(57)【要約】  遊離ヘムを生物から除去する十分な循環を可能にするように十分なシアリル化を有するおよび／または中性グリカンが存在しない組換えヘモペキシン分子を使用する治療のための組成物および方法を提供する。他の実施形態においては、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する、治療用組換えヘモペキシン分子を提供する。治療方法および組換えヘモペキシン分子の製造方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する比率の中性グリカンを含む治療用組換えヘモペキシン分子。
【請求項２】
ＣＨＯ細胞から発現される、請求項１記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項３】
ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む、請求項１記載の組換えヘモペキシン。
【請求項４】
組換えヘモペキシン分子が哺乳類ヘモペキシン分子を含む、請求項１記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項５】
蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の比率の中性グリカン、約２〜約４０％の範囲の比率のモノシアリル化グリカンおよび約２０〜約９０％の範囲の比率のジ／トリシアリル化グリカンを含む、治療用組換えヘモペキシン分子。
【請求項６】
ヘモペキシン分子が、疾患におけるヘムの毒性効果を治療するために使用される、請求項５記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項７】
疾患が鎌状赤血球症を含む、請求項６記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項８】
疾患がβ−サラセミアを含む、請求項６記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項９】
（ａ）組換えヘモペキシン核酸配列を含む核酸をＣＨＯ細胞内に挿入し、
（ｂ）ＣＨＯ細胞から組換えヘモペキシン分子を発現させることを含む、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子の製造方法であって、
組換えヘモペキシンの中性グリカンの比率が蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲である、製造方法。
【請求項１０】
ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む、請求項９記載の組換えヘモペキシン分子の製造方法。
【請求項１１】
総グリカンに対する中性グリカンの比率が蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で３０％未満である、請求項１記載の治療用組換えヘモペキシン分子。
【請求項１２】
総グリカンに対する中性グリカンの比率が蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で２０％未満である、請求項１記載の治療用組換えヘモペキシン分子。
【請求項１３】
総グリカンに対する中性グリカンの比率が蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で１０％未満である、請求項１記載の治療用組換えヘモペキシン分子。
【請求項１４】
蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子を対象に投与することを含む治療方法。
【請求項１５】
組換えヘモペキシン分子が、遊離ヘムに結合するのに十分な半減期で血流内を循環する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
総グリカンに対する中性グリカンの比率が蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲である、配列番号１に対して９０％以上の相同性を有する組換えヘモペキシン分子。
【請求項１７】
該分子が、鎌状赤血球症、β−サラセミア、虚血再灌流、骨髄性プロトポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、マラリア、関節リウマチ、炎症に関連した貧血、ヘモクロマトーシス、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、子癇前症、敗血症、急性出血、および移植に関連した臓器保存、血液または代用血液での輸血に関連した合併症からなる群から選択される疾患を治療するために使用される、請求項１または１６記載の組換えヘモペキシン分子。
【請求項１８】
細胞を請求項１または１６記載の組換えヘモペキシン分子と接触させることを含む、細胞からヘムを輸出させるための方法。
【請求項１９】
遊離ヘム毒性に関連した障害の治療方法であって、それを要する対象に請求項１または１６記載の組換えヘモペキシン分子の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項２０】
該障害が、鎌状赤血球症、β−サラセミア、骨髄性プロトポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、虚血再灌流およびマラリアから選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
過剰な細胞内ヘムに関連した障害の治療方法であって、それを要する対象に請求項１または１６記載の組換えヘモペキシン分子の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
該障害が、関節リウマチ、炎症に関連した貧血、および鉄がマクロファージ細胞内に蓄積する状態から選択される、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願に伴う配列表はＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子形式で出願されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書において用いる見出しは編成を目的としたものに過ぎず、記載されている内容を何ら限定しないと解釈されるべきである。
【背景技術】
【０００２】
ヘムは生物における種々の機能を果たす。それはシトクロム、ＤＮＡ合成酵素、ミオグロビンおよびヘモグロビンのようなヘムタンパク質の非常に重要な成分である。しかし、高レベルの遊離ヘムは毒性となることがあり、遊離ヘムを制御できないと種々の疾患および障害が生じうる。
【０００３】
溶血の促進を伴う疾患、例えば鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβ−サラセミア（ＢＴｈａｌｌ）においては、正常対照と比較してヘムレベルが上昇する。ヘムレベルの上昇は溶解赤血球からのヘモグロビンの遊離により引き起こされ、これは、緩やかな酸化の後、ヘム部分を遊離する。遊離ヘモグロビンおよびヘムは酸化窒素を捕捉除去する。そして遊離ヘモグロビンおよびヘムは、細胞毒性であり細胞内で炎症促進性応答を誘導する反応性酸素中間体の形成を触媒する。肝臓は、ヘムレベルの調節の補助において非常に重要な役割を果たす。肝臓は、過剰なヘムを胆汁および糞便へ輸出するために、種々のタンパク質（ＦＬＶＣＲを含む）と共に働く。正常個体においては、２つのタンパク質、すなわち、ハプトグロビンおよびヘモペキシンが、それぞれ、遊離ヘモグロビンおよびヘムを捕捉除去し、それにより、関連する細胞毒性および炎症促進性効果を低減する。
【０００４】
ヘモペキシンは、溶血性および感染性疾患に関連したヘム媒介毒性を防ぐ、血漿に基づく糖タンパク質である。このタンパク質は鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびサラセミアのような幾つかの臨床状況において著しく枯渇する。ヘモペキシンはヘムに対する最も高い公知結合アフィニティを有する（Ｋｄ＜１ｐＭであると報告されている）。更に、遊離ヘムの毒性効果を低減することに加えて、ヘモペキシンは、おそらくは関連毒性ヘムを捕捉除去するその能力ゆえに、遊離ヘモグロビンの負の効果を低減しうる。溶血性疾患においては、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの両方が著しく枯渇して、ヘモグロビンおよびヘムが自由にそれらの負の効果をもたらすようになりうる。ヘモポエキシンは、溶血性疾患における遊離ヘムの毒性効果を低減するためのヘムスカベンジャーとしても作用しうる。例えば、ヒト血漿由来のヘモペキシンは遊離ヘムの細胞毒性および炎症促進性効果を低下させ、ＳＣＤおよびＢｔｈａｌｌマウスモデルにおいて血管機能を改善することが示されている。ヘモペキシンは血管内ヘムに結合し、それを隔離し、その関連毒性を低減することが示されている。
【０００５】
ヒト血漿由来のヘモペキシンは、７日間の循環半減期を有する完全シアリル化血漿糖タンパク質である。ヘムへの結合に際して、ヘモペキシンにおけるコンホメーション変化が生じ、これは肝細胞上のＬＲＰ受容体に対するそのアフィニティを増加させて、その複合体を循環から迅速に除去する（Ｔ１／２＝７時間）。ヘモペキシンは、ＮおよびＯ結合炭水化物の両方で広範にグリコシル化されている。Ｎ結合グリカン上のガラクトース残基の適切なシアリル化はインビボでのタンパク質のクリアランス特性に重大な影響を及ぼしうる。不十分なシアリル化は、それが治療上の利益をもたらす機会を与える前に、肝細胞上のアシアリル糖タンパク質受容体を介した、より迅速なクリアランスをもたらして、タンパク質を循環から除去する。これは、グリコシル化およびシアリル化経路がタンパク質産生速度についていけない可能性がある場合に組換えタンパク質で高い発現レベルを求める場合に、特に問題となりうる。
【０００６】
該タンパク質のバイオアベイラビリティは、特定の疾患またはそれらの付随症状に影響を及ぼす又はそれらを軽減する非常に重要な要因である。更に、ヘモペキシンの治療的使用に関するもう１つの制限要因は、高レベルのタンパク質を投与する必要があることのようである。これは、溶血の促進を伴う疾患で見られる高い代謝回転速度ゆえだと考えられる。血漿由来のヘモペキシンは臨床開発のソースとして使用されうるが、それは患者への疾患の伝染（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶ）の可能性のような固有のリスクを有する。組換えヘモペキシンの製造工程の改良は、商業的に実施可能な方法を用いてそのようなタンパク質が製造されうる可能性を改善しうる。
【０００７】
治療のための、および生物の細胞および血漿からのヘムの除去のための有効な組成物および方法が依然として必要とされている。更に、過剰のヘムの毒性を低減し、これらの不均衡に関連した種々の生物学的障害を予防するためには、細胞および血漿からのヘムの輸出が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
概要
遊離ヘムを生物から除去する十分な循環を可能にするように十分なシアリル化を有するおよび／または中性グリカンが十分に低いレベルである若しくは存在しない組換えヘモペキシン分子を含む、治療用組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
幾つかの実施形態においては、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する比率の中性グリカンを含む、治療用組換えヘモペキシン分子を提供する。少なくとも１つの実施形態においては、該組換えヘモペキシン分子はＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞から発現されうる。少なくとも１つの実施形態においては、該組換えヘモペキシン分子は哺乳類ヘモペキシン分子を含みうる。
【００１０】
少なくとも１つの実施形態においては、該組換えヘモペキシン分子は治療用であり、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の比率の中性グリカン、約２〜約４０％の範囲の比率のモノシアリル化グリカンおよび約２０〜約９０％の範囲の比率のジ／トリシアリル化グリカンを含む。少なくとも１つの実施形態においては、該ヘモペキシン分子は、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアのような疾患におけるヘムの毒性効果を治療するために使用される。
【００１１】
少なくとも１つの実施形態においては、該ヘモペキシン分子は、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で３０％未満である、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する。少なくとも１つの実施形態においては、総グリカンに対する中性グリカンの比率は蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で２０％未満または１０％未満である。
【００１２】
他の実施形態においては、配列番号１に対して９０％以上の相同性を有する組換えヘモペキシン分子を提供し、ここで、総グリカンに対する中性グリカンの比率は蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲である。
【００１３】
組換えヘモペキシン分子の製造方法も提供する。幾つかの実施形態においては、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子の製造方法は、適当なインサートおよびベクターをＣＨＯ細胞内に挿入し、ＣＨＯ細胞から組換えヘモペキシン分子を発現させることを含み、ここで、組換えヘモペキシンの中性グリカンの比率は蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲である。該方法の少なくとも１つの実施形態においては、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む。
【００１４】
他の実施形態においては、ヘモペキシンを使用する治療方法も提供する。幾つかの実施形態においては、該治療方法は、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子を対象に投与することを含む。少なくとも１つの実施形態においては、組換えヘモペキシン分子は、遊離ヘムに結合するのに十分な半減期で血流内を循環する。
【００１５】
本開示のもう１つの態様においては、組換えヘモペキシン分子は、鎌状赤血球症、β−サラセミア、虚血再灌流、骨髄性プロトポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、マラリア、関節リウマチ、炎症に関連した貧血、ヘモクロマトーシス、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、子癇前症、敗血症、急性出血、および移植に関連した臓器保存、血液または代用血液での輸血に関連した合併症から選択される疾患を治療するために血管内および／または細胞内ヘムを減少させるために使用される。
【００１６】
本開示のもう１つの態様においては、組換えヘモペキシン分子は、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子と細胞を接触させることを含む、細胞からヘムを輸出させるための方法において使用される。少なくとも１つの実施形態においては、組換えヘモペキシン分子は、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子の有効量を、それを要する対象に投与することを含む、ヘム毒性に関連した障害の治療方法において使用される。好ましくは、該障害は、鎌状赤血球症、β−サラセミア、骨髄性プロトポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、虚血再灌流およびマラリアから選択される。
【００１７】
少なくとも１つの実施形態においては、組換えヘモペキシン分子は、蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後のＨＰＬＣによる測定で約２〜約３０％の範囲の、総グリカンに対する中性グリカンの比率を有する組換えヘモペキシン分子の有効量を、それを要する対象に投与することを含む、過剰な血管内または細胞内ヘムに関連した障害の治療方法において使用される。好ましくは、該障害は、鎌状赤血球症、β−サラセミア、関節リウマチ、炎症に関連した貧血、およびヘムが細胞内に蓄積する他の状態から選択される。
【００１８】
以下の図面は単なる例示目的に過ぎないと当業者は理解するであろう。図面は本教示または特許請求の範囲の範囲を何ら限定しないと意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、選択された高発現性ＣＨＯＫ１およびＣＨＯ−Ｓクローンにおける組換えヒトヘモペキシンの発現を示す。発現レベルは抗ヒトヘモペキシンＥＬＩＳＡキットにより決定された。
【図２】図２は、種々の高発現性ＣＨＯＫ１およびＣＨＯ−Ｓ由来ヘモペキシンからの馴化培地を使用するヘム依存性ペルオキシダーゼアッセイの抑制に関するＥＣ５０の決定結果を示す。アッセイは、商業的に入手可能なヘム依存性ペルオキシダーゼアッセイを用いて行われた。
【図３】図３は、グリカン分析を要約したフローチャートを示す。
【図４】図４はスクリーニングからのクローンのサブセットに関するシアリル化Ｎ−グリカンＭＡＬＤＩ分析を示す。
【図５】図５はスクリーニングからのクローンのサブセットに関する中性Ｎ−グリカンＭＡＬＤＩ分析を示す。
【図６】図６は種々のＣＨＯＫ１およびＣＨＯＳクローンに関する２ＡＡ分析に基づく中性グリカンの比率（％）を示す。
【図７】図７のグラフは、ＣＨＯＫ１クローンとＣＨＯ−Ｓ由来ヘモペキシンとを比較した場合の中性グリカンの比率（％）を示す。
【図８】図８はＣＨＯＫ１クローンに関する発現レベルに対する中性グリカン（％）のプロットを示す。選択されたクローンが円で囲まれている。ＣＨＯＫ１−７６クローンが矢印で示されている。
【図９】図９は、血漿由来（ｐｄ−ＨＰＸ）、２つのバッチのＣＨＯＫ１クローン７６（ＣＨＯＫ１バッチＡおよびＢ）およびＣＨＯＳ由来ヘモペキシン（薬物動態学的分析に用いたもの）の中性Ｎ−グリカンＭＡＬＤＩ分析を示す。
【図１０】図１０は、血漿由来（ｐｄ−ＨＰＸ）、２つのバッチのＣＨＯＫ１クローン７６（ＣＨＯＫ１バッチＡおよびＢ）およびＣＨＯＳ由来ヘモペキシン（薬物動態学的分析に用いたもの）のシアリル化Ｎ−グリカンＭＡＬＤＩ分析を示す。
【図１１】図１１は、血漿由来（ｐｄ−ＨＰＸ）、２つのバッチのＣＨＯＫ１クローン７６（ＣＨＯＫ１バッチＡおよびＢ）およびＣＨＯＳ由来ヘモペキシン（薬物動態学的分析に用いたもの）に関する中性グリカンの比率（％）を示す２ＡＡ分析を示す。
【図１２】図１２は、第７、１１および１４日に回収されたバイオリアクター培養に由来するＣＨＯＫ１クローン７６由来ヘモペキシン精製タンパク質における中性、モノシアリル化ならびにジおよびトリシアリル化Ｎ−グリカンの比率（％）を示す２ＡＡ分析を示す。
【図１３】図１３はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける組換え（ｒ−ＨＰＸ）および血漿由来ヘモペキシン（ｐｄ−ＨＰＸ）の薬物動態学的分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本教示のこれらの及び他の特徴は本明細書に記載されている。
【００２１】
詳細な説明
本開示はヘモペキシンおよび／または組換えヘモペキシンでの治療のための組成物および方法を提供する。該組成物および方法は、１以上の疾患または症状を有する対象に投与されうる。ある場合には、該疾患はヘムのレベルの上昇に関連づけられうる。
【００２２】
本明細書の解釈の目的には、以下の定義が適用される。以下に記載するいずれかの定義がいずれかの他の文書（参照により本明細書に組み入れるいずれかの文書を含む）におけるその語の用法に矛盾する場合には、本明細書およびその添付の特許請求の範囲を解釈する目的においては、矛盾する意味が明らかに意図されている場合（例えば、その語が元々用いられている文書における場合）を除き、以下に記載する定義が常に優先するものとする。
【００２３】
適当な場合には、単数形で用いられている語は複数形をも含み、その逆も成り立つ。本明細書における単数表現は、特に示されていない限り、または「１以上」の使用が明らかに不適当である場合を除き、「１以上」を意味する。「または」の使用は、特に示されていない限り、「および／または」を意味する。「含む」、「含み」、「含んで」、「包含する」、「包含し」および「包含」は交換可能であり、限定的ではない。「のような（例えば）」なる語も限定的でなものではないと意図される。例えば、「含む」なる語は、「含むが、それに限定されるものではない」ことを意味するものとする。
【００２４】
本明細書中で用いる「約」なる語は、示されている単位値の＋／−  １０％を意味する。本明細書中で用いる「実質的」なる語は、関心のある特徴または特性の全体的な又はおおよその度合を示す定性的状態を意味する。生物学的および化学的現象は絶対的な結果を達成または回避することが有るとしてもめったにない、と生物学の分野における当業者は理解するであろう。なぜなら、生物学的および化学的組成物ならびに材料の試験、製造および貯蔵に影響を及ぼす多数の変数が存在し、生物学的および化学的組成物ならびに材料の試験、製造および貯蔵において使用される装置および設備における固有の誤差が存在するからである。したがって、実質的なる語は、本明細書においては、多数の生物学的および化学的現象において固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために用いられる。
【００２５】
本明細書中で用いる「ヘモペキシン」または「血漿由来ヘモペキシン」または「ＨＰｘ」または「ｐｄ−ＨＰＸ」なる語は、ヘモペキシンの任意の変異体、アイソフォームおよび／または種ホモログであって、細胞により天然で発現され、血漿中に存在し、組換えヘモペキシンとは異なるその形態のものを意味する。
【００２６】
本明細書中で用いる「組換えヘモペキシン」または「ｒＨＰｘ」なる語は、ヘモペキシンの任意の変異体、アイソフォームおよび／または種ホモログであって、細胞から発現され、血漿由来ヘモペキシンとは異なるその形態のものを意味する。
【００２７】
「治療的有効量」なる語は、インビボで過剰なヘムを有効に除去するのに必要とされる、または測定可能な利益をインビボでそれを要する対象にもたらす、ヘモペキシンまたはタンパク質の組合せの量を意味する。厳密な量は、治療用組成物の成分および物理的特徴、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項など（これらに限定されるものではない）を含む多数の要因に左右され、当業者によって容易に決定されうる。
【００２８】
幾つかの要因が、治療用の分子または組成物としてヘモペキシンを使用する可能性を制限している。
【００２９】
治療のためのヘモペキシンの使用を制限する第１の要因は、高レベルのタンパク質を投与する必要があることである。これは、おそらく、溶血の促進を伴う疾患において見られる高い代謝回転速度によるものであろう。既存方法は、血漿からタンパク質を抽出し、精製し、濃縮することによりヘモペキシンを得る。これは、限られたタンパク質しか与えない、長時間を要する広範な方法である。
【００３０】
血漿由来ヘモペキシンの使用を制限する第２の要因は、疾患の伝染により生じる考えられうる問題に関するものである。例えば、血漿由来ヘモペキシンは臨床開発のソースとして使用されうるが、これらの組成物は、患者への疾患の伝染（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶ）の可能性のような固有のリスクを有する。更に、血漿由来サンプルおよび組成物は、疾患を引き起こす種々のウイルスおよび細菌を含有する可能性を含む。これらは病原体は大規模製造前に除去および／または濾過されないという潜在的リスクが存在する。
【００３１】
治療用物質としてのヘモペキシンの使用を制限する第３の要因は、該タンパク質が機能するのに必要な固有の特性を維持させながら該タンパク質を効率的製造方法において高レベルで発現させることができないこと、および／またはインビボもしくは天然に存在するタンパク質と同様には機能させることができないことに関するものである。遊離血漿由来ヘモペキシンは７日間の血漿半減期を有すると報告されている。ヘムの結合に際して、ヘモペキシンのコンホメーションが変化して、肝細胞上のＬＲＰ受容体に対するそのアフィニティが増加して、循環からの、より迅速な除去がもたらされる（Ｔ１／２＝７時間）。血漿由来ヘモペキシンは広範にグリコシル化されており、５個のＮ結合グリコシル化部位および１または２個のＯ結合グリコシル化部位を含有する。血漿由来ヘモペキシンの場合、Ｎ結合炭水化物は末端ガラクトース炭水化物上で完全にシアリル化されていて、肝臓におけるアシアリル糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）による認識および除去を妨げる。組換え産生ヘモペキシンにおけるＮ結合炭水化物上の末端ガラクトースの不完全なシアリル化は、遥かに迅速に循環から除去されるタンパク質を与えると予想されるであろう。不完全にシアリル化されたヘモペキシンの、ＡＳＧＰＲによる除去は、より迅速に生じるため、ヘム結合には無関係に、これは、治療効力が低下したヘモペキシン分子を与えると予想されるであろう。２ＡＡ分析により決定される中性Ｎ−グリカンの（全Ｎ−グリカンに対する）比率（％）はシアリル化の度合と逆相関し、したがって、小さな中性グリカン比率を有する組成物は高いシアリル化レベルを有する。本出願において、本発明者らは、十分にシアリル化されたヘモペキシンを高レベルで産生する発現系を記載し、クリアランス（除去）特性に対する低シアリル化の負の効果を実証し、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満および１０％未満の中性Ｎ−グリカン比率を有するヘモペキシンが、患者の治療に最も有用な組成物であることを示す。したがって、本組成物および方法は、ｐｄ−ＨＰＸ分子および他の組成物によっては得られない予想外の利益をもたらす。
【００３２】
例えば、組換えヘモペキシンの製造方法における改良は、商業的に実施可能な方法を用いてそのようなタンパク質が製造されうる可能性を向上させうる。しかし、一般的な発現系の使用はヘモペキシン分子または組成物の不適切なシアリル化をもたらす。したがって、更に、ヘモペキシン分子の全組成およびインビボの循環時間を改善するためには、全グリカンと比較して分子内に存在する中性グリカンのレベルを減少させることが望ましい。電荷が中性である分子および／または組成物は肝臓によって接触され除去される。したがって、血流におけるそれらの循環時間はより短く、それらのクリアランスは、遊離ヘムとの複合体の形成によって、より低い度合で駆動されるであろう。更に、該治療用分子または組成物は、血流内の遊離ヘムに強く結合するためには、血漿由来または野生型ヘモペキシンに十分に類似した特性を有していなければならないことも注目されるべきである。したがって、本組成物および方法は、ｐｄ−ＨＰＸ分子および組成物によっては得られない予想外の利益をもたらす。
【００３３】
したがって、Ｎ結合グリカン上のガラクトース残基の適切なシアリル化はインビボのタンパク質のクリアランス特性に有意な影響を及ぼしうる。不十分なシアリル化は、肝細胞上のアシアリル糖タンパク質受容体による、より迅速なクリアランスをもたらしうる。これは、組換えタンパク質において、高い発現レベルを求める場合に特に問題となりうる。天然に存在するヘモペキシンおよび組換えヘモペキシンは共に、Ｎ結合およびＯ結合の両方の炭水化物で広範にグリコシル化されている。中性グリカンの比率は、例えば２ＡＡ分析のような分析方法を用いて決定されうる。そのように決定される中性Ｎ−グリカンの比率はシアリル化の度合に反比例する。単一の炭水化物鎖上に１個を超える未シアリル化ガラクトースを有するグリカン構造はＡＳＧＰＲに対する最高のアフィニティを有すると予想され、最も迅速に除去されるであろう。
【００３４】
組換えヘモペキシンの製造においては、不十分にシアリル化された物質を産生する細胞は、迅速に除去される形態のヘモペキシンを与える。これとは対照的に、より大きな度合のシアリル化を有する物質を産生する細胞において物質が発現される場合には、クリアランス速度の低下が認められることを、本発明者らは示している。３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満および１０％未満の中性Ｎ−グリカンの比率を有する組換えヘモペキシンを与える精製プロセスと組合された十分にシアリル化された物質を産生する細胞における発現が、患者の治療に、より有用であろう。
【００３５】
ヘモペキシン分子または組成物における中性グリカンのレベルを更に低下させ、シアリル化のレベルを増加させるためには、種々の方法が使用されうる。これらの方法は、種々の一定の細胞系を使用すること、特定の賦形剤または栄養素を使用して培地供給を改善すること、シアル酸をＮ−グリカンから除去するシアリダーゼ酵素を遮断するための金属またはその誘導体（これらに限定されるものではない）を含むインヒビターを使用すること、ならびにＮ−グリコシル化パターンおよびシアリル化の度合に影響を及ぼすために種々のアミノ酸の内部または外部において操作するためにポリペプチド配列内に突然変異を施すことを含む。シアル酸をＮ−グリカンに付加する傾向が増加した細胞系が使用可能であり、シアル酸をＮ−グリカンに付加する傾向が増加したトランスフェクト化細胞の集団からのクローンの選択が行われうることを、本発明者らは示している。シアル酸輸送体、シアリルトランスフェラーゼ、シアリダーゼインヒビターまたはｓｉＲＮＡおよび同等の技術（これらに限定されるものではない）を含む、シアリル化プロセスに影響を及ぼすことが知られているタンパク質をコードするＤＮＡでの細胞の修飾が行われうる。
【００３６】
組換え産生タンパク質を使用する補充療法は難題である。これは少なくとも部分的には、高レベルのタンパク質が必要とされるからである。更に、ヘモペキシンは、適切なフォールディングと共にこのタンパク質の個々の特性に差次的に影響および効果を及ぼしうる広範な翻訳後修飾を有する。本発明はここにおいては、ヘモペキシンおよび／または組換えヘモペキシンの製造、ならびに疾患を治療するためのヘモペキシンおよび／または組換えヘモペキシンの使用に関する。
【００３７】
組換えヘモペキシン分子は、配列番号１に対して９０％以上の相同性を有する配列を有しうる。配列における逸脱は、天然に存在する或いは部位特異的突然変異誘発または他の合成もしくは組換え技術により導入されたものを含む欠失、付加、置換または挿入のような要因により引き起こされうる。更に、相同性は、それぞれの核酸分子またはそれによりコードされるタンパク質の間に機能的および／または構造的等価性が存在することを意味する。少なくとも１つの実施形態においては、配列番号１と相同である核酸分子は配列番号１と同じ生物学的機能を有する。
【００３８】
医薬用途
ヘモペキシンは、ヘム調節における遺伝的および後天的欠損または欠陥を治療するために治療目的に使用されうる。例えば、前記実施形態におけるタンパク質は、血液または血漿から過剰なヘムを除去するために使用されうる。
【００３９】
ヘモペキシンは、過剰な遊離血管ヘムが関わる障害および過剰な細胞内ヘムが関わる障害を含むヘムの障害の治療における治療的用途を有する。遊離ヘム毒性障害には、鎌状赤血球症、β−サラセミア、虚血再灌流、骨髄性プロトポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症およびマラリアが含まれる。過剰な遊離ヘムは、反応性酸素種の形成を触媒することにより、器官、組織および細胞の損傷または機能不全を招きうる。過剰な細胞内ヘムに関連した障害には、関節リウマチ、炎症に関連した貧血、および鉄がマクロファージ内に蓄積し赤血球へとリサイクルされ得ない他の状態が含まれる。ヘモペキシンの治療的使用から利益が得られうる過剰な鉄／鉄過負荷を伴う他の疾患には、ヘモクロマトーシス、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症または続発的現象（例えば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、子癇前症、マラリア、敗血症、ならびに他の感染性および／または炎症性疾患、急性出血、ならびに移植に関連した臓器保存、血液または代用血液での輸血に関連した合併症が含まれる。広範な細胞溶解、特に赤血球溶解が生じるいずれかの疾患において、潜在的な利益があるであろう。多量のミオグロビンを放出する筋肉の広範な破壊を伴う疾患もヘモペキシン投与から利益を受けうる。
【００４０】
そのような障害は、ヘモペキシンの治療的有効量を、それを要する対象に投与することにより治療されうる。該ヘモペキシン分子および組成物は、ＳＣＤのような稀な疾患の治療における治療用途をも有する。したがって、ＳＣＤおよび他の関連疾患の治療方法をも提供する。
【００４１】
ヘモペキシンは、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続注入によるもの）用に製剤化されることが可能であり、アンプル、予め充填されたシリンジ、小容量注入液における単位用量形態または多用量容器（添加された保存剤を含有するもの）において提供されうる。該組成物は懸濁剤または液剤（溶液）のような形態をとり、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有しうる。本明細書中で用いる「非経口」なる語は皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内投与を含む。
【００４２】
該ヘモペキシンタンパク質は、単独療法として、またはヘム障害に対処するための他の療法と組合せて使用されうる。疾患の重症度によって変動しうる、または予防療法の場合には鉄欠乏症の重症度によって変動しうる用量および頻度で、ヘム欠乏症に罹患している対象に該医薬組成物を投与することが可能である。
【００４３】
該組成物は、必要な患者に、ボーラスとして、または連続的もしくは断続的な注入により投与されうる。例えば、ヘモペキシンタンパク質のボーラス投与は、典型的には、３０分〜３時間にわたる注入により投与されうる。投与の頻度は状態の重症度に左右されるであろう。頻度は、１日１回または２回から、２週間〜６カ月に１回までの範囲でありうるであろう。更に、該組成物は皮下注射により患者に投与されうる。例えば、１〜８０００ｍｇのヘモペキシンの用量が毎日、毎週、隔週または毎月、皮下注射により患者に投与されうる。
【実施例】
【００４４】
実施例１
組換えヘモペキシンの発現、精製および分析
天然ヘモペキシンシグナル配列と共にＤＮＡ  ２．０最適化ヘモペキシンｃＤＮＡ配列（配列番号３）を使用して、ＣＨＯ細胞において高レベルの発現が示された。高発現性クローンの特定のための類似方法をＣＨＯＳおよびＣＨＯＫ１の両方の細胞に用いた。ＣＨＯＫ１クローンに使用した方法は以下のとおりであった。ＣＨＯＫ１細胞を、コドン最適化ヘモペキシンｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトした。９６ウェルプレート内の限界希釈クローニングにより合計３００個のＣＨＯＫ１クローンを選択した。該クローンからの馴化培地を、商業的に入手可能なヘモペキシンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ，４１−ＨＭＰＨＵ−Ｅ０１）を使用してアッセイした。元の３００個のクローンから２１個の高産生体を特定し、ついで、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＡｃｔｉＣＨＯ培地を使用する小規模フェドバッチ発現法（５０ｍｌ）を用いて評価した。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）または金属キレートクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＩＭＡＣ）およびそれに続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＤ２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２工程法を用いて、ヘモペキシンタンパク質を（＞９５％の純度まで）精製した。精製されたタンパク質を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル）および分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＤ２００，１０／３００）を使用して、純度に関して評価した。また、競合ヘム結合アッセイ（ヘム依存性ペルオキシダーゼに基づくもの）を用いて、精製サンプルをヘム結合に関して分析し、ついでグリカン分析（後記に概説されている方法）に付した。ＣＨＯＫ１およびＣＨＯ−Ｓの両方の細胞系において、類似した最大タンパク質発現レベルが得られた（図１）。ヘム依存性ペルオキシダーゼアッセイの抑制に関するＥＣ５０を、商業的に入手可能なキットを使用して決定した。全てのクローンが、類似した効力で、ヘム依存性ペルオキシダーゼ活性を抑制した（図２）。精製タンパク質をグリカン分析に付した。また、グリカン分析には、対照として商業的（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入手した精製血漿由来ヘモペキシンも含まれた。グリカン分析は、中性および荷電Ｎ−グリカン構造を特定するためのＭＡＬＤＩ分析、中性グリカンの比率（％）を特定するための２ＡＡ分析、そして幾つかの場合には、全シアル酸含量を測定するための全シアル酸分析を含むものであった（図３、実施例２における更なる詳細を参照されたい）。
【００４５】
意外にも、ＣＨＯ−Ｓおよび２１個のＣＨＯＫ１クローンから精製されたヘモペキシンに関するＭａｌｄｉおよび２ＡＡグリカン分析はグリカンプロファイルにおける有意な相違を示した（図４、５および６を参照されたい）。ＭＡＬＤＩシアリル化Ｎ−グリカン分析は、ＣＨＯ−Ｓ由来ヘモペキシンに関して、ＣＨＯＫ１クローンより多様なグリカンパターンを示した。更に、ＣＨＯ−Ｓ由来物に存在する中性グリカンの比率（４７．８％）は、ＣＨＯＫ１由来物で得られたもの（６．３％〜２４．６％）より有意に高かった。低下した中性グリカンの比率はシアリル化の度合に反比例する。したがって、この分析に基づけば、ＣＨＯＫ１クローンからの物質はより大きな度合のシアリル化を有していた。全クローンの中性グリカンの比率を図７にグラフで示す。中性Ｎ−グリカンの比率および発現レベルに基づく追加的な評価のためにクローンを選択した（図８）。
【００４６】
薬物動態学的研究用の物質を得るために、ＣＨＯ−ＳクローンおよびＣＨＯＫ１クローン７６を使用した。これらの２つの調製物（およびＡｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌａｓｍａ由来）における中性および荷電Ｎ−グリカンを示すＭＡＬＤＩ分析を図９および１０に示す。２ＡＡ分析からの中性グリカン比率のデータを図１１に示す。ＣＨＯ−Ｓ産生物は５２％の中性グリカンを含有し、ＣＨＯＫ１−７６（バッチＡ）産生物は１０％の中性グリカンを含有していた。ヘモペキシンの第２バッチを、増加した中性グリカン比率（１９％）を２ＡＡ分析により示したクローンＣＨＯＫ１−７６馴化培地から精製した。４つの組換え産生調製物および商業的に入手した血漿由来ヘモペキシンに関する中性グリカンの比率を要約した表を以下の表１に示す。また、より低い比率の全中性Ｎ−グリカンを含有する調製物は、より高いレベルの完全シアリル化Ｎ−グリカン、および２以上の非荷電末端ガラクトース部分を含有する低いレベルのＮ−グリカンを含有する。
【表１】
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【００４７】
これらの調製物からのタンパク質を、後記に示す薬物動態学的分析において評価した。
【００４８】
ＣＨＯＫ１クローン７６の更なる分析は、バイオリアクター培養からの馴化培地を使用して精製されたタンパク質に存在する中性グリカンの比率のレベルが、培養を行った時間の長さに左右されることを示した。１０Ｌのバイオリアクター（ＡｃｔｉＣＨＯＰ培地）に、第７日、１１日および１４日に、クローン７６から得た馴化培地を接種した。ヘモペキシンを、これらの日に集めた培地から精製し、ついで中性グリカンの比率に関して評価した。データ（図１２）は、バイオリアクターの運転中に中性グリカンの比率における時間依存的増加が生じることを示した。これは、決定的に重要な培地成分の消費、または経時的にシアル酸の除去をもたらす培地内のシアリダーゼの存在によるものでありうる。修飾された増殖条件、供給物における培地成分の添加または培地内へのシアリダーゼインヒビターの添加の組合せを用いて、産物におけるその中性グリカンの比率を減少させるために、条件を更に最適化することが可能である。更に、シアリル化を増強しうる種々の遺伝子をこれらの高産生細胞に加えるための或る公知方法または技術も予想されうる。これにはシアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸輸送体が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例２
グリカン分析
２ＡＡ分析  −  蛍光プローブ２−アミノ安息香酸での標識の後、ＨＰＬＣにより中性およびシアリル化Ｎ−グリカンを分析した。グリコシダーゼＦ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してＮ−グリカンを遊離させ、ついで２−アミノ安息香酸で標識した。溶媒Ａとしてのアセトニトリル中の２％  酢酸／１％  テトラヒドロフラン、および溶媒Ｂとしての水中の５％  酢酸／１％  テトラヒドロフラン／３％  トリエチルアミンを蛍光検出（励起３６０ｎｍ、発光４２５ｎｍ）と共に使用して、ＮＨ２Ｐ４０−２Ｄカラムで標識サンプルを分析した。
【００５０】
ＭＡＬＤＩ分析  −  グリカンの構造を決定するために、グリコシダーゼを使用してＮ−グリカンを遊離させ、ついでＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行った。中性グリカン分析のために、２，５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして使用し、一方、２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン一水和物をシアリル化グリカンの分析に使用した。中性Ｎ−グリカン分析の場合、データ収集パラメータは以下のとおりであった：イオン源１：２０ｋＶ、イオン源２：１７ｋｖ、レンズ９ｋｖ、リフレクタ１：２６、リフレクタ２：１４。シアリル化Ｎ−グリカン分析の場合、データ収集パラメータは以下のとおりであった：イオン源１：２０ｋｖ、イオン源２：１９ｋｖ、レンズ５ｋｖ。
【００５１】
実施例３
ＰＫ研究
組換え（ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯＫ１由来）および血漿由来（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ヘモペキシンの薬物動態学的および特性プロファイルを、意識のある雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて評価した。組換えＣＨＯ−Ｋ１由来ヘモペキシンをグリカン修飾して、中性グリカンの比率を低下させた。組換えＣＨＯ−Ｓ由来ヘモペキシンはグリカン修飾しなかった。ヘモペキシンを単一静脈内用量として３ｍｇ／ｋｇで大腿静脈内に投与した。この研究は、Ｃｕｌｅｘ（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用して行った。投与後、血液サンプルを頸静脈から、抗凝固剤としての５％  クエン酸ナトリウムを含有する収集チューブ内へ、所定の時点において７２時間まで連続的に集めた。ついで血漿をこれらのサンプルから得、分析まで−８０℃で保存した。ラット血漿における総ヒトヘモペキシンを測定するための検出として、捕捉およびＨＲＰ−抗ヒトヘモペキシン抗体としての抗ヒトヘモペキシン抗体と共にサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ法を用いて、ヒトヘモペキシンの血漿レベルを測定した。
【００５２】
ラット薬物動態学的分析において測定されたクリアランス（除去）特性とバッチにおける中性グリカンの比率との間に明らかな相関が認められた（図１３を参照されたい）。中性グリカンの増加（シアリル化の減少）を伴うヘモペキシン調製物はより速いアルファ相およびクリアランス速度、分布体積の増加、ならびにＡＵＣの減少を示した（図１３および表２）。これは恐らく、アシアリル糖タンパク質受容体による、不十分にシアリル化された分子の、より迅速なクリアランスによるものであろう。アシアリル糖タンパク質受容体による、不適切にシアリル化された物質のクリアランスは、循環からの遊離ヘモペキシンの迅速なクリアランスを招く可能性があり、これは、それが遊離ヘムを捕捉除去する前に生じる。シアリル化の改善を伴うヘモペキシン分子は、それがヘムに結合するまで、遥かに遅く除去されうる。ヘムへの結合に際して、ＬＲＰ受容体に対するアフィニティが増加して、ヘモペキシン−ヘム複合体が循環から除去される。アシアリル糖タンパク質受容体によるクリアランスを低減することにより、ヘモペキシンのインビボ効力が改善されうる。
【表２】
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【００５３】
本実施形態は特定の実施形態および実施例に関して記載されているが、本明細書に添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修飾および変更を施すことが可能であり、均等物が置換可能であると理解されるべきである。したがって、本明細書および実施例は限定的な意味ではなく例示的な意味で理解されるべきである。更に、本明細書中で言及されている全ての論文、書籍、特許出願および特許の開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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