(57)【要約】細胞組成物及び細胞を懸濁するための水性トレハロース媒質の使用に関係する方法が開示されている。トレハロース含有媒質は、例えばより濃縮された細胞調製液をトレハロース含有媒質の中へ希釈する際の、細胞集塊化を阻害するのに使用することができる。特定の実施形態では、凍結保存しその後に解凍した後の細胞をトレハロース含有媒体と組み合わせて集塊化の阻害された細胞懸濁液を調製している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞組成物を調製するための方法であって、
（ａ）凍結保存細胞を解凍して解凍生細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記解凍生細胞を、トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせてトレハロース含有細胞懸濁液を提供する段階と、
を備えている方法。
【請求項２】
（ａ）細胞を凍結保護剤含有媒質中に懸濁させて凍結保存可能細胞組成物を形成する段階と、
（ｂ）前記凍結保存可能細胞組成物を凍結保存条件に曝して凍結保存細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記凍結保存細胞を解凍して解凍生細胞を提供する段階と、
（ｄ）前記解凍生細胞を、トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせてトレハロース含有細胞懸濁液を提供する段階と、
を備えている方法。
【請求項３】
細胞濃縮物から希釈細胞懸濁液を調製するための方法であって、
（ａ）少なくとも３００万個／ｍＬの第１の生細胞密度を有する凍結保存細胞組成物を解凍して解凍生細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記解凍生細胞を、トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせて、前記第１の細胞密度より低い第２の生細胞密度を有するトレハロース含有細胞懸濁液を形成する段階と、
を備えている方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記水性媒質は１重量％乃至１０重量％の範囲のトレハロース濃度を有している、方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４の何れか一項に記載の方法において、前記水性媒質は、更に、約０．９重量％の塩化ナトリウムを含有している、方法。
【請求項６】
請求項１から請求項５の何れか一項に記載の方法において、前記水性媒質は２００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ乃至６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有している、方法。
【請求項７】
請求項１から請求項６の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は哺乳類の細胞である、方法。
【請求項８】
請求項１から請求項７の何れか一項に記載の方法において、前記細胞はヒトの細胞である、方法。
【請求項９】
請求項１から請求項８の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は幹細胞である、方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は間葉系幹細胞である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記間葉系幹細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項１２】
請求項１から請求項１１の何れか一項に記載の方法において、前記トレハロースは前記トレハロース含有細胞懸濁液中の前記細胞の集塊化を低減するのに有効な量で存在している、方法。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、前記トレハロース含有細胞懸濁液中に約１．５重量％乃至約７重量％の範囲のトレハロース濃度を提供するように行われる、方法。
【請求項１４】
請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、
前記解凍細胞を凍結保存容器から取り出す段階と、
前記解凍細胞を第２の容器内で前記トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせる段階と、を含んでいる、方法。
【請求項１５】
請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の方法であって、更に、前記トレハロース含有細胞懸濁液をヒト又は動物の患者へ投与する段階、を備えている方法。
【請求項１６】
請求項１から請求項１５の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、又はヒトの細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１から請求項１６の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、前記解凍生細胞を含有し且つ死細胞から放出されたＤＮＡを含有する液体媒質を、前記トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせる段階を備えている、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記液体媒質は、前記細胞が凍結保存されていた媒質である、方法。
【請求項１９】
請求項１から請求項１８の何れか一項に記載の方法によって調製された又は調製可能な細胞組成物。
【請求項２０】
細胞組成物であって、
トレハロースを含む液体水性媒質中に懸濁させた細胞を備えており、トレハロースの濃度は当該組成物の少なくとも０．５重量％である、
細胞組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の細胞組成物において、前記トレハロースは前記細胞の集塊化を阻害するのに有効である、細胞組成物。
【請求項２２】
請求項２０又は請求項２１に記載の細胞組成物において、前記細胞は間葉系幹細胞を備えている、細胞組成物。
【請求項２３】
請求項１から請求項１８の何れか一項に記載の方法であって、更に、前記トレハロース含有細胞懸濁液を濾過する段階、を備えている方法。
【請求項２４】
液体トレハロース組成物と、
前記液体トレハロース組成物を細胞と組み合わせるための容器と、
を備えているキット。
【請求項２５】
請求項２４に記載のキットであって、前記液体トレハロース組成物と組み合わされることになっている細胞を収容している容器、を更に備えているキット。
【請求項２６】
請求項２４又は請求項２５に記載のキットであって、更に濾過材を備えているキット。
【請求項２７】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記水性媒質は、更に、約０．９重量％の塩化ナトリウムを含有している、方法。
【請求項２８】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記水性媒質は２００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ乃至６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有している、方法。
【請求項２９】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は哺乳類の細胞である、方法。
【請求項３０】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記細胞はヒトの細胞である方法。
【請求項３１】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は幹細胞である、方法。
【請求項３２】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記細胞は間葉系幹細胞である、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記間葉系幹細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項３４】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記トレハロースは前記トレハロース含有細胞懸濁液中の前記細胞の集塊化を低減するのに有効な量で存在している、方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、前記トレハロース含有細胞懸濁液中に約１．５重量％乃至約７重量％の範囲のトレハロース濃度を提供するように行われる、方法。
【請求項３６】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、
前記解凍細胞を凍結保存容器から取り出す段階と、
前記解凍細胞を第２の容器内で前記トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせる段階と、
を含んでいる、方法。
【請求項３７】
請求項１から請求項３の何れか一項に記載の方法において、前記組み合わせる段階は、前記解凍生細胞を含有し且つ死細胞から放出されたＤＮＡを含有する液体媒質を、前記トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせる段階を備えている、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、前記液体媒質は前記細胞が凍結保存されていた媒質である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０１４年９月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０５６，８４２号の恩典を主張するものであり、同仮出願をこれにより参考文献としてここにそっくりそのまま援用する。
【０００２】
本開示の諸態様は、概括的には、細胞組成物に関しており、より具体的な諸態様では、既に凍結保存に曝された細胞を希釈又は懸濁するために有用な液体組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な病変又は障害の治療における細胞組成物のヒト及び動物への投与がいよいよ普及しつつあり、数多くの療法を改善する期待を担っている。細胞組成物は、患者へ投与されるものであることから、その性質は重要である。組成物への添加物は患者にとって生物学的に受容可能でなければならない。同様に、組成物中の細胞の状態、更には投与プロトコルの前、最中、及び後のそれら細胞の生存性も重要性が高い。
【０００４】
１つの懸念される分野では、液体媒質中に懸濁させた細胞は往々にして凝集又は集塊化する傾向がある。集塊化は、一部の事例では特有の問題として細胞を凍結保存しその後解凍した後に見られる。これは、細胞の高療法用量を回収し、温存し、送達しようとする試みを挫折させかねない。また集塊化の激しい細胞調製物の投与は患者に危険をもたらさないとも限らず、その様な危険は細胞集塊化を最小限に抑える又は軽減するための有効な方途があれば改善されもしよう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該分野の背景に鑑み、細胞懸濁液組成物を調製するための改善された及び／又は代わりの方法及び組成物の必要性、例えばヒト又は動物の患者へ送達するのに適した細胞懸濁液組成物を調製するための方法及び組成物の必要性が以前より存在する。本開示の諸態様はこれらの必要性に取り組んでいる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ここに開示されている特定の態様では、細胞懸濁液、好適には哺乳類細胞懸濁液、の調製に関連して、トレハロースを含有する水性媒質が好都合な使用を見出すことが発見されている。トレハロースは、有益にも、細胞集塊化を阻害し、療法上の使用又は他の使用のための改善された細胞懸濁液の調製を可能にさせることが発見された。細胞は、先に凍結保存及び解凍に曝された細胞であってもよい。解凍細胞を、トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせて細胞懸濁液を調製することができる。
【０００７】
ここに開示されている１つの実施形態によれば、細胞懸濁液を調製するための方法は、（ｉ）凍結保存細胞を解凍して解凍細胞を提供する段階と、（ｉｉ）解凍細胞を、トレハロースを含有する水性媒質と組み合わせる段階と、を含んでいる。好適な実施形態では、組み合わせる段階は、解凍細胞の、第１の高い１ミリリットル当たり細胞数（個／ｍＬ）の密度から第２の低い個／ｍＬの密度への希釈に影響を与える段階を含んでいる。例えば、希釈は、個／ｍＬでの密度の少なくとも３０％減少、又は個／ｍＬでの密度の少なくとも５０％減少を生じさせることができる。加えて又は代わりに、希釈は、３００万個／ｍＬより大きい第１の密度から、２５０万個／ｍＬ未満の第２の密度、例えば約２５万個／ｍＬ乃至約２５０万個／ｍＬの範囲へ、とすることもできる。
【０００８】
ここに開示されている他の実施形態によれば、トレハロース含有細胞懸濁液を調製するための液体組成物が提供されている。液体組成物は無菌水性媒質を含んでおり、当該無菌水性媒体は、トレハロースを、約０．５重量％乃至約２０重量％、より好適には約０．５重量％乃至約１０重量％、の範囲の濃度で含有しており、及び／又は約２００乃至約６００の範囲のオスモル濃度を有している。組成物は、約０．９％塩化ナトリウムを含むことができ、更に、例えばリン酸塩緩衝液で、緩衝されていて約６乃至約８のｐＨを有しているのが望ましい。
【０００９】
ここに開示されている更に別の実施形態によれば、以上に及び本明細書の他の箇所に記載の液体トレハロース組成物を含んでいる細胞懸濁液を調製するためのキットが、液体トレハロース組成物を細胞と組み合わせるための容器である例えば袋と組み合わせて提供されている。キットは、更に、液体トレハロース組成物と組み合わされることになっている細胞を収容している容器（例えばバイアル又は袋）、及び／又は調製された細胞懸濁液を患者への細胞懸濁液投与に先立って通過させる濾過材、を含むことができる。
【００１０】
追加の実施形態並びにそれらの特徴及び利点は本明細書の説明から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
この詳細な説明では特定の実施形態を参照してゆくことにし、それら実施形態を説明するのに特定の用語遣いを用いることにする。この説明は例示を目的とするものであることを理解しておきたい。説明されている実施形態における何らかの改変及び更なる修正、並びにその原理の何らかの更なる適用が、この開示に関連する技術分野の当業者には普通に想起されるであろうと考えている。
【００１２】
以上に開示されている様に、特定の態様では、本開示は、トレハロースを含有している細胞懸濁液を調製するための方法並びに同方法のための有用な組成物及びキットに関する。
【００１３】
トレハロースは、ミコース又はトレマロース（tremalose）としても知られているものであって、２つのα−グルコース単位間のα，α−１，１−グルコシド結合によって形成されるアルファ結合二糖類である。それは、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２−イル］オキシオキサン−３，４，５−トリオルの化学名（ＩＵＰＡＣ命名法）を有している。
【００１４】
本明細書の特定の実施形態では、トレハロースを含有する水性媒質（例えば溶液）を細胞と組み合わせて細胞懸濁液を調製する。水性媒質は、これらの目的にとって任意の適した濃度のトレハロースを含有することができる。特定の態様では、水性媒質は、トレハロースを、約１重量％乃至約２０重量％、又は約１重量％乃至約１０重量％、又は約２重量％乃至約７重量％、又は約２．５重量％乃至約５重量％、又は約３重量％乃至約４重量％、の濃度で含有している。水性媒質は他の成分も含むことができる。例えば、それは、塩化ナトリウムを、生理学的に受容可能なレベルで、例えば約０．５％乃至約１．５％の範囲のレベル、例えば約０．９％（等張性）のレベルで含むことができる。水性媒質は、更に、緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液、を含むことができ、約６乃至８、又は約６．８乃至７．８、又は約７乃至７．５の範囲のｐＨを有することができる。水性媒質は、更に、２００ミリオスモル毎キログラム（ｍｏｓｍ／ｋｇ）乃至６００ｍｏｓｍ／ｋｇ、２５０ｍｏｓｍ／ｋｇ乃至５００ｍｏｓｍ／ｋｇ、又は２５０ｍｏｓｍ／ｋｇ乃至４００ｍｏｓｍ／ｋｇ、の範囲のオスモル濃度を有することができる。
【００１５】
水性媒質を細胞と組み合わせて、適したトレハロース濃度を有するトレハロース含有細胞懸濁液を調製することができる。このトレハロースの濃度は、特定の実施形態では、約１重量％乃至約１０重量％、又は約２重量％乃至約７重量％、又は約２．５重量％乃至約５重量％、又は約３重量％乃至約４重量％、の範囲にある。加えて又は代わりに、トレハロースの濃度は、トレハロース無しの対応する細胞懸濁液と比べて細胞の集塊化を阻害するのに効果を発揮することができる。集塊化の阻害は、例えば細胞懸濁液調製後少なくとも１０分の時点、細胞懸濁液調製後少なくとも２０分の時点、又は細胞懸濁液の調製後少なくとも６０分後の時点での、調製された細胞懸濁液中の細胞集塊の形成がより少ない及び／又はより小さいことによって観察できる。細胞懸濁液の調製以後の相当な時間の期間に亘って集塊化を阻害するトレハロースの能力は、一例として、調製された細胞懸濁液を患者へ、例えば細胞懸濁液の患者の血流中への静脈アクセス又は動脈アクセスによる注入又は輸注によって及び／又は細胞懸濁液の局所移植によって、投与するのに十分な時間を提供することができる。細胞懸濁液の療法的用途では、懸濁液を、患者へ、比較的長い時間の期間、例えば、少なくとも１０分、少なくとも２０分、又は少なくとも６０分に亘って投与することができる。
【００１６】
この文書に開示されているトレハロース含有細胞懸濁液の調製に使用される細胞組成物は、どのような適した細胞組成物であってもよい。特定の実施形態では、細胞組成物は、凍結保存されている細胞ということになる。その様な凍結保存は、特定の態様では、細胞組成物を約−６０℃以下又は約−８０℃以下の温度で凍らせることを、また特定の態様では約−１９６℃の温度で（例えば液体窒素中で）凍らせることを、伴うことがある。凍結保存細胞組成物は、典型的には、凍結保護剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ラクトース−卵黄増量剤、トレハロース、及び／又は他のその様な作用物質、を含むということになろう。特定の実施形態では、凍結保存細胞組成物は、トレハロース非含有又は本質的にトレハロース非含有（即ち、約０．１％未満のトレハロースを含有）であろう。使用されることになる凍結保存された細胞組成物又は他の細胞組成物の細胞密度は様々に異なっていてもよい。幾つかの形態では、細胞密度は、少なくとも約１００万個／ｍＬ、少なくとも２００万個／ｍＬ、又は少なくとも５００万個／ｍＬであり、典型的には１００万個／ｍＬ乃至１億個／ｍＬの範囲にあり、より典型的には１００万個／ｍＬ乃至２０００万個／ｍＬの範囲にあろう。細胞は、凍結保存されるとき、凍結保存の条件に耐え尚且つ容器シールの完全性を維持するように構築されている凍結用袋又は凍結用バイアル(ｃｒｙｏｖｉａｌ)の様な適切な容器内に密封することができる。
【００１７】
本開示の実施形態では、広範に様々な細胞型を使用することができる。例えば、細胞は、皮膚細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肺細胞、腸間膜細胞、脂肪細胞、又は間葉系幹細胞の様な幹細胞、であってもよい。脂肪細胞は、大網脂肪、腹膜前脂肪、腎臓周囲脂肪、心膜脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪、又は副睾丸脂肪に由来していてもよい。特定の実施形態では、細胞は、間質細胞、幹細胞、又はそれらの組合せを備えている。ここでの使用に際し、「幹細胞」という用語は、広義で使用されており、伝統的な幹細胞、脂肪由来幹細胞、始原細胞、前始原細胞（preprogenitor cells）、予備細胞、など、を含む。例示としての幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、筋前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ球系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞、など、を含む。使用することのできる追加の例示としての細胞は、肝細胞、上皮細胞、クッパー細胞、線維芽細胞、神経細胞、心筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、膵腺房細胞、ランゲルハンス島、骨細胞、筋芽細胞、衛星細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、胆管上皮細胞、及びこれらの細胞型の何れかの始原細胞を含む。
【００１８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が使用される場合、それは何れの適した組織から得られてもよい。これらは、一例として、歯系組織（例えば、歯髄、歯周靭帯、又は他の歯系組織から採取されたものなど）、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織（子宮内膜再生細胞を含む）、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織（全層皮膚組織を含む）、に由来するＭＳＣを含む。これら又は他のＭＳＣを本開示の諸態様で使用することができる。ＭＳＣは、概して、フローサイトメトリーによって検出されることとしてマーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し（＞９０％）且つＣＤ３４及びＣＤ４５並びにＭＨＣクラスＩＩの発現を欠く（＜５％）付着性細胞集団であるとしてもよい。
【００１９】
ここでの実施形態に使用される細胞は、動物、例えば、ヒト、イヌ科（例えばイヌ）、ネコ科（例えばネコ）、ウマ科（例えばウマ）、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシの様な哺乳類、の適した如何なる種に由来していてもよい。
【００２０】
トレハロース含有細胞懸濁液を調製するのに使用される細胞組成物は、様々なやり方でトレハロースと組み合わせることができる。特定のモードでは、細胞組成物は、トレハロースを含有する水性溶液の様な水性液体媒質と組み合わせることができる。これに関し、細胞組成物がトレハロースを含有する媒質へ添加されてもよいし、トレハロースを含有する媒質が細胞組成物へ添加されてもよいし、又はその両方であってもよい。２つの材料の組み合わせは、細胞の生存性を実用可能な程度まで温存するように行うことができる。これらの目的には、漸進的に組み合わせてゆけばよく、緩く撹拌しながら行うのは随意である。
【００２１】
凍結保存細胞組成物が使用される場合、典型的にそれはトレハロース含有媒質と組み合わされる前に解凍される。何れの適した解凍技法が使用されてもよい。特定の形態では、細胞組成物は、凍結保存細胞を収容している袋又はバイアルの様な容器を、例えば約３７℃へ加熱された液体浴槽の中へ浸すことによって解凍される。細胞組成物が解凍されたら（例えば組成物中に氷の結晶が無いことが観察されることによる）、細胞組成物をトレハロース含有媒質と組み合わせることができる。幾つかの形態では、凍結保存細胞用の容器は、隔膜の様な無菌のアクセスポート又は部材を提供されていて、解凍後に、細胞及びそれらが保存されていた媒質を含む解凍細胞組成物が針及びシリンジ又は他の適した移送装置を用いて容器から引き出される。そのうちの少なくとも細胞成分が、その後、トレハロース含有媒質と組み合わされ、幾つかの形態では細胞及び保存媒質がトレハロース含有媒質と組み合わされる。トレハロース含有媒質との組み合わせの段階に保存媒質を含ませない事例では、例えば別の生理学的に受容可能な媒質を用いて細胞を洗い、それからトレハロース含有媒質と組み合わせるようにすればよい。何れの場合も、トレハロース含有媒質と組み合わされる細胞組成物は、細胞を懸濁させている液体媒質の中へ死細胞によって放出された細胞成分を、例えばＤＮＡを含め、含んでいる可能性があり、典型的にはその様な細胞成分を含んでいるはずである。このＤＮＡが細胞の集塊形成傾向に対する寄与因子にならないとも限らず、調製された細胞懸濁液中のトレハロースの存在はＤＮＡが助長する細胞の集塊化を阻害することができる。
【００２２】
細胞（及び随意的にはそれらの保存媒質又は洗浄媒質）とトレハロース含有媒質を組み合わせることは、任意の適した容器又は入れ物内で行うことができる。有益なモードでは、組み合わせは、第２の容器（凍結保存容器又は細胞が保存又は保持されていた他の容器以外）内で行われる。この第２の容器は、細胞及び／又はトレハロース含有媒質の様な材料を当該第２の容器の中へ無菌移送するための投入ポート又は他の投入部材、例えば隔膜、を含むことができる。幾つかの形態では、細胞組成物とトレハロース含有媒質を組み合わせる段階は、これらの両方を第２の容器の中へ、例えば順に又は同時のどちらかで送達する段階を含むことができる。他の形態では、第２の容器がトレハロース含有媒質を無菌状態で既に収容している事前製造容器として提供されていて、細胞組成物は事前製造容器へ添加することができる。これらの実施形態の何れにおいても、第２の容器は袋であってもよく、及び／又は第２の容器は投入ポートから離間した出口ポート又は細胞を袋又は他の容器から送達するための、例えば患者の中へ送達するための、他の部材を有していてもよい。第２の容器は、例えば医学的ケアでの患者治療用の一般的な生理食塩水袋に見られるのと同様に、材料の無菌投入のための隔膜と材料の出口としての弁付きポートとを有する袋であってもよい。細胞（潜在的にはそれらの保存媒質又は洗浄媒質と一体）が、そして潜在的にはトレハロース含有媒質（袋に入って事前製造されていない場合）が、隔膜を貫く針によって袋の中へ無菌送達され、調製されたトレハロース含有細胞懸濁液が弁付きポートを通って患者へ無菌送達されることになる。
【００２３】
調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、適した如何なる細胞密度を有していてもよい。幾つかの実施形態では、調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、少なくとも１０万個／ｍＬ、少なくとも２０万個／ｍＬ、少なくとも５０万個／ｍＬ、少なくとも１００万個／ｍＬ、又は少なくとも２００万個／ｍＬ、の細胞密度を有しているであろう。典型的には、その様な調製された懸濁液中の細胞密度は、１０万個／ｍＬ乃至１億個／ｍＬの範囲、より典型的には１０万個／ｍＬ乃至１０００万個／ｍＬの範囲、なおいっそう典型的には１０万個／ｍＬ乃至５００万個／ｍＬの範囲の細胞密度を有しているであろう。特定の形態では、調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、約５０万個／ｍＬ乃至約３００万個／ｍＬの範囲の細胞密度を有している。
【００２４】
調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、適したトレハロース濃度、望ましくは細胞懸濁液中の細胞の集塊化を阻害する濃度、を有することができる。幾つかの実施形態では、調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、少なくとも約０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、又は少なくとも３重量％、のトレハロース濃度を有しているであろう。典型的には、その様な調製された懸濁液中のトレハロース濃度は、約０．５％乃至約２０％の範囲に、より典型的には約１％乃至約１５％の範囲に、なおいっそう典型的には約２％乃至約１０％の範囲にあり、特定の実施形態では約２．５％乃至約８％ということになろう。特定の形態では、調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、約３％乃至約４％のトレハロース濃度を有しているであろう。ここに識別されている比較的低い又は中程度の濃度であってもトレハロースは調製された細胞懸濁液中の細胞集塊化を阻止できることが発見された。
【００２５】
調製されたトレハロース含有細胞懸濁液は、例えば研究又は療法上の使用を含め、適した如何なる使用に供されてもよい。療法上の使用については、細胞懸濁液は、一例としてヒト又は動物の患者へ疾病又は病態を治療する又は予防するために投与することができ、例えば、変性性骨疾患、変形性関節症、関節リューマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アトピー、肝炎、慢性ステロイド応答性髄膜炎動脈炎、ビーグル疼痛症候群、変性性脊髄症、慢性腎不全、拡張型及び僧房弁型心筋症、乾性角結膜炎、免疫介在性非びらん性関節炎、免疫介在性溶血性貧血、免疫介在性血小板減少症、エヴァンズ症候群、椎間板疾患、病気又は外傷に続発する筋線維症、難治性角膜潰瘍、真性糖尿病、脊椎外傷、好酸球性肉芽腫群、肥大型心筋症、胆管炎、脊髄損傷、運動誘発性肺出血、横紋筋融解症、角膜潰瘍、湿疹、多発性硬化症、筋ジストロフィー、脊髄損傷、真性糖尿病、肝炎、心筋梗塞、うっ血性心不全、又は筋線維症など、を治療する又は予防するために投与することができる。
【００２６】
細胞懸濁液は、何れの適した方式で患者へ投与されてもよい。特定の形態では、細胞懸濁液は全身的に患者の血流の中へ、例えば静脈又は動脈への送達によって、送達される。他の形態では、細胞懸濁液は、患者へ（例えば、アトピー又は他の皮膚障害の治療では）局所的に送達される。更に他の形態では、細胞懸濁液は患者の局所的移植部位へ送達される。これらの投与モードの何れか又はこれらの投与モードの何れかの組合せが患者の治療で使用されてもよい。特定の組合せ治療では、本明細書のトレハロース含有細胞懸濁液の第１の量を全身的に患者の血流の中へ送達し、本明細書のトレハロース含有細胞懸濁液の第２の量（第１の量と共に又は別に調製されていて同じ（単数又は複数の）型又は異なる（単数又は複数の）型の細胞を含んでいる）を患者体内で局所的に１つ以上の骨格関節に又はその付近に移植して、関節炎病態、例えばここに識別されている関節炎病態の何れか、を治療するようにしている。更に、ここでの患者治療では、ここに説明されているトレハロース含有細胞懸濁液の単回投与が幾つかの実施形態ではなされている一方、他ではここに説明されているトレハロース含有細胞懸濁液の多回独立投与が経時的になされてもよい（例えば、週単位投与又は月単位投与）。更なる実施形態では、細胞懸濁液は、例えば存在しているかもしれない何らかの細胞の集塊を除去するために、患者への投与に先立って濾過されてもよい。特定の形態では、細胞懸濁液を通して患者の血流の中へ、例えば患者の静脈又は動脈の中へ入れる管材内に配置させたインライン濾過材に細胞懸濁液を通過させるようにしている。その様な濾過材は、特定の変形型では、単独に懸濁している細胞が濾過材を通過するのを許容しながらも、約２００マイクロメートル以下の粒径カットオフ（即ち、約２００マイクロメートルより大きい最大断面寸法を有する粒子を通過から除外する）、又は約１７０マイクロメートル以下の粒径カットオフ、又は約１００マイクロメートル以下の粒径カットオフを有していてもよい。
【００２７】
ここでの追加の実施形態は、ここに説明されているトレハロース含有細胞懸濁液を調製する場合に有用な製品を含んでいる。１つの実施形態では、トレハロース含有細胞懸濁液を調製するのに有用な、トレハロースを含有する水性媒質が提供されている。トレハロースを含有する水性媒質は、ここに特定されている成分を、ここに特定されている量で含有していてもよい。同様に、トレハロース含有水性媒質は、キットに含まれている容器に入って無菌形態で提供されていてもよい。当該容器は、バイアル、袋、又は他の容器であってもよい。特定の形態では、容器は、トレハロース含有細胞懸濁液を調製することのできる以上に論じられている「第２の容器」の特徴を、例えば以上に論じられている入口ポート又は他の部材（例えば針隔膜）及び別になっている出口ポートを有していることを含め、有している。ここに開示されているキットは、トレハロース含有水性媒体を収容している容器を、１つ以上の追加の構成要素と併せて含んでいてもよく、その様な追加の構成要素には、限定するわけではないが例えば、シリンジの様な液体移送装置及び付着済みの又は付着可能な針、そしておそらくはトレハロース含有細胞懸濁液を調製するのに使用されることになっている細胞組成物を収容している容器も含まれる。細胞組成物を収容している容器は、組成物を凍結保存状態で含んでいてもよく（例えばキットと共に冷凍されて出荷）、又は組成物を非凍結保存（例えば、細胞が既に凍結保存されている場合に解凍させた）状態で含んでいてもよい。ここに開示されているキットは、更に、少なくとも１つの濾過材、例えば以上に説明されている濾過材であって調製されたトレハロース含有細胞懸濁液を患者への投与に先立って通過させる濾過材、及び／又は患者への投与時に細胞懸濁液を通す管材、を含んでいてもよい。
【００２８】
次に続く具体的な実験は本開示の諸態様の更なる理解を促すために提供されている。この実験は本質的に説明目的であり限定を課すものではないことを理解しておきたい。
【００２９】
実施例１
１．１要約
既に凍結保存されていたイヌの子宮再生細胞の解凍後の集塊化を防止するうえで、生理食塩水単独に比較して、デキストロース、ヒドロキシエチルスターチ（ＶｅｔＳｔａｒｃｈ（商標））、及びトレハロースの有効性を比較する研究を行った。デキストロースは細胞集塊化の低減化を示さなかった。ヒドロキシエチルスターチは、幾らかの改善を示しはしたものの、媒質集塊を有する調製物をもたらした。トレハロースは集塊化を大いに低減させており、集塊があったとしてもそれらは生理食塩水試料中の長い糸状構造と比較するとヒトの目に殆ど視認されない極めて小さい略球状粒子である、ということを発見した。推定される細胞輸注の持続時間に亘るトレハロースへの暴露後、細胞生存率は９０％より上を保った。更に、細胞をＴ２５フラスコへ平板培養したところ細胞形態は正常であった。
【００３０】
１．２細胞
この実施例で使用した細胞は、イヌの子宮組織（第５継代）から得た純粋間葉系幹細胞集団であった。細胞をＶｅｔＳｔａｒｃｈ中に２％ＤＭＳＯを含む凍結用バイアルの中で凍らせた。凍らせた細胞試料を、１０００万個／ｍＬの細胞密度の２ｍＬアリコートとして提供した。試験には３匹の異なるイヌドナーからの細胞が含まれており、ここではドナー１、ドナー２、及びドナー３と表示した。
【００３１】
１．３袋調製
実験は、生理食塩水を患者の血流へ投与するのに一般的に使用されている５０ｍＬ袋で施行した。調製された細胞懸濁液用の実験体積は、実行回に依存して５ｍＬ−１０ｍＬの間とした。抗集塊化能力について試験された化学物質は、デキストロース、ヒドロキシエチルスターチ、及びトレハロースを含んだ。これらの化学物質の濃度は実験間で異ならせた。抗集塊化剤の溶液を調製し、次いで袋の中へ注入した。細胞を袋に注入したら抗集塊化剤の目標濃度に達するように濃度と体積を算出した。袋内での最終組成物の調製後に細胞が１００万個／ｍＬであるように体積を選定した。
【００３２】
１．３細胞解凍及び注入
細胞を含有する凍結用袋を３７℃の水槽の中で、氷の結晶がちょうど解けるまで解凍した。１８ゲージの針を用いて細胞をバイアルからバイアルの針隔膜を通して引き出し、細胞を溶解させないようにゆっくりと細胞を袋の針隔膜を通して袋に添加した。次いでバイアルを生理食塩水で洗い、この洗った体積分もまた慎重に袋の中へ針隔壁を通して注入した。その後、袋を監視し、細胞の状態を１０分から８０分の間に亘って観察した。
【００３３】
１．４袋後の細胞の評価
袋内での時間が満了した後、シリンジ及び１８ゲージ針を用いて細胞を袋から慎重に取り出した。この体積を５０ｍＬ円錐フラスコに慎重に入れた。それを細胞の均一分布が確保されるように混合し、次いでトリパンブルーと１：１で混合し、生存性を確定するべく計数した。当該体積を次に４００ｇで５分間遠心分離機に掛け、上清を吸引し、２ｍＬの完全な媒質中に再懸濁させた。この細胞懸濁液の１ｍＬを次いでＴ２５フラスコの中へ平板培養した。２４時間後、平板培地を観察し、細胞の状態を書き留めた。
【００３４】
１．５結果―トレハロースのヒドロキシエチルスターチに対する比較
集塊化。ドナー１から得た細胞を、１００万個／ｍＬの細胞濃度で袋内にて抗集塊化剤候補であるトレハロース（最終調製物中３．３％）及びヒドロキシエチルスターチ（最終調製物中２５％）へ曝した。トレハロース試料については、８０分後もなお集塊は形成されなかった。溶液はやや混濁してはいたが集塊状ではないことが見てとれた。ヒドロキシエチルスターチ試料については、１２分で集塊化が観察され、小さくはあるが視認される球状集塊が形成された。
【００３５】
生存性。集塊化実験が終了すると、細胞を袋から取り出し、トリパンブルー染色によって生存性を試験し、Ｔ２５フラスコへ平板培養した。トレハロース中の細胞は９４％の生存率を示したのに対して、ヒドロキシエチルスターチ中の細胞は８０％の生存率を示した。表２から分かる様に、ＶｅｔＳｔａｒｃｈ中の細胞は、トレハロース中の細胞に比較し生存率が約１０％劣った。
【００３６】
細胞形態。平板培養から２４時間後、Ｔ２５フラスコを観察した。ヒドロキシエチルスターチ試料とトレハロース試料のどちらについても細胞形態は正常であった。
【００３７】
１．６結果――トレハロースのデキストロースに対する比較
ドナー２から得た細胞を、１００万個／ｍＬの細胞濃度で袋内にてデキストロース（５％）、トレハロース（１．６５％及び３．３％）、及びデキストロース（５％）へ曝した。デキストロース試料については、１０分以内に小さい集塊が形成され始め、８０分後には多くの糸状集塊があった。１．６５％トレハロース試料については、２０分後に小さい集塊が形成され始め、８０分後には少しの糸状集塊があった。３．３％トレハロース試料については、２０分後に小さい集塊が形成され始め、８０分後にはほんの数個の集塊しかなく、それらは小さいままであった。
【００３８】
１．７結果――他のドナー細胞でのトレハロース
ドナー１及びドナー３から得た細胞を、１００万／ｍＬの細胞濃度で袋内にてトレハロース（３．３％）に曝した。ドナー３試料は、２０分後に幾つかの集塊を形成し始めたが、それらは非常に小さく殆ど視認されず、８０分後、ほんの数個の非常に小さい集塊しかなく、それらはなおも殆ど視認されなかった。ドナー１試料については、２０分時に幾らかの集塊化が観察されたが、それらもまた同様に殆ど視認されないほどの非常に小さい集塊であり、８０分後も１つか２つの僅かに大きい集塊を別にして本質的に全ての集塊は非常に小さく殆ど視認されなかった。
【国際調査報告】
2017531446.tif 000002
2017531446.tif 000003
2017531446.tif 000004
2017531446.tif 000005