(57)【要約】  本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体とヒトＧＬＰ−２受容体両方へのアゴニスト活性を有する組成物とペプチドに関し、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である。また、本発明は該組成物とペプチドの製造方法と使用に関する。さらに、上記ペプチドの脂質付加類似体にも関連している。さらに、本発明は、ヒトの疾患、特に、消化管の炎症、短腸症候群、クローン病を含む、腸・脳関連疾患や代謝異常の治療または予防療法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧＬＰ−１受容体にアゴニスト活性を付与する第１のペプチドまたはその脂質付加類似体と、ヒトＧＬＰ−２受容体にアゴニスト活性を付与する第２のペプチドまたはその脂質付加類似体と、を含有する医薬用組成物であって、
前記ヒトＧＬＰ−１受容体への前記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、前記ヒトＧＬＰ−２受容体への前記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、腸増殖を誘発するための使用では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である、医薬用組成物。
【請求項２】
ヒトＧＬＰ−１受容体にアゴニスト活性を付与する第１のペプチドまたはその脂質付加類似体と、ヒトＧＬＰ−２受容体にアゴニスト活性を付与する第２のペプチドまたはその脂質付加類似体と、を含有する医薬用組成物であって、
前記ヒトＧＬＰ−１受容体への前記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、前記ヒトＧＬＰ−２受容体への前記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、各前記ペプチドは、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である、医薬用組成物。
【請求項３】
ヒトＧＬＰ−１受容体とヒトＧＬＰ−２受容体への二重アゴニスト活性をもつペプチドであって、前記ヒトＧＬＰ−１受容体へのペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、前記ヒトＧＬＰ−２受容体へのペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であるペプチド、または、
その医薬的に許容される塩、溶媒和物、若しくは、脂質付加類似体。
【請求項４】
前記（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．１、好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、さらに好ましくは少なくとも１である、請求項１または２に記載の組成物、または、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．０２、好ましくは少なくとも０．０３、より好ましくは少なくとも０．２、さらに好ましくは少なくとも０．５である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物、またはペプチド。
【請求項６】
（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）であり、
好ましくは（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞２（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）であり、
さらに好ましくは（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞１０（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物、またはペプチド。
【請求項７】
配列番号１の配列を含むペプチド、若しくは、前記配列番号１のアミノ酸配列とのずれが２以下である脂質付加ペプチド類似体であって、
前記配列番号１は
Ｈ−Ｘ２−Ｄ−Ｇ−Ｘ５−Ｆ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｙ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌ−Ａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｘ２４−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３
であり、ここで、
Ｘ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、
Ｘ７は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、
Ｘ８は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、  
Ｘ１２は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、
Ｘ１４は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、
Ｘ１５は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、  
Ｘ１６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
Ｘ１９は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、
Ｘ２１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｘ２４は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ２７は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｎｌｅ、
Ｘ２８は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ２９は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３０は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３１は、Ｉｌｅまたは存在しない、
Ｘ３２は、Ｔｈｒまたは存在しない、
Ｘ３３は、Ａｓｐまたは存在しない、
ペプチド若しくは脂質付加ペプチド類似体、または、
その医薬的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
Ｘ７はＴｈｒ、Ｘ９はＧｌｕ、Ｘ１９はＡｌａである、請求項７に記載のペプチドまたは脂質付加ペプチド類似体。
【請求項９】
配列番号２のペプチド配列を含み、
前記配列番号２は、Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｘ８−Ｅ−Ｘ１０−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｘ１６−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｘ２４−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｒ２であり、
Ｒ１は、水素、メチル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、または、トリフルオロアセチル、Ｒ２は、ＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ８は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、
Ｘ１６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
Ｘ２４は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３１は、Ｉｌｅまたは存在しない、
Ｘ３２は、Ｔｈｒまたは存在しない、
Ｘ３３は、Ａｓｐまたは存在しない、請求項８に記載のペプチドまたは脂質付加ペプチド類似体。
【請求項１０】
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ（好ましくはＳｅｒ）、
Ｘ１０はＬｅｕまたはＮｌｅ、
Ｘ１６はＡｌａまたはＡｓｎ、
Ｘ２４はＡｌａまたはＡｓｎ、
Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３はＩｌｅ、ＴｈｒおよびＡｓｐであるか又は、Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３は存在しない、
請求項７〜９のいずれか１項に記載のペプチドまたは脂質付加ペプチド類似体。
【請求項１１】
前記ペプチドは、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｒ２（配列番号３）と、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｒ２（配列番号４）と、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号５）と、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号６）と、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号７）
の中から選択される、
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のペプチドまたは脂質付加ペプチド類似体。
【請求項１２】
１つの脂質付加アミノ酸残基を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の脂質付加ペプチド類似体。
【請求項１３】
前記脂質付加アミノ酸残基はＸ７〜Ｘ１９の位置のいずれか１つに存在する、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記脂質付加アミノ酸残基は位置Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７の位置のいずれか１つに存在する、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記脂質付加アミノ酸残基は位置Ｘ１４またはＸ１７の位置のいずれか１つに存在する、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号１９）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２０）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２１）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２２）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２３）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２４）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２５）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２６）
の中から選択される、
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７】
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２３）と、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２（配列番号２５）
の中から選択される、
請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
被験者としてのヒトまたは動物の治療または予防療法の使用のための、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の組成物またはペプチド。
【請求項１９】
前記治療または予防療法は、消化管の炎症、短腸症候群、クローン病を含む、腸および脳関連疾患または代謝異常に関連する病態の治療または予防療法である、請求項１８に記載の使用のための組成物またはペプチド。
【請求項２０】
前記治療または予防療法は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防療法である、請求項１８または１９に記載の使用のための組成物またはペプチド。
【請求項２１】
前記治療または予防療法は、外科手術の外傷の治療または予防療法である、請求項１８または１９に記載の使用のための組成物またはペプチド。
【請求項２２】
請求項３〜１７のいずれか１項に記載のペプチドと、少なくとも１つの医薬用または獣医学用賦形剤を含有する、医薬用または獣医学用組成物。
【請求項２３】
請求項３〜１７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸分子を発現させ、産生した生成物を精製する工程を含む、請求項３〜１７のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１ＲおよびＧＬＰ−２Ｒ二重アゴニスト活性を有する組成物及びペプチドに関し、さらに、短腸症候群や短腸病等、吸収不良や腸の炎症に発展する腸疾患を含むヒトまたは動物の疾患の予防や治療への、該組成物およびペプチドの使用に関する。また、本発明による組成物とＧＬＰ１Ｒ−ＧＬＰ２Ｒ二重アゴニストペプチドは、代謝症候群、肥満、糖尿病の予防や治療にも有用である。さらに、本発明は、二重ペプチドを含有する医薬用および獣医学用組成物と、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
短腸症候群（ＳＢＳ、または単に短腸とも呼ぶ）は吸収不良疾患であり、その原因として、外科手術による小腸の一部除去や、腸部位の機能障害が挙げられる。疾患の大半は、例えば、クローン病、消化管の炎症性疾患、腸捻転、血流遮断や組織壊死を引き起こす自然発生的小腸の捻れ、小腸の腫瘍、小腸の損傷や外傷、壊死性全腸炎（未熟児、新生児）、肥満治療のバイパス手術、小腸の疾患の排除や損傷部位の除去手術等に関連して、発生する。また、生まれつき先天性短腸をもつ子供もいる。
【０００３】
短腸症候群の症状には、腹痛、下痢、体液の枯渇、体重の減少、栄養不良がある。短腸症候群患者は、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｂ９（葉酸）、Ｂ１２、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛の欠乏等、ビタミンやミネラルの吸収不良に伴う合併症を発症する場合もある。合併症は、貧血、角質増殖症（皮膚の落屑）、痣ができやすい、筋痙攣、血液凝固不良、骨痛として現れ得る。
【０００４】
移植を除けば、短腸症候群の治療方法はない。しかし、ＳＢＳの治療に、数種類のＧＬＰ−２類似体が提案されてきた。
【０００５】
グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２またはＧＬＰ２）は、腸内分泌細胞により産生される、３３アミノ酸のプログルカゴン由来ペプチドである。未変性ＧＬＰ−２は、Ｈ−ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨの配列を有し、グルカゴン様ペプチドー１（ＧＬＰ−１またはＧＬＰ１）とグルカゴン自体と同様に、ＧＣＧ遺伝子でコードされるプログルカゴンペプチドに由来する。ＧＬＰ−２は、腸増殖を刺激し、腸細胞のアポトーシスを低減する。さらに、ＧＬＰ−２は、全非経腸栄養に起因する腸の発育不全を防ぐ。Ｇ蛋白結合受容体のスーパーファミリに属するＧＬＰ−２Ｒは腸で発現し、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）とＧＬＰ−１の受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に密接に関連している。ＧＬＰ−２は、ＧＬＰ−２Ｒの天然アゴニストである。一旦循環すると、ＧＬＰ−２の半減期は、ＤＰＰ−ＩＶによる急速な分解により、数分程度となる。ＮＰＳ製薬とナイコメッド（武田薬品）が開発したグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）の類似体である製剤「テデュグルチド」は、米国および欧州で短腸病の治療薬として認可を受けており、商品名Ｇａｔｔｅｘ／Ｒｅｖｅｓｔｉｖｅで販売されている。テデュグルチドは、ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性ＧＬＰ−２類似体であり、薬力学的特性が向上している。
【０００６】
また、ＧＬＰ−１は腸増殖に好ましい効果があると示唆されてきた。この提案された作用の機序はわからないものの、ＧＬＰ−１は胃の収縮運動および分泌を阻害するため、これがプラスの効果をもたらすと言われている。
【０００７】
ペプチドグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１またはＧＬＰ１）の主な形態は、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨとＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２であり、プログルカゴンからの選択的開裂の結果、生ずる。活性ＧＬＰ−１は、食後、腸のＬ細胞から分泌される。ＧＬＰ−１は、グルカゴンの分泌を抑えながら、インスリン分泌のグルコース依存性刺激を誘発する、強力な抗高血糖ホルモンである。未変性ＧＬＰ−１は、Ｈ−ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧ−ＯＨの配列を有する。一旦循環すると、ＧＬＰ−１の半減期は、ＤＰＰ−ＩＶによる急速な分解により、数分程度となる。ＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）は、特に脳に発現し、食欲の制御に関与している。医薬品にＧＬＰ−１を用いると、哺乳動物の摂食量を抑え、結果として減量につながることは周知である。リラグルチドは、ノボノルディスク社が２型糖尿病の治療用に開発した、長時間作用型グルカゴン様ペプチド−１アゴニスト（ＧＬＰ−１アゴニスト）である。リラグルチドは、ビクトーザの商品名で販売されている。
【０００８】
したがって、ＧＬＰ−１もＧＬＰ−２も、いくつかの腸・脳関連疾患に関与していると信じられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６４４８４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２受容体活性を付与するペプチド類似体の同時投与による併用治療の効果の検証を目指した。
【００１１】
これにより、本発明は、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２二重受容体活性を付与する組成物を、ヒトまたは動物の疾患、特に、腸および／または脳関連疾患の治療に用いることが適切であるかを調べることを、目的の１つとした。より詳しくは、本発明は、腸・脳関連疾患の治療、特に、短腸病に関連する病態治療の向上を目的とした。
【００１２】
また、本発明は、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２受容体活性の併用（二重）活性をもつ各単体のペプチドを提供することを、別の目的とした。
【００１３】
特許文献１には、ＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２受容体の両方で活性をもつ、特定のＧＬＰ−２類似体が記載されている。しかし、このＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２受容体への受容体活性は、本発明による二重アゴニストペプチドとするには、不十分である。特許文献１の表２から明らかであるが、本発明が定義するような最大の二重活性を有するペプチドは、相対的ＧＬＰ−１Ｒ活性が０．０３未満、相対的ＧＬＰ−２Ｒ活性が３分の１の「化合物１１」である。したがって、化合物１１の（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、０．０１未満である。
【００１４】
本発明のさらに別の目的として、ＧＬＰ−１受容体およびＧＬＰ−２受容体への二重活性をもつペプチドを、ヒトまたは動物の疾患治療、特に、腸および／または脳関連疾患、さらに詳しくは、短腸病に関連する病態治療に用いることが適切であるかを調べた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２二重受容体活性を付与する組成物を、ヒトまたは動物の疾患治療、特に、腸および／または脳関連疾患の治療に好適に用いることができるという、目覚ましい知見に基づいている。
【００１６】
本出願の実験記載箇所に示すように、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２類似体を用いた併用治療は、腸の重量や体積を有意かつ相乗的に増加させ、同時に、他の治療群と比較して、マウスおよびラットの食餌量が減少するという効果をもたらした。
【００１７】
さらに、ＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２の両方に対して二重アゴニスト機能を有するペプチド類似体の驚くべき同定・開発が、本発明の根拠となっている。
【００１８】
また、本発明は、特定の腸・脳関連疾患の治療において、上述の二重アゴニストがより大きな効能を発揮するという目覚ましい知見を、その根拠としている。
【００１９】
したがって、第１の局面では、本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体にアゴニスト活性を付与する第１のペプチドまたはその脂質付加類似体と、ヒトＧＬＰ−２受容体にアゴニスト活性を付与する第２のペプチドまたはその脂質付加類似体、を含有する医薬用組成物に関する。該組成物では、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、腸増殖を誘発するための使用では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である。
【００２０】
別の局面では、本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体にアゴニスト活性を付与する第１のペプチドまたはその脂質付加類似体と、ヒトＧＬＰ−２受容体にアゴニスト活性を付与する第２のペプチドまたはその脂質付加類似体、を含有する医薬用組成物に関する。該組成物では、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、各上記ペプチドは、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）を特徴とする。
【００２１】
本発明の特に好ましい１つの局面では、それぞれ「第１の」ペプチド、「第２の」ペプチドと定義した上述の各ペプチドは、同じペプチドである。
【００２２】
したがって、特に好ましい１つの局面では、本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体とヒトＧＬＰ−２受容体へのアゴニスト活性をもつ二重ペプチドであって、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である二重ペプチド、または、その医薬的に許容される塩、溶媒和物、または、脂質付加類似体に関する。
【００２３】
別の局面では、本発明は、上述の組成物および二重ペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物の治療への使用に関する。さらに別の局面では、本発明は、上述の組成物および二重ペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物における短腸病の治療への使用に関する。
【００２４】
他の局面では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、または、上記配列番号１のアミノ酸配列においてずれ（deviation）が２以下である脂質付加ペプチド類似体に関する。
Ｈ−Ｘ２−Ｄ−Ｇ−Ｘ５−Ｆ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｙ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌ−Ａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｘ２４−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３
（配列番号１）
【００２５】
上記ペプチドでは、Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｉｂ（２−アミノイソ酪酸）またはＳａｒ（Ｎ−メチルグリシン）、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｘ７はＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｘ８はＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｕ、Ｘ９はＡｓｐまたはＧｌｕ、Ｘ１０はＬｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＴｙｒ、Ｘ１２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａ、Ｘ１４はＬｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、ＭｅｔまたはＶａｌ、Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕ、Ｘ１６はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＬｙｓ、Ｘ１９はＡｌａ、ＶａｌまたはＬｅｕ、Ｘ２０はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓ、Ｘ２１はＡｓｐまたはＧｌｕ、Ｘ２４はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＮｌｅ（ノルロイシン）、Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ２９はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ３０はＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ３１はＩｌｅまたは存在しない、Ｘ３２はＴｈｒまたは存在しない、Ｘ３３はＡｓｐまたは存在しない。
【００２６】
別の局面では、本発明は、上述のペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物の治療への使用に関する。さらに別の局面では、本発明は、上述のペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物における腸・脳関連疾患の治療への使用に関する。さらに別の局面では、本発明は、上述のペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物における短腸病の治療への使用に関する。
【００２７】
さらに他の局面では、本発明は、本発明による二重アゴニストペプチドと、少なくとも１つの医薬用または獣医学用賦形剤を含有する、医薬用または獣医学用組成物に関する。
【００２８】
本発明は、さらに他の局面では、本発明によるペプチドの製造方法に関するとともに、本発明によるペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００２９】
＜定義＞
本発明の文脈において、「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合で連結したアミノ酸モノマー鎖（「残基」と呼ぶ）を意味する。本発明によるペプチドは、該ペプチドの端部の各々に、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸残基を有する。好ましくは、Ｎ末端アミノ酸残基は、水素、メチル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、トリフルオロアセチルから選択されるＲ１基を含み、Ｃ末端アミノ酸残基は、ＮＨ２またはＯＨであるＲ２基を含む。本発明で用いる「ペプチド」には、１つまたは複数のアミノ酸モノマー鎖の医薬的に許容される塩類または溶媒和物が含まれる。
【００３０】
本発明の記載内容において、「ヒトＧＬＰ−１受容体へのアゴニスト活性」とは、例えば、後述の実験記載箇所で説明するように、適切なインビトロアッセイで判定される、ＧＬＰ−１受容体を活性化する能力を意味する。
【００３１】
本発明の文脈において、「ヒトＧＬＰ−１受容体への二重ペプチドの相対的アゴニスト活性」（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）とは、ＥＣ５０−濃度として測定される、当該化合物または二重ペプチドのＧＬＰ−１受容体への相対的活性を、同一条件下でＥＣ５０−濃度として測定される未変性ＧＬＰ−１の対応する活性と比較した値である。ＥＣ５０値は、特定のアッセイにおける最大活性の２分の１を達成するために要する濃度の尺度である。あるペプチドの特定の受容体（例えば、ＧＬＰ−１Ｒ）でのＥＣ５０が基準ペプチドのＥＣ５０よりも低い場合（同じアッセイで）、そのペプチドの該特定の受容体での作用強度は、基準ペプチドよりも高い。一例として、妥当なアッセイでの未変性ＧＬＰ−１Ｒ（基準）のＥＣ５０が、０．０１ｎＭであり、同一条件での二重ペプチドのＥＣ５０が０．０２である場合、この二重ペプチドの相対的活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、０．０１ｎＭ／０．０２ｎＭ＝０．５または５０％である。
【００３２】
本発明の文脈において、「ヒトＧＬＰ−２受容体へのアゴニスト活性」とは、例えば、後述の実験記載箇所で説明するように、妥当なインビトロＧＬＰ−１アッセイによって判定する、ＧＬＰ−２受容体を活性化する能力を意味する。
【００３３】
本発明の記載内容において、「ヒトＧＬＰ−２受容体への二重ペプチドの相対的アゴニスト活性」（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）とは、ＥＣ５０−濃度として測定される、当該化合物または二重ペプチドのＧＬＰ−２受容体への相対的活性を、同一条件下でＥＣ５０−濃度として測定される未変性ＧＬＰ−２の対応する活性と比較した値である。一例として、妥当なアッセイでの未変性ＧＬＰ−２ＲのＥＣ５０が、０．０１ｎＭであり、同一条件での二重ペプチドのＥＣ５０が０．１０ｎＭである場合、この二重ペプチドの相対的活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、０．０１ｎＭ／０．１０ｎＭ＝０．１または１０％である。
【００３４】
本発明の文脈において、「治療」は、被験者に発症している、または、発症する可能性がある望ましくない１つまたは複数の病態の内科治療および予防療法を包含することを意図する。よって、望ましくない病態とは、必ずしも、臨床的に治療を必要とする疾患または病態として、臨床的に分類される、または分類可能である必要はない。好ましくは、望ましくない病態を患う被験者は哺乳動物である。さらに好ましくは、望ましくない病態を患う被験者はヒトである。
【００３５】
本発明の文脈において、「血清アルブミン結合アミノ酸」は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸等、アミノ酸主鎖に血清アルブミン結合側鎖を付着させることで変性されたアミノ酸を意味する。血清アルブミン結合側鎖のアミノ酸主鎖への付着は、「脂質付加」と呼ばれることもある。
【００３６】
本発明の文脈において、「血清アルブミン結合側鎖」は、アミノ酸（残基）に付着させた側鎖を意味し、該側鎖は血清アルブミンに結合可能な官能基で構成されるか、そのような官能基を含有する。官能基は、側鎖におけるアルブミン結合バイオコアアッセイでの結合親和性が非脂質付加ペプチドと比較して大きくなると、本発明による血清アルブミンに結合可能である。アルブミン結合判定方法の別の一例では、米国特許出願公開第２０１１０２７５５５９号の記載にあるように、固定化アルブミンとマイクロタイタープレートを用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりペプチドの結合を測定することで、アルブミン結合を判定する。また、高アルブミン親和性をもつ誘導体を特定する別の間接的方法では、アッセイでのアルブミン濃度が低アルブミン濃度での結合と比較して高値の時に結合用量−応答曲線が右方向にシフトした類似体を選択する。（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８  （１８）：  ７３７０−７３８０）。本発明の好ましい一実施形態では、上記血清アルブミン結合側鎖は、脂質分子（脂質付加アミノ酸と呼ぶ）、コレステロール分子、または、シアル酸分子を含む。
【００３７】
本発明の文脈において、「脂質付加類似体」とは、請求項に定義した配列を有するペプチドの類似体を意味する。本発明による類似体は、１つまたは複数の、好ましくは１つのみの血清アルブミン結合アミノ酸残基と、１つまたは複数の血清アルブミン結合側鎖の導入（例えば、置換）により、その配列（請求項に定義したもの）が変化した（ずれ（deviation）の可能性）類似体である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明に至った各実験中、ＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２受容体への二重活性を付与する組成物によって、マウスの食餌量が他の治療群より減少し、同時に、腸重量が有意かつ相乗的に増大する、という驚くべき知見を得た。
【００３９】
こうして、上記組成物は、ヒトまたは動物の特定の疾患の治療、特に、腸および／または脳関連疾患の治療に好適に用いられるという結論に至った。
【００４０】
また、ＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２受容体両方に活性を有する二重ペプチドアゴニストの開発が可能であるという驚くべき知見を得た。
【００４１】
このように、本発明は、組成物と、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２受容体二重活性をもつペプチド、またはその脂質付加類似体に関する。ヒトＧＬＰ−１受容体への該組成物の相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への該組成物の相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、腸増殖を誘発するための使用では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．０１である。
【００４２】
また、本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体にアゴニスト活性を付与する第１のペプチドまたはその脂質付加類似体と、ヒトＧＬＰ−２受容体にアゴニスト活性を付与する第２のペプチドまたはその脂質付加類似体と、を含有する医薬用組成物に関し、該医薬用組成物において、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、各上記ペプチドは、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）を特徴とする。上記組成物の１つの好ましい局面では、上記第１のペプチドと第２のペプチドは、同じ（二重）ペプチドであり、共に、ＧＬＰ−１作用化合物とＧＬＰ−２作用化合物である。
【００４３】
また、上記組成物の１つの好ましい局面では、上記組成物のＧＬＰ−２作用化合物のＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅは少なくとも０．１、好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、より一層好ましくは少なくとも１である。
【００４４】
より好ましい１つの局面では、上記組成物の各化合物の相対的活性は、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０２、好ましくは少なくとも０．０３、より好ましくは少なくとも０．２、より一層好ましくは少なくとも０．５である。
【００４５】
より好ましい１つの局面では、上記組成物の各化合物の相対的活性は、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）、好ましくは（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞２（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）、より好ましくは（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞１０（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である。
【００４６】
ＧＬＰ−１類似体リラグルチドの相対的ＧＬＰ−１活性は０．１である。ＧＬＰ−２類似体テデュグルチドの相対的ＧＬＰ−２活性は≧１．０である。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＧＬＰ−１受容体とヒトＧＬＰ−２受容体への二重アゴニスト活性を有するペプチドに関し、該ペプチドにおいて、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である。また、本発明は、上記ペプチドの脂質付加類似体に関する。
【００４８】
また、本発明は、上記ペプチドの医薬的に許容される塩類および溶媒和物に関する。
本発明によるペプチドの二重活性は、ヒトＧＬＰ−１受容体とヒトＧＬＰ−２受容体への活性であり、ヒトＧＬＰ−１受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、ヒトＧＬＰ−２受容体への上記二重ペプチドの相対的アゴニスト活性（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１であり、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は少なくとも０．０１である。または、その医薬的に許容される塩類または溶媒和物。
【００４９】
未変性ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１ＲへのＥＣ５０は（殆どのアッセイにおいて）、未変性ＧＬＰ−２のＧＬＰ−２ＲへのＥＣ５０よりも低値である。したがって、本発明の特定のいくつかの局面では、ＧＬＰ−２活性は相対的に高いことが好ましい。本発明の１つの好ましい局面では、ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅは少なくとも０．１である。本発明のさらに好ましい１つの局面では、ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅは少なくとも０．２である。本発明のより一層好ましい１つの局面では、ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅは少なくとも０．３である。本発明のより一層好ましい１つの局面では、ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅは少なくとも１．０である。
【００５０】
本発明によるペプチドは、実質的に二重の活性をもつこと、すなわち、併用活性が可及的に高いことがより好ましい。これにより、本発明の１つの好ましい局面では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．０２である。本発明のより好ましい１つの局面では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．０３である。本発明のさらに好ましい１つの局面では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．２である。本発明のより一層好ましい１つの局面では、（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）は、少なくとも０．５である。
【００５１】
上記各局面に相応する本発明の１つの好ましい局面では、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である。本発明のさらに好ましい１つの局面では、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞２（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である。本発明のより一層好ましい１つの局面では、（ＧＬＰ−２Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）＞１０（ＧＬＰ−１Ｒｒｅｌａｔｉｖｅ）である。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、または、上記配列番号１のアミノ酸配列からのずれが２以下である脂質付加ペプチド類似体、または、その医薬的に許容される塩または溶媒和物に関する。
Ｈ−Ｘ２−Ｄ−Ｇ−Ｘ５−Ｆ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｙ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌ−Ａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｘ２４−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３（配列番号１）
【００５２】
この場合、Ｘ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｉｂ（２−アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ−メチルグリシン）、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、
Ｘ７は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、
Ｘ８は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、
Ｘ１２は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、
Ｘ１４は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、
Ｘ１５は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｘ１６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
Ｘ１９は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、
Ｘ２１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｘ２４は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ２７は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、
Ｘ２８は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ２９は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３０は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３１は、Ｉｌｅまたは存在しない、
Ｘ３２は、Ｔｈｒまたは存在しない、
Ｘ３３は、Ａｓｐまたは存在しない。
【００５３】
本発明の１つの好ましい局面では、上記ペプチドは、そのＮ末端残基に、水素、メチル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、または、トリフルオロアセチルであるＲ１基を含み、そのＣ末端残基に、ＮＨ２またはＯＨであるＲ２基を含む。
【００５４】
本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ７はＴｈｒ、Ｘ９はＧｌｕ、Ｘ１９はＡｌａである。
これにより、本発明の１つの好ましい局面では、上記ペプチドは、配列番号２のペプチド配列、または、その脂質付加ペプチド類似体を含有する、あるいは該ペプチド類似体で構成される。
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｘ８−Ｅ−Ｘ１０−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｘ１６−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｘ２４−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｒ２（配列番号２）
【００５５】
Ｒ１は、水素、メチル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、または、トリフルオロアセチルであり、Ｒ２は、ＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ８は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、
Ｘ１６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
Ｘ２４は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
Ｘ３１は、Ｉｌｅまたは存在しない、
Ｘ３２は、Ｔｈｒまたは存在しない、
Ｘ３３は、Ａｓｐまたは存在しない。
【００５６】
本発明の別の好ましい局面では、Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒであり、より好ましい１つの局面では、Ｘ８はＳｅｒである。本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ１０はＬｅｕまたはＮｌｅ（ノルロイシン）である。
【００５７】
本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ１６はＡｌａまたはＡｓｎである。
【００５８】
本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ２４はＡｌａまたはＡｓｎである。
【００５９】
本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ３１とＸ３２とＸ３３はＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐである。
【００６０】
本発明の１つの好ましい局面では、Ｘ３１とＸ３２とＸ３３は存在しない。
【００６１】
本発明の最も好ましい局面の１つにおいて、上記ペプチドは以下の配列番号から選択される。
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号３）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号４）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号５）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号６）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号７）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号８）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号９）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１０）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１１）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号１２）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１３）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１４）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号１５）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１６）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１７）、および
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１８）。
【００６２】
本発明のより好ましい１つの局面では、上記ペプチドは配列番号３〜７のペプチドから選択される。
【００６３】
本発明のより好ましい１つの局面では、上記ペプチドは配列番号３のペプチド、または、その脂質付加類似体である。
【００６４】
本発明のより好ましい１つの局面では、上記ペプチドは配列番号６のペプチド、または、その脂質付加類似体である。
【００６５】
本発明の特に好ましい各実施形態では、上記ペプチドは、１つまたは複数の、好ましくは１つのみの血清アルブミン結合側鎖を含む。好ましくは、上記血清アルブミン結合側鎖は、第１級アミノ基を含有する、リシン（すなわち、ε−Ｎ−アルキル化リシン）、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、オルニチン、Ｏ−アミノプロピルセリン、または、より長いＯ−アルキル化セリンの側鎖等、アミノ酸残基の側鎖に付着される。
【００６６】
好ましくは、上記血清アルブミン結合アミノ酸残基は、配列番号１の配列に置換として挿入され、これにより、配列番号１のアミノ酸配列は変化する（可能性がある）（本発明では、配列番号１の配列からの「ずれ」（deviation）として理解する）。こうしてもたらされたずれにより、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２受容体活性に関するペプチドの特性が影響を受けるが、その結果生ずる血清アルブミン結合ペプチドが本発明の範囲から逸脱することはない。１つまたは複数の血清アルブミン結合側鎖を導入することで、ＧＬＰ−１および／またはＧＬＰ−２受容体活性の低減（する可能性）と引き換えに、インビボでの半減期延長の見込みがあることは、当業者の理解の範疇である。
【００６７】
血清アルブミン結合アミノ酸残基は、１つの血清アルブミン結合側鎖を含む。好ましくは、本発明による血清アルブミン結合側鎖は、脂質分子を含む側鎖である。広義では、本発明による１つの血清アルブミン結合側鎖を含むアミノ酸残基は、脂質付加アミノ酸残基である。
【００６８】
一実施形態では、上記血清アルブミン結合側鎖は、少なくとも１４個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み、上記アルキル鎖は遠位カルボン酸基または遠位テトラゾール基を含み、また、上記アルキル鎖は近位カルボニル基を含む。
【００６９】
一実施形態では、血清アルブミン結合側鎖は以下から選択される構造Ａを含む。
【００７０】
【化１】
2017537894.tif 000002
【００７１】
この構造Ａにおいて、ａは少なくとも１０である。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態では、血清アルブミン結合側鎖は、Ａ−Ｂ−Ｃ−と、Ａ−Ｂ−と、Ａ−Ｃ−から成る群から選択され、Ａは以下から選択される。
【００７３】
【化１】
2017537894.tif 000003
【００７４】
この構造Ａにおいて、ａは１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、および、１８から成る群から選択され、Ｂは以下から選択される。
【００７５】
【化２】
2017537894.tif 000004
【００７６】
この構造Ｂにおいて、
ｂは０、１、及び２から成る群から選択され、
ｃは０、１、及び２から成る群から選択され、
ｄは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２から成る群から選択され、
Ｃは、少なくとも１つのＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、オルニチン、シトルリン、８−アミノ−３，６−ジオクタン酸、または、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサオクタデカン酸分子等の、スペーサ分子である。
本発明に従う血清アルブミン結合側鎖は、例えば国際公開第２０１１／０５８１６５号に記載されている。
【００７７】
構造Ａ−Ｂ−Ｃ−の一例を以下に示す。
【００７８】
【化３】
2017537894.tif 000005
【００７９】
構造Ａ−Ｂ−の一例を以下に示す。
【００８０】
【化４】
2017537894.tif 000006
【００８１】
構造Ａ−Ｃ−の一例を以下に示す。
【００８２】
【化５】
2017537894.tif 000007
【００８３】
一実施形態では、上記血清アルブミン結合側鎖は、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、または、ドデカン二酸等の、少なくとも１つのジカルボン酸を含む。
【００８４】
特に好ましい一実施形態では、上記血清アルブミン結合側鎖は、リシン残基に付着した構造Ａ−Ｂで構成される。
【００８５】
上述の実施形態の特に好ましい一例を以下に示す。この場合、Ａは以下であり、
【００８６】
【化６】
2017537894.tif 000008
【００８７】
この場合、Ｂはリシン残基に付着した以下の構造である。
【００８８】
【化７】
2017537894.tif 000009
【００８９】
特に好ましいアミノ酸側鎖（Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）と呼ぶ）を以下に示す。
【００９０】
＜Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）＞
【化８】
2017537894.tif 000010
【００９１】
ジカルボン酸の遠位端の負の電荷は、ペプチドの血清アルブミンへの親和性を高めると考えられる。一実施形態では、脂肪二酸またはテトラゾールは、負に帯電したアミノ酸、例えば、Ｌ−γ−グルタミン等のスペーサに付着させてもよい。一実施形態では、任意にジカルボン酸またはテトラゾール基を含むアルキル鎖を、スペーサに付着させてもよい。一実施形態では、任意にジカルボン酸またはテトラゾール基を含む結合アルキル鎖と負に帯電したアミノ酸を、スペーサを用いて分離してもよい。
【００９２】
１つの好ましい局面では、本発明には、上述で列記した配列番号１〜１８の脂質付加ペプチド類似体が含まれ、上記脂質付加ペプチドは、少なくとも１つの脂質付加アミノ酸残基を含む。上記脂質付加ペプチドは、脂質付加がペプチドの受容体活性に及ぼす影響を最小限に抑えるため、１つのみの脂質付加アミノ酸残基を含むことが、好ましい。
【００９３】
上述の各例に示すように、配列番号６をもつペプチドを基に、血清アルブミン結合側鎖を、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７、および、Ｘ２０の位置で導入すると、官能性ペプチドが得られる。
【００９４】
これにより、本発明の好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号１のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７、および、Ｘ２０の各位置から選択される１つの位置でアミノ酸残基に導入される脂質付加を含む。
【００９５】
本発明の好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号１のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７、および、Ｘ２０の各位置から選択される１つの位置で、アミノ酸残基を脂質付加血清アルブミン結合アミノ酸残基と置換することで導入される脂質付加を含む。
【００９６】
本発明のより好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号１のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、および、Ｘ１７の各位置から選択される１つの位置でアミノ酸残基に導入される脂質付加を含む。
【００９７】
本発明のより好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号１のペプチドの脂質付加類似体であり、該脂質付加は、Ｘ１４またはＸ１７の位置でアミノ酸残基に導入される。
【００９８】
本発明の特に好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号６のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７、および、Ｘ２０の各位置から選択される１つの位置でアミノ酸残基に導入される脂質付加を含む。
【００９９】
本発明の特に好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号６のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７、および、Ｘ２０の各位置から選択される１つの位置でアミノ酸残基に導入される脂質付加を含む。
【０１００】
本発明の特に好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号６のペプチドの脂質付加類似体であり、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１６、および、Ｘ１７の各位置から選択される１つの位置でアミノ酸残基に導入される脂質付加を含む。
【０１０１】
本発明の特に好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号６のペプチドの脂質付加類似体であり、該脂質付加は、Ｘ１４またはＸ１７の位置でアミノ酸残基に導入される。
【０１０２】
詳しくは、特に好ましい配列番号６のペプチドの脂質付加類似体は、以下の配列番号から選択される。
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号１９）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２０）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２１）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２２）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２３）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２４）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２５）、および
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２６）。
【０１０３】
配列番号６のペプチドの脂質付加類似体は、配列番号２３を有するペプチドであることが特に好ましい。
【０１０４】
これとは別の配列番号６のペプチドの特に好ましい脂質付加類似体は、配列番号２５を有するペプチドである。
【０１０５】
実験記載箇所に示すように、本発明による二重組成物またはペプチドは、有益な薬理学的効果をもたらすことが驚くべきことに確認された。これにより、本発明は、さらに、上述の本発明による二重ペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物の治療や予防療法への使用に関する。
【０１０６】
詳しくは、本発明は、上述の本発明による二重組成物またはペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物の腸・脳関連疾患の治療や予防療法への使用に関する。本発明は、さらに、上述の本発明による二重ペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物における、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２の両方に関連する疾患の治療や予防療法への使用に関する。
【０１０７】
詳しくは、本発明は、上述の本発明によるＧＬＰ１Ｒ−ＧＬＰ２Ｒ二重アゴニスト組成物またはペプチドの、被験者としてのヒトまたは動物の胃腸関連疾患のみならず、消化管疾患の治療や予防療法への使用に関する。消化管疾患には、食道の上部消化管の疾患が含まれる。胃腸関連疾患には、すべての病因を含む潰瘍全般（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー＝エリソン症候群、薬剤性潰瘍、感染症または他の病原に関連する潰瘍）、消化系傷害、吸収不良、短腸症候群、ダグラス窩症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、セリアック病、低ガンマグロブリン血症性スプルー、化学療法および／または放射線療法起因性の粘膜炎および下痢、が含まれる。
【０１０８】
さらに、本発明による上述の二重組成物またはＧＬＰ１ＲーＧＬＰ２Ｒアゴニストペプチドは、代謝症候群、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防や治療、また、肝臓、脂肪、膵臓、腎臓、腸を含む代謝上重要な組織の炎症予防や治療にも有用である。特に、本発明によるペプチドは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に有効であると考えられる。
【０１０９】
さらに、組織修復の主要な燃料であるグルコースの加速合成は、外科処置後の重要な代謝性変化であり、体タンパク質と貯蔵エネルギーを消費して発生する（Ｇｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．１９７４，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  １４：３７８−８８；Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８２，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．  １９６：４２０−３５）。以前は、こういった変化は、外傷に応答して放出される糖調節ストレスホルモンと、サイトカイン等の他の異化要因に起因するものとされていた。異化作用に至る変化が大きくなるにつれて、合併症の罹患率は高くなり、患者の回復が遅れる（Ｔｈｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．  １５９：５９３−９９；Ｃｈｅｒｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．  １４７：１２７３−８）。このように、本発明による上述の二重組成物およびＧＬＰ１ＲーＧＬＰ２Ｒアゴニストペプチドは、外科手術の外傷の予防または治療にも有用であり、外科手術の外傷に起因する異化反応およびインスリン抵抗性を抑えて外科処置後の回復を促す。
【０１１０】
詳しくは、本発明による組成物とペプチドは、被験者としてのヒトまたは動物の治療または予防療法に好適に用いられる。この場合、上述の治療または予防療法は、短腸症候群に関連する病態の治療または予防療法である。
【０１１１】
これにより、本発明は、本発明によるペプチドと、少なくとも１つの医薬用または獣医学用賦形剤を含有する、医薬用または獣医学用組成物に関する。
【０１１２】
本発明の二重類似体、またはその塩類または誘導体は、保管または投与用に調製した医薬用組成物として製剤化され、本発明のペプチド、またはその塩または誘導体の治療有効量を、医薬的に許容される担体に含有する。
【０１１３】
当業者であれば、ペプチド医薬品を含む好適な医薬用製剤または組成物の調製は熟知している。
【０１１４】
本発明は、さらに、本発明によるペプチドまたは組成物の、被験者としてのヒトまたは動物の医学的または獣医学的治療への使用に関する。
【０１１５】
本発明による医薬用または獣医学用組成物は、単位用量の形態で供されることが、好ましい。
【０１１６】
本発明は、さらに、本発明によるペプチドまたは組成物を被験者としてのヒトまたは動物に投与することを含む、被験者としてのヒトまたは動物の治療方法に関する。
【０１１７】
＜製造方法＞
本発明の類似体は、固相または液相ペプチド合成により合成することが、好ましい。上述のような合成は当業者には周知である。
【０１１８】
しかし、二重類似体は様々な方法で合成してもよく、例えば、方法は以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含む方法で合成してもよい。
（ａ）  ペプチドを固相または液相ペプチド合成手段で合成し、得られた合成ペプチドを回収する；
（ｂ）  ペプチドが天然のアミノ酸で構成される場合、該ペプチドをコードする核酸コンストラクトを宿主細胞に発現させ、該発現生成物を宿主細胞培養物から回収する；
（ｃ）  ペプチドが天然のアミノ酸で構成される場合、ペプチドをコードする核酸コンストラクトの無細胞インビトロ発現を起こし、該発現生成物を回収する；
または、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の各工程を組み合わせて、ペプチドの断片を得た後、各断片を結合（例えば、結紮）することでペプチドを得て、これを回収してもよい。
【０１１９】
このように、本発明は、さらに、本発明のペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子に関する。
【０１２０】
また、本発明は、本発明のペプチドの製造方法に関し、該方法は、上述の核酸分子を発現させ、産生した生成物を精製する工程を含む。
【０１２１】
＜実施例＞
＜実施例１：ペプチド合成および精製＞
ペプチドはすべて、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）をＮ−α−アミノ保護基として、また、側鎖機能性に好適な一般の保護基を用いて、固相ペプチド合成によって合成した。各合成は、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  Ｒａｍ樹脂（０．１ｍｍｏｌのスケール、０．２４ｍｍｏｌ／ｇの添加）を用いて、ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ  ＳｙｒｏＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ）で行った。結合は、Ｎ，Ｎ‘−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を結合剤として、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅを添加剤として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で用いて、行った。結合は、室温で２×２時間行った。各結合後、該樹脂を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（２×２．５ｍｌ）と、ジクロルメタン（２．５ｍｌ）と、ＮＭＰ（２×２．５ｍｌ）で洗浄した。Ｎ−α−脱保護には、ＮＭＰ中のピペリジン（４０％）を上記樹脂に加えた最初の脱保護（３分間）の後、ＮＭＰ中のピペリジン（２０％）を用いて２回目の脱保護を１７分間行った。この樹脂を、ＮＭＰ（２×２．５ｍｌ）と、ジクロルメタン（２．５ｍｌ）と、ＮＭＰ（２×２．５ｍｌ）で洗浄した。脂質付加は、Ｌｙｓのεアミンに部位選択的付着を行った。Ｌｙｓは、Ａｌｌｏｃで側鎖保護した。最後のＮ末端位置のアミノ酸（Ｈｉｓ）は、ＢｏｃでＮ保護した。Ａｌｌｏｃ基を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）とジメチルアミンボラン錯体を脱ガス化ジクロルメタン中で用いて、室温で２時間かけて除去した。ＤＣＭと、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンと、ＮＭＰで十分に洗浄後、脂質付加を手作業による合成で行った。ＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸塩Ｎ−酸化物）を結合試薬として、ＤＩＥＡを母材として、各結合を行った後、Ｆｍｏｓの除去をＮＭＰ中の２０％ピペリジンを用いて行った。
【０１２２】
固体支持体からのペプチドの開裂と、アミノ酸側鎖脱保護のため、上記樹脂をジクロルメタンで洗浄し、室温で３０分間乾燥させた。その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリエチルシラン（ＴＥＳ）／水（９５／２．５／２．５、室温で２時間）を用いて、樹脂を処理した。このＴＦＡ−ペプチド混合物を回収してジエチルエーテルを加え、未精製のペプチドを析出させた。遠心分離とデカンテーションにより、エーテルを除去した。各ペプチドは、ＡＸＩＡ  パックド  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸカラム（５μｍ、Ｃ−１８、１１０A、３０−１００ｍｍ）と、自動分取装置を搭載したＷａｔｅｒｓ  １５０  ＬＣシステムと、バッファＡ（水中の０．１％ＴＦＡ）に５〜６０％勾配のバッファＢ（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を加えたものを用いて、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ法により、３０ｍｌ／分で３５分間かけて精製した。バッファＡ（水中の５％アセトニトリル、０．１％蟻酸）に０〜１００％勾配のバッファＢ（アセトニトリル中に５％水、０．１％蟻酸）を加えたものを用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ（Ｃ−１８  １．７μｍ，  ２．１−１００ｍｍ）を搭載したＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）により、精製後のペプチドを６分間かけて判定した。すべてのペプチドは、ＵＶにより、９５％を超える純度と判定された。
【０１２３】
上述の技術で以下の各化合物を合成した。
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号３）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号４）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号５）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号６）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号７）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号８）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号９）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１０）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１１）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号１２）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１３）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１４）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ-Ｒ２
（配列番号１５）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１６）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ-Ｒ２
（配列番号１７）、
Ｒ１-Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−［Ｎｌｅ］−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号１８）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号１９）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２０）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２１）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２２）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２３）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２４）、
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２５）、および
Ｒ１−Ｈ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−［Ｋ（Ｃ１６−ｙＥ−）］−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｉ−Ｑ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｒ２
（配列番号２６）。
【０１２４】
＜実施例２：ＧＬＰ１とＧＬＰ２受容体の効能アッセイ＞
インビトロ機能性検査を、Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（ベルギー）またはＤｉｓｃｏｖｅＲｘ（米国）のいずれかで行った。基準化合物である未変性ヒトＧＬＰ−１とＧＬＰ−２と並行して、用量応答曲線を行った。その結果を表１と表２に例示する。
【０１２５】
【表１】
2017537894.tif 000011
【０１２６】
【表２】
2017537894.tif 000012
【０１２７】
＜実施例３：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腸増殖への効果＞
＜未変性ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２を用いたＰｏｃ研究１＞
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを４０匹、Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）から購入した。−１日目に記録した体重に基づき、各マウスを以下に示す４つの研究群（１群当たりｎ＝１０）に無作為に分けた。
第１群：ビヒクル、ＢＩＤ、ＳＣ。
第２群：未変性ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７〜３６）−アミド）、３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。
第３群：未変性ＧＬＰ−２、３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。
第４群：未変性ＧＬＰ−１、３．０ｍｇ／ｋｇ＋未変性ＧＬＰ−２、３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。
投与量は、５ｍｌ／ｋｇ、ＳＣであった。各化合物は、３％のマンニトールと、０．６％のＬ−Ｈｉｓ（ｐＨ９．０）を含むＰＢＳバッファに溶解した。腰部に皮下注射を行った。８日目に、各マウスを断命し、ＧＩ管を取り出して重量を判定した。腸の湿重量の結果を表３に示す。
【０１２８】
【表３】
2017537894.tif 000013
【０１２９】
＜結果＞
以上のデータによれば、未変性ＧＬＰ−２を７日間投与するだけで、ビヒクルでの処置と比較して、腸重量が約２５％も大きく増加させることができる。驚くべきことに、未変性ＧＬＰ−２を未変性ＧＬＰ−１と同時投与することで、さらに約３４％の腸重量の増加が得られる（表３）。同時治療後の腸重量のさらなる増加は、未変性ＧＬＰ−２のみでの治療と比較して、統計的に有意である。（Ｐ＝０．０１５、スチューデント検定）。
【０１３０】
＜実施例４：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの急性食餌への効果＞
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、本研究開始の７日前に到着した。到着前の上記期間、各被験動物は毎日、実験パラダイムに慣れるよう指導を受けた。一日目に、各マウスを体重別に無作為に分け、以下の薬剤治療群（各群のｎ＝６〜８）の１つに参加させた。
第１群：ビヒクル、
第２群：リラグルチド０．２ｍｇ／ｋｇ、
第３〜５群：配列番号３３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇ、
第６〜８群：配列番号４、３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇ、
第９〜１１群：配列番号５、３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇ、
第１２〜１４群：配列番号６、３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇ、
第１５〜１７群：配列番号７、３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇ。
投与開始３日前に、すべての被験動物を、毎日皮下注射の練習（背部の皮膚をつまむ）を行うことで、実験条件に慣れさせた。研究に先立って、基準の食餌を４日間観察した。−１日目に、各マウスを体重別に無作為に分けた。各被験動物には、２回の異なる注射を施した。第１回目の急性用量は０日目の消灯前に投与し、食餌を投与後２４時間監視した。３日目に、各マウスを新たな治療群に無作為に分け直し、消灯前に投与を行った。投与後２４時間、食餌摂取量を観察した。−５日目から研究が終了するまで、毎日体重を測定した。本研究は５日目に終了した。ＳＣでの類似体の３．０、１．０、０．３ｍｇ／ｋｇと、０．２ｍｇ／ｋｇのリラグルチドの投与を行った。投与は、午後の消灯前（１３時３０分〜１４時００分）に、皮下的に行った（用量５ｍｌ／ｋｇ）。デジタル計量セルを用いるオンラインのコンピュータ給餌システムである、ＨＭ−２システムを用いて、食餌のデータを収集した。−７日目から研究が終了するまで、食餌量と体重を測定した。３％のマンニトールと０．６％のＬ−Ｈｉｓをリン酸塩バッファ生理食塩水に溶解し、ｐＨを９．０に調整して、ビヒクルを調製した。結果を表４に示す。
【０１３１】
【表４】
2017537894.tif 000014
【０１３２】
＜結果＞
試験を行った配列番号３〜７は、ビヒクル治療対照群と比較して、すべての試験量で、４．５時間後に食餌摂取量が減少した。さらに、配列番号６（０．３〜３ｍｇ／ｋｇ）の単回投与と、配列番号７（１〜３ｍｇ／ｋｇ）の単回投与と、配列番号３〜５（３ｍｇ／ｋｇ）の単回投与は、ビヒクル治療対照群と比較して、４．５時間後に食餌量が有意に減少した。
【０１３３】
上記結果によれば、４．５時間後の食餌量を最も効果的に抑制するのは、配列番号６（表４）であり、これは作用強度が最大の二重アゴニストと、作用強度が最大のＧＬＰ−２受容体アゴニストである（表１）。この結果は、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２の二重受容体活性により、食餌量が減少することを示している。
【０１３４】
＜実施例５：ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２ペプチドの組合せのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腸増殖への効果＞
＜プロトコール手順全般＞
デンマークのＴａｃｏｎｉｃから入手した４０匹（ｎ＝１０、４群）の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。実験を行う時点で、各マウスはすでに９〜１０週齢に達していた。マウスを新しい環境に１週間順化させ、通常のチャウ飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４，Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ  Ａ／Ｓ、デンマーク）と、家庭用水道水を与えた。研究の間、各被験動物を、２匹ずつ１つのケージに入れ、調光と温度・湿度管理を施した部屋で飼育した（１２時間点灯−１２時間消灯のサイクル、午前４時と午後４時に点灯・消灯、２２±１℃、相対湿度５０±１０％）。−１日目に記録した体重に基づき、各マウスを４つの研究群に無作為に分けた。該被験動物は、到着後、埋込み式マイクロチップ（Ｐｅｔ  ＩＤマイクロチップ、Ｅ−ｖｅｔ）で一意に特定した。ＨＭ０２Ｌａｂソフトウェア（Ｅｌｌｅｇａａｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆａａｂｏｒｇ、デンマーク）を実行させたノートパソコンに接続したＷＳ−２重量検査所（ＭＢｒｏｓｅ  ＡｐＳ、Ｆａａｂｏｒｇ、デンマーク）を用いて、各被験動物を特定した。このＨＭ０２Ｌａｂソフトウェアは、体重とＩＤを照合し、用量を体重から直接計算する。実験に先立って、すべてのマウスを作業と注射になれるよう３日間世話した。
【０１３５】
＜既知のＧＬＰ−１類似体リラグルチドとＧＬＰ−２類似体テデュグルチドを用いたＰｏＣ研究２＞
−１日目に記録した体重に基づき、各マウスを以下に示す４つの研究群（１群当たりｎ＝１０）に無作為に分けた。各群は、第１群のビヒクル、ＢＩＤ、ＳＣ、第２群のリラグルチド０．２ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第３群のテデュグルチド１．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第４群のリラグルチド０．２ｍｇ／ｋｇとテデュグルチド１．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。投与量は、５ｍｌ／ｋｇ、ＳＣであった。各化合物を、３％のマンニトールと０．６％のＬ−Ｈｉｓを含有するＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）に溶解し、最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌとした。１ｍｌ容量のシリンジ（ｌｕｅｒ−ｌｏｃｋ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ）に接続した２７ｇ×５／８”針（Ｍｏｎｏｊｅｃｔ（商標）、Ｋｅｎｄａｌｌ）で、各被験動物に投与を行った。腰部に皮下注射を行った。８日目に、各マウスを断命し、ＧＩ管を取り出して重量を判定した。腸の湿重量の結果を表５に示す。小腸重量（表６）と大腸重量（表７）の結果と、小腸全長（表８）と大腸全長（表９）の結果を、以下に示す。
【０１３６】
【表５】
2017537894.tif 000015
【０１３７】
【表６】
2017537894.tif 000016
【０１３８】
【表７】
2017537894.tif 000017
【０１３９】
【表８】
2017537894.tif 000018
【０１４０】
【表９】
2017537894.tif 000019
【０１４１】
＜結果＞
本データによれば、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドは、腸の湿重量の増加（表５）と、小腸重量の増加（表６）と、小腸全長の増大（表８）と、大腸全長の増大（表９）をもたらす。また、本データによれば、ＧＬＰ−２類似体テデュグルチドは、腸の湿重量の増加（表５）と、小腸重量の増加（表６）と、小腸全長の増大（表８）をもたらす。
【０１４２】
しかし驚くべきことに、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドとＧＬＰ−２類似体テデュグルチドの併用治療は、腸の湿重量（表５）と小腸重量（表６）と大腸重量（表７）にも、大腸全長（表９）に対しても、相乗効果をもたらすことが示される。
【０１４３】
＜実施例６＞
＜ＧＬＰ１ＲーＧＬＰ２Ｒ二重アゴニスト化合物の研究＞
−１日目に記録した体重に基づき、各マウスを以下に示す４つの研究群（１群当たりｎ＝１０）に無作為に分けた。各群は以下の通りである。第１群  ビヒクル、ＢＩＤ、ＳＣ、第２群  テデュグルチド３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第３群  配列番号３、３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第４群  配列番号６、３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。投与量は、５ｍｌ／ｋｇ、ＳＣであった。各化合物を、３％のマンニトールと０．６％のＬ−Ｈｉｓを含有するＰＢＳバッファに溶解し、最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌとし、ｐＨを９．０に調整した。１ｍＬ容量のシリンジ（ｌｕｅｒ−ｌｏｃｋ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ）に接続した２７ｇ×５／８”針（Ｍｏｎｏｊｅｃｔ（商標）、Ｋｅｎｄａｌｌ）で、各被験動物に投与を行った。背下部に皮下注射を行った。表１０に累積食餌摂取量を示す。
【０１４４】
【表１０】
2017537894.tif 000020
【０１４５】
＜結果＞
一日２回投与を７日間行った配列番号３と配列番号６は、ビヒクルとテデュグルチド治療対照群と比較して、累積食餌量が著しく低下した。
【０１４６】
＜実施例７＞
７日目に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。経口グルコース負荷の前に４時間、飼料を撤去して各被験動物を軽く絶食させた。ＯＧＴＴに先だって、２時間、ビヒクル（ＳＣ）の投与と各化合物の皮下（ＳＣ）投与を行った。各マウスに、ｔ＝０で、経口グルコース負荷（２ｇ／ｋｇ、４ｍＬ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｍＬ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、スウェーデン）を課した。用量の正確を期すため、グルコースは、シリンジに接続した胃留置チューブを介して、胃管栄養として与えた。グルコース投与前（ｔ＝−１２０分、０分、基準）と、ｔ＝１５、３０、６０、１２０分でのグルコース投与後に、血糖を尾静脈血から測定した。血液サンプル（尾静脈血）を１０μＬ容量のヘパリン加ガラス毛細管（heparinized glass capillary tube）へ採取し、直ちにバッファ（０．５ｍＬのグルコース／乳酸塩システム溶液（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）に懸濁させ、ＢＩＯＳＥＮ  ｃ−Ｌｉｎｅグルコース計測器（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いて、メーカの指示に従い、グルコースの分析を試験日に行った。ＯＧＴＴによる結果を表１１に示す。
【０１４７】
【表１１】
2017537894.tif 000021
【０１４８】
＜結果＞
一日２回投与を７日間行った配列番号３と配列番号６は、ビヒクルとテデュグルチド治療対照群と比較して、空腹時血糖が著しく低下した。
【０１４９】
＜実施例８＞
研究８日目に、各マウスを断命し、ＧＩ管を取り出して腸の湿重量を判定した。腸の湿重量の結果を表１２に示す。
【０１５０】
【表１２】
2017537894.tif 000022
【０１５１】
＜結果＞
一日２回投与を８日間行った配列番号３と配列番号６は、ビヒクルとテデュグルチド処理対照群と比較して、腸の湿重量が著しく増加した。
【０１５２】
＜実施例９：食餌性肥満（ＤＩＯ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの体重および腸増殖への効果＞
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（７週齢）を３０匹、Ｔａｃｏｎｉｃ（デンマーク）から購入し、Ｇｕｂｒａの動物飼育装置に移した。順化期間中、各ラットを２匹ずつ１つのケージに入れ、１２時間の点灯・消灯サイクル（０４時００分〜１６時００分点灯）および温度制御条件下（２２±１℃、相対湿度５０±１０％）に置いた。本研究を通して、通常のチャウ飼料であるＡｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４  ｒｏｄｅｎｔ（Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、デンマーク）と、チョコレートスプレッド（Ｎｕｔｅｌｌａ、Ｆｅｒｒｅｒｏ、イタリア）、ピーナッツバターおよび通常の粉末状チャウ飼料であるＡｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４  ｒｏｄｅｎｔ（Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、デンマーク）からなるペーストの２種類の飼料を用意し、各ラットが自由に選択可能とした。各被験動物は、実験作業前の６５週間、上記食餌を続けた。また、研究期間（−６日目〜２５日目）を通して、各被験動物を個別飼育に切り換えた。
【０１５３】
各被験動物を、−１日目に記録した体重に基づき、３つの研究群（１群当たりｎ＝１０）に無作為に分け、以下の各群の１つに参加させた。第１群  ビヒクル、ＳＣ、ＢＩＤ、第２群  配列番号６、８２ｎｍｏｌ／ｋｇ（２〜７日目）、１６４ｎｍｏｌ／ｋｇ（８〜１４日目）、および、３２８ｎｍｏｌ／ｋｇ（１５〜２５日目）、ＳＣ、ＢＩＤ、第３群  リラグルチド、８２ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＳＣ、ＢＩＤ。３％のマンニトールと０．６％のＬ−Ｈｉｓをリン酸塩バッファ生理食塩水に溶解し、ｐＨを９．０に調整して、ビヒクルを調製した。投与は、午前中（０６：００〜０８：００時）と午後の消灯前（１３：３０〜１４：００時）に行った。用量は１ｍＬ／ｋｇで、皮下的に投与した。実験作業に先だって、すべてのマウスを作業と手順になれるよう指導した。−３日目から２５日目の終了日まで、体重を測定した。総体脂肪質量を、研究開始前（−１日目）と終了前（研究開始後２５日目）に、非侵襲的ＥｃｈｏＭＲＩ−９００（ＥｃｈｏＭＲＩ、米国）により分析した。研究開始後２３日目に、各ラットに経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。経口グルコース負荷の前に４時間、すべての飼料を撤去して各被験動物を軽く絶食させた。ＯＧＴＴに先だって、２時間、ビヒクルと各化合物を皮下（ＳＣ）投与した。各マウスに、ｔ＝０で、経口グルコース負荷（２ｇ／ｋｇ、４ｍｌ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｍｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、スウェーデン）を課した。用量の正確を期すため、グルコースは、シリンジに接続した胃留置チューブを介して、胃管栄養として与えた。グルコース投与前（ｔ＝−１２０分、０分、基準）と投与後（ｔ＝１５、３０、６０、１２０分）に、血糖を尾静脈血から測定した。血液サンプルを１０μＬ容量のヘパリン加ガラス毛細管へ採取し、直ちにバッファ（０．５ｍｌのグルコース／乳酸塩システム溶液（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）に懸濁させ、ＢＩＯＳＥＮ  ｃ−Ｌｉｎｅグルコース計測器（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いて、メーカの指示に従い、グルコースの分析を試験日に行った。２５日目に、各ラットを断命し、ＧＩ管を取り出した。それぞれの腸を生理食塩水で洗浄して計量後、４％のＰＦＡに固定して、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ５（３）：３４７-５８）に記載するような立体解析学的方法によって、小腸と大腸の体積を判定した。
【０１５４】
体重の結果を表１３に示す。体脂肪の全質量を表１４に示し、ＯＧＴＴの結果を表１５に示す。最後に、小腸と大腸の体積の結果を表１６と１７に示す。
【０１５５】
【表１３】
2017537894.tif 000023
【０１５６】
【表１４】
2017537894.tif 000024
【０１５７】
【表１５】
2017537894.tif 000025
【０１５８】
【表１６】
2017537894.tif 000026
【０１５９】
【表１７】
2017537894.tif 000027
【０１６０】
＜結果＞
このデータによると、脂質付加ＧＬＰ−１類似体リラグルチドを用いてＤＩＯラットに２５日間治療を行うことで、体重と総体脂肪質量が著しく減少する（表１３と１４）。これに加えて、配列番号０６を用いた治療によって、耐糖能の向上（表１５）のみならず、体重と総体脂肪質量（表１３と１４）に同様の低下をもたらすことが示されている。上記効果に加えて、配列番号６を用いて２５日間治療すると、立体解析学で推算するように、小腸の体積を著しく増加（表１６）させるが、どちらの治療も大腸に対して大きな効果はなかった（表１７）。
【０１６１】
＜実施例１０：糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスの血糖とＨｂＡ１ｃと腸増殖への効果＞
Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）から、糖尿病ｄｂ／ｄｂ（ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋、Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ）の、到着時点で５週齢の雄マウスを４６匹入手した。各マウスを、通常のチャウ飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ  Ａ／Ｓ、Ｇｅｎｔｏｆｔｅ、デンマーク）と家庭用水道水を自由に摂取できる新しい環境に２週間順化させた。マウスを各々ｎ＝２の群に分け、調光と温度・湿度管理を施した部屋で飼育した（１２時間点灯−１２時間消灯のサイクル、０４：００時と１６：００時に点灯・消灯、２２±１℃、相対湿度５０±１０％）。順化期間中、被験動物を実験パラダイムに慣れさせた。
研究開始に先立って、糖尿病の状態をスクリーニングするために、基準の自由食餌による血糖サンプルを隔週採取した（尾静脈から血液採取）。−３日目に平均ＢＧ／ＢＷ値に最も近似する４０匹の被験動物を、以下の４つの群に無作為に分けた（１群当たりｎ＝１０、残りの６匹の被験動物は主研究対象から外した）。第１群  ビヒクル、ＢＩＤ、ＳＣ、第２群  配列番号６、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第３群  配列番号６、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ、第４群  リラグルチド、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣ。ビヒクルと配列番号６を０．６％のＬ−Ｈｉｓと３％のマンニトールを投入したＰＢＳ（ｐＨ９．０）に溶解し、リラグルチドは、０．１％のＢＳＡを投入したＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。実験の１日目〜５８日目の期間中、被験動物に、１日２回、０６．００〜０８．００時と０２．００〜０４．００時に皮下投与を行った。用量は、５ｍｌ／ｋｇであった。
【０１６２】
実験の５６日目に、経口ブドウ糖負荷試験を実施した。経口グルコースのボーラス投与に先立って、飼料を撤去して被験動物を４時間軽く絶食させた。ＯＧＴＴの前に、各化合物を４５分間投与した。各マウスに、ｔ＝０で、２ｇ／ｋｇのグルコースの経口グルコース負荷（２００ｍｇ／ｍｌ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、スウェーデン）を課した。用量の正確を期すため、グルコースは、シリンジに接続した胃留置チューブを介して、胃管栄養として与えた。グルコース投与後−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分の時点で、尾静脈血液サンプルを採取し、血糖を測定した。血糖と並行して、ＨｂＡ１ｃ測定用のサンプルをｔ＝−６０分で採取した。最後の血液サンプル採取後、マウスに再度食餌を与えた。
【０１６３】
研究終了時に、イソフルラン麻酔下、各マウスを断頭により死亡させた。腸全体を切り取り、小腸と大腸に分けてその長さを測定した。それぞれの腸を生理食塩水で洗浄して計量後、４％のＰＦＡに固定し、（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ５（３）：３４７-５８）  に記載するような立体解析学的方法によって、小腸と大腸の体積を判定した。さらに、断命後の血液サンプルを採取し、（Ｊａｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０２：１６３５-４１）に記載するようにプラズマシトルリンの測定を行った。
【０１６４】
血糖とＨｂＡ１ｃの結果を表１８と１９に示す。ＯＧＴＴの結果を表２０に示す。立体解析学による、小腸と大腸の体積と表面積の推算値を、表２１、２２、２３、２４に示す。
【０１６５】
【表１８】
2017537894.tif 000028
【０１６６】
【表１９】
2017537894.tif 000029
【０１６７】
【表２０】
2017537894.tif 000030
【０１６８】
【表２１】
2017537894.tif 000031
【０１６９】
【表２２】
2017537894.tif 000032
【０１７０】
【表２３】
2017537894.tif 000033
【０１７１】
【表２４】
2017537894.tif 000034
【０１７２】
＜結果＞
このデータによれば、リラグルチドを用いて８週間治療を行うと、耐糖能の向上（表１８、１９、２０）のみならず、給餌状態での血糖値、ＨｂＡ１ｃ値の低下が見られた。配列番号６を用いた治療は、用量依存的な耐糖能の向上のみならず、給餌下の血糖値、ＨｂＡ１ｃ値の低下につながる。２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの配列番号６を用いて治療した被験動物は、リラグルチドで治療した被験動物（Ｐ＝０．０３、スチューデントｔ−検定、表２０）と比較して、耐糖能がさらに向上した。
【０１７３】
さらに、配列番号６で８週間行った治療では、小腸の体積にも表面積にも顕著な増加が確認され、この例では、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの低用量は、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの高用量と同等の効果を発揮した（表２１と２３）。化合物のいずれからも、大腸の体積や表面積に顕著な効果はなかった（表２２と２４）。
【０１７４】
＜実施例１１：痩せたＮＭＲＩマウスの食餌量への急性効果＞
Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）から、合計３５匹の雄のＮＭＲＩマウス（到着時に４週齢、平均体重２８．１１ｇ）を入手し、ＨＭ２システムに供した。全被験動物を４つの郡に分けた。被験動物には環境制御された部屋を用意した（目標範囲  温度：２２±２℃、相対湿度：５０±１０％、１２時間点灯と１２時間消灯の点灯・消灯サイクル、１４．００時〜０２．００時は消灯）。すべてのマウスは、Ａｌｔｒｏｍｉｎ（Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、デンマーク）と水道水を自由に摂取できるようにした。マウスは研究開始の５日前に到着し、ＨＭ−２システムに移した。到着日以降ケージには飼料を置かず、食餌手段から飼料を摂取することを覚えさせ、被験動物がＨＭ−２システムに早く慣れるようにした。−３日目から研究が終了するまで、食餌量と体重を測定した。デジタル計量セルを用いるオンラインのコンピュータ給餌システムであるＨＭ−２リアルタイム食餌監視システムを用いて、食餌のデータを収集した。被験動物はマイクロチップで一意に特定され、個々のマウスが食餌手段に入室・退出する度に、対応するマイクロチップで特定した。ＨＭ−２システムは、ヒトの介入なしに、２つの別個の食餌手段での給餌行動を連続かつリアルタイムモードで監視し、各食餌の開始・終了時間と、設定した時間枠内の各マウスの飼料消費量を記録した。最終的な食餌量を、ＨＭ−２制御ユニットソフトウェア（ＨＭＬａｂ、ＭＢＲｏｓｅ、Ｆａａｂｏｒｇ、デンマーク）で計算した。０日目に、被験動物を体重（および最後の２４時間の平均累積食餌量）により、以下の実験群に無作為に分けた（ｎ＝８〜９）。第１群はビヒクル、０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｓ．ｃ．、第２群はリラグルチド、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｓ．ｃ．、第３群は配列番号２３、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｓ．ｃ．であった。
【０１７５】
最初かつ単回のみの用量を、実験０日目の１３．３０時と１４．００時の間（消灯直前）に、腰部に皮下投与した（用量は５ｍＬ／ｋｇ）。被験動物への用量投与後、食餌摂取量を最長６８時間測定した。１２、２４、６０時間後の累積食餌摂取量を表２５に示す。
【０１７６】
【表２５】
2017537894.tif 000035
【０１７７】
＜結果＞
このデータによれば、リラグルチドを用いた治療により、各マウスへの５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回投与後、最長２４時間の間、急性食餌摂取量は著しく低下したことを示している（表２５）。さらに、配列番号２３を同等の小量単回投与した場合も、１２時間後と２４時間後に、急性食餌摂取量が、痩せたＮＭＲＩマウスのリラグルチドと同程度に著しく低下可能になることが分かる。６０時間では、リラグルチドは、ビヒクルと比較して、食餌摂取量の違いは認められず、一方、配列番号２３は依然として効果を発揮する傾向にある。
【０１７８】
＜実施例１２：痩せたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの体重への亜急性効果＞
雄のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスを１８匹、フランスのＪａｎｖｉｅｒから入手した。実験を行う時点で、このマウスらはすでに９週齢に達していた。マウスを新しい環境に１週間順化させ、通常のチャウ飼料Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ  Ａ／Ｓ、デンマーク）と、家庭用水道水を与えた。研究中、各被験動物を、６匹ずつ１つのケージに入れ、調光と温度・湿度管理を施した部屋で飼育した（１２時間点灯−１２時間消灯のサイクル、午前４時と午後４時に点灯・消灯、２２±１℃、相対湿度５０±１０％）。
【０１７９】
−３日目に記録した体重に基づき、各マウスを以下に示す２つの研究群に無作為に分けた。第１群はビヒクル、ＢＩＤ、ＳＣ、第２群は配列番号２３、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＢＩＤ、ＳＣであった。投与量は、５ｍｌ／ｋｇ、ＳＣであった。
各化合物は、０．１％のＢＳＡ含有、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファに溶解した。腰部に皮下注射を行った。実験前３日間、すべてのマウスを作業と注射になれるよう世話した。−３日目〜７日目に体重を測定し、基準体重に対する百分率で表した変化を表２６に示す。
【０１８０】
【表２６】
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【０１８１】
このデータによれば、５０ｎｍｏｌ／ｋｇの配列番号２３による治療により、痩せたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの体重が、２日間にわたる投与後著しく減少したことを示している。最長７日間の投与の間、体重減少は続いた（表２６）。
【配列表】
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【国際調査報告】
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