(57)【要約】   本発明は、Ｓｆ２を直接標的とすることによって血栓症およびそれに付随する合併症を予防する方法および組成物を提供する。本発明は、Ｓｆ２欠乏またはＳｆ２アンタゴニストもしくはＳｆ２抗体などの治療剤の予防的投与により、外科手術、臥床、遺伝的異常、癌、外傷をはじめとする危険因子によって引き起こされ得る血栓形成が著明に減少することを記載する。【選択図】図１
2017537942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする個体の血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する方法であって、前記個体にＳｆ２アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む組成物を血栓予防量投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｓｆ２アンタゴニストが、Ｓｆ２欠乏を引き起こすＳｆ２結合分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｓｆ２アンタゴニストが抗体またはその機能的フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントが組換え抗体または天然抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントが、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ＭＡｂ４９もしくはＭＡｂ７７またはその機能的フラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、４ｈ９、２７ｃ９もしくはＴＳ２３またはその機能的フラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
血栓形成またはそれに付随する合併症が、外科手術、臥床、遺伝的異常、癌、外傷をはじめとする危険因子によって引き起こされるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物と、抗凝固剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血小板剤および線維素溶解促進剤からなる群より選択される有効量の薬学的に活性な薬剤とを共投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
リスクのある患者の血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する組成物であって、血栓予防量のＳｆ２アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項１２】
前記Ｓｆ２アンタゴニストが、Ｓｆ２欠乏を引き起こすＳｆ２結合分子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｓｆ２アンタゴニストが抗体またはその機能的フラグメントである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントが組換え抗体または天然抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｓｆ２抗体またはその機能的フラグメントが、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、ＭＡｂ４９もしくはＭＡｂ７７またはその機能的フラグメントである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、４ｈ９、２７ｃ９もしくはＴＳ２３またはその機能的フラグメントである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
血栓形成またはそれに付随する合併症が、外科手術、臥床、遺伝的異常、癌、外傷をはじめとする危険因子によって引き起こされるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
抗凝固剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血小板剤および線維素溶解促進剤からなる群より選択される有効量の薬学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９５，４６２号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、血栓症およびそれに付随する合併症の発生を予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）は、１年間に人口１００，０００人当たり約１３３人が罹患するよくみられる問題であり、最近の推定では、ＶＴＥの発生率が上昇している可能性があることが示唆されている１。医学的管理に直接かかる費用は最大で年間１００億ドルにのぼり２，３、ＶＴＥによる合併症に起因する慢性障害（肺高血圧症、下肢痛、腫脹、潰瘍など）にかかる追加の費用は明らかになっていない。ＶＴＥ患者の死亡率は１０〜３０％であり、主として肺塞栓症に起因するものである３。標準治療を受けても、ＶＴＥにより血栓症後症候群などの慢性合併症を来たす患者は５０％にものぼる。静脈血栓症は、入院患者、特に大手術を受ける患者に目立つ問題の１つである４。このような患者では、重大な出血リスクがある場合、ＶＴＥの発症に対するより優れた予防法を特定することが極めて重要である。
【０００４】
静脈血栓症の予防に唯一効果のある薬剤は、血栓に不可欠な要素である架橋フィブリンの形成および血小板の活性化を誘発する凝固経路を標的とするものである５。ワルファリンなどの確立された治療薬は、ビタミンＫ依存性の凝固因子、例えば第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子などに干渉するものである５。未分画ヘパリンはトロンビンを不活性化するアンチトロンビンの機能を修飾し、低分子量ヘパリンはアンチトロンビンに作用して第Ｘ因子の阻害を増強する５。より新しい経口抗凝固薬として、トロンビンまたは第Ｘａ因子を直接阻害するものがいくつかある。しかし、現在用いられている静脈血栓塞栓症の予防戦略はいずれも、重大な出血リスクを伴うものである５。
【０００５】
血栓形成の予防に効果があり、重大な出血リスクを伴わない予防法が必要とされている。セルピンｆ２（Ｓｆ２、プラスミン阻害剤およびアルファ２−抗プラスミン剤としても知られる）は、第Ｘｉａ凝固因子、活性化プロテインＣおよびプラスミンのセリンプロテアーゼ阻害剤である６，７。最近の試験では、Ｓｆ２阻害およびＳｆ２欠乏は耐容性があり、重大な出血リスクもないことが明らかにされている。それでも、その相互作用の機能的重要性はわかっておらず、血栓形成に対するＳｆ２の寄与も明らかにされていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｓｆ２を直接標的とすることによって血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する方法を提供する。より具体的には、本発明は、Ｓｆ２が第ＸＩａ因子の調節およびプロテインＣの活性化を介して血栓形成に影響を及ぼし、Ｓｆ２の欠乏または不活性化を静脈血栓塞栓症の発症に対する安全な予防法として用い得ることを記載する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明は、リスクがある患者の血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する方法および組成物であって、Ｓｆ２を直接標的とする治療剤を予防量投与することを含む、方法および組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物に使用する治療剤は、Ｓｆ２に直接干渉するか、これを直接阻害して、Ｓｆ２欠乏を引き起こすＳｆ２アンタゴニストである。他の実施形態では、本発明の方法および／または組成物に使用する治療剤は、特に限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、天然抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含めたＳｆ２抗体またはその機能的フラグメントである。本発明に使用するＳｆ２抗体の例としては、特に限定されないが、Ｓｆ２抗体４ｈ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ４ｈ９／）、Ｓｆ２抗体２７ｃ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ２７ｃ９／）およびＴＳ２３（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が挙げられる。本発明は、現時点で知られているもの、または今後開発されるものを問わず、Ｓｆ２に直接干渉するか、これを直接阻害する任意のＳｆ２アンタゴニストおよび／またはＳｆ２抗体を包含する。このような治療剤を同定および／またはスクリーニングする方法は当該技術分野で公知であり、本発明の範囲内で企図される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、外科手術、臥床、遺伝的異常、癌、外傷をはじめとする危険因子による血栓形成またはそれに付随する合併症の予防に本発明の方法および／または組成物を用いる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、現時点で周知のまたは今後開発される、医薬品に使用する任意の生理的に許容される担体、溶媒または補形剤をさらに含む。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、２００９年１０月２３日に出願され現時点で米国特許第９，１５０，９０３号である米国特許出願第１２／５９７，３１１号、２００８年４月２５日に出願され国際公開第２０１０／００８６５３６号として公開されている国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６１６６２号および２００７年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９１３，９１３号に関連する。いくつかの態様では、本開示は、１９９７年９月１９日に出願され現時点で米国特許第６，１１４，５０６号である米国特許出願第０８／９３３，９８３号および１９９６年９月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／０２６，３５６号に関連する。いくつかの態様では、本開示は、２０１４年３月６日に出願され米国特許出願公開第２０１４／０２２００３４号として公開されている米国特許出願第１４／１９８，８０４号、２０１２年９月６日に出願され国際公開第２０１３／０３６５９６号として公開されている国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３９００号および２０１１年９月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５３１，２７８号に関連する。上記出願の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｓｆ２欠乏によって血栓形成が予防されることを示す図である。図１Ａ）は、偽処置マウス、Ｓｆ２＋／＋マウスおよびＳｆ２−／−マウスから単離したＩＶＣの静脈血栓の代表的な画像である。（偽処置大静脈は、摘出を容易にするため、実験終了時にのみ結紮したことに留意されたい）。図１Ｂ）は、マウスの体重に対して正規化した血栓重量（ｍｇ／ｇ）である。対照（Ｓｆ２＋／＋、Ｎ＝７Ｆ、４Ｍ）、偽処置（Ｎ＝４Ｍ）、Ｓｆ２−／−（Ｎ＝１１Ｆ）。平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、ニューマン・クールズ補正。
【図２】血栓形成初期に必要なＳｆ２活性を示す図である。様々な実験群の初期静脈血栓症を検討した。偽処置マウス（静脈結紮を実施していない）、対照マウス（Ｓｆ２＋／＋）、Ｓｆ２欠乏マウス（Ｓｆ２−／−）、生理的量のヒトＳｆ２を投与したＳｆ２欠乏マウス（Ｓｆ２−／−＋Ｓｆ２）、ヒトＳｆ２およびヒトＳｆ２不活性化抗体を投与したＳｆ２欠乏マウス（Ｓｆ２−／−＋Ｓｆ２＋ＴＳ２３）ならびにマウスＳｆ２を不活性化する抗体を投与した正常マウス（Ｓｆ２＋／＋＋４Ｈ９）。マウスの体重に対して正規化した血栓重量の平均±ＳＥＭ（ｍｇ／ｇ）。１グループあたりのマウスの数を示す。対照（Ｓｆ２＋／＋、Ｎ＝７Ｆ、４Ｍ）、偽処置（Ｎ＝４Ｍ）、Ｓｆ２−／−（Ｎ＝１１Ｆ）、Ｓｆ２−／−＋Ｓｆ２（Ｎ＝７Ｆ）、Ｓｆ２−／−＋Ｓｆ２＋ＴＳ２３（Ｎ＝５Ｆ、２Ｍ）、Ｓｆ２＋／＋＋４Ｈ９（Ｎ＝７、４Ｆ、３Ｍ）。平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、ニューマン・クールズ補正。
【図３】Ｓｆ２が血栓形成に対して長時間の効果があることを示す図である。偽処置マウス、対照マウス（Ｓｆ２＋／＋）およびＳｆ２欠乏マウス（Ｓｆ２−／−）の大静脈を結紮してから７日後、血栓形成を評価した。マウスの体重に対して正規化した血栓重量の平均±ＳＥＭ（ｍｇ／ｇ）。偽処置（Ｎ＝５Ｍ）、Ｓｆ２＋／＋（Ｎ＝７Ｆ、４３Ｍ）、Ｓｆ２−／−（Ｎ＝５Ｍ、４Ｆ）、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ＝有意差なし。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本明細書の以下に記載する本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および実施例を参照することによってさらに容易に理解され得る。ただし、本発明の化合物、組成物および方法を開示および記載する前に、本発明が特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件または特定の方法などに限定されず、したがって当然のことながら、様々なものであり得、その多数の修正形態および変形形態が当業者に明らかになることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであって、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１２】
本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数形を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａｎ  ａｇｅｎｔ（薬剤）」と言う場合、そのような様々な薬剤のうちの１つまたは複数のものがこれに包含され、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ（方法）」と言う場合、当業者に公知の同等の段階および方法であって、本明細書に記載される方法に合わせて改変し得るか、これに置き換え得る段階および方法への言及がこれに包含される。
【００１３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的なものであり、列挙される要素以外にもほかの要素が存在し得ることを意味するものとする。
【００１４】
本明細書で使用される「予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅまたはｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）」量は、疾患、疾患の症状もしくは医学的状態の発現の解消もしくは遅延、現れ得る症状の抑制または疾患もしくは症状の発現もしくは再発のリスクの低減をもたらす量を表すものとする。
【００１５】
本明細書で使用される「薬学的に活性な」という用語は、ある物質の生物、特に身体の細胞および組織に対する有益な生物活性を指す。「薬学的に活性な薬剤」または「薬物」とは薬学的に活性な物質のことであり、「薬学的に活性な成分」（ＡＰＩ）とは薬物中の薬学的に活性な物質のことである。本明細書で使用される薬学的に活性な薬剤には、合成または天然の小分子薬物およびさらに複雑な生体分子が含まれる。
【００１６】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認されている、一般的に認められている薬局方（例えば、米国薬局方）に記載されている、あるいは動物、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物に使用しても安全であることを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のＳｆ２アンタゴニストなどの化合物の酸付加塩または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩とは、親化合物の活性を保持し、投与する対象に対しても、投与する状況においても、有害作用も望ましくない作用も一切もたらさない任意の塩のことである。薬学的に許容される塩は、特に限定されないがシステインを含めたアミノ酸に由来するものであり得る。塩としての化合物を生成する方法は当業者に公知である（例えば、Ｓｔａｈｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｚｕｒｉｃｈ，２００２；Ｂｅｒｇｅら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１，１９７７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される塩」は、本明細書に記載される化合物の遊離酸または遊離塩基の塩であって、無毒性であるか、生物学的耐容性を示すか、あるいは対象に投与するのに生物学的に適している塩を意味するものとする。一般には、Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照されたい。好ましい薬学的に許容される塩は、薬学的効果があり、過度の毒性も刺激もアレルギー反応も引き起こさずに対象の組織に接触させるのに適しているものである。本明細書に記載される化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、その両方の種類の官能基または各種類のうちの２つ以上を有し、したがって、いくつかの有機塩または有機塩基ならびに無機酸および有機酸と反応して薬学的に許容される塩を形成し得る。
【００１８】
薬学的に許容される塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩およびマンデル酸塩が挙げられる。
【００１９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、Ｓｆ２アンタゴニストなどの化合物とともに投与する補形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または賦形剤を指す。このような担体は、無菌の液体、例えば水のほか、石油、動物、植物または合成起源の油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールをはじめとする合成溶媒を含めた油などであり得る。このほか、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調節する物質が担体となり得る。担体と組み合わせた組成物を作製する方法は当業者に公知である。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される担体」という語は、医薬品投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含するものとする。薬学的に活性な物質へのこのような媒質および薬剤の使用は当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ  ２００３）を参照されたい。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物に不適合である場合を除き、組成物へのそのような使用が企図される。
【００２０】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、「〜からなる」および／または「〜から実質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
【００２１】
特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明の実施には、特に明示されない限り、従来の細胞生物学、分子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の技術を用いる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，最新版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，最新版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，最新版（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１−８６３；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅａｒｓｅ，Ａ．Ｇ．Ｅ．，第１巻（１９８０）、第２巻（１９８５）および第３巻（１９９０）を参照されたい。
【００２２】
以下の説明では、免疫学の分野の当業者に周知の様々な方法論を参照する。免疫学の一般的原則を記載した標準的な参考文献としては、Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｎｏｎｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．ら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）のＣａｍｐｂｅｌｌ，Ａ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」；およびＥｉｓｅｎ，Ｈ．Ｎ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８０）が挙げられる。
【００２３】
本発明は、Ｓｆ２アンタゴニストでＳｆ２を標的化することによって血栓形成を予防する方法および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、Ｓｆ２が第ＸＩａ因子の調節およびプロテインＣの活性化を介して血栓形成に直接影響を及ぼし、Ｓｆ２の欠乏または不活性化を静脈血栓塞栓症の発症に対して予防的に用い得ることを記載する。
【００２４】
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｓｆ２が急性および慢性の血栓形成にｉｎ  ｖｉｖｏで直接影響を及ぼすことを初めて記載する。予防的抗凝固剤に関するこれまでの報告と同じく、本発明は、Ｓｆ２欠乏またはＳｆ２抗体の予防的投与によって静脈血栓形成が著明に減少し、Ｓｆ２を標的とする予防法が血栓症およびそれに付随する合併症の発生を効率的に予防し得ることがわかったことを示すものである。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本発明は、必要とする個体の血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する方法であって、個体にＳｆ２アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む組成物を血栓予防量投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する方法であって、必要とする個体にＳｆ２の活性または濃度を低下させるＳｆ２アンタゴニストを予防有効量投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態では、治療剤は、Ｓｆ２に直接的または間接的に干渉するか、これを直接的または間接的に阻害してＳｆ２欠乏を引き起こす、Ｓｆ２アンタゴニストである。ある特定の実施形態では、治療剤は、Ｓｆ２アンタゴニストとしての能力、例えば、Ｓｆ２に干渉するかこれを阻害してＳｆ２欠乏を引き起こす能力などを有する、天然または合成の抗体、ペプチド、核酸、受容体デコイ、リボザイム、センスポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＤＮＡアプタマー、化学剤をはじめとする小分子である。
【００２７】
ある特定の実施形態では、Ｓｆ２アンタゴニストは、Ｓｆ２の活性部位に直接結合するか、Ｓｆ２の他の領域に間接的に結合して、Ｓｆ２活性を封鎖またはその他の方法で低下または減少させることによって、Ｓｆ２の活性レベルを阻害するか、抑制するか、遮断するか、これに干渉し、それにより血栓形成を予防する。本明細書で使用される、Ｓｆ２アンタゴニストは、Ｓｆ２の遺伝子、タンパク質および／または活性レベルを阻害するか、抑制するか、遮断するか、これに干渉して、Ｓｆ２欠乏を引き起こす薬剤を指す。本発明は、現時点で知られている、または今後開発される、任意のＳｆ２アンタゴニストを包含する。Ｓｆ２アンタゴニストをスクリーニングおよび／または同定する方法は当該技術分野で周知であり、本発明の範囲に企図される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、イムノアッセイ条件下でＳｆ２アンタゴニストを明らかにすることができる。指定のイムノアッセイ条件下では、Ｓｆ２抗体（またはその他の種類のアンタゴニスト）はＳｆ２と結合し、試料中に存在する他のポリペプチドと有意な量で結合することはない。抗体などの分子とＳｆ２との選択的結合は、Ｓｆ２の特定のエピトープまたはペプチドに対する選択性を含み得る。Ｓｆ２の特定のポリペプチドと選択的に結合する抗体の選択には、様々なイムノアッセイ形式を用い得る。例えば、ポリペプチドに選択的な免疫反応性を示す抗体の選択には、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイをルーチンに用いる。選択的結合の判定に用いることができるイムノアッセイの形式および条件に関する記述については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，最新版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい。
【００２９】
ある特定の実施形態では、治療剤は、特に限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、天然抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含めたＳｆ２抗体またはその機能的フラグメントである。「抗体」（Ａｂ）という用語は、インタクトの分子のほかにも、Ｓｆ２と特異的に結合することが可能な抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）、一本鎖抗原結合タンパク質、「ヒト化」抗体およびキメラ抗体を包含するものとする。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクト抗体のＦｃフラグメントがなく、循環中から迅速に除去されるほか、インタクト抗体の非特異的組織結合が少なくなり得る。
【００３０】
本発明は、任意の動物種またはヒトに由来し、現時点で知られている、またはのちに開発される任意のＳｆ２抗体を包含する。哺乳動物からＳｆ２抗体を開発および／または作製する方法または抗体をヒト化する方法は当該技術分野で周知であり、本発明の範囲に企図される。本発明に使用するのに適したＳｆ２抗体の例としては、特に限定されないが、Ｓｆ２抗体４ｈ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ４ｈ９／）、Ｓｆ２抗体２７ｃ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ２７ｃ９／）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）およびＴＳ２３（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が挙げられる。
【００３１】
Ｒｅｅｄらに対する米国特許第６，１１４，５０６号、同第９，１５０，９０３号および米国特許出願公開第２０１４０２２００３４号には、特に限定されないが、ＭＡｂ４９Ｃ９、７０Ｂ１１、７７Ａ３およびＲＷＲ（およびそのフラグメント）を含めたＳｆ２アンタゴニストの特定の他の使用が開示されており、これらの分子（およびその免疫学的分子の結合領域のアミノ酸配列）はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
さらなる例示的Ｓｆ２アンタゴニストとしては、以下の市販の抗体：ＭＡＰ４Ｈ９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社）、２７Ｃ９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社）、１４ＡＰ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＭＰＷ１４ＡＰ（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ社）、３６１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に対するモノクローナル抗体、Ｓｆ２（Ｂｉｏｐｏｏｌ社）に対するヤギポリクローナル抗体ならびにＧｅｎｅｔｅｘ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手可能なＳｆ２に対するその他の抗ヒトポリクローナル抗体および抗ヒトモノクローナル抗体が挙げられる。本発明はこのほか、分子生物学技術によって構築されたヒト化抗体およびヒト抗体の使用を企図する。
【００３３】
本発明での使用に適した抗体は、様々な方法によって調製され得る。例えば、Ｓｆ２を発現する細胞（またはその画分、ライセートなど）を動物に投与して、Ｓｆ２と結合することが可能なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。いくつかの方法では、Ｓｆ２抗体の調製物を調製し、天然の夾雑物を実質的に含まないよう精製する。次いで、このような調製物を動物に導入して、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を作製する。
【００３４】
抗体はほかにも、ファージディスプレイ技術を用いて調製され得る。ファージディスプレイを用いて抗体を調製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；Ｃｌａｒｋｓｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｈｕｓｅ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｋａｎｇ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１１１２０−１１１２３；Ｍａｒｋｓ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照されたい。
【００３５】
いくつかの場合には、様々な宿主からモノクローナル抗体を調製するのが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製する技術に関する記載は、Ｓｔｉｔｅｓら編，「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，第４版）、およびそこに引用されている参考文献ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８にみることができる。例えば、ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。このような方法では一般に、抗原またはその抗原を発現する細胞で動物（多くの場合、マウス）を感作する。好ましい抗原は、精製したＳｆ２またはそのフラグメントである。適切な細胞は、それが抗Ｓｆ２抗体を分泌する能力を有することで識別することができる。このような細胞を任意の適切な組織培地、例えば、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活性化したもの）を添加し、約１０ｕｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したアールの改変イーグル培地で培養し得る。このようなマウスの脾細胞を抽出し、適切なミエローマ細胞系と融合する。体細胞融合の方法は、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）に記載されている。融合した後、生じたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓら，１９８１，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２に記載されている通りに限界希釈によってクローン化する。次いで、このような選択によって得たハイブリドーマ細胞をアッセイして、Ｓｆ２と結合することが可能な抗体を分泌するクローンを特定する。
【００３６】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２をはじめとするフラグメントは、本明細書に開示される方法に従って使用し得ることが理解されよう。このようなフラグメントは通常、パパイン（Ｆａｂフラグメントが生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生じる）などの酵素を用いるタンパク質分解切断によって作製する。あるいは、組換えＤＮＡ技術の適用、合成化学、ビオチン化をはじめとする当該技術分野で公知の任意の適切な手段によってＳｆ２アンタゴニストフラグメントを作製することができる。
【００３７】
このほか、ＭＡｂを産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を用いて作製されるヒト化抗体またはキメラ抗体が本発明の範囲内に含まれる。ヒト化抗体とは、マウスＡｂのフレームワーク領域をはじめとする領域が非マウス抗体の相同領域に置き換わっている抗体のことである。キメラ抗体とは、マウス定常領域を非マウス定常領域に置き換えた抗体のことである。キメラ抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５）；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）のほか、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号（１９８９年３月２８日）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，欧州特許第１７１４９６号（１９８６年２月１９日）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許第１７３４９４号（１９８６年３月５日）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，国際公開第８６０１５３３号（１９８６年３月１３日）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，国際公開第８７０２６７１号（１９８７年５月７日）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６（１９８４）；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０（１９８５）を参照されたい。ヒト化抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−７８３（１９９１）を参照されたい。
【００３８】
本発明ではこのほか、（１）ヒトおよびヒト以外の循環中Ｓｆ２ならびに（２）ヒトおよびヒト以外のフィブリン架橋Ｓｆ２の両方と結合することが可能な抗体が提供される。このような抗体は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，０９１，５１３号；および同第５，４５５，０３０号（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ほかにも、上記の抗体の変異体が本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、記載されている通りに（Ｒｅｅｄ，Ｇ．Ｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ  ｔｈａｔ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｉｍａｌ  ｐｌａｓｍａｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９９７；１６：２８１−２８６）体細胞融合し、Ｓｆ２との特異的結合に関して選択し、クローン化し、精製することによってＭＡｂを作製する。これらのＭＡｂの血清型は、４９（Ｉｇγ２ａＫ）、７７（Ｉｇγ２ａＫ）、ＲＷＲ（Ｉｇγ１ａＫ）である。いくつかの実施形態では、Ｒｅｅｄら，１９９２，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６８：３１５−３２０に記載されている通りに、ＮＨ２−末端およびＣＯＯＨ−末端を模倣するペプチドに対してポリクローナル抗体を作製する。
【００４０】
本発明ではこのほか、明らかに抗体またはそのフラグメントではないＳｆ２アンタゴニストが提供される。このようなＳｆ２アンタゴニストのスクリーニングは当該技術分野で日常的なものである。目的とする特定の既知の化合物またはコンビナトリアル化学技術によって作製した化合物のライブラリーを例えば、所望の結合活性および変換活性に関してスクリーニングすることができる。さらに、ファージディスプレイ技術を用いて、例えば所望の結合活性および変換活性に関して、ペプチドを同定することができる。ファージディスプレイは一般に、ペプチドまたはタンパク質の変異体のライブラリーをファージビリオンの外側に発現させ、各変異体をコードする遺伝物質はファージビリオンの内側に存在する選択技術を表す（Ｓｉｄｈｕら，２００３，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４：１４；Ｆｅｒｒｅｒら，１９９９，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．：５４，３２；ＢｏｕＨａｍｄａｎら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８００９）。これにより、各変異体タンパク質の配列とそれをコードするＤＮＡとの間に物理的関係が生じ、パニングと呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択過程によって、所与の標的分子に対する結合親和性に基づく迅速な分離が可能になる（Ｗｈａｌｅｙら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０５，６６５）。その最も単純な形態では、ファージディスプレイされたペプチドのライブラリーを標的でコートしたプレート（またはビーズ）でインキュベートし、未結合ファージを洗い流し、特異的に結合したファージを溶離させることによってパニングを実施する。次いで、溶離したファージを増幅し、結合／増幅サイクルをさらに実施してプールを濃縮し、結合配列が優勢な状態にする。３〜４ラウンド実施した後、ＤＮＡシーケンシングおよびＥＬＩＳＡによって個々のクローンの特徴を明らかにする。ファージディスプレイ技術の多数の変形形態が当業者に公知であり、これを本発明の目的に適合させることができる。
【００４１】
一実施形態では、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（マサチューセッツ州）などが供給するファージディスプレイペプチドライブラリーを用いる。予め作製されたランダムペプチドライブラリーであるＰｈ．Ｄ．ライブラリーは、エピトープマッピング、タンパク質−タンパク質接触の特定（ＲｏｚｉｎｏｖおよびＮｏｌａｎ，１９９８，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−２８）および酵素阻害剤（Ｒｏｄｉら，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：１９７−２０３）を含めた多種多様な類似の用途に用いられている。
【００４２】
本明細書で使用される「患者」または「個体」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のことである。本明細書で使用される「投与」という用語は、細胞内または患者体内に組成物を投入する様々な手段を指す。これらの手段は当該技術分野で周知であり、非経口送達のための注射または注入；経口投与のための錠剤、丸剤、カプセル剤をはじめとする固形物；経鼻液剤またはスプレー剤；エアゾール剤；吸入剤；局所製剤；リポソーム形態などがこれに含まれ得る。本明細書で使用される「予防量」、「有効量」および「治療量」という用語は、所望の結果をもたらす量を指し、選択したＳｆ２アンタゴニストの比活性および患者の状態に応じて当業者が容易に決定し得るものである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、有効量のＳｆ２アンタゴニストを含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、血栓形成またはそれに付随する合併症を予防するのに有用である。
【００４４】
本発明による適切な医薬組成物は一般に、意図する用途に応じて様々な最終濃度になるよう一定量の有効成分と無菌水溶液などの許容される医薬品用の希釈剤または補形剤とを混合したものを含み得る。調製技術は一般に、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０によって例示されるように、当該技術分野で周知である。調製物をヒトに投与するには、必要とされる無菌性、発熱原性および全般的安全性のほか、純度基準を満たすべきであることが理解されるべきである。
【００４５】
本発明の組成物は、様々な投与手段に合わせて製剤化され得る。本明細書で使用される投与「経路」という用語は、特に限定されないが、皮下注射、静脈内注射、眼内注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、硬膜外投与、吸入、鼻腔内投与、経口投与、舌下投与、バッカル投与、直腸内投与、膣内投与および局所投与を包含するものとする。ペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、アンチセンス核酸、受容体デコイ、リボザイム、センスポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アプタマーまたは小分子アゴニストを有効成分として含有する水性組成物の調製は、当業者には本開示を踏まえればわかるであろう。このような組成物は通常、液状の溶液または懸濁液のいずれかの注射用液として調製することができるほか、注射前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製するのに用いるのに適した固体形態を調製しても、調製物を乳化してもよい。
【００４６】
注射用途に適した医薬形態としては、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射用の溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、その形態は、無菌状態であり、かつ注射針を通過できる程度の流動性を有するべきである。また、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物による汚染活動から保護されるべきである。
【００４７】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態の無菌水性組成物に製剤化することができる。ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての溶液を調製することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成されるもの）および例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される塩などが挙げられる。このほか、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などおよび有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから、遊離カルボキシル基と形成される塩を誘導することができる。
【００４８】
適切な担体としては、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒ならびに分散媒が挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。しかるべき流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子径の維持によって、および／または界面活性剤の使用によって維持することができる。
【００４９】
通常の保管条件および使用条件下では、調製物は一般に、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有するべきである。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、微生物の作用を防ぐことができる。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【００５０】
製剤化の前または製剤化の際に、必要に応じて、望ましくない小分子量分子を除去するために本発明の組成物を透析し、かつ／または所望の賦形剤への製剤化を容易にするために凍結乾燥させ得る。必要量の活性な薬剤を上記の様々な他の成分とともにしかるべき溶媒に組み込んだ後、所望に応じてろ過滅菌することにより、無菌注射用液を調製することができる。分散液は一般に、基礎となる分散媒と上記の他の成分のうち必要な成分とを含有する無菌賦形剤に、滅菌した様々な有効成分を組み込むことによって調製する。
【００５１】
無菌注射用液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過した溶液から有効成分に任意の追加の所望の成分が加わった粉末が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｓｆ２アンタゴニストと、直接的または間接的に血栓形成の予防を促進するよう作用する追加の薬剤とを患者に共投与することを含む。このような追加の薬剤は、本開示のＳｆ２アンタゴニストと別個に投与しても共投与してもよい。「共投与」という用語は、Ｓｆ２アンタゴニストと追加の薬剤をそれぞれの薬理活性の時間が重なる時間枠内に投与することを意味するものとする。Ｓｆ２アンタゴニストと追加の薬剤は、同時に投与しても逐次的に投与してもよい。いくつかの実施形態では、Ｓｆ２アンタゴニストを抗凝固剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血小板剤および線維素溶解促進剤からなる群より選択される有効量の薬学的に活性な薬剤と共投与することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、製薬方法を用いて作用持続時間を制御し得る。Ｓｆ２アンタゴニストと複合体を形成するか、Ｓｆ２アンタゴニストを吸収するポリマーを用いることによって、制御放出製剤を得ることができる。しかるべき高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）を選択することによって、制御送達を実施し得る。ほかにも、このような高分子の濃度変化させることによって、Ｓｆ２アンタゴニストの放出速度を制御し得る。作用持続時間を制御する方法としてほかにも、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー物質の粒子内に治療剤を組み込む方法が考えられる。あるいは、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリル酸）マイクロカプセルの使用によって調製したマイクロカプセル、あるいはコロイド薬物送達システム、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセルで、あるいはマクロエマルションに治療剤を封入することが可能である。このような教示は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編，Ｍａｃｋ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９８０）に開示されている。
【００５４】
ある特定の実施形態では、外科手術、臥床、遺伝的異常、癌、外傷をはじめとする危険因子に起因する血栓形成またはそれに付随する合併症の予防に本発明の方法を用いる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明は、リスクのある患者の血栓形成またはそれに付随する合併症を予防する組成物であって、Ｓｆ２を標的とする治療剤を予防量含む組成物を提供する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、生理的に許容される担体、溶媒または補形剤をさらに含む。本発明は、当該技術分野において現時点で知られている、または今後開発される任意のこのような担体、溶媒または補形剤を企図する。
【００５７】
本開示を踏まえれば、当業者にはその他の実施形態および用途が明らかである。当業者には、本発明の実施形態に多数の変更および改変を施すことが可能であり、そのような変更および改変は本発明の趣旨を逸脱することなく施すことが可能であることが理解されよう。したがって、添付の「特許請求の範囲」は、そのようなあらゆる等価の変形形態を本発明の本来の趣旨の範囲内に収まるものとして包含するものとする。
【００５８】
本明細書全体を通じて、様々な刊行物および引用物が参照され、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明をさらに詳細に説明するため、以下に実施例を記載する。これは、本発明を限定することではなく、説明することを目的とするものである。
【実施例】
【００５９】
実施例１
材料および方法
方法
動物試験は施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたものである。Ｓｆ２レベルが正常な（Ｓｆ２＋／＋）Ｃ５７Ｂｌ６マウスまたはＳｆ２欠乏（Ｓｆ２−／−）Ｃ５７Ｂｌ６マウスを試験した。
【００６０】
静脈血栓症
マウスにノーズコーンを用いて２％イソフルランで麻酔をかけ、１〜２％に維持した。マウスを３７℃の加温パッドの上に背殿位で置いた。前腹部を剃毛した。腹部にクロルヘキシジン溶液を噴霧し、手術部位が清潔になるまで滅菌ガーゼで拭いた。正中切開を実施して開腹した。下大静脈（ＩＶＣ）を可視化した後、イソフルランを１〜２％の維持レベルまで減量し、十分な麻酔を維持しながら酸素速度を０．２リットル／分に維持する。
【００６１】
一部の実験群では、ヒトＳｆ２（４．９ｍｇ／ｋｇ、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）またはＳｆ２抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、４ｈ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ４ｈ９／）、Ｓｆ２抗体２７ｃ９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎｏｖ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ−ｍｏｕｓｅ−ｍｏｎｃｌｏｎａｌ−ｔｏ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｍａｐ２７ｃ９／）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）またはＴＳ２３（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をＩＶＣの側枝から投与した。次いで、腎静脈から腸骨分岐までの全ＩＶＣ側枝を７−０の非反応性プロレン縫合糸で結紮する。ＩＶＣを腎動脈下部で結紮したところ、血栓が発生した。開腹術部位を二層法で閉じた。マウスの術後鎮痛剤として０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下投与した。指定した時点で、承認された方法を用いて人道的に安楽死させた。心臓穿刺により血液を単離した。結紮部位の真上から腸骨分岐までのＩＶＣを付着した組織から慎重に剥離し、重量を測定した。大静脈結紮を実施したマウスの重量または大静脈および血栓から、大静脈を結紮せずに同じ外科手術を実施した偽処置マウスの大静脈の平均重量を減じることにより、血栓重量を求めた。血栓重量をマウスの体重に対して正規化した。
【００６２】
統計処理
ニューマン・クールズ補正を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによりデータを解析した。ｐ値０．０５未満を有意であるとした。
【００６３】
実施例２
Ｓｆ２欠乏が血栓形成を予防する
これまでの試験から、静脈の血塊または血栓は大静脈結紮後から数時間にわたって発生し、約２４時間後に最大になることがわかっている８。Ｓｆ２が初期の血栓発生に影響を及ぼすかどうかを明らかにするため、大静脈結紮から５時間後にマウスを検査した。大静脈を結紮せずに外科的処置を実施した偽処置マウスには、検出可能な血栓形成は認められなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。対照（Ｓｆ２＋／＋）マウスには大きな血栓が発達し、腸骨静脈に至るまで大静脈を塞いでいた。これに比較して、コンジェニックＳｆ２欠乏（Ｓｆ２−／−）マウスでは血栓形成がほとんど消失していた。Ｓｆ２＋／＋マウスの典型的な静脈血栓の横断面を検査したところ、マルチウス・スカーレットブルー染色によって検出されるフィブリンに富む血栓による静脈閉塞が見られたが、Ｓｆ２−／−マウスには有意な血栓は認められなかった。静脈重量を考慮に入れると、Ｓｆ２＋／＋マウスの血栓重量は、Ｓｆ２−／−マウスに検出された血栓重量の３倍超であった（図１、ｐ＜０．００１）。以上のデータをまとめると、Ｓｆ２欠乏が血栓形成を予防することがわかる。
【００６４】
実施例３
Ｓｆ２抗体はＳｆ２によって直接制御される血栓形成を阻害する
遺伝子欠失があると個体に代償性変化が生じ、これが結果に影響を及ぼすことがある。Ｓｆ２が血栓形成に直接寄与することを裏付けるため、静脈結紮の前に生理的レベルのＳｆ２をマウスに投与した。Ｓｆ２を投与したＳｆ２−／−マウスを対照Ｓｆ２＋／＋マウスと比較したところ、ほぼ同じ大きさの静脈血栓形成がみられた（図２）。これに対し、生理的量のヒトＳｆ２を投与したＳｆ２−／−マウスにはＳｆ２−／−マウスの３倍超の大きさの血栓がみられた（ｐ＜０．００１）。
【００６５】
Ｓｆ２が初期の血栓形成に寄与することを示す証拠をさらに得るため、Ｓｆ２を投与したＳｆ２−／−マウスに抗ヒトＳｆ２抗体（ＴＳ２３）を投与した。Ｓｆ２を投与したＳｆ２−／−マウスでは、Ｓｆ２抗体による血栓形成の著明な減少がみられ、実際、血栓の大きさの減少は、Ｓｆ２を投与していないＳｆ２−／−マウスでみられるレベルと同程度であった。Ｓｆ２＋／＋マウスでも同様に、別の抗マウスＳｆ２抗体（４Ｈ９）により、Ｓｆ２抗体を投与していないＳｆ２＋／＋マウスと比較して血栓形成が予防された（ｐ＜０．００１）。また別の抗マウスＳｆ２抗体２７Ｃ９で処置したマウスにも血栓形成の阻害がみられた（不掲載）。以上のデータをまとめると、Ｓｆ２自体が血栓形成を制御しており、Ｓｆ２抗体の予防的投与によって血栓形成を阻害することが可能であることがわかる。
【００６６】
血栓形成は何時間にもわたって進行することから、Ｓｆ２欠乏マウスにみられる初期の静脈血栓減少が持続するものであるかどうかを明らかにした。対照Ｓｆ２＋／＋マウスでは、大静脈の結紮から７日後に偽処置マウスと比較して有意な血栓形成がみられた（図３、ｐ＜０．００１）。実際、対照マウスでは、７日後の血栓の大きさは、５時間後にみられた血栓の２倍超であった（図２対図３）。これに対し、大静脈の結紮から７日後のＳｆ２欠乏マウスには、偽処置マウスと比較しても、５時間後のＳｆ２欠乏マウスと比較しても、有意な血栓形成はみられなかった（ｐ、ＮＳ）。
【００６７】
（参考文献）
１．Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＲＪ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＦＡ，Ｋｉｅｆｅ  ＣＩ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＦＡ．Ｓｅｃｕｌａｒ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ：Ｔｈｅ  ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  ｖｔｅ  ｓｔｕｄｙ（１９８５−２００９）．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；１２７：８２９−８３９  ｅ８２５
２．Ｓｈｏｒｒ  ＡＦ．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；１２０：Ｓ３５−４１
３．Ｂｅｃｋｍａｎ  ＭＧ，Ｈｏｏｐｅｒ  ＷＣ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ  ＳＥ，Ｏｒｔｅｌ  ＴＬ．Ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ：Ａ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｃｏｎｃｅｒｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３８：Ｓ４９５−５０１
４．Ｇｕｙａｔｔ  ＧＨ，Ａｋｌ  ＥＡ，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  Ｍ，Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ  ＤＤ，Ｓｃｈｕｕｎｅｍａｎｎ  ＨＪ．Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  ｓｕｍｍａｒｙ：Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，９ｔｈ  ｅｄ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ｃｈｅｓｔ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｃｈｅｓｔ．２０１２；１４１：７Ｓ−４７Ｓ
５．Ｈｉｒｓｈ  Ｊ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｍ，Ｗｅｉｔｚ  ＪＩ．Ｎｅｗ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：４５３−４６３
６．Ｓａｉｔｏ  Ｈ，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＧＨ，Ｍｏｒｏｉ  Ｍ，Ａｏｋｉ  Ｎ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ２−ｐｌａｓｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９７９；７６：２０１３−２０１７
７．Ｈｅｅｂ  ＭＪ，Ｇｒｕｂｅｒ  Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃ  ｂｙ  ａｌｐｈａ  ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ｘａ，ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１７６０６−１７６１２
８．Ａｇｈｏｕｒｉａｎ  ＭＮ，Ｌｅｍａｒｉｅ  ＣＡ，Ｂｌｏｓｔｅｉｎ  ＭＤ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１２；１０：４４７−４５２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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