(57)【要約】  本発明は、以下の式(I)のコポリマー[式中、-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間の整数であり、-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しく、-  Rは、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、又は親和性リガンドを表し、-  R'は、水素、-CH2-C≡CH基、-CH2-1H-1,2,3-トリアゾール基、-CH2-CH2-CH2-S-R"基を表し、式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す]、及びその使用に関する。2017525654.tif 000033
2017525654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下の式(I)のコポリマー:
【化１】
2017525654.tif 000028
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しく、
-  Rは、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、又は親和性リガンドを表し、
-  R'は、水素、-CH2-C≡CH基、-CH2-1H-1,2,3-トリアゾール基、又は-CH2-CH2-CH2-S-R"基を表し、式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す]。
【請求項２】
1から10個の炭素原子を有するアルキル基が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、n-ノニル、2-メチルシクロペンチル及び1-シクロヘキシルエチル基から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のコポリマー。
【請求項３】
Rが、4から9個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質若しくはグリコサミノグリカンを表し、及び/又は、R'が、水素若しくは-CH2-C≡CH基を表すことを特徴とする、請求項1又は2に記載のコポリマー。
【請求項４】
リン脂質が、ホスホグリセリド及びスフィンゴミエリンから選択されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項５】
グリコサミノグリカンが、ヘパリンであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項６】
ヘパリンが、天然ヘパリン、エノキサパリン、チンザパリン、ナドロパリン及びフォンダパリナックスから選択されることを特徴とする、請求項5に記載のコポリマー。
【請求項７】
Rが、ホスファチジン酸であり、好ましくは、3から22個の炭素原子の炭素系鎖を有する2つの脂肪酸、好ましくは2つの飽和脂肪酸、及びリン酸と、グリセロールとのエステル化によって形成されるホスファチジン酸であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項８】
Rが、下の式:
【化２】
2017525654.tif 000029
[式中、R1及びR2は同一であり、3から22個の炭素原子を有する脂肪酸の脂肪族鎖を表し、好ましくは、R1及びR2はそれぞれ、-(CH2)2-CH3又は-(CH2)3-CH3である]のホスファチジン酸であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項９】
Rが、トリアゾールグルタメート誘導モノマーのうちで同一である又は異なっていることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1種のコポリマー、及び少なくとも1種の治療用タンパク質を、薬学的に許容される媒体中に含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
1種又は複数のタンパク質、特に治療用タンパク質を封入するための、請求項1から9のいずれか一項に記載のコポリマーの使用。
【請求項１２】
治療用タンパク質が、抗体、凝固第I因子、第II因子、第V因子、第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子若しくは第XIII因子、又はウィルブランド因子、修飾された凝固因子、H因子、ITI、α1アンチトリプシン、アンチトロンビン、アルブミン、フィブリノーゲン、ヒトプロトロンビン複合体、プロテインC、インスリン及びエリスロポイエチンから選択されることを特徴とする、請求項10に記載の組成物又は請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
a) 下の式(II):
【化３】
2017525654.tif 000030
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しい]
のアルキンと、式R-N3の化合物(Rは、請求項1から8のいずれか一項に規定される通りである)との、銅(I)の存在下でのクリックケミストリーにより、
式(III):
【化４】
2017525654.tif 000031
の化合物を得る工程、
次に
b) 好ましくは、zが0以外であるとき、式(III)の化合物のアリル官能基を修飾する工程
を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のコポリマーを調製するための方法。
【請求項１４】
クリックケミストリーの工程が、Cu(I)Br、PMDETA及びDMFの存在下、30℃から40℃の間の温度で、20から40時間の間行われることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
工程b)が、式(III)の化合物のアリル保護基を、好ましくはアリル保護基の酸化及び切断によって脱保護することにより、R'が水素である式(I)のコポリマーを得る工程であることを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
工程b)が、式(III)の化合物と、式R"-SH(式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す)のチオールとのクリックケミストリーにより、R'が-CH2-CH2-CH2-S-R"基である式(I)のコポリマーを得る工程であることを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１７】
式(II)の化合物についてzが0に等しいとき、
式(II)のアルキンと式R-N3の化合物とのクリックケミストリーの工程a)を不完全に行うことにより、
式(I):
【化５】
2017525654.tif 000032
(式中、R'は-CH2-C≡CH基を表す)
のコポリマーを得る
ことを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１８】
請求項1から9のいずれか一項に記載のコポリマーから得られ、封入された治療用タンパク質を含む、ミセル。
【請求項１９】
請求項18に記載のミセルを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下の式(I)のコポリマーに関する:
【０００２】
【化１】
2017525654.tif 000003
【０００３】
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間、好ましくは20から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しく、
-  Rは、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、特にヘパリン、又は親和性リガンドを表し、
-  R'は、水素、-CH2-C≡CH基、-CH2-1H-1,2,3-トリアゾール基、又は-CH2-CH2-CH2-S-R"基を表し、式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、特にヘパリン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す。好ましくは、R'は水素を表す]。
【背景技術】
【０００４】
生物活性成分は、治療に広く使用される活性成分である。これらの活性成分は、時には長期間にわたって、更に時には患者の生涯(回数の多少はあれ反復投与を含む)を通してさえ、患者を治療するために使用される。こうした反復投与は、活性成分が投与される患者に相当な不利益をもたらすことが多い。
【０００５】
一般に、所望の治療又は予防効果に至り、それを維持するために、高用量及び高投与回数が必要とされるが、それは患者にとって拘束的であるだけでなく、高価でもある。
【０００６】
大抵の生物活性成分は分解に対して、例えばタンパク質分解を生じる切断に対して感受性があり、それによって治療又は予防効果のない分解生成物が形成される場合があることが示されてきた。この分解によって、生物活性成分の半減期及び/又は生物学的利用能は相当に減少する可能性がある。
【０００７】
生物活性成分を用いた治療及び/又は予防処置の質を向上させるために、現行の薬学的組成物と比較して、生物活性成分の半減期及び/又は生物学的利用能を増大させることを可能とする薬学的組成物を利用できれば有利であろう。現行の組成物と比較して、向上した安定性を呈し、分解に対して感受性が低い、生物活性成分を含む薬学的組成物を利用できれば、特に有利であろう。
【０００８】
特に、体内で生物活性成分の安定性を増大させ、生物活性成分の放出を経時的に制御することを可能とする薬学的組成物(又は製剤)を利用できれば有利であろう。これによって、実際に前記製剤の投与の回数を減少させることができるので、患者の生活の質を向上させ、医師の仕事を容易にすることができるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Smithら、Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry、Molecular Biosystems、2009、5、962〜972
【非特許文献２】Pocheら、Synthesis of novel γ-alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal C-C double bond to produce polypeptides with pendent unsaturation、Macromolecules、1997、30、8081〜8084
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、患者に投与される、特に非経口的に投与される製剤中の生物活性成分を安定化させる手段を提供すること、及びそれらの放出を経時的に制御することである。かかる手段により、特に、前記製剤の投与の回数を減少させることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
よって、本発明の対象は、下の式(I)のコポリマーである:
【００１２】
【化２】
2017525654.tif 000004
【００１３】
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間、好ましくは20から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しく、
-  Rは、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、特にヘパリン、又は親和性リガンドを表し、
-  R'は、水素、-CH2-C≡CH基、-CH2-1H-1,2,3-トリアゾール基、又は-CH2-CH2-CH2-S-R"基を表し、式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、特にヘパリン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す。好ましくは、R'は水素を表す。好ましくは、R'は-CH2-C≡C基を表す]。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
かかるコポリマーは、本出願において「本発明によるコポリマー」と呼ぶ。
【００１５】
実際に、かかるコポリマーは、生物活性成分、特にタンパク質、好ましくは治療用タンパク質を製剤中に封入するミセルを形成する能力がある。これらのミセルは、特に前記生物活性成分を安定化する効果を有する。
【００１６】
本発明によるコポリマーは、ブロックコポリマーである。それは、2種類のブロックから構成される:
-  エチレングリコールモノマーのブロックであって、一連の前記モノマーがポリ(エチレングリコール)(PEG)ブロックを形成し、そのうち1番目のエチレングリコールモノマーがメトキシ基に結合されているブロック、
-  トリアゾールグルタメート誘導モノマーのブロック、及び
-  任意選択により、グルタメートモノマー、又はチオエーテル含有(thioethereal)グルタメート誘導モノマー。R'が-CH2-CH2-CH2-S-R"基である場合、チオエーテル含有グルタメート誘導モノマーという用語が使用される。R'が水素を表す場合、グルタメートモノマーという用語が使用される。
【００１７】
より具体的には、PEGブロックは、x個のエチレングリコールモノマーから構成され、xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、特に45又は114に等しい。45個のエチレングリコールモノマーから構成されるPEGブロックは2000g/molの総分子量を有し、114個のエチレングリコールモノマーのPEGブロックは5000g/molの総分子量を有する。
【００１８】
本発明によるコポリマーは、y個のトリアゾールグルタメート誘導モノマーを含み、yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間、好ましくは20から60の間の整数であり、yは、好ましくは19又は21に等しい。最終的に、本発明によるコポリマーは、z個のグルタメートモノマー又はチオエーテル含有グルタメート誘導モノマーを含んでもよく、zは0から(100-y)の間の整数である。特定の一実施形態において、zは0に等しい。
【００１９】
「アルキル」という用語は、1から10個の炭素原子を含む、直鎖状、環状又は分枝状炭化水素系の基を指す。1から10個の炭素原子を有するアルキル基は、特に、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、n-ノニル、2-メチルシクロペンチル及び1-シクロヘキシルエチル基から選択される。好ましくは、アルキル基は、4から9個の炭素原子を有し、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、n-ノニル、2-メチルシクロペンチル及び1-シクロヘキシルエチル基から選択される。
【００２０】
「リン脂質」という用語は、両親媒性脂質、すなわち、親水性である極性の「頭部」及び疎水性である脂肪族の2つの「尾部」からなる脂質を指す。
【００２１】
好ましくは、リン脂質は、以下:
-  頭部が、極性分子でエステル化されたグリセロール3-リン酸残基からなり、2つの尾部が、2つの脂肪酸の脂肪族鎖である、ホスホグリセリド;及び
-  スフィンゴシン、脂肪酸、ホスフェート及び窒素含有アルコールからなる、スフィンゴミエリン
から選択される。
【００２２】
ホスホグリセリドは、好ましくは、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンから選択される。
【００２３】
「グリコサミノグリカン」という用語は、ヘキソサミンに結合したヘキソースから形成される二糖型の直鎖状多糖ポリマーを指す。グリコサミノグリカンは、結合組織の細胞外基質の重要な構成要素である。グリコサミノグリカンのうち、好ましくは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンを挙げることができる。
【００２４】
「ヘパリン」という用語は、天然ヘパリン及び低分子量ヘパリン(LMWH)を指す。
【００２５】
天然ヘパリンは、次の三硫酸化二糖単位、すなわち、L-イズロン酸2-O-硫酸及びD-グルコサミン-N-硫酸,6-O-硫酸から本質的になる種々のポリマーの混合物である。ヘパリンは、グリコサミノグリカンである。
【００２６】
LMWHは、スルホン化及びグリコシル化された複合ポリマーであり、ヘパリンの化学的又は酵素的解重合によって生成される。好ましくは、LMWHは、エノキサパリン、チンザパリン、ナドロパリン及びフォンダパリナックス(合成ヘパリン誘導体)から選択される。
【００２７】
「親和性リガンド」という用語は、生物活性成分、特に治療用タンパク質と、可逆的に結合する、詳細には、非共有相互作用によって(例えば、静電相互作用若しくは疎水性相互作用、又は水素結合によって)結合する、分子を意味することを意図している。
【００２８】
親和性リガンドとして、特に以下のもの:
-  基質又はエフェクター(治療用タンパク質が対応する酵素である場合);
-  抗原(治療用タンパク質がそれらを標的とする抗体である場合);或いは
-  受容体に結合する分子(治療用タンパク質が前記受容体である場合)
を挙げることができる。
【００２９】
好ましくは、親和性リガンドは、生物活性成分と結合しない基によって式(I)のコポリマーと共有結合する。
【００３０】
「イメージングプローブ」という用語は、医療を目的とする情報を可視化させ、蛍光、X線、核磁気共鳴、超音波反射、放射能、近赤外又はUV-可視領域における分光法及び陽電子放出断層撮影から選択されるイメージング技術で使用される、分子を意味することを意図している。イメージングプローブとして、特に、可視領域で発光するFluoroProbe(登録商標)547Hプローブ、又は近赤外領域で発光するFluoroProbe(登録商標)682プローブを挙げることができる。
【００３１】
式(I)のブロックコポリマーに存在するR基は、トリアゾールグルタメート誘導モノマーのうちで同一であっても異なっていてもよく、前記モノマーは、yの数で存在する。
【００３２】
よって、Rは、これらのモノマーで同一であって毎回同じ定義を有するか、或いは、Rはこれらのモノマーで異なるかのいずれかであり、後者の場合、異なるトリアゾールグルタメート誘導モノマーを有するコポリマーが最終的に得られる。
【００３３】
好ましくは、式(I)のコポリマーに存在するR基は、4から9個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質又はグリコサミノグリカンを表す。より優先的には、Rは、リン脂質、好ましくはホスファチジン酸である。ホスファチジン酸は、2つの脂肪酸、好ましくは飽和脂肪酸、及びリン酸と、グリセロールとのエステル化によって形成される脂質である。好ましくは、本発明によるホスファチジン酸は、3から22個の炭素原子の炭素系鎖を有する2つの脂肪酸、好ましくは飽和脂肪酸、及びリン酸と、グリセロールとのエステル化によって形成される。「3から22個の炭素原子の炭素系鎖を有する脂肪酸」という用語は、好ましくは、酪酸、吉草酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸(steric acid)及びアラキジン酸から選択される脂肪酸を意味することを意図している。
【００３４】
より優先的には、本発明によるホスファチジン酸は、2つの酪酸及びリン酸とグリセロールとのエステル化によって形成される。或いは、より優先的には、本発明によるホスファチジン酸は、2つの吉草酸及びリン酸とグリセロールとのエステル化によって形成される。好ましくは、Rは、下の式のホスファチジン酸であり、
【００３５】
【化３】
2017525654.tif 000005
【００３６】
式中、R1及びR2は同一であり、3から22個の炭素原子を有する脂肪酸の脂肪族鎖を表し、好ましくは、R1及びR2はそれぞれ、-(CH2)2-CH3又は-(CH2)3-CH3である。
【００３７】
式(I)のブロックコポリマーに存在するR'基は、グルタメート又はチオエーテル含有グルタメート誘導モノマーのうちで同一であっても異なっていてもよく、前記モノマーは、zの数で存在する。
【００３８】
よって、R'は、これらのモノマーで同一であって毎回同じ定義を有するか、或いは、R'はこれらのモノマーで異なるかのいずれかであり、後者の場合、グルタメートモノマー及びチオエーテル含有グルタメート誘導モノマーを有するコポリマーが最終的に得られる。
【００３９】
本発明の対象はまた、1種又は複数のタンパク質、好ましくは1種又は複数の治療用タンパク質を封入するための、本発明によるコポリマーの使用である。治療用タンパク質は、特に、抗体、凝固因子(特に、第I因子、第II因子、第V因子、第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子及び第XIII因子並びにウィルブランド因子に由来するもの)、修飾された凝固因子、H因子、ITI(インターαトリプシン阻害剤)、α1アンチトリプシン、アンチトロンビン、アルブミン、フィブリノーゲン、ヒトプロトロンビン複合体、プロテインC、インスリン、インターフェロン及びエリスロポイエチンから選択される。「修飾された凝固因子」という用語は、この因子の断片、この因子の断片を含むタンパク質又は変異した因子を意味することを意図している。好ましくは、治療用タンパク質は、修飾された又は修飾されてない凝固因子である。好ましくは、治療用タンパク質は、第VII因子、好ましくはその活性型の、FVIII又はFIXである。
【００４０】
本発明によるコポリマーは、実際に、高分子ミセルを形成することによって、生物活性成分、特に治療用タンパク質を封入することを可能とする。これらのミセルは、生分解されやすく、10から150nmの間の平均径を有し、注射可能、特に静脈内に注射可能である。
【００４１】
本発明の対象はまた、少なくとも1種の本発明による式(I)のコポリマー、及び少なくとも1種の治療用タンパク質を薬学的に許容される媒体中に含む薬学的組成物である。「薬学的に許容される媒体」という用語は、患者に投与するのに適合した媒体を意味することを意図している。
【００４２】
好ましくは、該薬学的組成物は、薬学的に許容される媒体中に、本発明による式(I)のコポリマーによって形成されたミセルを含み、前記ミセルは治療用タンパク質を封入する。
【００４３】
該薬学的組成物は、好ましくは、1:100から100:100の間の治療用タンパク質対コポリマーの質量比を含む。
【００４４】
該薬学的組成物は、好ましくは以下のようにして得られる:
-  コポリマーを5から30mg/mlの間の濃度で水に溶解させる。この溶液を5から15分間ボルテックスし、次に超音波浴に5から30分間通す。ミセルのサイズは、光散乱によって制御する、
-  ミセルの溶液を、適切な緩衝剤中、適切なpHの治療用タンパク質の水溶液に添加する、
-  この混合物を、封入に要する時間、すなわち5分から24時間の間、穏やかに撹拌しながら4から25℃の間に置く。
【００４５】
有利には、該薬学的組成物は、アミノ酸又は糖型の安定剤を含有してもよい。
【００４６】
有利には、該薬学的組成物は、塩、アミノ酸又は糖型の浸透剤を含有してもよい。
【００４７】
該薬学的組成物は、単位投与形態で投与してもよい。かかる適切な単位投与形態には、経口形態、例えば、経口、舌下の、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び液剤又は懸濁剤;口腔投与形態、例えば、エアロゾル、皮下埋込体;並びに、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、非経口(静脈内、皮内、筋肉内又は皮下)、髄腔内、鼻腔内及び直腸投与形態が含まれる。好ましい一形態は、液剤又は懸濁剤の形態での注射又は注入によるもの、特に静脈内へのものである。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、非経口投与に適しており、そうしたものには、皮下、皮内、筋肉内及び静脈内投与が含まれる。静脈内投与が好ましい。
【００４８】
本発明による薬学的組成物は、液体の形態であっても凍結乾燥された形態であってもよい。好ましくは、この場合、当業者であればわかるが、薬学的組成物が保存される形態(すなわち、凍結乾燥された形態又は液体の形態)とは無関係に、前記薬学的組成物は液体の形態で患者に投与される。
【００４９】
本発明の対象はまた、本発明で規定されるコポリマーから得られ、封入された治療用タンパク質を含む、ミセルである。本発明の対象はまた、上述のミセルを含む薬学的組成物である。
【００５０】
本発明の対象はまた、下の式(II):
【００５１】
【化４】
2017525654.tif 000006
【００５２】
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間、好ましくは20から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しい]
のアルキンと、式R-N3(Rは、本発明によるコポリマーについて規定される通りである)の化合物との、銅(I)の存在下でのクリックケミストリーの工程を含む、本発明によるコポリマーを調製するための方法である。
【００５３】
式(II)のアルケンと化合物R-N3とのクリックケミストリーの工程によって、下の式(III)の化合物を得ることが可能となる:
【００５４】
【化５】
2017525654.tif 000007
【００５５】
この式(III)の化合物は、次に:
-  R'が水素である式(I)のコポリマーを得るために、アリル保護基を酸化及び切断する工程を経る、
-  或いは、R'が-CH2-CH2-CH2-S-R"基である式(I)のコポリマーを得るために、式R"-SHのチオール(式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す)とのクリックケミストリーの工程を経る、のいずれかが可能である。
【００５６】
よって、本発明によるコポリマーを調製するための方法は、以下を含む:
a) 下の式(III):
【００５７】
下の式(II):
【００５８】
【化６】
2017525654.tif 000008
【００５９】
[式中、
-  xは、10から250の間、好ましくは40から120の間の整数であり、
-  yは、4から100の間、好ましくは10から100の間、好ましくは19から60の間、好ましくは20から60の間の整数であり、
-  zは、0から(100-y)の間の整数であり、好ましくは0に等しい]
のアルキンと、式R-N3の化合物(Rは、本発明によるコポリマーについて規定される通りである)との、銅(I)の存在下でのクリックケミストリーにより、
【００６０】
【化７】
2017525654.tif 000009
【００６１】
の化合物を得る工程、
次に
b) 好ましくは、zが0以外であるとき、式(III)の化合物のアリル官能基を修飾する工程。
【００６２】
第1の変形によれば、工程b)は、R'が水素である式(I)のコポリマーを得るために、式(III)の化合物のアリル保護基を脱保護する工程であり;好ましくは、この工程は、アリル保護基の酸化及び切断を含む。
【００６３】
第2の変形によれば、工程b)は、R'が-CH2-CH2-CH2-S-R"基である式(I)のコポリマーを得るための、式(III)の化合物と、式R"-SH(式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す)のチオールとのクリックケミストリーの工程である。
【００６４】
式(II)の化合物についてzが0に等しいとき、式(II)のアルキンと式R-N3の化合物とのクリックケミストリーの工程a)を不完全に行って、y個のトリアゾールグルタメート誘導モノマー、及びR'が-CH2-C≡CH基を表すz個のグルタメートモノマーを含む、本発明による式(I)のコポリマーが得られるようにすることもできる。
【００６５】
クリックケミストリー反応は、保護基を用いずに行われる、単純で高収率の立体特異的反応であり、20kcal/mol以上の熱力学的駆動力を有する。クリックケミストリー反応によって、2つの異なる単位を結合することが可能となる。
【００６６】
本発明で使用されるクリックケミストリー反応(工程a))は、置換1,2,3-トリアゾールを形成するための、アジド官能基とアルキン官能基の間の1,3-双極子付加環化反応を含む。銅(I)触媒が存在すると、1,4-位置異性体を排他的に得ることが可能となり、反応時間及び温度を減少させる。したがって、本発明の方法によれば、式(II)のアルキンコポリマー(すなわち三重結合を含む)は、アジドと反応して、トリアゾール環を含む式(III)のコポリマーを形成する。
【００６７】
好ましくは、本発明によるクリックケミストリーの工程に使用される銅(I)は、塩又は錯体の形態で存在する。
【００６８】
かかる塩は、特に、臭化銅(I)(Cu(I)Br)及びヨウ化銅(I)(Cu(I)I)から選択される。錯体は、特に、[Cu(OTf)(C6H6)]、[Cu(Ph3P)3Br]及び[Cu(NCCH3)4][PF6]から選択される。
【００６９】
銅(I)の塩又は錯体が使用されるとき、窒素含有塩基、例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、PMDETA(N,N,N',N',N"-ペンタメチルジエチレントリアミン)、ピリジン又は2,6-ルチジンを媒体に添加することが好ましい。
【００７０】
クリックケミストリー反応は、溶媒を含む媒体中で行われる。好ましくは、溶媒は、トルエン、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、ブタノール、水、及びそれらの混合物から選択される。
【００７１】
好ましくは、本発明によるクリックケミストリー反応は、Cu(I)Br、PMDETA及びDMFの存在下、25℃から50℃の間の温度で、15から48時間の間行われる。より優先的には、本発明によるクリックケミストリーの工程は、Cu(I)Br、PMDETA及びDMFの存在下、30℃から40℃の間の温度で、好ましくはおよそ35℃で、20時間から40時間の間、好ましくは24時間行われる。
【００７２】
好ましくは、本発明によるクリックケミストリーの工程は、銅(I)の存在下で、式(II)のアルキンと、下の式(IV)のホスファチジン酸のアジド誘導体(式R-N3の化合物)とで行われる:
【００７３】
【化８】
2017525654.tif 000010
【００７４】
[式中、R1=R2=3から22個の炭素原子を有する脂肪酸の脂肪族鎖であり、好ましくは、-(CH2)2-CH3又は-(CH2)3-CH3である]。好ましくは、ホスファチジン酸のアジド誘導体は、2つの酪酸、及びリン酸とグリセロールとのエステル化によって形成される[上の式(IV)、式中、R1=R2=-(CH2)2-CH3]。好ましくは、ホスファチジン酸のアジド誘導体は、2つの吉草酸、及びリン酸とグリセロールとのエステル化によって形成される[上の式(IV)、式中、R1=R2=-(CH2)3-CH3]。
【００７５】
使用される式(IV)のアジド誘導体は、特にL-酒石酸ジエチルから得られる。それによって、R基としてホスファチジン酸を含むコポリマーを最終的に得ることが可能となる。
【００７６】
好ましくは、この式(IV)のアジド誘導体は、公表文献、Smithら、Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry、Molecular Biosystems、2009、5、962〜972に記載されている方法によって得られる。特に、この公表文献のスキーム1に記載されている方法によって得られる。
【００７７】
式R-N3の化合物はまた、Rがブチル鎖又はノニル鎖である式(I)のコポリマーを得るために、それぞれアジドブタン又はアジドノナンであってもよい。
【００７８】
上述した通り、式(I)のコポリマーに存在するR基は、トリアゾールグルタメート誘導モノマー及びグルタメートモノマーのうちで異なっていてもよい。この場合、種々のトリアゾールグルタメート誘導モノマー及び種々のグルタメートモノマーを有するコポリマーが最終的に得られる。かかる式(I)のコポリマーは、以下の方法によって得ることができる。:
a) アジド型基を有する分子をグラフトする(特にクリックケミストリーを使用して)ことによって、次に
b) アリル保護基を脱保護することによって(後者の場合、カルボン酸基を再生する)、得ることができる。この場合、R'が水素である式(I)のコポリマーが得られる。
【００７９】
好ましくは、カルボン酸官能基は、Pocheらによる公表文献、Synthesis of novel γ-alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal C-C double bond to produce polypeptides with pendent unsaturation、 Macromolecules、 1997、30、8081〜8084に記載されている手順によって脱保護される。脱保護工程は、特に、R'が水素である式(I)のコポリマーを得るための、アリル保護基の酸化及び切断工程であり得る。
【００８０】
アリル基によって保護されているカルボン酸官能基が脱保護されないとき、この同じ官能基を、式R"-SH(式中、R"は、1から10個の炭素原子を有するアルキル基、リン脂質、グリコサミノグリカン、親和性リガンド又はイメージングプローブを表す)のチオール化誘導体との、チオール-エン反応と呼ばれるクリックケミストリー反応に使用して、下の式(V)のコポリマーを形成するようにしてもよい:
【００８１】
【化９】
2017525654.tif 000011
【００８２】
この化合物は、式(I)のコポリマーであり、式中、R'は-CH2-CH2-CH2-S-R"基であり、x、y、z、R"及びRは、上述の通りである。
【００８３】
本発明を、ここから種々の実施例によって例示する。
【実施例】
【００８４】
(実施例1)
m(PEG)45-b-PPLG21コポリマーの調製
工程A: PLG-NCA(プロパルギル-L-グルタメート-N-カルボキシ無水物)モノマーの調製
1)  グルタミン酸へのプロパルギルアルコールのグラフト化:
反応は、以下のように概略的に表される:
【００８５】
【化１０】
2017525654.tif 000012
【００８６】
L-グルタミン酸(19.6g、133mmol)及びまたプロパルギルアルコール(500ml、8.66mol)を、丸底フラスコに添加する。この溶液を次にアルゴン下で0℃に冷却する。塩化トリメチルシリル(36.2ml、333mmol)を次に1時間かけてこの溶液に滴加する。最後に、溶液を20℃で36時間混合する。反応後に、未反応生成物を除去するために混合物を濾過する。生成物を次に、この溶液の10倍量に相当する量のジエチルエーテルから析出させる。形成した析出物を次に濾別し、10/1のアセトニトリル/DMF混合物に再溶解させる。2℃で18時間後、形成した結晶を冷アセトニトリルですすぎ、最後に真空下で乾燥させる。25.2g(収率88%)のγ-プロパルギル-L-グルタメートがこのように得られる。
【００８７】
2) PLG-NCAモノマーを得るための、NCA環の閉環:
反応は、以下のように概略的に表される:
【００８８】
【化１１】
2017525654.tif 000013
【００８９】
γ-プロパルギル-L-グルタメート(5.5g、24.6mmol)及びトリホスゲン(2.4g、8.1mmol)を、冷却器を載せた二口丸底フラスコに添加する。次に、冷却器の出口をKOHの溶液に接続するように配慮しながら(反応中に形成された微量のホスゲンをすべて捕捉するため)、この系をアルゴン下に置く。無水酢酸エチル(150ml)を次に添加する。混合物を次に85℃で6時間アルゴンの通気下に置く。反応後に混合物を濾過し、次に30mlの冷水で、次に30mlの飽和NaCl溶液で極めて迅速に洗浄する。有機相を次にMgSO4で脱水し、次に濾過し、真空下で濃縮する。N-カルボキシ無水物環が開環するいかなる危険も防止するために、PLG-NCA生成物(2.9g、収率55%)を冷凍庫内、アルゴン下で保存する。
【００９０】
工程B: m(PEG)45-b-PPLG21コポリマーを得るための、mPEG-NH2によって開始するPLG-NCAモノマーの開環重合
反応は、以下のように概略的に表される:
mPEG45-b-PPLG21コポリマー[式(II)の化合物]
【００９１】
【化１２】
2017525654.tif 000014
【００９２】
mPEG45-b-PPLG21コポリマーを合成するために、合成法を以下のように説明する。
【００９３】
mPEG-NH2(0.242g、0.121mmol)を、冷却器を載せた二口フラスコに添加し、その末端を通気系に接続する。この系を次にアルゴン系の下に置く。無水DMFを次に添加する(15ml)。最後に、PLG-NCA(0.5068g、2.425mmol)の無水DMF(5ml)中溶液を、前の混合物に添加する。72時間30℃で反応させた後、生成物を300mlの冷ジエチルエーテルから単純に析出させ、10mlのDMFに再溶解させ、次に300mlの量の冷ジエチルエーテルから再度析出させる。ポリマーを次に濾過し、次に真空下で一晩乾燥させる。
【００９４】
(実施例2)
本発明による式(I)のコポリマーの調製
1)  アジドブタン又はアジドノナンから得られるコポリマー:
工程A:  アジドブタン(C4)及びアジドノナン(C9)の調製
反応は、以下のように概略的に表される:
【００９５】
【化１３】
2017525654.tif 000015
【００９６】
式中、X=Br又はIである。
【００９７】
アジドブタンを合成するために、合成法を以下のように説明する。
【００９８】
ヨードブタン(10g、54mmol)並びにまたアジ化ナトリウム(5.26g、81mmol)及び無水ジメチルスルホキシド(100ml)を、アルゴン下に置いた丸底フラスコに添加する。この系を次に95℃で24時間置く。反応後に、溶液を冷却し、次に水の溶液と混合する。水性相を次にジエチルエーテルで抽出する。有機相を次に水で洗浄し、MgSO4で次に脱水する。最後に、ジエチルエーテルをロータリーエバポレーターによって蒸発除去し、アジドブタン(4.3g、43mmol、収率80%)を真空下で乾燥させる。
【００９９】
工程B:  本発明による式(I)のコポリマー(以降「コポリマーC4」)を得るための、実施例1で得られたm(PEG)45-b-PPLG21コポリマーとアジドブタンとのクリックケミストリー反応
反応は、以下のように概略的に表される:
コポリマーC4。
【０１００】
【化１４】
2017525654.tif 000016
【０１０１】
mPEG45-b-PPLG21(0.4g、1.5mmolのアルキン官能基)、アジドブタン(0.297g、3mmol)及びジメチルホルムアミド(10ml)を丸底フラスコに添加する。この混合物をアルゴン下で30分間脱気する。更に、Cu(I)Br(0.1075g、0.75mmol)、PMDETA(313μl、1.5mmol)及びジメチルホルムアミド(5ml)の溶液を30分間脱気する。脱気後に、後者の溶液を丸底フラスコに添加し、この混合物を35℃で24時間撹拌する。この溶液を次に10mlのジメチルスルホキシドに再溶解させ、この混合物を次に10mM EDTA溶液に対して7日間、次にミリQ水溶液に対して5日間透析する。最後に、凍結乾燥後にコポリマーC4(0.4735g)を回収する。
【０１０２】
工程C:  本発明による式(I)のコポリマー(以降「コポリマーC9」)を得るための、実施例1で得られたm(PEG)45-b-PPLG21コポリマーとアジドノナンとのクリックケミストリー反応
反応は、以下のように概略的に表される:
コポリマーC9。
【０１０３】
【化１５】
2017525654.tif 000017
【０１０４】
mPEG45-b-PPLG21(0.4g、1.5mmolのアルキン官能基)、アジドノナン(0.777g、3mmol)及びDMF(10ml)を丸底フラスコに添加する。この混合物をアルゴン下で30分間脱気する。更に、Cu(I)Br(0.1075g、0.75mmol)、PMDETA(313μl、1.5mmol)及びジメチルホルムアミド(5ml)の溶液を、30分間脱気する。脱気後に、後者の溶液を丸底フラスコに添加し、この混合物を35℃で24時間撹拌する。この溶液を次に10mlのジメチルスルホキシドに再溶解させ、この混合物を次に10mM EDTA溶液に対して7日間、次にミリQ水に対して5日間透析する。最後に、凍結乾燥後にコポリマーC9(0.5576g)を回収する。
【０１０５】
2  ホスファチジン酸のアジド誘導体を用いて得られるコポリマー:
工程A:  ホスファチジン酸のアジド誘導体(生成物A1)の調製
ホスファチジン酸のアジド誘導体の調製は、6段階の合成工程を必要とする。
【０１０６】
工程1:  この合成の第1の工程は、ジオール官能基をアセタールで保護することにある。
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１０７】
【化１６】
2017525654.tif 000018
【０１０８】
L-酒石酸ジエチル(4.05g、19.6mmol)及びトルエン(130ml)を丸底フラスコに添加する。シクロペンタノン(8.7ml、98mmol)及びp-トルエンスルホン酸(373mg、1.96mmol)をこの溶液に添加する。次に共沸蒸留をディーン・スターク装置によって130℃で15時間行う。固体の炭酸水素ナトリウム(329mg)を次にこの溶液に添加し、撹拌を更に10分間維持する。反応媒体を濾過し、濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:シクロヘキサン、保持係数0.4、発色剤(revealer):リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A1(4.5g、16.5mmol、収率85%)が、黄色油状物の形態で得られる。
【０１０９】
工程2:  エステル基のアルコール基への還元
第2の工程は、生成物A2を得るために、エステル基をアルコール官能基に還元することにある。
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１１０】
【化１７】
2017525654.tif 000019
【０１１１】
生成物A1(5g、18.4mmol)をアルゴン下で無水THF(16ml)中に希釈する。LiAlH4(1.4mg、36.7mmol)の無水THF(20ml)中溶液を次にアルゴン下0℃で調製する。生成物A1の溶液をLiAlH4の溶液に0℃で滴加する。添加が完了したら、反応媒体を0℃で更に1時間、次に室温で1時間撹拌する。溶液を次に0℃に冷却する。反応を停止するために、水(2ml)、10%NaOH(4ml)及び水(2ml)を次に連続的に極めてゆっくりと添加する。反応混合物を更に30分間撹拌し、MgSO4上で30分間脱水する。この溶液を最後に濾過し、ロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【０１１２】
最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:酢酸エチル、保持係数=0.48、発色剤:リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A2(3.3g、17.4mmol、収率95%)が白色固体の形態で得られる。
【０１１３】
工程3:  アルコールのアジド官能基での置換
合成の第3の工程は、生成物A3を得るために、アルコール官能基をアジド官能基で置換することにある。
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１１４】
【化１８】
2017525654.tif 000020
【０１１５】
生成物A2(1.44g、7.66mmol)を、丸底フラスコ中で、ジクロロメタン(40ml)に懸濁させる。完全に溶解した後に、酸化銀(2.66g、11.5mmol)、塩化トシル(1.606g、8.42mmol)及びヨウ化カリウム(128mg、0.766mmol)を次に懸濁液に添加する。得られた溶液を次に室温で2時間撹拌する。酸化銀を除去するために、溶出液として酢酸エチルを使用して、反応媒体を小シリカカラムに通して濾過する。濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。DMF(80ml)及びアジ化ナトリウム(1.244g、19.16mmol)を次に濾液に添加する。この溶液を次に85℃で15時間撹拌する。この溶液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。水(30ml)を添加し、次に生成物をクロロホルムで抽出し(3×100ml)、有機相をMgSO4で脱水し、ロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【０１１６】
最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:1/1 v/v酢酸エチル/シクロヘキサン、保持係数0.57、発色剤:リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A3(1.3g、6.1mmol、収率80%)が橙色液体の形態で得られる。
【０１１７】
工程4:  アルコールのホスホトリエステル基での置換
合成の第4の工程は、生成物A4を得るために、残留アルコール官能基をホスホトリエステル基で置換することにある。
【０１１８】
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１１９】
【化１９】
2017525654.tif 000021
【０１２０】
生成物A3(850mg、3.98mmol)を、丸底フラスコ中で、20mlの無水ジクロロメタンに溶解させる。1H-テトラゾール(26.6ml、11.96mmol、0.45M)を次に添加し、この溶液を0℃でアルゴン下に置く。ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.442ml、4.38mmol)を次に滴加する。撹拌を0℃で10分間、次に室温で1時間継続する。この時点で、溶液を再び0℃に冷却し、m-クロロ過安息香酸(2.06g、11.96mmol、純度57%)をこの溶液に添加する。撹拌を1時間30分間継続する。反応を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(40ml)を添加することによって停止する。この溶液を次にジクロロメタンで抽出し(3×100ml)、MgSO4で脱水し、最後にロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【０１２１】
最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:1/1 v/v酢酸エチル/シクロヘキサン、保持係数0.61、発色剤:リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A4(1.5g、3.1mmol、収率80%)が淡黄色の油状物の形態で得られる。
【０１２２】
工程5:  ジオール官能基の脱保護
合成の第5の工程は、生成物A5を得るために、ジオール官能基を脱保護することにある。
【０１２３】
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１２４】
【化２０】
2017525654.tif 000022
【０１２５】
生成物A4(1.605g、3.39mmol)を丸底フラスコ中でメタノール(25ml)に溶解させる。p-トルエンスルホン酸(64.5mg、0.339mmol)を撹拌しながら添加する。この溶液を室温で15時間撹拌し、反応を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(30ml)を添加することによって停止する。生成物を次にクロロホルムで抽出する(2×100ml)。有機相をMgSO4で脱水し、ロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【０１２６】
最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:8/2 v/v酢酸エチル/シクロヘキサン、保持係数0.36、発色剤:リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A5(0.873g、2.1mmol、収率55%)が淡黄色の油状物の形態で得られる。
【０１２７】
工程6:  ジオールのアルキル鎖とのエステル化
合成の最終工程である第6の工程は、生成物A6を得るために、ジオールを2つのアルキル鎖とエステル化することにある。この場合、C5炭素系鎖を使用した。
【０１２８】
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１２９】
【化２１】
2017525654.tif 000023
【０１３０】
生成物A5(482mg、1.18mmol)、吉草酸(362mg、3.55mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(732mg、3.55mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(144mg、1.18mmol)及び最後にジクロロメタン(12ml)を丸底フラスコに添加する。この溶液を室温で15時間撹拌する。反応後に、反応媒体を濾過し、酢酸エチルで洗浄する。濾過後に、濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【０１３１】
最後に、シリカクロマトグラフィーカラム(溶出液:1/9 v/v酢酸エチル/シクロヘキサン、保持係数0.65、発色剤:リンモリブデン酸)での精製及び蒸発後に、生成物A6(0.332g、0.58mmol、収率49%)が白色固体の形態で得られる。
【０１３２】
工程B:  本発明による式(I)のコポリマー(以降、「保護されたリン脂質コポリマー」)を得るための、m(PEG)45-b-PPLG19コポリマー(実施例1に記載の方式と類似の方式で得られる)とホスファチジン酸のアジド誘導体とのクリックケミストリー反応
この反応は、触媒としてのCu(I)Brの存在下でPMDETAとともに行われる。
【０１３３】
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１３４】
【化２２】
2017525654.tif 000024
【０１３５】
丸底フラスコ中で、40mgのコポリマー(0.15mmolのアルキン官能基)及び2当量のホスファチジン酸のアジド誘導体(165mg、0.29mmol)を5mlの無水DMFに混ぜ入れる。この溶液をアルゴンで30分間脱気する。0.5当量のCu(I)Br(0.0108g、0.075mmol)及び1当量のN,N,N',N",N"-ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA、31μl、0.15mmol)の、5mlの無水DMF中溶液を、アルゴン下で30分間脱気する。Cu(I)Br及びPMDETAの溶液を、次にコポリマー及びホスファチジン酸のアジド誘導体を含む溶液に添加する。混合物を35℃で24時間撹拌する。反応終了時に、混合物を10mM EDTA溶液に対して2日間、次にミリQ水に対して更に4日間透析する。最終生成物を回収するために、溶液を最後に凍結乾燥する。
【０１３６】
NMR分析:
得られたスペクトルは、以下のものである:
【０１３７】
【化２３】
2017525654.tif 000025
【０１３８】
工程C:  本発明による式(I)のコポリマー(以降、「脱保護されたリン脂質コポリマー」)を得るための、ホスフェート基の脱保護
反応は、以下のように概略的に表される:
【０１３９】
【化２４】
2017525654.tif 000026
【０１４０】
試料管中で、工程Bで得られたコポリマー42mgを1.6mlのジクロロメタンにアルゴン雰囲気下で溶解させ、ブロモトリメチルシラン(0.350ml、2.6mmol)を添加する。反応媒体を、次に室温で1時間激しい撹拌に供する。溶媒を次に真空下で蒸発除去し、得られた生成物を2mlのメタノールに溶解させ、室温で1時間激しい撹拌に供する。メタノールを次に真空下で蒸発除去する。次に、不純物を除去し、本発明による脱保護されたリン脂質コポリマーを回収するために、メタノールでの洗浄/蒸発を5回行う。
【０１４１】
NMR分析:
得られたスペクトルは以下のものである:
【０１４２】
【化２５】
2017525654.tif 000027
【０１４３】
(実施例3)
コポリマーC4及びC9のミセル化の試験
1)  手順:
10mgのコポリマーC4又はC9を2mlのミリQ水に溶解させることによって、コポリマーC4及びC9の溶液を調製する。混合物を次に5分間ボルテックスし、最後に1μmのフィルターを使用して濾過する。
【０１４４】
2)  結果:
結果から、コポリマーC4は、15nmから120nmの間の平均径を有するミセルを形成する能力があることが示される。実際に、形成されたミセルの12%が、93nmの平均径を有する。
【０１４５】
コポリマーC9は、20nmから500nmの間の平均径を有するミセルを形成する能力がある。形成されたミセルのおよそ15%が、197nmの平均径を有する。
【０１４６】
(実施例4)
治療用タンパク質としての凝固因子を用いる薬物動態試験
実施例3によるコポリマーのミセルに封入された凝固因子(FVII、FVIII又はFIX)の薬物動態プロファイルを、カテーテルが挿入されたOFA SDラット(体重200〜250g)への1mg/kg、100又は200IU/kgの単回静脈注射後に決定する。
【０１４７】
毒物学的影響を評価するために、3匹のラットにFVIIミセル、FVIIIミセル又はFIXミセルを注入し、3匹のラットにFVII、FVIII又はFIX単体を注入し、2匹の対照ラットにミセル単体を注入する。
【０１４８】
注射後、幾つかの時点で血漿を収集する(注射前、5分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間及び96時間)。血液試料を直ちに10%クエン酸塩(試料:クエン酸塩比は9:1; 3.13質量/容量%に等しい)で処理し、1500g、15℃で15分間遠心分離し、-20℃で保存した後に分析する。
【０１４９】
血漿中のFVII、FVIII又はFIX濃度をELISAによって決定し、データを、WinNonlin(登録商標)ソフトウェア、バージョン6.3を使用するノンコンパートメント分析によって分析する。
【０１５０】
薬物動態パラメーターを決定する。それらには、最高血漿濃度(Cmax)、用量を投与した時間から開始して濃度測定可能最終時点までの時間の関数としての血漿濃度の曲線下面積(AUCLast)、排泄半減期(t1/2)、分布容積(Vd)、クリアランス(Cl)及び平均滞留時間(MRT)が含まれる。
【国際調査報告】
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