(57)【要約】  本発明は、バイオリアクター（２；１２；３２）と、音響定在波細胞分離器（５；１５；３５）と、フィルター（７；１７；３７）とを備える細胞培養用の装置（１；１１；３１）であって、バイオリアクターの出口（３；１３；３３）が、音響定在波細胞分離器の入口（４；１４；３４）と流体連通し、音響定在波細胞分離器の培地出口（６；１６；３６）が、フィルター（７；１７；３７）と流体連通しいる、装置（１；１１；３１）について開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクター（２；１２；３２）と、音響定在波細胞分離器（５；１５；３５）と、フィルター（７；１７；３７）とを備える細胞培養用の装置（１；１１；３１）であって、バイオリアクターの出口（３；１３；３３）が音響定在波細胞分離器の入口（４；１４；３４）と流体連通し、音響定在波細胞分離器の培地出口（６；１６；３６）がフィルター（７；１７；３７）と流体連通しいる、装置。
【請求項２】
フィルターが、保持液側（２０）及び透過液側（２１）を有するクロスフローフィルター装置（１７）であり、音響定在波細胞分離器（１５）の培地出口（１６）が保持液側の入口（２２）と流体連通し、音響定在波細胞分離器の細胞濃縮液出口（１８）及び保持液側の出口（２３）がバイオリアクターの入口（１９）と流体連通しており、当該装置が、透過液側（２１）から透過液（２４）を回収するように構成されている、請求項１に記載の装置（１１）。
【請求項３】
クロスフローフィルター装置（１７）が中空繊維フィルターカートリッジである、請求項２に記載の装置（１１）。
【請求項４】
クロスフローフィルター（１７）が、０．１〜５μｍの公称細孔径を有する精密濾過膜又は１０〜５００ｋＤのカットオフを有する限外濾過膜を含む、請求項２又は請求項３に記載の装置（１１）。
【請求項５】
フィルター（７；１７；３７）がデプスフィルターである、請求項１に記載の装置（１；１１；３１）。
【請求項６】
出口（３３）が、バイオリアクター（３２）から上清を吸引するように構成された吸引チューブである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の装置（３１）。
【請求項７】
音響定在波細胞分離器（５；１５；３５）が、２以上の直列に連結された分離器チャンバーを備える、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の装置（１；１１；３１）。
【請求項８】
バイオリアクター（２；１２；３２）がフレキシブルバッグを備える、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の装置（１；１１；３１）。
【請求項９】
フィルター（７；１７；３７）と流体連通し、フィルター（７；１７；３７）から濾液（８；３８）又は透過液（２４）を受け入れるように配置された１以上の分離カラム（８７；９７，９８）をさらに備える、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の装置（１；１１；３１）。
【請求項１０】
細胞培養の方法であって、
ａ）請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の装置（１；１１；３１）を設けるステップと、
ｂ）バイオリアクター（２；１２；３２）に培地及び細胞を導入するステップと、
ｃ）バイオリアクター（２；１２；３２）で細胞を培養するステップと、
ｄ）音響定在波細胞分離器（５；１５；３５）及びフィルター（７；１７；３７）を介して、濾液（８；３８）又は透過液（２４）を引き出すステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ステップａ）が、請求項２又は請求項３に記載の装置（１１）を設けることを含み、ステップｄ）あ、透過液（２４）を引き出すこと、及びｉ）音響定在波細胞分離器（１５）からの細胞濃縮液、及びｉｉ）クロスフローフィルター装置（１７）からバイオリアクター（１２）への保持液の両方を再利用することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）は、請求項６に記載の装置（３１）を設けることを含み、当該方法が、ステップｄ）の前に、凝集剤又は沈殿剤をバイオリアクター（２；１２；３２）に添加すること、及び上清及び沈殿を生成できるようにすることからなるステップｃ’）をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｃ）の少なくとも一部で、バイオリアクター（２；１２；３２）の細胞濃度が１０×１０6細胞／ｍｌ以上、例えば１５×１０6細胞／ｍｌ以上である、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｃ）の少なくとも一部で、バイオリアクター（２；１２；３２）において細胞で発現されたターゲットタンパク質の濃度が５ｇ／ｌ以上である、請求項１０乃至請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオリアクター（８２；９２）と、音響定在波細胞分離器（８５；９５）と、１以上の分離カラム（８７；９７，９８）とを備える生体分子回収用の装置（８１；９１）であって、バイオリアクターの出口（８３；９３）が音響定在波細胞分離器（８５；９５）の入口（８４；９４）と流体連通し、音響定在波細胞分離器の培地出口（８６；９６）が１以上の分離カラム（８７；９７，９８）と流体連通しいる、装置（８１；９１）。
【請求項１６】
培地出口（８６；９６）と１以上の分離カラム（８７；９７，９８）との間にフィルターを備えていない、請求項１５に記載の装置（８１；９１）。
【請求項１７】
擬似移動床又は周期的向流プロセスのような連続分離に適した複数の分離カラム（８７）を備える、請求項１５又は請求項１６に記載の装置（８１）。
【請求項１８】
１以上の分離カラム（８７；９７，９８）が１以上の吸着流動床カラムである、請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項に記載の装置（８１；９１）。
【請求項１９】
１以上の分離カラム（８７；９７，９８）が、体積加重平均粒径８０μｍ以上の粒子のような分離マトリックス粒子からなる充填床を含む、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項に記載の装置（８１；９１）。
【請求項２０】
分離マトリックス粒子が充填されたガードカラム（９７）の入口（９９）が音響波細胞分離器（９５）の培地出口（９６）と流体連通し、ガードカラムの出口（１００）が分離マトリックス粒子が充填されたメインカラム（９８）の入口（１０１）と流体連通しいる、請求項１９に記載の装置（９１）。
【請求項２１】
細胞培養物から生体分子を回収する方法であって、
ａ）請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項に記載の装置（８１；９１）を設けるステップと、
ｂ）バイオリアクター（８２；９２）に培地及び細胞を導入するステップと、
ｃ）細胞培養物を生成するために、バイオリアクター（８２；９２）で細胞を培養するステップと、
ｄ）音響定在波細胞分離器（８５；９５）に、細胞培養物の少なくとも一部分を引き出すステップと、
ｅ）細胞除去フラクションを生成するために、音響定在波細胞分離器（８５；９５）の細胞培養物から細胞を分離するステップと、
ｆ）細胞除去フラクションを１以上の分離カラム（８７；９７，９８）に搬送するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に関し、より詳細には、音響細胞分離装置及びフィルターを有するバイオリアクターに関する。本発明は、バイオリアクターシステムで細胞を培養する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセス環境では、治療薬の製造に有用なタンパク質の発現並びにワクチン製造のための抗原（例えばウイルス粒子）の生産のため、細胞を培養する。いずれの場合も、プロセスの経済性を向上させるためのように向かう連続的な原動力は、培養中、高い細胞濃度に対する要求につながっている。高い細胞濃度を得る１つの方法は、潅流モードで培養を実行することである。この操作では、細胞はバイオリアクターに保持され、生成物による有毒な代謝産物は連続して除去される。栄養素を含む供給物は継続的に加えられる。この操作は、高い細胞濃度を得ることが可能であり、より重要なことに、何週間から何ヶ月もの間、細胞を生産性の非常に高い状態に維持することができる。これは、はるかに高い収率を達成し、必要なバイオリアクターの大きさを減少させる。それは、初代細胞その他の増殖の遅い細胞を培養するための有用な技術でもある。潅流操作は、ヒト細胞及び遺伝子治療の適用に必要とされる大量の細胞を培養するための非常に大きな可能性を有する。
【０００３】
潅流培養における近年の開発は、例えば、米国特許第６５４４４２４号、同第８１１９３６８号及び同第８２２２００１号に記載された交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）法であり、これらの文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。ここでは、細胞培養物の一部分は、代謝産物を除去できるようにするために、バイオリアクターから移動されて中空繊維カートリッジに通され、中空繊維壁を通過して任意にタンパク質を発現する。繊維内腔が細胞で目詰まりを起こさないように、繊維に流す細胞培養物の流れを交互に逆転しなければならない。これは、濾過効率を低下させ、極めて高い細胞濃度では依然として内腔が閉塞するリスクがある。
【０００４】
そこで、フィルターを閉塞させずに高い細胞濃度で培養できる改善された解決策が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１０９５２０号
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの態様は、高い細胞濃度で効率的に細胞培養できる装置を提供することである。これは、請求項１に記載の装置によって達成される。１つの利点は、細胞損傷を最小限にすることができる点である。別の利点は、フィルターを詰まらせることを回避でき、利用可能なフィルター領域を効果的に利用できる点である。本発明の別の態様は、高い細胞濃度で効率的に操作できる培養方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。本発明の第３の態様は、高い細胞濃度の細胞培養物から生体分子を効率的に回収できる装置を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の装置によって達成される。１つの利点は、フィルター又は遠心分離機が分離カラムの上流で必要とされていない点である。別の利点は、装置が連続プロセスに容易に適合できる点である。第４の態様は、高い細胞濃度の細胞培養物で生成された生体分子のための効率的な回収方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。さらに、本発明の適した実施形態は、従属請求項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明に係る装置を示す図である。
【図２】クロスフローフィルター装置を有する、本発明に係る装置を示す図である。
【図３】中空繊維カートリッジを有する、本発明に係る装置を示す図である。
【図４】吸引チューブを有する、本発明に係る装置を示す図である。
【図５ａ】音響共鳴チャンバーを有する、本発明で使用するための音響定在波細胞分離器を示す図である。
【図５ｂ】直列に連結された２つの音響共鳴チャンバーを有する、本発明で使用するための音響定在波細胞分離器を示す図である。
【図６】交互に使用するための３つの分離カラムを有する、本発明に係る装置を示す図である。
【図７】直列に連結された２つの分離カラムを有する、本発明に係る装置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１つの態様では、本発明は、バイオリアクター２；１２；３２と、音響定在波細胞分離器５；１５；３５と、フィルター７；１７；３７とを備える細胞培養用の装置１；１１；３１を開示する。音響定在波細胞分離器は、例えば、米国特許第５６２６７６７号に記載された分離器であってもよく、この文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。分離器は、典型的に、細胞培養物のための入口４；１４；３４、細胞濃縮液出口９；１８；３９、及び細胞の枯渇した培地のための培地出口６；１６；３６を有することができる。バイオリアクターの出口３；１３；３３は、音響定在波細胞分離器の入口４；１４；３４と流体連通し、音響定在波細胞分離器の培地出口６；１６；３６は、フィルター７；１７；３７と流体連通しいる。バイオリアクターは、５００ｍｌ以上（最大数ｍ3まで）の規模での細胞培養に適したいかなるタイプのバイオリアクターであってもよい。それは、ＷＡＶＥタイプ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のロッキングプラットフォームバイオリアクターにおけるように、それ自身で予め滅菌して供給することができ使用することができる、例えば柔らかいプラスチックバッグを備えるバイオリアクターであってもよく、柔らかいプラスチックバッグは、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ  ＸＤＲバイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）におけるような固い支持容器で挿入物として使用することができる。バイオリアクターの出口と細胞分離器の入口との間の流体の連結、及び／又は細胞分離器の出口とフィルターとの間の流体の連結は、例えば、チューブを取り付けることによって、直接連結によって又はいくつかの他のタイプの導管若しくは液体輸送に適した構造によって達成することができる。連結は、さらに、細胞培養物／培地を搬送するための１つ以上のポンプを含んでもよく、流れを制御するための弁を任意に含んでもよい。
【０００９】
本発明での使用のための音響定在波細胞分離器５０；７０の例は、図５ａ）及び図５ｂ）に示されている。音響定在波細胞分離器５０；７０は、１つ以上のトランスデューサ５１；７１、例えば１つ以上の音響共鳴チャンバー５３；７３で音響定在波５２；７２を発生させるように構成された超音波圧電トランスデューサを含むことができる。それぞれの共鳴チャンバーは、定在波を安定化させるための音響ミラー５５；７５も含んでもよい。細胞懸濁液５７が入口５４；７４を経由して共鳴チャンバーを通って搬送されたとき、細胞は、定在波の節によって保持され、培地出口５６；７６を通してチャンバーから細胞が除去された液体５９を得ることができる。波動パターンを適切に制御することによって、細胞濃縮液出口５８；７８を通して、細胞集積濃縮液６０を引き出すこともできる。図５ａ）は、単一の共鳴チャンバー５３を有する分離器５０を示し、一方、図５ｂ）は、培地出口７６からの流れの細胞含量をさらに減少させることができる、直列に連結された２つの共鳴チャンバー７３を有する分離器７０を示す。上で説明したような適した分離器は、アプリコンバイオテクノロジー（オランダ）からＢｉｏＳｅｐの名前の下で市販されている。分離器への供給物の最初の細胞濃度が例えば、１００×１０6細胞／ｍｌで作動しているとき、細胞濃度の典型的な減少は９８％以上であってもよい。
【００１０】
音響細胞分離器によって得られる細胞の大きな減少は、極めて高い細胞濃度が分離器の入口に入れられた場合でさえ、培地出口で得られる細胞が除去された培地は、とても低い密度を有するので、後で通されるフィルターの閉塞が飛躍的に減少するということを意味する。実際には、これは、通される通常のフローフィルター（例えば、デプスフィルター）が、交換なしに数倍長く使用することができるということ、及びクロスフローフィルターは、閉塞する問題なしに実質的に使用することができるということを意味する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、フィルターは、保持液側２０及び透過液側２１を有するクロスフローフィルター装置１７である。音響定在波細胞分離器１５の培地出口１６は、保持液側の入口２２に流体的に連結することができ、一方、音響定在波細胞分離器の細胞濃縮液出口１８及び保持液側の出口２３は、バイオリアクターの入口１９に流体的に連結することができる。装置は、透過液側から透過液２４を回収するように、例えば、透過液回収容器と流体的に連結された透過液側からの出口を有することによって又は後のプロセスステップに透過液を直接供給することによって適切に適合することができる。培地出口と保持液入口との間の流体の連結、保持液出口とバイオリアクター入口との間の流体の連結、及び／又は細胞濃縮液出口とバイオリアクター入口との間の流体の連結は、例えば、チューブを取り付けることによって、直接連結によって又はいくつかの他のタイプの導管若しくは液体輸送に適した構造によって達成することができる。さらに、連結は、細胞培養物／培地を搬送するための１つ以上のポンプを含んでもよく、流れを制御するための弁を任意に含んでもよい。
【００１２】
クロスフローフィルター装置は、例えば、中空繊維フィルターカートリッジであってもよく又は代案として、薄いシートカセット装置又はプレートフレームモジュールであってもよい。クロスフローフィルター装置は、例えば０．１〜５μｍの公称細孔径を有する精密濾過膜又は例えば１０〜５００ｋＤのカットオフを有する限外濾過膜を適切に含むことができる。この機構は、フィルター／繊維閉塞のいかなる問題もなく、極めて高い細胞濃度までの潅流培養を許容し、フィルター装置での脈動する流れ又は交互に起こる流れに対していかなる要求もない。音響分離器をクロスフローフィルター装置と組み合わせることの特定の利点は、音響分離器が壊れやすい動物細胞への機械的損傷が最小限である極めて緩やかな分離を提供する点である。クロスフロー濾過は、狭いチャネルを通る高い流速及びこれらのチャネルの出入りを含むので、細胞損傷のリスクは、（特に、高い細胞濃度での）クロスフロー濾過においてはるかに高く、クロスフローフィルターに通す前に細胞濃度を大幅に減少させることによって、細胞損傷の全体の程度は、飛躍的に減少させることができる。損傷した細胞が細胞残屑、ＤＮＡ、及び他の詰まらせる可能性があるものを放出するので、これは、クロスフロー濾過及び後のプロセスの両方の効率を向上させるだろう。別の利点は、クロスフローフィルター装置での閉塞を回避するために、交互の流れが必要とされない点であり、これは、フィルター領域が逆行の洗浄サイクルなしで分離するために連続して使用されるということを意味する。
【００１３】
ある実施形態では、出口３３は、バイオリアクター３２から上清を吸引するように構成された吸引チューブである。吸引チューブは、例えばバイオリアクターの（使用中の）頂部側から、例えばバイオリアクターの底部からバイオリアクターの内側の高さの１０〜５０％の距離の、バイオリアクターの下半分の位置に、下向きに延びていてもよい。吸引チューブの位置は、例えば、バイオリアクターの細胞沈殿層の真上にチューブ端部を配置できるように伸縮することによって調整可能であってもよい。これは、標準のフローフィルターが使用される場合であっても、実質的にいかなるフィルター閉塞もなしに音響細胞分離器への上清の引き出しを可能にし、細胞が除去された上清の、その後のフィルターを通したフィルターリングを可能にする。
【００１４】
以下で説明する通り、装置は、フィルターと流体連通した１つ以上の分離カラムをさらに備えることができる。１つ以上の分離カラムは、フィルターから濾液又は透過液を受け入れるように適切に配置され、充填床クロマトグラフィーカラム又は吸着流動床カラムのようないずれか一方のクロマトグラフィーカラムであってもよい。それらは、擬似移動床又は周期的向流クロマトグラフィーのような連続的又は半連続的な使用のために、さらに配置することができる。このような方法で、バイオリアクターの下流の連続プロセスは実現することができる。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、細胞培養方法であって、
ａ）上で説明したような装置１；１１；３１を設けるステップと、
ｂ）バイオリアクター２；１２；３２に培地及び細胞を導入するステップと、
ｃ）バイオリアクターで細胞を培養するステップと、
ｄ）音響定在波細胞分離器５；１５；３５及びフィルター７；１７；３７を介して、濾液８；３８又は透過液２４を引き出すステップと
を含む方法を開示する。
【００１６】
細胞は、例えば、動物細胞（例えば、哺乳類、鳥類又は昆虫の細胞）のような真核細胞又は真菌細胞（例えば、菌又は酵母の細胞）であってもよい。それらは、特に、免疫グロブリン（例えば、単クローン抗体又は抗体フラグメント）、融合タンパク質、凝固因子、インターフェロン、インスリン、成長ホルモン、その他の組換えタンパク質のような治療の生体分子を発現できる細胞であってもよい。細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ．６細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＲ細胞などであってもよい。適切には、ターゲット生体分子を発現する間、細胞が分裂し、細胞濃度を増加させるように、少数の細胞及び細胞培地がバイオリアクターに導入され、培養条件が選択される。培養は、例えば、攪拌、酸素／空気を加えること、二酸化炭素及び他の気体の代謝産物の除去などの適切な度合いを含む、当技術分野で知られる方法に従って実行することができる。培養中、例えば、ｐＨ、導電率、代謝産物濃度、細胞濃度などのような様々なパラメータは、与えられた細胞タイプに適した条件を提供するように制御することができる。細胞濃度は、ステップｃ）の少なくとも一部で（例えば、ステップｃ）の終わりに）、バイオリアクターの細胞濃度が２５×１０6細胞／ｍｌ以上、２５〜１５０×１０6又は５０〜１２０×１０6細胞／ｍｌのような１０×１０6細胞／ｍｌ以上のレベルに適切に増加させることができる。上限は、主に、極めて高い細胞濃度での細胞懸濁液のレオロジー特性によって設定され、ペースト状の稠度に近付いたときに攪拌及びガス交換を阻止することができる。細胞の実行可能性は、例えば、５０％以上、例えば８０％以上又は９０％以上であってもよい。細胞で発現されたターゲット生体分子又はターゲットタンパク質の濃度は、ステップｃ）の少なくとも一部で（例えば、ステップｃ）の終わりに）、バイオリアクターで５ｇ／ｌ以上又は１０ｇ／ｌ以上であってもよい。
【００１７】
図２及び図３に示す実施形態では、ステップａ）は、上述の装置１１を設けることを含み、ステップｄ）は、透過液２４を引き出すこと、及び、ｉ）音響定在波細胞分離器１５からの細胞濃縮液と、ｉｉ）クロスフローフィルター装置１７からバイオリアクター１２への保持液との両方を再利用することを含む。未使用の培地は、引き出された透過液の量の損失を補うために、バイオリアクターに適切に添加することができる。クロスフローフィルター装置が精密濾過膜を備える場合、透過液は、収集することができ、例えば、１つ以上のクロマトグラフィーステップによってさらに処理することができる発現された生体分子を含むだろう。生体分子がＦｃ部分を含む場合（例えば、生体分子が免疫グロブリン又は免疫グロブリン融合タンパク質である場合）、例えば、プロテインＡカラムのようなアフィニティークロマトグラフィーカラムにそれを直接搬送することができる。クロスフローフィルター装置が限外濾過膜を含む場合、有毒な代謝産物及び／又は阻害する代謝産物が除去される間、タンパク質は保持されるだろう。このケースでは、ターゲットタンパク質は、独立した採取操作で培養後、回収することができる。上述のように、細胞を詰まらせる問題又は汚染問題なしに、細胞が除去された培地をクロスフローフィルター装置の入口に供給できるように、音響分離器は、緩やかであるが効率的な細胞の除去を提供する。音響分離器からの細胞濃縮液は、クロスフローフィルター装置からの保持液と一緒に、別の培養物のためのバイオリアクターに戻るように供給することができる。
【００１８】
図４に示すいくつかの実施形態では、ステップａ）は、上述の装置３１を設けることを含み、方法は、ステップｄ）の前に、凝集剤又は沈殿剤をバイオリアクターに添加すること、及び上清と沈殿とを生成できるようにすることからなるステップｃ’）をさらに備える。その後、上清は、ステップｄ）で吸引チューブ３３を通して引き出すことができ、分離器３５を介してフィルター３７に送達することができる。個々の細胞沈殿は、とても遅いので、重力沈殿によって個々の細胞沈殿を実質的に分離できない。しかしながら、凝集剤を加えることによって、個々の細胞沈殿を凝集できる場合、沈殿速度を飛躍的に増加させることができる。凝集剤は、例えば、キトサン、ポリビニルピリジン、その他の高分子電解質のような可溶性ポリマーであってもよい。それは、特にリン酸カルシウム（例えば、国際公開第２００７０３５２８３号に記載されたヒドロキシアパタイト、なお、この文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）のような粒子と組み合わせた多価塩であってもよい。凝集剤は、望まれていない細胞培養物成分、例えば宿主細胞タンパク質に対してほぼ選択的な沈殿剤の機能を果たすこともできる。沈殿する成分を有する細胞が凝集して沈殿したとき、上清は、沈殿していない細胞を除去するために、音響細胞分離器を通して引き出すことができ、最終的にフィルターを通る通路によって浄化することができる。ここで音響細胞分離器を使用する利点は、時間がかかる沈殿を完全に終了しなくてもよいこと、及び沈殿の頂部に極めて近い所で吸引チューブを操作することができるので、（価値のあるターゲット生体分子の回収を増加させて、）上清のより完全な引き出しを実行することができることである。
【００１９】
第３の態様では、本発明は、図６及び図７に示すような生体分子回収用の装置８１；９１を開示する。装置は、上述のようなバイオリアクター８２；９２、上述のような音響定在波細胞分離器８５；９５、及び１以上の分離カラム８７；９７，９８を備える。装置では、バイオリアクターの出口８３；９３は、音響定在波細胞分離器８５；９５の入口８４；９４と流体連通し、音響定在波細胞分離器の培地出口８６；９６は、分離カラム８７；９７，９８と流体連通しいる。装置は、培地出口と分離カラムとの間に、上述のようなフィルターを任意に含むことができるが、培地出口から得られる細胞除去フラクションが極めて低い細胞濃度を有し、フラクションを分離カラムに直接入れることができるので、いかなるフィルターもなしに使用することもできる。したがって、培地出口は、分離カラムに直接連結してもよい。分離カラムは、バイオリアクターで生成されたターゲット生体分子を結合することができる分離マトリックスを適切に含むことができる。生体分子が抗体又は別のＦｃを含むタンパク質である場合、分離マトリックスは、例えば、高い選択性を有するＦｃを含むタンパク質と結合し、高精製された抗体／Ｆｃを含むタンパク質を溶出できる、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）ｒプロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）マトリックスのようなプロテインＡマトリックスであってもよい。代案として、分離カラムは、例えば、イオン交換マトリックス、多様なマトリックス又は疎水性相互作用マトリックスのような他のタイプの分離マトリックスを含むことができる。複数のカラム８７が、図６にに示すように使用されるとき、弁８８は、前のカラムが十分にロードされているとき、未使用のカラムに切り替えるために、カラム間で連続的に切り替えることができるようにしてもよい。この概念は、例えば、米国特許第７９０１５８１号、米国特許出願公開第２０１３０２１３８８４号、及び米国特許出願公開第２０１２００９１０６３号に記載の、クロマトグラフィーの技術分野で公知の擬似移動床（ＳＭＢ）又は周期的向流（ＰＣＣ）プロセスのような連続クロマトグラフィープロセスに、さらに発展することができ、これらの文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。音響定在波細胞分離器と組み合わせた連続クロマトグラフィーの使用は、詳細には、バイオリアクターの下流で全てを連続して処理できるようにする点で有利である。分離器からの細胞集積濃縮液８９がバイオリアクターに再利用される場合、細胞培養ステップを含む全ての連続的な処理を実行することも可能である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、分離カラムは、吸着流動床（ＥＢＡ）カラムを含む。このタイプのカラムは、高密度（典型的に１．１〜１．５ｇ／ｃｍ3）の分離マトリックス粒子を含み、粒子床が供給物の流れによって膨張するように、供給物は、カラムの下端部に上向きの方向に入れられる。吸着流動床では、膨張床の粒子間の隙間が細胞を通すことができるよりも十分に大きいので、細胞その他の粒子を含む供給物は、カラムを直ちに詰らせることなく、入れることができる。しかしながら、時間とともに汚染を引き起こす、粒子表面に付着する細胞のリスクがある。細胞濃度が直立した音響波細胞分離器を通る通路によって減少したとき、このリスクは回避することができ、汚染は、サイクルの間に例えば、０．１〜１Ｍ水酸化ナトリウムのようなアルカリによって、マトリックス粒子のクリーニングによって容易に軽減することができる。さらに、吸着流動床の詳細は、全体が参照によって本明細書に取り込まれた、例えば、米国特許第５５２２９９３号、同第５７５９３９５号、同第５８６６００６号、同第５９３５４４２号、同第６３２５９３７号及び同第６６２０３２６号で提供される。吸着流動床のためのカラム及びマトリックスは、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社又はＤＳＭ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社からそれぞれＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）及びＲｈｏｂｕｓｔ（商標）という商品名で入手できる。
【００２１】
ある実施形態では、１以上の分離カラムは、分離マトリックス粒子が充填された床を含む。床が残りの細胞その他の粒子に向かって低感度を有するために、分離マトリックス粒子が８０μｍ以上、１５０μｍ以上又は２００μｍ以上のような大きな（体積加重）平均粒径を有する場合、有利であることがある。体積加重平均粒径は、粒子への低感度及び迅速な質量輸送の両方を可能にするために、８０〜３００μｍ、例えば１５０〜３００μｍ又は１５０〜２５０μｍの範囲に適切に存在することができる。これらの範囲の分離マトリックスの例は、プロテインＡ機能架橋アガロースビーズＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（８５μｍ）、架橋アガロースビーズＳｅｐＨａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（９０μｍ）、及び架橋アガロースビーズＳｅｐＨａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ（２００μｍ）（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）である。
【００２２】
図７に示すいくつかの実施形態では、分離マトリックス粒子が充填されたガードカラム９７の入口９９は、音響波細胞分離器９５の培地出口９６と流体連通し、ガードカラムの出口１００は、分離マトリックス粒子が充填されたメインカラム９８の入口１０１と流体連通しいる。粒子の平均粒径は、上述のように適切に存在することができ、ガードカラムは、例えば、メインカラムと同一のタイプのマトリックスを充填することができる。残りの細胞その他の粒子がカラムを詰まらせる傾向がある場合、残りの細胞その他の粒子は、必要とされるとき、例えば、特定の数のサイクルの後又はそれぞれのサイクルの後であっても、容易に交換することができるガードカラムに引っかかるだろう。ガードカラムは、適切に、例えば、メインカラムの容積の５０％未満、例えば２５％未満又は１０％未満となるように、メインカラムよりも小さくてもよい。
【００２３】
第４の態様では、本発明は、細胞培養物から生体分子を回収する方法であって、
ａ）上述の装置８１；９１を設けるステップと、
ｂ）バイオリアクター８２；９２に上述の培地及び細胞を導入するステップと、
ｃ）細胞培養物を生成するために、バイオリアクターで細胞を培養するステップと、
ｄ）細胞培養物の少なくとも一部分を音響定在波細胞分離器８５；９５に引き出すステップと、
ｅ）細胞除去フラクションを生成するために、音響定在波細胞分離器の細胞培養物から細胞を分離するステップと、
ｆ）細胞除去フラクションを分離カラム８７；９７，９８に搬送するステップと
を含み、生体分子は、分離マトリックスに結合することができ、カラムに溶出液を入れることによって精製された形で溶出することができる、方法を開示する。代案として、細胞培養物に存在する汚染物質は、分離マトリックスに結合してもよく、生体分子は、カラムからの流入フラクション及び／又は洗浄フラクションで回収することができる。
【００２４】
この方法は、現在使用されているような複雑な遠心分離操作なしに、生体分子を高効率に回収できるようにする。
【００２５】
この記載された説明は、ベストモードを含み、当業者に本発明を実施できるようにする、いかなる装置又はシステムを作成し使用すること、及び組み込まれた方法を実行することを含む、本発明を開示するための例を使用する。本発明の特許を受けることができる範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に想到する他の例を含んでもよい。他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構成要素を有する場合又は特許請求の範囲の文言に対してごくわずかな差を有する均等な構成要素を含む場合、特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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