(57)【要約】  造血幹細胞の動員は造血幹細胞が骨髄腔外で刺激される工程である。ＨＳＣは動員できる前に、ＨＳＣが存在し、接着相互作用により保持される、ＢＭ幹細胞ニッチから除去かつ放出されなければならない。従って、本発明の一の態様において、  ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからのインビボまたはエクスビボでの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法が提供される。末梢血（ＰＢ）に動員されれば、そのＨＳＣは移植のために収集されてもよい。ＨＳＣの動員を強化する方法もまた、血液疾患の治療を改善しうる。
2017537134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからのインビボまたはエクスビボでの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法。
【請求項２】
ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチからの放出をさらに強化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからの動員をさらに強化する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
α９インテグリンが、α９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
α４インテグリンが、α４β１アンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応してもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アンタゴニストが、次式（Ｉ）：
【化１】
2017537134.tif 000041
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉａ）：
【化２】
2017537134.tif 000042
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
フェニルが、少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｂ）：
【化３】
2017537134.tif 000043
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｃ）：
【化４】
2017537134.tif 000044
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１が置換されてもよいピリジルである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｄ）：
【化５】
2017537134.tif 000045
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｅ）：
【化６】
2017537134.tif 000046
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、ビシクラム誘導体、テトラヒドロキノリン誘導体、環状ペプチド、パラ−キシリレンジアミンをベースとする誘導体、イソチオ尿素誘導体、ＰＯＬ６３２６、ＰＯＬ５５５１、ＣＣＴＥ−９９０８およびＴＧ−００５４からなる群より選択され、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００であることが望ましい、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、合わさって、同時に、または連続して投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、Ｇ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、または経粘膜的に投与される；該α９インテグリンアンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分は、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＳＣならびにその前駆細胞および祖先細胞が骨髄より誘導される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＳＣならびにその前駆細胞および祖先細胞が、幹細胞ニッチ、望ましくは骨内膜ニッチより誘導される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
インビボまたはエクスビボにてＨＰＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＳＣならびにその前駆細胞および祖先細胞が、長期にわたって再増殖するＨＳＣならびにその前駆細胞および祖先細胞であり、所望によりＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択されてもよく；所望によりＣＤ３４＋またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞より選択されてもよい、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
α９インテグリンまたはその活性な部分のアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を含む、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための組成物。
【請求項３０】
ＨＳＣならびにその前駆細胞および祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出をさらに強化する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからＰＢへの動員をさらに強化し、所望によりＨＰＣのＢＭ幹細胞ニッチからＰＢへの動員をさらに強化してもよい、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
α９インテグリンがα９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
α４インテグリンがα４β１のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応してもよい、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
α９インテグリンアンタゴニストが、式（Ｉ）：
【化７】
2017537134.tif 000047
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項２９ないし請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉａ）：
【化８】
2017537134.tif 000048
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
フェニルが、少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｂ）：
【化９】
2017537134.tif 000049
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｃ）：
【化１０】
2017537134.tif 000050
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
Ｒ１が置換されてもよいピリジルである、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｄ）：
【化１１】
2017537134.tif 000051
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｅ）：
【化１２】
2017537134.tif 000052
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
Ｇ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、または経粘膜的に投与される；静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
ＨＳＣ／ＨＰＣを対象から採取する方法であって、
効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該効果的な量で、ＨＳＣ／ＨＰＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチにおけるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去が強化され；
その除去されたＨＳＣをＰＢに動員し；
そのＨＳＣをＰＢから採取する
ことを含む、方法。
【請求項５２】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、Ｇ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＳＣ／ＨＰＣが、インターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセルおよび顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群より選択される他のＨＳＣ動員剤の使用によってさらに動員される、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
インテグリンアンタゴニストの効果的な量が、２５−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは５０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果的な量が、１０−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは１０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法より得られるＨＳＣを含む、細胞組成物。
【請求項５７】
請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法より得られるＨＰＣを含む細胞組成物であって、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の不在下で動員された細胞組成物と比べて、ＨＰＣの部分をより多く含む、細胞組成物。
【請求項５８】
血液疾患の治療方法であって、請求項５６または５７に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５９】
対象における血液障害を治療するための方法であって、該対象に治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、ＨＳＣの、ＢＭ幹細胞ニッチにおけるＢＭ幹細胞結合リガンドからＰＢへの除去、放出または動員を強化する、方法。
【請求項６０】
α９インテグリンがα９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分の投与をさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６２】
α４インテグリンがα４β１のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応してもよい、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
アンタゴニストが、式（Ｉ）：
【化１３】
2017537134.tif 000053
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉａ）：
【化１４】
2017537134.tif 000054
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
フェニルが、少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｂ）：
【化１５】
2017537134.tif 000055
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｃ）：
【化１６】
2017537134.tif 000056
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｒ１が置換されてもよいピリジルである、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｄ）：
【化１７】
2017537134.tif 000057
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
式（Ｉ）の化合物が、次式（Ｉｅ）：
【化１８】
2017537134.tif 000058
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、ビシクラム誘導体、テトラヒドロキノリン誘導体、環状ペプチド、パラ−キシリレンジアミンをベースとする誘導体、イソチオ尿素誘導体、ＰＯＬ６３２６、ＰＯＬ５５５１、ＣＣＴＥ−９９０８およびＴＧ−００５４からなる群より選択され、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００であることが望ましい、請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
アンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、Ｇ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項５９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内または経粘膜に投与される；該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項５９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分が、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
血液障害が、免疫抑制、慢性病、外傷、変性疾患、感染またはそれらの組み合わせ；皮膚、消化器系、神経系、リンパ系、心血管系、内分泌系またはその組み合わせの疾患または症状；骨粗鬆症、アルツハイマー病、心筋梗塞、パーキンソン病、外傷性脳損傷、多発性硬化症、肝硬変またはその組み合わせ；神経芽腫、骨髄異形成、骨髄線維症、乳がん、腎細胞がん、または多発性骨髄腫；造血系新生物障害、自己免疫疾患；または悪性でない障害からなる群より選択される、請求項５９〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
血液障害が、Ｂ−リニージＡＬＬおよびＴ−リニージＡＬＬからなる群より選択される急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）である、請求項５８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから除去し；
そのＨＳＣをＢＭから放出させて、ＰＢに動員させ；
ＨＳＣをその対象より採取し；および
そのＨＳＣを患者に移植する、ことを含む方法。
【請求項８３】
ＨＳＣが長期にわたって再増殖するＨＳＣ／ＨＰＣであり、所望によりＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択されてもよい、所望によりＣＤ３４＋またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−から選択されてもよい、請求項８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の骨髄（ＢＭ）幹細胞ニッチからの除去および放出の強化、およびＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭおよび幹細胞ニッチからの除去および放出を強化する方法に関する。本発明はまた、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の除去および放出を強化するのに用いるための組成物にも関する。該方法および組成物により除去および放出されたＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の細胞集団、ならびにその細胞集団の血液障害の治療のための、ＨＳＣ、前駆細胞およびそれらの祖先細胞の移植のための使用も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭ幹細胞ニッチ内のＨＳＣ調節および保持は、ＨＳＣ表面受容体と、骨芽細胞および類洞内皮細胞などの周囲の細胞により発現されるその各自のリガンドとの間の相互作用を介して媒介される。機能アッセイならびにインビボおよびエクスビボ画像操作を用いてのＢＭ内でのＨＳＣの空間分布分析は、造血幹細胞が骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭの最も近くにある接触面に優先的に局部化することを示す。注目すべきは、古典的なＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−表現型と同じであるが、骨内膜ＢＭから単離されたＨＳＣが、中心髄腔から単離されたＨＳＣと比べて、より大きな帰巣能を有し、強化された長期に及ぶ多リニージ造血再構成を有することである。かくして、骨内膜ＨＳＣを動員用に治療標的化することは移植片のより良い成果をもたらすはずである。
【０００３】
血球形成のＢＭへの局在化は、原始造血細胞と、ＢＭ幹細胞ニッチの間質細胞介在性造血微小環境との間で発生的に調節された接着相互作用を含む。定常状態の条件下、ＨＳＣは、原始的造血祖先細胞のＢＭにおける生理学的保持をもたらす、間質要素（ＶＣＡＭ−１およびオステオポンチン（Ｏｐｎ）など）との接着相互作用によりＢＭニッチで保持される。接着相互作用の動揺は、ＢＭに保持されたＨＳＣの放出をもたらし、動員により幹細胞／祖先細胞を骨髄ニッチから、結局は循環系に放出することを惹起し得る。白血球の骨髄から最終的に末梢血への生理学的退出または動員、ならびに少数の幹細胞／祖先細胞の正常な骨髄環境から循環系への回避は理解に乏しい現象である。細胞が骨髄の血管外腔から循環系に移動するには、可逆的接着の連繋した順序および遊走工程を必要とするかもしれない。このプロセスでは、幹細胞／祖先細胞により、あるいは骨髄中の間質細胞により発現される接着分子のレパートリーが重要である。多様な刺激により引き起こされる祖先細胞の接着および／または遊走における変化は、骨髄と末梢血との間でその除去または再分布をもたらす可能性がある。
【０００４】
ＨＳＣの特定の集団を放出または動員することは、移植、遺伝子療法、白血病、乳がんを含む新生物がんなどのがんを含む疾患の治療、または組織および皮膚の修復を含む、種々の状況での使用を可能とし得る。しかしながら、ＨＳＣを動員するためには、ＨＳＣを最初にＢＭから除去し得る、迅速かつ選択的な動員レジメンを必要とする。ＨＳＣの特定の細胞集団をＢＭ幹細胞ニッチから除去および放出することは、より長期に及ぶ、多リニージ造血再構成を提供し得る。
【０００５】
動員された末梢血（ＰＢ）の造血幹細胞（ＨＳＣ）を血液疾患の治療を受けている患者に移植することが、実質的に、伝統的な骨髄（ＢＭ）移植に取って代わっている。ある臨床診療は、ＨＳＣを動員するのに、プロテアーゼ（ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の相互作用を切断する）の産生を刺激すると考えられる、５日間のコースの組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で達成される。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦは、大規模の患者集団では効果がなく、骨疼痛、脾臓肥大、希な症例で脾臓破裂、心筋梗塞および脳虚血などのいくつかの副作用と関連付けられる。
【０００６】
これらのＧ−ＣＳＦに固有の欠点は、小分子に基づいて別の動員手段を同定するように努力してきたことである。例えば、ＦＤＡ承認のＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００（Plerixafor；Mozobil（登録商標））は、毒性問題を限定しながら、ＨＳＣを速やかに動員することが示された。それにも拘わらず、ＡＭＤ３１００による臨床的動員はＧ−ＣＳＦとの併用で効果的であるに過ぎず、迅速で選択的なＧ−ＣＳＦと独立した動員レジメンについての研究が依然として臨床的関心の対象となっている。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦが最も広範に利用される動員剤であるが、その欠点として、さらには、潜在的に毒性の副作用、相対的に長期に及ぶ治療コース（５−７日の連続注入）、および患者の可変的応答が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、動員を行うためには、ＨＳＣは、そのＢＭ幹細胞ニッチとの結合から解放されなければならない。ニッチ機能において重要であり、ＨＳＣをニッチ環境に保持する分子として、ＶＣＡＭ−１、Ｏｐｎおよびテナシン−Ｃが挙げられる。
【０００８】
α４β１などのインテグリンがＨＳＣの動員と関連付けられる。具体的には、ＨＳＣにより発現されるα４β１（ＶＬＡ−４）およびα９β１の両方のインテグリンが、幹細胞の静止およびＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの結合を通して骨内膜領域内でのニッチ保持と関連付けられる。α９β１インテグリンのＨＳＣ動員における役割は不明であるが、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を用いるＯｐｎのダウンレギュレーションにより、ならびにインテグリンα４またはＧ−ＣＳＦの選択的阻害により、Ｏｐｎ／ＶＣＡＭ−１とインテグリンとの結合が、ＨＳＣ動員について効果的な標的であること確認した。しかしながら、インテグリンなどの小分子との結合等の様々な特徴は、インテグリンが明らかに異なる分子であることを示す。
【０００９】
Pepinskyら（2002）にて、α４β１とα９β１インテグリンとの間の違いは、その結合特性において明らかである。Pepinskyは、小分子であるＮ−ベンゼン−スルホニル−（Ｌ）−プロリル−（Ｌ）−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）との結合の違いがＥＧＴＡ処理で明らかであることを示す。該処理はモノクローナル抗体である９ＥＧ７のα４β１との結合を阻害するのに対して、それは９ＥＧ７のα９β１との結合を刺激した。最も注目すべきことは、α９β１と＞１０μＭの見かけＫｄで結合するのに比べて、α４β１と１０ｎＭの見かけＫｄで結合し、インテグリンのＶＣＡＭ−１に対するアフィニティにて推定して＞１０００倍違うことであった。違いは、α９β１およびα４β１とＯｐｎとの結合でも見られた。
【００１０】
従って、ＨＳＣの除去および放出を促進し、Ｇ−ＣＳＦとは独立して、これらの細胞型の動員および治療レジメンを改善する化合物を提供することが本発明の目的である。特定のＨＳＣ集団を標的とするこれらの化合物を提供することにより、再構成および移植の成果が改善され得る。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の一の態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の、インビボまたはエクスビボにおいてＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を、Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で、ＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、ＨＳＣの移動は、ＨＳＣをＢＭからＰＢに動員させる、ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出をもたらし、それによりＨＳＣの動員を促進する。動員のさらなる刺激が、ＨＳＣのＰＢの動員をさらに強化する動員剤の使用により助成され得る。
【００１３】
好ましくは、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜前駆細胞である。
【００１４】
好ましくは、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分は、α９β１インテグリンまたはその活性な部分である。
【００１５】
もう一つ別の実施態様において、該方法は、α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与することを含む。好ましくは、α４インテグリンはα４β１アンタゴニストまたはその活性な部分である。.
【００１６】
もう一つ別の実施態様において、該アンタゴニストはα９およびα４と交差反応し、所望によりα９β１およびα４β１と交差反応してもよい。所望により、該アンタゴニストはα９β１／α４β１アンタゴニストまたはその活性な部分であってもよい。
【００１７】
好ましくは、該アンタゴニストは、式（Ｉ）：
【化１】
2017537134.tif 000003
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００１８】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉａ）：
【化２】
2017537134.tif 000004
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００１９】
１の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｂ）
【化３】
2017537134.tif 000005
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２０】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｃ）：
【化４】
2017537134.tif 000006
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２１】
もう一つ別の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｄ）
【化５】
2017537134.tif 000007
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２２】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｅ）：
【化６】
2017537134.tif 000008
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２３】
もう一つ別の実施態様において、ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの移動、放出または動員を強化するための組成物であって、本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を含む、組成物が提供される。
【００２４】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを対象から採取する方法であって、
Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で、有効量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該有効量がＢＭ幹細胞ニッチにおけるＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの移動を強化し；
その移動したＨＳＣをＰＢに動員し；および
ＨＳＣをＰＢから採取する、ことを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、対象における血液障害を治療するための方法であって、Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で該対象に、治療的に効果的な量の本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分、あるいは本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与した対象から採取したＨＳＣを含む細胞組成物を投与し、ＨＳＣの、ＢＭからＰＢへの移動、放出または動員を強化する、方法が提供される。
【００２６】
さらにもう一つ別の好ましい実施態様において、血液障害が造血腫瘍性障害であり、該方法は、効果的でなくなった化学療法剤がより効果的となるように、ＨＳＣを化学療法に感受的とし、ＨＳＣの感受性を改変することを含む。
【００２７】
さらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから移動させ；
そのＨＳＣを放出させてＢＭからＰＢに動員させ；
ＨＳＣを患者から由来のＰＢより採取し；および
該ＨＳＣを該患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明の他の態様は、本発明の具体的な実施態様の以下の記載を考慮して、当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の態様および利点をさらに具体的に理解するために、添付される図面と一緒に以下の詳細な記載に言及されるべきである。
【００３０】
【図１】（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）が二価金属カチオン（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）の存在下でＣＨＯ細胞により発現されるネズミα４およびα９と特異的に結合することを示す（黒色実線）。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合はＥＤＴＡの存在下で排除される（黒色点線）。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）、ＢＯＰおよびＢＩＯ５１９２を用い、１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で（ｂ）ヒトおよび（ｃ）ネズミにおけるα４（黒色）と比べたα９（灰色）との結合の特異的検出を実証する。ｎ＝３で、少なくとも２回の独立した実験の代表例である。
【００３１】
【図２】（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のヒトＣＢ  ＭＮＣとの結合の用量応答を示す。ｎ＝３で、少なくとも２回の独立した実験の代表例である。（ｂ）ＣＢ  ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、祖先細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）および委任細胞（ＣＤ３４−ＣＤ３８＋）の代表的集団を示す。（ｃ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下、単独（黒色実線）で、あるいはＢＯＰ（灰色実線）またはＢＩＯ５１９２（黒色点線）と組み合わせて、ＣＢ  ＭＮＣ委任細胞、祖先細胞およびＨＳＣと結合するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を示す。データは３つの個々の試料の代表例である。α９β１を介するα９特異的結合、α４β１を介するα４特異的結合；（ｄ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のＣＢ委任細胞、祖先細胞およびＨＳＣ上のα９β１との特異的結合；ｎ＝３、ＵＤ−検出不可；（ｅ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のヒトＢＭ（ｈｕＢＭ）との結合；データは３つの個々の試料の代表例である。（ｆ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のｈｕＢＭ  α９β１との特異的結合；ｎ＝３で、一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０１；（ｇ）ｈｕＢＭ祖先細胞およびＨＳＣでのα９β１発現（黒色実線、破線ＩｇＧ１イソ型対照）；データは３つの独立した試料の代表例である。（ｈ）ヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−（ｈｕＮＳＧ）マウスのＣＢ単核細胞（ＭＮＣ）からの生成、およびＢＭ白血球（ＷＢＣ）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋祖先細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−  ＨＳＣおよびＣＤ３４−ＣＤ３８＋  委任細胞のフローサイトメトリー；（ｉ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のヒト化ＮＳＧ（ｈｕＮＳＧ）ＢＭとの結合；データは３つの独立した試料の代表例である。（ｊ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のｈｕＮＳＧ  ＢＭ  α９β１との特異的結合；ｎ＝３で、一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０１；（ｋ）ｈｕＮＳＧ  ＢＭ祖先細胞およびＨＳＣでのα９β１発現（黒色実線、破線ＩｇＧ１イソ型対照）；データは３つの独立した試料の代表例である。（ｌ）ｈｕＮＳＧ  ＢＭ委任細胞、祖先細胞およびＨＳＣでのα４の発現（実線）；イソ型＝破線；（ｍ）図２ｉからの、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のｈｕＮＳＧ  ＢＭ委任細胞、祖先細胞およびＨＳＣとの結合を示す定量データ；ｎ＝３で、一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.００５
【００３２】
【図３】（ａ）ネズミＢＭ  Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋ｃ−ｋｉｔ＋（ＬＳＫ；祖先細胞）およびＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−（ＬＳＫＳＬＡＭ；ＨＳＣ）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｂ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（黒色棒）または１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のネズミ祖先細胞およびＨＳＣとの結合を示す。（ｃ）骨内膜ＢＭ（ｅＢＭ）および中心ＢＭ（ｃＢＭ）を示す大腿骨の模式図であり、外から加えられたカチオンのないインビトロにおけるＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の中心（ｃＢＭ）および骨内膜（ｅＢＭ）前駆細胞およびＨＳＣとの結合を示す。（ｄ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）と中心および骨内膜ＢＭから由来のリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１Ｍａｃ１＋）、ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞との競合的結合を示す。データは２回の別個の実験の代表例である。一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０００１；（ｅ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の、ｗｔ（黒色棒）およびα４−／−／α９−／−条件付きＫＯマウス（白色棒）から由来の中心および骨内膜ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞との結合を示す；ｔ−試験  ｐ＜０.０１
【００３３】
【図４】１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（灰色線）および１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（黒色線）の存在下、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１０ｎＭ）で処理した骨内膜および中心ＷＢＭからのゲートに付したリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）、骨髄（Ｇｒ１Ｍａｃ１＋）およびリニージ−集団のプロットを示す。データはｎ＝３の代表例である。
【００３４】
【図５】α９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストのＢＯＰがネズミ長期再増殖性ＨＳＣを速やかに動員させることを示す。（ａ）ネズミ祖先細胞（ＬＳＫ、白色四角）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ、灰色四角）のＢＯＰでの用量依存性動因を示す。データを２回の生物学的反復よりプールする；一群に付きｎ＞３である。一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０５；（ｂ）祖先細胞およびＨＳＣの１０ｍｇ／ｋｇのＢＯＰを用いる経時的動員を示す。データを２回の生物学的反復よりプールする。反復解析ではなく、各時点で個々の動物がｎ＝５である。時間０はビヒクル対照である。一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０５である。
【００３５】
【図６】ＢＯＰを単回投与した後の１８時間までの（ａ）全祖先細胞（ＬＳＫ）、（ｂ）ＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）、および（ｃ）ＰＢ中のリンパ球含量、の拡張された経時的解析を示す。ｎ＝５で、一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０５である；（ｄ）セイラインまたはＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）で３０分間にわたって処理したマウスのＰＢにおけるＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ含量の解析を示す。データを２回の独立した実験よりプールする。ｎは＞６である。（ｅ）ＢＯＰを単独で、またはＢＯＰをＡＭＤ３１００と組み合わせて投与した後の、インビボにおけるＢＯＰの骨内膜と、それに対する中心の祖先細胞（ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）との結合の解析を示す。データは、ＢＯＰの中心細胞（点線）に対する骨内膜細胞との結合の増加（倍数）として表される。ｎ＝３である。ｐ値は各処理群の範囲内で中心および骨内膜集団の間でペアードｔ−テストを用いて統計学的に有意な結果を示す。ｐ＜０.０５
【００３６】
【図７】外部からのＣａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下（黒色実線）でインビトロにてＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を染色すること、およびＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）をインビボにて投与し、外部からのＣａ２＋／Ｍｇ２＋＋ＢＯＰ（点線）の存在下でＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を染色することを比較して表すプロットを示す。データはｎ＝３の代表例である。
【００３７】
【図８】ＢＯＰとＡＭＤ３１００を組み合わせて用いるＨＳＣの動員の強化を示す。セイライン（ｎ＝３）、ＢＯＰ（ｎ＝４）、ＡＭＤ３１００（ｎ＝４）およびＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせ（ｎ＝４）で処理したマウスの末梢血中の、（ａ）代表的なフローサイトメトリープロット、（ｂ）ＬＳＫ含量の測定、（ｃ）ＬＰＰ−ＣＦＣ含量の測定、およびＨＰＰ−ＣＦＣ含量の測定を示す。データは平均値±ＳＥＭである。（ｅ）セイライン、ＢＯＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＭＤ３１００（３ｍｇ／ｋｇ）単独で、ＢＯＰ（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて処理したマウスの末梢血中のＷＢＣ含量を解析する。データは平均値±ＳＥＭである。一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０５である。（ｆ）ＢＯＰ、ＡＭＤ３１００およびＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせにより動員されるＲＦＰ血液の限界希釈移植片解析を示す（一群５匹のレシピエント）。陽性多リニージ生着は、＞０.５％のＣＤ３＋、Ｂ２２０＋およびＧｒ１Ｍａｃ１＋であると思われる。（ｇ）３０μｌのＲＦＰ動員のＰＢを移植したレシピエントの生存率を示す。（ｈ）ＢＯＰ、ＡＭＤ３１００またはＢＯＰ＋ＡＭＤ３１００によってＰＢ中で動員される長期にわたるＨＳＣ度数を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭである。一方向性ＡＮＯＶＡ：＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００５、＊＊＊＊ｐ＜０.００１
【００３８】
【図９】（ａ）ビヒクル（ｎ＝５）、ＢＩＯ５１９２単独（ｎ＝５）またはＡＭＤ３１００との組み合わせ（ｎ＝５）、あるいはＢＯＰとＡＭＤ３１００との組み合わせ（ｎ＝３）を単回投与した１時間後のＰＢ白血球細胞（ＷＢＣ）含量を示す。（ｂ）ビヒクル（ｎ＝５）、ＢＩＯ５１９２単独（ｎ＝５）またはＡＭＤ３１００との組み合わせ（ｎ＝５）、あるいはＢＯＰとＡＭＤ３１００との組み合わせ（ｎ＝３）を単回投与した１時間後の全ＰＢ祖先細胞（ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）含量を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭである。一方向性ＡＮＯＶＡ  ＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００５、＊＊＊＊ｐ＜０.００１
【００３９】
【図１０】ＢＯＰ＋ＡＭＤ３１００を単回投与、またはＧ−ＣＳＦを４日間投与した後のＰＢ祖先細胞（ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）含量の解析を示す。データは２回の生物学的反復をプールする。ｎ＞８である。（ｂ）連続的競合移植アッセイの模式図である。（ｃ）１°レシピエントにおけるＰＢ  ＲＦＰ＋白血球細胞（ＷＢＣ）の割合を示す。データポイントは、各々、２回の移植の一つからの個々のレシピエントのものである。１回目＝Ｘであり、２回目は○である。破線は数学的に予想される生着レベルである。（ｄ）１°レシピエントにおけるＰＢ  ＲＦＰ＋およびＧＦＰ＋リンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１＋／Ｍａｃ１＋）生着の解析結果を示す。ｎ＝８；１回目および２回目の実験よりプールした。（ｅ）１°レシピエントのＢＭ中のドナー生着；および（ｆ）リニージ配分（リンパ球、Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋および骨髄、Ｇｒ１＋／Ｍａｃ１＋）の解析を示す。（ｇ）２°レシピエントＰＢ解析を示す。データポイントは、各々、個々のレシピエントを表す。破線は数学的に予想される生着レベルである。（ｈ）移植して２０週間経過した後の２°レシピエントにおけるＰＢ  ＲＦＰ＋およびＧＦＰ＋リンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１＋／Ｍａｃ１＋）生着の解析結果を示す。データは５つの個々の２°ドナーに基づいてグループ分けされる。ｎ＝４；ドナーに付き２°レシピエント；ＵＤ＝検出不可；（ｉ）移植して２０週間経過した後の２°レシピエントのＰＢ中のドナー生着；および（ｊ）リニージ配分（リンパ球、Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋および骨髄、Ｇｒ１＋／Ｍａｃ１＋）の解析を示す。記号はすべて個々の動物で表し、データはすべて平均値±ＳＥＭである。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００５、＊＊＊＊ｐ＜０.００１
【００４０】
【図１１】ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせは、ヒト化ＮＳＧ（ｈｕＮＳＧ）マウスにおけるヒトＣＤ３４＋幹細胞および祖先細胞を効果的に動員させることを示す。そのプロットは動員後のｈｕＮＳＧ  ＰＢ中のｈｕＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞含量の解析結果を示す。データはセイライン対照と比べて１ｍｌのＰＢ中のＣＤ３４＋細胞の増加（倍数）で表され、データポイントは、各々、個々の動物を表す。黒色棒＝平均値である。＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊＊ｐ＜０.００１
【００４１】
【図１２】構造は類似するが、ベンゼンスルホニル基が３−ピリジンスルホニル基と置換されている、ＢＯＰに代わる小分子を示す。データは、化合物なし、Ｐｙ−Ｂｏｐ単独、ＡＭＤ３１００単独、およびＰｙ−ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせを（ａ）祖先細胞（ＬＳＫ）および（ｂ）ＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）について示す。データは平均値±ＳＥＭである。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１
【００４２】
【図１３】（ａ）すべての細胞がＰＢに動員されたことを示し、増加（倍数）として表される。（ｂ）ＡＭＤ３１００のＢＯＰへの添加は、ＢＯＰにより占められるα４β１／α９β１の％が増加することを示す。データは平均値±ＳＥＭである。Ｔ−試験：＊ｐ＜０.０５
【発明を実施するための形態】
【００４３】
造血幹細胞動員は、造血幹細胞が骨髄腔（例えば、寛骨および胸骨）から血流に刺激され、それでそれらが将来の補液のための収集に利用可能であるか、または骨髄から自然に放出され、体内を通って脾臓などの臓器に留まって血球を提供する、ところの工程である。種々の血液障害に付随して生じることが多い、この興味深い自然現象は、ＨＳＣの血流への動員を人為的に引き起こし、それで該ＨＳＣが移植などの目的のために集められ、使用され得る薬剤の発見をもたらす、療法の有用な成分として適合されるかもしれない。Ｇ−ＣＳＦおよびＦＤＡ承認のＣＸＣＲ−４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００などの化合物は、ＨＳＣを動員することが知られている。しかしながら、毒性問題および種々の副作用がこの治療から生じ得る。
【００４４】
ＨＳＣが動員されうる前に、ＨＳＣは、それらが存在し、接着相互作用により保持される、ＢＭ幹細胞ニッチより取り除かれ、放出されなければならない。
【００４５】
従って、本発明の態様において、インビボまたはエクスビボにてＢＭ幹細胞と結合するリガンドからＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞を取り除くことを強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法が提供される。
【００４６】
定常状態条件にて、ＨＳＣは、ＢＭ幹細胞ニッチと称される、ＢＭの特定の区域に存在する。ここで、該ＨＳＣは、放出される前に、ＰＢに入って、組織に留まり、分化を開始することを容易にする、静止幹細胞として存在する。ＨＳＣは、接着分子または結合リガンド、例えば、限定されないが、ＶＣＡＭ−１、ＯｐｎおよびＴｅｎａｃｉｎ−ＣによりＢＭ幹細胞ニッチに保持される。ＨＳＣ／ＢＭ幹細胞ニッチの相互作用の調整は、ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチへの、最終的にはＰＢへの除去および放出に役立つ。
【００４７】
かくして、本発明は、ＨＳＣとＢＭ幹細胞ニッチ環境の間の接着相互作用および結合リガンドを中断することにより、ＨＳＣをＢＭ幹細胞ニッチの相互作用から除去および放出するための手段を提供する。次に、該細胞はＰＢに動員するために利用可能となるか、あるいはＢＭに留まってもよい。
【００４８】
ＢＭ幹細胞ニッチは骨内膜ニッチおよび中心髄腔を含む。骨内膜幹細胞ニッチは骨髄の骨内膜にあり、そこでは骨芽細胞が増殖および静止などのＨＳＣ機能の主たる調整物質である。さらには、有意な割合のＨＳＣは、内皮ニッチにある類洞内皮細胞と密接に関連付けられ、そこではＨＳＣが末梢血に入り、分化を開始する準備がなされている。中心髄腔は、赤血球および白血球の形成に関与する、別名骨髄として知られる、骨の中心腔である。
【００４９】
本発明者は、少なくともα９インテグリンを、ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の存在下、小分子のアンタゴニストで阻害することにより、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞をＢＭ幹細胞ニッチから、好ましくは骨内膜ニッチに除去できる、あるいはＰＢに動員し、長期にわたって多リニージの生着の可能性のあることを見出した。意外にも、α９インテグリンまたはその活性な部分に対するアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な誘導体を用いることで、少なくともＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞の血液中への除去および放出が有意に増加することが見出された。
【００５０】
本発明者らは、一連のＮ−フェニルスルホニルプロピンジペプチドをベースに、活性化されたヒトおよびネズミα９β１およびα４β１インテグリンならびにＢＭ  ＨＳＣおよび先駆細胞（図１ａ）と結合する、蛍光小分子のインテグリンアンタゴニスト、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１）（図１ａ）を開発した。本発明者らは、このファミリーの化合物が骨内膜ＢＭ内でα９β１／α４β１およびＯｐｎの間の相互作用の制限に基づき、動員のために強力な骨内膜ＨＳＣを標的とすると仮定した。この度、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１）およびその非標識化誘導体ＢＯＰ（２）が優先的に結合し、インビボにおいて本質的に活性化されたα９β１／α４β１インテグリンを介して、マウスおよびヒトＨＳＣならびに先駆細胞を動員することが見出された。さらに、ＢＯＰがＡＭＤ３１００であるＣＸＣＲ４アンタゴニストと組み合わせて使用されると、長期間にわたって再増殖するＨＳＣのより大きな動員が、４日間Ｇ−ＣＳＦのレジメンと比べて１時間で達成された。ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせはまた、ヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスモデルにおいてヒトＣＤ３４＋細胞を動員することも見出された。かくして、α９β１／α４β１インテグリン阻害剤を、単独で、あるいはＡＭＤ３１００と併用して用いて骨内膜ＨＳＣを標的とする療法は、幹細胞の移植適用について、現行の動員手段に代わる有望な手段を提示する。
【００５１】
インテグリンは、第一に細胞粘着および細胞シグナル伝達工程のメディエーターとして機能する、αβヘテロダイマーの膜貫通タンパク質と非共有結合する。それらはアルファ鎖とベータ鎖とから構成され、各鎖は異なる役割を果たし、その活性化および活動に重要な異なる金属結合部位を有する。哺乳動物にて、１８α−鎖および８β−鎖が同定されており、今日まで、２４種の異なる、独特なαβの組み合わせが記載されている。
【００５２】
α４β１インテグリン（最晩期抗原−４；ＶＬＡ−４）は主に白血球で発現され、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、フィブロネクチンおよびＯｐｎの受容体であることが知られている。α４β１インテグリンは白血球動員、移行および活性化の重要な調整物質であり、炎症および自己免疫疾患にて重要な役割がある。したがって、フェーズＩおよびＩＩの臨床試験にまで進行している数人の対象で、喘息、多発性硬化症およびクローン病を治療するために、著しい努力は、α４β１インテグリン機能の小分子阻害剤を開発することに焦点が当てられてきた。
【００５３】
ＩＴＧＡ９遺伝子によりコードされる、インテグリンα９、構造的に類似するインテグリンタンパク質もPepinskyら（2002）によって最近になって研究されていた。α９サブユニットはβ１サブユニットとヘテロダイマー複合体を形成し、α９β１インテグリンを形成する。
【００５４】
この関連するインテグリンの、α９β１と、α４β１とは、多くの構造的および機能的特性を共有するが、インテグリンのα４β１とα９β１との間には両者を区別する違いもある。白血球で大きく発現が制限されるα４β１と異なり、α９β１の細胞発現は広範囲に及ぶ。
【００５５】
さらには、ＶＣＡＭ−１およびＯｐｎを含む、同じリガンドのいくつかとも結合するが、他の小分子のα９β１およびα４β１インテグリンとの結合は異なることが分かっている。本明細書中の実施例に示されるように、最も大きな違いはオフ−レート反応速度にある。α９β１アンタゴニスト（Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ））ならびにＢＯＰは、α４β１に比べて、α９β１に対するオフ−レートを有意に減少させることが知られている。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）についての詳細は本明細書の実施例２（図５ｃ）で具体的に示されており、ＢＯＰについての詳細はPepinskyら（2002）にて具体的に示される
【００５６】
以前は、α４β１およびα９β１インテグリンは共に造血幹細胞（ＨＳＣ）により発現されることが示された。インテグリンのα４β１およびα９β１は、主として、ＨＳＣを隔離し、それを骨髄に動員すること、ならびにＨＳＣ静止の維持、長期間にわたって再増殖する幹細胞のための重要な特性と関連付けられる。
【００５７】
α４β１およびα９β１インテグリンによるＨＳＣの調整は、骨ライニング骨芽細胞、内皮細胞および骨髄環境の他の細胞により発現および／または分泌される、ＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの相互作用を通して媒介される。しかしながら、Pepinskyら（2002）により討論されるように、ＶＣＡＭ−１とＯｐｎに対する結合アフィニティの違いはα４β１とα９β１との間で著しく異なる。α４β１の小分子は効果的なＨＳＣ動員剤として関係付けられる。しかしながらα４β１とα９β１との間に構造的および機能的類似性があるにも拘わらず、結合特性は異なり、そこでこの点に関してα９β１インテグリンの役割は未開拓のままである。
【００５８】
本発明の１の好ましい実施態様において、α９インテグリンのアンタゴニストはα９β１インテグリンのアンタゴニストである。従って、α９インテグリンのアンタゴニストは、α９β１インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分であることが好ましい。
【００５９】
本明細書で使用されるように、α９β１インテグリンまたはα４β１インテグリンの活性な部分は、インテグリンの活性を保持するα９β１タンパク質またはα４β１タンパク質の部分である。すなわち、その部分は、α９β１タンパク質またはα４β１タンパク質の一部であり、完全なタンパク質よりも小さいが、完全なα９β１またはα４β１タンパク質と同じまたは類似する様式にてまだ作用しうる。「α９インテグリン」または「α４インテグリン」あるいは「α９β１インテグリン」または「α４β１インテグリン」なる語が本明細書で使用される場合、それはまたその活性ないずれの部分への言及も包含する。
【００６０】
同様に、本明細書で使用されるように、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの活性誘導体は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの活性を保持し、ＣＸＣＲ４アンタゴニストに類似する化合物である。「ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」なる語が本明細書中で使用される場合、それはその活性誘導体への言及も包含する。
【００６１】
本発明のもう一つ別の実施態様において、α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンのアンタゴニストは、α４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンのアンタゴニストでもある。本発明のα９インテグリンアンタゴニストは、α９β１インテグリンおよびα４β１インテグリンの両方の活性を阻害し得ることが望ましい。よって、アンタゴニストはα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストであることが好ましい。言い換えれば、アンタゴニストはα４β１ならびにα９β１と反応し、すなわち両方のインテグリンと交差反応することが好ましい。
【００６２】
α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンのアンタゴニストは、α４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンのアンタゴニストと同じであっても、または異なってもよい。そのアンタゴニストが同じであるならば、α９インテグリンおよびα４インテグリンの両方の活性を阻害するのに単一のアンタゴニストが用いられてもよい。α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンおよびα４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンを阻害するのに、別個のアンタゴニストが、同時または別々のいずれかで使用されてもよい。
【００６３】
本発明のさらにもう一つ別の実施態様において、α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリン、およびα４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンは、インテグリンのアンタゴニストと相互作用させる前に、活性化されるのが好ましい。アンタゴニストは本質的に活性化されたインテグリンと相互作用させるのが好ましい。従って、α９インテグリンは本質的に活性化されているのが望ましい。好ましくは、α９β１インテグリンが本質的に活性化されている。上記に記載されるように、α９β１インテグリン／α４β１インテグリンは共に、ＨＳＣおよび前駆細胞が骨内膜ニッチにある本質的に活性化されたα９／α４インテグリンを介してＨＳＣおよび前駆細胞を標的とするように、同時にまたは連続的に活性化されるのが望ましい。
【００６４】
インテグリンの活性化は、インテグリンのリガンドアフィニティを空間的および時間的に操作することにより、細胞がそれを通してインテグリン機能を調節する重要な機構である。インテグリンは、タンパク質の結合を調節することにより内側から、あるいは多価リガンドの結合により外側から活性化され得る。外部ドメインとのリガンド結合は、リガンドアフィニティを高め、細胞質ドメインにおけるタンパク質相互作用部位、および得られるシグナルを修飾する、立体構造変化を惹起する。このように、インテグリンの活性化は、本質的に、または二価カチオンの使用により達成されてもよい。
【００６５】
本発明のもう一つ別の実施態様において、α９インテグリンのアンタゴニスト、好ましくはα９β１インテグリン、より好ましくはα９β１／α４β１インテグリンのアンタゴニストは、式（Ｉ）：
【化７】
2017537134.tif 000009
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含む。
【００６６】
一連の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ４がＨであり；
Ｒ５が−ＯＲ７であり； および
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７が式（Ｉ）について定義されるとおりである。
【００６７】
かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化８】
2017537134.tif 000010
［式中：
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され； 
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１ないし３の範囲にある整数である］
で示される構造を有してもよい。
【００６８】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは１または２である。
【００６９】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７はＣ１−Ｃ４アルキルより選択される。
【００７０】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の基について本明細書に記載される例示としてのＣ１−Ｃ４アルキルは、直鎖であっても、または分岐してもよい。ある実施態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチルおよびtert−ブチルからなる群より選択されてもよい。
【００７１】
ある実施態様において、Ｒ７はメチルまたはtert−ブチルであってもよく、それで−ＯＲ７は−ＯＣＨ３または−ＯＣ（ＣＨ３）３である。
【００７２】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２である。かかる実施態様において、Ｒ１２は所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択されてもよく、ｎは１ないし３の範囲にある整数である。
【００７３】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２であり、ここでＲ１２は−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択されてもよく、ｎは１または２である。
【００７４】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２であり、ここで、
Ｒ１２は−ＯＣＨ３であり、ｎは２であるか、または
Ｒ１２は所望により置換されてもよいテトラゾリル（好ましくは、５−テトラゾリル）であり、ｎは１である。
【００７５】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３である。かかる実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択されてもよい。
【００７６】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよい５または６員のシクロアルキル環であってもよい。典型的なシクロアルキル環はシクロペンチルまたはシクロヘキシルであってもよい。
【００７７】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいアリール環であってもよい。典型的なアリール環はフェニルである。
【００７８】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいヘテロアリール環であってもよい。典型的なヘテロアリール環はピロリルである。
【００７９】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である
【００８０】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されてもよい。
【００８１】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、各々、エチルまたはイソプロピルである。
【００８２】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の一の具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５の一方がメチルであり、Ｒ１４およびＲ１５の他方がフェニルである。
【００８３】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよい。一の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環である。特定のヘテロシクロアルキル環はピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【００８４】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいピロリジニル環を形成する。
【００８５】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３は２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎは１または２である。
【００８６】
式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−である。かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化９】
2017537134.tif 000011
［式中：
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であって、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲の整数である］
で示される構造を有する。
【００８７】
式（ＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＲ７であって、式（ＩＩＩａ）：
【化１０】
2017537134.tif 000012
［式中
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（ＩＩＩ）にて定義されるとおりであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物を提供する。
【００８８】
式（ＩＩＩａ）のある実施態様において、Ｒ７はＣ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、メチルまたはtert−ブチル）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；ここで
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは１、２および３からなる群より選択される整数である。
【００８９】
式（ＩＩＩａ）の具体的な実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。一の形態にて、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【００９０】
式（Ｉ）の具体的な実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−であり、Ｒ４はＨであり、Ｒ５は−ＯＲ７であって、ここでＲ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、ピロリジニル環を形成する。かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩｂ）：
【化１１】
2017537134.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【００９１】
本明細書に記載の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいアリールである。もう一つ別の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいヘテロアリールである。ある実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいフェニルである。もう一つ別の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもピリジルである。
【００９２】
一連の実施態様において、Ｒ１は少なくとも１個のハロゲン基で置換されるフェニルである。ハロゲン置換基は、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードからなる群より選択されてもよく、好ましくはクロロである。
【００９３】
ある実施態様において、Ｒ１は複数のハロゲンで置換されるフェニルである。ハロゲン置換基はフェニル環の３−および５−位の位置にあってもよい。もう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ１はピリジルである。かかる実施態様において、残りの分子はピリジルの窒素原子に対してメタ位にあってもよい。
【００９４】
一の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）または（ＩＶｃ）：
【化１２】
2017537134.tif 000014
［（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）の各式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７は式（Ｉ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【００９５】
式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）または（ＩＶｃ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である。
【００９６】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）または（ＩＶｃ）の化合物のある実施態様において、Ｒ３はＨである。
【００９７】
Ｒ３がＨである実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化１３】
2017537134.tif 000015
［式中：
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される：
ただし、Ｒ４がＨの場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、およびＲ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキル、および所望により置換されてもよいアリールからなる群より選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される構造を有してもよい。
【００９８】
式（Ｖ）の化合物のある実施態様において、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＲ７であって、式（Ｖａ）：
【化１４】
2017537134.tif 000016
［式中
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ７は、式（Ｖ）にて定義されるとおりである］
で示される化合物を提供する。
【００９９】
式（Ｖａ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７がＣ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、メチルまたはtert−ブチル）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；ここでＲ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびｎは式（Ｖ）について本明細書にて定義されるとおりである。
【０１００】
式（Ｖａ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。一の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【０１０１】
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物のある実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−である。
【０１０２】
式（Ｖａ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−であり、Ｒ３およびＲ４は、各々、Ｈであり、Ｒ５は−ＯＲ７であって、ここでＲ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、ピロリジニル環を形成する。かかる実施態様において、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖｂ）：
【化１５】
2017537134.tif 000017
で示される構造を有してもよい。
【０１０３】
式（Ｖ）および（Ｖａ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいアリール、好ましくは所望により置換されてもよいフェニルである。任意の置換基は、好ましくは、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードからなる群より選択される少なくとも１個のハロゲン基であり、好ましくはクロロである。
【０１０４】
一連の実施態様において、Ｒ１は少なくとも１個のハロゲン基で置換されるフェニルである。ある実施態様において、Ｒ１は複数のハロゲン基で置換されるフェニルである。ハロゲン置換基は、フェニル環の３および５位に位置することが好ましい。
【０１０５】
１の実施態様において、式（Ｖ）の化合物は、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）：
【化１６】
2017537134.tif 000018
［（ＶＩａ）および（ＶＩｂ）の各式中、Ｒ２およびＲ７は式（Ｖ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【０１０６】
式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である。
【０１０７】
式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）の化合物のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７はメチル、tert−ブチル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２からなる群より選択され、ここでＲ１２は−ＣＮ、−ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、および所望により置換されてもよいヘテロアリール（好ましくは、５−テトラゾリル）からなる群より選択され、ｎは１または２である。
【０１０８】
式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）の化合物のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３であり、ここでＲ１３は所望により置換されてもよいシクロアルキル（好ましくは、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）、所望により置換されてもよいアリール（好ましくは、フェニル）および所望により置換されてもよいヘテロアリール（好ましくは、ピロリル）である。
【０１０９】
式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。１の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は、所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【０１１０】
具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩａ）：
【化１７】
2017537134.tif 000019
［式中、Ｒ２およびＲ３は式（Ｉ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有する。
【０１１１】
式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ３はＨであり、次式（ＶＩＩＩａ）：
【化１８】
2017537134.tif 000020
［式中、Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択される］
で示される化合物を提供する。
【０１１２】
式（Ｉ）の化合物の１の形態において、Ｒ２はＨであり、次式（ＩＸａ）：
【化１９】
2017537134.tif 000021
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１１３】
好ましい具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｃ）：
【化２０】
2017537134.tif 000022
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【０１１４】
もうひとつ別の具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩｂ）：
【化２１】
2017537134.tif 000023
［式中、Ｒ２およびＲ３は式（Ｉ）の定義と同じである］
で示される構造を有する。
【０１１５】
Ｒ３がＨである、式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、次式（ＶＩＩＩｂ）：
【化２２】
2017537134.tif 000024
［式中、Ｒ２はＨおよび置換基からなる群より選択される］
で示される化合物を提供する。
【０１１６】
Ｒ２がＨである、式（Ｉ）の化合物の１の形態において、次式（Ｉｄ）：
【化２３】
2017537134.tif 000025
の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１１７】
好ましい具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｅ）：
【化２４】
2017537134.tif 000026
の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１１８】
本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩｃ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩＩＩｂ）の化合物中、Ｒ２は、ある実施態様において、置換基であってもよい。
【０１１９】
一連の実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいヘテロアリール、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいシクロアルキル、ヒドロキシ、アミノおよびアジドからなる群より選択される置換基であるか、あるいはＲ２は、式（Ａ）：
【化２５】
2017537134.tif 000027
［式中
Ｙは、所望により置換されてもよいヘテロアリールまたは所望により置換されてもよいヘテロアリール−（Ｏ）ＮＨ−であり；
リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり；
ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数であり；および
Ｚはフルオロフォール（好ましくは、ロダミン基）である］
で示される構造の置換基である。
【０１２０】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩｃ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩＩＩｂ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は所望により置換されてもよいヘテロアリールである。適切な所望により置換されてもよいヘテロアリールは５〜１０個の環原子と、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含んでもよい。所望により置換されてもよいヘテロアリールは単環または二環であってもよい。
【０１２１】
ある実施態様において、Ｒ２は、ピラゾール、イミダゾール、１,２,３−トリアゾール、１,２,４−トリアゾール、テトラゾール、インダゾール、４,５,６,７−テトラヒドロインダゾールおよびベンズイミダゾールからなる群より選択されるヘテロアリールであってもよい。
【０１２２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルである。適切な所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルは、３ないし１０個の環原子、好ましくは４ないし８個の環原子と、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含んでもよい。所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルは単環または二環であってもよい。
【０１２３】
ある実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいアゼチジン、ピロリジン、ピペリジニル、アゼパン、モルホリンおよびチオモルホリンからなる群より選択される所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルであってもよい。
【０１２４】
ある実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいピペリジンであってもよい。ある実施態様において、ピペリジンは少なくとも１個のＣ１−Ｃ４アルキル置換基で置換されてもよい。ある実施態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換基はメチルであってもよい。
【０１２５】
ある実施態様において、Ｒ２は２−メチルピペリジン、３−メチルピペリジン、４−メチルピペリジン、３,５−ジメチルピペリジン、および３,３−ジメチルピペリジンからなる群より選択されてもよい。
【０１２６】
Ｒ２が所望により置換されてもよいヘテロアリールまたは所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル基である場合、Ｒ２は、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル環上のヘテロ原子を介して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のピロリジン環と連結してもよい。例えば、Ｒ２がピラゾール、イミダゾール、１,２,３−トリアゾール、１,２,４−トリアゾール、テトラゾール、インダゾール、４,５,６,７−テトラヒドロインダゾールおよびベンズイミダゾールからなる群より選択されるヘテロアリールである場合、あるいはＲ２が所望により置換されてもよいアゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンおよびチオモルホリンからなる群より選択される所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルである場合、その場合にはＲ２は、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基の窒素（Ｎ）ヘテロ原子を介して該化合物の残りの部分に共有結合する。
【０１２７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は式（Ａ）：
【化２６】
2017537134.tif 000028
［式中
Ｙは、所望により置換されてもよいヘテロアリール、または所望により置換されてもよいヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり；
リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり；
ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数であり；および
Ｚはフルオロフォール（好ましくは、ロダミン基）である］
で示される構造の置換基である。
【０１２８】
ある実施態様において、Ｙはトリアゾールまたはトリアゾール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択されてもよい。
【０１２９】
ある実施態様において、Ｙはトリアゾールまたはトリアゾール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であってもよく、その場合には、式（Ａ）の構造式は、式（Ａ１）または（Ａ２）：
【化２７】
2017537134.tif 000029
で示される。
【０１３０】
ある実施態様において、リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されても、またはそのいずれかの組み合わせであってもよく、ここでｐは、各々、１〜４の範囲にある整数である。
【０１３１】
ある実施態様において、リンカーは、式（Ａ３）または（Ａ４）：
【化２８】
2017537134.tif 000030
［式中、ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数である］
で示されてもよい。
【０１３２】
式（Ａ）、（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）のある実施態様において、Ｚはロダミンフルオロフォールであり、それは以下の群：
【化２９】
2017537134.tif 000031
より選択される。
【０１３３】
具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式（ＩＸａ）：
【化３０】
2017537134.tif 000032
で示される。
【０１３４】
もう一つ別の具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は次式（ＩＸｂ）：
【化３１】
2017537134.tif 000033
で示される。
【０１３５】
理論により限定されることを望むものではないが、本明細書に記載の式で示される化合物でピロリジンカルバマート部分が、α９インテグリン、より具体的にはα９β１インテグリン、あるいはその活性な部分に対して高い結合アフィニティを確保するのに重要であると考えられる。さらには、カルボン酸官能基はアンタゴニスト活性に不可欠であると考えられる。
【０１３６】
上記において、当業者に周知である多くの用語が使用される。にもかかわらず、明確化を目的として、多数の用語を以下に定義する。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「置換されない」なる語は、置換基がないこと、あるいは置換基が唯一水素であることを意味する。
【０１３８】
明細書を通して使用されるような「所望により置換されてもよい」なる語は、基が、１または複数の水素以外の置換基で、さらに置換または（縮合多環系を形成するように）縮合されてもよいこと、またはされていなくてもよいことを意味する。特定の実施態様において、置換基は、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルケニル、ヘテロシクロアルキルアルケニル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シクロアルキルヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルヘテロアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリールヘテロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシシクロアルキル、アルキルオキシヘテロシクロアルキル、アルキルオキシアリール、アルキルオキシヘテロアリール、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、シクロアルキルオキシ、シクロアルケニルオキシ、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルケニルオキシ、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、アミノスルフィニルアミノアルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｅ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、Ｃ（＝ＮＯＨ）Ｒｅ、Ｃ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、ＮＲｅＲｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）Ｒｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）ＯＲｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）ＮＲｆＲｇ、ＮＲｅＣ（＝ＮＲｆ）ＮＲｇＲｈ、ＮＲｅＳＯ２Ｒｆ、−ＳＲｅ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、−ＯＲｅ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅおよびアシルからなる群より独立して選択される１または複数の基であり、
ここで、ＲｅおよびＲｆ、ＲｇおよびＲｈは、各々、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロシクロアルケニル、Ｃ６アリール、およびＣ１−Ｃ５ヘテロアリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲｅおよびＲｆは、それらが結合する原子と一緒になる場合には、環原子が３ないし１２個の環式またはヘテロ環式環系を形成する。
【０１３９】
特定の実施態様において、任意の置換基は、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、ＯＣ（Ｏ）Ｒｅおよびアシルからなる群より選択されてもよく、ここでＲｅおよびＲｆは、各々、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキル、Ｃ６アリール、およびＣ１−Ｃ５ヘテロアリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲｅおよびＲｆは、それらが結合する原子と一緒になる場合には、環原子が３ないし１２個の環式またはヘテロ環式環系を形成する。
【０１４０】
基として、または基の一部としての「アルキル」は、特記されない限り、直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素基、好ましくはＣ１−Ｃ１２アルキル、より好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル、最も好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルをいう。適切な直鎖および分岐したＣ１−Ｃ４アルキル置換基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルが挙げられる。その基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１４１】
基として、または基の一部としての「アリール」は、（ｉ）所望により置換されてもよい単環式、または縮合した多環式の芳香族炭素環（環原子のすべてが炭素である環構造）であり、環に付き５ないし１２個の原子を有することが好ましく、アリール基として、フェニル、ナフチル等が挙げられ；（ｉｉ）所望により置換されてもよく、部分的に飽和の二環式芳香族炭素環部分であり、それらはフェニルと、Ｃ５−７シクロアルキルまたはＣ５−７シクロアルケニル基が一緒に縮合して、テトラヒドロナフチル、インデニルまたはインダニルなどの環構造を形成する環を意味する。その基は末端基であっても架橋基であってもよい。典型的には、アリール基はＣ６−Ｃ１８アリール基である。
【０１４２】
「結合手」は化合物または分子にある原子間の結合である。本明細書に記載されるような式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、結合手は単結合である。
【０１４３】
「シクロアルキル」は、特記されない限り、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等などの飽和単環式、または縮合もしくはスピロ多環式炭素環、好ましくは環に付き３ないし９個の炭素を含有する炭素環をいう。その環は、単環系（シクロヘキシルなど）、デカリンなどの二環系、およびアダマンタンなどの多環系を包含する。シクロアルキル基は、典型邸には、Ｃ３−Ｃ１２アルキル基である。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１４４】
「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素またはヨウ素を表す。
【０１４５】
「ヘテロアリール」は、単独または基の一部のいずれかであり、芳香族環の環原子として１または複数のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素原子である、その芳香族環（好ましくは５員または６員の芳香族環）を含有する基をいう。適切なヘテロ原子は、窒素、酸素および硫黄からなる群より選択されてもよい。該基は単環または二環式ヘテロアリール基であってもよい。ヘテロアリールの例として、チオフェン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２,３−ｂ］チオフェン、フラン、イソインドリジン、キサントレン、フェノキサチン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、テトラゾール、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、シンノリン、カルバゾール、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、オキサゾール、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン、２−、３−または４−ピリジル、２−、３−、４−、５−または８−キノリル、１−、３−、４−または５−イソキノリニル、１−、２−または３−インドリル、および２−または３−チエニルが挙げられる。ヘテロアリール基は、典型的には、Ｃ１−Ｃ１８ヘテロアリール基である。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１４６】
「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、硫黄、酸素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは少なくとも１個の環中に１ないし３個のヘテロ原子を含有する、飽和単環式、二環式または多環式環をいう。各環は、好ましくは３ないし１０員、より好ましくは４ないし７員である。適切なヘテロシクロアルキルの例として、ピロリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチオフラニル、ピペリジル、ピペラジル、テトラヒドロピラニルおよびモルホリノが挙げられる。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１４７】
式（Ｉ）の一連の化合物には、ジアステレオマー、エナンチオマーおよび互変異性体、および「Ｅ」または「Ｚ」配置の幾何異性体あるいはＥおよびＺ異性体の混合物を含む異性体が含まれると考えられる。また、ジアステレオマー、エナンチオマー、および幾何異性体などの数種の異性体は物理的および／または化学的方法により、および当業者によって分離され得ると理解される。幾何異性の可能性のあるそれらの化合物では、他の異性体が正しい構造帰属であるかもしれないと認識されるとしても、出願人はその化合物がその構造帰属であると考える異性体を表現する。
【０１４８】
開示される実施態様の化合物のいくつかは、単一の立体異性体、ラセミ体、および／またはエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物として存在してもよい。かかる単一の立体異性体、ラセミ体およびその混合物はすべて、本明細書に記載の、および特許請求の範囲に記載の事項の範囲内にあるものとする。
【０１４９】
さらには、式（Ｉ）は、適用できるならば、該化合物の溶媒和された、ならびに溶媒和されていない形態に及ぶものとする。かくして、各式の化合物は、水和された、ならびに水和されていない形態を含む、指摘された構造を有する化合物を包含する。
【０１５０】
式（Ｉ）の化合物は、さらには、該化合物の医薬的に許容される塩を包含するものとする。
【０１５１】
「医薬的に許容される塩」なる語は、上記される化合物の所望の生物活性を保持する塩をいい、医薬的に許容される酸付加塩および塩基付加塩を包含する。式（Ｉ）の化合物の適切な医薬的に許容される塩は、無機酸または有機酸から調製されてもよい。かかる無機酸の例は、塩酸、硫酸およびリン酸である。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、ヘテロ環式、炭素環式およびスルホン基種の有機酸より選択されてもよく、その例が、ギ酸、酢酸、プロパン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、アルキルスルホン酸、およびアリールスルホン酸である。同様に、塩基付加塩は、有機または無機塩基を用いて当業者に周知の方法により調製されてもよい。適切な有機塩基の例として、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン等などの単純なアミンが挙げられる。適切な無機塩基の例として、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等が挙げられる。医薬的に許容される塩のさらなる情報は、R emington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA 1995で見ることができる。試剤が固体である場合には、当業者であれば、本発明の化合物、試剤、および塩は、異なる結晶または多形の形態にて存在してもよく、そのすべてが本発明の化合物および具体的な式で示される化合物の範囲内にあるものとする、ことを理解する。
【０１５２】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のインビボまたはエクスビボでのＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出を強化する方法であって、インビボまたはエクスビボにて、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【０１５３】
ＨＳＣがＢＭ幹細胞結合リガンドより一旦取り除かれると、それらはもはやＢＭに固定されず、ＢＭより放出され、増殖および分化に向かう細胞周期に入ることも利用可能である。あるいはまた、それらはＢＭに残り、ＢＭにて細胞周期に入ることもできる。
【０１５４】
さらに好ましい本発明の実施態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のインビボまたはエクスビボでのＢＭ幹細胞ニッチからの動員を強化する方法であって、インビボまたはエクスビボにて、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【０１５５】
ＨＳＣが除去および放出され始めることで、ＨＳＣはＰＢに動員することが利用可能となる。その除去および放出は動員を可能とするのに不可欠である。ＨＳＣの放出の強化は、結果として、より多くの細胞を動員されるようにするであろう。
【０１５６】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、該方法はＧ−ＣＳＦの存在または不在下にて行われる。好ましくは、該方法はＧ−ＣＳＦの不在下にて行われる。
【０１５７】
Ｇ−ＣＳＦは、臨床的に、ＨＳＣのために最も広く使用される動員剤であるが、その欠点として、潜在的に毒性の副作用のあること、治療コースが相対的に長いこと（５−７日間の連続注入）および患者の応答が可変的であることが挙げられる。従って、本発明の利点は、毒性の副作用を実質的に回避することのできる、効果的な動員がＧ−ＣＳＦの不在下で起こり得ることである。
【０１５８】
７回膜貫通タンパク質であるＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）をグアニンヌクレオチド結合タンパク質とカップリングさせた。ＣＸＣＲ４は造血起源細胞上に広く発現され、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）についてＣＤ４＋との主たる共受容体である。正常な生理学的条件下、ＣＸＣＲ４は、主に、造血および免疫系で発現される。
【０１５９】
ＣＸＣＲ４は、間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）とも称される、ケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）に特異的である。ＳＤＦ−１は、恒常性ケモカインとして、８ｋＤａのケモカインペプチドである。他のケモカインと同様に、ＳＤＦ−１はその受容体に結合し、主に骨髄間質細胞に局在する、６７個のアミノ酸残基を有する特定の場所に細胞を指向的に遊走すること（走化性）を促進する。
【０１６０】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用を遮断するように開発された。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、プレリキサフォル（Plerixafor）は、造血幹細胞の動員に対して、２００８年にＦＤＡにより承認された。
【０１６１】
ＢＯＰと一緒に使用され得る適切なＣＸＣＲ４アンタゴニストは、限定されるものではないが、ビシクラム（bicyclam）誘導体（例えば、ＡＭＤ３１００）、テトラヒドロキノリン誘導体（例えば、ＡＭＤ０７０、ＡＭＤ１１０７０およびＧＳＫ８１２３９７）、環状ペプチド（例えば、Ｔ１４０、ＴＣ１４０１２、ＴＮ１４００３、ＦＣ１３１およびＦＣ１２２）、パラ−キシレンジアミンをベースとする誘導体（例えば、ＡＭＤ３６４６５、ＷＺ８１１およびＭＳＸ１２２）、イソチオ尿素誘導体、ならびにＰＯＬ６３２６、ＰＯＬ５５５１、ＣＣＴＥ−９９０８およびＴＧ−００５４などの他のＣＸＣＲ４アンタゴニストを包含する。好ましくは、ＣＲ＋ＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００である。
【０１６２】
ＡＭＤ３１００（１,ｒ−［１,４−フェニレンビス（メチレン）］ビス［１,４,８,１１−テトラアザシクロテトラデカン］オクトヒドロブロミド無水物；プレリキサフォルとしても公知）が、米国食品医薬品局により造血幹細胞の動員について承認されている、既知のＣＸＣＲ４アンタゴニストである。ＡＭＤ３１００がインビトロにてＣＸＣＲ４のアンタゴニストであることは確立されているが、インビボにて単純なＣＸＣＲ４拮抗作用よりもより大きな活性を有するようである。
【０１６３】
本発明で使用されるような「造血幹細胞」は、赤血球、白血球、巨核球、および血小板を含め、あらゆる血液細胞に最終的に分化しうる多能性幹細胞を意味する。これは祖先細胞または芽細胞に分化する中間段階を含んでもよい。かくして、「造血幹細胞」、「ＨＳＣ」、「造血祖先細胞」、「ＨＰＣ」、「祖先細胞」または「芽細胞」なる語は、本発明において互換的に使用され、分化能は減少しているが、未だに骨髄またはリンパ球系などの特定のリニージの異なる細胞に成熟する能力を有する、ＨＳＣを記載する。「造血祖先細胞」は、赤芽球バースト形成単位の顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニー形成単位の顆粒球、赤血球、マクロファージ、および顆粒球マクロファージコロニー形成単位を包含する。
【０１６４】
本発明は、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞をＢＭ幹細胞結合リガンドから取り除くことを強化することに関する。一旦取り除かれると、該細胞はＢＭ幹細胞ニッチより放出され、該細胞はそこに留まることもできるが、放出されてＰＢに動員されるのが好ましい。これらの細胞は造血再構築能を有する。本発明は、ＨＳＣを、好ましくは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭの接触面の最も近くにあるＢＭ幹細胞ニッチから、あるいは中心髄腔から除去することにより、ＨＳＣの動員を助成的に強化する方法を提供する。より好ましくは、ＨＳＣは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭ接触面より動員される。というのも、これらの細胞は、中心髄腔より単離されたＨＳＣと比べて、より長期にわたって多リニージ造血再構築を付与することが分かっているからである。
【０１６５】
除去、放出または動員される細胞の型はまた、ＢＭ誘導性祖先細胞に富むＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋（本明細書にて、「ＬＳＫ」と称される）、あるいは幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（本明細書にて、「ＬＳＫＳＬＡＭ」と称される）を含む群より選択されるネズミ集団で見つけることもできる。これらの均等なネズミ集団は、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を用いることにより、ＢＭ幹細胞ニッチより除去、放出または動員され得る細胞型の適用を提供する。好ましくは、細胞型は幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（ＬＳＫＳＬＡＭ）に見られる型と均等である。
【０１６６】
好ましくは、除去、放出または動員される細胞は、骨内膜祖先細胞であり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される。最も好ましくは、ヒト細胞である。
【０１６７】
本発明はインビボまたはエクスビボにて行われてもよい。すなわち、α９のアンタゴニスト、好ましくはα９β１のアンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１のアンタゴニストを、ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分と一緒に、その必要とする対象にインビボにて、またはエクスビボのサンプルに投与し、ＨＳＣをＢＭから動員させることができる。
【０１６８】
本明細書中で使用される「対象」は、哺乳類および他の動物（ペット、家畜および動物園の動物を含むが、これらに限定されない）を含め、あらゆる動物を包含する。「動物」なる語は、例えば、哺乳類、鳥類、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、げっ歯類等を含むカテゴリーの生きているいずれの多細胞脊椎動物も包含しうる。同様に、「哺乳類」なる語は、ヒトおよびヒト以外の両方の哺乳類を包含する。
【０１６９】
本発明は、ＨＳＣの除去、放出または動員の強化に関する。本明細書中で使用される「強化」、「強化する」または「強化している」は、細胞または有機体の特定のパラメータにおいてその能力を改善すること、または他の生理学的に有益な増加をもたらすことをいう。時には、現象の増加を特定のパラメータの測定値の減少として定量化することができる。例えば、幹細胞の遊走は循環系内を循環する幹細胞の数の減少として評価されてもよいが、これは、それにもかかわらず、これらの細胞の体の領域（該細胞が有益な生理学的結果（限定されないが、喪失または損傷を受けた機能を交換または訂正する細胞に分化することを含む）を成す、または促進し得る領域）に遊走することの強化を示してもよい。同時に、強化は、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの遊走の結果として、末梢血中におけるいずれか一つの型の細胞の増加として測定されてもよい。強化とは、循環している幹細胞の数が１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以上減少していることをいってもよく、別の言い方では、循環している幹細胞の数が１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以上増加することを示してもよい。幹細胞の遊走の強化は、細胞集団または細胞集団の応答の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％以上の減少などの、非造血リニージの細胞集団の減少をもたらしてもよく、あるいはそれにより測定されてもよい。言い換えれば、パラメータの強化は、幹細胞のトラフィッキングとして捉えることもできる。一の実施態様において、パラメータの強化はＢＭなどの原発組織からの幹細胞の放出である。一の実施態様において、パラメータの強化は幹細胞の遊走である。もう一つ別の実施態様において、パラメータは幹細胞の分化である。
【０１７０】
一の実施態様において、α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、または経粘膜に投与される；所望により、該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されてもよい。
【０１７１】
もう一つ別の実施態様において、α９インテグリンアンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストは、α９インテグリンアンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストの投与が一緒に作用してＨＳＣのＢＭからＰＢへの動員について相乗的結果をもたらすように、別々に、または組み合わせて投与される。α９インテグリンアンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストは、同時に、または順次、組み合わせて投与されてもよい。
【０１７２】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣの、ＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するのに用いるためのものであって、本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を含む、組成物が提供される。より好ましくは、該アンタゴニストは、本明細書に記載のα９インテグリンアンタゴニストである。最も好ましくは、該アンタゴニストは、本明細書に記載のα４β１／α９β１インテグリンアンタゴニストである。
【０１７３】
好ましくは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＡＭＤ３１００またはその活性な部分である。
【０１７４】
好ましい実施態様において、該組成物は、ＨＳＣの、ＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出を強化する。より好ましくは、該組成物はＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからＰＢへの移動または動員を強化する。
【０１７５】
該組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物であってもよい。本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストは、組成物中に、別々に、またはα９インテグリン、α４インテグリン、α９β１インテグリン、α４β１インテグリンのさらなるアンタゴニストと組み合わせて提供されてもよく、あるいはそれはα９β１／α４β１インテグリンの併用したアンタゴニストであってもよい。該アンタゴニストは同一であっても異なってもよいが、それらはすべて少なくともα９インテグリンのアンタゴニストとして作用するであろう。
【０１７６】
本発明のもう一つ別の態様において、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の患者内でのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための医薬の調製において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の使用が提供される。
【０１７７】
本明細書に記載の方法は、組成物および医薬組成物の製造および使用を包含し、それは、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための活性成分として本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を包含する。好ましくは、ＨＳＣの放出が強化される。より好ましくは、ＨＳＣの動員が強化される。医薬組成物は、典型的には、医薬的に許容される担体を含む。本明細書中で使用されるような「医薬的に許容される担体」なる語は、当業者に公知の薬学的投与と適合しうる、セイライン、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物、例えば、Ｇ−ＣＳＦなどの成長因子もまた、組成物中に配合されてもよい。シクロデキストリン、好ましくはプロピルシクロデキストリン、より好ましくはヒドロキシルプロピルシクロデキストリンを含む、より特異的な担体が用いられてもよい。これは、０−２０％の範囲、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５％、より好ましくは１０％にて存在してもよい。
【０１７８】
医薬組成物は、典型的には、意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、腹腔内、および経直腸投与が挙げられる。好ましくは、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分は皮下または静脈内投与される。これらの化合物は、組み合わせて、同時に、または別々に投与されてもよい。
【０１７９】
ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を骨髄に、好ましくはＢＭ幹細胞ニッチに、より好ましくはＢＭ幹細胞ニッチの骨内膜ニッチに標的として送達されるように処方される。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分と組み合わせて、リポソーム、ナノ懸濁液および（例えば、シクロデキストリンとの）包摂複合体に処方されてもよく、それは副作用を減らしつつ、ＢＭにより効果的に標的として送達され得る。
【０１８０】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１８１】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを対象から採取する方法であって、
効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここでその効果的な量はＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化し；
その除去されたＨＳＣをＰＢに動員し；および
該ＨＳＣをＰＢから採取する、ことを含む方法が提供される。
【０１８２】
好ましくは、α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分はＧ−ＣＳＦの不在下で投与される。
【０１８３】
本明細書に記載のα９β１インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分などの化合物を用いてＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチでのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化し、最終的に収集のために細胞がＰＢに動員されることを可能とする。その細胞はＢＭから自然に動員または放出されてもよく、あるいはインターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセルおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のＨＳＣ動員剤の使用により動員するように刺激されてもよいが、これらに限定されない。
【０１８４】
一の実施態様において、一度採取された細胞は、患者の造血前駆細胞集団を補完または補充するために体内に戻すことができ（同種または自家移植）、あるいはまた別の患者の造血前駆細胞集団を補完または補充するためにもう一つ別の患者に移植され得る（異種または同種移植）と考えられる。これは、個体が化学療法を受けていた期間の経過後に、利点がある。さらには、ＨＳＣおよびＨＰＣの数が減少するところの、地中海貧血、鎌状赤血球貧血、先天性異角化症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、およびダイアモンド・ブラックファン貧血などの特定の遺伝子疾患がある。かくして、ＨＳＣの除去、放出または動員の強化における本発明の方法は、有用であり、適用可能である。
【０１８５】
骨髄移植のレシピエントは、対象が高齢者であるか、または以前に化学療法などの免疫枯渇治療に暴露されたことがある、などの限定された骨髄予備能を有してもよい。該対象は、対照となる血球レベルと比べて、血球レベルが低くてもよく、または低血球レベルに発達する危険性がある。本明細書中にて使用されるように、「対照となる血球レベル」なる語は、対象において血球レベルに変化をもたらす事象の前の、あるいはかかる事象が実質的に不在の下での、対象における血球の平均レベルをいう。対象において血球レベルに変化をもたらす事象として、例えば、貧血、外傷、化学療法、骨髄移植および放射線療法が挙げられる。例えば、対象は、外傷に起因して貧血または血液喪失を有する。
【０１８６】
典型的には、効果的な量のα９β１インテグリンアンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストなどのα９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストがドナーに投与され、ＨＳＣのＢＭからの除去、放出または好ましくは動員を誘発し、そしてＰＢに放出かつ動員される。ＨＳＣがＰＢに動員されると、血液の収集およびＧＳＣの分離が、献血にて一般的に利用可能な方法、例えば、限定されないが、血液銀行にて利用される技法を用いて進められ得る。ある実施態様において、ＰＢまたはＢＭが本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを用いて治療されたことのある対象から得られると、ＨＳＣはアフェレーシス療法または白血球除去輸血などの標準的方法を用いて、そこから単離され得る。
【０１８７】
好ましくは、インテグリンアンタゴニストの効果的な量は、ヒトの場合で、２５−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは５０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。効果的な量は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０μｇ／ｋｇ体重からなる群より選択されてもよい。
【０１８８】
好ましくは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果的な量は、ヒトの場合で、１０−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは１０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。その効果的な量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０μｇ／ｋｇ体重 からなる群より選択されてもよい。
【０１８９】
除去、放出、または好ましくは動員は、α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の使用量に応じて、直ちに生じるかもしれない。しかしながら、ＨＳＣは投与した約１時間後に採取されてもよい。実際の時間およびα９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の実際の量は、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的身体状態、所定の投与量に対する応答を含む）および投与経路を含む、種々の要因に応じて変化してもよいが、これらに限定されない。臨床および薬理学の分野における当業者は、日常的な実験およびコントロール曲線の使用を通して効果的な量を決定できるであろう。
【０１９０】
本発明において考慮されるように、「コントロール曲線」なる語は、同一の条件下で、異なる濃度のα９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分のＨＳＣの除去、放出または動員を測定することを通して作成される統計学的および数学的に関連付けられる曲線をいい、そこで細胞は一定間隔で採取かつ計数され得る、と考えられる。本発明において考慮されるこれらの「コントロール曲線」は、後の機会に投与される様々な濃度を推定するための一の方法として使用され得る。
【０１９１】
本発明において考慮されるように、「造血幹細胞の採取」、「造血前駆細胞の採取」、「ＨＳＣの採取」または「ＨＰＣの採取」なる語は、細胞をＰＢから分離することをいうと考えられ、当業者に公知の技法であると考えられる。細胞は、所望により、収集され、分離されてもよく、所望によりさらに拡大してＨＳＣおよび分化した子孫のさらにより大きな集団を生成してもよい。
【０１９２】
本発明のもう一つ別の態様において、本明細書に記載の方法から得られるＨＳＣを含む細胞組成物が提供され、その方法は効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む。
【０１９３】
ＨＳＣの除去が強化された結果として、より多くのＨＳＣがその後のＰＢへの動員のためにＢＭ幹細胞ニッチに放出され得ると仮定される。従って、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分がＢＭ幹細胞ニッチに投与されたことのある対象から採取された細胞組成物は、ＨＳＣに富むであろう。 
【０１９４】
好ましくは、細胞組成物は、骨内膜ニッチの細胞に富み、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される骨内膜祖先細胞である。
【０１９５】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、血液障害を治療するための方法であって、本明細書に記載の、効果的な量の本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む、方法より得られるＨＳＣを含む細胞組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【０１９６】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、対象における血液障害を治療するための方法であって、該対象に、治療的に効果的な量の本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、ＨＳＣの、ＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む、方法が提供される。
【０１９７】
さらにもう一つ別の好ましい実施態様において、血液障害が造血腫瘍性障害であり、該方法は、効果的でなくなった化学療法剤がより効果的となるように、ＨＳＣを化学療法に感受的とし、ＨＳＣの感受性を改変することを含む。
【０１９８】
白血病の治療における長年の問題は、休眠状態にある悪性細胞は細胞傷害薬の作用を回避している可能性があり、該細胞は再発能を有するという、考えである。がん細胞の休眠の制御を理解することに多大な努力が払われてきたが、微小環境、特に骨髄幹細胞ニッチの役割に対してはほとんど集中されなかった。最近になって、骨髄にて正常な造血幹細胞を固定することが知られている、細胞外基質分子のオステオポンチンもまた、骨髄微小環境の重要な領域にこれらの細胞を固定することにより、白血病、特に急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の細胞の休眠を支持するのに一の役割を果たしていることを証明するデータが出現した。さらには、さらなるデータは再発したＡＬＬが有意に高いインテグリンα４β１レベルを有することを示す。本明細書に示されるこれらのデータは、α９β１とその細胞外基質リガンドとの相互作用と競合する薬剤がこれらの細胞を細胞周期に誘導し、該細胞を細胞傷害性化学療法に対して脆弱なものとすることを示唆する。従って、ＢＯＰまたはα９アンタゴニスト、好ましくはα９β１アンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１アンタゴニストはいずれのＣＸＣＲ４アンタゴニストと組み合わせて用い、ＨＳＣの除去、放出および末梢血への動員を強化すること、あるいは白血球細胞の化学療法に対する感受性を増大させることができる。
【０１９９】
本明細書に記載の方法は、ある実施態様において、幹細胞の数を増やす必要のある血液障害の対象を治療する方法を包含する。あるさらなる実施態様において、対象は、例えば、異種移植または自家移植において使用するために、ＨＳＣなどの幹細胞を提供するように計画されているか、または提供することを意図とする。一般に、該方法は、治療的に効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を、かかる治療を必要とする対象に、あるいはかかる治療が必要であると決定されたことのある対象に、投与することを含む。かかる対象を治療するために本明細書に記載の治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与することは、ＰＢまたはＢＭでのＨＳＣの数および／または度数の増加をもたらすであろう。
【０２００】
本明細書にて使用される「治療する」、「治療している」および「治療」は、治療的処理および予防的または防止的手段の両方をいい、ここでその目的は、仮にその処理が最終的にはうまくいかなかったとしても、標的とする症候、疾患または障害（包括的に「病気」）を防止すること、または鈍化させる（小さくする）ことである。処理を必要とする者として、その病気にすでに罹患している者、ならびにその病気に罹患しやすい者、またはその病気が防止されるべき者が挙げられる。
【０２０１】
「効果的な量」は、ＰＢまたはＢＭでのＨＳＣの数および／または度数を有意に増加または減少させるのに十分な量である。効果的な量は１または複数の投与、適用または投薬で投与され得る。
【０２０２】
本明細書にて使用される「治療的に効果的な量」は、治療される対象において所望の効果を達成するのに十分な、特定の組成物、または組成物中の活性剤の量をいう。例えば、この量は、ＨＳＣの遊走を強化するために、組織を補充、修復または活性化させる効果的な量とすることができる。もう一つ別の実施態様において、「治療的に効果的な量」は、血流中の幹細胞の循環レベルを上げることにより説明され得るような、ＨＳＣの放出の向上などの、ＨＳＣのトラフィッキングを強化するのに効果的な量である。さらにもう一つ別の実施態様において、「治療的に効果的な量」は、血流中に循環しているＨＳＣのレベルが低いこと、および／またはホーミングおよび遊走と関連付けられる表面マーカーの発現で説明され得るような、ＨＳＣの循環系から種々の組織または器官へのホーミングおよび遊走を強化するのに効果的な量である。治療的に効果的な量は、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的身体状態、所定の投与量に対する応答、所望する臨床効果を含む）および投与経路を含む、種々の要因に応じて変化してもよいが、これらに限定されない。臨床学および薬理学の分野の当業者は、日常的な実験を通して、治療的に効果的な量を決定することができるであろう。
【０２０３】
組成物は、一日に１回または複数回ないし週に１回または複数回（一日おきを含む）で投与され得る。当業者であれば、対象の以前の治療、一般的な健康状態および／または年齢、および現存する他の疾患を含め（これらに限定されないが）、特定の因子が対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量および時期に影響を与える可能性のあることを理解するであろう。その上、本明細書に記載の効果的な量の組成物で対象を治療することは、単回治療または一連の治療を含み得る。
【０２０４】
ある実施態様において、かかる投与はＰＢにおいてＨＳＣ数の約１０−２００倍の増加をもたらすであろう。
【０２０５】
ある実施態様において、かかる投与はＰＢ中のＣＤ３４＋細胞において約２−６倍増の増加をもたらすであろう。
【０２０６】
組成物の投与量、毒性および治療効果は、例えば、細胞培養での標準的な薬剤操作、または、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にて治療的に効果的な用量）を測定するための実験動物により決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。治療指数の高い化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることもできるが、その場合、非感染細胞に与える損傷の可能性を最小限とし、それによって副作用を減らすために、かかる化合物で罹患組織の部位を標的とするデリバリーシステムを設計するように注意しなければならない。
【０２０７】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を処方するのに使用できる。かかる化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの化合物についても、治療的に効果的な用量は細胞培養アッセイで最初に推定され得る。用量は、細胞培養にて決定されるようにＩＣ５０（すなわち、徴候の最大半量阻害を達成する本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストの濃度）を含む、循環血漿中濃度の範囲を達成するために、動物実験にて処方されてもよい。かかる情報を用いてヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定されてもよい。
【０２０８】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法は、もう一つ別のＨＳＣ動員剤、例えば、限定されるものではないが、インターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセル、および顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群より選択される薬剤を投与することを含む。ある実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを用いて治療される対象からＰＢまたはＢＭを一旦得た後に、例えば、アフェレーシスまたは白血球搬出法などの標準方法を用いてそこからＨＳＣを単離することができる。
【０２０９】
ある実施態様において、該方法は、単離された幹細胞を同一の対象に再導入するか、または該細胞を別の対象、例えば、ＨＬＡ型適合の第二対象に移植、同種移植するなどの、かかる細胞を対象に投与することを含む。
【０２１０】
本発明は、α９インテグリンアンタゴニストを患者に直接投与し、それ自身のＨＳＣを動員させること、またはα９インテグリンアンタゴニストで処理した別のドナーから由来のＨＳＣを用いて、そこからＨＳＣを採取することを含む。
【０２１１】
ある実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与した対象は健康体である。他の実施態様において、対象は免疫抑制、慢性病、外傷、変性疾患、感染またはそれらの組み合わせなどの疾患または生理的症状を患っている。ある実施態様において、対象は、皮膚、消化器系、神経系、リンパ系、心血管系、内分泌系またはその組み合わせの疾患または症候を患ってもよい。
【０２１２】
特定の実施態様において、対象は骨粗鬆症、アルツハイマー病、心筋梗塞、パーキンソン病、外傷性脳損傷、多発性硬化症、肝硬変またはその組み合わせを患う。
【０２１３】
本明細書に記載される治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、上記されるいずれかの症状を防止、治療し、および／またはその重篤度を緩めてもよく、あるいはそうでなければ上記したいずれかの症状について有益な臨床的利益を提供してもよいが、本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニストの方法および使用の適用はこれらの使用に限定されない。種々の実施態様において、この新規な組成物および方法は、とりわけ、骨、関節、腱および靱帯などの骨格組織、ならびにパーキンソン病および糖尿病などの退行性疾患の治療にて治療的有用性のあることが分かる。幹細胞が血液から組織に放出、循環、ホーミングおよび／または遊走されることを強化することにより、ＨＳＣを欠陥部位に効果的に送達させ、修復効率を上げることができる。
【０２１４】
ある実施態様において、ＨＳＣ、ＰＢまたはＢＭを用いて治療するのに有用であり得る対象は、骨髄または幹細胞移植で一般的に治療され得るいずれの対象も、例えば、がん、例えば神経芽腫（未成熟神経細胞に生じ、ほとんどが乳幼児を襲うがん）、骨髄異形成、骨髄線維症、乳がん、腎細胞がん、または多発性骨髄腫の対象を包含する。例えば、該細胞は、一例として、がんの治療に、またはＨＳＣを動員するためのＧ−ＣＳＦ処置に対して応答しない者に用いられる高線量の化学療法および／または放射線療法により破壊された幹細胞を修復するのに、放射線療法または化学療法での治療に耐性のあるがんの対象に移植され得る。
【０２１５】
ある実施態様において、対象は造血新生物障害がある。本明細書中で使用される場合、「造血新生物障害」なる語は、例えば、骨髄、リンパまたは赤血球リニージ、あるいはそれらの前駆細胞より生じる、造血起源の過形成／新生細胞に関与する疾患を包含する。ある実施態様において、該疾患は低分化急性白血病、例えば赤芽球性白血病または急性巨核芽球性白血病に起因する。さらなる例示としての骨髄性障害は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を包含するが、これらに限定されない。リンパ性悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ−リニージＡＬＬおよびＴ−リニージＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）を含むが、これらに限定されない。さらなる形態の悪性リンパ腫として、ホジキン病および中程度／高度（Medium/High grade）（攻撃的な）非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード−スタンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、該方法は、細胞組成物を投与すること、あるいは幹細胞を除去、放出または動員させて高線量の化学療法および／または放射線療法、例えば障害を治療するために使用された療法により破壊された幹細胞を修復することを含むであろう。あるいはまた、ＨＳＣはＢＭ幹細胞ニッチより除去、放出または動員され、ＢＭまたはＰＢのいずれかで細胞周期に入る一方で化学療法に感受的とされる。好ましくは、その造血新生物障害はＡＬＬである。
【０２１６】
ある実施態様において、ＢＭ、ＰＢまたはＨＳＣを用い、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、自己免疫性神経障害、強皮症、再生不良性貧血、および全身性エリトマトーゼスの対象を治療する。
【０２１７】
ある実施態様において、治療される対象は、再生不良性貧血、異常ヘモグロビン症（鎌状赤血球貧血を含む）または免疫不全障害などの非悪性障害を有する。
【０２１８】
さらには、本発明は投与計画を提供する。１の実施態様において、その投与計画は、治療される病態の重篤度および応答に依存しており、その治療コースは単回投与から数日および／または数週にわたる繰り返し投与まで続く。もう一つ別の実施態様において、その投与計画は対象の末梢血流を循環するＣＤ３４＋ＨＳＣの数に依存する。もう一つ別の実施態様において、その投与計画は対象の末梢血流を循環する骨髄由来の幹細胞の数に依存する。例えば、ＨＳＣのＢＭからの移動度はＰＢを既に循環しているＨＳＣの数に依存する可能性がある。
【０２１９】
本発明は、さらには、対象におけるＨＳＣのトラフィッキングを強化する方法であって、本明細書に記載の治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与することを含む、方法を提供する。１の実施態様において、ＨＳＣのトラフィッキングレベルは、対象の末梢血を循環するＣＤ３４＋ＨＳＣの数に関連する。もう一つ別の実施態様において、ＨＳＣのトラフィッキングレベルは、対象の末梢血を循環する骨髄由来のＨＳＣの数に関連する。
【０２２０】
本発明はさらには、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与した後に、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜前駆細胞などの循環するＨＳＣの個体数の一時的増加を誘発する方法を提供する。１の実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分を対象に付与することは、投与した後の１２日未満、６日未満、３日未満、２日未満、１日未満、１２時間未満、６時間未満、約４時間未満、約２時間未満、または約１時間未満などの特定の時間内でその対象のＨＳＣの放出を強化するであろう。
【０２２１】
１の実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはその活性な部分の投与は、投与した約３０分ないし約９０分後にＨＳＣを循環系中に放出させる。好ましくは、ＨＳＣの放出は投与から約６０分後であろう。もう一つ別の実施態様において、放出されたＨＳＣは循環系に入り、対象の体内で循環するＨＳＣの数を増加させる。もう一つ別の実施態様において、正常な基線と比べて、ＨＳＣの循環数の増加の割合は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％であってもよく、あるいは対照と比べて約１００％以上で増加する。１の実施態様において、対照は同じ対象から由来の基線値である。もう一つ別の実施態様において、対照は、未処理の対象中で、あるいはプラセボまたは薬理学的な担体で処理した対象中で循環する幹細胞またはＨＳＣの数である。
【０２２２】
本発明のもう一つ別の態様において、ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニスト、およびＣＸＣＲ４アンタゴニストを対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから除去し；
そのＨＳＣをＢＭから放出させて、ＰＢに動員させ；
ＨＳＣをその対象のＰＢより採取し；および
そのＨＳＣを患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
【０２２３】
１の実施態様において、一旦採取された細胞は、対象の造血前駆細胞集団を補完または補充するために体内に戻すことのできる、あるいはまた別の対象の造血前駆細胞集団を補充するためにその対象に移植され得る、細胞組成物を提供すると考えられる。このことは、ある場合、個体が化学療法を受けた期間の経過後に有利であり得る。
【０２２４】
１の実施態様において、該方法は、具体的には、ＨＳＣのサブセットを移植することに関する。これらの細胞は造血再構築能を有し、幹細胞ニッチにあるＢＭに存在する。本発明は、ＨＳＣを幹細胞ニッチから、好ましくは骨内膜ニッチ内の最も近い骨／ＢＭ接触面から、あるいは中心髄腔から移植する方法を提供する。より好ましくは、ＨＳＣは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭ接触面から移植される。というのも、これらの細胞は中心髄腔から単離されたＨＳＣと比べてより長期にわたって多リニージ造血再構築能を有することが明らかにされたからである。移植される細胞は、好ましくは、幹細胞ニッチに、より好ましくは中心または骨内膜ニッチにあることが分かる。
【０２２５】
移植され得る細胞の均等な型もまた、ＢＭ誘導性祖先細胞に富むＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋細胞（以下、ＬＳＫと称される）、または幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（以下、ＬＳＫＳＬＡＭと称される）からなる群より選択されるネズミ集団にて見出すことができる。
【０２２６】
好ましくは、移植される細胞は、骨内膜祖先細胞であり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される。
【０２２７】
要約すれば、本発明者らは、ＢＯＰ、α４β１およびα９β１インテグリンの小分子阻害剤が、ＨＳＣを長期にわたって多リニージの生着の可能性をもって効果的かつ迅速に動員したことを実証する。ＡＭＤ３１００などのＣＸＣＲ４阻害剤と組み合わせて使用される場合、Ｇ−ＣＳＦと比べて、長期にわたって再増殖するＨＳＣの動員における有意な強化が観察される。ＢＯＰ／ＡＭＤ３１００を用いるＨＳＤ動員の有効性が、ヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−モデルでのＣＤ３４＋細胞の動員にて確証された。関連する蛍光標識されたインテグリンアンタゴニストのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を用い、本発明者らは、この種の化合物が、骨内膜ニッチ内にある活性化されたα４β１およびα９β１インテグリンを通してネズミおよびヒトＨＳＣおよび祖先細胞と結合することを示す。かくして、小分子のα４β１およびα９β１インテグリンアンタゴニストを単独でまたはＡＭＤ３１００と組み合わせて用い、骨内膜ニッチを治療的に標的化することは、臨床でのＨＳＤ動員においてＧ−ＣＳＦと関連する多数の欠点に対処する効果的かつ都合のよい方法を提供する。
【０２２８】
文書、行為、材料、装置、物品等の考察は、単に本発明の背景を提供する目的で、本明細書中に含まれるものである。先行技術基準の一部を形成するか、本発明に関連する分野に共通の一般的知識である、これらのいずれの事項も、それが本願の各請求項の優先日より前に存在するとして、本発明を示唆または開示するものではない。
【０２２９】
「含む」、「含んだ」または「含んでいる」なる語が本願明細書（特許請求の範囲を含む）にて使用される場合、それらの用語は、指摘される特徴、整数、工程または成分の存在を具現化するが、１または複数の他の特徴、整数、工程または成分、あるいはそれらのグループの存在を除外するものではない、として解釈されるべきである。
【０２３０】
次に何ら本発明を限定するものではない実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。
【０２３１】
実施例
方法
（ｉ）フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析は、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences）を用いて実施された。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を５８２ｎｍ、５８５ｎｍまたは６１０ｎｍで検出し、黄緑レーザー（５６１ｎｍ）で励起した。ＢＭおよびＰＢ分析については、５ｘ１０６個までの細胞を１０−２０ｋ細胞イベント／秒の速度で分析した。ＰＢ  ＬＳＫＳＬＡＭの分析については、１ｘ１０６までのイベントをセーブした。細胞分類は、J. Grassingerらにより以前に記載されるように、C ytopeia Influx（BD）で行われた。
【０２３２】
（ｉｉ）細胞株
インテグリンα４β１（ＬＮ１８  α４β１）またはα９β１（ＬＮ１８  α９β１）を過剰発現する安定したＬＮ１８細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２６１０）を、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、ｐＭＳＣＶ−ｈＩＴＧＡ４−ＩＲＥＳ−ｈＩＴＧＢ１およびｐＭＳＣＶ−ｈＩＴＧＡ９−ＩＲＥＳ−ｈＩＴＧＢ１ベクターを用いるレトロウイルス形質導入により生成し、１０％ＦＢＳ中２ｍＭ  Ｌ−グルタマートを補充したＤＭＥＭに維持した。形質導入した細胞をＰＢＳ−２％ＦＢＳ中２.５μｇ／ｍｌのＰＥ−Ｃｙ５−コンジュゲートマウス−抗ヒトα４抗体（BD Bioscience）または２０μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα９β１抗体（Millipore）を用い、つづいて０.５μｇ／ｍｌのＰＥ−コンジュゲートヤギ−抗マウスＩｇＧ（BD Bio-science）を用いる、ＦＡＣＳ（２ラウンド）で選別した。ＬＮ１８およびＬＮ１８  α９β１細胞でのα４発現のサイレンシングをｐＳＭ２ｃ−ｓｈＩＴＧＡ４（Open Biosystems）を用いて上記されるように行った。α４−サイレンスのＬＮ１８細胞（対照細胞株；ＬＮ１８  ＳｉＡ４）およびＬＮ１８  α９β１（ＬＮ１８  α９β１ＳｉＡ４）を、ＦＡＣＳを用いてα４発現についてネガティブに選別した。
【０２３３】
（ｉｉｉ）免疫組織化学
（ａ）抗体染色
ＬＮ１８  ＳｉＡ４（対照細胞株）、ＬＮ１８  α４β１およびＬＮ１８  α９β１細胞をＰＢＳ−２％ＦＢＳ中２.５μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα４抗体（BD Bioscience）、４μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα９β１抗体（Millipore）または４μｇ／ｍｌのマウスイソ型対照（BD Bio-science）で１時間、つづいて５μｇ／ｍｌのアレキシア・フロアー（Alexa Fluor）５９４コンジュゲートヤギ−抗マウスＩｇＧ１で１時間染色に供し、次にＰＢＳ−２％ＦＢＳで３回洗浄した。
【０２３４】
（ｂ）抗体カクテル療法
ネズミ祖先細胞（ＬＳＫ；リニージ−Sca−1＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ；ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）に結合するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を分析するために、ＢＭおよびＰＢ細胞をリニージカクテル（抗−Ｔｅｒ１１９、抗−Ｂ２２０、抗−ＣＤ３、抗−Ｇｒ−１、抗−Ｍａｃ−１）、抗−Ｓｃａ−１、抗−ｃ−ｋｉｔ、抗−ＣＤ４８および抗−ＣＤ１５０で免疫標識に供した。リニージ分析では、細胞をＴ−細胞については抗−ＣＤ３を用い、Ｂ−細胞については抗−Ｂ２２０を用い、マクロファージについては抗−Ｍａｃ−１を用い、顆粒球については抗−Ｇｒ−１を用いて別々に染色した。別法として、リニージ分析はまた、抗−ＣＤ３／Ｂ２２０（ＰＢコンジュゲート）および抗−Ｂ２２０／Ｇｒ１／Ｍａｃ−１（ＡＦ６４７コンジュゲート）を含有するカクテルを用いて行われ、それによればＢ２２０＋細胞は＋／＋細胞と、ＣＤ３＋細胞は＋／−と、Ｇｒ１／Ｍａｃ−１＋細胞は−／＋の集団と同定された。臍帯血のＭＮＣからのヒトＷＢＣおよびヒト化ＮＳＧマウスからのＢＭおよびＰＢの分析には、細胞を抗−ｈｕＣＤ３／ＣＤ１４／ＣＤ１５（すべてＡＦ４８８コンジュゲート）、抗−ＣＤ１４／ＣＤ１５／ＣＤ１９／ＣＤ２０（すべてＡＦ６４７コンジュゲート）、抗−ｈｕＣＤ４５−ＰＢ、抗−ｍｕＣＤ４５−ＢＶ５１０、抗ｈｕＣＤ３４−ＰＥＣｙ７、抗−ｈｕＣＤ３４および抗−ＣＤ３８抗体を含有するリニージカクテルで免疫標識に供された。使用したコンジュゲート抗体の一覧を表１および２に詳細に示す。
【０２３５】
【表１】
2017537134.tif 000034
【０２３６】
【表２】
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【０２３７】
【表３】
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【０２３８】
【表４】
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【０２３９】
（ｃ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）染色
培養したＬＮ１８  ＳｉＡ４（対照細胞株）、ＬＮ１８  α４β１、およびＬＮ１８  α９β１細胞を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭグルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４）中のＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（５０ｎＭ）で処理し、３７℃で２０分間インキュベートし、次にＴＢＳ−２％ＦＢＳで３回洗浄した。染色した細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、水で３回洗浄し、ついで２.５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色した。その細胞をベクターシールド（Vectorshield）にのせ、水で洗浄し、カバースリップで覆い、４℃で一夜貯蔵し、その後で蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ５１）を用いて画像処理に付した。
【０２４０】
（ｉｖ）飽和結合実験
培養したα４β１、α９β１および対照のＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）を、ＴＢＳ−２％ＦＢＳ（カチオン不含、１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有する）中０、１、３、１０、３０および１００ｎＭの化合物（Ｒ−ＢＣ１５４）を１００μｌで用いて処理した。細胞を３７℃で６０分間インキュベートし、ＴＢＳ−２％ＦＢＳで１回洗浄し、乾燥させてペレット状にし、フローサイトメトリー分析と関連付けられる結合バッファーに再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を濃度に対してプロットし、グラフパッド・プリズム６（GraphPad Prism 6）を用いてワン−サイト飽和リガンド結合曲線に適合させた。解離定数Ｋｄをその曲線から決定した。
【０２４１】
（ｖ）オフ−レート速度測定
α４β１またはα９β１  ＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）を含有するエッペンドルフバイアルを、５０ｎＭのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ中１００μｌ）を用いて３７℃で３０分間まで処理し、関連する結合バッファーで１回洗浄し、乾燥させてペレット状にした。その細胞を５００ｎＭの標識化されていない競合阻害剤（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ中１００μｌ）を用いて３７℃で指摘される時間（０、２.５、５、１５、３０、４５、６０分間）処理した。その細胞を冷却ＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連するカチオンを含有する）で希釈し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用の結合バッファーで１回洗浄し、該バッファー（約２００μｌ）に再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム６を用いて一相または二相のいずれかの指数的減衰関数に適合させた。オフ−レート、ｋｏｆｆは該曲線より推定した。
【０２４２】
（ｖｉ）オン−レート速度測定
α４β１またはα９β１  ＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）をＴＢＳ−２％ＦＢＳ（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有する）（５０μｌ）中に含有するエッペンドルフバイアルをヒーティングブロックにて３７℃で２０分間予め活性化させた。１００ｎＭ  Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（５０μｌ−最終濃度＝５０ｎＭ）／関連するＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連カチオンを含む）を各チューブに加え、３７℃で０、０.５、１、２、３、５、１０、１５および２０分間インキュベーションした後に、該チューブに３ｍｌのＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連カチオンを含む）を添加してクエンチさせた。該細胞をＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連カチオンを含む）で１回洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、サイトメトリー分析用の関連する結合バッファー（２００μｌ）に再び懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム６を用いて一相または二相のいずれかの結合関数に適合させた。観察されたオン−レート、ｋｏｂｓを該曲線より推定し、ｋｏｎを
（ｋｏｂｓ−ｋｏｆｆ）／［Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）＝５０ｎＭ］
より推定した。
【０２４３】
（ｖｉｉ）マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをモナッシュ・アニマル・サービス（Monash Animal Services（Monash University, Clayton, Australia）で繁殖させた。６−８週齢のマウスを実験のために性適合させた。
【０２４４】
Ｃ５７ＢＩ／６（Ｃ５７）、ＲＦＰ、ＧＦＰおよびα４flox／flox／α９flox／flox ｖａｖ−ｃｒｅマウスをモナッシュ・アニマル・サービスで繁殖させた。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）マウスはChildren’s Medical Research Institute, Sydney, Australiaより提供された。条件付きα４flox／flox／α９flox／floxマウスは、初めは、α４flox／floxマウス（University of Washington, Department of Medicine/Hematologyから寄付）をα９flox／floxマウス（Department of Medicine, University of Californiaから寄付）およびｖａｖ−ｃｒｅマウス（WEHI Institute, Melbourneから寄付）と異種交配させることで作製された。ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスをインハウス（Australian Regenerative Medicine Institute）で入手した。ヒト化ＮＳＧマウスが新たに選別された臍帯血ＣＤ３４＋細胞（＞１５０ｋ）を２ｘ１０６個の放射線照射された単核支持細胞と一緒に尾静脈注射することにより作製された。移植した４−５週間後に、ＮＳＧマウスを眼出血（eyebled）に供し、ｈｕＣＤ４５およびｍｕＣＤ４５、およびＣＤ３４の生着について評価した。移植実験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合には移植する２４時間前に放射線照射を分割線量（各々、５.２５Ｇｙ）で６時間離して行い、ＮＳＧマウスの場合には移植する５時間前に単回線量（２.７５Ｇｙ）で行い、各々、合計で２ｘ１０５個の放射線照射した（１５Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭ細胞、または２ｘ１０６個の放射線照射した（１５Ｇｙ）臍帯血（ＣＢ）単核細胞（ＭＮＣ）が支持細胞として各被験者に付与された。
【０２４５】
（ｖｉｉｉ）インビボ骨髄結合アッセイ
ＰＢＳ中Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７マウスに静脈内注射した。５分後、骨髄細胞をD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069およびJ. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225において以前に記載されるように単離した。簡単には、１の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をＰＢＳ−２％ＦＢＳでフラッシュさせて全骨髄を得、それをＰＢＳ−２％ＦＢＳで洗浄し、次にフローサイトメトリーのために免疫標識に供した。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合の分析の場合、発光スペクトルの重なりを最小にするために次の抗体の組み合わせを選択した。祖先細胞（ＬＳＫ；リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ；ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）を染色する場合には、細胞をリニージカクテル（ＣＤ３、Ｔｅｒ−１１９、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０；すべての抗体  ＡＰＣ−Ｃｙ７とのコンジュゲートに付す）、抗−Ｓｃａ−１−ＰＢ、抗−ｃ−ｋｉｔ−ＡＦ６４７、抗−ＣＤ４８−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ１５０−ＢＶ６５０で標識化した。
【０２４６】
（ｉｘ）造血細胞単離
骨内膜および中心ネズミ骨髄細胞の集団を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069にて以前に記載されるように単離した。簡単には、１の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をＰＢＳ−２％ＦＢＳでフラッシュさせて中心骨髄細胞を得た。フラッシュに付した長骨、および骨端および骨幹端フラグメントをプールし、乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。骨フラグメントをコラゲナーゼＩ（３ｍｇ／ｍｌ）およびジスパーゼＩＩ（４ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃でオービタル振盪器にて７５０ｒｐｍで消化させた。５分後、骨フラグメントをＰＢＳで１回、ＰＢＳ２％ＦＢＳで１回洗浄し、骨内膜骨髄細胞を集めた。末梢血をレトロオービタルパンクチャーにより集め、ＮＨ４Ｃｌ溶解バッファーを室温で５分間用いて赤血球を溶解させた。単離した細胞集団をＰＢＳ２％ＦＢＳで洗浄し、次に上記の抗体カクテルにて記載されるようにフローサイトメトリーのために染色させた。
【０２４７】
（ｘ）ヒトＣＤ３４＋細胞の単離
単核細胞（ＭＮＣ）をNilsson, S. K.ら、Blood, 106, 1232-1239（2005）およびGrassinger, J.ら、Blood, 114, 49-59（2009）にて以前に記載されるように臍帯血より単離した。ＭＮＣをマウス抗−ヒトＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２４およびＣＤ２３５ａ（ＢＤ）を含有するリニージ抗体カクテルと一緒にインキュベートし、次に細胞に付き２ビーズの割合で５分間２ラウンドのダイナル（Dynal）のヒツジ抗マウスＩｇＧビーズ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で処理し、ついで一定の回転速度で４℃にて１０分間処理した。濃縮されたＭＮＣをＦＡＣＳで精製したＣＤ３４−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）ＣＤ３４＋細胞で染色した。
【０２４８】
（ｘｉ）インビトロおよびインビボＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合
インビトロでの標識実験の場合、Ｃ５７マウス、条件付きα４−／−／α９−／−マウスおよびヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスおよびヒト臍帯血ＭＮＣから由来の５ｘ１０６個のＢＭ細胞を、４０ｘ１０６個の細胞／ｍｌで４℃で２０分間にわたって１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２（活性化剤）または１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（不活性化剤）のいずれかを含有するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（３００ｎＭまで）／ＰＢＳ（０.５％ＢＳＡ）またはＴＢＳ（０.５％ＢＳＡ）で処理した。細胞をＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄し、次にフローサイトメトリー分析に付す前に「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。インビボ実験の場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、α４−／−／α９−／−ｖａｖ−ｃｒｅマウスおよびヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスは、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（５−１０ｍｇ／ｋｇ）を１００μｌ／１０ｇのマウス体重で静脈内または皮下注射のいずれかで投与され、上記されるように分析された。
【０２４９】
祖先細胞（ＬＳＫ細胞）の選別集団に対する蛍光顕微鏡検査法によるＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合分析が、未処理およびＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）注射のマウスより採取したＢＭ細胞をＢ２２０、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１およびＴｅｒ−１１９についてリニージ枯渇させ、抗−Ｓｃａ−１−ＰＢおよび抗−ｃ−ｋｉｔ−ＦＩＴＣで染色させ、Ｓｃａ１＋ｃ−ｋｉｔ＋で選別した。細胞を選別し、オリンパスＢＸ５１顕微鏡を用いて画像化した。
【０２５０】
（ｘｉｉ）競合的阻害アッセイ
α４β１およびα９β１  ＬＮ１８細胞（１−２ｘ１０５個の細胞）を５０ｎＭのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（８０μｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ−２％ＦＢＳ中）で３７℃にて１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、次にＢＯＰ（８０μｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を願有するＰＢＳ−２％ＦＢＳ）を用いて０、０.０１、０.１、０.３、１、１０、１００および３００ｎＭで処理した。細胞を３７℃で９０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用のＰＢＳ（２００μｌ）に再懸濁させた。％最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＢＯＰの対数濃度に対してプロットし、データをリガンド結合のＳ字型用量応答曲線に適合させ、ＩＣ５０値をグラフより得た。ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の競合的置換については、フローサイトメトリー分析に付す前に、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を注射したマウスより単離したＷＢＭ細胞を、ＰＢＳ中５００ｎＭ  ＢＯＰ（０.５％ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含有する）で４５分間にわたって３７℃で処理した。
【０２５１】
（ｘｉｉｉ）動員プロトコル
動員実験については、すべてのマウスを１００μｌ／１０ｇの体重で皮下注射し、咽喉部の出血操作によりＥＤＴＡ被覆のシリンジを用いてＰＢを採取した。
【０２５２】
（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）およびＢＯＰ：マウスは、指示される時に咽喉部の出血によりＰＢを採取する前に、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）およびＢＯＰのセイライン中の新たに調製された溶液を単回注射により指示される用量にて投与された。
【０２５３】
（ｂ）Ｇ−ＣＳＦ：マウスはＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｋｇで１日に２回（５００μｇ／ｋｇ／日）、６−８時間離して４日間連続して投与された。Ｇ−ＣＳＦおよびＢＯＰを受ける群は上記される標準的なＧ−ＣＳＦ投与計画に付され、つづいて採取の１時間前にＢＯＰの単回注射を受けた。対照となるマウスは等容量のセイラインを受けた。
【０２５４】
（ｘｉｖ）ヒト化ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスの動員
ヒト化ＮＳＧマウスが、新たに選別された臍帯血ＣＤ３４＋細胞（＞１５０ｋ）を２ｘ１０６個の放射線照射された単核支持細胞と一緒に尾静脈注射することにより作製された。移植した４−５週間後に、ＮＳＧマウスを眼出血に供し、ｈｕＣＤ４５およびｍｕＣＤ４５について評価した。これらの条件下、ＣＤ４５の合計％に対するｈｕＣＤ４５の％に基づき、フローサイトメトリー分析により測定した場合に＞９０％のヒト化が達成された。ヒト化ＮＳＧマウスは回復するのに実験まで少なくとも１週間を要した。マウスを「動員プロトコル」にて特定される関連する条件下で動員させ、その後でＰＢを咽喉部出血により集め、溶解させ、「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。
【０２５５】
（ａ）ＨＳＣ動員
マウスに１００μｌ／１０ｇ体重のＢＯＰ（１５ｍｇ／ｋｇまで）を単回注射で、種々の時間枠で、単一のＢＩＯ５１９２の注射を１ｍｇ／ｋｇで１時間にわたって、単一のＡＭＤ３１００の注射を３ｍｇ／ｋｇで１時間にわたって（ＢＯＰまたはＢＩＯ５１９２を受けているマウスにもまた、採取の１時間前に単回用量のＢＯＰまたはＢＩＯ５１９２を注射した）、またはＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｋｇで一日に２回（５００μｇ／ｋｇ／日）、６−８時間話して、４日間連続して皮下投与した（ＢＯＰおよび／またはＡＭＤ３１００を受けているマウスにもまた、採取の１時間前に単回用量のＢＯＰおよび／またはＡＭＤ３１００を注射した）。対照のマウスには等容量のセイラインを、または適当ならば１０％ＨＰβＣＤ／セイラインを付与した。
【０２５６】
（ｘｖ）低−および高−増殖能コロニー形成細胞アッセイ
低−および高−増殖能コロニー形成細胞（各々、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣ）を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびBartelmez, S. H.ら、Experimental Hematology 17, 240-245（1989）において以前に記載されるようにアッセイした。簡単には、動員したＰＢを溶解させ、４０００ＷＢＣを３５ｍｍ径ペトリ皿に入れた二層のニュートリエント寒天培養系（組換えマウス幹細胞因子および組換えヒトコロニー刺激因子−１、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）およびＩｌ−３を含有する）に置いた。培養物をヒト化インキュベーター中の５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２にて３７℃でインキュベートした。ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣをJ. Grassingerら（2012）において以前に記載されるように１４日間のインキュベーションで列挙した。
【０２５７】
（ｘｖｉ）長期移植アッセイ
（ａ）限界希釈分析
ＲＦＰマウスをＢＯＰ（ｎ＝１５）、ＡＭＤ３１００（ｎ＝５）またはＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせ（ｎ＝５）のいずれかで処理し、１時間後にＰＢを採取した。処理群当たりの各ドナーのマウスからのＰＢをプールし、溶解させ、ＰＢＳ中に最初の血液容量の１／３を占めるようにした。放射線照射したＷＢＭフィラー細胞（２ｘ１０５／マウス）を特定された移植片容量で溶解したＰＢのアリコートに加え、次にＰＢＳをいっぱいになるまで注ぎ足し、２００μｌ／マウスとした。放射線照射したＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射を介して投与し、多リニージＲＦＰ生着を移植した６、１２および２０週間後に評価した。
【０２５８】
（ｂ）競合的一次および二次移植アッセイ
ＲＦＰ（ｎ＝５）およびＧＦＰ（ｎ＝５）マウスを、「動員プロトコル」に記載されるように、各々、ＢＯＰ／ＡＭＤ３１００（１時間）およびＧ−ＣＳＦ（１日に２回、４日間）で処理した。次に、ＰＢを採取し、ＲＦＰおよびＧＦＰ群内にある血液をプールし、溶解させ、洗浄し、ＰＢＳ中に最初の血液容量の１／３まで再懸濁させた。等容量のＲＦＰおよびＧＦＰの血液を混合し、マウス当たり５００μｌのＲＦＰおよびＧＦＰの血液を移植させた。放射線照射に付したＷＢＭフィラー細胞（２ｘ１０５／マウス）を加え、その混合物にＰＢＳをいっぱいになるまで注ぎ足し、２００μｌの注射液／マウスとした。放射線照射したＣ５７ＢＬ／６受容者（ｎ＝５）に尾静脈注射を介して投与し、ＲＦＰおよびＧＦＰ生着を移植した６、１２および２０週間後に評価した。２０週間のテイクダウンで、各一次受容者（ｎ＝５）からのＷＢＭ細胞（大腿骨の１０分の１）を放射線照射したＣ５７二次受容者（ｎ＝４／一次受容者）に移植し、多リニージ生着について移植した６、１２および２０週間後に評価した。
【０２５９】
（ｘｖｉｉ）α４およびα９β１インテグリンのヒトＨＳＣ上での発現
ヒトα４（ＣＤ４９ｄ）およびα９β１の、ＣＤ３４＋に富むヒトＢＭ細胞からのヒトＨＳＣ、ｈｕＮＳＧマウスからのＢＭおよびＣＢ  ＭＮＣ  ＣＤ３４＋細胞上での発現を、精製されたマウス−抗−ヒトα９β１、ヤギ−抗−マウス−ＡＦ６４７で、つづいてマウス−抗−ｈｕＣＤ４９ｄ−ＰＥＣｙ７、抗−ｈｕＣＤ３４−ＦＩＴＣおよび抗−ｈｕＣＤ３８−ＢＶ４２１を用いて細胞を連続標識することにより評価した。マッチングマウスＩｇＧ１イソ型を対照として用いた。
【０２６０】
（ｘｖｉｉ）統計解析
データを、そのデータセットに適する、スチューデントｔ−試験、一方向または二方向ＡＮＯＶＡを用いて分析した。幹細胞の再生の度数の測定については、Ｌ−ＣＡＬＣソフトウェア（Stem Cell Technologies）を用いるポアソン解析が行われた。対数ランク（Mantel-Cox）試験は生存曲線と比べるのに使用された。ｐ＜０.０５は有意であると考えられた。
【０２６１】
実施例１：α９β１インテグリンアンタゴニストの調製
（ａ）アンタゴニスト化合物の合成
種々の実施態様の試剤は以下に記載の反応経路および合成スキームを用いて調製され得る。実施態様の特定の化合物の調製は、以下の実施例において詳細に記載されるが、当業者であれば、その記載される化学反応が種々の実施態様の多数の他の試剤を調製するのに容易に適合され得ることを理解するであろう。例えば、例示されていない化合物の合成は、当業者に明らかな修飾により、例えば、干渉基を適宜保護することにより、当該分野にて公知の他の適切な試薬と交換することにより、あるいは反応条件を慣用的に修飾することにより、うまく行うことができる。有機合成における適切な保護基の一覧をT.W. Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 1991に見ることができる。あるいはまた、本明細書に記載の、または当該分野にて公知の他の反応は、種々の実施態様の他の化合物を調製するのに適用性のあることが理解されよう。
【０２６２】
化合物の合成に有用な試剤は当該分野にて公知な技法に従って得ること、または調製することができる。
【０２６３】
合成方法、スキームおよび実施例における記号、略語および慣習は、現在の科学文献に使用される記号等と一致するものである。具体的には、限定することを意図するものではなく、以下の略語は、実施例において、および明細書を通して使用されてもよい。
【０２６４】
特記されない限り、温度はすべて℃（セ氏温度）で表される。反応はすべて、特記されない限り、室温で行われる。
【０２６５】
出発材料、試剤、および溶媒はすべて、特記されない限り、商業的供給源より入手し、さらに精製することなく用いた。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（tert−ブチルエーテル）チロシンメチルエステル２６はGenscriptより入手した。無水反応はすべて乾燥窒素雰囲気下で行われた。ジエチルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフランおよびトルエンは、Grubbsらによる当初の設計に基づき、J. C. Meyerによって構築された、ソルベント・ディスペンシング・システム（Solvent Dispensing System）の活性化中性アルミナの２連カラムを通すことにより乾燥させた。石油スピリットは、沸点が４０−６０℃の留分をいう。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はMerck製のプレコートされた０.２５ｍｍのシリカアルミニウムで裏打ちされたプレート上でなされ、ＵＶ光および／またはニンヒドリン溶液またはリンモリブデン酸溶液に浸し、つづいて加熱することで可視化された。反応生成物の精製は、Merck Silica Gel 60（２３０−４００メッシュ）または逆相Ｃ１８シリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより実施された。融点はReichert-Jung Thermovarの加熱段階式顕微鏡融点装置に記録された。旋光度はPerkin Elmer Model 341旋光計に記録された。ＦＴＩＲスペクトルは、ダイヤモンドウィンドーを装備したSmartATR（減衰全反射）を利用するThermo Nicolet 6700分光計を用いて得られた。プロトン（１Ｈ）およびカーボン（１３Ｃ）ＮＭＲスペクトルは、BrukerAV400分光計に各々、４００および１００ＭＨｚで記録された。１Ｈ  ＮＭＲは、溶媒を内部標準（ＣＤＣｌ３、７.２６ｐｐｍ）として用いてｐｐｍで報告される。プロトンデカップルの１３Ｃ  ＮMＲ（１００ＭＨｚ）は、溶媒を内部標準（ＣＤＣｌ３、７７.１６ｐｐｍ）を用いてｐｐｍで報告される。高分解能質量分析は、WATERS QTOF II（CMSE， Clayton, VIC 3168）またはElectrospray Ionisation（ＥＳＩ）を利用する、FinniganハイブリッドLTQ-FT質量分析（Thermo Electron Corp., Bio 21 Institute, University of Melbourne, Parkville, VIC 3010）のいずれかで行われた。
【０２６６】
実施例１Ａ：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）の調製
【０２６７】
ＢＯＰの合成は、以下のスキーム１にて示されるように、ジペプチド２６から始まった：
【化３２】
2017537134.tif 000038
【０２６８】
２６のtert−ブチル保護基を、０℃でトリフルオロ酢酸を用いる脱保護に付して、フェノール２７を得、それをさらに精製することなく、水性後処理に供した後、次工程に用いた。フェノール２７と１−ピロリジンカルボニルクロリドとの反応は、炭酸カリウムの存在下でスムーズに進行し、カルバマート２８を２工程にわたって良好な収率（７４％）で得た。Ｃｂｚ保護基の水素化分解は３時間以内に終了し、その結果としてのアミンはフラッシュクロマトグラフィーに付した後に極めて良好な収率（８５％）にて得られた。次にアミン２９を塩基の存在下でベンゼンスルホニルクロリドと反応させ、スルホンアミド３０をフラッシュクロマトグラフィーに付した後で極めて良好な収率（９６％）で得た。最後に、３０のメチルエステル部分を水酸化ナトリウムを用いてケン化し、つづいてアンバーライト樹脂上でイオン交換に供し、フラッシュクロマトグラフィーに付した後にＢＯＰを８１％収率にて得た。
【０２６９】
例示を目的として、ジペプチド２６より出発して、ＢＯＰを形成するための実際の反応条件を本明細書において提供する。
【０２７０】
工程１：Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−チロシンメチルエステル（２７）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１.２７ｍＬ、１６.６ミリモル）をＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（tert−ブチルエーテル）チロシンメチルエステル２６（０.８０ｇ、１.６６ミリモル；Genscriptからカスタムしたペプチド合成）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中０℃での懸濁液に滴下して加えた。その混合物をゆっくりと室温にまで加温し、３時間攪拌した。その時点でＴＬＣ（７０：３０  ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）は出発材料が完全に消費されたことを示した。その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンと一緒に濃縮し（ｘ３）、粗Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−チロシンメチルエステル２７（７００ｍｇ）を無色の油状物として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
【０２７１】
工程２：Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（２８）
１−ピロリジンカルボニルクロリド（１４７μＬ、１.３８ミリモル）を粗フェノール２７（３９３ｍｇ、０.９２２ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（２５６ｍｇ、１.８４ミリモル）のＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍＬ）中混合物に添加した。その混合物を５０℃で一夜攪拌し、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏで希釈し、有機相を分離した。有機層を５％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（７０％ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）に付して精製し、カルバマート２８（３５５ｍｇ、７４％）を無色の泡沫体として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
【０２７２】
工程３：Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（２９）
Ｃｂｚ保護のジペプチド２８（３５６ｍｇ、０.６８１ミリモル）および１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中混合物をＨ２で３回パージした。該混合物をＨ２雰囲気下で３時間攪拌し、その時点でＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）は出発材料が完全に消費されたことを示した。該混合物をセライト層を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５％→１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、アミン２９（２２４ｍｇ、８５％）を無色の油状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１.６４−１.７８（２Ｈ，ｍ）、１.８２−１.９２（５Ｈ，ｍ）、２.１６−２.２５（１Ｈ，ｍ）、２.９７−３.１５（４Ｈ，ｍ）、３.３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.４９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.６５（３Ｈ，ｓ）、４.０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.７、８.３Ｈｚ）、４.７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、１３.３Ｈｚ）、５.６９（１Ｈ，ｂｒｓ）、６.９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ）、８.４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.９Ｈｚ）
【０２７３】
工程４：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（３０）
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（９５μＬ、０.５４６ミリモル）をアミンＤ（７１ｍｇ、０.１８２ミリモル）、ＰｈＳＯ２Ｃｌ（３５μＬ、０.２７３ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２.２ｍｇ、０.０１８ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中攪拌溶液に添加した。その混合物を室温で４時間攪拌し、減圧下で濃縮した、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２.５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、生成物Ｅ（９３ｍｇ、９６％）を無色の泡沫体として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１.４２−１.５６（３Ｈ，ｍ）、１.９０−２.０５（５Ｈ，ｍ）、３.０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.６、１４.０Ｈｚ）、３.１０−３.１６（１Ｈ，ｍ）、３.２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.６、１４.０Ｈｚ）、３.３５−３.４０（１Ｈ，ｍ）、３.４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.７７（３Ｈ，ｓ）、４.０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.０、８.０Ｈｚ）、４.８２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５.７、１１.６Ｈｚ）、７.０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.７Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.７Ｈｚ）、７.２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ；溶媒のピークにより遮蔽されている）、７.５２−７.５７（２Ｈ，ｍ）、７.６１−７.６５（１Ｈ，ｍ）、７.８３−７.８５（２Ｈ，ｍ）
【０２７４】
工程５：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ、Ｉｃ）
０.１Ｍ  ＮａＯＨ（３.２ｍＬ、０.１６２ミリモル）をそのエステル３０（８６ｍｇ、０.１６２ミリモル）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中溶液に加え、該混合物を室温で一夜攪拌した。該反応物をアンバーライト樹脂（Ｈ＋形態）でクエンチさせ、濾過し、その濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、生成物のＢＯＰ、Ｉｃ（６８ｍｇ、８１％）を無色のガラス状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）：１.４７−１.５５（１Ｈ，ｍ）、１.５９−１.７２（２Ｈ，ｍ）、１.７７−１.８５（１Ｈ，ｍ）、１.９３−２.００（４Ｈ，ｍ）、３.１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、１３.７Ｈｚ）、３.１８−３.２４（１Ｈ，ｍ）、３.２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、１３.７Ｈｚ）、３.３５−３.４４（３Ｈ，ｍ）、３.５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、４.１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.０、８.５Ｈｚ）、４.６９（１Ｈ，ｍ）、７.０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.６Ｈｚ）、７.６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.４Ｈｚ）、７.８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.４Ｈｚ）
【０２７５】
インビトロおよびインビボにおける実験では、ＢＯＰ（Ｉｃ）は、ＢＯＰ（Ｉｃ）の遊離酸のＭｅＯＨ中溶液を０.９８当量のＮａＯＨ（０.０１Ｍ  ＮａＯＨ）で処理することにより、ナトリウム塩に変換された。その溶液を０.４５μｍのシリンジフィルターユニットを通して濾過し、生成物を凍結乾燥させ、そのナトリウム塩を綿毛のようにフワッとした無色の粉末として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：１.４７−１.５９（２Ｈ，ｍ）、１.６８−１.８３（２Ｈ，ｍ）、１.８７−１.９２（４Ｈ，ｍ）、３.０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.７、１３.８Ｈｚ）、３.１８−３.２６（２Ｈ，ｍ）、３.３４−３.４０（３Ｈ，ｍ）、３.４８−３.５１（２Ｈ，ｍ）、４.０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.４、８.７Ｈｚ）、４.４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、７.７Ｈｚ）、７.０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８.１Ｈｚ）、７.７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）
【０２７６】
実施例１Ｂ：Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の調製
ＰＥＧ−スペーサーを欠く、化合物ＩＸｂ（Ｒ−ＢＣ１５４）はまた、以下のスキーム２に示されるように合成された：
【０２７７】
【化３３】
2017537134.tif 000039
【０２７８】
このように、メチルエステル１８をＮａＯＨで加水分解に供し、脱保護されたアジド阻害剤２３を得、その後でそれをＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウムおよびＴＢＴＡの存在下でＮ−プロピニルスルホロダミンＢ２４と反応させ、蛍光標識された式ＩＸｂの化合物（Ｒ−ＢＣ１５４）をＨＰＬＣにより精製した後に収率４３％で得た。
【０２７９】
例示を目的として、メチルエステル１８より出発して、蛍光標識されたＢＯＰ誘導体ＩＸｂを形成するための実際の反応条件が本明細書にて提供される。
【０２８０】
工程１：（Ｓ）−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−アジド−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−（４−（（ピロリジン−１−カルボニル）オキシ）フェニル）プロパン酸（２３）
メチルエステル１８（４２０ｍｇ、０.７３７ミリモル）／ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）を０.２Ｍ  ＮａＯＨ（４.０５ｍＬ、０.８１１ミリモル）で処理し、室温で１時間攪拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＨを除去し、水相を１０％ＨＣｌで酸性にした。水相をＣＨＣｌ３（４ｘ１０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＋０.５％ＡｃＯＨ）に付して精製し、酸２３（３８４ｍｇ、９４％）を淡黄色の泡沫体として得た。［α］Ｄ  −０.７（ｃ  １.００  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.６７−１.７３（１Ｈ，ｍ）、１.８９−１.９６（５Ｈ，ｍ）、３.１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.０、１３.８Ｈｚ）、３.２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.０、１１.５Ｈｚ）、３.３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.３、１４.０Ｈｚ）、３.４４−３.５５（５Ｈ，ｍ）、３.８１（１Ｈ，ｍ）、４.１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、４.８９（１Ｈ，ｍ）、７.０５、７.２２（４Ｈ、２ｘｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ）、７.４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６.８Ｈｚ）、７.５３−７.６４（３Ｈ，ｍ）、７.８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.０、２５.８、３６.１、３６.８、４６.５、４６.６、５３.２、５３.９、５８.９、６１.２、１２２.０（２Ｃ）、１２８.０（２Ｃ）、１２９.４（２Ｃ）、１３０.５（２Ｃ）、１３３.６、１３３.７、１３６.０、１５０.５、１５３.６、１７０.９、１７３.７；ν／ｃｍ−１  ３３２９、２９７７、２８８１、２１０５、１７０６、１６７２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ５５７.１８１７（Ｃ２５Ｈ２９Ｎ７Ｏ６Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  ５５７.１８１３）
【０２８１】
工程２：Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）
アジド２３（１２ｍｇ、２２マイクロモル）およびＮ−プロピニルスルホロダミンＢ２４（１４ｍｇ、２４マイクロモル）／ＤＭＦ（２ｍＬ）をＣｕＳＯ４（８６μＬ、０.８６マイクロモル、Ｈ２Ｏ中０.０１Ｍ）、アスコルビン酸ナトリウム（４３０μＬ、４.３マイクロモル、Ｈ２Ｏ中０.０１Ｍ）およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）（１０８μＬ、１.０８マイクロモル、ＤＭＦ中０.０１Ｍ）で処理した。その混合物を６０℃で２時間攪拌し、その時点でＴＬＣは新たな蛍光性生成物の形成を示した。該混合物を減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（４０：１０：１  ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０.５％ＡｃＯＨ）に付して一部精製した。この材料をＨＰＬＣ（１５分間にわたって５０％−９８％勾配のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（ＴＦＡ中０.１％）；Ｒｔ＝１４.９分間）に付してさらに精製し、純生成物ＩＸｂ（１０.６ｍｇ、４３％）を紫色のガラス状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  １.２７−１.３１（１２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７.０、３.５Ｈｚ）、１.９１−１.９８（４Ｈ，ｍ）、２.２９−２.３５（１Ｈ，ｍ）、２.７１−２.７８（１Ｈ，ｍ）、３.０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.５、１３.８Ｈｚ）、３.２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.３、１３.８Ｈｚ）、３.４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.６３−３.７０（８Ｈ，ｍ）、３.８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３.５、１２.０Ｈｚ）、３.９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.６、１１.６Ｈｚ）、４.２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１.４Ｈｚ）、４.４１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.３Ｈｚ）、４.７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.４、７.５Ｈｚ）、５.０８（１Ｈ，ｍ）、６.９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２.２Ｈｚ）、６.９８−７.０４（４Ｈ，ｍ）、７.１１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９.０Ｈｚ）、７.３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６Ｈｚ）、７.４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ）、７.４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.５８−７.６８（４Ｈ，ｍ）、８.００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１.９、８.０Ｈｚ）、８.３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１.８Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  １２.９（４Ｃ）、２５.９、２６.７、３７.１、３７.６、３９.０、４６.８（４Ｃ）、４７.５、４７.６、５４.８、５５.７、６０.３、６２.１、９７.０（２Ｃ）、１１５.０（２Ｃ）、１１５.２６、１１５.２９、１２２.９（２Ｃ）、１２３.９、１２７.５、１２８.６（２Ｃ）、１２９.３、１３０.５（２Ｃ）、１３１.６（２Ｃ）、１３２.３、１３３.８、１３３.９、１３４.４、１３５.２６、１３５.３４、１３８.３、１４４.１、１４４.８、１４６.９、１５１.７、１５５.２、１５７.１６、１５７.１７、１５７.２、１５７.８、１５９.４、１７３.１、１７３.８；ν／ｃｍ−１  ３０８８−３４１８、２９７７、２８７６、１７１１、１６４９、１５８８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １１７４.３４４７（Ｃ５５Ｈ６１Ｎ９ＮａＯ１３Ｓ３として、［Ｍ＋Ｎａ］＋；計算値  １１７４.３４４３）。インビトロおよびインビボ試験のために、ＩＸｂの遊離酸（１１.７ｍｇ、９.９７マイクロモル）を０.０１Ｍ  ＮａＯＨ（９９７μＬ、９.９７マイクロモル）に溶かし、その暗紫色溶液０.４５μｍのシリンジフィルター���ニットを通して濾過した。生成物を凍結乾燥に供し、ＩＸｂのナトリウム塩（１１.６ｍｇ、９９％）を綿毛のようにフワッとした紫色の粉末として得た。
【０２８２】
実施例２：Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）およびＢＩＯ５１９２を用いるＨＳＣ上のヒトおよびネズミα９β１との特異的結合の解析
小分子のアンタゴニストによりＨＳＣ上のα９β１の特異的標的化を評価するために、選択的かつ強力な（Ｋｄ＜１０ｐＭ）α４β１アンタゴニスト  ＢＩＯ５１９２（Leone, D. R.ら（2003））、二元的α９β１／α４β１アンタゴニスト  ＢＯＰおよびその蛍光アナログ  Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を用いるインビトロアッセイを開発した。これらはヒトおよびネズミの両方のα９β１およびα４β１インテグリンと二価金属カチオン依存的方法にて効果的イ結合する（図１ａ）。これは、二価金属カチオンの存在および不在下で、α４β１と結合する、ＢＩＯ５１９２と対照的である。ヒトおよびネズミの両方のα９β１／α４β１をＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）および過剰量のＢＩＯ５１９２で共同標識し、α９β１との結合の特異的検出を可能とした（図１ｂ、ｃ）。反対に、過剰量のＢＯＰと組み合わせたＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）標識化は、ヒトおよびネズミα９β１／α４β１インテグリンとのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合を完全に阻害した（図１ｂ、ｃ）。すべての造血細胞でのα４β１の遍在的発現を考えた場合、Ｒ−ＢＣ１５４とＢＩＯ５１９２との組み合わせが、造血幹細胞および祖先細胞上のα９β１との特異的結合を測定する便利な方法を提供する。
【０２８３】
α９β１のＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合に対する寄与を評価するために、ヒトおよびネズミ細胞を、競合性アンタゴニストの不在下、または過剰量の選択的α４β１アンタゴニスト  ＢＩＯ５１９２（１μＭ）または二元的α４β１／α９β１アンタゴニスト  ＢＯＰ（１μＭ）の存在下、０.５％ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ中、０℃で３０分間、Ｒ−ＢＣ１５４（１００ｎＭ）で染色した。細胞を洗浄し、上記されるように免疫標識に付し、フローサイトメトリーにより解析した。α９β１結合の寄与は、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）＋ＢＩＯ５１９２と、＋ＢＯＰとの間のＭＦＩにおける違いを測定することにより算定され、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）単独の％として表された。同一の条件下でインキュベートされた形質導入ＬＮ１８細胞およびＣＨＯ細胞を対照として用い、ＢＩＯ５１９２がＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のα４β１との結合を＞９５％で阻害したが、α９β１との結合を阻害しなかったことを確認した。対照的に、ＢＯＰはＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のα４β１およびα９β１の両方との結合を＞９５％で阻害した。
【０２８４】
実施例３：Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）およびＢＯＰは、二価カチオンの下、α９β１依存的方法にて優先的にヒトおよびネズミＨＳＣおよび祖先細胞と優先的に結合する
ヒトＨＳＣがα９β１を発現し、それとｔｒＯｐｎとの相互作用がＨＳＣの静止を調整することが以前に実証された。二元的α９β１／α４β１または交差反応性アンタゴニストがα９β１を介してヒトＨＳＣと結合するかどうかを決定するのに、臍帯血（ＣＢ）の単核細胞（ＭＮＣ）と結合するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を評価し、二価カチオンで用量依存的であって、飽和可能であることが示された（図２ａ）。ＣＢ  ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、祖先細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）およびリニージ委任細胞（ＣＤ３４−ＣＤ３８＋）の解析（図２ｂ）では、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）は、１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下、ＨＳＣおよび祖先細胞と高い結合を示したが、委任細胞とは適当に結合したに過ぎなかった（図２ｃ）。さらには、これらの集団をＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）と一緒にＢＩＯ５１９２を組み合わせて共インキュベートし、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の（α９β１およびα４β１の両方を介する結合を反映する）ＨＳＣおよび祖先細胞との結合を部分的に阻害し、（α４β１を介する結合だけを反映する）リニージ委任細胞との結合を完全に阻害することが実証された（図２ｃ）。対照的に、ＢＯＰは、α９β１およびα４β１の両方と効果的に結合するため、その添加はＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のあらゆる細胞集団との結合の完全な阻害をもたらした（図２ｃ）。これらのデータは、合わさって、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）がα９β１を介してＨＳＣおよび祖先細胞と有意な割合で結合し、その一方で委任細胞との結合はα４β１を介して独占的に媒介されることを実証する（図２ｄ）。
【０２８５】
加えて、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下、ＣＢ細胞で明らかな結合と同様に、ヒトＢＭより単離されたＨＳＣおよび祖先細胞と効果的に結合し（図２ｅ）、この結合の大部分は、主にα４β１を介して結合する委任細胞と比べて、α９β１を介するものであった（図２ｆ）。これらのデータは、ヒトＢＭ  ＨＳＣおよび祖先細胞で明白な高いα９β１発現と一致する（図２ｇ）。
【０２８６】
のヒトＨＳＣとのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合をヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−（ｈｕＮＳＧ）マウスを用いてさらに評価した（図２ｈ）。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下でヒトＢＭ委任細胞、祖先細胞およびＨＳＣと結合したが（図２ｉ）、α９β１を介する有意な結合はＨＳＣで生じたに過ぎず（図２ｊ）、そのことはα９β１発現がＨＳＣに制限されること（図２ｋ）と一致する。対照的に、α４β１は３種のすべての集団で高度に発現される（図２Ｉ）。
【０２８７】
α４β１の造血細胞でのユビキタス発現は、α９β１のＨＳＣでの制限された発現と一緒になって、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の、祖先細胞および委任細胞と比べて、ＨＳＣへの付加的な結合をもたらした（図２ｍ）。これらのデータは、合わさって、ヒトＨＳＣおよび／または祖先細胞が、選択的α９β１アンタゴニストを用い、リニージ委任細胞に優先して標的とされる可能性のあることを強調する。
【０２８８】
実施例４：化合物Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）と骨髄ＨＳＣおよび祖先細胞とのインビボ結合
インビトロでの結合データは、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）がα４β１およびα９β１インテグリンアンタゴニストと高いアフィニティを示し、その結合活性はインテグリンの活性化に大きく依存することを示した。この実施例の試験は、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）がインビボでの結合実験に使用され、ＨＳＣの限定された集団でα９β１／α４β１インテグリン活性を研究することができるかどうかを試験する。今日まで、インテグリンのＨＳＣに対する活性の評価は、主に、骨髄細胞または生成されたＨＳＣの蛍光標識された抗体の、インビトロまたはエクスビボでの染色に依存してきた。エクスビボでの染色はＨＳＣによるインテグリンの発現の確認を提供し、複雑な骨髄の微小環境はインビトロにて正確に再構築できないため、骨髄内のその天然状態のインテグリン活性化の研究はインビボでの結合実験を通してのみ決定され得る。
【０２８９】
Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）およびこの種のＮ−フェニルスルホニルプロリンをベースとするペプチド模倣体がＨＳＣに直接結合し得るかどうかを評価するために、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに静脈内注射し、多色フローサイトメトリーを用いて表現型で定義された骨髄祖先細胞（ＬＳＫ細胞；リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ細胞；ＬＳＫＣＤ４８−ＣＤ１５０＋）のＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）標識化について分析した。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を注射していないマウスから由来の骨髄と比べて、細胞結合型蛍光の増加が、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合の結果として、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を注射したマウスより単離された、祖先細胞およびＨＳＣ集団の両方で観察された。さらには、祖先細胞（リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）の精製された集団を蛍光顕微鏡検査法に供することにより、インビボにてＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合も確認された。Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）標識された祖先細胞は、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合を示す蛍光ハローが主に細胞表面にあることを提示し、そのことはインテグリン結合とも一致する。インビボでの結合結果は、この種のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストが、ネズミ骨髄中の単核細胞のわずか０.２％および０.００２％に相当するにすぎない、各々、造血祖先細胞およびＨＳＣの極めて希な集団との結合能を有することを示す。
【０２９０】
これらの実験にて、ＢＯＰは、インビトロにおけるナノモルの阻害能で、α９β１およびα４β１インテグリンのＶＣＡＭ−１およびＯｐｎの両方との結合を阻害することが明らかとされた。これらのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を用いるインビボでの結合結果は、ＨＳＣにより発現されるα４β１およびα９β１インテグリンが、インサイチュにて活動的な結合構造にあることを示す。このことは、化合物ＩＸｂなどの小分子のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストが、骨髄のＨＳＣと直接結合するだけでなく、接着的相互作用に応じてα９β１／α４β１を阻害する能力を有し、以下に示されるように骨髄であるＨＳＣの末梢循環への動員を誘発する効果的な試剤として供する可能性のあることを示唆する。
【０２９１】
実施例５：Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）はインビトロにおいて優先的にマウスおよびヒト造血祖先細胞に結合する
中心および骨内膜のＢＭ祖先細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋細胞；ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞；ＬＳＫＳＬＡＭ）の両方に結合するのにインテグリンの活性化が必要とされるかどうかを決定するのに（図３ａ）、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）結合を１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で評価した（図３ｂ）。これらの条件下にて、中心のＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭとの結合が、そお骨内膜のカウンターパートとの関連で、より大きいことが観察された（ｐ＜０.００５）（図３ｂ）。ＥＤＴＡと共同して処置することにより表面にあるインテグリンを不活性化することで、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）とＨＳＣおよび祖先細胞との効率的な結合のために、インテグリンの活性化の要件を示す活動を完全に除去した（図３ｂ）。活性化カチオンおよびＥＤＴＡの両方の不存在下では、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）と骨内膜ＬＳＫ細胞とが結合していることは明らかであったが、中心ＬＳＫではそうではなかった（図３ｃ）。これらの結果は、骨内膜ＢＭより単離されたＨＳＣおよび祖先細胞より発現されたインテグリンが、採取後も活性化されたままであったことを示唆する。
【０２９２】
インテグリンα４β１は全白血球で普遍的に発現し、α９β１は好中球で広範囲に発現することが知られているため、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）とリニージ委任の造血細胞との結合が評価された。活性化に依存する結合が、外因的活性化の下で中心および骨内膜の両方のＢＭ領域より単離される、リニージ委任のすべてのリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１／Ｍａｃ１＋）子孫細胞で観察されることが判明した（図４）。しかしながら、この結合は、ＬＳＫＳＬＡＭ（ｐ＜０.０００１）およびＬＳＫ（ｐ＜０.０００１）細胞と比べて有意に小さかった（図３ｄ）。ＨＳＣおよび祖先細胞との結合がα４β１およびα９β１インテグリン依存的であるかどうかを確認するために、造血細胞中にα４およびα９インテグリンを欠くＢＭ細胞（α４flox／floxα９flox／flox  ｖａｖ−ｃｒｅマウス）をＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）で処理した。ＬＳＫ（ｐ＜０.００５）およびＬＳＫＳＬＡＭ（ｐ＜０.００５）のα４−／−／α９−／−細胞では、結合は本質的に存在せず、これらの２つのインテグリンのＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）活性についての要件を確かめた（図３ｅ）。
【０２９３】
Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）の二価カチオンおよび用量依存的結合もヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）で確認された（図２（ａ））。活性化条件下で、より大きな結合がリニージ委任ののＣＤ３４−細胞と比べてＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞に富む幹細胞にて観察された。にもかかわらず、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋祖先細胞と比べて結合度は減少した（図２（ｂ））。これらの結果は、ネズミおよびヒト造血細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）が二価金属カチオン依存的であり、また、インビトロにおける外因的活性化の下で、ＨＳＣと比べ、造血祖先細胞に対してバイアスが付されていることを示す。
【０２９４】
実施例６：ＢＯＰは、迅速かつ優先的に、ＨＳＣおよび祖先細胞を動員させるが、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）はそうではない
ＢＯＰは、迅速かつ優先的に、ＢＭ  ＨＳＣと結合するため、まず、ＢＯＰのＨＳＣを末梢血（ＰＢ）に動員させる能力を、用量および時間応答アッセイにおいて、ＢＯＰを皮下投与した後に祖先細胞（ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）を定量することによって解析した（図５ａ，ｂ）。ＢＯＰの投与は、ＰＢ祖先細胞およびＨＳＣの迅速で、有意な用量依存的増加をもたらし（図５ａ）、その増加は単回投与の６０分後にピークに達し（図５ｂ）、投与して４時間以内にベースラインに戻った（図６ａ，ｂ）。さらには、全ＰＢリンパ球において最初に有意な増加があったが、これらもまた１８時間までにベースラインまで減少した（図６ｃ）
【０２９５】
対照的に、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）は、インビトロにてＢＭ祖先細胞（ＬＳＫ細胞）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ細胞）と効果的に結合する能力を有したが（図７）、インビボにて投与された場合、ＰＢ祖先細胞およびＨＳＣにおいて穏やかな増加をもたらすに過ぎなかった（図６ｄ）。ＢＯＰと比べて、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）のインビボにおける効能の低下は、インビトロでの会合および解離の動態実験により測定されるように、大概、後者の結合アフィニティが結果として低いことによるものであり、このようにインテグリン依存の接着性相互作用に対する阻害能を減少させる。
【０２９６】
実施例７：ＢＯＰをＡＭＤ３１００と組み合わせて用いるＨＳＣ動員の強化
ＡＭＤＡＭＤ３１００とＢＯＰとの共投与は、ＡＭＤ３１００単独で処理したマウスと比べて、ＰＢ中のＬＳＫの割合に有意な増加を付与しなかった（図８ａ）。しかしながら、ＢＯＰをＡＭＤ３１００と一緒に添加することで、ＢＯＰまたはＡＭＤ３１００が単独の場合と比べて、ＬＳＫＳＬＡＭ細胞のＰＢ内での割合が有意に増加することが判明した（ｐ＜０.０５）。結果として、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせは、ＢＯＰまたはＡＭＤ３１００を単独で添加した群と比べて、ＰＢ中でより多数のＬＳＫ細胞を動員しなかった（図８ｂ）が、ＰＢ  ＬＳＫＳＬＡＭ細胞数にて有意な増加をもたらすことが判明した（図８ｂ）。
【０２９７】
動員されたＰＢ中のＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞の表現型の特徴付けが機能的ＨＳＣおよび祖先細胞を反映しているかどうかを確認するために、ＰＢを低増殖能（ＬＰＰ）および高増殖能（ＨＰＰ）のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の存在について評価した。ＬＰＰ−ＣＦＣは委任祖先細胞の代表例であり、ＨＰＰ−ＣＦＣはインビボにて再増殖能を有する細胞と強く相関することが示された。ＢＯＰまたはＡＭＤ３１００のいずれかで動員されるＰＢは、セイライン対照と比べて、より多くのＬＰＰ−ＣＦＣ（図８ｃ）およびＨＰＰ−ＣＦＣ（図８ｄ）含量を示した。しかしながら、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせでは、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００単独と比べた場合に、免疫表現型ＬＳＫＳＬＡＭのより多くの動員があったにもかかわらず、有意により多量のＬＰＰ−ＣＦＣ（図８ｃ）またはＨＰＰ−ＣＦＣ（図８ｄ）を含むＰＢが動員しなかった。これらの結果は、検出されたＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ含量と、動員された血液中で観察されたＨＰＰ−ＣＦＣ含量（各々、ｒ２＝０.４７および０.４６）およびＬＰＰ−ＣＦＣ含量（各々、ｒ２＝０.５４および０.３６）との間の適度な相関性を反映している（図８ｅ）．
【０２９８】
ＢＯＰが長期の多リニージ生着可能性のある真性なＨＳＣを含むＰＢを動員するかどうかを確かめるために、限界希釈移植分析を行った。ＢＯＰ、ＡＭＤ３１００またはＢＯＰとＡＭＰ３１００の併用療法により動員されるＲＦＰドナーからのＰＢの限界容量を、致死量の放射線を照射したＣ５７レシピエントに移植し、最大２０週間まで多リニージ再構成を評価した（図８ｆ）。ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせにより動員されたＰＢを受けているレシピエントでは、ＡＭＤ３１００単独で処理された群と比べて、有意に高い生存率が観察された（図８ｇ）。Ｌ−ｃａｌｃを用いるポアソン回帰分析は、ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせにより動員されたＰＢは、ＢＯＰ（３２２μｌ中に１個；９５％ＣＩ＝１２７μｌ中に１個〜６１２μｌ中に１個）およびＡＭＤ３１００（３５１μｌ中に１個；９５％ＣＩ＝１２８μｌ中に１個〜９５８μｌ中に１個）単独と比べて、より大きな２３μｌのＰＢ中に１個（９５％ＣＩ＝１０μｌ中に１個〜５１μｌ中に１個）の再増殖の度数を示し、モノ療法と比べて１０倍以上の改善が提供されたことを明らかにした（ｐ＜０.００５）（図８ｈ）。長期移植の成果が、ＬＰＰ−ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＳＫの決定と比べて、動員されたＰＢ中のＬＳＫＳＬＡＭ含量により最も正確に予測された。これらの結果は、ＢＯＰの単独、あるいはＡＭＤ３１００と組み合わせるかのいずれかの治療が、長期の再増殖性ＨＳＣを動員することを示し、ＨＳＣ動員についての速攻便利で適度に「リアルタイム」なアッセイとして、ＬＳＫＳＬＡＭ表現型のフローサイトメトリーモニター観察を検証する。
【０２９９】
実施例８：ＢＯＰを標的とするＣＸＣＲ４と組み合わせて用いるＨＳＣ動員の強化
ＡＭＤ３１００の投与は、ＢＯＰと比べて（７.０±０.８ｘ１０６／ｍｌ）、ＷＢＣ数において同様の増加をもたらし（７.８±１.５ｘ１０６／ｍｌ）、ＰＢ中の祖先細胞（ＬＳＫ細胞）の割合において比較可能な増加をもたらした（図８ａ）。しかしながら、ＢＯＰは、ＡＭＤ３１００と比べて、ＰＢ中のＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ細胞）の割合において有意に大きな増加をもたらし（図８ｂ；ｐ＜０.０５）、このことはＡＭＤ３１００が、主として、祖先細胞を動員する一方で、ＢＯＰもＨＳＣを動員することを示唆する。さらには、ＢＯＰとＡＭＤ３１００との組み合わせは、ＢＯＰまたはＡＭＤ３１００単独と比べて、ＷＢＣ（１６.４±１.９ｘ１０６／ｍｌ）、祖先細胞およびＨＳＣ細胞を相乗的に動員させた（図８ｂ）。興味深いことに、インビボにおいて、ＢＯＰと骨内膜ＬＳＫとの間で、その中心ＬＳＫと比べて、有意に大きな結合が観察された（図６ｅ）。
【０３００】
実施例９：α９β１とα４β１およびＣＸＣＲ４と組み合わせて阻害することが、α４β１単独を特異的に標的、またはα４β１とＣＸＣＲ４の組み合わせを標的とすることと比べて、ＨＳＣの動員を強化する
α９β１の共同阻害がα４β１単独またはＣＸＣＲ４と組み合わせた阻害よりも動員の利点を提供するかどうかを決定するために、α４β１の選択的阻害剤であるＢＩＯ５１９２を用いた。ＢＩＯ５１９２は、ＡＭＤ３１００と共にまたはなしで、ＣＦＵおよび長期再増殖性ＨＳＣを動員すると報告されてきたが、動員される特定の細胞型は研究されなかった。ＢＩＯ５１９２の静脈内投与は、ＰＢ中のＷＢＣ数（図９ａ）、祖先細胞（ＬＳＫ 細胞）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ 細胞）の数（図９ｂ）を適度に上昇させただけであった。ＢＩＯ５１９２とＡＭＤ３１００との共同投与は全ＷＢＣの有意な増加をもたらした（図９ａ）が、ＢＩＯ５１９２単独と比べて、祖先細胞にて適度な２.４倍の増加、およびＨＳＣにて１.４倍の増加に過ぎなかった（図９ｂ）。これは、同様のＰＢ  ＷＢＣ数を誘発するにも拘わらず（図９ａ）、有意により多数の祖先細胞およびＨＳＣを動員する、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせ（図９ｂ）とは全く異なるものである。これらのデータは、ＣＸＣＲ４およびα４β１との同時結合が主に委任されたＷＢの動員をもたらすが、反対にα４β１およびα９β１との共同結合がＨＳＣ動員を有意に増加させることを示す。
【０３０１】
実施例１０：α９β１およびα４β１を、ＣＸＣＲ４と共にまたはなしで、阻害することで機能的ＨＳＣが動員される
動員されたＰＢ中にてＬＳＫＳＬＡＭおよびＬＳＫ細胞の表現型が長期多リニージ生着の可能性のある機能的ＨＳＣおよび祖先細胞に反映しているかどうかを確かめるため、限界希釈移植分析をＢＯＰ、ＡＭＤ３１００またはその組み合わせを用いて行った。ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の両方を単独で用いた場合と比べ、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせを用いて動員された３０μｌのＰＢを受けているレシピエントにおいてより高い生存が観察された（ｐ＜０.０５）（図８ａ）。さらには、ポアソン回帰分析を限界希釈移植を受けて行い、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせにより動員されたＰＢが、ＢＯＰ（３２７μｌ中に１のＨＳＣ；９５％ＣＩ＝１５０μｌ中に１のＨＳＣ〜７１５μｌ中に１のＨＳＣ）またはＡＭＤ３１００（３５１μｌ中に１のＨＳＣ；９５％ＣＩ＝１２８μｌ中に１のＨＳＣ〜９５８μｌ中に１のＨＳＣ）単独と比べて、２３μｌのＰＢ中に１のＨＳＣ（９５％ＣＩ＝１０μｌ中に１のＨＳＣ〜５１μｌ中に１のＨＳＣ）のより大きな再増殖の度数を示し、モノ療法と比べて１０倍以上の改善が提供されたことを明らかにした（ｐ＜０.００５）（図８ｈ）。これらの結果は、ＢＯＰの単独またはＡＭＤ３１００と組み合わせた治療が長期の再増殖性ＨＳＣを動員することを実証し、ネズミＨＳＣ動員を評価することについての迅速な方法としてＬＳＫＳＬＡＭ表現型のフローサイトメトリーモニター観察を検証する。
【０３０２】
実施例１１：ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせはＧ−ＣＳＦ動員の効果的かつ迅速な代用である
４日間のＧ−ＣＳＦを用いる動員との比較にて、単回投与のＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせを用いて等数のＨＳＣが動員された（図１０ａ）。しかしながら、興味深いことに、Ｇ−ＣＳＦを単独で用いて、有意に多くの数の祖先細胞が動員された（図１０ａ）。複数回投与のＧ−ＣＳＦで動員されるＰＢの造血の可能性と、それに対する単回投与のＢＯＰとＡＭＤ３１００との可能性を比較するために、競合的長期再構成アッセイを用いた（図１０ｂ）。等数のＨＳＣがＧ−ＣＳＦおよびＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせで動員されるにも拘わらず（図１０ａ）、後者を用いて有意に強化された短期および長期多リニージ生着が観察された（図１０ｄおよび図１０ｅ、ｆ）。その上さらに、数学的に予想されるよりも有意に大きな生着がセカンダリー移植片にて維持された（図１０ｇ、ｈおよび図１０ｉ、ｊ）。ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００動員のＰＢで観察されるより高い生着は、Ｇ−ＣＳＦで動員されたＬＳＫ／ＬＳＫＳＬＡＭ表現型の細胞が造血の可能性を減少させることを示唆し、そのことはＧ−ＣＳＦで動員されたＬＳＫ細胞が天然のＢＭ  ＬＳＫと比べて生着を損傷する可能性が有意に高いことを示す、これまでの知見と一致する。
【０３０３】
実施例１２：ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせはヒトＣＤ３４＋幹細胞および祖先細胞も効果的に動員する
ＢＯＰを用いるＨＳＣの動員がヒトにおいても同じであるかどうかを測定するために、ｈｕＮＳＧマウスを利用した。単回投与のＢＯＰまたはＡＭＤ３１００で処理するか、または複数回投与のＧ−ＣＳＦで４日間単独で処理し、ＰＢヒトＷＢＣまたはヒトＣＤ３４＋幹細胞および祖先細胞において有意な増加は得られなかった（図１１）。対照的に、ＢＯＰをＡＭＤ３１００と組み合わせた単回投与は、ヒトＷＢＣおよび幹および祖先細胞の両方で有意な増加をもたらした（図１１）。これらのデータは、ｈｕＮＳＧマウスがヒトＨＳＣ動員についての有用な代替モデルであることを実証し、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００がヒトＣＤ３４＋細胞を臨床的に速やかに動員させる有望な効能を有することを示す。
【０３０４】
実施例１３：Ｎ−（３−ピリジンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（Ｐｙ−ＢＯＰ）の調製
ベンゼン環の代わりにピリジン環があることでＢＯＰと異なる、Ｐｙ−ＢＯＰもまた、次のスキーム３に示されるように、合成された。
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【０３０５】
このように、アミン２９を３−ピリジンスルホニルクロリドと反応させてスルホンアミド３１を得、その後でそれを水酸化ナトリウムで加水分解し、全体として非常に高い収率でＰｙ−ＢＯＰを得た。
【０３０６】
例示を目的として、アミン２９より出発してＰｙ−ＢＯＰを形成する実際の反応条件を本明細書にて提供する。
【０３０７】
工程１：Ｎ−（３−ピリジンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（３１）
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１１０μｌ、０.６３ミリモル）を、アミン２９（９８ｍｇ、０.２５２ミリモル）、３−ピリジンスルホニルクロリド（２９５μｌ、０.３３ミリモル；ＣＨ２Ｃｌ２中２００ｍｇ／ｍｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（５ｍｇ、０.０４１ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）中攪拌溶液に添加した。混合物をＮ２下の室温で２時間攪拌し、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５％→１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）に付して精製し、生成物３１（１２９ｍｇ、９６％）を無色の油状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.５１−１.６２（３Ｈ，ｍ）、１.８９−２.００（４Ｈ，ｍ）、２.０６−２.０９（１Ｈ，ｍ）、３.０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.５、１４.０Ｈｚ）、３.１６（１Ｈ，ｍ）、３.２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.６、１４.０Ｈｚ）、３.４１（１Ｈ，ｍ）、３.４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.６Ｈｚ）、３.５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.８Ｈｚ）、３.７８（３Ｈ，ｓ）、４.１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.８、８.５Ｈｚ）、４.８４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５.７、１１.４Ｈｚ）、７.０６−７.１４（５Ｈ，ｍ）、７.５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１.０、５.０、８.２Ｈｚ）、８.１３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１.７、２.５、８.１Ｈｚ）、８.８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１.６、４.８Ｈｚ）、９.０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０.８、２.５Ｈｚ）
【０３０８】
工程２：Ｎ−（３−ピリジンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（Ｐｙ−ＢＯＰ）
０.２Ｍ  ＮａＯＨ（１.３ｍｌ、０.２６１ミリモル）をエステル３１（１１６ｍｇ、０.２１８ミリモル）のＥｔＯＨ（５ｍｌ）中溶液に添加し、該混合物を室温で２時間攪拌し、濃縮し、次にＣ１８逆相クロマトグラフィー（３０％−５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）に供して精製し、生成物（９９ｍｇ、８８％）を無色のガラス状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）  １.５５−１.６９（２Ｈ，ｍ）、１.７５−１.９２（６Ｈ，ｍ）、３.０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.１、１４.０Ｈｚ）、３.２１−３.２７（２Ｈ，ｍ）、３.３２−３.３６（２Ｈ，ｍ）、３.４０−３.４８（３Ｈ，ｍ）、４.１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.４、８.７Ｈｚ）、４.４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.９、８.０Ｈｚ）、７.０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５）、７.６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、８.２Ｈｚ）、８.１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１.５、２.２、８.０Ｈｚ）、８.７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１.２、４.９Ｈｚ）、８.８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１.７Ｈｚ）；δｃ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）  ２４.２２、２４.６４、２５.２６、３０.８６、３７.０１、４６.５４、４６.６１、４９.６７、５６.１０、６２.１２、１２１.８６、１２５.１３、１３０.５９、１３２.８３、１３５.１５、１３６.５７、１４７.２４、１４９.６９、１５３.５５、１５５.１７、１７２.８５、１７７.３８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ５３９.１５７４（Ｃ２４Ｈ２８ＮａＮ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値  ５３９.１５７１）
【０３０９】
実施例１４：Ｐｙ−ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせはヒトＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞を効果的に動員する
Ｐｙ−ＢＯＰをインビボにてＡＭＤ３１００と組み合わせて投与し、１時間後にＰＢ祖先細胞（図１２ａ）およびＨＳＣ（図１２ｂ）の有意な増加を誘発し、迅速かつ選択的な動員を実証した。
【０３１０】
実施例 １５：ＢＯＰは重要な役割を果たすα９β１と共にＨＳＣおよびＢＣＰ−ＡＬＬを迅速に動員する
ＢＯＰのインビボでの投与は、ＰＢ  ＨＳＣにて用量依存的増加を誘発し（図５ａ）、それでは１時間でピークに達し、迅速かつ効果的な動員を実証する（図５ｂ）。さらには、ＡＭＤ３１００のＢＯＰへの添加は、ＨＳＣの動員数の有意かつ相乗的増加をもたらし（図８ｂ）、これらは長期にわたる多リニージの生着の可能性のある細胞を有意に高い度数で有した（図８ｈ）。
【０３１１】
重要なことは、ＷＢＣ数の同様の増加が、α４β１特異的阻害剤ＢＩＯ５１９２３９またはα４β１／α９β１二元的阻害剤ＢＯＰのいずれかをＡＭＤ３１００と組み合わせて用いた場合に、観察されたが、後者では著しく大きなＨＳＣ動員が観察され（図９ａ）、α９β１がＨＳＣを優先的に退出させるための重要な受容体であると強調している。ＢＯＰとＡＭＤ３１００を組み合わせた使用も、ヒトＣＤ３４＋（上記）およびＢＣＰ−ＡＬＬ（図１３ａ）細胞を迅速かつ効果的に動員し、ＢＯＰまたはＡＭＤ３１００の単独での使用と比べて、これは有意に増加された。重要なことは、ＢＯＰの著しく大きな結合が、ＢＯＰ単独と比べて、ＢＯＰがＡＭＤ３１００と組み合わせて使用された場合に、骨内膜に位置付けられるＡＬＬ細胞に観察され、ＡＭＤ３１００がインビボにてこのＢＭ領域においてα４β１／α９β１活性を強化することを実証した（図１３ｂ）。これらのデータは、ＢＯＰ＋ＡＭＤ３１００がｈｕＮＳＧ異種移植モデルにてヒトＣＤ３４＋およびＢＣＰ−ＡＬＬ細胞を効果的に動員することを実証し、ＢＯＰ＋ＡＭＤ３１００のＢＭ  ＡＬＬ細胞の臨床的な動員および除去の両方についての有効性を強調する。
【０３１２】
上記の例は、小分子のアンタゴニスト  ＢＯＰを用いるα９β１／α４β１インテグリンの阻害が、インテグリン依存のＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの結合の阻害を介して長期にわたって再増殖するＨＳＣの迅速な動員を誘発することを示す。
【０３１３】
二価金属カチオンによって活性化された場合にのみα４β１およびα９β１インテグリンと結合する蛍光性小分子のインテグリンアンタゴニスト（Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ））を用い、これらの２つのβ１インテグリンのネズミおよびヒトＨＳＣ上での活性化状態はインビボにおける骨膜内ニッチにより本質的に活性化および分化的に特異化されることが初めて示される。
【０３１４】
これらの例は、ＨＳＣおよび祖先細胞を含む、骨膜内ニッチ内にあるＢＭ細胞が、中心の骨髄コンパートメント内で観察される状態を超えて、さらに高いアフィニティ結合状態にある、α９β１／α４β１インテグリンを発現することを示す。
【０３１５】
本発明者らは、ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−（ＬＳＫＳＬＡＭ）の決定が、動員した血液のＣＦＣ含量を定量するよりもより密接に長期の移植成果を反映する、推定ＨＳＣの動員のための迅速かつ便利なサロゲートスクリーンとして使用され得ることを示す。具体的には、ＢＯＰは、単独で、またはＡＭＤ３１００と組み合わせるかのいずれかで、ＨＰＰ−ＣＦＣ、ＬＰＰ−ＣＦＣまたはＬＳＫ細胞含量の決定よりもより良好にＬＴ−ＨＳＣと相互に関連付けられるように表現型ＬＳＫＳＬＡＭを効果的に動員することが判明した。かくして、短期コロニー形成アッセイだけを基準にしてＨＳＣ動員を評価したのであれば、効果的な動員方法としてのＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせを疑問視したであろう。
【０３１６】
現在の研究では、Ｇ−ＣＳＦはヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスにおいてＣＤ３４＋造血幹細胞および祖先細胞の動員に失敗した。対照的に、ＢＯＰおよびＡＭＤ３１００の組み合わせはヒトＣＤ３４＋細胞の有意な動員をもたらし、この方法がヒト患者およびドナーの臨床的動員に適用可能であることを示唆する。
【０３１７】
本発明者らは、ＢＯＰの単回投与を用いてα９β１／α４β１を標的とすることが、たぶんｔｒＯｐｎおよびＶＣＡＭ−１へのインテグリン依存の結合の阻害を介して長期にわたって再増殖するＨＳＣの迅速な動員を誘発することを、実証した。蛍光性ＢＯＰアナログ、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を用い、ヒトおよびネズミＨＳＣとの結合のかなりな割合がα９β１を通して生じるのに対して、リニージ委任細胞との結合はα４β１を通してほとんど独占的に生じることが示される。結果的に、α４β１選択的アンタゴニストのＢＩＯ５１９２と比べて、ＢＯＰを用いて、特にＡＭＤ３１００と組み合わせて用いた場合に、ＨＳＣおよび祖先細胞の有意により大きな動員が実証されたため、α９β１の阻害はα４β１単独での阻害以上にＨＳＣ動員の収率に付加された利点を提供することが判明した。ＢＯＰをＡＭＤ３１００と組組み合わせた場合と比べ、ＢＩＯ５１９２をＡＭＤ３１００と組み合わせて用いて、ＷＢＣの動員ではそうではないが、ＨＳＣの動員における相乗効果の減少は、祖先細胞の動員に向かうα４バイアスを標的とすることを支持し、それに対してα９の標的化は優先的にＨＳＣを動員する。ＢＩＯ５１９２と比べてＢＯＰを用いてＡＭＤ３１００媒介の動員の顕著な増加は、ＨＳＣ動員のインテグリンα９β１の役割が、ＣＸＣＲ４の同時標的化で拡大されることを示唆する。
【０３１８】
要約すれば、ＢＯＰ、α４β１およびα９β１インテグリンを標的とする小分子の単回投与が、ＨＳＣを長期にわたる多リニージ生着の可能性をもって効果的かつ迅速に動員し、ＨＳＣの動員におけるα９β１のこれまでに認識されていない役割を同定することがこの度示された。ＡＭＤ３１００などのＣＸＣＲ４阻害剤と組み合わせて使用された場合、Ｇ−ＣＳＦと比べて、長期にわたって再増殖するＨＳＣの著しく強化された動員が観察された。ＢＯＰとＡＭＤ３１００の組み合わせを用いるＨＳＣ動員の有効性は、ヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスにおけるＣＤ３４＋細胞の動員において再現された。関連する蛍光標識されたインテグリンアンタゴニスト  Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）を用い、この種の化合物が内因的に活性化された／プライミングされたα４β１およびα９β１を介して骨内膜ニッチ内にてネズミおよびヒトＨＳＣおよび祖先細胞と結合することが示された。さらには、Ｒ−ＢＣ１５４（ＩＸｂ）／ＢＯＰのヒトＨＳＣとの結合の大部分が、リニージ委任細胞上に不在の、α９β１を介して生じることが示される。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦと関連する多数の欠点に対処する、骨内膜ＨＳＣを療法的に標的とする、効果的かつ都合のよい方法を強調するものであり、優先的にＨＳＣを動員するために付加的に選択的小分子のα９β１インテグリンアンタゴニストを開発する方法を堅持する。
【０３１９】
本発明の上記した記載により、当業者であれば、現時点でその最良の態様であると考えられるものを製造し、かつ使用することができるが、当業者は本明細書の特定の実施態様、方法および実施例の変形、組み合わせ、および均等の存在を理解し、認識するであろう。従って、本発明は、上記した実施態様、方法および実施例に限定されるべきではなく、本明細書にて広範囲に記載される発明の範囲および精神の範囲内にあるすべての実施態様および方法を包含するものとする。
【０３２０】
参考文献
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【図１】
2017537134.tif 000059
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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2017537134.tif 000090
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