳｅｑ受託物（ＮＰ＿０７１７５０［配列番号７］）と対比した配列解析からは、ＲｅｆＳｅｑタンパク質のアミノ末端配列の一部が、Ｏｒｉｇｅｎｅクローンからは欠けていることが示された。そこで、ＲｅｆＳｅｑタンパク質における配列に対応する、ｈＤＰＥＰ２  ＯＲＦの所望の始端をコードする、０．６２ｋＢｐの合成ＤＮＡを作製した（ＧｅｎｅＷｉｚ）。製造業者の指示に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるシームレスのクローニング技法（Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ｈＤＰＥＰ２  ＲｅｆＳｅｑに対応するタンパク質をコードする全長ＯＲＦをアセンブルした。このアセンブルされたｃＤＮＡクローンを、成熟ｈＤＰＥＰ２タンパク質またはその断片を発現する構築物に対する、全ての後続の操作のために使用した。
【０３０７】
ヒトＤＰＥＰ２タンパク質は、ｈＤＰＥＰ２タンパク質のＥＣＤであって、受託物ＮＰ＿０７１７５０による残基Ａ３３〜Ｓ４６３を含むＥＣＤを、上記のｈＤＰＥＰ３を伴うキメラ遺伝子構築物について記載したのと同じ様式により、ヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２  Ｆｃタグのいずれかと、インフレームで融合させたキメラ融合遺伝子を生成することにより作製（ｍａｄｅ）した。同様に、ヒスチジンタグ付けされた組換えｈＤＰＥＰ２またはヒトＩｇＧ２タグ付けされた組換えｈＤＰＥＰ２も、ｈＤＰＥＰ３について上記で記載した方法を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および／またはＣＨＯ−Ｓ細胞において作製（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）した。
【０３０８】
マウスＤＰＥＰ３タンパク質、ヒトＤＰＥＰ３タンパク質、およびカニクイザルＤＰＥＰ３タンパク質をコードするＤＮＡ断片
マウスＤＰＥＰ３タンパク質、ラットＤＰＥＰ３タンパク質、およびカニクイザルＤＰＥＰ３タンパク質に関する分子材料および細胞材料は、以下の通りに生成した。
【０３０９】
マウスＤＰＥＰ３タンパク質（ｍＤＰＥＰ３）については、マウスＲｅｆＳｅｑ  ＤＰＥＰ３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０８２２３６）と同一なタンパク質をコードするｃＤＮＡクローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０５１１４８［配列番号９］）を購入した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ラットＤＰＥＰ３タンパク質（ｒＤＰＥＰ３）については、ラットＲｅｆＳｅｑ  ＤＰＥＰ３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１００８３８４）と同一なタンパク質をコードするｃＤＮＡクローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０８５８２６［配列番号１１］）を購入した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＰＥＰ３タンパク質（ｃＤＰＥＰ３）については、ｈＤＰＥＰ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩにおけるカニクイザル全ゲノムショットガンコンティグ配列データベースと対比してＢＬＡＳＴにかけ、カニクイザルゲノム配列内の任意のギャップを、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ゲノムから推定される配列で充填することにより、カニクイザルＤＰＥＰ３配列をまず推定した。次いで、予測されるカニクイザルＤＰＥＰ３  ＯＲＦ配列を、コドン最適化ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＷｉｚ）として合成した。
【０３１０】
これらのＤＮＡクローンを、多様なＰＣＲ反応のための鋳型として使用して、マウスＤＰＥＰ３  ＥＣＤ、ラットＤＰＥＰ３  ＥＣＤ、またはカニクイザルＤＰＥＰ３  ＥＣＤのキメラ融合遺伝子であって、ヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２  Ｆｃタグを伴うキメラ融合遺伝子を生成した。これらの構築物は、ｈＤＰＥＰ３について上記で記載した方法を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞および／またはＣＨＯ−Ｓ細胞において作製した。
【０３１１】
細胞系の操作
当技術分野で周知の分子生物学の技法を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系に形質導入するようにレンチウイルスベクターを使用して、上記で列挙された多様なＤＰＥＰ３タンパク質を過剰発現する、操作された細胞系を構築した。まず、上記で鋳型として記載した特異的ＤＮＡ断片を用い、ＰＣＲを使用して、目的のタンパク質（例えば、ｈＤＰＥＰ３、ｍＤＰＥＰ３、ｒＤＰＥＰ３、またはｃＤＰＥＰ３）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。次いで、個別のＰＣＲ産物を、レンチウイルス発現ベクターであるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位（ＭＣＳ）へとサブクローニングして、一連のレンチウイルスベクターを生成した。結果として得られるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＤＰＥＰ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター内の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、第２のタンパク質の、単一のｍＲＮＡ転写物からの、キャップに依存しない開始を可能とする。ＩＲＥＳの上流においてコードされる、ＤＰＥＰ３タンパク質の高レベルの発現は、ＩＲＥＳエレメントの下流においてコードされるＧＦＰマーカータンパク質の共発現と相関する。この一連のレンチウイルスベクターは、個別のＤＰＥＰ３タンパク質を過剰発現する、別個の安定的なＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系を作製するのに使用した。ＤＰＥＰ３陽性細胞は、高発現ＨＥＫ−２９３ＴサブクローンについてのＦＡＣＳを使用して、それらの陽性ＧＦＰシグナルに基づき選択した。
【０３１２】
（実施例５）
抗ＤＰＥＰ３抗体の生成
抗ＤＰＥＰ３マウス抗体は、以下の通りに作製した。６匹のマウス（以下の系統：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢの各々２匹ずつ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバントで乳化させた、１０μｇのｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質を接種した。初回の接種に続き、マウスに、毎週２回ずつ４週間にわたり、ＣｐＧを加えた、等体積のアラムアジュバントで乳化させた、５μｇのｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質を注射した。
【０３１３】
マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（膝窩および鼠径および内側腸骨）を切り出し、抗体産生細胞のための供給源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁物（細胞４３０×１０６個）を、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ−１５８０）と、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用するエレクトロセルフュージョンにより、１：１の比で融合させた。細胞を、アザセリン、１５％の胎仔クローンＩ血清、１０％のＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ培地からなる、ハイブリドーマ選択培地中に再懸濁させ、４つのＴ２２５フラスコ内の、フラスコ当たり１００ｍＬずつの選択培地中で培養した。フラスコは、５％のＣＯ２および９５％の空気を含有する、加湿された３７℃のインキュベーター内に、６日間にわたり入れた。
【０３１４】
融合の後、ハイブリドーマライブラリー細胞を、フラスコから回収し、９０μＬの補充されたハイブリドーマ選択培地（上記で記載した）中に、ウェル当たり細胞１個で、１２のＦａｌｃｏｎ  ３８４ウェルプレートへと播種した（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞分取器を使用して）。ライブラリーの残りは、液体窒素中で保存した。
【０３１５】
ハイブリドーマは、１０日間にわたり培養し、以下の通りに実施されるフローサイトメトリーを使用して、上清を、ｈＤＰＥＰ３に特異的な抗体についてスクリーニングした。フローサイトメトリーは、以下の通りに実施した。ウェル当たり１×１０５個の、ｈＤＰＥＰ３を安定的に形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２５μＬのハイブリドーマ上清と共に、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で１：３００に希釈された、試料当たり２５μＬずつのＤｙｅＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションの１５分後、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩを伴うＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁させ、アイソタイプ対照抗体で染色された細胞の蛍光を超える蛍光についてのフローサイトメトリーにより解析した。使用されなかった残りのハイブリドーマライブラリー細胞は、将来のライブラリー試験およびライブラリースクリーニングのために、液体窒素中で凍結させた。
【０３１６】
ｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓによる免疫行動（immunization  campaign）により、ｈＤＰＥＰ３を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の表面に結合した多数のマウス抗体がもたらされた。
【０３１７】
（実施例６）
抗ＤＰＥＰ３抗体の特徴
多様な方法を使用して、生成した抗ＤＰＥＰ３抗体（実施例５）を、アイソタイプ、ｈＤＰＥＰ３に対するアフィニティー、ｈＤＰＥＰ１、ｈＤＥＰ２、ｍＤＰＥＰ３、ｒＤＰＥＰ３、およびｃＤＰＥＰ３との交差反応性、結合の動態について特徴付けし、それぞれの抗体により占有される固有のエピトープビンを確立した。
【０３１８】
代表的な数の抗体のアイソタイプは、製造業者のプロトコールに従い、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘマウス免疫グロブリンアイソタイプ解析キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して決定した。固有のＤＰＥＰ３特異的抗体についての結果は、図４に見ることができる。
【０３１９】
抗ＤＰＥＰ３抗体は、ＥＬＩＳＡにより、マウスＤＰＥＰ３、ラットＤＰＥＰ３、およびカニクイザルＤＰＥＰ３との交差反応性についてスクリーニングし、最も近縁のＤＰＥＰ３ファミリーメンバーであるｈＤＰＥＰ２との交差反応性についてもスクリーニングした。ＥＬＩＳＡは、以下の通りに実行した。プレートは、０．２Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．４中に、０．３μｇ／ｍＬの、精製されたマウスＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ、ラットＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ、もしくはカニクイザルＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ、またはｈＤＰＥＰ２−Ｈｉｓで、４℃で一晩にわたりコーティングした。タンパク質溶液を除去し、ウェルを、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で、３７℃で１時間にわたりブロッキングした。次いで、ＰＢＳＡ中１μｇ／ｍＬ  ５０μＬの抗ＤＰＥＰ３抗体またはマウスアイソタイプ対照抗体を、室温で１時間にわたり添加した。水による洗浄の後、ＰＢＳＡ中で１：１０，０００に希釈された、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、室温で３０分間にわたり添加した。プレートを洗浄し、室温で、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより発色させた。等体積の０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させた。次いで、試料を、分光光度計により、ＯＤ４５０で解析した。ＯＤ４５０がバックグラウンドの１．５倍超を有する試料を、交差反応性とみなした。例示的なＤＰＥＰ３特異的抗体についての交差反応性の結果は、図４に見ることができる。
【０３２０】
抗体の、ｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓに対するアフィニティーは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＲＥＤにより以下の通りに生成された反応速度曲線から定性的に決定した。抗ＤＰＥＰ３抗体は、接触時間を３分間とし、流速を１０００ｒｐｍとして、抗マウスＦｃ捕捉バイオセンサーへと固定した。捕捉された抗体ローディングは、ベースラインから０．３〜１単位で一定であった。抗体の捕捉および３０秒のベースラインの後、バイオセンサーを、４分間の会合相にわたり、２００ｎＭのｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ溶液中に浸漬するのに続いて、振とう速度を１０００ｒｐｍとする３分間の解離相にかけた。バイオセンサーは、各サイクルの後で、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７へと浸漬することにより再生した。データは、対照マウスＩｇＧによる表面応答を、特異的抗体応答から減じることにより処理し、会合相および解離相に対してトランケートした。会合曲線および解離曲線を使用して、選択された抗体のアフィニティーを定性的に推定した。図４は、えり抜きの抗体のアフィニティーを示し、ｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓに対する見かけの推定アフィニティー（ＫＤ）が５ｎＭ未満の抗体を「＋＋＋」で表示し、推定ＫＤが５〜１０ｎＭの抗体を「＋＋」で表示し、推定ＫＤが１０ｎＭを超える抗体を「＋」で表示する。「ＮＤ」という表示は、推定ＫＤが決定されなかったことを意味する。
【０３２１】
多数の抗ＤＰＥＰ３抗体のアフィニティーは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により確認した。抗マウス抗体捕捉キットを使用して、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体を、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。各抗原注入サイクルの前に、濃度を０．１〜２μｇ／ｍＬとするマウス抗体を、接触時間を２分間とし、流速を５μＬ／分として表面上で捕捉した。抗体の捕捉後およびベースライン後、実施例４で記載した通りに生成した、単量体のｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ抗原を、多様な濃度で、２〜４分間の会合相に続いて、４〜１５分間の解離相にわたり、流速を５μＬ／分として、表面上に流した。データは、対照非結合性抗体による表面応答を、特異的抗体による表面応答から減じることにより処理し、会合相および解離相に対してトランケートした。結果として得られる反応曲線を使用して、１：１のラングミュア結合モデルに当てはめ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して計算されたｋｏｎ反応速度定数およびｋｏｆｆ反応速度定数を使用して、見かけのアフィニティーを生成した（データは示さない）。抗ヒト抗体捕捉キットを使用して、類似のプロトコールを、ヒト化抗体（ｈＳＣ３４．２、ｈＳＣ３４．１１、ｈＳＣ３４．１４、ｈＳＣ３４．２５、ｈＳＣ３４．２８、ｈＳＣ３４．３８、ｈＳＣ３４．８７（実施例８を参照されたい））のアフィニティーを測定して、ｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質、ｒＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質、ｈＤＰＥＰ１−Ｈｉｓタンパク質、およびｈＤＰＥＰ２タンパク質との交差反応性を確認するのにも使用した。被験抗体のうちのいずれも、ラットＤＰＥＰ３−ＨｉｓまたはｈＤＰＥＰ１−Ｈｉｓと交差反応性であるとは見出されなかった。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイで調べた抗体のうちで、ｈＤＰＥＰ２−Ｈｉｓと交差反応性であることが見出されたのは、ｈＳＣ３４．１４だけであった。
【０３２２】
抗体のビニングを、多様な抗ＤＰＥＰ３抗体について決定した。製造業者の指示に従い、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＲＥＤを使用して、同じエピトープビンまたは異なるエピトープビンに結合する競合抗体を同定した。基準抗ＤＰＥＰ３抗体（Ａｂ１）は、抗マウス捕捉チップへと捕捉し、次いで、高濃度の非結合性抗体を使用して、チップをブロッキングし、ベースラインを収集した。次いで、単量体の組換えｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓ（実施例４による）を、特異的抗体（Ａｂ１）により捕捉し、チップを、対照としての同じ抗体（Ａｂ１）を伴うウェル内、または異なる被験抗体（Ａｂ２）を伴うウェル内に浸漬した。新規の抗体とのさらなる結合が観察されれば、Ａｂ１とＡｂ２とは、異なるビン内にあると決定した。結合レベルを対照Ａｂ１と比較することにより決定される、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ２は、同じビン内にあると決定した。このプロセスを拡張して、固有のビンを表す９６ウェルプレートにおける行全体にわたる抗体を使用して、固有の抗体の大規模ライブラリーについてスクリーニングすることができる。図４に示される競合アッセイの結果により、スクリーニングされた抗体は、ｈＤＰＥＰ３タンパク質についての、少なくとも４つの固有のビン（Ａ〜Ｄ）であって、各群またはビンのメンバーが、ｈＤＰＥＰ３タンパク質への結合について、互いと競合するビンへと群分けしうることが裏付けられる。「ビンＵ」と称する第５のビンは、ビンＡ〜Ｄ内の抗体とは競合しないが、互いと結合について競合し得る抗体を含有する。
【０３２３】
（実施例７）
抗ＤＰＥＰ３抗体の配列決定
抗ＤＰＥＰ３抗体は、上記で記載した通りに生成し、次いで、配列決定した。選択されたハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解させて、ＲＮＡを調製した。１０４〜１０５個の間の細胞を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させ、２００μＬのクロロホルムを添加した後で、強く振とうした。次いで、試料を、４℃で１０分間にわたり遠心分離し、水性相を、新しいマイクロ遠心管へと移し、等体積の７０％エタノールを添加した。試料を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラム上にロードし、２ｍＬの回収試験管に配置し、製造業者の指示に従い処理した。全ＲＮＡは、１００μＬのＲＮａｓｅ非含有水を用いる溶出により、スピンカラム膜へと直接抽出した。３μＬを、１％アガロースゲル中に分画することにより、ＲＮＡ調製物の品質を決定してから、使用するまで−８０℃で保存した。
【０３２４】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な、３’マウスＣγプライマーと組み合わせて、完全なマウスＶＨレパートリーを標的とするようにデザインされた、３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む、５’プライマーミックスを使用して増幅した。同様に、カッパ軽鎖を増幅および配列決定するために、ＶＫマウスファミリーの各々を増幅するようにデザインされた、３２の５’ＶＫリーダー配列を含有するプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に対して特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用した。ＶＨ転写物およびＶＬ転写物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、以下の通りに増幅した。各ハイブリドーマについて、４回はＶＫ軽鎖についてであり、４回はＶγ重鎖についてである、のべ８回にわたるＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマーのいずれか０．５μＬ（ＩＤＴにより特注で合成された）、５倍濃度のＲＴ−ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素ミックス１μＬ、ならびにリボヌクレアーゼ阻害剤であるＲＮａｓｉｎ０．４μＬ（１単位）を含んだ。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間のＲＴステップに続く、（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間）による３０サイクルであった。次いで、７２℃で１０分間にわたる最終インキュベーションを施した。
【０３２５】
抽出されたＰＣＲ産物は、上記で記載した可変領域の増幅のためのプライマーと同じ、特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。ヌクレオチド配列は、配列相同性が最高度である、生殖細胞系列のＶ遺伝子メンバー、Ｄ遺伝子メンバー、およびＪ遺伝子メンバーを同定するように、ＩＭＧＴ配列解析ツール（http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequuence_analysis.html）を使用して解析した。図５Ａは、４２の新規のマウス抗ＤＰＥＰ３抗体のＶＬ鎖の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜１８５、奇数）について描示し、図５Ｂは、同じ４２の新規のマウス抗ＤＰＥＰ３抗体のＶＨ鎖の連続アミノ酸配列（配列番号２３〜１８７、奇数）について描示する。図５Ａおよび５Ｂに表示されるＣＤＲ領域およびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔら（前出）に準拠して解析し、Ａｂｙｓｉｓデータベースの所有権のあるバージョンを使用して決定した。まとめると、図５Ａおよび５Ｂは、４２のマウス抗ＤＰＥＰ３抗体の、注釈の施された可変領域配列であって、ＳＣ３４．２、ＳＣ３４．４、ＳＣ３４．５、ＳＣ３４．６（ＳＣ３４．２１の複製）、ＳＣ３４．７、ＳＣ３４．１１、ＳＣ３４．１３、ＳＣ３４．１４、ＳＣ３４．１６、ＳＣ３４．１８、ＳＣ３４．１９、ＳＣ３４．２０、ＳＣ３４．２３、ＳＣ３４．２４、ＳＣ３４．２５、ＳＣ３４．２６、ＳＣ３４．２７、ＳＣ３４．２８、ＳＣ３４．３３、ＳＣ３４．３６、ＳＣ３４．３８、ＳＣ３４．３９、ＳＣ３４．４０、ＳＣ３４．４１（ＳＣ３４．６１の複製）、ＳＣ３４．４６、ＳＣ３４．４８、ＳＣ３４．４９、ＳＣ３４．５０、ＳＣ３４．５３、ＳＣ３４．５８、ＳＣ３４．６３、ＳＣ３４．６７、ＳＣ３４．７１、ＳＣ３４．７６、ＳＣ３４．７８、ＳＣ３４．８３、ＳＣ３４．８６、ＳＣ３４．８７、ＳＣ３４．８９、ＳＣ３４．９０、ＳＣ３４．９１、およびＳＣ３４．９５と称する配列を提示する。図５Ｃは、図５Ａおよび５Ｂの各アミノ酸配列に対応する核酸配列（配列番号２０〜１８６、偶数）を示す。
【０３２６】
（実施例８）
キメラ抗ＤＰＥＰ３抗体およびヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体の作製
キメラ抗ＤＰＥＰ３抗体（マウスＶＨおよびＶＬと、ヒト定常領域とを含む）は、当技術分野で認知された技法を使用して、以下の通りに生成した。全ＲＮＡは、実施例１で記載した方法を使用して、抗ＤＰＥＰ３抗体産生ハイブリドーマから抽出し、ＲＮＡはＰＣＲ増幅した。マウス抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントに関するデータは、本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体の核酸配列（核酸配列については、図５Ｃを参照されたい）から得た。以下の制限部位：ＶＨ断片のためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＶＬ断片のためのＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを使用して、抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のフレームワーク配列に対して特異的なプライマーセットをデザインした。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、ＶＨ断片のための制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＶＬ断片のための制限酵素ＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。ＶＨおよびＶＬの消化されたＰＣＲ産物を精製し、それぞれ、ＩｇＨ発現ベクターまたはＩｇＫ発現ベクターへとライゲーションした。ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物、ならびに２５ｎｇの直鎖化ベクターＤＮＡを伴う１０μＬの総体積中で実施した。コンピテントのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレートへと、１００μｇ／ｍＬの濃度で播種した。増幅されたライゲーション産物の精製および消化に続き、ＶＨ断片を、ＨｕＩｇＧ１を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）（ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位へとクローニングし、ＶＬ断片を、ヒトカッパ軽鎖定常領域を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）（ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位へとクローニングした。
【０３２７】
選択されたキメラ抗体は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターの共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１５０ｍｍプレート内、１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の標準的条件下で培養した。一過性トランスフェクションのため、細胞を、８０％のコンフルエンシーまで成長させた。ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１ベクターＤＮＡおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−ＫａｐｐａベクターＤＮＡの各々１２．５μｇずつを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクション試薬へと添加した。該ミックスを、室温で３０分間にわたりインキュベートし、細胞へと添加した。上清を、トランスフェクションの３〜６日後に採取した。８００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により、組換えキメラ抗体を含有する培養物上清を、細胞破砕物から分離し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、プロテインＡビーズで精製した。
【０３２８】
所有権のある、コンピュータ支援型ＣＤＲグラフティング法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）および標準的な分子操作技法を使用して、以下の通りに、マウス抗ＤＰＥＰ３抗体（キメラ抗体を生成するのに使用したのと同じ抗体）をヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域は、フレームワーク配列とヒト生殖細胞系列の抗体配列のＣＤＲカノニカル構造との最高度の相同性、およびフレームワーク配列と関与性のマウス抗体のＣＤＲとの最高度の相同性に基づきデザインした。解析の目的では、アミノ酸の、ＣＤＲドメインの各々への割当ては、Ｋａｂａｔらによる番号付けに従って行った。可変領域を選択したら、それらを、合成遺伝子セグメント（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から生成した。ヒト化抗体は、キメラ抗体について上記で記載した分子法を使用して、クローニングし、発現させた。
【０３２９】
ヒト化抗体であるｈＳＣ３４．２、ｈＳＣ３４．１１、ｈＳＣ３４．１４、ｈＳＣ３４．２５、ｈＳＣ３４．２８、ｈＳＣ３４．３８、およびｈＳＣ３４．８７（図５Ａおよび５Ｂ；配列番号１８９〜２１５、奇数）のＶＬアミノ酸配列およびＶＨアミノ酸配列は、対応するマウス抗体のＶＬアミノ酸配列およびＶＨアミノ酸配列から導出した（例えば、ｈＳＣ３４．２は、ＳＣ３４．２から導出した）。ヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のＶＬおよびＶＨの対応する核酸配列を、図５Ｃ（配列番号１８８〜２１４、偶数）に示す。図５Ｄが、例示的なヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体であるｈＳＣ３４．２、ｈＳＣ３４．１１、ｈＳＣ３４．１４、ｈＳＣ３４．２５、ｈＳＣ３４．２８、ｈＳＣ３４．３８、およびｈＳＣ３４．８７（配列番号２１６〜２３０）の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示すのに対し、図５Ｅ〜５Ｋは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法、およびＣｏｎｔａｃｔ法により決定される、マウス供給源抗体（すなわち、ＳＣ３４．２、ＳＣ３４．１１、ＳＣ３４．１４、ＳＣ３４．２５、ＳＣ３４．２８、ＳＣ３４．３８、およびＳＣ３４．８７）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【０３３０】
選択された抗体の好適な特性を維持するために、ｈＳＣ３４．１４およびｈＳＣ３４．３８のＶＨにおける、それぞれ、９４位および９３位に、単一のフレームワーク修飾だけを施した（下記の表８を参照されたい）。
【表８】
2017500028.tif 000020
【０３３１】
（実施例９） 
腫瘍におけるＤＰＥＰ３タンパク質の発現
実施例１および２で記載した多様な腫瘍と関連する、ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡ転写物レベルの上昇を踏まえ、ＤＰＥＰ３タンパク質発現はまた、ＰＤＸ腫瘍でも上昇するのかどうかについて調べる作業を行った。ＤＰＥＰ３タンパク質発現を検出および定量するため、ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光ＤＰＥＰ３サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
【０３３２】
ＰＤＸ腫瘍をマウスから摘出し、ドライアイス／エタノール上で瞬時凍結させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、融解させた腫瘍片へと添加し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、腫瘍を細かく砕いた。遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間、４℃）により溶解物を澄明化して、各溶解物における総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量した。次いで、タンパク質溶解物を、５ｍｇ／ｍＬへと正規化し、アッセイするまで、−８０℃で保存した。正常組織溶解物は、商業的供給元から購入した。
【０３３３】
溶解物試料に由来するＤＰＥＰ３タンパク質濃度は、ヒスチジンタグ付けされた精製組換えＤＰＥＰ３タンパク質（実施例４による）を使用して生成されたタンパク質濃度検量線から、値を内挿することにより決定した。ＤＰＥＰ３タンパク質検量線およびタンパク質定量アッセイは、以下の通りに実行した。
【０３３４】
ＭＳＤ標準プレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＳＣ３４．１４抗体１５μＬにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、３５μＬのＭＳＤ  ３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ溶液中で、１時間にわたり振とうしながら、ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴで再度洗浄した。また、１０％のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを含有するＭＳＤ  １％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ中で１０倍希釈された溶解物（または系列希釈された組換えＤＰＥＰ３標準物質）１０μＬも、ウェルへと添加し、２時間にわたり振とうしながら、インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで再度洗浄した。次いで、ＳＣ３４．９６抗体を、スルホタグ付けし（sulfo-tagged）、１０μＬのタグ付けされたＳＣ３４．９６を、洗浄されたプレートへと、室温、ＭＳＤ  １％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ中０．５μｇ／ｍＬで、１時間にわたり振とうしながら、添加した。プレートを、ＰＢＳＴで洗浄した。界面活性剤を伴うＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを、水中で１倍に希釈し、３５μＬを、各ウェルへと添加した。プレートを、統合型ソフトウェア解析プログラムを使用して、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００上で読み取って、検量線からの内挿を介して、ＰＤＸ試料におけるＤＰＥＰ３濃度を導出した。次いで、値を、総タンパク質濃度で除して、総溶解物タンパク質ミリグラム当たりのＤＰＥＰ３のナノグラムをもたらした。結果として得られる濃度を、各スポットが、単一のＰＤＸ腫瘍細胞系から導出されたＤＰＥＰ３タンパク質濃度を表す、図６に示す。各スポットは、単一のＰＤＸ系から導出されるが、大半の場合、同じＰＤＸ系に由来する複数の生体試料について調べ、値を平均して、データ点を得た。
【０３３５】
図６は、卵巣腫瘍の代表的試料が高いＤＰＥＰ３タンパク質発現を有することを示す。ＯＶ２７ＭＥＴが、高度なＤＰＥＰ３の発現（３５ｎｇ／ｍｌ）を示したのに対し、ＯＶ８７ＭＥＴは、ＤＰＥＰ３の発現を示さなかった（０ｎｇ／ｍｌ）。加えて、乳腺腫瘍のサブセットは、中程度のＤＰＥＰ３の発現を裏付けた。正常組織の溶解物（「Ｎｏｒｍ」）は、ＤＰＥＰ３タンパク質発現を示さなかった。これらのデータは、先行する実施例における、ＤＰＥＰ３発現についてのｍＲＮＡ転写データと組み合わされて、ＤＰＥＰ３は、治療的介入のための魅力的な標的を提供するという仮説を補強する。
【０３３６】
（実施例１０）
抗ＤＰＥＰ３抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、既に記載されている（Chaoら、Nat  Protoc.、１巻（２号）：７５５〜７６８頁、２００７年）酵母ディスプレイ法の変法を使用して、選択された抗ＤＰＥＰ３抗体において実施した。
【０３３７】
選択された抗ＤＰＥＰ３抗体のエピトープを同定する、さらなるスクリーニングのために、２つの方法を使用して、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の残基のサブセットを同定した。第１の方法は、ＤＰＥＰ３の表面に露出された残基を同定するために、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬおよびＤＰＥＰ１の構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）：１ＩＴＵ）を使用する、ＤＰＥＰ３の相同性のモデル化に関与する。これらの結果に基づき、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＤＰＥＰ３上のアラニンへの個別の変異を構築し、酵母ディスプレイフォーマットにおいて発現させた。結果として得られるライブラリーを、下記に示される通りにスクリーニングした。
【０３３８】
第２の方法は、選択された抗ＤＰＥＰ３抗体への結合性の喪失についてスクリーニングされたＤＰＥＰ３の変異体ライブラリーの作製に関与した。略述すると、ＤＰＥＰ３変異体のライブラリーは、クローン当たり１カ所のアミノ酸変異の標的変異誘発率のための、ヌクレオチド類似体である、８−オキソ−２’デオキシグアノシン５’−三リン酸および２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ）を使用する、エラープローンＰＣＲにより生成した。ＤＰＥＰ３変異体は、酵母ディスプレイフォーマットへと形質転換した。ライブラリーは、１：２５０の希釈率のニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０または２０ｎＭのマウス抗ＤＰＥＰ３抗体またはヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体のいずれかで染色した後、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗ニワトリ抗体およびＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。野生型ＤＰＥＰ３  ＥＣＤと比較して結合性の喪失を呈示するクローンは、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＦＡＣＳにより選択した。選択されたクローンは再成長させ、ＦＡＣＳにより、標的抗体への結合性の喪失について再スクリーニングした。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを、単離および配列決定した。必要な場合は、変異を、単一変異体ＥＣＤクローンとして、またはＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、アラニンへの点変異体として再フォーマットした。
【０３３９】
次いで、両方の方法により同定された、個々のＥＣＤ変異体クローンを、フローサイトメトリーによりスクリーニングして、コンフォメーション的に特異的な抗体のパネルにわたり、野生型ＥＣＤと比べて、結合性の喪失が認められるのかどうかを決定した。酵母ライブラリー法による変異であって、システイン、プロリン、または終止コドンに関与する変異は、ミスフォールディングを引き起こした可能性が高い変異であるために、自動的に棄却した。個々のＥＣＤ変異体クローンおよび野生型ＥＣＤは、１００ｐＭ〜３３ｎＭの範囲で目的の抗ＤＰＥＰ３抗体を染色した以外、上記で記載した通りの抗体で染色した。パネルにわたり比較したところ、目的の抗体および非競合抗体の両方への結合性の喪失を結果としてもたらす任意の点変異は、ＤＰＥＰ３のミスフォールディングを引き起こすと結論付けられた。目的の抗体による結合性の喪失だけを結果としてもたらし、パネル内の他の抗体による結合性の喪失は結果としてもたらさない任意の点変異は、ＥＣＤのフォールディングに影響を及ぼさないと結論付けられた。これらの残基は、目的の抗体のエピトープの一部であると結論付けられた。
【０３４０】
３つの例示的な抗体についてのマッピングの結果を、下記の表９に示すが、ここでは、対象の抗体が変異させたＤＰＥＰ３相同体に結合する能力と共に、特異的変異も指し示される。表９では、エピトープの成分として関与するこれらの残基を、対象の変異させた残基の前の＃で指し示す。ＤＰＥＰ３のミスフォールディングを結果としてもたらすことが見出された変異は、＊で指し示し、エピトープの成分を決定する場合には考慮しなかった。
【表９】
2017500028.tif 000021
【０３４１】
変異させた相同体から導出されたデータに基づき、被験抗体の各々について、潜在的なエピトープの成分を、すぐ下の表１０に示す。
【表１０】
2017500028.tif 000022
【０３４２】
（実施例１１）
フローサイトメトリーによる、腫瘍集団におけるＤＰＥＰ３の表面発現の検出
フローサイトメトリーを使用して、ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系の表面上および多様なＰＤＸ腫瘍細胞系の表面上のｈＤＰＥＰ３タンパク質の存在を特異的に検出する本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体の能力について評価した。
【０３４３】
ＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞またはｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、単一細胞懸濁液へと、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により採取および単離した。単離細胞を、３０分間にわたり、抗ＤＰＥＰ３抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回にわたり洗浄した。細胞を、１５分間にわたり、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで１：２００に希釈された、試料当たり５０μＬずつのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩ（生細胞を検出する）を伴うＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁させた。細胞は、抗ＤＰＥＰ３抗体を伴うＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで解析した。図７Ａにより、複数の例示的な本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体は、ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に特異的に結合することが可能であるが、親ＨＥＫ−２９３Ｔ対照細胞に結合しなかったことが示される。
【０３４４】
また、本発明の抗体が、卵巣腫瘍の腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）を含む卵巣ＰＤＸ腫瘍細胞系に結合する能力も、フローサイトメトリーを使用して評価した。卵巣ＰＤＸ腫瘍を採取し、当技術分野で認知された酵素組織消化技法を使用して解離させて、ＰＤＸ腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を得た（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）。ＰＤＸ腫瘍の単一細胞懸濁液を、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共にインキュベートして、死細胞を除外し、抗マウスＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄ抗体と共にインキュベートして、マウス細胞を同定し、抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共にインキュベートして、ヒト細胞を同定した。加えて、ＴＩＣを単離するために、腫瘍細胞を、抗ヒトＣＤ４６および／またはＣＤ３２４ならびにＥＳＡと共にインキュベートした（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１３／０２６０３８５、同２０１３／００６１３４０、および同２０１３／００６１３４２、ならびに上記の実施例１を参照されたい）。ＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄについて陽性に染色されたマウス細胞は、解析から除外した。次いで、腫瘍細胞を、抗ＤＰＥＰ３抗体を伴うＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリーにより解析した。
【０３４５】
図７Ｂ〜７Ｄは、抗ｈＤＰＥＰ３抗体であるＳＣ３４．５３により、一部のＯＶ−Ｓ  ＰＤＸ系（例えば、ＯＶ２７ＭＥＴ、ＯＶ４４）の生存ヒトＴＩＣ亜集団（黒色の実線）におけるＤＰＥＰ３タンパク質の発現が検出され、これより小さな程度ではあるが、他のＯＶ−Ｓ  ＰＤＸ系（例えば、ＯＶ７２ＭＥＴおよびＯＶ８７ＭＥＴ）におけるＤＰＥＰ３タンパク質の発現も検出された（図７Ｂ）のに対し、ＮＴＧ細胞（ＣＤ３２４またはＥＳＡを発現しない）（破線）は、抗ＤＰＥＰ３抗体による有意に低度の染色を裏付けたことを示す。また、抗ｈＤＰＥＰ３抗体であるＳＣ３４．５３により、ＯＶ−ＰＳ（例えば、ＯＶ６３ＭＥＴ、ＯＶ９１ＭＥＴ、ＯＶ１１９ＭＥＴ）（図７Ｃ）およびＯＶ−ＭＭＭＴ（例えば、ＯＶ１２４）（図７Ｄ）の生存ヒトＴＩＣ亜集団におけるＤＰＥＰ３タンパク質の、ＮＴＧ細胞と比較した発現も検出された。アイソタイプ対照抗体を用いて、染色特異性を確認した（グレーの影を付す）。ＴＩＣ細胞の表面上と、ＮＴＧ細胞の表面上とで観察される抗ＤＰＥＰ３抗体による鑑別染色についてまとめる表を、図７Ｂ〜７Ｄ内の挿入図として示すが、ここで、発現は、それぞれの腫瘍細胞亜集団についての、表示の抗ＤＰＥＰ３抗体とアイソタイプ対照との間の幾何平均蛍光強度の変化（ΔＭＦＩ）として列挙される。
【０３４６】
（実施例１２）
免疫組織化学検査およびｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用する、腫瘍表面上のＤＰＥＰ３の検出
免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を、ＰＤＸ腫瘍組織切片で実施して、腫瘍細胞におけるＤＰＥＰ３の発現および位置特定について評価した。
【０３４７】
ＩＨＣ適合性の抗ＤＰＥＰ３抗体を同定するために、本発明の多数の抗ＤＰＥＰ３抗体を使用して、ＩＨＣを、ＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞ペレットまたはＤＰＥＰ３を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットで実施した。ＩＨＣは、下記で記載される通り、当技術分野で標準的な、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットで実施した。細胞ペレットブロックからの平面状切片を切り出し、顕微鏡のスライドガラス上にマウントした。キシレンによる脱パラフィンの後で、５μｍの切片を、９９℃で２０分間にわたり、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）により前処理し、７５℃へと冷却し、次いで、ＰＢＳ中０．３％の過酸化水素での処理に続き、Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。次いで、ＦＦＰＥスライドを、ＰＢＳ緩衝液中３％ＢＳＡ中の１０％ウマ血清でブロッキングし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌへと希釈された、本発明の抗ＤＰＥＰ３一次抗体と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。ＦＦＰＥスライドは、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌへと希釈された、ビオチンコンジュゲートウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートするのに続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のインキュベーションを施した。発色の検出は、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、室温で５分間にわたり行い、組織を、マイヤーヘマトキシリン（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ）で対比染色し、アルコールで洗浄し、キシレン中に浸漬した。抗ＤＰＥＰ３抗体であるＳＣ３４．５８は、本発明の他の被験抗ＤＰＥＰ３抗体より効果的に、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットを特異的に検出することが可能であった（データは示さない）。ＳＣ３４．５８抗体が、ＤＰＥＰ３を特異的に検出する能力は、ＳＣ３４．５８抗体を、モル比で５倍過剰量のｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質と混合し、次いで、ＤＰＥＰ３を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ  ＦＦＰＥ切片と共にインキュベートする、競合実験により確認した。陽性染色の非存在により、ｈＤＰＥＰ３−Ｈｉｓタンパク質が、抗ＤＰＥＰ３  ＳＣ３４．５８抗体の、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞との結合に干渉することが裏付けられた（データは示さない）。
【０３４８】
図８Ａは、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）で解析された１２５例の原発性患者による卵巣腫瘍試料（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ）におけるｈＤＰＥＰ３の発現を示す。発現は、ＩＨＣを使用して、抗ＤＰＥＰ３  ＳＣ３４．５８抗体により検出した。膜における発現は、細胞表面染色の強度を定量し、各強度レベル（染色なしを０とし、強い染色を３とする）で染色された腫瘍細胞の百分率を反映する、最終的な「Ｈスコア」を提示する、自動式画像解析ソフトウェアパッケージ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。Ｈスコアは、以下：（０における％）×０＋（１＋における％）×１＋（２＋における％）×２＋（３＋における％）×３の通りに計算する。したがって、Ｈスコアは、０〜３００の範囲にわたる連続変数をもたらす。図８Ａは、ＴＭＡ上の腫瘍のうちの１７％が、ｈＤＰＥＰ３を発現させたことを示す。また、ＤＰＥＰ３発現は、ＤＰＥＰ３の発現が高度な（Ｈスコア＝１１３）ＯＶ２７ＭＥＴと、ＤＰＥＰ３の発現が極めて低度な（Ｈスコア＝３）ＯＶ８７ＭＥＴとを含む、多数のＰＤＸ腫瘍細胞系についても決定した。
【０３４９】
ＤＰＥＰ３  ｍＲＮＡについてのＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．０  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Wangら、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２１６６５４４）を使用して実施した。ＤＰＥＰ３について使用されるＲＮＡｓｃｏｐｅプローブは、ヌクレオチド１８７〜１６９６の間でデザインした。各試料は、全ての細胞の小胞体において位置特定される、シクロスポリン結合性タンパク質である、ペプチジルプロピルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）に対して特異的なＲＮＡｓｃｏｐｅプローブにより、ＲＮＡの完全性について品質管理した。バックグラウンドの染色は、ジアミノピメリン酸（ｄａｐＢ）ＲＮＡに対して特異的なプローブを使用して決定した。略述すると、原発性患者の卵巣腫瘍による１２５例の試料（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ）を含むＴＭＡを、熱およびプロテアーゼで前処理してから、標的オリゴプローブによるハイブリダイゼーションにかけた。次いで、前増幅用オリゴ、増幅用オリゴ、ＨＲＰ標識オリゴを、逐次ハイブリダイズさせた後、発色性沈殿物を、３，３’−ジアミノベンジジンにより発色させた。特異的なＲＮＡ染色シグナルを、褐色の点状ドットとして同定した。ＴＭＡは、ギルによるヘマトキシリンで対比染色した。ＨＡＬＯ（商標）画像解析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ）を使用して、データを解析した。具体的には、個々のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションドットを、各組織マイクロアレイコアの腫瘍領域においてカウントし、「細胞当たりの平均ドット」スコアを生成した。「細胞当たりの平均ドットスコア」が０．２０未満の全てのコアを、陰性とみなした。図８Ｂは、ＴＭＡ上で表される被験腫瘍のうちの４０％が、ｈＤＰＥＰ３を発現させたことを示す。水平方向の直線は、被験コア全てについての平均スコアを表し、これは、０．４であった。図８Ｂにおけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果は、ＤＰＥＰ３遺伝子を発現する腫瘍全体の百分率が、図８Ａで示したＩＨＣ結果であって、ＤＰＥＰ３タンパク質の発現を検出するＩＨＣ結果と比較して大きいことを示す。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの感度が、ＩＨＣアッセイより大きいためである。
【０３５０】
データは、被験卵巣腫瘍のうちの顕著な部分が、ＤＰＥＰ３を発現させ、抗ＤＰＥＰ３抗体が、卵巣がんにおいて診断的有用性を有することを裏付ける。
【０３５１】
（実施例１３）
抗ＤＰＥＰ３抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害剤の送達を容易とする
本発明の抗ＤＰＥＰ３抗体は、細胞傷害剤の、生存腫瘍細胞への送達を媒介するために、内部移行が可能であるのかどうかを決定するため、選択された抗ＤＰＥＰ３抗体と、抗マウス二次抗体ＦＡＢ断片へと連結されたサポリンとを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞殺滅アッセイを実施した。サポリンとは、リボソームを不活化させ、これにより、タンパク質の合成を阻害し、結果として細胞死をもたらす、植物性毒素である。サポリンが細胞傷害性であるのは、それがリボソームに接触した細胞の内部に限り、それ自体で内部移行することは不可能である。したがって、これらのアッセイにおける、サポリン媒介型の細胞の細胞傷害作用は、抗マウスＦＡＢ−サポリンコンジュゲートが結合したときのみ標的細胞へと内部移行する能力、およびマウス抗ＤＰＥＰ３抗体の内部移行の指標である。
【０３５２】
ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ウェル当たりの細胞５００個で、ＢＤ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと播種した。１日後、多様な濃度の精製抗ＤＰＥＰ３抗体を、２ｎＭの一定濃度の抗マウスＩｇＧ  ＦＡＢ−サポリンコンジュゲート（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、培養物へと添加した。ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、７２時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造業者の指示に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生細胞を数え上げた。二次ＦＡＢ−サポリンコンジュゲートだけと共にインキュベートされた細胞を含有する培養物を使用する未加工の発光カウント（ｒａｗ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ）を、１００％の基準値として定め、他の全てのカウントは、基準値に対する百分率として計算した。抗ＤＰＥＰ３抗体の大きなサブセットが、２０ｐＭの濃度で、ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、様々な有効性で、効果的に死滅させた（図９）のに対し、同じ濃度のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ１）は、ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を効果的に死滅させなかった。
【０３５３】
上記の結果により、抗ＤＰＥＰ３抗体が内部移行を媒介する能力、および細胞傷害性ペイロードを送達するそれらの能力が実証されることから、抗ＤＰＥＰ３抗体は、抗体薬物コンジュゲートに対するターゲティング部分としての治療的有用性を有しうるという仮説も裏付けられる。
【０３５４】
（実施例１４）
抗ＤＰＥＰ３抗体−薬物コンジュゲートの調製
上記で記載した、Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製した。各ＡＤＣは、遊離スルフヒドリル基を伴う末端マレイミド部分と、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）の二量体とを含むリンカー−薬物へと共有結合的に連結された抗ＤＰＥＰ３抗体を含んだ。全ての場合において、その構造が上記に提示されたＰＢＤ１を使用した。
【０３５５】
抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣは、当技術分野で認知された技法を使用して、以下の通りに合成および精製した。選択された抗ＤＰＥＰ３マウス抗体（ＳＣ３４．２５、ＳＣ３４．８３、ＳＣ３４．９７、およびＳＣ３４．９５）およびヒト化抗体（ｈＳＣ３４．２、ｈＳＣ３４．１１、ｈＳＣ３４．１４、ｈＳＣ３４．２５、ｈＳＣ３４．２８およびｈＳＣ３４．３８）のシステイン結合は、５ｍＭのＥＤＴＡを伴うリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中の抗体モル当たり所定のモル添加量のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）により、２０℃で９０分間にわたり部分還元した。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解したマレイミドリンカーペイロードを、抗ＤＰＥＰ３抗体モル当たり３．０モルの比で添加した。反応を３０分間にわたり進行させた。次いで、水中で調製されたＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の１０ｍＭ原液を使用して、リンカー−薬物と比較して過剰量のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチ時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを６．０へと調整し、３０ｋＤａの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、ダイアフィルトレーション緩衝液への緩衝液交換を行った。次いで、ダイアフィルトレーションを行った抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣを、スクロースおよびポリソルベート２０により、標的の最終濃度へと調合した。ＨＣ上およびＬＣ上のコンジュゲーションパーセントならびにＤＡＲ分布を決定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、最終的なＡＤＣ「ＨＩＣ精製ＤＡＲ＝２」調製物を解析した。試料はまた、ＤＡＲ＝２の種の量を、望ましくないＤＡＲ＞２の種およびＤＡＲ＜２の種と比べて決定するために、解析用ＨＩＣを使用しても解析した（実施例１６を参照されたい）。
【０３５６】
結果として得られる抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣを、ＳＣ３４．２５−ＰＢＤ１、ＳＣ３４．８３−ＰＢＤ１、ＳＣ３４．９７−ＰＢＤ１、ＳＣ３４．９５−ＰＢＤ１、ｈＳＣ３４．２−ＰＢＤ１、ｈＳＣ３４．１１−ＰＢＤ１、ｈＳＣ３４．１４−ＰＢＤ１、ｈＳＣ３４．２５−ＰＢＤ１、ｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１、およびｈＳＣ３４．３８−ＰＢＤ１と称した。
【０３５７】
（実施例１５）
部位特異的抗ＤＰＥＰ３抗体の作製
操作ヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＰＥＰ３部位特異的抗体であって、天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域と、重鎖（ＨＣ）定常領域とを含み、ＬＣ内のシステイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を形成する、ＨＣの上部ヒンジ領域におけるシステイン２２０（Ｃ２２０）を、セリンで置換した（Ｃ２２０Ｓ）抗体を構築した。アセンブルされると、ＨＣとＬＣとは、治療剤へのコンジュゲーションに適する、２つの遊離システインを含む抗体を形成する。そうでないことが注記されない限りにおいて、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらにおいて示されるＥＵ番号付けスキームに従う。
【０３５８】
操作抗体は、以下の通りに生成した。ヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体であるｈＳＣ３４．２８  ＨＣ（配列番号２０７）をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位特異的変異誘発の鋳型として使用した。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示に従い、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
【０３５９】
ｈＳＣ３４．２８の変異体であるＣ２２０Ｓ  ＨＣをコードするベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞内に、ｈＳＣ３４．２８の天然ＩｇＧ１カッパＬＣ（配列番号２０５）と共に共トランスフェクトし、哺乳動物による一過性発現系を使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体を含有する操作抗ＤＰＥＰ３部位特異的抗体を、ｈＳＣ３４．２８ｓｓ１と称した。ｈＳＣ３４．２８ｓｓ１部位特異的抗体の全長ＬＣおよび全長ＨＣのアミノ酸配列を、図５Ｄに示す（配列番号２２４および２２６）。ＬＣにおける反応性システインに、ＨＣにおける２２０位において変異させた残基と同様、下線を付す。操作抗ＤＰＥＰ３抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けて、適正な変異体が生成したことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の、あらかじめ成型された、１０％のトリス−グリシンミニゲルにおいて、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）など、還元剤の存在下および非存在下で実行した。電気泳動の後、ゲルを、コロイド状クーマシー溶液で染色した。還元条件下では、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドが観察された。このパターンは、還元条件下のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下では、バンドパターンが天然のＩｇＧ分子と異なったことから、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の非存在が示された。ＨＣ−ＨＣ二量体に対応する、９８ｋＤ近傍のバンドが観察された。加えて、遊離ＬＣに対応する微弱なバンドと、ＬＣ−ＬＣ二量体に対応する、４８ｋＤ近傍の主要なバンドも観察された。各ＬＣのＣ末端上の遊離システインのために、ある量のＬＣ−ＬＣ種の形成が予測される。
【０３６０】
（実施例１６）
選択的還元プロセスを使用する、部位特異的抗ＤＰＥＰ３抗体のコンジュゲーション
上記の実施例１５で示した通りに生成した部位特異的抗体であるｈＳＣ３４．２８ｓｓ１を、遊離スルフヒドリル基を伴う末端マレイミド部分を介して、ＰＢＤ１へとコンジュゲートさせた。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域における不対合システイン（Ｃ２１４）に最大限にコンジュゲートし、薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２を超える（ＤＡＲ＞２）ＡＤＣを最小化しながら、ＤＡＲが２（ＤＡＲ＝２）であるＡＤＣを最大化するＡＤＣである。
【０３６１】
コンジュゲーションの特異性および最終的な部位特異的ＡＤＣの均質性をさらに改善するために、ｈＳＣ３４．２８ｓｓ１抗体を、リンカー−薬物とのコンジュゲーションの前に、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）およびマイルドな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを用いて選択的に還元し、続いて、異なるＤＡＲ種を分離するのに使用される調製用疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行った。上記手順は、下記で記載される通りに実行した。
【０３６２】
ｈＳＣ３４．２８ｓｓ１の調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中、室温で最小限の１時間にわたり部分還元した。次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して、全ての調製物を、２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液への緩衝液交換を行い、還元緩衝液を除去した。次いで、結果として得られる部分還元調製物を、マレイミドリンカーを介して、室温で最小限の３０分間にわたり、ＰＢＤ１へとコンジュゲートさせた。次いで、水中で調製された１０ｍＭのＮＡＣ原液を使用して、リンカー−薬物と比較して過剰量のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチ時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０へと調整した。ｈＳＣ３４．２８ｓｓ１−ＰＢＤ１のコンジュゲート調製物を、３０ｋＤａの膜を使用して、ダイアフィルトレーション緩衝液へと緩衝液交換し、高塩緩衝液で希釈して、樹脂への結合を促進するように導電性を増加させ、次いで、Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ樹脂クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。下降塩勾配を援用して、疎水性に基づき、異なるＤＡＲ種を分離したところ、ＤＡＲ＝０の種がまず溶出し、続いて、ＤＡＲ＝１の種、ＤＡＲ＝２の種が溶出し、次いで、高ＤＡＲ種が溶出した。
【０３６３】
ＨＣ上およびＬＣ上のコンジュゲーションパーセントならびにＤＡＲ分布を決定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、最終的な抗体−薬物「ＨＩＣ精製ＤＡＲ＝２」調製物を解析した。結果は、薬物のうちの９３％は、ＬＣへとコンジュゲートし、薬物のうちの５％は、ＨＣへとコンジュゲートする（図１０Ａ）ことを示した。試料はまた、ＤＡＲ＝２の種の量を、望ましくないＤＡＲ＞２の種およびＤＡＲ＜２の種と比べて決定するように、解析用ＨＩＣを使用しても解析した。結果は、試料のうちの９６％は、ＤＡＲ＝２の種である（図１０Ｂ）ことを示した。操作構築物およびＨＩＣ精製プロセスと組み合わせた選択的コンジュゲーション法の結果として、９５％を超えるＤＡＲ＝２レベルのほか、９０％を超える軽鎖コンジュゲーションレベルももたらされたことから、最終的な試料中の高度の均質性が指し示され、コンジュゲーションは、軽鎖定常領域のＣ末端上の、所望される遊離システイン残基に実質的に限定された。
【０３６４】
（実施例１７）
抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害剤の送達を容易とする
本発明の抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣは、細胞傷害剤の、生存腫瘍細胞への送達を媒介するために、内部移行が可能であるのかどうかを決定するため、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣであるｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞殺滅アッセイを実施した。
【０３６５】
ｈＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞またはナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ウェル当たり細胞５００個で、ＢＤ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと播種した。１日後、多様な濃度の精製ｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１を、培養物へと添加した。細胞を、９６時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造業者の指示に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生細胞を数え上げた。非処理細胞を含有する培養物を使用する未加工の発光カウントを、１００％の基準値として定め、他の全てのカウントは、基準値に対する百分率として計算した。図１１は、ＤＰＥＰ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系が、ｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１  ＡＤＣに対して、ナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と比較して、はるかにより高感度であったことを示す。
【０３６６】
上記の結果は、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣが、ＤＰＥＰ３を発現する細胞への内部移行および細胞傷害性ペイロードの送達を特異的に媒介する能力を裏付ける。
【０３６７】
（実施例１８）
ヒト化抗ＤＰＥＰ３抗体薬物コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の成長を抑制する
上記の実施例１４で記載した通りに生成した抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣについて調べて、免疫不全状態のマウスにおける卵巣腫瘍の成長を抑制するそれらの能力を裏付けた。
【０３６８】
当技術分野で認知された技法を使用して、ＤＰＥＰ３を発現するＯＶ−Ｓ  ＰＤＸ腫瘍系（ＯＶ２７ＭＥＴ）と、低レベルのＤＰＥＰ３発現を呈示するＯＶ−Ｓ腫瘍細胞系（ＯＶ８７ＭＥＴ）とを、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹の皮下で成長させた。腫瘍体積およびマウスの体重を、毎週１回または２回モニタリングした。腫瘍体積が、１５０〜２５０ｍｍ３に到達したら、マウスを、処置群へと無作為に割り当て、５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンの２用量（標準治療）、１もしくは２ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１の単一用量、２ｍｇ／ｋｇの抗ハプテン対照ヒトＩｇＧ−ＰＢＤ１の単一用量、またはビヒクル対照（０．９％の食塩液もしくは５％のグルコース）のいずれかを腹腔内注射した。処置の後、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、またはマウスが発病するまで、腫瘍体積およびマウスの体重をモニタリングした。ｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１で処置されたマウスは、免疫不全の腫瘍保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて見られることが典型的な健康への有害作用以外のいかなる健康への有害作用も呈示しなかった。図１２は、ＤＰＥＰ３を発現する卵巣ＰＤＸ腫瘍（ＯＶ２７ＭＥＴ）では、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣであるｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１の投与の結果として、１００日間を超えて持続する腫瘍の抑制がもたらされたのに対し、標準治療であるシスプラチンおよび対照抗体であるＩｇＧ−ＰＢＤ１の投与の結果としては、腫瘍体積の低減がもたらされなかったことを示す。逆に、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣは、ＩＨＣ（実施例１２）、化学発光アッセイ（実施例９）、およびフローサイトメトリー（実施例１１）により測定される通り、ＤＰＥＰ３の発現レベルがはるかに低い卵巣ＰＤＸ細胞系であるＯＶ８７ＭＥＴ腫瘍では、シスプラチンまたは他の対照と比較して、影響を及ぼさなかった。
【０３６９】
ｈＳＣ３４．２８−ＰＢＤ１が、ＤＰＥＰ３を発現する卵巣腫瘍細胞を特異的に死滅させ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の成長を長期にわたり劇的に抑制する能力により、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣの、卵巣がんの治療的処置における効用がさらに確認され、特に、卵巣がんのＯＶ−Ｓ亜型の治療的処置における効用がさらに確認される。
【０３７０】
（実施例１９）
抗ＤＰＥＰ３抗体−薬物コンジュゲートによる腫瘍始原細胞頻度の低減
実施例１１で裏付けた通り、ＤＰＥＰ３の発現は、腫瘍形成性細胞と関連する。したがって、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣによる処置により、薬物抵抗性であり、腫瘍の再発および転移を促進することが公知である、ＴＩＣの頻度が低減されることを裏付けるために、例えば、下記で本質的に記載する通りに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を実施する。
【０３７１】
ＰＤＸ腫瘍（例えば、黒色腫または卵巣腫瘍）を、免疫不全状態のマウスにおいて皮下で成長させる。腫瘍体積が平均１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３のサイズになったら、マウスを、無作為に、２つの群へと分ける。一方の群に、陰性対照としての薬物へとコンジュゲートさせたヒトＩｇＧ１を腹腔内注射し、他方の群に、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣ（例えば、実施例１４および１６で調製した）を腹腔内注射する。投与の１週間後、各群から２匹ずつの代表的なマウスを安楽死させ、それらの腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液へと分散させる。次いで、実施例１で既に記載した通りに、各処置群からの腫瘍細胞を採取し、プールし、分別する。細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＨ２ｋＤ抗体および抗マウスＣＤ４５抗体で標識して、マウス細胞を検出し；ＥｐＣＡＭでヒト細胞を検出し；ＤＡＰＩで死細胞を検出する。次いで、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用するＦＡＣＳにより、結果として得られる懸濁液を分取し、ヒト腫瘍生細胞を、単離および回収する。
【０３７２】
４つのコホートのマウスに、抗ＤＰＥＰ３  ＡＤＣで処置された腫瘍から分取されたヒト生細胞１２５０、３７５、１１５、または３５個を注射する。陰性対照として、４つのコホートのマウスに、対照ＩｇＧ１  ＡＤＣで処置された腫瘍から分取されたヒト生細胞１０００、３００、１００、または３０個を移植する。レシピエントマウスにおける腫瘍は毎週測定し、個々のマウスは、腫瘍が１５００ｍｍ３に達する前に安楽死させる。レシピエントマウスは、腫瘍の成長が陽性であるかまたは陰性であるとしてスコア付けする。腫瘍の成長の陽性とは、１００ｍｍ３を超える腫瘍の成長と定義する。ポアソン分布統計（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各集団におけるＴＩＣ頻度を計算する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ａ−４】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｂ−４】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図５Ｃ−３】
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【図５Ｃ−４】
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【図５Ｃ−５】
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【図５Ｃ−６】
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【図５Ｃ−７】
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【図５Ｃ−８】
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【図５Ｃ−９】
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【図５Ｃ−１０】
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【図５Ｃ−１１】
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【図５Ｃ−１２】
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【図５Ｃ−１３】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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