(57)【要約】  対象におけるがんを治療する方法が開示される。方法は、対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）阻害剤を投与することを含み、がんは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない。ＣＫＩ阻害剤の追加の使用も開示される。
2017506259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）阻害剤を投与し、それによって前記がんを治療することを含み、前記がんが大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない方法。
【請求項２】
がんを治療するためのカゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）阻害剤の使用であって、前記がんが大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない使用。
【請求項３】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に治療有効量のＰＦ６７０４６２を投与し、それによって前記がんを治療することを含み、前記がんが慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ではない方法。
【請求項４】
がんを治療するためのＰＦ６７０４６２の使用であって、前記がんがＣＬＬではない使用。
【請求項５】
それを必要とする対象における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩ阻害剤を投与し、それによって前記ＣＭＬを治療することを含み、前記ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ関連ＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬからなる群から選択される方法。
【請求項６】
ＣＭＬを治療するためのカゼインキナーゼＩ阻害剤の使用であって、前記ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬからなる群から選択される使用。
【請求項７】
それを必要とする対象に細胞を移植する方法であって、
（ａ）血液または骨髄からの未熟血液細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ前記血液または骨髄中の前記未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量と接触させることによって、対象の血液または骨髄からの前記未熟血液細胞を枯渇させること；およびその後：
（ｂ）前記対象に細胞を移植すること
を含む方法。
【請求項８】
対象の血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させる方法であって、幹細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ前記血液または骨髄中の前記未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、それによって前記血液または骨髄からの前記未熟血液細胞を枯渇させることを含む方法。
【請求項９】
ＣＫＩδおよび／またはＣＫＩεよりもＣＫＩαへの少なくとも２倍大きい阻害活性を有する小分子を含む物質の組成物。
【請求項１０】
前記枯渇させることの前に、前記骨髄から前記血液への前記未熟血液細胞の動員を誘導することをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＫＩα阻害剤が、ｐ５３を上方制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤と少なくとも同じくらい効果的である、請求項１または２に記載の方法または使用。
【請求項１２】
前記阻害剤が、ＣＫＩαまたはそれをコードするポリヌクレオチドに結合する、請求項１、２、７および８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記阻害剤が、ＣＫＩまたはそれをコードするポリヌクレオチドに結合する、請求項５または６に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記阻害剤がＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を活性化する、請求項１、２および５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
前記ＣＫＩ阻害剤がＣＫＩα阻害活性を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
前記ＣＫＩ阻害剤がＣＫＩδおよび／またはＣＫＩ−ε阻害活性をさらに含む、請求項１５に記載の方法または使用。
【請求項１７】
前記ＣＫＩ阻害剤がＣＫＩδおよびＣＫＩ−ε阻害活性を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記阻害剤が小分子阻害剤である、請求項１、２および５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記阻害剤がＰＦ６７０４６２である、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記阻害剤がＲＮＡサイレンシング剤である、請求項１、２および５から８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記サイレンシング剤がＣＫＩαを標的とする、請求項２０に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記未熟血液細胞が幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
前記未熟血液細胞ががん幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触させることをｉｎ  ｖｉｖｏで実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触させることをｅｘ  ｖｉｖｏで実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触させることをアフェレーシス中に実施する、請求項８または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記枯渇させることを照射も化学療法もなしで実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項２８】
前記枯渇させることを照射および／または化学療法と組み合わせて実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんが血液悪性腫瘍である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３０】
前記血液悪性腫瘍が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ＣＭＬ移行期、または急性転化、多発性骨髄腫、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、急性未分化型白血病（ＡＵＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、成人Ｔ細胞ＡＬＬ、三血球系骨髄形成異常を伴うＡＭＬ（ＡＭＬ／ＴＭＤＳ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および骨髄肉腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法または使用。
【請求項３１】
前記血液悪性腫瘍が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項２９または３０に記載の方法または使用。
【請求項３２】
前記ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、イマチニブ関連ＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、および骨髄性またはリンパ性急性転化期ＣＭＬからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３３】
前記対象にイマチニブを投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３４】
前記対象にイマチニブ、ダサチニブおよびニロチニブからなる群から選択される薬剤を投与しない、請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３５】
前記がんが乳がんまたはメラノーマである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３６】
前記ＣＫＩα阻害剤がＣＫＩδまたはＣＫＩεよりもＣＫＩαに関する少なくとも２倍の阻害活性を有する、請求項１または２に記載の方法または使用。
【請求項３７】
幹細胞を枯渇させるのに有用な薬剤を同定するかつ任意に作製する方法であって、
（ａ）候補薬剤の存在下でＣＫＩの活性および／または発現を決定すること；
（ｂ）前記ＣＫＩの活性および／または発現を下方制御し、かつｐ５３の活性および／または発現を上方制御する薬剤を選択し、それによって幹細胞を除去するのに有用な薬剤を同定すること
を含む方法。
【請求項３８】
前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞ががん幹細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、細胞移植前に、がんに関する治療としてのまたは前治療としての前記候補薬剤の効果を試験することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記候補薬剤を合成することをさらに含む、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野および背景】
【０００１】
本発明は、その一部の態様では、造血幹細胞およびがん幹細胞を含む幹細胞を除去する方法に関する。
【０００２】
Ｗｎｔ経路は、虫から人間まで進化全体を通して高度に保存されており、胚発生および疾患において重要な役割を果たしている。Ｗｎｔシグナル伝達は、キナーゼおよびホスファターゼのセットによって厳しく制御され、カスケードの種々の構成要素に働き、生物の生涯中に様々な細胞運命につながる。
【０００３】
古典的Ｗｎｔ経路の主な標的は、細胞質β−カテニンであり、これは、増殖、分化、移動および生存の遺伝子に関する転写コアクチベーターとして役立つ。シグナルの伝達は、Ｗｎｔリガンドの存在または非存在に依存する。休止組織では、Ｗｎｔリガンドの非存在下で、β−カテニンは、常にリン酸化され、多タンパク質複合体によって分解され、したがって、細胞において低レベルで維持される。分裂細胞では、成体の自己再生組織においておよび胚形成全体を通して、分泌されたＷｎｔタンパク質は、細胞膜上のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーのメンバーおよび共受容体ＬＲＰ５／６に結合する。Ｗｎｔ結合は、ディシェベルド（Ｄｖ１）を活性化し、細胞質におけるβ−カテニン分解複合体の解離およびβ−カテニンの安定化をもたらす。これは、核中へのβ−カテニンのトランスロケーションおよびＴｃｆ／Ｌｅｆ依存性転写を通したその標的遺伝子（たとえばｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１）の活性化を可能にする。古典的Ｗｎｔシグナルの調節解除は、様々ながんにつながり、その中には、直腸結腸癌腫（ＣＲＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびメラノーマがある。かかるがんでは、１つ以上のＷｎｔ構成要素がしばしば変異され、核β−カテニンの異常な蓄積をもたらす。これは、細胞におけるβ−カテニンレベルに関する厳しい制御の要求を説明する。
【０００４】
β−カテニンがリン酸化され、分解される機構は、最近になってやっと明らかにされ、これは、Ｗｎｔシグナル伝達経路における重要な役者を強調している。β−カテニン分解複合体は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制因子、アキシン１またはアキシン２（足場機能を果たすと考えられている）、および４つのＮ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基上でβ−カテニンをリン酸化する２つのセリン／トレオニンキナーゼ：カゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）からなる。この現象は、β−カテニンをＳＣＦβ-TrCP  Ｅ３ユビキチンリガーゼによるユビキチン化およびその後のプロテアソーム分解に関してマークする。最初のリン酸化現象は、β−カテニンのＳｅｒ４５をリン酸化するＣＫＩによって媒介されることが最近示された。これは、ＧＳＫ３に関するプライミング部位を創出し、その後、ＧＳＫ３は、Ｔｈｒ４１、Ｓｅｒ３７およびＳｅｒ３３をリン酸化する。最後の２つの残基は、リン酸化された場合、Ｅ３リガーゼβＴｒＣＰに関するドッキング部位として役立ち、これは、β−カテニンを分解に関してマークする。
【０００５】
ＣＫＩの関与は、β−カテニン下方制御につながるカスケードを駆動するのに必要かつ十分であることが明らかにされた。これは、ショウジョウバエにおけるＷｎｔ構成要素の相同体に関する研究と一致し、したがって、ＣＫＩをＷｎｔアンタゴニストとして指定する。他方、ツメガエルおよびシノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における発生研究は、ＣＫＩをＷｎｔエフェクターとして関連づけ、ＣＫＩが二次的体軸および胚極性を促進する（Ｗｎｔ効果）ことを示した。それを支持するのは、ＣＫＩが別のＷｎｔエフェクターであるＤｖｌをリン酸化かつ活性化し、それによってβ−カテニンレベルを増加させるという知見である。
【０００６】
米国特許出願第２００５０１７１００５号は、β−カテニンリン酸化を調節する方法を教示している。
【０００７】
米国特許出願第２００９０００５３３５号は、ＡＰＣ遺伝子における変異を有するがん細胞をＢ−カテニンを上方制御する組成物を提供することによって治療することを教示している。
【０００８】
米国特許出願第２０１１００７６６８３号は、白血病の治療に関するＷｎｔ阻害剤を教示している。
【０００９】
追加の背景技術は、米国特許出願第２００８０１４６５５５号、ＷＯ２０１４０２３２７１および米国特許出願第２０１００１７９１５４号を含む。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一部の態様の側面によれば、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）阻害剤を投与し、それによってがんを治療することを含み、がんが大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない方法が提供される。
【００１１】
本発明の一部の態様の側面によれば、がんを治療するためのカゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）阻害剤の使用であって、がんが大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない使用が提供される。
【００１２】
本発明の一部の態様の側面によれば、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に治療有効量のＰＦ６７０４６２を投与し、それによってがんを治療することを含み、がんが慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ではない方法が提供される。
【００１３】
本発明の一部の態様の側面によれば、がんを治療するためのＰＦ６７０４６２の使用であって、がんがＣＬＬではない使用が提供される。
【００１４】
本発明の一部の態様の側面によれば、それを必要とする対象における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法であって、対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩ阻害剤を投与し、それによってＣＭＬを治療することを含み、ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ関連ＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ（imatinib-related TKI-resistant CML）、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ（accelerated CML）、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬ（lymphoid blast phase CML）からなる群から選択される方法が提供される。
【００１５】
本発明の一部の態様の側面によれば、ＣＭＬを治療するためのカゼインキナーゼＩ阻害剤の使用であって、ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬからなる群から選択される使用が提供される。
【００１６】
本発明の一部の態様の側面によれば、それを必要とする対象に細胞を移植する方法であって、
（ａ）血液または骨髄からの未熟血液細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ血液または骨髄中の未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量と接触させることによって、対象の血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させること；およびその後
（ｂ）対象に細胞を移植すること
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の一部の態様の側面によれば、対象の血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させる方法であって、幹細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ血液または骨髄中の未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、それによって血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させることを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の一部の態様の側面によれば、幹細胞を枯渇させるのに有用な薬剤を同定するかつ任意に作製する方法であって、
（ａ）候補薬剤の存在下でＣＫＩの活性および／または発現を決定すること；
（ｂ）ＣＫＩの活性および／または発現を下方制御し、かつｐ５３の活性および／または発現を上方制御する薬剤を選択し、それによって幹細胞を除去するのに有用な薬剤を同定すること
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の一部の態様の側面によれば、ＣＫＩδおよび／またはＣＫＩεよりもＣＫＩαへの少なくとも２倍大きい阻害活性を有する小分子を含む物質の組成物が提供される。
【００２０】
本発明の一部の態様によれば、方法は、枯渇させることの前に、骨髄から血液への未熟血液細胞の動員を誘導することをさらに含む。
【００２１】
本発明の一部の態様によれば、ＣＫＩα阻害剤は、ｐ５３を上方制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤と少なくとも同じくらい効果的である。
【００２２】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、ＣＫＩαまたはそれをコードするポリヌクレオチドに結合する。
【００２３】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、ＣＫＩまたはそれをコードするポリヌクレオチドに結合する。
【００２４】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を活性化する。
【００２５】
本発明の一部の態様によれば、ＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩα阻害活性を含む。
【００２６】
本発明の一部の態様によれば、ＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩδおよび／またはＣＫＩ−ε阻害活性をさらに含む。
【００２７】
本発明の一部の態様によれば、ＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩδおよびＣＫＩ−ε阻害活性を含む。
【００２８】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、小分子阻害剤である。
【００２９】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、ＰＦ６７０４６２である。
【００３０】
本発明の一部の態様によれば、阻害剤は、ＲＮＡサイレンシング剤である。
【００３１】
本発明の一部の態様によれば、サイレンシング剤は、ＣＫＩαを標的とする。
【００３２】
本発明の一部の態様によれば、未熟血液細胞は、幹細胞を含む。
【００３３】
本発明の一部の態様によれば、未熟血液細胞は、がん幹細胞を含む。
【００３４】
本発明の一部の態様によれば、接触させることをｉｎ  ｖｉｖｏで実施する。
【００３５】
本発明の一部の態様によれば、接触させることをｅｘ  ｖｉｖｏで実施する。
【００３６】
本発明の一部の態様によれば、接触させることをアフェレーシス中に実施する。
【００３７】
本発明の一部の態様によれば、枯渇させることを照射も化学療法もなしで実施する。
【００３８】
本発明の一部の態様によれば、枯渇させることを照射および／または化学療法と組み合わせて実施する。
【００３９】
本発明の一部の態様によれば、がんは、血液悪性腫瘍である。
【００４０】
本発明の一部の態様によれば、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ＣＭＬ移行期、または急性転化、多発性骨髄腫、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、急性未分化型白血病（ＡＵＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、成人Ｔ細胞ＡＬＬ、三血球系骨髄形成異常（trilineage myelodysplasia）を伴うＡＭＬ（ＡＭＬ／ＴＭＤＳ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および骨髄肉腫からなる群から選択される。
【００４１】
本発明の一部の態様によれば、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【００４２】
本発明の一部の態様によれば、ＣＭＬは、イマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、イマチニブ関連ＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、および骨髄性またはリンパ性急性転化期ＣＭＬ（myeloid or lymphoid blast phase CML）からなる群から選択される。
【００４３】
本発明の一部の態様によれば、方法は、対象にイマチニブを投与することをさらに含む。
【００４４】
本発明の一部の態様によれば、対象にイマチニブ、ダサチニブおよびニロチニブからなる群から選択される薬剤を投与しない。
【００４５】
本発明の一部の態様によれば、がんは、乳がんまたはメラノーマである。
【００４６】
本発明の一部の態様によれば、ＣＫＩα阻害剤は、ＣＫＩδまたはＣＫＩεよりもＣＫＩαに関する少なくとも２倍の阻害活性を有する。
【００４７】
本発明の一部の態様によれば、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。
【００４８】
本発明の一部の態様によれば、幹細胞は、がん幹細胞を含む。
【００４９】
本発明の一部の態様によれば、方法は、細胞移植前に、がんに関する治療としてのまたは前治療（pre-treatment）としての候補薬剤の効果を試験することをさらに含む。
【００５０】
本発明の一部の態様によれば、方法は、候補薬剤を合成することをさらに含む。
【００５１】
他に定義されない限り、ここで使用される全ての技術的および／または科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載されたものと類似したまたは同等の方法および材料が本発明の態様の実行または試験において使用され得るけれども、典型的な方法および／または材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は、例示的のみであり、必ずしも限定的であることは、意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明の一部の態様が添付の図および画像を参照して、例としてのみここで記載される。ここで、図を詳細に具体的に参照して、示された特徴は、例としておよび本発明の態様の例示的考察の目的のためであることが強調される。この点で、図と共に書かれた記述は、本発明の態様がどのように実行されてもよいかを当業者に明らかにする。
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ａ）キメラマウスを産出するスキーム。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ｂ）誘導後第７日での２つの大腿骨および２つの脛骨からのＬＴ−ＨＳＣ（系統-ｃ−ｋｉｔ+Ｓｃａ１+ＣＤ３４-ＦＬＴ３-）、ＳＴ−ＨＳＣ（系統-ｃ−ｋｉｔ+Ｓｃａ１+ＣＤ３４+ＦＬＴ３-）、ＭＰＰ（系統-ｃ−ｋｉｔ+Ｓｃａ１+ＣＤ３４+ＦＬＴ３+）の絶対数。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ｃ）ＣＫＩα  ＫＯ骨髄または対照マウスのいずれかを生着された致死的ＩＲマウスの生存曲線。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ｄ）ＣＫＩα再構成実験のスキーム。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ｅ）再構成されたまたは処置されなかったＣＫＩα  ＫＯ誘導マウスの生存曲線。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＣＫＩα消失がマウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、骨髄生着を可能にすることを例示する。Ｆ）再構成後３カ月でのＷＴまたはＣＫＩα  ＫＯ誘導マウスのいずれかからのＧＦＰ＋末梢血白血球の百分率。
【図２】図２は、ＣＭＬ急性転化のマウスモデルの産出のスキームである。
【図３Ａ】図３Ａは、どのようにＣＫＩα消失がＣＭＬ発達を妨げるかを例示する。Ａ）実験スキーム。
【図３Ｂ】図３Ｂは、どのようにＣＫＩα消失がＣＭＬ発達を妨げるかを例示する。Ｂ）白血病を引き起こす細胞（ＬＩＣ）の移植後２カ月間モニターされたＧＦＰ＋末梢血白血球の百分率；ＣＫＩα欠失を有さないマウス（ＰＢＳ処置またはＭＸＣｒｅを保有していないＬＩＣは、３週間以内に瀕死であり、屠殺された。
【図３Ｃ】図３Ｃは、どのようにＣＫＩα消失がＣＭＬ発達を妨げるかを例示する。Ｃ）ＣＫＩα欠失が誘導された（ｐＩｐＣ処置）または誘導されていない（ＰＢＳ処置）白血病マウスからの血液塗抹標本の写真。
【図３Ｄ】図３Ｄは、どのようにＣＫＩα消失がＣＭＬ発達を妨げるかを例示する。Ｄ）ＣＫＩα欠失がｐＩｐＣで誘導されたもしくは誘導されていない（ＰＢＳ処置）、または欠失に関するＭＸＣｒｅを有さない白血病マウスの生存）。
【図４Ａ】図４Ａは、どのようにＣＫＩα消失が正常と白血病幹細胞の両方を枯渇させ、正常骨髄再構成を可能にするかを例示する。Ａ）実験スキーム。
【図４Ｂ】図４Ｂは、どのようにＣＫＩα消失が正常と白血病幹細胞の両方を枯渇させ、正常骨髄再構成を可能にするかを例示する。Ｂ）ＣＫＩα欠失後のみの正常ドナーＢＭ再構成（ＣＤ４５．１）（赤い棒）およびＣＫＩα欠失なしの白血病ＧＦＰ陽性細胞の高百分率（ＰＢＳ処置、黒い棒）を示す、白血病に苦しめられたＢＭ移植１２日後の末梢血白血球中のＣＤ４５．１（ドナー細胞）およびＧＦＰ＋白血病細胞の百分率。
【図４Ｃ】図４Ｃは、どのようにＣＫＩα消失が正常と白血病幹細胞の両方を枯渇させ、正常骨髄再構成を可能にするかを例示する。Ｃ）成功的なドナー骨髄再構成による、ＣＫＩα欠失（ｐＩｐＣ処置における）後の白血病マウスの完全な生存。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２が白血病細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで優先的に標的とすることを例示する。Ａ）実験スキーム。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２が白血病細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで優先的に標的とすることを例示する。Ｂ）阻害剤処置におけるｐ５３およびＷｎｔ標的の発現の用量依存的増加を例示するＲＴ−ＰＣＲ結果。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２が白血病細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで優先的に標的とすることを例示する。Ｃ）白血病細胞数は、ＰＦ６７０４６２処置後、選択的に減少する−ＬＤ５０＜２μＭを有する用量反応曲線。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２が白血病細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで優先的に標的とすることを例示する。Ｄ）アポトーシス遺伝子発現は、ＰＦ６７０４６２処置後、白血病細胞において増加する。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ａ）実験処置スキーム。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ｂ）ＰＦ６７０４６２処置におけるβ−カテニンおよびｐ５３安定化ならびにｃ−Ｍｙｃ（Ｗｎｔ標的遺伝子の例）の上昇を例示するウエスタンブロット分析。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ｃ）ＰＦ６７０４６２処置後のＧＦＰ＋末梢血白血球の百分率は、ビヒクル処置マウスの末梢血におけるＧＦＰ＋白血病細胞の急速な増殖および阻害剤処置マウスにおける増殖なしを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ｄ）ビヒクル処置マウスにおける脊椎動物の芽細胞浸潤および完全な破壊ならびに阻害剤処置マウスにおける正常脊椎動物を示す、骨髄脊椎動物切片のＨ＆Ｅ染色。瀕死のビヒクル処置マウスは、白血病移植１２日後に屠殺された。健康な阻害剤処置マウスは、３週間後に屠殺され、それらの骨髄は、マウスを照射して、正常長期造血と白血病再発なしの両方をモニターするために移植された。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ｅ）死ぬ２日前のビヒクル処置マウスにおける未熟骨髄細胞および芽細胞ならびに同時の阻害剤処置マウスにおける正常末梢血写真。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＰＦ６７０４６２がＢＭ中のＷｎｔとｐ５３の両方を活性化し、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることを例示する。Ｆ）ＰＦ６７０４６２処置後の白血病マウスの生存。
【図７Ａ】図７Ａは、メラノーママウスモデルにおけるＣＫＩα欠失の効果を例示する写真である。図７Ａは、局所的耳タモキシフェン投与前および５６日後のＢｒａｆＶ６００Ｅ；Ｐｔｅｎ二重フロックスマウス（floxed mouse）顔の耳および組織学的検査を描写する写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、メラノーママウスモデルにおけるＣＫＩα欠失の効果を例示する写真である。図７Ｂは、局所的耳タモキシフェン誘導前（左）および５６日後（右）のＢｒａｆＶ６００Ｅ；Ｐｔｅｎ；ＣＫＩα三重フロックスマウスの耳を描写する写真である。Ｂにおけるタモキシフェン誘導後に腫瘍は可視でなく、耳色素沈着のみであり、腫瘍変異エスケープなく、ＣＫＩα欠失の強い腫瘍抑制因子効果を証明している。
【発明の具体的な態様の記述】
【００５３】
本発明は、その一部の態様では、造血幹細胞およびがん幹細胞を含む幹細胞を除去する方法に関する。
【００５４】
本発明に従って幹細胞を除去する方法の原理および操作は、図および付随する記述を参照してよりよく理解され得る。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの態様を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記述において示されたまたは例によって例証された詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の態様のまたは様々な様式で実行もしくは実施される能力がある。
【００５６】
β−カテニン分解複合体は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制因子である、アキシン１またはアキシン２（足場機能を果たすと考えられている）、および２つのセリン／トレオニンキナーゼ：４つのＮ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基上でβ−カテニンをリン酸化する、カゼインキナーゼＩ（ＣＫＩ）およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）からなる。ＣＫＩαとＡＰＣの両方は、Ｗｎｔシグナル伝達および紡錘体制御における役割を果たすことが注目されている。
【００５７】
骨髄幹細胞、たとえば造血幹細胞（ＨＳＣ）においてＣＫＩによって果たされる役割を分析するために、本発明者らは、コンディショナル骨髄ＣＫＩαノックアウト変異マウスを産出した。図１Ａ〜Ｆに例示されるように、骨髄ＣＫＩα消失は、マウスから造血幹細胞（ＨＳＣ）を枯渇させ、移植プレコンディショニングに通例使用されるさらなる手段（たとえば、照射または化学療法）なしで骨髄生着を可能にする（図１Ａ〜Ｆ）。
【００５８】
ＣＭＬ急性転化のマウスモデルを使用して、本発明者らは、ＣＫＩα消失が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）発達を妨げること（図３Ａ〜Ｄ）を示すことに取り掛かった。一般にＣＭＬは、特に急性転化期は、がん幹細胞と関連していることが既知であるので、本発明者らは、ＣＫＩα阻害剤が造血幹細胞（ＨＳＣ）だけでなく、他の幹細胞、たとえばがん幹細胞も枯渇させるために使用され得ると推測する。
【００５９】
ＣＫＩα欠失が化学療法または照射誘発骨髄破壊および白血病細胞排除に代わることができるかどうかを評価するために、白血病細胞をＭｘ−ＣｒｅマウスでフロックスされたＣＫＩα中に注入した。生存率データによって反映されるように（図４Ｃ）、ノックアウトが誘導されなかった場合、白血病細胞の非常に高い百分率が存在した一方、ＣＫＩα  ＫＯでは、白血病細胞は、検出不可能であった（図４Ｂ）。
【００６０】
本発明者らは、ＣＫＩを阻害する小分子薬剤を使用してそれらの結果を確認しようと努めた。ＣＫＩαの下方制御は、ｐ５３の発現を増加させることが既知であるので、本発明者らは、ｐ５３に及ぼす類似した効果を有するＣＫＩ阻害剤を探した。ＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２は、骨髄細胞におけるｐ５３およびその標的の発現を実質的に増加させたことが図５Ｂおよび６Ｂにおいて理解され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、本発明者らは、ＰＦ６７０４６２が白血病細胞を優先的に枯渇させることを示した。この阻害剤の重大な効果がｉｎ  ｖｉｖｏ研究において反映された。したがって、ＰＦ６７０４６２は、移植された白血病を引き起こす細胞を除去し、ＣＭＬ発達をｉｎ  ｖｉｖｏで妨げることが示された（図６Ｃ〜Ｆ）。白血病細胞は、致死的に照射されたマウスへの阻害剤処置マウスの骨髄の移植で明らかではなく（移植後１カ月）、これは、阻害剤処置が白血病幹細胞を根絶した一方、正常造血幹細胞を保存したことを示している。
【００６１】
実行するために本発明をさらにまとめる一方、本発明者らは、追加のがんに及ぼすＣＫＩα枯渇の効果を分析し、ＣＫＩαノックアウトがメラノーマに関するマウスモデルにおいて治療効果を有することを見出した。
【００６２】
メラノーマは、神経外胚葉の細胞に由来し、白血病細胞は、中胚葉の細胞に由来するので、本発明者らは、ＣＫＩの下方制御が、腫瘍細胞が由来する胚葉にかかわらず、無数のがんに効果的であり得ると推測する。さらに、ＣＫＩ阻害は、がん幹細胞を選択的に標的とすることが示されたので、本発明者らは、それらが関与する特定のがんにかかわらず、ＣＫＩ阻害の能力がある薬剤が一般にがん幹細胞に対して効果的であるはずであると結論づける。
【００６３】
したがって、本発明の第１の側面によれば、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩα阻害剤を投与し、それによってがんを治療することを含み、がんが大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連していない方法が提供される。
【００６４】
「がん」という用語は、ここでは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない増殖性疾患を表す。がんは、たとえば、固形腫瘍良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、結腸腺腫；腺癌、たとえば小細胞肺がん、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液型、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液型軟骨肉腫（Extraskeletel myxoid chonodrosarcoma）、ユーイング腫瘍であってもよく；他のものは、精巣および卵巣未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳房、皮膚、前立腺、ならびに卵巣を含む。
【００６５】
特定の態様によれば、がんは、メラノーマ、乳がんまたは血液悪性腫瘍である。
【００６６】
「血液悪性腫瘍」という用語は、ここでは、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍、ならびに脾臓およびリンパ節のがんを含む。本発明の開示された抗ＣＸＣＲ４抗体での治療を受け入れられる例示的なリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫とＴ細胞リンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と大部分の非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的な例は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ球性白血病と重複する）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的な例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液悪性腫瘍は、白血病、たとえば、これらに限定されないが、二次性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；急性リンパ性白血病とも称される）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ−ＰＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および骨髄形成異常（ＭＤＳ）も含む。血液悪性腫瘍は、骨髄腫、たとえば、これらに限定されないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）をさらに含む。
【００６７】
特定の態様によれば、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。ＣＭＬという用語は、イマチニブ抵抗性ＣＭＬ、第２／第３世代Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ＴＫＩ（たとえば、ダサチニブおよびニロチニブ）耐性ＣＭＬ、イマチニブ不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬを含む。
【００６８】
他の血液および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連がんは、血液悪性腫瘍という用語によって包含される。たとえば、血液悪性腫瘍は、樹状細胞、血小板、赤血球、ナチュラルキラー細胞、および多形核白血球、たとえば、好塩基球、好酸球、好中球および単球を含む追加の造血細胞のがんも含む。これらの前悪性腫瘍および悪性腫瘍が分類の変化するシステムにより種々の名称をしばしば有することになり、種々の名称下で分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の治療レジメンから利益を得ることができることが当業者に明らかである。
【００６９】
述べたように、本発明のこの側面に関して、がんは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異と関連しているものを含まない。
【００７０】
ＡＰＣ変異の例は、たとえば、ＡＰＣ産物のトランケーションを引き起こすものである。典型的に、変異は、コード配列の最初の半分において生じ、直腸結腸腫瘍における体細胞変異は、ＭＣＲ（変異クラスター領域）と称される特定の領域においてさらにクラスター化される。ヒト疾患に関与するＡＰＣ変異の一覧表は、ＯＭＩＭ、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂｄｏｔｎｃｂｉｄｏｔｎｌｍｄｏｔｎｉｈｄｏｔｇｏｖ／ｏｍｉｍに提供されている。ＡＰＣ変異と関連しているがんの例は、大腸がん、髄芽腫および肝細胞癌を含む。
【００７１】
本発明の別の側面によれば、それを必要とする対象におけるＣＭＬを治療する方法であって、対象に治療有効量のカゼインキナーゼＩ阻害剤を投与することを含む方法であって、ＣＭＬがイマチニブ抵抗性ＣＭＬ、イマチニブ（またはイマチニブ関連ＴＫＩ）不耐性ＣＭＬ、移行期ＣＭＬ、およびリンパ性急性転化期ＣＭＬからなる群から選択される方法が提供される。
【００７２】
本発明のさらに別の側面によれば、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に治療有効量のＰＦ６７０４６２を投与することを含み、がんがＣＬＬではない方法が提供される。
【００７３】
全てのがんが本発明のこの側面に関して企図される（ＣＬＬを除く）。本発明のこの側面の一態様によれば、がんは、ＡＰＣ変異と関連しているものも含む。別の態様によれば、がんは、ＡＰＣ変異と関連しているものを含まない。
【００７４】
本発明の治療する方法は、ＣＫＩを阻害する能力がある薬剤を接触させる／投与することによって実施される。
【００７５】
ＣＫＩは、酵母から人間まで試験された全ての生物に見出されるＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼのよく保存されたファミリーである。哺乳動物では、ＣＫＩファミリーは、１１の選択的にスプライシングされたアイソフォームをコードする７つの遺伝子（α、β、γ1、γ2、γ3、δ、ε）からなる。ＣＫＩファミリーのメンバーは、保存された触媒ドメインおよびＡＴＰ結合部位を共有し、これらは、それらを他のキナーゼファミリーから排他的に区別する。ＣＫＩは、全ての細胞に見出される遍在性酵素であり、種々の細胞内局在を占有し、Ｗｎｔシグナル伝達に加えて様々な細胞プロセスに関与する。
【００７６】
好ましくは、ＣＫＩ阻害剤は、ｐ５３の発現および／または活性を増加させる（少なくとも２倍）かつ／またはＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を活性化する。
【００７７】
本発明のＣＫＩ阻害剤は、他のキナーゼ、たとえば細胞周期を制御するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）（たとえばＣｄｋ２、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６）と比較して、ＣＫＩへの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍の阻害剤活性を好ましくは有する。加えて、ＣＫＩ阻害剤は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＫＡ、ｈｅｒ２、ｒａｆ１、ＭＥＫ１、ＭＡＰキナーゼ、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＰＩ３キナーゼ、ｗｅｅ１キナーゼ、Ｓｒｃ、および／またはＡｂｌと比較して、ＣＫＩへの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍の阻害剤活性を有する。
【００７８】
一部の態様では、薬剤は、ＣＫＩ−α阻害剤であり、すなわちそれらは、ＣＫＩ−α（ＣＳＮＫ１Ａ；ゲノム、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２０２７６およびＮＭ＿００１０２５１０５およびＮＭ＿００１０２０２７６）に選択的である。したがって、たとえば、かかるＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εと比較して、ＣＫＩ−αへの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍の阻害剤活性を有する。
【００７９】
好ましくは、ＣＫＩ−αに選択的である薬剤は、ｐ５３を制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤（たとえばＰＦ６７０４６２）と少なくとも同じくらい効果的である。好ましくは、ＣＫＩ−αに選択的である薬剤は、ｐ５３を制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤（たとえばＰＦ６７０４６２）より少なくとも２倍効果的である。
【００８０】
一部の態様では、薬剤は、ＣＫＩ−δ（ＣＳＮＫ１Ａ；ゲノム、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１８８４．２、ＮＰ＿６２０６９３．１、ＮＭ＿００１８９３．３およびＮＭ＿１３９０６２．１）およびＣＫＩ−ε（ＣＳＮＫ１Ｅ；ＮＰ＿００１８８５．１、ＮＰ＿６８９４０７．１、ＮＭ＿００１８９４．４  ＮＭ＿１５２２２１．２）を阻害する。
【００８１】
本発明の側面の一部の態様では、薬剤は、それらがＣＫＩ−αを阻害するよりも大きい程度までＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εを阻害する（たとえば、ＣＫＩ−αと比較して、ＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εへの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍の阻害剤活性。
【００８２】
本発明の側面の一部の態様では、ＣＫＩ阻害剤は、それらがＣＫＩ−β、γ1、γ2、またはγ3を阻害するよりも大きい程度までＣＫＩα、δおよびεアイソフォームを阻害する（たとえば、ＣＫＩβ、γ1、γ2、またはγ3のいずれかと比較して、ＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εへの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍の阻害剤活性。
【００８３】
一態様によれば、本発明のＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩ（たとえばＣＫＩ−α、ＣＫＩ−δおよび／またはＣＫＩ−ε）またはそれをコードする遺伝子に直接結合する。
【００８４】
ＣＫＩ−α、ＣＫＩ−δおよび／またはＣＫＩ−εの下方制御は、転写および／または翻訳に干渉するいろいろな分子（たとえば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、マイクロＲＮＡまたはＤＮＡザイム）を使用してゲノムおよび／または転写物レベルで、またはたとえば、アンタゴニスト、ポリペプチドなどを切断する酵素を使用してタンパク質レベルで実施され得る。
【００８５】
本発明のＣＫＩを下方制御する能力がある薬剤の一例は、特定のＣＫＩを特異的に結合する能力がある抗体または抗体断片である。好ましくは、抗体は、ＣＫＩ−α、ＣＫＩ−δまたはＣＫＩ−εの少なくとも１つのエピトープを特異的に結合する。
【００８６】
ここで使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を表す。
【００８７】
エピトープ決定基は、分子、たとえばアミノ酸または炭水化物側鎖の化学的に活性な表面グループ化から通常なり、特定の三次元構造特徴、および特定の電荷特徴を通常有する。
【００８８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で既知である。一般に、ヒト化抗体は、そこに導入された非ヒト供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入残基（import residue）としばしば称され、これらは、移入可変ドメインから典型的に採取される。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列をげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って本質的に行われ得る（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら（１９８８）．Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６を参照されたい）。したがって、かかるヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的に１つ未満のインタクトなヒト可変ドメインが非ヒト種からの相当する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的に、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【００８９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９１）．Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２２７，３８１−３８８）を含む当技術分野で既知の様々な技法を使用しても作製され得る。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Ｃｏｌｅら（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら（１９９１）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｐｒｉｍｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７，８６−９５）。同様に、ヒト抗体は、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているトランスジェニック動物、たとえば、マウスへのヒト免疫グロブリン座の導入によって作られ得る。負荷時、ヒト抗体作製は、遺伝子再構成、組立、および抗体レパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものによく似ていることが観察される。この手法は、たとえば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に；および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２）．Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１０（７），７７９−７８３；Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９４）．Ｎｅｗｓ  ａｎｄ  Ｖｉｅｗ：Ｓｕｃｃｅｓｓ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−８１３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）．Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｋａｐｐａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４，８４５−８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  Ｍａｂｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４，８２６；およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，６５−９３に報告されている。
【００９０】
本発明のＣＫＩを下方制御する能力がある薬剤の別の例は、ＲＮＡサイレンシング剤である。
【００９１】
ここで使用される場合、「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、相当するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される制御機構の群（たとえばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（quelling）、相互抑制、および翻訳抑制）を表す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、および菌類を含む生物の多くの型において観察される。
【００９２】
ここで使用される場合、「ＲＮＡサイレンシング剤」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害するまたは「サイレンシングする」能力があるＲＮＡを表す。いくつかの態様では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構を通してｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（たとえば、完全な翻訳および／または発現）を妨げる能力がある。ＲＮＡサイレンシング剤は、非コードＲＮＡ分子、たとえば、対になった鎖を含むＲＮＡ二本鎖、およびかかる小さい非コードＲＮＡがそこから産出され得る前駆体ＲＮＡを含む。例示的なＲＮＡサイレンシング剤は、ｄｓＲＮＡ、たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む。一態様では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導する能力がある。別の態様では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介する能力がある。
【００９３】
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す。植物における相当するプロセスは、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと通例称され、菌類においてクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来性遺伝子の発現を妨げるために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、多様な植物相および門によって通例共有されている。外来性遺伝子発現からのかかる保護は、相同一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染にまたは宿主ゲノム中へのトランスポゾンエレメントのランダムな組込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作製に応答して進化した可能性がある。
【００９４】
細胞における長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として既知であるｄｓＲＮＡの短い小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的に長さが約２１から約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対二本鎖を含む。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と通例称されるエンドヌクレアーゼ複合体も特色とし、これは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。
【００９５】
したがって、本発明は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡの使用を企図する。
【００９６】
一態様によれば、ｄｓＲＮＡは、３０ｂｐよりも大きい。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐよりも大きいｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこれらのより長い領域がインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすことになるという信念のために、非常に限られていた。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は、細胞が最適なサイレンシング配列を選択し得、多数のｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減するという点で多数の利点を提供し得；長いｄｓＲＮＡは、サイレンシングライブラリーがｓｉＲＮＡに必要であろうよりも少ない複雑さを有することを可能にすることになり；おそらく最も重要なことに、長いｄｓＲＮＡは、治療法として使用された場合、ウイルスエスケープ変異を妨げ得る。
【００９７】
様々な研究は、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導することも、著しいオフターゲット効果を引き起こすこともなく遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得ることを実証している−たとえば［Ｓｔｒａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、Ｖｏｌ．３４、Ｎｏ．１３  ３８０３−３８１０；ＢｈａｒｇａｖａＡらＢｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ  Ｍ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ  Ｎ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４］を参照されたい。
【００９８】
特に、本発明は、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（たとえば胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングに関する長いｄｓＲＮＡ（３０を超える塩基転写物）の導入も企図し、たとえばＢｉｌｌｙら、ＰＮＡＳ  ２００１、Ｖｏｌ  ９８、ｐａｇｅｓ  １４４２８−１４４３３およびＤｉａｌｌｏら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，２００３、１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照されたい。
【００９９】
本発明は、遺伝子発現を下方制御するためのインターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないように具体的に設計された長いｄｓＲＮＡの導入も企図する。たとえば、ＳｈｉｎａｇｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５、２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターから長い二本鎖ＲＮＡを発現する、ｐＤＥＣＡＰと命名されたベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓＲＮＡ搬出を促進する、５’キャップ構造と３’ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。
【０１００】
哺乳動物系におけるインターフェロンおよびＰＫＲ経路を逃れる別の方法は、トランスフェクションまたは内在性発現のいずれかを介した小分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入による。
【０１０１】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小分子阻害性ＲＮＡ二本鎖（一般に、１８〜３０塩基対）を表す。２５〜３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二本鎖が、同じ位置での２１塩基長と比較して、効力の１００倍もの増加を有し得ることが最近報告されたけれども、典型的に、ｓｉＲＮＡは、中心の１９ｂｐ二本鎖領域および末端上の対称性の２−塩基３’−オーバーハングを有する２１塩基長として化学的に合成される。より長いＲＮＡを使用して得られた、ＲＮＡｉをトリガーすることにおける観察された増加した効力は、産物（２１塩基長）の代わりに基質（２７塩基長）を有するダイサーを提供することから生じ、これがＲＩＳＣ中へのｓｉＲＮＡ二本鎖の流入の速度または効率を改善すると理論化される。
【０１０２】
３’−オーバーハングの位置がｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称性二本鎖は、センス鎖上に３’−オーバーハングを有するものよりも一般に強力であることが見出された（Ｒｏｓｅら、２００５）。これは、アンチセンス転写物を標的とする場合、逆の有効性パターンが観察されるので、ＲＩＳＣ中への非対称的鎖負荷に起因し得る。
【０１０３】
ｓｉＲＮＡは、両方のタンパク質によって共有される配列を選択することによって１つを超えるＣＫＩ（たとえば、ＣＫＩ−δとＣＫＩ−εの両方）を阻害するように設計されてもよいことが理解されよう。ＣＫＩ−αを下方制御する能力がある例示的なｓｉＲＮＡは、配列番号１および２に示されている。ＣＫＩ−δを下方制御する能力がある例示的なｓｉＲＮＡは、配列番号６（５’−ＧＡＡＡＣＡＵＧＧＵＧＵＣＣＧＧＵＵＵＴＴ−３）に示されている。ＣＫＩ−εを下方制御する能力がある例示的なｓｉＲＮＡは、配列番号５に示されている。ＣＫＩ−δとＣＫＩ−εの両方を下方制御する能力がある例示的なｓｉＲＮＡは、配列番号３および４に示されている。
【０１０４】
本発明のＣＫＩに関するサイレンサーＲＮＡは、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されてもいる。
【０１０５】
二本鎖干渉ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、連結されて、ヘアピンまたはステムループ構造（たとえば、ｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。したがって、述べたように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はまた、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
【０１０６】
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ここで使用される場合、相補的配列の第１および第２の領域を含む、ステムループ構造を有するＲＮＡ薬剤であって、相補性の程度および領域の向きが、塩基対形成が領域間で生じるために十分であり、第１および第２の領域がループ領域によって連結されており、ループがループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如から生じるＲＮＡ薬剤を表す。ループにおけるヌクレオチドの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１の数である。ループにおけるヌクレオチドの一部は、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用され得るオリゴヌクレオチド配列の例は、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ら（２００２）ＲＮＡ  ８：１４５４）を含む。生じた単鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用する能力がある二本鎖領域を含むステムループまたはヘアピン構造を形成することが当業者によって認識されることになる。
【０１０７】
別の態様によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡであってもよい。ｍｉＲＮＡは、様々なサイズの一次転写物をコードする遺伝子から作られる低分子ＲＮＡである。それらは、動物と植物の両方において同定された。一次転写物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と名付けられた）は、様々な核酸分解工程を通してより短い前駆体ｍｉＲＮＡ、または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」にプロセシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、最終（成熟）ｍｉＲＮＡが二本鎖で存在するように、折り畳まれた形態で存在し、２本の鎖は、ｍｉＲＮＡと称される（最終的に標的と塩基対形成することになる鎖）。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二本鎖を取り除くダイサーの形態に関する基質であり、この後、ｓｉＲＮＡと同様に、二本鎖がＲＩＳＣ複合体中に取り込まれ得る。ｍｉＲＮＡは、遺伝子導入で発現され、一次形態全体ではなく、前駆体形態の発現を通して効果的であり得ることが実証された（Ｐａｒｉｚｏｔｔｏら（２００４）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １８：２２３７−２２４２およびＧｕｏら（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：１３７６−１３８６）。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは、部分的な相補性のみで転写物配列に結合し（Ｚｅｎｇら，２００２，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３）、定常状態ＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく、翻訳を抑圧する（Ｌｅｅら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：８４３−８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：８５５−８６２）。ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの両方は、ダイサーによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の構成要素と会合する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８；Ｇｒｉｓｈｏｋら，２００１，Ｃｅｌｌ  １０６：２３−３４；Ｋｅｔｔｉｎｇら，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２６５４−２６５９；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６８８９−６８９４；Ｈａｍｍｏｎｄら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１４６−１１５０；Ｍｏｕｒｌａｔｏｓら，２００２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：７２０−７２８）。最近の報告（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  ２９７：２０５６−２０６０）は、ｍｉＲＮＡ経路対ｓｉＲＮＡ経路を通した遺伝子制御は、標的転写物との相補性の程度によって単独に決定されると仮定する。ｍＲＮＡ標的との部分的な同一性のみを有するｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分解をトリガーするのではなく、翻訳抑制において機能することになると推測される。
【０１０９】
本発明での使用に適したＲＮＡサイレンシング剤の合成は、以下のように実施され得る。第１に、ＣＫＩ  ｍＲＮＡ配列がＡＡジヌクレオチド配列に関してＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンされる。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現が潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、制御タンパク質結合部位に富んでいるので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合性タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉し得る［Ｔｕｓｃｈｌ  ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５］。しかしながら、５’ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％の低下を媒介し、タンパク質レベルを完全に消滅させたＧＡＰＤＨに関して実証されたように、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡも効果的であり得ることが理解されよう（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。
【０１１０】
第２に、潜在的標的部位が、任意の配列アラインメントソフトウェア、たとえば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して、適切なゲノムデータベース（たとえば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード配列との著しい相同性を示す推定上の標的部位が分離される。
【０１１１】
適格な標的配列がｓｉＲＮＡ合成に関する鋳型として選択される。好ましい配列は、低Ｇ／Ｃ含有量を含むものであるが、なぜならこれらは、５５％より高いＧ／Ｃ含有量を有するものと比較して、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより効果的であることが分かったからである。いくつかの標的部位が評価のために標的遺伝子の長さに沿って好ましくは選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良い評価のために、負の対照が組合せで好ましくは使用される。負の対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成物を好ましくは含むが、ゲノムとの著しい相同性を欠く。したがって、それがあらゆる他の遺伝子とのいかなる著しい相同性も示さないという条件で、ｓｉＲＮＡの混ぜられたヌクレオチド配列が好ましくは使用される。
【０１１２】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解されよう。
【０１１３】
一部の態様では、ここで提供されたＲＮＡサイレンシング剤は、細胞透過性ペプチドと機能的に会合していてもよい。ここで使用される場合、「細胞透過性ペプチド」は、血漿および／または細胞の核膜を通過する膜透過性複合体の輸送と関連しているエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシス）トランスロケーション性質を与える短い（約１２〜３０残基）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体において使用される細胞透過性ペプチドは、少なくとも１つの非機能的システイン残基を好ましくは含み、これは、遊離であるかまたはかかる結合のために修飾された二本鎖リボ核酸とのジスルフィド結合を形成するために誘導体化されている。かかる性質を与える代表的なアミノ酸モチーフは、その内容が参照によりここにはっきりと組み込まれている米国特許第６，３４８，１８５号に列挙されている。本発明の細胞透過性ペプチドは、これらに限定されないが、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰを好ましくは含む。
【０１１４】
本発明のＣＫＩを下方制御する能力がある別の薬剤は、ＤＮＡザイム分子であり、これは、ＣＫＩ−α、δまたはεのｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断する能力がある。ＤＮＡザイムは、一本鎖と二本鎖標的配列の両方を切断する能力がある一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９５）．Ａ  ＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｇ2+−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ２，６５５−６６０；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９７）．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｕｒｐｏｓｅ  ＲＮＡ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，４２６２−４２６６）。ＤＮＡザイムに関する一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案された。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれ７つから９つのデオキシリボヌクレオチドの２つの基質−認識ドメインが隣接した１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。ＤＮＡザイムのこの型は、プリン：ピリミジン結合点でその基質ＲＮＡを効果的に切断し得る（Ｓａｎｔｏｒｏ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ（１９９７））；ＤＮＡザイムの総説に関しては、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，Ｌ．Ｍ．（２００２）．ＤＮＡｚｙｍｅｓ：ｃｕｔｔｉｎｇ  ａ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４，１１９−１２１を参照されたい。
【０１１５】
一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する、合成、操作されたＤＮＡザイムの構築および増幅の例は、Ｊｏｙｃｅらへの米国特許第６，３２６，１７４号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に対して向けられた類似した設計のＤＮＡザイムがｉｎ  ｖｉｖｏでウロキナーゼ受容体発現を阻害し、結腸がん細胞転移を阻害することに成功することが最近観察された（Ｉｔｏｈ，Ｔ．ら，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４０９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ），Ｊｕｎｅ  ５−９，２００２，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．ＵＳＡ．）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なＤＮＡザイムは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の症例において、白血病細胞における癌遺伝子の発現を阻害すること、および自家骨髄移植における再発率を減少させることに成功した。
【０１１６】
本発明のＣＫＩの下方制御は、ＣＫＩをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズする能力があるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによっても実施され得る。
【０１１７】
ＣＫＩを効率的に下方制御するために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンス手法に重要な２つの側面を考慮しながら実施されなければならない。第１の側面は、適切な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達である一方、第２の側面は、その翻訳を阻害するように細胞内の指定されたｍＲＮＡを特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１１８】
従来技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型中に効率的に送達するために使用され得るいくつかの送達戦略を教示している（たとえば：Ｌｕｆｔ，Ｆ．Ｃ．（１９９８）．Ｍａｋｉｎｇ  ｓｅｎｓｅ  ｏｕｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｇｅｔｔｉｎｇ  ｔｈｅｒｅ  ｉｓ  ｈａｌｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６（２），７５−７６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら（１９９８）．Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔ．Ｂｌｏｏｄ  ９１，８５２−８６２；Ｒａｊｕｒ，Ｓ．Ｂ．ら（１９９７）．Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ８，９３５−９４０；Ｌａｖｉｇｎｅら  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７：５６６−７１（１９９７）；およびＡｏｋｉ，Ｍ．ら（１９９７）．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３１，５４０−５４５を参照されたい）。
【０１１９】
加えて、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー特性を説明する熱力学サイクルに基づいて、それらの標的ｍＲＮＡへの最も高い予測される結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（たとえば、Ｗａｌｔｏｎ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６５，１−９を参照されたい）。
【０１２０】
かかるアルゴリズムは、細胞においてアンチセンス手法を実行するために成功的に使用された。たとえば、Ｗａｌｔｏｎらによって開発されたアルゴリズムは、科学者らがウサギβグロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）転写物に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することに成功することを可能にした。同じ研究グループは、動態学的ＰＣＲ技法によって評価された、細胞培養における３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素ＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学的性質を有する２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験を含むほとんど全ての事例において効果的であることが分かったことをつい最近報告した。
【０１２１】
加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用して特定のオリゴヌクレオチドの効率を設計するかつ予測するためのいくつかの手法も公表された（Ｍａｔｖｅｅｖａ，Ｏ．ら（１９９８）．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６，１３７４−１３７５）。
【０１２２】
いくつかの臨床試験は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性、および活性を実証した。たとえば、がんの治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドが成功的に利用された（Ｈｏｌｍｕｎｄ，Ｂ．Ｐ．ら（１９９９）．Ｔｏｗａｒｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ＩＳＩＳ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １，３７２−３８５）一方、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３、およびＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを介した血液悪性腫瘍の治療は、臨床試験に入り、患者に許容されることが示された（Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｍ．（１９９９）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｃｌｏｔｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｍｐｅｒｏｒ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １，２９７−３０６）。
【０１２３】
つい最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑圧は、マウスモデルにおけるヒトがん細胞の胸膜播殖を阻害することが報告された（Ｕｎｏ，Ｆ．ら（２００１）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，７８５５−７８６０）。
【０１２４】
したがって、現在のコンセンサスは、上記のように、高度に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび多種多様なオリゴヌクレオチド送達系の産出を導いた、アンチセンス技術の分野における最近の進展が、当業者が過度の試行錯誤実験法に頼る必要なく、既知の配列の発現を下方制御するのに適したアンチセンス手法を設計し、実行するのを可能にするということである。
【０１２５】
ＣＫＩを下方制御する能力がある別の薬剤は、特定のＣＫＩをコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断する能力があるリボザイム分子である。リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害にますます使用されている（Ｗｅｌｃｈ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９８）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９，４８６−４９６）。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するためのリボザイムを設計する可能性により、それらは、基礎研究と治療適用の両方における貴重なツールになった。治療分野では、リボザイムは、感染症におけるウイルスＲＮＡ、がんにおける優性癌遺伝子、および遺伝性障害における特定の体細胞変異を標的とするために活用されてきた（Ｗｅｌｃｈ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９８）．Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｖｉｒｏｌ  １０，１６３−１７１）。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者に関するいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールが、すでに第１相試験にあることである。つい最近、リボザイムは、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的検証、および経路解明に使用された。いくつかのリボザイムは、臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（商標）は、ヒト臨床試験において研究される初めて化学的に合成されたリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な構成要素であるＶＥＧＦＲ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、および他の会社は、動物モデルにおける抗血管形成治療法の重要性を実証した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（商標）は、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを低下させるのに効果的であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ（ｗｗｗ．ｒｐｉ．ｃｏｍ））。
【０１２６】
細胞におけるＣＫＩ遺伝子の発現を制御する追加の方法は、三本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を介してである。最近の研究は、ＴＦＯが二本鎖ヘリックスＤＮＡにおけるポリプリンまたはポリピリミジン領域を配列特異的に認識し、結合するように設計され得ることを示している。これらの認識規則は、Ｍａｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．ら（１９８９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５，７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．ら（１９８７）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，６４５−６５０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．（１９９１）．Ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，１３６０−１３６３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．ら（１９８８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，４５６−４５９；およびＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．ら、ＥＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ３７５４０８に要約されている。オリゴヌクレオチドの修飾、たとえば、介入物の導入および主鎖置換、ならびに結合条件（たとえば、ｐＨおよび陽イオン濃度）の最適化は、ＴＦＯ活性への固有の障壁、たとえば電荷斥力および不安定性を克服するのを助け、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列を標的にし得ることが最近示された（最近の総説に関して、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｖｉａ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２，４８７−４９４を参照されたい）。
【０１２７】
一般に、三本鎖形成性オリゴヌクレオチドは、配列一致を有する：
オリゴ              ３’−−Ａ              Ｇ              Ｇ              Ｔ
二本鎖              ５’−−Ａ              Ｇ              Ｃ              Ｔ
二本鎖              ３’−−Ｔ              Ｃ              Ｇ              Ａ
しかしながら、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣトリプレットが最も大きい三重のヘリックス安定性を有することが示された（Ｒｅｉｔｈｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｊｅｌｔｓｃｈ，Ａ．（２００２）．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ＦＲＥＴ  ａｓｓａｙ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３（１），２７，Ｅｐｕｂ）。同じ著者らは、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣ規則に従って設計されたＴＦＯが非特異的三本鎖を形成しないことを実証し、これは、三本鎖形成が実に配列特異的であることを示している。
【０１２８】
したがって、三本鎖形成性配列は、ＣＫＩ制御領域における任意の所与の配列に関して考案され得る。三本鎖形成性オリゴヌクレオチドは、長さが好ましくは少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０以上のヌクレオチド、最大５０または１００ｂｐである。
【０１２９】
ＴＦＯでの細胞のトランスフェクション（たとえば、陽イオンリポソームを介した）および標的ＤＮＡとの三重のヘリックス構造の形成は、立体的および機能的変化を誘導し、転写開始および伸長をブロックし、内在性ＤＮＡにおける望ましい配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特定の下方制御をもたらす。ＴＦＯで処置された細胞における遺伝子発現の抑圧の例は、哺乳動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧ１および内在性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９９）．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７，１１７６−１１８１；およびＰｕｒｉ，Ｎ．ら（２００１）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｂｙ  ２’−Ｏ−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２８９９１−２８９９８）；前立腺がん病因学において重要であるＥｔｓ２転写因子の発現の配列および標的特異的下方制御（Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｇ．Ｍ．ら，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｔｓ２  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，８３３−８４３）；および炎症促進性ＩＣＡＭ−１遺伝子の制御（Ｂｅｓｃｈ，Ｒ．ら（２００３）．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，３２４７３−３２４７９）を含む。加えて、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌは、配列特異的ＴＦＯがｄｓＲＮＡに結合し、ｄｓＲＮＡ依存性酵素、たとえばＲＮＡ依存性キナーゼの活性を阻害し得ることを最近示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ，Ｍ．ａｎｄＢｅａｌ，Ｐ．Ａ．（２０００）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８，２３６９−２３７４）。
【０１３０】
そのうえ、上記の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復をもたらす、したがって、内在性遺伝子の発現の下方制御と上方制御の両方を提供する能力がある、方向付けられた突然変異誘発を誘導し得る（Ｓｅｉｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ（２００３））。効果的なＴＦＯの設計、合成、および投与の詳細な記述は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらへの米国特許出願第０３／０１７０６８号および同第０３／００９６９８０号ならびにＥｍａｎｕｅｌｅらへの同第０２／０１２８２１８号および同第０２／０１２３４７６号、ならびにＬａｗｎへの米国特許第５，７２１，１３８号において見出され得る。
【０１３１】
マイクロＲＮＡは、当技術分野で見出されるガイドラインを使用して設計され得る。かかる分子の設計に関するアルゴリズムも利用可能である。たとえば、参照によりここに組み込まれているｗｗｗ．ｗｍｄｄｏｔｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄｄｏｔｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉｒｎａｔｏｏｌｓｄｏｔｐｌを参照されたい。
【０１３２】
本発明のＣＫＩを下方制御する能力がある別の薬剤は、ＣＫＩに結合するかつ／またはこれを切断する任意の分子である。かかる分子は、たとえば、ＣＫＩアンタゴニスト、またはＣＫＩ阻害性ペプチドとすることができる。
【０１３３】
ＣＫＩの少なくとも触媒的または結合性部分の非機能的類似体もＣＫＩを下方制御する薬剤として使用され得ることが理解されよう。
【０１３４】
小さい化学ＣＫＩ阻害剤も本発明によって企図される。これらの化学薬剤は、１つの特定のＣＫＩへの選択的阻害活性を有してもよいかまたは２つ以上のＣＫＩへの阻害活性を含んでもよい。かかる阻害剤は、ＣＫＩ−αへのその阻害活性と比較して、ＣＫＩ−δおよびεへの少なくとも２倍、少なくとも５倍またはさらに１０倍大きい阻害活性を有してもよい。たとえば、ＩＣ２６１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから利用可能である）は、ＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εの特異的阻害剤である。
【０１３５】
特定の態様によれば、小さい化学ＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩ−δに選択的である。かかる阻害剤は、ＣＫＩ−αおよび／またはＣＫＩ−εへのその阻害活性と比較して、ＣＫＩ−δへの少なくとも２倍、少なくとも５倍またはさらに１０倍大きい阻害活性を有してもよい。
【０１３６】
別の態様によれば、小さい化学ＣＫＩ阻害剤は、ＣＫＩ−εに選択的である。かかる阻害剤は、ＣＫＩ−αおよび／またはＣＫＩ−δへのその阻害活性と比較して、ＣＫＩ−εへの少なくとも２倍、少なくとも５倍またはさらに１０倍大きい阻害活性を有してもよい。
【０１３７】
別の態様によれば、小分子、化学薬剤（すなわち、ポリヌクレオチド薬剤ではない）は、ＣＫＩ−δおよびＣＫＩ−εへのその阻害活性と比較して、ＣＫＩ−αへの少なくとも２倍、少なくとも５倍またはさらに１０倍大きい阻害活性を有する。一態様によれば、小分子薬剤は、ｐ５３を上方制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤と少なくとも同じくらい効果的である。好ましくは、小分子薬剤は、ｐ５３を上方制御することにおいてＣＫＩδおよびεの阻害剤より少なくとも２倍効果的である。
【０１３８】
特定の態様によれば、これらの薬剤のいずれもβカテニンおよびｐ５３を安定化せず、ＤＮＡ損傷応答を誘導もしないので、薬剤は、ＣＫＩ７でも、Ｄ４４７６でも、ＩＣ２６１でもない。
【０１３９】
企図された小分子薬剤は、ＰＦ６７０４６２（ＣＡＳ  Ｎｏ：９５０９１２−８０−８）またはＰＦ４８００５６７（ＣＡＳ  Ｎｏ：１１８８２９６−５２−７）を含む。
【０１４０】
ＣＫＩを下方制御するために本発明に従って使用され得る別の薬剤は、ＣＫＩ活性化または基質結合を妨げる分子である。
【０１４１】
ＣＫＩ−α、δまたはεを制御するために使用されてもよい他の薬剤は、当技術分野で既知であるスクリーニング方法を使用して見出され得るまたは（強化された選択性、特異性に関して）洗練され得る。かかるアッセイの例は、生化学的アッセイ（たとえば、ｉｎ−ｖｉｔｒｏキナーゼ活性）、細胞生物学アッセイ（たとえばタンパク質局在性）および分子アッセイ（たとえば、ノーザン、ウエスタンおよびサザンブロッティング）を含む。
【０１４２】
以下は、本発明のＣＫＩの１つを下方制御する能力を求めて小さい化学薬剤をスクリーニングするために使用されてもよい様々なアッセイの記述である。
【０１４３】
酵素阻害アッセイ：
１．組換えＣＫＩε酵素を小分子阻害剤（ＳＭＩ）で１０分間インキュベートし；基質ヒトＰｅｒ２を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのタンパク質上方シフトによってＳｅｒ６６２リン酸化を観察する（Ｔｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１：１０４０，２００１）。
２．組換えＣＫＩδ酵素をＳＭＩで１０分間インキュベートし；基質マウスｐ５３を加え、Ｎｏｖｕｓウサギ抗ｐ５３、ホスホ（Ｔｈｒ１８）ポリクローナル抗体（ＮＢ１００−９２６０７）を使用したウエスタンブロット法によってＴｈｒ１８リン酸化を観察する。
３．ヒト腫瘍細胞をＳＭＩで１〜２４時間インキュベートし；細胞を収集し、それらをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎウサギ抗β−カテニン、ホスホ（Ｓｅｒ４５）ポリクローナル抗体（４４−２０８Ｇ）でのＳｅｒ４５上でのβ−カテニンリン酸化に関して分析する（ＣＫＩαのユニークな性質）。
【０１４４】
生物学的アッセイ
１．ヒト腫瘍細胞をＳＭＩで１〜２４時間インキュベートし；細胞を収集し、それらを免疫組織化学的検査またはウエスタンブロット法によってγＨ２Ａ．Ｘおよびｐ５３への抗体でＤＤＲおよびｐ５３活性化に関して分析する。
２．ヒト原発腫瘍細胞および腫瘍関連線維芽細胞をＳＭＩで２４時間インキュベートし；ＳＭＩを取り除き、培地を交換し；細胞を細胞老化関連βガラクトシダーゼアッセイ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）によって細胞老化に関して分析する。
【０１４５】
候補薬剤は、小さい化学阻害剤、抗体または様々なポリヌクレオチド薬剤、たとえばここで上に記載されたものを含んでもよい。上に列挙されたスクリーニング方法を使用した確認試験に従って、薬剤は、がん細胞における候補抗がん剤としてまたは造血幹細胞を枯渇させるための候補として試験されてもよい。薬剤活性の確認は、ここで以下に詳しく述べるように、より大きい量の薬剤およびそれを含む医薬組成物でのその調製物を合成することが後に続いてもよい。
【０１４６】
述べたように、本発明の阻害剤は、細胞移植手順の前に、骨髄細胞を枯渇させるための血液消失薬剤としても使用されてもよい。血液消失は、化学療法および／または照射と共に、または化学療法および／もしくは照射の非存在下で行われてもよい。
【０１４７】
したがって、本発明の別の側面によれば、それを必要とする対象に細胞を移植する方法であって、
（ａ）血液または骨髄からの未熟血液細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ血液または骨髄中の未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量と接触させることによって、対象の血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させること；およびその後
（ｂ）対象に細胞を移植すること
を含む方法が提供される。
【０１４８】
本発明のこの側面によれば、対象は、細胞移植が治療的である疾患を患っている。
【０１４９】
かかる疾患は、血液疾患、心疾患、糖尿病、神経変性疾患、悪性疾患、免疫疾患および自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない。疾患は、先天性でも後天性でもよい。
【０１５０】
本発明のこの側面の態様によれば、疾患は、悪性疾患である。特定の態様によれば、悪性疾患は、造血またはリンパ組織の悪性腫瘍である。
【０１５１】
対象が患っていてもよい疾患は、白血病［たとえば、急性リンパ性、急性リンパ芽球性、急性リンパ芽球性プレＢ細胞、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性、単球性、急性骨髄、急性骨髄性、好酸球増加症を伴う急性骨髄性、Ｂ細胞、好塩基球性、慢性骨髄性、慢性、Ｂ細胞、好酸球性、フレンド、顆粒球または骨髄球性、ヘアリー細胞、リンパ球性、巨核芽球、単球性、単球性−マクロファージ、骨髄芽球性、骨髄性、骨髄単球性、形質細胞、プレＢ細胞、前骨髄球性、亜急性、Ｔ細胞、リンパ系新生物、骨髄性悪性腫瘍への素因、急性非リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）１、リンパ腫［たとえば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞、皮膚Ｔ細胞、前駆体Ｔ細胞白血病／リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、組織球性、リンパ芽球性、胸腺および菌状息肉腫］、移植片の移植と関連している疾患（たとえば移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主疾患）、自己免疫疾患、たとえば１型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、大理石骨病、再生不良性貧血、ゴーシェ病、地中海貧血症および他の先天性または遺伝的に決定される造血異常を含む重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
本発明のこの側面に従って枯渇される未熟血液細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血プロジェニター細胞およびがん幹細胞を含む。未熟血液細胞は、骨髄および／または循環血液に存在してもよい。
【０１５３】
「造血幹細胞」という用語は、骨髄（たとえば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（たとえば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）を含む生物の全ての血液細胞型を生じる複能性幹細胞を表す。致死的に照射された動物またはヒトに移植された場合、造血幹細胞は、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ造血細胞プールを再配置し得る。
【０１５４】
ここで使用される場合、「造血幹およびプロジェニター細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、抗原マーカーＣＤ３４の存在および系統（ｌｉｎ）マーカーの非存在によって同定される細胞を表す。したがって、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４+／Ｌｉｎ（−）細胞、およびかかる細胞の集団として特徴付けられる。ＣＤ３４+およびＬｉｎ（−）細胞を含む細胞の集団も造血プロジェニター細胞を含み、したがって、本出願の目的で、「ＨＳＰＣ」という用語は、造血プロジェニター細胞を含むことが認識される。
【０１５５】
ここで使用される場合、枯渇させるという用語は、骨髄幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％を除去することを表す。
【０１５６】
したがって、ＣＫＩ阻害剤は、骨髄破壊的または骨髄減少的（myeloreductive）用量で提供されてもよい。
【０１５７】
ここで使用される場合、「骨髄破壊的」は、造血幹細胞移植が与えられない場合、骨髄機能不全による死亡がかなりの数のレシピエントにおいて生じることになる処置を表す。
【０１５８】
ここで使用される場合、「非骨髄破壊的」は、骨髄細胞を死滅させるが、かなりの数のレシピエントにおいて、骨髄機能不全が原因の死亡につながることにならない処置を表す。
【０１５９】
ここで使用される場合、「骨髄減少的」は、血球減少または貧血を引き起こす処置を表す。
【０１６０】
ＣＫＩ阻害剤が骨髄減少的用量で提供される場合、追加の薬剤が完全な骨髄破壊をもたらすために使用されてもよいことが理解され、かかる薬剤は、たとえば、アルキル化剤（たとえば、ナイトロジェンマスタード［たとえばメクロレタミン］、シクロホスファミド、メルファランおよびクロランブシル）、スルホン酸アルキル（たとえば、ブスルファン）、ニトロソウレア（たとえば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチンおよびストレプトゾシン）、トリアゼン（たとえば、ダカルバジン）、代謝拮抗薬（たとえば、葉酸類似体、たとえばメトトレキサート）、ピリミジン類似体（たとえばフルオロウラシルおよびシタラビン）、プリン類似体（たとえば、フルダラビン、イダルビシン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ビンカアルカロイド（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデシン）、エピポドフィロトキシン（たとえば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシン）、ジブロモマンニトール、デオキシスペルグアリン、ジメチルミレランおよびチオテパの１つ以上から選択される細胞減少性薬剤を含む。
【０１６１】
追加の骨髄減少的非骨髄破壊的薬剤は、アルキル化剤、たとえば、シクロホスファミド、またはフルダラビンまたは類似物質であるが、しかしながら、造血スペース創出抗体もしくは薬物、たとえば、細胞増殖の阻害剤、たとえば、ＤＳＧ、または抗代謝剤、たとえばブレキナル、または抗Ｔ細胞抗体、たとえば、抗ＣＤ４もしくは抗ＣＤ８抗体の１つまたは両方が骨髄減少的非骨髄破壊的薬剤として使用され得る。Ｘ線照射ならびにＸ線照射および薬物投与の組合せも企図される。一部の態様では、骨髄消失は、転移性骨細胞を死滅させることが既知であるラジオアイソトープ、たとえば、放射性ストロンチウム、135サマリウム、または166ホルミウムの投与によって作製される（Ａｐｐｌｅｂａｕｍら，１９９２，Ｂｌｏｏｄ８０：１６０８−１６１３）。
【０１６２】
ＣＫＩ阻害剤は、ｐ５３の量および／または活性を増加させる能力がある量で典型的に提供される。
【０１６３】
ＣＫＩ阻害剤を骨髄細胞と接触させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでたとえばアフェレーシス中に実施されてもよい。
【０１６４】
したがって、本発明の別の側面によれば、対象の血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させる方法であって、幹細胞を、ｐ５３の量および／または活性を上方制御し、かつ血液または骨髄中の未熟血液細胞を死滅させるＣＫＩ阻害剤の量とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、それによって血液または骨髄からの未熟血液細胞を枯渇させることを含む方法が提供される。
【０１６５】
本発明のこれらの側面に従って使用されてもよいＣＫＩ阻害剤は、ここで、上で記載されている。
【０１６６】
移植される細胞は、単離細胞であっても（細胞移植片とも称される）または組織中に含まれていてもよい（組織移植片とも称される）。
【０１６７】
ここで使用される場合、「細胞または組織移植片」というフレーズは、体細胞（たとえば単一細胞または細胞の群）または組織（たとえば、完全にまたは部分的に移植されてもよい、固形組織または軟部組織）を表す。本発明の教示に従って移植されてもよい例示的な組織は、リンパ／造血組織（たとえばリンパ節、パイエル板胸腺または骨髄）を含むが、これらに限定されない。本発明の教示に従って移植されてもよい例示的な細胞は、造血幹細胞（たとえば未熟造血細胞）を含むが、これらに限定されない。特定の態様によれば、本発明の造血幹細胞は、ＣＤ３４＋である。
【０１６８】
骨髄幹細胞枯渇後に対象に移植される細胞の型は、治療される疾患に依存することが理解されよう。
【０１６９】
したがって、たとえば、対象が腎または心不全を有する場合、移植細胞は、腎臓または心臓細胞を含んでもよい。対象が肝もしくは肺不全または皮膚損傷（たとえば、火傷）を患っている場合、移植片は、肝、肺または皮膚組織を含んでもよい。対象が糖尿病を有する場合、細胞は、β細胞膵臓細胞を含む。対象が血液疾患を有する場合、細胞は、未熟造血細胞を含んでよい。
【０１７０】
適用に依存して、方法は、対象と同系または非同系である細胞または組織移植片を使用して実施されてもよい。
【０１７１】
ここで使用される場合、「同系」という用語は、対象と本質的に遺伝的に同一である個体に由来する細胞または組織を表す。典型的に、本質的に完全に近交系の哺乳動物、哺乳動物クローン、またはホモ接合性双生児の哺乳動物は、同系である。
【０１７２】
同系細胞または組織の例は、対象（当技術分野では、「自家」とも称される）、対象のクローン、または対象のホモ接合性双生児に由来する細胞または組織を含む。
【０１７３】
ここで使用される場合、「非同系」という用語は、対象のリンパ球と同種または異種である個体に由来する細胞または組織を表す（当技術分野では、「非自家」とも称される）。
【０１７４】
ここで使用される場合、「同種」という用語は、対象と同じ種のものであるドナーに由来するが、実質的に対象と非クローン性である細胞または組織を表す。典型的に、同じ種の非近交系、非接合体双生児哺乳動物は、互いに同種である。同種ドナーは、対象に関してＨＬＡ同一またはＨＬＡ非同一であってもよいことが理解されよう。
【０１７５】
ここで使用される場合、「異種」という用語は、対象のリンパ球のかなりの割合の種に対して、異なる種の抗原を実質的に発現する細胞または組織を表す。典型的に、異なる種の非近交系哺乳動物は、互いに異種である。
【０１７６】
本発明は、異種細胞または組織がいろいろな種、たとえば、これらに限定されないが、ウシ類（たとえば、乳牛）、ウマ類（たとえば、ウマ）、ブタ類（たとえばブタ）、ヒツジ類（たとえば、ヤギ、ヒツジ）、ネコ類（たとえば、フェリス・ドメスティカ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、イヌ類（たとえば、カニス・ドメスティカ（Ｃａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター）または霊長類（たとえば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）に由来することを想定する。
【０１７７】
異種起源（たとえばブタ起源）の細胞または組織は、人畜共通感染症、たとえばブタ内在性レトロウイルスを含まないことが既知である供給源から好ましくは得られる。同様に、ヒト由来細胞または組織は、実質的に病原体を含まない供給源から好ましくは得られる。
【０１７８】
本発明の態様によれば、対象とドナーの両方は、ヒトである。
【０１７９】
適用および利用可能な供給源に依存して、本発明の細胞または組織移植片は、出生前生物、出生後生物、成体または屍体ドナーから得てもよい。さらに、必要な適用に依存して、細胞または組織は、ナイーブであってもまたは遺伝的に改変されていてもよい。かかる決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８０】
当技術分野で既知の任意の方法が細胞または組織を得るために用いられてもよい（たとえば移植のために）。
【０１８１】
特定の態様によれば、移植される細胞は、造血細胞−たとえば未熟造血細胞を含む。
【０１８２】
ここで使用される場合、「未熟造血細胞」という用語は、完全に分化した造血細胞の１つ以上の型に分化する能力がある不完全に分化した細胞の任意の型を表す。未熟造血細胞は、限定することなく、「プロジェニター細胞」、「前駆体細胞」、「幹細胞」、「多能性細胞」、「複能性細胞」などと当技術分野で称される細胞の型を含む。
【０１８３】
好ましくは、未熟造血細胞は、造血幹細胞である。
【０１８４】
好ましくは、未熟造血細胞がヒトに由来する場合、未熟造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞、たとえばＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞である。
【０１８５】
未熟造血細胞を含む本発明の移植片の型は、全骨髄細胞移植片（Ｔ細胞枯渇または非Ｔ細胞枯渇）、骨髄液からの未熟造血細胞の移植片、末梢血由来未熟造血細胞の移植片および臍帯由来未熟造血細胞の移植片を含む。かかる移植片を得る方法は、以下に記載されている。
【０１８６】
ヒト末梢血由来造血幹細胞を含む移植片は、標準的な方法に従って、たとえば、ＣＤ３４＋細胞をドナーのサイトカイン処置によって末梢血に動員し、動員されたＣＤ３４＋細胞を、白血球アフェレーシスを介して収集することによって得られてもよい。骨髄または血液からの骨髄由来幹細胞の単離を行うための豊富なガイダンスが当技術分野の文献において提供されている（たとえば、Ａｒａｉ  Ｓ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  Ｈ  Ｇ．，２００３．Ａｒｃｈ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．３４：５４５−５３；およびＲｅｐｋａ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｄｏｒｆ  Ｄ．，１９９８．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１０：１１２−７；Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｗ  Ｅ．ら，１９９４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １：２２５−２３０；Ａｔｋｉｎｓｏｎ  Ｋ．，１９９９．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｐａｔｈｏｌ．９２：１０７−３６を参照されたい）。
【０１８７】
ヒト臍帯血由来造血幹細胞の移植片は、標準的な方法に従って得られてもよい（たとえば、Ｑｕｉｌｌｅｎ  Ｋ，Ｂｅｒｋｍａｎ  Ｅ  Ｍ．、１９９６．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．５：１５３−５を参照されたい）。
【０１８８】
本発明の造血幹細胞の移植片は、肝組織または卵黄嚢にも由来してもよい。
【０１８９】
造血幹細胞の必要な数は、初代造血幹細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ増殖によって提供され得る（Ｅｍｅｒｓｏｎ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：３０８２に概説されており、Ｐｅｔｚｅｒら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．３：１４７０；Ｚｕｎｄｓｔｒａら，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９０９；およびＷＯ９５１１６９２により詳細に記載されている）。
【０１９０】
細胞または組織移植片を対象に移植することは、様々なパラメーター、たとえば、細胞または組織型；レシピエントの疾患（たとえば臓器不全）の型、段階または重症度；対象に特異的な物理的または生理的パラメーター；および／または望ましい治療成績に依存して、多数の様式で実施されてもよい。
【０１９１】
本発明の細胞または組織移植片を移植することは、細胞または組織移植片を適用に依存して様々な解剖学的位置の任意の１つに移植することによって実施されてもよい。細胞または組織移植片は、同位置の解剖学的位置（移植に関する正常解剖学的位置）に、または異所性解剖学的位置（移植に関する異常解剖学的位置）に移植されてもよい。適用に依存して、細胞または組織移植片は、副腎下に、または腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、門脈、肝臓、脾臓、骨、心臓腔、心臓、胸腔、肺、皮膚、膵臓および／または腹腔内スペース中に有利に埋め込まれてもよい。
【０１９２】
本発明の同系または非同系造血細胞（たとえば未熟造血細胞）は、細胞移植に関する当技術分野で既知の任意の方法、たとえば、これらに限定されないが、細胞インフュージョン（たとえばＩ．Ｖ．）を使用して、または腹腔内経路を介してレシピエントに移植されてもよいことが理解されよう。
【０１９３】
任意に、本発明の細胞または組織移植片を欠陥のある臓器／細胞を有する対象に移植する場合、移植片の最適な発達、および対象の解剖／生理機能と共にその構造的／機能的組込みを可能にするために、不全の臓器／細胞を対象から最初に少なくとも部分的に取り除くことが有利であり得る。
【０１９４】
枯渇工程の前に、骨髄から血液への未熟血液細胞の動員も本発明によって企図される。動員薬剤の例は、動員に影響を及ぼす増殖因子またはサイトカイン、たとえばコロニー刺激因子（たとえば顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ）および幹細胞因子、ＳＣＦを含む。ペプチド動員薬剤も、米国特許出願公開第２００４／０２０９９２１号、米国特許第６，９４６，４４５号、米国特許第６，８７５，７３８号、米国特許出願公開第２００５／０００２９３９号、ＷＯ２００２／０２０５６１、ＷＯ２００４／０２０４６２およびＷＯ２００４／０８７０６８、ＷＯ００／０９１５２、ＵＳ２００２／０１５６０３４、およびＷＯ２００４／０２４１７８およびＷＯ０１／８５１９６に開示されているものを含めて、本発明によって企図される。
【０１９５】
本発明の教示による対象への細胞または組織移植片の移植後、標準的な医療行為に従って、様々な標準的な技術技法の任意の１つに従って臓器／細胞の増殖機能性および免疫適合性をモニターすることが賢明である。たとえば、細胞または組織の構造的発達は、コンピューター断層撮影または超音波画像診断を介してモニターされてもよい一方、非同系細胞または骨髄移植片の生着は、たとえば、キメラ現象試験によって［たとえば、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析を使用したＰＣＲに基づく手順によって］モニターされ得る。
【０１９６】
上記のＣＫＩ阻害剤（またはポリヌクレオチドＣＫＩ阻害剤をコードする発現ベクター）は、それ自体でまたは生理学的に許容される担体も含む医薬組成物の部分として個体に投与されてもよい。医薬組成物の目的は、生物への活性成分の投与を促進することである。
【０１９７】
ここで使用される場合、「医薬組成物」は、他の化学構成要素、たとえば生理的に適した担体および賦形剤を有するここで記載された活性成分の１つ以上（たとえばＣＫＩ−α阻害剤、ＣＫＩ−δ阻害剤および／またはＣＫＩ−ε阻害剤）の調製物を表す。
【０１９８】
ここでは、「活性成分」という用語は、生物学的効果を説明可能である薬剤（たとえば、サイレンシング分子）を表す。
【０１９９】
以下で、互換的に使用されてもよい、「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」というフレーズは、生物への著しい刺激作用を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および性質を抑止しない担体または希釈剤を表す。アジュバントは、これらのフレーズ下に含まれる。
【０２００】
ここでは、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に加えられる不活性物質を表す。賦形剤の例は、限定することなく、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、デンプンの様々な糖および型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを含む。
【０２０１】
薬物の製剤および投与に関する技法は、参照によりここに組み込まれている“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに見出され得る。
【０２０２】
投与の適した経路は、たとえば、筋肉内、皮下および髄内注入を含む、経口、直腸、直腸経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達、ならびにくも膜下腔内、直接的脳室内、たとえば、右または左心室腔への、通常の冠動脈への心臓内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注入を含んでもよい。
【０２０３】
あるいは、たとえば、患者の組織領域への直接的な医薬組成物の注入を介して、全身的ではなく、局所的に医薬組成物を投与してもよい。
【０２０４】
「組織」という用語は、類似した構造および／または共通の機能を有する細胞の凝集物からなる生物の部分を表す。例は、脳組織、網膜、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織を含むが、これらに限定されない。例示的な態様では、組織は、結腸がん組織である。
【０２０５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で既知のプロセスによって、たとえば、従来の混合、溶解、造粒、糖剤作製、研和、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥プロセスを用いて製造されてもよい。
【０２０６】
したがって、本発明による使用のための医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性成分のプロセシングを促進する、賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択された投与の経路に依存する。
【０２０７】
注入に関して、医薬組成物の活性成分は、水溶液中で、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、たとえば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液中で製剤化されてもよい。経粘膜投与に関して、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤において使用される。かかる浸透剤は、当技術分野で一般に既知である。
【０２０８】
経口投与に関して、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で既知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。かかる担体は、患者による経口摂取に関して、医薬組成物が錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化されるのを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固形賦形剤を使用して、望ましい場合、適した助剤を加えた後、生じた混合物を任意に粉砕し、顆粒の混合物をプロセシングし、錠剤または糖剤コアを得ることによって作られ得る。適した賦形剤は、特に、フィラー、たとえば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム；および／または生理学的に許容されるポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。望ましい場合、崩壊剤、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、たとえば、アルギン酸ナトリウムが加えられてもよい。
【０２０９】
糖剤コアは、適したコーティングと共に提供される。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適した有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有してもよい濃縮された糖溶液が使用されてもよい。色素またはピグメントが同定のためにまたは活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために錠剤または糖剤コーティングに加えられてもよい。
【０２１０】
経口で使用され得る医薬組成物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル剤（push-fit capsule）ならびにゼラチンおよび可塑剤、たとえば、グリセロールまたはソルビトール製の軟、密封カプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、活性成分をフィラー、たとえば、ラクトース、結合剤、たとえば、デンプン、滑沢剤、たとえば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意に安定剤との混合物で含有してもよい。軟カプセル剤では、活性成分は、適した液剤、たとえば、脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールに溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与に関する全ての製剤は、投与の選択された経路に適した用量であるべきである。
【０２１１】
頬側投与に関して、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチの形態であってもよい。
【０２１２】
経鼻吸入による投与に関して、本発明による使用のための活性成分は、適した噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して加圧パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレー提示の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。ディスペンサーにおける使用のための、たとえばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物および適した粉末ベース、たとえば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有して、製剤化されてもよい。
【０２１３】
ここで記載された医薬組成物は、たとえば、ボーラス注入または持続インフュージョンによる非経口投与のために製剤化されてもよい。注入用製剤は、任意に追加された防腐剤と共に単位剤形で、たとえば、アンプルでまたは複数回用量容器で提示されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液またはエマルションであってもよく、製剤薬剤、たとえば、懸濁、安定および／または分散剤を含有してもよい。
【０２１４】
非経口投与に関する医薬組成物は、水溶性型の活性調製物の水溶液を含む。そのうえ、活性成分の懸濁剤は、適切な油性または水性注入懸濁剤として調製されてもよい。適した親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、たとえば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームを含む。水性注入懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有してもよい。任意に、懸濁剤は、活性成分の溶解性を増加させて、高濃度の溶液の調製を可能にする適した安定剤または薬剤も含有してもよい。
【０２１５】
あるいは、活性成分は、使用前の適したビヒクル、たとえば、滅菌、発熱物質を含まない水性溶液での構成のための粉末形であってもよい。
【０２１６】
本発明の医薬組成物は、たとえば、従来の坐剤基剤、たとえば、カカオバターまたは他のグリセリドを使用して、直腸組成物、たとえば、坐剤または停留かん腸でも製剤化されてもよい。
【０２１７】
本発明の状況における使用に適した医薬組成物は、活性成分が意図された目的を達成するのに効果的な量で含有される組成物を含む。より具体的に、治療有効量は、障害の症状を妨げる、軽減する、もしくは寛解するまたは治療される対象の生存を延長するのに効果的な活性成分の量を意味する。
【０２１８】
治療有効量の決定は、特にここで提供された詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２１９】
本発明の方法において使用される任意の調製物に関して、治療有効量または用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから最初に推定され得る。たとえば、用量は、望ましい濃度または力価を達成するための動物モデル（たとえば、ここで例証されたＡＰＣモデル）において製剤化され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０２２０】
ここで記載された活性成分の毒性および治療有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞培養または実験動物において標準的な製薬手順によって決定され得る。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を製剤化するのに使用され得る。用量は、用いられる剤形および利用される投与の経路に依存して変動してもよい。正確な製剤、投与の経路および用量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る。（たとえば、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１におけるＦｉｎｇｌら、１９７５を参照されたい）。
【０２２１】
用量および間隔は、生物学的効果を誘導するまたは抑圧するのに十分である活性成分の組織レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために、個々に調整されてもよい。ＭＥＣは、各調製物によって変動することになるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するために必要な用量は、個々の特徴および投与の経路に依存することになる。検出アッセイが血漿濃度を決定するために使用され得る。
【０２２２】
治療される状態の重症度および応答性に依存して、投薬は、数日から数週間続く処置の過程で、または治癒がもたらされるもしくは疾患状況の減少が達成されるまで、単回または複数回投与のものとすることができる。
【０２２３】
投与される組成物の量は、当然、治療される対象、苦痛の重症度、投与の様式、処方医師の判断などに依存することになる。
【０２２４】
本発明の組成物は、望ましい場合、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有してもよい、パックまたはディスペンサーデバイス、たとえば、ＦＤＡ認可キットで提示されてもよい。キットは、阻害剤、たとえば、ＣＫＩ−α阻害剤、ＣＫＩ−δ阻害剤およびＣＫＩ−ε阻害剤の組合せを含んでもよい。パックは、たとえば、金属またはプラスチックホイル、たとえば、ブリスターパックを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与に関する説明書を伴ってもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する行政機関によって指示された形態である容器に関連している通知によって適合されていてもよく、その通知は、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与の機関による認可を反映している。かかる通知は、たとえば、処方薬に関する米国食品医薬品局によって認可された標識または認可された製品挿入物のものであってもよい。適合性の医薬品担体で製剤化された本発明の調製物を含む組成物も、上でさらに詳しく述べたように、調製され、適切な容器に配置され、指示された状態の治療に関して標識されてもよい。
【０２２５】
「治療する」という用語は、病態（疾患、障害または状態）の発達を阻害する、妨げるまたは停止することおよび／または病態の減少、寛解、もしくは退行を引き起こすことを表す。当業者は、様々な手法およびアッセイが病態の発達を評価するために使用され得、同様に、様々な手法およびアッセイが病態の減少、寛解または退行を評価するために使用されてもよいことを理解することになる。
【０２２６】
ここで使用される場合、「妨げる」という用語は、疾患、障害または状態が、疾患のリスクがあり得るが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において生じないようにすることを表す。
【０２２７】
ここで使用される場合、「対象」という用語は、病態を患う任意の年齢の哺乳動物、好ましくはヒトを含む。好ましくは、この用語は、病態を発症するリスクがある個体を包含する。
【０２２８】
特定の態様によれば、対象は、イマチニブ、ダサチニブまたはニロチニブで同時に治療されない。
【０２２９】
明瞭さのために、別々の態様の文脈で記載された本発明のいくつかの特徴は、単一の態様の組合せでも提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の態様の文脈で記載された本発明の様々な特徴は、別々にまたは任意の適した部分的組合せでまたは本発明の任意の他の記載された態様に適したものとしても提供されてもよい。様々な態様の文脈で記載されたいくつかの特徴は、態様がそれらの要素がなければ作用しないというのでなければ、態様の不可欠な特徴とは考えられない。
【０２３０】
上で描写され、以下の特許請求の範囲の節で特許請求された本発明の様々な態様および側面は、以下の例において実験的支持を見出す。
【０２３１】
［実施例］
ここで、上記の記述と共に本発明の一部の態様を非限定的に例示する以下の例を参照する。
【０２３２】
一般に、ここで使用される学術用語および本発明において利用されるラボ手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技法を含む。かかる技法は、文献において徹底的に説明されている。たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に示された手法を参照されたい；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ��，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい；まるでここに完全に明記されているように、上記の全ては、参照により組み込まれている。他の一般的な参考文献は、本文書全体を通して提供されている。その中の手順は、当技術分野で既知であると信じられており、読者の便宜のために提供されている。その中に含有された全ての情報は、参照によりここに組み込まれている。
【０２３３】
材料および方法
コンディショナルＣＫＩα  ＫＯマウス：ｌｏｘＰが隣接するＣＳＮＫ１Ａ１マウス（Ｅｌｙａｄａら、２０１１）を有するＣ５７ｂｌ／６マウスをｍｘ１−Ｃｒｅマウス（Ｋｕｈｎら、１９９５）と交雑させた。７世代をＣ５７ｂｌ／６マウスと戻し交配して、純粋な遺伝的背景を産出した。Ｍｘ１−Ｃｒｅ誘導を一日おきの２ｍｇ／ｍＬポリイノシン−ポリシチジン酸ナトリウム塩（ｐＩｐＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１５３０）の１０ｕＬ／ｇマウスの３回のＩ．Ｐ．注入によって行った。生着を新鮮単離５×１０6骨髄細胞のＩ．Ｖ．注入によって行った。
【０２３４】
ＢＣＲ−ＡＢＬ−誘導性ＣＭＬモデル：ＢＣＲ−ＡＢＬ−誘導性ＣＭＬモデルを産出するために、ＭｘＣｒｅ-Ｃｋ１α１fl/flまたはＭｘＣｒｅ+Ｃｋ１α１fl/flからのＢＭ細胞を抽出し、ｃＫｉｔ発現細胞（ＥａｓｙＳｅｐ＃１８７５７）に関して濃縮し、１５％ＦＣＳ  Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充されたＲＰＭＩ中で終夜インキュベートした。次いで、培養物を、上清培地を含有するｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルス構築物に４時間感染させ、追加の２４ｈ間培地に戻した。次いで、培養物を、亜致死的に照射された（５００ｒａｄ）マウス中にＩ．Ｖ．で注入した。マウス末梢血におけるＧＦＰ発現細胞の検出可能な着実な増加（ＦＡＣＳによる）ならびに白血球数および未熟細胞の上昇（ライトギムザ染色血液塗抹標本によって検出された）と同時に、マウスを屠殺し、それらの骨髄を亜致死的に照射されたＷＴ宿主に移入した。
【０２３５】
各かかる移入を疾患世代と名付けた。４番目の移入までに、宿主を疾患移入前にもはや亜致死的に照射せず、世代間の時間は、より短かった（通常１０日）。急性転化発達は、芽細胞の高度に異常な数（ＰＢ中のＷＢＣの３０％を超える）および移入間の短くなっていく時間によって容易に検出可能であった。実験手順を図３に例示する。実験を芽細胞が容易に検出可能であり、宿主の照射が必要ではなく、世代時間が短い（最大１４日）後の世代疾患において行った。マウスを悪液質、嗜眠、およびラフコート（ruff coat）、麻痺に関して毎日モニターし、瀕死のマウスを屠殺した。
【０２３６】
ＣＭＬに及ぼすＣｋ１α１  ＫＯ効果を評価するために、ｐＩｐＣを骨髄移植（ＢＭＴ）後２４ｈから始めて一日おきにＩ．Ｐ．（２０μｇ／ｇマウス）で投与した。
【０２３７】
ＭｘＣｒｅ+Ｃｋ１α１fl/fl  ＣＤ４５．２疾患宿主を使用した場合、最初のｐＩｐＣ投与から第７日でのＷＴ類遺伝子性ＣＤ４５．１ドナーからのＩ．Ｖ．５×１０6ＢＭ細胞の追加で同じ手順を行った。キメラ現象を生着後１カ月でマウスＰＢ中のＣＤ４５．１発現白血球の分析を通して評価した。ＬＴ−ＨＳＣ生着をＰＢ中の骨髄とリンパの両方の成熟ＣＤ４５．１発現白血球の出現によって評価した。
【０２３８】
ＰＦ６７０４６２を２０％２−ヒドロキシプロピルβ−サイクロデキストリン（ビヒクル）に溶解し、疾患移入後７時間に始めて６０ｍｇ／Ｋｇの毎日のＩ．Ｐ．によって投与した。対照マウスをビヒクルのみで処置した。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害剤試験：ＣＭＬ保有マウスからの新鮮単離骨髄を１：１比で正常マウス骨髄と混合し、１５％ＦＣＳ  Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ヘペス、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸で補充されたＲＰＭＩ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）中で増殖した。ＰＦ６７０４６２阻害剤をＤＭＳＯに溶解し、指示された濃度および０．１％ＤＭＳＯで組織培地に加えた。対照に関しては、細胞をビヒクルのみで処置した。３６〜４８ｈ後、細胞を収集し、カメラおよび標準的な倒立光学顕微鏡を使用して手動で計数した。死細胞を、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）を使用して除外した。正常およびＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞の数をＧＦＰ+／７ＡＡＤ-発現細胞％のＦＡＣＳ分析に従って後で推定した。アネキシンＶ−ＰＥ（ＭＢＬ）、７ＡＡＤ（Ｔｏｎｂｏ）染色を製造者の推奨に従ってＦＡＣＳによって評価した。
【０２４０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：細胞からの全ＲＮＡをＤｉｒｅｃｔＺｏｌ  ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｅｄ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡをポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）およびＭＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して産出し、製造者の説明書に従ってＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で増幅した。少なくとも３連の反応を各遺伝子に関して行った。融解曲線分析を非特異的ＰＣＲ産物およびプライマー二量体を制御するために各ランの後に行った。内部標準としてＰＰ１Ａ、ＵＢＣおよびＨＰＲＴを使用して正規化を行った。
【０２４１】
ウエスタンブロット分析：全細胞ライセートをビヒクルまたはＰＦ６７０４６２のいずれかで処置したＣＭＬ保有マウスの骨髄からプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下で抽出した。
【０２４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ニトロセルロース膜上に移動されたタンパク質抽出物をβ−カテニン、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３およびＨＳＰ９０に対する抗体でプローブした。目的のタンパク質をＨＲＰコンジュゲートロバ／ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で検出し、提供されたプロトコールに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬウエスタンブロット法基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で可視化した。
【０２４３】
ＦＡＣＳ分析：全てのアッセイをＢＤの：ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒ、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡソーターまたはＬＳＲ  ＩＩ装置において行った。染色のために、細胞を５ｕＭ  ＥＤＴＡを有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液に懸濁した。次いで、細胞を氷上で適切な抗体で３０分間インキュベートし、洗浄し、製造者の推奨に従って適切な二次抗体でインキュベートした。ＣＤ１６およびＣＤ３２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に特異的なモノクローナル抗体を染色の前にＦｃ受容体の遮断のために使用した。細胞表面標識に使用される抗体をここで以下に表１に列挙する。
【０２４４】
【表１】
2017506259.tif 000003
【０２４５】
例１
ＣＫＩα欠失は、骨髄再構成を可能にする正常ＨＳＣ枯渇につながる
Ｃｋ１α１fl/fl  Ｍｘ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを骨髄中のＣＫＩα欠失の効果を分析するために産出した。Ｍｘ−ＣｒｅをＢＭだけでなく、肝臓および脾臓においても誘導する。観察される表現型がＢＭ中のＣＫＩα欠失に特異的であり、他の組織においては特異的でないことを保証するために、ＧＦＰマウスを有するＣｋ１α１fl/fl  Ｍｘ−Ｃｒｅトランスジェニックの骨髄を致死的ＩＲ  ＷＴマウス中に注入した。それを行うことによって、レシピエントマウスへのｐＩｐＣ注入時に、ＣＫＩα欠失がＢＭにおいてのみ達成され、他の組織では達成されないことを保証した。長期（ＬＴ）生着を、移植後２カ月で末梢血における安定したドナーＧＦＰ陽性細胞を決定することによって検証した。成功的な生着の検証時にのみ、ｐＩｐＣを注入した。
【０２４６】
ＣＫＩα  ＫＯ誘導（ｐＩｐＣでの）時に、マウスは、２０日の生存中央値をもたらす減少したＨＳＣ数により致死的汎血球減少症を発症する（図１Ｃ）。しかしながら、ｐＩｐＣ処置の場合、ＢＭ  ＣＫＩα欠失マウスにｐＩｐＣ処置から第７日にＷＴ骨髄を移植し、それらを救出し、高レベルのキメラ現象を示した（図１Ｄ〜Ｆ）。これを３カ月を超えて維持し、骨髄とリンパ系列の両方を含み（示さず）、これは、長期骨髄再構成を示した。対照マウスは、ｐＩｐＣ誘導注射によって影響されず、生着において１％を超えるキメラ現象を示さなかった（データは示さず）。
【０２４７】
例２
ＣＫＩα欠失骨髄は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ駆動白血病起源を妨げる
Ｍｘ−Ｃｒｅを有するまたは有さないＣＫＩαのフロックス対立遺伝子を保有するマウスからの骨髄をＢｃｒ−Ａｂｌ保有レトロウイルスに感染させ、亜致死的に照射されたＷＴレシピエントマウス中に注入した（図２）。次に、病気のマウスからのＢＭを採取し、ＷＴマウス中に生着した。この手順を、慢性白血病疾患が、ＢＭおよび末梢血における複数の芽細胞および２〜３週以内の死を有する侵襲性急性急性転化疾患に変わるまで複数回繰り返した。
【０２４８】
第１世代では、マウスは、約５週間後に死んだ一方、次の世代では、マウスは、より侵襲性の疾患を患っているので、それらは、移植後２週間のみ生存した。さらに、少数回の移植の繰り返し後に白血病レシピエントマウスを照射するさらなる必要性はなく、これは、白血病の侵襲性の性質を証明していた。
【０２４９】
ＣＭＬ発達に及ぼすＣＫＩα消失の効果を試験するために、ｐＩｐＣをレシピエントマウスに白血病ＢＭ生着後２４ｈで注入した。この実験では、２つの異なる対照群を使用した：第１の対照群では、マウスにＭｘ−Ｃｒｅを保有する白血病細胞を注入し、マウスにＰＢＳを注入し、第２の対照群では、マウスにＭｘ−Ｃｒｅを欠く白血病細胞を注入したが、ｐＩｐＣ注入を行った（図３Ａ〜Ｄ）。疾患進行をレシピエントマウスの末梢血中のＧＦＰ＋を計数することによって追跡した（図３Ｂ）。
【０２５０】
対照マウスでは、ＧＦＰ＋細胞は、指数関数的に増加し、これは、侵襲性疾患を示していた一方、ＣＫＩα  ＫＯ群では、白血病細胞は、ほとんど検出不可能であった（図３Ｂ）。対照とＣＫＩα−欠失群間の差異は、血液塗抹標本においても明らかであった。対照群では、複数の芽細胞が、ＣＭＬ急性転化におけるように明らかであった一方、ＣＫＩα  ＫＯ群では、末梢血塗抹標本は、芽細胞なく正常に見えた（図３Ｃ）。マウスを生存に関しても追跡した。両方の対照群マウスが骨髄移入後約３週間で死んだ一方、ＣＫＩα  ＫＯ群の大多数は、生存した（図３Ｄ）。
【０２５１】
ＢＭＴの候補であるＣＭＬ患者は、ＢＭＴ前に白血病幹細胞（ＬＳＣ）を除去するために高用量の化学療法またはＩＲで処置される。これらのプロセスでは、正常造血幹細胞（ＨＳＣ）もまた除去される。
【０２５２】
ＣＫＩα欠失が化学療法または照射誘発骨髄破壊および白血病細胞排除の代わりになり得るかどうかを評価するために、白血病細胞をＭｘ−ＣｒｅマウスでフロックスされたＣＫＩα中に注入した。
【０２５３】
このモデルでは、ｐＩｐＣ注入は、レシピエントマウスの白血病と正常の両方のＨＳＣにおいてＣＫＩα  ＫＯを誘導した。ＫＯ誘導後７日で、ＷＴマウスからのＢＭを照射なしで白血病マウスに移植した（図４Ａ）。ドナーとレシピエントマウス間を区別するために、ＣＤ４５の２つの異なる亜型を有するマウスを使用した。
【０２５４】
図４Ｂに例示されるように、ＣＫＩα  ＫＯが誘導されなかった対照群では、ドナー由来細胞は、末梢血（ＰＢ）において明らかではない一方、ＫＯ群では、１２日後に２５％を超える細胞がドナー由来である。
【０２５５】
疾患進行の分析は、生存率データによって反映されるように（図４Ｃ）、対照マウスにおける白血病細胞の非常に高い百分率があった一方、ＣＫＩα  ＫＯでは、白血病細胞は、検出不可能であったことを示した（図４Ｂ）。
【０２５６】
例３
白血病細胞に及ぼすＣＫＩ阻害剤ＰＦ６７０４６２の効果
次に、本発明者らは、ＣＫＩ阻害剤であるＰＦ６７０４６２の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常ＢＭおよび白血病細胞において評価した。ＰＦ６７０４６２は、ＣＫＩ−δ／ε特異的阻害剤であると考えられており（Ｌｏｎｇ  Ａ，Ｚｈａｏ  Ｈ，Ｈｕａｎｇ  Ｘ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｊａｎ  ２６；５５（２）：９５６−６０．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ２０１３８７ｓ）、したがって、Ｗｎｔまたはｐ５３経路を活性化すると想定されていない（Ｐｒｉｃｅ  ＭＡ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．Ｆｅｂ１５；２０（４）：３９９−４１０）。細胞に阻害剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置した場合、用量依存的なＷｎｔおよびｐ５３の上方制御が骨髄細胞分析において観察され（図５Ｂ）、これは、ＣＫＩα阻害活性を示していた（Ｅｌｙａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｆｅｂ  １７；４７０（７３３４）：４０９−１３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６７３）。注目すべきことに、阻害剤での処置後に細胞型間の有意差が観察され、正常ＢＭ細胞数は、阻害剤の増加する濃度での処置においてわずかに減少したのみであった一方、白血病細胞数の減少は、はるかに顕著であった（図５Ｃ）。
【０２５７】
阻害剤が白血病細胞におけるアポトーシスを誘導したと推測され得る。これは、用量依存的な阻害剤処置下でのアポトーシス細胞割合の増加を実証した一方、ＷＴ  ＢＭ細胞は、著しく影響されなかった７ＡＡＤ−／アネキシン＋アッセイによって確認された（図５Ｄ）。
【０２５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を図６Ａのスキームに記載されたように行った。疾患移入後７時間で、マウスをＰＦ６７０４６２（ｉ．ｐ．）で毎日処置した。阻害剤処置マウスから収集された骨髄細胞のウエスタンブロット分析は、β−カテニンおよびｐ５３の安定化およびＷｎｔ標的遺伝子ｃ−Ｍｙｃの誘導を示し、ＰＦ６７０４６２のＣＫＩα阻害活性をここでも証明していた（図６Ｂ）。
【０２５９】
阻害剤処置マウスにおける疾患進行を、白血病を引き起こす細胞（ＬＩＣ）（すなわち、がん幹細胞）レシピエントマウスの末梢血におけるＧＦＰ＋を計数することによって追跡した。ビヒクルを処置したマウスの群では、ＧＦＰ＋細胞は、指数関数的に上昇し、これは、侵襲性疾患を示していた一方、ＣＫＩ阻害剤を処置したマウスの群では、白血病細胞は、ほとんど検出不可能であった（図６Ｃ）。ビヒクル処置マウスでは、骨髄は、脊椎動物を破壊する白血病細胞によって浸潤された一方、阻害剤処置マウスは、インタクトな脊椎動物を有する正常骨髄出現を有した（図６Ｄ）。ビヒクル処置マウスとは異なり、芽細胞は、阻害剤処置マウスの末梢血において検出されなかった（図６Ｅ）。
【０２６０】
マウスの生存を追跡した場合、ビヒクル処置群が１２日以内に死んだ一方、ＣＫＩ阻害剤処置群は、生存したままであったことが理解され得る（図６Ｆ）。健康に見える阻害剤処置マウスを２０日後に屠殺し、それらの組織を白血病の任意の兆候に関して調べ（たとえば、図６Ｄ）、それらの骨髄を致死的に照射されたマウスに移植して、任意の残留するＬＩＣが照射された宿主において生存し、増殖したかどうかおよび正常、長期再構築性造血幹細胞（ＬＴ０ＨＳＣ）が阻害剤によって影響されたかどうかを決定した。今までのところ、移植後１カ月で、レシピエントマウス骨髄は、末梢血における白血病ＧＦＰ＋細胞の証拠なく完全に再構成されており、これは、ＬＩＣの完全な除去を有するインタクトなＬＴ−ＨＳＣを示している。
【０２６１】
例４
メラノーママウスにおけるＣＫＩα欠失の効果
ＢＲＡＦの変異性活性化は、ヒトメラノーマにおける最も早期かつ最も一般的な遺伝子変異である。Ｐｔｅｎ腫瘍抑制因子遺伝子サイレンシングと組み合わせられたＢＲＡｆｖ６００Ｅの発現は、１００％浸透率、短潜時ならびにリンパ節、腹膜腔および肺において観察される転移を有するメラノーマの発達を誘発する。これらのマウスは、長く生存するメラノーマ引き起こす細胞（ＭＩＣ）の存在を有する転移のメラノーマの中核的な特色を研究するための系を提供する。ＢＲＡＦモデルとここで称される、発癌性ＢＲＡＦおよびＰＴＥＮ欠失（Ｂ６．Ｃｇ−Ｂｒａｆtm1Mmcm  Ｐｔｅｎtm1Hwu  Ｔｇ（Ｔｙｒ−ｃｒｅ／ＥＲＴ２）１３Ｂｏｓ／ＢｏｓＪ）に基づく、チロシナーゼ−Ｃｒｅのタモキシフェン−誘導性活性化（メラノサイトに特異的）に基づくマウスメラノーマモデルを、ＢＲＡＦ−ＣＫＩ  ＫＯマウスモデルとここで称されるＣＫＩα−フロックスマウス中に繁殖させた。ＢＲＡＦとＢＲＡＦ−ＣＫＩ  ＫＯモデルの両方をタモキシフェンの局所的耳適用によって処置した。タモキシフェン処置後５６日で、ＢＲＡＦモデルマウスは、局所的かつ全身的に広がる転移性メラノーマを発症した（図７Ａ）が、ＢＲＡＦ−ＣＫＩ  ＫＯモデルは、メラノーマの兆候を示さず、耳上の色素斑のみであった（図７Ｂ）。したがって、ＣＫＩα消失は、この実験系においてＭＩＣを除去する。
【０２６２】
ＢＲＡＦメラノーママウスをメラノーマのタモキシフェン誘導後２４時間または３週間で開始する毎日の６０ｍｇ／Ｋｇ  ＰＦ−６７０４６２皮下注入によって、またはビヒクル（２０％２−ヒドロキシプロピルβ−サイクロデキストリン；Ｓｉｇｍａ）によって処置する。阻害剤の効果を観察するために、マウスをタモキシフェン誘導後５６日で屠殺する。
【０２６３】
本発明は、その特定の態様と共に記載されたけれども、多くの代替物、変更形態および変形形態が当業者に明白となることが明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内にある、全てのかかる代替物、変更形態および変形形態を包含することが意図されている。
【０２６４】
本明細書で言及された、全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりここに組み込まれていると具体的にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、明細書中への参照によりその全体がここに組み込まれている。加えて、本出願におけるあらゆる参照の引用または同定は、かかる参照が本発明への従来技術として利用可能であるという承認と解釈されてはならない。節の見出しが使用される程度まで、それらは、必然的に限定的と解釈されるべきではない。
【図５Ｄ】
2017506259.tif 000004
【図１Ａ】
2017506259.tif 000005
【図１Ｂ】
2017506259.tif 000006
【図１Ｃ】
2017506259.tif 000007
【図１Ｄ】
2017506259.tif 000008
【図１Ｅ】
2017506259.tif 000009
【図１Ｆ】
2017506259.tif 000010
【図２】
2017506259.tif 000011
【図３Ａ】
2017506259.tif 000012
【図３Ｂ】
2017506259.tif 000013
【図３Ｃ】
2017506259.tif 000014
【図３Ｄ】
2017506259.tif 000015
【図４Ａ】
2017506259.tif 000016
【図４Ｂ】
2017506259.tif 000017
【図４Ｃ】
2017506259.tif 000018
【図５Ａ】
2017506259.tif 000019
【図５Ｂ】
2017506259.tif 000020
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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