(57)【要約】  鎖侵入を含み、標的核酸配列の上流及び下流の領域の両方に鎖侵入が生じる、標的核酸配列の増幅のための方法が提供される。かかる方法において用いるのに好適なキット及び組成物が、更に提供される。方法は、未知の配列の領域を含む標的核酸配列を増幅すること、又は未知の配列の領域を含む標的核酸の配列を決定することを含み得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を増幅するための方法であって、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、前記標的核酸配列と少なくとも１の上流プライマー、少なくとも１の下流プライマー、並びに第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、第１の鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流結合領域を一本鎖にして上流プライマーの結合を可能にし、且つ、第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の下流結合領域を一本鎖にして下流プライマーの結合を可能にする、方法。
【請求項２】
鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する、上流及び下流の結合領域を含む標的核酸配列を増幅するための方法であって、前記標的核酸配列と鎖侵入オリゴヌクレオチド及び標的核酸配列を増幅できる１以上のプライマーとを接触させることを含み、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を一本鎖にして、前記１以上のプライマーの結合を可能にする、方法。
【請求項３】
上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域が、標的核酸配列の同一鎖中に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域が、標的核酸配列の相対する両鎖に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の相対する両鎖に、それらの３’末端が互いに向かい合う方向、又は互いから離れる方向で結合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸配列の、上流及び／又は下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域が、上流又は下流のプライマーのそれぞれに対する結合領域とオーバーラップしない、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸配列の増幅を促進する条件が、リコンビナーゼの存在を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列の増幅を促進する等温条件下で行われる、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸配列と１以上の更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドとを接触させることを含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸配列をオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを更に含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸配列中の、プローブに対する結合領域が、鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する結合領域及び／又はプライマーに対する結合領域とオーバーラップしない、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１２】
プローブに対する結合領域が、標的核酸配列の上流と下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域の間にある、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１３】
鎖侵入オリゴヌクレオチド及びそれが標的核酸核酸配列に結合することを可能にするプライマーが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムを形成する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸配列と、少なくとも１の上流プライマー及び少なくとも１の下流プライマーとを接触させることを含み、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を一本鎖にし、上流及び下流のプライマーの結合を可能にする、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸配列と、標的核酸配列中の上流及び下流の結合領域の両方に結合できる単一種のプライマーとを接触させることを含み、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を一本鎖にし、単一種のプライマーの、その上流及び下流の結合領域の両方への結合を可能にする、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する、上流及び下流の結合領域がアダプター配列である、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸配列に対する、少なくとも１の上流プライマー及び少なくとも１の下流プライマー、並びに、標的核酸配列中に上流及び下流の結合領域をそれぞれ有する第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１８】
鎖侵入オリゴヌクレオチド及び１以上のプライマー、及び少なくとも１のＤＮＡアダプターを含むキットであって、標的核酸配列の上流結合領域及び下流結合領域にＤＮＡアダプターが存在する場合、前記鎖侵入オリゴヌクレオチドがそれに結合でき、且つ前記１以上のプライマーが前記標的核酸配列を増幅できる、キット。
【請求項１９】
前記標的核酸配列に対する、少なくとも１の上流プライマー及び少なくとも１の下流プライマーを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
標的核酸配列中の上流及び下流の結合領域の両方に結合できる単一種のプライマーを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
標的核酸配列中の上流及び／又は下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域が、上流又は下流のプライマーのそれぞれに対する結合領域とオーバーラップしない、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
少なくとも１のオリゴヌクレオチドプローブを更に含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
標的核酸配列中の、プローブに対する結合領域が、鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する結合領域及び／又はプライマーに対する結合領域とオーバーラップしない、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
プローブに対する結合領域が、標的核酸配列の上流と下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域の間にある、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
標的核酸配列の上流及び／又は下流の領域に結合する、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーがＦＲＥＴシステムを形成する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも１の制限エンドヌクレアーゼを更に含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
１以上の更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドを含む、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
少なくとも１のＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項１８又は請求項１８に従属する請求項１９〜２７に記載のキット。
【請求項２９】
未知の配列の領域を含む標的核酸配列を増幅する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、及び請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、前記標的核酸配列を増幅することを含む、方法。
【請求項３０】
未知の配列の領域を含む標的核酸の配列を決定する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施することにより前記標的核酸配列を増幅すること、及び前記未知の配列の領域の配列を決定することを含む、方法。
【請求項３１】
上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域のそれぞれがＤＮＡアダプター配列を含み、単一種の鎖侵入オリゴヌクレオチドが上流結合領域及び下流結合領域の両方においてＤＮＡアダプター配列に結合する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、鎖侵入（ｓｔｒａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）を含む、標的核酸配列の増幅方法に関する。本発明は更に、かかる方法において用いるのに好適なキット及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
鎖侵入による、標的核酸配列の増幅のための方法は、例えば、国際公開第２００９／１５０４６７号に記載されている。標的核酸配列の侵入は、標的二重鎖を開いて上流及び下流のプライマーの両方の結合を可能にする、一本鎖の侵入オリゴヌクレオチドによって媒介される。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】平行侵入オリゴヌクレオチド配置（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、反平行侵入オリゴヌクレオチド配置（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又は逆反平行配置（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のいずれかを伴う、２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。ＩＯ１−第１の鎖侵入オリゴヌクレオチド；ＩＯ２−第２の鎖侵入オリゴヌクレオチド。Ｆ−プライマー−フォワードプライマー又は上流プライマー；Ｒプライマー−リバースプライマー又は下流プライマー。ＩＯ１及びＩＯ２の伸長不可能な末端を、破線で示す。
【図２ａ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。増幅プロットは、（ａ）平行侵入オリゴヌクレオチド配置について示す。デュプリケートの反応を示す。増幅は、サイバーグリーンＩを検出することによってモニターした。増幅プロットのＸ軸：時間（分）、Ｙ軸：サイバーグリーンＩ蛍光（蛍光強度、任意単位）。
【図２ｂ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。反応の特異性は、融解曲線解析によって更に評価した。融解曲線分析を、平行侵入オリゴヌクレオチド配置について（ｂ）に示す。融解曲線解析についてのＸ軸：温度（摂氏度）、Ｙ軸（−ｄ（蛍光／ｄ（温度）、（任意単位））。
【図２ｃ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。増幅プロットは、（ｃ）反平行侵入オリゴヌクレオチド配置について示す。デュプリケートの反応を示す。増幅は、サイバーグリーンＩを検出することによってモニターした。増幅プロットのＸ軸：時間（分）、Ｙ軸：サイバーグリーンＩ蛍光（蛍光強度、任意単位）。
【図２ｄ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。反応の特異性は、融解曲線解析によって更に評価した。融解曲線分析を、反平行侵入オリゴヌクレオチド配置について（ｄ）に示す。融解曲線解析についてのＸ軸：温度（摂氏度）、Ｙ軸（−ｄ（蛍光／ｄ（温度）、（任意単位））。
【図２ｅ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。増幅プロットは、（ｅ）逆反平行侵入オリゴヌクレオチド配置について示す。デュプリケートの反応を示す。増幅は、サイバーグリーンＩを検出することによってモニターした。増幅プロットのＸ軸：時間（分）、Ｙ軸：サイバーグリーンＩ蛍光（蛍光強度、任意単位）。
【図２ｆ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。反応の特異性は、融解曲線解析によって更に評価した。融解曲線分析を、逆反平行入オリゴヌクレオチド配置について（ｆ）に示す。融解曲線解析についてのＸ軸：温度（摂氏度）、Ｙ軸（−ｄ（蛍光／ｄ（温度）、（任意単位））。
【図３ａ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。反応は、２の相補的な侵入オリゴヌクレオチドを用いて、又は１の相補的な侵入オリゴヌクレオチド及び１の非相補的な侵入オリゴヌクレオチドを用いてのいずれかで行った。増幅プロットについてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。（ａ）は、平行配置のオリゴヌクレオチドを用いた際の結果を示す。デュプリケートの反応を示す。
【図３ｂ】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅。反応は、２の相補的な侵入オリゴヌクレオチドを用いて、又は１の相補的な侵入オリゴヌクレオチド及び１の非相補的な侵入オリゴヌクレオチドを用いてのいずれかで行った。増幅プロットについてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。（ｂ）は、オリゴヌクレオチドの反平行配置による結果を示す。デュプリケートの反応を示す。
【図４】２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた増幅反応における、プライマーの特異性。反応は、相補的なフォワード及びリバースのプライマーを用いて、又は相補的なフォワードプライマー及び非相補的なプライマーを用いてのいずれかで行った。標的ＤＮＡの濃度は１ｐＭであった。増幅プロットについてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。
【図５ａ】標的特異的プローブを含む、２の侵入オリゴヌクレオチドを用いる反応の適合性。（ａ）は、標的特異的プローブの使用の拠り所となる配置の模式図を示す。
【図５ｂ】標的特異的プローブを含む、２の侵入オリゴヌクレオチドを用いる反応の適合性。（ｂ）は、２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた、標的ＤＮＡの増幅及びリアルタイム検出を示す。トレースについてのラベルに示す通り、サイバーグリーンＩ又は標的特異的プローブのいずれかを用いて、増幅のリアルタイムモニタリングを達成した。各グラフについてのＸ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩ又はプローブの蛍光（任意単位）。
【図５ｃ】標的特異的プローブを含む、２の侵入オリゴヌクレオチドを用いる反応の適合性。ｃ）は、一本鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅（ＳＩＢＡ）及びリアルタイム検出を示す。トレースについてのラベルに示す通り、サイバーグリーンＩ又は標的特異的プローブのいずれかを用いて、増幅のリアルタイムモニタリングを達成した。各グラフについてのＸ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩ又はプローブの蛍光（任意単位）。
【図６ａ】非特異的増幅の検出に対する、（ａ）２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた反応及び（ｂ）単一の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた標準的反応（ＳＩＢＡ）の抵抗性。標準的なＳＩＢＡは、短いプライマーによる非特異的増幅の検出への抵抗性が、２の侵入オリゴヌクレオチドによって行われる増幅よりも弱かった（ｉｓ  ｗａｓ  ｌｅｓｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）。標的ＤＮＡの濃度は、長いプライマーについては１ｐＭであり、短いプライマーについては１ｆＭであった。サイバーグリーンＩ又は鎖侵入オリゴヌクレオチド若しくはプライマーの結合部位とオーバーラップしない結合部位を有するプローブを用いて、増幅をモニターした。各グラフにつてのＸ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩ又はプローブの蛍光（任意単位）。（ａ）は、２の侵入オリゴヌクレオチドによる増幅の間の、サイバーグリーンＩ又はプローブを用いた、増幅のモニタリングを示す。
【図６ｂ】非特異的増幅の検出に対する、（ａ）２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた反応及び（ｂ）単一の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた標準的反応（ＳＩＢＡ）の抵抗性。標準的なＳＩＢＡは、短いプライマーによる非特異的増幅の検出への抵抗性が、２の侵入オリゴヌクレオチドによって行われる増幅よりも弱かった。標的ＤＮＡの濃度は、長いプライマーについては１ｐＭであり、短いプライマーについては１ｆＭであった。サイバーグリーンＩ又は鎖侵入オリゴヌクレオチド若しくはプライマーの結合部位と重なり合わない結合部位を有するプローブを用いて、増幅をモニターした。各グラフにつてのＸ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩ又はプローブの蛍光（任意単位）。（ｂ）は、ＳＩＢＡにおける、サイバーグリーンＩを用いた、増幅のモニタリングを示す。
【図７】２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた、プラスミドＤＮＡからの標的ＤＮＡの増幅。プラスミドＤＮＡは、直接使用したか、又はＥｃｏＲＶ−ＨＦ制限酵素で処理したかのいずれかであった。増幅は、サイバーグリーンＩを用いてモニターした。Ｘ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩの蛍光（任意単位）。
【図８ａ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ａ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｂ）は、対応する融解曲線分析を示す。ａ）及びｂ）：３２４塩基対の二重鎖標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｂ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ａ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｂ）は、対応する融解曲線分析を示す。ａ）及びｂ）：３２４塩基対の二重鎖標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｃ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｃ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｄ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｃ）及び（ｄ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｄ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｃ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｄ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｃ）及び（ｄ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｅ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｅ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｆ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｅ）及び（ｆ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの反平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｆ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｅ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｆ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｅ）及び（ｆ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの反平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｇ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｇ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｈ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｇ）及び（ｈ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの逆反平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｈ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｇ）は、サイバーグリーンＩを用いた、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングについての増幅プロットを示す。（ｈ）は、対応する融解曲線分析を示す。（ｇ）及び（ｈ）：標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの逆反平行配置。増幅プロット及び融解曲線分析についてのＸ軸及びＹ軸は図２の通り。標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングは、サイバーグリーンＩを用いて達成した。
【図８ｉ】２の同一の侵入部位を有する標的ＤＮＡの増幅。反応を、標的ＤＮＡの両方の侵入部位に結合する単一の侵入オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ｉ）は、反応生成物の非変性電気泳動を示す。（ｉ）標的ＤＮＡを増幅するために用いる、侵入オリゴヌクレオチドの反平行配置。（ｉ）電気泳動像に関して、レーンは以下の通り：レーン１、ＢｉｏＲａｄ  ＥＺ  Ｌｏａｄ  ２０  ｂｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ；レーン２〜６はそれぞれ１０７、１０６、１０５、１０４及び１０３のコピー；レーン７、水のコントロール。
【図９ａ】侵入及び増幅をリアルタイムモニタリングするための、ＦＲＥＴに基づくシステム：（ａ）標識されたプライマー及び侵入オリゴヌクレオチドの模式図。
【図９ｂ】侵入及び増幅をリアルタイムモニタリングするための、ＦＲＥＴに基づくシステム。（ｂ）ＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドを平行配置で用いた、標的ＤＮＡの侵入及び増幅及び検出のリアルタイムモニタリング。（ｂ）についてのＸ軸：時間（分）。Ｙ軸：プローブの蛍光（任意単位）。
【図１０ａ】２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた、鎖侵入に基づく増幅の感度。１０６〜１コピーの、標的ＤＮＡの希釈系列を用いて、異なる３アッセイにより感度を評価した。サイバーグリーンＩを用いて、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングを達成した。増幅プロット：（ａ）アッセイ１。Ｘ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩの蛍光（任意単位）。
【図１０ｂ】２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた、鎖侵入に基づく増幅の感度。１０６〜１コピーの、標的ＤＮＡの希釈系列を用いて、異なる３アッセイにより感度を評価した。サイバーグリーンＩを用いて、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングを達成した。増幅プロット：（ｂ）アッセイ２。Ｘ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩの蛍光（任意単位）。
【図１０ｃ】２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いた、鎖侵入に基づく増幅の感度。１０６〜１コピーの、標的ＤＮＡの希釈系列を用いて、異なる３アッセイにより感度を評価した。サイバーグリーンＩを用いて、標的ＤＮＡ増幅のリアルタイムモニタリングを達成した。増幅プロット：（ｃ）アッセイ３。Ｘ軸：時間（分）。Ｙ軸：サイバーグリーンＩの蛍光（任意単位）。
【０００４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、非相補的侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、非相補的ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、プローブのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、プローブのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、標識された侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、標識された侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、標識されたプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、標識されたプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、標的鋳型のヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、アダプターのヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、アダプターのヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、アダプターのヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、アダプターのヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、アダプターのヌクレオチド配列である。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、標的核酸配列の、少なくとも２箇所での鎖侵入のためのシステムに関する。本発明の方法は、上流及び下流のプライマーの結合を可能にして標的核酸配列の増幅を行うために、標的核酸配列の上流及び下流の領域に結合して侵入する１以上の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いる。上流及び下流の両方の位置で標的核酸配列の鎖侵入を提供することは、各プライマー結合のイベントを、独立した鎖侵入のイベントに結びつけ、増幅プライマーとオーバーラップしない鎖侵入オリゴヌクレオチド配列の使用の発展性を増大させる。異なる２位置で媒介される鎖侵入は、単一点の鎖侵入から典型的に増幅され得る標的核酸配列よりも、長い標的核酸配列の増幅を促進する利点ももたらす。
【０００６】
更に、好適な結合配列が標的配列の両方の領域に存在するならば、同一の鎖侵入種（ｓｔｒａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が上流及び下流の両方の位置に侵入し得る。同様に、好適な結合配列が標的配列の両方の領域に存在する場合、単一のプライマー種が用いられ得る。これらの実施形態は、既知の結合領域（アダプター配列等）が、標的配列を含む鋳型中に存在する場合、未知の配列の増幅及び配列決定を可能にする。鎖侵入オリゴヌクレオチドはまた、二重鎖標的核酸配列の上流及び下流の結合領域に、代替的な配置で結合するように設計され得る。これは、増幅パラメータを最適化するために、特定のアンプリコンを標的とするための配列の設計を変える機会を提供する。更に、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーは、アンプリコンの領域が、プローブの結合のために遊離したままであるよう、オーバーラップしない結合領域を有するように設計され得、そのようにして、増幅の間にアンプリコンに結合するオリゴヌクレオチド種間の競合を低減させ、非特異的な増幅産物の検出を回避する。
【０００７】
従って、本発明は、標的核酸配列を増幅するための方法であって、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、前記標的核酸配列と少なくとも１の上流プライマー、少なくとも１の下流プライマー、並びに第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、第１の鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流結合領域を一本鎖にして上流プライマーの結合を可能にし、且つ、第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸の下流結合領域を一本鎖にして下流プライマーの結合を可能にする、方法を提供する。
【０００８】
本発明は、鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する、上流及び下流の結合領域を含む標的核酸配列を増幅するための方法であって、前記標的核酸配列と鎖侵入オリゴヌクレオチド及び標的核酸配列を増幅できる１以上のプライマーとを接触させることを含み、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を一本鎖にして、前記１以上のプライマーの結合を可能にする、方法を更に提供する。
【０００９】
本発明は、標的核酸配列に対する、少なくとも１の上流及び少なくとも１の下流のプライマー、並びに、標的核酸配列中に上流及び下流の結合領域をそれぞれ有する第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを含む、キットも提供する。
【００１０】
本発明は、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び１以上のプライマー、及び少なくとも１のＤＮＡアダプターを含むキットであって、標的核酸配列の上流結合領域及び下流結合領域にＤＮＡアダプターが存在する場合、前記鎖侵入オリゴヌクレオチドがそれに結合でき、且つ前記１以上のプライマーが前記標的核酸配列を増幅できる、キットを更に提供する。
【００１１】
本発明は、未知の配列の領域を含む標的核酸配列を増幅する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、及び鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーを用いて本発明の方法を実施し、標的核酸配列を増幅することを含む、方法を更に提供する。
【００１２】
本発明は、未知の配列の領域を含む標的核酸の配列を決定する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーを用いて本発明の方法を実施し、標的核酸配列を増幅すること、及び前記未知の配列の領域の配列を決定することを含む、方法を更に提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
開示される方法の種々の用途は、当該技術分野における特定のニーズに適合され得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のためのみの用語であること、限定されることは意図されないことも、理解されるべきである。加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、内容に別段の明確な規定がない限り、複数の意味を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への参照は、２以上のかかるポリペプチドを含む、等となる。上記又は下記に関わらず、本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。
【００１４】
標的核酸配列の増幅のための方法
本発明の方法は、２の別個の部位における核酸の鎖侵入による、標的核酸配列の増幅を提供する。鎖侵入オリゴヌクレオチドによって媒介される、各部位における鎖侵入は、標的核酸配列を一本鎖にして、プライマーに対する結合を可能にする。典型的には、プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）の非存在下で標的核酸配列に接触させられた場合、それを増幅することができない。換言すれば、プライマーは、それらの結合領域を一本鎖にする鎖侵入オリゴヌクレオチドによって、それらの結合領域が露出しない限り、標的核酸配列中のそれらの結合領域に結合することができない。典型的には、鎖侵入オリゴヌクレオチドも、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない。特に、本発明の方法は、好ましくは、標的核酸配列が二重鎖核酸で存在する等温条件下で、標的核酸配列を増幅する。二重鎖の、少なくとも２部位における鎖侵入は、標的核酸配列を等温条件下で一本鎖にし、プライマーに基づく増幅を可能にする。
【００１５】
標的核酸配列
標的核酸配列は、任意の起源のものであり得、例えば、人工的であり得、又は天然に存在し得る。標的核酸配列は、既知の配列又は既知及び未知の配列の領域を含み得る。標的核酸配列は、ヒト、哺乳類、細菌又はウイルスのものであり得る。標的核酸配列は、遺伝子又は染色体の領域であり得る。標的核酸配列は、ＤＮＡ増幅により検出される遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）又は生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）（病原体等）に特異的であり得る。標的核酸配列は、特定の種のゲノムに特有であり得る。従って、特定の種の検出のための標的核酸配列は、典型的には、近縁種のいかなるホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）核酸配列とも異なる。典型的には、標的核酸配列は、近縁種のホモログ核酸配列とのいくつかのミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含む。標的核酸配列は、細菌の特定の株（ｓｔｒａｉｎ）又はウイルスの特定の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）、分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）若しくはクレード（ｃｌａｄｅ）に特異的な配列であり得る。
【００１６】
検出すべき標的核酸配列は、任意のサイズであり得、任意の配列を有し得る。標的核酸配列又はアンプリコンは、上流及び下流のプライマーのハイブリダイゼーション、及び標的配列の上流及び下流の部分への、適切な様態での鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）の結合を提供するのに十分な長さである。典型的には、アンプリコンは、上流プライマーの５’結合部位から、下流プライマーの５’結合部位まで測定して、長さ少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは長さ少なくとも６５ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチドである。アンプリコンは、長さ約６０〜約８０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、アンプリコンは、長さ８０ヌクレオチドを超え得る（１００ヌクレオチドを超える等）（長さ１５０、２００、３００、４００、５００、１０００ヌクレオチド又はそれ以上を超える等）。アンプリコンは、長さ約７０〜約１０００ヌクレオチド（長さ約７０〜約８００、約７０〜約６００、約７０〜約５００ヌクレオチド、長さ約７０〜約４００、約１００〜約４００、又は約１００〜約２００ヌクレオチド等）であり得る。
【００１７】
本発明の方法のための好適な標的核酸配列の例としては、配列番号１１、１２、１６、１７、１８、１９、２０及び２６が挙げられる。
【００１８】
標的核酸配列は、上流（５’）及び下流（３’）の領域（それぞれが鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーに対する結合領域を含む）を含む。鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーに対する上流の結合領域は、配列においてオーバーラップしていてもオーバーラップしていなくてもよい。同様に、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーに対する、下流の結合領域は、配列においてオーバーラップしていてもオーバーラップしていなくてもよい。標的核酸配列は、１以上のオリゴヌクレオチドプローブに対する結合領域も含み得る。プローブに対する結合領域は、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び／又はプライマーの上流又は下流の結合領域と配列においてオーバーラップしていてもよく、又は任意の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はプライマーに対する結合領域とオーバーラップしていなくてもよい。プローブに対する結合領域は、好ましくは、標的核酸配列の上流及び下流の、鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域の間に位置し得る。鎖侵入オリゴヌクレオチド、プライマー及びプローブに対する結合領域の選択、及びこれらのための適切な配列の設計は、以下でより詳細に記述する。
【００１９】
鎖侵入オリゴヌクレオチド、プライマー及びプローブに対する結合領域の長さは、以下により詳細に記述する通り、それらに含まれる、標的に対する相補的配列の長さによって定義される。典型的には、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、以下に記載する通り、少なくとも２５ヌクレオチドの、標的に対する相補的配列及び少なくとも１０ヌクレオチドの、プライマーに対する相補的配列を含む。従って、標的配列の、各鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域は、長さ少なくとも２５ヌクレオチドであり得、各プライマー結合領域は、長さ少なくとも１０ヌクレオチドであり得る。典型的には、標的配列は、長さ少なくとも１０ヌクレオチドのプローブ結合領域を更に含み得る。
【００２０】
上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域は、標的核酸配列の同一の鎖に存在してもよく、又は標的核酸配列を含む二重鎖の相対する両鎖（ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄｓ）に位置してもよい。従って、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）は、同一方向に５’から３’に整列して、標的核酸配列に、同一鎖上で平行的配向で結合し得る。或いは、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）は、標的二重鎖上で相対する方向に５’から３’に整列して、標的核酸配列の相対する両鎖に、反平行的配向で結合し得る。反平行的配向では、各鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’末端は、互いに向かい合っていてもよく、又は互いから離れる向きであってもよい。従って、各鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’末端は、アンプリコンの中心に（反平行配置）又はそのそれぞれのアンプリコン末端に（逆反平行配置）向き得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端は、それぞれのプライマーに対する結合領域に近接して結合し得る。上記の結合配置を図１に示す。
【００２１】
特定の結合配置の使用は、増幅パラメーターに対する、別の効果をもたらし得る。例えば、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、それぞれのプライマーに対する結合領域に、その５’末端が近接して位置する状態で結合する場合、プライマーの結合は、鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’末端に近接するプライマー結合と比較して、異なる特異性及び動力学的プロファイルを有し得る。典型的には、鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’末端は、それに近接して結合するプライマーの結合相互作用に影響を及ぼし得る多数の修飾ヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド等）を含む。平行及び逆反平行配置では、プライマー結合が可能になる前に、鎖侵入オリゴヌクレオチド（典型的には修飾ヌクレオチドを含む）の３’末端の分岐移動が必要とされるため、増幅の特異性が増強され得るとも考えられる。従って、本発明の方法は、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）の結合配置のバリエーションにより、増幅速度及び増幅の特異性のバリエーションを提供する。
【００２２】
標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域は、同一種の鎖侵入オリゴヌクレオチドを結合させ得る。従って、以下で更に記述する通り、標的核酸配列の２点で鎖侵入を開始させるために、単一種の鎖侵入オリゴヌクレオチドが提供され得る。この実施形態においては、上流及び下流の結合領域は、それぞれ、鎖侵入オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対する相補的配列を含む。上流及び下流の結合領域は、典型的には、互いに相同又は同一である。上流及び下流の結合領域は、互いに、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同又は同一であり得、又は完全に同一であり得る。上流及び下流の結合領域は、互いの間に、１〜５又は１〜３等の、１、２、３、４、５、６、７又は８のミスマッチを有し得る。更に、以下で更に記述する通り、標的核酸配列の２点で増幅を開始させるために、単一種のプライマーが提供され得る。この場合、標的核酸配列は、それぞれがプライマーの少なくとも一部に対する相補的配列を含み、且つ、上記の通り互いに相同であるか又は同一であり得る、上流及び下流の結合領域を含む。
【００２３】
異なる標的核酸配列にそれぞれ特異的な鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）、プライマー（及び必要に応じてプローブ）の複数の組み合わせを提供することにより、本発明の方法において、１を超える標的核酸配列が検出され得る。典型的には、異なる標的核酸配列に結合する鎖侵入オリゴヌクレオチド／プライマー対及び／又はプローブは、異なる蛍光色素分子／消光分子対で標識され、従って多重化が可能となる。少なくとも２、３、４、５、１０又はそれ以上の異なる標的配列が検出され得る。同一生物由来の、１を超える標的核酸配列が検出され得る。或いは、少なくとも２、３、４、５、１０又はそれ以上の異なる遺伝子型、生物又は病原体に特異的な標的核酸配列が検出され得る。
【００２４】
上流及び下流のプライマー
好適な上流及び下流のプライマーは、目的の標的核酸配列に基づいて、また標的核酸配列の上流又は下流の結合領域を一本鎖にし、それぞれのプライマーの結合を可能にする、それぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位を考慮して、選択される。
【００２５】
上流及び下流のプライマーは、標的に対して部分的に又は完全に相補的な配列、並びに必要に応じて、５’及び／又は３’に隣接する非相補的な配列を含む。或いは、上流及び下流のプライマーは、標的に対して部分的に又な完全に相補的な配列のみからなり得る。標的に対して相補的なプライマーの配列の長さは、標的核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションを提供するのに十分なものである。典型的には、相補的な配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５、少なくとも１６、又は少なくとも１７ヌクレオチドである。相補的な配列の長さは、１０〜２５、１５〜２５、１０〜３０又は１５〜３０ヌクレオチドであり得る。
【００２６】
上記の配列の長さは、標的核酸配列に対して部分的に又は完全に相補的であり得るプライマーの一部を指すことが、理解されるべきである。増幅を達成するための、上流及び下流のプライマーの使用の組合せ並びに鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）の、標的核酸配列上流及び下流の領域への結合を特に考慮すると、ミスマッチが、標的配列の特異的な増幅及び検出を依然として可能としつつ、プライマーと標的配列との間で、特定の場所に存在してもよい。プライマーの相補的な領域と、標的配列の対応する領域との間に、１、２、３、４又は５つのミスマッチがあり得る。
【００２７】
典型的には、上流及び下流のプライマーは、全体で長さ３０ヌクレオチド未満、より好ましくは、長さ２５ヌクレオチド未満（長さ１５〜２５、又は１５〜２３ヌクレオチド等）である。リコンビナーゼが鎖侵入に用いられる場合に、長さ３０ヌクレオチド未満のプライマーが用いられることが特に好ましい。かかるプライマーは、リコンビナーゼの基質としては作用できない。いくつかの実施形態においては、長さ約８〜約１４、約１０〜約１４又は約１２〜約１４のヌクレオチドのプライマー等の、長さ１５ヌクレオチド未満のプライマーが用いられ得る。プライマー又は鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する結合領域とオーバーラップしない、標的核酸配列中の結合領域を有するプローブと組み合わせた、かかる短いプライマーの使用が好ましい。短いプライマーによって産生された非特異的増幅産物の検出は、オーバーラップしない結合部位を有するプローブを用いることにより低減又は排除され得る。
【００２８】
上流（又はフォワード）プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位に近接するか、又はオーバーラップする位置で、二重鎖の標的核酸配列の片方の鎖の３’領域に結合する。下流（又はリバース）プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位と近接するか、又はオーバーラップする位置で、二重鎖の標的核酸配列の、上流プライマーに対して反対の鎖の３’領域に結合する。典型的には、上流及び下流のプライマーの５’結合部位は、二重鎖の標的配列上で、長さ少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６５、又は少なくとも７０ヌクレオチド離れている。
【００２９】
図１に示す通り、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合配置に依存して、上流プライマーは、それぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドの配列と、オーバーラップする配列の領域又は相補的な領域を有し得る。オーバーラップする配列の領域又は相補的な領域は、長さ１〜８ヌクレオチドであり得、長さ少なくとも５又は少なくとも６ヌクレオチドであり得る。同様に、下流プライマーは、長さ少なくとも５又は少なくとも６ヌクレオチド等の、１〜８ヌクレオチドの、それぞれの、鎖侵入オリゴヌクレオチドの配列とオーバーラップする配列の領域か、又は相補的な配列の領域を有し得る。
【００３０】
或いは、上流プライマー及びそれぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドの間には、配列のオーバーラップや相補性がなく、及び／又は、下流プライマー及びそれぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドの間には、配列のオーバーラップや相補性がなく、その代わり、適切なプライマーが、標的配列中の、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位に近接する位置で結合する場合もある。
【００３１】
鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する結合領域とオーバーラップしない、標的中の結合領域を有する１以上のプライマーの使用が、様々な利点をもたらし得る。本発明の方法が、ＤＮＡ増幅を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブを利用する実施形態においては、鎖侵入オリゴヌクレオチドとプローブ並びに／又は上流及び／若しくは下流のプライマーとプローブとの間に配列のオーバーラップや相補性が存在しない場合もある。上流プライマー、下流プライマー、各鎖侵入オリゴヌクレオチド、及び任意のプローブに対する、標的核酸配列内の結合領域間に配列のオーバーラップが存在しない場合がある。プライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチド又はプローブの、いずれの間にも相補性がない場合もある。標的中の、独立した、オーバーラップしない領域で、標的核酸配列に結合し得るような種々のオリゴヌクレオチド種の配列の設計は、標的核酸配列への結合についての、オリゴヌクレオチド種間の競合の減少をもたらし得、また、望ましくない増幅産物の形成を減少させ、且つ／又は検出を避け得る。
【００３２】
より詳細には、単一の鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いる、鎖侵入に基づく増幅方法（ＳＩＢＡ法）においては、典型的には、長さ１６〜２３塩基のプライマーが用いられる。プライマーの３’末端の配列は、通常約８塩基が鎖侵入オリゴヌクレオチドとオーバーラップするか、又は相補的である（上流プライマーは鎖侵入オリゴヌクレオチドとオーバーラップし、下流プライマーは鎖侵入オリゴヌクレオチドと相補的である）。この構成により、標的ＤＮＡの効率的な増幅が保証され、非特異的増幅のリスクが最小限に抑えられる。鎖侵入オリゴヌクレオチドとオーバーラップしない、長さ＜１４塩基の短いプライマーを用いることも可能である。鎖侵入オリゴヌクレオチドとオーバーラップする配列を有さない短いプライマーは、オーバーラップする長いプライマーよりも効率的に標的ＤＮＡを増幅できる。これは、オーバーラップする、より長いプライマーの３’末端が、標的鋳型の結合部位に関して鎖侵入オリゴヌクレオチドと競合するためである。例えば、上流プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドに取って代わる前に、まず二重鎖上で分岐移動する必要がある。
【００３３】
しかしながら、短いプライマー（＜１４塩基）は、非特異的増幅産物を生成し得る。この問題を回避するために、ＳＩＢＡにおいては、典型的に、鎖侵入オリゴヌクレオチドとオーバーラップするか又は相補的である３’末端を有する、より長いプライマー（１６〜２３塩基）が用いられる。この配置では、鎖侵入オリゴヌクレオチド外縁の領域は依然として約１４塩基長である。これにより、標的ＤＮＡが増幅されるときに、解離する短い外縁の領域のみが残る。
【００３４】
標的中の２点（上流及び下流）における鎖侵入を含む本発明の方法においては、ＳＩＢＡにおけるよりも短いプライマーが用いられ得る。更に、オーバーラップしないプライマーがより効率的に用いられ得る。これは、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーとは無関係の標的ＤＮＡ上に、プローブ結合部位を組み入れることが可能であるためである。更に、本発明の方法における逆反平行配置等の、異なるプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド配置を用いることができることにより、短いプライマー誘発性の非特異的増幅のリスクが最小限に抑えられ、又は取り除かれる。
【００３５】
プライマーが、そのそれぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドに近接して（配列のオーバーラップや相補性なしで）結合する場合、典型的には、１５ヌクレオチド以下、好ましくは１０ヌクレオチド以下、例えば約１〜約１５ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチド、約５〜約１０ヌクレオチド、又は約３〜約８ヌクレオチドが、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合領域と、それぞれのプライマーの結合領域との、最も近接した境界間に存在する。これで、プライマーが、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合によって生じた一本鎖領域に、確実にハイブリダイズすることができる。
【００３６】
好ましくは、各プライマーは、特定の遺伝子型等の特定の標的核酸配列、又は特定の生物又は特定の病原体等の特定の標的中に存在する核酸配列の特異的検出を可能にするように設計される。従って、典型的には、各プライマーは、標的においてのみ見出される相補的配列に特異的又は選択的にハイブリダイズする。しかし、別のプライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）及び必要に応じたオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる場合に、標的核酸配列の特異的検出が取得されるならば、各プライマーは、他の種に見られる配列等の他の配列ともハイブリダイズし得る。
【００３７】
本発明において用いられる任意の上流又は下流のプライマーは、１以上の修飾ヌクレオチド及び／又は検出可能な標識、例えば蛍光色素を含み得る。いくつかの実施形態においては、上流又は下流のプライマーは、それぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドとＦＲＥＴ対を形成し得、従って以下に記述する通り、蛍光色素分子又は消光分子を含む。
【００３８】
本発明の方法は、１を超える標的配列が、多重系において同時に検出されるべき場合、典型的に、１対を超える、上流及び下流のプライマーの使用を含み得ることが理解されるべきである。
【００３９】
鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）
標的核酸配列を、上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にするよう、適切な領域において一本鎖にするために、上流及び下流のプライマーの結合部位及び鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）の必要条件を考慮して、１以上の好適な鎖侵入オリゴヌクレオチドが、目的の標的核酸配列に基づいて選択される。標的核酸配列が、相同又は同一の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む場合、増幅を行うために、単一種の鎖侵入オリゴヌクレオチドが提供され得る。或いは、標的核酸配列の上流及び下流の部分中の異なる配列に結合する、２の別種の鎖侵入オリゴヌクレオチド（第１及び第２）が提供され得る。以下の、鎖侵入オリゴヌクレオチドの特徴の記載は、第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドの両方（これらが使用される場合）に適用可能である。
【００４０】
各鎖侵入オリゴヌクレオチドは、標的に対して相補的な配列、並びに必要に応じて、隣接する、更なる非相補的な配列（複数可）を含む。標的に対して相補的な配列の長さは、当業者により経験的に決定され得、且つ、必要に応じて、等温の条件下で、標的核酸配列の効率的な鎖侵入を提供するのに十分なものである。相補的な配列は、ＲＮＡ−ＤＮＡの相補的な塩基対形成及び修飾ヌクレオチドを含み得る。典型的に、相補的な配列の長さは、少なくとも２５ヌクレオチド又は少なくとも２７ヌクレオチド、典型的には、少なくとも３０ヌクレオチド（少なくとも３２、少なくとも３３又は少なくとも３５ヌクレオチド等）、より好ましくは、長さ少なくとも３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド以上である。相補的な配列の長さは、長さ３０〜５０、３２〜５０、３５〜５０、４０〜５０、３５〜４８、３５〜４６、３８〜４５又は４０〜４５ヌクレオチドであり得る。
【００４１】
上記配列の長さが、標的核酸配列に対して部分的に又は完全に相補的であり得る鎖侵入オリゴヌクレオチドの一部を指すことが、理解されるべきである。増幅を達成するための、上流及び下流のプライマー並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの組合せの使用を特に考慮すると、ミスマッチが、標的配列の特異的な増幅及び検出を依然として可能としつつ、鎖侵入オリゴヌクレオチドと標的配列との間で、特定の場所に存在してもよい。鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的な領域と、標的配列の対応する領域との間に、相補的な配列の全長に依存して、１〜５又は１〜３等の、１、２、３、４、５、６、７又は８のミスマッチが存在し得る。
【００４２】
鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的配列は、プライマーに対する結合領域を形成する標的配列の一部とオーバーラップしていてもいなくてもよい標的配列の一部にハイブリダイズする。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、長さ少なくとも５又は少なくとも６ヌクレオチドの領域等の、１〜８ヌクレオチドの、上流又は下流のそれぞれのプライマーと、オーバーラップするか、又は相補的な領域を有し得る。或いは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの配列は、上流又は下流のプライマーの配列とオーバーラップする領域を有さない場合がある。この実施形態においては、以上に記述した通り、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、プライマーに対する結合領域を一本鎖にし得るように、上流又は下流のプライマーに対する結合領域に近接した位置で結合させる。
【００４３】
標的核酸配列の上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域の、最も近接した境界は、標的核酸配列中、少なくとも２０ヌクレオチド又は少なくとも２５ヌクレオチド等、少なくとも１５ヌクレオチド離れて位置し得るが、いくつかの実施形態においては、より短い結合領域間距離も用いられ得る。
【００４４】
鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的な配列の５’部分は、典型的に、融解されることとなる二重鎖の標的ヌクレオチド配列（アンプリコン）の適切な境界から、２５ヌクレオチド以下、より好ましくは２０ヌクレオチド以下の範囲内で結合する。
【００４５】
鎖侵入オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、標的に対して非相補的な配列領域（複数可）（相補的な配列領域に隣接する）を更に含む。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、任意のヌクレオチド配列のものであり得る非相補的な５’領域を含み得る。５’非相補的領域は、典型的には、長さ少なくとも３ヌクレオチド、より典型的には、長さ少なくとも６、少なくとも８、好ましくは少なくとも１０、少なくとも１２又は少なくとも１４ヌクレオチドである。リコンビナーゼは協働的に結合するので、５’非相補的領域はリコンビナーゼの結合を促進（ａｓｓｉｓｔ）し得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、３’インバーテッドｄＴ（３’−ｐｒｉｍｅ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ）等の、ポリメラーゼ伸長を阻止するヌクレオチドを含む、典型的には長さ１〜３ヌクレオチドの３’非相補性領域を含み得る。
【００４６】
増幅方法における鎖侵入のために、鎖侵入オリゴヌクレオチドと共に、リコンビナーゼが用いられる場合、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さ少なくとも３０ヌクレオチドである。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ少なくとも３５、少なくとも４０又は少なくとも４５ヌクレオチド、より好ましくは、長さ少なくとも５０であり、長さ少なくとも５５ヌクレオチド以上の場合がある。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、長さ４０〜７０、４５〜７０、４５〜７０、５０〜７０、５５〜７０、４５〜６５、５０〜６５、５０〜６０又は５５〜６５ヌクレオチドであり得る。
【００４７】
典型的には、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの基質として機能し得ないように、伸長不可能な３’末端を有し、このようにして、標的配列は、特定の上流及び下流のプライマーがさらに結合した状態でのみ増幅される。これにより、非特異的な増幅産物の形成が回避される。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、その３’領域において、例えば３’末端から１０〜１５又は１０〜２０ヌクレオチドにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、３’末端のヌクレオチドの３’修飾を含み得、そしてそれはジデオキシヌクレオチドであり得、又は３’アミノ−アリル基、３’カーボンスペーサー、３’リン酸塩、３’ビオチン、３’シアリル若しくは３’チオールを含み得る。３’ヌクレオチドは、３’−３’リンケージにより、逆の方向で組み込まれるヌクレオチドであり得る。代替的に、又は追加的に、鎖侵入オリゴヌクレオチドの３’領域は、ＤＮＡポリメラーゼのための基質特性が不足しているヌクレオチド（例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）ヌクレオチド、ＬＮＡ（ロックド核酸）、２’−５’連結ＤＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ若しくは２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、又はそれらの組合せ）を含み得る。
【００４８】
鎖侵入オリゴヌクレオチドがＰＮＡヌクレオチドを含むか、ＰＮＡヌクレオチドからなるか、又はＰＮＡヌクレオチドから本質的になるＰＮＡオリゴマーである場合、かかるオリゴヌクレオチドは、リコンビナーゼ酵素の非存在下で、二重鎖ＤＮＡを不安定化させ、且つそれに侵入し得る。従って、ＰＮＡオリゴヌクレオチドが用いられる場合、本発明の方法は、リコンビナーゼ酵素の存在なしに実施され得る。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが二重鎖の鎖侵入を媒介するのに十分なＰＮＡヌクレオチドを含むならば、ＰＮＡヌクレオチド及びＤＮＡヌクレオチド等の他のヌクレオチドを含み得る。当業者は、鎖侵入を行い、ＤＮＡ増幅を可能にするその能力を試験することにより、オリゴヌクレオチドに取り込まれるＰＮＡのレベルを経験的に決定し得る。
【００４９】
鎖侵入オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、例えば蛍光色素を含み得る。いくつかの実施形態においては、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、上流又は下流のプライマーとＦＲＥＴ対を形成し得、従って、以下に記述する通り、蛍光色素分子又は消光分子を含み得る。
【００５０】
本発明の方法は、標的核酸配列の少なくとも２部位で、第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドにより、又は、標的核酸配列が、同一鎖侵入オリゴヌクレオチドに対して２の結合部位を含む場合は、同一種の鎖侵入オリゴヌクレオチドにより、媒介される鎖侵入を含む。本発明の方法は、標的核酸配列の、３以上、４以上、５以上、８以上、１０以上等の更なる部位における、更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドによる鎖侵入を更に含み得ることが理解されるべきである。更に、多重系において、本発明の方法は、更なる標的配列の上流及び下流の結合領域を標的とする、更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドの使用を含み得る。
【００５１】
標的核酸配列の増幅
ＤＮＡ増幅方法は、鎖侵入に基づく増幅を含む。鎖侵入増幅は、標的核酸配列中の、少なくとも２部位における鎖侵入を含む。鎖侵入は、標的核酸配列の上流及び下流の領域の両方で生じる。
【００５２】
標的核酸配列は、上流プライマー、下流プライマー、及びそれぞれのプライマーに対する、上流及び下流の結合領域の両方を一本鎖にできる（第１及び第２の等の）１以上の鎖侵入オリゴヌクレオチドと、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下でインキュベートされる。いくつかの実施形態においては、単一分子種のプライマーが、上流及び下流の両方のプライマーとして機能し得る。
【００５３】
かかる条件は、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の存在を含む。好適な条件としては、当該技術分野で既知のポリメラーゼ酵素の活性をもたらすために用いられる任意の条件が挙げられる。条件としては、典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ及びそれらの任意の類似体から選択されるｄＮＴＰ、酵素の性能又は安定性に必要な、好適な緩衝剤／ｐＨ及び他の因子の存在が挙げられる。典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの４つがすべて存在する。条件としては、界面活性剤及び安定化剤の存在が挙げられ得る。用いられる温度は、典型的には等温、すなわち増幅過程の間ずっと一定である。用いられる温度は、典型的にはポリメラーゼ酵素及び他の酵素成分の特質に依存し、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドに要求されるハイブリダイゼーションの温度も反映する。
【００５４】
用いられるポリメラーゼは、典型的には、鎖置換活性を有する。「鎖置換」という語は、ＤＮＡ合成の間、二本鎖ＤＮＡの遭遇する領域上で、必要に応じてアクセサリータンパク質と共に、相補鎖を置換する、ＤＮＡポリメラーゼの能力を説明するために、本明細書で用いられる。好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はＢ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のｐｏｌＩ、及びそれらの機能的断片又は変異体、並びにＴ４、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの機能的断片又は変異体が挙げられる。好適なポリメラーゼはＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ又はその機能的断片若しくは変異体である。
【００５５】
増幅条件は、好ましくは、リコンビナーゼの存在を含む。任意のリコンビナーゼの系が、本発明の方法で用いられ得る。リコンビナーゼの系は、原核生物又は真核生物起源のものであり得、細菌、酵母、ファージ、又は哺乳類の系であり得る。リコンビナーゼは、５’から３’、又は３’から５方向で、一本鎖のオリゴヌクレオチド上で重合し得る。リコンビナーゼは、ミオウイルス科のファージ、例えばＴ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂｌ４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂｌ６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、又はファージＬＺ２由来であり得る。好ましい実施形態においては、Ｔ４リコンビナーゼＵｖｓＸ（受入番号：Ｐ０４５２９）又はその機能的変異体若しくは断片が用いられる。真核生物のラッド（Ｒａｄ）の系又は大腸菌のｒｅｃＡ−Ｒｅｃｏの系、又は他の原核生物の系も用いられ得る。リコンビナーゼは、大腸菌のＲｅｃＡであり得る。
【００５６】
条件は、リコンビナーゼアクセサリータンパク質、例えば一本鎖結合タンパク質（例：Ｔ４  ｇｐ３２、受入番号Ｐ０３６９５）、及びリコンビナーゼローディング剤（例：ＵｖｓＹ、受入番号ＮＰ＿０４９７９９．２）の存在を更に含み得る。好ましい実施形態においては、条件はＴ４  ｇｐ３２、ＵｖｓＸ及びＵｖｓＹタンパク質の存在を含む。リコンビナーゼ（例えばＵｖｓＸ）、（用いられる場合は）リコンビナーゼローディング剤（例えばＵｖｓＹ）及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えばｇｐ３２）は、それぞれ、同一か、又は異なるミオウイルス科のファージのソース由来の、天然型、ハイブリッド型、又は突然変異型のタンパク質であり得る。天然型のタンパク質は、野生型又はタンパク質の自然変異体であり得る。
【００５７】
条件は、ＤＮＡの相互作用を制御するために用いられる化合物等の、リコンビナーゼの効率を増強するために用いられる他の因子、例えば、ＤＮＡ上にリコンビナーゼのローディングを増強することが知られる、プロリン、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、ＰＥＧ又は他の密集剤を更に含み得る（Ｌａｖｅｒｙ  Ｐ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，（１３），９３０７−９３１４）。
【００５８】
条件は、ＡＴＰ再生の系の存在も含み得る。様々なＡＴＰ再生の系が、当業者にとって既知であり、糖分解酵素が挙げられる。ＡＴＰ再生の系の好適な成分としては、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、ピロホスファターゼ、スクロース及びスクロースホスホリラーゼのうちの１以上が挙げられ得る。条件は、ＡＴＰの存在を更に含み得る。
【００５９】
マグネシウムイオン、ＤＴＴ又は他の還元剤、塩等の更なる成分も、含められ得る。
【００６０】
更なる成分としては、標的核酸配列と、他の増幅試薬とを接触させる前に、又はそれと同時に、標的核酸配列を含む核酸を消化するための、（１以上の制限エンドヌクレアーゼ等の）１以上の制限酵素が挙げられ得る。ＤＮＡプラスミドに含まれる標的核酸配列の増幅速度は、プラスミドを制限酵素で消化し、従って開始鋳型を線状化することにより増大させられ得る。従って、本発明の方法は、増幅される標的核酸を含む核酸と制限酵素とを接触させることを含み得る。標的核酸配列を含む核酸中に好適な認識部位を有する任意の好適な制限酵素が、消化に用いられ得る。典型的には、認識部位は、核酸の、標的核酸配列以外の領域に位置する。
【００６１】
上記で説明した様々な成分は、ＤＮＡ増幅をもたらすため、様々な濃度で提供され得る。当業者は実際に、様々な成分の適切な作用濃度を選択し得る。
【００６２】
増幅ＤＮＡの存在の検出
ＤＮＡ増幅を促進する条件下での、標的核酸配列とプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）との接触から生じる、増幅ＤＮＡの存在が、任意の好適な手段によってモニターされ得る。
【００６３】
片方若しくは両方のプライマー、又は（第１及び／若しくは第２の鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）等の）１以上の鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）は、標識又は他の検出可能な部位を組み込み得る。任意の標識又は検出可能な部分が、用いられ得る。好適な標識の例としては、蛍光部分、蛍光色素分子とアクセプター部位とのＦＲＥＴ対が挙げられる。例えば、上流プライマーは、標的核酸配列中の上流結合領域を有する鎖侵入オリゴヌクレオチドとＦＲＥＴ対を形成し得、及び／又は下流プライマーは、標的核酸配列中の下流結合領域を有する鎖侵入オリゴヌクレオチドとＦＲＥＴ対を形成し得る。プライマー（複数可）は、蛍光色素分子又は消光分子で標識され得、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）は、ＦＲＥＴ対の対応するメンバー（消光分子又は蛍光色素分子）で標識される。好適な標識及び結合部位を以下に記載する。かかるＦＲＥＴ対の使用は、標的核酸配列の鎖侵入及び増幅を検出する方法を提供し得る。接触クエンチング（ｃｏｎｔａｃｔ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を含む検出可能な２部分の相互作用の変化を検出する他のクエンチングシステム（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ）も用い得る。
【００６４】
より好ましくは、又は追加的に、増幅されたＤＮＡを検出する１以上のプローブが、やはり標識又は他の検出可能な部分を組み入れて、用いられ得る。好ましくは、プローブからのシグナルは、標的核酸配列の増幅と関連してリアルタイムでモニターされる。プローブは、標的核酸配列中の任意の適切な位置で結合し得る。プローブは、プライマー及び／又は鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する結合領域とオーバーラップしない標的核酸配列の領域に結合することが特に好ましい場合がある。従って、プローブは、特に好ましくは、１以上の他のオリゴヌクレオチド分子種の結合部位（複数可）とは独立した、標的核酸配列内の結合部位を有し得る。オーバーラップしない、プローブに対する結合領域の選択は、増幅の間のプローブの結合に対する競合を低減し得る。標的核酸配列中の、独立した位置におけるプローブ結合の使用は、プライマー二量体等の非特異的増幅産物の検出も低減又は排除し得、標的核酸配列増幅のより正確な検出をもたらす。
【００６５】
増幅された、異なる標的配列を検出するプローブは、異なる蛍光波長でシグナルを出し、多重検出を提供し得る。１反応における、いくつかの異なる標的配列の多重検出のために、３、４、５、６、８、１０又はそれ以上等の、２以上の異なるプローブが用いられ得る。本発明の方法において用いるためのオリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、長さ約１０〜約２０、約１２〜約２５、又は約１５〜約２５ヌクレオチド等の、長さ約８〜約２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、プローブは、鎖侵入オリゴヌクレオチドとしても機能し得る（従って、上記の鎖侵入オリゴヌクレオチドについての特徴を有する）。例えば、上流又は下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域に近接する標的核酸配列中に結合領域を有するプローブとして作用する、更なる標識付き鎖侵入オリゴヌクレオチドが、上流又は下流の領域に結合するそれぞれの鎖侵入オリゴヌクレオチドとＦＲＥＴ対を形成できるように提供され得る。この実施形態においては、上流又は下流の領域に結合する鎖侵入オリゴヌクレオチドは、蛍光色素分子又は消光分子で標識され得、且つ更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドが、対応する、相互作用する検出可能な部分（消光分子又は蛍光色素分子）で標識され得る。
【００６６】
プローブは、標的核酸配列に対して、配列において完全に相補的な配列を含み得、又は、鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）及びプライマー（複数可）と組み合わせて、標的配列を特異的に検出できるならば、標的配列に対して、２又は３のミスマッチ等の、１以上のミスマッチを有し得る。本発明において用いるためのオリゴヌクレオチドプローブは、（例えば米国特許第７２４１５９６号に記載の通りの）標的結合において構造変化を示すハイブリダイゼーションプローブ、（例えば米国特許第５９２５５１７号に記載の通りの）分子ビーコン、又は（例えば、米国特許第７４３５５６１号及び米国特許出願公開第２００５０２１４８０９号に記載の通りの）エンドヌクレアーゼで切断可能なプローブ又は制限酵素で切断可能なプローブ等の、切断可能なプローブであり得る。
【００６７】
本発明の方法において用いられるプライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチド、又はプローブは、任意の蛍光色素分子又は消光分子で標識され得る。蛍光色素分子及び消光分子は、消光分子の吸収スペクトルが蛍光色素分子の蛍光スペクトルとオーバーラップするように選択される。蛍光色素分子及び消光分子は、標的鋳型とのハイブリダイゼーションの際に、蛍光色素分子が、消光効果の減少によってシグナルの増加をもたらすように、更に選択及び配置される。
【００６８】
消光分子は、非蛍光性、例えば非蛍光性発色団であり得る。消光分子は、ダーククエンチャーであり得る。或いは、蛍光色素分子又は消光分子の蛍光を特異的にモニターする場合、いずれかのシグナルの変化が、標的鋳型へのハイブリダイゼーションを表し（ｒｅｐｏｒｔ）得るように、消光分子は、蛍光色素分子とは異なる蛍光スペクトルで蛍光を発し得る。蛍光色素分子又は消光分子は、標識されたオリゴヌクレオチド種の５’又は３’末端に位置し得る。３’末端位置は、ポリメラーゼ依存性伸長が望ましくない実施形態において特に有用であり得る。蛍光色素分子又は消光分子は、標識された種の５’又は３’末端から１０ヌクレオチド以下等の内部位置にも位置し得る。
【００６９】
蛍光色素分子は、任意の蛍光部分、典型的には有機蛍光色素であり得る。消光分子は、蛍光色素分子の蛍光を消光する任意の部分であり得、典型的には、有機色素等の発色分子である。当業者は、彼ら共通の一般的知識に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブについて適切な蛍光色素分子−消光分子対を選択することができる。好適なペア形成は、例えば、以下の参考文献に記述されている：Ｍａｒｒａｓ  ＳＥ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ａｎｄ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  Ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｄｅｎｋｏ  Ｖ，ｖｏｌ．３３５：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２００６：３−１６，及びＤｉｄｅｎｋｏ  ＶＶ：ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）：ｄｅｓｉｇｎｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００１，３１（５）：１１０６−１１１６，１１１８，１１２０−１１０１．
【００７０】
好適な蛍光色素分子としては、カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ、５−ＦＡＭ、ｄＴ  ＦＡＭを含むＦＡＭ）、ＶＩＣ、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）等のフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、並びにＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン等のクマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、ＮＥＤ、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５  カルボキシローダミン、Ｎ−（ｐ−２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、ＣＹ５等のシアニン色素、、ローダミン色素、キサンテン色素、ナフチルアミン、アクリジン、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン及びピレンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な消光分子としては、ＤＡＢＳＹＬ、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ブラックホールクエンチャー３、ダーククエンチャー１、ダーククエンチャー２、アイオワブラックＲＱ、アイオワブラックＦＱが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
好適な蛍光色素分子／消光分子のペアとしては：
−  ＴＡＭＲＡ及びブラックホールクエンチャー２；
−  ＲＯＸ及びブラックホールクエンチャー２；
−  ＲＯＸ及びＤＡＢＣＹＬ；
−  ＦＡＭ（ｄＴ−ＦＡＭ等）及びアイオワブラックＦＱ；
−  ＦＡＭ（ｄＴ−ＦＡＭ等）及びＤＡＢＣＹＬ；
−  ＲＯＸ及びアイオワブラックＦＱ；
−  ＣＹ５及びアイオワブラックＲＱ
が挙げられる。
【００７２】
蛍光色素分子又は消光分子は、典型的には、標識されたオリゴヌクレオチド種に共有結合される。蛍光色素分子又は消光分子は、任意の好適なリンカーによって、オリゴヌクレオチド種の配列中に存在する１以上のヌクレオチドに結合され得る。当業者は、彼らの共通の一般知識に基づいて、任意の適切なリンカーを選択することができる。好適なリンカーは、例えば、Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ（ｅｄ．）：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；１９９３に記述されている。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、標的核酸配列に相補的な領域、蛍光色素分子及び消光分子を含む１以上のプローブの使用を含み得る。かかるオリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも２０％のＲＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド及び／又はＰＮＡヌクレオチドを含み得る。かかるプローブの使用は、相補的鋳型配列の非存在下で一本鎖ＤＮＡに結合できる（リコンビナーゼ等の）タンパク質の存在下、プローブからの蛍光シグナルの防止に関して、好都合である。換言すれば、オリゴヌクレオチドプローブ中に存在するヌクレオチドの少なくとも２０％は、ＲＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド及び／又はＰＮＡヌクレオチドである。より好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のＲＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド及び／又はＰＮＡヌクレオチドを含み得る。プローブ中にＲＮＡ塩基が含まれる場合、本発明の方法においては、プローブ−標的二重鎖を切断し、消光を減少させることによって、プローブからのシグナルを増強するために、ＲＮアーゼＨ２等のＲＮアーゼＨ酵素が提供され得る。好ましいＲＮアーゼＨ２酵素はテルモコックス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）のＲＮアーゼＨ２である。或いは、上記の通り、制限酵素又はエンドヌクレアーゼで切断可能なプローブ等の、他の形態の切断可能なプローブが用いられ得る。
【００７４】
蛍光色素分子及び消光分子で標識されたプローブが用いられる場合、蛍光色素分子及び消光分子は、典型的には、プローブの長さに応じて、プローブの配列中、少なくとも８ヌクレオチド離れて、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド又は少なくとも１２ヌクレオチド離れて配置される。蛍光色素分子及び消光分子は、５’及び３’末端に位置し得、従ってプローブ中で可能な最大限の距離で離れて位置し得る。蛍光色素分子と消光分子との間の距離は、プローブが（開放又は直鎖状構造の）標的核酸配列にハイブリダイズすると、消光分子による蛍光色素分子の消光が低減し、標的核酸配列の存在についての、検出可能なシグナルをもたらすように、選択される。蛍光色素分子と消光分子との間の適切な距離は、経験的に最適化し得る。
【００７５】
サイバーグリーンＩ及びチアゾールオレンジ等の、増幅ＤＮＡに挿入される色素は、増幅ＤＮＡを検出するためにも用いられ得る。
【００７６】
増幅ＤＮＡからのシグナルの検出は、リアルタイム検出法を含む、任意の適切なシステムによりなされ得る。
【００７７】
増幅方法の用途
本発明の増幅方法は、標的核酸配列の特異的増幅が所望される、任意の用途に用いられ得る。
【００７８】
本発明の方法は、標的核酸配列の検出のため、及び、例えば、臨床試料が標的核酸配列を含有するかどうかの診断のために用いられ得る。本発明は、医療上の場面（ｓｅｔｔｉｎｇ）において特に好都合である。本発明の検出方法は、標的核酸配列の存在の判定を可能にする、高度に特異的な試験を提供する。該方法は、様々な疾患状況（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ）に適用し得る。本発明は、被験体における疾患の診断のための方法であって、前記疾患に関連する標的核酸配列を検出するために、本発明の、前記被験体由来の試料中の標的核酸配列の増幅方法を実施することを含む、方法を提供する。
【００７９】
核酸が、試料から取得され得るか、又は導出され得るならば、任意の試料が、標的核酸配列の検出に用いられ得る。試料は、例えば、環境試料、基準試料又は臨床試料であり得る。本発明の方法が、標的核酸配列の検出による疾患の診断のために用いられる場合、試料は、一般に臨床試料、例えば疾患を有する疑いがあるか、又は疾患を有する患者から取得された試料、である。好適なタイプの臨床試料は、被験体に存在しているか、又は存在していることが疑われる、特定のタイプの疾患又は感染によって様々である。試料は、唾液、痰、血液、血漿、血清、尿又は便の試料であり得る。試料は、細胞又は組織の試料であり得る。好ましい実施形態においては、試料は、哺乳動物被験体等の動物被験体から採取される。一般的に、試料はヒト被験体から採取されるが、本発明は、通例、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、鳥類及び魚類にも適用可能である。例えば、本発明は、獣医療上又は農業上の場面において適用され得る。試料は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る核酸を含む。核酸が、試料中に、本発明による検出を可能にする好適な形態で存在する場合、試料は、直接的に用い得る。しかし、典型的には、核酸は、試料から導出され、取得され、又は抽出される。核酸を含有する試料を処理するための方法、核酸を抽出するための方法及び／又は検出方法において用いるための核酸を精製するための方法は、当該技術分野で周知である。全核酸が単離されてもよく、又はＤＮＡ及びＲＮＡが別々に単離されてもよい。
【００８０】
典型的には、試料は、核酸が、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）及び必要に応じた更なる試薬との接触のために都合のよい形態で提供されるように、適切な様態で処理される。核酸がＤＮＡである場合、典型的には、ＤＮＡは二本鎖形態で提供される。核酸がＲＮＡである場合、典型的には、それは逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを用いてｃＤＮＡに変換される。標的配列の濃度を効果的に増大させるリボソームが、細菌細胞中に非常に多く存在するため、ＲＮＡは細菌検出に有用であり得る。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に加えて、例えばトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）といった他の形態のＲＮＡも、原核生物及び真核生物の検出に有用であり得る。
【００８１】
本発明の方法は、病原体からの標的核酸配列の検出を含む、被験体における、前記病原体による感染の診断のために用いられ得る。病原体が存在するか否かの判定は、患者に存在するか又は存在していると疑われる任意の疾患又は病気に関連している場合がある。かかる疾患としては、病原体の存在によって引き起こされた、関連付られた、又は悪化したものが挙げられる。従って、患者は病原体の存在を示す症状を呈し得、病原体の存在を判定するために、試料が、上記の方法によって、患者から取得され得る。
【００８２】
任意の病原体が検出され得る。病原体は、ウイルス又は細菌又は寄生虫であり得る。病原体は、真菌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、ＨＳＶ２／ＨＳＶ１、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）、ポリオウイルス、ＲＳＶウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウィルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、マールブルク及びエボラを含むウイルス；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、フランシスセルラ・トラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（Ａ型及びＢ型）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、メニンゴコッカス（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（タイプｂ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、カンピロバクター症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ドノバン症（Ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ）及び放線菌症（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｏｓｉｓ）を含む細菌；カンジダ症（Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）及びアスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）を含む真菌病原体；テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、吸虫属（Ｆｌｕｋｅｓ）、回虫（Ｒｏｕｎｄｗｏｒｍ）、アメーバ症（Ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トリコモナス症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）及び旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）を含む寄生虫病原体等を含むが、これらに限定されない病原体であり得る。
【００８３】
本発明の方法の更なる用途としては、断片解析、クローニング、及び一塩基多型（ＳＮＰ）検出が挙げられる。
【００８４】
本発明の別の態様においては、標的核酸配列が増幅され、その配列の決定が可能にされ得る。かかる実施形態においては、配列が部分的に又は完全に未知である核酸配列は、その配列が決定される領域に隣接する、１以上の鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）に対する、好適な結合領域の提供によって増幅され得る。従って、本発明は、未知の配列の領域を含む標的核酸の配列を決定する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、前記標的核酸配列を、上記の本発明の増幅方法に従って増幅すること、及び前記未知の配列の領域の配列を決定することを含む、方法を提供する。本発明は、未知の配列の領域を含む標的核酸配列を増幅する方法であって、前記未知の配列の領域の上流及び下流に鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列を作製すること、前記標的核酸配列を、上記の本発明の増幅方法に従って増幅すること、を含む方法を更に提供する。上流及び下流の鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む標的核酸配列は、目的の核酸配列の５’及び／又は３’末端への、鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含むオリゴヌクレオチドのライゲーションによって作製され得る。或いは、目的の核酸配列は、核酸配列が導入される部位に隣接する鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含む、プラスミド等の好適な核酸ベクターに挿入又は連結され、それによって、標的核酸配列が作製され得る。他の実施形態においては、決定される配列は、一部既知であり得、１種の鎖侵入オリゴヌクレオチド（及びそのそれぞれのプライマー）が、既知の配列の領域に結合するように、そして他の種の鎖侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーが、未知の配列の領域に隣接して導入されたアダプター配列に結合するように、設計され得る。次いで、既知配列の上流及び未知の配列の下流での、鎖侵入に基づく増幅が、未知の配列の領域を増幅するために用いられ得、その結果、その配列が決定され得る。
【００８５】
鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含むオリゴヌクレオチドは、好適には、オーバーハングあり又はなしで、典型的には二本鎖形態で提供されるＤＮＡアダプターである。アダプターは、目的のＤＮＡ断片へのそのライゲーションを可能にするために、二本鎖オリゴヌクレオチドとして提供される場合、一般的には、平滑末端にされる。鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域を含むオリゴヌクレオチドは、プライマー結合領域を更に含み得る。標的核酸配列に、上流及び下流の位置で侵入するために、同一種の鎖侵入オリゴヌクレオチド（及び必要に応じて同一種のプライマー）が用いられる場合、鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域（及び必要に応じてプライマー結合領域も）を含む単一種のオリゴヌクレオチドが提供され得る。
【００８６】
標的核酸の配列決定は、任意の適切な配列決定法を用いて行われ得る。好適な配列決定方法としては、Ｓａｎｇｅｒ配列決定又はＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ及び４５４配列決定等の次世代配列決定法が挙げられる。配列決定される断片は、それらの結合アダプターから直接プレ増幅され得るか、又はまず配列決定プラスミドにクローニングされ得る。後者の場合、クローニングされた断片は、アダプター配列（複数可）を含有し得るか、又は、これらは、断片が連結されるプラスミドによって提供され得る。
【００８７】
任意の好適なアダプター配列が用いられ得、それは、標的核酸配列に隣接する位置か又は標的核酸配列内の位置に組み込まれると、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び／又はプライマーの結合が可能となり、標的核酸配列の増幅を可能とする。標的核酸配列の上流領域に隣接する位置か、又は上流領域内の位置で組み込まれたアダプター配列は、典型的には、標的核酸配列の下流領域に隣接する位置か、又は下流領域内の位置で組み込まれたアダプター配列と同一である。しかし、標的核酸配列を増幅できる、異なるアダプターに基づいた１以上の鎖侵入オリゴヌクレオチド及び１以上のプライマーが提供されるならば、標的核酸配列の上流及び下流の末端に関して、異なるアダプター配列が用いられ得る。当業者は、特定の標的配列に対して適切なアダプター配列を選択することができる。アダプター配列は、存在し得る任意の配列と干渉しないように、自由に選択され得る。アダプター配列は、リコンビナーゼの、ピリミジンに対する選択性も斟酌して選択され得る。アダプター配列は、増幅前又はそれ以降の精製又は分離のためのタグを含み得る。アンプリコンの更なるプロセシングを促進するために、制限部位又はニッキング酵素の認識部位が加えられ得る。
【００８８】
キット及び組成物
【００８９】
本発明は、標的核酸配列に対する、少なくとも１の上流プライマー及び少なくとも１の下流プライマー、並びに前記標的核酸配列中の上流及び下流の結合領域を有する、第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを含むキット又は組成物を提供する。
【００９０】
本発明は、標的核酸配列における上流結合領域及び下流結合領域の両方に結合し得る鎖侵入オリゴヌクレオチド、前記標的核酸配列を増幅できる１以上のプライマー、及び少なくとも１のＤＮＡアダプターを含む、キット又は組成物を更に提供する。典型的には、ＤＮＡアダプターは二本鎖形態である。キット又は組成物は、ＤＮＡアダプターを、目的の核酸に連結するために用いられ得るＤＮＡリガーゼを更に含み得る。キット又は組成物は、１以上の制限酵素を更に含み得る。典型的には、鎖侵入オリゴヌクレオチドに対する、上流及び下流の結合領域は、ＤＮＡアダプターの配列を含み、従って、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアダプターの少なくとも一部に結合できる。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、１以上のプライマーに対する、上流及び下流の結合領域を一本鎖にできる。従って、１以上のプライマーが、鎖侵入オリゴヌクレオチド結合領域に近接する、標的核酸配列中の領域に結合する。ＤＮＡアダプターが鎖の侵入及び未知の配列の増幅の両方のメカニズムを提供するように、１以上のプライマーが、ＤＮＡアダプターの配列に結合し得る。キット又は組成物は、標的核酸配列（典型的にはアダプター配列）中の、上流及び下流の結合領域の両方に結合し得る単一種のプライマー、又は前記標的核酸配列に対する上流及び下流のプライマー、を含み得る。
【００９１】
関連態様においては、本発明は、標的核酸配列中の上流結合領域及び下流結合領域の両方に結合し得る鎖侵入オリゴヌクレオチドと、前記標的核酸を増幅できる１以上のプライマーとを含むキット又は組成物であって、鎖侵入オリゴヌクレオチドが、１以上のプライマーに対する上流及び下流の結合領域を一本鎖にでき、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び１以上のプライマーは、それぞれＤＮＡアダプター配列に結合する、キット又は組成物を提供する。従って、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び１以上のプライマーは、それぞれ、標的核酸配列中の上流及び下流の位置に存在する同一のＤＮＡアダプター配列を結合させることができる。キット又は組成物は、クローニング部位に隣接するアダプター配列を含む核酸ベクターを含み得る。
【００９２】
上記のキット又は組成物中に提供されるプライマー（複数可）及び鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）は、本発明の関連方法において用いるための、上記のもののいずれかであり得る。本発明のキット及び組成物は、１以上の、更なる鎖侵入オリゴヌクレオチドを更に含み得る。
【００９３】
組成物は、例えば、溶液、凍結乾燥物、懸濁液、又は油性又は水性ビヒクル中の乳液であり得る。
【００９４】
本発明のキットにおいては、（プライマー（複数可）及び鎖侵入オリゴヌクレオチド（複数可）等の）異なるオリゴヌクレオチド種は、混合物としてか、又は別々の容器中に提供され得る。キットは、必要に応じて、本発明の方法において用いるための説明書を更に含み得る。従って、第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドを含むキットは、第１及び第２の鎖侵入オリゴヌクレオチドの使用を含む標的核酸配列の増幅のための本発明の方法において用いるための、説明書を含み得る。キットは、増幅ＤＮＡの検出のための手段を含み得る。キットは、ＤＮＡ配列決定用の試薬を含み得る。
【００９５】
本発明のキット又は組成物は、必要に応じて、増幅されたＤＮＡを検出する１以上のプローブを含み得る。キット又は組成物中に提供されるプローブは、本発明の方法における使用のための、上記のいずれかのものであり得る。
【００９６】
キット又は組成物は、必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼ、及びリコンビナーゼアクセサリータンパク質のうちの１以上を含み得る。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＢｓｕポリメラーゼである。好ましくは、リコンビナーゼは、必要に応じてリコンビナーゼアクセサリータンパク質ＵｖｓＹ及びｇｐ３２と組み合わせた、バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸである。キット又は組成物は、上記の通りの、本発明の方法におけるＤＮＡ増幅に必要な、ｄＮＴＰ、好適な緩衝液及び他の因子を更に含み得る。
【００９７】
以下の実施例で本発明を説明する。
【実施例】
【００９８】
実施例
実施例１  ２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた標的ＤＮＡの増幅
人工標的ＤＮＡの増幅における２の侵入オリゴヌクレオチドの使用を図１及び２に示す。用いたオリゴヌクレオチドは、すべてＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）のいずれかから購入した。クレアチンキナーゼ及びスクロースホスホリラーゼを含む試薬及び緩衝液は、すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｔ４一本鎖結合タンパク質（ｇｐ３２）及びＢＳＵポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＵｖｓＸ及びＵｖｓＹは、以前に記載［１、２］された通りに精製した。テルモコックス・ガンマトレランスＲＮアーゼＨＩＩは、ＧｅｎｅＳｙｓ  Ｌｔｄ  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入した。
【００９９】
等温ＤＮＡ増幅反応を、４０℃で少なくとも９０分間行った。反応体積は、特に明記しない限り、２０μｌであった。１０ｍＭトリス−酢酸ｐＨ８．０、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ＤＭＳＯ、５％ＰＥＧ１０００、４ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＡＴＰ、２００μＭ  ＤＮＴＰ、１：１０００００  サイバーグリーンＩ、６０ｍＭトリス−ホスホクレアチンが、反応用の緩衝溶液であった。２５０ｎ／μｌのｇｐ３２、５μＭのＵｖｓＸ、０．０６２５Ｕ／μｌのＢＳＵ、０．０１２５Ｕ／μｌのスクロースホスホリラーゼ及び０．０２５Ｕ／μｌのクレアチンキナーゼが、緩衝液に含まれるタンパク質であった。各プライマー及び侵入オリゴヌクレオチドの濃度は、特に明記しない限り、２００ｎＭであった。侵入オリゴヌクレオチドは、標的二重鎖に対して平行又は反平行のいずれかの配置で結合するように設計された（図１）。反応は、１０ｆＭ又は１ｐＭのいずれかで（ａｔｅｉｔｈｅｒ）存在する標的ＤＮＡと共に、又はそれとは別に、酢酸マグネシウムを加えることによって開始した。増幅のリアルタイム検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＸ  ｐｒｏ装置を用いることにより行った。該装置を、４０℃、６０秒間のサイクルでプログラムし、各サイクルの蛍光を検出した。サイクルの直後に融解分析を行うことにより、反応生成物の特異性を評価した。反応物を９５℃に、１５秒間急速に加熱し、その後２５℃への急速冷却工程６０秒間によって、これを行った。次いで、反応物を２５℃から８５℃まで徐々に加熱し、蛍光を０．５℃間隔で測定した。
【０１００】
平行配置に関しては、２の侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１及び２）並びにフォワード（配列番号３）及びリバース（配列番号４）のプライマーを用いた。配列番号１１の配列を含む標的ＤＮＡを含有する反応物においてのみ、増幅を検出した。標的ＤＮＡを含まない反応（鋳型のコントロールなし、ＮＴＣ）は、サイバーグリーンＩシグナルの非存在によって認められる通り、増幅を生じなかった（図２ａ）。標的ＤＮＡを含有しない細菌１５種からのゲノムＤＮＡの混合物を加えることによって、平行配置の特異性を、更に実証した（１種あたり、１反応当たり１０００コピーのゲノムＤＮＡを添加した）。この混合物においては、増幅を検出せず、このことは、この配置が標的ＤＮＡのみを検出することを、更に実証した。サイバーグリーンＩによる融解分析は、標的ＤＮＡを含有する反応チューブにおいて、特異的な増幅反応が起こることを更に確認した（図２ｂ）。
【０１０１】
反平行配置に関しては、２の侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１及び２）並びにフォワード（配列番号３）及びリバース（配列番号５）のプライマーを用いた。増幅は、配列番号１２の標的配列を含む標的ＤＮＡを反応物に加えた場合にのみ検出された（図２ｃ）。更に、ＮＴＣも細菌種からのゲノムＤＮＡの混合物も、この配置により増幅をもたらさなかった。サイバーグリーンＩによる融解分析は、標的ＤＮＡを含有する反応チューブにおいて、特異的な反応が生じることを確認した（図２ｄ）。
【０１０２】
図１ｃに示す逆反平行配置も試験した。２の侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１及び１３）並びにフォワード（配列番号１４）及びリバース（配列番号２５）のプライマーを用いて、配列番号２６の配列を含む標的ＤＮＡの鋳型を増幅した。増幅は、標的ＤＮＡを反応物に加えた場合にのみ検出された（図２ｅ）。標的ＤＮＡの非存在下では、試料中に検出可能なシグナルは観察されなかった。サイバーグリーンＩによる融解分析は、標的ＤＮＡを含有する反応チューブにおいて、特異的反応が生じることを更に確認した（図２ｆ）。
【０１０３】
実施例２  増幅のための侵入オリゴヌクレオチドの必要条件
標的ＤＮＡの指数関数的増幅には、両方の侵入オリゴヌクレオチドが必要であった。標的ＤＮＡ配列に相補的な２の侵入オリゴヌクレオチド、又は１つが相補的で、且つ１つが非相補的である侵入オリゴヌクレオチド、のいずれかを用いることによって、これを実証した。平行（図３ａ）及び反平行（図３ｂ）の配置においては、標的ＤＮＡ配列に相補的な他の侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１）を、非相補的な侵入オリゴヌクレオチド（配列番号６）に置き換えた。両方の配置に用いたプライマー及び試薬は、実施例１に記載の通りであった。増幅反応は、標的ＤＮＡ  １ｐＭの存在下で行った。標的ＤＮＡは、両方の侵入オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡ配列に相補的である場合にのみ増幅した（図３）。このことは、増幅産物が標的鋳型の全長を有することも示唆している。更に、ＮＴＣ又は相補的侵入オリゴヌクレオチドと非相補的オリゴヌクレオチドとの置換によっては、増幅はもたらされなかった。このことは、侵入オリゴヌクレオチドの非存在下では、プライマーが標的ＤＮＡを増幅しないことを実証している。
【０１０４】
実施例３  増幅のためのプライマーの必要条件
標的ＤＮＡの増幅には、フォワード及びリバースのプライマーが必要である。標的ＤＮＡに相補的なプライマーの１つを非相補的プライマーで置換することによって、このことを実証した。増幅反応は、リバースプライマー（配列番号４）の存在下又は標的ＤＮＡに対して非相補的なリバースプライマー（配列番号７）の存在下のいずれかで行った。標的ＤＮＡの濃度は１ｐＭであった。標的ＤＮＡに相補的なリバースプライマー（配列番号４）を含有する反応物においてのみ、増幅を検出した（図４）。相補的リバースプライマー（配列番号４）を非相補的リバースプライマー（配列番号７）で置き換えた反応においては、増幅を検出しなかった。このことは、侵入オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ基質として作用できないために、独立して標的ＤＮＡ配列を増幅しないことを示す。更に、このことは、増幅を生じるために、全てのオリゴヌクレオチドが必要なことを実証している。
【０１０５】
実施例４  標的特異的プローブの、２の侵入オリゴヌクレオチドとの適合性
２の侵入オリゴヌクレオチドを伴う、鎖侵入に基づく増幅により、標的ＤＮＡ特異的プローブ設計の可能性を広げることが可能となる。平行及び反平行の配置の両方において、侵入オリゴヌクレオチドにもプライマーにも相補的でない標的ＤＮＡ上の領域が存在する。これは、侵入オリゴヌクレオチドやプライマーと競合することなく、これらの領域に結合するように、更なるプローブを設計し得ることを意味する（図５ａ）。標的特異的プローブの存在下で、反平行配置における増幅を試験した。プローブは、ＲＮＡ塩基によって分離された蛍光色素分子及び消光分子を含む。非特異的伸張が起こらないことを更に確実にするため、プローブを３’末端でもブロックする。侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１及び２）の濃度は２００ｎＭで、プライマー（配列番号３及び４）及びプローブ（配列番号８）の濃度は４００ｎＭであった。１０μｇ／ｍｌのテルモコックス・ガンマトレランスＲＮアーゼＨ２の存在下で、標準的な増幅反応を、実施例１に記載の通り行った。サイバーグリーンＩ又は蛍光色素分子及び消光分子で標識したプローブのいずれかにより、リアルタイム増幅を検出した（図５ｂ）。このことは、反応の間に、プローブが標的ＤＮＡに効率的に結合し、検出可能なシグナルを生成することを示す。
【０１０６】
前述の、１の侵入オリゴヌクレオチドのみを用いた鎖侵入に基づく増幅（ＳＩＢＡ）では、配置が、標的ＤＮＡ領域上のプローブの自由な結合を容易には後押ししないため、プローブケミストリー（ｐｒｏｂｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の開発は手間がかかる。これは、典型的には、標的ＤＮＡのすべての領域が、侵入オリゴヌクレオチド又はプライマーに対する結合部位のいずれかとして機能するためである。従って、標的特異的プローブは、特別な設計をされない限り、侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーと、結合に関して競合しなければならない。図５ｃに示す結果は、ＳＩＢＡにおいて、侵入オリゴヌクレオチドと同じ標的領域に特異的な標的特異的プローブを用いることに関連する問題を示した。ＳＩＢＡアッセイにおいては、侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１）、フォワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号５）の濃度は２００ｎＭで、プローブ（配列番号９）の濃度は４００ｎＭであった。サイバーグリーンＩ又はプローブのいずれかを用いてリアルタイム増幅をモニターした（図５ｃ）。標的ＤＮＡを含有する反応物におけるサイバーグリーンＩシグナルの増加は、増幅が起こることを示した。しかし、侵入オリゴヌクレオチド結合部位とオーバーラップするプローブではシグナルが検出されず、これにより、プローブが標的ＤＮＡに結合できないことが示唆された。これは、侵入オリゴヌクレオチドとプローブとの間の競合に起因する可能性がある。
【０１０７】
実施例５  ２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた配置における標的特異的プローブの使用は、短いプライマーによって生成される非特異的増幅シグナルを減少させる
非常に短いプライマーの使用は、侵入オリゴヌクレオチドが伸長し得るために、ＳＩＢＡにおける非特異的増幅をもたらし得る。かかる非特異的増幅は、侵入オリゴヌクレオチドのＤＮＡ領域を潜在的に伸長させ得る特定の短いプライマー（１４塩基）で検出された（図６ｂ）。従って、標準的なＳＩＢＡにおいては、プライマーは、長さ約１６〜２３塩基で、その３’末端が侵入オリゴヌクレオチドと部分的に相同であるように設計される。２の侵入オリゴヌクレオチドを伴う配置においては、増幅方法は、短いプライマーからの非特異的増幅産物の検出がされにくい。これは、侵入オリゴヌクレオチド又はプライマーのいずれの結合部位ともオーバーラップしないプローブ結合部位が使用され得るという事実に起因する。
【０１０８】
図６は、反平行配置において２の侵入オリゴヌクレオチドを用いて、又は従来のＳＩＢＡを用いてのいずれかで行われた増幅反応を実例で示す。両方の鎖侵入に基づく増幅法においては、短いプライマー（本実施例では１４塩基）及び長いプライマー（本実施例では２１塩基）の使用により、標的鋳型を伴うサイバーグリーンＩシグナルが増加した。しかし、長いプライマーでは、ＮＴＣにおいてシグナルは生じず、短いプライマーでは、ＮＴＣからもわずかなシグナルが検出された。けれども、２の侵入オリゴヌクレオチドを伴う配置は、侵入オリゴヌクレオチド及びプライマーと競合することなく、標的配列へのプローブの結合を可能にした。かかる配置は、ＮＴＣ中の短いプライマーで生成されたシグナルの検出を排除した（図６ａ）。
【０１０９】
実施例６  ２の侵入オリゴヌクレオチドを用いた、プラスミドＤＮＡの増幅
異なるタイプのＤＮＡ鋳型を増幅するために、２侵入オリゴヌクレオチド増幅法が用いられ得る。標的ＤＮＡ二重鎖（反／平行配置のための標的、配列番号２０）を市販のｐＣＲ２．１  ｖｅｃｔｏｒ  ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。インサートは、ＥｃｏＲＩ制限部位に隣接していた。次いで、プラスミドを、実施例１に記載の通りの、２侵入オリゴヌクレオチド法の反平行配置の鋳型として用いた。各侵入オリゴヌクレオチド、プライマー及びプローブの濃度は、それぞれ２００、４００及び６００ｎＭであった。図７に示す通り、適切な量（１００ｆＭ〜１０ｐＭ）の、消化されたか、又は消化されていないプラスミドを、反応物に加えた。標的プラスミドを、ＥｃｏＲＶ−ＨＦ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）と３７℃で３時間インキュベーションすることにより、消化したプラスミドを調製した。図７に示す通り、該方法は、消化したプラスミド及び消化していないプラスミドの両方から標的ＤＮＡを増幅することができた。しかし、制限酵素で消化されたプラスミドＤＮＡは、消化されていないプラスミドより早く検出された。このことは、環状化プラスミドが標的鋳型として用いられる場合の、増幅の第１ラウンドに関連する遅延に起因し得る。このことは、複合ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤＮＡ）を鋳型として用いる場合、制限酵素を用いて、増幅の第１ラウンドの間の遅延時間を最小化し得ることも示唆する。これは、最初に複合ＤＮＡを適切な制限酵素と共にインキュベーションするか、又は制限酵素を増幅試薬に含めるかのいずれかで行い得る。
【０１１０】
実施例７  複数の侵入部位を伴う標的ＤＮＡの増幅
標的二重鎖は、侵入オリゴヌクレオチドに対して同一の結合部位を含有する末端領域を有するように設計し得る。これは、標的二重鎖の両端を解離させるためには、１の侵入オリゴヌクレオチドのみが必要であることを意味する。かかる標的二重鎖は、アダプター（既知の配列）と連結された未知のＤＮＡ断片か、又はＤＮＡ断片配列の一部のみが既知である場合の、ライブラリーによく似ている。次いで、これらの未知のＤＮＡ断片を、アダプター特異的プライマーを用いることにより増幅し得る。この時、増幅産物は、ＤＮＡ配列決定等の、派生的用途（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のための鋳型として役立つ。かかるシステムは、断片解析、クローニング、一塩基多型（ＳＮＰ）検出等の他の派生的用途にも用い得る。ＤＮＡ断片は、平行、反平行又は逆反平行配置において、単一の侵入オリゴヌクレオチドに対する、同一の２標的配列を用いて効率的に増幅し得る（図８）。本実施例においては、標準的な増幅反応を、５％ＰＥＧ１０００を７．５％ＰＥＧ４００に換えた以外は、実施例１に記載の通りに行った。
【０１１１】
平行配置に関して、４００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１３）、２００ｎＭのフォワードプライマー（配列番号１４）、及び２００ｎＭのリバースプライマー（配列番号１５）を用いて、適切な量の、３２４ｂｐの標的二重鎖ＤＮＡ（配列番号１６）を増幅した。標的二重鎖（配列番号１６）は、侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２８及び２９）に対する結合部位として機能する配列が隣接する、２００ｂｐのヒトラクターゼ（ＬＣＴ）遺伝子断片を含有していた。標的二重鎖ＤＮＡ（配列番号１６）を含有する反応物においてのみ増幅を検出し、標的二重鎖ＤＮＡを含まない反応物（鋳型コントロールなし、ＮＴＣ）は、あらゆる検出可能なサイバーグリーンＩのシグナルをもたらさなかった（図８Ａ）。増幅速度は、反応開始２０分以内に１０００コピーの標的ＤＮＡが検出され、非常に速く且つ効率的であった。サイバーグリーンＩによる融解分析は、反応が特異的であることを更に確認した（図８Ｂ）。
【０１１２】
４００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２）、２００ｎＭのフォワードプライマー（配列番号５）、及び２００ｎＭのリバースプライマー（配列番号４）を用いることにより、侵入オリゴヌクレオチド（配列番号３０及び３１）に対する結合部位として機能する隣接配列を含む、別の標的ＤＮＡ（配列番号１７）を増幅し、平行配置の実例を更に示した。反応は、図８Ａにおいてさきに見られた反応と同様の成績を示した。標的ＤＮＡ（配列番号１７）の増幅も、反応開始２０分以内に１０００コピーが検出され、非常に効率的であることが判明した（図８Ｃ）。サイバーグリーンＩによる融解分析は、標的ＤＮＡを含有する反応チューブにおいて、特異的増幅反応が生じることを更に確認した（図８Ｄ）。
【０１１３】
反平行配置に関して、４００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２）及び４００ｎＭのプライマー（配列番号５）を用いて、アダプター配列（配列番号２７）を含む標的ＤＮＡ（配列番号１８）を増幅した。プライマー（配列番号５）は、フォワード及びリバースの両方のプライマーとして機能した。従って、適切な結合配列を提供する場合、１のＩＯ及び１種のプライマーのみを使用して、標的ＤＮＡを増幅し得る。標的ＤＮＡ（配列番号１８）を含有する反応物においてのみ、増幅を検出した。標的ＤＮＡを含まない反応物（鋳型コントロールなし、ＮＴＣ）は、サイバーグリーンＩのシグナルにより検出可能なあらゆるシグナルを生成しなかった（図８Ｅ）。サイバーグリーンＩによる融解分析は、反応が標的特異的であることを更に実証した。（図８Ｆ）。
【０１１４】
逆反平行配置を用いて同様の研究を行った。４００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号１３）及び４００ｎＭのプライマー（配列番号１５）を用いて標的ＤＮＡ（配列番号１９）を増幅した。プライマー（配列番号１５）は、フォワード及びリバースの両方のプライマーとして機能した。この配置は、標的ＤＮＡを特異的に増幅することもでき、ＮＴＣにおいては非特異的反応は見られなかった（図８Ｇ）。サイバーグリーンＩによる融解分析は、反応が標的特異的であることを更に実証した（図８Ｈ）。
【０１１５】
逆反平行配置を用いた増幅の速度は、平行及び反平行配置よりも遅いようであった。平行配置が、最も速い増幅速度を示すようであった。増幅速度における差異には、種々の要因が介在し得る。例えば、３システムは、すべて類似の侵入オリゴヌクレオチドを用いるが、それらのプライマーは異なる。プライマーの融解温度及び長さが増幅速度に影響を及ぼし得るため、このことで増幅速度における差異をある程度説明し得る。
【０１１６】
反平行配置を用いた反応物を、更に非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供した（図８ｉ）。酢酸マグネシウムを２０ｍＭで用い、５％ＰＥＧ１０００を７．５％ＰＥＧ４００に換え、反応を、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＣＦＸ  ９６  ＰＣＲ装置を用いることにより、４４℃で１２０分間行った以外は、実施例１に記載の通りに、標準的な増幅反応を行った。２００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２）及び４００ｎＭのプライマー（配列番号５）を用いて、適切な量の標的ＤＮＡ（配列番号１８）を増幅した。プライマー（配列番号５）は、フォワード及びリバースの両方のプライマーとして機能した。従って、適切な結合配列が提供されるため、１のＩＯ及び１種のプライマーのみを用いて、標的ＤＮＡを増幅した。ＰＡＧＥに関しては、反応混合物の５μｌ等分割量を、８％ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に充填し、１５０Ｖ（一定）で６０分間電気泳動した。ゲルをｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（ＧｅｌＲｅｄ；Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で染色し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＥＺ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて可視化した。予想される長さの増幅産物に対応する明確なバンドは、標的鋳型を含有する反応物においてのみ現れた。標的鋳型なしの試料では、バンドは検出されず、このことは、非特異的増幅産物が存在しないことを実証した。
【０１１７】
実施例８  鎖侵入及び増幅をモニターするためのＦＲＥＴベースのプローブ
実施例８は、侵入及び標的ＤＮＡの増幅（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ）をモニターするためのＦＲＥＴプローブケミストリーの展開を記述する。該ケミストリーにより、標的二重鎖の両方の末端領域において生じる侵入過程の同時モニタリングが可能となる。これは、標的ＤＮＡの全長が増幅されることを確実にする確認的な方法でもある。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムを形成するために、プライマー及び侵入オリゴヌクレオチドを、図９Ａに示す通り、それぞれ蛍光色素分子及び消光分子で標識する。標的二重鎖の末端領域を確定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）プライマーは、５’末端において、又は内部で、蛍光色素分子（フォワード及びリバースのプライマーについて異なる蛍光色素分子）で標識される。標的ＤＮＡの下流末端に結合する侵入オリゴヌクレオチドを、３’末端において消光分子で標識し、標的ＤＮＡの下流末端に結合する侵入オリゴヌクレオチドを、５’末端において消光分子で標識する。
【０１１８】
５％ＰＥＧ１０００を７．５％ＰＥＧ４００に換えた以外は、実施例１に記載の通りに、平行配置を用いた標準的な増幅反応を行った。２００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２１）（その５’末端の近傍で消光分子で標識した）及び２００ｎＭの侵入オリゴヌクレオチド（配列番号２２）（３’末端で消光分子で標識した）を用いた。内部で標識された蛍光色素分子ＲＯＸ及びＣｙ５をそれぞれ有するフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）を２００ｎＭで用いた。これらのオリゴヌクレオチドを用いて標的ＤＮＡ（配列番号１７）を増幅した。増幅のリアルタイム検出は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＣＦＸ  ９６  ＰＣＲ装置を用いることにより行った。シグナルは、１２０サイクル（各サイクルは３０秒に等しい）について、各サイクルの後に測定し、シグナルは相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。
【０１１９】
図９Ｂは、標的鋳型（配列番号１７）の増幅の間の、ＦＲＥＴシステムのシグナルプロファイルを示す。反応の間に、アンプリコンの末端領域は、異なる蛍光色素分子を取り込むようになる。この場合の上流領域は蛍光色素分子ＲＯＸを取り込み、下流領域は蛍光色素分子Ｃｙ５を取り込む。図９Ｂに見られる通り、アンプリコンの侵入の間には、蛍光色素分子シグナルの発生は減少した（消光分子で標識された侵入オリゴヌクレオチドがアンプリコンの末端領域に近接したため）。フォワード及びリバースのプライマーによって放出されるシグナルの同時減少は、両方のプライマーがアンプリコンに組み込まれることを示唆した。
【０１２０】
実施例９  多重侵入システムの感度
本実施例では、３通りの異なるアッセイの分析感度を評価した。標準的な増幅反応は、５％ＰＥＧ１０００を７．５％ＰＥＧ４００に換えた以外は、実施例１に記載の通りに行った。アッセイ１、２及び３を用いて、それぞれ標的ＤＮＡ１（配列番号１６）、標的ＤＮＡ２（配列番号１７）、及び標的ＤＮＡ３（配列番号１８）を増幅した。用いたオリゴヌクレオチド及びそれらの濃度は、実施例７に記載の通りであった。１０６コピーから１コピーまでの標的ＤＮＡに対する、１０倍希釈系列を試験した。結果を図１０に示す。３通りのアッセイは、全て、少なくとも１００のＤＮＡ標的コピーに対して感度があった（アッセイ１、２及び３を、それぞれ図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃに示す）。アッセイ３は、いくつかの実験において、標的ＤＮＡの単一コピーでさえも検出する感度を示した（図１１Ｃ）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図８ｉ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017521056.tif 000034
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