(57)【要約】  メラトニンアゴニストを対象に投与することを含む、多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象におけるＭＳの季節性悪化を治療し、またはその発症リスクを軽減する方法。
2017537083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症（ＭＳ）を治療し、もしくはその発症リスクを軽減し、またはＭＳを有する対象におけるＭＳの季節性悪化を治療し、もしくはその発症リスクを軽減する方法であって、必要とされる対象に治療有効量のメラトニンアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２】
対象からの試料中のメラトニン（例えば、６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ））のレベルを検出すること；
前記試料中のメラトニンのレベルと、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有する対照対象（例えば、ＭＳを有する対象）におけるメラトニンのレベルを表すメラトニンの参照レベルとを比較すること；および
前記試料中のメラトニンのレベルが前記参照レベル未満である場合、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有するとして前記対象を同定すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メラトニンの前記参照レベルは、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇであり、またはそれに対応する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記メラトニンアゴニストが、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記メラトニンアゴニストを、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象におけるＭＳの季節性悪化の治療、またはその発症リスクの軽減に使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項９】
前記対象が、参照レベル未満のメラトニンのレベルを有する、請求項８に記載の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１０】
メラトニンの前記参照レベルが、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇであり、またはそれに対応する、請求項９に記載の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１１】
ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である、請求項８の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１２】
前記対象が、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している、請求項８に記載の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１３】
ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを含む組成物中に存在する、請求項８に記載の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１４】
経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与するように配合される、請求項８の使用されるメラトニンアゴニスト。
【請求項１５】
多発性硬化症（ＭＳ）の季節性悪化を発症するリスクを低減させるためのメラトニンアゴニストによる治療のための対象を同定する方法であって、
ＭＳを有する対象を選択すること；
前記対象からの試料中のメラトニン（例えば、６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ））のレベルを検出すること；
前記試料中のメラトニンのレベルと、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有する対照対象（例えば、ＭＳを有する対象）におけるメラトニンのレベルを表すメラトニンの参照レベルとを比較すること；
前記試料中のメラトニンのレベルが前記参照レベル未満である場合、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有するとして前記対象を同定すること；および
場合により、メラトニンアンタゴニストを前記対象に投与すること
を含む方法。
【請求項１６】
メラトニンの前記参照レベルが、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇであり、またはそれに対応する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記メラトニンアゴニストが、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記メラトニンアゴニストを、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象におけるＴｈ１７細胞のレベルを減少させ、および／またはＴｒ１細胞のレベルを増加させる方法であって、必要とされる対象に治療有効量のメラトニンアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記メラトニンアゴニストが、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、自己免疫疾患を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、多発性硬化症、過敏性腸疾患、クローン病、脊椎関節炎、全身性エリテマトーデス、白斑、関節リウマチ、乾癬、シェーグレン症候群または糖尿病を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記メラトニンアゴニストを、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与する、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１４年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／０７８，４７３号明細書の利益を主張する。上記の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により資金提供された研究開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号第ＡＩ０９３９０３号および同第ＮＳ０８７８６７号のもと政府支援により作製された。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
メラトニンアゴニストを対象に投与することを含む、多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象におけるＭＳの季節性悪化を治療し、またはその発症リスクを軽減する方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、自己反応性Ｔ細胞によるミエリンの破壊から生じると考えられている中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫媒介疾患である。ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１細胞）またはＩＬ−１７（Ｔｈ１７細胞）の産生を特徴とするＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＭＳ免疫病原性に対する重要な寄与因子とみなされている（Ｍｉｏｓｓｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２０１４）。ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＩＬ−１０分泌１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）はエフェクターＴ細胞の活性を調節し、したがって、ＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞の欠損がＭＳにおいて説明されている（Ａｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、エフェクターおよび制御性Ｔ細胞間のバランスがＭＳ疾患活性を制御する（Ｍｉｏｓｓｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２０１４）。
【０００５】
遺伝的多型は、ＭＳリスクおよび／または病因に関連している（Ｂｅｅｃｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓａｗｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、環境因子、例えば、感染（Ａｓｃｈｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ａｎｄ  Ｆａｒｅｚ，２００７；Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ナトリウム摂取（Ｆａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、喫煙（Ｈｅｒｎａｎ，２００５）およびビタミンＤレベル（Ａｓｃｈｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）も、ＭＳ発症および過程に影響する。例えば、低いレベルのビタミンＤは、高い再発率に関連する（Ｒｕｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。日光曝露によるビタミンＤの合成の調節の結果として、ビタミンＤレベルに対する有意な季節性変動がほとんどの場所で観察され、ピークは春季から夏季であり、最下点は秋季および冬季である（Ｒｏｓｅｃｒａｎｓ  ａｎｄ  Ｄｏｈｎａｌ，２０１４）。したがって、ビタミンＤの報告された抗炎症効果（Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）（Ａｓｃｈｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に基づくと、ＭＳ再発発生は、秋季および冬季の間にピークを示すと予測される。しかしながら、メタ分析（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）および近年の多施設研究（Ｓｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を含むいくつかの研究により、ＭＳ疾患活性が春季および夏季により高いことが見出され、そのことは、追加の因子がＭＳ再発の季節性の役割を担うことを示唆する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載のとおり、秋季から冬季にかけてピークを示すメラトニンレベルは、ＭＳ患者における臨床的疾患活性と逆相関を示す。さらに、メラトニンは、ＥＡＥの発症を制限し、Ｔｈ１７およびＴｒ１細胞分化を制御する。したがって、メラトニンレベルの季節性変化が、少なくとも部分的にエフェクターおよび制御性Ｔ細胞の調節により媒介される機序を介して秋季および冬季に観察される疾患活性の減少に寄与し得る。
【０００７】
したがって、本明細書において、多発性硬化症（ＭＳ）を治療し、その発症リスクを軽減する方法、または既に多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象におけるＭＳの季節性悪化を治療し、もしくはその発症リスクを軽減する方法が提供される。本方法は、必要とされる対象に治療有効量のメラトニンアゴニストを投与することを含む。
【０００８】
必要とされる対象に治療有効量のメラトニンアゴニストを投与することにより、対象におけるＴｈ１７細胞のレベルを減少させ、および／またはＴｒ１細胞のレベルを増加させる方法も提供される。一部の実施形態において、対象は、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、過敏性腸疾患、クローン病、脊椎関節炎、全身性エリテマトーデス、白斑、関節リウマチ、乾癬、シェーグレン症候群、または糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病を有する。
【０００９】
一部の実施形態において、本方法は、対象からの試料中のメラトニン（例えば、６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ））のレベルを検出すること；試料中のメラトニンのレベルと、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有する対照対象（例えば、ＭＳを有する対象）におけるメラトニンのレベルを表すメラトニンの参照レベルとを比較すること；および試料中のメラトニンのレベルが参照レベル未満である場合、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有するとして対象を同定することを含む。
【００１０】
一部の実施形態において、メラトニンの参照レベルは、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇであり、またはそれに対応する。
【００１１】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である。
【００１２】
一部の実施形態において、対象は、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している。
【００１３】
一部の実施形態において、本方法は、ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを投与することを含む。
【００１４】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与する。
【００１５】
本明細書において、多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象におけるＭＳの季節性悪化の治療、またはその発症リスクの軽減に使用されるメラトニンアゴニストも提供される。
【００１６】
一部の実施形態において、対象は、参照レベル、例えば、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇのメラトニンであり、またはそれに対応するメラトニンの参照レベル未満のメラトニンのレベルを有する。
【００１７】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である。
【００１８】
一部の実施形態において、対象は、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している。
【００１９】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを含む組成物中に存在する。
【００２０】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与するように配合される。
【００２１】
さらに、本明細書において、多発性硬化症（ＭＳ）の季節性悪化を発症するリスクを低減させるためのメラトニンアゴニストによる治療のための対象を同定する方法が提供される。本方法は、ＭＳを有する対象を選択すること；対象からの試料中のメラトニン（例えば、６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ））のレベルを検出すること；試料中のメラトニンのレベルを、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有する対照対象（例えば、ＭＳを有する対象）におけるメラトニンのレベルを表すメラトニンの参照レベルと比較すること；試料中のメラトニンのレベルが参照レベル未満である場合、ＭＳの季節性悪化を有し、または発症する増加リスクを有するとして対象を同定すること；および場合により、メラトニンアンタゴニストを対象に投与することを含む。
【００２２】
一部の実施形態において、メラトニンの参照レベルは、クレアチニン１ｍｇ当たり２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、または２４ｎｇであり、またはそれに対応する。
【００２３】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である。
【００２４】
一部の実施形態において、対象は、ＭＳの季節性悪化の既往歴を有し、そのＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候中で生活している。
【００２５】
一部の実施形態において、本方法は、ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストまたはＲＯＲアゴニストを投与することを含む。
【００２６】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、経口投与、経鼻腔投与、静脈内投与、または髄腔内投与する。
【００２７】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明において使用される方法および材料が本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説明にすぎず、限定するものではない。本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】メラトニンレベルは、ＭＳ臨床的再発と逆相関を示す。（ａ）それぞれの季節についての増悪率をフォローアップの期間で推定し、主軸に示した。それぞれの季節において早朝第１尿中で測定された６−スルファトキシメラトニンレベルを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として副軸に示す。Ｐ値は、ポアソン回帰モデルに対応する。増悪率およびビタミンＤ（ｂ）、報告された呼吸器感染（ｃ）、およびブエノスアイレス市のＵＶ照射量（ｄ）間の相関の欠落。表１も参照。
【図２】メラトニン投与は、ＥＡＥを改善する。（ａ）ビヒクル（０．０１％のＤＭＳＯ）またはメラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）により処理されたＣ５７／Ｂ６におけるＥＡＥ発症。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）（ｎ≧２０匹のマウス／群）。Ｐ値は、反復測定混合効果モデルにおける処理の効果に対応する。（ｂ）疾患誘導の７日後のビヒクルまたはメラトニン処理マウスの脾臓からのＩＬ−１７＋、ＩＬ１０＋、ＩＦＮ−γ＋およびＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋細胞のフローサイトメトリー分析。１群当たり少なくとも４匹のマウスを分析し、データを平均±ＳＥＭとして提示する。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｃ〜ｄ）ＥＡＥにおける臨床ピークにおける対照またはメラトニン処理マウスのＣＮＳからのＩＬ−１７＋、ＩＦＮ−γ＋、ＩＬ−１７＋−ＩＦＮ−γ＋（ＤＰ）およびＩＬ−１７＋−ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）ビヒクルまたはメラトニン処理マウスのＭＯＧ３５−５５に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答。１群当たり少なくとも３匹のマウスを分析し、データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）ビヒクルおよびメラトニン処理からの増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｇ）メラトニン処理または非処理マウスに由来する樹状細胞との同時培養物中のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答およびサイトカインプロファイル（ｈ）。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｉ）樹状細胞の存在下のＭＯＧ３５−５５に対するメラトニン処理２Ｄ２ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｊ）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によってのみ刺激されたＭＯＧ３５−５５に対するメラトニン処理２Ｄ２ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｋ）ＭＯＧ３５−５５刺激メラトニン処理ＤＣに対する処理２Ｄ２ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。図７ａ〜ｅも参照。
【図３】メラトニンは、ヒトＴｈ１７細胞分化を妨害し、Ｔｒ１生成を増強する。（ａ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｈ１７分化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１）中のＩＬ−１７発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｂ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在および不存在下のヒトＴｈ１７分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７のＥＬＩＳＡによるサイトカイン定量。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｃ）ａと同様に培養されたＴｈ１７細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｄ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｈ１分化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ−１２）中のＩＦＮ−ｇ発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。（ｅ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｈ１分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによるサイトカイン定量。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）ｄと同様に培養されたＴｈ１細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｇ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｒ１分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１０発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｈ）ｆと同様に培養されたＴｒ１細胞の定量的ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。図８も参照。
【図４】メラトニンは、Ｅｒｋ１／２−Ｃ／ＥＢＰα経路を介してＴｈ１７細胞分化を妨害する。（ａ）ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下でＴＦＧ−β、ＩＬ−６（０時間）およびＩＬ−２３（４８時間）の添加によりＴｈ１７細胞に分化させ、７２時間後にＲＴ−ＰＣＲにより分析した。示される画像は、５つの実験の代表値である。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５（ｂ）ａと同様の培養の７２時間後のＩＬ−１７およびＩＬ−１０のサイトカイン分泌分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５（ｃ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）、アゴメラチン（２０ｎｇ／ｍｌ、ＭＴＮＲ１Ａリガンド）およびＣＧＰ５２６０８（２０ｎｇ／ｍｌ、ＲＯＲ−αリガンド）の存在または不存在下のＴｈ１７分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のサイトカイン分泌。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｄ）ｃと同様に培養されたＴｈ１７細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）野生型マウスおよびＭＴＮＲ１Ａ欠損マウスにおけるａと同様のＩＬ−１７発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）ｅと同様に培養された野生型およびＭＴＮＲ１Ａ欠損マウスの定量的ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｇ）リバースタンパク質アレイを使用するシグナル伝達プロファイリング。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｈ）Ｔ−およびＰ−Ｅｒｋ１／２のイムノブロット分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。（ｉ）ＴおよびＰ−Ｃ／ＥＢＰαのイムノブロット分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。（ｊ）ｎｒ１ｄ１中のＣ／ＥＢＰαの推定結合部位（左パネル）；抗Ｃ／ＥＢＰαによるクロマチン免疫沈降（右側パネル）。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｋ）ｎｒ１ｄ１プロモーターのためのルシフェラーゼレポーター構築物により形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞のルシフェラーゼ活性。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｌ）野生型マウスおよびＣ／ＥＢＰα欠損マウスにおけるａと同様のＩＬ−１７発現のフローサイトメトリー分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（Ｍ）野生型マウスおよびＣ／ＥＢＰａ欠損マウスにおける（Ａ）と同様のＩＬ−１７発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。図９〜１０も参照。
【図５】メラトニンは、ＮＦＩＬ３発現を制限することによりＴｈ１７細胞分化を妨害する。（ａ）Ｔｈ１７細胞分化に対するメラトニンの効果を媒介する、提案される機序の模式図。（ｂ）Ｔｈ０、Ｔｈ１７およびＴｒ１極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｎｒ１ｄ１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｃ）ビヒクル、メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）またはアゴメラチン２０ｎｇ／ｍｌ）により処理されたＴｈ１７極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｎｒ１ｄ１（左側パネル）およびｎｆｉｌ３（右側パネル）発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。ＮＦＩＬ３発現は、ウエスタンブロットによりさらに確認した。（ｄ）データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。（ｅ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）および／またはＵＯ１２６の存在下でＴｈ１７極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｎｆｉｌ３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、５つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｆ、ｇ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）および／またはＵＯ１２６の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７発現（ｆ）およびｒｏｒｃ発現（ｇ）のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｈ、ｉ）対照またはｎｒ１ｄ１コードレトロウイルスによる感染後にメラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７発現（ｈ）ならびにｒｏｒｃおよびｉｌ１７発現（ｉ）のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｊ、ｋ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化された野生型およびＲＥＶ−ＥＲＢα欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７発現（ｊ）ならびにｒｏｒｃおよびｉｌ１７発現（ｋ））のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｌ）ｒｏｒｃおよびｒｏｒａ中のＮｆｉｌ３の推定結合部位（左側パネル）；Ｔｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＮＦＩＬ３とその推定結合部位との相互作用のＣｈＩＰ分析（右側パネル）。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｍ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｒｏｒｃおよびｒｏｒａ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｎ、ｏ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化され、対照またはｎｆｉｌ３コードレトロウイルスにより形質導���されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７発現（ｎ）ならびにｒｏｒｃおよびｉｌ１７発現（ｏ）のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｐ、ｑ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化された野生型マウスおよびＮＦＩＬ３欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７発現（ｐ）ならびにｒｏｒｃおよびｉｌ１７発現（ｑ）のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｒ）野生型、ＭＴＮＲ１Ａ−ＲＥＶ−ＥＲＢαまたはＮＦＩＬ３欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞により再構成され、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５により免疫化され、ビヒクルまたはメラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）により処理されたＲＡＧ−１欠損マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７およびＩＦＮ−γ発現のフローサイトメトリー分析。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。図１１も参照。
【図６】メラトニンは、Ｔｒ１細胞分化を増強する。（ａ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のＴｒ１分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のｉｌ１０、ａｈｒおよびｍａｆ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５（ｂ）インビトロ抑制アッセイ、ａと同様の処理または非処理の分化Ｔｒ１細胞を、ＣＳＦＥにより既に標識されたＣＤ４＋Ｔ細胞と７２時間後に同時培養し、４８時間後にフローサイトメトリーにより増殖サイクル（ＣＳＦＥ希釈）を測定した。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｃ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）、アゴメラチン（２０ｎｇ／ｍｌ、ＭＴＮＲ１Ａリガンド）およびＣＧＰ５２６０８（２０ｎｇ／ｍｌ、ＲＯＲ−αリガンド）の存在または不存在下のＴｒ１分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１０発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｄ）ｃと同様に培養されたＴｒ１細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）野生型マウスおよびＭＴＮＲ１Ａ欠損マウスにおけるｃと同様のｉｌ１０発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）ＵＯ１２６を添加し、または添加せずにメラトニン処理されたＴｒ１細胞中のｉｌ１０のＲＴ−ＰＣＲ発現。データは、５つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。ビヒクルおよびシグナリングインヒビター対照条件に対する対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。ＵＯ１２６処理条件のビヒクルに対する＊＊Ｐ＜０．０５。（ｇ）野生型マウスおよびＲＯＲ−α欠損マウスにおけるｃと同様のＩＬ−１０発現のフローサイトメトリー分析。（ｈ）ｉｌ１０プロモーター中に存在するＲＯＲ−α推定結合部位（下段パネル）、および抗ＲＯＲ−αによるクロマチン免疫沈降（上段パネル）。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｉ）ｉｌ１０プロモーターのためのルシフェラーゼレポーター構築物により形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞のルシフェラーゼ活性。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。対応のないＴ検定の＊Ｐ＜０．０５。（ｊ）Ｔｒ１細胞中のメラトニンの効果を示す模式図。
【図７】メラトニン依存性ＥＡＥ改善に関与する機序。図２に関して、（Ａ）疾患誘導から１５日目に開始してビヒクル（またはメラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）により処理されたＣ５７／Ｂ６のＥＡＥ発症。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）（ｎＲの１０匹のマウス／群）。中央パネルのｐ値は、反復測定混合効果モデルにおける処理の効果に対応する。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）疾患のピークにおけるビヒクルまたはメラトニン処理マウスのＣＮＳからのＩＬ−１７＋、ＩＬ１０＋、ＩＦＮ−ｇ＋およびＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋細胞のフローサイトメトリー分析。１群当たり少なくとも４匹のマウスを分析し、データを平均±ＳＥＭとして提示する。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）疾患のピークにおけるビヒクルまたはメラトニン処理マウスからの脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｇｄＴ細胞およびＬｉｎ−ＣＤ９０＋ＣＤ１２７＋ＩＬ１７＋ＩＬ２２＋自然リンパ球（ＩＬＣ）のフローサイトメトリー分析。１群当たり少なくとも４匹のマウスを分析し、データを平均±ＳＥＭとして提示する。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）ＥＡＥの臨床的ピークにおける対照またはメラトニン処理マウスのＣＮＳからのＩＬ−１７＋、ＩＬ−１７＋−ＩＦＮ−ｇ＋、ＩＬ−１７＋−ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析（総数）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）抗原提示細胞およびＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下でインビトロで培養された２Ｄ２＋Ｔ細胞の上清中のＩＬ１７、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−ｇ。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｆ）ビヒクルまたはメラトニンの存在下の抗体ＣＤ３およびＣＤ２８による３日間の刺激後のヨウ化プロピジウム＋およびアネキシンＶ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）ビヒクルおよびメラトニン２０ｎｇ／ｍｌの存在下で（Ｆ）に記載のとおり活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＢｃｌ−ｘｌおよびアクチンのイムノブロット分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。（Ｈ）メラトニンおよび対照またはＩＬ−１０遮断抗体の存在下でＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊ｐ＜０．０５。
【図８】メラトニンは、ヒトＴｈ１７細胞分化を妨害する。図３に関して、（Ａ）メラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｈ１７分化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−２３）中のＩＬ−１７発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）ａと同様にメラトニン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびアゴメラチン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下のヒトＴｈ１７分化ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７のＥＬＩＳＡによるサイトカイン定量。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ａと同様に培養されたＴｈ１７細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊ｐ＜０．０５。
【図９】メラトニンは、Ｔｈ１７細胞分化を選択的に妨害し、Ｔｒ１生成を増強する。図４に関して、（ＡおよびＢ）ビヒクルまたはメラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７（Ａ）またはＴｈ１（Ｂ）極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡの＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ビヒクルまたはメラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＲＯＲｇｔ発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）ビヒクルまたはメラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔ発現のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびｓ．ｅ．ｍ．）。（Ｅ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）を添加し、または添加せずに、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒ１およびＦｏｘＰ３＋ｉＴｒｅｇ細胞の分化に有利な極性化条件下で３日間活性化されたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞のフローサイトメトリー分析。データは、３つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｆ）（Ｅ）に記載のとおり培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞中の遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。
【図１０】メラトニンおよび関連薬物は、Ｔｈ１７細胞分化に影響する。図４に関して、（ＡおよびＢ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）および対照またはＩＬ−２遮断抗体の存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｒｏｒｃ（Ａ）およびｉｌ１７（Ｂ）発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ１７またはＴｒ１極性化条件下で３日間活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞中のＭＴＮＲ１Ａの発現のイムノブロット分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。（Ｄ）３日間のインビトロ分化後の異なるＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット中のｒｏｒａ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、５つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。(Ｅ）ＲＯＲａをコードする構築物およびＲＯＲａ応答性ｂｍａｌプロモーターのためのルシフェラーゼレポーター構築物により同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中のルシフェラーゼ活性。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（Ｆ）ビヒクル、メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）およびラメルテオン（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴｈ０またはＴｈ１７極性化条件下で活性化されたネズミＣＤ４＋Ｔ細胞の上清中のＩＬ１７およびＩＬ−１０。（Ｇ）（Ｆ）と同様に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｒｏｒｃおよびｉｌ１７発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。（ＨおよびＩ）Ｔｈ１７極性化条件下で活性化され、ビヒクル、メラトニン（２ｎｇ／ｍｌ）またはアゴメラチン（２０ｎｇ／ｍｌ）により処理された野生型またはＭＴＮＲ１Ａ  ＫＯ  ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＥｒｋ１／２リン酸化のフローサイトメトリー分析のホスホ／総Ｅｒｋ比の割合（Ｈ）およびＭＦＩ比（Ｉ）。データは、２つの独立実験の代表値である（平均およびＳＥＭ）。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。
【図１１】図５に関して、ＥＡＥにおけるメラトニン効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＭＴＮＲ１ＡおよびＮｆｉｌ３により媒介される。野生型、ＭＴＮＲ１ＡまたはＮＦＩＬ３欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞により再構成され、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５により免疫化され、ビヒクルまたはメラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）により処理されたＲＡＧ−１欠損マウスのＣＮＳからのＣＤ４＋Ｔ細胞中のｒｏｒｃ、ｉｌ１７およびｃｓｆ２発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。
【図１２】ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ＲＥＶ−ＥＲＢアルファアゴニストＳＲ９００９（５マイクロモル）の存在または不存在下でＴＦＧ−ｂ、ＩＬ−６（０時間）、およびＩＬ−２３（４８時間）の添加によりＴｈ１７細胞に分化させ、７２時間後にＲＴ−ＰＣＲにより分析した。対応のないｔ検定の＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
強力な疫学的証拠により、ＭＳ再発の軽減におけるビタミンＤの役割が支持されている（Ａｓｃｈｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ビタミンＤレベルは、ＭＳ患者における再発発生がピークを示す春季および夏季の間により高いことが際立っている。したがって、より低いビタミンＤレベルを特徴とする季節における再発のより低い発生は「季節性パラドックス」を表し：再発は、ビタミンＤレベルがより高い春季および夏季にはより低頻度であるはずであるが、数例の例外（Ｌｏｋｅｎ−Ａｍｓｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を除き、ほとんどの研究において依然として逆のことが見出されている（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本発明者らのデータは、ＭＳにおける免疫応答の追加の調節因子としての、日長の季節性変動によりレベルが調節されるメラトニンを同定することにより、このパラドックスを解明し得る。夜間勤務は、より低い全メラトニンレベルを伴い（Ｓｃｈｅｒｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＭＳを発症するリスクを増加させることに留意されたい（Ｈｅｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらの知見は、メラトニンがＭＳリスク因子でもあり得ることを示唆し；メラトニンレベルおよびＭＳ発症リスク間の関係が、目下の調査の焦点である。最後に、異なる地理的位置におけるメラトニンおよびＭＳに影響を及ぼすことが公知の他の季節性環境因子、例えば、ビタミンＤ間の相互作用が、依然としてさらに解明されるべきである。
【００３１】
自己免疫障害の罹患率の過去５０年間の上昇は大流行の域に達しており、遺伝的リスクのみによっては説明することができない。したがって、環境因子ならびに免疫応答および特にＴ細胞分化に対するそれらの影響への留意が増加している。例えば、家庭用品中に存在するいくつかの化合物は、アリール炭化水素受容体を活性化させ、Ｔｈ１７および制御性細胞分化の両方に影響を及ぼし得（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）；西洋式の食事および加工食品中のナトリウムは、Ｔｈ１７細胞分化を向上させ得（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）；片利共生微生物叢の組成物は、Ｔ細胞分化および応答に影響を及ぼし（Ｌａｔｈｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）；日光曝露の欠落および食習慣は、ビタミンＤレベルを縮小させ、制御性Ｔ細胞機能に影響し得る（Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。これらの環境因子のそれぞれは異なるシグナリング経路に作用し、それらの間の複合的な相互作用の研究は、免疫系に対する環境の効果を明らかにし得る。
【００３２】
炎症促進性Ｔｈ１７細胞は、ＥＡＥおよびＭＳの病因に寄与すると考えられている（Ｍｉｏｓｓｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｔｈ１７細胞分化はＲＯＲ−αおよびＲＯＲ−γｔにより調節され、Ｔｈ１７細胞を標的化する治療法がＭＳおよび他の自己免疫疾患において現在試験されており、予備的な有望な結果を示している（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｌ．Ｐ．Ｂａｅｔｅｎ  ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ，２０１３）。メラトニンは、ＲＯＲ−αを活性化させる潜在性を有するにもかかわらず、ＮＦＩＬ３依存的にその膜受容体を介してＴｈ１７細胞の生成を抑制する。興味深いことに、近年、概日時計が、類似のＮＦＩＬ３依存性機序を介して夜間のＴｈ１７発生を抑制することが示された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本発明者らの研究は、Ｔｈ１７細胞に加え、Ｔｒ１細胞もＥｒｋ１／２−およびＲＯＲ−α依存的に夜間にメラトニンにより調節されることを示唆する。松果腺によるメラトニン産生および日光によるその調節の高度な進化的保存（Ｍａｃｃｈｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，２００４）に基づくと、免疫応答に対するメラトニンの概日および季節性効果は、進化間のその正の選択を推進する生理学的役割を担う可能性が高い。
【００３３】
Ｔｒ１細胞は、ＩＬ−１０の産生を特徴とする（Ｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＡｈＲ、ｃ−ＭａｆおよびＥｒｋ１／２は、Ｔｒ１細胞発生およびＩＬ−１０発現を調節する（Ａｐｅｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇａｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。本研究は、メラトニンが、Ｔ細胞およびＤＣ中のＩＬ−１０発現を制御することが既に記載されているＥｒｋ１／２シグナリング（Ｓａｒａｉｖａ  ａｎｄ  Ｏ’Ｇａｒｒａ，２０１０）を活性化させることによりＴｒ１細胞分化を促進することを示す。本発明者らは、Ｔｒ１細胞中のメラトニンの効果の媒介因子としてのＲＯＲ−αも同定した。したがって、これらのデータは、メラトニンが複数の経路を利用してＴｒ１細胞分化を増強することを示唆する。
【００３４】
炎症促進性および制御性細胞間の相互作用は、自己免疫疾患、例えば、ＭＳの発症を制御する。ここで、本発明者らは、レベルが季節性変動を示すメラトニンが、病原性および制御性Ｔ細胞間のバランスを制御することを報告する。本データは、治療的免疫調節のための潜在的標的としてのメラトニン依存性シグナリングを同定する。
【００３５】
治療方法
本明細書において示されるとおり、メラトニンは、そのレベルが季節性変動を示し、病原性および制御性Ｔ細胞間のバランスを制御し、病原性Ｔｈ１７細胞が増加レベルにおいて存在し、および／または増加活性を有する自己免疫疾患、例えば、ＭＳを改善し得る。本明細書に記載の組成物および方法を使用する治療から利益を受け得る他の自己免疫病態としては、限定されるものではないが、例えば、アジソン病、脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、糖尿病（例えば、Ｉ型）、自律神経障害、子宮内膜症、好酸球増加筋痛症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛、症候群／線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症（脊椎関節炎）、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。一部の実施形態において、自己免疫疾患は、ＩＢＤ、クローン病、脊椎関節炎、全身性エリテマトーデス、白斑、関節リウマチ、乾癬、シェーグレン症候群、または糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病であり、それらは全てＴｈ１７細胞機能不全に結びつけられている（例えば、Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；２７：４８５−５１７Ｄｏｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４）２４：９０１−９０３；Ｚａｍｂｒａｎｏ−Ｚａｒａｇｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｎｆｌａｍ．２０１４；２０１４：６５１５０３；Ｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｋｏｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２（２０１２），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８１９４６７，１０  ｐａｇｅｓ，ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１２／８１９４６７；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９（１）：１０−１９（２０１５）参照。
【００３６】
本明細書に記載の方法は、メラトニン受容体、例えば、ＭＴＮＲ１Ａのアゴニストを使用する自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）の治療を含む。したがって、一部の実施形態において、障害は、ＭＳである。本方法は、メラトニンレベルがより低い春季および夏季の間に特に有用であるが、常に使用することができる。
【００３７】
一部の実施形態において、ある者が自己免疫疾患、例えば、ＭＳを有することが決定されたら、治療有効量のメラトニンアゴニストの投与を含む治療を施すことができる。これらの方法は、対象から試料を得ること、ならびに試料中のメラトニンの存在および／またはレベルを評価すること、ならびにその存在および／またはレベルと、１つ以上の参照、例えば、メラトニンの正常レベル、例えば、冬季に関連する対象におけるレベルを表す対照参照および／または夏季に関連するメラトニンのレベルを表す患部参照とを比較することも含み得る。参照レベル未満のメラトニンのレベルの存在は、対象をメラトニンアゴニストにより治療すべきであることを示す。これらの方法を使用してある者がメラトニンアゴニストによる治療から利益を受けるか否かを予測することもでき；参照レベル未満のメラトニンのレベルを有する対象は、参照レベルを超えるメラトニンのレベルを有する対象よりもメラトニンアゴニストによる治療から利益を受ける可能性が高い。さらに、本方法は、対象のための治療の選択に使用することができ；メラトニンアゴニストによる治療は、参照レベル未満のメラトニンのレベルを有する対象のために選択する。一部の実施形態において、対象は、その自己免疫疾患、例えば、ＭＳの季節性悪化に伴う１つ以上の症状を有し、低いメラトニンレベルを有し、低メラトニンの季節が生じており、もしくは生じつつある気候中で生活しており、またはメラトニンレベルが通常低い気候（例えば、熱帯性気候）中で生活している。
【００３８】
一般に、本方法は、本明細書に記載の治療有効量のメラトニンアゴニストを、そのような治療が必要とされる対象、または必要であると決定された対象に投与することを含む。本文脈において使用される「治療する」ことは、自己免疫疾患、例えば、ＭＳの季節性悪化に伴う障害の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。治療は、自己免疫疾患、例えば、ＭＳの１つ以上の症状、例えば、うつ病および疲労、膀胱機能不全、痙性、疼痛、運動失調、および企図振戦の軽減をもたらし得る。治療有効量は、急性エピソードの発症を予防するため、または急性エピソードの持続期間を短縮するため、または１つ以上の症状、例えば、熱感、核間性眼筋麻痺、視神経炎、およびレールミット症状の重症度を減少させるために十分な量であり得る。一部の実施形態において、治療有効量は、例えば、ＭＲＩ上で実証される対象の脳、視神経および脊髄の１つ以上における脱髄病変の出現を予防し、または成長（すなわち、サイズ増加）を遅延させ、もしくは予防し、またはその治癒を促進するために十分な量である。
【００３９】
再発寛解型および進行型ＭＳ
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳは、典型的には、ＣＮＳ中の病変により引き起こされる再発または慢性進行型神経機能不全を臨床的特徴とする。病理学的には、病変は、脳、視神経、および脊髄を侵す脱髄の複数の区域を含む。根本的な病因は不明であるが、ＭＳは、少なくとも部分的には自己免疫または免疫媒介疾患と広く考えられている。
【００４０】
患者の８５％において、ＭＳは、最初に、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する急性自己免疫攻撃の後に完全回復が続く再発寛解過程（ＲＲＭＳ）を生じる（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ  ３７２，１５０２−１５１７（２００８））。ＲＲＭＳ患者の大多数は、神経障害の進行型不可逆性蓄積を特徴とする二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）の発症に移る（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。ＳＰＭＳを特徴付ける進行型および不可逆性障害は、新たな炎症性病変の不存在下で生じ、そのことは、他の機序がＭＳのこの段階における役割を担い得ることを示唆する（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。いくつかの治療法がＲＲＭＳに対して好ましい効果を示すが、それらは通常、ＳＰＭＳにおいて有効でなく、ＳＰＭＳへの移行をモニタリングするためのマーカーは利用可能でない。実際、適応炎症性応答を停止させる治療は、ＲＲＭＳの管理に対して好ましい効果を示すが、通常、ＳＰＭＳにおいて有効でない（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉｅｇｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，９０９−９２５（２００８））。したがって、進行型ＭＳのための新たな治療法およびＲＲＭＳからＳＰＭＳの移行をモニタリングするためのバイオマーカーを同定するため、ＳＰＭＳへの移行に関与するプロセスを特徴付けすることが重要である。
【００４１】
二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）は、多発性硬化症の４つの国際的に承認された形態の１つであり（他は、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および進行再発型多発性硬化症である）、多重再発ならびにマイナーな寛解およびプラトーを伴い、または伴わない臨床的神経損傷の着実な進行を特徴とする。ＳＰＭＳ発症者は、一般に、一定期間の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）に既に罹患しており、それは２から４０年以上続くことがある。対象は、ＳＰＭＳの発症後にいくつかの再発および寛解を有するが、それらは経時的に低頻度になる傾向があることもある。
【００４２】
一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）は相対的に希少であり（ＭＳ患者集団の約１５％）、疾患の発症からの緩慢な進行型の能力消失を特徴とする。ほとんどのＰＰＭＳ患者は、進行型ミエロパシーまたは進行型脳機能不全を有する。
【００４３】
ＭＳの診断、およびサブタイプの決定は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、空間および時間的に消失したＣＮＳ病変の存在および代替診断の排除に基づき行うことができる（Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１２２：１９６５；５５２−５６８）。あるいは、診断は、臨床的徴候および症状、例として、熱感、核間性眼筋麻痺、視神経炎、およびレールミット症状の存在に基づき行うことができる（例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１；５０：１２１；およびＰｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：２００５  Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ“ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ．”Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００５；５８：８４０−８４６参照）。
【００４４】
ＭＳの障害度を定量する方法としては、クルツケ総合障害度スケール（Ｋｕｒｔｚｋｅ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ）（ＥＤＳＳ）；ＭＲＩスキャニング；スクリップス神経評定スケール（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）（ＳＮＲＳ）；クルップ疲労重症度スケール（Ｋｒｕｐｐ  Ｆａｔｉｇｕｅ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃａｌｅ）（ＦＳＳ）；不能状態スケール（Ｉｎｃａｐａｃｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ）（ＩＳＳ）；機能的自立度評価法（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅ）（ＦＩＭ）；歩行指数（Ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）（ＡＩ）；ケンブリッジ多発性硬化症基礎スコア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｏｒｅ）（ＣＡＭＢＳ）；多発性硬化症の機能的評価（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＦＡＭＳ）；感情プロファイル検査（Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｏｄ  Ｓｔａｔｅｓ）（ＰＯＭＳ）；および疾病影響プロファイル（Ｓｉｃｋｎｅｓｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）（ＳＩＰ）が挙げられる。
【００４５】
ＭＳ、および進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＭＰＳの診断および治療に関するさらなる情報は、例えば、当技術分野、例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００９  Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；１２（４）：２２６−２３０；およびＳｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（Ｄｅｍｏｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，２００３）、例えば、Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｖ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３２，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”に見出される。一般に、本明細書に記載の方法は、任意の哺乳動物、好ましくは、ヒトに実施することができる。
【００４６】
メラトニンアゴニスト
本明細書に記載の方法において有用なメラトニンアゴニストとしては、例えば、不眠症を治療するメラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン、ＣＡＳ７３−３１−４）（Ｓｉｇｍａ）；Ｃｉｒｃａｄｉｎ／Ｎｅｕｒｉｎ／ＰＲＭ（徐放性メラトニンとしても公知）（Ｎｅｕｒｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ）、抗うつ薬として使用され、ＭＴ１およびＭＴ２受容体の両方についてのアゴニストであるアゴメラチン／Ｖａｌｄｏｘａｎ／Ｓ−２００９８（（Ｎ−［２−（７−メトキシ−１−ナフタレニル）エチル］−アセトアミド；ＣＡＳ１３８１１２−７６−２）（Ｓｅｒｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；Ｎ−アセチルセロトニン（ＮＡＳ）；ジメトキシプリオピオンアミド（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｒｉｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）９８（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂ）；ＴＡＫ−３７５／ラメルテオン／Ｒｏｚｅｒｅｍ（Ｎ−［２−［（８Ｓ）−２，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｅ］［１］ベンゾフラン−８−イル］エチル］プロパンアミド；ＣＡＳ１９６５９７−２６−９））（Ｔａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、タシメルテオン／Ｈｅｔｌｉｏｚ（Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｒ）−２−（２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−４−イル）シクロプロピル］メチル］プロパンアミド））（Ｖａｎｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられ、それは、大うつ障害を治療する。ルジンドール（Ｎ−［２−（２−ベンジル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アセトアミド）は、ＭＴ２メラトニン受容体についての１５から２５倍高い親和性を有する非選択的リガンドであり、４Ｐ−ＰＤＯＴ  Ｎ−（４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロパンアミドまたはＮ−［（２Ｓ，４Ｓ）−４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−イル］プロパンアミドまたはＮ−［（２Ｒ，４Ｒ）−４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−イル］プロパンアミド）は、選択的ＭＴ２リガンドであり；ＩＩＫ７（Ｎ−ブタノイル−２−（２−メトキシ−６Ｈ−イソインドロ［２，１−ａ］インドール−１１−イル）−エタンアミン（Ｓｉｇｍａ）、ベンラファキシンまたはＥｆｆｅｘｏｒ（１−［２−（ジメチルアミノ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］シクロヘキサン−１−オール；塩酸塩）；ＣＡＳ９９３００−７８−４）（Ｓｉｇｍａ）；および関連ＳＳＲＩ。メラトニン受容体アンタゴニストとしては、以下のものも挙げられる：ＢＭＳ−２１４７７８（Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｒ）−２−（２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−４−イル）シクロプロピル］メチル］プロパンアミド）；セルタリン（Ｓｅｒｔａｌｉｎｅ）４（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−アミン；パロキセチン（３Ｓ，４Ｒ）−３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルオキシメチル）−４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン；フルオキセチン（Ｎ−メチル−３−フェニル−３−［４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］プロパン−１−アミン）��ＡＭＭＴＣ（Ｎ−［（６−メトキシ−９−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−４−イル）メチル］アセトアミド）。小分子ＭＴ１および２特異的受容体アゴニストのさらなる例は、米国特許出願公開第２０１４００１１８４９号明細書；国際公開第２００７１４８８０８号パンフレット（メラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン））；米国特許出願公開第２００９００４２８６１号明細書；国際公開第２００６１０７０１９Ａ１号パンフレット（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）；米国特許出願第１３／７５１，０１１号明細書；米国特許出願第１４／６８８，３０１号明細書および米国特許出願公開第２０１４０３５７７１０号明細書（（Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｒ）−２−（２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−４−イル）シクロプロピル］メチル］プロパンアミド））；米国特許出願公開第２００５０１６４９８７号明細書／国際公開第２００５０６３２９７号パンフレット（ＭＬ−２３またはＮ−［２−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−２，４−ジニトロアニリン）；米国特許出願公開第２００５０１３７２４７号明細書（ＬＹ−１５６７３５；ＢＭＳ−２１４７７８）；米国特許第８８５９５９３号明細書；米国特許第８３８９５４４号明細書；米国特許出願公開第２００９０２０９６３８号明細書、国際公開第２００７１３７２４７号パンフレットおよび国際公開第２０１１１２６９４８号パンフレットに見出すことができる。
【００４７】
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストは、ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［５，４−ｂ］フラン−８−イル）エチル］プロピオンアミド）、アゴメラチン（Ｎ−［２−（７−メトキシナフタレン−１−イル）エチル］アセトアミド）、タシメルテオン（（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル）シクロプロピルメチル］プロパンアミド）、またはＴＩＫ−３０１（ＬＹ−１５６７３５）（Ｎ−［（２Ｒ）−（６−クロロ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）プロピル］アセトアミド）である。
【００４８】
一部の実施形態において、本方法は、他の活性としてメラトニン合成における役割を担うＡＡ−ＮＡＴ（アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）および／またはＨＩＯＭＴ（ヒドロキシインドール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）のアゴニストを投与することを含む。これらとしては、アンジオテンシン受容体アゴニスト、例えば、Ｌ−１６２，３１３（（５，７−ジメチル−２−エチル−３−［［４−［２（ｎ−ブチルオキシカルボニルスルホンアミド）−５−イソブチル−３−チエニル］フェニル］メチル］−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン））および［Ｖａｌ５］−アンジオテンシンＩＩ酢酸塩水和物を挙げることができる。
【００４９】
ＲＥＶ−ＥＲＢ／ＲＯＲアゴニスト
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストに加え、またはその代替物として、本方法は、ＲＥＶ−ＥＲＢ（例えば、ＲＥＶ−ＥＲＢαおよび／またはＲＥＶ−ＥＲＢβの）および／またはレチノイン酸受容体関連オーファン受容体のアゴニスト（ＲＯＲ、例えば、ＲＯＲα、ＲＯＲβおよび／またはＲＯＲγアゴニスト）を投与することを含み、その多数が当技術分野において公知である。例えば、本方法は、天然ＲＥＶ−ＥＲＢ／ＲＯＲリガンド、例えば、ヘム；コレステロール／硫酸コレステロール；７α−ヒドロキシコレステロール；７β−ヒドロキシコレステロール；７−ケトコレステロール；２０α−ヒドロキシコレステロール；２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール；２５−ヒドロキシコレステロール；２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール；２４Ｒ−ヒドロキシコレステロール；２４，２５−エポキシコレステロール；ステアリン酸；オールトランスレチノイン酸；ネオルスコゲニン；または（２５Ｓ）−ルスコゲニンの投与を含み（または排除し）得る。あるいは、またはさらに、本方法は、合成ＲＥＶ−ＥＲＢリガンド、例えば、ＧＳＫ４１１２、ＳＲ９００９；ＳＲ９０１１；ＧＳＫ２９４５；ＧＳＫ０９９９；ＧＳＫ５０７２；および／またはＧＳ２６６７；および／または合成ＲＯＲリガンド、例えば、Ｔ０９０１３１７；ＳＲ１０７８；ＳＲ３３３５（ＳＲ３３３５／ＭＬ１７６としても公知）；ＳＲ１００１；ＳＲ２２１１；ＳＲ１５５５；ジゴキシン；ウルソル酸；ＭＬ２０９；および／またはＺｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８２，５８３−５９０（２０１２）に記載の化合物（例えば、化合物１ａ；化合物１ｂ：Ｎ−（４，６−ジメチルベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−３−メチルチオフェン−２−カルボキサミド；化合物１ｃ：Ｎ−（２−（４−エチルフェニル）−２Ｈ−ベンゾ−［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−５−イル）プロピオンアミド；および／またはインヒビターＹ：Ｎ−（５−ベンゾイル−４−フェニルチアゾール−２−イル）−２−（４−（エチルスルホニル）フェニル）アセトアミドの投与を含み得る。例えば、Ｋｏｊｅｔｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １３，１９７−２１６（２０１４）参照。
【００５０】
標準的治療
一部の実施形態において、メラトニンアゴニストを含む本明細書に記載の治療は、ＭＳのための標準的治療、例えば、コルチコステロイド療法、インターフェロンベータ−１ｂ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、フィンゴリモド、テリフルノミド、ジメチルフマレート、ナタリズマブ、大麻、またはそれらの組合せの施与との組合せで施す。一部の実施形態において、本明細書に記載の治療は、ＭＳの１つ以上の症状、例えば、うつ病および疲労、膀胱機能不全、痙性、疼痛、運動失調、および企図振戦のための治療との組合せで施し、そのような治療としては、薬理物質、運動、および適切な矯正器具が挙げられる。ＭＳの診断および治療に関する追加の情報は、ｎａｔｉｏｎａｌｍｓｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇにおけるワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙのウェブサイトにおいて見出すことができる。
【００５１】
一部の実施形態において、規定の期間内に対象がＭＳの季節性悪化を有し、またはそれを発症する可能性が高いと、例えば、参照レベル未満のメラトニンのレベルを有すると同定される場合、例えば、ミトキサントロンまたはナタリズマブを含む進行型ＭＳのための治療を施す。
【００５２】
医薬組成物
本明細書に記載の方法は、活性成分としてのメラトニンアゴニストを含む医薬組成物の製造および使用を含む。医薬組成物自体も含まれる。
【００５３】
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される語「薬学的に許容可能な担体」は、医薬投与と適合性である生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物を組成物中に取り込むこともできる。
【００５４】
医薬組成物は、典型的には、意図される投与経路と適合性であるように配合される。本方法において特に有用な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内）、髄腔内、経口、および経鼻腔または鼻腔内（例えば、点滴薬または吸入薬としての投与による）投与が挙げられる。血液脳関門を横断しない化合物については、例えば、髄腔内ポンプ（例えば、Ｂｏｒｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ２０１４；９５：１０３２−８；Ｐｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１５１７−２１（１９８９）；およびＲｅｚａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ２０１３；１６：４１５−４１７参照）またはナノ粒子、例えば、金ナノ粒子（例えば、グルコースコーティング金ナノ粒子、例えば、Ｇｒｏｍｎｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（１２）：ｅ８１０４３参照）の移植を使用するＣＮＳまたはＣＳＦ中への直接送達を使用することができる。好適な医薬組成物を配合および送達する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）；およびＡｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）の一連の書籍参照。
【００５５】
注射使用に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末を含み得る。静脈内投与については、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射器利用性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対抗して保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによりもたらすことができる。
【００５６】
無菌注射溶液は、適宜、上記列挙の成分の１つまたはその組合せを有する適切な溶媒中に要求量の活性化合物を取り込み、次いで滅菌濾過することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および要求される上記列挙の他の成分を含有する無菌ビヒクル中に取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望成分の粉末を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００５７】
経口投与については、組成物は、不活性希釈剤または食用担体と配合することができる。経口治療投与の目的のため、活性化合物は、賦形剤と取り込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、洗口液として使用される流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性である結合剤、および／または補助材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似性質の化合物を含有し得る：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバリング。
【００５８】
吸入による投与のため、化合物は、好適な噴射剤、例えば、ガス、例えば、二酸化炭素を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載のものが挙げられる。
【００５９】
核酸であり、またはそれを含む治療化合物は、核酸剤、例えば、ＤＮＡワクチンの投与に好適な任意の方法により投与することができる。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター（ｂｉｏ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、および皮膚貼付剤ならびにニードルフリー法、例えば、米国特許第６，１９４，３８９号明細書に開示される微粒子ＤＮＡワクチン技術、および米国特許第６，１６８，５８７号明細書に開示される粉末形態ワクチンを用いる哺乳動物経皮ニードルフリーワクチン接種が挙げられる。さらに、とりわけ、Ｈａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０（１９９８）に記載のとおり鼻腔内送達が考えられる。
【００６０】
リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書に記載）およびマイクロ封入を使用して本明細書に記載の化合物を送達することもできる。生分解性巨大分子送達系を使用することもできる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書に記載）。
【００６１】
一実施形態において、治療化合物は、体内からの急速な排除から治療化合物を保護する担体、例えば、制御放出配合物、例として、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を用いて調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような配合物は、標準的技術を使用して調製し、または市場から、例えば、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から得ることができる。リポソーム懸濁液（細胞抗原に対するモノクローナル抗体により選択細胞に標的化されるリポソームを含む）を、薬学的に許容可能な担体として使用することもできる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載のものにより調製することができる。
【００６２】
医薬組成物は、投与についての説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサー、例えば、単回用量ディスペンサー中に含めることができる。容器、パック、またはディスペンサーは、例えば、１日、１週間、または１ヵ月の治療のための十分な単回用量ディスペンサーを含み得るキットの一部として含めることもできる。
【００６３】
投与量
化合物の投与量、毒性および治療効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療有効用量）を決定するための、例えば、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性および治療効果間の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができる一方、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより副作用を軽減するようにそのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するように留意すべきである。
【００６４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投与量の配合において使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、毒性はわずかであり、または存在しない。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて配合することができる。このような情報を使用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００６５】
「有効量」は、有益または所望の結果を生じさせるために十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療結果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防するために必要な量である予防有効量と同一でも異なっていてもよい。有効量は、１つ以上の投与、適用または投与量で投与することができる。組成物の治療有効量は、選択される組成物に依存する。組成物は、１日１回以上から１週間に１回以上；例として、１日おきに１回投与することができる。当業者は、ある因子、例として、限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、前治療、全身健康状態および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患が対象を効率的に治療するために要求される投与量およびタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量の本明細書に記載の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。
【実施例】
【００６６】
本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
実験手順
以下の材料および方法を、下記の実施例において使用した。
患者。マクドナルド基準（Ｐｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）による再発寛解型ＭＳを有する継続患者を、同一年の９月から１１月の間にＲａｕｌ  Ｃａｒｒｅａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＦＬＥＮＩ）におけるＭＳ診療所から採用した。全ての患者は、ブエノスアイレス市内（緯度３４．６°Ｓ、経度５８．４°Ｗ）で生活していた。血清および早朝第１尿をそれぞれの季節において２０１１〜２０１２年の間に午前８時から９時の間に回収し、−８０℃において貯蔵した。２６人の再発寛解型ＭＳ患者の第２のコホートは、２０１５年の１月から２月の間に採用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離およびメラトニン測定のために血清および全血を午前８時から９時の間に回収した。それぞれの試料について、回収および処理の正確な日付および時間を記録した。季節は、南半球に従って以下のとおり定義した：夏季（１月〜３月）、秋季（４月〜６月）、冬季（７月〜９月）、春季（１０月〜１２月）。試験プロトコルは施設倫理委員会により承認され、全ての対象はインフォームドコンセントフォームに署名した。
【００６８】
動物およびＥＡＥ。ＥＡＥは、以下のとおり誘導した：マウスを、１００μｇのＭＯＧ３５−５５および５００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抽出物Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）により免疫化した。０および２日目にマウスに２００ｎｇの百日咳毒素も腹腔内注射した。メラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（０．０１％のＤＭＳＯ）を毎日午後７時に投与した。
【００６９】
フローサイトメトリー染色および収集。細胞内サイトカイン染色のため、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびモネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ；１μｇ／ｍｌ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を３７℃において４時間刺激した。表面マーカーについて染色した後、製造業者の説明書（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って細胞を固定し、透過性にした。サイトカインに対する全ての抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製であった。全ての実験は、同一の時間（午前８〜９時）に開始した。データは、ＬＳＲＩＩまたはＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により回収し、次いでＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）により分析した。
【００７０】
サイトカインの測定。分泌されたサイトカインを、既に記載の酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｆａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）により７２〜９６時間後に組織培養上清中で測定した。
【００７１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）により抽出し、次いで製造業者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲ用テンプレートとして使用した。全てのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供され、それをＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で使用した。発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの発現に対して正規化した。
【００７２】
イムノブロット分析。イムノブロット分析のため、プロテアーゼインヒビター「カクテル」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補給された放射性免疫沈降緩衝液により細胞を溶解させた。異なるＴ細胞サブセットの総溶解物（４０μｇ）を４〜１２％のビス−トリスＮｕｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に通す電気泳動により分解し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。以下の一次抗体を使用した：抗ＲＯＲ−α（Ａｂｃａｍ）；抗ＭＴＮＲ１Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗総およびホスホＥｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗総Ｃ／ＥＢＰα（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＣ／ＥＢＰα（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｎｆｉｌ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および抗ＧＡＤＰＨ（Ａｂｃａｍ）。ブロットを、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）により示されるとおりにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅにより発色させた。
【００７３】
臨床データ。臨床データは、本発明者らのＭＳ患者データベースから検索した。２００７年から２０１２年までに生じた再発数を使用して月ごとのおよび季節ごとの増悪率を計算した。増悪は、少なくとも４８時間継続し、先に安定または改善が少なくとも３０日間継続する神経学的試験により確認される新たな症状の発症または既存の症状の悪化と定義した。
【００７４】
メラトニン、ビタミンＤ、ＵＶＢおよび感染評価。Ｒａｕｌ  Ｃａｒｒｅａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＦＬＥＮＩ）の臨床実験室においてビタミンＤレベルを定量した。主なメラトニン代謝物であり、夜間メラトニンレベルとの優れた相関を有する６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ）（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、既に記載のＥＬＩＳＡ（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により測定した。一部の実験のため、競合ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して血清メラトニンを測定した。試験期間のブエノスアイレス市における上部呼吸器感染の公式報告は、政府関係者により提供された。ブエノスアイレスの位置についてのＵＶ発生量は、ＮＡＳＡ人工衛星からＧｉｏｖａｎｎｉシステム（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｃ．ｓｃｉ．ｇｓｆｃ．ｎａｓａ．ｇｏｖ／ｇｉｏｖａｎｎｉ）を介して入手した。
【００７５】
動物およびＥＡＥ。ＭＴＮＲ１ＡおよびＲＯＲ−αノックアウトマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６野生型をＬａ  Ｐｌａｔａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ獣医学部およびＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＮＦＩＬ３欠損マウスは、Ｃｈｅｎ  Ｚｈｕ氏により提供され；ＲＥＶ−ＥＲＢα欠損マウスは、Ｍｉｔｃｈ  Ｌａｚａｒ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ）により提供され、Ｃ／ＥＢＰαノックアウトマウスは、Ｄａｎｉｅｌ  Ｔｅｎｅｎ氏（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）により提供された。ＥＡＥは、以下のとおり誘導した：マウスを１００μｇのＭＯＧ３５−５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）および５００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抽出物Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）により免疫化した。０および２日目にマウスに２００ｎｇの百日咳毒素も腹腔内注射した。メラトニン（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（０．０１％のＤＭＳＯ）を毎日午後７時に投与した。全ての実験は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  ａｎｄ  ＩＢＹＭＥにおける動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）により処方された指針に従って実施した。
【００７６】
ＣＮＳ浸潤物の単離。ＣＮＳ浸潤物を記載のとおり単離した（Ｍａｓｃａｎｆｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。マウスに氷冷ＰＢＳを潅流させた。脳および脊髄を摘出し、ＩＩＩ型コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）およびＤＮアーゼ（２０単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中でインキュベートした。次いで、組織をホモジナイズし、ＣＮＳ浸潤物の濃縮のために３０％−３７％−７０％のＰｅｒｃｏｌｌ勾配上にロードした。
【００７７】
インビトロマウスＴ細胞分化。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２ＬｈｉＣＤ２５−）は、磁気ビーズ（ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した、Ｃ５７ＢＬ／６野生型、ＭＴＮＲ１Ａ、ＮＦＩＬ３、ＲＥＶ−ＥＲＢα、Ｃ／ＥＢＰα欠損またはＲＯＲα欠損マウスの脾臓およびリンパ節からのものであった。全ての実験は、午前７時から９時の間に開始した。細胞を、プレート結合抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ；１４−００３１−８６；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ；１６−０２８１−８６；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により活性化させた。Ｔｒ１細胞の生成のためにマウスＩＬ−２７（３０ｎｇ／ｍｌ；３４−８２７１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。Ｔｈ１７細胞の生成のためにＩＬ−６（３０ｎｇ／ｍｌ；４０６−ＭＬ−０２５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦ−β１（１５ｎｇ／ｍｌ；１３０−０９５−０６７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、抗ＩＬ−４（２．５μｇ／ｍｌ；Ｃ１７．８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ；ＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。２日目に組換えマウスＩＬ−２３（３０ｎｇ／ｍｌ；１８８７−ＭＬ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。一部の実験については、それに代えてＴｈ１７細胞分化のためにＩＬ−６およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；４０１−ＭＬ−０２５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＴＧＦ−β１およびＩＬ−２１（１００ｎｇ／ｍｌ；５９４−ＭＬ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。Ｔｈ１細胞の生成のためにＩＬ−１２（３０ｎｇ／ｍｌ；４１９−ＭＬ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＩＬ−４（２．５μｇ／ｍｌ；Ｃ１７．８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用した。Ｔｈ２細胞の生成のためにＩＬ−４（３０ｎｇ／ｍｌ；４０４−ＭＬ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ；ＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの生成のためにＴＧＦ−β１（１５ｎｇ／ｍｌ；１３０−０９５−０６７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した。培養の開始時および２日目にメラトニン（Ｇａｄｏｒ，Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）、アゴメラチン、およびＣＧＰ−５２６０８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、最終濃度は２〜２０ｎｇ／ｍｌとした。
【００７８】
インビトロヒトＴ細胞分化。Ｔｈ１７分化のため、磁気ビーズ（ナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりＰＢＭＣからナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３および（２μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８によりコーティングされた２４ウェルプレート中で５×１０５個の細胞／ｍｌの密度において播種し、以下のサイトカインＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ）ならびにＩＦＮ−ｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０マイクログラム／ｍｌ）に対する中和抗体の存在下で培養した。あるいは、ＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−２３（５０ｎｇ／ｍｌ）ならびにＩＦＮ−ｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０マイクログラム／ｍｌ）に対する中和抗体を使用することによりＴｈ１７細胞を分化させた。Ｔｈ１分化のため、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。
【００７９】
サイトカインの測定。分泌されたサイトカインを、既に記載の酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｆａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）により７２〜９６時間後に組織培養上清中で測定した。
【００８０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。マウス実験用プライマー−プローブ混合物は、以下のとおりであった（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製；括弧内は識別子）：ｒｏｒｃ（Ｍｍ０１２６１０２２＿ｍ１）、ｉｌ２３ｒ（Ｍｍ００５１９９４２＿ｍ１）、ｉｌ１０（Ｍｍ００４３６１４＿ｍ１）、ｉｌ１７（Ｍｍ００４３９６１９＿ｍ１）、ｉｌ２１（Ｍｍ００５１７６４０＿ｍ１）、ｒｏｒａ（Ｍｍ０１１７３７６６＿ｍ１）、ｒｏｒｃ（Ｍｍ００４４１１４４＿ｇ１）、ｆｏｘｐ３（Ｍｍ００４７５１５６＿ｍ１）、ｔｂｘ２１（Ｍｍ００４５０９６０＿ｍ１）、ｇａｔａ３（Ｍｍ００４８４６８３＿ｍ１）、ｎｒ１ｄ１（Ｍｍ００５２０７０８＿ｍ１）、ｎｆｉｌ３（Ｍｍ００６００２９２＿ｓ１）およびｇａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）。ヒト実験用プライマー−プローブ混合物は、以下のとおりであった（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製；括弧内は識別子）：ＲＯＲＣ（Ｈｓ０１０７６１２２＿ｍ１）、ＩＬ１７Ａ（Ｈｓ００１７４３８３＿ｍ１）、ＩＬ１７Ｆ（Ｈｓ００３６９４００＿ｍ１）、ＩＬ１０（Ｈｓ００９６１６２２＿ｍ１）、ＩＦＮＧ（Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１）および１８ｓ（Ｈｓ０３００３６３１＿ｇ１）。
【００８１】
クロマチン免疫沈降。細胞中のＤＮＡ−タンパク質複合体を、４％のパラホルムアルデヒドにより架橋させ、１×プロテアーゼインヒビター「カクテル」（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する０．３５ｍｌの溶解緩衝液（１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）により溶解させた。クロマチンを超音波処理によりせん断し、遠心分離後に上清を回収し、緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）中で希釈した。５μｇの抗体を、プロテインＡおよびプロテインＧ  Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に事前に少なくとも６時間結合させ、５％のＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳにより試料を３回洗浄し、次いで希釈クロマチンに添加し、次いで一晩免疫沈降させた。次いで、磁気ビーズ−クロマチン複合体を放射性免疫沈降緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．７％のデオキシコール酸Ｎａ、１％のＮＰ−４０および０．５ＭのＬｉＣｌ）中で３回洗浄し、次いでトリス−ＥＤＴＡ緩衝液により２回洗浄した。次いで、免疫沈降させたクロマチンを１％ＳＤＳおよび０．１ＭのＮａＨＣＯ３の溶液により抽出し、それをパラホルムアルデヒド架橋の反転のために６５℃において少なくとも６時間加熱した。ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）により分析した。
【００８２】
シグナリングアレイ。極性化条件下で活性化された細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．００１％）、メラトニン（２〜１０ｎｇ／ｍＬ）、アゴメラチン（２〜１０ｎｇ／ｍＬ）およびＣＧＰ−５２６０８（２〜１０ｎｇ／ｍＬ）により７２〜９６時間処理し、溶解させた。溶解物を３８４ウェルポリプロピレンプレートに移し、ソリッドスポッティングピンを備えるロボティックマイクロアレイヤー（Ｇｅｎｅｔｉｘ）によりＳｕｐｅｒ  Ｅｐｏｘｉスライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）上にスポッティングした。次いで、スライドをプロービングし、加工し、記載のとおり分析した（Ｆａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００８３】
増殖アッセイ。脾細胞を、ビヒクルまたはメラトニン処理ＷＴマウスからＭＯＧ３５−５５による免疫化の１０日後に得、ＭＯＧ３５−５５の存在下でインビトロで３日間再刺激した。細胞を、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）により最後の２４時間パルス処理した。ＩＬ−１７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＩＬ−１０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を産生するＴ細胞およびＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の頻度をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＦＳＥベース増殖アッセイのため、ＣＤ４＋Ｔ細胞を１μＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により標識した。データは、ＬＳＲＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＭａｃｓＱｕａｎｔｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）により分析した。
【００８４】
プラスミド。ＩＬ−１０プロモーターレポーターならびにＣ−ＭａｆおよびＡｈＲベクターは既に記載されており（Ａｐｅｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＲＯＲ−αを発現するベクターをＨａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌにおけるＰｌａｓｍＩＤから購入した。Ｃ／ＥＢＰα（４４６２７）およびＢｍａｌレポーター（４６８２４）をコードするベクターをＡｄｄｇｅｎｅから購入した。Ｔ細胞中のｎｆｉｌ３過剰発現に使用されるレトロウイルスは、寛大にも、Ｌａｕｒａ  Ｈｏｏｐｅｒ氏（ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）により提供された。Ｔ細胞中のｎｒ１ｄ１過剰発現に使用されるレトロウイルスは、寛大にも、Ｂａｒｔ  Ｓｔａｅｌｓ氏（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ，ＵＳＡ）により提供された。ｎｒ１ｄ１プロモーターレポーターは、寛大にも、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌａｕｄｅｎｔ氏（Ｅｃｏｌｅ  Ｎｏｒｍａｌｅ  Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒｅ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）により提供された。
【００８５】
形質移入およびルシフェラーゼアッセイ。ＨＥＫ２９３細胞を１０％のＦＢＳが補給されたＤＭＥＭ中で成長させ、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ形質移入試薬およびそれぞれ２μｇのプラスミドにより製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従って形質移入した。ホタルおよびレニンルシフェラーゼ活性を形質移入の４８時間後、およびＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）による処理の２４時間後に分析した。
【００８６】
レトロウイルス形質導入。レトロウイルス発現構築物を、ｅｃｏおよびｇａｇ−ｐｏｌウイルスエンベロープ構築物とともにヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に形質移入した。ウイルス上清を形質移入の７２時間後に回収した。レンチウイルス形質導入は、１２００ｇにおけるスピノキュレーションによりポリブレン（８μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）の存在下で３２℃において１時間実施した。
【００８７】
Ｔ細胞移植および免疫化。Ｃ５７ＢＬ／６、ＭＴＮＲ１Ａ、ＲＥＶ−ＥＲＢαおよびＮＦＩＬ３欠損マウスからのソートされた脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（マウス当たり１０×１０６個の細胞）を、ＲＡＧ−１欠損マウス中に腹腔内移植した。移植の１０日後、マウスをＣＤ４＋Ｔ細胞の再構成について確認し、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５により免疫化した。免疫化の２０日後、Ｔ細胞を単離し、サイトカインについて染色した。
【００８８】
統計的分析。ポアソン回帰モデルを使用して季節の影響、６−ＳＭレベルおよび臨床的再発数を評価し、罹患率比（ＩＲＲ）および対応する９５％の信頼区間（ＣＩ）を生成した。反復計測混合モデルを使用してＥＡＥ実験における処理の効果およびその時間との相互作用を評価した。線形回帰モデルを使用して血清メラトニンレベルおよびＩＬ−１７またはＩＬ−１０遺伝子発現間の関係を分析した。２つ以上の条件間の差をスチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定、一元配置ＡＮＯＶＡまたはウィルコクソン順位和検定により適宜分析した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。特に規定のない限り、全てのデータを平均±ＳＥＭとして提示する。全ての統計的分析は、Ｓｔａｔａ  ｖ１２（Ｓｔａｔａｃｏｒｐ  ＬＰ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【００８９】
実施例１．メラトニンレベルは、ＭＳ臨床的再発と負に相関する
本発明者らは、最初に、１３９人の再発寛解型ＭＳ患者の本発明者らのコホートにおけるＭＳ再発の季節性を確立した（表１）。ポアソン回帰モデルを使用して、本発明者らは、秋季および冬季の間に生じる再発数の３２％の軽減を検出した（罹患率比、ＩＲＲ  ０．６８２、９５％ＣＩ  ０．４９〜０．９５、Ｐ＝０．０２）。したがって、本試験において使用されたＭＳ患者コホートは、他のコホートについて既に記載されたＭＳ再発の季節性（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を示す。
【００９０】
メラトニン産生は暗所により刺激され、秋季および冬季の間により高いレベルの季節パターンに従う（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，１９９７）。メラトニンは、いくつかの生物学的プロセス、例として、概日時計および免疫応答に影響を及ぼし得る（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，１９９７）。したがって、本発明者らは、再発寛解型ＭＳ患者における６−スルファトキシメラトニン（６−ＳＭ）レベルを測定することにより、メラトニンおよびＭＳ疾患活性間の関係を調査した。６−ＳＭは、主なメラトニン代謝物であるため、早朝第１尿中のそのレベルは、夜間メラトニン分泌と強力に相関し、そのことは疫学研究におけるその使用を支持する（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ＭｃＭｕｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。従来の報告（Ｍｏｒｅｒａ  ａｎｄ  Ａｂｒｅｕ，２００７；Ｕｅｎｏ−Ｔｏｗａｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致して、本発明者らは、秋季および冬季間のメラトニン分泌の増加を検出し、春季および夏季においてレベルはより低かった（図１ａおよび表１）。さらに、本発明者らは、６−ＳＭレベルおよびＭＳ増悪率間の有意な負相関を見出した（Ｐ＜０．０１  スピアマン相関）。これは年齢および性別調整ポアソン回帰モデルにおいてさらに確認し、それぞれの６−ＳＭ単位増加について再発数は３％軽減した（ＩＲＲ  ０．９７、９５％ＣＩ  ０．９５〜０．９９、Ｐ＝０．００７）。最後に、メラトニンレベルおよび増悪率間の関係が同調したか否かを試験するため、本発明者らは、１ヵ月（ＩＲＲ  １．０１、９５％ＣＩ  ０．９７〜１．０５；Ｐ＝０．７）、２ヵ月（ＩＲＲ  １．０３、９５％ＣＩ  ０．９９〜１．０７；Ｐ＝０．１）、および３ヵ月（ＩＲＲ  １．０３、９５％ＣＩ  ０．９９〜１．０７；Ｐ＝０．７）、再発の発生を遅らせ、再発発生における遅延効果の証拠は示されなかった。
【００９１】
本発明者らはビタミンＤレベルも評価し、本発明者らの領域における健常対照およびＭＳ患者について既に報告されているとおり（Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｆａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、全レベルは、年全体にわたり低く、夏季の間により高いレベルであったが、ＭＳ再発との有意な相関は示されなかった（図１ｂ）。最後に、本発明者らは、ＭＳ再発と、追加の環境因子、例えば、国家登録およびＮＡＳＡ人工衛星によりそれぞれ決定された、報告された上部呼吸器感染およびＵＶ発生量との間の相関を検出しなかった（図１ｃ、ｄ）。したがって、秋季および冬季間のより高いメラトニンレベルは、臨床的再発の軽減に関連する。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
実施例２．メラトニンは、実験的自己免疫性脳炎を改善する
本発明者らの疫学的知見に基づき、本発明者らは、ＭＳの実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）モデルを使用してＣＮＳ炎症に対するメラトニンの効果を試験した。ナイーブＣ５７ＢＬ／６野生型マウスをＭＯＧ３５−５５により免疫化し、メラトニン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクルにより毎日処理した。メラトニン投与により、ＥＡＥ臨床的症状が改善された（図２ａ、表２および図７ａ）。ＥＡＥの改善は、脾臓、リンパ節およびＣＮＳ中のＴｈ１７細胞の数および頻度の減少に関連し；この減少は、ＥＡＥの病因に関連したＩＬ−１７＋ＩＦＮγ＋およびＩＬ−１７＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃｏｄａｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｅｌ−Ｂｅｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ）においても検出された（図２ｃ、ｄ）。本発明者らはＩＬ−１０分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の付随増加も検出し；他のＴ細胞サブセット、Ｂ細胞、γδＴ細胞または自然リンパ球（ＩＬＣ）の数においても頻度においても有意な変化は検出されなかった（図２ｂおよび図７ｂ〜ｄ）。
【００９４】
脳炎誘発性Ｔ細胞応答に対するメラトニンの効果をさらに特徴付けするため、本発明者らは、ＭＯＧ３５−５５に対するリコール応答を分析した。メラトニン処理マウスからの脾細胞は、ＭＯＧ３５−５５に対する増殖応答の縮小、ＩＬ−１０産生の増加に付随するＩＬ−１７の軽減を示したが、ＩＦＮ−γ産生に対する有意な効果は検出されなかった（図２ｅ、ｆ）。したがって、メラトニンは脳炎誘発性Ｔｈ１７細胞応答を停止させる。
【００９５】
メラトニンがＴ細胞に直接作用するか否か、またはそれが抗原提示細胞に対するその効果を介して間接的にＴ細胞応答を制御するか否かを調査するため、本発明者らは、メラトニン処理または対照マウスからのソートされたＣＤ４＋Ｔ細胞を、処理切り替え樹状細胞（ＤＣ）と同時インキュベートした。ビヒクル処理マウスから単離された対照と比較して、対照マウスから単離された脾臓ＤＣと同時インキュベートされたメラトニン処理マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、増殖およびＩＬ−１７分泌の減少を示し、ＩＬ−１０産生の増加が付随した（図２ｇ、ｈ）。逆に、本発明者らは、メラトニンまたはビヒクル処理マウスから単離されたＤＣを使用して対照処理マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させた場合に有意差を検出しなかった。
【００９６】
Ｔ細胞に対するメラトニンの直接的効果の裏付けとして、メラトニンは、ＭＯＧ３５−５５およびＤＣ（図２ｉ、図７ｅ）による、またはＤＣの不存在下のＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体（図２ｊ）によるナイーブ２Ｄ２＋トランスジェニックＴ細胞のインビトロ活性化を抑制した。メラトニンによるＤＣの前処理は、ＭＯＧ３５−５５の存在下で２Ｄ２＋Ｔ細胞を活性化させるその能力に影響しなかった（図２ｋ）。メラトニンは、フローサイトメトリーによるアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色またはＢｃｌ−ｘｌレベル発現の分析により示されるとおり、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアポトーシスを増加させなかった（図７ｆ、ｇ）。しかしながら、ＩＬ−１０遮断は、Ｔ細胞増殖に対するメラトニンの抑制効果を阻止した（図７ｈ）。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
実施例３．メラトニンは、ヒトＴ細胞分化に影響する
次いで、本発明者らは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対するメラトニンの効果を試験した。さらに、本発明者らは、メラトニン依存的シグナリングを活性化させるアゴメラチンの効果も分析した（Ｈｉｃｋｉｅ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，２０１１）。ＥＡＥの間のＴ細胞に対するメラトニン投与の効果に基づき、本発明者らは、ヒトＴｈ１７およびＴｒ１細胞に関する本発明者らの試験にフォーカスした。メラトニンおよびアゴメラチンは、Ｔｈ１７極性化条件下で活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７、ＲＯＲＣおよびＩＬ１７Ａ発現の産生を低減させ（図３ａ〜ｃおよび図８）、ヒトＴｈ１細胞の分化に対する効果は検出されなかった（図３ｄ〜ｆ）。これに付随して、メラトニンおよびアゴメラチンはＩＬ１０発現を増加させた。実際、メラトニンおよびアゴメラチンは、Ｔｒ１極性化条件下で活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生も増加させた（図３ｇ、ｈ）。
【００９９】
ＭＳにおける免疫応答に対するメラトニンの役割をさらに調査するため、本発明者らは、２６人のＲＲＭＳ患者の血清メラトニンレベルと末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ１７およびＩＬ１０発現との間の相関を分析した（表３）。年齢および性別調整線形回帰モデルを使用して、本発明者らは、血清中メラトニンおよび末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ１７発現間の負相関を検出し（Ｐ＝０．０１２）：より高い血清メラトニンレベルは、より低いＩＬ１７発現に関連した（表４）。逆に、線形回帰分析により、末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞中のより高いＩＬ１０発現および血清中メラトニン間の正相関が同定された（Ｐ＝０．００３）。本発明者らは、メラトニンレベルおよびＣＤ４＋Ｔ細胞中のＲＯＲＣ、ＮＲ１Ｄ１またはＮＦＩＬ３の発現間の有意な相関を検出しなかった（表４）。したがって、メラトニンは、インビトロでヒトＴｈ１７およびＴｒ１細胞の分化をモジュレートし、内因性メラトニンレベルは、ＲＲＭＳ患者における末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ１７およびＩＬ１０の発現レベルに関連する。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
実施例４．メラトニンは、Ｔｈ１７生成を妨害する
Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞と一緒にＭＳおよびＥＡＥの病因に寄与すると考えられている（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＥＡＥおよびＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生に対するメラトニンの抑制効果に基づき、本発明者らは、ネズミＴｈ１７細胞分化に対するメラトニンの効果を試験した。メラトニンは、完全病原性細胞へのＴｈ１７細胞の分化に必要なｒｏｒｃ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２３受容体の発現により示されるとおり、インビトロでＴｈ１７細胞の分化を妨害し；ＦｏｘＰ３＋ｉＴｒｅｇ、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞の分化に対する効果は検出されなかった（図４ａ、ｂおよび図９）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ）。メラトニンは、非病原性Ｔｈ１７細胞に関連するＩＬ−１０の発現も増加させた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ；ＭｃＧｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）（図４ａ、ｂ）。
【０１０３】
ＩＦＮγおよびＩＬ−２は、Ｔｈ１７細胞分化を制限することが示されている（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、本発明者らの試験において、Ｔｈ１７細胞はＩＦＮγ遮断抗体の存在下で分化し、ＩＬ−２遮断抗体はメラトニンによるＴｈ１７分化の抑制を阻止し得なかった（図１０ａ、ｂ）。したがって、メラトニンは、ＩＦＮγともＩＬ−２とも独立した機序を介してＴｈ１７細胞分化を抑制する。
【０１０４】
生理学的濃度のメラトニンは、膜および核内受容体により制御されるシグナリング経路の活性化をもたらす（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，１９９７）。メラトニン膜受容体ＭＴＮＲ１Ａは、種々の組織、例として、免疫系の細胞により発現される（Ｊｏｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらに、メラトニンは、同様に免疫細胞により発現されるレチノイド関連オーファン核内受容体アルファ（ＲＯＲ−α）に結合し（Ｐｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、Ｔｈ１７発生における役割を担う（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本発明者らは、Ｔｈ１７細胞上のＭＴＮＲ１ＡおよびＲＯＲ−αの両方の発現を検出した（図１０ｃ、ｄ）。Ｔｈ１７細胞に対するメラトニンの効果に対するＭＴＮＲ１Ａシグナリングの役割を試験するため、本発明者らは、ＭＴＮＲ１Ａ特異的アゴニストのアゴメラチンおよびラメルテオン（Ｋａｒｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を使用した（図１０ｅ）。メラトニンについての本発明者らの観察と類似して、アゴメラチンまたはラメルテオンによるＭＴＮＲ１Ａ活性化は、Ｔｈ１７細胞の分化を抑制した（図４ｃ、ｄおよび図１０ｆ、ｇ）。逆に、メラトニンは、使用されたＭＴＮＲ１Ａ欠損（ＭＴＮＲ１Ａ  ＫＯ）Ｔｈ１７細胞の分化を抑制し得なかった（図４ｅ、ｆ）。したがって、ＭＴＮＲ１Ａは、Ｔｈ１７細胞分化に対するメラトニンの抑制効果を媒介する。
【０１０５】
実施例５．メラトニンは、Ｅｒｋ１／２およびＣ／ＥＢＰα活性化を介してＴｈ１７細胞分化を抑制する
ＲＥＶ−ＥＲＢα（ｎｒ１ｄ１によりコードされる）は、ｒｏｒｃ転写の直接的インヒビターのＮＦＩＬ３の発現を制限することによりＴｈ１７分化を促進する概日時計の構成成分である（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。メラトニンは、概日および季節時計の両方の活性を調節する（Ｐｅｖｅｔ，２００３）。実際、メラトニンレベルは、ｎｒ１ｄ１発現との概日逆相関を示し、そのことは、メラトニンがＲＥＶ−ＥＲＢα発現に影響することを示唆する（Ｋｏｊｅｔｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｓ，２０１４）。したがって、本発明者らは、メラトニンがＴｈ１７細胞分化を抑制するようにＲＥＶ−ＥＲＢαに作用するか否かを調査した。
【０１０６】
リバースタンパク質アレイを使用して（Ｆａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、本発明者らは、Ｔ細胞中でメラトニンにより誘発されるシグナリング経路を分析し、Ｅｒｋ１／２の活性化のＭＴＮＲ１Ａ依存的増加を検出した（図４ｇ、ｈ；図１０ｈ、ｉ）。無論、Ｅｒｋ１／２阻害は、Ｔｈ１７細胞分化を向上させることが既に示されており（Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｌａｍ，２０１０）、Ｅｒｋ１／２リン酸化は、ＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質の発現の低減に結びつけられている（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋｏｊｅｔｉｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｓ，２０１４）が、関与する機序およびＴ細胞についてのその関連性は、依然として特徴付けされていない。ｎｒ１ｄ１プロモーターのバイオインフォマティック分析を介して、本発明者らは、細胞分化の調節に関与するロイシンジッパー転写因子のＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）（Ｌｅｋｓｔｒｏｍ−Ｈｉｍｅｓ  ａｎｄ  Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８）についての結合部位を同定した。Ｃ／ＥＢＰαは、リン酸化により活性化されるＥｒｋ１／２の下流標的である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，２００５）。したがって、本発明者らは、Ｅｒｋ１／２がＣ／ＥＢＰα依存的にｎｒ１ｄ１プロモーターの転写活性を調節するか否かを分析した。
【０１０７】
メラトニンの存在下のＴｈ１７細胞分化は、Ｃ／ＥＢＰαリン酸化およびｎｒ１ｄ１プロモーターへのＣ／ＥＢＰαのリクルートメント（図４ｉ、ｊ）をもたらした。Ｃ／ＥＢＰαリン酸化およびｎｒ１ｄ１プロモーターへのリクルートメントは、ＭＴＮＲ１Ａ  ＫＯ  Ｔ細胞中で、Ｅｒｋ１／２インヒビターＵＯ２１６の存在下で抑制された（図４ｉ、ｊ）。したがって、メラトニンは、ＭＴＮＲ１ＡおよびＥｒｋ１／２依存的にｎｒ１ｄ１プロモーターへのＣ／ＥＢＰαのリクルートメントを誘発する。
【０１０８】
ｎｒ１ｄ１プロモーターの転写活性に対するＣ／ＥＢＰαの効果を分析するため、本発明者らは、ｎｒ１ｄ１プロモーターがルシフェラーゼ発現を制御するレポーター構築物を使用した。メラトニンまたはアゴメラチンによるｎｒ１ｄ１レポーター形質移入ＨＥＫ２９３細胞の処理は、ルシフェラーゼ活性の減少をもたらし、類似の結果がＣ／ＥＢＰα過剰発現により達成された（図４ｋ）。最後に、メラトニンによるＴｈ１７細胞分化の抑制に対するＣ／ＥＢＰαの役割を調査するため、本発明者らは、Ｃ／ＥＢＰα欠損Ｔ細胞（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を使用した。Ｃ／ＥＢＰα欠損は、メラトニンにより誘導されるｎｒ１ｄ１発現の減少およびＴｈ１７分化の抑制を阻止した（図４ｌ、ｍ）。したがって、メラトニンは、ＭＴＮＲ１Ａ、Ｅｒｋ１／２およびＣ／ＥＢＰαにより媒介される機序を介してＴｈ１７の分化を抑制する。
【０１０９】
さらに、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ＲＥＶ−ＥＲＢアルファアゴニストＳＲ９００９（５マイクロモル）の存在または不存在下のＴＦＧ−ｂ、ＩＬ−６（０時間）、およびＩＬ−２３（４８時間）の添加によりＴｈ１７細胞に分化させ、７２時間後にＲＴ−ＰＣＲにより分析した。＊対応のないｔ検定のｐ＜０．０５。図１２に示される結果は、ＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストがＴｈ１７細胞への分化を抑制することを示す。
【０１１０】
実施例６．メラトニンは、Ｎｆｉｌ３を誘導することによりＴｈ１７細胞中のＲＯＲ−γｔおよびＲＯＲ−α発現を阻害する
ＮＦＩＬ３は、ＲＯＲ−γｔの発現を抑制することによりＴｈ１７細胞分化を制限する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＲＥＶ−ＥＲＢαは、ｎｆｉｌ３発現を阻害する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。したがって、本発明者らは、メラトニンにより誘導されるｎｒ１ｄ１発現の減少が、ｒｏｒｃ発現のＮＦＩＬ３依存的阻害をもたらすことを仮定した（図５ａ）。本発明者らは、Ｔｈ１７細胞中でｎｒ１ｄ１発現を検出したが、Ｔｈ０細胞中でもＴｒ１細胞中でも検出しなかった（図５ｂ）。メラトニンは、Ｔｈ１７細胞分化の間にｎｒ１ｄ１発現を抑制し、そのことは、ＲＯＲ−γｔ受容体ＮＦＩＬ３の発現の付随増加をもたらす（図５ｃ、ｄ）。Ｔｈ１７細胞分化に関する本発明者らの結果と一致して、メラトニンによるＲＥＶ−ＥＲＢαおよびＮＦＩＬ３発現の調節は、その膜受容体ＭＴＮＲ１ＡおよびＥｒｋ１／２により媒介された（図５ｃ〜ｇ）。メラトニンによるＴｈ１７細胞分化のモジュレーションについてのＲＥＶ−ＥＲＢα発現の調節の関連性は、ｎｒ１ｄ１過剰発現実験において、およびＲＥＶ−ＥＲＢα欠損Ｔ細胞の使用により確認された。ｎｒ１ｄ１過剰発現およびＲＥＶ−ＥＲＢα欠損は、Ｔｈ１７細胞分化に対するメラトニンの効果を阻止した（図５ｈ〜ｋ）。したがって、メラトニンにより誘発されるＭＴＮＲ１Ａ依存的シグナリングは、ＲＥＶ−ＥＲＢα発現の調節を介してＴｈ１７細胞分化を抑制する。
【０１１１】
ＲＯＲ−αは、Ｔｈ１７細胞分化を促進する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、特異的アゴニストＣＧＰ５２６０８によるＲＯＲ−α活性化は、Ｔｈ１７細胞分化を増強した（図４ｃ、ｄ）。ＲＯＲ−αは、メラトニンにより直接活性化される（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，１９９７）。実際、メラトニンは、ＭＴＮＲ１Ａ欠損Ｔｈ１７細胞の分化を増強し（図４ｅ）、そのことは、メラトニンにより誘発されるＭＴＮＲ１ＡシグナリングがＲＯＲ−αによるＴｈ１７細胞分化の促進を妨害することを示唆する。ＲＯＲ−γｔ発現およびＴｈ１７細胞分化に対するＮＦＩＬ３の阻害効果（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に基づき、本発明者らは、ＮＦＩＬ３がＲＯＲ−α発現も阻害するか否かを試験した。
【０１１２】
バイオインフォマティック分析により、ｒｏｒａおよびｒｏｒｃプロモーター中のＮＦＩＬ３結合部位が同定された。したがって、本発明者らは、メラトニンの存在下でＴｈ１７極性化条件下で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のｒｏｒａおよびｒｏｒｃプロモーターへのＮＦＩＬ３のリクルートメントを検出し、ＲＯＲ−αおよびＲＯＲ−γの両方の発現の低減が付随した（図５ｌ、ｍ）。次いで、本発明者らは、Ｔｈ１７細胞分化のモジュレーションについてのＮＦＩＬ３発現の調節の関連性を調査した。ＮＦＩＬ３（図５ｎ、ｏ）の過剰発現およびＮＦＩＬ３欠損（図５ｐ、ｑ）は、Ｔｈ１７細胞分化に対するメラトニンの抑制効果を阻止した。したがって、メラトニンによるＮＦＩＬ３発現の調節は、インビトロでＴｈ１７細胞の分化に対するその阻害効果を媒介する。インビボのメラトニンによるＴｈ１７細胞分化の抑制に対するＭＴＮＲ１ＡおよびＮＦＩＬ３の役割を評価するため、本発明者らは、野生型、ＭＴＮＲ１Ａ、ＲＥＶ−ＥＲＢαまたはＮＦＩＬ３欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞により再構成され、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５により免疫化されたＲＡＧ−１欠損マウスを使用した。本発明者らのインビトロ観察と一致して、インビボのメラトニンによるＴｈ１７細胞分化の抑制は、ＭＴＮＲ１Ａ、ＲＥＶ−ＥＲＢαおよびＮＦＩＬ３欠損により阻止された（図５ｒ、図１１）。実際、本発明者らは、ＭＴＮＲ１Ａ、ＲＥＶ−ＥＲＢαまたはＮＦＩＬ３欠損Ｔ細胞により再構成されたマウスの処理に応答したＴｈ１７細胞分化の増加を検出し、そのことは、ＲＯＲ−αに対するメラトニンの非拮抗的アゴニスト活性およびＴｈ１７細胞の分化に対するその促進効果を反映する可能性が最も高い。まとめると、これらのデータは、メラトニンが、ＮＦＩＬ３依存的機序を介するＲＯＲ−γｔおよびＲＯＲ−α発現の阻害を介してＴｈ１７細胞分化を妨害することを示唆する。
【０１１３】
実施例７．メラトニンは、Ｅｒｋ１／２およびＲＯＲ−αを介してＴｒ１細胞分化を増強する
ＣＤ４＋ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞は、免疫応答の調節において重要な役割を担う（Ｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。メラトニン投与によるＥＡＥの改善は、ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の増加に関連した（図２）。したがって、本発明者らは、Ｔｒ１極性化条件下のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に対するメラトニンの効果を調査した。本発明者らは、メラトニンがＩＬ−１０ならびにＴｒ１関連分子ｉｌ２１、ａｈｒおよびｃｍａｆ（Ａｐｅｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）の発現を増強することを見出した（図６ａ）。さらに、メラトニンは、インビトロでＴｒ１細胞の抑制活性を増強した（図６ｂ）。
【０１１４】
次いで、本発明者らは、Ｔｒ１制御性細胞に対するメラトニンの効果の基礎をなす機序を調査した。本発明者らは、Ｔｒ１細胞によるＭＴＮＲ１ＡおよびＲＯＲ−αの両方の発現を検出した（図１０ｃ、ｄ）。実際、それぞれＭＴＮＲ１ＡおよびＲＯＲ−αについての特異的アゴニストのアゴメラチンおよびＣＧＰ５２６０８の両方が、Ｔｒ１細胞分化を増強した（図６ｃ、ｄ）。これらの結果と一致して、ＭＴＮＲ１Ａ欠損またはＵＯ１２６によるＭＴＮＲ１Ａ活性化Ｅｒｋ１／２の阻害は、メラトニンによるＴｒ１分化の増強を妨害した（図６ｅ、ｆ）。無論、Ｅｒｋ１／２活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるｃｍａｆ依存的ＩＬ−１０産生を促進することが報告されている（Ｓａｒａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。さらに、ＲＯＲ−α欠損は、ＩＬ−２７により誘導されるＴｒ１細胞の分化およびメラトニンによるその増強を抑制した（図６ｇ）。
【０１１５】
ＲＯＲ−αは、標的遺伝子中のＲＯＲ応答エレメント（ＲＯＲＥ）への結合によるその生物学的効果を付与する（Ｊｅｔｔｅｎ，２００９）。バイオインフォマティック分析によりｉｌ１０プロモーター中のＲＯＲ−α結合部位が同定され（図６ｈ）、そのことは、メラトニンがｉｌ１０プロモーターへのＲＯＲ−αのリクルートメント、および結果的にｉｌ１０転写を増加させ得ることを示唆する。この仮定と一致して、本発明者らは、メラトニンの存在下のＴｒ１極性化条件下のＴ細胞活性化後のｉｌ１０プロモーターへのＲＯＲ−α結合の増加を検出した（図６ｈ）。さらに、ＲＯＲ−αは、レポーターアッセイにおいてｉｌ１０プロモーターをトランス活性化させ、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）およびｃ−Ｍａｆとの相乗作用を示してｉｌ１０発現を促進するその能力を増強した（アグレガー・ペーパー・イバン（ａｇｒｅｇａｒ  ｐａｐｅｒ  ｉｖａｎ））（Ａｐｅｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇａｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）（図６ｉ）。まとめると、これらのデータは、メラトニンがＭＴＮＲ１ＡおよびＲＯＲ−αに対するその効果を介してＴｒ１細胞分化を増強することを示唆する（図６ｊ）。
【０１１６】
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Ｊｉｎ，Ｙ．，ｄｅ  Ｐｅｄｒｏ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｊ．，Ｓｏｅｄｅｒｓｔｒｏｅｍ，Ｍ．，Ｓｔａｗｉａｒｚ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｋ，Ｈ．（２０００）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｏｐｔｉｃ  ｎｅｕｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８１，５６−６４．
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Ｋａｒｉｍ，Ａ．，Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｃａｏ，Ｃ．（２００６）．Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｒａｍｅｌｔｅｏｎ，ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＭＴ１  ａｎｄ  ＭＴ２  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｏｍｎｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４６，１４０−１４８．
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｏ，Ｓ．Ｍ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｋ．，Ｎｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｍａｈａｒｓｈａｋ，Ｎ．，Ｂｏｒｓｔ，Ｌ．Ｂ．，Ｈｏｓｔａｇｅｒ，Ｂ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｖ．，Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＮＦＩＬ３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ＩＬ−１２／２３−ｄｒｉｖｅｎ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９２，１９１８−１９２７．
Ｋｏｊｅｔｉｎ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｓ，Ｔ．Ｐ．（２０１４）．ＲＥＶ−ＥＲＢ  ａｎｄ  ＲＯＲ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １３，１９７−２１６．
Ｋｏｒｎ，Ｔ．，Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｏｕｋｋａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．（２００９）．ＩＬ−１７  ａｎｄ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，４８５−５１７．
Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｒａｏ，Ｓ．Ｍ．，Ｎｕｔｓｃｈ，Ｋ．，Ｌｉｏ，Ｃ．−Ｗ．，Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，Ｎ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ，Ｔ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．−Ｓ．（２０１１）．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７８，２５０−２５４．
Ｌｅｅ，Ｙ．，Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｆ．Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｓ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ，Ｍ．，Ｋｕｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２ａ）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１−１１．
Ｌｅｅ，Ｙ．，Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｆ．Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｓ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ，Ｍ．，Ｋｕｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２ｂ）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，９９１−９９９．
Ｌｅｋｓｔｒｏｍ−Ｈｉｍｅｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ，Ｋ．Ｇ．（１９９８）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８５４５−２８５４８．
Ｌｏｋｅｎ−Ａｍｓｒｕｄ，Ｋ．Ｉ．，Ｈｏｌｍｏｙ，Ｔ．，Ｂａｋｋｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｅｉｓｋｅ，Ａ．Ｇ．，Ｂｊｅｒｖｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｊｏｒｎａｒａ，Ｂ．Ｔ．，Ｈｏｖｄａｌ，Ｈ．，Ｌｉｌｌｅａｓ，Ｆ．，Ｍｉｄｇａｒｄ，Ｒ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７９，２６７−２７３．
Ｍａｃｃｈｉ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，Ｊ．Ｎ．（２００４）．Ｈｕｍａｎ  ｐｉｎｅａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ．Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２５，１７７−１９５．
ＭｃＧｅａｃｈｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｋ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｔａｔｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ，Ｗ．，ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｕａ，Ｄ．Ｊ．（２００７）．ＴＧＦ−β  ａｎｄ  ＩＬ−６  ｄｒｉｖｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１７  ａｎｄ  ＩＬ−１０  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒａｉｎ  ＴＨ−１７  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１３９０−１３９７．
ＭｃＭｕｌｌａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｒｉｍｍ，Ｅ．Ｂ．，Ｈｕ，Ｆ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｐ．（２０１３）．Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊａｍａ  ３０９，１３８８−１３９６．
Ｍｉｏｓｓｅｃ，Ｐ．，Ｋｏｒｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．（２００９）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  １７  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１，８８８−８９８．
Ｍｏｒｅｒａ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ａｂｒｅｕ，Ｐ．（２００７）．Ｄａｙｔｉｍｅ／ｎｉｇｈｔ−ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｍｍｅｒ／ｗｉｎｔｅｒ  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｒｈｙｔｈｍｓ：ａｎ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｊ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ  ４３，３１３−３１４．
Ｐｅｖｅｔ，Ｐ．（２００３）．Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ：ｆｒｏｍ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｔｏ  ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｓｉｇｎａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５，４２２−４２６．
Ｐｏｌｍａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｒｅｉｎｇｏｌｄ，Ｓ．Ｃ．，Ｂａｎｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｃｌａｎｅｔ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｆｉｌｉｐｐｉ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｈａｒａ，Ｋ．，Ｈａｖｒｄｏｖａ，Ｅ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｋａｐｐｏｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：２０１０  Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９，２９２−３０２．
Ｐｏｔ，Ｃ．，Ａｐｅｔｏｈ，Ｌ．，Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．（２０１１）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｒ１  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＩＬ−２７．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３，４３８−４４５．
Ｐｏｚｏ，Ｄ．，Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｌｖｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｏｍａｒｉｚ，Ｒ．Ｐ．，Ｍａｒｔｉｎ−Ｌａｃａｖｅ，Ｉ．，Ｏｒｔｉｚ，Ｇ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｌ１ａ−ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１１，４６６−４７３．
Ｐｏｚｏ，Ｄ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｕｒｉｎｏ，Ｓ．，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃａｌｖｏ，Ｊ．Ｒ．（２００４）．ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ／ＲＯＲａｌｐｈａ，ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＭＴ１，ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｘｉｎｄｏｌｅ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ  ３７，４８−５４．
Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｆ．Ｊ．，Ｂａｓｓｏ，Ａ．Ｓ．，Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ａ．Ｈ．，Ｋｏｒｎ，Ｔ．，Ｆａｒｅｚ，Ｍ．Ｆ．，Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｃａｃｃａｍｏ，Ｍ．，Ｏｕｋｋａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．（２００８）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｒｅｇ  ａｎｄ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，６５−７１．
Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．−Ｇ．，Ｇｒｅｇｏｒｉ，Ｓ．，Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．，Ｂａｃｃｈｅｔｔａ，Ｒ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｇｓ，Ｍ．Ｋ．（２００６）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２１２，２８−５０．
Ｒｏｓｅｃｒａｎｓ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｏｈｎａｌ，Ｊ．Ｃ．（２０１４）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，６７０−６７２．
Ｒｕｎｉａ，Ｔ．Ｆ．，Ｈｏｐ，Ｗ．Ｃ．Ｊ．，ｄｅ  Ｒｉｊｋｅ，Ｙ．Ｂ．，Ｂｕｌｊｅｖａｃ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｎｔｚｅｎ，Ｒ．Ｑ．（２０１２）．Ｌｏｗｅｒ  ｓｅｒｕｍ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈｅｒ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７９，２６１−２６６．
Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｍｉｙａｒａ，Ｍ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．（２０１０）．ＦＯＸＰ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，４９０−５００．
Ｓａｒａｉｖａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，１７０−１８１．
Ｓａｒａｉｖａ，Ｍ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｖｅｌｄｈｏｅｎ，Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔ．Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（２００９）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｈ１  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＳＴＡＴ４  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＥＲＫ  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｏｓｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１，２０９−２１９．
Ｓａｗｃｅｒ，Ｓ．，Ｈｅｌｌｅｎｔｈａｌ，Ｇ．，Ｐｉｒｉｎｅｎ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｃ．Ａ．，Ｐａｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．Ａ．，Ｍｏｕｔｓｉａｎａｓ，Ｌ．，Ｄｉｌｔｈｅｙ，Ａ．，Ｓｕ，Ｚ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｃ．，Ｈｕｎｔ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７６，２１４−２１９．
Ｓｃｈｅｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｒｏｓｎｅｒ，Ｂ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｗ．Ｃ．，Ｌａｄｅｎ，Ｆ．，Ｃｏｌｄｉｔｚ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．（２００４）．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｎｉｇｈｔ  ｗｏｒｋ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．１３，９３６−９４３．
Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｂ．，Ｂｌｉｚｚａｒｄ，Ｌ．，Ｐｏｎｓｏｎｂｙ，Ａ．−Ｌ．，Ｐｉｔｔａｓ，Ｆ．，Ｔｒｅｍｌｅｔｔ，Ｈ．，Ｄｗｙｅｒ，Ｔ．，Ｇｉｅｓ，Ｐ．，ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｉ，Ｉ．（２０１０）．Ｈｉｇｈｅｒ  ２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗｅｒ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６８，１９３−２０３．
Ｓｏｓｐｅｄｒａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．（２００５）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，６８３−７４７．
Ｓｐｅｌｍａｎ，Ｔ．，Ｇｒａｙ，Ｏ．，Ｔｒｏｊａｎｏ，Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ｇ．，Ｌｕｇａｒｅｓｉ，Ａ．，Ｈｕｐｐｅｒｔｓ，Ｒ．，Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，Ｒ．，Ｄｕｑｕｅｔｔｅ，Ｐ．，Ｇｒａｍｍｏｎｄ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｓ  ｌａｔｉｔｕｄｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．
Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｌ．（２０１４）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，２５７−２８１．
Ｔａｎ，Ａ．Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌａｍ，Ｋ．Ｐ．（２０１０）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＥＫ−ＥＲＫ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｈ１７  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８４，１８４９−１８５７．
Ｕｅｎｏ−Ｔｏｗａｔａｒｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｉｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ｂｌａｚｅｊｃｚｙｋ，Ｋ．，Ｔｏｋｕｒａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．（２００７）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｏｕｎｇ  Ｆｅｍａｌｅｓ  ｕｎｄｅｒ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ  ２６，２０９−２１５．
Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ，Ｖ．，Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，Ｃ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．（２００４）．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９，９７１−９７９．
Ｗｕ，Ｃ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｔｈａｌｈａｍｅｒ，Ｔ．，Ｚｈｕ，Ｃ．，Ｘｉａｏ，Ｓ．，Ｋｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｒｅｇｅｖ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．（２０１３）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓａｌｔ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  ＳＧＫ１．Ｎａｔｕｒｅ  １−５．
Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｃｒｏｎｉｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｅｋｓｔｒｏｍ−Ｈｉｍｅｓ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｆｅｎｙｕｓ，Ｍ．，Ｔｅｎｅｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．（２００５）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ａ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，３８６８９−３８６９９．
Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｏ．，Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｒｉｅｖａ，Ｒ．，Ａｋｉｍｚｈａｎｏｖ，Ａ．，Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．，Ｍａ，Ｌ．，Ｓｈａｈ，Ｂ．，Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｄ．，Ｓｃｈｌｕｎｓ，Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｔ  Ｈｅｌｐｅｒ  １７  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｂｙ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＲＯＲα  ａｎｄ  ＲＯＲγ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，２９−３９．
Ｙｕ，Ｘ．，Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．，Ｒｕｈｎ，Ｋ．Ａ．，Ｓｔｕｂｂｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｋａｓｈｉｗａｄａ，Ｍ．，Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｖ．（２０１３）．ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｃｌｏｃｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２，７２７−７３０．
【０１１７】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載してきた一方、上記説明は、本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2017537083.tif 000007
【図２】
2017537083.tif 000008
【図３】
2017537083.tif 000009
【図４】
2017537083.tif 000010
【図５】
2017537083.tif 000011
【図６】
2017537083.tif 000012
【図７】
2017537083.tif 000013
【図８】
2017537083.tif 000014
【図９】
2017537083.tif 000015
【図１０】
2017537083.tif 000016
【図１１】
2017537083.tif 000017
【図１２】
2017537083.tif 000018
【国際調査報告】
2017537083.tif 000019
2017537083.tif 000020