(57)【要約】  刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して、液相中で生体分子を精製する効率的且つ費用効率の高い方法が提供される。タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、刺激応答性ポリマーへコンジュゲートされた標的生体分子結合タンパク質を含み、再使用可能である。
2017534602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激応答性ポリマーへコンジュゲートされた１つまたは複数の標的生体分子結合タンパク質を含む、刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
前記標的生体分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、細胞、細胞器官、ポリサッカライド、リポサッカライド、脂質、または炭水化物である、請求項１に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３】
前記標的生体分子結合タンパク質が、標的生体分子へ特異的に結合する、請求項１または２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４】
前記標的生体分子がビオチン化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項５】
前記標的生体分子−結合タンパク質がストレプトアビジンまたはアビジンを含む、請求項４に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項６】
前記標的生体分子が抗体またはその断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項７】
前記標的生体分子結合タンパク質が抗体結合タンパク質を含む、請求項６に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項８】
前記抗体結合タンパク質がＦｃ結合タンパク質を含む、請求項７に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項９】
前記Ｆｃ結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物である、請求項８に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１０】
前記プロテインＡがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから単離された生来のプロテインＡである、請求項９に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１１】
前記プロテインＡが、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項９に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１２】
前記プロテインＡが、哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項９に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１３】
前記組換えプロテインＡが、システイン（Ｃｙｓ）残基をＣ末端で含む、請求項１１または１２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１４】
前記組換えプロテインＡが、４つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１５】
前記組換えプロテインＡが、Ｂドメインまたはその機能的等価物である少なくとも１つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１６】
前記組換えプロテインＡが、Ｚドメインである少なくとも１つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１７】
前記非哺乳類源が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１８】
前記組換えプロテインＡが、単一ポリペプチドにおける４つのＺ  ＩｇＧ結合ドメイン及びＣ末端でのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１９】
前記Ｆｃ結合タンパク質が、プロテインＧまたはその機能的等価物である、請求項８のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２０】
前記プロテインＧが、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項１９に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２１】
前記非哺乳類源がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２０に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２２】
前記プロテインＧが哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項１９に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２３】
前記Ｆｃ結合タンパク質が、プロテインＡ／Ｇまたはその機能的等価物である、請求項８に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２４】
前記プロテインＡ／Ｇが、プロテインＡからの４つのＩｇＧ結合ドメイン及びプロテインＧからの２つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項２３に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２５】
前記抗体結合タンパク質がＩｇＧについて特異的である、請求項７〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２６】
前記抗体結合タンパク質がカッパ軽鎖結合タンパク質を含む、請求項７に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２７】
前記カッパ軽鎖結合タンパク質が、プロテインＬまたはその機能的等価物である、請求項２６に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２８】
前記プロテインＬが、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＬである、請求項２７に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２９】
前記非哺乳類源がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２８に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３０】
前記プロテインＬが、哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項２６に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３１】
前記刺激応答性ポリマーが、ｐＨ、温度、塩濃度、またはその組み合わせに感受性である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３２】
前記刺激応答性ポリマーが、ｐＨ、温度、塩濃度、またはその組み合わせに基づいて可逆的に可溶性である、請求項３１に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３３】
前記刺激応答性ポリマーがｐＨ感受性である、請求項３１または３２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３４】
前記ｐＨ感受性ポリマーが酸性もしくは中性のｐＨで可溶性であり、塩基性ｐＨで不溶性であるか、または前記ｐＨ感受性ポリマーが中性ｐＨで可溶性であり、塩基性及び酸性のｐＨで不溶性である、請求項３３に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３５】
前記ｐＨ感受性ポリマーが陰イオン高分子電解質である、請求項３３または３４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３６】
前記ポリマーがジメチルアミノエチルメタクリレートの第三級アミンの単位の鎖を含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３７】
前記ポリマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＥＥＭＡ）、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート（ｔＢｕＭＡＥＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＩＰＡＥＭＡ）のポリマー及び／またはそのコポリマーを含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３８】
前記ポリマーが、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート］、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート］、ポリ［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート］、またはポリ［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート］である、請求項３７に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３９】
前記ポリマーが、ポリ［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート］である、請求項３７に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４０】
前記ポリマーが、約８以上もしくは約７．５以上のｐＨで不溶性である、及び／または約４以下のｐＨで不溶性である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４１】
前記ポリマーが、約９以上または約９．５以上のｐＨで不溶性である、請求項４０に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４２】
前記ポリマーが約１０以上のｐＨで不溶性である、請求項４０に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４３】
前記ポリマーが約２００〜約２０００のモノマー単位を含む、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４４】
前記コンジュゲートがＡＴＲＰを使用して合成される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４５】
前記コンジュゲートの抗体へ結合するストイキオメトリーが、約１：１を超える、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４６】
前記コンジュゲートの抗体へ結合するストイキオメトリーが、約２：１、約３：１、または約４：１である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４７】
前記コンジュゲートが、固体相においてよりも高い能力で溶液中で前記標的生体分子を結合する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４８】
前記コンジュゲートが、ｒプロテインＡ−ポリＤＥＡＥＭＡコンジュゲート、ｒプロテインＡ−ポリＤＩＰＡＥＭＡコンジュゲート、またはポリＤＩＰＡＥＭＡ−コ−ＤＥＡＥＭＡのコポリマーを含むコンジュゲートであり、前記コンジュゲートが約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａまたは約１００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａの範囲中の分子量を有する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４９】
前記コンジュゲートが、約２００〜約２０００のＤＥＡＥＭＡモノマー単位または約２００〜約５，０００のＤＥＡＥＭＡモノマー単位を含むｒプロテインＡ−ポリＤＥＡＥＭＡコンジュゲートである、請求項１〜４８のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項５０】
ａ）請求項１〜４９のいずれか一項で定義されるタンパク質−ポリマーコンジュゲートと生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的生体分子を結合することを可能にし、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を形成するステップと；
ｂ）サンプルの刺激条件を変化させて、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を沈殿させるステップと；
ｃ）沈殿物を回収するステップと；
ｄ）沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を再可溶化し、標的生体分子をそれから解離するステップと；
ｅ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された標的生体分子を得るステップと
を含む、生物学的サンプルから標的生体分子を精製する方法。
【請求項５１】
前記標的生体分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、細胞、細胞器官、ポリサッカライド、リポサッカライド、脂質、または炭水化物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的生体分子がビオチン化される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的生体分子結合タンパク質がストレプトアビジンまたはアビジンを含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的生体分子が抗体またはその断片である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的生体分子結合タンパク質が抗体結合タンパク質を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記刺激条件が、ｐＨ、温度、及び／または塩濃度である、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記刺激条件がｐＨである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｆ）ステップｅ）において除去されたタンパク質−ポリマーコンジュゲートを回収するステップ
を更に含む、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ｇ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートが生物学的サンプル中で可溶性であり、ステップａ）〜ｆ）において再使用することができるように、ＣＯ２を介してバブリングすることによって、回収されたタンパク質−ポリマーコンジュゲートをプロトン化するステップ
を更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ステップｂ）においてｐＨを塩基性条件へ増加させて、結合されたコンジュゲート標的生体分子複合体を沈殿させる、請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｐＨが、約ｐＨ８へ、約ｐＨ９へ、約ｐＨ９．５、または約ｐＨ１０へ増加される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記コンジュゲートの前記標的生体分子への結合が、ｐＨの増加によって、影響されないかまたは増加される、請求項６０または６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記コンジュゲートが、酸性ｐＨ、またはｐＨ約３〜約４で、またはｐＨ約３．５で、前記標的生体分子へ結合しない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記沈殿物がステップｃ）において遠心分離によって回収される、請求項５０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が、前記刺激条件を変化させることまたは前記刺激条件をサンプルにおけるもとの値へ戻して復帰させることによって、ステップｄ）において再可溶化される、請求項５０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が、ステップｄ）において酸性溶液中で再可溶化される、請求項５０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記酸性溶液が約ｐＨ３．５または約ｐＨ３〜約ｐＨ４である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的生体分子が酸性溶液中でコンジュゲートから解離される、請求項６６または６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記タンパク質−ポリマーコンジュゲートが、酸性ｐＨで沈殿させたタンパク質−ポリマーコンジュゲートのイオン交換クロマトグラフィー、遠心濾過、タンジェンシャルフロー濾過、または濾過を使用して、ステップｅ）において除去される、請求項５０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体がＩｇＧである、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体がマウス抗体である、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体がキメラ抗体または組換え抗体である、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記生物学的サンプルが、細胞培養抽出液、細胞培養培地、または腹水を含む、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的生体分子が哺乳類細胞発現系において産生される、請求項５０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記生物学的サンプルが血清または血液を含む、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０５７，６４２号の優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は生体分子の精製及び分離に関する。より具体的には、それは、所望される生体分子を溶液中で結合し、次いで条件の変化によって不溶性にされる、刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する、生体分子（タンパク質、ポリペプチド、抗体、核酸、脂質及び同種のもの等）の精製及び分離に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般的に、生体分子（タンパク質等）の製造は、宿主細胞中での生体分子の発現、続いて生体分子の精製を包含する。第１のステップは、バイオリアクター中の宿主細胞を増殖させて生体分子の発現を達成することを包含している。この目的のために使用される株化細胞のいくつかの例には、哺乳類の細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）、細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等）、及び昆虫細胞が含まれる。一旦、生体分子が所望されるレベルで発現されたならば、それは宿主細胞から取り出され精製される。懸濁粒子（細胞、細胞断片及び他の不溶物質等）は、典型的には、濾過または遠心分離によって生体分子含有サンプルから除去され、溶液中の対象となる生体分子に加えて他の可溶性不純物を含有する、清澄にした液体または上清をもたらす。
【０００４】
精製のステップは、一般的には、不純物（宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、エンドトキシン、ウイルス、タンパク質バリアント、タンパク質凝集物、及び他の所望されない生体分子等）を除去することを含む。単純でコスト効率の良い様式で高度に純粋な生体分子を得ることが所望される。従来の精製法には、典型的には、例えば溶液の塩濃度変化による沈殿及び／または複数のクロマトグラフィーステップ（多孔質アガロース、ポリマー、セラミックまたはガラス等の固体支持体上の親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィー等）が含まれる。親和性クロマトグラフィーは、生物学的機能または個別の化学構造に基づく生体分子の高選択性による精製を可能にし、複雑な生物学的混合物からの特異的物質の単離に良く適する。サンプルは、固定化リガンドへの特異的結合を促進する条件下で適用される。未結合物質を洗浄して流し、実験条件を脱離を支援する条件へ変化させることによって対象となる物質を回収することができる。しかしながら、かかる従来の方法は、多くの場合、労力を要し時間を消費し高価である。
【０００５】
米国特許第８，３６２，２１７号は、所望される生体分子に選択的且つ可逆的に結合することができる選択的に可溶性の刺激応答性ポリマー、及びかかるポリマーを使用して生物学的材料含有ストリーム中で所望される生体分子を精製する方法に関する。ポリマーは、プロセス条件の特定のセット（ｐＨ、塩濃度または温度等）下で可溶性であり、条件の変化に際して、不溶性にされ、溶液から沈殿する。沈殿後に、対象となる生体分子はポリマーから溶出され回収される。しかしながら、刺激応答性ポリマーは、酸性ｐＨでのみ所望される生体分子を結合することができ、溶液から沈殿させる場合、生体分子への結合は非常に可変的である。
【０００６】
米国特許第８，２６３，３４３号は、（ａ）水性液体中の少なくとも１つの応答性ポリマーであって、少なくとも１つの疎水性部分を含む該ポリマーを提供することと；（ｂ）標的（複数可）を含む液体と（ａ）の水性液体を接触させることと；（ｃ）（ｂ）からもたらされる混合物へ少なくとも１つの第１の刺激を適用すること、及び可逆的な相分離（１つの相は少なくとも１つの標的を含むポリマーに富む相であり、他の相はポリマーに乏しい相である）が得られるまでそれを維持することと；（ｄ）ポリマーに富む相が非水相または実質的に固体の相へと転換するまで、前記刺激を維持すること、またはあるいは、少なくとも１つの第２の刺激を適用することと；（ｅ）標的（複数可）を含む実質的に固体の相を単離することとを含む、液体から標的生体分子（タンパク質等）を精製する方法に関する。しかしながら、応答性ポリマーの標的生体分子への結合特性は、広く変動する。
【０００７】
米国特許第７，７８６，２１３号は、治療法上の使用、他の材料の形成ための中間体としての使用、または診断用センサーにおける使用のために、タンパク質によって開始され、及びそれから進む化学重合を使用して、生体マクロ分子ポリマー複合体を調製する方法に関する。重合は、追加の開始薬剤の非存在下においてタンパク質によって開始されて、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを形成することができる。あるいは、重合はタンパク質と相互作用しない追加の開始薬剤の存在下において開始される。しかしながら、記載されるタンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ｐＨの変化または他のプロトン化刺激に応答性でなく、特定の生体マクロ分子（抗体等）の精製における使用に好適ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生体分子（モノクローナルヒト抗体等）の使用を包含する治療法上の戦略がますます多く利用可能になるので、そして産生方法は生体分子の量の増加をもたらし続けるので、十分な結合能力を有する生体分子を精製し、多量の産物を効率的且つ費用効果的に精製するための代替の材料及び方法についての必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
先行技術の短所のうちの少なくともいくつかを克服する刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して、生体分子を精製する方法が本明細書において提供される。現在使用されている固相精製法とは対照的に、本明細書において提供される方法は溶液ベース（例えば水相ベース）であり、当技術分野における方法を超える複数の可能性のある利点を提供する。
【００１０】
一態様において、標的生体分子の精製ための刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートが提供される。刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、刺激応答性ポリマーへコンジュゲートされた１つまたは複数の標的生体分子結合タンパク質を含む。標的生体分子は、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、細胞、細胞器官、ポリサッカライド、リポサッカライド、脂質、または炭水化物であり得る。いくつかの実施形態において、標的生体分子はビオチン化され、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはストレプトアビジンまたはアビジンを含む。他の実施形態において、標的生体分子は抗体またはその断片であり、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは抗体結合タンパク質（プロテインＡまたはその機能的等価物）を含む。
【００１１】
別の態様において、生物学的サンプルからの標的生体分子の精製のための方法が提供される。方法は、ａ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートと生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的生体分子を結合することを可能にし、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を形成するステップと；ｂ）サンプルの刺激条件を変化させて、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を沈殿させるステップと；ｃ）沈殿物を回収するステップと；ｄ）沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を再可溶化し、標的生体分子をそれから解離するステップと；ｅ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された標的生体分子を得るステップとを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、標的生体分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、細胞、細胞器官、ポリサッカライド、リポサッカライド、脂質、または炭水化物である。生物学的サンプルは、例えば細胞培養上清、細胞培養物抽出液、培養液、溶解物、モノクローナル腹水、ポリクローナル抗血清、哺乳類細胞培養物、または細胞培養物抽出液等であり得る。
【００１３】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは標的生体分子を特異的に結合し、刺激応答性（例えばｐＨに応答性）である。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ポリマーまたはコンジュゲートのｐＨ感受性に影響しないかまたはそれを破壊せずに、標的生体分子へ結合することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは塩基性ｐＨ条件に感受性がある（すなわち可溶性はｐＨの増加によって減少する）。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは高い結合の能力またはストイキオメトリーで生体分子へ結合する（例えば１つより多く、２よりも多く、３よりも多く、または４よりも多い生体分子が、１つのコンジュゲート分子へ結合することができる）。いくつかの実施形態において、結合の能力またはストイキオメトリーは、固相系（すなわち標的生体分子結合タンパク質が樹脂または他の固体支持体に添付される場合）で得られたものよりも高い。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは再使用可能である（すなわちタンパク質−ポリマーコンジュゲートは多くの場合、生体分子結合能力の有意な損失なしに多くの生体分子精製手順で再使用することができる）。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、分離条件（例えば高いｐＨ）下で生体分子へ強く（すなわちより高い親和性で）結合し、分離の間の生体分子損失を防止する。
【００１４】
一実施形態において、抗体の単離及び／または分離のためのタンパク質−ポリマーコンジュゲート、ならびにタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して抗体を精製する方法が提供される。かかる実施形態において、本明細書において提供される方法は、複数の系パラメーター（ｐＨ、イオン強度、濃度、及び／またはポリマー長／サイズ等）を調整する必要なしに、広範囲の標的抗体ならびにその断片のために使用することができる単一プラットフォームを提供するという利点を有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法の更なる利点は、高ｐＨでの相分離を介して標的抗体損失が防止されるということであり、このことは、相分離の駆動がｐＨの減少に依存し、例えばプロテインＡとＩｇＧとの間の結合の弱化を介して産物損失をもたらす他のポリマー系とは対照的である。いくつかの実施形態において、さらに別の利点は、中性ｐＨでの標的生体分子への結合及び中程度の塩基性ｐＨでの相分離／沈殿であり、プロテインＡへのＩｇＧの結合を支援または強化し、プルダウン効率を改善する。
【００１５】
本明細書において提供される方法は、バイオ分離の分野における複数の用途を有することができる。一態様において、本発明に記載の方法は、サンプルからの（例えば溶液または液体からの）１つまたは複数の標的生体分子の分離に有用である。別の態様において、本方法を使用して、１つまたは複数の所望されない生体分子が除去されたサンプルを得る。なお別の態様において、本方法を使用して、サンプル中の１つまたは複数の標的生体分子を濃縮することができる。別の態様において、本方法は、純粋または実質的に純粋な形状で標的生体分子を得ること（すなわち所望されない混入物または不純物を含有するサンプルから標的生体分子を精製すること）に有用である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、以下の利点：収率の改善（いくつかの実施形態において、固相と比較して、溶液中の標的生体分子（例えば抗体）のより高い結合能力に起因して）；効率の改善（いくつかの実施形態において、より少ない要求ステップによる単純なプロセス及び／または材料を再使用する性能に起因して）；及び、費用の低減（いくつかの実施形態において、材料（特にタンパク質−ポリマーコンジュゲート）を再使用する性能及び／またはより少ない材料を使用する性能に起因して、いくつかの実施形態において、溶液中の標的生体分子についての材料のより高い結合能力に起因して）のうちの１つまたは複数を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される精製法の利点は、結合及び精製の後続するラウンドのためにタンパク質−ポリマーコンジュゲートを再使用またはリサイクルする性能であり、このことは、苛酷な洗浄及び再チャージの条件に起因して結合能力を失うクロマトグラフィー樹脂とは対照的である。
【００１７】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、大スケール操作に好適である、経済的である、及び／または再使用可能であるという利点を有する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、生体分子の精製のためのキットであって、本明細書において記載されるようなタンパク質−ポリマーコンジュゲート、随意に１つまたは複数のバッファー、及びタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する生物学的サンプルからの生体分子の精製のための書面の説明書を含む、該キットを包含する。
【００１９】
本発明の更なる実施形態及び利点は、添付の請求項及び以下の記載から明らかにされるだろう。
【００２０】
本発明を良好に理解し、それをどのように実行に移すことができるかをより明瞭に示すために、添付の図面はここで一例として参照され、本発明の実施形態に記載の態様及び特色を例示するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ポリ−ＤＥＡＥＭＡ及びポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡがｐＨ感受性の相変化を実証することを示す。（Ａ）において、ＨＣｌ中で調製された、ＤＥＡＥＭＡのアニオン重合の反応産物の５０ｍｇ／ｍｌの溶液が示される（左パネル）；曇り点に到達し、固体相沈殿物が観察されるまで、ＮａＯＨを溶液へ滴加した（中央のパネル）；次いでＨＣｌを溶液へ再度添加して、ポリマーの可逆的な相変化を実証した（右パネル）。（Ｂ）において、修飾プロテインＡから開始されたポリ−ＤＥＡＥＭＡのＡＴＲＰを介して生成されたコンジュゲートの溶液の様々なｐＨでの吸光度を示す紫外分光法のグラフが示される。
【図２】本発明の精製法の一実施形態を図示する図解の図面を示し、そこでステップ１〜１２は示されるように番号付けされる。
【図３】本発明の精製法の一実施形態を図示する図解の図面を示し、そこでステップ１〜１０は示されるように番号付けされる。
【図４】修飾プロテインＡから開始された、ＤＥＡＥＭＡ、ＤＩＰＡＥＭＡ、及びその組み合わせ（５０／５０、２５／７５、及び７５／２５と示される）のＡＴＲＰを介して生成されたプロテインＡコンジュゲートの溶液の様々なｐＨでの正規化吸光度を示す、紫外線可視光線分光法のグラフを示す。グラフは、ポリＤＩＰＡＥＭＡ、またはポリＤＥＡＥＭＡ−コ−ＤＩＰＡＥＭＡを得るＤＥＡＥＭＡ及びＤＩＰＡＥＭＡの組み合わせの使用によって、ｐＨ修飾が得られることを示す。
【図５】ポリＤＩＰＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲート及びポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートについて様々なｐＨで測定したζ電位のグラフを示す。リン酸緩衝食塩水中の各々のコンジュゲートの等電点を矢印によって示す。グラフはコンジュゲートのζ電位に対するｐＨの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
バイオ分離における使用のための、刺激応答性ポリマーへコンジュゲートされた標的生体分子結合タンパク質を含む、刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートが提供される。
【００２３】
「コンジュゲート」という用語は、タンパク質及びポリマーが一緒に共有的に結合または連結されることを指摘するように本明細書において使用される。「共有結合」は、原子間のまたは原子と他の共有結合との間の電子対の共有を特徴づける化学結合の形状である。
【００２４】
「標的生体分子」は、生物学的サンプルからの精製が所望される、任意の有機化合物またはマクロ分子である。標的生体分子の非限定例には、タンパク質（抗体等）；ペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド等）；核酸（ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ等）；ウイルス（ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルス等）；細胞（原核生物または真核生物細胞等）；細胞内小器官；ポリサッカライド；リポサッカライド；脂質；及び炭水化物が含まれる。「生体分子」という用語には、任意のその断片または誘導体（組換え産物または融合産物等）も含まれることを理解すべきである。一実施形態において、標的生体分子は、タンパク質、例えばヒトまたは動物起源の例えば抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体等）である。
【００２５】
本明細書において使用される時、「リガンド」という用語は、標的生体分子との相互作用が可能な分子または化合物を意味する。
【００２６】
「生物学的サンプル」は、典型的には標的生体分子を含む溶液、すなわち標的生体分子を含む液体、典型的には水性液体（水または好適なバッファー等）である。生物学的サンプルは生理学的条件で存在し得る。いくつかの実施形態において、標的生体分子が、細胞培養中で（例えば細胞発現系中で）、または発酵によって産生されるならば、次いで、生物学的サンプルは、細胞培養上清、細胞培養抽出液、培養液、または溶解物等であり得る。いくつかの実施形態において、標的生体分子が抗体である場合、生物学的サンプルは、モノクローナル腹水、ポリクローナル抗血清、哺乳類の細胞培養等であり得る。
【００２７】
本明細書において使用される時、「精製」という用語には、生物学的サンプル（細胞培養抽出液、細胞培養上清、モノクローナル腹水、またはポリクローナル抗血清等等）からの分離及び単離が含まれる。一般的に、所望されない混入物または不純物（宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、エンドトキシン、タンパク質バリアント、タンパク質凝集物等）、及び／または他の所望されない生体分子（例えばタンパク質が精製されている場合には、ウイルス、核酸、脂質）は、精製される生体分子調製物から除去される。
【００２８】
本明細書において使用される時、「溶出液」という用語は本分野における従来の意味で使用され、すなわち分離マトリックスまたは結合された複合体からの１つまたは複数の化合物の放出に好適なｐＨ及び／またはイオン強度のバッファーを意味する。
【００２９】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において、互換的に使用され、それらには抗体の結合特異性を保持するその断片が含まれる。
【００３０】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、その多くが当技術分野において公知である従来の方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を使用して作製される。例えば、コンジュゲートは、ＡＴＲＰイニシエーターにより標的生体分子結合タンパク質を修飾すること、及び触媒の存在下においてモノマーとタンパク質−ＡＴＲＰイニシエーターを反応させることによって、調製することができる。かかる方法は、例えば米国特許第７，７８６，２１３号（その内容全体は参照により本明細書に援用される）中で記載される。所望されるポリマー鎖長は、反応時間を適宜変動させることによって得ることができる。他の重合法及びコンジュゲーション法も公知であり、本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートの調製に使用することができる。
【００３１】
本明細書において使用される時、「刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲート」という用語は、選択的に可溶性（すなわちｐＨ、塩濃度、または温度等の特定の条件のセット下で可溶性）であり、条件（ｐＨ、塩濃度、または温度）の変化に際して不溶性にされる、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを意味する。したがって、刺激応答性コンジュゲートは、特定の条件下の液体中で選択的に可溶化することができ、その液体の異なる条件下で不溶性であり溶液から沈殿する。このプロセスは一般的には可逆的である（すなわち刺激応答性コンジュゲートはその可溶性を支援する条件へ復帰させることによって再可溶化することができる）。「ｐＨ応答性」コンジュゲートまたは「ｐＨ感受性」コンジュゲートは、ｐＨに感受性（すなわちｐＨに基づいて可逆的に可溶性）である。「刺激条件」は、刺激応答性コンジュゲートが応答する条件（ｐＨ、塩濃度または温度等）を指す。
【００３２】
「標的生体分子結合タンパク質」は、標的生体分子へ特異的に結合するタンパク質である。標的生体分子へ優先的または高い親和性で結合し、それについては特異的であるが、他の生体分子へ実質的に結合しないかまたは低親和性でのみ結合する場合、タンパク質は、標的生体分子へ「特異的に結合」する。一実施形態において、標的生体分子結合タンパク質は、他の生体分子への最小の親和性を有するか、またはまったく有していない。一実施形態において、標的生体分子結合タンパク質は、所望されない混入物または不純物（宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、エンドトキシン、ウイルス、タンパク質バリアント、及び／またはタンパク質凝集物等）を結合しないかまたは実質的に結合しない。
【００３３】
「ポリマー−タンパク質コンジュゲート」、「タンパク質−ポリマーコンジュゲート」、「刺激応答性ポリマー−タンパク複合体」、「刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲート」、及び「コンジュゲート」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。同様に、「ポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡ」及び「プロテインＡ−ポリＤＥＡＥＭＡ」という用語は、互換的に使用される。同様の用語は、他のポリマータンパク複合体の記載に使用される。例えば、ポリ−ＤｉＰＡＥＭＡ−プロテインＡ／プロテインＡ−ポリ−ＤＩＰＡＥＭＡ、ポリ−ＤｉＰＡＥＭＡ−コ−ＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡ／プロテインＡ−ポリ−ＤＩＰＡＥＭＡ−コ−ＤＥＡＥＭＡ等という用語は、本明細書において、互換的に使用される。「ｒプロテインＡ」及び「組換えプロテインＡ」という用語も互換的に使用される。「標的生体分子結合タンパク質」及び「結合タンパク質」という用語も互換的に使用される。
【００３４】
刺激応答性ポリマー
本明細書において使用される時、「ポリマー」という用語は、１セットのマクロ分子を含む材料を指す。ポリマー中に含まれるマクロ分子は、同じであるかまたはいくつかの様式で互いとは異なり得る。マクロ分子は、多様な骨格構造のうちの任意のものを有することができ、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含むことができる。特に、マクロ分子は直鎖骨格構造または非直鎖骨格構造を有することができる。非直鎖骨格構造の例には分岐骨格構造が含まれ、それらは、星型分岐構造、櫛型分岐構造、樹状分岐構造、及びネットワーク骨格構造等である。ホモポリマー中に含まれるマクロ分子は典型的には１つのタイプのモノマー単位を含み、一方でコポリマー中に含まれるマクロ分子は典型的には２つの以上タイプのモノマー単位を含む。コポリマーの例には、統計コポリマー、ランダムコポリマー、交互コポリマー、周期コポリマー、ブロックコポリマー、放射状コポリマー、及びグラフトコポリマーが含まれる。
【００３５】
認識できるように、ポリマーの分子量（ＭＷ）は、ポリマーの形成のために使用されるプロセシング条件に依存し得るので、ポリマーは異なる分子量を有する多様な形状で提供され得る。したがって、ポリマーは、特異的な分子量または分子量の範囲を有すると見なされ得る。ポリマーに関して本明細書において使用される時、「分子量（ＭＷまたはＭｗ）」という用語は、数平均分子量、重量平均分子量、またはポリマーのメルトインデックスを指すことができる。
【００３６】
本発明は、それらの環境の変化（刺激）の結果として、特定のポリマーが特性の変化を受けるという事実に少なくとも部分的に基づく。刺激の結果として変化する最も一般的なポリマー特性は可溶性であり、可溶性に関する最も一般的な刺激は温度、塩濃度、及びｐＨ、またはその組み合わせである。一例として、ｐＨ、塩レベルまたは温度が特定の範囲内に維持される限り、ポリマーは溶液で維持され得るが、条件が該範囲の外側に変化させられると直ちに、それは溶液から沈殿するだろう。ポリマーは、可溶性を維持する条件へ戻すことによって、再可溶化することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートは、刺激応答性ポリマー（すなわちコンジュゲートへ全体として刺激応答性を付与する、刺激応答性ポリマー）を含む。本明細書において使用される時、「刺激応答性ポリマー」は、選択的に可溶性（すなわちｐＨ、塩濃度、または温度等の特定の条件のセット下で可溶性）であり、条件（ｐＨ、塩濃度、または温度）の変化に際して不溶性（可逆的に）にされる、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを意味する。したがって、刺激応答性ポリマーは、特定の条件下の液体中で選択的に可溶化することができ、その液体の異なる条件下で不溶性であり溶液から沈殿する。刺激応答性ポリマーは、可溶性を支援する条件へ戻すことによって、再可溶化することができる。「ｐＨ応答性」ポリマーまたは「ｐＨ感受性」ポリマーは、ｐＨに感受性（すなわちｐＨに基づいてまたはｐＨの変化に応答して可逆的に可溶性）である。例えば、ｐＨ応答性ポリマーは酸性ｐＨで可溶性であり、塩基性ｐＨで不溶性であるか、もしくはその逆であり得るか、または中性ｐＨ付近のｐＨの範囲で可溶性であり、酸性及び塩基性のｐＨで不溶性であり得る。
【００３８】
多くの刺激応答性ポリマーが公知であり、もしそれらが標的生体分子結合タンパク質のその標的への結合を妨害せず、他の点では、本発明の方法における使用に好適であるならば、それらを本タンパク質−ポリマーコンジュゲートにおいて使用することができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、刺激応答性ポリマーは、ポリマー分子の正味電荷を減少させること及び／または中和することによって、可溶性と不溶性状態との間でそれらの転移が起こるポリマーである。ｐＨを変化させることによって正味電荷を減少させて、マクロ分子上の電荷を中和し、したがってマクロ分子の親水性を低減する（疎水性を増加させる）ことができる。例えば、メチルメタクリレート（疎水性部分）及びメタクリル酸（カルボキシ基が高ｐＨで脱プロトン化された場合に親水性であるが、カルボキシ基がプロトン化された場合により疎水性である）のコポリマーは、５付近のｐＨへの酸性化によって水溶液から沈殿し、メチルメタクリレート（疎水性部分）とジメチルアミンエチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｈｙｌ）メタクリレート（アミノ基が低ｐＨでプロトン化された場合に親水性であるが、アミノ基が脱プロトン化された場合により疎水性である）とのコポリマーは、低ｐＨで可溶性であるが、弱アルカリ性の条件で沈殿する。下垂（ｐｅｎｄｉｎｇ）カルボキシ基を有する疎水的に修飾されたセルロース誘導体（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート）も、塩基性条件で可溶性であるが、弱酸性媒質において沈殿する。
【００４０】
ｐＨ感受性のポリマーのｐＨ誘導性沈殿は非常に鋭く、０．２〜０．３単位以下のｐＨの変化を要求し得る。ポリマーのｐＨ応答性は、他の官能基（疎水性を増加させる非荷電性糖（より高いｐＨで沈殿をもたらす）等）またはカウンターイオン（低分子量カウンターイオンまたは反対の電荷のポリマー分子（多重錯体）等）の添加によっても修飾することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ポリマー分子の正味電荷は、ポリマー溶液を介してＣＯ２をバブリングしてポリマーをプロトン化することによって、変化させることができる。この方法はポリマー分子の正味電荷を改変するために使用され、したがって、その可溶性が特に限定されることは意味しない。
【００４２】
ｐＨ感受性の可溶性ポリマーの例には、陽イオン高分子電解質及び陰イオン高分子電解質が含まれるが、これらに限定されない。陽イオン高分子電解質は、一般的には塩基性基（例えば−ＮＨ２）を有し、酸性条件に応答し、非限定例は、キトサン、ポリビニルピリジン、第一級アミン含有ポリマー、第二級アミン含有ポリマー、及び第三級アミン含有ポリマーである。陰イオン高分子電解質は、一般的には酸性基（例えば−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ）を有し、塩基性条件に応答し、非限定例には、ポリアクリル酸に加えて、アクリル酸、メタクリル酸及びメチルメタクリレートのコポリマーが含まれる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートのポリマーは、１つまたは複数のｐＨ感受性ポリマー（陰イオン高分子電解質及び／または陽イオン高分子電解質等）を含む。かかるｐＨ感受性ポリマーの例には、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＩＰＡＥＭＡ）のポリマー及び／またはそのコポリマーが、限定されずに含まれる。一実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートのポリマーは、アクリルポリマー、メタクリルポリマー、またはビニルポリマーである。いくつかの実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートにおいて、ポリマーは、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート］、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート］、またはポリ［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート］であるポリマーを含む。いくつかの実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ポリ［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート］（ＤＥＡＥＭＡ）であるポリマーを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、ビニルモノマー（アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡＡｃ）、マレイン酸無水物（ＭＡｎｈ）、及び／またはアミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）等であり、これらに限定されない）に基づく合成ポリマーである。
【００４５】
他の実施形態において、ポリマーは、温度感受性ポリマー（ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−プロピルピペラジン）［ＰＡｃｒＮＰＰ］、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−メチルピペラジン）［ＰＡｃｒＮＭＰ］、及び／またはポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−エチルピペラジン）［ＰＡｃｒＮＥＰ］等）である。
【００４６】
他の実施形態において、ポリマーは、合成ポリマー（ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）［ポリ（ＤＭＥＡＥＭＡ）］、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート）［ポリ（ＤＥＡＥＭＡ）］、ポリ（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート［ポリ（ＤＩＰＡＥＭＡ）］、またはポリ（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート−コ−ポリ（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート［ポリ（ＤＩＰＡＥＭＡ−コ−ＤＥＡＥＭＡ）］）等）である。
【００４７】
一実施形態において、ポリマーは、メタクリル酸及びメタクリレートのランダムコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ  １００、Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＧＭＢＨ）である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、極性第三級アミン官能基を備えた単官能基のアクリレートモノマーに基づく合成ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ジメチルアミノエチルメタクリレートファミリーの第三級アミンの単位の鎖である。
【００４９】
熱感受性ポリマーについて、可逆的な可溶性は、一般的には、温度を増加させることにより誘導される非荷電性ポリマーの疎水性−親水性のバランスの変化によって引き起こされる。非荷電性ポリマーは水分子との水素結合に起因して水中で可溶性である。水素結合の効率は温度の増加につれて低下する。水素結合の効率がマクロ分子の可溶性のために不十分になる場合、ポリマーの相分離が起こる。したがって、スマートポリマーの水溶液の温度が特定の臨界温度（それは多くの場合、転移温度、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）、または曇り点と称される）を越えて上昇された場合、相分離は起こる。ポリマーを実際的には含有しない水相、及びポリマーが豊富な相が形成される。両方の相は、デカント、遠心分離、または濾過によって容易に分離することができる。相転移の温度はポリマー濃度及び分子量に依存する。相分離は完全に可逆的であり、温度が転移温度未満に低減される場合熱感受性ポリマーは水中で溶解する。
【００５０】
特定のポリマー（ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡＭ）、ポリ（Ｎ−置換アクリルアミド）（［ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド）、及びポリ（Ｎアクリロイル−Ｎ’−アルキルピペラジン）］を含む）、及びヒドロキシアルキルセルロース等）は、温度変化の結果として可溶性変化を示すポリマーの例である。他のポリマー（アクリル酸及びメタクリル酸のコポリマー、２−ビニルピリジンまたは４−ビニルピリジン及びキトサンのポリマー及びコポリマー等）は、ｐＨまたは塩の変化の結果として可溶性の変化を示す。他の温度感受性可溶性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、官能化アガロース及び官能化ポリエチレンオキシドの官能性コポリマーを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートにおいて使用されるポリマーは、疎水性である。一実施形態において、ポリマーは支配的な疎水性形質を提示するが、１つまたは複数の親水性部分も含む。したがって、ポリマーの少なくとも一部は、ポリマーを含む水相の調製を可能にするのに十分に親水性であるべきである。一実施形態において、前記１つまたは複数の刺激が適用されるにつれて（例えばｐＨが変化されるにつれて）、ポリマーはより疎水性の立体配座へシフトするだろう。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ｐＨ感受性ポリマーは塩基性条件に応答する（すなわちその可溶性はｐＨの増加に応答して変化する）。一実施形態において、水溶液中のｐＨ感受性ポリマーの可溶性は、より高いｐＨで（例えば塩基性ｐＨで、中性よりも高いｐＨ（すなわち７を超える）で、または約７．５以上のｐＨで、または約８以上のｐＨで）減少する。一実施形態において、ｐＨ感受性ポリマーは、約８以上のｐＨで、約９以上のｐＨで、約９．５以上のｐＨ、または約１０以上のｐＨで沈殿する。いくつかの実施形態において、かかるｐＨ感受性ポリマーは、ｐＨの減少に（例えば酸性ｐＨに、中性よりも低いｐＨ（すなわち７を超える）に、約５以下のｐＨに、約４以下のｐＨに、約３以下のｐＨに、または約３．５のｐＨに）応答して再可溶化される。代替の実施形態において、水溶液中のｐＨ感受性ポリマーの可溶性は、より低いｐＨで（例えばｐＨ４または約４以下で）低下する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲート中のポリマーは、無限数のモノマー単位を含む。他の実施形態において、ポリマーは有限数のモノマー単位からなる。一実施形態において、ポリマーは、約１，０００〜約１，０００，０００Ｄａ、約１，０００〜約２５０，０００Ｄａ（例えば約２，０００〜約３０，０００Ｄａ）の分子量の範囲である。したがって、一実施形態において、ポリマーの分子量は少なくとも約１０００Ｄａである。一実施形態において、ポリマーの分子量は、少なくとも約２００ｋＤ、少なくとも約４００ｋＤ、もしくは少なくとも約６００ｋＤ、及び／または約７００ｋＤａ以下、もしくは約１，０００ｋＤａ以下である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートの分子量は少なくとも約１００ｋＤである。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの分子量は約１００ｋＤ〜約７００ｋＤの範囲である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの分子量は約２００ｋＤ〜約４００ｋＤの範囲である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの分子量は、約２００ｋＤ〜約３００ｋＤ、約１００ｋＤ〜約４００ｋＤ、または約１００ｋＤ〜約３００ｋＤの範囲である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、約２００以上のモノマー単位、約３００以上のモノマー単位、約４００以上のモノマー単位、約５００以上のモノマー単位、約９００以上のモノマー単位、約１０００以上のモノマー単位、約１２００以上のモノマー単位、約１４００以上のモノマー単位、約１６００以上のモノマー単位、または約１８００以上のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、約５０００未満のモノマー単位、約４０００未満のモノマー単位、約３０００未満のモノマー単位、約２０００未満のモノマー単位を含む。一実施形態において、ポリマーは、約２００よりも多いモノマー単位及び約２０００未満のモノマー単位を含む。一実施形態において、ポリマーは、約４００〜約２０００のモノマー単位、約９００〜約２０００のモノマー単位、約１０００〜約２０００のモノマー単位、約１２００〜約１９００のモノマー単位、または約１４００〜約１９００のモノマー単位を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ポリマー鎖の長さは、タンパク質−ポリマーコンジュゲートの機能性に影響し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリマー鎖が長すぎるかまたは短すぎるならば、標的生体分子への結合及び／または刺激応答性は損なわれ得る。言いかえれば、標的生体分子結合能力及び／または刺激応答性（例えばｐＨ感受性）は、いくつかの実施形態において、ポリマー鎖長によって影響を受け得る。したがって、コンジュゲートの所望される特性（すなわち標的生体分子への結合及び刺激応答性）を最大化するように、コンジュゲートまたはポリマーのサイズまたは長さは当業者によって選択されるだろう。いくつかの実施形態において、ポリマーは、標的生体分子への結合の所望される能力もしくはストイキオメトリー及び／または所望される刺激応答性を備えたコンジュゲートを提供するのに十分な数のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、所望される結合能力で標的生体分子へ特異的に結合することができ（例えば１：１よりも高いストイキオメトリーで）、刺激応答性（例えばｐＨ感受性）を保持することができる、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが提供される。
【００５７】
ポリマーは、合成ポリマーまたは天然ポリマーであり得る。本タンパク質−ポリマーコンジュゲート中で使用されるポリマーは、商業的供給源から得ることができるか、または、あるいは、当業者は、従来の方法を使用して、モノマーから好適な応答性ポリマーを容易に合成することができる。「重合」は、化学反応においてモノマー分子を一緒に反応させて、三次元ネットワークまたはポリマー鎖を形成するプロセスである。重合の多くの形式が公知であり、当技術分野において公知であるように、分類される異なる系が存在する。いくつかの実施形態において、ポリマーは原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を使用して合成される。
【００５８】
方法
刺激応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して、生物学的サンプルから標的生体分子を精製する方法が提供される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、単一ステッププロセスとして、またはマルチステップのプロセス中の１つのステップとして、使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法を使用して、標的生体分子を含有する溶液から標的生体分子を単離する。他の実施形態において、本明細書において提供される方法を使用して、所望されない混入物または不純物を除去し、標的生体分子を溶液から精製または実質的に精製する。更なる実施形態において、本方法を使用して、サンプルまたは溶液から所望されない生体分子を除去する。例えば、所望される構成要素（血漿タンパク質等）を精製するために血液または血漿から抗体（ＩｇＧ等）を除去することが所望され得る。本明細書において提供される方法を使用して、リガンドを含む生体分子、すなわち特異的に標的を結合することができる官能基またはリガンドを含む生体分子（親和性リガンドを含有するタンパク質等）も精製または保存することができる。
【００６０】
一実施形態において、本発明に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲートと標的生体分子を含有する生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的生体分子を結合することを可能にし（結合された標的生体分子−コンジュゲート複合体を形成し）、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが生物学的サンプル中で可溶性であるステップと；刺激条件を変化させて、結合された標的生体分子−コンジュゲート複合体を沈殿させるステップと；結合された標的生体分子−コンジュゲート複合体を含有する沈殿物を回収するステップと；コンジュゲートから標的生体分子を放出もしくは解離する条件下で、沈殿させた標的生体分子−コンジュゲート複合体を再可溶化するか、または標的生体分子へのコンジュゲートの結合を破壊する（例えば、再び刺激条件を変化させて、この時は結合された標的生体分子−コンジュゲート複合体を可溶化する）ステップと；タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された標的生体分子を得るステップとを含む、方法が提供される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ｐＨを塩基性条件に増加させて、結合された標的生体分子−コンジュゲート複合体を沈殿させ、沈殿させた標的生体分子−コンジュゲート複合体を酸性溶液中で再可溶化する。いくつかの実施形態において、沈殿させた標的生体分子−コンジュゲート複合体を再可溶化する条件はまた、標的生体分子−コンジュゲート結合を破壊し、標的生体分子−コンジュゲート複合体から標的生体分子を放出する。
【００６２】
一実施形態において、
ａ）本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートと生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的生体分子を結合することを可能にし、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を形成するステップと；
ｂ）サンプルのｐＨを変化させて、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を沈殿させるステップと；
ｃ）沈殿物を回収するステップと；
ｄ）沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を再可溶化し、標的生体分子をそれから解離するステップと；
ｅ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された標的生体分子を得るステップと
を含む、生物学的サンプルから標的生体分子を精製する方法が提供される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは塩基性条件へ応答性である（すなわちステップｂ）においてｐＨを増加させて、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を沈殿させ、ステップｄ）において酸性ｐＨを使用して、沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を再可溶化する）。いくつかの実施形態において、標的生体分子が再可溶化に際して結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体から解離されるように、酸性ｐＨは標的生体分子へのコンジュゲートの結合も破壊する。
【００６４】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、標的生体分子が精製される生物学的サンプル中で可溶性であるべきことが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、例えば、ＡＴＲＰを使用するタンパク質−ポリマーコンジュゲートの合成後に、またはポリマーに依存して、コンジュゲートの生物学的サンプル中での可溶性を保証または促進するために、生物学的サンプルへコンジュゲートを添加する前にコンジュゲートをプロトン化することが必要であるか、または所望され得る。例えば、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを含有する溶液を介してＣＯ２をバブリングしてコンジュゲートをプロトン化し、生物学的サンプル中で可溶性にすることができる。
【００６５】
一旦、コンジュゲートが生物学的サンプルへ導入されたならば、それは溶液中の標的化された生体分子を結合するだろう。例えば、プロテインＡ−ポリマーコンジュゲートは、溶液中のモノクローナル抗体のＦｃ領域へ標的化されており、高特異性で結合する。結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体の回収及び精製は、刺激応答性ポリマーが感受性のある条件の変化（すなわちｐＨ、温度または塩濃度等の刺激条件の変化）によって起こる。いくつかの実施形態において、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体は、ｐＨを、例えば塩基性ｐＨへ、中性よりも高いｐＨ（すなわち７を超える）へ、または約８以上のｐＨへ増加させることによって、溶液から沈殿される。いくつかの実施形態において、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を含有するサンプルのｐＨは、約８以上、約９以上、約９．５以上、または約１０以上に増加される。ｐＨは、塩基、塩基性バッファーまたは塩基性溶液の添加によって増加させることができ、その多くのものが当技術分野において公知である。非限定例には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び高ｐＨホウ酸バッファー（例えばｐＨ１０のホウ酸バッファー）が含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、使用されている特定のタンパク質−ポリマーコンジュゲートに依存して、そして理論により限定されることは意図しないが、ｐＨの増加は、ポリマー鎖を脱プロトンさせることによってポリマー化学におけるスイッチを誘導することができ、これは疎水構造を生成し、次いでそれは相分離（すなわちコンジュゲートを不溶性にし、その結果溶液から沈殿させる）を駆動することができると考えられている。いくつかの実施形態において、相分離は、非常に迅速に（例えば数秒内に）起こり得る。
【００６７】
結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体の沈殿に使用される刺激条件（温度、ｐＨ及び塩濃度等）の変化は、標的生体分子へのコンジュゲートの結合に悪影響を与えないことが所望されることは理解されるだろう。いくつかの実施形態において、標的生体分子へのコンジュゲートの結合は、刺激条件の変化によって（例えばｐＨの増加によって）影響されない。いくつかの実施形態において、標的生体分子へのコンジュゲートの結合は、刺激条件の変化によって（例えばｐＨの増加によって）増加または強化される。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは塩基性ｐＨで標的生体分子へ結合し、酸性ｐＨで（例えば約７未満のｐＨで、約６未満のｐＨで、約５未満のｐＨで、約４未満のｐＨ、または約３未満のｐＨで）標的生体分子へ結合しない。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは標的生体分子へ結合しない（すなわち標的生体分子は、約３〜約４のｐＨで、約ｐＨ３．５で、または約４以下のｐＨで、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体から解離される）。
【００６８】
例えば、プロテインＡへのＩｇＧの結合はｐＨ感受性であり、塩基性条件へのｐＨの増加はプロテインＡとＩｇＧとの間の結合を強化する。したがって、抗体結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物であり、標的生体分子が抗体（ＩｇＧ等）である場合の複数の実施形態において、本方法は、高ｐＨでの相分離の間の抗体損失を防止するという利点を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、不溶性の結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体は、沈殿後に回収される。例えば、溶液を遠心分離して、不溶性の結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体をペレットにすることができる。他の同様の回収方法は当技術分野において公知であり、使用することができる。典型的には、液体相（例えば上清）は廃棄される。いくつかの実施形態において、不溶性沈殿を高ｐＨバッファー（０．１ＭのＮａＯＨ等）中で洗浄して、液体相または上清に由来する残存タンパク質及び混入物を除去する。
【００７０】
一旦、不溶性の結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が回収されたならば、精製または実質的に精製された標的生体分子は、不溶性の結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体画分を再可溶化し、タンパク質−ポリマーコンジュゲートから標的生体分子を解離することによって得られる。例えば、いくつかの実施形態において、不溶性画分は、コンジュゲートへの標的生体分子結合を破壊する条件下で再可溶化され、それによって、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体から標的生体分子を解離または溶出する。例えば、標的生体分子結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物であり、標的生体分子が抗体（ＩｇＧ等）である場合の複数の実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを可溶化するだけでなく、プロテインＡ−ＩｇＧ結合を破壊することによって抗体へのその結合を破壊する、低ｐＨバッファー（例えばｐＨ３．５のバッファー）中で、不溶性画分は再可溶化される。
【００７１】
一旦、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が再可溶化及び解離されたならば、精製された標的生体分子は溶液から単離される。いくつかの実施形態において、このステップは、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを溶液から除去することによって遂行される。例えば、いくつかの実施形態において、溶液を、タンパク質−ポリマーコンジュゲート上のポリマー鎖を結合するイオン交換カラムを介して通過させる一方で、標的生体分子が、そこで精製された画分の中へと通り抜けることを可能にする。他の実施形態において、遠心濾過方法を使用して、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去するか、または標的生体分子を分離する。例えば、コンジュゲートを保持する一方で標的生体分子がフロースルーするような分子量カットオフを有する遠心用フィルターを使用して、フロースルーにおいて、精製されたかまたは実質的に純粋である標的生体分子の収集を可能にすることができる。多くの同様の方法が当技術分野において公知であり、タンパク質−ポリマーコンジュゲートからの標的生体分子の分離に使用することができる。
【００７２】
一旦、精製された標的生体分子がタンパク質−ポリマーコンジュゲートから分離されたならば、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは再使用することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、再使用のための回収及び調製前に、高ｐＨ洗浄（０．１ＭのＮａＯＨ等）で随意に洗浄される。かかる洗浄物は、例えば中性ｐＨバッファーを使用して、またはＣＯ２中でバブリングすることによって、コンジュゲートを再使用の前に再可溶化することを必要とし得る。一実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはイオン交換カラムから回収される。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートを保持する一方で標的生体分子が通り抜けることを可能にするフィルターによる遠心濾過を使用して、回収される。一旦回収されたならば、タンパク質−ポリマーは、必要であるかまたは所望されるならば再可溶化される。例えば、コンジュゲートは、ＣＯ２のバブリングによって再可溶化することができ、必要であるかまたは所望されるならば、次いで更なる精製サイクルに再使用される。したがって、いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは再使用される（すなわち後続する標的生体分子の精製または分離の手順においてリサイクルされる）。
【００７３】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法の利点は、標的生体分子結合能力の有意な損失なしにタンパク質−ポリマーコンジュゲートを再使用し、より高い効率及び費用の低減を提供する性能である。
【００７４】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、１：１を超える、または約２：１、または約３：１、または約４：１の結合のストイキオメトリーで、標的生体分子を結合する。本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートのその標的生体分子への結合のストイキオメトリーは、固体相よりも（すなわち固体支持体に添付された場合よりも）溶液中でより高い。
【００７５】
本明細書において記載される方法は、複数の因子（使用されている特定のコンジュゲート、コンジュゲート中のポリマー及び標的生体分子結合タンパク質の特性、生物学的サンプルのタイプ、精製される特定の標的生体分子等）に基づいて、変動し得ることを理解すべきである。当業者は、当分野における一般的な知識を使用して、かかる因子に基づいてステップ及び条件を必要に応じて変動させるだろう。
【００７６】
図２及び３中で、本発明の精製法の例示的な実施形態を図示する図解の図面が示される。これらの図面はもっぱら本発明の方法を図示することを意図し、多少なりとも方法を限定するとして解釈されるべきでない。
【００７７】
本明細書において提供される方法を使用して、多様な生物学的サンプル（細胞培養培地、培養液、抽出液、血液、血漿、血清サンプル、腹水、及び上清が限定されずに含まれる）から標的生体分子を単離することができる。一実施形態において、標的生体分子含有生物学的サンプルは培養液を含む。この実施形態において、標的生体分子は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、細胞培養培地の構成要素（消泡剤及び抗生物質等）、及び／または製品関連の不純物（誤って折り畳まれた種及び凝集物等）から精製することができる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、タンパク質−ポリマーコンジュゲートとの接触前に機械的濾過へかけられ、したがってサンプルは清澄にした細胞培養ブロスである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは固体及び不溶性成分を除去するように、タンパク質−ポリマーコンジュゲートとの接触前に遠心分離へさらされ、したがってサンプルは上清である。標的生体分子は様々な生物学的サンプルから回収され得ることを理解すべきであり、生物学的サンプルが限定されることは意図されない。
【００７８】
本明細書において提供される方法を使用して、広範囲の標的生体分子を単離することができる。標的生体分子の非限定例には、タンパク質（抗体等）；ペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド等）；核酸（ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ等）；ウイルス（ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルス等）；細胞（原核生物または真核生物細胞等）；細胞内小器官；ポリサッカライド；リポサッカライド；脂質；及び炭水化物；加えて、その断片、誘導体、バリアント、類似体、及び機能的等価物が含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、標的生体分子は、標的生体分子結合タンパク質を特異的に結合することができるリガンドまたは官能基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、標的生体分子はビオチンを含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子は、親和性タグ（キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、カルモデュリン結合タグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等）を含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子は、抗エピトープタグ（Ｖ５タグ、ＭｙｃタグまたはＨＡタグ等）を含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子は蛍光性タグ（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）を含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子は、ポリ（ヒスチジン）含有融合タンパク質へ特異的に結合する金属イオンを含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子は、特異的な受容体または担体タンパク質を結合するホルモンまたはビタミンを含む。多くの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質は公知であり、したがって、標的生体分子には、タンパク質−ポリマーコンジュゲート中に含まれる特異的な結合タンパク質によって結合される特異的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が含まれ得る。
【００８０】
適切な結合タンパク質が標的生体分子に基づいて選択されるであろうことを理解すべきである。例えば、標的生体分子がビオチンを含む場合の複数の実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ストレプトアビジン、アビジンまたは別のビオチン結合タンパク質を含むだろう。
【００８１】
抗体を精製する方法
特定の実施形態において、標的生体分子は抗体またはその断片であり、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは抗体結合タンパク質を含む。
【００８２】
本明細書において使用される時、「抗体結合タンパク質」という用語は、結合メカニズムにかかわらず、抗体またはその断片へ特異的に結合するタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質はＦｃ結合タンパク質を含む。本明細書において使用される時、「Ｆｃ結合タンパク質」という用語は、抗体の結晶化可能な部分（Ｆｃ）へ結合することができるタンパク質を意味し、それらには、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはその組み合わせ、またはその機能的等価物（該結合特性を維持しているその断片または遺伝学的誘導体または融合タンパク質等）が含まれる。
【００８３】
プロテインＡは、もともと細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの細胞壁中で見出された４２ｋＤの表面タンパク質である。それは、多くの哺乳類種（ヒト、マウス及びウサギ等）のＩｇＧからのＦｃ領域と相互作用できる５つの高親和性ＩｇＧ結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）を含有する。それは、大部分の免疫グロブリンのＦｃ領域、及びヒトＶＨ３ファミリーの事例においてＦａｂ領域内の重鎖も結合する。プロテインＡのＺドメインは、ＩｇＧ結合ドメインＢの操作された類似体である。Ｚドメインは、逆平行の３つのヘリックス束にアレンジされる３つのαヘリックスを含有する。
【００８４】
プロテインＧは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のＣ群及びＧ群において発現される免疫グロブリン結合タンパク質であり、プロテインＡに酷似するが、異なる特異性を備えている。それは、６５ｋＤ（Ｇ１４８プロテインＧ）及び５８ｋＤ（Ｃ４０プロテインＧ）の細胞表面タンパク質であり、多くの哺乳類種のＩｇＧからのＦａｂ領域及びＦｃ領域への結合を介して抗体を精製することに適用される。しかしながら、生来の分子はアルブミンも結合し、血清アルブミンは抗体源の主要な混入物であるので、アルブミン結合部位は、抗体精製のために使用されるプロテインＧの多くの組換え型から除去されている。
【００８５】
プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡ及びプロテインＧの両方のＩｇＧ結合ドメインを組み合わせた組換え融合タンパク質である。例えば、プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡからの４つ及びプロテインＧからの２つのＦｃ結合ドメインを含み得る。プロテインＡ／ＧはヒトＩｇＧのすべてのサブクラスへ結合し、そのことにより、プロテインＡ／Ｇは、サブクラスが決定されていないポリクローナルまたはモノクローナルのＩｇＧ抗体の精製に有用になる。加えて、それは、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及び（より少ない程度で）ＩｇＤへ結合する。プロテインＡ／Ｇは、マウスＩｇＧのすべてのサブクラスへも結合する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、非哺乳類源（Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞等）において産生された組換えプロテインＡを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、哺乳類源（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）において産生された組換えプロテインＡを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＧを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、哺乳類源において産生された組換えプロテインＧを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、非哺乳類源または哺乳類源において産生された組換えプロテインＡ／Ｇを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質の機能的等価物が使用される。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合特性を保持するプロテインＡまたはプロテインＧの断片、誘導体、バリアント、類似体、または融合タンパク質を使用することができる。これらのＦｃ結合特性の多くの組換え型または突然変異型が公知であるかまたは作製することができ、Ｆｃ結合タンパク質の任意のかかる断片、誘導体、バリアント、または融合タンパク質（Ｆｃ結合タンパク質の抗体結合特性を保持する）を包含することが意図される。「機能的等価物」は、抗体精製の本方法における使用のための、十分な抗体結合親和性、特異性及び／または選択性を維持するＦｃ結合タンパク質の断片、誘導体、バリアント、類似体、または融合タンパク質を意味する。機能的等価物が所望される標的抗体の精製のための本方法における使用のために十分である限り、機能的等価物の抗体結合特性は、Ｆｃ結合タンパク質の特性と同一である必要がない。Ｆｃ結合タンパク質は、タンパク質分析方法における機能性を可能にするようにも修飾され得る。例えば、Ｆｃ結合タンパク質は、免疫アッセイ（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）における使用のために、ビオチン化、ペルオキシダーゼにコンジュゲート、またはアルカリホスファターゼにコンジュゲートされ得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＡドメインのモノマー、ダイマーまたはマルチマーを含む。例えば、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＡからの１つまたは複数のドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを含み得る。一実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＡからのドメインＢ及び／またはドメインＣのうちの１つまたは複数を含む。一実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、ドメインＢの突然変異型であるプロテインＺを含む（例えば米国特許第５，１４３，８４４号を参照）。別の実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、４つのＩｇＧ結合部位を備えた組換えプロテインＡを含む。
【００８９】
代替の実施形態において、本タンパク質−ポリマーコンジュゲートの抗体結合タンパク質は、カッパ（κ）軽鎖結合タンパク質（プロテインＬまたはその機能的等価物等）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＬを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、哺乳類源において産生された組換えプロテインＬを含む。
【００９０】
プロテインＬは、細菌種Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓの表面から最初に単離され、軽（Ｌ）鎖相互作用を介して免疫グロブリンを結合することが見出された。プロテインＡ及びプロテインＧ（免疫グロブリンのＦｃ領域へ結合する）とは異なり、プロテインＬは、カッパ軽鎖を含有する抗体のみに結合する。しかしながら、重鎖の一部は結合相互作用に関与しないので、プロテインＬは、プロテインＡまたはプロテインＧよりも幅広い範囲の抗体クラスを結合する。プロテインＬは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤが含まれるすべての抗体クラスの代表に結合する。単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＦａｂ断片もプロテインＬへ結合する。プロテインＬが、カッパ軽鎖の特定のサブタイプの結合でのみ効果的であることが指摘されるべきである。例えば、それはヒトＶκＩ、ＶκＩＩＩ及びＶκＩＶサブタイプを結合するが、ＶκＩＩサブタイプを結合しない。マウス免疫グロブリンの結合はＶκＩ軽鎖を有するものに制限される。プロテインＬは、腹水または細胞培養上清からのカッパ軽鎖を有することが公知のモノクローナル抗体の精製のために多くの場合使用され、プロテインＬはウシ免疫グロブリン（多くの場合血清添加物として培地中に存在する）を結合しないので、培養液上清からのＶＬκ含有モノクローナル抗体の精製のために非常に有用であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、非組換えＦｃ結合タンパク質（すなわち細菌源から単離された生来のタンパク質）を含む。一実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから単離された生来のプロテインＡを含む。別の実施形態において、Ｆｃ結合タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌から単離された生来のプロテインＧを含む。
【００９２】
プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ及びプロテインＬはすべて、哺乳類の免疫グロブリンへ結合するが、それらの結合特性は、種及びＩｇＧのサブクラス中でも異なることが公知である。例えば、プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４へ強く結合するが、ＩｇＧ３へは結合しない。プロテインＡは、時にはウサギ、ブタ、イヌ及びネコのＩｇＧに好ましいが、プロテインＧは、より広い範囲のマウス及びヒトのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）について、より良好な結合能力を有し得る。プロテインＡ／Ｇは、時にはウサギ、マウス、ヒト及び他の哺乳類のサンプルからの最も広い範囲のＩｇＧサブクラスを結合すると判断される。カッパ軽鎖がすべてのクラスの免疫グロブリン（すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤ）のメンバーにおいて存在するので、プロテインＬはこれらの異なるクラスの抗体を精製することができる。しかしながら、適切なカッパ軽鎖を持つ各々のクラス内の抗体のみが結合するだろう。したがって、特定の抗体結合タンパク質が特定の抗体の精製のために効果的かどうかを決定するために、時には経験的な試験が要求され得る。
【００９３】
一般に、多くの特異的な抗体結合タンパク質が公知であり、もしそれらがポリマー及び／またはコンジュゲートの刺激応答性（例えばｐＨ感受性）を妨害せず、他の点では、本発明の方法における使用に好適ならば、それらを本タンパク質−ポリマーコンジュゲートにおいて使用することができる。当業者は、公知の技法及びタンパク質の抗体結合特性に関する利用可能な情報を使用して、特定の抗体の精製に適切なタンパク質を選択するだろう。抗体結合タンパク質の選択に好適な方法は当業者に周知である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性でＩｇＧへ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、齧歯類、霊長類、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタから選択される哺乳類）を起源とする抗体へ、またはニワトリを起源とする抗体へ、結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、培養細胞（ハイブリドーマ等）を起源とする抗体へ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、ヒト抗体またはヒト化抗体へ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、モノクローナル抗体へ結合する。他の実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、ポリクローナル抗体へ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高親和性で及び／または特異性で、キメラ抗体へ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、組換え抗体へ結合する。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、高い親和性で及び／または特異性で、単一鎖抗体へ結合する。すべての事例において、抗体結合タンパク質が、抗体へまたは所望される機能性を保持するその断片へ結合し得ることを理解すべきである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を結合しないかまたは実質的に結合しない。いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質は、所望もしくは標的化された抗体以外の細胞培養または抽出液中のタンパク質を結合しないかもしくは実質的に結合しない、及び／または所望されない混入物（ＨＣＰ、核酸、エンドトキシン、ウイルス、タンパク質バリアント、及び／またはタンパク質凝集物等）を結合しないかもしくは実質的に結合しない。
【００９６】
一実施形態において、本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ジメチルアミノエチルメタクリレートファミリーの第三級アミンの単位のポリマー鎖へコンジュゲートした、４つのＩｇＧ結合部位を備えた組換えプロテインＡリガンドを含む。
【００９７】
したがって、いくつかの実施形態において、標的生体分子は抗体である。かかる実施形態において、コンジュゲートは、刺激応答性ポリマーへコンジュゲートされた抗体結合タンパク質を含む。
【００９８】
免疫系は、細菌、寄生生物、真菌、ウイルスの感染、及び腫瘍細胞の増殖から、身体を集合的に保護する多くの相互依存の細胞タイプから構成される。感染または免疫付与によって攻撃接種された場合に、Ｂ細胞は、異種の侵入物へ結合する抗体と呼ばれるタンパク質を産生するように刺激される。抗体と抗原との間の結合事象は、ファゴサイトーシスまたは補体系の活性化経由での破壊のために異種の侵入物をマークする。異なる５つのクラスの抗体または免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）が存在する。それらは生理的役割だけでなく構造でも異なる。構造的な観点から、ＩｇＧ抗体は、恐らく成熟免疫応答における支配的な役割を果たすので、広汎に研究された特定のクラスの免疫グロブリンである。
【００９９】
免疫グロブリンの生物学的活性は、ヒト及び獣医学分野の診断、健康管理及び治療部門における範囲の異なる適用で今日利用されている。実際、モノクローナル抗体及び組換え抗体コンストラクトは、臨床試験において現在調査され、治療剤及び診断剤としてＦＤＡの承認を受ける最大のクラスのタンパク質になった。
【０１００】
一般的に、抗体の製作は、（１）宿主細胞中での抗体の発現、続いて（２）細胞上清からの抗体の精製の主要な２つのステップを包含する。第１のステップは、バイオリアクター中で所望される宿主細胞を増殖して抗体の発現を達成することを包含する。この目的のために使用される株化細胞のいくつかの例には、哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）、細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等）、及び昆虫細胞が含まれる。一旦、タンパク質が所望されるレベルで発現されたならば、タンパク質は宿主細胞から取り出され、収穫される。懸濁粒子（細胞、細胞断片、脂質及び他の不溶物質等）は、典型的には、濾過または遠心分離によってタンパク質含有サンプルから除去され、溶液中で対象となる抗体に加えて他の可溶性不純物を含有する、清澄にした液体または上清をもたらす。免疫グロブリンの単離のための他の従来の方法は、複数のクロマトグラフィーステップ（親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー等）を包含する。
【０１０１】
モノクローナル抗体を含む免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）について、プロテインＡは大部分のサブクラスを結合する選択的親和性リガンドである（例えばＢｏｙｌｅ，Ｍ．Ｄ．Ｐ．ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：６９７を参照）。プロテインＧはＩｇＧについての別の親和性リガンドである（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２）。プロテインＡ及びプロテインＧの両方は２つ以上のＩｇＧを結合することができる。一旦、多孔性クロマトグラフィー支持体（樹脂等）、膜または他のメディアの上へ固定化されたならば、両者は、ポリクローナルＩｇＧまたはモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の精製及び商業的な産生に有用である。プロテインＡはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからその生来型で単離されるか、または例えばＥ．ｃｏｌｉ中で組換えにより産生され得る。プロテインＡの多くの修飾型及び／または組換え型が記載されている（例えば米国特許第５，１５１，３５０号；米国特許第５，０８４，５５９号；米国特許第６，３９９，７５０号；米国特許第７，８３４，１５８号を参照）。システイン残基を含むプロテインＡリガンドも公知である（例えば米国特許第５，０８４，５５９号；米国特許第６，３９９，７５０号を参照）。システインアミノ酸の追加は、ベースマトリックスまたは樹脂へのリガンドのカップリングを促進する。プロテインＡのＢドメインへの修飾も記載されている（例えば米国特許第７，８３４，１５８号を参照）。
【０１０２】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びプロテインＧ親和性クロマトグラフィーは、主に使用が容易であること及び高純度が得られること起因して、免疫グロブリンの単離及び精製のための、特にモノクローナル抗体の単離のための、ポピュラーで広く普及した方法である。特に、プロテインＡベースの親和性クロマトグラフィーは、抗体の工業的製造において広く使用される。しかしながら、既存のプロテインＡクロマトグラフィー樹脂は高価であり、酸性条件またはアルカリ性条件下での（例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）による）苛酷な洗浄及び再チャージ技法を多くの場合要求する。典型的には、反復する浄化サイクルへの親和性クロマトグラフィーマトリックスの曝露は、標的分子のためのマトリックスの結合能力の有意な消失を経時的にもたらし、プロセスを通じてより高い量の使用が要求される。このことは、長いだけでなくより高価になる精製プロセスをもたらすので、非経済的であり所望されない。
【０１０３】
更に、固相における固定化プロテインＡの結合能力は、自由溶液中でのプロテインＡの結合能力と比較して大幅に低減され、１グラムの回収抗体あたりの高い量のプロテインＡの使用が要求される。これは、２０ｋｇを超える総産物タンパク質の量をもたらすことができる高力価発酵バッチで、１０，０００〜２０，０００リットルのスケールのバイオリアクター中での哺乳類細胞の発酵を包含するモノクローナル抗体のための現在の産生方法を考慮して、特に不利である。１バッチあたりの総タンパク質の増加は、プロテインＡカラムの結合能力に対して需要増加を課す。
【０１０４】
したがって一実施形態において、本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して抗体を精製する方法が、本明細書において提供される。固定化リガンドと標的抗体との間の結合反応のための反応動態及び平衡定数は、多くの場合自由溶液中での挙動とは非常に異なることが指摘される。リガンド間の立体障害に加えて、カラムを介するタンパク質拡散に対する固定マトリックス微小環境の有意な効果は、固相アフィニティーカラムの結合能力を低減することが公知である。したがって、ＩｇＧ分子についての固定化プロテインＡの結合ストイキオメトリーは、およそ１：１であるが、自由溶液中のプロテインＡとＩｇＧの結合ストイキオメトリーは、最大３．９に達し得る。したがって、水相ベースの戦略または溶液ベースの戦略は、結合能力の改善を提供することが予想される。
【０１０５】
したがって、いくつかの実施形態において、現在使用されているプロテインＡ／抗体が固定マトリックスへ結合される固相クロマトグラフィー方法とは対照的な、溶液ベースのプロセス（例えば水相ベース）を使用する生物学的サンプルからの抗体の精製の方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、したがって、本明細書において提供される抗体精製法の利点は、収率の改善及び／または費用の低減であり、それは、少なくとも部分的に、自由に拡散できるプロテインＡリガンドの使用（１グラムの回収抗体あたりより少ないプロテインＡの使用を意味する）に起因する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体精製法の利点は、高収率であり、それは、少なくとも部分的に、自由に拡散できるプロテインＡリガンドの使用（固相方法と比較して、プロテインＡの結合能力（例えばプロテインＡのＩｇＧへの結合ストイキオメトリー）を増加させる）に起因する。
【０１０６】
一実施形態において、本発明に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲートと標的抗体を含有する生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的抗体を結合することを可能にし（結合された抗体−コンジュゲート複合体を形成し）、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが生物学的サンプル中で可溶性であるステップと；刺激条件を変化させて、結合された抗体−コンジュゲート複合体を沈殿させるステップと；結合された抗体−コンジュゲート複合体を含有する沈殿物を回収するステップと；コンジュゲートから抗体を放出もしくは解離する条件下で、沈殿させた抗体−コンジュゲート複合体を再可溶化するか、または抗体へのコンジュゲートの結合を破壊する（例えば、再び刺激条件を変化させて、この時は結合された抗体−コンジュゲート複合体を可溶化する）ステップと；タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された抗体を得るステップとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｐＨを塩基性条件に増加させて、結合された抗体−コンジュゲート複合体を沈殿させ、沈殿させた抗体−コンジュゲート複合体を酸性溶液中で再可溶化する。いくつかの実施形態において、沈殿させた抗体−コンジュゲート複合体を再可溶化する条件はまた、抗体−コンジュゲート結合を破壊し、抗体−コンジュゲート複合体から抗体を放出する。
【０１０７】
一実施形態において、
ａ）本発明のタンパク質−ポリマーコンジュゲートと生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが抗体を結合することを可能にし、結合されたコンジュゲート−抗体複合体を形成するステップと；
ｂ）サンプルのｐＨを変化させて、結合されたコンジュゲート−抗体複合体を沈殿させるステップと；
ｃ）沈殿物を回収するステップと；
ｄ）沈殿させた結合されたコンジュゲート−抗体複合体を再可溶化し、抗体をそれから解離するステップと；
ｅ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された抗体を得るステップと
を含む、生物学的サンプルから抗体を精製する方法が提供される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは塩基性条件へ応答性である（すなわちステップｂ）においてｐＨを増加させて、結合されたコンジュゲート−抗体複合体を沈殿させ、ステップｄ）において酸性ｐＨを使用して、沈殿させた結合されたコンジュゲート−抗体複合体を再可溶化する）。いくつかの実施形態において、抗体が再可溶化に際して結合されたコンジュゲート−抗体複合体から解離されるように、酸性ｐＨは抗体へのコンジュゲートの結合も破壊する。
【０１０９】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、抗体が精製される生物学的サンプル中で可溶性であるべきことが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、例えば、ＡＴＲＰを使用するタンパク質−ポリマーコンジュゲートの合成後に、またはポリマーに依存して、コンジュゲートの生物学的サンプル中での可溶性を保証または促進するために、生物学的サンプルへコンジュゲートを添加する前にコンジュゲートをプロトン化することが必要であるか、または所望され得る。例えば、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを含有する溶液を介してＣＯ２をバブリングしてコンジュゲートをプロトン化し、生物学的サンプル中で可溶性にすることができる。
【０１１０】
一旦、コンジュゲートが生物学的サンプルへ導入されたならば、それは溶液中の標的化された抗体を結合するだろう。例えば、プロテインＡ−ポリマーコンジュゲートは、溶液中のモノクローナル抗体のＦｃ領域へ標的化されており、高特異性で結合する。結合されたコンジュゲート−抗体複合体の回収及び精製は、刺激応答性ポリマーが感受性のある条件の変化（すなわちｐＨ、温度または塩濃度等の刺激条件の変化）によって起こる。いくつかの実施形態において、結合されたコンジュゲート−抗体複合体は、ｐＨを、例えば塩基性ｐＨへ、中性よりも高いｐＨ（すなわち７を超える）へ、または約８以上のｐＨへ増加させることによって、溶液から沈殿される。いくつかの実施形態において、結合されたコンジュゲート−抗体複合体を含有するサンプルのｐＨは、約８以上、約９以上、約９．５以上、または約１０以上に増加される。ｐＨは、塩基、塩基性バッファーまたは塩基性溶液の添加によって増加させることができ、その多くのものが当技術分野において公知である。非限定例には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び高ｐＨホウ酸バッファー（例えばｐＨ１０のホウ酸バッファー）が含まれる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、使用されている特定のタンパク質−ポリマーコンジュゲートに依存して、そして理論により限定されることは意図しないが、ｐＨ中の増加は、ポリマー鎖を脱プロトンさせることによってポリマー化学におけるスイッチを誘導することができ、これは疎水構造を生成し、次いでそれは相分離（すなわちコンジュゲートを不溶性にし、その結果溶液から沈殿させる）を駆動することができると考えられている。いくつかの実施形態において、相分離は、非常に迅速に（例えば数秒内に）起こり得る。
【０１１２】
結合されたコンジュゲート−抗体複合体の沈殿に使用される刺激条件（温度、ｐＨ及び塩濃度等）の変化は、抗体へのコンジュゲートの結合に悪影響を与えないことが所望されることは理解されるだろう。いくつかの実施形態において、抗体へのコンジュゲートの結合は、刺激条件の変化によって（例えばｐＨの増加によって）影響されない。いくつかの実施形態において、抗体へのコンジュゲートの結合は、刺激条件の変化によって（例えばｐＨの増加によって）増加または強化される。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは塩基性ｐＨで抗体へ結合し、酸性ｐＨで（例えば約７未満のｐＨで、約６未満のｐＨで、約５未満のｐＨで、約４未満のｐＨ、または約３未満のｐＨで）抗体へ結合しない。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは抗体へ結合しない（すなわち抗体は、約３〜約４のｐＨで、約ｐＨ３．５で、または約４以下のｐＨで、結合されたコンジュゲート−抗体複合体から解離される）。
【０１１３】
例えば、プロテインＡへのＩｇＧの結合はｐＨ感受性であり、塩基性条件へのｐＨ中の増加はプロテインＡとＩｇＧとの間の結合を強化する。したがって、抗体結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物であり、標的抗体がＩｇＧである場合の複数の実施形態において、本方法は、高ｐＨで相分離の間の抗体損失を防止するという利点を有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、不溶性の結合されたコンジュゲート−抗体複合体は、沈殿後に回収される。例えば、溶液を遠心分離して、不溶性の結合されたコンジュゲート−抗体複合体をペレットにすることができる。他の同様の回収方法は当技術分野において公知であり、使用することができる。典型的には、液体相（例えば上清）は廃棄される。いくつかの実施形態において、不溶性沈殿を高ｐＨバッファー（０．１ＭのＮａＯＨ等）中で洗浄して、液体相または上清に由来する残存タンパク質及び混入物を除去する。
【０１１５】
一旦、不溶性の結合されたコンジュゲート−抗体複合体が回収されたならば、精製された抗体は、不溶性の結合されたコンジュゲート−抗体複合体画分を再可溶化し、タンパク質−ポリマーコンジュゲートから抗体を解離することによって得られる。例えば、いくつかの実施形態において、不溶性画分は、コンジュゲートへの抗体結合を破壊する条件下で再可溶化され、それによって、結合されたコンジュゲート−抗体複合体から抗体を解離または溶出する。例えば、抗体結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物であり、抗体がＩｇＧである場合の複数の実施形態において、不溶性画分は、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを可溶化するだけでなく、プロテインＡ−ＩｇＧ結合を破壊することによって抗体へのその結合を破壊する、低ｐＨバッファー（例えばｐＨ３．５のバッファー）中で再可溶化される。
【０１１６】
一旦、結合されたコンジュゲート−抗体複合体が再可溶化及び解離されたならば、精製された抗体は溶液から単離される。いくつかの実施形態において、このステップは、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを溶液から除去することによって遂行される。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲート上のポリマー鎖を結合する一方で、抗体が、そこで精製された画分の中へと通り抜けることを可能にする、イオン交換カラムを介して、溶液を通過させる。他の実施形態において、遠心濾過方法を使用して、タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去するか、または抗体を分離する。例えば、コンジュゲートを保持する一方で抗体がフロースルーするような分子量カットオフを備えた濾過膜を有する遠心用フィルターまたはタンジェンシャルフロー濾過ユニットを使用して、フロースルー中の精製された抗体の収集を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、このステップは、酸性ｐＨで沈殿できるタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用すること及び濾過の遠心分離によってこのようにして得られた固体を溶液から除去することによって遂行される。多くの同様の方法が当技術分野において公知であり、タンパク質−ポリマーコンジュゲートからの抗体の分離に使用することができる。
【０１１７】
一旦、精製された抗体がタンパク質−ポリマーコンジュゲートから分離されたならば、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは再使用することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、再使用のための回収及び調製前に、高ｐＨ洗浄（０．１ＭのＮａＯＨ等）で随意に洗浄される。かかる洗浄物は、例えば中性ｐＨバッファーを使用して、またはＣＯ２中でバブリングすることによって、再使用の前にコンジュゲートを再可溶化することを必要とし得る。一実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはイオン交換カラムから回収される。いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートを保持する一方で抗体が通り抜けることを可能にするフィルターによる遠心濾過を使用して、回収される。一旦回収されたならば、タンパク質−ポリマーは、必要であるかまたは所望されるならば再可溶化される。例えば、コンジュゲートは、ＣＯ２のバブリングによって再可溶化することができ、必要であるかまたは所望されるならば、次いで更なる精製サイクルに再使用される。したがって、いくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは再使用される（すなわち後続する抗体の精製手順においてリサイクルされる）。
【０１１８】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法の利点は、抗体結合能力の有意な損失なしにタンパク質−ポリマーコンジュゲートを再使用し、より高い効率及び費用の低減を提供する性能である。
【０１１９】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、１：１を超える、または約２：１、または約３：１、または約４：１の結合のストイキオメトリーで、標的抗体を結合する。
【０１２０】
本明細書において記載される方法は、複数の因子（使用されている特定のコンジュゲート、コンジュゲート中のポリマー及び抗体結合タンパク質の特性、生物学的サンプルのタイプ、精製される抗体のタイプ等）に基づいて、変動し得ることを理解すべきである。当業者は、当分野における一般的な知識を使用して、かかる因子上基づいてステップ及び条件を必要に応じて変動させるだろう。
【０１２１】
図２及び３中で、本発明の精製法の例示的な実施形態を図示する図解の図面が示される。これらの図面はもっぱら本発明の方法を図示することを意図し、多少なりとも方法を限定するとして解釈されるべきでない。
【０１２２】
本明細書において提供される方法を使用して、任意の種類のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（限定されずに、哺乳類宿主（マウス、齧歯類、霊長類及びヒト等）を起源とする抗体、または培養細胞（ハイブリドーマまたは哺乳類細胞発現系等）を起源とする抗体等）を精製することができる。一実施形態において、精製された抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。一実施形態において、精製された抗体はキメラ抗体である。一実施形態において、精製された抗体は組換え抗体である。一実施形態において、精製された抗体は治療用抗体である。一実施形態において、精製された抗体は一本鎖抗体である。
【０１２３】
別の実施形態において、精製された抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、齧歯類、霊長類、モルモット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、トリからなる群を起源とする抗体から選択される。抗体は、任意のクラスであり得る（すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択される）。一実施形態において、精製された抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。特定の実施形態において、ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧＡ、ヒトＩｇＧＤ、ヒトＩｇＧＥ、ヒトＩｇＧＭ、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ウサギＩｇ、ハムスターＩｇ、モルモットＩｇ、ウシＩｇ、及びブタＩｇからなる群から選択される。したがって、一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。周知であるように、モノクローナル抗体技術は、抗体を産生する哺乳類細胞と連続的な複製能を有する不死化細胞の融合を包含する。もたらされた細胞融合物または「ハイブリドーマ」は、続いて細胞培養においてモノクローナル抗体を産生するだろう。この文脈において、「抗体」という用語には、抗体断片、及び抗体または抗体断片を含む任意の融合タンパク質も含まれることを理解すべきである。したがって、本方法は、免疫グロブリンのプロテインＡ及び／またはプロテインＧ及び／またはプロテインＬ結合特性を提示する任意の免疫グロブリン様分子を単離するのに有用である。
【０１２４】
他の実施形態において、精製された抗体はポリクローナル抗体である。
【０１２５】
本明細書において提供される方法を使用して、多様な生物学的サンプル（細胞培養培地、培養液、抽出液、血液、血漿、血清サンプル、腹水、及び上清が限定されずに含まれる）から抗体を単離することができる。一実施形態において、標的含有生物学的サンプルは培養液を含む。この実施形態において、抗体は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、細胞培養培地の構成要素（消泡剤及び抗生物質等）、及び／または製品関連の不純物（誤って折り畳まれた種及び凝集物等）から精製することができる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、タンパク質−ポリマーコンジュゲートとの接触前に機械的濾過へかけられ、したがってサンプルは清澄にした細胞培養ブロスである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは固体及び不溶性成分を除去するようにタンパク質−ポリマーコンジュゲートとの接触前に遠心分離へさらされ、したがってサンプルは上清である。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は様々な生物学的サンプルから回収され得ることを理解すべきであり、生物学的サンプルが限定されることは意図されない。
【０１２６】
一実施形態において、抗体は、プロテインＡ−ブロック−ポリ（ジエチルアミノエチルメタクリレート）コンジュゲートを含むタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用して精製され、そこでプロテインＡは組換えであり、コンジュゲートは、約１００ｋＤ〜約４００ｋＤの範囲中の分子量を有するか、またはコンジュゲートは約４００〜約２０００のＤＥＡＥＭＡモノマー単位を含む。
【０１２７】
キット
本発明は、生体分子の精製のためのキットであって、本明細書において記載されるようなタンパク質−ポリマーコンジュゲート、随意に１つまたは複数のバッファー、及びタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する生物学的サンプルからの生体分子の精製のための書面の説明書を、分離したコンパートメント中に含む、該キットも包含する。
【０１２８】
一実施形態において、本発明は、抗体の精製のためのキットであって、抗体結合タンパク質を含むタンパク質−ポリマーコンジュゲート、随意に１つまたは複数のバッファー、及びタンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する生物学的サンプルからの抗体の精製のための書面の説明書を、分離したコンパートメント中に含む、該キットを包含する。
【実施例】
【０１２９】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、実施例は本発明を図示するために提供され、いかなる様式でもその範囲を限定すると解釈することはできない。
【０１３０】
特別に定義されない限り、または文脈が明らかに指示ない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法の実践または試験において、本明細書において記載されるものに類似または等価の任意の方法及び材料を使用できることを理解すべきである。
【０１３１】
実施例１。プロテインＡ−ポリマーコンジュゲートの調製。
材料。
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド（９７％）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、≧９９％）、トリエチルアミン（≧９９％）、ジクロロメタン（無水、≧９９．８％）、α−ブロモイソブチリルブロミド（９８％）、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ、９９．８％）、石油エーテル（＞９５％、３０〜４０℃）、酢酸エチル（無水、≧９９．８％）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ  ＨＣｌ≧９８％）、水素化ホウ素ナトリウム（≧９９％）及び５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、≧９８％）、及び塩酸（３４〜３７％）を、Ａｌｄｒｉｃｈから得て、受け取ったままで使用した。ｒプロテインＡ−ＣｙｓをＢｉｏｍｅｄａｌから購入した（９５％、分子量：２９．８７ｋＤ）。Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート（ＤＥＡＥＡ）、及び２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（ｔＢＡＥＭＡ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入し、使用前に塩基性酸化アルミニウムカラムを介して通過させた。
【０１３２】
ＡＴＲＰイニシエーターの合成。
【化１】
2017534602.tif 000003
【０１３３】
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド（２００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１９７μＬ、１．４２ｍｍｏｌ）及び無水ジクロロメタン（５ｍＬ）を、１０ｍＬのシングルネックフラスコ中で混合し、隔壁によって更にシールし、氷浴に浸漬した。α−ブロモイソブチリルブロミド（１９９μＬ、１．６ｍｍｏｌ）を、撹拌下で混合物中に徐々に添加した。反応を０℃で２時間、次いで室温で１５時間実行した。その後に、溶出液として石油エーテル及び酢酸エチル（４：１、ｖ：ｖ）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによって、産物を精製した。産物の収率は８０％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：６．７３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ＝），４．３３（ｔ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．８６（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ２），１．８９（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）。
【０１３４】
ＡＴＲＰイニシエーターによるｒプロテインＡの修飾。
４コピーのＺ結合ドメイン及びＣ末端Ｃｙｓ残基を有する組換えプロテインＡ（Ｂｉｏｍｅｄａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｅｖｉｌｌｅ、スペインから購入したｒプロテインＡ−Ｃｙｓ（４ｘＺｃ））を使用した。この組換えプロテインＡは、単一の２９．８７ｋＤのポリペプチドにアセンブルされた、Ｆｃ領域結合ドメイン（Ｚドメイン）の４つの同一のコピーを含有し、その中でＣ末端残基はシステイン残基により置き換えられる。それはＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え発現によって産生される。
【０１３５】
組換えプロテインＡ（１０ｍｇ、３．３３×１０−４ｍｍｏｌ）を０．９ｍＬのリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中で溶解した。ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（１００μＬ×２．８６ｍｇ／ｍＬ、１×１０−３ｍｍｏｌ）を撹拌下で溶液中に添加した。３０分後に、０．１ｍＬのＣＨ３ＣＮ中の２−ブロモイソブチラートエトキシマレイミド（４．８７ｍｇ、１．６６×１０−２ｍｍｏｌ）を、溶液へ添加した。反応を室温で１５時間実行した。その後に、ＣＨ３ＣＮを真空回転蒸発装置で除去し、後続して、残留物を遠心分離式透析系（分子量カットオフ＝３ｋＤ）の中へ移動し、１５ｍＬのリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に対して３回（１００００ｒｐｍ×２０分間）透析した。ｒプロテインＡ−ＡＴＲＰイニシエーターの最終的な濃度を、ｒプロテインＡ−Ｃｙｓの連続希釈物の紫外線スペクトルから得た標準曲線から決定した。ｒプロテインＡ−ＡＴＲＰイニシエーターの濃度は約６ｍｇ／ｍＬであった。このプロセスの測定した収率は、３７．５〜６６．７％の範囲であった。
【０１３６】
修飾効率の試験。
修飾効率を決定するために、ＡＴＲＰイニシエーターの付加に続いてｒプロテインＡ上のチオール基をＥｌｌｍａｎアッセイによってタイトレーションした（Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １１，１９６５−１９７１，２０１０中に記載されるように）。試験の前に、システイン−システインカップリング反応に起因するｒプロテインＡ上のジスルフィド結合を、以下の通り還元した。ｒプロテインＡ（１００μＬ×６ｍｇ／ｍＬ）及び水素化ホウ素ナトリウム（２μＬ、１Ｍ）を、０．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に添加し、３７．５℃で３０分間インキュベーションした。次いで塩酸（２μＬ、５Ｍ）を溶液の中へ添加して反応をクエンチングした。溶液を透析チューブ（分子量カットオフ＝３ｋＤ）へ移動し、ＰＢＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）によって４回（１００００ｒｐｍ×２０分間）精製した。処理後に、ｒプロテインＡの濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって計算した。更に、リン酸バッファー（３μＬ、１０ｍＭ）中の、処理されたｒプロテインＡ（１００μＬ、６ｍｇ／ｍＬ）及びＤＴＮＢを、０．５ｍＬチューブ中で混合し１０分間インキュベーションした。遊離チオール基の濃度を４１２ｎｍでのＵＶ吸光度によって計算した。ｒプロテインＡとチオール基との間のモル濃度を使用して、修飾効率を決定した。
【０１３７】
ｒプロテインＡ−ｂ−ＰＤＥＡＥＭＡコンジュゲートの調製。
【化２】
2017534602.tif 000004
【０１３８】
ポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡを以下の通り調製した。Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）（１６．８μＬ、８．３５×１０−２ｍｍｏｌｅ）及びｒプロテインＡ−ＡＴＲＰイニシエーター（５．０ｍｇ、３００μＬの１０ｍＭのＰＢＳバッファー中で１．６７×１０−４ｍｍｏｌｅ）を、５ｍＬのワンネックフラスコ中で混合し、隔壁によってシールした。窒素を溶液を介して１５分間通過させて、酸素を除く。５ｍＬの脱酸素水中でＣｕＢｒ（１３．２ｍｇ、９．２×１０−２ｍｍｏｌ）、ＣｕＢｒ２（２０．５ｍｇ、９．２×１０−２ｍｍｏｌ）及びｂｐｙ（２８．７ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を混合することによって、触媒ストック溶液を調製した。２０μＬの触媒溶液をシリンジによって反応溶液の中へ注入して、室温で重合を開始した。５０μＬの反応溶液を計画した時間で採取して、１Ｈ  ＮＭＲによってモノマーの転換を決定した。ポリマーは、ＣＯ２飽和水中で溶解し、ＮａＯＨ溶液（ｐＨ８．５）から沈殿させることによって、２回精製した。
【０１３９】
同様の手順を使用して他のポリマー及びコポリマー（ｒプロテインＡ−ｂ−ＰＤＩＰＡＥＭＡ及びｒプロテインＡ−ｂ−ＰＤＥＡＥＭＡ−コ−ＰＤＩＰＡＥＭＡが含まれる）を得たが、（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）を、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＩＰＡＥＭＡ）（８．３５×１０−２ｍｍｏｌｅ）または両方の組み合わせのいずれかによって置き換えることによって、コポリマー（各々を５０％、７５％のＤＥＡＥＭＡ及び２５％のＤＩＰＡＥＭＡ、または２５％のＤＥＡＥＭＡ及び７５％のＤＩＰＡＥＭＡ、総量で８．３５×１０−２ｍｍｏｌｅ）を得た。
【０１４０】
実施例２。ポリＤＥＡＥＭＡ及びポリＤＩＰＡＥＭＡに基づくポリマー、及びコンジュゲートについての、ｐＨ感受性、ｐＨ感受性修飾及びポリマーのζ電位に対するｐＨ影響の実証。
ポリＤＥＡＥＭＡ及びポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートのｐＨ感受性の実証。最初に、ベースポリマーのｐＨ誘導性の相分離が実証された。実施例１中で記載されるように、ポリ−２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ポリ−ＤＥＡＥＭＡ）サンプルをＤＥＡＥＭＡのアニオン重合を介して生成した。次いで生成された反応産物を０．１ＮのＨＣｌ中で可溶化して５０ｍｇ／ｍｌの溶液を製作し、それは透明に見えた（図１Ａ、左パネル）。曇り点に到達し固体相沈殿が観察されるまで０．２５ＮのＮａＯＨを滴加し、相変化が起こったことが指摘される（図１Ａ、中央のパネル）。その後に、次いで、溶液がもう一度透明になるまで０．１ＮのＨＣｌを溶液へ再度添加し、ポリマーの相変化の可逆的な性質が実証される（図１Ａ、右パネル）。
【０１４１】
予測されるｐＫａならびにｐＨ誘導相の不透明度及び物理的外観上に基づいて、ポリ−２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレートを、組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ−Ｃｙｓ  ４ｘＺ、Ｂｉｏｍｅｄａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ｒプロテインＡ」とも本明細書において称される）と併用した使用のために選択して、原子移動ラジカル重合技法を上記のように使用して、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートを生成した（実施例１を参照）。次いでコンジュゲートを６．０〜１０．０の範囲の様々なｐＨの水性バッファー中で可溶化し、もたらされた溶液の６００ｎｍの吸光度を測定した。紫外分光法を遂行して、修飾プロテインＡから開始されたポリ−ＤＥＡＥＭＡのＡＴＲＰを介して生成されたポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートの溶液の様々なｐＨでの吸光度を測定した（実施例１中で記載されるように）（図１Ｂ）。図１Ｂは、吸光度ｖｓ波長（左パネル）及び６００ｎｍでの吸光度ｖｓ  ｐＨ（右パネル）のプロットを示す。このデータは、コンジュゲートが、ｐＨの増加（特にｐＨ８〜９の間の）により明瞭な相変化応答を実証したことを指摘する。より高いｐＨでの固体相の存在は視覚的に確認され（図１Ｂ、右パネル、挿入図写真）、白色で不透明に見えた。これらの結果は、スマートポリマーベース材料が、選択されたｐＨ刺激に応答して所望される相分離機能性を提供したことを指摘する。これらの結果は、ポリ−ＤＥＡＥＭＡ及びポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡの両方が、ｐＨ感受性の相変化及び可溶性変化を実証したことも示す。
【０１４２】
ｐＨ感受性修飾の実証。ｐＨ感受性を修飾するために、より低いｐＫａを備えたポリマー（すなわち（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＩＰＡＥＭＡ））の合成が選択された。更に、ＤＥＡＥＭＡ及びＤＩＰＡＥＭＡの異なる比によりコポリマーを上記のように合成することによって、感受性の修飾を細かく調整した（実施例１）。異なるコンジュゲートを、酸性化したリン酸食塩水バッファー（１０ｍＭのリン酸塩、２．７ｍＭの塩化カリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５）中で溶解した。０．５Ｍの水酸化ナトリウムの数マイクロリットルの追加で、ｐＨを０．５のステップで増加させ、６００ｎｍでの吸光度を各々のステップについて測定した。
【０１４３】
ｐＨ変化に際してのポリマー可溶性の変化を、溶液の吸光度の変化とリンクさせた。ｐＨ変化に際してのポリマー可溶性の変化を追跡するために、紫外分光法を遂行して各々のポリマー溶液について様々なｐＨ値で吸光度を測定した（図４）。図４は、２つのポリマーならびにＤＥＡＥＭＡ及びＤＩＰＡＥＭＡの異なる比を含有する３つのコポリマーについて、６００ｎｍでの吸光度ｖｓ  ｐＨのプロットを示す（上記のように）。各々のコンジュゲートは特異的なｐＨについて吸光度の明瞭な増加を示し、ｐＨ刺激への応答としてコンジュゲートの可溶性変化を示した。さらに、各々のコンジュゲートは、理論的ｐＫａに従って、ＤＩＰＡＥＭＡに富むコンジュゲートについてより低く、ＤＥＡＥＭＡに富むコンジュゲートについてより高い、特異的なｐＨ応答性を示した。
【０１４４】
ＤＩＰＡＥＭＡに富む（７５％及び５０％）ポリ−ＤＩＰＡＥＭＡ及びコポリマーの相変化はｐＨ６．５〜７．５の間で起こり、一方で７５％のＤＥＡＥＭＡを含有するコポリマーはｐＨ７〜８の間で相変化を示し、ポリ−ＤＥＡＥＭＡコンジュゲートはｐＨ７．５〜９の間で相変化を示すことも観察された。これらの結果は、ＤＥＡＥＭＡ及びＤＩＰＡＥＭＡの比の調整によって、ｐＨ感受性をより低くシフトするだけでなく、ｐＨトリガーも修飾するという可能性を示す。図４中で示される結果によれば、５０％以上のＤＩＰＡＥＭＡの比は純粋なＤＩＰＡＥＭＡコンジュゲートに同等のｐＨ感受性を提供した、一方で、２５％以下のＤＩＰＡＥＭＡによるコンジュゲートは、ＤＩＰＡＥＭＡコンジュゲート及びＤＥＡＥＭＡコンジュゲートについて得られたものの中間のｐＨ感受性を提供した。
【０１４５】
ζ電位に対するｐＨ影響の実証。コンジュゲートのζ電位に対するｐＨ影響を観察するために、ポリ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート−プロテインＡ（ＤＩＰＡＥＭＡ）及びポリ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート−プロテインＡ（ＤＥＡＥＭＡ）の合成を、上記のように遂行した（実施例１を参照）。２つのコンジュゲートを、酸性化したリン酸食塩水バッファー（１０ｍＭのリン酸塩、２．７ｍＭの塩化カリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５）中で溶解した。０．５Ｍの水酸化ナトリウムの数マイクロリットルの追加で、ｐＨを０．５のステップで増加させ、溶液のζ電位を各々のステップで自動滴定器を装備したＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）によって測定した。
【０１４６】
ポリマーコンジュゲートのζ電位の変化がポリマーの等電点、バッファーのイオン濃度、及び溶液のｐＨに依存することが見出された。溶液のｐＨの関数としてζ電位測定を遂行して、ＰＢＳバッファーの存在下においてポリマーの等電点を決定した（図５）。図５は、２つのポリマー−コンジュゲートについてのζ電位ｖｓ  ｐＨのプロットを示す。各々のコンジュゲートは、ポリマーの完全な中和に対応するｐＨ（すなわちコンジュゲートの等電点）についての横軸の交差で、正の値から負の値へのζ電位の減少を示した。各々のコンジュゲートの理論的ｐＫａに従って、ポリ−ＤＩＰＡＥＭＡの電荷中和がポリ−ＤＥＡＥＭＡの中和の前に起こった。この実験において、ポリ−ＤＩＰＡＥＭＡコンジュゲートの見かけ上の等電点はｐＨ８であり、ポリ−ＤＥＡＥＭＡコンジュゲートの見かけ上の等電点はｐＨ８．９であった。これらの値は、ＰＢＳによって同様に影響を受け、ＰＢＳバッファーの存在下におけるポリマーの中和に、水酸化物の量が必要であることが指摘された。
【０１４７】
図４及び５を比較して、ポリマーの可溶性の変化がコンジュゲートの完全な中和の前に起こったことを観察することができ、コンジュゲートの電荷の小さな変化が、その可溶性に強く影響するのに十分であることを指摘する。
【０１４８】
実施例３。ポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートの抗体結合特性。
等温滴定熱量計を使用して抗体（ＩｇＧ）への結合を決定する。非修飾ｒプロテインＡ（Ｂｉｏｍｅｄａｌによって供給されたままで）、ＡＴＲＰイニシエーターと反応させたｒプロテインＡ、またはポリマー−プロテインＡコンジュゲートを、およそ１７μＭの濃度でＰＢＳ中で溶解した。次いで２５０μＬの試験溶液を等温熱量計（ＩＴＣ）チャンバーへ添加し、ＰＢＳ中で溶解した限定量の精製参照ＩｇＧモノクローナル抗体（７８μＭ）の段階的な注入を行う。ＩＴＣ装置（Ｎａｎｏ  ＩＴＣ、ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、各々の注入ステップについてチャンバー中で２つの分子の結合に際して起こる熱のもたらされた変化、及び注入物の質量の関数としての累積エネルギー変化を測定する。飽和点及び熱交換曲線の傾きに基づいて、ストイキオメトリーに加えて結合事象の熱力学を計算することは可能である。
【０１４９】
使用したＩｇＧが系中の限定試薬である可能性を排除するために、初期注入がＩｇＧよりもはるかに多くのプロテインＡを有する状況を生成し、したがって単一のＩｇＧへの複数のプロテインＡ分子の結合を支援して、ＩＴＣ測定を遂行し、そこではＩｇＧをチャンバー中に配置し、組換えプロテインＡを注入物として使用する。２つの条件における結合ストイキオメトリーを比較して、滴定の方向が結合のストイキオメトリーに影響するか、それともストイキオメトリーが使用された特定のｒプロテインＡの特性かどうかを決定する。
【０１５０】
結合ストイキオメトリーを試験して、ポリマー鎖の存在は、コンジュゲートのプロテインＡ部分の結合部位へのＩｇＧ分子のアクセスを妨害しないことを確認する。
【０１５１】
これらの実験を実行して、コンジュゲートは、可溶性の高いプロテインＡに対して高親和性且つ等しいストイキオメトリーで、ＩｇＧを結合し、固体相における高効率回収を可能にすることを確認する。ポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートは、可溶性の高いプロテインＡのＩｇＧ結合特性（特に固定化プロテインＡの立体障害効果を回避することから生じる結合効率の追加）を保持することが所望される。これらの実験から、ＡＴＲＰ開始を使用するポリマーコンジュゲートの生成はプロテインＡリガンドのＩｇＧ結合特性を妨害しないことも確認される。
【０１５２】
結合されたＩｇＧが、ｐＨ誘導性相変化及びもたらされた分離を介して、結合されたままであることを確立する実験も遂行される。これを実証するために、モデルプルダウン実験を遂行し、そこではポリマー−プロテインＡコンジュゲートをｐＨ７．０のＰＢＳへ１５μＭの濃度まで添加し、次いで２８０ｎｍでの吸光度について紫外分光法によって測定した。その後に、精製された参照ＩｇＧモノクローナル抗体を溶液へ添加して、２：１のコンジュゲート対ＩｇＧのモル比を形成し、再び２８０ｎｍでの吸光度を紫外分光法によって測定する。最終的に、ｐＨ１０．０のホウ酸バッファー（２５ｍＭ硼酸ナトリウム）の添加によって溶液のｐＨを増加させて、相分離を誘導する。固体相及び液体相を分離する遠心分離後に、回収された上清を２８０ｎｍでの吸光度について測定する。
【０１５３】
ｐＨ誘導性相分離後に上清中に残存する未結合抗体のパーセンテージを定量化するために、上清の吸光度を、コンジュゲート単独の吸光度を引いた最初の混合物の吸光度によって割る。推論によって、残りのＩｇＧは沈殿物中にあると推測され、次いでこの画分は「プルダウン効率」と称される。相分離を誘導するためにｐＨの範囲の変化を使用して、このモデルプルダウン実験を遂行し、プルダウン効率を上記のように計算する。これらの実験から、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートへのＩｇＧ結合が、ｐＨ誘導性相分離を介して安定的であり、回収可能な固体相中にとどまることが確認される。
【０１５４】
プロテインＡリガンドが、ポリ−ＤＥＡＥＭＡプロテインＡコンジュゲートのＩｇＧ結合特性のために必要であることを確認するために、モデルプルダウン実験を、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートの代わりに溶液中にコンジュゲートされていないポリ−２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレートを使用して反復した。次いでＩｇＧを添加する。高ｐＨホウ酸バッファー（ｐＨ１０．０）によりｐＨを１０へ増加させ、次いで誘導された固体相を遠心分離を介して分離する。これらの実験から、ＩｇＧのどれもポリマー単独へ結合しないことが確認され、コンジュゲートが効果的にＩｇＧ抗体を結合及び分離できるには、プロテインＡリガンドが不可欠に要求されることが実証され得る。
【０１５５】
固定化相の使用を超える、可溶性の高いポリマー−プロテインＡコンジュゲートの使用の別の潜在的な利点は、結合を可能にするインキュベーション期間の排除である。溶液中の結合の動態は、コンジュゲート溶液のＩｇＧ抗体溶液への導入に際して、インキュベーション時間を実質的に要求しないようなものである。これは、ｐＨ１０．０のホウ酸バッファーの追加によりｐＨが１０へ増加する前に、増加するインキュベーション期間を使用して、モデルプルダウン実験を上記のように反復することによって実証することができる。プルダウン効率を結合ステップについてのインキュベーション期間の関数として測定する場合、ＩｇＧへのコンジュゲートの結合の動態及びポリマー相変化を決定することができる。コンジュゲートへのＩｇＧ結合が非常に迅速に起こるならば、インキュベーションの増加は、プルダウン効率を有意に増加させないであろうことが予想される。
【０１５６】
ポリマー−プロテインＡコンジュゲートのｐＨ誘導性相分離を使用して、ＩｇＧプルダウンについての最適条件を更に確認するために、濃度を変動させたＩｇＧ抗体を添加して０．５：１〜４：１の範囲のコンジュゲート対ＩｇＧのモル比を生成して、モデルプルダウン実験を反復する。過剰なコンジュゲートの使用がＩｇＧのプルダウンの増加に関する利益を提供するかどうか、及びプルダウン効率における損失がスケールの増加とともに起こるかどうかが、決定される。
【０１５７】
コンジュゲートの中へ取り込まれたポリマー鎖を形成する構成モノマーの数及び機能化学は、増加させた数の２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレートモノマー単位を取り込む多くの異なるサンプルを生成すること、分子量を増加させたコンジュゲートを生じさせること、及び増加させた数の（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレートモノマーも使用することによって、最適化される。これらのサンプルを上記のようにモデルプルダウン実験のために使用し、そこでは２：１のコンジュゲート対ＩｇＧ抗体のモル比を使用し、ｐＨの１０への増加を使用して相分離を誘導する。もたらされた上清の紫外分光法測定を使用して、１１１ｋＤ〜３７２ｋＤの分子量範囲の間の異なる化学のコンジュゲートについてプルダウン効率（Ｐｄ％）を決定し、効果的な分離がコンジュゲートの物理的特性及び化学的特性に依存するかどうか及びどのようにそれらに依存するかを示す。
【０１５８】
実施例４。回収された画分の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入についてスクリーニング。
抗体の単離及び精製のための系としての使用のために、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートが抗体を選択的に結合することができ、抗体を分離しなければならない収穫された細胞培養培地中に存在する混入宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）も沈殿させることなしに、相分離を達成することができることは、重要である。回収された画分の純度を実証するために、モデル分離実験を遂行し、そこでは様々なステップはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検討される。抗体が産生される細胞培養物をクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上で分析して、ＨＣＰが存在するかどうかを観察する。１：２のモル比の精製されたＩｇＧ及びポリマー−プロテインＡコンジュゲートを、標的ＩｇＧを添加した細胞培養サンプルへ添加する。次いで混合物のｐＨをホウ酸バッファーにより１０へ上昇させ、もたらされた沈殿物を遠心分離によって分離する。回収された上清及び沈殿物の両方のサンプルも同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、ＨＣＰバンドの存在を決定し、特に、それらが上清中に観察されるが、沈殿物中に存在せず、一方でＩｇＧバンドは沈殿物中に優位であり、少量の画分のみが上清中に残存するかどうかを決定する。これらの実験は、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートが、同様に沈殿するＨＣＰ混入物なしに、ＩｇＧ抗体を選択的に精製することができるかどうか示す。
【０１５９】
実施例５。回収されたポリマー−プロテインＡコンジュゲートの再利用。
プロテインＡの使用は、抗体（ＩｇＧ抗体等）の精製についての有意なコスト推進要因として残るので、記載されるポリマー−プロテインＡコンジュゲートベースの系の経済的実現可能性は、抗体の分離後のポリマー−プロテインＡコンジュゲートを回収及び再使用する性能に依存する。ｐＨ誘導性相分離及び後続する低ｐＨバッファー中での再可溶化の反復サイクルは、コンジュゲートの機能性を低減しないことを実証するために、上記のものに類似する１シリーズのモデルプルダウン実験を遂行する。ポリマー−プロテインＡコンジュゲートのサンプルを、３、６または１０サイクルのｐＨ１０のｐＨ誘導性相分離への曝露、続いて上清の遠心分離及び除去、次いでｐＨ３．５の１００ｍＭのクエン酸バッファー中での再可溶化後に、プルダウンＩｇＧのために使用する。プルダウン効率を上記のように測定し、サイクル数の関数としてプロットした。結果は、高ｐＨでの沈殿及び低ｐＨでの可溶化のサイクルがコンジュゲートのプルダウン効率に有意な影響を有するかどうかを示し、コンジュゲートを複数の精製において再使用できるかどうかを指摘する。
【０１６０】
遠心分離式ダイアフィルトレーションの使用を介するポリマー−プロテインＡコンジュゲートの回収可能性が実証される。３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホンベースのフィルター（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉから）を使用して、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した場合に、精製されたＩｇＧ抗体はフィルターを通り抜けるだろうことが確認される。紫外分光法を使用してフロースルーの吸光度を測定し、ＩｇＧ抗体（両方とも提供されたままで、ＰＢＳ中で２．３μＭの溶液として）の＞９５％がフィルターを介して通過することが指摘される。ＰＢＳ中の３．８μＭのポリマー−プロテインＡコンジュゲート溶液を同じ濾過手順へかけ、フロースルーをＵＶ吸光度について測定する場合に、コンジュゲートが通過するかどうかを試験し、フィルターが、コンジュゲートからのＩｇＧの分離に好適かどうかを指摘する。最終的に、ポリマー−プロテインＡコンジュゲート：ＩｇＧ抗体を２：１のモル比でｐＨ３．５の１００ｍＭのクエン酸バッファー中に調製する。これらの低ｐＨ条件は、プロテインＡクロマトグラフィーにおいて使用される溶出バッファーに類似し、ＩｇＧのプロテインＡへの結合を妨害することが予測される。この混合物を同じ濾過条件へかけ、フロースルーを紫外分光法によって測定する場合に、ＩｇＧ抗体のどのくらいの量が回収されるかを確かめることができる。これらの実験は、ポリＤＥＡＥＭＡ−プロテインＡコンジュゲートがＩｇＧの結合及び分離の複数のサイクルに好適かどうかを示す。
【０１６１】
実施例６。タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する抗体の精製。
図２は、モノクローナル抗体が精製される本発明の精製法の一実施形態を図示する図解の図面を示す。この図面における実施例は本発明の方法を図示することを意図し、多少なりとも方法を限定すると解釈すべきでない。
【０１６２】
図２において、ステップ１（「ポリマー−プロテインＡコンジュゲートを収穫した細胞培養培地へ添加する」）で、ポリマー−タンパク複合体を収穫された細胞培養培地へ添加する。この実施例について、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートを以下の通り調製した。４つのＩｇＧ結合部位及びＣ末端Ｃｙｓ残基を備えた組換えプロテインＡリガンド（ｒプロテインＡ−Ｃｙｓ  ４ｘＺｃ）を、ジメチルアミノエチルメタクリレートファミリーの第三級アミンの単位のポリマー鎖へコンジュゲートした。最初に、プロテインＡは、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中にｒプロテインＡ−Ｃｙｓを溶解することによって、ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）イニシエーター（２−ブロモイソブチラートエトキシマレイミド）により修飾した。次いでＴＣＥＰ・ＨＣｌを撹拌下で溶液中に添加した。３０分後に、０．１ｍＬのＣＨ３ＣＮ中のイニシエーターを溶液へ添加した。反応を室温で１５時間実行した。その後に、ＣＨ３ＣＮを真空回転蒸発装置で除去し、残留物を遠心分離式透析系（分子量カットオフ＝３ｋＤ）の中へ移動し、リン酸バッファーに対して透析した。
【０１６３】
次いで、コンジュゲートを、モノマー（２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、または２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、または２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート）及びプロテインＡ−ＡＴＲＰイニシエーターを、ワンネックフラスコ中で混合することによって調製し、隔壁によってシールした。窒素を溶液を介して１５分間通過させて、酸素を除く。触媒ストック溶液を、ＣｕＢｒ、ＣｕＢｒ２及びｂｐｙを脱酸素水中で混合することによって調製した。触媒溶液をシリンジによって反応溶液の中へ注入して、室温で重合を開始した。反応溶液を、所望されるポリマー鎖長（３２ｋＤ、１０５ｋＤ、１８０ｋＤ、２５０ｋＤ、及び４２０ｋＤ）のコンジュゲートを達成するように、計画した時間で採取し、ＣＯ２飽和水中に溶解し、ＮａＯＨ溶液（ｐＨ８．５）からそれを沈殿させることを介して、精製した。
【０１６４】
もたらされたコンジュゲートは、ＣＯ２のバブリングを介して随意にプロトン化して、その可溶性を促進することができる（図２、ステップ２）。コンジュゲートは、収穫された細胞培養培地のｐＨで可溶性である。細胞培養培地へのコンジュゲートの導入によって、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートは溶液中のモノクローナル抗体のＦｃ領域への標的化され、高特異性により及び固定化プロテインＡと比較して増加した化学量論比で結合する（図２、ステップ３）。結合された標的産物（標的抗体に結合されたコンジュゲート）の回収及び精製は、低濃度ＮａＯＨの導入を介する（図２、ステップ４）、または別の塩基（ｐＨ１０での塩基性ホウ酸バッファー等）の追加による、ｐＨの緩やかな上昇（例えば８または９へ）によって起こり、それはポリマー鎖を脱プロトン化し疎水構造を生成することによってポリマー化学のスイッチを誘導し、次いでそれは数分以内に相分離を駆動する（図２、ステップ５）。
【０１６５】
重要なことには、プロテインＡへのＩｇＧの結合はｐＨ感受性であり、ｐＨの増加は、プロテインＡとＩｇＧとの間の結合を強化する。これは高ｐＨでの相分離を介して産物損失を防止し、このことは、相分離の駆動がｐＨの減少に依存し、プロテインＡとＩｇＧ（この実施例では）との間の結合の弱化を介して産物損失をもたらす他のポリマー系とは対照的である。
【０１６６】
ｐＨの上昇に際して産生された結合された不溶性画分を、遠心分離を介して回収し、上清を廃棄する（図２、ステップ６及び７）。随意に、結合された不溶性画分を、高ｐＨバッファー（０．１ＭのＮａＯＨ）により洗浄して、上清に由来する残存するタンパク質を除去する（図２、ステップ８）。次いで、ポリマーコンジュゲートを可溶化するだけでなく、プロテインＡへのその結合の破壊によって抗体を溶出または解離する、低ｐＨバッファー（例えばｐＨ３．５のバッファー）中でペレット画分を再可溶化することによって、抗体を回収する（図２、ステップ９）。
【０１６７】
タンパク質−ポリマーコンジュゲート上のここで完全にプロトン化されたポリマー鎖を結合する一方で、抗体が、そこで精製された画分の中へと通り抜けることを可能にするであろう、イオン交換カラムを介して、溶液を通過させる（図２、ステップ１０）。当技術分野において公知の他の方法も使用して抗体を分離できることを、理解すべきである。例えば、遠心濾過を使用することができる。一例として、溶液は、遠心用フィルター（Ｐａｌｌ  Ｎａｎｏｓｅｐの３００ｋＤの分子量カットオフ遠心用フィルター（Ｓｉｇｍａｌ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）等）を介して通過させることができ、そこでは、ＩｇＧは通り抜けるがコンジュゲートは通り抜けず、精製された抗体のフロースルー中での回収を可能にする。
【０１６８】
コンジュゲートを、例えば高ｐＨ洗浄（０．１ＭのＮａＯＨ等）において随意に洗浄する。この洗浄は沈殿を誘導し、例えば中性バッファー中での及び／またはＣＯ２を介するバブリングによる再可溶化を必要とするだろう（図２、ステップ１１）。適切であるならば、コンジュゲートはイオン交換カラムから回収される（図２、ステップ１２）。一旦回収されたならば、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、随意に、必要であるかまたは所望されるならば、ＣＯ２を介するバブリングによって再可溶化され、更なる抗体結合／精製サイクルに再使用される。例えば、リサイクルされたタンパク質−ポリマーコンジュゲートを、その後の収穫された細胞培養液体のバッチからの抗体の精製のために使用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体精製法の利点は、精製の後続するラウンドのためにタンパク質−ポリマーコンジュゲートを再使用またはリサイクルする性能であり、このことは、苛酷な洗浄及び再チャージの条件に起因して結合能力を失うクロマトグラフィー樹脂とは対照的である。
【０１６９】
実施例７。タンパク質−ポリマーコンジュゲートを使用する抗体の精製。
図３は、モノクローナル抗体が精製される本発明の精製法の一実施形態を図示する図解の図面を示す。この図面における実施例は本発明の方法を図示することを意図し、多少なりとも方法を限定すると解釈すべきでない。
【０１７０】
図３において、ステップ１（「ポリマー−プロテインＡコンジュゲートを収穫した細胞培養培地へ添加する」）で、ポリマー−タンパク複合体を収穫された細胞培養培地へ添加する。この実施例について、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートを上記の通り調製する。コンジュゲートは、収穫された細胞培養培地のｐＨで可溶性である。細胞培養培地へのコンジュゲートの導入によって、ポリマー−プロテインＡコンジュゲートは溶液中のモノクローナル抗体のＦｃ領域への標的化され、高特異性により及び固定化プロテインＡと比較して増加した化学量論比で結合する（図３、ステップ２）。結合された標的産物（標的抗体に結合されたコンジュゲート）の回収及び精製は、例えば塩基性ホウ酸バッファー（２５ｍＭのホウ酸バッファー、ｐＨ１０）の添加による、ｐＨの緩やかな上昇によって起こり、それはポリマー鎖を脱プロトン化し疎水構造を生成することによってポリマー化学のスイッチを誘導し、次いでそれは相分離を駆動する（図３、ステップ３及び４）。
【０１７１】
ｐＨの上昇に際して産生された結合された不溶性画分を、遠心分離を介して回収し、上清を廃棄する（図３、ステップ５及び６）。随意に、結合された不溶性画分を、高ｐＨバッファー（０．１ＭのＮａＯＨ）により洗浄して、上清に由来する残存するタンパク質を除去する（図３、ステップ７）。次いで、ポリマーコンジュゲートを可溶化するだけでなく、プロテインＡへのその結合の破壊によって抗体を溶出または解離する、低ｐＨバッファー（例えばｐＨ３．５のバッファー）中でペレット画分を再可溶化することによって、抗体を回収する（図３、ステップ８）。
【０１７２】
次いでコンジュゲートは、コンジュゲートを保持する一方で抗体がそこで精製されたフロースルーの中へと通り抜けることを可能にするフィルターによる遠心濾過を使用して、溶液から取り出される（図３、ステップ９）。例えば、３００ｋＤの分子量カットオフ遠心用フィルターを備えたＰａｌｌ  Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）遠心デバイス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、または同様のデバイス）を使用する。
【０１７３】
抗体の結合及び精製の更なるサイクルにおける再使用のための調製において、コンジュゲートを、例えば高ｐＨ洗浄（０．１ＭのＮａＯＨ等）において随意に洗浄する、ならびに／または必要であるならば、例えば中性バッファー中で及び／もしくはＣＯ２を介するバブリングにより再可溶化する（図３、ステップ１０）。
【０１７４】
本発明はその実施形態に関して詳細に記載されるが、これらの実施形態は、本発明を例証するためであり、限定するために提示されるものでない。他の実施形態が、本発明の原則を用いて、本明細書に添付される請求項によって定義されるような趣旨及び範囲内にあるようにすることは可能である。
【０１７５】
本明細書において引用されるすべての文書及び参照の内容は、各々が本明細書における参照によって個別且つ具体的に援用されるのと同程度に、それらの全体の参照によって本明細書に援用される。
【図１】
2017534602.tif 000005
【図２】
2017534602.tif 000006
【図３】
2017534602.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月24日(2016.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ応答性ポリマーへコンジュゲートされた１つまたは複数の標的生体分子結合タンパク質を含む、ｐＨ応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲートであって、
該標的生体分子結合タンパク質がプロテインＡまたはその機能的等価物を含み；
該ｐＨ応答性ポリマーの分子量が少なくとも約２００ｋＤであり；
該タンパク質−ポリマーコンジュゲートが該標的生体分子を溶液中で結合することができ；
該ｐＨ応答性ポリマーがタンパク質−ポリマーコンジュゲートにｐＨ応答性を付与する、
該ｐＨ応答性タンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
前記標的生体分子がタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３】
前記標的生体分子結合タンパク質が、標的生体分子へ特異的に結合する、請求項１または２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４】
前記標的生体分子がビオチン化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項５】
前記プロテインＡがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから単離された生来のプロテインＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項６】
前記プロテインＡが、非哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項７】
前記プロテインＡが、哺乳類源において産生された組換えプロテインＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項８】
前記組換えプロテインＡが、システイン（Ｃｙｓ）残基をＣ末端で含む、請求項６または７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項９】
前記組換えプロテインＡが、４つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１０】
前記組換えプロテインＡが、Ｂドメインまたはその機能的等価物である少なくとも１つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１１】
前記組換えプロテインＡが、Ｚドメインである少なくとも１つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１２】
前記非哺乳類源が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１３】
前記組換えプロテインＡが、単一ポリペプチドにおける４つのＺ  ＩｇＧ結合ドメイン及びＣ末端でのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１４】
前記プロテインＡがプロテインＧからのＩｇＧ結合ドメインを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１５】
前記プロテインＡが、プロテインＡからの４つのＩｇＧ結合ドメイン及びプロテインＧからの２つのＩｇＧ結合ドメインを含む、請求項１４に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１６】
前記プロテインＡがＩｇＧについて特異的である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１７】
前記ｐＨ応答性ポリマーが酸性もしくは中性のｐＨで可溶性であり、塩基性ｐＨで不溶性であるか、または前記ｐＨ応答性ポリマーが中性ｐＨで可溶性であり、塩基性及び酸性のｐＨで不溶性である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１８】
前記ｐＨ応答性ポリマーが陰イオン高分子電解質である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ポリマーがジアルキルアミノエチルメタクリレートの第三級アミンの単位の鎖を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２０】
前記ポリマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（別名Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート）（ＤＥＡＥＭＡ）、２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート（別名Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート）（ＤＥＡＥＡ）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（別名Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＤＭＡＥＭＡ）、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート（別名Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート）（ｔＢｕＭＡＥＭＡ）、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（別名Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート）（ＤＩＰＡＥＭＡ）のポリマー及び／またはそのコポリマーを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２１】
前記ポリマーが、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート］、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート］、ポリ［２−ジメチルアミノエチルメタクリレート］、ポリ［２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート］またはポリ［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−エチルメタクリレート］である、請求項２０に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２２】
前記ポリマーが、ポリ［２−ジエチルアミノエチルメタクリレート］である、請求項２０に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２３】
前記ポリマーが、約８以上もしくは約７．５以上のｐＨで不溶性である、及び／または約４以下のｐＨで不溶性である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２４】
前記ポリマーが、約９以上または約９．５以上のｐＨで不溶性である、請求項２３に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２５】
前記ポリマーが約１０以上のｐＨで不溶性である、請求項２３に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２６】
前記ポリマーが少なくとも約１０００のモノマー単位を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２７】
前記コンジュゲートがＡＴＲＰを使用して合成される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２８】
前記コンジュゲートの抗体へ結合するストイキオメトリーが、約１：１を超える、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２９】
前記コンジュゲートの抗体へ結合するストイキオメトリーが、約２：１、約３：１、または約４：１である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３０】
前記コンジュゲートが、固体相においてよりも高い能力で溶液中で前記標的生体分子を結合する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３１】
前記コンジュゲートが、プロテインＡ−ポリ（ＤＥＡＥＭＡ）コンジュゲート、プロテインＡ−ポリ（ＤＩＰＡＥＭＡ）コンジュゲート、またはポリ（ＤＩＰＡＥＭＡ−コ−ＤＥＡＥＭＡ）のコポリマーを含むコンジュゲートであり、前記コンジュゲートが約２００ｋＤａ〜約４００ｋＤａまたは約２００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａの範囲中の分子量を有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３２】
前記コンジュゲートが、約１０００〜約２０００のＤＥＡＥＭＡモノマー単位または約１０００〜約５，０００のＤＥＡＥＭＡモノマー単位を含むプロテインＡ−ポリ（ＤＥＡＥＭＡ）コンジュゲートである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のタンパク質−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３３】
ａ）請求項１〜３２のいずれか一項で定義されるタンパク質−ポリマーコンジュゲートと生物学的サンプルを接触させ、タンパク質−ポリマーコンジュゲートが標的生体分子を結合することを可能にし、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を形成するステップと；
ｂ）サンプルの刺激条件を変化させて、結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を沈殿させるステップと；
ｃ）沈殿物を回収するステップと；
ｄ）沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体を再可溶化し、標的生体分子をそれから解離するステップと；
ｅ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートを除去して、精製された標的生体分子を得るステップと
を含む、生物学的サンプルから標的生体分子を精製する方法。
【請求項３４】
前記標的生体分子はがタンパク質またはペプチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的生体分子がビオチン化される、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的生体分子が抗体またはその断片である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的生体分子結合タンパク質が抗体結合タンパク質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記刺激条件がｐＨである、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ｆ）ステップｅ）において除去されたタンパク質−ポリマーコンジュゲートを回収するステップ
を更に含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ｇ）タンパク質−ポリマーコンジュゲートが生物学的サンプル中で可溶性であり、ステップａ）〜ｆ）において再使用することができるように、ＣＯ２を介してバブリングすることによって、回収されたタンパク質−ポリマーコンジュゲートをプロトン化するステップ
を更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップｂ）においてｐＨを塩基性条件へ増加させて、結合されたコンジュゲート標的生体分子複合体を沈殿させる、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐＨが、約ｐＨ８へ、約ｐＨ９へ、約ｐＨ９．５、または約ｐＨ１０へ増加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記コンジュゲートの前記標的生体分子への結合が、ｐＨの増加によって、影響されないかまたは増加される、請求項４１または４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記コンジュゲートが、酸性ｐＨ、またはｐＨ約３〜約４で、またはｐＨ約３．５で、前記標的生体分子へ結合しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記沈殿物がステップｃ）において遠心分離によって回収される、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が、前記刺激条件を変化させることまたは前記刺激条件をサンプルにおけるもとの値へ戻して復帰させることによって、ステップｄ）において再可溶化される、請求項３３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記沈殿させた結合されたコンジュゲート−標的生体分子複合体が、ステップｄ）において酸性溶液中で再可溶化される、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記酸性溶液が約ｐＨ３．５または約ｐＨ３〜約ｐＨ４である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的生体分子が酸性溶液中でコンジュゲートから解離される、請求項４７または４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質−ポリマーコンジュゲートが、酸性ｐＨで沈殿させたタンパク質−ポリマーコンジュゲートのイオン交換クロマトグラフィー、遠心濾過、タンジェンシャルフロー濾過、または濾過を使用して、ステップｅ）において除去される、請求項３３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体がＩｇＧである、請求項３６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体がマウス抗体である、請求項５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がキメラ抗体または組換え抗体である、請求項５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記生物学的サンプルが、細胞培養抽出液、細胞培養培地、または腹水を含む、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的生体分子が哺乳類細胞発現系において産生される、請求項３３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記生物学的サンプルが血清または血液を含む、請求項５８に記載の方法。
【国際調査報告】
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