(57)【要約】  微生物汚染について給水源を検査する方法は、給水源を、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有する新規試薬と接触させることを含み、本試薬は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する。本方法は、さらに、給水源中のレジオネラ種の汚染濃度を検出または測定することを含む。有用な試薬は、配列番号３〜１０から選択されるプライマー配列またはそのようなプライマー配列の組み合わせを含む少なくとも１つのヌクレオチド配列プライマーを含む。そのような試薬の増大した特異性は、微生物汚染のより高感度な検出を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジオネラ微生物種に対して高特異性を有するヌクレオチド配列を含む、微生物汚染について給水源を検査するための試薬であって、
前記ヌクレオチド配列は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する、試薬。
【請求項２】
配列番号１〜１０を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列プライマー、または配列番号１〜１０を含む複数のプライマー配列の組み合わせ、または配列番号１〜１０の修飾を含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
順方向ヌクレオチド配列プライマー及び逆方向ヌクレオチド配列プライマーを含む１セットのプライマーを含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記順方向プライマーは、配列番号１、３、４、５、または６のうちの少なくとも１つを含み、前記逆方向プライマーは、配列番号２、７、８、９、または１０のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
前記順方向プライマーは、配列番号４を含み、前記逆方向プライマーは、配列番号１０を含む、請求項３に記載の試薬。
【請求項６】
配列番号１〜１０を含む前記プライマーから選択される複数のセットの試薬を含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項７】
前記試薬は、配列番号１〜１０を含む全てのヌクレオチド配列プライマーを含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列のうちの１つ以上が固定化または固定される基板をさらに備える、請求項２に記載の試薬。
【請求項９】
検出可能な標識または標識コンポーネントが、少なくとも１つのプライマーに関連付けられる、請求項２に記載の試薬。
【請求項１０】
前記基板は、アレイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、プラスチック表面、またはガラス表面である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡである、請求項１に記載の試薬。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列は、ＤＮＡである、請求項１に記載の試薬。
【請求項１３】
請求項１に記載の試薬と、標識、基板、前記標識と相互作用し、検出可能なシグナルを産生することが可能な標識コンポーネントから選択される、１つ以上のコンポーネントと、を備える、キット。
【請求項１４】
請求項１に記載の試薬を備える、水質監視デバイス。
【請求項１５】
微生物汚染について給水源を検査する方法であって、
給水源を、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有する請求項１の試薬と接触させることであって、前記試薬は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する、接触させることと、
前記給水源中のレジオネラ種の汚染濃度を検出または測定することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記試薬は、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列プライマー、配列番号１〜１０を含むプライマー配列の組み合わせ、または配列番号１〜１０の修飾を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
測定することは、５８℃より低い選択されたアニーリング温度で、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーまたはプライマーの組み合わせをアニーリングすることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定することは、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーをハイブリダイズすることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリアルタイム定性的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行うことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
レジオネラ種での汚染とシュードモナス種での汚染とを区別することを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
レジオネラニューモフィラは、淡水に関連する至るところに存在する細菌である。この微生物は、吸入した場合、致死的になる可能性のある肺炎、すなわち、レジオネラ症、肺炎、ポンティアック熱を引き起こし得、したがって、ホテル及びレストラン等の水を提供する公共施設の運営者を含む、家庭用水システムの所有者、運営者、及び処理業者にとって重大な問題である。冷却水システムに関連するレジオネラニューモフィラ感染症の激増は、噴水式水飲み器及びＨＶＡＣ関連のコンポーネント等の家庭用水システムと関連付けられる激増よりもさらにまれであるが、レジオネラニューモフィラで汚染された水滴を拡散する冷却塔の能力は、広い地理的領域にわたる激増を引き起こし得る。
【０００２】
冷却システムの所有者、運営者、及び処理業者に指導を提供するために、種々の指針、実施基準、及び規則が、水源中のレジオネラの拡散を検出及び／または制御するために世界的に導入されている。北米には、間もなく完成予定の、業界団体により作成されている２つの指針ＡＳＨＲＡＥ  １８８Ｐ及びＣＴＩ  ＳＴＤ−１５９標準が存在する。加えて、ＯＳＨＡは、家庭用水システムまたは工業用水システムのいずれかに見られるレジオネラの数に基づいた、改善及び処置の推奨される行動レベルを示している。
【０００３】
水源中の混合微生物集団からレジオネラを同定及び／または定量的に同定する能力は、感染症の可能性を判定するのに不可欠であり、かつ現在の処理プロトコルが、何らかの水システムにおいてレジオネラを防止することまたは改善することのいずれかに有効であるかを判定するのに不可欠である。米国ＣＤＣは、レジオネラの酸耐性、特徴的なコロニー形態、抗生物質グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、及びシクロヘキサミドに対する固有の耐性、ならびに成長培地中に鉄及びＬ−システインを添加する絶対的な要件を活用して、混合培養からうまくレジオネラ菌を濃縮する、培養ベースの試験アプローチを推奨している。しかしながら、レジオネラはまた、最適な成長条件下で、成長培地上に現れるのに２〜１０日間を必要とする比較的成長が遅い生物でもある。レジオネラをうまく単離させるための複雑な培地要件及び成長ステップごとに必要とされる比較的長いインキュベーション時間を考慮すると、レジオネラを検出するものとしてこの方法は最適ではない。
【０００４】
他の検出技術は、独特のレジオネラ外膜タンパク質を利用する。Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍによるラテックス凝集方法は、レジオネラコロニーが、実際に、レジオネラ激増に最も関連付けられる菌株であるレジオネラニューモフィラＳＧ１であることを確認するためのツールである。ＢｉｏｔｉｃａのＬＥＧＩＰＩＤ（商標）試験及びＦａｓｔｐａｔｈ  Ｄｕｏ  ＳｙｓｔｅｍとしてＮａｌｃｏによって市販されているＨｙｄｒｏｓｅｎｓｅの比色抗体試験等の他の方法は、水中のレジオネラの比較的迅速な抗体ベースの検出方法である。水中のレジオネラを直接可視化するために、蛍光顕微鏡と共に使用され得る、血清型１及び２〜１４／１５／１６によってレジオネラを描出する蛍光抗体が存在する。これらの手法及びデバイスの制限は、それらが、レジオネラを検出するためにタンパク質を必要とすることである。タンパク質は、細胞死後に水中に存在し得るため、これらの方法は、偽陽性検出につながり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】ｑＰＣＲプライマーを用いたｑＰＣＲ結果のグラフである。
【図１Ｂ】レジオネラニューモフィラ以外のレジオネラ種対レジオネラニューモフィラ及びレジオネラデュモフィイの検出の結果を示すｑＰＣＲのグラフである。
【図２】ｏｍｐＳプライマー位置の図である。
【図３Ａ】Ａ：ＤＮＡラダー、Ｂ：レジオネラニューモフィラ（対照）、Ｃ：シュードモナス（陰性対照）、Ｄ：レジオネラデュモフィイ、Ｅ．レジオネラロングビーチ、Ｆ：レジオネラチェリイ、Ｇ：レジオネラニューモフィラＳＧ６Ａ、Ｈ：レジオネラニューモフィラＳＧ６Ｂ、及びＩ：レジオネラフィーレイである同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、プライマー３２７対５２８ＧＣスクリーニングのゲル画像である。全ての種は、プライマーによって検出され、いくらかの交差反応性を示した。
【図３Ｂ】図３Ａと同様に同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、配列番号３のプライマー３２７及び配列番号９のプライマー６６０ＧＣのゲル画像である。レジオネラフィーレイは、プライマー対によって検出されず、より強い交差反応性を示した。
【図３Ｃ】図３Ａと同様に同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、配列番号３のプライマー３２７対配列番号１０の８２５ＧＣスクリーニングのゲル画像である。レジオネラフィーレイは、プライマー対によって検出されず、軽度の交差反応性を示した。
【図３Ｄ】図３Ａと同様に同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、配列番号４のプライマー５２８対配列番号１０の８２５ＧＣスクリーニングのゲル画像である。全ての種が検出された。軽度の交差反応性が観察された。
【図３Ｅ】図３Ａと同様に同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、配列番号３のプライマー３２７対配列番号９の６６０ＧＣスクリーニングのゲル画像である。全ての種が検出された。軽度のレジオネラ交差反応性が観察された。シュードモナス検出は観察されなかったか、最小限のシュードモナス検出が観察された。
【図３Ｆ】図３Ａと同様に同定された、各レーンの精製されたゲノムＤＮＡに対する、配列番号５のプライマー６６０対配列番号１０の８２５ＧＣスクリーニングのゲル画像である。レジオネラフィーレイは、検出されなかった。レジオネラ交差反応性は、観察された。シュードモナス検出は観察されなかったか、最小限のシュードモナス検出が観察された。
【図４】配列番号４のプライマー５２８／配列番号１０の８２５ＧＣを用いてＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試験試料から単離されたＤＮＡの試験のゲル画像である。各レーンのＤＮＡは、Ａ：ＤＮＡマーカー、Ｂ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料１、Ｃ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料１−濃縮、Ｄ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料２、Ｅ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料２−濃縮、Ｆ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料３、Ｇ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料３−濃縮、Ｈ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料４、Ｉ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料４−濃縮、Ｊ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料５、Ｋ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料５−濃縮、Ｌ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料６、Ｍ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料６−濃縮であると同定された。無濾過の試料で有望な結果が得られた。バックグラウンドは、〜２００倍の試料濃縮で増加する。それぞれ配列番号４及び１０の５２８／８２５ＧＣ  ｏｍｐＳプライマーのＣＤＣ試験からの結論は、矢印で指し示され、左から右に読む。  矢印１．純粋なレジオネラニューモフィラｓｇ３、２．６×１０３ｃｆｕ／ｍｌ  矢印２．純粋なレジオネラニューモフィラｓｇ１４、３．３×１０１ｃｆｕ／ｍｌ  矢印３．レジオネラニューモフィラに対して陰性  矢印４．レジオネラニューモフィラに対して陰性  矢印５．混合レジオネラニューモフィラｓｇ６、１．３×１０３ｃｆｕ／ｍｌ  矢印６．混合レジオネラニューモフィラｓｇ６、６．０×１０１ｃｆｕ／ｍｌ
【図５】発明者のプライマー（ＤＭＣ）及び配列番号１５及び１６の既知のプライマーを用いてＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試験試料から単離されたＤＮＡの比較試験を示すゲル画像である。各レーンのＤＮＡは、Ａ：ＤＮＡマーカー、Ｂ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料１ＤＭＣ、Ｃ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料１−既知、Ｄ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料２ＤＭＣ、Ｅ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料２−既知、Ｆ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料３ＤＭＣ、Ｇ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料３−既知、Ｈ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料４ＤＭＣ、Ｉ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料４−既知、Ｊ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料５ＤＭＣ、Ｋ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料５−既知、Ｌ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料６ＤＭＣ、Ｍ：ＣＤＣ−ＥＬＩＴＥ試料６−既知と同定された。これらの結果は、試験試料で有意義な差を示さない。ＤＭＣプライマー及び既知のプライマー（米国特許公報第２０１２／０１７１６６１号、配列番号１５及び１６に由来）の両方が、混合されたニセ環境試料においてレジオネラニューモフィラを検出する。改善は観察されなかった。
【図６Ａ】陰性対照としての緑膿菌と共に、ＤＭＣプライマー配列番号４及び１０ならびに配列番号１５及び１６のプライマーを用いて、単独培養ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡの比較試験の結果を示すゲルである。ＤＭＣプライマー及び配列番号１５及び１６プライマーの両方が、広範囲なレジオネラ種を検出する。ＤＭＣプライマーは、緑膿菌と比べて高レベルの汚染ＤＮＡに対する交差反応が低い。ゲルのレーンは、ゲル上で同定される。
【図６Ｂ】陰性対照としてのパラコッカスデントリフィカンスと共に、配列番号４及び１０のＤＭＣプライマーならびに配列番号１５及び１６の既知のプライマーを用いて、単離された単独培養ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡの比較試験を示すゲルである。２μｌのＰＣＲ産物を、２．２％Ｌｏｎｚａ  ＦＬＡＳＨＧＥＬ（商標）システムに充填した。ゲルのレーンＡ〜Ｋは、以下の通りである。Ａ：ＤＮＡラダー、Ｂ：レジオネラニューモフィラ（ＤＭＣ）、Ｃ：レジオネラニューモフィラ（既知）、Ｄ：パラコッカスデニトリフィカンス（ＤＭＣ）、Ｅ：パラコッカスデニトリフィカンス（既知）、Ｆ：レジオネラデュモフィイ（ＤＭＣ）、Ｇ：レジオネラデュモフィイ（既知）、Ｈ：レジオネラロングビーチ  （ＤＭＣ）、Ｉ：レジオネラロングビーチ（既知）、Ｊ：レジオネラフィーレイ（ＤＭＣ）、及びＫ：レジオネラフィーレイ（既知）。配列番号４及び１０のＰＣＲプライマーは、既知のプライマーに対して改善を実証する。本明細書で説明される配列は、種々の条件下で、レジオネラ種の低い交差反応検出を提供する。
【図７】配列番号１〜１０の新規プライマーならびに本明細書で考察される配列番号１５及び１６の他の既知のプライマーのヌクレオチド位置を示す、配列番号１７のレジオネラニューモフィラｏｍｐＳ遺伝子配列の描写である。
【図８Ａ】緑膿菌ＡＴＣＣ１５４４２に対する低濃度勾配試験を示すＯｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーのゲル画像である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、以下の通りである。    Ａ：ＤＮＡラダー、    Ｂ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、    Ｃ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０１ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｄ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０２ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｅ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０３、ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｆ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０４ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４ＤＮＡ、    Ｇ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０５ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｈ：１×１０４ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０６ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｉ：１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０７ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｊ：１×１０２ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０７ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｋ：１×１０１ｃｆｕ／ｍｌ非標的ＤＮＡ、１×１０５ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｌ：１×１０５ｃｆｕ／ｍｌレジオネラニューモフィラ  ＢＡＡ７４  ＤＮＡ、    Ｍ：ＤＮＡ対照なし
【図８Ｂ】バークホルデリアセパシアＡＴＣＣ  ２５４１６に対する低濃度勾配試験を示す、Ｏｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーのゲル画像である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａに示される。
【図８Ｃ】スフィンゴモナスパウチモビリスＢＡＡ  １０９２に対するＯｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図８Ｄ】エンテロバクテリアエロゲネスＡＴＣＣ  １３０４８に対するＯｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。図８Ｅは、クレブシエラニューモニエＡＴＣＣ  ８３０８に対するＯｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーの第１の低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図８Ｆ】クレブシエラニューモニエＡＴＣＣ  ８３０８に対するＯｍｐ５２８／８２５ＧＣ配列番号４／１０プライマーの反復低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図９Ａ】緑膿菌ＡＴＣＣ  １５４４２に対する既知の１１１６Ｒ／４９２配列番号１２／１１プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。１μＭのプライマーを用いたＰＣＲ条件は、９５℃で３分、３５Ｘ（３０秒で９４℃、３０秒で５０℃、３０秒で７２℃、及び１０分７２℃である。
【図９Ｂ】バークホルデリアセパシアＡＴＣＣ  ２５４１６に対する１１１６Ｒ／４９２配列番号１２／１１プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。ＰＣＲ条件は、図９Ａと同様である。
【図９Ｃ】スフィンゴモナスパウチモビリスＢＡＡ  １０９２に対する１１１６Ｒ／４９２配列番号１２／１１プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図９Ｄ】エンテロバクテリアエロゲネスＡＴＣＣ  １３０４８に対する１１１６Ｒ／４９２配列番号１２／１１プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図９Ｅ】クレブシエラニューモニエＡＴＣＣ  ８３０８に対する１１１６Ｒ／４９２配列番号１２／１１プライマーの反復低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１０Ａ】緑膿菌ＡＴＣＣ  １５４４２に対する１１２６Ｒ／４５０配列番号１４／１３プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１０Ｂ】バークホルデリアセパシアＡＴＣＣ  ２５４１６に対する低濃度勾配試験を示す１１２６Ｒ／４５０配列番号１４／１３プライマーのゲル画像である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１０Ｃ】スフィンゴモナスパウチモビリスＢＡＡ  １０９２に対する１１２６Ｒ／４５０配列番号１４／１３プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。サイクル条件については、表２を参照されたい。
【図１０Ｄ】エンテロバクターエロゲネスＡＴＣＣ  １３０４８に対する１１２６Ｒ／４５０配列番号１４／１３プライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１１Ａ】緑膿菌ＡＴＣＣ  １５４４２に対する米国特許第２０１２／０１７１６６１号の配列番号１５及び１６のプライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。ＰＣＲ条件は、表２に列挙される。
【図１１Ｂ】バークホルデリアセパシアＡＴＣＣ  ２５４１６に対する低濃度勾配試験を示す配列番号１５及び１６の既知のＦ及びＲプライマーのゲル画像である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１１Ｃ】スフィンゴモナスパウチモビリスＢＡＡ  １０９２に対する米国特許第２０１２／０１７１６６１号の配列番号１５及び１６のＦ及びＲプライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。サイクル条件については、表２を参照されたい。
【図１１Ｄ】エンテロバクターエロゲネスＡＴＣＣ  １３０４８に対する配列番号１５及び１６の米国特許第２０１２／０１７１６６１号のＦ及びＲプライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【図１１Ｅ】クレブシエラニューモニエＡＴＣＣ  ８３０８に対する米国特許第２０１２／０１７１６６１号の配列番号１５及び１６のＦ及びＲプライマーの低濃度勾配試験である。ゲルのレーンＡ〜Ｍは、図８Ａと同様である。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有する高感度な新規試薬を利用する、微生物汚染について給水源を検査する方法が説明される。この方法は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する試薬を利用する。方法は、給水源を試薬と接触させることと、給水源中のレジオネラ種の汚染濃度を検出または測定することとを含む。一実施形態において、方法は、選択されたアニーリング温度で、レジオネラ中に存在する標的核酸配列に試薬プライマーまたはプライマーの組み合わせをアニーリングすることを含む、ＰＣＲまたはｑＰＣＲステップを利用する。別の実施形態において、方法は、ハイブリダイゼーションベースのステップを利用する。方法は、レジオネラ濃度が許容可能な安全限度内かどうかの判定を可能にする。
【０００７】
別の態様において、レジオネラ微生物種、例えば、レジオネラニューモフィラに対して高特異性を有し、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する、新規試薬が提供される。一実施形態において、試薬は、複数のレジオネラ種に対して高特異性を有するが、シュードモナス種に対しては高特異性を有さない、ｑＰＣＲまたはＰＣＲプライマー等のヌクレオチドプライマーを含む。別の実施形態において、試薬は、ヌクレオチド配列のうちの１つ以上が固定化または固定される基板を含む。別の実施形態において、試薬は、本明細書で同定されるプライマーを含有するバイオセンサーである。
【０００８】
さらに別の実施形態において、本明細書で説明される新規試薬のうちの１つ以上と、標識、基板、標識と相互作用し、検出可能なシグナルを産生することが可能な標識コンポーネントを含む他のアッセイ方法コンポーネントと、を備えるキットが提供される。
【０００９】
これらの方法及び組成物の他の態様及び利点は、以下の発明を実施するための形態においてさらに説明される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で説明されるように、試料水または給水源中のレジオネラ、例えば、レジオネラニューモフィラの迅速かつ正確な検出を可能にする、新規組成物、例えば、試薬及び方法が提供される。以下の実施例において実証されるように、本明細書で説明される組成物（試薬及びプライマー）及び方法は、レジオネラ検出のために使用されてきた検出方法及び組成物における改善を提供する。本明細書で説明される試薬及びプライマーは、レジオネラに対して高度に特異的であり、ｍｉｐまたはｄｏｔ／ｉｃｍ等のより一般的な検出遺伝子に対して大部分が見落とされていた標的配列を利用する。これらのプライマーは、レジオネラ種、好ましくは、レジオネラニューモフィラ種のｑＰＣＲベースの検出、ＰＣＲ、及びハイブリダイゼーションベースの手法を利用する、汚染の検出方法において利用される。本明細書で使用される方法及びプライマーは、より低い温度をプライマーのアニーリングにおいて利用することを可能にし、これは、方法の実施時におけるエネルギー使用の効率を向上させる。さらに、本明細書で説明される試薬及び方法は、水システムにおいて一般的な高レベルの汚染ＤＮＡ、例えばシュードモナスに対する交差反応性が低く、それによって、これらの方法及び組成物は、偽陽性の結果をあまり伴わずにレジオネラ汚染の検出を達成する。
【００１１】
Ａ．方法及び組成物の定義及びコンポーネント
本明細書で使用されるとき、用語「給水源」または「試料」は、何らかの自然発生の水域、例えば、湖、水流、川、または水を保有する工業用もしくは家庭用人工容器または水体、例えば、貯水槽、プール、噴水式水飲み器、飲料水または飲用水、水を含有または保有するＨＶＡＣシステム、瓶詰めの水、工業用給水源または容器、廃水容器等を意味する。これらの給水源または試料は、純粋なレジオネラを含有し得るか、高いレジオネラレベルの微生物の混合集団を含有し得るか、低いレジオネラレベルの微生物の混合集団を含有し得るか、レジオネラを有さない微生物の混合集団を含有し得るか、または微生物汚染を含有し得ない。そのような試料または給水源は、指し示された微生物からの標的配列の濃縮されていないか、または濃縮されたＤＮＡ試料を含有し得る。
【００１２】
「標的」は、１つ以上のレジオネラ種で見られ、かつある望ましい特徴を有する核酸配列を意味する。そのような特徴は、他のレジオネラ遺伝子配列と比べて比較的高いレベルでの比較的安定な発現を含む。他の特徴は、ヌクレオチド配列発現が、成長条件に非感受性であり、非レジオネラ微生物の検出を防止するのに十分にレジオネラに独特であることである。標的配列は、哺乳類対象、例えば、ヒトに感染し、水または給水源を汚染するレジオネラ微生物からの核酸材料中に見られ得る。一実施形態において、標的は、レジオネラ主要外膜タンパク質の一部をコードする配列である。標的は、レジオネラからの一本鎖リボ核酸配列または一本鎖のデオキシリボ核酸配列である。レジオネラ遺伝子からのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、一本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、及びＤＮＡが、この定義に含まれる。一実施形態において、選択された標的遺伝子は、レジオネラの主要外膜タンパク質遺伝子、またはｏｍｐＳ、ｏｍｐ２８、ｌｐｇ１９７４、もしくはｌｐｎｏｍｐ２８として既知である。一実施形態において、標的ｏｍｐＳは、成長条件に関係なく、安定に発現するように見え、レジオネラ属内で重度に保存される遺伝子であり、給水源汚染の検出に対して魅力的な標的となる。ｏｍｐＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、ジェンバンクデータベースにおいて、受入番号Ｍ７６１７８で見出され得る。配列番号１７も参照されたい。この標的遺伝子はまた、ｍｏｍｐＳまたは主要外膜タンパク質前駆体遺伝子も含み、その配列は、ジェンバンクデータベースにおいて、受入番号ＡＦ０７８１４７で一般に入手可能である。
【００１３】
より具体的には、ｏｍｐＳ配列の標的は、配列番号１７の核酸領域であり得るか、またはｑＰＣＲプライマー、ＰＣＲプライマー、またはハイブリダイゼーションプローブ等の核酸ベースの検出ツールによる検出に適した「標的」を提供する、その相同体または自然発生のオルソログであり得る。ｏｍｐＳの標的領域を同定し易くするために、本明細書は、配列番号１７の領域を参照する。しかしながら、配列番号１７の配列からの、または他のレジオネラ種ｏｍｐＳからの修飾または変異を有するレジオネラｏｍｐＳ遺伝子の相同配列もまた、本明細書の試薬及び方法の説明に含まれ得ることが当業者によって理解される。
【００１４】
「レジオネラ」は、レジオネラ属の何らかの種、具体的には、水体または給水源で一般的に見られるそれらの種を意味する。レジオネラ種は、レジオネラニューモフィラ、レジオネラデュモフィイ、レジオネラロングビーチ、レジオネラチェリイ、レジオネラニューモフィラＳＧ６Ａ、レジオネラニューモフィラＳＧ６Ｂ、レジオネラフィーレイ、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。本明細書で説明される試薬及び方法の目標は、ヒト疾患を引き起こすため、他の種の中でも、汚染レジオネラニューモフィラを検出することである。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「試薬」は、単一のプライマー、１つ以上のセットの順方向及び逆方向プライマー、標識されたプライマー、基板上またはアレイもしくはマイクロアレイあるいは種々の給水源中のレジオナラ汚染を検出するのに使用するための上記のいずれかを取り込むデバイス中に固定化されるプライマーを指し得る。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「プライマー」は、ＰＣＲまたはｑＰＣＲの実施において、標的配列に結合し得るか、または標的配列を増幅し得るオリゴヌクレオチド配列を意味するよう意図される。一実施形態において、プライマーセットは、５’〜３’の方向に標的のコード鎖に結合する順方向プライマーを含む。別の実施形態において、プライマーセットは、３’〜５’の方向に標的配列の補体に結合する逆方向プライマーを含む。本明細書で使用されるとき、「プライマー」は、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さであり得、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さを含む、何らかの中間の長さを含む。そのようなプライマーは、溶液中、例えば、緩衝液中に利用され得るか、または基板またはマイクロアレイ上に固定化され得る。他の実施形態において、プライマーは、標的ＤＮＡが、ｑＰＣＲ時に、またはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素等の蛍光標識または他の標識を使用して増幅されるときにのみ、標的に特異的なオリゴヌクレオチドが蛍光シグナルを生成するように、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）手法に従って、検出可能な標識、例えば、蛍光標識を用いて標識され得る。
【００１７】
用語「マイクロアレイ」は、規則正しい配列のハイブリダイズ可能なアレイ素子を指す。一実施形態において、マイクロアレイは、基板上の特定の標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを含む。別の実施形態において、マイクロアレイは、任意に、基板上に固定化される複数のプライマー（逆方向及び順方向）を含む。
【００１８】
用語「ＰＣＲアレイ」は、各マイクロウェルに、規則正し配列の遺伝子に特異的な順方向及び逆方向プライマーのならびに蛍光標識されたプローブを含有するマイクロ流体カードまたはマルチウェルプレートを指す。このアレイは、蛍光色素、例えば、レポーター蛍光色素を使用するＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＴａｑｍａｎ技術を使用して監視される、リアルタイムＰＣＲ反応において、給水源からの試料または由来する産物（例えば、ＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ）と共に使用される。各セットのプライマーは、本明細書で説明されるもの等の関心の標的配列を増幅するように設計される。そのようなプライマーは、本明細書で説明されるプライマー同一性に関する説明書を考慮して、当業者によって容易に設計され得る。例えば、参考文献１３を参照されたい。プライマーはまた、例えば、調製され得るか、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販され得る：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｇｅｎｏｍｅ−ｄａｔａｂａｓｅ／ｂｒｏｗｓｅ／ｇｅｎｅ−ｅ×ｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｋｅｙｗｏｒｄ／Ｔａｑｍａｎ％２０ｐｒｉｍｅｒｓ？ＩＣＩＤ＝ｕｃ−ｇｅ×−Ｔａｑｍａｎ
【００１９】
用語「リアルタイム定量的ＰＣＲ」または「ｑＰＣＲ」は、ＰＣＲ増幅及び検出を組み合わせて単一のステップにする技術を指す。ｑＰＣＲでは、蛍光色素は、熱サイクリング時にＰＣＲ産物を標識するために使用される。リアルタイムＰＣＲ機器は、ＰＣＲ産物の高速で正確な数量化及び客観的なデータ分析のために、反応の対数期時に蛍光シグナルの蓄積を測定する。ｑＰＣＲ反応産物は、２つの主要な戦略のうちの１つを使用して蛍光標識される。反応は、熱サイクリング及び蛍光検出能力を用いて、リアルタイムＰＣＲ機器において実行される。高効率のＰＣＲプライマー及び増幅に最適な条件を使用することによって、あらゆる標的分子が、各サイクルで一度コピーされ、データは、熱サイクリングを通じて捕捉される。ｑＰＣＲ反応は、早期段階の熱サイクリングにおいて、大モル過剰のＰＣＲプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて設定されるため、標的鋳型は、反応の制限因子となり、したがって、蛍光シグナルは、投与試料中の標的の量に正比例する。
【００２０】
Ｂ．本発明の試薬
一実施形態において、微生物汚染について給水源を検査するための試薬は、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有し、レジオネラ以外微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する。一実施形態において、そのような試薬は、レジオネラ中の標的配列を増幅するか、またはハイブリダイズする少なくとも１つのヌクレオチド配列プライマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド５２８と８４４との間に見られ、かつそれらを含んでいる。一実施形態において、ｏｍｐＳ標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド３２７と４９１との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド３２７と８４４との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド３２７と４９１との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド３２７と５５０との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド３２７と６８０との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド５２８と５５０との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド５２８と６８０との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド６６０と８４４との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド６６０と６８０との間に見られ、かつそれらを含んでいる。さらに他の実施形態において、標的領域は、同定された配列の両端に約５〜約１５のさらなるヌクレオチドを含む、上記で同定されたそれらの領域を含み得る。
【００２１】
これらの試薬は、配列番号１、３、４、５、及び６として下記の表１に記載される順方向プライマー配列から選択される、上記に定義されるプライマーであり得る。これらの配列は、ある修飾によって表１のものと異なり得ることが理解されるべきである。一実施形態において、修飾は、表１に示され、定義される、指し示されたゆらぎ塩基の存在によって指し示される。表のプライマー配列の他の修飾は、配列番号１７に位置する各順方向プライマーの５’ヌクレオチド塩基に、１個〜約５個のさらなる連続するヌクレオチド５’を含めることによって、表１のものと異なるプライマー配列を含む。別の実施形態において、さらなる修飾されたプライマー配列は、配列番号１７に位置する各順方向プライマーの３’ヌクレオチド塩基に、１個〜約５個のさらなる連続するヌクレオチド３’を含めることによって、表１のものと異なるプライマー配列を含み得る。図７を参照すると、同定されたプライマーの両端に連続する塩基を添加することによって、またはプライマーの両端から１つ以上の塩基を削除することによって、あるいは両方の種類の修飾の組み合わせによって、同定されたプライマーがどのように修飾され得るかが分かる。その上さらなる実施形態において、プライマーは、表１の関連する配列の５’または３’末端から１個、２個、３個、４個、または５個の塩基を削除し、プライマーの反対端に１個、２個、３個、４個、または５個のさらなる連続する塩基を添加し、それによって、プライマー配列を変化させることによって、表１の配列と異なり得る。例えば、あるプライマー配列は、配列番号４の修飾であり得、配列番号１７のヌクレオチド５２６〜５５０、または配列番号１７の５２６〜５４７等に及び得る。
【００２２】
これらの試薬は、配列番号２、７、８、９、１０として下記の表１に記載の逆方向プライマー配列から選択される、上記に定義されるプライマーであり得る。これらの配列は、表１の指し示しされたゆらぎ塩基等の修飾によって、その表のものと異なり得ることが理解されるべきである。上述のように、さらなる修飾は、配列番号１７の各逆方向プライマー５’ヌクレオチド塩基に、１個〜約５個のさらなる連続するヌクレオチド５’を含めることによって、表１のものと異なる修飾された逆方向プライマー配列をもたらし得る。別の実施形態において、配列番号１７の各逆方向プライマーの３’ヌクレオチド塩基に、１〜約５個のさらなる連続するヌクレオチド３’を含めることによって、表１のものと異なり得る。順方向プライマーについて上述したものと類似の様式において、表１の逆方向プライマーは、配列番号１７のプライマー位置からプライマー配列１〜５塩基５’または３’を変更することによって修飾され得る。
【００２３】
したがって、一実施形態において、試薬は、表１から選択される順方向ヌクレオチド配列プライマー及び逆方向ヌクレオチド配列プライマーを含む、１セットのプライマーを含む。一実施形態において、試薬は、配列番号１、３、４、５、または６のうちの少なくとも１つを含む順方向プライマー及び配列番号２、７、８、９、または１０のうちの少なくとも１つを含む逆方向プライマーを含有する。別の実施形態において、試薬は、配列番号４を含む順方向プライマー及び配列番号８、９、または１０のうちの１つを含む逆方向プライマーを含有する。別の実施形態において、試薬は、配列番号４を含む順方向プライマー及び配列番号１０を含む逆方向プライマーを含有する。別の実施形態において、試薬は、配列番号４を含む順方向プライマー及び配列番号８のうちの１つを含む逆方向プライマーを含有する。別の実施形態において、試薬は、配列番号４を含む順方向プライマー及び配列番号９のうちの１つを含む逆方向プライマーを含有する。同様の様式において、試薬は、配列番号１〜１０の表１の順方向及び逆方向プライマーの他の組み合わせを含み得る。さらに別の実施形態において、試薬は、配列番号１〜１０または３〜１０を含むプライマーから選択される複数のセットの試薬を含む。さらに別の実施形態において、試薬は、配列番号１〜１０を含むプライマー配列または上述のような５’または３’末端にその修飾を有する配列から選択される全てのヌクレオチド配列プライマーを含む。
【００２４】
さらに別の実施形態において、試薬は、ヌクレオチド配列のうちの１つ以上が固定化または固定される基板を備える。そのような基板は、アレイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、プラスチック表面、またはガラス表面である。基板上のプライマーの関連付け及び関連付けを達成するための方法は、当技術分野において周知である。代替的に、プライマー配列は、試薬が使用される方法の種類に応じて、適した緩衝液中に提供され得る。
【００２５】
さらに別の実施形態において、試薬は、検出可能な標識または標識コンポーネントが関連付けられるプライマーを含む。適した検出可能な標識は、ＴＡＱＭＡＮ試薬によって利用されるもの等の蛍光標識または他の既知の蛍光分子を含む。適した標識は、本明細書の教示を考慮して、当業者によって、多くの既知の標識の種類の中から選択され得る。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明の試薬は、プライマー、逆方向及び順方向プライマーセットまたは標識されたプライマー−プローブ、適した標識及び標識手法、適した基板、及び／またはプライマーに関連付けられ、検出可能なシグナルを産生することが可能な標識コンポーネント、例えば、酵素のうちの１つ以上を含有するキットの形であり得る。
【００２７】
さらに別の実施形態において、試薬は、本明細書で説明されるプライマーを含む水質監視デバイスとして構成される。
【００２８】
Ｃ．汚染を検出する方法
試薬、例えば、本明細書で説明されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションベースの手法の技術を含む、レジオネラ検出のための方法において望ましく使用される。
【００２９】
一態様において、微生物汚染、具体的には、レジオネラでの汚染について給水源を検査する方法が提供される。そのような方法は、給水源を、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有する試薬と接触させることを含み、試薬は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する。その後、方法は、給水源中のレジオネラ種の汚染濃度を検出または測定することを含む。
【００３０】
一実施形態において、方法において利用される試薬は、本明細書で説明される試薬のうちの１つである。例えば、方法は、以下から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列プライマーを含む試薬を利用し得る。
（ａ）配列番号３を含む順方向プライマー配列３２７、
（ｂ）配列番号４含む順方向プライマー配列５２８、
（ｃ）配列番号５を含む順方向プライマー配列６６０、
（ｄ）配列番号６を含む順方向プライマー配列８２５、
（ｅ）配列番号７を含む逆方向プライマー配列ＧＣ−３２７、
（ｆ）配列番号８を含む逆方向プライマー配列ＧＣ−５２８、
（ｇ）配列番号９を含む逆方向プライマー配列ＧＣ−６６０、
（ｈ）配列番号１０を含む逆方向プライマー配列ＧＣ−８２５、または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）を含むプライマー配列の組み合わせ、または
（ｊ）ゆらぎ塩基を用いるか、あるいは１つ以上の５’もしくは３’塩基を添加もしくは削除することによる、または配列番号１７のその位置に沿ってプライマー１〜５塩基の位置を変更することによる、そのようなプライマー配列の修飾。
【００３１】
別の実施形態において、方法は、（ａ）〜（ｊ）のプライマーから選択される複数のセットの試薬を利用するか、または適した手法において、プライマーまたは逆方向／順方向プライマー対のうちのいくつかまたは全てを使用する複数のステップを含む。上述の試薬のうちの何らかは、後述の方法及び実施例において有用であると考えられる。
【００３２】
したがって、一実施形態において、方法は、選択されたアニーリング温度で、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーまたはプライマーの組み合わせをアニーリングすることによって、標的配列を増幅するために、ＰＣＲまたはｑＰＣＲステップを行うことを含む。一実施形態において、アニーリング温度は、５８℃未満である。別の実施形態において、アニーリング温度は、約４０℃である。別の実施形態において、アニーリング温度は、約４１℃である。別の実施形態において、アニーリング温度は、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０℃である。さらに他の実施形態において、本明細書で説明される試薬のアニーリング温度は、他の既知のｏｍｐＳプライマーを使って利用されるアニーリング温度より低い。例えば、表２に示されるように、方法は、９５℃で３分間試料を１μＭのプライマーと接触させることと、９４℃で３０秒間３５サイクルの変性を行うことと、４０℃で３０秒間プライマーをアニーリングすることと、７２℃で３０秒間の伸張と、７２℃で１０分の拡張ステップを含み得る。さらに他の条件が、下記の実施例に詳述される。
【００３３】
別の実施形態において、測定することは、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーをハイブリダイズすることと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行うことを含む。これらの方法は、標的配列を増幅することと、該レジオネラ濃度が、許容可能な安全限度内であるかどうかを判定することを利用する。
【００３４】
プライマーが、標的配列を増幅するか、またはハイブリダイゼーションにより同定すれば、汚染の量を測定または検出する種々の方法は、当技術分野において既知である。検出する方法は、可視化のためにアガロースゲル上で増幅またはハイブリダイズされた標的配列を実行することを含み得る。ゲルを通して電流を流すことは、負電荷を有するＤＮＡをゲルの正電荷を有する側に移動させる。ゲルは、二重鎖のＤＮＡに結合する色素で染色され、それによって、可視化を可能にする。ＤＮＡは大きいほど、ゲルを通してゆっくり移動する。ＰＣＲの結果を測定するさらに他の方法及びハイブリダイゼーション手法が、当業者によって選択され得る。
【００３５】
したがって、一実施形態において、方法は、複数のレジオネラニューモフィラのみに対して高特異性を有する試薬を利用する。したがって、一実施形態において、方法及び試薬は、レジオネラでの給水源の汚染と緑膿菌またはシュードモナスデニトリフィカンス等のシュードモナス種での汚染を区別し得る。
【００３６】
下記の実施例で実証されるように、本明細書で説明されるプライマーは、ｑＰＣＲ及びＰＣＲ手法において、より高度の標的特異性を提供する。実施例は、種々の菌株からの精製されたＤＮＡに対する試験及び６つのＣＤＣ  ＥＬＩＴＥ試験試料から抽出されたＤＮＡに対する試験を示した。後述するように、プライマー５２８／８２５ｇｃは、微生物の他の種との交差反応性が低いため、米国特許公報第２０１２／０１７１６６１号で説明される既知の配列番号１５及び１６プライマー配列より良好である。これらのｑＰＣＲプライマー、例えば、配列番号１及び２または４及び１０は、米国特許公報第２０１２／０７１６６１号のもの等の他の既知のアッセイにおいて開示されるプライマーより高速のレジオネラ検出を可能にする。
【００３７】
上述のデバイスをさらに理解し、方法が実際にどのように行われ得るかを実証するために、ここで、上記の添付の図面及び後述の実施例を参照してある実施形態を説明する。以下の実施例は、例示のために提供され、特許請求の範囲及び本明細書の開示または範囲を限定しない。
【００３８】
実施例１：標的の同定及び使用されるアッセイ
発明者は、レジオネラ遺伝子を、新規レジオネラ検出の試薬に適した標的の源としてｌｐｇ１９７４（Ｗｅｉｓｓｅｎｍａｙｅｒ，Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）と同定した。ｏｍｐＳ（ＮＣＢＩジェンバンク受入番号Ｍ７６１７８．１）としても既知のこの遺伝子は、他のレジオネラ遺伝子と比べて、かなり高レベルで安定に発現することが分かった。したがって、この遺伝子及びそのコード外膜タンパク質は、発現が、成長条件に非感受性であり、非標的生物の検出を防止するためにレジオネラに独特であるヌクレオチド配列の発明者対の目標を満たす。
【００３９】
Ａ．ｑＰＣＲプライマーの開発及び試験
ｏｍｐＳの５’末端は、遺伝子の他の領域に対してばらつきが少なく、レジオネラニューモフィラ生物に対してより特異的であるように見えたため、それを、ｑＰＣＲプライマー産生の標的とした。発明者は、ツール、すなわち、ＩＤＴプライマー設計ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｃｉｔｏｏｌｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ／）を利用して、特定の融解温度、長さ、及びホモ二量体／ヘテロ二量体特徴を有するｑＰＣＲプライマーを構築した（表１）。
【００４０】
標的ＤＮＡの増幅を以下の条件下で行った：
９５℃で３分間、続いて、９５℃で１０秒４１サイクル、５８℃で１０秒、７２℃で３０秒、その後、９５℃で１０秒、続いて、ソフトウェアの初期設定状態を使用した融解曲線。検証を実行するために使用される市販で購入したレジオネラゲノム標準を用いて、ＣＦＸ９６Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＳｙｓｔｅｍでｑＰＣＲ増幅を行った。ｑＰＣＲ条件は、推奨された説明書と違ったが、効率及びＲ＾２値は、通常のパラメーター内であったため、変更が何らかの影響を及ぼした可能性は低い。これらの条件は、反応ウェルごとに、１２．５μｌのＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉＸ、０．１５μｌの順方向及び逆方向プライマーの両方（ストックプライマー濃度は、５０μＭであった）、４．７μｌの分子生物学グレードＨ２Ｏ（正確な７．２μｌのＨ２Ｏの代わり）を使用することを含んだ。その量まで、５μｌの１００倍希釈の精製されたゲノムＤＮＡを添加した。
【００４１】
Ｂ．ＰＣＲプライマーの開発
従来のＰＣＲアプローチまたはハイブリダイゼーションベースのアプローチのいずれかに使用され得るＤＮＡの領域もまた、例えば、複数のレジオネラ種の広範な検出のために分析した。これを行うために、レジオネラニューモフィラからのｏｍｐＳ遺伝子のＤＮＡ配列及びレジオネラロングビーチからのｏｍｐＳ遺伝子のＤＮＡ配列を、整列し、直接比較して、総類似度または十分に高い配列類似度の領域を同定して、１〜２個のゆらぎ塩基を有するプライマーを同定することを可能にした。「ゆらぎ塩基」は、反応に使用されるプライマープールに基づいて、代替的な塩基選択肢が可能なプライマー配列に位置するあるヌクレオチド塩基を指す。例えば、「Ｒ」のゆらぎ塩基は、所与のプライマープール中、５０％グアニン及び５０％シトシンである。このアプローチは、関連性が高いが、１００％同一ではないＤＮＡの領域を含めるために、プライマー反応性の広範化を可能にした。
【００４２】
重要な領域が様々な試験に使用され得るように、産生した相補的プライマーを有するプライマーのために使用され得るＤＮＡの４つの領域を同定するために、ｏｍｐＳ整列を視覚的に検査した。下記の表１に同定されるプライマーは、以下の条件を用いて、従来のＰＣＲ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して試験した：１２．５μｌのＭａｓｔｅｒ  ＭｉＸ、０．５μｌの順方向及び逆方向プライマーの両方、及び９．５μｌのｄＨ２Ｏ。これに、ＭｏｌＢｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して単離した２μｌの精製されたゲノムＤＮＡを添加した。初回スクリーニングのＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で２分、９５℃で３０秒３５サイクル、４５℃（プライマー融解温度要件に起因して、配列番号４のプライマー５２８及び配列番号１０のプライマー８２５Ｇｃでは４０℃）で３０秒、その後、７２℃で１０分の最終拡張ステップ。
【００４３】
表１に同定される配列番号１〜１０のプライマー配列及び配列番号１５及び１６の既知の配列は、図７に例示されるｏｍｐＳ遺伝子上に位置する。
【００４４】
【表１−１】
2017521066.tif 000002
【００４５】
【表１−２】
2017521066.tif 000003
【００４６】
Ｃ．初回プライマー比較
既知のプライマーの一連のベンチマークを行って、新規ｏｍｐＳプライマーが、他の既知のｏｍｐＳプライマーと比べて改善を実証したかを特定した。プライマー設定に最適であった条件（プライマー融解温度（ＴＭ）を下回る２℃での、一比較において、反応条件は、１２．５μｌのＭａｓｔｅｒ  ＭｉＸ、０．５μｌの順方向及び逆方向プライマーの両方、及び１０．５μｌのｄＨ２Ｏで、ＭｏｌＢｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを利用して単離された１μｌの精製されたゲノムＤＮＡが添加された。定義された菌株からのＤＮＡ及びＣＤＣ  ＥＬＩＴＥ試験パネルから単離された核酸からのＤＮＡをアッセイした。
【００４７】
Ｄ．精製されたプライマー比較
定義された細菌種（レジオネラニューモフィラＡＴＣＣ  ＢＡＡ７４、Ｐ．緑膿菌ＡＴＣＣ  １５４４２、バーコオルデリアセパシアＡＴＣＣ  ２５４１６、スフィンゴモナスパウチモビリス  ＢＡＡ１０９２、フラボバクテリウムオドラタム（別名ミロイデスオドラタス）ＮＣＩＭＢ  １３２９４、エンテロバクターエロゲネスＡＴＣＣ  １３０４８、及びクレブシエラニューモニエＡＴＣＣ  ８３０８）からの細胞懸濁液を得、２つの分割量に分割した。１つの分割量を蒔いて、生物濃度の尺度としてｃｆｕ／ｍｌ数を得、他方を、ＭｏｌＢｉｏ  ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＤＮＡ  Ｋｉｔを介して、ＤＮＡ単離に晒した。各開始コロニーのｃｆｕ／ｍｌが特定されたら、細胞数に基づいて、等しいゲノム単位／ｍｌ濃度を、各ＤＮＡの小瓶を割り当てた。それから、希釈範囲を産生して、標的生物の非存在を模擬し、その後、高レベルの非標的生物ＤＮＡに対してレジオネラの量を増加した（表２に特定の条件を参照）。
【００４８】
【表２】
2017521066.tif 000004
【００４９】
同一のＤＮＡ試料が、各反応に使用されるように、ＤＮＡ濃度を用いてマスターブロックを作製した。反応の開始から終わりまで相互汚染からＤＮＡ試料に有意義な変更が生じなかったこと、または偽陽性が生じなかったことを確認するために、実験の開始時から終わりに向かって、配列番号１〜１０のプライマーを試験した。他の刊行物において提案される条件で、プライマーを試験した。
【００５０】
Ｅ．ＤＮＡゲルプロトコル
ＰＣＲ断片を可視化するために、ゲル鋳造、緩衝液、及び安全上の注意について、ＬｏｎｚａのＦｌａｓｈｇｅｌカセットベースのシステムまたは標準動作手順のいずれかに従った。ＳＯＰに従って、５μｌのＰＣＲ産物／ローディング色素を、各ウェルに添加し、１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）／ローディング色素のうちの５つを、一番左のウェルに添加した（Ｌｏｎｚａ  Ｆｌａｓｈｇｅｌシステムでは２μｌ）。１．５％アガロースゲルを、３０分間１００Ｖで１ｘ  ＴＢＥ緩衝液中で実行した。その後、それらを、空のプラスチックピペットチップボックスに置き、６０分間５０ｍｌの１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に曝露し、その後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  ＸＲ  Ｉｍａｇｅｒ上で可視化した。Ｌｏｎｚａ  Ｆｌａｓｈｇｅｌｓを、製造者の説明書を使用して操作し、組込みの撮像カメラを用いて可視化した。
【００５１】
実施例２：広範なレジオネラ検出のためのｑＰＣＲベースの方法
ｑＰＣＲプライマー配列番号１及び２を産生して、ｏｍｐＳ遺伝子が、広範なレジオネラ検出のためにｑＰＣＲベースの方法に使用され得るかを判定した。液体培養成長緑膿菌及びパラコッカスデニトリフィカンスからのＤＮＡを、陰性対照として使用した。レジオネラニューモフィラ  ＢＡＡ７４からのＤＮＡは、陽性対照として機能し、菌株から抽出したＤＮＡを、実験試料として使用されるＣＤＣ  ＥＬＩＴＥ試験試料（レジオネラデュモフィ、レジオネラロングビーチ、レジオネラフィーレイ、及びレジオネラチェリイ）から単離した。レジオネラＤＮＡを得るために、コロニーを、細菌培地プレートから塗布し、バイオセイフティキャビネット内で水中に撹拌して、ＭｏＢｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  ＤＮＡ抽出キットを使用して抽出した。ＤＮＡを、ｑＰＣＲ実行において使用されるＢｉｏ−Ｒａｄからのプラスチック試薬を用いて、分析前にｄＨ２Ｏ中に１００倍希釈した。市販で購入したレジオネラニューモフィラゲノム標準は、５対数標準希釈の材料として機能した。
【００５２】
実行の効率は、９５．７％で、Ｒ＾２は、０．９９９であり、わずかに高い濃度の混合及びプライマーにもかかわらず、実行は、十分許容可能なｑＰＣＲ標準範囲内であったことが示唆される。図１Ａ及び１Ｂに見られるように、レジオネラニューモフィラ及びレジオネラデュモフィイは、他のレジオネラ菌試料に対して優先的に増幅されるように見えた。陰性対照パラコッカスデニトリフィカンス及び鋳型添加のない対照は、１×１０１ｃｆｕ／ｍｌ範囲で増幅された緑膿菌で、有意義な増幅を有することに失敗した。抽出に使用された細胞が、後期対数期／定常期細胞から直接得られたことを考慮すると、この数は、緑膿菌細胞存在の正確な測定ではない可能性があるが、むしろ、低レベルの相互汚染を意味している。特に興味の対象となるのは、ｑＰＣＲ  ｏｍｐＳプライマーを有するレジオネラデュモフィイの高反応性である。
【００５３】
本実験の反復は、生細胞の列挙後にＤＮＡ投与量を規準化して、等しいゲノム単位／ｍｌを得、この高度の類似度が正確であることを確認することを支援することを含む。
【００５４】
実施例３：広範なレジオネラ検出のためのハイブリダイゼーション方法
高選択性のレジオネラプライマー設計であると観察された点、及びプライマー（表１）が提案されたハイブリダイゼーションアプローチのために、さらに離間されるべきであるとの判定に従って、新しいプライマーを、ｏｍｐＳ遺伝子のより中核を成す３’末端から選択した（図２及び７参照）。特定の領域を、レジオネラロングビーチに対して相同性の高度の配列に基づいて単離した。プライマー名称の「ｇｃ」は、「産生された補体」を指し、プライマー製造者（ＩＤＴ）は、反対の鎖のＤＮＡ上の同一の位置に位置したプライマーを産生して、同一の領域のＤＮＡが、その位置の５’及び３’の両方のプライマーを用いて試験され得るようにした。その後、各プライマーセットの適合性を、表２に列挙された条件を使用して試験した。
【００５５】
これらのプライマーを試験するために、塗布したレジオネラ菌株（または緑膿菌及びパラコッカスデニトリフィカンスの場合は液体培養）からのゲノムＤＮＡを、それらの「ｇｃ」対応物（それぞれ、配列番号３〜１０）と共に、ｏｍｐＳプライマー３２７、５２８、６６０、及び８２５を用いてアッセイした。各反応の融解温度は、プライマー融解温度に応じて、４５℃または４０℃であった。この初回の試験では、反応条件は、以下の通りであった：１μＭのプライマー、９５℃で３分、９４℃で３０秒間３５サイクルの変性、４０℃または４５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長、最後に７２℃で１０分の拡張ステップ。結果を、図３Ａ〜３Ｆに表示する。反応の清浄度を考慮し、配列番号４及び１０のプライマー対５２８／８２５ｇｃを選択して、さらなる分析を行った。
【００５６】
これらの反応が行われると、これらのプライマーを他の既知の配列、例えば、配列番号１５及び１６（参考文献８）と比較するさらなる作業を行って、プライマー配列番号４及び１０が、レジオネラ検出に改善を提供したかを判定した。試験は、精製されたゲノムＤＮＡに対するプライマーの試験及びＥＬＩＴＥ認証試験のための米国ＣＤＣによって提供されるニセの試料の試験の２つのアプローチの範囲内に収まった。これらの試験の結果を、図４及び５に表示する。発明者のプライマーでの改善は、ＣＤＣ  ＥＬＩＴＥ試料のアッセイ時に不明瞭であった。しかしながら、同一の試験を精製されたＤＮＡに対して実行したとき、交差反応性における改善が観察された。プライマー５２８及び８２５ｇｃは、当技術分野において既知の他の配列の非レジオネラ微生物汚染、例えば、緑膿菌との交差反応性が低いことを示した。（図６及び６Ｂを参照）
【００５７】
この初回スクリーニング後、試験プロトコルを修正した。定義されたゲノムＤＮＡでのＤＮＡの試験濃度は、プライマー配列番号１５及び１６に対して発明者のプライマーによる改善があっかを正確に判定するには、高過ぎた可能性があった。冷却水サービス会社との相互交流及び実地試行経験に基づいて、これらの試料における典型的な細菌負荷は、約１×１０５ｃｆｕ／ｍｌである傾向があった。次に、プライマープールを拡張して、表１の配列番号１１〜１４の参考文献１０及び１１からの他の２つのセットの既知のプライマーを含めた。刊行物（例えば、参考文献１〜３参照）及び水処理用途の専門家との考察、ならびにこれらの汚染微生物菌株の有効性に基づいて、特定の微生物種を試験した。
【００５８】
計数したｃｆｕ／ｍｌに等しいゲノム単位／ｍｌを有する単離されたＤＮＡのマスターブロックを、実施例１で説明されるように産生し、ＰＣＲ分析に使用した。その後、全非標的試料または高い非標的対レジオネラニューモフィラＤＮＡ比を有する試料のいずれかにおいて交差反応性が観察される程度を、観察した。図８Ａ〜８Ｆを参照されたい。５２８Ｆ及び８２５ｇｃ逆方向プライマーを、実験の最初及び終了時に試験して、他のプライマーで観察された何らかの交差反応性が、本物であり、材料の偶発性の相互汚染に起因しないことを確実にした。１回目のプライマー試験は、ゲルが薄すぎて明瞭に読めなかった。図８Ｅ及び８Ｆは、実験の両方のコピーを示す。これらの試験を反復する場合、結果は、図８Ｅ及び８Ｆと一貫すると予測される。
【００５９】
興味深いことに、セパシア菌（図９Ａ及び９Ｂ）及びエンテロバクターエロゲネス（図９Ｃ及び９Ｄ）に対して、これらのプライマーで非特異的な増幅が観察され、これを、四角形で強調表示した。これらの結果は、５２８Ｆ及び８２５ｇｃプライマーが、既知のプライマーより改善を成すことを即時に示唆する。クレブシエラニューモニエ試験では、同様の改善は観察されなかった。
【００６０】
表２に列挙された条件により、既知の１１２６Ｒ／４５０プライマー配列番号１４及び１３をアッセイした。クレブシエラに対する１１２６Ｒ／４５０プライマーの性能に関するデータが欠けていたが、交差反応性に関して試験された種を有する５２８Ｆ／８２５ｇｃプライマーに対する性能の明らかな減少は存在しなかった。プライマーは、レジオネラの検出（１×１０２−１×１０３）に対してより高い閾値を有するように見えた。いくつかのウェルは、増幅に失敗し、したがって、この実験は、反復されるときに、検出感度の改善を確認することが予測される。
【００６１】
最後に、配列番号１５及び１６のプライマーを、表２の条件に従って試験して、発明者のプライマーに対する性能を判定した。
【００６２】
要約すると、ゲルの品質は、最初は不十分であったが、セパシア菌に対して明らかな交差反応性が観察された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。再度、これは、ＤＭＣプライマーが米国特許第２０１２／０１７１６６１号プライマーに対して改善を有することを示唆する。
【００６３】
しかしながら、これらのプライマーに関する本発明のデータは、発明者が同定したプライマーが、複雑な試料中のレジオネラの検出のために、他のｏｍｐＳまたはｍｏｍｐＳに着目したプライマーの改善を成すことを示す証拠を提供する。
【００６４】
本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解される意味と同一の意味を有し、公開されたテキストへの参照は、本出願において使用される用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する。一切の定義は、明確さのためのみに提供され、本発明を限定するよう意図されない。
【００６５】
本明細書の種々の実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を使用して提示されるが、種々の状況下で、関連する実施形態はまた、「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という言語を使用しても説明されることが理解されるべきである。用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を指し、例えば、「試験化合物」は、１つ以上の試験化合物を表すよう理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）は、本明細書で同じ意味で使用される。
【００６６】
上記に例示された実施形態の多数の変更及び変形が、本明細書に含まれ、当業者には明らかであると予想される。本明細書で説明される組成物及びプロセスへのそのような変更及び変形は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると考えられる。上記に列挙または参照された特許、特許出願、広報、及び非特許刊行物を含む全ての文書、ならびに添付の図面及び／または配列一覧表は、本明細書の明示的な教示に矛盾しない程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
参考文献
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７．米国特許公報第２００９／０１７０７１７号
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９．独国特許公報第４４１９２９４号
１０．Ｖｅｋｅｎｓ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  １  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｌｇｉｕｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ２０００  ａｎｄ  ２０１０．Ｅｕｒｏ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌ１７（４３）．
１１．Ｇａｉａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍａｙ  ２００５；４３（５）：２０４７−５２．
１２．Ｍｅｎｔａｓｔｉ  Ｍ，Ｆｒｙ  ＮＫ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＳｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ（ＳＢＴ）ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ．Ｖｅｒｓｉｏｎ４．２．Ｏｃｔ  ２００９；ｐｐ１−９．以下から入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐａｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ／ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ＿ｓｂｔ／ｐｈｐ／ＳＢＴ  ２０ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２０ｆｏｒ  ２０ｗｅｂｓｉｔｅ  ２０２００８  ２０ｖ４．２．ｐｄｆ
１３．Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１０，２３：５２４−３４
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月5日(2017.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2017521066.tif 000005
【図１Ｂ】
2017521066.tif 000006
【図２】
2017521066.tif 000007
【図３−１】
2017521066.tif 000008
【図３−２】
2017521066.tif 000009
【図４】
2017521066.tif 000010
【図５】
2017521066.tif 000011
【図６Ａ】
2017521066.tif 000012
【図６Ｂ】
2017521066.tif 000013
【図７−１】
2017521066.tif 000014
【図７−２】
2017521066.tif 000015
【図８−１】
2017521066.tif 000016
【図８−２】
2017521066.tif 000017
【図８−３】
2017521066.tif 000018
【図９−１】
2017521066.tif 000019
【図９−２】
2017521066.tif 000020
【図９−３】
2017521066.tif 000021
【図１０−１】
2017521066.tif 000022
【図１０−２】
2017521066.tif 000023
【図１１−１】
2017521066.tif 000024
【図１１−２】
2017521066.tif 000025
【図１１−３】
2017521066.tif 000026
【国際調査報告】
2017521066.tif 000027
2017521066.tif 000028
2017521066.tif 000029
2017521066.tif 000030