(57)【要約】  本発明は、改変されたヘテロ多量体タンパク質に関し、より具体的には、二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質を生成および精製するための方法に関し、このような改変されたヘテロ二量体タンパク質を生成および精製するための方法、ならびに診断薬および治療剤におけるこれらの使用も提供されている。本発明はまた、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合するヒト化抗体、ならびにとりわけ難聴障害を処置するための抗体を生成および使用するための方法に関する。【図１】2017521361.tif 000054
2017521361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１のＣＨＣＬ界面で相互作用して第１のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）を形成する、第１のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第１のＣＬドメイン（ＣＬ）；
（ｉｉ）第２のＣＨＣＬ界面で相互作用して第２のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）を形成する、第２のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第２のＣＬドメイン（ＣＬ）
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＣＨ１は、第１のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第２のＣＨ１と異なるように改変されており；第１のＣＬは、第１のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第２のＣＬと異なるように改変されており；
その結果、第１のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基は、第２のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に優先して互いに相互作用し、第１のＣＨ１および第１のＣＬの相互作用している突然変異残基は、それによって第１の相補的な残基セットを形成し、
第１のＣＨ１は、第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬは、第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１は、第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬは、第２のＶＬに付着されており、その結果、組み合わされたとき、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第１のＣＨ、および第１のＣＬは一緒に、第１のＦａｂを形成し、組み合わされたとき、第２のＶＨ、第２のＶＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬは、第２のＦａｂを形成し、
第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成は、可変ドメインの相補的対合を利用しない、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２】
第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３】
第２のＣＨ１が、第２のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第１のＣＨ１と異なるように改変されており；第２のＣＬが、第２のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第１のＣＬと異なるように改変されており；その結果、第２のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基が、第１のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に対して互いに優先的に相互作用し、第２のＣＨ１および第２のＣＬの相互作用している突然変異残基が、それによって第２の相補的残基セットを形成する、請求項１から２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４】
第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である、請求項３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５】
第１の相補的残基セットの突然変異残基が、第２の相補的残基セットの突然変異残基と異なる、請求項２から４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６】
第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４倍優先的に起こる、請求項１から５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
ＣＬドメインの少なくとも１つが、カッパドメインである、請求項１から６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
相補的残基セットが、一方のドメイン中に正または負に荷電した残基、および他方のドメイン中に極性残基、または逆に荷電した残基を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
相補的残基セットの場所が、
（ｉ）ＣＨ１−１２４およびＣＬ−１７６；
（ｉｉ）ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１７８；
（ｉｉｉ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１７８；
（ｉｖ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３１；
（ｖ）ＣＨ１−２２１およびＣＬ−１２３；
（ｖｉ）ＣＨ１−１４５およびＣＬ−１３１；
（ｖｉｉ）ＣＨ１−１７９およびＣＬ−１３１；
（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１８６およびＣＬ−１３１；および
（ｉｘ）ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１３３
からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１０】
ＣＨ１位置の突然変異が、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され、ＣＬ位置の突然変異が、Ｓ、Ｍ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され、またはＣＨ１位置の突然変異が、ＥおよびＤからなる群から選択され、ＣＬ位置の突然変異が、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群から選択される、請求項９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１１】
相補的残基セットが、ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＨ１−１４５Ｓ、ＣＨ１−１８６Ａ、ＣＨ１−１８６Ｅ，ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７６Ｍ、およびＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７８Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異をさらに含む、請求項１０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１２】
第１および第２の相補的残基セットが、以下の群：
（ｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ；
（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ；
（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；
（ｖｉ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；
（ｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；
（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；
（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；
（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；
（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；
（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；
（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；
（ｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；
（ｘｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；
（ｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ；
（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；
（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；
（ｘｉｘ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；
（ｘｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；
（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；
（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；
（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ，；
（ｘｘｉｖ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ；
（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ；
（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ；
（ｘｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３１Ｄ
のうちの２つから選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１３】
第１のＣＨ１と第１のＣＬおよび／または第２のＣＨ１と第２のＣＬとの間に改変されたジスルフィド結合を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１４】
改変されたジスルフィド結合が、以下の位置：
（ｉ）ＣＨ１−１２２およびＣＬ−１２３；
（ｉｉ）ＣＨ１−１３９およびＣＬ−１１６；ならびに
（ｉｉｉ）ＣＨ１−１７４およびＣＬ−１７６
の１つまたは複数に位置している、請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１５】
野生型ジスルフィド結合が、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬ上で、ＣＨ１−Ｃ２３０およびＣＬ−２１４の一方または両方を、Ｃを除く任意の残基に突然変異させることによって除去されており、第１および／または第２のＣＨ１−Ｃ２３０ならびに第１および／または第２のＣＬ−Ｃ２１４が、Ｓに突然変異されている、請求項１３から１４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１６】
第１のＣＨＣＬが、以下の群：
（ｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＬ−１３３Ｓ；
（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；
（ｖｉ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；
（ｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；
（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；
（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；
（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；
（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；
（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；
（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；
（ｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；
（ｘｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；
（ｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；
（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；
（ｘｉｘ）ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；
（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；
（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；
（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｘｉｖ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；
（ｘｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ
の１つに由来する残基を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１７】
第２のＣＨＣＬが、群（ｉ）〜（ｘｘｖｉｉ）の１つからの残基を含み、ただし、第１および第２のＣＨＣＬがともに、同じ群からの残基を含むことはない、請求項１８に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１８】
第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３）および第２のＣＨ３が、それぞれ第１のＣＨ３突然変異残基および第２のＣＨ３突然変異残基を含むように、第１のＣＨ１が、第１のＣＨ３に接続されている第１のＣＨ２ドメイン（ＣＨ２）に接続されており、第２のＣＨ１が、第２のＣＨ３に接続されている第２のＣＨ２に接続されており、第１のＣＨ３突然変異残基および第２のＣＨ３突然変異残基が、互いに異なり、かつ互いに優先的に相互作用するように改変されており、それによってＣＨ３ホモ二量体の形成より多くＣＨ３ヘテロ二量体を形成する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１９】
第１のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含み、第２のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を含む二重特異性抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質をコードする核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含み、または請求項２０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）細胞株に１種または複数のベクターをコトランスフェクトして、第１のＣＨＣＬの第１のＣＨ１、第１のＣＬ、ならびに第２のＣＨＣＬの第２のＣＨ１および第２のＣＬを発現させることと；
（ｉｉ）１種または複数のベクターを発現させる、かつ第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬをアセンブルさせる条件下で細胞株を培養することと；
（ｉｉｉ）細胞培養液からヘテロ二量体タンパク質を精製することと
を含む、方法。
【請求項２４】
細胞株に、第１のＣＨ１、第１のＣＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬを１：１：１：１の比で発現するベクターがコトランスフェクトされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヒトＴｒｋＢに特異的に結合する単離抗体であって、配列番号５１のアミノ酸を含むＶＨ領域、および配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、抗体。
【請求項２６】
重鎖が配列番号７５のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号７８のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項２５に記載の抗体、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２５に記載の抗体をコードする単離核酸。
【請求項２９】
それを必要とする患者における難聴障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を患者に投与し、それによって難聴障害を処置することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された二重特異性抗体、および関連したポリペプチド、これらの多量体形態、ならびにこのようなタンパク質を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）と呼ばれ、改変されてきた。２つの同一のヘテロ二量体（すなわち、軽鎖部分および重鎖部分）「アーム」を含み、各アームが抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ領域）を含む古典的な抗体と異なり、二重特異性抗体は、２つのアームのそれぞれの中に異なる配列（例えば、Ｆａｂ領域）を有し、その結果、Ｙ形状分子の各アームは、異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０００３】
同じ抗原の２つの異なる抗原分子または異なるエピトープに結合することによって、ＢｓＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断薬および免疫療法のための標的化剤として多種多様な臨床用途をもたらす。二重特異性抗体は、がんを含めた様々な疾患状態のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ診断にとっても有利である。例えば、ＢｓＡｂの一方のアームを腫瘍関連抗原に結合するように改変することができ、他方のアームを検出可能マーカーに結合するように改変することができる。
【０００４】
ＢｓＡｂは、患者の細胞免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体（例えば、ＨＩＶもしくはインフルエンザウイルスなどのウイルス感染細胞；トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物）に向けるのに使用することができる。特に、ＢｓＡｂの一方のアームを所望の標的（例えば、腫瘍細胞または病原体）に結合するように改変し、ＢｓＡｂの他方のアームを細胞傷害性トリガー分子、例えば、Ｔ細胞受容体またはＦｃガンマ受容体などに結合するように改変し、それによって下流の免疫エフェクター経路を活性化することによって、免疫モジュレート細胞傷害性を向け直すことができる。このストラテジーを使用して、ＦｃガンマＲＩＩＩに結合するＢｓＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞によって腫瘍細胞死滅を媒介し、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を防止することが示された。代わりに、治療指標に関連した２つの別個の抗原または標的を標的化すると、特異性を増強し、望まれない相互作用を低減し、それによって治療指数を広げることができる。
【０００５】
二重特異性抗体は、カノニカルな二価の単一特異性の古典的な抗体に対してある特定の利点を有するが、二重特異性抗体の使用は、十分な量および純度でＢｓＡｂを得ることにおける費用によって妨げられている。
【０００６】
多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体および他のヘテロ二量体またはヘテロ多量体を生成するために、ホモ多量体より所望のヘテロ多量体の形成を優遇する方法を使用することが望ましい。Ｆｃ含有ＢｓＡｂを得るための一方法は、相変わらず２つの抗体が同時発現されるハイブリッドハイブリドーマ技法である。しかし、この手法は、収率および純度に関して非効率であり、所望のヘテロ多量体は、不適切に対合したポリペプチド鎖を含む相対的に大きいレベルの混入物からさらに精製することが困難であることが多い。
【０００７】
ヘテロ多量体形成を優遇し、不適切なマッチングを低減する他の技法は、ＣＨ３ドメイン界面における多量体化ドメイン中で立体的に相補的な突然変異を改変し、Ｒｉｄｇｗａｙら（ＵＳ５７３１１６８）およびＭｅｒｃｈａｎｔら（ＵＳ７１８３０７６）によって記載されたように「ノブイントゥホール」ストラテジーと呼ばれる。
【０００８】
ヘテロ二量体形成を促進するために両方のＣＨ３ドメイン中でＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つまたは複数の残基を荷電アミノ酸と置き換える技法も、Ｓｔｒｏｐら（ＷＯ２０１１／１４３５４５）によって記載されている。
【０００９】
最近の総説にはまた、二重特異性抗体を生成するときの鎖会合問題を克服するための様々な手法が論じられている（Ｋｌｅｉｎら、ｍＡｂｓ、４（６）：６５３〜６６３（２０１２））。
【００１０】
しかし、これらの技法のほとんどは、重鎖ポリペプチドの適切な対合を保証することを対象とし、機能的な抗原結合部位をもたらすために各軽鎖ポリペプチドをその対応する重鎖ポリペプチドとさらにマッチングすることに対処していない。したがって、所望の二重特異性抗体の生成は、製品の高いコストに起因して商業的に実現可能でない技術的に困難で高価なプロセスのままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＢｓＡｂが組換え細胞培養液から直接かつ／もしくは効率的に発現および回収されることを可能にし、かつ／または商業的に合理的なコストで効率的な収率および純度を伴って生成され得る二重特異性抗体断片および／または全長ＢｓＡｂを改変するための方法について、当技術分野において長年の切実な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
Ｅ１．本発明の第１の実施形態によれば、
（ｉ）第１のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第１のＣＬドメイン（ＣＬ）を含む第１のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）であって、第１のＣＨ１および第１のＣＬは第１のＣＨＣＬ界面で相互作用する、第１のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）；
（ｉｉ）第２のＣＨ１および第２のＣＬを含む第２のＣＨＣＬであって、第２のＣＨ１および第２のＣＬは第２のＣＨＣＬ界面で相互作用する、第２のＣＨＣＬ；
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＣＨ１は第１のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第２のＣＨ１と異なり；第１のＣＬは第１のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第２のＣＬと異なり；
その結果、第１のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基は、第２のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に優先して互いに相互作用し、第１のＣＨ１および第１のＣＬの相互作用している突然変異残基は、それによって第１の相補的な残基セットを形成する、ヘテロ二量体タンパク質が提供されている。
【００１３】
以下に記載されているのは、本発明のこの第１の実施形態のいくつかのさらなる実施形態（Ｅ）であり、便宜上、Ｅ１は第１の実施形態と同一である。
Ｅ２．第２のＣＨ１が、第２のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第１のＣＨ１と異なり；第２のＣＬが、第２のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第１のＣＬと異なり；
その結果、第２のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基が、第１のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に優先して互いに相互作用し、第２のＣＨ１および第２のＣＬの相互作用している突然変異残基が、それによって第２の相補的な残基セットを形成する、Ｅ１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３．
（ｉ）第１のＣＨＣＬ界面で相互作用して第１のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）を形成する、第１のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第１のＣＬドメイン（ＣＬ）；
（ｉｉ）第２のＣＨＣＬ界面で相互作用して第２のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）を形成する、第２のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第２のＣＬドメイン（ＣＬ）
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＣＨ１は、第１のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第２のＣＨ１と異なるように改変されており；
第１のＣＬは、第１のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第２のＣＬと異なるように改変されており；
その結果、第１のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基は、第２のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に優先して互いに相互作用し、第１のＣＨ１および第１のＣＬの相互作用している突然変異残基は、それによって第１の相補的な残基セットを形成する、ヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４．第２のＣＨ１が、第２のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第１のＣＨ１と異なるように改変されており；第２のＣＬが、第２のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第１のＣＬと異なるように改変されており；その結果、第２のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基が、第１のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に対して互いに優先的に相互作用し、第２のＣＨ１および第２のＣＬの相互作用している突然変異残基が、それによって第２の相補的な残基セットを形成する、Ｅ３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である、Ｅ１からＥ４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２０Å２未満である、Ｅ１からＥ５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ７．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１５０Å２未満である、Ｅ１からＥ６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ８．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１００Å２未満である、Ｅ１からＥ７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ９．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５０Å２未満である、Ｅ１からＥ８のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１０．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２０Å２未満である、Ｅ１からＥ９のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１１．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１０Å２未満である、Ｅ１からＥ１０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１２．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５Å２未満である、Ｅ１からＥ１１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１２．第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１Å２未満である、Ｅ１からＥ１２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１３．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である、Ｅ１からＥ１２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１４．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２０Å２未満である、Ｅ１からＥ１３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１５．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１５０Å２未満である、Ｅ１からＥ１４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１６．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１００Å２未満である、Ｅ１からＥ１５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１７．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５０Å２未満である、Ｅ１からＥ１６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１８．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２０Å２未満である、Ｅ１からＥ１７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ１９．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１０Å２未満である、Ｅ１からＥ１８のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２０．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５Å２未満である、Ｅ１からＥ１９のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２１．第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１Å２未満である、Ｅ１からＥ２０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２１．第１または第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積が、２．５Åプローブを使用して測定した場合、約０Å２である、Ｅ１からＥ２０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２２．第１の相補的残基セットの突然変異残基が、第２の相補的残基セットの突然変異残基と異なる、Ｅ１からＥ２１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２３．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して優先的に起こる、Ｅ１からＥ２２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２４．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ２３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２５．第１のＣＨ１が、第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬが、第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１が、第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬが、第２のＶＬに付着されている、Ｅ１からＥ２４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２６．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの優先的な形成が、可変ドメインの相補的対合を利用しない、Ｅ１からＥ２５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２７．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ２６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２８．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ２７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ２９．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ２８のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３０．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ２９のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３１．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１５倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３２．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３３．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２５倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３４．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約３０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３５．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３６．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３７．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３８．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ３９．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９０倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３８のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４０．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１００倍優先的に起こる、Ｅ１からＥ３９のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４１．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの優先的な形成が、可変ドメイン中の任意の相補的対合の非存在下で起こる、Ｅ２５からＥ３９のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４２．一緒に組み合わされた第１のＶＨ、第１のＶＬ、第１のＣＨ、および第１のＣＬが、第１のＦａｂを形成し、一緒に組み合わされた第２のＶＨ、第２のＶＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬが、第２のＦａｂを形成する、Ｅ２５からＥ４１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４３．第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成が、可変ドメインの相補的対合を利用しない、Ｅ４２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４４．第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成が、可変ドメイン中の任意の相補的対合の非存在下で起こる、Ｅ４２からＥ４３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４４．第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの優先的な形成が、相補的残基セットの相補的対合を利用する、Ｅ１からＥ４３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４５．ＣＬドメインの少なくとも１つが、カッパドメインである、Ｅ１からＥ４６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４６．第１のＣＬおよび第２のＣＬの両方が、カッパドメインである、Ｅ１からＥ４５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４７．相補的残基セットが、一方のドメイン中に正または負に荷電した残基、および他方のドメイン中に極性残基、または逆に荷電した残基を含む、Ｅ１からＥ４６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４８．相補的残基セットの場所が、Ｋａｂａｔ番号付けによる、ＣＨ１−１２４およびＣＬ−１７６；（ｉｉ）ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１７８；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１７８；（ｉｖ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３１；（ｖ）ＣＨ１−２２１およびＣＬ−１２３；（ｖｉ）ＣＨ１−１４５およびＣＬ−１３１；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１７９およびＣＬ−１３１；（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１８６およびＣＬ−１３１；ならびに（ｉｘ）ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１３３からなる群から選択される、Ｅ１からＥ４７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ４９．ＣＨ１位置の突然変異が、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され、ＣＬ位置の突然変異が、Ｓ、Ｍ、Ｄ、およびＥからなる群から選択される、Ｅ４８に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５０．ＣＨ１位置の突然変異が、ＥおよびＤからなる群から選択され、ＣＬ位置の突然変異が、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群から選択される、Ｅ４９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５１．相補的残基セットが、ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＨ１−１４５Ｓ、ＣＨ１−１８６Ａ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７６Ｍ、およびＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７８Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異をさらに含む、Ｅ４９からＥ５０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５２．第１および第２の相補的残基セットが、以下の群：ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ；（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ；（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；（ｖｉ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；（ｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；（ｘｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；（ｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ；（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｉｘ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、（ｘｘｉｖ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ；（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ；（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ；（ｘｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３１Ｄの２つから選択される、Ｅ１からＥ５１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５３．第１のＣＨ１と第１のＣＬ、および／または第２のＣＨ１と第２のＣＬとの間に改変されたジスルフィド結合を含む、Ｅ１からＥ５２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５４．改変されたジスルフィド結合が、以下の位置（ｉ）ＣＨ１−１２２およびＣＬ−１２３；（ｉｉ）ＣＨ１−１３９およびＣＬ−１１６；ならびに（ｉｉｉ）ＣＨ１−１７４およびＣＬ−１７６の１つまたは複数に位置している、Ｅ５３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５５．野生型ジスルフィド結合が、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬ上で、ＣＨ１−Ｃ２３０およびＣＬ−２１４の一方または両方を、Ｃを除く任意の残基に突然変異させることによって除去されている、Ｅ５３からＥ５４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５６．第１および／または第２のＣＨ１−Ｃ２３０、ならびに第１および／または第２のＣＬ−Ｃ２１４が、Ｓに突然変異されている、Ｅ５５に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５７．第１のＣＨＣＬが、以下の群：（ｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；（ｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；（ｘｉｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；（ｘｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｖｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｉｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；（ｘｘ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓの１つからの残基を含む、Ｅ１からＥ５６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５８．第２のＣＨＣＬが、群ｉ〜ｘｘｖｉｉの１つからの残基を含み、ただし、第１および第２のＣＨＣＬがともに、同じ群からの残基を含むことはない、Ｅ５７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ５９．第１のＣＨ１が、第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３）に接続されている第１のＣＨ２ドメイン（ＣＨ２）に接続されており、第２のＣＨ１が、第２のＣＨ３に接続されている第２のＣＨ２に接続されている、Ｅ１からＥ５８のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６０．第１のＣＨ３および第２のＣＨ３が、それぞれ第１のＣＨ３突然変異残基および第２のＣＨ３突然変異残基を含み、第１のＣＨ３突然変異残基および第２のＣＨ３突然変異残基が、互いに異なり、かつ互いに優先的に相互作用するように改変されており、それによってＣＨ３ホモ二量体の形成より多くＣＨ３ヘテロ二量体を形成する、Ｅ５９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６１．第１のＣＨ１が第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬが第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１が第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬが第２のＶＬに付着されており、第１のＶＨがＶＨ−Ｑ３９およびＶＨ−Ｑ１０５を含む、Ｅ１からＥ６０のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６２．第１のＣＨ１が、第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬが、第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１が、第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬが、第２のＶＬに付着されており、第２のＶＨが、ＶＨ−Ｑ３９およびＶＨ−Ｑ１０５を含む、Ｅ１からＥ６１のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６３．第１のＣＨ１が、第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬが、第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１が、第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬが、第２のＶＬに付着されており、第１のＶＬが、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１、ＶＬ−Ｓ１、ＶＬ−Ｄ１、ＶＬ−Ｅ１、ＶＬ−Ａ１、またはＶＬ−Ｎ１の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２、ＶＬ−Ｑ４２、またはＶＬ−Ｋ４２の１つを含む、Ｅ１からＥ６２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６４．第１のＣＨ１が第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬが第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１が第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬが第２のＶＬに付着されており、第２のＶＬが、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１、ＶＬ−Ｓ１、ＶＬ−Ｄ１、ＶＬ−Ｅ１、ＶＬ−Ａ１、またはＶＬ−Ｎ１の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２、ＶＬ−Ｑ４２、またはＶＬ−Ｋ４２の１つを含む、Ｅ１からＥ６３のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６５．第１のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ１からＥ６４のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６６．第２のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ１からＥ６５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６７．第１のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含み、第２のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ１からＥ６６のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質。
Ｅ６８．Ｅ１からＥ６７のいずれか１つのようなヘテロ二量体タンパク質を含む二重特異性抗体。
Ｅ６９．第１のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ６６に記載の二重特異性抗体。
Ｅ７０．第２のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ６８からＥ６９のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
Ｅ７１．第１のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含み、第２のＣＨＣＬが、ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む、Ｅ６８からＥ７０のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
Ｅ７２．Ｅ１からＥ６５のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質、またはＥ６８からＥ７１のいずれか１つに記載の二重特性抗体をコードする核酸。
Ｅ７３．Ｅ７２に記載の核酸を含むベクター。
Ｅ７４．Ｅ７２に記載の核酸を含み、またはＥ７１に記載のベクターを含む細胞。
Ｅ７５．Ｅ１からＥ６７のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法であって、（ｉ）細胞株に１種または複数のベクターをコトランスフェクトして、第１のＣＨＣＬの第１のＣＨ１、第１のＣＬ、ならびに第２のＣＨＣＬの第２のＣＨ１および第２のＣＬを発現させることと；（ｉｉ）１種または複数のベクターを発現させる、かつ第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬをアセンブルさせる条件下で細胞株を培養することと；（ｉｉｉ）細胞培養液からヘテロ二量体タンパク質を精製することとを含む、方法。
Ｅ７６．細胞株に、第１のＣＨ１、第１のＣＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬを１：１：１：１の比で発現するベクターがコトランスフェクトされる、Ｅ７５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】２つの異なる抗体軽鎖および２つの異なる抗体重鎖の同時発現を介して二重特異性抗体を生成するように試みることから生じ得る潜在的な生成物であって、ＣＨ３界面は、ヘテロ二量体形成を優遇するように確立された技術を使用して改変されているが、重鎖／軽鎖界面は、本発明の突然変異を欠く、潜在的な生成物を表す図である。ＨＣ１と対合したＬＣ１は、１つのエピトープに結合しているＦａｂアームをもたらし、ＨＣ２と対合したＬＣ２は、場合により異なる抗原上の別個のエピトープに結合しているＦａｂアームをもたらす。ＨＣ２と対合したＬＣ１、またはＨＣ１と対合したＬＣ２は、これらのエピトープへの結合が低減した、またはこれらに結合していないＦａｂをもたらす。Ａ：左のアーム上に、第１のＣＨＣＬの優先的な形成（黒丸および白丸により表した第１の相補的残基セットの相互作用によって促進される）を通じた第１のＶＨおよび第１のＶＬ（それぞれ濃い垂直の縞および薄い垂直のダッシュによって表した）の組合せ、ならびに右のアーム上に、第２のＣＨＣＬの優先的な形成（黒三角および白三角により表した第２の相補的残基セットの相互作用によって促進される）を通じた第２のＶＨおよび第２のＶＬ（それぞれ濃い斜め網掛けおよび薄いチェックパターンにより表した）の組合せを示す、代表的な二重特異性抗体の正しい対合。Ｂ：左のアーム上に、第３のＣＨＣＬの形成を通じた第１のＶＨおよび第２のＶＬ（それぞれ濃い垂直の縞および薄いチェックパターンで表した）の組合せ、ならびに右のアーム上に、第４のＣＨＣＬの形成を通じた第２のＶＨおよび第１のＶＬ（それぞれ濃い斜め網掛けおよび薄い垂直のダッシュによって表した）の組合せを示す、二重特性抗体の誤った対合。ＣおよびＤはそれぞれ、左または右のアームが正しく対合され、他方のアームが誤って対合された半機能的な二重特異性抗体を示す。
【図２】野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１（パネルＡ）、カッパＣＬ（パネルＢ）、およびラムダＣＬドメインの配列を表す図である。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って番号付けされている。ダッシュ（「−」）は、異なるタイプの抗体ドメインまたは異なる種においてのみ占有されているアミノ酸位置を示す。
【図３】天然のジスルフィド架橋を有する（Ａ）、ジスルフィド架橋を有さない（Ｂ）、またはそれぞれクローンＣｙｓ１、Ｃｙｓ３ａ、Ｃｙｓ３ｂ、およびＣｙｓ６について表１に詳述した新規の位置にジスルフィド架橋を有する（Ｃ〜Ｆ）野生型２９Ｄ７モノクローナルＩｇＧ１抗体の非還元性および還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す図である。Ｍ；分子量マーカー。
【図４】改変されたジスルフィドを有するコンストラクトの質量分光分析を表す図である。パネルＡ：クローンＣｙｓ＿ベータ、野生型ジスルフィドが除去されたコンストラクト；パネルＢ：クローンＣｙｓ＿１；パネルＣ：クローンＣｙｓ＿３ａ；パネルＤ：クローンＣｙｓ＿３ｂ；パネルＥ：クローンＣｙｓ＿６。
【図５】設計Ｓ１に伴った界面領域のＸ線結晶構造を表す図である。各パネル内で、ＣＨ１ドメインは、重要残基をボールアンドスティック形式にして暗灰色で上に示されている。ＣＬドメインは、重要残基をチューブとして与えて薄灰色で下に示されている。重要な相互作用は、オングストロームでの距離とともに点線で示されている。パネルＡ：ＩｇＧ１  ＣＨ１およびカッパＣＬを含む天然Ｆａｂアーム中の重要残基ＣＨ１−１２４、およびＣＬ−Ｓ１７６、ならびにサポート残基ＣＬ−Ｖ１３３、ＣＨ１−Ｓ１８８、およびＣＨ１−Ｖ１９０の配向。パネルＢ：突然変異ＣＨ１−Ｌ１２４Ｋ、ＣＬ−Ｓ１７６Ｄ、ＣＬ−Ｖ１３３Ｓ、およびＣＨ１−Ｖ１９０Ｓを有する標準的な２アーム抗体の一方のＦａｂアーム中に使用される設計。パネルＣ：突然変異ＣＨ１−Ｌ１２４Ｅ、ＣＬ−Ｓ１７６Ｋ、ＣＬ−Ｖ１３３Ｓ、およびＣＨ１−Ｓ１８８Ｇを有する標準的な２アーム抗体の他方のＦａｂアーム中に使用される設計。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むことなく、ＢおよびＣに示した突然変異が抗体の２本のＦａｂアームのそれぞれに導入される場合、重鎖／軽鎖誤対合は、Ｌｙｓ／ＬｙｓもしくはＡｓｐ／Ｇｌｕ電荷反発によって退けられることになり、かつ／または正しい対合は、Ｌｙｓ／ＡｓｐもしくはＬｙｓ／Ｇｌｕ電荷誘引によって奨励されることになる。パネルＡは、ＰＤＢエントリー３ＱＱ９を表し、一方、パネルＢおよびＣは、未発表の結晶構造である。
【図６】実施例４に記載した両方のＦａｂアームのＣＨ１／ＣＬ−カッパ界面において改変された好都合な静電相互作用を含むヘテロ二量体二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２（パネルＡ）、および天然のＣＨ１／ＣＬ−カッパ界面を有する対照Ａｂ１／Ａｂ２コンストラクト（パネルＢ）の質量分光分析の結果を表す図である。新規の静電相互作用突然変異は、単離されたＦａｂ断片中で誤って対合される軽鎖を有意に低減した。凡例：＊潜在的な不完全なリーダー配列プロセシング；＾軽鎖中に翻訳後修飾を伴った正しく対合された（Ｈ鎖およびＬ鎖の両方）Ａｂ２  Ｆａｂアーム
【図７】二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２  Ｆｃドメイン（パネルＡ）、およびＨＣヘテロ二量体化突然変異を含有するが、ＦａｂアームＣＨ／ＣＬ界面突然変異を含有しない対照Ａｂ１／Ａｂ２の質量分光分析を表す図である。Ｆｃ（Ａｂ１＆２に由来する重鎖からなる）の予期された分子量が両方の場合において検出され、一方、重鎖ホモ二量体は、検出されなかった。
【図８】陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２の分離からの結果を示すグラフを表す図である。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、プロテインＡおよび分取ＳＥＣクロマトグラフィー後の二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２抗体調製物内のタンパク質異種性を評価した。親抗体Ａｂ１およびＡｂ２の分析結果が、それぞれパネルＡ（ｉ）およびパネルＡ（ｉｉ）に示されている。親Ａｂ１は、明らかな単一ピークを示す。親Ａｂ２は、それぞれ主ピークの前および後に溶出する酸性および塩基性の電荷種の集団を示す。ヘテロ二量体二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２抗体は、パネルＢに示されている。二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２抗体（パネルＢ）からのピーク１、ピーク２Ａ、およびピーク２Ｂからの画分を、質量分析によって分析した。
【図９】イオン交換分画されたヘテロ二量体二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２からのＦａｂコンポーネント（図８Ｂで得た）の質量分光分析を示すグラフを表す図である。パネル９Ａは、図８Ｂからのピーク２Ｂが、各Ｆａｂアーム中に正しく対合された軽鎖を含むが、Ａｂ２  Ｆａｂアーム中に翻訳後修飾を伴った富んだ二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２を含有することを示す。パネル９Ｂは、図８Ｂからのピーク２Ａが富んだ誤った軽鎖対合（抗体１重鎖が抗体２軽鎖を組み合わせた）を有することを示し、パネル９Ｃは、図８Ｂからのピーク１を示す。このピークは、翻訳後修飾を伴わない正しく対合された二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２  Ｆａｂアームのみを表す。凡例：＊潜在的な不完全なリーダー配列プロセシング；＾翻訳後修飾を伴ったＡｂ２  Ｆａｂ。
【図１０】コンストラクトＣ５ＸＡｂ３−Ｍ１＆Ｃ５ＸＡｂ３−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥのデュアルアームＦａｂ断片の質量分光分析を示すグラフを表す図である。Ｃ５＆Ａｂ３間の誤って対合された軽鎖の有意な低減が、Ｃ５ＸＡｂ３−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥと比較してコンストラクトＣ５ＸＡｂ３−Ｍ１において観察された。凡例：＊潜在的な不完全なリーダー配列プロセシング。
【図１１】コンストラクトＣ５ＸＡｂ３−Ｍ２（パネル１１Ｂ）およびＣ５ＸＡｂ３−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥ（パネル１１Ａ）のデュアルアームＦａｂ断片の質量分光分析を示すグラフを表す図である。Ｃ５＆Ａｂ３間の誤って対合された軽鎖の有意な低減が、Ｃ５ＸＡｂ３−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥと比較してコンストラクトＣ５ＸＡｂ３−Ｍ２において観察された。凡例：＊潜在的な不完全なリーダー配列プロセシング。
【図１２】疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する二重特異性抗体の分離を示すグラフを表す図である。それぞれパネル１２Ａ（１）およびパネル１２Ａ（２）に示した親抗体Ａｂ３およびＣ５は、それぞれ明らかな単一ピークを示す。ヘテロ二量体化手法Ｍ１は、パネル１２Ｃに示されており、ヘテロ二量体化手法Ｍ２は、パネル１２Ｂに示されている。パネル１２Ｂ（１）および１２Ｃ（１）の両方の左のクロマトグラムは、重鎖ヘテロ二量体化突然変異単独の組込みを示す。右のクロマトグラム（パネル１２Ｂ（２）および１２Ｃ（２））は、実施例５に記載した重鎖および軽鎖の突然変異の両方を含有する二重特異性抗体を示す。これらの結果は、ＣＨ３／ＣＨ３突然変異のみを含む二重特異性（例えば、「ＮＥＧＡＴＩＶＥ」）と比較して、正しい軽鎖対合のためのＣＨ１およびＣＬ−カッパ突然変異ならびにＣＨ３突然変異の両方を組み込んで生成した抗体の異種性の低減を実証する。
【図１３】ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の界面領域（ＰＤＢエントリー３ＱＱ９からの）を表す図である。図は、左に暗灰色のＣＨ１、右に薄灰色のＣＬを用いて、ドメイン間の相互作用エッジに沿っている。
【図１４】図１３と同様の描画スタイルを用いたＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の界面領域（ＰＤＢエントリー３ＱＱ９からの）を表す図である。この図は、ＣＬと相互作用するＣＨ１の領域を強調する（相互作用残基の骨格原子は、ボールアンドスティックレンダリングを用いて示されている）。主要なＩｇ−フォールドβ−鎖領域は、Ｎ末端からＣ末端に１〜７で番号付けられている。
【図１５】図１３と同様の描画スタイルを用いたＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の界面領域（ＰＤＢエントリー３ＱＱ９からの）を表す図である。この図は、ＣＨ１と相互作用するＣＬの領域を強調する（相互作用残基の骨格原子は、ボールアンドスティックレンダリングを用いて示されている）。主要なＩｇ−フォールドβ−鎖領域は、Ｎ末端からＣ末端に１〜７で番号付けられている。
【図１６】ＰＤＢエントリー３ＱＱ９のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のほとんど埋め込まれた溶媒和したポケットを表す図である。薄灰色のリボンを使用して示した軽鎖骨格は、図の前にあり、暗灰色の重鎖骨格リボンは、より後ろである。このポケットを画定する重要な水分子は、球として示されている。
【図１７】Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異のサブセットのインパクトを示すように設計されたデュアルアームＦａｂ断片の質量分光分析を示すグラフを表す図である。パネルＡおよびＢは、ＣＨ１／ＣＬ突然変異を含まない元の単一特異性抗体を示す。２つの親抗体を組み合わせた二重特異性は、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異の非存在下で有意な誤対合を有する（パネルＣ）が、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖが使用される場合、ほぼ排除された誤対合を有する（パネルＤ）。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異の様々なサブセットを使用すると、パネルＣと比べて誤対合が低減されているが、パネルＤで使用した完全なＳ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計より依然として忠実度が低い抗体（パネルＥおよびＦ）がもたらされる。誤対合したＦａｂに対応するピークは、「Ａｂ３Ｈ  Ｃ５Ｌ」および「Ｃ５Ｈ  Ａｂ３Ｌ」と標識されており、一方、正しい対合は、「Ｃ５  Ｆａｂ」および「Ａｂ３  Ｆａｂ」と標識されている。
【図１８】疎水性クロマトグラフィーを使用する二重特異性抗体の分離を示すグラフを表す図である。パネルＡでは、Ｃ５およびＡｂ３抗体が組み合わされて、重鎖ヘテロ二量体化のためのＣＨ３突然変異のみを組み込んでいるが、重鎖／軽鎖界面において二重特異性優遇（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｆａｖｏｒｉｎｇ）突然変異を組み込んでいない二重特異性にされている。３つの主要ピークが存在し、不均一な試料を示す。パネルＢでは、Ｓ１およびＳ１  ｒｅｖ設計が、間違った重鎖および軽鎖の誤対合を退けるために重鎖／軽鎖界面に加えられている。試料均質性は、大いに改善されている。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計の二次支援の突然変異の一部が利用されない場合（パネルＣおよびＤ）、試料は、中間レベルの異種性を有する。パネルＥおよびＦは、パネルＡ〜Ｄの二重特異性抗体をアセンブルするのに使用した２つの抗体の単一特異性バージョンで観察された均質性のレベルを示す対照である。
【図１９】表２３に記載した、各Ｆａｂアーム中に突然変異の様々な組合せを含む二重特異性Ｆａｂの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線を表す図である。実線の太線は、生データを示し、一方、薄い点線は、必要に応じて２転移または３転移モデルに生データをフィッティングした結果を示す。表２４に要約したように、すべてのＦａｂは、６５℃超のこれらの最も低い転移を伴って良好な安定性を示した。
【図２０】表２３に列挙した各Ｆａｂアーム中に設計の様々な組合せを含むデュアルアームＦａｂ断片の質量分光分析を表す図である。Ａｂ３  Ｆａｂアーム中にＳ１、およびＣ５  Ｆａｂアーム中にＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、またはＴ９のいずれかを含む二重特異性抗体は、高い忠実度の重鎖／軽鎖対合を示した（パネルＡ〜Ｅ）。少量の誤対合（約３％）が、一方のＦａｂアーム中のＳ１と他方のＦａｂアーム中のＳ１＿ｒｅｖとを組み合わせる試料中で検出された（パネルＦ、「Ｃ５  Ｈ  Ａｂ３  Ｌ」と標識された誤対合）。一方のＦａｂアーム（パネルＧ〜Ｈ）または両方のＦａｂアーム（パネルＩ）が二重特異性優遇設計を含有しない場合、より大量の誤対合したＦａｂ（１９％またはそれ超）が検出された。
【図２１】疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する二重特異性抗体の分離を表す図である。抗体は、表２３に列挙されている。Ａｂ３  Ｆａｂアーム中にＳ１、およびＣ５  Ｆａｂアーム中にＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、またはＴ９のいずれかを含む二重特異性抗体は、高い忠実度の重鎖／軽鎖対合を示した（パネルＡ〜Ｅ）。少量の誤対合が、主ピークの左側の小さいテールとして明らかである。ピークのこのテールは、Ｃ５上のＳ１＿ｒｅｖと対合したＡｂ３上のＳ１についてわずかにより大きい（パネルＦ、矢印を参照）。これらの結果は、実施例４１および図２０の質量分光分析と一致する。一方のＦａｂアーム（パネルＧ〜Ｈ）または両方のＦａｂアーム（パネルＩ）が二重特異性優遇設計を含有しない場合、追加のピークの存在によって示されているように、より大量の誤対合したＦａｂが検出された。参考のために、パネルＪ〜Ｋは、これらの二重特異性設計の基となった単一特異性Ａｂ３およびＣ５抗体の対応するプロファイルを示す。
【図２２】本発明による二重特異性抗体を表す図である。ドメインは、以下の通り標識されている：１−ＶＬ：第１の可変軽鎖ドメイン；１−ＶＨ：第１の可変軽鎖ドメイン。１−ＣＬ：第１の定常軽鎖ドメイン。１−ＣＨ１：第１の定常重鎖１ドメイン。１−ＣＨ２：第１の定常重鎖２ドメイン。１−ＣＨ３：第１の定常重鎖３ドメイン。２−ＶＬ：第２の可変軽鎖ドメイン；２−ＶＨ：第２の可変軽鎖ドメイン。２−ＣＬ：第２の定常軽鎖ドメイン。２−ＣＨ１：第２の定常重鎖１ドメイン。２−ＣＨ２：第２の定常重鎖２ドメイン。２−ＣＨ３：第２の定常重鎖３ドメイン。第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬドメインは、中括弧記号間に示されており（それぞれ１−ＣＨＣＬおよび２−ＣＨＣＬ）、それぞれのＣＬおよびＣＨドメインを包含する。点線の長円形の線は、第１および第２のＦａｂ（それぞれ１−Ｆａｂおよび２−Ｆａｂ）を構成する４つのドメイン（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１）を捕捉する。第１のＣＨＣＬ界面および第２のＣＨＣＬ界面は、れんが積みでパターン化されている。ＣＬおよびＣＨ１ドメイン中の突然変異残基は、黒丸および白丸ならびに黒三角および白三角によって表されている（黒丸および白丸のセットは、第１のＦａｂの相補的残基セットを表し、黒三角および白三角のセットは、第２のＦａｂの相補的残基セットを表す）。第１のＣＨ３および第２のＣＨ３ドメインの「ノブアンドホール」対合は、矢印および環によって表されている。  この図は、本発明によって回避される２つの半機能的および１つの非機能的順列をさらに例示する。すなわち、本発明は、第１のＣＨ１（１−ＣＨ１）および第２のＣＨ（２−ＣＬ）が会合して、本明細書および図１Ａに示した優遇される対合と比較して第３のＣＨＣＬ（図１Ｂ、左のアーム）を形成する確率を低減する。同様に、本発明は、図１Ｃ（右のアーム）に例示した第４のＣＨＣＬ（第２の２−ＣＨ１および１−ＣＬを含む）の形成の可能性を低減する。同様に、本発明は、一方のアーム中に第３のＣＨＣＬおよび他方のアーム中に第４のＣＨＣＬを含む非機能抗体（例えば、図１Ｂ）の形成を低減する。
【図２３】キメラＴＯＡ−１抗体は、ヒトＴｒｋＢに結合することを示す図である。
【図２４】キメラＴＯＡ−１抗体は、マウスＴｒｋＢに結合することを示す図である。
【図２５】ヒト化ＴＯＡ−１バリアントは、ビオチン化キメラＴＯＡ−１とヒトＴｒｋＢへの結合を競合することを示す図である。
【図２６】ヒト化ＴＯＡ−１バリアントは、ビオチン化キメラＴＯＡ−１とヒトＴｒｋＢへの結合を競合することを示す図である。
【図２７】ヒト化ＴＯＡ−１バリアントは、ビオチン化キメラＴＯＡ−１とヒトＴｒｋＢへの結合を競合することを示す図である。
【図２８】ヒト化ＴＯＡ−１バージョン１．０／１．４は、親ＴＯＡ−１抗体と比べてヒトＴｒｋＢ結合性質を完全に保持することを示す図である。
【図２９】抗ＴｒｋＢ  ＴＯＡ−１抗体のアゴニスト活性を示す図である。
【図３０】ヒト化ＴＯＡ−１は、ＴｒｋＢシグナル伝達カスケードを活性化することを示す図である。
【図３１】ｈＴｒｋＢ上のＴＯＡ−１およびＢＤＮＦ結合部位が重なることを示す図である。
【図３２】キメラＴｒｋＢ−ＴｒｋＡ受容体へのＴＯＡ−１結合を示す図である。
【図３３】抗ＴｒｋＢ抗体は、マウス、ネコ、およびイヌＴｒｋＢに結合することを示す図である。
【図３４】ＴＯＡ−１抗体は、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣに結合しないことを示す図である。
【図３５】ヒト化ＴＯＡ−１は、ｐ７５に結合しないことを示す図である。
【図３６】ヒト化ＴＯＡ−１は、ｐ７５に結合しないことを示す図である。
【図３７】ＴＯＡ−１は、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣシグナル伝達カスケードを活性化しないことを示す図である。
【図３８】ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢ細胞内のＣｒｅ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化することを示す図である。
【図３９】ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＡ−ＣｒｅおよびｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ細胞内のＣｒｅ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化しないことを示す図である。
【図４０】ＴＡＭ−１６３は、ＳＨＣ１動員アッセイにおいてｈＴｒｋＢを活性化するが、ｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣを活性化しないことを示す図である。
【図４１】図１．ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ細胞内でＴｒｋＢ依存性リン酸化事象を活性化することを示す図である。
【図４２】ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＡ−ＣｒｅまたはｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ細胞内でＴｒｋ依存性リン酸化事象を活性化しないことを示す図である。
【図４３】ＴＡＭ−１６３は、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内でＴｒｋ依存性リン酸化事象を活性化することを示す図である。
【図４４】ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅおよびヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内でＴｒｋＢの内部移行を誘導することを示す図である。
【図４５】ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅおよびヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内でＴｒｋＢの分解を誘導することを示す図である。
【図４６】ＴＡＭ−１６３は、ヒトｐ７５ＮＴＲに結合しないことを示す図である  −  ＦＡＣＳ分析。
【図４７】ＴＡＭ−１６３は、ヒトｐ７５ＮＴＲに結合しないことを示す図である  −  細胞ベースＥＬＩＳＡ
【図４８】ＴＡＭ−１６３は、高親和性を伴ってマウス、イヌ、およびネコＴｒｋＢに結合することを示す図である。
【図４９】ＴＡＭ−１６３は、マウスＴｒｋＢをトランスフェクトした細胞内でＴｒｋＢ依存性シグナル伝達を活性化することを示す図である。
【図５０】ＴＡＭ−１６３は、イヌＴｒｋＢをトランスフェクトした細胞内でＴｒｋＢ依存性シグナル伝達を活性化することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一部の態様では、本発明は、（ｉ）第１のＣＨＣＬ界面で相互作用して第１のＣＨＣＬドメイン（ＣＨＣＬ）を形成する、第１のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第１のＣＬドメイン（ＣＬ）；（ｉｉ）第２のＣＨＣＬ界面で相互作用して第２のＣＨＣＬを形成する、第２のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）および第２のＣＬドメイン（ＣＬ）を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＣＨ１は、第１のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第２のＣＨ１と異なるように改変されており；第１のＣＬは、第１のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第２のＣＬと異なるように改変されており；その結果、第１のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基は、第２のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に優先して互いに相互作用し、第１のＣＨ１および第１のＣＬの相互作用している突然変異残基は、それによって第１の相補的残基セットを形成する、ヘテロ二量体タンパク質に関する。
【００１６】
一部の態様では、第２のＣＨ１は、第２のＣＨ１中の少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基だけ第１のＣＨ１と異なるように改変されており；第２のＣＬは、第２のＣＬ中の少なくとも１つのＣＬ突然変異残基だけ第１のＣＬと異なるように改変されており；その結果、第２のＣＨＣＬのＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基は、第１のＣＨＣＬ上の対応する残基位置に対して互いに優先的に相互作用し、第２のＣＨ１および第２のＣＬの相互作用している突然変異残基は、それによって第２の相補的残基セットを形成する。
【００１７】
第１のＣＨ１は、野生型ＣＨ１と異なるように改変され得る。第２のＣＨ１は、野生型ＣＨ１と異なるように改変され得る。第１のＣＬは、野生型ＣＬと異なるように改変され得る。第２のＣＬは、野生型ＣＬと異なるように改変され得る。
【００１８】
第１のＣＨ１は、第２のＣＨ１上の対応する位置と異なるように改変された少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基を含む場合がある。第１のＣＬは、第２のＣＬ上の対応する位置と異なるように改変された少なくとも１つのＣＬ突然変異残基を含む場合がある。第２のＣＨ１は、第１のＣＨ１上の対応する位置と異なるように改変された少なくとも１つのＣＨ１突然変異残基を含む場合がある。第２のＣＬは、第１のＣＬ上の対応する位置と異なるように改変された少なくとも１つのＣＬ突然変異残基を含む場合がある。
【００１９】
本発明の一部の態様では、第１の相補的残基セットの突然変異残基の同一性は、第２の相補的残基セットの突然変異残基の同一性と異なる。一部の態様では、第１の相補的残基セットの突然変異残基の場所は、第２の相補的残基セットの突然変異残基の場所と異なる（本明細書に記載のＫａｂａｔ番号付けによる場所）。本発明の一部の態様では、第１の相補的残基セットの突然変異残基の同一性および場所は、第２の相補的残基セットの突然変異残基の同一性および場所と異なる
【００２０】
ヘテロ二量体の優先的な形成
第２のＣＨＣＬ中に第２の相補的残基セットをもたらすと、ドメインの誤対合のリスクがさらに減少する。このストラテジーは、異なるドメインの改変された突然変異同士間にほとんど重なりがない場合により有効であり得る。一部の態様では、第１のＣＨＣＬの第１の相補的残基セットは、第２のＣＨＣＬの第２の相補的残基セットの場所と比べて異なる位置に位置する。
【００２１】
したがって、本発明の一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成は、第１のＣＨ１および第２のＣＬ（以下、第３のＣＨＣＬと呼ぶ）、または第２のＣＨ１および第１のＣＬ（以下、第４のＣＨＣＬと呼ぶ）から構成されるＣＨＣＬの形成に対して優先的に起こる。
【００２２】
図１Ａおよび図２２は、正しく対合した抗体（第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬを含む）を例示する。不適切に対合したドメインも表されている。第３のＣＨＣＬ（第１のＣＨ１および第２のＣＬを含む）は、図１Ｂおよび１Ｄの左のアームとして示されており、第４のＣＨＣＬ（第２のＣＨ１および第１のＣＬを含む）は、図１Ｂおよび１Ｃの右のアームとして示されている。同様に、図２２の右手の軽鎖と左手の軽鎖を交換すると、第３のＣＨＣＬおよび第４のＣＨＣＬを含む非機能的抗体がもたらされる。
【００２３】
有利には、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１２倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約３０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約３５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９０倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９５倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９９倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１００倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２００倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５００倍優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１０００倍優先的に起こる。
【００２４】
一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１２対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約３０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約３５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約６５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約７５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約８５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９０対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９５対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約９９対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１００対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２００対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５００対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約１０００対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約２０００対約１の比で優先的に起こる。一部の態様では、第１および第２のＣＨＣＬの形成は、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約５０００対約１の比で優先的に起こる。
【００２５】
「誤った」軽鎖対合（すなわち、形成される第３および第４のＣＨＣＬ）と比べた「正しい」ヘテロ二量体軽鎖対合（すなわち、形成される第１および第２のＣＨＣＬ）のレベルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）によって測定され得る。二重特異性抗体調製物は、いずれの凝集体も除去するためにプロテインＡクロマトグラフィーおよび分取サイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができ、またはより低い分子量コンポーネントは、独立した断片（合計で３つの断片）として各ＦａｂアームおよびＦｃを放出するためにＬｙｓＣ酵素で消化される。次いでＬＣＭＳを使用して各ＦａｂアームおよびＦｃの経験的質量を測定することができ、得られた値は、２つの可能な正しいＦａｂアームおよび２つの可能な誤ったＦａｂアームの理論的質量と比較され、Ｆｃについて、ホモ二量体対ヘテロ二量体Ｆｃの理論的質量の比較が行われる。各断片の信号強度は、バックグラウンドノイズを超えて検出されたすべての断片の全強度の％に変換し、正しいＦａｂ生成物と誤ったＦａｂ生成物の比の比較を可能にすることができる。別個の手法では、プロテインＡ後の二重特異性抗体調製物溶離液をイオン交換またはＨＩＣクロマトグラフィーを使用して分画し、溶出した画分を、ＬＣＭＳを使用して同定することができる。次いで同定されたピークは、クロマトグラフィーステップと関連したＡ２８０測定からの％ＡＵＣに対応付けられる。イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーは、差分電荷または疎水性性質に基づいて正しいおよび誤った軽鎖対合を含有する二重特異性ＩｇＧを分画する。得られたＡ２８０クロマトグラムからの％曲線下面積は、正しい生成物の量を定量化するのに使用することができる。
【００２６】
溶媒接触可能表面積
非野生型ヒト残基（本明細書の相補的残基セットなど；以下を参照）をヒト患者への投与を意図した抗体中に導入する場合、ヒト免疫系が修飾された残基を外来と認識し、治療剤に対する抗体（抗薬物抗体またはＡＤＡ応答、これは、より速いクリアランス、循環している治療剤の活性の低減、または両方をもたらし得る）を産生するリスクがある。ＡＤＡによって認識されるために、治療抗体の非ヒト残基は、ＡＤＡに接触可能でなければならない。ＡＤＡに接触可能な表面積を最小限にすると、ＡＤＡの治療抗体と相互作用する能力が低減されることが予期される。
【００２７】
一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２５Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２２０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１５０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１５０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１２０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１２０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１００Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１００Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、８０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、８０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、４０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、４０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、３０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、３０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１０Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１０Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、５Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、２Å２未満である。一部の態様では、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１Å２未満である。一部の態様では、第２の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定した場合、１Å２未満である。
【００２８】
一部の態様では、溶媒接触可能表面積は、Ｍａｅｓｔｒｏ９．６、９．７、または９．９（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）中の表面積アルゴリズムを使用して測定される。分解能は、０．３であり得る。好ましくは、第１の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、Ｍａｅｓｔｒｏ９．６、９．７、または９．９（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）中の表面積アルゴリズムを使用して、高分解能（例えば、０．３の分解能）で２．５Åプローブを使用して測定した場合、５０Å２未満である。
【００２９】
単一側鎖の突然変異は、抗体結合効力を１桁またはそれ超改善することができることが当技術分野で周知である。例えば、約９０Å２の接触可能表面積を有するＨｉｓ／Ｔｙｒ置換は、ベバシズマブの１０倍超の結合性改善を引き起こすことが公知である（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．、５３（１１）、２９３７〜５０（２０１３））。しかし、より小さい表面変化でさえ、同様の効果を有し得ることが当技術分野で周知である。アラニン側鎖は、約２０Å２の接触可能表面積を有する。アラニンへの突然変異は、２つのタンパク質間の結合親和性を１桁超変化させるのに十分であり得る。例えば、Ｍａｂｓ、３（５）、４７９〜４８６（２０１１）を参照。したがって、小さい突然変異された表面積は、免疫系が、天然ヒト抗体に結合することに対して有意な選択性を有しながら改変された生物治療抗体を認識する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を産生することを可能にするのに十分であり得る。
【００３０】
溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）は、溶媒（典型的には水）に接触可能な生体分子の表面である。ＳＡＳＡは、１９７３年にＳｈｒａｋｅ＆Ｒｕｐｌｅｙによって開発された「ローリングボール」アルゴリズムを使用することによって計算することができ、このアルゴリズムは、分子の表面を「プローブ」するのに溶媒分子のサイズを近似する球をモデル化する。球の半径の典型的な値は、１．４Åであり、理由は、これが水分子のおおよその半径に対応するためである。しかし、より大きい値（２．５Åなど、本明細書で使用する場合）が、結晶構造において固有の原子位置の実験の不確定度を考慮するとき、または生体分子の表面へのアクセスが問われている分子的実体が水分子より大きい場合（例えば、潜在的な宿主の免疫系の生体分子）、適切となり得る。
【００３１】
本発明の一態様は、ＣＨ１およびＣＬドメイン中の改変された突然変異を使用することによって、二重特異性異種抗体またはこれらのＦａｂ断片を生成および維持する手段を提供することである。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために抗体中に非カノニカルな残基を導入すると、宿主免疫応答を誘発するリスクにさらされる。したがって、抗体またはそのＦａｂ断片に対して導入され、または改変される残基が潜在的に宿主免疫応答を誘発し得る程度を最小限にすることが有利である。したがって、本発明のいくつかの態様の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、５０Å２未満である。
【００３２】
一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、４５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、４０Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、３５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、３０Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、２５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、２０Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、１５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、１０Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、９Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、８Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、７Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、６Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、４Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、３Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、２Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、１Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、０．５Å２未満である。一部の態様では、本発明の相補的残基セットの溶媒接触可能表面積は、２．５Åプローブを使用して測定される場合、約０Å２未満である。
【００３３】
可変ドメイン
一部の態様では、第１のＣＨ１は、第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）に付着されており、第１のＣＬは、第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に付着されており、第２のＣＨ１は、第２のＶＨに付着されており、第２のＣＬは、第２のＶＬに付着されている。組み合わせたとき、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第１のＣＨ１、および第１のＣＬは、第１のＦａｂを形成する。組み合わせたとき、第２のＶＨ、第２のＶＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬは、第２のＦａｂを形成する。
【００３４】
一部の態様では、第１のＶＨは、第１のＣＨ１に接続されており、これはさらに、第１のＣＨ２に接続されており、これはさらに第１のＣＨ３に接続されており、それによって第１の重鎖を形成している。一部の態様では、第２のＶＨは、第２のＣＨ１に接続されており、これはさらに第２のＣＨ２に接続されており、これはさらに第２のＣＨ３に接続されており、それによって第２の重鎖を形成している。
【００３５】
一部の態様では、第１のＶＬは、第１のＣＬに接続されており、それによって第１の軽鎖を形成している。一部の態様では、第２のＶＬは、第２のＣＬに接続されており、それによって第２の軽鎖を形成している。
【００３６】
一部の態様では、本発明は、可変ドメインの相補的対合を利用しない第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成を提供する。
【００３７】
ヘテロ二量体タンパク質ドメイン相互作用の優先的な形成が、可変ドメインの相補的残基対合を利用しないとして論じられている場合、これは、例えば、第１のＣＨ１および第１のＣＬドメインの相補的対合が、第１のＣＨＣＬ（または第１のＦａｂ）の優先的な形成を生じさせるのに十分であることを意味する。可変または定常ドメインの１つまたは複数における追加の改変された残基は、所望のドメイン対合の優先的な形成の忠実度を増大させる相加効果をもたらし得る。
【００３８】
一部の態様では、第１の相補的残基セットは、第１のＣＨＣＬの優先的な形成に必要である。一部の態様では、第１の相補的残基セットは、第１のＦａｂの優先的な形成に必要である。一部の態様では、第２の相補的残基セットは、第２のＣＨＣＬの優先的な形成に必要である。一部の態様では、第２の相補的残基セットは、第２のＦａｂの優先的な形成に必要である。
【００３９】
一部の態様では、第１の相補的残基セットは、第１のＣＨＣＬの優先的な形成に十分である。一部の態様では、第１の相補的残基セットは、第１のＦａｂの優先的な形成に十分である。一部の態様では、第２の相補的残基セットは、第２のＣＨＣＬの優先的な形成に十分である。一部の態様では、第２の相補的残基セットは、第２のＦａｂの優先的な形成に十分である。
【００４０】
一部の態様では、本発明は、第１および第２のＣＨＣＬの形成が、少なくとも約４対約１の比で、第３および第４のＣＨＣＬの形成に対して優先的に起こり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１２、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、５００、１０００、２０００、および５０００対１の群から選択される値の比で起こり得るように、可変ドメインの相補的対合を利用しない第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成をもたらす。
【００４１】
互いに天然の親和性を有する公知のＶＬ／ＶＨ対のいくつかの事例が存在する。したがって、一部の態様では、本発明は、相補的残基セットを形成する改変された突然変異残基を含む可変ドメインのいずれも利用しない第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成をもたらす。一部の態様では、本発明の多量体タンパク質は、改変されてない、または野生型ＶＬ／ＶＨフレームワーク配列のものを超えて相補的対合を増大させるように改変されている、可変ドメインのいずれかにおける突然変異を含まない。
【００４２】
可変ドメイン中に相補的残基セットの突然変異残基を挿入することを回避することによって実現される複数の利点が存在する。例えば、可変領域に異なる生殖系列フレームワークを使用することが時に有利である。各生殖系列中の配列バリエーションは、可変ドメイン中で行われる任意の突然変異に対して異なる局所環境を提示し；いくつかのフレームワーク中で働く突然変異は、他のフレームワーク中で働かない場合がある（例えば、発現、凝集、安定性、または他の物理的性質の問題が起こり得る）。また、ＶＬ／ＶＨ界面（対合特異性に影響する可能性が最も高い範囲）における突然変異は、ＣＤＲ付近にあり、抗体から抗体で、およびフレームワーク間で異なる微妙な様式でＶＬおよびＶＨの相対的な配向に影響し得る。ＶＬ／ＶＨ配向の微妙なバリエーションは、いくつかの抗体によって許容され得るが、他の抗体によって許容され得ない。さらに、タンパク質表面の複数の領域（可変および定常ドメインの両方）を突然変異させると、患者の免疫系が抗体を外来として認識し、抗薬物抗体応答（ＡＤＡ）を介してそれを拒絶する追加の機会がもたらされる。ＡＤＡ応答の２つの可能性がある結果は、患者からの治療剤のクリアランスのより速い速度、および薬物の意図された標的に結合するその能力の中和である（Ｊａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９（３）、５３４〜５５（２０１３））。二重特異性抗体の開発では、ＡＤＡ応答を開始する患者の免疫系の確率を最小限にするステップを採用することが望ましい。Ｔ細胞ＡＤＡ応答を予測するためのいくつかのコンピューターモデルが存在するが、立体構造エピトープのための正確なツールは、欠如している。したがって、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の限られた精度を考慮すると、Ｌｅｗｉｓらの方法（以下を参照）によって、必要に応じて複数のドメインを突然変異させるのではなく、ＣＨ１およびＣＬドメインに高忠実度二重特異性ＩｇＧ分子の修飾を限定することが好ましい。
【００４３】
一部の態様では、第１のＶＨは、ＶＨ−Ｑ３９（ＤＰ５４もしくはＤＰ７５のような）またはＶＨ−Ｑ１０５（ＪＨ２以外のヒトＪセグメントのような）を含む。一部の態様では、第２のＶＨは、ＶＨ−Ｑ３９（ＤＰ５４もしくはＤＰ７５のような）またはＶＨ−Ｑ１０５（ＪＨ２以外のヒトＪセグメントのような）を含む。
【００４４】
一部の態様では、第１のＶＬは、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８（ＤＰＫ９またはＤＰＬ１６のような）；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｓ１（ＤＰＬ１６のような）、ＶＬ−Ｄ１（ＤＰＫ９のような）、ＶＬ−Ｅ１（ＤＰＫ２３のような）、ＶＬ−Ａ１（ＤＰＫ３のような）、またはＶＬ−Ｎ１（ＤＰＫ２のような）の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｑ４２（ＤＰＬ１６のような）、またはＶＬ−Ｋ４２（ＤＰＫ９のような）の１つのうちの１つまたは複数を含む。
【００４５】
一部の態様では、第２のＶＬは、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８（ＤＰＫ９またはＤＰＬ１６のような）；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｓ１（ＤＰＬ１６のような）、ＶＬ−Ｄ１（ＤＰＫ９のような）、ＶＬ−Ｅ１（ＤＰＫ２３のような）、ＶＬ−Ａ１（ＤＰＫ３のような）、またはＶＬ−Ｎ１（ＤＰＫ２のような）の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｑ４２（ＤＰＬ１６のような）、またはＶＬ−Ｋ４２（ＤＰＫ９のような）の１つのうちの１つまたは複数を含む。
【００４６】
一部の態様では、第１のＶＨは、ＶＨ−Ｑ３９（ＤＰ５４またはＤＰ７５のような）およびＶＨ−Ｑ１０５（ＪＨ２以外のヒトＪセグメントのような）を含む。一部の態様では、第２のＶＨは、ＶＨ−Ｑ３９（ＤＰ５４またはＤＰ７５のような）およびＶＨ−Ｑ１０５（ＪＨ２以外のヒトＪセグメントのような）を含む。一部の態様では、第１および第２のＶＨの両方がこれらの残基を含む。
【００４７】
一部の態様では、第１のＶＬは、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８（ＤＰＫ９またはＤＰＬ１６のような）；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｓ１（ＤＰＬ１６のような）、ＶＬ−Ｄ１（ＤＰＫ９のような）、ＶＬ−Ｅ１（ＤＰＫ２３のような）、ＶＬ−Ａ１（ＤＰＫ３のような）、またはＶＬ−Ｎ１（ＤＰＫ２のような）の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｑ４２（ＤＰＬ１６のような）、またはＶＬ−Ｋ４２（ＤＰＫ９のような）の１つを含む。
【００４８】
一部の態様では、第２のＶＬは、（ｉ）ＶＬ−Ｑ３８（ＤＰＫ９またはＤＰＬ１６のような）；および（ｉｉ）ＶＬ−Ｑ１（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｓ１（ＤＰＬ１６のような）、ＶＬ−Ｄ１（ＤＰＫ９のような）、ＶＬ−Ｅ１（ＤＰＫ２３のような）、ＶＬ−Ａ１（ＤＰＫ３のような）、またはＶＬ−Ｎ１（ＤＰＫ２のような）の１つ；および（ｉｉｉ）ＶＬ−Ｔ４２（ＤＰＬ７のような）、ＶＬ−Ｑ４２（ＤＰＬ１６のような）、またはＶＬ−Ｋ４２（ＤＰＫ９のような）の１つを含む。
【００４９】
一部の態様では、第１のＶＬおよび第２のＶＬの両方が上記残基を含む。
【００５０】
ルイスら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２、１９１〜９８（２０１４）、または以下で「Ｌｅｗｉｓ刊行物」）は、軽鎖を適切な重鎖と対合する問題に対処するように試みたＣＨ１、ＣＬ、ＶＬ、およびＶＨドメイン中の突然変異を報告した。関連した特許出願、ＷＯ２０１４１５０９７３では、可変ドメインの少なくとも１つの突然変異をすべて伴う二重特異性抗体が開示されている。Ｌｅｗｉｓ刊行物では、「我々の方法は、可変および定常ドメインの両方の保存されたフレームワーク領域中への複数の突然変異の導入を必要とする」と述べられている。この著者らは、彼らの経験において、「可変ドメインが重鎖および軽鎖の特異的アセンブリーを支配した」とさらに注記した。彼らは、タンパク質折り畳み経路の間に、可変ドメインは、「最初に互いに認識し、ＣＬドメインに折り畳まれていないＣＨ１と相互作用させる」ことができ、その結果、重鎖／軽鎖対合は、ＣＨ１およびＣＬが相互作用する前にＶＨおよびＶＬの相互作用によって概ね決定されると仮定した。その仮説は、可変領域中の突然変異が要求された彼らの観察を説明するはずである。
【００５１】
対照的に、本発明は、ＣＤＲ、またはさらには可変領域の残りの突然変異を必要とせず、それでも高い忠実度の鎖対合を実現するヘテロ二量体タンパク質（例えば、二重特異性抗体）を提供する。したがって、この分野における最近の技術、具体的にはＬｅｗｉｓおよびＷＯ２０１４１５０９７３と比べて、本発明のヘテロ二量体タンパク質および二重特異性抗体は、予想外であり、かなりの有益な利点をもたらす。
【００５２】
当技術分野で公知であるように、抗体とその抗原との間の相互作用は、ＣＤＲループによって主に推進される。すべてのＣＤＲループがすべての抗原の抗原結合に参加するわけではないが、高忠実度二重特異性鎖対合を試し、実現するための抗体改変の方法を設計するとき、ＣＤＲおよび可変領域内の位置の突然変異は、抗体結合親和性に悪影響するリスクに起因して不利である。単一のＦａｂではなく複数のＦａｂ配列（または二重特異性ＩｇＧ）の同時生成を伴う場合について、ＷＯ２０１４１５０９７３の様々な実施形態はすべて、Ｋａｂａｔによって定義される重鎖のＣＤＲ２領域を突然変異させることを想定している（「ＫａｂａｔによるＨＦＲ３の第１の残基の上流の４つのアミノ酸である残基」がグルタミン酸に突然変異され、ここでＨＦＲ３は、重鎖のフレームワーク３を指す）。本発明のヘテロ二量体タンパク質および二重特異性抗体は、ＣＤＲを修飾せず、したがってこのリスクを回避する。さらに、軽鎖可変領域の１位（ＷＯ２０１４／１５０９７３Ａ１の特許請求の範囲によれば、４本鎖混合物の生成中にＡｒｇに突然変異される）は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループ付近にあり、それは、この位置における突然変異は、いくつかの抗原に対する結合親和性にも影響し得ることを意味する。ＰＤＢエントリー４ＬＬＹ、Ｌｅｗｉｓ刊行物に記載された結晶構造において、１位の側鎖は、Ｃβを超えると無秩序であるが、骨格原子は、ＣＤＲ  Ｌ１の５Å以内、およびＣＤＲ  Ｌ３の６Å以内にあり、Ｃβは、ＣＤＲ残基の大部分を含有するＦａｂの面（すなわち、抗原が結合すると予期される場所）に向けて配向している。対照的に、本発明のヘテロ二量体タンパク質および二重特異性抗体は、この位置、または可変ドメイン中の任意の他の位置の突然変異を伴わず、したがって、近傍のフレームワーク残基を突然変異させるとき存在するＣＤＲ適所配置および／または抗原結合を妨害するリスクを回避する。
【００５３】
原理上は、ヘテロ二量体優遇（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ−ｆａｖｏｒｉｎｇ）突然変異は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の界面、および可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの間の界面である重鎖と軽鎖との間の主要な界面領域のいずれかに含めることができる。しかし、上記で部分的に述べたように、ＣＨ１／ＣＬ界面中の突然変異が、ロバストな二重特異性プラットフォームの開発にとって高度に好適である。可変ドメイン界面中の突然変異は、ＣＤＲループのコンホメーションに影響し得る。理由は、ＣＤＲループは、可変ドメイン界面の一部を形成するので、これらは、可変ドメイン中に行われた突然変異と相互作用し得る（直接に、または近傍の残基を通じて間接的に）ためである。ヘテロ二量体増強突然変異とのこのような相互作用が抗体親和性に影響する様式でＣＤＲループコンホメーションを変更する場合、これらのヘテロ二量体突然変異は、広い範囲の抗体にわたる信頼できる使用にとって芳しくない候補であることを証明することになる。
【００５４】
さらに、２つの可変ドメインの相対的な配向は、すべての抗体の間で一定ではなく、２つのドメイン間の角度は、抗体間で少なくとも３０度変動し得ることが公知である（ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．、２３（９）、６８９〜９７、（２０１０））。これらの変化は、可変ドメイン中の残基同士間の接触の詳細なパターンを必然的に変更し、対応して、界面内で許容されるアミノ酸置換の範囲を変更する。
【００５５】
これらの事実を考慮すると、可変ドメイン突然変異がヘテロ二量体優遇プラットフォーム設計で使用される場合、既知の抗体構造中で一般的なやり方で遭遇する様々なＣＤＲコンホメーションおよび可変ドメイン配向角度をカバーする多数の例を試験することなく、ロバストで信頼できる適用性を実証することが困難であるはずである。したがって、本発明によるヘテロ二量体および二重特異性抗体の生成における利点の１つは、ＣＨ１／ＣＬ界面の修飾をもっぱら利用することである。本発明の実施形態のいずれも、有用なレベルの対合忠実度を実現するための本質的な特徴として可変ドメインの修飾体との対合を必要としない。
【００５６】
本発明は、有利なことに、第１のＦａｂおよび第２のＦａｂの優先的な形成が、相補的残基セットの相補的対合を利用することを示す。
【００５７】
一部の態様では、優先的な形成は、第２のＣＬとともに第１のＣＨ１、または第１のＣＬとともに第２のＣＨ１を含むＦａｂ（またはＣＨＣＬ）の形成より大きい程度の第１のＣＨ１および第１のＣＬを含む第１のＦａｂ（または第１のＣＨＣＬ）の形成を指す。一部の態様では、優先的な形成は、第２のＣＬとともに第１のＣＨ１、または第１のＣＬとともに第２のＣＨ１を含むＦａｂ（またはＣＨＣＬ）の形成より大きい程度の第２のＣＨ１および第２のＣＬを含む第２のＦａｂ（または第２のＣＨＣＬ）の形成を指す。
【００５８】
一部の態様では、ＣＬドメインの少なくとも１つは、カッパドメインである。一部の態様では、ＣＬドメインの少なくとも１つは、ラムダドメインである。一部の態様では、ＣＬドメインの両方がカッパドメインである。一部の態様では、ＣＬドメインの両方がラムダドメインである。一部の態様では、ＣＬドメインの一方は、カッパドメインであり、他方のＣＬドメインは、ラムダドメインである。
【００５９】
一部の態様では、本発明は第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの形成が、第１のＣＨ１および第２のＣＬ、または第２のＣＨ１および第１のＣＬから構成されるＣＨＣＬの形成に対して、少なくとも約４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、および２００倍からなる群から選択される量で優先的に起こるヘテロ二量体タンパク質および二重特異性抗体を提供する。
【００６０】
正しいＣＨＣＬ対合の判定は、質量スペクトル分析によって行われ得る。
【００６１】
相補的残基セット
一部の態様では、相補的残基セットは、一方のドメイン中に正または負に荷電した残基、および他方のドメイン中に逆に荷電した残基を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、一方のドメイン中に正に荷電した残基、および他方のドメイン中に負に荷電した残基を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、一方のドメイン中に正または負に荷電した残基、および他方のドメイン中に極性残基、または逆に荷電した残基を含む。正に荷電した残基は、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群から選択され得る。負に荷電した残基は、ＥおよびＤからなる群から選択され得る。疑義を回避するために、負に荷電した残基は、正に荷電した残基に対して逆に荷電していると言われ、逆の場合も同様である。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｗ、およびＹからなる群から選択され得る。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、およびＷからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、およびＹからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、およびＷからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｍ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される場合がある。極性残基は、Ｓ、Ｍ、およびＷからなる群から選択される場合がある。極性残基は、ＳおよびＴからなる群から選択される場合がある。一部の態様では、Ｍは、極性残基と見なされない。
【００６２】
例えば、ＣＨ１突然変異残基は、正または負に荷電した残基を含み得、ＣＬ突然変異残基は、極性残基、または逆に荷電した残基を含み得る。ＣＬ突然変異残基は、正または負に荷電した残基を含み得、ＣＨ１突然変異残基は、極性残基、または逆に荷電した残基を含み得る。ＣＬ突然変異残基は、正に荷電した残基を含み得、ＣＨ１突然変異残基は、負に荷電した残基を含み得る。ＣＨ１突然変異残基は、正に荷電した残基を含み得、ＣＬ突然変異残基は、負に荷電した残基を含み得る。
【００６３】
本発明の一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１突然変異残基およびＣＬ突然変異残基を含み得、これらの逆に荷電した側鎖が静電相互作用を促進する。有利には、改変された突然変異残基から生じるそれぞれのＣＨ１およびＣＬドメインの変更された荷電極性が、第１または第２のＦａｂの形成を支持し、同様に、改変された突然変異残基の１つまたは複数から生じる反発的な電荷相互作用が、第３または第４のＦａｂの形成を抑制する。
【００６４】
一部の態様では、相補的残基セットの場所は、本明細書に定義したＫａｂａｔ番号付けによる（ｉ）ＣＨ１−１２４およびＣＬ−１７６；（ｉｉ）ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１７８；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１７８；（ｉｖ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３１；（ｖ）ＣＨ１−２２１およびＣＬ−１２３；（ｖｉ）ＣＨ１−１４５およびＣＬ−１３１；（ｖｉ）ＣＨ１−１７９およびＣＬ−１３１；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１８６およびＣＬ−１３１；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３３からなる群から選択される。
【００６５】
一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１２４およびＣＬ−１７６を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１８８およびＣＬ−１７８を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１７８を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−２２１およびＣＬ−１２３を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４５およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１７９およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４５、ＣＨ１−１７９、ＣＨ１−１８６、およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４３、ＣＨ１−１７９、ＣＨ１−１８６、およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１８６およびＣＬ−１３１を含む。一部の態様では、相補的残基セットは、ＣＨ１−１４３およびＣＬ−１３３を含む。
【００６６】
一部の態様では、ＣＨ１位置における突然変異は、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され、ＣＬ位置における突然変異は、Ｓ、Ｍ、Ｄ、およびＥからなる群から選択される。
【００６７】
一部の態様では、ＣＨ１位置における突然変異は、ＥおよびＤからなる群から選択され、ＣＬ位置における突然変異は、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群から選択される。
【００６８】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、１つまたは複数のさらなる突然変異をさらに含む。
【００６９】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＨ１−１４５Ｓ、ＣＨ１−１８６Ａ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７６Ｍ、およびＣＬ−１７８Ｓからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる突然変異を含む。
【００７０】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、本明細書に記載のＫａｂａｔ番号付けによるＣＨ１−１４３、ＣＨ１−１４５、ＣＨ１−１８６、ＣＨ１−１８８、ＣＨ１−１８８、ＣＨ１−１９０、ＣＨ１−１９０、ＣＬ−１３３、ＣＬ−１３５、ＣＬ−１７６、ＣＬ−１７６、およびＣＬ−１７８からなる群から選択される１つまたは複数の位置に位置したさらなる突然変異を含む。
【００７１】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１４３においてさらなるＣＨ１突然変異残基を含む。ＣＨ１−１４３における突然変異残基は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。ＣＨ１−１４３における突然変異残基は、ＥおよびＤからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１４３における突然変異残基は、Ｅであり得る。ＣＨ１−１４３における突然変異残基は、Ｄであり得る。
【００７２】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１４５においてさらなるＣＨ１突然変異残基を含む。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｗ、またはＹからなる群から選択され得る。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、またはＤからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、またはＮからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、またはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｓであり得る。ＣＨ１−１４５における突然変異残基は、Ｔであり得る。
【００７３】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１８６においてさらなるＣＨ１突然変異残基を含む。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｗ、Ｆ、またはＹからなる群から選択され得る。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、またはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、またはＩからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＬからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、またはＶからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、ＧまたはＡからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、ＡまたはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｆ、Ｙ、またはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ｗであり得る。ＣＨ１−１８６における突然変異残基は、Ａであり得る。
【００７４】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１８８においてさらなるＣＨ１突然変異残基を含む。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｗ、Ｆ、またはＹからなる群から選択され得る。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、またはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、またはＩからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＬからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、ＧまたはＡからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、またはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、ＧまたはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｆ、Ｙ、またはＷからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｗであり得る。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ａであり得る。ＣＨ１−１８８における突然変異残基は、Ｇであり得る。
【００７５】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＨ１−１９０においてさらなるＣＨ１突然変異残基を含む。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌからなる群から選択され得る。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、ＩまたはＬからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、ＳまたはＴからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、ＳまたはＩからなる群から選択される場合がある。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、Ｔであり得る。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、Ｌであり得る。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、Ｉであり得る。ＣＨ１−１９０における突然変異残基は、Ｓであり得る。
【００７６】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＬ−１３３においてさらなるＣＬ突然変異残基を含む。ＣＬ−１３３における突然変異残基は、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＭからなる群から選択され得る。ＣＬ−１３３における突然変異残基は、Ｓであり得る。ＣＬ−１３３における突然変異残基は、Ｔであり得る。ＣＬ−１３３における突然変異残基は、Ｍであり得る。ＣＬ−１３３における突然変異残基は、Ｑであり得る。
【００７７】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＬ−１３５においてさらなるＣＬ突然変異残基を含む。ＣＬ−１３５における突然変異残基は、Ｉ、Ｔ、またはＭからなる群から選択され得る。ＣＬ−１３５における突然変異残基は、Ｉであり得る。
【００７８】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＬ−１７６においてさらなるＣＬ突然変異残基を含む。ＣＬ−１３５における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、またはＴからなる群から選択され得る。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｇ、Ａ、またはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、ＧまたはＭからなる群から選択される場合がある。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｇであり得る。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ａであり得る。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｍであり得る。ＣＬ−１７６における突然変異残基は、Ｎであり得る。
【００７９】
一部の態様では、相補的残基セットの１つまたは複数は、ＣＬ−１７８においてさらなるＣＬ突然変異残基を含む。ＣＬ−１３５における突然変異残基は、Ｇ、Ｓ、Ｖ、またはＡからなる群から選択され得る。ＣＬ−１３５における突然変異残基は、Ｓであり得る。
【００８０】
一部の態様では、第１および第２の相補的残基セットは、以下の群：（ｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ；（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ；（ｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ；（ｖｉ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；（ｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；（ｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；（ｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ；（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｖｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｉｘ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、（ｘｘｉｖ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ；（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ；（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ；（ｘｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３１Ｄの２つから選択される。
【００８１】
新規のジスルフィド連結
一部の態様では、本発明は、第１のＣＨ１と第１のＣＬ、および／または第２のＣＨ１と第２のＣＬの間に新規のジスルフィド結合をもたらす。新規のジスルフィド結合は、以下の位置（ｉ）ＣＨ１−１２２およびＣＬ−１２３；（ｉｉ）ＣＨ１−１３９およびＣＬ−１１６；ならびに（ｉｉｉ）ＣＨ１−１７４およびＣＬ−１７６の１つまたは複数に位置し得る。
【００８２】
野生型ジスルフィド結合は、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬのいずれかまたは両方上で、ＣＨ１−Ｃ２３０およびＣＬ−２１４の一方または両方を、Ｃを除く任意の残基に突然変異させることによって除去され得る。一部の態様では、ＣＬ−Ｃ２１４は、第１および／または第２のＣＨＣＬのいずれかまたは両方において欠失される。一部の態様では、ＣＨ１−Ｃ２３０は、第１および／または第２のＣＨＣＬのいずれかまたは両方において欠失される。
【００８３】
一部の態様では、第１および／または第２のＣＨ１−Ｃ２３０ならびに第１および／または第２のＣＬ−Ｃ２１４は、Ｓに突然変異される。一部の態様では、第１のＣＨＣＬは、ＣＨ１−Ｃ２３０ＳおよびＣＬ−Ｃ２１４Ｓを含み、以下の残基対：ＣＨ１−１２２ＣおよびＣＬ−１２３Ｃ；ＣＨ１−１３９ＣおよびＣＬ−１１６Ｃ；ならびにＣＨ１−１７４ＣおよびＣＬ−１７６Ｃの１つまたは複数をさらに含む。一部の態様では、第２のＣＨＣＬは、ＣＨ１−Ｃ２３０ＳおよびＣＬ−Ｃ２１４Ｓを含み、以下の残基対：ＣＨ１−１２２ＣおよびＣＬ−１２３Ｃ；ＣＨ１−１３９ＣおよびＣＬ−１１６Ｃ；ならびにＣＨ１−１７４ＣおよびＣＬ−１７６Ｃの１つまたは複数をさらに含む。有利には、第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬは、同じ対応する位置に位置した新規のサイトカイン突然変異を含まない。
【００８４】
一部の態様では、所与のＣＨＣＬはＣＨ−１７４ＣおよびＣＬ−１７６Ｃを含み、所与のＣＨＣＬは、ＣＨ−１９０ＩおよびＣＬ−１３５Ｉをさらに含む。
【００８５】
ＣＨ／ＣＬ突然変異
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、以下の群：（ｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｉｉ）ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｉｖ）ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＬ−１３３Ｓ；（ｖ）ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＨ１−１４３Ｅ；（ｖｉ）ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、ＣＨ１−１４３Ｄ；（ｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒ；（ｉｘ）ＣＨ１−１４３Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ；（ｘ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ；（ｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、ＣＬ−１７６Ｍ；（ｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＬ−１３１Ｒ；（ｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ；（ｘｉｖ）ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、ＣＨ１−１８６Ａ；（ｘｖ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ；（ｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｋ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｖｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ；（ｘｉｘ）ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘ）ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１４５Ｓ；（ｘｘｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ；（ｘｘｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＬ−１７８Ｇ；（ｘｘｉｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｉｖ）ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｖ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｖｉ）ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓ；（ｘｘｖｉｉ）ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１７６Ｃ、ＣＬ−２１４Ｓの１つからの残基を含む。
【００８６】
有利には、第１および第２のＦａｂはともに、同じ群からの残基を含むことはない。
【００８７】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｄ、ＣＨ１−１９０Ｓ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４ＫおよびＣＬ−１７６Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｋ、ＣＬ−１７６Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｒ、ＣＬ−１７６Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｒ、ＣＬ−１７６Ｅを含む。
【００８８】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｅ、ＣＬ−１７６Ｋ、ＣＨ１−１８８Ｇ、およびＣＬ−１３３Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４ＥおよびＣＬ−１７６Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｅ、およびＣＬ−１７６Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｄ、およびＣＬ−１７６Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１２４Ｄ、およびＣＬ−１７６Ｒを含む。
【００８９】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８ＫおよびＣＨ１−１４３Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｅ、およびＣＬ−１７８Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｄ、およびＣＬ−１７８Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｅ、ＣＬ−１７８Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｄ、ＣＬ−１７８Ｒを含む。
【００９０】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄ、およびＣＨ１−１４３Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｒ、ＣＬ−１７８Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｋ、ＣＬ−１７８Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８８Ｒ、ＣＬ−１７８Ｅを含む。
【００９１】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｋ、およびＣＬ−１７８Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｋ、およびＣＬ−１７８Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｒ、およびＣＬ−１７８Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｒ、およびＣＬ−１７８Ｅを含む。
【００９２】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、およびＣＬ−１７８Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｅ、およびＣＬ−１７８Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、およびＣＬ−１７８Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｅ、およびＣＬ−１７８Ｋを含む。
【００９３】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＬ−１７８Ｋ、およびＣＬ−１７６Ｍを含む。
【００９４】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｋを含む。
【００９５】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｒ、ＣＬ−１３１Ｅ、およびＣＨ−１８６Ａを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｒ、およびＣＬ−１３１Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｋ、およびＣＬ−１３１Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｒ、およびＣＬ−１３１Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｋ、およびＣＬ−１３１Ｄを含む。
【００９６】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−２２１Ｄ、ＣＬ−１２３Ｋ、ＣＨ１−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、およびＣＬ−２１４Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−２２１Ｄ、およびＣＬ−１２３Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−２２１Ｅ、およびＣＬ−１２３Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−２２１Ｄ、およびＣＬ−１２３Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−２２１Ｅ、およびＣＬ−１２３Ｒを含む。
【００９７】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５ＤおよびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｒを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｋを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。
【００９８】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｅ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｄ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。
【００９９】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４５Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１２３ＣおよびＣＬ−２１４Ｓを含む。
【０１００】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、およびＣＨ１−１４５Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。
【０１０１】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、およびＣＬ−１７８Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８ＷおよびＣＬ−１３１Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｔ、ＣＨ１−１８８Ｗ、およびＣＬ−１３１Ｄを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、およびＣＬ−１３１Ｅを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｔ、ＣＨ１−１８８Ｗ、およびＣＬ−１３１Ｅを含む。
【０１０２】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７６Ｇ、およびＣＬ−１７８Ｇを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、およびＣＬ−１３３Ｍを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｔ、ＣＨ１−１８８Ｗ、およびＣＬ−１３３Ｍを含む。
【０１０３】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１９０Ｉ、ＣＬ−１３５Ｉ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６Ｃ、およびＣＬ−２１４Ｓを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｅ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｄ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｈ、ＣＨ１−１７９Ｅ、ＣＨ１−１８６Ｄ、およびＣＬ−１３１Ｈを含む。
【０１０４】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ−１８６Ｅ、ＣＬ−１３１Ｈ、ＣＨ−１４５Ｓ、ＣＨ１−１３９Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１１６ＣおよびＣＬ−２１４Ｓを含む。
【０１０５】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＨ１−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１７６ＣおよびＣＬ−２１４Ｓを含む。
【０１０６】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｍ、ＣＬ−１７８Ｇ、ＣＬ−１７６Ｇ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１２３Ｃ、およびＣＬ−２１４Ｓを含む。
【０１０７】
一部の態様では、第１のＣＨＣＬおよび／または第２のＣＨＣＬは、残基ＣＨ１−１４３Ｓ、ＣＬ−１３１Ｄ、ＣＨ１−１８８Ｗ、ＣＬ−１３３Ｓ、ＣＬ−１７８Ｓ、ＣＨ１−１２２Ｃ、ＣＨ−１３９Ｃ、ＣＨ−１７４Ｃ、ＣＨ１−２３０Ｓ、ＣＬ−１１６Ｃ、ＣＬ−１２３Ｃ、ＣＬ−１７６Ｃ、およびＣＬ−２１４Ｓを含む。
【０１０８】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号５と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号６と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号７と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号８と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。
【０１０９】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３３と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３４と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３５と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３６と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３７と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３８と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３９と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４０と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４１と同一の配列を含むＣＨ１ドメインを含む。
【０１１０】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号９と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１０と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１１と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１２と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。
【０１１１】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２４と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２５と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２６と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２７と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２８と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２９と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３０と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３１と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号３２と同一の配列を含むＣＬドメインを含む。
【０１１２】
ヘテロ二量体を生成するための抗体の定常ドメインへの修飾は、ＵＳ５７３１１６８、ＷＯ２００９０８９００４、およびＷＯ２０１１１４３５４５に開示されており、これらの内容のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれている。
【０１１３】
ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
一部の態様では、第１のＣＨ１は、第１のＣＨ２ドメイン（ＣＨ２）に接続されており、第２のＣＨ１は、第２のＣＨ２に接続されている。第１および第２のＣＨ２は、それぞれ、互いに異なるように改変されている、それぞれ第１および第２のＣＨ２突然変異残基を含み、互いに優先的に相互作用し、それによってＣＨ２ホモ二量体の形成に対して優先的にＣＨ２ヘテロ二量体を形成し得る。
【０１１４】
一部の態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、第１のＣＨ２領域および第２のＣＨ２領域をさらに含み、これらは、相互作用してＣＨ２界面を形成し、ＣＨ２界面内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体形成を不安定化し、ホモ二量体形成に対して静電気的に不都合でない。
【０１１５】
一部の態様では、第１のＣＨ１またはＣＨ２は、第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３）に接続されており、第２のＣＨ１またはＣＨ２は、第２のＣＨ３に接続されている。第１および第２のＣＨ３は、それぞれ、互いに異なるように改変されている、それぞれ第１および第２のＣＨ３突然変異残基を含み、互いに優先的に相互作用し、それによってＣＨ３ホモ二量体の形成に対して優先的にＣＨ３ヘテロ二量体を形成し得る。ヘテロ二量体形成を促進するために、両方のＣＨ３ドメイン中でＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つまたは複数の残基を荷電アミノ酸と置き換えることを伴う技法は、ＷＯ２００９／０８９００４にも記載されている。
【０１１６】
一部の態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域をさらに含み、これらは、相互作用してＣＨ３界面を形成し、ＣＨ３界面内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体形成を不安定化し、ホモ二量体形成に対して静電気的に不都合でない。一部の実施形態では、改変されたＣＨ３界面は、ホモ二量体形成に対してヘテロ二量体形成を立体的に優遇する。一部の実施形態では、改変されたＣＨ３界面は、ホモ二量体形成に対してヘテロ二量体形成を静電気的に優遇する。
【０１１７】
一部の実施形態では、第１のＣＨ３ポリペプチド中のアミノ酸修飾は、ＣＨ３−３９１におけるアミノ酸置換であり、第２のＣＨ３ポリペプチド中のアミノ酸修飾は、ＣＨ３−４４１におけるアミノ酸置換である（配列番号１８の番号付けによる）。一部の実施形態では、第１のＣＨ３ポリペプチド中のアミノ酸修飾は、ＣＨ３−４４１Ｒであり、第２のＣＨ３ポリペプチド中のアミノ酸修飾は、ＣＨ３−３９１ＥまたはＣＨ３−３９１Ｄである（より詳細については、ＷＯ２０１１／１４３５４５を参照）。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおいて、配列番号４２（ヒンジＩｇＧ１）のＣＨ２−Ｄ２３２位およびＣＨ２−Ｐ２４１位、または配列番号７９（ＩｇＧ２ヒンジ配列）のＣＨ２−Ｃ２３３位、ＣＨ２−Ｅ２３７位、およびＣＨ２−Ｐ２４１位において第１のヒンジ領域中にアミノ酸修飾をさらに含み、第１のヒンジ領域中の置換された／置き換えられたアミノ酸は、別のアームにおける第２のヒンジ領域中の対応するアミノ酸と反対電荷を有する（より詳細については、ＷＯ２０１１／１４３５４５を参照）。例えば、ヒンジ領域中のアミノ酸修飾は、ＣＨ２−Ｄ２３２Ｒ、ＣＨ２−Ｄ２３２Ｅ、ＣＨ２−Ｐ２４１Ｒ、および／またはＣＨ２−Ｐ２４１Ｅであり得る。別の例では、ヒンジ領域中のアミノ酸修飾は、ＣＨ２−Ｃ２３３Ｄ、ＣＨ２−Ｃ２３３Ｅ、ＣＨ２−Ｃ２３３Ｋ、ＣＨ２−Ｃ２２３Ｒ、ＣＨ２−Ｅ２３７Ｅ、ＣＨ２−Ｅ２３７Ｋ、ＣＨ２−Ｅ２３７Ｒ、ＣＨ２−Ｐ２４１Ｄ、ＣＨ２−Ｐ２４１Ｅ、ＣＨ２−Ｐ２４１Ｋ、および／またはＣＨ２−Ｐ２２８Ｒであり得る。一部の態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号８２、８３、８４、および８５からなる群から選択される。
【０１１８】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１３と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１４と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１５と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１６と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１７と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４５と同一の配列を含むＣＨ２ドメインを含む。
【０１１９】
一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１８と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号１９と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２０と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２１と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２２と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号２３と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４６と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４７と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４８と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、本発明は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％からなる群から選択される量で配列番号４９と同一の配列を含むＣＨ３ドメインを含む。
【０１２０】
一部の態様では、本発明は、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間にＩｇＧヒンジ領域をさらに含む。ＩｇＧヒンジ領域は、配列番号４２を含み得る。ＩｇＧヒンジ領域は、配列番号４３を含み得る。ＩｇＧヒンジ領域は、配列番号４４を含み得る。ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２ヒンジ領域である場合があり、配列番号７９を含み得る。
【０１２１】
Ｉｇアイソタイプおよびサブクラス
一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のＩｇＡドメインを含み得る。一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のＩｇＤドメインを含み得る。一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のＩｇＥドメインを含み得る。一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のＩｇＧドメインを含み得る。一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のＩｇＭドメインを含み得る。
【０１２２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＦａｂは、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＦａｂは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一部の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆａｂは、ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を含む。一部の実施形態では、第１および第２のＦａｂは、同じサブクラスである（すなわち、両方は、ＩｇＧ１であり、または両方は、ＩｇＧ２であり、または両方は、ＩｇＧ３であり、または両方は、ＩｇＧ４である）。
【０１２３】
代替の実施形態では、第１のＦａｂは、第２のＦａｂと異なるサブクラスのものである（すなわち、第１のＦａｂおよび第２のＦａｂは、それぞれ異なるサブクラスのものであってもよく、それぞれは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２からなる群から選択され得る）。例えば、本発明の抗体は、１つの抗体サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２からなる群から選択される）に由来する第１のＦａｂ、ならびに異なるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２からなる群から選択され、ただし第２のＦａｂは、第１のＦａｂと異なるサブクラスのものである）に由来する第２のＦａｂ、ならびに単一抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２からなる群から選択される）に由来する第１および第２のＣＨ２ドメインならびに第１および第２のＣＨ３ドメインを含み得る。
【０１２４】
本発明の別の態様では、本明細書に記載の抗体またはそのＦａｂ領域（例えば、二重特異性抗体）は、全長のヒト抗体を含み、抗体またはそのＦａｂの第１の抗体可変ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置したエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合することができる。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。
【０１２５】
脈絡によって別段に示されている場合を除いて、用語「第１の」および「第２の」、ならびにこれらのバリエーションは、単に一般的な識別子であり、具体的なまたは特定のＣＨ１、ＣＬ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＦａｂを同定すると解釈されるべきでない。
【０１２６】
本発明の別の態様では、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／５２９７６号および同第ＷＯ００／３４３１７号に記載されたものなどの公知の技法を使用して、対象に投与した後の免疫原性を低減するために脱免疫化され得る。
【０１２７】
他の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、別のポリペプチドまたは分子剤に連結された、ヘテロ二量体ポリペプチド、例えば、本明細書に開示の二重特異性抗体のすべてまたは一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンを作製するなどによって修飾または誘導体化され得る。本明細書に開示のヘテロ多量体、例えば、ヘテロ二量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）は、より安定な融合分子を生成することによって、かつ／または「ＰＥＧ化」と一般に呼ばれるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性ポリマーを用いた処置によって、またはいくつかの当技術分野で周知の他の改変方法のいずれかによって、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために修飾または誘導体化され得る。
【０１２８】
ヘテロ二量体タンパク質は、周知の技法を使用して、それだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、エステル、炭水化物基などを含めた化学基を用いて誘導体化され得る。これらの化学基（およびｉｎ  ｖｉｖｏで安定性治療化合物に使用されてきたこれらと同様の他の基）は、ヘテロ二量体ポリペプチドの生物学的特性を改善する、例えば、血清半減期および生物活性を増大させるのに有用である。
【０１２９】
ヘテロ二量体タンパク質は、多数の当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して標識することもできる。本明細書において、用語「標識」または「標識された」は、抗体中の別の分子の組込みを指す。一実施形態では、標識は、検出可能マーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的方法もしくは比色法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。別の実施形態では、標識またはマーカーは、治療剤、例えば、薬物コンジュゲートまたは毒素であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例としては、それだけに限らないが、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または同族体がある。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって付着されている。
【０１３０】
本発明のポリペプチドおよびヘテロ二量体タンパク質を生成する核酸および方法
一部の実施形態では、異なる核酸分子が、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の１つまたは複数の鎖または部分をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質をコードする。
【０１３１】
一態様では、本発明は、上述した本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質の鎖の１つ、またはその部分をコードする核酸配列を提供する。本発明の核酸分子としては、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、例えば、本発明の核酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ超同一のものなどがある。
【０１３２】
一部の態様では、核酸は、ＤＮＡである。一部の態様では、核酸は、ＲＮＡである。一部の態様では、核酸は、ｍＲＮＡである。一部の態様では、核酸は、非天然核酸、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、およびロックされた核酸など、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸である。
【０１３３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示のヘテロ多量体もしくはヘテロ二量体タンパク質の鎖もしくは部分の１つもしくは複数、または本明細書に記載のその部分をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【０１３４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質の鎖もしくは部分の１つもしくは複数、または本明細書に記載のその部分を発現させるのに適したベクターを提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明の核酸分子は、特定のアミノ酸配列、例えば、ヒンジおよび定常重鎖ドメイン配列などの中の特異的抗体配列のためのプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される。例えば、核酸は、診断法におけるプローブとして、またはとりわけ、有用な配列をコードする追加の核酸分子を単離するのに使用され得るＤＮＡの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖のヒンジおよび定常ドメイン領域に由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明のヘテロ二量体ポリペプチド、例えば、二重特異性抗体、またはこれらの断片の修飾されたＦａｂ領域の１つまたは複数のすべてまたは一部をコードする。
【０１３６】
本発明の組換え発現ベクターは、一部の実施形態では、宿主細胞内の抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持し得る。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることが当業者によって察知されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現についての好適な調節配列としては、哺乳動物細胞内で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、ポリオーマ、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば、天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどがある。
【０１３７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などを担持し得る。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。例えば、選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ−宿主細胞内で使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
【０１３８】
用語「発現制御配列」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列であって、これらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを行うのに必要である、ポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望まれる場合、タンパク質分泌を増強する配列がある。このような制御配列の特質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み；真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに本質的であるすべてのコンポーネントを含むように意図されており、その存在が有利である追加のコンポーネント、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【０１３９】
一部の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのＣＨ１またはＣＬをコードする核酸を含む。本発明はさらに、本発明のＦａｂをコードする核酸を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の第１のＦａｂをコードする核酸を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の第２のＦａｂをコードする核酸を提供する。
【０１４０】
一部の態様では、本発明は、本発明の第１の重鎖をコードする核酸を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の第２の重鎖をコードする核酸を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の第１の軽鎖をコードする核酸を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の第２の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【０１４１】
一部の態様では、本発明は、本発明のベクターを含む細胞を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の核酸を含む細胞を提供する。一部の態様では、本発明は、本発明の核酸を発現する細胞を提供する。
【０１４２】
有利には、本発明は、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞を提供する。同じ細胞内での第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬの同時発現は、ヘテロ多量体タンパク質の正しい形成を可能にする相補的残基セットを利用する。一部の態様では、これは、二重特異性抗体が完全にアセンブルされた形態で発現および生成されることを可能にし、モノクローナル抗体の精製に典型的には要求されるものに対して皆無かそれに近い追加の精製またはプロセシングステップを必要とする。
【０１４３】
一部の態様では、本発明の二重特異性抗体は、ｍＲＮＡ補充療法またはＲＮＡ転写物療法で使用され得る。したがって、一部の態様では、本発明は、本発明の１種または複数のポリペプチド鎖をコードする１種または複数の核酸を含む細胞またはベクターを含み、その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のポリペプチド鎖が発現されると、ｉｎ  ｖｉｖｏで二重特異性抗体が生成される。このようなベクターの送達機構としては、脂質ベースシステムおよびナノ粒子がある（例えば、その内容のそれぞれが完全に組み込まれているＷＯ２０１００５３５７２、ＷＯ２０１２１７０９３０、およびＷＯ２０１１０６８８１０を参照）。
【０１４４】
一部の態様では、本発明は、核酸を含めた生物学的活性剤の投与に関連して使用することができる標準的な薬学的担体、希釈剤、賦形剤などのいずれかとして本明細書で定義される移動ビヒクル（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｈｉｃｌｅ）をさらに含む。本明細書に記載の組成物、特に、移動ビヒクルは、本発明の核酸を標的細胞に送達することができる。一部の実施形態では、移動ビヒクルは、ｍＲＮＡを標的細胞に移動させるのに適した脂質ナノ粒子である。
【０１４５】
一部の態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードするｍＲＮＡ、移動ビヒクルを含み、かつ標的細胞との接触、および後続のそのトランスフェクションを促進する作用物質を含んでもよい。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明の１種または複数のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡに安定性を付与する（例えば、野生型または天然バージョンのｍＲＮＡと比較して）１つまたは複数の修飾を含むことができる。例えば、本発明の核酸は、５’および３’非翻訳領域の一方または両方への修飾を含み得る。このような修飾として、それだけに限らないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期１（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  １）（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、ポリＡ尾部、Ｃａｐｌ構造、またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列を含めることを挙げることができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ免疫原性を減少させるように修飾される。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、これらをより安定にするために化学的または生物学的修飾を受けている。ｍＲＮＡへの例示的な修飾としては、塩基の枯渇（例えば、欠失、もしくは１つのヌクレオチドの別のものへの置換による）、または塩基の修飾、例えば、塩基の化学修飾がある。一部の態様では、ポリＡ尾部をｍＲＮＡ分子に付加し、こうしてｍＲＮＡをより安定にすることができる。
【０１４８】
一部の態様では、本発明の組成物における移動ビヒクルは、リポソーム移動ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子である。移動ビヒクルは、ｍＲＮＡの標的細胞への送達を最適にするように選択および／または調製され得る。例えば、標的細胞が肝実質細胞である場合、移動ビヒクルの性質（例えば、サイズ、電荷、および／またはｐＨ）を、このような移動ビヒクルを標的細胞に有効に送達し、免疫クリアランスを低減し、かつ／またはその標的細胞内での保持を促進するように最適化することができる。代わりに、標的細胞が中枢神経系である場合（例えば、神経変性疾患を処置するために投与されるｍＲＮＡは、脳または脊髄組織を特異的に標的にし得る）、移動ビヒクルの選択ならびに調製は、血液脳関門の侵入、およびその中での保持、ならびに／またはこのような移動ビヒクルをこのような標的細胞に直接送達する代替手段の使用を考慮しなければならない。一部の態様では、本発明の組成物は、外因性ｍＲＮＡの移動を促進する作用物質（例えば、血液脳関門の浸透性を破壊または改善し、それによって外因性ｍＲＮＡの標的細胞への移動を増強する作用物質）と組み合わせてもよい。
【０１４９】
核酸の標的細胞への送達を促進するためのリポソーム移動ビヒクルの使用は、本発明によって企図されている。一部の態様では、移動ビヒクルは、脂質ナノ粒子として製剤化される。適当な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）がある。単独での、または他の移動ビヒクルと組み合わせた移動ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図されている。適当なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、およびポリエチレンイミンを挙げることができる。
【０１５０】
本発明は、タンパク質産生のためのデポーとして作用する、カプセル化し、かつ／またはｍＲＮＡの標的細胞への送達を増強するためのカチオン性脂質を含む移動ビヒクルとしての脂質ナノ粒子の使用を企図する。本明細書において、語句「カチオン性脂質」は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有し得るいくつかの脂質種のいずれかを指す。
【０１５１】
一態様では、本発明は、抗体の１つまたは複数のＦａｂ領域の軽鎖と重鎖との間の界面を変更または改変することによって、二重特異性抗体の形成を増強するためのストラテジーを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＦａｂ領域のＣＨ１／ＣＬ界面を構成する１つまたは複数の残基は、修飾された残基が、タンパク質中の他のＦａｂ領域の重鎖または軽鎖との誤対合に対して、修飾されたＦａｂ領域の特定の重鎖および軽鎖の対合を優遇するような残基と置き換えられる。一実施形態では、修飾により、Ｆａｂ領域中に新規のジスルフィド架橋が導入される。別の実施形態では、修飾により、Ｆａｂ領域のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の天然界面を破壊する破壊突然変異、および界面で非天然安定相互作用を導入する復帰修飾（ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が導入される。別の実施形態では、破壊突然変異は、新規のジスルフィド架橋ならびに破壊および復帰突然変異の両方を導入する場合がある。
【０１５２】
一部の実施形態では、本明細書に開示の１つまたは複数のＦａｂ領域のＣＨ１／ＣＬ界面中に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を含まない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して、実質的に増大する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＦａｂ領域のＣＨ１／ＣＬ界面中に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を含まない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して、少なくとも約５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％増大のいずれかである。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、本発明のヘテロ多量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質を生成する方法も提供する。一部の実施形態では、本方法は、
ａ）細胞株に、タンパク質の各Ｆａｂ領域の各重鎖および各軽鎖を発現するベクターをコトランスフェクトするステップと；
ｂ）タンパク質の各Ｆａｂ領域の各重鎖および各軽鎖を発現させる、かつヘテロ多量体タンパク質をアセンブルするのを可能にする条件下で細胞株を培養するステップと；
ｃ）細胞培養液からヘテロ多量体タンパク質を精製するステップとを含む。一部の実施形態では、細胞株に、各Ｆａｂ領域の重鎖および軽鎖を１：１：１：１の比で発現するベクターがコトランスフェクトされる。
【０１５４】
一部の実施形態では、本方法は、
（ｉ）細胞株に、第１のＣＨＣＬの第１のＣＨ１、第１のＣＬ、ならびに第２のＣＨＣＬの第２のＣＨ１および第２のＣＬを発現する１種または複数のベクターをコトランスフェクトするステップと；
（ｉｉ）１種または複数のベクターを発現させる、かつ第１のＣＨＣＬおよび第２のＣＨＣＬをアセンブルするのを可能にする条件下で細胞株を培養するステップと；
（ｉｉｉ）細胞培養液からヘテロ多量体タンパク質を精製するステップとを含む。
【０１５５】
一部の態様では、細胞株に、第１のＣＨ１、第１のＣＬ、第２のＣＨ１、および第２のＣＬを１：１：１：１の比で発現するベクターがコトランスフェクトされる。
【０１５６】
当業者は、本明細書に開示の方法に従って使用するための分子または抗体の相対量を、周知の技法を使用して容易に判定することができる。
【０１５７】
本明細書に開示の方法では、インキュベーションは、ある範囲の温度にわたって実施され得る。このような温度は、当業者によって認識されることになり、例えば、混合された分子または抗体中で変性または分解などの有害な物理的変化が起こらないインキュベーション温度を含むことになる。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、約３７℃で実施される。
【０１５８】
いくつかの宿主細胞のいずれも、本発明の方法において使用され得る。このような細胞は、当技術分野で公知であり（これらのいくつかは、本明細書に記載されている）、または当技術分野で公知の慣例的技術を使用して本発明の方法において使用するための適性に関して経験的に判定することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性菌細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性プロテアーゼ活性が欠乏した系統のものである。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の遺伝子型は、ｄｅｇＰおよびｐｒｃ遺伝子を欠き、突然変異体ｓｐｒ遺伝子を宿す。本発明の他の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１５９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、宿主細胞内でのその発現が本発明の二重特異性抗体またはヘテロ二量体タンパク質の収率を高める分子をコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターを宿主細胞内で発現させることをさらに含む。例えば、このような分子は、シャペロンタンパク質であり得る。一実施形態では、前記分子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ、およびＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドである。これらの方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣの両方をコードする。
【０１６０】
一態様では、本発明は、本発明の抗体またはこれらの部分の組換え発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。このような組換え宿主細胞内のこのような組換え発現によって産生される抗体は、「組換え抗体」と本明細書で呼ばれる。本発明は、このような宿主細胞の子孫細胞、およびそれによって産生される抗体も提供する。用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において、中に組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。ある特定の修飾が突然変異または環境的な影響に起因して世代を継いでいく中で起こり得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書において用語「宿主細胞」の射程内に依然として含まれる。このような細胞は、上述した本発明によるベクターを含み得る。
【０１６１】
別の態様では、本発明は、上述した抗体またはその部分を作製するための方法を提供する。一実施形態によれば、前記方法は、上述したベクターをトランスフェクトされた、またはそれで形質転換された細胞を培養することと、前記抗体またはその部分を抽出することとを含む。抗体をコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適当な哺乳動物、植物、細菌、または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の公知の方法によるものであり得る。非相同ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当技術分野で周知であり、これらとしては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセル化、およびＤＮＡの核内への直接のマイクロインジェクションがある。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入されてもよい。細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号を参照。植物細胞を形質転換する方法は、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注射、電気穿孔、およびウイルス形質転換を含めて、当技術分野で周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も、当技術分野で周知である。
【０１６２】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、これらとしては、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株がある。これらとして、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを判定することにより選択される。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が増殖されている培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培地から回収することができる。適当な植物宿主細胞として、例えば、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモを挙げることができる。適当な細菌宿主細胞として、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種を挙げることができる。適当な酵母宿主細胞として、例えば、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を挙げることができる。
【０１６３】
産生細胞株からの本発明のポリペプチドまたはこれらの部分の発現は、いくつかの公知の技法を使用して増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある特定の条件下で発現を増強するための一般的な手法である。ＧＳ系は、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７、およびＥＰ０３３８８４１に関連して全体または一部において論じられている。
【０１６４】
ＦｃポリペプチドまたはＦｃ領域を含むポリペプチドおよび免疫グロブリン様ヒンジポリペプチド、例えば、異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物内で発現される抗体などは、これらのグリコシル化パターンにおいて互いに異なることになる可能性が高い。免疫グロブリン様ヒンジ配列を含むポリペプチドのすべてのヘテロ二量体、二重特異性ポリペプチド、抗体などを含めた本発明のポリペプチドのすべてのこのような「糖型」は、これらのグリコシル化状態にかかわらず、かつより一般に、任意の翻訳後修飾の存在または非存在にかかわらず本発明の一部であると見なされる。
【０１６５】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、抗体、マキシボディ、モノボディ、ペプチボディ、Ｆｃ融合タンパク質、または上記のいずれかのＦａｂ領域である。一部の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、二重特異性抗体である。
【０１６６】
そのヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のヒトドメインを含み得る。ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のヒト化Ｉｇドメインを含み得る。ヘテロ二量体タンパク質は、１つまたは複数のマウスＩｇドメインを含み得る。ヘテロ二量体タンパク質は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリ、およびサメからなる群から選択される種に由来する１つまたは複数のＩｇドメインを含み得る。
【０１６７】
一部の態様では、本発明の抗体は、起源が哺乳動物、トリ、またはツノザメ（Ｓｑｕａｌｉｆｏｒｍ）である（任意の人工的に突然変異された、または別段に改変されたバージョンを生成するのに使用される方法にかかわらず）。哺乳動物、トリ、またはツノザメ種は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマ、ラクダ、ラマ、霊長類、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、またはアブラツノザメであり得る。本発明の抗体は、ヒト化であり得る。
【０１６８】
一部の態様では、本発明は、突然変異抗体およびこれらの部分を含み、突然変異体は、その天然のカノニカル配列以外の配列に改変または変更された配列として定義され、その結果、本発明のポリペプチドのある特定の実施形態は、定義の射程内に入る天然に存在する配列を特に除外する。したがって、一部の態様では、本発明は、Ｉｇドメインポリペプチド配列がその天然に存在する対応する配列と異なるようにヘテロ二量体Ｉｇドメイン対合を可能にするための突然変異を含む本発明のポリペプチドに関する。
【０１６９】
抗体ＣＨ１ドメインは、ＣＨα１、ＣＨδ１、ＣＨε１、ＣＨγ１、およびＣＨμ１からなる群から選択され得る。
【０１７０】
一部の態様では、本発明の定常軽鎖（ＣＬ）ドメインは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続されている。まとめると、これらは、抗体軽鎖を含み得る。ＣＬドメインは、ＣＬκ（定常軽鎖カッパ）であり得る。ＣＬドメインは、ＣＬλ（定常軽鎖ラムダ）であり得る。
【０１７１】
一部の態様では、本発明のＣＨ１ドメインは、可変重鎖（ＶＨ）ドメインに接続されている。まとめると、これらは、Ｆａｂ分子の重鎖部分を含み得る。一部の態様では、ＶＨおよびＣＨ１ドメインは、その特定のＩｇアイソタイプに典型的なＣＨドメインの残りに接続されている（すなわち、ＣＨα１は、ＣＨα２およびＣＨα３に接続されている場合があり；ＣＨδ１は、ＣＨδ２およびＣＨδ３に接続されている場合があり；ＣＨε１は、ＣＨε２、ＣＨε３およびＣＨε４に接続されている場合があり；ＣＨγ１は、ＣＨγ２およびＣＨγ３に接続されている場合があり；ＣＨμ１は、ＣＨμ２、ＣＨμ３、およびＣＨμ４に接続されている場合がある）。
【０１７２】
一部の態様では、本発明は、本発明の抗体を組換え産生する単離宿主細胞を提供する。本発明は、本発明のタンパク質、ドメイン、および抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の態様では、本発明は、抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質を生成する方法であって、抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質の産生をもたらす条件下で宿主細胞を培養することと、宿主細胞または培養液から抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質を単離することとを含む、方法を提供する。
【０１７３】
本発明は、ヘテロ多量体複合分子、より好ましくは、例えば、二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質を生成するための改良法、組成物、キット、および製造品を提供する。本発明は、生物学的治療薬の商業的生産に望ましい収率および純度でヘテロ多量体複合分子を作製および精製する方法を提供する。本発明は、ひいては多重特異性抗体の使用が望ましい、かつ／または要求される様々な障害または状態を診断および／または処置するのに使用することができる複合分子の効率的な生成を可能にする。本発明の方法、組成物、キット、および製造品の詳細は、本明細書に提供されている。
【０１７４】
本発明のタンパク質を使用する方法
本発明は、本発明のタンパク質のための様々な治療用途も提供する。一態様では、本発明のタンパク質は、第１のタンパク質（例えば、第１のヒト抗体可変ドメイン）をエフェクター抗原に結合することによって、かつ第２のタンパク質（例えば、第２のヒト抗体可変ドメイン）を標的抗原に結合することによって様々な疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、またはウイルス感染症）を処置するのに使用することができる。例えば、本発明のタンパク質は、細胞傷害性を向け直し、血栓溶解剤を血餅に送達するため、免疫毒素を腫瘍細胞に送達するため、または標的部位（例えば、腫瘍）で酵素活性化プロドラッグを変換するために使用することができる。
【０１７５】
別の態様では、本発明のタンパク質は、治療剤の特異性を増大させ、かつ／または相乗的もしくは相加的な経路（例えば、代謝経路もしくは生化学的経路）をモジュレートするのに使用することができる。例えば、本発明のタンパク質は、受容体／受容体、受容体／リガンド、リガンド／リガンド、細胞／細胞、リガンド／ペイロード、受容体／ペイロード、または単一受容体を噛み合わせることができる。
【０１７６】
医薬組成物
本発明は、本発明のタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書において、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性である任意かつすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容できる担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せの１種または複数を含み、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムを含んでもよく、抗体または抗体部分の保存可能期間または有効性を増強する薬学的に許容できる物質、例えば、湿潤量または少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝液などを含み得る。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、中性形態（双性イオン形態を含む）で、または正もしくは負に荷電した種として存在し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対イオンと複合体形成して「薬学的に許容できる塩」を形成する場合があり、この塩は、１種または複数のポリペプチドおよび１種または複数の対イオンを含む複合体を指し、この場合、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０１７８】
本発明の組成物は、様々な形態で存在し得る。これらとしては、例えば、液体、半固体、および固形剤形、例えば、溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、および坐剤などがある。好適な形態は、意図される投与モードおよび治療用途に依存する。典型的な好適な組成物は、一般に抗体を用いたヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物などの注射用または注入用溶液の形態で存在する。好適な投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好適な実施形態では、本発明のタンパク質は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好適な実施形態では、本発明のタンパク質は、筋肉内または皮下注射によって投与される。
【０１７９】
医薬組成物は、別のコンポーネント、例えば、抗腫瘍剤またはイメージング試薬などをさらに含み得る。本発明の別の態様は、本発明の抗体、およびこれらの抗体を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または医薬組成物に加えて、診断剤または治療剤を含み得る。キットは、診断法または治療法で使用するための指示書も含み得る。一部の実施形態では、キットは、抗体またはその医薬組成物、および診断剤を含む。他の実施形態では、キットは、抗体またはその医薬組成物、および１種または複数の治療剤、例えば、追加の抗新生物剤、抗腫瘍剤、または化学療法剤などを含む。
【０１８０】
本発明のこれらの作用物質および化合物は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および繰り返しは、特定の個体およびその個体の医療歴に依存することになる。
【０１８１】
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸など；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくはＩｇなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含み得る。
【０１８２】
本発明の化合物を含有するリポソームは、ＵＳ４４８５０４５およびＵＳ４５４４５４５に記載されているものなどの当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、ＵＳ５０１３５５６に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、規定された孔サイズのフィルターに通して押出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【０１８３】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入することもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
【０１８４】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の適当な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えば、膜またはマイクロカプセルの形態で存在する。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（ＵＳ３７７３９１９）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩から構成される注射用ミクロスフェア）など、スクロースアセテートイソブチレート、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
【０１８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。本発明の治療化合物は、一般に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
【０１８６】
本発明の例示的な限定されない医薬組成物は、約５．０〜約６．５の範囲であるｐＨを有し、本発明のヘテロ二量体タンパク質を含む約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの組成物、約１ミリモル〜約１００ミリモルのヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロース、および約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む滅菌水溶液としての製剤である。
【０１８７】
適当なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などを使用して調製され得る。活性成分は、予備混合エマルジョン組成物中に溶解させてもよく、または代わりにこれは、油（例えば、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、または扁桃油）、およびリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、またはダイズレシチン）と水を混合すると形成されるエマルジョン中に溶解させてもよい。エマルジョンの張性を調整するために他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが察知されるであろう。適当なエマルジョンは、典型的には、最大で２０％の油、例えば、５から２０％の間の油を含有することになる。脂肪エマルジョンは、０．１から１．０μｍ、特に０．１から０．５μｍの間の脂肪滴を含み、５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有することができる。
【０１８８】
エマルジョン組成物は、本発明の化合物をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはそのコンポーネント（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものであり得る。
【０１８９】
吸入またはガス注入用組成物としては、薬学的に許容できる水性もしくは有機溶媒、またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末がある。液体または固体組成物は、上記に示した適当な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所的または全身的な効果のために経口または鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは滅菌した薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、ガスを使用することによって霧状化される場合がある。霧状化された溶液は、噴霧器から直接呼吸されてもよく、または噴霧器をフェイスマスク、テント、または間欠的陽圧呼吸機に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、好ましくは、適切な様式で製剤を送達するデバイスから経口的または経鼻的に投与され得る。
【０１９０】
本発明の化合物および組成物は、関連した適応症について確立された処置とともに使用され得る。
【０１９１】
本発明の治療法
治療法も本発明によって提供されている。治療法は、本発明の化合物または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１９２】
本明細書において、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果に影響するのに十分な量である。予防的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、疾患、その合併症、および疾患の発症中に存在する中間病理学的表現型の生化学的な、組織学的な、および／または行動性の症状を含めた疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の緩和、または始まりの遅延がある。治療的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、臨床結果、例えば、腫瘍の腫瘍サイズ、伝播、血管系、またはがんもしくは血管新生の増大と関連した他の疾患の１つもしくは複数の症状の低減、疾患を処置するのに要求される他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の効果の増強、および／あるいは患者の疾患の進行の遅延などがある。有効投与量は、１回または複数の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的に予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されているように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物とともに実現されてもよく、または実現されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１種または複数の治療剤の投与との関連で考慮される場合があり、単剤は、１種または複数の他の作用物質と併せて、望ましい結果が実現され得る、または実現されている場合、有効量で与えられていると見なすことができる。
【０１９３】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物として、それだけに限らないが、家畜、競技動物、ペット、霊長類、およびウマも挙げられる。
【０１９４】
ヒト対象への投与に関して、本発明の抗体の合計の毎月の用量は、典型的には、投与モードに応じて、患者１人当たり約０．５〜約１２００ｍｇの範囲内である。例えば、静脈内の毎月の用量は、約１〜約１０００ｍｇ／患者を必要とし得る。合計の毎月の用量は、単回または分割用量で投与することができ、医師の自由裁量で、本明細書に示した典型的な範囲外に入ってもよい。
【０１９５】
本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体またはその部分の治療有効量または予防有効量の例示的な限定されない範囲は、約１〜約１０００ｍｇ／患者／月である。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、約１〜約２００または約１〜約１５０ｍｇ／患者／月で投与され得る。
【０１９６】
本発明における方法による本発明の化合物の投与は、例えば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的または予防的であるか否か、および熟練した専門家に公知の他の要因に応じて連続的または断続的であり得る。本発明の化合物の投与は、予め選択された時間にわたって本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔を置いた投薬であってもよい。
【０１９７】
抗体
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域に位置した少なくとも１つの抗原結合部位を通じて標的または抗原、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。
【０１９８】
本明細書において、脈絡によって別段に示されていない限り、この用語は、２つの同一の全長重鎖ポリペプチドおよび２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含むインタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、サメおよびラクダ抗体を含めた単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（ｄＡｂ）、ならびに抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体が所望の生物活性を呈する限り二重特異性抗体）、ならびに本明細書に記載の抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成、例えば、限定することなく、ミニボディ、マキシボディ、モノボディ、ペプチボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖも包含するように意図されている。
【０１９９】
抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法、またはインタクト抗体の酵素もしくは化学切断によって生成され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分であるＩｇの少なくとも一部を含有するポリペプチドがある。
【０２００】
免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインは、典型的には２つのβ−シート中に配置された７β−鎖と９β−鎖との間の２層サンドイッチからなる（しかし、これらの配置のバリエーションが公知である）、一タイプのタンパク質ドメインである。β−鎖は、ほとんど完全に伸長したコンホメーションにある骨格を伴った典型的には３〜１０アミノ酸の長さのポリペプチド鎖のストレッチである。βシートは、少なくとも２または３つの骨格水素結合によって横方向に接続されたβ−鎖からなり、一般にねじれた、ひだ状のシートを形成している。鎖の骨格は、シート中のその２本の反対の隣接する鎖との相互作用間で、またはシートの縁部の鎖のシートと非シートの相互作用間で繰り返して切り替わる。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーは、異なる機能の数百のタンパク質中に見つかる。例としては、抗体、巨大筋肉キナーゼタイチン、および受容体チロシンキナーゼがある。Ｉｇ様ドメインは、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−リガンド相互作用に関与している場合がある。
【０２０１】
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ヘテロ多量体分子である。天然に存在するＩｇでは、各多量体は、ポリペプチド鎖の同一の対から主に構成され、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。
【０２０２】
各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭとして抗体のアイソタイプを定義する。これらのクラスのいくつかは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに細分される場合がある。
【０２０３】
軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれ超のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合されており、重鎖は、さらに約１０アミノ酸の「Ｄ」領域も含む（抗体配列全体との関連で、ＤおよびＪ領域は、これらが接合された後に可変領域の一部として時に見なされる）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトなＩｇが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【０２０４】
抗体分子中の各ドメインは、圧縮された逆平行のβ−バレル中に互いにしっかりと詰められた２つのβ−シートという同様の構造を有する。この保存された構造は、免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドと呼ばれる。定常ドメインのＩｇフォールドは、互いに詰められた２つのβシートを含有し、各鎖は、連続したポリペプチドストリング（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｔｒｉｎｇ）によって分離されている。これらの連続したポリペプチドストリングは、典型的には、α−ヘリックス、ループ、ターン、およびβ−ヘアピンと呼ばれる２つのβ−シート間の短い、鋭いターンを含む。
【０２０５】
可変ドメインは、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接合された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を呈する。各対の２本の鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
【０２０６】
ＣＤＲを構成する特定の抗体中のアミノ酸残基の同一性は、当技術分野で周知の方法を使用して判定することができる。例えば、抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、公衆衛生局、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）によって最初に定義された超可変領域として同定され得る。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３）によって記載された構造的ループ構造として同定される場合もある。ＣＤＲ同定の他の手法は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の妥協案であり、Ａｂｙｓｉｓプログラム（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）から導出される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に示された観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」がある。Ｎｏｒｔｈは、ＣＤＲ定義の異なる好適なセット使用してカノニカルＣＤＲコンホメーションを同定した（Ｎｏｒｔｈら、２０１１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、４０６：２２８〜２５６）。ＣＤＲの「コンホメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定され得る（Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６）。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わないが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになり、それでも、これらは、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しくインパクトを与えないという予測または実験の知見を踏まえて短く、または長くされ得る。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態に関して、ＣＤＲ（または抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｎｏｒｔｈ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義され得る。
【０２０７】
明示的に、または脈絡によって別段に示されている場合を除いて、本明細書に記載のすべてのＣＨ１残基番号付け位置は、配列番号１の番号付けに従い、すべてのＣＬ残基位置は、配列番号９の番号付けに従って本明細書に記載されている。この番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けに最も厳密に関連し、これは、（ａ）ある特定の実験データが、Ｋａｂａｔが誤っていると示したＩｇＭドメインなどの場合において、（ｂ）Ｋａｂａｔの参照が内部で矛盾しているとき、または（ｃ）別段に言及されているときを除いて本明細書で使用される。元のＫａｂａｔ参照では、１０７Ａ位がＣＬの第１の残基である。多くの軽鎖配列は、１０７Ａ位に割り当てられる任意の残基を有さず、多くは、１０８位にも残基を有さない。ＣＬの第１の残基は、それが何であっても１０７超に番号付けられた第１の残基である。
【０２０８】
ＣＨ１ドメインは、好ましくは長さが少なくとも８０残基であり、その残基の８５％超を配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１の１つまたは複数と共通して有するタンパク質配列の領域である。一部の態様では、ＣＨ１ドメインは、その残基の８５％超を配列番号１と共通して有するタンパク質配列である。
【０２０９】
ＣＨ２ドメインは、好ましくは長さが少なくとも８０残基であり、その残基の８５％超を配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号４５の１つまたは複数と共通して有するタンパク質配列の領域である。一部の態様では、ＣＨ２ドメインは、その残基の８５％超を配列番号１３と共通して有するタンパク質配列である。
【０２１０】
ヒンジ領域は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号８１の１つまたは複数と８０％超の同一性を有するタンパク質配列の領域である。一部の態様では、ヒンジ領域は、その残基の８０％超を配列番号４２と共通して有するタンパク質配列である。
【０２１１】
ＣＨ３ドメインは、好ましくは長さが少なくとも８０残基であり、その残基の８５％超を配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、または配列番号４９の１つまたは複数と共通して有するタンパク質配列の領域である。一部の態様では、ＣＨ３ドメインは、その残基の８５％超を配列番号１８と共通して有するタンパク質配列である。
【０２１２】
ＣＬドメインは、好ましくは長さが少なくとも８０残基であり、その残基の８５％超を配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２の１つまたは複数と共通して有するタンパク質配列の領域である。一部の態様では、ＣＬドメインは、ＣＬカッパドメインであり、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の１つまたは複数と少なくとも８５％の同一性を共有する。一部の態様では、ＣＬドメインは、ＣＬラムダドメインであり、配列番号１２と少なくとも８５％の同一性を共有する。一部の態様では、ＣＬドメインは、その残基の８５％超を配列番号９と共通して有するタンパク質配列である。
【０２１３】
哺乳動物の軽鎖は、２つのタイプ、κおよびλのものであり、任意の所与の天然に存在する抗体分子では、ただ１つのタイプが存在する。λ分子のおよそ２倍多くのκがヒトにおいて産生されるが、他の哺乳動物では、この比は変動し得る。各遊離軽鎖分子は、定常および可変領域ドメインを形成するように折り畳まれている単一ポリペプチド鎖中におよそ２２０アミノ酸を含有する。
【０２１４】
Ｂ細胞発生中に、ＤＮＡレベルでの組換え事象により、単一可変（Ｖ）セグメントが接合（Ｊ）セグメントと接合され；定常（Ｃ）セグメントは、ＲＮＡレベルでのスプライシングによって後に接合される。多くの異なるＶセグメントのいくつかのＪセグメントとの組換えは、広範囲の抗原認識をもたらす。追加の多様性は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるヌクレオチドのランダムな付加から生じる接合多様性によって、かつ脾臓およびリンパ節内のＢ細胞成熟中に起こる体細胞超変異によって達成される。定常カッパ（ＣＬκ）領域は、単一遺伝子によってコードされ、一方、ラムダ定常（ＣＬλ）領域は、複数の遺伝子によってコードされ、スプライシングを受ける。ＣＬλの特定の多型種と関連したいくつかのマーカーが公知である：例えば、ＩｇＣＬλ１（Ｍｃｇマーカー）；ＩｇＬＣ２−ＩｇＣＬλ２（Ｋｅｒｎ−Ｏｚ−マーカー）；ＩｇＣＬλ３（Ｋｅｒｎ−Ｏｚ＋マーカー）、およびＩｇＣＬλ７。当業者は、ヒトＣＬλ鎖においてこれまで同定された多型のすべてを容易に確認することができる。本発明の配列は、ＣＬκおよびＣＬλ、ならびに一般に抗体の他の公知の多型を包含する。２つの多型遺伝子座がＣＬκにおいて同定されている；ＣＬκ−Ｖ／Ａ１５３およびＣＬκ−Ｌ／Ｖ１９１。これまで同定された３つの多型は、Ｋｍ（１）：ＣＬκ−Ｖ１５３／Ｌ１９１；Ｋｍ（１，２）：ＣＬκ−Ａ１５３／Ｌ１９１；およびＫｍ（３）：ＣＬκ−Ａ１５３／Ｖ１９１である。
【０２１５】
用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクト抗体のパパイン消化によって入手可能であるものである。Ｆｃ領域は、天然またはバリアントＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ配列は一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ４ドメインを含んでもよい。用語「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を構成するポリペプチドの１つを指すのに本明細書で使用される。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、様々なＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つ、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭなど、任意の適当な免疫グロブリンから得ることができ、またはそれに由来し得る。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部またはすべてを含む（一般にそのＮ末端において）。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列を含まない。Ｆｃポリペプチドは、天然またはバリアントＦｃ配列を含み得る。
【０２１６】
「免疫グロブリン様ヒンジ領域」、「免疫グロブリン様ヒンジ配列」、およびそのバリエーションは、本明細書において、免疫グロブリン様または抗体様分子（例えば、イムノアドヘシン）のヒンジ領域およびヒンジ配列を指す。一部の実施形態では、免疫グロブリン様ヒンジ領域は、そのキメラ形態、例えば、キメラＩｇＧ１／２ヒンジ領域を含めた、任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭからのものであり得、またはそれに由来し得る。
【０２１７】
「抗体断片」は、インタクト抗体の部分のみを含み、この部分は、好ましくはインタクト抗体中に存在するときその部分と通常関連した機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持する。
【０２１８】
「二価抗体」は、１分子（例えば、ＩｇＧ）当たり２つの抗原結合部位を含む。一部の場合では、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は、二重特異性であり得る（以下を参照）。
【０２１９】
「一価抗体」は、１分子（例えば、ＩｇＧ）当たり１つの抗原結合部位を含む。一部の場合では、一価抗体は、１つを超える抗原結合部位を有することができるが、結合部位は、異なる抗原に由来する。
【０２２０】
「多重特異性抗体」は、１つを超える抗原またはエピトープを標的にするものである。「二重特異性」、「デュアル特異性」、または「二官能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、多重特異性抗体の１つの種であり、それだけに限らないが、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法で生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１；およびＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照。二重特異性抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合することになる。
【０２２１】
語句「抗原結合アーム」、「標的分子結合アーム」、およびそのバリエーションは、本明細書において、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する本発明の抗体のコンポーネント部分を指す。一般にかつ好ましくは、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、免疫グロブリン軽鎖および重鎖のＣＤＲおよび／または可変ドメイン配列の複合体である。
【０２２２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原に向けられて、高度に特異的である。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。
【０２２３】
本明細書において、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクターコンポーネントと組み合わせる抗体様または免疫グロブリン様分子を指定する。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）（抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ））以外である（すなわち、「非相同」である）所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列、ならびに免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合物を含む。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどから得ることができる。
【０２２４】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなり；ｄＡｂ断片は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる（例えば、ヒト、ラクダ科の動物、またはサメ）。
【０２２５】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が、これらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーを介して一価の分子を形成するように対合されている抗体である。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上であるが、短すぎて、同じ鎖上で２つのドメイン間の対合を可能にすることができず、それによってドメインを別の鎖の相補的なドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創製するリンカーを使用して発現される二価の二重特異性抗体である。１つまたは複数のＣＤＲは、分子中にそれをイムノアドヘシンにするように共有結合的または非共有結合的に組み込まれ得る。イムノアドヘシンは、ＣＤＲをより大きいポリペプチド鎖の一部として組み込む場合があり、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結する場合があり、ＣＤＲを非共有結合的に組み込む場合がある。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【０２２６】
抗体は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。１つを超える結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよく、または異なっていてもよい。例えば、天然に存在する抗体は、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【０２２７】
「単離抗体」は、（１）その天然の状態でそれに伴う他の天然に付随した抗体を含めた天然に付随したコンポーネントと付随していない、（２）同じ種に由来する他のタンパク質を含まない、（３）抗体を天然に発現しない細胞によって発現され、もしくは異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然において存在しない抗体である。
【０２２８】
用語「ヒト抗体」は、ヒトＩｇ配列に由来する１つまたは複数の可変領域および定常領域を有するすべての抗体を含む。本発明の一部の実施形態では、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインのすべては、ヒトＩｇ配列に由来する（完全ヒト抗体）。
【０２２９】
ヒト化抗体は、ある特定のアミノ酸がヒトにおける免疫応答を回避または阻止するように突然変異された、非ヒト種に由来する抗体である。代わりに、ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合することによって生成され得る。
【０２３０】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体に由来する１つまたは複数の領域、および１つまたは複数の他の抗体に由来する１つまたは複数の領域を含有する抗体を指す。各抗体は、別個の種（ヒトおよびマウスなど）に源を発し得る
【０２３１】
用語「エピトープ」は、ＩｇまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の分子決定基を含む。エピトープ決定基は通常、原子の表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）、例えば、アミノ酸または糖側鎖などからなり、通常、特異的な３次元の構造特性および特異的な荷電特性を有する。抗体は、解離定数が１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満であるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０２３２】
完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス誘導体化モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に固有の免疫原性反応およびアレルギー反応を最小限にし、したがって、投与される抗体の有効性および安全性を増大させると予期される。完全ヒト抗体を使用すると、抗体投与の繰り返しを要求し得る慢性および再発性ヒト疾患、例えば、炎症およびがんなどの処置において実質的な利点がもたらされることを予期することができる。
【０２３３】
さらに、２つ（またはそれ超）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体を創製することができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価または多価抗体を創製したい場合、または二重特異性抗体を創製したい場合有用である。
【０２３４】
「Ｆｃ融合物」とは、本明細書において、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃポリペプチドに作動可能に連結したタンパク質を意味する。Ｆｃ融合物は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、一般に任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーと組み合わせる。実質的に任意のタンパク質または低分子が、Ｆｃ融合物を生成するためにＦｃに連結され得る。タンパク質融合パートナーとして、それだけに限らないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインを挙げることができる。低分子融合パートナーとして、Ｆｃ融合物を治療標的に向ける任意の治療剤を挙げることができる。このような標的は、任意の分子、例えば、限定することなく、疾患に結びつけられる細胞外受容体であり得る。
【０２３５】
一タイプの誘導体化抗体は、２つまたはそれ超の抗体（同じタイプまたは異なるタイプの；例えば、二重特異性抗体を創製するために）を架橋することによって生成される。適当な架橋剤としては、適切なスペーサーによって分離された２つの明確に反応性の基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものがある。
【０２３６】
別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。本発明の抗体または抗体部分が誘導体化され得る有用な検出剤としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光化合物がある。抗体は、検出に有用である酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識されてもよい。抗体が検出可能な酵素で標識される場合、それは、見分けることができる反応生成物を生成するために酵素が使用する追加の試薬を添加することによって検出される。例えば、作用物質西洋わさびペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加すると、検出可能である着色された反応生成物がもたらされる。抗体を、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接測定によって検出してもよい。抗体は、ガドリニウムなどの磁性剤で標識される場合がある。抗体は、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識してもよい。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０２３７】
抗体は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などで誘導化される場合もある。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、例えば、血清半減期を増大させ、または組織結合を増大させるのに有用であり得る。
【０２３８】
抗体特異性
抗原結合ドメインを含むいくつかの実施形態において、少なくとも抗原結合ドメイン（例えば、限定されるものではないが、６個全部のＣＤＲを有する抗体可変領域、または抗体可変領域と少なくとも９０％同一である等価な領域）は、アバゴボマブ、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）、ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ）、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アデカツムマブ、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈもしくはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＬＹＭＰＨＯ−ＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、βセプト（ＥＭＢＲＥＬ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、カナキヌマブ（ＡＣＺ８８５）、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶ  ＡＢ（登録商標））、セデリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰ  ＡＸ（登録商標））、デノスマブ（ＡＭＧ  １６２）、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、デュルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、エドバコマブ、エドレコロマブ（Ｍａｂｌ７−１Ａ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、エフングマブ（ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標））、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリズマブ、エピツモマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ（エタラツズマブ、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、ＡＢＥＧＲＩＮ（商標））、エクスビビルマブ、ファノレソマブ（ＮＥＵＴＲＯＳＰＥＣ（登録商標））、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ（ＨＵＺＡＦ（登録商標））、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ（ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ｒ））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ  １４８）、ゴミリキシマブ、イバリズマブ（ＴＮＸ−３５５）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤ  Ｅ（登録商標））、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０）、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ（���ＧＳ−ＥＴＲ２、ＥＴＲ２−ＳＴ０１）、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲＩ、ＴＲＭ−Ｉ）、マスリモマブ、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、メポリズマブ（ＢＯＳＡＴＲＩＡ（登録商標））、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（商標））、ムロモナブ（ＯＫＴ３）、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ  ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡ−ＣＩＭ−ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、パスコリズマブ、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ランビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＭａｂＴＨＥＲＡ（登録商標））、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ（ＭＥＤＩ−５０７）、ソンツズマブ、スタムルマブ（Ｍｙｏ−０２９）、スレソマブ（ＬＥＵＫＯＳＣＡＮ（登録商標））、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトックス、テフィバズマブ（ＡＵＲＥＸＩＳ（登録商標））、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ  １２７５）、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標））、ボロシキシマブ（Ｍ２００）、ボツムマブ（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザルツムマブ、ザノリムマブ（ＨｕＭＡＸ−ＣＤ４）、ジラリムマブ、またはゾリモマブアリトックスに存在するものから選択される。
【０２３９】
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、かつ／または先のリストから選択される抗体と結合を競合する。抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、先のリスト中の抗体と同じエピトープに結合する。抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、合計６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、先のリスト中の抗体と同じ抗原に結合する。
【０２４０】
抗原結合ドメインを含むいくつかの実施形態において、少なくとも第一の抗原結合ドメインは、６個全部のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＫＤＲ、ｆｌｔ−１、ＦＬＫ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−１、ＰＬＧＦ、ＣＥＡ、ＣＸＣＬ１３、Ｂａｆｆ、ＩＬ−２１、ＣＣＬ２１、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、ＭＡＣ−Ｉ、ＩＬ２３ｐｌ９、ＦＰＲ、ＩＧＦＢＰ４、ＣＸＣＲ３、ＴＬＲ４、ＣＸＣＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢｌ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐｌ８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４  ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）、ＳＣｌ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＡＧＥ、ｓ１００Ａ８、ｓ１００Ａ９、Ｎａｖｌ．７、ＧＬＰｌ、ＲＳＶ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、ＨＭＧＢｌ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ２２、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＨＤＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＧＩＴＲ、β−アミロイド、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−Ｉ、ＰＩＶ−２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＧＦＢＰ３、ｃＭｅｔ、ＰＤ−Ｉ、ＰＬＧＦ、ネプリライシン（Ｎｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）、ＣＴＤ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ−１３、ＩＬ−ＩＲｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−４Ｒ、ＩｇＥ、ＰＡＩ−Ｉ、ＮＧＦ、ＥｐｈＡ２、ｕＰＡＲｔ、ＤＬＬ−４、αｖβ５、αｖβ６、α５β１、α３β１、インターフェロン受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＣＤ  １９、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１７、第ＩＩ因子、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＣＤ  １９、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＰＩＶ−３、ＣＭＶ、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＥＢＶから選択される抗原に特異的に結合する。
【０２４１】
抗原結合ドメインを含むいくつかの実施形態において、少なくとも第一の抗原結合ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（受容体またはリガンド）に特異的に結合する。様々な分子として、限定されるものではないが、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」）、リンホトキシン−α（「ＬＴ−α」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）、ＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも呼ばれる）、ＤＲ４、ＤＲ５（Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２、またはＫＩＬＬＥＲとしても知られる）、ＤＲ６、ＤｃＲＩ、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８としても知られる）、ＣＡＲＩ、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２としても知られる）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−Ｉ、ＴＮＦＬＩ、ＣＤ３０、ＬＴＢｒ、４−１ＢＢ受容体およびＴＲ９が挙げられる。
【０２４２】
抗原結合ドメインを含むいくつかの実施形態において、少なくとも第一の抗原結合ドメインは、５Ｔ４、ＡＢＬ、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＦｌ、ＡＣＶＲｌ、ＡＣＶＲｌＢ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬｌ、ＡＤ０ＲＡ２Ａ、アグレカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦＩ、ＡＩＧｌ、ＡＫＡＰｌ、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、ＡＮＧＰＴｌ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、アネキシンＡ２、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣｌ、ＡＲ、アロマターゼ、ＡＴＸ、ＡＸｌ、ＡＺＧＰｌ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧｌ、ＢＡＩｌ、ＢＣＲ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＢＩｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１２、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧｌ（プレクチン）、ＢＲＣＡｌ、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴｌ、ＣＡＳＰｌ、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶｌ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬｌ（１−３０９）、ＣＣＬＩ  １（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＥＰ−２）、ＳＬＣ、エクソダス−２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡｌ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＥｌ、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤｌＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ−２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３７、ＣＤＨｌ（Ｅ−カドヘリン）、ＣＤＣＰ１ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、���ＤＫＮｌＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮｌＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲｌ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クラウジン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）、ＣＮＲｌ、ＣＯＬｌ  ８Ａｌ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦｌ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬ８、ＣＴＮＮＢｌ（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬｌＯ（ＩＰ−ＩＯ）、ＣＸＣＬＩｌ（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ  １４、ＣＸＣＬ  １６、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、Ｃｙｒ６１、ＣＹＳＬＴＲｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬｌ、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦｌ５ＥＤＧｌ、ＥＦＮＡｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、エンドグリン、ＥＮＯｌ、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥＰＨＡｌ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡｌＯ、ＥＰＨＢｌ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ａｌ、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ２、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ３、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ４、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ５、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂｌ、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ２、ＥＰＨＲＴＮ−Ｂ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＧ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、エストロゲン受容体、ＥＳＲｌ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮｆ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦｌ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦｌＯ、ＦＧＦｌ  １、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、(ｍｉｍＡｂ１のような）ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＢＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）、ＦＬＴｌ、ＦＬＴ−３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ−Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢｌ、ＧＡＧＥＣｌ、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ８、ＧＦＩｌ、ＧＧＴｌ、ＧＭ−���ＳＦ、ＧＮＡＳｌ、ＧＮＲＨｌ、ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰｌ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ヘッジホッグ、ＨＧＦ、ＨＩＦｌＡ、ＨＩＰｌ、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸｌ、ＨＳＰ９０、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＢＦＮＡ７、ＩＦＮＢｌ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮＷｌ、ＩＧＢＰｌ、ＩＧＦｌ、ＩＧＦｌＲ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＤＬ−Ｉ、ＩＬｌＯ、ＩＬｌＯＲＡ、ＩＬｌＯＲＢ、ＩＬ−１、ＩＬｌＲｌ（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬｌＲ２（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬ−ＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ−５、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＢ（ＣＤ１３１）、ＩＬ−６、ＩＬ６ＲＡ（ＣＤ１２６）、ＩＲ６ＲＢ（ＣＤ１３０）、ＩＬ−７、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＩＬ−８、ＣＸＣＲｌ（ＩＬ８ＲＡ）、ＣＸＣＲ２（ＩＬ８ＲＢ／ＣＤ１２８）、ＩＬ−９、ＩＬ９Ｒ（ＣＤ１２９）、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲＡ（ＣＤ２１０）、ＩＬ１０ＲＢ（ＣＤＷ２１０Ｂ）、ＩＬ−１１、ＩＬｌ  ＩＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、１Ｌ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬｌＢ、ＩＬｌＦｌＯ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＤＬ１Ｆ９、ＩＬｌＨＹｌ、ＩＬｌＲｌ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬｌＲＡＰ、ＩＬｌＲＡＰＬｌ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＬｌ、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬｌＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＤＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（α６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（β４インテグリン）、ＪＡＫｌ、ＪＡＫ３、ＪＴＢ、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩｌ、ＫＤＲ、ＫＩＭ−１、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫｌＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴｌ、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、���ＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＤＫ、ＭＩＢｌ、ミドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＳＲＩＩ、ＭＪＰ−２、ＭＫ、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−Ｕｉ）、ｍＴＯＲ、ＭＴＳＳｌ、ＭＵＣｌ（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ニューレグリン−１、ニューロピリン−１、ＮＦＫＢｌ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＭＥｌ（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＴＣＨ、ＮＯＴＣＨｌ、Ｎ０Ｘ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢｌ、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲｌＤｌ、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰｌ、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＣＴ−１、ＯＤＺ１、ＯＰＮ１、ＯＰＮ２、ＯＰＲＤｌ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴｌ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＤＧＦ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭｌ、ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、Ｐｌｅｘｉｎ  Ｂ２（ＰＬＸＮＢ２）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ５ＰＬＸＤＣｌ、ＰＫＣ、ＰＫＣ−β、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲｌ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤｌ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ｐｒｏ−ＮＧＦ、プロサポシン、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（Ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＲＡＲＢ、ＲＧＳｌ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩ１０（ＺＮＦ１４４）、Ｒｏｎ、Ｒ０Ｂ０２、ＲＸＲ、セレクチン、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＣＧＢ  １Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥｌ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＥＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥ
ＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−Ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦｌ、ＳＨＩＰ−Ｉ、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＢｌ、ＳＨＢ２、ＳＨＢＧ、ＳｆｃＡＺ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰｌ、ＳＰＲＲｌＢ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢｌ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＳＵＬＦ−１、Ｓｕｌｆ−２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰｌＯ、ＴＤＧＦｌ、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢｌ、ＴＧＦＢｌＩｌ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲｌ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨｌＬ、ＴＨＢＳｌ（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２／ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＩＫＩ２、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６ＪＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＢ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦｌＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦｌ  １（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ  １８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、Ｔ０Ｐ２Ａ（トポイソメラーゼＩｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭｌ、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦｌ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＫＡ、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＲＯＹ、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬ  Ｃ５、ＶＬＡ−４、Ｗｎｔ−１、ＸＣＬｌ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）、ＹＹｌ、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数の標的に結合することができる。
【０２４３】
定義
一般に、生化学、分析化学、合成有機化学、医薬および製薬化学、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびに本明細書に記載のハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技法は、周知の、かつ一般に当技術分野で使用されるものである。本発明の方法および技法は、一般に、別段に示されていない限り、当技術分野で周知の、かつ本明細書全体にわたって引用され、論じられている様々な一般的および具体的な参考文献に記載されている従来法に従って実施される。反応および精製技法は、当技術分野で一般に達成され、または本明細書に記載するように、製造者の仕様に従って実施される。本明細書において、２０の天然のまたは慣例的なアミノ酸、およびこれらの略語は、ＩＵＰＡＣの１文字および３文字コードに従う。
【０２４４】
「相補的残基セット」は、本明細書において、互いに相互作用するように改変された、ＣＨ−１ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸、およびＣＬドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸を指す。互いに相互作用することによって、これらは、これらのそれぞれのドメインがヘテロ二量体化するのを推進し、相補的残基セットの残基間の相互作用の少なくとも一部を含む界面を形成する。相互作用は、塩橋、静電相互作用、またはファンデルワールス力によって特徴付けられ得る。相補的残基セットは、各ドメイン中に１つを超える改変された残基を含み得る。
【０２４５】
相補的残基セット内の任意の所与の残基は、その相補的残基セットの少なくとも１つの他の残基の５Å以内に存在することになる。
【０２４６】
相補的残基セットとの関連で、２つの残基は、各残基の少なくとも１個の原子が互いに５Å以内にある場合、相互作用すると言われる。残基相互作用は、塩橋、静電相互作用、またはファンデルワールス力として特徴付けられ得る。誤解を避けるために、他の脈絡において、原子間力は、より長い距離にわたって作用し得ることが認識される。
【０２４７】
ドメイン間の「相補的対合」は、相補的残基セットを少なくとも部分的に通じたこれらの２つのドメインの相互作用を指す。
【０２４８】
「改変された」は、本明細書において、支配的な野生型配列中に見つからない残基の意図的な突然変異を指し、改変された挿入、欠失、または置換突然変異であり得る。
【０２４９】
「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体複合体」、または「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子であって、第２のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ第１のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる、分子である。ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロ二量体」を含むことができ、または第１および第２のポリペプチドに加えてポリペプチドが存在するより高次の三次構造を形成することができる。
【０２５０】
「ヘテロ二量体」、「ヘテロ二量体タンパク質」、「ヘテロ二量体複合体」、または「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子であって、第２のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ第１のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる、分子である。
【０２５１】
本発明との関連で、用語ヘテロ二量体は、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのポリペプチドを含むヘテロ多量体を示すのに使用されるが、それは、多くの実施形態、特に、本発明がＩｇＧ抗体および同様の分子に関するものでは、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ヘテロ多量体タンパク質と同等に呼ばれる場合があり、理由は、４つの別個のポリペプチド（第１の重鎖および軽鎖、ならびに第２の重鎖および軽鎖）が必然的に存在することになるためであることが容易に察知されるであろう。
【０２５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに互換的に使用される。本明細書において、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用する。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用する。アミノ酸は、ペプチドの結合特性および他の所望の特性が維持される限り、Ｌ型であってもＤ型であってもよい。ポリペプチドは、モノマーであっても、ポリマーであってもよい。この用語は、天然に修飾された、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の改変もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１種または複数の類似体、および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義内に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
【０２５３】
「Ｄ」の接頭辞、例えば、Ｄ−ＡｌａもしくはＮ−Ｍｅ−Ｄ−Ｉｌｅによって、または小文字形式、例えば、ａ、ｉ、ｌ（Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕのＤバージョン）で書かれて別段に示されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載のペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のα−炭素の立体化学は、天然または「Ｌ」構成である。
【０２５４】
すべてのペプチド配列は、α−Ｎ末端アミノ酸残基が左にあり、α−Ｃ末端アミノ酸残基が右にある一般に認められている慣習に従って書かれる。本明細書において、用語「Ｎ末端」は、ペプチド中のアミノ酸の遊離αアミノ基を指し、用語「Ｃ末端」は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を指す。１つの基でＮ末端をなしているペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ窒素上に１つの基を持つペプチドを指す。１つの基でＣ末端をなしているアミノ酸は、メチルエステルをもたらすメチル基などのカルボキシル部分上に１つの基を持つアミノ酸を指す。
【０２５５】
本明細書において、「生物活性」は、化合物、組成物、もしくは他の混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性、または化合物、組成物、もしくは他の混合物をｉｎ  ｖｉｖｏ投与すると生じる生理反応を指す。したがって生物活性は、このような化合物、組成物、および混合物の治療効果、診断効果、および薬学的活性を包含する。
【０２５６】
用語「生物学的に適合性の」は、本明細書において、細胞内および細胞外生物学的分子と生物学的に不活性または非反応性であり、かつ無毒性であるものを意味する。
【０２５７】
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用される場合、変数の示された値、および示された値の実験誤差以内（例えば、平均についての９５％信頼区間以内）、または示された値の１０パーセント以内のいずれか大きい方である変数のすべての値を指す。数値範囲は、範囲を画定する数値を含む。
【０２５８】
用語「同一性」は、当技術分野で公知であるように、配列を比較することによって判定される、２つもしくはそれ超のポリペプチド分子、または２つもしくはそれ超の核酸分子の配列間の関係を指す。当技術分野において、「同一性」は、場合によって、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のストリング間の一致によって判定される、ポリペプチドまたは核酸分子配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、コンピュータープログラムの特定の数学的モデル（すなわち「アルゴリズム」）によって対処されるギャップ整列を用いて２つまたはそれ超の配列間の完全な一致のパーセントを測定する。
【０２５９】
用語「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」と対照的に、完全な一致および保存的置換一致の両方を含む類似性の尺度を指す。保存的置換は、ポリペプチドに適用し、核酸分子に適用しないので、類似性は、ポリペプチド配列比較のみを扱う。２つのポリペプチド配列が例えば、２０のうち１０の同一のアミノ酸を有し、残りがすべて非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性はともに５０％である。同じ例において、保存的置換が存在する位置がさらに５つ存在する場合、パーセント同一性は、５０％のままであるが、パーセント類似性は、７５％である（２０のうち１５）。したがって、保存的置換が存在する場合では、２つのポリペプチド配列間の類似性の程度は、これらの２つの配列間のパーセント同一性より高いことになる。
【０２６０】
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性、電荷、およびおおよその体積に対してほとんどまたはまったく効果がないような、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の任意の他の非極性残基との置換から生じる。この用語は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたは関連したマトリックスのような高度に同様のタンパク質間で頻繁に起こるとして同定される置換も指す場合がある（ＰＮＡＳ，ＵＳＡ、８９（２２）、１０９１５〜９、１９９２）。
【０２６１】
用語「ベクター」は、本明細書において、核酸分子であって、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すように意図される。一タイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、これらが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、これらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に、「組換えベクター」）と本明細書で呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用なものの発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態であるので、互換的に使用され得る。
【０２６２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、本明細書で互換的に使用される場合があり、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオシドまたはヌクレオチドのポリマーの、場合により単離された形態を指す。この用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、もしくは塩基、および／またはこれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によってポリマー中に組み込むことができる任意の基質であり得る。
【０２６３】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびこれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーをアセンブルする前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションなどによって、合成後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｏｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびにポリヌクレオチドの無修飾形態などがある。さらに、糖中に通常存在する水酸基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えられ、標準的な保護基によって保護され、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を調整するために活性化される場合があり、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされる場合がある。５’および３’末端ＯＨをリン酸化し、またはアミン、もしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めて、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似型も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基としては、それだけに限らないが、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられている実施形態があり、式中、各ＲあるいはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−−Ｏ−−）連結を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、あるいはアラルジルである。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前記記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書に参照されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【０２６４】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、一般に、しかし必ずしもではないが、長さが約２００ヌクレオチド未満である短い、一般に一本鎖の、一般に合成ポリヌクレオチドを一般に指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的でない。ポリヌクレオチドについての上記記載は、オリゴヌクレオチドに同等にかつ完全に適用可能である。
【０２６５】
ヌクレオチド配列への言及は、本明細書において、別段に指定されていない限りその相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、脈絡により別段に定義されていない限り、その相補配列を有するその相補鎖を包含することが理解されるべきである。
【０２６６】
「細胞」または「細胞株」は、本明細書において、本発明のヘテロ二量体タンパク質、ポリペプチド、または核酸を発現させるのに使用することができる様々なタイプの細胞、例えば、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、ラット細胞、ヒト細胞を含む。
【０２６７】
用語「精製する」、およびその文法的バリエーションは、ポリペプチドおよび１種または複数の不純物を含有する混合物から少なくとも１種の不純物を、完全にであっても部分的にであっても除去し、それによって組成物中のポリペプチドの純度のレベルを改善する（すなわち、組成物中の不純物の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）ことを意味するのに使用される。
【０２６８】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、目的のイオン性溶質（例えば、混合物中の目的のタンパク質）が、ｐＨおよび伝導性の適切な条件下で、固相イオン交換材料に連結した（例えば、共有結合によって）逆に荷電したリガンドと相互作用し、その結果、目的の溶質が、混合物中の溶質不純物または混入物より多くまたは少なく荷電化合物と非特異的に相互作用するクロマトグラフィープロセスを指す。混合物中の汚染溶質は、イオン交換材料のカラムから洗浄することができ、または目的の溶質より速くもしくは遅く樹脂に結合され、もしくは樹脂から除外される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には、陽イオン交換、陰イオン交換、および混合モードクロマトグラフィーを含む。
【０２６９】
「阻止」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減するものである。「アゴニスト抗体」は、本明細書において、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【０２７０】
用語「免疫エフェクター細胞」または「エフェクター細胞」は、本明細書において、標的細胞の生存能に影響するように活性化され得るヒト免疫系中の細胞の天然レパートリー内の細胞を指す。標的細胞の生存能として、細胞生存、増殖、および／または他の細胞と相互作用する能力を挙げることができる。
【０２７１】
塩橋は、一タイプの非共有結合相互作用である。塩橋は、反対の形式電荷を有する２つの原子間の近距離直接相互作用を伴う。タンパク質構造との関連で、塩橋は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアニオン性カルボキシレート（ＲＣＯＯ−）と、ヒスチジンが別の可能性を伴って、リシンに由来するカチオン性アンモニウム（ＲＮＨ３＋）またはアルギニンのグアニジニウム（ＲＮＨＣ（ＮＨ２）２＋）との間でほとんどの場合形成する。しかし、他のアミノ酸も、これらのｐＫａ値の変化およびポリペプチド鎖中の場所に応じて参加することができる（ＮおよびＣ末端残基がイオン化される場合があり、したがってアミノ酸タイプにかかわらず塩橋を形成することができる）。
【０２７２】
静電相互作用は、非ゼロ電荷を有する原子間の非共有結合相互作用である。これらは、好都合な、不都合な、または中性の相互作用エネルギーを有し得、形式電荷を有し、または形式電荷の欠如にかかわらず分極した原子を伴い得る。水素結合、塩橋、およびパイカチオンスタッキング（ｐｉ−ｃａｔｉｏｎ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）は、タンパク質構造中で頻繁に観察される静電相互作用の例である。
【０２７３】
通常、タンパク質に、および時にＲＮＡ配列に特異的である構造的整列は、配列を整列させるのに役立つタンパク質またはＲＮＡ分子の二次および三次構造についての情報を使用する。これらの方法は、２つまたはそれ超の配列に使用され、典型的には、局所的な整列を生じさせるが、これらは、構造情報の利用可能性に依存するので、対応する構造が既知である（通常、Ｘ線結晶構造解析法またはＮＭＲ分光法によって）配列についてのみ使用することができる。タンパク質およびＲＮＡ構造はともに、配列より進化的に保存されているので、構造的整列は、非常に遠縁であり、かつ配列比較がその類似性を確実に検出することができないほど非常に広範に分岐している配列間でより信頼できるものであり得る。タンパク質の１つについて利用可能な構造データが存在しない場合、構造データが種にわたる免疫グロブリン、特に、種およびサブタイプにわたる抗体定常ドメインなどの１つまたは好ましくはそれ超の厳密に関連したタンパク質について利用可能であれば、比較を依然として行うことができる。
【０２７４】
構造的整列は、「ゴールドスタンダード」として使用され、理由は、これらが配列情報をもっぱら利用するのではなく構造的に同様であるタンパク質配列の領域を明示的に整列させるためである。構造的整列について一般に使用されるアルゴリズムは、ＴＭ−ＡＬＩＧＮ（ＺｈａｎｇおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３：２３０２〜２３０９（２００５））であり、これは、重ね合わせ中の構造の最も同様の領域に大きくした重みを割り当てる。
【０２７５】
配列整列
本発明のタンパク質配列を用いた構造的整列が、例えば、標的配列のＮＭＲまたは結晶構造データがないことに起因して可能でない場合、配列整列が使用され得る。当業者は、配列整列ツール（ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ、および本明細書に記載のものなどの当業者に公知のその他など）に精通しており、特に、サブタイプおよび種にわたって免疫グロブリンドメイン、抗体、および抗体定常ドメインについて既に存在する多数の例示的な構造的試験に特に起因して、配列、特に、公知の構造モチーフに従う抗体定常ドメイン配列を整列させることができる。
【０２７６】
配列整列へのコンピューターによる手法は、２つのカテゴリー：グローバル整列およびローカル整列に入る。グローバル整列の計算は、整列がすべてのクエリー配列の全長に及ぶように「強要する」グローバル最適化の一形態である。対照的に、ローカル整列は、全体的に広く多岐にわたることが多い長い配列内の類似性の領域を同定する。ローカル整列は、好ましいことが多いが、類似性の領域を同定するという追加の課題のために、計算するのがより困難であり得る。様々なコンピューターによるアルゴリズムが、配列整列問題に適用されている。これらには、ダイナミックプログラミングのような遅いが正式に正しい方法、およびまた、ベストマッチを見つけることを保証しない大規模データベース検索のために設計された、効率的な、ヒューリスティックアルゴリズムまたは確率論的方法が含まれる。
【０２７７】
あらゆる配列中のあらゆる残基を整列させようと試みるグローバル整列は、クエリーセット中の配列が同様であり、おおよそ等しいサイズのものであるとき、最も有用である。一般的なグローバル整列技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムであり、これは、ダイナミックプログラミングに基づく。ローカル整列は、そのより大きい配列関係内で類似性の領域または同様の配列モチーフを含有する疑いのある異なった配列についてより有用である。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、やはりダイナミックプログラミングに基づく一般的なローカル整列法である。
【０２７８】
ペアワイズ配列整列法は、２つのクエリー配列のベストマッチングピースワイズ（ローカル）またはグローバル整列を見つけるのに使用される。ペアワイズ整列を生じさせる３つの主要な方法は、ドットマトリックス法、ダイナミックプログラミング、およびワード法であるが、多重配列整列技法も、配列の対を整列させることができる。各方法は、その個々の強みおよび弱点を有するが、３つすべてのペアワイズ法は、特に、反復の数が整列される２つの配列中で異なる場合、低い情報含有量の高度に反復性の配列に対して困難を有する。所与のペアワイズ整列の有用性を定量化する一方法は、「最大ユニークマッチ（ｍａｘｉｍｕｍ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍａｔｃｈ）」（ＭＵＭ）、または両方のクエリー配列中に存在する最長部分配列である。より長いＭＵＭ配列は、典型的には、より近い関連性を反映する。同一性および／または類似性を判定する好適な方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラム中に体系的にまとめられている。２つの配列間の同一性および類似性を判定する好適なコンピュータープログラム法としては、それだけに限らないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：３８７（１９８４）；遺伝学コンピューターグループ、ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含めたＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０（１９９０））がある。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を判定するのに使用され得る。
【０２７９】
例として、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（遺伝学コンピューターグループ）を使用して、パーセント配列同一性が判定される２つのポリペプチドが、これらのそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングについて整列される（アルゴリズムによって判定される「マッチドスパン」）。ギャップ開始ペナルティー（平均対角項（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）の３倍として計算され；「平均対角項」は、使用されている比較マトリックスの対角項の平均であり；「対角項」は、特定の比較行列によってそれぞれの完全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数値である）、およびギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップ開始ペナルティーの０．１倍である）、および比較行列、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などが、アルゴリズムと併せて使用される。ポリペプチド配列比較のための好適なパラメータは、以下を含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎおよび  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜５３（１９７０）。比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：１０９１５〜１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２。
【０２８０】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、バージョン９、１９９７年９月に示されたものを含めた他の例示的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較行列、類似性の閾値なども、当業者によって使用され得る。行われる特定の選択は、行われる具体的な比較、例えば、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡなど；さらに、比較が、配列の所与の対間であるか（この場合ではＧＡＰもしくはＢｅｓｔＦｉｔが一般に好適である）、または１つの配列と配列の大きいデータベースとの間であるか（この場合ではＦＡＳＴＡもしくはＢＬＡＳＴＡが好適である）否かに依存することになる。
【０２８１】
保存された構造を有する特定のタンパク質ファミリーについて、他の整列アルゴリズムも利用可能である。抗体の場合では、Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てるための様々なアルゴリズムが利用可能である。Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）の２０１２年リリースでインプリメントされるアルゴリズムが、別段に注記されていない限り、可変領域にＫａｂａｔ番号付けを割り当てるのに本明細書で使用される。
【０２８２】
核酸配列との関連で用語「パーセント配列同一性」は、最大対応について整列されるとき同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常、少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には、少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれ超のヌクレオチドのストレッチにわたるものであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用することができる当技術分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．０、遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列との間のベストオーバーラップの領域の整列およびパーセント配列同一性をもたらす（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２２７〜２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７６：７１〜８４（１９９８）；参照により本明細書に組み込まれている）。別段に指定されていない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトのパラメータが使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスについてＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦＡＳＴＡを使用して、または参照により本明細書に組み込まれているＧＣＧバージョン６．１に提供されているそのデフォルトのパラメータを用いてＧａｐを使用して判定することができる。
【０２８３】
【表１−１】
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【０２８４】
【表１−２】
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【０２８５】
【表１−３】
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【０２８６】
【表１−４】
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【０２８７】
【表１−５】
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【０２８８】
【表１−６】
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【０２８９】
【表１−７】
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【０２９０】
【表１−８】
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【０２９１】
【表１−９】
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【０２９２】
【表１−１０】
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【０２９３】
【表１−１１】
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【０２９４】
【表１−１２】
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【０２９５】
【表１−１３】
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【０２９６】
【表１−１４】
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【０２９７】
【表１−１５】
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【０２９８】
【表１−１６】
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【０２９９】
【表１−１７】
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【実施例】
【０３００】
残基の番号付け
野生型アミノ酸残基は、図２に例示したようにＫａｂａｔ適合性番号方式を使用して番号付けする。本明細書において、表に列挙した突然変異は、ドメイン、その後のＫａｂａｔ適合性番号付けによる残基位置を指す（例えば、配列番号１（ＣＨ１）、配列番号９（ＣＬ）、配列番号１３（ＣＨ２）、および配列番号１８（ＣＨ３）を参照）。野生型残基の素性は、残基位置の前にＩＵＰＡＣ一文字コードで記載する（例えば、ＣＨ１−Ｓ１８８）。突然変異残基の素性は、残基位置の後に記載する（ＣＨ１−１８８Ｅ）。該当する場合、野生型および突然変異残基の素性の両方を提供する（ＣＨ１−Ｓ１８８Ｅ）。代替の表示法では、天然アミノ酸を最初に、その後、括弧内に鎖および位置、その後に置換されたアミノ酸を列挙することができる。例えば、Ｓｅｒ（Ｈ１８８）Ｇｌｕ。
【０３０１】
（実施例１）
抗体中にヘテロ二量体優遇突然変異を生成するための部位の同定
タンパク質と別の分子との間の結合親和性は、結合状態で最も近い空間的な近接における原子を修飾することによって変更することができることが多い。天然抗体では、ＣＨ１およびＣＬドメインは、互いに結合しており、結合の程度は、結合状態で密接に接触している（５．０Å未満）原子の対、各ドメイン中の１つの原子によって著しく影響を受け得る。これらの結合対に関与した原子に対する変更は、結合を増大または減少させ得る。関与した具体的な原子は、ＮＭＲ分光法およびタンパク質Ｘ線結晶構造解析法などの方法によって判定することができる。他のドメインと密接に接触している１つのドメイン上の原子は、原子およびその局所環境の特質に応じて２つのドメイン間で引力または反発力をもたらし得る。さらに、第２のドメインの１２Å以内に原子を有する第１のドメイン中の残基（Ｇｌｙなど）について、第２のドメインとの密接な接触は、残基が異なるコンホメーションを採用する異なる残基（Ａｒｇなど）によって置き換えられる場合に起こり得、第１のドメイン中のこのような残基はまた、本明細書で密接接触残基と見なされる。修飾後、新しいアミノ酸は、以前に第１のドメインと密接に接触していなかった第２のドメイン上の残基と密接に接触した状態になり得、これらの残基も、密接接触残基と見なされる。例えば、第１のドメイン上のＡｌａからＴｒｐへの突然変異は、第２のドメインと不都合な立体的相互作用を引き起こす場合があり、それは、第１のドメイン上にＴｒｐを導入する前に密接に接触していなかった第２のドメイン上の残基を変更することによって緩和され得る。この原理を、野生型ＣＨ１（またはＣＬ）ドメインと相互作用しない新規のＣＬ（またはＣＨ１）ドメインを設計するのに使用してもよい。次いで新規のＣＬ（またはＣＨ１）ドメインと相互作用を復帰させる新規のＣＨ１（またはＣＬ）ドメインを構築することができる。多重特異性抗体は、各重鎖と各軽鎖との間の正しい対合を保証するために、このような新規のＣＬおよびＣＨ１ドメインの１つまたは複数の組合せを使用することができる。このような設計は、立体的相互作用だけでなく、静電相互作用、または両タイプの相互作用にも基づき得る。
【０３０２】
Ｍａｅｓｔｒｏ（Ｍａｅｓｔｒｏ、バージョン９．２、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２０１１））などのグラフツールを使用するタンパク質結晶構造の検査により、上記に定義した基準を使用して原子間距離を測定することによって、直接密接に接触した原子が明らかになった。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）エントリー３ＱＱ９（ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ３ｑｑ９／ｐｄｂ）における結晶構造の場合では、ＣＨ１ドメインと密接に接触しているＣＬドメイン中の残基は、それだけに限らないが、１１６〜１１９、１２１、１２３〜１２４、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５〜１３８、１６０〜１６４、１６７、１７４〜１７６、１７８、１８０、２０９を含む（本明細書に記載の番号付けスキームを使用して；図２を参照）。ＣＬと同様に密接に接触しているＣＨ１中の残基は、それだけに限らないが、１２１〜１２７、１３７〜１４０、１４３、１４５、１６９、１７２〜１８０、１８６、１８８、１９０、１９２、２２１を含む（本明細書に記載の番号付けスキームを使用して）。
【０３０３】
実験的測定中に存在する不確定性、および異なる結晶形におけるタンパク質表面環境の差異に起因して、他のタンパク質構造の検査は、相対的な原子位置の変動を示す場合があり、その結果、これらの構造の検査は、ここで与えたものと実質的に同様であるが、同一でない残基のリストをもたらす。例えば、ＰＤＢエントリー１ＨＺＨ（Ｓａｐｈｉｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１１５５〜５９（２００１））において、構造は、異なる局所環境を有する２つのＣＨ１ドメインを含有し、一方のドメインでは、Ｌｙｓ２２１は、そのパートナーＣＬドメインの４．５Å以内に存在する一方、他方のＣＨ１ドメインでは、それは、その中にない。１つのこのようなＣＨ１／ＣＬ界面中の密接な接触の判定は、密接接触残基として残基を定義するのに十分である。
【０３０４】
修飾アミノ酸側鎖の配向、およびこのような変化がタンパク質／タンパク質界面結合親和性に対して有し得る相対的な効果を予測するのに、複数の計算方法が利用可能である。しかし、異なる方法は、異なる結果を与えることが多い。方法にわたるこのばらつきを補償するために、いくつかの方法を使用して、ＣＨ１／ＣＬ結合の親和性を低減し得るアミノ酸変化を同定した。次いで、標的にされるはずである潜在的なアミノ酸残基のリストを、構造モデルの検分に基づいて洗練させた。
【０３０５】
（実施例２）
新規の共有結合性ＣＨ１−ＣＬジスルフィド連結を有する抗体
二重特異性抗体は、各Ｆａｂアーム中に異なる重鎖および軽鎖を含有することができる。例えば、二重特異性抗体が、それぞれが異なるＬＣおよびＨＣを有する２つのＦａｂアームを有する場合、二重特異性抗体の生成は、４つの異なるポリペプチドの発現を伴い得る。誤った重鎖とクロスオーバーおよび対合する軽鎖の可能性に起因して、重鎖がヘテロ二量体化を優遇するように修飾されていても、４つの異なる重鎖および軽鎖のコトランスフェクションおよび発現が、図１に例示したように望ましくない生成物を依然としてもたらし得る。
【０３０６】
ＣＨ１とＣＬとの間の野生型界面は、ＣＨ１−Ｃ２３０とＣＬ−Ｃ２１４との間の共有結合性ジスルフィド結合によって安定化される。二重特異性抗体のアセンブリー中に、任意の誤ったＨＣ／ＬＣ対合が起こる場合、このジスルフィド結合の形成は、誤った対合を所定の位置に保持するのを助け得る。
【０３０７】
本発明者らは、誤対合した抗体アームが天然のジスルフィドを形成することができない場合、それは、誤対合した鎖を解離させ、正しいパートナーを見つける機会を増大させ得ると仮定した。この可能性を探索するために、ジスルフィド結合の代替の位置を設計した。これらの設計では、誤って対合したＣＨ１およびＣＬドメインは、システインがあまりに遠く離れて存在するためにジスルフィド結合を形成することができない。正しいＣＨ１／ＣＬ対合が起こる場合、ジスルフィド結合は、形成し、対合を所定の位置に保持するのを助けることができる。
【０３０８】
ＣＨ１とＣＬとの間の界面を調査し、可能なジスルフィド連結を評価する特定用途向けの方法を開発した。この方法は、Ｄａｎｉら（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１６（３）：１８７〜９３（２００３））のものと同様であるが、各部位の品質をランク付けするために追加のタイプの分析を実施する。
【０３０９】
２つの残基のアルファ炭素が７．５Å以内にあり（Ｃα１−Ｃα２距離）、２つの残基のベータ炭素が６．０Å以内にある（Ｃβ１−Ｃβ２距離）、各鎖上に１つの残基の対を選択した。側鎖が互いに離れて配向している対を除去するために、Ｃβ１とＣβ２との間の距離をＣβ１とＣα２との間の距離と比較した。前者の距離がより大きい場合、側鎖は、互いに離れて部分的に配向しており、したがってジスルフィドを形成するための芳しくない候補であり、前者の距離が０．５Å超大きい場合、対を断念した。
【０３１０】
残存している対について、各推定上のジスルフィドを、突然変異される原子についてランダム化された開始座標から築いた９つのモデルを用いてモデラー（Ｅｓｗａｒら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１（１３）：３３７５〜８０（２００３））で構造的にモデル化した。野生型の対照モデルも、モデラーで構築した。すべてのモデルを、ＴＭ−ＡＬＩＧＮ（ＺｈａｎｇおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３：２３０２〜９（２００５））を使用して元の結晶構造上に再び重ね合わせた。１．０Åおよび１．５Åのプローブ半径を用いて、ＶＯＩＤＯＯ（ＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ、Ｄ５０：１７８〜８５（１９９４））を使用して、タンパク質コア中の空隙体積の導入についてモデルを点検した。小さい、または存在しない空隙が好適であった。モデラーＤＯＰＥ  Ｚスコアを計算し、野生型と同じぐらい低い突然変異体スコアが好適であった。突然変異前後のラマチャンドランプロットを、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９（１）：２２１〜２（２００１））を使用して比較して、共有結合性ジスルフィド結合の束縛によって引き起こされる骨格品質の任意の劣化を検出した。モデラー目的関数によって最良にランク付けされた突然変異体モデルを野生型と比較し、突然変異されている２つの残基中の任意の骨格原子の最大の変位に注目し、より小さい変位が好適であった。
【０３１１】
最後に、突然変異体システインのχ１、χ２、およびχ３角度を算出し、４０％の配列同一性レベルでフィルタリングした４５００の高分解能結晶構造中のこれらの角度の分布と比較した。実験的に観察された分布から最小に逸脱している幾何形状を有するモデルをもたらす推定上のジスルフィドが好適であった。
【０３１２】
このプロセスから得たいくつかの基本設計を表２に列挙する。設計Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ４、およびＣｙｓ５は、マニュアル検分によっても、上述した自動手順によってもあまり有利にランク付けされず、さらに探求しなかった。設計Ｃｙｓ３は、２つのバリアント：Ｃｙｓ３ａおよびＣｙｓ３ｂを有する。Ｃｙｓ３ｂでは、２つの追加の近傍の残基を、ジスルフィド周囲のパッキングを改善するためにＩｌｅに変更した（Ｖ１９０ＩおよびＬ１３５Ｉ）。理由は、Ｆ１７４Ｃ突然変異は、構造中に小さい腔を導入することが予測されたためである。
【０３１３】
【表２】
2017521361.tif 000020
【０３１４】
（実施例３）
Ｃｙｓ変更された重鎖／軽鎖の発現および精製
表２に示した３つの新規の重鎖／軽鎖ジスルフィド架橋位置（Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ６）が、ジスルフィド結合を形成することができるか否かを判定するためのプラットフォームとして抗体２９Ｄ７を使用した。２９Ｄ７は、二価、単一特異性、モノクローナル抗チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）ＩｇＧ１抗体である（Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２６（３７）：９３９４〜９４０３（２００６）を参照）。
【０３１５】
天然ジスルフィド架橋を有する陽性対照（ＣＨ−Ｃ２３０とＣＬ−Ｃ２１４との間、「２９Ｄ７」）、および架橋をまったく有さない陰性対照（ＣＨ−Ｃ２３０ＳおよびＣＬ−Ｃ２１４Ｓ：「２９Ｄ７  ΔＣｙｓ」）も、アッセイ設計において使用した。２９Ｄ７発現カセット遺伝子を、新規の遺伝子合成を使用して部分的に構築し、制限酵素−ライゲーションベースクローニング技法を使用して発現ベクター中に２９Ｄ７重鎖および軽鎖可変領域とインフレームでサブクローニングした。軽鎖遺伝子をｐＳＭＥＮ３中にクローニングし、重鎖遺伝子をｐＳＭＥＤ２中にクローニングした。懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を、３７℃で７％ＣＯ２とともに加湿したインキュベーター内で維持した。馴化培地を、標準的な一過性のＨＥＫ２９３Ｆトランスフェクションプロセスから生成した。馴化培地を０．２μｍフィルターに通して濾過した後、精製した。コンストラクトは、馴化培地中に３０〜５０ｍｇ／Ｌの範囲で発現した。
【０３１６】
（実施例４）
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現された２９Ｄ７抗体の精製
濾過した馴化培地を、ＰＢＳ−ＣＭＦ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）で平衡化したＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填した。樹脂をＰＢＳ−ＣＭＦ  ｐＨ７．２  １０カラム容積で洗浄した後、抗体をプロテインＡ溶出緩衝液（２０ｍＭ  クエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）の０〜１００％の直線勾配で溶出した。ピーク画分を２Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を用いてｐＨ７．０に中和し、プールした。材料を、ＰＢＳ−ＣＭＦ  ｐＨ７．２中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００分取サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮し、０．２μｍで濾過した。
【０３１７】
分析ＳＥＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムに接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。非還元性条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３）により、陰性対照、Ａｂ  ２９Ｄ７  Ｃｙｓ  Ｎｅｇは、ＳＤＳ変性によって推進され、重鎖／軽鎖ジスルフィド架橋の欠如に起因して１００ｋＤａ重鎖および２５ｋＤａ軽鎖コンポーネントに崩壊することが明らかになった。天然ジスルフィド架橋を有する陽性対照（「２９Ｄ７］）は、９８ｋＤａと１８８ｋＤａマーカーの間で移動する単一バンドを呈し、おそらくジスルフィド架橋によって結合された重鎖および軽鎖を有するインタクトな１５０ｋＤａ  ＩｇＧ１分子を表す。表２に記載した４つの新規のシステインコンストラクト（２９Ｄ７  Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ  ３ａ、Ｃｙｓ３ｂ、およびＣｙｓ６）は、陽性対照と同様の様式で挙動し、表２に示した位置におけるジスルフィド架橋の形成を暗示する。
【０３１８】
（実施例５）
ジスルフィド連結が変更された抗体の質量分析
新規の共有結合性ＣＨ１−ＣＬジスルフィド連結のために導入された突然変異の効果を判定するために、様々な２９Ｄ７コンストラクトのインタクトな質量分析を実施した。表２に列挙したジスルフィド修飾を含有する抗体２９Ｄ７の精製形態、ならびに陽性および陰性対照を、ＰＮＧａｓｅＦの存在下で脱グリコシル化し、その後以下の通りＬＣ／ＭＳを続けた。抗体を、４００：１のタンパク質：酵素比でＬｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ）とともにインキュベートし、３７℃で２０分間インキュベートした。消化反応を、水中の０．１％ギ酸を添加してクエンチした。消化した試料を、Ｗａｔｅｒ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とカップリングしたＡｇｌｉｅｎｔ  １１００キャピラリーＨＰＬＣでのＬＣ／ＭＳ分析によって分析した。分析物を、０．１％ギ酸とともにＺｏｒｂａｘ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ  Ｃ３  カラム（１．０ｍｍ×７５ｍｍ、８０℃で維持した）に装填し、４分にわたって６５μｌ／分の流量で１５〜９８％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）の勾配を使用して溶出した。質量分析検出を、キャピラリー電圧を３．３ｋＶに設定して正、感度モードで実施した。データ分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ中のＭａｘＥｎｔ１関数を用いて実施した。
【０３１９】
２９Ｄ７ΔＣｙｓについて、基準ピークを、２３１９０Ｄａの理論的質量を有するモノマー軽鎖に割り当てた（図４Ａ）。二次ピークをクリップされたリシンを有する重鎖二量体（理論的質量９８０８６Ｄａ）に割り当てた。この結果は、ＣＨ１とＣＬとの間のジスルフィド結合の形成を破壊するための初期設計と一致した。コンストラクトＣｙｓ１の結果を図４Ｂに示す。基準ピークは、リシンクリッピングを有するインタクトなＩｇＧ（理論重量１４４４３８Ｄａ）に対応する。２本の重鎖および１本のみの軽鎖を有する部分的にインタクトなＩｇＧ（理論重量１２１２９２Ｄａ）も観察された。同様の結果が、２本の重鎖および１本のみの軽鎖を有する部分的にインタクトなＩｇＧ（理論重量１２１１９９Ｄａ）の検出に加えて、基準ピークがリシンクリッピングを有するインタクトなＩｇＧ（理論重量１４４４０４Ｄａ）を表すコンストラクトＣｙｓ３ａについて得られた（図４Ｃ）。
【０３２０】
２本の重鎖および１本のみの軽鎖を有するわずかに残留する部分的にインタクトなＩｇＧを伴ってインタクトな抗体として大部分を示す２つの追加のコンストラクトを図４Ｄ＆Ｅに示す。
【０３２１】
（実施例６）
ジスルフィド連結が変更された抗体のＤＳＣ分析
抗体の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して測定した。表２に記載した２９Ｄ７ジスルフィドバリアント抗体を、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に、同じ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中で希釈した。試料および緩衝液（４００μＬ）を、９６ウェルディープウェルプレートに移し、ＤＳＣ（Ｃａｐ−ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のオートサンプラー内に置いた。計測器中に注入した後、試料を１０℃から１１０℃に１００℃／時間で加熱した。データを緩衝液およびベースラインで補正した後、３つの非二状態転移にフィッティングして融解温度を判定した（表２）。すべての突然変異体は、高いＴｍ値を伴った安定なタンパク質であった。いくらかの差異を、それぞれＣＨ２およびＦａｂドメインに割り当てられたＴｍ１およびＴｍ２において観察することができた。
【０３２２】
【表３】
2017521361.tif 000021
【０３２３】
結論として、Ｆａｂ  ＩＤ（Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ３ａ、Ｃｙｓ３ｂ、およびＣｙｓ６）を用いて表２で概説した突然変異体は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびカッパ軽鎖の定常軽鎖ドメインの両方中に導入された新規のシステイン残基を有し、これらのシステインは、意図的に除去された天然ジスルフィド結合の代わりとなる新規の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。次いでこれらの設計を、一方のＦａｂアーム中に天然ジスルフィド架橋、および他方のＦａｂアーム中に新規のジスルフィド架橋を有する二重特異性抗体状況において正しい軽鎖対合を優遇するこれらの能力について引き続いて評価した。
【０３２４】
（実施例７）
Ｒｏｓｅｔｔａモデル化を使用して同定される破壊的突然変異体
複数のモデル化方法を使用して、突然変異がそれぞれのＣＬおよびＣＨドメインの対合を退けるという点で「破壊突然変異」として分類され得る一連の突然変異を同定した。突然変異を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した（表５）（やはり、試験抗体として抗体２９Ｄ７を使用して）。１つのモデル化方法は、Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｄａｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７７：３６３〜８２（２００８））、バージョン２．３においてインプリメントされる界面エネルギー法を使用した。いくつかのプロトコールを、タンパク質中の様々な程度のフレキシビリティとともに使用した。「ＲＦｌｅｘ」プロトコールは、突然変異した残基付近の側鎖を結合および非結合状態において別個に緩和させた。「ＥｘＲＦｌｅｘ」プロトコールは、アミノ酸側鎖コンホメーションのより細かい拡張サンプリングを可能にした（Ｒｏｓｅｔｔａオプション［−ｅｘｔｒａｃｈｉ＿ｃｕｔｏｆｆ  １２」、「−ｅｘ１  １」、「−ｅｘ２  １」、「−ｅｘ３  １」、および「−ｅｘ４  １」）。１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ超の不都合な鎖内エネルギーを生じさせることなく１ｋｃａｌ／ｍｏｌ超鎖間結合親和性を破壊することが予測されたアミノ酸変化を初期に選択した（「破壊突然変異」）。いくつかの突然変異は、結合を破壊したが、不都合な鎖内エネルギー変化も引き起こした（例えば、ＣＨ１−Ｓ１８８Ｙについて＋２２ｋｃａｌ／ｍｏｌ；表３を参照）。
【０３２５】
ＣＨ１−Ｓ１８８Ｙについて、検分により、Ｌ１４３をより小さい残基に突然変異させると、この鎖内歪みが軽減され得ることが示唆された。Ｒｏｓｅｔｔａにより、ＣＨ１−Ｓ１８８ＹをＣＨ１−Ｌ１４３Ａと組み合わせると、軽鎖との相互作用を依然として破壊しながら、ＣＨ１鎖を安定化させる（−５．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）ことが予測された。ＣＨ１−Ａ１３９などの一部の位置で、すべての他のアミノ酸は、複合体を破壊すると予測された（結果のサブセットのみが表３に示されている）。
【０３２６】
モデル化によって得られる可能な破壊突然変異の総数は、実験的な試験にとって大きすぎ、したがって破壊突然変異を、結合を復帰させることができるパートナー鎖中の突然変異（「復帰突然変異」）を補償することを設計する実現可能性についてさらにモデル化した。各破壊突然変異について、プロトコールは、上述した反対の鎖上のすべての密接接触残基を同定した。各破壊突然変異について、復帰突然変異を有する最大で数百万の候補配列（すべての可能な単一および二重復帰突然変異体の組合せ）を、Ｒｏｓｅｔｔａでモデル化した。少なくとも１つのＲｏｓｅｔｔａで予測された破壊突然変異をＤＳＣによって実験的に試験した代表的なアミノ酸位置を表３に示す。
【０３２７】
【表４】
2017521361.tif 000022
【０３２８】
（実施例８）
ＳＣＷＲＬ４モデル化を使用して同定される破壊的突然変異体
第２のモデル化方法は、界面中で突然変異される密接接触残基の側鎖の位置を予測するのにＳＣＷＲＬ４（Ｋｒｉｖｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７７（４）：７７８〜９５（２００９））を使用し、その後、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ、バージョン９．９、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２０１２））におけるエネルギー最小化を使用した。ＳＣＷＲＬステップにおいてバリエーションを用いて、２つのプロトコールをこの方法とともに使用した。「Ｂａｓｅ」法については、突然変異される側鎖のみを調整し、一方、「Ｒｅｐａｃｋ」法については、すべての側鎖を詰め直した。「Ｒｅｐａｃｋ」法からの結果が好適であった。これらが、破壊は、軽微な側鎖調整によって容易に和らげられないことを示すように予期されたためである。ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌステップは、ＧＢ／ＳＡ溶媒和とともにＯＰＬＳ−２００５力場を使用し、すべての水素原子および突然変異される残基の自由な移動を可能にした。他の原子は、１００ｋＪ／ｍｏｌ−Å２の束縛によって束縛されたが、エネルギー井戸上に０．２Åの半値幅のフラットボトムを伴った。各突然変異体について、ＳＣＷＲＬ４およびＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ計算を、結合状態、ならびに非結合の個々のＣＨ１およびＣＬドメインに対して実施し、結合エネルギーを、結合形態と非結合形態との間のエネルギー差異として算出した。この方法は、突然変異されている鎖上の歪みを直接測定せず、したがって最も有望なモデルを、立体的衝突、歪んだ結合角、または歪みの他の徴候について手作業で検分し、補償突然変異を、要求される場合加えた。およそ４０の異なるバリアントをモデル化および評価した。このプロトコールによって同定された有望な代表的な設計を、表４に列挙する（一部の突然変異は、ＲｏｓｅｔｔａおよびＳＣＷＲＬ４＋ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌの両方によって同定した）。
【０３２９】
【表５】
2017521361.tif 000023
【０３３０】
（実施例９）
モデル化からのコンストラクトの生成
各破壊突然変異セット（表３〜４中の各行）を含有する突然変異体Ａｂ  ２９Ｄ２コンストラクトの生成を試みた。ＣＨ１ドメインは、本質的に無秩序であり、ＣＬとの相互作用後にのみ、通常の折り畳みＩｇＧ構造を採用する。ＣＬと相互作用する前に、重鎖は、小胞体中で、シャペロン結合免疫グロブリンタンパク質（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢｉＰ）に結合して、折り畳まれていない状態で保持されている（Ｆｅｉｇｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、３４（５）：５６９〜７９（２００９））。したがって、モデル化された設計がＣＨ１／ＣＬ相互作用を完全に破壊する場合、どの材料も、さらなる特徴付けのために単離可能でない。コンストラクトＨ２、Ｈ３、Ｈ６、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ８、Ｌ１１、Ｌ１２、およびＬ１４は、精製にとって十分に発現し、ＣＨ１／ＣＬ結合のせいぜい部分的な破壊を示した。中程度に低減された発現（１５μｇ／ｍＬ超の親の発現と比較して４μｇ／ｍＬ未満）が、コンストラクトＬ４およびＬ８についてＣＯＳ細胞内で観察された。９ｂ、９ｃ、１０ｂ、および１０ｃの発現は、試みなかった。
【０３３１】
（実施例１０）
発現されたコンストラクトのＤＳＣ
部位の構造的な多様性、ならびにＣＨ１およびＣＬ部位の同様の数の選択に基づいて、実施例９の発現されたＡｂ  ２９Ｄ７抗体バリアントのサブセットを、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による検査のために選択した（以下の表５を参照）。ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中のコンストラクトを、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に同じ緩衝液中で希釈した。試料および緩衝液（４００μＬ）を、９６ウェルディープウェルプレートに移し、ＤＳＣ（Ｃａｐ−ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のオートサンプラー内に置いた。計測器中に注入した後、試料を１０℃から１１０℃に１００℃／時間で加熱した。データを緩衝液およびベースラインで補正した後、３つの非二状態転移にフィッティングして融解温度を判定した。最も大きい変化がＴｍ２に見られ、転移をＦａｂドメインに割り当てた。表５に示した標準誤差を考慮すると、表５中のすべてのコンストラクトは、破壊突然変異を欠く抗体と比べて少なくともわずかに低減された熱安定性を有することが判明し、ＣＨ１／ＣＬ界面中の突然変異が抗体を不安定化することを示した。ＣＨ１（Ｈ２  Ｈ１０）の、およびＣＬ（Ｌ１、Ｌ４）の最大破壊を有するコンストラクトを、フォローアップ作業のために選択した。
【０３３２】
理論では、一方の鎖上に復帰突然変異（特に、反対の鎖上の立体的な「隆起」を収容するように設計した「穴」）、および他方の鎖上に天然配列を有する誤対合した抗体が依然として形成し得る。破壊突然変異は、すべての可能な誤対合の組合せを退けるために、ＣＨ１およびＣＬドメインの両方上で作製されなければならない場合があることが仮定された。したがって、Ｌ１およびＬ４を、ＤＳＣ実験におけるこれらのより小さい程度の破壊にもかかわらず、Ｈ１７に対して選択した。理由は、ＣＨ１およびＣＬの両方について複数の破壊選択肢を有することが好適であったためである。
【０３３３】
【表６】
2017521361.tif 000024
【０３３４】
（実施例１１）
復帰突然変異体
復帰突然変異を、上述したＳＣＷＲＬ＋ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌおよびＲｏｓｅｔｔａ２プロトコールを使用して、またはＲｏｓｅｔｔａ３配列トレランス法（Ｒｏｓｅｔｔａ  ３  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＳｍｉｔｈおよびＫｏｒｔｅｍｍｅ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６（７）：ｅ２０４５１（２０１１））を使用することによって設計した。ＳＣＷＲＬ＋ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌを用いて、破壊突然変異に由来する反対の鎖上の残基を、手動検分によって同定し、２つの鎖の空間的または静電的な相補性を潜在的に増大させる残基を記録した。これらの残基の二重または三重突然変異体の組合せを、ＳＣＷＲＬ＋ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌを用いて網羅的に列挙し、結合エネルギーを野生型配列と比較して、破壊的突然変異によって引き起こされる結合エネルギー喪失を有意に低減したアミノ酸置換を同定した。最新のコンピューティングクラスターで、このプロトコールは、数万の突然変異の組合せを評価することができる。例えば、復帰突然変異の１０００超の組合せを、表５のＨ１０の破壊例について考慮した。最大で数百万の突然変異体を評価したＲｏｓｅｔｔａ２プロトコールについては、復帰突然変異の探索を上述した。Ｒｏｓｅｔｔａ３配列トレランス法は、破壊突然変異を見つけるために設計されていないが、その設計は、復帰突然変異を見つけるのに適切である。破壊突然変異のモデル（他の方法の１つを使用して構築した）を、突然変異が破壊効果を回復させることができた近傍の残基のリスト（手動検分によって判定した）とともに、入力として提供した。このプロトコールからの主要な出力は、近傍の部位のそれぞれにおけるアミノ酸タイプの好感度ランキングである。次いでこれらの残基を含有する特異的配列を、配列トレランスソフトウェアを使用して、かつ／またはＳＣＷＲＬ＋ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌでモデル化した。配列トレランスパッケージでインプリメントされたデフォルトのボルツマン加重（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）配列ランキングに加えて、各位置のアミノ酸頻度の統計を、配列の上位スコア１％に１の加重、および残りの配列に０の加重を適用するステップ関数によって判定した方法も使用した。
【０３３５】
すべてのプロトコールについて、プロトコールのエネルギースコア、およびモデルの手動検分の組合せを使用して、最良の設計を選択した。突然変異された側鎖の回転異性体が既知の回転異性体（Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアで分配された回転異性体データからの）と密接に一致するモデルが、手動検分中に好適であった。複数の復帰設計が、特定の破壊突然変異体についてもっともらしいことが多かった。代表的な復帰設計を表６に示す。ＣＬ−Ｅ１２３とＣＨ１−Ｋ２２１との間など、天然塩橋が反転されている場合では、どの残基が破壊性であり、どれが復帰性であるかの割り当ては、自由裁量によって考慮され得る。
【０３３６】
要約すると、ＤＳＣによって確認した後に選択した突然変異の破壊セット（Ｌ１、Ｌ４、Ｈ２、Ｈ１０）について、推定上の復帰突然変異を、複数のコンピューターモデル化技法の組合せを使用して同定した。Ｌ１、野生型配列中の塩橋について、塩橋の反転（しかし、ＧｌｕがＡｓｐによって置き換えられた）が、試験する価値のあると判断された唯一の設計であった。他の３つの破壊設計については、複数のもっともらしい復帰設計が同定された。
【０３３７】
【表７】
2017521361.tif 000025
【０３３８】
（実施例１２）
破壊、復帰、および新規のジスルフィド突然変異を有する設計
突然変異体の追加のセットは、適切な場合分子モデル化に基づいて、表６に列挙した設計の１つまたは複数とともに、表２で強調した新規の鎖間ジスルフィド結合設計を組み込むことからなっていた。新規のジスルフィドを組み合わせて二重特異性設計にした場合では、天然ジスルフィドシステイン残基（ＣＨ１−Ｃ２３０およびＣＬ−Ｃ２１４）をともに、天然ジスルフィド結合を切断するためにセリン残基に突然変異させた。
【０３３９】
組合せのほとんどは、相補的と思われたが、一部の場合では、突然変異される残基は、互いに近くに存在し（突然変異間の予想外の相互作用のリスクを増大させていた）、または同一であった。例えば、Ｃｙｓ６設計は、突然変異ＣＬ−Ｅ１２３Ｃを使用し、そのことは、これが表６中のＣＬ−Ｅ１２３Ｋコンストラクトに適合しないことを意味する。Ｒ４．２およびＲ１０．３はともに、残基ＣＨ１−Ｌ１４３を突然変異させる。Ｒ４．１およびＲ１０．３は、同じ残基を突然変異させないが、構造的に隣接し、これらの間の思いがけない相互作用のリスクを増大させ、天然構造では、Ｒ４．１で使用される残基ＣＬ−Ｓ１３１は、Ｒ１０．３で使用されるＣＨ１−Ｌ１４３に接触する。例示的な適合性の設計は、表７の行に示されており、各行のＣＨ１およびＣＬの列は、対合した設計を構成している。
【０３４０】
【表８】
2017521361.tif 000026
【０３４１】
（実施例１３）
新規の静電相互作用を有する二重特異性抗体
一タイプのタンパク質界面選択性設計は、静電気的な相補性を伴い、この場合、界面の一方の側上の正電荷は、界面の反対側上の負電荷と対合される。電荷が反転されている界面の代替のバリアントが改変されている場合、選択性が起こり得る。
【０３４２】
本実施例では、現存するＣＨ−ＣＬドメイン塩橋に関与した各ドメインの対合した残基は、相互作用しているドメイン間で反転され得る。１つのこのような例は、表６のように、Ｋ２２１Ｄと組み合わされたＥ１２３Ｋである。最終的な二重特異性では、抗体の１つの結合アームは、野生型塩橋を有し、１つは、反転された塩橋を有する。
【０３４３】
上述した二段階設計プロセス（最初に表５のような１つまたは複数の破壊突然変異を見つけ、次いで表６のような補償性復帰突然変異を見つける）も、静電気的な選択性を改変することができ、この場合、表６のＲ４．１設計などのように、２つの荷電残基の１つのみが天然タンパク質中に存在する。ここで、天然残基は、ＣＬ−Ｓ１３１およびＣＨ１−Ｋ１４５である。プロセスの第１段階は、Ｌｙｓと同じ電荷の破壊突然変異、この場合、ＣＬ−Ｓ１３１Ｈを見つける。次いで、第２段階は、復帰突然変異、ＣＨ１−Ｋ１４５Ｅとして反対電荷に天然Ｌｙｓを突然変異させ、それは、好都合な静電相互作用を創り出す。
【０３４４】
しかし、いずれの天然残基も荷電されていない新規の好都合な静電的電荷相互作用を設計し、この新規の電荷相互作用を使用して界面選択性を推進することが概念的に可能である。第２の荷電残基の非存在下で、第１の荷電残基の導入は、破壊的でない場合があり（立体的接触などの他の理由でない限り）、したがって上述した二段階プロセスによって見つけられない場合がある。したがって、新規の静電相互作用改変のための異なるプロセスも使用した。
【０３４５】
新規の静電相互作用は、バルク溶媒への曝露がほとんどもしくはまったくない界面コア中に配置することができ、またはこれは、溶媒および両タンパク質鎖が出会う境界に配置することができる。ＣＨ１／ＣＬ界面コアを含めたコア領域は、一般に疎水性であり、荷電側鎖にとって理想的な環境でない。両残基の水素結合の可能性を完全に満たす最適な水素結合ネットワークを改変することができない限り、推定上の荷電残基は、互いにではなく、溶媒との相互作用（ＣＨ１およびＣＬドメインは非結合のままである）に対してエネルギー的優先権を有し得る。他方では、電荷相互作用が界面の周辺で改変される場合、荷電残基（特にＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＧｌｕ）は、電荷／電荷誤対合が、介在する溶媒によって著しく減衰させられた静電反発力を伴って、２つの同様に荷電した残基を互いに離れて向かせることを可能にし得るように十分にフレキシブルである。免疫系が突然変異された曝露された残基に対して抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を開始する場合、曝露された残基も、タンパク質治療剤の望まれないクリアランスのリスクを創り出す。新規の電荷相互作用設計の理想的な場合は、立体配置的に制限されたポケットであり、これは、著しい側鎖のフレキシビリティを可能にしないが、やはり十分に極性であり、その結果、相互作用している荷電残基は、近傍の残基または水分子との追加の極性相互作用によって安定化される。
【０３４６】
ＣＨ１／ＣＬ界面上のこのような領域を同定し、取り組みをそこに集中させた。ＣＨ１／ＣＬ界面は、両ドメインと密接に接触しており、バルク溶媒から概ね遮蔽されている水分子の２つのポケットを含む。ＰＤＢエントリー３ＱＱ９では、これらの水分子は、残基ＣＨ−２９２、ＣＨ−３１９、ＣＨ−４９８、ＣＨ−５０４、ＣＨ−５４４、ＣＬ−２５４、ＣＬ−２７９、ＣＬ−３５９、およびＣＬ−４９０と標識されたものを含む（図１６）。これらの水は、ＣＨ−Ｌ１２４、ＣＨ−Ｌ１４３、ＣＨ−Ｋ１４５、ＣＨ−Ｑ１７９、ＣＨ−Ｓ１８６、ＣＨ−Ｓ１８８、ＣＬ−Ｓ１３１、ＣＬ−Ｖ１３３、ＣＬ−Ｓ１６２、ＣＬ−Ｓ１７６、ＣＬ−Ｔ１７８、およびＣＬ−Ｔ１８０を含めたタンパク質側鎖に接触する。これらの残基のほとんどは、極性であるが、ＣＨ−Ｋ１４５のみが荷電している。ＳＣＷＲＬ／ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ法を使用して、ＣＨ１に対する１つの突然変異およびＣＬ上の１つ突然変異を伴い、天然残基がＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＬｙｓのすべての可能な組合せに突然変異されるこれらの残基のすべての可能な二重突然変異体を評価した。この手順は、単一設計段階で新規の好都合な電荷相互作用の両方の残基を改変した。完全なタンパク質リパッキングを伴わないプロトコールからの結果は、著しい調整を必要とすることなく天然側鎖回転異性体によって容易に適応される設計を優遇するのに好適であった。ポケット中の追加の残基、例えば、ＣＨ−Ｆ１７４、ＣＨ−Ｖ１７７、ＣＬ−Ｆ１１８、およびＣＬ−Ｑ１２８などを参考のために記載したが、初期設計スキャンの一部ではなかった。
【０３４７】
結果の検分は、ＣＨ−Ｌ１２４位およびＣＬ−Ｓ１７６位における突然変異が有望であることを示した。これらの残基の野生型の配向を図５Ａに示す。モデル化（図示せず）は、好都合な静電相互作用を、ＣＬ−Ｓ１７６Ｄと対合したＣＨ−Ｌ１２４Ｋの組合せから形成することができ、電荷相互作用の反転配向をＣＨ−Ｌ１２４ＥおよびＣＬ−Ｓ１７６Ｋで形成することができることを示した。しかし、いくつかの悪い立体的な接触が各場合において明白であった。モデルの手動検分は、前者の荷電対について、突然変異ＣＨ−Ｖ１９０ＳおよびＣＬ−Ｖ１３３Ｓは、歪みを和らげ、さらに、ＣＬ−Ｓ１３３は、ＣＨ−Ｋ１２４位および／またはＣＬ−Ｄ１７６位と追加の水素結合を形成し得ることを示唆した。同様に、相互作用の反転配向について、突然変異ＣＨ−Ｓ１８８ＧおよびＣＬ−Ｖ１３３Ｓを加えて、パッキング接触を改善した。これらの設計を作成し、実験的にバリデートした後、各電荷対設計のＸ線結晶構造を判定した。結果を図５のパネルＢおよびＣに示す。
【０３４８】
上記手順により、いずれかの配向（正のアミノ酸を有するＶＨおよび負のアミノ酸を有するＶＬ、または反対、したがってこれらは、「可逆性」電荷相互作用と見なされ得る）で有利に形成することができるいくつかの追加の潜在的な電荷相互作用を同定した。多くの場合、１つまたは複数の突然変異された側鎖は、別の近傍の側鎖との軽微な悪い接触を作り、または別の近傍の側鎖によって好適な回転異性体を採用することを防止された。これらの場合では、予測された二重突然変異体構造を、他の近傍の周囲の残基を最適化するためにＲｏｓｅｔｔａ配列トレランスプロトコールにまわした。
【０３４９】
同定された好都合な電荷相互作用設計を表８に示す。この表中の各行は、単一のＣＨ１／ＣＬ界面を修飾するのに使用することができる設計である。しかし、第１の列は、抗体の２つのＣＨ１／ＣＬ界面が、それぞれが２つの対をなした設計（電荷相互作用の「順」および「逆」配向）の１つを含有するように別個に改変されている設計の好適な対合を示す。好適な対合は、いずれかのＣＬが誤ったＣＨ１ドメインを会合するように試みる場合、明白な電荷／電荷反発をもたらすことになる。
【０３５０】
【表９】
2017521361.tif 000027
【０３５１】
（実施例１４）
Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖＸ線結晶構造
分子モデル化が好都合な静電相互作用の形成を正しく予測したか否かを確認するために、表８からのＳ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計のＸ線結晶構造を判定した（図５、パネルＢおよびＣ）。設計をそれぞれ、ＨＥＫ−２９３細胞内の一過性トランスフェクションによって組換えＦａｂ分子として発現させた（可変ドメインについて抗体Ａｂ１を使用して）。Ｆａｂを、ＰｏｒｏｓプロテインＡ樹脂へのバッチ結合、その後の０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ２．５を用いた溶出によって馴化培地から精製した。次いで、溶出したＦａｂを、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。Ｓ１  Ｆａｂは、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０％  ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ  プロリン中で結晶化させ、１０６．７、１２７．１、８４．５Åの単位格子の輪郭を伴った空間群Ｐ２１２１２で結晶化した。Ｓ１＿ｒｅｖは、１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ５．９、１４％  ＰＥＧ６０００の条件下で空間群Ｐ４２２１２（格子輪郭１１８．４、１１８．４、８４．２Å）の結晶を形成した。
【０３５２】
データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおいてビームライン１７−ＩＤで収集した。データを、Ａｕｔｏｐｒｏｃ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ．）を使用して処理した。構造は、探索モデルとしてそのリガンドとの複合体中で以前に解明された野生型Ｆａｂの構造（データを示さず）を使用して、Ｐｈａｓｅｒ（Ｐｈｅｎｉｘ）を用いて分子置換によって解明した。構造は、ｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ．）を使用して洗練させ、ｃｏｏｔを使用して構築した。Ｓ１設計のＦａｂは、１．３Åの分解能に回折し、１６．８％のＲ因子（１９．０％のＲｆｒｅｅ）に洗練された。Ｓ１＿ｒｅｖ結晶は、２．１Åの分解能に回折し、構造を１７．８％のＲ因子（２１．７％のＲｆｒｅｅ）に洗練された。
【０３５３】
Ｓ１＿ｒｅｖ設計では、ＣＬ−Ｋ１７６は、ＣＨ１−Ｅ１２４の両方のカルボキシル酸素と好都合な静電的接触をした（３．３Åおよび３．５Å、図５Ｃ）。Ｓ１設計では、ＣＨ１−Ｋ１２４は、ＣＬ−Ｄ１７６と同様であるが、わずかにより長い（３．５Åおよび３．７Å）接触をした。この実験結果により、理論的な設計が確認され、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖはともに、重要な設計された残基間で好都合な静電相互作用を有する。
【０３５４】
（実施例１５）
Ｆａｂアーム改変設計の混合
組合せの追加のセットは、表７からの行のいずれかのように改変された抗体の一方のＦａｂアーム、および表８に与えたＳ１アミノ酸置換を使用して改変された抗体の他方のＦａｂアームを使用する。表９は、得られた組合せを示す。
【０３５５】
【表１０】
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【０３５６】
（実施例１６）
修飾された二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２の設計
抗原１（ＡＧ１）に特異的な抗体１（Ａｂ１）を、そのＦａｂアームが、定常ドメイン界面で新規の静電相互作用を導入して、表８のＦａｂＩＤ  Ｓ１に表したようにＣＨ１およびＣカッパドメイン中に突然変異を含有するように突然変異させた。抗原２（ＡＧ２）に特異的な抗体２（Ａｂ２）を、そのＦａｂアームが、やはりドメイン界面で新規の静電相互作用を導入して、表８のＦａｂＩＤ  Ｓ１＿ＲＥＶに表したようにＣＨ１およびＣカッパドメイン中に突然変異を含有するように突然変異させた。ノブイントゥホール突然変異をＣＨ３ドメイン界面中に導入して、重鎖ヘテロ二量体化に偏りをかけた（Ｒｉｄｇｗａｙら、上記、およびＭｅｒｃｈａｎｔら、上記を参照）。一方のＣＨ３ドメインでは、ＣＨ３−Ｙ３７０をＣに突然変異させ、ＣＨ３−Ｔ３８９をＷに突然変異させ、立体的な隆起を創り出した（「ノブ」鎖と呼ばれる；残基の番号付けは、元の参考文献のＥＵ番号付けとは対照的にＫａｂａｔに適合する）。反対のＣＨ３ドメインでは、ＣＨ３−Ｓ３７５をＣに、ＣＨ３−Ｔ３８９をＳに、ＣＨ３−Ｌ３９１をＡに、かつＣＨ３−Ｙ４３８をＶに突然変異させ、腔（「ホール」鎖と呼ばれる）、したがって２つの異なるＣＨ３ドメイン間に立体的な相補性を創り出した。ＣＨ３−Ｃ３７０およびＣＨ３−Ｃ３７５は、鎖間ジスルフィド結合を形成してヘテロ二量体を安定化させる。Ｆａｂ重鎖／軽鎖界面は、突然変異を帯びない（野生型界面）が、重鎖ヘテロ二量体化突然変異が依然として存在する適切な対照を生じさせた。Ａｂ１の重鎖、Ａｂ２の重鎖、Ａｂ１の軽鎖、およびＡｂ２の軽鎖を含む合計４本の鎖を哺乳動物細胞内に同時にトランスフェクトし、正しい軽鎖対合のレベルを、ＢＩＡｃｏｒｅベース化学量論分析、質量分析、および陰イオン交換クロマトグラフィーによる異種性評価を介して評価した。生物物理学的な分析結果を、重鎖ヘテロ二量体化突然変異を含有するが、重鎖および軽鎖間の界面で突然変異を含有しない対照と比較した。抗体のアイソタイプは、エフェクター機能を切断するヒンジ／ＣＨ２重鎖突然変異（Ｌ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、およびＧ２５０Ａ）を有するヒトＩｇＧ１であった。表９に示した追加の突然変異設計も、正しい軽鎖対合の傾向を評価するためにＡｂ１／Ａｂ２抗体を使用して実験的に評価した。
【０３５７】
（実施例１７）
二重特異性抗体の発現
二重特異性抗体遺伝子を、新規の遺伝子合成および制限酵素−ライゲーションベースクローニング技法を使用して構築した。軽鎖遺伝子をｐＳＭＥＮ３中にクローニングし、重鎖遺伝子をｐＳＭＥＤ２中にクローニングした。懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を、３７℃で７％ＣＯ２とともに加湿したインキュベーター内で維持した。馴化培地は、標準的な一過性のＨＥＫ２９３Ｆトランスフェクションプロセスから生成した。馴化培地を０．２μｍフィルターに通して濾過した後、精製した。典型的には、二重特異性抗体は、馴化培地中に５〜５０ｍｇ／Ｌの範囲で発現した。
【０３５８】
（実施例１８）
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現された抗体の精製
濾過した馴化培地を、ＰＢＳ−ＣＭＦ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）で平衡化したＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填した。樹脂をＰＢＳ−ＣＭＦ  ｐＨ７．２  １０カラム容積で洗浄した後、抗体をプロテインＡ溶出緩衝液（２０ｍＭ  クエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）の０〜１００％の直線勾配で溶出した。ピーク画分を２Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を用いてｐＨ７．０に中和し、プールした。材料を、ＰＢＳ−ＣＭＦ  ｐＨ７．２中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００分取サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮し、０．２μｍで濾過した。
【０３５９】
分析ＳＥＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムに接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。抗体ｖ−ドメインの組合せに応じて、典型的な％高分子量種は、２〜２０％の範囲であり、低分子量種は、１５０ｋＤａの二重特異性抗体種を表す目的の支配的なピーク以外に観察されなかった。
【０３６０】
（実施例１９）
二重特異性抗体（Ａｂ１／Ａｂ２）の質量分光分析
二重特異性抗体の生成を確認するために、Ａｂ１およびＡｂ２のＦａｂ断片を質量分析によって分析した。Ａｂ１およびＡｂ２に由来するＦａｂ断片の分子量は、これらのユニークなアミノ酸配列によって定義され、正確な分子量判定は、正しく対合した抗体の存在の証拠をもたらす。
【０３６１】
二重特異性抗体を、４００：１のタンパク質：酵素比でＬｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ）とともにインキュベートし、３７℃で２０分間インキュベートした。消化反応を、水中の０．１％ギ酸を添加してクエンチした。消化した試料を、Ｗａｔｅｒ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とカップリングしたＡｇｌｉｅｎｔ  １１００キャピラリーＨＰＬＣでのＬＣ／ＭＳ分析によって分析した。分析物を、０．１％ギ酸とともにＺｏｒｂａｘ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ  Ｃ３カラム（１．０ｍｍ×７５ｍｍ、８０℃で維持した）に装填し、４分にわたって６５μｌ／分の流量で１５〜９８％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）の勾配を使用して溶出した。質量分析検出を、キャピラリー電圧を３．３ｋＶに設定して正、感度モードで実施した。データ分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ中のＭａｘＥｎｔ１関数を用いて実施した。
【０３６２】
二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２のＦａｂ分析は、検出されたＦａｂ断片の大部分が、図６に示したように正しく対合したＡｂ１およびＡｂ２であることを実証した。ＣＨ１／ＣＬ−カッパ界面での本発明者らの新規の突然変異の導入に対して、Ａｂ１とＡｂ２との間の誤って対合した軽鎖の著しい低減があった。Ｆｃ分析は、重鎖の大部分がＡｂ１に由来する１本の重鎖およびＡｂ２に由来する１本の重鎖から構成されていることを示唆する。重鎖ホモ二量体は、検出されなかった（図７）。
【０３６３】
（実施例２０）
二重特異性抗体（Ａｂ１／Ａｂ２）のタンデム陰イオン交換および質量分光分析
Ｑ−ＳＴＡＴ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０  ＵＨＬＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プロテインＡおよび分取ＳＥＣクロマトグラフィーによって精製した二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２タンパク質およそ２０〜３０μｇを、１ｍＬ／分の流量で、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．６で平衡化したカラムに注入した。次いでタンパク質を、０〜１００％の７分の直線勾配で、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．６中の１Ｍ  ＮａＣｌで溶出させた。
【０３６４】
タンパク質は、２８０ｎｍの吸収によって検出した。この分析の結果を、図８に示す。親抗体を図８パネルＡに示す。親Ａｂ１（図８Ａ（ｉ））は、明らかな均質の単一ピークを示す。Ａｂ２の陰イオン交換クロマトグラム（図８Ａ（ｉｉ））は、それぞれ主ピークの前および後に溶出する酸性および塩基性電荷種の集団を示し、抗体調製物の割合に影響するＡｂ２  Ｆａｂアーム内の翻訳後修飾によって引き起こされる異種性を表す。二重特異性ヘテロ二量体Ａｂ１／Ａｂ２抗体を、図８パネルＢに示す。このクロマトグラムは、親抗体（Ａｂ２）から二重特異性抗体への電荷不均一性の組込みを示す。プロットは、タンパク質種のおよそ６０％を占める主ピーク（ピーク１）からなる。残りのタンパク質の３２％を占めるピーク２は、２つのサブピーク（ピーク２Ａおよびピーク２Ｂ）からなる。タンパク質の残り８％は、２つの軽微なピークに分けられる。
【０３６５】
二重特異性Ａｂ１／Ａｂ２分画からのピーク１、２Ａ、および２Ｂに由来する材料を含有し、またはこの材料に富んだ画分を、上述したＦａｂアーム単離のために収集および処理し、質量分析によって分析した（図９）。３つの陰イオン交換画分の分析により、ピーク１が、予期されたＭＷに基づいて正しい軽鎖対合を伴った２つのＦａｂアームのみを含有することが明らかになった。画分２Ａは、正しく対合したａｂ２  Ｆａｂに加えて、Ａｂ１の重鎖およびＡｂ２からの軽鎖からなる誤って対合したＦａｂに富んでいる。画分２Ｂは、正しく対合したＡｂ１  Ｆａｂおよび正しく対合したＡｂ２  Ｆａｂからなるが、後者は、親抗体から継承された翻訳後修飾を含有する。
【０３６６】
（実施例２１）
ＤＳＣ分析
ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中の二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２を、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に同じ緩衝液中で希釈した。さらに、タンパク質を、１０ｋＤａ  カットオフ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットを使用して、Ｈｉｓ：スクロース（２０ｍＭ  Ｈｉｓ、８．５％  スクロース、５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中に２つの緩衝液変更を用いて一晩透析し、引き続いて０．３ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料および緩衝液（４００μＬ）を、９６ウェルディープウェルプレートに移し、ＤＳＣ（Ｃａｐ−ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のオートサンプラー内に置いた。計測器中に注入した後、試料を１０℃から１１０℃に１００℃／時間で加熱した。データを緩衝液およびベースラインで補正した後、２つの非二状態転移にフィッティングして融解温度を判定した。グラフ的に、ＰＢＳおよびＨｉｓ：スクロース中の熱的プロファイルは、広く同様である。これは、得られたＴｍ値にも反映されている（表１０）。
【０３６７】
【表１１】
2017521361.tif 000029
【０３６８】
（実施例２２）
高濃度の二重特異性抗体の安定性
二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２を、１０ｋＤａ  カットオフ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットを使用して、Ｈｉｓ：スクロース（２０ｍＭ  Ｈｉｓ、８．５％  スクロース、５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中に２つの緩衝液変更を用いて一晩透析した。タンパク質を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００濃縮器、１０ｋＤａカットオフに移し、１４，０００ｇで回転させた。到達した最終濃度は、１１２ｍｇ／ｍＬであった。試料を、プラスチックＳＥＣバイアルに移し、鉱油２０μＬを覆い被せた。試料を室温にて暗所で貯蔵した。各時点について、試料をＡｇｉｌｅｎｔ１２００内に置き、ランニング緩衝液としてのＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）、流量０．５ｍＬ／分、１５分のランを使用して、１μＬをＴＯＳＯＨ  ＱＣ−ＰＡＫ  ３００カラムに注入した。ピーク下面積を各注入に対して監視した。平均回収率は、１０６±２％であった。良好な回収率という状況から、パーセント凝集体を、モノマーピークの曲線下面積を凝集体ピークのものと比較することによって得た。室温で１４週間後、わずか２．４％の凝集が観察された（表１１）。
【０３６９】
【表１２】
2017521361.tif 000030
【０３７０】
（実施例２３）
抗体１（Ａｂ１）×抗体２（Ａｂ２）対サイトカイン１×サイトカイン２のＢＩＡｃｏｒｅ分析
表８からの対１から使用したＦａｂアーム突然変異（Ｆａｂ  ＩＤ  Ｓ１およびＳ１＿Ｒｅｖ）
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｔ２００モデル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合化学量論比の分析を行った。結合分析を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝溶液からなるランニング緩衝液を使用して行った。抗ヒト抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１２，０００ＲＵを、ヒト抗体捕捉キット（部品ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供給された製造者の指示書に従って、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面にアミンカップリング化学を介して固定化した。抗ヒト抗体を、参照および試験フローセルの両方にアミンカップリングさせた。結合化学量論比を測定するために、精製した推定上の二重特異性抗体１００〜２００ＲＵを、１〜１０ｎＭの濃度で３０〜６０秒にわたって１０μＬ／分の流量で試験フローセル上に捕捉した。６０秒にわたってサイトカイン／抗体相互作用のＫＤの１００倍を超える飽和濃度で、５０μＬ／分の流量で両方のフローセル上にサイトカイン１を引き続いて流し、この時点で、反応は、定常状態に到達していた。サイトカインおよび試験抗体を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を使用して表面から剥がした。このＭｇＣｌ２は、３０〜４０秒にわたって１０μＬ／分でチップ表面に曝露した。次いで注入ポートを、次のサイクルの前にランニング緩衝液で洗浄した。次いで、記載したプロセスを、サイトカイン２を使用して繰り返した。サイトカインの分子量（ＭＷＣ）、抗体の分子量（ＭＷＡ）、捕捉された試験抗体の量（ＡＢ−ＲＵ）、および飽和でのサイトカインの観察された結合（Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ）に基づいて、観察された結合化学量論比（ＯＢＳＴ）を計算した。このための式は、
ＯＢＳＴ＝［Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ］／［（ＭＷＣ／ＭＷＡ）×ＡＢ−ＲＵ］
であった。
【０３７１】
これらの試験において、式の既知の要素は、サイトカインおよび抗体のＭＷ、捕捉された抗体のＲＵ、ならびに飽和でのサイトカイン結合のＲＵであり、後者の２つの変数は、実験的に測定した。その情報から、観察された結合化学量論比を計算した。それは、各それぞれの抗原について正しく形成されたＦａｂアームを有する捕捉抗体分子の％を推測する。理由は、誤った重鎖／軽鎖対合を有するＦａｂアームが、所与のサイトカインへの所与のＦａｂアームの検出可能な結合無し、およびしたがって抗体集団全体を表すプールされた結合化学量論比の低減をもたらすことになるためである。この後者の事実を、抗体１重鎖に抗体２軽鎖をトランスフェクトし、逆の場合も同様にした試験、およびＥＬＩＳＡによって試験した各抗原への結合から検証した（データを示さず）。Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓのデータを、参照を差し引いたデータから生成し、経時的なチップ表面からの抗体の根本的な解離によって引き起こされるベースラインドリフト、および非特異的結合について調整した。結合化学量論比を、親二価陽性対照抗体への飽和結合に基づいて正規化した。
【０３７２】
推定上の二重特異性抗体のサイトカイン１およびサイトカイン２についての飽和結合化学量論比を、二価単一特異性陽性対照、および軽鎖対合のすべての順列を呈し、したがって全体的な化学量論比にインパクトを与えるＦａｂアーム改変を伴わない対照と比較した。データ（表１２）は、Ｆａｂアーム改変された新規の静電相互作用が、正しい軽鎖会合に向けた偏りのためのＦａｂアーム改変された静電相互作用を欠く陰性対照と比較して、１：１に著しくより近い結合化学量論比を伴って少なくも９０％に正しい軽鎖対合を増大させることを示す。
【０３７３】
【表１３】
2017521361.tif 000031
【０３７４】
（実施例２４）
抗体１（Ａｂ１）×抗体２（Ａｂ２）対サイトカイン１×サイトカイン２  −  複数の追加の設計の評価
一方のＦａｂアームにおいて表７から使用し、かつ天然界面を持つ他方のＦａｂアームを伴ったＦａｂアーム突然変異
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｔ２００モデル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合化学量論比の分析を行った。結合分析を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝溶液からなるランニング緩衝液を使用して行った。抗ヒト抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１２，０００ＲＵを、ヒト抗体捕捉キット（部品ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供給された製造者の指示書に従って、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面にアミンカップリング化学を介して固定化した。抗ヒト抗体を、参照および試験フローセルの両方にアミンカップリングさせた。結合化学量論比を測定するために、推定上の二重特異性抗体１００〜２００ＲＵを、１〜１０ｎＭの濃度で３０〜６０秒にわたって１０μＬ／分の流量で試験フローセル上に未精製の馴化培地から捕捉した。６０秒にわたってサイトカイン／抗体相互作用のＫＤの１００倍を超える飽和濃度で、５０μＬ／分の流量で両方のフローセル上にサイトカイン１を引き続いて流し、この時点で、反応は、定常状態に到達していた。サイトカインおよび試験抗体を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を使用して表面から剥がした。このＭｇＣｌ２は、３０〜４０秒にわたって１０μＬ／分でチップ表面に曝露した。次いで注入ポートを、次のサイクルの前にランニング緩衝液で洗浄した。次いで、記載したプロセスを、サイトカイン２を使用して繰り返した。サイトカインの分子量（ＭＷＣ）、抗体の分子量（ＭＷＡ）、捕捉された試験抗体の量（ＡＢ−ＲＵ）、および飽和でのサイトカインの観察された結合（Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ）に基づいて、観察された結合化学量論比（ＯＢＳＴ）を計算した。このための式は、ＯＢＳＴ＝［Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ］／［（ＭＷＣ／ＭＷＡ）×ＡＢ−ＲＵ］であった。
【０３７５】
これらの試験において、式の既知の要素は、サイトカインおよび抗体のＭＷ、捕捉された抗体のＲＵ、ならびに飽和でのサイトカイン結合のＲＵであり、後者の２つの変数は、実験的に測定した。その情報から、観察された結合化学量論比を計算した。それは、各それぞれの抗原について正しく形成されたＦａｂアームを有する捕捉抗体分子の％を推測する。理由は、誤った重鎖／軽鎖対合を有するＦａｂアームが、所与のサイトカインへの所与のＦａｂアームの検出可能な結合無し、およびしたがって抗体集団全体を表すプールされた結合化学量論比の低減をもたらすことになるためである。Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓのデータを、参照を差し引いたデータから生成し、経時的なチップ表面からの抗体の根本的な解離によって引き起こされるベースラインドリフト、および非特異的結合について調整した。結合化学量論比を、親二価陽性対照抗体への飽和結合に基づいて正規化した。
【０３７６】
推定上の二重特異性抗体のサイトカイン１およびサイトカイン２についての飽和結合化学量論比を、軽鎖対合のすべての順列を呈し、したがって全体的な化学量論比にインパクトを与えるＦａｂアーム改変を伴わない対照と比較した。データ（表１３）は、表７からのＦａｂアーム改変された突然変異が、天然重鎖／軽鎖Ｆａｂアーム界面を有する陰性対照と比較して、正しい軽鎖対合を増大させることを示す。
【０３７７】
【表１４】
2017521361.tif 000032
【０３７８】
（実施例２５）
抗体１（Ａｂ１）×抗体２（Ａｂ２）対サイトカイン１×サイトカイン２  −  複数の追加の設計の評価
表９に要約した、表７から使用したＦａｂアーム突然変異（一方のアームにおける）および表８からの静電相互作用突然変異（他方のアームにおけるＦａｂ  ＩＤ  Ｓ１）
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｔ２００モデル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合化学量論比の分析を行った。結合分析を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝溶液からなるランニング緩衝液を使用して行った。抗ヒト抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１２，０００ＲＵを、ヒト抗体捕捉キット（部品ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供給された製造者の指示書に従って、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面にアミンカップリング化学を介して固定化した。抗ヒト抗体を、参照および試験フローセルの両方にアミンカップリングさせた。結合化学量論比を測定するために、推定上の二重特異性抗体１００〜２００ＲＵを、１〜１０ｎＭの濃度で３０〜６０秒にわたって１０μＬ／分の流量で試験フローセル上に未精製の馴化培地から捕捉した。６０秒にわたってサイトカイン／抗体相互作用のＫＤの１００倍を超える飽和濃度で、５０μＬ／分の流量で両方のフローセル上にサイトカイン１を引き続いて流し、この時点で、反応は、定常状態に到達していた。サイトカインおよび試験抗体を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を使用して表面から剥がした。このＭｇＣｌ２は、３０〜４０秒にわたって１０μＬ／分でチップ表面に曝露した。次いで注入ポートを、次のサイクルの前にランニング緩衝液で洗浄した。次いで、記載したプロセスを、サイトカイン２を使用して繰り返した。サイトカインの分子量（ＭＷＣ）、抗体の分子量（ＭＷＡ）、捕捉された試験抗体の量（ＡＢ−ＲＵ）、および飽和でのサイトカインの観察された結合（Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ）に基づいて、観察された結合化学量論比（ＯＢＳＴ）を計算した。このための式は、ＯＢＳＴ＝［Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ］／［（ＭＷＣ／ＭＷＡ）×ＡＢ−ＲＵ］であった。
【０３７９】
これらの試験において、式の既知の要素は、サイトカインおよび抗体のＭＷ、捕捉された抗体のＲＵ、ならびに飽和でのサイトカイン結合のＲＵであり、後者の２つの変数は、実験的に測定した。その情報から、観察された結合化学量論比を計算した。それは、各それぞれの抗原について正しく形成されたＦａｂアームを有する捕捉抗体分子の％を推測する。理由は、誤った重鎖／軽鎖対合を有するＦａｂアームが、所与のサイトカインへの所与のＦａｂアームの検出可能な結合無し、およびしたがって抗体集団全体を表すプールされた結合化学量論比の低減をもたらすことになるためである。Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓのデータを、参照を差し引いたデータから生成し、経時的なチップ表面からの抗体の根本的な解離によって引き起こされるベースラインドリフト、および非特異的結合について調整した。結合化学量論比を、親二価陽性対照抗体への飽和結合に基づいて正規化した。
【０３８０】
推定上の二重特異性抗体のサイトカイン１およびサイトカイン２についての飽和結合化学量論比を、軽鎖対合のすべての順列を呈し、したがって全体的な化学量論比にインパクトを与えるＦａｂアーム改変を伴わない対照と比較した。データ（表１４）は、表９からの選択されたＦａｂアーム改変された突然変異が、天然重鎖／軽鎖Ｆａｂアーム界面を有する陰性対照と比較して、正しい軽鎖対合を増大させることを示す。
【０３８１】
【表１５】
2017521361.tif 000033
【０３８２】
（実施例２６）
修飾二重特異性抗体Ｃ５×Ａｂ３
ヒトＣＣＬ２０に特異的な抗ＣＣＬ２０抗体（クローンＣ５）をファージライブラリーから単離し、ＩｇＧ１形式に変換した。そのＦａｂアームは、表８のＦａｂ  ＩＤ  Ｓ１＿Ｒｅｖに表したＣＨ１およびＣ−カッパドメイン中に突然変異を含有し、定常ドメイン界面で新規の静電相互作用を導入した。ヒトＩＬ１３に特異的な抗ＩＬ１３抗体（クローンＡｂ３）を、そのＦａｂアームが、表８のＦａｂ  ＩＤ  Ｓ１に表したＣＨ１およびＣ−カッパドメイン中に突然変異を含有し、やはりドメイン界面で新規の静電相互作用を導入するように突然変異させた。突然変異の２つの異なるセットを、以下の実施例において方法１（Ｍ１）と呼ぶノブイントゥホール（Ｒｉｄｇｗａｙら、上記、およびＭｅｒｃｈａｎｔら、上記を参照）、または方法２（Ｍ２）と呼ぶＳｔｒｏｐら、上記、およびＷＯ２０１１／１４３５４５に開示されたヘテロ二量体化法によって、重鎖ヘテロ二量体化に偏りをかけるようにＣＨ３ドメイン中に導入した。Ｍ１、抗ＩＬ１３クローンＡｂ３重鎖（Ｆａｂ  ＩＤ  Ｓ１を有する）について、ＣＨ３ドメインは、重鎖ヘテロ二量体化のために以下の突然変異を有していた：ＣＨ３−Ｙ３７０をＣに突然変異させ、ＣＨ３−Ｔ３８９をＷに突然変異させ、立体的な隆起（「ノブ」鎖と呼ぶ）を創り出した。抗ＣＣＬ２０クローンＣ５重鎖（Ｆａｂ  ＩＤ  Ｓ１＿Ｒｅｖを有する）では、ＣＨ３ドメインは、重鎖ヘテロ二量体化のために以下の突然変異を有していた：腔（「ホール」鎖と呼ぶ）、したがって、２つの異なるＣＨ３ドメイン間で立体的な相補性を創り出すＣＨ３−Ｓ３７５Ｃ、ＣＨ３−Ｔ３８９Ｓ、ＣＨ３−Ｌ３９１Ａ、およびＣＨ３−Ｙ４３８Ｖ。Ｃｙｓ−３７０およびＣｙｓ−３７５は、鎖間ジスルフィド結合を形成して、ヘテロ二量体を安定化させる。Ｍ２設計では、使用した突然変異は、抗ＩＬ１３  Ａｂ３重鎖上にＤ２３２Ｒ、Ｐ４４１Ｒ、およびＫ４４０Ｒ、ならびに抗−ＣＣＬ２０  Ｃ５重鎖上にＤ’２３２Ｅ、Ｐ’４４１Ｅ、Ｌ’３９１Ｅを含む。Ｆａｂ重鎖／軽鎖界面は、突然変異を帯びない（野生型界面）が、重鎖ヘテロ二量体化突然変異（方法１または方法２）が依然として存在する適切な対照を生じさせた。すべての抗体は、ヒンジ／ＣＨ２エフェクター機能切断突然変異（Ｌ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、およびＧ２５０Ａ）を有するＩｇＧ１アイソタイプであった。Ａｂ３の重鎖、Ｃ５の重鎖、Ａｂ３の軽鎖、およびＣ５の軽鎖を含む合計４本の鎖を哺乳動物細胞内に同時にトランスフェクトし、正しい軽鎖対合のレベルを、重鎖ヘテロ二量体化突然変異を含有するが、重鎖と軽鎖との間の界面で突然変異を含有しない対照と比較して、様々な生物物理学的分析技法を介して評価した。４つの別個の発現を実施した。第１のもの（「Ａｂ３×Ｃ５−Ｍ１」と呼ぶ）は、重鎖ヘテロ二量体化方法Ｍ１と組み合わせて、上記に論じたＦａｂアーム突然変異（表７からのＦａｂ  ＩＤ  Ｓ１およびＳ１＿Ｒｅｖ）からなる。第２の発現は、第１のものの対照であり（「Ａｂ３×Ｃ５−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ」と呼ぶ）、Ｆａｂアーム中に突然変異はないが、重鎖ヘテロ二量体化突然変異が存在する（方法Ｍ１）。第３の発現（「Ａｂ３×Ｃ５−Ｍ２」と呼ぶ）は、重鎖ヘテロ二量体化方法Ｍ２と組み合わせて、上記に論じたＦａｂアーム突然変異（表７からのＦａｂ  ＩＤ  Ｓ１およびＳ１＿Ｒｅｖ）からなる。第４の発現は、第３のものの対照であり（「Ａｂ３×Ｃ５−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥ」と呼ぶ）、Ｆａｂアーム中に突然変異はないが、重鎖ヘテロ二量体化突然変異が存在する（方法Ｍ２）。対照対試験中に存在する正しい軽鎖対合のレベルを比較することによって、突然変異の効果を評価することができる。二重特異性抗体ＣＣＬ２０×Ａｂ３を、Ａｂ１／Ａｂ２について実施例１６および１７で上記に論じたように発現させ、精製した。
【０３８３】
（実施例２７）
二重特異性抗体Ｃ５×Ａｂ３の質量分光分析
デュアルアーム抗体（Ｃ５＆Ａｂ３）コンストラクトのＦａｂ生成およびＬＣ／ＭＳ分析を、Ａｂ１／Ａｂ２について上述したのと同じ方法論を使用して実施した。上述した合計４つのコンストラクトを分析して、Ｆａｂ分子量測定に基づいて重鎖および軽鎖の存在を判定した。
【０３８４】
Ｃ５×Ａｂ３−Ｍ１およびＣ５×Ａｂ３−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥコンストラクトのデコンボリューション質量スペクトルを図１０に示す。この場合、かなりの量の誤って対合したＦａｂ（Ａｂ３軽鎖とのＣ５重鎖＆Ａｂ３重鎖とのＣ５軽鎖）が、コンストラクトＣ５×Ａｂ３−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ中で検出された（合計強度の２４．８％が誤って対合したＦａｂに由来する）。しかし、誤って対合したＦａｂの量は、そのＦａｂアーム中に存在する記載した静電相互作用突然変異を有するＣ５×Ａｂ３−Ｍ１において低減された。正しく軽鎖対合したＩｇＧのレベルは、およそ９５％に上昇した。
【０３８５】
コンストラクトＣ５×Ａｂ３−Ｍ２およびＣ５×Ａｂ３−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥのデータ（図１１）は、コンストラクトＣ５×Ａｂ３−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥ中の誤って対合したＦａｂの強度は、２８．５％になり、コンストラクトＣ５×Ａｂ３−Ｍ２中の誤対合したＦａｂは、４．６％に低減されることを示す。誤った対合のかなりの低減は、改変された静電相互作用突然変異の有効性を実証する。
【０３８６】
（実施例２８）
ＤＳＣ分析
以下の表１５に列挙したタンパク質を、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に入れ、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に同じ緩衝液中で希釈した。試料および緩衝液（４００μＬ）を、９６ウェルディープウェルプレートに移し、ＤＳＣ（Ｃａｐ−ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のオートサンプラー内に置いた。計測器中に注入した後、試料を１０℃から１１０℃に１００℃／時間で加熱した。データを緩衝液およびベースラインで補正した後、２または３つの非二状態転移にフィッティングして融解温度を判定した。全体的に、これらはすべて、高いＴｍ値を伴って安定なタンパク質であった。
【０３８７】
【表１６】
2017521361.tif 000034
【０３８８】
（実施例２９）
ｐＨ可逆性
以下の表１６に列挙したタンパク質を、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に入れ、同じ緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈した。２つの２０μＬのアリコートに、ＰＢＳ  ０．８μＬを添加した。２つのさらなる２０μＬのアリコートを、１０×プロテインＡ溶出緩衝液（２００ｍＭ  クエン酸、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．０）０．８μＬを添加することによって約ｐＨ３．５に酸性化した。４℃で２４時間後、さらなるＰＢＳ  ０．５μＬを、以前にＰＢＳを添加されていた試料に添加し、一方、酸性化した試料を、２Ｍ  トリス  ｐＨ８．０緩衝液０．５μＬを添加することによって中和した。試料をＡｇｉｌｅｎｔ１２００システムに装填し、ランニング緩衝液としてのＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）、流量０．５ｍＬ／分、１５分のランを使用して、１５μＬをＴＯＳＯＨ  ＱＣ−ＰＡＫ３００カラムに注入した。各注入からのパーセントモノマーを記録し、各試料中のパーセント凝集体を計算するのに使用した。凝集の有意な増大は、酸性化後に観察されなかった。
【０３８９】
【表１７】
2017521361.tif 000035
【０３９０】
（実施例３０）
強制凝集
以下の表１７に列挙したタンパク質を、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に入れ、同じ緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈した。アリコート（２０μＬ）を９６ウェルプレート中に置き、鉱油４０μＬを覆い被せ、２４時間にわたって勾配ＰＣＲブロック中で４０℃、４３．９℃、５０℃、５４℃、６０．１℃、および６４℃でインキュベートした。この後、アリコートをＡｇｉｌｅｎｔ１２００システムに装填し、ランニング緩衝液としてのＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）、流量０．５ｍＬ／分、１５分のランを使用して、１５μＬをＴＯＳＯＨ  ＱＣ−ＰＡＫ３００カラムを注入した。各注入からのパーセントモノマーを記録し、各試料中のパーセント凝集体を計算するのに使用した。回収率が著しい凝集に起因して低かった場合、ピーク面積を、凝集体のパーセントを計算するのに使用した。一価の二重特異性は、５４℃から著しい凝集を示し、一方、二価の二重特異性は、この温度で依然として安定であった。一価のＣ５×Ａｂ３−Ｍ２は、Ｃ５×Ａｂ３−Ｍ１より凝集しやすかった。
【０３９１】
【表１８】
2017521361.tif 000036
【０３９２】
（実施例３１）
Ｂｉａｃｏｒｅ分析  ＣＣＬ２０−クローン５（Ｃ５）×ＩＬ１３−クローンＡｂ３（Ａｂ３）抗原：ヒトＣＣＬ２０×ヒトＩＬ１３
表８からの対１から使用したＦａｂアーム突然変異（Ｆａｂ  ＩＤ  Ｓ１およびＳ１＿Ｒｅｖ）
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｔ２００モデル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合化学量論比の分析を行った。結合分析を、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  界面活性剤ｐ２０を含有するｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ）からなるランニング緩衝液を使用して行った。組換えプロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）１５００ＲＵを、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランチップにアミンカップリング化学を介して固定化した。組換えプロテインＡを、参照および試験フローセルの両方にアミンカップリングさせた。結合化学量論比を測定するために、推定上の二重特異性抗体１００〜２００ＲＵを、１〜１０ｎＭの濃度で３０〜６０秒にわたって１０μＬ／分の流量で試験フローセル上に捕捉した。６０秒にわたってＣＣＬ２０／抗体相互作用のＫＤの１００倍を超える飽和濃度で、５０μＬ／分の流量で両方のフローセル上に組換えヒトＣＣＬ２０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を引き続いて流し、この時点で、反応は、定常状態に到達していた。サイトカインおよび試験抗体を、１０ｍＭ  グリシン−ＨＣＬ  ｐＨ１．７を使用して表面から剥がした。このグリシン−ＨＣＬは、３０秒にわたって１０μＬ／分でチップ表面に曝露した。次いで注入ポートを、次のサイクルの前にランニング緩衝液で洗浄した。次いで、記載したプロセスを、組換えヒトＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して繰り返した。サイトカインの分子量（ＭＷＣ）、抗体の分子量（ＭＷＡ）、捕捉された試験抗体の量（ＡＢ−ＲＵ）、および飽和でのサイトカインの観察された結合（Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ）に基づいて、観察された結合化学量論比（ＯＢＳＴ）を計算した。このための式は、ＯＢＳＴ＝［Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓ］／［（ＭＷＣ／ＭＷＡ）×ＡＢ−ＲＵ］であった。
【０３９３】
これらの試験において、式の既知の要素は、サイトカインおよび抗体のＭＷ、捕捉された抗体のＲＵ、ならびに飽和でのサイトカイン結合のＲＵであり、後者の２つの変数は、実験的に測定した。その情報から、観察された結合化学量論比を計算した。それは、各それぞれの抗原について正しく形成されたＦａｂアームを有する捕捉抗体分子の％を推測する。理由は、誤った重鎖／軽鎖対合を有するＦａｂアームが、所与のサイトカインへの所与のＦａｂアームの検出可能な結合無し、およびしたがって抗体集団全体を表すプールされた結合化学量論比の低減をもたらすことになるためである。Ｒｍａｘ＿Ｏｂｓのデータを、参照を差し引いたデータから生成し、経時的なチップ表面からの抗体の根本的な解離によって引き起こされるベースラインドリフト、および非特異的結合について調整した。結合化学量論比を、親二価陽性対照抗体への飽和結合に基づいて正規化した。
【０３９４】
推定上の二重特異性抗体のＣＣＬ２０およびＩＬ１３についての飽和結合化学量論比を、二価単一特異性陽性対照、および軽鎖対合のすべての順列を呈し、したがって全体的な化学量論比にインパクトを与えるＦａｂアーム改変を伴わない対照と比較した。データ（表１８）は、Ｆａｂアーム改変された静電相互作用が、各サイトカイン／ケモカインについて、１：１に近い結合化学量論比を伴って約９５％に正しい軽鎖対合を増大させることを示す。
【０３９５】
【表１９】
2017521361.tif 000037
【０３９６】
（実施例３２）
疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する二重特異性抗体の分離
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、コンストラクトＣ５×Ａｂ３−Ｍ１、Ｃ５ｘＡｂ３−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ、Ｃ５×Ａｂ３−Ｍ２、およびＣ５×Ａｂ３−Ｍ２−ＮＥＧＡＴＩＶＥの馴化培地からの２ステップ抗体精製法の後にタンパク質異種性を評価するのに使用した。ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０（Ｄｉｏｎｅｘ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０  ＵＨＬＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質およそ２０〜３０μｇを、１ｍＬ／分の流量で、１００ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび１Ｍ  硫酸アンモニウム  ｐＨ７．０で平衡化したカラムに注入した。次いでタンパク質を、０〜１００％の７分の直線勾配で、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０で溶出させた。タンパク質は、２８０ｎｍの吸収によって検出した。この分析の結果を図１２に示す。図１２パネルＡに示した親Ｃ５およびＡｂ３抗体は、明らかな単一ピークを示す。ヘテロ二量体化手法Ｍ２を図１２パネルＣに示し、ヘテロ二量体化手法Ｍ１を図１２パネルＢに示す。パネルＢおよびＣの両方の左のクロマトグラムは、重鎖ヘテロ二量体化突然変異単独の組込みを示す。右のクロマトグラムは、重鎖および軽鎖突然変異の両方を含有する二重特異性抗体のものである。これらの結果は、重鎖および軽鎖突然変異の両方の組込みでの異種性の低減を明らかに示す。
【０３９７】
（実施例３３）
接触可能表面積の計算
非ヒト残基をヒト患者への投与を意図した抗体中に導入する場合、ヒト免疫系が修飾された残基を外来と認識し、治療剤に対する抗体（抗薬物抗体またはＡＤＡ応答、これは、より速いクリアランス、循環している治療剤の活性の低減、または両方をもたらし得る）を産生するリスクがある。
【０３９８】
ＡＤＡ応答のこれらの結果を最小限にする一方法は、突然変異であって、これらが治療剤の表面上になく、したがってＡＤＡによる結合にアクセスできないことを意味する、治療剤のコアに概ね閉じ込められている、突然変異を選択することである。したがって、二重特異性設計の好ましさをランク付けする１つのやり方は、修飾残基の接触可能表面積（ＡＳＡ）を測定することである。すべての他の要因が等しい場合、その突然変異された残基についてより低いＡＳＡ値を有する二重特異性設計は、より高いＡＳＡ値を有する二重特異性設計より低いＡＤＡリスクを有するはずである。表６の相補的残基セットのＡＳＡを、上述した分子モデルに基づいて測定し、表８からの設計Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖのＡＳＡも、Ｘ線結晶解析に基づいて測定した。上述したように、表８中の設計（実施例１３）を、ＡＳＡを最小限にする埋め込まれたポケット中に特別に設計した。結果を表１９に示す。これらは、背景としてそれぞれの関与したドメインの構造（背景設定としての「エントリー」）を使用して、溶媒および緩衝液分子を除去した後、高分解能設定で、Ｍａｅｓｔｒｏ  ９．７（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、２０１４）またはＭａｅｓｔｒｏ  ９．９（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、２０１５）中の分子表面ツールを使用して計算した。プローブ半径は、２．５Åに設定した。溶媒分子の半径は、１．４Åとして選択されることが多い。Ｘ線構造中の実験的な座標誤差、Ｘ線構造で明らかでない側鎖の動き、および多くの他のＡＳＡ計算において仮定されているように、水分子とは対照的に表面における極めて狭い開口部にアクセスすることのＡＤＡの困難を考慮するために、２．５Åをここで使用した。ベータ鎖相互作用で観察されるタンパク質骨格の密接な接近は、一般に、２．５Åまたはそれ超の水素結合接触をもたらすはずであり、したがってこれは、非分岐状側鎖より広い任意のタンパク質化学基によって侵入され得る最小のホールのおおよそのサイズである。
【０３９９】
ＡＤＡ応答の結果は、適応症によって異なる場合がある。免疫系が抑制されるある特定の疾患では、ＡＤＡ応答のリスクは、より低い場合があり、より高いＡＳＡを有する設計をより実現可能にする。免疫系が過敏性であるある特定の疾患では、ＡＤＡリスクは、より高い場合があり、したがって、低い（好ましくは５０Å２未満、４０Å２未満、３０Å２未満、２０Å２未満、１０Å２未満）またはゼロのＡＳＡ値を有する二重特異性設計の使用を必要とする。以前に報告されたいくつかの設計（Ｌｅｗｉｓらによって、およびＷＯ２０１４／１５０９７３Ａ１においてなど）は、本明細書で報告したある特定の設計（Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖなど）より高いＡＳＡを有し、このような以前に報告された設計は、望まれないＡＤＡ応答に対してより感受性であり得る。ＷＯ２０１４１５０９７３に開示された様々な実施形態はすべて、ＡＳＡが、Ｌｅｗｉｓらによって報告されたように、少なくとも１４８Å２またはそれ超（ＰＤＢエントリー４ＬＬＹ（ＷＯ２０１４１５０９７３の請求項１）または４ＬＬＷ（ＷＯ２０１４１５０９７３の請求項７）から計算される）である改変された残基を有する。ＷＯ２０１４１５０９７３の請求項１および関連した請求項に開示された実施形態について、報告された値は、過小評価であり、理由は、軽鎖可変ドメイン上の残基１の側鎖が、結晶構造において無秩序であったためである。主張されたアルギニンが存在すると、モデル化は、２３０．３という増大した値を示唆する。
【０４００】
１つの例外は、いくつかのバリアントにおいて請求項１のより大きいＴｙｒではなくＰｈｅであるＣＬ−１３５位の突然変異であるが、この残基は埋もれており、ＡＳＡ計算から完全にそれを除外すると、ＷＯ２０１４１５０９７３の請求項１および請求項７で開示された残基を組み合わせるとき、依然として１４９Å２という値がもたらされる（ＷＯ２０１４１５０９７３の表１９も参照）。さらに、Ｌｅｗｉｓによって報告された結晶構造４ＬＬＹ（ＷＯ２０１４１５０９７３に関連した突然変異を含有する）について、Ａｒｇに突然変異される軽鎖の残基１は、無秩序側鎖を有する。この残基がその最も一般に存在する回転異性体コンホメーションでそれをモデル化することによって加えられる場合（Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェア中の回転異性体ライブラリーを使用して）、ＷＯ２０１４１５０９７３に含まれた突然変異された残基の総ＡＳＡは、２３０Å２にさらに増大する。本明細書に報告した設計（最も特にＳ１およびＳ１＿ｒｅｖ）の露出表面積は、２つの異なる重鎖配列および２つの異なる軽鎖配列を有する二重特異性との関連でインプリメントされるとき、相当により低い。
【０４０１】
好都合な性質を有する治療抗体の設計において、外来残基に接触可能ないくらかの表面の導入は、ある特定の機能特性（それだけに限らないが、安定性を含む）を付与するための必要な要件であり得る。したがって、他の改変ステップ中に導入される外来残基のＡＳＡ実装面積のいかなる最小化も、外来残基の総最終ＡＳＡの低減において有利であると見ることができる。
【０４０２】
【表２０】
2017521361.tif 000038
【０４０３】
（実施例３４）
対合忠実度の測定
疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、正しい二重特異性分子とこの特定の二重特異性抗体にとって誤対合した軽鎖を含有する分子とを区別することは可能でなかった。理由は、誤対合した軽鎖を有する分子が、ＨＩＣカラム樹脂と相互作用するのに十分異なる傾向を有さない可能性が最も高いためである。しかし、陰イオン交換クロマトグラフィー（図８Ｂ）は、誤対合した軽鎖／重鎖相互作用を含有する二重特異性抗体（図８Ｂからのピーク２Ａ）から二重特異性抗体（図８Ｂからのピーク１）を完全に分離することができた。残念ながら、親抗体の１つの翻訳後修飾（硫酸化）は、二重特異性分子に伝わり（図８Ｂからのピーク２Ｂ）、二重特異性陰イオン交換溶出時間を変化させ、その結果これは、誤対合した軽鎖を含有する二重特異性分子からベースライン分解されなかった。したがって、陰イオン交換クロマトグラフィーによって％二重特異性抗体を正確に定量化することは可能でなかった。図８Ｂピーク１の％ＡＵＣ（６０％）を、１７％を占めた硫酸化形態（図８Ｂピーク２Ｂ）に加えると、正しい二重特異性抗体の％がタンパク質製剤の７８％であると近似される。以下の表２０は、Ａｂ１×Ａｂ２の例示的調製物中の正しく対合したＦａｂアームの質量分析による相対定量化を表す。
【０４０４】
【表２１】
2017521361.tif 000039
【０４０５】
【表２２】
2017521361.tif 000040
【０４０６】
【表２３】
2017521361.tif 000041
【０４０７】
（実施例３５）
Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖにおける二次突然変異の効果
表８に示したように、設計Ｓ１は、二次突然変異ＣＬ−Ｖ１３３ＳおよびＣＨ１−Ｖ１９０Ｓを伴った一次突然変異ＣＨ１−Ｌ１２４ＫおよびＣＬ−Ｓ１７６Ｄからなる。設計Ｓ１＿ｒｅｖは、二次突然変異ＣＬ−Ｖ１３３ＳおよびＣＨ１−Ｓ１８８Ｇを伴った一次突然変異ＣＨ１−Ｌ１２４ＥおよびＣＬ−Ｓ１７６Ｋからなる。二次突然変異は、界面中の側鎖パッキングを最適化するために設計した。これらの突然変異が軽鎖対合の忠実度に寄与するか否かを試験するために、二次突然変異のいずれも省略しなかった、そのいくつか、またはすべてを省略したＣ５×Ａｂ３のバリアントを生成した。Ｃ５  ＦａｂアームをＳ１＿ｒｅｖのバリエーションを試験するのに使用し、一方、Ａｂ３  ＦａｂアームをＳ１のバリエーションを試験するのに使用した。Ｍ１と呼ぶノブイントゥホール（Ｒｉｄｇｗａｙら、上記、およびＭｅｒｃｈａｎｔら、上記）法を使用して、各組合せの重鎖ヘテロ二量体化に偏りをかけた。Ｍ１から、この実施例のために作製した各Ａｂ３バリアントのＣＨ３ドメインは、重鎖ヘテロ二量体化のための以下の突然変異を有していた：ＣＨ３−Ｙ３７０をＣに突然変異させ、ＣＨ３−Ｔ３８９をＷに突然変異させた（「ノブ」鎖）。Ｍ１から、この実施例のために作製した各Ｃ５バリアントのＣＨ３ドメインは、重鎖ヘテロ二量体化のために以下の突然変異を有していた：ＣＨ３−Ｓ３７５Ｃ、ＣＨ３−Ｔ３８９Ｓ、ＣＨ３−Ｌ３９１Ａ、およびＣＨ３−Ｙ４３８Ｖ（「ホール」鎖）。Ｃｙｓ−３７０およびＣｙｓ−３７５は、ヘテロ二量体を安定化させるための鎖間ジスルフィド結合を形成する。６つのコンストラクトを、突然変異の役割をデコンボリュートするために試験した。Ｃ５およびＡｂ３について上述したＭ１突然変異のみを含有し、Ｓ１またはＳ１＿ｒｅｖ突然変異のいずれも含有しなかった「Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ」。デコンボリュート−２を対照として再使用した。これを、この実施例については、デコンボリュート−１とも呼ぶ。上述したＭ１突然変異、Ｃ５  Ｆａｂアーム中にＳ１＿ｒｅｖ、およびＡｂ３アーム中にＳ１を含有した「Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１」を対照として再使用した。これを、この実施例については、デコンボリュート−２と呼ぶ。デコンボリュート−３は、それが、表８に列挙したＳ１およびＳ１＿ｒｅｖについて「二次突然変異」のいずれも含まなかったことを除いてデコンボリュート−２と同一であった。デコンボリュート−４は、それが、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖの両方についてＣＨ１ドメインの二次突然変異を省略したことを除いてデコンボリュート−２と同一であった。したがって、明確にするために、デコンボリュート−４のＡｂ３  Ｆａｂアームは、ＣＨ１−Ｌ１２４Ｋ、ＣＬ−Ｓ１７６Ｄ、およびＣＬ−Ｖ１３３Ｓを含有したが、ＣＨ１−Ｖ１９０Ｓを含有しなかった。そして、明確にするために、デコンボリュート−４のＣ５  Ｆａｂアームは、ＣＨ１−Ｌ１２４Ｅ、ＣＬ−Ｓ１７６Ｋ、およびＣＬ−Ｖ１３３Ｓを含有したが、ＣＨ１−Ｓ１８８Ｇを含有しなかった。Ｍ１突然変異も、Ｓ１またはＳ１＿ｒｅｖ突然変異（ＣＨ配列５４およびＣＬ配列９）も有さない親単一特異性コンストラクト「Ｃ５」および「Ａｂ３」（それぞれ��コンボリュート−５およびデコンボリュート−６とも呼ぶ）を、各抗体の単一特異性バリアントの挙動を確立するために、対照として試験した。６つすべての設計は、ヒンジ／ＣＨ２エフェクター機能切断突然変異（Ｌ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、およびＧ２５０Ａ）を有するＩｇＧ１であった。設計デコンボリュート−１〜デコンボリュート−４について、Ａｂ３の重鎖、Ｃ５の重鎖、Ａｂ３の軽鎖、およびＣ５の軽鎖を含む合計４本の鎖を、哺乳動物細胞中に同時にトランスフェクトした。正しい軽鎖対合のレベルを、様々な生物物理学的な分析技法を介して評価し、Ａｂ３Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ、Ｃ５、およびＡｂ３Ａｂ３対照と比較した。別個の発現を記載したコンストラクトについて実施した。対照対試験中に存在する正しい軽鎖対合のレベルを比較することによって、突然変異の効果を評価することができる。Ａｂを、Ａｂ１／Ａｂ２について実施例１６および１７に論じたように発現させ、精製した。コンストラクトのデコンボリュート−１〜デコンボリュート−６の発現は、９〜２００ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【０４０８】
（実施例３６）
Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖデコンボリューションの質量分光分析
デュアルアーム抗体コンストラクトのデコンボリュート−１〜デコンボリュート−６（先の実施例で記載した）のＦａｂ生成およびＬＣ／ＭＳ分析を、Ａｂ１／Ａｂ２について上述したのと同じ方法を使用して実施した。上述した合計６つのコンストラクトを分析して、Ｆａｂ分子量に基づいて重鎖および軽鎖の対合を判定した。
【０４０９】
デコンボリューション質量スペクトルを図１７に示す。パネルＡおよびＢは、単一特異性対照抗体、Ｃ５Ｃ５およびＡｂ３Ａｂ３が、これらのそれぞれのＦａｂ断片の予測された分子量に対応する１つの支配的なピークを提示することを示す。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異を欠く陰性対照二重特異性Ａｂ３Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ（パネルＣ）は、２つの正しい、ならびに２つの誤った（Ａｂ３重鎖＋Ｃ５軽鎖およびＡｂ３軽鎖＋Ｃ５重鎖）、４つすべての可能な重鎖／軽鎖対合を示す。分析は、試料のおよそ３０％が誤対合したＦａｂからなることを示す。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異の完全セットを含有する陽性対照二重特異性Ａｂ３Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１（パネルＤ）は、４７３９７および４６９０６の予測された質量を有する重鎖／軽鎖誤対合の目に見える証拠を示さない。これらの値の小さい読み（図中で容易に目に見えない）は、この試料中の０．５％の誤対合を予測する。対照的に、重鎖および軽鎖中の二次Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異（表８を参照）がデコンボリュート−２と比べて除去されているデコンボリュート−３（パネルＥ）は、試料のおよそ１８％を占める両方の可能な重鎖／軽鎖誤対合の明らかな証拠を示す。最後に、デコンボリュート−４（パネルＦ）は、重鎖から二次Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異を除去しても（しかし軽鎖中にこれらを残して）、誤対合した鎖が検出可能なレベルで形成することが可能になり、試料の１１％が誤対合していると推定されることを示す。要約すると、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖについての突然変異の完全セットは、最高の忠実度をもたらし、一方、Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計の部分的なインプリメンテーションは、ＣＨ１／ＣＬ二重特異性改変突然変異を欠く陰性対照に対して検出可能な（しかしより小さい）改善をもたらす。
【０４１０】
（実施例３７）
Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖデコンボリューションコンストラクトの疎水性相互作用クロマトグラフィー分析
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、コンストラクトのデコンボリュート−１〜デコンボリュート−６の馴化培地からの２ステップ抗体精製法の後にタンパク質異種性を評価するのに使用した。ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０（Ｄｉｏｎｅｘ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０  ＵＨＬＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質およそ２０〜３０μｇを、１ｍＬ／分の流量で、１００ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび１Ｍ  硫酸アンモニウム  ｐＨ７．０で平衡化したカラムに注入した。次いでタンパク質を、０〜１００％の７分の直線勾配で、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０で溶出させた。タンパク質を２８０ｎｍの吸収によって検出した。この分析の結果を図１８に示す。対照単一特異性抗体「Ｃ５」および「Ａｂ３」はそれぞれ、鋭い主ピークを示す（パネルＥ〜Ｆ）。２つの抗体が、ＣＨ３ドメインのみが改変されている二重特異性にアセンブルされる場合、単一の主ピークの代わりに重複するピークが存在し、重鎖および軽鎖の様々な組合せに起因して試料中の異種性を示す（パネルＡ）。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ突然変異が、正しい重鎖／軽鎖対合のみを優遇するようにＣＨ１／ＣＬ界面に加えられる場合、試料の異種性は、大いに低減される（パネルＢ）。Ｓ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計は、表８に示したように、静電相互作用を直接形成する一次突然変異、およびサポート二次突然変異（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含有する。重鎖サポート突然変異が除去され（パネルＣ）、一方軽鎖サポート突然変異がインタクトなままにされる場合、異種性のレベルは、ＨＩＣによって同様であるが、差異は、質量分析によって検出可能であった（実施例３６）。すべてのサポート突然変異が除去される場合（パネルＤ）、異種性は、「Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１−ＮＥＧＡＴＩＶＥ」と比べて低減されるが、デコンボリュート−２、「Ａｂ３  Ｃ５−Ｍ１」と比べて依然としてより顕著である。実施例３６の質量分析データと総合すると、これらの結果は一括して、完全なＳ１およびＳ１＿ｒｅｖ設計が組み合わされる場合、最少量の異種性が生じることを例示する。
【０４１１】
（実施例３８）
混合Ｆａｂアーム設計を有する二重特異性抗体の生成
概念的に、二重特異性Ｆａｂは、実施例１５に論じたように、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ改変設計の異なる組合せを使用することによって改変することができる。この仮説を試験するために、Ａｂ３およびＣ５  Ｆａｂアームを有する二重特異性抗体を生成した。ここで、Ａｂ３  Ｆａｂアームは、二重特異性改変突然変異を含有していなかったか（陰性対照）、または表８のＳ１設計を含有していた。Ｃ５アームは、二重特異性改変突然変異を含有していなかった（陰性対照）、表８のＳ１＿ｒｅｖ設計（陽性対照）、または表７に指定した設計Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ９の１つを含有していたのいずれかであった。Ｃ５中にＳ１＿ｒｅｖ突然変異を含有するが、Ａｂ３中にＦａｂアーム二重特異性突然変異を含有しない追加の対照も調製した。表２３中に要約および命名したこれらの９つのコンストラクトすべてを、実施例３５に記載した同じ構成でＡｂ３およびＣ５重鎖中にＭ１ノブイントゥホール（Ｒｉｄｇｗａｙら、上記、およびＭｅｒｃｈａｎｔら、上記）突然変異、ならびに以前に記載したように、両方の重鎖のＣＨ２中にエフェクター機能切断突然変異を有するＩｇＧ１として生成した。
【０４１２】
各設計について、Ａｂ３の重鎖、Ｃ５の重鎖、Ａｂ３の軽鎖、およびＣ５の軽鎖を含む４本の鎖を、哺乳動物細胞中に同時にトランスフェクトした。正しい軽鎖対合のレベルを、様々な生物物理学的な分析技法を介して評価し、重鎖ヘテロ二量体化突然変異を含有するが、重鎖と軽鎖との間の界面で突然変異を含有しない対照と比較した。別個の発現を、記載したばかりのコンストラクトについて実施した。対照対試験中に存在する正しい軽鎖対合のレベルを比較することによって、突然変異の効果を評価することができる。抗体を、Ａｂ１／Ａｂ２について実施例１６および１７で上記に論じたように発現させ、精製した。表２３中のコンストラクトの発現は、４〜７３ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【０４１３】
【表２４】
2017521361.tif 000042
【０４１４】
（実施例３９）
混合Ｆａｂアーム設計のＤＳＣ分析
実施例３８に記載し、以下の表２４に列挙したタンパク質を、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に入れ、同じ緩衝液中で０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。試料および緩衝液（４００μＬ）を、９６ウェルディープウェルプレートに移し、ＤＳＣ（Ｃａｐ−ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のオートサンプラー内に置いた。計測器中に注入した後、試料を１０℃から１１０℃に１００℃／時間で加熱した。データを緩衝液およびベースラインで補正した後、２または３つの非二状態転移にフィッティングして融解温度を判定した。全体的に、これらはすべて、高いＴｍ値を伴って安定なタンパク質であった。各抗体の詳細な融解温度プロファイルを、図１９に提供する。
【０４１５】
【表２５】
2017521361.tif 000043
【０４１６】
（実施例４０）
混合Ｆａｂアーム設計のＢｉａｃｏｒｅ結合化学量論比分析
表２３（実施例３８）から使用したＦａｂアーム突然変異
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｔ２００モデル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合化学量論比の分析を、実施例３１に記載したように行った。推定上の二重特異性抗体のＣＣＬ２０およびＩＬ１３についての飽和結合化学量論比を、二価単一特異性陽性対照、および軽鎖対合のすべての順列を呈し、したがって全体的な結合化学量論比にインパクトを与えるＦａｂアーム改変を伴わない対照と比較した。データ（表２５）は、両方のＦａｂアーム中に改変を有するすべての組合せは、標的サイトカインおよびケモカインとの抗体の各対について１：１に近い結合化学量論比を実現し（１：１結合から１０％以下の変動）、一方、一方または両方のアーム中に改変を欠く組合せは、一方のアームにおいて０．７：１未満の化学量論比を有したことを示す。これらの結果は、二重特異性設計の異なる組合せを、重鎖／軽鎖誤対合を低減するのに使用することができることを示す。
【０４１７】
【表２６】
2017521361.tif 000044
【０４１８】
（実施例４１）
混合Ｆａｂアーム設計の質量分光分析
各Ｆａｂアーム中に設計の様々な組合せを有するデュアルアーム抗体コンストラクト（表２３および実施例３８に記載した）のＦａｂ生成およびＬＣ／ＭＳ分析を、Ａｂ１／Ａｂ２について上述したのと同じ方法を使用して実施した。上述した合計９つのコンストラクトを分析して、Ｆａｂ分子量に基づいて重鎖および軽鎖の対合を判定した。デコンボリューション質量スペクトルを図２０に示す。Ａｂ３  Ｆａｂアーム中のＳ１設計をＣ５  Ｆａｂアーム中のＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、またはＴ９（図２０、パネルＡ〜Ｅ）と対合させたとき、最低量の誤対合したＦａｂ：Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３について０．５％；Ｔ４について０．４％、ならびにＴ９について１．３％が検出された。Ｃ５  Ｆａｂアーム中のＳ１＿ｒｅｖと対合したＡｂ３×Ｓ１も、高い忠実度を与え、３．２％のみが誤対合した（パネルＦ；この二重特異性設計は、実施例３７のデコンボリュート２と同じＦａｂアーム突然変異を使用し、したがって、この設計の有効性の第２の測定であることに留意されたい）。しかし、いずれかのＦａｂアームが二重特異性優遇設計を欠いていたとき、より大量の誤対合した試料：Ａｂ３−Ｓ１および天然Ｃ５に対して１９％（パネルＧ）、天然Ａｂ３およびＣ５−Ｓ１ｒｅｖに対して４１％（パネルＨ）、ならびに一方のＦａｂアーム中に天然Ａｂ３および他方に天然Ｃ５に対して３５％（パネルＩ）が生成された。したがって、異なる組合せを、異なる二重特異性優遇設計を使用して各Ｆａｂアームで試行した各場合において、試料純度は、質量分析によって測定した場合、著しく改善した。
【０４１９】
（実施例４２）
混合Ｆａｂアーム設計の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、各Ｆａｂアーム中に設計の様々な組合せを有するコンストラクト（表２３および実施例３８に記載した）の馴化培地からの２ステップ抗体精製法の後のタンパク質異種性を評価するのに使用した。ＴＯＳＯＨブチルカラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０  ＵＨＬＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質およそ２０〜３０μｇを、１ｍＬ／分の流量で、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび２Ｍ硫酸アンモニウム  ｐＨ７．２で平衡化したカラムに注入した。次いでタンパク質を、０〜１００％の７分の直線勾配で、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．２で溶出させた。タンパク質を２８０ｎｍの吸収によって検出した。この分析の結果を図２１に示す。Ａｂ３  Ｆａｂアーム中にＳ１、およびＣ５  Ｆａｂアーム中にＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、またはＴ９のいずれかを有する二重特異性抗体は、重鎖／軽鎖対合の高い忠実度を示した（パネルＡ〜Ｅ）。少量の誤対合が主ピークの左側の小さいテールとして明らかである。ピークのこのテールは、Ｃ５上のＳ１＿ｒｅｖと対合したＡｂ３上のＳ１についてわずかにより大きい（パネルＦ、矢印を参照）。これらの結果は、実施例４１および図２０の質量分光分析と一致する。一方のＦａｂアーム（パネルＧ〜Ｈ）または両方のＦａｂアーム（パネルＩ）が二重特異性優遇設計を含有しない場合、追加のピークの存在によって示されるように、より大量の誤対合したＦａｂが検出された。参照のために、パネルＪ〜Ｋは、これらの二重特異性設計の基になった単一特異性Ａｂ３およびＣ５抗体の対応するプロファイルを示す。両方は、鋭い単一ピークを示す。したがって、異なる組合せを、異なる二重特異性優遇設計を使用して各Ｆａｂアームで試行した各場合において、試料純度は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって測定した場合、Ｆａｂ改変設計を欠く設計に対して著しく改善した。
【０４２０】
（実施例４３）
マウス抗ＴｒｋＢ  ＴＯＡ−１抗体
本発明は、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合するヒト化マウス抗体を含む。
【０４２１】
抗ＴｒｋＢ抗体を、ヒトおよびマウスＴｒｋＢ−細胞外ドメイン抗原、ならびに免疫化のための標準法を使用してマウス中で調製した。ＴＯＡ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、個々のＢ細胞の骨髄腫細胞との融合によって生成した。マウスＴＯＡ−１抗体は、「２９Ｄ７」とも呼ばれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ７，７５０，１２２に開示されている。
【０４２２】
ＴＯＡ−１抗ＴｒｋＢ抗体重鎖および軽鎖可変領域は、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ｃＤＮＡ合成システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃｏｆ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、その後ＰＣＲ増幅を使用してクローニングした。ｃＤＮＡは、ＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともに、オリゴ体（ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）および  ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＩＩＡオリゴ体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、ＴＯＡ−１ハイブリドーマ細胞から単離したトータルＲＮＡ  １μｇから合成した。次いでｃＤＮＡを、ＶＥＮＴ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃｏｆ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）とともに、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマー、ならびにマウス定常領域特異的プライマー（軽鎖についてマウスカッパおよび重鎖についてマウスＩｇＧ１）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物をｐＥＤ６発現ベクター中にサブクローニングし、核酸配列を判定した。この方法は、ＤＮＡ配列の先の知識は、要求されないという点で有利である。さらに、結果として生じるＤＮＡ配列は、縮重ＰＣＲプライマーの使用によって変更されない。
【０４２３】
ＴＯＡ−１重鎖可変領域のヌクレオチド配列を、配列番号１０４のヌクレオチド５８〜４１１として示す。ＴＯＡ−１重鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号１０５の残基２０〜１３７として示す。ＴＯＡ−１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、配列番号１０６のヌクレオチド６１〜３８１として示す。ＴＯＡ−１軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号１０７の残基２０〜１３７として示す。
【０４２４】
（実施例４４）
キメラＴＯＡ−１抗体の構築
マウス重鎖および軽鎖可変領域配列が正しかったことを検証するために、キメラＴＯＡ−１抗体を構築した。キメラＴＯＡ−１重鎖を生成するために、ＴＯＡ−１重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１０４のヌクレオチド５８〜４１１）を、最小限のエフェクター機能について突然変異されたヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードするｃＤＮＡにライゲーションした。これらの突然変異は、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を、ＥＵ番号付けによって定義される残基２３４、２３５、および２３７において、それぞれロイシン、ロイシン、およびグリシンからアラニン、アラニン、およびアラニンに変更する。キメラＴＯＡ−１軽鎖は、ＴＯＡ−１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１０６のヌクレオチド６１〜３８１）を、ヒトカッパ定常領域をコードするＤＮＡに接合することによって構築した。ＴＯＡ−１軽鎖可変領域の残基１に存在するアラニンを、この位置で一般に見つかるアスパラギン酸に変更し、次いでこれをヒトカッパ定常領域に融合してキメラＴＯＡ−１  Ａ１Ｄ軽鎖（ヌクレオチド配列配列番号１０８およびアミノ酸配列配列番号１０９）を生成した。キメラＴＯＡ−１抗体の両バージョンをコードするＤＮＡを、ＣＯＳ−１細胞内に一過性にトランスフェクトしてタンパク質を生成した。ＴＯＡ−１抗体を含有する結果として生じる馴化培地を、総ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。キメラＴＯＡ−１抗体の活性を、直接結合ＥＬＩＳＡによって評価した。直接結合アッセイは、ヒトまたはマウスＴｒｋＢ−細胞外ドメインタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、キメラＴＯＡ−１抗体を含有する連続希釈された馴化培地を添加し、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて結合した抗体を検出することによって実施した。キメラＴＯＡ−１抗体は、マウスＴＯＡ−１抗体と同等の親和性でヒトおよびマウスＴｒｋＢに結合した（図２３および２４）。ＴＯＡ−１軽鎖可変領域の１位でアラニンをアスパラギン酸に変更しても、ヒトまたはマウスＴｒｋＢへの結合性質に影響しなかった（図２３および２４）。キメラＴＯＡ−１抗体を、ＣＯＳ−１細胞にキメラＴＯＡ−１をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトすることによって生成した馴化培地から標準的なプロテインＡ精製技法によって精製した。
【０４２５】
（実施例４５）
マウスＴＯＡ−１抗体のヒト化
マウスＴＯＡ−１抗体のＣＤＲを、配列変異性および構造ループ領域の場所に基づくＡｂＭ定義を使用して同定した。ヒト化ＴＯＡ−１重鎖可変領域を、ヒトＤＰ−５４フレームワーク領域にグラフトされたマウスＴＯＡ−１のＣＤＲを含むように構築した。このアミノ酸配列を配列番号５１  ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ１．０として示す。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ１．０は、配列番号１１０中の核酸配列によってコードされる。ヒトフレームワーク受容体配列の追加の突然変異を、例えば、抗原接触に関与すると考えられるマウス残基および／または抗原結合部位の構造的完全性に関与する残基を復帰させるために行う。ＴｒｋＢ結合性質を保存するのに重要であると予測されたＡ２４Ｔ、Ｒ７２Ｖ、およびＬ７９Ａ突然変異を、ＤＰ−５４フレームワークに導入した。このアミノ酸配列を配列番号１１１として示し、ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ１．１と本明細書で呼ぶ。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ１．１は、配列番号１１２中の核酸配列によってコードされる。さらに、ヒト化ＴＯＡ−１重鎖可変領域を、ＤＰ−３ヒト生殖系列受容体フレームワークであって、それがマウスＴＯＡ−１重鎖可変領域のフレームワーク領域と実質的に同様であることに基づいて選択された、ＤＰ−３ヒト生殖系列受容体フレームワークにグラフトされたマウスＴＯＡ−１のＣＤＲを含むように構築した。このアミノ酸配列を配列番号１１３  ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ２．０に示す。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＨ  ｖ２．０は、配列番号１１４中の核酸配列によってコードされる。同様に、ＤＰＫ２１ヒト生殖系列受容体フレームワークを、ヒト化ＴＯＡ−１軽鎖可変領域のＣＤＲグラフトバージョンを構築するのに使用した。理由は、この生殖系列フレームワークが、ＴＯＡ−１軽鎖可変領域と高い配列同一性を呈するためである。このアミノ酸配列を配列番号１３２  ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ２．０に示す。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ２．０は、配列番号１３３中の核酸配列によってコードされる。別のヒト化ＴＯＡ−１軽鎖可変領域を、ヒトＤＰＫ９生殖系列受容体フレームワーク領域にグラフトされたマウスＴＯＡ−１のＣＤＲを含むように構築した。このアミノ酸配列を配列番号１１５  ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ１．０として示す。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ１．０は、配列番号１１６中の核酸配列によってコードされる。さらに、ＴｒｋＢ結合性質を保存するのに重要であると予測されたＫ４２Ｅ、Ａ４３Ｓ、およびＹ４９Ｋ突然変異を、ＴＯＡ−１可変軽鎖領域ＣＤＲを含有するＤＰＫ９フレームワークに導入した。このアミノ酸配列を配列番号１１７  ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ１．１．として示す。ｈｕＴＯＡ−１  ＶＬ  ｖ１．１は、配列番号１１８中の核酸配列によってコードされる。ＶＨ  ｖ１．０およびＶＬ  ｖ１．４を含むｈｕＴＯＡ−１を、ｈｕＴＯＡ−１およびＴＡＭ−１６３と本明細書で互換的に呼ぶ。ＤＰＫ９フレームワークに基づく他のバリアントも構築した。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表２７に列挙した配列番号によって表す。ヒト化ＴＯＡ−１抗体のすべての可能なバージョンをコードするＤＮＡをＣＯＳ−１細胞内に一過性にトランスフェクトしてタンパク質を生成した。ヒト化ＴＯＡ−１抗体バ���アントを含有する結果として生じる馴化培地を、総ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。ＴｒｋＢ結合性質を、ビオチン化キメラＴＯＡ−１抗体との競合ＥＬＩＳＡを使用して、かつ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｂｉａｃｏｒｅ）によって評価した。
【０４２６】
【表２７】
2017521361.tif 000045
【０４２７】
（実施例４６）
ｈｕＴＯＡ−１バリアントのＴｒｋＢ結合性質の評価
ＴｒｋＢ結合性質を、ビオチン化キメラＴＯＡ−１抗体との競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ｈｕＴＯＡ−１バリアントについて評価した。このアッセイ手順について、９６−ウェルプレートを４℃にて一晩１μｇ／ｍｌで、ｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  ＃３９７−ＴＲ／ＣＦ）で被覆した。次いでプレートを室温にて１時間ＰＢＳ＋０．０２％  カゼインでブロックした。ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋０．０２％  ｔｗｅｅｎ−２０中の２５ｎｇ／ｍｌのビオチン化キメラＴＯＡ−１を、様々な濃度のｈｕＴＯＡ−１バリアントまたは未標識キメラＴＯＡ−１と混合し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ＃７１００−０５）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ）を添加した。反応を５〜１０分間展開し、次いで０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。４５０ｎｍの吸光度を判定した。表２８に要約した結果は、ヒト化ＴＯＡ−１  ＶＨ  バージョン１．０およびＶＬバージョン１．１が、キメラＴＯＡ−１抗体と比べてＴｒｋＢ結合性質を完全に保持したことを示す（図２５、２６、および２７）。さらなる特徴付けを行って、ＴＯＡ−１  ＶＬバージョン１．１内に含有したどのマウスフレームワーク残基がＴｒｋＢに結合するのに要求されるかを判定した。ヒト化ＴＯＡ−１  ＶＬバージョン１．４は、単一のマウスフレームワーク残基Ｋ４９（Ｋａｂａｔ番号付け）を含有し、このバージョンは、ＴＯＡ−１  ＶＬバージョン１．１と同等の活性を有する（図２８）。
【０４２８】
【表２８】
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【０４２９】
（実施例４７）
ｈｕＴＯＡ−１バリアントの動力学的評価
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を実施して、ヒトおよびマウスＴｒｋＢに対するＴＯＡ−１およびヒト化ＴＯＡ−１バリアントについての親和定数を判定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）技術は、ＴＯＡ−１抗体バリアントが層に固定化されたＴｒｋＢタンパク質に結合した際の表面層における屈折率の変化を利用する。結合は、表面から屈折するレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出する。信号動態オンレートおよびオフレートの分析は、非特異的相互作用と特異的相互作用との識別を可能にする。ヒトおよびマウスＴｒｋＢ外部ドメインタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９７／ＴＲ／ＣＦおよび＃１４９４−ＴＢ／ＣＦ）をＣＭ５チップ上に低密度で固定化し（それぞれ４１および３０ＲＵ）、次いで様々な濃度のＴＯＡ−１およびヒト化ＴＯＡ−１バリアントを表面の上に注入した。表面を注入サイクル間に４Ｍ  ＭｇＣｌ２で再生した。結果は、ヒト化ＴＯＡ−１バリアントが、親マウスＴＯＡ１抗体およびキメラＴＯＡ−１抗体の両方と比べてヒトおよびマウスの両方について同等の親和定数を有することを示し（表２９）、これらのヒト化バリアントが完全に保持されたＴｒｋＢ結合性質を有すること実証する。
【０４３０】
【表２９】
2017521361.tif 000047
【０４３１】
（実施例４８）
抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性
ヒト化抗ＴｒｋＢ  ＴＯＡ−１抗体の、ＴｒｋＢシグナル伝達カスケードを活性化する能力を、１）ＴｒｋＢシグナル伝達活性化を監視するための転写レポーター、ならびに２）ＴｒｋＢシグナル伝達のメディエーターとして公知のｈＴｒｋＢの自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、およびＰＬＣγ１のリン酸化の評価を使用して評価した（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１９９９；２５３：１３１〜１４２に総説されている）。
【０４３２】
ＴｒｋＢを発現する安定な細胞株
ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター、およびｒｈｕＴｒｋＢ（ｎｍ＿００６１８０）またはｒｍｕＴｒｋＢ（ｎｍ＿００１０２５０７４）の両方を発現するＨＥＫ−２９３細胞の安定な細胞株を、標準技法を使用して生成した（Ｚｈａｎｇら、２００７、Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ、１５：２９〜３９）。安定な細胞株をｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥおよびｒｍｕＴｒｋＢ−ＣＲＥと命名する。
【０４３３】
転写レポーターアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、以下の通り実施した。ｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥ細胞を、白底９６−ウェルプレート中の増殖培地（１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中に３５，０００細胞／１００μｌ／ウェルで蒔いた。翌日、１０μｌ／ウェルのマウスＴＯＡ１、ヒト化ＴＯＡ−１バリアント、またはアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１もしくはｈＩｇＧ１）抗体を、培地を変更することなくアッセイプレートに１０×として添加した。ルシフェラーゼ活性は、製造者のプロトコールに従ってＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２５２０）を使用して１６〜１８時間後に測定した。簡単に説明すると、培地を１００μｌ／ウェルの１×ＰＢＳと置き換えた。次に、１００μｌ／ウェルのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を添加する。プレートをＴｏｐＳｅａｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒカタログ番号６００５１８５）で密閉し、Ａ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒ（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）で、速度６００で５分間振盪させる。発光をＶＩＣＴＯＲ３、１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【０４３４】
図２９に例示し、表３０に要約したように、ＴＯＡ−１抗体処置は、マウスＴＯＡ−１およびすべてのヒト化ＴＯＡ−１バリアントに対してルシフェラーゼ活性を用量依存的に増大させ、これらの抗体がＴｒｋＢシグナル伝達カスケードを活性化することができることを示した。
【０４３５】
【表３０】
2017521361.tif 000048
【０４３６】
ＴＯＡ−１抗体によるＴｒｋＢ自己リン酸化、ならびにＰＬＣγ１、ＡＫＴ、およびＥＲＫ１／２のリン酸化の刺激
リン酸化分析を実施して、ＴｒｋＢを過剰発現する改変された細胞株（上述したように生成したｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥおよびｒｍｕＴｒｋＢ−ＣＲＥ安定細胞株）、ならびにヒトＴｒｋＢを発現する分化したヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞内のＴｒｋＢシグナル伝達の近位マーカーの活性化を測定した。これらの細胞内のヒトＴｒｋＢ発現は、抗ＴｒｋＢ抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓカタログ番号６１０１０２）を使用して、以下に記載するように標準技法を使用してウエスタン分析によって確認した。以下で詳述するように、ＴｒｋＢ発現細胞をＴＯＡ−１抗体で処置し、ウエスタン分析を実施して、ｈＴｒｋＢ（Ｔｙｒ４９０）の自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、およびＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）のリン酸化を監視した。
【０４３７】
ｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥまたはｒｍｕＴｒｋＢ−ＣＲＥ細胞を、１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ増殖培地中に５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに蒔き、細胞が８５〜９０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を０．１％  ＦＣＳ  −  ＤＭＥＭ（低血清培地）で１回洗浄し、低血清培地中でさらに４時間インキュベートした。次に、細胞をＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ＃２４８ＢＤ）またはＴＯＡ−１抗体で、指定濃度で１５〜６０分間処置した。培地をウェルから吸引し、１×ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１％  ｂ−ＭＥを含む）０．６ｍｌを１ウェル当たりに添加して細胞を溶解させた。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、１００℃で５分間加熱した。各試料２５μｌをＮｕＰＡＧＥ  ４〜２０％ビス−トリス勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解させた。
【０４３８】
ウエスタン分析を以下の通り実施した。電気泳動後、サイズ分画されたタンパク質をニトロセルロース膜上に移した。膜をＴ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中０．１５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の５％ミルクでブロックし、１％ミルク  Ｔ−ＴＢＳ中の適切な一次抗体［抗Ｐ−ＴｒｋＢ：Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＴｒｋＡ（Ｔｙｒ４９０）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＣＳ）＃９１４１；抗ホスホ−ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）、ＣＳ＃２８２１；抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＣＳ＃９２７１；抗Ｐ−ＥＲＫ１／２（ホスホ−Ｐ４４／Ｐ４２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＣＳ  ＃９１０１；抗アクチン、Ｓｉｇｍａ  Ａ２０６６］とともに、４℃にて一晩ロッキングプラットフォーム上でインキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳ中で３回洗浄し、次いで適切なＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃７９７４）とともに２時間インキュベートした。次に、膜をＴ−ＴＢＳ中で４回、およびＴＢＳ中で１回洗浄した。信号を、ＥＣＬキット（ＧＥ  ＲＰＮ２１０６Ｖ）および製造者のプロトコール、その後Ｘ線フィルム曝露またはＧｅｌ−Ｄｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して展開させて、画像を捕捉した。
【０４３９】
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレート中に蒔き、増殖培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１５％  ＦＢＳ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１））中で培養した。細胞をレチノイン酸（１０μＭ）とともに３日間インキュベートして分化を誘導した。次いで細胞を低血清培地（１％  ＦＢＳを含む増殖培地）中で一晩培養し、０．１％  ＦＢＳ培地中で４時間さらに培養した。指定濃度のＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ＃２４８ＢＤ）またはＴＯＡ−１抗体を添加し、細胞を１５〜６０分間インキュベートした。培地をウェルから吸引し、１×ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１％  ｂ−ＭＥを含む）０．６ｍｌを１ウェル当たりに添加して細胞を溶解させた。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、１００℃で５分間加熱した。各試料２０μｌをＮｕＰＡＧＥ  ４〜２０％ビス−トリス勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に溶解させた。ウエスタン分析を上述したように実施した。
【０４４０】
図３０に示したように、ヒト化ＴＯＡ−１抗体を用いた処置は、ヒトＴｒｋＢ（過剰発現されたＴｒｋＢ、図３０Ａ、および内因性ＴｒｋＢ、図３０Ｃの両方）、またはマウスＴｒｋＢ（図３０Ｂ）を発現する細胞内で、用量依存的なＴｒｋＢの自己リン酸化、ならびにシグナル伝達分子ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、およびＰＬＣγ１のリン酸化を誘導した。
【０４４１】
上述したように実施したリン酸化アッセイにおけるＢＤＮＦおよびｍＴＯＡ−１の相対的な活性も示す。ＢＤＮＦは、ｍＴＯＡ−１より、ＴｒｋＢ自己リン酸化およびＰＬＣγ１リン酸化によって測定した場合、ＴｒｋＢシグナル伝達カスケードの強力な刺激物質である（図３０Ｄ）。
【０４４２】
要約すると、転写レポーターアッセイおよびリン酸化アッセイはともに、ＴＯＡ−１抗体がＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化することを実証した。
【０４４３】
（実施例４９）
ＢＤＮＦに対する抗体結合エピトープの特徴付け
競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＴｒｋＢタンパク質への抗ＴｒｋＢ抗体の結合がどのようにＴｒｋＢタンパク質とのＢＤＮＦ相互作用に影響するかを評価した。
【０４４４】
１つのフォーマットでは、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９０）を、４℃でＰＢＳ中のＢＤＮＦ（０．３μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号２４８−ＢＤ）で被覆し、一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、次いでウェルを、ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、室温で１時間ブロックした。複数の濃度のＰｒｏＡ精製抗ＴｒｋＢ抗体を、ｒｈＴｒｋＢ／Ｆｃキメラ（１５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６８８−ＴＫ）とともに、室温で３０分間プレインキュベートし、次いで混合物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＰＩＥＲＣＥ、カタログ番号３１４１３）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＴＭＢＷ−０１００−０１）を１０分にわたって添加した。反応を、０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４５０ｎｍの吸光度を判定した。
【０４４５】
第２のフォーマットでは、９６−ウェルプレートを、ＰＢＳ中のｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤ−Ｈｉｓ（１μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩被覆した。次いでプレートを、ＰＢＳ＋０．０２％カゼインで、室温で１時間ブロックした。２５ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト化ＴＯＡ−１を、様々な濃度のｒｈＢＤＮＦ、未標識ｈｕＴＯＡ−１、または無関係のヒトＩｇＧ１抗体とともにインキュベートし、次いで混合物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ＃７１００−０５）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ）を添加した。反応を５〜１０分間展開し、次いで０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。４５０ｎｍの吸光度を判定した。
【０４４６】
図３１に示したように、両方の競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用した結果は、ＴＯＡ−１がＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢへの結合を部分的に競合することを示し、ＴＯＡ−１結合部位がｈＴｒｋＢ上のＢＤＮＦドッキング部位と少なくとも部分的に重なることを示唆する。
【０４４７】
（実施例５０）
ヒトＴｒｋＢ上のＴＯＡ−１結合部位のマッピング
ＴｒｋＢ上のＴＯＡ−１結合部位をさらに描写するために、一連のキメラＴｒｋＢ−ＴｒｋＡ受容体を生成し、細胞ベースＥＬＩＳＡでＴＯＡ−１結合について評価した。
【０４４８】
ＴｒｋＢ−ＴｒｋＡキメラ受容体発現コンストラクトの生成
ＴｒｋＡ−ＴｒｋＢキメラ受容体を生成し、標準的な分子クローニング技法を使用して哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。キメラＴｒｋＢ（ｄ５ＴｒｋＡ）受容体（配列３５）を、ＴｒｋＢのドメイン５と呼ばれる残基２８４〜３７７（ｎｐ＿００１０１８０７４  配列３４）を、ＴｒｋＡドメイン５の残基２８０〜３７７（ｎｐ＿００２５２０、配列３３）と置き換えることによって生成した。同様に、キメラＴｒｋＡ（ｄ５ＴｒｋＢ）を、ＴｒｋＡの残基２８３〜３７７をＴｒｋＢの残基２８１〜３７７（配列３６）と置き換えることによって生成した。キメラＴｒｋＢ（ｄ４ＴｒｋＡ）を、ＴｒｋＢの残基１９０〜２８２をＴｒｋＡの残基１８７〜２８１（配列３７）と置き換えることによって生成した。キメラＴｒｋＡ（ｄ４ＴｒｋＢ）を、ＴｒｋＡの残基１８７〜２８１をＴｒｋＢの残基１９０〜２８２（配列３８）と置き換えることによって生成した。
【０４４９】
ヒト化ＴＯＡ−１抗体のＴｒｋＢ−ＴｒｋＡキメラ受容体への結合を評価するための細胞ベースＥＬＩＳＡを、以下の通り実施した。
【０４５０】
細胞トランスフェクション：
ヒト胚腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、１０ｃｍ２の組織培養プレート１つ当たり４．５×１０６細胞で蒔き、３７℃で一晩培養する。翌日、製造者プロトコールを使用して試薬とプラスミドＤＮＡの３：１の比でＬＦ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して、細胞にキメラＴｒｋＡ−Ｂ発現プラスミドをトランスフェクトする。細胞を、トリプシンを使用してトランスフェクトして４８時間後に回収し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで２×１０６細胞／ｍｌで血清を含まない増殖培地中に懸濁させる。
【０４５１】
細胞ベースＥＬＩＳＡアッセイ
１μｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＢまたは対照抗体を、９６−ウェルプレートを使用して１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：３に連続希釈する。無血清増殖培地中２×１０６細胞／ｍｌの適切なキメラＴｒｋＡ−Ｂ−トランスフェクト２９３細胞または対照親２９３細胞  １００μｌをＵ底９６ウェルプレートに添加して１×１０５細胞／ウェルを得る。細胞を１６００ｃｐｍで２分間遠心分離する。上清を１回のスイングで廃棄し、プレートを穏やかにたたいて細胞ペレットを放つ。１０％  ＦＣＳを含有する冷ＰＢＳ中の希釈した一次抗ＴｒｋＢまたはアイソタイプ−マッチング対照抗体１００μｌを細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートする。次いで細胞を、希釈した二次抗ＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート（ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３１４５８；ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＦＣ、Ｐｉｅｒｃｅ、３１４３９；ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１４１３）１００μｌを用いて氷上で１時間染色する。一次抗体および二次抗体インキュベーションの各ステップの後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。基質ＴＭＢ１コンポーネント（ＢＩＯ  ＦＸ、ＴＭＢＷ−０１００−０１）１００μｌをプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートする。発色を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加することによって停止する。細胞を遠心分離し、上清を新鮮なプレートに移し、４５０ｎｍ（Ｓｏｆｔ  ＭＡＸ  ｐｒｏ  ４．０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で読み取る。
【０４５２】
図３３に示したように、この細胞ベースＥＬＩＳＡにおいて、抗ＴｒｋＢ抗体ＴＯＡ−１は、細胞表面で発現したＴｒｋＢ（配列３４）に結合するが、ＴｒｋＡ（配列３３）に結合しない。この同じアッセイフォーマットにおいて、ＴＯＡ−１は、キメラＴｒｋＡ（ｄ５ＴｒｋＢ）に結合するが、ＴｒｋＢ（ｄ５ＴｒｋＡ）に結合しない。さらに、ＴＯＡ−１は、ＴｒｋＢ（ｄ４ＴｒｋＡ）に結合し、ＴｒｋＡ（ｄ４ＴｒｋＢ）に結合しない。総合して、結果は、ＴＯＡ−１抗体は、ＴｒｋＢのドメイン５に結合し、ＴｒｋＢのドメイン４は、ＴＯＡ−１結合に十分でないことを示す。
【０４５３】
（実施例５１）
ネコＮＴＲＫ２（ＴｒｋＢ）ｃＤＮＡの単離
方法
ネコ（フェリス・ドメスティクス（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））ＴｒｋＢの単離
ＴｒｋＢネココード配列を単離し、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してクローニングした。全長ネコ（フェリス・ドメスティクス（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））ＴｒｋＢ配列を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｅａｓｙ−Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙシステム（カタログ番号６００６４０）、ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチド、５’ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧ（配列番号１４４）および５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＧＧＡＧＡＴ（配列番号１４５）を使用する示唆されたプロトコールを使用して、ネコ脳ｃＤＮＡプール（ＢｉｏＣｈａｉｎ）から増幅させた。ｃＤＮＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、引き続いてＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いてｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。結果として生じるプラスミドを配列決定した（配列番号１４０、１４１）。
【０４５４】
イヌ（カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））全長ＴｒｋＢ（ＸＭ＿８５１３２９）コード配列を、プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧ（配列番号１４６）および５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＣＴＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＧ（配列番号１４７）を使用して、上述したようにイヌ脳ｃＤＮＡプール（ＢｉｏＣｈａｉｎ）からＰＣＲによって増幅させた。ヒトＴｒｋＢアイソフォームｃのイヌオルソログを上述したｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇ中へのサブクローニングのために選択した。結果として生じるプラスミドを配列決定した（配列番号１４２、１４３）。
【０４５５】
（実施例５２）
細胞ベースＥＬＩＳＡによって測定した異なる種のＴｒｋＢへの抗体結合
細胞ベースＥＬＩＳＡを実施して、マウス（ｎｍ＿００１０２５０７４）、ネコ、およびイヌＴｒｋＢ受容体への抗ＴｒｋＢ抗体の結合を評価した。
【０４５６】
細胞トランスフェクション：
ヒト胚腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）細胞を、１０ｃｍ２の組織培養プレート１つ当たり５×１０６細胞で蒔き、３７℃で一晩培養する。翌日、製造者のプロトコールを使用して試薬とプラスミドＤＮＡの３：１の比でＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞にヒト、イヌ、またはネコＴｒｋＢ発現プラスミドをトランスフェクトする。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してトランスフェクトして２４時間後に回収し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで２×１０６細胞／ｍｌで０．２％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中に懸濁させる。
【０４５７】
細胞ベースＥＬＩＳＡアッセイ
１０μｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＢまたは対照抗体を、９６−ウェルプレートを使用して０．２％  ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ中で１：３．１７に連続希釈する。上記からの適切なＴｒｋＢ−トランスフェクト２９３細胞または対照ＬａｃＺ−トランスフェクト２９３細胞５０μｌをＵ底９６ウェルプレートに添加して１×１０５細胞／ウェルを得る。プレートを４℃で１５分間放置した後、希釈した一次抗ＴｒｋＢまたはアイソタイプ−マッチング対照抗体５０μｌを細胞に添加する。細胞および抗体を穏やかなピペット操作によって混合し、次いで４℃で１時間インキュベートする。細胞を、１６００ｃｐｍで２分間遠心分離することよって氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。各回に、上清を１回のスイングで廃棄し、プレートを穏やかにたたいて細胞ペレットを放した後、次の緩衝液または培地を添加する。次いで、０．２％  ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中の希釈した二次抗ＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌを細胞に添加する。細胞を４℃で１時間インキュベートし、上述したように３回洗浄する。染色のために、基質ＴＭＢ１コンポーネント（ＢＩＯ  ＦＸ、ＴＭＢＷ−０１００−０１）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間インキュベートする。色展開を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加することによって停止する。細胞を遠心分離し、上清を新鮮なプレートに移し、４５０ｎｍ（Ｓｏｆｔ  ＭＡＸ  ｐｒｏ  ４．０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で読み取る。
【０４５８】
抗ＴｒｋＢ抗体マウスＴＯＡ−１およびヒト化ＴＯＡ−１は、図３３に示したように、細胞ベースＥＬＩＳＡによって判定した場合、マウス、ネコ、およびイヌＴｒｋＢに結合する。細胞ベースＥＬＩＳＡによって判定した場合の、細胞表面マウス、イヌ、およびネコＴｒｋＢへのＴＯＡ−１の結合についてＥＣ５０値を表３１に示す。
【０４５９】
【表３１】
2017521361.tif 000049
【０４６０】
（実施例５３）
ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、およびｐ７５に対する抗ＴｒｋＢ抗体の選択性
複数の実験的手法を使用して、抗ＴｒｋＢ抗体、ＴＯＡ−１が、ヒトＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、および低親和性ＢＤＮＦ受容体ｐ７５  ＮＴＲに対してヒトＴｒｋＢについて選択的であることを実証した。
【０４６１】
直接結合ＥＬＩＳＡ
ＴｒｋＢへのＴＯＡ−１選択性を、以下の通り、ビオチン化ヒト化ＴＯＡ−１、キメラＴＯＡ−１、およびマウスＴＯＡ−１抗体を用いた組換えヒトＴｒｋＡ−Ｆｃ、ＴｒｋＢ−Ｆｃ、またはＴｒｋＣ−Ｆｃへの直接結合ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０４６２】
９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌ  ｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄシステム、６８８−ＴＫ）、５μｇ／ｍｌ  ｒｈＴｒｋＡ−ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄシステム、１７５−ＴＫ）、または５μｇ／ｍｌ  ｒｈＴｒｋＣ−ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄシステム、３７３−ＴＣ／ＴＦ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ＋０．２％  カゼイン（１ウェル当たり１００μｌ）で、室温で３時間ブロックした。次に、６．７ｎＭのビオチン化抗体（マウスＴＯＡ１、キメラＴＯＡ１、ヒト化ＴＯＡ−１、またはアイソタイプ対照）１００μｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号７１００−０５）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０３％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ）を添加した。反応を５〜１０分間展開させ、次いで０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。４５０ｎｍの吸光度を判定した。
【０４６３】
図３４に示したように、ヒト化ＴＯＡ−１（すなわち、ＴＡＭ−１６３）、キメラＴＯＡ−１、およびマウスＴＯＡ−１は、ＴｒｋＢ−Ｆｃに結合するが、ＴｒｋＡ−ＦｃまたはＴｒｋＣ−Ｆｃに結合しない。
【０４６４】
ＦＡＣｓ分析
９０％コンフルエントなＨＥＫ２９３細胞に、製造者の指示に従ってＦｕｇｅｎｅ６  （Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ヒトＴｒｋＢ（哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇ中にクローニングしたｎｍ＿００６１８０に由来するオープンリーディングフレーム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはヒトｐ７５ＮＴＲ（ベクターｐＳＭＥＤ２中にクローニングしたＮＭ＿００２５０７に由来するオープンリーディングフレーム）を発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。ヒトＴｒｋＢおよびヒトｐ７５ＮＴＲの発現をウエスタン分析によって検証した。トランスフェクション後２４時間において、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡ中に再懸濁させた。２．５×１０５個のｈｕＴｒｋＢおよびｈｕ  ｐ７５ＮＴＲ細胞を以下の通り抗体を用いて染色した。ｐ７５ＮＴＲ検出のために、細胞を１μｇ／ｍｌ  マウス抗Ｐ７５−Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３６８Ｘ）とともに４℃で３０分間インキュベートし、その後、遠心分離（５分にわたって１５００ｒｐｍ）によってＰＢＳで洗浄した。ＴｒｋＢ染色のために、細胞を１μｇ／ｍｌ  ヒト化ＴＯＡ−１抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートし、その後、上述したようにＰＢＳで洗浄した。次に、細胞をＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ９６７０−０２）とともに４℃で３０分間インキュベートし、その後上述したようにＰＢＳで洗浄した。染色した細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した。
【０４６５】
図３５に示したように、ＦＡＣＳ分析を使用して、ＴＯＡ−１抗体は、細胞表面で発現したヒトＴｒｋＢに結合するが、細胞表面で発現したヒトｐ７５ＮＴＲに結合しない。それぞれの細胞株上の抗ｐ７５を使用するＦＡＣＳ分析は、これらの細胞株中のｐ７５の細胞表面発現を確認する。
【０４６６】
細胞ベースＥＬＩＳＡ
細胞ベースＥＬＩＳＡを実施して、ＴＯＡ−１がヒトＴｒｋＢ受容体に結合するが、ｐ７５ＮＴＲに結合しないことを評価した。
【０４６７】
ヒト胚腎臓２９３細胞を、２×１０６細胞／ｍｌで０．２％  ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させたことを除いて上記の通りトランスフェクトおよび回収した。２０μｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＢ（ＴＯＡ−１）、対照抗体（抗ｐ７５ＮＴＲ、Ｒ＆Ｄ  ＡＦ３６７）、または抗ｈｕＩｇＧアイソタイプ抗体を、９６−ウェルプレートを使用して０．２％  ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ中に１：３．１７に連続希釈する。上記からのトランスフェクトまたは対照２９３細胞５０μｌをＵ底９６ウェルプレートに添加して１×１０５細胞／ウェルを得る。プレートを４℃で１５分間インキュベートした後、冷たい中での希釈した一次抗ＴｒｋＢまたはアイソタイプ−マッチング対照抗体５０μｌを細胞に添加する。細胞および抗体を、上下に３回ピペット操作することによって混合した後、４℃で１時間インキュベートする。細胞を、１６００ｃｐｍで２分間遠心分離することによって氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。各回に、上清を１回のスイングで廃棄し、プレートを穏やかにたたいて細胞ペレットを放した後、次の緩衝液または培地を添加する。次いで、０．２％  ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中の希釈した二次抗ＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌを細胞に添加する。細胞を４℃で１時間インキュベートし、上述したように３回洗浄する。染色に関して、基質ＴＭＢ１コンポーネント（ＢＩＯ  ＦＸ、ＴＭＢＷ−０１００−０１）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間インキュベートする。色展開を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加することによって停止する。細胞を遠心分離し、上清を新鮮なプレートに移し、４５０ｎｍ（Ｓｏｆｔ  ＭＡＸ  ｐｒｏ  ４．０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で読み取る。
【０４６８】
図３６に示したように、ＴＯＡ−１抗体は、ＴｒｋＢを発現する細胞に結合するが、ｐ７５ＮＴＲコンストラクトをトランスフェクトした細胞に結合しない（図３６Ａ）。トランスフェクトされた細胞は、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体によって検出した場合、細胞表面上でｐ７５ＮＴＲを確かに発現する（図３６Ｂ）。
【０４６９】
Ｔｒｋシグナル伝達
マウス、キメラ、およびヒト化抗ＴｒｋＢ  ＴＯＡ−１抗体の、ＴｒｋＢシグナル伝達カスケードを活性化するが、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣカスケードを活性化しない能力を、Ｔｒｋシグナル伝達のメディエーターとして公知のＴｒｋの自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、およびＰＬＣγ１のリン酸化を監視することによって評価した（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１９９９；２５３：１３１〜１４２に総説されている）。
【０４７０】
ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター、ならびにｒｈｕＴｒｋＡ（ＮＭ＿００２５２９．３に由来するオープンリーディングフレーム）、ｒｈｕＴｒｋＢ（ｎｍ＿００６１８０に由来するオープンリーディングフレーム）、およびｒｈｕＴｒｋＣ（ＮＭ＿００１０１２３３８．１に由来するオープンリーディングフレーム）の両方を発現するＨＥＫ−２９３細胞の安定な細胞株を、標準技法を使用して生成した（Ｚｈａｎｇら、２００７、Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ、１５：２９〜３９）。安定な細胞株を、ｒｈｕＴｒｋＡ−ＣＲＥ、ｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥ、およびｒｈｕＴｒｋＣ−ＣＲＥと命名する。
【０４７１】
Ｔｒｋ−発現細胞を、ＴＯＡ−１抗体、アイソタイプ対照抗体、またはニューロトロフィンリガンドＢＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＮＴ３で処置した。以下に詳述するように、ウエスタン分析を実施して、ｈＴｒｋ（Ｔｙｒ４９０）の自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、およびＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）のリン酸化を評価した。
【０４７２】
ｒｈｕＴｒｋＡ−ＣＲＥ、ｒｈｕＴｒｋＢ−ＣＲＥ、ｒｈｕＴｒｋＣ、または親ＨＥＫ−２９３細胞を、１０％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ増殖培地中で、５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに蒔き、細胞が８５〜９０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を０．１％  ＦＣＳ−ＤＭＥＭ（低血清培地）で１回洗浄し、低血清培地中でさらに４時間インキュベートした。次に、細胞を、ＴＯＡ−１抗体（最終濃度１００ｎＭ）またはニューロトロフィン（ＴｒｋＢ：ＢＤＮＦ、Ｒ＆Ｄ  ＃２４８ＢＤ、１０ｎＭの最終濃度；ＴｒｋＡ：ＮＧＦ、Ｒ＆Ｄ  ２５６ＧＦ、１０ｎＭの最終濃度；ＴｒｋＣ：ＮＴ３、Ｒ＆Ｄ２６７Ｎ３、２５ｎＭの最終濃度）で１５〜６０分間処置した。培地をウェルから吸引し、１×ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７、１％  ｂ−ＭＥを含む）０．６ｍｌを１ウェル当たりに添加して細胞を溶解させた。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、１００℃で５分間加熱した。各試料２５μｌをＮｕＰＡＧＥ  ４〜２０％ビス−トリス勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に溶解させた。
【０４７３】
ウエスタン分析を以下の通り実施した。電気泳動後、サイズ分画されたタンパク質をニトロセルロース膜上に移した。膜をＴ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中０．１５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％ミルクでブロックし、１％ミルク  Ｔ−ＴＢＳ中の適切な一次抗体［抗Ｐ−Ｔｒｋ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＴｒｋＡ（Ｔｙｒ４９０）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＣＳ）＃９１４１；抗ホスホ−ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）、ＣＳ＃２８２１；抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＣＳ＃９２７１；抗Ｐ−ＥＲＫ１／２（ホスホ−Ｐ４４／Ｐ４２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＣＳ  ＃９１０１；抗アクチン、Ｓｉｇｍａ  Ａ２０６６］とともに、４℃にて一晩ロッキングプラットフォーム上でインキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳ中で３回洗浄し、次いで適切なＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃７９７４）とともに２時間インキュベートした。次に、膜をＴ−ＴＢＳ中で４回、およびＴＢＳ中で１回洗浄した。信号を、ＥＣＬキット（ＧＥ  ＲＰＮ２１０６Ｖ）および製造者のプロトコール、その後Ｘ線フィルム曝露またはＧｅｌ−Ｄｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して展開させて、画像を捕捉した。
【０４７４】
図３７に示したように、ＴＯＡ−１抗体は、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣ発現細胞内で、Ｔｒｋ自己リン酸化、ならびにＰＬＣγ１、ＡＫＴ、およびＥＲＫ１／２リン酸化において基礎レベルを超える検出可能な増大を引き起こすことができなかった。対照的に、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣリガンド、それぞれＮＧＦおよびＮＴ３は、応答を誘導し、細胞シグナル伝達システムがインタクトであることを示した。
【０４７５】
すべてのさらなる実施例において、ｈｕＴＯＡ−１（配列番号５１および５３）をＴＡＭ−１６３と呼ぶ。
【０４７６】
（実施例５４）
触媒および非触媒ＴｒｋＢアイソフォームのｍＲＮＡ発現
機能的試験に備えて、かつ高レベルの内因性ＴｒｋＢを発現する組織および細胞株を同定するために、ＴｒｋＢの非触媒アイソフォームと比較した触媒アイソフォームの組織分布を、Ｔａｑｍａｎ定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して検査した。プライマー−プローブ対を、すべてのｈＴｒｋＢアイソフォームに一般的な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、または触媒ｈＴｒｋＢ−ａおよびｈＴｒｋＢ−ｃアイソフォームに一般的な触媒ドメインを認識するように設計した。検量線を、ＴｒｋＢプラスミドｃＤＮＡを使用して各プライマープローブ対について生成し、生データをＴｒｋＢ  ｃＤＮＡ分子に変換するのに使用した。異なるｍＲＮＡ試料について同様の効率の逆転写を仮定すると、この数値は、各組織についてのＴｒｋＢ  ｍＲＮＡの分子を反映する。２つの独立したプライマー−プローブ対を各領域について設計し、同様の結果が両方の対で得られた。表３２で分かるように、ｈＴｒｋＢは、脳内で最も高度に発現され、この組織において、ＴｒｋＢの触媒アイソフォームは、すべてのＴｒｋＢアイソフォームの約３５％を占める。神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、レチノイン酸で分化させたとき、ヒト脳内で見つかるものと同等のレベルのＴｒｋＢ  ｍＲＮＡを発現し、ＴｒｋＢ  ｍＲＮＡの８７％が触媒アイソフォームによって占められた。したがって、この細胞株を、内因性ＴｒｋＢに対するＴＡＭ−１６３の効果を評価するのに選択した。非神経細胞組織は、すべてのアイソフォームの発現を検査したとき、脳内で見つかるＴｒｋＢ  ｍＲＮＡレベルの１０％未満を示し、触媒アイソフォームの発現は、より低くさえあり、脳内で観察される量の２％未満を構成した。ＴｒｋＢの最低の発現が末梢血白血球内で観察され、ＴｒｋＢ  ｍＲＮＡは、かろうじて検出可能であった。
【０４７７】
【表３２】
2017521361.tif 000050
【０４７８】
（実施例５５）
組換えｈＴｒｋＢ、ｈＴｒｋＡ、およびｈＴｒｋＣを発現する細胞株内のＴＡＭ−１６３によるシグナル伝達
ＴＡＭ−１６３の、ＴｒｋＢシグナル伝達カスケードを活性化する能力を、１）ＴｒｋＢシグナル伝達活性化を監視するための転写レポーターアッセイ、２）シグナル伝達分子ＳＨＣ１のＴｒｋＢへの動員を監視するための酵素相補性アッセイ、ならびに３）Ｔｒｋシグナル伝達のメディエーターとして公知のｈＴｒｋＢの自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、およびＰＬＣγ１のリン酸化の評価を使用して評価した。同じアッセイを、ＴＡＭ−１６３のＴｒｋＡおよびＴｒｋＣシグナル伝達経路を活性化する能力を検査するのにも使用した。
【０４７９】
（実施例５６）
ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢを発現する細胞株内でＣｒｅ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化するが、ｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣを発現する細胞株内で活性化しない。
Ｃｒｅ−ルシフェラーゼ（Ｃｒｅ−ｌｕｃ）転写レポーターアッセイは、ＴｒｋＢリガンドのＣＲＥ応答エレメントを活性化し、したがって、複数の上流シグナル伝達経路を組み込む能力を測定する。このアッセイに使用される細胞株、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ、ｈＴｒｋＡ−Ｃｒｅ、およびｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅは、以前に記載されており、適切な内因性リガンドに対して特異的に応答することが示された（Ｚｈａｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ．、２００６−２００７；１５（１）：２６〜３９、Ｑｉａｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００６年９月１３日；２６（３７）：９３９４〜９４０３）。ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ細胞をＴＡＭ−１６３で処置すると、ルシフェラーゼ活性が用量依存的に増大し、ＥＣ５０は、０．２ｎＭであり、最大増大倍率は、５倍であった（図３８）。同じ実験において、ヒトＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）は、５．２ｎＭのＥＣ５０および７．５倍の最大増大倍率を示し、一方、ｈＩｇＧ対照抗体は、効果を有さなかった（図３８）。実験間で、ＥＣ５０および最大誘導倍率は、ＴＡＭ−１６３について０．１０ｎＭ〜０．７９ｎＭおよび２．５〜５．４倍、ならびにヒトＢＤＮＦについて５．２〜８．２ｎＭおよび６〜７．５倍の範囲であった。ｈＴｒｋＢ  Ｃｒｅ−ｌｕｃレポーターアッセイにおいて複数回試験したＴＡＭ−１６３の異なるロットについての個々の活性データを以下に示す（表３３）。すべてのアッセイにわたって平均すると、このアッセイにおけるＴＡＭ−１６３のＥＣ５０値は、０．３７±０．０６ｎＭであると判定され、誘導倍率は、４．２±０．３であった。
【０４８０】
【表３３】
2017521361.tif 000051
【０４８１】
ＴＡＭ−１６３のヒトＴｒｋＡおよびＴｒｋＣとの交差反応性を、適切な内在性対照（ｈＴｒｋＡについてＮＧＦ、ｈＴｒｋＢについてＢＤＮＦ、およびｈＴｒｋＣについてＮＴ−３）とともにｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ、ｈＴｒｋＡ−Ｃｒｅ、およびｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ、ならびに２０ｎＭまたは１００ｎＭのＴＡＭ−１６３を使用して試験した（図３９）。内因性リガンドは、予期された応答をもたらした一方（ＮＧＦ：４．５倍の増大  ｈＴｒｋＡ−Ｃｒｅ；ＮＴ−３：２．９倍の増大  ｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ）、ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣ細胞のいずれにおいてもｈＩｇＧ対照と比較していずれのルシフェラーゼ活性の増大も示さなかった。同じ実験において、ＴＡＭ−１６３は、３．４〜４．１倍、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ細胞を確かに活性化し、予期されたようにＴＡＭ−１６３がＴｒｋＢに対して有効であったことを実証した。
【０４８２】
（実施例５８）
ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢを発現する細胞内でＳＨＣ１動員を媒介するが、ｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣを発現する細胞内で媒介しない
ＴＡＭ−１６３のｈＴｒｋＡ、ｈＴｒｋＢ、およびｈＴｒｋＣを活性化する能力も、酵素相補性アッセイでアッセイした（図４０；表３４）。このアッセイは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ  Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ技術を使用してＵ２０Ｓ細胞内の自己リン酸化ＴｒｋＢへのシグナル伝達分子ＳＨＣ１の動員を監視する。ＴＡＭ−１６３は、Ｃｒｅ−ルシフェラーゼレポーターアッセイで観察されたものと同様の効力を伴って、このアッセイにおいてｈＴｒｋＢを活性化した（ＥＣ５０＝０．６７ｎＭ）（図４０；表３４）。Ｃｒｅ−ルシフェラーゼアッセイと同様に、ＴＡＭ−１６３によって誘導された最大信号は、ＢＤＮＦで観察された最大信号より有意に低く、ＴＡＭ−１６３がこのアッセイにおいて部分アゴニストであることを示唆した。重要なことに、ＴＡＭ−１６３は、最大で６７０ｎＭの濃度でｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣを活性化せず、一方、これらの受容体の内因性リガンドは、非常に低い濃度で強い活性化を示した（図４０；表３４）。ｈＴｒｋＡ、ｈＴｒｋＢ、およびｈＴｒｋＣは、このアッセイにおいて著しく広いアレイの内因性Ｔｒｋリガンドによって活性化された。それは、アッセイした特定のシグナル伝達経路（ＳＨＣ１動員）、細胞バックグラウンド（Ｕ２ＯＳ細胞）、またはＰａｔｈｈｕｎｔｅｒシステムの特質を反映し得る（このアッセイは、小さいペプチドエピトープに融合したｈＴｒｋＢ−ａアイソフォームを使用し、一方、本発明者らの他のアッセイは、天然ｈＴｒｋＢ−ｃアイソフォームで行う）。ＴＡＭ−１６３は、このアッセイにおける内因性リガンドの明らかな緩和された特異性にもかかわらずｈＴｒｋＡおよびｈＴｒｋＣを交差活性化（ｃｒｏｓｓａｃｔｉｖａｔｅ）しなかったことは注目すべきである。
【０４８３】
【表３４】
2017521361.tif 000052
【０４８４】
（実施例５９）
ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢを発現する細胞内でＴｒｋ依存性リン酸化事象を活性化するが、ｈＴｒｋＡまたはｈＴｒｋＣを発現する細胞内で活性化しない。
ＴｒｋＢの下流のシグナル伝達事象を直接監視するために、本発明者らは、ウエスタンブロッティングを使用した。ＴｒｋＢ（Ｙ４９０）の自己リン酸化、ならびにＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）、およびＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）を含めたＴｒｋＢの下流のシグナル伝達分子のリン酸化を、上述したｈＴｒｋＡ−Ｃｒｅ、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ、およびｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ細胞株を使用して評価した。ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ細胞内でＴｒｋＢ（Ｙ４９０）、ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）、およびＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の用量依存的リン酸化を誘導したが、ｈＩｇＧ対照抗体は、それを誘導しなかった（図４２）。
【０４８５】
ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＡ−ＣｒｅまたはｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ細胞内でシグナル伝達を誘導することができなかった（図４２）。ｈＴｒｋＡ（ＮＧＦ）およびｈＴｒｋＣ（ＮＴ−３）の内因性リガンドは、ｈＴｒｋＡ−ＣｒｅならびにｈＴｒｋＣ−Ｃｒｅ細胞内でＴｒｋ自己リン酸化、ならびにシグナル伝達中間体ＥＲＫ１／２およびＰＬＣγ１のリン酸化の両方を誘導し、これらの細胞株がこれらの適切なリガンドに応答することを実証した。同じ実験において、ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢの下流のシグナル伝達を活性化することができ、ＴＡＭ−１６３が活性であることを実証した。
【０４８６】
（実施例６０）
ＴＡＭ−１６３は、内因性ｈＴｒｋＢを発現するヒト神経芽細胞腫細胞株内でＴｒｋ依存性リン酸化事象を活性化する。
ＴＡＭ−１６３の内因性ＴｒｋＢを発現する細胞内でシグナル伝達する能力を検査するために、本発明者らは、分化したヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用した。ＴＡＭ−１６３は、これらの細胞内で、用量依存的な様式でＥＲＫ１／２、ＰＬＣγ１、およびＡＫＴのリン酸化を誘導したが、ｈＩｇＧ対照抗体は、それを誘導しなかった。効果は、１ｎＭ以上のＴＡＭ−１６３の濃度で明らかとなった（図４３）。ＢＤＮＦと比較して、ＴＡＭ−１６３は、いくぶん強力でないと思われ、リン酸化の有意により低い最大刺激を示し、ＴＡＭ−１６３がこのシステムにおいて部分アゴニストであることを示唆した。
【０４８７】
（実施例６１）
ＴＡＭ−１６３は、ｈＴｒｋＢの内部移行および分解を誘導する
ＢＤＮＦは、ＴｒｋＢの内部移行および分解を媒介すると報告されている。本発明者らは、組換え（ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ）または内因性（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）ＴｒｋＢを発現する細胞株を使用してＴｒｋＢの内部移行および分解に対するＴＡＭ−１６３の効果を検査した。内部移行を監視するために、細胞を、示した時間にわたってＴＡＭ−１６３またはＢＤＮＦで活性化し、次いで細胞表面タンパク質を、ビオチンで標識し、ストレプトアビジン親和性精製によって単離し、細胞表面ＴｒｋＢタンパク質をウエスタンブロッティングによって同定した。このアッセイにおいて、ビオチン化ＴｒｋＢは、活性化後に細胞表面上に残っているＴｒｋＢを表す。図４４で分かるように、ＴＡＭ−１６３は、組換えＴｒｋＢ（ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ）を発現する細胞、および内因性ＴｒｋＢ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を発現する細胞内でＴｒｋＢのかなりの内部移行を誘導したが、対照ｈＩｇＧ抗体は、それを誘導しなかった。ＴＡＭ−１６３は、無関係のタンパク質（ＥＧＦ−受容体、ＮＭＤＡ−受容体）の細胞表面レベルに影響しなかった。ＴＡＭ−１６３によって誘導されるＴｒｋＢ内部移行の時間経過および量は、ｈＴｒｋＢ−ＣｒｅおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の両方においてＢＤＮＦと同等であった（図４４）。
【０４８８】
ＴｒｋＢ分解を監視するために、細胞表面タンパク質をリガンド曝露の前にビオチンで標識し、次いで細胞をＴＡＭ−１６３またはＢＤＮＦで示した時間にわたって活性化した。標識したタンパク質をストレプトアビジン親和性精製によって単離し、ＴｒｋＢをウエスタンブロッティングによって同定した。このアッセイにおいて、ビオチン化ＴｒｋＢは、活性化後に残っている総ＴｒｋＢを表し、標識したＴｒｋＢの消失は、細胞からのそのクリアランスの尺度である。図４５で分かるように、ＴＡＭ−１６３は、組換えＴｒｋＢ（ｈＴｒｋＢ−Ｃｒｅ）を発現する細胞、および内因性ＴｒｋＢ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を発現する細胞内で細胞表面標識ＴｒｋＢの分解を誘導したが、ｈＩｇＧ対照抗体は、それを誘導しなかった。ＴＡＭ−１６３は、無関係のタンパク質（ＥＧＦ−受容体、ＮＭＤＡ−受容体）に影響しなかった。ＴＡＭ−１６３によって誘導されるＴｒｋＢ分解の時間経過および量は、ｈＴｒｋＢ−ＣｒｅおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の両方においてＢＤＮＦと同等であった（図４５）。
【０４８９】
（実施例６２）
ＴＡＭ−１６３は、ヒトｐ７５ＮＴＲに結合しない
ＴＡＭ−１６３のヒトｐ７５ＮＴＲへの交差反応性を、ｈＴｒｋＢまたはヒトｐ７５ＮＴＲを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析によって検査した。ＴＡＭ−１６３（６．７ｎＭ）は、対照空ベクターをトランスフェクトした細胞と比較して蛍光の増大によって証明されるように、ｈＴｒｋＢをトランスフェクトした細胞に特異的に結合することができた（図４６）。ＴＡＭ−１６３は、ヒトｐ７５ＮＴＲをトランスフェクトした細胞へのいずれの結合も示さず、実際には、染色は、対照のトランスフェクトした細胞と比較してわずかにより低かった（図４６、上のパネル）。ｐ７５ＮＴＲが実際に発現され、細胞表面に存在したことを検証するために、細胞をＡＬＥＸＡ−標識抗ｐ７５ＮＴＲ抗体で染色した。図４６、下のパネルで分かるように、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体は、ｐ７５ＮＴＲを発現する細胞を強く染色したが、ｈＴｒｋＢまたは対照ベクターを発現する細胞を染色しなかった。
【０４９０】
第２の手法として、本発明者らは、細胞ベースＥＬＩＳＡを使用してｐ７５ＮＴＲを発現する細胞へのＴＡＭ−１６３の結合を試験した。ｈＴｒｋＢ、ヒトｐ７５ＮＴＲ、または対照ベクターを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＴＡＭ−１６３または抗ｐ７５ＮＴＲ抗体とともにインキュベートした。ＴＡＭ−１６３は、０．２ｎＭという低い濃度で検出可能な結合を伴ってヒトＴｒｋＢを発現する細胞に特異的に結合した（図４７）。ＴＡＭ−１６３は、非常に高い濃度（６７ｎＭ）でさえ、ヒトｐ７５ＮＴＲを発現する細胞へのいずれの結合も示さなかった。ｐ７５ＮＴＲが実際に発現され、細胞表面に存在したことを検証するために、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体を用いた染色を使用した。予期されたように、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体は、ヒトｐ７５ＮＴＲを発現する細胞を染色したが、対照細胞またはｈＴｒｋＢを発現する細胞を染色しなかった（図４７）。
【０４９１】
（実施例６３）
サル、マウス、イヌ、およびネコＴｒｋＢとのＴＡＭ−１６３の交差反応性
カニクイザルＴｒｋＢについての配列情報が利用可能でないので、本発明者らは、標準的なクローニング生物学技法および鋳型として脳を使用してこの種に由来するＴｒｋＢ  ｃＤＮＡを単離した。配列決定は、ＴｒｋＢ−ｃおよびＴｒｋＢ−ａアイソフォームの両方の存在を明らかにし、クローンの大部分（８／１０）は、ＴｒｋＢ−ｃアイソフォームを含有した。カニクイザルＴｒｋＢ  ｃＤＮＡ配列のヒトＴｒｋＢ配列との比較は、シグナル配列中の１つのアミノ酸変化を例外として、成熟したカニクイザルＴｒｋＢタンパク質は、ヒトＴｒｋＢのアミノ酸配列において同一であることを示す。アカゲザルＴｒｋＢ配列（ＸＰ＿００１１０７２６４として公共データベースにおいて利用可能）は、成熟したヒトＴｒｋＢと同一であることが見出される（示さず）。サルＴｒｋＢタンパク質は、ヒトと同一であるので、上記に示したすべてのヒトＴｒｋＢ結合およびシグナル伝達データは、サルＴｒｋＢに同等に適用可能である。
【０４９２】
本発明者らは、結合およびシグナル伝達実験の両方を使用してＴＡＭ−１６３のマウスおよびイヌＴｒｋＢとの交差反応性を評価した。結合については、細胞ベースＥＬＩＳＡを使用した。マウス、イヌ、もしくはネコＴｒｋＢ、または対照ベクターを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、様々な濃度のＴＡＭ−１６３抗体とともにインキュベートした。用量依存的な結合が、すべての種に由来するＴｒｋＢに対して観察され、一方、結合は、ｌａｃｚを発現する対照細胞株に対して観察されなかった。ＥＣ５０は、種間で同様であり（マウスＴｒｋＢ＝０．３４ｎＭ；イヌＴｒｋＢ＝０．９４ｎＭ；ネコＴｒｋＢ＝０．３９ｎＭ）、ＴＡＭ−１６３は、高親和性を伴ってマウス、イヌ、およびネコＴｒｋＢに結合することを示した（図４８）。
【０４９３】
マウスおよびイヌＴｒｋＢにシグナル伝達を誘導するＴＡＭ−１６３の能力を評価するために、本発明者らは、マウスまたはイヌＴｒｋＢを発現する安定な細胞株を生成した。ＴＡＭ−１６３は、マウス（図４９；ＴＡＭ−１６３）およびイヌ（図５０；ＴＡＭ−１６３）ＴｒｋＢ細胞の両方において、ＴｒｋＢ（Ｙ４９０）、ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）、およびＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を用量依存的に活性化したが、ｈＩｇＧ対照抗体は、それを活性化しなかった。シグナル伝達経路の活性化は、マウスおよびイヌの両方において１ｎＭ以下の濃度で検出可能であり、マウスおよびイヌＴｒｋＢについての結合アッセイにおいて観察されたＥＣ５０と一致した。
【０４９４】
（実施例６４）
感覚神経性難聴におけるＴｒｋＢ：
一時的および永続的な難聴を、強烈な音への過剰曝露、化学誘導損傷、または老化から起こる神経変性（老人性難聴）を含めた様々な源によって誘導する。Ｌｉｂｅｒｍａｎ、２００９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９（４５）：１４０７７〜１４０８５からの最近の証拠は、リボンシナプスが急性騒音曝露後の、および老人性難聴においての両方の傷害の原因の第１の部位であることを示唆する。このリボンシナプス損傷は、らせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）および毛髪細胞消失に先行し、リボンシナプスを難聴介入の誘引性の標的にする。
【０４９５】
ニューロトロフィンとして公知の因子関連ペプチドが、神経発達および維持にとって本質的であり、いくつかのニューロトロフィンが、いくつかの神経細胞受容体に対して作用し、神経細胞の生存および分化を促進することが知られている。このクラスのペプチドは、リボンシナプス、具体的には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）にインパクトを与えることが示されている。Ｗｉｓｅらのエレガントな研究（その内容が参照により本明細書に組み込まれているＪ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００、４８７：１４７〜１６５）は、ＢＤＮＦ処置が、すべての蝸牛領域にわたって常に聴力を失わせることに応答してＳＧＮの喪失を防止したことを明らかに実証する。具体的には、ＢＤＮＦを適用すると、試験したモデルにおいて聴覚神経細胞死が防止され、継続した神経細胞喪失が低減され、蝸牛の性能が増強され、聴覚に対して大きい効果が生じた。Ｍｅｌｓｔｅｒら（その内容が参照により本明細書に組み込まれているＣｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、２０１４：２４（６）：６５８〜６６３）は、ＴｒｋＢが、マウスの蝸牛における騒音外傷に対する概日感度に対する保護を媒介することを実証した。Ｓｃｈｉｍｍａｎｇら（その内容が参照により本明細書に組み込まれているＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００３、１３０：４７４１〜４７５０）は、出生後の蝸牛においてＢＤＮＦおよびＴｒｋＢシグナル伝達が欠如すると、周波数軸（ｔｏｎｏｔｏｐｉｃ  ａｘｉｓ）に沿った神経支配の空間的な再形成および難聴に至ることを実証した。
【０４９６】
チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）は、いくつかの増殖因子関連ペプチド（ニューロトロフィン）、特に、ＢＤＮＦおよびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）の高親和性触媒受容体である。ＴｒｋＢは、それを、突然の難聴、騒音誘導難聴、年齢関連難聴（老人性難聴）、騒音誘導難聴、薬物誘導難聴、および聴覚の遺伝子障害を含めた様々な感音難聴障害の強い潜在的な治療標的にするリボンシナプスを含めた中枢神経系全体にわたる神経細胞内で主に発現され、機能する。したがって、ＴｒｋＢアゴニストは、このような難聴障害を処置するための潜在的な治療剤であり得る。
【０４９７】
ＴＡＭ−１６３は、ＴｒｋＢのアゴニストとして設計されたヒト化モノクローナル抗体である。ＴＡＭ−１６３（ｈｕＴＯＡ−１およびＰＦ−０５２３０９０１とも呼ぶ）は、下流シグナル伝達カスケードの強い活性化を示し（図４１、ＴＲＫ、ＰＬＣγ１、およびＥＲＫ１／２）、優れた選択性プロファイルを実証する（図４２）選択的抗体ＴｒｋＢアゴニストであることが示されている。したがって、ＴＡＭ−１６３は、ＴｒｋＢアゴニストによって処置され得る難聴障害の処置であって、このような処置を必要とする患者における、処置のための潜在的な治療剤であり得る。
【０４９８】
このような患者は、異なる周波数で個体の聴覚感度を判定するために聴力計を使用してオージオロジストが行い得る難聴を判定するための試験によって同定することができる。他の聴覚試験、例えば、当技術分野で公知の多くのこのような試験の中でも、Ｗｅｂｅｒ試験、Ｒｉｎｎｅ試験、騒音中の聴覚の試験、音響反射試験、およびティンパノグラムも使用され得る。
【０４９９】
（実施例６５）
結論
本データは、ＴＡＭ−１６３がＴｒｋＢシグナル伝達カスケードのすべての態様を活性化するヒトＴｒｋＢの強力で特異的なアゴニストであることを実証する。ＴＡＭ−１６３の効力（ＥＣ５０）は、内因性ＴｒｋＢリガンドＢＤＮＦと同等であるが、最大効果は、ＢＤＮＦで観察されるものより低く（アッセイに応じて最大信号の約５０〜８０％）、ＴＡＭ−１６３がヒトＴｒｋＢの部分アゴニストであることを示唆する。ＴＡＭ−１６３は、ＢＤＮＦと同様の様式でヒトＴｒｋＢの内部移行および分解を誘導する。ＴＡＭ−１６３は、細胞−表面結合実験においてヒトＴｒｋＡ、ヒトＴｒｋＣ、またはヒトｐ７５ＮＴＲと交差反応せず、ヒトＴｒｋＡまたはＴｒｋＣを発現する細胞株内でシグナル伝達を誘導しない。ＴＡＭ−１６３は、ヒトＴｒｋＢに対するその効果と同様に、低ナノモル濃度でマウスおよびイヌＴｒｋＢに結合し、これらを活性化する。サルＴｒｋＢは、ヒトＴｒｋＢと１００％同一であるので、ＴＡＭ−１６３はまた、サルＴｒｋＢと完全に交差反応する。正常なヒト組織内のＴｒｋＢの触媒アイソフォームおよびすべてのＴｒｋＢアイソフォームのｍＲＮＡ発現を検査すると、ＴｒｋＢの触媒アイソフォームは、脳内で最も高度に発現され、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙを、内因性ＴｒｋＢによって媒介されるシグナル伝達を検査するのに使用することができることが確認される。
【０５００】
本発明のさらなる実施形態
Ｅ７７．本発明の７７番目の実施形態（Ｅ７７）によれば、ヒトチロシン受容体キナーゼＢ（ｈｕＴｒｋＢ）に特異的に結合する単離されたｈｕＴｒｋＢ抗体であって、ＶＨ領域は、配列番号５１、配列番号１１１、および配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号５３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、および配列番号１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたｈｕＴｒｋＢ抗体が提供されている。
Ｅ７８．ＶＨ領域が、配列番号５１のアミノ酸を含み、ＶＨ領域が、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、Ｅ７７に記載の抗体。
Ｅ７９．ＩｇＧ１サブクラスである、Ｅ７７からＥ７８のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ８０．ＨＣが配列番号７５を含み、ＬＣが配列番号７８を含む、Ｅ７７からＥ７９のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ８１．ヒトチロシン受容体キナーゼＢ（ｈｕＴｒｋＢ）に特異的に結合する単離されたｈｕＴｒｋＢ抗体であって、ＶＨ領域は、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１３からなる群から選択される配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号１２３、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、および配列番号１３３からなる群から選択される配列を含む核酸によってコードされる、単離されたｈｕＴｒｋＢ抗体。
Ｅ８２．ＶＨ領域が、配列番号１１０を含む核酸によってコードされ、ＶＬ領域が、配列番号１２３を含む核酸によってコードされる、Ｅ７７からＥ８１のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ８３．Ｅ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体をコードする核酸。
Ｅ８４．ＶＨ領域が、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１３からなる群から選択される配列を含む核酸によってコードされ、ＶＬ領域が、配列番号１２３、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、および配列番号１３３からなる群から選択される配列を含む核酸によってコードされるＥ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体をコードする核酸。
Ｅ８５．ＶＨ領域が、配列番号１１０を含む核酸によってコードされ、ＶＬ領域が、配列番号１２３を含む核酸によってコードされるＥ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体をコードする核酸。
Ｅ８６．Ｅ８３からＥ８５のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
Ｅ８７．Ｅ８３からＥ８６のいずれか１つに記載の抗体をコードする核酸を含むベクター。
Ｅ８８．Ｅ８３からＥ８５のいずれか１つに記載の核酸を含む細胞。
Ｅ８９．Ｅ８６からＥ８７のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞。
Ｅ９０．Ｅ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体を発現する細胞。
Ｅ９１．Ｅ８３からＥ８５のいずれか１つに記載の核酸を含む細胞。
Ｅ９２．抗体を生成する方法であって、抗体発現に貢献する条件下でＥ８８からＥ９１のいずれか１つに記載の細胞を培養することと、前記細胞に前記抗体を発現させることとを含む、方法。
Ｅ９３．Ｅ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
Ｅ９４．個体における難聴を処置する方法であって、治療有効量のＥ９３に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
Ｅ９５．個体におけるさらなる難聴を防止する方法であって、治療有効量のＥ９３に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
Ｅ９６．難聴が、突然の難聴、年齢関連難聴、騒音誘導難聴、薬物誘導難聴、および聴覚の遺伝子障害からなる群から選択される、Ｅ９４から９５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９７．難聴が、聴覚神経細胞死によって特徴付けられる、Ｅ９４からＥ９６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９８．聴覚神経細胞死が、ＴｒｋＢ活性化によって最小限にされる、または阻害される、Ｅ９４からＥ９７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９９．聴覚神経細胞死が、リボンシナプスで起こる、Ｅ９４からＥ９８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１００．蝸牛の性能を改善する、Ｅ９４からＥ９９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１０１．難聴を処置するのに使用するための、Ｅ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０２．個体におけるさらなる難聴の防止において使用するための、Ｅ７７からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０３．難聴が、突然の難聴、年齢関連難聴、騒音誘導難聴、薬物誘導難聴、および聴覚の遺伝子障害からなる群から選択される、Ｅ１０１から１０２のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０４．難聴が、聴覚神経細胞死によって特徴付けられる、Ｅ１０１からＥ１０３のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０５．聴覚神経細胞死が、ＴｒｋＢ活性化によって最小限にされ、または阻害される、Ｅ１０４に記載の抗体。
Ｅ１０６．聴覚神経細胞死が、リボンシナプスで起こる、Ｅ１０４からＥ１０５のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０７．難聴を有する個体への抗体の投与が、蝸牛の性能を改善する、Ｅ１０１からＥ１０６のいずれか１つに記載の抗体。
Ｅ１０８．難聴を処置するのに使用するための、Ｅ９３に記載の医薬組成物。
Ｅ１０９．個体におけるさらなる難聴を防止するのに使用するための、Ｅ９３に記載の医薬組成物。
Ｅ１１０．難聴が、突然の難聴、年齢関連難聴、騒音誘導難聴、薬物誘導難聴、および聴覚の遺伝子障害からなる群から選択される、Ｅ１０８から１０９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１１１．難聴が、聴覚神経細胞死によって特徴付けられる、Ｅ１０８からＥ１１０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１１２．聴覚神経細胞死が、ＴｒｋＢ活性化によって最小限にされる、または阻害される、Ｅ１１１に記載の医薬組成物。
Ｅ１１３．聴覚神経細胞死が、リボンシナプスで起こる、Ｅ１１１からＥ１１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１１４．難聴を有する個体への抗体の投与が、蝸牛の性能を改善する、Ｅ１０８からＥ１１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１１５．Ｅ１から７１、およびＥ７７からＥ１０７のいずれか１つに記載の抗体。
【０５０１】
本発明を、こうして、上述した代表的な実施形態を参照して広く開示し、例示してきた。当業者は、様々な改変を、本発明の趣旨および射程から逸脱することなく、本発明に行うことができることを認識するであろう。すべての刊行物、特許出願、および発行済み特許は、各個々の刊行物、特許出願、または発行済み特許が、その全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれているテキストに含有されている定義は、これらが本開示における定義と矛盾する範囲で除外される。
【０５０２】
明確にするために別個の実施形態の脈絡で記載されている本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態中に組合せで提供される場合もあることが察知される。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の脈絡で記載されている本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適当なサブコンビネーションで提供される場合もある。
【０５０３】
本発明の一実施形態に関して論じた任意の制限事項は、本発明の任意の他の実施形態に適用し得ることが具体的に企図されている。さらに、本発明の任意の組成物を、本発明の任意の方法で使用することができ、本発明の任意の方法を、本発明の任意の組成物を生成または利用するのに使用することができる。特に、単独で、または１つもしくは複数の追加の請求項および／もしくは本記載の態様と組み合わせた、特許請求の範囲に記載の本発明の任意の態様は、特許請求の範囲、および／または記載、および／または配列表、および／または図面中の他の場所で示した本発明の他の態様と組み合わせられると理解されるべきである。
【０５０４】
本明細書に見出される特定の実施例が、本発明の射程内に入らない限りにおいて、前記特定の実施例は、明示的に放棄され得る。
【０５０５】
請求項における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すように明示的に示されていない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するのに使用されるが、本開示は、選択肢のみ、ならびに「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において、指定「ａ」または「ａｎ」は、別段に明らかに示されていない限り、１つまたは複数を意味し得る。請求項において本明細書で使用する場合、単語「含む」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つを超えるを意味し得る。本明細書において、「別の」は、少なくとも第２の、またはそれ超を意味し得る。本明細書で別段に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、脈絡によって別段に要求されていない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および単語「有する／含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明を参照して本明細書で使用する場合、述べた特徴、整数、ステップ、またはコンポーネントの存在を指定するのに使用されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、コンポーネント、またはこれらの群の存在または付加を排除しない。
【０５０６】
開示される教示を、様々な用途、方法、および組成物を参照して記載してきたが、様々な変更および改変を、本明細書の教示および以下の請求項に係る発明から逸脱することなく行うことができることが察知されるであろう。実施例は、開示した教示をより良好に例示するように提供されており、本明細書に提示した教示の射程を限定するように意図されていない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から記載してきたが、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が、過度の実験を用いることなく可能である。すべてのこのようなバリエーションおよび改変は、本教示の射程内である。
【０５０７】
本発明の態様または実施形態が、選択肢のマーカッシュ群または他のグループ分けの観点から記載されている場合、本発明は、全体として列挙した群全体だけでなく、個々に群の各メンバー、および主群のすべての可能な亜群、また群メンバーの１つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明は、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明確な除外も想定する。
【０５０８】
特許、特許出願、論文、教科書などを含めた本明細書に引用されたすべの参考文献、およびその中に引用された参考文献は、それらが既に組み込まれていない範囲で、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。それだけに限らないが、定義される用語、用語使用、記載した技法などを含めて、組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が本願と異なり、または矛盾する事象では、本願が支配する。
【０５０９】
本記載および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図するベストモードを記載する。しかし、上記がどんなに詳述されて本文に出現し得ても、本発明を多くのやり方で実践することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびこれらの任意の均等物に従って解釈されるべきであることが察知されるであろう。
【０５１０】
【表３５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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