(57)【要約】ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有し、インタクトな血液脳関門を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、組換えＮａＧｌｕの静脈内投与を含む方法。組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、以下：ＣＳＦ／血清アルブミン指数；ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；ＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又はダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）により決定されるインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、ここで前記静脈内投与によって、ＣＳＦ中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積が阻止される、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、以下：
ＣＳＦ／血清アルブミン指数；
ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；
ＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又は
ダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）
により決定されるインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、
ここで、前記静脈内投与によって、ＣＳＦ中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積が阻止される、方法。
【請求項２】
前記患者が、請求項１に記載の治療に先立ち、例えば、少なくとも３ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも９ヵ月、又は少なくとも１年にわたりｒｈＮａＧｌｕで処置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、約７歳以下であり、約５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数、及び約０．７未満のＣＳＦ／ＩｇＧ指数の少なくとも１つを有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者のＫｔｒａｎｓ、ＣＳＦ／血清アルブミン指数、ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数、及び／又はＣＳＦ  ＩｇＧ指数のうち１つ又は複数を決定するステップ、並びに健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓの約１２５％以下のＫｔｒａｎｓ、１５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数、及び／又は約１０未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数、及び／又は約０．８５未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数の存在に基づいて前記被験者を選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓ以下のＫｔｒａｎｓ、約１０未満、若しくは約９未満、若しくは約５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数を有するか；又は約８未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数を有するか；又は約０．８５未満、若しくは約０．７未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｍ６Ｐ及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１分子当たり約２〜約４個のバイセクティングＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ糖構造を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の治療が、前記治療前に観察されたレベルに対してＣＳＦ中のＨＳ蓄積レベルの少なくとも２０％を低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記ヒト患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記ヒト患者におけるサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状の進行を阻止するために治療有効量の組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）を前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、以下：
ＣＳＦ／血清アルブミン指数；
ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；
ＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又は
ダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）により決定されるインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、
ここで、前記静脈内投与によって、サンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状が改善される、方法。
【請求項１２】
組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、インタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、前記静脈内投与によって、前記ＣＳＦ中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積が阻止される、方法。
【請求項１３】
前記治療有効量が、前記被験者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状を改善するのに十分なものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状が、言語発達遅滞、進行性精神遅滞、神経機能障害、神経認知及び発達機能遅滞又は認知症である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経認知及び発達機能遅滞が、バインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）−ＩＩ、バーレイ乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及びカウフマン式児童用アセスメント・バッテリー（Ｋａｕｆｍａｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｂａｔｔｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）からなる群から選択される１つ又は複数のテストに基づく患者のスコアにより決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状が、介護者のクオリティ・オブ・ライフの評価、言語、又は神経認知及び発達機能の評価により決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記介護者のクオリティ・オブ・ライフが、ザリット介護負担尺度（Ｚａｒｉｔ  Ｂｕｒｄｅｎ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）により決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記言語の評価が、子供用コミュニケーションチェックリスト（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ）により決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状が、子供用睡眠習慣質問票（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｓｌｅｅｐ  Ｈａｂｉｔｓ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）により評価される睡眠障害である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項２０】
１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を前記被験者に週１回又は週２回投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者が、以下：
１５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数；
１０未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；
０．９未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又は
健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓの１２５％以下のＫｔｒａｎｓ
を有する、請求項１、１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、前記細胞表面にＭ６Ｐ受容体を有する前記ＣＮＳの細胞への取り込みのために十分な量のＭ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｍ６Ｐが、タンパク質１モル当たり約０．５、約１、約２、約３、約４、約５又は約６モルより高い濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｒｈＮａＧｌｕが、シアル酸付加されていないか、又はタンパク質当たり多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、インタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、前記静脈内投与によって、前記ＣＳＦ中のＨＧＦレベルの再蓄積が抑制又は阻止される、方法。
【請求項２６】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法であって、前記方法は、第１の用量で第１の期間にわたり定期的に、また第２の用量で第２の期間にわたり定期的に、治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記第１期間の治療で、ヘパラン硫酸（ＨＳ）レベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１期間の治療で、ＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも５０％低下させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２期間の第２用量で、前記ＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前記第１期間のレベルから維持するか、又はさらに低下させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が、前記第１期間中に、前記第２期間よりも高い頻度で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
注入又は注射毎に投与される前記第１用量の量が、注入又は注射毎に投与される前記第２用量の量より高い、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１期間の第１用量が、約７日に１回〜約３０日に１回において、体重１ｋｇあたり約３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２５ｍｇ、及び体重１ｋｇあたり約３０ｍｇである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２期間の第２用量が、約１４日に１回〜約３０日に１回において、体重１ｋｇあたり約３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳＩＩＩＢ）としても知られるサンフィリポ症候群Ｂ型は、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）として知られるリソソーム酵素をコードする、ヒト第７染色体のＮａｇｌｕ遺伝子の突然変異を原因とする常染色体劣性リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。ＮａＧｌｕは、リソソーム中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の段階的分解の一環としてのヘパラン硫酸（ＨＳ）の分解に必要となる。ＮａＧｌｕの欠乏又は非存在は、ヘパラン硫酸の蓄積及び尿中排泄を招き、これが、重症中枢神経系（ＣＮＳ）異常、並びに軽度の全身性臓器機能障害が起こり；ＣＮＳ内のニューロンへの作用は、発達遅滞、進行性精神遅滞、神経機能障害、重度認知症、及び早期死亡を引き起こす。今日までに７０を超える種々の突然変異が同定され、サンフィリポ症候群Ｂ型は、広範囲の分子及び遺伝的異質性を呈示する。
【０００２】
血液脳関門（ＢＢＢ）の機能は、全身のコンパートメントからの分子及び細胞の選択的輸送による脳のホメオスタシスを制御することである。ＢＢＢは、脳毛細血管の微小脈管内皮細胞、脈絡叢の上皮細胞、アストロサイトエンドフィート、及び周皮細胞の構造成分から構成される。内皮細胞は、密着結合及び接着結合を介して連結され、これにより、拡散障壁を形成する。
損傷した血液脳関門（ＢＢＢ）から、ＭＰＳＩＩＩＢの動物モデル（Ｇａｒｂｕｚｏｖａ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（３）：ｅ１６６０１（２０１１））並びにＭＰＳＩＩＩＡ及びＭＰＳＩＩＩＣを有するヒト患者において、異なる酵素欠乏に起因するが、共通してＨＳを蓄積すると共に、共通の神経疾患の発現を有する密接に関連する状態が明らかにされている（Ｇａｒｂｕｚｏｖａ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １３：１７４（２０１３））。しかし、ＭＰＳＩＩＩＢヒト患者におけるＢＢＢの状態についてはほとんどわかっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｇａｒｂｕｚｏｖａ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（３）：ｅ１６６０１（２０１１）
【非特許文献２】Ｇａｒｂｕｚｏｖａ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １３：１７４（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これは、ＭＰＳＩＩＩＢ患者におけるＢＢＢの透過を必要とする組換えヒトＮａＧｌｕ酵素の全身送達（例えば、静脈内投与）を含む酵素補充療法が、疾患を治療しながら、且つ、もしあれば、潜在的ＢＢＢ機能障害を改善しながら、脳（ＣＮＳ）において効果を及ぼし得るか否かの問題を呈する。従って、患者のＢＢＢ構造及び機能、並びに神経認識及び運動技能に影響を与えるＣＮＳ中のＨＳ蓄積の動態に応じて、ＭＰＳＩＩＩＢ患者のＣＮＳにおける全身初期投与から維持療法までのＭＰＳＩＩＩＢの安全且つ有効な治療が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ｒｈＮａＧｌｕがＢＢＢを効果的に通過して、ＮａＧｌｕ欠乏動物のＣＮＳ内の細胞に取り込まれることを可能にするグリコシル化パターンを含む組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）を用いて、ＮａＧｌｕ関連疾患、例えば、ＭＰＳＩＩＩＢを治療する方法が、ＰＣＴ／米国特許第１２／５９７０８号明細書に記載されている。本発明は、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕが、いずれのＣＮＳ障害又は状態にも罹患していないか、又は障害されていない健常な哺乳動物被験者におけるインタクトなＢＢＢでも効果的に通過することができるという発見に基づいている。従って、本明細書には、ｒｈＮａＧｌｕの静脈内投与を用いて、ＮａＧｌｕ関連疾患、例えば、ＭＰＳＩＩＩＢの治療を目的とする、ｒｈＮａＧｌｕによる長期酵素補充療法を受療中の哺乳動物の中枢神経系（例えば、脳組織）における治療レベルのｒｈＮａＧｌｕの初期投与レジメン及びそれに続く維持のための方法が記載される。
【０００６】
第１の形態では、本発明は、組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢを有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法を提供する。この方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、この静脈内投与によって、ＣＳＦ中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積が阻止される。
【０００７】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、第１の用量で第１の期間にわたり定期的に静脈内投与され、第２の用量で第２の期間にわたり定期的に静脈内投与される。一実施形態では、第１の期間と第２の期間の間に、患者がｒｈＮａＧｌｕ療法を一切受けないウォッシュアウト期間を設けることができる。一実施形態において、第１期間の治療では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）レベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下させる。好ましい実施形態では、第１期間の治療では、ＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも５０％低下させる。一実施形態において、第２期間の治療では、ＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を第１期間のレベルから維持するか、又はさらに低下させる。好ましい実施形態では、患者は、第１期間中に、第２期間よりも高い頻度で投与される。一実施形態では、第１期間中に注入又は注射毎に投与されるｒｈＮａＧｌｕの量と第２期間中に注入又は注射毎に投与されるｒｈＮａＧｌｕの量は同じであってもよいが、投与頻度は、第２期間の方が低い。一実施形態では、第１用量の量（１用量中）は、第２用量の量より高い。例えば、第１期間の第１用量は、注入又は注射毎に体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約４０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇである。第２用量は、注入又は注射毎に体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約４０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇであってよい。一実施形態では、第１用量は、約７日に１回〜約３０日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約７日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約１０日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約１４日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約３０日に１回投与される。一実施形態では、ＣＳＦ  ＨＳレベルが、少なくとも例えば、前処置レベルから５０％、６０％、７０％、８０％以上低下したら、患者は、第２用量の開始まで、約１ヵ月、約２ヵ月、約３ヵ月、約４ヵ月、約５ヵ月又は約６ヵ月の間投薬されない。一実施形態では、第２用量は、第１用量よりも低い頻度で、例えば、約１０日に１回〜約６０日に１回投与される。一実施形態では、第２用量は、約１４日に１回又は約９０日に１回投与される。好ましい実施形態では、第２用量は、約１４日に１回又は約３０日に１回投���される。
【０００８】
本明細書で使用する場合、インタクトなＢＢＢとは、ＢＢＢが、類似年齢の健常な被験者によって呈示されるレベルの範囲内の透過性レベルを有する、すなわち、類似年齢の健常な被験者と同等の透過性を有することを意味する。患者がインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有するか否かは、ＣＳＦ／血清アルブミン指数；ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；ＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又はダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）により決定することができる。一部の実施形態では、患者は、この治療に先立ち、例えば、少なくとも３ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも９ヵ月、又は少なくとも１年にわたって、ｒｈＮａＧｌｕ（例えば、静脈内又は髄腔内投与）で処置されている。一部の実施形態では、患者は、約７歳以下であり、及び／又は約５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数を有する、及び／又は約０．７未満のＣＳＦ／ＩｇＧ指数を有する。
【０００９】
一部の実施形態では、本方法は、被験者のＫｔｒａｎｓ、ＣＳＦ／血清アルブミン指数、ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数、及び／又はＣＳＦ  ＩｇＧ指数のうち１つ又は複数を決定するステップ、並びに健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓの１２５％以下のＫｔｒａｎｓ、１５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数、及び／又は１０未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数、及び／又はＣＳＦ  ＩｇＧ指数の存在に基づいて被験者を選択するステップを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、患者は、健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓ以下のＫｔｒａｎｓ、１０未満、若しくは９未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数を有するか；又は８未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数を有するか；又は０．８５未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数を有する。
【００１１】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｍ６Ｐ及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含む。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１分子当たり約２〜約４個のバイセクティングＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ糖構造を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、細胞表面上にＭ６Ｐ受容体を有するＣＮＳの細胞への取り込みのために十分な量のＭ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐは、タンパク質１モル当たり約０．５、約１、約２、約３、約４、約５若しくは約６モル超の濃度で存在する。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、シアル酸付加されていないか、又はタンパク質当たり多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型を有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法を提供し、ここで、前記患者は、ＣＳＦ／血清アルブミン指数；ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数；ＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又はダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）により決定されるインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有する。この方法は、ヒト患者におけるサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状の進行を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、この静脈内投与によって、サンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状が改善される。一実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、細胞表面上にＭ６Ｐ受容体を有するＣＮＳの細胞への取り込みのために十分な量のＭ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐを含む。一実施形態では、Ｍ６Ｐは、タンパク質１モル当たり約０．５、１、約２、約３、約４、約５若しくは約６モル超の濃度で存在する。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、シアル酸付加されていないか、又はタンパク質当たり多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ｒｈＮａＧｌｕによる長期酵素補充療法を受療中のＭＰＳＩＩＩＢを有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法を提供し、この方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積を阻止するために治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、インタクトなＢＢＢを有し、上記の静脈内投与によって、ＣＳＦ中のヘパラン硫酸レベルの再蓄積が阻止される。
【００１５】
一部の実施形態では、治療有効量は、被験者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状を改善するのに十分なものである。
【００１６】
一部の実施形態では、ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状は、言語発達遅滞、進行性精神遅滞、神経機能障害、神経認知及び発達機能遅滞又は認知症である。一部の実施形態では、神経認知及び発達機能遅滞は、バインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）−ＩＩ、バーレイ乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及びカウフマン式児童用アセスメント・バッテリー（Ｋａｕｆｍａｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｂａｔｔｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）からなる群から選択される１つ又は複数のテストに基づく患者のスコアにより決定される。
【００１７】
一部の実施形態では、ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状は、介護者のクオリティ・オブ・ライフの評価、言語、又は神経認知及び発達機能の評価により決定される。一部の実施形態では、介護者のクオリティ・オブ・ライフは、ザリット介護負担尺度（Ｚａｒｉｔ  Ｂｕｒｄｅｎ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）により決定される。一部の実施形態では、言語の評価は、子供用コミュニケーションチェックリスト（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ）により決定される。
【００１８】
一部の実施形態では、ヒト患者のサンフィリポ症候群Ｂ型の１つ又は複数の神経症状は、子供用睡眠習慣質問票（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｓｌｅｅｐ  Ｈａｂｉｔｓ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）により評価される睡眠障害である。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇのｒｈＮａＧｌｕの用量を投与するステップを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、被験者は、約１５未満、約９未満、約７未満若しくは約５未満のＣＳＦ／血清アルブミン指数；約１０未満、若しくは約８未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ比；約０．９未満若しくは約０．７未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数；及び／又は健常な被験者のインタクトなＢＢＢを表す基準Ｋｔｒａｎｓの約１２５％以下のＫｔｒａｎｓを有する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、組換えヒトＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）による長期酵素補充療法を受療中のＭＰＳＩＩＩＢを有するヒト患者の中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法を提供し、この方法は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レベルの再蓄積を抑制又は阻止するための治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、インタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）を有し、上記の静脈内投与によって、ＣＳＦ中のＨＧＦレベルの再蓄積が阻止される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】３ｍｇ／ｋｇ／用量でのＩＶ投与後の血清及びＣＳＦ中のｒｈＮａＧｌｕのレベルを示す図である。
【図２】９時間にわたってモニターした３０ｍｇ／ｋｇ／用量で１時間のＩＶ投与後の血清（ひし形）又はＣＳＦ（四角）中のｒｈＮａＧｌｕレベルのセミログプロットを示す図である。各時点は、試験した６つのサンプル：３匹の動物×２回の毎週用量の平均を示す。前用量ｒｈＮａＧｌｕ濃度は、グラフにプロットする前に各ＣＳＦ時点から差し引いた。
【図３Ａ】ＢＢＢアッセイ細胞システムの概略図を示す図である。インサートウェルをそれより大きい下部ウェル内に配置する。多孔質フィルタで、インサートウェル内の培地を下部ウェル内の培地から分離する。内皮細胞はインサートウェル培地に面したフィルタ上で増殖させ、周皮細胞は、下部ウェル培地に面したフィルタの裏面に増殖させる。アストロサイトは、下部ウェルの底部に増殖させる。
【図３Ｂ】図３Ａに示すシステムの培養物中での時間経過による経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）変化を示す図である。一旦ＴＥＥＲ値が１５０Ω×ｃｍ２に達したら、ＥＷ−ＮａＧｌｕ  ＢＢＢ輸送実験にウェルを使用する。ＴＥＥＲは通常、約４又は５日目にこの値に到達するが、７日目に次第に下降し始める。７日目の細胞は試験に使用しない。
【図４Ａ】卵白由来のｒｈＮａＧｌｕ（ＥＷ−ＮａＧｌｕ）が、ラットｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門アッセイを通して時間依存的様式で輸送されることを示す図である。ＥＷ−ＮａＧｌｕは、内皮／周皮細胞障壁（●）を効率的に通過するのに対し、マンノース−６−リン酸は、卵白由来ｒｈＮａＧｌｕの取り込みを阻止する（□）が、マンノースは阻害しない（◆）。
【図４Ｂ】卵白由来のｒｈＮａＧｌｕ（ＥＷ−ＮａＧｌｕ）が、ラットｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門アッセイを通して時間依存的様式で輸送されることを示す図である。ＢＢＢアッセイウェルへの２ｍｇ／ｍＬの添加から８時間後に、最大卵白由来ｒｈＮａＧｌｕ取り込み速度（約４２ｎｇ／秒／ｃｍ２）が起こる（◆）が、０．２ｍｇ／ｍＬのＥＷ−ＮａＧｌｕ濃度は、１０倍低い（■）取り込み速度（約４ｎｇ／秒／ｃｍ２）を示した。
【図５Ａ】Ｍ６Ｐ依存的様式でＮａＧｌｕ欠乏線維芽細胞（ＧＭ００１５６）へのＥＷ−ＮａＧｌｕの取り込みを示す図である。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）でＥＷ−ＮａＧｌｕを処理すると、ヒトＮａＧｌｕ欠乏線維芽細胞への取り込みが妨げられる。
【図５Ｂ】ＥＷ−ＮａＧｌｕ処理のＡＰが、ＮａＧｌｕ活性に最小限の作用しか及ぼさなかったことを示す図である。
【図６Ａ】０．２ｍｇ／ｍＬ（◆）及び０．１ｍｇ／ｍＬ（■）ＥＷ−ＮａＧｌｕと０．１ｍｇ／ｍＬ（▲）及び０．０８ｍｇ／ｍＬ（▼）ＣＨＯ−ＮａＧｌｕの経時的輸送比較で明らかにされる通り、ＢＢＢ細胞培養アッセイにおいてＥＷ−ＮａＧｌｕ輸送がＣＨＯ由来酵素よりも効果的であることを示す図である。
【図６Ｂ】ＥＷ−ＮａＧｌｕ及びＣＨＯ−ＮａＧｌｕからのＣＥ−ＬＩＦ  Ｎ−結合オリゴ糖プロフィールを示す図である。
【図７Ａ】ＣＨＯ−ＮａＧｌｕ及びシアリダーゼ処理ＣＨＯ−ＮａＧｌｕからのＣＥ−ＬＩＦ  Ｎ−結合オリゴ糖プロフィールを示す図である。
【図７Ｂ】ＥＷ−ＮａＧｌｕ及びシアリダーゼ処理ＥＷ−ＮａＧｌｕからのＣＥ−ＬＩＦ  Ｎ−結合オリゴ糖プロフィールを示す図である。
【図８】Ｎａｇｌｕ欠乏マウスモデルにおけるｒｈＮａＧｌｕの反復静脈内投与（４週間、毎週１回）の長期効果の評価を示す図である。
【図９】Ｎａｇｌｕ欠乏マウスにおいてｒｈＮａＧｌｕを用いた２週間毎のＩＶボーラス薬物動態試験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で用いられる定義及び略語のいくつかは、以下を含む：ａａ、アミノ酸；ｂｐ、塩基対；ＣＤＳ、コードする配列ｃＤＮＡ、ＲＮＡと相同的なＤＮＡ；ＧａｌＮａｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇａｌ、ガラクトース；ＧｌｃＮａｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；ｎｔ、ヌクレオチド；ｋｂ、１，０００塩基対；μｇ、マイクログラム；ｍＬ、ミリリットル；ｎｇ、ナノグラム；及びｎｔ、ヌクレオチド。
【００２４】
本発明を記述するために本明細書で用いられる様々な用語の意味及び範囲を説明し、定義するために、いくつかの定義を本明細書に記載する。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「鳥類」は、分類学クラス鳥類（ａｖａ）の生物の任意の種、亜種又は系統、例えば、限定はしないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、並びにダチョウ、エミュー及びヒクイドリなどの走鳥類を指す。この用語は、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、又はニワトリ、（例えば、ホワイトレグホン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、褐色レグホン（Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、バーレッドロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロード・アイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カリフォルニア・グレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｇｒａｙ）、イタリアン・パートリッジ・カラード（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ）、並びにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ及び商業的な量で一般に飼育されているその他の家禽類の系統を包含する。
【００２６】
語句「〜に基づく」及び「〜に由来する」は、典型的に全部又は一部が取得されることを意味する。例えば、特定のレトロウイルスに基づく若しくは由来する、又は特定のレトロウイルスのヌクレオチド配列に基づくレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのゲノムが、特定のレトロウイルスのゲノムのヌクレオチド配列の実質的部分を含有することを意味する。
【００２７】
特定の生物のゲノムの天然に存在する部分ではないか、又は生物のゲノムの非ネイティブ部位に導入されたヌクレオチド配列は、「外来の」ヌクレオチド配列、「異種」ヌクレオチド配列、「組換え」ヌクレオチド配列又は「外性」ヌクレオチド配列と呼ばれる。さらに、単離された後、同じタイプ（例えば、同じ種）の生物に再導入されたヌクレオチド配列は、特定の生物のゲノムの天然に存在する部分とはみなされず、従って、外性又は異種とみなされる。「異種タンパク質」又は「外性タンパク質」は、外来、異種若しくは外性ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質であってもよく、従って、これらは、多くの場合、宿主生物の細胞に天然に発現されない。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、用語「外性」、「異種」及び「外来」は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸に関する場合、置き換え可能に用いられ、それが存在する染色体、ゲノム若しくは細胞の一部として天然に存在しないか、又はそれが天然に存在する位置及び／若しくは量とは異なる位置及び／若しくは量で見出される核酸を指す。これは、ゲノム、染色体又は細胞に対して内因性ではなく、ゲノム、染色体又は細胞に外から導入された核酸であってもよい。異種ＤＮＡの例として、限定はしないが、例えば、コードされたタンパク質の産生のために、１つ又は複数の目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡがある。用語「異種」及び「外性」はまた、生物によって産生される特定の細胞、組織若しくは物質に通常見出されないか、又は生物によって産生される特定の細胞、組織若しくは物質に、それが天然に存在するのと同じ量若しくは位置で、通常見出されないタンパク質などの生体分子も指すことがある。例えば、卵に対して異種又は外性のタンパク質は、卵に通常見出されないタンパク質である。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「発現された」又は「発現」は、コード配列の転写を指し、これにより、コード配列の２つの核酸鎖の一方の領域と、少なくとも一部が相補的なＲＮＡ分子が得られる。本明細書で使用されるとき、用語「発現された」又は「発現」はまた、タンパク質又はペプチドを産生するｍＲＮＡの翻訳を指すこともある。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、プロモータ又はプロモータ成分などの遺伝子発現制御領域を含む核酸ベクターを指す。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「断片」は、例えば、人工的に（例えば、化学合成により）又は制限エンドヌクレアーゼ若しくは機械的せん断を用いて、天然の産物を複数の部分に切断することにより、又は酵素的に、例えば、ＰＣＲ若しくは当技術分野で公知のいずれか他の重合技術により構築された、あるいは、当業者には周知のいずれか他の組換え核酸技術により宿主細胞に発現された核酸の少なくとも約１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、５０００、６０００、８０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００又は６００００ヌクレオチド長の部分を指し得る。本明細書で使用されるとき、用語「断片」は、例えば、ＮａＧｌｕ（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３）の完全長アミノ酸配列よりも短い少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、若しくは５０アミノ酸残基を指し、この部分は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断によって天然に存在するアミノ酸配列から切断されるか、又は化学的方法により、若しくは当業者には周知の組換えＤＮＡ技術（例えば、天然に存在するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部から発現される）を用いて合成された天然に存在するアミノ酸配列の一部である。「断片」はまた、特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の一部、例えば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％を指してもよい。
【００３２】
用語「完全にトランスジェニック」又は「生殖細胞系列トランスジェニック」は、その細胞のほぼ全てに少なくとも１つのトランスジーンのコピーを含有する動物、例えば、鳥類などを指す。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「グリカン」、「グリカン構造」、「グリカン部分」、「オリゴ糖」、「オリゴ糖構造」、「グリコシル化パターン」、「グリコシル化プロフィール」及び「グリコシル化構造」は、本質的に同じ意味を有し、各々、糖残基から形成されて、ｒｈＮａＧｌｕなどのグリコシル化タンパク質に結合している１つ又は複数の構造を指す。例えば、「Ｎ−グリカン」又は「Ｎ−結合グリカン」は、グリコシル化タンパク質のアスパラギン又はアルギニン側鎖の窒素に結合したグリカン構造を指す。「Ｏ−グリカン」又は「Ｏ−結合グリカン」は、グリコシレートタンパク質のセリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン、又はヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシル酸素に結合したグリカン構造を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「過剰発現」は、トランスジェニック動物において、正常又は非形質転換生物での産生レベルを超える遺伝子産物の産生を指す。
【００３６】
用語「卵管」又は「卵管組織」は、鳥類卵管、例えば、膨大部（例えば、管状腺細胞）などの組織を指し、そこでは、肝臓若しくは腎臓組織などの鳥類の他の組織で産生されるタンパク質の量と比較して、多量のマンノース及びマンノース−６−リン酸（例えば、Ｍ６Ｐ若しくはビス−Ｍ６Ｐ）と、実質的に少量のガラクトース及び／又はシアル酸を含有するＮ−結合オリゴ糖と共に、タンパク質が産生される。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「卵管特異的プロモータ」は、機能性である、すなわち、かなりの程度まで、例えば、主として（鳥類の卵管細胞にすなわち、特定のプロモータタイプにより動物において産生される転写産物の５０％超）又は卵管細胞だけに、コード配列の転写をもたらすプロモータ又はプロモータ成分を指す。卵管特異的プロモータの例として、限定はしないが、オボアルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、オボインヒビタープロモータ、リゾチームプロモータ及びオボトランスフェリンプロモータ並びにこれらのプロモータの機能性部分、例えば、プロモータ成分が挙げられる。卵管特異的プロモータを用いて、ＮａＧｌｕタンパク質の発現を膨大部に限定することにより、鳥類の他の組織でのこれらの酵素の発現に起因する鳥類に対する有害な生理学的作用を最小限にすることができる。
【００３８】
用語「配列同一性（％）」、「同一性（％）」、「％同一性」、「配列相同性（％）」、「相同性（％）」、「％相同性」及び「配列類似性（％）」は各々、２つの核酸配列又は２つのアミノ酸配列同士の配列のマッチ度を指してもよい。こうした配列マッチングは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２２６４−２２６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３−５８７７において改変されたアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｑ１５：４０３−４１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて実施することにより、本明細書に記載する通りの核酸分子と相同性のヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施することにより、基準アミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較を目的とするギャップアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載の通りにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用する。他のアルゴリズム、プログラム及びデフォルト設定も好適であり、例えば、限定はしないが、英国ヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンター（Ｕ．Ｋ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ）のＧＣＧ配列解析パッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）があり、これは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列比較のためのプログラムを含む。配列は、別の配列、例えば、本明細書で同定されるＮａＧｌｕタンパク質配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であってもよい。
【００３９】
用語「鳥類由来（の）」は、トリ、家禽若しくは鳥類により産生されるか、又はそれらから得られる組成物若しくは物質を指す。「鳥類」は、家畜として飼育することができるトリを指し、限定はしないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラ及び走鳥類が含まれる。例えば、「鳥類由来」は、ニワトリ由来、シチメンチョウ由来及び／又はウズラ由来を指すこともある。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモータ」は、鳥類細胞においてＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始する上で有用なＤＮＡ配列を指す。「プロモータ成分」は、それ自体で、又は他のＤＮＡ配列と組み合わせて、転写をもたらすか、促進することができるＤＮＡ配列である。プロモータ成分は、プロモータの機能性断片であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え核酸」及び「組換えＤＮＡ」は、真核又は原核細胞に天然に存在しない少なくとも２つの核酸配列の組み合わせを指す。核酸配列として、限定はしないが、核酸ベクター、遺伝子発現調節エレメント、複製起点、発現されると抗生物質耐性を賦与する好適な遺伝子配列、タンパク質コード配列などが挙げられる。用語「組換えポリペプチド」は、その位置、純度又は構造のいずれかが、天然に存在するポリペプチドとは異なるように、組換えＤＮＡ技術により生成されたポリペプチドを含むことを意味する。概して、こうした組換えポリペプチドは、自然界で通常観察されるものとは異なる量で細胞に存在する。
【００４２】
「治療用タンパク質」又は「医薬タンパク質」は、全体又は一部が薬剤を構成する物質である。特に、「治療用タンパク質」又は「医薬タンパク質」は、全体又は一部が薬剤を構成するアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、核酸を宿主に挿入するプロセスを指す。原核若しくは真核生物への核酸の形質転換又はトランスフェクションを促進するための多くの技術が当業者には周知である。これらの方法は、特定濃度の塩、例えば、限定なしに、カルシウム若しくはマグネシウム塩で細胞を処理する、又は細胞を電界、洗剤、若しくはリポソーム材料に曝露させることにより、宿主細胞に核酸分子の取り込み能力を付与するなど、様々な技術を含む。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック動物」は、動物の１つ又は複数の細胞が、本明細書に開示されるものを含む当技術分野で公知のトランスジェニック技術（例えば、２００７年１０月１８日に公開された米国特許出願公開第２００７／０２４３１６５号明細書を参照；その開示内容は、参照により全体として本明細書に組み込む）など、人為的介入の方法により導入された異種核酸を含有する任意の非ヒト動物、例えば、鳥類である。核酸は、マイクロインジェクション又は組換えウイルスへの感染など、意図的な遺伝子操作の方法による細胞（例えば、卵又は胚細胞）への導入によって直接若しくは間接的に動物に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な雑種形成、又は体外受精は含まず、組換えＤＮＡ分子の導入に関する。この分子は、クロロソーム内に組み込むことができ、又はこれは、染色体外でＤＮＡを複製し得る。典型的なトランスジェニック動物では、トランスジーンは、細胞に標的タンパク質又はポリペプチドの組換え形態を発現させることができる。用語「キメラ動物」又は「モザイク動物」は、本明細書で使用されるとき、当該動物の細胞の全部ではないが一部に、トランスジーンが見出されるか、又は組換えヌクレオチド配列が発現される動物を指す。生殖細胞系キメラ動物は、その生殖細胞にトランスジーンを含有し、子孫のトランスジェニック動物を生み出すことができ、その子孫の細胞のほとんど又は全部が、トランスジーンを含有することになる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「トランスジーン」は、それが導入される動物若しくは細胞に対して部分的若しくは完全に異種である、すなわち外性であるか、又はそれが導入されるトランスジェニック動物若しくは細胞の内因性遺伝子に対して部分的若しくは完全に相同的であるが、それが挿入される生物のゲノムを改変するように、動物若しくは細胞ゲノムに挿入が設計されているか、又は挿入されている（例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されているか、若しくはその挿入によりノックアウトが起こる）核酸配列（例えば、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質をコードする）を意味する。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、欠乏する酵素を被験者に投与することにより、被験者の酵素欠乏を解消するための治療戦略を指す。リソソーム酵素補充療法を有効にするために、治療用酵素は、貯蔵欠損症を呈している組織における適切な細胞中のリソソームに送達しなければならない。本方法では、酵素は、被験者に全身（例えば、静脈内）投与するため、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。特定の機構に限定されることは意図しないが、血液が患者の組織に灌流すると、酵素は、細胞により取り込まれて、リソソームに輸送され、そこで、酵素は、酵素の欠乏によってリソソームに蓄積された物質を排除するために作用する。
【００４７】
用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、疾患若しくは症状の緩和、寛解、又は改善、別の症状の予防、症状の根本原因の改善若しくは予防、疾患若しくは病状の阻害、疾患若しくは病状の発生の停止、疾患若しくは病状の軽減、疾患若しくは病状の退行、疾患若しくは病状により生じる状態の軽減、あるいは、予防的及び／若しくは症状が起こった後の疾患若しくは病状の症状の停止、例えば、疾患、病状若しくは症状の根本原因の再発の停止若しくは予防、又は疾患若しくは病状の寛解状態にある患者の維持の方法を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「被験者」又は「患者」は、ヒト及び非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。好ましい被験者としては、ＮａＧｌｕ欠乏症又はＮａＧｌｕ関連疾患を有するヒト被験者が挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「ＮａＧｌｕ関連疾患」は、ＮａＧｌｕ活性により媒介されるか、又は異常なＮａＧｌｕ発現若しくは活性に関連する疾患若しくは病状である。ＮａＧｌｕ関連疾患の一例として、限定はしないが、サンフィリポ症候群Ｂ型（ムコ多糖症ＩＩＩＢ型としても知られる）などのＮａＧｌｕ欠乏症が挙げられる。
【００５０】
往々にして医療分野でＩＶプッシュ法又はボーラス注射と呼ばれる「静脈内注射」は、注射器をＩＶアクセスデバイスに接続して、薬剤を直接、典型的には急速に注射し、ときに静脈の刺激又は速すぎる効果を引き起こす場合には、最大１５分かけて注射する、投与経路を指す。一旦薬剤がＩＶ管の液流に注入されたら、管から患者に到達することを確実にする何らかの手段がなければならない。通常、これは、液流が正常に流れるようにし、これにより、薬剤を血流に運搬させることによって達成される。しかしながら、場合によっては、薬剤が血流に進入するのを促進するために、１回目の注射後に、「フラッシュ」と呼ばれることもある２回目の注射を使用する。静脈内投与は、全身投与の１タイプである。
【００５１】
「静脈内注入」は、長時間にわたって薬剤を送達する投与経路を指す。例えば、１〜８時間にわたって薬剤を患者に送達することができる。また、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、又は約８時間にわたって薬剤を患者に送達することもできる。静脈内注入を達成するために、ＩＶ点滴又はＩＶポンプを使用することができる。ＩＶ注入は、一般的に、患者が特定の時間にのみ薬剤を必要とし、電解質、血糖、及び水分損失を回復するものなどの追加の静脈内輸液（例えば、ナトリウム、塩化物、グルコース、又はそれらの組み合わせを含有し得る水溶液）を必要としない場合に使用される。
【００５２】
略語
ＢＢＢ  血液脳関門
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ＣＮＳ  中枢神経系
ＣＳＦ  脳脊髄液
Ｆｕｃ  フコース
ＧＡＧ  グルコサミノグリカン
Ｇａｌ  ガラクトース
ＧａｌＮＡｃ  Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｇｌｃ  グルコース
ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−アセチルグルコサミン
ＨＧＦ  肝細胞増殖因子
ＨＳ  ヘパラン硫酸
ＨＳＤ  ヘパラン硫酸二糖
ＩＶ  静脈内
ＩＴ  髄腔内
Ｍａｎ  マンノース
Ｍ６Ｐ  マンノース−６−リン酸
ＭＰＳＩＩＩＢ  ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（サンフィリポ症候群Ｂ型）
ｒｈＮａＧｌｕ  組換えヒトα−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ
ＮｅｕＮＡｃ  Ｎ−アセチルノイラミン酸
【００５３】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる技術及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料を本明細書に記載するが；当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び例は、例示的に過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で述べる刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及びその他の参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込むものとする。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
【００５４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに請求の範囲から明らかになるであろう。
【００５５】
サンフィリポ症候群Ｂ型
２００，０００羽のトリのうち約１羽がサンフィリポ症候群Ｂ型に罹患しており、この欠乏症は、主に幼児において発現する。初期の無症状期間の後、サンフィリポ症候群Ｂ型に罹患している患者は、通常、精神発達の遅滞及び行動障害、続いて進行性知能低下を呈し、その結果、重度精神遅滞、認知症及び運動疾患を引き起こす。言語の習得は遅く、不完全である。重症患者は、２歳という早期に精神運動及び言語発達遅滞を呈し得る。疾患は、通常、行動障害及び睡眠障害の増大に進行する。臨床上の特徴は、主に神経学的であり、患者は、下痢、虫歯、肝臓及び脾臓肥大、関節のこわばり、多毛性及び／又は硬毛を発生し、血液凝固障害を呈する場合もある。疾患の最終段階では、患者は、動けなくなり、無反応になり、嚥下障害及び発作を発症する。罹患した子供の寿命は、一般に十代後半から二十代初めまでに延びていない。
【００５６】
患者に欠落した酵素を供給するために、様々なアプローチが試みられている。酵素補充療法（ＥＲＴ）のためにＮａＧｌｕを生成する目的で、多様な哺乳動物細胞培養系でヒトＮａＧｌｕが発現されている。しかしながら、リポソームに細胞内輸送される天然のＮａＧｌｕとは対照的に、哺乳動物細胞から生成及び分泌されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を全くか、又は微量にしか含まないことが判明した。分泌された哺乳動物細胞由来の組換えＮａＧｌｕの非存在又は不足は、Ｍ６Ｐ受容体媒介エンドサイトーシスを介した細胞（例えば、ヒト皮膚線維芽細胞）へのタンパク質のターゲティングにおいて問題となっている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９：２０２−２１１（２０００）；及びＷｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１：２５１−２５９（２００１）を参照）。ＣＨＯ細胞に発現された分泌マウスＮａＧｌｕ、ヒーラ細胞に発現された分泌ヒトＮａＧｌｕ、ヒト線維芽細胞に発現された分泌ヒトＮａＧｌｕ、及びヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株２９３に発現された分泌ＮａＧｌｕにおいて、低度のリン酸化が見られた（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９：２０２−２１１（２０００）；Ｙｏｇａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５０２：４１５−４２５；及びＷｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１：２５１−２５９（２００１）を参照）。哺乳動物細胞から分泌されるＮａＧｌｕタンパク質中のＮ−グリカンのリン酸化がないか、又は弱いことは、酵素補充療法に好適なｒｈＮａＧｌｕタンパク質を開発する上で大きな障害となった（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９：２０２−２１１（２０００）を参照）。
【００５７】
さらに、ＮａＧｌｕ欠乏マウスの中枢神経系（ＣＮＳ）へのネイティブアミノ酸配列を有する哺乳動物細胞産生ｒｈＮａＧｌｕの直接投与（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）中への髄腔内投与）が試みられたが、効率的な細胞取り込みに必要なＭ６Ｐ残基の不足のために、脳への酵素の十分な生体内分布を示すことができなかった。
【００５８】
ＭＰＳＩＩＩＢ患者は、軽度に漏出性又は損傷したＢＢＢ完全性を有する（実施例３．２を参照）。最初の治療が有効であれば、こうした治療の成功は、ＢＢＢの機能及び完全性を回復することになり、これによって、長期療法の場合、静脈内投与などの全身投与の効果が低下し得る。
【００５９】
本発明は、本明細書に記載するｒｈＮａＧｌｕが、いずれのＣＮＳ障害若しくは状態によっても影響又は損傷されていない、健常な哺乳動物被験者のインタクトなＢＢＢであっても有効に通過することができるという発見に基づく。これらの知見は、ＢＢＢの回復によって、ＭＰＳＩＩＩＢの初期治療後に全身投与経路の効果が低下し得るという考えから生じる問題に技術的解決をもたらす。ＭＰＳＩＩＩＢ欠乏は、生涯にわたる酵素補充療法を必要とする可能性がある遺伝障害であることから、長期にわたって全身投与（例えば、静脈内投与）でＭＰＳＩＩＩＢ患者を治療することができれば、患者だけではなく、介護者のクオリティ・オブ・ライフを著しく改善するため、患者の介護に大きな進歩が達成される。
【００６０】
治療方法
本発明は、ＮａＧｌｕ関連疾患、例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型の長期治療方法のために、ｒｈＮａＧｌｕの治療レベルを維持する方法を提供する。本発明に従って使用される組換えヒトＮａＧｌｕは、限定はしないが、以下にさらに詳しく述べる通り、ｒｈＮａＧｌｕが適切なオゴリ糖と一緒に発現されるか、又はそうでなければ、適切なオゴリ糖を含有するように修飾されていれば、細胞培養物（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、哺乳動物及び鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、及びシチメンチョウ）などのトランスジェニック動物並びに植物系（例えば、アオウキクサ及びタバコ）を含む、任意の有用なタンパク質発現系で生成することができるｒｈＮａＧｌｕを含む。一部の実施形態では、組換えＮａＧｌｕは、鳥類などのトランスジェニック動物に産生される。一実施形態では、組換えＮａＧｌｕは、トランスジェニックニワトリに産生される。
【００６１】
投与
本明細書に記載する方法は、例えば、ｒｈＮａＧｌｕによる初期治療で、被験者の細胞中のＨＳのレベルを低下するのに成功した後、長期間、例えば、１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、又は１年を超える期間にわたる、本明細書に記載する治療有効量のｒｈＮａＧｌｕの複数回投与を含む。ｒｈＮａＧｌｕは、被験者の状態の性質、重症度及び程度に応じて、規則的間隔で投与することができる。一部の実施形態では、例えば、初期治療効果が達成されたら、ｒｈＮａＧｌｕの治療有効レベルを維持するのに十分なｒｈＮａＧｌｕタンパク質の量を規則的間隔（例えば、年１回、６ヵ月に１回、５ヵ月に１回、３ヵ月に１回、２ヵ月毎（２ヵ月に１回）、毎月（１ヵ月に１回）、２週間毎（２週間に１回）又は毎週）で定期的に全身（例えば、静脈内）投与することができる。
【００６２】
「治療有効量」又は「治療有効用量」は、本明細書で使用されるとき、意図する治療応答（例えば、ヘパラン硫酸レベルの低減；脳などの標的組織中のＮａＧｌｕ活性の増大；脳のＭＰＳＩＩＩＢ症状の寛解の維持；又はＭＰＳＩＩＩＢ症状の再発の予防）を生み出すのに必要な薬物の用量（例えば、量及び／又は間隔）を指す。治療有効用量は、その用量を受けなかった対応する被験者と比較して、疾患、障害、又は副作用の治療、治癒、予防、若しくは改善、あるいは疾患若しくは障害の発生若しくは再発又は進行の速度の低下をもたらす用量を指す。この用語はまた、その範囲内で、疾患、障害、若しくは症状の寛解の維持を促進するか、又は疾患、障害、若しくは症状の再発を予防するのに有効な用量も含む。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、主に、本発明の医薬組成物に含有される治療薬の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、被験者に有意義な利益（例えば、基礎疾患若しくは病状の治療、調節、治癒、予防及び／又は改善）を達成するのに十分なものである。例えば、治療有効量は、所望の治療及び／又は予防効果を達成するのに十分な量、例えば、リソソーム酵素受容体又はそれらの活性を調節し、これによってそうしたリソソーム貯蔵疾患若しくはその症状を治療する上で十分な量であってもよい。概して、それを必要とする被験者に投与される治療薬の量（例えば、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕ）は、被験者の特徴に左右されることになる。そうした特徴として、被験者の状態、疾患の重症度、全身の健康状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者であれば、上記及びその他の関連因子に応じて、適切な投薬量を容易に決定することができよう。さらに、客観的及び主観的アッセイの両方を任意選択で使用して、最適な投薬量の範囲を見出すこともできる。
【００６４】
一部の実施形態では、治療有効用量は、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜４００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜３００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜９０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜８０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜７０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜６０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜４０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜３０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜２５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．００５ｍｇ〜１０ｍｇの範囲である。また、上に記載した範囲及び値の中間の範囲及び値（例えば、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．３〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜３０ｍｇ／ｋｇ、又は６〜２７ｍｇ／ｋｇ）も本発明に含まれると考えられる。
【００６５】
一部の実施形態では、治療有効用量は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約０．２ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約０．４ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約３ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約６ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約７ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約４０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約６０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約７０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約８０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約９０ｍｇ以上、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ以上である。上に記載した範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明に含まれると考えられる。
【００６６】
一部の実施形態では、治療有効用量はまた、ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦによって定義することもできる。当業者には理解されるように、脳重量及び体重に基づく治療有効用量は、ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦに変換することができる。例えば、成人のＣＳＦの量は、約１５０ｍＬである（Ｊｏｈａｎｓｏｎ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｙ  １４；５：１０）。従って、成人に対する０．１ｍｇ〜５０ｍｇのタンパク質の単一用量注射は、成人において約０．０１ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦ（５０ｍｇ）用量となる。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法は、ｒｈＮａＧｌｕによる初期治療で、被験者のＣＮＳ細胞中のＨＳのレベルを低下する（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＨＳにより測定される）のに成功して、ＢＢＢの完全性を部分的又は完全に回復した後、例えば、１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、又は１年を超える時点（「第１期間」）で、ＮａＧｌｕ欠乏症又はＮａＧｌｕ関連疾患の１つ又は複数の症状を治療（例えば、軽減、改善）又は予防するのに十分な量で、十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノース及びリン酸化マンノース（すなわち、Ｍ６Ｐ若しくはビス−Ｍ６Ｐ））を含有するｒｈＮａＧｌｕを被験者に全身投与、例えば、静脈内投与するステップを含む。ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、治療若しくは予防、又はその両方の目的で投与することができる。ｒｈＮａＧｌｕは、単独で、又は本明細書に記載する他の治療法と併用して被験者に投与することができる。
【００６８】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、第１期間にわたって定期的に第１用量で静脈内投与した後、第２期間にわたって定期的に第２用量で静脈内投与する。一実施形態では、第１期間と第２期間の間にウォッシュアウト期間を設けることができ、その期間中、患者はｒｈＮａＧｌｕ療法を一切受けない。一実施形態では、第１期間の治療で、ヘパラン硫酸（ＨＳ）レベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下させる。好ましい実施形態では、第１期間の治療で、ＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を前処置レベルから少なくとも５０％低下させる。一実施形態では、第２期間の治療は、第１期間のものからＨＳレベル（例えば、ＣＳＦ中の）を維持するか、又はさらに低下させる。好ましい実施形態では、患者は、第１期間中に、第２期間中よりも高い頻度で投与される。一実施形態では、第１期間中に注入又は注射毎に投与されるｒｈＮａＧｌｕの量と、第２期間中に注入又は注射毎に投与されるｒｈＮａＧｌｕの量は、同じであってもよいが、投与の頻度が異なり得る。例えば、患者は、第２期間中、第１期間中よりも低い頻度で投与することができる。一実施形態では、注入又は注射当たり第１用量の量は、注入又は注射当たりの第２用量の量よりも高い。例えば、第１期間の第１用量は、注入又は注射当たり体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約４０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇである。第２用量は、注入又は注射当たり体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり３ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約８ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約４０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇであってよい。一実施形態では、第１用量は、約７日に１回〜約３０日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約７日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約１０日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約１４日に１回投与される。一実施形態では、第１用量は、約３０日に１回投与される。一実施形態では、第２用量は、第１用量よりも低い頻度で、例えば、約１０日に１回〜約６０日に１回投与される。一実施形態では、第２用量は、約１４日に１回又は約９０日に１回投与される。好ましい実施形態では、第２用量は、約１４日に１回又は約３０日に１回投与される。任意選択で、ＣＳＦ  ＨＳレベルが、前処置レベルから、少なくとも例えば５０％、６０％、７０％、８０％以上低下したら、患者は、���２用量の開始まで、約１ヵ月、約２ヵ月、約３ヵ月、約４ヵ月、約５ヵ月又は約６ヵ月の間治療を受けなくてもよい。
【００６９】
一実施形態では、第１期間の注入又は注射当たりの第１用量は、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇであってよく、第２期間の注入又は注射当たりの第２用量は、体重１ｋｇあたり約５ｍｇであってよい。別の実施形態では、第１期間の注入又は注射当たりの第１用量は、週１回（例えば、約７日毎に１回）体重１ｋｇあたり約１０ｍｇであってよく、また第２期間の注入又は注射当たりの第２用量は、月２回（例えば、約１４日毎に１回）体重１ｋｇあたり約１０ｍｇであってよい。
【００７０】
本発明の治療方法は、該当臓器及び組織へのｒｈＮａＧｌｕタンパク質の取り込み又は輸送を促進する任意の全身投与経路を包含し；本明細書で使用されるとき、全身投与経路は、髄腔内送達又はＣＮＳへのその他の直接送達方法を含まない。好ましい実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、患者に静脈内投与する（例えば、静脈内注射、静脈内注入を介して）ことができ、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する被験者のインタクトな血液脳関門（ＢＢＢ）でも通過する。
【００７１】
上述したように、本明細書に記載するｒｈＮａＧｌｕタンパク質の特徴の１つは、静脈内投与されると、特に、インタクトなＢＢＢを有する哺乳動物、例えば、正常な哺乳動物であっても、血液脳関門（ＢＢＢ）及び脳表面にわたって効果的且つ広範囲に拡散し、脳深部領域を含め、脳の様々な層及び領域を透過することができるものである。本明細書に記載する治療方法は、長期療法を受療中であり、ＢＢＢ完全性を回復しているＭＰＳＩＩＩＢ患者における中枢神経系（ＣＮＳ）の様々な組織及びニューロン又は細胞にｒｈＮａＧｌｕタンパク質を効果的に送達する。さらに、本発明の方法は、血流並びに様々な末梢器官及び組織に十分な量のｒｈＮａＧｌｕタンパク質を送達する。
【００７２】
ｒｈＮａＧｌｕ
本明細書に記載する方法は、細胞取り込みの増大及び細胞内活性の増加を賦与するグリコシル化のパターンを有するｒｈＮａＧｌｕ（配列番号１に示されるアミノ酸配列２４〜７４３）の組成物の全身（例えば、静脈内）投与を含み、これは、例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型（ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型）の治療などの療法に特に有用である。
【００７３】
ヒトＮａＧｌｕアミノ酸配列（シグナルペプチド：ａａ１〜２３、下線部）
【化１】
2017531632.tif 000002
【００７４】
一部の態様では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含むｒｈＮａＧｌｕの単離された混合物であってよい。一部の実施形態では、混合物は、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞中に、Ｍ６Ｐ含有ｒｈＮａＧｌｕを内在化させて、内因性ＮａＧｌｕを活発に発現する同じタイプの野生型ヒト細胞に認められるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を回復するように、リン酸化マンノース（例えば、Ｍ６Ｐ及びビス−Ｍ６Ｐ）を含む少なくとも１つのグリカン構造を有するｒｈＮａＧｌｕを十分な量で含有する。一態様では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも４０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、リン酸化マンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。
【００７５】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、１つ又は複数のＮ−結合グリカン構造を含む。ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも１つのリン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐ）を含み、これは、限定はしないが、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、肝細胞、マクロファージ、又はＭ６Ｐ受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞表面にＭ６Ｐ受容体を発現する任意の細胞などのヒト細胞への上記タンパク質の取り込みを可能にする。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも１つのマンノース（Ｍａｎ）を含有する。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含有する。
【００７６】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、リン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐ）を含むグリカン構造を含む。本明細書で述べるＭ６Ｐは、モノ−及びビス−リン酸化マンノースを含み得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、Ｍ６Ｐは、タンパク質１モル当たり約０．５、約１、約２、約３、約４、約５又は約６モルの濃度で存在する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２、約３、約４、又は約５モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約４モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約５モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約６モルの濃度のＭ６Ｐを含有する。
【００７７】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｍ６Ｐ受容体媒介エンドサイトーシスを介した、細胞表面にＭ６Ｐ受容体を有するヒト細胞への細胞取り込みのために十分な量のＭ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、ヒト細胞への取り込みのためのＭ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐの十分な量は、タンパク質１モル当たり約０．５、約１、約２、約３、約４、約５又は約６モルである。ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞に内在化することができ、これによって、内在化されたタンパク質が、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞における正常レベルのＮａＧｌｕ活性を完全に（１００％以上）回復するようにする。一部の実施形態では、内在化ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９若しくは１．０μｇ／ｍＬの濃度で、ヒト細胞中に正常レベルのＮａＧｌｕ活性を完全に回復する。一部の実施形態では、内在化ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０μｇ／ｍＬの濃度で、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞中に正常レベルのＮａＧｌｕ活性を完全に回復する。一部の実施形態では、内在化ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｍＬの濃度で、ヒト細胞中の正常レベルのＮａＧｌｕ活性を完全に回復する。本明細書に記載するように、ＮａＧｌｕ活性の正常レベルは、正常なＮａＧｌｕ酵素を活発に発現する同じタイプの野生型ヒト細胞において測定されるＮａＧｌｕ活性のレベルである。
【００７８】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞に内在化することができ、これによって、タンパク質が、同じタイプの正常なヒト細胞のＮａＧｌｕ活性の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％を回復するようにする。
【００７９】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞に内在化することができ、これによって、内在化されたｒｈＮａＧｌｕが、同じタイプの正常なヒト細胞において認められるものよりも高い酵素活性をもたらすようにする。
【００８０】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞に内在化されて、これにより、内在化されたｒｈＮａＧｌｕが、同じタイプの正常なヒト細胞において認められるものに比して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９及び約１０倍高い活性をもたらすようにする。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞に内在化されて、これにより、内在化されたｒｈＮａＧｌｕが、正常なヒト細胞において認められるものに比して約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０又は約１００倍高い活性をもたらすようにする。
【００８１】
一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、細胞表面に１つ又は複数のＭ６Ｐ受容体を発現する任意のＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、ヘパラン硫酸を蓄積するヒトムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型線維芽細胞である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、ニューロン細胞、又はグリア細胞である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、内皮細胞である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞は、マクロファージである。
【００８２】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕのヒト細胞への取り込みは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０ｍＭの競合Ｍ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕの細胞取り込みは、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９又は約１．０ｍＭのＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕの細胞取り込みは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、又は約０．０９ｍＭのＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。
【００８３】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５モルの濃度で、そのグリカン構造中にマンノースを含有する。一実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０モルの濃度でマンノースを有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８モルの濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２４モルの濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２５モルの濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２６モルの濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２７モルの濃度でマンノースを含有する。一実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２０〜約３０モルの濃度でマンノースを有する。
【００８４】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２８〜約４２モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを含有する。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３０〜約４０モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを有する。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３２〜約３８モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを含む。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３４〜約３６モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを含む。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３５モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０モルの濃度でＧｌｃＮＡｃを含有する。
【００８５】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）及び／又はガラクトース（Ｇａｌ）を含む。ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌの存在は、典型的に、ＮａＧｌｕが、ゴルジ体領域内のタンパク質に付加される１つ又は複数のＯ−結合グリカン構造を含有し得ることを示している。従って、本発明は、任意選択で、１つ又は複数のＯ−結合グリカン構造を含有するｒｈＮａＧｌｕを含む組成物を包含する。
【００８６】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１、２、３、４、５、６又は７モルの濃度でガラクトースを含有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２、３、４、５又は６モルの濃度でガラクトースを有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルの濃度でガラクトースを有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約４モルの濃度でガラクトースを有する。
【００８７】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり少なくとも１個のＧａｌＮＡｃ分子を含む。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１又は２モルの濃度でＧａｌＮＡｃを含む。
【００８８】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、フコースを含有しない。また別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、グルコースを含有しない。また別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、フコース及びグルコースのどちらも含有しない。
【００８９】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、バイセクティング糖残基を含むＮ−グリカンにより、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０部位でＮ−グリコシル化されている。一実施形態では、バイセクティング糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃなどのバイセクティング糖を含むＮ−グリカンを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐高マンノースグリカン）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。また別の実施形態では、こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。いくつかの実施形態では、任意のこうしたタンパク質のＮ−グリカンの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％は、シアル酸付加されていない（すなわち、ノイラミン酸を欠失している）。いくつかの特定の態様では、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンの１つ、２つ、３つ、４つ、又は全部の末端糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンは、例えば、構造１２であってよく、ここで、中括弧（表Ａ）の左側のＧｌｃＮＡｃの少なくとも１つは、グリカンの還元末端（すなわち、表Ａに示す構造の右側の末端）に最も近いマンノースに結合している。
【００９０】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、バイセクティング糖を含む複合体型Ｎ−グリカンにより、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０部位でＮ−グリコシル化されている。一実施形態では、バイセクティング糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃなどのバイセクティング糖を含む複合型Ｎ−グリカンを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕはさらに、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐高マンノースグリカン）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。また別の実施形態では、こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。いくつかの実施形態では、任意のこうしたタンパク質のＮ−グリカンの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％は、シアル酸付加されていない。いくつかの特定の態様では、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンの１つ、２つ、３つ、４つ、又は全部の末端糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンは、例えば、構造１２であってよく、ここで、中括弧（表Ａ）の左側のＧｌｃＮＡｃの少なくとも１つは、グリカンの還元末端（すなわち、表Ａに示す構造の右側の末端）に最も近いマンノースに結合している。
【００９１】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、バイセクティング糖残基を含むハイブリッド型Ｎ−グリカンにより、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０部位でＮ−グリコシル化されている。一実施形態では、バイセクティング糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃなどのバイセクティング糖を含むハイブリッド型Ｎ−グリカンを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕはさらに、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐高マンノースグリカン）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。また別の実施形態では、こうしたタンパク質の集団において、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、高マンノースであるＮ−グリカン（例えば、２分岐、３分岐、若しくは４分岐）を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個含む。いくつかの実施形態では、任意のこうしたタンパク質のＮ−グリカンの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％は、シアル酸付加されていない。いくつかの特定の態様では、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンの１つ、２つ、３つ、又は４つの末端糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンは、例えば、構造１２であってよく、ここで、中括弧（表Ａ）の左側のＧｌｃＮＡｃの少なくとも１つは、グリカンの還元末端（すなわち、表Ａに示す構造の右側の末端）に最も近いマンノースに結合している。
【００９２】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、フィトヘマグルチニン−Ｅ（ＰＨＡ−Ｅ）に結合することができる。いくつかのより具体的な態様では、タンパク質集団におけるタンパク質の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は全部が、ＰＨＡ−Ｅに結合する。
【００９３】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−グリコシル化されており、ここで、グリコシル化構造の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、又は少なくとも９８％が、末端ＧｌｃＮＡｃを含む複合型構造である。
【００９４】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化されており、ここで、タンパク質集団におけるタンパク質の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、複合型Ｎ−グリカンを含む。より具体的には、ｒｈＮａＧｌｕは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化されており、ここで、タンパク質集団におけるタンパク質の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は少なくとも９９％が、複合型Ｎ−グリカンを含み、これらのタンパク質は、シアル酸付加されていないか、又はタンパク質当たり多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する。
【００９５】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、以下を特徴とする：
ａ）低シアル酸（すなわち、低ノイラミン酸）含有率（すなわち、タンパク質は、多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する）又はシアル酸の非存在；並びに
ｂ）下記の１つ又は複数：
（ｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマンノース−６−リン酸残基、
（ｉｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基、
（ｉｉｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の高マンノース構造、及び
（ｉｖ）１つ又は複数の構造１〜２０（表Ａを参照）。
【００９６】
タンパク質集団に関して、タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、以下を特徴とする：
ａ）低シアル酸（すなわち、低ノイラミン酸）含有率（すなわち、タンパク質は、多くとも１、２、３、４、若しくは５個のシアル酸残基を有する）又はシアル酸の非存在；並びに
ｂ）下記の１つ又は複数：
（ｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のマンノース−６−リン酸残基、
（ｉｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基、
（ｉｉｉ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の高マンノース構造、及び
（ｉｖ）１つ又は複数の構造１〜２０（表Ａを参照）。
【００９７】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、１つ又は複数のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化されている。これらのＮ−グリカンの構造は、以下の表Ａに示す構造１〜２０から選択することができる。
【００９８】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化されており、ここで、タンパク質集団におけるタンパク質の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、構造１〜２０（表Ａ）から選択される１つ又は複数のＮ−グリカンを含む。
【００９９】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化されており、ここで、タンパク質集団におけるタンパク質の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％が、構造８、構造１２、構造１５、構造１６、及び構造１７（表Ａ）から選択される１つ又は複数のＮ−グリカンを含む。
【０１００】
特定の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、表Ａの構造８、１２、１５、１６、及び１７の１つ又は複数を有する。より具体的な態様では、タンパク質集団のＮ−グリコシル化部位の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は全部が、表Ａの構造８、構造１２、構造１５、構造１６、及び構造１７の１つ又は複数を含む。
【０１０１】
特定の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、多くとも１、２、３、４、又は５個の末端ガラクトース残基を有する。より具体的な態様では、こうしたタンパク質は、末端ガラクトース残基を含有しない。いくつかの態様では、こうしたタンパク質の集団は、実質的に末端ガラクトース残基を含有しない（すなわち、２％未満のタンパク質が、末端ガラクトースを含有する、タンパク質集団の１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．２％未満、又は０．１％未満のタンパク質が、末端ガラクトースを有する）。いくつかの態様では、こうしたタンパク質の集団におけるグリカンは、実質的にガラクトース残基を含有しない（すなわち、２％未満のグリカンが、末端ガラクトースを含有する、こうしたタンパク質の集団の１％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．２％未満、又は０．１％未満のグリカンが、末端ガラクトースを有する）。
【０１０２】
一部の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、シアル酸を欠失している（すなわち、ノイラミン酸を欠失している；より具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸を欠失している）。いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、マンノース−６−リン酸を含むが、シアル酸付加されていない（すなわち、ノイラミン酸を欠失している；より具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸を欠失している）。さらに具体的には、ｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個のマンノース−６−リン酸残基と、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は多くとも１０個のシアル酸残基を含む。こうしたタンパク質の集団は、平均して、タンパク質１分子当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個のマンノース−６−リン酸残基と、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は多くとも１０個のシアル酸残基を含む。特定の態様では、こうしたタンパク質の集団は、平均して、２〜４、２〜３、又は３〜４個のマンノース−６−リン酸残基を含み、シアル酸を一切含まないか、又は多くとも１個のシアル酸残基を含む。
【０１０３】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−グリコシル化されており、配列番号１の断片、例えば、配列番号１のアミノ酸２４〜７４３の配列の断片を含み、ここで、この断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は少なくとも１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、タンパク質はまた、配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列も含む。
【０１０４】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−グリコシル化されており、配列番号１の断片、例えば、配列番号１のアミノ酸２４〜７４３の配列の断片と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、この断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は少なくとも１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、タンパク質はまた、配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列も含む。
【０１０５】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、５．５〜７．５、又は５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、又は７．５のｐＩを有する。いくつかの態様では、ＢＢＢ外部からの投与（例えば、静脈内又は筋肉内投与）後にＣＮＳ内に蓄積することができるタンパク質のｐＩは、アミノ酸配列だけに基づくタンパク質についての予測ｐＩよりも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１高い。いくつかの態様では、ＢＢＢ外部からの投与（例えば、静脈内又は筋肉内投与）後にＣＮＳ内に蓄積することができるタンパク質のｐＩは、アミノ酸配列だけに基づくタンパク質についての予測ｐＩとほぼ同じである。
【０１０６】
いくつかの態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、ミリストイル化（ミリスチル酸塩の結合）、パルミトイル化（パルミチン酸塩の結合）、イソプレニル化又はプレニル化（イソプレノイド基の付加（例えば、ファルネソール及びゲラニルゲラニオール、すなわち、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）；グリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）（Ｃ末端テイルとのアミド結合によるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）などの膜局在化を促進する翻訳後修飾を有する。
【０１０７】
表Ａでは、中括弧の左側の残基は、中括弧の右側の構造のどの候補位置にあってもよい。Ｐ＝リン酸塩。符号の凡例は、表Ａの下に記載する。
【０１０８】
【表１】
2017531632.tif 000003
【０１０９】
【表２】
2017531632.tif 000004
【０１１０】
【表３】
2017531632.tif 000005
【０１１１】
【表４】
2017531632.tif 000006
【０１１２】
【表５】
2017531632.tif 000007
【０１１３】
符号、略語及び関連（ＳＹＭＢＯＬＳ，ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＬＩＮＫＡＧＥＳ）［Ｄ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，９，（２００９），３７９６］
【０１１４】
本発明はまた、ｒｈＮａＧｌｕの修飾核配列から産生される修飾ｒｈＮａＧｌｕタンパク質の組成物も考慮する。修飾核酸配列としては、機能的に同等のポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換が挙げられる。コードされたタンパク質もまた、サイレント変化を生み出して、機能的に同等のタンパク質又はポリペプチドをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を含有し得る。ＮａＧｌｕの生物活性が保持される限り、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は残基の両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負荷電アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むことができ；正荷電アミノ酸は、リシン及びアルギニンを含むことができ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；フェニルアラニン及びチロシンを含むことができる。
【０１１５】
他の態様では、ｒｈＮａＧｌｕは、追加部分又は第２のペプチドを含有するように、修飾することができる。一部の実施形態では、トランスフェリン受容体リガンド（ＴｆＲＬ）は、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ−又はＣ末端でヒトＮａＧｌｕに結合することができる。一部の実施形態では、トランスフェリン受容体リガンドは、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質のＣ末端に結合することができる。別の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ−又はＣ末端でインスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ２Ｒ）リガンドに融合される。また別の実施形態では、ＮａＧｌｕタンパク質は、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ−又はＣ末端で低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体リガンドに融合される。
【０１１６】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕタンパク質をコードするトランスジーンを含有するトランスジェニック鳥類において産生される。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、トランスジェニック鳥類（例えば、ニワトリ（ヤケイ属（Ｇａｌｌｕｓ））の卵管細胞（例えば、管状腺細胞）において産生される。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、トランスジェニック鳥類の卵管細胞（例えば、管状腺細胞）においてグリコシル化される。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、トランスジェニック鳥類の卵管細胞で産生されるｒｈＮａＧｌｕから得られるグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、トランスジェニック鳥類により産卵される硬質殻卵の内容物から単離及び精製することができる。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕは、トランスジェニック鳥類の卵白から単離及び精製することができる。
【０１１７】
本発明はまた、１つ又は複数の断片及び完全長ｒｈＮａＧｌｕの混合物（例えば、配列番号１に示される２４〜７４３）などのＮａＧｌｕタンパク質の単離された混合物の組成物も包含する。一部の実施形態では、混合物の実質的部分は、リン酸化Ｍ６Ｐを含有する。一部の実施形態では、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも７０％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも８０％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９０％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９５％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９６％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９７％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９８％が、Ｍ６Ｐを含有する。また別の実施形態では、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９９％が、Ｍ６Ｐを含有する。
【０１１８】
任意選択で、鳥類又は哺乳動物発現系（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、若しくはヒト皮膚線維芽細胞株）から産生されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、生物活性を保持しながら、細胞の取り込みのための好ましいグリコシル化パターン（例えば、Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐの量の増加）を達成するために、さらに修飾することができる。米国特許第６，６７９，１６５号明細書、同第７，１３８，２６２号明細書、又は米国特許出願公開第２００９／００２２７０２号明細書（これらの各々の教示内容全体は、参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、他のヒドロラーゼに適用される一般的方法によって、追加の末端Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６ＰをｒｈＮａＧｌｕに導入することができる。例えば、高度リン酸化マンノピラノシルオリゴ糖化合物を、カルボニル反応性基含有化合物で誘導体化した後、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を酸化して、タンパク質の一グリカン構造上にカルボニル（アルデヒド）基を生成し、グリカンを有する酸化ＮａＧｌｕタンパク質を、誘導体化した高度リン酸化マンノピラノシルオリゴ糖化合物と反応させることにより、ヒドラジン結合を有する新規の化合物を形成することができる。
【０１１９】
ベクター
当業者には周知の方法を用いて、ＮａＧｌｕをコードする配列並びに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。こうした技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されており、これらの各々の教示内容全体は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１２０】
様々な発現ベクター／宿主系を使用して、ｒｈＮａＧｌｕをコードする核酸配列を発現させることができる。こうしたものとして、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ若しくはｐＢＲ３２２プラスミド）に感染させた昆虫細胞系；又は哺乳動物細胞培養系（例えば、ｐＴＴ２ベクター）が挙げられる。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌若しくはシグナルペプチドをコードする別のコード領域と結合させてもよく、この領域が、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指令する。シグナル仮説によれば、脊椎動物（例えば、鳥類若しくは哺乳動物）細胞により分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダ配列を有し、これは、粗面小胞体（ＥＲ）を介した成長タンパク質鎖の輸出が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によりＥＲ中に産生されるポリペプチドは、一般にポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが、完全又は「完全長」ポリペプチドから切断されて、分泌又は「成熟」形態のポリペプチドを産生することを認識されよう。いくつかの実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えば、ヒトＮａＧｌｕのＭＥＡＶＡＶＡＡＡＶＧＶＬＬＬＡＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号１の１〜２３）シグナルペプチド、又はそれと作動可能に結合したポリペプチドの分泌を指令する能力を保持する上記配列の機能性誘導体を使用する。あるいは、異種シグナルペプチド（例えば、異種哺乳動物若しくは鳥類シグナルペプチド）、又はそれらの機能性誘導体を用いてもよい。例えば、野生型リーダ配列を、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダ配列で置換してもよい。
【０１２２】
ｒｈＮａＧｌｕの生成
ｒｈＮａＧｌｕをコードするトランスジーンをゲノム中に含有するトランスジェニック鳥類を用いて、ｒｈＮａＧｌｕを生成することができる。一部の実施形態では、トランスジェニック鳥類は、生殖細胞系トランスジェニックニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウである。１つの特に有用な実施形態において、本発明は、ニワトリの卵管で産生させることができるｒｈＮａＧｌｕの生成に関与する。
【０１２３】
鳥類系（例えば、鳥類卵管）における修飾を含む、又は含まないｒｈＮａＧｌｕの生成は、本明細書に記載する方法の範囲に含まれる。一部の実施形態では、非修飾ｒｈＮａＧｌｕは、ヒト細胞による効率的な取り込みを可能にするグリコシル化構造（すなわち、Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐ）を備えた野生型アミノ酸配列（配列番号１の２４〜７４３）を含む。別の実施形態では、修飾タンパク質は、ヒト細胞による効率的な取り込みを可能にするグリコシル化パターン（すなわち、Ｍ６Ｐ又はビス−Ｍ６Ｐ）を有するｒｈＮａＧｌｕ融合タンパク質であってよい。
【０１２４】
宿主細胞
本発明はまた、限定はしないが、細胞培養物（例えば、鳥類細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＯＳ細胞）、酵母、細菌、及び植物などの任意の有用なタンパク質発現系で産生されるｒｈＮａＧｌｕも考慮する。
【０１２５】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、又は発現されたｒｈＮａＧｌｕを所望の様式でプロセシングするその能力について選択することができる。ｒｈＮａＧｌｕのポリペプチドのこうした修飾として、限定はしないが、グリコシル化、リン酸化、又は脂質化が挙げられる。本発明の融合タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、特定の細胞機構及びそうした翻訳後活性に特有の機序を有する様々な宿主細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒーラ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷ１３８などを選択することができる。本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として、鳥類腫瘍細胞株も考慮される。有用な鳥類細胞株（例えば、鳥類卵管腫瘍細胞株）の例は、米国特許出願公開第２００９／０２５３１７６号明細書（その教示内容全体は、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０１２６】
医薬組成物
本明細書はまた、単離され、実質的に精製されたｒｈＮａＧｌｕ又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物も特徴とする。ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、例えば、医薬製剤の一部として、１つ又は複数の担体を用いて、又は担体なしで投与することができる。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、且つそのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。構成分子を含め、こうした担体を含む組成物は、公知の従来の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．を参照）（その教示内容全体は、参照により本明細書に組み込む）により製剤化される。担体は、希釈剤を含んでもよい。一部の実施形態では、製剤用担体は、液体であってよく、タンパク質は、溶液の形態であってもよい。製剤用担体は、蝋、脂肪、又はアルコールであってよい。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、粉末、凍結乾燥粉末、又は錠剤の形態をした固体であってもよい。一部の実施形態では、担体は、リポソーム又はマイクロカプセルを含んでもよい。
【０１２７】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を含む医薬組成物は、さらにバッファーを含む。バッファーの例として、酢酸、リン酸、クエン酸及びグルタミン酸バッファーが挙げられる。また、例示的バッファーとして、クエン酸リチウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カルシウム、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、マレイン酸リチウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン酸カリウム、マレイン酸カルシウム、酒石酸リチウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸カルシウム、コハク酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸カルシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、並びにこれらの混合物も挙げられる。一部の実施形態では、バッファーは、クエン酸三ナトリウム二水和物である。一部の実施形態では、バッファーは、クエン酸一水和物である。一部の実施形態では、医薬組成物は、クエン酸三ナトリウム二水和物とクエン酸一水和物である。
【０１２８】
一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を含む医薬組成物は、安定剤をさらに含む。例示的安定剤として、アルブミン、トレハロース、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カルシウムなどの塩、凍結乾燥防止剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒト血清アルブミンを含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、医薬組成物に界面活性剤を添加するのが望ましい。例示的界面活性剤として、以下のものが挙げられる：ポリソルベート（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０又は８０）などのノニオン性界面活性剤；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウレル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、又は二ナトリウムメチルオフェイル−タウレート；並びにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）。典型的に、添加する界面活性剤の量は、タンパク質の凝集を低減すると共に、粒子状物質又は泡立ちの形成を最小限に抑える量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％又は約０．００５〜０．０１％）の濃度で、製剤中に存在してもよい。特に、界面活性剤は、約０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、又は０．５％などの濃度で、製剤中に存在してもよい。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載する好適な医薬組成物は、特に、凍結乾燥製剤の場合、１種又は複数種の充填剤をさらに含んでもよい。「充填剤」は、凍結乾燥混合物に嵩を加えると共に、凍結乾燥ケークの物理構造に寄与する化合物である。例えば、充填剤は、凍結乾燥ケークの外観を改善し得る（例えば、ほぼ均質な凍結乾燥ケーク）。好適な充填剤として、限定はしないが、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトール、グリシン、スクロース、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。充填剤の例示的濃度は、約１％〜約１０％（例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、及び１０．０％）である。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。医薬組成物は、希釈剤を用いて再構成する注射用の滅菌凍結乾燥粉末の形態であってもよい。希釈剤は、注射用水、注射用静菌水、又は滅菌食塩水であってよい。凍結乾燥粉末は、融合タンパク質の溶液を凍結乾燥して、乾燥形態のタンパク質を生成することにより、製造してもよい。当技術分野で公知の通り、凍結乾燥タンパク質は、一般に、高い安定性を有し、溶液状のタンパク質よりも貯蔵寿命が長い。
【０１３１】
医薬製剤は、非経口投与に好適なものを含む。好ましくは、本明細書に記載する医薬製剤は、静脈内投与に好適なものを含む。製剤は、適切であれば、個別の投薬単位として好都合に提供することができ、薬学の分野で公知の方法のいずれかによって調製することができる。医薬製剤を製造する方法は、典型的に、治療用タンパク質を液体担体若しくは微粉砕した固体担体又はその両方と結合させた後、必要に応じて、生成物を所望の製剤に造形するステップを含む。
【０１３２】
本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、ＩＶ投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は連続的注入による）用に製剤化して、保存料を添加したアンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入又は多数回用量容器として提供することができる。治療用タンパク質は、例えば、皮下注射、筋肉内注射、及び静脈内（ＩＶ）注入又は注射により注射することができる。
【０１３３】
好ましい実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、任意の有用な方法によるＩＶ注入によって静脈内投与する。一例では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、末梢系統を介した静脈内注入によって投与することができる。別の例では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、末梢穿刺中心静脈カテーテルを介した静脈内注入によって投与することができる。別の例では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、静脈血管アクセスポートに接続された携帯型注入装置により促進される静脈内注入によって投与することができる。静脈内注入の一実施形態では、熟練した医師により決定される通りに、注入しようとする薬剤の量及び患者の以前の注入関連反応歴に応じて、１〜８時間にわたり薬剤を投与する。一部の実施形態では、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、ＩＶ注射により静脈内投与する。
【０１３４】
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、注入によって投与し、注入は、例えば、３０分〜１０時間という長時間にわたって実施することができる。従って、注入は、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、又は約５時間といった時間にわたって実施することができる。注入はまた、様々な速度で実施してもよい。従って、例えば、注入速度は、毎時約１ｍＬ〜毎時約２０ｍＬであってよい。一部の実施形態では、注入速度は、毎時５ｍＬ〜毎時１０ｍＬである。一部の実施形態では、注入速度は、毎時１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＬである。一部の実施形態では、注入速度は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／時である。一部の実施形態では、注入速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０又は約３ｍｇ／ｋｇ／時である。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１３５】
治療用タンパク質は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態を採ることができ、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤用剤を含有し得る。ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、滅菌固体の無菌単離により、又は溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態の形態であってよく、これは、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌の発熱性物質除去蒸留水で構成される。
【０１３６】
生体分布及び生体利用可能性
様々な実施形態において、一旦標的組織に送達されると、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、細胞内で局在化される。例えば、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞などのニューロン）の軸索、リソソーム、ミトコンドリア又は液胞に局在化し得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載するｒｈＮａＧｌｕは、トランスロケーションダイナミクスを示し、これによって、ｒｈＮａＧｌｕは、血管周囲腔内に移動する（例えば、脈動促進対流機構により）。さらに、投与されるタンパク質又は酵素と神経学フィラメントの結合に関する活性軸索輸送機構は、中枢神経系のより深部の組織への本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕタンパク質の分布に寄与するか、あるいはそうでなければ分布を促進する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明に従って送達される本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕは、本明細書に記載する様々な標的組織において、治療又は臨床的に有効なレベル若しくは活性を達成し得る。本明細書に記載する通り、治療又は臨床的に有効なレベル若しくは活性は、標的組織に治療効果を付与するのに十分なレベル若しくは活性である。治療効果は、客観的（すなわち、何らかのテスト若しくはマーカにより測定可能）又は主観的（すなわち、被験者が、効果の徴候を示すか、又は効果を感じる）のいずれであってもよい。例えば、治療又は臨床的に有効なレベル若しくは活性は、標的組織の疾患（例えば、ＧＡＧ蓄積）に関連する症状を改善するのに十分な酵素レベル又は活性であってよい。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明に従って送達される本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕは、標的組織の対応ＮａＧｌｕ酵素の正常レベル又は活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の酵素レベル又は活性を達成し得る。一部の実施形態では、本発明に従って送達される本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕは、対照（例えば、処置をしていない内因性レベル又は活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍若しくは１０倍増大した酵素レベル又は活性を達成し得る。一部の実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、標的組織において、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ若しくは６００ｎｍｏｌ／時／ｍｇという高い酵素レベル又は活性を達成し得る。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１３９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、腰部をターゲティングするのに特に有用である。一部の実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、腰部において、少なくとも５００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、若しくは１０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇという高い酵素レベル又は活性を達成し得る。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１４０】
一般に、本発明に従って送達される治療薬（例えば、ｒｈＮａＧｌｕ）は、脳、脊髄、及び末梢器官のＣＳＦ及び標的組織において、十分に長い半減期を有する。一部の実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも約３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、最大３日、最大７日、最大１４日、最大２１日又は最大１ヵ月の半減期を有し得る。一部の実施形態では、一部の実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、投与から１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間、又は１週間後に、ＣＳＦ若しくは血流中に検出可能なレベル又は活性を保持し得る。検出可能なレベル又は活性は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて決定することができる。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、投与後（例えば、被験者への医薬組成物の投与後１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、又は３０分未満）に被験者のＣＮＳ組織及び細胞中に少なくとも３０μｇ／ｍＬの濃度を達成する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達されるｒｈＮａＧｌｕは、上記の被験者への投与後（例えば、被験者への上記医薬組成物の投与後１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、又は３０分未満）に被験者の標的組織又は細胞中に少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも７μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、若しくは少なくとも０．５μｇ／ｍＬの濃度を達成する。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１４２】
サンフィリポ症候群Ｂ型における血液脳関門
本明細書で使用されるとき、用語「インタクトなＢＢＢ」は、年齢相応の健常な被験者のインタクトなＢＢＢと実質的に同様に、完全性が損なわれておらず、溶質を排除するように機能する（例えば、約４００Ｄａ超の分子量を有する物質が自由拡散によりＢＢＢを通過するのを防止する）ＢＢＢを意味する。ＢＢＢ完全性を評価する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｃｈｌｉｅｐ及びＦｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２１８，７７−９６（１９７８）；Ｓｋｏｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．５０：９６６−９７１（１９９８）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ，２４：６９５−７００（２００６）；及びＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，３２：２１８３−２１８９（２０１１）；Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．６８（２１）：１８０９−１８１４（２００７）；Ｌｉｎｋ及びＴｉｂｂｌｉｎｇ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．３７（５）：３９７−４０１（１９７７)；Ｔｉｂｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．３７（５）：３８５−９０（１９７７）；並びにＷａｄａ，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．３７（６）：５０９−１３（１９９８）を参照）。例えば、ＢＢＢ完全性は、ＭＰＳＩＩＩＢ被験者において、ＣＳＦ中のアルブミン及び／又はＩｇＧレベルと血清中のレベルの比を推定することにより評価することができる。手短には、血液サンプルは、同じ来院時に腰椎穿刺として採取し、ＣＳＦと共に分析して、例えば、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｗａｄａ，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．３７（６）：５０９−１３（１９９８）；及びＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３２：２１８３−２１８９（２０１１）に記載の通り）を用いて、アルブミン及びＩｇＧ抗体比を定量する。ＣＳＦ／血清アルブミン指数（ＣＳＦ／血清アルブミン比、ＣＳＦ／血清ＡＩ及びＣＳＦ−ＡＩとも呼ばれる）は、次のように計算する：ＣＳＦ／血清アルブミン指数＝（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）×１０００（ｍｇ／Ｌ濃度）。ＣＳＦ／血清アルブミン指数を用いて、ヒト被験者における血液脳関門の完全性を評価することができる。
【０１４３】
ＢＢＢ完全性、又はＢＢＢ障害のレベルは、例えば、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、表Ｂに示すＳｃｈｌｉｅｐ及びＦｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ（Ｓｃｈｌｉｅｐ及びＦｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２１８，７７−９６（１９７８））の基準を用いて決定されるＣＳＦ／血清アルブミン指数（ＣＳＦ／血清ＡＩ）を使用して、並びに表Ｂに示すようにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ２９／６：１０２８−１０３０（１９８３）に記載される通りに、推定することができる：
【０１４４】
【表６】
2017531632.tif 000008
【０１４５】
従って、本発明を用いて、有意な障害がない（及び９以下のＣＳＦ／血清ＡＩ）か、若しくは軽度以下の障害（約１４．３以下のＣＳＦ／血清ＡＩ）；又は中度以下のＢＢＢ障害（約３３．３以下のＣＳＦ／血清ＡＩ）；又は重度以下のＢＢＢ障害（約１００以下のＣＳＦ／血清ＡＩ）を有する患者のＣＮＳにｒｈＮａＧｌｕを送達することができ、ここで、いずれの場合も、患者は、ＭＰＳＩＩＩＢの長期酵素補充療法を受療中である。これに関連して用いられるとき、「約」は、±０．５の変動を可能にする。
【０１４６】
Ｅｅｇ−Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ．１９８１  Ｍａｒ；７０（２）：１６７−７０により報告された研究では、ＣＳＦ及び血清中のＢＢＢ機能を表すタンパク質変数が、年齢別に細分されている。
【０１４７】
【表７】
2017531632.tif 000009
【０１４８】
結果は、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。表Ｃに示すように、血液脳関門機能を表すＣＳＦ／血清ＡＩは、年齢と共に増加する。ＣＳＦ／血清ＡＩ（平均＋２Ｓ．Ｄ．）の上限値は、０．５〜５歳の患者の場合、４．０であり、６〜１５歳（例えば、７歳）の患者の場合、４．９であり、１６〜２０歳の患者の場合、６．７であり、２１〜３０歳の患者の場合、６．５であった。従って、本発明のいくつかの実施形態では、約４．０以下のＣＳＦ／血清ＡＩを有する０．５〜５歳、約４．９（例えば、５）以下のＣＳＦ／血清ＡＩを有する６〜１５歳、約６．７（例えば、７）以下のＣＳＦ／血清ＡＩを有する１６〜２０歳、約６．５（例えば、７）以下のＣＳＦ／血清ＡＩを有する２１〜３０歳の患者（いずれの場合も、患者は、ＭＰＳＩＩＩＢの長期酵素補充療法を受療中である）のＣＮＳに、ｒｈＮａＧｌｕを静脈内投与により送達する。
【０１４９】
一部の実施形態では、アルブミンの代わりにＩｇＧレベルを測定する；ＣＳＦ／血清ＩｇＧ比＝ＣＳＦＩｇＧ（ｍｇ／ｄＬ）血清ＩｇＧ（ｇ／ｄＬ）。正常なＣＳＦ  ＩｇＧ比は、３〜８の範囲内であり；本方法を用いて、１０未満、又は８未満のＣＳＦ／血清ＩｇＧ比を有する被験者のＣＮＳにｒｈＮａＧｌｕを送達することができる。例えば、Ｍｕｎｄｔ及びＳｈａｎａｈａｎ，Ｇｒａｆｆ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０１０）を参照されたい。あるいは、ＣＳＦ  ＩｇＧ指数は、（ＣＳＦ  ＩｇＧ／ＣＳＦアルブミン）／（血清ＩｇＧ／血清アルブミン）として計算され、ここで、正常なレベルは、約０．８５未満であり；本方法を用いて、約０．９未満、又は約０．８５未満、又は約０．７未満、又は約０．６未満、又は約０．５未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数を有する被験者のＣＮＳにｒｈＮａＧｌｕを送達することができる。表Ｃにも示すように、ＣＳＦ  ＩｇＧ指数（平均＋２Ｓ．Ｄ．）の上限値は、０．５〜５歳の患者の場合、０．６２であり、６〜１５歳の患者の場合、０．６８であり、１６〜２０歳の患者の場合、０．６４であり、２１〜３０歳の患者の場合、０．６３であった。従って、本発明のいくつかの実施形態では、約０．７以下、例えば、約１．０未満及び約０．５未満のＣＳＦ  ＩｇＧ指数を有する０．５〜３０歳、例えば、０．５〜５歳、６〜１５歳（例えば、約７歳）、１６〜２０歳、及び２１〜３０歳の患者（いずれの場合も、患者は、ＭＰＳＩＩＩＢの長期酵素補充療法を受療中である）のＣＮＳに、ｒｈＮａＧｌｕを静脈内投与により送達する。
【０１５０】
一部の実施形態では、被験者は、ＣＳＦ／血清ＩｇＧ指数、ＣＳＦ  ＩｇＧ指数又はＣＳＦ／血清アルブミン指数により測定される通り、健常な被験者のＢＢＢ完全性の少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又はそれ以上を有する。例示的な正常値は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができ、例えば、Ｅｅｇ−Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ．１９８１  Ｍａｒ；７０（２）：１６７−７０に記載のものを挙げることができる。
【０１５１】
上記に代わり、又はそれに加えて、ＢＢＢ完全性は、ＭＰＳＩＩＩＢ被験者において、より直接的に、例えば、非侵襲性イメージング法を用いて評価することができる。例えば、ＢＢＢ完全性は、ＢＢＢ移行定数（Ｋｔｒａｎｓ）を決定することにより評価することができ、これは、ＭＰＳＩＩＩＢ被験者において、ダイナミック造影強調ＭＲ画像法（ＤＣＥ−ＭＲＩ）を用いて、例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、推定することができる（例えば、Ｎａｇａｒａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６８６：１９３−２１２（２０１１）；Ｈａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ．２８（３）：５８８−９７（２００８）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１６２（１）：１３４−４２  ２０１２）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３２：２１８３−２１８９（２０１１）を参照）。好ましい実施形態では、標準的造影剤（例えば、ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）又はゴドブトロールなどのガドリニウムベースの造影剤）を使用する。血液から脳組織への造影剤の移行速度により表されるＢＢＢ透過性は、例えば、Ｔｏｆｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  １０：２２３−２３２（１９９９）の標準モデル；拡張型Ｔｏｆｔｓモデル（ＥＴＭ）（Ｓｏｕｒｂｒｏｎ及びＢｕｃｋｌｅｙ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６６（３）：７３５−７４５（２０１１），Ｔｏｆｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，７（１）：９１−１０１（１９９７）、並びにＢｕｃｋｌｅｙ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４７（３）：６０１−６０６（２００２）を参照）；又はＰａｔｌａｋアルゴリズム（Ｐａｔｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３（１）：１−７（１９８３）；Ｎａｇａｒａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６８６：１９３−２１２（２０１１））に基づくＭＲ画像（例えば、Ｔ１強調画像）から計算される。また、Ｂｅｒｇａｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ＩＳＲＮ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３（２０１３），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９０５２７９，６ページ（ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１３／９０５２７９から入手可能）；Ｓｏｕｒｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６２（１）：２０５−２１７（２００９）も参照されたい。他の方法を用いてＫｔｒａｎｓを決定することもでき、例えば、Ｔ１及びＴ１ｓａｔの変化の評価を含む磁化移動ＭＲＩ（ＭＴ−ＭＲＩ）を用いた方法があり、例えば、Ｎａｇａｒａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６８６：１９３−２１２（２０１１）を参照されたい。特に好ましい方法は、標準Ｔｏｆｔｓモデルである。当業者であれば理解されるように、Ｋｔｒａｎｓの閾値（それを下回れば、被験者がＢＢＢ完全性を有するとみなすこ��ができる）は、使用するイメージング法、使用する分析法、及び使用する造影剤に応じて変動し得る。従って、本方法では、被験者において決定されるＫｔｒａｎｓの値は、同じイメージング法、分析法、及び造影剤を用いて決定された基準値と比較する必要がある。当業者であれば、こうした基準値を容易に決定することができよう。好適な基準値としては、中央値若しくは平均値などの単一カットオフ（閾値）値、あるいは、Ｋｔｒａｎｓに関して他のセグメントとは統計的に異なると決定された臨床試験集団の上位若しくは下位四分位、三分位、又はその他のセグメントを含み得る。これは、信頼区間などのカットオフ（又は閾値）値の範囲であってもよい。これは、例えば、１つの規定群のＫｔｒａｎｓが、別の規定群のＫｔｒａｎｓよりもある倍率で（例えば、約２倍、４倍、８倍、１６倍若しくはそれ以上）高い、又は低いといった、比較群に基づいて確立することができる。これは、例えば、被験者（例えば、対照被験者）の集団が均等（若しくは非均等）に、低Ｋｔｒａｎｓ群、中Ｋｔｒａｎｓ群、高Ｋｔｒａｎｓ群などの群、又は四分位（最下位四分位は、最低Ｋｔｒａｎｓを有する被験者であり、最高位四分位は、最高Ｋｔｒａｎｓを有する被験者である）、又はｎ−四分位（すなわち、ｎ個の規則的な間隔）（ｎ−四分位の最も低いものは、最低Ｋｔｒａｎｓを有する被験者であり、ｎ−四分位の最も高いものは、最高Ｋｔｒａｎｓを有する被験者である）に区分される範囲であってよい。
【０１５２】
Ｓｏｎｇら（前掲）に記載される方法を用いる一部の実施形態では、０．１／分−１未満のＫｔｒａｎｓを基準値として用いてもよい。
【０１５３】
本明細書に記載する方法は、被験者のＣＳＦ中のＧＡＧ／ヘパラン硫酸のレベルの低下、例えば、被験者を治療する上で十分な低下をもたらす。
【０１５４】
一部の実施形態では、治療は、サンフィリポ症候群Ｂ型患者の神経障害の部分的若しくは完全な緩和、改善、軽減、阻害、発症の遅延、重症度及び／又は発生率の低下を指す。本明細書で使用されるとき、用語「神経障害」は、中枢神経系（例えば、脳及び脊髄）の障害に関連する様々な症状を含む。神経障害の症状として、中でも、例えば、発達遅滞、段階的認知障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能障害、活動過多、攻撃性及び／又は睡眠障害が挙げられる。
【０１５５】
従って、一部の実施形態では、治療は、様々な組織におけるリソソーム（例えば、ＧＡＧの）蓄積の低減を指す。一部の実施形態では、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン、及び／又は末梢標的組織におけるリソソーム蓄積の低減を指す。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、リソソーム蓄積は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍低減する。一部の実施形態では、リソソーム蓄積は、ＬＡＭＰ−１染色により決定される。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１５６】
一部の実施形態では、治療は、ニューロン（例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロン）の空胞変性の低減を指す。いくつかの実施形態では、ニューロンの空胞変性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、空胞変性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍低減する。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１５７】
一部の実施形態では、治療は、様々な組織におけるＮａＧｌｕ酵素活性の増大を指す。一部の実施形態では、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン及び／又は末梢標的組織におけるＮａＧｌｕ酵素活性の増大を指す。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％又はそれ以上増大する。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍増大する。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ酵素活性は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、若しくは６００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ又はそれ以上である。一部の実施形態では、ＮａＧｌｕ酵素活性は、腰部において増大する。一部の実施形態では、腰部において増大したＮａＧｌｕ酵素活性は、少なくとも約２，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、又はそれ以上である。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明に従う治療によって、ＮａＧｌｕ関連疾患に関連する１つ又は複数の病理学的若しくは生物学的マーカの存在、あるいは、それらの蓄積の低減（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上の低減）又は完全な排除が達成される。こうした低減又は排除は、ＣＮＳの細胞、体液及び組織（例えば、ＣＳＦ、ニューロン及び希突起膠細胞）において特に明らかとなり得る。例えば、一部の実施形態では、被験者への投与後、本発明の医薬組成物は、被験者のＣＳＦにおけるバイオマーカ肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又は被験者のＣＮＳ細胞及び組織（例えば、大脳皮質、小脳、尾状核及び被殻、白質及び／又は視床）におけるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）の蓄積の低減を立証又は達成する。ＬＡＭＰ１は、リソソーム膜に高度に発現される糖タンパク質であり、その存在は、リソソーム蓄積症を有する多くの患者において増加する（Ｍｅｉｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）４３：１３２５−１３３５）。そのため、リソソーム蓄積症の患者におけるＬＡＭＰ１の存在又は非存在（例えば、ＬＡＭＰ染色により決定される通り）は、リソソーム活性についての有用な指標、並びにリソソーム蓄積症の診断及びモニタリング両方のマーカを提供し得る。
【０１５９】
従って、本発明の一部の実施形態は、ＮａＧｌｕ関連疾患に関連する１つ又は複数の病理学的又は生物学的マーカ（例えば、ＨＧＦ）の存在又は蓄積を低減するか、あるいはそうでなければ排除する方法に関する。同様に、本発明の一部の実施形態は、リソソーム蓄積症に関連する１つ又は複数の病理学的又は生物学的マーカ（例えば、ＬＡＭＰ１及びＨＧＦ）の分解（若しくは分解速度）を増大する方法に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ｒｈＮａＧｌｕによる長期酵素補充療法を受療中のムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ型のヒト患者における中枢神経系（ＣＮＳ）を治療する方法を提供し、この方法は、ＣＳＦ中のＨＧＦレベルの再蓄積を抑制又は阻止するための治療有効量のｒｈＮａＧｌｕを前記患者に静脈内投与するステップを含み、ここで、前記患者は、インタクトなＢＢＢを有し、静脈内投与によって、ＣＳＦ中のＨＧＦレベルの再蓄積が阻止される。
【０１６０】
一部の実施形態では、治療は、認知能力損失の進行の低減を指す。いくつかの実施形態では、認知能力損失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、治療は、発達遅滞の低減を指す。いくつかの実施形態では、発達遅滞は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上低減する。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１６１】
一部の実施形態では、治療は、生存（例えば、生存期間）の増加を指す。例えば、治療によって、患者の平均余命の増加をもたらすことができる。一部の実施形態では、本発明の治療により、類似疾患を有し、治療を受けていない１又は複数の対照個体の平均余命と比較して、患者の平均余命の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％超又はそれ以上の増加がもたらされる。一部の実施形態では、本発明の治療により、類似疾患を有し、治療を受けていない１又は複数の対照個体の平均余命と比較して、患者の平均余命の約６ヵ月、約７ヵ月、約８ヵ月、約９ヵ月、約１０ヵ月、約１１ヵ月、約１２ヵ月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年超又はそれ以上の増加がもたらされる。一部の実施形態では、本発明の治療によって、患者の長期生存がもたらされる。本明細書で使用されるとき、用語「長期生存」は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年超、若しくはそれ以上の生存期間又は平均余命を指す。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１６２】
本明細書で使用されるとき、用語「改善する」、「増加する」又は「低減する」は、対照に対する値を示す。一部の実施形態では、好適な対照は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載する治療の開始前の同じ個体における測定値、又は本明細書に記載する治療の非存在下の対照個体（若しくは複数の対照個体）における測定値である。「対照個体」は、サンフィリポ症候群Ｂ型に罹患した個体で、治療を受ける個体とほぼ同じ年齢及び／又は同じ性別の個体である（被治療個体及び対照個体における疾患の病期が同等であることを確実にするために）。
【０１６３】
治療を受ける個体（「患者」又は「被験者」とも呼ばれる）は、サンフィリポ症候群Ｂ型を有するか、又はサンフィリポ症候群Ｂ型を発症する可能性を有する個体（胎児、乳幼児、小児、青年、又は成人）である。個体は、残留する内因性ＮａＧｌｕ発現及び／若しくは活性を有していてもよいし、又は測定可能な活性がなくてもよい。例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型を有する個体は、正常なＮａＧｌｕ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＮａＧｌｕ発現レベルを有し得る。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【０１６４】
一部の実施形態では、個体は、疾患を有すると最近診断された個体である。典型的には、早期治療（診断後可能な限り早期に開始する治療）は、疾患の作用を最小限にすると共に、治療の利益を最大限にするために重要である。
【０１６５】
併用療法
十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノース及びリン酸マンノース（すなわちＭ６Ｐ））を含有するｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、単独で又は組み合わせて使用して、ＮａＧｌｕ関連疾患（例えば、サンフィリポ症候群Ｂ型）を治療することができる。本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、単独で、又は別の処置、例えば、外科的処置、若しくは薬剤、例えば、治療薬と組み合わせて使用できることは理解すべきであり、別の処置又は薬剤は、意図する目的のために当業者によって選択される。例えば、別の処置又は薬剤は、本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質の治療対象である疾患又は病状を治療する上で有用なものとして当技術分野で認識されている治療処置又は薬剤であってよい。別の処置又は薬剤は、治療組成物に有益な性質を付与する薬剤、例えば、組成物の粘度に影響を与える薬剤であってもよい。
【０１６６】
また、本発明の範囲に含まれる組み合わせは、意図する目的に有用な組み合わせであることも理解すべきである。以下に記載する薬剤及び処置は、例示を目的とし、本発明の限定を意図するものではない。本発明の一部である組み合わせは、本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質と、以下のリストから選択される少なくとも１つの別の薬剤又は処置であってよい。また、組み合わせは、形成される組成物がその意図する機能を果たすことができるものであれば、２つ以上の別の薬剤又は処置、例えば、２つ又は３つの別の薬剤を含んでもよい。
【０１６７】
併用療法は、外科的処置、遺伝子療法、又は酵素補充療法を含み得る。さらに、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、１つ又は複数の別の治療薬、例えば、非分解基質の蓄積を阻止若しくは抑制することができる他の組換えタンパク質又は抗体又は薬物（例えば、基質合成抑制療法）と共製剤化することもできる。
【０１６８】
１つ又は複数の実施形態では、併用療法は、以下にさらに詳しく述べる通り、免疫抑制剤との共投与を含んでもよい。例えば、アナフィラキシー反応若しくは有害な免疫応答が予想されるか、又は患者により経験されている場合には、限定はしないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキセート、ＩＬ−２受容体に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、ＴＮＦ−αに対する抗体又は融合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、若しくはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（例えば、アバタセプト）、抗ＯＸ−４０Ｌ抗体などの免疫抑制剤を、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質などの組換えヒトタンパク質の投与前、投与中、又は投与後に投与することもできる。
【０１６９】
免疫原性
本発明の医薬組成物は、その忍容性を特徴とする。本明細書で使用されるとき、用語「忍容できる」及び「忍容性」は、本発明の医薬組成物が投与される被験者において有害な反応を誘発しないか、あるいは、そうした組成物が投与される被験者において重篤な有害反応を誘発しない医薬組成物の能力を指す。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、組成物が投与される被験者による良好な忍容性を示す。
【０１７０】
一般に、本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質の投与は、被験者に重度の有害作用をもたらさない。本明細書で使用されるとき、重度の有害作用は、限定はしないが、実質的な免疫応答、毒性、又は死亡を誘発する。本明細書で使用されるとき、用語「実質的な免疫応答」は、適応Ｔ細胞免疫応答などの重度又は重篤な免疫応答を指す。
【０１７１】
従って、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法（すなわち、本方法の前処置／プレコンディショニングとして又は本方法と同時に用いられる任意の免疫抑制剤療法）を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法は、治療対象の被験者における免疫寛容誘導を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を用いた被験者の前処置又はプレコンディショニングを含まない。
【０１７２】
しかしながら、一部の実施形態では、被験者は、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕを投与された後、免疫応答を増大させる。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＮａＧｌｕを受ける被験者を酵素補充療法に対して耐性にするのが有用となり得る。免疫寛容は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて誘導することができる。例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）などのＴ細胞免疫抑制剤及びアザチオプリン（Ａｚａ）などの抗増殖剤の初期３０〜６０日レジメンを低用量のｒｈＮａＧｌｕの毎週ＩＶ注入と併用してもよい。
【０１７３】
本明細書に記載する併用療法と一緒に、当業者には周知の任意の免疫抑制剤を使用してもよい。こうした免疫抑制剤として、限定はしないが、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、及びエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ剤が挙げられる（例えば、Ｍｏｄｅｒ，２０００，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４，２８０〜２８４；Ｎｅｖｉｎｓ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２，１４６−１５０；Ｋｕｒｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１，２２４−２３０；Ｉｄｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９５，２１７−２２６；Ｐｏｔｔｅｒｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５，１５９−１７４；Ｓｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９，１−２４；Ｇａｚｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５，６８９−６９６；Ｈｅｎｒｙ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３，２０９−２２０；Ｇｕｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０，１３６６−１３８０；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９，１２７５−１２８３を参照）。また、抗ＩＬ２受容体（α−サブユニット）抗体ダクリズマブ（例えば、Ｚｅｎａｐａｘ（商標））（移植患者に有効であることが実証されている）も免疫抑制剤として使用することができる（例えば、Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｒｕｇｓ  ５８，１０２９−１０４２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，６１３−６１９；Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．１，５５−６０；Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  １９，１  １２７−１  １３７；Ｅｃｋｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９，１８６７−１８７２；Ｅｋｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１３，１５１−１５９を参照）。別の免疫抑制剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：抗ＣＤ２（Ｂｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８，１５８８−１５９６；Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９２，４０６６−４０７１）、抗ＣＤ４（Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４３，６３８−６４４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２，１３８−１５２）、及び抗ＣＤ４０リガンド（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０，１０８−１２５；Ｃｈｉｒｍｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３３４５−３３５２；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１２３０−１２３５）。
【０１７４】
他の実施形態では、本発明は、本発明のＮａＧｌｕタンパク質と、ＮａＧｌｕタンパク質に対する免疫応答を低減又は抑制する薬剤、例えば、免疫抑制剤との共投与を含む方法を包含する。例えば、アナフィラキシー反応若しくは有害な免疫応答が予想されるか、又は患者により経験されている場合には、限定はしないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキセート、ＩＬ−２受容体に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、ＴＮＦ−αに対する抗体又は融合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、若しくはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（例えば、アバタセプト）、抗ＯＸ−４０Ｌ抗体などの免疫抑制剤を、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質などの組換えヒトタンパク質の投与前、投与中、又は投与後に投与することもできる。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質の投与によって引き起こされ得るあらゆる潜在的アナフィラキシー反応を最小限にするか、又は予防するための前処置を提供する。一部の実施形態では、潜在的アナフィラキシー反応を予防するために、抗ヒスタミン剤としても知られるＨ−１受容体アンタゴニスト（例えば、ジフェンヒドラミン）を患者に投与する。一部の実施形態では、Ｈ−１受容体アンタゴニストは、体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与する。例えば、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当たり約５ｍｇの用量で投与する。一部の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与する。一部の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約５ｍｇの用量で投与する。例えば、用量は、体重１キログラム当たり１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、又は５ｍｇであってよい。抗ヒスタミン剤は、任意の有用な方法により投与することができる。一部の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、静脈内投与する。別の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、薬学的に許容されるカプセルで投与する。
【０１７６】
抗ヒスタミン剤の投与は、本発明の組換えＮａＧｌｕの投与前に行うことができる。一部の実施形態では、Ｈ−１受容体アンタゴニストは、組換えＮａＧｌｕの投与の約１０〜約９０分前、例えば、約３０〜約６０分前に投与する。Ｈ−１受容体アンタゴニストは、静脈血管アクセスポートに接続された携帯型装置を用いて投与することができる。一部の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の約９０分前に投与する。一部の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の約１０〜約６０分前に投与する。別の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の約２０〜約４０分前に投与する。例えば、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の２０、２５、３０、３５、又は４０分前に投与することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、投与される抗ヒスタミン剤は、ジフェンヒドラミンである。任意の有用な抗ヒスタミン剤を用いることができる。こうした抗ヒスタミン剤として、限定はしないが、クレマスチン、ドキシラミン、ロラチジン、デスロラチジン、フェキソフェナジン、フェニラミン、セチリジン、エバスチン、プロメタジン、クロルフェニラミン、レボセチリジン、オロパタジン、クエチアピン、メクリジン、ジメンヒドリナート、エンブラミン、ジメチデン、及びデキスクロロフェニラミンが挙げられる。
【０１７８】
別の実施形態では、静脈内注入に関して、ランプアップ（ｒａｍｐ−ｕｐ）プロトコルを用いて輸液を投与することにより、アナフィラキシー反応の可能性を低減することができる。これに関連して、ランプアッププロトコルは、薬剤の注入に対する患者の感受性を減じるために、注入過程で注入速度をゆっくりと高めることを指す。
【０１７９】
キット
本発明はさらに、本発明のｒｈＮａＧｌｕを含み、その再構成（凍結乾燥されている場合）及び／又は使用のための指示書を賦与するキット又は他の製品を提供する。キット又は他の製品は、ＩＶ投与に有用な容器、カテーテル及びその他の製品、デバイス若しくは装置を含み得る。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、注射器（例えば、プレフィルドシリンジ）、アンプル、カートリッジ、レザバー、又はリオ−ジェクト（ｌｙｏ−ｊｅｃｔ）が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されたものでよい。一部の実施形態では、容器は、プレフィルドシリンジである。好適なプレフィルドシリンジとして、限定はしないが、焼成シリコーンコーティングを有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器、又はシリコーンを含まないプラスチック樹脂注射器が挙げられる。
【０１８０】
典型的には、容器に貼られた、又は付随するラベルで、使用及び／又は再構成についての指示を示すことができる。例えば、ラベルは、前述したタンパク質濃度に製剤を再構成することを示すものであってもよい。ラベルはさらに、製剤が、静脈内投与に有用であるか、又は静脈内投与用に意図されることを示してもよい。一部の実施形態では、容器は、補充酵素（例えば、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質）を含む安定な製剤の単回用量を含有してもよい。様々な実施形態において、安定な製剤の単回用量は、約１５ｍＬ、１０ｍＬ、５．０ｍＬ、４．０ｍＬ、３．５ｍＬ、３．０ｍＬ、２．５ｍＬ、２．０ｍＬ、１．５ｍＬ、１．０ｍＬ、又は０．５ｍＬ未満の量で存在する。あるいは、製剤を保持する容器は、製剤の反復投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする複数回用量バイアルであってもよい。キット又は他の製品はさらに、好適な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、食塩水、緩衝食塩水）を含む第２の容器を含んでもよい。希釈剤と製剤を混合すると、再構成された製剤中の最終タンパク質濃度は、一般に少なくとも１ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ）となる。
【０１８１】
キット又は他の製品は、商業的及びユーザの視点から望ましい他の用品をさらに含んでもよく、こうした用品として、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル、カテーテル、注射器、及び使用指示書の入ったパッケージ挿入物などが挙げられる。上に挙げた範囲及び値の中間の範囲及び値も本発明の一部であると考慮される。
【実施例】
【０１８２】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０１８３】
実施例１．正常なラットにおける８９Ｚｒ標識ｒｈＮａＧｌｕの薬物動態の調査
この実施例では、ｒｈＮａＧｌｕの８９Ｚｒ標識、並びに１及び１０ｍｇ／ｋｇ（０．３及び２０ｍｇ／ｋｇでの追加データポイントを含む）での正常なラット（野生型）における８９Ｚｒ標識（Ｌａｂｅｌｅｄ）ｒｈＮａＧｌｕの薬物動態の調査の結果を記載する。
【０１８４】
ナトリウムペントバルビタール（３５〜５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内、必要に応じて補助の追加用量を含む）で動物（雄及び雌、約２００ｇ）を麻酔した。ヘパリン化ＩＶカテーテルを尾静脈の１つに設置して、滅菌食塩水で潅水した。ＩＶカテーテルを介して、ｒｈＮａＧｌｕを高速（１０秒）ボーラスとして投与した。８９Ｚｒ標識ｒｈＮａＧｌｕの投与から２時間後、過剰用量のペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）で動物を安楽死させた後、解剖した。組織サンプルの放射能を高エネルギー自動ウェルカウンターで計測した。４匹の動物（２匹の雄と２匹の雌、各々１又は１０ｍｇ／ｋｇ）についての値を表Ｄに示す。吸収された用量に関して、やはり肝臓が重要な臓器であった。脳及び脊髄中のｒｈＮａＧｌｕのレベルは、他の臓器と比較して、相対的に低かったが、中枢神経系を治療するには比較的低い量の酵素が必要であるため、これらのレベルは、臨床的に有意であった。
【０１８５】
【表８】
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【０１８６】
実施例２．非ヒト霊長類におけるｒｈＮａＧｌｕのＣＮＳ透過
この実施例では、非ヒト霊長類におけるｒｈＮａＧｌｕのＣＮＳ透過の調査を説明する。
【０１８７】
正常なカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に対して、１日目及び８日目に３及び３０ｍｇ／ｋｇ／用量で髄腔内注射によりｒｈＮａＧｌｕを投与した後、１５日目及び２２日目に３又は３０ｍｇ／ｋｇ／用量で静脈内注入した。この用量は、サルにおいて良好な忍容性を示した。続く９時間にわたって酵素レベルを測定した。図１に示すように、１５日目及び２２日目の両方で、ＣＳＦ中にｒｈＮａＧｌｕ濃度の増加が認められ、ＩＶ投与されたｒｈＮａＧｌｕのＣＮＳ透過が実証された。
【０１８８】
さらなる実験において、３０ｍｇ／ｋｇ／用量で１時間のＩＶ注入を実施し、その後９時間にわたって酵素レベルを測定した。６つのサンプルを各時点で試験した：３匹の動物×２回の毎週用量。図２に示すＩＶ注入後のＣＳＦ中のｒｈＮａＧｌｕの濃度は、ＩＶ投与されたｒｈＮａＧｌｕのＣＮＳ透過を示している。
【０１８９】
実施例３．ＭＰＳＩＩＩＢヒト患者における血液脳関門（ＢＢＢ）完全性の評価
３．１  この実施例では、２つの無料の（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）、しかも広く受け入れられている方法であるＣＳＦ／血清アルブミン指数（ＣＳＦ−ＡＩ）及びダイナミック造影強調磁気共鳴画像法（ＤＣＥＭＲＩ）を用いてＭＰＳＩＩＩＢ被験者のＢＢＢの完全性を調べた。
【０１９０】
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）酵素活性の欠乏の記録又はＮａＧｌｕ遺伝子の両対立遺伝子における機能的に関連する突然変異の記録のいずれかによって決定される通りに、ＭＰＳＩＩＩＢの確定診断を受けた６歳以上の被験者。
【０１９１】
この実施例は、血清に対してＣＳＦ中に存在するアルブミン又はＩｇＧタンパク質の比を推定することにより、酵素補充療法を受療中のＭＰＳＩＩＩＢ被験者におけるＢＢＢ完全性を評価するステップを含む。手短には、腰部穿刺と同じ来院時に血液サンプルを採取して、当技術分野で公知の方法を用いて、ＣＳＦと共に分析することにより、アルブミン及びＩｇＧ抗体比を定量する。ＣＳＦ／血清アルブミン指数は、次のように計算する：ＣＳＦ／血清アルブミン指数＝（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）×１０００（ｍｇ／Ｌ濃度）。ＣＳＦ／血清アルブミン指数を用いて、酵素補充療法を受療中のＭＰＳＩＩＩＢを有するヒト被験者における血液脳関門の完全性を評価する。あるいは、同様の方法で、ＣＳＦ−ＩｇＧ指数を計算する。
【０１９２】
ダイナミック造影強調ＭＲ画像法（ＤＣＥ−ＭＲＩ）を用いて、例えば、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３２：２１８３−２１８９（２０１１）を参照）を用いて、ＭＰＳＩＩＩＢ被験者におけるＢＢＢ移行定数（Ｋｔｒａｎｓ）を推定する。標準的造影剤又は標識ｒｈＮａＧｌｕ、例えば、８９Ｚｒ−標識ｒｈＮａＧｌｕを用いる。Ｋｔｒａｎｓは、Ｔｏｆｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  １０：２２３−２３２（１９９９））の２コンパートメントモデルに基づくＭＲ画像、例えば、Ｔ１強調画像から計算する。ＲＯＩは、例えば、大脳基底核及び脳室周囲白質内に手動で配置する。例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）を参照されたい。
【０１９３】
３．２  ＣＳＦ−ＡＩ及びマルチモーダルＭＲＩを用い、ＭＰＳＩＩＩＢ患者においてＢＢＢ完全性及び脳構造の異常を評価した。年齢が６〜８歳で、古典的な重症表現型を有する５人の白人ＭＰＳＩＩＩＢ患者（男性４人、女性１人）が参加した。ＭＰＳＩＩＩＢの診断時の患者の平均年齢は、２．４歳であった。血液サンプル及びＣＳＦサンプル（腰部穿刺による）をＣＳＦ−ＡＩの決定から取得した。血漿量、ＢＢＢ移行定数（ＢＢＢ透過性を表すＫｔｒａｎｓ）及び組織ＭＲＩ緩和時間、Ｔ１（組織の物理的特性を表す）を決定するために、ガドテル酸メグルミン（Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標））造影剤の静脈内注射前、その最中、及び注射後に、ＤＣＥ−ＭＲＩ（ダイナミック造影強調ＭＲＩ）画像を取得した。ＨＳ（血清、尿、及びＣＳＦ中）及びＣＳＦ中の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レベルなどの探索的バイオマーカもこれらの患者において評価した。ＣＳＦ−ＡＩは、５人の患者のうち４人で５．５〜１１．３の範囲であり（正常の上限値４．９）、５人目の患者のＣＳＦ−ＡＩは、正常の上限値を下回った。ＤＣＥ−ＭＲＩ結果は、非常に低く、成人の健康な脳で以前報告されたものと類似する灰白質及び白質のＫｔｒａｎｓ値と、類似年齢の正常なボランティアと同等である白質のＴ１値を示した。ＭＲＩからの他の重要な知見には、脳萎縮、頭蓋骨厚さの増加及び白質病変の異常領域が含まれた。探索的バイオマーカは、ＣＳＦ、血清及び尿中のＨＳレベルの実質的な増加、並びにＣＳＦ中のＨＧＦの増加（正常範囲と比較して）を示した。ＭＰＳＩＩＩＢ患者において、ＣＳＦ−ＡＩ知見に基づく軽度のＢＢＢ浸漏のエビデンスがあり；これらの知見は、ＭＲＩでのＢＢＢ浸漏の明らかなエビデンスの非存在下で示されている。ＭＲＩ容積計測は頑健であったため、これらの患者における全体及び組織特異的萎縮のエビデンスを示すことに成功した。
【０１９４】
実施例４．組換えヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデルにおいてマンノース−６−リン酸受容体依存性輸送を示す
組換えヒトＮａＧｌｕのＣＮＳ取り込みの潜在的機構をさらに詳しく調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門（ＢＢＢ）アッセイを用いて、頂端面（血液を表す）上の一次ラット脳毛細血管内皮細胞と、フィルタの裏面（基底面）に付着させた周皮細胞から構成される細胞二重層を介したｒｈＮａＧｌｕ輸送をモニターした。
【０１９５】
材料及び方法
ヒトＮａＧｌｕ欠乏線維芽細胞（ＧＭ００１５６）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ニュージャージー州カムデン）から購入した。ＣＨＯ由来ｒｈＮａＧｌｕ（ＣＨＯ−ＮａＧｌｕ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。
【０１９６】
トランスジェニック鳥類の卵白から単離及び精製した組換えヒトＮａＧｌｕ（ＥＷ−ＮａＧｌｕ）を、ＰｈａｒｍａＣｏ−Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．から購入した市販のＢＢＢキットを用いたラットｉｎ  ｖｉｔｒｏＢＢＢアッセイに付して、それが細胞二重層を介して輸送される能力をモニターした。二重層は、インサートウェル底部の多孔質フィルタの頂端（血液）面上に位置する一次脳毛細血管内皮細胞から構成される（図３Ａ）。フィルタによって、頂端培地を、下部ウェル、すなわち基底（脳）面に含まれる培地から分離した。周皮細胞は、フィルタの反対側（裏面）に位置して、基底培地に曝露され、下部ウェルの底部にはアストロサイトを増殖させる。脳内皮細胞は、その通常のｉｎ  ｖｉｖｏ隣接細胞（主として周皮細胞及びアストロサイト）のクロストークのない培養物中で増殖させると、その表現型を喪失する。このＢＢＢ系では、周皮細胞及びアストロサイトの両方が、必要な因子を提供したため、内皮細胞は、ＢＢＢの基本的特徴である密着結合を形成することができた。密着結合形成は、アッセイに用いた各ウェルについて、専用のオーム計を用いて、二重層を介した経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することにより確認した。ＴＥＥＲ値は、３７℃の培養物に細胞を投入した２日後から毎日測定した（図３Ｂ）。これらの値は、ウェルを用いて、ＥＷ−ＮａＧｌｕが、二重層を介して頂端面から基底面に輸送される能力を評価する前には、１５０Ω×ｃｍ２以上であった。ＴＥＥＲ値を達成しなかったウェルは使用しなかった。各期間の終了時に、ＦＩＴＣ標識デキストランを各頂端ウェルに添加して、基底培地中の蛍光の量を測定した。密着結合がインタクトなままであれば、ＦＩＴＣ標識デキストランに起因する蛍光は、基底培地中に存在しないはずである（表Ｅ）。検出可能な蛍光を有するウェルは全て試験から除外した。
【０１９７】
【表９】
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【０１９８】
２−アミノ酸安息香酸（２−ＡＡ）蛍光法を用いて、ＥＷ−ＮａＧｌｕのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）組成物分析を実施した。６．７Ｍトリフルオロ酢酸を用いた加水分解により、１００℃で３時間にわたってタンパク質グリカンからＭ６Ｐを放出した。次に、サンプルを乾燥させてから、２−アミノ安息香酸で標識した。標識Ｍ６Ｐは、ｐＨ４．４のギ酸アンモニウム／アセトニトリル移動相を用いた親水性／アニオン交換混合モードカラムでの順相ＨＰＬＣにより分析した。蛍光検出励起波長及び発光波長は、３６０及び４２５ｎｍであった。Ｍ６Ｐ標準較正曲線を用いて、定量を実施した。
【０１９９】
ＰＮＧａｓｅ−Ｆを用い、３８℃で３時間にわたり、ＥＷ−ＮａＧｌｕからＮ−結合グリカンを放出させた後、室温で一晩かけて発蛍光団８−アミノピレン−１，３，６−トリスルフォネート（ＡＰＴＳ）で標識した。ＬＥＤ誘導蛍光検出装置に接続したキャピラリー電気泳動により、標識グリカン及びマルトデキストリンラダーを分析した。−３０ｋＶ下の被覆キャピラリー中のポリマーゲルバッファーを用いて、分離を実施した。グリカン構造決定は相対泳動時間に基づき、また、標識グリカンの相対パーセンテージはピーク面積に基づいて算出した。
【０２００】
結果：ｒｈＮａＧｌｕ血液脳関門細胞培養物輸送
卵白（ＥＷ）系プラットフォームに発現された組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したＣＨＯ由来ｒｈＮａＧｌｕ（ＣＨＯ−ＮａＧｌｕ）と、細胞二重層を介してＮａＧｌｕが輸送される能力をモニターする血液脳関門細胞培養アッセイにおいて比較した（上の材料及び方法を参照）。ＢＢＢアッセイの開始から４又は５日目に、３．３ｍＭマンノース又は３．３ｍＭマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の添加と共に、又は添加せずに、ｒｈＮａＧｌｕを０．２ｍｇ／ｍＬで頂端面培地に添加した（図４Ａ）。比較対照として、ＣＨＯ−ＮａＧｌｕを個別のウェルに０．１ｍｇ／ｍＬで添加した。０時間、また再び４、８、１４、及び２４時間の時点で開始し、基底培地中で各条件についての酵素活性をモニターした。４時間の時点（約２３００ｎｇ／ｍＬ）で開始する基底培地中でｒｈＮａＧｌｕを検出したところ、これは、１４時間までに３５００ｎｇ／ｍＬまで増加し続け、その時点で、２４時間時点で同様の基底培地濃度により示されるプラトーに達した。これは、基底面から頂端面に戻る輸送の間で平衡に到達したことを示唆している。３．３ｍＭマンノースの添加は、ｒｈＮａＧｌｕの輸送に影響を一切及ぼさなかったが、３．３ｍＭ  Ｍ６Ｐの添加は、ｒｈＮａＧｌｕ輸送を＜９０％と顕著に低減し、これは、輸送がＭ６Ｐ受容体に媒介され、マンノース受容体により影響されないことを示している。これらのデータから、２ｍｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕを頂端面培地に添加したとき、取り込み速度は約４２ｐｇ／秒／ｃｍ２と決定され、０．２ｍｇ／ｍＬを添加したときは約４ｐｇ／秒／ｃｍ２と決定された（図４Ｂ）。これらのデータを合わせて、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｍ６Ｐ依存的に、マンノース受容体結合の必要性はあったとしてもごくわずかで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＢＢＢを介して効率的に輸送されることが実証された。細胞取り込みに対するＭ６Ｐの必要性をさらに研究するために、ｒｈＮａＧｌｕをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で６時間処理した後、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト線維芽細胞に添加した。ＡＰ処理によりｒｈＮａＧｌｕ取り込みが阻止された（図５Ａ）が、ＮａＧｌｕ酵素活性には何ら影響を及ぼさず（図５Ｂ）、これは、線維芽細胞へのｒｈＮａＧｌｕ取り込みに対するＭ６Ｐの必要性を証明している。
【０２０１】
ＣＨＯ−ＮａＧｌｕは、ＢＢＢ細胞培養アッセイにおいて８０ｎｇ／ｍＬのプラトー濃度を達成し（図６Ａ）、これは、同等量の酵素をアッセイに添加する（０．１ｍｇ／ｍＬ）場合、ＥＷ−ＮａＧｌｕ（２４０ｎｇ／ｍＬ）により達成される取り込みより約３倍少ない。ＥＷ−ＮａＧｌｕ輸送に対するＭ６Ｐの影響を考慮すれば、ＣＨＯＮａＧｌｕ輸送の減少は、ＣＨＯが産生したＮａＧｌｕが、ＥＷ−ＮａＧｌｕと比較して少ないＭ６Ｐを含有し得ることを示唆している。ＭＰＳ−ＩＩＩＢ線維芽細胞へのＣＨＯＮａＧｌｕ取り組みに関して他のグループから以前公開された論文は、ＣＨＯ発現ＮａＧｌｕのＭ６Ｐレベルが、極めて低いか、又は存在しないことを示唆した（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。ＣＥ−ＬＩＦによるＥＷ−ＮａＧｌｕ及びＣＨＯ−ＮａＧｌｕのＮ−結合オリゴ糖分析は、それら各々のプロフィールにおける有意な差を明らかにしている（図６Ｂ）。
【０２０２】
ＣＨＯ由来ＮａＧｌｕとＥＷ−ＮａＧｌｕの間で観察されたＮ結合オリゴ糖の差を理解するために、両酵素をシアリダーゼ処理に付して、シアル酸部分（もしあれば）を除去した後、ＣＥ−ＬＩＦを実施して、Ｎ結合オリゴ糖を分離した（図７Ａ及び７Ｂ）。非処理ＣＨＯ由来ＮａＧｌｕのプロフィールは、シアリダーゼ処理サンプルとは有意に相違しており（図７Ａ）、有意な量のＣＨＯＮａＧｌｕ炭水化物が、シアル酸に捕捉されたことを示すのに対し、非処理ＥＷ−ＮａＧｌｕプロフィールは、シアリダーゼ処理サンプルと区別がつかないように見えた（図７Ｂ）。Ｍ６Ｐ含有グリカンの存在と共にシアル酸の欠如から、ＥＷ−ＮａＧｌｕ炭水化物プロフィールが、受容体結合を妨げるシアル酸誘導の反発なしに、Ｍ６Ｐ受容体結合を促進する上で理想的であることが示唆される。
【０２０３】
実施例５
ＮａＧｌｕ欠乏マウスモデルにおけるｒｈＮａＧｌｕの効果を決定するために、１２ヵ月の静脈内投薬試験を実施した（図８）。ヘパラン硫酸組織レベルの低減及び運動技能の維持に基づいて効果をスコアリングした。野生型対照を含む、３ヵ月齢前後の動物に毎週、計４週間静脈内投与した（図８、グラフ上部の小さな矢印）。図８の上部パネルは、ロッキングパラダイムを用いたロータロッド（ＲｏｔａＲｏｄ）行動テストを示し、これは、１８０秒時間枠で、落下するまでの時間に基づいてスコアリングする。ビヒクル処置ＮａＧｌｕ欠乏マウスは、約６ヵ月で運動技能の低下（早期落下）を示し初め、９ヵ月までさらに悪化する。ｒｈＮａＧｌｕの用量の増加と共に、ビヒクル処置マウスと比較して、処置ノックアウトマウスに運動技能の向上が見られる。ｒｈＮａＧｌｕでの４週間の処置後、運動技能の維持が少なくとも４ヵ月まで、場合によっては５〜６ヵ月まで維持された。
【０２０４】
図８の下部パネルは、組織１ミリグラム当たりナノグラムで表される、脳及び肝臓中のヘパラン硫酸の総レベルを示す。これらのデータは、脳及び肝臓ヘパラン硫酸レベルの双方に用量依存的減少があることを示している。組織ヘパラン硫酸レベルの減少は、運動技能機能の向上と相関することが明らかである。ｒｈＮａＧｌｕによる４週間の処置の後、減少したヘパラン硫酸レベルは、少なくとも４カ月まで、場合によっては５〜６ヵ月まで維持された。１２ヵ月間継続したが、全ての群に有意な健康問題が観察されたため、１２ヵ月時点は分析しなかった。４ヵ月から６ヵ月まで、ビヒクルノックアウトマウスにおいてある程度の性差も観察され、雌マウスと比較して、雄マウスは肝臓中ヘパラン硫酸レベルにはるかに大きな増加を呈示した。
【０２０５】
実施例６
この試験の目標は、ｒｈＮａＧｌｕ処置後に脳及び肝臓組織中ヘパラン硫酸の用量依存的減少があるか否かを決定することであった。この試験では、３〜６月齢のＮａＧｌｕ欠乏マウスに、８週間の合計治療時間域にわたり０．３、１．３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間に１回静脈内投与した（図９）。１処置群につき４匹の雄及び４匹の雌マウスが含まれた。脳及び肝臓サンプルを採取した後、最終用量の翌日にヘパラン硫酸レベルについて分析した。総ヘパラン硫酸レベルは、組織１ミリグラム当たりのナノグラムとして示す。これらのデータは、ｒｈＮａＧｌｕの用量増加と共に、脳及び肝臓中に用量依存的ヘパラン硫酸減少があることを示している。
【０２０６】
他の実施形態
本発明を詳細な説明と共に記載してきたが、以上の記載は、説明を意図するものであって、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。他の態様、利点、及び変更は、以下に記載する特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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