(57)【要約】  本発明は、1-プロパノールの製造方法を包含する。いくつかの実施態様において、方法は、培養された細菌バイオフィルムを供給すること；1-プロパノール産生に適した条件で細菌バイオフィルムを培養すること；及びバイオフィルムの培養物により産生された1-プロパノールを回収することを含む。いくつかの実施態様において、方法は、細菌及びLB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地を含む細菌培養物を供給すること；1-プロパノール産生に適した条件で細菌培養物を維持すること；及び培養物により産生された1-プロパノールを回収することを含む。また、本発明は、細菌培養系を包含する。いくつかの実施態様において、細菌培養系は、人工の固相基質上で生育した細菌を含む細菌バイオフィルム；培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；及び培養物により産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む。いくつかの実施態様において、培養系は、細菌；LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；及び培養物により産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  tdcA-G遺伝子及びadhE遺伝子の発現に適した条件で細菌を培養することによって、1-プロパノールを産生する工程と；
b)  前記培養によって産生された1-プロパノールを回収する工程と
を含む、1-プロパノールの製造方法。
【請求項２】
前記工程a)が、培養された細菌バイオフィルムを供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程a)が、プランクトン細菌培養物を供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、嫌気性条件又は微嫌気性条件で培養される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、スレオニン又はその前駆体を含む培地で培養される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、完全培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、少なくとも0.4％のスレオニンを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が、少なくとも0.1％のグリシンを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、腸内細菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腸内細菌が、E.コリ(E. coli)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、adhE, tdcB, ilvA, tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌が、ptA, tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が、少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌が、好気性条件で、プランクトン培養物中で培養される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
当該細菌がバイオフィルムを形成するのに十分な条件で、人工又は天然の固相基質に細菌を播種することを含む方法によって、培養された細菌バイオフィルムを供給することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、少なくとも24時間培養される、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
少なくともadhE遺伝子及びtdcB遺伝子を過剰発現する、遺伝子操作された細菌。
【請求項１９】
ilvA遺伝子、tdcE遺伝子及びpflB遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１８に記載の細菌。
【請求項２０】
ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子改変されている、請求項１８又は１９に記載の細菌。
【請求項２１】
遺伝子改変されていない細菌；
培地；及び
液体及び/又は気体の1-プロパノール：
を含む細菌培養物。
【請求項２２】
請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細菌；
培地；及び
液体及び/又は気体の1-プロパノール：
を含む細菌培養物。
【請求項２３】
人工又は天然の固相基質上で生育した細菌を含む細菌バイオフィルムを含む、請求項２１又は２２に記載の細菌培養物。
【請求項２４】
前記バイオフィルムを構成する細菌の組成が既知である、請求項２３に記載の細菌培養物。
【請求項２５】
前記培養された細菌バイオフィルムが、培養されたE. コリのバイオフィルムである、請求項２３又は２４に記載の細菌培養物。
【請求項２６】
前記培地が、スレオニン又はその前駆体を含む、請求項２１〜２５のいずれか１つに記載の細菌培養物。
【請求項２７】
前記培地が、完全培地である、請求項２１〜２６のいずれか１つに記載の細菌培養物。
【請求項２８】
前記培地が、少なくとも0.4％のスレオニンを含む、請求項２６又は２７に記載の細菌培養物。
【請求項２９】
前記培地が、少なくとも0.1％のグリシンを含む、請求項２６又は２７に記載の細菌培養物。
【請求項３０】
請求項２１〜２９のいずれか１つに記載の細菌培養物及び前記培養物により産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイス：
を含む、細菌培養系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム又はプランクトン培養物中で生育した細菌を用いる1-プロパノールの製造方法に関する。また、本発明は、1-プロパノールを製造するための細菌培養物及び細菌培養系に関する。
【背景技術】
【０００２】
エネルギー価格高騰、環境問題及び化石由来輸送燃料への依存度低減の必要性に起因して、再生可能資源由来の燃料代替物の生産が大きな注目を浴びている。現在、エタノールが主要なバイオ燃料であり、2011年の全世界におけるバイオエタノール生産量は840億リットルである。バイオエタノールの生産能力及び需要の両方が急速に高まる一方で、エタノールの特性は、既存の燃料インフラには不適合である。実際、エタノールが水を吸収する傾向は、現在用いられているパイプラインにおける配給の問題を突きつけ、そのエネルギー密度の低さ(ガソリンの30％未満)は、高いパーセンテージのガソリンブレンドを用いるときであっても、車両の燃料系統の改造を要する(Yan及びLiao, 2009)。
【０００３】
エタノールに関するこれらの問題は、ガソリンの大規模な置換えの妨げになる。代替物として、再生可能資源由来のより長鎖のアルコールバイオ燃料(n-プロパノール、n-ブタノール、イソブタノール、メチルブタノール)、脂肪酸エステル及びイソプレノイドの生産が、それらのエネルギー密度の高さ及びそれらの吸湿性の低さ(これは、貯蔵及び配給の問題を減らし、現在のエンジンの利用を可能にする)のために、関心が高まっている。しかしながら、燃料として高品質なこれらのバイオ燃料化合物は、一般的にバイオプロセスで生産されないか(例えば、いくつかのクロストリジウム属の生物種(Clostridium species)によるものは例外)、及び/又は燃料用途に十分な程、大量には生産されない。
【０００４】
1-プロパノール(CH3CH2CH2OH; n-プロパノール、プロパン-1-オール、プロピリックアルコール、n-プロピルアルコール、プロピルアルコール、プロピロール、エチルカルビノール、1-ヒドロキシプロパン、プロピオニックアルコール、プロピオニルアルコール、プロピオニロール)は、樹脂の主成分として、医薬、塗料、化粧品(ローション、石鹸及びマニキュア)及びセルロースエステル系の工業品の担体及び抽出溶媒として用いられている、産業上重要な化合物である。また、それは、メタノール及びエタノールより高いエネルギー密度及び引火点のために、燃焼効率、貯蔵利便性及び輸送の観点から、バイオ燃料としての高い潜在性を有する。
【０００５】
1-プロパノールの製造及び使用は、プロピオン酸、イソ-プロパノール、プロピオンアルデヒド及びトリヒドロキシメチルエタン(これらは全て重要なコモディティケミカルである)のような化合物への変換を伴う。何十万トンもの1-プロパノールが、プロパナールを製造するためのエチレンの触媒的ヒドロホルミル化及びその後のプロパナールの触媒的水素化を要する２工程の方法によって製造される。あるいは、1-プロパノールは、ジャガイモ発酵の副産物として製造することもできるが、エタノール及びブタノールとは違って、非常に数少ない「環境に優しい」、この非常に重要なコモディティの製造のための生物発酵方法は殆ど存在しない。
【０００６】
これらの製造上の問題を回避するため、代謝工学技術者は、ゲノム情報及び分子生物学的手法を用いて、天然の生物が産生できる範囲を超えて燃料グレードの化合物を製造するための製造プラットフォームとして役立つ、ユーザーフレンドリーな(非天然の)異種宿主生物、例えばエシェリシア・コリ(Escherichia coli)又はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を構築してきた。微生物による1-プロパノールの製造は、クロストリジウム属の種及び酵母によって実証されており(Edenら, 2001; Janssen, 2004)、70 mg/L未満の最終力価が達成された。近年、2-ケトブチレートから1 g/Lの1-プロパノールを製造可能な、2-ケト酸デカルボキシラーゼ及びアルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼを有する、代謝的に操作されたエシェリシア・コリ株が開発された(Shen及びLiao, 2013)。
【０００７】
ピルベートを2-ケトブチレートに直接変換できる改変メタノコッカス・ジャンナスキイ(Methanococcus jannaschii)の(cimAによりコードされる)シトラマレートシンセターゼの導入は、最大3.5 g/Lの1-プロパノールの産生をもたらした(Atsumi及びLiao, 2008) (Howellら, 1999)。また、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824のアルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼを有するセルロース分解微生物であるサーモビフィダ・フスカ(Thermobifida fusca)は、代謝中間体としての2-ケトブチレートによって、炭素源としての未処理のリグノセルロース系バイオマスから、0.48 g/Lの1-プロパノールを産生する(Deng及びFong, 2011)。
【０００８】
近年、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)由来の1,2-プロパンジオールデヒドラターゼを有する野生型E. コリが、1,2-プロパンジオール経路の更なる操作の後に、0.25 g/Lの1-プロパノールを産生することを示した(Jain及びYan, 2011)。最後に、グルコース又はグリセロールを炭素源として用いるアミノ酸生合成経路による1-プロパノールの製造が、好気性条件で1-プロパノールの形成をもたらし、プラスミド-ベースのatoDA、adhEmut、thrABC、ackA及びcimA遺伝子を有する新規経路を樹立するよう操作されたE. コリ株において達成され、好気性流加発酵において、グルコース又はグリセロールから10 g/Lを超える1-プロパノールを産生することができた(Shen及びLiao, 2013, Choiら, 2012, Shen及びLiao, 2008) (Sriranganら, 2013)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野において、1-プロパノールを製造するための効率的な手段のニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、このニーズ及びその他のニーズを満たすための方法、細菌培養物及び細菌培養系を提供する。
【００１１】
実施例は、プランクトン培養物中で生育した同一の構成細菌が1-プロパノールを産生しないかもしれないにも拘らず、細菌バイオフィルムが1-プロパノールを産生することを実証する。また、実施例は、スレオニンが1-プロパノール産生のための生物起源の前駆体であること、及び1-プロパノール産生経路がadhE遺伝子及びtdcABCDEFGオペロン中に位置するtdc遺伝子群の発現に依存することを実証する。また、実施例は、完全培地(例えばLB、TSB、TYT、TB)中に天然に存在するか又は該培地に添加されたスレオニン(又はスレオニン前駆体)の存在下における嫌気性条件での培養により、液体(プランクトン)培地中で生育した細菌が1-プロパノールを産生するように誘導できることを実証する。スレオニン前駆体は、該細菌中における内因性スレオニン生合成を刺激する(図12)。したがって、本発明は、スレオニン存在下及び嫌気性条件下において、バイオフィルムフォーマット中で生育した遺伝子改変されていない細菌及び/又はプランクトン培養物中で生育した細菌を用いる、1-プロパノールの製造方法を提供する。また、本発明は、例えば1-プロパノールを製造するために有用な細菌培養物及び細菌培養系を提供する。また、本発明は、プロパノール経路に関与する遺伝子(tdcA-G遺伝子群及びadhE)を発現するように操作された細菌が、嫌気生活を経なくても、バイオフィルム又はプランクトン性条件(planktonic condition)において1-プロパノールを産生できることの証拠を提供する。本発明のこれらの態様及びその他の態様は、本明細書で提供される。
【００１２】
本発明は、1-プロパノールの製造方法を包含する。いくつかの実施態様において、方法は、培養された細菌バイオフィルムを供給すること；1-プロパノールの製造に適した条件下で細菌バイオフィルムを培養すること；及びバイオフィルムの培養物によって産生された1-プロパノールを回収することを含む。いくつかの実施態様において、培養された細菌バイオフィルムは、培養された腸内細菌(腸内細菌科；Enterobacteriaceae)のバイオフィルム、好ましくは培養されたE. コリのバイオフィルムである。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを含む、スレオニン‐プロパノール経路に関与する遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作された細菌；及びptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、Lysogeny Broth (LB)中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、少なくとも0.4% (w/v)のスレオニンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%又は0.8% (w/v)のグリシンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTB中での培養を含む。いくつかの実施態様において、方法は、細菌がバイオフィルムを形成するのに十分な条件で、人工の固相基質に細菌を播種することを含む方法によって、培養された細菌バイオフィルムを供給することを更に含む。
【００１３】
また、本発明は、細菌培養系を包含する。いくつかの実施態様において、細菌培養系は、人工の固相基質上で生育した細菌を含む細菌バイオフィルム；培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む。いくつかの実施態様において、バイオフィルムを構成する細菌の組成は既知である。いくつかの実施態様において、培養された細菌バイオフィルムは、培養された腸内細菌バイオフィルム、好ましくは培養されたE. コリのバイオフィルムである。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを含む、スレオニン‐プロパノール経路に関与する遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作された細菌；及びptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施態様において、培地は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.4%のスレオニンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%又は0.8% (w/v)のグリシンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００１４】
また、本発明は、1-プロパノールの製造方法を更に包含する。いくつかの実施態様において、方法は、細菌及び、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地を含む細菌培養物を供給すること； 1-プロパノールの製造に適した条件下で細菌培養物を維持すること；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収することを含む。いくつかの実施態様において、方法は、培養されたバイオフィルムでないプランクトン培養物を供給すること；1-プロパノールの製造に適した嫌気性条件下でプランクトン細菌を培養すること；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細菌は、腸内細菌、好ましくはE. コリである。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作されており；細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.4%のスレオニンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%又は0.8% (w/v)のグリシンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００１５】
また、本発明は、細菌培養物を包含する。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、細菌；LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地；及び液体及び/又は気体の1-プロパノールを含む。いくつかの実施態様において、培養物は、バイオフィルム中で生育した細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物は、プランクトン細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌は、腸内細菌、好ましくはE. コリである。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともadhE及び/又はtdcBを過剰発現するように遺伝子操作されており；細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは少なくともtdcDの発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.4%のスレオニンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%又は0.8% (w/v)のグリシンを含む。いくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００１６】
また、本発明は、細菌培養系を更に包含する。いくつかの実施態様において、培養系は、細菌；LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；培養物によって産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む。いくつかの実施態様において、培養物は、バイオフィルム中で生育した細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物は、プランクトン細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌は、腸内細菌、好ましくはE. コリである。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作されており；細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.4%のスレオニンを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、バイオフィルム製造に用いた方法及び細菌バイオフィルムのコミュニティにより発せられた揮発性化合物の分析に用いた方法を示す。
【図２】図２は、SPME-GC-MSによる1-プロパノールのバイオフィルム特異的検出を実証する最初の結果を示す。一方、プランクトン培養物中では1-プロパノールは検出されない。いずれも嫌気性条件での培養である。
【図３】図３は、多種多様な片利共生及び病原性E. コリ株によって形成されたバイオフィルム中における、SPME-GC-MSによる1-プロパノールのバイオフィルム特異的検出を示す。
【図４】図４は、E. コリadhEの変異が、バイオフィルム特異的1-プロパノール産生を無効化することを示す。
【図５】図５は、可能性ある代謝経路の解析及びバイオフィルム特異的プロパノール産生に関与する遺伝子のスクリーニングを示す。
【図６】図６は、バイオフィルムによるプロパノール産生が、adhE遺伝子及びtdcオペロンの発現に依存することを示す。
【図７】図７は、E. コリのバイオフィルムにおける1-プロパノール産生の、提唱された経路を示す。
【図８】図８は、細菌のバイオフィルム及びプランクトン培養物による1-プロパノール産生が、好気性条件又は嫌気性条件に依存し得ることを実証する更なるデータを示す。  A.  示されるように、データは、微好気性条件で培養されたE. コリのバイオフィルムが1-プロパノールを産生することを実証する。また、データは、嫌気性条件で培養されたE. コリのバイオフィルムが1-プロパノールを産生することを実証する。しかしながら、好気性条件で培養されたE. コリのバイオフィルムは、1-プロパノールを産生しなかった。  B.  好気性条件又は微好気性条件で培養されたE. コリのプランクトン培養物もまた、1-プロパノールを産生しなかった。
【図９】図９は、プランクトン性液体培地条件及び好気性条件下におけるE. コリによる1-プロパノールの製造を示す。  A.  漸増濃度(0.4% (w/v)、0.8% (w/v)及び1.2 % (w/v))のスレオニン存在下における、プロパノール産生の用量依存的増大が観察される。  B.  プラスミドからのE. コリadhE遺伝子の過剰発現は、液体培地条件及び好気性条件下における1-プロパノール産生を可能にする。
【図１０】図10は、グラム陰性細菌であるサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、シゲラ・フレキシネリ(Shigella flexneri)及びシトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)に対応する細菌培養物中における、SPME-GCMSベースの1-プロパノール検出を示す。
【図１１】図11は、スレオニンがE. コリのバイオフィルムにおける1-プロパノール産生の生物起源の前駆体であることを示し(A)、1-プロパノールがスレオニンの代謝分解から産生されることを実証するためのC13同位体標識されたスレオニンの使用を説明する(B)。
【図１２】図12は、内因性スレオニン生合成の刺激、例えばグリシン添加による1-プロパノール産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
A.  イントロダクション
バイオフィルムの生活様式は、遺伝子発現における大規模な改変を引き起こす。これは、バイオフィルム特異的な生理的変化に相当すると提唱されている(Ghigo, 2003)。バイオフィルムの生理的特徴の研究は、非バイオフィルム細菌と比較して、細菌バイオフィルムのコミュニティ内で起こる著しい代謝経路再編(metabolic rewiring)を示唆する(Beloinら, 2004, Ghigo, 2003)。このことは、様々な分子及び二次代謝産物の産生をもたらす(Valleら, 2008, Renduelesら, 2011, Renduelesら, 2013 ; Renduelesら, 2014)。しかしながら、細菌バイオフィルムによる1-プロパノールの製造は、以前に報告されていない。
【００１９】
B.  定義
本明細書中で他の定義をしない限り、本開示に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者が共通に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈上そうでないことが要求されない限り、単数形の用語は当該用語の複数形を含むものとし、複数形の用語は当該用語の単数形を含むものとする。一般的に、本明細書中に記載される生化学、酵素学、分子生物学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連付けて用いられる名詞及び当該分野の技術は、周知で当該技術において共通に用いられている。本明細書中で引用される特定の参照文献及びその他の文書は、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。加えて、本明細書中で引用される全てのUniProt/SwissProtの記録は、参照により本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合には、定義も含めて、本明細書が統制する。材料、方法及び実施例は、説明に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００２０】
本開示の方法及び手法は、一般に、そうでないと記載されない限り、当該技術において周知の慣用の方法に従って、かつ、本明細書を通じて引用され、議論される多種多様な一般的な及びより具体的な参照文献に記載されるとおりに行われる。例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992及び付録2002); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976)を参照されたい。
【００２１】
この開示は、インターネット上で公表されている特定のタンパク質及び遺伝子配列についての配列データベースエントリー(例えばUniProt/SwissProtの記録)及びインターネット上のその他の情報を参照する。当業者は、配列データベースエントリーを含むインターネット上の情報は時々アップデートされること、及び例えば特定の配列を参照するために用いられる参照番号が変わり得ることを理解している。参照がインターネット上の配列情報又はその他の情報の公的データベースについてされる場合には、このような変化が起こり得、インターネット上の情報の具体的態様が現れたり消えたりすることがあると理解される。当業者は、インターネット検索により等価の情報を見つけることができるため、インターネットのウェブページアドレス又は配列データベースエントリーの参照は、懸案の情報の利用可能性及び公然普及の証である。
【００２２】
本発明のタンパク質、組成物、方法及びその他の実施態様を開示及び記載する前に、本明細書中で用いられる用語が、特定の実施態様を記載することのみを目的としており、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が反対のことをはっきりと記載していない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」又は「含む(containing)」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、記載されていない更なるメンバー、要素又は方法工程を排除しない。
【００２４】
「1-プロパノール」は、式CH3CH2CH2OHの一級アルコールであり、n-プロパノール、プロパン-1-オール、プロピリックアルコール、n-プロピルアルコール、プロピルアルコール、プロピロール、エチルカルビノール、1-ヒドロキシプロパン、プロピオニックアルコール、プロピオニルアルコール及びプロピオニロールとの名称でも知られる。
【００２５】
本明細書中で用いられるように、「組換え体(recombinant)」は、生体分子、例えば遺伝子又はタンパク質、又は生物を指し得る。用語「組換え体」は、クローニングされた単離DNA、化学的に合成されたポリヌクレオチド又は異種の系により生物学的に合成されるポリヌクレオチド、並びに、このような核酸によってコードされるタンパク質又はポリペプチド及び/又はRNAを参照して用いられ得る。「組換え体」の核酸は、(天然には結合していない)ヌクレオチド又はポリヌクレオチドに結合した核酸である。「組換え体」のタンパク質又はポリペプチドは、(1) (天然には結合していない)アミノ酸又はポリペプチドに結合したタンパク質又はポリペプチド；及び/又は(2)組換え体の核酸の転写及び/又は翻訳によって作製されたタンパク質又はポリペプチドであり得る。よって、細菌により合成されたタンパク質は、例えばそれが細胞中に存在する組換え体の核酸から合成されたmRNAから合成されるならば、組換え体である。「組換え体」の生物は、「組換え体」の生体分子を含む生物である。例えば、「組換え体」のE. コリ株は、「組換え体」の核酸を含むE. コリ株である。
【００２６】
本明細書中で用いられるように、生物ゲノム中の内因性核酸の配列(又は当該配列にコードされるタンパク質産物)は、異種の配列が内因性核酸の配列の隣に置かれるならば、本明細書において「組換え体」と見做される。この文脈において、異種の配列は、それ自体が(同一の宿主細胞又はその子孫に由来する)内因性のものであるか又は(異なる宿主細胞又はその子孫に由来する)外因性のものであるかに拘らず、天然には内因性核酸の配列と隣り合っていない配列である。例えば、宿主細胞ゲノム中の遺伝子の天然のプロモータについて、当該遺伝子の発現パターンが変更されるように、(例えば相同組換えによって)プロモータ配列を置換することができる。この遺伝子は、それに天然にフランキングする配列の少なくとも幾つかからそれが分離されるため、もはや「組換え体」となる。
【００２７】
また、核酸は、それがゲノム中の対応する核酸に天然に起こらない改変を含む場合に、「組換え体」と考えられる。例えば、内因性のコーディング配列は、それが人工的に、例えばヒトの介入によって導入された挿入、欠失又は点変異を含む場合に、「組換え体」と考えられる。また、「組換え体の核酸」は、非相同の部位で宿主細胞の染色体にインテグレートされた核酸及びエピソームとして存在する核酸構築物を含む。
【００２８】
本明細書で用いるように、「発現制御配列」とは、機能的に結合したコーディング配列の発現に影響するポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後イベント及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモータ配列及びエンハンサ配列；効率的なRNAプロセッシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質のmRNAを安定化する配列；翻訳効率を高める配列(例えばリボソーム結合部位)；タンパク質の安定性を高める配列；及び所望の場合には、タンパク質分泌を高める配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物において、このような制御配列は、一般に、プロモータ、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、発現のためにその存在が必要な全ての構成要素を最低限含み、また、その存在が有利な更なる構成要素、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含んでいてもよいことが意図される。
【００２９】
本明細書で用いるように、「機能的に結合した(operatively linked)」又は「作動可能に結合した(operably linked)」発現制御配列とは、当該興味ある遺伝子を制御するように発現制御配列が興味ある遺伝子と隣接する結合及びトランス又は遠位に作用して当該興味ある遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
【００３０】
本明細書で用いるように、「ベクター」は、それが結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの１つのタイプは、一般に、更なるDNAセグメントがライゲーションしていてもよい環状の二本鎖DNAループを指す「プラスミド」であるが、直鎖状の二本鎖分子、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅又は環状プラスミドの制限酵素処理により得られるものも含む。その他のベクターは、コスミド、細菌人工染色体(BAC)及び酵母人工染色体(YAC)を含む。別のタイプのベクターは、更なるDNAセグメントが(以下でより詳しく検討する)ウイルスゲノムにライゲーションしていてもよいウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自己複製できる(例えば、宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター)。その他のベクターは、宿主細胞への導入後、宿主細胞のゲノムにインテグレートされてもよく、そのことにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが機能的に結合している遺伝子の発現を指揮できる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え体の発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ばれる。組込み型コスミドベクターであるpYUB412は、「ベクター」の例である。
【００３１】
本明細書で用いるように、用語「組換え体の宿主細胞」(又は単に「組換え細胞」若しくは「宿主細胞」)は、組換え体の核酸、例えば組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。いくつかの例では、単語「細胞」は、細胞のタイプを特定する名称によって置き換えられる。例えば、「組換え体の微生物」は、微生物宿主細胞である、組換え体の宿主細胞である。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることが理解されるべきである。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、継代において特定の改変が起こり得るため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書で用いるように、用語「組換え体の宿主細胞」、「組換え細胞」及び「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。組換え体の宿主細胞は、培地中で生育した、単離された細胞又は細胞株であってもよいし、あるいは、生きた組織又は生物において存在する細胞であってもよい。
【００３２】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子操作された」は、組換え体の核酸を含む細菌細胞を指すことが意図される。組換え体の核酸は、内因性核酸の組換え体であってもよい。組換え体の核酸は、組換えベクターであってもよい。遺伝子操作された細菌を作製する方法は、当該技術において周知である。
【００３３】
本明細書で用いるように、フレーズ「少なくとも１つの遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌」は、特定の条件下で、通常発現するよりも高いレベルで遺伝子を発現するように細菌が遺伝子操作されていることを意味する。いくつかの実施態様において、遺伝子は、細菌のゲノム中に通常存在しない。いくつかの実施態様において、細菌は、特定の更なるコピーの遺伝子を含むように遺伝子操作されている。いくつかの実施態様において、遺伝子は、アルコール/アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhE)、代謝性スレオニンデヒドラターゼtdcB (tdcB)、スレオニンデアミナーゼ(ilvA)、2-ケトブチレートホルメートリアーゼ(tdcE)遺伝子及びピルベートホルメートリアーゼI (pflB)から選択される遺伝子である。
【００３４】
本明細書で用いるように、フレーズ「少なくとも１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌」は、特定の条件下で、細菌が通常発現するよりも低いレベルで遺伝子を発現するか又は特定の条件下で、細菌が通常発現する遺伝子を発現しないように、細菌が遺伝子操作されていることを意味する。いくつかの実施態様において、細菌のゲノム中に存在する遺伝子は、遺伝子操作によって変異している。いくつかの実施態様において、遺伝子は、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ(ptA)、プロピオネートキナーゼ(tdcD)及びアセテートキナーゼ(ackA)から選択される。
【００３５】
本明細書で用いるように、「バイオフィルム」は、互いに、かつ、その他の有機及び/又は無機の基質に付着する少なくとも１つのタイプの細菌及び任意にその他の微生物の凝集したコミュニティを意味する。バイオフィルムの、その別々の「凝集していない」構成要素と区別するその独特の特徴は、細胞凝集塊が包埋されているマトリクスを形成する細胞外高分子物質(EPS)(例えば炭化水素、タンパク質、核酸及びその他のバイオポリマー)の自己生産及び分泌である。
【００３６】
C.  バイオフィルムを用いる1-プロパノールの製造方法
本発明は、1-プロパノールの製造方法を包含する。いくつかの実施態様において、方法は、培養された細菌バイオフィルムを供給すること；1-プロパノールの製造に適した条件下で、細菌バイオフィルムを培養すること；及びバイオフィルムの培養物によって産生された1-プロパノールを回収することを含む。バイオフィルム中の細菌を培養する方法は、当該技術において公知である(例えばGhigo, 2001を参照)。
【００３７】
いくつかの実施態様において、細菌バイオフィルムは、単一タイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌バイオフィルムは、複数の異なるタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、バイオフィルム中の全てのタイプの細菌が、1-プロパノールを産生する。いくつかの実施態様において、バイオフィルムは、1-プロパノールを産生しない少なくとも１つのタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養された細菌バイオフィルムは、腸内細菌、好ましくはE. コリを含む。いくつかの実施態様において、培養された細菌バイオフィルムは、E. コリからなる。
【００３８】
いくつかの実施態様において、バイオフィルム中における1-プロパノールの製造に適した条件は、微好気性(半好気性(mid aerobic)；典型的には2〜10％のO2)条件又は嫌気性条件である。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、少なくとも0.2％のスレオニン、少なくとも0.4％のスレオニン、少なくとも0.6％のスレオニン、少なくとも0.8％のスレオニン、少なくとも1.0％のスレオニン、少なくとも1.2％のスレオニン、少なくとも1.4％のスレオニン、少なくとも1.6％のスレオニン、少なくとも1.8％のスレオニン、少なくとも2.0％のスレオニン、少なくとも2.5％のスレオニン、少なくとも3％のスレオニン、少なくとも3.5％のスレオニン、少なくとも4.0％のスレオニン、少なくとも4.5％のスレオニン又は少なくとも5.0％のスレオニンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％又は0.8％(w/v)のグリシンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTB中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、流動条件を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間又は少なくとも96時間、細菌バイオフィルムを培養することを含む。
【００３９】
いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４１】
いくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４２】
D.  スレオニンを含む細菌培養物を用いる1-プロパノールの製造方法
また、本発明は、スレオニン又はその前駆体の存在下において細菌を培養することを含む1-プロパノールの製造方法を包含する。いくつかの実施態様において、方法は、細菌及びLB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地を含む細菌培養物を供給すること；1-プロパノールの製造に適した条件下で細菌培養物を維持すること；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収することを含む。
【００４３】
いくつかの実施態様において、細菌培養物は、単一タイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、複数の異なるタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養物中の全てのタイプの細菌が1-プロパノールを産生する。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、1-プロパノールを産生しない少なくとも１つのタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、腸内細菌、好ましくはE. コリを含む。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、E. コリからなる。
【００４４】
いくつかの実施態様において、培養物は、細菌バイオフィルムを含む。いくつかの実施態様において、バイオフィルムによる1-プロパノールの製造に適した条件は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件である。
【００４５】
いくつかの実施態様において、培養物は、プランクトン細菌を含む。いくつかの実施態様において、プランクトンによる1-プロパノールの製造に適した条件は、好気性条件である。いくつかの実施態様において、プランクトンによる1-プロパノールの製造に適した条件は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件である。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、少なくとも0.2％のスレオニン、少なくとも0.4％のスレオニン、少なくとも0.6％のスレオニン、少なくとも0.8％のスレオニン、少なくとも1.0％のスレオニン、少なくとも1.2％のスレオニン、少なくとも1.4％のスレオニン、少なくとも1.6％のスレオニン、少なくとも1.8％のスレオニン、少なくとも2.0％のスレオニン、少なくとも2.5％のスレオニン、少なくとも3％のスレオニン、少なくとも3.5％のスレオニン、少なくとも4.0％のスレオニン、少なくとも4.5％のスレオニン又は少なくとも5.0％のスレオニンを含む培地での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％又は0.8％(w/v)のグリシンを含む培地中での培養を含む。いくつかの実施態様において、1-プロパノールの製造に適した条件は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTB中での培養を含む。
【００４６】
いくつかの実施態様において、細菌培養物は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４７】
いくつかの実施態様において、細菌培養物は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４８】
いくつかの実施態様において、細菌培養物は、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００４９】
E.  バイオフィルムを含む細菌培養系
また、本発明は、細菌培養系を包含する。いくつかの実施態様において、細菌培養系は、人工の固相基質上で生育する細菌；培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む細菌バイオフィルムを含む。
【００５０】
いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルムを構成する細菌の組成は既知である。いくつかの実施態様において、細菌培養系の細菌バイオフィルムは、単一タイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の細菌バイオフィルムは、複数の異なるタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルム中の全てのタイプの細菌が1-プロパノールを産生する。いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルムは、1-プロパノールを産生しない少なくとも１つのタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の培養された細菌バイオフィルムは、腸内細菌、好ましくはE. コリを含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の培養された細菌バイオフィルムは、E. コリからなる。
【００５１】
いくつかの実施態様において、細菌培養系は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件下での細菌バイオフィルムの培養を提供する。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.2％のスレオニン、少なくとも0.4％のスレオニン、少なくとも0.6％のスレオニン、少なくとも0.8％のスレオニン、少なくとも1.0％のスレオニン、少なくとも1.2％のスレオニン、少なくとも1.4％のスレオニン、少なくとも1.6％のスレオニン、少なくとも1.8％のスレオニン、少なくとも2.0％のスレオニン、少なくとも2.5％のスレオニン、少なくとも3％のスレオニン、少なくとも3.5％のスレオニン、少なくとも4.0％のスレオニン、少なくとも4.5％のスレオニン又は少なくとも5.0％のスレオニンのスレオニン濃度を含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％又は0.8％(w/v)のグリシンを含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００５２】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、バイオフィルム上に流動させる。
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００５３】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００５４】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００５５】
F.  スレオニンを含む細菌培養系
また、本発明は、細菌培養系を更に包含する。いくつかの実施態様において、培養系は、細菌；LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地；液体及び/又は気体の1-プロパノール；及び培養物によって産生された1-プロパノールを回収するように構成された回収デバイスを含む。
【００５６】
いくつかの実施態様において、細胞培養系は、バイオフィルム中で生育した細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養系は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件下での細菌の培養を提供する。
【００５７】
いくつかの実施態様において、培養物は、プランクトン細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養系は、好気性条件での細菌の培養を提供する。いくつかの実施態様において、培養系は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件での細菌の培養を提供する。いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルムを構成する細菌の組成は既知である。いくつかの実施態様において、細菌培養系の細菌バイオフィルムは、単一タイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の細菌バイオフィルムは、複数の異なるタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルム中の全てのタイプの細菌が1-プロパノールを産生する。いくつかの実施態様において、細菌培養系のバイオフィルムは、1-プロパノールを産生しない少なくとも１つのタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の培養された細菌バイオフィルムは、腸内細菌、好ましくはE. コリを含む。いくつかの実施態様において、細菌培養系の培養された細菌バイオフィルムは、E. コリからなる。
【００５８】
いくつかの実施態様において、細菌培養系は、嫌気性条件又は半好気性条件での細菌バイオフィルムの培養を提供する。いくつかの実施態様において、細菌培養系は、好気性条件でのプランクトン細菌の培養を提供する。いくつかの実施態様において、細菌培養系は、嫌気性条件又は微好気性(半好気性)条件でのプランクトン細菌の培養を提供する。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.2％のスレオニン、少なくとも0.4％のスレオニン、少なくとも0.6％のスレオニン、少なくとも0.8％のスレオニン、少なくとも1.0％のスレオニン、少なくとも1.2％のスレオニン、少なくとも1.4％のスレオニン、少なくとも1.6％のスレオニン、少なくとも1.8％のスレオニン、少なくとも2.0％のスレオニン、少なくとも2.5％のスレオニン、少なくとも3％のスレオニン、少なくとも3.5％のスレオニン、少なくとも4.0％のスレオニン、少なくとも4.5％のスレオニン又は少なくとも5.0％のスレオニンのスレオニン濃度を含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％又は0.8％(w/v)のグリシンを含む。細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００５９】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培地は、バイオフィルム上に流動させる。
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６０】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６１】
細菌培養系のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６２】
G.  細菌培養物
また、本発明は、細菌培養物を包含する。いくつかの実施態様において、細菌培養物は、細菌；LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む培地；及び液体及び/又は気体の1-プロパノールを含む。
【００６３】
いくつかの実施態様において、培養物は、バイオフィルム中で生育した細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物は、プランクトン細菌を含む。
いくつかの実施態様において、培養物を構成する細菌の組成は既知である。いくつかの実施態様において、培養物は、単一タイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物は、複数の異なるタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物中の全てのタイプの細菌が1-プロパノールを産生する。いくつかの実施態様において、培養物は、1-プロパノールを産生しない少なくとも１つのタイプの細菌を含む。いくつかの実施態様において、培養物は、腸内細菌、好ましくはE. コリを含む。いくつかの実施態様において、培養物は、E. コリからなる。
【００６４】
いくつかの実施態様において、培養物は、嫌気性又は半好気性の培養物である。培養物のいくつかの実施態様において、培地は、LB中に存在するよりも高濃度のスレオニンを含む。培養物のいくつかの実施態様において、培地は、少なくとも0.2％のスレオニン、少なくとも0.4％のスレオニン、少なくとも0.6％のスレオニン、少なくとも0.8％のスレオニン、少なくとも1.0％のスレオニン、少なくとも1.2％のスレオニン、少なくとも1.4％のスレオニン、少なくとも1.6％のスレオニン、少なくとも1.8％のスレオニン、少なくとも2.0％のスレオニン、少なくとも2.5％のスレオニン、少なくとも3％のスレオニン、少なくとも3.5％のスレオニン、少なくとも4.0％のスレオニン、少なくとも4.5％のスレオニン又は少なくとも5.0％のスレオニンのスレオニン濃度を含む。培養物のいくつかの実施態様において、培地は、スレオニン前駆体、好ましくはグリシン、より好ましくは少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％又は0.8％(w/v)のグリシンを含む。培養物のいくつかの実施態様において、培地は、最終的に上記のスレオニン又はその前駆体を補った完全培地、例えば限定されないがLB、TSB、TYT又はTBである。
【００６５】
細菌培養物のいくつかの実施態様において、培地は、バイオフィルム上に流動させる。
培養物のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６６】
培養物のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６７】
培養物のいくつかの実施態様において、培養されたバイオフィルムは、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作された細菌を含む。
【００６８】
H.  操作された細菌
また、本発明は、操作された細菌を包含する。いくつかの実施態様において、操作された細菌は、バイオフィルムとして提供される。いくつかの実施態様において、操作された細菌は、プランクトン培養物として提供される。いくつかの実施態様において、操作されたプランクトン細菌は、好気性条件で培養される。
いくつかの実施態様において、操作された細菌は、腸内細菌、好ましくはE. コリである。
【００６９】
いくつかの実施態様において、操作された細菌は、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００７０】
いくつかの実施態様において、操作された細菌は、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作されている。
【００７１】
いくつかの実施態様において、操作された細菌は、(1) adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも１つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも２つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも３つの遺伝子、adhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBから選択される少なくとも４つの遺伝子、好ましくはadhE及び/又はtdcBを含む上記の遺伝子；又はadhE、tdcB、ilvA、tdcE及びpflBの全ての遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作され；かつ(2) ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも１つの遺伝子、ptA、tdcD及びackAから選択される少なくとも２つの遺伝子、好ましくはtdcDを含む上記の遺伝子；又はptA、tdcD及びackAの全ての遺伝子の発現を低減するように遺伝子操作されている。
【実施例】
【００７２】
実施例１：バイオフィルムからの1-プロパノール産生の検出
材料及び方法
連続流動式ミクロ発酵槽におけるバイオフィルムの形成は、Ghigo, 2001に以前に記載されたとおりにして行った。簡潔には、取外し可能なガラス製スパチュラを含む連続流動式ミクロ発酵槽を用いて、バイオフィルムの発達を最大化し、プランクトンの生育を最小化した。植菌は、完全培地中で一晩生育させた細菌培養物から、600 nmにおける光学密度(OD600)が１となるように調整した培養物にガラス製スパチュラを２分間浸すことによって行った。次いで、スパチュラをミクロ発酵槽に再び導入し、スレオニンを補った完全培地又はスレオニンを含まない完全培地中で、37℃でバイオフィルムの培養を行った。バイオフィルムミクロ発酵槽中で産生されたか又はスパチュラ表面に発達しているバイオフィルムのバイオマスによって産生されたプロパノールをガスクロマトグラフィ-質量分析(GC-MS)によって分析した。
【００７３】
結果
細菌バイオフィルムにより産生された揮発性化合物の性質及び役割を調査する間、バイオフィルム及びプランクトン培養物から発せられる揮発性化合物の性質を比較するために、我々は、SPME-GC-MSアプローチを開発した(図１)。
我々は、古典的な好気性条件又は嫌気性(プランクトン性)液体条件中で培養(対数増殖期-5h;定常期-24hから最大72hまで)された細菌又は完全培地(例えばLB)中で培養されたプランクトン細菌のヘッドスペースにおいて1-プロパノールを検出できなかったが、1-プロパノールがE. コリ K-12バイオフィルムのコミュニティによって発せられることを示した(図２)。
【００７４】
我々の知る限り、E. コリの細菌も細菌バイオフィルムも、一般に、検出可能な量の1-プロパノールを天然に産生するものとして、これまでに報告されたことがない。加えて、我々は、1-プロパノールは、厚く成熟したバイオフィルムの形成に有利に働く動的な流動条件においてバイオフィルムとして生育したときに、試験された全てのE. コリ単離株によって産生されることを示した(図３)。
【００７５】
実施例２：E. コリ酵素AdhE (アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ)の役割
1-プロパノールを産生するバイオフィルム細菌によって用いられる代謝経路を特徴決定するために、我々は、その他の生物において1-プロパノール産生に関与する遺伝子と相同性を示す遺伝子について、いくつかのE. コリ変異株を試験した。このストラテジを用いて、我々は、E. コリにおけるバイオフィルムに関連付けられる1-プロパノール産生における(adhE遺伝子(adhC又はanaとしても知られる)によってコードされる)アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ酵素AdhEの役割を実証した(図４)。バイオフィルムにおけるadhE依存的な1-プロパノール産生は、その他の細菌に存在することが既知の経路又は存在する疑いのある経路から理論的に推測可能ないくつかの可能性ある代謝経路に相当し得る。
【００７６】
実施例３：1-プロパノール産生を増大する前駆体基質としてのスレオニンの同定
バイオフィルムに関連付けられる1-プロパノール産生をもたらす代謝経路を更に特徴決定するために、我々は、可能性あるadhE依存的1-プロパノール前駆体の効果を試験した。LB中のスレオニン濃度が以前に決定されており(Sezonovら, 2007)、約0.05％(w/v)と評価されているが、我々は、LB培地へのスレオニン(0.4％)の添加がプロパノール産生を増大することを見出した(図５)。このことは、1-プロパノールをもたらすadhE依存的な経路が前駆体としてスレオニンを用いることを示唆する。また、プロパナールの添加もプロパノール産生をもたらした。
【００７７】
実施例４：E. コリにおける、バイオフィルムに関連付けられる1-プロパノール産生経路の特徴決定
我々は、スレオニンから1-プロパノールをもたらす可能性のある経路の様々な変異株を試験した。これにより、我々は、1-プロパノール収率を改善するか又は改変するいくつかの変異株を同定し、LB完全培地中におけるバイオフィルムの生育中に1-プロパノールを産生する、E. コリによって用いられている蓋然性が最も高い代謝経路を特徴決定することができた(図６及び７)。tdcA-Gオペロンは、嫌気性条件又は微好気性条件及びスレオニンの存在の両方によって誘導され、スレオニン表面トランスポーター(TdcC)及びスレオニンの分解に関与するいくつかの酵素をコードする。AdheEは、嫌気性条件又は微好気性条件によって誘導され、広範な補酵素A依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。結果として、細菌のバイオフィルム及びプランクトン培養物による1-プロパノール産生は、好気性条件又は嫌気性条件に依存し得る(図８Ａ及び８Ｂ)。
【００７８】
実施例５：液体プランクトン培養物中における1-プロパノール産生をもたらすE. コリの生育条件の決定
バイオフィルムにおける1-プロパノール産生をもたらす代謝経路について得られた我々の結果を利用して、我々は、古典的なプランクトンの(液体)培養物中において1-プロパノールを得るための生育条件を最適化した。我々は、LB培地(テストチューブ5 ml)中での一晩のE. コリ液体培養においてはプロパノールを検出できなかったが、漸増濃度のスレオニン添加は、1-プロパノール産生の用量依存的な増大をもたらすことを示した(図９Ａ)。また、併行して、我々は、プラスミドからのE. コリadhE遺伝子の過剰発現が、液体培地における1-プロパノール産生を可能にすることを示した(図９Ｂ)。
【００７９】
これらの結果は、1-プロパノール産生が、1-プロパノール前駆体としてのスレオニンアミノ酸の添加によって増大され得ることを示唆する。遺伝子操作されたE. コリを用いることが規制上問題とならない場合、スレオニン添加と、adhE及び同定された天然の代謝経路のその他の遺伝子(tdcB- 及び ilvA, tdcE- 及び pflB；図７参照)の過剰発現との組合せは、とりわけスレオニンから1-プロパノールへの代謝フローが増大され得るptA、tdcD及びackAを欠失した変異体において、1-プロパノール産生収率を更に増大し得る。これらの株及び産生ストラテジは、連続流動式ミクロ発酵槽中で生育したバイオフィルム形成性E. コリ(例えばTG1, MG1655 F)と共に用いて、1-プロパノールを含む大量の培養物上清を継続的に生み出すことができる。あるいは、任意のE. コリのバックグラウンドを、古典的な液体バッチにおいて、スレオニンにより促進された1-プロパノール産生に用いることができる。
【００８０】
実施例６：バイオフィルム及びプランクトンの嫌気性培養からの1-プロパノール産生の定量
材料
E. コリのバイオフィルムは、連続流動式ミクロ発酵槽中において、スレオニン0.4％を含むか又は含まないTerrific Broth (TB) 1X若しくは2X培地又はLysogeny Broth (LB)培地中で培養する。
E. コリは、スレオニン0.4％を含むか又は含まないTerrific Broth 1X中で液体条件(プランクトン培養物)及び嫌気性条件で生育させる。
【００８１】
方法
1-プロパノールの定量は、まず固相マイクロ抽出(SPME)によって、及び第２のステップにおけるE. コリのバイオフィルムのガスクロマトグラフィ質量分析(GC-MS)によって行われる。方法は、参照化合物である1-プロパノール -d7で較正される。GCは、シアノプロピルフェニル化されたPDMSの抽出相及び自動化スプリットレス/スプリット注入法を備えたShimadzu 2010クロマトグラフを用いる。MS分析は、電気的衝撃によるイオン化(70eV)及びスキャニングによる検出を備えたShimadzu QP2010+質量分析器を用いる。
【００８２】
結果
バイオフィルムを連続流動式発酵槽中で24hの間生育させ、停止させ、SPME及びGC-MSによって直ちに分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：LB中50 mg/l、LB + スレオニン0.4％中300 mg/l、TB 1X中150 mg/l、TB 1X + スレオニン0.4％中350 mg/lである。
バイオフィルムを連続流動式発酵槽中で24hの間生育させ、停止させ、15hの間蓄積させ、その後SPME及びGC-MSによって分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：TB 1X中255 mg/l、TB 1X + スレオニン0.4％中1220 mg/lである。
バイオフィルムを連続流動式発酵槽中で24hの間生育させ、停止させ、24hの間蓄積させ、その後SPME及びGC-MSによって分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：TB 1X + スレオニン 0.4％中2500 mg/lである。
【００８３】
バイオフィルムを連続流動式発酵槽中で24hの間生育させ、停止させ、48hの間蓄積させ、その後SPME及びGC-MSによって分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：
TB 1X中228 mg/l (実験１)、236 mg/ml (実験２)
TB 2X中1405 mg/l (実験１)、1105 mg/l (実験２)
TB 1X + スレオニン0.4%中4875 mg/l (実験１)、3870 mg/l (実験２)
TB 2X + スレオニン0.4%中3940 mg/l (実験１)、3790 mg/l (実験２)
である。
【００８４】
バイオフィルムを連続流動式発酵槽中で24hの間生育させ、停止させ、96hの間蓄積させ、その後SPME及びGC-MSによって分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：
TB 1X中250 mg/l
TB 1X + スレオニン 0.4％中3850 mg/l
である。
【００８５】
種々のバイオフィルム培養条件から結論すると、培地の栄養価が高いほど、スレオニンがなくても、より多くの1-プロパノールが産生される。培地にスレオニンを添加するとき、培地の完全性は何ら影響しない。
【００８６】
プランクトン嫌気性条件下で24hの間細菌を培養し、停止させ、SPME及びGC-MSによって直ちに分析するとき、1-プロパノールの定量結果は：
TB 1X中375 mg/l (実験１)及び385 mg/l (実験２)
TB 1X + スレオニン 0.4％中3245 mg/l (実験１)及び2960 mg/l (実験２)
である。
これらの結果は、プランクトン嫌気性条件下で1-プロパノールを実質的に産生できたことを示す。
【００８７】
実施例７：その他のグラム陰性嫌気性細菌(腸内細菌)における1-プロパノール産生
材料及び方法
サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、シゲラ・フレキシネリ(Shigella flexneri)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)細菌の植菌及び嫌気性条件下におけるLB培地中での24h、37℃での培養(嫌気的状況下でのフラスコの撹拌)。上記のSPME-GCMSによって、プロパノールを検出する。
【００８８】
結果
これらの結果は、その他のグラム陰性嫌気性細菌(腸内細菌)、例えばサルモネラ・エンテリカ、シゲラ・フレキシネリ及びシトロバクター・ロデンティウムにおいて、1-プロパノールを実質的に産生できたことを示す(図１０)。
【００８９】
実施例８：スレオニンの代謝分解から1-プロパノールが産生される
C13同位体標識スレオニンを用いて、スレオニンの代謝分解から1-プロパノールが産生されることを証明した(図１１Ｂ)。
プロパノール産生のために外因性スレオニンを優先的に用いたことを決定するために、(スレオニンを含まない)最小培地：M9グリセロール0.4％中で48h、連続流動式ミクロ発酵槽中でエシェリシア・コリTG1によってバイオフィルムを製造した。その後、+ スレオニン 0.2％(50％の非標識スレオニン及び50％のC13標識スレオニン(EURISO-TOP)に相当)あり又はなしで流動させた。48h後バイオフィルム培養を15hの間中断し；バイオフィルムのバイオマスを回収し、RMNによって分析し、C13-標識スレオニンの代謝分解産物を検出した。M9グリセロール0.4％中で生育させたバイオフィルムにおいてプロパノールは検出されなかったが、C13標識スレオニン0.2％(50％の非標識スレオニン及び50％のC13標識スレオニン(EURISO-TOP；図１１Ａ及び１１Ｂに相当)を含むM9グリセロール0.4％中で生育させたバイオフィルムにおいては、標識プロパノールを検出できた。
【００９０】
本発明はそれらの特定の実施態様に関連付けて記載されているが、本発明の真の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、様々な変更を行ってもよいこと及び等価物を置き換えてもよいことが当業者に理解されるべきである。加えて、多くの改変を行って、具体的な状況、材料、物の組成、方法、方法の工程又はステップを本発明の目的、精神及び範囲に適合させてもよい。本願特許請求の範囲内において、このような改変の全てが意図される。
【参照文献】
【００９１】
Atsumi, S. & J. C. Liao, (2008) Metabolic engineering for advanced biofuels production from Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 19: 414-419.
Choi, Y. J., J. H. Park, T. Y. Kim & S. Y. Lee, (2012) Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 1-propanol. Metab Eng 14: 477-486.
Deng, Y. & S. S. Fong, (2011) Metabolic engineering of Thermobifida fusca for direct aerobic bioconversion of untreated lignocellulosic biomass to 1-propanol. Metab Eng 13: 570-577.
Howell, D. M., H. Xu & R. H. White, (1999) (R)-citramalate synthase in methanogenic archaea. J Bacteriol 181: 331-333.
Jain, R. & Y. Yan, (2011) Dehydratase mediated 1-propanol production in metabolically engineered Escherichia coli. Microb Cell Fact 10: 97.
Rendueles, O., C. Beloin, P. Latour-Lambert & J. M. Ghigo, (2014) A new biofilm-associated colicin with increased efficiency against biofilm bacteria. Isme J.
Shen, C. R. & J. C. Liao, (2008) Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways. Metab Eng 10: 312-320.
Shen, C. R. & J. C. Liao, (2013) Synergy as design principle for metabolic engineering of 1-propanol production in Escherichia coli. Metab Eng 17: 12-22.
Srirangan, K., L. Akawi, X. Liu, A. Westbrook, E. J. Blondeel, M. G. Aucoin, M. Moo-Young & C. P. Chou, (2013) Manipulating the sleeping beauty mutase operon for the production of 1-propanol in engineered Escherichia coli. Biotechnol Biofuels 6: 139.
Yan, Y. & J. C. Liao, (2009) Engineering metabolic systems for production of advanced fuels. J Ind Microbiol Biotechnol 36: 471-479.
Eden, A., Van Nedervelde, L., Drukker, M., Benvenisty, N., Debourg, A., (2001) Involvement of branched-chain amino acid aminotransferases in the produc- tion of fusel alcohols during fermentation in yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 296-300.
Janssen, P.H., (2004) Propanol as an end product of threonine fermentation. Arch. Microbiol. 182, 482-486. 
Ghigo, JM. (2003) Are there biofilm-specific physiological pathways beyond a reasonable doubt? Res. Microbiol.Jan-Feb;154(1):1-8. Review. 
Beloin C, Valle J, Latour-Lambert P, Faure P, Kzreminski M, Balestrino D, Haagensen JA, Molin S, Prensier G, Arbeille B, Ghigo JM. (2004) Global impact of mature biofilm lifestyle on Escherichia coli K-12 gene expression. Mol. Microbiol. Feb; 51(3):659-74.
Valle J, Da Re S, Schmid S, Skurnik D, D'Ari R, Ghigo JM. (2008) The amino acid valine is secreted in continuous flow bacterial biofilms. J Bacteriol. Jan;190(1):264-74. Epub 2007 Nov 2.
Rendueles O, Travier L, Latour-Lambert P, Fontaine T, Magnus J, Denamur E, Ghigo JM. (2011) Screening of Escherichia coli species biodiversity reveals new biofilm-associated anti-adhesion polysaccharides. MBio. May 10;2(3):e00043-11. 
Rendueles O, Kaplan JB, Ghigo JM. (2013) Antibiofilm polysaccharides.Environ. Microbiol.Feb;15(2):334-46. Epub 2012 Jun 26. Review.
Rendueles O, Beloin C, Latour-Lambert P, Ghigo JM. (2014) A new biofilm-associated colicin with increased efficiency against biofilm bacteria. ISME J. Jun;8(6):1275-88.
Ghigo JM. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature, 412:442-445.
Baldoma L, Badia J, Obradors N, Aguilar J. (1988) Aerobic excretion of 1,2-propanediol by Salmonelle typhimurium. J Bacteriol. Jun;170(6):2884-5.
Sezonov et al., (2007). Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth. Journal of Bacteriology, 189(23), 8746-8749. 
【図１】
2017518047.tif 000002
【図２】
2017518047.tif 000003
【図３】
2017518047.tif 000004
【図４】
2017518047.tif 000005
【図５】
2017518047.tif 000006
【図６】
2017518047.tif 000007
【図７】
2017518047.tif 000008
【図８】
2017518047.tif 000009
【図９】
2017518047.tif 000010
【図１０】
2017518047.tif 000011
【図１１】
2017518047.tif 000012
【図１２】
2017518047.tif 000013
【国際調査報告】
2017518047.tif 000014
2017518047.tif 000015
2017518047.tif 000016