(57)【要約】  OGF及びエンケファリンペプチドの治療効果を増強する、加水分解可能な結合を介してＣ末端に結合した巨大なポリマーを有する独自のポリマーOGFとのエンケファリンペプチドコンジュゲート。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式のエンケファリン-ポリマーコンジュゲート：
[エンケファリン-C（O）-O]n-PEG
ここでエンケファリンは、内因性エンケファリン、オピオイドペプチド、プロエンケファリン、エンドルフィンおよび合成エンケファリン類似体からなる群から選択され;
n≧1であり;
ここで-C（O）-Oは、エンケファリンペプチドC末端カルボン酸エステル結合であり、PEGポリマーに直接連結され;
ここでPEGは、mPEG（モノメトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多アームPEG、PEG-脂質、PEGコポリマー、PEGブロックコポリマー、PEGターポリマー、およびヒドロゲル、リポソームまたはナノ粒子を形成可能なPEGポリマー誘導体からなる群から選択される。
【請求項２】
請求項１に記載のエンケファリン - ポリマーコンジュゲートであって、前記エンケファリンはOGFであって、前記OGF-PEGコンジュゲートは、以下の構造：
[OGF-C(O)-O]n-PEG または [H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C(O)-O]n-PEG
であり、
n≧1であり; および
ここでC-末端メチオニンカルボン酸エステル結合はPEGポリマーに直接結合している。
【請求項３】
請求項２に記載のコンジュゲートであって、ここで、エンケファリンOGF-X誘導体であり、前記コンジュゲートは、式：
[H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-X-C(O)-O]n-PEG
であり、
ここでXがペプチドまたはアミノ酸である。
【請求項４】
請求項１に記載のエンケファリン−ポリマーコンジュゲートであって、前記エンケファリンがLeu‐エンケファリンであって、前記Leu‐エンケファリン-PEGコンジュゲートは以下の構造：
[Leu‐エンケファリン-C（O）-O]n-PEGまたは
[H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-C（O）-O]n-PEG
であり、
ここでn≧1であり; および
ここでC末端ロイシンカルボン酸エステル結合が、PEGポリマーに直接結合される。
【請求項５】
請求項２に記載のOGF-PEGコンジュゲートであって、前記PEGはメトキシポリエチレングリコール（mPEG）であり;
n=1であり; および
ここでOGF-mPEGコンジュゲートが、式：
OGF-C（O）-O-mPEGまたはH2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O-mPEG
である。
【請求項６】
請求項4に記載のLeu‐エンケファリン-PEGコンジュゲートであって、前記PEGがメトキシポリエチレングリコール（mPEG）であり;
n=1であり; および
前記Leu‐エンケファリン-mPEGコンジュゲートが、式：
Leu‐エンケファリン-C（O）-O-mPEGまたはH2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-C（O）-O-mPEG
である。
【請求項７】
以下の式を有するペプチド-PEGコンジュゲート：
[ペプチド-C（O）-O]n-PEG
n≧1である;
-C（O）-Oは、ペプチドのC末端であるカルボン酸エステル結合であり、PEGポリマーに直接連結され;
ここで、PEGは、PEG（モノメトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多アームPEG、PEG-脂質、PEGコポリマー、PEGブロックコポリマー、PEGターポリマー、および、ヒドロゲル、リポソームまたはナノ粒子を形成可能なPEGポリマー誘導体からなる群から選択される。
【請求項８】
以下の式を有する加水分解性エステル結合を有するペプチド-PEGコンジュゲート：
[ペプチド-C（O）-NH-AA-C（O）-O]n-PEG
n≧1であり;
AAは、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、バリンおよびホモアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。
【請求項９】
前記PEGが分子量約50〜約40,000ダルトンの範囲である請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
PEGが約20,000ダルトンの分子量を有する請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
PEGが約40,000ダルトンの分子量を有する請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
以下の式を有する予め合成されたC末端アミノ酸-PEGエステル誘導体：
AA-mPEG（H2N-アミノ酸-C（O）-O-（CH2CH2O）nCH2CH2-OCH3）
または
AA-PEG-AA（H2N-アミノ酸-C（O）-O-（CH2CH2O）n-O-（O）C-アミノ酸-NH2）
nは約4〜約1000であり; および
AAはペプチドのアミノ酸または所望のアミノ酸のＣ末端であって、前記AAが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、バリンおよびホモアミノ酸からなる群から選択される。
【請求項１３】
請求項２に記載のOGF-PEGコンジュゲートを製造する方法であって、
テトラペプチドTyr-Gly-Gly-Pheを予め合成したMet-C（O）O-mPEGと反応させる工程を含む製造方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の加水分解可能なエステル結合を有するペプチド-PEGコンジュゲートを製造する方法であって、
ペプチドのC末端アミノ酸を予め合成したAA-C（O）O-mPEGで置換する工程を含む製造方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の加水分解可能なエステル結合を有するペプチド-PEGコンジュゲートを製造する方法であって、
ペプチドのC末端アミノ酸を予め合成したAA-C（O）O-mPEGと反応させる工程を含む製造方法。
【請求項１６】
AAはメチオニンであり、以下の構造を有する請求項１２に記載のC末端アミノ酸-PEGエステル誘導体。
H2N-メチオニン-C（O）-O-（CH2CH2O）nCH2CH2-OCH3
【請求項１７】
神経学的または神経変性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項２、３、５または９〜１１のいずれか1項に記載のOGF-PEGコンジュゲートを投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、2014年7月14日に出願された米国仮出願第62/024,116号の優先権の利益を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、エンケファリンのポリマーコンジュゲートおよび血漿中の活性エンケファリン分子を放出することができるC末端カルボキシル基に結合した関連オピオイドペプチド生物学的利用能の向上エンケファリン分子の循環寿命の延長および製造方法そのようなコンジュゲートを使用する。より詳細には、本発明は、放出可能なポリマーOGFデリバティブ大きなサイズのポリマーがOGFのC末端カルボキシル基に結合しているスペーサー部分を含まない加水分解可能なエステル結合を介して結合する。
【背景技術】
【０００３】
エンケファリン、エンドルフィンおよびダイノルフィンは、体内で生成されるオピオイドペプチドである。エンケファリンの2つの形態は、Met‐エンケファリンおよびLeu‐エンケファリンである。オピオイド成長因子（OGF）とも呼ばれるMet-エンケファリンは、免疫調節効果および免疫刺激効果を有することが見出されている天然に存在する内因性オピオイドペプチドである。OGFは、多発性硬化症、ぶどう膜炎、ベーチェット症候群、および視神経炎を含むいくつかの自己免疫疾患を治療するために使用されてきた。OGFはまた、エイズ患者の治療に使用されていると報告されている。研究により、OGFがナチュラルキラー細胞のレベルを顕著に上昇させ、ウイルス、および癌細胞、細菌、寄生虫および真菌を殺すことに特化するとの研究が示されている。さらに、腫瘍増殖および転移の阻害によるがん治療において重要な役割を有する血管新生に対して、OGFが阻害することが見出されている。
【０００４】
乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部癌、子宮頸癌、カポジ肉腫、リンパ球性白血病、肝臓癌、リンパ腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞および非小細胞肺癌、咽喉癌、舌癌および子宮癌の多くの癌が、OGF受容体を有することが示され、またはOGFおよびOGF-増強機構に応答することが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ペプチドは一般的に、in vivoで短い半減期のものである。OGFはペンタペプチドであり、他のペプチドと同様に、生物学的利用能が低く、速やかに代謝され、非常に短い半減期（分）を有する。OGFは、エンケファリナーゼとして知られる様々な異なる酵素によって代謝される。PEGコンジュゲーションは、ペプチドのサイズおよび分子量を増加させ、ペプチドをタンパク質分解から保護し、血漿中での半減期の延長をもたらす。しかしながら、ペグ化の欠点は、分枝鎖または直鎖PEG化合物のいずれかでペグ化されるペプチドコンジュゲートの生物学的活性の低下又は損失である。多くの治療用ペプチドに対して、生物学的活性の顕著なな損失は、しばしばペグ化された構築物の治療的適用を制限する。
【０００６】
したがって、本分野では、治療活性を失うことなく、短寿命のOGF、エンケファリン又はペプチドの半減期を延長することができる有効な治療組成物に対して、明らかに満たされていない医学的必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の少なくとも1つの態様は、新規なOGF-ポリマーまたはエンケファリン - ポリマーコンジュゲートを提供し、これは、加水分解可能な結合を介して、分枝または直鎖状ポリマーに共有結合しているC末端を有するエンケファリンである。該エンケファリンポリマーコンジュゲートは、長時間作用性で、血漿中の制御された連続放出であり、対応する非共役エンケファリンと比較して、エンケファリンの半減期の延長およびバイオアベイラビリティの増加をもたらす。大型ポリマーを有するエンケファリン−ポリマーコンジュゲートは血漿中でエンケファリンを徐々に放出し、エンケファリンのプロドラッグとみなすことができる。
【０００８】
本発明の少なくとも1つの態様は、下記式を含むエンケファリン−ポリマーコンジュゲートを提供する。
[エンケファリン-C（O）-X]n-P
式I
ここで、Pは、末端アミノ酸とポリマーとの間のスペーサーのないC末端カルボキシル基に結合しているポリマー、ポリマー - 脂質またはポリマー誘導体であり;
Xは、O、S、イミダゾ、及びリン酸エステルからなる群から選択される原子または基であり;
C（O）-Xはカルボン酸エステル、チオエステル、アシルイミダゾ、およびホスホン酸エステルから選択される官能基を含む加水分解性結合であり;
n≧1であり、ポリマーP上の結合部位の利用能に依存し、;
ポリマーに結合したエンケファリンは、OGF（Met-エンケファリン）、Leu‐エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン、プロエンケファリンおよび合成エンケファリン類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
PがPEGポリマーであり、Xが酸素である場合、コンジュゲートは下記式を有し：
[エンケファリン-C（O）-O]n-PEG
式II
PEGポリマーが、C末端とPEGポリマーの間にスペーサーのないエステル結合を介してC末端カルボキシル基に直接結合し;n≧1であり、PEG上の結合部位の数に依存しており（直鎖PEGの場合n=1または2、マルチアームPEGの場合はn>1）; PEGが、mPEG（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多重アーム型PEG、PEG-脂質、コポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマー、およびヒドロゲル、リポソームまたはナノ粒子を形成することができるPEGポリマー誘導体の群から選択される。
【００１０】
本発明の少なくとも1つの態様は、エンケファリンがOGFであり、コンジュゲートが下記式で表されるOGF-PEG（Met‐エンケファリン-PEG）エステルコンジュゲートである：
[OGF-C（O）-O]n-PEG
または
[H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O]n-PEG
式III  。
【００１１】
本発明の少なくとも1つの態様は、以下の式を含む新規なペプチド-PEGコンジュゲートを提供する：
[ペプチド-C（O）-O]n-PEG
式IV
PEGポリマーは、ペプチドのアミノ酸とPEGポリマーとの間のスペーサーがなく、エステル結合を介してペプチドのC末端カルボキシル基に直接結合し;
n≧1であり;
ここで、PEGは、mPEG（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多重アームPEG、PEG-脂質、コポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマー、およびヒドロゲル、リポソームおよびナノ粒子を形成することができるPEGポリマー誘導体の群から選択される。
【００１２】
PEGとカルボキシル基との間にスペーサーを含まない、OGF、エンケファリンまたはペプチドのC末端に直接結合するPEGポリマーの水酸基のカップリングの利点の1つは、結合スペーサー分子によって引き起こされる毒性および免疫原性の問題の回避である。
【００１３】
本発明の別の利点は、放出可能なOGF-PEG、エンケファリン-PEGまたはペプチド-PEGコンジュゲートが、血漿中において、それらの親分子（それぞれ、OGF、エンケファリンまたはペプチド）を放出して、それらのバイオアベイラビリティーを増加させるだけでなく、コンジュゲートはまた、それらの治療効果を増強するために延長された循環時間を提供する。
【００１４】
大きなサイズのmPEG-OH（例えば、20,000ダルトン）をOGFのＣ末端に直接結合させてOGF-C（O）O-PEGエステルコンジュゲートを形成することの困難性は、かさ高いサイズのPEGおよびOGFペンタペプチドの両方からの固有の立体障害のため、ならびにPEG-OHの比較的非反応性のヒドロキシル基-OHのためである。実際に、これは、直接接合されたペプチド-C（O）-O-PEG構築物を利用できないようにする。
【００１５】
この問題に対する我々の解決法は、予め合成されたH2N-メチオニン-C（O）-O-PEGエステル誘導体をOGFのC末端メチオニンカルボキシル基に置換するために使用し、テトラペプチドTyr-Gly-Gly-Phe-CO2Hアミド結合のカルボキシ基にアミド結合を介して放出性OGF-PEGコンジュゲート（H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O-PEG）を放出させるために結合させる。さらなる実施形態では、予め合成されたH2N-メチオニン-C（O）-O-PEGエステルまたは他のアミノ酸-PEGエステル誘導体が、ペンタペプチドOGF自体と結合させることができ、追加のアミノ酸を含むコンジュゲートを形成する。
【００１６】
予め合成されたH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEGエステル誘導体を用いペプチドのＣ末端に置換する戦略は、加水分解可能なペプチド-PEGエステルコンジュゲート（式II、IIIおよびIV）の合成に重要である。
【００１７】
本発明の少なくとも1つの態様は、それぞれ式II、IIIおよびIVにおける放出可能なエンケファリン-PEG、OGF-PEGおよびペプチド-PEGエステルコンジュゲートの合成のために、対応するC末端アミノ酸を置換するために、加水分解可能なH2N-アミノ酸C（O）-O-mPEG誘導体（AA-PEG、式V）を提供する。OGF-PEGコンジュゲートの合成のために、AA-PEGはH2N-メチオニン-C（O）-O-mPEGである。Leu‐エンケファリン-PEGの合成のために、AA-PEGは、H2N-ロイシン-C（O）-O-mPEGである。
AA-PEGまたはH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEG
式V
ここで、AAは、メチオニン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、バリンおよびホモアミノ酸を含むペプチドのC末端アミノ酸であるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
エステル結合を有するアミノ酸を有する加水分解性AA-PEG試薬は、放出可能なPEG-ペプチドコンジュゲートを製造するために有用である。放出性ペプチド-PEGコンジュゲート（式VI）を提供するために、放出可能なAA-PEG誘導体は、ペプチドのC末端またはカルボキシル基に共有結合させることができる。
[ペプチド-C（O）-NH-アミノ酸-C（O）-O]n-PEG
式VI
【００１９】
H2N-アミノ酸-C（O）-O-PEG誘導体は、好ましくは、ペプチドC末端カルボキシル基に結合される。例えば、OGF-X-AA-PEGの構造は以下のように表される：
H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-X-AA-PEG
または
[H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-X-C(O)-NH-AA-PEG
ここで、Xはペプチドまたはアミノ酸である。OGF-Xペプチドは、OGFの合成類似体である。
【００２０】
放出可能なAA-PEG試薬は、また、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、カルボキシル、カルボニルおよびアルデヒドからなる群から選択される求電子基で生物学的物質または小分子に結合させることによって、放出可能な生物学的-PEGコンジュゲートを作製に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましい実施形態の詳細な説明
エンケファリン、エンドルフィン、およびダイノルフィンは、身体によって産生されるオピオイドペプチドの3つのよく特徴付けられたファミリーである。エンケファリンの2つの形態は、プロエンケファリン遺伝子の産物である。それらはMet-エンケファリン（OGF、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met）およびLeu‐エンケファリン（Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu）である。
【００２２】
OGFは、多くの生物学的効果、例えば鎮痛、血管新生の阻害、免疫刺激性および免疫調節性などが挙げられる。OGFは、腫瘍増殖を阻害し、ウイルス感染細胞と癌を破壊するために、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびNK-T細胞の数および機能を増加させる。
【００２３】
OGFまたはエンケファリンペプチドは、生物学的利用能が低く、迅速に代謝され、非常に短い半減期（分）を有する。治療的OGFまたはエンケファリンペプチド薬物の循環中における長期間の維持は、主要な臨床的重要性の望ましい特徴である。ペグ化は、タンパク質およびペプチドの安定性および循環の向上に使用されており、一方、タンパク質分解性、免疫原性およびクリアランスを減少させる。しかし、欠点は、大きなPEGポリマーサイズによる、および/またはペプチドの活性結合部位でのPEGの付着を含む立体障害によってもたらされる生物活性の喪失である。PEGコンジュゲート化[D-Pen2、D-Pen5]-エンケファリン（DPDPE）に対して、2k PEGに対するN末端での修飾が、δ-オピオイド受容体に対する結合親和性の有意な損失をもたらしたことが、Wittら、 J Pharmacol Exp Ther 298：848-856によって記載されている。
【００２４】
本発明は、加水分解可能な結合を介してC末端のエンケファリンに共有結合しているポリマーを有するエンケファリン-ポリマーコンジュゲート、ならびにそのようなコンジュゲートを製造および使用する方法に関する。式は次のように表される:
[エンケファリン-C（O）-X]n-P
式I
ここで、ポリマーに結合したエンケファリンは、限定されないが、Met-エンケファリン（OGF）、Leu‐エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン、プロエンケファリンおよび合成エンケファリン類似体を含み; Xは、O、S、イミダゾ、及びリン酸エステルからなる群から選択される原子または原子団であり;C（O）Xは、エステル、チオエステル、アシルイミダゾ、およびホスホン酸エステルから選択される官能基であり; n≧1であり、Pはポリマー、ポリマー-脂質またはポリマー誘導体である。
【００２５】
エンケファリンはまた、Met‐エンケファリン-Arg-Phe、Met‐エンケファリン-Arg-Agly-Leu，アドレノルフィン、アミドルフィン、BAM-18、BAM-20P、BAM22P、ペプチドB、ペプチドE、ペプチドFおよびα-ネオエンドルフィンなどの他の神経ペプチドを含む場合がある。プロエンケファリンは、プロエンケファリンA（プロエンケファリンまたはPENKとして知られる）およびプロエンケファリンB（プロダイノルフィン）を含む。
【００２６】
エンケファリン - ポリマーコンジュゲートに使用されるポリマーは、好ましくは水溶性である。そのようなポリマーの非限定的なリストは、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）、ポリポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、ポリポリ（オキサゾリン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオキシエチレン化ポリオール、分岐ポリマー、コポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマー、およびそれらの混合物などのポリアルキレンオキシドホモポリマーを含む。モノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）などのアルキル末端を含むポリアルキレンオキシドも含まれる。前記ポリマーは、ヒドロゲル、リポソームおよびナノ粒子を形成可能なポリマー誘導体が含まれる。
【００２７】
本発明の1つの態様において、血漿中において、活性エンケファリンが放出可能なエンケファリン-PEGエステルコンジュゲート（式II）、およびそのようなコンジュゲートを作製および使用する方法が即座に開示される。エンケファリン-PEGコンジュゲートは、スペーサー部分を有さない加水分解可能なエステル結合を介してC末端でエンケファリンに直接連結されているPEGポリマーを含む。前記エンケファリン-PEGコンジュゲートは、以下の式で表される：
[エンケファリン-C（O）-O]n-PEG
式II
ここで、エンケファリン-PEGコンジュゲートは、加水分解可能な結合を介してエンケファリンにC末端で直接結合したPEGポリマーを含み;PEGポリマーに結合したエンケファリンは、これに限定されるものではないが、Met‐エンケファリン（OGF）、Leu‐エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン、プロエンケファリンおよび合成エンケファリン類似体を含み; ここで-C（O）-Oは、エンケファリンのC末端とPEGの間で直接連結されている加水分解性カルボン酸エステル結合であり;ここでPEGは、mPEG（モノメトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多重アームPEG、PEG脂質、コポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマー、およびPEGポリマー誘導体形成可能なヒドロゲル、リポソームおよびナノ粒子からなる群から選択される。
【００２８】
好ましくは、エンケファリンはOGF（Met-エンケファリン）またはLeu‐エンケファリンである。コンジュゲートは、式：
[OGF-C（O）-O]n-PEG
または
[Leu‐エンケファリン-C（O）-O]n-PEG
式III
であり、ここでn=1であり;ここでmPEGはメトキシポリエチレングリコールであり;直鎖PEGポリマーを有するOGF-PEGまたはLeu‐エンケファリン-PEGは、下記式で表され：
OGF-C（O）-O-mPEG
（H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O-mPEG）
または
Leu‐エンケファリン-C（O）-O-mPEG
（H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-C（O）-O-mPEG）
であり、
前記PEGまたはmPEGは、約200〜約40,000ダルトンの範囲、好ましくは約1000〜約40,000ダルトン、より好ましくは約5,000ダルトンから約40,000ダルトン、さらにより好ましくは約20,000ダルトンから約40,000ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００２９】
n=2のとき、直鎖PEGポリマーに対して、好ましいOGF-PEGまたはLeu‐エンケファリン-PEGコンジュゲートの例は、以下の式で表される：
OGF-C（O）-O-PEG-O-（O）C-OGF
（H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O-PEG-O-（O）C-Met-Phe-Gly-Gly-Tyr-NH2）
または
Leu‐エンケファリン-C（O）-O-PEG-O-（O）C-エンケファリン-Leu
（H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-C（O）-O-PEG-O-（O）C-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-NH2）。
【００３０】
[OGF-C（O）-O]n-PEGは、PEGがマルチアームの場合に、マルチOGF分子を含む場合がある。例えば、マルチアームPEGは、4アームPEGまたは8アームPEGなどであり得る。マルチアームPEGポリマーの合計分子量は、約2,000〜約40,000ダルトンの範囲であり、好ましくは約20,000ダルトン〜約40,000ダルトンである。
【００３１】
高分子量のポリエチレングリコール（PEG）は、加水分解可能な結合でのエンケファリンペプチドへカップリングは、インビボでの送達活性エンケファリンに有用である。大きな利点の1つC末端に加水分解可能なエステル結合を有する具体的なエンケファリン-PEGコンジュゲートにおいて開示されている主要な利点は、エンケファリンペプチドの半減期を延長することができ、血漿中におけるバイオアベイラビリティを増加させることができるコンジュゲートの能力である。20kDaを超えるより高い分子量のPEGで、腎臓濾過は、減少する。したがって、好ましくは、大きなサイズのPEG-エンケファリンコンジュゲートが、インビボでゆっくりと放出されるエンケファリン循環を提供する。
【００３２】
PEGとペプチドとの間のスペーサーなしに、PEGのヒドロキシル基のエンケファリンまたはペプチドのC末端への直接カップリングの別の利点は、スペーサー部分によって引き起こされる毒性および免疫原性の問題を回避することができる。
【００３３】
本発明は、ペプチドとPEGの間に連結スペーサー部分を持たないペプチド-PEGエステル結合コンジュゲートの製造のための方法を提供する。
【００３４】
OGF-PEGエステルコンジュゲートの合成は、大型PEG分子のヒドロキシル基のOGFのC末端カルボキシル基への直接カップリングによって、大きなサイズのPEGおよびOGFペンタペプチドの固有の立体障害の故に、およびPEGの相対的なヒドロキシル基OHの非反応性の故に、問題とされる。
【００３５】
予め合成されたC末端アミノ酸メチオニン-PEGエステル誘導体（H2N-Met-C（O）-O-mPEG）を用いる戦略は、OGF-mPEGエステルコンジュゲートの合成の鍵となる。遊離α-アミノ基を含む予め合成されたH2N-Met-C（O）-O-mPEGは、したがって、大きなサイズのH2N-Met-C（O）-O-PEGとテトラペプチド-CO2H分子の間のアミド結合の形成によって、効率的にテトラペプチド（Boc-HN-Tyr-Gly-Gly-Phe-CO2H）に結合できる。
【００３６】
したがって、OGF-mPEGエステル（Met-エンケファリン-mPEGエステル）コンジュゲートは、Boc-HN-Tyr-Gly-Gly-PheおよびH2N-Met-C（O）-O-mPEGによって合成され、そして続いてBocグループを非ブロック化する。
【００３７】
合成スキームが以下に示される：
Boc-HN-Met-C(O)OH + mPEG-OH → Boc-HN-Met-C(O)-O-mPEG
Boc-HN-Met-C(O)-O-mPEG + TFA → H2N-Met-C(O)-O-mPEG
Boc-HN-Tyr-Gly-Gly-Phe + H2N-Met-C(O)-O-mPEG
→ Boc-H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C(O)-O-mPEG
Boc-H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C(O)-O-mPEG + TFA 
→ H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C(O)-O-mPEG
【００３８】
C末端アミノ酸を置換するために、予め合成されたC末端アミノ酸-PEGエステル（AA-PEG）ペプチドを使用する戦略は、生物学的に活性なペプチドに対して、ペプチドとPEGポリマーの間にスペーサー部分がない放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートを提供するために有益である。タンパク質およびペプチド上のスペーサー部分は、免疫原性および毒性の副作用を引き起こす可能性がある。さらに、親ペプチドのアミノ酸配列は、予め合成されたAA-PEGの方法論を使用することによって、合成された放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートにおいてインタクトである。
【００３９】
固有の放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートは以下の式を含む：
[ペプチド-C（O）-O]n-PEG
式IV
ここでn≧1;ここで前記PEGポリマーは、ペプチドのアミノ酸とPEGポリマーの間にスペーサーなしのエステル結合を介して、前記ペプチドのC末端カルボキシル基に直接結合しており; mPEG（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖PEG、分枝PEG、多重アームPEG、PEG-脂質、コポリマー、ブロックコポリマー、ターポリマー、並びにヒドロゲル、リポソームおよびナノ粒子を形成することができるPEGポリマー誘導体からなる群から選択される。
【００４０】
[ペプチド-C（O）-O]n-PEGコンジュゲートは、血漿中において、活性ペプチドの制御された連続放出システムを提供する。本発明の利点の1つは、血漿中で親ペプチド分子をゆっくりと放出させることによって、放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートの生物学的利用能を高めるだけでなく、コンジュゲートはまた、ペプチド分子の半減期を増加させる延長された血漿循環時間を提供する。本発明の別の利点は、PEGとカルボキシル基との間にスペーサー部分がなく、ペプチドのC末端カルボキシル基に直接結合しているPEGポリマーを有するユニークな放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートであり、結合スペーサー分子によって引き起こされる毒性および免疫原性の副作用を回避することができる。
【００４１】
しかしながら、大きなサイズのmPEG-OHをペプチド（例えば、ペンタペプチド）C末端に直接結合することによる所望のペプチド-C-末端-PEGエステルコンジュゲートの合成は、かさ高いサイズのPEGおよびペプチドの両方からの固有の立体障害に加えて、PEG-OHのヒドロキシ基-OHの相対的な非反応性のために問題が存在する。
【００４２】
問題に対する新しいアプローチは、大きなサイズのH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEGとペプチド-CO2H分子との間で共有結合アミド結合を生成するためにペプチドと効率的に結合することができる遊離α-アミノ基を含む予め合成されたH2N-アミノ酸C（O）-O-PEGエステル誘導体（AA-PEG）を使用する。この方法論は、血漿中においてインタクトなペプチド分子を放出することができるペプチド-PEG共役体を合成するための効率的な方法を提供する。
【００４３】
ペプチドのC末端アミノ酸を置換する予め合成されたH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEGエステル誘導体（AA-PEG）は下記式で表される：
H2N-アミノ酸-C(O)-O-(CH2CH2O)nCH2CH2-OCH3 (AA-mPEG)
または
H2N-アミノ酸-C(O)-O-(CH2CH2O)n-O-(O)C-アミノ酸-NH2 (AA-PEG-AA)
式V
ここでnは約4〜約1000、好ましくは約10〜約1000、好ましくは約20〜約1000、より好ましくは約50〜約1000、さらにより好ましくは約100〜約1000、さらにより好ましくは約250〜約1000、最も好ましくは約500〜約1000である。さらなる実施形態において、予め合成されたH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEGエステル誘導体（AA-PEG）は、ペンタペプチドOGF自体と反応させることができ、追加のアミノ酸を含むコンジュゲートを形成する。
【００４４】
アミノ酸（AA）が、ペプチドのC末端アミノ酸の場合に、AAは、これらに限定されない、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、バリンおよびホモアミノ酸を含む。
【００４５】
C末端アミノ酸を置換するための予め合成されたH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEGエステルを用いる戦略は、エンケファリン-PEG（式II）、OGF-PEGおよびLeu‐エンケファリン-PEG（式III）、およびペプチド-PEG（式IV）などの放出可能なペプチド-PEGエステルコンジュゲートの合成に重要である。この戦略は、様々なPEGサイズ、特に5000ダルトン以上のPEGポリマーサイズのポリマーに適用することができる。
【００４６】
放出可能なH2N-アミノ酸-C（O）-O-PEG誘導体は、ペプチドのC末端またはカルボキシル基とカップリングするために使用することもでき、加水分解可能なエステル結合を有するペプチド-PEGコンジュゲートを生成する。H2N-アミノ酸-C（O）-O-PEG-PEG誘導体は、好ましくはペプチドのC末端カルボキシル基に結合される。
【００４７】
コンジュゲートの式は以下に表される：
[ペプチド-NH-アミノ酸-C（O）-O]n-PEG
式VI
【００４８】
合成スキームは、以下に表される：
ペプチド-CO2H + H2N-アミノ酸-C（O）-O-PEG
→  ペプチド-C（O）-NH-アミノ酸-C（O）-O-PEG
ここで所望のアミノ酸は、限定されないが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リシン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、バリンおよびホモ-アミノ酸を含む。
【００４９】
例えば、ペプチドがOGF-X誘導体である場合、放出可能なOGFコンジュゲートは以下の式で表される：
H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-X-アミノ酸-C(O)-O-PEG
式VII
ここでXはペプチドまたはアミノ酸である。OGF-Xペプチドは合成類似体またはOGFの誘導体である。
【００５０】
加水分解可能なアミノ酸-C（O）-O-PEGはまた、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、カルボキシル、カルボニルおよびアルデヒドからなる群からなる求電子基で、アミノ酸-C（O）-O-PEG試薬のアミノを生物製剤に結合させることにより、エステル結合を有する放出可能なPEG‐生物製剤を創出するのに役に立つ。
【００５１】
前記式IVまたはVIに記載の放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートは、酵素的消化からの保護、腎臓による排泄の減少、活性ペプチドの緩徐な放出によって循環系におけるペプチドの保持を増加することができる。
【００５２】
前記式IIIまたはVIIIに示す放出可能なOGF-PEGペプチドコンジュゲートは、腎臓のクリアランス速度の低下、タンパク質分解からの保護の増加、活性型OGFペプチドの緩徐な放出の3つの主要な効果を提供することができる。独自の放出可能なOGF-PEGペプチドコンジュゲートは、癌、自己免疫および感染症の多数の潜在的な治療のために、循環の遅延及びOGFの生物学的利用能の改善を提供する。
【００５３】
OGFは、血管新生の阻害、ウイルス感染細胞と癌を破壊するナチュラルキラー細胞レベルの有意な上昇が見つかっている。OGFは、進行した膵臓癌患者の治療に使用されている。本発明のOGF-PEGペプチドコンジュゲートは、これらに限定されない、髄膜癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、胃癌、膠芽腫、頭部および頸部、肝臓癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌および多発性骨髄腫を含む多くの癌疾患の治療に使用できる潜在力を有する。OGF-PEGペプチドコンジュゲートは、化学療法、標的療法、免疫療法、放射線療法、光線力学療法等の他のタイプの癌治療と組み合わせて投与することもできる。
【００５４】
OGFは免疫調節効果および免疫刺激効果を有し、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェット症候群、および視神経炎を含む）の治療。それはまた報告されているパーキンソン病、クローン病、炎症性腸疾患等の自己免疫疾患に使用されている。現在開示されている本発明のOGF-PEGペプチドコンジュゲートは、これらに限定されない、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェット病、視神経炎、パーキンソン病、クローン病、潰瘍性大腸炎及び炎症性腸疾患を含む多くの自己免疫疾患の治療に使用される潜在力を有する。PEG-OGFペプチドコンジュゲートは、自己免疫疾患の治療のために他の薬物と組み合わせて投与することもできる。
【００５５】
OGFは、腹側被蓋領域においてドーパミンニューロンを調節して活性化する。OGF-PEGは、ニューロンまたはドーパミンニューロンの漸進的で進行性の死を止めることができ、神経系の機能喪失を予防する。本発明の現在開示されているOGF-PEGペプチドコンジュゲートは、これらに限定されない、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、統合失調症、神経因性疼痛、てんかん、自閉症、薬物中毒（ヘロイン、コカイン、マリファナなど）およびうつ病を含む多くの神経学的および神経変性疾患又はそれらの状態に対して潜在的な治療の可能性を有する場合がある。OGF-PEGペプチドコンジュゲートは、神経学的および神経変性疾患並びにそれらの状態の治療のために、他の薬物と組み合わせて投与することもできる。
【００５６】
OGFは、ウイルス感染細胞、細菌、寄生虫、および真菌を殺すためのナチュラルキラー細胞レベルを上昇させる。OGF-PEGペプチドコンジュゲートは、これらに限定されません、HIV /エイズ、ウイルス性出血熱、デング熱およびマラリアを含む感染症の治療のために、有効な薬としての潜在力を有する。OGF-PEGペプチドコンジュゲートは、ウイルス性疾患の治療のために、他の抗ウイルス薬と組み合わせて投与することもできる。
【００５７】
本発明のOGF-PEGコンジュゲートは、OGFの酵素制御連続放出システムであり、血漿中のOGFの持続的な生物学的活性を提供する。OGF-PEGコンジュゲートは、治療効力を増強するために遅延の薬物循環と改善された生物学的利用能を提供する。
【００５８】
本発明は、ペプチドまたは生体分子結合のためにエステル結合およびアミノ酸-PEGカルボキシルエステルを介して、放出可能なペプチドのC末端-PEGコンジュゲートの合成の方法論を提供する。該合成方法論は、例えば、これに限定されるものではないが、保護、脱保護、活性化および挿入の方法、および操作放出可能なペプチドのC末端-PEGコンジュゲートの合成のための手順を含む。
【００５９】
本発明は、ペプチドとPEGポリマーとの間にスペーサーは存在しない、C末端での放出可能なペプチド-PEGコンジュゲートを製造する方法も提供する。
【００６０】
本発明は、C末端のコンジュゲートエンケファリンとPEGポリマーとの間にスペーサーを含まない放出可能なエンケファリン-PEGを調製する方法も提供する。
【実施例】
【００６１】
以下の非限定的な実施例は、本発明のいくつかの態様を示している。
【００６２】
実施例1
20K Boc-Met-C（O）O-mPEG（20K Boc-Met-mPEGエステル）の合成
氷水浴中で冷却した乾燥DCM中の20kDa mPEG（4g、0.2mmol）およびBoc-L-メチオニン（252mg、1.0mmol）の溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（783mg、3.8mmol）を加え、終夜、室温に温めて、その混合物を窒素下で撹拌した。濾過により反応混合物からN、N'-ジシクロヘキシル尿素を除去した。濾液を真空下濃縮し、白色固体生成物をエチルエーテルで沈殿させた。白色固体生成物を回収し、エチルエーテルで洗浄して20KのBoc-Met-C（O）O-mPEG（3.4g）を得た。
【００６３】
実施例2
20K Met-C（O）O-mPEG（20K Met-mPEGエステル）の合成
乾燥DCM（11mL）中の20KのBoc-Met-C（O）O-mPEG（1.3g、0.065mmol）およびチオアニソール（0.8mL）にトリフルオロ酢酸（5.7ml）を加え、溶液を室温で30分間攪拌した。溶液を真空下濃縮し、生成物をエチルエーテルで沈殿させ、濾過し、回収し、エチルエーテルで洗浄して、20K Met-C（O）O-mPEG（1.2g）を得た。
【００６４】
実施例3
20K Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）O-mPEG（20K Boc-Met-エンケファリン-mPEGエステル）の合成
DCM / DMF（14mL / 7mL）の混合物中の、Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe（65mg、0.12mmol）、20K Met-C（O）O-mPEG（1.2g、0.06mmol）、N-ヒドロキシスクシンイミド（7mg、0.06mmol）およびDMAP（66mg、0.54mmol）の溶液を0℃に冷却し、続いてEDC（107mg、0.55mmol）を添加した。混合物を室温に温め、終夜撹拌した。溶液を真空下濃縮し、生成物をエチルエーテルで沈殿させ、濾過し、回収し、エチルエーテルで洗浄してBoc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）OPEG（1.2g）を得た。
【００６５】
実施例4
20K Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）O-mPEG（20K OGF-mPEGエステルまたは20K Met-エンケファリン-mPEGエステル）
20KのBoc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）O-mPEG（1.2g）の溶液に、m-クレゾール（0.8mL）およびチオアニソール（0.8mL）のDCM（10mL）溶液に、トリフルオロ酢酸（TFA、5.7mL）を加え、溶液を室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧下で部分的に除去し、生成物をエチルエーテルで沈殿させ、濾過し、固体をDCMに溶解し、0.01N HClで洗浄した。有機層を乾燥させ（無水硫酸マグネシウム）、濾過し、溶液を真空下濃縮し、生成物をエチルエーテルで沈殿させ、20K Tyr-Gly-Gly-L-Phe-Met-C（O）-O-mPEG（1.0g）を得た。
【００６６】
実施例5
ヒト血漿中における加水分解可能なエステル結合を有する20K OGF-PEGコンジュゲート
20K Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-C（O）-O-mPEGコンジュゲート（20K OGF-C（O）-O-mPEGまたは20K OGF-PEGエステル）の分解、及び、OGFの放出に対する実験を37℃でヒト血漿中で行った。加水分解可能なエステル結合を含むOGF-PEGコンジュゲートを37℃のヒト血漿中で、0.5〜24時間の範囲の様々な時間にわたってインキュベートした。アリコート血漿サンプルを採取し、アセトニトリルまたはアセトニトリル/メノール有機溶媒で処理し、ボルテックスで撹拌し、遠心分離し、濃縮した。次に、溶液残渣が、逆相HPLCクロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって分析され、様々な時点でのOGF-PEGの量およびOGFの放出量をチェックした。20K OGF-C（O）-O-mPEGの血漿T 1/2は約5時間であった。
【００６７】
前述の実施例および好ましい実施形態の記載は、例示としてとらえられるべきであり、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものではない。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載されている本発明から逸脱することなく、上述した特徴の多くの変形および組み合わせを利用することができる。このような変形は、本発明の精神と範囲からの逸脱とはみなされない。そのようなすべての変形は、以下の請求項の範囲内であると意図される。
【国際調査報告】
2017525678.tif 000002
2017525678.tif 000003