(57)【要約】  本発明は、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法に関する。上述したような本発明によれば、１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスを低レベル放射線の環境で飼育する段階と、（２）前記（１）段階で飼育された胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウス及び正常ＩＣＲマウスの胸腺を採取する段階と、（３）前記（２）段階で採取された胸腺の遺伝子を分析する段階と、（４）前記（３）段階で分析された遺伝子のうち、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出する段階と、（５）前記（４）段階で検出された遺伝子を増幅し、発現量を測定する段階とを含んでなる、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法を提供することにより、産業及び医療従事者の放射線被ばくと発癌との相関性を評価することが可能な低レベル放射線ＤＮＡ修復指標遺伝子として活用することができ、癌患者の癌の進行及び治療程度を評価することが可能な低レベル放射線ＤＮＡ修復遺伝子として活用することができるうえ、放射線と癌発生との因果関係を評価することが可能な低レベルＤＮＡ修復指標として活用することができるという効果がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスを低レベル放射線の環境で飼育する段階と、
（２）前記（１）段階で飼育された胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウス及び正常ＩＣＲマウスの胸腺を採取する段階と、
（３）前記（２）段階で採取された胸腺の遺伝子を分析する段階と、
（４）前記（３）段階で分析された遺伝子のうち、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出する段階と、
（５）前記（４）段階で検出された遺伝子を増幅し、発現量を測定する段階とを含んでなる、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記（１）段階で、低レベル放射線量が０．７ｍＧｙ／時間であることを特徴とする、請求項１に記載の低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記（１）段階で、０．７ｍＧｙ／時間の低レベル放射線の環境における総累積線量が１．７Ｇｙとなるように飼育することを特徴とする、請求項１に記載の低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記（５）段階で、ＤＮＡ修復関連遺伝子が、Ｃｙｐ１１ａ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒｎｄ３、Ｐｌｘｎｃｌ及びｃｙｐ２ｅｌから選ばれるプライマーで増幅されることを特徴とする、請求項１に記載の低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記（５）段階で、ベン図、定量的核酸増幅法、特殊タンパク質検出検査及び統計プログラムＳＡＳによって発現量を測定することを特徴とする、請求項１に記載の低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法に係り、さらに詳しくは、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに低レベル放射線を照射した後、胸腺を採取して、共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出し、増幅して発現量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線に敏感な遺伝子を発掘するために様々な方法が用いられてきたが、分子的にタンパク質レベルまで確認しなかった。本発明に提示された遺伝子は、ＲＮＡだけではなく、タンパク質レベルまで発現の差異を確認した。また、従来では、ＤＮＡ損傷及び修復に関連する遺伝子を、低レベル放射線が照射された健康なマウスと癌発生マウスとを比較して確認したことがなく、本発明で発掘された遺伝子は、低レベル放射線に対して敏感な遺伝子として知られていない。低レベル放射線に対して敏感な遺伝子プロファイルの発掘に先行された技術を見ると、次のとおりである。
【０００３】
ｉ）ヒト骨髄性白血病細胞株に２−５０ｃＧｙ放射線を照射した後、ＣＤＫＮ１Ａ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＭＤＭ２、ＢＴＧ２、ＰＨＬＤＡ３などの遺伝子発現を確認する（Ａｍｕｎｄｓｏｎ等、２００３年）
ｉｉ）放射線事故の際に線量評価に利用するために、ヒト血液に０．５、２、８Ｇｙの放射線を照射した後、線量に応じて反応するＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＰＨＰＴ１、ＢＢＣ３、ＳＥＳＮ１遺伝子を発見する（ＰａｕｌとＡｍｕｎｄｓｏｎ、２００８年）。
ｉｉｉ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに０．０３２〜１３μＧｙ／分で４８５日間放射線を照射した後、腎臓と睾丸を採取し、マイクロアレイを用いて、低レベル放射線に敏感な遺伝子を発見する（Ｔａｋｉ等、２００９年）。
ｉｖ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに４０１〜４８５日間（８Ｇｙ、０．４Ｇｙまたは０．０２Ｇｙ）１７〜２０ｍＧｙ／日、０．８６〜１．０ｍＧｙ／日で照射した後、肝を採取し、マイクロアレイと逆転写核酸増幅法を用いて、低レベル放射線に敏感な遺伝子を発見する（Ｕｅｈａｒａ等、２０１０）。
ｖ）マイクロアレイと定量的核酸増幅法を用いて、低レベル放射線が照射されたキイロショウジョウバエから低レベル放射線に敏感な遺伝子を３９個発見する（Ｓｅｏｎｇ等、２０１１）。
ｖｉ）ヒト血液に０、０．０２、０．１、０．５、１、２、４Ｇｙの放射線を照射した後、マイクロアレイを用いて、低レベル放射線に敏感な遺伝子を合計９個発掘する。また、生物学的線量評価に応用するために、線量別、照射後の時間別に発現量が異なる遺伝子グループを選定する（Ｋｎｏｐｓ等、２０１２）。
ｖｉｉ）ゼブラダニオの胚と成体に０．１または１Ｇｙの放射線を照射した後、肝のｍＲＮＡを用いてマイクロアレイと定量的核酸増幅法を行う。放射線に敏感な遺伝子を発掘する（Ｊａａｆａｒ等、２０１３）。
ｖｉｉｉ）マイクロアレイを用いて、５〜５００ｍＧｙの放射線が照射されたヒト血液から、低レベル放射線に敏感な遺伝子を発掘する（Ｎｏｓｅｌ等、２０１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、放射線による癌発生の研究の際に、一般に細胞株を用いた研究の結果をヒトや動物に直ちに適用して解釈することは難しく、実験動物として一般マウスを多用してきたが、癌発病率が低く、低レベル放射線の影響が人体影響で表現されるまで多くの限界があるので、このような短所を補完するために、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと一般的に癌の研究に多く使用する正常ＩＣＲマウスを用いて、オブジェクト間の差異を次の方法で分析することにより、本発明を完成するに至った。
【０００５】
１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線を照射した後、胸腺から低レベル放射線に敏感な遺伝子プロファイルを発掘し、２）ＤＮＡ修復に関連する遺伝子を中心に検証した後、その機能を分析
【０００６】
結論として、本発明の目的は、（１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスを低レベル放射線の環境で飼育する段階と、（２）前記（１）段階で飼育された胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウス及び正常ＩＣＲマウスの胸腺を採取する段階と、（３）前記（２）段階で採取された胸腺の遺伝子を分析する段階と、（４）前記（３）段階で分析された遺伝子のうち、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出する段階と、（５）前記（４）段階で検出された遺伝子を増幅し、発現量を測定する段階とを含んでなる、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、（１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスを低レベル放射線の環境で飼育する段階と、（２）前記（１）段階で飼育された胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウス及び正常ＩＣＲマウスの胸腺を採取する段階と、（３）前記（２）段階で採取された胸腺の遺伝子を分析する段階と、（４）前記（３）段階で分析された遺伝子のうち、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出する段階と、（５）前記（４）段階で検出された遺伝子を増幅し、発現量を測定する段階とを含んでなる、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法を提供する。
【０００８】
前記（１）段階で、低レベル放射線量は０．７ｍＧｙ／時間であることを特徴とする。
【０００９】
前記（１）段階で、０．７ｍＧｙ／時間の低レベル放射線の環境における総累積線量が１．７Ｇｙとなるように飼育することを特徴とする。
【００１０】
前記（５）段階で、ＤＮＡ修復関連遺伝子はＣｙｐ１１ａ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒｎｄ３、Ｐｌｘｎｃｌ及びｃｙｐ２ｅｌから選ばれるプライマーで増幅されることを特徴とする。
【００１１】
前記（５）段階で、ベン図、定量的核酸増幅法、特殊タンパク質検出検査及び統計プログラムＳＡＳによって発現量を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
上述した本発明によれば、（１）胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスを低レベル放射線の環境で飼育する段階と、（２）前記（１）段階で飼育された胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウス及び正常ＩＣＲマウスの胸腺を採取する段階と、（３）前記（２）段階で採取された胸腺の遺伝子を分析する段階と、（４）前記（３）段階で分析された遺伝子のうち、胸腺癌モデルＡＫＲ／Ｊマウスと正常ＩＣＲマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を検出する段階と、（５）前記（４）段階で検出された遺伝子を増幅し、発現量を測定する段階とを含んでなる、低レベル放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子の検出方法を提供することにより、産業及び医療従事者の放射線被ばくと発癌との相関性を評価することが可能な低レベル放射線ＤＮＡ修復指標遺伝子として活用することができ、癌患者の癌の進行及び治療程度を評価することが可能な低レベル放射線ＤＮＡ修復遺伝子として活用することができるうえ、放射線と癌発生との因果関係を評価することが可能な低レベルＤＮＡ修復指標として活用することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験例１のＤＮＡ損傷／修復関連遺伝子のうち、低レベル放射線に種特異的に反応を示す遺伝子の相対的な発現量を、核酸増幅法を用いて確認したグラフである。
【図２】実験例２の低レベル放射線が照射されたＡＫＲ／Ｊマウス及びＪＣＲマウスの胸腺のタンパク質分析結果を示すグラフである。（（１）低レベル放射線ＤＮＡ修復遺伝子（Ｃｙｐ１１ａ、Ｒｎｄ３、Ｐｌｘｎｃ１）タンパク質の量、（２）ローディングコントロール、（３）特殊タンパク質検出法の定量分析、各バンドの密度測定後のβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）密度値で定量化）
【図３】マウス胸腺の低レベル放射線の照射による分子的変化を示す図式画である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
一般に、高線量放射線は、ＤＮＡ損傷を起こし、癌を発生させると知られているが、逆に、低線量放射線は、損傷したＤＮＡの修復、アポトーシスの誘導、免疫活性、及び抗酸化機能を促進して癌を抑制すると知られている。ところが、国連科学委員会（ＵＮＳＣＥＡＲ、２０００）で提示した低線量率の放射線（≦６ｍＧｙ／ｈ）の基準を満たしていない場合が多い。また、細胞株を用いて確保した研究結果は、ヒトに直ちに適用して解釈することは難しく、実験動物を用いた場合であっても、低レベル放射線がＤＮＡ修復に及ぼす影響についてタンパク質レベルまで確認した従来技術はない。本発明では、ＡＫＲ／Ｊマウスと正常マウス（ＩＣＲ）を低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線の環境で飼育しながら、斃死が始まる時期（１００日）に達したときに胸腺を採取して遺伝子を分析した。また、同じ条件で飼育した正常マウス（ＩＣＲ）の胸腺を採取して遺伝子を分析した。最終的に２種のマウスに共通または単独で発現するＤＮＡ修復関連遺伝子を増幅し、タンパク質の検出によって最終的にゲノム、プロテオームを発掘した。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎない。本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当該分野における通常の知識を有する者にとって自明である。
【００１６】
実施例１
本発明では、雌（７週齢）ＡＫＲ／ＪマウスとＩＣＲマウスを日本のＳｈｉｚｕｏｋａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙセンターから購入し、１週間、特定病原菌不在施設で飼育して安定化させた。
【００１７】
各グループあたり５匹のマウスを用いて、低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線の環境で１００日間（総累積線量１．７Ｇｙ）飼育した後、胸腺を採取し、液体窒素に急速冷凍させた後、遺伝子分析を行った。
【００１８】
低レベル放射線が照射されたＡＫＲマウスとＩＣＲマウスとの胸腺を比較して、低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子を発掘し、機能を解析した。
【００１９】
ベン図、定量的核酸増幅法、特殊タンパク質検出検査及び統計プログラムＳＡＳ（ＡＮＯＶＡ、ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて分析した。
【００２０】
一方、低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線が照射されたマウス胸腺における敏感に反応するＤＮＡ修復関連遺伝子に対して発現量を計測するために使用したプライマーの塩基配列は、下記表１に示すとおりである。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実験例１：ＤＮＡ損傷／修復関連遺伝子の発現量の測定
ＡＫＲ／ＪマウスとＩＣＲマウスに対して低レベル（０．７ｍＧｙ／時間）放射線を照射し、癌発生初期段階（１００日）で胸腺を採取した後、ＤＮＡ損傷／修復関連遺伝子のうち、低レベル放射線に種特異的に反応を示す遺伝子の相対的な発現量を、核酸増幅法を用いて確認した。
【００２３】
その結果、図１に示すように、低レベル放射線が照射されたＡＫＲ／ＪマウスにおけるＣｙｐ１１ａ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒｎｄ３、Ｐｌｘｎｃ１や、ＩＣＲマウスにおけるＣｙｐ２ｅ１などが種特異的に低レベル放射線に敏感に反応した。
【００２４】
実験例２：低レベル放射線が照射されたＡＫＲ／Ｊマウス及びＩＣＲマウスの胸腺のタンパク質分析
実施例１での低レベル放射線が照射された場合のタンパク質と、対照群として高レベル放射線（０．８Ｇｙ／ｍｉｎ、総線量：４．５Ｇｙ）が照射されたマウス胸腺のタンパク質を分析した。
【００２５】
その結果、図２に示すように、低レベル放射線が照射されたＡＫＲ／ＪマウスにおけるＣｙｐ１１ａ１、Ｒｎｄ３、Ｐｌｘｎｃ１などが種特異的に低レベル放射線に敏感に反応することを検証した。
【００２６】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に述べたが、当該分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述が好適な実施態様に過ぎず、これらにより本発明の範囲が制限されないことは明白である。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるというべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017531439.tif 000008
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