(57)【要約】  本発明は、非病原性真菌（例えば、キャンディダ・ユティリス）から精製された真菌グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）および随意にアジュバントを含む組成物を特徴とする。また、本発明は、真菌性疾患を有する患者を治療する方法、およびこれら組成物の投与により対象の真菌性疾患を予防する方法を特徴とする。また、（ａ）非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミドを準備すること；および（ｂ）真菌グルコシルセラミドを、生理学的に許容される賦形剤中のアジュバントと混合することにより、真菌ワクチンを製剤化する方法が、本発明の範囲内にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非病原性真菌から精製された真菌グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）およびアジュバントを含む組成物。
【請求項２】
前記非病原性真菌がキャンディダ・ユティリスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
真菌性疾患を有する患者を治療する方法であって、非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミドを含む組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記真菌性疾患が、アブシジア属、アルタナリア属、アスペルギルス属、バシディオボールス属、ビポラリス属、キャンディダ属、クラドスポリウム属、クリプトコックス属、クルブラリア属、エピデルモフィトン属、クレブシェラ属、ミクロスポルム属、ペニシリウム属、ニューモシスティス属、ロドトルラ属、サッカロマイセス属、スタキボトリス属、トリコフィトン属、トリコスポロン属、またはワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）の真菌による感染により引き起こされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非病原性真菌がキャンディダ・ユティリスである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記患者の治療が成功するまで前記組成物を１日１回投与することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、局所投与用または注射による投与用に製剤化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
対象の真菌性疾患を予防する方法であって、非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミドを含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項９】
前記真菌性疾患が、アブシジア属、アルタナリア属、アスペルギルス属、バシディオボールス属、ビポラリス属、キャンディダ属、クラドスポリウム属、クリプトコックス属、クルブラリア属、エピデルモフィトン属、クレブシェラ属、ミクロスポルム属、ペニシリウム属、ニューモシスティス属、ロドトルラ属、サッカロマイセス属、スタキボトリス属、トリコフィトン属、トリコスポロン属、またはワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）の真菌による感染により引き起こされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非病原性真菌がキャンディダ・ユティリスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物がアジュバントを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物の投与が、少なくとも２回に分けて行われ、１回目は初回ワクチン接種としてであり、２回目は追加免疫としてである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、局所投与用または注射による投与用に製剤化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
真菌ワクチンを製剤化する方法であって、
（ａ）非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミドを準備すること、および
（ｂ）前記真菌グルコシルセラミドを、生理学的に許容される賦形剤中のアジュバントと混合することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原性の真菌グルコシルセラミド、上記グルコシルセラミドを含む組成物（例えば、真菌性疾患を治療または予防するために使用することができるワクチン）、およびそのような組成物を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染症は、公衆衛生にとって重大な脅威をもたらす。真菌は、環境中に遍在しており、土中、植物および樹木、表面、ならびにヒト皮膚を含む生命体で繁殖することができる。抗真菌剤が利用可能であるにもかかわらず、侵襲性真菌感染症の罹患率および死亡率は、特に危篤状態の患者の場合、依然として高いままである。概説は、Ｅｎｏｃｈら（Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：８０９−８１８，２００６）およびＳｐｅｌｌｂｅｒｇ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：１３，２０１１）を参照されたい。予防的または治療的な免疫化後に真菌病原体の除去が成功するかどうかは、宿主の免疫系が、免疫化に応答して適切に活性化され、健常組織を著しく損傷しない有効な応答を開始することができるかどうかに大きく左右される。真菌ワクチンを開発および改善する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｅｎｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：８０９−８１８，２００６
【非特許文献２】Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：１３，２０１１
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、非病原性真菌から精製されたグルコシルセラミドの投与が、病原性真菌に対して保護性であることを示す本発明者らの研究に部分的に基づくものである。より詳しくは、本発明者らの研究は、非病原性真菌キャンディダ・ユティリス（トルラ酵母）から精製されたグルコシルセラミドの腹腔内投与が、マウスにおいて肺から脳へのクリプトコッカス・ネオフォルマンスの播種を著しく低減し、結果として命にかかわる髄膜脳炎の発症が予防されることを示すものである。本組成物は、能動免疫を誘導するだけでなく、脂質抗原により能動免疫を誘導するものである。対照的に、ほとんどのワクチンは、タンパク質またはペプチドで構成されている。抗原の由来は非病原性真菌であるため、本明細書で開示された治療法は、多くの病原性真菌、および恐らくは全ての病原性真菌に対して保護性となるであろうと予想される。したがって、第１の態様では、本発明は、非病原性真菌（例えば、キャンディダ・ユティリス）から精製された真菌グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）およびアジュバント（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、フロインド完全アジュバント、またはフロインド不完全アジュバント）を含む組成物を特徴とする。
【０００５】
第２の態様では、本発明は、真菌性疾患を有する患者に真菌グルコシルセラミド（例えば、非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミド）を含む組成物を投与することにより、上記患者を治療する方法を特徴とする。本発明者らは、アブシジア属、アルタナリア属、アスペルギルス属、バシディオボールス属、ビポラリス属、キャンディダ属、クラドスポリウム属、クリプトコックス属、クルブラリア属、エピデルモフィトン属、クレブシェラ属、ミクロスポルム属、ペニシリウム属、ニューモシスティス属、ロドトルラ属、サッカロマイセス属、スタキボトリス属、トリコフィトン属、トリコスポロン属、またはワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）の真菌による感染により引き起こされるものを含む、広範な真菌性疾患を治療することができると予想する。ＧｌｃＣｅｒを精製することができる非病原性真菌は、例えば、キャンディダ・ユティリスであってもよい。組成物は、治療上有効量で投与することができる。治療上有効量とは、患者が、軽減または好しくは完全な軽減を経験する程度まで、真菌性疾患の徴候または症状を緩和する量である。組成物は、患者の治療が成功するまで１日１回投与することできる。組成物は、局所投与または注射（例えば、皮下注射または筋肉内注射）による投与用に製剤化することできる。
【０００６】
第３の態様では、本発明は、真菌グルコシルセラミド（例えば、非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミド）を含む組成物を患者に投与することにより、上記患者の真菌感染症を予防する方法を特徴とする。治療法の場合と同様に、予防法は、アブシジア属、アルタナリア属、アスペルギルス属、バシディオボールス属、ビポラリス属、キャンディダ属、クラドスポリウム属、クリプトコックス属、クルブラリア属、エピデルモフィトン属、クレブシェラ属、ミクロスポルム属、ペニシリウム属、ニューモシスティス属、ロドトルラ属、サッカロマイセス属、スタキボトリス属、トリコフィトン属、トリコスポロン属、またはワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）の真菌による感染により引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。ＧｌｃＣｅｒが精製される非病原性真菌は、キャンディダ・ユティリスであってもよい。組成物は、ＧｌｃＣｅｒ抗原の種類に関わらず、本明細書に記載されているような、ワクチン療法の技術分野で知られているアジュバントを更に含んでいてもよい。組成物を投与するステップは、少なくとも２回に分けて行ってもよく、１回目は初回ワクチン接種としてであり、２回目（およびそれ以降）は追加免疫としてである。治療法の場合と同様に、予防のために投与される組成物は、局所投与または注射（例えば、皮下注射または筋肉内注射）による投与用に製剤化することできる。
【０００７】
第４の態様では、本発明は、（ａ）非病原性真菌から単離された真菌グルコシルセラミドを準備すること；および（ｂ）真菌グルコシルセラミドを、生理学的に許容される賦形剤中のアジュバントと混合することにより、真菌ワクチンを製剤化する方法を特徴とする。
本発明者らによると、「約」とは、参照値のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。例えば、約１０ｍｇは、９〜１１ｍｇを意味する。
本発明者らによると、「抗原」または「免疫原」とは、対象（例えば、ヒト）に投与されると、抗体の産生を誘発する物質を意味する。
本発明者らによると、「非病原性真菌」とは、対象に疾患を引き起こさない真菌を意味する。
本発明者らによると、「病原性真菌」とは、疾患が、疾患それ自体を一般に指すか、または障害もしくは状態等を指すかに関わらず、対象（例えば、ヒト）に疾患を引き起こす真菌を意味する。病原性真菌は、健康な対象に疾患を引き起こすものであってもよく、または免疫抑制性の対象に感染症を引き起こす日和見病原体であってもよい。
本発明者らによると、「予防」とは、真菌感染症（例えば、病原性真菌により対象に引き起こされる疾患）を示す臨床徴候または症状を未然に防ぐことを意味する。そのような未然防止は、真菌感染症のリスクのある対象の正常な生理学的指標を維持すること（例えば、正常な体温、体重、および精神状態の維持）ならびに真菌感染症の病変または他の病理学的症状を未然に防ぐことを含む。
本発明者らによると、グルコシルセラミドに関する「精製された」とは、少なくとも５０％または約５０％の純度を意味する（例えば、所与の製剤の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超（例えば、約９９．５％）がグルコシルセラミドである）。
本発明者らによると、「対象」とは、家畜動物またはヒト等の哺乳動物を含む個々の生物を意味する。本発明者らは、状況がそうではないと示さない限り、用語「対象」、「個体」、および「患者」を同義的に使用する。本発明者らによると、用語「患者」は、真菌感染症を有すると診断されている個々の生物を指すために使用される傾向があってもよい。
本発明者らによると、「治療」とは、真菌感染症と診察されている患者が経験する臨床徴候または症状の改善を意味する。同様に、そのような患者を「治療」する方法は、患者が経験する臨床徴候または症状を改善する方法である。治療または治療法は、真菌性疾患の徴候または症状の１つまたは複数の進行が停止した場合、および／または患者が、疾患の重症度、疾患の慢性合併症、もしくは日和見性真菌感染症の軽減を経験した場合、成功であると言える。ある患者では、本方法による治療は、組織もしくは器官内の真菌の播種、またはある組織もしくは器官から別の組織もしくは器官への真菌の播種を阻害または予防することができる。例えば、ある患者では、本方法による治療は、肺から脳へのクリプトコッカス・ネオフォルマンスの播種を阻害または予防し、したがって命にかかわる髄膜脳炎の発症を予防することができる。本明細書に記載の治療法はいずれも、「使用」の観点で表すこともできる。例えば、本発明は、薬剤の調製における、または真菌性疾患を予防もしくは治療するための薬剤の調製における、本明細書に記載の組成物の使用を特徴とする。
本発明者らによると、「ワクチン」とは、病原性真菌により引き起こされる１つまたは幾つかの疾患に対する免疫を提供することになる免疫応答を誘発または追加免疫する目的で対象（例えば、ヒト）に投与される組成物を意味する。この用語は、対象への投与に好適な形態の組成物、ならびに他の形態（例えば、投与前に更なる操作を必要とする濃縮原溶液および粉末形態または凍結乾燥形態）の組成物を包含する。対象は、現在は真菌感染症を有していないが、そのような感染症を発症するリスクのある個々の生物であってもよい。
【０００８】
病原性真菌に対して有効なワクチンはごく少数しかないことが知られている。また、受動免疫を誘発するための戦略も同様に追求されている。例えば、グルコシルセラミドに対して誘発されたモノクローナル抗体の投与は、特に免疫抑制性患者の中枢神経系に影響を及ぼし、死に至る場合があるクリプトコックス症を誘発する場合がある酵母様病原体であるクリプトコッカス・ネオフォルマンスに感染したマウスにおいて限定的な保護をもたらした（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４（１０）：１３７２−１３７６，２００７）。このマウスモデルでは保護が観察されたが、受動免疫は、真菌に対して部分的に保護性であるに過ぎない。
【０００９】
下記に記載の研究にて、本発明者らは、非病原性真菌キャンディダ・ユティリスから精製されたＧｌｃＣｅｒ投与後に、病原性真菌クリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する部分的な保護がもたらされることを見出した。この保護は、真菌ＧｌｃＣｅｒに対する抗体により媒介されると考えられるため、真菌ＧｌｃＣｅｒが抗原として作用することができると考えられる。フロインドアジュバントと共にＧｌｃＣｅｒを投与すると、保護が向上し、肺から脳への真菌細胞の播種を低減させるのに特に有用であると考えられる。機序に関して言えば、保護は、抗ＩｇＭ抗体のオプソニン効果により媒介されるものではないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】キャンディダ・ユティリスから抽出された精製ＧｌｃＣｅｒの構造を示す図である。
【図２】キャンディダ・ユティリスから抽出された精製ＧｌｃＣｅｒの構造を示す図である。
【図１】４，８−スフィンガジエニン（ｄ１８：２）スフィンゴイド塩基を有するＧｌｃＣｅｒを示す図である。
【図２】９−メチル−４，９−スフィンガジエニン（ｄ１９：２）スフィンゴイド塩基を有するＧｌｃＣｅｒを示す図である。Ｒ＝Ｃ９〜Ｃ２７。
【図３】実施例３に記載のようにグルコシルセラミド投与を１日１回マウスに投与するためのスケジュールを示す図である。
【図４】図３に示されているように、および実施例３に更に記載されているように処置したマウスの生存を図示するグラフである。
【図５】図３に示されているように、および実施例３に更に記載されているようにＧｌｃＣｅｒで処置したまたは処置しなかったクリプトコックス感染マウスの真菌組織量を図示する棒グラフである。
【図６】図３に示されているように、および実施例３に更に記載されているようにＧｌｃＣｅｒで処置したまたは処置しなかったクリプトコックス感染マウスの真菌組織量を図示する棒グラフである。
【図７】図３に示されているように、および実施例３に更に記載されているようにＧｌｃＣｅｒで処置したまたは処置しなかったクリプトコックス感染マウスの真菌組織量を図示する棒グラフである。
【図５】媒体（群５；「溶媒」）でワクチン接種した感染マウスの真菌組織量を示す図表である。２２、２４、２７、および２９日間（それぞれ、マウス＃１（「Ｃｎ１」）、マウス＃３（「Ｃｎ３」）、マウス＃４（「Ｃｎ４」）、およびマウス＃６（「Ｃｎ６」））生存したマウスのＬｏｇ１０  ＣＦＵ／器官（左から右に、脳、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）がプロットされている。クリプトコックス細胞は、試験した器官全てに存在した。
【図６】ＧｌｃＣｅｒ（第３群）でワクチン接種し、９０日間生存した４匹の感染マウス（＃７、＃８、＃９、および＃１０と呼ぶ）の真菌組織量を示す図表である。真菌細胞は、４匹のマウス全てから回収した肺組織、２匹のマウスから回収した肝臓組織、および２匹のマウスから回収した腎臓組織に見出された。
【図７】ＧｌｃＣｅｒ＋フロインドアジュバント（群４）でワクチン接種し、９０日間生存した４匹の感染マウスの真菌組織量を示す図表である。真菌細胞は、感染症の原発部位である肺組織にのみ見出された。
【図８】ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ；写真左側）およびムシカルミン（写真右側）で染色した脳（図８）および肺（図９）の顕微鏡写真パネルである。処置群は表示の通りである。
【図９】ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ；写真左側）およびムシカルミン（写真右側）で染色した脳（図８）および肺（図９）の顕微鏡写真パネルである。処置群は表示の通りである。
【図１０】表示の通りに処置したマウスの血清中のＩｇＭ抗ＧｌｃＣｅｒ抗体の存在を示す棒グラフである。「ＧｌｃＣｅｒ」はグルコシルセラミドを示し、「ＦＡ」はフロインドアジュバントを示し、「Ｃｎ」はクリプトコッカス・ネオフォルマンスを示し、「Ｓｏｌ」は「溶媒」を示す。
【図１１】実施例４に更に記載されているようにグルコシルセラミドを週１回投与した実験的治療計画を模式的に示す図である。
【図１２】いかなる処置も受けなかったマウス（群３）；生理食塩水で処置し、クリプトコッカス・ネオフォルマンスで負荷したマウス（群２）；およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスで負荷する前にＧｌｃＣｅｒおよびフロインドアジュバントで処置したマウス（群１）（実施例４に更に記載されているように）の生存をプロットしたグラフである。
【図１３】抗体応答を示す１対の棒グラフである（種々の処置群で産生されたＩｇＭ抗体の量は、左側のグラフに示されており、ＩｇＧ抗体の量は、右側のグラフに示されている）。この研究では、図１１に示されているように、および実施例４に更に記載されているようにマウスを処置した。その結果、ロバストなＩｇＭ応答は示されたが、観察の期間中に検出可能なＩｇＧ応答は示されなかった。ＩｇＧ応答は後の時点で生じることになるとも考えられるが、こうしたデータは、保護が、ＩｇＧによるものではないことを示している（ＩｇＧ応答が刺激される前に保護が観察されたため）。
【図１４】実施例５に更に記載されているように、異なる投与経路を使用して異なるマウス系統に、アジュバントの存在下または非存在下でグルコシルセラミドを投与するためのスケジュールを模式的に示す図である。
【図１５】図１４に示されているようにおよび実施例５に更に記載されているように処置したマウスから収集した血液中の抗ＧｌｃＣｅｒ抗体のレベルを示す４つの棒グラフのパネルである。
【図１６】抗ＧｌｃＣｅｒ  ＩｇＭ抗体または抗ＧＸＭ  ＩｇＧ抗体の存在下でのマクロファージによるクリプトコックスの食作用に関する本発明者らの研究結果を示す１対の棒グラフである。
【図１７】スフィンゴ糖脂質の基本構造を模式的に示す図である。長鎖スフィンゴイド塩基骨格（グリセロ脂質とは区別され、グリセロール骨格を有する）は、２−アミノ基とのアミド結合により脂肪酸と、およびＣ１位でエステル結合により極性頭部基と結合して、セラミドを成形する。このセラミドは、糖のヘミアセタール基とセラミドのＣ１ヒドロキシル基との間のβ−グリコシド結合により糖（グルコース、ガラクトース、またはイノシトール）に結合されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
真菌グルコシルセラミドは、ヒト（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：５５８９−５５９６，１９８４；Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｌｅｓｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：５５８１−５５８８，１９８４；Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｌｕｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：２０８５−２０９０，１９９０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：７０４９−７０６０，２０００）、またはマウス（Ｔｏｌｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：１０５−１１２，２００１，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１３７２−１３７６，２００７）において宿主抗体の産生を誘発する抗原性分子である。こうした研究では、抗体産生は、真菌により感染中に産生されるＧｌｃＣｅｒにより抗ＧｌｃＣｅｒ抗体を刺激した場合（つまり、完全な真菌が投与された場合）のほうが、植物から精製し、外部から導入したＧｌｃＣｅｒで抗体産生を刺激した場合よりも、より良好であった。抗体産生は、精製ＧｌｃＣｅｒを吸着させたＥＬＩＳＡプレートに患者血清を添加することにより確認された。加えて、植物グルコシルセラミド（大豆から精製）は、マウスにおいて局所的な先天性免疫活性化を誘発し、結腸癌の発症からマウスを保護する（Ｓｙｍｏｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４：１１５７−１１６１，２００４）。更に、植物グルコシルセラミドでマウスを処置すると、その後の真菌感染症に対する保護が誘発される（Ｕｍｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：７７８−７８４，２００２；Ｕｍｅｍｕｒａ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：６７６−６８３，２０００；Ｋｏｇａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３１９８５−３１９９１，１９９８）。こうした知見は、グルコシルセラミドが、宿主の先天性免疫および体液性免疫を両方とも強力に誘発し、必然的に真菌感染症に対する保護をもたらす因子であることを示唆する。
【００１２】
グルコシルセラミド：グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ；グルコセレブロシドとも呼ばれる）としては、次いでスフィンゴシン（スフィンゴイド塩基とも呼ばれる）、脂肪酸、およびグルコース残基で構成されるセラミドが挙げられる。それらは、自然界に豊富に存在し、植物、動物、および真菌に見出される。ＧｌｃＣｅｒの正確な化学構造は、それが自然界で関連する真菌のタイプに応じて様々であり得る。例えば、スフィンゴシン骨格に結合されている脂肪酸は様々であり得る（長鎖スフィンゴイド塩基骨格が、２−アミノ基でアミド結合により脂肪酸に結合されている）。脂肪酸は、４〜２８個の炭素原子を含み、６個未満の炭素原子を有する短鎖脂肪酸であってもよく、６〜１２個の炭素原子を有する中鎖脂肪酸であってもよく、１３〜２１個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸であってもよく、および２２個を超える炭素原子を有する超長鎖脂肪酸であってもよい。また、スフィンゴイド塩基または脂肪酸中の炭素原子は、飽和または不飽和であってもよく、およびヒドロキシル化されていてもよくまたはされていなくともよい。こうした特徴のいずれかまたはこうした特徴の任意の組み合わせを有するグルコシルセラミドは、本発明の範囲内にあり、本明細書に記載の組成物および方法に含まれ得る。本発明は、メチル化またはアセチル化されている天然ＧｌｃＣｅｒの変異体を更に包含し、これら変異体は、本組成物に含まれていてもよく、本明細書に記載のように投与してもよい。グルコシルセラミドは、真菌細胞分裂、アルカリ耐性、菌糸形成、および胞子発芽に関与する。したがって、グルコシルセラミドは、真菌毒性の制御に重要であると考えられる。ＧｌｃＣｅｒは疎水性脂質であるため、主に膜に局在化している。
【００１３】
本組成物（例えば、医薬組成物およびワクチン）中のグルコシルセラミドは、キャンディダ・ユティリスおよびピキア・パストリス等の多くの病原性真菌を含む、本質的にあらゆる真菌から単離することができる。真菌ＧｌｃＣｅｒの化学構造は、種々の植物および哺乳動物により発現されるＧｌｃＣｅｒの化学構造とは異なり（Ｄｅｌ  Ｐｏｅｔａ，Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ２０１４）、種々の供給源から単離または精製されたＧｌｃＣｅｒは、性質が、例えば上記の点（炭素鎖の長さ、飽和度、およびヒドロキシル化の程度）が様々であろう。真菌ＧｌｃＣｅｒは、デルタ−８−デサチュラーゼ（Ｓｌｄ８）により８位が不飽和化されており、デルタ−９−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｍｔ１）により９位がメチル化されているスフィンゴシン骨格を有する。これら２つの酵素は、真菌にのみ存在し、植物細胞または哺乳動物細胞には存在しないことが知られている。したがって、真菌ＧｌｃＣｅｒの生化学的構造は独特であり（Ｄｅｌ  Ｐｏｅｔａ，Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ２０１４）、真菌ＧｌｃＣｅｒ（例えば、非病原性真菌から精製されたもの）が、植物から精製されたＧｌｃＣｅｒよりも宿主免疫応答を強力に刺激することになると考えられる。真菌ＧｌｃＣｅｒでは、セラミド骨格は、場合によっては３位のｔｒａｎｓ結合により、２−ヒドロキシ−オクタデカン酸と結合していてもよい。図１７には、スフィンゴ糖脂質の基本構造が示されている。
【００１４】
本組成物（例えば、治療に有用なワクチンおよび医薬組成物）中のグルコシルセラミドは、合成であってもよく、任意の非病原性真菌から精製してもよい。有用なグルコシルセラミドを精製するためには、例えば、（ａ）酵母残渣を準備し、（ｂ）残渣をエタノールで抽出し、（ｃ）抽出液をろ過し、（ｄ）ろ過した溶液を鹸化し（例えば、トリグリセリドおよびリン脂質のアルカリ加水分解により）、および（ｅ）鹸化した溶液を中和（例えば、酸を用いて）してもよい。中和時に形成された塩は、ろ過により除去することでき、アセトン沈殿を使用して、ＧｌｃＣｅｒを更に分画することができる。シリカゲルクロマトグラフィを連続して繰り返し実施して（例えば、２回）、単純脂質からＧｌｃＣｅｒを精製し、最終ステップで調製用ＴＬＣを使用して、精製ＧｌｃＣｅｒ試料を調製することができる。ＧｌｃＣｅｒ試料のＨＰＬＣ純度は、大豆に由来するＧｌｃＣｅｒ標準物質と比較して、９８％を超えることができる。この方法は、国際公開第２０１２／１５０６８３号パンフレットに更に記載されており、乾燥重量、ＴＬＣ、およびＨＰＬＣ等の分析法も記載されている。国際公開第２０１２／１５０６８３号パンフレットの教示を参照し、また下記の実施例を参照して、製剤用にＧｌｃＣｅｒを精製し、本明細書に記載のように使用することができる。
【００１５】
真菌性疾患を予防および治療する方法に適切な対象および患者：全ての対象が、本明細書に記載の真菌性疾患を予防する方法に適切であるが、ある対象は、感染症に罹りやすいため、特に適切である。特に適切な対象としては、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）による感染、免疫抑制療法、高齢または早産のため免疫抑制性である個体が挙げられる。他の特に適切な対象としては、臓器移植（例えば、実質臓器移植）、輸血、または骨髄移植を受けた対象；手術、特に大手術を受けた対象；高窒素血症、真性糖尿病、気管支拡張症、気腫、結核、リンパ腫、白血病、または別のタイプの癌を有する対象；過労または別の深刻なトラウマを経験した対象；真菌感染症に対する易罹患性の病歴を有する対象；幼児（例えば、約２歳未満のヒト）；高齢者（例えば、約６５歳を超えるヒト）；および真菌感染症に罹りやすい環境で居住または労働する対象が挙げられる。
【００１６】
本予防法により得られる保護は、１つまたは複数の病原性真菌による感染症を未然に防ぐことができ、本明細書に記載の治療法に適切な対象は、１つまたは複数の病原性真菌による感染症を治療することができる。病原性真菌としては、以下のものが挙げられる：アブシジア属の種、アルタナリア属の種、アスペルギルス属の種（例えば、Ａ．フラバタス、Ａ．フラバス、Ａ．フミガーツス、Ａ．グラウカス、Ａ．ニデュランス、クロコウジカビ、Ａ．シドウィ（Ａ．ｓｙｄｏｗｉ）、およびＡ．テレウス；ビポラリス属の種、キャンディダ属の種（例えば、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．エノラーゼ、およびＣ．グラブラタ、Ｃ．ギリエルモンジイ、Ｃ．クルセイ、Ｃ．クセイ（Ｃ．ｋｕｓｅｉ）、Ｃ．ルシタニエ、Ｃ．パラクウセイ（Ｃ．ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．プソイドトロピカリス、Ｃ．ステラトイデア、およびＣ．トロピカリス）、クラドスポリウム属の種、クリプトコックス属の種（例えば、Ｃ．アルビダス、Ｃ．ガッティ、Ｃ．ローレンティ、およびＣ．ネオフォルマンス）、ヒストプラスマ属の種（例えば、Ｈ．カプスラーツム）、クルブラリア属の種、クレブシェラ属の種（例えば、Ｋ．ニューモニエ）、ニューモシスティス属の種（例えば、Ｐ．カリニおよびＰ．イロヴェチ）、サッカロマイセス属の種（例えばＳ．ブラウディ、Ｓ．セレビシエ、およびＳ．ポンベ）、トリコスポロン属の種（例えば、Ｔ．ベイゲリイ（Ｔ．ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、ロドトルラ属の種、接合菌綱、ヒアリンカビ（ｈｙａｌｉｎｅ  ｍｏｕｌｄ）（例えば、フザリウム、およびスケドスポリウム属の種（例えば、Ｓ．アピオスペルム（Ｓ．ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）およびＳ．プロリフィカンス（Ｓ．ｐｒｏｌｉｆｉｃａｎｓ））、スタキボトリス属の種（例えば、Ｓ．カルタルム）、ペニシリウム属の種（例えば、Ｐ．マルネッフェイ）、ならびに多種多様な黒色真菌。また、本組成物および製剤に含まれる真菌ＧｌｃＣｅｒは、以下の任意の種を含む皮膚糸状菌から得ることができる：ミクロスポルム属、エピデルモフィトン属、またはトリコフィトン属（例えば、Ｅ．フロクスム（Ｅ．ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、Ｍ．アウドウイニイ（Ｍ．ａｕｄｏｕｉｎｉ）、Ｍ．カニス（Ｍ．ｃａｎｉｓ）、Ｍ．ジストルツム（Ｍ．ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、Ｍ．エクイヌム（Ｍ．ｅｑｕｉｎｕｍ）、Ｍ．ギプスム（Ｍ．ｇｙｐｓｕｍ）、Ｍ．ナヌム（Ｍ．ｎａｎｕｍ）、Ｔ．コンセントリクム（Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、Ｍ．エクイヌム、Ｔ．ガリナ（Ｔ．ｇａｌｌｉｎａｅ）、Ｔ．ギプセウム、Ｔ．メグニニ（Ｔ．ｍｅｇｎｉｎｉ）、Ｔ．タグロフィテス、Ｔ．ワインケアナム、Ｔ．ルブルム、Ｔ．シェーンライン、Ｔ．トンズランス、Ｔ．ベルコーズム、Ｔ．ベルコーズムアルブム（ａｌｂｕｍ）変種、ジスコイデス変種、オクラコイム（ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）変種、Ｔ．ビオラセウム、および／またはＴ．ファビホルム。他には、以下のものが挙げられる：バシディオボールス属の種、ブラストミセス・デルマチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、ブラストスキゾミセス・カピタツス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、クラドスポリウム属の種（例えば、Ｃ．カリオニイ（Ｃ．ｃａｒｒｉｏｎｉｉ））、コクシジオイデス・イミチス、コニディオボルス属の種、クンニングアメラ属の種、クルブラリア属の種、フォンセセア属の種、ゲオトリクム・クラバツム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヘルミントスポリウム属の種、マラセジア属の種、モノリニア属（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ）の種、モルティエラ属の種、ムコール属の種、ペシロマイセス属の種、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、ピトリオミセス属（Ｐｉｔｌｉｏｍｙｃｅｓ）の種、ピチロスポルム・オバーレ、ピシウムン・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、リゾクトニア属の種、リゾープス属の種、サクセネア属の種、スポロトリックス属の種（例えば、Ｓ．シェンキイ）、トキソプラズマ・ゴンディ、およびワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）の種。
【００１７】
製剤および用量：真菌ＧｌｃＣｅｒは、確立した真菌感染症を予防するためのワクチン調製物として、または確立した真菌感染症を治療するための治療用薬剤として製剤化することができる。ワクチン調製物はアジュバントを含んでいてもよく、アジュバントは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、フロインド完全アジュバント、またはフロインド不完全アジュバントであってもよい。
【００１８】
種々の投与経路および投与スケジュールを使用することができる。本発明者らの現在まで研究によると、ＧｌｃＣｅｒの１日１回投与は、週１回の投与よりも、わずかにより効果的であることが示されている。組成物は、注射用に調製してもよい（例えば、液体溶液または懸濁液として）。しかしながら、本発明は、経口投与することできるか、または注射前に液体媒体に溶解もしくは懸濁することができる固体形態も包含する。投与は、一般的に非経口であろう（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかの注射による）。また、組成物は、病変に投与してもよく、または皮膚もしくは粘膜から吸収させてもよい。したがって、本発明は、鼻道、肺、およびその間の組織への吹送により投与することができる製剤を含む噴霧製剤、坐剤、および経皮または経皮膚貼付剤であることを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明の組成物は、無菌であり、一般的に約ｐＨ７．０のｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０〜８．０）で安定させるための緩衝剤を含んでいてもよい。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、緩衝剤は、好ましくはヒスチジン緩衝剤である。組成物は、低レベル（例えば、＜０．０１％）の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、および保存剤の１つまたは複数を更に含んでいてもよい。
【００２０】
個々の抗原の至適量は、経験的に評価することができる。治療の回数および抗原の量の両方による投与量は、治療される対象、対象の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の保護の程度に依存する場合がある。しかしながら、動物研究に基づくと、一般的に１〜２ｍｇ／ｋｇ／日であれば、所望の保護を提供するはずであると予想される。
【００２１】
真菌性疾患を治療または予防する方法は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュール（例えば、初回刺激投与製剤の投与後に、１回または複数回のその後の「追加免疫」が行われる）により実施することができる。複数用量が投与される場合、種々の用量を、同じまたは異なる投与経路（例えば、静脈内初回刺激および粘膜追加免疫）で投与することができる。１回を超える用量の投与が、免疫学的未感作患者に特に有用であると予想される。複数用量は、少なくとも１週間または約１週間の間隔をおいて（例えば、約２、３、４、６、８、１０、１２、または１６週間の間隔をおいて）投与してもよい。継続的な保護には、年１回の追加免疫を使用してもよい。慢性感染症の場合、投与は、少なくとも臨床症状または臨床検査が、ウイルス感染の除去またはかなりの緩和を示すまで、およびその後のある期間にわたって継続されるべきである。
幾つかの実施形態では、ＧｌｃＣｅｒ抗原は、当技術分野で周知であるリポソーム製剤の方法によりリポソーム内に投与することができる。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
グルコシルセレブロシドの精製。
エタノール抽出およびアルカリ加水分解：８００ｇの乾燥酵母を、１．６リットルの９５％のＥｔＯＨで撹拌しながら１０時間６０℃で抽出した。その後、抽出液を紙ろ過で酵母細胞と分離し、得られたろ過溶液を、４０℃に加熱し、終濃度が０．４Ｎになるように１０Ｎ  ＫＯＨ水溶液を添加して、アルカリ加水分解を開始させた。アルカリ加水分解による鹸化を、４０℃で２時間撹拌しながら実施した。抽出液を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７に中和し、中和時に形成されたＫＣｌ結晶を、紙フィルタで除去した。ろ過溶液を、減圧エバポレータで乾燥し、乾燥物質の一部を用いて、乾燥重量を分析し、ＧｌｃＣｅｒ含有量をＨＰＬＣで分析した。
アセトン沈殿：上述のように調製した乾燥物質を、１００ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）に溶解した。３（三）リットルのアセトンを添加および混合し、得られた溶液を、−２０℃で４時間静置した後、−２０℃で１０分間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、ＧｌｃＣｅｒを含有する沈殿物を収集した。沈殿物の一部を使用して、乾燥重量およびＧｌｃＣｅｒ含有量を分析した。
シリカゲルクロマトグラフィ：シリカゲル（イアトロビーズ）は、三菱化学メディエンス社から購入し、使用前に１２０℃で２時間再生した。６０ｇの再生シリカゲルをクロロホルムに懸濁した後、カラムに充填した。シリカゲルの湿潤容積を測定したところ１００ｍｌだった。試料を負荷する前に、２００ｍｌのクロロホルムでカラムを平衡化した。ＧｌｃＣｅｒを含有するアセトン沈殿物を、５ｍｌのクロロホルムに溶解し、カラムに負荷した後、３００ｍｌのクロロホルムで洗浄した（溶出液は廃棄した）。その後、カラムを４００ｍｌのクロロホルム：アセトンで洗浄した（２：８；この場合も溶出液は廃棄した）。４００ｍｌのクロロホルム：アセトン（１：９）をカラムにポンプ送入し、画分をＴＬＣでモニタした。ＧｌｃＣｅｒを含有する画分を収集した。その後、４００ｍｌのアセトンをカラムにポンプ送入し、ＧｌｃＣｅｒを含有する画分を収集した。上記ステップでのＧｌｃＣｅｒ画分を一緒に混合し、減圧エバポレータで乾燥した。乾燥物質の一部を使用して、乾燥重量およびＧｌｃＣｅｒ含有量を分析した。上記シリカゲルクロマトグラフィをもう１回繰り返して、ＧｌｃＣｅｒを更に精製した。
調製用ＴＬＣ：調製用ＴＬＣ（シリカゲル６０、ガラスプレートＰＬＣ、２０ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ２ｍｍ）は、日本メルクミリポア社から購入した。１つ前のステップからの乾燥物質を、１ｍｌのクロロホルム：メタノール（７：３）に溶解し、試料をＰＬＣにスポッティングし、クロロホルム：メタノール：水（６５：１６：２）で展開させた。ＧｌｃＣｅｒを含有するシリカゲルを収集し、５０ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）に懸濁し、その後コットンでろ過してから０．５μｍ  ＰＶＤＦフィルタでろ過した。ＧｌｃＣｅｒを含有するろ過溶液を、減圧エバポレータで一晩乾燥した。総乾燥重量を測定し、ＧｌｃＣｅｒ試料の純度をＨＰＬＣで分析した。
要約：
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【００２３】
（実施例２）
ＧｌｃＣｅｒ種の検出。
ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ（商標）トリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を使用して、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析／質量分析法）により、上記で得た抽出物中のＧｌｃＣｅｒを分析した。試料を、メタノール中に１ｍＭギ酸アンモニウム＋０．２％ギ酸を含有する緩衝液に懸濁した。直接シリンジループインジェクションを１０μｌ／分の速度で使用することにより、試料をＭＳに送達した。試料は、陽イオンモードで［Ｍ＋Ｈ］＋として分析した。４．５ｋＶの電源電圧および２０Ｖの衝突エネルギーを使用した。ＧｌｃＣｅｒスペクトル（表１）は全て、ｍ／ｚ２００から１０００まで検出した。ＭＳ−ＭＳプロファイルは、２つの異なる衝突エネルギー、２０Ｖおよび４５Ｖを使用して生成した。それぞれ２６２．２および２７６．２の断片の親イオン走査を使用して、４，８−スフィンガジエニン（ｄ１８：２）および９−メチル−４，９−スフィンガジエニン（ｄ１９：２）スフィンゴイド塩基を有するＧｌｃＣｅｒ種を検出した。これら断片は、アミド結合の切断およびその後の脱水に起因する。
【表１】
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【００２４】
（実施例３）
ＧｌｃＣｅｒの投与およびその後のクリプトコックスによる負荷。
４週齢雌ＣＢＡ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入し、各群１０匹マウス（ｎ＝１０）の５群に分割した。群１および群３のマウスには、最終容積１００μｌの精製グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）を上述の方法を使用して２０μｇ／マウス／日で腹腔内（ｉｐ）注射した。マウスの体重はおよそ２５ｇであったため、注射用量を１．６ｍｇ／ｋｇ／日とした。脂質（ＧｌｃＣｅｒ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でメタノールを１．３％とした溶液に懸濁した。したがって、２０μｇのＧｌｃＣｅｒを含有する１００μｌのＰＢＳ中１．３％メタノール溶液を、毎日各マウスに腹腔内注射した。注射と注射との間は、溶液を−２０℃で保存した。群２および４のマウスには、ＧｌｃＣｅｒ＋不完全フロインドアジュバント（ＦＡ）を２０μｇ／マウスで投与し、群５のマウスには、媒体のみの対照（ＰＢＳ中１．３％メタノール）を投与した。２週後、群３、群４、および群５の動物には、５×１０５個のクリプトコックス細胞（クリプトコッカス・ネオフォルマンス）を鼻腔内負荷し、群１および群２の動物にはＰＢＳを投与した。マウスは不断給餌し、不快感または不調の徴候をモニタし、生存を記録した。０、２、４、および１２週目に、マウスから血液を採取し、ＥＬＩＳＡによりＧｌｃＣｅｒ抗体の存在を検証した。
図４に示されているように、ＧｌｃＣｅｒ（群１）またはＧｌｃＣｅｒ＋ＦＡ（群２）を注射した未感染マウスは、それぞれ１００％および９０％の生存率を示した。感染群では、ＧｌｃＣｅｒ投与は、６０％の保護（群３）をもたらし、ＧｌｃＣｅｒ＋ＦＡ（群４）は、７０％の保護をもたらした。対照的に、送達媒体のみを投与した感染マウス（群５）の死亡率は１００％であり、平均生存率は２５日だった。
クリプトコックス感染マウス中の真菌組織量を評価した。その結果は図５〜７に示されている。媒体のみでワクチン接種した感染マウス（群５）には、試験した器官全てにクリプトコックス細胞が見出された（脳、肺、肝臓、脾臓、および腎臓；図５を参照）。また、９０日間生存した、ＧｌｃＣｅｒでワクチン接種した４匹の感染マウス（群３）を試験した。４匹のマウスの各々から回収した肺組織、２匹のマウスの肝臓組織、および２匹のマウスの腎臓組織に、真菌細胞が見出された。これら動物の脳または脾臓には、クリプトコックス細胞は見出されなかった（図６を参照）。また、９０日間生存した、ＧｌｃＣｅｒ＋フロインドアジュバントでワクチン接種した４匹の感染マウス（群４）を試験した。真菌細胞は、肺のみに見出された（真菌細胞を鼻腔内注入したため、感染症の原発部位だった）。脳、肝臓、腎臓、または脾臓では、クリプトコックス細胞は見出されなかった。こうした結果は、ＧｌｃＣｅｒ＋フロインドアジュバント製剤が、肺から他の組織または器官への真菌細胞の播種を防止するために最も有効であることを示唆する。なお、感染の９０日後に群３または群４のいずれかのマウスの肺から回収したクリプトコックス細胞の数は、約５×１０５細胞であり、０日目に注入した細胞数と同様であった。これは、ＧｌｃＣｅｒまたはＧｌｃＣｅｒ＋フロインドアジュバントによるワクチン接種が、肺での真菌細胞増殖を阻止することを示す。
群３、群４、および群５のマウスから回収した脳組織および肺組織を検査した。その研究のデータは、図８および９に示されている。クリプトコッカス・ネオフォルマンスに感染させたが治療しなかったマウス（群５）の脳組織は、感染２５日目に脳での広範なクリプトコックス浸潤を示した（図８の矢印を参照）。対照的に、ＧｌｃＣｅｒのみ（群３）またはＧｌｃＣｅｒ＋ＦＡ（群４）のいずれかでワクチン接種したマウスの脳組織は、感染の９０日後にクリプトコックス細胞を示さなかった。肺組織には、感染させたが治療しなかったマウスのクリプトコックス細胞の大規模な分散が観察された（図９の矢印；感染後２５日）。対照的に、感染させたが、ＧｌｃＣｅｒ（群３）またはＧｌｃＣｅｒ＋ＦＡ（群４）で治療したマウスの肺は、分析した切片ではクリプトコックス細胞を示さなかった。組織を１０％ホルマリンで固定し、ミクロトーム切片化および染色のためにパラフィン包埋した。ＺＥＩＳＳ顕微鏡を用いて画像を撮影した。
マウス血清中の抗グルコシルセラミド抗体を検出するための追加研究を実施した。治療計画の０、１４、２８、および８４日目に、図３に示されているように処置したマウスから血液を採取した。血液を凝固させ、血清を遠心分離で収集した。精製ＧｌｃＣｅｒを抗原源として使用して、マウス血清中のグルコシルセラミド抗体（ＩｇＭ）を、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出した。反応を停止させ、ＦｌｉｔｅｒＭａｘ多重プレートリーダを使用して４５０ｎｍでの吸光度を記録した。ＧｌｃＣｅｒを投与したマウスの血清にＩｇＭ抗ＧｌｃＣｅｒ抗体が検出された。クリプトコッカス・ネオフォルマンスによる感染８４日後に、ＧｌｃＣｅｒおよびＦＡで免疫したマウスで最も高いレベルが観察された（図１０）。
それと同じ時点で（感染８４日後）、血球数を分析し、肝臓機能および腎臓機能の検査を実施した。表２に示されているように、感染マウスの白血球数（特に好中球）はより高かったが、総白血球数には大きな変化はなかった。
【表２】
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表２に示されているように、赤血球数または血小板数の合計に大きな変化はなかった。
【表３】
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表３に示されているように、肝臓機能および腎臓機能に大きな変化はなかった。
【表４】
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【００２５】
（実施例４）
ＧｌｃＣｅｒの週１回投与。
４週齢雌ＣＢＡ／Ｊマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。１日目に、完全フロインドアジュバントの存在下で５０μｇのＧｌｃＣｅｒを群１（ｎ＝１０）の動物に腹腔内注射した。その後、不完全フロインドアジュバントの存在下で５０μｇのＧｌｃＣｅｒを週１回で３週間注射した。この実験では、群２（ｎ＝１０）のマウスにはＰＢＳのみを投与し、群３（ｎ＝１０）のマウスには一切の処置を施さなかった。ＧｌｃＣｅｒの初回注射の２週間後、群１および群２のマウスに、５×１０５個のクリプトコックス細胞を負荷した。マウスは不断給餌し、生存をモニタした。０、２、４、６、および１２週目に、マウスから血液を採取し、抗ＧｌｃＣｅｒ抗体の存在を検証した。図１１を参照されたい。
生存に関しては、未処置マウス（群３）は予想通り生存した。図１１に示されているように、ＧｌｃＣｅｒおよびフロインドアジュバントを注射したマウス（群１）は、クリプトコッカス・ネオフォルマンスでの負荷に際して６０％の保護を示したが、ＰＢＳのみで処理したマウスは、負荷に際して８０％の死亡率を示した。図１２を参照されたい。
ＧｌｃＣｅｒを週１回注射した（本明細書に記載のように、および図１１に示されているように）マウスの血清に抗ＧｌｃＣｅｒ抗体を検出するための研究を実施した。治療計画の開始０日目（注射前）、ならびに１４、２８、４２、および８４日後に血液を収集した。血液を凝固させ、血清を遠心分離で収集した。精製ＧｌｃＣｅｒを抗原源として用いて、マウス血清中のグルコシルセラミド抗体を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出した。ＩｇＭおよびＩｇＧのアイソタイプは、ＩｇＭまたはＩｇＧ特異的二次抗体を使用することにより決定した。反応を停止させ、ＦｌｉｔｅｒＭａｘ多重プレートリーダを使用して４５０ｎｍでの吸光度を記録した。結果は、ＧｌｃＣｅｒの投与が、特に８４日目に、抗体応答（ＩｇＭ）を刺激することを示している。図１３を参照されたい。
【００２６】
（実施例５）
異なる投与経路を使用した異なるマウス系統へのＧｌｃＣｅｒ投与。
６週齢雌ＣＢＡ／Ｊマウスおよび６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。マウスを６群（ｎ＝６）に分割した。群１、群２、および群５はＣＢＡ／Ｊマウスで構成し、群３、群４、および群６はＢＡＬＢ／ｃマウスで構成した。０日目に、完全フロインドアジュバントの存在下で５０μｇのＧｌｃＣｅｒを群１〜４のマウスに注射した。群１および群３のマウスには腹腔内注射し、群２および群４のマウスには皮下注射した。群５および群６のマウスには、処置群に使用した媒体のみを注射した。初回処置の１週間後、不完全フロインドアジュバントの存在下で５０μｇのＧｌｃＣｅｒを群１〜４のマウスに注射し、その投与を、初回処置後に合計３週間にわたって週１回繰り返した。これら群は表５に要約されている：
【表５】
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０日目に、ならびに０日目の２、４、６、および８週後に血液を収集して、ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合する抗体の存在を検証した。この研究では、マウスはいずれも、クリプトコックスに感染しなかった。収集した血液を凝固させ、血清を遠心分離で収集した。精製ＧｌｃＣｅｒを抗原源として使用して、血清中のグルコシルセラミド抗を、サンドイッチＥＬＩＳＡで検出した。ＩｇＭおよびＩｇＧのアイソタイプは、ＩｇＭまたはＩｇＧ特異的二次抗体を使用して決定した。反応を停止させ、ＦｌｉｔｅｒＭａｘ多重プレートリーダを使用して４５０ｎｍでの吸光度を記録した。こうした結果は、ＧｌｃＣｅｒを腹腔内または皮下のいずれかで投与すると、特に初回投与後の５６日目に、抗ＧｌｃＣｅｒ  ＩｇＭ抗体が産生されたことを示している。２つの投与経路間の抗体産生に有意差はなかった。図１５を参照されたい。
抗ＧｌｃＣｅｒ抗体がクリプトコックス細胞に影響を及ぼした機序を研究するために、クリプトコックス細胞をマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４と共に共培養した。マクロファージを、３７℃で１４時間５％ＣＯ２の存在下にて、９６ウェル細胞培養プレートの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで増殖させた。非付着細胞を加温ＤＭＥＭで洗い流した。Ｊ７７４細胞との目標細胞比を１：１としたクリプトコックス細胞（１０５細胞／２００μＬ）を、様々な濃度のＧｌｃＣｅｒ抗体でオプソニン化し（図１６に示されているように）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）およびインターフェロン（ＩＦＮγ）の存在下でＪ７７４細胞を添加した。陽性対象として、抗ＧＸＭ  ＩｇＧ抗体を用いて同様の実験を実施した。細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで２時間５％ＣＯ２の存在下で３７℃にてインキュベートし、食作用を可能にした。２時間後、貪食されなかったＣｎ細胞を、加温ＤＭＥＭで洗い流した。滅菌水を添加することによりマクロファージ細胞を破砕し、アリコートをＹＰＤ寒天プレートに播種して、コロニー形成単位の数を決定した。１０μｇまたは２０μｇの抗ＧｌｃＣｅｒ  ＩｇＭ抗体でＣｎ細胞をオプソニン化すると、食作用のわずかな増加が観察されたが、この増加は有意ではなかった。こうした結果は、抗ＧｌｃＣｅｒ抗体がクリプトコックスに対する保護を提供する機序は、食作用および細胞内殺菌の刺激に依存するものではないことを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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