(57)【要約】本発明は、個体における炎症性疾患を処置するための送達方法および構築物を提供する。ターゲティング送達アプローチは、炎症部位に存在することが見出されたエピトープを認識する抗体を利用する。前記抗体を使用して、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を炎症部位に送達し、そこでそれが補体活性化のレクチン経路を阻害する。個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を該個体に投与することを含み、該構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を該個体に投与することを含み、該構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む、方法。
【請求項２】
前記補体媒介性疾患が関節炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号４４の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、約５０〜約３８０アミノ酸長であり、配列番号４４の連続する配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記構築物がターゲティング部分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ターゲティング部分が抗体またはその断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲティング部分が、天然に存在する抗体またはその断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片が、アネキシンＩＶまたはリン脂質を認識する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記天然に存在する抗体またはその断片が、ｉ）モノクローナル抗体Ｂ４もしくはその断片、またはｉｉ）モノクローナル抗体Ｃ２もしくはその断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはその断片がアネキシンＩＶに特異的に結合する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体またはその断片が、アネキシンＩＶに対するモノクローナル抗体Ｂ４の結合を競合的に阻害する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体またはその抗体断片が、モノクローナル抗体Ｂ４と同じエピトープに結合する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アネキシンＩＶが、傷害を受けている組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体またはその断片がリン脂質に特異的に結合する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体またはその断片が、前記リン脂質に対するモノクローナル抗体Ｃ２の結合を競合的に阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはその断片が、モノクローナル抗体Ｃ２のエピトープと同じエピトープに結合する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リン脂質が、組織傷害および／または酸化的損傷を受けている組織中のまたは該組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体またはその断片がマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記構築物が融合タンパク質である、請求項３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体またはその断片および前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、ペプチドリンカーを介して連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体またはその断片がｓｃＦｖである、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体またはその断片がＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
天然に存在しないＭＡｐ４４断片を含む構築物であって、該ＭＡｐ４４断片が、配列番号４４の配列の連続する少なくとも約５０アミノ酸を含む、構築物。
【請求項２７】
前記ＭＡｐ４４断片が約１００〜約３５０アミノ酸長である、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２８】
前記ＭＡｐ４４断片が、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２９】
前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む、請求項２６に記載の構築物。
【請求項３０】
抗体またはその断片をさらに含み、該抗体またはその断片がアネキシンＩＶに特異的に結合し、（ｉ）配列番号１もしくは７の配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、配列番号２もしくは８の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号３もしくは９の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または（ｉｉ）配列番号４もしくは１０の配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、配列番号５もしくは１１の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号６もしくは１２の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３１】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１または７の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号２または８の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、および配列番号３または９の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項３０に記載の構築物。
【請求項３２】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号４または１０の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１；配列番号５または１１の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２；および配列番号６または１２の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項３０または３１に記載の構築物。
【請求項３３】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１３または１４の配列を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３４】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１５または１６の配列を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３５】
前記抗体またはその断片が、配列番号１７または１８の配列を含むｓｃＦｖである、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３６】
前記抗体またはその断片が、アネキシンＩＶに対するモノクローナル抗体Ｂ４の結合を競合的に阻害する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３７】
前記抗体またはその断片が、モノクローナル抗体Ｂ４と同じエピトープに結合する、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３８】
前記アネキシンＩＶが、組織傷害を受けているまたは受けるリスクにある組織中のまたは該組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３９】
抗体またはその断片をさらに含み、該抗体またはその断片がリン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号２５もしくは３１の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号２６もしくは３２の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号２７もしくは３３の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または（ｉｉ）配列番号２８の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号２９の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号３０の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４０】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２５または３１の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１；配列番号２６または３２の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２；および配列番号２７または３３の配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項３９に記載の構築物。
【請求項４１】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号２８の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１；配列番号２９の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２；および配列番号３０の配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項３９または４０に記載の構築物。
【請求項４２】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３４または３５の配列を含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４３】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３６の配列を含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４４】
前記抗体または断片が、配列番号３７または３８の配列を含むｓｃＦｖである、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４５】
前記抗体またはその断片が、リン脂質に対するモノクローナル抗体Ｃ２の結合を競合的に阻害する、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４６】
前記抗体またはその断片が、モノクローナル抗体Ｃ２と同じエピトープに結合する、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４７】
前記リン脂質が、組織傷害を受けているまたは受けるリスクにある組織中のまたは該組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４８】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４９】
前記抗体またはその断片がＭＤＡに結合する、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５０】
融合タンパク質である、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５１】
前記抗体またはその断片および前記ＭＡｐ４４断片が、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項５０に記載の構築物。
【請求項５２】
請求項２６〜５１のいずれか一項に記載の構築物と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項５３】
個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、有効量の請求項５２に記載の組成物を該個体に投与することを含む、方法。
【請求項５４】
個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、請求項２６〜５１のいずれか一項に記載の構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を含むベクターを該個体に投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびプラスミドからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年６月５日に出願された米国仮出願第６２／００８，４７０号（この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本出願は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片、およびその使用方法に関する。
【０００３】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって表彰された認可番号ＡＲ０５１７４９の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
補体系は、先天性免疫系の中心的部分である。補体系の活性化は、ヒトの関節リウマチ（ＲＡ）、特に非常に初期の疾患における炎症および組織損傷に寄与すると考えられている（Ｏｋｒｏｊら、２００７，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３９：５１７−５３０；Ｓｔｕｒｆｅｌｔ  ａｎｄ  Ｔｒｕｅｄｓｓｏｎ，２０１２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：４５８−４６８；Ｚｖａｉｆｌｅｒ，１９７４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１７：２９７−３０５）。ＲＡは、遺伝的および環境的要素を伴う複雑な自己免疫疾患であり、全世界の人口の約１％が罹患している（Ｈｅｌｍｉｃｋら、２００８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５８：１５−２５）。自己抗体は、特に免疫複合体（ＩＣ）の構成要素として、この疾患の炎症をトリガーする中心的な役割を果たす（Ａｒｅｎｄ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，２０１２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：５７３−５８６；Ｋｌａｒｅｓｋｏｇら、２００８，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６：６５１−６７５）。補体系は、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）および他の炎症性関節炎動物モデルにおける炎症および組織損傷の発症において主要な役割を果たすことが見出されている（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｈｉｅｔａｌａら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４５４−４５９；Ｊｉら、２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−１６８；Ｗａｎｇら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３４０−４３４７）。ＩｇＧアイソタイプのＡｂを含有するＩＣは、ＲＡ患者の関節の軟骨および滑膜に見られ、補体系の活性化を介して局所組織損傷の誘導に関与している（Ｃｏｏｋｅら、１９７５，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１８：５４１−５５１；Ｇｈｏｓｅら、１９７５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：１０９−１１７；Ｏｈｎｏ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｅ，１９７８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２１：５１６−５２７）。
【０００５】
補体系は、３つの経路：古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）および代替経路（ＡＰ）によって活性化され得る。ヒトＲＡにおける関節炎関連ＩＣのＩｇＧ  Ａｂは、補体系のＣＰおよびＡＰの両方を活性化することが以前に示されている（Ｂａｎｄａら、２００８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５８：３０８１−３０８９；Ｒａｔｎｏｆｆら、１９８３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６：３６１−３７１；Ｗｏｕｔｅｒｓら、２００６，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４：１１４３−１１５０）。ＣＡＩＡでは、遺伝子ターゲッティングおよび特定の経路成分の不活性化によって生じた補体系の経路特異的機能欠損を使用して、ＡＰのみが、開始過程および増幅ループの両方におけるその役割によって、ＣＡＩＡの発症に必要かつ十分であると結論付けられた（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２）。ＬＰの役割の欠如は、ＭＢＬ−Ａ／ＣおよびＣ４欠損マウスを使用して推測され（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｊｉら、２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−１６８；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）、ＣＰの役割の欠如は、Ｃ４およびＣ１ｑ欠損マウスを使用して推測されたが（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）、疾患はほとんど変化していなかった。
【０００６】
ＣＰは、ＩＣにおけるＡｂに対するＣ１ｑ結合によって開始され、Ｃｌｒ、Ｃｌｓが活性化され、続いて、ＣＰ  Ｃ３コンバターゼＣ４ｂ２ｂが形成される。ＬＰは、コレクチンという名称のパターン認識分子ファミリーのメンバー（このメンバーは、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、フィコリン（ヒトの３つは、Ｈ、ＬおよびＭと命名されている）およびコレクチン−１１（ＣＬ−Ｋ１とも称される）である）が、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２およびＭＡＳＰ−３）と共に、微生物の表面ならびに他の標的表面および分子上に存在する一連の特定の単糖または修飾炭水化物に結合すると開始される。注目すべきことに、ヒトでは、１つのＭＢＬが見出されているが、マウスでは、２つ（ＭＢＬ−ＡおよびＭＢＬ−Ｃ）が存在する；加えて、マウスでは、２つのフィコリン（フィコリン−Ａおよびフィコリン−Ｂ）が、コレクチン−１１と共に見出されている（Ｈａｎｓｅｎら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２６１０−２６１８；Ｋａｗａｉら、２００２，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６：２１３４−２１４５；Ｏｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，１９９８，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３６０：２２３−２３２；Ｏｈｔａｎｉら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３６８１−１３６８９）。このプロセスは、ＭＡＳＰ−１の初期関与を必要とする様式で（Ｍｏｌｌｅｒ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００７，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４１−１４９；Ｈｅｊａら、２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１０４９８−１０５０３）、ＭＡＳＰ−２の活性を通じて（Ｔｈｉｅｌら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５０６−５１０）、共通のＣＰ／ＬＰ  Ｃ３コンバターゼＣ４ｂ２ｂの形成をもたらす。ＡＰは、Ｃ３の自発的なターンオーバーによって開始され、加水分解Ｃ３（Ｈ２Ｏ）が一過性形成され、続いて、因子Ｂ（ＦＢ）が結合し、因子Ｄ（ＦＤ）によって切断され、ＡＰ開始Ｃ３コンバターゼＣ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂが生成する（Ｐａｎｇｂｕｒｎら、１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１９３０−１９３５）。Ｃ３の切断はまた、Ｃ３ｂ中の短命のチオエステルを露出させ、これが、標的表面上のアミンおよびカルボキシル基に共有結合する（Ｐａｎｇｂｕｒｎら、１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１９３０−１９３５）。３つの経路のいずれかを介してＣ３ｂが形成された後、Ｂｂの結合およびＦＤによる切断を介して増幅ループが開始されて、Ｃ３ｂＢｂ  Ｃ３コンバターゼが形成される（Ｒｏｓｅｎら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１４８３−１４８７）。
【０００７】
ＡＰはまた、標的含有分子パターンに結合したプロパージンによって（Ｋｅｍｐｅｒら、２０１０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１３１−１５５）、または付着性ＩｇＧもしくはＩｇＡによって（Ｗｏｕｔｅｒｓら、２００６，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４：１１４３−１１５０；Ｈｉｅｍｓｔｒａら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：５２７−５３３）開始され得る。加えて、マウスにおけるＡＰは、前駆ＦＤがＭＡＳＰ−１／３切断されて循環中に成熟ＦＤが形成されることに依存すること（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２９−３７）、ならびにＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３を欠くマウスは、欠陥ＡＰおよびＬＰを有することが報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８）。最近、ＭＡＳＰ−１／３−／−／ｆＨ−／−マウスは循環中に前駆ＤＦを有し、ＡＰは存在するが依然としていくらか欠陥があることが示されている（Ｒｕｓｅｖａら、２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）。しかしながら、マウスとは対照的に、機能的ＡＰは、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３を欠くと報告された患者の血清中に存在していた（Ｄｅｇｎら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９：３９５７−３９６９）。
【０００８】
ＭＢＬ、フィコリンおよびコレクチン−１１は、ＭＡＳＰ−１、−２および−３ならびに２つのさらなるタンパク質（ＭＡｐｌ９およびＭＡｐ４４。それぞれｓＭＡＰおよびＭＡＰ１としても公知である）との複合体で循環する（Ｄｅｇｎら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９：３９５７−３９６９；Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０）。ＭＡＳＰは前駆酵素として存在し、ＭＢＬ、フィコリンまたはコレクチン−１１がリガンドに結合すると活性化される。３つのタンパク質（ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−３およびＭＡｐ４４）は、ＭＡＳＰ−１遺伝子によってコードされるＲＮＡの選択的スプライシングによって形成されるｍＲＮＡから翻訳される（Ｄｅｇｎら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９：３９５７−３９６９）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、最初の５つのドメイン（ＣＵＢ１−ＥＧＦ−ＣＵＢ２−ＣＣＰ１−ＣＣＰ２）を共有するが、別のエクソンによってコードされる異なるセリンプロテアーゼドメインを有する２つのプロテアーゼである（Ｄａｈｌら、２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１２７−１３５）。ＭＡｐ４４は、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３と最初の４つのドメインを共有し、その後に、別個のエクソンによってコードされる１７個のユニークなＣ末端アミノ酸残基がある（Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０）。最初の３つのドメインは、ＭＢＬに対する結合を媒介するので、ＭＡｐ４４、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、ＭＢＬ上の同じ部位に結合する。したがって、セリンプロテアーゼドメインを欠くＭＡｐ４４は、ＭＢＬおよび他のコレクチンに対する結合についてＭＡＳＰと競合し、この機構を介してＬＰの活性を調節する（Ｄｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８）。ＭＡＳＰ−１の阻害はＭＡＳＰ−２の自己活性化を妨げ（Ｈｅｊａら、２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１０４９８−１０５０３）、ＭＡＳＰ−１を欠くマウスにはＬＰが存在しないので（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８）、ＭＡＳＰ−２の活性化は、ＭＡＳＰ−１の活性化の開始に厳密に依存する。ＭＡｐ４４はまた、ＭＢＬまたはフィコリンからＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２を離して、ＭＡＳＰ−２の活性化ならびにそれに続くＣ４およびＣ２の切断をさらに阻害し得る（Ｄｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８）。これらの活性を通じて、ＭＡｐ４４は、天然の内在性ＬＰ阻害剤であると考えられている（Ｐａｖｌｏｖら、２０１２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２２２７−２２３５）。
【０００９】
以前、補体系の様々な要素が欠損したマウスの研究では、ＣＡＩＡを媒介するためには、ＬＰおよびＣＰはいずれも不要と思われるので、ＡＰが必要かつ十分であることが示された（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）。加えて、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−３およびＭＡｐ４４を欠くマウス（ＭＡＳＰ−１／３−／−）は、おそらくは成熟ＦＤおよび機能的ＡＰを欠いていたという理由で（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８）、ＣＡＩＡに対して耐性であることが示された（Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６）。ＡＰは、ＣＡＩＡを開始および増幅し得るが、ＬＰ（およびＣＰ）もまた、疾患プロセスを開始するように機能し得る。ＬＰが、ＣＡＩＡにおいて本質的な役割を果たすことは以前に示されていなかったので、本発明者らは、フィコリン−Ａもしくは−Ｂまたはコレクチン−１１が、ＭＢＬ−Ａ／Ｃとは独立してリガンドの認識を媒介し得ると仮説した。加えて、Ｃ３の直接的なＭＡＳＰ媒介性切断（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９４：４４３−４４８）は、ＭＢＬ−Ａ／ＣまたはＣ４の非存在下であっても、Ｃ３の活性化および増幅ループの関与を可能にすることができた。認識分子とＭＡＳＰとの間の相互作用の妨害により、すべてのＭＡＳＰの内因性阻害剤としてＭＡｐ４４を使用することは、ＬＰのより完全な障害を可能にするはずである。
【００１０】
治療剤としてのＭＡｐ４４の有効性は、組織傷害または疾患に関係する補体活性化部位に対するターゲッティングによって増加され得る。天然抗体は、免疫正常者において存在し、抗体が結合する特定の抗原によって刺激されたことが知られていない個体の血清中または血漿中に見られ得る。本発明者および共同研究者らによる以前の研究では、特定の種類の天然抗体は、虚血性組織上のエピトープを認識し、虚血再灌流傷害の発症およびそれに続く進行を促進することが示されている（Ｆｌｅｍｉｎｇら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２１２６−２１３３；Ｒｅｈｒｉｇら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５９２１−５９２７）。虚血再灌流傷害ならびに乏血性ショックおよびそれに続く組織損傷は、補体およびＦｃ受容体の活性化、ならびに好中球および他の炎症細胞の動員および活性化によって引き起こされることが公知である（Ｒｅｈｒｉｇら、２００１、前掲）。リン脂質および他の細胞外または細胞内抗原（例えば、ＤＮＡ）と広く反応する単一モノクローナル抗体は、他の抗体を欠くマウス（すなわち、Ｂ細胞欠損マウス）において虚血再灌流傷害を引き起こし得ることも示されている。
【００１１】
虚血再灌流（ＩＲ）傷害は、虚血期間（血液供給の制限）後に血液供給が組織に戻ると引き起こされる組織損傷を指す。血液からの酸素および栄養分の不足は、循環の回復が、正常機能の回復ではなく炎症および酸化的損傷をもたらす状態を作り出す。虚血再灌流傷害は、出血性ショックを含む外傷性損傷および多くの他の医学的症状、例えば卒中および大血管閉塞に関連し得、主な医学的問題である。より具体的には、虚血再灌流傷害は、心臓発作、卒中、血管手術後腎不全、移植後傷害および慢性拒絶、ならびに出血が器血流の低下をもたらし、次いで急速輸液中の再灌流傷害をもたらす様々な種類の外傷性損傷において重要である。虚血再灌流傷害、または再灌流および虚血性事象に起因する傷害はまた、様々な自己免疫疾患および炎症性疾患で観察される。他の要因とは無関係に、虚血再灌流傷害は、死亡率の増加をもたらす。
【００１２】
再灌流傷害に関連すると従来は考えられなかった自己免疫疾患および炎症性疾患において、再灌流傷害が見られ得る証拠が増加している。例えば、関節リウマチ患者の滑膜は、一定の再灌流ストレス（例えば、低ｐＨ、大きな組織圧および灌流の低下）を受ける部位である。この疾患を有する移動性患者に見られる多量の滑液は、関節内圧の増加を引き起こし、次いでこれが関節動作によって悪化する。これは、低酸素／再灌流機構を介して局所炎症を悪化させ得、今度はこれが、間欠性虚血による酸化的損傷を引き起こす（例えば、Ｐｕｎｚｉら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００１；４０：２０２−２０４；Ｐｉａｎｏｎら、Ｒｅｕｍａｔｉｓｍｏ  １９９６；４８（Ｓｕｐｐｌ．１）：９３；およびＪａｗｅｄら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  １９９７；５６：６８６−９を参照のこと）。様々な炎症性疾患および自己免疫疾患もまた、再灌流傷害のいくつかの変化に類似しまたはこれを模倣する局所細胞の細胞ストレス応答の類似変化に関連し得る。
Ｋｕｌｉｋらは、アネキシンＩＶを認識する病原性天然抗体が、腸虚血再灌流傷害の発症に必要であることを示した。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２：５３６３−５３７３。米国特許出願公開第２０１１／００１４２７０号には、様々な疾患および症状に関連する虚血再灌流傷害および再灌流傷害の予防および／または処置に使用するための脂質、アネキシンおよび脂質−アネキシン複合体が開示されている。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／００１４２７０号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｏｋｒｏｊら、２００７，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３９：５１７−５３０
【非特許文献２】Ｓｔｕｒｆｅｌｔ  ａｎｄ  Ｔｒｕｅｄｓｓｏｎ，２０１２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：４５８−４６８
【非特許文献３】Ｚｖａｉｆｌｅｒ，１９７４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１７：２９７−３０５
【非特許文献４】Ｈｅｌｍｉｃｋら、２００８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５８：１５−２５
【非特許文献５】Ａｒｅｎｄ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，２０１２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：５７３−５８６
【非特許文献６】Ｋｌａｒｅｓｋｏｇら、２００８，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６：６５１−６７５
【非特許文献７】Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２
【非特許文献８】Ｈｉｅｔａｌａら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４５４−４５９
【非特許文献９】Ｊｉら、２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−１６８
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３４０−４３４７
【非特許文献１１】Ｃｏｏｋｅら、１９７５，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１８：５４１−５５１
【非特許文献１２】Ｇｈｏｓｅら、１９７５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：１０９−１１７
【非特許文献１３】Ｏｈｎｏ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｅ，１９７８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２１：５１６−５２７
【非特許文献１４】Ｂａｎｄａら、２００８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５８：３０８１−３０８９
【非特許文献１５】Ｒａｔｎｏｆｆら、１９８３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６：３６１−３７１
【非特許文献１６】Ｗｏｕｔｅｒｓら、２００６，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４：１１４３−１１５０
【非特許文献１７】Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９
【非特許文献１８】Ｈａｎｓｅｎら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２６１０−２６１８
【非特許文献１９】Ｋａｗａｉら、２００２，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６：２１３４−２１４５
【非特許文献２０】Ｏｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，１９９８，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３６０：２２３−２３２
【非特許文献２１】Ｏｈｔａｎｉら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３６８１−１３６８９
【非特許文献２２】Ｍｏｌｌｅｒ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００７，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４１−１４９
【非特許文献２３】Ｈｅｊａら、２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１０４９８−１０５０３
【非特許文献２４】Ｔｈｉｅｌら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５０６−５１０
【非特許文献２５】Ｐａｎｇｂｕｒｎら、１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１９３０−１９３５
【非特許文献２６】Ｒｏｓｅｎら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１４８３−１４８７）。
【非特許文献２７】Ｋｅｍｐｅｒら、２０１０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１３１−１５５
【非特許文献２８】Ｈｉｅｍｓｔｒａら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：５２７−５３３
【非特許文献２９】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２９−３７
【非特許文献３０】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８
【非特許文献３１】Ｒｕｓｅｖａら、２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
【非特許文献３２】Ｄｅｇｎら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９：３９５７−３９６９
【非特許文献３３】Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０
【非特許文献３４】Ｄａｈｌら、２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１２７−１３５
【非特許文献３５】Ｄｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８
【非特許文献３６】Ｐａｖｌｏｖら、２０１２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２２２７−２２３５
【非特許文献３７】Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６
【非特許文献３８】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９４：４４３−４４８
【非特許文献３９】Ｆｌｅｍｉｎｇら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２１２６−２１３３
【非特許文献４０】Ｒｅｈｒｉｇら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５９２１−５９２７
【非特許文献４１】Ｐｕｎｚｉら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００１；４０：２０２−２０４
【非特許文献４２】Ｐｉａｎｏｎら、Ｒｅｕｍａｔｉｓｍｏ  １９９６；４８（Ｓｕｐｐｌ．１）：９３
【非特許文献４３】Ｊａｗｅｄら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  １９９７；５６：６８６−９
【非特許文献４４】Ｋｕｌｉｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２：５３６３−５３７３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一態様では、本開示は、個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、補体媒介性疾患は、関節炎である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、約５０〜約３８０アミノ酸長であり、配列番号４４の連続する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、構築物は、ターゲティング部分、例えば抗体またはその断片（例えば、抗原結合断片）、例えば天然に存在する抗体またはその断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、天然に存在する抗体またはその断片は、アネキシンＩＶまたはリン脂質、例えば天然に存在する抗体Ｂ４またはＣ２を認識する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対するモノクローナル抗体Ｂ４の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体Ｂ４と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、傷害を受けている組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対するモノクローナル抗体Ｃ２の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体Ｃ２と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害および／または酸化的損傷を受けている組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。
【００２１】
上記方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、ペプチドリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【００２２】
前記方法のいくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である。
【００２３】
別の態様では、本開示は、天然に存在しないＭＡｐ４４断片を含む構築物であって、前記ＭＡｐ４４断片が、配列番号４４の配列の連続する少なくとも約５０アミノ酸を含む構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４断片は、約５０〜約３５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４断片は、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む。
【００２４】
構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、抗体またはその断片をさらに含み、前記抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに特異的に結合し、（ｉ）配列番号１もしくは７の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２もしくは８の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３もしくは９の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または（ｉｉ）配列番号４もしくは１０の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号５もしくは１１の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号６もしくは１２の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１または７の配列、配列番号２または８の配列および配列番号３または９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４または１０の配列、配列番号５または１１の配列および配列番号６または１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００２５】
構築物のいくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１３または１４の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１５または１６の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号１７または１８の配列を有するｓｃＦｖである。
【００２６】
構築物のいくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対するモノクローナル抗体Ｂ４の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体Ｂ４と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害を受けているまたは受けるリスクにある組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する。
【００２７】
構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、抗体またはその断片を含み、前記抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号２５もしくは３１の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２６もしくは３２の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号２７もしくは３３の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに／または（ｉｉ）配列番号２８の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２９の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３０の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２５または３１の配列、配列番号２６または３２の配列および配列番号２７または３３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００２８】
構築物のいくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３４または３５の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号３７または３８の配列を有するｓｃＦｖである。
【００２９】
構築物のいくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対するモノクローナル抗体Ｃ２の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体Ｃ２と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害を受けているまたは受けるリスクにある組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＭＤＡに結合する。
【００３０】
構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片およびＭＡｐ４４断片は、ペプチドリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片およびＭＡｐ４４断片は、直接連結される。
【００３１】
別の態様では、本開示は、上記構築物のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、上記構築物のいずれか１つを含む有効量の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、個体における補体媒介性疾患を処置する方法は、上記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を含むベクターを前記個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびプラスミドからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスである。
【００３３】
本明細書に記載される方法に有用な単位剤形、キットおよび製造品も提供される。
【００３４】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、いくつかまたはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＡｄｈＭＡｐ４４による前処置による、抗ＣＩＩ  ｍＡｂ誘導性関節炎のＣＤＡの実質的減少。高用量（ＨＤ）および低用量（ＬＤ）のＡｄｈＭＡｐ４４粒子を使用した。図１Ａ。実験期間中の関節炎の有病率（％）。図１Ｂ。実験期間中のＣＤＡ。黒色の矢印は、−５日目、０日目および３日目のＡｄｈＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰの注射時期を示す。＊Ｂのデータについて、ＡｄＧＦＰ処置との比較でｐ＜０．０５。図１Ｃ。５つの関節（２つの前肢、右後膝、右後足首および右後肢）の炎症（黒色の実線棒）、パンヌス形成（白色の斜線棒）、軟骨損傷（白色の棒）および骨損傷（白色の直線棒）の全関節平均（ＡＪＭ）組織病理学スコアを、組織の加工および切片のトルイジンブルー染色後に実施した。図１Ｄ。滑膜（黒色の実線棒）、軟骨表面（白色の棒）および総スコア（白色の直線棒）で調査した５つの関節におけるＣ３沈着のＡＪＭを示す。データは、疾患の平均±ＳＥＭとして表される（各時点でｎ＝５）。
【００３６】
【図２】ＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４（ＨＤ）で処置したＷＴマウスの膝関節の代表的な組織病理学およびＣ３沈着画像。左から右に２つの上パネル（図２Ａおよび２Ｃ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｈＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの膝関節のトルイジンブルーによる染色を示す。左から右に２番目の２つのパネル（図２Ｂおよび２Ｄ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｈＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの足首関節のトルイジンブルーによる染色を示す。左から右に３番目の２つのパネルセット（図２Ｅおよび２Ｇ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｈＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの膝関節のＣ３  Ａｂによる染色を示す。左から右に４番目の２つのパネルセット（図２Ｆおよび２Ｈ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｈＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの足首関節のＣ３  Ａｂによる染色を示す。滑膜（Ｓ−黒色の矢印）、軟骨（Ｃ−黒色の矢印）、骨（Ｂ）および半月板（Ｍ）の領域が特定されている。研究でＡｄｈＭＡｐ４４のＬＤまたはＨＤを使用したデータは、区別不可能であった；したがって、本発明者らは、ＡｄｈＭＡｐ４４のＨＤのみの代表的な画像を示す。図２に示されているすべての膝関節画像の倍率は２０倍であり、図２に示されているすべての足首関節の倍率は１０倍である。スケールバーは、０．１ｍｍである（１００μｍ）。
【００３７】
【図３】Ｃ５ａレベルおよびＣ３活性化に対するＡｄｈＭＡｐ４４の効果。図３Ａ。ＡｄｈＭＡｐ４４処置マウスの循環中のＣ５ａの絶対レベルの減少。ＰＢＳ、ＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＣＡＩＡ誘導の前（−５日目）後（１０日目）のマウス由来の血清を使用して、Ｃ５ａの絶対レベルを測定した。Ａのデータは、各群について、ｎ＝５に基づく平均±ＳＥＭを表す。ＬＤ＝低用量ＡｄｈＭＡｐ４４。ＨＤ＝高用量ＡｄｈＭＡｐ４４。＊ＡｄＧＦＰ処置との比較でｐ＜０．０５。図３Ｂ。ＡｄｈＭＡｐ４４処置マウス由来の血清を使用した、インビトロにおけるマンナン誘導性（ＬＰ）Ｃ３活性化の減少を示すＥＬＩＳＡ。ＰＢＳ、ＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスから得られた１０日目の血清を、インビトロでＣ３活性化について分析した。非ＣＡＩＡ  ＷＴマウス（未処置）由来の血清を陽性対照として使用した。Ｃ３−／−およびＭＢＬ／Ｄｆ−／−マウス由来の血清を陰性対照として使用した。図３Ｂのデータは、未処置の非ＣＡＩＡ  ＷＴマウス（ｎ＝４）、Ｃ３−／−（ｎ＝４）およびＭＢＬ／Ｄｆ−／−（ｎ＝４）に基づく平均±ＳＥＭを表す。＊ＡｄＧＦＰ処置との比較でｐ＜０．０５。図３Ｃ。インビトロにおける組換えヒトＭＡｐ４４による、Ｃａ＋＋を含むＧＶＢ緩衝液（すべての補体経路が活性である）中での、インビトロにおけるＬＰＳ誘導性Ｃ３活性化の全体的減少を示すＥＬＩＳＡ。非ＣＡＩＡマウス由来のＷＴ血清を、ｒｈＭＡｐ４４または抗ｆＢ阻害抗体で前処理した。図３Ｄ。インビトロにおける組換えヒトＭＡｐ４４による、Ｍｇ＋＋ＥＧＴＡを含むＣａ欠乏緩衝液（ＡＰのみが活性である）中での、ＬＰＳ誘導性Ｃ３活性化の減少を示すＥＬＩＳＡ。非ＣＡＩＡマウス由来のＷＴ血清を、ｒｈＭＡｐ４４または抗ｆＢ阻害抗体で前処理した。図３Ｃおよび３Ｄのデータは、各処置群について、ｎ＝４に基づく平均±ＳＥＭを表す。ＷＴマウス由来の未処理血清との比較でｐ＜０．０５。
【００３８】
【図４】ＡｄＭＡｐ４４処置または非処置ＣＡＩＡマウスの循環中のヒトＭＡｐ４４のレベル。図４Ａ。ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰまたはＬＤおよびＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４腹腔内（ｉ．ｐ．）注射する前の−５日目におけるマウスの循環中のヒトＭＡｐ４４のレベル。図４Ｂ。ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４を注射したマウスの循環中の０日目のヒトＭＡｐ４４のレベル。図４Ｃ。ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４を注射した３日目のヒトＭＡｐ４４のレベル。図４Ｄ。ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４を注射したＣＡＩＡマウスの循環中のヒトＭＡｐ４４の１０日目のレベル。ヒトＭＡｐ４４について、ＥＬＩＳＡを実施した。ＬＤまたはＨＤ用量のＡｄｈＭＡｐ４４を注射したＣＡＩＡマウス由来の血清は、ヒトＭＡｐ４４のある程度類似のレベルを示す。対照的に、ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰを注射したマウスは、検出可能なレベルのヒトＭＡｐ４４を有しない。データは、ＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４を注射したマウス（ｎ＝４）を除いて、各群について、ｎ＝５に基づく平均±ＳＥＭ（ｎｇ／ｍｌ）を表す。＊ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰ処置との比較でｐ＜０．０１。
【００３９】
【図５】ＣＡＩＡにおけるＡｄｍＭＡｐ４４による前処置に起因するＣＤＡの減少。示されているデータは、抗ＣＩＩ  ｍＡｂおよびＬＰＳ注射後の示されている日から得られたものである。パネルＡおよびＢにおける矢印は、ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４の注射日を示す。図５Ａ。実験期間中の関節炎の有病率（％）。図５Ｂ。実験期間中のＣＤＡ。データは、各群（ｎ＝５）の平均±ＳＥＭを表す。矢印は、ＡｄｍＭＡｐ４４およびＡｄＧＦＰの注射日を示す。＊ＡｄＧＦＰ処置との比較でｐ＜０．０５。
【００４０】
【図６】炎症、パンヌス、軟骨損傷および骨損傷のスコアの減少、ならびにＡｄＧＦＰと比較してＡｄｍＭＡｐ４４で処置したＣＡＩＡマウスの膝関節におけるＣ３沈着の染色。図６Ａ。５つの関節（２つの前肢、右後膝、右後足首および右後肢）の炎症（黒色の実線棒）、パンヌス形成（白色の斜線棒）、軟骨損傷（白色の棒）および骨損傷（白色の直線棒）の組織病理学スコアのＡＪＭを、組織の加工および切片のトルイジンブルー染色後に実施した。図６Ｂ。組織学スコア（総スコア）とＣＤＡとの間のピアソン相関（ｒ）。図６Ｃ。滑膜（黒色の実線棒）、軟骨表面（白色の棒）および総スコア（白色の直線棒）における５つの関節のＣ３沈着のＡＪＭを示す。図６Ｄ。Ｃ３沈着総スコア（滑膜および軟骨）とＣＤＡとの間のピアソン相関（ｒ）。データは、疾患の平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝５）。
【００４１】
【図７】抗ＣＩＩ  ｍＡｂによって誘導された関節炎に対するＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰの局所右膝関節注射による全ＣＤＡの減少。−５日目、０日目および３日目に、ＷＴマウスの右膝関節に３回局所注射した。両前肢および左後肢について、効果を調査した。示されているデータは、ｍＡｂおよびＬＰＳ注射後の示されている日から得られたものである。図７Ａ。実験期間中のすべての関節におけるＣＤＡ。図７Ｂ。実験期間中のすべての関節における関節炎の有病率（％）。図７Ｃ。実験期間中の右膝関節におけるＣＤＡ。図７Ｄ。実験期間中の左後肢におけるＣＤＡ。図７Ｅ。実験期間中の右前肢におけるＣＤＡ。図７Ｆ。実験期間中の左前肢におけるＣＤＡ。データは、各群（ｎ＝５）の平均±ＳＥＭを表す。＊ＡｄＧＦＰ処置と比較してＡｄｍＭＡｐ４４についてｐ＜０．０５。黒色の矢印は、ＡｄｍＭＡｐ４４およびＡｄＧＦＰの注射時期を示す。
【００４２】
【図８】ＣＡＩＡの誘導の前後のＷＴマウスの血清中のマウスＭＡｐ４４上のＨＡタグに対するウエスタンブロット分析を使用することによって評価した、ＡｄＭＭＡｐ４４またはＡｄｈＭＡｐ４４のインビボ形質導入および発現効率。別個の研究では、ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄｈＭＡｐ４４をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、右膝関節にも局所注射した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロースへの転写後、ブロットを抗ＨＡウサギ抗体でプローブした。血清中のＨＡバンド（約４３〜５０ｋＤａ）の存在は、ＡｄｍＭＡｐ４４で処置したマウスにおける細胞形質導入およびタンパク質発現の成功を示す。図８Ａ。−２日目（レーン２）にＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後０日目（レーン３）、３日目（レーン４）および１０日目（レーン５）における血清中のＨＡバンドの存在。図８Ｂ。−５日目（レーン２）にＡｄｍＭＡｐ４４をマウスの右膝関節に注射した後３日目（レーン４）および１０日目（レーン５）における血清中のＨＡバンドの存在。アデノウイルスベクター非注射ＷＴマウス由来の血清を陰性対照として使用した（レーン１）。図８Ｃ。−５日目にＡｄｈＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後の血清中のＭＢＬに結合したＭＡｐ４４。マンノース−アガロースビーズを使用してＭＢＬ−ＭＡｐ４４複合体をプルダウンし、０日目（レーン４）、３日目（レーン５）および１０日目（レーン６）における血清中のヒトＭＡｐ４４上のＨＡタグの存在を、ウサギ抗ＨＡ抗体を使用して検出した。マンノース−アガロース調製物なしのＷＴマウス由来の血清（レーン１）、およびＡｄベクター非注射ＷＴマウス由来の血清（レーン２）も対照として調査した。
【００４３】
【図９】−２日目および０日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したＡｄＧＦＰおよびＡｄｍＭＡｐ４４のインビボ形質導入と比較したＣＡＩＡマウスにおける代表的なＩＨＳ。１０日目にすべてのマウスを屠殺して、ＩＨＳによってＧＦＰの存在をアッセイし、または抗ＨＡタグ抗体を使用して免疫蛍光によってＨＡタグ（砂粒粒子）をアッセイした。図９Ａ。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに注射せず、ＰＢＳのみを２回注射した。滑膜および半月板では、緑色の蛍光は見られなかった。図９Ｃ。ＡｄＧＦＰをマウスに２回注射したところ、白色の矢印によってマークされているように、滑膜では、緑色蛍光タンパク質が明確に見られる。図９Ｅ。ＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに２回注射したところ、滑膜では、緑色蛍光タンパク質が存在していなかった。図９Ｂ。ＡｄＧＦＰおよびＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに注射せず、ＰＢＳのみを２回注射した。滑膜または半月板（ｍｅｎｉｎｉｓｃｕｓ）では、砂粒粒子が見られなかった。図９Ｄ。ＡｄＧＦＰをマウスに２回注射したところ、黒色の矢印によってマークされているように、滑膜では、砂粒粒子が見られない。図９Ｆ。ＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに２回注射したところ、非常に明確な砂粒粒子（ＨＡ）が滑膜全体に存在していた。滑膜の円形領域を挿入図で４倍にすると、ＨＡ染色の砂粒粒子がより明確に示されている。滑膜（Ｓ）および半月板（Ｍ）の領域が特定されている。左パネルにおけるすべての画像の倍率は、１０倍である。スケールバーは、０．１ｍｍ（１００μｍ）である。右パネルにおけるすべての画像の倍率は、４０倍である。スケールバーは、０．０４ｍｍ（４０μｍ）である。
【００４４】
【図１０】図１０Ａ。ＡｄｈＭＡｐ４４中間ベクターの構築およびＡｄ粒子の生産を示す図（番号順）。ヒトＭＡｐ４４  ｃＤＮＡをｐＥＮＴＣＭＶＭＡＰ４４  ＨＡベクター（Ｗｅｌｇｅｎ  Ｉｎｃ．製）にクローニングした。ＨＡ配列をタグとして使用して、ヒトおよびマウスＡｄＭＡｐ４４の両方の発現を追跡した。マウスＭＡｐ４４遺伝子をクローニングし、ＡｄｍＭＡｐ４４を同様に構築した。図１０Ｂ。ＡｄＧＦＰベクターを同様に構築した。ＡｄＧＦＰを陰性対照として使用して、様々な器官における形質導入の効率を調査した。
【００４５】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＡＩＡを有するＷＴにおける臨床疾患活動性および有病率を示す。抗コラーゲンｍＡｂ（ａｒｔｈｒｉｔｏｍａｂ）のみまたはＬＰＳのみを注射したＷＴマウスは、低レベルの疾患を発症しなかったが、対照的に、抗コラーゲンｍＡｂを注射し、続いてＬＰＳを注射したマウスは重度の疾患を発症した。図１１Ａ。０日目および３日目に抗ＣＩＩ  ｍＡｂ／ＬＰＳを、０日目に抗ＣＩＩ  ｍａｂを、ならびに３日目にＬＰＳを注射したＷＴにおけるＣＤＡ。図１１Ｂ。抗ＣＩＩ  ｍＡｂ／ＬＰＳ、抗ＣＩＩ  ｍａｂまたはＬＰＳを注射したＷＴマウスにおける疾患の有病率（％）。データは、各群について、ｎ＝５に基づく平均±ＳＥＭを表す。＊抗ＣＩＩまたはＬＰＳ処置との比較でｐ＜０．０５。図１１Ｃおよび１１Ｄは、別個のＣＡＩＡ実験中の体重の変化率を示す。疾患の経過中、マウスの体重について、ＡｄｈＭＡｐ４４、ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰは、ＰＢＳと比較して大きな効果が見られなかった。図１１Ｃ。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したＡｄＧＦＰおよびＰＢＳと比較した、体重に対するＨＤおよびＬＤのＡｄｈＭＡｐ４４の効果。図１１Ｄ。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したＡｄＧＦＰと比較した、体重に対するＡｄｍＭＡｐ４４の効果。データは、開始体重に対するパーセント（％）として示される（平均＋ＳＥＭ）。各グラフにおける黒色の矢印は、ＡｄｈＭＡｐ４４、ＡｄｍＭＡｐ４４、ＡｄＧＦＰまたはＰＢＳの注射時期を示す。
【００４６】
【図１２】ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、続いて抗ＣＩＩ  ｍＡｂおよびＬＰＳを注射したマウスの膝関節の代表的な組織病理学およびＣ３沈着画像。左から右に２つの上パネル（図１２Ａおよび１２Ｃ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｍＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの膝関節のトルイジンブルーによる染色を示す。左から右に２番目の２つのパネル（図１２Ｂおよび１２Ｄ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｍＭＡｐ４４（右パネル）で処置したＷＴマウスの足首関節のトルイジンブルーによる染色を示す。左から右に３番目の２つのパネルセット（図１２Ｅおよび１２Ｇ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｍＭＡｐ４４（左パネル）で処置したＷＴマウスの膝関節のＣ３  Ａｂによる染色を示す。左から右に４番目の２つのパネルセット（図１２Ｆおよび１２Ｈ）は、ＡｄＧＦＰ（左パネル）およびＡｄｍＭＡｐ４４（左パネル）で処置したＷＴマウスの足首関節のＣ３  Ａｂ（褐色）による染色を示す。滑膜（Ｓ−黒色の矢印）、軟骨（Ｃ−黒色の矢印）、骨（Ｂ）および半月板（Ｍ）の領域が特定されている。図１２に示されているすべての膝関節および足首関節画像の倍率は、２０倍である。スケールバーは、０．１ｍｍである（１００μｍ）。
【００４７】
【図１３】ＲＲＶ誘導性関節炎に対するＡｄｈＭＡｐ４４の効果。−３日目、０日目および０日目にＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４をＷＴマウスの左後足蹠に注射した。示されているデータは、ＲＲＶを右足蹠に注射した後の示されている日から得られたものである。図１３Ａ。実験期間中のＣＤＡ。図１３Ｂ。実験期間中の体重の変化（％）。データは、各群について、ｎ＝４に基づく平均±ＳＥＭを表す。
【００４８】
【図１４】関節炎のマウスモデル。コラーゲン抗体誘導性関節炎およびコラーゲン誘導性関節炎の動物プロトコールを示す概略図。
【００４９】
【図１５】コラーゲン抗体誘導性関節炎。抗ＣＩＩ抗体を注射し、続いてＬＰＳを注射した動物においてのみ、重度の関節炎が発症する。
【００５０】
【図１６】準最大誘導性ＣＡＩＡに対する天然抗体Ｃ２およびＢ４の効果。図１６Ａ。実験期間中のＣＤＡ。図１６Ｂ。実験期間中の関節炎の有病率（％）。データは、各群の平均±ＳＥＭを表す。矢印は、示されているＩｇＭまたはＰＢＳの注射日を示す。＊ｐ＜０．０５。
【００５１】
【図１７】ＣＡＩＡマウスの肢の代表的な画像。図１７Ａおよび１７Ｂ。ＬＰＳ注射後３日目のＣＡＩＡマウスの肢の画像。図１７Ｃ〜１７Ｆ。ＬＰＳ注射後１０日目のＣＡＩＡマウスの肢の画像。
【００５２】
【図１８】ＷＴマウスと比較した、ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡｐ−／−マウスにおける抗コラーゲンｍＡｂ誘導性関節炎の臨床疾患活動性の有意な減少。０日目に、マウス１匹当たり８ｍｇのＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂをＷＴおよびＭＡＳＰ−２／ｓＭＡｐ−／−マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウス１匹当たり５０μｇのＬＰＳ（大腸菌株、０１１１Ｂ４）をすべてのマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１０日目に、すべてのマウスを屠殺した。図１８Ａ。実験期間中の臨床疾患活動性（ＣＤＡ）。１０日目に、ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡｐ−／−マウスでは、ＣＤＡが、ＷＴマウスと比較して７０％減少していた。図１８Ｂ。実験期間中の関節炎の有病率（％）。１０日目に、ＷＴおよびＭＡＳＰ−２／ｓＭＡｐ−／−マウスでは、疾患の有病率は１００％であった。データは、疾患の平均±ＳＥＭとして表される（各時点でｎ＝５）。＊ＷＴマウスとの比較でｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
本出願は、ＭＡｐ４４ポリペプチド、その新規な断片、ならびに補体媒介性疾患（例えば、関節炎）を処置するためのこれらのＭＡｐ４４ポリペプチドおよびその断片の使用を提供する。本出願は、コラーゲン抗体誘導性関節炎疾患モデルにおけるレクチン経路および特にＭＡｐ４４の重要な役割の発見に部分的に基づく。本出願の前では、炎症性疾患の媒介におけるＬＰおよび特にＭＡｐ４４の役割は不明であった。例えば、補体系の様々な要素が欠損したマウスの研究では、ＣＡＩＡを媒介するためには、ＬＰおよびＣＰはいずれも不要と思われるので、ＡＰが必要かつ十分であることが示された。ＭＢＬ−Ａ／ＣおよびＣ４欠損マウスを使用したＬＰの研究（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｊｉら、２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−１６８；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）では、疾患は、ＬＰによってほとんど影響されないことが示された。
【００５４】
本出願は、ＭＡｐ４４のアデノウイルス媒介性発現がＣＡＩＡを劇的に軽減し、マウスにおけるＲＲＶ誘導性関節炎の重症度を減少させることを実証したが、これは、ＬＰが、これらのモデルにおける組織傷害の発症に重要であることを示唆している。本出願は、ＭＡｐ４４およびその断片の使用に基づく有効な処置方法（限定されないが、ＭＡｐ４４のターゲティング送達を含む方法を含む）を提供する。
【００５５】
したがって、一態様では、本出願は、ターゲティング部分（例えば、抗体またはその断片）に場合により連結されたＭＡｐ４４またはその新規断片を含む構築物を提供する。
【００５６】
別の態様では、個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、ターゲティング部分（例えば、抗体またはその断片）に場合により連結された有効量のＭＡｐ４４またはその新規断片を前記個体に投与することを含む方法が提供される。
【００５７】
本明細書に記載される方法に有用な単位剤形、キットおよび製造品も提供される。
【００５８】
定義
「個体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指す。個体としては、限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類または霊長類が挙げられる。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００５９】
本明細書で使用される「処置」または「処置する」は、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、限定されないが、以下の１つまたはそれを超えるものが挙げられる：疾患に起因する１つもしくはそれを超える症候の緩和、疾患の程度の低減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の拡散の予防もしくは遅延、疾患の再発の予防もしくは遅延、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善、疾患の（部分または完全）寛解の提供、疾患の処置に必要な１つもしくはそれを超える他の医薬の用量の減少、疾患進行の遅延、生活の質の向上もしくは改善、体重増加の増大、および／または生存の延長。「処置」は、疾患の病理学的転帰の軽減も包含する。本発明の方法は、これらの処置態様のいずれか１つまたはそれを超えるものを想定する。
【００６０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の障害、症状または疾患を処置する（例えば、その症候の１つまたはそれを超えるものを改善、緩和、軽減および／または遅延する）のに十分な化合物または組成物の量を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」または「薬理学的に適合し得る」は、生物学的にまたは他の理由で望ましくないものではない材料を意味し、例えば、前記材料は、いかなる有意な望ましくない生物学的効果も引き起こさず、またはそれが含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害に相互作用せずに、個体または患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容され得る担体または賦形剤は、好ましくは、毒物学的製造試験の必要な基準を満たしており、および／またはＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎが作成したＩｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅに含まれる。
【００６２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００６３】
「約」に関して、本明細書の値またはパラメータは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（表す）。例えば、「約Ｘ」に関する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００６４】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」を含むと理解される。
【００６５】
ＭＡｐ４４ポリペプチドおよびその断片
本明細書に記載される構築物は、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含み、前記ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、補体活性の阻害剤として機能する。ＭＡｐ４４は、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３などの他のＭＡＳＰタンパク質と比較して、血清中に低レベルで存在し、局所レクチン経路特異的補体阻害剤として機能する（Ｓｋｊｏｄｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４７：２２２９−３０（２０１０）。
【００６６】
補体活性の減少は、漸増的（例えば、活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の減少）または完全なものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、標準的なインビトロ赤血球細胞溶血アッセイ、インビトロＣＨ５０ｅｑアッセイまたはＷｉｅｓｌａｂ（登録商標）補体アッセイ（Ｅｕｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）において、補体活性を少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれを超えて）阻害し得る。例えば、Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ）”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”１３５−２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＣＣ  Ｔｈｏｍａｓ（１９６１）ｐａｇｅｓ  １３５−１３９、またはこのアッセイの通常の変法、例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎら、（２００４）Ｎ  ＥｎｇｌＪ  Ｍｅｄ  ３５０（６）：５５２に記載されているニワトリ赤血球溶血方法を参照のこと。
【００６７】
ＣＨ５０ｅｑアッセイは、血清における古典的な全補体活性を測定するための方法である。この試験は溶解アッセイであり、抗体感作赤血球（古典的な補体経路の活性化因子として）および試験血清の様々な希釈物を使用して、５０％溶解をもたらすのに必要な量（ＣＨ５０）を決定する。例えば、溶血率は、分光光度計を使用して決定され得る。ＴＣＣそれ自体が、測定される溶血に直接関与するので、ＣＨ５０ｅｑアッセイは、終末補体複合体（ＴＣＣ）形成の間接的な指標を提供する。
【００６８】
前記アッセイは当業者に周知であり、一般に実施される。簡潔に言えば、古典的な補体経路を活性化するために、未希釈の血清サンプル（例えば、ヒト血清サンプル）を、抗体感作赤血球を含有するマイクロアッセイウェルに追加し、それにより、ＴＣＣを生成する。次に、捕捉試薬（例えば、ＴＣＣの１つまたはそれを超える要素に結合する抗体）でコーティングされたマイクロアッセイウェル中で、活性化血清を希釈する。活性化サンプル中に存在するＴＣＣは、マイクロアッセイウェルの表面をコーティングするモノクローナル抗体に結合する。ウェルを洗浄し、検出可能に標識された検出試薬であって、結合ＴＣＣを認識する検出試薬を各ウェルに追加する。検出可能な標識は、例えば、蛍光標識または酵素標識であり得る。アッセイの結果は、１ミリリットル当たりのＣＨ５０単位当量（ＣＨ５０  Ｕ  Ｅｑ／ｍＬ）で表される。
【００６９】
Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）補体アッセイは、血清サンプル中のＣＰ、ＡＰまたはＬＰの特異的活性化を決定するために使用され得る市販のキットである。簡潔に言えば、アッセイされない補体経路を遮断する溶液で血清を希釈し、次いで、アッセイされる特定の経路の活性化因子でコーティングされたウェル中でインキュベートする。
【００７０】
ＬＰの活性化に対する推定阻害剤の効果を検出するために有用なアッセイは、Ｄｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８に記載されている。簡潔に言えば、推定ＬＰ阻害剤をＭＢＬと共にインキュベートし、その後、ＭＡＳＰ−２を追加し、混合物をマンナンコーティングウェルに移す。ウェルを洗浄し、ヒト補体Ｃ４を追加し、インキュベートする。ビオチン標識抗Ｃ４抗体を追加し、続いて、検出可能なマーカー（例えば、放射性標識または蛍光標識）にコンジュゲートしたストレプトアビジンを追加することによって、Ｃ４断片の堆積を検出し得る。
【００７１】
インビトロで補体活性を検出および／または測定するためのさらなる方法は、実施例に記載および例示されている。
【００７２】
一態様では、本出願は、ＭＡｐ４４ポリペプチド（配列番号４４）またはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、約５０〜約１００アミノ酸長、約１００〜約１５０アミノ酸長、約１５０〜約２００アミノ酸長、約２００〜約２５０アミノ酸長、約２５０〜約３００アミノ酸長、約３００〜約３５０アミノ酸長または約３５０〜約３８０アミノ酸長であり、配列番号４４に見られる連続する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、約１００アミノ酸長未満、約２００アミノ酸長未満、約２５０アミノ酸長未満または約３００アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、ＣＵＢ１、ＥＧＦ、ＣＵＢ２およびＣＣＰ１からなる群より選択される１つまたはそれを超えるＭＡｐ４４ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％相同である。
【００７４】
ターゲティング部分
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、ターゲティング部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、抗体（例えば、標的疾患部位のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｔｏｐｅ）を認識する抗体）である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、補体受容体２型（ＣＲ２）の断片、または同様に作用して構築物を補体活性化部位に指向させる分子である。国際公開第２００４／０４５５２０号は、例示的なＣＲ２ベースのターゲティング部分を提供し、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。他の実施形態では、ターゲティング部分は、構築物を、炎症、虚血または酸化的傷害もしくは他の傷害形態の部位に指向させるペプチドまたは他の分子である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、炭水化物である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、アネキシンＩＶまたはリン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片である。
【００７６】
アネキシンＩＶは、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーに属する。アネキシンの構造は、４つのアネキシンリピート（アネキシンＩＶが８つ）の保存されたＣａ２＋膜結合コアと、可変Ｎ末端領域とからなる。アネキシンは可溶性細胞質タンパク質であるが、明白なシグナル配が欠如しており、明らかに古典的な分泌経路に侵入不能であるにもかかわらず、アネキシンは、細胞外液で確認されており、またはほとんど未知の結合部位を介して外細胞表面と会合している。アネキシンＩＶは、上皮細胞によって主に産生され、肺、腸、膵臓、肝臓および腎臓においても高レベルで見られる。Ｒｅｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，（２００４）１１７：２６３１−２６３９およびＺｅｒｎｉｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．，（２００３）６８（１）：１２９−６０。
【００７７】
いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体の細胞の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、虚血再灌流傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体の細胞の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片に対するアネキシンＩＶ上のエピトープは、組織傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在するが、組織傷害を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上に存在しない。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片に対するアネキシンＩＶ上のエピトープは、酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上に存在するが、酸化的損傷を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上に存在しない。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片に対するアネキシンＩＶ上のエピトープは、虚血再灌流傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在するが、虚血再灌流傷害を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上に存在しない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片はリン脂質に特異的に結合し、これらとしては、限定されないが、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）が挙げられ、本出願との関連では、スフィンゴ脂質およびマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を包含することを意図する。ＰＥ、ＣＬおよびＰＣは、生体膜に見られるリン脂質のクラスである。ホスファチジルコリンは、外部原形質または細胞膜外葉により一般に見られる。ホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリン輸送タンパク質（ＰＣＴＰ）によって細胞内の膜間で輸送されると考えられる。リン脂質は、コリン頭部基と、様々な脂肪酸（ある脂肪酸は飽和脂肪酸であり、ある脂肪酸は不飽和脂肪酸である）を有するグリセロリン酸とから構成される。ＰＥは、２つの脂肪酸でエステル化されたグリセロールと、リン酸との組み合わせからなる。ホスファチジルコリンでは、リン酸基はコリンと結合しているのに対して、ＰＥでは、それはエタノールアミンと結合している。２つの脂肪酸は同じでもよいし、または異なっていてもよく、通常は１，２位にある（しかし、１，３位にある場合もある）。カルジオリピン（ＩＵＰＡＣ名「１，３−ビス（ｓｎ−３’−ホスファチジル）−ｓｎ−グリセロール」）は、ミトコンドリア内膜の重要な要素であり、全脂質組成の約２０％を構成する。カルジオリピン（ＣＬ）は、２つのホスファチジルグリセロールが中央でグリセロール骨格と結合して二量体構造を形成しているジホスファチジルグリセロール脂質の一種である。ほとんどの動物の組織では、カルジオリピンは、それぞれに２つの不飽和結合を有する１８炭素脂肪アルキル鎖を含有する。（１８：２）４アシル鎖の立体配置は、哺乳動物ミトコンドリアの内膜タンパク質に対するＣＬの高親和性の重要な構造要件であることが提案されている。加齢黄斑変性を伴う眼では、リン脂質の蓄積が示されている（Ｌｏｍｍａｔｚｓｃｈら、（２００８）Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２４６（６）：８０３−１０）。
【００８０】
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は活性酸素種（ＲＯＳ）から生成されるので、酸化ストレスのバイオマーカーとしてインビボでアッセイされることが多い。活性酸素種は多価不飽和脂質を分解して、マロンジアルデヒドを形成する。この化合物は反応性アルデヒドであり、細胞内で毒性のストレスを引き起こし、終末過酸化産物（ＡＬＥ）と称される共有結合タンパク質付加物を形成する多くの反応性求電子種の１つである。このアルデヒドの産生はまた、生物における酸化ストレスのレベルを測定するためのバイオマーカーとして使用される。加齢黄斑変性を伴う眼では、およびウェット型ＡＭＤのレーザ誘導性ＣＮＶマウスモデルでは、ＭＤＡの改変が示されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎら、（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ．４７８（７３６７）：７６−８１）。
【００８１】
いくつかの実施形態では、リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）は、組織傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（または病理学的構造、例えばドルーゼン中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）は、眼疾患を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体の細胞の表面上（または病理学的構造、例えばドルーゼン中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）は、酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体の細胞の表面上（または病理学的構造、例えばドルーゼン中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）は、酸化されている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片が結合するリン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）のエピトープは、組織傷害を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在するが、組織傷害を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在しない。抗体またはその断片が結合するリン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）のエピトープは、眼疾患を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在するが、眼疾患を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在しない。抗体またはその断片が結合するリン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）のエピトープは、酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在するが、酸化的損傷を受けていない（または受けるリスクを有しない）組織中のまたは前記組織に隣接する細胞の表面上または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在しない。
【００８３】
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される特定の組織中のまたは前記組織に隣接する細胞（および／または病理学的構造）は、特定の事象（例えば、非虚血性傷害または酸化的損傷）が起こっており、起こる可能性があり、もしくは起こり始めている組織もしくは器官の一部であり、または前記組織もしくは器官に隣接する（その近くにある、そのすぐ隣にある、その微環境にある、その境界にある、その横にある、それに接している）細胞（および／または病理学的構造、例えばドルーゼン）を含む。隣接細胞の場合、細胞は十分に、酸化的損傷および／または炎症の症状が隣接細胞および特定の組織または器官を冒すような特定の組織または器官の微細環境内にある。このような細胞は、限定されないが、「ストレスタンパク質」（例えば、熱ショックタンパク質および細胞ストレス応答に関連する他のタンパク質（アネキシンを含む））または他の細胞表面上分子（リン脂質、炭水化物部分）の表出（異常なレベルのタンパク質、改変タンパク質または他の細胞表面上分子の表出を含む）を含むストレスの徴候を示し得る。このような細胞はアポトーシスを受け得るか、またはアポトーシスの徴候を示し得、このような徴候としては、細胞の形態学的変化、クロマチンの凝縮、細胞シグナル伝達タンパク質相互作用の変化、細胞内カルシウムレベルの変化、リン脂質の外在化、細胞脱離、細胞表面構造の消失などが挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される「に選択的に結合する」という用語は、別のタンパク質、脂質または炭水化物部分に対するあるタンパク質の特異的結合（例えば、抗原に対する抗体、その断片または結合パートナーの結合）であって、標準的なアッセイ（例えば、イムノアッセイ）によって測定した場合の結合レベルが、アッセイのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高い特異的結合を指す。例えば、イムノアッセイを実施する場合、対照としては、典型的には、抗体または抗原結合断片のみを含有する（すなわち、抗原が存在しない）反応ウェル／チューブが挙げられ、抗原の非存在下における抗体またはその抗原結合断片による反応性の量（例えば、ウェルに対する非特異的結合）がバックグラウンドであると考えられる。結合は、限定されないが、ウエスタンブロット、イムノブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴、化学発光法、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学的分析、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリーを含む当技術分野で標準的な様々な方法を使用して測定され得る。
【００８５】
本発明によれば、所定のタンパク質またはペプチドまたは他の分子の「エピトープ」は、一般に、抗体に関して、抗体またはその抗原結合断片が結合する巨大分子であって、抗体が産生される対象となる巨大分子の一部または前記巨大分子上の部位と定義される。エピトープという用語は、所定のタンパク質または抗原の「抗原性決定因子」、「抗体結合部位」または「保存的な結合表面」という用語と互換的に使用され得る。より具体的には、エピトープは、抗体結合に関与するアミノ酸残基およびさらには三次元空間におけるそれらの立体構造（例えば、立体構造エピトープおよび保存的な結合表面）の両方によって規定され得る。エピトープは、約４〜６アミノ酸残基程度の小さいペプチドに含まれ得るか、またはタンパク質のより大きいセグメントに含まれ得、特に抗体結合エピトープに関してエピトープの三次元構造に言及する場合、連続するアミノ酸残基から構成される必要はない。抗体結合エピトープは、多くの場合、連続エピトープ（すなわち、直鎖エピトープ）ではなく立体構造エピトープであり、または換言すれば、抗体が結合するタンパク質もしくはポリペプチドの表面上で三次元的に配列したアミノ酸残基によって規定されるエピトープである。上述のように、立体構造エピトープは、アミノ酸残基の連続する配列から構成されないが、その代わり、前記残基はおそらく、一次タンパク質配列中で遠く離れており、タンパク質がそのネイティブな三次元立体構造にフォールディングされると一緒になって結合表面を形成する。
【００８６】
競合アッセイは、当技術分野の標準的な技術を使用して実施され得る（例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイ）。例えば、競合阻害剤は、公知の標識抗体（例えば、ｍＡｂ  Ｂ４）に対する、または特定の抗原に対する抗体を含有することが既知の血清もしくは別の組成物（例えば、抗原に対する天然抗体を含有することが既知の血清）に対する抗原の結合を阻害するそれらの能力によって検出および定量され得る。
【００８７】
本発明によれば、抗体は、免疫グロブリンドメインを含むことを特徴とするので、それらは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。一般に、抗体分子は、２種類の鎖を含む。一方の種類の鎖は重鎖またはＨ鎖と称され、他方は軽鎖またはＬ鎖と称される。２本の鎖は等モル比で存在し、各抗体分子は、典型的には、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を有する。２本のＨ鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結されており、各Ｈ鎖は、ジスルフィド結合によってＬ鎖に連結されている。Ｌ鎖は、ラムダ（λ）鎖およびカッパ（κ）鎖と称される２種類のみである。対照的に、Ｈ鎖は、アイソタイプと称される５つの主要クラスがある。５つのクラスとしては、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭまたはμ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤまたはδ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧまたはλ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡまたはα）および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥまたはε）が挙げられる。このようなアイソタイプ間の独自の特徴は、免疫グロブリンの定常ドメインによって規定され、以下に詳細に記載されている。ヒト免疫グロブリン分子は、９つのアイソタイプ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、４つＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）およびＩｇＧ４（γ４）を含む）および２つのＩｇＡサブクラス（ＩｇＡ１（α１）およびＩｇＡ２（α２）を含む）を含む。ヒトでは、ＩｇＧサブクラス３およびＩｇＭが最も強力な補体活性化因子（古典的な補体系）である一方、ＩｇＧサブクラス１およびこれよりも少ない程度だがサブクラス２は、古典的な補体系の中程度〜低度の活性化因子である。ＩｇＧ４サブクラスは、（古典的なまたは代替の）補体系を活性化しない。代替の補体系を活性化することが公知の唯一のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＡである。マウスでは、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３である。マウスＩｇＧ１は補体を活性化しない一方、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３は補体活性化因子である。
【００８８】
免疫グロブリン分子の各Ｈ鎖またはＬ鎖は、Ｌ鎖可変領域（ＶＬドメイン）、Ｌ鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）、Ｈ鎖可変領域（ＶＨドメイン）およびＨ鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン）と称される２つの領域を含む。完全ＣＨドメインは、３つのサブドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）およびヒンジ領域を含む。１本のＨ鎖および１本のＬ鎖は共に、免疫グロブリン可変領域を有する免疫グロブリン分子のアームを形成し得る。完全免疫グロブリン分子は、２つの会合した（例えば、ジスルフィド結合した）アームを含む。したがって、全免疫グロブリンの各アームは、ＶＨ＋Ｌ領域およびＣＨ＋Ｌ領域を含む。本明細書で使用される「可変領域」または「Ｖ領域」という用語は、ＶＨ＋Ｌ領域（Ｆｖ断片としても公知である）、ＶＬ領域またはＶＨ領域を指す。また、本明細書で使用される「定常領域」または「Ｃ領域」という用語は、ＣＨ＋Ｌ領域、ＣＬ領域またはＣＨ領域を指す。
【００８９】
免疫グロブリン分子の抗原特異性は、可変領域またはＶ領域のアミノ酸配列によって付与される。このため、異なる免疫グロブリン分子のＶ領域は、それらの抗原特異性に応じて、大きく変動し得る。Ｖ領域の特定の部分は、他よりも保存されており、フレームワーク領域（ＦＲ領域）と称される。対照的に、Ｖ領域の特定の部分は、非常に可変性であり、超可変領域と称される。免疫グロブリン分子におけるＶＬおよびＶＨドメインが対合すると、各ドメイン由来の超可変領域が会合し、抗原結合部位を形成する超可変ループが作られる。したがって、超可変ループは、免疫グロブリンの特異性を決定し、それらの表面は抗原に相補的であるので、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。
【００９０】
Ｌ鎖およびＨ鎖Ｖ遺伝子配列セグメントは両方とも、アミノ酸配列の可変性が大きい３つの領域を含有する。このような領域は、それぞれＬ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。Ｌ鎖ＣＤＲ１の長さは、異なるＶＬ領域間で大きく変動し得る。例えば、ＣＤＲ１の長さは、約７アミノ酸〜約１７アミノ酸で変動し得る。対照的に、Ｌ鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の長さは、典型的には、異なるＶＬ領域間で大きく変動しない。Ｈ鎖ＣＤＲ３の長さは、異なるＶＨ領域間で大きく変動し得る。例えば、ＣＤＲ３の長さは、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸で変動し得る。各Ｈ鎖およびＬ鎖ＣＤＲ領域は、ＦＲ領域に隣接する。
【００９１】
プロテアーゼによる免疫グロブリンの限定的な消化は、２つの断片を生成し得る。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片と称される。抗原結合能力を欠く断片は、Ｆｃ断片と称される。Ｆａｂ断片は、ＶＨ領域およびＣＨ領域（ＣＨ１ドメイン）の一部と対合したＬ鎖（ＶＬ＋ＣＬドメイン）を含有する免疫グロブリン分子の１つのアームを含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域の一部がＣＨ１ドメインに結合したＦａｂ断片に相当する。Ｆ（ａｂ’）２断片は２つのＦａｂ’断片に相当し、これらは通常、典型的にはヒンジ領域においてジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【００９２】
本発明の単離された抗体は、このような抗体を含有する血清、または様々な程度に精製された抗体を含み得る。本発明の全抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。あるいは、全抗体の機能的等価物、例えば、１つまたはそれを超える抗体ドメインが短縮または欠如している抗体結合断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片）および遺伝子操作抗体またはその抗原結合断片（一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、複数のエピトープに結合し得る抗体（例えば、二重特異性抗体）、または１つもしくはそれを超える異なる抗原に結合し得る抗体（例えば、二重特異性抗体または多重特異性抗体）を含む）も本発明で用いられ得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるターゲティング構築物のターゲティング部分は、抗体を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ｉ）配列番号１３の軽鎖可変ドメインおよび／または（ｉｉ）配列番号１５の重鎖可変ドメインを含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ｉ）配列番号１４の軽鎖可変ドメインおよび／または（ｉｉ）配列番号１６の重鎖可変ドメインを含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号１７の配列を有するｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号１８の配列を有するｓｃＦｖである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ｉ）配列番号３４の軽鎖可変ドメインおよび／または（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ｉ）配列番号３５の軽鎖可変ドメインおよび／または（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号３７の配列を有するｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号３８の配列を有するｓｃＦｖである。
【００９５】
一実施形態では、本発明のターゲティング構築物は、ヒト化抗体またはその断片（例えば、ヒト化ｓｃＦｖ）を含む。ヒト化抗体またはその断片は、非ヒト種の免疫グロブリン由来の抗原結合部位を有する分子であって、分子の残りの免疫グロブリン由来部分がヒト免疫グロブリンに由来する分子である。抗原結合部位は、ヒト定常ドメインに融合された完全可変領域を含み得るか、または可変ドメイン中の適切なヒトフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。ヒト化抗体またはその断片は、例えば、抗体可変ドメインをモデリングし、ＣＤＲ移植などの遺伝子工学技術を使用して抗体を生産することによって生産され得る。様々なヒト化抗体生産技術の説明は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−５５；Ｗｈｉｔｔｌｅら、（１９８７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１：４９９−５０５；Ｃｏら、（１９９０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４；Ｃｏら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２７１７−２７２５ならびに国際公開第号９１／０９９６７号；国際公開第号９１／０９９６８号および国際公開第号９２／１１３８３１号に見られる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号４の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号５の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号６の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号７の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号８の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号９の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号１０の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号１１の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号１２の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１の配列、配列番号２の配列および配列番号３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７の配列、配列番号８の配列および配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４の配列、配列番号５の配列および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１０の配列、配列番号１１の配列および配列番号１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１の配列、配列番号２の配列および配列番号３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号４の配列、配列番号５の配列および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号７の配列、配列番号８の配列および配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号１０の配列、配列番号１１の配列および配列番号１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号４の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１３の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１５の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１４の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１６の重鎖可変ドメインを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１３の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号１５の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号１４の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号１６の重鎖可変ドメインを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号１７の配列を有するｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号１８の配列を有するｓｃＦｖである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号２５の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２６の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号２７の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号２８の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２９の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３０の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３１の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号３２の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３３の配列（例えば、軽鎖ＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号２８の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ１配列）、配列番号２９の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ２配列）もしくは配列番号３０の配列（例えば、重鎖ＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、配列番号２５の配列、配列番号２６の配列および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、配列番号３１の配列、配列番号３２の配列および配列番号３３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号２５の配列、配列番号２６の配列および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３１の配列、配列番号３２の配列および配列番号３３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３４の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３５の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号３４の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、（ｉ）配列番号３５の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号３７の配列を有するｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号３８の配列を有するｓｃＦｖである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、多価抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、二重特異性抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、アネキシンＩＶおよびリン脂質の両方に結合する二重特異性抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、抗体またはその断片の第１のアームがアネキシンＩＶに結合し、抗体またはその断片の第２のアームがリン脂質に結合する二重特異性抗体またはその断片である。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ａ）抗体またはその断片の第１のアームがアネキシンＩＶに結合し、アネキシンＩＶに結合する抗体またはその断片の上記配列を含み；および（ｂ）抗体またはその断片の第２のアームがリン脂質に結合し、リン脂質に結合する抗体またはその断片の上記配列を含む二重特異性抗体またはその断片である。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ａ）天然に存在する抗体Ｂ４のアームである第１のアーム；および（ｂ）天然に存在する抗体Ｃ２のアームである第２のアームを含む二重特異性抗体またはその断片である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、（ａ）上記アネキシンＩＶおよびリン脂質の両方に結合する二重特異性抗体または断片；ならびに（ｂ）補体活性の阻害剤（例えば、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片）を含む構築物が提供される。本明細書に記載される構築物は、本発明に記載される方法のいずれかに使用され得ることを理解すべきである。
【０１１４】
ＭＡｐ４４構築物
本明細書に記載される方法は、ＭＡｐ４４構築物の投与を含む。本出願はさらに、新規ＭＡｐ４４構築物（例えば、本明細書に記載される新規ＭＡｐ４４断片および／または新規ターゲティング部分−ＭＡｐ４４融合構築物）を提供する。ＭＡｐ４４構築物は、このセクションに詳細に記載されており、本明細書のこのセクションに記載される構築物のいずれかは、本発明に記載される方法のいずれかに使用され得る。
【０１１５】
本出願はさらに、本明細書に記載される構築物のいずれか１つを個体に投与することによって、本明細書に開示されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のいずれかを個体に送達する方法を提供する。
【０１１６】
本出願はさらに、本明細書に記載される構築物のいずれか１つを個体に投与することによって、本明細書に開示されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のいずれかを、個体における補体活性化の部位、組織傷害（例えば、非虚血性組織傷害）の部位または補体関連疾患の部位に送達する方法を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）が提供される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、配列番号４４の配列を含むＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）が提供される。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、約５０〜約１００アミノ酸長、約１００〜約１５０アミノ酸長、約１５０〜約２００アミノ酸長、約２００〜約２５０アミノ酸長、約２５０〜約３００アミノ酸長、約３００〜約３５０アミノ酸長または約３５０〜約３８０アミノ酸長であり、配列番号４４に見られる連続する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４のアミノ酸１〜１３７、アミノ酸１〜１７６、アミノ酸１〜２９６またはアミノ酸１〜３６３を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、約１００アミノ酸長未満、約２００アミノ酸長未満、約２５０アミノ酸長未満または約３００アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４６、４８、５０および５２からなる群より選択される１つまたはそれを超える配列を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、配列番号４４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％相同である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）が提供される。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片（以下、「ターゲティング部分」と称される）およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号１の配列、配列番号２の配列もしくは配列番号３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号４の配列、配列番号５の配列もしくは配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号７の配列、配列番号８の配列もしくは配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号１０の配列、配列番号１１の配列もしくは配列番号１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１の配列、配列番号２の配列および配列番号３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号７の配列、配列番号８の配列および配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号４の配列、配列番号５の配列および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１０の配列、配列番号１１の配列および配列番号１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号１の配列、配列番号２の配列および配列番号３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号４の配列、配列番号５の配列および配列番号６の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号７の配列、配列番号８の配列および配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号１０の配列、配列番号１１の配列および配列番号１２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号１の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号４の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３を含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１３の軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１５の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１４の軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１６の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号１３の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号１５の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号１４の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号１６の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１７の配列を有するｓｃＦｖである構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号１８の配列を有するｓｃＦｖである構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号２５の配列、配列番号２６の配列もしくは配列番号２７の配列を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列もしくは配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号３１の配列、配列番号３２の配列もしくは配列番号３３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列もしくは配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号２５の配列、配列番号２６の配列および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３１の配列、配列番号３２の配列および配列番号３３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号２５の配列、配列番号２６の配列および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号３１の配列、配列番号３２の配列および配列番号３３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号２８の配列、配列番号２９の配列および配列番号３０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；および（ｖｉ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３４の軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３５の軽鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号３４の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、（ｉ）配列番号３５の軽鎖可変ドメイン；および（ｉｉ）配列番号３６の重鎖可変ドメインを含む構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３７の配列を有するｓｃＦｖである構築物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）リン脂質（例えば、ＰＥ、ＣＬ、ＭＤＡおよび／またはＰＣ）に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物（または、前記構築物を含む組成物、例えば医薬組成物、または前記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクル）であって、前記抗体またはその断片が、配列番号３８の配列を有するｓｃＦｖである構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、非虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞、基底膜（例えば、ブルッフ膜）の表面上にまたは病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接連結される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、多価抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、二重特異性抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、アネキシンＩＶおよびリン脂質の両方に結合する二重特異性抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、抗体またはその断片の第１のアームがアネキシンＩＶに結合し、抗体またはその断片の第２のアームがリン脂質に結合する二重特異性抗体またはその断片である。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ａ）抗体またはその断片の第１のアームがアネキシンＩＶに結合し、アネキシンＩＶに結合する抗体またはその断片の上記配列を含み；および（ｂ）抗体またはその断片の第２のアームがリン脂質に結合し、リン脂質に結合する抗体またはその断片の上記配列を含む二重特異性抗体またはその断片である。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、（ａ）天然に存在する抗体Ｂ４のアームである第１のアーム；および（ｂ）天然に存在する抗体Ｃ２のアームである第２のアームを含む二重特異性抗体またはその断片である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、直接的に結合され、共有結合され、または可逆的に結合される。
【０１３９】
本明細書で使用される「ターゲッティング構築物」は、「ターゲティング部分」およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む天然に存在しない分子を指す。ターゲティング部分は、アネキシンＩＶまたはリン脂質に特異的に結合することができる。ターゲティング構築物のターゲティング部分は、例えば、補体活性化の部位への分子の標的送達に関与する。ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、例えば、補体活性化を特異的に阻害して、治療活性に関与する。ターゲティング構築物分子のそのターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、これら２つの部分の所望の機能性が維持される限り、当技術分野で公知の任意の方法によって互いに連結され得る。
【０１４０】
したがって、本明細書に記載されるターゲティング構築物は、一般に、本明細書に記載される抗体によって認識されるエピトープに対する結合、および治療活性の発揮という二重機能を有する。「モノクローナルＣ２抗体またはＢ４抗体のエピトープ」は、天然に存在するＣ２またはＢ４抗体に結合する任意の分子であって、Ｃ２またはＢ４抗体に天然に結合するエピトープの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかの結合親和性で、Ｃ２またはＢ４抗体に結合するエピトープを含む分子を指す。結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴、熱量滴定、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを含む当技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティング構築物は、一般に、補体活性化を阻害する（例えば、レクチン経路の活性化を阻害する）ことができる。ターゲティング構築物は、本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片よりも強力な補体阻害剤であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のものの約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍またはそれを超えるもののいずれかの補体阻害活性を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、約１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭまたは１０ｎＭのいずれか（これらの数値の間の任意の値を含む）未満のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、約５〜６０ｎＭ（例えば、８〜５０ｎＭ、８〜２０ｎＭ、１０〜４０ｎＭおよび２０〜３０ｎＭのいずれかを含む）のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のものの約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかの補体阻害活性を有する。
【０１４２】
補体阻害は、例えば、インビトロザイモサンアッセイ、赤血球溶解アッセイ、抗体または免疫複合体活性化アッセイ、代替経路活性化アッセイおよびマンナン活性化アッセイを含む当技術分野で公知の任意の方法に基づいて評価され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、融合タンパク質である。本明細書で使用される「融合タンパク質」は、作動可能に互いに連結された２つまたはそれを超えるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、互いに直接融合される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、アミノ酸リンカー配列によって連結される。リンカー配列の例は当技術分野で公知であり、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（ＳｅｒＧｌｙ４）、（ＳｅｒＧｌｙ４）２、（ＳｅｒＧｌｙ４）３および（ＳｅｒＧｌｙ４）４が挙げられる。連結配列はまた、補体因子の異なるドメイン間に見られる「天然」連結配列を含み得る。融合タンパク質中のターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片の順序は、変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング部分のＣ末端は、ターゲティング構築物のＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のＮ末端に（直接的または間接的に）融合される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分のＮ末端は、ターゲティング構築物のＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のＣ末端に（直接的または間接的に）融合される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物のターゲティング部分は、配列番号１９〜２４および５７のいずれか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物分子は、配列番号１９〜２４および５７のいずれかのものと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、化学架橋リンカーを介して連結されたターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む。２つの部分の連結は、２つの部分上にある反応性基において起こり得る。架橋リンカーを使用してターゲティングされ得る反応性基としては、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物およびカルボン酸、またはタンパク質に付加され得る活性基が挙げられる。化学リンカーの例は当技術分野で周知であり、限定されないが、ビスマレイミドヘキサン、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ＮＨＳ−エステル−マレイミド架橋リンカー、例えばＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、イミドエステル架橋リンカー、例えばＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＴＢＰ、ＥＤＣおよびＤＴＭＥが挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、非共有結合的に連結される。例えば、２つの部分は、ターゲティング部分またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片にそれぞれ連結された２つの相互作用架橋タンパク質（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）によって一緒になり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物のターゲティング部分は、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のアミノ末端に（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）結合される。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物のターゲティング部分は、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片のカルボキシ末端に（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）結合される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物のターゲティング部分の軽鎖は、少なくとも１つのＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片に連結され、重鎖は、少なくとも１つのＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片に連結される。２つまたはそれを超えるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は同一であり得るか、または異なり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、本明細書に記載されるターゲティング部分のＦａｂ断片を含み、（ｉ）前記Ｆａｂ断片の軽鎖は、本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片に（そのＣ末端で）連結され；（ｉｉ）前記Ｆａｂ断片の重鎖は、同じまたは異なる本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片に（そのＣ末端で）連結される。２本の鎖の適切なペアリングは、Ｆａｂの固有特性として起こると予想され得る。ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片およびＦａｂの軽鎖または重鎖は、直接的にまたはリンカー配列（例えば、本明細書に記載されるもののいずれか）を介して互いに結合され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、２つまたはそれを超える（同じまたは異なる）本明細書に記載されるターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、２つまたはそれを超える（同じまたは異なる）本明細書に記載されるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む。これら２つまたはそれを超えるターゲティング部分またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片は、互いにタンデムに連結（例えば、融合）され得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、ターゲティング部分および２つまたはそれを超える（例えば、３つ、４つ、５つまたはそれを超える）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片および２つまたはそれを超える（例えば、３つ、４つ、５つまたはそれを超える）ターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング構築物は、２つまたはそれを超えるターゲティング部分および２つまたはそれを超えるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、単離された構築物が提供される。いくつかの実施形態では、構築物は、二量体または多量体を形成する。
【０１５１】
ターゲティング構築物中のＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片およびターゲティング部分は、同じ種（例えば、ヒトまたはマウス）に由来し得るか、または異なる種に由来し得る。
【０１５２】
構築物の変異体
構築物の変異体も包含される。本明細書に記載される構築物の変異体は、（ｉ）ターゲティング部分および／もしくはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片のアミノ酸残基の１つもしくはそれを超えるものが、保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されたもの（このような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものでもよいし、または遺伝子コードによってコードされるものでなくてもよい；（ｉｉ）ターゲティング部分および／もしくはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片の１つもしくはそれを超えるアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）構築物が別の化合物（例えば、構築物の半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されたもの、（ｉｖ）さらなるアミノ酸が構築物（例えば、ターゲティング部分またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片）、例えばリーダーもしくは分泌配列、もしくは構築物の精製に用いられる配列に融合されたもの、または、（ｖ）構築物が、効果の持続時間の増加のためのより大きいポリペプチド（すなわち、ヒトアルブミン、抗体またはＦｃ）に融合されたものであり得る。このような変異体は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、構築物の変異体は、１つまたはそれを超える予測された好ましくは非必須アミノ酸残基においてなされた保存的アミノ酸置換（以下でさらに定義される）を含有する。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させずに、タンパク質の野生型配列から変化される残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。
【０１５４】
一般に、２０種のアミノ酸がタンパク質に見られる。これらのアミノ酸は、側鎖の化学特性に基づいて、９つのクラスまたはグループに分けられ得る。同じクラスまたはグループにおけるアミノ酸残基の別のものへの置換は、本明細書では「保存的」置換と称される。保存的アミノ酸置換は、多くの場合、タンパク質の立体構造または機能を有意に変化させずに、タンパク質でなされ得る。異なるクラスまたはグループのアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換は、本明細書では「非保存的」置換と称される。対照的に、非保存的アミノ酸置換は、タンパク質の立体構造および機能を破壊する傾向がある。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる（以下の表１を参照のこと）。
【表１】
2017518318.tif 000002
【０１５５】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの脂肪族アミノ酸の任意の他のものへの置換；セリン（Ｓ）のトレオニン（Ｔ）への置換（逆の場合も同じ）；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換（逆の場合も同じ）；グルタミン（Ｑ）のアスパラギン（Ｎ）への置換（逆の場合も同じ）；リジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換（逆の場合も同じ）；フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）の、これらの芳香族アミノ酸の任意の他のものへの置換；ならびにメチオニン（Ｍ）をシステイン（Ｃ）への置換（逆の場合も同じ）を含む。特定のアミノ酸の環境、およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、他の置換も保存的であると考えられ得る。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）のように、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、多くの場合に交換可能であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンと多くの場合に交換可能であり、バリンと交換可能なこともある。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２種類のアミノ酸残基のｐＫの相違は重要ではない位置において、多くの場合に交換可能である。特定の環境では、さらに他の変更が「保存的」であると考えられ得る（例えば、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ａｔ  ｐｐ．１３−１５，２ｎｄ  ｅｄ．Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ  ｅｄ．（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０（２０）：１１８８２−１１８８６を参照のこと）。
【０１５６】
構築物の機能を改善するために、構築物のターゲティング部分および／またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片のアミノ酸置換が導入される。例えば、そのリガンドに対するターゲティング部分の結合親和性を増加させ、そのリガンドに対するターゲティング構築物の結合特異性を増加させ、所望の部位へのターゲティング構築物のターゲティングを改善し、ターゲティング構築物の二量体化または多量体化を増加させ、ターゲティング構築物の薬物動態を改善するために、アミノ酸置換が構築物のターゲティング部分に導入され得る。同様に、構築物分子の機能性を増加させ、構築物の薬物動態を改善するために、アミノ酸置換が構築物のＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片に導入され得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、構築物は、別の化合物、例えば、構築物の半減期を増加させるための、および／または構築物の潜在的な免疫原性を減少させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」）と融合される。ＰＥＧは、水溶解性、サイズ、低速の腎臓クリアランス、および低免疫原性を構築物に付与するのに使用され得る。例えば、米国特許第６，２１４，９６６号を参照のこと。ＰＥＧ化の場合、ＰＥＧへの本明細書に記載される構築物の融合は、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。例えば、ＰＥＧ化は、最初に、システイン突然変異をターゲティング部分またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片に導入し、その後、ＰＥＧ−マレイミドによる部位特異的誘導体化によって達成され得る。システインは、構築物のＣ末端に付加され得る。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７（１５）：８５４８−８５５３を参照のこと。構築物に対して行われ得る別の改変は、ビオチニル化を含む。特定の場合、それがストレプトアビジンと容易に反応し得るように、構築物をビオチニル化することが有用であり得る。タンパク質をビオチニル化するための方法は、当技術分野で周知である。加えて、硫酸コンドロイチンは、構築物と連結され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、構築物は、構築物のターゲティング効率をさらに増加させる別の部分と融合される。例えば、Ｂ４抗体を含む構築物は、例えば、Ｃ２抗体、または血管の内皮細胞に対する結合能力もしくは他の接着能力を有する別の抗体（「血管内皮ターゲティングアミノ酸リガンド」と称される）に融合され得る。例示的な血管内皮ターゲティングアミノ酸リガンドとしては、限定されないが、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、インテグリン、フィブロネクチン、Ｉ−ＣＡＭ、ＰＤＧＦ、または血管内皮細胞表面上で発現される分子に対する抗体が挙げられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、構築物は、細胞間接着分子のリガンドにコンジュゲート（例えば、融合）される。例えば、構築物分子は、細胞間接着分子に結合する１つまたはそれを超える炭水化物部分にコンジュゲートされ得る。炭水化物部分は、傷害部位への構築物分子の局在化を容易にする。炭水化物部分は、細胞外事象、例えば化学的もしくは酵素的な結合によって、構築物分子に結合され得るか、または適切な酵素の発現によって達成される細胞内プロセシングの結果であり得る。いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、特定のクラスの接着分子、例えばインテグリンまたはセレクチン（Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチンまたはＰ−セレクチンを含む）に結合する。いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、Ｎ連結炭水化物、例えば複合体型（フコシル化炭水化物およびシアル酸化炭水化物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ抗原、例えばシアル酸化Ｌｅｗｉｓ  Ｘ抗原に関係する。
【０１６０】
眼疾患、例えばＡＭＤの処置のために、構築物は、ドルーゼンのエピトープを認識する抗体にコンジュゲート（例えば、融合）され得る。他のターゲティング分子、例えば小さなターゲティングペプチドも使用され得る。構築物の他の改変としては、例えば、公知の保護／ブロッキング基などによるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化が挙げられる。
【０１６１】
ポリペプチドのターゲティングまたは精製を容易にするために、構築物は、免疫学的に活性なドメイン、例えば抗体エピトープまたは他のタグの付加を含み得る。タグとして６×ＨｉｓおよびＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）を使用することは、周知である。融合部または融合部付近に切断部位を含めることにより、精製後に、構築物から外来ポリペプチドを除去することが容易になるであろう。構築物に含まれ得る他のアミノ酸配列としては、機能性ドメイン、例えば酵素（例えば、ヒドロラーゼ）由来の活性部位、グリコシル化ドメインおよび細胞ターゲティングシグナルが挙げられる。
【０１６２】
構築物の変異体は、本明細書に記載される構築物のアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「十分に類似する」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と同一または同等の十分数または最小数のアミノ酸残基を含有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、好ましくは約７５％〜９８％同一の共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列は、本明細書では十分に類似すると定義される。変異体としては、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる構築物の変異体が挙げられる。このような変異体は、一般に、本発明の構築物の機能活性を保持する。ポリヌクレオチドの断片のライブラリーは、スクリーニングおよびそれに続く選択のための多様な断片集合物を作製するのに使用され得る。例えば、断片のライブラリーは、１分子当たりわずか約１回のニッキングが起こる条件下で、ポリヌクレオチドの二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを復元して二本鎖ＤＮＡ（これは、異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る）を形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理によって再形成二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることによって作製され得る。前記方法によって、様々なサイズの本発明の構築物のＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１６３】
変異体は、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる構築物を含む。加えて、構築物の生物学的に同等な類似体もまた、ターゲティング部分および／またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片の残基または配列に対して様々な置換を行うことによって構築され得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、構築物は、シグナルペプチドのＮ末端に融合される。このようなシグナルペプチドは、構築物の分泌に有用である。適切なシグナルペプチドとしては、例えば、ＣＤ５タンパク質のシグナルペプチド（例えば、ヒトＣＤ５タンパク質ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡＳ、配列番号５４のシグナルペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲ２タンパク質のシグナルペプチドが使用される。例えば、いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ２タンパク質のシグナルペプチド（ＭＧＡＡＧＬＬＧＶＦＬＡＬＶＡＰＧ、配列番号５５またはＭＧＡＡＧＬＬＧＶＦＬＡＬＶＡＰＧＶＬＧ、配列番号５６）が使用される。
【０１６５】
構築物の生産方法
本明細書に記載される構築物は、分子生物学およびタンパク質化学の分野で公知の様々な技術を使用して生産され得る。例えば、本明細書に記載される構築物をコードする核酸は、転写および翻訳調節配列（これらとしては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられる）を含有する発現ベクターに挿入され得る。調節配列は、プロモーター、ならびに転写開始および終結配列を含む。加えて、発現ベクターは、それが２つの異なる生物において（例えば、発現の場合には哺乳動物細胞または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅の場合には原核宿主において）維持され得るように、複数の複製系を含み得る。
【０１６６】
哺乳動物細胞において核酸から構築物を発現させるために、いくつかの可能なベクター系が利用可能である。第１のクラスのベクターは、宿主細胞のゲノムへの所望の遺伝子配列の組み込みに依拠する。安定に組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、薬物耐性遺伝子、例えば大腸菌ｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７８：２０７２）またはＴｎ５  ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８２）ＭｏｌＡｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １：３２７）を同時に導入することによって選択され得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ遺伝子配列に連結され得るか、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入され得る（Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７９）Ｃｅｌｌ  １６：７７）。第２のクラスのベクターは、自己複製能力を染色体外のプラスミドに付与するＤＮＡ要素を利用する。これらのベクターは、動物ウイルス、例えばウシパピローマウイルス（Ｓａｒｖｅｒら、（１９８２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７９：７１４７）、ポリオーマウイルス（Ｄｅａｎｓら、（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａ  ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：１２９２）またはＳＶ４０ウイルス（Ｌｕｓｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：７９）に由来し得る。
【０１６７】
発現ベクターは、その後の核酸発現に適切な方法で、細胞に導入され得る。以下に記載されるように、導入方法は、標的細胞の種類によって大きく決定される。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈降、リポソーム融合、リポフェクチン、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合および直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１６８】
構築物の発現のための適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物および上述のように哺乳動物細胞が挙げられる。興味深いのは、細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、昆虫細胞、例えばＳＦ９、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）および初代細胞株（例えば、初代哺乳動物細胞）である。いくつかの実施形態では、構築物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または適切な骨髄腫細胞株、例えば（ＮＳＯ）において発現され得る。適切な細胞株としては、例えば、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスターの腎臓）細胞；２９３（ヒト腎臓幹細胞）細胞；ＨＭＥｐＣ（ヒト乳腺上皮細胞；３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞）細胞も挙げられる。
【０１６９】
ターゲティング部分および１つまたはそれを超えるＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、場合により互いに直接結合され得るか、または場合によりリンカーを介して結合され得る。ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片が直接結合している場合、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ自体が、公知の科学方法を使用して互いに直接ライゲーションされているハイブリッドベクターが作られる。リンカーが使用される場合、ターゲティング部分をコードするＤＮＡが、リンカーの一方の末端をコードするＤＮＡにライゲーションされており、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡが、リンカーの他方の末端にライゲーションされているハイブリッドベクターが作られる。適切な方向でこのようなライゲーションを実施するための方法は公知である。このようなライゲーションは、連続して実施され得るか、またはスリーウェイライゲーションとして実施され得る。本発明においてリンカー配列として機能し得る配列の例としては、約２〜約１６アミノ酸長の短いペプチドが挙げられる。本発明においてリンカーとして有用なペプチドの中では、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１〜８）；（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）；（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒＧｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）がある。本発明においてリンカー配列として有用な配列の他の例としては、以下の補体関連タンパク質：Ｈ因子；補体受容体１；補体受容体２；Ｂ因子；ＤＡＦなどの１つまたはそれを超えるものに由来する１つまたはそれを超える短い保存領域（ＳＣＲ）ドメインが挙げられる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）において発現され得、前記トランスジェニック動物から精製され得る。例えば、本明細書に記載される構築物は、例えば、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３（６）：６２５−６２９；ｖａｎ  Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎら、（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ９（２）：１５５−１５９；およびＰｏｌｌｏｃｋら、（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１４７−１５７に記載されているように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類、ヒツジまたはヤギ）において産生され得、乳から単離され得る。哺乳動物乳産物中にタンパク質を生産するためのさらなる方法は、例えば、米国特許出願公開第２００６００１０５３４７号および米国特許出願公開第２００４０００６７７６号および米国特許第７，０４５，６７６号に記載されている。
【０１７１】
本明細書に記載される構築物は、構築物の発現を可能にするのに十分な条件下および時間で、構築物をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、細胞から生産され得る。タンパク質発現のこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、通常の実験を通じて当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、大腸菌において発現されたポリペプチドは、封入体からリフォールディングされ得る（例えば、Ｈｏｕら、（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３１９−３０を参照のこと）。細菌発現系およびそれらの使用方法は、当技術分野で周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−−３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照のこと）。コドン、適切な発現ベクターおよび適切な宿主細胞の選択は、いくつかの要因に応じて変動し、必要に応じて容易に最適化され得る。本明細書に記載される構築物は、哺乳動物細胞において、または他の発現系（限定されないが、酵母、バキュロウイルスおよびインビトロ発現系を含む）において発現され得る（例えば、Ｋａｓｚｕｂｓｋａら、（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １８：２１３−２２０を参照のこと）。
【０１７２】
発現の後、構築物は単離され得る。本明細書に記載されるタンパク質（例えば、構築物、ターゲティング部分および／またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片）のいずれかに適用される「精製された」または「単離された」という用語は、それに天然に付随する要素（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生体分子または有機分子）、例えば、タンパク質を発現する原核生物中の他のタンパク質、脂質および核酸から分離または精製されたポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、それがサンプル中の全タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７または９９）重量％を構成する場合、精製されている。
【０１７３】
本明細書に記載される構築物は、どのような他の要素がサンプル中に存在するかに応じて、当業者に公知の様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法としては、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術およびクロマトグラフィー技術（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む）が挙げられる。例えば、構築物は、標準的な抗構築物抗体アフィニティカラムを使用して精製され得る。タンパク質濃縮と組み合わせた限外ろ過および透析技術も有用である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。必要な精製の程度は、所望の用途に応じて変動するであろう。いくつかの場合では、発現されたそのポリペプチドの精製は不要であろう。
【０１７４】
精製ポリペプチドの収率または純度を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＵＶ分光法、Ｂｉｕｒｅｔタンパク質アッセイ、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分光法（ＭＳ）およびゲル電気泳動方法（例えば、クマシーブルーまたはコロイド銀染色などのタンパク質染色を使用）が挙げられる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、当技術分野で周知の化学方法を使用して、全体的または部分的にデノボ合成され得る。例えば、アミノ酸配列要素を固相技術によって合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製し、その後、化学結合して所望のポリペプチドを形成し得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認され得る。
【０１７６】
発現および／または精製したら、本明細書に記載される構築物は、インビトロまたはインビボアッセイ、例えば本明細書に記載されるもののいずれかを使用して、いくつかの所望の特性のいずれか１つについてアッセイされ得る。例えば、本明細書に記載される構築物は、本明細書に記載されるように、補体活性を阻害する能力についてアッセイされ得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、内毒素は、構築物の調製物から除去され得る。タンパク質サンプルから内毒素を除去するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、内毒素は、限定されないが、ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔｓ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）またはＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）−Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む様々な市販の試薬を使用して、タンパク質サンプルから除去され得る。
【０１７８】
（精製前および精製後の両方に）サンプル中に存在する内毒素を検出および／またはその量を測定するための方法は当技術分野で公知であり、市販のキットが利用可能である。例えば、タンパク質サンプル中の内毒素の濃度は、ＱＣＬ−１０００  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃキット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、アメリカカブトガニアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）に基づくキット、例えば、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬおよびＣＳＥキット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ．から入手可能）を使用して決定され得る。
【０１７９】
発現および精製の後、本明細書に記載される構築物は改変され得る。改変は、共有結合または非共有結合性の改変であり得る。このような改変は、例えば、ターゲティング部分および／またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片における標的アミノ酸残基と、選択側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることによって、構築物に導入され得る。適切な改変部位は、例えば、本明細書に記載される構築物の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む様々な基準のいずれかを使用して選択され得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、異種部分にコンジュゲートされ得る。異種部分がポリペプチドであるいくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物および対応する異種部分は、融合タンパク質によって結合され得る。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、毒素または薬物）または検出可能な標識、例えば、限定されないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識または発光標識であり得る。適切な異種ポリペプチドとしては、例えば、構築物の精製に使用するための抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、ヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））が挙げられる。異種ポリペプチドとしては、診断マーカーまたは検出マーカーとして有用なポリペプチド、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も挙げられる。異種部分がポリペプチドである場合、前記部分を本明細書に記載される融合タンパク質に組み込んで、融合タンパク質を得ることができる。
【０１８１】
コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合分子は、２つの独立して作られたポリペプチド断片、例えば抗体（例えば、Ｂ４またはＣ２抗体のＦａｂ断片）および補体調節因子ポリペプチド（例えば、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片）の連結によって作られる。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、リジン、システイン、グルタメート、アスパルテートまたはアルギニンアミノ酸を介して、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片にコンジュゲートされる。ターゲティング部分は、例えば、チオール化ターゲティング部分と、ＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片のマレオイル活性化アミンとの反応；ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化ターゲティング部分と、ＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片のアミンとの反応；またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化カルボン酸と、ターゲティング部分アミンとの反応によって、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質（例えば、本明細書に記載される構築物および異種部分またはターゲティング構築物の２つの構成部分）は、いくつかの公知の化学架橋剤のいずれかを使用して化学的に架橋され得る。このような架橋剤の例は、「ヒンダード」ジスルフィド結合を含む連結によって、２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結では、架橋単位内のジスルフィド結合は、（ジスルフィド結合の両側の基を妨害することによって）、例えば、還元グルタチオンまたは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用による還元から保護される。適切な試薬の１つである４−スクシンイミジルオキシカルボニルａ−メチル−ａ（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質の一方の末端リジン、および他方の末端システインを利用して、２つのタンパク質間でこのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能試薬も使用され得る。他の有用な架橋剤としては、限定されないが、２つのアミノ基を連結する試薬（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基を連結する試薬（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基およびスルフヒドリル基を連結する試薬（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基およびカルボキシル基を連結する試薬（例えば、４−［パジドサリチルアミド］ブチルアミン）、ならびにアミノ基およびアルギニンの側鎖中に存在するグアニジニウム基を連結する試薬（例えば、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）が挙げられる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、融合タンパク質に化学的に連結された異種部分を含有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬物、蛍光標識、常磁性標識、放射性標識などは、構築物および／またはターゲティング部分のアミノ酸骨格に直接コンジュゲートされ得る（例えば、インビボイメージング研究のための標識構築物の使用）。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、構築物は、例えば、循環中（例えば、血中、血清中または他の組織中）の構築物の安定および／または保持を改善する部分を用いて改変され得る。例えば、本明細書に記載される構築物は、例えば、Ｌｅｅら、（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０（６）：９７３−８；Ｋｉｎｓｔｌｅｒら、（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４７７−４８５；およびＲｏｂｅｒｔｓら、（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６に記載されているようにＰＥＧ化され得る。安定化部分は、構築物の安定性または保持性を少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれを超えて）改善し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、グリコシル化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される構築物は、構築物、ターゲティング部分および／またはＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片が低グリコシル化を有するかまたはグリコシル化を有しないように、酵素的もしくは化学的処理に供され得るか、または細胞から生産され得る。低グリコシル化ポリペプチドを生産するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号；Ｗｒｉｇｈｔら、（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ  １０（１０）：２７１７−２７２３；およびＣｏら、（１９９３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１３６１−１３６７に記載されている。
【０１８５】
医薬組成物
ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物も本明細書で提供される。医薬組成物は、例えば、全身投与または局所的な投与を含む本明細書に記載される様々な投与様式に適切であり得る。医薬組成物は、点眼薬、注射可能な溶液の形態、または（口または鼻のいずれかを介した）吸入もしくは経口投与に適切な形態であり得る。本明細書に記載される医薬組成物は、単一の単位剤形または複数の単位剤形でパッケージされ得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、ヒトへの投与に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、眼内投与に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、眼への局所適用に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、静脈内注射に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、動脈（例えば、腎動脈）への注射に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む。
【０１８７】
一般に、組成物は、滅菌で、実質的に等張性で、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）の規制に完全に従うように製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、病原体を含まない。注射の場合、医薬組成物は、液体溶液の形態、例えば、生理学的に適合し得る緩衝液、例えば、Ｈａｎｋ溶液またはＲｉｎｇｅｒ溶液の形態であり得る。加えて、医薬組成物は、固体形態であり得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥組成物も含まれる。
【０１８８】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば、結合剤（例えば、糊化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとり得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、液体、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るか、またはそれらは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示され得る。このような液体調製物は、薬学的に許容され得る添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用水素化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて、従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、適切な場合、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有し得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物と、眼への投与に適切な薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を提供する。このような医薬担体は、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油などを含む滅菌された液体（例えば、水および油）であり得る。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のための液体担体として用いられ得る。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、ナトリウムステート、グリセロールモノステアレート、グリセロール、プロピレン、水などが挙げられる。医薬組成物はまた、所望により、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤を含有し得る。構築物の制御放出を提供するために、構築物および組成物の他の要素は、ポリマーまたはフィブリン糊に含められ得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、ゲルまたは他の固体もしくは半固体組成物などの形態をとり得る。組成物は、典型的には、４．５〜８．０の範囲内のｐＨを有する。組成物はまた、眼および眼組織の房水と適合する浸透圧値を有するように製剤化されなければならない。このような浸透圧値は、一般に、約２００〜約４００ミリオスモル／キログラム水（「ｍＯｓｍ／ｋｇ」）の範囲内であるが、好ましくは、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであろう。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、組成物は、通常の手順にしたがって、静脈内注射、腹腔内注射または硝子体内注射に適合された医薬組成物として製剤化される。典型的には、注射のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤と、注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔薬、例えばリグノカインとを含み得る。一般に、前記成分は、別個に供給されるか、または密閉密封容器（例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋）において単位剤形で、例えば凍結乾燥粉末もしくは非含水濃縮物として一緒に混合されて供給される。組成物が点滴によって投与される場合、それは、医薬グレードの滅菌水または生理食塩水を含有する点滴瓶を用いて分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１９１】
組成物は、さらなる成分、例えば保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化剤および安定化剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含み得る。
【０１９２】
溶液で使用するのに適切な保存剤としては、ポリクアテルニウム−１、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。典型的には（必須ではないが）このような保存剤は、０．００１重量％〜１．０重量％のレベルで用いられる。
【０１９３】
適切な緩衝液としては、ｐＨをｐＨ約６〜ｐＨ約８、好ましくはｐＨ約７〜ｐＨ約７．５に維持するのに十分な量のホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどが挙げられる。
【０１９４】
適切な等張化剤は、点眼薬の塩化ナトリウム当量が０．９±０．２％の範囲内にあるような、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどである。
【０１９５】
適切な抗酸化剤および安定化剤としては、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤および清澄剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【０１９６】
単純な水溶液よりも高粘度の局所組成物を提供するための増粘剤の使用は、標的組織による活性化合物の眼吸収を増加させ、または眼内保持時間を増加させるために望ましい場合がある。このような粘度構築剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者に公知の他の薬剤が挙げられる。このような薬剤は、典型的には、０．０１重量％〜２重量％のレベルで用いられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物をコードするヌクレオチドを送達するための医薬組成物が提供される。遺伝子治療のための医薬組成物は、許容され得る希釈剤中に溶解され得るか、または遺伝子送達ビヒクルもしくは化合物が埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達系が組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターからインタクトに産生され得る場合、医薬組成物は、遺伝子送達系を産生する１つまたはそれを超える細胞を含み得る。
【０１９８】
臨床場面では、遺伝子治療のための遺伝子送達系は、いくつかの方法のいずれかによって被験体に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の医薬組成物は、例えば、静脈内注射によって全身に導入され得、標的細胞へのタンパク質の特異的形質導入は、遺伝子送達ビヒクルによって提供されるトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型もしくは組織型発現、またはそれらの組み合わせから特異的に起こる。他の実施形態では、動物への導入が非常に局所的であれば、組換え遺伝子の初期送達がより制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位的注入によって（Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７）導入され得る。構築物をコードするポリヌクレオチドは、Ｄｅｖら、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．２０：１０５−１１５に記載されている技術を使用して、エレクトロポレーションによって遺伝子治療構築物に送達され得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、眼への遺伝子送達のための医薬組成物が提供される。発現ベクターの保存および／または送達に有用な点眼薬は、例えば、国際公開第０３０７７７９６号Ａ２に開示されている。
【０２００】
疾患を処置する方法
いくつかの実施形態では、本出願は、補体活性化を阻害し、炎症を阻害し、または個体における炎症性疾患を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、非経口注射、静脈内注射、皮下注射、眼内注射、関節内注射または筋肉内注射などの注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を、個体における組織傷害（例えば、非虚血性組織傷害）の部位に送達する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、構築物は、ターゲティング部分（例えば、抗体）をさらに含む。いくつかの実施形態では、補体活性化を阻害し、炎症を阻害し、または個体における炎症性疾患を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片；（ｂ）アネキシンＩＶまたはリン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記組成物は、非経口注射、静脈内注射、皮下注射、眼内注射、関節内注射または筋肉内注射などの注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を、個体における組織傷害（例えば、非虚血性組織傷害）の部位に送達する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片；（ｂ）アネキシンＩＶまたはリン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片を含む方法が提供される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、個体中の組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、個体中の組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、個体中の組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）リン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、個体中の酸化的損傷を有する組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、個体中の酸化的損傷を有する組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、個体中の酸化的損傷を有する組織中の補体活性化を阻害する（または、炎症、例えば補体媒介性炎症を阻害する）方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）リン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、組織は、肝臓または門脈管、心臓、筋肉、脳、中枢または末梢神経系、胃腸管、肺、四肢、動脈または静脈血管系、皮膚、骨髄細胞（赤血球細胞、血小板および有核細胞を含む）、膵臓、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組織は、眼、関節および腎臓のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のいずれかを含む）の補体活性化または炎症が阻害される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、個体における炎症性疾患（または酸化的損傷を伴う疾患）を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性、例えば超急性異種移植拒絶）、妊娠関連疾患、有害薬物反応（例えば、薬物アレルギーおよびＩＬ−２誘導性血管漏出症候群）、自己免疫または免疫複合体障害のいずれかである。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、個体における炎症性疾患（または酸化的損傷を伴う疾患）を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）アネキシンＩＶに特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アネキシンＩＶに対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｂ４）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（および／または病理学的構造中）に存在する。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、有核細胞（例えば、哺乳動物細胞）によって産生される。いくつかの実施形態では、アネキシンＩＶは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性、例えば超急性異種移植拒絶）、妊娠関連疾患、有害薬物反応（例えば、薬物アレルギーおよびＩＬ−２誘導性血管漏出症候群）、自己免疫または免疫複合体障害のいずれかである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、個体における炎症性疾患（または酸化的損傷を伴う疾患）を処置する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）リン脂質に特異的に結合する抗体またはその断片；および（ｂ）ＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、リン脂質に対する病原性抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｃ２）と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、組織傷害（例えば、虚血性傷害）および／または酸化的損傷を受けている（または受けるリスクにある）組織中のまたは前記組織に隣接する個体中の細胞の表面上（または病理学的構造（例えば、ドルーゼン）中）に存在する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン（ＣＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、中性である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、リン脂質は、酸化されている。いくつかの実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分およびＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性、例えば超急性異種移植拒絶）、妊娠関連疾患、有害薬物反応（例えば、薬物アレルギーおよびＩＬ−２誘導性血管漏出症候群）、自己免疫または免疫複合体障害のいずれかである。
【０２１１】
ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物を、個体中の組織傷害の部位に送達する方法であって、構築物を含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記構築物が、（ａ）ＭＡｐ４４ポリペプチドもしくはその断片；および／または（ｂ）アネキシンＩＶもしくはリン脂質に特異的に結合する抗体もしくはその断片を含む方法も提供される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、補体活性化を阻害し、炎症を阻害し、または個体における炎症性疾患を処置する方法であって、ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を個体に導入するためのビヒクルを前記個体に投与することを含み、前記ビヒクルが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびプラスミドからなる群より選択されるベクターである方法が提供される。
【０２１３】
ターゲティング部分に場合により連結されたＭＡｐ４４ポリペプチドまたはその断片を含む構築物を、個体中の組織傷害の部位に送達する方法であって、上記構築物の発現のための配列を含む外因性核酸を患者に導入するためのビヒクルを前記個体に投与することを含み、前記ビヒクルが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびプラスミドからなる群より選択されるベクターである方法も提供される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は、眼疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、補体活性化に関連する眼疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、ウェット型ＡＭＤとドライ型ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）である。本明細書に記載される方法によって処置され得る他の眼疾患としては、限定されないが、ＣＭＶ網膜炎、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症および眼黒色腫が挙げられる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は、炎症性関節炎である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は、限定されないが、急性腎傷害、糸球体腎炎、慢性腎疾患および巣状分節性糸球体硬化症を含む腎臓疾患である。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は炎症性障害であり、限定されないが、火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、心肺バイパス、血液透析、アナフィラキシーショック、喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、膜性腎炎および膵炎が挙げられる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は妊娠関連疾患であり、限定されないが、ＨＥＬＬＰ（溶血性貧血、肝酵素上昇および低血小板数）、再発性胎児喪失および子癇前症が挙げられる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は自己免疫または免疫複合体障害であり、限定されないが、重症筋無力症、アルツハイマー病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＧ４関連疾患、インスリン依存性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｙｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、自己免疫性肝炎、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、シェーグレン症候群、高安動脈炎、自己免疫性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型、膜性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑症、ブドウ膜炎、網膜変性障害、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、ＡＮＣＡ関連血管炎、溶血性尿毒症症候群、志賀毒素関連溶血性尿毒症症候群および非定型溶血性尿毒症症候群が挙げられる。いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は自己免疫性糸球体腎炎であり、限定されないが、免疫グロブリンＡ腎症または膜性増殖性糸球体腎炎Ｉ型が挙げられる。
【０２２０】
処置すべき疾患
本明細書に記載される処置方法は、限定されないが、炎症性疾患、移植拒絶、妊娠関連疾患、有害薬物反応、虚血再灌流傷害に起因する組織損傷、眼疾患、腎臓疾患、関節疾患および自己免疫または免疫複合体障害を含む様々な疾患を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置すべき疾患としては、限定されないが、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎、関節リウマチ、心肺バイパスおよび血液透析、臓器移植の超急性拒絶、心筋梗塞、虚血／再灌流傷害、抗体媒介性同種拒絶（例えば、腎臓における）および成人呼吸促迫症候群が挙げられる。また、限定されないが、熱傷、重症喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、膜性増殖性糸球体腎炎、非定型溶血性尿毒症症候群、シェーグレン症候群、腎臓および肺虚血／再灌流および他の器官特異的炎症性障害を含む他の炎症症状および自己免疫／免疫複合体疾患もまた、補体活性化に密接に関連する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、限定されないが、炎症性疾患、移植拒絶、妊娠関連疾患、有害薬物反応、虚血再灌流傷害に起因する組織損傷、眼疾患、腎臓疾患、関節疾患または自己免疫または免疫複合体障害を含む補体媒介性疾患を処置するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、個体における補体媒介性疾患を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される組成物（例えば、構築物を含む組成物）のいずれかを前記個体に投与することを含む方法も本明細書で提供される。
【０２２１】
本明細書に記載される方法は、限定されないが、火傷、内毒血症、敗血症ショック、成人呼吸促迫症候群、心肺バイパス、血液透析、アナフィラキシーショック、喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、連鎖球菌関連後の糸球体腎炎、膜性腎症、膵炎、関節リウマチ、炎症性関節炎、炎症性腸疾患、急性肺損傷および播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を含む炎症性疾患を処置するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、炎症（例えば、補体媒介性炎症）は、炎症性障害または自己炎症性障害、移植拒絶（細胞または抗体媒介性）、妊娠関連疾患、有害薬物反応、変性、血管新生、溶血性、血栓性、血管炎性、関節炎、再生、外傷性、自己免疫または免疫複合体障害に起因する組織損傷に関連する。
【０２２２】
本明細書に記載される組成物はまた、限定されないが、超急性移植拒絶、抗体媒介性移植拒絶、細胞媒介性移植拒絶、急性移植拒絶および慢性移植拒絶を含む移植拒絶を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、移植物は、異種移植片、同種移植片または同系移植片であり得る。いくつかの実施形態では、移植物は、液体、細胞、組織または器官である。いくつかの実施形態では、移植物は、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、腸、胃、精巣、手、腕、足、子宮、卵巣および胸腺からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、移植物は、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、ランゲルハンス島、骨髄、造血幹細胞、輸血および静脈からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、移植物は、心臓、肝臓または腎臓である。移植拒絶は、いくつかの合併症、例えば移植片対宿主病をもたらし得る。いくつかの実施形態では、補体媒介性疾患は、移植片対宿主病である。
【０２２３】
本明細書に記載される方法はまた、限定されないが、ＨＥＬＬＰ（溶血性貧血、肝臓酵素の上昇および低い血小板数）、習慣性流産、非定型溶血性尿毒症症候群、胎児低酸素症候群、高血圧疾患および子癇前症を含む妊娠関連疾患を処置するのに特に有用である。
【０２２４】
加えて、本明細書に記載される方法は、限定されないが、薬物アレルギー、Ｘ線撮影の造影剤アレルギーおよびＩＬ−２によって誘発される血管漏出を含む有害薬物反応を処置するのに有用である。
【０２２５】
本明細書に記載される方法はまた、以下の虚血再灌流傷害、限定されないが、急性心筋梗塞、動脈瘤、動脈瘤修復、超低体温循環停止、止血帯の使用、固形臓器移植、卒中（周産期卒中を含む）、出血性ショック、挫傷、多器官不全、血液透析、乏血性ショック、脊髄損傷、外傷性脳損傷、腸管虚血、網膜虚血、心肺バイパス、経皮経管冠動脈形成（ＰＣＴＡ）不全のための緊急心冠手術および血管遮断を伴う任意の血管手術、膵管または胆管の操作後の膵炎に起因する組織損傷を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、組織損傷は、虚血再灌流傷害をトリガーする虚血事象（例えば、腸管虚血）の前に、前記虚血事象中に、または前記虚血事象後に処置され得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、組織損傷は、再灌流前に本明細書に開示される構築物（または構築物または構築物の発現のためのビヒクルを含む組成物）を投与することによって、本明細書に開示される任意の方法を使用して処置される。いくつかの実施形態では、組織損傷は、再灌流後に本明細書に開示される構築物（または構築物または構築物の発現のためのビヒクルを含む組成物）を投与することによって、本明細書に開示される任意の方法を使用して処置される。いくつかの実施形態では、虚血再灌流傷害は、心筋虚血再灌流、腎臓虚血再灌流傷害、胃腸虚血再灌流傷害、肝臓虚血再灌流傷害、骨格筋虚血再灌流傷害、脳虚血再灌流傷害、肺虚血再灌流傷害、腸虚血再灌流傷害、網膜虚血再灌流傷害および関節虚血再灌流傷害からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、組織損傷は、酸化的損傷によって引き起こされる。
【０２２７】
治療または手術が再灌流を誘導するが、虚血は誘導しない事例（本明細書では、非虚血性再灌流傷害と称される）がある。このような治療または手術としては、限定されないが、薬理学的血栓溶解、卒中、急性冠動脈症候群、末梢動脈閉塞、肺塞栓、腎臓動脈閉塞の静脈内および血管内治療、機械的血栓除去術、例えば、経皮的冠動脈形成術、末梢動脈血管形成術、動脈内膜血管形成術、冠動脈バイパス術、頚動脈内膜切除、腸間膜虚血、出血性ショック、心原性ショック、神経原性ショック、アナフィラキシーショックを含むショック、皮弁不全、例えば、形成手術、指および肢の再移植および腸狭窄が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、非虚血性再灌流傷害から引き起こされる組織損傷は、本明細書に開示される構築物（または構築物または構築物の発現のためのビヒクルを含む組成物）を投与することによって、本明細書に開示される任意の方法を使用して処置される。
【０２２８】
本明細書に記載される方法はまた、限定されないが、急性腎臓損傷、溶血性尿毒症症候群、糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、急性感染後糸球体腎炎（例えば、連鎖球菌関連後の糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症による糸球体腎炎、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（例えば、間質性毛細管性糸球体腎炎）、デンスデポジット病、微小変化群、糖尿病性ネフロパシー、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ＩｇＡネフロパシー、慢性腎臓疾患、腎臓移植後増機能障害、急性および慢性の腎臓移植拒絶、タンパク尿の腎疾患およびネフローゼ症候群、高血圧腎臓疾患および巣状分節性糸球体硬化症を含む、腎臓疾患を処置するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、腎臓疾患は、糸球体疾患である。例えば、前記方法はまた、損傷糸球体に対する天然ＩｇＭの結合を導く、糸球体疾患を処置するに有用である。いくつかの実施形態では、損傷糸球体は、機械的ストレス、代謝ストレス、化学薬品ストレス、酸化ストレスまたは免疫学的ストレスの結果であり得る。いくつかの実施形態では、損傷糸球体は、虚血、糖尿病、高血圧および続発性巣状分節性糸球体硬化症の結果であり得る。損傷糸球体の症候としては、炎症応答、例えば、サイトカイン放出および線維症、例えば、コラーゲン糸球体間質マトリックスの蓄積、尿細管細胞の損傷および尿細管間質性線維症が挙げられる。前記方法はまた、例えば、糸球体の炎症である糸球体腎炎腎臓疾患を処置するのに有用である。糸球体腎炎は、一般に、Ｃ３を含む補体成分を含む糸球体中の高電子密度物質の蓄積に関連する。前記方法はまた、腎臓虚血に関連する急性腎臓損傷を処置するのに有用である。虚血は、急性腎臓損傷の主な原因である。虚血およびそれに続く再灌流は、内皮機能不全、白血球媒介性炎症および微細血管の血流減少によって急性腎臓損傷を誘発し、これが尿細管周囲毛細血管の希薄化をもたらして、大脳皮質接合部への酸素需給の危ういバランスを負の酸素バランスに変化させ得る。このバランスの変化は低酸素環境を引き起こし、線維の蓄積およびそれに続く慢性腎臓疾患をもたらし得る。いくつかの実施形態では、腎臓疾患は、Ｈ因子の欠損に起因する。
【０２２９】
本明細書に記載される方法はまた、限定されないが、関節炎（例えば、関節リウマチ）および感染（例えば、Ｂ型肝炎感染）に関連する関節炎症、炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患）または自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）を含む、関節疾患を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、限定されないが、関節炎、アミロイド関節症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、手根管症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発関節痛、腱炎、ウィップル病、滑液包炎、三叉神経痛、線維筋腫、線維炎、自己免疫関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、ループス関節炎、ポリ関節炎、自己免疫疾患または障害に起因しない炎症性関節炎、例えば、感染性関節炎、すなわち、関節痛、痛み、硬直および感染性物質、例えば、細菌（マイコプラズマを含む）、ウイルス、真菌によって引き起こされる腫れ、化膿性感染炎または変形性関節症を含む、関節疾患を処置するのに有用である。関節疾患は、症候、例えば、関節の硬直、疼痛、衰弱、関節疲労、圧痛および腫れに関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、関節疾患の症候は、本明細書に開示される構築物（または構築物または構築物の発現のためのビヒクルを含む組成物）を投与することによって、本明細書に開示される任意の方法を使用して処置され得る。例えば、前記組成物は、関節炎または関節炎の症候を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、関節炎は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびループス関節炎からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、関節炎は、変形性関節症である。いくつかの実施形態では、関節炎は、細菌病原体、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｇｏｎｏｃｃｏｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．Ｍｅｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（ヘーヴァヒル熱）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ（イチゴ腫）またはＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．によって引き起こされる感染性関節炎である。いくつかの実施形態では、関節炎は、ウイルス病原体、例えば風疹ウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、エコーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、パルボウイルス、レトロウイルスおよびアルファウイルスまたは肝炎ウイルスによって引き起こされる感染性関節炎である。いくつかの実施形態では、関節炎は、真菌、例えばＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏａ  ｓｐｐ．、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．またはＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．によって引き起こされる感染性関節炎である。別の例として、前記組成物は、関節疾患または関節疾患の症候を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、関節疾患は、関節炎、アミロイド関節症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、手根管症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発関節痛、腱炎、ウィップル病、滑液包炎三叉神経痛、線維筋腫および線維炎である。いくつかの実施形態では、関節疾患は、関節炎に関連する。いくつかの実施形態では、関節疾患は、関節炎の発症に先行する。いくつかの実施形態では、関節疾患は、関節炎の発生により発症する。
【０２３０】
関節リウマチは、人口の約１％が罹患しており、罹患する女性は男性よりも３倍多い。関節リウマチおよび若年性関節リウマチは、関節の炎症態様に加えて、多くの病的徴候を示す全身性疾患である。関節リウマチでは、これらの徴候としては、ほぼ任意の器官系を冒し得る脈管炎（血管の炎症）であって、多くの病的後遺症（多発性神経障害、皮膚の潰瘍および内臓の梗塞を含む）を引き起こし得るものが挙げられる。胸膜肺の徴候としては、胸膜炎、間質性線維症、胸膜肺の小瘤、肺臓炎および動脈炎が挙げられる。他の徴候としては、様々な関節周囲の構造（例えば、伸筋表面、胸膜および髄膜）での炎症性リウマチによる小瘤の成長が挙げられる。骨格筋の衰弱および萎縮が一般的である。多くの全身性エリテマトーデス患者はまた、ループス関節炎と称される関節炎症を発症する。全身性エリテマトーデスは、多くの異なる細胞、組織および器官が、病的な自己抗体および免疫複合体によって損傷される原因不明の自己免疫疾患である。全身性エリテマトーデスの臨床徴候は多く、様々な斑点状丘疹、腎炎、脳炎、脈管炎、血球減少および凝固障害を含む血液の異常、心膜炎、心筋炎、肋膜炎、胃腸の症候および上述の関節炎症が挙げられる。変形性関節症は、最も一般的な慢性関節疾患である。それは、関与する関節の疼痛、硬直および腫れによって現れる。関節の最も重要な機械的機能に関与する関節軟骨は、変形性関節症、様々な酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、プラスミンおよびカテプシンによって媒介される変形性関節症における関節軟骨の破壊の主な標的組織であり、今度はこれが、炎症媒介物質としても作用し得る様々な因子によって刺激される。これらの因子としては、サイトカイン、例えば、病的な軟骨および滑液のプロテアーゼを活性化することが公知のインターロイキン−１が挙げられる。疾患が進行すると、滑膜炎がより頻繁になる。乾癬性関節炎は、乾癬を有する者の５〜８％が罹患する慢性炎症性関節障害である。これらの個体のかなりの割合（４分の１）が、進行性破壊性疾患を発症する。関節炎症を有する乾癬患者の２５％は、関節リウマチの関節炎症徴候と似た対称性の関節炎症を発症し、これらの半分超が様々な程度の関節破壊を発症する。
【０２３１】
本明細書に記載される方法は、限定されないが、重症筋無力症、アルツハイマー病、多発性硬化症、気腫、肥満、視神経脊髄炎、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＧ４関連疾患、インスリン依存性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｙｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、自己免疫性肝炎、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、シェーグレン症候群、高安動脈炎、自己免疫性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型としても公知である）、膜性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑症、ブドウ膜炎、網膜変性障害、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、ＡＮＣＡ関連血管炎、溶血性尿毒症症候群、志賀毒素関連溶血性尿毒症症候群、非定型溶血性尿毒症症候群、ならびに炎症関連心肺バイパスおよび血液透析を含む自己免疫または免疫複合体を処置するのに有用である。いくつかの実施形態では、処置すべき疾患は、自己免疫性糸球体腎炎であり、限定されないが、免疫グロブリンＡネフロパシーまたは膜性増殖性糸球体腎炎Ｉ型が挙げられる。いくつかの実施形態では、自己免疫または免疫複合体障害は、炎症性疾患である。
【０２３２】
本明細書に記載される方法は、限定されないが、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（ウェット型ＡＭＤおよびドライ型ＡＭＤを含む）、ＣＭＶ網膜炎、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症および眼黒色腫を含む眼疾患を処置するのに特に有用である。例えば、前記方法は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置するのに有用である。ＡＭＤは、臨床的に、黄斑と称される網膜の中心領域にある光受容細胞への損傷に起因する進行性中心視力喪失を特徴とする。ＡＭＤは、ウェット型およびドライ型の２つの臨床状態に広く分類され、ドライ型が、全症例の８０〜９０％を構成する。ドライ型は、黄斑ドルーゼン（これは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルッフ膜との間の局所的な沈着である）の存在と、上部光受容体萎縮を伴うＲＰＥ細胞死とを臨床的に特徴とする。ウェット型ＡＭＤは、重度の視力喪失の約９０％を占め、黄斑領域における血管新生およびこれらの新血管の漏出に関連する。血管および液体貯留は、網膜剥離、続いて急速な光受容体の変性および視力喪失を引き起こし得る。ドライ型がウェット型ＡＭＤに先行し、ウェット型ＡＭＤはドライ型に起因することが一般に認められている。
【０２３３】
ＡＭＤ患者におけるドルーゼンの内容物の分析では、アミロイドタンパク質、凝固因子および多数の補体経路タンパク質を含む多数の炎症性タンパク質が示されている。Ｈ補体因子の遺伝的変異は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のリスクを高めるが、このことは、無秩序な補体活性化がＡＭＤの病因の根底にあることを示唆している。Ｅｄｗａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０８：４２１；Ｈａｉｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０８：４１９；Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３８５−３８９；Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００５，１０２：７２２７。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎を処置するのに使用され得る。ＣＭＶ網膜炎は、網膜の光受容細胞の炎症を引き起こす感染症である。ＣＭＶは、典型的には、免疫応答性の個体ではまれである。しかしながら、例えば、疾患、移植または化学療法によって免疫不全となった個体は、特に、ＣＭＶ網膜炎にかかりやすい。網膜炎は、通常、一方の眼で始まるが、他方の眼に進行することが多い。処置しなければ、網膜に対する進行性損傷は、４〜６カ月またはそれ未満に失明をもたらし得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、黄斑浮腫を処置するのに使用され得る。体液およびタンパク質沈着が眼の黄斑上または下に集まると、黄斑浮腫が生じ、厚化および腫れが引き起こされる。黄斑は、密集した円錐形（これは、直接に視線方向にある細部、形態および色を見ることを可能にするための鮮明な中心視力を提供する）を保持するので、腫れは、個体の中心視力を歪ませ得る。黄斑浮腫は、２種類に分類され得る。嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）は、網膜周囲毛細血管透過性の異常に続発して、外網状層における液体貯留を伴う。同様に、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑の毛細血管の漏出によって引き起こされる。ＤＭＥは、増殖性および非増殖性の糖尿病性網膜症において、視力喪失の最も一般的な原因である。
【０２３６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ブドウ膜炎、すなわち、ブドウ膜（強膜の下にある眼の虹彩、毛様体および脈絡膜）の炎症を処置するのに使用され得る。ブドウ膜炎は、典型的には、眼感染症、眼傷害および／または自己免疫障害に関連する。しかしながら、多くの場合、原因は不明である。ブドウ膜炎の最も一般的な形態は、前部ブドウ膜炎であり、虹彩の炎症を伴う。後部ブドウ膜炎は、眼の中央部分にある血管層および結合組織である脈絡膜を冒す。別の形態のブドウ膜炎は、扁平部炎である。この炎症は、虹彩と脈絡膜との間の狭い領域（扁平部）を冒す。
【０２３７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、視神経損傷および視力喪失をもたらす一群の眼症状である緑内障を処置するのに使用され得る。神経損傷は、特徴的なパターンの網膜神経節細胞の消失を伴う。緑内障の多くの異なるサブタイプは、すべて視神経症の一種と考えられ得る。眼圧の上昇（２１ｍｍＨｇまたは２．８ｋＰａよりも高い）が最も重要であり、緑内障の唯一の修正可能なリスク因子である。眼圧は、眼の毛様体プロセスによる房水の生産、および小柱網を通じたその排泄に依存する。房水は、毛様体プロセスから後部の空間に流れ、後眼房では水晶体および眼のチン小帯によって、前眼房では虹彩によって結合している。次いで、虹彩の瞳孔を通って前眼房へと流れ、後眼房では虹彩によって、前眼房では角膜によって結合している。ここから、小柱網は、シュレム管を介して房水を膜叢および一般的な血液循環に排出する。
【０２３８】
開放隅角／広隅角緑内障では、小柱網の変性および閉塞により、流れは、小柱網（この元の機能は、房水を吸収することである）を通って減少する。房水の吸収の喪失は、抵抗性の増加をもたらし、それにより、慢性的で無痛の眼圧の上昇をもたらす。閉塞隅角／狭隅角緑内障では、角膜に対し、虹彩の丸い部分と根部分が最終的に前側にずれるため、角膜の角度が完全に閉じ、十分な液体が後眼房から前眼房まで流れることができなくなり、小柱網から外れる。この房水の蓄積によって、圧力が急に上がり、痛みが出る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、網膜微細血管の変化に起因する損傷を引き起こす糖尿病の合併症である糖尿病性網膜症を処置するのに使用され得る。微小血管（例えば、眼内のもの）は、特に血糖コントロール不良に弱い。グルコースおよび／またはフルクトースの過剰な蓄積は、網膜の微小血管を損傷する。高血糖症誘導性の周皮細胞死および基底膜の肥厚は、血管壁の透過性の増加をもたらし、血液網膜関門の形成を変化させる。いくつかの個体では、糖尿病性網膜症は、黄斑浮腫を伴う。糖尿病性網膜症が進行するにつれて、網膜における酸素不足は、網膜に沿ったおよび硝子体における脆弱な新血管の成長を引き起こす。適時に処置しなければ、これらの新血管は出血し、視界を曇らせ、網膜を破壊し、および／または牽引性の網膜剥離を引き起こし得る。
【０２４０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、重度の視力不全および失明を引き起こす、遺伝性の眼の変性疾患の一群である網膜色素変性症（ＲＰ）を処置するのに使用され得る。６０個超の遺伝子における突然変異は、網膜色素変性症を引き起こすことが公知である。ＲＰの約２０％は、常染色体優性（ＡＤＲＰ）であり、２０％は、常染色体劣性（ＡＲＲＰ）であり、１０％は、Ｘ染色体連鎖である一方（ＸＬＲＰ）、残りの５０％は、いかなる既知の罹患親戚も有しない患者に見られる。網膜色素変性症に関連する遺伝子は、網膜の光受容体の構造および機能において重要な役割を果たし、これらの細胞の進行性変性が、視界喪失を引き起こす。
【０２４１】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、増殖性硝子体網膜症（すなわち、多くは裂孔原性網膜剥離の合併症がある、眼の中の瘢痕組織の形成）を処置するのに使用され得る。裂孔原性網膜剥離中、硝子体液由来の体液が網膜円孔に入る。網膜下腔における液体貯留、および網膜上の硝子体の牽引力は、裂孔原性網膜剥離をもたらす。この過程中、網膜細胞層が硝子体サイトカインと接触し、これが、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の増殖および移動をトリガーする。ＲＰＥ細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受け、硝子体内外への遊走能力を発達させる。この過程中、ＲＰＥ細胞層−神経網膜接着およびＲＰＥ−ＥＣＭ（細胞外マトリックス）接着が失われる。ＲＰＥ細胞は線維膜下にある一方、それらは遊走し、これらの膜が網膜を伸縮させ、これが、１回目の網膜剥離手術後に２回目の網膜剥離をもたらし得る。
【０２４２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、例えば網膜裂傷、網膜裂孔もしくは網膜剥離の修復のための手術、または例えば眼黒色腫の処置のための放射線治療と併せて使用され得る。
【０２４３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、角膜創傷治癒および／もしくは角膜移植を処置し、ならびに／またはこれらの転帰を改善するのに使用され得る。角膜創傷治癒の応答は、上皮細胞、間質性角膜実質細胞、角膜の神経、涙腺、涙膜および免疫系の細胞の間のサイトカイン媒介性相互作用が関与する複雑なカスケードである。組織変化の応答は、誘発傷害に依存する。例えば、瘢痕、表層および表面の掻き傷は、屈折矯正角膜手術で使用されるものと同様に、いくつかの点では類似するが他の点では異なる典型的な創傷治癒応答に続く。例えば、身体の他の場所では、創傷治癒は瘢痕形成および血管新生に至るのに対して、角膜創傷治癒の最も重要な態様の１つは、治癒プロセスがこれらの結末どのように最小限に抑えるかである（さもなければ、視力の転帰は深刻である）。感染症、レーザ屈折手術、角膜移植、眼の外傷（化学的または物理的）または角膜ジストロフィーにかかわらず、角膜瘢痕の原因は、正常な角膜構造および機能に対するほとんどの破壊を含む。
【０２４４】
角膜移植（角膜の移植としても公知である）は、その全体で（全層角膜移植）または部分的に（表層角膜移植）、損傷または罹患した角膜を、提供された角膜組織（移植片）と置き換える外科的手術である。移植片は、公知の疾患、または提供組織の生存能力もしくはレシピエントの健康に影響を与え得る他の因子を有しない最近死亡した個体から採取する。角膜は、血管を有さず（房水から栄養を受け取る）、皮膚の切り傷よりも治癒が実質的に遅い。リスクは、他の眼手術と同様であるが、加えて、移植拒絶（生涯）、表層移植の剥離または変位および一次生着不全が挙げられる。感染症のリスクもある。
【０２４５】
本発明は、構築物を含む有効量の組成物を投与することによって、本明細書に記載される眼疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、限定されないが、眼ドルーゼンの形成、眼または眼組織の炎症、光受容細胞の消失、視力喪失（例えば、視力および視界を含む）、血管新生（例えば、脈絡膜血管新生またはＣＮＶ）および網膜剥離を含む本明細書に記載される眼疾患の１つまたはそれを超える態様または症候を処置する方法を提供する。他の関連態様、例えば光受容体の変性、ＲＰＥ変性、網膜変性、脈絡網膜の変性、錐体変性、網膜機能不全、露光に応答する網膜損傷（例えば、一定光の曝露）、ブルッフ膜の損傷、ＲＰＥ機能の消失、増加またはＲＰＥ機能、細胞の組織構造および／または通常の黄斑の細胞外マトリックスの一体性消失、黄斑細胞の機能消失、光受容体ジストロフィー、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー、前部ブドウ膜炎および後部ブドウ膜炎および糖尿病性ニューロパシーも含まれる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ドルーゼン関連疾患を処置する方法が提供される。「ドルーゼン関連疾患」という用語は、ドルーゼンまたはドルーゼン様細胞外疾患プラークの形成が起こる任意の疾患であって、ドルーゼンまたはドルーゼン様細胞外疾患プラークがそれを引き起こし、もしくはそれに寄与し、またはそれらの兆候を表す任意の疾患を指す。例えば、黄斑ドルーゼンの形成を特徴とするＡＭＤは、ドルーゼン関連疾患と考えられている。非眼ドルーゼン関連疾患としては、限定されないが、アミロイドーシス、弾性線維症、緻密デポジット病および／またはアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
【０２４７】
投与様式
本明細書に記載される組成物は、限定されないが、静脈内（例えば、注入ポンプ）、腹膜内、眼内、動脈内、肺内、経口、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経皮、経胸膜、局所、吸入（例えば、スプレーの霧）、粘膜（例えば、鼻粘膜を介する）、胃腸内、関節内、嚢内、心室内、直腸（すなわち、坐剤を介する）、膣内（すなわち、ペッサリーを介する）、頭蓋内、尿道内、肝臓内および腫瘍内を含む任意の経路によって、個体に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、静脈内注射によって）全身投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、動脈内注射または眼内注射によって）局所投与される。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、組成物は、眼または眼組織に直接投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、点眼薬で眼に局所投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼（眼内注射）または眼関連組織への注射によって投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼球周囲の注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、腔内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍への送達によって投与され得る。これらの方法は、当技術分野で公知である。例えば、網膜薬物送達のための例示的な眼周囲経路の説明については、Ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ  ｒｏｕｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒａｇｈａｖａら、（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１（１）：９９−１１４を参照のこと。組成物は、例えば、個体の硝子体、房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、脈絡膜組織、網膜脈絡膜組織、黄斑、または他の眼内領域もしくは眼近接領域に投与され得る。組成物はまた、インプラントとして個体に投与され得る。好ましいインプラントは、長期間にわたって化合物を徐々に放出する生体適合性および／または生分解性の持続性放出製剤である。薬物送達のための眼インプラントは、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５０１，８５６号、米国特許第５，４７６，５１１号および米国特許第６，３３１，３１３号を参照のこと。組成物はまた、限定されないが、米国特許第４，４５４，１５１号および米国特許出願公開第２００３／０１８１５３１号および米国特許出願公開第２００４／００５８３１３号に記載されているイオン泳動方法を含むイオン泳動を使用して個体に投与され得る。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、組成物は、血管内投与、例えば、脈内（ＩＶ）投与または動脈内投与される。いくつかの実施形態では（例えば、腎臓疾患の処置のために）、組成物は、動脈（例えば、腎動脈）に直接投与される。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、組成物は、関節組織に直接投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、滑膜に投与される。
【０２５１】
組成物の最適有効量は、経験的に決定され得、疾患の種類および重症度、投与経路、疾患進行ならびに個体の健康、体重および体面積に依存するであろう。このような決定要因は、当業者の範囲内である。有効量はまた、インビトロ補体活性化アッセイに基づいて決定され得る。本明細書に記載される方法に使用され得る構築物の投与量の例としては、限定されないが、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇまたは約０．１μｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇまたは約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの投与量範囲内の有効量が挙げられる。例えば、眼内投与される場合、組成物は、例えば、約０．１μｇ／ｋｇもしくはそれ未満、約０．０５μｇ／ｋｇもしくはそれ未満または０．０１μｇ／ｋｇもしくはそれ未満を含む低マイクログラム範囲で投与され得る。いくつかの実施形態では、個体に投与される構築物の量は、例えば、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約２００μｇ、約２００μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約３００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約４００ｍｇまたは約４００ｍｇ〜約５００ｍｇ／用量のいずれかを含む約１０μｇ〜約５００ｍｇ／用量である。
【０２５２】
組成物は、１日１回投与で投与され得るか、または総１日用量は、１日２回、３回もしくは４回の分割投与量で投与され得る。組成物はまた、１日１回よりも低頻度、例えば１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回または６カ月に１回投与され得る。組成物はまた、持続放出性製剤で、例えば、長期使用のために組成物を徐々に放出するインプラントであって、組成物のより低頻度の投与、例えば１カ月に１回、２〜６カ月に１回、１年に１回の投与または単回投与を可能にするインプラントで投与され得る。持続放出性デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノ球、微小球など）は、眼または眼関連組織の様々な位置、例えば眼内、硝子体内、網膜下、眼球周囲、結膜下またはテノン下に注射によって投与され得るか、または外科的に埋め込まれ得る。
【０２５３】
医薬組成物は単独で、または網膜結合もしくは損傷網膜組織に対して有益な効果を有することが公知の他の分子（組織の修復および再生が可能であり、および／または炎症を阻害することが可能な分子を含む）と組み合わせて投与され得る。有用な補体因子の例としては、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ＶＥＧＦに対する抗体）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アキソキン（ＣＮＴＦのムテイン）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子ＩＩ、プロスタグランジンＥ２、３０ｋＤ生存因子、タウリンおよびビタミンＡが挙げられる。他の有用な補体因子としては、症候を緩和する補体因子が挙げられ、保存剤、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤および鎮痛剤および麻酔薬を含む。
【０２５４】
遺伝子治療
構築物はまた、インビボ発現によって送達され得る（これは、「遺伝子治療」と称されることが多い）。例えば、エクスビボで構築物をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて細胞を遺伝子操作し、次いで、遺伝子操作細胞を、融合タンパク質と共に、処置すべき個体に提供する。このような方法は、当技術分野で周知である。例えば、細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を使用することによって、当技術分野で公知の手順によって遺伝子操作され得る。
【０２５５】
遺伝子治療を使用した本発明の構築物の局所送達は、治療剤を標的領域、例えば眼または眼組織に提供し得る。
【０２５６】
遺伝子送達方法は、当技術分野で公知である。これらの方法としては、限定されないが、直接的なＤＮＡ移動、例えば、Ｗｏｌｆｆら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８を参照のこと；２）リポソーム媒介性のＤＮＡ移動、例えば、Ｃａｐｌｅｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：３９−４６；Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１５−１７；Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０−２８５；３）レトロウイルス媒介性のＤＮＡ移動、例えば、Ｋａｙら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１７−１１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３を参照のこと；４）ＤＮＡウイルス媒介性のＤＮＡ移動が挙げられる。このようなＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス（好ましくは、Ａｄ２またはＡｄ５に由来するベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルスに由来するベクター）およびパルボウイルス（好ましくは、「欠陥のある」または非自律系パルボウイルスに由来するベクター、さらに好ましくは、アデノ随伴ウイルスに由来するベクター、最も好ましくは、ＡＡＶ−２に由来するベクター）が挙げられる。例えば、Ａｌｉら、（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−３８４；米国特許第４，７９７，３６８号（参照により本明細書に組み込まれる）および米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
【０２５７】
本明細書に記載されるレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルスが挙げられる。一実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来し得る。
【０２５８】
アデノウイルスは、広い宿主範囲を有するという利点を有し、静止した細胞または末端が分化した細胞、例えば、ニューロンまたは肝細胞および明らかに本質的に非発癌性であり得る。例えば、Ａｌｉら、（１９９４）、前掲、ｐ．３６７を参照のこと。アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれないようである。それらは染色体外に存在するので、挿入突然変異のリスクが大きく減少する。Ａｌｉら、（１９９４）、前掲、ｐ．３７３。
【０２５９】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルス系ベクターと類似の利点を示す。しかしながら、ＡＡＶは、ヒト染色体１９に対する部位特異的な組み込みを示す（Ａｌｉら、（１９９４）、前掲、ｐ．３７７）。
【０２６０】
遺伝子治療ベクターは、１つまたはそれを超えるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、複数の細胞型で発現するプロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、特定の細胞型（例えば、網膜細胞または腎臓中の細胞）で発現するプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターとしては、限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７（９）：９８０−９９０に記載されているヒトサイトメガロウイルス（ＣＶＭ）プロモーターまたは任意の他のプロモーター（例えば、細胞プロモーター、例えば、真核細胞プロモーター、限定されないが、ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターを含む）が挙げられる。用いられ得る他のウイルスプロモーターとしては、限定されないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から、当業者に明らかであろう。
【０２６１】
構築物をコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。用いられ得る適切なプロモーターとしては、限定されないが、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター；または異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター、例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡｌプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書で上記に記載される改変レトロウイルスＬＴＲ）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。
【０２６２】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞株を形成するのに用いられ得る。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４に記載されている。ベクターは、当技術分野で公知の任意の手段によって、パッケージング細胞に形質導入され得る。このような手段としては、限定されないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびＣａＰＯ４沈降が挙げられる。一代替例では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに封入し、または脂質にカップリングし、次いで、宿主に投与し得る。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を形成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞に形質導入し得る。形質導入真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入され得る真核細胞としては、限定されないが、胚幹細胞、胚性癌腫細胞および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、眼において構築物の発現を指令する遺伝子送達ベクターが使用される。眼への遺伝子送達のためのベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９４３，１５３号および米国特許出願公開２００２０１９４６３０号、米国特許出願公開２００３０１２９１６４号、米国特許出願公開２００６００６２７１６５号に開示されている。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、補体活性化は、構築物が補体活性化を阻害することを可能にする条件下で、構築物を含む組成物と体液とをエクスビボで接触させることによって阻害される。適切な体液としては、個体に戻され得るもの、例えば血液、血漿またはリンパ液が挙げられる。アフィニティ吸着アフェレーシスは、一般に、Ｎｉｌｓｓｏｎら、（１９８８）Ｂｌｏｏｄ  ５８（ｌ）：３８−４４；Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、（１９９３）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３３：２３４−２４２；Ｒｉｃｈｔｅｒら、（１９９７）ＡＳＡＩＯ  Ｊ．４３（ｌ）：５３−５９；Ｓｕｚｕｋｉら、（１９９４）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：１０５−１１２；米国特許第５，７３３，２５４号；Ｒｉｃｈｔｅｒら、（１９９３）Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．４２：８８８−８９４；およびＷａｌｌｕｋａｔら、（１９９６）Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃａｒｄ．５４：１９１０１９５に記載されている。
【０２６５】
したがって、本発明は、個体における本明細書に記載される１つまたはそれを超える疾患を処置する方法であって、分子が補体活性化を阻害するように機能することを可能にする条件下で、構築物を含む組成物で前記個体の血液を体外で（すなわち、体の外側またはエクスビボで）処理すること、および前記血液を前記個体に戻すことを含む方法を含む。
【０２６６】
単位投与量、製造品およびキット
構築物組成物の単位剤形も提供され、各投与量は、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの構築物を含み、例えば、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇまたは約１５ｍｇの構築物を含有する。いくつかの実施形態では、構築物組成物の単位剤形は、約０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇ、０．１ｍｇ〜０．２ｍｇ、０．２ｍｇ〜０．２５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜０．３ｍｇ、０．３ｍｇ〜０．３５ｍｇ、０．３５ｍｇ〜０．４ｍｇ、０．４ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜１．０ｍｇ、１０ｍｇ〜２０ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜８０ｍｇ、８０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜１５０ｍｇ、１５０ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜２５０ｍｇ、２５０ｍｇ〜３００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇまたは４００ｍｇ〜５００ｍｇのいずれかの構築物を含む。いくつかの実施形態では、単位剤形は、約０．２５ｍｇの構築物を含む。「単位剤形」という用語は、個体のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な医薬担体、希釈剤または賦形剤と併せて、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質を含有する。これらの単位剤形は、単一または複数の単位投与量で適切な包装中に保存され得、さらに滅菌および密封され得る。
【０２６７】
適切な包装中に本明細書に記載される組成物を含む製造品も提供される。本明細書に記載される組成物（例えば、眼科用組成物）のための適切な包装は、当技術分野で公知であり、例えば、バイアル（例えば、密閉バイアル）、容器、アンプル、ボトル、瓶、フレキシブルな包装（例えば、密閉Ｍｙｌａｒまたはプラスチック袋）などが挙げられる。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封され得る。
【０２６８】
本発明はまた、本明細書に記載される組成物（または単位剤形および／または製造品）を含むキットを提供し、前記組成物の使用方法、例えば本明細書に記載される用途の説明書をさらに含み得る。本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載される任意の方法を実施するための説明書と共に、商業的なおよび使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジおよび添付文書を含む）をさらに含み得る。
【実施例】
【０２６９】
実施例１：アデノウイルスプログラミングを使用して明らかになったコラーゲン抗体誘導性関節炎におけるレクチン経路の重要な役割
材料および方法
マウス
８〜１０週齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウス（ｎ＝７３）を本研究に使用した。本発明者らは、元々はＤｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  ＣａｒｒｏｌｌからＣ４−／−マウスを入手し、Ｄｒ．Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＳｔａｈｌからＣ１ｑ／ＭＢＬ−／−マウスを入手した。現在、本発明者らの研究室では、Ｃ４−／−およびＣ１ｑ／ＭＢＬ−／−Ｃ５７ＢＬ／６ホモ接合マウスの両方のコロニーを維持している；これらのマウス由来の血清を様々なＥＬＩＳＡに使用した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。すべてのマウスを使用前に計量し、明／暗サイクルが１２時間の気候制御された環境のバリア動物施設で飼育した。各ケージでは、フィルタートップケージを３匹のマウスで使用した。本研究の期間中、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅが、すべての実験マウスにブリーダー飼料を給餌した。
【０２７０】
ＡｄＭＡｐ４４ベクターの構築
ヒトＡｄＭＡｐ４４（ＡｄｈＭＡｐ４４）構築物は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入したヒトＭＡｐ４４  ｃＤＮＡを使用して、Ｗｅｌｇｅｎ，Ｉｎｃ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が作製した。ＡｄｈＭＡｐ４４またはＡｄｍＭＡｐ４４の投与によって生成されたマウス循環中の組換えＭＡｐ４４の検出を容易にするために、ＨＡタグ（ヒトインフルエンザ赤血球凝集素、配列「ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ」）をＭＡｐ４４のＣ末端に追加した。ＣＡＩＡマウスおよび非ＣＡＩＡマウスの血清中のＨＡの存在を検出するために、抗ＨＡタグ抗体を使用した。本明細書に記載されるベクターおよび特定の要素に関する情報は、図１０に見られる。ＡｄｍＭＡｐ４４ではなくＡｄｈＭＡｐ４４については、ＣＡＲ以外の滑膜細胞におけるアデノウイルス侵入用の受容体を刺激するために、さらなるＲＧＤ配列を構築物に追加した（Ｂａｋｋｅｒら、２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１７８５−１７９３）。簡潔に言えば、ｐＢＳＫ−ＭＡｐ−ｌ−ＨＡをＸｈｏｌ／Ｘｂａｌで切断し、ＭＡｐ４４−ＨＡ断片を、同じ酵素で消化したｐＥｎｔＣＭＶシャトルベクターにライゲーションした。陽性クローンをスクリーニングし、確認のために配列決定した。ｐＥｎｔＣＭＶ−ＭＡｐ４４−ＨＡをＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、プラスミドｐＡｄ５とライゲーションした。組換え産物を使用して、大腸菌を形質転換した。一晩インキュベートした後、クローンを選択し、成長させ、コスミドＤＮＡを精製した。精製したコスミドＤＮＡ（２ｍｇ）をＰａｃｌで消化し、次いで、製造業者の説明書にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、２９３細胞にトランスフェクトした。２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。トランスフェクションの７日後までに、Ａｄプラークの成長は明らかになった。ウイルス粒子（ｖｐ）の力価を１０１２ｖｐ／ｍｌにさらに増幅した。増幅したＡｄを２連続塩化セシウム勾配で精製し、次いで、１０％グリセロールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析した。精製したウイルスの力価を、２６０ｎｍの吸収度から推定した。ＡｄｈＭＡｐ４４の最終力価は、粒子１．０×１０１２個／ｍｌであった。すべてのＣＡＩＡ研究について、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）配列およびプログラミング発現の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するＡｄ（ＡｄＧＦＰ）を陰性対照として使用した。
【０２７１】
ヒト組換えＭＡｐ４４
他で詳細に記載されているように（Ｄｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８）、ヒト組換えＭＡｐ４４（ｈｒＭＡｐ４４）を生産した。簡潔に言えば、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを使用して、ヒトＭＡｐ４４をコードするベクターで哺乳動物細胞のＨＥＫ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトした。上清中に発現されたＭＡｐ４４を、ＭＢＬコーティングビーズのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０２７２】
コラーゲン抗体誘導性関節炎の誘導
以前に記載されているように（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６）、滅菌ＰＢＳに懸濁したウシＣＩＩ（Ａｒｔｈｒｉｔｏｍａｂ−ＣＩＡ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）に対する５つのｍＡｂのカクテルを使用して、ＷＴマウスにおいて、ＣＡＩＡを誘導した。ＡｒｔｈｒｉｔｏｍａｂおよびＬＰＳの供給業者が提案する標準プロトコールにしたがって、関節炎を発症させるために、０日目に、マウス１匹当たり４ｍｇのＡｒｔｈｒｉｔｏｍａｂをＷＴマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、３日目に、マウス１匹当たり５０μｇの大腸菌株０１１１Ｂ４由来ＬＰＳ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。４日目に、マウスは関節炎を発症し始め、１０日目に屠殺した。抗ＣＩＩ  ａｂまたはＬＰＳのみを、それぞれ６ｍｇ／マウス／ｉ．ｐまたは５０μｇ／マウス／ｉ．ｐ．で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射すると、マウスは、組織学的損傷を伴わない非常に軽度の一時的な関節炎を数日間発症する（図１１Ａ）。さらに、抗ＣＩＩ  ａｂまたはＬＰＳを単独で注射したマウスは、罹患率から明らかなように、不整合な疾患を発症したが、補体阻害剤の因果関係を評価することは困難である（図１１Ｂ）。したがって、組織学的損傷を伴う疾患を最低１０日間にわたって持続的に引き起こすために、および補体阻害剤の効果を観察するために、抗コラーゲンｍＡｂの注射とそれに続くＬＰＳの注射が必要である（図１１Ａ）。以前に公開された本発明者らの研究のように（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６）、処置を把握していない観察者が、臨床疾患活動性（ＣＤＡ）を１０日目まで毎日調査した。
【０２７３】
Ａｄ研究では、−５日目、０日目および３日目に、（高用量（１×１０１１）または低用量（５．０×１０１０）のいずれかの）ＡｄｈＭＡｐ４４、ＡｄＧＦＰ（粒子１×１０１１個）、またはＰＢＳのみをＷＴマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（各処置について、ｎ＝５）。通常通り、０日目に、Ａｒｔｈｒｉｔｏｍａｂを注射した。局所関節注射実験では、−５日目、０日目（抗ＣＩＩ  ｍＡｂ注射後）および３日目（ＬＰＳ注射後）に、粒子５．０×１０１０個のＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰを含有する５０μｌを右膝関節に注射した。
【０２７４】
炎症性関節炎のロスリバーウイルス誘導性マウスモデル
以前に記載されているように（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：５１３２−５１４３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１１２６３−１１２７２；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：７３７−７４９）、１０３ＰＦＵのロスリバーウイルス（ＲＲＶ）を容量１０μｌで３〜４週齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左後足蹠に接種した。以前に記載されているように（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：５１３２−５１４３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔ  ａｌ，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１１２６３−１１２７２；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：７３７−７４９）、握力、後肢の筋力低下、および歩行の変化を評価することによって、疾患スコアを決定した。ＲＲＶ誘導性関節炎では、−３日目、０日目および３日目に、膝注射のＣＡＩＡ研究で使用したものと同一のウイルス粒子用量（すなわち、５×１０１０）で、ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄＧＦＰを右後足蹠に注射した。
【０２７５】
すべての関節の組織病理学および免疫組織化学
１０日目に、ＷＴ  ＣＡＩＡマウスの両前肢の膝関節、ならびに右後肢の膝関節、足首および足を４％パラホルムアルデヒドで固定し、公開されている本発明者らの方法（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１００−１０８）にしたがって、免疫組織化学染色（ＩＨＳ）によって、トルイジンブルー（Ｔ−ブルー）およびＣ３沈着について調査した。加えて、ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄＧＦＰを形質導入したマウス由来の滑膜および膝関節部におけるインテグリンανβ５（抗体の１：５００希釈）を検出するために、ＩＨＳを使用した。滑膜の存在を示すために、ヘマトキシリン（ＶＷＲ）染色を使用した。公開されている基準（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１００−１０８）にしたがって、炎症、パンヌス形成、ならびに軟骨および骨の損傷を決定するための組織病理学を評価するために、トルイジンブルー染色を使用した。組織学のために７μｍの切片を切断し、Ｔ−ブルーおよびＣ３  ＩＨＳのために加工した。組織病理学およびＣ３沈着のためのすべてのスライドを、倍率２０倍または１０倍の光学顕微鏡下で盲検的に観察し、公開されている基準（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１００−１０８）にしたがってスコアリングした。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの未処置Ｃ３−／−マウス由来の膝関節を陰性対照として使用した。
【０２７６】
器官におけるＧＦＰおよびＨＡタグを検出するための免疫組織化学
１０日目に、ＷＴ  ＣＡＩＡまたは非ＣＡＩＡマウスの右後肢の膝関節、肝臓、脾臓および腎臓を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＩＨＳによって、ＧＦＰについて調査した。ＧＦＰを検出するために、抗ＧＦＰポリクローナルウサギ（希釈１：２００）および二次抗体（ヤギ抗ウサギ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８（１：２００希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用した。Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｏｄｅｌ−ＢＸ５１）顕微鏡を使用してＵＶ光下で、切片を可視化した。ＵＶ光下における緑色蛍光の存在により、組織におけるＧＦＰ発現の存在が示された。
【０２７７】
加えて、本発明者らは、１０日目に、ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスの膝関節由来の滑膜におけるＨＡの存在を調査した。屠殺時に、肝臓、脾臓、腎臓および膝関節を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、加工し、切片を切断した。抗ＨＡ抗体（希釈１：１０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）で染色した後、抗ウサギＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＨＲＰ結合、続いてＤＡＢ  ｐｌｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｄａｋｏ）を使用した発色現像を光学顕微鏡によって可視化し、写真撮影した。
【０２７８】
インビボ形質導入効率およびウエスタンブロット分析の調査
ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄｍＭＡｐ４４構築物は両方ともＨＡタグを利用しているので、本発明者らは、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後−５日目または−２日目、０日目、３日目および１０日目に、ウエスタンブロット分析を使用して、ＨＡの存在について、血清を分析した。同様に、本発明者らは、−５日目、０日目、３日目および１０日目に、ウエスタンブロット分析を使用して、ＨＡの存在について、ＡｄｍＭＡｐ４４を膝関節に注射したマウス由来の血清を分析した。
【０２７９】
ウエスタンブロット分析
１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元ＳＤＳゲルを、マウス血清中のタンパク質の分離に使用した。転写後、ブロットを、ＨＡ特異的ウサギＡｂ（希釈１：１０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）と共に４０℃で一晩インキュベートした。抗ウサギＨＲＰ結合Ａｂを二次Ａｂ（希釈１：２０００）（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）として使用した。ブロットを１×ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３×１０分間洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１混合物を使用して３分間現像した。約４３〜５０ｋＤａのＨＡおよびＭＡｐ４４バンドの存在により、循環中のＡｄｈＭＡｐ４４またはＡｄｍＭＡｐ４の存在が確認されたが、これは、合成および分泌の成功を示している。本発明者らはまた、発現されたｈＭＡｐ４４タンパク質が機能的に活性であった（すなわち、それがＭＢＬに結合した）かを評価した。血清をマンノース−アガロースビーズ（これはＭＢＬに結合するので、ＭＢＬとの相互作用を介してＭＡｐ４４に間接的に結合するはずである）と共にインキュベートすることによって、これを調査した。ビーズから溶出した物質をウエスタンブロット分析によって分析し、上記のように抗ＨＡ  Ａｂでプローブした。
【０２８０】
ｍＲＮＡ発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ
誘導後１０日目に、ＣＡＩＡマウスから膝関節を採取した。−５日目、０日目および３日目に、ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＰＢＳ、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤ、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤまたはＡｄＧＦＰを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したすべての実験マウスの左膝関節から全ＲＮＡを抽出した。公開されている方法（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｖａｋ，２００８，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：１１０１−１１０８）にしたがって、４０サイクルを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、サンプル中のマウスＭＢＬ−Ａ、ＭＢＬ−Ｃ、フィコリン−Ａ（ＦＣＮ−Ａ）、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、ＦＤ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの存在を分析した。ｃＤＮＡに基づく標準曲線を使用して、すべてのＲＴ−ＰＣＲデータを分析した。それぞれ、ＦＤについてはマウス脂肪組織由来のｍＲＮＡを使用し、ＭＢＬ−Ａ、ＭＢＬ−Ｃ、ＦＣＮ−Ａ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βおよびＭＡＳＰについては肝臓由来のｍＲＮＡを使用することによって、ＦＤ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２およびＭＡＳＰ−３をコードするｍＲＮＡの標準曲線を作成した。同時に、未処置の非ＣＡＩＡ年齢適合ＷＴマウスの膝関節由来の様々な標的のベースラインｍＲＮＡレベルも決定した。ｍＲＮＡ濃度を決定するために使用したプライマー配列は、対応する著者からの要求に応じて利用可能である。
【０２８１】
ヒトＭＡｐ４４アッセイ
最近公開された研究（Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０）にしたがって、ＰＢＳ、ＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４（低用量または高用量）を注射したＷＴマウスの循環中に存在するヒトＭＡｐ４４の絶対レベルを決定するために、サンドイッチ型免疫アッセイ法を使用した。このアッセイは、ヒトＭＡｐ４４に対して高特異的および高感度であり、マウス血清中のヒトＭＡｐ４４のレベルを決定するために使用され得る。ＭＡｐ４４のレベルを測定するために、−５日目、０日目、３日目および１０日目に得た各マウス由来の血清を、結合緩衝液で１：１５希釈した。標準曲線を確立するために、既知レベルのヒトＭＡｐ４４を含む標準ヒト血漿プールを使用した。記載されているように（Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０）、すべてのサンプルを２回反復で試験し、３つの品質対照を各アッセイに含めた。
【０２８２】
血清中のＣ５ａの絶対レベルの測定
ＡｄｈＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰまたはＰＢＳを注射したＷＴマウスにおける疾患発症前（−５日目）後（１０日目）の血清中Ｃ５ａレベルを、公開されている本発明者らの方法（Ｂａｎｄａら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：１４６９−１４７８）にしたがって、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して測定した。
【０２８３】
血清中のＬＰ誘導性Ｃ３の測定
１０日目に、ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤまたはＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤで処置したＣＡＩＡマウス由来の血清を使用したＬＰ誘導性Ｃ３活性化を、以前に記載されている方法（Ｂａｎｄａ  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２０１４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１００：３６５−３７１）にしたがって、マンナン粒子プレコーティングＥＬＩＳＡプレートを使用することによって決定した。非ＣＡＩＡ  ＷＴマウス由来の血清を陽性対照として使用した。Ｃ３−／−およびＭＢＬ／Ｄｆ−／−マウス由来の血清を陰性対照として使用した。
【０２８４】
ＬＰＳ誘導性Ｃ３活性化に対する組換えヒトＭＡｐ４４の分析
ＬＰおよびＡＰを介したＬＰＳ誘導性Ｃ３活性化に対する組換えヒトＭＡｐ４４（ｒｈＭＡｐ４４）の効果を、ＥＬＩＳＡを使用することによって決定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ウェルの大腸菌株０１１１Ｂ４由来ＬＰＳでプレコーティングした。非罹患ＷＴマウス由来の血清を希釈（１：１０）し、ｒｈＭＡｐ４４（１０μｇ／１０μｌの血清）のＧＢＶ＋緩衝液（Ｃａ＋＋十分緩衝液）またはＭｇ２＋ＥＧＴＡ緩衝液（Ｃａ＋＋欠乏緩衝液）で３０分間前処理した。（Ｋｉｍｕｒａら、２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１１：７３２−７４０）に記載されている方法にしたがって、ＬＰＳ誘導性Ｃ３活性化を測定した。同時に、陽性対照として、ＷＴマウス由来の血清中も阻害抗Ｂ因子抗体（４μｇ／１０μｌの血清）で前処理して、ＡＰによるＣ３活性化を特異的に阻害した。Ｃ３−／−マウス由来の血清を陰性対照として使用したところ、予想通りＣ３活性化は認められなかった。
【０２８５】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）４統計プログラムを使用してｐ値を計算するために、スチューデントｔ検定を使用した。すべてのグラフおよびヒストグラムにおけるデータは、平均＋ＳＥＭとして示されている（ｐ＜０．０５を有意とみなす）。組織学的パラメータとＣ３沈着とＣＤＡとの間のｒ２値を計算するために、ピアソンの相関を使用した。ｗ統計の帰無仮説を使用した予備分析により、データが正規分布していたことが示された。
【０２８６】
結果
ヒトＡｄＭＡｐ４４は、ＣＡＩＡマウスにおける疾患の開始を予防する
ＡｄＧＦＰ、ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄｍＭＡｐ４４の作製は、材料および方法に詳細に記載されており、図１０に示されている。ヒトＭＡｐ４４発現の効果を決定するために、本発明者らは、ＡｄＧＦＰおよびＰＢＳ緩衝液のみと比較して、高用量または低用量のＡｄｈＭＡｐ４４で処置したＷＴマウスにおけるＣＡＩＡの発症を調査した。−５日目、０日目および３日目に、ＡｄｈＭＡｐ４４、ＡｄＧＦＰまたはＰＢＳのみでマウスを処置した。０日目に、抗ＣＩＩ  ｍＡｂを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。各条件における疾患の有病率は、１０日目に１００％であった（図１Ａ）。高用量（ＨＤ）または低用量（ＬＤ）のＡｄｈＭＡｐ４４を注射したＷＴマウスにおけるＣＤＡは、驚くべきことに、同等の高用量のＡｄＧＦＰを注射したＷＴマウスと比較して、それぞれ８１％および７５％軽減した（図１Ｂ）。具体的には、ＨＤおよびＬＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスにおける１０日目のＣＤＡは、それぞれ２．０＋０．４および２．６＋０．４であった。対照的に、ＰＢＳおよびＡｄＧＦＰで処置したマウスでは、１０日目のＣＤＡは、それぞれ１０．６＋１．８および８．８＋２．０であった。これらの結果は、いずれの用量のＡｄｈＭＡｐ４４による前処置もＣＡＩＡを予防しなかった一方、驚くべきことに重症度を軽減したことを実証している。
【０２８７】
ＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ＡｄＧＦＰで処置したマウスと比較して、炎症（ｐ＜０．００８０）、パンヌス（ｐ＜０．００６）、軟骨損傷（ｐ＜０．００７）および骨損傷（ｐ＜０．００９）に関する個々のスコアだけではなく、組織病理学総スコアについても、有意な減少（ｐ＜０．０３４）が見られた（図１Ｃ）。ＬＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ほぼ同一の結果が観察された（図１Ｃ）。ＣＤＡと組織学スコアとの間の相関係数（ｒ２）は、非常にプラスであった（０．９９）。それぞれＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４（ＨＤ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスの膝関節（図２Ａ、Ｃ）および足首（図２Ｂ、Ｄ）における組織学の代表的な組織切片が示されている。
【０２８８】
いずれの用量のＡｄｈＭＡｐ４４を注射したマウスでは、ＡｄＧＦＰまたはＰＢＳを注射したマウスと比較して、滑膜および軟骨におけるＣ３沈着のレベルも有意に減少した（図１Ｄ）。ＬＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ＡｄＧＦＰで処置したマウスと比較して、滑膜（ｐ＜０．００１）および軟骨（ｐ＜０．００３）に関する個々のスコアだけではなく、Ｃ３沈着総スコアについても、有意な減少が見られた（図１Ｄ）。ＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ほぼ同一の結果が見られた（図１Ｄ）。全体としては、ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４のいずれかで処置したマウスの膝関節におけるＣ３沈着の減少は９０％超であった。それぞれＡｄＧＦＰまたはＡｄｈＭＡｐ４４（ＨＤ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスの膝関節（図２Ｅ、Ｇ）および足首関節（図２Ｆ、Ｈ）におけるＣ３沈着の代表的な組織切片が示されている。疾患の発症前、発症中および発症後において、ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ＡｄＧＦＰまたはＰＢＳと比較して、マウスの体重に対する効果はなかった（図１１Ｃ）。
【０２８９】
血清中のＣ５ａレベルに対するＡｄｈＭＡｐ４４の効果
それぞれＬＤまたはＨＤを使用したＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウス由来の血清を使用すると、ＡｄＧＦＰ形質導入マウスと比較して、１０日目のＣ５ａレベルの２２％（ｐ＜０．０４５）および４５％（ｐ＜０．００１）の減少が認められた（図３Ａ）。−５日目（すなわち、処置前）において、Ｃ５ａの絶対レベルは同一であり、予想通り、すべての処置群で有意差はなかった。ＣＡＩＡの血清中のＣ５ａの絶対レベルの減少は、このモデルにおける補体活性化に対するＡｄＭＡｐ４４処置の予測効果と一致していた。
【０２９０】
マンナン誘導性Ｃ３活性化に対するＡｄｈＭＡｐ４４の効果
マンナン粒子は、ＬＰを介してＣ３を特異的に活性化する。ＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤおよびＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤで処置したマウス由来の血清によって誘導したＣ３活性化の１０日目の減少は、ＡｄＧＦＰと対比して、それぞれ４０％および４９％であった（図３Ｂ）。ＷＴ血清のＯ．Ｄ．値は１．１８７±０．１０８であり、ＰＢＳでは１．３８３±０．０３５であり、ＡｄＧＦＰでは１．２５８±０．０７８であり、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤでは０．７５０±０．０８６（ＡｄＧＦＰとの対比でｐ＜０．００２）であり、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤでは０．６４６±０．１２２（ＡｄＧＦＰとの対比でｐ＜０．００３）であった。対照的に、ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰのみで処置したマウス由来の血清では、Ｃ３活性化の減少が見られなかった。予想通り、Ｃ３−／−およびＭＢＬ／Ｄｆ−／−マウス由来の血清を使用すると、Ｃ３活性化はなかった。Ｃ３−／−およびＭＢＬ／Ｄｆ−／−マウス由来の血清をＥＬＩＳＡの陰性対照として使用した。これらの結果は、ＣＡＩＡマウスの循環中に存在する組換えヒトＭＡｐ４４がＬＰの活性化に影響を与えたことを示している。
【０２９１】
ＬＰＳ誘導性Ｃ３沈着に対する組換えヒトＭＡｐ４４の効果
ＬＰＳは、ＬＰおよびＡＰの両方を介して補体を活性化することが公知である。本発明者らのＣＡＩＡの疾患モデルでは、抗ＣＩＩ  ｍＡｂの受動注入後にＬＰＳを使用するが、ＬＰＳが疾患を促進する機構は不明である。ｒｈＭＡｐ４４は、補体系のＬＰまたはＡＰを介して、ＣＡＩＡの誘発に対するＬＰＳの促進効果を阻害し得るという可能性がある。本発明者らは、Ｃａ＋＋十分緩衝液（これは、３つの補体経路のすべてを可能にする）、またはＭｇ＋＋ＥＧＴＡを含むＣａ＋＋欠乏緩衝液（これは、ＡＰのみが活性である）の存在下で、ＬＰＳコーティングプレートおよび血清を使用して、インビトロでＣ３沈着を誘導することによって、この疑問を調査した。ｒｈＭＡｐ４４の有無にかかわらず、Ｃａ＋＋の存在下におけるＬＰＳ誘導性Ｃ３沈着は、２．２８±０．１０  Ｏ．Ｄ．から  １．４５±０．１３  Ｏ．Ｄ．に減少し（３６％の減少）（ｐ＜０．００２）、抗ＦＢ  ｍＡｂの存在下では、０．６７９±０．０４２に減少した（７０％の減少）（ｐ＜０．００１）（図２Ｃ）。Ｃａ＋＋欠乏緩衝液では、より顕著な結果が観察され、処置を使用していないＬＰＳ誘導性Ｃ３沈着のＯ．Ｄ．値は０．１６１±０．０１７であり、ｒｈＭＡｐ４４ありの場合には０．０４４±０．００３（ｐ＜０．０００４）であり、抗ＦＢ  ｍＡｂありの場合には０．０２７±０．００３（ｐ＜０．０００２）であった（図２Ｄ）；これらの減少は、それぞれ７２％および８３％であった。これらの結果は、ｒｈＭＡｐ４４が、主にＡＰを介して補体の誘導を阻害し得ることを示唆している。
【０２９２】
ＡｄｈＭＡｐ４４の注射後に、ヒトＭＡｐ４４は、マウスの循環中に存在する
ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＭＡｐ４４が、ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したＣＡＩＡマウス由来の−５日目、０日目、３日目および１０日目の血清中に存在するが、ＰＢＳまたはＡｄＧＦＰのみを注射したマウス由来の血清中に存在しないことが見出された（図４Ａ−Ｄ）。０日目に、ＬＤまたはＨＤ用量のＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスの循環中では、ヒトＭＡｐ４４のレベルの非常に有意な増加（ｐ＜０．００１）が見られた（図４）。３日目に、ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスの循環中では、ヒトＭＡＰ４４のレベルは、それぞれ８０８．６±１７０．５４（ｎｇ／ｍｌ）および１８４１．０±１１７３．９（ｎｇ／ｍｌ）であった（図４Ｃ）。１０日目に、ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスの循環中では、ヒトＭＡｐ４４のレベルは、２３８．３９±７０．６６（ｎｇ／ｍｌ）および１２７．２５±５６．０８（ｎｇ／ｍｌ）であった（図４Ｄ）。１０日目に、ＬＤのＡｄｈＭＡｐ４４とＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４との間のヒトＭＡｐ４４のレベルの差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．５）。予想通り、未処置のＷＴマウス由来の血清を使用すると、ヒトＭＡｐ４４は検出されなかった（データは示さず）。０日目、３日目および１０日目のマウスの循環中のヒトＭＡｐ４４の存在は、Ａｄ標的細胞がＡｄｈＭＡｐ４４で有効に形質導入されて、ヒトＭＡｐ４４を産生したことを実証している。
【０２９３】
ＡｄｍＭＡｐ４４処置はまた、ＣＡＩＡマウスにおける臨床疾患活動性を実質的に抑制する
ＡｄｈＭＡｐ４４の効果は、マウスにおけるヒトタンパク質の非生理学的効果によるものではなかったことを確認するために、マウスＭＡｐ４４の発現の効果も調査した。この疑問を評価するために、材料および方法に記載されているように、ＡｄｍＭＡｐ４４および対照ＡｄＧＦＰをマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１０日目に、ＡｄＧＦＰおよびＡｄｍＭＡｐ４４を注射したＷＴマウスにおけるＣＤＡは、それぞれ９．０＋１．６５および３．４＋１．６０であった（図５Ｂ）。したがって、１０日目に、ＡｄｍＭＡｐ４４で前処置したマウスでは、ＡｄＧＦＰで同様に前処置したマウスと比較して、ＣＤＡが６０％減少した（ｐ＜０．０２６）。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４を注射したＷＴマウスにおける１０日目の疾患の有病率は、それぞれ１００％および６０％であった（図５Ａ）。ＡｄｍＭＡｐ４４と比較して、ＡｄＧＦＰで処置したマウスの体重に対する効果は有意ではなかった（図１１Ｄ）。これらのデータは、ＡｄｈＭＡｐ４４と同様に、ＡｄｍＭＡｐ４４による処置がＣＡＩＡの発症を予防することを実証している。
【０２９４】
外因性マウスＭＡｐ４４の発現は、ＣＡＩＡにおける関節の組織学的変化およびＣ３沈着を予防する
ＡｄｍＭＡｐ４４の処置効果をさらに調査するために、ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウス由来の固定関節において、組織病理学的分析を実施した。ＡｄｍＭＡｐ４４で処置したマウスでは、ＡｄＧＦＰと比較して、炎症（ｐ＜０．０４０）、パンヌス（ｐ＜０．０１５）、軟骨損傷（ｐ＜０．０２１）および骨損傷（ｐ＜０．０２６）に関する個々のスコアだけではなく、組織病理学総スコアについても、有意な減少（ｐ＜０．０２３）が見られた（図６Ａ）。ＣＤＡと組織学スコアとの間の相関係数（ｒ２）は、０．９３であった（図６Ｂ）。ＡｄｍＭＡｐ４４を形質導入したマウスでは、ＡｄＧＦＰの形質導入と比較して、滑膜および軟骨におけるＣ３沈着のレベルも有意に減少した（ｐ＜０．０２）（図６Ｃ）。ＣＤＡとＣ３沈着スコアとの間の相関係数（ｒ２）は、非常にプラスであった（０．９５）（図６Ｄ）。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスの膝関節（図１２Ａ、Ｃ）および足首（図１２Ｂ、Ｄ）における代表的な組織切片が示されている。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４を注射したマウスの膝関節（図１２Ｅ、Ｇ）および足首（図１２Ｆ、Ｈ）におけるＣ３沈着の代表的な組織切片が示されている。
【０２９５】
右膝関節に注射したＡｄｍＭＡｐ４４の全身効果
ＣＡＩＡの発症中、−５日目、０日目および３日目に、ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰを右膝に３回注射した（０日目に抗ＣＩＩ  ｍＡｂを注射）；未注射の左膝は、対照としての役割を果たした。ＡｄｍＭＡｐ４４で前処置したＣＡＩＡマウスにおける示されている関節すべての全ＣＤＡは、ＡｄＧＦＰを注射したマウスと比較して、有意に５５％減少した；ＣＤＡの値は、それぞれＡｄＧＦＰ  １０．１＋１．２６およびＡｄｍＭＡｐ４４  ４．５＋１．４０であった（ｐ＜０．００８）（図７Ａ）。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４で前処置ＣＡＩＡマウスにおける１０日目の疾患の有病率は、それぞれ１００％および７０％であった（図７Ｂ）。右膝関節への注射は、この関節におけるＣＤＡの減少をもたらした（図７Ｃ）。右膝関節への注射後、左後肢（ＦＩＧ．７Ｄ）、右前肢（ＦＩＧ．７Ｅ）および左前肢（ＦＩＧ．７Ｆ）では、ＣＤＡの減少も観察された。右膝において、この実験を同一の注射スケジュールで２回繰り返し、データをプールした。したがって、ＡｄｍＭＡｐ４４は、局所注射したマウスの右膝関節内でＣＡＩＡを予防することが実証されたことに加えて、すべての関節のＣＤＡが実質的に減少したことから、前記効果は全身的であった。
【０２９６】
ＡｄｈＭＡｐ４４処置は、ロスリバーウイルス誘導性関節炎および筋炎の重症度を減少させる
ＬＰ依存性筋骨格炎症性疾患の別のモデルにおけるＡｄｈＭＡｐ４４の役割を評価するために、本発明者らは、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）誘導性関節炎および筋炎のマウスモデルを使用した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：７３７−７４９）（図１３）。以前の研究では、Ｃ３およびＭＢＬ欠損マウスは両方とも、ＷＴマウスと比較して、ＲＲＶ誘導性疾患の重症度および組織破壊の軽減を示すので、ＲＲＶ誘導性疾患の発症における補体系のＬＰの役割が示唆されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：５１３２−５１４３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：７３７−７４９）。ヒトＭＡｐ４４がＲＲＶ誘導性疾患を緩和し得るかを評価するために、−３日目、０日目および３日目に、ＡｄｈＭＡｐ４４またはＡｄＧＦＰをマウスの右後足蹠に投与し、０日目に、ＲＲＶを左後足蹠に接種した。示されているように、ＡｄｈＭＡｐ４４による前処置は、ＲＲＶ誘導性疾患の徴候の重症度を有意に（ｐ＜０．０５）軽減した（図１３Ａ）。体重に対する効果はなかった（図１３Ｂ）。
【０２９７】
ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄｈＭＡｐ４４処置後の循環中のＨＡタグ付マウスＭＡｐ４４の存在
ＣＡＩＡの誘導の前後に、ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄｈＭＡｐ４４を注射したマウスにおいて、ＨＡタグに対するＥＬＩＳＡを使用して、血清中のＡｄ由来マウスまたはヒトＭＡｐ４４の存在を調査した（図８）。−２日目、０日目、３日目および１０日目に、ＨＡタグに対するウエスタンブロット分析を使用して、ＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウス由来の血清を調査した（図８Ａ）。同様に、−５日目、０日目、３日目および１０日目に、ＨＡタグに対するウエスタンブロット分析を使用して、ＡｄｍＭＡｐ４４を右膝関節に注射したマウス由来の血清を調査した（図８Ｂ）。ＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスでは、約４３〜５０ｋＤａのバンドが存在していたが、予想通り、注射前−２日目には消失していた（図８Ａ、レーン２）。同様に、ＡｄｍＭＡｐ４４を膝関節に注射したマウスの血清中では、約４３〜５０ｋＤａのバンドが存在していたが、注射前−５日目には存在していなかった（図７Ｂ、レーン２）。未処置の非罹患マウス由来の血清を使用すると、ＨＡは検出されなかった（図８Ａ、Ｂ、レーン１）。０日目、３日目および１０日目における血清中のＨＡの存在は、マウス組換えＭＡｐ４４が循環中に存在していたことを明らかに示している。加えて、マンナン−アガロースビーズを使用して、血清由来のＨＡタグ付タンパク質をプルダウンすることが確認されたように、ＡｄｈＭＡｐ４４の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与後に生成されたヒトＭＡｐ４４は、ＭＢＬに結合したので明らかに機能的であった（図８Ｃ）。これらの結果はまた、注射経路にかかわらず、ＡｄｍＭＡｐ４４またはＡｄｈＭＡｐ４４が細胞に有効に形質導入され、インビボにおける組換えタンパク質発現をもたらしたことを示している。マウスＭＡｐ４４を測定するためのＥＬＩＳＡが利用不可能であるので、本発明者らは、ウエスタンブロット分析を使用してＨＡタグを検出した。
【０２９８】
ＧＦＰおよびＨＡの検出による膝関節滑膜におけるインビボ形質導入効率
ＡｄｍＭＡｐ４４がＣＡＩＡマウスの膝関節における滑膜に形質導入されたかを具体的に決定するために、本発明者らはＩＨＳを使用した。ＡｄＧＦＰまたはＡｄｍＭＡｐ４４をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後、膝関節の滑膜において、ＧＦＰおよびＨＡタグの存在を評価した（図９）。本発明者らは、ＡｄＧＦＰの注射後１０日目のＣＡＩＡマウスの膝関節では、ＩＨＳによってＧＦＰが明確に見えることを見出した（図９Ｃ）。対照的に、ＰＢＳ（図９Ａ）またはＡｄｍＭＡｐ４４（図９Ｅ）を注射したマウスでは、緑色蛍光が見られなかった。しかしながら、本発明者らは、ＡｄｍＭＡｐ４４を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したマウスの細胞では、ＨＡタグが砂粒粒子として検出可能であったが（図９Ｆ）、ＰＢＳ（図９Ｂ）またはＡｄＧＦＰ（図９Ｄ）を注射したマウスでは検出不可能であったことを見出した。これらのデータは、ＡｄｍＭＡｐ４４が滑膜の細胞のサブセットに形質導入されたことを示している。本発明者らは、前記細胞の正確な同一性を把握していないが、これらの細胞集団におけるＣＡＩＡの存在から、それらは滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｔｙｅｓ）、リンパ球、好中球および／またはマクロファージであり得る（Ｂａｎｄａら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：１４６９−１４７８）。
【０２９９】
ＣＡＩＡ膝関節におけるレクチン、ＭＡＳＰ、ＦＤおよびサイトカインのｍＲＮＡレベルに対するＡｄＭＡｐ４４の効果
ＭＢＬ−Ａ、ＭＢＬ−Ｃ、ＦＣＮ−Ａ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３およびＦＤならびに炎症促進性サイトカインの発現に対するヒトＭＡｐ４４発現の効果を決定するために、本発明者らは、ＰＢＳ、ＡｄＧＦＰ、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤまたはＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤを３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したＣＡＩＡマウスの膝関節の１０日目のｍＲＮＡレベルを測定した（表２）。すべての標的の最低ベースラインｍＲＮＡレベルは、未処置の非ＣＡＩＡマウスの膝関節中に存在していた（表２）。全１０個の標的のｍＲＮＡレベルを調査するために、肝臓を陽性対照として使用した。ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスの膝関節におけるＦＣＮ−ＡのｍＲＮＡレベルは、ＡｄＧＦＰ処置マウスと比較して、それぞれ４２％および６０％減少していた；この減少は有意であった（ＬＤではＰ＜０．００１７、ＨＤではＰ＜０．０８）。ＰＢＳ、ＡｄＧＦＰ、ＡｄｈＭＡｐ４４  ＬＤまたはＡｄｈＭＡｐ４４  ＨＤで処置したマウスの膝関節では、４０サイクル未満のＰＣＲで、最低レベルのＭＢＬ−ＡまたはＭＢＬ−ＣのｍＲＮＡが存在していた。いずれかの用量のＡｄｈＭＡｐ４４を注射したマウスの膝関節におけるＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３およびＦＤのｍＲＮＡレベルの減少は、ＡｄＧＦＰまたはＰＢＳを注射したマウスと比較して、統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。ＬＤまたはＨＤのＡｄｈＭＡｐ４４のいずれかで処置したマウスの膝関節におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルは、それぞれ有意に６６％、８７％および８５％減少していた（ｐ＜０．０２またはそれを超える）（表２）。これらのｍＲＮＡのデータは、ＡｄｈＭＡｐ４４によるＣＡＩＡマウスの処置が、ＦＣＮ−Ａ、ＦＤおよびＭＡＳＰならびに炎症促進性サイトカインのｍＲＮＡレベルを減少させたことを示している。
【表２】
2017518318.tif 000003
【０３００】
考察
ヒトおよびマウスＭＡｐ４４の両方のＡｄプログラム化発現を使用して、これらの研究では、ＣＡＩＡの発症における補体系のＬＰの予想外の重要な役割が明らかになった。アデノウイルスによって発現されたＭＡｐ４４による臨床疾患の予防は、軟骨および滑膜のＣ３沈着の減少、組織学的傷害スコアの顕著な改善、ならびにＬＰおよびＡＰ構成要素および炎症促進性サイトカインの局所ｍＲＮＡレベルの減少に関連していた。ヒトおよびマウスＭＡｐ４４は両方とも、疾患を改善するのに有効であると思われ、インビボにおけるＭＢＬに対する結合によって評価したところ、両分子は機能的であった。全身注射および局所関節注射を使用した場合には両方とも、Ａｄによる処置は有効であり、後者の状況では全身の改善が見られたが、これはおそらくは、循環中の組換えＭＡｐ４４によって得られた効果によるものである。要するに、本発明者らの研究では、ＬＰが、補体活性化の開始において中心的な役割を果たすこと、およびＬＰの役割を組み入れるように、炎症性関節炎の分子病態の理解を拡大しなければならないことが明らかになった。
【０３０１】
ＭＢＬ−Ａ／ＣまたはＣ４欠損マウスを使用した過去の研究では、ＣＡＩＡにおける関節損傷の発症に対する効果は実証されなかった。ＭＢＬは、ＬＰ内の主なパターン認識分子であり、ＬＰがＣ３を活性化する主な手段は、Ｃ４およびＣ２のＭＡＳＰ−１−およびＭＡＳＰ−２媒介性切断を介して、共通のＣＰ／ＬＰ  Ｃ３コンバターゼＣ４ｂ２ｂを生成することによるものである。ＭＢＬ−Ａ／ＣまたはＣ４の欠失が、ＣＡＩＡにおける組織傷害の進行に対して明確な効果がないことにより、ＬＰついては、大きな役割が存在しないことが示唆された。しかしながら、最近の知見は、ＬＰの開始に重要であり得るさらなるパターン認識分子の存在を示している（Ｋａｗａｉら、２００２，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６：２１３４−２１４５）。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９４：４４３−４４８，Ｐｒｅｓａｎｉｓら、２００４，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：９２１−９２９およびＤｅｇｎら、２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７３７１−７３７８も参照のこと。
【０３０２】
ＭＡｐ４４は、ｎＭの親和性でＭＢＬおよびフィコリンと相互作用し、Ｃａ２＋依存性ホモ二量体を形成する（Ｓｋｊｏｅｄｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：８２３４−８２４３）。ＭＡｐ４４は、競合的な阻害または置換によって、ＭＢＬおよびフィコリンとＭＡＳＰとの間の相互作用を遮断して、活性化複合体を破壊し、それにより、ＬＰ媒介性補体活性化を障害する（Ｄｅｇｎら、２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：１３３４−１３４５）。インビトロにおける構造的および機能的研究の結果は、ＭＡｐ４４が、ＭＢＬ−Ａ／Ｃ依存性モデルにおける心筋傷害および動脈血栓形成を軽減することを示すインビボ研究によって裏付けられている（Ｐａｖｌｏｖら、２０１２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２２２７−２２３５）。したがって、ＭＡｐ４４は、天然のインビボ内因性ＬＰ阻害剤であると示唆された（Ｐａｖｌｏｖら、２０１２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２６：２２２７−２２３５）。
【０３０３】
ＣＡＩＡモデルは、ＭＢＬ−Ａ／Ｃの関与を必要としないが、本発明者らは、ＭＡｐ４４が他のコレクチン−ＭＡＳＰ相互作用を阻害する場合には、それが、マウスにおけるＣＡＩＡの発症に影響を与え得ると仮説した。実験に利用可能な大量の精製ＭＡｐ４４タンパク質がなかったので、本発明者らは、ＡｄｈＭＡｐ４４およびＡｄｍＭＡｐ４４を使用して、ＣＡＩＡ研究のためのヒトおよびマウスＨＡタグ付ＭＡｐ４４をインビボで継続的に生産した。本発明者らは、ＡｄｈＭＡｐ４４でマウスを処置した場合、ＡｄＧＦＰと対比して、ＬＰによるＣ３活性化が４０％超減少したことを見出した。ヒト血清中のＭＡｐ４４の濃度は、１．７μｇ／ｍｌである（Ｄｅｇｎら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６１：３７−５０；Ｓｋｊｏｅｄｔら、２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：８２３４−８２４３）。マウスＭＡｐ４４のレベルは不明であるが、顕著な臨床効果の実証により、本発明者らが治療有効用量を達成したことが示された。これは、−５日目にＡｄｈＭＡｐ４４を単回注射すると、０日目のＭＡｐ４４のレベルが大きく１０００倍増加していたという事実によるものであり、これらのデータは、ＭＡｐ４４のウエスタンブロット分析と一致していた。１０日目に得られた血清を使用すると、ヒトＭＡｐ４４の測定レベルは１００〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲内であり、これは、プルダウン実験によって評価される下位レベル点であった。
【０３０４】
アデノウイルス５型は、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ、細胞接着分子）を使用して細胞に結合し（Ｂａｋｋｅｒら、２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１７８５−１７９３）、続いて、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列がインテグリンανβ５およびανβ３に結合することによってインターナリゼーションが起こる（Ｂａｉら、１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５１９８−５２０５；Ｍａｔｈｉａｓら、１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６８：６８１１−６８１４；Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９３，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９）ので、今回の研究の送達ビヒクルとしてアデノウイルス５型を選択した。滑膜細胞は、それらの表面上でＣＡＲまたはＲＧＤ結合インテグリンを発現し、アデノウイルスは、これらを使用して細胞に侵入する。本発明者らは、ＦＡＣＳ分析を使用することによって、ＣＩＡマウスの滑膜由来の線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）細胞株がそれらの表面上で相当レベル（約６０％）のインテグリンανβ５を発現していたことを見出した（データは示さず）。また、ＩＨＳデータにより、マウス滑膜では、関節炎の有無にかかわらず、ＲＧＤ結合インテグリンが高発現され（データは示さず）（Ｎｉｋｋａｒｉら、１９９５，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２２：１６−２３；Ｐｉｒｉｌａ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｏ，１９９６，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３：１６９１−１６９８；Ｒｉｎａｌｄｉら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５６：７２９−７３６）、ＲＧＤなしのＡｄｍＭＡｐ４４の投与は、部分的だがＣＡＩＡを軽減したので（しかしそれは、高度に統計的に有意ではなかった）（データは示さず）、ＲＧＤ配列を構築物に含めると、滑膜細胞への送達が顕著に改善されることが示された（Ｈｅｊａら、２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１０４９８−１０５０３）。したがって、ＡｄＧＦＰもＲＧＤを含有していたので、ＡｄＭＡｐ４４中のＲＧＤ配列は、有効な送達ビヒクルとして機能して、疾患それ自体に影響を与えずに、ＡｄＭＡｐ４４をマウスの膝関節の滑膜にホーミングした。例えば、マウスインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ｍＩＬ−１Ｒａ）を含有するアデノウイルスは、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）を抑制し（Ｂａｋｋｅｒら、２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１７８５−１７９３）、ヒトアディポネクチンＡＰＮ（Ａｄ−ＡＰＮ）遺伝子を有するＡｄベクターは、驚くべきことに、膝関節におけるＣＩＡおよびＣ３沈着を軽減した（Ｅｂｉｎａら、２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３７８：１８６−１９１）。
【０３０５】
ＣＡＩＡは、ＬＰの役割を研究するための適切なモデルである。補体系（先天性免疫の一部）は、病原体の侵入を防ぐだけではなく、ＲＡなどの自己免疫疾患および炎症性疾患の病理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たす。本発明者らの研究により、ＣＡＩＡでは、ＡＰが、組織傷害の発症の主因であることが以前に示された（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２）。加えて、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、プロＦＤと称されるＦＤのチモーゲンを切断する（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２９−３７）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３を欠くマウスは両方ともＬＰを欠いており、ＡＰ活性が減少していることが示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２９−３７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８）。同様に、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３が欠損した患者は、ＡＰ活性が検出可能だが減少していることが報告されている（Ｄｅｇｎら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９：３９５７−３９６９）。ｆＨ−／−／ＭＡＳＰ−１／３−／−マウスの循環中では、プロＦＤの切断が観察されなかった；これらのマウスでは、ＡＰ活性が減少しており、コブラ毒因子を注射した後においてのみ、活性化が可能であった（Ｒｕｓｅｖａら、２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。全体としては、プラスミン、トロンビンおよびカリクレインの存在下であっても、プロＦＤのみが循環中に存在しており、成熟ＦＤは存在していないことから、ＭＡＳＰ−１／３−／−マウスは、不十分なＡＰ活性化を示す（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２９−３７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１３２−６１３８；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６）。これらの観察結果と一致して、本発明者らは、ＭＡＳＰ−１／３−／−マウスは、補体系の不十分なＡＰを有するだけではなく、ＣＡＩＡに対して極めて抵抗性であることを示した（Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５５９８−５６０６）。したがって、ＣＡＩＡの発症のためには、補体系のＡＰが必要であり、ＡＰの構成要素を欠くマウスは、関節炎に対して抵抗性である（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｋｅｍｐｅｒら、２０１０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１３１−１５５；Ｂａｎｄａら、２０１０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１００−１０８）。
【０３０６】
今回のＣＡＩＡ研究では、本発明者らは、いくつかの新たな観察結果を得た。第１に、ＡｄｈＭＡｐ４４は、マウスにおけるＣＡＩＡを劇的に軽減する。０日目、３日目および１０日目に、ＡｄｈＭＡｐ４４で処置したＣＡＩＡマウスの循環中では、組換えｈＭＡｐ４４が検出可能であった。加えて、ＡｄｈＭＡｐ４４の投与は、マウスにおけるＲＲＶ誘導性関節炎の重症度を減少した。第２に、送達経路として全身注射または局所注射のいずれかを使用すると、ＡｄｍＭＡｐ４４もまた、マウスにおけるＣＡＩＡを軽減する。第３に、ＡｄｈＭＡｐ４４で処置したＷＴマウスの循環中では、ＡｄＧＦＰ処置と比較して、Ｃ５ａのレベルが減少しており、これは、ＭＡｐ４４発現の意図される効果と一致する（図３Ａ）。第４に、ＡｄｈＭＡｐ４４で処置したマウスの膝関節では、ＭＡｐ４４は、ＭＡＳＰとそのリガンドとの間の相互作用を阻害しただけではなく、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３およびプロ−ＦＤ  ｍＲＮＡ発現ならびに炎症促進性サイトカイン発現のレベルの減少をもたらした。そして第５に、本発明者らがＲＲＶ誘導性関節炎の別のマウスモデル（これは、補体のＡＰに依存しないが、ＬＰリガンドＭＢＬに部分的に依存する）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：５１３２−５１４３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１１２６３−１１２７２；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：７３７−７４９）を使用したところ、本発明者らは先と同様に、ＡｄｈＭＡｐ４４が関節炎の有意な軽減に成功したことを見出したので、ＭＡｐ４４の改善効果は、１つの関節炎モデルに特異的ではない。
【０３０７】
最後に、本発明者らは、ＭＡｐ４４のＡｄ媒介性遺伝子導入が、関節炎の潜在的な処置ツールとして使用され得ると結論する。ヒトＭＡｐ４４は循環中に存在し、このアプローチによって送達されるＭＡｐ４４は、低い形質導入効率であっても、炎症性関節炎に対する長期阻害効果を有し得る。さらに、インビトロおよびインビボの両方において、遺伝子を様々な増殖細胞および静止細胞に導入する際に、Ａｄ遺伝子送達システムが非常に効率的である（Ｗｉｌｓｏｎ，１９９６，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１１８５−１１８７）。ＲＡ線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）ならびにヒトおよびマウス滑膜の形質導入では、短いシャフトファイバーを有する遺伝子改変Ａｄ５ベクターが非常に効率的であることも示されている（Ｔｏｈら、２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：７６８７−７６９８）。ＡｄｈＭＡｐ４４配列を使用した疾患の顕著な予防は、補体阻害因子遺伝子を含有するＡｄベクター、および／または組換えＭＡｐ４４の単独使用が、ヒトにおける炎症性関節炎の処置として評価されるべきであるという証拠を提供する。
【０３０８】
実施例２：ＭＡｐ４４研究のための関節炎のマウスモデル
以下の系統のマウスを関節リウマチ（ＲＡ）の研究に利用する：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＤＢＡ／１  ｌａｃＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／１  ｌａｃＪマウスは、それぞれ抗コラーゲン抗体（受動的）およびコラーゲン誘導性関節炎（能動的）に対して感受性であり、炎症性関節炎を研究するために広く使用されている。雄性マウスおよび雌性マウスは両方とも、ウシＩＩ型コラーゲンによる免疫後に、またはコラーゲンに対するモノクローナル抗体のカクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）の注射後に、関節炎を同様に発症しやすい。
【０３０９】
本発明者らは、コラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）およびコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）と称されるＲＡの２つのマウスモデルを使用する。ＣＡＩＡは、補体系に依存するＲＡのマウスモデルであり、ＣＩＡは、Ｔ細胞、Ｂ細胞および補体に依存する。８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ１／ｌａｃＪならびに様々なＫＯ雄および雌を５００μｌのアバチン（腹腔内注射：用量０．７５ｍｇ／ｇ）で麻酔する。アバチンは、本発明者らの外科手術のすべてに使用した麻酔薬である。それは、Ｓｉｇｍａから入手可能である。
【０３１０】
ＣＡＩＡの場合、モノクローナル抗コラーゲン抗体のカクテル（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎカクテルは、５つの抗体を含有する）をマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、マウス１匹当たり８ｍｇのＡｒｔｈｒｏｇｅｎを必要とする。３日目に、２５Ｇ針を使用して、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｌｙｓａｃｃｒｉｄｅ）をすべてのマウスに腹腔内注射する（５０μｇ／マウスの濃度で総容量５０μｌ）。ＬＰＳの注射は、このモデルにおける疾患の循環に必要である。抗ＣＩＩ抗体のみまたはＬＰＳを注射したマウスは、非常に低レベルの関節炎を発症する。対照的に、抗ＣＩＩ抗体を注射し、続いてＬＰＳを注射したマウスは、重度の関節炎を発症する（図１５）。
【０３１１】
マウスは、４日目に臨床疾患の徴候を示し始め、１０日目にすべてのマウスを屠殺する。前述のように、マウスは、ＬＰＳ注射直後４日目に臨床疾患の徴候を示し始める。４日目に、前肢および後肢が両方とも少し赤くなる。その後、強直により、膝関節が肥大する。本発明者らは、マウスにおける臨床疾患を調査するための以下の基準を既に確立および公表している。
【０３１２】
ＣＩＡの場合、０日目に、２５Ｇ針を使用して、４ｍｇ／ｍｌの不活性化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する不完全フロイントアジュバント中の２００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンをマウスの尾の基部に皮内注射する（総容量１００μｌ）。３週間（２１日）後、マウスをアバチンで麻酔し、４ｍｇ／ｍｌの不活性化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含有する不完全フロイントアジュバント中の２００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンの２回目の追加免疫注射を行う。２１日目の追加免疫注射は、疾患の循環に必要であり、関節炎の発症に必要な抗体の産生に必要である。コラーゲン注射は両方とも、皮内投与である。このプロトコールは、ＤＢＡ１／Ｊマウスにおいてコラーゲン誘導性関節炎を誘導するために広く使用されている。フロイントアジュバントおよび不活性化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、この関節炎モデルを誘導するために必要である。本発明者らがＩＦＡと一緒に不活性化Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを使用しなければ、マウスは、一貫して重度のレベルの関節炎を発症しない。異なるタンパク質および抗体の効果を調査するためには、マウスが重度の関節炎を発症しなければならず、さもなければ、本発明者らは、異なる処置群の転帰を比較することができない。関節炎の発症について、動物を毎日モニタリングする。関節炎は、通常、最初のコラーゲン注射の４〜５週目後に起こる。関節炎の初期徴候は、前肢および後肢における赤みの出現である。対照群は、ＷＴマウスからなる。関節炎の発症の２〜３週間後に、麻酔して採血し、続いて頸椎脱臼することによって、すべての群の動物を屠殺する。静脈内（ＩＶ）注射または膝関節注射のために、本発明者らは、ｌｃｃ  Ｕ−１００  ２７Ｇ５／８（０．４０×１６００）インスリン注射器を使用する。この注射器は、取り外し不可能な針を有する。
【０３１３】
臨床疾患活動性（ＣＤＡ）を３段階評価／肢でスコアリングする：０＝正常な関節；１＝わずかな炎症および赤み；２＝肢全体に影響を与え、使用禁止を伴う重度の紅斑および腫れ；ならびに３＝強直を伴う肢または関節の変形、関節の硬直および機能の喪失。臨床疾患活動性の総スコアは、全４本の肢に基づいており、各マウスについて、最大値は１２である。
【０３１４】
ＣＡＩＡ研究の場合には１０日目に、またはＣＩＡ研究の場合には３５日目に、すべてのマウスから両前肢および右後肢全体（足、足首および膝を含む）を外科的に取り去り、１０％緩衝ホルマリン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）で直ぐに固定する。以前に記載されているように（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）、組織サンプルの調製および組織学的分析を実施する。マウスの種類および各マウスの臨床疾患活動性スコアを把握していない熟練の観察者が、すべての切片を観察する。炎症、パンヌス、軟骨損傷および骨損傷の変化について、関節の切片を０〜５段階でスコアリングし、４つの個々のパラメータの合計として、総スコアを計算する。マウス１匹当たり５つの関節の平均値として、各パラメータを表す。
【０３１５】
１０日目または３５日目の屠殺時に、すべてのマウスから右後肢全体（足、足首および膝を含む）を外科的に取り去り、１０％緩衝ホルマリン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）で直ぐに固定する。ポリクローナルヤギ抗マウスＣ３抗血清（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を使用することによって、すべての実験マウスの関節におけるＣ３沈着を免疫組織化学的に評価する。組織学的切片を抗マウスＣ３抗体と共に４℃で一晩インキュベートする（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９）。組織切片をビオチン化ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＣＡ）と共に連続的にインキュベートし、次いで、Ｄａｋｏ  ＬＳＡＢ２  Ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）でさらに処理する。Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，ＣＡ）で染色を現像し、ヘマトキシリンで対比する。同一の方法を使用して、ＭＡＣの免疫組織化学染色を行う。
【０３１６】
Ｃ３免疫組織化学染色のスコアリングを以下のように実施する：３段階のスコアリングシステム（０は染色なしを表し、３は３＋の染色を表す）に基づいて、滑膜および周囲組織を両方ともスコアリングする。軟骨における染色も評価する。軟骨染色の基準は、以下の通りである：０−染色が存在しない、０．５−ごくわずかな１つの染色領域が１つの関節の軟骨細胞にある、１−中程度の１つの染色領域が１つの関節の軟骨細胞にある、２−中程度の複数の染色領域が軟骨細胞−複数の罹患関節にある、３−強い複数の染色領域が軟骨細胞にあり、および／またはびまん性の多巣性染色が関節軟骨病変にある。各動物について、５つの各関節の滑膜および軟骨スコアを別々に決定する。個々の（滑膜または軟骨の）各パラメータの合計（最大は１５）および平均（最大は３）だけではなく、動物の総スコアの合計（全５つ関節、最大スコアは３０）および５つの関節の平均動物スコア（最大は６）を決定する。本発明者らは、Ｃ３およびＩｇＧの上記免疫組織化学的スコアリング方法を既に公開している（Ｂａｎｄａら、２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１９１２；Ｂａｎｄａら、２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４１０１−４１０９；Ｂａｎｄａら、２０１２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：１４６９−１４７８）。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月10日(2017.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017518318000001.app
【国際調査報告】
2017518318.tif 000032
2017518318.tif 000033
2017518318.tif 000034