(57)【要約】  開示されるのは、疎水性ポリエステルキャリア材料および安定した過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノキャリアを提供する組成物および方法である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアはまた、最初に滅菌濾過可能でもある。他の態様において、ラパマイシンは、合成ナノキャリア組成物において、５０重量％（組成物におけるラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）未満の量で存在する。
2017537081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含む合成ナノキャリア
を含む組成物であって；
ラパマイシンが、５０重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）未満の安定した過飽和量で合成ナノキャリアに存在し；および
合成ナノキャリアが、最初に滅菌濾過可能である、前記組成物。
【請求項２】
ラパマイシンが、４５重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ラパマイシンが、４０重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ラパマイシンが、３５重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ラパマイシンが、３０重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ラパマイシンが、２５重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
ラパマイシンが、２０重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ラパマイシンが、１５重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ラパマイシンが、１０重量％未満の安定した過飽和量で存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ラパマイシンが、７重量％超の安定した過飽和量で存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
疎水性ポリエステルキャリア材料が、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
疎水性ポリエステルキャリア材料が、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧまたはＰＣＬ−ＰＥＧをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量が、５〜９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量が、６０〜９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
合成ナノキャリアが、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、ソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪アルコール、ポロキサマーまたは脂肪酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、SPAN 40、SPAN 20、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、グリセロールモノステアラート、BRIJ 52、BRIJ 93、Pluronic P-123、Pluronic L-31、パルミチン酸、ドデカン酸、トリパルミチン酸グリセリルまたはトリリノール酸グリセリルを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、SPAN 40である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、合成ナノキャリアに封入されているか、合成ナノキャリアの表面上に存在するか、またはその両方である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧０．１重量％であるが≦１５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧１重量％であるが≦１３重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧１重量％であるが≦９重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
組成物が、０．２２μｍのフィルターを介して、最初に滅菌濾過可能である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
合成ナノキャリアの動的光散乱法を使用して得られる粒子サイズ分布の平均が、１２０ｎｍ超の直径である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
直径が、１５０ｎｍ超である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
直径が、２００ｎｍ超である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
直径が、２５０ｎｍ超である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
直径が、３００ｎｍ未満である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
直径が、２５０ｎｍ未満である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
直径が、２００ｎｍ未満である、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ラパマイシンが、合成ナノキャリアに封入されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
組成物が、抗原をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
抗原が、組成物において、合成ナノキャリアと混和されている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
組成物が、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
本明細書に提供される方法のいずれか１つにおける使用のための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物
を含む、キット。
【請求項３６】
組成物が、抗原を含まないとき、キットが、抗原をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
組成物および抗原が、別個の容器に含有されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
組成物および抗原が、同じ容器に含有されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
使用のための説明書をさらに含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
使用のための説明書が、本明細書に提供される方法のいずれか１つの説明を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物を対象へ投与することを含む、方法。
【請求項４２】
組成物が抗原を含まないとき、方法が、抗原を対象へ投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗原が、異なる合成ナノキャリアに含まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗原が、いずれの合成ナノキャリアともカップリングされていない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
投与することが、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下の投与による、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアを生産するための方法であって、
疎水性ポリエステルキャリア材料を得ることまたは提供すること、
ラパマイシンの飽和限度を超過する量でラパマイシンを得ることまたは提供すること、
疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを組み合わせること、および、
ラパマイシンを安定化させること
を含む、前記方法。
【請求項４７】
ラパマイシンが、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤を加えることによって、安定化される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、ソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪アルコール、ポロキサマーまたは脂肪酸を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、SPAN 40、SPAN 20、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、グリセロールモノステアラート、BRIJ 52、BRIJ 93、Pluronic P-123、Pluronic L-31、パルミチン酸、ドデカン酸、トリパルミチン酸グリセリルまたはトリリノール酸グリセリルを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤が、SPAN 40である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧０．１重量％であるが≦１５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧１重量％であるが≦１３重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量が、≧１重量％であるが≦９重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料の重量）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ラパマイシンが、溶媒の存在下で組み合わせられた疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンの急速な溶媒蒸発により安定化される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を決定することをさらに含む、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
決定することが、本明細書に提供される配合のいずれか１つを使用して実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ラパマイシンの量が、飽和限度を１％超の差で超過する、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも５％の差で超過する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも１０％の差で超過する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも１５％の差で超過する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも２０％の差で超過する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも２５％の差で超過する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも３０％の差で超過する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ラパマイシンの量が、飽和限度を少なくとも３５％の差で超過する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
方法が、その結果得られる組成物を濾過することをさらに含む、請求項４６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
濾過することが、０．２２μｍのフィルターを介して濾過することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
疎水性ポリエステルキャリア材料が、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンを含む、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
組成性ポリエステルキャリア材料が、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧまたはＰＣＬ−ＰＥＧをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４６〜６８のいずれか一項に記載の方法によって生産される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第62/075,864号（2014年11月5日出願）および第62/075,866号（2014年11月5日出願）の35 U.S.C. §119の下、その利益を主張するものであり、これら各々の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、疎水性ポリエステルキャリア材料と、安定した過飽和量のラパマイシンとを含む、合成ナノキャリアに関する。好ましくは、これらの合成ナノキャリアは、最初に滅菌濾過可能であり、いくつかの態様においては、in vivoでの有効性を呈する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の概要
合成ナノキャリア形成の間の配合物におけるラパマイシンの濃度が、該配合物におけるラパマイシンの溶解限度とは相対的に、その結果得られた合成ナノキャリアの免疫寛容誘導能に著しい影響を及ぼし得ることが、驚くべきことに発見された。加えて、かかるラパマイシンが合成ナノキャリアを介し如何にして分散されているかが、その結果得られた合成ナノキャリアが最初に滅菌可能であるか否かに影響を及ぼし得る。具体的には、形成されたナノキャリア懸濁液においてその溶解度を超過するラパマイシン濃度をもたらす条件下で創出された合成ナノキャリアの組成物および関連の方法が提供される。かかる合成ナノキャリアは、より持続的な免疫寛容を提供し得、および、最初に滅菌濾過可能であり得る。
【０００４】
一側面において、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアを含む組成物が提供され、ここでラパマイシンが、５０重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料の重量に対するラパマイシンの重量に基づく）未満の安定した過飽和量で合成ナノキャリアに存在する。
【０００５】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、重量は、合成ナノキャリアの配合の間に組み合わせられた材料の処方された重量(recipe weights)である。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、重量は、その結果得られた合成ナノキャリア組成物における材料の重量である。
【０００６】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、４５重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、４０重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、３５重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、３０重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、２５重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、２０重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、１５重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、１０重量％未満の安定した過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、７重量％超の安定した過飽和量で存在する。
【０００７】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料は、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンを含む。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料はさらに、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧまたはＰＣＬ−ＰＥＧを含む。
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、５〜９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、６０〜９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）である。
【０００８】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアはさらに、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤を含む。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤は、ソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪アルコール、ポロキサマー、脂肪酸、コレステロール、コレステロール誘導体、または胆汁酸もしくは塩を含む。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤は、SPAN 40、SPAN 20、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、グリセロールモノステアラート、BRIJ 52、BRIJ 93、Pluronic P-123、Pluronic L-31、パルミチン酸、ドデカン酸、トリパルミチン酸グリセリルまたはトリリノール酸グリセリルを含む。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤は、SPAN 40である。
【０００９】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤は、合成ナノキャリアに封入されているか、合成ナノキャリアの表面上に存在するか、またはその両方である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．１であるが≦１５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧１であるが≦１３重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧１であるが≦９重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。
【００１０】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、組成物は、０．２２μｍのフィルターを介して、最初に滅菌濾過可能である。
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアの動的光散乱法を使用して得られた粒子サイズ分布の平均は、１２０ｎｍ超の直径である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、１５０ｎｍ超である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、２００ｎｍ超である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、２５０ｎｍ超である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、３００ｎｍ未満である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、２５０ｎｍ未満である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、直径は、２００ｎｍ未満である。
【００１１】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、合成ナノキャリアに封入されている。
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、組成物はさらに、抗原を含む。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、抗原は、組成物において、合成ナノキャリアと混和されている。
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの一態様において、組成物はさらに、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【００１２】
別の側面において、本明細書に提供される組成物のいずれか１つを含むキットが提供される。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、組成物は、提供される方法のいずれか１つにおける使用のためのものである。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、組成物が抗原を含まないとき、キットは抗原をさらに含む。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、組成物および抗原は、別個の容器において含有される。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、組成物および抗原は、同じ容器において含有される。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、キットは、提供されるキットのいずれか１つの一態様における使用のための説明書をさらに含み、使用のための説明書は、本明細書に提供される方法のいずれか１つの記載を含む。
【００１３】
別の側面において、本明細書に提供される組成物のいずれか１つを対象へ投与することを含む方法が提供される。本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、組成物が抗原を含まないとき、方法は抗原を対象へ投与することをさらに含む。本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、抗原は、異なる合成ナノキャリアに含まれる。本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、抗原は、いずれの合成ナノキャリアともカップリングされない。本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、投与することは、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下の投与によるものである。
【００１４】
別の側面において、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアを生産するための方法であって、疎水性ポリエステルキャリア材料を得ることまたは提供すること、ラパマイシンの飽和限度を超える量でラパマイシンを得ることまたは提供すること、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを組み合わせること、および、ラパマイシンが安定した過飽和量で存在できるように合成ナノキャリアを形成することを含む、前記方法が、提供される。
【００１５】
別の側面において、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアを生産するための方法であって、疎水性ポリエステルキャリア材料を得ることまたは提供すること、ラパマイシンの飽和限度を超える量でラパマイシンを得ることまたは提供すること、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを組み合わせること、および、ラパマイシンを安定化させることを含む、前記方法が、提供される。
生産のための方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアが存在下で形成されるか、または、ラパマイシンが、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤を加えることによって安定化される。
【００１６】
生産のための方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアが形成されるか、または、ラパマイシンが、溶媒の存在下で組み合わされた疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンからの急速な溶媒蒸発により安定化される。
生産のための方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアが形成されるか、または、ラパマイシンが、固体溶融プロセス(a solid melt process)および／または冷却射出成形(cooling injection molding)により安定化される。
生産のための方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を決定することを含む。生産のための方法のいずれか１つの一態様において、決定することは、本明細書に提供される配合のいずれか１つを使用して実施される。
【００１７】
生産のための方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、その結果得られる組成物を濾過することを含む。生産のための方法のいずれか１つの一態様において、濾過することは、０．２２μｍのフィルターを介して濾過することを含む。
別の側面において、本明細書に提供される生産するための方法のいずれか１つによって生産される組成物が、提供される。
【００１８】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも１％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも５％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも１０％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも１５％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも２０％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも２５％上回る過飽和量で存在する。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの一態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を少なくとも３０％上回る過飽和量で存在する。
【００１９】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも１％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも５％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも１０％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも１５％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも２５％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも２５％の差で超過する。別の態様において、ラパマイシンの量は、飽和限度を少なくとも３０％の差で超過する。
【００２０】
別の側面において、例に提供される配合のいずれか１つが提供される。本明細書に提供される方法のいずれか１つは、提供される配合のいずれか１つを使用してラパマイシンの濃度を決定するステップを含み得る。本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、配合は、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を決定するために使用される。
別の側面において、例のいずれか１つの組成物が、提供される。
【００２１】
別の側面において、例の組成物のいずれか１つなどの、本明細書に提供されるとおりの組成物のいずれか１つを生産するための方法が、提供される。
別の側面において、本明細書に提供される組成物またはキットのいずれか１つを製造する方法が、提供される。これらの方法のいずれか１つの一態様において、製造する方法は、本明細書に提供される方法のいずれか１つのステップを含む。これらの方法のいずれか１つの別の態様において、製造する方法は、例に提供される方法のいずれか１つなどの、本明細書に提供される方法のいずれか１つのステップを含む。
【００２２】
別の側面において、対象における免疫寛容を促進するための医薬の製造のための、本明細書に提供される組成物またはキットのいずれか１つの使用が、提供される。本明細書に提供される使用のいずれか１つの別の態様において、使用は、本明細書に提供される方法のいずれか１つを達成するためのものである。
別の側面において、本明細書に提供される組成物またはキットのいずれか１つは、本明細書に提供される方法のいずれか１つにおける使用のためのものであってもよい。
別の側面において、免疫寛容を促進することを目的とする医薬を製造する方法が、提供される。一態様において、医薬は、本明細書に提供される組成物のいずれか１つを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、過飽和量におけるラパマイシンの決定を例示する、ラパマイシン損失および回収の分析結果を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載のラパマイシンの過飽和量をもつ合成ナノキャリアの投与によるＩｇＧのレベルを示す。
【図３】図３は、本明細書に記載のラパマイシンの過飽和量をもつ合成ナノキャリアの投与によるＩｇＧのレベルを示す。
【００２４】
【図４】図４は、本明細書に記載の、急速な溶媒蒸発法および低ＨＬＢの界面活性剤により調製された合成ナノキャリアを用いた投与プロトコールを使用する抗体力価を示す。
【図５】図５は、様々な容器における標準的なエマルションの溶媒蒸発速度を示す。５０ｍＬビーカー（試料１、ひし形）；１２５ｍｍディッシュ（試料４、四角）。結果は、表面積がより大きくなるにつれ、蒸発がより急速になり得ることを実証する。
【図６】図６は、ラパマイシン（ＲＡＰＡ）とともに共投与されたナノキャリアおよびＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）の寛容誘導能を実証する結果を示す。マウスの血清は、各ＫＬＨチャレンジの後にＫＬＨに対する抗体について分析された。
【００２５】
【図７】図７は、低ＨＬＢ界面活性剤をもつナノキャリアによる持続的な抗体力価の低減を実証する結果を示す。頭字語「tSIP」は、記載されるようなナノキャリアを指す。
【図８】図８は、マウスにおいて、遊離ラパマイシン＋ＫＬＨと比較した、合成ナノキャリア＋ＫＬＨの有効性を実証する結果を示す。合成ナノキャリア＋ＫＬＨで処置されたかまたはされていないマウスについての、（２または３回のＫＬＨ単独チャレンジ後）第３５および４２日の抗体力価での抗ＫＬＨ ＥＣ５０（記号は幾何平均±９５％ＣＩを表す）。頭字語「ＮＣ」は、記載されたとおりのナノキャリアを指す。
【００２６】
【図９】図９は、例１３についての処置プロトコールを示す。頭字語「ＮＣ」は、記載されたとおりのナノキャリアを指す。
【図１０】図１０は、マウスにおける合成ナノキャリア＋ＫＬＨの抗原特異性を示す。合成ナノキャリア＋ＫＬＨで処置されたかまたはされていないマウスについて第６５日の抗体力価での抗ＯＶＡ ＥＣ５０（バーは幾何平均±９５％ＣＩを表す）。頭字語「ＮＣ」は、記載されたとおりのナノキャリアを指す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の詳細な記載
本発明を詳細に記載する前に、具体的に例示された材料またはプロセスパラメータは当然に変動し得るものであるから、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語は、本発明のみの特定の態様を記載する目的のためのものであり、本発明を記載する代替的な専門用語の使用を限定することは意図されないこともまた理解されるべきである。
本明細書においてこの前後にかかわらず引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的において、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本明細書および添付のクレームにおいて使用されるとおり、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明確に他を示さない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「ポリマー」への参照は、２以上のかかる分子の混合物または異なる分子量の単一のポリマー種の混合物を含み、「合成ナノキャリア」への参照は、２以上のかかる合成ナノキャリアまたは複数のかかる合成ナノキャリアなどの混合物を含む。
【００２９】
本明細書に使用されるとおり、用語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含むこと(comprising)」などのその変形は、いずれか列挙された整数（例として、特長(a feature)、要素、特徴、特性、方法／プロセスのステップまたは限定）または整数の群（例として、特長(features)、要素、特徴、特性、方法／プロセスのステップまたは限定）の包含を示すが、いずれの他の整数または整数の群の排除を示さないように読まれるべきである。よって、本明細書に使用されるとおり、用語「含むこと(comprising)」は包括的であり、列挙されていない追加の整数または方法／プロセスのステップを排除しない。
【００３０】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つの態様において、「含むこと(comprising)」は、「本質的に、〜からなること(consiting essentially of)」または「〜からなること(consisting of)」と置き換えられてもよい。句「本質的に、〜からなること」は、特定の整数（単数または複数）またはステップならびにクレームされた本発明の特徴または機能に実質的に影響を及ぼさないものを必要とするように本明細書に使用される。本明細書に使用されるとおり、用語「からなること(consisting)」は、列挙された整数（例として、特長、要素、特徴、特性、方法／プロセスのステップまたは限定）または整数の群（例として、特長、要素、特徴、特性、方法／プロセスのステップまたは限定）単独の存在を示すように使用される。
【００３１】
Ａ．緒言
過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアが、抗原特異的免疫寛容、さらに言えば持続的な抗原特異的免疫寛容を促進し得ることが見出された。しかしながら、かかる量をもつ合成ナノキャリアを生産するためには、いくつかの態様において、ラパマイシンの安定した組み込みが必要とされる。安定した組み込みがないと、かかる態様において、合成ナノキャリアは、ラパマイシンの損失を呈することがあり、０．２２μｍのフィルターを介して滅菌濾過することが難しいことがある。いずれの特定の理論によっても縛られないことを望むが、典型的には、合成ナノキャリアに安定的に組み込まれないラパマイシンは、合成ナノキャリア組成物から細菌を除去するために使用されるフィルターを詰まらせ得る凝集体を形成し得る。かかる除去は、所望のレベルの細菌をもつ合成ナノキャリア組成物をもたらすために、結果的に、in vivoでの投与のために使用される組成物にとって有益な特長である、より滅菌されている組成物をもたらすために、重要である。in vivoでの有益な効果を実現させるために安定であること、および最初に滅菌濾過可能であることは、合成ナノキャリアにおける過飽和量のラパマイシンにとって重要なことである。
【００３２】
驚くべきことに、および例において実証されているとおり、安定した過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリア組成物が生産され得、かかる合成ナノキャリアは、対象において長期の抗原特異的寛容を提供し得る。かかる合成ナノキャリアを生産するための方法は、低ＨＬＢの界面活性剤の使用ならびに例えば急速な溶媒蒸発を伴う合成ナノキャリアを生産するためのプロセスを含む。多数の例の結果は、かかる方法により生産された合成ナノキャリアが、最初に滅菌濾過可能である過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアをもたらし得ることを示す。かかる合成ナノキャリアはまた、対象における持続的な抗原特異的寛容を呈し得る合成ナノキャリア組成物をもたらす例においても示されている。
【００３３】
結果的に、本明細書に提供されるのは、安定した過飽和量でラパマイシンを含む合成ナノキャリア組成物の、組成物および関連の方法である。かかる合成ナノキャリアは、好ましくは、最初に滅菌濾過可能であり得る。また、好ましくは、いくつかの態様において、本明細書に提供される合成ナノキャリア組成物は、抗原特異的免疫寛容を促進し得るのみならず、ラパマイシンが安定した過飽和量で存在しない合成ナノキャリアに対して増強されたレベルでもそうし得る。
本発明はこれから、下でより詳細に記載されるであろう。
【００３４】
Ｂ．定義
「投与すること(administering)」または「投与(administration)」または「投与する(administer)」は、薬理学的に有用であるやり方で材料を対象へ提供することを意味する。用語は、いくつかの態様において投与させることを含むことを意図する。「投与させること(Causing to be administered)」は、直接的にまたは間接的に、別の当事者に材料を投与するよう、引き起こすこと、促すこと、助長すること、補助すること、誘導すること、または指示することを意味する。
「混和された」は、組成物において、抗原などの１つの構成要素を、合成ナノキャリアなどの別のものと混合することを指す。混合される構成要素は、別個に作製されるかまたは得られ、一緒に置かれる。結果的に、構成要素は、組成物において一緒に置かれたときに生じてもよい、可能な非共有結合性の相互作用を除き、互いにカップリングしない。
【００３５】
対象への投与のための組成物または用量に即した「有効な量」は、対象における１以上の所望の応答、例えば抗原特異的寛容原性免疫応答の生成を引き起こす組成物または用量の量を指す。いくつかの態様において、有効な量は、薬力学的に有効な量である。したがって、いくつかの態様において、有効な量は、本明細書に提供されるとおりの１以上の所望の治療効果および／または免疫応答を引き起こす、本明細書に提供される組成物または用量のいずれかの量である。この量は、in vitroまたはin vivoでの目的のためであり得る。in vivoでの目的のために、量は、抗原特異的免疫寛容を必要とする対象にとって臨床的有益性を有してもよいと臨床医が考えるであろうものであり得る。本明細書に提供されるとおりの組成物のいずれか１つは、有効な量であり得る。
【００３６】
有効な量は、所望されない免疫応答のレベルを低減することを伴い得るが、いくつかの態様において、それは、所望されない免疫応答を完全に予防することを伴う。有効な量はまた、所望されない免疫応答の出現を遅延させることも伴い得る。有効である量はまた、所望の治療エンドポイントまたは所望の治療結果を引き起こす量でもあり得る。他の態様において、有効な量は、治療エンドポイントまたは結果などの所望の応答のレベルを増強することを伴い得る。有効な量は、好ましくは、抗原に対して対象における寛容原性免疫応答をもたらす。前記したあらゆるものの達成は、慣例の方法によってモニターされ得る。
【００３７】
有効な量は、処置される特定の対象；症状、疾患または障害の重篤度；年齢、健康状態、サイズおよび重量を含む個々の患者のパラメータ；処置の持続期間；同時治療の性質（もしある場合）；投与の具体的な経路ならびに医療関係者(the health practitioner)の知識および技能の範囲内の同様な因子に、当然に依存するであろう。これらの因子は、当業者に周知であり、ただの慣例にすぎない実験で対処され得る。最大用量が使用される、つまり、堅実な医学的判断に従う最大限に安全な用量が一般に好ましい。しかしながら、医学的理由、心理学的理由のために、または実際上いずれかの他の理由のために、患者がより低い用量または耐容用量を求めてもよいことは、当業者によって理解されるであろう。
【００３８】
一般に、本発明の組成物における構成要素の用量は、構成要素の量を指す。代替的に、用量は、所望の量を提供する合成ナノキャリアの数に基づいて投与され得る。
「抗原」は、Ｂ細胞抗原またはＴ細胞抗原を意味する。「抗原のタイプ（単数または複数）」は、同じかまたは実質的に同じ抗原の特徴を共有する分子を意味する。いくつかの態様において、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、多糖類であってもよく、または細胞に含有または発現されている。いくつかの態様において、抗原が十分に定義されていないかまたは特徴付けられていないなどのとき、抗原は、細胞または組織の調製物、細胞残屑、細胞エキソソーム、馴化培地などの中に含有されていてもよい。
【００３９】
「抗原特異的」は、抗原またはその一部の存在に起因するか、または抗原を特異的に認識または結合する分子を生成する、いずれの免疫応答をも指す。例えば、免疫応答が抗原特異的抗体生産である場合、抗原に特異的に結合する抗体が生産される。別の例として、免疫応答が、抗原特異的なＢ細胞またはＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖および／または活性である場合、増殖および／または活性は、抗原またはその一部を単独で、またはＭＨＣ分子、Ｂ細胞などと複合して認識されることに起因する。
【００４０】
「平均」は、本明細書に使用されるとおり、特記しない限り、算術平均を指す。
「決定すること」または「決定する」は、事実関係を突き止めることを意味する。決定することは、実験を実施することまたは予測を立てることを含むが、これらに限定されない多数の手段により成し遂げられてもよい。態様において、「決定すること」または「決定する」は、「決定させること(causing to be determined)」を含む。「決定されること」は、事実関係を突き止めるために実体(entity)に対して、実体と連携して、引き起こすこと、促すこと、助長すること、補助すること、誘導すること、または指示すること、または作用することを意味する；それは、直接的または間接的に、または明示的または暗示的に、を含む。
【００４１】
「封入する」は、合成ナノキャリア内に少なくとも一部の物質を囲い込むことを意味する。いくつかの態様において、物質は合成ナノキャリア内に完全に囲い込まれる。他の態様において、封入される物質の大半またはすべては、合成ナノキャリアの外の局所的な環境に対して露出されていない。他の態様において、たった５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％（重量／重量）しか局所的な環境に対して露出されていない。封入は、合成ナノキャリアの表面上に物質の大半またはすべてを置く吸収とは異なり、合成ナノキャリアの外の局所的な環境に対して物質を露出されたままにしておく。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの態様において、ラパマイシンおよび／または１０以下の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値をもつ非イオン界面活性剤が、合成ナノキャリア内に封入される。
【００４２】
「疎水性ポリエステルキャリア材料」は、１以上のポリエステルポリマーまたはそれらの単位を含み、かつ、疎水性の特徴を有する、１以上の分子（例としてラパマイシンおよび１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤）を送達し得るいずれの薬学的に許容可能なキャリアを指す。ポリエステルポリマーは、これらに限定されないが、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＧおよびポリカプロラクトンを含む。疎水性ポリエステルキャリア材料は、合成ナノキャリアまたはそれらの一部を形成し得、かつ、１以上の分子（例としてラパマイシンおよび１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤）を含み得るか、またはそれらが負荷され得る、材料を含む。一般に、キャリア材料は、１以上の分子（例としてラパマイシンおよび１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤）の標的部位または標的細胞への送達、１以上の分子の制御放出、および、他の所望の活性を可能にさせ得る。
【００４３】
「疎水性」は、水との水素結合に実質的に関与しない材料を指す。かかる材料は一般に、非極性、主に非極性、または電荷的に中性である。本明細書に記載の組成物に好適なキャリア材料は、あるレベルにて疎水性を呈するそれに基づき選択されてもよい。したがって、疎水性ポリエステルキャリア材料は、全体的に見て疎水性であるものであり、疎水性ポリエステルまたはそれらの単位から完全に構成されていてもよい。しかしながら、いくつかの態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料は、全体的に見て疎水性であって、疎水性ポリエステルまたはそれらの単位を含むが、他のポリマーまたはそれらの単位と組み合わせられている。これらの他のポリマーまたはそれらの単位は、疎水性であってもよいが、そうである必要はない。かかるキャリア材料は、１以上の他のポリマーまたはそれらの単位を含んでもよいが、ただしポリマーまたはそれらの単位のマトリックスが疎水性であると考えられる場合である。
【００４４】
「最初に滅菌濾過可能」は、０．２２μｍフィルターなどのフィルターを介して、これまでは濾過されなかったが、少なくとも５０グラムのナノキャリア／フィルター膜表面積のｍ２の処理量で濾過され得る合成ナノキャリアの組成物を指す。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、処理量は、９ｍＬの体積の合成ナノキャリア懸濁液を取り、いずれか１つの本明細書に提供されるとおりのフィルターのいずれか１つをもつ１０ｍＬのシリンジにそれを入れることによって決定される。合成ナノキャリア懸濁液は、次いで、さらなる懸濁材料がフィルターを介して通過しなくなるまで、フィルターを介して押される。処理量は、次いで、フィルターを介して押された材料、およびシリンジ中に残っている懸濁材料に基づいて計算され得る。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、最初に滅菌濾過可能な組成物は、非滅菌であるか、および／または、in vivo投与に好適ではない（すなわち、実質的に純粋ではなく、in vivoでの投与には決して望ましくない可溶性構成要素を含む）。
【００４５】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの他の態様において、最初に滅菌濾過可能な組成物は、生産されたが、医療グレードの材料を生産するためにさらに処理されていない合成ナノキャリアを含む。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、最初に滅菌濾過可能な組成物は、０．２２μｍフィルターなどのフィルターを介して、これまで濾過されなかったが、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１６０、２００、２５０、３００、３５０、５００、７５０、１０００または１５００グラムのナノキャリア／フィルター膜表面積のｍ２の処理量で濾過され得る。０．２２μｍフィルターは、０．２２μｍの孔サイズをもついずれのフィルターでもあり得る。かかるフィルターは、例えばポリエチレンスルホン、フッ化ポリビニリデン、混合セルロースエステル、無溶媒酢酸セルロース、再生セルロース、ナイロンなどの様々な材料から作製され得る。フィルターの具体的な例は、Millipore SLGPM33R、Millipore SLGVM33RS、Millipore SLGSM33SS、Sartorius 16534、Sartorius 17764、Sartorius 17845などを含む。
【００４６】
「合成ナノキャリアの最大寸法」は、合成ナノキャリアのいずれかの軸に沿って測定されたナノキャリアの最大の寸法を意味する。「合成ナノキャリアの最小寸法」は、合成ナノキャリアのいずれかの軸に沿って測定された合成ナノキャリアの最小の寸法を意味する。例えば、球状の合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最大および最小寸法は、実質的に同一であろうし、その直径のサイズであろう。類似して、立方状の合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最小寸法は、その高さ、幅または長さのうち最小のものであろうが、合成ナノキャリアの最大寸法は、その高さ、幅または長さのうち最大のものであろう。態様において、試料における合成ナノキャリアの総数に基づいて、試料における合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍ以上である。
【００４７】
態様において、試料における合成ナノキャリアの総数に基づいて、試料における合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、５μｍ以下である。好ましくは、試料における合成ナノキャリアの総数に基づいて、試料における合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１１０ｎｍより大きく、より好ましくは１２０ｎｍより大きく、より好ましくは１３０ｎｍより大きく、なおより好ましくは１５０ｎｍより大きい。合成ナノキャリアの最大および最小寸法のアスペクト比は、態様に依存して変動し得る。例えば、合成ナノキャリアの最大寸法：最小寸法のアスペクト比は、１：１から１，０００，０００：１まで、好ましくは１：１から１００，０００：１まで、より好ましくは１：１から１０，０００：１まで、より好ましくは１：１から１０００：１まで、なおより好ましくは１：１から１００：１まで、さらにより好ましくは１：１から１０：１まで変動し得る。
【００４８】
好ましくは、試料における合成ナノキャリアの総数に基づいて、試料における合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、３μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下、より好ましくは８００ｎｍ以下、より好ましくは６００ｎｍ以下、なおより好ましくは５００ｎｍ以下である。好ましい態様において、試料における合成ナノキャリアの総数に基づいて、試料における合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍ以上、より好ましくは１２０ｎｍ以上、より好ましくは１３０ｎｍ以上、より好ましくは１４０ｎｍ以上、なおより好ましくは１５０ｎｍ以上である。
【００４９】
合成ナノキャリア寸法（例として有効直径）の測定は、いくつかの態様において、合成ナノキャリアを液体（通常は水性の）媒体に懸濁させ、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用することによって（例としてBrookhaven ZetaPALS instrumentを使用して）得られてもよい。例えば、合成ナノキャリアの懸濁液は、およそ０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬの合成ナノキャリア懸濁液の最終濃度を達成するために、水性緩衝液から精製水中へ希釈され得る。希釈された懸濁液は、ＤＬＳ分析に好適なキュベットの内部で直接的に調製されてもよく、または当該キュベットへ移されてもよい。次いでキュベットは、ＤＬＳに置かれ、制御された温度まで平衡化させ、次いで媒体の粘性および試料の屈折率にとって適切なインプットに基づいて安定した再現性のある分布を取得するのに充分な時間スキャンされてもよい。次いで、分布の有効直径または平均が報告される。高いアスペクト比または非球状の合成ナノキャリアの有効サイズを決定することは、より正確な測定値を得るために、電子顕微鏡などの増進技術を必要としてもよい。合成ナノキャリアの「寸法」または「サイズ」または「直径」は、例えば、動的光散乱法を使用して得られた粒子サイズ分布の平均を意味する。
【００５０】
「１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤」または「低ＨＬＢ界面活性剤」は、本明細書に使用されるとおり、少なくとも１つの疎水性テールおよび親水性ヘッドを含む構造を有するか、または疎水性の基または領域および親水性の基または領域を有する、非イオン性の両親媒性分子を指す。界面活性剤のテール部分は、一般に、炭化水素鎖からなる。界面活性剤は、親水性のヘッド部分または基または領域の荷電特性に基づいて分類され得る。本明細書に使用されるとおり、「ＨＬＢ」は、界面活性剤の親水性(hydrophilic)−親油性(lipophilic)バランス、または親水性(hydrophile)−親油性(lipophile)バランスを指し、界面活性剤の親水性または親油性の性質の測定値である。
【００５１】
本明細書に提供される界面活性剤のいずれか１つのＨＬＢは、Griffinの方法またはDavieの方法を使用して計算されてもよい。例えばGriffinの方法を使用すると、界面活性剤のＨＬＢは、界面活性剤の親水性部分の分子質量を、界面活性剤全体の分子質量で除したものに２０を乗じた積である。ＨＬＢ値は、０から２０までの尺度であり、０は完全に疎水性（親油性）の分子に対応し、２０は完全に親水性（疎油性）の分子に対応する。いくつかの態様において、本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの界面活性剤のＨＬＢは、（例えば、GriffinまたはDavieの方法によって決定されるとおり）０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。本明細書に提供される組成物および方法のいずれか１つにおける使用のためのかかる界面活性剤の例は、限定することなく、SPAN 40、SPAN 20などのソルビタンエステル；オレイルアルコール、ステアリルアルコールなどの脂肪アルコール；イソプロピルパルミタート、グリセロールモノステアラートなどの脂肪酸エステル；BRIJ 52、BRIJ 93などのエトキシル化脂肪アルコール；Pluronic P-123、Pluronic L-31などのポロキサマー；パルミチン酸、ドデカン酸などの脂肪酸；グリセリルトリパルミタート、グリセリルトリリノレアートなどのトリグリセリド；コレステロール；硫酸コレステリルナトリウム、コレステリルドデカノアートなどのコレステロール誘導体；および、リトコール酸、リトコール酸ナトリウムなどの胆汁塩または酸を含む。
【００５２】
かかる界面活性剤のさらなる例は、ソルビタンモノステアラート（SPAN 60）、ソルビタントリステアラート（SPAN 65）、ソルビタンモノオレアート（SPAN 80）、ソルビタンセスキオレアート（SPAN 83）、ソルビタントリオレアート（SPAN 85）、ソルビタンセスキオレアート（Arlacel 83）、ソルビタンジパルミタート、脂肪酸のモノおよびジグリセリド、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（Tween 85）、ポリオキシエチレンソルビタンヘキサオレアート（G 1086）、ソルビタンモノイソステアラート（Montane 70）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（BRIJ 93）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（BRIJ 52）、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（BRIJ L4）；１−モノテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロール；グリセリルモノステアラート；グリセロールモノパルミタート；エチレンジアミンテトラドキステトラオール（Tetronic 90R4、Tetronic 701）、ポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテル（IGEPAL CA-520）、MERPOL A界面活性剤、MERPOL SE界面活性剤、およびポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレアートを含む。さらなる例もまた当業者に明らかであろう。
【００５３】
「薬学的に許容可能な添加剤」または「薬学的に許容可能なキャリア」は、組成物を配合するための薬理学的に活性な材料と一緒に使用される薬理学的に不活性な材料を意味する。薬学的に許容可能な添加剤は、糖類（例えばグルコース、ラクトースなど）、抗菌剤などの防腐剤、再構成補助剤、着色剤、生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水など）、および緩衝液を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において知られている様々な材料を含む。
「提供すること」は、本発明の実践のための必要とされる物品または物品のセットまたは方法を供給する、個人が実施する活動または活動のセットを意味する。活動または活動のセットは、自身によって直接的または間接的のいずれかで取られ得る。
【００５４】
「急速な溶媒蒸発」は、合成ナノキャリア配合プロセスの一部として使用されるとき、安定した過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノキャリアをもたらし得るいずれの溶媒蒸発ステップをも指す。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、かかるステップは、本明細書に提供されるとおりの疎水性ポリエステルキャリア材料とラパマイシンとを組み合わせられている、少なくとも９８％の溶媒（ジクロロメタンなど）が、４５分以内に蒸発する場合である。本明細書に提供される方法のいずれか１つの他の態様において、かかるステップは、本明細書に提供されるとおりの疎水性ポリエステルキャリア材料とラパマイシンとを組み合わせられている、少なくとも９０％の溶媒が、３０分以内に蒸発する場合である。本明細書に提供される方法のいずれか１つのさらなる他の態様において、かかるステップは、本明細書に提供されるとおりの疎水性ポリエステルキャリア材料とラパマイシンとを組み合わせられている、少なくとも９０％の溶媒が、１５分以内に蒸発する場合である。
【００５５】
合成ナノキャリアの形成において、かかるステップを使用する、かかるステップおよびプロセスの例は、例において本明細書に提供されている。合成ナノキャリアを配合し、かつ、溶媒蒸発の１以上のステップを含み得るプロセスは、エマルションプロセス（二重エマルションプロセス）、ナノ沈殿(nanoprecipitation)、噴霧乾燥、ロータ系(rotor systems)および超臨界流体プロセス（超臨界ＣＯ２など）を含む。別の例として、プロセスは、冷凍粉砕を含むものであり得る。例えば、過飽和をもたらしたであろう量のラパマイシンは、溶媒によりバルクのポリマーに溶解し得、そして溶媒が蒸発する。次いで、その結果得られた材料は粉砕されて、所望のサイズの合成ナノキャリアが生産され得る。さらなる他のプロセスは、当業者に知られているであろう。
【００５６】
「飽和限度」は、本明細書に使用されるとおり、溶媒が、より多くの溶質を溶解または吸収すると予測されない点である。追加の溶質が、飽和限度を超えて溶媒へ加えられる場合、別個の相（例として沈殿）が現れるときがある。特定の条件下の溶媒における溶質の飽和限度は、溶質の溶解度に基づき計算されてもよい。いくつかの態様において、飽和限度は、固相の飽和限度を指し得る。例えば、固体は、２以上の構成要素の均一な混合物であって、材料の特定の比率を上回る（すなわち飽和限度）前記混合物からの固化によって形成され得、分子的に均質な相の形成能は、通常のまたは平衡の条件下で超過されていることがある。合成ナノキャリアにおけるラパマイシンの飽和限度を決定することの例は、例において見出され得る。その飽和限度を上回るラパマイシンを指すとき、ラパマイシン（溶質）の量は、疎水性ポリエステルキャリア材料または合成ナノキャリア組成物（溶媒）に分散されることが予測されるであろうラパマイシンの量を上回る。このラパマイシンの飽和限度を決定するための配合は、下の例において見出され得る。
【００５７】
「溶媒」は、本明細書に提供されるとおりの合成ナノキャリアの構成要素のいずれか１以上などの溶質を溶解し得る物質を指す。いくつかの態様において、溶媒は、エマルションプロセス（例として二重エマルションプロセス）などにおける合成ナノキャリアの形成に有用である。かかる溶媒の例は、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、およびプロピレンカルボナートを含む。例はまた、低水溶性の有機溶媒と、アセトン、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ホルムアミドなどの水混和性の溶媒との組み合わせである溶媒混合物も含む。さらなる例は当業者に知られているであろう。
【００５８】
「対象」は、ヒトおよび霊長類などの温血哺乳動物；鳥類；ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマおよびブタなどの家庭内で飼育された動物または家畜；マウス、ラットおよびモルモットなどの実験動物；魚類；爬虫類；動物園の動物および野生動物；および同種のものを含む動物を意味する。
【００５９】
「過飽和」は、平衡条件下でそれに溶解され得るより多くの溶質（例としてラパマイシン）を含有する組成物（例として合成ナノキャリア組成物）を指す。換言すると、過飽和濃度をもつ組成物は、飽和の濃度を超える濃度を有する。いくつかの態様において、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料（例として配合プロセスの水相において、単独でまたは溶媒と組み合わせて）におけるその飽和限度を上回り得る。組成物におけるラパマイシンの量は、当該技術分野において知られているいずれの方法、例えば、組成物における分子の濃度を決定すること、および、その濃度を予想される飽和濃度と比較すること（例えば、プロセス、材料および数量などの詳細が、ラパマイシンの過飽和のレベルを計算するために使用され得る例を参照）、によっても過飽和であるように決定されてもよい。
【００６０】
ラパマイシンが過飽和量であるか否かを決定するための他の方法は、流延成形(film casting)、Ｘ線散乱および電子顕微鏡を含む。電子顕微鏡の形態は、これらに限定されないが、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および低温の(cryogenic)透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）を含む。過飽和はまた、合成ナノキャリアの形成の間の物理的観察によっても決定されてもよく、ここで、揮発性有機溶媒がほぼ完全に蒸発したとき、疎水性ポリエステルキャリア材料およびラパマイシンを含有する混濁エマルションが、より透き通ってくるであろうし、また、過飽和量のラパマイシンが凝集してナノキャリア配合物になるにつれて、溶液がより混濁するようになる。
【００６１】
別の例として、合成ナノキャリア材料は、アセトン、ジクロロメタン、酢酸エチルなどの揮発性有機溶媒中へ分散され得、それによって、材料のすべてが溶解して透き通った溶液を形成し、スライドガラス上へ置かれて乾燥される。過飽和である場合、ラパマイシンは、疎水性ポリエステルキャリア材料から分離する。過飽和を決定するために使用されてもよいさらなる別の方法は、ラパマイシンの存在量を定量化するため、抽出に続くＨＰＬＣ法によって試料の一部を分析することを伴い得る。キャリア材料は、プロトンＮＭＲもしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳなどの他の直交法(other orthogonal methods)により同定されても、および／または、ＨＰＬＣにより同定された時点で定量化されてもよい、次いで、実験的に、疎水性ポリエステルキャリア材料におけるラパマイシンの飽和限度を決定することができる。
【００６２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される組成物のいずれか１つは、過飽和量で、例えば過飽和濃度にて、ラパマイシンを含み得る。いくつかの態様において、組成物は、ラパマイシンが、組成物の飽和限度を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはそれ以上で超えるほどの過飽和である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアにおけるラパマイシンの過飽和量は、≧６であるが≦５０重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つの他の態様において、かかる量は、≧６であるが≦４５、≧６であるが≦４０、≧６であるが≦３５、≧６であるが≦３０、≧６であるが≦２５、≧６であるが≦２０、≧６であるが≦１５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つの他の態様において、かかる量は、≧７であるが≦４５、≧７であるが≦４０、≧７であるが≦３５、≧７であるが≦３０、≧７であるが≦２５、≧７であるが≦２０、≧７であるが≦１５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのさらなる他の態様において、かかる量は、≧８であるが≦２４重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、かかる量は、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）またはそれ以上である。
【００６３】
過飽和量のラパマイシンは、好ましくは「安定して」いる。合成ナノキャリアが、いくつかの態様において懸濁液であるとき、かかる量を保持する場合、過飽和量のラパマイシンは、合成ナノキャリアにおいて安定している。好ましくは、安定した過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアは、最初に滅菌濾過可能であり、最初に滅菌濾過可能であることは、合成ナノキャリアにおける過飽和量のラパマイシンの安定性の試験の代わりになることもある。いくつかの態様において、合成ナノキャリアにおける過飽和量のラパマイシンは、合成ナノキャリアが、in vivoで投与されたときの有益な抗原特異的寛容効果のために使用され得るとき、安定しているといえる。ラパマイシンの過飽和量をもつ合成ナノキャリアの例は、例を通して見出され得る。過飽和量のラパマイシンが合成ナノキャリアにおいて安定化され得る方法は多数ある。かかる方法は、合成ナノキャリアの生産における、１０以下であるＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の使用、急速な溶媒蒸発の１以上のステップを含む合成ナノキャリアの形成方法、ならびに、固体溶融および／または冷却射出成形を含み得る合成ナノキャリアの形成方法、を含む。
【００６４】
「界面活性剤」は、２つの液体間または液体と固体との間の表面張力を低下させ得る化合物を指す。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および分散剤として働いていもよく、本明細書に提供されるとおり合成ナノキャリアの形成において使用され得る。いくつかの態様において、界面活性剤は、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤である。
【００６５】
「合成ナノキャリア（単数または複数）」は、天然で見出されていない、５ミクロン以下のサイズである少なくとも１つの寸法を保有する、分離した物体を意味する。本明細書に提供されるとおり、合成ナノキャリアは、疎水性ポリエステルキャリア材料を含む。結果的に、合成ナノキャリアは、疎水性ポリエステルのナノ粒子を含む合成ナノキャリアであり得るが、これに限定されない。合成ナノキャリアは、球状、立方状、錐体状、長方形（楕円）状、円柱状、ドーナツ状などを含むが、これらに限定されない様々な異なる形状であり得る。本発明に従う合成ナノキャリアは、１以上の表面を含む。態様において、合成ナノキャリアは、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７より大きい、または１：１０より大きいアスペクト比を保有してもよい。
【００６６】
約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有する本発明に従う合成ナノキャリアは、補体を活性化するヒドロキシル基をもつ表面を含まないか、または代替的に、本質的に、補体を活性化するヒドロキシル基ではない部分からなる、表面を含む。好ましい態様において、約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有する本発明に従う合成ナノキャリアは、補体を実質的に活性化する表面を含まないか、または代替的に、本質的に、補体を実質的に活性化しない部分からなる、表面を含む。より好ましい態様において、約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有する本発明に従う合成ナノキャリアは、補体を活性化する表面を含まないか、または代替的に、本質的に、補体を活性化しない部分からなる、表面を含む。
【００６７】
「全固体」は、合成ナノキャリアの組成物または懸濁液に含有される全構成要素の総重量を指す。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、全固体の量は、懸濁液のｍＬあたりの乾燥ナノキャリアの総質量として決定される。これは、重量測定法によって決定され得る。
「重量％」は、１つの重量の別の重量に対する、１００倍の比率を指す。例えば、重量％は、１つの構成要素の重量の別のものに対する、１００倍の比率、または１つの構成要素の、１より多い構成要素の総重量に対する、１００倍の比率であり得る。一般に、重量％は、合成ナノキャリアの集団にわたる平均、または組成物もしくは懸濁液における合成ナノキャリアにわたる平均として測定される。
【００６８】
Ｃ．組成物および関連の方法
本明細書に提供されるのは、疎水性ポリエステルキャリア材料および安定した過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノキャリアを含む組成物、および関連の方法である。かかる組成物および関連の方法は、抗原特異的寛容効果をもたらし得る。よって、提供される組成物および関連の方法は、抗原特異的免疫寛容を必要とするいずれの対象においても使用され得る。上述のとおり、合成ナノキャリアにおける過飽和量のラパマイシンを送達することが、より持続的な抗原特異的免疫寛容を提供し得ることが見出された。しかしながら、過飽和量のラパマイシンは一般に安定しないこともまた、発見されている。合成ナノキャリアにおいてラパマイシンを安定化させることは、形成の間の合成ナノキャリアにおいて適切な量を保持するのに役立ち得、その量は、効果的であることが示されている。合成ナノキャリアにおける安定化された過飽和量のラパマイシンはまた、最初に滅菌濾過可能であるというさらなる有益な効果を有する合成ナノキャリア組成物をももたらす。
【００６９】
驚くべきことに、ある界面活性剤、１０以下の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値をもつ非イオン界面活性剤が、疎水性ポリエステルキャリア材料をもつ合成ナノキャリアにおけるラパマイシンを安定化すること、および、改善された最初の滅菌濾過可能性を可能にすることが見出された。例に示されるとおり、０．２２μｍフィルターを最初に通過したとき、ラパマイシンを含む合成ナノキャリア配合物の増加した処理量は、SPAN 40などの界面活性剤が合成ナノキャリア配合物に組み込まれたとき、見出された。例においてもまた示されるとおり、１０以下の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値をもつ非イオン界面活性剤とともに配合された多数のかかる合成ナノキャリアはまた、対象における持続的な抗原特異的寛容を提供することも可能であった。
【００７０】
本明細書に提供されるとおりの合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の最適化された量もまた発見された。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．０１であるが≦２０重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．１であるが≦１５重量％、≧０．５であるが≦１３重量％、≧１であるが≦９または１０重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。
【００７１】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つの他の態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．０１であるが≦１７重量％、≧０．０１であるが≦１５重量％、≧０．０１であるが≦１３重量％、≧０．０１であるが≦１２重量％、≧０．０１であるが≦１１重量％、≧０．０１であるが≦１０重量％、≧０．０１であるが≦９重量％、≧０．０１であるが≦８重量％、≧０．０１であるが≦７重量％、≧０．０１であるが≦６重量％、≧０．０１であるが≦５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）などである。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのなお他の態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．１であるが≦１５重量％、≧０．１であるが≦１４重量％、≧０．１であるが≦１３重量％、≧０．１であるが≦１２重量％、≧０．１であるが≦１１重量％、≧０．１であるが≦１０重量％、≧０．１であるが≦９重量％、≧０．１であるが≦８重量％、≧０．１であるが≦７重量％、≧０．１であるが≦６重量％、≧０．１であるが≦５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）などである。
【００７２】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのなお他の態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧０．５であるが≦１５重量％、≧０．５であるが≦１４重量％、≧０．５であるが≦１３重量％、≧０．５であるが≦１２重量％、≧０．５であるが≦１１重量％、≧０．５であるが≦１０重量％、≧０．５であるが≦９重量％、≧０．５であるが≦８重量％、≧０．５であるが≦７重量％、≧０．５であるが≦６重量％、≧０．５であるが≦５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）などである。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのなお他の態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧１であるが≦９重量％、≧１であるが≦８重量％、≧１であるが≦７重量％、≧１であるが≦６重量％、≧１であるが≦５重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）などである。
【００７３】
本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのなお他の態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、≧５であるが≦１５重量％、≧５であるが≦１４重量％、≧５であるが≦１３重量％、≧５であるが≦１２重量％、≧５であるが≦１１重量％、≧５であるが≦１０重量％、≧５であるが≦９重量％、≧５であるが≦８重量％、≧５であるが≦７重量％、≧５であるが≦６重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）などである。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアにおける１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０重量％（１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤／疎水性ポリエステルキャリア材料）である。本明細書に提供されるＨＬＢ値のいずれか１つは、GriffinまたはDavieの方法を使用して決定されてもよい。
【００７４】
同様に、急速な溶媒蒸発を利用する合成ナノキャリアを生産するための方法もまた、安定した過飽和量でラパマイシンを含む合成ナノキャリアをもたらし得ることもまた見出されている。かかる蒸発が急速に生じるとき、ラパマイシンは、合成ナノキャリアに安定して組み込まれて、本明細書に記載されるような有益な結果に繋がり得る。例えば、例において実証されているとおり、かかるプロセスにより生産される合成ナノキャリアは、最初に滅菌濾過可能であり、in vivoで投与されたときに有益な免疫効果が達成される。かかる合成ナノキャリアを生産するための具体的な方法は、例に提供されている。かかる方法の他の例は、１以上の溶媒蒸発ステップを有するいずれのプロセスも含む。溶媒蒸発の１以上のステップを含み得るプロセスは、エマルションプロセス（二重エマルションプロセスなど）、ナノ沈殿、噴霧乾燥および超臨界流体プロセスを含む。さらなる他のプロセスは、当業者に明らかであろう。
【００７５】
さらに、本明細書に提供される合成ナノキャリアはまた、固体溶融および冷却射出成形を含むプロセスを使用しても生産されてもよい。さらなる他のプロセスは当業者に知られているであろう。
本明細書に提供されるとおり、合成ナノキャリアにおけるラパマイシンの量は、その量が、合成ナノキャリアが対象へ投与されたときに効果的な結果（例として持続的な抗原特異的寛容）をもたらすことができるように、最適化および安定化され得る。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、安定した過飽和量でラパマイシンを含む合成ナノキャリアは、≧６であるが≦５０重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）を含む。
【００７６】
本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、≧６であるが≦４５、≧６であるが≦４０、≧６であるが≦３５、≧６であるが≦３０、≧６であるが≦２５、≧６であるが≦２０、≧６であるが≦１５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）含む。本明細書に提供される組成物のいずれか１つの他の態様において、合成ナノキャリアは、≧７であるが≦４５、≧７であるが≦４０、≧７であるが≦３５、≧７であるが≦３０、≧７であるが≦２５、≧７であるが≦２０、≧７であるが≦１５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）含む。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのさらなる他の態様において、合成ナノキャリアは、≧８であるが≦２４重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）含む。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４５重量％（ラパマイシン／疎水性ポリエステルキャリア材料）またはそれ以上で含む。
【００７７】
さらに、合成ナノキャリア組成物における疎水性ポリエステルキャリア材料の最適化された量もまた決定された。好ましくは、本明細書に提供される組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリア組成物における疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、５〜９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）である。本明細書に提供される組成物のいずれか１つの他の態様において、合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、１０〜９５、１５〜９０、２０〜９０、２５〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）などである。本明細書に提供される組成物のいずれか１つのなお他の態様において、合成ナノキャリアにおける疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５重量％（疎水性ポリエステルキャリア材料／全固体）の量である。
【００７８】
本明細書に提供される組成物のいずれか１つについて本明細書に列挙されたとおりの構成要素または材料の量は、当業者に知られている方法またはさもなくば本明細書に提供される方法を使用して決定され得る。例えば、１０以下のＨＬＢ値をもつ非イオン界面活性剤の量は、抽出に続くＨＰＬＣ法による定量によって測定され得る。疎水性ポリエステルキャリア材料の量は、ＨＰＬＣを使用して決定され得る。かかる量の決定は、いくつかの態様において、プロトンＮＭＲ、またはＭＡＬＤＩ−ＭＳなどの他の直交法の使用に続き、疎水性ポリエステルキャリア材料の同一性を決定してもよい。類似の方法が、本明細書に提供される組成物のいずれか１つにおけるラパマイシンの量を決定するために使用され得る。いくつかの態様において、ラパマイシンの量は、ＨＰＬＣを使用して決定される。
【００７９】
構成要素または材料の量を決定するための方法のさらなる例は、例などの、本明細書の他で提供されるとおりである。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つについて、構成要素または材料の量はまた、ナノキャリア配合物の処方された重量に基づいても決定され得る。結果的に、本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、本明細書に提供される構成要素のいずれか１つの量は、合成ナノキャリアの配合の間の水相における構成要素のものである。本明細書に提供される組成物または方法のいずれか１つのいくつかの態様において、構成要素のいずれか１つの量は、生産された合成ナノキャリア組成物における構成要素、および、配合プロセスの結果のものである。
【００８０】
本明細書に提供されるとおりの合成ナノキャリアは、疎水性ポリエステルキャリア材料を含む。かかる材料はポリエステルを含み、それは、本明細書において「ＰＬＧＡ」として集合的に言及される、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）などの乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー；ならびに、本明細書において「ＰＧＡ」として言及される、グリコール酸単位を含むホモポリマー、および本明細書において「ＰＬＡ」として集合的に言及される、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチドおよびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドなどの乳酸単位を含む。いくつかの態様において、例示的なポリエステルは、例えば、ポリヒドロキシ酸；ＰＥＧコポリマー、およびラクチドとグリコリドとのコポリマー（例として、ＰＬＡ−ＰＥＧコポリマー、ＰＧＡ−ＰＥＧコポリマー、ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマー、およびそれらの誘導体）を含む。いくつかの態様において、ポリエステルは、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）−ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、およびそれらの誘導体を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、ポリエステルは、ＰＬＧＡであってもよい。ＰＬＧＡは、乳酸およびグリコール酸の生体適合性および生分解性のコポリマーであり、ＰＬＧＡの多様な形態が、乳酸：グリコール酸の比率によって特徴付けられる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、またはＤ，Ｌ−乳酸であり得る。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸：グリコール酸の比率を変えることによって調節され得る。いくつかの態様において、本発明に従って使用されるＰＬＧＡは、およそ８５：１５、およそ７５：２５、およそ６０：４０、およそ５０：５０、およそ４０：６０、およそ２５：７５、またはおよそ１５：８５の、乳酸：グリコール酸の比率によって特徴付けられる。
【００８２】
本明細書に提供されるとおりの疎水性ポリエステルキャリア材料は、１以上の非ポリエステル疎水性ポリマーもしくはそれらの単位、および／または、疎水性ではないポリマーもしくはそれらの単位を含んでもよいが、ただし、全体的に見て疎水性ポリエステルキャリア材料は疎水性であり、１以上のポリエステルまたはそれらの単位を含有するものとする。
【００８３】
本明細書に提供されるとおりの疎水性ポリエステルキャリア材料は、非メトキシ末端の、pluronicポリマーである１以上のポリマー、またはそれらの単位を含んでもよい。「非メトキシ末端のポリマー」は、メトキシ以外の部分で終わる少なくとも１つの末端を有するポリマーを意味する。いくつかの態様において、ポリマーは、メトキシ以外の部分で終わる少なくとも２つの末端を有する。他の態様において、ポリマーは、メトキシで終わる末端を有しない。「非メトキシ末端の、pluronicポリマー」は、両末端にメトキシをもつ直鎖状pluronicポリマー以外のポリマーを意味する。
【００８４】
疎水性ポリエステルキャリア材料は、いくつかの態様において、ポリヒドロキシアルカノアート、ポリアミド、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアクリラート、ポリカルボナート、ポリスチレン、シリコーン、フルオロポリマー、またはそれらの単位を含んでもよい。本明細書に提供される疎水性ポリエステルキャリア材料において含まれていてもよいポリマーのさらなる例は、ポリカルボナート、ポリアミド、またはポリエーテル、またはそれらの単位を含む。他の態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはそれらの単位を含んでもよい。
【００８５】
いくつかの態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料が生分解性であるポリマーを含むことが好ましい。したがって、かかる態様において、疎水性ポリエステルキャリア材料のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）またはポリプロピレングリコールなどのポリエーテルまたはそれらの単位を含んでいてもよい。加えて、ポリマーは、ポリエーテルおよび生分解性ポリマーのブロックコポリマーを含んでいてもよく、これにより、ポリマーは生分解性である。他の態様において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）またはポリプロピレングリコールまたはそれらの単位などの、ポリエーテルまたはそれらの単位を単独で含まない。
【００８６】
本発明における使用に好適なポリマーの他の例は、ポリエチレン、ポリカルボナート（例として、ポリ（１，３−ジオキサン−２オン））、ポリ無水物（例として、ポリ（セバシン無水物））、ポリプロピルフメラート、ポリアミド（例として、ポリカプロラクタム）、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル（例として、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酸（例として、ポリ（β−ヒドロキシアルカノアート）））、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、およびポリアミン、ポリリシン、ポリリシン−ＰＥＧコポリマー、およびポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンイミン）−ＰＥＧコポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
疎水性ポリエステルキャリア材料に含まれていてもよいポリマーのなお他の例は、例えば、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリラートコポリマー、エトキシエチルメタクリラート、シアノエチルメタクリラート、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（メタクリル酸無水物）、メチルメタクリラート、ポリメタクリラート、ポリ（メチルメタクリラート）コポリマー、ポリアクリルアミド、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、グリシジルメタクリラートコポリマー、ポリシアノアクリラート、および前記ポリマーの１以上を含む組み合わせなどのアクリルポリマーを含む。
【００８８】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアのポリマーは、結び付いてポリマーマトリクスを形成する。多種多様なポリマーおよびそれからポリマーマトリクスを形成するための方法が従来知られている。いくつかの態様において、疎水性ポリエステルマトリクスを含む合成ナノキャリアは、合成ナノキャリア内で疎水性の環境を生成する。
いくつかの態様において、ポリマーは、１以上の部分および／または官能基によって改変されてもよい。様々な部分または官能基は、本発明に従って使用され得る。いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、および／または、多糖類に由来する非環式ポリアセタールにより、改変されてもよい（Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301）。ある態様は、Gref et al.のＵＳ特許第5543158号、またはVon Andrian et al.によるＷＯ公報WO2009/051837の一般の教示を使用してなされてもよい。
【００８９】
いくつかの態様において、ポリマーは、脂質または脂肪酸基で改変されてもよい。いくつかの態様において、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸の１以上であってもよい。いくつかの態様において、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはエルカ酸の１以上であってもよい。
いくつかの態様において、ポリマーは生分解性であることが好ましい。いくつかの態様において、本発明に従うポリマーは、21 C.F.R. § 177.2600の下で米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってヒトにおける使用について承認されたポリマーを含む。
【００９０】
ポリマーは、天然または非天然（合成）ポリマーであってもよい。ポリマーは、２以上の単量体を含むホモポリマーまたはコポリマーであってもよい。配列に関して、コポリマーはランダム、ブロックであってもよい、またはランダムおよびブロック配列の組み合わせを含んでもよい。典型的には、本発明に従うポリマーは、有機ポリマーである。
【００９１】
いくつかの態様において、ポリマーは、直鎖状または分枝状のポリマーであり得る。いくつかの態様において、ポリマーは、デンドリマーであり得る。いくつかの態様において、ポリマーは、相互に実質的に架橋され得る。いくつかの態様において、ポリマーは、実質的に架橋のないものであり得る。いくつかの態様において、ポリマーは、本発明に従って、架橋するステップを経ることなく使用され得る。合成ナノキャリアが、前記および他のポリマーのいずれかの、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ブレンド、混合物、および／または、付加物を含んでもよいことがさらに理解されるべきである。当業者は、本明細書に列挙されたポリマーが、ただし当該ポリマーが所望の基準を満たすならば、本発明に従って使用され得る、例示的であるが包括的ではないポリマーのリストを表すことを認識するであろう。
【００９２】
これらのおよび他のポリマーの特性およびそれらを調製するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＵＳ特許6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；および4,946,929；Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480；Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460；Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94； Langer, 1999, J.Control. Release, 62:7；およびUhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181を参照）。より一般に、ある好適なポリマーを合成するための様々な方法は、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980；Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004；Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981；Deming et al., 1997, Nature, 390:386；およびＵＳ特許6,506,577、6,632,922、6,686,446、および6,818,732において記載されている。
【００９３】
多種多様な合成ナノキャリアは、本発明に従って使用され得る。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、球体または球状である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、平面またはプレート形状である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、立方体または立方体状である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、楕円または長円である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、円柱、円錐または角錐である。
【００９４】
いくつかの態様において、各合成ナノキャリアが類似の特性を有するように、サイズまたは形状に関して相対的に均一である合成ナノキャリアの集団を使用することが望ましい。例えば、合成ナノキャリアの総数に基づいて、合成ナノキャリアの少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、合成ナノキャリアの平均直径または平均寸法の５％、１０％、または２０％以内に入る最小寸法または最大寸法を有していてもよい。
【００９５】
本発明に従う組成物は、防腐剤、緩衝液、生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容可能な添加剤と組み合わせて要素を含み得る。組成物は、有用な剤形を作り上げるための従来の医薬の製造および調合技術を使用して作製されてもよい。態様において、合成ナノキャリアを含む組成物などのものは、防腐剤と一緒に注射するための滅菌生理食塩水溶液において懸濁されている。
【００９６】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるとおりの合成ナノキャリアのいずれの構成要素は、単離されていてもよい。単離されていることは、その本来の環境とは別個であり、その同定または使用を容認するのに充分な分量で存在する要素を指す。これは、例えば、要素がクロマトグラフィーまたは電気泳動法によって精製されてもよいことを意味する。単離されている要素は、実質的に純粋であってもよいが、実質的に純粋である必要はない。単離されている要素は、医薬調製物において薬学的に許容可能な添加剤とともに混和されてもよいため、要素は調製物のわずかな重量パーセントしか含んでいなくてもよい。要素は、それにもかかわらず、生体システムに関連してもよい物質から分離されている、すなわち、他の脂質またはタンパク質から単離されている点において、単離されている。本明細書に提供される要素のいずれも、単離され、組成物に含まれてもよく、または単離された形態で方法において使用されてもよい。
【００９７】
Ｄ．組成物を作製し、使用する方法および関連の方法
合成ナノキャリアは、当該技術分野において知られている多種多様な方法を使用して調製されてもよい。例えば、合成ナノキャリアは、ナノ沈殿、流体チャネルを使用する収束流(flow focusing)、噴霧乾燥、一重および二重エマルション溶媒蒸発、溶媒抽出、相分離、粉砕（凍結粉砕を含む）、超臨界流体（超臨界二酸化炭素など）処理、微細エマルション手順、微細加工、ナノ加工、犠牲層、単純および複雑なコアセルベーション、および当業者に周知の他の方法などの方法によって形成され得る。
【００９８】
代替的にまたは加えて、単分散の半導体、伝導性、磁性、有機、および他のナノ材料のための、水性および有機溶媒の合成が記載されている（Pellegrino et al., 2005, 小, 1:48；Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545；およびTrindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843）。追加の方法は、文献（例として、Doubrow, Ed., “Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,” CRC Press, Boca Raton, 1992；Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13；Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275；およびMathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755；ＵＳ特許5578325および6007845；P. Paolicelli et al., “Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles” Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)を参照）において記載されている。
【００９９】
様々な材料が、C. Astete et al., “Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles” J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006)；K. Avgoustakis “Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery” Current Drug Delivery 1:321-333  (2004)；C. Reis et al., “Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles” Nanomedicine 2:8- 21 (2006)；P. Paolicelli et al., “Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles” Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)を含むが、これらに限定されない様々な方法を使用して、所望するとおりに合成ナノキャリア中へ封入されてもよい。2003年10月14日に発行されたUngerの合衆国特許6,632,671において開示された方法を限定することなく含む、材料を合成ナノキャリア中へ封入するのに好適な他の方法が使用され得る。
【０１００】
ある態様において、合成ナノキャリアはナノ沈殿プロセスまたは噴霧乾燥によって調製される。合成ナノキャリアを調製することに使用される条件は、所望のサイズまたは特性（例として、疎水性、親水性、外部のモルホロジー(external morphology)、「粘り」、形状など）の粒子を生み出すために変えられもよい。合成ナノキャリアを調製する方法および使用される条件（例として、溶媒、温度、濃度、空気流量など）は、合成ナノキャリアおよび／またはキャリアマトリクスの組成物において含まれる材料に依存してもよい。
上の方法のいずれかによって調製される合成ナノキャリアが、所望の範囲外のサイズ範囲を有する場合、かかる合成ナノキャリアは、例えばふるいを使用して、大きさが決められ得る。
態様において、合成ナノキャリアは、同じビヒクルまたは送達システムにおいて混和することによって抗原または他の組成物と組み合わされ得る。
【０１０１】
本明細書に提供される組成物は、無機または有機緩衝液（例として、リン酸、炭酸、酢酸またはクエン酸のナトリウムまたはカリウム塩）およびｐＨ調節剤（例として、塩酸、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、クエン酸または酢酸の塩、アミノ酸およびそれらの塩）、抗酸化剤（例として、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール）、界面活性剤（例として、polysorbate 20、polysorbate 80、ポリオキシエチレン９〜１０ノニルフェノール、デスオキシコール酸ナトリウム）、溶液のおよび／または低温／凍結(cryo/lyo)の安定剤（例として、スクロース、ラクトース、マンニトール、トレハロース）、浸透圧調節剤（例として、塩または糖）、抗細菌剤（例として、安息香酸、フェノール、ゲンタマイシン）、抗発泡剤（例として、ポリジメチルシロゾン）、防腐剤（例として、チメロサール、２−フェノキシエタノール、ＥＤＴＡ）、ポリマー安定剤および粘性調節剤（例として、ポリビニルピロリドン、ポロキサマー４８８、カルボキシメチルセルロース）および共溶媒（例として、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール）を含んでもよい。
【０１０２】
本発明に従う組成物は、薬学的に許容可能な添加剤を含んでいてもよい。組成物は、有用な剤形を作り上げるための、従来の薬学的な製造および調合技術を使用して作製されてもよい。本発明を実践するのにおける使用に好適な技術は、Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.；およびPharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstoneから見出されるものであってもよい。態様において、組成物は、防腐剤と一緒に注射用滅菌生理食塩水溶液に懸濁される。
【０１０３】
本発明の組成物は、いずれの好適なやり方でも作製され得ること、および、本発明は、本明細書に記載の方法を使用して生産され得る組成物に何ら限定されないことが理解されるべきである。適切な製造の方法の選択は、特定の要素の特性が関連していることに注意する必要があり得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、組成物は、滅菌条件の下で製造されるか、または、最初にもしくは最後に滅菌される。その結果得られた組成物が滅菌されて非感染性であることが、これによって確保され得、よって非滅菌の組成物と比較されたとき安全性が改善される。とくに組成物を与えられている対象が免疫欠如を有するか、感染症を患っているか、および／または、感染症を起こしやすいとき、これによって貴重な安全対策が提供される。いくつかの態様において、組成物は、長期間活性を失わない配合ストラテジー(the formulation strategy)に応じて、凍結乾燥されて、懸濁状態でまたは凍結乾燥粉末として保管されてもよい。
【０１０５】
本発明に従う投与は、皮内、筋肉内、皮下、静脈内および腹腔内の経路を含むがこれらに限定されない多様な経路によってもよい。本明細書において言及される組成物は、従来の方法を使用して投与のために製造および調製されてもよい。
【０１０６】
本発明の組成物は、本明細書中の他にも記載の有効な量などの有効な量で投与され得る。剤形の用量は、本発明に従う、様々な量の要素を含有してもよい。本発明の剤形に存在する要素の量は、それらの性質、成し遂げられるべき治療的有用性、および他のかかるパラメータに従って変動され得る。態様において、用量決定試験(dose ranging studies)は、剤形に存在する最適治療量を定めるために行われ得る。態様において、要素は、対象への投与の際に所望の効果および／または軽減された免疫応答を生み出させるのに有効な量で剤形に存在する。対象において従来の用量決定試験および技術を使用して所望の結果を達成するための量を決定することは可能であり得る。本発明の剤形は、多様な頻度にて投与されてもよい。態様において、本明細書に提供される組成物の少なくとも１回の投与は、薬理学的に妥当な応答を生み出させるのに十分である。
【０１０７】
本開示の別の側面は、キットに関する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に提供される組成物のいずれか１つを含む。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットは、安定した過飽和量ラパマイシンを含む合成ナノキャリアを含む。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアはまた、最初に滅菌濾過可能でもある。提供されるキットのいずれか１つの他の態様において、キットは、本明細書に提供される量のいずれか１つにおける疎水性ポリエステルキャリア材料および本明細書に提供される量のいずれか１つにおけるラパマイシンを含む。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、かかるキットはさらに、本明細書に提供される量のいずれか１つにおいて、１０以下の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値をもつ非イオン界面活性剤を含む。
【０１０８】
提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットはさらに、抗原を含む。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物またはそれらの要素は、キットにおける別個の容器中にまたは同じ容器中に含有され得る。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、容器は、バイアルまたはアンプルである。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物またはそれらの要素は、組成物または要素が以降のある時点にて容器へ加えられてもよいように、容器とは別個の溶液中に含有される。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物またはそれらの要素は、それらが以降のある時点にて再構成されてもよいように、別個の容器または同じ容器の各々において凍結乾燥された形態である。
【０１０９】
提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットはさらに、再構成、混合、投与などのための説明書を含む。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、説明書は、本明細書に記載の方法の説明を含む。説明書は、例として印刷された挿入物またはラベルなどのいずれか好適な形態であり得る。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットはさらに、合成ナノキャリアをin vivoで対象へ送達し得る１以上のシリンジまたは他のデバイス（単数または複数）を含む。
【０１１０】
例
例１−過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリア
ポリマーであるＰＬＧＡ（３：１  ラクチド：グリコリド、固有粘度  ０．３９ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａのＰＥＧブロック、固有粘度  ０．３６ｄＬ／ｇ）ならびに剤であるラパマイシン（ＲＡＰＡ）を含有するナノキャリア組成物を、油中水エマルション蒸発法を使用して合成した。有機相を、ポリマーおよびＲＡＰＡをジクロロメタンに溶解することによって形成した。エマルションを、界面活性剤であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有する水相において有機相を均質化することによって、形成した。次いでエマルションを、より大量の水性緩衝液と組み合わせ、混合して溶媒を蒸発させた。ＲＡＰＡ含量が増えるにつれて組成物が系のＲＡＰＡ飽和限度を越えられるように、種々の組成物においてＲＡＰＡ含量を変動させた。組成物における飽和限度でのＲＡＰＡ含量を、水相および分散されたナノキャリア相におけるＲＡＰＡの溶解度を使用して計算した。水相における主な溶質としてのＰＶＡを含有する組成物において、水相におけるＲＡＰＡの溶解度がＰＶＡ濃度と比例することを見出し、これによって、ＲＡＰＡが、溶解したＰＶＡに対し１：１２５の質量比率にて溶解できるようになった。
【０１１１】
ナノキャリアポリマーとして記載されたＰＬＧＡおよびＰＬＡ−ＰＥＧを含有する組成物において、分散されたナノキャリア相におけるＲＡＰＡ溶解度が７．２％（ｗｔ／ｗｔ）であったことを見出した。以下の式を、組成物について飽和限度でのＲＡＰＡ含量を計算するために使用してもよい：
ＲＡＰＡ含量＝Ｖ（０．００８ｃＰＶＡ＋０．０７２ｃｐｏｌ）
ここで、ｃＰＶＡは、ＰＶＡの質量濃度であり、ｃｐｏｌは、組み合わせられたポリマーの質量濃度であり、Ｖは、蒸発終わりのナノキャリア懸濁液の体積である。
【表１】
2017537081.tif 000003
【０１１２】
１、２および３について、ＲＡＰＡの６０％が一貫して回収されない。これは、水相と有機相との間の未飽和平衡型(a sub-saturation equilibrium regime)であることを示す。より多い量のＲＡＰＡを含有する残りのナノキャリアについて、６．８ｍｇのＲＡＰＡが一貫して回収されない。この一貫した絶対質量の損失は、系が、過飽和型にある（すなわち１以上の相において過飽和である）ことを示す。
【０１１３】
例２−過飽和ラパマイシンをもつ合成ナノキャリアは、抗体発生を排除または遅延する
ポリマーであるＰＬＧＡ（３：１  ラクチド：グリコリド、固有粘度  ０．３９ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａのＰＥＧブロック、固有粘度  ０．３６ｄＬ／ｇ）ならびに剤であるＲＡＰＡを含有するナノキャリア組成物を、例１に記載の油中水エマルション蒸発法を使用して合成した。ＲＡＰＡ含量が増えるにつれて組成物が系のＲＡＰＡ飽和限度を越えられるように、種々の組成物においてＲＡＰＡ含量を変動させた。
【０１１４】
【表２】
2017537081.tif 000004
【０１１５】
組成物の免疫寛容誘導能を査定するために、マウスに、共投与されるナノキャリアおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を毎週３回静脈内注射し、次いで毎週ＫＬＨのみでチャレンジした。次いでマウスの血清を、ＫＬＨチャレンジ後のＫＬＨに対する抗体について分析した。過飽和状態で作製され、かつ８％またはそれより高い最終ＲＡＰＡ負荷を有する組成物は、飽和にてまたはそれを下回って創出され、かつ５％またはそれより低い最終ＲＡＰＡ負荷を有する組成物より大きな程度で、ＫＬＨに対する抗体発生の欠如または遅延に繋がった。
【０１１６】
例３−過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリア
ポリマーであるＰＬＡ（固有粘度  ０．４１ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａのＰＥＧブロック、固有粘度  ０．５０ｄＬ／ｇ）ならびに剤であるＲＡＰＡを含有するナノキャリア組成物を、例１に記載の油中水エマルション蒸発法を使用して合成した。ＲＡＰＡ含量が増えるにつれて組成物が系のＲＡＰＡ飽和限度を越えられるように、種々の組成物においてＲＡＰＡ含量を変動させた。組成物について飽和限度でのＲＡＰＡ含量を、例１に記載の方法を使用して計算した。記載されたＰＬＧＡおよびＰＬＡ−ＰＥＧをナノキャリアポリマーとして含有する組成物において、分散されたナノキャリア相におけるＲＡＰＡ溶解度が８．４％（ｗｔ／ｗｔ）であったことを見出した。以下の式を、組成物について飽和限度でのＲＡＰＡ含量を計算するために使用してもよい：
ＲＡＰＡ含量＝Ｖ（０．００８ｃＰＶＡ＋０．０８４ｃｐｏｌ）
ここで、ｃＰＶＡは、ＰＶＡの質量濃度であり、ｃｐｏｌは、組み合わせられたポリマーの質量濃度であり、Ｖは、蒸発の終わりのナノキャリア懸濁液の体積である。すべてのナノキャリアのロットを、形成の終わりに、０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。
【０１１７】
【表３】
2017537081.tif 000005
【０１１８】
漸増量のＲＡＰＡをナノキャリア１２〜１５へ加えたにもかかわらず、ナノキャリアにおける最終ＲＡＰＡ含量は増えない一方、濾過処理量は低下する。これは、組成物がＲＡＰＡで過飽和にあったこと、ならびに、過剰のＲＡＰＡが洗浄および／または濾過の間に除去されたことを示す。
【０１１９】
例４−過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアは、飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアより大きな程度で、抗体生産を遅延する
ポリマーであるＰＬＡ（固有粘度  ０．４１ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａのＰＥＧブロック、固有粘度  ０．５０ｄＬ／ｇ）ならびに剤であるラパマイシン（ＲＡＰＡ）を含有するナノキャリア組成物を、油中水エマルション蒸発法を使用して合成した。１つの組成物が、系のＲＡＰＡ飽和限度にて作製され、また１つの組成物が、３３％の過飽和にて作製されるように、種々の組成物においてＲＡＰＡ含量を変動させた。各ケースにおいて、材料の半分を、０．２２μｍの滅菌フィルターを介して濾過し、残り半分は濾過しなかった。
【０１２０】
【表４】
2017537081.tif 000006
【０１２１】
組成物の免疫寛容誘導能を査定するために、マウスに、共投与されるナノキャリアおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を毎週３回静脈内注射し、次いで毎週ＫＬＨのみでチャレンジした。次いでマウスの血清を、ＫＬＨチャレンジ後のＫＬＨに対する抗体について分析した。過飽和状態で作製された組成物は、飽和にて創出された組成物より大きな程度で、ＫＬＨに対する抗体発生を遅延させた。その上、組成物が濾過されたかまたはされなかったかは、繰り返しのチャレンジ後の力価における遅延および低減によって明白であった。
【０１２２】
例５−より急速な溶媒蒸発および低ＨＬＢ界面活性剤は、最初に滅菌可能でもある、過飽和量のラパマイシンをもつ合成ナノキャリアをもたらす
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．０５ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88 (PVA)、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Cellgro PBS １×（ＰＢＳ）を、Corning Incorporated（One Riverfront Plaza Corning, NY 14831 USA）から購入した（品番 21-040-CV）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 １×（ＤＰＢＳ）を、Lonza（Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland）から購入した（製品コード 17-512Q）。ソルビタンモノパルミタートを、Croda International（300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837）から購入した（製品コード SPAN 40）。
【０１２３】
試料１について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ＰＬＡをジクロロメタンｍＬあたり１８．７５ｍｇにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり６．２５ｍｇにて、および、ラパマイシンをｍＬあたり４．７ｍｇにて、溶解することによって調製した。溶液２：ＰＶＡを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において５０ｍｇ／ｍＬにて調製した。
【０１２４】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（１．０ｍＬ）と溶液２（３．０ｍＬ）とを小ガラス圧力管において組み合わせ、１０秒間ボルテックス混合し、次いで、圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用して３０％の振幅にて１分間の超音波処理によって乳化することによって、調製した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する開口５００ｍＬビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じ容器へ加えた。次いで、これを室温にて２時間撹拌することでジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。
【０１２５】
ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳにペレットを再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いで０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳにペレットを再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度(a nominal concentration)を有するナノキャリア懸濁液が得られた。同一の配合物を、別個の５００ｍＬビーカーにおいて調製し、同じプロセスを経て、滅菌濾過直前の第１配合物と一緒にプールした。次いで、ナノキャリア懸濁液を、３３ｍｍ直径の０．２２μｍＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１２６】
試料２について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ジクロロメタンに、ＰＬＡをｍＬあたり７５ｍｇにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり２５ｍｇにて、およびラパマイシンをｍＬあたり１６ｍｇにて、溶解することによって調製した。溶液２：モノパルミチン酸ソルビタン混合物を、ジクロロメタンにSpan 40を２０ｍｇ／ｍＬにて溶解することによって調製した。溶液３：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）においてｍＬあたり５０ｍｇにて調製した。溶液４：ジクロロメタンを、０．２０μｍのＰＴＦＥメンブレンシリンジフィルター（VWR 品番 28145-491）を使用して濾過した。
【０１２７】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（０．５ｍＬ）、溶液２（０．１２５ｍＬ）および溶液４（０．３７５ｍＬ）および溶液３（３．０ｍＬ）を小ガラス圧力管中で組み合わせ、１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用して３０％の振幅にて１分間の超音波処理によって乳化することによって調製した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じビーカーへ加えた。次いでナノキャリア懸濁液を、試料１と同じ手段で処理した。
【０１２８】
試料３について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ジクロロメタンに、ＰＬＡをｍＬあたり３７．５ｍｇにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり１２．５ｍｇにて、およびラパマイシンをｍＬあたり８ｍｇにて溶解することによって調製した。溶液２：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）においてｍＬあたり７５ｍｇにて調製した。
【０１２９】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（１ｍＬ）および溶液２（３．０ｍＬ）を小ガラス圧力管中で組み合わせ、１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用して３０％の振幅にて１分間の超音波処理によって乳化することによって調製した。Ｏ／Ｗエマルションを、試料１について上に記載したのと同じ方法を使用して形成した。超音波処理による乳化の後、エマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで同じ溶媒蒸発容器へ加えた。エマルションを２時間撹拌させることで、有機溶媒を蒸発させてナノキャリアを形成した。
【０１３０】
次いで、ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇにて５０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットをＰＢＳに再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットをＰＢＳに再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、３３ｍｍ直径の０．２２μｍＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１３１】
ナノキャリアサイズを動的光散乱法によって決定した。ナノキャリアにおけるラパマイシンの量を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。懸濁液のｍＬあたりの乾燥ナノキャリア総質量を重量法によって決定した。
【表５】
2017537081.tif 000007
【０１３２】
６週齢のC57BL/6メスマウスを、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳに溶解された２００μＬのＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）と混合されたナノキャリアで、ｄ０、７および１４に静脈内処置した。マウスを、第２１、２８、３５および４２日に２００μｇのＫＬＨでブーストした。抗ＫＬＨ  ＩｇＧ力価を、第２６、４０および４７日に読み取った。結果を図４に示す。急速な溶媒蒸発または低ＨＬＢ界面活性剤により生産された、安定した過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノキャリアが、in vivoでの抗原特異的抗体生産を有意に低減したことを実証した。
【０１３３】
【表６】
2017537081.tif 000008
【０１３４】
例６−より急速な溶媒蒸発は、合成ナノキャリアの増大した濾過可能性に繋がる
材料および方法
試料１、２および４について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ジクロロメタンにＰＬＡをｍＬあたり１８．８ｍｇにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり６．２５ｍｇにて、およびラパマイシンをｍＬあたり４．７ｍｇにて溶解することによって調製した。溶液２：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）においてｍＬあたり５０ｍｇにて調製した。
【０１３５】
Ｏ／Ｗエマルションを、例５、試料１について上に記載したのと類似の手段で形成した。超音波処理の後、エマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有するビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じ容器へ加えた。試料１は５０ｍＬビーカーを使用し、試料２は２５０ｍＬビーカーを使用し、試料４は１２５ｍｍ蒸発ディッシュを使用した。各ロットについて、二重の単一エマルション(the double single emulsion)を、同じサイズおよびタイプの新しい溶媒蒸発容器を使用して繰り返し、洗浄ステップ後に第１と一緒にプールした。次いで、ナノキャリア懸濁液を、例５、試料１と同じ手段で処理した。
【０１３６】
ナノキャリアサイズを動的光散乱法によって決定した。ナノキャリアにおけるラパマイシンの量を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。懸濁液のｍＬあたりの乾燥ナノキャリア総質量を、重量法によって決定した。濾過処理量を、０．２２μｍのフィルターを介したナノキャリア質量のｇ／ｍ２として測定した。加えて、配合物へ加えられたポリマーの設定１０ｍｇ／ｍＬ濃度にて、溶液は、４．５ｃｍのフィルター表面積を有する、たった１つの３３ｍｍ  ０．２２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルターを通過したようであった。ビーカーから蒸発した溶媒のパーセントを、配合と同じ時間（２時間）にわたり、３６ｍＬのＳＥ緩衝液をもつ同じ溶媒蒸発容器の水の損失を測定することによって、計算した。次いで、水の損失（ｇ）を、配合物において測定された損失から引くことで、ジクロロメタン有機溶媒の蒸発を計算した。
【０１３７】
【表７】
2017537081.tif 000009
【０１３８】
例７−過飽和を決定するための方法
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。
溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマー溶液を、ＰＬＡをジクロロメタンのｍＬあたり１００ｍｇにて溶解することによって調製した。溶液２：ラパマイシン溶液を、ラパマイシンをジクロロメタンのｍＬあたり１００ｍｇにて溶解することによって調製した。
【０１３９】
顕微鏡スライドガラス(Glass microscope slides)を、７０％のイソプロパノールで浄化し、化学換気フード(a chemical fume hood)中、清浄な平坦な表面上で乾燥した。混合物１を、耐溶媒スクリューキャップをもつガラスバイアル中１００μＬの溶液１を１００μＬのジクロロメタンと混合し、ボルテックス混合することによって調製した。混合物２を、１００μＬの溶液１、３３．３μＬの溶液２、および６６．７μＬのジクロロメタンを用い、混合物１と同じ方法を使用して調製した。混合物３を、６６．７μＬの溶液２および３３．３μＬのジクロロメタンを用い、１００μＬの溶液１を使用して、混合物１と同じ方法を使用して調製した。次に、５０μＬの各混合物を、清浄なスライドガラス上の別個の位置へ塗り、換気フード中、室温にて終夜乾燥させた。各乾燥フィルムのデジタル画像を撮り、画像分析ソフトウェアを使用して分析した。正規化平均強度が増大することは、フィルムが飽和点を上回って不透明となったことを示し得る。
【０１４０】
【表８】
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【０１４１】
例８−低ＨＬＢ界面活性剤であるＳＭは、ＲＡＰＡの負荷および合成ナノキャリアの濾過可能性を増大させる
ポリマーであるＰＬＡ（固有粘度  ０．４１ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａのＰＥＧブロック、固有粘度  ０．５０ｄＬ／ｇ）ならびに疎水性薬物であるラパマイシン（ＲＡＰＡ）を含有するナノキャリア組成物を、油中水エマルション蒸発法を使用して、低ＨＬＢ界面活性剤であるソルビタンモノパルミタート（ＳＭ）の添加ありまたはなしで合成した。有機相を、ポリマーおよびＲＡＰＡをジクロロメタンに溶解することによって形成した。エマルションを、プローブチップソニケーター(probe-tip sonicator)を使用し、界面活性剤であるＰＶＡを含有する水相中で有機相を均質化することによって形成した。次いでエマルションを、より大量の水性緩衝液と組み合わせて、溶媒の溶解および蒸発が可能となるように混合した。その結果得られたナノキャリアを洗浄し、０．２２μｍフィルターに通して濾過した。すべての組成物は１００ｍｇのポリマーを含有していた。種々の組成物中のＲＡＰＡ含量は異なっていた。
【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
界面活性剤であるＳＭを含有しない組成物（試料１、２および３）について、ナノキャリア組成物中に完全にＲＡＰＡを組み込むという能力を制限する兆候が、ＲＡＰＡの添加量が増えるにつれ、いくつか観察された。ＳＭ不在下での濾過前と濾過後と間のナノキャリアサイズの差異が、より高いレベルのＲＡＰＡ配合レベルにて増大することは、洗浄および／または濾過のプロセスの間に除去されるより大きな微粒子（個々の粒子または凝集体）の存在を示した。これはまた、詰まる前の減少した濾過処理量によっても示された。最後に、ＳＭなしで漸増量のＲＡＰＡをナノキャリア組成物へ加えることは、増大したＲＡＰＡ負荷（例えば試料３と比較した試料１）をもたらさなかった。これは、追加のＲＡＰＡが、バルクのナノキャリアから分離可能であったことと、洗浄および／または濾過ステップの間に除去されたこととを示す。
【０１４４】
対照的に、界面活性剤であるＳＭを含有する組成物は容易に、漸増量のＲＡＰＡを組み込んだ。ナノキャリアサイズは濾過による影響を受けなかった。組成物へ加えられた漸増量のＲＡＰＡは、ナノキャリアの増大したＲＡＰＡの負荷をもたらした。いくらかの濾過処理量の低減が、最も高い負荷レベルにて観察されたが（試料６）、これは、本質的により大きなナノキャリアサイズに起因する可能性がある。つまり、ＳＭの組み込みは、合成ナノキャリア組成物のＲＡＰＡの負荷および濾過可能性を増大させるのに役立った。
【０１４５】
例９−ＳＭおよびコレステロールは、ＲＡＰＡの負荷および濾過可能性を増大した
ナノキャリア組成物を、例８に記載されたとおりの材料および方法を使用して生産した。ポリマーおよびＲＡＰＡを含有するナノキャリアを、ＲＡＰＡ負荷レベルを変動させて生産した。加えて、ＲＡＰＡがより高度に負荷されたナノキャリアもまた、３．２：１の添加剤：ＲＡＰＡ質量比で、添加剤、界面活性剤であるＳＭまたはコレステロールを使用して生産した。
【０１４６】
【表１０】
2017537081.tif 000012
【０１４７】
添加剤の不在下で生産されたナノキャリアの試料（試料７および８）は、見掛けのナノキャリア飽和点を超えたＲＡＰＡ負荷の増大が、濾過処理量の低減につながる傾向があることを実証した。ＳＭまたはコレステロールのいずれかの添加は、安定性を維持しつつ、より大きなＲＡＰＡ負荷をもたらした（試料９および１０）。
組成物の免疫寛容誘導能を査定するために、マウスに、共投与されるナノキャリアおよびＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）を、同じＲＡＰＡ用量で毎週３回静脈内注射し、次いでＫＬＨのみで毎週チャレンジした。次いでマウスの血清を、各ＫＬＨチャレンジ後にＫＬＨに対する抗体について分析した（図６）。
【０１４８】
ＲＡＰＡナノキャリア処置を受けているすべてのマウスが、同じ用量のＲＡＰＡを受けたにもかかわらず、種々の群において、ＫＬＨに対する寛容化の程度が異なることを示した。最も低い負荷をもつナノキャリア組成物（試料７）を受けた全５匹のマウスは、３回目の（第４０日にて）ＫＬＨチャレンジ後、抗ＫＬＨ抗体の定量化可能な力価を有した。この群のマウスは、ＰＢＳしか受けなかったマウスと比較して、低減した力価の抗ＫＬＨ抗体を発生させたが、他のナノキャリア群と比較して、最も小さい寛容化を呈した。添加剤（ＳＭまたはコレステロール）の不在下でナノキャリアのＲＡＰＡの負荷を増大させることは（試料８）、寛容化を有意に改善し、３回の（第４０日にて）ＫＬＨチャレンジ後、５匹中たった２匹のマウスではあるが、定量化可能な力価を実証した。添加剤としてコレステロールを含有する組成物（試料１０）は、ナノキャリアのＲＡＰＡの負荷が高いにもかかわらず、５匹中４匹のマウスが、たった２回の（第３３日にて）チャレンジ後、有意な抗ＫＬＨ抗体力価を実証したという結果をもたらした。
【０１４９】
ＳＭを含有するナノキャリア組成物（試料９）は、５匹中たった１匹のマウスが、３回の（第４０日にて）ＫＬＨチャレンジ後、定量化可能な力価の抗ＫＬＨ抗体を発生させたことから、高処理量（生産の間の０．２２μｍ濾過処理量）と優れた寛容化との両方を実証した。この研究の結果は、両添加剤（ＳＭおよびコレステロール）が、濾過処理量によって示されるとおり、寛容を誘導する性能と処理の好ましさとに矛盾せず、増大したナノキャリア負荷を可能にしたことを示す。低ＨＬＢ界面活性剤であるＳＭは、ナノキャリアの安定性を増大するのに必要とされる特性を提供し、より高い性能を実証した。
【０１５０】
例１０−ＲＡＰＡの負荷および濾過可能性に対する低ＨＬＢ界面活性剤の効果
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Lakeshore Biomaterials（756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211）から購入した（製品コード100 DL 4A）。およそ５，０００ｋＤａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Lakeshore Biomaterials（756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211）から購入した（製品コード100 DL mPEG 5000 5CE）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 １×（ＤＰＢＳ）を、Lonza（Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland）から購入した（製品コード 17-512Q）
【０１５１】
ソルビタンモノパルミタートを、Croda International（300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837）から購入した（製品コード SPAN 40）。Polysorbate 80を、NOF America Corporation（One North Broadway, Suite 912 White Plains, NY 10601）から購入した（製品コード Polysorbate80 (HX2)）。ソルビタンモノラウラート（SPAN 20）を、Alfa Aesar（26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835）から購入した（製品コード L12099）。ソルビタンステアラート（SPAN 60）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード S7010）。ソルビタンモノオレアート（SPAN 80）を、Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.（9211 North Harborgate Street Portland, OR 97203）から購入した（製品コード S0060）。オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドを、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード O8001）。オレイルアルコールを、Alfa Aesar（26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835）から購入した（製品コード A18018）。
【０１５２】
パルミチン酸イソプロピルを、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード W515604）。ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（BRIJ 52）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 388831）。ポリエチレングリコールオレイルエーテル（BRIJ 93）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 388866）。ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（Pluronic L-31）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 435406）。ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（Pluronic P-123）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 435465）。パルミチン酸を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード P0500）。ＤＬ−α−パルミチンを、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード M1640）。トリパルミチン酸グリセリルを、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード T5888）。
【０１５３】
試料１１について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ＰＬＡを７５ｍｇ／ｍＬにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｏｍｅを２５ｍｇ／ｍＬにて、およびラパマイシンを１６ｍｇ／ｍＬにて、ジクロロメタンに溶解することによって調製した。溶液２：Polysorbate80混合物を、Polysorbate80を８０ｍｇ／ｍＬにて、ジクロロメタンに溶解することによって調製した。溶液３：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において５０ｍｇ／ｍＬにて調製した。
【０１５４】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（０．５ｍＬ）、溶液２（０．１ｍＬ）、ジクロロメタン（０．４ｍＬ）および溶液３（３．０ｍＬ）を小ガラス圧力管中で組み合わせて、１０秒間ボルテックス混合し、次いで、圧力管を氷水浴中に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用して３０％の振幅にて１分間の超音波処理によって調製した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じ容器へ加えた。次いでこれを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させてナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳ中にペレットを再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳ中に再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、０．２２μｍPESメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１５５】
試料１２〜２５について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ＰＬＡを７５ｍｇ／ｍＬにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｏｍｅを２５ｍｇ／ｍＬにて、およびラパマイシンを１６ｍｇ／ｍＬにて、ジクロロメタンに溶解することによって調製した。溶液２：ＨＬＢ混合物を、ＨＬＢ界面活性剤を５．０ｍｇ／ｍＬにてジクロロメタンに溶解することによって調製した。ＨＬＢ界面活性剤は、SPAN 20、SPAN 40、SPAN 60、SPAN 80、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、オレイル酸(oleyl acid)、パルミチン酸イソプロピル、BRIJ 52、BRIJ 93、Pluronic L-31、Pluronic P-123、パルミチン酸、ＤＬ−α−パルミチン、およびトリパルミチン酸グリセリルを含む。溶液３：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において６２．５ｍｇ／ｍＬにて調製した。
【０１５６】
Ｏ／Ｗエマルションを、小ガラス圧力管中、溶液１（０．５ｍＬ）、溶液２（０．５ｍＬ）および溶液３（３．０ｍＬ）を組み合わせ、１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用して、３０％の振幅にて１分間超音波処理することによって調製した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じビーカーへ加えた。次いでこれを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成させた。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳにペレットを再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳに再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、０．２２μｍＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１５７】
【表１１】
2017537081.tif 000013
【０１５８】
ＨＬＢを、低ＨＬＢ界面活性剤のほとんどについて、公的に入手可能な情報を使用して決定した。ＤＬ−α−パルミチンについて、ＨＬＢを、以下の式を使用して計算した：Ｍｗ＝３３０．５ｇ／ｍｏｌ、親水性部分＝１１９．０ｇ／ｍｏｌ；ＨＬＢ＝１１９．０／３３０．５＊１００／５＝７．２。パルミチン酸グリセリルについて、ＨＬＢを、以下の式を使用して計算した：Ｍｗ＝８０７．３ｇ／ｍｏｌ、親水性部分ｈ＝１７３．０ｇ／ｍｏｌ；ＨＬＢ＝１７３．０／８０７．３＊１００／５＝４．３。パルミチン酸イソプロピルについて、ＨＬＢを、以下の式を使用して計算した：Ｍｗ＝２９８．５ｇ／ｍｏｌ、親水性部分＝４４．０ｇ／ｍｏｌ；ＨＬＢ＝４４．０／２９８．５＊１００／５＝２．９。オレイルアルコールについて、ＨＬＢを、以下の式を使用して計算した：Ｍｗ＝２６８．５ｇ／ｍｏｌ、親水性部分＝１７．０ｇ／ｍｏｌ；ＨＬＢ＝１７．０／２６８．５＊１００／５＝１．３。加えて、低ＨＬＢ界面活性剤の負荷を、抽出に続くＨＰＬＣ法による定量化によって測定した。
【０１５９】
動物への注射に先立ち、バルクのナノキャリア懸濁液を、室温の水浴中３０分間解凍した。ナノキャリアをＤＰＢＳで希釈することで、所望の濃度の２７８μｇ／ｍＬラパマイシンになった。６週齢のC57BL/6メスマウスを、ｄ０、７および１４に、１３０μＬの１０×ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）と混合されたナノキャリア（１．１７ｍＬ）で静脈内処置した。マウスを、第２１、２８、３５および４２日に、２００μｇのＫＬＨでブーストした。抗ＫＬＨ ＩｇＧ力価（ＥＬＩＳＡにより測定した）を、第４０、４７および６１日に読み取った。結果は、低ＨＬＢ界面活性剤が、実質的なラパマイシンの負荷および合成ナノキャリアの濾過可能性をもたらし得ることを実証する。加えて、図７に示されるような低ＨＬＢ界面活性剤によるナノキャリアのすべてが、少なくとも４０および４７日間、低減された抗体力価をもたらした。
【０１６０】
例１１−合成ナノキャリアの濾過可能性に対する低ＨＬＢ界面活性剤の効果
材料および方法
およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Evonik Industries（Rellinghauser Strasse 1-11 45128 Essen, Germany）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Evonik Industries（Rellinghauser Strasse 1-11 45128 Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。ソルビタンモノパルミタートを、Croda（315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720）から購入した（製品コード SPAN 40）。ジクロロメタンを、Spectrum（14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027）から購入した（品番 M1266）。
【０１６１】
EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）カルシウムおよびマグネシウムなしのDulbecco’s Phosphate Buffered Saline、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）を、BioWhittaker（8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547）から購入した（品番#12001、製品コード Lonza DPBS）。乳化を、１／８”先細チップチタンプローブをもつBranson Digital Sonifier 250を使用して実行した。
【０１６２】
溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマー混合物を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（100 DL mPEG 5000 5CE）を１ｍＬあたり５０ｍｇにて、ＰＬＡ（100 DL 4A）をｍＬあたり１５０ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解することによって調製した。溶液２：ラパマイシンを、ジクロロメタンに１ｍＬあたり１６０ｍｇにて溶解した。溶液５：ソルビタンモノパルミタート（SPAN 40）を、ジクロロメタンに１ｍＬあたり５０ｍｇにて溶解した。溶液６：ジクロロメタンを、０．２μｍＰＴＦＥメンブレンシリンジフィルター（VWR 品番 28145-491）を使用して滅菌濾過した。 溶液７：ポリビニルアルコール溶液を、ポリビニルアルコール（EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88）を１ｍＬあたり７５ｍｇにて、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解することによって調製した。溶液８：ポリビニルアルコールおよびDulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）の混合物を、ポリビニルアルコール（EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88）を１ｍＬあたり２．５ｍｇにて、Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）（Lonza DPBS）に溶解することによって調製した。
【０１６３】
試料２６について、Ｏ／Ｗエマルションを、小ガラス圧力管中、溶液１（０．５ｍＬ）、溶液２（０．１ｍＬ）、溶液５（０．１ｍＬ）および溶液６（０．３０ｍＬ）を組み合わせることによって調製した。溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。次に、溶液７（３．０ｍＬ）を加え、配合物を１０秒間ボルテックス混合した。次いで配合物を、圧力管を氷浴に浸しながら、３０％の振幅にて１分間超音波処理した。次いでエマルションを、Lonza ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する開口の５０ｍＬビーカーへ加えた。次いで、これを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを溶液８に再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを溶液８に再懸濁することで、ポリマーベースでｍＬあたり１０ｍｇの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。ナノキャリア配合物を、０．２２μｍＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millex 品番 SLGP033RS）を使用して濾過した。ナノキャリア溶液濾過処理量の質量を測定した。次いで、濾過されたナノキャリア溶液を−２０℃にて保管した。
【０１６４】
試料２７について、Ｏ／Ｗエマルションを、小ガラス圧力管中、溶液１（０．５ｍＬ）、溶液２（０．１ｍＬ）および溶液６（０．４０ｍＬ）を組み合わせることによって調製した。溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。次に、溶液７（３．０ｍＬ）を加え、配合物を１０秒間ボルテックス混合した。次いで配合物を、圧力管を氷浴に浸しながら、３０％の振幅にて１分間超音波処理した。次いでエマルションを、Lonza ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬ開口ビーカーへ加えた。次いでこれを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを溶液８に再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを溶液８に再懸濁することで、ポリマーベースでｍＬあたり１０ｍｇの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。ナノキャリア配合物を、０．２２μｍＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millex 品番 SLGP033RS）を使用して濾過した。ナノキャリア溶液濾過処理量の質量を測定した。次いで、濾過されたナノキャリア溶液を−２０℃にて保管した。
【０１６５】
ナノキャリアサイズを、動的光散乱法によって決定した。ナノキャリアにおけるラパマイシンの量をＨＰＬＣ分析によって決定した。懸濁液ｍＬあたりの乾燥ナノキャリアの全質量を重量法によって決定した。濾過可能性を、第１フィルターを通過した濾過物の量によって評価した。
データは、ラパマイシンについて、合成ナノキャリアにおけるSPAN 40の組み込みが、合成ナノキャリア組成物の濾過可能性における増大をもたらしたことを示す。
【０１６６】
【表１２】
2017537081.tif 000014
【０１６７】
例１２−SPAN 40は、ポリエステルポリマーを含む合成ナノキャリアの濾過可能性を大きく増大する
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ（100 DL 4A）を、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88 (PVA)、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 １×（ＤＰＢＳ）を、Lonza（Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland）から購入した（製品コード 17-512Q）。
【０１６８】
ソルビタンモノパルミタート（SPAN 40）を、Croda International（300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837）から購入した（製品コード Span 40）。およそ５４重量％のラクチドおよび４６重量％のグリコリドならびに０．２４ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＧＡ（5050 DLG 2.5A）を、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 5050 DLG 2.5A）。およそ７３重量％のラクチドおよび２７重量％のグリコリドならびに０．３９ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＧＡ（7525 DLG 4A）を、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（7525 DLG 4A）。平均１４，０００ＤａのＭｗおよび１０，０００ＤａのＭｎのポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 440752）。
【０１６９】
試料１、３、５および７について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり５０ｍｇにて、Span 40をｍＬあたり１０ｍｇにて、およびラパマイシンをｍＬあたり３２ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。溶液２：100 DL 4Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにてジクロロメタンに溶解した。溶液３：5050 DLG 2.5Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにてジクロロメタンに溶解した。溶液４：7525 DLG 4Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにてジクロロメタンに溶解した。溶液５：ＰＣＬを、ｍＬあたり１５０ｍｇにてジクロロメタンに溶解した。溶液６：ＰＶＡを、ｍＬあたり７５ｍｇにて、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において調製した。
【０１７０】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（０．５ｍＬ）を厚肉ガラス圧力管へ移すことによって調製した。これへ、溶液２（０．５ｍＬ）を加えロット１とし、溶液３（０．５ｍＬ）を加えロット３とし、４（０．５ｍＬ）を加えロット５とし、溶液５（０．５ｍＬ）を加えロット７とした。次いで２つの溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。次に溶液６（３．０ｍＬ）を加え、管を１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用し３０％の振幅にて１分間超音波処理によって乳化した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。次いでこれを、室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇにて５０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットをＤＰＢＳに再懸濁させることによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットをＤＰＢＳに再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、０．２２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）ならびに必要ならば：０．４５μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（PALL 品番 4614）および／または１．２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（PALL 品番 4656）を使用して、濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１７１】
ナノキャリアサイズを動的光散乱法によって決定した。ナノキャリアにおけるラパマイシンの量をＨＰＬＣ分析によって決定した。濾過可能性を、第１滅菌０．２２μｍフィルターのフロースルーの重量を、ブロッキングに先立ち前記フィルターを通過したナノキャリアの実際の質量または第１かつ唯一のフィルターを介した全量を決定した収量と比較することによって、決定した。懸濁液ｍＬあたりの乾燥ナノキャリアの全質量を重量法によって決定した。
【０１７２】
試料２、４、６および８について、溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯｍｅをｍＬあたり５０ｍｇにて、およびラパマイシンをｍＬあたり３２ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解させることによって調製した。溶液２：100 DL 4Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。溶液３：5050 DLG 2.5Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。溶液４：7525 DLG 4Aを、ｍＬあたり１５０ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。溶液５：PCLを、ｍＬあたり１５０ｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。溶液６：ポリビニルアルコールを、ｍＬあたり７５ｍｇにて、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において調製した。
【０１７３】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（０．５ｍＬ）を、厚肉ガラス圧力管へ移すことによって調製した。これへ、溶液２（０．５ｍＬ）を加えロット２とし、溶液３（０．５ｍＬ）を加えロット４とし、４（０．５ｍＬ）を加えロット６とし、溶液５（０．５ｍＬ）を加えロット８とした。次いで２つの溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。ＰＶＡ溶液の添加、洗浄、濾過および保管は、上と同じである。
ナノキャリアサイズを、上と同じように評価した。
【０１７４】
結果は、合成ナノキャリアにSPAN 40を含ませることにより、ポリエステルポリマーを含む合成ナノキャリアの濾過可能性が、有意に増大したことを示す。
【表１３】
2017537081.tif 000015
【０１７５】
例１３−低ＨＬＢ界面活性剤および有意なＲＡＰＡ負荷をもつ合成ナノキャリアは、持続的な抗原特異的寛容をもたらす
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Lakeshore Biomaterials（756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Lakeshore Biomaterials（756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。ソルビタンモノパルミタートを、Sigma-Aldrich（3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103）から購入した（製品コード 388920）。EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol (PVA) 4-88、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 １×（ＤＰＢＳ）を、Lonza（Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland）から購入した（製品コード 17-512Q）。
【０１７６】
溶液を以下のように調製した：
溶液１：ポリマー、ラパマイシンおよびソルビタンモノパルミタートの混合物を、ＰＬＡを３７．５ｍｇ／ｍＬにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｏｍｅを１２．５ｍｇ／ｍＬにて、ラパマイシンを８ｍｇ／ｍＬにて、および、ソルビタンモノパルミタートを２．５にて、ジクロロメタンに溶解することによって、調製した。溶液２：ポリビニルアルコールを、５０ｍｇ／ｍＬにて、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において調製した。
【０１７７】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（１．０ｍＬ）および溶液２（３ｍＬ）を小ガラス圧力管中で組み合わせ、１０秒間ボルテックス混合することによって、調製した。次いで配合物を、３０％の振幅にて１分間の超音波処理によって均質化した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する開口ビーカーへ加えた。第２Ｏ／Ｗエマルションを、上と同じ材料および方法を使用して調製し、次いで、第１エマルションおよびＤＰＢＳを含有する同じビーカーへ加えた。次いで、組み合わせたエマルションを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、０．２５％（ｗ／ｖ）ＰＶＡを含有するＤＰＢＳにペレットを再懸濁させることによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳに再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、０．２２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリ懸濁液を−２０℃にて保管した。
【０１７８】
ナノキャリアサイズを動的光散乱法によって決定した。ナノキャリアにおけるラパマイシンの量をＨＰＬＣ分析によって決定した。懸濁液ｍＬあたりの乾燥ナノキャリアの全質量を重量法によって決定した。
【表１４】
2017537081.tif 000016
【０１７９】
合成ナノキャリアの、遊離ラパマイシンに対する、モデル抗原ＫＬＨに対する持続的な免疫寛容の誘導能を評価した。実験未使用の(naive)C57BL/6マウスの群（ｎ＝群あたり１０匹）に、ＰＢＳ（群１）を、５０μｇ（〜２ｍｇ／ｋｇ）の遊離ラパマイシン単独またはこれとＫＬＨとを混和したもの（夫々、群２および３）を、あるいは、合成ナノキャリア中に封入された５０μｇのラパマイシン単独（群６）またはこれとＫＬＨとを混和したもの（群７および８）を、第０、７および１４日に静脈内投薬した（図８）。長期ラパマイシン投与の効果を決定するため、群４に、遊離ラパマイシン単独を、第０日から第２０日まで週あたり５回（５０μｇ／日）、または週あたり１回投与されるＫＬＨと組み合わせて（群５）、受けさせた。続いて、すべての群に対し、第２１、２８および３５日に、２００μｇのＫＬＨでチャレンジした。血清を採取し、抗ＫＬＨ抗体応答を第３５および４２日に測定した（夫々、２回および３回の注射後）。有効性を、ＥＬＩＳＡによって決定されるとおりの抗ＫＬＨ抗体力価をＥＣ５０として評価した。図９はプロトコールを例証する。
【０１８０】
対照のＰＢＳ処置マウスは、２回および３回のＫＬＨのチャレンジ注射後夫々、第３５および４２日に、高レベルの抗ＫＬＨ抗体が発生していた。ＫＬＨの不在下、遊離ラパマイシンで（毎週または毎日のいずれかに）処置されたマウスは、ＰＢＳで処置された群と類似したレベルの抗ＫＬＨ抗体が発生していた。合成ナノキャリア単独で、または毎日の遊離ラパマイシンおよびＫＬＨで処置されたマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して、遅延した応答を示したが、力価は、ＫＬＨによる各チャレンジによりブーストされていた。これらの結果は、合成ナノキャリア単独での処置が長期の免疫抑制を誘導しないこと、ならびに、毎日の遊離ラパマイシンとともに投与されたＫＬＨが、合成ナノキャリアにおいて投与されたとおりのラパマイシンの毎週の全用量である５回目でさえ、持続的な免疫寛容を誘導しないこと、を示す。
【０１８１】
対照的に、有意な量のラパマイシンが含まれる合成ナノキャリア＋ＫＬＨで処置されたマウス（群７および８）は、処置後毎週のＫＬＨチャレンジを３回受けた後であっても（合計６回のＫＬＨ注射）、検出可能な抗ＫＬＨ抗体がほとんどまたはまったく発生しなかった。これは、持続的な免疫寛容を示す。合成ナノキャリアの両ロットも類似して、有効であった。合成ナノキャリア＋ＫＬＨで処置された群以外のすべての群は、第４２日までに、アナフィラキシー応答を発生した。これらの結果は、有意な量のラパマイシンおよびＫＬＨを含む合成ナノキャリアによる処置によって誘導されたＫＬＨに対する寛容化が、過敏性応答の発生を予防したことを示す。
【０１８２】
ＫＬＨに対する寛容の抗原特異性を評価するために、すべての動物に対し、後肢に（ｓ．ｃ．）、ＯＶＡ＋ＣｐＧ（３５μｇ＋２０μｇ）を、第４９および５６日にチャレンジした。図１０は、全動物が、ＯＶＡに対して類似したレベルの力価ができていたことを示す。これは、合成ナノキャリアと抗原の同時投与が、免疫学的寛容を生み出させ得ること、および、合成ナノキャリア処置が、長期の免疫抑制を誘導しないことを実証する。これらの結果は、遊離よりむしろ、ナノキャリアに封入されたラパマイシンが（有意な量にて存在するとき）、標的抗原とともに同時投与されたとき、持続的かつ抗原特異的な免疫寛容を誘導したことを実証する。
【０１８３】
例１４−SPAN 40は、ラパマイシンの濾過可能性を増大させる
材料および方法
０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Evonik Industries AG（Rellinghauser Strasse 1-11, Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 １×（ＤＰＢＳ）を、Lonza（Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland）から購入した（製品コード 17-512Q）。ソルビタンモノパルミタートを、Croda International（300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837）から購入した（製品コード SPAN 40）。
【０１８４】
溶液を以下のように調製した。溶液１：ポリマーおよびラパマイシンの混合物を、ＰＬＡを１５０ｍｇ／ｍＬにて、およびＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｏｍｅを５０ｍｇ／ｍＬにて、溶解することによって調製した。溶液２：ラパマイシン溶液を、ジクロロメタンにおいて、１００ｍｇ／ｍＬにて調製した。溶液６：ソルビタンモノパルミタート溶液を、SPAN 40を５０ｍｇ／ｍＬにてジクロロメタンに溶解することによって調製した。溶液７：ポリビニルアルコールを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）において７５ｍｇ／ｍＬにて調製した。
【０１８５】
Ｏ／Ｗエマルションを、溶液１（０．５ｍＬ）を、厚肉圧力管へ加えることによって調製した。ロット１について、これを溶液６（０．１ｍＬ）およびジクロロメタン（０．２８ｍＬ）と組み合わせた。次いでロット１を、溶液２（０．１２ｍＬ）とともにこれらと組み合わせた。類似したやり方で、ロット２を、ジクロロメタン（０．３８ｍＬ）と組み合わせ、次いでロット２を、溶液２（０．１２ｍＬ）と組み合わせた。個々の各ロットにおいて、有機相の総体積はしたがって、１ｍＬであった。組み合わせた有機相溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。次に、溶液７（３．０ｍＬ）を加え、圧力管を１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷水浴に浸しながら、Branson Digital Sonifier 250を使用し、３０％の振幅にて１分間超音波処理した。次いでエマルションを、ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する５０ｍＬビーカーへ加えた。次いでこれを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを急速に蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳにペレットを再懸濁させることによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットを、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡを含有するＤＰＢＳに再懸濁することで、ポリマーベースで１０ｍｇ／ｍＬの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。次いでナノキャリア懸濁液を、０．２２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millipore 品番 SLGP033RB）を使用して濾過した。次いで、濾過されたナノキャリア懸濁液を、−２０℃にて保管した。
【０１８６】
結果は、合成ナノキャリアにおけるSPAN 40の組み込みが、ラパマイシンの濾過可能性を増大させたことを示す。
【表１５】
2017537081.tif 000017
【０１８７】
例１５−ラパマイシン負荷および合成ナノキャリアの濾過可能性に対する、構成要素の量の効果を示す
材料および方法
およそ５，０００Ｄａのメチルエーテル末端ＰＥＧブロックおよび全体的に見て０．５０ＤＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅブロックコポリマーを、Evonik Industries（Rellinghauser Strasse 1-11 45128 Essen, Germany）から購入した（製品コード 100 DL mPEG 5000 5CE）。０．４１ｄＬ／ｇの固有粘度をもつＰＬＡを、Evonik Industries（Rellinghauser Strasse 1-11 45128 Essen Germany）から購入した（製品コード 100 DL 4A）。ラパマイシンを、Concord Biotech Limited（1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India）から購入した（製品コード SIROLIMUS）。
【０１８８】
ソルビタンモノパルミタートを、Croda（315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720）から購入した（製品コード SPAN 40）。ジクロロメタンを、Spectrum（14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027）から購入した（品番 M1266）。EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88, (PVA)、ＵＳＰ（８５〜８９％加水分解、３．４〜４．６ｍＰａ・ｓの粘度）を、EMD Chemicals Inc.（480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027）から購入した（製品コード 1.41350）。Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）、カルシウムおよびマグネシウムなしを、BioWhittaker（8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547）から購入した（品番 #12001、製品コード Lonza DPBS）。乳化を、１／８”先細チップチタンプローブをもつBranson Digital Sonifier 250を使用して実行した。
【０１８９】
溶液を以下のように調製した：
ポリマー溶液：ポリマー混合物を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（100 DL mPEG 5000 5CE）およびＰＬＡ（100 DL 4A）を、示されるｍＬあたりのｍｇにて、ＰＬＡ−ＰＥＧ：ＰＬＡの比率１：３にて、ジクロロメタンに溶解することによって調製した。ラパマイシン溶液：ラパマイシンを、示される１ｍＬあたりのｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。SPAN 40溶液：ソルビタンモノパルミタート（SPAN 40）を、示されるｍＬあたりのｍｇにて、ジクロロメタンに溶解した。ＣＨ２Ｃｌ２溶液：ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を、０．２μｍのＰＴＦＥメンブレンシリンジフィルター（VWR 品番 28145-491）を使用して滅菌濾過した。ＰＶＡ溶液：ポリビニルアルコール溶液を、ポリビニルアルコール（EMPROVE（登録商標）Polyvinyl 4-88）を、示される１ｍＬあたりのｍｇにて、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解することによって調製した。ＤＰＢＳ ＰＶＡ溶液：ポリビニルアルコールおよびDulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）の混合物を、ポリビニルアルコール（EMPROVE（登録商標）Polyvinyl Alcohol 4-88）を、１ｍＬあたり２．５ｍｇにて、Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水、１×、０．００９５Ｍ（ＰＯ４）（Lonza DPBS）に溶解することによって調製した。
【０１９０】
Ｏ／Ｗエマルションを、ポリマー溶液、ラパマイシン溶液、SPAN 40溶液および／またはＣＨ２Ｃｌ２溶液（総体積１〜２ｍＬ）を、厚肉ガラス圧力管中で組み合わせることによって調製した。溶液を、ピペッティングを繰り返すことによって混合した。次に、ＰＶＡ溶液（３〜６ｍＬ）を加えた（１ｍＬの有機相と３ｍＬの水性ＰＶＡ溶液とをもつ単一のエマルション、または、順々に調製された２つの単一のエマルションのいずれかとして）。配合物を、１０秒間ボルテックス混合し、次いで圧力管を氷浴に浸しながら、３０％の振幅にて１分間超音波処理した。次いでエマルションを、Lonza ＤＰＢＳ（３０ｍＬ）を含有する開口５０ｍＬビーカーへ加えた。次いでこれを室温にて２時間撹拌することで、ジクロロメタンを蒸発させ、ナノキャリアを形成した。ナノキャリア懸濁液を遠心管へ移し、７５，６００×ｇおよび４℃にて５０分間遠心分離し、上清を除去し、ＤＰＢＳ ＰＶＡ溶液にペレットを再懸濁することによって、ナノキャリアの一部を洗浄した。洗浄手順を繰り返し、次いでペレットをＤＰＢＳ ＰＶＡ溶液に再懸濁することで、ポリマーベースでｍＬあたり１０ｍｇの設定濃度を有するナノキャリア懸濁液が得られた。ナノキャリア配合物を、０．２２μｍのＰＥＳメンブレンシリンジフィルター（Millex 品番 SLGP033RS）を使用して濾過した。ナノキャリア溶液の濾過処理量の質量を測定した。次いで、濾過されたナノキャリア溶液を−２０℃で保管した。
【０１９１】
濾過可能性は、１つの３３ｍｍ ＰＥＳメンブレン ０．２２μｍ シリンジフィルター（Milliporeから、品番 SLGP033RB）を通過する測定ナノキャリアの、フィルターメンブレン表面積のｇ／ｍ２として与えられる。
結果は、in vivoで有効であると予測される量のラパマイシンをもつ最初に滅菌濾過可能な合成ナノキャリアをもたらし得る多数の合成ナノキャリアにおける様々な構成要素の量を示す。
【０１９２】
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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