(57)【要約】  Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、１種以上のコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む。Ｐｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元は、シスプラチン及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤をもたらすことができる。コンセプトの実証のために、シスプラチン及びアスピリンを生み出すことができるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグ、プラチン−Ａが合成された。プラチン−Ａは、優れた抗癌性及び抗炎症性を示したが、それらは、シスプラチンの遊離製剤とアスピリンの組み合わせよりも良好であった。【選択図】  図５
2017500315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するＰｔ（ＩＶ）化合物：
【化１】
2017500315.tif 000018
（式中、
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨ又は−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤であり；
Ｒ4は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤又は標的化部分であり、ここで、Ｒ4がコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｒ3とＲ4は同じ又は異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、Ｌ1とＬ2は、両方存在する場合、同じ又は異なっており；
ｍ及びｘは、独立に、０又は１であり；且つ
ｎ及びｙは、独立に、１以上の整数である）。
【請求項２】
ｍ＝０であり、且つｎ＝１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｘ＝０であり、且つｙ＝１である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ｍ＝１であり、且つｎが１から４の整数である、請求項１又は３に記載の化合物。
【請求項５】
ｘ＝１であり、且つｙが１から４の整数である、請求項１、２、及び４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4が、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ4が、コンジュゲートされたアスピリンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1が、コンジュゲートされた非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1が、ＣＯＸ−１のコンジュゲートされた阻害剤、ＣＯＸ−２のコンジュゲートされた阻害剤、又はＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２のコンジュゲートされた阻害剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1が、コンジュゲートされたアスピリンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1Ｈがサリチル酸である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｐｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元が、シスプラチン、Ｒ1Ｈ、及びＲ2Ｈを生み出す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記式Ｉによる化合物が下記である、請求項１に記載の化合物
【化２】
2017500315.tif 000019
。
【請求項１４】
前記式Ｉによる化合物が下記である、請求項１に記載の化合物：
【化３】
2017500315.tif 000020
（式中、ｏ及びｐは、それぞれ独立に、３から７である）。
【請求項１５】
ｏ＝５であり、且つｐ＝５である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
その必要のある患者における癌を治療するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
前記癌が高度炎症と関連している、請求項１６に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
前記癌が前立腺癌である、請求項１６又は１７に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
その必要のある患者における炎症性疾患を治療するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２０】
その必要のある患者における癌又は炎症性疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
癌又は炎症性疾患のリスクがある、又はそれを患っている患者を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物を前記患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の声明
本発明は、合衆国政府の国防総省により与えられた、認可番号Ｗ８１ＸＷＨ−１２−１−０４０６の政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、本明細書に示される開示と矛盾しない程度にその全体が引用により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１１０号の利益を主張する。
【０００３】
分野
本開示は、対象への投与の後でシスプラチン及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を放出するように構成されたプロドラッグ；及びそれに関連する癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景及び序論
慢性炎症は、ヒト癌のおよそ２０％において重要な役割を果たしている。前立腺癌（ＰＣａ）は、米国の男性において最も頻繁に診断される癌であり、癌の死の２番目の原因である。ＰＣａを有する患者は、必然的に、ホルモン非依存性の疾患に進行する。アンドロゲン遮断の存在下で進行するＰＣａは、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）と定義される。複雑な免疫媒介性のプロセス及び炎症が、去勢状況におけるＰＣａ進行に決定的な役割を果たし、癌関連の炎症は、機能上、転移の形成に重要な役割を果たす。
【０００５】
シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）又はシスプラチンは、現在、種々の固形腫瘍を治療するのに利用可能な最も有効な抗癌剤の１つである。アポトーシス死に対する抵抗性は、進行性ＰＣａの独特な特徴であり、ホルモン不応性疾患のシスプラチン系の治療戦略がうまくいかない原因の１つである。
【０００６】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、癌化学予防におけるその明示的な可能性のため、ＰＣａの化学治療手法に付け加える魅力的なものになり得る。ＮＳＡＩＤの主な標的は、プロスタグランジン（ＰＧ）の形成における律速工程を触媒するシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）アイソフォーム、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２である。ＰＧは、アラキドン酸から誘導される脂質分子の群であり、炎症反応を発生させる重要な役割を果たす。誘導性アイソフォームＣＯＸ−２及びその産物、特にＰＧＥ２は、炎症反応、アポトーシスの阻害、及び抵抗性の誘導に関与している。上昇したレベルのＰＧＥ及びＣＯＸ−２  ｍＲＮＡは、ヒトＰＣａ試料の８３％において過剰発現されている。
【０００７】
シスプラチンの使用は、腎毒性及び聴覚毒性などのその副作用のために限定されている。腎毒性は、食塩水補給を利用して低減できる。しかし、シスプラチン聴覚毒性に対する保護的な治療手法は全くない。アセチルサリチル酸とＣＯＸのＳｅｒ−５３０残基との間のエステル交換によりＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２を不可逆的に阻害することが知られているアセチルサリチル酸すなわちアスピリンは、聴覚、バランス、及び腎臓に関連するシスプラチンが誘発する副作用の重症度を減少させる能力も有する。アスピリン及びその代謝物サリチル酸は、いくつかの抗炎症性サイトカインを誘導して、炎症を減少させる。シスプラチンとアスピリンとの組み合わせは、高悪性度ＰＣａを管理する魅力的な戦略になり得る。
【０００８】
シスプラチンとアスピリン混合物との組み合わせの有益な効果がある程度研究された。しかし、薬物組み合わせを試験する際には多くの難題が存在する。遊離の薬物製剤を投与する際の主要な障害には、２種の薬物の比率の選択、正しい薬物比率の決定的な送達、検討している標的への曝露、並びに個別の薬物動態及び生体内分布パラメーターがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、とりわけ、Ｐｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元と同時にＰｔ（ＩＩ）シスプラチン及び１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤を生み出すＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを記載する。薬物組み合わせを含む単一のプロドラッグは、先に議論された難題のいくつかを潜在的に克服できる。
【００１０】
本明細書に記載される種々の実施形態において、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグを使用して、とりわけ、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の抗炎症性により、シスプラチンにより起こる腎毒性を改善できる。本明細書に記載される試験において、プラチン−Ａ（Ｐｌａｔｉｎ−Ａ）は、Ｐｔの還元と同時にシスプラチン及びアスピリンを生成できるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグであり、優れた抗癌性及び抗炎症性を示した。プラチン−Ａで得られた結果は、遊離のシスプラチン及びアスピリンの製剤の組み合わせよりも良好であった。
【００１１】
本明細書に記載されるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグは、直接Ｐｔ（ＩＶ）に結合又はリンカーを介してＰｔ（ＩＶ）に結合した１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含み得る。クリックケミストリーなどの容易に利用できる化学的技法を利用して、１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤がリンカーを介してＰｔ（ＩＶ）に結合している、本明細書に記載されるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを合成できる。
【００１２】
本明細書に記載される種々の実施形態において、プロドラッグになり得る化合物は、以下の構造を有する：
【化１】
2017500315.tif 000003
（式中
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨ又は−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤であり；
Ｒ4は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤又は標的化部分であり、ここで、Ｒ4がコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｒ3とＲ4は同じ又は異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、ここで、Ｌ1とＬ2は、両方とも存在する場合、同じ又は異なっており；
ｍ及びｘは、独立に、０又は１であり；且つ
ｎ及びｙは、独立に、１以上の整数である）。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ｍ＝０である場合、ｎ＝１であり、ｘ＝０である場合、ｙ＝１である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、式Ｉのｎ及びｙは、１から４の整数など、１から８の整数である。リンカー、Ｌ1及びＬ2は、使用される場合、式Ｉの化合物に存在するＲ3及びＲ4の部分の数を制御するように選択できる。すなわち、リンカー、Ｌ1及びＬ2は、ｎ及びｙの値を決めることができる。種々の実施形態において、式ＩのＲ4は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤である。
【００１５】
式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）がＰｔ（ＩＩ）へ還元されると、シスプラチン、Ｒ1Ｈ、及びＲ2Ｈが生じる。ｍ＝０且つｎ＝１である場合、Ｒ1ＨはＲ3Ｈであり、Ｒ3Ｈはシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。ｘ＝０且つｙ＝１である場合、Ｒ2ＨはＲ4Ｈであり、Ｒ4Ｈは、水、ＣＯＸ阻害剤、還元された細胞標的化部分などである。種々の実施形態において、Ｒ4ＨはＣＯＸ阻害剤である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、Ｒ3ＨとＲ4Ｈの一方又は両方はアスピリンである。
【００１７】
式Ｉによる化合物は、その必要のある対象における前立腺癌などの癌の治療に使用できる。式Ｉによる化合物は、別法として又は追加的に、その必要のある対象における炎症性疾患の治療に使用できる。
【００１８】
本明細書に示される種々の実施形態の１つ以上の、シスプラチン及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む以前の併用療法より優る利点は、添付される図面と共に読まれれば以下の詳細な説明に基づいて当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本明細書に記載される実施形態による化合物を合成する反応スキームの実施形態を表す概略図である。
【図２】図２：ＤＭＳＯ−ｄ６中の「プラチン−Ａ」の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ。
【図３】図３：ＤＭＳＯ−ｄ６中のプラチン−Ａの１９５Ｐｔ  ＮＭＲスペクトル。
【図４】図４：「プラチン−Ａ」の陽イオンＥＳＩ−ＨＲＭＳスペクトル及び同位体ピークパターン分析。
【図５】図５は、本明細書に記載される実施形態による化合物、プラチン−Ａの構造、及びその作用機序の実施形態を表す概略図である。
【図６】図６：２つの異なるｐＨ値の１：４ジメチホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（ＤＭＦ）−リン酸緩衝液−０．１Ｍ  ＫＣｌ中の「プラチン−Ａ」のサイクリックボルタモグラム。上のグラフは、ｐＨ７．４でスキャン速度を変えた「プラチン−Ａ」のサイクリックボルタモグラムを示す。下のグラフは、ｐＨ６．４でスキャン速度を変えた「プラチン−Ａ」のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７】図７：アスコルビン酸ナトリウムの存在下でのプラチン−Ａと５’’−ＧＭＰとの反応により得られたＰｔ−ＧＧ付加物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳクロマトグラム。示された同位体のピークパターンは、Ｐｔ−ＧＧ付加物中のＰｔ種の存在を確認する。
【図８】図８：プラチン−Ａとアスコルビン酸ナトリウムの反応生成物のＨＰＬＣ分析。比較のために、純粋なアスピリン及びサリチル酸を使用した。利用した波長：２８０ｎｍ。
【図９】図９：（Ａ）ＰＣａ細胞株中のプラチン−Ａの代表的な細胞傷害性プロファイル並びにシスプラチン及びシスプラチンとアスピリンの等モルの混合物の活性との比較。（Ｂ）ＰＣ３細胞のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色によるプラチン−Ａのアポトーシス誘導性。４つの別個の表現型：生細胞（左下の四半分）；早期のアポトーシスにある細胞（右下の四半分）；末期のアポトーシス又は壊死にある細胞（右上の四半分）；細胞破片（左上の四半分）。
【図１０】図１０：第２日のＰＣ３細胞（１×１０6細胞／ｍＬ）を、アポトーシス及び壊死の陽性対照としてエトポシド（１００μＭ、１２時間）及びＨ2Ｏ2（１ｍＭ、４５分）により処理し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色により分析した。４つの別個の表現型：生細胞（左下の四半分）；早期のアポトーシスにある細胞（右下の四半分）；末期のアポトーシス又は壊死にある細胞（右上の四半分）；細胞破片（左上の四半分）。
【図１１】図１１：ＥＩＡを利用する、プラチン−ＡがヒツジＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２を阻害する能力。
【図１２】図１２：酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を利用する、異なる濃度でのプラチン−ＡのＣＯＸ阻害性及びアスピリンとの比較。
【図１３】図１３：ＰＣ３細胞中のＣＯＸ−２発現の免疫蛍光法分析。（Ａ）ＰＣ３細胞中のＣＯＸ−２発現並びにアスピリン（１μＭ）、及び等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１μＭ）、及びプラチン−Ａ（１μＭ）の作用、（Ｂ）ＴＮＦ−αによる処理時のＰＣ３細胞中のＣＯＸ−２レベルに対する作用並びにアスピリン（１μＭ）、及び等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１μＭ）、及びプラチン−Ａ（１μＭ）のＴＮＦ−α刺激細胞に対する作用。細胞はＤＡＰＩ染色で青に染色された。ＣＯＸ−２は、一次ウサギポリクローナル抗体で標識され、その後に二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体で標識された。スケールバーは全て２５μｍである。
【図１４】図１４：アスピリン（１μＭ）、等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１μＭ）、及びプラチン−Ａ（１μＭ）によるＰＣ３細胞中のＣＯＸ−２阻害の定量化（左）。ＴＮＦ−αによる処理（右）及びその後のアスピリン（１μＭ）、等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１μＭ）、及びプラチン−Ａ（１μＭ）による処理後のＣＯＸ−２の発現レベル（右）。ＣＯＸ−２は、一次ウサギポリクローナル抗体により標識され、その後に二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギ抗体により標識された。データは、発光波長４８８ｎｍ及び励起波長５１９ｎｍで、プレートリーダーで記録された。統計分析は、Ｔｕｋｅｙポストホック検定（ｐｏｓ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）と共に一元配置分散分析を利用して実施された。
【図１５】図１５：プラチン−Ａの抗炎症。（Ａ）ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージはＬＰＳにより処理されて、炎症が誘導され、シスプラチン、アスピリン、シスプラチンとアスピリンの等モル混合物、及びプラチン−Ａの、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０のレベルに対する作用が、ＥＬＩＳＡを利用して試験された。（Ｂ）ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージは、シスプラチン、アスピリン、シスプラチンとアスピリンの等モル混合物、及びプラチン−Ａにより処理され、それに続いてＬＰＳが加えられ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０のレベルに対する被験物品の予防作用が、ＥＬＩＳＡを利用して試験された。統計分析は、Ｔｕｋｅｙ事後検定と共に一元配置分散分析を利用して実施された。
【図１６】図１６：プラチン−Ａ（１０μＭ）、シスプラチン（１０μＭ）、アスピリン（１０μＭ）、及びシスプラチン（１０μＭ）＋アスピリン（１０μＭ）の、インキュベーション時間２４時間のＬＰＳ活性化ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージに対する細胞傷害性。
【図１７】図１７：腫瘍微小環境におけるプラチン−Ａの作用機序。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
概略図は、必ずしも一定の比率でない。図に使用される同様な数は、同様な成分、工程などを指す。しかし、所与の図中の成分に言及するための数の使用が、同じ数で表示される別な図中のその成分を限定するものではないことが理解されるだろう。さらに、複数の成分に言及するための異なる数の使用は、異なる数が付いた成分が同じにも類似にもなり得ないことを示すものではない。
【００２１】
詳細な説明
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成し、実例として装置、システム、及び方法のいくつかの具体的な実施形態が示されている添付図面が参照される。他の実施形態が企図され、本開示の範囲又は趣旨から逸脱せずになされ得ることが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味にとられるべきではない。
【００２２】
本開示は、とりわけ、Ｐｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元と同時にＰｔ（ＩＩ）シスプラチン及び１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤をもたらすＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを説明する。本明細書に記載されるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグは、Ｐｔ（ＩＶ）に直接結合又はリンカーを介してＰｔ（ＩＶ）に結合した１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含み得る。クリックケミストリーなどの容易に利用可能な化学技法を利用して、１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤がリンカーを介してＰｔ（ＩＶ）に結合している、本明細書に記載されるＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを合成できる。
【００２３】
本明細書に記載される種々の実施形態において、プロドラッグであり得る化合物は以下の構造を有する：
【化２】
2017500315.tif 000004
（式中
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨ又は−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤であり；
Ｒ4は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤又は標的化部分であり、ここで、Ｒ4がコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｒ3とＲ4は同じ又は異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、ここで、Ｌ1とＬ2は同じ又は異なっており；
ｍ及びｘは、独立に、０又は１であり；且つ
ｎ及びｙは、独立に、１以上の整数である）。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ｍ＝０である場合、ｎ＝１であり、ｘ＝０である場合、ｙ＝１である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、式Ｉのｎ及びｙは、１から４の整数など、１から８の整数である。リンカー、Ｌ1及びＬ2は、使用される場合、式Ｉの化合物に存在するＲ3及びＲ4の部分の数を制御するように選択できる。すなわち、リンカー、Ｌ1及びＬ2は、ｎ及びｙの値を決定できる。
【００２６】
クリックケミストリーを利用して、リンカー、又は１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分などが結びつけられているリンカーを、Ｐｔ（ＩＶ）化合物にコンジュゲートできる。好適なクリックケミストリー技法の例には、銅触媒を用いるアジド−アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）、歪みが促進するアルキン環化付加反応（ＳＰＡＡＣ）などがある。アジド官能基は、例えば、以下に示される通りＰｔ（ＩＶ）化合物をアジド無水物と反応させることにより、ｃ，ｃ，ｔ［ＰｔＣｌ2（ＮＨ3）2（ＯＨ）2］などのＰｔ（ＩＶ）化合物に容易に付加できる：
【化３】
2017500315.tif 000005
式中、ｏ及びｐは、独立に、３から７、又は例えば５など、０から１０である。いくつかの実施形態において、ｏとｐは同じである。いくつかの実施形態において、アジド無水物は、６−アジドヘキサン酸無水物である。いくつかの実施形態において、アジド無水物の濃度を制限することにより、又はヒドロキシル基の１つをブロックすることにより、アジド部分が１つだけ、生じるＰｔ化合物に付加される。任意の好適な溶媒を使用できる。好適な溶媒の例には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などがある。ｃ，ｃ，ｔ［ＰｔＣｌ2（ＮＨ3）2（ＯＨ）2］は、シスジアンミン白金（ＩＩ）ジクロリド（シスプラチン）を過酸化水素と反応させることなど、任意の好適な方法で合成できる。
【００２７】
次いで、上述の式ＩＩによる化合物など、アジド官能化Ｐｔ（ＩＶ）化合物を、アルキン含有リンカーと反応させることができるが、これは、任意選択で１種以上のコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分などを含み得る。アルキン含有リンカーが、例えば、１種以上のコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤又は標的化部分を含んでいない場合、リンカーをアジド−官能化Ｐｔ（ＩＶ）化合物と反応させた後で、そのような部分をリンカーにコンジュゲートできる。
【００２８】
上記で示された通り、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、又はあらゆる他の好適な形態のクリックケミストリーを利用できる。シクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分などを含み得るか、又は含むように修飾され得るＳＰＡＡＣアルキン含有化合物の例は、例えば、「アルキン及びアルキンを１，３−双極子官能化合物と反応させる方法（ＡＬＫＹＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＲＥＡＣＴＩＮＧ  ＡＬＫＹＮＥＳ  ＷＩＴＨ  １，３−ＤＩＰＯＬＥ−ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ）」という名称の米国特許第８，１３３，５１５号、及び「歪みにより促進されるＰＴ（ＩＶ）スキャホールドに対するアジドアルキン環化付加反応：シスプラチンプロドラッグを官能化する万能な生体直交型手法（ＳＴＲＡＩＮ  ＰＲＯＭＯＴＥＤ  ＡＺＩＤＥ  ＡＬＫＹＮＥ  ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＯＮ  ＰＴ（ＩＶ）  ＳＣＡＦＦＯＬＤ：Ａ  ＶＥＲＳＡＴＩＬＥ  ＢＩＯＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥ  ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ  ＰＲＯＤＲＵＧＳ）」という名称の２０１４年３月４日に出願の米国仮特許出願第６１／９４７，７０３号に記載されており、これらの特許及び特許出願は、それらが本開示と矛盾しない程度に、そのそれぞれの全体として引用により本明細書にそれぞれ組み込まれている。
【００２９】
説明のために、官能化アザジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）誘導体と、式ＩＩによるアジド官能化Ｐｔ（ＩＶ）化合物とのＳＰＡＡＣ反応は下記に示される。
【化４】
2017500315.tif 000006
式中、ｏ及びｐは、式ＩＩによる化合物に関して先に定義された通りであり、Ｘは、Ｒ3、又は−リンカー−Ｒ3、又はＲ3若しくは−リンカー−Ｒ3がコンジュゲートできる官能基であり、Ｙは、Ｒ4、又は−リンカー−Ｒ4、又はＲ3若しくは−リンカー−Ｒ3がコンジュゲートできる官能基である。Ｒ3及びＲ4は、式Ｉによる化合物に関して先に定義された通りである。Ｘ及びＹのリンカーは、存在する場合、独立に、Ｒ3又はＲ4が結合できるどのような好適なリンカーでもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、Ｒ3又はＲ4、Ｒ4がシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合）の制御可能な放出を与えることができる。あらゆる好適な切断可能なリンカーが利用できる。好適な切断可能なリンカーの例には、米国特許第８，１３３，５１５号の図１２に表されているもの、例えば、ジスルフィドリンカー、オキシムリンカー、ヒドラジンリンカー、ジアゾリンカー、カルボニルオキシエチルスルホンリンカー、アミノ酸リンカー、フェニルアセトアミドリンカーなどがある。リンカーは、式Ｉによる化合物が投与される対象の標的位置で予測される環境において、場合に応じて、Ｒ3又はＲ4の放出を促進するように選択できる。いくつかの実施形態において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、式Ｉによる化合物の実施形態が癌を有する対象に投与されると、細胞／腫瘍環境中で、エステラーゼによる、又は酸塩基触媒による反応により放出されるだろう。癌細胞は、細胞エステラーゼの上方制御を特徴とすることが多く、その腫瘍微小環境は酸性になる。したがって、エステラーゼによる、又は酸塩基触媒によるシクロオキシゲナーゼの放出は、腫瘍の微小環境又は腫瘍細胞内部で選択的に放出され得る。したがって、シクロオキシゲナーゼの早過ぎる放出を最小限にできる。
【００３０】
さらに説明のため、式ＩＩによるアジド官能化Ｐｔ（ＩＶ）化合物と、２つ以上のＲ3、Ｒ4、−リンカー−Ｒ3、又は−リンカー−Ｒ4部分（例えば、上述の通り）がコンジュゲートできるリンカーとして作用できるアルキン含有化合物とのＣｕＡＡＣクリックケミストリーは以下に示される。
【化５】
2017500315.tif 000007
式中、ｏ及びｐは、式ＩＩによる化合物に関して先に定義された通りである。反応は、ＣｕＩなどの銅触媒の存在下で起こり得る。Ｒ3、Ｒ4、−リンカー−Ｒ3、又は−リンカー−Ｒ4部分は、式ＩＶによる化合物のヒドロキシル基の酸素に、縮合反応など任意の好適な方法でコンジュゲートできる。いくつかの実施形態において、Ｒ3、Ｒ4、−リンカー−Ｒ3、又は−リンカー−Ｒ4部分は、ＣｕＡＡＣ反応の前にアルキン官能化リンカーにコンジュゲートされるが、それにより、生じる化合物に、異なるＲ3、Ｒ4、−リンカー−Ｒ3、又は−リンカー−Ｒ4部分を組み込むことができる。
【００３１】
例示のために、本明細書に提示される教示による４つのアスピリン部分を含むＰｔ（ＩＶ）化合物が以下に示される。
【化６】
2017500315.tif 000008
式中、ｏ及びｐは、式ＩＩによる化合物に関して先に定義された通りである。
【００３２】
例示のために、本明細書に提示される教示による８つのアスピリン部分を含むＰｔ（ＩＶ）化合物が以下に示される。
【化７】
2017500315.tif 000009
式中、ｏ及びｐは、式ＩＩによる化合物に関して先に定義された通りである。
【００３３】
式ＶＩによる化合物の合成のための反応スキームが図１に描かれているが、「プラチン−Ａｚ」は、ｏが５でありｐが５である式ＩＩによる化合物であり、「Ｐｔ（ＩＶ）−ボウタイ（Ｂｏｗ  Ｔｉｅ）」は、ｏが５でありｐが５である式ＶＩによる化合物である。
【００３４】
アスピリンは、癌を有する対象に投与されると、細胞／腫瘍環境中で、エステラーゼによる、又は酸塩基触媒による反応により式Ｖ及びＶＩによる化合物から放出されるはずである。癌細胞は、細胞エステラーゼの上方制御を特徴とすることが多く、その腫瘍微小環境は酸性になる。したがって、エステラーゼによる、又は酸塩基触媒によるシクロオキシゲナーゼの放出は、腫瘍の微小環境又は腫瘍細胞内部で、選択的に放出され得る。したがって、シクロオキシゲナーゼの早過ぎる放出を最小限にできる。さらに、発明者らは、式Ｖ又はＶＩによる化合物の場合、２又は４つのアスピリンを有するデンドロン全体が、Ｐｔ（ＩＶ）種がＰｔ（ＩＩ）形態に転化する間に、最初にＰｔ（ＩＶ）種から離れるだろうと仮定した。このデンドロンは、炎症を起こした腫瘍組織環境中で、時間空間的にゆっくりとアスピリンを放出して、癌に関連する炎症を低減できる。
【００３５】
種々の実施形態において、式Ｉによる化合物は、Ｒ1がＲ3であり、それがコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤であるように、ｍが０でありｎが１である化合物である。説明のために、Ｒ1がコンジュゲートされたアスピリンでありＲ2がＯＨである式Ｉによる化合物が以下に示される：
【化８】
2017500315.tif 000010
。
式（ＶＩＩ）による化合物は、本明細書において「プラチン−Ａ」と呼ばれることがある。プラチン−Ａを合成する反応の実施形態は、以下により詳細に説明される。簡単に述べると、プラチン−Ａは、ｃ，ｃ，ｔ−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2（ＯＨ）2］をアスピリン無水物と反応させて合成された。１つのアスピリンをシスプラチンプラットフォームに得るために、希釈された反応媒体が使用された。プラチン−Ａは、いくつかの分光学的技法及び分析技法により特性化された（図２〜４）。
【００３６】
さらに説明するため、Ｒ1がコンジュゲートされたサリチル酸でありＲ2がＯＨである式Ｉによる化合物が以下に示される：
【化９】
2017500315.tif 000011
。
【００３７】
上述の具体的な化合物及び反応スキームが、式Ｉによる幅広い化合物が種々の反応スキームに従って製造され得ることを示す目的で提示され、限定の目的で提示されていないことが理解されるだろう。
【００３８】
式ＩのＰｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元から生じるＲ1Ｈ、Ｒ2Ｈ、及びシスプラチンを示す全般的なスキームは以下に与えられる。
【化１０】
2017500315.tif 000012
【００３９】
Ｒ1がＲ3であり、それがコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｐｔの還元は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤Ｒ3Ｈの放出をもたらす。Ｒ1が、上述の通り、リンカー、Ｌ1を含む場合（例えば、ｍが１である）、いくつかの場合において、１つ以上のＲ3部分が放出されてから（例えば、切断可能なリンカーの切断、加水分解などにより）、Ｐｔが還元され、Ｒ1の残りの部分が放出され得る。同様に、Ｒ2がＯＨ又はＲ4である場合、Ｐｔの還元は水又はＲ4Ｈの放出をもたらすが、これは、上記で議論された通り、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分などであり得る。Ｒ2が、上述の通り、リンカー、Ｌ2を含む場合（例えば、ｘが１である）、いくつかの場合、１つ以上のＲ4部分が放出されてから（例えば、切断可能なリンカーの切断、加水分解などにより）、Ｐｔが還元され、Ｒ2の残りの部分が放出され得る。
【００４０】
式Ｉによる化合物のＲ3、及び任意選択でＲ4は、どのような好適なコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤でもよい。いくつかの実施形態において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。好適なＮＳＡＩＤＳの例には、アスピリン、サリチル酸塩（例えば、ナトリウム、マグネシウム、コリン）、セレコキシブ、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサレート、スリンダク、トルメチンナトリウム、バルデコキシブなどがある。いくつかの実施形態において、式Ｉによる化合物は、薬学的に活性な形態で放出可能な、以下のコンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤の１つ以上を含む：アスピリン（アセチルサリチル酸）；サリチル酸；スリンダクスルホン（（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１［ｐ−（メチルスルホニル）ベンジリデン］インデン−３−酢酸）；スリンダクスルフィド（（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−［ｐ−（メチルチオ）ベンジリデン］インデン−３−酢酸）；ＳＣ−５６０（５−（４−クロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−３−トリフルオロメチルピラゾール）；レスベラトロール（トランス−３，４，５−トリヒドロキシスチルベン）；プテロスチルベンスクシナート、（（Ｅ）−４−（４−（３，５−ジメトキシスチリル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸）；メロキシカム（４−（（２−メチル−３−（（５−メチルチアゾール−２−イル）カルバモイル）−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−イル）オキシ）−４−オキソブタン酸）；インドメタシンエステル、４−メトキシフェニル−（１−（ｐ−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸、４−メトキシフェニルエステル；インドメタシン１−（ｐ−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸；イブプロフェン；フルルビプロフェン（±）−２−フルオロ−α−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−酢酸）；ジクロフェナクナトリウム（２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、ナトリウム）；ジクロフェナク、４’−ヒドロキシ−（２−［（（２’，６’−ジクロロ−４’−ヒドロキシ）フェニル）アミノ］ベンゼン酢酸）、及びＣＯＸ−２阻害剤Ｉ（メチル［５−メチルスルホニル−１−（４−クロロベンジル）−１Ｈ−２−インドリル］カルボキシラート）。
【００４１】
上記で議論された通り、式Ｉによる化合物のＲ4は、コンジュゲートされた標的化部分であり得る。任意の好適な標的化部分が、本明細書に提示される教示に従って使用できる。本明細書では、「標的化部分」は、分子が対象に投与されるときに、標的化部分を欠く化合物に比べて、検討している組織、細胞などの中又はその近くで化合物の濃度を増加させる部分である。標的化部分は、例えば、癌標的化部分でも、ミトコンドリア標的化部分でもよい。標的化部分は、コンジュゲートされたシクロオキシゲナーゼ阻害剤に関して先に記載されたのに類似して、式Ｉによる化合物のＰｔにコンジュゲートされていても、式Ｉによる化合物のＰｔにコンジュゲートされたリンカーにコンジュゲートされていてもよい。標的化部分は、例えば、２０１４年４月８日に出願された「ミトコンドリア標的化シスプラチンプロドラッグ（ＭＩＴＯＣＨＯＮＤＲＩＡ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ  ＰＲＯＤＲＵＧ）」という名称の米国仮特許出願第６１／９７６，５５９号に記載のものと類似の方法で結びつけることができ、その出願は、本明細書に提示される開示と矛盾しない程度に引用により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
あらゆる好適な癌標的化部分を、本明細書に記載されるナノ粒子に結び付けることができる。癌標的化部分の例には、癌細胞に選択的であるか、又は過剰発現され、上方制御され、若しくは非癌細胞に見られない量で別な状態で存在する細胞表面抗原又はマーカーに結合する部分がある。
【００４３】
あらゆる好適なミトコンドリア標的化部分を使用できる。式Ｉによる化合物に組み込むことができるミトコンドリア標的化部分の例は、例えば、「アポトーシス標的化ナノ粒子（ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ）」という名称で２０１３年３月７日に公開された国際公開第２０１３／０３３５１３  Ａ１号パンフレットに記載されている。一実施形態において、ミトコンドリア標的化部分は、ミトコンドリアマトリックス中でナノ粒子の蓄積を促進する部分である。
【００４４】
ミトコンドリアマトリックス内でナノ粒子の蓄積を促進するあらゆる好適な部分を利用できる。内部ミトコンドリア膜をまたいでかなりの負の電気化学ポテンシャルが維持されているため、非局在化された親油性カチオンが、疎水性膜を越えてミトコンドリアマトリックス中に蓄積するのに効果的である。トリフェニルホスホニウム（ｐｈｏｓｏｐｈｏｎｉｕｍ）（ＴＰＰ）含有部分を使用して、ミトコンドリアマトリックス中で化合物の濃度を高めることができる。あらゆる好適なＴＰＰ含有化合物を、ミトコンドリアマトリックス標的化部分として使用できる。ＴＰＰ系部分の代表例は、式ＩＸ、式Ｘ、又は式ＸＩで以下に示される構造を有し得る：
【化１１】
2017500315.tif 000013
【化１２】
2017500315.tif 000014
式中、アミン（図示されている）は、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートされたリンカーにコンジュゲートされていてよい。もちろん、コンジュゲーションは、式ＩＸ、Ｘ、又はＸＩによる化合物の他の基によっても達成することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ミトコンドリアマトリックスを標的化する非局在化親油性カチオンは、以下に描かれる式ＸＩＩを有するローダミン１２３などのローダミンカチオンである：
【化１３】
2017500315.tif 000015
式中、二級アミン（図示されている）は、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートされたリンカーにコンジュゲートされていてよい。もちろん、コンジュゲーションは、式ＸＩＩによる化合物の別な基によっても達成できる。
【００４６】
もちろん、非カチオン性化合物は、ミトコンドリアマトリックスを標的化し、その中に蓄積するように作用し得る。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ミトコンドリアマトリックス中のナノ粒子を標的化し、蓄積するように作用し得る。あらゆる好適なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリアマトリックス標的化部分として使用できる。好適なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定的な例には、以下に描かれるそれぞれ式ＸＩＩＩ及び式ＸＩＶを有するＳＳ−０２及びＳＳ−３１がある：
【化１４】
2017500315.tif 000016
式中、二級アミン（図示されている）は、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートされたリンカーにコンジュゲートされていてよい。もちろん、コンジュゲーションは、式ＸＩＩ又はＸＩＶによる化合物の他の基によっても達成できる。
【００４７】
式Ｉによる化合物は、あらゆる好適な目的に使用できる。いくつかの実施形態において、式Ｉによる化合物は、癌、増殖性疾患、又は炎症性疾患を有する、患っている、又はそのリスクがある対象を治療するために使用される。
【００４８】
「癌を有する対象を治療すること」は、下記の１つ以上を部分的又は実質的に達成することを含む：癌の成長又は広がりを停止させること、癌の程度を減少させること（例えば、腫瘍のサイズを減少させること、又は罹患部位の数を減少させること）、癌の成長速度を抑制すること、及び癌に関連する臨床症状又は指標（組織又は血清成分など）を改良若しくは改善すること。
【００４９】
有効量の式Ｉによる化合物を対象に投与して、炎症性疾患を治療できる。治療可能な炎症性疾患には、局所炎症反応と全身性炎症反応の一方又は両方を特徴とする疾患、例えば、消化管及び関連組織を含む疾病（虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、及び十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、及び虚血性大腸炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、小児脂肪便症、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、及びウィップル病など）；全身性又は局所の炎症性疾患及び病態（喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、花粉症、敗血症、敗血症、エンドトキシンショック、カヘキシー、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、及びサルコイドーシスなど）；尿生殖器系（ｕｒｏｇｅｎｔｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）及び関連組織を含む疾病（敗血性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、及び尿道炎など）；呼吸器系及び関連組織を含む疾病（気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、成人呼吸窮迫症候群、肺臓炎、超微視的珪質火山塵肺疾患（ｐｎｅｕｍｏｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｓｉｌｉｃｏｖｏｌｃａｎｏｃｏｎｉｏｓｉｓ）、肺胞炎（ａｌｖｅａｌｉｔｉｓ）、細気管支炎、咽頭炎、肋膜炎、及び副鼻腔炎など）；種々のウイルス（インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びヘルペスなど）、細菌（播種性菌血症（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ）、デング熱など）、真菌（カンジダ症など）、並びに原生動物及び多細胞寄生生物（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、及び胞虫嚢腫など）による感染から生じる疾病；皮膚の皮膚科疾病及び病態（熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹疣贅、及び丘疹など）；心血管系及び関連組織を含む疾病（血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、鬱血性心不全、結節性多発動脈炎、及びリウマチ熱など）；中枢神経系又は末梢神経系及び関連組織を含む疾病（アルツハイマー病、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｍｅ−Ｂａｒｒｅ）症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、及びブドウ膜炎など）；骨、関節、筋肉、及び結合組織の疾病（種々の関節炎及び関節痛、骨髄炎、筋膜炎、ページェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、及び滑膜炎など）；他の自己免疫及び炎症性疾患（重症筋無力症、甲状腺炎（ｔｈｒｙｏｉｄｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー病、Ｉ型糖尿病を含む糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー病、及びラター（Ｒｅｔｉｅｒ’ｓ）症候群など）；院内（ｎｏｓｉｃｏｍａｌ）感染；並びに種々の癌、腫瘍、及び増殖性疾患（ホジキン病など）がある。
【００５０】
あらゆる好適な種類の癌は、有効量の式Ｉによる化合物を、その必要のある対象に投与することにより治療され得る。有効量の式Ｉによる化合物をその必要のある対象に投与することにより治療又は予防可能な癌には、ヒトの肉腫及び癌腫、例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、大腸癌、肛門癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、子宮内膜癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、心房粘液腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、甲状腺及び副甲状腺の新生物、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌腫、上皮癌、グリオーマ、下垂体新生物、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、メラノーマ、神経芽細胞腫、褐色細胞腫、１〜３型内分泌腺腫症、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）；及び真性多血病、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｂｍ’ｓ）マクログロブリン血症、及び重鎖病があるが、これらに限定されない。式Ｉによる化合物は、前立腺癌を有する対象の治療に特に効果的になり得ると考えられる。いくつかの実施形態において、有効量の式Ｉによる化合物が対象に投与されて、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）が治療される。
【００５１】
有効量の式Ｉによる化合物は対象に投与されて、非癌増殖性疾患が治療され得る。非癌性増殖性疾患には、平滑筋細胞増殖、全身性強皮症、肝硬変、成人呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、紅斑性狼蒼、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症又は他の網膜症、心臓過形成、良性前立腺肥大症及び卵巣嚢腫などの生殖系関連疾患、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、過誤腫（ｈａｒｍａｔｏｍａｓ）、リンパ管腫症、サルコイドーシス、類腱腫などがある。
【００５２】
「有効量」は、化合物が対象に投与される場合に有益な臨床成績が達成される化合物の量である。例えば、式Ｉによる化合物が癌を有する対象に投与される場合、「有益な臨床成績」には、腫瘍質量の減少、転移の減少、癌に関連する症状の重症度の減少、又は治療のない場合と比べた対象の寿命の増加がある。
【００５３】
対象に投与される化合物の精密な量は、疾病又は病態の種類及び重症度、並びに対象の特性、例えば、全般的な健康状態、年齢、性別、体重、及び薬物に対する耐容性などに依存する。それは、癌の程度、重症度、及び種類にも依存し得る。当業者は、これらの因子及び他の因子によって適切な用量を決定できるだろう。開示される化合物の有効量は、１日あたり約１ｍｇ／ｍｍ2から１日あたり約１０グラム／ｍｍ2の範囲になり得る。癌の治療のための別な抗癌剤と共投与される場合、第二の抗癌剤の「有効量」は、利用される薬物の種類によるだろう。好適な用量は認可された抗癌剤に関して公知であり、対象の病態、治療されている癌の種類、及び利用されている式Ｉによる化合物によって、当業者により調整できる。
【００５４】
種々の実施形態において、式Ｉによる化合物、又はその互変異性体、薬学的に許容できる塩、溶媒和物、若しくはクラスレートは、医薬組成物に含めることができる。医薬組成物は、化合物及び薬学的に許容できる担体又は希釈剤を含み得る。
【００５５】
好適な薬学的に許容できる担体は、好ましくは、式Ｉによる化合物の生物学的活性を阻害しない不活性な成分を含み得る。薬学的に許容できる担体は、好ましくは（ｐｅｒｆｅｒａｂｌｙ）生体適合性、すなわち非毒性、非炎症性、非免疫原性であり、対象への投与時に他の望ましくない反応が全くない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載の技法など、標準的な医薬製剤技法を利用できる。投与すべき化合物の製剤は、選択される投与経路により変わるだろう（例えば、液剤、乳剤、カプセル剤）。非経口投与用の好適な医薬担体には、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液などがある。組成物をカプセル化する方法（硬質ゼラチン又はシクロデキストリンのコーティング中など）は当技術分野に公知である（Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９８６）。
【００５６】
式Ｉによる化合物は、任意の好適な経路により、例えば、カプセル剤、懸濁剤、錠剤中で経口的にも、非経口投与によっても投与できる。非経口投与は、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、又は腹腔内注射による全身投与を含み得る。本発明の化合物は、治療すべき癌の種類によって、経口的にも（例えば、飲食）、局所的にも、吸入によっても（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入、又は点鼻剤）、直腸内にも投与できる。
【００５７】
いまや多くの新たな薬物が、癌を有する患者の治療に、腫瘍専門医が使用するのに利用可能である。複数の抗癌薬が組み合わされて患者に投与される場合、同じ薬物が個別且つ連続的に投与される場合よりも、腫瘍が治療に対して反応性があることが多い。この手法の利点の１つは、腫瘍細胞が、複数の作用機構を有する薬剤により同時に攻撃されるため、抗癌剤が相乗的に作用することが多いことである。そのため、これらの薬剤を組み合わせて投与することにより、より急速な腫瘍サイズの低下の達成が可能なことが多い。併用化学療法の別な利点は、腫瘍を完全に根絶する可能性が高く、患者の治療に利用されている抗癌剤に対する耐性が生じにくいことである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、式Ｉによる化合物はナノ粒子中に組み込まれる。式Ｉによる化合物を組み込むことができるナノ粒子の例には、例えば、「アポトーシス標的化ナノ粒子（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」という名称の公開されたＰＣＴ特許出願第２０１３／０３３５１３号パンフレット；「薬剤のミトコンドリア輸送のためのナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ）」という名称の公開されたＰＣＴ特許出願第２０１３／１２３２９８号パンフレット；「機能性樹状細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」という名称の公開されたＰＣＴ特許出願第２０１４／１２４４２５号パンフレット；及び「併用治療ナノ粒子（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」という名称の公開されたＰＣＴ特許出願第２０１４／１６９００７号パンフレットに記載されるナノ粒子があり、公開された特許出願のそれぞれは、本明細書に提示される開示と矛盾しない程度に、それぞれの全体として引用により本明細書に組み込まれる。ナノ粒子は、１種以上の式Ｉによる化合物に加えて、１種以上の抗癌剤又は抗増殖剤を含み得る。ナノ粒子は、上述の標的化部分などの、１種以上の標的化部分を組み込むことができる。
【００５９】
シスプラチン及びアスピリンをそれぞれの生物学的作用のために放出する能力を有するＰｔ（ＩＶ）プロドラッグ、プラチン−Ａ（式ＶＩＩによる化合物）を表す概略図を、図５に示す。
【００６０】
プラチン−Ａ及び他の式Ｉによる化合物は、非癌細胞の微小環境よりも酸性になる傾向がある癌細胞の微小環境中で還元されると考えられる。７．３５から７．４５という血液の狭いｐＨ範囲をミミックすることにより、ｐＨ７．４でのプラチン−Ａの還元電位が標準水素電極（ＮＨＥ）に対して−５３６ｍＶであることが見出された（図６）。調節不全のｐＨは、ほとんどの癌の適応性を示す特徴である。正常な細胞では、細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）は約７．２であり、約７．４の細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）より低い。癌細胞では、ｐＨｉは７．４より高く、ｐＨｅは７．１より低い。プラチン−Ａの還元性を、癌の低下した細胞外ｐＨｅをミミックするｐＨ  ６．４で試験した。６．４のｐＨ値で、４２ｍＶの正のシフトが観察され（図６）、癌微小環境中の低下したｐＨｅが、プラチン−Ａの還元によるシスプラチン及びアスピリンの放出を促進するだろうことが示された。
【００６１】
シスプラチンの際立った抗癌活性は、ＤＮＡ損傷につながるグアニン塩基のＮ７位に結合するその固有の能力による。プラチン−Ａのシスプラチンへの細胞内還元及び発生したシスプラチンのＤＮＡによる活性をミミックするために、プラチン−Ａが、ＤＮＡの短縮型としての２’−デオキシグアノシン５’−モノホスフェートナトリウム塩水和物（５’−ＧＭＰ）の存在下でアスコルビン酸ナトリウムにより還元され、生成物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間（ＴＯＦ）−質量分析法（ＭＳ）により分析された。プラチン−Ａ還元と、それに続く５’−ＧＭＰとの反応は、ＰｔＩＩ−５’−ＧＭＰ−ビス付加体［Ｐｔ（ＮＨ３）２（５’−ＧＭＰ−Ｎ７）２］（ｍ／ｚ＝９２２、図７）の形成を示した。５’−ＧＭＰとの結合試験は、プラチン−Ａの還元と同時に放出されるシスプラチンが、核ＤＮＡと効率よく相互作用するだろうということの有力な証拠を与えた。もう１つの薬物、アスピリンのプラチン−Ａからの放出はＨＰＬＣにより分析された（図８）。還元反応から得たＨＰＬＣクロマトグラム及びアスピリン及びサリチル酸の純粋な試料のクロマトグラムとのトレースの比較により、プラチン−Ａが、還元時に最初にアスピリンを生み出すことが示された。時間がたつにつれ、量が増えつつあるアスピリンの主代謝物、サリチル酸の形成が検出された（図８）。この観察は、それぞれＣＯＸ阻害活性及び抗炎症活性のための、プラチン−Ａからの元の形態のアスピリン部分の放出又はその最終代謝物形態の放出を支持した。
【００６２】
ＣＯＸ−２の高発現が種々の癌に見られるが、ＰＣａ細胞株並びに組織では矛盾した結果が存在する。そのため、発明者らは、アンドロゲン応答性ＬＮＣａＰ並びに悪性度が異なるアンドロゲン不応性（ａｎｄｒｏｇｅｎｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）ＰＣ３細胞とＤＵ１４５  ＰＣａ細胞に対する、プラチン−Ａの抗増殖性を試験した。プラチン−Ａは、ＰＣ３細胞中で、シスプラチン単独及びシスプラチンとアスピリンの等モル混合物に匹敵するＩＣ５０値を示した（図９、以下の表１）。同様な傾向が、プラチン−Ａ及びシスプラチンで、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞で観察された（図９、表１）。プラチン−Ａは、ＤＵ１４５において、シスプラチンとアスピリンの等モル混合物よりわずかに高いＩＣ５０値を示した。しかし、ＬＮＣａＰ細胞において、プラチン−Ａ活性はシスプラチンとアスピリンの等モル混合物より良好であった。一般に、Ｐｔ（ＩＶ）化合物は、その活性Ｐｔ（ＩＩ）形態に比べて細胞傷害性が低い。シスプラチンに匹敵するプラチン−Ａ、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグの細胞傷害性は、ＰＣａ細胞中でのその独特な抗増殖効力を示した。癌細胞増殖のプラチン−Ａ依存性の阻害がアポトーシスと関連するかどうかを評価するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色試験がＰＣ３細胞で実施され、データが、蛍光支援細胞選別により分析された。２日にＰＣ３細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）が、アスピリン（２５μＭ）、シスプラチン（２５μＭ）、シスプラチンとアスピリンの等モル混合物（２５μＭ）、及びプラチン−Ａ（２５μＭ）と共に６時間インキュベートされた。さらに、エトポシド（１００μＭ、１２時間）処理細胞及びＨ２Ｏ２（１ｍＭ、４５分）処理細胞を、それぞれ、アポトーシス及び壊死の陽性対照として使用した（図１０）。高レベルのアポトーシスがプラチン−Ａにより誘導された。プラチン−Ａのアポトーシス誘導性は、シスプラチン及びシスプラチンとアスピリンの等モル混合物に非常に類似していた。アスピリン単独は、これらの条件下で健康なＰＣ３集団に何も変化を示さなかった（図９Ｂ）。
【００６３】
【表１】
2017500315.tif 000017
【００６４】
プラチン−ＡのインビトロＣＯＸ阻害性が、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を利用して試験された。アスピリンが陽性対照として使用された（図１１、図１２）。プラチン−Ａは、濃度非依存的に、アスピリンにより示されたものと非常に類似した、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２の両方の阻害を示した。アスピリンは、サリチル酸よりも、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２の阻害剤として強力であることが知られている。プラチン−Ａの同等なＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害性は、アスコルビン酸ナトリウムによるプラチン−Ａ還元の発明者らのＨＰＬＣ分析により支持される通り、プラチン−Ａの還元が最初にアスピリンを放出することを示した。これらの際立ったプラチン−ＡのＣＯＸ阻害性は、腫瘍関連炎症の減少におけるその能力を示した。
【００６５】
多くの癌が、ＣＯＸ−２のレベル上昇を示すが、ＣＯＸ−２のＰＣａへの寄与及び炎症性サイトカインによるその制御には議論の余地がある。基礎的なＣＯＸ−２レベルはＰＣ３細胞において非常に低く、３種の試験物品全ての存在下で効果は全く観察されなかった（図１３Ａ、図１４）。したがって、発明者らは、ＣＯＸ−２プロモーター中の核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）結合モチーフによるその強力なＣＯＸ−２遺伝子発現誘導性のために、ＣＯＸ−２誘導性サイトカイン腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に応答したＣＯＸ−２レベルの増大を調査した（図１３Ｂ、図１４）。ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）による２時間のＰＣ３細胞の処理と、それに続くプラチン−Ａ（１μＭ）、シスプラチンとアスピリン（１μＭ）、及びアスピリン（１μＭ）による２時間の処理時のＣＯＸ−２発現パターンの調査を試験した。増加したＣＯＸ−２発現が、ＴＮＦ−αに刺激されたＰＣ３細胞に観察され、そのレベルは、プラチン−Ａによる処理時に低下した（図１３Ｂ、図１４）。シスプラチンとアスピリンの等モル混合物は、これらの活性化細胞に対して、顕著さの低い効果を示し、アスピリンにより示される阻害のレベルは、プラチン−Ａにより観察されるものに類似していた（図１３、図１４）。プラチン−Ａによる細胞ＣＯＸ−２の著しい阻害は、腫瘍関連炎症を減少させるその独特な能力をさらに支持した。
【００６６】
慢性炎症は、ＰＣａを含むヒト癌の進行に重要になり得る。炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−α及びインターロイキン（ＩＬ）−６は、癌の増殖、生存、転移、及び免疫監視機構からの逃避にとって重要になり得る。癌細胞上のトール様受容体（ＴＬＲ）の活性化による慢性炎症は、免疫系の抗腫瘍機能を損ない、発育及び生存を可能にする腫瘍微小環境を作り出す。サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−６は、炎症誘導性発癌の主要な調節物質、ＮＦ−κＢの強力な活性化物質である。ＴＮＦ−αの分泌増大は、シスプラチン腎毒性を媒介する。抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０は、シスプラチンにより誘導される急性腎損傷における炎症性及び細胞傷害性経路を阻害する。腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）からのＴＬＲ媒介性の炎症性サイトカイン産生は、腫瘍進行、転移、及び癌細胞転移に主要な役割を果たす。したがって、発明者らは、癌の炎症性環境をミミックするために、ＴＬＲ４の外因性リガンドであるリポ多糖（ＬＰＳ）により活性化されたＲＡＷ  ２６４．７マクロファージに対するプラチン−Ａの作用を調査した。最初に、発明者らは、ＬＰＳにより刺激されたＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ中の炎症性サイトカイン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及び抗炎症ＩＬ−１０産生に対するプラチン−Ａ、シスプラチン、シスプラチンとアスピリンの組み合わせ、及びアスピリンの作用を評価した。ＬＰＳによるＲＡＷ細胞の刺激は、対照条件下で生じたものに比べて、ＩＬ−６とＴＮＦ−αの産生を著しく増加させた（図１５Ａ）。発明者らの実験条件下で、ＬＰＳによる刺激時にＲＡＷマクロファージからのＩＬ−１０の分泌を、発明者らは全く観察しなかった。次いで、発明者らは、プラチン−Ａが、ＬＰＳにより誘導された炎症性サイトカインＩＬ−６、ＴＮＦ−αの産生を減少させるかどうか、及び抗炎症ＩＬ−１０の誘導の可能性を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用して試験した。ＬＰＳにより活性化されたマクロファージの１０μＭのプラチン−Ａによる１２時間の処理は、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルを著しく低下させた。同条件下でのシスプラチンは、これらのサイトカインのレベルに対して全く作用を示さなかった（図１５Ａ）。サイトカインレベルの低下が、単にプラチン−Ａの細胞傷害性によるものである可能性を除外するために、細胞生存率を評価した。プラチン−Ａ（１０μＭ）は、２４時間インキュベートされた場合に、細胞生存率に影響しなかった（図１６）。ＩＬ−１０は、種々の炎症性サイトカインの産生及び活性を阻害でき、これらの制御性マクロファージは、多くの炎症性サイトカインを産生する能力を保持している事実にもかかわらず、炎症の強力な阻害因子である。プラチン−Ａの存在下でのＬＰＳにより活性化されたマクロファージによるＩＬ−１０の分泌は、その独特な抗炎症を示した。
【００６７】
発明者らは、ＬＰＳ刺激前のマクロファージに対するプラチン−Ａの前処理の効果を評価した。図１５Ｂに示されるように、ＬＰＳによるＲＡＷマクロファージの刺激は、１２時間後に、細胞条件培地中のＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルを著しく増加させた。プラチン−Ａによるこれらのマクロファージの前処理は、１０μＭの低濃度で、ＬＰＳにより誘発されたＩＬ−６とＴＮＦ−αの産生を著しく阻害した。プラチン−ＡとＬＰＳによる前処理の組み合わせは、ＩＬ−１０のレベルを上昇させた（図１５Ｂ）。これらの結果を合わせると、プラチン−Ａが炎症反応を削減するのに効率的であることが示された。シスプラチン、アスピリン、及びシスプラチンとアスピリン組み合わせの等モル混合物によるマクロファージの前処理は、ＬＰＳ刺激に対して予防作用を全く示さなかった。
【００６８】
発明者らのデータに基づいて、発明者らは、可能性のあるプラチン−Ａの作用機序を図１７に描写した。プラチン−Ａは、酸性で還元性の腫瘍微小環境中で還元されて、活性薬物シスプラチン及びアスピリンを放出すると予測される。活性形態のＰｔ（ＩＩ）は、種々の技法により示される通り、核ＤＮＡに作用する。アスピリンはＣＯＸ酵素を阻害し、その代謝物サリチル酸と共に、ＥＬＩＳＡ実験により示される通り、ＴＡＭ中の炎症反応のレベルを制御する。プラチン−Ａは、抗癌性、ＣＯＸの阻害、及び効率的な抗炎症プロファイルを示す独特な能力を示した。
【００６９】
まとめると、独特な化学抗炎症分子（ｃｈｅｍｏ−ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、プラチン−Ａ、シスプラチンとアスピリンのプロドラッグが合成され、特性化された。プラチン−Ａの好ましい還元パターンが観察されて、生物活性のあるＰｔ（ＩＩ）形態が放出され、それに伴ってアスピリンが遊離した。プラチン−Ａは、ＰＣａ細胞においてシスプラチンに匹敵する細胞傷害性プロファイルを示し、独特なアポトーシス誘導効力を示した。アスピリン分子を有するその特徴的な処方により、プラチン−Ａは、シスプラチンに関連する腎毒性及び聴覚毒性を減少させる能力と共に、抗炎症効果を示した。ＴＮＦ−αをＣＯＸ−２誘導因子として使用して、発明者らは、ＰＣ３細胞中のＣＯＸ−２レベルを増加させることができ、細胞内ＣＯＸ−２を阻害するプラチン−Ａの独特な能力を観察した。プラチン−Ａは、ＬＰＳに誘導された炎症を起こしたマクロファージ中で効率的な抗炎症性を示した。これらの結果は、慢性炎症を特徴とする癌の潜在的な候補としてのプラチン−Ａのさらなる開発を促す。この研究は、アスピリンなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はＮＳＡＩＤを、単一のプロドラッグの形態でシスプラチン治療レジメンに独自に組み合わせて、効率を増加させ、聴覚毒性などの化学療法の副作用を減少させる機会を強調した。
【００７０】
本明細書で使用される全科学技術用語は、特記されない限り、当技術分野で通常使用される意味を有する。本明細書で与えられる定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を助けるためのものであり、本開示の範囲を限定しないものとする。
【００７１】
本明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される通り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容によりそうでないと明らかに示されない限り、複数の指示対象を有する実施形態を包含する。本明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される通り、用語「又は（ｏｒ）」は、内容によりそうでないと明らかに示されない限り、「及び／又は」を含むその意味で一般的に使用される。特定の場所における「及び／又は」の使用は、他の場所における「又は」の使用が「及び／又は」を意味し得ないことを意味するものではない。
【００７２】
本明細書では、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、その開放式の意味で使用され、一般的に「含むが、それに限定されない」を意味する。「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などが、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などに包含されることが理解されるだろう。
【００７３】
本明細書では、「疾病」は、正常な機能を損なう生物又はその１つ以上の部分の状態を意味する。本明細書では、疾病という用語は、疾病、疾患、病態、機能不全などを包含する。
【００７４】
本明細書では、「治療する」などは、疾病の１つ以上の症状を治癒し、予防し、又は改善することを意味する。
【００７５】
本明細書では、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合した（ｂｏｕｎｄ）」、「コンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」などは、化学物質が、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  ｗａｌｌｓ）力などの任意の好適な種類の結合により連結していることを意味する。「結合する」、「結合した」などは、本明細書において、「結び付けられる（ａｔｔａｃｈ）」、「結び付けられた（ａｔｔａｃｈｅｄ）」などと互換的に使用される。好ましくは、「コンジュゲートされた」は、本明細書において共有結合を指すように使用される。
【００７６】
本明細書に記載される化合物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を含むことがあり、そのため、二重結合異性体（すなわち幾何異性体）、エナンチオマー、又はジアステレオマーなどの立体異性体として存在し得る。本開示の目的のため、式Ｉによる化合物を含む、本明細書に描かれている化学構造は、対応する化合物のエナンチオマー、ジアステレオマー、及び幾何異性体の全て、すなわち、立体化学的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、エナンチオマー的に純粋、又はジアステレオマー的に純粋）と異性体混合物（例えば、エナンチオマー的な、ジアステレオマー的な、及び幾何学的な異性体混合物）の両方を包含する。いくつかの場合において、１つのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は幾何異性体は、他の異性体に比べて、優れた活性、又は改善された毒性若しくは反応速度プロファイルを有するだろう。それらの場合において、本発明の化合物のそのようなエナンチオマー、ジアステレオマー、及び幾何異性体が好ましい。
【００７７】
開示される化合物が構造により命名されるか、又は描かれる場合、化合物又はその薬学的に許容できる塩の溶媒和物（例えば、水和物）も含まれることが理解されよう。「溶媒和物」は、溶媒分子が結晶化の間に結晶格子中に組み込まれた結晶形を指す。溶媒和物は、水又は、非水性溶媒、例えば、エタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、エタノールアミン、及びＥｔＯＡｃなどを含み得る。水が、結晶格子中に組み込まれた溶媒分子である溶媒和物は、典型的には、「水和物」と呼ばれる。水和物は、非共有結合の分子間力により結合した化学量論量又は非化学量論量の水を含む。
【００７８】
開示される化合物が構造により命名されるか、又は描かれる場合、溶媒和物を含む化合物が、結晶形、非結晶形、又はその混合物として存在し得ることが理解できよう。化合物又は溶媒和物は、多形も示し得る（すなわち、異なる結晶形で存在する能力）。これらの異なる結晶形は、典型的には、「多形体」として知られている。構造により命名されるか、又は描かれている場合、開示される化合物及び溶媒和物（例えば、水和物）がその全多形体も含むことが理解されよう。本明細書では、用語「多形体」は、化合物又はその錯体の固体の結晶形を意味する。同じ化合物の異なる多形体は、異なる物理的、化学的、及び／又は分光学的な性質を示し得る。異なる物理的性質には、安定性（例えば、熱又は光に対する）、圧縮性及び密度（製剤及び製品製造において重要）、及び溶解速度（バイオアベイラビリティに影響し得る）があるが、これらに限定されない。安定性の差は、化学的反応性の変化からも（例えば、剤形がある多形体で構成されている場合に、別な多形体で構成されている場合よりも迅速に変色するような示差酸化）、機械的特性からも（例えば、速度論的に有利な多形体が熱力学的により安定な多形体に転化するにつれて、錠剤が貯蔵時に崩壊する）、両方からも（例えば、ある多形体の錠剤が、高湿度でより分解しやすい）生じ得る。多形体の異なる物理的性質は、その加工に影響し得る。例えば、ある多形体は、溶媒和物をより形成しやすいことがあり、又は、例えば、その粒子の形状又はサイズ分布により、別な多形体よりも濾過又は洗浄して不純物を除くことが困難であり得る。さらに、ある多形体は、特定の条件下で、別な多形体に自然に転化することがある。
【００７９】
開示される化合物がその構造により命名されるか、又は描かれる場合、化合物、又はその薬学的に許容できる塩、溶媒和物、若しくは多形体のクラスレート（「包摂化合物」）も包含されることが理解できよう。本明細書では、用語「クラスレート」は、ゲスト分子（例えば、溶媒又は水）を捕捉している空間（例えば、チャネル）を含む結晶格子の形態にある本発明の化合物又はその塩を意味する。
【実施例】
【００８０】
実験セクション
材料及び装置。化学薬品は全て、特記されない限り、さらに精製せずに受け取り使用した。シスプラチンは、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入した。アスピリン、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、過酸化水素溶液（３０重量％水溶液）、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１０、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）サイトカインは、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡマウス酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。超純粋リポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡから購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アネキシンＶ／死細胞アポトーシスキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＣＯＸ（ヒツジ）阻害剤スクリーニングアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌアイテム番号５６０１０１）は、Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡから調達した。ＣＯＸ−２の一次ウサギポリクローナル抗体はＡｂｃａｍから調達し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ヒトＴＮＦ−αはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから調達した。Ｋ2ＰｔＣｌ4、２’−デオキシグアノシン５’−モノホスフェートナトリウム塩水和物（５’−ＧＭＰ）、及びアスコルビン酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。電気化学のためのＫＣｌは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００８１】
蒸留水は、０．２２μｍフィルターを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ水精製システム（１８．２ＭΩ）に通して精製した。１Ｈ及び１３Ｃスペクトルは４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ分光計で記録し、195Ｐｔ  ＮＭＲスペクトルは、Ｋ2ＰｔＣｌ4を外部標準として使用して５００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ分光計で記録した。プレートリーダー分析を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーで実施した。フローサイトメトリー試験を、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ６を使用するデジタル取得を備えたＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで実施した。共焦点像は、ニコンＡ１共焦点顕微鏡で記録した。エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）及び高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）−ＥＳＩは、それぞれＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  １  ｐｌｕｓ及びＴｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ  ＥＬＩＴＥ装置で記録した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間（ＴＯＦ）−質量分析法（ＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ（ＴＯＦ）質量分析計で実施した。電気化学測定は、２５℃で、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の分析システムモデルＣＨＩ  ９２０ｃポテンショスタットで行った。ＦＴＩＲスペクトルは、圧縮されたＫＢｒ錠剤として調製された試料を使用して、ＯＭＮＩＣソフトウェアを備えたＴｈｅｒｍｏ−Ｎｉｃｏｌｅｔ  ６７００分光光度計で集めた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、多波長ＵＶ−可視光検出器及び蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ装置で実施した。細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから調達したＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して計数した。
【００８２】
細胞株及び細胞培養。ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、及びＤＵ１４５並びにＲＡＷ  ２６４．７マクロファージは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から調達した。ＤＵ１４５細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２中で成長させた。ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、及びＲＡＷ  ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で成長させた。細胞は、３から４日ごとに継代し、継代数２０に達すると凍結ストックから再開した。
【００８３】
２−アセトキシ安息香酸無水物（アスピリン無水物）の合成：２−アセトキシ安息香酸（５．０ｇ、２８ｍｍｏｌ）の３０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の懸濁液を調製し、ＤＣＣ（２．９ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の１０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の溶液を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。副生成物、ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）をガラスフィルター中に濾去し、少量のＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。溶媒を蒸発させ、生じた残渣を酢酸エチルに溶解させた。生じた懸濁液をガラスフィルターに通して濾過して残留ＤＣＵを除いた。濾液を蒸発させると無水物を透明な濃い油として与えたが、−２０℃で保存すると凝固した。収量４．６ｇ、定量的。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δｐｐｍ，８．０８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．７０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），２．３１（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）：δ１６９．４２，１５９．２９，１５１．８３，１３５．５４，１３２．２４，１２６．２９，１２４．４２，１２１．６９，２０．８９。ＩＲ（ＫＢｒ）υｍａｘ（ｃｍ−１）：３５７０（ｗ），３４９１（ｗ），３４４５（ｗ），３３３２（ｂｒ），３２０５（ｗ），３１００（ｓ，Ｃ−Ｈ），２９３２（ｓ，Ｃ−Ｈ），２８５５（ｗ），２４０９（ｗ），２０３２（ｗ），１７８９（ｂｒ，Ｃ＝Ｏ），１７２８（ｂｒ，Ｃ＝Ｏ），１６０３（ｓ，Ｃ＝Ｃ），１５８１（ｓ），１４８４（ｓ，δａｓＣＨ3），１４５１（ｓ），１３６９（ｓ，δｓＣＨ3），９１６（ｓ）。５０６（ｓ）。ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ、Ｃ18Ｈ14ＮａＯ7の計算値：（Ｍ＋Ｎａ）＋３６５．０６３７。実測値３６５．０６３８。融点：８０−８５℃。
【００８４】
ｃ，ｃ，ｔ−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2（ＯＨ）2］の合成：過酸化水素（３０重量％、６０ｍＬ）を、シスプラチン（１．０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を含む丸底フラスコに滴加した。反応混合物を７５℃に５時間加熱した。山吹色の溶液を、暗所で一晩、室温に保ち、生成物の結晶化を可能にした。黄色の結晶を濾過により分離し、冷水で洗浄し、乾燥させると１ｇの化合物を得た。収率９０％。ＩＲ（ＫＢｒ）υｍａｘ（ｃｍ−１）：３８０３（ｗ），３５１５（ｗ），３４５８（ｂｒ，ＯＨ），３２６９（ｗ），１５８２（ｓ），１４４２（ｓ），１３７８（ｓ），１０７４（ｍ，Ｐｔ−ＯＨ），８６０（ｂｒ），５４２［ｂｒ，Ｐｔ−Ｎ（Ｏ）］。ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃｌ2Ｈ9Ｎ2Ｏ2Ｐｔの計算値：（Ｍ＋Ｈ）＋  ３３３．９６８９。実測値３３３．９６８３。融点：２９５−３００℃。
【００８５】
プラチン−Ａの合成。ｃ，ｃ，ｔ−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2（ＯＨ）2］（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）とアスピリン無水物（１０２．５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の６０ｍＬのジメチスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の混合物を室温で２４時間撹拌し、それに続いて６５℃で１２時間撹拌すると、透明な黄色の溶液を得た。反応混合物を１５℃に冷却し、複数のジエチルエーテル洗液と共に濃縮することによりＤＭＳＯを除去した。粗生成物をアセトニトリルに懸濁させ、ジエチルエーテルで沈殿させた。このプロセスを、最終生成物が完全にアセトニトリルに可溶になるまで、繰り返した。最後に、プラチン−Ａのアセトニトリル溶液をジエチルエーテルにより沈殿させることにより、黄色を帯びた白色の固体として生成物を単離した。収率１７％（２５ｍｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）（図Ｓ３）：δｐｐｍ，７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．４７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．００（ｍ，６Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）（図Ｓ３）：δｐｐｍ，１６９．６，１４９．７，１３２．３，１３２．０，１２８．６，１２５．６，１２３．９，２１．８。１９５Ｐｔ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１０７．６ＭＨｚ）（図Ｓ４）：δｐｐｍ  １０２０．４。ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ9Ｈ15Ｃｌ2Ｎ2Ｏ5Ｐｔの計算値：（Ｍ＋Ｈ＋）４９６．００００。実測値４９５．９９９０（図Ｓ５）。ＩＲ（ＫＢｒ）υｍａｘ（ｃｍ−１）：３４８５（ｂｒ），３２２６（ｂｒ），１７３８（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６０５（ｓ，Ｃ＝Ｃ），１５６７（ｍ，Ｃ＝Ｃ），１４８２（ｍ，δａｓＣＨ３），１４５０（ｍ），１３３９（ｂｒ，δｓＣＨ3），１２２６（ｍ），１１９８（ｓ，Ｐｔ−ＯＨ），１０１８（ｗ），７５８（ｍ），５８０［ｍ，Ｐｔ−Ｎ（Ｏ）］。融点：１１０−１１５℃。
【００８６】
プラチン−Ａの代替合成：ｃ，ｃ，ｔ−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2（ＯＨ）2］（１４２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）とアスピリン無水物（５３７ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（６０ｍＬ）中の混合物を、６５℃で４８時間撹拌すると、透明な黄色の溶液を得た。注意：アスピリン無水物を、少量ずつ、すなわち、０時間で１７５ｍｇ、１２時間で１４４ｍｇ、及び２０時間で２１８ｍｇ加えた。ＤＭＦをロータリーエバポレーションにより除去した。粗生成物をアセトニトリルに再懸濁させ、ジエチルエーテルにより沈殿させた。このプロセスを、最終生成物が完全にアセトニトリルに可溶になるまで、繰り返した。最後に、プラチン−Ａのアセトニトリル溶液をジエチルエーテルにより沈殿させることにより、生成物を、黄色を帯びた白色の固体として単離した。収率２７％（５６ｍｇ）。
【００８７】
サイクリックボルタンメトリー。電気化学的測定を、２５℃で、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の分析システムモデルＣＨＩ  ９２０ｃポテンショスタットで実施した。ガラス状炭素作用電極、白金ワイヤー補助電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）参照電極を含む従来の３電極構成を、電気化学的測定に使用した。電気化学的データは、接続電位に関して補正しなかった。ＫＣｌを、支持電解質として使用した。プラチン−Ａ（２ｍＭ）溶液を、０．１ｍＭ  ＫＣｌと共に、ｐＨ  ６．４及び７．４の２０％  ＤＭＦ−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、ボルタモグラムを異なるスキャン速度で記録した（図６）。
【００８８】
Ｐｔ−ＧＧ測定：プラチン−Ａ（１．４８５ｍｇ、０．００３ｍＭ）を、アセトニトリル−水（１：２、３ｍＬ）に溶かし、２’’−デオキシグアノシン５’’−モノホスフェートナトリウム塩水和物（５’−ＧＭＰ）（５．２０ｍｇ、０．０１５ｍＭ）、及びアスコルビン酸ナトリウム（２．６４ｍｇ、０．０１５ｍＭ）を加え、この混合物を３７℃で２４０時間インキュベートした。こげ茶色の溶液を凍結乾燥した。生じた残渣を水に溶かし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した（図７）。
【００８９】
逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ）（ＲＰＨＰＬＣ）によるプラチン−Ａからのアスピリン放出：還元性雰囲気下でプラチン−Ａがアスピリンを放出する能力を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。プラチン−Ａ（２．９７ｍｇ、２ｍＭ）の還元を、アセトニトリル−水（１：２、３ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（５．２８ｍｇ、１０ｍＭ）を使用して実施し、還元生成物をＨＰＬＣにより調べた。アスピリン（２ｍＭ）及びサリチル酸（２ｍＭ）を、クロマトグラム中のアスピリン及びサリチル酸ピークと照合する対照として使用した。各溶液５μＬを、Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８カラム及びｐＨ  ７．０の６０：４０アセトニトリル（１％トリフルオロ酢酸）：酢酸アンモニウム緩衝液を移動相として使用して注入した。これらの実験に使用した波長は２８０ｎｍであった（図８）。
【００９０】
（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド又はＭＴＴアッセイ及びデータ分析。シスプラチン、アスピリン、シスプラチン＋アスピリン、及びプラチン−Ａの細胞傷害性挙動を、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、及びＲＡＷ  ２６４．７細胞に対して、ＭＴＴアッセイを利用して評価した。細胞（ＰＣ３、及びＤＵ１４５細胞では２０００細胞／ウェル；ＬＮＣａＰ及びＲＡＷ  ２６４．７では１００００細胞／ウェル）を、９６−ウェルプレートで１００μＬの所望の培地に播種し、２４時間インキュベートした。細胞を、種々の濃度で異なるコンストラクトにより処理し、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ以外、３７℃で７２時間インキュベートした。マクロファージには２４時間のインキュベーション時間を利用した。次いで、細胞を２０μＬのＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）で５時間処理した。培地を除去し、細胞を１００μＬのＤＭＳＯで溶解させ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーを利用して、紫色のホルマザンの吸光度を５５０ｎｍで記録した。各ウェルを三連で実施した。細胞傷害性を、曝露されていない対照に対する平均増加パーセンテージ±ＳＤで表した。対照値を、０％細胞傷害性又は１００％細胞生存率と設定した。細胞傷害性データ（適切な場合）をＳ字状曲線にフィッティングし、３パラメーターロジスティックモデルを使用してＩＣ50を計算したが、これは、処理されていない対照に比べて５０％阻害を起こす化学療法剤の濃度である。平均ＩＣ50は、実験条件下で細胞成長を５０％低下させる薬剤の濃度であり、再現性があり統計的に有意な少なくとも４つの独立した測定値の平均である。ＩＣ50値は、±９５％信頼区間で報告した。この分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）により実施した。
【００９１】
アネキシンＶアッセイによるアポトーシス検出。ＰＣ３細胞を、６ウェルプレートの各ウェルで、１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、一晩成長させた。培地を変え、細胞を、２５μＭシスプラチン、２５μＭアスピリン、シスプラチン（２５μＭ）とアスピリン（２５μＭ）の混合物、及び２５μＭのプラチン−Ａにより３７℃で８時間処理した。陽性対照として、アポトーシスのためのエトポシド（１００μＭ、インキュベーション時間：１２時間）及び壊死のためのＨ2Ｏ2（１ｍＭ、インキュベーション時間：４５分）を使用した。細胞をトリプシン処理し、繰り返し洗浄し、１，８００毎分回転数（ＲＰＭ）で３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞密度を測定し、細胞を、１×アネキシンＶ結合緩衝液中で１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、アッセイあたり１００μＬを有するのに充分な体積を調製した。１００μＬの細胞懸濁液に、５μＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アネキシンＶ及び１μＬの１００μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）希釈標準溶液を加え、１５分間室温でインキュベートした。インキュベーション期間の後、４００μＬの１×アネキシン−結合緩衝液を各試料に加え、試料を氷上に保ったまま試料を穏やかに混合し、試料を直ちにフローサイトメーターで分析した。
【００９２】
インビトロＣＯＸ阻害アッセイ。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ番号５６０１０１）の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）キットを使用して、プラチン−ＡがヒツジＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２を阻害する能力を評価した。ＣＯＸ阻害アッセイは、製造業者のプロトコルの通りに実施した。ストック溶液は全て、製造業者の説明に従って調製した。この阻害アッセイは、２段階のプロセス：ＣＯＸ反応及びＥＩＡを利用して実施した。ＣＯＸ反応は、以下の試料の調製を含んでいた。
（ｉ）バックグラウンド試料：ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２を、２０μＬの各酵素をエッペンドルフチューブに移し、チューブを沸騰水中に３分間配置することにより不活性化した。不活性化の後に、９７０μＬの反応緩衝液、１０μＬのヘム、及び１０μＬの不活性ＣＯＸ−１又は不活性ＣＯＸ−２を試験管に加えた。
（ｉｉ）ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２  １００％初期活性試料：９５０μＬの反応緩衝液、１０μＬのヘム、１０μＬのＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２、及び２０μＬの反応緩衝液を各試験管に加えた。
（ｉｉｉ）ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２阻害剤試料：９５０μＬの反応緩衝液、１０μＬのヘム、１０μＬのＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２、及び２０μＬの異なる濃度（ＣＯＸ−１では、０．２５、０．５、０．７５、１、及び１．５ｍＭ；ＣＯＸ−２では、０．７５、１、１．２５、１．５、及び２ｍＭ）の検討中のＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害剤、アスピリン及びプラチン−Ａを、各試験管に加えた。
【００９３】
全試料を、３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。１０μＬのアラキドン酸を全試料に加えることにより反応を開始させた。これらの試料をボルテックスにかけ、３７℃の水浴中でさらに２分間インキュベートした。５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌを各試験管に加えて、酵素触媒作用を止めた。試験管を水浴から取り出し、１００μＬの飽和塩化第一スズ溶液を各試験管に加え、この混合物をボルテックスにかけた。これらの試料を室温で５分間インキュベートした。バックグラウンド試料を１：１００倍に希釈し、ＣＯＸ  １００％初期活性試料及びＣＯＸ阻害剤試料を１：２０００倍に希釈した。
【００９４】
ＥＩＡのために、１００μＬのＥＩＡ緩衝液を非特異的結合ウェルに加え、５０μＬのＥＩＡ緩衝液を最大結合ウェルに加えた。５０μＬのＰＧスクリーニングスタンダードを各標準ウェルに加えた。５０μＬのバックグラウンド試料をバックグラウンド試料ウェルに加えた。５０μＬのＣＯＸ  １００％初期活性試料を特異的ウェルに加えた。５０μＬのＣＯＸ阻害剤試料、アスピリン及びプラチン−Ａ試料を、特異的ウェルに加えた。５０μＬのＰＧスクリーニングアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）トレーサーを、全活性及びブランクウェルを除き全ウェルに加えた。５０μＬのＰＧスクリーニングＥＩＡ抗血清を、全活性、非特異的結合、及びブランクウェルを除き全ウェルに加えた。ＥＩＡプレートをプラスチックフィルムで覆い、オービタルシェーカー上で、室温で１８時間インキュベートした。ウェルを空にし、洗浄緩衝液で５回すすいだ。エルマン試薬（２００μＬ）を各ウェルに加え、それに続いて、５μＬのトレーサーを全活性ウェルに加えた。ＥＩＡプレートを再びプラスチックフィルムで覆い、次いで、オービタルシェーカー上で、暗所で、室温で１時間インキュベートした。プレートリーダーを使用し、４１０ｎｍの波長で吸光度を記録した。
【００９５】
ＰＣ３細胞中のヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）を使用するＣＯＸ−２の誘導及びプラチン−ＡによるＣＯＸ−２阻害の免疫蛍光法分析。ＰＣ３細胞を、１×１０６細胞／ｍＬの濃度でガラスカバーガラスに播種し、一晩成長させた。次いで、細胞を血清除去培地中で２４時間成長させた。次いで、ヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）を細胞に加え、２時間インキュベートした。プラチン−Ａ（１μＭ）、アスピリン（１μＭ）、及び等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１μＭ）を細胞に加え、さらに２時間インキュベートした。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により、３０分間室温で固定化した。次いで、細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により、１５分間室温で透過処理した。細胞を、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ヤギ血清、０．０７５％グリシン）により１時間室温でブロッキングした。ＣＯＸ−２用の一次ウサギポリクローナル抗体（ブロッキング緩衝剤中２．５μｇ／ｍＬ）を加え、インキュベーションを４℃で１２時間実施した。カバースリップを、水で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液で５回洗浄した後、細胞を、封入剤（ｐＨ  ８．０の２０ｍＭトリス、０．５％の没食子酸ｎ−プロピル、及び７０％グリセロール）と共に顕微鏡スライドに載せた。ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣフィルターを使用して、５００ｍｓの露光で画像を集めた。相対蛍光単位（ＲＦＵ）も、プレートリーダーにより、４８８ｎｍの励起波長及び５１９ｎｍの発光波長で分析した。
【００９６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるプラチン−Ａの抗炎症性。ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、１０，０００細胞／ｍＬの濃度で、９６プレートに播種し、一晩成長させた。予防的な抗炎症処理のために、プラチン−Ａ（１０μＭ）、アスピリン（１０μＭ）、シスプラチン（１０μＭ）、及び等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１０μＭ）を、ＲＡＷ細胞と共に６時間インキュベートした。リポ多糖（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、細胞をさらに１２時間インキュベートした。治療的な抗炎症処理のため、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）をＲＡＷ細胞に加え、６時間インキュベートした。次いで、プラチン−Ａ（１０μＭ）、アスピリン（１０μＭ）、シスプラチン（１０μＭ）、及び等モル比のシスプラチンとアスピリン（それぞれ１０μＭ）を細胞に加え、１２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡを、サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−αに対して、上清に実施した。簡単に言うと、抗体を被覆したプレートを、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳにより１時間室温でブロックし、それに続いて３回洗浄した。ＲＡＷ細胞上清を、プレート上で、２時間室温でインキュベートした。これの後に、直ちに洗浄し、サイトカイン−ビオチンコンジュゲート及びストレプトアビジン希釈標準溶液と共に連続的にインキュベートした。最後に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを含む基質試薬（１００μＬ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートし、５０μＬのＨ２ＳＯ４（０．１Ｍ）を加えて反応を止めた。ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  ｗｅｌｌプレートリーダーを利用して、吸光度を４５０ｎｍで記録した。
【００９７】
ボウタイ化合物の合成。プラチン−Ａｚ（０．０７２ｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）とＡｃ−［Ｇ２］−（Ａｓｐ）4（０．５０３ｇ、０．４７０ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０３０ｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）との１０ｍＬジメチホルムアミド（ＤＭＦ）中の混合物を、不活性ガスのパージ下で、１時間室温で撹拌した。ＣｕＩ（０．０２２ｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を、この反応混合物に加え、撹拌を３時間継続した。ロタバック（ｒｏｔａｖａｃ）を使用して溶媒を除去した。粗生成物をアセトニトリルに懸濁させ、ジエチルエーテルにより沈殿させた。最後に、アセトニトリル溶液をジエチルエーテルにより沈殿させることにより、黄色を帯びた白色の固体として生成物を単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，４００ＭＨｚ）：δｐｐｍ，７．８５（ｄ，８Ｈ），７．６６（ｔ，８Ｈ），７．３４（ｔ，８Ｈ），７．２２（ｄ，８Ｈ），６．５３（ｍ，６Ｈ），４．３８（ｓ，１２Ｈ），４．１６（ｍ，２０Ｈ），２．２０（ｓ，２４Ｈ），１．７８（ｍ，１０Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２３（ｍ，１８Ｈ），１．３０８（ｍ，１８Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ122Ｈ133Ｃｌ2Ｎ8Ｏ48Ｐｔの計算値：（Ｍ−Ｈ）-２７４２．７。実測値２７４２．４。
【００９８】
このように、シスプラチン及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤の放出のためのプロドラッグの実施形態が開示される。当業者は、本明細書に記載されるナノ粒子及び方法が、開示されたもの以外の実施形態により実施可能であることを認識するだろう。開示される実施形態は、限定のためでなく説明のために提示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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