(57)【要約】  本発明はiPS細胞の集団を調製する方法に関し、前記方法は、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
iPS細胞の集団を調製する方法であって、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項２】
CAF1複合体の量及び/又は活性を低下させることが、当該標的細胞のCHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4タンパク質の量及び/又は活性を低下させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
SUMO経路の量及び/又は活性を低下させることが、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7の量及び/又は活性を低下させることを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
CAF1複合体の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させることが、CHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4の発現を阻害する1つ以上の作用因子の細胞への投与を含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
SUMO経路の量及び/又は活性を低下させることが、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7の発現を阻害する1つ以上の作用因子の細胞への投与を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
作用因子がsiRNA又はshRNA分子である、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
さらに、SETDB1の活性を標的細胞で低下させることを含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
作用因子が、標的細胞で一過性発現系によってコードされるsiRNA又はshRNA分子である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
標的細胞が36時間から120時間一過性発現系に暴露される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞が哺乳動物体細胞、好ましくはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、又はマウス細胞である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物体細胞が、線維芽細胞、成熟動物の幹細胞、セルトリ細胞、顆粒層細胞、ニューロン、膵小島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（B及びTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞又は骨格筋細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれかに記載の方法にしたがって調製されるiPS細胞の集団。
【請求項１３】
分化細胞の集団を調製する方法であって、（i）請求項1から11のいずれかに記載の方法にしたがってiPS細胞の集団を調製すること、（ii）当該iPS細胞をあるプロトコル又は因子を用いて分化させて分化細胞の集団を形成すること、を含む、前記方法。
【請求項１４】
CHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4の発現を阻害する1つ以上の作用因子の当該細胞への投与を含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、iPS形成効率を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
iPSの発見以来、分化万能性への細胞の再プログラミングは広く用いられる実験ツールとなった。基礎研究及び生体医療研究におけるその大いなる有用性以上に、iPS再プログラミングは、広範囲の医療的応用（例えば細胞療法用の患者固有組織の生成）に利用可能であると考えられる。しかしながら、iPS再プログラミングプロセスは、依然として非常に非効率的でかつ特性として確率論的であり、このことは、特に体細胞供給源が限られている場合は多くの応用でその有用性を低下させる。効率的なiPS再プログラミングを妨げる主要な妨害は鉄条網で囲まれた（hard-wired）後成的な眺望内に存在すると考えられるが、この妨害に寄与する重要なメカニズム及び因子は未だ完全には理解されていない。
哺乳動物細胞を再プログラミングする改善方法が当技術分野で希求されている。
【発明の概要】
【０００３】
したがって、本発明の第一の特徴はiPS細胞の集団を調製する方法を提供し、前記方法は、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む。
本発明者らは機能的遺伝子スクリーニングを実施して、iPS再プログラミングの阻止に関与するクロマチン結合因子を系統的に同定した。このスクリーニングにより、前記発明者らは、ある種の遺伝因子（CAF1複合体又はSUMO経路の構成要素を含む）が減少するとき、細胞の再プログラミング効率が劇的に増加することに気付いた。それらの効果の度合いは以前に同定された因子で観察された増加をはるかに超え、細胞の再プログラミングを用いる治療法の開発で重要な進展を提供する。
例えばRNAiのような因子、他の遺伝的技術、又は小分子阻害剤を用いることによってこれらの遺伝因子を抑制する手法は、広域な研究及び生体医療への応用に新規で強力なツールを提供する。
例えば、
−医療への応用のために、量及び/又は質に限りがある材料によるiPS細胞の効率的な生成：本発明の方法は、疾患の研究のためにだけでなくin vitroでの組織の再生のために患者固有iPS細胞の効率的でより迅速な生成を提供する。前記は、生検で得られる少量の材料からiPSを生成することを可能にするであろう。
−直接的な組織の再プログラミング：同定された遺伝因子のいくつか（例えばCAF1複合体構成要素CHAF1A/B、及びSETDB1）は、細胞分裂中に後成的状態の保存で偏在的機能を有することが知られている。したがって、それらの阻害は、後成的記憶を消去しそれによって多くの組織の状況において細胞の再プログラミングを強化しうることはありそうなことである。iPSレジメンを強化する以上に、これらの因子の阻害はまた他の細胞の状況間における再プログラミングを促進することができる（例えば線維芽細胞からニューロンへの直接的再プログラミング）。
−in situ再生医療：本明細書で提供するデータは、当該同定因子（特にCHAF1A/B及びUBE21）の抑制は、後成的記憶の重ね書きによって細胞運命の切り換えを強力に促進することを示唆する。したがって、これらの因子及びそれらと密接に関係する複合体及び経路（特にCAF1複合体及びSUMO経路）の阻害を目的とする手法を用いて、in vivo脱分化を必要とする再生プロセス（例えば組織損傷（例えば卒中、心臓発作、骨髄再構成など）に続く修復機構）を改善することができる。
−より単純で安全なiPS再プログラミングプロトコルの開発：当該同定因子の阻害（単独又は組合せ阻害）による後成的妨害の除去を利用して、より少量の異所的に発現される再プログラミング因子をベースとしより短期間で済む、新規で効果的な再プログラミングプロトコルの開発を可能にすることができる。生体医療への応用に特に所望されるものは、c-MYCもウイルス性遺伝子デリバリーも必要としないiPSレジメンの開発であろう（なぜならばこれらの因子は両者とも実質的な生体安全性のリスクとなるからである）。より一般的には、既存の再プログラミング因子とは異なり、当該同定遺伝因子は化学的に誘導される再プログラミングのための第一の標的セットである。
−再プログラミングの研究：iPSプロセスの機構のより良好な理解は、再プログラミング技術の更なる最適化及び生体医療への応用のために決定的な関係を有する。しかしながら、既存の再プログラミングプロトコルは極めて非効率的でかつ性質として確率論的であるという事実は、このプロセスの動態の研究を複雑にする。再プログラミング効率を大々的に改善するアプローチ（本発明の方法によって提供される）は、分化状態からiPS状態への転換で細胞に関するより良好な手掛かりを提供するであろう。
−量及び/又は質に限りがある材料からでも研究用のiPS細胞が効率的に生成される：再プログラミングのプロセスは非効率的であるので（特に最終分化細胞、加齢細胞又は低増殖性細胞材料の場合）、再プログラミングを最適化して、内在する疾患のメカニズムの研究のために例えば患者固有iPS細胞を誘導することが重要である。最適化されたiPSプロトコルは、従来はiPS形成に適さない細胞タイプ又は生物のiPS生成を促進するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ドキシサイクリン誘導（＝D0）後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンは、OSKM誘導に対して-3日目（D3）及び-6日目（D6）に形質導入された。培地：FCS及びアスコルベートを含むDMEM。
【図２ａ】上位スコアを有する再プログラミング妨害因子のRNAiノックダウン。画像は、各上位スコア遺伝子に対する1つのshRNAのiPSコロニー形成に対する影響を示す。コントロールにはニュートラルshRNA（Ren.713）及びTrp53（公知の再プログラミング妨害因子）を標的とするshRNAが含まれる。iPS細胞は、再プログラミングされなかった又は部分的に再プログラミングされたMEF層上の半球形状コロニーとして出現する。
【図２ｂ】11日目に1：5に分割し、FCS及びLIFを含む培地でさらに3日間増殖させたiPS細胞の外観。非常に暗い/黒色のクラスターは、アルカリホスファターゼ染色でiPS形成を示している。
【図３】OSKM誘導再プログラミング中のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンはOSKM誘導に対して-3日目（D3）に形質導入された。培地：FCS及びアスコルベートを含むDMEM。Caf-1複合体メンバーのノックダウンはOct4-GFPレポーター発現の劇的な加速をもたらすことに留意されたい。Ube2iノックダウンはiPS形成で最小限の進展をもたらすが、しかしながらより後の時点では急速な増加を生じる。一方、Caf-1ノックダウンではGFP+細胞は飽和に達し、第二の増殖相でのみ増加する。
【図４】ドキシサイクリン誘導（＝D0）後13日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンは、OSKM誘導に対して-3日目（D3）及び-6日目（D6）に形質導入された。培地：FCS及びアスコルベートを含むDMEM。細胞を分割し、ドキシサイクリンを表示の日数で培養条件から除去した。全ての条件は遅くとも7日目にドキシサイクリンを始動させた。
【図５】ドキシサイクリン誘導（＝D0）後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンは-3日目に形質導入された。培地：FCS及びアスコルベートを含むDMEM。
【図６】ドキシサイクリン誘導（＝D0）後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンは-3日目に形質導入された。培地：FCSを含みアスコルベートを含まないDMEM。
【図７】ドキシサイクリン誘導（＝D0）後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージ。ヘアピンは-3日目に形質導入された。培地：血清代替物及び最小限のFCSを含みアスコルベートを含まないDMEM。
【図８】2iの存在下で血清代替物により増殖させた単一細胞由来iPS細胞コロニーの外観。非常に暗い/黒色のクラスターはアルカリホスファターゼ染色でiPS形成を示している。Chaf1a/bノックダウンのコロニーは前iPSのクラスターから出現し、一方、Setdb1及び特にUbe2iでのコロニーは前iPSクラスターの非存在下で出現し形成されることに留意されたい。
【図９】OSKMカセットの発現レベルをQ-PCRで定量し、アクチンに対して標準化した。用いたプライマーはOSKMカセットに特異的であった。Oct4-3’外側：CCCACTTCACCACACTCTACTCAGTC（配列番号:1）；Klf4-5’外側：GCTGGACGCAGTGTCTTCTCCCTTCC（配列番号:2）。OSKM発現無しを任意に1と設定した。PCRは、3つの生物学的トリプリケートについて三重に実施し、本質的な変動を説明する。誘導発現レベルには大きな相違は検出しえない。
【図１０】再プログラミング強化のモデル。CAF1の阻害は分化細胞から前iPS細胞への転換を改善できるが、一方、SUMO化の阻害は前iPS細胞からiPS細胞への転換を強化できる。
【図１１】多重スクリーニング手法で得られるヒットの検証。エラーバーは生物学的トリプリケートの標準偏差（SD）を示す。星印（*）は統計的に有意な相違を示す。
【図１２】2iを含む血清代替培地中で、表示の標的に対するshRNAベクターを保有する10,000個のMEFから生じるdox非依存性コロニーの数。
【図１３】再プログラミングでの形成に対する、SUMO E2リガーゼUbe2i、E1リガーゼSae1及びUba2抑制の影響。11日目のOct4-GFP+細胞分画（7日間のOKSM誘導、4日間のトランスジーン非依存性増殖）が示されている。エラーバーは生物学的トリプリケートにおけるSTDEVである。SUMO化経路における多様な酵素の抑制はiPS再プログラミングを強く強化する。
【図１４】Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iの抑制後の再プログラミング強化で生じたiPS細胞の表現型の分析。（a）表示のshRNAを用いたノックダウンの13日目に生じたiPSCのアルカリホスファターゼ染色（スケールバー1mm）。（b）表示のshRNAの存在下でOKSM発現7日後に生じたコロニーのNanog及びSox2発現についての免疫蛍光染色。Chaf1a、Chaf1b、Ube2iの抑制後に生じるコロニーはNanogを発現する（スケールバー100μm）。
【図１５】Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iのRNAi媒介抑制はNanog+ iPS細胞の形成を強く強化する。（a）Oct4-GFPレポーター発現のフローサイトメトリー分析、及び表示のshRNAベクターを保有する再プログラミングが可能なMEFの再プログラミング中のNanog発現についての細胞内フローサイトメトリー。（b）OKSM発現7日目、9日目及び11日目のOct4-GFP+細胞の出現におけるChaf1a/b又はUbe2iノックダウンの影響を示す代表的なFACSの図。ヒストグラムはOct4-GFP+細胞内のNanog+細胞の割合を示す。
【図１６】Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iの抑制による再プログラミング強化は開発のために完全に適合するiPS細胞をもたらす。（a）胚盤胞（アルビノ）へのiPSC（アグーチ色素）の注入によって得られた複数の高度キメラ。iPSCは、dox誘導（OKSM発現）及びChaf1a、Chaf1b又はUbe2iのいずれかの同時shRNA発現から7日後の再プログラミング可能MEFから入手した。コントロールshRNAで処理した細胞からは同じ期間内にiPSCは回収されないことに留意されたい。キメラ現象は、Chaf1a shRNA誘導iPSCについては95−100%（3匹のマウス）、Chaf1b shRNA誘導iPSCについては80−100%（12匹のマウス）、及びUbe2i shRNA誘導iPSCについては85−100%（8匹のマウス）であった。アルビノマウスは非キメラ同腹仔を表す。（b）Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iのdox誘導ノックダウンに際してiPSCから生じるアグーチキメラ（Tyrc；A/a）の生殖細胞系列伝達。生殖細胞系列伝達は、キメラをアルビノの雌と交配したときの子孫へのアグーチの毛皮色寄与によって決定した（Tyr+/Tyrc；Tyrc/Tyrcに対してA/a及びa/a；A/a及びa/a）。生殖細胞系列伝達は、Chaf1aキメラについては8/8、4/4、6/8事例で、Chaf1bキメラについては7/7、4/4、7/7、9/9事例で、Ube2iキメラについては5/5、7/7及び5/5事例で観察された。
【図１７】iPS再プログラミングにおける相乗的RNAi効果を精査するための系統的コンビナトリアルRNAi実験。（a）Oct4-GFP+細胞の出現におけるshRNAペアの共同抑制の結果を要約した表で、コントロールに対する倍数変化として示されている（空ベクターで標準化したiPSC/線維芽細胞）。（b）（a）で示したサンプルの代表的なフローサイトメトリー図表。CAF-1構成要素及びUbe2i構成要素の一体化抑制はiPS再プログラミング効率を強化する。
【図１８】一次スクリーニングデータのヒートマップによる表示。個々のshRNAの相対的濃縮が、黒色（濃縮又は枯渇が存在しない）から白色（＞30倍の濃縮）の連続スケールで示されている。相対的濃縮は、各レプリケートのiPS細胞のディープシーケンシングの読みと再プログラミング前の感染MEFの読みとの間の比を基準にして計算された。縦欄は96スクリーニングの全てを示す（48の生物学的レプリケート、各々をOSKM誘導の2つの時点を用いてスクリーニング）。横列は個々のshRNAを示し（合計5049、アルファベット順）、Chaf1/Chaf1b shRNAのレベルの説明が示されている。複数のChaf1a及びChaf1b shRNAがレプリケート間で一貫して強く濃縮され、はっきりと当該スクリーニングの上位スコアを占める。
【図１９】全レプリケートにおける5049のshRNAの合計スコアを示す散布図。96のiPSサンプル（48の生物学的レプリケート、OKSMの前の3又は6日のKD）の全てで、各shRNAの標準化した読みを、ウイルスによる形質導入から3日後のMEFの標準化した読みで割り、得られた比を用いて各レプリケートの各shRNAのスコアを計算した（標準スコア＝0；比が＞1の場合はスコア＝1、比が＞10の場合はスコア＝3）。48レプリケートの各shRNAのスコアをd3及びd6の時点について別々に加えて合計コアを得て、全レプリケートについて各shRNAの全体的濃縮を概算した。Chaf1a、Chaf1b、Ube2i及びSetdb1を標的とする高いスコアを有するshRNAに注釈が与えられる。Chaf1a、Chaf1b及びUbe2iは、複数のshRNAによって支持される当該スクリーニングの非常に明瞭な上位ヒットとして出現する。
【図２０】構成的にOSKMを発現するレンチウイルスベクターを用いたChaf1a、Chaf1b又はUbe2i抑制による再プログラミング強化の検証。最初にOct4-GFPトランスジェニックMEFに表示のpLENC-shRNAを形質導入し、続いて（3日後）強力なEF1-アルファプロモーター（pHAGE又はEF1along-4Fpuro）からOKSMを構成的に発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。レンチウイルス感染後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージが示される。エラーバーは3つの生物学的レプリケートの標準偏差（SD）を示す。Chaf1a、Chaf1b及びUbe2iの抑制はiPS再プログラミングを強化する。レンチウイルスOSKM発現を用いる再プログラミング効率の基準線は高いので、強化倍数は一次システム（ColA-TRE-OKSM/rtTA-M2/Oct4-GFP三重トランスジェニック再プログラミング可能MEF）と比較して低く、OKSM因子の発現又は供給が限定される条件下ではChaf1a、Chaf1b及びUbe2i発現の効果は特に強力であることを示唆している。
【図２１】Tet誘導性OSKMを発現するレンチウイルスベクターを用いたChaf1a、Chaf1b又はUbe2i抑制による再プログラミング強化の検証。最初にOct4-GFP;CAGGS-rtTA3二重トランスジェニックMEFに表示のpLENC-shRNAを形質導入し、3日後に、ドキシサイクリンの存在下でTet応答性プロモーターTRE（TetO-STEMCCA）又はTRE3G（T3G-4Fpuro）から誘導的にOKSMを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。OSKM発現を誘導するために、細胞をドキシサイクリンで合計7日間処理した。レンチウイルス感染後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージが示される。エラーバーは3つの生物学的レプリケートの標準偏差（SD）を示す。Chaf1a、Chaf1b及びUbe2iの抑制は、両Tet誘導性OKSM発現ベクターを使用してiPSC再プログラミングを強く強化する。したがって、再プログラミングの改善は初期スクリーニングで用いられた二次システムに特有ではない。
【図２２】OKSMの短期間一過性発現及びほんの2−4日間のChaf1aの抑制は激烈なiPSC再プログラミングを可能にする。最初にOct4-GFP;CAGGS-rtTA3二重トランスジェニックMEFに、強力なChaf1a shRNAをコードするTet調節性shRNA発現ベクター（T3G-mCherry-miRE.Chaf1a.3118）を形質導入し、3日後にTet応答性プロモーターTRE（TetO-STEMCCA）又はTRE3G（T3G-4Fpuro）から誘導的にOKSMを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。細胞を、OKSM感染の日から開始して2又は4日間ドキシサイクリンで処理し、一過性で可逆的なOKSM発現及びChaf1a抑制を引き起こす。レンチウイルス感染後11日目のOct4-GFP陽性細胞のパーセンテージが示される。エラーバーは3つの生物学的レプリケートの標準偏差（SD）を示す。Chaf1a、Chaf1b及びUbe2iの抑制は、両Tet誘導性OKSM発現ベクターを使用してiPSC再プログラミングを強化する。2日間の短いChaf1aの一過性抑制と協調して一過性OKSM発現は激烈なiPS細胞形成をもたらす。
【図２３】線維芽細胞でのChaf1a/b抑制の致死的影響をアッセイする競合増殖アッセイ。表示の上位スコアChaf1a/b shRNA及びいくつかのコントロールshRNAを発現するpLENCベクターを一コピー条件下でNIH3T3線維芽細胞に形質導入した。時間を追ってshRNA+（mCherry+）細胞のパーセントを追跡した。棒線グラフは、形質導入後2、4、6、8、10及び12日の各shRNAについての測定を示す。DNA複製因子Rpa3を標的とするshRNAと同様に、Chaf1a及びChaf1b抑制はshRNA+細胞の急速な枯渇を生じ、我々のスクリーニングで用いた条件下でChaf1a/b抑制は線維芽細胞に有害であることを示した。これは、iPSC再プログラミングを強化するためにChaf1a/b shRNAを使用することについて、一過性のChaf1a/b抑制は安定的なChaf1a/b抑制よりも好ましいはずであることを示唆している。
【図２４】遺伝的Chaf1a破壊による再プログラミング強化の検証。Chaf1a対立遺伝子の安定的破壊が再プログラミングを改善できるか否かを試験するために、我々は、CRISPR Cas9技術を用いてOKSM誘導性MEFでChaf1aを標的とした。この目的のために、我々はガイドRNAを設計し、レンチウイルスを介してMEFにそれらをデリバーした。感染後2日に形質導入の成功についてFACSによってMEF細胞を仕分けし、レポーターとしてThy1.1表面抗原を利用した。ガイドは以下の多様なドメインへの変異導入によってChaf1aを破壊するように設計した：例えばタンパク質ドメイン（KO1及び2）の間、sumo相互作用ドメイン（SIM1及び2）の内部、HP1相互作用ドメイン（HP1及びHP2）の内部の他にPCNA結合ドメイン（PCNA1及び2）の内部。ゲノム編集を7日間進行させた。7日目に、生物学的トリプリケートのMEFの等数をプレートし、OKSMトランスジーンをドキシサイクリンで7日間誘導した。形質導入後11日目に、以前に記載されたOct4駆動GFPレポーター系を利用してiPS形成スコアをFACSによって決定した。図24は、Chaf1aコード領域を標的とするとき再プログラミング効率はsh媒介ノックダウンに匹敵することを示している。したがって、再プログラミング強化はCAF1複合体のRNAi媒介阻害に依存せず、様々なタンパク質ドメインの阻害に際して生じることが期待される。本実験は、CAF1の薬理学的阻害もまた再プログラミング強化を誘発するであろうということを強く示唆する。
【図２５】皮膚線維芽細胞にレンチウイルスをトランスフェクトしてノックダウンを導入した。続いて等しい数の細胞をプレートし、EF1アルファロングプロモーター駆動OKSMを用いて再プログラミングを誘導した。コロニーをアルカリホスファターゼ染色により目視で計測した。最良のiPSコロニー形成を示す（上位）ヘアピンは、これらのヘアピンはヒト皮膚線維芽細胞での競合アッセイで予期された（下位）増殖劣勢を示すという事実にもかかわらず最良のコロニー形成を示した。
【図２６】siRNAトランスフェクションを用いたChaf1a、Chaf1b又はUbe2iの一過性抑制はiPSC再プログラミングを強化する。再プログラミングが可能なトランスジェニックMEF（Tet-OKSM、Rosa26-rtTAM2、Oct4-GFP）に、Renilla、Chaf1a、Chaf1b、Ube2iを標的とするsiRNAを表示のドキシサイクリン処理日に1から3回トランスフェクトした。11日後のOct4-GFP陽性細胞の割合が示されている。Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iの一過性siRNA媒介抑制は再プログラミングを強化する。再プログラミングの初期時点（OKSM発現後1−3日目）でのこれらの標的の抑制が重要であるように思われ、さらに種々の日に連続的にトランスフェクトすることによってこの効果を強化できる。これらの結果はまた、CAF1及びUbe2i抑制の程度及び持続期間は最適化をされるべき重要なパラメーターであることを示唆している。本実験に用いられたsiRNA分子は以下の配列を有する：Ube2i.414-2：CACAATTTACTGCCAAAACAA（配列番号:103）、Chaf1a.3120：CAGCTACTTCCAAATTGTAAA（配列番号:104）、Chaf1b.271：TGGAATTTCTCTCCAATCTTA（配列番号:105）、及びRen.713：AGGAATTATAATGCTTATCTA（配列番号:106）。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
したがって、本発明の第一の特徴はiPS細胞の集団を調製する方法を提供し、前記方法は、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む。
iPS再プログラミングの阻止に関与するクロマチン結合因子を系統的に同定する機能的遺伝子スクリーニングにより、本発明者らは、ある種の遺伝因子（CAF1複合体又はSUMO経路の構成要素を含む）が減少するとき、細胞の再プログラミング効率が劇的に増加することに気付いた。本発明の方法は、再プログラミング効率の数桁の増加を可能にし、さらにコントロールと比較して2又は3倍迅速にiPSCを生成した。
本発明までは、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素及び/又は1つ以上のSUMO経路の調整が、細胞の再プログラミング効率でそのような劇的な増加をもたらすということはこれまで知られていなかったし、疑いすら持たれていなかった。
クロマチン会合因子1（CAF-1）は核内複合体であり、前記は、DNA複製及びヌクレオチド除去修復時のヌクレオソームのde novo会合で機能する。ヌクレオソーム会合は二工程プロセスであり、前記プロセスは、DNA上へのヒストンH3/H4テトラマーの最初の沈積とその後の一対のヒストンH2A/H2Bダイマーの沈積を含む。CAF-1はPCNAと相互作用し、DNA複製及びDNA修復巣に集まり、そこで新規合成ヒストンH3/H4テトラマーを複製DNA上に会合させるために機能する。ヒストンH2A/H2Bダイマーの会合には追加の会合因子が要求される。CAF-1複合体は3つのタンパク質、CHAF1A（p150）、CHAF1B（p60）及びRBAP48（p48又はRBBP4）から成る。CHAF1A及びCHAF1Bタンパク質はCAF-1複合体に固有であるが、一方、RBAP48は多様なクロマチン改変複合体の構成要素である。
【０００６】
“CAF1複合体の構成要素”によって、本発明は、特許請求の方法において、本明細書で提供するCAF1複合体の構成要素（すなわちCHAF1A、CHAF1B及びRBBP4）の1つ以上の量及び/又は活性を低下させる工程を含む。
本発明の好ましい実施態様では、CAF1複合体の量及び/又は活性を低下させる工程は、標的細胞でのCHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4タンパク質の量及び/又は活性を低下させることを含む。
CHAF1A、CHAF1B及びRBBP4は当業界で公知であり、それらのアミノ酸配列及び関連する遺伝子の核酸配列に関する情報を当業者は容易に確認できる。
例示すれば、ヒトCHAF1Aは遺伝子番号:10036としてNCBIデータベースに記載されている。Chaf1aについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10036
ヒトCHAF1Bは遺伝子番号:8208としてNCBIデータベースに記載されている。Chaf1bについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8208
ヒトRBBP4は遺伝子番号:5928としてNCBIデータベースに記載されている。Chaf1aについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5928
【０００７】
SUMO経路は、様々な細胞プロセスに関係する何百ものタンパク質を改変する。SUMO経路は当業界で周知である。CAF-1複合体は、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7から成る。
“SUMO経路の構成要素”によって、本発明は、特許請求の方法において、本明細書で提供するSUMO経路の構成要素（すなわちSUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7）の1つ以上の量及び/又は活性を低下させる工程を含む。
本発明の好ましい実施態様では、SUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させる工程は、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7の量及び/又は活性の低下を含む。
SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、UBE2I、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6又はSENP7は当業界で公知であり、それらのアミノ酸配列及び関連する遺伝子の核酸配列に関する情報を当業者は容易に確認できる。
【０００８】
例示すれば、ヒトSUMO1は遺伝子番号:7341としてNCBIデータベースに記載されている。SUMO1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7341
ヒトSUMO2は遺伝子番号:6613としてNCBIデータベースに記載されている。SUMO2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6613
ヒトSUMO3は遺伝子番号:6612としてNCBIデータベースに記載されている。SUMO3についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6612
ヒトSUMO4は遺伝子番号:387082としてNCBIデータベースに記載されている。SUMO4についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/387082
ヒトSAE1は遺伝子番号:10055としてNCBIデータベースに記載されている。SAE1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10055
ヒトUBA2は遺伝子番号:10054としてNCBIデータベースに記載されている。UBA2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10054
ヒトUBE2Iは遺伝子番号:7329としてNCBIデータベースに記載されている。UBE2Iについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7329
ヒトPIAS1は遺伝子番号:8554としてNCBIデータベースに記載されている。PIAS1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8554
ヒトPIAS2は遺伝子番号:9063としてNCBIデータベースに記載されている。PIAS2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9063
【０００９】
ヒトPIAS3は遺伝子番号:10401としてNCBIデータベースに記載されている。PIAS3についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10401
ヒトPIAS4は遺伝子番号:51588としてNCBIデータベースに記載されている。PIAS4についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/51588
ヒトRANBP2は遺伝子番号:5903としてNCBIデータベースに記載されている。RANBP2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5903
ヒトCBX4は遺伝子番号:8535としてNCBIデータベースに記載されている。CBX4についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8535
ヒトNSMCE2は遺伝子番号:286053としてNCBIデータベースに記載されている。NSMCE2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/286053
ヒトMUL1は遺伝子番号:79594としてNCBIデータベースに記載されている。MUL1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/79594
ヒトHDAC4は遺伝子番号:9759としてNCBIデータベースに記載されている。HDAC4についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9759
ヒトHDAC7は遺伝子番号:51564としてNCBIデータベースに記載されている。HDAC7についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/51564
ヒトTOPORSは遺伝子番号:10210としてNCBIデータベースに記載されている。TOPORSについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10210
【００１０】
ヒトFUSは遺伝子番号:2521としてNCBIデータベースに記載されている。FUSについての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10210
ヒトRASD2は遺伝子番号:23551としてNCBIデータベースに記載されている。RASD2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23551
ヒトTRAF7は遺伝子番号:84231としてNCBIデータベースに記載されている。TRAF7についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/84231
ヒトSENP1は遺伝子番号:29843としてNCBIデータベースに記載されている。SENP1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/29843
ヒトSENP2は遺伝子番号:59343としてNCBIデータベースに記載されている。SENP2についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/59343
ヒトSENP3は遺伝子番号:26168としてNCBIデータベースに記載されている。SENP3についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/26168
ヒトSENP5は遺伝子番号:205564としてNCBIデータベースに記載されている。SENP5についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/205564
ヒトSENP6は遺伝子番号:26054としてNCBIデータベースに記載されている。SENP6についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/26054
ヒトSENP7は遺伝子番号:57337としてNCBIデータベースに記載されている。SENP7についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/57337
本発明の第一の特徴の実施態様は、当該方法が標的細胞でSETDB1活性を調整する工程を追加で含む実施態様である。
SETDB1は当業界で公知であり、それらのアミノ酸配列及び関連する遺伝子の核酸配列に関する情報を当業者は容易に確認できる。
例示すれば、ヒトSETDB1は遺伝子番号:9869としてNCBIデータベースに記載されている。SETDB1についての記載にはアミノ酸及び核酸配列を含む情報が含まれる。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9869
【００１１】
本発明の第一の特徴はiPS細胞の集団を調製する方法を提供し、前記方法は、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又は1つ以上のSUMO経路、及び場合によってSETDB1の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む。
本発明の好ましい実施態様は、CAF1複合体の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させる工程が、CHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4の発現を低下させる1つ以上の作用因子を細胞に投与する工程を含む実施態様である。
本発明の好ましい実施態様は、SUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させる工程が、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASD2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6及び/又はSENP7の発現を低下させる1つ以上の作用因子を細胞に投与する工程を含む実施態様である。
実施例4及び添付の例に開示するように、本発明者らは、標的細胞でCAF1複合体及びSUMO経路の例示構成要素の発現を系統的に低下させ、iPSC生成に対する影響を測定した。それらは、CAF1複合体の構成要素さらにまたSUMO経路の構成要素の発現が低下するとき、iPS生成頻度に驚くべきかつ相乗的効果が存在することを示した。
したがって、本発明の第一の特徴の好ましい実施態様は、当該方法が、CAF1複合体の1つ以上の構成要素及びSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を標的細胞の集団で低下させることを含む実施態様である。本発明のさらに好ましい方法では、CAF1複合体の構成要素はCAF-1サブユニット（特にChaf1b）であり、SUMO経路の構成要素はUbe2iである。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様は、SUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させる工程が、SETDB1の発現を低下させる1つ以上の作用因子を細胞に投与する工程を含む実施態様である。
好ましい実施態様は、作用因子がsiRNA又はshRNA分子である実施態様である。
当該方法は、記載の標的複合体又は経路の量及び/又は活性を低下させる工程を含む。複合体及び経路の両者における個々の遺伝子構成要素及びタンパク質構成要素は上記に提供される。
個別の遺伝子又はタンパク質の量又は活性を低下させることができる種々の多くの手段が存在する。
“低下”は当該タンパク質の活性又は発現を阻害することによって達成できる。便宜上、本明細書では“活性を低下させる”は、CAF1複合体若しくはSUMO経路の構成要素の活性（例えばmRNAの分解の惹起、mRNA翻訳の低下によって低下させる）又はSETDB1を低下させることを指すために用いられるであろう。
いくつかの実施態様では、活性の低下はRNAiを用いて達成される。RNAiは当業界では周知の用語であり、典型的には特定のmRNA分子の破壊を引き起こすことによってRNA分子が遺伝子発現を阻害する生物学的プロセスである。
【００１３】
RNAiは細胞を狙い撃ちするために多くの方法で利用することができる。典型的には、shRNA（小さなヘアピンRNA分子（small hairpin RNA molecule））をコードする配列を適切なプラスミドから細胞内で発現させるか、又はsiRNA（小さな干渉RNA（small interfering RNA））を含む培地で標的細胞を培養することができる。いくつかの実施態様では、本発明で使用される阻害因子はRNAi因子である。当業者は問題の遺伝子の発現を阻害する適切なRNAi因子を同定することができる。本発明のいくつかの実施態様では、当該RNAi因子は発現を十分に阻害して、当該遺伝子から転写されるRNA（例えばmRNA）又はそのコードタンパク質の平均的定常状態レベルを例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またそれ以上低下させる。RNAi因子は、15−29ヌクレオチドの長さ（例えば17−23ヌクレオチドの長さ、例えば19−21ヌクレオチドの長さ）の配列を含むことができ、前記は当該mRNAに100%相補性であるか、又は前記は、最大数の相補性塩基対を達成できるように当該mRNAとアラインメントしたときにワトソン-クリック塩基対に関係しない1、2、3、4若しくは5までのヌクレオチド、又は約10−30%までのヌクレオチドを含む。RNAi因子は17−29ヌクレオチドの長さの二重鎖を含み、前記二重鎖では、全てのヌクレオチドがワトソン-クリック塩基対に関係するか又は約10−30%までのヌクレオチドがワトソン-クリック塩基対に関係しない。当業者は、どちらの配列の特徴が優れたsiRNAの機能性に密接に関係するを認識し、さらにそのようなsiRNAを設計できるアルゴリスム及び法則を認識していよう（例えば以下を参照されたい：Jagla, B., et al, RNA, 11(6):864-72, 2005）。本発明の方法はそのような特徴を有するsiRNAを利用することができる。いくつかの実施態様では、RNAi因子の一方又は両方の鎖の配列は非標的遺伝子のサイレンシングを回避するように選択され、例えば、当該鎖は標的mRNA以外の任意のmRNAに対して70%、80%又は90%未満の相補性を有することができる。いくつかの実施態様では、複数の異なる配列が用いられる。哺乳動物の遺伝子をサイレンシングできるRNAi因子は市場で入手できる（例えば以下の販売業者（Qiagen、Dharmacon、Ambion/ABI、Sigma-Aldrichなど）から入手できる）。問題の遺伝子で複数のアイソフォームが存在する場合、与えられた対象細胞で発現されるアイソフォームの全てに存在する領域を標的とするsiRNA又はshRNAを設計することができる。
【００１４】
当業者への手引きとして、本出願は、CAF1複合体及びSUMO経路の構成要素のためのshRNA分子を生成するために用いることができるsiRNA配列の例を本明細書の最後に提供する。この情報により、当業者は容易に適切な分子を生成して、本発明の方法で用いられるCAF1複合体及びSUMO経路の構成要素の発現でRNAi媒介低下を達成することができる。
細胞にsiRNA又はshRNAをコードする構築物をトランスフェクトすることによって遺伝子をサイレンシングする方法は当業界で公知である。体細胞でRNAi因子を発現させるために、RNAi因子をコードする配列（適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター）に作動できるように連結されてある）を含む核酸構築物を、当業界で公知のように細胞に導入することができる。本発明の目的のために、問題のRNA又はポリペプチドをコードする配列を含む核酸構築物は“発現カセット”と称され、前記配列は、問題の細胞で転写を指令する発現制御エレメント（例えばプロモーター）に作動できるように連結される。プロモーターは、哺乳動物の体細胞で機能的なRNAポリメラーゼI、II又はIIIプロモーターでありうる。ある種の実施態様では、RNAi因子の発現は条件性である。いくつかの実施態様では、発現は、RNAi因子をコードする配列を調節性（例えば誘導性又は抑制性）プロモーターの制御下に置くことによって調節される。本明細書で提供する例はある種のsiRNAのための配列を開示し、それらはマウス胚線維芽細胞でそれらの標的の発現阻害に有効であることが示された。当業者は、ヒトオルソローグの対応する領域を標的とするsiRNA配列を同定することができるであろう。
本発明の好ましい実施態様では、当該因子の発現は一過性である。
一過性抑制は、（I）一過性にデリバリーする方法又は（II）誘導性/調節性発現カセットの安定なデリバリーにより達成できる。
当業者には理解できるところであるが、一過性にデリバリーする方法の例には以下が含まれる：（1）siRNA、他の阻害性RNA分子の一過性トランスフェクション、（2）shRNA/siRNA発現カセットをコードするDNA又はRNAベクターの一過性トランスフェクション、（3）shRNA/siRNA又は標的を抑制する他の阻害性遺伝子エレメントをコードする非組込みウイルス（例えばAAV、アデノウイルス、センダイウイルス及び他の多くのウイルス）による感染。
哺乳動物細胞に誘導性/調節性/条件性発現カセットを安定的にデリバリーする仕方には多くの例、例えばレトロ/レンチウイルス、CRISPR及びTALEN技術、並びに他のデリバリー方法が存在する。加えて、多くの誘導可能な系が存在する。
本発明の実施態様では、本発明者らは、Tet応答性エレメントプロモーター（TRE3G）の制御下でshRNAをコードする自己不活化レトロウイルスベクターを用いた。当該ベクターは、本発明の方法で用いられるshRNAをコードし、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の発現を抑制した。ベクターは、好ましくはshRNAの誘導性及び可逆性発現を提供する。添付の例で概略するように、特異的ベクターはpSIN-TRE3G-mCherry-miRE-PGK-Neoと呼ばれる。しかしながら、当業者は、本発明の方法で用いられるshRNA分子をコードするように適合させることができる適切な一過性の誘導性/調節性発現カセット、及び標的細胞の集団に当該ベクターを導入するために用いられるプロトコルもまた容易に同定することができよう。
【００１５】
本発明のいくつかの実施態様では、細胞は少なくとも1日の期間作用因子と接触され、一方、他の実施態様では当該期間は少なくとも3、5、10、15又は20日間である。いくつかの実施態様では、細胞は、少なくとも1日かつ3、5、10、15又は20日を超えない期間接触される。
本発明のある種の実施態様では、作用因子はタンパク質、小分子、又はアプタマーである。いくつかの実施態様では、作用因子（例えばタンパク質、小分子又はアプタマー）はその標的と結合しこれを阻害するか、又はその活性が当該標的に必要とされるタンパク質と結合しこれを阻害する。標的複合体又は経路の構成要素の小分子阻害因子を本発明の多様な実施態様で用いることができる。
いくつかの実施態様では、培地に添加される作用因子の濃度は、10から10,000ng/mL、例えば100から5,000ng/mL、例えば1,000から2,500ng/mL又は2,500から5,000ng/mL又は5,000から10,000ng/mLである。
本発明の方法は、複数の作用因子による細胞の同時（すなわち、期間が少なくとも部分的にオーバーラップする）又は連続的処理、及び/又は1つの作用因子による細胞の処理工程の繰返しを含むことができる。繰返し処理に用いられる作用因子は、最初の処理時に用いられた作用因子と同じでも異なっていてもよい。
細胞は多様な期間再プログラミング作用因子と接触させることができる。いくつかの実施態様では、細胞は1時間から60日の期間、例えば10から30日、例えば約15−20日間作用因子と接触される。再プログラミング作用因子は、細胞培養培地を入替えるたびに細胞に添加できる。再プログラミング作用因子は、分化万能性細胞の濃縮のために選別を実施する前又は分化万能性の特徴について細胞を評価する前に除去することができる。
【００１６】
本発明のある好ましい実施態様では、CAF1複合体構成要素又はSUMO経路構成要素の発現を低下させる作用因子は、一過性発現系を用いて標的細胞内で発現されるRNAi因子である。
本発明者らは、同定遺伝子の発現レベルを標的細胞内で調整することができる種々の方法を試験する一連の実験を実施した。添付の実施例に示すように、本発明者らは驚くべきことに、CAF1複合体構成要素又はSUMO経路構成要素の発現を低下させるRNAi因子の一過性発現を用いて、細胞の再プログラミングの効率を増加させることが可能であることを見出した。特に、CAF1（Chaf1a又はChaf1b）及び/又はUbe2iの一過性発現はOKSMの一過性発現と一緒になって、たとえshRNA/siRNA及びOKSMが2日間しか発現されなくても安定な再プログラミングを促進できる。このことは驚くべく結果である。なぜならば、確立されたOKSMに基礎を置くiPSC再プログラミングレジメンは、典型的には長期間に及ぶOKSM発現を要求するからである。理解しうるところであるが、本発明の方法で用いられるRNAi因子の一過性デリバリーは、標的遺伝子発現を改変して再プログラミング効率を促進する既存の方法よりはるかに有利である。なぜならば、標的細胞ゲノムに永久的に取り込まれる外来核酸は存在せず、さらにまたCRISPR若しくは他の同様な技術の場合のような損傷DNA編集によるアーティファクトの機会が少ないからである。
本発明のさらに別の実施態様は、RNAi因子を発現する一過性発現系に細胞が120、96、72、48又は36時間暴露される実施態様である。理解されるところであるが、上記に記載の時間範囲は網羅を意図するものではなく単に便宜的であり、提示の時間範囲の間の全時点が本発明の方法の範囲に含まれる。
したがって、本発明の第一の特徴の好ましい方法は、標的細胞にCAF1複合体構成要素及び/又はSUMO経路構成要素の発現を一過性に抑制する1つ以上の作用因子を投与する方法であって、前記作用因子がRNAi因子である方法である。RNAi因子を用いてCAF1複合体構成要素及び/又はSUMO経路構成要素の発現を一過性に抑制する方法は上記に提供されている。例えば、上記に記載の、Tet応答性エレメントプロモーターの制御下でshRNAをコードする自己不活化レトロウイルスベクターを用いることができる。
【００１７】
本発明で使用される標的細胞は、初代細胞（非不死化細胞）、例えば動物から新しく単離した細胞でもよく、又は培養で長期増殖できるか（例えば3カ月以上）若しくは無限増殖できる（不死化細胞）細胞株から誘導してもよい。成熟動物の体細胞を個体（例えばヒト対象動物）から入手し、当業者が利用できる標準的な細胞培養プロトコルにしたがって培養することができる。細胞は、対象動物からそれらを分離した後細胞培養で維持することができる。ある種の実施態様では、個体から単離した後、細胞は、本発明の方法で使用する前に1回以上（例えば2−5、5−10、10−20、20−50、50−100回、又はそれ以上）継代される。細胞は凍結することができ、続いて使用前に融解することができる。いくつかの実施態様では、個体から単離した後本発明の方法で使用される前に、細胞の継代は1、2、5、10、20又は50回を超えない。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、細胞株（例えば、典型的には単一の先祖細胞、又は範囲が限定された及び/又は実質的に同一の先祖細胞の集団から誘導される、大部分が同一又は実質的に同一の細胞の集団）の細胞、又は個別の個体から入手した組織サンプル由来の細胞を利用する。細胞株は、長期間培養で維持されてきたか、又は維持することができる（例えば何カ月も何年も無限の期間にわたって）。細胞株は偶発的又は誘導的な形質転換プロセスを受けている可能性があり、前記プロセスは当該細胞に無限の培養寿命を付与する。細胞株には当業界で細胞株として認識されている全ての細胞株が含まれる。細胞は、突然変異及びおそらく後成的変化も時間の経過とともに獲得し、したがって細胞株の個々の細胞の少なくともいくつかの特性は互に異なりうることは理解されるであろう。
本発明の好ましい実施態様は、標的細胞が哺乳動物の体細胞、好ましくはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、又はマウス細胞である実施態様である。
本発明の好ましい実施態様は、哺乳動物の体細胞が、線維芽細胞、成熟動物の幹細胞、セルトリ細胞、顆粒層細胞、ニューロン、膵小島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（B及びTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞又は骨格筋細胞である実施態様である。
【００１８】
本発明で使用される体細胞は、典型的には哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、又はマウス細胞である。それらは、周知の方法によって、多様な器官、例えば皮膚、肺、膵、肝、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道及び他の泌尿器官など、一般的には生きた体細胞を含む任意の器官又は組織から入手できる。本発明の多様な実施態様で有用な哺乳動物体細胞は、線維芽細胞、成熟動物の幹細胞、セルトリ細胞、顆粒層細胞、ニューロン、膵小島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（B及びTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、骨格筋細胞など、一般的には任意の有核の生きた体細胞である。いくつかの実施態様では、体細胞は最終的に分化した細胞である。すなわち、細胞は完全に分化し、（当該身体の正常な状態下では）より専門化した細胞を生じない。いくつかの実施態様では、体細胞は、当該身体の正常な状態下では分裂しない最終的に分化した細胞である。すなわち、細胞は自己再生できない。いくつかの実施態様では、体細胞は前駆細胞である。すなわち、細胞は完全には分化しておらず、より完全に分化した細胞を生じることができる。いくつかの実施態様では、比較的便利な手順でヒト対象動物から入手できる細胞が用いられる（例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、循環白血球）。
本発明の方法では、標的細胞の集団は、一般的には、温度、pH、及び他の環境条件の標準的条件下で、例えば5−10%のCO2を含む雰囲気に37℃で組織培養プレートにおいて接着細胞として培養できる。細胞及び/又は細胞培養培地を適切に改変して、本明細書に記載する再プログラミングを達成できる。細胞培養培地は、生存能力を維持するために十分であり、典型的には少なくともいくつかの細胞タイプの増殖を補助する栄養素を含む。培地は、以下のいずれかを適切な組み合わせで含むことができる：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコース又は他の糖、抗生物質、血清又は血清代替物、及び他の構成要素（例えばペプチド増殖因子）など。個別の細胞タイプに通常的に用いられる細胞培養培地は当業者に公知である。いくつかの非限定例が本明細書で提供される。
【００１９】
当業者には理解されるところであろうが、CAF1複合体の1つ以上の構成要素及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を標的細胞の集団で低下させるために必要な作用因子の量は、本発明の方法で用いられる標的細胞のタイプに応じて変動しうる。同様に、標的細胞を上記に記載の作用因子に暴露する時間の長さも本発明の方法で用いられる標的細胞のタイプに応じて変動しうる。
個別の細胞タイプで再プログラミングをもっとも効果的に促進するために必要な量及び時間の長さは、本明細書に開示する方法さらにまた通常の実験手順を用いて容易に同定できる。もっとも効果的な作用因子タイプもまた同定することができる。
例えば、当業者は同じ標的細胞を用いて一連の実験を実施し、続いて時間を固定して前記細胞の種々の量を用いて本発明の方法を実施し、その後、当該標的細胞タイプのためにもっとも効果的な条件を同定することができる。同様に、当業者は、同じ標的細胞を用いて一連の実験を実施し、続いて固定量の作用因子に細胞を暴露する時間を変動させて本発明の方法を実施し、その後、当該標的細胞タイプのためにもっとも効果的な条件を同定することができる。さらにまた、一過性発現系で用いられるプロモーター配列を変更する類似の実験を実施して、最適な系を同定することができる。さらに、標的細胞に一過性発現ベクターをトランスフェクトする種々の方法を用いて、標的細胞のために最適なプロトコルもまた同定することができる。
理解されるように、上記アプローチの多様な日常的変法を用いて、本特許請求の方法で個別の標的細胞タイプに適用できる最良の条件を同定できる。
【００２０】
本発明の第一の特徴の方法では、標的細胞の集団は、再プログラミングの間iPS細胞の培養に適した培地で培養される。例示的な血清含有iPS培地は、80% DMEM（典型的にはKO DMEM）、20%の吟味済の（defined）非熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、1%の非必須アミノ酸、1mM L-グルタミン及び0.1mM [ベータ]-メルカプトエタノールで作製される。培地はろ過され、4℃で2週間以内保存される。無血清ES培地は、80% KO DMEM、20%血清代替物、1%非必須アミノ酸、1mM L-グルタミン、及び0.1mM [ベータ]-メルカプトエタノール、並びに血清代替物（例えばInvitrogen Cat. No. 10828-028）で調製できる。培地はろ過して４℃で保存される。条件付けのために用いられる細胞と一緒にする前に、ヒトbFGFを最終濃度4ng/mLで添加することができる。StemPro(R) hESC SFM（Invitrogen Cat. No. A1000701）（ヒト胚性幹細胞の増殖及び増加のために特別に処方された、十分に吟味済の無血清かつ無フィーダー培地）が使用される。いくつかの実施態様では、iPS細胞は1つ以上の分化細胞タイプに再プログラミングされる。iPS細胞は、最初はES細胞の維持に適切な培地で培養し、さらに所望の細胞タイプに適した培地に移すことができる。
本発明はiPS細胞の集団を調製する方法を提供し、前記方法は、標的細胞の集団でCAF1複合体の1つ以上の構成要素、及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させること、並びに（ii）場合によって当該標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む。
本発明の方法は、iPS細胞の調製のための再プログラミングプロトコルの部分として用いられる。
“再プログラミングプロトコル”は、少なくともいくつかの細胞に再プログラミングを引き起こす任意の処理又は処理の組み合わせを指す。いくつかの実施態様では、“再プログラミングプロトコル”は公知の再プログラミングプロトコルの変型を指すことができ、前記変型では、公知の再プログラミングプロトコルで用いられる因子又は他の作用因子が省略又は改変される。いくつかの実施態様では、“再プログラミングプロトコル”は公知の再プログラミングプロトコルの変型を指すことができ、前記変型では、再プログラミングに使用されることが知られている因子又は作用因子が、再プログラミングにおけるその有用性がこれまで確立されたなかった異なる作用因子とともに用いられる。
さて、再プログラミングプロトコルの詳細を下記に提供する。
【００２１】
体細胞を分化万能性細胞へと再プログラミングするためには、細胞を処理して、1つ以上の再プログラミング因子又は分化万能性因子がそのような処理が存在しないときのレベルより高いレベルで発現されるか又は含まれるようにすることができる。例えば、体細胞を遺伝的に操作して1つ以上のそのような因子をコードする1つ以上の遺伝子を発現させるか、及び/又はそのような因子をコードする1つ以上の内因性遺伝子の発現を増加させ、及び/又はそのような因子を安定化させる作用因子で処理することができる。作用因子は、例えば小分子、核酸、ポリペプチドなどでありうる。いくつかの実施態様では、分化万能性因子は、例えばマイクロインジェクションによって、又は因子が細胞によって摂取される条件下で当該因子と細胞を接触させることによって体細胞に導入される。いくつかの実施態様では、因子を改変してタンパク質形質導入ドメインを取り込ませる。いくつかの実施態様では、細胞を透過性にするか、そうでなければ細胞の因子摂取を高めるために処理する。例示的な因子は下記で考察される。
【００２２】
転写因子Oct4（Pou5f1、Oct-3、Oct3/4とも呼ばれる）は分化万能性因子の一例である。Oct4は、ES細胞の未分化表現型の確立及び維持に必要であることが示され、胚発生及び細胞分化の初期事象の決定に主要な役割を果たす（Nichols et al., 1998, Cell 95:379-391；Niwa et al., 2000, Nature Genet. 24:372-376）。Oct4は、幹細胞がより専門化された細胞に分化するにつれてダウンレギュレートされる。Nanogは分化万能性因子の別の例である。Nanogは、内部細胞塊の分化万能性細胞の維持及びこれらからES細胞の派生において必須の機能を有するホメオボックス含有転写因子である。さらにまた、Nanogの過剰発現は、通常は分化を誘導する培養条件である条件下で、ESCの分化万能性及び自己再生の特徴を維持する能力を有する（例えば以下を参照されたい：Chambers et al., 2003, Cell 113: 643-655；Mitsui et al., Cell. 2003, 1 13(5):631-42）。Sox2（別の分化万能性因子）は、正常な分化万能性細胞の発達及び維持に必須であることが知られているHMGドメイン含有転写因子である（Avilion, A., et al., Genes Dev. 17, 126-140, 2003）。K1f4は、最初は腸で発現されるKIfファミリーメンバーとして同定されたKruppel型ジンクフィンガー転写因子である（Shields, J.M, et al., J. Biol. Chem. 271 :20009-20017, 1996）。マウスES細胞でのK1f4の過剰発現は、浮遊培養で形成される胚様体で分化を妨げることが見出され、K1f4はESの自己再生に寄与すると提唱されている（Li, Y., et al., Blood 105:635-637, 2005）。Sox2は、SOX（性決定領域Y-ボックス）転写因子のファミリーのメンバーであり、ES細胞の自己再生の維持に重要である。c-Mycは正常な発達及び生理学で多くの役割を果たす転写因子であるとともに、オンコジーンであり、その調節不良発現又は変異は多様な癌タイプに関係がある（以下で概説されている：Pelengaris S, Khan M., Arch Biochem Biophys. 416(2):129-36, 2003；Cole MD, Nikiforov MA, Curr Top Microbiol Immunol, 302:33-50, 2006）。いくつかの実施態様では、そのような因子は、Oct4、Sox2、K1f4及び前記の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施態様では、異なる、機能的にオーバーラップするKIfファミリーメンバー（例えばK1l2）がK1f4と取り替えられる。いくつかの実施態様では、因子は少なくともOct4を含む。いくつかの実施態様では、因子は少なくともOct4及びKIfファミリーメンバー（例えばK1f2）を含む。Lin28は、発生的に調節されるRNA結合タンパク質である。いくつかの実施態様では、体細胞は、Oct4、Sox2、K1f4、Nanog、Lin28及び前記の組み合わせから成る群から選択される1つ以上の再プログラミング因子を発現又は含むことができるように処理される。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質アルファ（C/EBPアルファ）は、少なくともある種の細胞タイプ（例えばリンパ様細胞（例えばB系列細胞））で再プログラミングを促進する別のタンパク質で、そのような細胞タイプの再プログラミング因子と考えられる。
【００２３】
ある実施態様では、外因的に導入した遺伝子は、その機能が分化万能性と密接に関係する内因性遺伝子の染色体遺伝子座以外の染色体遺伝子座から発現されうる。そのような染色体遺伝子座はオープンクロマチン構造を有する遺伝子座であり、その発現が体細胞で必要とされない遺伝子を含むことができる（例えば当該染色体遺伝子座はその破壊が細胞を死滅させない遺伝子を含む）。例示的な染色体遺伝子座には、例えばマウスROSA26遺伝子座及びII型コラーゲン（Col2a1）遺伝子座が含まれる（例えば以下を参照されたい：Zambrowicz et al., 1997）。
【００２４】
細胞で遺伝子を発現させる方法は当業界で公知である。一般的には、ポリペプチド又は機能性RNA（例えばRNAi因子）をコードする配列は、適切な調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー及び/又は他の発現制御エレメント）に作動できるように連結される。例示的な調節配列は以下に記載されている：Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990) [0086]）。遺伝子は、その発現を調節することができるように、誘導性又は抑制性調節配列から発現させることができる。例示的な誘導性プロモーターには例えば以下が含まれる：重金属に応答するプロモーター（CRC Boca Raton, FIa. (1991), 167-220；Brinster et al. Nature (1982), 296, 39-42）、熱ショックに応答するプロモーター、ホルモンに応答するプロモーター（Lee et al. P.N.A.S. USA (1988), 85, 1204-1208；(1981), 294, 228-232；Klock et al. Nature (1987), 329, 734-736；Israel and Kaufman, Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2589-2604）、化学薬剤（例えばグルコース、ラクトース、ガラクトース又は抗生物質）に応答するプロモーター。テトラサイクリン誘導性プロモーターは、抗生物質（テトラサイクリン又はそのアナローグ）に応答する誘導性プロモーターの例である（以下の文献及びその中の参照文献を参照されたい：Gossen, M. and Bujard, H., Annu Rev Genet. Vol. 36: 153-173 2002）。テトラサイクリンのアナローグには、テトラサイクリンと構造的類似性を示し、テトラサイクリン誘導性プロモーターを活性化できる任意の化合物が含まれる。例示的なテトラサイクリンアナローグには、例えばドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン及びアンヒドロテトラサイクリンが含まれる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施態様では、導入した遺伝子（例えば再プログラミング因子又はRNAi因子をコードする遺伝子）の発現は一過性である。一過性発現は、一過性トランスフェクション、又は調節可能なプロモーターから発現させることによって達成できる。いくつかの実施態様では、発現は、部位特異的リコンビナーゼの発現によって調節しうるか、又は位置特異的リコンビナーゼの発現に左右される。リコンビナーゼ系にはとりわけCre-Lox及びF1p-Frt系が含まれる（Gossen, M. and Bujard, H., 2002）。いくつかの実施態様では、リコンビナーゼを用いてストッパー配列を除去することによって発現が始動される（ストッパー配列はまた別にはコード配列を発現制御配列から分離させる）。いくつかの実施態様では、リコンビナーゼを用いて、再プログラミング誘導後に遺伝子の少なくとも一部分が切り出される。いくつかの実施態様では、リコンビナーゼを一過性に発現させ、例えばリコンビナーゼは約1−2日後、2−7日後、1−2週間後などには検出不能になる。いくつかの実施態様では、リコンビナーゼは外部供給源から導入される。
タンパク質再プログラミング因子（例えばOct4、Sox2、K1f4など）を細胞に導入し、それによって外因性遺伝物質の導入を回避することが意図される。タンパク質形質導入ドメインを含むようにそのようなタンパク質を改変することができる。そのような摂取強化アミノ酸配列は、例えばHIV-I TATタンパク質、単純ヘルペスウイルス1（HSV-I）DNA結合タンパク質VP22、ドロソフィラ・アンテナペジア（Antp）転写因子などで見出される。人工的配列もまた使用される。例えば以下を参照されたい：Fischer et al, Bioconjugate Chem., Vol. 12, No. 6, 2001及び米国特許6,835,810号。
再プログラミングを強化するために多様な追加的作用因子の使用が意図される。そのような作用因子は、CAF1複合体の1つ以上の構成要素及び/又はSUMO経路の1つ以上の構成要素の量及び/又は活性を低下させる作用因子（例えば本明細書に開示するshRNA因子）と組み合わせて用いることができる。
【００２６】
本開示は体細胞の分化万能性への再プログラミングに焦点を当てているが、本発明は、分化した体細胞を第一の細胞タイプから第二の細胞タイプへ再プログラミングするために利用することができる。例えば、本明細書で同定した調整遺伝子及びプロセスは、転写因子の個別の組み合わせの発現を必要とする再プログラミングプロトコルを強化して、それら細胞を異なるタイプの細胞に変換することが意図される。標的の調整を必要とするそのような再プログラミングプロトコルが本明細書で同定された。
ある種の実施態様では、細胞は、細胞外マトリックスの1つ以上の特色を模倣するか、又は1つ以上の細胞外マトリックス若しくは基底膜構成要素を含む物質上で又は当該物質の存在下で培養される。いくつかの実施態様では、マトリゲルTM（MatrigelTM）が用いられる。他の物質にはタンパク質又はその混合物、例えばゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチンなどが含まれる。本発明のある種の実施態様では、細胞はフィーダー細胞層の存在下で培養される。そのような細胞は、例えばネズミ又はヒト起源でありうる。それらは放射線照射されるか、化学的不活化剤（例えばマイトマイシンc）による処理によって化学的に不活化されるか、又はそうでなければ所望の場合にはそれらの増殖を阻害するために処理できる。他の実施態様では、標的細胞はフィーダー細胞無しで培養される。
【００２７】
本発明の第一の特徴の方法にしたがって調製されるiPS細胞は、所望される細胞の状態又は細胞タイプの1つ以上の特徴について評価することができる。例えば、細胞は分化万能性の特徴について査定することができる。分化万能性の特徴の存在は、標的細胞が分化万能性状態へ再プログラミングされたことの指標である。本明細書で用いられる“分化万能性の特徴”という用語は、分化万能性に随伴し分化万能性の指標となる特徴を指し、例えば、全3胚葉の全てのタイプから誘導される細胞に分化する能力、及び分化万能性細胞のために明瞭な遺伝子発現パターン（分化万能性因子の発現及び他のES細胞マーカーの発現を含む）が含まれる。
再プログラミングされた可能性がある標的細胞を分化万能性の特徴について評価するために、そのような細胞を個別の増殖の特徴及びES細胞様形態について分析することができる。細胞を免疫抑制SCIDマウスの皮下に注入して、それらがテラトーマを誘発するか否かを決定できる（ES細胞のための標準的アッセイ）。ES様細胞は胚様体に分化することができる（別のES固有の特色）。さらにまた、ES様細胞は、固有の細胞タイプへの分化を駆動することが知られているある種の成長因子を添加することによってin vitroで分化させることができる。自己再生能力（テロメラーゼ活性の誘導によって表される）は、モニターすることができるもう1つの分化万能性の特徴である。再プログラミングされた標的細胞を胚盤胞に導入し、当該細胞が全ての細胞タイプを形成できるか否かを決定することによって当該細胞の機能性アッセイを実施できる（以下を参照されたい：Hogan et al., 2003）。再プログラミングされた細胞が身体のいくつかの細胞タイプを形成できるならば、それらは多能性であり、再プログラミングされた細胞が身体の全ての細胞タイプ（生殖細胞を含む）を形成できるならば、それらは分化万能性である。
【００２８】
個々の分化万能性因子の発現もまた試験することができる。つけ加えて或いはまた別に、他のES細胞マーカー（例えばステージ特異的胚性15抗原1、3及び4（SSEA-I、SSEA-3、SSEA-4）、前記は初期胚発生で特異的に発現される糖タンパク質であり、ES細胞のマーカーである）の発現を評価してもよい（Solter and Knowles, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5565-5569；Kannagi et al., 1983, EMBO J 2:2355-2361）。アルカリホスファターゼ（AP）酵素の発現上昇は、未分化胚性幹細胞に密接に関係する別のマーカーである（Wobus et al., 1 984, Exp. Cell 152:212-219；Pease et al., 1990, Dev. Biol. 141 :322-352）。追加されるES細胞マーカーは以下に記載されている：Ginis, L, et al., Dev. Biol, 269: 369-380, 2004；並びにThe International Stem Cell Initiative, Adewumi O, et al., Nat Biotechnol., 25(7):803-16, 2007及びその中の参照文献。例えば、TRA-1−60、TRA-1−81、GCTM2及びGCT343、並びにタンパク質抗原CD9、Thyl（CD90）、クラス1 HLA、NANOG、TDGFl、DNMT3B、GABRB3及びGDF3、REX-I、TERT、UTF-I、TRF-I、TRF-2、コネキシン43、コネキシン45、Foxd3、FGFR-4、ABCG-2及びGlut-1が用いられる。
再プログラミングされた標的細胞の発現プロフィール試験を実施して、それらの分化万能性の特徴を評価することができる。分化万能性細胞（例えば胚性幹細胞）及び多能性細胞（例えば成熟動物幹細胞）は、別個の包括的遺伝子発現パターンを有することが知られている（例えば以下を参照されたい：Ramalho-Santos et al., Science 298: 597-600, 2002；Ivanova et al., Science 298: 601-604, 2002；Boyer, LA, et al. Nature 441, 349, 2006；及びBernstein, BE, et al., Cell 125 (2), 315, 2006）。DNAメチル化、遺伝子発現、及び/又は細胞DNAの後成的状態、及び/又は細胞の発生潜在能力を評価することができる（例えば以下に記載されている：Wernig, M., et al., Nature, 448:318-24, 2007）。SCIDマウスに注入したとき内胚葉、中胚葉及び外胚葉の特徴を有する細胞を含むテラトーマを形成できるか、及び/又は（ネズミの胚盤胞に注入した後）出産まで生存するキメラの形成に関与する能力を有する細胞は分化万能性と考えられる。分化万能性を評価するために用いられる別の方法は、細胞がサイレントなX染色体を活性化したか否かを決定するものである。
【００２９】
同様な方法を用いて、所望の細胞タイプ又は系列へ細胞を再プログラミングする効率を評価できる。そのような細胞で選択的に又は特異的に発現されるマーカーの発現を評価することができる。例えば、神経性、造血性、筋原性又は他の細胞系列及び分化細胞によって選択的に又は特異的に発現されるマーカーは公知であり、それらの発現を評価することができる。本発明のいくつかの実施態様では、本発明の方法にしたがって細胞を再プログラミングすることによって、2−5、5−10、10−25、25−50、50−100、100−250、250−500、500−1000又は前記を超えるRNA（例えばmRNA）又はタンパク質の発現レベルが増加する。当該細胞の機能的又は形態学的な特徴を評価して再プログラミングの効率を評価することができる。
本発明のある種の方法は、多能性若しくは分化万能性細胞によって又は所望の細胞タイプ若しくは系列によって発現されるマーカーを発現する細胞を同定又は選別する工程を含む。標準的な細胞分離方法、例えばフローサイトメトリー、アフィニティ選別などを用いることができる。また別に或いは付け加えて、再プログラミングされた可能性がある細胞の元の細胞に特徴的なマーカーを発現しない細胞を選別することができよう。細胞を分離する他の方法は、分化万能性細胞と元の標的細胞との間に存在しうる平均細胞サイズ又は密度の相違を利用することができる。例えば、一定の細胞のみを通過させる孔を有する物質で細胞をろ過することができる。
いくつかの実施態様では、標的細胞は、選別可能又は検出可能なマーカー（例えばGFP又はneo）と作動できるように連結された分化万能性因子をコードする遺伝子の調節配列を含む核酸を含む。マーカーをコードする核酸配列は分化万能性因子をコードする遺伝子（例えばOct4、Nanog）の内因性遺伝子座に組み込まれるか、又は構築物はマーカーに作動できるように連結された調節配列を含むことができる。マーカーの発現を利用して、再プログラミングされた細胞を選別、同定、及び/又は定量することができる。
【００３０】
再プログラミングされた標的細胞の形成に関する本発明の方法のいずれも、細胞療法の必要な個体から標的細胞を入手する工程又は標的細胞の集団を入手する工程を含むことができる。iPSは、入手された細胞から又は入手された細胞の子孫細胞から形成、選別又は同定される。場合によって、ドナーに遺伝的に適合したiPS細胞の形成、選別又は同定の前に細胞を培養で増加させる。
いくつかの実施態様では、所望の細胞（すなわちiPS細胞）が濃縮された細胞の集団を得るために、コロニーは1回以上サブクローニング及び/又は継代される。濃縮された集団は、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%又は前記を超える（例えば100%の）所望タイプの細胞を含むことができる。本発明は、安定的にかつ遺伝させることができるようにES様状態に再プログラミングされてある標的細胞の細胞株を提供する。
いくつかの実施態様では、当該方法は、形態学的な基準を利用して、所望のタイプに再プログラミングされていない細胞の集団から再プログラミングされた細胞を同定する。いくつかの実施態様では、当該方法は、形態学的な基準を利用して、ES様状態に再プログラミングされていない、又は部分的にしか再プログラミングされていない細胞の集団から、ES様状態に再プログラミングされてある標的細胞を同定する。“形態学的基準”は広い意味で用いられ、当該細胞又はコロニーの任意の目視により検出できる特色又は特徴を指す。形態学的基準には、例えばコロニーの形状、コロニーの境界の明瞭さ、密度、小さなサイズ、及び再プログラミングされていない細胞と比較した当該細胞の球形の形状などが含まれる。例えば、小さな球形細胞で構成され、明瞭なコロニー境界を有する密なコロニーはES及びiPS細胞に特徴的である。本発明は、コロニーが所望の細胞タイプの1つ以上の特徴を示す場合、コロニー（又はコロニーから細胞）を同定し場合によって単離する工程を包含する。iPS細胞は第一の細胞培養皿（この用語は、生細胞をin vitroで維持することができる任意の器、プレート、ディッシュ、入れ物、容器などを指す）で増殖するコロニーとして同定され、当該コロニー又はその部分は第二の細胞培養皿に移され、それによって再プログラミングされた細胞を単離することができる。続いて細胞はさらに増加させることができる。
【００３１】
本発明は、本発明の方法によって作製されるiPS細胞を提供する。これらの細胞は医学、農学及び他の重要な領域で多くの適用性を有する。本発明は、哺乳動物で症状の治療又は予防のための方法を提供する。ある実施態様では、当該方法は、個体から体細胞を入手する工程、これら細胞を用いて標的細胞の集団を調製する工程、及び本発明にしたがってiPS細胞の集団を調製する工程を含む。
本発明のある種の実施態様では、入手したiPS細胞は、続いて所望の細胞タイプへそれら細胞を発育させるために適切な条件下で培養される。すなわち、それらは続いて再分化したiPS細胞になる。所望の細胞タイプの細胞は当該症状を治療されるべき個体に導入される。iPS細胞はまた所望の器官に発育させるために誘導することができ、前記器官を収集して当該症状を治療されるべき個体に導入される。症状は、細胞又は器官の機能が異常であるか、及び/又は正常レベルより低下している任意の症状でありうる。したがって、本発明は、細胞療法の必要な個体から体細胞を入手すること、これら細胞を標的細胞の集団として本発明の方法で用いること、及び場合によってiPS細胞を分化させて1つ以上の所望の細胞タイプの細胞を作製すること、及び当該個体に当該細胞を導入することを包含する。細胞療法が必要な個体は任意の症状に罹患し、当該症状又は当該症状の1つ以上の徴候は当該ドナーへ細胞を投与することによって緩和できるか、及び/又は当該個体への細胞の投与によって症状の進行を遅らせることができる。当該方法は、再プログラミングされた体細胞を同定又は選別する工程、及び再プログラミングされていない細胞から前記体細胞を単離する工程を含むことができる。
【００３２】
したがってiPS細胞は、そのような細胞を分化させる公知の方法にしたがって所望の細胞タイプを得るために誘導して分化させることができる。例えば、iPS細胞は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞、神経系細胞（例えばニューロン）などに、そのような細胞を分化培地中で及び細胞分化を提供する条件下で培養することによって分化を誘導することができる。伝統的な方法を用いて入手される胚性幹細胞の分化をもたらす培地及び方法は、適切な培養条件として当業界で公知である。そのような方法及び培養条件は、本発明にしたがって入手されるiPS細胞に適用できる。例えば以下の文献及びその中の参照文献（前記文献のいずれも参照により取り込まれる）をいくつかの例のために参照されたい：Trounson, A., The production and directed differentiation of human embryonic stem cells, Endocr Rev. 27(2):208-19, 2006。さらにまた以下の文献及びその中の参照文献（前記文献のいずれも参照により取り込まれる）を参照されたい：Yao, S., et al, Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions, Proc Natl Acad Sci U S A, 103(18): 6907-6912, 2006。
したがって、公知の方法及び培養培地を用いて、当業者はiPS細胞を培養して、所望の分化細胞タイプ（例えば神経細胞、筋肉細胞、造血細胞など）を入手できる。対象細胞を用いて任意の分化した細胞タイプを入手することができる。そのような分化したヒト細胞は多くの治療機会を提供することができる。例えば、本発明にしたがって再プログラミングした細胞から誘導したヒト造血幹細胞を、骨髄移植を必要とする医学的治療で用いることができる。そのような手順を用いて多くの疾患（例えば後期癌及び悪性疾患（例えば白血病））が治療される。そのような細胞はまた貧血、免疫系を損なう疾患（例えばエイズ）などの治療に使用される。本発明の方法はまた、神経学的疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病若しくはALS、リソソーム貯蔵疾患、多発性硬化症又は脊椎損傷）の治療、予防又は安定化のために用いることができる。例えば、体細胞を治療が必要な個体から入手し、分化万能性を得るために再プログラミングし、さらに症状を示す又は損傷した組織の正常な機能を代替又は補助するために用いることができる神経外胚葉細胞を誘導するために培養することができる。
【００３３】
成長因子又はホルモン（例えばインスリンなど）を生成する再分化したiPS細胞は、内分泌疾患の治療又は予防のために哺乳動物に投与できる。上皮細胞を形成する再分化iPS細胞は、体腔又は器官（例えば肺、腸、外分泌腺、又は泌尿生殖管）の基底層の損傷を修復するために投与できる。iPSを哺乳動物に投与してある器官の細胞の損傷又は機能不全を治療することもまた意図される（ある器官は、例えば膀胱、脳、食道、卵管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺臓、卵巣、膵臓、前立腺、脊椎、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、又は子宮である）。
iPS細胞をマトリックスと一緒にして、レシピエントの哺乳動物の組織又は器官の代替又は修復に用いられうる組織又は器官をin vitro又はin vivoで形成できる（そのような方法は“細胞療法”という用語に包含される）。例えば、iPS細胞はマトリックスの存在下にin vitroで培養して、泌尿生殖系、心脈管系、又は筋肉骨格系の組織又は器官を形成できる。或いはまた、所望の組織をin vivoで形成するために、細胞及びマトリックスの混合物を哺乳動物に投与してもよい。本発明にしたがって作製したiPS細胞を用いて、遺伝子操作された細胞又はトランスジェニックに分化させた細胞を作製できる。前記は、例えば、所望の1つ又は複数の遺伝子を導入するか、又は本発明にしたがって作製したiPS細胞の内在性の1つ又は複数の遺伝子の全部又は部分を除去し、そのような細胞を所望の細胞タイプに分化させることによって達成される。そのような改変を達成するための1つの方法は相同組換えによるものであり、前記技術を用いて、ゲノム内の固有の1つ又は複数の部位に1つ又は複数の遺伝子を挿入し、欠失させ又は改変することができる。
【００３４】
この方法論を用いて、欠損遺伝子を代替するか又は治療的に有益なタンパク質（例えば成長因子、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、酵素など）の発現をもたらす遺伝子を導入することができる。例えば、脳由来成長因子をコードする遺伝子をヒト胚細胞又は幹様細胞に導入し、当該細胞を神経細胞に分化させ、当該細胞をパーキンソン病の患者に移植してそのような疾患時の神経細胞の消失を遅らせることができる。所望の遺伝子/変異をiPS細胞に導入する公知の方法を用いて、iPS細胞を遺伝子操作し、生じた操作細胞を所望の細胞タイプ（例えば造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞など）に分化させることができる。iPS細胞に導入できる遺伝子には例えば以下が含まれる：上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア由来神経栄養増殖因子、インスリン様成長因子（I及びII）、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4/5、毛様体神経栄養因子、AFT-1、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（アルファ及びベータ）など）、治療用酵素、コラーゲン、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子、など。
【００３５】
当業界で公知の負の選別系を用い、所望の場合には患者から治療用細胞を排除することができる。例えば、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子をトランスフェクトされた細胞は、TK遺伝子を含む再プログラミング細胞（前記もまたTK遺伝子を発現する）の形成をもたらすであろう。そのような細胞はガンシクロビル投与に際して任意の時に患者から選択的に排除できる。そのような負の選別系は米国特許5,698,446号に記載されている。他の実施態様では、細胞は、有毒生成物（その発現は誘導性プロモーターの制御下にある）をコードする遺伝子を含むように操作される。誘導物質の投与は有毒生成物の生成を引き起こし、細胞死をもたらす。したがって、本発明の体細胞のいずれも自殺遺伝子を含むことができる。前記自殺遺伝子は場合によって発現カセットに含まれ、ゲノムに組み込むことができる。自殺遺伝子は、その発現が細胞にとって致死的な遺伝子である。例には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシンなどをコードする遺伝子が含まれる。自殺遺伝子は、特定の誘導性物質又は刺激が存在しない正常な環境下では発現を指令しない発現制御エレメントの制御下に置くことができる。しかしながら、発現は、例えば（i）適切な誘導作用因子を細胞又は器官に投与することによって、又は（ii）特定の遺伝子（例えばオンコジーン、細胞分裂周期に関与する遺伝子、又は脱分化若しくは分化の低下を表示する遺伝子）が当該細胞で発現される場合、又は（iii）例えば細胞周期制御遺伝子又は分化表示遺伝子の如き遺伝子の発現が低下する場合に、適切な条件下で誘導することができる。例えば、米国特許6,761,884号を参照されたい。いくつかの実施態様では、遺伝子は、位置特異的リコンビナーゼによって媒介される組換え事象の後でのみ発現される。そのような事象は、コード配列を発現制御エレメント（例えばプロモーター）に作動できるように結合させることができる。自殺遺伝子の発現は、細胞（又はそれらの先祖）が対象動物に投与された後で細胞（又はそれらの子孫）を対象動物の身体から排除することが所望される場合に誘導することができる。例えば、再プログラミングされた体細胞が腫瘍を生じた場合、当該腫瘍は自殺遺伝子の発現を誘導することによって排除することができる。いくつかの実施態様では、当該細胞が脱分化又は適切な細胞周期制御の消失に際して自動的に排除されるために、腫瘍形成は阻害される。
【００３６】
治療又は予防できる疾患、異常又は症状の例には以下のものが含まれる：神経学的、内分泌系、構造性、骨格性、脈管係、泌尿系、消化系、皮膚、血液、免疫、自己免疫、炎症性、内分泌系、腎臓、膀胱、心脈管系、癌、循環系、消化系、造血系、並びに筋肉の疾患、異常及び症状。加えて、再プログラミングされた細胞は、再建的な応用のために、例えば組織又は器官の修復又は代替のために用いることができる。いくつかの実施態様では、血管形成を促進する増殖因子及びタンパク質又は他の作用因子を加えることは有益でありうる。或いはまた、組織の形成は、適切な培養培地及び条件、増殖因子並びに生物分解性ポリマーマトリックスとともに完全にin vitroで実施することができる。
本発明は全ての投与態様を意図し、前記投与態様には、筋肉内、静脈内、関節内、皮下、又は疾患の予防又は治療に適切な用量を提供するために不足のない他の任意のルートが含まれる。iPS細胞は、一用量又は複数用量を哺乳動物に投与できる。複数用量を投与するとき、当該用量は、互に（例えば1週間、1月、1年、又は10年）離すことができる。1つ以上の成長因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン又は他の細胞もまた、当該細胞の投与前、投与中又は投与後に投与して、特定の細胞タイプへそれらをさらに偏向させることができる。
本発明の方法を用いて入手したiPS細胞を、例えば初期発生の調節に必要とされる遺伝子の研究のために、in vitro分化モデルとして用いることができる。再プログラミング細胞を用いて作製した分化細胞の組織及び器官を、作用因子の効果の研究及び/又は潜在的に有用な医薬の同定に用いることができる。
【００３７】
本明細書に開示する再プログラミングの方法を用いて、多様な動物種についてiPS細胞を作製できる。作製されたiPS細胞は所望の動物の作製に有用でありうる。動物には、例えば鳥類及び哺乳動物の他に絶滅危惧種の任意の動物が含まれる。例示的な鳥には家禽（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ）が含まれる。例示的な哺乳動物には、げっ歯類、ヤギ類、ヒツジ類、ウシ類、ブタ類、イヌ類、ネコ類及び非ヒト霊長類が含まれる。これらのうちで、好ましいメンバーには、家畜（例えばウシ、ブタ、ウマ、乳牛、ウサギ、モルモット、ヒツジ、及びヤギを含む）が含まれる。
したがって、本発明のさらに別の特徴は分化した細胞の集団を調製する方法を提供し、前記方法は、（i）本発明の第一の特徴の方法にしたがってiPS細胞の集団を調製すること、（ii）あるプロトコル又は因子を用いて当該iPS細胞を分化させて分化細胞の集団を形成することを含む。細胞を再プログラミングする方法及びそれら細胞の有用性は上記で提供される。
本発明のさらに別の特徴は、本発明の第一の特徴の方法にしたがって調製されたiPS細胞の集団を提供する。
本発明のさらに別の特徴は細胞培養培地を提供し、前記培地は、CHAF1A、CHAF1B及び/又はRBBP4の発現を阻害する1つ以上の作用因子、及び/又はSUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SAE1、UBA2、PIAS1、PIAS3、PIA3、PIA4、RANBP2、CBX4、NSMCE2、MUL1、HDAC4、HDAC7、TOPORS、FUS、RASd2、TRAF7、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6及び/又はSENP7の発現を阻害する1つ以上の作用因子を含む。
【実施例１】
【００３８】
後成的妨害の解除によるiPS細胞への再プログラミングの増強
体細胞は、4転写因子（Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Myc；いわゆるOSKM又はヤマナカ因子）一式の発現によって胚性幹細胞様状態に復帰できる。しかしながら、このプロセスは極めて非効率的かつ確率論的であり、非常にわずかな細胞しか人工多能性幹細胞（iPS）状態にたどり着けない。初期状態の後成的記憶は、効率的なiPS再プログラミングを妨げる主要な妨害因子であると一般的に信じられている。iPS再プログラミングの後成的妨害の確立に関与する因子を系統的に探索するために、我々は、特別に誂えた新規なshRNAmirライブラリー（650の公知であり予測されるクロマチン調節因子を標的とする5100のshRNA）を確立された再プログラミングアッセイでスクリーニングした。我々は、その抑制がiPS再プログラミング効率に劇的な増加をもたらすいくつかの新規な因子を同定及び検証し、後成的妨害の解除がこの確率論的で非効率的なプロセスを高度に効果的な方法に変えうることを示す。我々の試薬の品質及び我々のアプローチの系統的な特性に基づいて、我々は、同定された遺伝子は、iPS再プログラミング（及び潜在的には他の細胞運命転換方法）で後成的妨害を解除するためにもっとも強力なクロマチン結合標的であると考える。さらにまた、以前の再プログラミング因子とは対照的に、これらの因子のいくつかは薬理学的な調整に馴染みやすく、したがって化学的に誘導される細胞再プログラミングのための第一の標的セットとなる。RNAi、他の遺伝子又は小分子アプローチによるこれら因子の阻害は、高度に効率的でかつ（潜在的には）単純化されたより安全なiPS再プログラミングのレジメンを確立させるであろう（前記レジメンは広域の基礎研究及び生体医療への応用に極めて有用であろう）。
【００３９】
研究及びデータの説明
iPSの発見以来、分化万能性への細胞の再プログラミングは広く用いられる実験ツールとなった。基礎研究及び生体医療研究におけるその大いなる有用性以上に、iPS再プログラミングは、広範囲の医療的応用（例えば細胞療法用の患者固有組織の生成）に利用可能であると考えられる。しかしながら、iPS再プログラミングプロセスは、依然として非常に非効率的でかつ特性として確率論的であり、このことは、特に体細胞供給源が限られている場合は多くの応用でその有用性を低下させる。効率的なiPS再プログラミングを妨げる主要な妨害は強固に囲まれた後成的な眺望内に存在すると考えられるが、この妨害に寄与する重要なメカニズム及び因子は未だ完全には理解されていない[1、2]。
iPS再プログラミングの阻止に関与するクロマチン随伴因子を系統的に同定するために、我々は、マウスの胚線維芽細胞（MEF）及び公知の予測される全クロマチン調節因子を標的とする新規なshRNAmirライブラリー（650遺伝子、等モルでプールされた約5,100の配列検証済みshRNA）において、確立された再プログラミングアッセイを活用する機能的遺伝子スクリーニングを実施しようとした。センサーによる予測及び改善されたmiR-E骨格を特色とするpLENCベクター[3]を取り入れることによって、このライブラリーは、（以前のmiR30系及び他の利用可能なRNAi試薬とは異なり）、一コピー条件下で強力な（＞80%）タンパク質ノックダウンを引き起すshRNA構築物の大半を含む（これにより、初めて全クロマチンネットワークの真に系統的な分析を多重様式で可能になる）。
【００４０】
細胞スクリーニングのモデルとして、我々は、以下を保持するように操作した、従前に確立されているMEFを用いることにした：（1）Tet応答性エレメント（TRE）の制御下にある4OSKM因子を保有する発現カセット、（2）Rosa26プロモーター（RP）から駆動されるリバースTet-トランスアクチベーターrtTA-M2、及び（3）iPS細胞の同定用のOct4プロモーター駆動GFPトランスジーン[4]（前記はKonrad Hochedlinger（MGH/Harvard）の研究室で樹立され提供された）。トランスジェニックOSKM/RR/OG-MEFは、培養培地にドキシサイクリン（Dox）を添加することによって低効率で再プログラミングすることができ、したがって制御可能で再誘導可能なiPS再プログラミングモデルを提供する（前記は多重スクリーニングのために理想的に適合する）。
多重/プール様式でのスクリーニングを実施し、かつ散発的な再プログラミング事象による偏向を減少させるために、我々は以下のスクリーニング手法を考案した：4つの独立した胚から単離したOSKM/RR/OG-MEFをアスコルベートの存在下に低酸素で増殖させ[5]、5,100のpLENC-shRNAベクター（miRE系shRNA、mCherry及びNeo耐性遺伝子を同時発現する）をレトロウイルスにより形質導入し、G418で選別した。OSKM発現は、ライブラリーの形質導入の3日後又は6日後から開始して7日間のDox処理により誘導した。両方の条件について、スクリーニングを、その各々がライブラリーの100倍超の代表物を含む、48の独立した生物学的レプリケート（合計96）で実施した（それらレプリケートは全実験を通して別々に操作された）。プレートをOSKM誘導から11日後にトリプシン処理し、プレプレーティングによってMEFを減少させ同等表面に再播種した。
OSKM誘導後18日目に、GFP発現及び細胞サイズを基準にして各レプリケートから3−5百万のiPS細胞をFACソーティングし、ゲノムDNAを抽出し、shRNAガイド鎖を増幅させた（イルミナ（Illumina）アダプター及びサンプルバーコードをタグとして直接付加する最適化PCRプロトコルを使用）。PCR生成物をディープシーケンシングに付し、ディープシーケンシングデータを特別誂えのGalaxyワークフローを用いて分析した。ライブラリーの各shRNAの代表物を全96サンプルで定量し、ライブラリー形質導入3日後のOSKM/RR/OG-MEFの代表物と比較した。過剰提示shRNAを各サンプルで同定し、個々のサンプルを総合shRNAスコアに統合した。続いて前記スコアを、shRNAの数、スコアリングレプリケートの数及び効果のスケールを考慮した遺伝子スコアに統合した。注目すべきは、上位スコアの遺伝子について、いくつかの別個のshRNAが、多数のレプリケートで非常に強くかつ一貫して濃縮された。表1は同定された候補遺伝子のリストを示す。
【００４１】
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表1：スコア付けしたshRNAの数、別個のスコアを有するレプリケートの数及び効果の激しさを考慮したスコアによってランク付けした一次スクリーニングにおける上位24のスクリーニングヒット。マウス遺伝子記号、ライブラリー中のshRNAの合計、スコアリングshRNAの数、各遺伝子について上位スコアのshRNAの倍数変化による濃縮（FC max）及びスコアが提供される。
【００４２】
一次多重スクリーニングで同定されたヒットを検証するために、いくつかの上位ヒットを含む32の独立したshRNAのセットの他に、中間的スコアを有するshRNAのパネルを単一アッセイで試験した。この目的のために、OSKM/RR/OG-MEFに生物学的トリプリケートの個々のpLENC shRNAを形質導入し、選別し、OSKM誘導のためにDoxで処理した。iPS再プログラミング効率を、Oct4-GFPレポーターのフローサイトメトリー分析（図1）及び顕微鏡検査（図2a）を用いて定量した。
コントロール（Ren.713、shRNA無し）と比較したとき、大半の被験shRNAは再プログラミング効率の顕著な増加をもたらし、その増加の多くはTrp53（再プログラミング妨害因子として以前に示唆された）を標的とするshRNAの範囲にあり、多重スクリーニングは、iPS細胞の形成を妨げる遺伝子を同定できることを示唆する。再プログラミング効率の最も劇的な増加は4遺伝子（Chaf1a、Chaf1b、Setdb1及びUbe2i）で観察され、それらはまた多重スクリーニングの我々の分析で上位4ヒットを占める（表1）。これら遺伝子のRNAi媒介抑制は、20%−50%のOct4-GFP+細胞（コントロールでは1%未満；図1）及びiPSコロニー形成の顕著なブースト（図2）をもたらす。これらの効果の程度は、以前に確立された妨害について観察された増加をはるかに超え、そのような因子としてMBD3を報告し大いに疑問視された論文（前記を我々及び他の研究者は再現できない）及び刺激惹起性多能性獲得細胞（STAP）についての最近の報告（前記論文はまさに撤回されようとしている）のみが匹敵する。
Chaf1a、Chaf1b及びUbe2iは再プログラミング妨害因子として以前には示唆されていなかったが、Setdb1（我々のヒットで4番目に強力）はiPS形成のバリヤーとして最近報告され[6]、したがって本実験設定の完璧な内部コントロールとして役立つ。以前には知られてなかった3つの上位ヒットの2つ（Chaf1a及びChaf1b）は、CAF1と呼ばれる複合体を形成することが知られている（CAF1は、S期に新生DNAにコアヒストンをローディングするために必要である）。この確立された機能に基づいて、我々は、CAF1の阻害が細胞分裂時の後成的記憶の維持を妨げ、そのことは、最終的に細胞の運命の転換（例えばiPS再プログラミング）に対して細胞をより感受性にすると仮説をたてた。
【００４３】
我々の多重スクリーニングにおける上位ヒットの三番目はSUMO E2結合酵素Ube2i/Ubc9であり、そのノックダウンは我々の一次検証実験で単一でもっとも強力な効果を引き起こした（図1）。Ube2iは唯一のE2リガーゼであるので、SUMO化はUbe2iのノックダウン後には全体として不完全であると考えねばならず、SUMO化は未だ不明の下流の標的/メカニズムによりiPS再プログラミングに対する遺伝的妨害因子であると示唆される。
重要なことに、新規に同定された両経路（Chaf1a/b及びSUMO化によるヒストンローディン）は、OSKM因子及びもっとも以前に記載された妨害因子と異なり薬剤干渉を受けやすい酵素活性を必要とする。これらの経路を抑制し、それによってiPS再プログラミングを強化しうる物質には、CAF-1についてはロスコビチン[7]とともに、UBE2IについてはH2O2、スペクトマイシンB1、ケトクロミンA、ビオメリン及びダビジンが含まれうる[8]。加えて、SUMO化は当該反応カスケードの他のレベル、例えばE1阻害剤[9]によって又は別のどこかで阻害されうる。
注目すべきことには、4つの上位ヒット以外に、いくつかの他のスコア付けおよび検証shRNAは、薬理学的阻害剤が既に利用可能な因子を標的とする。例にはBrdt及びBrd4が含まれ、これらに対して中間的なノックダウン能力をもついくつかの検証済みshRNAが再プログラミング効率で明瞭な強化をもたらす。別の例はCsnk2a1（カゼインキナーゼ2、アルファ1ポリペプチド）であり、これらに対して、強力な阻害剤（例えばCX-4945/シルミタセルチブ）が既に存在する。再プログラミングを強化するこれらの阻害剤の能力について個々にそれらを試験する以外に、我々の実験で得られた系統的な遺伝子データを用いて、iPS細胞の有効性を強化する化合物レジメン（すなわち“再プログラミングカクテル”）を設計できよう。単純なiPS再プログラミングプロトコルを確立するか、又は直接的な組織の再プログラミングを促進するために、1つ又はいくつかの妨害因子の薬剤媒介又はRNAi媒介抑制のいずれを用いるかは、追跡調査で決定しなければならないであろう。
【００４４】
実施例１で参照されている文献
[1] Apostolou, E. and Hochedlinger, K. (2013). Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature 502, 462-71.
[2] Orkin, S.H. and Hochedlinger, K. (2011). Chromatin connections to pluripotency and cellular reprogramming. Cell 145, 835-50.
[3] Fellmann, C. et al. (2013). An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Rep 5, 1704-13.
[4] Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M. and Hochedlinger, K. (2010). 
A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nat Methods 7, 53-5.
[5] Stadtfeld, M. et al. (2012). Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. 
Nat Genet 44, 398-405, S1-2.
[6] Chen, J. et al. (2013). H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet 45, 34-42.
[7] Keller, C. and Krude, T. (2000). Requirement of Cyclin/Cdk2 and protein phosphatase 1 activity for chromatin assembly factor 1-dependent chromatin assembly during DNA synthesis. J Biol Chem 275, 35512-21.
[8] Hirohama, M. et al. (2013). Spectomycin B1 as a novel SUMOylation inhibitor that directly binds to SUMO E2. ACS Chem Biol 8, 2635-42.
[9] Fukuda, I. et al. (2009). Ginkgolic acid inhibits protein SUMOylation by blocking formation of the E1-SUMO intermediate. Chem Biol 16, 133-40.
【実施例２】
【００４５】
本発明に関する更なる情報及びデータ
一次ヒットの初期スクリーニングとともに検証を、アスコルベート（iPS細胞形成を促進することが示された）の存在下で実施した。アスコルベートは、抑制性ヒストン修飾を低下させると考えられる[1]。さらにまた、全ての実験を、15% FCS（Invitrogen）及び2x LIEを含むESC培地中で実施した。FCSは、Bmp-4の存在のために再プログラミングに対して阻害効果を有することが以前に示された[1]。Setdb1は、引用文献でFCSの阻害性効果のために必要な因子として提示されている（Setdb1のノックダウンはFCS始動阻害を解除する）。追加の実験（下記）により、我々が同定した再プログラミング強化レジメンを多様な設定で試験し、それによって記載の発見を広げた。
一般的には、iPS形成は、最初に分化細胞（我々の事例ではより具体的にはマウス胚線維芽細胞（MEF））が前iPS細胞と呼ばれるステージを通過するプロセスであると考えられる[1]。前iPS細胞は部分的にiPS細胞と同一性を有する細胞として同定される。したがって、原則としてMEFからのiPS細胞形成は、前iPS形成を強化するか、又は前iPS細胞からiPS細胞への最終的な細胞同一性スイッチの強化によって改善できる[2]。本明細書で提示する発明は、最終的な再プログラミングの出現を強化するどちらかの工程の改善の証拠を提供していることを主張する。Chaf1複合体阻害はiPS細胞形成を強化するように見えるが、Ube2iの阻害は前iPSからiPSへの遷移の妨害を除去する。
第一の検証実験はいくつかのヘアピンによる劇的なiPS形成の改善を示した。この効果は特定の時期に限定されるということを除外するために、我々は、ヘアピンの形質導入から3日後（D3）及び6日後（D6）にOSKMの誘導を試験した。非常に類似する効果が認められた。期待したように、再プログラミングは、一般的には初代MEFの継代時間の増加のためにD6でわずかに効率が低下する。注目すべきことに、Caf-1タンパク質（Chaf1a及びChaf1b）のノックダウンは、Caf-1の低下が再プログラミングの開始に必須であることを主張する予測された転換をもたらさなかった（この実験では形質導入のちょうど72時間後のD3においては完全な消失は確立されなかったかもしれない）（実施例1の表1を参照されたい）。
【００４６】
A．再プログラミング時のOct4-GFP発現のタイムライン
1）FACSによるタイムライン分析
再プログラミング強化レジメンにおける再プログラミングの動態を観察するために、FACS分析を用いてGFP陽性細胞を定量した。内因性Oct4遺伝子座から駆動されるGFPは、Oct4（したがってiPS及びおそらくは前iPS状態）のための発現マーカーとして機能する。図3からわかるように、Caf-1の抑制は顕著に再プログラミングを加速したが、10日目辺りで定常状態に至る。対照的に、Ube2i抑制は再プログラミングのタイムラインをわずかに加速しただけであるが、当該プロセスをはるかに効率的にし、最終的にはCaf-1で観察された抑制効果を超える（すなわち、実際にはGFP+細胞のパーセンテージはCaf-1抑制により達成される強化を10日目に追い越す）。
このことは、iPS再プログラミングの後期ステージにおけるCaf-1抑制の負の効果、及び/又は初期再プログラミングの工程（例えば前iPS細胞の形成）の間のCaf-1抑制の優先的作用によるのかもしれない。Caf-1抑制が、iPS形成の後期ステージ及び/又は樹立されたiPSの維持で阻害作用を有する場合には、そのような有害な作用は、一過性Caf-1抑制のみを始動させる方法（例えば誘導性shRNA発現、siRNA/shRNAトランスフェクション、一過性薬剤処理）を用いて軽減又は回避できる（前記方法はiPS再プログラミング有効性の更なる強化に対して潜在能力を有しうる）。
2）分割及びDOX除去時のエンドポイント分析
次に、我々は、細胞が異所性OSKM発現の影響を受けなくなりiPSコロニー形成能力を獲得する（iPS細胞への完全な脱分化及び幹細胞回路の正方向ループの確立の指標）時点を決定しようとした。この目的のために、多様な時点でiPS細胞群を分割し、ドキシサイクリンを除去した。図3のタイムラインとは際立って対照的に、Caf-1及びUbe2i抑制によって提供される再プログラミング強化は非常に類似する動態をたどる。最も完全に脱分化したiPS細胞は全ての再プログラミング強化事例で6日目及び8日目に生じ、一方、コントロールiPS細胞は樹立に10日を超える日数を要する。したがって、Chaf1a/b抑制下で観察される極めて大量のGFP+細胞（図3）は前iPS細胞の蓋然性が極めて高く、一方、Ube2i抑制ははるかに高い割合の細胞でiPS形成をもたらす。
【００４７】
B．多様な条件下での再プログラミングの強化を試験する
以前に述べたように、追加的実験を設計して種々の状況下における改善再プログラムレジメンを試験した。
この目的のために、ドキシサイクリン誘導性再プログラミング因子（OSKM、4F、ヤマナカ因子）を含む記載のMEFに、以前に記載した生物学的トリプリケートのpLENC-shRNAベクター（miRE系shRNA、mCherry及びNeo耐性遺伝子を同時発現する）を形質導入した。感染細胞の選別はG418耐性によった。感染後3日で、細胞をトリプシン処理し、各レプリケートを、FCS及びアスコルベート含有培地とともにドキシサイクリンの存在下で複数のウェルにプレートした。ドキシサイクリン添加後24時間で開始して（すなわちOSKM因子の予測される完全な発現の前に）、iPS形成のための多様な条件に細胞を付した。ドキシサイクリンは培地に7日間添加された。iPS細胞形成の分析はドキシサイクリン添加14日後で、内因性Oct4プロモーターによって駆動されるGFPの発現に依拠するFACS分析を用いた。
この実験に用いたMEFは所内でe14.5胚から調製した。交配に用いた雌は、以前に記載されたようなROSA遺伝子座に組み込まれたrtTAカセットを保持するものであるが、所内で育種したものである。したがって、本実験は、具体的なマウス背景に対する我々の発見の独自性をさらに例示する。
1）アスコルベートを含む血清
最初の検証で用いた先の条件を繰り返し実施して、別個のMEF及び別個の実験で当該発見の再現性を明示し、さらに代替レジメンとの比較の基礎を設定した。図5を参照されたい。
以前のように、同定した再プログラミング妨害因子のノックダウンは再プログラミングの劇的な改善をもたらす。結論すれば、記載の効果は定性的に再現性を有する。
2）アスコルベートを含まない血清
再プログラミング妨害の解除がアスコルベートの存在に依存するということを排除するために、アスコルベートが存在せずそれ以外は同一の培地条件で、形質導入MEFの一部分を用いて再プログラミングを誘導した。図6からわかるように、再プログラミングの改善はアスコルベートに依存しないことが示され、一方、コントロール条件は再プログラミング効率の予測された低下を示す。
したがって、この実験セットの再プログラミング効率の改善係数はさらに高い。
3）アスコルベートを含まない血清代替物
以前に述べたように、ウシ胎児血清（FCS）は、iPS細胞形成に阻害性作用を有するBmp-4を含む。さらにまた、種々のFCSバッチが様々な程度でiPSの増殖及び形成を支援する。再プログラミング妨害の上述の解除が、標準化条件を表す血清代替物で繰り返されうるか否かを試験するために、我々はこれらの条件下で同じ遺伝子系を用いた。図7に示すように、期待の通り、コントロールの遺伝的条件下（例えばニュートラル又はヘアピン無し）でiPS形成は強化される。ノックダウンによる再プログラミング強化もまた血清代替物で改善を示す。
4）アスコルベートを含まず2iを含む血清代替物、コロニー形成アッセイ
iPS形成強化を達成する因子をコロニーアッセイで試験するために、iPS形成のために記載した最適条件（すなわち血清代替物、LIF及び2i）を選択した。2つの阻害因子（2i）は、分化万能性の基礎的状態を支援し、iPS形成を強化することが示された。より具体的には、2iは前iPS細胞からiPS細胞への遷移を支援する[3]。
そのようにして、我々は、最適で潜在的に飽和状態で改善係数を測定しようとした。10000細胞を10cmのディッシュにプレートし、ドキシサイクリンを7日間添加して再プログラミングを誘導した。2iの存在下での再プログラミングはさらにまた、本明細書に記載の再プログラミング強化レジメンのための追加の条件を表す。
論じたように、Caf-1の阻害は前iPSに向かって妨害を解除する。LIF及び2iの存在下では、iPS細胞形成への遷移はドキシサイクリン誘導性OSKM系では障害されない。したがって、iPSコロニー形成はChaf1a又はChaf1bノックダウンに際して劇的に改善される。他方でUbe2iのノックダウン（前iPSからiPSへの遷移に関連すると推定される）は、2iの存在下では効果は少ない．しかしながら、Ube2iノックダウン条件で観察されるコロニーは、前iPSが寄与しない均一なiPSコロニーを連想させる（表2及び図8）。
【００４８】
表2：単一細胞密度下での血清代替物、2iプラスLIEでのコロニー数
2017525347.tif 000003
C．ドキシサイクリン誘導性OSKMに対する再プログラミング強化における転写効果
iPS再プログラミングの改善が単にOSKM因子の異所性発現レベルの強化によるということを排除するために、OSKMトランスジーンに特異的なプライマー対を用いて定量的RT-PCRを実施し、アクチンに対して発現を正規化した。Q-PCRは3つの生物学的トリプリケートの各々について三重に実施した。
図9からわかるように、同定妨害因子の抑制後のOSKM発現レベルは同じ範囲内にあり、非誘導状態（すなわちドキシサイクリン無し）よりも約100倍から200倍高い。
D．提唱モデル及び将来の実験
iPS形成の二工程における加速
総合すれば、タイムライン実験及び再プログラミング中の細胞の表現型の特徴付けはともに、Caf-1及びUbe2iの抑制は、2つの異なる工程で、潜在的には別個のメカニズムを介してiPS細胞の形成を強化することを示唆している。Caf-1抑制は、再プログラミングの初期工程、特に前iPS細胞の形成を強力に促進及び加速し、このことは、Oct4-GFP発現細胞の迅速で大量の出現によって立証される。後期ステージでは、Caf-1抑制は更なる強化をもたらさず、生じたコロニーの多くは部分的なアルカリホスファターゼ染色を示すだけであり、このことは持続的なCaf-1抑制は、前iPSからiPS状態への遷移に有益な効果をもたらさず、潜在的には有害ですらあることを示唆する。したがって、再プログラミング初期ステージでCaf-1の一過性抑制を可能にし、一方、前iPSからiPSへの遷移ではCaf-1の内因性発現を回復させる手法は、再プログラミングにおけるCaf-1抑制の有効性をさらに増加させるかもしれない。対照的に、Ube2i抑制は、再プログラミングの初期工程を加速しないが、完全に発達したiPSコロニーの形成で大きな増加をもたらす。このモデルにしたがって、我々は、Caf-1の初期及び一過性抑制を、再プログラミングプロセスを通して又はその後期ステージにおけるUbe2i（又はSUMO経路の他の構成要素）の阻害と組み合わせることによって、iPS形成の有効性をさらに促進及び高めることができると予測する。図10を参照されたい。
【００４９】
E．詳細な実験手順
shRNAライブラリーの作製：650の遺伝子を標的とするクロマチン集中shRNAライブラリーを改善されたSensor予測を基にして特注設計し、オンチップ合成オリゴからクローニングし、所内パイプラインを用いて配列を立証した。スクリーニングに用いたshRNAmirプールは、miR-E骨格を特色とするpLENCに配列を立証し等モルでプールした約5100のshRNAをシャトルすることによって作製した[3]。
次世代シーケンシング：ディープシーケンシングをイルミナ2500で実施し、特別誂えのGalaxyワークフローを用いてデータを分析した。
細胞培養：標準的細胞培養技術を用いた。iPS細胞誘導は[4]に記載されたように実施した。
FACS：細胞はBD Aria-IIIで分類し、FSC、SSC、GFP及びCherryに対してゲートコントロールした。
F．使用材料
プラスミド：プールしたRNAiのスクリーニングのために、shRNAをpLENCベクターから発現させた[4]。スクリーニングの検証のために、マウスshRNAを個々にpLENCでクローニングした（前記は以前に記載されている[4]）。
細胞培養及び培地：レトロウイルス粒子を生成するために、パッケージ細胞（Platinum-Eレトロウイルスパッケージング細胞株）をDMEMで5% CO2下にて37℃で培養した（DMEMには15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びピルビン酸ナトリウム（1mM）が補充された）。レンチウイルスを生成するために293FT細胞をDMEMで5% CO2下にて37℃で培養した（DMEMには15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びピルビン酸ナトリウム（1mM）が補充された）。
マウス胚線維芽細胞は、DMEMで低酸素（4.5%のO2）下にて37℃で培養した（DMEMには15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びピルビン酸ナトリウム（1mM）、1ｘのNEAA（非必須アミノ酸）、50uMベータ-メルカプトエタノール及びL-アスコルビン酸（50uM）が補充された）。iPS細胞は、DMEMで5% CO2下にて37℃で培養した（DMEMには15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、1ｘのNEAA、50uMベータ-メルカプトエタノール及び1000U/mL LIF（すなわちESGRO）が補充された）。
【００５０】
ESC培地
再プログラミングにおける培養条件の影響を試験するために、細胞をOSKM発現中に以下の条件で培養した：
−再プログラミング標準ESC培地：15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、1ｘのNEAA、1000U/mL LIF及び50uMベータ-メルカプトエタノールを補充したDMEM。
−L-アスコルビン酸を含む再プログラミング標準ESC培地：15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、L-アスコルビン酸、1ｘのNEAA、1000U/mL LIF及び50uMベータ-メルカプトエタノールを補充したDMEM。
−血清代替物を伴う再プログラミング：13% ノックアウト血清代替物（すなわちGibco）、2% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、1ｘのNEAA、L-アスコルビン酸（50uM）、1000U/mL LIF及び50uMベータ-メルカプトエタノールを補充したDMEM。
−血清代替物及び2iを伴う再プログラミング：13% ノックアウト血清代替物（例えばGibco）、2% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、1ｘのNEAA、L-アスコルビン酸（50uM）、1000U/mL LIF、50uMベータ-メルカプトエタノール、MEK阻害剤（1μM）（すなわちStemMACS）及びGSK3阻害剤（3μM）（すなわちStemMACS）を補充したDMEM。
マウス胚線維芽細胞のレトロウイルス形質導入及び感染（OSKM MEF）
shRNAをOSKM MEFに形質導入した。36時間後に形質導入細胞を、0.5mg/mLのG418で3日間、0.25mg/mLのG418でさらに3日間選別した。shRNA形質導入から3又は6日後、感染細胞をPBS（1ｘ）で洗浄し、トリプシン-EDTA（1ｘ）でトリプシン処理し、20000細胞を6ウェルにプレートした。OSKM発現を7日間誘導し、15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、1000U/mL LIF、ベータ-メルカプトエタノール及び1μg/mLドキシサイクリンを補充したDMEMで細胞を培養した。OSKM発現の7日後、4因子を取り除くために細胞をさらに4日間ドキシサイクリン無しで培養した。FACS BD LSRFortessaを用いて細胞を分析した。
MEF：トランスジェニックOSKM/RR/OG-MEF[4]はSihem Cheloufi（laboratory of Konrad Hochedlinger, Harvard, Boston, MA, USA）によって供給された。
【００５１】
実施例２で参照されている文献
[1] Chen, J. et al. (2013). H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat. Genet 45, 34-42
[2] Apostolou, E. and Hochedlinger, K. (2013). Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature 502, 462-71.
[3] Theunissen, T.W., van Oosten, A.L., Castelo-Branco, G., Hall, J., Smith, A. and Silva, J.C. (2011). Nanog overcomes reprogramming barriers and induces pluripotency in minimal conditions. Curr Biol 21, 65-71.
[4] Fellmann, C. et al. (2013). An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Rep 5, 1704-13.
【実施例３】
【００５２】
スクリーニングの結果の更なる検証
以下の実施例は本発明を支持するさらに別の実験データを提供する。
図18及び19に含まれるデータは、“多重スクリーニング”のアプローチを用いて本発明者らが実施した実験の結果を示す。続いて本発明者らは、shRNA分子の再プログラミング有効性を個々に評価することによってこれらの結果を検証することにした。この実験では、これら個々のshRNA分子は再プログラミング有効性を有すると確認された（図11に示される通り）。ここでは26の被験shRNAのうち20が検証実験で再プログラミングを顕著に強化することを認めることができる。
Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iを標的とする被験shRNAはいずれもOct4-GFP+細胞の割合を20−60%に激しく増強し、それは、iPSC形成の公知のリプレッサーであるTrp53を標的とするshRNAよりもはるかに高い。当該再プログラミング有効性は、図12からわかるように、実験で用いられた特定の培養条件に左右されなかった。加えて、Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iは、AP及びNanogを発現するdox非依存性コロニーの形成を強力に増加させ、トランスジーン非依存性iPSC様状態の効果的獲得を示している（図14及び15）。
CAF-1複合体の構成要素に加えて、Ube2i（SUMO経路の重要な酵素）を標的とするshRNAもまたスクリーニングアッセイで高いスコアを示した。更なる実験で、Sae1及びUba2a（SUMO E1リガーゼ複合体の構成要素）を標的とするshRNAもまた、図13でわかるように、iPSC再プログラミングを強力に強化することを実証した。
この実験に続いて、本発明者らは、再プログラミング中のChaf1a、Chaf1b又はUbe2iの一過性ノックダウンが、正常な発達に寄与する生成iPSCの能力に影響を及ぼすか否かを続いて試験した。この実験を実施するために、本発明者らは、dox誘導性shRNAmir発現系を開発しこれを利用した。shRNA及びOKSMは、Oct4-GFP+細胞がCAF-1及びUbe2i枯渇細胞で出現するがコントロールではまだ出現していないときに、再プログラミング可能MEFで7日間同時に発現された。
続いて、FACSを用いてOct4-GFP+細胞を精製し、その後doxを除去してトランスジーン非依存性iPSCを選別した。これらのiPSCの胚盤胞への注入は、生殖細胞系列子孫を効率的に産する成熟高等キメラを生じた（Chaf1a：18仔/20仔；Chaf1b：27仔/27仔；Ube2i：17仔/17仔）（図16）。これらの結果は、再プログラミング中のChaf1a、Chaf1b又はUbe2iのサイレンシングは、in vivoで体細胞系列及び生殖細胞系列に分化するiPSCの潜在能力を損なわないことを示している。
【実施例４】
【００５３】
再プログラミング中のChaf1a、Chaf1b、Ube2i及びSetdb1抑制の機能的相互作用及び協同性
上記に提示したように、本発明者らは、再プログラミング効率を調節するために重要ないくつかの遺伝子を同定した。
本発明者らは、続いて4つの再プログラミング抑制因子（Chaf1a、Chaf1b、Ube2i及びSetdb1）の遺伝子発現の合同RNAi媒介による低下の効果をペア毎に試験することにした。
2つの構成的miR-E系shRNA又はコントロールベクターを連続的に、全ての可能な組み合わせ及び順序で再プログラム可能MEF形質導入し（合計64）、続いて7日間doxで誘導した。11日目のOct4-GFP+細胞のトランスジーン非依存性分画を続いてフローサイトメトリーで測定し、空ベクターコントロールで標準化した（図17）。これらのデータセットの比較で以下が明らかになった。（i）種々のCAF-1サブユニット（すなわちChaf1a/Chaf1a、Chaf1a/Chaf1b及びChaf1b/Chaf1bに対するshRNA）の共同ノックダウンは、個々のサブユニットの抑制と比較してOct4-GFP+細胞の割合をわずかに低下させ、強力なCAF-1ノックダウンは細胞の生存能力を損なうという以前の観察と一致する。（ii）Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iのいずれかとSetdb1の共同抑制は、Chaf1a、Chaf1b又はUbe2iの単独抑制と比較して全体的な再プログラミング効率を低下させ、Setdb1のノックダウンはiPSC生成におけるCAF-1又はUbe2i抑制の強化効果を、おそらくは細胞傷害性により低下させることを示している。（iii）どちらかのCAF-1サブユニット及びUbe2iの同時ノックダウンは、種々のshRNA組合せでOct4-GFP+細胞の割合を増加させ、これらの因子が独立した経路及び/又はステージで機能して、iPSC形成を抑制する可能性を示唆している。
二重ノックダウン方法論
三重トランスジェニック再プログラミング可能MEFに、以前に記載したようにLEPCから発現されるshRNAを形質導入し、MEF培地で培養した。レトロウイルス感染から3日後に、細胞をmCherry発現について分類し、6ウェルディッシュの各ウェルに40000細胞をプレートした。次の日、これらの細胞に対応する第二のshRNA（LENCから発現される）を感染させた。24時間後に、細胞をDMEMで低酸素（4.5%のO2）下にて37℃で培養した（DMEMには15% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、L-グルタミン（4mM）、1000U/mLのL1F、0.1mMの2-メルカプトエタノール及び1μg/mL、50μg/mLアスコルビン酸ナトリウム、及びドキシサイクリンが補充された）。第二のshRNA形質導入後36時間から開始して、細胞培養培地に0.5mg/mLのG418を3日間、0.25mg/mLのG418をさらに3日間補充して二重感染を担保した。7日間のOSKMトランスジーン誘導の後で、OSKM除去のために細胞をさらに4日間ドキシサイクリン無しのESC培地で5% CO2下にて37℃で培養した。FACS BD LSRFortessa（BD Biosciences）を用い、Oct4-GFP発現について細胞を分析した。
【実施例５】
【００５４】
CAF-1の抑制はiPSC形成を加速する
さらに本発明者らは、Oct4-GFP+細胞の出現を時間経過とともに追跡することによって、同定したクロマチン妨害因子の非存在下における遺伝子発現低下の影響を試験することにした。Ube2iの抑制はOct4-GFP活性化をコントロールよりもわずかに早く促進し（Ube2i shRNAでは6日目に対しRenilla shRNAでは9日目）、一方、どちらかのCAF-1サブユニットの抑制は、このプロセスの劇的な加速を始動させ、一貫してOKSM発現における4日間と同じように早くOct4-GFP+細胞を生じた（図3）。同様な影響が、Nanog発現のフローサイトメトリー系分析によって観察された（図15）。
上記実験に加えて、本発明者らは、さらにトランスジーン非依存性クローン増殖（真正iPSCのホールマーク）を促進するshRNAの能力を試験した。どちらかのCAF-1サブユニット又はUbe2iの抑制は、実際OSKM発現における5日後と同じように短時間後にトランスジーン非依存性Oct4-GFP+細胞を生じ、一方、コントロールshRNA処理細胞ではトランスジーン非依存性iPSCは9日目に初めて観察できた（図4）。
多重クロマチン集中RNAiスクリーニングで明瞭な上位ヒットとしてChaf1a、Chaf1b及びUbe2iが同定されたこと、及びこれらの因子の抑制がiPSC再プログラミングを劇的に強化しかつ（Chaf1a及びChaf1bの場合には）加速することが実証されたことによって、これら因子はiPSC再プログラミングの新規で主要な“妨害因子”として確立される。さらにまた、これらの発見は、iPSC再プログラミングレジメンの効率を高めるための新規な実験ツールとしてこれらの因子を確立させる。
【００５５】
追加データ
多重RNAiスクリーニング（プロトコルは実施例1及び2に概略）でiPS再プログラミング強化をもたらすshRNAmirの成熟siRNAガイド配列を下記に提示する。
2017525347.tif 000004
2017525347.tif 000005
2017525347.tif 000006
【図１】
2017525347.tif 000007
【図１−２】
2017525347.tif 000008
【図２ａ】
2017525347.tif 000009
【図２ｂ】
2017525347.tif 000010
【図３】
2017525347.tif 000011
【図４】
2017525347.tif 000012
【図５】
2017525347.tif 000013
【図６】
2017525347.tif 000014
【図７】
2017525347.tif 000015
【図８】
2017525347.tif 000016
【図９】
2017525347.tif 000017
【図１０】
2017525347.tif 000018
【図１１】
2017525347.tif 000019
【図１２】
2017525347.tif 000020
【図１３】
2017525347.tif 000021
【図１４】
2017525347.tif 000022
【図１５】
2017525347.tif 000023
【図１６ａ】
2017525347.tif 000024
【図１６ｂ】
2017525347.tif 000025
【図１７】
2017525347.tif 000026
【図１８−１】
2017525347.tif 000027
【図１８−２】
2017525347.tif 000028
【図１８−３】
2017525347.tif 000029
【図１９】
2017525347.tif 000030
【図２０】
2017525347.tif 000031
【図２１】
2017525347.tif 000032
【図２２】
2017525347.tif 000033
【図２３】
2017525347.tif 000034
【図２４】
2017525347.tif 000035
【図２５】
2017525347.tif 000036
【図２６】
2017525347.tif 000037
【配列表】
2017525347000001.app
【国際調査報告】
2017525347.tif 000038
2017525347.tif 000039
2017525347.tif 000040
2017525347.tif 000041
2017525347.tif 000042
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