(57)【要約】実施形態は、原発性腫瘍部位、二次性遠隔臓器、および循環のヒト微小環境を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣するアセンブリを生産する方法を提供する。原発性腫瘍、浸潤性および転移性細胞を単離して、治療的効能の評価および転移性がんに適用される診断に使用するためのプラットフォームを提供する方法および装置がさらに提供される。一局面において、ａ）脊椎動物由来の流体および任意選択で原発性部位増殖マトリクスを含む第１の構成要素と、ｂ）生物学的マトリクス模倣体を含む第２の構成要素と、ｃ）二次性部位増殖培地を含む動的流体構成要素であって、上記流体構成要素は、上記第１の構成要素および上記第２の構成要素と流体接触している、流体構成要素と、を含む細胞培養アセンブリが提供され、上記二次性部位増殖培地は、上記流体よりも高い血清濃度を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）脊椎動物由来の流体および任意選択で原発性部位増殖マトリクスを含む第１の構成要素と、
ｂ）生物学的マトリクス模倣体を含む第２の構成要素と、
ｃ）二次性部位増殖培地を含む動的流体構成要素であって、前記流体構成要素は、前記第１の構成要素および前記第２の構成要素と流体接触している、流体構成要素と
を含む細胞培養アセンブリであって、
前記二次性部位増殖培地は、前記流体よりも高い血清濃度を有する、アセンブリ。
【請求項２】
前記二次性部位増殖培地が、少なくとも８％の血清または血清代用物を含有している、請求項１に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項３】
前記二次性部位増殖培地が、少なくとも１５％の血清または血清代用物を含有している、請求項１に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項４】
前記流体が、５％未満の血清または血清代用物を含有している、請求項２に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項５】
前記二次性部位増殖培地の血清濃度が、前記流体の血清濃度の少なくとも２倍である、請求項２に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項６】
前記第１の構成要素と前記第２の構成要素とが、別個の組織培養容器内に含まれている、請求項１に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項７】
前記第１の構成要素は、少なくとも一部がインサート容器内に含まれている、請求項１に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項８】
前記流体構成要素に結合されたポンプまたはかき混ぜ装置をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項９】
前記第１の構成要素中の前記流体が、健常な脊椎動物に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１０】
前記第１の構成要素中の前記流体が、がんを有する脊椎動物に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１１】
前記動的流体構成要素が、がんを有する脊椎動物から取得した流体を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１２】
前記動的流体構成要素が、骨髄間質細胞の培養物から取得した流体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１３】
前記生物学的マトリクス模倣体が、臓器特異的マトリクスを含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１４】
前記臓器特異的マトリクスが、副腎、骨髄、脳、肝臓、肺組織、リンパ節、卵巣、腹膜、皮膚、脾臓、結合組織、骨、血管構造物または関節結合部をシミュレートする、請求項１３に記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１５】
前記生物学的マトリクス模倣体が、コラーゲン１〜１４もしくはその断片、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸もしくは関連するヒアルロナン、レクチカン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）または他のグリコサミノグリカン、コンドロイチン、デルマタン、または関連する細胞外マトリクスもしくは糖衣構成要素、またはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１６】
前記第１の構成要素が、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、結腸、子宮内膜、食道、腎臓、肝臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、胃、精巣、甲状腺、または子宮、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、瘢痕、線維症性組織、外科的癒着組織、または過剰増殖性骨病変の固形腫瘍を模倣する、前記請求項のいずれかに記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１７】
前記第１の構成要素が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、レクチカン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１８】
系が、約３０℃〜約４５℃の温度で維持される、前記請求項のいずれかに記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１９】
抗がんまたは抗過剰増殖（抗ＨＰＰ）治療薬を特定する方法であって、
ａ）可能性のある抗がん／抗ＨＰＰ治療薬を含む溶液を、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリに添加するステップであって、前記細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の転移性がん細胞またはＨＰＰ細胞を含む、ステップと、
ｂ）前記細胞培養アセンブリに存在する原発性腫瘍、浸潤性もしくは転移性がんまたはＨＰＰ細胞の量を、前記可能性のある抗がん／抗ＨＰＰ治療薬の添加の前および後に検出するステップと、
ｃ）可能性のある抗がん／抗ＨＰＰ治療薬を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
抗がん／抗ＨＰＰ治療薬または組み合わせまたは処置スケジュールの、患者に対する効能を特定する方法であって、
ａ）可能性のある抗がん／抗ＨＰＰ治療薬または組み合わせまたは処置スケジュールを含む溶液を、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素または第２の構成要素に添加するステップであって、前記細胞培養アセンブリの前記第２の構成要素は、検出可能な量の転移性がんまたはＨＰＰ細胞を含有する、ステップと、
ｂ）前記第２の構成要素に存在する転移性がんまたはＨＰＰ細胞の量を、前記可能性のある抗がん／抗ＨＰＰ治療薬、組み合わせ、または処置スケジュールの添加の前および後に検出するステップと、
ｄ）抗がん／抗ＨＰＰ治療薬、組み合わせ、または処置スケジュールの効能を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項２１】
患者におけるがんの転移性播種または病理学的ＨＰＰ増殖の進行を予測および／または特定する方法であって、
ａ）前記患者から取得したがんまたはＨＰＰ細胞を含む溶液を、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素に添加するステップであって、前記細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の前記患者由来のがんまたはＨＰＰ細胞を含む、ステップと、
ｂ）十分な期間後に、前記細胞培養アセンブリの前記第２の構成要素における転移性がんまたはＨＰＰ細胞の存在または不在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記細胞培養アセンブリが、前記アセンブリに結合された、転移性細胞の定着を検出するための系をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞培養アセンブリが、前記アセンブリに結合された、転移性がんまたはＨＰＰ細胞の定着または増殖を検出するためのデジタル顕微鏡または系をさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞培養アセンブリが、前記アセンブリに結合されたフローサイトメータをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年１月２２日に出願された米国仮出願第６１／９３０，３９０号および２０１５年１月６日に出願された同第６２／１００，３７５号（これらは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本明細書の実施形態は、細胞を培養するための方法および装置に関し、より詳細には、がん治療薬の調査ならびに原発性、ｉｎ  ｓｉｔｕ、浸潤性、転移性および再発性がんの診断および予後戦略の開発のために、原発性腫瘍部位、遠隔転移性部位および循環のヒト微小環境を模倣した状態下でがん細胞を培養するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
転移は、複雑な複数ステップのプロセスであり、悪性細胞が原発性腫瘍から脱出し、組織の基底膜を通って浸潤し、足場非依存性状態下、循環中で生存し、そして二次性部位の異質な微小環境下で定着する（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）（Ｇｕｐｔａ  ＧＰら、Ｃｅｌｌ、１２７巻：６７９頁（２００６年）；Ｍｅｈｌｅｎ  Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、６巻：４４９頁（２００６年））。
【０００４】
転移は、がんに関連した重大な病的状態の原因であり、がん関連死の９０％を占める（Ｇｕｐｔａ  ＧＰら、Ｃｅｌｌ、１２７巻：６７９頁（２００６年）；Ｍｅｈｌｅｎ  Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、６巻：４４９頁（２００６年））。新たな処置戦略の発展にもかかわらず、大半のがんに由来する遠隔部位への転移を示す患者の５年生存率は３０パーセント未満にとどまっている（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ＡＣ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１３年））。転移による死亡率がそのように高い理由はおそらく、効果的な治療剤ならびに主として薬物耐性がある転移性細胞を特異的に特定および標的化する初期診断戦略が欠如しているためである。
【０００５】
二次性部位に成功裏に定着するために、転移性細胞は、その生存および増殖を支持するニッチを見つけなければならない。そのようなニッチは、特定の組織の細胞外マトリクス、間質、免疫、および他の細胞構成要素ならびに分泌因子で構成されている。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法、例えば、スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ、および浸潤アッセイは、固形基層の上またはそれを通じた細胞の遊走能力を評価するにすぎず、循環を通じた転移性播種で要件となる足場非依存性を再現していない（Ｋａｍ  Ｙら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ、８巻：１９８頁（２００８年）；Ｋｒａｍｅｒ  Ｎら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２年）；Ｌｉａｎｇ  Ｃ−Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２巻：３２９頁（２００７年））。さらに、浸潤アッセイ、例えばマトリゲル浸潤は、原発性および二次性部位の細胞外マトリクスの組成の差異の原因を説明できない（Ｉｏａｃｈｉｍ  Ｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、３８巻：２３６２頁（２００２年））。これらの欠点により、原発性部位から腫瘍細胞の播種または二次性臓器の浸潤の両方でないがいずれかへの研究のために標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用することは大きく制限されている。転移のモデルマウスは、同様に、ヒト疾患を忠実に再現していないことから、前臨床で使用するには不適切である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｐｔａ  ＧＰら、Ｃｅｌｌ（２００６年）１２７巻：６７９頁
【非特許文献２】Ｍｅｈｌｅｎ  Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６年）６巻：４４９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示は、原発性腫瘍部位、二次性遠隔臓器、および循環のヒト微小環境をｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣する包括的系である細胞培養アセンブリに関する。細胞培養アセンブリは、本明細書において、再構築転移モデル、または「ｒＭｅｔ」系、培養物、プラットフォームもしくはモデルとも称される。本明細書で示すデータは、ｒＭｅｔ系が、腫瘍形成の全ての段階（すなわち、原発性腫瘍、浸潤性、転移性および再発性がん）ならびに転移性拡散の主要ステップ：１）原発性部位からの脱出、２）基底膜を通じた浸潤、３）足場非依存性状態下での生存、および４）二次性部位の浸潤／定着を再現することを示す。さらに、ｒＭｅｔ系は、原発性および二次性部位の両方の細胞外マトリクスを考慮して設計され、したがって現在使用されている系の主要な制限を克服する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、ａ）脊椎動物由来の流体および任意選択で原発性部位増殖マトリクスを含む第１の構成要素と、ｂ）生物学的マトリクス模倣体を含む第２の構成要素と、ｃ）合成または脊椎動物由来の二次性部位増殖培地を含む動的流体構成要素であって、第１および第２の構成要素と流体接触している流体構成要素とを含む細胞培養アセンブリが提供される。一部の実施形態では、二次性部位増殖培地は、上記流体よりも高い血清濃度を有する。例えば、二次性部位増殖培地は、１０〜３０％の範囲の血清（または代用血清（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｓｅｒｕｍ）もしくは代替血清（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｅｒｕｍ））濃度を有し、一方で、上記流体は０％〜５％の血清濃度を有しうる。
【００１０】
別の実施形態では、抗がん治療薬を特定する方法であって、ａ）可能性のある抗がん治療薬を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリに添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量のがん細胞、例えば限定されないが、原発性腫瘍細胞、浸潤性細胞、および／または転移性細胞を含む、ステップと、ｂ）細胞培養アセンブリに存在する原発性腫瘍細胞、浸潤性細胞、および／または転移性細胞の量を、可能性のある抗がん治療薬の添加の前および後に検出するステップと、ｃ）可能性のある抗がん治療薬を特定するステップとを含む、方法が提供される。
【００１１】
別の実施形態では、患者に対する抗がん治療薬の効能を特定する方法であって、ａ）可能性のある抗がん治療薬を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素に添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量のがん細胞、例えば限定されないが、原発性腫瘍細胞、浸潤性細胞、および／または転移性細胞を含有する、ステップと、ｂ）第２の構成要素に存在する原発性腫瘍細胞、浸潤性細胞、および／または転移性細胞の量を、可能性のある抗がん治療薬の添加の前および後に検出するステップと、ｃ）抗がん治療薬の効能を特定するステップとを含む、方法が提供される。
【００１２】
別の実施形態では、患者におけるがんの転移性播種を予測および／または特定する方法であって、ａ）患者から取得したがん細胞を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素に添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の患者由来のがん細胞を含む、ステップと、ｂ）十分な期間後に、細胞培養アセンブリの第２の構成要素における転移性がん細胞の存在または不在を検出するステップとを含む、方法が提供される。
【００１３】
さらなる実施形態は、明細書全体にわたって見出されうる。
【００１４】
本発明の実施形態は、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明により容易に理解される。本発明の実施形態は、例として示され、添付の図面の図の限定としては示されない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１Ａ〜Ｄは、様々な実施形態に従って、原発性組織と二次性臓器のｉｎ  ｖｉｖｏ微小環境を模倣するように設計されたｒＭｅｔモデルのアセンブリを示す。図１Ａは、アセンブリ中の流体をかき混ぜる任意選択のデバイスを備えた、原発性部位（インサート）および二次性部位（組織培養プレートのウェル）を模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養装置としてのｒＭｅｔモデル（再構築転移、ｒＭｅｔモデル）のアセンブリを示す；図１Ｂは、固形化マトリゲル（「原発性部位」細胞外マトリクス）のクライオ走査型（ｃｒｙｏ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）電子顕微鏡検査画像を示す；図１Ｃは、重合された再構築骨髄（ｒＢＭ）マトリクスのクライオ走査型電子顕微鏡検査画像を示す；図１Ｄは、ｒＭｅｔ培養物の一定期間後の細胞分布を示す。
【図１−２】図１Ａ〜Ｄは、様々な実施形態に従って、原発性組織と二次性臓器のｉｎ  ｖｉｖｏ微小環境を模倣するように設計されたｒＭｅｔモデルのアセンブリを示す。図１Ａは、アセンブリ中の流体をかき混ぜる任意選択のデバイスを備えた、原発性部位（インサート）および二次性部位（組織培養プレートのウェル）を模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養装置としてのｒＭｅｔモデル（再構築転移、ｒＭｅｔモデル）のアセンブリを示す；図１Ｂは、固形化マトリゲル（「原発性部位」細胞外マトリクス）のクライオ走査型電子顕微鏡検査画像を示す；図１Ｃは、重合された再構築骨髄（ｒＢＭ）マトリクスのクライオ走査型電子顕微鏡検査画像を示す；図１Ｄは、ｒＭｅｔ培養物の一定期間後の細胞分布を示す。
【図２】図２は、原発性組織および／または二次性部位が、容器間で流体を移動させる供給源によって接続された別個の容器で設定されているｒＭｅｔモデルの代替的アセンブリを示す。
【図３−１】図３Ａ〜Ｄは、ｒＭｅｔモデルが、固形腫瘍転移の複雑性を再現していることを示す；図３Ａは、ｒＭｅｔ中で培養された乳がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｂは、ｒＭｅｔ中で培養された原発性乳がん細胞による腫瘍様および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｃは、ｒＭｅｔ中で培養された前立腺がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｄは、ｒＭｅｔ中で培養された肺、胃、膵臓、結腸、卵巣、黒色腫および精巣がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す。
【図３−２】図３Ａ〜Ｄは、ｒＭｅｔモデルが、固形腫瘍転移の複雑性を再現していることを示す；図３Ａは、ｒＭｅｔ中で培養された乳がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｂは、ｒＭｅｔ中で培養された原発性乳がん細胞による腫瘍様および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｃは、ｒＭｅｔ中で培養された前立腺がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｄは、ｒＭｅｔ中で培養された肺、胃、膵臓、結腸、卵巣、黒色腫および精巣がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す。
【図３−３】図３Ａ〜Ｄは、ｒＭｅｔモデルが、固形腫瘍転移の複雑性を再現していることを示す；図３Ａは、ｒＭｅｔ中で培養された乳がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｂは、ｒＭｅｔ中で培養された原発性乳がん細胞による腫瘍様および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｃは、ｒＭｅｔ中で培養された前立腺がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す；図３Ｄは、ｒＭｅｔ中で培養された肺、胃、膵臓、結腸、卵巣、黒色腫および精巣がん細胞による腫瘍様、浸潤性および転移性細胞集団の形成を示す。
【図４】図４は、腫瘍の種類に基づいた「転移性部位」の定着のタイミングを示す。
【図５】図５は、ｒＭｅｔの「転移性部位」でのマトリクス基層に基づく転移定着を確立する細胞の傾向を示す。
【図６−１】図６は、ｒＭｅｔモデル内の転移性細胞が生存可能なままであることを実証する。
【図６−２】図６は、ｒＭｅｔモデル内の転移性細胞が生存可能なままであることを実証する。
【図７−１】図７Ａ〜Ｂは、ｒＭｅｔから単離された細胞の転移能力を示す。図７Ａは、ｒＭｅｔモデルから単離された転移性細胞が転移を誘発する一方、腫瘍様細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで拡散する能力が著しく減少していることを示す。図７Ｂは、様々な二次性部位での転移性病変の外観を示す。
【図７−２】図７Ａ〜Ｂは、ｒＭｅｔから単離された細胞の転移能力を示す。図７Ａは、ｒＭｅｔモデルから単離された転移性細胞が転移を誘発する一方、腫瘍様細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで拡散する能力が著しく減少していることを示す。図７Ｂは、様々な二次性部位での転移性病変の外観を示す。
【図８】図８は、効能を試験するためにｒＭｅｔプラットフォームを使用する利点を、従来の培養方法と比較して実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の詳細な説明において、その一部を形成する添付の図面を参照するが、この図面では、実施されうる実施形態が例として示されている。他の実施形態が利用されうること、および範囲を逸脱しない範囲で、構造的または論理的変更が行われうることが理解されるべきである。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきでなく、実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって定義される。
【００１７】
様々な操作が、実施形態の理解を助けるように、複数の別個の操作として順に記載されうるが、その記載の順序は、これらの操作が順序に依存することを含意するものと解釈されるべきではない。
【００１８】
記載は、上へ／下へ、の上に／の下に、後ろに／正面に、および頂部に／底部に、などの見方に基づいた記載を使用する場合がある。そのような記載は、単に議論を平易にするために使用され、実施形態の適用を限定することは意図していない。
【００１９】
定義
本明細書では、生物内の原発性部位から二次性の場所への細胞遊走プロセスを再構築するように設計された装置中で真核細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する、細胞培養アセンブリが提供される。上記のように、再構築転移モデルである細胞培養アセンブリは、「ｒＭｅｔ」モデルもしくは系または細胞培養装置もしくはプラットフォームと呼ばれることもある。ｒＭｅｔモデルは、腫瘍細胞の、原発性組織部位、例えば乳腺から、二次性部位、例えば骨髄への播種を、伝統的培養方法を使用して可能なものよりも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの拡散に緊密に類似した様式で行うことを可能にする。ｒＭｅｔモデルは、治療薬開発、抗がん薬試験、処置に対する応答の評価および個々の腫瘍の転移能力の予測に使用される原発性腫瘍、浸潤性および転移性細胞を単離するための機会の改善を提供する。
【００２０】
ｒＭｅｔモデルを説明するために使用した用語を下記に示す。
【００２１】
細胞培養アセンブリは、組織培養容器または細胞培養容器を使用しうる。実施形態を記載する目的において、表現「組織培養容器」および「細胞培養容器」は相互に交換可能に使用され、真核細胞の増殖に適した任意の容器／コンテナを指し、市販のまたはその目的のための注文仕様の任意の容器／コンテナが含まれる。一部の実施形態では、表現「組織培養インサート」、「細胞培養インサート」、「インサート容器」または「トランスウェル」は、複数の分離されたチャンバを作製することを目的として組織培養容器内に入るように設計された装置を指す。組織培養容器または容器インサートは、限定されないが、ポリスチレン、ポリマー、ガラス、プラスチックなどを含む材料から構築されてもよく、細胞を付着するように適合させた表面で処理／被覆／構築されてもよい。インサートは、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートまたは任意の他の適切な材料などの材料から構築された多孔質膜を有しうる。組織培養容器および／またはインサートの表面は、親水性、疎水性、負に荷電、正に荷電、非イオン性であってもよく、または１つもしくは複数の表面積を増加させるようにテクスチャが改変されていてもよい。さらに、組織培養容器は、ガス透過性であってもよく、および／または、ガス透過性のキャップ／蓋／閉鎖器を含んでもよい。実施形態に従う組織培養容器としては、限定されないが、フラスコ、単一ウェルプレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、ボトル、ペトリ皿、チャンバスライド、および他のコンテナが挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「脊椎動物由来の流体」としては、限定されないが、任意の脊椎動物（例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、イヌなど）からの血漿、または血液もしくは骨髄からの血清、腹膜液、腹水液、脳脊髄液、全血、リンパ液および／または滑液、涙、尿、唾液、または任意の他の胃腸液が挙げられうる。脊椎動物は、健常であってもよく、がんまたは前悪性症候群を有していてもよい。脊椎動物ががんを有さず健常である一実施形態では、同じ供給源または別の供給源からの腫瘍細胞を、系に添加してもよい。脊椎動物ががんを有する実施形態では、この流体としては、任意の形態のがん、例えば限定されないが、固形腫瘍または骨、軟組織、筋肉、皮膚および／もしくは血液のがんを有する任意の脊椎動物（例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、イヌなど）からの血漿、血清、腹膜液、腹水液、脳脊髄液、血液、リンパ液および／または滑液が挙げられうる。実施形態を記載する目的において、表現「健常脊椎動物」、「正常脊椎動物」または「無疾患脊椎動物」は相互に交換可能に使用され、いかなる疾患状態も病理もない脊椎動物を記載する。
【００２３】
一部の実施形態では、第１の構成要素は、原発性腫瘍増殖部位または健常組織、例えば臓器を模倣することが意図された「原発性部位増殖マトリクス」も含みうる。原発性腫瘍部位は、様々な部位、例えば、膀胱、骨、脳、乳房、頚部、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、胃、子宮、精巣、甲状腺などから選択されうる。一部の実施形態では、このマトリクスは、Ｌ−グルタミンと約１％のウマ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０（または他の増殖培地）を含む細胞培養培地を含む。マトリクスは、抗菌物質、抗生物質、および／または抗真菌物質を含んでもよい。例えば、本明細書で示される一部の実施形態では、増殖培地は、Ｌ−グルタミン、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、６．２×１０−４ＭのＣａＣｌ２、１×１０−６Ｍのコハク酸ナトリウムおよび１×１０−６Ｍのヒドロコルチゾン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ−１６４０を含む。
【００２４】
原発性部位増殖マトリクスのためのさらなる構成要素は、原発性腫瘍部位に基づいて選択されうる。さらなる構成要素としては、基底膜（ＢＭ）、コラーゲン（Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンについてＣＩ−Ｖと下記で定義）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン（ＬＮ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、エラスチン、レクチカン（ｌｅｃｔｉｃａｎ）などが挙げられうる。
【００２５】
例示的な原発性部位増殖マトリクスを、下記表ＩＡに示す。さらに、代表的な濃度および適切な濃度範囲も示している。
【表１Ａ】
2017506066.tif 000002
【００２６】
実施形態を記載する目的において、表現「生物学的マトリクス模倣体」、「再構築臓器マトリクス」、「臓器特異的マトリクス」または「細胞外マトリクス」は、１つまたは複数の生物学的マトリクス、例えば、細胞外マトリクス、細胞内マトリクス、基底膜および／または結合組織の構造をｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣または近似するために設計、生産または使用される任意の物質、溶液、混合物、例えば市販品のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などを指す。このマトリクスは、転移の部位または二次性部位を模倣する。マトリクスは、二次性部位または転移性部位に基づいて選択しうる。さらなる構成要素としては、基底膜（ＢＭ）、コラーゲン（Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンに対してＣＩ−Ｖと下記で定義）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン（ＬＮ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくは関連するヒアルロナン、エラスチン、レクチカン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、または他のグリコサミノグリカン、コンドロイチン、デルマタン、または関連する細胞外マトリクスもしくは糖衣構成要素、またはそれらの組み合わせなどが挙げられうる。代表的なマトリクスおよび濃度を下記表ＩＢに示す。
【表１Ｂ】
2017506066.tif 000003
【００２７】
実施形態を記載する目的において、表現「二次性部位増殖培地」は、６．２×１０−４ＭのＣａＣｌ２、１×１０−６Ｍのコハク酸ナトリウムおよび１×１０−６Ｍのヒドロコルチゾンを補充された、Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０もしくは適切な増殖培地、骨髄間質細胞の培養物由来の流体、または脊椎動物由来の流体を含む細胞培養培地をいう。増殖培地は、抗菌物質／抗生物質／抗真菌物質を含んでいてもよい。ウマ血清または骨髄間質細胞培養物由来の流体は、健常な脊椎動物またはがんを有する脊椎動物由来の流体の代わりに使用されうる。増殖培地中の各構成要素の体積モル濃度および／または重量モル濃度は、実施形態の間で変動しうる。「骨髄間質細胞の培養物由来の流体」としては、例えば、限定されないが、任意の脊椎動物（例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、イヌなど）由来の骨髄間質細胞株または初代骨髄細胞を含みうる骨髄間質細胞の培養物から回収される細胞培養培地が挙げられうる。表現「骨髄間質細胞の培養物」は、初代骨髄細胞または骨髄細胞株が細胞培養培地で覆われた組織培養容器で増殖される系を指す。
【００２８】
流体および任意選択での原発性部位増殖マトリクスは、腫瘍細胞が生じる原発性腫瘍部位をシミュレートすることが意図される。転移の間に、原発性腫瘍細胞は、本技術の第２の構成要素における生物学的マトリクス模倣体がシミュレートする異なる部位へ、浸潤し、遊走する必要がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでの浸潤および遊走は、循環系によって媒介される。本技術では、動的流体構成要素が循環系をシミュレートし、内部の二次性部位増殖培地が循環血液またはリンパをシミュレートする。
【００２９】
この文脈において、本系のシミュレーション効率が、二次性部位増殖培地が上記流体よりも高い血清含有量を含有するときに増強されることが、本明細書で発見される。例えば、二次性部位増殖培地は、８％〜３５％、またはより特には１０％〜３０％の範囲の血清濃度を有しうる。対照的に、第１の構成要素の流体中の血清含有量は、１％〜５％、またはより一般的には０．５％〜６％でありうる。
【００３０】
当技術分野で周知のように、血清は、血液細胞および凝固因子が除去された後の血液成分であり、フィブリノーゲンを含まない血漿である。血清は、血液凝固に使用されない全てのタンパク質、ならびに全ての電解質、抗体、抗原、ホルモンおよび任意の外来性物質を含む。天然の血清は、健常であるかまたはがんを有する脊椎動物の血液から単離しうる。
【００３１】
合成、代用または代替血清（集約的に「代用血清」と称する）は、作製することもでき、市販もされている。代用血清は、一般的に、脊椎動物で見出される主要血清タンパク質のほとんどまたは全てを含む。主要血清タンパク質としては、例えば、アルブミン、グロブリン、および調節性タンパク質が挙げられる。より詳細な例としては、限定されないが、プレアルブミン、アルファ１抗トリプシン、アルファ１酸性糖タンパク質、アルファ１フェトプロテイン、アルファ２−マクログロブリン、ガンマグロブリン、ベータ−２−ミクログロブリン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、補体成分３、補体成分４、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リポタンパク質（カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、トランスフェリン、マンナン結合レクチンおよびマンノース結合タンパク質が挙げられる。
【００３２】
一部の態様では、二次性部位増殖培地における血清または代用血清の濃度は、少なくとも８％、９％  １０％、１２％、１５％、１８％、２０％または２５％である。一部の態様では、第１の構成要素の流体中の血清または代用血清の濃度は、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３％、２％または１．５％未満である。一部の態様では、二次性部位増殖培地における血清または代用血清の濃度は、第１の構成要素の流体中の血清または代用血清の濃度より、少なくとも５０％高い、８０％高い、またはその２倍、３倍、４倍、もしくは５倍である。
【００３３】
さらなる構成要素、例えば、インキュベータ、顕微鏡、ポンプなどを、細胞培養アセンブリに結合させてもよい。用語「結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ）」および「接続される（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、それらの派生語と共に使用されうる。これらの用語が互いに同意語として意図されるものでないことが理解されるべきである。むしろ特定の実施形態では、「接続される」は、２つまたはそれを超える要素が、直接に物理的または電気的に互いに接触していることを示すために使用されうる。「結合される」は、２つまたはそれを超える要素が、直接に物理的または電気的に接触していることを意味しうる。しかし「結合される」は、２つまたはそれを超える要素が、直接には互いに接触していないが依然として互いに協働または相互作用していることも意味する。
【００３４】
実施形態を記載する目的において、表現「インキュベータ」は、細胞培養物を３０〜４５℃の温度および１〜１０％ＣＯ２に維持する、制御された二酸化炭素（ＣＯ２）環境を有する温度制御された加湿されたチャンバである。
【００３５】
本明細書で使用するとき、表現「固形腫瘍」は、任意の非造血性起源のがんを指し、「抗がん治療薬」は、がん細胞の増殖または遊走を防ぎ、がん細胞における細胞死を誘導し、ならびに／またはがん細胞集団の生存および拡張に有害である、任意の化合物、化学物質、物質、またはそのような化合物、化学物質、物質の組み合わせ、ナノ粒子、または他の薬物送達ビヒクルを指す。
【００３６】
実施形態を記載する目的において、表現「腫瘍」、「がん」、「悪性疾患」および「新生物」は、相互に交換可能に使用される。
【００３７】
細胞培養アセンブリおよびその構成要素
本明細書において、腫瘍細胞集団を分離して異なる腫瘍形成段階の細胞（例えば、原発性腫瘍、浸潤性および転移性細胞、ならびに再燃（ｒｅｃｕｒｒｉｎｇ）／再発がん由来の細胞）を単離するためのプラットフォームを提供する固有な系が提供される。
【００３８】
９０％を上回る抗がん薬が、臨床開発中に落第するので、市場にまで至らない。前臨床開発中に動物モデルで高い効能が実証されているにもかかわらず、新たな治療薬の最も高い割合での減損は、フェーズＩＩおよびＩＩＩ臨床試験（効能フェーズ）でみられる。このことは、前臨床開発に使用される実験的転移のｉｎ  ｖｉｖｏ齧歯動物モデルが、ヒト組織の微小環境を忠実に再現していないことを示唆する。したがって、包括的３次元（３−Ｄ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構築転移（ｒＭｅｔ）モデルを開発した。このモデルでは、原発性部位と二次性部位との別個の組織特異的なヒト微小環境が単一のアッセイに組み込まれ、足場非依存性ステップを含め、転移の主要相（原発部位からの脱出および遠隔臓器での定着）が再現される。ｒＭｅｔ系のモジュール設計が、臓器特異的な微小環境を設定し、原発性部位および二次性部位ならびにヒト組織の循環系環境を再構築することを可能にする。特異的な細胞外マトリクス構成要素の存在は、ヒト腫瘍および非悪性細胞を成功裏に拡張させることを可能にし、ｉｎ  ｖｉｖｏと同様の細胞−細胞相互作用を保存する。
【００３９】
ｒＭｅｔモデルは、転移性および浸潤性細胞集団の単離を可能にするだけでなく、がんおよびその拡散の基本的生物学を研究するための包括的系も提供する。ｒＭｅｔモデルは、原発性腫瘍、浸潤性および転移性集団を標的化する新規治療薬を設計して評価するために、処置レジメンを個別化し、個々の患者に対して有効な薬物を特定するために、および個々の腫瘍の転移能力を予測するために有用なツールである。これらの実施形態を、下記にさらに綿密に説明する。さらに、このモデルは、特異的な細胞区画を標的化する可能性を有する薬物のハイスループット分析のために適合可能である。
【００４０】
様々な原発性腫瘍部位および転移性腫瘍部位を、本明細書に記載の方法および系を使用して調査しうる。例えば、原発性腫瘍部位としては、限定されないが、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、結腸、子宮内膜、食道、腸、腎臓、肝臓、肺、口、筋肉、卵巣、皮膚、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、甲状腺、子宮、ならびに、例えば血管構造物を含む任意の過剰増殖性組織（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、瘢痕、線維症性組織、外科的癒着組織、または過剰増殖性骨病変）などが挙げられる。
【００４１】
様々な転移性部位も、本明細書に記載の系を使用して調査しうる。これらの部位としては、限定されないが、副腎、骨、脳、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、腹膜、皮膚、脾臓などが挙げられる。一実施形態では、細胞培養アセンブリは、乳腺の原発性部位と骨髄の転移性部位との組み合わせを含まない。
【００４２】
一実施形態では、細胞培養アセンブリは、脊椎動物由来の流体および任意選択で原発性部位増殖マトリクスと、生物学的マトリクス模倣体を含む第２の構成要素と、二次性部位増殖培地を含む動的流体構成要素とを含み、ここで流体構成要素は、第１および第２の構成要素と流体接触する。
【００４３】
様々な細胞が、本明細書に記載の細胞アセンブリで培養されうる。ある特定の実施形態では、培養された細胞は、上皮細胞、造血性細胞、間質細胞および／または任意の他の真核細胞を含みうる。一部の実施形態は、がん細胞を培養することに関するが、本開示には、限定されないが、芽細胞、多形核細胞、好中球、好酸球、好塩基球、前ＰＭＮ細胞、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、リンパ球、Ｂおよび／またはＴ細胞、有核赤血球（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ）、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、マクロファージ、線維芽細胞、筋上皮細胞、間葉系幹細胞、細網細胞、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、間葉細胞、ニューロン細胞などを含む任意の細胞型を培養するためのアセンブリ、装置および方法も包含される。
【００４４】
一実施形態では、第１の構成要素は、脊椎動物由来の流体を含む。一部の実施形態では、流体は、がんを有する脊椎動物に由来する。この構成要素は、原発性腫瘍部位を模倣しうる。一部の実施形態は、健常な脊椎動物またはがんを有する脊椎動物由来の流体を、生物学的マトリクス模倣体の表面に添加することをさらに含み、一方で他の実施形態は、細胞培養流体および／または希釈剤を、生物学的マトリクス模倣体の表面に添加することをさらに含む。一部の実施形態は、脊椎動物由来の造血構成要素または間質構成要素を有する流体を含む。１つまたは複数の細胞接着因子、または限定されないが、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカインを含む他の因子も、生物学的マトリクス模倣体および／または流体に添加されうる。
【００４５】
第２の構成要素は、生物学的マトリクス模倣体を含む。この構成要素は、転移性部位を模倣する。一実施形態では、マトリクス模倣体は、臓器特異的である。一実施形態では、臓器特異的マトリクスは、副腎、骨髄、脳、肝臓もしくは肺組織、リンパ節、卵巣、腹膜、皮膚、脾臓、結合組織、骨、血管構造物または関節結合部などをシミュレートする。
【００４６】
一部の実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が、生物学的マトリクス模倣体であり、他の実施形態では、別の生物学的マトリクス模倣体および／またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１つまたは複数の構成要素が、生物学的マトリクス模倣体として代用されうる。
【００４７】
上で述べたように、原発性部位増殖マトリクス、二次性部位培地と、生物学的マトリクス模倣体との両方が、細胞接着因子を含みうる。細胞接着因子は、当技術分野で周知であり、例えば、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、テネイシン、ヒアルロン酸、レクチカン、正に荷電した分子（（例えばポリ−ｌ−リジン、キトサン、ポリ（エチレンイミン）、アクリル重合体など））、細胞表面炭水化物結合タンパク質／糖タンパク質、インテグリン、カドヘリン、細胞接着分子の断片／サブユニット、細胞接着分子の合成アナログ、ゼラチン、ポリ−ｌ−オルニチンなどが挙げられる。実施形態は、各混合物の構成要素として、これらの因子のうちの１、２、３、４、５、６またはそれより多くを含んでもよく、および／または健常な脊椎動物またはがんを有する脊椎動物由来の流体に対する添加剤として１つまたは複数を含んでもよい。さらに、これらの因子の比率および／または濃度は、実施形態の間で変動しうる。
【００４８】
さらに、１つまたは複数の希釈剤および／または細胞培養培地を、混合物のいずれかおよび／または脊椎動物由来の流体に添加してもよい。希釈剤／培地としては、水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ−１６４０増殖培地、最少必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、およびそれらの改変物などが挙げられうる。細胞培養培地は、新たに作製したものでも、脊椎動物細胞の培養物から回収したものでもよい。
【００４９】
第１および第２の構成要素は、静的または動的流体構成要素と流体接触する。動的流体構成要素は、循環系を模倣する。この構成要素は、全体を通して記述されるように、二次性部位増殖培地を含む。流体は、アセンブリをかき混ぜるまたは撹拌することによって動的にされうる。任意選択で、アセンブリは、系を動かす機械的デバイスに結合されていてもよい。一実施形態では、アセンブリは、撹拌デバイスまたはさらにはポンプに結合または接続されていてもよい。これは下記でより綿密に議論する。
【００５０】
第１および第２の構成要素は、静的または動的流体層と流体接触する。一実施形態では、第１の構成要素と第２の構成要素とは、構成要素の内容物を、第１の構成要素から、動的流体構成要素を通じて、第２の構成要素へ移動させる膜または他の多孔性構成要素を含む。
【００５１】
細胞培養アセンブリを作製および使用する方法
細胞培養アセンブリは、図１Ａに示されるように垂直であってもよく、図２に示されるように水平であってもよい。
【００５２】
図１Ａは、ｒＭｅｔモデルの基本的構成要素およびアセンブリを示す概略図である。この実施形態では、マトリゲルを、ヒトがん細胞と組み合わせ、この混合物を、８μｍの孔を有する細胞培養インサートに添加し、これを次いで、ｒＢＭマトリクスを含有する組織培養プレートのウェルに挿入した。適切な孔径は、当業者であれば容易に決定しうると考えられる。代表的なインサートは、約４μｍから約１０μｍの孔径を有する。細胞培養インサート中で設定される原発性腫瘍部位を完成させるために、細胞／マトリゲル混合物を増殖培地で覆った。転移性部位の微小環境を組み立てるために、骨髄培養培地（ＢＭＣＭ）を、ｒＢＭ含有組織培養ウェルに添加した。アセンブリ全体を章動ミキサー上に置いて、マトリクス上で培地をかき混ぜた。この章動混合物は、流体構成要素の移動を提供するための１つの選択肢にすぎない。この図面では、骨髄培養培地を参照しているが、様々な種類の培地、例えば、限定されないが、増殖培地、健常な脊椎動物由来の流体、またはがんを有する脊椎動物由来の流体なども使用することができる。
【００５３】
図１Ｂは、クライオ走査型電子顕微鏡検査により視覚化した重合マトリゲルの構造を示す（スケールバー：５μｍ）。図１Ｃは、クライオ走査型電子顕微鏡検査により視覚化した重合ｒＢＭの構造を示す（スケールバー：５μｍ）。図１Ｄは、ｒＭｅｔ培養物で１４日後の、インサートのマトリゲル内に捕捉された球状体からなる腫瘍様画分への細胞の分布を示す。浸潤性画分は、マトリゲルを通じて浸潤し、インサートの膜表面上に単層を形成した細胞から構成される。最後に、転移性集団は、マトリゲルを通じて浸潤し、足場非依存性状態下、ＢＭＣＭ中で生存し、ｒＢＭマトリクスに定着した。
【００５４】
一部の実施形態では、ｒＭｅｔモデルには、生理学的に関連する様式で固形腫瘍転移を調べるための臓器特異的細胞外マトリクス構成要素が組み込まれている。ある特定の実施形態では、ｒＭｅｔモデルは、細胞培養培地オーバーレイと共にゲルを形成する生物学的マトリクス模倣体が組み込まれ、第１の混合物で被覆された組織培養容器に後に挿入される組織培養インサートと、第１の混合物の上にゲルを形成する生物学的マトリクス模倣体を含む第２の混合物と、第２の混合物を覆う細胞培養培地とを含む。一部の実施形態では、ヒトがん細胞は、原発性部位を再構築するように設計されたインサートの内部でゲルに埋め込まれる。インサートは、次いで、ゲルおよび培地が設定されている組織培養容器内に入れられる。実施形態によるｒＭｅｔ細胞培養物を形成する方法を、本明細書でさらに記述する。
【００５５】
一部の実施形態では、ｒＭｅｔモデルを形成するための方法は、生物学的マトリクス模倣体を、多孔質膜を有する組織培養インサート中に入れて原発性腫瘍部位を模倣することと、混合物を細胞培養培地で覆うことと、目的の組織の基底膜を模倣するための生物学的マトリクス模倣体で被覆され、組織を模倣するゲルを形成する混合物で覆われ、細胞培養培地で覆われた、組織培養容器にインサートを挿入することとを含む。蠕動ポンプまたは任意の他のポンプ、章動ミキサー、またはインサートより下の細胞培養培地をかき混ぜることが可能な任意の他の装置から選択されるかき混ぜ装置を系に取り付ける。アセンブリ全体を、次いでインキュベートする。一部の実施形態では、１つまたは複数の真核細胞を、コーティングとゲルとの間に配置してもよく、一方で他の実施形態では、真核細胞を、一方もしくは両方のチャンバのゲル内に埋め込むかまたは一方もしくは両方のチャンバ中の上記培地中に入れてもよい。他の実施形態は、原発性および二次性組織部位のための別個の組織培養容器を含む。
【００５６】
より詳細には、ｒＭｅｔモデルを形成するための方法は、１）多孔質膜を有する組織培養インサート中に真核細胞および生物学的マトリクス模倣体を入れるステップであって、ここで混合物はゲルを形成し、真核細胞はゲルに埋め込まれる、ステップ；第２の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第２の混合物は、脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；２）組織培養容器の内表面の一部を第１の混合物で被覆するステップであって、第１の混合物は組織の基底膜に特異的な細胞外マトリクスタンパク質を含む、ステップ；第２の混合物を組織培養容器の内表面の一部に添加するステップであって、第２の混合物は、生物学的マトリクス模倣体を含み、第２の混合物はゲルを形成する、ステップ；第３の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第３の混合物は脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；３）（２）に（１）を挿入し、（２）の流体が移動中であり、温度がおよそ３０〜４５℃、例えばおよそ３７℃であり、１〜１０％のＣＯ２、例えばおよそ５％のＣＯ２の条件下でアセンブリをインキュベートするステップを含む。
【００５７】
代替的な実施形態では、ｒＭｅｔモデルのための方法は、１）多孔質膜を有する組織培養インサート中に生物学的マトリクス模倣体を入れるステップであって、ここで混合物はゲルを形成し、真核細胞はゲルに埋め込まれる、ステップ；第２の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第２の混合物は、脊椎動物被験体由来の真核細胞と流体とを含む、ステップ；２）組織培養容器の内表面の一部を第１の混合物で被覆するステップであって、第１の混合物は組織の基底膜に特異的な細胞外マトリクスタンパク質を含む、ステップ；第２の混合物を組織培養容器の内表面の一部に添加するステップであって、第２の混合物は、生物学的マトリクス模倣体を含み、第２の混合物はゲルを形成する、ステップ；第３の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第３の混合物は脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；３）（２）に（１）を挿入し、（２）の流体が移動中であり、温度がおよそ３０〜４５℃、例えばおよそ３７℃であり、１〜１０％のＣＯ２、例えばおよそ５％のＣＯ２の条件下でアセンブリをインキュベートするステップを含む。
【００５８】
代替的な実施形態では、ｒＭｅｔモデルのための方法は、１）多孔質膜を有する組織培養インサート中に真核細胞および生物学的マトリクス模倣体を入れるステップであって、ここで混合物はゲルを形成し、真核細胞はゲルに埋め込まれる、ステップ；第２の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第２の混合物は、脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；２）組織培養容器の内表面の一部を第１の混合物で被覆するステップであって、第１の混合物は組織の基底膜に特異的な細胞外マトリクスタンパク質を含む、ステップ；真核細胞と第２の混合物を組織培養容器の内表面の一部に添加するステップであって、第２の混合物は、生物学的マトリクス模倣体を含み、第２の混合物はゲルを形成する、ステップ；第３の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第３の混合物は脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；３）（２）に（１）を挿入し、（２）の流体が移動中であり、温度がおよそ３０〜４５℃、例えばおよそ３７℃であり、１〜１０％のＣＯ２、例えばおよそ５％のＣＯ２の条件下でアセンブリをインキュベートするステップを含む。
【００５９】
代替的な実施形態では、ｒＭｅｔモデルのための方法は、１）組織培養容器中に真核細胞と生物学的マトリクス模倣体を入れるステップであって、ここで混合物はゲルを形成し、真核細胞はゲルに埋め込まれる、ステップ；第２の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第２の混合物は、脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；２）第２の組織培養容器の内表面の一部を第１の混合物で被覆するステップであって、第１の混合物は組織の基底膜に特異的な細胞外マトリクスタンパク質を含む、ステップ；真核細胞と第２の混合物を組織培養容器の内表面の一部に添加するステップであって、第２の混合物は、生物学的マトリクス模倣体を含み、第２の混合物はゲルを形成する、ステップ；第３の混合物を第２の混合物の表面に添加するステップであって、第３の混合物は脊椎動物被験体由来の流体を含む、ステップ；３）組織培養容器（１）および（２）を、がんを有する脊椎動物由来の流体が各組織培養容器の生物学的マトリクス模倣体を通って移動するように接続し、（２）の流体が移動中であり、温度がおよそ３０〜４５℃、例えばおよそ３７℃であり、１〜１０％のＣＯ２、例えばおよそ５％のＣＯ２の条件下でアセンブリをインキュベートするステップを含む。
【００６０】
上記の例示的実施形態では、マルチウェル組織培養プレートでの真核細胞の増殖のための培養装置を調製するための方法は、２４ウェル組織培養プレートの１ウェルを含みうる（他の培養皿に関しては、体積を適宜調節する）。
【００６１】
当業者は、所望の結果を得るためにこれらの例示的方法を改変しうることを容易に理解する。一部の実施形態では、マトリクス混合物は、ウェルに最初に添加されるときに細胞が欠如しており、一方で他の実施形態では、マトリクス混合物は細胞を含んでいる。標識した細胞、正常細胞、がん細胞および他の細胞型を、マトリクス混合物に、単独でまたは組み合わせで添加してもよい。さらに、増殖培地を、一部のおよび／または全ての混合物に添加してもよい。
【００６２】
再懸濁され、そして後で個々の混合物に添加される細胞の最適密度は、個々の細胞型に特異的であることも当業者は認識している。したがって、上記のステップに列挙された密度は、通常の実験にわたって、様々な密度で変動される。実施形態は、ｒＭｅｔ培養装置および方法に含めるための様々な密度の細胞を意図している。さらに実施形態は、添加剤、例えば限定されないが、抗がん化合物、抗ウイルス化合物、抗菌化合物、抗真菌化合物、または培地補充物質の任意選択の添加を意図している。これらの添加剤は全て、目的の細胞の増殖を促進し、目的でない細胞、ウイルスまたは生物の増殖を抑制するために有用である。
【００６３】
上記のように、細胞培養アセンブリは、水平にしてもよい。図２は、ｒＭｅｔ培養物の代替的設定を示しており、ここでは図１Ａの細胞培養インサートに示された原発性部位の微小環境が、図１Ａのアセンブリの底部に示されるように、別個の容器で設定される二次性部位の微小環境とは、別個の組織培養容器で設定されている。２つの容器を接続する管状材料は、図１Ａで「二次性部位培地」によって示された循環系微小環境を表す。ポンプは、流体が容器間を移動するように設定され、図１Ａの章動ミキサーと同等のものである。腫瘍様細胞集団は、原発性部位の組織培養容器内で球状体を形成し、浸潤性画分は、原発性部位でマトリクスを通って遊走するが、組織培養容器の内部の膜に付着したままである細胞によって形成される。転移性画分は、１つの組織培養容器から別の組織培養容器へ移動する細胞によって形成される。
【００６４】
実施形態はさらに原発性腫瘍、浸潤性および転移性細胞集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡張を支援する装置を提供し、がん幹細胞のさらなる分析のための手段を提供する。実施形態に従った装置は、ｒＭｅｔの細胞区画、がん細胞および／または腫瘍に対する薬物および／または他の治療の影響を試験するための前臨床モデルを提供する。一実施形態は、正常および悪性組織中のサイトカイン／ケモカインおよび増殖因子ネットワークならびに正常組織ホメオスタシスおよび疾患状態組織ホメオスタシスの細胞シグナル伝達を研究するための装置を提供する。さらなる実施形態は、限定されないが、個々の細胞、正常細胞、がん細胞および固相腫瘍に対する化学療法の効果の特徴付けを含む、様々な細胞区画を標的化する可能性を有する治療のハイスループットおよび／またはハイコンテント分析のための装置を提供する。
【００６５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の真核細胞は、ｒＭｅｔモデルの生物学的マトリクス模倣体のゲル層内に埋め込まれていてもよく、他の実施形態では、真核細胞は、生物学的マトリクス模倣体の上の流体内に配置される。一実施形態では、第１の種類の細胞は、中央のゲル層内に埋め込まれていてもよく、一方で別の種類の細胞が、底部の層と中央の層との間に配置されていてもよい。ｒＭｅｔ組織培養アセンブリは、上記ｒＭｅｔ培養方法について記載したようにさらに改変されうる。
抗がん／抗過剰増殖治療について試験する方法
【００６６】
実施形態は、悪性細胞の拡張が集合的微小環境内で観察される前臨床試験の現在探求されている態様に有用な培養方法および装置を開示する。腫瘍微小環境のｒＭｅｔ再構築により、全ての悪性階層に対する処置戦略および新規薬物の治療可能性を評価するための必須のツールが提供される。
【００６７】
例示的な一実施形態では、抗がん治療を試験するためのｒＭｅｔモデルは、原発性および二次性部位の微小環境を再構築し、正常および／またはがん細胞に適用される治療を可能にし、この治療は次いで、細胞に対する治療の効果、ならびに潜在的毒性およびオフターゲット効果を決定するために調べられうる。一実施形態では、抗がん（または抗過剰増殖（抗ＨＰＰ））治療薬を特定する方法であって、ａ）可能性のある治療薬を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリに添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の原発性腫瘍細胞、浸潤性細胞、転移性細胞、がん幹細胞またはＨＰＰ細胞を含む、ステップと、ｂ）細胞培養アセンブリに存在するがん細胞の量を、可能性のある治療薬の添加の前および後に検出するステップと、ｃ）可能性のある抗がんまたは抗ＨＰＰ治療薬を特定するステップとを含む、方法が提供される。一実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合された、転移性細胞の定着を検出するための系をさらに含む。一実施形態では、アセンブリは、アセンブリに結合されたデジタル顕微鏡をさらに含む。さらに別の実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合されたフローサイトメータをさらに含む。
【００６８】
一部の実施形態では、装置は、ｒＭｅｔ組織培養アセンブリのサイズ／体積を減少させることにより、および／または９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、３４５６ウェルまたは任意の他の数のウェルのマイクロタイタープレートを使用することにより、ハイスループットスクリーニング／分析に対して適合される。培養物は、個体により、コンピュータにより、自動化機械により、ロボットにより、または別の方法により調べられうる。ｒＭｅｔ組織培養アセンブリ装置は、ハイコンテントスクリーニングに対して適合させてもよく、自動化画像読取機、デジタル顕微鏡／画像読取機、および／またはフローサイトメータを含んでもよい。様々な実施形態に従ったデジタル顕微鏡は、蛍光顕微鏡、自動顕微鏡、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡などであってもよい。さらに、がん治療を試験するための装置の実施形態は、画像解析用ソフトウェアを含んでもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、治療は、ｒＭｅｔアセンブリ中のいずれの区画、管状材料、流体、および／またはマトリクス模倣体に入れられてもよい。
【００７０】
実施形態は、細胞に対する治療薬の効果を測定する方法、例えば、限定されないが、ｒＭｅｔアセンブリにおける任意の細胞に対する細胞毒性、細胞増殖抑制性、抗増殖性、抗遊走性および／または何らかの他の効果を測定する方法を提供する。
抗がん治療の効能を特定する方法
【００７１】
例示的一実施形態では、抗がん治療の効能を特定するためのｒＭｅｔ装置は、原発性および二次性部位の微小環境を再構築し、正常および／またはがん細胞に治療が適用されるのを可能にし、次いで、細胞に対するこの治療の効果を決定するために調べられうる。実施形態は、細胞に対する治療薬の効果を測定する方法、例えば、限定されないが、ｒＭｅｔアセンブリにおける任意の細胞に対する細胞毒性、細胞増殖抑制性、抗増殖性、および／または何らかの他の効果を測定する方法を提供する。培養物は、個体により、コンピュータにより、自動化機械により、ロボットにより、または別の方法により調べられうる。ｒＭｅｔ組織培養アセンブリ装置は、ハイコンテントスクリーニングに対して適合させてもよく、自動化画像読取機、デジタル顕微鏡／画像読取機、および／またはフローサイトメータを含んでもよい。様々な実施形態に従ったデジタル顕微鏡は、蛍光顕微鏡、自動顕微鏡、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡などであってもよい。さらに、がん治療を試験するための装置の実施形態は、画像解析用ソフトウェアを含んでもよい。
【００７２】
一実施形態では、患者の腫瘍に対する抗がん治療薬の効能を特定する方法であって、ａ）可能性のある抗がん治療薬を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素に添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の転移性がん細胞を含有する、ステップと、ｂ）第２の構成要素に存在する転移性がん細胞の量を、可能性のある抗がん治療薬の添加の前および後に検出するステップと、ｃ）抗がん治療薬の効能を特定するステップとを含む、方法が提供される。一実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合された、転移性細胞の定着を検出するための系をさらに含む。一実施形態では、アセンブリは、アセンブリに結合されたデジタル顕微鏡をさらに含む。さらに別の実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合されたフローサイトメータをさらに含む。
【００７３】
この実施形態では、がんを有する個々の脊椎動物由来の腫瘍細胞が、ｒＭｅｔアセンブリに治療を適用し、細胞毒性、細胞増殖抑制性、抗増殖性、および／または何らかの他の効果を測定するｒＭｅｔで培養される。個々の治療および／または組み合わせが、がんを有する単一の脊椎動物のｒＭｅｔ培養物に適用され、ｒＭｅｔの任意の区画におけるがん細胞を除去することができる治療が特定される。そのプロセスは、がんを有する複数の個々の脊椎動物のために拡大縮小することができる。
【００７４】
腫瘍の転移能力を予測する方法
例示的一実施形態では、ｒＭｅｔ装置は、個々の腫瘍の転移可能性を予測するための原発性および二次性部位の微小環境を再構築する。実施形態は、腫瘍細胞の遊走および播種能力を測定し、転移を形成する可能性のある個々の腫瘍を特定するための方法を提供する。培養物は、個体により、コンピュータにより、自動化機械により、ロボットにより、または別の方法により調べられうる。ｒＭｅｔ組織培養アセンブリ装置は、ハイコンテントスクリーニングに対して適合させてもよく、自動化画像読取機、デジタル顕微鏡／画像読取機、および／またはフローサイトメータを含んでもよい。様々な実施形態に従ったデジタル顕微鏡は、蛍光顕微鏡、自動顕微鏡、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡などであってもよい。さらに、がん治療を試験するための装置の実施形態は、画像解析用ソフトウェアを含んでもよい。
【００７５】
一実施形態では、患者におけるがんの転移性播種を予測および／または特定する方法であって、ａ）患者から取得したがん細胞を含む溶液を、本明細書に記載の細胞培養アセンブリの第１の構成要素に添加するステップであって、細胞培養アセンブリの第２の構成要素は、検出可能な量の患者由来のがん細胞を含む、ステップと、ｂ）十分な期間後に、細胞培養アセンブリの第２の構成要素における転移性がん細胞の存在または不在を検出するステップとを含む、方法が提供される。一実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合された、転移性細胞の定着を検出するための系をさらに含む。一実施形態では、アセンブリは、アセンブリに結合されたデジタル顕微鏡をさらに含む。さらに別の実施形態では、細胞培養アセンブリは、アセンブリに結合されたフローサイトメータをさらに含む。
【００７６】
この実施形態では、がんを有する脊椎動物由来の腫瘍細胞を、ｒＭｅｔアセンブリで培養し、検出された転移性細胞は、個々の腫瘍が転移する能力を備える。そのプロセスは、がんを有する複数の個々の脊椎動物に対して拡大縮小することができる。
【００７７】
本開示の系および方法は、標的のスクリーニングおよび発見のため、ならびに候補治療薬の毒性およびオフターゲット効果を評価するためにも有用である。例えば、系は、マイクロアレイ、次世代シーケンシング、抗体アレイ、質量分析、ならびに本明細書に記載の系を使用したｅｘ  ｖｉｖｏでの非悪性細胞および組織に対する治療薬、組み合わせ、または処置スケジュール／レジメンをスクリーニングするための複数の他の技術と結合させうる。
【００７８】
例えば、創薬は、遺伝子、タンパク質、脂質、代謝物、ならびに非悪性、前悪性、非転移性、浸潤性および転移性細胞、およびがん幹細胞間の任意の他の細胞および細胞外構成要素、ならびに上記の任意の組み合わせの差次的発現／産生に基づきうる。治療剤のオフターゲット効果は、ｒＭｅｔに組み込まれた非悪性細胞集団、例えば間質細胞（線維芽細胞、筋上皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、破骨細胞など）、血液細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、骨髄性細胞など）、上皮および任意の他の非がん組織の薬物処置に対する応答に基づき、評価しうる。
【００７９】
一実施形態では、本開示の系は、単一の薬剤または組み合わせ処置に対する個々の患者による処置への応答を評価するために使用しうる。例えば、ｒＭｅｔで増殖させた腫瘍細胞を、可能性のある治療薬モダリティに曝露させ、処置に対する細胞応答およびオフターゲット毒性に基づいて最適な処置を選択しうる。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
乳腺または前立腺原発性部位および骨髄二次性部位を用いた使用のための例示的ｒＭｅｔ系
原発性部位が乳腺または前立腺であり、二次性部位が骨髄であるｒＭｅｔ系のマトリクス混合物は、以下のように設定される。２ｍｇ／ｍｌのラット尾Ｉ型コラーゲンのストック溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、中和緩衝液（２×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ））、ｐＨ７．２〜７．４に希釈した。再構築骨内膜（ｒＥｎｄ）（充実な骨と骨髄との間の境界にある細胞外マトリクス層）は、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まない１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、および２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンのそれぞれ６３：５．３：１  ｖ／ｖ混合物であった。再構築骨髄（ｒＢＭ）マトリクスを、マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン、２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン、および２ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸のそれぞれ４：２．５：１：１  ｖ／ｖ混合物として設定した。
【００８１】
ｒＭｅｔ系は、以下のように組み立てられる。再構築骨髄（ｒＢＭ）を、２４ウェル組織培養容器に、１３０μｌ／ウェルのｒＥｎｄマトリクスを添加し、１時間３７℃でインキュベートし、過剰な液体を除去し、ｒＢＭマトリクスを７５μｌ／ウェルで添加し、１時間３７℃でインキュベートして設定する。ｒＢＭの組み立ては、固形化ｒＢＭマトリクスの頂部を、１ｍｌの温めた骨髄間質細胞馴化培地（ＢＭＣＭ）で覆うことによって完了させる。ＢＭＣＭは、骨髄間質細胞の３日間培養物からの馴化培地（増殖培地：６．２×１０−４ＭのＣａＣｌ２、１×１０−６Ｍのコハク酸ナトリウム、１×１０−６Ｍのヒドロコルチゾン、２０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０）を回収することによって得た。乳腺／前立腺微小環境は、８μｍの孔を有する組織培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、マトリゲル（２３μｌ）と乳がんまたは前立腺がん細胞を２．５×１０４細胞／７μｌのＰＢＳ／インサートで混合し、マトリゲル／細胞混合物を細胞培養インサート中にピペッティングし、マトリクス／細胞混合物を３７℃で３０分間ゲル化させ、各インサートを、ｒＢＭマトリクスが予め設定された２４ウェル組織培養容器のウェル中に入れ、インサート中の細胞／マトリクス混合物を、０．５ｍｌの温かい増殖培地（１％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０）で覆うことによって設定する。アセンブリ全体を章動ミキサー上に置いて培地をかき混ぜ、３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベータに入れる。
【００８２】
重合マトリクスを視覚化するために、クライオ走査型電子顕微鏡検査を使用する。クライオ走査型電子顕微鏡検査のために、少量のマトリゲルまたはｒＢＭマトリクスを、クライオホルダーのスリットインサート中に入れ、その後、液体窒素スラッシュの中に投じた。真空を引き、試料をＧａｔａｎ  Ａｌｔｏ  ２５００プレチャンバ（−１７０℃に冷却）へ移した。試料を冷却したメスで割り、破損のない表面を形成した後、試料を−９０℃で１０分間昇華させ、次いで白金で１２０秒間、スパッタ被覆した。その後、試料を、画像化のために顕微鏡クライオステージ（−１３０℃）に移した。
【００８３】
表ＩＡおよびＩＢの情報に基づき、この系を、いくつかの異なる原発性部位および二次性部位に適合させうる。
【００８４】
（実施例２）
ｒＭｅｔ系における様々な転移性がん細胞の再定着
図３および図４に示される実施形態では、様々な細胞株を、実施例１の記載と同様の様式にてｒＭｅｔ系で試験した。以下の細胞株を試験した：乳がん（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ１０ＡｎｅｏＴ、ＭＣＦ１０ＣＡ１ｈ、ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＯ、ＭＣＦ７）、前立腺がん（ＰＣ−３およびＬＮＣａｐ）、肺がん（Ａ５４９）、胃がん（ＡＧＳ）、膵臓がん（Ｐａｎｃ−１）、結腸がん（ＬｏＶｏ）、卵巣がん（ＳＫ−ＯＶ−３）、黒色腫（Ａ３７５）、精巣がん（ＮＴＥＲＡ−２）細胞株を、ｒＭｅｔ培養物で増殖させた。細胞株は、ＡＴＣＣおよびＢａｒｂａｒａ  Ａｎｎ  Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得した。浸潤性および転移性がんを有する患者から単離した乳がん細胞も、ｒＭｅｔモデルで試験した。アセンブリの調製についてのさらなる詳細は、使用される様々なマトリクスを含め、以下に示される。
【００８５】
重合Ｉ型コラーゲンゲルの調製
１）調製した中和緩衝液：２×ＰＢＳ中の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ。この溶液のｐＨは、約７．０であった
２）２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン溶液を、１０．２１ｍｇ／ｍｌのラット尾Ｉ型コラーゲンを中和緩衝液で希釈することによって調製した。この溶液を低速でボルテックスするか、ピペットを使用して十分に混合した
３）ステップ２で調製した溶液を、平板ウェルに添加し、少なくとも１時間３７℃でインキュベートし、十分に重合させてゲルを形成させた。添加する体積は、所望するゲルの厚さに従って決定した。
【００８６】
再構築骨内膜（ｒＥｎｄ）の調製
１）５ｍｌのｒＥｎｄを作製するために、３８４．６μｌのフィブロネクチン（１ｍｇ／ｍｌのストック）、７２．３μｌのＩ型コラーゲン（２ｍｇ／ｍｌのストック）、および４．５４３ｍｌの１×ＰＢＳを混合して、氷上で保持した。
【００８７】
再構築骨髄マトリクス（ｒＢＭ）の調製
１）ｒＢＭを作製するために、１０４μｌのマトリゲル、６８μｌのフィブロネクチン（１ｍｇ／ｍｌのストック）、２８μｌのＩ型コラーゲン（２ｍｇ／ｍｌのストック）、および２８μｌのヒアルロン酸（２ｍｇ／ｍｌ）を混合し、氷上で保持した。
【００８８】
骨髄増殖培地（ＢＭＧＭ）の調製
１）ＢＭＧＭを作製するために、５００μｌの塩化カルシウム（０．６２Ｍのストック）、５００μｌのコハク酸ナトリウム（１×１０−３Ｍのストック）、５００μｌのヒドロコルチゾン（１×１０−３Ｍのストック）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを１０％のＦＢＳに添加し、３９４ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０に添加した。
【００８９】
乳腺上皮増殖培地（ＭＥＧＭ）
１）ＭＥＧＭを作製するために、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のウマ血清を、４９０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０に添加した。
【００９０】
再構築転移（ｒＭｅｔモデル）の設定
１）マトリゲルは、４℃で終夜、解凍した
２）ｒＥｎｄ、ｒＢＭ、ＭＥＧＭおよびＢＭＧＭを、上記のように調製した
３）２４ウェルのプレートのウェルあたり１３０μｌのｒＥｎｄを添加した
４）このプレートを、１時間３７℃でインキュベートした
５）ｒＥｎｄと共に１時間インキュベーションした後、溶液をウェルから除去し、７５μｌのｒＢＭを各ウェルの中心にそれぞれ添加し、プレートを１時間３７℃でインキュベートした
６）２４ウェルプレートの各ウェルに対して、７μｌのＰＢＳ中の２５，０００個の細胞を、２３μｌのマトリゲルと混合した
７）ステップ６の混合物を穏やかにインサートの膜に添加し、均一に拡散した
８）細胞／マトリゲル混合物を、３０分間３７℃でインキュベートした
９）組織培養プレートおよびインサート中のマトリクスが固形化されたら、各インサートを２４ウェルプレートのウェル中に先に設定したマトリクスと共に入れた
１０）１ｍｌのＢＭＧＭを、組織培養プレートの各ウェルに添加した
１１）４００マイクロリットルのＭＥＧＭをインサートへ添加した
１２）アセンブリ全体を章動ミキサー上に置いて、３７℃および５％二酸化炭素のインキュベータ中に入れた。
【００９１】
明視野顕微鏡検査のために、細胞をｒＭｅｔモデルで１２〜１４日間培養し、頂部の浸潤性および転移性画分の明視野画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア４．７．３を備えたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して得た。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０Ｃ倒立顕微鏡を使用してｒＭｅｔを通じた細胞遊走を観察した。
【００９２】
図３に示すパネルは、ヒト乳がん細胞株（図３Ａ）、原発性ヒト乳がん細胞（図３Ｂ）、前立腺がん（図３Ｃ）、肺がん（図３Ｄ（ａ））、胃がん（図３Ｄ（ｂ））、膵臓がん（図３Ｄ（ｃ））、結腸がん（図３Ｄ（ｄ））、卵巣がん（図３Ｄ（ｅ））、黒色腫（図３Ｄ（ｆ））、および精巣がん細胞株（図３Ｄ（ｇ））が、ｒＭｅｔモデル中で１４日間培養され、画像化されたことを説明している。全ての種類の腫瘍が、原発性腫瘍様画分、細胞培養インサートの膜上で増殖した細胞（ダークスポット：膜内の孔）からなる浸潤性画分、および転移性画分を生じた。
【００９３】
図４は、ｒＭｅｔモデルでの細胞の転移傾向が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の転移傾向と緊密に一致していることを示す。高い転移性の細胞、例えば、ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＯ、ＰＣ−３、Ａ５４９、およびＡＧＳは、ｒＭｅｔで１４日後に、組織培養容器の９０％超を占めるｒＭｅｔの転移性画分を堅固に形成した。中程度の転移性の細胞、例えば、Ｐａｎｃ−１、ＬｏＶｏ、およびＳＫ−ＯＶ−３は、組織培養容器の５０〜７５％を占める転移性画分を形成した。弱い転移性の細胞、例えば、ＭＣＦ１０ＡｎｅｏＴ、ＭＣＦ１０ＣＡ１ｈ、Ａ３７５およびＮＴＥＲＡ−２は、希薄な転移性画分を形成し、非転移性細胞、例えば、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＬＮＣａＰは、ｒＭｅｔで転移性層を形成しなかった。
【００９４】
表ＩＩは、本明細書に記載した系で使用した様々な細胞株の遊走性特徴を示す。
【表２】
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【００９５】
図５は、ｒＭｅｔにおける細胞の転移能力の維持に対するマトリクス構成要素の影響を示す。ｒＭｅｔ培養物の底部チャンバ（組織培養容器）は、様々なマトリクス構成要素またはその混合物（マトリゲル／フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン（ＣＩ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、またはｒＢＭ（マトリゲル、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸の混合物）で設定し、転移性画分の形成を、ｒＭｅｔ培養物での１４日後に視覚化した。ｒＢＭは、最多数の転移性細胞を保持することができたが、マトリゲル／フィブロネクチン混合物または個々の構成要素は、同等レベルの転移性画分の形成を保持できなかった（ｐ値＝０．００５６）。
【００９６】
（実施例３）
ｒＭｅｔ系における細胞の生存度
図６に示される実施形態では、ｒＭｅｔ細胞培養を実施し、続けて各画分の細胞生存度を測定した。細胞アセンブリは、実施例１に従って作製した。以下の細胞株を試験した：乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＯ、ＭＣＦ７）、前立腺がん（ＰＣ−３およびＬＮＣａｐ）、肺がん（Ａ５４９）、胃がん（ＡＧＳ）、膵臓がん（Ｐａｎｃ−１）、結腸がん（ＬｏＶｏ）、卵巣がん（ＳＫ−ＯＶ−３）、黒色腫（Ａ３７５）、精巣がん（ＮＴＥＲＡ−２）。
【００９７】
ｒＭｅｔモデルにおける１２〜１４日間培養後の細胞生存度を測定するために、腫瘍様、浸潤性および転移性画分を、製造業者の指示書に従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存度／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色した。簡潔に述べれば、細胞を、１μＭのカルセインＡＭとエチジウムホモダイマー−１と共に、３０分間３７℃でインキュベートした。カルセインおよびエチジウム生成蛍光は、染色から１時間以内に、４９３ｎｍおよび５２８ｎｍのフィルターセットをそれぞれ使用してＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で画像化した。画像は、明るさ、コントラストまたは大きさについて編集し、スケールバーは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４６ｒ；ＮＩＨ）を使用して加えた。
【００９８】
図６は、各細胞株をｒＭｅｔモデルで１４日間培養した後、転移性細胞の大半（＞９５％）がｒＭｅｔで生存可能であること（緑色：カルセインＡＭ陽性、生細胞；赤色：エチジウムホモダイマー−１陽性、死細胞）を示す。
【００９９】
（実施例４）
ｒＭｅｔ系と異種移植片モデルとの比較
図７に示される実施形態では、異種移植片モデルを設定してｒＭｅｔからの転移性画分の転移能力を検証した。
【０１００】
ｒＭｅｔモデルからの細胞の転移可能性を評価するために、腫瘍様および転移性画分を、１４日目のｒＭｅｔ培養物から、製造業者の指示に従って細胞回収溶液（ＣＲＳ）（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を下記の改変を加えたうえで使用して、単離した。培地を、ｒＭｅｔ系の頂部および底部のチャンバから取り出し、５６５μｌおよび１５８５μｌの氷冷ＣＲＳを細胞培養インサート中の残余のマトリクス層およびプレートにそれぞれ添加した。ＣＲＳ／細胞／マトリクス混合物を、微量遠心管に移し、氷上で１時間インキュベートした。続いて、細胞を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＣＲＳを除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを、注射用に１×ＰＢＳに再懸濁した。１００マイクロリットルの原発性腫瘍様または転移性細胞を、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）の左心室に、２７  １／２ゲージ針を使用して注射した。マウスは、イソフルラン（２．０〜２．５％、３．０Ｌ／分Ｏ２中；ＶｅｔＥｑｕｉｐ卓上気化器）を使用して麻酔をかけた。全ての動物実験は、動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得て実施した。動物は、衰弱、可動度の減少、体重減少、または１ｃｍ３を超える触知可能な腫瘍の出現が示されたときは、ＣＯ２窒息／頚椎脱臼を使用して屠殺した。剖検の間に、臓器罹患部位（ｏｒｇａｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）および転移性病変の画像を、Ｃａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ  Ａ６５０  ＩＳデジタルカメラを使用して取得した。
【０１０１】
図７Ａは、ｒＭｅｔから誘導した転移性集団が、原発性腫瘍様集団と比較して高い頻度で、および１００％の感受性（すなわち、転移性画分を注射した全ての動物で遠隔部位転移が発生）で、転移性病変を生じることを示す。
【０１０２】
図７Ｂは、骨、肺、卵巣、肝臓、および腎臓などの二次性部位における転移性病変の例を示す。
【０１０３】
（実施例５）
異種移植片から回収した腫瘍細胞を、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の存在に対してフローサイトメトリーにより評価した。
【０１０４】
腫瘍断片を小片に切り、０．５〜１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）またはリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）中で、３０分間３７℃で、７００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。増殖培地を添加して、酵素を失活させ、解離された細胞を、４０μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ）に通し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１×ＰＢＳで１回洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、２７  １／２ゲージ針を有する１０ｍｌのシリンジを使用して３０〜４０ｍｌの１×ＰＢＳで大腿骨および脛骨のＢＭから洗い流した。洗い流した細胞をピペットで吸引／排出してあらゆる凝集物を破壊し、４０μｍの細胞ストレーナーに通し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、蒸留水中に１分間再懸濁し、赤血球細胞を溶解させた。続いて、数体積の１×ＰＢＳを添加し、細胞を、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。解離された細胞を、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で１５分間、室温で固定し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、４℃でＰＢＳ中で保存した。非特異的結合は、ラット抗マウスＣＤ１６／３２  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＭ．Ｏ．Ｍキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用してブロックした。細胞を、マウス抗ＨＬＡ−Ａ−Ｃ−ＰＥ−Ｃｙ５またはマウスＩｇＧ１κ−ＰＥ−Ｃｙ５アイソタイプ対照（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に１時間（１：５０希釈）インキュベートし、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フローサイトメータで分析した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．６）を使用して実施した。
【０１０５】
転移性病変から単離した細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対して陽性であり、各病変が注射したヒト細胞由来のものであることが実証された。対応のあるｔ検定分析に基づくと、転移性画分を注射したマウスの転移性病変においてＨＬＡ陽性細胞の統計学的に有意な増加があり（ｐ値＝０．０２１）、一方でｒＭｅｔの腫瘍様画分を注射したマウスではアイソタイプ対照レベルを上回るＨＬＡ陽性染色の増加は無かった（ｐ値＞０．０５）。
【０１０６】
（実施例６）
ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを使用して、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性を検出した。細胞を、上記のようにｒＭｅｔモデルで、ＤＱ−ＦＩＴＣ  Ｉ型またはＩＶ型コラーゲン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５０μｇ／ｍｌで製造業者の指示に従ってマトリゲルおよびｒＢＭマトリクスに組み込んで培養した。ＭＭＰ分泌を、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ倒立顕微鏡を使用して、蛍光顕微鏡検査で１４日間にわたってモニターした。各時間点で、画像を、４９５ｎｍの励起波長で同じ露光時間で取得した。画像を、明るさ、コントラストまたは大きさについて、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．４６ｒ；ＮＩＨ）またはＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６  ｅｘｔｅｎｄｅｄ（バージョン１３．０）を使用して編集した。
【０１０７】
（実施例７）
ｒＭｅｔの前臨床における能力を実証するために、従来モデルおよびｒＭｅｔ前臨床モデルを使用して５つの治療薬の効能を評価した。化合物＃１、３および５は、ｒＭｅｔ系で評価されるときに最小限の耐性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび臨床活性を実証した。化合物＃２は、フェーズＩＩ臨床試験に落第し、化合物＃４は放棄となった；両方ともｒＭｅｔで乏しい活性が実証された（ｒＭｅｔ曲線は、落第閾値を超えたままである）。したがって、この実施例は、ｒＭｅｔ系からの試験結果と臨床試験の結果との高い相関を示す。したがって、そのような相関性は、候補がん治療薬の臨床上の性能の予測におけるｒＭｅｔ系の価値を強調する。
【０１０８】
統計分析については、各実験で少なくとも３つの独立した生物学的複製で実施した。転移性または非転移性細胞がｒＢＭで定着を開始するまでの時間は、カイ二乗検定を使用して比較した。生存期間ならびにＢＭにおけるＨＬＡ陽性細胞の存在に対する統計的有意性は、ログランク検定および対応のあるｔ検定でそれぞれ決定した。データは、平均±ＳＤで示した。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｍａｃ用バージョン５．０ａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して行い、ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。
【０１０９】
一部の実施形態は、ｒＭｅｔ組織培養アセンブリおよびインキュベータのみを含んでもよく、一方、他の実施形態は、自動化画像読取機、デジタル顕微鏡、および／またはフローサイトメータをさらに含んでもよい。ｒＭｅｔ組織培養装置の一部の実施形態では、自動化画像読取機をデジタル顕微鏡および／またはフローサイトメータに結合させてもよく、および／またはデジタル顕微鏡をフローサイトメータに結合させてもよい。一部の実施形態では、これらの構成要素のいくつかまたは全てを、コンピュータおよび／またはユーザーインターフェイスに結合させてもよく、および／またはコンピュータおよび／またはユーザーインターフェイスを通して制御してもよい。ハイスループットおよび／またはハイコンテントスクリーニングに対して適合された一部の実施形態では、構成要素のいくつかまたは全ての制御を自動化してもよい。
【０１１０】
ある特定の実施形態を、好ましい実施形態を記載する目的で本明細書において示し記載してきたが、当業者は、様々な種類の代替的および／もしくは同等の実施形態または同じ目的を達成するために計算された実施が、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書に示され記載された実施形態の代用となりうることを認識する。当業者は、本発明に従った実施形態が、非常に様々な方法で実施しうることを容易に理解するであろう。この出願は、本明細書で議論された実施形態のあらゆる適応または変形を含むことが意図されている。したがって、本発明に従った実施形態は、特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されることが明白に意図されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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