(57)【要約】抗ＡＮＧ２抗体が本明細書で報告される。特定の抗ＡＮＧ２抗体は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【請求項２】
（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号：１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６又は配列番号：３３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、
ｉ）配列番号：１９と７０％超の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６と７０％超の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）重鎖可変ドメインにおいて２８位にアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、３０位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）、１００ｂ位にアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、及び１００ｊ位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）を有し、軽鎖可変ドメインにおいて５１位にアミノ酸残基トレオニン（Ｔ）を有し（ナンバリングは、Kabatに従う）、
ｉｉｉ）ヒトＴｉｅ２を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した細胞系アッセイにおいて、Ｔｉｅ２リン酸化ＥＬＩＳＡを使用して決定した場合に、そのレセプターＴｉｅ２に対するＡＮＧ２の結合の阻害について、配列番号：１９の配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６又は配列番号：３３の配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と比較して低いＥＣ５０値を有する、抗体。
【請求項６】
二重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
二重特異性抗体がＣｒｏｓｓＭａｂである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトＴｉｅ２レセプターに対するヒトＡＮＧ２の結合を阻害することによって、ヒトＡＮＧ２の生物学的活性を遮断する、請求項１〜４及び６〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体、及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項１１】
抗ＩＬ−１β抗体又は抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体から選択されるさらなる治療剤をさらに含む、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
医薬が、眼血管疾患を処置するためのもの、好ましくは黄斑変性症を処置するためのものである、請求項１２及び１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
医薬が、ガンを処置するためのもの、好ましくは血管新生ガンを処置するためのものである、請求項１２及び１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
医薬が、ＡＮＧ２とＴｉｅ２レセプターとの間の相互作用を阻害するためのものである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ＡＮＧ２抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）（あるいは、ＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略記される）（配列番号：１０６）は、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されている。アンジオポエチン−１及び−２（ＡＮＧ−１（配列番号：１０７）及びＡＮＧ−２（配列番号：１０６））は、Ｔｉｅ（血管内皮内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリー）のリガンドとして発見された。Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの確定メンバーが存在する。アンジオポエチン−３及び−４（Ａｎｇ−３及びＡｎｇ−４）は、マウス及びヒトにおける同じローカスで大きく異なるカウンターパートであり得る。Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528を参照のこと。当初、ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２は、組織培養実験において、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして同定された（ＡＮＧ−１については、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69を参照のこと；及びＡＮＧ−２については、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。公知のアンジオポエチンは全てＴｉｅ２に主に結合し、ＡＮＧ１及びＡＮＧ２は両方とも３nM（Ｋｄ）の親和性でＴｉｅ２に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。ＡＮＧ−１は、ＥＣの生存を支援し、内皮細胞の完全性を促進することが示されているのに対して、（Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-2514; Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63）、ＡＮＧ−２は、逆の効果を有し、生存因子ＶＥＧＦ又は塩基性線維芽細胞成長因子の非存在下で血管の不安定化及び退行を促進した（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。しかしながら、ＡＮＧ−２の機能に関する多くの研究により、より複雑な状況が示唆されている。ＡＮＧ−２は、血管発芽及び血管退行の両方において役割を果たす血管リモデリングの複雑な調節因子であり得る。ＡＮＧ−２のこのような役割を支援して、発現分析により、成人の血管新生発芽状況では、ＡＮＧ−２はＶＥＧＦと共に迅速に誘導されるのに対して、血管退縮状況では、ＡＮＧ−２は、ＶＥＧＦの非存在下で誘導されることが明らかになった。Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62。状況依存的役割と一致して、ＡＮＧ−２は、同じ内皮特異的レセプターＴｉｅ−２（これは、ＡＮＧ−１によって活性化されるが、その活性化に対して状況依存的効果を有する）に特異的に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。
【０００３】
角膜血管新生アッセイにより、ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２は両方とも、類似効果を有し、ＶＥＧＦと相乗的に作用して新たな血管の成長を促進することが示された。Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40。in vitroでは、ＡＮＧ−２は、高濃度で血管新生促進性であり得るという観察結果によって、用量依存的な内皮応答が起こったという可能性がある。Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52。高濃度では、ＡＮＧ−２は、血清欠乏アポトーシスの間、ＰＩ−３キナーゼ及びＡｋｔ経路を介したＴｉｅ２の活性化によって、内皮細胞のアポトーシス生存因子として作用する。Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52。
【０００４】
他のin vitro実験により、持続的な曝露中、ＡＮＧ−２の効果は、Ｔｉｅ２のアンタゴニストの効果からアゴニストの効果に徐々にシフトし得、その後、それは、血管形成及び新規血管安定化に直接寄与し得ることが示唆された。Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovas. Res. 49 (2001) 659-70。さらに、ＥＣをフィブリンゲル上で培養した場合、ＡＮＧ−２によるＴｉｅ２の活性化も観察されたが、これはおそらく、ＡＮＧ−２の作用がＥＣの分化状態に依存し得ることを示唆している。Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovas. Res. 49 (2001) 659-70。三次元コラーゲンゲルで培養した微小血管ＥＣでは、ＡＮＧ−２はまた、Ｔｉｅ２の活性化を誘導し、毛細血管様構造の形成を促進し得る。Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83。血管成熟のin-vitroモデルとして３Ｄ球状共培養を使用することにより、ＥＣと間葉細胞との間の直接的な接触は、ＶＥＧＦに対する応答を無効化するのに対して、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ−２の存在は、発芽を誘導したことが実証された。Korff, T., et al., FASEB J. 15 (2001) 447-457。Etoh, Tらは、ＶＥＧＦの存在下では、Ｔｉｅ２を構成的に発現するＥＣ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９及びｕ−ＰＡの発現）が、ＡＮＧ−２によって強くアップレギュレーションされたことを実証した。Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53。in vivo瞳孔膜モデルを用いて、Lobov, I.Bらは、内因性ＶＥＧＦの存在下では、ＡＮＧ−２が、毛細血管直径の急速な増加、基底層のリモデリング、並びに内皮細胞の増殖及び遊走を促進し、新たな血管の発芽を刺激することを示した。Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10。対照的に、ＶＥＧＦなしの場合、ＡＮＧ−２は、内皮細胞死及び血管退行を促進する。Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10。同様に、in vivo腫瘍モデルを用いて、Vajkoczy, Pらは、多細胞集合体が、宿主及び腫瘍内皮によるＶＥＧＦＲ−２及びＡＮＧ−２の同時発現を介した血管新生発芽によって、血管成長を開始させることを実証した。Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85。このモデルにより、成長中の腫瘍の確立された微小血管系は、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ−２の発現によって媒介されると推測される連続的リモデリングを特徴とすることが例証された（Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85）。
【０００５】
Ｔｉｅ−２及びアンジオポエチン−１のノックアウトマウスの研究は、類似の表現型を示し、アンジオポエチン−１によって刺激されたＴｉｅ−２リン酸化が、発達中の血管のリモデリング及び安定化を媒介し、血管新生中の血管成熟及び内皮細胞−支持体細胞接着を促進することを示唆されている（Dumont, D.J.,  et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463）。アンジオポエチン−１が広く構成的に発現している成人では、アンジオポエチン−１の役割は、保存されていると考えられている（Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., et al., Exp. Neurol. 159 (1999) 391-400）。対照的に、アンジオポエチン−２の発現は、血管のリモデリングの部位（この部位では、それは、アンジオポエチン−１の構成的安定化又は成熟機能を遮断し、血管が、発芽シグナルに対してより応答性であり得る可塑的状態に復帰してその状態を維持することを可能にすると考えられている）に主に限定されている（Hanahan, D., 1997; Holash, J., et al., Oncogene 18 (199) 5356-62; Maisonpierre, P.C., 1997）。病的な血管新生におけるアンジオポエチン−２発現の研究により、多くの腫瘍型が血管アンジオポエチン−２発現を示すことが見出された（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。機能研究は、アンジオポエチン−２が腫瘍血管新生に関与することを示唆しており、アンジオポエチン−２過剰発現を、マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長の増加と関連付けている（Ahmad, S.A., et al., Cancer Res., 61 (2001) 1255-1259）。他の研究は、アンジオポエチン−２過剰発現を腫瘍血管過剰増生と関連付けている（Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129）。
【０００６】
近年、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２及び／又はＴｉｅ−２は、抗ガン治療ターゲット候補として提案されている。例えば、米国特許第６，１６６，１８５号、米国特許第５，６５０，４９０号及び米国特許第５，８１４，４６４号にはそれぞれ、抗Ｔｉｅ−２リガンド及びレセプター抗体が開示されている。可溶性Ｔｉｅ−２を使用した研究では、齧歯類における腫瘍の数及びサイズの減少が報告された（Lin, 1997; Lin 1998）。Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91では、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞株を作製し、これらをヌードマウスに注射注入したところ、可溶性Ｔｉｅ−２が腫瘍成長及び腫瘍血管新生の有意な阻害をもたらすと報告された。アンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２は両方ともＴｉｅ−２に結合することを考慮すると、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２又はＴｉｅ−２が抗ガン治療の魅力的なターゲットであるかについては、これらの研究から不明である。しかしながら、有効な抗アンジオポエチン−２治療は、プロセスの遮断が疾患進行の予防につながり得る異常な血管新生に進行が依存する疾患（例えば、ガン）の処置に有益であると考えられている（Folkman, J., Nature Medicine. 1 (1995) 27-31）。
【０００７】
加えて、いくつかのグループが、アンジオポエチン−２に結合する抗体及びペプチドの使用を報告している。例えば、米国特許第６，１６６，１８５号及び米国特許出願公開第２００３／１０１２４１２９号、国際公開公報第０３／０３０８３３号、国際公開公報第２００６／０６８９５３号、国際公開公報第０３／０５７１３４号又は米国特許出願公開第２００６／０１２２３７０号を参照のこと。
【０００８】
アンジオポエチン−２の限局性発現の効果の研究により、アンジオポエチン−１／Ｔｉｅ−２シグナルのアンタゴナイズは、緊密な血管構造を緩めて、それにより、ＥＣを血管新生誘導因子（例えば、ＶＥＧＦ）由来の活性化シグナルに曝露することが示されている（Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50）。アンジオポエチン−１の阻害から生じるこの血管新生促進効果は、抗アンジオポエチン−１治療が有効な抗ガン処置ではないであろうことを示している。
【０００９】
ＡＮＧ−２は、発達中に、血管リモデリングが起こっている部位で発現される。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。成人個体では、ＡＮＧ−２発現は、血管リモデリングの部位及び血管が豊富な腫瘍（神経膠腫（Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09); Koga, K., et al., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54）、肝細胞ガン（Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45）、胃ガン（Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61）、甲状腺腫瘍（Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76）、非小細胞肺ガン（Wong, M.P., et al., Lung Cancer 29 (2000) 11-22）、結腸（Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43）及び前立腺（Wurmbach, J.H., et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20）のガンを含む）に限定される。いくつかの腫瘍細胞は、ＡＮＧ−２を発現することが見出されている。例えば、Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45では、ヒト肝細胞ガン（ＨＣＣ）の１２個の標本の１０個において、ＡＮＧ−２  ｍＲＮＡが検出された。Ellisのグループは、ＡＮＧ−２が上皮腫瘍において普遍的に発現されることを報告した。Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43。他の調査者らは、同様の知見を報告した。Chen, L., et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-35。保存されているヒト乳ガン標本におけるＡＮＧ−２  ｍＲＮＡレベルを検出することによって、Sfiligoi, C., et al., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74では、ＡＮＧ−２  ｍＲＮＡは、腋窩リンパ節浸潤、短い無病時間及び全生存不良に有意に関連することが報告された。Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29では、それぞれ病期Ｉ〜病期ＩＩＩＡの非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の患者合計２３６人について概説されている。免疫組織化学を使用して、ＮＳＣＬＣ患者の１６．９％がＡＮＧ−２陽性であったことが見出された。ＡＮＧ−２陽性腫瘍の微小血管密度は、ＡＮＧ−２陰性のものよりも有意に高い。ＡＮＧ−２のこのような血管新生効果は、ＶＥＧＦ発現が高かった場合にのみ見られた。また、ＡＮＧ−２の陽性発現は、術後不良を予測するための重要な因子であった。Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129。しかしながら、Ａｎｇ−１発現と微小血管密度との間に有意な相関関係は見出されなかった。Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129。これらの結果は、ＡＮＧ−２が、いくつかの種類のガンを有する患者の予後不良の指標であることを示唆している。
【００１０】
最近、ＡＮＧ−２ノックアウトマウスモデルを使用して、Yancopoulosのグループは、ＡＮＧ−２が出生後血管新生に必要であることを報告した。Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23。眼における硝子体血管構造の発生的にプログラムされている退行は、ＡＮＧ−２ノックアウトマウスでは起こらず、それらの網膜血管は、中心網膜動脈から発芽することができないことが示された。Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-423。ＡＮＧ−２の欠失は、リンパ血管系のパターニング及び機能の著しい欠陥をもたらすことも見出された。Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-423。Ａｎｇ−１による遺伝子レスキューは、リンパ血管系を修正するが、血管新生の欠陥を修正しない。Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-423。
【００１１】
Peters及び彼の同僚らは、リコンビナントタンパク質として、又はウイルス発現ベクターで送達した場合に、可溶性Ｔｉｅ２が、マウスモデルにおけるマウス乳ガン腫及び黒色腫のin vivo成長を阻害したことを報告した。Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34; Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78。このように処置した腫瘍組織における血管密度は、大きく減少した。加えて、可溶性Ｔｉｅ２は、腫瘍細胞で馴化した培地によって刺激したラット角膜における血管新生を遮断した。Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78。さらに、Isner及び彼のチームは、ＶＥＧＦへのＡＮＧ−２の追加が、ＶＥＧＦ単独よりも有意に長い及び多い周囲新生血管を促進したことを実証した。Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40。過剰な可溶性Ｔｉｅ２レセプターは、ＡＮＧ−２によるＶＥＧＦ誘導性新生血管のモデュレーションを妨害した。Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40。Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91では、ヌードマウス異種移植片を使用して、異種移植片におけるＦｌｔ−１又はＴｉｅ２のいずれかの細胞外リガンド結合ドメインの過剰発現が、他方によって補われ得ない経路の有意な阻害をもたらすことが示されたが、これは、ＶＥＧＦレセプター経路及びＴｉｅ２経路が、in vivo血管新生のプロセスに必須の２つの独立したメディエーターとみなされるべきであることを示唆している。Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-3191。これは、White, R., R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33によるより最近の論文によって証明されている。この研究では、ＡＮＧ−２に特異的に結合してそれを阻害するヌクレアーゼ耐性ＲＮＡアプタマーは、ラット角膜マイクロポケット血管新生モデルにおいて、ｂＦＧＦによって誘導される新生血管を有意に阻害したことが実証された。
【００１２】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの眼血管疾患は、それぞれ異常脈絡膜又は網膜新生血管形成に起因する。先進国では、それらは、視力低下の主な原因である。網膜は、ニューロン、グリア及び血管要素の明確に定義された層からなるので、比較的小さな障害（例えば、血管増殖又は浮腫に見られるもの）が、視覚機能の有意な低下につながり得る。網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性もまた、細動脈狭窄及び血管萎縮などの血管異常に関連する。それらに罹患する者は３，５００人に１人であり、それらは、進行性夜盲、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減弱及び視力の中心喪失を特徴とし、完全な失明に進行することが多い。
【００１３】
虚血性網膜症は、血流の減少及び低酸素状態をもたらす網膜血管系の喪失又は機能不全を特徴とする。網膜は、新たな血管を成長させるためシグナルを生成することによって低酸素状態に応答するが、これらの新たな血管は、通常は脆弱で無秩序なものである。それは、これらの新たな異常血管の成長であり、漏出して出血につながり得るか、又は網膜剥離をもたらし得る瘢痕化につながり得るので、視力への脅威の大半を作り出す。虚血性網膜症の現在の処置は病的な血管の成長を停止させようとするものであるが、それらの成長を駆動する根本的な虚血に対処するものではない。さらに、糖尿病性網膜症（これは、何百万人が罹患している虚血性網膜症である）の標準的な処置は、新たな血管の成長を停止させて中心視力を保護するために、レーザーを用いて網膜の一部を破壊することを含む。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（これは、血管成長の主なプロモーターである）の機能を遮断する戦略が用いられている。短期的には、抗ＶＥＧＦ治療は視力を改善し得るが、根本的な虚血には対処するものではなく、有益な側副血管を含む全ての血管成長を阻害するので、実際にはこの症状を悪化させ得る。虚血性の脳、心臓又は四肢において新たな血管成長が必要であり得る高齢者及び／又は糖尿病患者では、これらの薬物の全身曝露に関する深刻な懸念もある。
【００１４】
典型的には、眼疾患の場合、Ｆａｂ又はＦａｂ２のような小さな抗体フラグメントは短い血清半減期を有し、全身毒性のリスクが低いので、硝子体内適用を介して使用されることが多い。しかしながら、典型的には、この小さなフラグメントは、（例えば、血清中への拡散が速いので）硝子体内半減期も短く、典型的にはより頻繁に投与されなければならない。
【００１５】
国際公開公報第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）には、１つの結合アームにおいてドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ）が詳細に記載されている。それらは、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副生成物を（このようなドメイン交換を用いないアプローチと比較して）明らかに減少させる。しかしながら、それらの調製は、副産物を完全に伴わないわけではない。主な副産物は、ベンス−ジョーンズ型相互作用に基づくものである。Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191;付録の図Ｓ１Ｉ)も参照のこと。
【００１６】
国際公開公報第２０１０／０４０５０８号には、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ−２抗体が報告されている。国際公開公報第２０１４／１７７４６０号には、ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及びその使用方法が報告されている。Thomas, Mらは、パン−アンジオポエチン−１／−２阻害剤と比較して強力な抗腫瘍及び抗血管新生効果並びに優れた副作用プロファイルを有する新規のアンジオポエチン−２選択的完全ヒト抗体を報告した（PLOS One 8 (2013) E54923）。Papadopoulos, K. Pらは、進行性固形腫瘍悪性度を有する患者におけるＲＥＧＮ９１０（ＳＡＲ３０７７４６）（完全ヒト選択的アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）モノクローナル抗体（ＭＡｂ））の第Ｉ相ヒト初回投与試験を報告した（abstract 2517, ASCO Annual Meeting 2013）。
【発明の概要】
【００１７】
概要
本発明は、抗ＡＮＧ２抗体及びその使用方法を提供する。特定の実施態様では、抗体は、親和性成熟抗体である。
【００１８】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体である。
【００１９】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００２０】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体である。
【００２１】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００２２】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体である。
【００２３】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００２４】
一実施態様では、抗体は、配列番号：１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６又は配列番号：３３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００２５】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、
ｉ）配列番号：１９と７０％超又は８５％又は９０％又は９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６と７０％超又は８５％又は９０％又は９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）重鎖可変ドメインにおいて２８位にアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、３０位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）、１００ｂ位にアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、及び１００ｊ位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）を有し、軽鎖可変ドメインにおいて５１位にアミノ酸残基トレオニン（Ｔ）を有し（ナンバリングは、Kabatに従う）、
ｉｉｉ）ヒトＴｉｅ２を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した細胞系アッセイにおいて、Ｔｉｅ２リン酸化ＥＬＩＳＡを使用して決定した場合に、そのレセプターＴｉｅ２に対するＡＮＧ２の結合の阻害について、配列番号：１９の配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６又は配列番号：３３の配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と比較して低いＥＣ５０値を有する抗体である。
【００２６】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものである。
【００２７】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、κ軽鎖を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものである。
【００２８】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、λ軽鎖を有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものである。
【００２９】
本明細書で報告された全ての態様の一実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３０】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：１９のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含む抗体である。
【００３１】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：２８のＶＨ配列及び配列番号：３３のＶＬ配列を含む抗体である。
【００３２】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：３７のＶＨ配列及び配列番号：４２のＶＬ配列を含む抗体である。
【００３３】
一実施態様では、抗体は、二重特異性抗体である。
【００３４】
全ての態様の一実施態様では、ヒト化抗体は、Ｔｉｅ２レセプターに対するヒトＡＮＧ２の結合を阻害することによって、ヒトＡＮＧ２の生物学的活性を遮断する。
【００３５】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体Ｆａｂフラグメントであって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００３６】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体Ｆａｂフラグメントは、（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００３７】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体Ｆａｂフラグメントであって、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００３８】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体Ｆａｂフラグメントは、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００３９】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体Ｆａｂフラグメントであって、（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００４０】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体Ｆａｂフラグメントは、（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００４１】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：１９のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００４２】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：２８のＶＨ配列及び配列番号：３３のＶＬ配列を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００４３】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：３７のＶＨ配列及び配列番号：４２のＶＬ配列を含む抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００４４】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントであって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００４５】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００４６】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントであって、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００４７】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００４８】
本明細書で報告される一態様は、ヒトＡＮＧ２に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントであって、（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００４９】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【００５０】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：１９のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００５１】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：２８のＶＨ配列及び配列番号：３３のＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００５２】
本明細書で報告される一態様は、配列番号：３７のＶＨ配列及び配列番号：４２のＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００５３】
本明細書で報告される一態様は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した場合に、本明細書で報告される抗体と少なくとも９０％同じＡＮＧ２の残基と相互作用する抗ＡＮＧ２抗体である。
【００５４】
本明細書で報告される一態様は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した場合に、本明細書で報告される抗体と少なくとも同じＡＮＧ２の残基と相互作用する抗ＡＮＧ２抗体である。
【００５５】
本明細書で報告される一態様は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した場合に、本明細書で報告される抗体と少なくとも９０％同じＡＮＧ２の残基と相互作用する抗ＡＮＧ２抗体であって、そのレセプターに対するＡＮＧ２の結合を阻害する抗ＡＮＧ２抗体である。
【００５６】
本明細書で報告される一態様は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した場合に、本明細書で報告される抗体と少なくとも同じＡＮＧ２の残基と相互作用する抗ＡＮＧ２抗体であって、そのレセプターに対するＡＮＧ２の結合を阻害する抗ＡＮＧ２抗体である。
【００５７】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体をコードする（単離された）核酸である。
【００５８】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される核酸を含む宿主細胞である。
【００５９】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体を生産する方法であって、本明細書で報告される宿主細胞を培養して該抗体を生産すること、及び該宿主細胞又は培養培地から該抗体を回収することを含む方法である。
【００６０】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬製剤である。
【００６１】
一実施態様では、医薬製剤は、さらなる治療剤をさらに含む。一実施態様では、さらなる治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体又は抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【００６２】
本明細書で報告される一態様は、医薬として使用するための本明細書で報告される抗体である。
【００６３】
本明細書で報告される一態様は、血管疾患を処置するための本明細書で報告される抗体である。
【００６４】
本明細書で報告される一態様は、血管疾患を処置するための医薬組成物である。
【００６５】
本明細書で報告される一態様は、血管疾患を処置するための医薬を製造するための本明細書で報告される抗体の使用である。
【００６６】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、血管疾患を患っている患者を処置する方法である。
【００６７】
本明細書で報告される一態様は、血管疾患の処置に使用するための、好ましくはガンの処置に使用するための本明細書で報告される抗体である。
【００６８】
本発明の一実施態様は、ガンを処置するための本明細書で報告される抗体である。
【００６９】
本明細書で報告される一態様は、ガンの処置に使用するための医薬として使用するためのものである。
【００７０】
本明細書で報告される一態様は、ガンを処置するための医薬を製造するための本明細書で報告される抗体の使用である。
【００７１】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、ガンを患っている患者を処置する方法である。
【００７２】
本明細書で報告される一態様は、転移を予防するための医薬として使用するためのものである。
【００７３】
本明細書で報告される一態様は、転移を予防するための医薬を製造するための本明細書で報告される抗体の使用である。
【００７４】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、原発性ガンを患っている患者における転移を予防する方法である。
【００７５】
本明細書で報告される一態様は、眼血管疾患の処置に使用するための、好ましくは黄斑変性症の処置に使用するための本明細書で報告される抗体である。
【００７６】
ＡＮＧ２とＴｉｅ２レセプターとの間の相互作用の阻害に使用するための本明細書で報告される抗体。
【００７７】
本明細書で報告される一態様は、医薬の製造における本明細書で報告される抗体の使用である。
【００７８】
一実施態様では、医薬は、眼血管疾患を処置するため、好ましくは黄斑変性症を処置するためのものである。
【００７９】
一実施態様では、医薬は、ＡＮＧ２とＴｉｅ２レセプターとの間の相互作用を阻害するためのものである。
【００８０】
本明細書で報告される一態様は、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与することを含む方法である。
【００８１】
本明細書で報告される一態様は、個体におけるＡＮＧ２とＴｉｅ２レセプターとの間の相互作用を阻害する方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与して、ＡＮＧ２とＴｉｅ２レセプターとの間の相互作用を阻害することを含む方法である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列において、ＶＬヒト免役グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【００８３】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の一対一相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（ｋｄ）により表現され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法により測定され得る。結合親和性を測定するための特定の具体的及び例示的な実施態様は、以下に記載されている。
【００８４】
「親和性成熟」抗体は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有する抗体を指す。
【００８５】
「抗ＡＮＧ２抗体」及び「ＡＮＧ２に結合する抗体」という用語は、抗体がＡＮＧ２のターゲティングにおける診断剤及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性で、ＡＮＧ２に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、無関係の非ＡＮＧ２タンパク質に対する抗ＡＮＧ２抗体の結合の程度は、例えば、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴によって測定した場合には、ＡＮＧ２に対する該抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＡＮＧ２に結合する抗体は、１μM以下、１００nM以下又は１０nM以下（例えば、１０−８Ｍ以下）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、異なる種由来のＡＮＧ２間で保存されているＡＮＧ２のエピトープに結合する。
【００８６】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含む様々な抗体構造を包含する。
【００８７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００８８】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体と少なくとも同じアミノ酸残基との相互作用を有する抗体を指す。これらの相互作用は、例えば、電荷アミノ酸残基間のイオン相互作用、又は疎水性アミノ酸残基間の疎水性相互作用である。
【００８９】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【００９０】
本明細書で使用される「ガン」という用語は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺ガン、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）ガン、細気管支肺胞細胞肺ガン、骨ガン、膵臓ガン、皮膚ガン、頭部又は頚部のガン、皮膚又は眼内黒色腫、子宮ガン、卵巣ガン、直腸ガン、肛門部のガン、胃ガン（stomach cancer）、胃ガン（gastric cancer）、結腸ガン、乳ガン、子宮ガン、卵管のガン腫、子宮内膜のガン腫、子宮頚部のガン腫、膣のガン腫、外陰部のガン腫、ホジキン病、食道のガン、小腸のガン、内分泌系のガン、甲状腺のガン、副甲状腺のガン、副腎のガン、軟組織の肉腫、尿道のガン、陰茎のガン、前立腺ガン、膀胱のガン、腎臓又は尿道のガン、腎細胞ガン腫、腎盂のガン腫、中皮腫、肝細胞ガン、胆道ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮ガン、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上記ガンのいずれか難治性型、又は上記ガンの１つ以上の組み合わせを含む）を指す。
【００９１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。
【００９２】
「イムノコンジュゲート」という用語は、抗体と非抗体部分との間の共有結合的コンジュゲートを表す。このような非抗体部分は、検出可能な標識、エフェクター分子又は細胞傷害剤であり得る。
【００９３】
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは抑制し、及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤としては、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；酵素及びそのフラグメント、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）；並びに以下で考察される様々な抗腫瘍剤又は抗ガン剤が挙げられる。
【００９４】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性であって、抗体クラスにより異なる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９５】
薬剤（例えば、医薬製剤）の「有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療的結果又は予防的結果を達成するために有効な量を指す。
【００９６】
本明細書では、「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシル−リシンジペプチド（Ｇｌｙ４４６Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、又は存在しなくてもよい。本明細書で特に指定がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されているＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも称される）に従う。
【００９７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９８】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書では、ネイティブな抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために互換的に使用される。
【００９９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、継代数にかかわらず、初代トランスフォーメーション細胞及びそれに由来する子孫を含む「トンスフォーマント」及び「トランスフォーメーション細胞」を含む。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含有し得る。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。
【０１００】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【０１０１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も多く存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般的に、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3のサブグループである。一実施態様では、ＶＬの場合、サブグループは、Kabat et al（前掲）のサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨの場合、サブグループは、Kabat et al（前掲）のサブグループＩＩＩである。
【０１０２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基と、ヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を場合により含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループ（超可変ループ）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ（ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３））を含む。
【０１０４】
本明細書におけるＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）において存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）において存在するＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）及び９３〜１０１（Ｈ３）において存在する抗原接触点（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
【０１０５】
特に指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、Kabat et al（前掲）にしたがってナンバリングされる。
【０１０６】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。
【０１０７】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の実施態様では、個体又は被験体は、ヒトである。
【０１０８】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ法（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定した場合に、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体の純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【０１０９】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞内に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１１０】
「抗ＡＮＧ２抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子（単一のベクター又は別個のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む）を指す。
【０１１１】
本発明による「転移」という用語は、ガン性細胞が原発性腫瘍から患者の１つ以上の他の部位に伝播し、次いで二次腫瘍が発達することを指す。ガンが転移したかを決定するための手段は当技術分野で公知であり、骨スキャン、胸部Ｘ線、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン及び腫瘍マーカー試験が挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される「転移の予防」又は「二次腫瘍の予防」という用語は同じ意味を有し、ガン性細胞が原発性腫瘍から患者の１つ以上の他の部位にさらに伝播するのを阻害又は軽減するような、ガンを患っている患者における転移に対する予防手段を指す。これは、原発性腫瘍又はガンの転移が予防、遅延又は軽減され、したがって二次腫瘍の発達が予防、遅延又は軽減されることを意味する。好ましくは、転移（すなわち、肺の二次腫瘍）は予防又は軽減され、これは、ガン性細胞が原発性腫瘍から肺に転移伝播するのが予防又は軽減されることを意味する。
【０１１３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す。すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる可能な変異体抗体であって、一般に微量で存在する変異体抗体を除いて、集団を含む個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用すべきモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製され得、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
【０１１４】
「ネイキッドな抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッドな抗体は、医薬製剤中に存在し得る。
【０１１５】
「ネイティブな抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２種類の１つに割り当てられ得る。
【０１１６】
「添付文書」という用語は、このような治療製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌についての情報及び／又はその使用に関する警告を含有する治療製品の市販パッケージに通例含まれる説明書を指すために使用される。
【０１１７】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の部分とみなさない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当業者の範囲内である様々な方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２は、Genentech, Inc.の著作物であり、ソースコードは、ユーザーマニュアルと共にU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。配列比較パラメータは全て、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。
【０１１８】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムによるＡ及びＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないと認識されよう。特に明記されない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、直前の段落に記載されているように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して得られる。
【０１１９】
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が有効になるのを可能にするような形態の調製物であって、該製剤が投与される被験体に対して許容し得ないほど毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【０１２０】
「薬学的に許容し得る担体」は、医薬製剤中の有効成分以外の成分であって、被験体に対して非毒性の成分を指す。薬学的に許容し得る担体としては、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定化剤又は保存剤が挙げられる。
【０１２１】
本明細書で使用される「ＡＮＧ２」という用語は、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されているヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）（あるいは、ＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略記される）（配列番号：５４））を指す。アンジオポエチン−１及び−２は、Ｔｉｅ（血管内皮内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリー）のリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-248）。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの確定メンバーが存在する。アンジオポエチン−３及び−４（ＡＮＧ３及びＡＮＧ４）は、マウス及びヒトにおける同じローカスで大きく異なるカウンターパートであり得る（例えば、Kim, I., et al., FEBS Lett., 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528を参照のこと）。当初、ＡＮＧ１及びＡＮＧ２は、組織培養実験において、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして同定された（ＡＮＧ１については、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69を参照のこと；ＡＮＧ２については、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。公知のアンジオポエチンは全てＴｉｅ２に主に結合し、ＡＮＧ１及びＡＮＧ２は両方とも３nM（Ｋｄ）の親和性でＴｉｅ２に結合する（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。
【０１２２】
本明細書で使用される「処置」（及びその文法的変化形、例えば「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床的病状の経過中に実施され得る。処置の望ましい効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症候の軽減、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１２３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。一般的に、ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは類似構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。１つのＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと）。
【０１２４】
「血管疾患」という用語は、ガン、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、ＣＯＰＤ、喘息、糖尿病、ＡＭＤ、網膜症、脳卒中、脂肪症、急性肺損傷、出血、血液漏出（例えば、サイトカインによって誘導されるもの）、アレルギー、グレーブス病、橋本自己免疫甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、特に固形腫瘍、眼内新生血管症候群、例えば増殖性網膜症又は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、関節リウマチ及び乾癬を含む（Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239;及びGarner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710）。
【０１２５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１２６】
ＩＩ．組成物及び方法
改善された親和性を有する抗ＡＮＧ２抗体が本明細書で報告される。
【０１２７】
本発明の抗体は、例えば、血管疾患、例えば眼血管疾患、例えば黄斑変性症又はガンなどの処置に有用である。
【０１２８】
本発明の抗体は、このような疾患を患っている（特に、ガン又は黄斑変性症を患っている）患者に利益をもたらす非常に有益な特性を有する。本明細書で報告される抗体は、血管新生又は血管疾患の阻害に非常に有効である。
【０１２９】
本発明の抗体は、
ａ）腫瘍成長の阻害、及び／若しくは
ｂ）腫瘍血管新生若しくは血管疾患の阻害、並びに／又は
ｃ）黄斑変性症の阻害に有効であろう。
【０１３０】
Ａ．本明細書で報告される例示的な抗ＡＮＧ２抗体
改善された結合特性を有する抗ＡＮＧ２抗体及びそのフラグメントが本明細書で報告される。
【０１３１】
【表１】
2017534644.tif 000002
【０１３２】
【表２】
2017534644.tif 000003
【０１３３】
本明細書で報告される抗体の実施例６のアッセイで決定した相対的生物学的活性を以下の表に示す。
【表３】
2017534644.tif 000004
【０１３４】
凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することによって、異なる抗体の熱安定性を評価した（以下の表を参照のこと）。
【表４】
2017534644.tif 000005
【０１３５】
加えて、抗体は、ストレス試験において優れた安定性を示す。表面プラズモン共鳴を使用して、結合活性を決定した（以下の表を参照のこと）。
【表５】
2017534644.tif 000006
【０１３６】
ＣＥ−ＳＤＳ分析では、同じ安定性が見られ得る（以下の表を参照のこと）。
【表６】
2017534644.tif 000007
【０１３７】
以下の表は、本明細書で報告される抗体の特性を要約したものである。
【表７】
2017534644.tif 000008
【表８】
2017534644.tif 000009
【表９】
2017534644.tif 000010
2017534644.tif 000011
【表１０】
2017534644.tif 000012
2017534644.tif 000013
【表１１】
2017534644.tif 000014
2017534644.tif 000015
【表１２】
2017534644.tif 000016
2017534644.tif 000017
【０１３８】
本明細書で報告される態様は、上記表に示されている重鎖及び軽鎖の個々の組み合わせの全てである。
【０１３９】
本明細書で報告される一態様は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むヒト化抗ヒトＡＮＧ２抗体である。一実施態様では、抗体は、（ｄ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【０１４０】
本明細書で報告される一態様は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むヒト化抗ヒトＡＮＧ２抗体である。一実施態様では、抗体は、（ｄ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。
【０１４１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＡＮＧ２抗体を提供する。
【０１４２】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施態様では、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１４４】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：３２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４５】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１４６】
別の態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＡＮＧ２抗体は、ＡＮＧ２に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号：２８において、合計１〜１０アミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域において（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。場合により、抗ＡＮＧ２抗体は、配列番号：２８のＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つ全てのＨＶＲを含む。
【０１４７】
別の態様では、配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＡＮＧ２抗体が提供される。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＡＮＧ２抗体は、ＡＮＧ２に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号：３３において、合計１〜１０アミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域において（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。場合により、抗ＡＮＧ２抗体は、配列番号：３３のＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つ全てのＨＶＲを含む。
【０１４８】
別の態様では、上記で提供される実施態様のいずれかにおけるＶＨ、及び上記で提供される実施態様のいずれかにおけるＶＬを含む抗ＡＮＧ２抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号：２８及び配列番号：３３のＶＨ及びＶＬ配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
【０１４９】
本発明のさらなる態様では、上記実施態様のいずれかの抗ＡＮＧ２抗体は、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書で定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
【０１５０】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、エフェクターサイレント抗ＡＮＧ２抗体である。本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、エフェクターサイレント抗ＡＮＧ２抗体であり、ヒトＦｃＲｎに結合しない。本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、ヒトサブクラスＩｇＧ１のものであり、両重鎖において突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３４Ａを有する（ナンバリングは、Kabatのインデックスに従う）。
【０１５１】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体は、二重特異性抗体である。
【０１５２】
本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である。
【０１５３】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０１５４】
ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶで交換されており、
及び
重鎖内において、
可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬで交換されている。
【０１５５】
一実施態様では、
ｉ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（ナンバリングは、Kabatに従う）は、正電荷アミノ酸で置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）は、負電荷アミノ酸で置換されており、
又は、
ｉｉ）ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（ナンバリングは、Kabatに従う）は、正電荷アミノ酸で置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）は、負電荷アミノ酸で置換されている。
【０１５６】
好ましい一実施態様では、
ｉ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されており、
又は
ｉｉ）ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されている。
【０１５７】
一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０１５８】
一実施態様では、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０１５９】
好ましい一実施態様では、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０１６０】
一実施態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅで置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅで置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋで置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０１６１】
本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である。
【０１６２】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０１６３】
ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶで交換されており、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１で交換されており、
並びに
重鎖内において、
可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬで交換されており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬで交換されている。
【０１６４】
本明細書で報告される一態様は、二価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、及び
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である。
【０１６５】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０１６６】
ｂ）の抗体では、
軽鎖内において、
定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１で交換されており、
及び
重鎖内において、
定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬで交換されている。
【０１６７】
本明細書で報告される一態様は、多重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２の及び／又は第３の及び／又は第４の及び／又は第５の抗原、好ましくは１つのさらなる抗原、すなわち第２の抗原に特異的に結合する）１つ、２つ、３つ又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメント
を含み、
前記ｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記ａ）の全長抗体に融合されており、
第１の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＡＮＧ２である多重特異性抗体である。
【０１６８】
一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１６９】
一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の重鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１７０】
一実施態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１７１】
一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の各重鎖又は軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１７２】
一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の各重鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１７３】
一実施態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体の各軽鎖のＣ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体に融合されている。
【０１７４】
本明細書で報告される一態様は、三価二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第１のポリペプチドであって、
そのＶＨドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の一方のＣ末端に融合されている第１のポリペプチド、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第２のポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の他方のＣ末端に融合されている第２のポリペプチド、
を含み、
並びに
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
並びに
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である三価二重特異性抗体である。
【０１７５】
一実施態様では、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置間：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位〜軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位〜軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位〜軽鎖可変ドメインの１００位（ナンバリングは常に、KabatのＥＵインデックスに従う）
へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋を介して連結及び安定化されている。
【０１７６】
安定化のための非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393;又はSchmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位との間にある。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位との間にある（ナンバリングは常に、KabatのＥＵインデックスに従う）。一実施態様では、一本鎖Ｆａｂフラグメントにおける可変ドメインＶＨとＶＬとの間の前記任意選択のジスルフィド安定化を有しない三価二重特異性抗体が好ましい。
【０１７７】
本明細書で報告される一態様は、三重特異性又は四重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖、並びに
を含み、
ｃ）１つ又は２つのさらなる抗原（すなわち、第３の及び／又は第４の抗原）に特異的に結合する１〜４つの抗原結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＡＮＧ２である三重特異性又は四重特異性抗体である。
【０１７８】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０１７９】
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つ又は２つのさらなる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
【０１８０】
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントからなる群より選択される。
【０１８１】
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメントである。
【０１８２】
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦａｂフラグメントである。
【０１８３】
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。
【０１８４】
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、１つのさらなる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
【０１８５】
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ペプチドを含む。好ましい一実施態様では、このような２つの同一の抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドリンカーを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。好ましい一実施態様では、２つの同一の抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
【０１８６】
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第３の及び第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ペプチドを含む。一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドコネクターを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。好ましい一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
【０１８７】
本明細書で報告される一態様は、二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する（及び２つのＦａｂフラグメントを含む）抗体の２本の軽鎖及び２本の重鎖、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つのさらなるＦａｂフラグメントであって、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに両方とも融合されている２つのさらなるＦａｂフラグメント
を含み、
並びに
該Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変
ｉ）
ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている
が実施された二重特異性四価抗体である。
【０１８８】
一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はａ）の重鎖のＮ末端のいずれかに融合されている。
【０１８９】
一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端のいずれかに融合されている。
【０１９０】
一実施態様では、前記さらなるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドコネクターを介して、ａ）の重鎖のＮ末端に融合されている。
【０１９１】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。
【０１９２】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。
【０１９３】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）
ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。
【０１９４】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、
並びに／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。
【０１９５】
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が実施されている：
ｉ）ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている。
【０１９６】
本明細書で報告される一態様は、二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の（改変）重鎖であって、第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含み、前記第１の抗体の第２のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、
ｂ）前記ａ）の第１の抗体の２本の軽鎖、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の（改変）重鎖であって、第１のＶＨ−ＣＬドメインペアを含み、前記第２の抗体の第２のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、及び
ｄ）前記ｃ）の第２の抗体の２本の（改変）軽鎖であって、それぞれがＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む２本の（改変）軽鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性四価抗体である。
【０１９７】
本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、該重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、該軽鎖のＣ末端に接続されている重鎖及び軽鎖、
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性抗体である。
【０１９８】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告される改変を含有せず、重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０１９９】
本明細書で報告される一態様は、二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントであって、ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含み、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに接続されているＦｖフラグメント
を含み、
該ＶＨ２ドメイン又は該ＶＬ２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性抗体である。
【０２００】
二重特異性抗体では、ａ）の重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
【０２０１】
一実施態様では、ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合されていない。
【０２０２】
本明細書で報告される全ての態様では、第１の軽鎖は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０２０３】
全ての態様の一実施態様では、本明細書で報告される抗体は、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドのヘテロ多量体化を必要とする多重特異性抗体であって、ヒトＡＮＧ２及び第２の非ヒトＡＮＧ２抗原に特異的に結合する多重特異性抗体である。
【０２０４】
ヘテロ二量体化を支援するためのＣＨ３改変のための複数アプローチは、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。典型的には、当技術分野で公知のアプローチでは、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは両方とも、１つの操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖が同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化し得ない（例えば、第１のＣＨ３操作重鎖が、別の第１のＣＨ３操作重鎖ともはやホモ二量体化し得ず、第２のＣＨ３操作重鎖が別の第２のＣＨ３操作重鎖ともはやホモ二量体化し得ない）ように相補的に操作されている。それにより、１つの操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的に操作されているＣＨ３ドメインを含む別の重鎖と強制的にヘテロ二量体化される。本発明のこの実施態様では、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び第２の重鎖が強制的にヘテロ二量体化されるのに対して、第１の重鎖及び第２の重鎖が（例えば、立体的な理由により）もはやホモ二量体化し得ないように、アミノ酸置換によって相補的に操作される。
【０２０５】
上記で引用されており、上記に挙げられている当技術分野で公知の重鎖ヘテロ二量体化を支援するための様々なアプローチは、本発明について上記されている特定のアミノ酸置換と組み合わせて、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体由来の「非交差Ｆａｂ領域」と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体由来の「交差Ｆａｂ領域」とを含む本発明の多重特異性抗体に使用される異なる代替手段として企図される。
【０２０６】
本明細書で報告される多重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681に複数の例を用いてより詳細に記載されている「ノブ・イントゥ・ホール」技術により変化され得る。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変化される。（２本の重鎖の）２つの各ＣＨ３ドメインは「ノブ」であり得る一方、他のものは「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増加させる。
【０２０７】
好ましい一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。例えば、Ｙ３４９Ｃ突然変異を「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに導入し、Ｅ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに導入することによって、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。したがって、別の好ましい実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、又は本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける、さらなるＹ３４９Ｃ突然変異、及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２０８】
しかし、あるいは又は加えて、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されている他のノブ・イン・ホール技術も使用され得る。一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２０９】
一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、加えて「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２１０】
一実施態様では、本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、又は本明細書で報告される多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、加えて「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２１１】
「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化を強制するように多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術は、当技術分野で公知である。これらの技術、特に、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号及び国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載されているものは、本明細書で報告される多重特異性抗体と組み合わせて「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替手段として本明細書で企図される。
【０２１２】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。このアプローチは、逆電荷を有する電荷アミノ酸を、第１の及び第２の重鎖の両方の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメインインターフェイスの特定のアミノ酸位置に導入することに基づくものである。
【０２１３】
したがって、この実施態様は、本明細書で報告される多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインが、各抗体ＣＨ３ドメイン間に位置するインターフェイスを形成し、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインの各アミノ酸配列がそれぞれ、抗体の三次構造において前記インターフェイス内に位置するアミノ酸のセットを含み、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中のインターフェイスに位置するアミノ酸のセットから、第１のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中のインターフェイスに位置するアミノ酸のセットから、第２のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている多重特異性抗体に関する。この実施態様の多重特異性抗体は、本明細書では「ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体」とも称される（「＋／−」という略語は、各ＣＨ３ドメインに導入された逆電荷アミノ酸を表す）。
【０２１４】
本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０２１５】
本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０２１６】
本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正電荷アミノ酸はＫであり、負電荷アミノ酸はＥである。
【０２１７】
本明細書で報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｒは、Ｄで置換されており、位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、３５７位のアミノ酸Ｅは、Ｋで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２１８】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２１９】
本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋで置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。加えて、以下の置換の少なくとも１つは、他方の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる：３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｅで置換されており、３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｄで置換されており、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。一実施態様では、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２０】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙで置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。別の実施態様では、上記置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４１１位（元々はＴ）、３９９位（元々はＤ）、４００位（元々はＳ）、４０５位（元々はＦ）、３９０位（元々はＮ）及び３９２位（元々はＫ）のアミノ酸の少なくとも１つは、置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。好ましい置換は、
−Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ及びＷから選択されるアミノ酸による、４１１位のアミノ酸Ｔの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｒ、Ｗ、Ｙ及びＫから選択されるアミノ酸による、３９９位のアミノ酸Ｄの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｅ、Ｄ、Ｒ及びＫから選択されるアミノ酸による、４００位のアミノ酸Ｓの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ及びＷから選択されるアミノ酸による、４０５位のアミノ酸Ｆの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、
−Ｒ、Ｋ及びＤから選択されるアミノ酸による、３９０位のアミノ酸Ｎの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、並びに
−Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ及びＥから選択されるアミノ酸による、３９２位のアミノ酸Ｋの置換（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）
である。
【０２２１】
（国際公開公報第２０１２／０５８７６８号にしたがって操作された）本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙで置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｖで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａで置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。前記の最後の上記実施態様では、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、４１１位のアミノ酸Ｔは、Ｅで置換されており、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｒで置換されており、４００位のアミノ酸Ｓは、Ｒで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２２】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変は、３６８位及び／又は４０９位に導入される（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２３】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。国際公開公報第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸改変に関する。本明細書で報告される前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｗで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｙで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ｔで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２４】
ＩｇＧ２アイソタイプである本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。
【０２２５】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋ又はＮは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄ、３５６位のアミノ酸Ｅ若しくはＤ、又は３５７位のアミノ酸Ｅは、正電荷アミノ酸（好ましい一実施態様ではＫ又はＲ、好ましい一実施態様ではＫで、好ましい一実施態様では３９９位又は３５６位のアミノ酸は、Ｋで置換されている）で置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。さらなる一実施態様では、上記置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｋ又はＲは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。特にさらなる一実施態様では、上記置換に加えて、又は上記置換に代えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４３９位のアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位のアミノ酸Ｋは、負電荷アミノ酸で（好ましい一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）互いに独立して置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２６】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書で報告される前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２５３位のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、２８２位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、３２２位のアミノ酸Ｋは、Ｄで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２３９位のアミノ酸Ｄは、Ｋで置換されており、２４０位のアミノ酸Ｅは、Ｋで置換されており、２９２位のアミノ酸Ｋは、Ｄで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２２７】
本明細書で報告される多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されているアプローチは、多重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。
【０２２８】
本明細書で報告される全ての態様及び実施態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。本発明の好ましい一実施態様では、多重特性抗体は、二重特異性抗体である。
【０２２９】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、抗体は、二価又は三価抗体である。一実施態様では、抗体は、二価抗体である。
【０２３０】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１のものであるか、又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ２のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ３のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ４のものであるか、又はさらなる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で報告される全ての態様のさらなる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有するヒトサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
【０２３１】
本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、さらなるＣ末端グリシン−リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含む。本明細書で報告される全ての態様の一実施態様では、本明細書で特定されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含む。
【０２３２】
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかの抗ＡＮＧ２抗体は、以下のセクション１〜５に記載されている特徴のいずれかを単独で又は組み合わせで取り込み得る。
【０２３３】
１．抗体親和性
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、１μM以下、１００nM以下又は１０nM以下（例えば、１０−８Ｍ以下）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０２３４】
ＫＤ値の決定方法は、以下の実施例に概説されている。
【０２３５】
BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用する場合、ＫＤ値は、以下のように代替的に測定され得る：ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物に対する抗体又は抗体フラグメントの結合は、BIACORE T200 instrument (GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって調査され得る。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、約４０００RUの抗ヒト抗体（１０μg/ml抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体；注文コードBR-1008-39; GE Healthcare）をSeries S CM5 chip (GE Healthcare BR-1005-30)上にｐＨ５．０でカップリングする。固定化手順中のランニングバッファーとして、ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、GE Healthcare）を使用する。その後の動態特性評価では、サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）である。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、動態特性評価前にランニングバッファーで２回プライミングする。
【０２３６】
１μg/ml溶液を流速５μl／分で３０秒間注入することによって、ＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物を捕捉する。３００nMから開始して連続１：３希釈で、様々な濃度のＣｒｏｓｓ−Ｆａｂ溶液を流速９０μl／分で９０秒間注入することによって、会合を測定する。解離相を最大６００秒モニタリングし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーする。３M ＭｇＣｌ２溶液を用いて流速５μl／分で洗浄して、全ての表面を６０秒間再生する。抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率差を補正する。ブランク注入も減算した（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用する。
【０２３７】
２．抗体フラグメント
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメント並びに以下に記載される他のフラグメントが挙げられる。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、増加したin vivo半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
【０２３８】
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許出願公開第０４０４０９７号；国際公開公報第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリボディ及びテトラボディもまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134に記載されている。
【０２３９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。
【０２４０】
抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化及びリコンビナント宿主細胞（例えば、E. coli又はファージ）による産生を含む様々な技術によって作製され得る。
【０２４１】
３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０２４２】
特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させる。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を場合により含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
【０２４３】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号及び米国特許第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングが記載している）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」が記載している）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」が記載している）；Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（「ＦＲシャッフリング」に対する「誘導選択」アプローチが記載している）にさらに記載されている。
【０２４４】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）を使用して選択されたフレームワーク領域；特定のサブグループの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られたフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照のこと）が挙げられる。
【０２４５】
４．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一方はＡＮＧ２に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＡＮＧ２の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、ＡＮＧ２を発現する細胞に細胞傷害剤を局限するために使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製され得る。
【０２４６】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアのリコンビナント同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電気的ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと）；二重特異性抗体を生産するためのロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを生産するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；並びに例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。
【０２４７】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。
【０２４８】
本明細書における抗体又はフラグメントはまた、ＡＮＧ２及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
【０２４９】
本明細書における抗体又はフラグメントはまた、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、国際公開公報第２０１０／１４５７９２号及び国際公開公報第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体を含む。
【０２５０】
５．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、該残基中への挿入及び／又は該残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行い得る。
【０２５１】
ａ）置換変異体、挿入変異体及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。目的の置換突然変異誘発部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、表の「好ましい置換」という項目に示されている。アミノ酸側鎖クラスについて以下にさらに記載されているように、より実質的な変更は、表１の「例示的な置換」という項目に提供されている。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについて生成物をスクリーニングし得る。
【表１３】
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【０２５２】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５３】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
【０２５４】
置換変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体を基準として特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術、例えば本明細書に記載されるものを使用して簡便に作製され得る親和性成熟抗体である。簡潔に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２５５】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中に変化（例えば、置換）を行い得る。ＨＶＲ「ホットスポット」（すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）及び／又は抗原と接触する残基）において、このような変化を行い得、得られた変異体ＶＨ又は変異体ＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、同時に４〜６個の残基）をランダム化するＨＶＲ特異的アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がターゲティングされることが多い。
【０２５６】
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、このような変化によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に減少しない限り、１つ以上のＨＶＲ内に存在し得る。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われ得る。このような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側にあり得る。上記で提供される変異体ＶＨ配列及び変異体ＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは変化されないか、又は１個、２個、若しくは３個以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２５７】
突然変異誘発のためにターゲティングされ得る抗体の残基又は領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称され、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されている。この方法では、ターゲット残基の一残基又は一群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの電荷残基）を同定し、中性又は負電荷アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかを決定する。さらなる置換は、最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は加えて、抗体と抗原の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補としてターゲティング又は排除され得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかを決定し得る。
【０２５８】
アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、（例えば、ＡＤＥＰＴの）酵素又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が挙げられる。
【０２５９】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製又は排除されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成され得る。
【０２６０】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物が変化され得る。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブな抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般的に結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースが挙げられ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変が行われ得る。
【０２６１】
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合しているフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％又は２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定した場合に、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のわずかな配列変異により、２９７位からアミノ酸±約３個上流又は下流に（すなわち、２９４位〜３００に）位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；国際公開公報第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；国際公開公報第２００３／０８４５７０号；国際公開公報第２００５／０３５５８６号；国際公開公報第２００５／０３５７７８号；国際公開公報第２００５／０５３７４２号；国際公開公報第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化に欠陥があるＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号を参照のこと）が挙げられる。
【０２６２】
分岐オリゴ糖を有する抗体変異体であって、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって分岐されている抗体変異体が提供される。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖において少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４；及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０２６３】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸改変を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域中に導入し、それによりＦｃ領域変異体を作製し得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０２６４】
特定の実施態様では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有する（このことは、抗体のin vivo半減期が重要だが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）が不要又は有害な用途の望ましい候補にする）抗体変異体を企図する。ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／消失を確認するために、in vitro及び／又はin vivo細胞傷害性アッセイが行われ得る。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを保証するために、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイが行われ得る。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; and Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502)を参照のこと）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、in vivoで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されている動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができないので、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイも行われ得る（例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び国際公開公報第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びin vivoクリアランス／半減期の決定はまた、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769を参照のこと）。
【０２６５】
減少したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８位、２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、３２７位及び３２９位の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体（アラニンへの残基２６５位及び２９７位の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む）が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２６６】
改善又は減弱したＦｃＲ結合性を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。
【０２６７】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換（例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）における置換）を有するＦｃ領域を含む。
【０２６８】
いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、変化（すなわち、改善又は減弱のいずれか）したＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域において行われる。
【０２６９】
増加した半減期及び改善された新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合性（これは、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与する）を有する抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８位、２５６位、２６５位、２７２位、２８６位、３０３位、３０５位、３０７位、３１１位、３１２位、３１７位、３４０位、３５６位、３６０位、３６２位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、４１３位、４２４位又は４３４位の１つ以上において置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４位の置換）を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２７０】
Ｆｃ領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２７１】
ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。前記残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施態様では、以下の残基の任意の１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatのナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製され得る。
【０２７２】
ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適切な部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性により、製造に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分枝状又は非分枝状であり得る。抗体に結合しているポリマーの数は変動し得、複数のポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善すべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が所定条件下の治療法で使用されるかなどを含む検討事項に基づいて決定され得る。
【０２７３】
別の実施態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長のものであり得、限定されないが、普通の細胞を害しないが、抗体−非タンパク性部分の近くの細胞が殺傷される温度に非タンパク性部分を加熱する波長を含む。
【０２７４】
Ｂ．リコンビナント法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているリコンビナント法及びリコンビナント組成物を使用して生産され得る。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＡＮＧ２抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらでトランスフォーメーションされている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体を作製する方法であって、抗体の発現に適切な条件下で、上記で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。
【０２７５】
抗ＡＮＧ２抗体のリコンビナント生産では、例えば上記抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定され得る。
【０２７６】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が不要な場合には、細菌において生産され得る。細菌における抗体フラグメント及び抗体ポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。（E. coliにおける抗体フラグメントの発現が記載されているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから抗体を単離し得、さらに精製し得る。
【０２７７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物（そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株及び酵母株を含む）が、抗体コードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０２７８】
グリコシル化抗体の発現のための適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２７９】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照のこと。
【０２８０】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０でトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されているＨＥＫ２９３又は２９３細胞）；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸部ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０２８１】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特定及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング又は特性評価され得る。
【０２８２】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、１つ以上の細胞傷害剤、例えば化学療法剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体にコンジュゲートされている本明細書で報告される抗ＡＮＧ２抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２８３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号及び欧州特許第０４２５２３５号）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号及び米国特許第７，４９８，２９８号を参照のこと）；ドラスタチン；カリチアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号及び米国特許第５，８７７，２９６号；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342;及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照のこと）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセル；トリコテシン；及びＣＣ１０６５を含む１つ以上の薬物にコンジュゲートされている抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【０２８４】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（Pseudomonas aeruginosa由来の）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、dianthinタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシンを含む酵素活性毒素又はそのフラグメントにコンジュゲートされている本明細書に記載される抗体を含む。
【０２８５】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされているラジオコンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。様々な放射性同位体が、ラジオコンジュゲートの生産に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。ラジオコンジュゲートが検出に使用される場合、それは、シンチグラフィ試験のための放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても公知である）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含み得る。
【０２８６】
抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジニルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン），ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されるように調製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン５酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際公開公報第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞における細胞傷害薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）。
【０２８７】
本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）を含む架橋リンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明確に企図するが、これらに限定されない。
【０２８８】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体はいずれも、生物学的サンプル中のヒトＡＮＧ２の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。
【０２８９】
一実施態様では、診断又は検出の方法に使用するための抗ＡＮＧ２抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的サンプル中のＡＮＧ２の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、ＡＮＧ２に対するＡＮＧ２抗体の結合を可能にする条件下で、生物学的サンプルと本明細書に記載される抗ＡＮＧ２抗体とを接触させること、及び抗ＡＮＧ２抗体とＡＮＧ２との間で複合体が形成されるかを検出することを含む。このような方法は、in vitro又はin vivo方法であり得る。一実施態様では、例えば、ＡＮＧ２が、患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗ＡＮＧ２抗体は、抗ＡＮＧ２抗体による治療に適格な被験体を選択するために使用される。
【０２９０】
特定の実施態様では、標識抗ＡＮＧ２抗体が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光及び放射性標識）、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用により間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射線同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、蛍光体、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ（過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼとカップリングされている）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが挙げられる。
【０２９１】
Ｆ．医薬製剤
本明細書に記載される抗ＡＮＧ２抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意選択の薬学的に許容し得る担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16thedition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態で調製される。一般的に、薬学的に許容し得る担体は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、限定されないが、バッファー、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシン；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン系界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体としてはさらに、侵入型薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。
【０２９２】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸バッファーを含む。
【０２９３】
本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症に必要な複数の有効成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。例えば、抗ＩＬ−１β抗体又は抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をさらに提供することが望ましい場合がある。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２９４】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入され得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16thedition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０２９５】
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性マトリックスが挙げられる。
【０２９６】
一般的に、in vivo投与に使用すべき製剤は、滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成され得る。
【０２９７】
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体はいずれも、治療方法に使用され得る。
【０２９８】
一態様では、医薬として使用するための抗ＡＮＧ２抗体が提供される。さらなる態様では、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症の処置に使用するための抗ＡＮＧ２抗体が提供される。特定の実施態様では、処置方法に使用するための抗ＡＮＧ２抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を有する個体を処置する方法であって、有効量の抗ＡＮＧ２抗体を該個体に投与することを含む方法に使用するための抗ＡＮＧ２抗体を提供する。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、血管新生の阻害に使用するための抗ＡＮＧ２抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における血管新生を阻害する方法であって、有効量の抗ＡＮＧ２抗体を該個体に投与して、血管新生を阻害することを含む方法に使用するための抗ＡＮＧ２抗体を提供する。上記実施態様のいずれかの「個体」は、好ましくは、ヒトである。
【０２９９】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＡＮＧ２抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を処置するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を処置する方法であって、有効量の医薬を、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を有する個体に投与することを含む方法に使用するためのものである。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、血管新生を阻害するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体における血管新生を阻害する方法であって、有効量の医薬を該個体に投与して、血管新生を阻害することを含む方法に使用するためのものである。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであり得る。
【０３００】
さらなる態様では、本発明は、眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を処置するための方法を提供する。一実施態様では、該方法は、有効量の抗ＡＮＧ２抗体を、このような眼血管疾患、好ましくは黄斑変性症を有する個体に投与することを含む。このような一実施態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を個体に投与することをさらに含む。上記実施態様のいずれかの「個体」は、ヒトであり得る。
【０３０１】
さらなる態様では、本発明は、個体における血管新生を阻害するための方法を提供する。一実施態様では、該方法は、有効量の抗ＡＮＧ２抗体を個体に投与して、血管新生を阻害することを含む。一実施態様では、「個体」は、ヒトである。
【０３０２】
さらなる態様では、本発明は、例えば上記治療方法のいずれかに使用するための医薬製剤であって、本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体のいずれか、及び薬学的に許容し得る担体を含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供される抗ＡＮＧ２抗体のいずれか、及び少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記）を含む。
【０３０３】
治療では、本発明の抗体は単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。特定の実施態様では、さらなる治療剤は、抗ＩＬ−１β抗体又は抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０３０４】
このような上記併用療法は、併用投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ製剤又は別個の製剤に含まれる）及び個別投与（この場合、１つ又は複数のさらなる治療剤の投与の前に、同時に及び／又は後に、本発明の抗体の投与を行い得る）を包含する。一実施態様では、抗ＡＮＧ２抗体の投与及びさらなる治療剤の投与は、互いに約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行なわれる。
【０３０５】
本発明の抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、静脈内、硝子体内、肺内及び鼻腔内、並びに局所処置の場合には所望により病変内投与を含む任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。投薬は、任意の適切な経路による、例えば、投与が短時間又は慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内又は皮下注射などの注射によるものであり得る。限定されないが、単回投与又は様々な時点の複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
【０３０６】
本発明の抗体は、優れた医療行為と一致した様式で、製剤化、投薬及び投与されるであろう。これとの関連での検討要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理及び医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。抗体は、必須ではないが場合により、問題の障害を予防又は治療するために現在使用される１つ以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上記で考察されている他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％、若しくは適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投与量で及び任意の経路で使用される。
【０３０７】
疾患の予防又は治療のために、（単独で又は１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用される場合の）本明細書で報告される抗体の適切な投与量は、処置すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への反応、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、１回で又は一連の処置で患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個投与又は連続注入にかかわらず、約１μg/kg〜５０mg/kg（例えば、０．５mg/kg〜３０mg/kg）の抗体が、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上記要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であり得る。症状に応じて数日間以上の反復投与では、処置は、一般的に、疾患症候の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲内であろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、１０mg/kg、３０mg/kg又は５０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が抗体の約２〜約２０、又は例えば、約６つの用量を受けるように）投与され得る。初回高ローディング用量とそれに続く１つ以上の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０３０８】
上記製剤化又は治療方法はいずれも、抗ＡＮＧ２抗体の代わりに、又は抗ＡＮＧ２抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して行われ得ると理解される。
【０３０９】
ＩＩＩ．製品
本発明の別の態様では、上記障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器と、該容器上の又は該容器に結合しているラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなど様々な材料から形成され得る。容器は、組成物（これは、それ自体であるか、又は症状を治療、予防及び／若しくは診断するために有効な別の組成物と組み合わされている）を収容し、滅菌取出口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された症状を処置するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれる第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害剤又は別の治療剤を含む組成物がその中に含まれる第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様の製品は、組成物が、特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容し得るバッファーを含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的観点及び使用者観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０３１０】
上記製品はいずれも、抗ＡＮＧ２抗体の代わりに、又は抗ＡＮＧ２抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ると理解される。
【０３１１】
ＩＶ．特定の実施態様
１．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【０３１２】
２．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【０３１３】
３．（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様１〜２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３１４】
４．（ａ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様１〜２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３１５】
５．（ａ）配列番号：１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号：６若しくは配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、実施態様１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
【０３１６】
６．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【０３１７】
７．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【０３１８】
８．（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様６〜７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３１９】
９．（ａ）配列番号：３７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、実施態様６〜８のいずれか１つに記載の抗体。
【０３２０】
１０．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、
ｉ）配列番号：１９と７０％超の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６と７０％超の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）重鎖可変ドメインにおいて２８位にアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）、３０位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）、１００ｂ位にアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、及び１００ｊ位にアミノ酸残基アラニン（Ａ）を有し、軽鎖可変ドメインにおいて５１位にアミノ酸残基トレオニン（Ｔ）を有し（ナンバリングは、Kabatに従う）、
ｉｉｉ）ヒトＴｉｅ２を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した細胞系アッセイにおいて、Ｔｉｅ２リン酸化ＥＬＩＳＡを使用して決定した場合に、そのレセプターＴｉｅ２に対するＡＮＧ２の結合の阻害について、配列番号：１９と配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６又は配列番号：３３と配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と比較して低いＥＣ５０値を有する、抗体。
【０３２１】
１１．配列同一性が８０％超、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超である、実施態様１０に記載の抗体。
【０３２２】
１２．ヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４のものである、実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。
【０３２３】
１３．モノクローナル抗体である、実施態様１〜１２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３２４】
１４．配列番号：２８のＶＨ配列及び配列番号：３３のＶＬ配列を含む、抗体。
【０３２５】
１５．配列番号：１９のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含む、抗体。
【０３２６】
１６．配列番号：３７のＶＨ配列及び配列番号：４２のＶＬ配列を含む、抗体。
【０３２７】
１７．二重特異性抗体である、実施態様１〜１６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３２８】
１８．二重特異性抗体がＣｒｏｓｓＭａｂである、実施態様１７に記載の抗体。
【０３２９】
１９．ヒトＴｉｅ２レセプターに対するヒトＡＮＧ２の結合を阻害することによって、ヒトＡＮＧ２の生物学的活性を遮断する、実施態様１〜１８のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３０】
２０．二価二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３１】
２１．ｉ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されており、
又は
ｉｉ）ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングは、Kabatに従う）で独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で独立して）置換されており、ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）で独立して置換されている、実施態様２０に記載の抗体。
【０３３２】
２２．第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸がＫで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、実施態様２０〜２１のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３３】
２３．第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸がＥで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、実施態様２０〜２２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３４】
２４．第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸がＫで置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸がＥで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、実施態様２０〜２３のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３５】
２５．第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位及び１２３位のアミノ酸がＫで置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸がＥで置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸がＫで置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸がＥで置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸がＫで置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸がＥで置換されている（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、実施態様２０〜２４のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３６】
２６．二価二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３７】
２７．二価二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の軽鎖及び第２の重鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二価二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３８】
２８．多重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２の及び／又は第３の及び／又は第４の及び／又は第５の抗原、好ましくは１つのさらなる抗原、すなわち第２の抗原に特異的に結合する）１つ、２つ、３つ又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメント
を含み、
前記ｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記ａ）の全長抗体に融合されており、
第１の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＡＮＧ２である多重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３９】
２９．三価二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第１のポリペプチドであって、
そのＶＨドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の一方のＣ末端に融合されている第１のポリペプチド、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第２のポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端において、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の２本の重鎖の他方のＣ末端に融合されている第２のポリペプチド、
を含み、
並びに
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
並びに
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である三価二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４０】
３０．ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、以下の位置間：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位〜軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位〜軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位〜軽鎖可変ドメインの１００位（ナンバリングは常に、KabatのＥＵインデックスに従う）
へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋を介して連結及び安定化されている、実施態様２９に記載の抗体。
【０３４１】
３１．三重特異性又は四重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている第２の（改変）軽鎖及び第２の（改変）重鎖、並びに
を含み、
ｃ）１つ又は２つのさらなる抗原（すなわち、第３の及び／又は第４の抗原）に特異的に結合する１〜４つの抗原結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原又はさらなる抗原の１つがヒトＡＮＧ２である三重特異性又は四重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４２】
３２．二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する（及び２つのＦａｂフラグメントを含む）抗体の２本の軽鎖及び２本の重鎖、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つのさらなるＦａｂフラグメントであって、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに両方とも融合されている２つのさらなるＦａｂフラグメント
を含み、
並びに
該Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変
ｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｉｉ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
並びに
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｉｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、
又は
ｖ）ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されており、並びにｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに交換されている
が実施された二重特異性四価抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４３】
３３．二重特異性四価抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の（改変）重鎖であって、第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含み、前記第１の抗体の第２のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、
ｂ）前記ａ）の第１の抗体の２本の軽鎖、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の（改変）重鎖であって、第１のＶＨ−ＣＬドメインペアを含み、前記第２の抗体の第２のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記重鎖のＣ末端に融合されている（改変）重鎖、及び
ｄ）前記ｃ）の第２の抗体の２本の（改変）軽鎖であって、それぞれがＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む２本の（改変）軽鎖
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性四価抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４４】
３４．二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、該重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、該軽鎖のＣ末端に接続されている重鎖及び軽鎖、
を含み、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４５】
３５．二重特異性抗体であって
ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体であって、２本の抗体重鎖及び２本の抗体軽鎖からなる全長抗体、並びに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントであって、ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含み、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに接続されているＦｖフラグメント
を含み、
該ＶＨ２ドメイン又は該ＶＬ２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合されており、
第１の抗原又は第２の抗原がヒトＡＮＧ２である二重特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４６】
３６．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、
−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｋ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４、並びに
−突然変異  Ｎ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ３
を含む群から選択され、
並びに
ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、
−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチド、
−突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ１、並びに
−突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４
を含む群から選択される、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４７】
３７．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４８】
３８．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ
の突然変異の組み合わせを含む、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３４９】
３９．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（ヒト起源に由来し）、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、
又は
ｂ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（すなわち、ヒト起源に由来し）、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、該Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を両方が含み、それにより、全ての突然変異が第１の若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第１のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、１つ若しくは２つの突然変異が第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、
又は
ｃ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（すなわち、ヒト起源に由来し）、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むか、又は第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５０】
４０．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
ａ）第１の変異体Ｆｃ領域ポリペプチドが第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドに由来し、第２の変異体Ｆｃ領域ポリペプチドが第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドに由来し、それにより、第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドが第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドと同一であるか又は異なり、並びに
ｂ）第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドが第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドと異なるアミノ酸残基以外の１つ以上のアミノ酸残基において、第１の変異体Ｆｃ領域ポリペプチドが第２の変異体Ｆｃ領域ポリペプチドと異なり、並びに
ｃ）第１の変異体Ｆｃ領域ポリペプチド及び第２の変異体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域が、ａ）の第１の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチド及びａ）の第２の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域のものと異なるヒトＦｃ−レセプター親和性を有し、
第１のＦｃ領域ポリペプチド若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチドのいずれか又は両Ｆｃ領域ポリペプチドが互いに独立して、以下の突然変異の１つ又は突然変異の組み合わせ：
−Ｔ３０７Ｈ、又は
−Ｑ３１１Ｈ、又は
−Ｅ４３０Ｈ、又は
−Ｎ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｑ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｅ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｎ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ
を含む、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５１】
４１．第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール鎖）を含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ノブ鎖）を含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチド（ホール鎖）が突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ
を含み、
第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが、１つ以上のジスルフィド架橋によって接続されており、
第１のポリペプチドのＣＨ３−ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ３−ドメインが両方ともプロテインＡに結合するか、又は両方ともプロテインＡに結合しない（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５２】
４２．突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ若しくはＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ若しくはＬ３１４Ｇ若しくはＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６Ｅ若しくはＴ２５６Ａ
を含む、実施態様４１に記載の抗体。
【０３５３】
４３．突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、並びに
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ、並びに
ｉｉｉ）場合によりａ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又はＴ２５６Ｅ若しくはＴ２５６Ａ、並びに
ｉｖ）ａ）Ｌ２５１Ａ若しくはＬ２５１Ｇ若しくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０Ａ若しくはＨ３１０Ｇ
を含む、実施態様４１〜４２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５４】
４４．突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、並びに
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ、並びに
ｉｉｉ）ａ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又はＴ２５６Ｅ若しくはＴ２５６Ａ、並びに
ｉｖ）ａ）Ｌ２５１Ａ若しくはＬ２５１Ｇ若しくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０Ａ若しくはＨ３１０Ｇ
ｖ）場合によりａ）Ｔ３０７Ａ若しくはＴ３０７Ｈ若しくはＴ３０７Ｑ若しくはＴ３０７Ｐ、及び／又はｂ）Ｑ３１１Ｈ、及び／又はｃ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又はｄ）Ｓ２５４Ｔ
を含む、実施態様４１〜４３のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５５】
４５．突然変異
ｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｉ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又は
ｉｉｉ）Ｓ２５４Ｔ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６Ｅ若しくはＴ２５６Ａ、及び／又は
ｖ）Ｔ３０７Ａ若しくはＴ３０７Ｈ若しくはＴ３０７Ｑ若しくはＴ３０７Ｐ、及び／又は
ｖｉ）Ｑ３１１Ｈ
を含む、実施態様４１〜４４のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５６】
４６．ａ）配列番号：５７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｂ）配列番号：５８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｃ）配列番号：５９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｄ）配列番号：６０のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｅ）配列番号：６１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｆ）配列番号：６２のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｇ）配列番号：６３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｈ）配列番号：６４のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｉ）配列番号：６５のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｊ）配列番号：４６のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：６６のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｋ）配列番号：４６のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：６７のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｌ）配列番号：６８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｍ）配列番号：６９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｎ）配列番号：７０のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｏ）配列番号：４７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｐ）配列番号：７１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｑ）配列番号：７２のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｒ）配列番号：７３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｓ）配列番号：７２のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｔ）配列番号：７３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｕ）配列番号：４８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｖ）配列番号：４８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｗ）配列番号：７４のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｘ）配列番号：７４のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｙ）配列番号：４７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ｚ）配列番号：５１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａａ）配列番号：５２のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：４９のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｂ）配列番号：５２のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｃ）配列番号：５３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｄ）配列番号：４７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：７８のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｅ）配列番号：４８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：７８のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
ａｇ）配列番号：８３のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号：８１のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、配列番号：８４のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号：８２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖、又は
ａｈ）配列番号：８５のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号：８１のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、配列番号：８６のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号：８２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖、又は
ａｉ）配列番号：８９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号：８７のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、配列番号：９０のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号：８８のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖、又は
ａｊ）配列番号：８１のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号：８７のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、配列番号：９２のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号：８８のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖
を含む、単離された抗体又は単離されたＦａｂフラグメント。
【０３５７】
４７．医薬として使用するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５８】
４８．眼血管疾患の処置に使用するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３５９】
４９．眼疾患、特に眼血管疾患を処置するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体の使用。
【０３６０】
５０．眼疾患の処置に使用するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３６１】
５１．眼疾患、特に眼血管疾患の処置に使用するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３６２】
５２．眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体を該個体に投与することを含む、方法。
【０３６３】
５３．実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体を含む、医薬製剤。
【０３６４】
５４．眼血管疾患の処置に使用するための医薬製剤であって、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体を含む、医薬製剤。
【０３６５】
５５．眼血管疾患を処置するための医薬を製造するための、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体の使用。
【０３６６】
５６．実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することによって、眼血管疾患を患っている患者を処置する方法。
【０３６７】
５７．抗体が硝子体内適用によって投与される、実施態様５３〜５４のいずれか１つに記載の医薬製剤。
【０３６８】
５８．投与が硝子体内適用である、実施態様５６〜５７のいずれか１つに記載の投与。
【０３６９】
５９．実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体をコードする、核酸。
【０３７０】
６０．実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体をコードする１つ以上の核酸を含む、細胞。
【０３７１】
６１．実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体を生産するための方法であって、以下の工程：
ａ）場合により、実施態様１〜４６のいずれか１つに記載の抗体をコードする１つ以上の核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクションすること、
ｂ）該細胞を培養して、該抗体を発現させること、及び
ｃ）該細胞又は培養培地から該抗体を回収し、それにより、該抗体を生産すること
を含む、方法。
【実施例】
【０３７２】
Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供される一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様を実施し得ると理解される。
【０３７３】
材料及び方法
クローニング：
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を使用して、点突然変異を導入した。数個の単一コロニーを採取し、ＬＢ−Ａｍｐ培地４ml中に移し、３７℃で１６〜１８時間培養した。遠心分離によって２mlを回収し、続いて、製造業者の説明書にしたがってHigh Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して、プラスミド調製を行った。配列決定による確認後、プラスミドをE.coli細胞（Agilent Technologies）にリトランスフォーメーションした。単一コロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地２mlに移し、３７℃で６〜８時間培養した。その後、この培養物２００μlを使用して、振盪フラスコ中のＬＢ−Ａｍｐ培地１５０mlに植菌した。培養物を３７℃、３００rpmで一晩インキュベーションし、続いて、遠心分離によって細胞を回収した。製造業者の説明書にしたがってHiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen)を使用して、プラスミド調製を実施した。
【０３７４】
ＣｒｏｓｓＦａｂ及びＣｒｏｓｓＭａｂ−骨格プラスミドにおけるＶＨ領域及びＶＬ領域をそれぞれ交換することによる、制限部位を介したクローニングの鋳型として、突然変異ＣｒｏｓｓＦａｂを使用した。同じ制限酵素ペアによる鋳型及び骨格プラスミドの消化後、混合物を１％アガロースゲルに追加して、ドナーＤＮＡ（ＶＨ又はＶＬ領域）及びアクセプターＤＮＡ（プラスミド骨格）を単離した。その後、High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を用いて、アガロース片を精製した。その後、rAPid Alkaline Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)によってアクセプターＤＮＡを脱リン酸化し、次いで、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用することによってアクセプターＤＮＡ及びドナーＤＮＡをライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをE.coli細胞（Agilent Technologies）にトランスフォーメーションした。
【０３７５】
一過性発現
１２５ml振盪フラスコ（３７℃、７％ＣＯ２、湿度８５％、１３５rpmでインキュベーション／振盪）中で解凍した後、少なくとも４倍希釈することによって（容量３０ml）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Invitrogen）を継代した。
【０３７６】
細胞を容量２５０mlで細胞３×１０５個／mlに増殖させた。３日後、細胞を分け、１リットル振盪フラスコ中、容量２５０ml、細胞７＊１０５個／mlの密度で新たに播種した。２４時間後、細胞約１．４〜２．０×１０６個／mlの細胞密度で、トランスフェクションを行った。
【０３７７】
トランスフェクションの前に、プラスミド−ＤＮＡ ２５０μg（軽鎖プラスミド１２２μg及び重鎖プラスミド１２８μg）を、予熱（水浴；３７℃）Opti-MEM培地（Gibco）によって最終容量１０mlで希釈した。この溶液を穏やかに混合し、室温で５分間未満インキュベーションした。その後、293-freeトランスフェクション試薬３３３．３μlをＤＮＡ−OptiMEM溶液に追加した。この溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベーションした。全容量の混合物を、ＨＥＫ細胞培養容量２５０mlで１Ｌ振盪フラスコに追加した。フラスコを、３７℃、７％ＣＯ２、湿度８５％、１３５rpmで６日間又は７日間振盪／インキュベーションした。１回目の遠心分離工程（２０００rpm、４℃、１０分間）によって、上清を回収した。２回目の遠心分離工程（４，０００rpm、４℃、２０分間）のために、上清を新たな遠心分離フラスコに移した。その後、無細胞上清を、０．２２μmボトルトップフィルターでろ過し、冷凍庫（−２０℃）中で保存した。
【０３７８】
精製
MabSelectSure-Sepharose（商標）(GE Healthcare, Sweden)を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養上清から、抗体及びＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１−ＣＬを精製した一方、KappaSelect-Agarose (非Ｆｃ領域含有結合ドメイン用) (GE Healthcare, Sweden)を使用し、続いて、butyl-Sepharose (GE Healthcare, Sweden)を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー及びSuperdex 200 size exclusion (GE Healthcare, Sweden)クロマトグラフィーによって、ＡＡＡ突然変異を有するＦａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ及びＡｎｇ２ＶＥＧＦ  ＣｒｏｓｓＭＡｂを精製した。
【０３７９】
簡潔に言えば、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂上の滅菌ろ過細胞培養上清から、抗体及びＣｒｏｓｓＭＡｂを捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で溶出した。２５mMトリス、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化したKappaSelect樹脂上にＦａｂを捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．９で溶出した。溶出した抗体又はＦａｂ含有画分をプールし、２Ｍトリス、ｐＨ９．０で中和した。１．６Ｍ硫酸アンモニウム溶液を最終濃度０．８Ｍの硫酸アンモニウムに追加することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィーのために、抗体／Ｆａｂプールを調製した。酢酸を使用して、ｐＨをｐＨ５．０に調整した。３５mM酢酸ナトリウム、０．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０でbutyl-Sepharose樹脂を平衡化した後、抗体を樹脂にアプライし、平衡化バッファーで洗浄し、０〜３５mM酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０の直線勾配を使用して溶出した。二重特異性抗体／抗体又はＦａｂ含有画分をプールし、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。それぞれ抗体又はＦａｂ含有画分をプールし、Vivaspin ultrafiltration devices (Sartorius Stedim Biotech S.A., France)を使用して必要濃度に濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３８０】
ＣＥ−ＳＤＳ分析
各精製工程後、microfluidic Labchip technology (Caliper Life Science, USA)を使用してＣＥ−ＳＤＳによって、抗体の純度及び完全性を分析した。したがって、製造業者の説明書にしたがってHT Protein Express Reagent Kitを使用して、分析物溶液５μlを調製し、HT Protein Express Chipを使用してLabChip GXII systemによって分析した。LabChip GX Softwareを使用して、データを分析した。
【０３８１】
実施例１
アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）に結合する交差抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）及び交差抗体Ｆａｂフラグメント（ＣｒｏｓｓＦａｂ）。
方法のセクションに記載されているように分子生物学技術によってクローニングすることによって、交差抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）又は交差フラグメント抗原結合（ＣｒｏｓｓＦａｂ）を作製し、上記のようにＨＥＫ２９３細胞において一過性発現させた。
【０３８２】
ＣＤＲにおいて特定の点突然変異を有する作製した抗体及びＦａｂの一般的スキームを表１に示す。表１に示されているアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使用して、交差抗体及び交差Ｆａｂを発現させた。
【表１４】
2017534644.tif 000019
2017534644.tif 000020
【０３８３】
実施例２
アンジオポエチン−２（ＡＮＧ２）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する交差二価二重特異性抗体であって、ＡＮＧ２結合においてＣＬ−ＣＨ１ドメイン交換（ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１／ＣＬ）を有する交差二価二重特異性抗体
ＡＮＧ２  ＦａｂアームにおいてＣＨ１−ＣＬ交差を有するＡＮＧ２−ＶＥＧＦ  ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１−ＣＬを、上記のように分子生物学技術によってクローニングすることによって作製し、上記のようにＥＫ２９３細胞において一過性発現させた。
【０３８４】
ＣＤＲにおいて特定の点突然変異を有する作製したＡＮＧ２−ＶＥＧＦ  ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１−ＣＬの一般的なスキームを表２に示す。表２に示されているアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使用して、ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ  ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１−ＣＬを発現させた。
【表１５】
2017534644.tif 000021
【０３８５】
全ての構築物について、第１のＣＨ３ドメインにおいて典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）突然変異、及び第２のＣＨ３ドメインにおいて対応するホール突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）（及び、導入した２つのさらなるシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９Ｃ）（対応する上記各重鎖（ＨＣ）配列に含まれる）を用いて、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を使用した。
【０３８６】
実施例３
ＨＥＫ細胞におけるＡＮＧ２結合ＣｒｏｓｓＦａｂ、抗体及びＡｎｇ２−ＶＥＧＦ  ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１−ＣＬのトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬293-free (Novagen)を用いた、懸濁液適合HEK293F(FreeStyle 293-F細胞; Invitrogen)細胞における抗体の一過性発現。
【０３８７】
１２５ml振盪フラスコ（３７℃、７％ＣＯ２、湿度８５％、１３５rpmでインキュベーション／振盪）中で解凍した後、少なくとも４倍希釈することによって（容量３０ml）、細胞を継代した。
【０３８８】
細胞を容量２５０mlで細胞３×１０５個／mlに増殖させた。３日後、細胞を分け、１リットル振盪フラスコ中、容量２５０ml、細胞７＊１０５個／mlの密度で新たに播種した。２４時間後、細胞約１．４〜２．０×１０６個／mlの細胞密度で、トランスフェクションを行う。
【０３８９】
トランスフェクションの前に、プラスミド−ＤＮＡ ２５０μg（軽鎖１２２μg及び重鎖１２８μg）を、予熱（水浴；３７℃）Opti-MEM（Gibco）によって最終容量１０mlで希釈する。この溶液を穏やかに混合し、室温で５分間未満インキュベーションする。次いで、293-freeトランスフェクション試薬３３３．３μlをＤＮＡ−OptiMEM溶液に追加する。この溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベーションする。全容量の混合物を、ＨＥＫ細胞培養容量２５０mlで１Ｌ振盪フラスコに追加する。
【０３９０】
３７℃、７％ＣＯ２、湿度８５％、１３５rpmで６日間又は７日間振盪／インキュベーションした。
【０３９１】
１回目の遠心分離工程（２０００rpm、４℃、１０分間）によって、上清を回収する。次いで、２回目の遠心分離（４，０００rpm、４℃、２０分間）のために、上清を新たな遠心分離フラスコに移す。その後、無細胞上清を、０．２２μmボトルトップフィルターでろ過し、冷凍庫（−２０℃）中で保存する。
【０３９２】
実施例４
ＨＥＫ上清からのＦａｂ精製
抗体を含有する細胞培養上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程によって精製した。Kappa Select (GE Healthcare)を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって、ＡＡＡ突然変異を有するＣｒｏｓｓＦａｂ及びＣｒｏｓｓＭＡｂを捕捉し、さらなるＨＩＣ及びＳＥＣクロマトグラフィー工程によってポリッシュした。詳細については、上記材料及び方法を参照のこと。
【０３９３】
実施例５
ＨＥＫ上清からのＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１−ＣＬ精製
培養上清をろ過し、３回のクロマトグラフィー工程によって精製した。HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare)を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を捕捉し、ＨＩＣ及びＳＥＣクロマトグラフィー工程でポリッシュした。Biomax-SK membraneを備えるUltrafree -CL centrifugal filter unit(Millipore, Billerica, MA)を用いて、抗体含有溶液を濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３９４】
実施例６
ＣｒｏｓｓＦａｂ及びＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１−ＣＬ調製物の分析
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０nmの光学密度（ＯＤ）を測定することによって、調製物のタンパク質濃度を決定した。
【０３９５】
Protein Express Chip及びHT Protein Express Reagents Kitと共にLabChip GX II (PerkinElmer)を使用してＣＥ−ＳＤＳによって、抗体の純度及び完全性を分析した。
【０３９６】
ランニングバッファーとして２×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用したTSK-GEL G3000SWXLを使用して高速ＳＥＣによって、又はランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用したBioSuite High Resolution SEC, 250Å, 5 μm analytical size-exclusion column (Waters GmbH)を使用して高速ＳＥＣによって、抗体調製物の凝集物含量を決定した。
【０３９７】
実施例７
抗体からのＦａｂフラグメントの調製及び分析
抗体１２mg（２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中１mg/ml）を、Ｌ−システイン溶液２４０μl（Merck Millipore；２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中２５０mM）及びパパイン３２７μl（Roche Life Science；０．００１U/mg抗体）と共に３７℃で１２０分間インキュベーションした。切断後、インタクトなＩｇＧ及びＦｃフラグメントの除去のために、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化したHiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare)を使用したアフィニティークロマトグラフィーを使用した。続いて、第２の精製工程としてSuperdex 200（商標）(GE Healthcare)によるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーをさらに精製した。２０mMヒスチジンバッファー、０．１４M ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。Biomax-SK membraneを備えるUltrafree -CL centrifugal filter unit(Millipore, Billerica, MA)を用いて、Ｆａｂフラグメント含有溶液を濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３９８】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０nmの光学密度（ＯＤ）を測定することによって、Ｆａｂフラグメントのタンパク質濃度を決定した。
【０３９９】
還元剤（５mM １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Invitrogen）並びにSimply Blue Safe Stain (Invitrogen)による染色によって、Ｆａｂフラグメントの純度及び完全性を分析した。
【０４００】
ランニングバッファーとして２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用したBioSuite High Resolution SEC, 250Å, 5 μm analytical size-exclusion column (Waters GmbH)を使用して高速ＳＥＣによって、Ｆａｂ調製物の凝集物含量を決定した。
【０４０１】
実施例８
成熟Ｃｒｏｓｓ−ＦａｂのＡＮＧ２結合動態及び交差反応性
BIACORE T200 instrument (GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって、ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物に対する成熟Ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂの結合を調査した。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、約４０００RUの抗ヒト抗体（１０μg/ml抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体；注文コードBR-1008-39; GE Healthcare）をSeries S CM5 chip (GE Healthcare BR-1005-30)上にｐＨ５．０でカップリングした。固定化手順中のランニングバッファーとして、ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、GE Healthcare）を使用した。その後の動態特性評価では、サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、動態特性評価前にランニングバッファーで２回プライミングした。
【０４０２】
１μg/ml溶液を流速５μl／分で３０秒間注入することによって、ヒト又はカニクイザルＡＮＧ２−ＲＢＤ−Ｆｃ領域融合物を捕捉した。３００nMから開始して連続１：３希釈で、様々な濃度のＣｒｏｓｓ−Ｆａｂ溶液を流速９０μl／分で９０秒間注入することによって、会合を測定した。解離相を最大６００秒モニタリングし、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーした。３M ＭｇＣｌ２溶液を用いて流速５μl／分で洗浄して、全ての表面を６０秒間再生した。抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率差を補正した。ブランク注入も減算した（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０４０３】
実施例９
生物学的活性
該方法は、そのレセプターＴｉｅ２に対するＡＮＧ２の結合を阻害する抗体の能力を決定する。細胞表面上におけるＴｉｅ２レセプターチロシンキナーゼの発現のために、ＨＥＫ２９３細胞株（ヒト胚性腎臓細胞株）をヒトＴｉｅ２の発現ベクターで安定トランスフェクションして、細胞株ＨＥＫ２９３＿Ｔｉｅ２を得た。
【０４０４】
Ｔｉｅ２レセプターに結合し、該レセプターの自己リン酸化を誘導するＡＮＧ２で、該細胞を刺激する。本明細書で報告される抗ＡＮＧ２抗体の追加によって、Ｔｉｅ２に対する結合を阻害し得る。ＥＬＩＳＡによって、リン酸化の程度を分析する。ＯＤ値はリン酸化Ｔｉｅ２の量と相関し、抗体濃度に対してプロットする。ＥＣ５０値を決定し、同じプレート上の参照標準と比べた相対的生物学的活性（ＲＢＡ）として報告する。
【０４０５】
ヒトＴｉｅ２レセプターに対する抗体で、マルチウェルプレートをコーティングした（１０μg/mlの１００μl；R&D Systems, Cat# MAB3132；９６ウェルMaxisorbイムノプレートを室温で一晩インキュベーションし；コーティングプレートを容量２５０μlで３回洗浄し；その後、ブロッキング２００μlと共に室温で１〜２時間インキュベーション）。
【０４０６】
別途、ＨＥＫ２９３＿Ｔｉｅ２細胞（４０μl；細胞５×１０６個／ml；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を、問題の抗体及びＡＮＧ２（R&D Systems, Cat# 623-CF）のプレインキュベーションした連続希釈混合物（８０μl）に追加した。１０分後、細胞を溶解し（溶解バッファー６０μlを追加し、１５分間インキュベーション）、細胞溶解物をＥＬＩＳＡ用のコーティングプレートに移した。
【０４０７】
溶解物のＴｉｅ２レセプターは、捕捉抗Ｔｉｅ２抗体に結合する（溶解物１００μl；室温で９０分間インキュベーション）。ビオチンにコンジュゲートされている抗ホスホチロシン抗体（１００μl；０．３μg/ml抗ホスホチロシン抗体、clone 4G10（登録商標）、ビオチンコンジュゲート、Upstate, Cat# 16-103；室温で６０分間インキュベーション）によって、Ｔｉｅ２レセプター上のリン酸化チロシンを検出した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１００μl；１００mU/ml；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat# 11089153001；室温で３０分間インキュベーション）によって、ビオチン残基を結合させた。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（１００μl；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat# 11835033001）を追加し、５〜１０分後に、光学密度を４５０nmで測定した。
【０４０８】
実施例１０
化学分解試験
サンプルを３つのアリコートに分け、それぞれ２０mM Ｈｉｓ／Ｈｉｓ＊ＨＣｌ、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又はＰＢＳに再緩衝し、４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で保存した。コントロールサンプルを−８０℃で保存した。
【０４０９】
インキュベーションの終了後、相対的活性濃度（BIAcore）、凝集（ＳＥＣ）及びフラグメンテーション（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）についてサンプルを分析し、未処理コントロールと比較した。
【０４１０】
実施例１１
熱安定性
２０mMヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で、サンプルを濃度１mg/mLで調製し、０．４μmフィルタプレートによる遠心分離によって光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィン油で覆った。サンプルを０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃に加熱する間に、DynaPro Plate Reader (Wyatt)による動的光散乱によって、流体力学的半径を反復測定した。
【０４１１】
あるいは、サンプルを１０μLマイクロキュベットアレイに移し、それらを０．１℃／分の速度で２５℃から９０℃に加熱する間に、静的光散乱データ、及び２６６nmレーザーによる励起時の蛍光データを、Optim1000 instrument (Avacta Inc.)で記録した。
【０４１２】
凝集開始温度は、流体力学的半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度と定義する。
【０４１３】
あるいは、サンプルを９μLマルチキュベットアレイに移した。Optim1000 instrument (Avacta Analytical Inc.)で、マルチキュベットアレイを０．１℃／分の一定速度で３５℃から９０℃に加熱した。この機器は、約０．５℃ごとのデータ点で、２６６nmレーザーの散乱光強度を連続的に記録する。光散乱強度を温度に対してプロットした。凝集開始温度（Ｔ＿ａｇｇ）は、散乱光強度が増加し始める温度と定義する。
【０４１４】
融解温度は、波長グラフに対する蛍光強度の変曲点と定義する。
【０４１５】
理解を明確にするために、例示及び実施例によって、上記本発明を幾分詳細に説明したが、該説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【配列表】
2017534644000001.app
【国際調査報告】
2017534644.tif 000022
2017534644.tif 000023
2017534644.tif 000024
2017534644.tif 000025
2017534644.tif 000026
2017534644.tif 000027