(57)【要約】  本発明は、一部の側面において、光活性化イオンチャネルポリペプチドおよびコード核酸に関し、一部には、光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む組成物ならびに光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて細胞活性および機能を変更する方法にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドであって、膜において発現され、青色光と接触したとき、イオンチャネルが活性化され、ポリペプチドが、野生型もしくは修飾されたスケルフェリアまたはクロロモナスチャネルロドプシンポリペプチド配列を含む、単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項２】
スケルフェリアポリペプチド配列が、スケルフェリア・ドゥビアポリペプチド配列を含み、クロロモナスポリペプチド配列が、クロロモナス・オオガマポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項３】
発現されたイオンチャネルを黄色光および赤色光の一方または両方と接触させることが、イオンチャネルを活性化しない、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項４】
活性化する青色光が、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項５】
赤色光が、約６２０ｎｍ〜約６９０ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、ＣｈＲ６４（配列番号２）またはＣｈＲ８６（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項７】
修飾されたスケルフェリアチャネルロドプシンポリペプチド配列が、ＣｈＲ６４のアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１５４に対応するアミノ酸残基においてＥ→Ａ置換を含む、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項８】
修飾されたスケルフェリアチャネルロドプシンポリペプチド配列が、配列番号７として示される配列である、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項９】
修飾されたクロロモナスチャネルロドプシンポリペプチド配列が、ＣｈＲ８６のアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸１２４に対応するアミノ酸残基においてＤ→Ａ置換を含む、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項１０】
修飾されたクロロモナスチャネルロドプシンポリペプチド配列が、配列番号８として示される配列である、請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む細胞。
【請求項１２】
光活性化イオンチャネルが細胞の脱分極に適した条件下で光と接触したとき、光活性化イオンチャネルが活性化され、脱分極する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
興奮性細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
哺乳類細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１５】
インビトロ、エクスビボ、またはインビボにある、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１６】
１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドをさらに含み、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、非青色光波長を有する光との接触により活性化される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１７】
さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、黄色光または赤色光の一方または両方との接触により活性化され、場合により、青色光との接触により活性化されない、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項１９】
配列番号１、または配列番号３として示される配列を含む、請求項１８に記載の単離された核酸配列。
【請求項２０】
哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列である、請求項１８に記載の単離された核酸配列。
【請求項２１】
核酸配列によりコードされる光活性化イオンポンプが、細胞において発現される、請求項１８に記載の単離された核酸配列。
【請求項２２】
請求項１８に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２３】
核酸配列が、プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
光活性化イオンチャネルをコードする核酸配列に作動可能に連結された、１個、２個、またはそれより多くの核酸シグナル配列をさらに含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２５】
輸送配列をさらに含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２６】
プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、または人工染色体である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルをさらに含み、さらなる光活性化イオンチャネルの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、非青色光波長を有する光との接触により活性化される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、黄色光または赤色光の一方または両方との接触により活性化され、場合により、青色光との接触により活性化されない、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
細胞を脱分極させる方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された光活性化イオンチャネルを含む細胞を、細胞を脱分極させるのに適した条件下で青色光と接触させ、そして、細胞を脱分極させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項３１】
光活性化イオンチャネルが、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある青色光に応答して活性化する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
光活性化イオンチャネルポリペプチドが、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
光活性化イオンチャネルポリペプチド配列のアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として示される配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
光活性化イオンチャネルが、黄色光および赤色光の一方または両方との接触に応答して活性化されない、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、神経系細胞、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、または筋肉細胞である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドをさらに含み、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、非青色光波長を有する波長との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある青色光波長を有する光により活性化されない、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個またはそれより多くが、黄色光または赤色光の一方または両方との接触により活性化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が対象中にあり、細胞を脱分極させることが、対象における障害の診断または診断における助け、となる、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が対象中にあり、細胞を脱分極させることが、対象において障害を処置する、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
候補化合物の細胞に対する効果を評価する方法であって、
ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された光活性化イオンチャネルを含む試験細胞を、細胞の脱分極に適した条件下で青色光と接触させ、
ｂ）試験細胞を候補化合物と接触させ、そして、
ｃ）青色光と接触させ、候補化合物と接触させない対照細胞における、脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴とそれぞれ比較された、青色光および候補化合物と接触させた試験細胞における脱分極の変化または脱分極媒介性の細胞特徴の変化の存在または不存在を同定する、
ことを含み、
ここで、対照と比較された、試験細胞における脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴の変化が、候補化合物の試験細胞に対する効果を示す、
前記方法。
【請求項４２】
青色光が、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
候補化合物の効果が、試験細胞の脱分極に対する効果である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
候補化合物の効果が、試験細胞における脱分極媒介性の細胞特徴に対する効果である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴において同定される変化を特徴付けることをさらに含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
光活性化イオンチャネルが、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
光活性化イオンチャネルポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
光活性化イオンチャネルが、黄色光または赤色光の一方または両方との接触に応答して活性化しない、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
脱分極媒介性の細胞特徴が活動電位である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
脱分極媒介性の細胞特徴が、神経伝達物質の放出である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
細胞が、神経系細胞、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、筋肉細胞、または別の興奮性細胞である、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
細胞が哺乳類細胞である、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドをさらに含み、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、非青色光波長を有する光との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する青色光との接触により活性化されない、請求項４１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、黄色光または赤色光の一方または両方との接触により活性化される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
対象において障害を処置する方法であって、
ａ）かかる処置を必要とする対象に、治療有効量の、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の青色光活性化イオンチャネルを投与して、障害を処置し、そして、
ｂ）細胞を青色光と接触させ、細胞における光活性化イオンチャネルを、細胞を脱分極させるのに十分な条件下で活性化する、ここで、細胞を脱分極させることが、対象において障害を処置する、
ことを含む、前記方法。
【請求項５６】
光活性化イオンチャネルが、光活性化イオンチャネルを発現する細胞の形態で投与されるか、または光活性化イオンチャネルをコードする核酸配列を含むベクターの形態で投与され、ベクターの投与が、対象における細胞において青色光活性化イオンチャネルの発現をもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ベクターがシグナル配列をさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
ベクターが細胞特異的なプロモーターをさらに含む、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
障害が、神経障害、視覚系障害、循環器系障害、筋骨格系障害、または聴覚系障害である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
さらなる治療組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
細胞を脱分極させることが、脱分極媒介性の細胞特徴を調節する、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
脱分極媒介性の細胞特徴が活動電位である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
脱分極媒介性の細胞特徴が、神経伝達物質の放出である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
青色光活性化イオンチャネルが、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する光に応答して活性化する、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
青色光活性化イオンチャネルが、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
青色光活性化イオンチャネルのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号７、または配列番号８として示される、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
光活性化イオンチャネルが、青色光ではない光との接触に応答して活性化しない、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
細胞が、神経系細胞、ニューロン、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、または筋肉細胞である、請求項５５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
細胞が哺乳類細胞である、請求項５５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞が、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドをさらに含み、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、非青色光波長を有する光との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する青色光との接触により活性化されない、請求項５５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くが、黄色光または赤色光の一方または両方により活性化され、場合により、青色光との接触により活性化されない、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、２０１４年２月７日付けで出願された米国仮出願第６１／９３７，０６６号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その開示は、全体として本明細書において参照により組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
[0002]本発明は、全米科学財団により与えられたＮＳＦ  ＣＢＥＴ  １０５３２３３、国立衛生研究所により与えられたＮＩＨ  １Ｒ０１ＤＡ０２９６３９およびＮＩＨ  １Ｒ０１ＮＳ０７５４２１の両方、ならびに国防総省により与えられたＤＡＲＰＡ  ＨＲ００１１−１２−Ｃ−００６８に基づく政府の支持でなされた。政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
[0003]本発明は、一部の側面において、細胞活性および機能を変更するための組成物および方法、ならびに光活性化イオンチャネルの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]細胞膜および細胞内領域イオン透過性を変更すること、ならびに制御することは、細胞、組織、および生物の特徴決定の調査を可能にする。光によりもたらされるポンプおよびチャネルを用いて、細胞活性が静められるか、または増強され、その使用は、薬物スクリーニング、治療適用、ならびに細胞および細胞内機能を探索するため、提案される。
【０００５】
[0005]光の特異的な波長により活性化され（例えば、脱分極し）、または不活性化され（例えば、過分極し）得る細胞を調製する分子遺伝子的方法が開発された（例えば、Ｈａｎ，Ｘ．およびＥ．Ｓ．Ｂｏｙｄｅｎ、２００７年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２、ｅ２９９頁を参照）。光活性化カチオンチャネルのチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）、および光活性化クロライドポンプのハロロドプシン（Ｈａｌｏ／ＮｐＨＲ）は、ニューロンのような細胞において遺伝子導入で発現されるとき、それぞれ、青色光により活性化され、黄色光により静められることに対してそれらを敏感にさせることが同定された（Ｈａｎ，Ｘ．およびＥ．Ｓ．Ｂｏｙｄｅｎ、２００７年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２（３）：ｅ２９９頁、Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．Ｓ．ら、２００５年、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００５年９月；８（９）：１２６３〜８頁、Ｅｐｕｂ  ２００５年８月１４日）。既に同定された光活性化ポンプおよびチャネルは、光の特定の波長による活性化に限定され、これにより、それらの有用性が制限される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｎ，Ｘ．およびＥ．Ｓ．Ｂｏｙｄｅｎ、２００７年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２（３）：ｅ２９９頁
【非特許文献２】Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．Ｓ．ら、２００５年、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００５年９月；８（９）：１２６３〜８頁、Ｅｐｕｂ  ２００５年８月１４日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0006]本発明は、一部には、単離された光活性化イオンチャネルポリペプチド、ならびにその調製および使用の方法に関する。本発明はまた、本発明の光によりもたらされるイオンチャネルをコードする単離された核酸配列、ならびにかかる核酸配列を含むベクターおよび構築物も含む。加えて、本発明は、一部の側面において、細胞、組織、および生物における光活性化イオンチャネルポリペプチドの発現、ならびに細胞および組織機能を変更するために光活性化イオンチャネルを使用する方法、ならびに障害の診断および処置において使用する方法を含む。
【０００８】
[0007]本発明はまた、一部には、細胞、細胞内領域、または細胞外領域のボルテージポテンシャルを調整する方法にも関する。本発明の一部の側面は、光によりもたらされるイオンチャネルをコードする少なくとも１つの核酸配列を少なくとも１個の標的細胞、細胞内領域、または細胞外領域に取り込む方法を含み、イオンチャネルは、特異的な波長の光に応答してイオンの膜貫通型の移動を変化させる働きをする。本発明の発現された光によりもたらされるイオンチャネルを含む興奮性細胞を、チャネルを活性化する波長の光に曝露することは、興奮性細胞の脱分極をもたらし得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む細胞を特定の波長の光に接触させることにより、細胞は脱分極する。異なる波長の光により活性化される光活性化イオンチャネルの複数を用いて、マルチカラー脱分極が達成され得る。
【０００９】
[0008]一部の態様において、本発明は、パルスの光に応答して電流を脱分極させるというミリ秒時間スケールの発生を可能にする、遺伝子的に標的にされる細胞において、ある種のクラスの、光によりもたらされるイオンチャネルをコードする遺伝子を発現させる方法を含む。これらのチャネルは、特異的な細胞において（例えば、ウイルスを用いて）遺伝子的に発現され、次に、それを用いて、パルスの光に応答して、インタクトな生物（ヒトを含む）における細胞ならびにインビトロの細胞が制御され得る。これらのチャネルが、互いにおよび前のチャネル（例えば、ＣｈＲ２／ＶＣｈＲ１）と異なる活性化スペクトルを有することを考えると、それらはまた、単に、異なる細胞において遺伝子的に異なる活性化スペクトルを有するチャネルを発現させ、次に、組織を異なる色の光で照らすことにより、マルチカラーの光が、同一組織において異なるセットの細胞を脱分極させるために用いられることも可能にする。
【００１０】
[0009]一部の側面において、本発明は、興奮性細胞を脱分極させるために、スケルフェリア・ドゥビア（Scherffelia dubia）およびクロロモナス・オオガマ（Chloromonas oogama）ロドプシンのような真核生物のチャネルロドプシンを用いる。また、これらのチャネルロドプシンを用いて、細胞のｐＨが修飾され得るか、または化学伝達物質としてカチオンが導入され得る。
【００１１】
[0010]細胞の機能を光学的に混乱させるか、修飾するか、または制御する能力は、速度、非侵襲性、およびナノスケールからマクロスケールまでの広大な空間規模に容易に広がる能力のような、物理的操作メカニズムに対する多くの利点がある。１つのかかるアプローチはオプトジェネティクアプローチであり、ここで、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのような異種性に発現された光活性化膜ポリペプチドを用いて、種々のスペクトルの光でイオンが動かされる。
【００１２】
[0011]本発明の１つの側面によると、単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドが提供される。単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドは、膜において発現され、青色光と接触したとき、活性化され、ここで、ポリペプチドは、野生型もしくは修飾されたスケルフェリア（Scherffelia）またはクロロモナス（Chloromonas）チャネルロドプシンポリペプチド配列を含む。一部の態様において、スケルフェリアポリペプチド配列は、スケルフェリア・ドゥビアポリペプチド配列であり、クロロモナスポリペプチド配列は、クロロモナス・オオガマポリペプチド配列である。ある種の態様において、発現されたイオンチャネルを赤色光と接触させることは、イオンチャネルを活性化しない。一部の態様において、青色光を活性化することは、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する。一部の態様において、赤色光は、約６２０ｎｍ〜約６９０ｎｍの範囲にある波長を有する。一部の態様において、ポリペプチドは、ＣｈＲ６４（配列番号２）またはＣｈＲ８６（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、修飾されたスケルフェリアチャネルロドプシンポリペプチド配列は、ＣｈＲ６４のアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１５４に対応するアミノ酸残基においてＥ→Ａ置換を含む。一部の態様において、修飾されたスケルフェリアチャネルロドプシンポリペプチド配列は、配列番号７として示される配列である。一部の態様において、修飾されたクロロモナスチャネルロドプシンポリペプチド配列は、ＣｈＲ８６のアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸１２４に対応するアミノ酸残基においてＤ→Ａ置換を含む。ある種の態様において、修飾されたクロロモナスチャネルロドプシンポリペプチド配列は、配列番号８として示される配列である。
【００１３】
[0012]本発明の別の側面によると、単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドの上述の態様のいずれかを含む細胞が、提供される。一部の態様において、光活性化イオンチャネルが、細胞の脱分極に適した条件下で光と接触したとき、光活性化イオンチャネルは活性化され、細胞は脱分極する。一部の態様において、細胞は興奮性細胞である。一部の態様において、細胞は哺乳類細胞である。ある種の態様において、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボである。一部の態様において、細胞はまた、１個、２個、３個、４個またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドも含み、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、非青色光波長を有する光との接触により活性化される。
【００１４】
[0013]本発明の別の側面によると、上述の単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸配列が、提供される。ある種の態様において、配列は、配列番号１、または配列番号３として示される配列を含む。一部の態様において、核酸配列は、哺乳類のコドン最適化ＤＮＡ配列である。一部の態様において、核酸配列によりコードされる光活性化イオンポンプが、細胞において発現される。
【００１５】
[0014]本発明の別の側面によると、単離された核酸の上述の態様のいずれかを含むベクターが、提供される。一部の態様において、ベクターはまた輸送配列も含む。一部の態様において、核酸配列は、プロモーター配列に作動可能に連結される。ある種の態様において、ベクターはまた、光活性化イオンチャネルをコードする核酸配列に作動可能に連結された１個、または２個以上の核酸シグナル配列を含む。一部の態様において、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、または人工染色体である。
【００１６】
[0015]本発明の別の側面によると、ベクターの任意の上述の態様を含む細胞が、提供される。ある種の態様において、細胞はまた、１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルも含み、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、非青色光波長を有する光との接触により活性化される。
【００１７】
[0016]本発明の別の側面によると、細胞を脱分極させる方法が、提供される。方法は、単離された光活性化イオンチャネルポリペプチドの任意の上述の態様を含む細胞を、細胞を脱分極させるのに適した条件下で青色光と接触させ、そして、細胞を脱分極させる、ことを含む。一部の態様において、光活性化イオンチャネルは、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある青色光に応答して活性化する。一部の態様において、光活性化イオンチャネルポリペプチドは、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる。ある種の態様において、光活性化イオンチャネルポリペプチド配列のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として示される配列を含む。一部の態様において、光活性化イオンチャネルは、赤色光との接触に応答して活性化されない。一部の態様において、細胞は、神経系細胞、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、または筋肉細胞である。ある種の態様において、細胞は哺乳類細胞である。一部の態様において、細胞は、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドをさらに含み、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、非青色光波長を有する光との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある青色光波長を有する光により活性化されない。一部の態様において、細胞は対象中にあり、細胞を脱分極させることが、対象における障害の診断、または診断における助け、となる。一部の態様において、細胞は対象中にあり、細胞を脱分極させることが、対象における障害を処置する。
【００１８】
[0017]本発明のなお別の側面によると、候補化合物の細胞に対する効果を評価する方法が、提供される。方法は、ａ）単離された光活性化イオンチャネルの任意の上述の態様を含む試験細胞を、細胞の脱分極に適した条件下で青色光と接触させ；ｂ）試験細胞を候補化合物と接触させ；そして、ｃ）青色光と接触させ、候補化合物と接触させない対照細胞における、脱分極もしくは脱分極媒介性の細胞特徴とそれぞれ比較された、青色光および候補化合物と接触させた試験細胞における脱分極の変化もしくは脱分極媒介性の細胞特徴の変化の存在または不存在を同定する、ことを含み、ここで、対照と比較された試験細胞における脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴の変化が、候補化合物の試験細胞に対する効果を示す。ある種の態様において、青色光は、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する。一部の態様において、候補化合物の効果は、試験細胞の脱分極に対する効果である。一部の態様において、候補化合物の効果は、試験細胞における脱分極媒介性の細胞特徴に対する効果である。ある種の態様において、方法は、脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴において同定される変化を特徴付けることをさらに含む。一部の態様において、光活性化イオンチャネルは、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる。一部の態様において、光活性化イオンチャネルポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様において、光活性化イオンチャネルは、赤色光との接触に応答して活性化しない。ある種の態様において、脱分極媒介性の細胞特徴は活動電位である。一部の態様において、脱分極媒介性の細胞特徴は、神経伝達物質の放出である。一部の態様において、細胞は、神経系細胞、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、筋肉細胞、または別の興奮性細胞である。一部の態様において、細胞は哺乳類細胞である。ある種の態様において、細胞はまた、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドも含み、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、非青色光波長を有する光との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する青色光との接触により、活性化されない。
【００１９】
[0018]本発明の別の側面によると、対象において障害を処置する方法が提供される。方法は、ａ）かかる処置を必要とする対象に、治療有効量の、青色光活性化イオンチャネルの上述の態様のいずれかを投与して、障害を処置し、そして、ｂ）細胞を青色光と接触させ、細胞を脱分極させるのに十分な条件下で細胞中の光活性化イオンチャネルを活性化させる、ことを含み、ここで、細胞を脱分極させることは、対象において障害を処置する。一部の態様において、光活性化イオンチャネルは細胞の形態で投与され、ここで、細胞は、光活性化イオンチャネルを発現し、またはベクターの形態で投与され、ここで、ベクターは、光活性化イオンチャネルをコードする核酸配列を含み、ベクターの投与は、対象において細胞中の青色光活性化イオンチャネルの発現をもたらす。一部の態様において、ベクターはまたシグナル配列も含む。一部の態様において、ベクターはまた細胞特異的プロモーターを含む。ある種の態様において、障害は、神経障害、視覚系障害、循環器系障害、筋骨格系障害、または聴覚系障害である。一部の態様において、方法はまた、さらなる治療組成物を対象に投与することも含む。一部の態様において、細胞を脱分極させることは、脱分極媒介性の細胞特徴を調節する。一部の態様において、脱分極媒介性の細胞特徴は、活動電位である。ある種の態様において、脱分極媒介性の細胞特徴は、神経伝達物質の放出である。一部の態様において、青色光活性化イオンチャネルは、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する光に応答して活性化する。一部の態様において、青色光活性化イオンチャネルは、配列番号１または配列番号３として示される核酸配列によりコードされる。一部の態様において、青色光活性化イオンチャネルのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号７、または配列番号８として示される。ある種の態様において、青色光活性化イオンチャネルは、青色光でない光との接触に応答して活性化しない。一部の態様において、細胞は、神経系細胞、ニューロン、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、または筋肉細胞である。ある種の態様において、細胞は哺乳類細胞である。一部の態様において、細胞はまた、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドも含み、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルポリペプチドの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、非青色光波長を有する光との接触により活性化され、約４５０ｎｍ〜約４９５ｎｍの範囲にある波長を有する青色光との接触により活性化されない。
【００２０】
[0019]本発明は、本発明の任意の定められた目的もしくは特性の１つまたは複数を満たすに違いない系あるいは方法に制限されることは意図されない。本発明が、本明細書において記載される例示的または基本的な態様に制限されないことに注意することも重要である。当業者による修飾および置換は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[0020]図１は、種々の波長の光と接触したときの、ＣｈＲ２、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ６４  Ｅ１５４Ａ、およびＣｈＲ８６光活性化イオンチャネルポリペプチドについて、ＨＥＫ２９３細胞において記録された作用スペクトルを示す図である。
【図２】[0021]図２は、光活性化イオンチャネルが発現される、培養された海馬のニューロンにおける青色光光電流および動力学的比較を示すグラフである。ＣｈＲ２、ＣｈＲ６４、およびＣｈＲ６８由来の結果が示される。図２Ａは、青色照射量と接触した電流を示すグラフである。図２Ｂは、ＣｈＲ２、ＣｈＲ６４、およびＣｈＲ６８光活性化イオンチャネルについての結果の比較をもたらす、５ｍＷ／ｍｍ２の照射におけるｔｏｎのグラフである。図２Ｃは、ＣｈＲ２、ＣｈＲ６４、およびＣｈＲ６８光活性化イオンチャネルについての結果の比較をもたらす、４．２３ｍＷ／ｍｍ２の照射におけるｔｏｎのグラフである。図２Ｄは、４．２３、０．２、および０．０５ｍＷ／ｍｍ２の青色照射量でのＣｈＲ８６光活性化イオンチャネル由来のｔｏｆｆ結果を示すグラフである。
【図３】[0022]図３は、光活性化イオンチャネルポリペプチドのある種の態様の輸送、発現、および光感受性を示す顕微鏡写真および表を提供する図である。図３Ａは、野生型ＳｄＣｈＲを発現する培養されたニューロンの顕微鏡写真画像を示す図である。ＳｄＣｈＲは、神経細胞体において典型的に凝集し、斑点を形成した。スケールバー２５μｍ。図３Ｂは、ＳｄＣｈＲのＣ末端とｅＧＦＰのＮ末端の間にＫｉｒ２．１由来のさらなる輸送配列を有するＳｄＣｈＲを発現するニューロンの顕微鏡写真画像を示す図である。この輸送配列は、細胞内斑点を実質的に低減した。スケールバー２５μｍ。図３Ｃは、ＣｈｅＲｉｆｆを発現する２つのニューロンの顕微鏡写真画像を示す図である。Ｅ１５４Ａ変異の包含は、良好な膜輸送を維持しながら、赤色光感受性を低減し、τｏｆｆを低減した。スケールバー２５μｍ。図３Ｄは、ＣｈＲ６４からＣｈｅＲｉｆｆまでを導く、輸送における改善を示す表である。スケルフェリア・ドゥビアチャネルロドプシン（ＳｄＣｈＲ）は、見込みのある光感受性、およびＱｕａｓＡｒｓとの対形成に適当な青色によりシフトされる作用スペクトルを有し、ラットの海馬のニューロンにおいて細胞膜に効率的に依然輸送しなかった。３種の変異体のうち、ＣｈｅＲｉｆｆが、輸送、青色光電流、赤色光電流、およびｔｏｆｆ値について最良の結果を示した。
【図４】[0023]図４は、トレース、ならびにＣｈｅＲｉｆｆの分光学的および動力学的特性を示すグラフである。上部左の図４Ａは、青色光におけるステップにより誘発されるチャネルロドプシン電流の成分を示す図である。Ｉｐｋは、ベースライン電流とピーク電流の間の差である。ｔｏｎは、光開始とピーク電流の間の時間である。τｄｅｓは、ピーク後の電流減衰に対する単一指数関数近似により示される脱感作時間定数である。Ｉｓｓは、定常状態の光電流である。τｏｆｆは、照射停止後の電流減衰に対する単一指数関数近似により示されるチャネル終了時間定数である。上部右の図４Ａは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝１０個の細胞）、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝６個の細胞）、およびＣｈＩＥＦ（ｎ＝６個の細胞）を発現するニューロンにおけるピーク（Ｉｐｋ）および定常状態（Ｉｓｓ）光電流を示す図である。光電流は、１秒間の４８８ｎｍの光パルス（５００ｍＷ／ｃｍ２）に応答して測定された。ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）より有意に大きなピーク光電流を生じた。ＣｈｅＲｉｆｆはまた、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．０１）より有意に大きな定常状態光電流を有した。下部左：ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）と比較されたとき、ピークへの有意に速い時間（ｔｏｎ）を有した。下部中央：ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）より有意に遅い時間定数で脱感作した。下部右の図４Ａは、τｏｆｆが、５ｍｓの照射パルス（５００ｍＷ／ｃｍ２）に応答して測定されたときの結果を示す図である。ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝９個の細胞）は、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝６個の細胞、ｐ＜０．０５）より有意に速いτｏｆｆを有し、ＣｈＩＥＦ（ｎ＝６個の細胞、ｐ＝０．９４）に相当した。全てのチャネルロドプシン比較が、一致する培養物、ＤＩＶ  １４−１５において行われた。発現は、同一のプラスミド骨格中のＣａＭＫＩＩａプロモーターによりもたらされた。細胞培養の詳細については実施例の節を参照。図４Ｂは、Ａｒｃｈベースの電位指標（６４０ｎｍ、９００Ｗ／ｃｍ２）を画像化するために用いられた赤色光によるＣｈｅＲｉｆｆの活性化を示す図である。図４Ｂ上部トレースは、ＣｈｅＲｉｆｆを発現するニューロンにおける電流−クランプ（ｉ＝０）下で、パルスの赤色光が小さい定常脱分極３．１±０．２ｍＶ（ｎ＝５個の細胞）を導いたことを示す結果を示す。図４Ｂ下部トレースは、電位−クランプ（Ｖ＝−６５ｍＶ）下で、パルスの赤色光が、小さい内向き光電流１４．３±３．１ｐＡ（ｎ＝５個の細胞）を示す結果を示す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計的有意は、ダネット事後検定を用いた一元ＡＮＯＶＡにより決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】[0024]図５は、培養された海馬のニューロンにおけるＣｈｅＲｉｆｆの適用を示す、顕微鏡写真画像およびグラフを提供する図である。図５Ａは、側面図（上部）および正面図（下部）のスケルフェリア・ドゥビア（株ＣＣＡＣ  ００５３）の光顕微鏡写真（ＤＩＣ）を示す図である。矢印は、眼状斑点（赤色）を印付ける。スケールバー１０μｍ。図５Ｂは、ｅＧＦＰ蛍光を介して画像化された、ＣｈｅＲｉｆｆ−ｅＧＦＰを発現する培養されたラット海馬ニューロンの顕微鏡写真画像を示す図である。スケールバー２５μｍ。図５Ｃは、４８８ｎｍ、５００ｍＷ／ｃｍ２での照射でＣｈｅＲｉｆｆにより、およびチャネルロドプシン２  Ｈ１３４Ｒにより誘導された光電流を示す図である。図５Ｄは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝５個の細胞）またはＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝５個の細胞）を発現する、一致する培養物における照射強度の関数としての光電流の比較を示すグラフを提供する図である。照射は、全体の細胞に渡り、または神経細胞体に限局してのいずれかであった。図５Ｅは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝５個の細胞）を発現するニューロンにおける刺激頻度と照射強度の関数としてスパイキングフィデリティーを示すグラフを提供する図である。図５ＤおよびＥにおけるエラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列の簡単な説明
[0025]配列番号１は、本明細書においてＣｈＲ６４またはＳｄＣｈＲとしても言及される、野生型スケルフェリア・ドゥビアチャネルロドプシンをコードする、哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列である。
【００２３】
【化１】
2017506889.tif 000003
【００２４】
[0026]配列番号２は、本明細書においてＣｈＲ６４またはＳｄＣｈＲとしても言及される、野生型スケルフェリア・ドゥビアのアミノ酸配列である。
【００２５】
【化２】
2017506889.tif 000004
【００２６】
[0027]配列番号３は、本明細書においてＣｈＲ８６としても言及される、野生型クロロモナス・オオガマチャネルロドプシンをコードする、哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列である。
【００２７】
【化３】
2017506889.tif 000005
【００２８】
[0028]配列番号４は、本明細書においてＣｈＲ８６としても言及される、野生型クロロモナス・オオガマチャネルロドプシンのアミノ酸配列である。
【００２９】
【化４】
2017506889.tif 000006
【００３０】
[0029]配列番号５は、本明細書においてＣｈＲ２としても言及される、野生型チャネルロドプシン−２をコードする、哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列である（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８、１２６３〜１２６８頁（２００５年）、およびＮａｇｅｌ，Ｇ．ら、ＰＮＡＳ、２００３年１１月２５日、１００巻、２４号、１３９４０〜１３９４５頁を参照）。
【００３１】
【化５】
2017506889.tif 000007
【００３２】
[0030]配列番号６は、本明細書においてＣｈＲ２としても言及される、野生型チャネルロドプシン−２のアミノ酸配列である（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８、１２６３〜１２６８頁（２００５年）、およびＮａｇｅｌ，Ｇ．ら、ＰＮＡＳ、２００３年１１月２５日、１００巻、２４号、１３９４０〜１３９４５頁を参照）。
【００３３】
【化６】
2017506889.tif 000008
【００３４】
[0031]配列番号７は、アミノ酸１５４位においてＥ→Ａ置換を有するＣｈＲ６４のアミノ酸配列である。
【００３５】
【化７】
2017506889.tif 000009
【００３６】
[0032]配列番号８は、アミノ酸１２４位においてＤ→Ａ置換を有するＣｈＲ８６のアミノ酸配列である。
【００３７】
【化８】
2017506889.tif 000010
【００３８】
[0033]配列番号９は、（本明細書において「ＥＲ２」としても言及される）ＥＲ排出配列のＤＮＡ配列である。
【００３９】
【化９】
2017506889.tif 000011
【００４０】
[0034]配列番号１０は、（本明細書において「ＥＲ２」としても言及される）ＥＲ排出配列のアミノ酸配列である。
【００４１】
【化１０】
2017506889.tif 000012
【００４２】
[0035]配列番号１１は、カリウムチャネルＫｉｒ２．１由来のＣ末端排出配列（「輸送配列」としても言及される）である、ＫＧＣのＤＮＡ配列である。それはまた、本明細書において「ＴＳ」としても言及される。
【００４３】
【化１１】
2017506889.tif 000013
【００４４】
[0036]配列番号１２は、カリウムチャネルＫｉｒ２．１由来のＣ末端排出配列（「輸送配列」としても言及される）である、ＫＧＣのアミノ酸配列である。それはまた、本明細書において「ＴＳ」としても言及される。
【００４５】
【化１２】
2017506889.tif 000014
【００４６】
詳細な説明
[0037]本発明は、一部の側面において、１種または複数のパルスの光との接触により活性化され得る光によりもたらされるイオンチャネルポリペプチドの細胞における発現に関し、それは、細胞の強力な脱分極をもたらす。本明細書において光活性化イオンチャネルとしても言及される、本発明の光活性化チャネルは、特異的な細胞、組織、および／または生物において発現され、パルスの適当な波長の光に応答して、細胞をインビボ、エクスビボ、およびインビトロで制御するのに用いることができる。本発明は、一部には、本明細書において光活性化チャネルとしても言及される、光開口型イオンチャネルについての遺伝子、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質を含む。遺伝子的に標的にされる細胞における本発明の光活性化チャネルの発現は、パルスの光に応答して、電流を脱分極させるというミリ秒時間スケールの発生を可能にする。本発明の光活性化チャネルは、特異的な細胞において（例えば、ウイルスの使用を介して）遺伝子的に発現され、次に、それを用いて、パルスの光に応答して、ヒトを含むがこれらに限定されない、インタクトな生物における細胞、ならびにインビトロの細胞において電気的活性が制御され得る。
【００４７】
[0038]チャネルロドプシンは、電気的な興奮性細胞における膜電位の光学的制御のためのツールとして当該技術分野において周知である。光活性化チャネルポリペプチドは、本発明の一部の態様において、いくつかの方法における従前のチャネルロドプシンツール、例えば、非限定的に、飽和照射、および正確に時間を決められたニューロンの活動電位の引き金を引くのに必要とされるより少ない照射強度下で可能なより多い最大光電流と異なる。より低い強度においてニューロンを活性化する能力は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用が、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するために用いられる青色光により、赤色により移動された種を偽活性化することなく、１つまたは複数の赤色により移動された光活性化ポンプおよびチャネル（例えば、非限定的に、Ｈａｌｏ／ＮｐＨＲ、Ａｒｃｈ、ＶＣｈＲ１）と併用して用いられることを可能にする。加えて、一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するために用いられる青色光により、レポーターを偽活性化することなく、１つまたは複数の他の赤色により移動されたレポーター（例えば、Ａｒｃｈベースの電位指標、Ｒ−ＧＥＣＯカルシウム指標）と併用して発現されてもよい。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのある種の態様は、より小さい出力の光源を用いて、代替のチャネルロドプシンを用いて従前に可能だったものより光毒性のより少ないリスクで、より広い領域に渡りニューロンを活性化するために用いられ得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのさらなる利点は、細胞下領域のみが照射されるとき、ニューロンの活動電位の引き金を引くその能力および使用である。この能力により、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの態様を用いて、細胞下電気的動態の研究を行うことを可能にする。加えて、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、赤色光との接触、赤色により移動された光学的駆動装置およびレポーターとの併用をさらに促進することにより活性化されないか、または最小限にのみ活性化される。
【００４８】
[0039]ある種の態様において、本発明は、興奮性細胞を脱分極させるための、スケルフェリア・ドゥビア（「ＣｈＲ６４」、「ＳｄＣｈＲ」）もしくはクロロモナス・オオガマ（「ＣｈＲ８６」）由来のロドプシン、およびそのバリアントを含むが、これらに限定されない、スケルフェリアまたはクロロモナス属由来のような、真核生物のロドプシンの使用を含む。本発明のある種の態様において、本発明のこれらの光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞のｐＨが修飾されるか、または化学伝達物質としてカチオンが導入され得る。
【００４９】
[0040]一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ＣｈＲ６４またはＣｈＲ８６ポリペプチドのバリアントであってもよい。従って、一部には、本発明はまた、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの有効性および動力学を変更するためのチャネルロドプシンの特異的アミノ酸残基において標的部位特異的変異誘発も含む。ＣｈＲ２配列のＤ１４４に対応する、１つの変異は、光電流の振幅を保ちながらチャネル停止動力学を改善することとして本明細書において示される。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのある種の態様は、特異的なアミノ酸変化、例えば、置換を含む。例えば、ＣｈＲ６４へのＥ１５４Ａ変異は、停止動力学を加速し、光電流の振幅を保存する。同様に、ＣｈＲ８６のアミノ酸配列におけるＤ１２４Ａ単一点変異はまた、発現され、イオンチャネルを活性化するための適当な光と接触したときの本発明のこの光活性化イオンチャネルポリペプチドの性能も変更する。光活性化イオンチャネルポリペプチドの構築物の態様の非限定的な例は、本明細書においてＣｈｅＲｉｆｆとして言及される。ＣｈｅＲｉｆｆは、Ｅ１５４Ａ変異を有するＣｈＲ６４配列を含み、「ＴＳ」輸送配列も含む。構築物は、ＣｈＲ６４（Ｅ１５４Ａ）−ＴＳ−フルオロフォアとして定義される。本明細書において用いられる、用語「ＴＳ」はまた、「ＫＧＣ」配列としても言及され、それは、
ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号１２）として示される。
【００５０】
[0041]多くのチャネルロドプシンは、哺乳類細胞において正確に輸送されず、および／または機能しないことが見出されたので、全てのチャネルロドプシンが、細胞において発現され、それを利用して、チャネルを通じてイオンコンダクタンスが変更され得るとは限らないことが同定された。多くのチャネルロドプシンが、ここで調べられ、光活性化イオンチャネルポリペプチドＣｈＲ６４およびＣｈＲ８６が、他のクラスのチャネルロドプシンより哺乳類細胞においてより有効にかつ良好に機能するとしてここで同定された。
【００５１】
[0042]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、興奮性細胞および光を照射された細胞において遺伝子的に発現され、それは、光に応答して、これらの細胞の迅速な脱分極および光学的に惹起されたスパイキングをもたらした。これにより、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、インビボ（ヒトおよび非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない）、ならびにインビトロで細胞の機能の光制御のため利用され得、従って、補綴学、薬物スクリーニング、および他の生物工学的分野に対して広範囲の影響を有し、その非限定的な例が本明細書において開示される。
【００５２】
[0043]スケルフェリア・ドゥビアおよびクロロモナス・オオガマロドプシン配列に由来する光活性化イオンチャネルポリペプチドが、ここで同定された。
[0044]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、イオンチャネルであり、細胞の膜において発現され得る。イオンチャネルは、膜を通じてポアを形成する膜内在性タンパク質であり、全ての細胞の細胞膜を渡って存在する小さい電位勾配の確立および調節の補助であり、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリアなどのような小器官の細胞内膜においても見出される。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが、細胞を適当な光と接触させることにより活性化されるとき、チャネルポアが開き、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのようなイオンの、ポアを介したコンダクタンスを可能にする。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、青色光との接触により活性化されることが同定された。一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、黄色光または赤色光の一方または両方により活性化されない。本発明のある種の態様は、赤色光または黄色光の少なくとも１つにより最小限に活性化されるか、もしくは全く活性化されない、光活性化イオンチャネルポリペプチドを含み得る。例えば、赤色光もしくは黄色光と接触したとき、光活性化イオンチャネルポリペプチドは、全く活性化されないか、または青色光と接触したときの光活性化イオンチャネルポリペプチドの活性化のレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％未満が活性化される。同様に、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを介したイオン伝導は、赤色光と接触したとき、イオンチャネルポリペプチドが青色光と接触したときと同一の方法で検出される、光活性化イオンチャネルポリペプチドのイオン伝導のレベルの少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満であってもよい。
【００５３】
[0045]同様に、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを介したイオン伝導は、黄色光と接触したとき、イオンチャネルポリペプチドが青色光と接触したときと同一の方法で検出される、光活性化イオンチャネルポリペプチドのイオン伝導のレベルの少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満であってもよい。
【００５４】
[0046]本発明の一部の態様において、光活性化チャネルを用いて、細胞（および／またはそれらの細胞内領域、およびそれらの局所環境）の膜電位差（および／またはイオン組成）が修飾され得る。例えば、内向き整流性カチオンチャネルの使用は、細胞外環境から細胞質に正に荷電したイオンを動かすことにより、細胞を脱分極させるだろう。ある種の条件下で、それらの使用は、細胞内ｐＨ（および／またはカチオン濃度）を低減するか、あるいは細胞外ｐＨ（および／またはカチオン濃度）を増大させ得る。一部の態様において、組織または生物中の細胞の１つ、２つ、３つまたはそれより多く（例えば、複数）の細胞における本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの存在は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを適当な波長の光と接触させることにより、単一の細胞もしくは複数の細胞の脱分極をもたらし得る。
【００５５】
[0047]細胞において発現されるとき、本発明のある光活性化イオンチャネルポリペプチドは、細胞を約４５０ｎｍ〜４９５ｎｍの間の波長を有する青色光と接触させることにより、活性化され得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドはまた、この範囲の外側にある波長の光と接触したとき、活性化され得、例えば、紫色、緑色、黄色、橙色、または赤色光との接触は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをあるレベルで活性化し得る。従って、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの活性化は、紫色、緑色、黄色、または橙色と接触したとき、イオンチャネルポリペプチドが青色光と接触したときと同一の方法で検出される、光活性化イオンチャネルポリペプチドの活性化（例えば、一部の態様において、イオン伝導として測定され得る）のレベルの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％未満であってもよい。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの最も有効かつ効率的なレベルの活性化は、４５０ｎｍ〜４９５ｎｍ、４５５ｎｍ〜４９０ｎｍ、４６０ｎｍ〜４８５ｎｍ、４６５ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４５５ｎｍ〜４８５ｎｍの範囲にある光と接触したとき生じ得る。従って、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、青色光と接触したとき活性化されるが、それはまた、他の色の光と接触したとき、活性化のあまり有効でないより低いレベルで活性化され得る。
【００５６】
[0048]本発明の青色光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む興奮性細胞を青色スペクトルの光と接触させることは、細胞を強力に脱分極させる。例えば、４５０ｎｍ〜４９５ｎｍ、４５５ｎｍ〜４９０ｎｍ、４６０ｎｍ〜４８５ｎｍ、４６５ｎｍ〜４８０ｎｍ、または４５５ｎｍ〜４８５ｎｍの間のような波長範囲にある光との接触は、細胞を脱分極させる。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、青色範囲においてピーク波長感受性を有し、これにより、従前に同定された光活性化チャネル、例えば、ＣｈＲ２より、青い波長においてより大きい光電流を示す。
【００５７】
[0049]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、適当な条件下で適当な波長の光と接触したとき、イオンコンダクタンスおよび脱分極を可能にする。当業者により理解されるであろう、細胞との関連で用いられる用語「脱分極する」は、細胞電位の上方変化を意味する。例えば、約−６５ｍＶのベースライン電位の興奮性細胞において、電位の正の変化、例えば、最大５、１０、１５、２０、３０、４０、またはそれより多くのミリボルト（ｍＶ）が、その細胞の脱分極である。電位の変化が、細胞のスパイク開始電位閾値に達するのに十分であるとき、活動電位（例えば、スパイク）が生じる。細胞が、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを適当な波長の光で活性化することにより、脱分極するとき、細胞電位は、ベースラインレベルより正になり、入ってくるシグナルは、閾値に達するのに十分な細胞の電位をより容易に生じ、細胞において活動電位の引き金を引き得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現する細胞を約４５５ｎｍ〜約４８５ｎｍの間の範囲にある光と接触させることにより、細胞の電位は、より少なく負になり、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＶ（細胞タイプに依存する）上昇し、これにより、細胞が脱分極し得ることが発見された。
【００５８】
[0050]本発明のイオンチャネルを活性化するのに有用な、特異的な範囲の波長の光が提供され、本明細書において記載される。活性化に適当な波長の光が、活性化に適当なパワーおよび強度を有することは理解されるだろう。チャネルを光で活性化するとき、光パルス持続時間、強度、およびパワーが、変更され得るパラメーターであることは、当該技術分野において周知である。従って、当業者は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するために本明細書において教示される波長を用いるとき、パワー、強度を適当に調整することができるであろう。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの利益は、チャネルを活性化するのに適当な照射変数（例えば、波長、強度、持続時間など）を用いて、その応答を「適合させる」能力であり得る。照射変数を調整する方法は、当該技術分野において周知であり、代表的な方法は、Ｌｉｎ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２００９年３月４日；９６（５）：１８０３〜１４頁、Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、２００７年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００７年５月８日；１０４（１９）：８１４３〜８頁、Ｅｐｕｂ、２００７年５月１日のような刊行物において見ることができ、そのそれぞれが、本明細書において参照により組み込まれる。従って、狭い範囲の１つまたは複数の照射特徴を利用して、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化することが可能である。これは、それらの活性化のための異なるセットの照射パラメーター（例えば、限定されることは意図されないが、異なる波長）で照射され得る１つまたは複数の他の光活性化チャネルと共発現され、これにより、光活性化チャネルの混合された集団の制御された活性化を可能にする、光活性化イオンチャネルポリペプチドを照射するのに有用であり得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、青色光に強く応答し活性化され、それ故、緑色、赤色、または黄色光に応答して細胞を脱分極させる他のチャネルロドプシンが存在するので、本発明のある種の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、これらの他のオプシンの１つを発現する細胞の集団から細胞の集団と別個の細胞の集団において発現され、これにより、マルチカラーの光が、細胞のこれら２つの集団、または異なる時間における１つの部位からのニューロンの投射を刺激するために用いられることを可能にする。
【００５９】
[0051]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、活性化および脱分極のための選択的光スペクトルを用いて単独で用いられ得、それはまた、活性化および脱分極のための異なる波長の光を利用する他の光活性化イオンチャネルと併用して用いられ得、これにより、２種、３種、４種、またはそれより多くの異なる波長の光が、異なる細胞において異なる活性化スペクトルでチャネルを発現させること、次に、チャネルを活性化し、細胞を脱分極させるために適当な波長の光で組織および／または生物を照射することにより、組織または生物中の異なるセットの細胞を脱分極させるために用いられることを可能にする。本発明の一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルは、赤色光または黄色光の一方または両方により活性化されない。この特性は、赤色光および／または黄色光により活性化される別のイオンチャネルでのまったくの非混乱性画像化（例えば、Ｒ−ＧＥＣＯ、Ａｒｃｈ電位画像化など）におけるそれらの使用を可能にする。
【００６０】
[0052]従って、本発明は、一部の態様において、異なるタイプのイオンチャネルの発現を含み、その一部は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドであり、一部はそうではない。本発明の方法は、一部の態様において、異なる（例えば、オーバーラップしない）波長の光により活性化される光活性化イオンチャネルの発現を含み得る。これは、青色光範囲照射、ならびに赤色および／または黄色範囲にある光と接触したとき活性化される電位／イオンセンサーチャネルポリペプチドでの画像化を用いて、本発明の１つまたは複数の光活性化イオンチャネルポリペプチドの同時活性化を可能にする。非限定系な例として、本発明の青色光活性化イオンチャネルポリペプチドが、細胞において発現され、黄色および／または赤色光活性化イオンチャネルと併せて用いられてもよい。かかる使用は、青色光範囲にある光との接触による本発明の光活性化イオンチャネルの活性化、ならびに赤色光および／または黄色光との接触／照射により活性化されるイオンチャネルを用いた細胞シグナル（例えば、カルシウム、電位など）の同時モニタリングを提供する。
【００６１】
[0053]例示的な実行において、本発明は、ここで同定された、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする遺伝子を調製し、使用する方法を含む。本発明はまた、一部には、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする配列、ならびにかかる核酸配列を含むベクターおよび構築物を含む単離された核酸も含む。一部の態様において、本発明は、細胞、組織、および生物における核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現を含む。
分類学および配列供給源
[0054]特に、本発明は、一部には、新規の光活性化イオンチャネルポリペプチド、および細胞を脱分極させるためのその使用を含む。本発明の一部の非限定的な態様において、１つまたは複数の新たに同定された光活性化イオンチャネルポリペプチドが、細胞において発現され得る。本発明のある光活性化イオンチャネルポリペプチドは、天然に発現されるスケルフェリア・ドゥビアまたはクロロモナス・オオガマロドプシンに由来するアミノ酸配列を有する。本発明のある種の側面において、スケルフェリア・ドゥビアもしくはクロロモナス・オオガマポリペプチドまたはコード核酸配列のバリアントであるポリペプチドのアミノ酸あるいはコード核酸配列は、それぞれ、スケルフェリア・ドゥビアもしくはクロロモナス・オオガマアミノ酸配列または核酸配列に「由来する」として本明細書において言及され得る。本発明の一部の態様は、スケルフェリア・ドゥビアもしくはクロロモナス・オオガマ由来の単離された野生型または修飾された核酸および／またはアミノ酸ロドプシン配列を含み、一部の側面において、本発明はまた、それらの使用方法も含む。当業者は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが、本明細書において開示される光活性化イオンチャネルポリペプチド配列に対する配列相同性に基づき同定され得ることを理解するだろう。
【００６２】
[0055]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、それらのポアを介してイオンコンダクタンスを可能にし、これにより、それらが発現される膜の電位を変更させてオープンにさせるために光エネルギーを用いる、膜貫通型チャネルポリペプチドである。本発明のポアを介して動かされ得るイオンの非限定的な例は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、プロトンなどを含む。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、持続性の光により、および／または光パルスにより、ならびに活性化の際イオンコンダクタンスを可能にすることにより、活性化され得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの活性化は、細胞を脱分極させ、それらが発現される細胞および小器官における電位を変更し得る。
【００６３】
[0056]本発明の側面および方法において用いられる野生型および修飾されたスケルフェリア・ドゥビアまたはクロロモナス・オオガマロドプシン核酸ならびにアミノ酸配列は、「単離された」配列である。本明細書において用いられる、ロドプシンのポリヌクレオチド、核酸配列、またはポリペプチド配列に関連して用いられる用語「単離された」は、その天然の環境から離され、その同定または使用を可能にするのに十分な量で存在する、ポリヌクレオチド、核酸配列、またはポリペプチド配列を意味する。従って、本発明の単離されたポリヌクレオチド、核酸配列、またはポリペプチド配列は、その天然の宿主の一部ではないか、もしくはそれに含まれるポリヌクレオチド、核酸配列、またはポリペプチド配列である。例えば、核酸またはポリペプチド配列は、スケルフェリアもしくはクロロモナス属のメンバーである細胞または生物において天然で発現され得るが、配列が、スケルフェリアもしくはクロロモナス細胞または生物の一部でなく、それに含まれないとき、それらは単離されるとみなされる。従って、異種細胞、組織、もしくは生物などにおけるベクターに存在する、スケルフェリアまたはクロロモナス、あるいは他のチャネルロドプシンの核酸あるいはポリペプチド配列は、単離された配列である。本明細書において用いられる用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、天然の細胞、組織、または生物ではない、細胞、組織、または生物を意味する。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において互換的に用いられる。本明細書において用いられる、本発明の光活性化チャネルポリペプチドをコードする配列に関連して用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」は、互換的に用いられ得る。
修飾された配列を含む光活性化イオンチャネル配列
[0057]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、野生型ポリペプチド配列を含み得るか、または修飾されたポリペプチド配列であり得る。本明細書において用いられる、核酸もしくはポリペプチド配列に関連する用語「修飾された」または「修飾」は、それが由来する野生型配列と比較して、配列中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれより多くのアミノ酸の変更を指す。例えば、修飾されたポリペプチド配列は、それらが、１個、２個、３個、４個、５個もしくはそれより多くのアミノ酸置換、欠失、挿入、またはその組み合わせを有することを除き、野生型ポリペプチド配列と同一であり得る。本発明の一部の態様において、修飾された配列は、野生型チャネルロドプシン配列において１個、２個、３個、４個またはそれより多くのアミノ酸置換を含んでもよい。
【００６４】
[0058]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの配列が、スケルフェリア属もしくはクロロモナス属の種々のメンバー、またはその相同体に由来し得ることは理解されるだろう。配列相同性を決定する標準的方法を用いて、当業者は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドとしても機能する、相同なポリペプチドを同定するためのさらなるチャネルロドプシン配列（他のスケルフェリアまたはクロロモナス配列を含むが、これらに限定されない）を同定することができる。
【００６５】
[0059]本発明はまた、一部の側面において、本明細書において記載されるもの由来の１つもしくは複数の置換または他の修飾を有する光活性化イオンチャネルポリペプチドも含む。例えば、光活性化イオンチャネルポリペプチドの配列は、１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、または他の修飾で修飾され得、本明細書において開示される方法を用いて、光との接触に応答した発現、細胞局在化、活性化、および脱分極を含むが、これらに限定されない、特徴について本明細書において記載される方法を用いて試験され得る。例示的な修飾は、保存的アミノ酸置換を含むが、これに限定されず、それは、かかる修飾が成されるものに由来する分子のものと類似する機能的特徴を有する分子を作成するだろう。「保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドまたはタンパク質の活性もしくは３次構造における有意な変化をもたらさない置換である。かかる置換は、選択されたアミノ酸残基を、類似の物理化学特性を有する異なる残基で置換することを典型的に含む。例えば、ＡｓｐについてのＧｌｕの置換は、両方が、同様の大きさの負に荷電したアミノ酸であるので、保存的置換であるとみなされる。物理化学特性によるアミノ酸のグループ分けは、当業者に公知である。次のグループそれぞれは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）［例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照］。１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの保存的アミノ酸置換を含むが、これらに限定されない、修飾を含む本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、同定され、本明細書において開示される方法を用いて光との接触に応答した発現、細胞局在化、活性化、ならびに脱分極および脱分極効果を含むが、これらに限定されない、特徴について試験され得る。
【００６６】
[0060]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本明細書において示される配列または別のロドプシン配列のアミノ酸バリアント（例えば、修飾された配列を有するポリペプチド）を含み得る。修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチド配列は、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ８６、またはそのバリアントのような、本明細書において開示される光活性化イオンチャネルポリペプチドのポリペプチド配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列類似性（配列同一性としても言及される）を有してもよい。この関連における類似性は、配列類似性または同一性を意味する。かかる配列類似性は、当該技術分野において公知の標準的技術を用いて決定され得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本明細書において提供される光活性化イオンチャネルポリペプチドおよび核酸配列、ならびに提供された配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するバリアントを含む。
【００６７】
[0061]２つのアミノ酸配列のパーセント同一性（類似性）を決定するために、配列は、最適な比較目的のため整列される（例えば、ギャップが、１つのタンパク質の配列において、他のタンパク質との最適な整列のため導入され得る）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。１つの配列中の位置が、他の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基により占められるとき、次に、分子は、その位置において同一性／類似性を有する。２つの配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性は、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性または％類似性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。かかる整列化（アラインメント）は、かかる目的のため当該技術分野においてデザインされ、用いられる、いくつかの周知のコンピューターアルゴリズムのいずれか１つを用いて行われ得る。同様に、本発明の光活性化チャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のパーセント同一性／類似性は、核酸についての当該技術分野において公知の整列化および比較方法を用いて決定され得る。
【００６８】
[0062]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本明細書において示される光活性化イオンチャネルポリペプチド配列より短いか、または長くあってもよい。従って、本発明の一部の態様において、全長ポリペプチドまたはその機能的フラグメントは、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの定義内に含まれる。加えて、本発明の核酸を用いて、当該技術分野において公知の技術を用いて、さらなるコード領域、これによりさらなるポリペプチド配列が得られ得る。
【００６９】
[0063]本発明の一部の側面において、実質的に類似の光活性化イオンチャネルポリペプチド配列は、本明細書において開示される光活性化イオンチャネルポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または１００％類似性を有し、その非限定的な例は、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ８６、およびそのバリアントを含む。当該技術分野において公知の整列化方法およびツールを用いて、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを調製するために本明細書において記載される通り修飾され得る、アミノ酸の位置の同定を可能にする類似の配列が実質的に整列され得る。配列番号２および配列番号４のバリアントの非限定的な例は、それぞれ、配列番号７および配列番号８を含む。
【００７０】
配列修飾は、３つのクラス、置換、挿入、または欠失の１つもしくは複数であり得る。これらの修飾された配列（それはバリアントとしても言及され得る）は、修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするＤＮＡを作製し、その後、組み換え細胞培養においてＤＮＡを発現させるために、カセットまたはＰＣＲ変異誘発または他の当該技術分野において公知の技術を用いて、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするＤＮＡ中の核酸の部位特異的な変異誘発により通常調製される。アミノ酸置換が、ポリペプチドの小さいフラグメントに対して成される場合、置換は、ポリペプチドを直接的に合成することにより成され得る。本発明のある種の態様において、光活性化チャネルポリペプチドのバリアントまたはフラグメント、あるいは光活性化チャネルポリペプチドのバリアントの活性は、変更されたポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳類発現ベクターにクローニングすること、ベクターを適当な宿主細胞に導入すること、変更されたポリペプチドを発現させること、および本明細書において開示されるポリペプチドの機能的能力について試験することにより、試験され得る。
【００７１】
[0064]アミノ酸配列バリアントは、バリエーションの予め決定された性質、それらを本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子または種間バリエーションから区別する特性により特徴付けられ得る。修飾された特徴を有するバリアントも選択され得るが、本発明の修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチドは、天然に存在する類似体と同一の定性的生物学的活性を一般に示す。
【００７２】
[0065]アミノ酸配列修飾を導入するための部位または領域が予め決定されてもよく、変異自体は、予め決定されることを必要としない。例えば、所定の部位における変異の性能を最適化するために、ランダム変異誘発が、標的コドンまたは領域において行われ、発現された修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチドが、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位において置換変異を成す技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が周知である。
【００７３】
[0066]アミノ酸置換は、単一の残基の典型であり、本発明のある種の態様において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くの置換が、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのアミノ酸配列、例えば、制限することは意図されないが、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として本明細書において示される配列において成され得る。例えば、制限することを意図されないが、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として本明細書において示される配列における、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸挿入は、より大きな挿入が許容され得るが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸の挿入を含み得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの配列、例えば、制限することは意図されないが、配列番号２、配列番号４、配列番号７、または配列番号８として示される配列におけるアミノ酸欠失は、より大きな挿入が許容され得るが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸の欠失を含み得る。
【００７４】
[0067]置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせを用いて、本発明の最終的な修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチドに到達し得る。一般的に、これらの変化は、分子の変更を最小にするために数個のアミノ酸において成される。しかしながら、より大きな変化が、ある種の状況において許容され得る。
【００７５】
[0068]本明細書において示される光活性化イオンチャネルポリペプチドのバリアントは、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ８６、もしくはそのバリアントのような本明細書において示される配列の１つまたは複数と同一の定性的な光活性化イオンチャネル活性を示すが、変更された光電流、安定性、速度、適合性、および毒性、またはその組み合わせのようないくつかの変更された特徴を示し得る。例えば、ポリペプチドは、増大した光電流を有し、および／または別の光活性化イオンチャネルポリペプチドより少ない毒性を有するように、修飾され得る。
【００７６】
[0069]本発明の修飾された光活性化イオンチャネルポリペプチドは、非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸を取り込み得る。非天然アミノ酸は、光電流、安定性、速度、適合性、またはより低い毒性などのような特徴を増強するために、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドにおいて含まれ得る。
【００７７】
[0070]本発明の原理によると、光活性化イオンチャネルポリペプチドの性能は、他の分子または光学的装置と併せたそれらの使用に関連して含む、最適な使用のため適合され得る。例えば、マルチカラー刺激に最適な対比を達成するために、輸送増強配列の付属物、または部位特異的変異誘発、指定された進化、遺伝子混合、またはコドン使用の変更による遺伝子バリアントの創出により、互いに関連する１つの分子の性能を改良するか、または低減することのいずれかを所望し得る。光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本質的に変動するスペクトル感受性を有し得る。これは、時間、パワー、および照射履歴に関する光学的照射に対する応答の直線性または非直線性を適合させることにより、インビボ（ここで、散乱ならびに吸収は、波長、干渉性、および極性化に関連して変動するだろう）の利点のため用いられ得る。
【００７８】
[0071]一部の態様において、本発明は、スケルフェリアおよびクロロモナスのロドプシンの残基を含むが、これらに限定されない、チャネルロドプシンの特異的なアミノ酸残基における標的部位特異的変異誘発の使用を含む。単一の変異についての特異的な位置が同定され、単独で、または２つ以上のさらなる変異と併用して、チャネルロドプシン配列に置かれ、それらの活性化および光電流振幅に関して試験され得る。従って、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの配列、および／または類似のチャネルロドプシン配列が修飾され、得られたポリペプチドが、本明細書において開示される方法を用いて試験され得る。
【００７９】
[0072]本発明の別の側面は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが、種々の核酸によりコードされ得ることは、当業者により理解されるだろう。タンパク質中のそれぞれのアミノ酸は、３つの核酸（コドン）の１つまたは複数のセットにより表される。多くのアミノ酸は、１つより多くのコドンにより表されるので、所定のタンパク質をコードする固有の核酸配列は存在しない。タンパク質のアミノ酸配列を識別することにより、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードし得る核酸配列を作製する方法が、当業者により理解されるだろう。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列は、そのポリペプチドまたはタンパク質の「遺伝子」である。遺伝子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードするもの以外の核酸であり得る。
【００８０】
[0073]異なる生物におけるコドン系は若干異なり得ること、およびそれ故、所定の生物由来の所定のタンパク質の発現が所望される場合、核酸配列は、その生物内での発現のため修飾され得ることは、当該技術分野において理解される。従って、一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、哺乳類コドン最適化核酸配列によりコードされ、それは、一部の態様において、ヒトコドン最適化核酸配列であり得る。本発明の側面は、哺乳類細胞での発現のため最適化される、光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本発明のある種の側面において、核酸配列は、ヒト細胞における発現のため最適化される。
光活性化イオンチャネルポリペプチドの送達
[0074]光活性化イオンチャネルポリペプチドの細胞への送達、および／または細胞における光活性化イオンチャネルポリペプチドの発現は、当該技術分野において公知の送達手段を用いて行われ得る。
【００８１】
[0075]本発明の一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、融合タンパク質中に含まれる。ポリペプチド配列を含む融合タンパク質を調製し、利用する方法は、当該技術分野において周知である。本発明のある種の態様において、融合タンパク質を用いて、光活性化イオンチャネルポリペプチドが細胞まで送達され得、一部の態様において、それをまた用いて、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが、対象において特異的な複数の細胞もしくは特異的な細胞、組織、または領域に標的化され得る。標的化、および所望の細胞、組織、または領域への送達に適した標的配列は、当該技術分野において公知の手順を用いて行われ得る。
【００８２】
[0076]発現される細胞において無毒性または実質的に無毒性である、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを提供することは、本発明の側面である。光の不存在下で、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、発現される細胞において細胞の健康状態または進行中の電気的活性を有意に変更しない。
【００８３】
[0077]本発明の一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、細胞膜に遺伝子的に導入され、試薬および方法が、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ８６、およびそのバリアントなどを含む、光活性化イオンチャネルポリペプチドの遺伝子的に標的化された発現のため提供される。遺伝子標的化を用いて、光活性化イオンチャネルポリペプチドが、特異的な細胞タイプ、特異的な細胞サブタイプ、生物内の特異的な空間的領域、および細胞内の細胞下領域に送達され得る。遺伝子標的化はまた、発現される光活性化イオンチャネルポリペプチドの量、および発現のタイミングの制御に関する。
【００８４】
[0078]本発明の一部の態様は、光活性化イオンチャネルポリペプチドの遺伝子的に標的化された発現のための試薬を含み、ここで、試薬は、光活性化イオンチャネルポリペプチドの遺伝子を含有するベクターを含む。
【００８５】
[0079]本明細書において用いられる、用語「ベクター」は、異なる遺伝子環境間でそれが作動可能に連結される別の核酸を輸送する能力のある核酸分子を指す。用語「ベクター」はまた、核酸分子を輸送する能力があるウイルスまたは生物も指す。ベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外の複製の能力がある核酸分子である。ある有用なベクターは、それらが連結される核酸の自立性複製および／または発現の能力があるものである。作動可能に連結される遺伝子の発現を指示する能力があるベクターは、本明細書において「発現ベクター」として言及される。他の有用なベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびファージのようなウイルスを含むが、これらに限定されない。本発明のある方法において有用なベクターは、光活性化イオンチャネルポリペプチドを分裂している細胞および分裂していない細胞に遺伝子的に挿入し得、光活性化イオンチャネルポリペプチドを、インビボ、インビトロ、またはエクスビボ細胞である細胞に挿入し得る。
【００８６】
[0080]本発明の方法において有用なベクターは、１種または複数のシグナル配列、および／またはプロモーター配列、あるいはその組み合わせを含むが、これらに限定されない、さらなる配列を含んでもよい。発現ベクターおよびその使用方法は、当該技術分野において周知である。適当な発現ベクターおよびその使用方法の非限定的な例が、本明細書において提供される。
【００８７】
[0081]本発明のある種の態様において、ベクターは、ＣｈＲ６４、ＣｈＲ８６、またはそのバリアントのような、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの遺伝子を含むレンチウイルスであってもよい。レンチウイルスは、適当な細胞株を作製するために用いられ得るベクターの非限定的な例である。本明細書において用いられる、用語「細胞株」は、適当な培地を前提として継続して増殖するであろう、確立された細胞培養物である。
【００８８】
[0082]本発明の方法およびベクターにおいて用いられ得るプロモーターは、細胞特異的プロモーターまたは一般的なプロモーターを含むが、これらに限定されない。細胞特異的プロモーターおよび一般的なプロモーターを選択し、使用する方法は、当該技術分野において周知である。非限定的な例の、多種多様な細胞タイプにおいて光活性化イオンチャネルポリペプチドの発現を可能にする一般的な目的のプロモーター、これにより、様々な細胞タイプにおいて広く発現される遺伝子のプロモーター、例えば、「ハウスキーピング遺伝子」を用いて、様々な細胞タイプにおいて光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現され得る。一般的なプロモーターの非限定的な例が、本明細書の他の場所で提供され、適当な代替のプロモーターが、当該技術分野において周知である。
【００８９】
[0083]本発明のある種の態様において、プロモーターは、誘導可能なプロモーターであってもよく、その例は、テトラサイクリン−オンもしくはテトラサイクリン−オフ、またはタモキシフェンにより誘導可能なＣｒｅ−ＥＲを含むが、これらに限定されない。
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用方法
[0084]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、標的細胞に十分に合い、電位に関連する細胞活性を特異的に変更させる。本発明の一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを利用して、カチオンが細胞に導入され、これにより、内在性シグナル伝達経路（例えば、カルシウム依存性シグナル伝達）が活性化され、次に、（カルシウム、または電位感受性のダイを用いて）細胞の応答を調節する薬物が適用される。これは、目的のチャネルを活性化するための光だけを用い、薬物の目的のチャネルに対する効果を読み取る光だけを用いた新規種類の薬物スクリーニングを可能にする。
【００９０】
[0085]本発明のある種の側面において、本発明の野生型または修飾されたスケルフェリアもしくはクロロモナス光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞が青色光に対して感受性にされ得る。かかる方法を用いて、盲目が処置され、青色光に対する視覚的認知が導入され得る。
【００９１】
[0086]本発明の別の側面において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、それが発現される細胞のｐＨが低減され得る。かかる技術を用いて、アルカローシスが処置され得る。
【００９２】
[0087]本発明の別の側面は、過分極と細胞内アルカリ化の連結した効果のため、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用と併せて１つまたは複数の光活性化プロトンポンプを用いる方法を含む。例えば、両方の現象は、過分極により誘導されるカチオン電流、またはｐＨ依存性過剰興奮性の引き金を引くことにより、ニューロンにおいて自発的スパイキングを誘導し得る。本発明の別の側面は、特に、シナプスにて、ならびにシナプス伝達を変更させるためにシナプス小胞、およびＡＴＰ合成を改善するためにミトコンドリアにおいて、細胞下電位またはｐＨ勾配を生じさせるために光活性化イオンチャネルポリペプチドを利用することである。
【００９３】
[0088]本発明の原型の実用的な実施は、興奮性細胞において本発明の光活性化イオンチャネル分子を遺伝子的に発現させ、細胞を適当な波長の光で照射し、光に応答した細胞の迅速な脱分極ならびに光の停止の際に脱分極からの迅速な放出を示すことにより、示された。特定の実行に依存し、本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、およびインビトロでの細胞の機能の光制御を可能にする。
【００９４】
[0089]本発明の方法の非限定的な例において、微生物チャネルロドプシンは、任意の種類の化学的補足を必要とすることなく哺乳類細胞において、ならびに正常な細胞の環境条件およびイオン濃度において用いられる。例えば、スケルフェリアおよびクロロモナスのチャネルロドプシンをコードする遺伝子が、本発明の例示的な実行において用いられた。ヒト化またはマウス最適化形態のこれらの配列は、青色光波長における脱分極を可能にする（例えば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチド）。
【００９５】
[0090]本明細書において用いられる、用語「イオンチャネル」は、ポアを形成する膜貫通型ポリペプチドを意味し、それは、開口を活性化したとき、膜を渡ってポアを介したイオンコンダクタンスを可能にする。多くのイオンチャネルは、細胞において十分に発現せず、および／またはそれらの発現は、細胞にとって毒性であり、細胞の健康状態を低減し得る。従って、多数のチャネルロドプシン光活性化イオンチャネルポリペプチドを調製し、スクリーニングして、細胞健康状態および生存率を有意に低減することなく細胞において発現され得る本発明の光活性化イオンチャネルを同定することが必要である。
【００９６】
[0091]本発明の光活性化イオンチャネルは、正常な細胞の環境条件およびイオン濃度において、任意の種類の化学補足を必要とすることなく、哺乳類細胞における発現および使用に適することが見出された。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、従前に同定されたチャネルと異なることが見出され、ここで、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、青色光範囲にある波長の光において最も効率的に活性化する。
細胞および対象
[0092]本発明の方法において、本発明の配列と共に用いられる細胞は、興奮性細胞または非興奮性細胞であり得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現され、本発明の方法において用いられる細胞は、原核生物の細胞および真核生物の細胞を含む。有用な細胞は、哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現され得る細胞の例は、興奮性細胞であり、それは、電気的シグナルを産生し、応答することができる細胞を含む。興奮性細胞タイプの例は、ニューロン、筋肉、心臓細胞、および分泌細胞（例えば、膵臓細胞、副腎髄質細胞、下垂体細胞など）を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
[0093]本発明の方法において用いられ得る細胞の非限定的な例は、神経系細胞、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、分泌細胞、内分泌細胞、または筋肉細胞を含む。一部の態様において、本発明と併せて用いられる細胞は、健常な正常細胞であり、それは、疾患、障害、または異常な状態を有することが分かっていない。一部の態様において、本発明の方法および本発明のチャネルと併せて用いられる細胞は、異常な細胞、例えば、変性細胞、神経疾患を生じる細胞、疾患もしくは状態の細胞モデル、および損傷された細胞などを含むが、これらに限定されない、障害、疾患、または状態を有すると診断された細胞であってもよい。本発明の一部の態様において、細胞は制御細胞であってもよい。
【００９８】
[0094]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、培養物由来の細胞、溶液中の細胞、対象から得られた細胞、および／または対象における細胞（インビボ細胞）において発現され得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、培養細胞、培養組織（例えば、脳切片調製物など）において、および生きている対象においてなどで発現され、活性化され得る。本明細書において用いられる、用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ハエ、または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物生物を指し得る。
対照および候補化合物試験
[0095]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチド、ならびに本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いた方法を利用して、それらが発現される、細胞、組織、および対象における変化が評価され得る。本発明の一部の態様は、候補化合物の細胞、組織、および対象に対する効果を同定するための本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用を含む。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの試験の結果は、対照に対して有利に比較され得る。
【００９９】
[0096]本明細書において用いられる対照は、予め決定された値であってもよく、それは、様々な形態をとることができる。それは、中央値または平均のような、単一のカットオフ値であり得る。それは、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを含み、光と接触させるが、候補化合物と接触させない細胞または組織のような比較群、ならびに同一の試験条件下で、候補化合物と接触させる同一タイプの細胞または組織に基づき確立され得る。比較群の別の例は、障害もしくは状態を有する細胞または組織、および障害または状態を有しない群を含む。別の比較群は、疾患または状態の家族歴を有する群由来の細胞、およびかかる家族歴を有しない群由来の細胞であってもよい。例えば、試験された集団が、試験の結果に基づき群に均等に（または非均等に）分けられる場合、予め決定された値が用意され得る。当業者は、本発明の比較方法において使用するための適当な対照群および値を選択することができる。
【０１００】
[0097]候補治療剤または化合物を同定するための光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用の非限定的な例として、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、培養中の興奮性細胞において、または対象において発現され得、興奮性細胞は、光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化する光、および候補治療化合物と接触し得る。一態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む試験細胞は、細胞を脱分極させる光と接触し、候補化合物とも接触し得る。細胞、組織、および／または細胞を含む対象は、試験条件対対照条件下で生じる変化の存在もしくは不存在についてモニターされ得る。例えば、細胞において、変化は、試験細胞対対照細胞における脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴の変化であり得、対照と比較された、試験細胞における脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴の変化が、候補化合物が試験細胞または細胞を含む組織に対する効果を有することを示し得る。本発明の一部の態様において、脱分極媒介性の細胞特徴は、活動電位、細胞におけるｐＨ変化、神経伝達物質の放出などであってもよく、一部の態様において、１つまたは複数のさらなる細胞に対する下流の効果を含み得、それは、光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む細胞の脱分極に起因して生じる。当該技術分野において公知の方法を用いて、脱分極および脱分極媒介性の細胞特徴、ならびに候補化合物とのさらなる接触ありまたはなしで、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの励起の際の脱分極または脱分極媒介性の細胞特徴に対する変化が評価され得る。
【０１０１】
[0098]対象において、または培養細胞もしくはインビトロ細胞において行われる本発明の候補化合物の同定方法。対象において行われる本発明の候補化合物の同定方法は、対象において光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現させ、光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化し、細胞を脱分極させるのに適した条件下で、対象を光と接触させ、そして、対象に候補化合物を投与する、ことを含み得る。次に、対象をモニターして、対象における対照効果と異なる任意の変化が生じるかどうかが決定される。インビトロで行われる、本発明の候補化合物の同定方法は、培養細胞であってもなくてもよい細胞において光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現させ、光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化させ、細胞を脱分極させるのに適した条件下で、細胞を光と接触させ、そして、細胞を候補化合物と接触させる、ことを含み得る。次に、細胞をモニターして、細胞において対照効果と異なる任意の変化が生じるかどうかが決定され得る。従って、例えば、光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現する細胞は、候補化合物の存在下で、光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するのに適当な光と接触し得る。光活性化イオンチャネルポリペプチドの候補化合物との接触はまた、光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するのに適当な光との接触に先立ち、同時、または続く１つまたは複数の時間ポイントにおいても生じ得る。候補化合物とのかかる接触の結果が測定され、候補化合物の効果の存在または不存在の決定値として対照値に比較され得る。
【０１０２】
[0099]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて候補化合物の効果を同定する方法はまた、細胞が候補化合物と接触したとき、細胞、組織、または対象において同定される変化をさらに特徴付ける、さらなるステップおよびアッセイも含み得る。一部の態様において、細胞、組織、または対象において試験することはまた、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを有し、１個、２個、３個、またはそれより多くのさらなる異なる光活性化イオンチャネルも有する、１個または複数の細胞も含み得、ここで、さらなる光活性化イオンチャネルの少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くは、本発明の青色光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化するために用いられたものと異なる波長を有する光との接触により活性化される。
【０１０３】
[0100]本発明の候補薬物の同定方法の非限定的な例において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む細胞は脱分極し、次に、神経伝達物質の細胞からの放出が引き金を引かれ、次に、細胞の脱分極に対する応答を調節する薬物が適用される（例えば、パッチクランピング方法または他の適当な当該技術分野において公知の手段を用いて決定される）。かかる方法は、目的のチャネルを活性化するための光だけを用い、薬物の目的のチャネルおよびチャネル含有細胞に対する効果を読み取る光だけを用いた新規種類の薬物スクリーニングを可能にする。
【０１０４】
[0101]一部の態様において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、異種性に発現された系において、膜タンパク質輸送および生理学的機能、ならびに細胞を脱分極させるための光活性化チャネルの使用を評価するための試験系およびアッセイにおいて用いられ得る。
処置の方法
[0102]本発明の一部の側面は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞、組織、もしくは対象において障害または状態を処置する方法を含む。本発明の処置方法は、障害を処置するために、かかる処置を必要とする対象に、治療有効量の本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを投与する、ことを含み得る。処置は、予防的処置であり得るか、または疾患もしくは状態の診断後施される処置であり得ることは理解されるだろう。本発明の処置は、障害、疾患、もしくは状態の症状または特徴を低減するか、あるいは排除し得るか、あるいは障害、疾患、または状態自体を排除する。本発明の処置は、疾患、障害、もしくは状態の進行を低減するか、または排除し得、ある場合では、疾患、障害、または状態の退縮をもたらし得ることは理解されるだろう。処置は、有効であるように疾患、障害、または状態を完全に排除する必要はない。
【０１０５】
[0103]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与は、細胞を含む医薬組成物の投与を含み得、ここで、細胞は光活性化イオンチャネルを発現する。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与は、ベクターを含む医薬組成物の投与を含み得、ここで、ベクターは、光活性化イオンチャネルをコードする核酸配列を含み、ベクターの投与は、対象において細胞における光活性化イオンチャネルの発現をもたらす。
【０１０６】
[0104]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの有効量は、対象に有益であるレベルまで、細胞、組織、または対象における光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを増大させる量である。有効量はまた、投与後の症状の低減のような、投与の細胞または対象に対する生理学的効果を評価することによっても決定され得る。他のアッセイが当業者に公知であろうし、処置に対する応答のレベルを測定するために用いられ得る。処置の量は、例えば、投与される光活性化イオンチャネルポリペプチドの量を増大させるか、または低減することにより、光活性化イオンチャネルポリペプチドが投与される、治療組成物を変えることにより、投与経路を変えることにより、投薬のタイミングを変えることにより、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの活性化量およびパラメーターを変えることによりなどで変動され得る。有効量は、処置される特定の状態、処置される対象の年齢および身体の状態、状態の重症度、処置の持続時間、同時療法（もしあれば）の性質、投与の特異的経路などの医療関係者の知識および経験内のファクターで変動するだろう。例えば、有効量は、光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現されるべき、対象における細胞の位置および数に依存し得る。有効量はまた、処置されるべき組織の位置にも依存し得る。
【０１０７】
[0105]有効量はまた、もちろん、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体的状態、大きさおよび体重を含む個々の患者のパラメーター、処置の持続時間、同時療法（もしあれば）の性質、投与の特異的な経路などの医療関係者の知識および経験内のファクターにも依存するだろう。これらのファクターは、当業者に周知であり、日常的実験程度で対処され得る。対象において、光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを増大させるため、および／または光活性化イオンチャネルポリペプチドの長さもしくは活性化のタイミングを変更させるための組成物の最大用量、すなわち、妥当な医療判断による最大の安全な用量または量が、（単独、もしくは他の治療剤と併用して）用いられことが、一般に好ましい。しかしながら、患者は、医療上の理由、心理的理由、もしくは事実上の任意の他の理由のためより低い用量または許容可能な用量を強く主張し得ることは、当業者により理解されるだろう。
【０１０８】
[0106]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて投与され得る。投与される形式および投薬量は、特に、任意の合併症の事象において、個々の医師または獣医師により調整され得る。投与される絶対量は、投与のため選択される材料、投与が単回または複数回用量であるかどうか、ならびに年齢、身体的状態、大きさ、体重および疾患または状態のステージを含む個々の対象のパラメーターを含む、様々なファクターに依存するであろう。これらのファクターは、当業者に周知であり、日常的実験程度で対処され得る。
【０１０９】
[0107]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを送達する医薬組成物は、単独で、互いに併用して、および／または対象に投与される他の薬物療法もしくは他の処置計画と併用して投与され得る。前述の方法において用いられる医薬組成物は、対象への投与に適した重量および容量の単位で所望の応答を生じるレベルまで、光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを増大するであろう、有効量の治療化合物を含有し得る。本発明の一部の態様において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体を含んでもよい。
【０１１０】
[0108]薬学的に許容し得る担体は、当該技術分野において周知である、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤、および他の材料を含む。例示的な薬学的に許容し得る担体は、米国特許第５，２１１，６５７号において記載され、他の物は当業者により公知である。本発明のある種の態様において、かかる調製物は、塩、緩衝剤、保存剤、適合可能な担体、水溶液、水などを含有してもよい。医薬において用いられるとき、塩は、薬学的に許容し得るが、薬学的に許容し得ない塩を便宜的に用いて、その薬学的に許容し得る塩が調製され得、本発明の範囲から排除されない。かかる薬理学的または薬学的に許容し得る塩は、以下の酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含むが、これらに限定されない。また、薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム、カリウム、もしくはカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
【０１１１】
[0109]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドまたはコードポリヌクレオチドの１個もしくは複数、あるいは本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドもしくはコード核酸を含む細胞またはベクターは、例えば、医薬組成物において、組織に直接的に投与されてもよい。直接的な組織投与は、直接的注射により達成され得、かかる投与は、１回、または代替的に複数回行われ得る。複数回投与されるなら、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および／またはベクターは、異なる経路を介して投与され得る。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は、影響された組織に直接的に成されてもよく、一方、後の投与は全身性であってもよい。
【０１１２】
[0110]対象の細胞において光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを増大させるために対象に投与される医薬組成物の用量は、異なるパラメーターに従い、特に、使用される投与の様式および対象の状態に従い選ばれ得る。他のファクターは、所望の処置の期間を含む。対象における応答は、適用された開始用量で不十分である事象において、より多い用量（または異なるより局所化された送達経路により、より有効な多い用量）が、患者許容範囲が許可する程度まで利用され得る。対象に投与された、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの量および活性化のタイミング（例えば、光波長、光接触の長さなど）はまた、特定の対象における処置の有効性に基づき、調整され得る。対象に投与される、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの照射および活性化のパラメーターは、当該技術分野において公知の方法を用いて、過度の実験を必要とすることなく、決定され得る。
【０１１３】
[0111]対象の所望の細胞、組織、または身体領域において、光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを増大させるための医薬組成物を有効に送達するために用いられ得る、種々の投与の様式が、当業者に公知であろう。本発明のかかる組成物または他の医薬化合物を投与する方法は、局所、静脈内、経口、腔内、くも膜下腔内、滑液嚢内、口腔、舌下、鼻腔内、経皮、硝子体内、皮下、筋肉内、および皮内投与であり得る。本発明は、本明細書において開示される特定の投与の様式により制限されない。当該技術分野における標準的な参考文献（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年）は、医薬担体中の種々の医薬調製物および製剤の送達のための投与様式および製剤を提供する。本発明の治療化合物の投与に有用である他のプロトコールは、当業者に公知であり、ここで、投薬量、投与のスケジュール、投与の部位、投与の様式（例えば、器官内）などは、本明細書において提示されるものと異なる。
【０１１４】
[0112]ヒト以外の哺乳類において光活性化イオンチャネルポリペプチドレベルを増大させるための細胞またはベクターの投与、ならびに例えば、試験目的または獣医治療目的のため、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与および使用は、上で記載されるのと実質的に同一の条件下で行われる。本発明がヒトおよび動物の両方に適用可能であることは、当業者により理解されるだろう。従って、本発明は、畜産および獣医医薬において、ならびにヒト治療において用いられることが意図される。
【０１１５】
[0113]本発明の一部の側面において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて処置する方法は、神経系細胞、ニューロン、心臓細胞、循環器系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、筋肉細胞、または内分泌細胞などを含むが、これらに限定されない細胞に適用される。本発明の方法を用いて処置され得る障害および状態は、負傷、脳損傷、変性神経状態（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、発作、視力喪失、難聴など）を含む。
障害、疾患および状態
[0114]本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞および膜が標的にされ、電位に関連する細胞活性が変更され得る。一部の態様において、本発明の青色光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞が青色光に感受性にされ得る。かかる方法を用いて、盲目が処置され得る。
【０１１６】
[0115]本発明の別の側面において、光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、それが発現される細胞のｐＨが低減され得る。かかる技術を用いて、アルカローシスが処置され得る。
【０１１７】
[0116]本発明の別の側面は、過分極と細胞内アルカリ化の連結した効果のため、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用と併せて光活性化プロトンポンプを用いる方法を含む。例えば、両方の現象は、過分極により誘導されるカチオン電流、またはｐＨ依存性過剰興奮性の引き金を引くことにより、ニューロンにおいて自発的スパイキングを誘導し得る。
【０１１８】
[0117]一部の態様において、本発明の方法および光活性化イオンチャネルポリペプチドは、視覚系障害の処置のため、例えば、視力低下または喪失を処置するために用いられ得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、視力低下または喪失を有する対象に投与され得、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現する細胞は、視覚系において光感受性細胞として機能し、これにより、対象において視覚機能の獲得を可能にし得る。
【０１１９】
[0118]本発明は、一部の側面において、核酸配列およびポリヌクレオチド配列を調製すること、細胞、および調製された核酸およびポリヌクレオチド配列によりコードされる膜ポリペプチドにおいて発現させること、細胞および／または膜を適当な光で照射すること、ならびに細胞の迅速な脱分極および／または光に応答して膜を渡ったコンダクタンスの変化、ならびに光の停止の際に脱分極からの迅速な放出を示すことを含む。光で、膜を渡る電位および細胞脱分極を制御可能に変更させる能力が示された。本発明は、インビボ、エクスビボ、およびインビトロでの細胞の機能の光制御を可能にし、本発明の光活性化イオンチャネルおよびそれらの使用は、薬物スクリーニング、処置、および研究適用のための広範囲の適用を有し、その一部が、本明細書において記載される。
【０１２０】
[0119]本発明の説明的な実行において、細胞の機能を光学的に混乱させ、修飾し、または制御する能力は、物理的操作メカニズムに渡り多くの利点を提示する。これらの利点は、速度、非侵襲性、およびナノスケールからマクロスケールまでの広大な空間規模に容易に広がる能力を含む。
【０１２１】
[0120]本発明において用いる試薬（およびそれらが表すクラスの分子）は、スペクトルにおいてより以前の分子と異なり得る青色光波長により活性化される電流を少なくとも可能にする（細胞のマルチカラー制御を開始する）。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
導入
[0121]本発明は、細胞（および／またはそれらの細胞下領域、およびそれらの局所環境）の膜電位差（および／またはイオン組成）を修飾するための光開口型チャネルの使用を記載する。特に、内向き整流性カチオンチャネルの使用は、正に荷電したイオンを、細胞外環境から細胞質に移動させることにより、細胞を脱分極するだろう。ある種の条件下で、それらの使用は、細胞内ｐＨを低減する（および／または細胞内カチオン濃度を増大させる）か、または細胞外ｐＨを増大させる（および／または細胞外カチオン濃度を低減する）ことができる。先行技術［例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４６、６３３〜６３９頁、（２００７年）、およびＨａｎ，Ｘ．およびＢｏｙｄｅｎ，Ｅ．Ｓ．、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２、ｅ２９９頁、（２００７年）を参照、そのそれぞれの内容を本明細書において参照により組み込む］（この開示にも関わらず）においてニューロンを脱分極させるために用いられる、現在報告された天然の遺伝子配列と比較し、ＣｈＲ６４およびＣｈＲ８６は、青色光に応答して光電流発生を明らかに改善した。
【０１２３】
[0122]スケルフェリア・ドゥビアまたはクロロモナス・オオガマのいずれかに由来する遺伝子を細胞において発現させた実験を行った。スケルフェリア・ドゥビアに由来する遺伝子は、配列番号２として示されるアミノ酸配列をコードし、本明細書においてＣｈＲ６４として言及し、それは、本明細書において配列番号１として示される哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列によりコードされる。クロロモナス・オオガマに由来する遺伝子は、配列番号４として示されるアミノ酸配列をコードし、本明細書においてＣｈＲ８６として言及し、それは、本明細書において配列番号３として示される哺乳類コドン最適化ＤＮＡ配列によりコードされる。実験において、ＣｈＲ６４およびＣｈＲ８６を、以下の通り、細胞において発現させた。［または、実験の方法および手順の説明ならびに例については、Ｃｈｏｗ，Ｂ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６３、９８〜１０２頁、（２０１０年）を参照し、その内容を本明細書において参照により組み込む。］
方法
[0123]（１）オプシン遺伝子を、レンチウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングプラスミド、または別の所望の発現プラスミドにクローニングし、次に、ＧＦＰを好ましい遺伝子の下流にクローニングし、オプシン遺伝子の停止コドンを取り除き、これにより、融合タンパク質を生成した。
【０１２４】
[0124]（２）ウイルスまたは発現プラスミドは、１つまたは複数の論理的エレメント（例えば、ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ配列、これは、トランスジェニック動物における細胞において選択的に発現されるＣｒｅリコンビナーゼにより、または第２のウイルスにおいて取り除かれ、次に、強力な一般的なプロモーターが遺伝子を駆動することを可能にする）の後に、強力な遍在性プロモーター、細胞特異的プロモーター、または強力な一般的なプロモーターのいずれかを含有した［実験の方法および手順の説明ならびに例については、例えば、Ａｔａｓｏｙ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８、７０２５〜７０３０頁、（２００８年）、およびＫｕｈｌｍａｎ，Ｓ．Ｊ．およびＨｕａｎｇ，Ｚ．Ｊ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３、ｅ２００５頁、（２００８年）を参照し、そのそれぞれの内容を本明細書において参照により組み込む］。
【０１２５】
[0125]（３）ウイルスプラスミドを用いるなら、標準的技術［実験の方法および手順の説明ならびに例については、例えば、Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２２、１３１〜１３９頁、（２００４年）を参照し、その内容を本明細書において参照により組み込む］を用い、ウイルスプラスミドを用いて、ウイルスベクターを合成した。
【０１２６】
[0126]（４）遺伝子療法に適当である（１つの有害事象なく、４８の別々の臨床試験において、６００人を越える人々が、種々の遺伝子ペイロードを有するＡＡＶでこれまでに処置された）、ウイルスを用いるなら、小さな針またはカニューレを用いて、目的の領域にウイルスを注射し、これにより、目的の細胞にオプシン融合タンパク質をコードする遺伝子を送達する。別の発現ベクターを用いるなら、（オプシンを急性的に発現させるため、あるいは細胞株、またはトランスジェニックマウスもしくは他の動物を作製するため）細胞または生物にベクターを直接的に電気穿孔するかまたは注射する。
【０１２７】
[0127]（５）光を照射する。ＣｈＲ６４およびＣｈＲ８６について、発現された光活性化イオンチャネルポリペプチドが接触したピーク照射波長は、４７０ｎｍ＋１５ｎｍであった。
【０１２８】
[0128]（６）上記波長は、操作の典型的な様式を説明するが、用い得るプロトコールを制約することを意味しない。より狭いもしくはより広い波長、または異なる中央値の照射スペクトルのいずれかを用いる。補助的使用のため、標準的手順［実験の方法および手順の説明ならびに例については、例えば、Ｃａｍｐａｇｎｏｌａ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９、２７〜３３頁、（２００８年）を参照し、その内容を本明細書において参照により組み込む］を用いて、例えば、ＬＥＤおよびファイバーアレイを用いて、光を送達するために用いた装置を移植してもよい。薬物スクリーニングのため、キセノンランプまたはＬＥＤを用いて、光を送達することができる。
【０１２９】
[0129]ＣｈＲ６４に対するＥ１５４Ａの単一変異、およびＣｈＲ８６に対するＤ１２４Ａ単一点変異のような、部位特異的変異誘発により、ＣｈＲ６４またはＣｈＲ８６のいずれかから変更される、光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現させることにより、上記例の性能を変えてもよい。Ｃ末端Ｋｉｒ２．１シグナル配列（「ＫＧＣ」として示す）のような、細胞の輸送に影響するためにＣ末端ペプチド配列を付加することにより、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの性能も改善してもよい［Ｍｕｎｏｚ−Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、８００４〜８０１３頁、（２００５年）を参照し、その内容を本明細書において参照により組み込む］（アミノ酸配列：ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ  配列番号１２、ＤＮＡ配列：ａａａｔｃｃａｇａａｔｔａｃｔｔｃｔｇａａｇｇｇｇａｇｔａｔａｔｃｃｃｔｃｔｇｇａｔｃａａａｔａｇａｃａｔｃａａｔｇｔｔ（配列番号１１）。
光活性化イオンチャネルポリペプチドの使用方法
[0130]低い青色光のパワーで、ＣｈＲ６４およびＣｈＲ８６を活性化することができ、それは赤色光感受性を有しないことをここで示す。これらの青色ピークのチャネルロドプシンを赤色により移動された蛍光センサーと一緒に用いることにより、画像化チャネルにおける干渉なく、弱い青色光パワーを用いて、生理学的応答（例えば、電位、イオンなど）を同時に画像化すること、および細胞を光学的に脱分極させることが可能である。この同時画像化および光学的脱分極は、細胞生理学およびネットワーク生理学のフィードバック制御および照合に特に有用である。
【０１３０】
[0131]上の前記分子またはクラスの分子の性能を、特に、他の分子もしくは光学的装置と併せたそれらの使用の事情において、最適な使用に適合させることができる。例えば、同時光学的脱分極および画像化のため最適な対比を達成するために、部位特異的変異誘発、指示される進化、遺伝子混合、もしくはコドン使用の変更による、輸送増強配列の付属または遺伝子バリアントの創出により、別のものと関連する１つの分子の性能を改善するか、または低減することを所望し得る。分子または分子のクラスは、時間、パワー、および照射履歴に関して、光学的照射に対する応答の直線性または非直線性を適合させることにより、インビボ（ここで、散乱および吸収が、波長、干渉性、および極性化に関して変動するだろう）で機能的に有利であり得る、本質的に変動するスペクトル感受性を有し得る。
【０１３１】
[0132]カチオンを細胞に導入し、これにより、内在性シグナル伝達経路（例えば、カルシウム依存性シグナル伝達）を活性化し、次に、（細胞電気生理の出力としてカルシウムまたは電位感受性のダイを用いて）細胞の応答を調節する薬物を適用する能力も、本開示により可能にされる。これは、目的のチャネルを活性化する光だけを用い、および薬物の目的のチャネルに対する効果を読み取るための光だけを用いた、新規種類の薬物スクリーニングを可能にする。
【０１３２】
[0133]本発明の別の側面は、細胞のｐＨを低減するための光活性化チャネルの使用である。かかる技術を用いて、アルカローシスを処置し得る。
[0134]本発明の別の側面は、特に、シナプスにて、ならびにシナプス伝達を変更させるためにシナプス小胞、およびＡＴＰ合成を調節するためにミトコンドリアにおいて、細胞下電位またはｐＨ勾配を生じさせることである。
【０１３３】
[0135]本発明の別の側面は、（１）上記遺伝子をコードするプラスミド、（２）上述の遺伝子をコードするペイロードを有するレンチウイルス、（３）上述の遺伝子をコードするペイロードを有するアデノ随伴ウイルス、（４）上述の遺伝子を発現する細胞、および（５）上述の遺伝子を発現する動物を含むが、これらに限定されない、調製した種々の組成物である。
実施例２
[0136]配列を調製し、細胞、組織、および対象において光活性化イオンチャネルを発現させる研究を行った。非限定的な例示的な方法を、実施例１において示す。一般的な方法も光活性化チャネル分子に適用可能であり、それらの使用方法は、米国出願公開番号第２０１０／０２３４２７３号、米国出願公開番号第２０１１０１６５６８１号、Ｃｈｏｗ  ＢＹら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０１１年；４９７巻：４２５〜４３頁、Ｃｈｏｗ，ＢＹら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年１月７日；４６３（７２７７）：９８〜１０２頁、その内容を本明細書において参照により組み込む、のような刊行物において開示される。
【０１３４】
[0137]配列を調製し、細胞、組織、および対象において光活性化イオンチャネルを発現させる研究を行った。非限定的な例示的な方法を以下に示す。
プラスミド構築および部位指定変異誘発
[0138]Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．、ＮＪ）により、オプシンを哺乳類コドン最適化し、合成した。ＣａＭＫＩＩプロモーターを含有するレンチウイルスベクターにおいて、停止コドンなしで、ＧＦＰの前に、（ＢａｍＨＩおよびＡｇｅｌを用いて）オプシンをインフレームで融合させ、これにより、直接ニューロントランスフェクション、ＨＥＫ細胞トランスフェクション（ＨＥＫ細胞における発現を、レンチウイルスカセットの上流の遍在性プロモーターにより可能にする）、ならびにレンチウイルス産生およびトランスフェクションを可能にした。
【０１３５】
[0139]種々のオプシンのアミノ酸配列は以下の通りであった：ＣｈＲ６４（配列番号２）、ＣｈＲ８６（配列番号４）、Ｅ１５４Ａ置換を有するＣｈＲ６４（配列番号７）、Ｄ１２４Ａ置換を有するＣｈＲ８６（配列番号８）。
【０１３６】
「ＥＲ２」ＥＲ排出配列は、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ、ＤＮＡ配列ｔｔｃｔｇｃｔａｃｇａｇａａｔｇａａｇｔｇに対応した。「ＫＧＣ」シグナル配列は、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号１２）、ＫＧＣシグナル配列のＤＮＡ配列：ａａａｔｃｃａｇａａｔｔａｃｔｔｃｔｇａａｇｇｇｇａｇｔａｔａｔｃｃｃｔｃｔｇｇａｔｃａａａｔａｇａｃａｔｃａａｔｇｔｔ（配列番号１１）に対応した。
ニューロン培養、トランスフェクション、インフェクション、および画像化
[0140]動物を含む全ての手順は、実験動物のケアおよび使用についてのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅに従い、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。Ｓｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒまたはＣ５７マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ、またはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＡ）を用いた。海馬の培養のため、出生後日数０または１日のマウスの海馬領域を単離し、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）で約１２分間消化し、次に、１０〜２０％ウシ胎児血清およびトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＨａｎｋｓ溶液で処理した。次に、組織をパスツールピペットで機械的に解離し、１０００ｒｐｍにおいて４℃で１０分間遠心分離した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でコートした、１枚の２０ガラスのカバーガラス当たりおよそ４個の海馬の密度で、解離したニューロンを蒔いた。皮質培養のため、従前に記載した通り、解離したマウス皮質ニューロン（出生後０日または１日）を調製し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でコートした１枚のガラスのカバーガラス当たり１００〜２００ｋの密度で蒔いた。Ｂ２７［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］およびグルタミンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍにおいて培養物を維持した。海馬および皮質培養物を互換的に用い、試薬性能における差を示さなかった。
【０１３７】
[0141]リン酸カルシウム［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］を用いて、インビトロで、３〜５日において、ニューロンをトランスフェクトした。ＧＦＰ蛍光を用いて、トランスフェクトされたニューロンを首尾よく同定した。あるいは、３〜５日において、インビトロで、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）１ウェル当たり０．１〜３μｌで、ニューロンをトランスフェクトした。
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞培養およびトランスフェクション
[0142]１０％ウシ胎児血清［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、および１％  ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を補充したＤ１０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中１０〜７０％の間のコンフルエンスで、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］を維持した。記録のため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でコートした１枚のガラスのスライドガラス当たり５〜２０％コンフルエンスで、細胞を蒔いた。蒔いたおよそ２４時間後に、ＴｒａｎｓＬＴ２９３リポフェクタミントランスフェクションキット（Ｍｉｎｉｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、またはリン酸カルシウムトランスフェクションキット［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］のいずれかで、接着細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの３６〜７２時間後の間に、全体細胞パッチクランプを介して記録した。
レンチウイルス調製
[0143]レンチウイルスプラスミド、ウイルスヘルパープラスミドｐΔ８．７４、およびシュードタイピングプラスミドｐＭＤ２．Ｇで、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）］をトランスフェクトした。次に、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルスを含有するトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の上清を集め、精製し、次に、超遠心分離を介してペレット化した。レンチウイルスペレットを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において再懸濁し、インビトロまたはインビボでのさらなる使用まで、−８０℃で保存した。推定最終力価は、およそ１０９感染単位／ｍＬである。
インビトロ全体細胞パッチクランプ記録および光学的刺激
[0144]Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０デジタイザー、およびＰＣ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｐＣｌａｍｐ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、全体細胞パッチクランプ記録を作製した。１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣ１、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭグルコース、０．０１ｍＭ  ＮＢＱＸ、および０．０１ｍＭ  ＧＡＢＡｚｉｎｅを含有する室温のタイロードに、ニューロンを浸した。タイロードのｐＨをＮａＯＨで７．３に調整し、浸透圧をスクロースで３００ｍＯｓｍに調整した。ニューロンについてのものと同一だが、ＧＡＢＡｚｉｎｅおよびＮＢＱＸを欠くタイロードバス溶液に、ＨＥＫ細胞を浸した。外径１．２ｍｍおよび壁厚０．２５５ｍｍを有するホウケイ酸ガラスピペット（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）を、Ｐ−９７  Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）で抵抗性３〜９ΜΩまで引き、１２５ｍＭグルコン酸カリウム、８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．６ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、および０．４ｍＭ  Ｎａ−ＧＴＰを含有する溶液を充填した。ピペット溶液のｐＨをＫＯＨで７．３に調整し、浸透圧をスクロースで２９８ｍＯｓｍに調整した。電位−クランプ記録を介してモニターした、アクセス抵抗性は５〜３０ΜΩであった。電流−クランプ記録において、静止膜電位は、ニューロンについて約−６０ｍＶ、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞について約−３０ｍＶであった。
【０１３８】
[0145]−６０ｍＶで電位−クランプしたニューロン、および−３０ｍＶで電位−クランプしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において、５００ｍｓの光パスルで光電流を測定した。それらの静止膜電位にて電流−クランプした細胞において、５００ｍｓの光パルスで光により誘導される膜過分極を測定した。３００Ｗキセノンランプを有するＤＧ−４光スイッチ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）で６６０ｎｍを除く全ての波長についての光パルスおよび作用スペクトル特徴実験を遂行し、Ｄｉｇｉｄａｔａシグナル発生装置を通じて生じたＴＴＬパルスを介して制御した。５７５±２５ｎｍバンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）および５７５±７．５ｎｍバンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）で緑色光を送達した。Ｔｉｌｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  Ｖ、１５０Ｗキセノンランプ、１５ｎｍモノクロメータバンド幅で作用スペクトルを取得した。
【０１３９】
[0146]Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いて、データを分析した。
実施例３
[0147]実施例に記載した方法を用いて、ＨＥＫ２９３細胞において、ＣｈＲ６４（配列番号２）、ＣｈＲ８６（配列番号４）、Ｅ１５４Ａ置換を有するＣｈＲ６４（配列番号７）、Ｄ１２４Ａ置換を有するＣｈＲ８６（配列番号８）、およびＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ置換変異体を含むＣｈＲ２を発現させた。−６５ｍＶに電位クランプした生理的条件下の細胞において、正規化した作用スペクトルを記録した。それぞれの波長において、同等の光子束を用いた。
【０１４０】
[0148]図１は、ＨＥＫ２９３細胞において記録した作用スペクトルを示す。
[0149]図２は、培養した海馬のニューロンにおける青色光光電流および動力学的比較を示す。
【０１４１】
[0150]図３は、ＣｈＲ６４からＣｈｅＲｉｆｆまでを導く、輸送における改善を示す。図３Ａは、野生型ＳｄＣｈＲを発現する培養したニューロンの顕微鏡写真画像を示す。ＳｄＣｈＲは、神経細胞体において典型的に凝集し、斑点を形成した。図３Ｂは、ＳｄＣｈＲのＣ末端とｅＧＦＰのＮ末端の間にＫｉｒ２．１由来のさらなる輸送配列を有するＳｄＣｈＲを発現するニューロンの顕微鏡写真画像を示す。この輸送配列は、細胞内斑点を実質的に低減した。図３Ｃは、ＣｈｅＲｉｆｆを発現する２つのニューロンの顕微鏡写真画像を示す。Ｅ１５４Ａ変異の包含は、良好な膜輸送を維持しながら、赤色光感受性を低減し、τｏｆｆを低減した。図３Ｄは、ＣｈＲ６４からＣｈｅＲｉｆｆまでを導く、輸送における改善を示すデータを示す。スケルフェリア・ドゥビアチャネルロドプシン（ＳｄＣｈＲ）は、見込みのある光感受性、およびＱｕａｓＡｒｓとの対形成に適当な青色によりシフトされる作用スペクトルを有し、ラットの海馬のニューロンにおいて細胞膜に効率的に依然輸送しなかった。
【０１４２】
[0151]図４は、ＣｈｅＲｉｆｆの分光学的および動力学的特性を示す。上部左の図４Ａは、青色光におけるステップにより誘発されるチャネルロドプシン電流の成分を示す。Ｉｐｋは、ベースライン電流とピーク電流の間の差である。ｔｏｎは、光開始とピーク電流の間の時間である。τｄｅｓは、ピーク後の電流減衰に対する単一指数関数近似により示される脱感作時間定数である。Ｉｓｓは、定常状態の光電流である。τｏｆｆは、照射停止後の電流減衰に対する単一指数関数近似により示されるチャネル終了時間定数である。上部右の図４Ａは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝１０個の細胞）、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝６個の細胞）、およびＣｈＩＥＦ（ｎ＝６個の細胞）を発現するニューロンにおけるピーク（Ｉｐｋ）および定常状態（Ｉｓｓ）光電流を示す。光電流は、１秒間の４８８ｎｍの光パルス（５００ｍＷ／ｃｍ２）に応答して測定された。ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）より有意に大きなピーク光電流を生じた。ＣｈｅＲｉｆｆはまた、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．０１）より有意に大きな定常状態光電流を有した。下部左：ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）と比較されたとき、ピークへの有意に速い時間（ｔｏｎ）を有した。下部中央：ＣｈｅＲｉｆｆは、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｐ＜０．００１）またはＣｈＩＥＦ（ｐ＜０．００１）より有意に遅い時間定数で脱感作した。下部右の図４Ａは、τｏｆｆが、５ｍｓの照射パルス（５００ｍＷ／ｃｍ２）に応答して測定されたときの結果を示す。ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝９個の細胞）は、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝６個の細胞、ｐ＜０．０５）より有意に速いτｏｆｆを有し、ＣｈＩＥＦ（ｎ＝６個の細胞、ｐ＝０．９４）に相当した。全てのチャネルロドプシン比較を、一致する培養物、ＤＩＶ  １４−１５において行った。発現は、同一のプラスミド骨格中のＣａＭＫＩＩａプロモーターによりもたらされた。細胞培養の詳細については実施例の節を参照。図４Ｂは、Ａｒｃｈベースの電位指標（６４０ｎｍ、９００Ｗ／ｃｍ２）を画像化するために用いた赤色光によるＣｈｅＲｉｆｆの活性化を示す。図４Ｂ上部は、ＣｈｅＲｉｆｆを発現するニューロンにおける電流−クランプ（ｉ＝０）下で、パルスの赤色光が小さい定常脱分極３．１±０．２ｍＶ（ｎ＝５個の細胞）を導いたことを示す結果を示す。図４Ｂ下部は、電位−クランプ（Ｖ＝−６５ｍＶ）下で、パルスの赤色光が、小さい内向き光電流１４．３±３．１ｐＡ（ｎ＝５個の細胞）を示す結果を示す。
【０１４３】
[0152]表１は、ＣｈｅＲｉｆｆ、ＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ、およびＣｈＩＥＦ間の比較の概要を含む。［ＣｈＩＥＦについてのさらなる情報については、Ｌｉｎ，Ｊ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９年）、９６巻、５版、３月４日、１８０３〜１８１４頁を参照し、その内容を本明細書において参照により組み込む。］
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
[0153]図５は、培養された海馬のニューロンにおけるＣｈｅＲｉｆｆの適用を示す。図５Ａは、側面図（上部）および正面図（下部）のスケルフェリア・ドゥビア（株ＣＣＡＣ  ００５３）の光顕微鏡写真（ＤＩＣ）を示す。矢印は、眼状斑点（赤色）を印付ける。それぞれ、ＣＣＡＣ［ｗｗｗ．ｃｃａｃ．ｕｎｉ−ｋｏｅｌｎ．ｄｅ／］およびＳｅｂａｓｔｉａｎ  Ｈｅｓｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ）の好意による株および顕微鏡写真。図５Ｂは、ｅＧＦＰ蛍光を介して画像化した、ＣｈｅＲｉｆｆ−ｅＧＦＰを発現する培養したラット海馬ニューロンの顕微鏡写真画像を示す。図５Ｃは、４８８ｎｍ、５００ｍＷ／ｃｍ２での照射でＣｈｅＲｉｆｆにより、およびチャネルロドプシン２  Ｈ１３４Ｒにより誘導された光電流を示す。図５Ｄは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝５個の細胞）またはＣｈＲ２  Ｈ１３４Ｒ（ｎ＝５個の細胞）を発現する、一致する培養物における照射強度の関数としての光電流の比較を示すグラフを提供する。照射は、全体の細胞に渡り、または神経細胞体に限局してのいずれかであった。図５Ｅは、ＣｈｅＲｉｆｆ（ｎ＝５個の細胞）を発現するニューロンにおける刺激頻度と照射強度の関数としてスパイキングフィデリティーを示すグラフを提供する。
均等物
[0154]本発明のいくつかの態様が、本明細書において記載され、説明されるが、当業者は、様々な他の手段、および／または機能を行う、および／または結果および／または本明細書において記載される利点の１つまたは複数を得るための構造を容易に描くだろうし、それぞれのかかるバリエーションおよび／または修飾は、本発明の範囲内であると思われる。より一般的に、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および配置が例示的であることを意味すること、ならびに実際のパラメーター、寸法、材料、および配置が、本発明の教示が用いられる、特異的な適用または複数の適用に依存するであろうことは、容易に認めるだろう。当業者は、日常的実験程度を用いて、本明細書において記載される本発明の特異的な態様に対する多くの均等物を認識するか、または確かめることができるであろう。それ故、前述の態様は、例示のみの目的で提示されること、ならびに添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載され、請求される以外に実施され得ることは、理解されるべきである。本発明は、本明細書において記載されるそれぞれの個々の特性、系、物品、材料、および／または方法に向けられる。加えて、２つ以上のかかる特性、系、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特性、系、物品、材料、および／または方法が、必ずしも一致しなくても、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４６】
[0155]本明細書において定義され、用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味に渡り制御することは理解されるべきである。
【０１４７】
[0156]明細書および特許請求の範囲においてここで用いられる、不定冠詞「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、対照的に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することは理解されるべきである。明細書および特許請求の範囲においてここで用いられる、語句「および／または」は、統合された構成要素、すなわち、ある場合において結合して存在し、他の場合において解離して存在する構成要素の「一方または両方」を意味することは理解されるべきである。具体的に同定されるその構成要素と関連するか、または関連しないかに関わらず、対照的に明確に示されない限り、「および／または」節により具体的に同定される構成要素以外の、他の構成要素が、場合により存在してもよい。
【０１４８】
[0157]本出願において引用されるか、または参照される全ての参考文献、特許および特許出願、ならびに刊行物は、本明細書において全体として参照により組み込まれる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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