(57)【要約】本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子療法の分野に関し、特に、組換えＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと免疫抑制剤及び／又は空ＡＡＶキャプシドとの組み合わせの使用に関する。本発明は、この組み合わせに基づく組成物及びキットオブパーツをさらに提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療を含む治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤であって、前記治療は、個体へのｒＡＡＶベクター組成物の投与及び免疫抑制剤の投与を含み、前記ｒＡＡＶベクター組成物は、少なくとも１：１の空キャプシドのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する比で、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドを含むｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項２】
前記ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも１つが局所的に投与される、請求項１に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項３】
前記ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも１つが全身投与される、請求項１又は２に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項４】
前記ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤が連続して投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項５】
前記免疫抑制剤が、自然免疫細胞阻害剤、細胞増殖抑制剤、非ステロイド性抗炎症剤、及び／又はマクロファージ枯渇抗体、ＴＮＦ遮断薬、ＩＬ−６遮断薬及び／又はＩＬ−２遮断薬などの免疫抑制生物製剤、及び／又はプリン作動性シグナル伝達経路修飾剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項６】
前記免疫抑制剤が、グルココルチコイド及び／又はリポソームビスホスホネートなどの自然免疫細胞阻害剤である、請求項５に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項７】
前記ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに含まれる導入遺伝子が治療用タンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項８】
前記遺伝子治療が、炎症状態又は炎症性疾患を予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項９】
前記導入遺伝子が治療用抗炎症性タンパク質をコードする、請求項８に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１０】
前記炎症状態又は疾患がリウマチ性状態又は疾患である、請求項８又は９に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１１】
前記ｒＡＡＶベクター組成物が関節内投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１２】
前記遺伝子治療が、非炎症状態又は非炎症性疾患を治療、予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１３】
前記ｒＡＡＶベクター組成物が、医薬として許容される担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／又は賦形剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１４】
前記免疫抑制剤が前記ｒＡＡＶベクター組成物内に含まれる、請求項１〜３及び５〜１３のいずれか一項に記載の治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１５】
前記免疫抑制剤が前記ｒＡＡＶベクター組成物内に含まれる、ｒＡＡＶベクター組成物。
【請求項１６】
少なくとも１：１の空キャプシドのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する比で、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと空キャプシドを含む、ｒＡＡＶベクター組成物；及び
免疫抑制剤
を含むキットオブパーツ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子治療の分野に関し、特に、組換えＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと免疫抑制剤及び／又は空ＡＡＶキャプシドとの組み合わせの使用に関する。本発明は、この組み合わせに基づく組成物及びキットオブパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、インビボでヒトにおいて遺伝子を送達するための最良の安全性及び有効性プロファイルを有すると考えられるため、最適な遺伝子導入ベクターである。したがって、ＡＡＶベクターは、インビボの遺伝子治療用に広く用いられ、前臨床モデル並びに臨床試験において安全であり、有効であることが示されている。ＡＡＶベクターは、血友病Ｂ、嚢胞性線維症、α−１抗トリプシン欠乏症、パーキンソン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びレーバー先天性黒内障についての第１相／第２相試験において成功している（Ｓｅｌｏｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、１４、１０７２−１０８２頁）。アリポジーン・チパルボベック（グリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ）（登録商標）、ｕｎｉＱｕｒｅ）は、リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）を治療するための遺伝子治療薬として、欧州において販売承認を取得している。様々な障害の治療のためのＡＡＶベースの遺伝子治療アプローチが有望であるにもかかわらず、望ましくない免疫応答（野生型ＡＡＶ又はＡＡＶベースのベクターへの暴露後）がＡＡＶベクターの治療効果を制限することがある。最近、静脈内投与後にＡＡＶ導入遺伝子組成物に相当量の空キャプシドを添加すると、中和抗体の阻害効果を克服することができ、肝臓において導入遺伝子発現に対して改善効果を有することが報告されている（国際公開第２０１３／０７８４００号；国際公開第２０１３／１２３５０３号）。
【０００３】
ＡＡＶベクターベースの遺伝子治療はまた、集団の約１％に影響を及ぼす慢性炎症性疾患である関節リウマチ（ＲＡ）にも適用されている。ＲＡの病理は滑膜関節の全体に及ぶ。関節の局所的な性質により、インビボでの遺伝子治療を非常に魅力的なものにしている。ＲＡにおける均衡を抗炎症状態にシフトさせることを目的とする抗炎症性タンパク質を提供する治療法が適用されている。本発明者らは、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶの関節内投与後、全ての関節が効果的に形質導入されるわけではなく（通常＜５０％）、注射された関節における発現が変化に富んでいることを見出した。関節、特にリウマチ滑膜における、有効量の治療用タンパク質の持続的な局所生成を可能にするために、効率的な遺伝子送達系を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、遺伝子治療を含む治療に使用するためのｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤であって、上記治療は、個体へのｒＡＡＶベクター組成物の投与及び免疫抑制剤の投与を含み、該ｒＡＡＶベクター組成物は、少なくとも１：１の空キャプシドのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する比で、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドを含むｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤を提供する。
【０００５】
好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも１つは局所的に投与される。
【０００６】
さらに好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも１つは全身的に投与される。
【０００７】
ｒＡＡＶベクター組成物は局所的に投与されることが好ましく、好ましくは実質量の自然免疫細胞を含む部位に投与され、ｒＡＡＶベクター組成物は関節内に投与されることがさらにより好ましい。
【０００８】
一実施形態において、免疫抑制剤は局所的に投与され、好ましくは実質量の自然免疫細胞を含む部位に投与され、さらに好ましくは関節内に投与される。
【０００９】
さらなる実施形態において、免疫抑制剤は全身投与され、好ましくは筋肉内又は静脈内に投与される。
【００１０】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤は連続して投与され、好ましくは免疫抑制剤はｒＡＡＶベクター組成物の前に投与される。
【００１１】
一実施形態において、免疫抑制剤は、自然免疫細胞阻害剤、メトトレキセートなどの細胞増殖抑制性若しくはプリン作動性のシグナル伝達経路修飾薬、非ステロイド性抗炎症剤、及び／又はマクロファージ枯渇抗体、ＴＮＦ遮断薬、ＩＬ−６遮断薬及び／又はＩＬ−２遮断薬などの免疫抑制性生物製剤である。免疫抑制剤は、自然免疫細胞阻害剤であることが好ましく、グルココルチコイド及び／又はリポソームビスホスホネートであることが好ましい。
【００１２】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに含まれる導入遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。
【００１３】
好ましい実施形態において、遺伝子治療は、炎症状態又は炎症性疾患を予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療するためのものであり、好ましくは導入遺伝子は治療用抗炎症性タンパク質をコードする。炎症状態又は疾患は、リウマチ性状態又は疾患であることが好ましい。遺伝子治療は、非炎症性状態又は非炎症性疾患を治療、予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療するためのものであることが好ましい。
【００１４】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／又は賦形剤をさらに含む。
【００１５】
特定の実施形態において、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクター組成物内に含まれる。
【００１６】
本発明は、少なくとも１：１の空キャプシドのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する比で、本明細書において定義されるｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと本明細書において定義される空キャプシド、及び本明細書において定義される免疫抑制剤を含む組成物をさらに提供する。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において定義されるｒＡＡＶベクター組成物と本明細書において定義される免疫抑制剤とを含むキットオブパーツを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ルシフェラーゼ発現は、関節炎発症前又は発症後にベクター投与によって影響される。関節炎を誘導した後、マウス（ｎ＝５／群）は、関節炎発症前の１７日目又は関節炎の発症後２４日目のいずれかに、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｒＡＡＶ５−導入遺伝子ベクター（ｒＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ５）の１．５ｅ１０ｖｇを関節内に注射された。画像化は、ベクター注射の３日後に、その後は４週間まで（２４日目の群）又は５週間まで（１７日目の群）に週１回行われた。挿入図：陽性シグナルを発現する膝関節の割合。陽性シグナルは、少なくとも１回の測定時間、対照となる膝関節の値の上限の１．５倍の値として定義された。発光は、群あたりの平均として示される；誤差バー、ＳＥＭ。
【図２ａ】ｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現におけるリポソームクロドロネート、トリアムシノロン及び空キャプシドの添加の影響。関節炎の誘導後、マウス（群あたりｎ＝５）は、１．５ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．ＦＬｕｃベクターを関節内に注射された。画像化は、ベクター注射の３日後、その後は４週間まで週１回行われた。（ａ）リポソームクロドロネート（５μｌ／ｇ  ｉ．ｖ．）及びトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）の添加は、より高いレベルの発光をもたらした。（ｂ）ゲノム含有キャプシドと共に５：１の比（空対完全）で空ＡＡＶ５キャプシドを添加すると、ルシフェラーゼ発現を改善した。（ｃ）陽性シグナルを発現する膝関節の割合は、４〜９倍改善された。（ｄ）臨床スコアは、トリアムシノロン処置された動物において減少傾向を示し、リポソームクロドロネート処置された動物において初期に減少傾向を示した。
【図２ｂ】ｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現におけるリポソームクロドロネート、トリアムシノロン及び空キャプシドの添加の影響。関節炎の誘導後、マウス（群あたりｎ＝５）は、１．５ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．ＦＬｕｃベクターを関節内に注射された。画像化は、ベクター注射の３日後、その後は４週間まで週１回行われた。（ａ）リポソームクロドロネート（５μｌ／ｇ  ｉ．ｖ．）及びトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）の添加は、より高いレベルの発光をもたらした。（ｂ）ゲノム含有キャプシドと共に５：１の比（空対完全）で空ＡＡＶ５キャプシドを添加すると、ルシフェラーゼ発現を改善した。（ｃ）陽性シグナルを発現する膝関節の割合は、４〜９倍改善された。（ｄ）臨床スコアは、トリアムシノロン処置された動物において減少傾向を示し、リポソームクロドロネート処置された動物において初期に減少傾向を示した。
【図２ｃ】ｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現におけるリポソームクロドロネート、トリアムシノロン及び空キャプシドの添加の影響。関節炎の誘導後、マウス（群あたりｎ＝５）は、１．５ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．ＦＬｕｃベクターを関節内に注射された。画像化は、ベクター注射の３日後、その後は４週間まで週１回行われた。（ａ）リポソームクロドロネート（５μｌ／ｇ  ｉ．ｖ．）及びトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）の添加は、より高いレベルの発光をもたらした。（ｂ）ゲノム含有キャプシドと共に５：１の比（空対完全）で空ＡＡＶ５キャプシドを添加すると、ルシフェラーゼ発現を改善した。（ｃ）陽性シグナルを発現する膝関節の割合は、４〜９倍改善された。（ｄ）臨床スコアは、トリアムシノロン処置された動物において減少傾向を示し、リポソームクロドロネート処置された動物において初期に減少傾向を示した。
【図２ｄ】ｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現におけるリポソームクロドロネート、トリアムシノロン及び空キャプシドの添加の影響。関節炎の誘導後、マウス（群あたりｎ＝５）は、１．５ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．ＦＬｕｃベクターを関節内に注射された。画像化は、ベクター注射の３日後、その後は４週間まで週１回行われた。（ａ）リポソームクロドロネート（５μｌ／ｇ  ｉ．ｖ．）及びトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）の添加は、より高いレベルの発光をもたらした。（ｂ）ゲノム含有キャプシドと共に５：１の比（空対完全）で空ＡＡＶ５キャプシドを添加すると、ルシフェラーゼ発現を改善した。（ｃ）陽性シグナルを発現する膝関節の割合は、４〜９倍改善された。（ｄ）臨床スコアは、トリアムシノロン処置された動物において減少傾向を示し、リポソームクロドロネート処置された動物において初期に減少傾向を示した。
【図３ａ】空キャプシド及び／又はトリアムシノロンの添加による関節内のｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現の改善。ＣＩＡモデルにおいて、マウス（群あたりｎ＝１３）は、空ＡＡＶ５キャプシド（５：１の空対完全）又はトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）の添加あり又は添加なしで、１．５ｅ１０のｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクター（関節内）を注射された。マウスは、１カ月間は週１回追跡され、その後は６カ月間まで月１回追跡された。（ａ）関節炎活性は、各時点でスコア化され、臨床スコアを算出した。当初、関節炎活性は、トリアムシノロンで処置された群において低かった。（ｂ）発光は、全ての群について４カ月まで増加し、その後、安定した状態であった。（ｃ）トリアムシノロンと空キャプシドの両方を添加した場合、一般化推定方程式の分析は、発光の有意な改善を示した。臨床スコア及び発光は、群あたりの平均として示される；誤差バー、ＳＥＭ。
【図３ｂ】空キャプシド及び／又はトリアムシノロンの添加による関節内のｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現の改善。ＣＩＡモデルにおいて、マウス（群あたりｎ＝１３）は、空ＡＡＶ５キャプシド（５：１の空対完全）又はトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）の添加あり又は添加なしで、１．５ｅ１０のｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクター（関節内）を注射された。マウスは、１カ月間は週１回追跡され、その後は６カ月間まで月１回追跡された。（ａ）関節炎活性は、各時点でスコア化され、臨床スコアを算出した。当初、関節炎活性は、トリアムシノロンで処置された群において低かった。（ｂ）発光は、全ての群について４カ月まで増加し、その後、安定した状態であった。（ｃ）トリアムシノロンと空キャプシドの両方を添加した場合、一般化推定方程式の分析は、発光の有意な改善を示した。臨床スコア及び発光は、群あたりの平均として示される；誤差バー、ＳＥＭ。
【図３ｃ】空キャプシド及び／又はトリアムシノロンの添加による関節内のｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現の改善。ＣＩＡモデルにおいて、マウス（群あたりｎ＝１３）は、空ＡＡＶ５キャプシド（５：１の空対完全）又はトリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）の添加あり又は添加なしで、１．５ｅ１０のｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクター（関節内）を注射された。マウスは、１カ月間は週１回追跡され、その後は６カ月間まで月１回追跡された。（ａ）関節炎活性は、各時点でスコア化され、臨床スコアを算出した。当初、関節炎活性は、トリアムシノロンで処置された群において低かった。（ｂ）発光は、全ての群について４カ月まで増加し、その後、安定した状態であった。（ｃ）トリアムシノロンと空キャプシドの両方を添加した場合、一般化推定方程式の分析は、発光の有意な改善を示した。臨床スコア及び発光は、群あたりの平均として示される；誤差バー、ＳＥＭ。
【図４】局所対全身トリアムシノロン投与の比較。ＣＩＡモデル（ｎ＝１８）において、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）（又は生理食塩水）は、ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクター（１．５ｅ１０ｖｇ）＋空ＡＡＶ５キャプシド（５：１の空：完全比）のｉ．ａ．投与（関節内）の２日前に、局所的に（ｉ．ａ．）又は全身に（ｉ．ｍ．）投与された。ルシフェラーゼ発現を経時的に追跡した。
【図５ａ】異なる組織における脾臓の大きさ及び細胞集団におけるトリアムシノロンの効果。関節炎をいくつかの群（群あたりｎ＝５）に導入し、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は対照としての生理食塩水は、２２日目（ベクター投与の２日前）に筋肉内に投与された。トリアムシノロン投与の４８時間後に、フローサイトメトリーにより組織を分析した。（ａ）脾臓におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ６８＋）の割合は、生理食塩水及びトリアムシノロンで処置された動物間で類似していたが、（ｂ）滑膜におけるマクロファージの割合は、トリアムシノロン群において減少していた。（ｃ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。（ｄ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。
【図５ｂ】異なる組織における脾臓の大きさ及び細胞集団におけるトリアムシノロンの効果。関節炎をいくつかの群（群あたりｎ＝５）に導入し、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は対照としての生理食塩水は、２２日目（ベクター投与の２日前）に筋肉内に投与された。トリアムシノロン投与の４８時間後に、フローサイトメトリーにより組織を分析した。（ａ）脾臓におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ６８＋）の割合は、生理食塩水及びトリアムシノロンで処置された動物間で類似していたが、（ｂ）滑膜におけるマクロファージの割合は、トリアムシノロン群において減少していた。（ｃ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。（ｄ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。
【図５ｃ】異なる組織における脾臓の大きさ及び細胞集団におけるトリアムシノロンの効果。関節炎をいくつかの群（群あたりｎ＝５）に導入し、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は対照としての生理食塩水は、２２日目（ベクター投与の２日前）に筋肉内に投与された。トリアムシノロン投与の４８時間後に、フローサイトメトリーにより組織を分析した。（ａ）脾臓におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ６８＋）の割合は、生理食塩水及びトリアムシノロンで処置された動物間で類似していたが、（ｂ）滑膜におけるマクロファージの割合は、トリアムシノロン群において減少していた。（ｃ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。（ｄ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。
【図５ｄ】異なる組織における脾臓の大きさ及び細胞集団におけるトリアムシノロンの効果。関節炎をいくつかの群（群あたりｎ＝５）に導入し、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は対照としての生理食塩水は、２２日目（ベクター投与の２日前）に筋肉内に投与された。トリアムシノロン投与の４８時間後に、フローサイトメトリーにより組織を分析した。（ａ）脾臓におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ６８＋）の割合は、生理食塩水及びトリアムシノロンで処置された動物間で類似していたが、（ｂ）滑膜におけるマクロファージの割合は、トリアムシノロン群において減少していた。（ｃ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。（ｄ）脾臓重量は、トリアムシノロン処置された動物において有意に減少した；グラフ及び写真は、トリアムシノロン／生理食塩水の投与の３日後に屠殺にされた群の脾臓を示す。
【図６】２つの異なる比（５：１及び２０：１）の空キャプシドの添加は、関節内のｒＡＡＶ５−ルシフェラーゼ発現を改善する。健常なマウス（群あたりｎ＝７）は、ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ（１．５ｅ１０ｖｇ）を関節内に注射され、２群において、空ＡＡＶ５キャプシドを異なる比率で添加した。ルシフェラーゼ発現は、マウスを４週間後に屠殺するまで週１回測定された。（ａ）４週目の発光は、群あたりの平均として示される；誤差バー、ＳＥＭ。空キャプシドが添加された群対ゲノム含有ベクターのみを受けた対照群において＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１（片側不対ｔ検定）。
【図７】滑膜炎症（ＡＰＳＩ）の空気嚢モデルにおけるルシフェラーゼ発現。ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ（３．１６ｅ１１ｖｇ）は、空気嚢形成後の０日目、１１日目又は１８日目にマウスの空気嚢（ｎ＝５）に投与された。トリアムシノロン処置群において、トリアムシノロンは、９日目にｉ．ｍ．投与（５ｍｇ／ｋｇ）され、続いて１１日目にベクターが投与された。３０日目に、全てのマウスを屠殺し、空気嚢膜を取り出し、ルシフェラーゼアッセイに供した。群あたりのルシフェラーゼ発現を平均＋ＳＥＭとして示す。黒色水平線は、ルシフェラーゼ検出の限界を示す。いずれもの検出可能なルシフェラーゼ発現を示した唯一の群は、ベクターを０日目に注射した場合であり、又はトリアムシノロンをベクターの２日前に投与した場合である。
【図８ａ】健常マウスにおける関節内のＡＡＶ５遺伝子発現における空キャプシド及びトリアムシノロンの効果。健常なマウス（群あたりｎ＝１７、関節に計３４回注射された）は、生理食塩水（ＮａＣｌ）又はトリアムシノロンのいずれかのｉ．ｍ．投与に先行して２日前に、ｒＡＡＶ５−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ関節内（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）±空ＡＡＶ５キャプシド（完全に対する５：１の空比）を注射された。ルシフェラーゼ発現は、ＩＶＩＳにより８週まで週１回測定された。ａ）全ての群について経時的なルシフェラーゼ測定。ｂ）８週目の全ての群におけるルシフェラーゼ発現。データは、群あたりの平均＋ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側マンホイットニー検定で測定した場合。
【図８ｂ】健常マウスにおける関節内のＡＡＶ５遺伝子発現における空キャプシド及びトリアムシノロンの効果。健常なマウス（群あたりｎ＝１７、関節に計３４回注射された）は、生理食塩水（ＮａＣｌ）又はトリアムシノロンのいずれかのｉ．ｍ．投与に先行して２日前に、ｒＡＡＶ５−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ関節内（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）±空ＡＡＶ５キャプシド（完全に対する５：１の空比）を注射された。ルシフェラーゼ発現は、ＩＶＩＳにより８週まで週１回測定された。ａ）全ての群について経時的なルシフェラーゼ測定。ｂ）８週目の全ての群におけるルシフェラーゼ発現。データは、群あたりの平均＋ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側マンホイットニー検定で測定した場合。
【図９ａ】健常マウスにおける関節内のＡＡＶ２遺伝子発現における空キャプシド及びトリアムシノロンの効果。健常なマウス（群あたりｎ＝１７、関節に計３４回注射された）は、生理食塩水（ＮａＣｌ）又はトリアムシノロンのいずれかのｉ．ｍ．投与に先行して２日前に、ｒＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ関節内（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）±空ＡＡＶ２キャプシド（完全に対する５：１の空比）を注射された。ルシフェラーゼ発現は、ＩＶＩＳにより４週まで週１回測定された。ａ）全ての群について経時的なルシフェラーゼ測定。ｂ）４週目の全ての群におけるルシフェラーゼ発現。データは、群あたりの平均＋ＳＥＭを示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側マンホイットニー検定で測定した場合。
【図９ｂ】健常マウスにおける関節内のＡＡＶ２遺伝子発現における空キャプシド及びトリアムシノロンの効果。健常なマウス（群あたりｎ＝１７、関節に計３４回注射された）は、生理食塩水（ＮａＣｌ）又はトリアムシノロンのいずれかのｉ．ｍ．投与に先行して２日前に、ｒＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ関節内（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）±空ＡＡＶ２キャプシド（完全に対する５：１の空比）を注射された。ルシフェラーゼ発現は、ＩＶＩＳにより４週まで週１回測定された。ａ）全ての群について経時的なルシフェラーゼ測定。ｂ）４週目の全ての群におけるルシフェラーゼ発現。データは、群あたりの平均＋ＳＥＭを示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、片側マンホイットニー検定で測定した場合。
【図１０】ＡＡＶ２対ＡＡＶ５キャプシド（ＶＰ１）アライメント。この配列は、下線付きのアミノ酸によって示されるように、５７％の同一性を示す。  本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を明確にするために役立つものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
「ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター」とは、分子方法の使用により野生型ＡＡＶに由来する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを指す。ウイルスゲノムの全体又は一部が、本明細書においてさらに定義されるＡＡＶ核酸配列に対して非天然の核酸である導入遺伝子で置換されているため、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは野生型（ｗｔ）ＡＡＶベクターと区別される。野生型ＡＡＶはディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属し、さらにその属はパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科に属し、パルボウイルスとも呼ばれ、脊椎動物に感染することができる。パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）は、小さなＤＮＡ動物ウイルスのファミリー、すなわちパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する。ディペンドウイルスのメンバーは、その属の名前から推測されるように、細胞培養における生産的感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を通常必要とする点で独特である。ディペンドウイルス属には、ヒトに通常感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科の他のメンバーに関するさらなる情報は、ケネス  Ｉ．ベルンズ（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ）、「パルボウイルス科：ウイルス及びその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、第６９章「フィールドウイルス学」（第３版、１９９６年）に記載されている。便宜上、本発明は、ＡＡＶを参照して本明細書においてさらに例示され、説明される。しかしながら、本発明は、ＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスに同様に適用できることが理解される。
【００２０】
全ての公知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満である直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の固有のコードヌクレオチド配列の両端に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）はキャプシド又はタンパク質の殻を形成する。末端の１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして役割を果たす。哺乳類細胞におけるｗｔＡＡＶ感染後、Ｒｅｐ遺伝子２５（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、Ｐ５プロモーター及びＰ１９プロモーターからそれぞれ発現され、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製において機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際に４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞におけるＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡはＡＡＶベクター生成に十分であることが示されている。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染は、キャプシドタンパク質生成に関して、２つのスプライスアクセプター部位の交互の使用と、ＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適な利用との組み合わせに依存する。
【００２１】
ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、１つ又は好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子を欠失していてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）又はｃａｐ（キャプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まないことが好ましい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であってもよく、又は野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の配列同一性を有してもよく、又は例えば、それらが機能的である限り、ヌクレオチドの挿入、変異、欠失又は置換によって変更されてもよい。この文脈において、機能性とは、キャプシド殻へのゲノムのパッケージングを指向し、次に、形質導入される宿主細胞、又は標的細胞において発現を可能にする能力を指す。典型的には、野生型ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復は、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに保持される。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングすることができ、又はＡＡＶ  ＩＴＲを含むベクターから切り出すことができる。ＩＴＲヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学技術を用いて、本明細書において定義される導入遺伝子のいずれかの末端に連結され得、又はＩＴＲ間の野生型ＡＡＶ配列は所望のヌクレオチド配列で置換され得る。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、好ましくは、少なくともＡＡＶ血清型の１つの逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列、及び２つのＩＴＲの間に挿入された（適切な調節エレメントの制御下の）治療用タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。現在使用されている大部分のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶ血清型２由来のＩＴＲ配列を使用する。好ましいＩＴＲ配列は、表１に示される配列番号１〜６で表される。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに存在する最も好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖又は二本鎖（自己相補的）ＤＮＡを含むことができる。一本鎖核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであり、両方の極性が同様に遺伝子発現が可能であるためである。一本鎖ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ＩＴＲ配列（配列番号２４、２５）を利用することができ、二本鎖（自己相補的）ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＩＴＲ（配列番号２６、２７）の修飾バージョンを利用することができる。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、当該技術分野において公知である、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子、或いは化学的、酵素的又は他の仕方で検出可能な及び／又は選択可能な生成物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー又はレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。
【００２２】
ＡＡＶ血清型キャプシド及びＡＡＶゲノムＩＴＲの任意の可能な組み合わせを含むｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｎら、（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９年）７３：３４１０−３４１７頁）、Ｃｌａｒｋら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９年）１０：１０３１−１０３９頁）、Ｗａｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１年）８０７：３６１−４０４頁）及びＧｒｉｍｍ（Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）２８（２）：１４６−１５７頁）に記載される、当該技術分野において公知の方法を用いて生成される。要約すると、この方法は、一般的に、（ａ）宿主細胞にｒＡＡＶゲノム構築物を導入すること、（ｂ）宿主細胞に、野生型ｒＡＡＶゲノムから欠けているウイルス機能を含むＡＡＶヘルパー構築物を導入すること、及び（ｃ）宿主細胞にヘルパーウイルス構築物を導入することを伴う。ｒＡＡＶベクターへのｒＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングを達成するためには、ｒＡＡＶベクター複製及びパッケージングのための全ての機能が存在する必要がある。宿主細胞への導入は、標準的な分子生物学技術を用いて行うことができ、同時に又は連続して行うことができる。最後に、宿主細胞を培養してｒＡＡＶベクターを生成し、ＣｓＣｌ勾配（Ｘｉａｏら、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０９８−８１０８頁）などの標準的技術を用いて精製する。次に、精製されたｒＡＡＶベクターは、この方法での使用に対して準備される。１ｍｌあたり１０１２粒子超の高力価及び高純度（検出可能なヘルパー及び野生型ウイルスが存在しない）を達成することができる（Ｃｌａｒｋら、上掲、及びＦｌｏｔｔｅら、１９９５年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９−３７頁）。ＩＴＲ領域間のｒＡＡＶベクターに挿入される導入遺伝子の総サイズは、一般的に、５キロベース（ｋｂ）より小さいサイズである。
【００２３】
キャプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８などの天然に見出されるキャプシド配列であり得、それらのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は配列番号７〜１８に示される。好ましい実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型５又はＡＡＶ血清型８キャプシドタンパク質である。或いは、配列は人工的であり、例えば、配列はハイブリッド形態であってもよく、又は例えばＡｃｍＮＰｖ若しくはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のコドン使用頻度によってコドン最適化されてもよい。例えば、キャプシド配列は、ＡＡＶ１のＶＰ２及びＶＰ３配列から構成され得るが、ＶＰ１配列の残りはＡＡＶ５である。人工的な配列は、合理的な設計又は指向的進化実験の結果として生じてもよい。これは、ＤＮＡシャフリング、エラープローンＰＣＲ、バイオインフォーマティックな合理的設計、部位飽和突然変異誘発によるキャプシドライブラリーの生成を含むことができる。得られるキャプシドは、既存の血清型に基づくが、このようなキャプシドの特徴を改善する様々なアミノ酸又はヌクレオチドの変化を含有する。得られたキャプシドは、既存の血清型の様々な部分の組み合わせであり得、「シャッフルされたキャプシド」、或いはグループに組織化された又は遺伝子若しくはタンパク質の全長にわたり分散された、完全に新規な変化、すなわち１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの付加、欠失又は置換を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＭａｈｅｓｈｒｉ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ  ＥＭＢＳ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ；Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １−５、２００４年、３５２０−３５２３頁；Ａｓｕｒｉら、（２０１２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（２）：３２９−３３８９頁；Ｌｉｓｏｗｓｋｉら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０６（７４８８）：３８２−３８６頁を参照されたい。
【００２４】
本発明の文脈において、キャプシドタンパク質の殻は、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターゲノムＩＴＲとは異なる血清型のものであり得る。したがって、本発明のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、キャプシドタンパク質の殻、すなわちＡＡＶ血清型の１つ、例えば、ＡＡＶ血清型５のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む２０面体キャプシドによってキャプシド形成されてもよいが、一方で、そのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに含有されるＩＴＲ配列は、ｒＡＡＶ５ベクターを含む、上記のｒＡＡＶ血清型のいずれかであってもよい。好ましい野生型キャプシドタンパク質の殻の配列は、表１に示される配列番号７〜１８によって表される。一実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶ血清型５又はＡＡＶ血清型２又はＡＡＶ血清型８のキャプシドタンパク質の殻によってキャプシド形成され、ここで、上記ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに存在するｒＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２又はＡＡＶ血清型５（配列番号５及び６によってコードされる）又はＡＡＶ血清型８に由来する。この実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶ血清型５のキャプシドタンパク質の殻（より好ましくは、配列番号１１によってコードされる配列番号１２、１３、１４）によってキャプシド形成され、上記ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに存在するｒＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２（より好ましくは、配列番号１、２として一本鎖、又は配列番号３、４として二本鎖）に由来することがさらに好ましい。この実施形態は、関節への遺伝子の局所送達に好ましい。
【００２５】
別の実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶ血清型８のキャプシドタンパク質の殻（より好ましくは、配列番号１５によってコードされる配列番号１６、１７、１８）によってキャプシド形成され、上記ベクターに存在するｒＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２（より好ましくは、配列番号１、２として一本鎖、又は配列番号３、４として二本鎖）に由来することが好ましい。この実施形態は、全身送達に好ましい。
【００２６】
さらに別の実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターは、ＡＡＶ血清型２のキャプシドタンパク質の殻（より好ましくは、配列番号７によってコードされる配列番号８、９、１０）によってキャプシド形成され、上記ベクターに存在するｒＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２（より好ましくは、配列番号１、２として一本鎖、又は配列番号３、４として二本鎖）に由来することが好ましい。ＡＡＶ５及び他のＡＡＶ血清型の完全なゲノムが配列決定されていて（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９年、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．２、１３０９−１３１９頁）、ヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号ＡＦ０８５７１６）において入手可能である。したがって、ＡＡＶ５のＩＴＲヌクレオチド配列は、当業者に容易に利用可能である。ＡＡＶ２の完全ゲノムは、ＮＣＢＩ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００１４０１．２）において入手可能である。それらは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって、又は標準的な分子生物学技術によって供給されるオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて、当該技術分野において公知であるクローン化又は化学合成によって作製することができる。
【００２７】
「血清型」は、伝統的には、あるウイルスに対する抗体と他のウイルスに対する抗体との間の交差反応性の欠如に基づいて定義される。このような交差反応性の差異は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列の相違に起因する）の差による。伝統的な定義の下、血清型とは、対象とするウイルスが、中和活性に関して既存の及び特徴付けられた全ての血清型に特異的である血清に対して試験されており、対象とするウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。天然に存在するウイルス単離物が発見され、キャプシド変異体が生成されるにつれて、現在、既存の血清型のいずれかとの血清学的相違が存在してもよく又は存在しなくてもよい。したがって、新しいＡＡＶに血清学的差異がない場合、この新しいＡＡＶは、対応する血清型の亜群又は改変体であろう。多くの場合、血清型の伝統的な定義による別の血清型であるかどうかを決定するための、中和活性についての血清学試験は、キャプシド配列修飾を有する変異ウイルスで未だ行われていない。したがって、便宜上及び反復を避けるために、用語「血清型」とは、血清学的に区別されるウイルス（例えば、ＡＡＶ）、並びに所定の血清型のサブグループ又は改変体内にあり得る血清学的に区別されないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。例として、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターには、種々の天然に存在する及び天然に存在しない血清型が含まれる。このような非限定的な血清型には、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ及びＡＡＶ−２ｉ８が含まれる。また、便宜上、血清型には、別個の血清型であることが十分に特徴付けられていないキャプシド配列修飾を伴うＡＡＶが含まれ、実際には公知の血清型のサブグループ又は改変体を構成し得る。
【００２８】
「空ＡＡＶキャプシド」は、本明細書において「空キャプシド」とも命名され、キャプシドタンパク質のみによって構成され、ウイルス核酸ゲノムを含まない。空キャプシドは、完全な（ゲノム含有）ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、ＡＡＶ）と結合し、それにより好ましくはウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるデコイとして機能する、１つ以上の抗体又はスカベンジャー受容体と結合する点でウイルス様粒子である。このようなデコイは、好ましくは、ウイルスベクターに対して指向される抗体又はスカベンジャー受容体を吸収するように作用し、それにより、このような抗体又はスカベンジャー受容体との関連で、細胞のウイルスベクター導入遺伝子の導入（導入遺伝子の導入）を増加又は改善し、順に遺伝子転写物及び／又はコードされたタンパク質の細胞発現を増加させる。例えば、空ＡＡＶ８キャプシドは、野生型ＡＡＶ８若しくはｒＡＡＶ８−導入遺伝子ベクター又は別のＡＡＶ血清型などのＡＡＶに結合する１つ以上の抗体又はスカベンジャー受容体と結合する能力を保持する。例えば、空ＡＡＶ２キャプシドは、野生型ＡＡＶ８又はｒＡＡＶ８−導入遺伝子ベクターに結合する１つ以上の抗体又はスカベンジャー受容体と結合する能力を保持する。空キャプシドは、細胞に入る能力を保持することができるが、細胞に入る必要はなく、例えば、空キャプシドのキャプシドタンパク質配列を修飾又は架橋することは、修飾又は架橋されたキャプシドが細胞に入る能力を減少させる。したがって、このような空キャプシドは、導入遺伝子を含むウイルスベクターと比較して、細胞への結合が低下している場合がある。したがって、空キャプシドは、未修飾である又は修飾されてもよく、導入遺伝子を含むウイルスベクターと比較して、細胞への結合が低下していてもよい。特定の実施形態において、空キャプシドは、架橋剤で処理される、又はＡＡＶ受容体への結合の低下若しくは減少を示す変異したキャプシドを含む。特定の態様において、変異キャプシドは、国際公開第２０１３／０７８４００号に開示されている１つ以上の変異したキャプシドタンパク質、すなわち、ヘパリン硫酸プロテオグリカン結合に寄与する１つ以上のアルギニン（Ｒ）残基が非荷電若しくは疎水性残基で置換されているキャプシドタンパク質、又は以下の位置：４５１位、４４８位、５３０位、５８５位若しくは５８８位のいずれかで置換される１つ以上のアルギニン（Ｒ）残基（例えば、以下の任意の位置：４５１位でシステインにより、４４８位でシステインにより、５３０位でアラニンにより、５８５位でアラニンにより若しくは５８８位でアラニンにより置換される１つ以上のアルギニン（Ｒ）残基）を有するＡＡＶ２  ＶＰ１（配列番号８）及び／若しくはＶＰ２（配列番号９）などの任意のＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。
【００２９】
空ＡＡＶキャプシド又は空キャプシドは、ＡＡＶベクター調製物中に天然に見出されることがある。このような天然の混合物は、本発明に従って使用することができ、又は必要に応じて、空キャプシド及び／若しくはベクターの量を増加若しくは減少させるように操作することができる。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、空キャプシドはデコイとして作用し、それによってｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターの分解を防ぎ得る。この場合、空キャプシドの量は、個体においてベクター媒介性遺伝子導入に使用されることが意図されるｒＡＡＶベクターと反応し又は結合する抗体又はマクロファージの阻害効果を低下させることが期待される量に調整することができる。
【００３０】
空キャプシドはまた、ＡＡＶベクター調製物とは独立して生成することができ、必要に応じて、ＡＡＶベクター調製物に添加され、又は個体に別々に投与することができる。空キャプシド、ゲノムを含有するキャプシド及びキャプシドタンパク質を生成及び精製し、それらの量を、例えば、個体におけるＡＡＶ抗体力価又は血清型に従って決定し、場合により調整し、それらの意図する目的に従って使用又は投与することができる。
【００３１】
「自然免疫細胞」は、本明細書において、異物に対する炎症応答に関与する可能性を有する好中球、マクロファージ、単球、好酸球、好塩基球又は樹状細胞として理解される。
【００３２】
「マクロファージ」は、本明細書において、食作用と呼ばれる過程において、細胞破片、異物、微生物及び癌細胞を貪食及び消化する自然免疫細胞として理解される。
【００３３】
用語「導入遺伝子」は、ＡＡＶ核酸配列に関して非天然の核酸を指すために使用される。これは、細胞又は生物に導入され得るポリヌクレオチドを指すために使用される。導入遺伝子には、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする遺伝子、阻害性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、又は転写されないポリヌクレオチド（例えば、転写を駆動するプロモーターなどの発現調節エレメントを欠損している）などの任意のポリヌクレオチドが含まれる。本発明の導入遺伝子は、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでもよく、それぞれは、異なっていてもよく又は異なる治療分子をコードしてもよい。少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）エレメントによって連結され得、単一のプロモーターの調節下でバイシストロン性転写物を提供し得る。適切なＩＲＥＳエレメントは、例えば、Ｈｓｉｅｈら（１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：９１０−９１７頁）に記載されている。さらに、異なる（治療的）ポリペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａ配列によって連結されてもよく、単一のプロモーターから両方の導入遺伝子を効率的に発現させることができる。２Ａ配列の例には、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、トーセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス及びブタテッショウウイルス（ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）−１（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１１）６（４）：ｅ１８５５６）を含む。導入遺伝子は、好ましくは、上記の通り、ｒＡＡＶゲノム内又はＩＴＲ配列間に挿入される。導入遺伝子はまた、コード配列及び３’終結配列に作動可能に連結されたプロモーター又は転写調節配列などの発現調節エレメントを含む発現構築物であってもよい。導入遺伝子内のコード配列は、ステロイド誘導性プロモーターに作動可能に連結されていないことが好ましい。導入遺伝子内のコード配列は、デキサメタゾン誘導性プロモーターに作動可能に連結されていないことがより好ましい。
【００３４】
導入遺伝子を有する細胞において、導入遺伝子は、細胞のｒＡＡＶ「形質導入」によって導入／転移／形質導入されている。導入遺伝子が導入されている細胞又はその子孫は、「形質導入された」細胞と呼ばれる。典型的には、導入遺伝子は、形質導入された細胞の子孫に含まれる、又はその細胞から発生する生物の一部となる。したがって、（例えば、哺乳動物において、細胞又は組織又は臓器細胞などの）「形質導入された」細胞は、外因性分子、例えば、ポリヌクレオチド又はタンパク質（例えば、導入遺伝子）を細胞内に組み込んだ後の細胞における遺伝子変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、例えば、外因性分子が導入された細胞、又はその子孫である。細胞（単数又は複数）は増殖され、導入されたタンパク質は発現され、又は核酸は転写される。
【００３５】
「形質導入」とは、レシピエント宿主細胞へのウイルスベクターによる導入遺伝子の転移を指す。本発明のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクターに含まれる導入遺伝子の導入細胞への転移をもたらす。「宿主細胞」又は「標的細胞」とは、個体の滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）又は滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）などの、ＤＮＡ送達が起こる細胞を指す。ＡＡＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入することができる。
【００３６】
「遺伝子」又は「コード配列」とは、特定のタンパク質を「コードする」ＤＮＡ又はＲＮＡ領域を指す。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれた場合、転写され（ＤＮＡ）、及びポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。遺伝子は、ポリアデニル化部位又はシグナル配列を含む、プロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列及び３’非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された断片を含んでもよい。キメラ遺伝子又は組換え遺伝子は、例えば、プロモーターが、転写されるＤＮＡ領域の一部又は全部に自然界では結合していない遺伝子などの、通常、自然界では見出されない遺伝子である。「遺伝子の発現」とは、遺伝子がＲＮＡに転写され、及び／又は活性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１つ以上のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列、例えば、限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位の存在、並びにプロモーターから転写の量を調節するために直接的に又は間接的に作用することが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列によって、構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生的条件下で大部分の組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学的誘導物質の適用によって、生理学的又は発生的に調節されるプロモーターである。好ましい誘導性プロモーターは、炎症に対して誘導可能なＮＦ−Ｋｂ応答性プロモーターである。より好ましいＮＦ−Ｋｂ応答性プロモーターは、配列番号１９を含む。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞において優先的に活性である。適切なプロモーター配列の選択は、一般的に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。本発明のｒＡＡＶ及び／又は導入遺伝子内の好ましいプロモーター配列は、リウマチ滑膜の細胞、例えば、内膜マクロファージ並びに／又は線維芽細胞様滑膜細胞及び／若しくは他の滑膜細胞、例えば、限定されないが、Ｔ細胞において発現を付与するプロモーターである。好ましいプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウイルス）、ＩＬ−６遺伝子のプロモーター若しくはＳＶ４０プロモーターなどの滑膜細胞において発現することが公知である遺伝子のプロモーター、又は本明細書において先に同定されたＮＦ−κＢ誘導性プロモーター、及び当業者によって容易に決定されるような他のものが挙げられる。或いは、導入遺伝子は、効率的な全身発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結される。適切なプロモーター配列は、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡ（ニワトリベータアクチン）、又はヒトα−１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）若しくはＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）などの肝特異的プロモーターである。ｒＡＡＶ及び／又は導入遺伝子内のプロモーターは、ステロイド誘導性プロモーターではないことが好ましい。ｒＡＡＶ及び／又は導入遺伝子内のプロモーターは、デキサメタゾン誘導性プロモーターではないことがより好ましい。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。「作動可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的には、連続していて、必要であれば２つのタンパク質のコード領域を連結し、連続し、リーディングフレームにあることを意味する。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「遺伝子治療」は、疾患を治療するために、個体の細胞及び／又は組織に核酸配列（例えば、本明細書中で定義される導入遺伝子）を挿入することである。導入遺伝子は、欠損したものに代わる又はそれを補う機能的変異対立遺伝子であってもよい。遺伝子治療はまた、本質的に阻害性であって、すなわち、望ましくない若しくは異常な（例えば、病原性の）遺伝子又はタンパク質などの内因性遺伝子又はタンパク質の発現、活性又は機能を阻害、減少又は低下させる導入遺伝子の挿入を含む。このような導入遺伝子は外因性であり得る。外因性分子又は配列は、治療されるべき細胞、組織及び／又は個体においては通常は生じない分子又は配列であると理解される。後天性疾患と先天性疾患の両方が遺伝子治療に適している。
【００４０】
「治療用ポリペプチド」又は「治療用タンパク質」は、本明細書において、個体に有益な効果を有し得るポリペプチド又はタンパク質として理解され、好ましくは上記個体はヒトであり、より好ましくは上記ヒトは疾患に罹患している。このような治療用ポリペプチドは、酵素、補因子、サイトカイン、抗体、増殖因子、ホルモン及び抗炎症性タンパク質からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００４１】
「治療上有効な」量は、本明細書で使用するとき、疾患状態に関連する症状のうちの少なくとも１つを軽減する（例えば緩和する、減少させる、低下させる）に十分な量である。或いは、「治療上有効な」量は、個体の状態をいくらか改善させるのに十分な量である。
【００４２】
「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。好ましい実施形態において、配列同一性は、所与の２つの配列番号の全長又はその一部に基づいて計算される。その一部は、好ましくは、両方の配列番号の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味する。当該技術分野において、また、「同一性」とは、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定される、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。本明細書中で他に示されない限り、所与の配列番号との同一性又は類似性とは、上記配列の全長に基づく（すなわち、その全長にわたる又は全体としての）同一性又は類似性を意味する。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができ、限定されないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びに、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８年）に記載される方法が挙げられる。
【００４４】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なコンピュータプログラムにまとめられている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公衆に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））。また、周知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムを用いて同一性を決定することができる。
【００４５】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータには、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３−４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９頁（１９９２年）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４が含まれる。これらのパラメータで有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐの「Ｏｇａｐ」プログラムとして公衆に利用可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（エンドギャップについてペナルティなし）。
【００４６】
核酸比較のための好ましいパラメータは、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３−４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３が含まれる。ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＧａｐプログラムを利用することができる。核酸比較のためのデフォルトパラメータは上述されている。
【００４７】
場合により、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、当業者には明らかなように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換改変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸変化は保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸の各々の好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕ。
【００４８】
「滑膜」又は「滑膜組織」又は「滑膜細胞」は、本明細書で使用するとき、滑膜関節の非軟骨性表面を覆う細胞裏打ちを指し、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｋ（２０００年、Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ．Ｉｎ：Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ、Ｐａｎｙａｎｉ  ＧＳ、Ｗｏｌｌｈｅｉｍ  ＦＡ編集、Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．５５−６８頁）にさらに記載されている。滑膜は、内膜裏打ち層（又は滑膜裏打ち層）及び滑膜下垂（副腎皮質）からなり、関節包と合わさる。内膜裏打ち層は、内膜マクロファージ（又はマクロファージ様滑膜細胞若しくはＡ型滑膜細胞）及び線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ若しくはＢ型滑膜細胞）を含む。したがって、「滑膜」は、「滑膜組織」によって置き換えられるか、又は同義であり得る。滑膜細胞は、ＦＬＳ及びマクロファージ様滑膜細胞を含む滑膜に存在する任意の細胞を含むことができる。滑膜細胞はまた、滑膜中に全て存在し得る好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又は結合組織細胞であり得る。
【００４９】
用語「リウマチ滑膜」又は「リウマチ滑膜細胞」又は「リウマチ滑膜組織」とは、関節リウマチに罹患している個体の関節の炎症性滑膜を指す。リウマチ滑膜は、内膜裏打ち肥厚、及び滑膜下垂体におけるＦＬＳ、Ｔ細胞、形質細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の蓄積によって特徴付けられる。これらの蓄積された細胞は、リウマチ滑膜細胞の定義に含まれる。
【００５０】
さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」によるエレメントへの言及は、文脈上、要素のうち１つ及びただ１つが存在することを明確に要求していない限り、１を超えるエレメントが存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つの」を意味する。
【００５１】
用語「およそ」又は「約」は、数値（およそ１０、約１０）に関連して使用される場合、好ましくは、その値が、値よりも１０％多い又は１０％少ない所定の値であり得ることを意味する。
［発明の詳細な説明］
【００５２】
第一の態様において、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター組成物を提供する。上記ｒＡＡＶベクター組成物は、遺伝子治療用である又は遺伝子治療における応用に適していることが好ましい。本発明のｒＡＡＶベクター組成物は、本明細書において定義されている少なくともｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターを含む。導入遺伝子は、治療的に活性であることが好ましい。
【００５３】
導入遺伝子は、治療用（ポリ）ペプチド又は治療用タンパク質をコードすることが好ましい。本発明との関連で使用するための治療用（ポリ）ペプチド及びタンパク質には、限定されないが、（可溶性）分化のクラスター３９（ＣＤ３９）タンパク質、（可溶性）分化のクラスター７３（ＣＤ７３）タンパク質、組換え抗炎症融合タンパク質（ＲＡＩＮ）（ＣＤ７３−３９融合）、インターロイキン−１阻害剤、腫瘍壊死因子−α阻害剤、インターロイキン−１２阻害剤、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−１８結合タンパク質、可溶性腫瘍壊死因子−α受容体ｐ５５又は可溶性腫瘍壊死因子−αタンパク質７５、ドミナントネガティブＩκＢキナーゼ−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、インターフェロン−β、血管作動性腸ポリペプチド、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、ユートロフィン、血液凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）（凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ））因子（例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、タンパク質Ｃ、第ＶＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、又は凝固因子の高活性若しくは長期半減期改変体、又は活性型若しくは不活性型の凝固因子）、モノクローナル抗体（例えば、腫瘍壊死因子−α又はインターロイキン−１２に対する）、網膜色素上皮特異的な６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、Ｐ−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、増殖因子、インスリン様増殖因子１又は２、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子−３及び−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子α及びβ、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ））、ＶＥＧＦ、マイクロジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、アリールスルファターゼＡ及びＢ、ＡＴＰ７Ａ及びＢ、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性若しくは免疫原性ペプチド又はタンパク質であるＴｒｅｇｉｔｏｐｅ又はｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（Ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ）、��ＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（回転萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖レチノスキシン）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群ＩＣ）、Ｘ連鎖網膜色素変性ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ形態のＲＰ：網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色素沈着症）、ＰＫＤ−１又はＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎症）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積疾患に関与する遺伝子産物（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質アクチベータータンパク質）、又は１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＥＲ−Ｃａｓ９タンパク質、又はゲノム編集のための修復鋳型として使用されるドナー配列、並びにそれを必要とする個体において治療効果を有する他の任意のペプチド又はタンパク質が挙げられる。治療用タンパク質は、治療用抗炎症性タンパク質であることが好ましく、好ましくは、（可溶性）分化のクラスター３９（ＣＤ３９）タンパク質、（可溶性）分化のクラスター７３（ＣＤ７３）タンパク質、インターロイキン−１阻害剤、腫瘍壊死因子−α阻害剤、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−１８結合タンパク質、可溶性腫瘍壊死因子−α受容体ｐ５５又は可溶性腫瘍壊死因子−αタンパク質７５、ドミナントネガティブＩκＢキナーゼ−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、インターフェロン−β及び血管作動性腸ポリペプチドからなる群から選択される。
【００５４】
導入遺伝子によってコードされるさらなる例示的な治療用ペプチド又はタンパク質には、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患及び非アルコール性脂肪症、嚢胞性線維症（及び肺の他の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血及び他の血液疾患、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経学的障害、癌、真性糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ、ベッカー）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、グリコーゲン貯蔵疾患及び他の代謝欠損、網膜変性疾患（及び眼の他の疾患）、並びに固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患を含む疾患又は障害の治療に使用され得るものが挙げられる。
【００５５】
本明細書に記載されるように、本発明の導入遺伝子は、阻害性及び／又はアンチセンス核酸配列であり得る。阻害性、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を調節することができる。このような分子には、疾患プロセスの媒介に関与する標的遺伝子の発現を阻害し、それにより疾患の１つ以上の症状を軽減、阻害又は緩和することができるものが含まれる。
【００５６】
アンチセンスには、ＲＮＡ転写物又はＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）に結合する一本鎖、二本鎖又は三本鎖のポリヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。標的遺伝子の転写開始部位、例えば、開始部位から−１０位と＋１０位の間に由来するオリゴヌクレオチドは、別の特定の例である。三重鎖を形成するアンチセンスは、二本鎖ＤＮＡに結合することができ、それにより遺伝子の転写を阻害することができる。「ＲＮＡｉ」は、遺伝子発現を阻害するための一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ配列の使用である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７（１９９８年）；及びＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６（１９９８年）を参照されたい）。したがって、標的遺伝子コード領域由来の二本鎖ＲＮＡ配列を用いて、本発明の方法及び使用に従って、遺伝子発現／転写を阻害又は防止することができる。アンチセンス及びＲＮＡｉは、哺乳動物及びヒトのＨＴＴをコードする核酸などの標的遺伝子配列（例えば、ＨＴＴ）をコードする核酸に基づいて生成され得る。例えば、一本鎖又は二本鎖の核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ＨＴＴ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とすることができる。
【００５７】
「ｓｉＲＮＡ」とは、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシング又は遺伝子ノックダウンについてのＲＮＡ干渉プロセスに関与する治療用分子を指す。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の同族ｍＲＮＡの配列と相同性を有する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インビトロで合成され得、又はより長いｄｓＲＮＡからのリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生成され得、配列特異的なｍＲＮＡ分解のメディエーターである。本発明のｓｉＲＮＡ又は他のこのような核酸は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成することができる。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として、又は２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給業者には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの子会社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）が挙げられる。標的遺伝子のｍＲＮＡを阻害するための特定のｓｉＲＮＡ構築物は、長さが１５〜５０ヌクレオチド、より典型的には長さが約２０〜３０ヌクレオチドであり得る。このような核酸分子は、当業者に公知である従来の方法を用いて、本明細書に開示されているウイルスベクターに容易に組み込むことができる。
【００５８】
本発明による阻害性核酸配列を使用して標的としてもよい遺伝子（例えば、ゲノムＤＮＡ）又は病原性遺伝子（例えば、ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ）の転写物の特定の非制限的な例としては、限定されないが、ハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子などのポリヌクレオチド反復疾患と関連する病原性遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（例えば、アトロフィン１、ＡＴＮ１）と関連する遺伝子；球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒト  アタキシン−１、−２、−３及びー７、（ＣＡＣＮＡ  ＩＡ）によりコードされたＣａ，２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られているアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ  ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータイソ型、脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおける筋強直性プロテインキナーゼ（ＭＴＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子；アポリポタンパクＢ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染症におけるＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染症におけるＲＳＶヌクレオキャプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）；ｐ５３、急性腎損傷又は腎臓移植後臓器機能障害（ｄｅｌａｙｅｄ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）又は腎臓損傷による急性腎不全；進行性、再発性又は転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、ＬＭＰ２はプロテアソームサブユニットベータ型９（ＰＳＭＢ９）、転移性黒色腫としても知られている；ＬＭＰ７、プロテアソームサブユニットベータ型８（ＰＳＭＢ８）、転移性黒色腫としても知られている；ＭＥＣＬ１、プロテアソームサブユニットベータ型１０（ＰＳＭＢ１０）、転移性黒色腫としても知られている；固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフーリン；肝腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロール１８アシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）若しくは加齢黄斑変性におけるＤＡＮ損傷誘導性転写産物４タンパク質としても知られているＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性症又は脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ  Ｎ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染症におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるＳＡＲＳコロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染症における呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染症におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症におけるＨＳＶゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染症におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシンＡ（ＴＯＲＩＡ）、ｐａｎ−ｃｌａｓｓＩ及び移植において特定のＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的なサイレンシング）；炎症性疾患におけるＩＬ−６、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ、若しくはＣＣＬ２などの前炎症性分子；又は遺伝子常染色体優性遺伝網膜色素変性（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）が挙げられる。
【００５９】
ｒＡＡＶベクター組成物は、上記で定義されているｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び本明細書において定義されている空キャプシドを含むことが好ましい。空キャプシドは、本発明の組成物のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと比較して、同一の血清型又は異なる血清型のものであり得る。空キャプシドは、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと同じ血清型のものであることが好ましい。本発明のｒＡＡＶベクター組成物内で、空キャプシドは、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターのキャプシドと同一の血清型のものであることが好ましく、好ましくはＡＡＶ２又はＡＡＶ５のいずれかである。しかしながら、空キャプシドが、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターのキャプシドと比較して異なる血清型（例えば、限定されないが、ＡＡＶ５血清型のキャプシドを有するｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと組み合わせたＡＡＶ２の空キャプシド、又はその反対のものが挙げられる）を有するｒＡＡＶベクター組成物が本発明によって包含される。さらに、空キャプシドが、限定されないが、ＡＡＶ２キャプシド及びＡＡＶ５キャプシドの混合物などの血清型の混合物を有するｒＡＡＶベクター組成物が包含される。本発明者らは、有意な量の空キャプシドと混合されたｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターの関節内投与後の関節における導入遺伝子発現の増加効果を報告している。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、組成物中に空キャプシド対ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターが少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、５０：１、１００：１又は１０００：１の比で存在することが好ましく、好ましくは少なくとも５：１（すなわち、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターの少なくとも５倍量である空キャプシドの量）である。上記組成物は、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドを、空キャプシド対ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターが最大１００００：１、５０００：１、４０００：１、３０００：１、２０００：１、１０００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１又は５：１の比で含むことが好ましく、好ましくは最大１０００：１の比で含む。上記組成物は、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドを、空キャプシド対ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターが１：１〜１００：１、２：１〜１００：１、５：１〜１００：１、１：１〜２０：１、２：１〜２０：１の間の比で含むことが好ましく、又は好ましくは５：１〜２０：１の間の比で含む。
【００６０】
本明細書中、上記において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドが単一の組成物に存在する実施形態が提供される。また、本発明内に、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドが（少なくとも２つ以上の）別個であり、区別される組成物に存在する代替の実施形態が包含される。ここの代替の実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、時間（例えば、連続して）及び／又は位置において別々に投与され得、ここで、位置は投与部位として理解される。さらに、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、例えば、実質的に同じ時期で、場合により別々の場所で同時に投与することができる。前の実施形態で示したような導入遺伝子及びｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する空キャプシドの比に関する全てのさらなる限定は、この実施形態について繰り返される。
【００６１】
上記で定義されているｒＡＡＶベクター組成物は、免疫抑制剤と組み合わせて使用されることが好ましい。本発明者らは、驚くべきことに、対象が免疫抑制剤とｒＡＡＶ−導入遺伝子の両方で処置された場合、ＡＡＶ導入遺伝子発現における免疫抑制剤の増加効果を見出した。当該技術分野において、グルココルチコイドの効果はＡＡＶ遺伝子発現について試験されているため、この効果は驚くべきことであるが、しかし、結果についてはむしろ失望している。Ｐｆｅｉｆｅｒらは、グルココルチコイド（デキサメタゾン）が肺におけるＡＡＶ９遺伝子発現においていずれの有意な影響も及ぼさなかったことを報告した（Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１年）１８、１０３４−１０４２頁）。Ｍｏｎａｈａｎらは、マウスにおいてＡＡＶ肝臓遺伝子発現が増加しないこと、及び１匹のイヌにおいて遺伝子発現に少しの有意でない増加があったことを報告した（Ｍｏｎａｈａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１０年）１８、１９０７−１９１６頁）。さらに、本発明者らは、ｒＡＡＶ導入遺伝子の発現において、空ベクターを伴う免疫抑制剤の驚くべき相乗効果を発見した。一実施形態において、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクター組成物とは別個に、場所及び／又は時間において別個の意味で別々に適用される。このような実施形態において、免疫抑制剤及びｒＡＡＶベクター組成物は、別個であり、区別される組成物に存在してもよい。免疫抑制剤、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空ベクターは、それぞれ、別個であり、区別される組成物にそれぞれ存在してもよい。別の実施形態において、免疫抑制剤及びｒＡＡＶベクター組成物は、単一の組成物に存在してもよい。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び免疫抑制剤は、単一の組成物に存在し、好ましくは、この組成物は、空キャプシドを含む別個の組成物とともに治療に使用される。なおさらなる実施形態において、免疫抑制剤及び空キャプシドは、単一の組成物に存在し、好ましくは、この組成物は、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターを含む別個の組成物とともに治療に使用される。したがって、本発明はまた、本明細書において定義される空キャプシドと免疫抑制剤を含む組成物、本明細書において定義されるｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと免疫抑制剤を含む組成物、及び本明細書において定義されるｒＡＡＶベクター組成物と免疫抑制剤を含む組成物を提供する。
【００６２】
本発明の免疫抑制剤は、自然免疫細胞阻害剤であることが好ましく、好ましくはマクロファージ阻害剤である。自然免疫細胞は、本明細書において、自然免疫細胞活性及び／又は自然免疫細胞数の減少をもたらす薬剤として定義される。マクロファージ阻害剤は、本明細書において、マクロファージ活性及び／又はマクロファージ数の減少をもたらす薬剤として定義される。本発明の自然免疫細胞又はマクロファージ阻害剤は、処置前の自然免疫細胞又はマクロファージの初期数又は活性と比較して、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％又は好ましくは１００％の自然免疫細胞又はマクロファージの数又は活性の減少をもたらすことが好ましい。自然免疫細胞又はマクロファージ活性及び／又は数は、当業者に公知の任意の適切なアッセイにより検出することができ、例えば、限定されないが、Ｆｅｒｒａｒｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３１（１９９０年）１６５−１７２頁）によって報告されている、インビトロでマクロファージの細胞傷害活性を試験するためのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）比色アッセイによって、サイトカインレベル（例えば、ＣＣＬ２、ＴＮＦ）の測定によって、例えばＣＤ６８標識による組織学的及び組織化学的検出方法によって、又はＹｉ−Ｘｉａｎｇ  Ｊ．Ｗａｎｇ（Ｑｕａｎｔ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ（２０１１年）１：３５−４０頁）によって概説されている、好ましくは超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）の静脈内投与後の、マクロファージによる超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）取り込みのインビボの磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検出によって検出することができる。検出は、インビトロ又はインビボのいずれかであってもよい。インビボでの検出は動物モデルにおいてであることが好ましく、好ましくはラット又はマウスモデルにおいてである。
【００６３】
免疫抑制剤は、グルココルチコイド及び／又はビスホスホネートであることが好ましく、好ましくはリポソームビスホスホネートである。グルココルチコイドの特定の非限定的な例は、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン及びアルドステロンである。免疫抑制剤はトリアムシノロンであることが好ましい。ビスホスホネートの特定の非限定的な例は、エチドロネート、クロドロンテ、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートである。ビスホスホネートは、リポソーム封入ビスホスホネート又はリポソームビスホスホネートであることが好ましく、好ましくはリポソームクロドロネートである。グルココルチコイドはデキサメトゾンではないことが好ましい。本発明の炎症性又はマクロファージ阻害剤は、グルココルチコイド及び／又はビスホスホネートに限定されないことを理解するべきである。例えば、本発明の炎症性又はマクロファージ阻害剤は、抗Ｆ４／８０抗体などの炎症性又はマクロファージ枯渇性抗体であってもよい。このような抗体はヒト抗体又はヒト化抗体であることが好ましい。本発明において使用されるべきさらに関連する免疫抑制剤は、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤及び／若しくはメトトレキセートなどの代謝拮抗物質）、プリン作動性シグナル伝達経路を修飾する薬剤（例えば、メトトレキセート、アデノシン類似体、アデノシン受容体アンタゴニスト若しくはアゴニスト）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ、例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、メロキシカム、ナプロキセン、アセチルサリチル酸）、生物製剤、例えば、ＴＮＦ遮断薬（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ）、ＩＬ−６遮断薬（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ−２遮断薬（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ＩＬ−１β遮断薬（例えば、アナキンラ、リロナセプト、カナキヌマブ）、ムロモナブ、アバタセプト、及び／又はリツキシマブ、並びに／或いは他の化合物、例えば、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、レフルノミド、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、金塩及びペニシラミンである。
【００６４】
ｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空キャプシドを含む組成物及び／又は免疫抑制剤を含む組成物を含む組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／又は賦形剤をさらに含むことが好ましい。このような医薬として許容される担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／又は賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００に見出され得る。
【００６５】
第二の態様において、本発明は、遺伝子治療を含む治療において使用するための第一の態様によるｒＡＡＶベクター組成物を提供する。さらに、本発明は、遺伝子治療用の医薬を調製するための第一の態様によるｒＡＡＶベクター組成物の使用を提供する。また、本発明は、第一の態様によるｒＡＡＶベクター組成物を投与することを含む、遺伝子治療を伴う治療方法を提供する。
【００６６】
上記遺伝子治療は、ｒＡＡＶベクター組成物内に存在する、又は別個の区別される組成物、すなわちｒＡＡＶベクター組成物とは別個の区別される組成物内に含まれる、本明細書において定義される免疫抑制剤の投与をさらに含むことが好ましい。投与時に、本発明のｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空キャプシド及び／又は免疫抑制剤は、個体、該個体の細胞、組織又は臓器、好ましくは本明細書で定義される状態又は疾患に罹患している個体に送達される。ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤は同時に投与されることが好ましい。同時投与は、本明細書において、多かれ少なかれ同時に、好ましくは１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、１２時間又は２４時間よりも長くは時間的に離れずに、好ましくは１５分より長くは時間的に離れずに投与されるものとして理解されなければならない。別の実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤は連続して投与され、ここで、好ましくは免疫抑制剤はｒＡＡＶベクター組成物の前に投与される。免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクター組成物の投与の少なくとも１時間、３時間、１２時間、２４時間、２日、４日又は１週間前に投与されることが好ましい。ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドが別個の組成物中に存在する場合、免疫抑制剤は、同時に、又は空キャプシドの前の少なくとも１５分、１時間、２時間、３時間、１日、２日若しくは１週間以内に投与され得、空キャプシドは、順に、同時に、又はｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターの前の少なくとも１５分、１時間、２時間、３時間、１日、２日又は３日以内に投与される。
【００６７】
本明細書において定義される実施形態において、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクター組成物とともに、反復して、すなわち、その前及び／又はそれと同時に投与されてもよい。本明細書において上記で示したように、ｒＡＡＶベクター組成物は、多量の空キャプシドを含むことが好ましい。さらに、本発明は、本発明の方法又は使用において同時に又は連続して投与することができる、別個の区別される組成物にあるｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターと空キャプシドの両方を投与することを包含する。別々の組成物に含まれる場合、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、好ましくは同時に投与される。さらなる実施形態において、空キャプシドは、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター投与の最大３日、２日、１日、２４時間、１２時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、１５分間又は５分間前に、好ましくは最大２４時間前に投与される。さらに、別々の組成物に含まれる場合、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、好ましくは同じ部位に投与される。
【００６８】
本発明のｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空キャプシド及び／又は免疫抑制剤は、当該技術分野において公知である適切な手段を用いて直接的に又は間接的に投与され得る。本発明の方法及び使用には、全身に、局部的に若しくは局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）に、又はいずれかの経路により、例えば、注射、注入、経口（例えば、摂取若しくは吸入）により、又は局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）（例えば、経皮的に）、ｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空ベクター及び／又は免疫抑制剤を送達及び投与することを含む。例示的な投与及び送達の経路としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、筋肉内、非経口、皮下、胸膜内、局所、皮膚、皮内、経皮、非経口、例えば、経粘膜、頭蓋内、脊髄内、経口（消化器）、粘膜、呼吸、鼻腔内、挿管、肺内注入、肺内点滴、頬側、舌下、血管内、髄腔内、腔内、イオン導入、眼内、眼科的、光学的、腺内、臓器内、胸腔内投与が挙げられる。本発明のｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空キャプシド及び／又は免疫抑制剤を個体又は該個体の細胞、組織、臓器に提供する手段の改良は、これまでに達成された進展を考慮して予想される。このような将来の改良は、当然に、本発明の上述した効果を達成するために組み込むことができる。ｒＡＡＶベクター組成物及び／又は空キャプシド及び／又は本発明の免疫抑制剤を投与する場合、このような組み合わせ及び／又は組成物は、送達方法に適合する溶液中に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内、関節内及び／又は脳室内投与のためには、溶液は生理的食塩溶液であることが好ましい。
【００６９】
ｒＡＡＶベクター組成物は、局所的に、好ましくは自然免疫細胞の実質的な浸潤を含む身体の部位に、又は実質的な量の自然免疫細胞が存在する場所に投与されることが好ましく、ここで、好ましくは上記自然免疫細胞は単球及び／又はマクロファージであり、さらにより好ましくは上記自然免疫細胞はマクロファージである。自然免疫細胞若しくはマクロファージの浸潤又は実質的な量の自然免疫細胞若しくはマクロファージの存在は、当業者に公知である方法によって、例えば、ＣＤ６８標識による組織学的及び組織化学的方法、又は上記で示される静脈内投与後のマクロファージＳＰＩＯ取り込みのＭＲＩ画像を検出することによって、並びに／又はＩＬ−６、ＴＮＦ及び／若しくはＣＣＬ２などのサイトカインを検出する方法によって、評価することができる。身体の特定の部位における実質的な自然免疫細胞又はマクロファージの浸潤は、好ましくは、本明細書において、上記で定義される自然免疫細胞又はマクロファージの浸潤を評価するための方法の検出限界で、類似部位の自然免疫細胞又はマクロファージの数及び／又は活性と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０倍、好ましくは少なくとも２倍の自然免疫細胞又はマクロファージの数及び／又は活性が存在するものとして理解されることが好ましい。身体の特定の部位における実質的な自然免疫細胞又はマクロファージの浸潤は、好ましくは、本明細書において、好ましくは、上記で示されている自然免疫細胞又はマクロファージの浸潤評価方法を用いた場合、治療上の有効用量のトリアムシノロンによる処置後、類似部位の自然免疫細胞又はマクロファージの数と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０倍、好ましくは少なくとも２倍の自然免疫細胞又はマクロファージの数及び／又は活性が存在するものとして理解されることが好ましい。上記治療上の有効用量は、当業者に公知である用量であり、関節の大きさに応じて、例えば、経口的に８〜１６ｍｇ／日、筋肉内に３〜４８ｍｇ、関節内に５〜４０ｍｇであることが好ましい。トリアムシノロンの最大週用量は７５ｍｇである。実質的な自然免疫細胞若しくはマクロファージの浸潤又は実質的な量の自然免疫細胞若しくはマクロファージを含む部位の特定の非限定的な例としては、関節（関節内）、炎症部位、関節炎関節、損傷部位、アテローム性動脈硬化プラーク、腫瘍、特に浸潤性腫瘍、ＣＮＳ（中枢神経系及び／又は脳）、肺、皮膚、眼、腸、肝臓、脾臓及び脂肪組織である。実質的な量の自然免疫細胞を含む組織又は部位は、本明細書において、自然免疫細胞、好ましくはマクロファージが、上記組織又は部位の細胞の総量の少なくとも２％、又は好ましくは少なくとも５％を構成する組織又は部位であるとして理解されることが好ましい。
【００７０】
免疫抑制剤が本発明のｒＡＡＶベクター組成物内に存在する場合において、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクター組成物と同じ部位に、すなわち、好ましくは上記で示される局所的に投与される。免疫抑制剤がｒＡＡＶベクター組成物とは区別される別個の組成物内に含まれる実施形態において、免疫抑制剤は、全身的に、好ましくは筋肉内に又は静脈内に投与され得る。ｒＡＡＶベクター組成物はまた、局所的に、好ましくは本明細書において定義される実質的な数のマクロファージを含む身体の部位に投与することができ、免疫抑制剤は、全身的に、好ましくは筋肉内に又は静脈内に投与される。また、免疫抑制剤及びｒＡＡＶベクター組成物は、区別される組成物に存在するとしても、同じ部位に、好ましくは局所的に、より好ましくは関節内に投与される実施形態が、本発明に包含される。本明細書においてさらに示されるように、このような区別される組成物の投与は、同時に又は連続してもよい。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明の療法は、炎症状態又は炎症性疾患を予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療するためのものである。炎症状態又は疾患は、炎症が検出され得る任意の状態又は疾患であってもよい。炎症は、個体由来のサンプル中のＣ反応性タンパク質及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−８若しくはＣＣＬ２などの炎症性サイトカイン／ケモカインの濃度を評価することによって検出することができる。Ｃ反応性タンパク質及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−８若しくはＣＣＬ２などの炎症性サイトカイン／ケモカインの濃度の評価は、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロッティングを用いてタンパク質レベルで行うことができる。Ｃ反応性タンパク質及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−８若しくはＣＣＬ２などの炎症性サイトカイン／ケモカインの濃度の評価は、ＰＣＲを用いて核酸レベルで行うことができる。これらのアッセイの全ては、当業者に公知である。ＩＬ−６、ＩＬ−８又はＣＣＬ２などの炎症性サイトカイン／ケモカインの存在を評価するためのアッセイは、実験部分に記載されている。検出可能なＣ反応性タンパク質及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−８若しくはＣＣＬ２などの検出可能な炎症性サイトカイン／ケモカインは、このような炎症性疾患又は状態の第一の又は初期のパラメータとして存在し得る。検出可能な、Ｃ反応性タンパク質及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−８若しくはＣＣＬ２などの炎症性サイトカイン／ケモカインは、上記炎症性疾患又は状態の経過中に後で存在し得る。
【００７２】
炎症性疾患又は状態は、ＡＴＰの増加したレベル及び／又はＡＭＰの増加したレベル及び／又はＡＴＰアーゼ活性レベルの低下（又は減少）がサンプル中で又は個体由来の組織中で評価され得る任意の疾患又は状態として定義され得る。炎症性疾患又は状態は、増加したレベルのアデノシンが、このような炎症性疾患又は状態に関連付けられたパラメータ又は症状を緩和することが期待される任意の疾患又は状態として定義され得る。前文で特定された増減は、好ましくは本明細書において説明するように評価される。
【００７３】
炎症状態、疾患又は障害の特定の非限定的な例は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患及び非アルコール性脂肪症である。炎症状態又は疾患は、さらに、限定されないが、疼痛、虚血性障害、緑内障、喘息、関節炎、癌、神経変性障害、慢性障害、急性炎症、血液凝固障害、心不全、血小板機能の障害及び他の障害から選択されてもよく、炎症は、当業者に公知である方法（Ｌｉｂｂｙ、Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ（２０１２年）３２、２０１４５−２０１５１頁；Ｂｅｎｄｉｎｇら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２年）６：３３９−３４６頁；Ｃａｌｌｅ及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ（２０１２年）３：１８３−１９１頁）によって検出することができ、好ましくは、さらに、限定されないが、疼痛、虚血性障害、緑内障、関節炎、癌、神経変性障害、慢性障害、急性炎症、血液凝固障害、心不全、血小板機能の障害及び他の障害から選択され、この場合、炎症は検出され得る。変形性関節症（ＯＡ）が炎症性障害又は非炎症性障害であると考えられるかどうかについては現在議論されているが、変形性関節症は、本発明の方法によって、予防、遅延、治癒、回復及び／又は治療されるべき状態と考えるべきであることに留意されたい。
【００７４】
関節リウマチ（ＲＡ）及び他のタイプの関節炎（ＯＡ、乾癬性関節炎、脊椎関節症（ＳｐＡ）、痛風）の場合において、炎症は、関節及び／又は軟骨及び／又は滑膜組織及び／又は滑膜細胞及び／又は線維芽細胞様滑膜細胞内に起こることが想定される。これらの組織及び／又は細胞型の各々が、炎症に関与し、寄与し及び／又は関連付けられる。したがって、ＲＡ及び他のタイプの関節炎（ＯＡ、乾癬性関節炎、ＳｐＡ、痛風）のために、本発明のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターが、関節及び／又は軟骨及び／又は滑膜組織及び／又は滑膜細胞及び／又は線維芽細胞様滑膜細胞に送達されることが包含される。上記関節、軟骨、滑膜組織及び／又は滑膜細胞及び／又は線維芽細胞様滑膜細胞は、炎症性障害に罹患している個体のものであることが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクター組成物の投与は、局所的又は全身的であり、好ましくは上記で同定された細胞のいずれかのタイプを標的とする。投与は関節内であることがより好ましい。用語「関節内」とは、関節の内部、例えば、膝、肘、肩、足首、手首などを指す。したがって、関節内注射は、関節の骨と骨の間の空間への注射である。膝において、「関節内」とは、膝蓋骨の背部及び周囲を囲む、大腿骨と脛骨との間の空間を指す。
【００７５】
ＩＢＤ及びクローン病に関して、炎症は、主に胃及び腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（腸（ｇｕｔ））で起こる。したがって、ＩＢＤ及びクローン病のために、本発明のｒＡＡＶベクター組成物が胃及び／又は腸に送達され得ることが包含される。上記胃及び／又は腸は、このような炎症性障害に罹患している個体のものであることが好ましい。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクター組成物の投与は、局所的又は全身的である。投与は、局所的又は全身的であり、胃及び／又は腸を標的とすることがより好ましい。
【００７６】
肝炎及び肝疾患に関して、炎症は、主に肝臓で起こる。したがって、肝炎及び肝疾患のために、本発明のｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターが肝臓に送達され得ることが包含される。上記肝臓は、このような炎症性障害に罹患している個体のものであることが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクター組成物の投与は、局所的又は全身的である。投与は局所的又は全身的であり、肝臓を標的とすることがより好ましい。
【００７７】
敗血症に関して、炎症は全身的であり得る。したがって、このような疾患について、本発明のｒＡＡＶベクター組成物の投与は全身的であり、好ましくはこのような患者の肝臓を標的とすることが包含される。
【００７８】
治療効果を達成するためのｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクター用量、例えば、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターゲノム数／ｋｇ体重（ｖｇ／ｋｇ）の用量、又は形質導入単位は、いくつかの因子に基づいて変化し、これらの因子には、限定されないが、投与経路、治療効果の達成に必要とされる導入遺伝子発現のレベル、治療される特定の疾患、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターに対する宿主免疫応答、導入遺伝子又は発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、及び発現されるタンパク質の安定性が含まれる。当業者は、上記の因子、並びに他の因子に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するために、ｒＡＡＶ−導入遺伝子ベクターの用量範囲を容易に決定することができる。一般的に、用量は、治療効果を達成するために、少なくとも１×１０６、１×１０７、１×１０８、又はそれ以上、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３又は１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、若しくはそれ以上のベクターゲノム数／個体のｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）体重の範囲である。
【００７９】
免疫抑制剤の用量は、免疫抑制剤のタイプに依存する。効果的な投薬量は、当業者に公知である。トリアムシノロンの好ましい治療上の有効用量は上記で示されている。リポソームクロドロネートの好ましい治療上の有効用量は、好ましくは、当業者に公知である治療上の有効用量、例えば、好ましくは関節内に８０〜３２０ｍｇ／用量、より好ましくは関節内に１６０ｍｇ／用量である（Ｂａｒｒｅｒａら、２０００年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、Ｖｏｌ  ４３（９）、１９５１−１９５９頁）。
【００８０】
より好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶ組成物及び本発明の免疫抑制剤は、別個の区別される組成物の組み合わせとして又は単一組成物に含まれるものとして、処置された患者からの１つ以上の症状（単数若しくは複数）を緩和することができ、及び／又は処置された患者由来の細胞若しくは組織の１つ以上の特徴（単数若しくは複数）又はパラメータ（単数若しくは複数）は、本発明の組み合わせ又は組成物を用いて改善される。例えば、各炎症性疾患について、当業者は、該疾患と関連した、少なくとも１つの症状、パラメータ又は特徴、上記パラメータ又は特徴の値、及びそれらの各々を評価する方法を知っている。以下、本発明者らは、関節リウマチに特異的なパラメータを示す。関節リウマチは、好ましくは、個体におけるいくつかのパラメータ及び症状の測定値を含む、疾患活動性スコア（ＤＡＳ）又は関連ＤＡＳ２８（ｖａｎ  Ｒｉｅｌ、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００１年）１５：６７−７６頁）の指標を評価した後に診断される疾患である。上記指標の評価は、個体を診察する臨床医によって行うことができる。より好ましい実施形態において、本発明の組み合わせ又は組成物は、処置された患者からの１つ以上の症状（単数若しくは複数）を緩和することができ、及び／又は処置された患者由来の細胞又は組織の１つ以上の特徴（単数若しくは複数）又はパラメータ（単数若しくは複数）は、本発明の組み合わせ又は組成物がＤＡＳ又はＤＡＳ２８の有意な変化を誘発することができる場合、本発明の組み合わせ又は組成物を用いて改善される。また、関節リウマチを評価する他の方法もが報告されている（ｖａｎ  Ｒｉｅｌ、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００１年）１５：６７−７６頁；Ｇｅｓｔｅｒ  Ａ．Ｍ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９年）１３：６２９−６４４頁）。本発明の組み合わせ又は組成物を含む医薬は、本発明の組み合わせ及び／又は組成物を使用して、少なくとも１週間、１カ月、６カ月、１年又はそれ以上の治療後に、上記パラメータの値が、治療開始前の上記パラメータの値と比較して、少なくとも１％、２％、５％、１０％又はそれ以上改善されていた場合に、１つのパラメータを改善することができる。本発明の組み合わせ又は組成物を含む医薬は、本発明の組み合わせ及び／又は組成物を使用して、少なくとも１週間、１カ月、６カ月、１年又はそれ以上の治療後に、患者又は該患者の細胞、組織若しくは臓器の症状又は特徴がもはや検出不可能である場合、１つの該症状又は１つの該特徴を緩和することができる。
【００８１】
本発明は、ヒトと獣医学の両方の医療用途において有用である。適切な個体には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用するとき、限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト個体が最も好ましい。ヒト個体には、胎児、新生児、乳児、若年者及び成人の個体が含まれる。最も好ましいのは、本明細書中に示されるいずれかの種類の疾患又は状態を患っているヒト個体である。
【００８２】
第三の態様において、本発明は、第一の態様によるｒＡＡＶベクター組成物と第一の態様において定義される免疫抑制剤を含むキットオブパーツを提供する。キットオブパーツは、ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤のための投薬計画のための使用説明書をさらに含むことが好ましい。これらの使用説明書は、好ましくは、望ましい効果を達成するための投薬形態の使用、及び好ましくは本明細書における第二の態様において特定される、特定の期間にわたって摂取される投薬形態の量を指示する。製剤は、当業者に公知である方法によって、単位投薬形態で都合よく提供され得る。ｒＡＡＶベクター組成物及び免疫抑制剤は、単回投与（又はその倍数）のための関連する投薬計画に対応する量で別々の単位（又はその倍数）でそれぞれ包装されることが好ましい。パッケージは、任意の適切な形態、例えば、バイアル、アンプル又は注射ペン用のカートリッジであってもよい。上記キットオブパーツは、本明細書において定義されている遺伝子治療を含む治療において使用するためのものであることが好ましい。
【００８３】
本明細書に引用されている全ての特許及び文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において特定される各々の実施形態は、他に指示がない限り、互いに組み合わせることができる。
【表１】
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【実施例】
【００８４】
方法
ベクター生成と空キャプシド
以前に報告されているように、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有するホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｒＡＡＶ５−導入遺伝子ベクター（実施例１〜７）又はｒＡＡＶ２−遺伝子導入ベクター（実施例８）（ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ；Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を生成した［Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９８年：５；９３８］。簡単に言うと、プラスミドは、ＣＭＶプロモーター及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下でＦｌｕｃ遺伝子をコードする。導入遺伝子カセットは、その両端にＡＡＶ−２逆方向末端反復が隣接し、ＡＡＶ５からのキャプシドにパッケージングされている［Ｇａｏ  ＧＰら；ＰＮＡＳ  ２００２年；１１８５４］。ゲノム含有ベクター及び空ＡＡＶキャプシド粒子は、クロマトグラフィー及び塩化セシウム密度勾配遠心分離を組み合わせて精製された［Ａｙｕｓｏ  Ｅ、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０年：１７；５０３］。ベクター力価はｑＰＣＲにより決定され、ベクターゲノム数／ｍｌ（ｖｇ／ｍｌ）として表された。
【００８５】
マウスにおけるインビボでのイメージング実験
関節内ｒＡＡＶ５発現は、５匹の動物実験において雄性ＤＢＡマウス（８〜１２週齢；Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｈｏｒｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において調べられた。マウスは、両膝関節（足関節の注射の有無にかかわらず）にｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃが注射され、ルシフェラーゼ発現について（５日間から最大６カ月まで）定期的にモニターされた。関節炎のない動物については、ベクターは１日目に投与され、関節炎の動物においては、ベクターは、免疫付与後の１７日目又は２４日目に、疾患の発症時に注射された。動物は、膝関節あたり１．２６ｅ１０〜１．５ｅ１０ｖｇの間で（５μｌの容量で）、及び足関節あたり０．７５ｅ１０ｖｇで（２．５μｌ／容量で）受けた。空キャプシドは、５：１又は２０：１の比（ゲノム含有ベクターに対する空キャプシドとして表される比）で、いくつかの群において、ゲノムを含む粒子と同時に投与された。群は５〜１８匹の動物からなっていた。
【００８６】
コラーゲン誘発性関節炎
コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は、ＣＦＡ（鉱油及び熱で死滅させた結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の２ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）で１：１に希釈した１００μｌのＩＩ型コラーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）を皮内注射することによって誘発させた。２１日目に、１００μｌのＮａＣｌに溶解させた１００μｇのＩＩ型コラーゲンを含有するブースター注射を腹腔内投与した。
【００８７】
関節炎活性を半定量的スコアリングシステムで１８日目から３週間毎にスコア化し、各マウスの足を別々に分析した（０−正常；１−１つの関節の腫脹及び／又は紅斑；２−複数の関節の腫脹；３−全ての関節の腫脹；４−足全体の腫脹及び以下の症状のうちの少なくとも１つ：強直、機能喪失）。
【００８８】
空気嚢滑膜炎（ＡＰＳＩ）モデル
空気嚢は、以前に報告されているように形成された（Ｏ’Ｂｏｙｌｅら（２００９年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２３（１１）：３９０６〜３９１６頁）。簡単に言うと、３ｍｌの空気を各動物の背中に皮下注射した。空気嚢は、必要に応じて空気を再注入することによって膨張状態とした。ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクター（３．１６ｅ１１ｖｇ）を空気嚢形成後の０日目、１１日目又は１８日目に１ｍｌ容量の嚢に投与した。トリアムシノロンで処置された動物に関して、トリアムシノロンは、１１日目のベクター投与の２日前に筋内注射により投与（５ｍｇ／ｋｇ）された。３０日目に、マウスを屠殺し、空気嚢膜を取り出し、急速冷凍した。凍結された空気嚢組織を受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）でホモジナイズし、標準ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりルシフェラーゼを測定した。
【００８９】
マクロファージ阻害
ベクター投与の２日前に、ＲＡ患者における使用と同様にトリアムシノロンを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。ＲＡ患者は、トリアムシノロンを体重１ｋｇあたり０．４〜１．０ｍｇの用量で受ける。マウスのより速い代謝速度を考慮に入れて（因子１２．５）、５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を使用し、５０μｌの容量で投与した。対照群は、５０μｌのＮａＣｌの筋内注射を受けた。第四の実験において、筋内トリアムシノロンは、（５μｌの容量に）匹敵する容量で、ベクター投与の２日前に関節内（ｉ．ａ．）投与と比較された。対照群は、５μｌのＮａＣｌの関節内注射を受けた。
【００９０】
ルシフェラーゼ発現の画像化
ルシフェラーゼ発現は、異なる実験において３日目から６カ月目まで、ベクター投与後の異なる時点で測定された。Ｄ−ルシフェリンカリウム塩基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を腹腔内（１５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２００μｌの容量で）注射した。冷却した電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラシステム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、基質投与の１０分後、５分間、光子計数を獲得した。各々の光子計数セッションの直後に光表面画像を得、動物の解剖学的図を与えた。画像処理並びにシグナル強度の定量化及び分析は、Ｍ３  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ）を用いて行われた。画像は、グレースケールの解剖学的な白色光画像に重ね合わされた擬似色の光子計数画像として表示され、生物発光強度と解剖学的光源の両方の評価を可能にした。関心領域（ＲＯＩ）は、膝関節領域上の楕円ＲＯＩを描くことによって画定された。ＲＯＩの表面積を一定に保った。ステラジアンあたり１平方センチメートルあたり１秒あたり放出された光子の数をルシフェラーゼ活性の尺度として計算した。
【００９１】
一般的な動物の条件と倫理陳述
免疫化、関節内注射及びインビボ画像化は、イソフルラン麻酔（３％イソフルラン及び酸素）下で行われた。実験の最後に、動物は、イソフルラン麻酔下で心臓穿刺により屠殺され、続いて、頚部脱臼を行い、その後、後肢、血液、リンパ節及び脾臓を回収した。研究は、アムステルダム大学（アムステルダム、オランダ；許可番号：ＡＲＴ  １０２８８１、ＡＲＴ  １０２６５６、ＡＲＴ  １０２７９３、ＡＲＴ  １０２９４８及びＡＲＴ  １０３０２１）の動物保護及び使用委員会によって審査され承認され、動物福祉に関するオランダ法の指示に厳密に従って行われた（Ｗｅｔ  ｏｐ  Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ）。動物は、アムステルダム大学の動物施設において、病原体のない条件下で維持された。
【００９２】
フローサイトメトリー
脾臓及び滑膜中のマクロファージをフローサイトメトリーによって分析した。簡単に言うと、滑膜細胞は、関節から細胞を掻き取り、続いて、リベラーゼ／ＤＮａｓｅで３０分間、３７℃で消化することにより抽出された。次に、細胞を洗浄し（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）、細胞ストレーナーに通した。滑膜細胞を遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間、４℃）し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）に再懸濁した。滑膜中の細胞数が少ないため、各群の全ての動物をプールした。脾臓細胞を機械的破砕により単離し、細胞を細胞ストレーナーを通して洗い流した。赤血球を、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、続いて氷上で１０分間インキュベートすることにより溶解した。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞（プールされた滑膜又は脾細胞（１ｅ６細胞）を５％正常マウス血清（Ｓａｎｑｕｉｎ）でブロックし、Ｆ４／８０−ＡＰＣ及びＣＤ６８−ＦＩＴＣ標識抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。データをＢＤ  Ｃａｎｔｏ２で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ  ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ  ＯＲ）を用いて分析した。
【００９３】
統計分析
縦断的分析（利用可能な全ての縦断的データを含み、不均衡な数の反復測定を可能にする）を可能にするために、一般化推定方程式（ＧＥＥ）を用いて経時的な発光を調べた（Ｔｗｉｓｋ（２００４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９（８）：７６９〜７７６頁）。他の全ての統計値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｊａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析された。全ての試験について、ｐ値が０．０５未満の差を有意と考慮した。
【００９４】
実施例１
炎症は関節内のｒＡＡＶ５導入遺伝子発現に影響を及ぼす
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）は、ＲＡ患者の炎症関節において有意に増加することが知られている（Ｂａｒｔｏｋ及びＦｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、２０１０年）。これはまた、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルを含むＲＡのマウスモデルにあてはまる。ＦＬＳは関節におけるＡＡＶ５の主要標的細胞であるため、本発明者らは、ＣＩＡモデルにおける炎症の発症後のｒＡＡＶ５−導入遺伝子ベクターの投与が、より多数の形質導入されたＦＬＳに起因して、より高い発現を導くと仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは、関節炎発症の前（１７日目）又は後（２４日目）にＣＩＡのマウスにホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ）をコードするｒＡＡＶ５導入遺伝子ベクターを関節内的に投与した。驚くべきことに、この実験は、炎症の発症（２４日目）後のｒＡＡＶ５−導入遺伝子ベクターの投与が、炎症の発症前（１７日目）のベクター投与と比較して、関節あたりの低発現、並びに導入遺伝子を発現する関節の低い割合をもたらすことを示した（図１）。
【００９５】
実施例２
免疫抑制剤はｒＡＡＶ５導入遺伝子発現を改善する
炎症関節の動物における発現の減少についての説明は、標的細胞を形質導入することができる前のベクターの分解又は中和であり得る。炎症中に、ＦＬＳの数の増加だけでなく、マクロファージの数及び活性化の増加もあり、したがって、本発明者らは、発現の減少が、（例えば、食作用又は可溶性因子（補体）によるオプソニン化を通じて）マクロファージによるベクターの中和によるものであり得るものと仮定した。この可能性を調べるために、本発明者らは、マクロファージの活性／数に影響を及ぼす薬剤の投与がｒＡＡＶ５導入遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを研究した。グルココルチコステロイドであるトリアムシノロンは、マクロファージの活性化及び増殖を阻害することによって作用する［Ｆａｕｃｉ  ＡＳ、Ｄａｌｅ  ＤＣ、Ｂａｌｏｗ  ＪＥ；Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９７６年；８４；３０４〜１５頁］。これは、例えば、ＲＡ患者の関節における急性炎症を治療するために、ヒトにおいて一般的に使用される薬理作用のある薬剤である。グルココルチコステロイドの全身投与はまた、ＲＡ患者の滑膜組織におけるマクロファージの数及び活性を減少させることによって局所効果を発揮することが知られている［Ｇｅｒｌａｇ  ＤＭら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４年；５０（１２）：３７８３頁］。マクロファージを枯渇させるために使用される第二の薬剤は、クロドロン酸含有リポソームであった［ｖａｎ  Ｒｏｉｊｅｎ及びＨｅｎｄｒｉｋｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（６０５）１８９〜２０３頁、２０１０年］。２つの薬剤は、ベクター投与の４８時間前に別々の群で投与された。
【００９６】
トリアムシノロンとリポソームクロドロネートの両方は、４週間にわたってｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃ発現を改善し、マクロファージの枯渇又は阻害のいずれかが遺伝子発現の増加をもたらすことを示した（図２ａ）。
【００９７】
本発明者らは、マクロファージベクター中和を回避する別の方法が、ベクター投与に空キャプシド粒子を添加することであると仮定した。これらの空キャプシドは、ゲノム含有ベクターの分解を防ぐためのデコイとして作用し、したがって、完全なウイルス粒子が標的細胞に到達し得る機会を高めることができた。空（ＡＡＶ５）キャプシドが完全なゲノム含有キャプシドに５：１の比（空対完全）で添加されると、発現が有意に改善された（図２ｂ）。これらのデータは、ベクターがマクロファージによって中和されるという本発明者らの仮説を支持した。また、３つの全ての群において、陽性関節の割合の増加が見られた（図２ｃ）。
【００９８】
トリアムシノロンが抗炎症剤であるため、関節炎活性を入念に監視した。トリアムシノロンで処置されたマウスは、関節炎活性の減少傾向を示した（図２ｄ）。
【００９９】
実施例３
トリアムシノロン及びデコイキャプシドはｒＡＡＶ５導入遺伝子発現において相乗効果を有する
次に、本発明者らは、改善された発現の持続期間を評価するための長期フォローアップ研究を行った。この研究は、薬理学的阻害と空キャプシドデコイとの組み合わせが、遺伝子発現の相乗的増強をもたらすことを示した。その抗炎症効果のために期待されるように、関節炎活性は、トリアムシノロンで処置した群では４週目まで低下した（図３ａ）。長期の関節炎活性は群間で同等であった。ルシフェラーゼ発現を６カ月間にわたって経時的にモニターし、１カ月までの最初の増加以降は安定した状態であった（図３ｂ）。トリアムシノロン及び／又は空キャプシドの添加の効果は、一般化推定方程式（ＧＥＥ）を用いて縦断的に分析され、全ての利用可能な縦断的データを含むことを本発明者らに可能にし、不均衡な数の反復測定を可能にした。両方の化合物を添加した場合、発光の有意な増加が観察された（比５．８５；ｐ＝０．００１）（図３ｃ）。これとは別に、化合物は発現の増加傾向を示した（有意ではない）。これは、トリアムシノロンと空キャプシドとの組み合わせが遺伝子発現の増加において相乗効果を有することを示す。
【０１００】
同様のレベルの発現が、健常対関節炎マウスにおいて観察された（データは示されていない）。技術的な問題のために、ＩＶＩＳデータは、８週間の時点では入手できなかった。人為的エンドポイントに達したため、実験終了前に計１５匹の動物（１群あたり２〜４匹）を屠殺した。
【０１０１】
トリアムシノロンの関節内投与がＲＡ患者のケアの標準であるため、本発明者らは、トリアムシノロン投与の経路（全身対局所）が有効性に何らかの効果を有するかどうかを決定しようとした。これを調べるために、マウス（ｎ＝１８）は、空キャプシド：ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクターの比が５：１でｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクターと空キャプシドの組成物を関節内（ｉ．ａ．）投与する２日前に、トリアムシノロンを局所的に（ｉ．ａ．）（若しくは対照として生理食塩水）又は全身に（筋内（ｉ．ｍ．）投与された。図４に見られるように、トリアムシノロンによる動物の前処置は、遺伝子発現の増強をもたらした。これは、トリアムシノロンを全身投与（ｉ．ｍ．）又は局所投与（ｉ．ａ．）したかにかかわらず当てはまり、トリアムシノロンの投与経路が有効性にとって重要な因子ではないことを示した。
【０１０２】
実施例４
トリアムシノロンは脾臓対滑膜におけるマクロファージに異なる効果を有する
導入遺伝子発現におけるトリアムシノロンの効果の背後にある作用機序をさらに調べることを目的として、マクロファージ及び他の細胞型の数及び活性における影響を評価するために、滑膜組織及び脾臓細胞についてエクスビボ分析を行った。異なる組織の細胞集団が、トリアムシノロン投与の４８時間後にＦＡＣＳ分析によってトリアムシノロン処置動物とＮａＣｌ処置動物との間で比較された。
【０１０３】
顕著には、脾臓におけるマクロファージ（ＣＤ６８＋、Ｆ４−８０＋）の相対的な割合は、（生理食塩水と比較して）トリアムシノロンで処置された動物と類似した状態であったが（図５ａ）、一方で、脾臓の絶対量は、トリアムシノロン処置後（４倍）、２５日目で減少し（ｐ＝０．００１１）（図５ｃ及びｄ）、２９日目まで差が減少した。脾臓とは対照的に、滑膜中のマクロファージの割合は、トリアムシノロン処置後に減少した（図５ｂ）。滑膜から抽出することができる細胞の数が少ないことを考慮すると、本発明者らは、十分な細胞数を得るために、群の全ての動物をプールしなければならなかったことに留意されたい。
【０１０４】
実施例５
ＡＡＶ空キャプシドは炎症及び既存の体液性免疫の不存在下で導入遺伝子の発現を改善する
以前の実験は全て、動物がベクター投与の時点で関節において有意な炎症を経験したＣＩＡモデルで行われた。次に、本発明者らは、ルシフェラーゼ発現の増強が健康な関節においても見られ得るかどうかを調べることにした。
【０１０５】
空キャプシドを２つの異なる比、すなわち空キャプシド対ｒＡＡＶ５．ＣＭＶ．Ｆｌｕｃベクターの比が５：１及び２０：１であるゲノム含有粒子にそれぞれ添加したとき、本発明者らは、発光の用量依存的増加を観察した（図６）。注入ルシフェラーゼ後の３日目から、空キャプシドをゲノム含有ベクターに用量依存的に添加した後に発現が増加した（図６）。この増加は、完全キャプシドに対して５：１の比で空キャプシドを注射した動物において平均して４．８倍であった（ｐ＜０．０１）。２０：１の比（空対完全）は２０倍まで発現を改善した（Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
実施例６
マクロファージの回避／阻害は空気嚢滑膜炎（ＡＰＳＩ）モデルにおける発現を可能にする
空気嚢滑膜炎（ＡＰＳＩ）モデルは、マウスにおいてヒト滑膜をモデル化する方法として最初に開発された。それは、マウスの背中の皮膚の下に空気を注入することを伴う。６〜７日後、裏打ち膜がこの空気嚢の周囲に形成する。この裏打ちは、主に線維芽細胞様の細胞及びマクロファージからなる関節腔の周囲に形成する滑膜裏打ちに非常に類似している。ＡＡＶ発現ルシフェラーゼを７日目（空気嚢の裏打ちの形成後）に空気嚢に投与した場合、高ベクター用量でさえ、本発明者らはいかなる発現も観察しなかった（データを示していない）。本発明者らは、おそらく空気嚢膜を裏打ちしているマクロファージがベクターの形質導入を阻害していると仮定した（関節内注射したベクターで観察されたものと同様である）。本発明者らは、ａ）ベクター投与の２日前にトリアムシノロンを投与するか、又はｂ）空気嚢裏打ち内にマクロファージが浸潤する前にベクターを０日目に投与するかのいずれかによってこの仮説を試験した。図７に見られるように、ルシフェラーゼ発現は、マクロファージが阻害された（例えば、トリアムシノロン）又は回避された（０日目で投与）場合にのみ観察された。これらのデータは、マクロファージがＡＡＶ形質導入に有害であり、マクロファージによるＡＡＶ中和を回避／阻害するための戦略が望まれるという仮説をさらに支持する。
【０１０７】
実施例７
空キャプシドとトリアムシノロンとの組み合わせが関節内のＡＡＶ５遺伝子発現を増強する
本発明者らは、空デコイキャプシドとトリアムシノロンとの組み合わせが、ＣＩＡのマウスの炎症関節における遺伝子発現を増加させるのに有効であることを示し（実施例３）、本発明者らは、空キャプシドだけが健康な関節における関節内の遺伝子発現を増加させることを示したので（実施例５）、本発明者らは、空デコイキャプシドとトリアムシノロンとの組み合わせが炎症の非存在下（健康な関節）でも遺伝子発現を増強するかどうかを調べようとした。これを決定するために、マウス群（ｎ＝１８）は、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（対照）をｉ．ｍ．投与（全量５０μＬ）により投与された。次に、群は、両膝内への関節内注射により（５μＬ全量）、ＡＡＶ５−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）又はＡＡＶ５−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ＋空ＡＡＶ５キャプシド（空：完全比＝５：１）を投与された。ルシフェラーゼ発現は、生きている動物のＩＶＩＳ画像化によってモニターされた。図８に見られるように、空デコイキャプシドとトリアムシノロンの両方で処置された動物は、ベクター単独の動物と比較して遺伝子発現の増加を示した。空キャプシドとトリアムシノロンとの組み合わせは、炎症（ＣＩＡ）関節において観察されたものと同様に、遺伝子発現レベルで最も高い増加を生じさせた。これらのデータは、トリアムシノロンと空キャプシドとの組み合わせが、罹患した関節における発現を増加させるために効果的であるだけでなく、健康な関節における発現も増加させ得ることを示す。これらの結果は、滑膜裏打ち（健康な関節でさえ）中の多数のマクロファージがＡＡＶ媒介性の発現を阻害し、デコイキャプシド粒子を添加すること及び／又はマクロファージ活性を阻害することがこの阻害を克服し、遺伝子発現を増加させるという仮説を支持する。
【０１０８】
実施例８
空キャプシドとトリアムシノロンとの組み合わせがＡＡＶ５に特異的ではなく、他の血清型からの関節内遺伝子発現を増強する
これまでの本発明者らの研究は、ＡＡＶ５の血清型が関節に対して優れた指向性を有するため、ＡＡＶ５に焦点をあててきたが、しかし、ＡＡＶのマクロファージ中和は血清型特異的ではないと仮説を立てている。これは、マクロファージによるＡＡＶの更新が、スカベンジャー受容体を利用する一般的な現象であるからであり、したがって、マクロファージが広範なウイルス及び細菌を摂取することが知られているため、いずれか１つの血清型又はいずれかのウイルス型に限定されるべきではないからである。この仮説を試験するために、本発明者らは、トリアムシノロン及び空キャプシドが、ＡＡＶ５とは非常に異なる血清型であって、ＡＡＶ２である血清型からの遺伝子発現を増強できるかどうかを評価する実験を行った。ＡＡＶ５及びＡＡＶ２は、アミノ酸レベルで５７％の相同性しか持たず（図１０参照）、それらは、公知のＡＡＶの最も多様な血清型のうちの２つである。これを決定するために、実施例７と同一の実験を行ったが、しかし、ＡＡＶ５を使用する代わりに、本発明者らはＡＡＶ２ベクターを使用した。マウス群（ｎ＝１８）は、トリアムシノロン（５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（対照）をｉ．ｍ．投与（５０μＬ全量）により投与された。次に、群は、両膝内への関節内注射により（５μＬ全量）、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ（１．２６ｅ１０ｖｇ／関節）又はＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ＋空ＡＡＶ５キャプシド（空：完全比＝５：１）を投与された。ルシフェラーゼ発現は、生きている動物のＩＶＩＳ画像化によってモニターされた。図９に見られるように、ＡＡＶ５で見られた結果と同様に、空デコイキャプシドとトリアムシノロンの両方で処置された動物は、ＡＡＶ２投与後のベクター単独の動物と比較して遺伝子発現の増加を示した。空キャプシドとトリアムシノロンの組み合わせは、ＡＡＶ５処置された動物で観察されたものと同様に、遺伝子発現レベルの最も高い増加を生じさせた。これらのデータは、トリアムシノロンと空キャプシドとの組み合わせが、ＡＡＶ５による発現を増加させるために効果的であるだけでなく、ＡＡＶ２などの他の多様な血清型に対して効果的であることを示す。したがって、マクロファージ阻害による遺伝子発現の増強は、ＡＡＶ５に限定されず、全てのＡＡＶ血清型に適用可能であることは明らかである。
【０１０９】
空ＡＡＶ２及びＡＡＶ５キャプシドはともに遺伝子発現を増加させることができたことを考慮すると、この発現の増強は具体的なキャプシド血清型に特異的ではないと理解される。したがって、本発明者らは、空キャプシドの血清型は、完全ゲノム含有ベクターと同じ血清型である必要はなく、空キャプシド血清型（天然又は突然変異）は、他の任意のＡＡＶベクター血清型（天然又は突然変異）からの関節内発現を増強することができなければならないと結論を下す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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