(57)【要約】【課題】癌におけるＷｎｔシグナル伝達経路の不適切な活性化を停止させることができる分子を同定する。【解決手段】本発明は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ７受容体を認識する抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに、本発明は、これらの抗体を用いて対象における癌を治療する方法を提供する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
当該抗体が、前記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２】
配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号１の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする抗体。
【請求項３】
当該抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４】
配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号２の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号３の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号２の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
当該抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記抗体が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合するが、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体には結合しないことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記抗体が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体を発現する細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合部分が、細胞傷害性部分に結合されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
前記抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合部分が、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二量体または三量体であることを特徴とする請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、ヒト化、キメラ型、またはキメラ型／ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
対象において癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍原性を低下させる方法であって、
対象に、治療上有効量の、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の単離された抗体を投与するステップを含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分を投与することによって、前記腫瘍における癌幹細胞の頻度を低下させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
対象において腫瘍を治療する方法であって、
治療上有効量の、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、
前記抗体が、前記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合することを特徴とする方法。
【請求項１９】
対象において腫瘍を治療する方法であって、
対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、
前記単離された抗体が、配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号１の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
対象において腫瘍を治療する方法であって、
対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、
前記単離された抗体が、配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号２の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２２】
対象において腫瘍を治療する方法であって、
対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、
前記単離された抗体が、配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号３の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
対象において腫瘍を治療する方法であって、
対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、
前記単離された抗体が、配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号４の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離された抗体が、前記Ｆｒｉｚｚｅｌｅｄ７受容体に結合するが、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体には結合しないことを特徴とする請求項１９ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離された抗体が、前記腫瘍におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１９ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、細胞傷害性部分に結合されることを特徴とする請求項１９ないし２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記単離された抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離された抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記単離された抗体が、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二量体または三量体であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
当該抗体が、ヒト化、キメラ型、またはキメラ型／ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍がウィルムス腫瘍であることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍が、メラノーマ細胞で構成されていることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が、結腸癌細胞で構成されていることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
当該方法が、
化学療法抗体を投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９ないし３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
当該方法が、
第２の抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含むことを特徴とする請求項１９ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
対象において腫瘍を検出する方法であって、
対象から生体試料を採取するステップと、
前記生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ７を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
対象において腫瘍を検出する方法であって、
対象から生体試料を採取するステップと、
前記生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、
配列番号１の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３８または３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
対象において腫瘍を検出する方法であって、
対象から生体試料を採取するステップと、
前記生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、
配列番号２の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする方法。
【請求項４２】
対象において腫瘍を検出する方法であって、
対象から生体試料を採取するステップと、
前記生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、
配列番号３の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする方法。
【請求項４３】
対象において腫瘍を検出する方法であって、
対象から生体試料を採取するステップと、
前記生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、
配列番号４の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合し、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合しないことを特徴とする請求項３９ないし４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記単離された抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離された抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離された抗体が、発色性組換え抗体または放射性抗体に結合されることを特徴とする請求項３８ないし４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍がウィルムス腫瘍であることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記腫瘍が、メラノーマ細胞で構成されていることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記腫瘍が、結腸癌細胞で構成されていることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌などの疾患を治療するための組成物に関する。詳細には、本発明は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合する抗体、及び該抗体を癌治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、大部分でないとしてもその多くが、専ら自己複製能を有しかつ腫瘍前駆遺伝子の発現により腫瘍を維持するような細胞集団から生じることが明らかになりつつある。これらの「癌幹細胞」は、腫瘍容積の大部分を含む分化した癌細胞とは生物学的に異なっていることが多い。癌幹細胞は、腫瘍の発生並びに化学療法及び放射線療法に対する耐性の主な原因であると考えられているので、その永続性が癌患者における疾患の再発の原因となっている可能性がある。
【０００３】
腎臓癌や腎芽細胞腫の一種であるウィルムス腫瘍（ＷＴ）は、小児の最もよく見られる固形腫瘍の１つであり、発症率は小児１０，０００人に１人であり、小児癌の８％を占める。集学的治療の向上により、ＷＴ生存率は過去４０年間で８５〜９０％に上昇した。しかし、再発や転移が起こった場合には、集中的なサルベージ療法を行ってもその後の生存率は５０％前後でしかない。さらに、サバイバー（生存者）は、遅発性死亡や二次癌など、化学療法及び放射線療法によって引き起こされる幅広い有害転帰のリスクが高い。
【０００４】
ウィルムス腫瘍は、胚性分化能を持つ異常に永続的な腎臓幹細胞の悪性転換の結果生じると考えられている。実際に、マイクロアレイによって得られた最近の分子データによれば、ウィルムス腫瘍及びウィルムス腫瘍幹様異種移植片が、腎臓における腫瘍形成と器官形成を結び付ける正常な後腎臓形成の最初期段階に相当する腎臓の前駆遺伝子を系統的に過剰発現させることが示されている。
【０００５】
腎臓系統を特定する遺伝子に加えて、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（ＦＺＤ７）及びｆｒｉｚｚｌｅｄ２（ＦＺＤ２）を含むＷｎｔ経路関連分子が同時にウィルムス腫瘍において誘発される。一般的に、ｆｒｉｚｚｌｅｄ細胞表面受容体へのＷｎｔリガンドの結合は、通常、ＡＰＣ／アキシン／ＧＳＫ−３β／Ｃｋ１／Ｄｖｌ及び他の因子からなる「分解複合体」の阻害、続いて、脱リン酸化安定化βカテニンの蓄積、そしてその標的遺伝子の転写をもたらす。興味深いことに、最近のデータは、腎形成におけるＷｎｔ−βカテニンシグナル伝達経路のための重要な役割を示している。また、ウィルムス腫瘍のゲノムスクリーニングによって、ウィルムス腫瘍における癌幹細胞のバイオマーカであるべきＷｎｔ受容体であるＦＺＤ７が特定された。さらに、βカテニンシグナル伝達とウィルムス腫瘍の増殖との顕著な関連も実証されている。
【０００６】
近年、様々な他の腫瘍（例えば結腸、乳房）及び幹細胞の自己再生機構においてＷｎｔ経路の関与が明らかにされた。Ｗｎｔの異常な活性化は、腫瘍細胞の発生運命を、未分化及び増殖状態に維持するように変更することができる。したがって、発癌は、幹細胞によって正常な成長及び組織修復を制御する変更されたホメオスタシス機構を背景として進行し得る。
【０００７】
分泌型Ｗｎｔリガンドは、Ｆｚｄ受容体ファミリーメンバ及び低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５または６（ＬＰＲ５／６）からなる受容体複合体を活性化させる。Ｆｚｄ受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの７つの膜貫通ドメイン受容体であり、（システインリッチドメインとして知られている）１０個の保存システインを含む大きな細胞外Ｎ末端リガンド結合ドメインを含む。１０個の既知のヒトＦＺＤ受容体：ＦＺＤ１〜１０が存在する。異なるＦｚｄシステインリッチドメインは、特定のＷｎｔに対する結合親和性が異なる。Ｆｚｄ受容体は、古典的βカテニン経路を活性化させるものと、非古典的経路を活性化させるものとに分類されている。
【０００８】
ＦＺＤリガンドに結合する受容体複合体を形成するために、ＦＺＤ受容体は、１回膜貫通タンパク質ＬＲＰ５／６と相互作用する。受容体結合時に活性化された古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｆｚｄ受容体と直接的に相互作用する細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）によって仲介され、細胞質の安定化及びβカテニンの蓄積をもたらす。Ｗｎｔシグナルの不存在下において、βカテニンは、腫瘍抑制タンパク質である腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）及びアキシンを含む細胞質分解複合体に局在する。Ｄｓｈの活性化は、分解複合体の解離をもたらす。
【０００９】
古典的シグナル伝達経路に加えて、Ｗｎｔリガンドは、βカテニン非依存性経路（すなわち非古典的Ｗｎｔシグナル伝達）も活性化させる。非古典的Ｗｎｔシグナル伝達は、原腸陥入のプロセスに関与してきた。古典的経路と非古典的経路との間で拮抗作用がしばしば報告され、いくつかの証拠は非古典的シグナル伝達が癌形成を抑制することができることを示している。したがって、特定の状況では、Ｆｚｄ受容体は古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子として作用する。例えば、ＦＺＤ６は、ＦＺＤ１と共発現したときにＷｎｔ古典的シグナル伝達を抑制する。
【００１０】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路はまた、小腸及び結腸における幹細胞集団の維持において中心的な役割を果たし、この経路の不適切な活性化は、結腸直腸癌において重要な役割を果たす。結腸直腸癌は、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードにおいて突然変異を活性化することによって開始されることが最も多い。全結腸直腸癌の約５〜１０％は遺伝的なものであり、主な形態の１つである家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）は、罹患した個体の約８０％が大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の生殖細胞系列突然変異を含む常染色体優性疾患である。アキシン及びβカテニンを含む他のＷｎｔ経路コンポーネントにおいても突然変異が同定された。
【００１１】
ヒトの乳癌においては、βカテニンの蓄積は癌の５０％超における活性化されたＷｎｔシグナル伝達を暗に示唆しており、特異的突然変異は同定されていないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の上方制御は観察されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、癌（結腸直腸癌、メラノーマ及び乳癌を含むが、これらに限定されるものではない）におけるＷｎｔシグナル伝達経路の不適切な活性化を停止させることができる分子を同定する必要性が残っている。本発明は、ＦＺＤ７受容体に特異的な抗体を提供することにより、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態では、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、当該抗体が、上記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであってよい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１の少なくとも５アミノ酸（ＡＡ）部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号１の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する抗体を提供する。別の実施形態では、抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであってよい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号２の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する抗体を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号３の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する抗体を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号４の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号４の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する抗体を提供する。別の実施形態では、抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであってよい。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法を提供する。該方法は、治療上有効量の、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、当該抗体は、受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法を提供する。該方法は、対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、単離された抗体は、配列番号１の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合し、配列番号１の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、腫瘍は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法を提供する。該方法は、対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、単離された抗体は配列番号２の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合し、配列番号１の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、腫瘍は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法を提供する。該方法は、対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、単離された抗体は配列番号３の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合し、配列番号３の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、腫瘍は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法を提供する。該方法は、対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、単離された抗体は配列番号４の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合し、配列番号４の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、腫瘍は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ７を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、上記抗体は、上記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号１の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、配列番号１の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号２の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、配列番号２の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号３の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、配列番号３の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、配列番号４の少なくとも５ＡＡ部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含み、配列番号４の上記部分はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ウィルムス腫瘍、結腸直腸腫瘍、結腸癌、メラノーマ細胞を含む腫瘍、または乳房腫瘍、あるいはそれらの任意の組合せを対象とする。
【００２９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、例及び図面から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明及び具体例は、本発明の好適実施形態を示しているが、単に例として与えられていることを理解されたい。本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な修正形態及び変更形態は、この詳細な説明から当業者に明らかになるためである。
【００３０】
本発明と見なされる主題は、本明細書の結論部分において特に指摘されかつ明確に主張されている。しかし、本発明は、構造及び操作方法の両方に関して、本発明の目的、特徴及び利点とともに、添付の図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって最も良く理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ＦＺＤ７（左）とＦＺＤ２（右）との組織特異性比較を示す。
【図１Ｂ】ヒトＦＺＤ２とヒトＦＺＤ７における、Ｆｚファミリーメンバのシステインリッチ細胞外ドメインに特徴的な１０個のシステイン残基の比較を示す。９５％（１４２／１５０）相同性が示されている。黒い長方形は、選択されたエピトープの位置を示している。隣接する正方形は、エピトープの対応する配列番号を示す（例えば、数字の「１」が書かれた正方形は、配列番号１である配列を含む正方形に標識を付けている）。
【図２】選択されたエピトープを使用して作製されたハイブリドーマクローンによって産生されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による悪性細胞増殖の阻害を示す。数は、抗体を採取したハイブリドーマクローンを示している（例えば、２８８−１は、ハイブリドーマクローン２８８−１によって作製されたモノクローナル抗体を示している）。ウィルムス腫瘍細胞（Ｗ００５）を９６ウェルプレートに播種し、抗体と４８時間インキュベーション後に、ＭＴＳ（細胞増殖アッセイ）によってアッセイした。同じことをメラノーマ細胞株細胞（ＳＫ−ＭＥＬ２８）、ウィルムス腫瘍細胞（ＷＴ）及びＨｅＬａ子宮頸癌細胞においても行った。ウィルムス腫瘍細胞（ＷＴ）、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞及びＨｅＬａ細胞のＦＺＤ７発現レベルはそれぞれ、１０％、１１％及び３％である。
【図３】選択されたハイブリドーマクローンから得られるＦＺＤ７特異的抗体による悪性細胞増殖の阻害を示す。ＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞を９６ウェルプレートに播種した。表示されたクローンから得られる抗体と細胞を４８時間インキュベーションした後に、ＭＴＳ（細胞増殖アッセイ）によってアッセイした。同じことをＨｅＬａ及びＨＴ−２９結腸直腸腺癌細胞においても行った。ＳＫ−ＭＥＬ２８のＦＺＤ７発現レベル（１１〜２２％）、ＨｅＬａのＦＺＤ７発現レベル（３％）及びＨＴ−２９のＦＺＤ７発現レベル（２．６％）が示されている。丸で囲んだ星は、示されているクローンが有効であることを示している（ｎ＝５）。
【図４Ａ】ＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による原発腫瘍悪性細胞の死滅を示す。原発腫瘍はウィルムス腫瘍であり、抗体は、選択されたエピトープを使用して作製されたハイブリドーマクローンによって産生されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体であった。数は、抗体を採取したハイブリドーマクローンを示している（例えば、２８８−１は、ハイブリドーマクローン２８８−１によって作製されたモノクローナル抗体を示している）。ウィルムス腫瘍細胞（Ｗ００５）を９６ウェルプレートに播種し、抗体と４８時間インキュベーション後に、トリパンブルーによって細胞生存率を測定した。全細胞からの生細胞の割合が示されている。
【図４Ｂ】選択されたエピトープを使用して作製されたハイブリドーマクローンによって産生されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体によるＳＫ−ＭＥＬ２８及びＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞の死滅を示す。数は、抗体を採取したハイブリドーマクローンを示している（例えば、２８８−１は、ハイブリドーマクローン２８８−１によって作製されたモノクローナル抗体を示している）。ＳＫ−ＭＥＬ２８及びＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞を９６ウェルプレートに播種し、抗体と４８時間インキュベーション後に、トリパンブルーによって細胞生存率を測定した。生細胞の絶対細胞数を示す。
【図４Ｃ】モノクローナル抗体のうちの１つにより処理した後（クローン２８８−２、右の画像）及び抗体での処理なし（左）のＳＫ−ＭＥＬ２８細胞の代表的なマイクロ画像を示す。処理された細胞（右）においては細胞死が見て取れる。
【図５Ａ】クローン２８８−１（上）及び２８８−５（下）において産生される様々な濃度の抗ＦＺＤ７モノクローナル抗体に露出されたときの細胞増殖の阻害の観点からの用量反応を示す。高ＦＺＤ７発現悪性組織（ＳＫ−ＭＥＬ２８、メラノーマ細胞）の反応を低ＦＺＤ７発現悪性組織（ＨｅＬａ、子宮頸癌細胞）の反応と比較している。細胞を抗体に４８時間露出させ、ＭＴＳアッセイによって増殖を評価し、抗体により処理されなかった細胞と比較した。高ＦＺＤ７発現細胞においてはいずれかのＦＺＤ７抗体の存在下で増殖が阻害されたが、低発現細胞（ＨｅＬａ）においては増殖が阻害されなかった。約５ｕｇ／ｍｌの抗体濃度で増殖の最適な阻害が観察された。示されているデータは、細胞株毎に対照非処理細胞に正規化されている。
【図５Ｂ】図５Ａから得られたデータを、５ｕｇ／ｍｌのハイブリドーマクローン２８８−１及び２８８−５によって産生されるＦＺＤ７モノクローナル抗体による増殖の阻害のレベルに対するＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞の培養密度の影響が強調されるようにして示す。２８８−５の場合に４０００個の細胞／ウェルの密度が採用されたときにこの抗体濃度で阻害がより大きく、２８８−１の場合においても同様であることが観察された。
【図６】表示された濃度において２８８−１抗体で４８時間処理した後の、ＨｅＬａ及びＳＫ−ＭＥＬ２８細胞における活性βカテニン（ミリポア０５６６５）のウェスタンブロット解析を示す。２８８−１によって産生されるＦＺＤ７モノクローナル抗体によるβカテニン阻害が示されている。
【図７Ａ】本発明の抗体により処理された悪性細胞のアポトーシスを示す。具体的には、メラノーマ及びＨｅＬａ細胞に結合するＡＰＣ標識アネキシンＶのフローサイトメトリーが示されている。様々な濃度のハイブリドーマ２８８−１によって産生されるモノクローナル抗体の存在下または抗体なしでのアネキシン染色のレベルが比較されている。
【図７Ｂ】ＲＱ−ＰＣＲを用いたＷＮＴ標的化遺伝子の発現を示す。非処理及び処理されたウィルムス腫瘍及びＨｅＬａ細胞。
【図８】細胞膜内のＦＺＤ７ポリペプチドの配置を示し、ペプチド１〜４の位置を特定する。
【図９】ハイブリドーマから分泌されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害を対照の増殖率と関連付けて示すデータを示す。
【図１０】市販のＳＫ−ＭＥＬ２８細胞の抗ＦＺＤ７抗体による抗ＦＺＤ７抗体２８８−１二重標識を示す顕微鏡写真を示す。
【図１１】（Ａ）ないし（Ｃ）からなり、（Ａ）は、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞溶解物においてＦＺＤ７受容体に結合するモノクローナル抗体２８８−１の特異性を確認する免疫沈降アッセイの結果を示す。（Ｂ）は、ＦＺＤ７受容体の抗原Ｃに対するモノクローナル抗体２８８−１の特異性を示すペプチドブロッキングアッセイの結果を示す。（Ｃ）は、モノクローナル抗体２８８−１の連続希釈法（４ｕｇ／ｍｌ、２ｕｇ／ｍｌ及び１ｕｇ／ｍｌ）を示し、ＦＺＤ７に対するこの抗体の特異性を確認するウェスタンブロットデータを示す。
【図１２】安定化抗ＦＺＤ７抗体２８８−１がメラノーマ細胞の増殖を低下させることを示す棒グラフを示す。対照非処理細胞を１００％に設定し、増殖率の平均を棒グラフ中に距離マーカで示した。
【図１３Ａ】ＭＡｂ２８８−１がＳＫ−ＭＥＬ２８細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路標的遺伝子ＡＸＩＮ、ＣＣＮＤ１、Ｃ−ＭＹＣ、ＦＺＤ７及びＣＴＮＮＢ（βカテニン）並びにＷｎｔ経路阻害剤ＤＫＫ１及びｓＦＲＰ１の発現を阻害することを実証する結果（棒グラフ）を示す。
【図１３Ｂ】ＭＡｂ２８８−１がウィルムス腫瘍細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路標的遺伝子、すなわち、ＡＸＩＮ、ＣＣＮＤ１、Ｃ−ＭＹＣ；ＦＺＤ７；ＣＴＮＮＢ（βカテニン）並びにＷｎｔ経路阻害剤、すなわち、ＤＫＫ１及びｓＦＲＰ１の発現を阻害することを示す結果（棒グラフ）を示す。
【図１３Ｃ】ウィルムス腫瘍細胞において５ｕｇ／ｍｌの抗ＦＺＤ７抗体２８８−１によって活性βカテニンのタンパク質レベルが低下したことを示すウェスタンブロットデータを示す。
【図１４Ａ】アネキシンＶ及び７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色を用いた、ＭＡｂ２８８−１により処理された細胞及び非処理細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ここで、ＳＫ−ＭＥＬ２８（７１％）及びＷＴ（４７％）により処理した細胞における前アポトーシス細胞の割合が増加した。
【図１４Ｂ】ＭＡｂ−２８８−１での処理後のＳＫ−ＭＥＬ２８の死細胞率の増加を示すデータ（棒グラフ）を示す。
【図１４Ｃ】ＭＡｂ−２８８−１での処理後のＷＴの死細胞率の増加を示すデータ（棒グラフ）を示す。Ｗ００２、Ｗ０２６、Ｗ００２７及びＷ０１１Ｘｎは、別々のドナーからのウィルムス腫瘍由来細胞を示す。
【図１５Ａ】ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞においてＣＦＵの数が減少したことを示すコロニー形成単位（ＣＦＵ）データ（棒グラフ）を示す。
【図１５Ｂ】非処理及びＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞の顕微鏡写真を示しており、ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞においてコロニーサイズがより小さいことが実証された。
【図１５Ｃ】ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞において形成されたスフィアの数が減少したことを示すスフィアフォーメーションアッセイの結果（棒グラフ）を示す。
【図１５Ｄ】ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＷＴ細胞において形成されたスフィアの数が減少したことを示すスフィアフォーメーションアッセイの結果（棒グラフ）を示す。
【図１５Ｅ】ＭＡｂ−２８８−１の存在下または不存在下（非処理）においてＳＫ−ＭＥＬ２８細胞から形成されたスフィアの代表的な顕微鏡写真を示す。ＭＡｂ−２８８−１により処理した後、より低濃縮かつより小さなスフィアが形成された。
【図１５Ｆ】ＭＡｂ−２８８−１の存在下または不存在下（非処理）においてＷＴ細胞から形成されたスフィアの代表的な顕微鏡写真を示す。ＭＡｂ−２８８−１により処理した後、より低濃縮かつより小さなスフィアが形成された。
【図１６Ａ】ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞における形態変化を非処理細胞と比較して示す顕微鏡写真を示す。
【図１６Ｂ】ＭＡｂ−２８８−１により処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞の遊走が非処理細胞と比較して有意に阻害されたことを示す創傷治癒遊走アッセイの顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
説明を簡潔かつ明瞭にするために、図中の要素は必ずしも一定の縮尺で描かれているとは限らないことを理解されたい。例えば、明確にするために、いくつかの要素の寸法が他の要素に比べて誇張されていることがある。さらに、適切であると考えられる場合には、対応する要素または類似の要素を示すために、図面間で符号が繰り返して用いられることもある。
【００３３】
以下の詳細な説明においては、本発明を完全に理解できるように、多数の具体的詳細について説明する。しかし、これらの具体的詳細がなくとも本発明を実施することができることは、当業者に理解されるであろう。他の例では、本発明を分かりにくくしないように、公知の方法、手順及び成分については詳細に説明していない。
【００３４】
例はこの点に関して限定されるものではないが、「複数の」及び「複数」なる語は、本明細書において、例えば、「多数の」や「２つ以上の」を含み得る。「複数の」及び「複数」なる語は、本明細書を通して、２つ以上の成分、要素、装置、パラメータなどを説明するために用いられ得る。明示的に述べられていない限り、本明細書に記載の方法例は、特定の順序や配列に制約されるものではない。さらに、本明細書に記載の方法例または要素のいくつかを同一時点で用いたり行ったりすることができる。
【００３５】
定義
【００３６】
「抗体」なる語は、本明細書において、抗体全体及び任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」または「抗原結合ドメイン」）またはその一本鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に結合された少なくとも２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書における略称はＶＨ）及び重鎖定常領域（本明細書における略称はＣＨ）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書における略称はＶＬ）及び軽鎖定常領域（本明細書における略称はＣＬ）で構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で並んでいる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１のコンポーネントを含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００３７】
「エピトープ」なる語は、本明細書において、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなりかつ、通常、特異的な３次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において、後者ではなく前者との結合が失われることで区別される。
【００３８】
「不連続エピトープ」なる語は、本明細書において、タンパク質の一次配列における少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の立体構造エピトープを意味する。
【００３９】
「単離された抗体」なる語は、本明細書において、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に含まれない抗体を指すものとする（例えば、ＦＺＤ７の細胞質ドメインにおけるアミノ酸残基に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に特異的に結合する抗体が実質的に含まれない）。しかし、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連する抗原、例えば他の種に由来するもの（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ種相同体）に対する交差反応性を有し得る。単離された抗体は、尚も特異的なままである他の抗原との交差反応性を有する、すなわち、特定のエピトープにのみ結合することができる。交差反応性について言えば、このエピトープは、２つ以上のタンパク質または抗原上に存在し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質が実質的に含まれなくてもよい。
【００４０】
「モノクローナル抗体」なる語は、本明細書において、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００４１】
「対象」なる語は、本明細書において、任意のヒト及び非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」なる語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００４２】
本発明の好適実施形態をさらに十分に説明するために、以下の例を示す。しかし、これらの例は、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４３】
本発明は、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体（ＦＺＤ）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合ドメインを提供する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する。ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体または抗体に結合された受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９及びＦＺＤ１０からなる群から選択されたものであってよい。特定の実施形態では、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及び／またはＦＺＤ８を含む。特定の実施形態では、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体はＦＺＤ７を含む。特定の実施形態では、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ７、ＦＺＤ５及び／またはＦＺＤ８を含む。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ１の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ２の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ３の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ４の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ５の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ６の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ８の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ９の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７及びＦＺＤ１０の両方に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はＦＺＤ７、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８に特異的に結合する。ヒトＦＺＤ１〜１０のための完全長アミノ酸（ＡＡ）配列は、当分野で既知であり、本明細書においては、配列番号５（ＦＺＤ１  ＡＡ）、配列番号６（ＦＺＤ２  ＡＡ）、配列番号７（ＦＺＤ３  ＡＡ）、配列番号８（ＦＺＤ４  ＡＡ）、配列番号９（ＦＺＤ５  ＡＡ）、配列番号１０（ＦＺＤ６  ＡＡ）、配列番号１１（ＦＺＤ７  ＡＡ）、配列番号１２（ＦＺＤ８  ＡＡ）、配列番号１３（ＦＺＤ９  ＡＡ）及び配列番号１４（ＦＺＤ１０  ＡＡ）として提供される。
【００４４】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＦＺＤ７に特異的に結合する。他の実施形態では、当該抗体はさらに、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合するかまたは該受容体と交差反応することができる。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８からなる群から選択される。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８からなる群から選択される。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８からなる群から選択される。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８からなる群から選択される。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８の両方を含む。特定の実施形態では、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８からなる群から選択される。
【００４５】
特定の実施形態では、抗体は３つ以上のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する。特定の実施形態では、３つ以上のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８からなる群から選択される３つ以上のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を含む。特定の実施形態では、抗体はさらに、１若しくは複数の追加のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する。
【００４６】
特定の実施形態では、抗体は、該抗体が結合する１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内の細胞外ドメインに特異的に結合する。各ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外ドメインの配列は、当分野で既知である。
【００４７】
特定の実施形態では、抗体は、該抗体が結合するヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内のＦＲＩドメイン（ＦＲＩ）（システインリッチドメイン（ＣＲＤ）としても知られている）に特異的に結合する。各ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のＦＲＩドメインの配列は、当分野で既知である。
【００４８】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体内のＦＲＩドメイン（ＦＲＩ）（システインリッチドメイン（ＣＲＤ））に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２のアミノ酸（ＡＡ）の全てに特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２のアミノ酸（ＡＡ）の一部に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも５つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも４つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも５つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも６つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも７つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも８つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも９つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１０個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１１個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１２個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１３個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。
【００４９】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ２受容体内のＦＲＩドメイン（ＦＲＩ）（システインリッチドメイン（ＣＲＤ））に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＦＲＩドメイン内の配列番号２に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２のアミノ酸（ＡＡ）の全てに特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２のアミノ酸（ＡＡ）の一部に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも５つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも４つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも５つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも６つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも７つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも８つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも９つの連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１０個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１１個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１２個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のＦＲＩドメイン内の配列番号２の少なくとも１３個の連続または非連続アミノ酸（ＡＡ）に特異的に結合する。
【００５０】
特定の実施形態では、抗体はヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の膜貫通部分に特異的に結合する。各ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の膜貫通部分の配列は当分野で既知である。
【００５１】
特定の実施形態では、抗体はヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞質部分に特異的に結合する。各ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞質部分の配列は当分野で既知である。
【００５２】
特定の実施形態では、抗体はヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の一部に特異的に結合し、この部分は、膜貫通部及び細胞質部の両方からなる。
【００５３】
特定の実施形態では、抗体はヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の膜貫通部分に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、この膜貫通部分内の配列番号１の全部または一部に結合する。
【００５４】
特定の実施形態では、抗体はヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の細胞質部分に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、この細胞質部分内の配列番号１の全部または一部に結合する。
【００５５】
特定の実施形態では、抗体はヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の一部に特異的に結合し、この部分は、膜貫通部及び細胞質部の両方からなる。特定の実施形態では、抗体は、この部分内の配列番号１の全部または一部に結合する。
【００５６】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＦＺＤ結合抗体の個々の抗原結合部位は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以上のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合することができる。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体の個々の抗原結合部位は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合することができる。
【００５７】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、１若しくは複数（例えば、２つ以上、３つ以上、または４つ以上）のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対して、約１０００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下の解離定数（ＫＱ）を以って結合する。例えば、特定の実施形態では、２つ以上のＦＺＤ受容体に結合する本明細書に記載のＦＺＤ結合抗体は、これらのＦＺＤ受容体に対して、約１００ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下のＫＤを以って結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の各ＦＺＤに対して、約４０ｎＭ以下の解離定数を以って結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８のうちの１つ以上の各ＦＺＤに対して、約１０ｎＭ以下の解離定数を以って結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８のうちの１つ以上の各ＦＺＤに対して、約１０ｎＭ以下の解離定数を以って結合する。
【００５８】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対して、約１０００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＥＣ５０を以って結合する。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載の、２つ以上のＦＺＤに結合するＦＺＤ結合抗体は、それらのＦＺＤに関して、約４０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、次のＦＺＤ：ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）に関して約２０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、次のＦＺＤ：ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）に関して約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【００５９】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体内の配列ＲＦＹＨＲＬＳＨＳＳＫＧＥＴＡＶ（配列番号１）に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内の配列ＲＦＹＨＲＬＳＨＳＳＫＧＥＴＡＶ（配列番号１）の少なくとも５つのアミノ酸を含む配列に特異的に結合する。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続である。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続ではない。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＲＦＹＨＲである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＦＹＨＲＬである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＹＨＲＬＳである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＨＲＬＳＨである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＲＬＳＨＳである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＬＳＨＳＳである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＳＨＳＳＫである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＨＳＳＫＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＳＳＫＧＥである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＳＫＧＥＴである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＫＧＥＴＡである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＥＴＡＶである。一実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体であってよい。
【００６０】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ７における配列ＲＦＹＨＲＬＳＨＳＳＫＧＥＴＡＶ（配列番号１）に対応するＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９及び／またはＦＺＤ１０における配列の少なくとも一部に結合する。
【００６１】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体２または７内の配列ＱＥＤＡＧＬＥＶＨＱＦＹＰＬ（配列番号２）に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内の配列ＱＥＤＡＧＬＥＶＨＱＦＹＰＬ（配列番号２）の少なくとも５つのアミノ酸を含む配列に特異的に結合する。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続である。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続ではない。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＱＥＤＡＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＥＤＡＧＬである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＤＡＧＬＥである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＡＧＬＥＶである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＬＥＶＨである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＬＥＶＨＱである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＥＶＨＱＦである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＶＨＱＦＹである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＨＱＦＹＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＱＦＹＰＬである。一実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−４によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−５によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃４によって産生される抗体であってよい。
【００６２】
特定の実施形態では、抗体は、ＦＺＤ２またはＦＺＤ７における配列ＱＥＤＡＧＬＥＶＨＱＦＹＰＬ（配列番号２）に対応するＦＺＤ１、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９及び／またはＦＺＤ１０における配列の少なくとも一部に結合する。
【００６３】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体７内の配列ＰＧＡＳＤＧＲＧＲＰＡＦＰＦＳ（配列番号３）に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内の配列ＰＧＡＳＤＧＲＧＲＰＡＦＰＦＳ（配列番号３）の少なくとも５つのアミノ酸を含む配列に特異的に結合する。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続である。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続ではない。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＰＧＡＳＤである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＡＳＤＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＡＳＤＧＲである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＳＤＧＲＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＤＧＲＧＲである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＲＧＲＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＲＧＲＰＡである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＲＰＡＦである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＲＰＡＦＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＰＡＦＰＦである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＡＦＰＦＳである。
【００６４】
特定の実施形態では、抗体は、ＦＺＤ７における配列ＰＧＡＳＤＧＲＧＲＰＡＦＰＦＳ（配列番号３）に対応するＦＺＤ１、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９及び／またはＦＺＤ１０における配列の少なくとも一部に結合する。
【００６５】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体７内の配列ＤＧＳＧＧＰＧＧＧＰＴＡＹＰＴＡ（配列番号４）に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体内の配列ＤＧＳＧＧＰＧＧＧＰＴＡＹＰＴＡ（配列番号４）の少なくとも５つのアミノ酸を含む配列に特異的に結合する。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続である。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続ではない。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＤＧＳＧＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＳＧＧＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＳＧＧＰＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＧＰＧＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＰＧＧＧである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＰＧＧＧＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＧＧＰＴである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＧＰＴＡである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＧＰＴＡＹである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＰＴＡＹＰである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＴＡＹＰＴである。特定の実施形態では、これら５つのアミノ酸は連続アミノ酸ＡＹＰＴＡである。一実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−３によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、ＦＺＤ抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃１３によって産生される抗体であってよい。
【００６６】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ７における配列ＤＧＳＧＧＰＧＧＧＰＴＡＹＰＴＡ（配列番号４）に対応するＦＺＤ１、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９及び／またはＦＺＤ１０における配列の少なくとも一部に結合する。
【００６７】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ受容体の一部（例えば、ＦＺＤのＢＢＳ）へのリガンド（例えばＷｎｔ）の結合を阻害する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ＦＺＤ受容体の一部（例えば細胞質部分）へのシグナル伝達分子（例えば細胞内タンパク質であるｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ））の結合を阻害する。
【００６８】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＧ１抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＧ２抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＧ３抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＧ４抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＡ抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＤ抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＥ抗体である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＩｇＭ抗体である。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗体は、キメラ型抗体またはキメラ型／ヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗体は抗体フラグメントである。
【００６９】
当分野で既知の任意の方法によって、本発明の抗体の特異的結合を測定することができる。使用可能な免疫アッセイは、種々の技術を用いる競合及び非競合アッセイシステム、例えば、ビアコア（BIAcore）分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光抗体法、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光免疫測定アッセイ及びタンパク質Ａ免疫アッセイを含むが、これらに限定されるものではない。そのようなアッセイは、ありふれたものであり、かつ当分野で公知である。
【００７０】
例えば、ＥＬＩＳＡを用いてヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体の特異的結合を測定することができる。
【００７１】
ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原を調製するステップと、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングするステップと、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に接合されたＦＺＤ結合抗体をウェルに加えるステップと、所定の時間にわたってインキュベーションするステップと、抗原の存在を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は検出可能な化合物に結合されないが、代わりに、ＦＺＤ結合抗体を認識する二次抗体標識物がウェルに加えられる。いくつかの実施形態では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、ウェルにＦＺＤ結合抗体をコーティングし、かつコーティングされたウェルに抗原を加えた後に検出可能な化合物に接合された二次抗体を加えることができる。当業者は、当分野で既知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション及び検出されるシグナルを増加させるために変更可能なパラメータに関する知識が豊富であろう。
【００７２】
ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体の結合親和性及び抗体抗原相互作用の解離速度定数（off-rate）は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、ラジオイムノアッセイであって、量を増加させた未標識抗原の存在下において、標識抗原（例えば３Ｈまたは１２５Ｉ）あるいはそのフラグメントまたは変異体を目的抗体とインキュベーションした後に、標識抗原に結合させた抗体を検出するステップを含むアッセイである。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体の親和性及び結合解離速度定数は、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定することができる。いくつかの実施形態では、ビアコアカイネティクス分析は、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合する抗体の結合及び離速度定数を決定するために用いられる。ビアコアカイネティクス分析は、表面上に免疫化ＦＺＤ抗原を有するチップとの抗体の結合及び解離を分析するステップを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、抗体は、抗体に結合される少なくとも１つのヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＦＺＤ）のアンタゴニストである。特定の実施形態では、抗体は、結合されるヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の１若しくは複数の活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または約１００％を阻害する。
【００７４】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、少なくとも１つのヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体へのリガンドの結合を阻害する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の生物学的結合部位（ＢＢＳ）へのリガンドの結合を阻害する。特定の実施形態では、リガンドはヒトＷｎｔタンパク質である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体によって提供される特定のヒトｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質への特定のリガンドの結合の阻害は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。特定の実施形態では、ＦＺＤへのＷｎｔなどのリガンドの結合を阻害する抗体は、さらにＷｎｔシグナル伝達を阻害する（例えば、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）。
【００７５】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はＷｎｔシグナル伝達を阻害する。当然のことながら、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するＦＺＤ結合抗体は、特定の実施形態では、１若しくは複数のＷｎｔによるシグナル伝達を阻害することができるが、必ずしも全てのＷｎｔによるものである必要はない。特定の別の実施形態では、全てのヒトＷｎｔによるシグナル伝達が阻害され得る。特定の実施形態では、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ（以前はＷＮＴ１４）、ＷＮＴ９Ｂ（以前はＷＮＴ１５）、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１及びＷＮＴ１６からなる群から選択される１若しくは複数のＷｎｔによるシグナル伝達が阻害される。特定の実施形態では、阻害されるＷｎｔシグナル伝達は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ７ａ、ＷＮＴ７ｂ及び／またはＷＮＴ１０Ｂによるシグナル伝達である。特定の実施形態では、抗体は、（少なくとも）ＷＮＴ１、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ７ｂ及びＷＮＴ１０Ｂによるシグナル伝達を阻害する。特定の実施形態では、抗体は、（少なくとも）ＷＮＴ３Ａによるシグナル伝達を阻害する。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体によって提供されるＷｎｔによるシグナル伝達の阻害は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のＷｎｔによるシグナル伝達のレベルの低下である。特定の実施形態では、阻害されるＷｎｔシグナル伝達は古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。特定の実施形態では、阻害されるＷｎｔシグナル伝達は非古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。
【００７６】
ＦＺＤ結合抗体がＷｎｔシグナル伝達を阻害するか否かを判定するためのインビボ及びインビトロアッセイは当分野で既知である。例えば、インビトロで古典的Ｗｎｔシグナル伝達レベルを測定するために、ホタルルシフェラーゼレポータ遺伝子の上流においてＴＣＦ結合ドメインの複数のコピーを含むＴＣＦ／Ｌｕｃレポータベクターを利用する細胞ベースのルシフェラーゼレポータアッセイを用いることができる。１若しくは複数のＷｎｔの存在下においてＦＺＤ結合抗体が存在する場合のＷｎｔシグナル伝達のレベルを、ＦＺＤ結合抗体が存在しない場合のシグナル伝達のレベルと比較する。ＴＣＦ／ｌｕｃレポータアッセイに加えて、抗体がβカテニン（図６に示すようなもの）またはｃ−ｍｙｃなどのβカテニン調節遺伝子の発現のレベルに与える影響を測定することによって、ＦＺＤ結合抗体が古典的Ｗｎｔシグナル伝達に与える影響をインビトロまたはインビボで測定することができる。
【００７７】
特定の実施形態では、抗体がＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−１、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−２、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−３、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６及び／またはβカテニンのリン酸化状態に与える影響を測定することによって、抗体がＷｎｔシグナル伝達に与える影響を評価することもできる。さらに別の実施形態では、Ｗｎｔシグネチャにおける１若しくは複数の遺伝子の発現レベルに及ぼすＦＺＤ結合抗体の影響を評価することによって、ＦＺＤ結合抗体がＷｎｔシグナル伝達に与える影響を測定する。
【００７８】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、次の効果、すなわち、腫瘍細胞の増殖を阻害する、腫瘍における癌幹細胞の頻度を低下させることによって腫瘍の腫瘍形成能を低下させる、腫瘍増殖を抑制する、生存率を上昇させる、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす、発癌性細胞を非腫瘍形成状態に分化する、または腫瘍細胞の転移を防止する、のうちの１つ以上の効果がある。
【００７９】
特定の実施形態では、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する抗体は、毒素複合体、化学療法抗体、放射性同位元素、または他のそのような抗体を用いて細胞死を引き起こす。例えば、特定の実施形態では、ヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体に対する抗体は、タンパク質の内在化によってＦＺＤを発現する腫瘍細胞内で活性化される毒素に接合される。特定の別の実施形態では、抗体は、毒素、化学療法抗体または放射性同位元素に接合されない。
【００８０】
別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体「融合タンパク質」であり、本明細書においては「抗体複合体」と呼ばれることもある。融合パートナーまたは複合体パートナーは、タンパク質性または非タンパク質性であってよく、後者は通常、抗体上及び複合体パートナー上の官能基を用いて生成される。複合体及び融合パートナーは、小分子化合物及びポリペプチドを含む任意の分子であってよい。可能な複合体パートナーは、サイトカイン、細胞傷害性抗体、毒素、放射性同位元素、化学療法抗体、抗血管新生抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及び他の治療的に活性な抗体を含むが、これらに限定されるものではない。融合または複合体としての抗体の指定は、それが本発明のいずれかの特定の実施形態に制約されることを意味するものではない。むしろ、これらの用語は、本発明の任意の抗体と、１若しくは複数のポリペプチドまたは分子とを、遺伝的、化学的、または別な方法で結び付けることによって、いくつかの望ましい特性を提供することができる、という広い概念を伝えるために用いられる。
【００８１】
適切な複合体には、例えば、細胞毒性薬（例えば化学療法抗体）または毒素または当該毒素の活性フラグメントを含む薬物及び細胞傷害性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞傷害性抗体には、抗体に放射性同位元素を接合させるかまたは抗体に共有結合させたキレート抗体に放射性核種を結合させることによって製造される放射性化学物質も含まれる。
【００８２】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、腫瘍増殖を抑制することができる。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、インビボで（例えば、異種移植片マウスモデルにおいて、及び／または癌に罹ったヒトにおいて）腫瘍増殖を抑制することができる。
【００８３】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、腫瘍の腫瘍原性を低下させることができる。特定の実施形態では、抗体または抗体は、マウス異種移植片モデルなどの動物モデルにおいて、癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍原性を低下させることができる。特定の実施形態では、腫瘍における癌幹細胞の数または頻度は、少なくとも約２分の１、約３分の１、約５分の１、約１０分の１、約５０分の１、約１００分の１、または約１０００分の１に低下させられる。特定の実施形態では、増殖する癌細胞の数または頻度の低下は、腫瘍細胞増殖アッセイによって決定される。抗ＦＺＤ抗体の有効性を検証するために用いられる増殖阻害アッセイ（ＭＴＳ）の例を以下の例２に示す。特定の実施形態では、増殖する癌細胞の数または頻度の低下は、腫瘍細胞生存率アッセイによって決定される。抗ＦＺＤ抗体の有効性を検証するために用いられる細胞生存率アッセイ（トリパンブルー）の例を以下の例３に示す。特定の実施形態では、増殖する癌細胞の数または頻度の低下は、腫瘍細胞アポトーシスアッセイによって決定される。抗ＦＺＤ抗体の有効性を検証するために用いられるアポトーシスアッセイ（アネキシンＶ染色）の例を以下の例４に示す。
【００８４】
特定の実施形態では、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＦＺＤタンパク質を発現する細胞の細胞死を仲介する。ＡＤＣＣは、抗体のＦｃ部分を認識するエフェクタ細胞による細胞溶解を含む。多くのリンパ球、単球、組織マクロファージ、顆粒球及び好酸球。
【００８５】
特定の実施形態では、１若しくは複数のＦＺＤに対する抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化させることによって、ＦＺＤタンパク質を発現する細胞の細胞死を引き起こす。
【００８６】
１若しくは複数のＦＺＤに対する任意の特定の抗体が補体活性化及び／またはＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を仲介する能力を測定することができる。目的細胞をインビトロで成長させて標識し、細胞培養に対して、抗原抗体複合体によって活性化することができる血清補体または免疫細胞のいずれかと組み合わせて、抗体を加える。例えば溶解した細胞からの標識の放出によって、標的細胞の細胞崩壊が検出される。実際に、患者の自己血清を補体及び／または免疫細胞の源として用いて、抗体をスクリーニングすることができる。インビトロ検査において補体を活性化させるかまたはＡＤＣＣを仲介することができる抗体を、その後、当該特定の患者において治療に用いることができる。
【００８７】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体の血中半減期は、マウス、カニクイザルまたはヒトにおいて、少なくとも約１０時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、または少なくとも約２週間である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、その血中半減期が、マウス、カニクイザルまたはヒトにおいて、少なくとも約１０時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、または少なくとも約２週間であるようなＩｇＧ抗体である。ポリペプチド及び抗体などの抗体の半減期を長くする方法は当分野で既知である。例えば、ＩｇＧ抗体の血中半減期を長くする既知の方法は、ｐＨ６．０において新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する抗体のｐＨ依存結合を増加させるＦｃ領域における突然変異の導入を含む。Ｆｃ領域を欠いた抗体フラグメントの血中半減期を長くする既知の方法は、ペグ化などの技術を含む。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、任意の既知の方法によって創製することができる。ポリクローナル抗体は、関連抗原（精製されたペプチドフラグメント、完全長組換えタンパク質、融合タンパク質など）を皮下または腹腔内に複数回注射することによって動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバなど）を免疫化することによって産生され、ここで、関連抗原は、任意でキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミンなどに接合させ、滅菌生理食塩水で希釈し、アジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）と組み合わせることによって安定なエマルジョンを形成したものである。ポリクローナル抗体はその後、そのようにして免疫化された動物の流血、腹水などから回収される。採取した血液を凝固させ、血清を別の容器に静かに移し、遠心分離により清澄化し、抗体力価を測定する。アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む当分野における標準的な方法に従って、血清または腹水からポリクローナル抗体を精製することができる。
【００８９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて創製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を上述の如く免疫化することによって、免疫抗原に特異的に結合することになる抗体のリンパ球による産生が誘発される。リンパ球は、インビトロで免疫付与することもできる。免疫付与に続いて、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを用いて適切な骨髄腫細胞株と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を形成することができ、それをその後、融合されていないリンパ球及び骨髄腫細胞から選択して取り去ることができる。その後、免疫沈降、イムノブロッティング、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ））によって決定されるような選択された抗原に特異的に向けられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法を用いたインビトロ培養または動物の腹水腫瘍などインビボのいずれかで増殖させることができる。その後、上記のポリクローナル抗体に関して説明したように腹水または培養培地からモノクローナル抗体を精製することができる。
【００９０】
あるいは、組換えＤＮＡ法を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる。成熟したＢ細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えばＲＴ−ＰＣＲによって、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマを用いて、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来の手順を用いてポリヌクレオチド配列を決定する。その後、重鎖及び軽鎖をする単離されたポリヌクレオチドをクローニングして適切な発現ベクターに挿入し、それが宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞であって免疫グロブリンタンパク質をそうでなければ産生しない細胞内にトランスフェクトされたとき、宿主細胞によってモノクローナル抗体が作製される。また、上記したような所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントを単離することができる。
【００９１】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、組換えＤＮＡ技術を用いて多くの異なる方法でさらに修飾することにより、別の抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、１）例えばヒト抗体の同領域の代わりに用いてキメラ型抗体を作製するか、または２）非免疫グロブリンポリペプチドの代わりに用いて融合抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、定常領域を切断するかまたは除去することにより、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを作製する。可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態では、そのような抗体は、ヒト対象に投与されたときに、抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を低下させるために治療的に用いられる。当分野で既知の様々な技術を用いて、ヒト化抗体を産生することができる。一般的なヒト化抗体産生方法は、（齧歯類宿主を免疫することによって産生される）ＭＡｂから得られるＣＤＲ配列をヒトＩｇバックボーンに移植すること及び、キメラ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内に導入すること（トランスフェクション）であり、後者は、ＣＨＯ細胞から分泌される機能的抗体を産生する。本明細書に記載の方法はまた、Ｉｇ遺伝子、または宿主細胞内にトランスフェクトされたキメラＩｇ内で遺伝子変化を生じさせるのに有用である。ヒト化抗体は、免疫付与時に内因性免疫グロブリン産生がなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。
【００９３】
特定の別の実施形態では、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体は、ヒト抗体である。
【００９４】
ヒト抗体は、当分野で既知の様々な技術を用いて直接創製することができる。標的抗原に対する抗体を産生する免疫化された個体から単離されるかまたはインビトロで免疫化された不死化ヒトＢリンパ球を生成することができる。また、ヒト抗体を発現するファージライブラリからヒト抗体を選択することもできる。
【００９５】
本発明はまた、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を特異的に認識する二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識しかつ結合することができる抗体である。二重特異性抗体が、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体と、例えば、１）白血球上のエフェクタ分子、例えば、Ｔ細胞受容体（例えばＣＤ３）またはＦｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２またはＣＤ１６）あるいは２）以下で詳細に説明する細胞傷害性抗体とを特異的に認識しかつ結合することができるように、少なくとも２つの異なるエピトープは、同じ分子（例えば同じヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体）内にも異なる分子上にも存在し得る。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、少なくとも１つのヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体、及びＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈリガンド、例えば、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅリガンド（例えばＤＬＬ４）やｊａｇｇｅｄリガンド、またはＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される少なくとも１つのＮｏｔｃｈ受容体のいずれかに特異的に結合する。二重特異性抗体は、インタクト抗体または抗体フラグメントであってよい。
【００９６】
例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも一方は本発明のポリペプチドに由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、ＩｇＧのためのＦｃ受容体、またはＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）などの白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせることができる。特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性抗体を向けるために二重特異性抗体を用いることもできる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性抗体または放射性核種キレート剤、例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡに結合するアームとを持っている。二重特異性抗体を作製するための技術は、当分野で一般的である。３つ以上の原子価を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を創製することができる。このように、特定の実施形態では、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体は多重特異性である。
【００９７】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単一特異性抗体であってよい。例えば、特定の実施形態では、抗体に含まれる１若しくは複数の抗原結合部位の各々は、同じ１若しくは複数のヒトＦＺＤ受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ７またはＦＺＤ８、あるいはいくつかのＦＺＤの組合せ上の相同エピトープ）に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の単一特異性抗体の抗原結合部位は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ（またはそれ以上）のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合することができる。
【００９８】
本発明によれば、種々の技術を、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的な一本鎖抗体の産生に適応させることができる。さらに、種々の方法を、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に適応させることにより、ＦＺＤ受容体、あるいはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対する望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定を可能にすることができる。種々の技術によって抗体フラグメントを産生することができ、そのようなフラグメントには、（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって作製されるＦａｂフラグメント、（ｃ）還元抗体及びパパインでの抗体分子の処理によって作製されるＦａｂフラグメント、及び（ｄ）Ｆｖフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
特定の実施形態では、抗体フラグメントの場合には特に、抗体を、その血中半減期を短縮させるように修飾することがさらに望ましい場合がある。これは、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを、抗体フラグメントにおける適切な領域の突然変異による抗体フラグメントに組み込むことによって、または当該エピトープを、（例えば、ＤＮＡ合成またはペプチド合成によって）その後いずれかの端部または中央において抗体フラグメントに融合されるペプチドタグに組み込むことによって達成することができる。
【０１００】
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合された抗体からなる。ヘテロコンジュゲート抗体は、例えば、免疫細胞に望ましくない細胞を狙い撃ちさせるために提案されてきた。抗体は、抗体の架橋を含む合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、インビトロで創製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、抗毒素を構築することができる。
【０１０１】
本発明の種々の目的のために、修飾された抗体は、抗体とヒトＦＺＤ受容体のポリペプチドとを会合させる任意の種類の可変領域を含むことができることを理解されたい。この点で、可変領域は、体液性応答反応を開始し、望ましい腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンを作製するために、誘発され得る如何なる種類の哺乳類を含むものであっても当該哺乳類に由来するものであってもよい。したがって、修飾された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、ネズミ、ヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、マカク属のサルなど）またはオオカミ起源のものであってよい。いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンの可変領域及び定常領域はともにヒトである。他の実施形態では、互換性のある抗体（通常は非ヒト源に由来する）の可変領域を、結合特性を向上させるかまたは分子の免疫原性を低下させるように操作するかまたは特異的に調整することができる。この点において、本発明において有用な可変領域を、ヒト化させるか、そうでなければ取り込まれたアミノ酸配列の包含によって変化させることができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖における可変領域はともに、１若しくは複数のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、そして必要な場合には部分的なフレームワーク領域の置換及び配列の変更によって、変化させられる。ＣＤＲは、フレームワーク領域が生じる抗体と同じクラスの抗体またはサブクラスに由来し得るが、ＣＤＲが、異なるクラスの抗体から、好適には異なる種からの抗体から得られることが予想される。或る可変領域の抗原結合能を別の可変領域に転移させるためにＣＤＲの全てをドナー可変領域からの完全ＣＤＲに置換することは必ずしも必須ではない。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を転移させることのみが必要であろう。
【０１０３】
可変領域の変化にもかかわらず、本発明の修飾された抗体は、ネイティブすなわち不変の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して、腫瘍局在の増加や血中半減期の短縮などの望ましい生化学的特性を提供するように複数の定常領域ドメインのうちの１つ以上のドメインの少なくとも一部が削除または別な方法で変更された抗体（例えば、完全長抗体またはその免疫活性フラグメント）を含むことになることは、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態では、修飾された抗体の定常領域はヒト定常領域を含むことになる。本発明と相性がよい定常領域の修飾は、１若しくは複数のドメインにおける１若しくは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。すなわち、本明細書に開示されている修飾された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）のうちの１つ以上及び／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の変更または修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、１若しくは複数のドメインが部分的または完全に削除された修飾された定常領域が考えられる。いくつかの実施形態では、修飾された抗体は、ドメインが削除された構築物（コンストラクト）またはＣＨ２ドメイン全体が除去された変異体（ＡＣＨ２構築物）を含むことになる。いくつかの実施形態では、除外された定常領域ドメインは、通常は定常領域によって与えられる分子のフレキシビリティの一部を提供する短いアミノ酸スペーサ（例えば１０残基）に置換されることになる。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体はエフェクタ機能を変化させ、そのことが、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、（点突然変異または他の手段による）定常領域ドメインの欠失または不活性化は、血中における修飾された抗体のＦｃ受容体結合を減少させ、それによって腫瘍局在を増加させることができる。他の事例では、本発明に相応しい定常領域修飾が、補体結合を抑制し、したがって血中半減期を短縮させかつ細胞毒素複合体の非特異的会合を減少させることがある。定常領域のさらに別の修飾を用いて、抗原特異性または抗体の柔軟性の増加に起因する局在の強化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を取り除くことができる。同様に、本発明による定常領域の修飾は、十分に当業者の知識の範囲内にある公知の生化学または分子工学技術を用いて容易に行うことができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、１若しくは複数のエフェクタ機能を有していない抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有しておらず、かつ／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有していない。特定の実施形態では、抗体はＦｃ受容体及び／または補体因子に結合しない。特定の実施形態では、抗体はエフェクタ機能を有していない。
【０１０６】
特定の実施形態では、修飾された抗体を、それぞれの修飾された抗体のヒンジ領域にＣＨ３ドメインを直接融合させるように操作することができることに留意されたい。他の構築物では、ヒンジ領域と修飾されたＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサを提供することが望ましいであろう。例えば、ＣＨ２ドメインが削除され、残りのＣＨ３ドメイン（修飾されたかまたは修飾されていない）が５−２０アミノ酸スペーサによりヒンジ領域に結合されている場合、互換性のある構築物を発現させることができる。そのようなスペーサを追加することにより、例えば、定常ドメインの調節要素が何とも結合しておらずかつアクセス可能なままであることまたはヒンジ領域がフレキシブルなままであることを確実にすることができる。しかし、アミノ酸スペーサは、場合によっては、免疫原性であることが判明し、かつ構築物に対する望ましくない免疫応答を誘発することができることに留意されたい。したがって、特定の実施形態では、修飾された抗体の望ましい生化学的性質を維持するために、構築物に加えられるスペーサは、比較的非免疫原性のものであるか、または完全に除外されることにすらなる。
【０１０７】
定常領域ドメイン全体の欠失の他に、数個または単一のアミノ酸の部分的欠失または置換によって本発明の抗体を提供することもできることを理解されたい。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域の単一のアミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を大幅に減少させ、それによって腫瘍局在を増加させるのに十分であり得る。同様に、１若しくは複数の定常領域ドメインにおける、調節されるエフェクタ機能（例えば、補体ＣＬＱ結合）を制御する部分を、単に削除することが望ましいであろう。そのような定常領域の部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわないままで、抗体の選択された特性（血中半減期）を向上させることができる。さらに、上記で示唆したように、開示されている抗体の定常領域は、結果として得られる構築物のプロファイルを改善する１若しくは複数のアミノ酸の突然変異または置換により修飾することができる。この点において、修飾された抗体の構造及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存結合部位（例えばＦｃ結合）によって与えられる活性を破壊することが可能であり得る。特定の実施形態は、エフェクタ機能の増減など望ましい特性を高めるため、またはより多くの細胞毒素または炭水化物の付着を提供するために、定常領域に１若しくは複数のアミノ酸を付加することを含むことができる。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入するかまたは複製することが望ましい場合がある。
【０１０８】
本発明はさらに、本明細書に記載の、キメラ型、ヒト化及びヒト抗体、またはその抗体フラグメントに実質的に相同な変異体及び等価物を含む。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち、１若しくは複数のアミノ酸を同様のアミノ酸に置換することを含むことができる。例えば、保存的置換は、或るアミノ酸を同じ一般的クラス内の別のアミノ酸に置換すること、例えば、或る酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換すること、或る塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換すること、または或る中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換することを指す。保存的アミノ酸置換によって意図されることは、当分野で公知である。
【０１０９】
本発明はまた、細胞傷害性抗体に接合させた抗体を含む免疫複合体に関連する。細胞傷害性抗体は、化学療法抗体、増殖阻害抗体、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、放射性同位元素（すなわち放射性複合体）などを含む。そのような免疫複合体の作製に有用な化学療法抗体は、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入抗体を含む。使用可能な酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトクシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロトン、サポナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類を含む。２１２Ｂｉ、１３１１、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含めて、放射性抗体標識物の産生には様々な放射性核種が利用可能である。抗体及び細胞傷害性抗体の複合体は、様々な二官能性タンパク質結合抗体、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの双方向機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン−２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を用いて作製される。抗体及び１若しくは複数の小分子毒素の複合体、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセン及びＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体を用いることもできる。
【０１１０】
コンジュゲート抗体は、２つの共有結合された抗体からなる。該抗体は、抗体の架橋を含む合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、インビトロで創製することができると考えられる。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的の例は、イミノチオレート（iminothiolate）及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート（methyl-4-mercaptobutyrimidate）を含む。
【０１１１】
どれほど有用な量が得られるかに関係なく、本発明の抗体を多数のコンジュゲート型（すなわち免疫複合体）または非コンジュゲート型のうちのいずれか１つで用いることができる。あるいは、本発明の抗体を非コンジュゲート型または「ｎａｋｅｄ」型で用いることもできる。特定の実施形態では、悪性細胞を取り除くために補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む対象の自然の防御機構を活用するべく、抗体は非コンジュゲート型で用いられる。いくつかの実施形態では、数多くの公知のキレート剤または直接標識のうちの任意の１つを用いて、抗体を放射性同位元素、例えば、９０Ｙ、１２５１、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅに接合させることができる。他の実施形態では、開示されている組成物は、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、及びリンホカイン（例えばインターフェロン）などの、薬物、プロドラッグまたは生物学的反応修飾物質に結合された抗体を含むことができる。本発明のさらに別の実施形態は、リシンまたはジフテリア毒素などの特定の生物毒素に接合された抗体の使用を含む。さらに別の実施形態では、修飾された抗体は、他の免疫学的活性リガンド（例えば、抗体またはそのフラグメント）との複合体を形成することができ、結果として得られる分子は、腫瘍細胞及びエフェクタ細胞（例えばＴ細胞）の両方に結合する。コンジュゲートまたは非コンジュゲート修飾抗体のどちらを用いるかの選択は、癌の種類及びステージ、補助治療（例えば化学療法や外部放射線療法）の使用、及び患者の病状によって決まる。そのような選択をすることは本明細書の教示を考慮すれば当業者にとって容易であることを理解されたい。
【０１１２】
本発明の抗体は、ヒトＦＺＤ受容体に対する組換え抗体、天然抗体または合成抗体、あるいはそのフラグメントであってよい。当分野において、タンパク質の構造または機能の重要な影響なしに本発明のいくつかのアミノ酸配列を変化させることができることが認識されるであろう。したがって、本発明は、十分な活性を示すか、あるいはヒトＦＺＤ受容体タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの領域を含むような、様々なポリペプチドをさらに含む。そのような突然変異体は、欠失、挿入、逆位、反復配列及び型置換（type substitution）を含む。
【０１１３】
ポリペプチド及び類似体を、通常はタンパク質の一部ではない追加の化学部分を含むようにさらに修飾することができる。これらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解性、生物学的半減期または吸収性を向上させることができる。当該部分は、タンパク質の望ましい副作用などを減少させるかまたはなくすこともできる。
【０１１４】
本明細書に記載の単離された抗体は、当分野で既知の任意の適切な方法によって産生することができる。そのような方法は、直接タンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築してそれらの配列を適切な形質転換宿主内で発現させる方法まで様々である。いくつかの実施形態では、野生型の目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することによって、組換え技術を用いて、ＤＮＡ配列が構築される。任意で、該配列に部位特異的突然変異誘発によって突然変異を起こさせることによって、その機能的類似体を提供することもできる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、化学合成によって、目的抗体をコードするＤＮＡ配列が構築されることになる。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列と、目的組換えポリペプチドが産生されることになる宿主細胞において好まれるコドンの選択とに基づいて設計することができる。単離された目的ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために、標準的な方法を適用することができる。例えば、完全アミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドのためのヌクレオチド配列コーディングを含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、その後、それらを結合させることができる。個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補アセンブリのための５’または３’オーバーハングを含む。（合成、部位特異的突然変異誘発、または別の方法によって）アセンブルされたら、特定の単離された目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターに挿入され、かつ所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に作動可能に連結されることになる。適切なアセンブリは、適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピングによって確認することができる。当分野で公知であるように、宿主において高発現レベルの移入遺伝子を得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結されなければならない。
【０１１６】
特定の実施形態では、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する抗体をコードするＤＮＡ、またはそのフラグメントを増幅して発現するために組換え発現ベクターが用いられる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節要素に作動可能に連結された抗ＦＺＤ抗体のポリペプチド鎖をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメント、またはそのフラグメントを有する複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は通常、（１）遺伝子発現において調節的な役割を持つ遺伝的要素、例えば、転写プロモータまたはエンハンサ、（２）ｍＲＮＡに転写されかつタンパク質に翻訳される構造またはコーディング配列、及び（３）以下で詳細に説明する適切な転写及び翻訳開始及び終了配列のアセンブリを含む。そのような調節要素は、転写を制御するためのオペレータ配列を含むことができる。通常は複製起点により与えられる宿主内で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子とをさらに組み込むことができる。ＤＮＡ領域は、互いに対して機能的に関連付けられている場合に、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合にポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されるか、プロモータが、配列の転写を制御する場合にコーディング配列に作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位が、翻訳を可能にするように配置された場合にコーディング配列に作動可能に連結されている。酵母発現系での使用が意図される構造的要素は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列またはトランスポート配列なしに発現される場合には、Ｎ末端メチオニン残基を含むことができる。任意で、その後、発現された組換えタンパク質からこの残基を切断することにより、最終的な製品を提供することができる。
【０１１７】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択によって決まることになる。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスから得られる発現制御配列を含むベクターを含む。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、広宿主域プラスミド、例えば、Ｍｌ３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージを含む。
【０１１８】
ＦＺＤ結合ポリペプチドまたは抗体（または抗原として用いるためのＦＺＤタンパク質）の発現のための適切な宿主細胞は、適切なプロモータの制御下において、原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞を含む。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌を含む。高等真核細胞は、後述する哺乳動物起源の樹立細胞株を含む。無細胞翻訳系を用いることもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞の宿主とともに用いるための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、当分野で既知である。
【０１１９】
様々な哺乳動物や昆虫細胞培養システムもまた、組換えタンパク質を発現させるために有利に用いられる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能的であるので、そのようなタンパク質を発現させることができる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、サルの腎臓細胞のＣＯＳ−７細胞株及び適切なベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株などを含む。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、抗体を産生する方法であって、抗体の発現を許容する条件下において本発明の抗体をコードするための核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。適切な培地において維持される宿主細胞における発現の後、例えば本発明の抗体、その抗体等価物をコードするような、発現させるべきポリペプチドまたはペプチドを培地から単離し、当分野で既知の方法によって精製することができる。ポリペプチドまたはペプチドが培養培地に分泌されない場合、単離及び精製の前に宿主細胞を溶解させる。
【０１２１】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害における効果、抗腫瘍効果、及び／または癌幹細胞に対する効果について、抗体をスクリーニングする方法をさらに提供する。これらの方法は、抗体に露出された第１の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカのレベルを、抗体に露出されなかった第２の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカのレベルと比較するステップを含む方法を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、これらの方法は、（ａ）第１の固形腫瘍を第２の固形腫瘍には露出させないが抗体に露出させるステップと、（ｂ）第１及び第２の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカのレベルを評価するステップと、（ｃ）第１及び第２の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカのレベルを比較するステップとを含む。特定の実施形態では、抗体は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤であり、かつ／または１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体への１若しくは複数のヒトＷｎｔタンパク質の結合を阻害する。特定の実施形態では、抗体は、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する抗体である。特定の実施形態では、第２の固形腫瘍に対する第１の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカのレベルの上昇は、固形腫瘍幹細胞に対する効果を示す。特定の別の実施形態では、第２の固形腫瘍に対する第１の固形腫瘍における１若しくは複数の分化マーカ（すなわち分化のための陰性マーカ）のレベルの低下は、固形腫瘍幹細胞に対する効果を示す。特定の実施形態では、固形腫瘍は膵臓腫瘍である。特定の実施形態では、固形腫瘍は膵臓腫瘍であり、１若しくは複数の分化マーカは、１若しくは複数のムチン（例えばＭｕｃｌ  ６）及び／またはクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を含み得る。特定の別の実施形態では、固形腫瘍は結腸腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は結腸腫瘍であり、１若しくは複数の分化マーカはサイトケラチン７を含む。膵臓及び結腸並びに他の腫瘍型のための他の潜在的分化マーカは、当業者に既知である。スクリーニング方法における潜在的分化マーカの有用性は、１８Ｒ５及び／または４４Ｒ２４などの本明細書に開示され抗ＦＺＤ抗体のうちの１つ以上を用いて所望の腫瘍型を治療し、その後、対照に対する、治療された腫瘍によるマーカの発現の変化を評価することによって、当業者が容易に評価することができる。そのような方法の非限定的な例は、例えば、以下の具体例に見ることができる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはその抗原結合部分を含むポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態をとることができる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖である場合はコード鎖または非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１２３】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが単離される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは実質的に不純物を含まない。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの変異体は、コーディング領域、ノンコーディング領域、またはその両方の変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体に含まれる変異は、サイレント置換、付加または欠失を有するが、コードされたポリペプチドの特性や活性を変えない。いくつかの実施形態では、遺伝コードの縮退に起因するサイレント置換によってヌクレオチド変異体を作製する。様々な理由のために、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために、ポリヌクレオチド変異体を作製する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを大腸菌などの細菌宿主に好まれるコドンに変更する）ことができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
【０１２５】
本発明のＦＺＤ結合抗体は、様々な用途（癌の治療などの治療療法を含むが、これに限定されるものではない）において有用である。特定の実施形態では、抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達（例えば古典的Ｗｎｔシグナル伝達）の阻害、腫瘍増殖の抑制、分化の誘発、腫瘍容積の減少及び／または腫瘍の腫瘍原性の低下に有用である。使用方法は、インビトロ、エキソビボまたはインビボ方法であってよい。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体またはポリペプチドまたは抗体は、該抗体等が結合する１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のアンタゴニストである。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体またはアンタゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達活性化を伴う疾患の治療に用いられる。特定の実施形態では、疾患は、Ｗｎｔシグナル伝達に依存する疾患である。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達は古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体またはアンタゴニストは、幹細胞及び／または前駆細胞レベルの上昇によって特徴付けられる障害の治療に用いられる。
【０１２７】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体により治療する疾患は、癌である。特定の実施形態では、癌は、Ｗｎｔ依存性腫瘍によって特徴付けられる。特定の実施形態では、癌は、ＦＺＤ結合抗体が結合する１若しくは複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を発現する腫瘍によって特徴付けられる。特定の実施形態では、癌は、Ｗｎｔ遺伝子特性において１若しくは複数の遺伝子を発現する腫瘍によって特徴付けられる。
【０１２８】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体またはアンタゴニストにより治療する疾患は、癌ではない。例えば、疾患は、代謝異常、例えば肥満や糖尿病であり得る。あるいは、疾患は、骨障害、例えば、骨粗しょう症、変形性関節症、または関節リウマチであり得る。疾患はまた、腎臓障害、例えば多発性嚢胞腎であり得る。あるいは、眼障害（黄斑変性症及び家族性滲出性硝子体網膜症を含むが、これらに限定されるものではない）を治療することができる。心血管障害、例えば、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症及び弁疾患を治療することもできる。いくつかの実施形態では、疾患は、肺障害、例えば特発性肺動脈高血圧症や肺線維症である。いくつかの実施形態では、ＦＺＤ結合抗体により治療する疾患は、肝臓疾患、例えば肝硬変や肝線維症である。
【０１２９】
本発明は、対象（例えば、治療が必要な対象）に治療上有効量のＦＺＤ結合抗体を投与するステップを含む癌の治療方法を提供する。特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌（例えばウィルムス腫瘍）、前立腺癌、消化管癌、メラノーマ、子宮頸癌、膀胱癌、膠芽腫、及び頭頸部癌からなる群から選択される癌である。特定の実施形態では、癌は膵臓癌である。別の実施形態では、疾患は卵巣癌である。別の実施形態では、疾患は肺癌である。別の実施形態では、疾患は「肺」＋「卵巣」腫瘍である。別の実施形態では、疾患は肺癌から転移した腫瘍である。別の実施形態では、疾患は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、疾患はＮＳＣＬＣに対するベバシズマブ（Ｂｅｖ）適格（アバスチン）である。別の実施形態では、疾患はＮＳＣＬＣ−Ｂｅｖ不適格（アバスチン）である。別の実施形態では、疾患は前立腺癌である。別の実施形態では、疾患は前立腺癌から転移した腫瘍である。別の実施形態では、疾患は良性前立腺過形成である。別の実施形態では、疾患はホルモン抵抗性前立腺癌（ＨＲＰＣ）である。別の実施形態では、疾患は膀胱癌である。別の実施形態では、疾患は胆嚢癌である。別の実施形態では、疾患は骨癌である。別の実施形態では、疾患は子宮頸癌である。別の実施形態では、疾患は副腎皮質癌である。別の実施形態では、疾患は副腎癌である。別の実施形態では、疾患は網膜癌である。別の実施形態では、疾患は網膜芽細胞腫である。別の実施形態では、疾患は胃癌である。別の実施形態では、疾患は神経内分泌癌である。別の実施形態では、疾患は胆管癌、例えば胆管細胞癌である。別の実施形態では、疾患は骨髄腫である。別の実施形態では、疾患はアンドロゲン依存性腫瘍である。別の実施形態では、疾患はアンドロゲン非依存性腫瘍である。別の実施形態では、疾患は末端肥大症である。別の実施形態では、疾患は滑膜肉腫である。別の実施形態では、疾患は転移性カルチノイドに関連する下痢である。別の実施形態では、疾患は血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍である。別の実施形態では、疾患は巨人症である。別の実施形態では、疾患は乾癬である。別の実施形態では、疾患はアテローム性動脈硬化症である。別の実施形態では、疾患は血管の平滑筋再狭窄である。別の実施形態では、疾患は不適切な微小血管増殖である。別の実施形態では、疾患は神経芽細胞腫である。別の実施形態では、疾患は膠芽腫である。別の実施形態では、疾患は胎生期（ＥＭＢ）癌である。別の実施形態では、疾患はＡＬＶである。別の実施形態では、疾患は髄芽腫である。別の実施形態では、疾患は上衣腫である。別の実施形態では、疾患はＨＣＣ／肝細胞癌である。別の実施形態では、疾患は肝芽腫である。別の実施形態では、疾患はウィルムス癌である。別の実施形態では、疾患はユーイング癌である。別の実施形態では、疾患はラブドイド腫瘍である。別の実施形態では、疾患は白血病である。別の実施形態では、疾患は食道癌である。別の実施形態では、疾患は小児固形腫瘍であり、具体的にはユーイング肉腫／未分化外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）を含む。別の実施形態では、疾患は成人固形腫瘍である。別の実施形態では、疾患は骨肉腫である。別の実施形態では、疾患は横紋筋肉腫（ＲＭＳ）である。別の実施形態では、疾患は軟部肉腫である。別の実施形態では、疾患は、軟部肉腫、例えば、胎児性横紋筋肉腫及び胞巣状横紋筋肉腫、ＧＩＳＴ、胞巣状軟部肉腫、明細胞肉腫などである。別の実施形態では、疾患は胸腺腫である。別の実施形態では、疾患は胸腺癌である。特定の実施形態では、癌は結腸直腸癌である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法であって、治療上有効量の、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む方法を提供する。本方法の抗体は、受容体の細胞質部分及び任意で受容体の膜貫通部分に結合することができる。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体であってよい。
【０１３１】
対象において腫瘍を治療する方法であって、対象に治療上有効量の単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、単離された抗体が配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、配列番号１の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、腫瘍がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有するような方法を提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法であって、治療上有効量の、配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、配列番号１の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在するような方法を提供する。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体であってよい。一実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の検出時であり得る。別の実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性の検出時であり得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法であって、治療上有効量の、配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、配列番号２の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在するような方法を提供する。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−４によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−５によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃４によって産生される抗体であってよい。一実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の検出時であり得る。別の実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性の検出時であり得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法であって、治療上有効量の、配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、配列番号３の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在するような方法を提供する。一実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の検出時であり得る。別の実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性の検出時であり得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を治療する方法であって、治療上有効量の、配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含み、配列番号４の上記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在するような方法を提供する。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−３によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃１３によって産生される抗体であってよい。一実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の検出時であり得る。別の実施形態では、抗体での処理は、異常な（例えば高）レベルのＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性の検出時であり得る。
【０１３６】
治療は、哺乳類における疾患の何らかの治療を意味し、（１）疾患に罹りやすい傾向があり得るが未だ罹っていないかまたは疾患の症状を呈していない哺乳類において、疾患が発生するのを予防すること；例えば、臨床症状の発生の予防；（２）疾患を抑制すること、例えば、その進行を止めること；または（３）疾患を軽減すること、例えば、疾患の症状の後退を引き起こすことを含む。
【０１３７】
疾患の治療のための有効用量は、それを必要とする哺乳類に投与されたときに当該疾患に対する上記したような治療を達成するのに十分な量を意味する。本明細書に記載の治療方法は、任意の適切な哺乳類を治療するために用いることができ、哺乳類はヒトであることが好ましい。
【０１３８】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体または他の抗体を用いて腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍増殖を抑制する方法は、インビトロで細胞をＦＺＤ結合抗体に接触させるステップを含む。例えば、腫瘍増殖を抑制するために、標的とされたＦＺＤを発現する癌細胞株または不死化細胞株を、抗体または他の抗体が添加される培地内で培養する。いくつかの実施形態では、腫瘍増殖を抑制するために、腫瘍細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料などの患者試料から単離し、ＦＺＤ結合抗体が添加される培地内で培養する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、腫瘍増殖を抑制する方法は、インビボで腫瘍または腫瘍細胞をＦＺＤ結合抗体に接触させるステップを含む。特定の実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞をＦＺＤ結合抗体に接触させるステップは、動物モデルにおいて行われる。例えば、
【０１４０】
腫瘍増殖を抑制するために、免疫不全マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において成長させた１若しくは複数のＦＺＤを発現する異種移植片にＦＺＤ結合抗体を投与することができる。いくつかの実施形態では、例えば、組織生検、胸水、または血液試料などの患者試料から癌幹細胞を単離して免疫不全マウスに注射する。その後、免疫不全マウスには、腫瘍細胞増殖を抑制するためにＦＺＤ結合抗体を投与する。いくつかの実施形態では、腫瘍の増殖を防ぐために、動物に発癌性細胞を導入するのと同時に、またはその直後に、ＦＺＤ結合抗体を投与する。いくつかの実施形態では、発癌性細胞を特定のサイズまで成長させた後に、ＦＺＤ結合抗体を治療薬として投与する。
【０１４１】
特定の実施形態では、腫瘍増殖を抑制する方法は、対象に治療上有効量のＦＺＤ結合抗体を投与するステップを含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は腫瘍を持っているかまたは腫瘍が除去されている。特定の実施形態では、腫瘍は、Ｗｎｔシグナル伝達が活性である腫瘍である。特定の実施形態では、活性であるＷｎｔシグナル伝達は古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。特定の実施形態では、腫瘍はＷｎｔ依存性腫瘍である。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍はアキシンの過剰発現に敏感である。特定の実施形態では、腫瘍は、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子において不活性化突然変異（例えば短縮型突然変異）を含まず、βカテニン遺伝子において活性化突然変異を含まない。特定の実施形態では、腫瘍は、Ｗｎｔ遺伝子特性において１若しくは複数の遺伝子を発現する。特定の実施形態では、対象において治療される癌は、そのような腫瘍を含む。
【０１４２】
特定の実施形態では、腫瘍は、ＦＺＤ結合抗体または抗体が結合する１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を発現する。特定の実施形態では、腫瘍はヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を過剰発現させる。特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍（例えばウィルムス腫瘍）、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、頸部腫瘍、膀胱腫瘍、膠芽腫、及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は膵臓腫瘍である。
【０１４３】
本発明はまた、細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞を有効量のＦＺＤ結合抗体に接触させるステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。特定の実施形態では、本方法は、細胞を抗体に接触させるステップが対象に治療上有効量の抗体を投与するステップを含むインビボ方法である。いくつかの別の実施形態では、本方法は、インビトロまたはエキソビボ方法である。特定の実施形態では、阻害されるＷｎｔシグナル伝達は古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ７ａ、ＷＮＴ７ｂ及び／またはＷＮＴ１０Ｂによるシグナル伝達である。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ７ｂ及び／またはＷＮＴ１０Ｂによるシグナル伝達である。
【０１４４】
さらに、本発明は、対象における腫瘍の腫瘍原性を低下させる方法であって、対象に治療上有効量のＦＺＤ結合抗体を投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍は癌幹細胞を含む。特定の実施形態では、腫瘍における癌幹細胞の頻度は、抗体の投与によって低下させられる。したがって、本発明はまた、腫瘍における癌幹細胞の頻度を低下させる方法であって、腫瘍を有効量のＦＺＤ結合抗体に接触させるステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、発癌性細胞を非発癌性細胞に分化する方法であって、（例えば、発癌性細胞を含む腫瘍を有するかまたはそのような腫瘍が取り除かれた対象にＦＺＤ結合抗体を投与することによって）発癌性細胞をＦＺＤ結合抗体に接触させるステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍は膵臓腫瘍である。特定の他の実施形態では、腫瘍は結腸腫瘍である。特定の他の実施形態では、腫瘍はウィルムス腫瘍である。
【０１４５】
細胞（腫瘍細胞を含むが、これに限定されるものではない）の分化を誘発するための、本明細書に記載のＦＺＤ結合抗体、またはその抗原結合部分の使用も提供される。例えば、細胞の分化を誘発する方法であって、細胞を本明細書に記載の有効量のＦＺＤ結合抗体（すなわち抗ＦＺＤ抗体）に接触させるステップを含む方法が考えられる。対象において腫瘍における細胞の分化を誘発する方法であって、対象に治療上有効量のＦＺＤ結合抗体を投与するステップを含む方法も提供される。特定の実施形態では、腫瘍は膵臓腫瘍である。特定の他の実施形態では、腫瘍は結腸腫瘍である。特定の他の実施形態では、腫瘍はウィルムス腫瘍である。
【０１４６】
対象において疾患または障害を治療する方法であって、疾患または障害が、Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連付けられ、かつ／または幹細胞及び／または前駆細胞のレベルの上昇によって特徴付けられる方法がさらに提供される。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に治療上有効量のＦＺＤ結合抗体、ポリペプチドまたは抗体を投与するステップを含む。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達は古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性によってもたらされる医学的疾患を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＦＺＤ７内の配列番号１に特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に治療上有効量の、ＦＺＤ７またはＦＺＤ２内の配列番号２に特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＦＺＤ７内の配列番号３に特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＦＺＤ７内の配列番号４に特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＦＺＤ７受容体における膜貫通ドメインに特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、対象に、治療上有効量の、ＦＺＤ７受容体の細胞質ドメインに特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。
【０１４８】
本発明はさらに、本明細書に記載のＦＺＤ結合抗体のうちの１つ以上を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される溶媒をさらに含む。これらの医薬組成物は、ヒト患者における腫瘍増殖の抑制及び癌の治療に用いられる。
【０１４９】
特定の実施形態では、本発明の精製された抗体を薬学的に許容される溶媒（例えば、担体、賦形剤）と組み合わせることによって、保存及び使用のために製剤を創製する。適切な薬学的に許容される溶媒は、非毒性緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；塩、例えば、塩化ナトリウム；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０未満のアミノ酸残基）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；炭水化物、例えば、単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート抗体、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、局所または全身治療のいずれかのために任意の数の方法を用いて投与することができる。投与は、局所投与（例えば、経膣及び直腸送達を含む粘膜へ）、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末；肺投与（例えば、ネブライザによる粉末またはエアロゾルの吸入または通気による投与；気管内、鼻腔内、表皮および経皮投与）；経口投与；または非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；あるいは頭蓋内（例えば髄腔内または脳室内）投与であってよい。
【０１５１】
本発明の抗体の医薬製剤は、特定の実施形態では、単位用量形態をとることができる。そのような製剤は、経口投与、非経口投与、直腸投与、または吸入投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒、水または非水性媒体に溶かした溶液または懸濁液、あるいは坐剤を含む。錠剤などの固体組成物では、主要な活性成分を医薬担体と混合する。従来の錠剤化成分は、本発明の化合物、またはその非毒性、薬学的に許容される塩の均一混合物を含む固体プレフォーミュレーション組成物を形成するために、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、及び他の希釈剤（例えば水）を含む。固体プレフォーミュレーション組成物はその後、上記した種類の単位用量形態に細分される。新規な組成物の錠剤、丸剤などは、持続作用の利点をもたらす用量形態を提供するようにコーティングされるかまたは別な方法で化合される。例えば、錠剤または丸剤は、外側成分で覆われた内側組成物を含むことができる。さらに、これら２つの成分を腸溶性層によって分離することができ、腸溶性層は、崩壊に耐えるように機能し、内側成分が無傷で胃を通過するかまたは遅れて放出されることを可能にする。そのような腸溶性層またはコーティングのために、様々な材料、例えば、多くのポリマー酸を含む材料や、セラック、セチルアルコール及び酢酸セルロースなどの材料とポリマー酸との混合物を用いることができる。
【０１５２】
特定の実施形態では、抗体をマイクロカプセルに封入することもできる。そのようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって創製され、例として、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）におけるヒドロキシエチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルや、当分野で説明されているマクロエマルジョンにおけるポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルが挙げられる。
【０１５３】
特定の実施形態では、医薬製剤は、リポソームとの複合体を形成する本発明の抗体を含む。循環時間が改善されたリポソームは当分野で既知である。さらに、徐放性製剤を創製することができる。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み、該マトリックスは成形された物品（例えば、フィルムやマイクロカプセル）の形態をとる。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル、Ｌ−グルタミン酸及び７メチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばリュープロン・デポ（LUPRON DEPOT）（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸からなる注入可能な微小球）、イソ酪酸酢酸スクロース及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体の投与に加えて、本発明の方法または治療は、（ＦＺＤ結合抗体の投与の前、投与と同時、及び／または投与の後に）第２の抗癌抗体を投与するステップをさらに含む。ＦＺＤ結合抗体及び第２の抗癌抗体を含む医薬組成物も提供される。選択された実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、以前に第２の抗癌抗体による治療を受けた患者に投与されることになる。特定の他の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体及び第２の抗癌抗体は、実質的に同時または同時期に投与されることになる。例えば、対象は、ＦＺＤ結合抗体を投与されると同時に第２の抗癌抗体による治療（例えば化学療法）を受けることができる。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、第２の抗癌抗体による治療から１年以内に投与されることになる。特定の別の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、第２の抗癌抗体による治療から１０、８、６、４または２か月以内に投与されることになる。特定の他の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、第２の抗癌抗体による治療から４、３、２または１週間以内に投与されることになる。いくつかの実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、第２の抗癌抗体による治療から５、４、３、２または１日以内に投与されることになる。さらに、数時間または数分もしないうちに（すなわち実質的に同時に）対象に２つの抗体を投与したり２つの治療を行ったりすることができることを理解されたい。
【０１５５】
本発明の抗体と組み合わせて投与することができる抗癌抗体の有用なクラスは、例えば、抗チューブリン抗体、アウリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブバインダ、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化抗体（例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質の抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、実行化合物（performing compound）、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。特定の実施形態では、第２の抗癌抗体は代謝拮抗剤、抗有糸分裂薬、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。
【０１５６】
ＦＺＤ結合抗体と組み合わせて投与することができる抗癌抗体は、化学療法剤を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法または治療は、本発明の抗体と、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤の混合物との組合せ投与を含む。抗体による治療は、化学療法剤の投与の前か、投与と同時か、または投与の後に行うことができる。本発明で考慮される化学療法剤は、当分野で既知でありかつ市販されている化学物質または薬物、例えば、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、ＴＡＸＯＬ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンを含む。組合せ投与は、単一医薬製剤での、または別々の製剤を用いた同時投与、あるいは、順序は問わないが通常は所定時間内に全ての活性抗体が同時に各々の生物学的活性を発揮し得るようになされる連続投与を含むことができる。
【０１５７】
本発明において有用な化学療法剤はまた、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹ−ＴＯＸＡＮ）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）及びウレドーパ（uredopa）；エチレンイミン及びメチルメラミン（methy-lamelamine）、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びメラミン窒素マスタードトリメチロール、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルチェロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充液、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフラン（sizo-furan）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’���−トリクロルトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacy-tosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；トキソイド、例えば、パクリタキセル（ニュージャージー州プリンストンのブリストル・マイヤーズ  スクイブ  オンコロジー社（Bristol-Myers Squibb Oncology）製ＴＡＸＯＬ）及びドセタキセル（フランス国アントニーのローヌ・プーランク・ローラー社（Rhone-Poulenc Rorer）製ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上記のうち任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。化学療法剤はまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン抗体、例として抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤としての４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（フェアストン）；及び抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びに上記のうち任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。特定の実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、ドキソルビシンＨＣＬ、ダウノルビシンクエン酸、ミトキサントロンＨＣＬ、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣＬ、テニポシド（ＶＭ−２６）及びイリノテカンを含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、第２の抗癌剤はイリノテカンである。特定の実施形態では、治療すべき腫瘍は結腸直腸腫瘍であり、第２の抗癌剤はイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤である。特定の実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラルチトレキシド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン（グラクソ・スミスクライン）、５−アザシチジン、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、及びクラドリビン、並びに上記のうち任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、第２の抗癌剤はゲムシタビンである。特定の実施形態では、治療すべき腫瘍は膵臓腫瘍であり、第２の抗癌剤は代謝拮抗剤（例えばゲムシタビン）である。特定の実施形態では、化学療法剤は、抗���糸分裂抗体であり、チューブリンに結合する抗体を含むが、これに限定されるものではない。非限定的な例として、化学療法剤はタキサンを含む。特定の実施形態では、化学療法剤は、パクリタキセルまたはドセタキセル、あるいはパクリタキセルまたはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。特定の実施形態では、抗体は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミンと結合させたパクリタキセル（例えばＡＢＲＡＸＡＮＥ）、ＤＨＡ−パクリタキセルまたはＰＧ−パクリタキセルである。特定の別の実施形態では、抗有糸分裂剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、またはビンデシン、あるいはそれらの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、抗有糸分裂剤は、Ｅｇ５キネシンの阻害剤、またはオーロラＡやＰｌｋｌなどの有糸分裂キナーゼの阻害剤である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体またはポリペプチドまたは抗体と組み合わせて投与される化学療法剤が、抗有糸分裂剤を含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、対象における癌または腫瘍の治療は、本発明の抗体と放射線療法との組合せ投与を含む。抗体による治療は、放射線療法の投与の前か、投与と同時か、または投与の後に行うことができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、治療は、本発明の抗体と追加の腫瘍関連抗原に対する他の抗体との組合せ投与を含むことができ、他の抗体は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ２、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ及び／またはＶＥＧＦに結合する抗体を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では第２の抗癌抗体は、血管新生阻害剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）である抗体である。特定の実施形態では、第２の抗癌抗体はＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤である。特定の実施形態では、第２の抗癌抗体は、アバスチン（ベバシズマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ベクティビックス（パニツムマブ）、またはエルビタックス（セツキシマブ）である。組合せ投与は、単一医薬製剤での、または別々の製剤を用いた同時投与、あるいは、順序は問わないが通常は所定時間内に全ての活性抗体が同時に各々の生物学的活性を発揮し得るようになされる連続投与を含むことができる。
【０１６０】
さらに、対象における癌または腫瘍の治療は、１若しくは複数のサイトカイン（例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子及び／または増殖因子）の投与を含むことができ、あるいは癌細胞の外科的切除または治療する医師が必要と認める任意の他の治療を伴うことができる。
【０１６１】
疾患の治療のために、本発明の適切な用量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度及び経過、疾患の反応性、抗体または抗体が治療または予防を目的として投与されるか否か、以前の治療、または患者の病歴によって決まる。抗体または抗体は、１回限り投与するか、または数日間から数カ月間に及ぶ一連の治療期間にわたってするか、あるいは治療の効き目が出るかまたは病状が緩和する（例えば、腫瘍サイズが小さくなる）まで投与することができる。最適な投与スケジュールは、患者の体内における薬物の蓄積の測定から計算することができ、個々の抗体または抗体の相対抗力によって異なる。特定の実施形態では、用量は体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇであり、１日、１週間、１カ月または１年に１回またはそれ以上の投与が可能である。特定の実施形態では、ＦＺＤ結合抗体は、２週間に１回または３週間に１回投与される。特定の実施形態では、抗体または他のＦＺＤ結合抗体の用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜２０ｍｇである。
【０１６２】
本発明は、本明細書に記載の抗体を含みかつ本明細書に記載の方法を実行するために用いることができるキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、１若しくは複数の容器内に、１若しくは複数のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に対する少なくとも１つの精製された抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、検出アッセイを行うのに必要な、かつ／または十分なコンポーネントの全てを含み、全ての対照、アッセイを行うための説明書、結果の解析及び提示のための任意の必要なソフトウェアを含む。開示されている抗体または本発明の抗体を、当分野で公知の定評のあるキット形式のうちの１つに容易に組み込むことができることは、当業者であれば容易に認識するであろう。
【０１６３】
ＦＺＤ結合抗体及び第２の抗癌剤を含むキットがさらに提供される。特定の実施形態では、第２の抗癌剤は化学療法剤である。特定の実施形態では、第２の抗癌剤は血管新生阻害剤である。特定の実施形態では、第２の抗癌剤はＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤（例えば、抗ＤＬＬ４または抗Ｎｏｔｃｈ抗体）である。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性によって仲介される医学的疾患を診断する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を本発明の抗体を用いて検査するステップとを含む。抗体を用いて生体試料の反応性を検査する方法は、当分野で公知である。検査方法の例は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学及び免疫沈降を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明は、ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の高発現または活性によって仲介される医学的疾患を診断する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体を本発明の抗体を用いて検査するステップとを含む。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のｆｒｉｚｚｌｅｄ７を、ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する本発明の単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含む。抗体は、受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合し得る。一実施形態では、得られた生体試料におけるｆｒｉｚｚｌｅｄ７の発現のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。別の実施形態では、得られた生体試料におけるｆｒｉｚｚｌｅｄ７の活性のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、該Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含む。一実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の発現のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。別の実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体であってよい。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、該Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含む。一実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の発現のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。別の実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８８−４によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−５によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃４によって産生される抗体であってよい。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、該Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含む。一実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の発現のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。別の実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍を検出する方法を提供する。該方法は、対象から生体試料を採取するステップと、該生体試料のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を、該Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在する配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分によって検査するステップとを含む。一実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の発現のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。別の実施形態では、得られた生体試料におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性のレベルを評価することによって、腫瘍の有無を判定する。活性レベルが異常であれば（例えば高ければ）、このことは悪性腫瘍の存在を示唆している。一実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株２８９−３によって産生される抗体であってよい。別の実施形態では、本方法で用いられる抗体は、ハイブリドーマ細胞株＃１３によって産生される抗体であってよい。
【０１７１】
本明細書に記載の方法において用いられる生体試料は、本発明の方法によって検査される体液であり、別の実施形態では脳脊髄液（ＣＳＦ）である。別の実施形態では、体液は血漿である。別の実施形態では、体液は、当分野で既知の任意の他の種類の流体である。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。別の実施形態では、生体試料は、羊水、血液、血清、唾液、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、生体試料は組織生検である。別の実施形態では、生体試料は、便または尿、または他の排泄物（例えば汗）から得られる。
【０１７２】
例
【０１７３】
例１：ＦＺＤ７モノクローナル抗体を作製するためのエピトープの選択
【０１７４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体は、高レベルの相同性を有する。ＦＺＤ７に特異性なモノクローナル抗体を生成するために、ＦＺＤ７と別のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体−ＦＺＤ２との間でオーバーラップしない配列を同定した。
【０１７５】
ＦＺＤ２及びＦＺＤ７遺伝子の発現は、胎児の腎臓及び肺並びに成体の結腸及び卵巣における高レベルの発現を伴い、発生学的に調整されるように見える（図１Ａ）。ＦＺＤ７及びＦＺＤ２は、特にリガンド結合ドメインにおいて、高度に相同な膜貫通タンパク質である（図１Ｂ）。
【０１７６】
材料及び方法
【０１７７】
エピトープマッピング：エピトープマッピングにはペプチドスキャン法を用いた。この技術は、標的タンパク質から得られる同じ長さのオーバーラップするセグメントからなる多くの短いペプチド配列のライブラリを用い、目的抗体に結合する能力をテストする。突出（オーバーハング）させた端部及び追加の外部領域を備えた所望の配列に対して、短いオーバーラップペプチドを設計した。
【０１７８】
ワクチン接種：４つの異なる領域から得られるＦＺＤ７に特異的な配列に対応するペプチドを用いて免疫を付与した。免疫付与のために、マレイミド活性化済みのＢＳＡ／ＫＬＨ結合キット（シグマ社（Sigma）製，ＭＢＫ−１）を用いてペプチドをＫＬＨに結合させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫を付与し、ブーストを行った。
【０１７９】
ハイブリドーマの作製：免疫化マウスから脾臓を採取し、細胞を単離した。細胞をマウス骨髄腫細胞（ＮＳ−１）と融合させた。ハイブリドーマ上清のペプチド特異抗体をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【０１８０】
抗体の精製及びスクリーニング：ハイブリドーマをバイオリアクタ内で成長させ、タンパク質Ａアガロースカラムを用いて培養上清から抗体を精製した。ＦＺＤ７特異抗体のスクリーニングを、ペプチドを接合させたＢＳＡ上でＥＬＩＳＡによって行った。以下の方法、すなわち、
ａ．完全長ＦＺＤ７を安定発現するＣＨＯ細胞にＥＬＩＳＡを行い、ＥＬＩＳプレート上に固定
ｂ．完全長ＦＺＤ７を安定発現するＣＨＯ細胞の細胞抽出物を用いたウェスタンブロッティング
によって行う。
【０１８１】
上記３つの方法によって陽性であったクローンをさらにアッセイし、選択性及び有効性を実証した。
【０１８２】
ＥＬＩＳＡ：スクリーニングされたペプチドのＢＳＡ複合体を用い、ペプチド陽性クローンをさらに細胞抽出物を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした。マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試薬（シグマ社製ＩＳＯ−２）を用いて、ＥＬＩＳＡによって、アイソタイプを決定した。
【０１８３】
結果
【０１８４】
ＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体作製の目的に向けて、ＦＺＤ７タンパク質のエピトープマッピングを行い、ＦＺＤ２とのオーバーラップしない配列並びにＣ末端のもの及びＮ末端のものを含む４つのエピトープを作製した（図１Ｂ）。これら４つのエピトープのアミノ酸配列は、配列番号１〜４で具体化されている。これらのＦＺＤ７配列は、ＦＺＤ２とそれぞれ５６％、１００％、４０％及び２５％の相同性を有している。エピトープをマウスに注射してハイブリドーマを作製した。さらに、ＦＺＤ７構築物のクローンを作製し、それをＣＨＯ細胞において過剰発現させ、ハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡベースのスクリーニングを行った。さらに、ＦＬＡＧ及びＭＹＣタグを含む分泌型ＦＺＤ７ベクターのクローンを作製した。この手法は、ＦＬＡＧ／ＭＹＣカラム上の分泌型ＦＺＤ７への特異的結合によって生成されたＭＡｂのさらなる精製を可能にした。したがって、選択された配列解析済みペプチドのＭＡｂ特異性及びＦＺＤ２との相同性の程度を検証することができる。
【０１８５】
作製されたハイブリドーマから、インビトロ実験のために全部で１２個のクローンを選択した。選択されたクローンは、ＥＬＩＳＡ試験において、それぞれの特異的な抗原（ペプチド）に対して陽性であったクローンであった。表１は、選択されたハイブリドーマ及びそれらが産生するモノクローナル抗体の特異性を示している。試験した１０個の追加ハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原特異性を示さなかった。
【０１８６】
2017506214.tif 000003
【０１８７】
結論
【０１８８】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体上で４つの異なるエピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生した。ＦＺＤ７に対するこれらの抗体の特異性の尤度は、ＦＺＤ７とＦＺＤ２との間のエピトープ配列の相同性と逆相関の関係にある。
【０１８９】
例２：ＦＺＤ７モノクローナル抗体が悪性細胞の増殖に与える影響
【０１９０】
例１で説明したように作製したＦＺＤ７モノクローナル抗体が原発悪性組織及び悪性細胞株の両方の増殖を阻害する能力を測定した。
【０１９１】
材料及び方法
ＭＴＳアッセイ：３連で細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間経過後、該細胞を、所望の抗体により高濃度下で４８時間処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（プロメガ社（Promega）製）によって評価した。
【０１９２】
結果
ＦＺＤ７モノクローナル抗体が様々なＦＺＤ７発現レベルの悪性細胞の増殖を阻害する能力を測定した。次の細胞型、すなわち、原発ウィルムス腫瘍細胞、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ２８）、結腸（ＨＴ２９）、膠芽腫（Ｕ８７）及び陰性対照ＨｅＬａ細胞（低レベルのＦＺＤ７を発現する）について分析を行った。ＦＡＣＳ分析を用いて各腫瘍型におけるＦＺＤ７レベルを決定した：ウィルムス腫瘍約１０％、メラノーマ１１％、結腸癌２．６％、ＨｅＬａ細胞３％であった。ＭＴＳアッセイを用いて悪性細胞増殖の阻害を評価した。ウィルムス腫瘍（ＷＴ）、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ２８）及び子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞に関するデータを図２に、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ２８）、子宮頸癌（ＨｅＬａ）及び結腸癌（ＨＴ−２９）に関するデータを図３にそれぞれ示す。阻害がｆｒｉｚｚｌｅｄ７の発現レベルにどのように関連しているかに留意されたい。
【０１９３】
結論
腫瘍細胞の増殖の阻害に対するインビトロでの有益な効果を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７を発現する腫瘍細胞は、特に抗体の活性に対して弱い。
【０１９４】
例３：ＦＺＤ７モノクローナル抗体が悪性細胞の生存率に与える影響
【０１９５】
例１で説明したように作製したＦＺＤ７モノクローナル抗体が原発悪性組織及び悪性細胞株の両方の細胞死を誘発する能力を測定した。
【０１９６】
材料及び方法
ＭＴＳアッセイ：３連で細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間経過後、該細胞を、所望の抗体により高濃度下で４８時間処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（プロメガ社製）によって評価した。
【０１９７】
結果
ＦＺＤ７モノクローナル抗体が様々なＦＺＤ７発現レベルの悪性細胞を死滅させる能力を測定した。先ず、様々なＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による原発腫瘍悪性細胞の死滅を評価した。原発腫瘍の源として、ＦＺＤ７の発現レベルが約１０％であるウィルムス腫瘍を用いた。抗体は、例１で説明したような選択されたエピトープを使用して作製されたハイブリドーマクローンによって産生されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体であった。抗体細胞と４８時間インキュベーションした後、トリパンブルーによって細胞生存率を測定した。用いた各モノクローナル抗体について、全細胞からの生細胞の割合を図４Ａに示す。次に、ＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体によるＳＫ−ＭＥＬ２８及びＳＫ−ＭＥＬ−２９メラノーマ細胞の死滅を評価した。ＳＫ−ＭＥＬ２８及びＳＫ−ＭＥＬ−２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、抗体と４８時間インキュベーションした後に、トリパンブルーによって細胞生存率を測定した。生細胞の絶対細胞数を図４Ｂに示す。最後に、モノクローナル抗体のうちの１つ（クローン２８８−２）処理した後、または抗体での処理なしの、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞のマイクロ画像を得た。処理された細胞においては細胞死が見て取れる（図４Ｃ）。
【０１９８】
例４：腫瘍阻害の誘発のための最適なＦＺＤ７モノクローナル抗体の濃度の決定
【０１９９】
例１で説明したように作製したＦＺＤ７モノクローナル抗体が様々な濃度で悪性細胞増殖を阻害する能力を評価した。
【０２００】
材料及び方法
ＭＴＳアッセイ：３連で細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間経過後、該細胞を、所望の抗体により高濃度下で４８時間処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（プロメガ社製）によって評価した。
【０２０１】
結果
様々な濃度のクローン２８８−１及び２８８−５において産生される抗ＦＺＤ７モノクローナル抗体への露出時における、細胞増殖の阻害の観点からの用量反応を測定した。高ＦＺＤ７発現悪性組織（ＳＫ−ＭＥＬ２８、メラノーマ細胞）の反応を低ＦＺＤ７発現悪性組織（ＨｅＬａ、子宮頸癌細胞）の反応と比較した。細胞を抗体に４８時間露出させ、ＭＴＳアッセイによって増殖を評価し、抗体により処理されなかった細胞と比較した。増殖は、高ＦＺＤ７発現細胞においてはいずれかのＦＺＤ７抗体の存在下で阻害されたが、ＨｅＬａなどの低発現細胞においては阻害されなかった（図５Ａ）。約５ｕｇ／ｍｌの抗体濃度で増殖の最適な阻害が観察された。示されているデータは、細胞株毎に対照非処理細胞に正規化されている。図５Ｂは、図５Ａから得られたデータを、約５ｕｇ／ｍｌのハイブリドーマクローン２８８−１及び２８８−５によって産生されるＦＺＤ７モノクローナル抗体による増殖の阻害のレベルに対するＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞の培養密度の影響が強調されるようにして示している。この抗体濃度では、２８８−５の場合に４０００個の細胞／ウェルの密度が採用されたときに阻害がより大きく、２８８−１の場合においても同様であることが観察された。
【０２０２】
結論
腫瘍細胞において細胞死を誘発するための、ハイブリドーマクローンから単離されたモノクローナル抗体の最適濃度を決定した。これは、細胞株及び原発腫瘍の両方において示される。
【０２０３】
例５：ＦＺＤ７モノクローナル抗体が悪性細胞のＷｎｔシグナル伝達に与える影響
【０２０４】
例１で説明したように作製したＦＺＤ７モノクローナル抗体が悪性細胞のＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を評価した。
【０２０５】
結果：
表示された濃度において２８８−１抗体で４８時間処理した後、ＨｅＬａ及びＳＫ−ＭＥＬ２８細胞における活性βカテニン（ミリポア（millipore）０５６６５）のウェスタンブロット解析を行った（図６）。２８８−１によって産生されるＦＺＤ７モノクローナル抗体によるβカテニン阻害が示されている。また、図７Ｂにおいて、非処理及び抗体により処理されたウィルムス腫瘍及びＨｅＬａ細胞においてＲＱ−ＰＣＲを用いてＷＮＴ標的化遺伝子の発現を評価した（図７Ｂ）。
【０２０６】
結論：例１で説明したように作製したＦＺＤ７モノクローナル抗体は、受容体結合時にＷｎｔシグナル伝達を阻害することができた。この阻害は、例３に示したような悪性細胞死及び以下の例６に示すようなアポトーシスを伴う。
【０２０７】
例６：ＦＺＤ７モノクローナル抗体による悪性細胞におけるアポトーシスの誘発
【０２０８】
本発明の抗体が悪性細胞においてアポトーシスを誘発する能力を測定した。
【０２０９】
結果
本発明の抗体により処理された悪性細胞のアポトーシスが観察された（図７Ａ）。具体的には、メラノーマ及びＨｅＬａ細胞に結合するＡＰＣ標識アネキシンＶのフローサイトメトリーが示されている。様々な濃度のハイブリドーマ２８８−１によって産生されるモノクローナル抗体の存在下において、または抗体なしで、アネキシン染色のレベルを比較する（図７Ａ）。
【０２１０】
結論：本発明の抗体が悪性細胞においてアポトーシスを誘発する能力が観察された。
【０２１１】
例７：ハイブリドーマクローンから分泌されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害
【０２１２】
本発明の特異的モノクローナル抗体が癌細胞増殖を阻害する能力を測定した。細胞を９６ウェルプレートに播種した。メラノーマ細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ２８）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９）、及び原発ウィルムス腫瘍（ＷＴ）細胞を、表示されたクローンから得られた抗体と４８時間インキュベーションした後に、細胞増殖アッセイキット（プロメガ社製）によってアッセイした。
【０２１３】
結果：図８は、細胞膜内のＦＺＤ７ポリペプチドの配置を示し、ペプチド１〜４の位置を特定している。これらのペプチドと受容体のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの他のメンバーとの相同性を下表に示す。ここで、「相同性」は、表示されたＦＺＤ受容体の抗原領域とペプチドとの間で類似しているアミノ酸残基の数を示す。
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【０２１４】
図９は、ハイブリドーマから分泌されるＦＺＤ７特異的モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害を対照の増殖率と関連付けながら示している。数は、抗体を採取したハイブリドーマクローンを示しており、「＊」は、有効クローンが２８８−１、２８８−２、２８８−５、２８９−１０、２８９−１６及び２８９−１３であることを示している。ペプチドマッチング及びアイソタイプによる有効クローンの分類を下表に示す。
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【０２１５】
例８：抗ＦＺＤ７抗体２８８−１の特異性−ＦＺＤ７受容体タンパク質のＣ末端抗原に対する抗ＦＺＤ７モノクローナル抗体２８８−１の特異性
【０２１６】
ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞溶解物においてＦＺＤ７受容体に結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＭＡｂ−２８８−１、ＭＡｂ−２８８．５及びＭＡｂ−２８９．１３の特異性を、タンパク質免疫沈降アッセイを用いて実証した。
【０２１７】
方法：免疫化のために、マウスにペプチド１及びペプチド４の両方を注射した。抗体特異性を測定するために、ブロッキングアッセイを行った。簡単に説明すると、結合抗原をブロックするために細胞の溶解物をペプチドとインキュベーションした後に、表示された抗ＦＺＤ７抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。ＦＺＤ７入力（全細胞溶解物）及びＦＺＤ７に結合したフラクションを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてウェスタンブロッティングを行い、抗ＦＺＤ７抗体を用いて検出した。様々なモノクローナル抗体と一晩インキュベーションした後、タンパク質Ａアガロースビーズを用いてタンパク質を免疫沈降させた。マウスＩｇＧは陰性対照として機能した。ＦＺＤ７受容体の抗原Ｃに対するＭＡｂ−２８８−１の特異性を検証するためにペプチドブロックアッセイを行った。ＭＡｂ−２８８−１を免疫化ペプチドで４時間インキュベーションした。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離ＨＥＫ２９３細胞の溶解物をし、その後、ウェスタンブロッティングを行った。ＭＡｂ−２８８−１、ＭＡｂ−２８８−１＋ペプチドＣまたは陰性対照抗体のいずれかを用いて、ＦＺＤ７タンパク質の検出を行った。ＦＺＤ７を過剰発現させるＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＦＺＤ７受容体へのＭＡｂ−２８８−１の結合を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細胞抽出物を分離して様々な濃度のＭＡｂ−２８８−１で解析した。
【０２１８】
さらに特異性を確認するために、免疫沈降（ＩＰ）を行った。表示された抗体を用いてメラノーマ細胞株細胞にタンパク質ＩＰを行った。
【０２１９】
結果：図１１（Ａ）は、ＷＢ解析によるＩＰの結果を示している。図１１（Ｂ）は、抗ＦＺＤ７の２８８−１抗体結合部位がペプチド１ではなくペプチド４によってブロックされたことを示している。ＩＰは、２８８−１抗体を用いたときに成功した。（入力−ＩＰを行う前に細胞溶解物から採取した非処置フラクション；ＩＰ−免疫沈降フラクション；対照−非特異的Ａｂ対照；モック−マウス抗ヒトＩｇＧ対照）。図１１（Ａ）は、抗ＦＺＤ７抗体２８８−１がＦＺＤ７タンパク質を特異的に免疫沈降させることを実証している。抗体のメラノーマ細胞標識は、Ｃｙ３に接合された抗ＦＺＤ７抗体２８８−１がメラノーマ細胞を標識することを示している（図１０）。
【０２２０】
結論：細胞を発現するＦＺＤ７への抗体の特異的結合が観察された。図１１（Ａ）は、ＦＺＤ７受容体への特異的なＭＡｂ−２８８−１の結合を実証している。さらに、図１１（Ｂ）に示した結果は、ＦＺＤ７へのＭＡｂ２８８−１の結合がペプチドＣによって妨害されることを実証している。図１１（Ｃ）は、ＭＡｂ２８８−１の特異性を裏付ける追加のウェスタンブロットの結果を示しており、ここで、抗体の連続希釈法はシグナルの低下に対応する。
【０２２１】
例９：インビトロでの抗ＦＺＤ７抗体２８８−１の機能的効果
【０２２２】
メラノーマ細胞増殖阻害率（％）を測定した。５μｇ／ｍｌにおいて抗ＦＺＤ７抗体２８８−１の不存在下（非処理）または存在下において細胞を４８時間インキュベーションすることによって、メラノーマ細胞株細胞平均増殖率（ｎ＞５）を測定した。対照非処理細胞を１００％に設定し、増殖率の平均を図１２の棒グラフ中に距離マーカで示した。
【０２２３】
結果：
図１２は、抗ＦＺＤ７抗体２８８−１がメラノーマ細胞増殖を低下させることを示している。
【０２２４】
例１０：モノクローナル抗体２８８−１はインビトロでの悪性細胞のＷｎｔシグナル伝達を阻害する。
【０２２５】
Ｗｎｔ経路標的遺伝子（ＡＸＩＮ２、ＣＣＮＤ１、ＭＹＣ−Ｃ）、ＦＺＤ７、βカテニン、及びＷｎｔ経路阻害剤（ＤＫＫ１、ｓＦＲＰ１）の発現を、ＳＫ−ＭＥＬ２８（図１３Ａ）及びＷＴ細胞（図１３Ｂ）において測定した。
【０２２６】
ウェスタンブロット解析を行って、表示された濃度で抗ＦＺＤ７抗体２８８−１の不存在下（非処理）または存在下で４８時間インキュベーション後、メラノーマ細胞株細胞及びウィルムス腫瘍細胞において活性βカテニンを同定した（図６及び図１３Ｃ）。
【０２２７】
結果：図１３Ａ及び図１３Ｂに示した結果は、ＭＡｂ−２８８−１がＷｎｔ経路関連遺伝子の発現を阻害することを示している。各細胞型について、５つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとしてデータを計算した，ｐ＜０．０５。これは、図６及び図１３Ｃに示した活性βカテニン発現の低下とよく相関している。
【０２２８】
例１１：モノクローナル抗体２８８−１は悪性細胞におけるアポトーシスを誘発する
【０２２９】
ＭＡｂ−２８８−１を用いたＦＺＤ７のターゲティングがＳＫ−ＭＥＬ２８及びＷＴ細胞の細胞死を誘発した。
【０２３０】
方法：細胞を５μｇ／ｍｌのＭＡｂ−２８８−１で４８時間処理し、その後、アネキシンＶ及び７ＡＡＤで染色した。メラノーマ細胞株細胞及びウィルムス腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析を用いた。アネキシンＶ抗体陽性染色細胞は、前アポトーシス、アポトーシス、またはネクローシス段階のいずれかにある。アイソタイプ対照染色（ＩＣ＜１％）に従ってゲートを設定した。
【０２３１】
結果：図１４Ａは、ＭＡｂ−２８８−１により処理した後の、細胞のアネキシンＶ染色のフローサイトメトリー分析を示している。結果は、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞（左パネル）及びＷＴ細胞（右パネル）における前アポトーシス細胞の著しい増加を％で示している。さらに、細胞をＭＡｂ−２８８−１により処理し、０．４％トリパンブルーで染色し、死細胞の数を数えて割合％を計算した。結果は、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞（図１４Ｂ）及びＷＴ細胞（図１４Ｃ）（ｐ＜０．０５；ｎ＝４）の両方において死細胞の％が有意に低かったことを示している。
【０２３２】
例１２：モノクローナル抗体２８８−１はインビトロでの幹細胞性形質の枯渇を引き起こす
【０２３３】
ＭＡｂ−２８８−１でのインビトロ処理は、幹細胞性形質を減少させた。非処理のＳＫ−ＭＥＬ２８細胞と処理された細胞とでコロニー形成能（ＣＦＵ）を比較した。図１５Ａに示した結果は、処理された細胞によって形成されたコロニーの数が非処理細胞よりも有意に低かったことを示している。処理された細胞におけるより小さなコロニーを示す処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞及び非処理細胞から形成されたコロニーの代表的な位相差画像を図１５Ｂに示す。（スケールバー＝１００μｍ、倍率２０倍）。ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞及びＷＴ細胞に対してスフィアフォーメーションアッセイを行った。処理された細胞から形成されたスフィアの数は、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞（図１５Ｃ）及びＷＴ細胞（図１５Ｄ）の両方において有意に減少した。データは、３連で行った少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭとして示されている（それぞれ、ｐ＝０．０００９８、ｐ＝０．０００６５）。処理されたＳＫ−ＭＥＬ２８細胞及び非処理細胞（図１５Ｅ）及びＷＴ細胞（図１５Ｆ）から形成されたスフィアの代表的な位相差画像は、処理された細胞の方が、スフィアがずっと小さく、より低濃縮であることを示している（スケールバー＝１００μｍ、倍率１０倍）。
【０２３４】
例１３：ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞のモノクローナル抗体２８８−１での処理は細胞遊走の機能的効果の阻害を示す
【０２３５】
組織培養物中で成長させたＳＫ−ＭＥＬ２８をＭＡｂ−２８８−１により処理することで、図１６Ａに示すように、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞に形態変化が誘発された。ここで、処理された細胞は、減少拡散表現型（reduced spreading phenotype）を示している。スケールバー，１００μｍ。図１６Ｂは、遊走アッセイの結果を示しており、５μｇ／ｍｌのＭＡｂ−２８８−１でＳＫ−ＭＥＬ２８を４８時間処理することで、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞の遊走能を、非処理細胞と比較して有意に阻害したことを実証している。スケールバー，１０００μｍ。
【０２３６】
本発明の特定の特徴部について本明細書に図示したり説明したりしてきたが、今や当業者は、数多くの変更形態、置換形態、修正形態及び等価形態を思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような変更形態及び修正形態を本発明の真の趣旨に含まれるものとして網羅するものであることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2017506214.tif 000037
【図１５Ｆ】
2017506214.tif 000038
【図１６Ａ】
2017506214.tif 000039
【図１６Ｂ】
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【配列表】
2017506214000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月18日(2017.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
当該抗体が、前記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号１の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
当該抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４】
配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号２の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号３の前記部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号４の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
当該抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項５または６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記抗体が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合するが、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体には結合しないことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記抗体が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体を発現する細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合部分が、細胞傷害性部分に結合されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
前記抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二量体または三量体であることを特徴とする請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、ヒト化、キメラ型、またはキメラ型／ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍原性を低下させるための薬剤の調製時における、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項１８】
腫瘍を治療するための薬剤の調製時における、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
前記抗体が、前記受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合することを特徴とする使用。
【請求項１９】
腫瘍を治療するための薬剤の調製時における、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
前記単離された抗体が、配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号１の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする使用。
【請求項２０】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８または１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
腫瘍を治療するための薬剤の調製時における、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
前記単離された抗体が、配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号２の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする使用。
【請求項２２】
腫瘍を治療するための薬剤の調製時における、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
前記単離された抗体が、配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号３の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする使用。
【請求項２３】
腫瘍を治療するための薬剤の調製時における、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、、
前記単離された抗体が、配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号４の前記部分がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記腫瘍が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の高発現または活性を有することを特徴とする使用。
【請求項２４】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記単離された抗体が、前記Ｆｒｉｚｚｅｌｅｄ７受容体に結合するが、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体には結合しないことを特徴とする請求項１９ないし２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記単離された抗体が、前記腫瘍におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１９ないし２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、細胞傷害性部分に結合されることを特徴とする請求項１９ないし２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記単離された抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記単離された抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項１９ないし２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記単離された抗体が、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二量体または三量体であることを特徴とする請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体が、ヒト化、キメラ型、またはキメラ型／ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１９ないし３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
前記腫瘍がウィルムス腫瘍であることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記腫瘍が、メラノーマ細胞で構成されていることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記腫瘍が、結腸癌細胞で構成されていることを特徴とする請求項１９ないし３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
化学療法抗体の投与をさらに含むことを特徴とする請求項１９ないし３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
第２の抗体またはその抗原結合部分の投与を含むことを特徴とする請求項１９ないし３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
腫瘍を検出するための、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
当該使用が、生体試料にＦｒｉｚｚｌｅｄ７が存在するかどうかのインビトロ検査を含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合し、
前記抗体が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体の細胞質部分及び任意で膜貫通部分に結合することを特徴とする使用。
【請求項３９】
腫瘍を検出するための、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
当該使用が、生体試料にＦｒｉｚｚｌｅｄ７が存在するかどうかのインビトロ検査を含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、配列番号１の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号１の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の存在によって、前記腫瘍を検出することを特徴とする使用。
【請求項４０】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８８−１によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８８−２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８８−３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８８−５によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３８または３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
腫瘍を検出するための、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
当該使用が、生体試料にＦｒｉｚｚｌｅｄ７が存在するかどうかのインビトロ検査を含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、配列番号２の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号２の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の存在によって、前記腫瘍を検出することを特徴とする使用。
【請求項４２】
腫瘍を検出するための、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
当該使用が、生体試料にＦｒｉｚｚｌｅｄ７が存在するかどうかのインビトロ検査を含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、配列番号３の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号３の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在することを特徴とする使用。
【請求項４３】
腫瘍を検出するための、単離された抗体またはその抗原結合部分の使用であって、
当該使用が、生体試料にＦｒｉｚｚｌｅｄ７が存在するかどうかのインビトロ検査を含み、
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、配列番号４の少なくとも５アミノ酸部分を含む配列に結合し、
配列番号４の前記部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体上に存在し、
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の存在によって、前記腫瘍を検出することを特徴とする使用。
【請求項４４】
前記単離された抗体が、
ａ）ハイブリドーマ細胞株２８９−６によって産生される抗体、
ｂ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１２によって産生される抗体、
ｃ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１３によって産生される抗体、
ｄ）ハイブリドーマ細胞株２８９−１８によって産生される抗体、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分が、前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体に結合し、他のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合しないことを特徴とする請求項３９ないし４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
前記単離された抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
前記単離された抗体が組換え抗体であることを特徴とする請求項３８ないし４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
前記単離された抗体が、発色性組換え抗体または放射性抗体に結合されることを特徴とする請求項３８ないし４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
前記腫瘍がウィルムス腫瘍であることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
前記腫瘍が、メラノーマ細胞で構成されていることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記腫瘍が、結腸癌細胞で構成されていることを特徴とする請求項３８ないし４９のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
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