(57)【要約】  本発明は、必要とするヒト患者における座瘡治療の新規な方法であって、前記患者に有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン（化合物１）またはその薬学上許容可能な塩を局所的に投与することを含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする患者において座瘡を治療する方法であって、前記患者に局所的に有効な量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２】
座瘡が体幹座瘡である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
座瘡病巣が顔面および頭皮を侵している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が前記患者の患部に１日１回投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が前記患者の患部に１日２回投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が０．５％〜５％ｗ／ｗの範囲の濃度で局所的に適用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が０．５％〜２％ｗ／ｗの範囲の濃度で局所的に適用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が０．５％ｗ／ｗ、１％ｗ／ｗ、または２％ｗ／ｗで局所的に適用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、座瘡の治療のための有効量の治療薬と併用投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第２の治療薬の併用投与が、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と、同時点で一緒に、逐次または同時期である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩が、第２の治療薬と交互の時間に、例えば、一方が朝に、他方が晩に、投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
必要とするヒトにおいてＩＬ−１７Ａの生産を抑制する方法であって、前記ヒトに有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を局所的に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１４】
必要とするヒトにおいて誘導アポトーシスを介してケラチノサイトの過剰増殖を抑制する方法であって、前記ヒトに有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を局所的に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
必要とするヒトにおいてケラチノサイトの細胞死を促進する方法であって、前記ヒトに有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を局所的に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１６】
座瘡の局所的治療において使用するための、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン、またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において使用するための、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン、またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項１８】
必要とする患者において座瘡を治療する方法であって、前記患者に局所的に有効な量の３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩、および薬学上許容可能な担体または希釈剤を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において使用するための医薬組成物であって、局所的に有効な量の３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と、薬学上許容可能な担体または希釈剤とを含んでなる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尋常性座瘡の治療のためのスチルベン誘導体の新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
尋常性座瘡（または単に座瘡）は、世界で推定６億５０００万人、または集団の９．４％を侵している一般的な皮膚病態である(Vos et al. Lancet, 380(9859):2163-2196, 2012)。この病態は、脂漏、面皰、丘疹、結節、吹き出物、および場合によっては瘢痕を伴う皮膚領域を特徴とし、しばしば青年期に見られるが、多くはさらに成人まで持続し得る(James. N Engl J Med, 352(14):1463-1472, 2005)。
【０００３】
青年期は、社会的に極めて不安定な時期であり、座瘡の存在およびそれに由来する瘢痕はしばしば自尊心の低下、鬱病、または極端な場合には自殺などの心理的問題を招く(Goodman. Aust Fam Physician, 35(7):503-504, 2006; Purvis et al. J Paediatr Child Health, 42(12):793-796, 2006)。
【０００４】
グラム陽性菌プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)（Ｐ．アクネス）に対する免疫反応は、患者における急性炎症性応答の誘導に主要な役割を果たすことに関連付けられている(De Young et al. J Invest Dermatol, 83(5):394-398, 1984; Jappe et al. Br J Derm. 146(2):202-209, 2002)。座瘡治療は、皮脂細胞による皮脂生産の低下、細胞のターンオーバー加速化、細菌感染に対する対抗、炎症の軽減、またはこれらの戦略のいくつかの組合せによって機能する。座瘡の治療は、長期的である傾向があり、レチノイド、過酸化ベンゾイル、および抗菌薬、特に、経口テトラサイクリンおよび局所用クリンダマイシンの使用を主として中心とする。これらの治療に対するＰ．アクネスの耐性率の上昇に加え、最近、座瘡治療の主要な標的としての、ほとんどの健康なヒト皮膚に見られる共生細菌Ｐ．アクネスの根絶の有用性が疑問視されており、代わりに、この細菌に対する炎症性応答の治療に基づくモデルが考えられている(Agak et al. J Invest Dermatol, 2013)。炎症は、臨床的には炎症を起こした丘疹および濃胞の存在で、および組織学的には開放面皰における細胞浸潤物の存在により座瘡の後期に関連付けられる(Tanghetti, E.A. J. Clin. and Aesthetic Derm. 6(9):27-35, 2013)。ここ１０年で、新たな所見が、初期座瘡の病因の一部としての炎症機構の関与(Norris, J.F. and et al. Br. J. Dermatol. 118:651-659, 1988)および座瘡が炎症性疾患と見なされるべきことが先進的な見方であること(Stein, L.F. and et al. J. Drugs Dermatol. Suppl 6:s67-s69, 2013)を実証した。事実として、皮膚は免疫学的に活性な器官である。毛包脂腺単位の主要な構成成分である毛包ケラチノサイトおよび皮脂細胞は、Ｐ．アクネスを認識することによって自然免疫系を活性化させる。毛包間および毛漏斗ヒトケラチノサイトおよび皮脂細胞の両方は、それらが自然免疫におけるこれらの細胞の役割と一致して機能的Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２、ＴＬＲ４およびＣＤ１４を発現することから、Ｐ．アクネスの存在を感知することができる(Song, P.I. et al. J. Invest Dermatol. 119:424-432, 2002; Selway, J.L. et al. BMC Dermatol. 13:10, 2013; Nagy et al. Microbes and Infection, 8:2195-2205, 2006)。実際に、グラム陽性細菌Ｐ．アクネスは、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびリポテイコ酸（ＬＴＡ）などの病原体関連分子パターン(pathogen associated molecular patterns)（ＰＡＭＰ）によるＴＬＲ２の活性化を介して初期および後期座瘡病巣において免疫系を惹起し得る。事実として、ＩＬ−１ａはＴＬＲ２の活性化に応答してケラチノサイトにより放出される。同様に、ＰＧＮおよびＬＴＡは、座瘡病巣に特徴的なケラチノサイトの角化亢進を招く。また、Ｐ．アクネスは、ヒト単球においてＴｈ１および炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−８、およびＩＬ−１ｂ）の分泌を誘発することも示されており、このことは、Ｐ．アクネスが毛包脂腺嚢を取り囲む組織マクロファージを活性化し得ることを示唆する(Sugisaki, H. et al. J. Dermatol. Sci.  55(1):47-52, 2009; Kim, J. Dermatology. 211(3):193-198, 2005)。最後に、最近の研究では、Ｐ．アクネスがＩＬ−１７Ａ、ＲＯＲα、ＲＯＲγ、ＩＬ−１７ＲＡを含むＴｈ１７関連遺伝子の発現を刺激し、ＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ−１７の分泌を惹起したことが示されている(Agak et al. J Invest Dermatol, Feb 2014 134(2): 366-73)。従っ���、炎症は初期および後期座瘡病巣の両方に存在していることから、抗炎症療法はどの病因論的因子が座瘡病巣の誘発または維持に関与しているかにかかわらず、座瘡病巣を清浄化し得ると提案される。
【０００５】
市販の純粋に抗炎症性の化合物の有用性は、コルチコステロイド、およびレチノイドおよびビタミンＤ類似体の長期使用に関する安全懸念のために制限されている。加えて、抗炎症治療は、皮脂生産、細菌集団、および皮膚ターンオーバーに他の効果も持ち得る。
【０００６】
よって、座瘡治療において使用するためのより安全かつより有効な療法の必要がなお存在する。安全、有効、かつ、現行の抗炎症治療と同じ安全懸念を持たない新規な経路による抗炎症性の治療は、座瘡治療計画に対する発明的追加となろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、抗炎症化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン（１）またはその薬学上許容可能な塩を用いた座瘡治療のための方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を用いた座瘡治療のための患者への局所適用である。
【０００９】
本発明の別の態様は、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩のための座瘡治療のための患者への１日１回の局所適用である。
【００１０】
別の実施態様では、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、座瘡の局所的治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＩＬ−１７Ａの転写産物の発現は３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの１日の前処理で阻害されることを示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１７Ａタンパク質生産に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンによる用量依存的効果を示す。
【図３】図３（Ａ〜Ｃ）は、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンが分化したＴｈ１７細胞によるサイトカイン分泌を抑制し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＴｈ１７分極を著しく阻害することを示す。
【図４】図４は、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンが皮脂生産を阻害しないことを示す。
【図５】図５は、初代ケラチノサイトに対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンのアポトーシス効果を示す。
【図６】図６は、１４９の生化学アッセイパネルにおける３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンとレスベラトロールを試験した結果を比較する。
【発明の具体的説明】
【００１２】
化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン、またはその薬学上許容可能な塩は、５−［（Ｅ）−２−フェニルエテニル］−２−（プロパン−２−イル）ベンゼン−１，３−ジオール、または２−（１−メチエチル）−５−［（１Ｅ）−２−フェニルエテニル］−１，３−ベンゼンジオールとしても知られ、本明細書では化合物１とも呼ばれ、下記構造を有する：
【化１】
2017537936.tif 000002
【００１３】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの合成は既知であり、複数の研究者によりさらに研究されている、Krow, G.R. et al. JOC, 57(14):4040-4043, 1992; Azzena, U. et al. Synthetic Communications 33(8):1309-1317, 2003; Gao, J. et al., Advanced Materials Research 236-238:2378-2382, 2011参照。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｂｅｉ  Ｓｃｉ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる種々の特許出願がこの化合物の合成についても出願している、ＣＮ１０１５３１５７１（２００９）；ＣＮ１０１６３３６０６（２０１０）；ＣＮ１０１６４８８５１（２０１０）；ＣＮ１０１８３０７６４（２０１０）；およびＣＮ１０１８３８１７３（２０１０）。
【００１４】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓによる、１を含むスチルベンの生産の生合成経路も提案されている（Joyce, S.A. et al., Angewandte Chemie Int. Ed. 47:1942-1945, 2008）。化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンは、最初にPaul, V. et al., Journal of Chemical Ecology 7(3):589-597, 1981により抗生物質として開示されていたと考えられる。Li, J. et al, Applied and Environmental Microbiology 61(12):4329-4333, 1995もまた、異なる細菌株からではあるがこの化合物を単離し、さらに殺真菌活性を実証した。殺真菌活性はまた、ＷＯ１９９５／００３６９５としてＡｇｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより出願されたＰＣＴ出願でも確認されている。この化合物はさらにＷＯ２００１／０４２２３１、Ｗｅｌｉｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈにタンパク質キナーゼ阻害剤として記載されている。この化合物は、乾癬およびアトピー性皮膚炎の治療のためのＷＢＩ−１００１としてＷｅｌｉｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより開発中であった。
【００１５】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの殺虫、殺菌、および殺真菌活性はよく研究されてきたが、Ｐ．アクネスに対するその使用については研究されていない。化合物１の経緯を見れば、Ｐ．アクネスに対して活性があると容易に考えられたであろうが、以下の実験の節で見て取れるようにそうではない。例えばタンパク質キナーゼ阻害剤としてなど、この化合物のタンパク質の既知の作用様式も、当業者にこの化合物が座瘡治療における使用に好適であろうと考えるに至らせないであろう。よって、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンが座瘡治療に有用であるということは予期できない発見である。
【００１６】
化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンは、今般、Ｔｈ１７分子経路の阻害剤であることが判明した。瘡治療におけるその使用が確立されるのは、この作用様式によるものである。
【００１７】
もともとナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の分化に由来する明瞭に異なる１つのＴｈ系譜であるＴｈ１７細胞は、組織炎症の強力な誘導因子であり、Ｔｈ１７細胞の活性亢進は、乾癬、関節リウマチおよび多発性硬化症などの様々な炎症性疾患および自己免疫疾患に関連付けられている(Peck et al. Infect Immun, 78(1):32-38, 2010)。分子レベルでは、Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆを含む、明瞭に異なるプロフィールのエフェクターサイトカインの生産を特徴とする。これらのサイトカインは、ケラチノサイトなどの異なるタイプの細胞を活性化し、それらの過剰増殖、さらには炎症性サイトカイン、ケモカインおよび抗微生物ペプチドの生産をもたらし、次に、炎症を起こした皮膚で他の免疫細胞を動員および活性化し、炎症性応答の増幅をもたらす。
【００１８】
研究によれば、Ｐ．アクネスおよび座瘡患者由来の臨床単離株は、ナイーブＣＤ４＋  ＣＤ４５ＲＡ  Ｔ細胞の、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞への分化を誘導し、ヒトＰＢＭＣ細胞からのＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの分泌を誘導し得ることが示されている(Agak et al., J Invest Dermatol, advance online publication 12 September 2013; doi: 10.1038/jid.2013.334)。加えて、ＩＬ−１７発現細胞は、座瘡患者の皮膚生検には見られるが、健康な個体の皮膚の毛包脂腺嚢付近には見られない。これらの所見は、ＴＨ１７細胞の誘導ならびにＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの生産が座瘡の病因に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００１９】
加えて、炎症性サイトカインのダウンレギュレーションまたは阻害は座瘡患者に有益な効果を持ち得るというエビデンスがある。両方とも座瘡治療に使用されるビタミンＤおよびビタミンＡ類似体は、ヒトＰＢＭＣ細胞においてＰ．アクネスに応答してＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの発現をダウンレギュレートすることが示されている（Ａｇａｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲参照）。
【００２０】
この点で、皮膚においてＴｈ１７由来炎症性サイトカインの生産を阻害する薬物局所的および全身性薬物は、座瘡に対する潜在的療法を提供する。
【００２１】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの作用機序は、これまでに完全に解明されていない。３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの抗炎症活性は、マウス耳浮腫モデル（皮膚の発赤および肥厚の両方に用量依存的軽減を示す）と乾癬およびアトピー性皮膚炎に関するヒト治験の両方で実証されている（Bissonnette et al., Arch Dermatol, 146(4):446-449, 2010; Bissonette et al., Br. J. Dermatol., 166(4):853-860, 2012;およびBissonnette et al., J Eur Acad Dermatol Venereol, 26(12):1516-1521, 2012参照）。これ以前には、ＴＨ１７細胞からのＩＬ−１７分泌に対する化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの作用は実証されてない。
【００２２】
よって、本発明の１つの態様は、座瘡治療のための、有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の使用である。別の態様は、座瘡を、有効量の化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩で治療する方法である。本発明のさらなる態様は、座瘡治療において使用するための、化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を提供する。
【００２３】
本発明はまた、座瘡治療における、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と薬学上許容可能な担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物の使用を提供する。本発明の別の態様は、有効量の、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と薬学上許容可能な担体または希釈剤との医薬組成物で座瘡を治療する方法である。本発明のさらなる態様は、座瘡治療に使用するための、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様は、必要とする哺乳動物においてＩＬ−１７Ａの生産を抑制するための、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の使用である。本発明の別の態様は、必要とする哺乳動物におけるＩＬ−１７Ａの生産の抑制であり、哺乳動物に、有効量の３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を投与することを含んでなる。
【００２５】
本発明の別の態様は、ケラチノサイトの細胞死を誘導するための、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の使用である。ケラチノサイトの細胞死は、ケラチノサイトの過剰増殖および面皰形成を軽減し、それにより、毛包遮断とそれに続く遮断孔における皮脂保持を軽減すると考えられる。本発明の別の態様は、必要とする哺乳動物におけるケラチノサイトの細胞死の誘導であり、前記哺乳動物に、有効量の３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩を投与することを含んでなる。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、Ｔｈ１７分極条件で刺激した培養皮膚組織からのＩＬ−１７Ａの生産を抑制するための、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の使用である。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約０．５％〜約５％ｗ／ｗの範囲の濃度で局所的に適用される。
【００２８】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約０．５％〜約２％ｗ／ｗの濃度で局所的に適用される。
【００２９】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約０．５％ｗ／ｗ、１％ｗ／ｗ、または２％ｗ／ｗの濃度で局所的に適用される。
【００３０】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約０．５％ｗ／ｗの濃度で局所的に適用される。
【００３１】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約１．０％ｗ／ｗの濃度で局所的に適用される。
【００３２】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、約２．０％ｗ／ｗの濃度で局所的に適用される。
【００３３】
本発明の１つの実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、それを必要とする患者の患部に１日１回または２回局所的に適用される。
【００３４】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、それを必要とする患者の患部に１日１回局所的に適用される。
【００３５】
別の実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、それを必要とする患者の患部に１日２回局所的に適用される。
【００３６】
本発明の１つの実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、それを必要とする患者の患部に１日１回または２回、約０．５％〜約５％ｗ／ｗの量で局所的に適用される。
【００３７】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンおよびその薬学上許容可能な塩の生体プロフィールは、現行利用可能な製品のものとは異なるので、これは患者に座瘡治療の新規な治療選択肢を与える。他の局所治療選択肢も利用可能であるが、高レベルの有効性と、治療期間に制限が無く大きな体表面積に適用可能とする許容可能な安全性プロフィールを合わせた新規な局所的投薬がなお極めて必要である。
【００３８】
１つの実施態様では、患部への投与頻度としては、今般では、従来想定されていたものよりも低頻度で投与することができる。３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の適用としては、１日２回、１日１回、１日おきに１回；週２回；週３回、または週１回、本明細書の実施態様のいずれかにより示される用量で患部に適用され得る。別の実施態様では、治療は、１日１回または２回などの初期投与頻度、次いで、１日おき；週２回；週３回、または週１回などの維持相の、二相で投与され得る。
【００３９】
本発明の別の態様では、少なくとも１つの付加的治療薬とともに投与される３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩の組合せは、座瘡疾患に対する、抗菌薬などの異なる作用様式を有する２種類以上の駆動因子を提供するであろう。
【００４０】
さらに、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩と、他の治療処置計画および製品との組合せも使用されると予想される。よって、１つの実施態様では、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩は、１以上の第２のの薬剤と組み合わせて局所的に適用される。
【００４１】
少なくとも１つまたはそれを越える治療化合物を対象に投与する種々の経路は、限定されるものではないが、局所、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、直腸、耳内および眼内経路を含め、当技術分野で周知である。１つの実施態様では、第２の薬剤の投与は、局所または経口である。別の実施態様では、第２の薬剤の投与は局所である。第２の治療薬も、患者の身体の、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン化合物と同じ局部病巣に適用されると予想される。
【００４２】
好適には、第２の薬剤は、薬学的または皮膚科的に許容可能な組成で投与される。好適な薬剤には、限定されるものではないが、過酸化ベンゾイル、アゼライン酸、ダプソン、サリチル酸、トレチノイン、アダパレン、および他のレチノイン酸誘導体が含まれる。さらに、リン酸クリンダマイシン、クリナイシン(clinamycin)、リンコマイシン、レタパムリン、ムピロシン、フシジン酸、テトラサイクリンおよびその誘導体（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン）、ペニシリンおよびその誘導体、ならびにキノロンおよびその総ての誘導体（フルオロキノロン種の化合物を含む）などの局所用抗生物質との併用治療がともに含まれる。本明細書で使用する経口製品として使用するための第２の治療薬には、限定されるものではないが、イソトレチノイン、ならびにテトラサイクリンおよびその誘導体（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン）（その長期放出型を含む）、ペニシリンおよびその誘導体、ならびにキノロンおよびその総ての誘導体（フルオロキノロン種の化合物を含む）といった経口利用可能な抗生物質が含まれる。それらの投与経路の種々の順列の総てが本明細書に包含されるものとする。
【００４３】
２種類以上の投薬は一緒に（第２の治療薬に応じる）、逐次、同時期または交互の時間、例えば、朝または晩に行われ得る。同じ処方物への第２の治療活性の組み込みは、企図される場合、安定性および配合禁忌の通常の問題を受け得る。
【００４４】
結論として、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベン、または薬学上許容可能な塩は、座瘡治療に利用可能な通常の薬剤とともに．異なる処方物の場合に同時点で一緒に使用されるか、逐次使用されるか、または同時期に使用されるか、またはさらには完全に交互の時間、例えば、一方は朝、他方は晩に投与されてよい。
【００４５】
用語
本明細書で使用する場合、「調節する」とは、特定の活性の量、質または効果の増大または低減を意味する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「生物薬剤」は、抗体、モノクローナル抗体、タンパク質、ポリペプチドおよびヌクレオチドなどの複雑な生体分子を意味する。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「座瘡」は、体幹座瘡、顔面座瘡、頭皮座瘡、背部座瘡、上腕座瘡、前腕座瘡、または脚座瘡を含む。
【００４８】
本明細書で使用する場合、座瘡病態などの医学的状態の「治療」、または「治療する方法」は、その医学的状態の徴候、症状、または進行を軽減、改善または遅延する方法を意味する。本明細書で使用する場合、「治療」は、治癒を含意しない。治療は、医学および薬学分野で認識されているように、臨床的有用性を持つために、集団、例えば、座瘡を有する患者の集団のどの構成員にも有効である必要はない。
【００４９】
本明細書で使用する場合、病態に関して「を治療する」、「の治療」、または「を治療する方法」は、（１）その病態もしくはその病態の１以上の生物学的発現を改善または予防すること、（２）（ａ）その病態につながるもしくはその疾患の原因である生物学的カスケードの１以上の点、もしくは（ｂ）その病態の１以上の生物学的発現に干渉すること、（３）その病態に関連する１以上の症状もしくは影響を軽減すること、（４）その病態もしくはその病態の１以上の生物学的発現の進行を緩徐化することを意味する。当業者ならば、「予防」は絶対的な用語でないことを認識するであろう。医学では、「予防」は、病態もしくはその生物学的発現の尤度もしくは重篤度を実質的に低減するため、またはそのような病態もしくはその生物学的発現の発生を遅延させるための薬物の予防的投与を意味すると理解される。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能な賦形剤」は、医薬組成物に形状または稠度を与える際に含ませる薬学上許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各賦形剤は、個体に投与した際に本発明の化合物の有効性を実質的に低下させる相互作用および薬学上許容可能でない医薬組成物をもたらす相互作用が回避されるように、混合した際に医薬組成物の他の成分と適合しなければならない。加えて、各賦形剤は、当然のことながら、それを薬学上許容可能とするのに十分高い純度のものでなければならない。
【００５１】
本明細書で使用する場合、Ｔｈ１７活性化条件は、組織に常在するＴ細胞の、エフェクターＴｈ１７ヘルパー細胞への分化をもたらす組織培養条件を意味する。本明細書で使用する場合、「Ｔｈ１７活性化」は、用語「Ｔｈ１７刺激」と互換的に使用される。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「対象」および／または「患者」は、成人患者、１０代の患者および小児患者を含め、ヒト対象および患者を含む。
【００５３】
本明細書で使用する場合、化合物または薬剤の「局所的」投与は、上皮または皮膚粘膜の内面への適用およびそれを経た吸収を意味する。１つの態様において、局所適用は、座瘡病巣への適用を含む、皮膚の表皮への適用など、対象の真皮または外皮への適用からなる、またはを含んでなる。局所適用における使用に適当なビヒクルおよび医薬担体は、当技術分野で公知である。
【００５４】
１つの実施態様では、用語「薬学上許容可能な」は、連邦もしくは州政府の規制当局により承認され得る、または米国薬局方もしくは動物、より詳しくはヒトにおける使用に関して一般に認知された他の薬局方に挙げられていることを意味する。用語「担体」は、ともに治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「１つの(a)」および「１つの(an)」は、列挙された成分のうち「１以上」または「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。特にそうではないこと述べられない限り、単数形の使用は複数形を含むことは当業者には自明であろう。
【００５６】
用語「および／または」は、本明細書で使用する場合、一覧の個々の要素を付加的およびまた択一的の両方で包含し、従ってこれらは、これらの要素が選択的に「および」とまたは個々に「または」と結びつけられると理解されるように結びつけられる。さらに、単数形で使用された用語は、当然のことながら、複数形も含む。
【００５７】
本出願を通し、種々の実施態様の記載では「を含んでなる」という言葉を使用するが、いくつかの特定の場合では、実施態様は、「から本質的になる」または「からなる」という言葉を用いて記載されることがある。
【００５８】
疾患または病態の治療のための化合物または薬剤の「有効量」は、標準的な臨床技術によって決定することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「哺乳動物」は、限定されるものではないが、児患者、成人患者および高齢患者を含め、ヒトを含む。
【実施例】
【００６０】
実施例１：末梢血由来ＣＤ４＋  Ｔ細胞皮膚常在型免疫細胞サイトカイン生産に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果
本実施例では、炎症性Ｔｈ１７スキューイングカクテルで刺激したｅｘ  ｖｉｖｏヒト皮膚からのＩＬ−１７Ａの放出を抑制する化合物１の能力を検討する。
【００６１】
ｅｘ  ｖｉｖｏヒト皮膚外植片における皮膚常在型免疫細胞の刺激は、限定されるものではないが、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２２を含む、炎症性サイトカインの生産をもたらし、それにより、皮膚炎症プロセスを標的とする免疫調節治療薬を評価する新規なモデル系を提供する。この系を用い、本発明者らは、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンがＩＬ−１７Ａ誘導を抑制し得ることを示す。
【００６２】
試験化合物の、炎症性サイトカインの発現を調節する能力を、皮膚常在型免疫細胞活性化法を用いて評価した。腹壁形成術から取得したｅｘ  ｖｉｖｏヒト皮膚を除脂肪のために処理し、組織からデルマトームにて約７５０ミクロンで採皮した。次に、採取した皮膚を、終濃度１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）に対して、１％ファンギゾン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．５％ＰＳＧを含有する抗生物質／抗真菌薬溶液を含む室温のＰＢＳで各５〜１０分の２回のすすぎで清浄化した。使い捨て１回使用生検パンチで切り取り１０ｍｍ径の円形切片を得、次にこれを３０μｌの６４％ウシコラーゲン溶液（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、＃２００−０５５）を含有する、０．４ｕｍ  ＰＣＦ膜トランスウェル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＃ＰＩＨＰ０１２５０）の上のチャンバーに入れた。これらの皮膚サンプルを３７℃で３０分間、コラーゲン溶液上に設置した。その後、トランスウェル上の皮膚サンプルを６ウェルプレートに移し（各ウェルに１サンプル）、下のチャンバーを１ｍＬ完全培地（角化培地）で満たし、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンで処理たか非処理とした。
【００６３】
培養の最終日に、皮膚組織をｑＰＣＲによる分析のためにＲＮＡレーターに採取した（Ｎ＝９名の各皮膚ドナー）。
【００６４】
皮膚常在型免疫細胞を、ＰＢＭＣに関する文献で使用された条件と同様に、Ｔｈ１７分極条件下でｉｎ  ｓｉｔｕにて活性化した。具体的には、ヒト皮膚外植片（１ドナー当たり１条件当たり３反復）を、Ｔ細胞抗原受容体と結合させＴｈ１７分極条件の存在下で共刺激シグナルを得るために、培養培地中、ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ；クローンＵＣＨＴ１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体およびＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ；クローン＃３７４０７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体で刺激し、これは、ＩＦＮγ（２μｇ／ｍｌ；クローン＃２５７２３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−４（２μｇ／ｍｌ；クローン＃３００７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの組換えヒト（ｒｈ）サイトカイン（ｒｈ  ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈ  ＩＬ−１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む）、およびＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）、ならびにＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈからのｒｈ  ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）に対する中和抗体を含む。
【００６５】
Ｑｉａｇｅｎの（カタログ番号７４１０６）  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ単離キットを用い、約３０〜４０ｍｇの組織から全ＲＮＡを単離した。１％２−β−メルカプトエタノールを添加した３００μＬのＲＬＴバッファーを用い、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ−２４機にて６３００ｒｐｍで３０秒間、３サイクルごとに２分のアイスブレークを入れて９サイクル、組織をホモジナイズした。このホモジネートにプロテイナーゼＫを含有するＲＮアーゼ不含水（６００μｌ）を加え、５５℃で１５分間消化した。消化した組織を１０，０００×ｇで３分間回転沈降させ、上清を、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニカラムを生産のプロトコールに従って用いるＲＮＡ単離に使用した。各技術的反復のために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １ステップキット（ＡＢ  カタログ番号４３９２９３８）を用い、２０ｕＬのＰＣＲ容量で鋳型として１００ｎｇのＲＮＡを、ならびに定量する各遺伝子に対する特異的ＴａｑＭａｎプローブを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのマスターミックスはＲＯＸ色素内部対照を備えている。ＯｎｅＳｔｅｐＰｌｕｓ  ＰＣＲ機をＲＴ工程および４０回の増幅サイクルの両方に使用した。各遺伝子を３反復で測定し、相対的遺伝子発現の計算には平均Ｃｔ値を使用した。
【００６６】
相対的遺伝子発現データは、技術的反復におけるＰＣＲ増幅実施からの３回の生物学的反復の平均値とした。データは総て非処理対照サンプル（１に設定）に対して正規化し、各グラフについて平均変化倍率（＋／−ＳＥＭ）を計算した。処理群間での有意差をスチューデントの両側ｔ検定、ｐ≦０．０５で同定した。
【００６７】
ｅｘ  ｖｉｖｏヒト皮膚外植片の、Ｔヘルパー細胞−１７型（Ｔｈ１７）分化に有利な抗体およびサイトカインでの刺激（全体を通して「Ｔｈ１７条件」または「Ｔｈ１７分極条件」と呼称）は、Ｔｈ１７型サイトカイン、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの転写産物の発現およびタンパク質分泌に劇的な誘導をもたらす。化合物１は、それがこのモデルでサイトカイン発現に影響を及ぼしたかどうかを確認するために検討した。Ｔｈ１７分極条件下での皮膚常在型Ｔ細胞の刺激前の１日の処理は、対照刺激外植片培養物に比べ、刺激後２４時間でＩＬ−１７Ａ遺伝子の発現レベルを低下させた（図１）。相対的転写産物レベルは個々の皮膚外植片から抽出した全ＲＮＡからｑＰＣＲを用いて決定し（１処理群当たり１ドナー当たりＮ＝３）、対象遺伝子の発現（すなわち、ＩＬ−１７Ａ遺伝子の発現）と内因性ハウスキーピング対照遺伝子（すなわち、β−アクチン）を比較するｄΔΔＣｔ法により定量した。
【００６８】
化合物１により媒介されるＴｈ１７関連サイトカインの抑制の有効用量範囲をさらに理解するために、ＩＬ−１７Ａタンパク質分泌を、Ｔｈ１７分極条件下、漸増用量の化合物１の存在下または不在下での５日間の培養の後、末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞で調べた（図２）。培養期間の終了時に上清を採取し、分泌されたタンパク質をＭａｇｐｉｘ（磁気に基づくＬｕｍｉｎｅｘ技術）によって分析した。この試験では、ＩＬ−１７Ａタンパク質のレベルは化合物１により用量依存的に抑制されていた。
【００６９】
図１に見て取れるように、実験スキーム：化合物１（１０μＭ）により誘導されるｉｌ１７ａ遺伝子発現の阻害を、ビヒクル処理（０．２％ＤＭＳＯ）サンプル（複数の皮膚ドナー間の阻害が比較できるように１００％に設定）に対して示す。化合物１は、本明細書で使用する場合、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンを意味する。
【００７０】
図２は、Ｔｈ１７分極化末梢血Ｔ細胞からのＩＬ−１７Ａタンパク質レベルに対する化合物１による用量依存的効果を示す。
【００７１】
刺激したｅｘ  ｖｉｖｏ皮膚および末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞における化合物１の、ＩＬ−１７Ａを抑制する能力は、化合物１が座瘡などのＩＬ−１７Ａ分泌を必要とする炎症性皮膚病態の治療において効能があるという主張を裏づける。
【００７２】
実施例２：Ｔｈ１７分極化細胞およびＴｈ１７細胞分化に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果
既存のＴｈ１７分極化細胞の化合物１による２４時間の処理は、濃度依存的なＩＬ−１７分泌の低減を示した。アクチベータービーズは固定化された抗ＣＤ３に比べてＩＬ−１７放出により大きな増加をもたらしたが、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの阻害効果はどちらのＴＣＲ刺激に関しても同等であった（図３）。
【００７３】
３０μＭで、化合物は、刺激単独の８０〜９５％ＩＬ−１７レベルを低減した。レスベラトロールは、ＩＬ−１７に対して、３０μＭでは部分的な阻害だけを、そしてより低濃度では増強という二相効果を示した。
【００７４】
３０μＭで、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンはＩＬ−１７の分泌を完全に阻害し、１０μＭで、ＩＬ−１７は、およそ８０％低下した。１００ｎＭの３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンで、ＩＬ−１７分泌は６０％を越えて抑制された（図３（Ａ〜Ｂ））。化合物は、ＩＬ−１７Ａ  ｍＲＮＡの発現を、ＩＬ−１７タンパク質の分泌と並行して、同じ効力で阻害した（図３（Ｃ））。
【００７５】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ  ＬＬＣから凍結バイアルとして購入した。
【００７６】
示されているように、図３は、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンが分化したＴｈ１７細胞によるサイトカイン分泌を抑制し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＴｈ１７分極を強く阻害することを示す。図３（Ａ）では、分化したＴｈ１７細胞を化合物１またはレスベラトロール（０．０１〜３０μＭ）で処理し、かつ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。２４時間後、細胞馴化培地に分泌されたＩＬ−１７の濃度を決定した。図３（Ｂ〜Ｃ）では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｔｈ１７分極カクテル、抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体の存在下、化合物１またはレスベラトロール（０．０１〜３０μＭ）を伴って、または伴わずに５日の培養でＴｈ１７細胞に分極させた。図３（Ｂ）では、化合物１の濃度反応曲線を分泌された総ＩＬ−１７Ａタンパク質としてｐｇ／ｍｌで表した。図３（Ｃ）では、ＩＬ−１７Ａ  ｍＲＮＡ発現をＰＰＩＢに対して正規化した。図３（Ａ）に示された結果は、１回の実験からのものである。図３（ＢおよびＣ）のデータは、同様の結果を伴って少なくとも１回反復された代表的実験からのものである。
【００７７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、本質的にYang et al. Nature, 454(7202):350-352, 2008に記載されているように、抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした容器で、１０％ＨＩ−ＦＢＳ、５５μＭβ−ＭＥ、可溶性抗ＣＤ２８（３μｇ／ｍＬ）、ならびにＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮγ（１０μｇ／ｍＬ）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍＬ）のＴｈ１７サイトカイン／抗サイトカイン抗体カクテルを含有するイスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中、５日間培養することにより、Ｔｈ１７サブタイプへと分化させた。既存のＴｈ１７分極化細胞に対する化合物の効果を調べるために、分極５日の培養期に、細胞を採取し、洗浄し、ＩＭＤＭ＋１０％ＨＩ−ＦＢＳ中で２日間休止させた。次に、これらの細胞を、非コーティングしていないかまたは抗ＣＤ３でコーティングした、連続希釈化合物をすでに含有する丸底９６ウェルプレートに、７５，０００細胞／ウェルで播種した。非コーティングウェルに分散させた細胞に次にＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ：細胞  １：１比）を施した。総てのプレートを２４時間培養した。Ｔｈ１７分極に対する化合物の効果を調べるために、総てのＴｈ１７分極カクテル成分（上記）を添加したＩＭＤＭ中に新しく調製したＣＤ４＋細胞をそのまま低細胞密度（２０，０００細胞／ウェル）で、連続希釈化合物をすでに含有する抗ＣＤ３コーティング丸底９６ウェルプレートに播種し、５日間、非破壊的に(undisturbed)培養した。
【００７８】
実施例３：皮脂細胞における脂肪生成に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果
皮脂細胞における脂肪生成の調節に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価した。簡単に述べれば、ヒト不死化皮脂細胞（ｔｓＳＶ４０およびｈＴＥＲＴ）を播種し、皮脂細胞増殖培地でコンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス時に、ラージＴ抗原分解を誘導するために細胞を３７℃に移行した。２日後、細胞を１μＭ  Ｔ０９０１３１７およびビヒクル（ＤＭＳＯ）または化合物１を含有する皮脂細胞標識媒体で刺激した。化合物３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンを１０、３、１、０．３および０．１μＭの濃度で試験した。翌日、この媒体を１μＭ  Ｔ０９０１３１７およびオリジナルの処理剤またはビヒクル＋１μＭインスリンを含有する皮脂細胞標識媒体と置き換えた。２ｕｌの１４Ｃ−酢酸塩を各ウェルに加え、プレートを４時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、１０ｕｌのＣＴＢ試薬を正規化のために各ウェルに加えた。残りの２時間インキュベーションを続け、プレートのＣＴＢシグナルをＥｘ．５６０  Ｅｍ．５９０で読み取った。次に、脂質抽出のために細胞を洗浄し、トリプシンで処理し、ガラスバイアルに移した。結果は対照（ＬＸＲ＋インスリン群）に対する脂質生産％として表す。
【００７９】
図４に示されるように、データは対照（ＬＸＲ＋インスリン群）に対する阻害率％を表す。データは平均±ＳＥＭで表される。データは３反復からのものものである。
【００８０】
化合物１は、皮脂細胞脂肪生成アッセイで活性がないことが判明した。皮脂細胞モデルで、対照群（ＬＸＲ＋インスリン）よりも化合物１に脂肪生成増加傾向があった。
【００８１】
実施例４  ケラチノサイト生存率に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果
ケラチノサイト生存率に対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。ケラチノサイトの過剰増殖は座瘡において遮断を増大させ、面皰形成を促進し得る。化合物１は、１０および３０ｕＭで明らかに細胞傷害性であることが判明した。初代ケラチノサイトにおける化合物１のアポトーシス誘導能は、座瘡患者における有効性に寄与し得る。データを図５に示す。
【００８２】
初代ヒトケラチノサイトを、ＨＫＧＳ増殖添加剤を含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地で培養し、組織培養プレートにプレート当たり２５０，０００細胞で播種した。翌日、培養培地を除去した後、ケラチノサイトを、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）または漸増濃度の化合物１（１、１０、３０ｕＭ）を含有する培養培地で処理した。培養４８時間後、ケラチノサイトを組織培養プレートから除去し、細胞生存率を、フローサイトメトリーを用い、アポトーシスマーカーに対する染色（アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム）により評価した。活性のあるケラチノサイトのパーセンテージを、両アポトーシスマーカーに染まらなかった細胞として定量した。
【００８３】
実施例５：Ｐ．アクネスに対する３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの効果
この抗菌相乗作用の概念を評価するために使用した細菌株は、臨床単離株Ｐ．アクネス６６０１、６６０２、ＡＮ２４、１００３７２、および参照株ＡＴＣＣ６９１９であった。これらはＵｐｐｅｒ  ＰｒｏｖｉｄｅｎｃｅサイトのＣＥＤＤにより保持されている内部培養物ＧＳＫコレクションから受け取った。細菌接種物を調製し、ＣＬＳＩガイドライン法に関して記載されているように(Bhate, K. et al. Brit. J. Derm. 168:474-485, 2013)、添加を行ったブルセラ血液寒天培地で、最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定を行った。簡単に述べれば、希釈した抗菌剤を、テンパリングした融解寒天に加え、無菌的にペトリ皿に注ぎ、固化させた。嫌気性環境で２４時間のインキュベーション後、細菌コロニーを懸濁させ、０．５マクファーランド標準に相当する濁度に調整した。１〜２マイクロリットルの接種物を、各抗生物質を含有する寒天プレートに入れ、３０分間吸収させた。次に、プレートを転倒し、成長の観察まで嫌気的に４８〜７２時間インキュベートした。細菌成長を阻害した最低薬物濃度をＭＩＣとした。
【００８４】
３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンに対して試験した総てのＰ．アクネス株で１２８μｇ／ｍｌのＭＩＣが見られた（表１）。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
これらの結果に基づけば、Ｐ．アクネスに対してＭＩＣ＜０．５μｇ／ｍｌのクリンダマイシンなどの真の抗生物質とは対照的に、化合物１はこの細菌種に対する抗菌薬として活性があるとは考えられない。
【００８７】
実施例６：コルチコステロイド、カルシニュリン阻害剤、ビタミンＤ類似体、およびレチノイン酸受容体アンタゴニストとは異なる３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの生物学的プロフィール
化合物１と、デキサメタゾン（低効力コルチコステロイド）、プロピオン酸フルチカゾン（中等度効力コルチコステロイド）、プロピオン酸クロベタゾール（高効力コルチコステロイド）、カルシトリオール（ビタミンＤの活性型）、タクロリムス（免疫抑制薬）、およびレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＬＥ  １３５）などの皮膚科病態に使用されている他の活性薬剤の効果をＤｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｎｅｌ  ＢｉｏＭＡＰシステム(Berg et al. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 53(1):67-74, 2006)で使用される初代ヒト細胞種に対して比較検討した。
【００８８】
用いたＢｉｏＭＡＰ（商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍは、複数の疾患関連シグナル伝達経路を活性化する種々の病状を模倣するために選択された薬剤で刺激されたヒト細胞（内皮細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび平滑筋細胞）の特定の組合せを利用する１２のアッセイ系を含んだ。合計１４８の表現型読み出し（アッセイ）が本試験中に測定された。化合物１は、本試験で用いた１以上の試験濃度で、炎症、免疫機能、組織リモデリングおよび抗増殖活性に関与する２５を越えるバイオマーカーを調節するその能力を示した。処理サンプルにおける各パラメーターの測定値を、８つのＤＭＳＯ対照サンプル（同プレートからのもの）からの平均値で割って比を求めた。次に、総ての比をｌｏｇ１０変換した。既存対照に関して有意性推定エンベロープを計算した（９９％および９５％）。７水準の化合物デキサメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸フルチカゾン、カルシトリオール、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、ＳＲ−２１１１（ＲＯＲγ逆アゴニスト）およびＬＥ−１３５（ＲＡＲアンタゴニスト）のＢｉｏＭＡＰ（商標）プロフィールを化合物１と比較し、選択閾値＞０．７のピアソンスコアを有するものとして類似のプロフィールを同定した。３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンのプロフィールは、ピアソンスコアが０．７以下の、デキサメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸フルチカゾン、カルシトリオール、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、ＳＲ−２１１１（ＲＯＲγ逆アゴニスト）およびＬＥ−１３５（ＲＡＲアンタゴニスト）とは統計的に有意に異なることが判明した（表２）。これらの結果は、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンまたはその薬学上許容可能な塩が比較化合物とは異なる作用機序を介して働いていることを示す。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
レスベラトロールにおけるスチルベンファーマコフォアの構造的類似性を考慮して、植物により生産されるヒドロキシル化スチルベン誘導体は、化合物１は、それらの相対的活性プロフィールを評価するためにレスベラトロールと一緒にスクリーニングした。レスベラトロールと化合物１の間の低いピアソンスコアにより示されるように（表２）、３，５−ジヒドロキシ−４−イソプロピル−トランス−スチルベンの活性プロフィールは、レスベラトロールとは有意に異なる。このことをさらに確認するために、これら２つの化合物を１４９の生化学アッセイのパネルで比較した。活性の重複はほとんど無く、これら２つの化合物は異なる活性プロフィールを示した（図５）。よって、化合物１の機能および活性は、レスベラトロールの活性に関して公開されている文献に基づいて推定することはできない。
【００９１】
限定されるものではないが、本明細書に飲用される特許および特許出願を含む総ての刊行物は、各個の刊行物が、全内容が示されているかのうように具体的かつ個々に引用することにより本明細書の一部とされる場合と同じく、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００９２】
上記は、その好ましい実施態様を含め、本発明を十分に開示する。本明細書に具体的に開示されている実施態様の改変および改良は以下の特許請求の範囲の範囲内にある。さらに詳しく述べなくとも、当業者ならば、上記の記載を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。よって、本明細書の実施例は単に例示であり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。その排他的所有または権利が請求される本発明の実施態様は以下に定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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