(57)【要約】ＣＤ３８を標的とする細胞外薬物共役体（ＥＤＣ）は、癌、及び喘息を含む免疫障害等の疾患の治療において有用である。本開示は、薬剤部分（薬物、診断薬剤、もしくはその誘導体等の治療薬剤であり得る）、及び標的化部分（抗ＣＤ３８抗体もしくはその結合断片等の抗体標的化部分であり得る）が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、及びＡＴＰ１Ａ４遺伝子を含む、ＡＴＰ１遺伝子ファミリーによってコードされる）を含有する錯体に結合するか、またはその上で作用する、細胞外標的化薬物共役体またはＥＤＣを提供する。【選択図】図１
2017506640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定したまたは開裂不可能なリンカーによって薬剤に結合される標的化部分を含む、細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）であって、前記標的化部分が、ＣＤ３８に結合し、前記薬剤が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅに結合するか、またはその活性を修飾する、細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）。
【請求項２】
前記標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及び任意のそれらの結合断片から成る群から選択されるＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項３】
前記標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、またはＳＵＮＢ４７と同じもしくは実質的に同様のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項４】
前記標的化部分が、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じもしくは実質的に同様のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項５】
前記リンカーが、少なくとも１つの窒素ヘテロ原子を含む、いずれかの先行請求項に記載のＥＤＣ。
【請求項６】
前記少なくとも１つの窒素原子が、第３級窒素原子である、請求項５に記載のＥＤＣ。
【請求項７】
前記リンカーが、少なくとも１つのエチレングリコール部分を含む、いずれかの先行請求項に記載のＥＤＣ。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ２４またはＰＥＧ３６である、請求項７に記載のＥＤＣ。
【請求項９】
前記薬剤が、カルデノライドまたは強心ステロイドである、いずれかの先行請求項に記載のＥＤＣ。
【請求項１０】
前記強心ステロイドが、ブファリン、ジギトキシゲニン、シラレニン、または前述のうちのいずれかの誘導体である、請求項９に記載のＥＤＣ。
【請求項１１】
式（Ｉ）の細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）であって、
［標的化部分］-［リンカー］-［薬剤］      式（Ｉ）
式中、
［標的化部分］が、ＣＤ３８に結合する抗体であり、
［薬剤］が、強心ステロイドまたはカルデノライドであり、
［リンカー］が、式（ＩＩ）の式を有し、
【化３４】
2017506640.tif 000042
式中、Ｘ１が、任意に存在し、存在するとき、
【化３５】
2017506640.tif 000043
であり、ｄが、０〜６であり、
Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が、各々任意に存在し、存在するとき、アルキル、ケトン、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ９−から個々に選択され、Ｒ８及びＲ９が、アルキル（例えば、メチル）、ヘテロアルキル、アリール、及びヘテロアリールから個々に選択され、
Ｘ５及びＸ６が、ＣＲ１０及びＮから各々個々に選択され、Ｒ１０が、Ｈ、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルであり、
Ｘ７が、任意に存在し、存在するとき、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＲ１１Ｃ（Ｏ）−から選択され、Ｒ１１が、Ｈ、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルであり、
Ｒ１が、任意に存在し、存在するとき、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルから選択され、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ６の各々が、任意に存在し、存在するとき、各々が、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、及び不飽和アルキルから個々に選択され、
Ｒ４及びＲ５の各々が、任意に存在し、存在するとき、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルから個々に選択されるが、但し、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが存在しなければならないことを条件とし、
ａが０〜９９であり、
ｂが０〜９９であり、
ｃが０〜９９である、細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）。
【請求項１２】
式中、
Ｘ１が
【化３６】
2017506640.tif 000044
であり、ｄが２であり、
Ｘ２が−Ｏ−であり、
Ｘ３がヌルであり、
Ｘ４が−ＮＨ−であり、
Ｘ５及びＸ６が、各々Ｎであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり、
Ｒ３及びＲ６が、各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、
ａが２４であり、
ｂが１であり、
ｃが１である、請求項１１に記載のＥＤＣ。
【請求項１３】
前記標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７と同じまたは実質的に同じＣＤ３８のエピトープに結合する、請求項１１または１２に記載のＥＤＣ。
【請求項１４】
前記薬剤がブファリンである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＥＤＣ。
【請求項１５】
疾患を治療するための方法であって、前記疾患のための治療を必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＥＤＣを投与することを含み、前記疾患が任意に喘息等の免疫疾患である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４０，２１９号、及び２０１４年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９４６，３１４号の優先権を主張するものであり、これらの各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれ、かつそれに依存する。
【０００２】
本開示は、疾患の治療において、また生体系の評価のためのツールとしても有用な細胞外薬物共役体を提供する。本開示は、生物学、化学、医薬化学、医学、分子生物学、及び薬理学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発達、免疫、及び腫瘍形成を含む、全ての基本的な生物学的プロセスは、異なる組織及び細胞型における遺伝子の選択的及び差次的発現に関する。多くの悪性腫瘍の形成は、ある特定の細胞表面シグナル伝達分子の産生及び／もしくは発現、または増加した産生及び／もしくは発現と関連付けられることが示されている。現代の分子医学の目標のうちの１つは、薬物の非標的毒性効果を低減または排除するように、選択的に薬物を標的化するための方法を見出すことである。抗体、ペプチド、またはアプタマー等の標的化部分を使用して、罹患した細胞型に特有の、またはそれにおいて高いレベルで発現する特定の標的に薬物を送達することが、調査されている。これらの標的化部分を直接、リンカーを通じて薬物に、またはナノ粒子に結合させることが、調査されている。
【０００４】
疾患の治療のための新たな細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）に対する必要性が存在する。本開示は、この必要性を満たす。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと細胞表面上の細胞シグナル伝達経路タンパク質との間のタンパク質・タンパク質相互作用を識別及び評価するための方法及び試薬に対する必要性もまた依然として存在する。本開示はまた、この必要性も満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、概して、式（Ｉ）と一致し、かつ３つの部分：標的化部分の部分（例えば、式（Ｉ）中の［標的化部分］）、開裂不可能なリンカー部分（例えば、式（Ｉ）中の［リンカー］）、及び治療または診断薬剤部分（例えば、式（Ｉ）中の［薬剤］）を含む、細胞外標的化薬物共役体（ＥＤＣ）に関し、３つの部分は、概して、以下のとおりに関連付けられる。
【化１】
2017506640.tif 000003
【０００６】
別の態様において、本開示は、薬学的製剤含む組成物、ならびに疾患の治療において有用である、本明細書に開示されるような式（Ｉ）と一致するＥＤＣを含む単位用量形態及び薬物送達系を提供する。
【０００７】
本開示のこれらの及び他の態様ならびに実施形態を、以下で詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本開示の種々のＥＤＣに対する構造を示す。
【図２】ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞における本開示の抗ＣＤ３８標的ＥＤＣの比較である。
【図３】ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞における本開示の抗ＣＤ３８標的ＥＤＣの比較である。
【図４】Ｒａｍｏｓ細胞における本開示の抗ＣＤ３８標的ＥＤＣの比較である。
【図５】本開示に従う１つのＥＤＣ（ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６）に関する薬物動態プロットである。
【図６】本開示に従う１つのＥＤＣ（ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ３７１）に関する薬物動態プロットである。
【図７】本開示の種々のＥＤＣに対する腫瘍移植後の日数の関数としての２，０００ｍｍ３未満のサイズの腫瘍を有する腫瘍誘導動物の数のプロットである。
【図８】本開示の種々のＥＤＣに対する腫瘍移植後の日数の関数としての平均腫瘍体積のプロットである。
【図９】ＡＴＲＡの添加を伴わない、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＭＶ４−１１における本開示の抗ＣＤ３８標的ＥＤＣに関する、インビトロ活性の比較である。
【図１０】ＡＴＲＡの添加を伴わない、細胞株ＭＶ４−１１における本開示の抗ＣＤ３８標的ＥＤＣに関するインビトロ活性の比較である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、薬剤部分（薬物、診断薬剤、もしくはその誘導体等の治療薬剤であり得る）、及び標的化部分（抗ＣＤ３８抗体もしくはその結合断片等の抗体標的化部分であり得る）が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、及びＡＴＰ１Ａ４遺伝子を含む、ＡＴＰ１遺伝子ファミリーによってコードされる）を含有する錯体に結合するか、またはその上で作用する、細胞外標的化薬物共役体またはＥＤＣを提供する。ＥＤＣは、様々な用途、特に、癌、ならびに喘息及び肺の炎症を伴う他の疾患を含む肺疾患、ならびに他の医学的状態等のヒト疾患の治療において有用である。
【００１０】
本開示は、安定した、または開裂不可能なリンカー（例えば、その最大の治療効果を与えるように、ＥＤＣに対して、無傷であるか、もしくは開裂していないリンカー）を介して薬剤に結合される標的化部分を含むＥＤＣを提供する。種々の実施形態において、標的化部分は、ＣＤ３８を標的とし、抗体、即ち、抗ＣＤ３８抗体またはその結合断片である。これらのＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ及びＣＤ３８の錯体上で作用する。本開示のＥＤＣは、薬剤を、単独で投与される薬剤よりも、選択に標的細胞及び組織に送達する。多くの実施形態において、ＥＤＣは、細胞シグナル伝達経路を調節する際にＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと会合するとき、ＣＤ３８に結合する（例えば、特異的に結合する）標的化部分を含有し、かつ安定した、もしくは開裂不可能なリンカーを介して標的化部分に結合される、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅに（もしくはＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅとの相互作用をブロックするタンパク質結合部位に）結合する、強心ステロイドまたは強心グリコシド等の薬剤を含有する。種々の実施形態において、リンカーは、１つ以上の窒素等のヘテロ原子、またはアミノグリコシド等のグリコシドを含む。
【００１１】
このため、本開示のＥＤＣの３つの部分は、（１）ＣＤ３８を含むが、これに限定されない、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅではなく、かつ関心対象の疾患もしくは他の状態においてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと会合し、それにごく近接する、細胞外標的に結合する、標的化部分と、（２）ＥＤＣがその標的に結合するために必要とされる時間中、標的化部分を治療薬に接続し、無傷の（開裂していない）ままである、安定した、もしくは開裂不可能なリンカーと、（３）強心ステロイドもしくは強心グリコシド等のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅとの会合を制御する関連タンパク質上の部位）上で作用するか、またはそれに結合する、治療（もしくは診断）薬剤と、を含み得るか、本質的にそれらから成り得るか、またはそれらから成り得る。
【００１２】
第ＰＣＴ公開第２０１０／０１７４８０号、第２０１１／０３１８７０号、第２０１２／１２２５１４号、及び第２０１２／１７８１７３号、ならびに本明細書に引用される全ての他の特許、特許出願、及び科学文献からの参考文献は、それらの全体として、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、抗原のエピトープに特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片（遺伝子工学によって産生されるその非自然発生形態を含む）によってコードされる、１つ以上のペプチド鎖を含む、タンパク質またはタンパク質の混合物を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これは、同様に、免疫グロブリンクラスである、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的に、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性及び親和性において最も重要である。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、ならびにＩｇＹを含む。本明細書で使用される際、「抗体」という用語は、単鎖抗体を含む全抗体、及びその抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はまた、抗原結合抗体断片であり得、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、及びＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、ならびにナノボディを含むが、これらに限定されない（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／０４６７８号及びＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖ９（１）ｐｐ  １２９−１３４，２００３を参照されたい）。抗体は、鳥類及び哺乳類を含む、任意の動物起源からであり得る。典型的に、商業的または研究使用における抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ）ウマ、またはニワトリ抗体である。「抗体」は、本明細書で使用される際、モノクローナル、免疫吸着ポリクローナル、キメラ、及びヒト化抗体、ならびに無傷抗体及び単離抗体を含む。抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多特異性であり得る。
【００１４】
「抗原」という用語は、抗体または標的化部分が結合する物質または標的を指す。抗原は、抗体または標的化部分によって結合されるその能力によって特徴付けられる。抗原はまた、抗原での免疫化を通じた抗原特異的抗体の産生等の標的化部分の産生を惹起するために使用される物質を意味し得る。抗原は、多くの実施形態において、受容体を含むが、これに限定されないタンパク質である。
【００１５】
「抗原結合部位」または「エピトープ」という用語は、抗体等の標的化部分が結合する抗原の部分を指す。
【００１６】
「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、及び「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」という用語は、それが非標的に結合するよりも大きい親和性で細胞外標的に結合する標的化部分の能力を指す。ある実施形態において、特異的結合は、非標的に対する親和性よりも少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍大きい親和性での細胞外標的に対する結合を指す。
【００１７】
「結合親和性」という用語は、その会合及び解離定数の関数としての抗体（または他の標的化部分もしくは薬物もしくは他の薬剤）と、その抗原（または標的）との間の相互作用の強度を指す。より高い親和性は、典型的に、標的化部分が、速いオンレート（会合）及び遅いオフレート（解離）を有することを意味する。結合親和性は、それらの条件下で抗原または抗体／標的化部分に生じる変化による種々の生理学的条件下で変化し得る。標的化部分の結合親和性はまた、治療薬剤及び／またはリンカーが結合されるときにも変化し得る。結合親和性はまた、アミノ酸配列の変化または抗原のグリコシル化等の若干の変化が抗原に生じるときにも変化し得る。一般的に、本開示のＥＤＣの標的化部分及び薬剤は、それらのそれぞれの標的に対する高い結合親和性を有する。
【００１８】
「癌」という用語は、細胞の制御されていない異常な増殖、罹患細胞が局所的に、または血流及びリンパ系を通って身体の他の部分に広がる（例えば、転移する）能力によって特徴付けられるいくつかの疾患のうちのいずれか、ならびにいくつかの特徴的な構造的及び／または分子特性のうちのいずれかを指す。「癌性細胞」または「癌細胞」は、特異的な構造的特性を有する細胞として理解され、これは、分化を欠き、かつ浸潤及び転移が可能であり得る。癌の例は、乳、肺、脳、骨、肝臓、腎臓、結腸、及び前立腺癌である（全ての目的で、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈ．Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい）。
【００１９】
「キメラ抗体」という用語は、１つの種（典型的にマウス）からのモノクローナル抗体のＦｃ定常領域が、組み換えＤＮＡ技術を使用して、別の種（典型的にヒト）の抗体からのＦｃ領域で置き換えられている抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡは、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するように特異的に選択される制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの同等の部分は、置換される。ＣＤＲグラフト抗体は、いわゆる「アクセプタ」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を有するいわゆる「ドナー」抗体から、ＣＤＲ「グラフト」によって置き換えられている抗体である。一般的に、ドナー及びアクセプタ抗体は、異なる種からのモノクローナル抗体であり、典型的に、アクセプタ抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおいてその抗原を最小化するように）、この場合、得られるＣＤＲグラフト抗体は、「ヒト化」抗体と称される。グラフトは、アクセプタ抗体の単一のＶＨもしくはＶＬ内の単一のＣＤＲ（もしくは更には単一のＣＤＲの一部分）であり得るか、またはＶＨ及びＶＬの一方もしくは双方内の複数のＣＤＲ（またはその部分）であり得る。ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体を生成するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、及び米国特許第５，６９３，７６２号、ならびにＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９によって教示されている。「抗体」へのいずれも言及も、キメラ抗体への言及を示唆する。
【００２０】
「ごく近接」という用語は、例えば、標的化部分（Ｘ）及び治療薬剤（Ｙ）がリンカーを通じて共役される、ならびにＸ及びＹの双方が、それらのそれぞれの標的に結合されるとき、共役体が、ＸまたはＹのいずれか単独によって誘導されるものとは異なる、及びそれよりも優れた、所望の生物学的または医学的応答を誘導するように、物理的に近接している２つの標的Ｘ及びＹを指す。一実施形態において、達成される生物学的または医学的応答は、標的化部分または治療薬剤のいずれか単独によって観察されるものよりも大きい。別の実施形態において、達成される生物学的または医学的応答は、標的化部分及び治療薬剤の相加効果によって観察されるものよりも大きい。例えば、Ｘ及びＹが異なる分子上に位置するが、分子が同じ多分子錯体内に存在するとき、標的は、本明細書で定義されるように、「ごく近接」している。別の実施例において、Ｘ及びＹが、互いから２００以下のオングストローム以内で同じ細胞上にあり、かつシグナルを伝送する、またはそうでなければ生化学的応答を生成するように共に作用するとき、標的は、本明細書で定義されるように、互いに「ごく近接」している。Ｘ及びＹが、異なる細胞上にある（及び／または互いと相互作用しない）とき、それらは、本明細書で定義されるようには「ごく近接」していない。
【００２１】
「有効量」という用語は、対象に投与されたときの疾患段階または状態のいずれかの症状、態様、パラメータ、または特徴において、いずれかの検出可能な、プラスの治療効果を有することが可能である、単独での、または薬学的組成物の一部としてのいずれかのＥＤＣの量を指す。かかる効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
【００２２】
「エピトープ」という用語は、通常、特異的な３次元構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有し、かつモノクローナル抗体によって特異的に結合することが可能である、抗原の表面におけるアミノ酸残基または糖側鎖等の分子の基を指す。
【００２３】
「細胞外」及び「細胞表面」という用語は、細胞膜の外側部分上、または循環構造の流体中に位置する、タンパク質、抗原、もしくはエピトープを指す（例えば、アンジオテンシン変換酵素は、細胞外タンパク質である）。
【００２４】
「細胞外標的」という用語は、細胞膜上、または循環構造の流体中に位置する、タンパク質、ガングリオシド、抗原、及び／またはエピトープ等のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅではない標的を指す。例えば、かつ限定することなく、以下は、細胞外標的である：細胞表面受容体、細胞表面イオンチャネル、ＣＤ（分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎまたはｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ））略称タンパク質。より具体的に、かつ再度限定することなく、ＣＤ３８は、細胞外標的である。
【００２５】
「細胞外標的化薬物共役体」または「ＥＤＣ」という用語は、細胞外標的を標的とする抗体または他の標的化部分が、安定した、または開裂不可能なリンカーを介して、細胞外標的に結合する薬物または他の薬剤に結合される、本開示の薬物共役体を指す。本開示の種々の実施形態において、ＥＤＣは、ＣＤ３８抗体またはその結合断片である標的化部分を介してＣＤ３８を標的とし、かつ強心ステロイド（ｃａｒｉｏｔｏｎｉｃ  ｓｔｅｒｏｉｄ）である薬剤を介して、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを標的とする。
【００２６】
「免疫障害」は、任意の炎症性疾患もしくは他の疾患、または免疫系が不適切に機能している望ましくない状態を指す。本開示のＥＤＣは、概して、免疫障害を治療する際に有用である。多くの癌は、免疫障害を伴う。他の免疫障害は、炎症が原因要素である肺の疾患、または望ましくない症状を含む。本開示の種々のＥＤＣは、喘息を含む、肺の免疫障害を治療する際に有用である。
【００２７】
「無傷抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨとして略称される）及び重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲＸまたはＶＬとして略称される）及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから成る。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序で構成される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得る。結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片である、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから成る一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片である、ヒンジ領域でジスルフィドブリッジによって結合される２つのＦａｂ断片から成る二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｌｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される際、抗体へのいずれの一般的な言及も、いずれの型の無傷抗体（自然発生、組み換え、キメラ、またはヒト化）ならびに結合断片を指す。
【００２８】
「修飾された抗体」という用語は、例えば、抗体の一部分を欠失、付加、または置換することによって修飾されている、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体等の抗体を指す。例えば、抗体は、定常領域を欠失させ、かつそれを、抗体の半減期、例えば、血清半減期、安定性、または親和性を増加させることが意図される定常領域で置き換えることによって、修飾することができる。治療薬剤の複数の分子または複数の異なる薬剤は、１つの抗体分子に結合させることができる。例えば、異なる部分を、同じリンカーを介して抗体分子に結合させることができるか、または結合のための複数の部位を提供する複数のリンカー（例えば、デンドリマー）を使用することができる。「抗体」へのいずれも一般的な言及も、「修飾された抗体」への言及を示唆する。
【００２９】
「調節する」という用語は、例えば、細胞シグナル伝達経路の活性を限定もしくは低減する（例えば、阻害する）、または増加させることを含む、直接的にまたは間接的に、細胞シグナル伝達経路を改変するためのＥＤＣと細胞外標的及びＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅとの相互作用を指す。
【００３０】
「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を提示する。「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域（存在する場合）を有する、単一の結合特異性を提示する、抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって産生することができるが、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、いずれの真核、原核も含む単一クローン、またはファージクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージ提示技術の使用を含む、当該技術分野において既知の多種多様な技術を使用して調製することができる。「抗体」へのいずれも言及も、「モノクローナル抗体」への言及を示唆する。
【００３１】
「非内在化標的化部分」または「非内在化抗体」という用語は、インビボまたはインビトロで生理学的条件（３７℃及びｐＨ７で）下において、細胞の外側の抗原に、循環構造内で、または細胞表面上で、反応する（結合する）特性を有する、かつ、その標的抗原に結合されるとき、細胞に進入せず、リソソームで分解しない、標的化部分または抗体をそれぞれ指す（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９（６）２３５８−６４を参照されたい）。この文脈において、「内在化する」及び「内在化」は、材料が細胞に進入し、分解し、非共役薬剤を放出するプロセスを指す。一実施形態において、標的化部分または抗体は、その標的抗原に結合されるとき、細胞に進入せず、エンドソームに内在化されない。「非内在化標的化部分」または「非内在化抗体」の標的は、本明細書において「非内在化標的」と称され、これは、標的化部分または抗体への結合の結果として、リソソームの中へ内在化されない標的である。しかしながら、非内在化標的は、他の生物学的プロセスにおいて、細胞の中へ内在化され得る。非内在化標的の例としては、ＣＤ３８が挙げられるが、これに限定されない。
【００３２】
「非内在化薬剤」という用語は、細胞の中へ内在化されることなく、インビボまたはインビトロで生理学的条件（３７℃及びｐＨ７で）下において、その標的と反応する（典型的に、その受容体への結合を介して）特性を有する、薬剤（例えば、薬物等の治療薬剤）を指す。
【００３３】
送達される薬物の量の文脈における「薬学的有効量」及び「有効量」という用語は、組織、系、動物、またはヒトにおいて所望の生物学的または医学的応答を誘導することができる、薬物の量を指す。
【００３４】
「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原に対して１つを超える（２つ以上の）異なる抗体の調製物を指す。かかる調製物は、様々な異なる抗原結合部位に結合する抗体を含む。
【００３５】
「受容体」という用語は、１つ以上の特定の種類のシグナル伝達分子が結合し得る、血漿膜または細胞の細胞質のいずれかに埋め込まれる、細胞外標的タンパク質分子を指す。各細胞は、典型的に、多くの異なる種類の多くの受容体を有する。
【００３６】
「循環構造において安定した」という用語は、分解に抵抗するためのＥＤＣ等の化合物の特性を指し、かつ、例えば、化合物の約５０％未満、または約２０％未満、または典型的に約２％未満が、約３７℃で少なくとも約２時間、循環血液中で分解または開裂することを意味する。
【００３７】
「実質的に同時に」という用語は、同じ時間に、または比較的狭い時間フレーム内に生じる２つ以上の事象を指す。種々の実施形態において、実質的に同時にとは、互いの約６０、約４０、約３０、約２０、約１０、約５、約２、もしくは約１秒、または約１秒未満以内に生じる２つ以上の事象を指す。例えば、本開示のＥＤＣは、標的化部分結合及び薬剤（薬物）作用が実質的に同時に発生するような特性を有する。
【００３８】
「相乗的に」という用語は、単独で使用されるときの双方の薬剤の効果の合計よりも大きい、組み合わされて使用されるときの２つ以上の薬剤の効果を指す。例えば、本開示のＥＤＣにおいて、リンカーを通じて結合されるときの標的化部分及び薬剤（薬物）の相互作用の組み合わされた治療効果は、単独で使用されるときの標的化部分及び薬剤の組み合わされた個々の効果よりも大きい。「効果」は、結合、治療効果、及び／または特異性のいずれも指し得る。
【００３９】
「標的」という用語は、標的化部分が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物、または核酸を指し、また、治療薬剤が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物、または核酸も指す。薬剤及び標的化部分は、「標的錯体」において異なる標的に結合し、「標的錯体」は、インビボで互いと物理的にごく近接している多サブユニットタンパク質の異なるサブユニット、または多タンパク質錯体中の２つの異なるタンパク質等の２つ以上の分子を指す。
【００４０】
「標的細胞」という用語は、病理に関与し、かつそのため、治療活性に対する好ましい標的である、細胞を指す。標的細胞は、例えば、かつ限定することなく、以下の群の細胞のうちの１つ以上であり得る：原発性もしくは続発性腫瘍細胞（転移）、原発性もしくは続発性腫瘍の間質細胞、腫瘍または腫瘍転移の血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、多形核白血球、及びリンパ球、ならびに腫瘍及び腫瘍転移に浸潤する多核薬剤。
【００４１】
「標的化部分」及び「標的薬剤」という同義的な用語は、抗体、アプタマー、ペプチド、または標的に特異的に結合する他の物質を指す。標的化部分は、標的（即ち、その結合断片）または非抗体標的化部分（例えば、アプタマー、ペプチド、もしくは標的に特異的に結合する他の物質）に特異的に結合する、抗体標的化部分（例えば、抗体またはその断片であり得る。
【００４２】
「標的組織」という用語は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）、及び標的細胞の環境内の細胞を指す。
【００４３】
「治療薬剤」及び「薬物」及び「薬剤」という用語は、治療有効量で存在するとき、作用部位に結合すると、治療効果をもたらし、その作用部位が、標的細胞の表面または内側に位置するか、またはその効果が、そこに与えられる化合物を指すように、本明細書において同義的に使用される。例として、治療薬剤は、化学的薬剤、例えば、抗生物質もしくは抗癌剤、ポリペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。
【００４４】
「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、及び／または予防を指す。
【００４５】
「半減期時間を増加させる」という用語は、参照化合物と比較して、血液中での化合物、典型的に治療薬剤の平均滞留時間を増加させること、または血液もしくは血漿クリアランスを低減することを意味する。
【００４６】
「治療する」及び「治療」という用語は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患への素因を治癒する、回復させる、軽減する、緩和する、改変する、修復する、改善する、向上させる、またはそれに影響を及ぼす目的での、疾患もしくは障害（例えば、癌もしくは転移性癌）、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害への素因を有する患者への治療薬剤もしくは組成物の投与を指すように、同義的に使用される。癌もしくは転移性癌を「治療する」または「治療」は、症状の除去、寛解、縮小等のいずれの客観的もしくは主観的パラメータを含む、癌の治療もしくは改善もしくは、または疾患状態を患者にとってより許容可能にすること、悪化もしくは衰退の速度の減速、または悪化の最終点をより弱体化させることを指す。症状の治療または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的もしくは主観的パラメータに基づき得る。したがって、「治療する」という用語は、腫瘍性疾患を含むが、これに限定されない、疾患に関連する症状もしくは状態の発症をもしくは遅延、軽減、または阻止もしくは阻害するための治療薬剤の投与を含む。
【００４７】
「腫瘍特異的抗原」という用語は、腫瘍に特有であるか、または正常細胞に対して、腫瘍細胞上で少なくともより豊富である、タンパク質または他の分子を指す。
【００４８】
ＩＩ．Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ及び細胞シグナル伝達経路
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、イオンチャネル及びシグナル伝達物質として機能する。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、最初は、濃度勾配に対して、カリウムイオンを取り込み、ナトリウムイオンを排出するだけであると考えられていたが、最近では、細胞膜にわたってシグナルを伝送することも示されている、内在性膜貫通タンパク質酵素である。酵素は、３つのサブユニット：触媒コア、及びステロイド化合物に対する主要な標的であるアルファ；アルファサブユニットを特定の細胞表面位置に輸送すると考えられ、かつアルファサブユニット活性に必要とされる、ベータサブユニット；ならびに補足的サブユニットであり、かつ様々な細胞型特異的アイソタイプで存在する、ガンマサブユニットから成る。強心（心臓作用性）グリコシドのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅへの主要な結合部位は、膜貫通へリックスＭ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５、及びＭ６によって形成されるくぼみに位置する［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００９，１０６，１３７４２−１３７４７］。強心グリコシドは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを標的とする。しかしながら、強心グリコシドの治療ウィンドウは、小さい。実際、認可された強心グリコシド（例えば、ジゴキシンまたはプロスシラリジン）は、投与に対して認可されたレベルの２〜３倍のみで、患者の死亡を引き起こし得る。Ａｎｅｓｔｈ  Ｐｒｏｇ．２００７  Ｓｐｒｉｎｇ；５４（１）：１９-２４。
【００４９】
本開示は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅが、ＣＤ３８と密接に会合（錯化）し、かつそれと共に作用して、細胞シグナル伝達経路を調節する、ならびにかかる錯体を標的とするＥＤＣが、特に、癌、及び喘息等の免疫障害の治療において、顕著な治療活性を有するという発見に、部分的に起因する。本開示のＥＤＣにおいて有用な標的化部分を、以下の項で説明する。
【００５０】
ＩＩＩ．標的化部分
本開示のＥＤＣの多くの実施形態において、標的化部分は、限定することなく、標的結合時に内在化を誘導せず、かつこのため、一度その細胞外標的に結合されると、リソソームに内在化されない、ヒト、マウス、ヒト化、もしくはキメラ抗体であり得る。
【００５１】
本開示のＥＤＣは、それらが含有する薬物よりも選択的である、及び／または特性が少ない。本開示のＥＤＣにおいて、標的化部分及び／またはリンカーは、標的化部分がその標的に結合するまで、薬物の治療（かつそのため毒性の非標的を低減する）効果を効果的に防止または劇的に低減し得る。これは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅが、無数の他のシグナル伝達タンパク質と相互作用し、著しい望ましくない「非標的」効果に対する潜在性を創出するという発見を考慮すると、本開示の特に重要な態様である。このため、本開示のＥＤＣは、標的化部分がその標的に結合され、治療薬剤の標的にごく近接しているとき、及びＥＤＣが無傷であるときのみに、主に活性である。総合すれば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅに作用する潜在性は、抗体がその標的に結合するときに、著しく高いに過ぎないため、これらの特徴は、より特異的かつより毒性が低いＥＤＣを可能にする。本開示のＥＤＣは、薬剤及び抗体標的部位の双方が存在し、かつＥＤＣが治療効果を与えるために、互いにごく近接している必要があるため、より選択的である。本開示のＥＤＣは、薬剤が、安定したリンカーを通じて、選択的にその標的に結合する標的化部分に結合され、薬剤をごく近接した状態に保ち、このため、そのごく近接したＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅｓのみに作用することができるため、より毒性が低い。
【００５２】
ＥＤＣの標的化部分は、細胞シグナル伝達経路を調節するようにＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと会合する、ＣＤ３８等の抗原を標的とする。
【００５３】
ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても既知である）は、多くの免疫細胞の表面で見出される３００アミノ酸（４５ｋＤ）糖タンパク質であり、ＣＤ３８遺伝子によってコードされる。ＣＤ３８は、外酵素として作用する細胞外ドメインであり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのニコチンアミド、アデノシン二リン酸リボース、及び環状アデノシン二リン酸リボースへの変換を触媒する、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）において、ＣＤ３８発現は、不良な予後を表す。ＣＬＬは、より効果的な治療が必要とされる致死的な疾患である。本開示は、この必要性を満たす。ＣＤ３８は、多くの造血器悪性（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）腫瘍において、かつ非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、ならびに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む、種々の造血器悪性腫瘍に由来する細胞株において上方制御される。一方、造血系のほとんどの原始的な多能性幹細胞は、ＣＤ３８陰性である。造血器悪性腫瘍におけるＣＤ３８発現及びその疾患の進行との相関は、ＣＤ３８を、抗体療法に対するより魅力的な標的にする（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６：２２１７０−２２１７７）。
【００５４】
ＣＤ３８は、Ｃａ２＋移動（Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１２：５８１−５９２；Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：２８４０−２８４５）、ならびにリンパ性及び骨髄性細胞もしくは細胞株におけるホスホリパーゼＣ−γ、ＺＡＰ−７０、ｓｙｋ、及びｃ−ｃｂｌを含む、多数のシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を通じたシグナル伝達（Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２４０７−２４１１；Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１２：５８１−５９２；Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４５：２３９０−２３９６；Ｍ．Ｚｕｂｉａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１９３−２０５；Ｓ．Ｄｅａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ  １０２：２１４６−２１５５；Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２；Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８；Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：２８４０−２８４５；Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１８４−１９２；Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８；Ｒ．Ｍａｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：３９７−４０９）に関与することが報告されている。これらの観察に基づき、ＣＤ３８は、それらの正常な発達中のリンパ性及び骨髄性細胞の成熟及び活性化における重要なシグナル伝達分子であると提唱された。
【００５５】
シグナル伝達及び造血におけるＣＤ３８の正確な役割は、特に、これらのシグナル伝達研究のほとんどが、非生理学的リガンドである、ＣＤ３８及び抗ＣＤ３８モノクローナル抗体を異所的に過剰発現する細胞株を使用していたため、文献では依然として明確ではない。ＣＤ３８タンパク質は、Ｃａ２＋移動を誘導し得る分子であるｃＡＤＰＲを産生する酵素活性を有するため（Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６４：１６０８−１６１５；Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ａａｒｈｕｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ，２：２０３−２０９）、モノクローナル抗体によるＣＤ３８結紮が、ｃＡＤＰＲの産生を増加させることによって、リンパ球におけるＣａ２＋移動及びシグナル伝達を引き起こすことが提唱されている（Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，４１９：４１１−４１９）。この仮説とは対照的に、ＣＤ３８タンパク質の切断及び点突然変異分析は、その細胞質尾部もその酵素活性も、抗ＣＤ３８抗体によって媒介されるシグナル伝達には必要ではないことを示した（Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８；Ｆ．Ｅ．Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：２６９３−２７０２；Ｓ．Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８，７４１−７４７）。
【００５６】
ＣＤ３８ノックアウトマウスを生成した。これらの動物は、組織関連ＮＡＤａｓｅ活性のほぼ完全な喪失を示す。それにもかかわらず、これらの動物は生存可能であり、ＣＤ３８及びその活性が、生存に必要ではないという結論を導き出す。しかしながら、これらのマウスは、樹状細胞遊走の欠損により、それらの先天性免疫の欠損、及び低減されたＴ細胞依存性液性応答を呈する（Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０：２７９−２９１；Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，７：１２０９−１２１６）。
【００５７】
抗癌剤の発見及び開発における最近の進歩にもかかわらず、ＣＤ３８発現腫瘍を含む多くの形態の癌は、依然として、不良な予後を有する。ＣＤ３８は、骨髄腫のほとんどの症例、ＡＩＤＳ関連のリンパ腫の一部の症例、及び移植後のリンパ増殖の多くの症例を含む、様々なリンパ性腫瘍によって、高いエピトープ密度で発現する。正常細胞とそれらの白血病対応物との間の細胞表面発現における際立った量的差異は、ＣＤ３８を、免疫療法治療のための魅力的な標的にした。
【００５８】
ＣＤ３８はまた、機関紙過敏症及び気道炎症等の喘息の主な特性に関与し、かつ喘息に対する新たな潜在的な治療標的を表し得る。異常なＣＤ３８活性及び／または発現は、喘息を有する患者において観察される気道狭窄を強調し得る。ＣＤ３８は、喘息の病因において重要である、ＩＬ−６及びＲＡＮＴＥＳ等の異なる炎症性遺伝子の制御における役割を有し得る。ＴＮＦα及びＩＦＮ等の前喘息サイトカインは、ＮＦ−κＢ活性化によって、ＣＤ３８タンパク質及びｍＲＮＡレベルの双方を相乗的に増加させる。一方、ＣＤ３８発現は、ＮＦ−ｋＢの阻害を介して、抗炎症性グルココルチコイドによって減少する。ＣＤ３８発現はまた、炎症関連のステロイド耐性に関与する。ＣＤ３８制御、ならびにその喘息及び他の炎症性疾患との相関は、ＣＤ３８を、慢性閉塞性肺疾患及び肺線維症のような喘息を超える疾患の病態生理に影響を及ぼし得る、新規のＣＤ３８療法の開発のための魅力的な標的にする。現時点での喘息に対するＣＤ３８特異的薬物は、現在存在しない。
【００５９】
ある実施形態において、本開示のＥＤＣは、ＣＤ３８を標的とし、かつ炎症を減少させる及び／またはＣＤ３８を発現する細胞を殺滅するように作用する薬剤に結合させることができるため、本開示のＥＤＣは、それらの表面上でＣＤ３８を上方制御する、悪化した喘息を含む種々の型の喘息（ａｓｔｍａ）を有する患者を治療する際に有用であろう。ある実施形態において、本開示のＥＤＣの薬剤はまた、ＮＦ−κＢ（活性化したＢ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサ）の活性化を遮断するため、本開示のＥＤＣは、炎症性及び自己免疫疾患、敗血性ショック、ウイルス感染、ならびに不適切な免疫発達に関連するもの等の疾患を治療する際の使用を有し得る（２０００  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，ｐｐ  ３８３８-３８４７及び（２００３  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６  ｐｐ２２２３-２２３９）。ある実施形態において、本開示のＥＤＣの薬剤はまた、インターフェロンベータ、ＩＬ−１、及びＩＬ−８等のサイトカイン産生を低減するため、本開示のＥＤＣは、上昇したレベルのかかるサイトカインによって特徴付けられるいくつかの障害の治療、、または改善につながり得る（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９６：１５０１−１５０６）。
【００６０】
ある実施形態によると、本開示のＥＤＣの薬剤はまた、炎症を低減し得るため、炎症関連障害または疾患もまた、本明細書で説明されるＥＤＣを使用して治療され得る（ＰＮＡＳ  ２００５  ｖｏｌ．１０２  ｎｏ．２７，９６３１-９６３６、第ＵＳ２０１４００８８０５６  Ａ１号）。炎症によって特徴付けられるかかる障害または疾患は、喘息、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、骨盤炎症性疾患、再かん流傷害、関節炎、珪肺症、血管炎、炎症性ミオパチー、過敏症、片頭痛、乾癬、痛風、アテローム性動脈硬化（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、及び任意のこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
【００６１】
例示的な炎症性疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、潰瘍性結腸炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、脈管炎（ｖａｃｕｌｉｔｉｓ）、ならびにアレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍｉａｔｉｔｉｓ）、及び接触過敏症等のアレルギー性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫関連疾患または障害の他の例としては、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病（甲状腺機能亢進）、橋本甲状腺炎（甲状腺機能不全）、１型糖尿病、セリアック病、クローン病及び潰瘍性結腸炎、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性硬化症／肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症候群ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫アジソン病、強直性脊椎炎、急性播種性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ  ａｎａｅｍｉａ）、イヌにおける多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、線維筋痛（ＦＭ）、自己炎症性ＰＡＰＡ症候群、家族性地中海熱（Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｒｒａｎｅａｎ  Ｆｅｖｅｒ）、家族性感冒自己炎症性症候群、マックル‐ウェルズ症候群、及び新生児期発症多臓器性炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されると解釈されるべきではない。
【００６２】
本明細書で使用される際、抗炎症治療は、炎症の発症または進行等の望ましくない生理学的変化または障害を、または減速（低下）させることを目指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化した（即ち、悪化しない）状態、炎症疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは緩和、及び寛解（部分的もしくは完全にかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。抗炎症治療はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、延長された生存を意味し得る。抗炎症治療はまた、炎症応答を完全に抑制し得る。
【００６３】
癌を治療するための抗体（モノクローナル及び二重特異性）ならびに抗体薬物共役体を作製及び使用するための多くの試みが行われており、ある型のヒト癌細胞を殺滅する際に活性であることが示されている（特許第ＵＳ８１５３７６５号）。抗ＣＤ３８抗体のうちの一部は、ＣＤ３８陽性細胞において、しかしながら、間質細胞または間質由来サイトカインの存在下でのみ、アポトーシスを引き起こすことが示されている。アゴニスト抗ＣＤ３８抗体（ＩＢ４）は、ヒト胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞のアポトーシスを防止すること（Ｓ．Ｚｕｐｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４：１２１８−１２２２）、ならびにＫＧ−１及びＨＬ−６０  ＡＭＬ細胞の増殖を誘導する（Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８）が、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔリンパ芽球細胞においてはアポトーシスを誘導しないこと（Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１２：５８１−５９２）が報告されている。別の抗ＣＤ３８抗体Ｔ１６は、ＡＬＬ患者からの未熟リンパ性細胞及び白血病リンパ芽球細胞（Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０）、ならびにＡＭＬ患者からの白血病性骨髄芽球細胞（Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２）のアポトーシスを誘導したが、Ｔ１６は、間質細胞または間質由来サイトカイン（ＩＬ−７、ＩＬ−３、幹細胞因子）の存在下でのみアポトーシスを誘導した。一方、一部のＣＤ３８特異的抗体は、架橋後にアポトーシスを誘導するが、単独でインキュベートされるとき、いずれのアポトーシス活性も完全に欠いている（第ＷＯ  ２００６／０９９８７５号）。ＳＡＲ６５０９８４様抗体は、３つの異なる細胞毒性機構：アポトーシス、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣの誘導によって、ＣＤ３８陽性細胞を殺滅することが可能である（第ＵＳ２０１２０１５６２１８号）。
【００６４】
一部の有望な結果にもかかわらず、これらの調査は、いまだに臨床的応用につながっていない。これは、主に、抗体薬物がヒトに投与されたときの負の治療指数に起因する。これらの効果は、リンパ、骨髄、及び上皮細胞、ならびに特殊組織、及び眼を含む臓器における、ＣＤ３８の広範な分布に関連し得る。組み合わせ療法は、治療ウィンドウ（即ち、ＣＤ３８を上方制御するレチノイン酸）を増加させるために試みられているが、患者における著しい副作用が観察された。このため、ＣＤ３８が、癌を治療するための標的として使用される場合、薬物が、ＣＤ３８を発現する特定の罹患細胞を標的とするように、どのようにそれが機能するか、及び薬物をそれに送達するより正確な方法の発見のより良好な理解が必要である。標的化部分がＣＤ３８への抗体であり、かつ薬物がステロイドである、本明細書で説明されるＥＤＣは、ＣＤ３８を発現するある細胞が、ＥＤＣに対して耐性を有する一方、同様にＣＤ３８を発現する他の細胞は、かなり感受性であることを示し、このため、ＥＤＣが、ＥＤＣの２つの標的間で錯体を発現する細胞に正確に作用する能力を有するという証拠を示す。
【００６５】
ヒトＣＤ３８の複数の機能、及び裸ＣＤ３８抗体単独では、ＣＤ３８上の種々のエピトープの結合を上回る特異性を提供しないという事実を考慮すると、罹患細胞上のＣＤ３８の特定の機能をより特異的に調節する新たな治療に対する必要性が存在する。
【００６６】
ＣＤ３８に結合するいくつかの抗体が存在し、これらのうちの一部は、臨床試験で現在調査されている。表１は、ＣＤ３８を標的とする抗体のリスト（これらに限定されない）を提供し、これらの抗体、またはその断片もしくは誘導体は、本開示の種々の実施形態において有用であり得る。本開示の種々のＥＤＣの標的化部分を標的とするＣＤ３８として機能することができる更に多くの抗体は、［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ９９．ｍｈ−ｈａｎｎｏｖｅｒ．ｄｅ／ａｋｔｕｅｌｌｅｓ／ｐｒｏｊｅｋｔｅ／ｈｌｄａ７／ｈｌｄａｂａｓｅ／ｓｅｌｅｃｔ．ｈｔｍ］及び［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｍＡｂ−ＤＢ／ｉｎｄｅｘ］の臨床抗体のリストで見出すことができる。
【表１】
2017506640.tif 000004
【００６７】
ＣＤ３８に特異的に結合する抗体の他の例としては、限定することなく、表１に上で列記される抗体、例えば、ＳＵＮ４Ｂ７、ＯＫＴ１０、ＨＢ７、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４（または３８ＳＢ１９）、ダラツムマブ、ＩＢ６、ＡＴ２、ＵＭ１６、５Ｄ２、ＢＢ５１、ＧＲ７Ａ４、ＨＩ１５７、ＨＩＴ２、ＨＩＴ３、及びＭＯＲ２０２が挙げられる。以下の表２は、それらのＣＤ３８エピトープ（結合部位）、及びマカクＣＤ３８との交差反応を含む、表１に列記される種々の抗ＣＤ３８抗体に関する追加の情報を提供する。
【表２】
2017506640.tif 000005
【００６８】
ヒトＣＤ３８は、短い細胞質内尾部（２１アミノ酸）、膜貫通ドメイン（２３アミノ酸）、及び主要細胞外ドメイン（２５６アミノ酸）から成る。受容体及び酵素活性の双方が存在するＣＤ３８細胞外ドメインは、このファミリーのメンバに共通の１２個のシステイン／６個のジスルフィドシグネチャを有し、これは、タンパク質の全体的な構造を安定化させるのに役立つ（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ＣＤ３８の６個のシステインジスルフィドは、その触媒活性に重要であることが以前に示されている。ヒトＣＤ３８のエピトープマップは、６つの特異的抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、ＩＢ４、ＩＢ６、ＳＵＮ４Ｂ７、ＯＫＴ１０、ＡＴ１、及びＡＴ２のパネルを使用して以前に生成された（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７を参照されたい）。結果は、モノクローナル抗体が、大きく２つのグループに分離され得、これは、完全にまたは部分的に重複するエピトープを認識することを示した。ＩＢ４、ＡＴ２、及びＩＢ６抗体は、ＣＤ３８の一方の側に結合したが、ＯＫＴ１０、ＳＵＮ４Ｂ７、及びＡＴ１は、ＣＤ３８の他方の側に結合した。
【００６９】
モノクローナル抗体を使用したヒトＣＤ３８及びシノムルガス・マカクＣＤ３８の特性評価は、ＣＤ３８の追加の構造的・機能的特徴を識別した（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ＩＢ４、ＩＢ６、ＯＫＴ１０、ＳＵＮ４Ｂ７、ＡＴ１、及びＨＢ７を含むヒトＣＤ３８に対して作製されたモノクローナル抗体のパネルを、ヒトＣＤ３８への結合に関して、ならびにヒトＣＤ３８との９２％のアミノ酸配列同一性及び９４％の類似性を有する、シノムルガス・マカクＣＤ３８（カニクイザル）への交差反応に関して評価した。結果は、ＩＢ４、ＩＢ６、ＯＫＴ１０、ＳＵＮ４Ｂ７、ＡＴ１、及びＨＢ７抗体が全て、ヒトＣＤ３８に結合したことを示した。しかしながら、ＯＫＴ１０、ＳＵＮ４Ｂ７、及びＡＴ１抗体のみは、シノムルガスＣＤ３８に結合したが、ＩＢ４、ＩＢ６、及びＨＢ７抗体は、シノムルガスＣＤ３８に結合しなかった。研究は、２つのＣ末端ジスルフィドループに位置するヒトＣＤ３８上の２つの異なるエピトープを識別した。ＯＫＴ１０  ＣＤ３８エピトープ結合部位は、ＣＤ３８の残基Ｃｙｓ２８７〜Ｃｙｓ２９６を含むヒトＣＤ３８の最後の（６番目の）ジスルフィドループにマップされた。しかしながら、ＳＵＮ４Ｂ７及びＡＴ１  ＣＤ３８エピトープ結合部位は、ヒトＣＤ３８の残基Ｃｙｓ２５４〜Ｃｙｓ２７５を含む最後から２番目の（５番目の）Ｃ末端ジスルフィドループにマップされた。２つのＣ末端ジスルフィドループの近傍の抗体のフットプリントを例解する、Ａｐｌｙｕｓｉａ  ＡＤＰＲシクラーゼに由来するヒトＣＤ３８のホモロジーモデルが生成された。他の研究は、異なるモノクローナル抗体によって認識される追加のＣＤ３８エピトープを識別した。
【００７０】
ある実施形態によると、ＥＤＣ中の標的化部分の例は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体標的化部分であり得る。ヒトＣＤ３８のポリヌクレオチド配列は、配列番号１において提供され、これは、配列番号２において提供されるＣＤ３８アミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＥＤＣ中の標的化部分は、配列番号１を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る、ポリヌクレオチド配列によってコードされる、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体標的化部分であり得る。ある実施形態において、ＥＤＣ中の標的化部分は、配列番号２を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体標的化部分であり得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）の細胞外ドメインに位置するエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、表１または２に列記される抗体のうちのいずれかと同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、表１または２に列記される抗体のうちのいずれかと、同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。当業者は、表１または２に列記される抗体のうちのいずれかと、同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する、本明細書で説明されるＥＤＣにおいて使用されるべき抗体を生成することができることを認識するであろう。種々の実施形態において、ＥＤＣ中の抗体標的化部分は、例えば、モノクローナル抗体であり得る抗体である。ある実施形態において、抗体標的化部分は、限定することなく、上の表１または２に見出される抗体のうちの１つのマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。一実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、任意の非ヒト源、例えば、マウスからのヒト化形態の抗ＣＤ３８抗体であり得る。一実施形態において、ヒト化抗体は、例えば、上の表１または２に見出される抗体のうちの１つのヒト化形態であり得る。一実施形態において、ヒト化抗体は、細胞表面上のＣＤ３８を認識する重鎖及び軽鎖可変配列から構築され得る。一実施形態において、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片であり得る。種々の実施形態において、ＥＤＣの抗体は、ＣＤ３８等のヌクレオチド代謝（外）酵素ファミリーメンバタンパク質の細胞外部分に特異的に結合する。
【００７１】
種々の実施形態において、本明細書で説明されるＥＤＣは、ＣＤ３８を標的とする標的化部分を含む。種々の実施形態において、本明細書で説明されるＥＤＣは、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体標的化部分である標的化部分を含む。種々の実施形態において、ＥＤＣ中の抗体標的化部分は、抗ＣＤ３８マウスモノクローナル抗体ＳＵＮ４Ｂ７（ＩｇＧ１、κ）である（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１；Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７を参照されたい）。以下の実施例において示されるように、標的化部分を比較するとき、ＳＵＮ４Ｂ７を使用して構築されたＥＤＣは、この標的化部分が、ＰＫ活性試験によって判定される際、最も低い同等の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値及び最も長いインビボ半減期を有するＥＤＣを産生したため、好ましい活性を提示した。実施例５に提供される研究は、ＳＵＮ４Ｂ７で産生されるＥＤＣが、ＣＤ３８を発現する細胞株において特異的にアポトーシスを誘導する際に最も効力が高かったため、ＳＵＮ４Ｂ７は、本明細書に提供されるＥＤＣに対する例示的な標的化部分であることを実証する。ヒトＣＤ３８上のＳＵＮＢ４７エピトープ結合部位は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）の細胞外ドメインのＣｙｓ２５４〜Ｃｙｓ２７５を伴うヒトＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループ（即ち、ジスルフィドループは、アミノ酸２５４〜２７５を含む）にマッピングするとして、一研究において以前に特徴付けられた（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。更に、この研究は、ＳＵＮ４Ｂ７もまた、シノムルガス・マカクＣＤ３８に結合することを示した。ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に（ｓｐｅｃｆｉｃｉａｌｌｙ）結合するＥＤＣ中の抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２５４（即ち、Ｃｙｓ２５４）及び２７５（即ち、Ｃｙｓ２７５）によって形成されるＣＤ３８のジスルフィド結合を含むエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、エピトープは、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２５４〜２７５を含むＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループを含み得る。ある実施形態において、エピトープは、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２５４〜２７５のうちの１つ以上を含み得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＳＵＮ４Ｂ７モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＳＵＮ４Ｂ７と、同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトＣＤ３８（即ち、配列番号２）及びシノムルガス・マカクＣＤ３８（即ち、配列番号３）の双方に特異的に結合する。本明細書で説明される実施形態の全てにおいて、抗体標的化部分は、限定することなく、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化抗体またはその結合断片から選択され得る。
【００７２】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１のモノクローナル抗体である、ＡＴ１であり得る。ＡＴ１によって認識されるＣＤ３８エピトープは、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）の細胞外ドメインのＣｙｓ２５４〜Ｃｙｓ２７５を伴うヒトＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループ（即ち、ジスルフィドループは、アミノ酸２５４〜２７５を含む）にマッピングするＣＤ３８のカルボキシル末端の近くに位置する、ＳＵＮ４Ｂ７によって認識される同じエピトープである（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ＡＴ１もまた、シノムルガスＣＤ３８に結合することが以前に示された。同文献。ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２５４（即ち、Ｃｙｓ２５４）及び２７５（即ち、Ｃｙｓ２７５）によって形成されるＣＤ３８のジスルフィド結合を含むエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、エピトープは、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２５４〜２７５を含むＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループを含み得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＡＴ１モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＡＴ１モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトＣＤ３８（即ち、配列番号２）及びシノムルガス・マカクＣＤ３８（即ち、配列番号３）の双方に特異的に結合する。本明細書で説明される実施形態の全てにおいて、抗体標的化部分は、限定することなく、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化抗体またはその結合断片から選択され得る。
【００７３】
以下の実施例において示されるように、抗体標的化部分としてＳＵＮ４Ｂ７を有するＥＤＣは、最適な結果を提供した。当業者は、ＳＵＮ４Ｂ７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープ（即ち、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）の細胞外ドメインのアミノ酸２５４〜２７５を含む、Ｃｙｓ２５４〜Ｃｙｓ２７５を伴うＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループ）に結合する抗体を生成することができることを認識するであろう。更に、ある実施形態において、ＳＵＮ４Ｂ７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し、かつ、シノムルガス・マカクＣＤ３８（即ち、配列番号３）にも特異的に結合する、ＥＤＣで使用するための抗体が生成され得る。本明細書で説明される実施形態の全てにおいて、ＥＤＣで使用するための抗体は、限定することなく、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化抗体またはその結合断片から選択され得る。
【００７４】
本開示において同様に有用である他の抗体は、ＳＵＮ４Ｂ７と同じＣＤ３８エピトープ結合部位（即ち、Ｃｙｓ２５４〜Ｃｙｓ２７５を伴うヒトＣＤ３８の５番目のＣ末端ジスルフィドループ）を有することが報告されているが、シノムルガス・マカクＣＤ３８（即ち、配列番号３）には結合しない。例えば、ＣＤ３８に対するＨＢ７の特異性は、ＨＢ７が、ＳＵＮ４Ｂ７に関して報告された同じエピトープ結合部位である、ＣＤ３８の残基Ｃｙｓ２５４及びＣｙｓ２７５によって形成される、特異的なジスルフィドにマッピングするヒトＣＤ３８上のエピトープに直接結合することを示すｘ線結晶学及び部位特異的突然変異誘発法研究によって以前に確立された（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（２５）：２２１７０−７を参照されたい）。追加の研究は、ＨＢ７がシノムルガスＣＤ３８に結合しないことを示した（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ＨＢ７（マウスＩｇＧ１、κ）は、寄託番号ＨＢ−１３６でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているハイブリドーマ細胞株を使用して産生される（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．１９８４；２４（３）：１４０−９を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＨＢ７モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＨＢ７モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトＣＤ３８（即ち、配列番号２）に特異的に結合するが、シノムルガス・マカクＣＤ３８（即ち、配列番号３）には特異的に結合しない。
【００７５】
本明細書で提供されるＥＤＣにおいて有用な抗体はまた、表１及び２に列記されるいずれかの抗体もしくはその結合断片、または表１及び２に列記される抗体のうちのいずれかと同じもしくは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する、いずれかの抗体もしくはその結合断片を含み得る。本明細書で説明される実施形態の全てにおいて、抗体標的化部分は、限定することなく、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化抗体またはその結合断片から選択され得る。
【００７６】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、寄託番号ＣＲＬ−８０２２でＡＴＣＣに１９７９年１１月２１日に寄託されたハイブリドーマ細胞株を使用して産生されるＣＤ３８に対するモノクローナル抗体である、ＯＫＴ１０であり得る（ＯＫＴ１０及びＯＫＴ１０を産生する方法の説明については、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，３６４，９３５号を参照されたい）。以下の実施例５に示されるように、ＡＴＲＡは、ＯＫＴ１０で構築されたＥＤＣで試験された、ＣＤ３８を発現する全ての細胞の細胞感受性を増強した。以前の研究は、ＯＫＴ１０によって認識されるＣＤ３８エピトープが、ＣＤ３８のカルボキシル末端の近くに位置し、ＣＤ３８の残基２８７〜２９６を伴うヒトＣＤ３８の最後の（６番目の）ジスルフィドループにマップされたことを示した（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７；ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。更に、ＯＫＴ１０もまた、シノムルガスＣＤ３８に結合することが示された。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２８７（即ち、Ｃｙｓ２８７）及び２９６（即ち、Ｃｙｓ２９６）によって形成されるＣＤ３８（即ち、配列番号２）のジスルフィド結合を含むエピトープに、特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２８７〜２９６を含む６番目のＣ末端ジスルフィドループを含むエピトープに、特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＯＫＴ１０モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＯＫＴ１０モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。
【００７７】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、寄託番号ＨＢ−１０１６４でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマ細胞株を使用して産生される、抗ＣＤ３８抗体ＩＢ４であり得る（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５８（２）：７４１−７を参照されたい）。ＩＢ４が、ヒトＣＤ３８のアミノ酸２７３〜２８５（参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５８（２）：７４１−７を参照されたい）、及び同様にヒトＣＤ３８のアミノ酸２２０〜２４１（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７、表１を参照されたい）にまたがるＣＤ３８のカルボキシル末端の近くに位置するエピトープに結合することが以前に確立された。追加の研究は、ＩＢ４がシノムルガスＣＤ３８に結合しないことを示した（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２２０〜２４１を含むエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２７３〜２８５を含むエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２２０〜２４１及び２７３〜２８５を含むエピトープに特異的に結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＩＢ４モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７に説明されるように、ＩＢ４モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。
【００７８】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、アイソタイプサブクラス、ＩｇＧ２ｂである、抗ＣＤ３８抗体ＩＢ６であり得る（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６（６）：５３９−４７を参照されたい）。以前の研究は、ＩＢ６がシノムルガスＣＤ３８に結合しないことを示した（ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：２１を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＩＢ６モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＩＢ６モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。
【００７９】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、現在、臨床開発中であるである、ＣＤ３８に対するヒト化モノクローナル抗体である、ＳＡＲ６５０９８４（３８ＳＢ１９としても既知である）であり得る。ＳＡＲ６５０９８４は、寄託番号ＰＴＡ−７６７０でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマ細胞株を使用して産生される（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；２０（１７）４５７４−８３）（３８ＳＢ１９抗体及び他の抗ＣＤ３８抗体、ならびに重鎖、軽鎖、及びＣＤＲ配列を含むそれらの配列、ならびに該抗体を産生する方法の説明については、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１５３，７６５号も参照されたい）。ＳＡＲ６５０９８４は、ＣＤ３８のアミノ酸１０７〜１２０、１２５、１４６、１５５、１８９、１９３、１９４、及び２２６を含む、ＣＤ３８上のエピトープを認識する（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；２０（１７）；４５７４-８３を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸１０７〜１２０、１２５、１４６、１５５、１８９、１９３、１９４、及び２２６を含むエピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸１０７〜１２０、１２５、１４６、１５５、１８９、１９３、１９４、及び２２６のうちの１つ以上を含むエピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＳＡＲ６５０９８４モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＳＡＲ６５０９８４モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、米国特許第８，１５３，７６５号に記載される抗ＣＤ３８抗体のうちのいずれかと同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、米国特許第８，１５３，７６５号に記載される抗ＣＤ３８抗体のうちのいずれかの重鎖、軽鎖、及びＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。
【００８０】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、現在、臨床開発中であるである、ＣＤ３８に対するヒトモノクローナル抗体である、ダラツムマブであり得る（その全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１８６（３）：１８４０−８を参照されたい）。ダラツムマブは、アミノ酸２３３〜２４６及び２６７〜２８０を含むＣＤ３８の細胞外ドメイン内の２つのベータ鎖に限局するＣＤ３８上のエピトープを認識する（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１８６（３）：１８４０−８を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＣＤ３８（即ち、配列番号２）のアミノ酸２３３〜２４６及び２６７〜２８０のうちの１つ以上を含むエピトープに結合し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ダラツムマブモノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ダラツムマブモノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。
【００８１】
ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体は、ＣＤ３８に対する完全ヒトモノクローナル抗体である、ＭＯＲ２０２であり得る（ＭＯＲ２０２抗体及び他の抗ＣＤ３８抗体、ならびに重鎖、軽鎖、及びＣＤＲ配列を含むそれらの配列、ならびに該抗体を産生する方法に関する情報については、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８７７，８９９号を参照されたい）。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＭＯＲ２０２モノクローナル抗体と同じＣＤ３８（即ち、配列番号２）に対する結合特異性を有し得る。ある実施形態において、抗体標的化部分は、ＭＯＲ２０２モノクローナル抗体と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合し得る。ある実施形態において、ＣＤ３８に特異的に結合するＥＤＣ中の抗体標的化部分は、米国特許第８，８７７，８９９号で提供されるようなＭＯＲ２０２抗体または他の抗ＣＤ３８抗体の重鎖、軽鎖、及びＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。
【００８２】
本開示のＥＤＣ中の抗体標的化部分は、典型的に、それらのネイティブ非共役対応物の抗原結合能力を保持する。このため、本開示のＥＤＣにおいて有用な抗体は、安定した（かつ、一部の実施形態において、開裂不可能な）リンカーを通じて、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（例えば、シラレニン）上で作用する薬剤に共有結合されつつ、抗原に特異的に結合することが可能である。かかる抗原は、治療的介入（または診断）のために標的とされている細胞または組織中のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと会合され、かつそれにごく近接する、タンパク質または標的を含む。
【００８３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するために種々の方法が採用されており、これらの方法は、本開示のＥＤＣにおける使用のための抗体の産生に適用可能であり、そのため、以下では簡潔に概説する。単一の型の抗体を産生するクローン化細胞株を意味するハイブリドーマ技術は、マウス（ｍｉｃｅ）（マウス（ｍｕｒｉｎｅ））、ハムスター、ラット、及びヒトを含む、種々の種の細胞を使用する。キメラ及びヒト化抗体を含む、ＭＡｂを調製するための他の方法は、遺伝子工学、例えば、組み換えＤＮＡ技術を採用する。
【００８４】
ポリクローナル抗体は、関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において作製され得る。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の個体群から得られ、例えば、該個体群を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生突然変異を除き、同一である。
【００８５】
ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１、及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって、判定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０のＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって判定することができる。
【００８６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能である、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの源として機能する。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ得、これは、次いで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞等の宿主細胞に形質転換されて、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る（米国特許出願公開第ＵＳ２００５００４８５７２号及び第ＵＳ２００４０２２９３１０号を参照されたい）。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する概説記事としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８が挙げられる。
【００８７】
更なる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体断片は、それぞれ、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を説明する、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７において説明される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリから単離することができる。その後の公開物は、非常に大きいファージライブラリを構築するための戦略としての、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）、ならびに組み合わせ感染及びインビボ組み換えによる、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生を説明する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）。このため、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替策である。
【００８８】
ＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７）；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１）、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の免疫グロブリンコード配列全てまたは一部に共有結合させることによって、修飾され得る。
【００８９】
典型的に、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに対して置換されるか、またはそれらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換されて、ある抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含む、キメラ二価抗体を作製する。
【００９０】
ヒト化の代替としては、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、フルレパートリのヒト抗体を産生することが可能である、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号；第５，５８９，３６９号；及び第５，５４５，８０７号）。
【００９１】
代替的に、ファージ提示技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）を使用して、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生することができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．３：５６４−５７１）。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリを構築することができ、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、本質的に単離することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞によって生成することができる（米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号）。ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体が、説明されている（米国特許第５，７７２，９９７号及びＰＣＴ公開第ＷＯ  ９７／００２７１号。
【００９２】
種々の技術が、抗体断片の産生のために開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照されたい）。抗体断片はまた、上で述べられる組み換え宿主細胞及び抗体ファージライブラリによって直接産生することができる。Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、直接大腸菌から回収され、結合されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組み換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態において、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｖ（ｓＦｖ）二量体である（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８）。例えば、化学結合を使用して、抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術もまた、説明されており、ここでは、無傷抗体は、タンパク質分解的に開裂されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１）。Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から回収され、結合されて、二重特異性抗体を形成することができる（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５。「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的な方法を提供する（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。
【００９３】
２よりも多い原子価を有する抗体を、本開示のＥＤＣの種々の実施形態において採用することができる。３つ以上の抗原結合部位及び２つ以上の可変ドメインを有する多価「オクトパス」抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現によって容易に産生することができる（米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０００４５８６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／７７３４２号）。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０）。
【００９４】
抗体のアミノ酸配列修飾（複数を含む）が、本開示によって企図される。例えば、腫瘍関連または他の抗原に結合する抗体の突然変異体及び種々のイソフォームは、抗体の結合親和性及び／もしくは他の生物学的特性を向上させる、ならびに／または抗体へのリンカー及び／もしくは治療薬剤の部位特異的共役を可能にするように企図される。抗体のアミノ酸配列変異は、抗体をコードする核酸に、適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製される。かかる修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に達するように行われるが、ただし、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変化等の抗体の翻訳後プロセスを改変し得る。
【００９５】
突然変異誘発のための好ましい位置にある抗体のある残基または領域の識別のための有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」であり（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、ここでは、アミノ酸残基、または標的残基群が識別され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）、アラニンもしくはポリアラニン等の中性もしくは負に荷電されたアミノ酸によって置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用を最適化する。アミノ酸配列挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。
【００９６】
抗体のアミノ酸配列は、通常、基本的な核酸配列を改変することによって、改変される。抗体のアミノ酸配列変異をコードする核酸分子は、当該技術分野において既知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（自然発生アミノ酸配列変異の場合）、または抗体の先に調製された変異もしくは非変異型のオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。置換突然変異誘発のための最も関心の高い部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた、企図される。
【００９７】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはらせん構造としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位においける分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するそれらの効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。自然発生残基は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅに基づいて、グループに分割される。非保存置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【００９８】
抗体の適切な構造を維持することに関与しないいずれのシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止するように、一般的にはセリンで置換され得る。逆に、システイン結合（複数を含む）は、その安定性（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）を向上させるように、抗体に付加され得る。
【００９９】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号で説明されるように、抗体（特に、抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込み得る。本明細書で使用される際、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させることに関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（米国特許出願公開第ＵＳ２００３０１９０３１１号、ならびに米国特許第６，８２１，５０５号；第６，１６５，７４５号；第５，８３４，５９７号；第５，６４８，２６０号；及び第５，６２４，８２１号を参照されたい）。ＰＥＧ化もまた、本開示のＥＤＣの半減期を増加させるために使用することができる。
【０１００】
抗体のグリコシル化変異は、抗体のグリコシル化パターンが改変されている変異である。改変するとは、抗体で見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させる、１つ以上の炭水化物部分を抗体に付加する、グリコシル化（グリコシル化パターン）の組成またはグリコシル化の程度を変化させることを意味する。抗体は、それらの定常領域の保存位置（Ｎ結合またはＯ結合された）でグリコシル化され得る（Ｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９９７）ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；Ｗｉｔｔｗｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）、ならびに糖タンパク質の構造及び提示された３次元表面に影響を及ぼし得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ、上記を参照；Ｗｙｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）に影響を及ぼす。オリゴ糖はまた、特定の認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質をある分子に対する標的とする機能を果たし得る（Ｍａｌｈｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２３７−２４３；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。オリゴ糖の除去は、抗体の抗原結合及び他の特性を最適化し得る（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８）。
【０１０１】
抗体の組み換え産生中のグリコシル化に影響を及ぼす要因としては、成長モード、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが挙げられる（米国特許第５，０４７，３３５号；第５，２７８，２９９号；及び第５，５１０，２６１号）。グリコシル化、またはある型のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。加えて、組み換え宿主細胞は、遺伝子操作され、例えば、ある型の多糖を処理する際に不良なものにし得る。これらの及び類似の技術は、当該技術分野において公知である。
【０１０２】
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、ＮＭＲ、質量分光分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖組成分析、連続酵素消化、及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して、荷電に基づいてオリゴ糖を分離する）を含む、炭水化物分析の従来の技術によって容易に分析することができる。分析目的でオリゴ糖を放出するための方法は、既知であり、それらとしては、限定することなく、酵素処理（一般的に、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンド−．ベータ．−ガラクトシダーゼを使用して実施される）、主にＯ結合構造を放出するように厳しいアルカリ性環境を使用した排除、ならびにＮ及びＯ結合オリゴ糖の双方を放出するように無水ヒドラジンを使用した化学的方法が挙げられる。
【０１０３】
本開示のＥＤＣ中の抗体は、例えば、かつ限定することなく、上で提供される定義において説明されるようなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、修飾された抗体、キメラ抗体、または向上された抗体であり得る。例えば、現代の代替的な戦略は、現在、抗体の免疫原性を低減するように、完全ヒト化抗体の産生を可能にする。加えて、抗原結合Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びミニボディを含む、より小さい抗体断片を操作することができ、抗体はまた、抗体の親和性、安定性、及び発現レベルを増加するように、増強することができる（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３  Ｊａｎ；９（１）：１２９−３４を参照されたい）。
【０１０４】
本開示の代替的な実施形態において、本開示のＥＤＣの標的化部分は、抗体ではないが、代わりに、抗体のペプチドもしくはタンパク質、または標的とすることに関して、機能的な同等物であるペプチド模倣薬である。例えば、かつ限定することなく、抗体は、コンビナトリアルタンパク質設計の方法を使用して、所定の結合機能を備え得る、いくつかの小さいかつ堅牢な非免疫グロブリン「足場」のうちのいずれかによって置き換えることができる。かかる足場は、種々の概説で説明されている（例えば、“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”ｉｎ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ｊｕｎ；１３（３）：２４５−５５及び“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９  Ｍａｙ；５３（Ｐｔ  １）：１−２９を参照されたい）。
【０１０５】
本開示の別の代替的な実施形態において、本開示のＥＤＣの標的化部分は、抗体ではないが、代わりに、抗体のＤＮＡ、ＲＮＡ、または標的とすることに関して、機能的な同等物であるオリゴヌクレオチドである。例えば、ＳＥＬＥＸ方法を使用して、所定の結合機能を有するＤＮＡまたはＲＮＡまたはその修飾を識別することができる。アプタマーは、指数関数的富化ＳＥＬＥＸプロセスのようなリガンドの系統的進化によって単離されるＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはその修飾のポリマーである（Ｈｉｃｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，２０００，“Ｅｓｃｏｒｔ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ａ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６（８），ｐｐ．９２３-９２８を参照されたい）。
【０１０６】
典型的に、標的化部分（抗ＣＤ３８抗体もしくはその結合断片、または他の標的化部分）は、本開示のＥＤＣを形成する上で使用する前に、しばしば９５重量％を上回って（例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって判定される際）、かつしばしば９９重量％超まで精製される。一度、標的化部分、または関心対象のＥＤＣに対する所望の合成経路における使用のためのその好適な部分が利用可能になると、以下の項で述べられるように、様々なリンカー及び結合技術のうちのいずれかによって、例えば、かつ限定することなく、強心ステロイドであり得る治療薬剤に結合させることができる。
【０１０７】
ＩＶ．リンカー部分
本開示のＥＤＣにおいて、薬剤は、安定したリンカーを介して標的化部分の部分に結合される。リンカーは、長く（一般的に少なくとも約５０オングストローム（Ａｎｇｓｔｏｍ）の長さ、及びより典型的に１００オングストロームの長さ、または約２００オングストロームもしくは更には３００オングストローム程度の長さ以上）、可撓性かつ延長可能であり、一部の実施形態においては、正に荷電されている（リンカー部分の全てもしくは一部を形成し、薬剤に結合される、アルキル鎖中の１つ以上のヘテロ原子（例えば、窒素）の存在によるものを含む）。１つの重要な態様において、本開示は、抗ＣＤ３８抗体または他の標的化部分を、強心（ｃａｒｄｉｏｔｏｉｎｉｃ）ステロイド、強心グリコシド、及びＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを標的とする他の薬剤、及び他の薬剤全般に結合させるための新たなリンカー、ならびにそれらの合成において有用な精製された形態の組成物及び化合物を開示し、そのための方法もまた、本開示によって提供される。リンカー（例えば、完全なリンカー部分として）の結合、または、例えば、リンカーの第１の部分に結合された標的化部分、及び次いで、リンカーの更なる部分、または任意に、薬剤がリンカーの第２の部分に結合される合成中間体にあり得る薬剤部分に直接結合させることによって、段階的に形成される。
【０１０８】
本開示（ｄｉｓｃｌｓｏｕｒｅ）のＥＤＣにおいて採用されるリンカーは、安定している。例えば、投与後、ＥＤＣは、安定しており、かつ無傷のままであり、例えば、標的化部分は、リンカーを介して薬剤に結合されたままである。リンカーは、標的細胞の外側で安定しており、かつ有効性のために未開裂のままである。効果的なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）共役体もしくは薬剤の送達を可能にし、（ｉｉｉ）安定かつ無傷のままであり、例えば、抗体及び／もしくは薬剤が安定かつ無傷のままである限り、開裂しておらず、（ｉｖ）ＥＤＣが無傷である間、薬剤の細胞毒性、細胞殺滅効果、または細胞増殖抑制効果を維持する。例として、安定したリンカーは、本開示のＥＤＣ内にあるとき、循環構造、標的組織の表面、標的細胞の表面、または細胞外マトリクスに少なくとも４〜８時間以上の期間、例えば、８〜２４時間、または１〜１０日以上存在する間、最小の（例えば、１０％未満）開裂を示すものであり、開裂不可能なリンカーは、２０日以上程度の期間を含む、より長い期間、これらの条件において安定している（Ｄｕｒｃｙ，Ｌ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１０，２１，５-１３）。
【０１０９】
好適なリンカーの長さは、実験的測定によって、例えば、得られる本開示のＥＤＣの活性を判定するために使用されるアッセイにおいて複数のリンカーの長さを試験することによって、判定され得る。例えば、リンカーの長さが短すぎる（薬物及び標的化部分が同時にそれらの結合部位に到達することを可能にしない）場合、問題を容易に識別及び解決して、本開示のＥＤＣを提供することができる。典型的に、リンカーの長さは、約５０〜約３００オングストローム、または約５０〜約２００オングストロームの範囲であろう。リンカーの長さ及び組成物は、ＥＤＣが、酵素及び他の環境的物質が、そうでなければ崩壊し得る、循環構造において、安定していることを確実とするように、かつ標的化部分がその抗原に結合する場所から、薬剤がその標的上で作用する場所までの距離を反映するように、選択される。これらの要件に適合する多種多様なリンカーは、入手可能であるか、または合成することができ、これは、特に、本開示のＥＤＣにおいて採用することができる多種多様なリンカー、治療薬剤、及び標的化部分を考慮するとき、非常に大きいクラスの本開示によって提供されるＥＤＣを作製する。
【０１１０】
リンカーは、ＥＤＣの一部の代わりに、個別のエンティティとして概念化される場合、１つ以上の薬物を抗体に結合させてＥＤＣを形成するために使用することができる、単官能性または多官能性部分である。ＥＤＣは、薬物及び抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して、好都合に調製することができる。例えば、システインチオール、またはアミン、例えば、抗体の還元ジスルフィド結合の硫黄原子、またはリジンもしくはヒスチジン等のＮ末端もしくはアミノ酸側鎖は、リンカー試薬または薬物−リンカー試薬（薬剤及びリンカーから成る）の官能基との結合を形成することができる。
【０１１１】
一部の実施形態において、リンカーは、１つ以上のエチレングリコール単位（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。理論によって束縛されることを望むことなく、リンカーにおけるエチレングリコール単位の存在は、可撓性、薬剤と標的化部分との間の調節可能な空間、及びＥＤＣに対する望ましい可溶特性を付与すると考えられる。一部の実施形態において、リンカーは、標的化部分にごく近接した、例えば、標的化部分に直接結合された、または短いアルキル鎖（例えば、２〜約２０個の原子を有する官能化アルキル鎖）によって標的化部分に結合された、エチレングリコール単位（複数を含む）を含む。一部の実施形態において、リンカーは、約６〜約６０個のエチレングリコール繰り返し単位、例えば、約６、約１２、約２４、約３６、約４８、または約６０個のエチレングリコール繰り返し単位を有する、ポリエチレングリコールサブユニットを含む。一部の好ましい実施形態において、リンカーは、２４個のエチレングリコール繰り返し単位（本明細書において、「ＰＥＧ２４」とも称される）を含む。他の好ましい実施形態において、リンカーは、３６個のエチレングリコール単位（「ＰＥＧ３６」）を含む。
【０１１２】
一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、窒素）を含む、第２の部分を含む。理論によって束縛されることを望むことなく、リンカーにおける窒素等のヘテロ原子（複数を含む）の存在は、生理学的ｐＨでのＥＤＣの可溶特性を増強させると考えられる。したがって、その中に含まれる最適な数のヘテロ原子を含む、最適なリンカーは、薬剤部分及び標的化部分の部分の異なる組み合わせによって異なり得る。
【０１１３】
一部の実施形態において、ヘテロ原子（複数を含む）は、アルキル鎖（例えば、官能化ヘテロアルキル鎖）に含まれる。ヘテロアルキル鎖は、薬剤の活性が実質的に縮小されないように（例えば、薬剤が強心剤であるとき、Ｃ３炭素を通じて）、任意の好適な場所で薬剤に結合され得る。一部の実施形態において、ヘテロアルキル鎖は、標的化部分に直接結合されるが、好ましい実施形態において、ヘテロアルキル鎖は、１つ以上のエチレングリコール単位（例えば、ＰＥＧ２４等のポリエチレングリコール）によって、標的化部分に結合される。一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも（ａ  ｌｅａｓｔ）１つのグリコシド残基（例えば、アミノグリコシド）を含み、これは、典型的に、ＥＤＣの薬剤に結合される。
【０１１４】
一部の実施形態において、本開示のリンカーは、式（ＩＩ）と一致する式を有し、
【化２】
2017506640.tif 000006
式中、
Ｘ１が、任意に存在し、存在するとき、（標的化部分との結合前に）標的化部分の一部分と反応性の基を含む。例えば、かつ限定することなく、標的化部分が抗体、抗体断片、タンパク質、またはペプチドであるとき、リンカーは（標的化部分との結合前に）、還元ジスルフィド結合からの硫黄原子、またはリジンまたはヒスチジン残基からの窒素原子等の求核原子を通じて、標的化部分との結合を可能にするように、マレイミド等の求電子基を含み得る。このため、一部の実施形態において、式（ＩＩ）のＸ１は、
【化３】
2017506640.tif 000007
であり得、式中、ｄが０〜６であり、
Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４の各々が、任意に存在し得、かつアルキル、ケトン、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ９−から個々に選択され得、Ｒ８及びＲ９が、アルキル（例えば、メチル）、ヘテロアルキル、アリール、及びヘテロアリールから個々に選択され、
Ｘ５及びＸ６が、ＣＲ１０及びＮから各々個々に選択され、Ｒ１０が、Ｈ、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルであり、
Ｘ７が、任意に存在し、かつ−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＲ１１Ｃ（Ｏ）−から選択され得、Ｒ１１が、Ｈ、分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルであり、
Ｒ１が、任意に存在し、かつ分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルから選択され得、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ６の各々が、任意に存在し得、かつ分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、及び不飽和アルキルから個々に選択され得、
Ｒ４及びＲ５の各々が、任意に存在し、かつ分岐アルキル、非分岐アルキル、飽和アルキル、または不飽和アルキルから個々に選択され得るが、但し、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが存在しなければならないことを条件とし、
ａが０〜９９であり、
ｂが０〜９９であり、
ｃが０〜９９である。
【０１１５】
一部の好ましい実施形態において、リンカーは、式（ＩＩ）の式を有し、式中、Ｘ１が
【化４】
2017506640.tif 000008
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４及びＲ５が各々−ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが１〜５０であり；ｂが１〜１０であり；ｃが１〜１０である。
【０１１６】
１つの特に好ましい実施形態において、リンカーは、式（ＩＩ）の式を有し、式中、Ｘ１が
【化５】
2017506640.tif 000009
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４及びＲ５が各々−ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４または３６であり；ｂが１であり；ｃが１である。
【０１１７】
別の特に好ましい実施形態において、リンカーは、式（ＩＩ）の式を有し、式中、Ｘ１が
【化６】
2017506640.tif 000010
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４または３６であり；ｂが１；でありｃが１である。
【０１１８】
別の特に好ましい実施形態において、リンカーは、式（ＩＩ）の式を有し、式中、Ｘ１が
【化７】
2017506640.tif 000011
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４及びＸ５が各々−ＮＨ−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｎ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４または３６；ｂが１であり；ｃが１である。
【０１１９】
Ｖ．薬剤部分
多種多様な薬剤が、本開示のＥＤＣにおける使用に好適である。一般的に、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅに結合するか、またはそうでなければ、ポンプ活性に影響を及ぼす（例えば、ポンプ活性を低減するか、またはポンプ活性を停止する）ことが可能である。典型的に、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ上、例えば、アルファサブユニットで直接作用する「非内在化治療薬剤」である。本開示の他の実施形態において、薬剤は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと、それと会合する細胞表面経路シグナル伝達タンパク質との相互作用を阻害するように作用する。本開示の種々の実施形態において、薬剤は、ステロイド、修飾ステロイド、ステロイド誘導体（例えば、官能化ステロイド）、強心ステロイド、強心グリコシド、またはカルデノライドであり得る。一部の実施形態において、薬剤は、ブファリン、シラレニン、またはジギトキシゲニンである。他の実施形態において、薬剤は、強心グリコシド、または強心グリコシドのアグリコン、例えば、ジギトキシン、ジゴキシン、ウアベイン、もしくはプロスシラリジンである。
【０１２０】
本開示の好ましい実施形態において、薬剤は、カルデノライド、強心ステロイド、または以下の式（ＩＩＩ）の強心グリコシドであり、
【化８】
2017506640.tif 000012
式中、ステロイド環が、飽和、不飽和、またはこれらの組み合わせのいずれかであり、
【化９】
2017506640.tif 000013
であるか、またはＲが、ＣＨＯＣＨ３、Ｏ、ＯＨ、または分岐アルカン等の種々のコルチコステロイド上で見出される側鎖であり、ＲａがＣＨ３であり；ＲｂがＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、もしくはＣＨＯであり；ＲｃがＨ、ＯＨ、もしくはＣＨ３ＣＯＯであり；ＲｄがＨ、ＯＨ、もしくはＣＨ３ＣＯＯであり；ＲｅがＨであるか、あるいはＲｆがＨもしくはＯＨであるとき、または炭素Ｃ４及びＣ５間に二重結合が存在するとき、Ｒｅが基ではなく；ＲｆがＨもしくはＯＨであるか、またはＲｅがＨであるか、もしくは炭素Ｃ４及びＣ５間に二重結合が存在するとき、Ｒｆが基ではなく；ＲｇがＨであるか、またはＲｅがＨであるか、もしくは炭素Ｃ４及びＣ５間に二重結合が存在するとき、Ｒｇが基ではなく；ＲｈがＨもしくはＯＨであり；Ｘが「−Ｙ−Ｚ−」の一般式を有し、式中、Ｙが炭素Ｃ３に共有結合され、かつＯ、Ｓ、Ｎ（ＯＲ’）、Ｎ（ＳＲ’）、及びＮ（ＮＲ’）から選択され、Ｚがヌルであるか、またはグリコシド、例えば、３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシド、及び／もしくは４−アミノ−キシロシドであり；Ｒ’がアルキルもしくはアリール基である。
【０１２１】
一部の実施形態において、薬剤は、式（ＩＩＩ）のカルデノライド、強心ステロイド、または強心グリコシドの薬学的に許容可能なエステル、誘導体、共役体、水和物、溶媒和物、プロドラッグ、もしくは塩、または前述のうちのいずれかの混合物である。
【０１２２】
一部の実施形態において、ＥＤＣの薬剤部分は、ブファリンである。他の実施形態において、ＥＤＣの薬剤部分は、シラレニンである。更に他の実施形態において、ＥＤＣの薬剤部分は、ジギトキシゲニンである。
【０１２３】
ＶＩ．ＥＤＣ構築、スクリーニング、及び具体的な実施形態
本開示は、安定した（かつ、一部の実施形態において、開裂不可能な）リンカーを介して、強心ステロイド等の薬剤部分に結合される、抗ＣＤ３８抗体等の標的化部分を概して含むＥＤＣを提供する。
【０１２４】
概して、本開示のＥＤＣにおいて、薬剤部分がリンカーに結合される部位は、リンカー結合が、ＥＤＣにおける薬剤の所望の活性、例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅへの結合を最小限に干渉するのみであるか、または全く干渉しない位置である。本開示の実施形態は、これらの強心ステロイドのＣ３を通じて結合されるリンカーを例解するが、他の結合点が可能であり、かつ本開示の範囲内である。
【０１２５】
概して、リンカー部分は、チオール（例えば、最初にジスルフィド結合を還元することによって得られる）またはアミン（例えば、リジンもしくはヒスチジン残基から）等のペプチドの反応基を通じて、標的化部分に結合される。一部の好ましい実施形態において、標的化部分の反応基または原子は、抗体（例えば、抗ＣＤ３８抗体）のヒンジ領域における硫黄原子である。
【０１２６】
したがって、一部の実施形態において、本開示のＥＤＣは、以下の式（ＩＶ）に示されるような構造を有し、
【化１０】
2017506640.tif 000014
式中、Ｑが、硫黄または窒素原子等の標的化部分の反応性原子であり、リンカー及び薬剤（薬剤の置換基Ｘを含む）が、上で説明されるとおりである。
【０１２７】
一部の実施形態において、ＥＤＣは、式（ＩＶａ）に示されるような構造を有し、
【化１１】
2017506640.tif 000015
式中、
【化１２】
2017506640.tif 000016
が、上で説明されるような標的化部分の部分であり、
【化１３】
2017506640.tif 000017
が、上で説明されるような薬剤部分であり、ａがリンカー部分に関して上で定義されるとおりである。
【０１２８】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１４】
2017506640.tif 000018
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４であり；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１２９】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１５】
2017506640.tif 000019
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６であり；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３０】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１６】
2017506640.tif 000020
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４であり；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３１】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１７】
2017506640.tif 000021
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６であり；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３２】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１８】
2017506640.tif 000022
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ３であり、Ｒ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４であり；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３３】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化１９】
2017506640.tif 000023
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３４】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２０】
2017506640.tif 000024
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３５】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２１】
2017506640.tif 000025
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５及びＸ６が各々Ｎであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が、各々−ＣＨ２ＣＨ２であり；Ｒ３及びＲ６が各々−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３６】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２２】
2017506640.tif 000026
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３７】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２３】
2017506640.tif 000027
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３８】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２４】
2017506640.tif 000028
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１３９】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２５】
2017506640.tif 000029
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４０】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２６】
2017506640.tif 000030
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４１】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２７】
2017506640.tif 000031
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが３６；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４２】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２８】
2017506640.tif 000032
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４３】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がブファリンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化２９】
2017506640.tif 000033
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４４】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化３０】
2017506640.tif 000034
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４５】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がシラレニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化３１】
2017506640.tif 000035
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４６】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化３２】
2017506640.tif 000036
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４７】
一部の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）のＥＤＣを提供し、式中、薬剤がジギトキシゲニンであり；リンカーが、式（ＩＩ）の構造を有し、式中、Ｘ１が
【化３３】
2017506640.tif 000037
であり、ｄが２であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；Ｘ３がヌルであり；Ｘ４が−ＮＨ−であり；Ｘ５が−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ｘ６がヌルであり；Ｘ７が−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；Ｒ４がヌルであり；Ｒ５及びＲ６が共に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；ａが２４；ｂが１であり；ｃが１であり；標的化部分が、ＳＵＮ４Ｂ７、ＨＢ７、ＯＫＴ１０、ＩＢ４、ＡＴ１、ＳＡＲ６５０９８４、３８ＳＢ１９、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２抗体、及びこれらの任意の結合断片から成る群から選択される、ＣＤ３８エピトープに結合する、抗体標的化部分を含む。一部の実施形態において、抗体標的化部分は、ヒトまたはキメラＳＵＮ４Ｂ７抗体もしくはその結合断片、あるいはＳＵＮＢ４７と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。一部の実施形態において、標的化部分は、ＡＴ１抗体もしくはその結合断片、またはＡＴ１と同じまたは実質的に類似のＣＤ３８エピトープに結合する抗体もしくはその結合断片である。
【０１４８】
本開示のＥＤＣは、（１）窒素等のヘテロ原子（複数を含む）を含むリンカーのサブユニットに対する薬剤部分の反応、続いて、リンカー部分の残りに対する（例えば、ポリエチレングリコールに対する）、リンカーサブユニットの末端部分の反応、及び最後に、標的化部分をリンカーの末端部に反応させて、ＥＤＶを形成すること；（２）窒素等のヘテロ原子（複数を含む）を含むリンカーのサブユニットに対する薬剤部分の反応、リンカー部分の残りの部分に対する標的化部分の反応、及び最後にリンカーサブユニットの末端部を結合させて、ＥＤＣを形成すること；（３）標的化部分と、リンカー部分のサブユニット（例えば、ＰＥＧポリマー）との反応、続いて、リンカーサブユニットの末端部と、リンカー部分の残りのサブユニットとの反応、及び最後に薬剤部分との反応で、ＥＤＣを形成すること；（４）ヘテロ原子（複数を含む）（例えば、窒素）を含むリンカーのサブユニットと、ＰＥＧサブユニットとの反応で、完全なリンカー部分を形成し、続いて、完成したリンカー部分と薬剤部分との反応で、薬剤−リンカーサブユニットを形成し、最後に、薬剤−リンカーサブユニットと標的化部分との反応で、ＥＤＣを形成すること；ならびに／または（５）ヘテロ原子（複数を含む）（例えば、窒素）を含むリンカーのサブユニットと、ＰＥＧサブユニットとの反応で、完全なリンカー部分を形成し、続いて、完成したリンカー部分と、標的化部分の部分との反応で、標的化部分−リンカーサブユニットを形成し、最後に、標的化部分−リンカーサブユニットと薬剤部分との反応で、ＥＤＣを形成すること、を含む、当業者には既知の有機化学反応、条件、及び試薬を採用して、いくつかの経路のうちのいずれかによって段階的に調製され得る。
【０１４９】
標的化部分の部分（例えば、抗体）をＰＥＧ型リンカーサブユニットに結合させる方法は、当業者には既知であり、例えば、以下の実施例、及び第ＷＯ２０１２／１７８１７３号（この内容は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。
【０１５０】
一実施形態において、本開示のＥＤＣは、活性化された形態の薬剤部分（例えば、３−ヒドロキシル酸素原子に結合される４−ニトロフェニルカルバメート基を有する、ステロイド型薬剤）を、リンカーのアルキルアミンサブユニットと反応させ、続いて、保護されたＰＥＧポリマー（例えば、ＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステル、製品番号１０５５４、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ，Ｐｌａｉｎ  Ｃｉｔｙ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）と結合させて、薬剤−（保護）リンカー（例えば、ＭＡＬ−ＰＥＧ２４−アルキルアミン−薬剤）を形成することによって、形成される。次いで、薬剤−（保護）リンカーを、標的化部分と（例えば、任意にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン等の還元剤との反応により還元された、ＳＵＮ４Ｂ７等の、マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化抗ＣＤ３８抗体、もしくはその結合断片等の抗体と）共役させて、薬剤−（保護）リンカーのマレイミド部分への求核付加を通じてＥＤＣを形成する。
【０１５１】
抗体及び他の標的化部分上の求核基としては、例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）糖ヒドロキシルまたはアミノ基（抗体がグリコシル化されている）が挙げられるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物等の活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミド等のハロゲン化アルキル及びベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基との共有結合を形成するように反応することが可能である。ある抗体は、還元性鎖間ジスルフィド、即ち、システインブリッジを有する。抗体は、ＤＴＴ（Ｃｌｅｌａｎｄ試薬、ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩等の還元剤による処理によって、リンカー試薬との共役のために反応性にされ得る；Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）。このように、各システインジスルフィドブリッジは、理論上は、２つの反応性チオール求核試薬を形成する。加えて、ジスルフィドブリッジは、リンカー−薬剤が、抗体に共有結合されつつ、２つのシステイン間の閉結合を維持し、このため、抗体を安定化させるように、本開示のＥＤＣのリンカー部分によって架橋することができる（第ＷＯ  ２０１３／０８５９２５Ａ１号、及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，１９９０  ｐｐ  ３６−５０）。追加の求核基は、アミンのチオールへの変換をもたらす、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）とのリジンの反応を通じて、抗体に導入することができる。
【０１５２】
ＥＤＣはまた、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するための抗体の修飾によって産生され得る。グリコシル化された抗体の糖は、例えば、過ヨウ素酸塩酸化試薬で参加されて、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成し得る。得られたイミンＳｃｈｉｆｆ塩基基は、安定した結合を形成し得るか、または、例えば、ホウ化水素試薬によって還元されて、安定したアミン結合を形成し得る。一実施形態において、グリコシル化された抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応により、薬物上の適切な基と反応することができるタンパク質中のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を得ることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ２３４−２４２）。別の実施形態において、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応することができ、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらす（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５，３６２，８５２号）。かかるアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核試薬と反応させることができる。
【０１５３】
同様に、薬物部分上の求核基としては、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物等の活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミド等のハロゲン化アルキル及びベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することが可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸、及びアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
抗体等のある標的化部分は、薬剤−リンカーサブユニットのリンカー部分に反応性の１つを超える部位を含み得る。かかる実施形態において、１つを超える薬剤は、単一の標的化部分に結合され得る。薬剤負荷は、ＥＤＣ中の１つの標的化部分（例えば、抗体）あたりの薬剤の平均数を指す。各リンカーが１つの薬剤に結合される場合、薬剤の平均数は、標的化部分上のリンカーの平均数に等しくなる。本開示のＥＤＣに対する薬剤負荷は、標的化部分が抗体（Ａｂ）である場合、典型的に、１つの標的化部分あたり１〜８つの薬剤の範囲であり、例えば、ここでは、１、２、３、４、５、６、７、または８つの治療薬剤が、抗体に共有結合される。このため、ＥＤＣの組成物は、１〜８のある範囲の薬物と共役された抗体の集合体を含む。共役反応物からのＥＤＣの調製物における１つの抗体あたりの薬物の平均数は、質量スペクトル分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気泳動、及びＨＰＬＣ等の従来の手段によって特徴付けられ得る。ＥＬＩＳＡにより、ＥＤＣの特定の調製物における治療薬剤の平均化値が判定され得る（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２）。しかしながら、ＥＬＩＳＡに基づく方法によって、抗体に共役された治療薬剤及び／またはリンカーの位置を識別することは可能ではない。一部の例において、均質なＥＤＣ（治療薬剤の数は同じであるが、抗体上の位置は異なり得る場合）の分離、精製、及び特性評価は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動等の手段によって達成され得る。
【０１５５】
一部の実施形態において、薬剤部分、リンカー部分、及び標的化部分の部分から成るＥＤＣは、標準的な親和性、サイズ排除、濾過、または当業者に既知の他の方法を使用して、結合されていない薬剤、リンカー、及び／または標的化部分から精製される。
【０１５６】
種々の実施形態において、本開示のＥＤＣは、概して、癌、免疫障害（例えば、喘息）、及び他の疾患の治療に有用である。癌治療のための疾患の例としては、乳癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、及び膵臓癌が挙げられる。具体的に、以下の腫瘍型のうちの１つのための治療が効果的であり得る：Ｂ細胞リンパ芽球白血病、Ｔ細胞リンパ芽球白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、結腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌、及び結腸癌。
【０１５７】
ＶＩＩ．薬学的製剤
本開示に従う化合物または製剤（例えば、開示されるＥＤＣを含む化合物または製剤）の投与は、治療薬剤に対して受け入れられている、及び当該技術分野において一般的に既知の投与方法のうちのいずれかによって行うことができる。これらのプロセスとしては、例えば、非経口、経口、経鼻、または局所投与（例えば、パッチによる）による、全身投与が挙げられるが、これに限定されない。非経口投与は、一般的に、皮下、筋肉内、もしくは静脈内注射によって、または潅流によって、行われる。一般的に、抗体に基づく治療は、典型的に、静脈内投与される。注射可能な組成物は、懸濁液もしくは液体溶液、または液体中での用時溶解に好適である固体形態のいずれかの標準的な形態で調製することができる。一実施形態において、非経口投与は、一定の用量レベルの維持を確実とする緩速放出または延長放出を有するシステムの設定を使用する。鼻腔内投与に関しては、当業者に公知である好適な鼻腔内ビヒクルを使用することが可能である。経口投与は、錠剤、カプセル、ソフトカプセル（遅延放出または延長放出を有する製剤を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、染料、懸濁液、シロップ、及びエマルションによって行うことができる。この形態の提示は、腸管バリアの通過のためにより特に適している。
【０１５８】
本開示による化合物または製剤の投与のための用量は、対象の型、血統、年齢、体重、性別、及び医学的状態；治療されるべき状態の重篤性；投与方法；対象の腎臓及び肝臓機能の状態、ならびに既知の試験プロトコルを使用して、あるいはインビボもしくはインビトロ試験または診断データからの外挿によって、使用され、かつ経験的に判定され得る、特定の化合物もしくは塩の性質を含む、様々な要素に従って選択される。任意の特定の個人に関して、具体的な用量レジメンが、個々の必要性、及び製剤を投与する、または製剤の投与を管理する人物の専門的な判断に従って、経時的に調節されるべきであることが更に理解される。例えば、通常の経験のある医者は、治療されることになる医学的状態の進行を、中断、または停止するための所望の化合物の有効量を容易に判定及び処方するであろう。例として、非経口的に投与されるとき、本開示に従う化合物の有効レベルは、体重１ｋｇあたり約０．００２〜約５００ｍｇ、より具体的には、体重１ｋｇあたり約０．０２ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲内であり、毎日、毎週、または隔週投与される。
【０１５９】
本開示に従う化合物または製剤は、１日１回の用量の形態で投与することができるか、または、１日の総用量を、１日あたり２、３、４回以上の用量の用量（例えば、分割用量）で投与することができる。かかる容量（複数を含む）は、断続的に、例えば、毎週、または３週毎（例えば、患者が、組成物または製剤の約２〜約２０、例えば、約６回の用量を受けるように）投与されてもよい。初期のより高い負荷用量、続いて、１回以上のより低い用量が投与されてもよい。例示的な投薬レジメンは、初期負荷用量、続いて、毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の用量レジメンは、有用であり得る。より具体的には、用量は、一部の実施形態において、１〜２０ｍｇｓ／平方メートル（ｍｇｓ／ｍ２）体表面積（ｂｓａ）の範囲で類似であってもよく、用量は、毎週、または２週毎に投与することができる。固形腫瘍に関しては、用量は、一部の実施形態において、より高い、例えば、２００〜６００ｍｇｓ／ｍ２ｂｓａまたは約０．０１〜２０ｍｇｓ／ｋｇ（例えば、１２０分の静脈内点滴を通じて投与）、及び１５０〜３５０ｍｇｓ／ｍ２または１〜１０ｍｇｓ／ｋｇ（６０分の静脈内点滴を通じて投与）の範囲の初期用量であってもよい。したがって、本開示に従う化合物の投薬範囲は、毎日〜毎週の１ｍｇｓ／ｍ２〜５００ｍｇｓ／ｍ２ｂｓａの用量とすることができる。
【０１６０】
本開示に従う組成物または製剤は、殺菌することができる、かつ／または以下のうちの１つ以上を含有することができる：保存、安定化、湿潤、もしくは乳化のための薬剤等の非毒性アジュバント及び補助物質；溶解を促進する薬剤；ならびに浸透圧を制御するための塩及び／もしくは緩衝剤。加えて、それらはまた、治療利点を提供する他の物質を含有することができる。組成物は、当業者には公知の混合、造粒、またはコーティングの標準的なプロセスによって、それぞれ調製される。
本明細書における本開示の化合物または製剤は、第２の薬物と同時に、連続的に、もしくは交互に、または他の療法で反応がなければ、投与することができる。このため、第２の薬物の組み合わせ投与は、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用する同時投与、及びいずれかの順序の連続投与を含み、好ましくは、双方の（または全ての）療法が、それらの生物学的活性を同時に与える期間が存在する。複数の第２の薬物が、本開示の化合物と組み合わせて使用されてもよい。
【０１６１】
本開示の別の実施形態において、上で説明される障害の治療に有用な材料を含有する製造物品が提供される。一態様において、製造物品は、（ａ）本明細書における化合物または製剤を含む容器（好ましくは、容器は、容器内にＥＤＣ及び薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む）；ならびに（ｂ）患者における障害を治療するための説明を有するパッケージ挿入物を含む。
【０１６２】
本開示の治療ＥＤＣは、治療されるべき状態に適切ないずれの経路によっても投与されてよい。ＥＤＣは、典型的に、非経口的投与され、例えば、点滴、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、ボーラス、腫瘍内注射、または硬膜外注射である（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３（６）：１３９０−１４０２）。ＥＤＣの薬学的製剤は、典型的に、薬学的に許容可能な非経口ビヒクルと共に、非経口投与のために、かつ単位用量の注射可能な形態で調製される。所望の純度を有するＥＤＣは、任意に、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、または安定剤と混合される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）。
【０１６３】
許容可能な非経口ビヒクル、希釈剤、担体、賦形剤、及び安定剤は、採用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、かつリン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤を含む。例えば、凍結乾燥された抗ＥｒｂＢ２抗体製剤は、明示的に参照により本明細書に組み込まれる第ＷＯ  ９７／０４８０１号で説明されている。ＥＤＣの例示的な製剤は、適切にｐＨ６の約１００ｍｇ／ｍｌのトレハロース（２−（ヒドロキシメチル）−６−［３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラン−２−イル］オキシ−テトラヒドロピラン−３，４，５−トリオール；Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１；ＣＡＳ番号９９−２０−７）、及び約０．１％のＴＷＥＥＮ（商標）２０（ポリソルベート２０；ドデカン酸２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロフラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチルエステル；Ｃ２６Ｈ５０Ｏ１０；ＣＡＳ番号９００５−６４−５）を含有する。
【０１６４】
治療ＥＤＣの薬学的製剤は、ＥＤＣを作製するプロセスにおける、不完全な精製、ならびに過剰な試薬、不純物、及び副生成物の分離；あるいは時間／温度加水分解、またはバルクＥＤＣもしくは製剤化されたＥＤＣ組成物の保存後の分解の結果として、ある量の未反応薬剤部分、標的化部分−リンカー中間体、及び／または薬剤−リンカー中間体を含有し得る。例えば、それは、検出可能な量の薬剤−リンカーまたは種々の中間体を含有し得る。代替的に、または加えて、それは、検出可能な量の結合されていない遊離標的化部分を含有し得る。例示的な製剤は、インビトロ細胞増殖アッセイによって、一部の場合において、薬剤−リンカー共役体が、遊離薬剤よりも細胞殺滅において効力が低いことが示されたため、最大１０％モル当量の薬剤−リンカーの薬剤を含有し得る。
【０１６５】
活性薬学的成分はまた、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて、それぞれ、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１６６】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例は、ＥＤＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、成形された物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、分解不可能なエチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから成る注射可能なマイクロスフェア）等の分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１６７】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならず、これは、無菌濾過膜を通じた濾過によって、容易に達成される。
【０１６８】
製剤は、前述の投与経路に好適なものを含む。製剤は、単位用量形態で好都合に提示され得、かつ薬学の技術分野において公知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。技術及び製剤は、概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）において見出される。かかる方法は、活性成分を、１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体、または微細に分割された固体担体、または双方と均一かつ緊密に会合させ、次いで、必要な場合、製品を成形することによって、調製される。
【０１６９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物中に活性材料（ＥＤＣ）を含有する。かかる賦形剤としては、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、及びアカシアゴム、ならびに分散もしくは湿潤剤、例えば、自然発生フォスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が挙げられる。水性懸濁液はまた、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート等の１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の矯味剤、及びスクロースまたはサッカリン等の１つ以上の甘味剤を含有し得る。
【０１７０】
ＥＤＣの薬学的組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液等の無菌の注射可能な調製物の形態であり得る。この懸濁液は、上で言及されているそれらの好適な分散または湿潤剤、及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化され得る。無菌の注射可能な調製物はまた、１，３−ブタン−ジオール中の溶液等の非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁液であり得るか、または凍結乾燥粉末として調製され得る。採用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及び生理食塩液である。加えて、無菌固定油が、溶媒または懸濁媒体として従来的に採用されてもよい。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性固定油が採用されてもよい。加えて、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の調製物において同様に使用されてもよい。
【０１７１】
単一用量形態をもたらすように担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与形態に依存して変化する。例えば、静脈内点滴が意図される水性溶液は、約３０ｍＬ／時の速度の好適な体積の点滴を行うことができるようにするために、溶液１ミリリットルあたり約３〜５００μｇの活性成分を含有し得る。皮下（ボーラス）投与は、約１．５ｍｌ以下の総体積、及び１ｍｌあたり約１００ｍｇのＥＤＣの濃度で達成され得る。頻回及び長期投与を必要とするＥＤＣに関して、事前充填された注射器または自動注射デバイス技術等による、皮下経路が採用されてもよい。
【０１７２】
一般的な提案として、１用量あたりに投与されるＥＤＣの初期の薬学的有効量は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、即ち、１日あたり約０．１〜２０ｍｇ／患者の体重１ｋｇの範囲内であり、使用される化合物の典型的な初期範囲は、０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日である。例えば、ヒト患者は、患者の体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇのＥＤＣで初期に投薬されてもよい。用量は、最大耐性量（ＭＴＤ）まで上昇されてもよい。投薬スケジュールは、約３週毎であってもよいが、診断された状態または応答に従って、スケジュールは、より多いまたはより少ない頻度であってもよい。用量は、約４サイクル以上等の複数のサイクルで安全に投与することができるＭＴＤ以下となるように、治療過程の間に更に調節されてもよい。
【０１７３】
非経口投与に好適な製剤は、意図されるレシピエントの血液で製剤を等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び溶質を含有し得る、水性及び非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る、水性及び非水性無菌懸濁液を含む。
【０１７４】
タンパク質治療の経口投与は、一般的に、胃腸における限られた吸収、加水分解、または変性による乏しいバイオアベイラビリティにより、不利であるが、経口投与に好適なＥＤＣの製剤は、既定量のＥＤＣを各々含有するカプセル、カシェー、または錠剤等の個別の単位として調製され得る。
【０１７５】
製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば、封止されたアンプル及びバイアルにパッケージ化されてもよく、かつ、使用の直前に、注射するために、無菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で、保存されてもよい。用時注射溶液及び懸濁液は、先で説明される種類の無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製される。例示的な単位用量製剤は、１日用量もしくは単位１日サブ用量、またはその適切な一部分の活性成分を含有する。
【０１７６】
本開示は、上で定義されるような少なくとも１つの活性成分と共に、そのための獣医学的担体を含む、獣医学的組成物を更に提供する。獣医学的担体は、組成物を投与する目的上有用な材料であり、本来不活性であるか、または獣医学的技術分野において許容可能であり、かつ活性成分と適合性がある、固体、液体、または気体状材料であり得る。これらの獣医学的組成物は、非経口的に、経口的に、または任意の他の所望の経路によって投与され得る。
【０１７７】
本開示のＥＤＣは、ヒトもしくは動物対象において、癌及び自己免疫状態または他の免疫障害等の種々の疾患または障害を治療するために使用され得る。一実施形態において、対象は、ヒトである。別の実施形態において、対象は、非ヒト動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、トリなど）である。例示的な状態または障害としては、良性もしくは悪性腫瘍；白血病及びリンパ性悪性腫瘍；ニューロン、グリア、アストロサイト、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔の、炎症性、血管形成、及び免疫学的障害（喘息を含むが、これに限定されない）等の他の障害が挙げられる。
【０１７８】
動物モデル及び細胞ベースのアッセイにおいて識別されるＥＤＣ化合物は、腫瘍を有する高等霊長類及びヒト臨床試験において更に試験することができる。ヒト臨床試験は、有効性を試験する臨床試験と同様に設計することができる。臨床試験は、既知の化学療法及び／または細胞毒性薬剤を含む、放射線及び／または化学療法等の既知の治療レジメンと組み合わせて、ＥＤＣの有効性を評価するために設計されてもよい（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２２４１−２２５１）。一実施形態において、組み合わせ治療薬剤は、ＡＴＲＡ、ベルケイド、三酸化ヒ素、サリドマイド、ブクラシン（Ｂｕｃｌａｓｉｎｅ）、ＡＢＴ−１９９、ゲルダナマイシン、ｍＴＯＲ阻害剤、酪酸塩、（ＭＧ１３２、ベルケイド、他の（プロテアソーム阻害剤ｓ）、アニソマイシン、Ｄ−ｃＡＭＰ、ベルベリン、カルシフェロール、もしくは他のビタミンＤ誘導体、バフィロマイシンＡ１、（ロカグラミドもしくは他のフラバグリン）、ベバシズマブ；カルボプラチン；シスプラチン；シクロホスファミド；ドセタキセル注射；ドキソルビシン；エトポシド；リン酸エトポシド；ジェムザール（ゲムシタビンＨＣＬ）；ハイカムチン（塩酸トポテカン）；イホスファミド；イレッサ（ゲフィチニブ）；イリノテカン注射；メトトレキサート注射；マイトマイシン；パクリタキセル；フォトフリン、ＱＬＴ；プレメトレキセド（Ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）；プロカルバジン；ストレプトゾシン；タルセバ（エルロチニブ）；ビンブラシン（Ｖｉｎｂｌａｓｉｎｅ）；ビンクリスチン；ならびに酒石酸ビノレルビンから選択される。
【０１７９】
本開示のＥＤＣを使用して治療される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病、またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば、扁平上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ））、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃（（ｇａｓｔｒｉｃ）もしくは（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓（（ｋｉｄｎｅｙ）もしくは（ｒｅｎａｌ））癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭部及び頸部癌が挙げられる。
【０１８０】
疾患の防止または治療のために、ＥＤＣの適切な用量は、上で定義されるような治療されるべき疾患の型、疾患の重篤性及び過程、分子が予防または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。分子は、１度に、または一連の治療にわたって、患者に好適に投与される。疾患の型及び重篤性に依存して、例えば、１つ以上の別個の投与によるか、または連続的な点滴によるかにかかわらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇを含む、例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が、患者への投与に対する初期候補用量である。典型的な１日用量は、上で言及される要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）以上の範囲であり得る。患者に投与されるべきＥＤＣの例示的な用量は、約０．１〜約１０ｍｇ／患者の体重の１ｋｇの範囲内である。
【０１８１】
本開示のＥＤＣは、抗癌特性を有する第２の化合物と、薬学的組み合わせ製剤、または組み合わせ療法としての投薬レジメンにおいて組み合わされ得る。薬学的組み合わせ製剤または投薬レジメンの第２の化合物は、好ましくは、それらが互いに悪影響を及ぼさないように、組み合わせのＥＤＣに対する補足的活性を有する。
【０１８２】
第２の化合物は、化学療法剤、細胞毒性薬、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、抗アンドロゲン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子治療ワクチン、抗血管形成剤、及び／または心筋保護剤であり得る。かかる分子は、意図される目的上、効果的である量において、組み合わせで好適に存在する。ＥＤＣを含有する薬学的組成物はまた、チューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ結合剤等の治療有効量の化学療法剤を有し得る。
【０１８３】
他の治療レジメンが、本開示に従って識別される抗癌剤の投与と組み合わされてもよい。組み合わせ療法が、同時または連続的レジメンとして投与されてもよい。連続的に投与されるとき、組み合わせは、２回以上の投与で投与されてもよい。組み合わされた投与は、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用した同時投与、及びいずれかの順序における連続投与を含み、双方の（または全ての）活性薬剤が、それらの生物学的活性を同時に与える期間が存在する。
【０１８４】
一実施形態において、本開示のＥＤＣでの治療は、本明細書で識別される抗癌剤と、異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む、１つ以上の化学療法剤または成長阻害剤との組み合わせ投与を含む。化学療法剤は、タキサン（パクリタキセル及びドキセタキセル等）、ならびに／またはアントラサイクリン系抗生物質を含む。かかる化学療法剤に関する調製及び投薬スケジュールは、製造元の説明書に従って、または技能を有する実践者によって経験的に判定されるとおりに、使用され得る。かかる化学療法の調製及び投薬スケジュールもまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）に説明されている。
【０１８５】
抗癌剤は、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物；オナプリストン等の抗プロゲステロン（第ＥＰ  ６１６８１２号）；またはフルタミド等の抗アンドロゲンと、かかる分子に対して既知の用量で組み合わされてもよい。治療されるべき癌がホルモン非依存性癌である場合、患者は、以前に、抗ホルモン療法に供された可能性があり、癌がホルモン非依存性になった後で、抗ＥｒｂＢ２抗体（及び任意に本明細書で説明されるような他の薬剤）が患者に投与されてもよい。心筋保護剤（療法と関連付けられる心筋機能障害を予防もしくは低減するように）、または１つ以上のサイトカインを、患者に同時投与することもまた有益であり得る。上の治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｓ）に加えて、患者は、癌細胞の外科的除去及び／または放射線療法に供され得る。
【０１８６】
上の同時投与される薬剤のうちのいずれかに対する好適な用量は、現在使用されているものであり、新たに識別された薬剤及び他の化学療法剤または治療の組み合わせ作用（相乗効果）により、低下され得る。
【０１８７】
組み合わせ療法は、共に使用される活性成分が、別個に化合物を使用することに起因する効果の合計を上回るときに達成される効果を提供し得る。効果は、活性成分が、（１）同時製剤化され、組み合わされた単位用量製剤で同時に投与もしくは送達されるとき；（２）別個の製剤として、交替で、もしくは並行して送達されるとき；または（３）何らかの他のレジメンによって、実現され得る。交替療法で送達されるとき、効果は、化合物が、連続的に、例えば、別個の注射器の異なる注射によって投与または送達されるときに実現され得る。一般的に、交替療法中、有効用量の各活性成分は、連続的に、例えば、順次に投与されるが、組み合わせ療法においては、有効用量の２つ以上の活性成分は、共に投与される。
【０１８８】
本明細書で説明されるＥＤＣ化合物のインビボ代謝産物もまた、かかる産物が、先行技術に対して新規かつ非自明である限り、本開示の範囲内である。かかる産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的開裂などに起因し得る。したがって、本開示は、その代謝産物を得るために十分な期間、本開示の化合物を哺乳類と接触させることを含むプロセスによって産生される、新規かつ非自明の化合物を含む。
【０１８９】
代謝産物は、放射標識されたＥＤＣを調製し、それを非経口的に、検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ超）で、ラット、マウス、モルモット、サル等の動物に、または人間に投与し、十分な時間、代謝を生じさせ（典型的に約３０秒〜３０時間）、その変換産物を尿、血液、または他の生物学的試料から単離することによって、識別され得る。これらの産物は、それらが標識されているため、容易に単離される（他は、代謝産物中で生存するエピトープに結合することが可能な抗体の使用によって単離される）。代謝産物構造は、例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、またはＮＭＲ分析によって、従来的に判定される。一般的に、代謝産物の分析は、当業者に公知の従来の薬物代謝研究と同じように行われる。変換産物は、それらがインビボで見出されない限り、ＥＤＣ化合物の治療的投薬のための診断アッセイにおいて有用である。
【０１９０】
代謝産物は、薬物部分を抗体に結合させる、任意の結合の開裂が生じる、ＥＤＣのインビボ開裂の産物を含む。このため、代謝開裂は、裸抗体、または抗体断片をもたらし得る。抗体代謝産物は、リンカーの一部または全てに結合され得る。代謝開裂はまた、薬物部分またはその一部の産生をもたらし得る。薬物部分代謝産物は、リンカーの一部または全てに結合され得る。
【０１９１】
別の実施形態において、ＥＤＣ、及び上で説明される障害の治療に有用な材料を含有する、製造物品、または「キット」が提供される。製造物品は、容器と、容器上に、またはそれと関連付けられる、ラベルまたはパッケージ挿入物と、を含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、注射器、またはブリスタパックが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を治療するために効果的であるＥＤＣ組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有する、静脈注射用溶液のバッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、ＥＤＣである。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が、癌等の選択される状態を治療するために使用されることを示す。例えば、癌は、本開示のＥＤＣの標的のうちの１つを過剰発現するものである。ラベルまたはパッケージ挿入物はまた、組成物が、癌を治療するために使用され得、癌が、本開示のＥＤＣの標的のうちの１つの過剰発現によって特徴付けられないことを示し得る。他の実施形態において、パッケージ挿入物は、ＥＤＣ組成物が、ホルモン非依存性癌、前立腺癌、結腸癌、または大腸癌を治療するためにも使用され得ることを示し得る。
【０１９２】
製造物品は、その中に化合物が含有される容器を含んでもよく、化合物は、本開示のＥＤＣを含む。この実施形態における製造物品は、ＥＤＣが癌を治療するために使用され得ることを示すパッケージ挿入物を更に含んでもよい。代替的に、または更に、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容可能な緩衝剤を含む、第２の（または第３の）容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及び注射器を含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：リンカーの準備が整った治療薬剤の合成、ＥＤＣの調製、及び生物学的活性の評価。
この実施例は、そのチオール反応性形態における「リンカーの準備が整った」薬剤ＣＥＮ０１０−１０５の合成（パートＡ）、及び本開示の種々のＥＤＣを形成するための抗体へのステロイドシラレニンの共役（パートＢ）を説明する。この実施例はまた、ＥＤＣ活性を評価するために使用することができる種々の方法を説明する（パートＣ）。
【０１９４】
パートＡ  「リンカーの準備が整った」薬剤の合成
【０１９５】
この実施例は、本明細書で説明されるように、ステロイド薬物をリンカーに結合させて、抗体に容易に結合させることができる「リンカーの準備が整った」薬剤を産生するための合成プロトコルを説明する。アミノ酸システインをチオール反応性形態の「リンカーの準備が整った」薬剤に結合させることによって、キャップされた「リンカーの準備が整った」薬剤もまた、インビボのプロテアーゼによるＥＤＣ分解によって生成され得るような、潜在的なＥＤＣ分解産物の活性を調査するために使用することができる。
【０１９６】
ＣＥＮ０１０−１０５は、シラレニンと、リンカーと、及び抗体への安定した共有結合を形成するために使用される活性基とを含む、「リンカーの準備が整った」シラレニンである。ＣＥＮ０１０−１０５の調製のための一般的な合成ステップは、以下のとおりである。
２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセトイミダート。１−アリル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（１１．９ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン／メタノール（８０ｍＬ、９０：１０）に溶解し、ＰｄＣｌ２（０．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。混合物を終夜室温で撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅのパッドを通じて濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７０：３０）のパッドを通じて濾過した。得られた化合物（８．３８ｇ、２１．８３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ジクロロメタン（１７０ｍＬ）に溶解した。ＣＣｌ３ＣＮ（２１．９ｍＬ、２１８．３ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、０℃のＤＢＵ（１．６３ｍＬ、１０．９１ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応物を０℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６０：４０〜４０：６０）のパッドを通じて濾過して、黄色油として２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド−１−トリクロロアセトイミダートを得た（９．７ｇ、６５％）。化合物は、更に精製することなく次で用いた。Ｒｆ  ０．３７（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）。
シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド。２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセトイミダート（０．４８３ｇ、０．９１５ｍｍｏｌ）を、０℃のアルゴン下で、無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の活性化４Å分子篩（９０ｍｇ）の懸濁液に添加した。次いで、シラレニン（０．１８２ｇ、０．４７４ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。５分後、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（１７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で更に３０分間撹拌した。追加量のシラレニン（０．１８２ｇ、０．４７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応を数滴のＥｔ３Ｎで停止させた。混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７５：２５〜５０：５０）によって精製して、白色粉末としてシラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを得た（０．５２１ｇ、７６％）Ｒｆ０．３５（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５０：５０）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ、０．６８（ｓ、３Ｈ）、０．９０−２．１７（ｍ、２１Ｈ）、２．３９−２．４４（ｍ、１Ｈ）、３．４７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．０、９．５Ｈｚ、Ｈ−５ｂ）、３．７９−３．８７（ｍ，１Ｈ、Ｈ−４）、４．１７−４．２２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５ａ）、４．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、Ｈ−１）、５，２６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．６、６．８Ｈｚ、Ｈ−２）、５．３３（ｓ、１Ｈ）、５．４９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、Ｈ−３）、６．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、０．６Ｈｚ）、７．１８−７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．３３−７．３９（ｍ、４Ｈ）、７．４７−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．８０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、２．６Ｈｚ）、７，９２−７．９７（ｍ、４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １６．７、１９．０、２１．４、２５．８、２８．７、２８．８、３２．４、３２．８、３５．２、３７．６、４０．８、４２．９、４８．４、５０．２、５１．２、５９．２、６３．１、７１．６、７２．９、７６．１、８５．２、１００．０、１１５．５、１２１．７、１２２．８、１２８．５、１２８．６、１２９．１、１２９．５、１２９．９、１３０．１、１３３．４、１３３．６、１４６．９、１４７．６、１４８．７、１６２．５、１６５．３、１６５．７。
シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド。シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（０．３５１ｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（７ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９８：２〜９５：５）によって精製して、黄色粉末としてシラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを得た（４０ｍｇ、２４％）Ｒｆ０．３１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ、０．７４（ｓ、３Ｈ）、１．０３−２．２１（ｍ、２１Ｈ）、２，５２−２．５７（ｍ、１Ｈ）、３．１２−３．２０（ｍ、２Ｈ）、３．４０−３．４４（ｍ、２Ｈ）、３．８７−３．９２（ｍ、１Ｈ）、４．１７−４．２３（ｍ、１Ｈ）、４．３１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、Ｈ−１）、５．３５（ｓ、１Ｈ）、６．２８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、０．８Ｈｚ）、７．４３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．５Ｈｚ）、７．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、２．６Ｈｚ）。
シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド。シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１．６１ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（２．８ｍＬ、９０：１０）に溶解した。ＰＰｈ３ポリマー結合（７９ｍｇ、３ｍｍｏｌ．ｇ−１）を添加した。反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。次いで、混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０〜８０：２０）によって精製して、黄色粉末としてシラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを得た（２３ｍｇ、５８％）Ｒｆ０．２（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ、０．７４（ｓ、３Ｈ）、１．０６−２．１９（ｍ、２１Ｈ）、２．５２−２．５７（ｍ、１Ｈ）、２．７５−２．８６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４）、３．１４−３．２４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３）、３．６４−３．７２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５ｂ）、３．８７−３．９１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５ａ）、４．１９−４．２４（ｍ、１Ｈ）、４．３６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、Ｈ−１）、５．３８（ｓ、１Ｈ）、６．２８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、０．６Ｈｚ）、７．４２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、７．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、２．５Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ  １７．４、１９．６、２２．５、２６．８、２９．９、３０．１、３３．３、３３．６、３６．６、３８．８、４１．８、４３．５、４９．４、５１．７、５２．２、７５．３、７６．５、７８．９、７９．３、７９．８、８５．８、１０３．７、１１５．６、１２３．４、１２５．１、１４８．４、１４９．４、１５０．５、１６４．９。
ＣＥＮ０１０−１０５。室温のＤＭＦ（１ｍＬ）中のシラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１８．５ｍｇ、０．０３５９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド（５０ｍｇ、０．０３５９ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、Ｅｔ３Ｎ（０．０２５ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗材料をフラッシュクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５〜８０：２０）によって精製して、黄色油としてＣＥＮ０１０−１０５を得た（４８ｍｇ、７５％）Ｒｆ０．６６（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）。ＨＰＬＣ分析［Ｌｕｎａ  Ｃ１８、２５０×４，６０ｍｍ、５μｍ、３２分にわたり５％〜９５％ＡＣＮ、１ｍｌ．分−１］は、＞９５％純粋であった生成物を示した。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：Ｃ８７Ｈ１４７Ｎ３Ｏ３５［Ｍ＋Ｋ＋］＋に対する計算値：１８３２．９４５２、実測値１８３２．９７７７。
【０１９７】
パートＢ  免疫共役体（ＥＤＣ及び対照）の調製
【０１９８】
実施例２〜１０に説明されるＥＤＣ、及び対照共役体（抗体４Ｆ１２、マウスＩｇＧカッパを含有し、これは細胞ヒト細胞に結合しない）は、抗体鎖間ジスルフィドの還元を含む、以下の方法によって調製した。簡潔に述べると、ＰＢＳ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）中の１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を、３７℃で２時間、１ｍＭのジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＬＬＣ）及び８モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（カタログ番号：ＨＲ２−６５１、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の存在下で還元し、次いで、湿潤氷に移した。次いで、９．６当量のＣＥＮ０１０−１０５（「リンカーの準備が整った」薬剤）を添加し、３０分間氷上で反応させた。ＣＥＮ０１０−１０５への１．５当量のＬ−システインの添加によって反応を停止させ、室温で３０分間反応させた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０，０００  ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用した繰り返し遠心濃縮、及びＤＰＢＳ緩衝液交換によって、抗体共役体を非共役ＣＥＮ０１０−１０５から分離した。共役体を、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＰＢＳ中に２〜８℃で保存した。
【０１９９】
薬剤としてのシラレニンを含むＥＤＣに対する薬剤負荷（１つの抗体あたりの薬剤の数）は、以下の方法によって判定される。一度、薬剤の減衰係数が２８０ｎｍの±１０ｎｍの外側の波長で判定されると、この方法は、ステロイド薬物を含むいずれのＥＤＣに対しても使用することができる。該方法は、２８０ｎｍ、及び、シラレニンの場合には、２９９ｎｍの双方で共役体、抗体（Ａｂ）、及びシラレニン（薬物）の吸光度を測定することを必要とする。まず、遊離抗体の吸光度を、２８０ｎｍ（Ａ２８０Ａｂ）及び２９９ｎｍ（Ａ２９９Ａｂ）の双方で測定して、抗体定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］を判定する。次に、遊離薬物の吸光度を、２８０ｎｍ（Ａ２８０薬物）及び２９９ｎｍ（Ａ２９９薬物）の双方で測定して、薬物定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｕｇ］を判定する。最後に、抗体薬物共役体の吸光度を測定する［Ａ２８０Ｃｏｎｊ及びＡ２９９Ｃｏｎｊ］。２８０ｎｍの抗体モル減衰係数＝２０４，０００Ｍ−１ｃｍ−１。
【０２００】
パートＣ  細胞毒性活性評価
【０２０１】
細胞及び培養条件：細胞株Ｈ４６０、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＰＡＮＣ−１、ＭＢ２３１、ＦａＤｕ、Ｈ６９、及びＨ９２９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得た。悪性メラノーマ細胞株ＬＯＸ  ＩＭＶＩは、ＤＣＴＤ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄから得た。細胞株を、推奨される培地製剤中に維持し、３〜４日毎に継代培養した。薬物部分が結合するある標的の発現を達成するため、及び／またはあるタンパク質とのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ錯体を形成するため、細胞は、推奨される培地＋ホルボールエステル等の添加剤、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子、ヒト成長因子、インターロイキン、及び腫瘍壊死因子等の種々の成長因子及びサイトカインにおいて培養することができる。加えて、細胞は、ヒト線維芽細胞のような他の細胞と共培養することができる。更に、マイクロタイタープレートは、フィブリノゲンのような種々のタンパク質でコーティングすることができる。
【０２０２】
インビトロ細胞毒性評価：細胞を、２０ｕｌ完全培地中の３８４−ウェル白色組織培養処理マイクロタイタープレートの１ウェルあたり１２５０〜３３３３の密度でプレートし、次いで、共役体または小分子薬剤添加の前に、加湿されたインキュベータにおいて、７％のＣＯ２で、３７℃で２４時間成長させた。細胞を、細胞生存試験の前に、７２時間、試験化合物の存在下でインキュベートした。細胞生存試験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。各細胞株に対する試験化合物のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して判定した。
【０２０３】
実施例２：種々の薬剤及び薬剤−リンカー中間体の合成
ｉ．４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ブファリン合成
３６．０８（９３．３μｍｏｌ）のブファリンを計量し、２ｍＬのＤＣＥに溶解した。３８μＬ（４６７μｍｏｌ）のピリジン及び５７．５ｍｇｓ（２８５．３μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルマートをブファリンに添加し、終夜（約１６時間）撹拌した。ＴＬＣは、反応が約５０％完全であったことを示した。追加の３８μＬ（４６７μｍｏｌ）のピリジン及び６８．５ｍｇｓ（３４０μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルマートを、４Å分子篩と共に添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。２ｍＬの氷酢酸を１９８ｍＬのナノ純水に添加して、１％酢酸溶液を作製した。６０〜７０ｍＬのＤＣＭを反応物に添加して、分液漏斗に注入した。抽出は、５０ｍＬの１％酢酸溶液を分液漏斗に添加することによって、実施した。これを、更に３回繰り返した。次いで、水層を廃棄した。１．４ｇ（１１．６３ｍｍｏｌ）のＭｇＳＯ４を有機層に添加した。混合物を２０分間撹拌し、重力濾過し、続いて、溶媒を回転蒸発させた。材料を最小量のＤＣＭに溶解し、シリカゲル（孔径＝０．０１５〜０．０４０μｍ）を使用して、フラッシュカラムを行った。適切な画分を収集し、溶媒を蒸発させた。４１．３４ｍｇｓ（７４．６７μｍｏｌ）の生成物を得、８０．０３％の収率に相当した。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ２＝０．４６；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．３（ｄ、２Ｈ、Ｈ２３、２４）、７．９２（ｓ、１Ｈ、Ｈ２１）、７．５６（ｄ、２Ｈ、Ｈ２２，２５）、７．５１（ｓ、１Ｈ、Ｈ１４）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｈ２０）、４．１７（ｓ、１Ｈ、Ｈ１０）、４．１３（ｓ、１Ｈ、Ｈ１３）、３．８７（ｓ、１Ｈ、Ｈ３）、２．１−１．１（複数ピーク、２２Ｈ、Ｈ１、２、４、５、６、７、８、９、１１、１２１５、１６、１７）、０．８９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１８）、０．５９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１９）。ＩＵＰＡＣ名：不明
【０２０４】
ｉｉ．４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ジギトキシゲニン合成
２．９１４ｇの４Å分子篩を含有する６９５．５ｍｇｓ（３．４５ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルマートを、１２ｍＬのＤＣＥに溶解した。２．９１４ｇの４Å分子篩及び４６１．２μＬ（５．７０２ｍｍｏｌ）のピリジンを、反応物に添加した。次いで、２１１．８５ｍｇｓ（５７０．２ｕｍｏｌ）のジギトキシゲニン（３）を反応物に添加し、終夜（約１６時間）撹拌した。溶媒を傾瀉し、丸底フラスコに入れ、回転蒸発させた。残りの固体をＤＣＭ（１２ｍＬ）に再懸濁し、フラッシュカラム（７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；孔径＝０．０１５〜０．０４０μｍ）上に静置した。精製された画分を組み合わせ、溶媒を回転蒸発させた。２７２ｍｇｓ（５０５μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ジギトキシゲニンを８８．５６％の収率％で得た。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ４＝０．５７。ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：２０（Ａ：Ｂ）；１〜１６分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；１６〜２５分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；Ｒｔ４＝２１．２２分（λｍａｘ＝２７１ｎｍ）。ＩＵＰＡＣ名：不明
【０２０５】
ｉｉｉ．ＣＥＮ−３７１合成
１０ｍｇｓ（１８．１μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ブファリンを、２００μＬ（９７１．５μｍｏｌ）の１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンと、室温で３５分間撹拌することによって、反応させた。材料を、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中１％酢酸；緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中１％酢酸）。収集した材料の溶媒を回転蒸発させた。材料を凍結し、終夜凍結乾燥させた。４．８７ｍｇｓ（７．９５μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７１を、４３．９％の収率％で得た。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；ＲｆＣＥＮ−３７１＝０．０；ニンヒドリン陽性；ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜１分＝８０：２０（Ａ：Ｂ）；１〜１９分＝１０：９０（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７１＝９．２７分（λｍａｘ＝３００ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．９２（ｄ、１Ｈ、Ｈ２１）、７．５２（ｓ、１Ｈ、Ｈ１４）、７．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ２６）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｈ２０）、４．７８（ｓ、１Ｈ、Ｈ３）、４．１３（ｓ、１Ｈ、Ｈ１３）、３−１．１（複数ピーク、４４Ｈ、Ｈ１、２、４−９、１１、１２、１５−１７、２７−３７）、０．８９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１８）、０．５９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１９）。１３Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １７７．０２、１６２．３７、１５６．２８、１４８．５１、１４６．８、１２２．６７、１１５．２５、８５．２６、７０．１１、５７．４６、５６．４３、５２．８、５２．５９、５１．２０、４８．３２、４２．２９、４０．８２、４０．４０、３５．７８、３５．１５、３２．７５、３０．７３、３０．５４、２８．７０、２６．４３、２５．８１、２５．３４、２３．８３、２３．２８、２２．９３、２１．３９、２１．２９、１６．５２。ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ＭＷｏｂｓ＝６１３．４４ｇ／ｍｏｌ；ＭＷｃａｌｃ．＝６１３．８４ｇ／ｍｏｌ。ＩＵＰＡＣ名：４−（３−｛（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，１０Ｒ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ）−１１−ヒドロキシ−２，５，１４，１５−テトラメチル−１４−（６−オキソ−３−ピラニル）テトラシクロ［８．７．０．０２，７．０１１，１５］ヘプタデカ−５−イルオキシカルボニルアミノ｝プロピル）−１−（３−アミノプロピル）ピペラジン。
【０２０６】
ｉｖ．ＣＥＮ−３７２合成
３１．８ｍｇｓ（５７．４４μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ブファリンを、１ｍＬのＤＣＭ及び１ｍＬのＭＴＢＥに溶解した。４６．３μＬ（２８７．２μｍｏｌ）の３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンを添加し、室温で撹拌した。９０分後、４ｍＬのＭＴＢＥを添加し、更に３０分間撹拌した。溶媒を傾瀉し、黄色沈殿物が残った。沈殿物を最小量のＭＴＢＥで洗浄した。ＭＴＢＥを傾瀉し、先に傾瀉した材料と共に静置した。傾瀉した溶媒を回転蒸発させた。材料を１０ｍＬのヘキサンで４回洗浄した。５ｍＬのＨ２Ｏを添加し、沈殿物を吸引濾過した。沈殿物を１０〜１５ｍＬのＨ２Ｏで３回洗浄した。沈殿物（１６．５ｍｇｓ）に、１ｍＬのＭｅＯＨを添加した。溶媒を傾瀉した状態で、材料を遠心分離した。傾瀉した材料を回転蒸発させた。１４．２１ｍｇｓ（２５．４８ｕｍｏｌ）のＣＥＮ−３７２を４４．４％の収率％で得た。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；ＲｆＣＥＮ−３７２＝０．０；ニンヒドリン陽性；ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１５分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７２＝１１．６０分（λｍａｘ＝３００ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．９２（ｄ、１Ｈ、Ｈ２１）、７．５１（ｓ、１Ｈ、Ｈ１４）、６．９５（ｓ、１Ｈ、Ｈ２６）、６．２７（ｄ、１Ｈ、Ｈ２０）、４．７８（ｓ、１Ｈ、Ｈ３）、４．１５（ｓ、１Ｈ、Ｈ１３）、３−１．１（複数ピーク、３９Ｈ、Ｈ１、２、４−９、１１、１２、１５−１７、２７−３４）、０．８７（ｓ、３Ｈ、Ｈ１８）、０．５９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１９）。ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ＭＷｏｂｓ＝５５８．３９ｇ／ｍｏｌ；ＭＷｃａｌｃ．＝５５８．８４ｇ／ｍｏｌ。ＩＵＰＡＣ名：５−［（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，１０Ｒ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ）−５−｛３−［Ｎ−メチル（３−アミノプロピル）アミノ］プロピルアミノカルボニルオキシ｝−１１−ヒドロキシ−２，１５−ジメチルテトラシクロ［８．７．０．０２，７．０１１，１５］ヘプタデカ−１４−イル］−２−ピラノン
【０２０７】
ｖ．ＣＥＮ−３７３合成
２１ｍｇｓ（３７．９３μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ブファリンを、２ｍＬのＤＣＭ及び１．４ｍＬのＭＴＢＥに溶解した。２６．６μＬ（１９０μｍｏｌ）のビス（３−アミノプロピル）アミンを添加し、室温で撹拌した。２５分後、５ｍＬのＭＴＢＥを添加し、更に３０分間撹拌した。沈殿物を吸引濾過し、１０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した。沈殿物を２０ｍＬのＤＣＭで洗浄した。濾液を回転蒸発させた。５ｍＬのＨ２Ｏを添加し、吸引濾過した。沈殿物を３０ｍＬのＨ２Ｏで洗浄した。沈殿物を１：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ混合物（約５ｍＬ）に溶解し、溶媒を蒸発させた。１００μＬのＨ２Ｏを材料に添加し、これを凍結させ、終夜、凍結乾燥機上に静置した。９．５７ｍｇｓ（１７．６μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７３を４６．４％の収率％で得た。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；ＲｆＣＥＮ−３７３＝０．０；ニンヒドリン陽性；ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１５分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７３＝１１．７０分（λｍａｘ＝３００ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．９２（ｄ、１Ｈ、Ｈ２１）、７．５１（ｓ、１Ｈ、Ｈ１４）、６．９９（ｓ、１Ｈ、Ｈ２６）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｈ２０）、４．７９（ｓ、１Ｈ、Ｈ３）、４．１５（ｓ、１Ｈ、Ｈ１３）、３−１．１（複数ピーク、３７Ｈ、Ｈ１、２、４−９、１１、１２、１５−１７、２７−３４）、０．８５（ｓ、３Ｈ、Ｈ１８）、０．５９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１９）。ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ＭＷｏｂｓ＝５４４．３８ｇ／ｍｏｌ；ＭＷｃａｌｃ．＝５４４．８２ｇ／ｍｏｌ。ＩＵＰＡＣ名：５−｛（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，１０Ｒ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ）−５−［３−（３−アミノプロピルアミノ）プロピルアミノカルボニルオキシ］−１１−ヒドロキシ−２，１５−ジメチルテトラシクロ［８．７．０．０２，７．０１１，１５］ヘプタデカ−１４−イル｝−２−ピラノン。
【０２０８】
ｖｉ．ＣＥＮ−３７５合成（活性化ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３７１）
１７０μＬのＤＭＳＯ中の４．０５ｍｇｓ（６．６２μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７１を、１００μＬのＤＭＳＯ中の１０．６５ｍｇｓ（７．２８μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステル（例えば、ＭＡＬ−ｄＰＥＧ２４−ＴＦＰエステル、２，３，５，６−テトラフルオロフェニル１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３−オキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７０，７３，７６−テトラコサオキサ（ｔｅｔｒａｃｏｓａｏｘａ）−４−アザノナヘプタコンタン（ａｚａｎｏｎａｈｅｐｔａｃｏｎｔａｎ）−７９−オアート（ｏａｔｅ）、Ｃ６４Ｈ１０８Ｆ４Ｎ２Ｏ２９、製品番号１０５５４、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ，Ｐｌａｉｎ  Ｃｉｔｙ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）に添加した。反応物を室温で９０分間撹拌した。９０分後、追加の５ｍｇｓ（３．４２μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステルを添加し、終夜反応させた。１５ｍＬのエーテル及び２ｍＬのＤＣＭを反応物に添加し、続いて、２５ｍＬのヘキサンを添加した。反応物を−２０℃で１時間静置した。材料は沈殿せず、そのため、溶媒を回転蒸発させた。反応物をＤＭＳＯに再懸濁し、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中１％酢酸；緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中１％酢酸）。収集した材料の溶媒を回転蒸発させた。材料を凍結し、終夜凍結乾燥させた。６．２１ｍｇｓ（３．２８μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７５を、４９．６％の収率％で得た。ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜１分＝８０：２０（Ａ：Ｂ）；１〜１９分＝１０：９０（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７５＝１２．８７分（λｍａｘ＝３０１ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．０５，（ｓ、１Ｈ、Ｈ４２）、７．９２（ｄ、１Ｈ、Ｈ２１）、７．８（ｓ、１Ｈ、Ｈ３７）、７．５２（ｓ、１Ｈ、Ｈ１４）、７．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ２６）、６．７（ｄ、２Ｈ、Ｈ４５，４６）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｈ２０）、４．７８（ｓ、１Ｈ、Ｈ３）、４．１３（ｓ、１Ｈ、Ｈ１３）、３．７−３．２（ｍ、ＰＥＧピーク）、３−１．１（複数ピーク、４４Ｈ、Ｈ１、２、４−９、１１、１２、１５−１７、２７−３７）、０．８９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１８）、０．５９（ｓ、３Ｈ、Ｈ１９）。１３Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １７４．４３、１７３．２８、１７１．０６、１７０．７３、１７０．４４、１６９．５９、１６９．１３、１６２．２９、１６０．９４、１５６．２４、１４９．６１、１４８．４９、１４６．７１、１３４．１７、１２２．８７、１２２．６０、１１５．２８、８６．０７、８５．２８、７８．６３、７７．５７、７０．６、７０．５２、７０．４７、７０．４５、７０．３４、７０．２２、７０．１９、７０．１２、６９．６１、６９．５５、６８．８１、６７．３０、６４．３２、６３．００、５６．９５、５６．７８、５３．４０、５３．２３、５３．０６、５１．１９、４９．７１、４８．２９、４４．８３、４２．３３、４２．０１、４１．７７、４０���８２、４０．６５、４０．５０、３９．２１、３８．６０、３８．５８、３８．３７、３７．１１、３６．９２、３５．７８、３５．６７、３５．４０、３５．１５、３４．４９、３４．２６、３３．３２、３２．７５、３２．２２、３０．７５、３０．５４、２８．６８、２７．２７、２６．４１、２５．８４、２５．８１、２５．３６、２５．３２、２３．８４、２１．３９、２１．２８、２１．２３、２１．０８。１６．５０、１６．４６。ＩＵＰＡＣ名：Ｎ／Ａ。
【０２０９】
ｖｉｉ．ＣＥＮ−３７６合成（活性化ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３７２）
８．２ｍｇｓ（１４．７μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７２を、３００μＬのＤＭＳＯに溶解した。２６．７７ｍｇｓ（１８．２９μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステルを反応物に添加し、これを、室温で８０分間撹拌した。７．５ｍＬのＭＴＢＥを、１ｍＬのＤＣＭと共に反応物に添加した。反応物を−２０℃で静置した。１時間後、溶液を除去し、溶媒を丸底フラスコに傾瀉し、回転蒸発を通じて除去した。４５０μＬのナノ純水を、未精製の生成物を含有した材料に添加した。この材料を凍結し、終夜凍結乾燥機上に静置した。材料をアセトニトリルに再懸濁し、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中１％酢酸；緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中１％酢酸）。収集した材料の溶媒を回転蒸発させた。材料を凍結し、終夜凍結乾燥させた。０．８９ｍｇｓ（０．４８４μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７６を３．３％の収率％で得た。ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１５分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７６＝１２．６５分（λｍａｘ＝３００ｎｍ）。ＩＵＰＡＣ名：Ｎ／Ａ。
【０２１０】
ｖｉｉｉ．ＣＥＮ−３７７合成（活性化ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３７３）
２００μＬのＤＭＳＯ中の４．０ｍｇｓ（７．３６μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７３を、１２．０ｍｇｓ（８．２６μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステルに添加した。反応物を室温で９０分間撹拌した。７．５ｍＬのＭＴＢＥを反応物に添加し、次いで、これを、−２０℃で２時間静置した。液体を傾瀉し、沈殿物を１０ｍＬのＭＴＢＥで４回洗浄した。溶媒を回転蒸発させ、１２０μＬのＤＭＳＯに再懸濁した。材料をＨＰＬＣによって精製した。収集された画分の溶媒を、回転蒸発を通じて除去した。４００μＬのＨ２Ｏを添加した。溶液を凍結し、終夜凍結乾燥機上に静置した。０．６ｍｇｓ（０．３２９μｍｏｌ）のＣＥＮ−３７７を４．４７％の収率％で得た。ＨＰＬＣ分析  Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１５分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３７７＝１２．４７分（λｍａｘ＝３００ｎｍ）。ＩＵＰＡＣ名：Ｎ／Ａ。
【０２１１】
ｉｘ．ＣＥＮ−３８１合成
室温で２時間、２０．７７ｍＬのＤＣＥ、１４．２３ｍＬのＤＣＭ、及び３５ｍＬのヘキサン中で撹拌することにより、１６１．３５ｍｇｓ（３００μｍｏｌ）の４−ニトロフェニルカルバメート−３−Ｏ−ジギトキシゲニンを、８８．９４μＬ（４３２μｍｏｌ）の１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンと反応させた。反応物を４℃で２日間静置した。沈殿物を、吸引濾過を通じて除去し、約２０ｍＬのヘキサンで洗浄した。濾液に、２４．９４μＬ（４３２μｍｏｌ）の氷酢酸を添加した。溶媒を回転蒸発させ、ＭｅＯＨに再懸濁した。材料を、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中１％酢酸；緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中１％酢酸）。収集した材料の溶媒を回転蒸発させた。材料を凍結し、終夜凍結乾燥させた。１０９．４３ｍｇｓ（１８２．１３μｍｏｌ）のＣＥＮ−３８１を６０．７１％の収率％で得た。ＴＬＣ：７５：２５  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ；ＲｆＣＥＮ−３８１＝０．０；ニンヒドリン陽性；ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１４分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３８１＝１１．５３分（λｍａｘ＝２２０ｎｍ）。ＩＵＰＡＣ名：４−（３−｛（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，１０Ｒ，１１Ｓ，１４Ｒ，１５Ｒ）−１１−ヒドロキシ−２，５，１４，１５−テトラ
メチル−１４−（５−オキソ−２Ｈ−フル−３−イル）テトラシクロ［８．７．０．０２，７．０１１，１５］ヘプタデカ−５−イルオキシカルボニルアミノ｝プロピル）−１−（３−アミノプロピル）ピペラジン。
【０２１２】
ｘ．ＣＥＮ−３８２合成（活性化ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３８１）
１５ｍｇｓ（２４．９７μｍｏｌ）のＣＥＮ−３８１を１．６ｍＬのＤＣＭに溶解した。４２．４６ｍｇｓ（２９．０１μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステルを反応物に添加した。反応物を室温で３時間撹拌した。追加の２ｍｇｓ（１．３７μｍｏｌ）のＭＡＬ−ＰＥＧ２４−ＴＦＰエステルを添加し、３０分間反応させた。反応物を約４０〜５０℃に加熱し、キャップを取り外して、ＤＣＭの蒸発を促進しやすくした。材料を３００μＬのＭｅＯＨに再懸濁し、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａ＝Ｈ２Ｏ中１％酢酸；緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ中１％酢酸）。収集した材料の溶媒を回転蒸発させた。材料を凍結し、終夜凍結乾燥させた。３９．３８ｍｇｓ（２０．９４μｍｏｌ）のＣＥＮ−３８２を８３．８６％の収率％で得た。ＨＰＬＣ分析：Ｃ１８カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）Ｔ３；３ｕｍ；４．６×１５０ｍｍ；勾配：０〜２分＝９０：１０（Ａ：Ｂ）；２〜１６分＝０：１００（Ａ：Ｂ）；流速：１ｍＬ／分；ＲｔＣＥＮ−３８２＝１３．２０分（λｍａｘ＝２１８ｎｍ）。ＩＵＰＡＣ名：Ｎ／Ａ。
【０２１３】
ｘｉ．ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３７１の合成
ＳＵＮ４Ｂ７緩衝液交換：ＰＢＳ緩衝液中の約０．８ｍＬ（１．２ｍｇｓ）のＳＵＮ４Ｂ７を、３０ｋ  ＭＷＣＯ遠心分離フィルタに添加し、約３５〜４５μＬに沈降させた。濾液を廃棄し、０．４ｍＬの１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝６．５）をＳＵＮ４Ｂ７に添加した。遠心分離プロセスを更に２回繰り返し、濾液はその都度廃棄した。ＳＵＮ４Ｂ７を除去し、フィルタを、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝６．５）で２回（各回約６０〜７０μＬで）洗浄した。総作用体積は、約１４０μＬである。ＵＶ−ＶＩＳ判定は、８．８０ｍｇ／ｍＬ（約１．２ｍｇｓ）の濃度を示した。０．６７μＬのＤＴＰＡをＳＵＮ４Ｂ７に添加し、続いて、１４０μＬの１５０ｍＭの酢酸ナトリウム／１．２Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）を添加した。ＳＵＮ４Ｂ７の最終濃度は、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム／６００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）の最終緩衝液で、４．４０ｍｇ／ｍＬであった。
【０２１４】
ＳＵＮ４Ｂ７還元：ＳＵＮ４Ｂ７（４．４０ｍｇ／ｍＬ；８．２１ｎｍｏｌ）を、０〜８℃で約５分間静置した。ナノ純水中の１０ｍＭのＴＣＥＰ溶液の４．１１μＬ（４１．１ｎｍｏｌ；ＳＵＮ４Ｂ７に対して５当量）を添加し、続いて、５〜１０秒間わずかに撹拌した。溶液を３０分にわたって３７℃に加熱した。溶液が３７℃に到達したとき、反応物を更に２時間反応させた。還元されたＳＵＮ４Ｂ７を３７℃から取り出し、室温で静置した。
【０２１５】
ＳＵＮ４Ｂ７へのＣＥＮ−３７５共役：２５ｍＭの酢酸ナトリウムを含有するＩＰＡ：Ｈ２Ｏ（１：１）の溶液（ｐＨ＝５．５）中のＣＥＮ−３７５の４ｍＭの溶液の２１μＬ（８４ｎｍｏｌ；ＳＵＮ４Ｂ７に対して１０．２当量）を還元されたＳＵＮ４Ｂ７に添加した。反応物を５〜１０秒間わずかに撹拌し、室温で２時間放置した。３６０μＬの１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝６．５）を反応物に添加し、更に２０分間放置した。反応物を３０ｋ  ＭＷＣＯ遠心分離フィルタに配置し、そこで、それを約３５〜４０μＬに沈降させた。０．４ｍＬのＤＰＢＳを添加し、３５〜４０μＬに遠心分離した。これを更に４回繰り返した。最終生成物をバイアルに配置し、遠心分離フィルタを約３４０μＬのＤＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ＤＰＢＳ中のＳＵＮ４Ｂ７（ＣＥＮ−３７５）の最終体積は、３６０μＬであった。ＵＶ−ＶＩＳ分析は、３．３３ｍｇ／ｍＬ（２２．１８μＭ）の濃度で５．０２の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を示した。疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）分析は、５．３６のＤＡＲ値を示し、４．８６％は未標識ＳＵＮ４Ｂ７から成った。ＵＶ−ＶＩＳ（２９９／２８０）は、３．３３ｍｇ／ｍＬ（２２．１８ｕＭ）の濃度で５．０２のＤＡＲ値を示した。
【０２１６】
ＳＵＮ４Ｂ７へのＣＥＮ−３８２共役：直上で説明される「ＳＵＮ４Ｂ７へのＣＥＮ−３７５共役」に類似の手順を、類似の結果で実施した。
【０２１７】
実施例３：インビトロモデルにおける薬剤及び薬剤−リンカー中間体の細胞毒性
選択薬剤及び薬剤−リンカー中間体の細胞毒性は、インビトロ癌細胞細胞毒性分析を使用して評価した。細胞を、以下の密度：１ウェルあたり２０００（Ｒａｍｏｓ、ＳＵ−ＤＨ−８、ＨＬ６０）細胞、１ウェルあたり１５００（Ｈｕｔ７８）細胞、及び１ウェルあたり１３３３（Ｈ９２９）細胞で、２５０ｎＭの全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含む、または含まない、２０μＬの完全培地中の３８４−ウェル白色組織培養処理マイクロタイタープレートにプレートした。これらの細胞を、試験絵化合物の添加の前に、加湿されたインキュベータにおいて、５％のＣＯ２で、３７℃で２４時間平衡化した。化合物及び／またはマウス血漿試料を５ｘ最終作用濃度で完全培地において順次希釈し、各々の５μＬをアッセイに使用される細胞に添加した。処理した細胞を、細胞生存試験の前に、３日間インキュベートした。細胞生存試験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。各細胞株への薬剤のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して判定し、表３に示される。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０２１８】
実施例４：選択ＥＤＣの細胞毒性
式（Ｉ）の選択ＥＤＣの細胞毒性は、インビトロ癌細胞細胞毒性分析を使用して評価した。表４に列記されるＥＤＣの各々に関する構造は、図１に示される。薬剤負荷は、約４であると判定された。細胞を、以下の密度：１ウェルあたり２０００（Ｒａｍｏｓ、ＳＵ−ＤＨ−８、ＨＬ６０）細胞、１ウェルあたり１５００（Ｈｕｔ７８）細胞、１ウェルあたり１３３３（Ｈ９２９）及び１５００（ＭＶ−４−１１）細胞で、２５０ｎＭの全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含む、または含まない、２０μＬの完全培地中の３８４−ウェル白色組織培養処理マイクロタイタープレートにプレートした。これらの細胞を、試験絵化合物の添加の前に、加湿されたインキュベータにおいて、５％のＣＯ２で、３７℃で２４時間平衡化した。化合物及び／またはマウス血漿試料を５ｘ最終作用濃度で完全培地において順次希釈し、各々の５μＬをアッセイに使用される細胞に添加した。処理した細胞を、細胞生存試験の前に、３日間インキュベートした。細胞生存試験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。各細胞株への薬剤のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して判定し、表４に示される。非共役ＳＵＮ４Ｂ７、非共役治療薬剤、非共役ブファリン、及び／または抗体４Ｆ１２で製造される対照ＥＤＣと比較した、一部の例における、選択データもまた、図２、３、４、９、及び１０において、グラフで（対数変換）示される。
【表４】
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【０２１９】
実施例５：ＣＤ３８を発現する細胞に対する選択ＥＤＣの細胞毒性
標的化部分に対するエピトープが本開示のＥＤＣに重要であるかどうかを判定するために、及び全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）が本発明のＥＤＣの活性を増強させることができるかどうかを判定するために、以下の研究を行った。異なるＣＤ３８エピトープに特異的な４つの異なる抗ＣＤ３８抗体を、ＰＥＧ３６含有リンカーを介してＣＥＮ０９−１０６に共役させた。得られたＥＤＣに対する一般構造は、図１に示される。薬剤負荷は、約４であると判定された。各ＥＤＣを、６つのヒト血液癌細胞型（ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＭＶ４１１、Ｈｕｔ７８、Ｈ９２９、及びＲＡＭＯＳ）において試験した。全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、ＣＤ３８の既知の誘導因子である（Ｆｅｒｒｅｒｏ  Ｅ，Ｍａｌａｖａｓｉ  Ｆ．（２００２）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３８  Ｇｅｎｅ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ，ｐｐ．８１-９９）。したがって、これらのＥＤＣは、ＡＴＲＡ誘導を伴う、及び伴わない、様々な細胞型におけるインビトロ細胞毒性活性に関して試験され、ＥＤＣ曝露の７２時間後のピコモルでのＥＣ５０及び生存細胞率（％）が示される（表５を参照されたい）。
【表５】
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【０２２０】
この研究において、全ての条件下の全ての裸抗体は、全ての条件下で不活性であることが見出された。この研究において、ＡＴＲＡ単独は、ＲＡＭＯＳを除く、試験された全ての細胞株において細胞成長を減速させ、ＲＡＭＯＳ細胞にＡＴＲＡを添加することは、試験されたＥＤＣに対するそれらの感受性を増加させなかった。この研究において、及び抗体細胞染色によって判定されるように、かつＨＬ−６０細胞を除いて、全ての細胞は、ＡＴＲＡ添加の前に、種々のレベルの細胞表面ＣＤ３８を発現した。ＲＡＭＯＳを除いて、この研究において試験された全ての細胞株は、ＣＤ３８発現を増加させ、このため、ＥＤＣに対する増強された活性を提示した（より低いＥＣ５０値及びより少ない残留生存細胞）。
これらのデータは、ＳＵＮ４Ｂ７で産生されたＥＤＣが、細胞表面上でＣＤ３８を発現する細胞株において、アポトーシスを誘導する際に最も効力が高かったことを実証する。これらのデータはまた、ＡＴＲＡがＥＤＣに対する細胞感受性を増強させることができることを実証する。
【０２２１】
実施例６：選択ＥＤＣのインビボ薬物動態
本開示の種々のＥＤＣの薬物動態を検査するために、３つのＥＤＣを研究室マウスに投与し、投与後の種々の時点における活性ＥＤＣの存在について、血液を検査した。ＥＤＣであるＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１７（薬剤負荷：各ＥＤＣに関して約４）を、２匹のマウスにそれぞれに、６ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ用量で、別個に投与し、種々の時点で血液を採取し、インビトロ試験によって、活性ＥＤＣの存在について試験した。この研究の結果は、図５〜６にグラフで示される。ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１７のインビボ半減期は、それぞれ３７時間または６９時間で計算することができなかった。加えて、結果は、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１７が、試験された時点の間にそれらの完全活性（細胞の＞９９％を殺滅する能力）を維持した一方、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９が、２４時間後にその活性を喪失した（即ち、細胞の３０％超が生存したままであった）ことを示した。これらのデータは、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１７が好ましいＥＤＣであることを示す。これは、ＥＤＣが０．１〜１０ｍｇｓ／ｋｇで、かつ２週に１度の低頻度で投与され得ることを意味する。
【０２２２】
実施例７：選択ＥＤＣのインビボ有効性
本明細書に開示される種々のＥＤＣのインビボ有効性を検査するために、標的化部分としてＳＵＮ４Ｂ７を使用して構築された２つのＥＤＣ（ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６；薬剤負荷：各ＥＤＣに関して約４）を、非共役ＳＵＮ４Ｂ７、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾンの混合物から成る、リンパ腫のための標準治療）、ならびにビヒクル群と比較した。
【０２２３】
研究室マウスにＲａｍｏｓ腫瘍細胞を移植し、約２５０ｍｍ３の平均サイズの腫瘍の担持を監視した。腫瘍が２５０ｍｍ３の平均サイズに到達した後、各群の５匹のマウスに、各々、ＥＤＣ（ＰＢＳに希釈し、１０ｍｇ／ｋｇで５週毎に４回投与）、非共役ＳＵＮ４Ｂ７（ＰＢＳに希釈し、１０ｍｇ／ｋｇで５週毎に４回投与）、ビヒクル（ＰＢＳを１０ｍｇ／ｋｇで５週毎に４回投与）、またはＣＨＯＰは１回、３０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド、２．４７５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン、０．３７５ｍｇ／ｋｇのビンクリスチンで、及びＰは毎日５回、０．１５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンで投与した。
【０２２４】
図７に示されるように、５つの群の動物を比較したとき、ＥＤＣを受けた群は、ＣＨＯＰ、非共役ＳＵＮ４Ｂ７、またはビヒクルを受けた群よりも、４５日後に２，０００ｍｍ３よりも小さい腫瘍を担持した。同様に、図８に示されるように、腫瘍は、ＣＨＯＰ、非共役ＳＵＮ４Ｂ７、またはビヒクルを投与された群と比較して、ＥＤＣを投与された群においては、はるかにずっと遅く成長した。
【０２２５】
これらのデータは、双方のＥＤＣが、標準治療であるＣＨＯＰと比較して、かつマウスに安全な用量で投与されるとき、優れた様態で腫瘍成長を低減させることを示す。
【０２２６】
細胞株及び細胞培養：細胞株Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ番号-ＣＲＬ−１５９６）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＡＴＣＣ番号-ＣＲＬ−２９６１）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ番号-ＣＲＬ−１５９６．２）、Ｈｕｔ７８（ＡＴＣＣ番号-ＴＩＢ−１６１）、Ｈ９２９（ＡＴＣＣ番号-ＣＲＬ−９０７８）、ＨＬ６０（ＡＴＣＣ番号-ＣＣＬ−２４０）、及びＭＶ−４−１１（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ−９５９１）を、加湿されたインキュベータにおいて、３７℃、５％のＣＯ２で、１ｍＬあたり１×１０５〜１×１０６細胞の密度で、完全培地［１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清及びゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で補充したＲＰＭＩ培地１６４０］に維持した。
【０２２７】
インビトロ癌細胞細胞毒性分析：細胞を、以下の密度：１ウェルあたり２０００（Ｒａｍｏｓ、ＳＵ−ＤＨ−８、ＨＬ６０）、１５００（Ｈｕｔ７８）、１３３３（Ｈ９２９）、及び１５００（ＭＶ−４−１１）細胞で、２５０ｎＭの全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含む、または含まない、２０ｕｌの完全培地中の３８４−ウェル白色組織培養処理マイクロタイタープレートにプレートした。これらの細胞を、試験絵化合物の添加の前に、加湿されたインキュベータにおいて、５％のＣＯ２で、３７℃で２４時間平衡化した。化合物及び／またはマウス血漿試料を５Ｘ最終作用濃度で完全培地において順次希釈し、５μｌをアッセイに使用される細胞に添加した。処理した細胞を、細胞生存試験の前に、３日間インキュベートした。細胞生存試験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。各細胞株に対する薬剤のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して判定した。
【０２２８】
薬物動態。ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ−３１９、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ０９−１０６、及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ−３７１（薬剤負荷：各ＥＤＣに関して約４）の薬物動態を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝２）に、腹腔内（ＩＰ）注射によって、１０ｍｇ／ｋｇの試験材料（ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ−３１９）または６ｍｇ／ｋｇ（ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ−２４−ＣＥＮ−３７１）を投与した。血液試料を、注射の２４時間、７２時間、１２０時間、及び１６８時間後に、ヘパリン化ヘマトクリット管を使用した眼窩後方からの採血を介して、各マウスから収集した。血液を遠心分離して（５，０００Ｘｇ、５分）、血漿を単離した。Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓの細胞毒性アッセイにおけるＥＣ５０をもたらした血漿希釈係数（各採血に対する）を確立することによって、マウス血液中の活性共役体の持続性をアッセイし、次いで、マウス血液中に存在する化合物の細胞毒性活性が半分に減少するために必要とされる時間として、半減期を計算した。
【０２２９】
有効性：リン酸緩衝生理食塩水中のＲａｍｏｓリンパ腫細胞（１０７）を、５〜７週齢のメスＣｒｌ：ＳＨＯ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨｒｈｒマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の脇腹に、０．１ｍＬ／マウスの体積で、皮下注射した。処理は、５匹の動物の群の腫瘍体積が、平均で約２５０ｍｍ３になったとき（腫瘍移植の１８日後）に開始した。ＳＵＮ４Ｂ７、ＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９、及びＳＵＮ４Ｂ７−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ５ｄｘ４（５日毎に４回）で投薬した。ＣＨＯＰ処理は、３０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド、２．４７５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン、０．３７５ｍｇ／ｋｇのビンクリスチンの単回腹腔内注射、及び５日間の０．１５ｍｇ／ｋｇでのプレドニゾンの毎日の投薬から成った。腫瘍体積は、ノギスを使用して各群について毎週２回測定し、かつ腫瘍体積は、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｗは腫瘍幅であり、Ｌは腫瘍長さである）を使用して計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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