(57)【要約】  免疫学及び感染症の分野における本発明は、グラム陽性細菌に特異的な、特に該細菌の表面上に露出された炭水化物構造に対して特異的なオプソニン作用性及び保護性の抗体に関する。本発明は、モノクローナル抗体及びキメラ抗体並びに該抗体の断片、領域及び誘導体を含む。また、この発明は、本発明の抗体が結合するエピトープ並びに該エピトープの配列、断片及び領域に関する。上記抗体及び上記エピトープを含むペプチドの両方、そしてそれらの領域及び断片は、診断用途、予防用途及び治療用途に使用することができる。【選択図】図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの軽鎖と少なくとも1つの重鎖とを含むグラム陽性細菌に特異的なオプソニン作用性のモノクローナル抗体であって、前記少なくとも1つの軽鎖は、配列番号1から選択される軽鎖可変領域と少なくとも80 %の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ前記少なくとも1つの重鎖は、配列番号3、5、7及び9から選択される重鎖可変領域と少なくとも80 %の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記同一性のパーセンテージは、少なくとも90 %、例えば少なくとも95 %である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記少なくとも1つの可変領域は、配列番号1によるアミノ酸配列と、配列番号3、5、7及び9から選択される1つのアミノ酸配列とからなる、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
少なくとも1つの軽鎖、少なくとも1つの重鎖、又はその両方はキメラ型である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、重鎖定常領域を含み、前記定常領域は、全てのサブクラスのヒトIgG配列、IgA配列、IgM配列又はIgD配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv又はscFvを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ヒトκ配列又はヒトλ配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識に結合されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１０】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系統。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーとを含む医薬組成物。
【請求項１２】
静脈内投与用である、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
グラム陽性細菌によって引き起こされる感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量又は予防的有効量の請求項11又は12に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus hemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcusmutans）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcuspyogenes）又はストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）又はストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記グラム陽性細菌は、抗生物質耐性である、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
被験体においてグラム陽性細菌を検出する方法であって、該方法は、請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離された抗グラム陽性モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が被験体由来の試料へと結合する試験レベルを求めることと、その結合する試験レベルを対照と比較することとを含み、ここで、結合する試験レベルが対照よりも高いことは、前記試料においてグラム陽性細菌が存在することを示すものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
免疫学及び感染症の分野における本発明は、グラム陽性細菌に特異的な、特に該細菌の表面上に露出された炭水化物構造に対して特異的なオプソニン作用性及び保護性の抗体に関する。本発明は、モノクローナル抗体及びキメラ抗体並びに該抗体の断片、領域及び誘導体を含む。また、この発明は、本発明の抗体が結合するエピトープ並びに該エピトープの配列、断片及び領域に関する。上記抗体及び上記エピトープを含むペプチドの両方、そしてそれらの領域及び断片は、診断用途、予防用途及び治療用途に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質が発見されて開発される前には、細菌感染症による死はしばしば急激なものであり、避けることはできなかった。グラム陽性の多剤耐性細菌、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）及び腸球菌（Enterococci）は、なかでも主要な院内病原体であり、多くの死因であるとともに患者の入院期間を長引かせる要因である。
【０００３】
グラム陽性細菌の細胞壁は、3種の主要成分、すなわちペプチドグリカン、莢膜多糖体及びテイコ酸を含むとともに、種に応じた追加の炭水化物、複合多糖及びタンパク質を含んでいる。
【０００４】
グラム陽性細菌のなかでも、最も一般的な属の一つはブドウ球菌属である。ブドウ球菌は、通常、人間及び動物にコロニー形成し、人間の、特に入院患者における罹病率及び死亡率の一つの重要な原因である。ブドウ球菌は皮膚及び粘膜内層に偏在するため、理屈上は局所性感染症及び全身性感染症の両方を引き起こす状態にある。
【０００５】
ブドウ球菌感染症は様々な理由のため治療が困難である。抗生物質に対する耐性は、よく見られ、メチシリン耐性及び多剤耐性が伝播可能であるためますます増えてきている。さらに、ブドウ球菌感染症に対する宿主の耐性は、まだあまり明確に理解されていない。
【０００６】
オプソニン作用性の抗体は、ブドウ球菌感染症の予防又は治療のために提案されている。例えば特許文献1を参照のこと。
【０００７】
腸球菌は、しばしば対になって存在（「双球菌」）するか、又は短い鎖状に存在するグラム陽性球菌であるが、物理特性だけでは「ブドウ球菌」と区別しづらい。エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）（90 %〜95%）及びエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）（5%〜10 %）の2種はヒトの腸内における一般的な共生生物である。
【０００８】
腸球菌によって引き起こされる重要な臨床感染症には、尿管感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、憩室炎及び髄膜炎が含まれる。医療的観点から、この属の一つの重要な特徴は、高レベルの潜在的抗生物質耐性である。一部の腸球菌は、β−ラクタム系抗生物質（ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類）及び多くのアミノグリコシド類に対して潜在的耐性を有する。ここ二十年で、バンコマイシンに対して耐性の腸球菌の特に毒性の強い菌株（バンコマイシン耐性腸球菌又はVRE）が、特に米国で入院患者の院内感染症において現れた。
【０００９】
特許文献2は、（グラム陰性細菌である）シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の多くの菌株に対して免疫応答を誘導する方法であって、ヒト又は動物へと、そのヒト又は動物において免疫応答を誘導するのに十分な量のシュードモナス・アエルギノーザ2192由来のムコイド型菌体外多糖を投与することを含む方法を記載し、それと一緒にこの抗原を産生する微生物及び該抗原を細菌粘質そのものから分離する方法が開示されている。こうして、シュードモナス・アエルギノーザの多くの菌株に対する免疫応答を誘導することができるワクチンが提供される。好ましい最少量は、投与前に存在した濃度の少なくとも4倍の濃度にまで抗体形成を惹起するのに必要な量である。
【００１０】
特許文献3は、シュードモナス・アエルギノーザのムコイド型菌体外多糖に特異的に結合するペプチド、特にヒトモノクローナル抗体を更に記載している。本発明は、シュードモナス・アエルギノーザ感染症及び関連疾患（例えば嚢胞性線維症）の診断、予防及び治療においてこれらのペプチドを使用する方法を更に提供する。当該発明の一部の抗体は、シュードモナス・アエルギノーザの多くのムコイド型菌株のオプソニン貪食作用性の殺菌を高める。医薬組成物を含め、上記ペプチドの組成物も提供され、そのようなペプチドの機能的に同等な変異体も提供される。
【００１１】
特許文献4は、ムコイド型シュードモナス・アエルギノーザに対してオプソニン作用性である抗イディオタイプモノクローナル抗体を記載している。上記抗イディオタイプモノクローナル抗体は、C9F5と呼ばれる、ATCCアクセッション番号HB10715を有する細胞系統によって産生される。該抗イディオタイプモノクローナル抗体は、ワクチンとして有用であるとともに、診断目的にも有用である。
【００１２】
特許文献5は、グラム陽性細菌のリポテイコ酸へと結合するモノクローナル抗体及びキメラ抗体を記載している。該抗体は、細菌全体にも結合し、そしてin vitroでその細菌の貪食作用及び殺菌を高めるとともに、in vivoでは致死的な感染症からの保護を強める。ここでは、ヒト化されたマウスモノクローナル抗体が記載されている。当該公報は、そのモノクローナル抗体によって規定されるリポテイコ酸エピトープ結合部位のペプチドミミックも含む。
【００１３】
特許文献6は、グラム陽性細菌のリポテイコ酸（LTA）へと結合するモノクローナル抗体を開示している。該抗体は、細菌全体にも結合し、そしてin vitroでその細菌の貪食作用及び殺菌を高める。また、ヒト配列を有する抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体）も開示されている。
【００１４】
特許文献7は、病原体のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（MRSA）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ（Staphylococcussciuri）、腸球菌属の一種、及びPBP2a又はこのタンパク質に相同の配列を保有する任意の他の細菌を含む、PBP2aタンパク質及びPBP2aと相同の配列を表す他のタンパク質を認識して結合することができるモノクローナル抗体を開示している。PBP2aは、ムレインの合成に際しての細菌性ペプチド転移反応に役割を担う細菌の膜中に係留されたクラスIIのマルチモジュール酵素である。モノクローナル抗体での処理によって与えられた保護は、処理された動物の腎臓中に存在する細菌量に89倍の低下をもたらしたが、この保護は、5倍のバンコマイシン用量での処理により得られる保護（35倍の低下）よりも高いものであった。しかしながら、最も大きな低下の成果は、抗体＋バンコマイシンで処理された群において見られ、450倍の低下を引き起こした。
【００１５】
Theilackerらは非特許文献1において、エンテロコッカス・フェカリスのLTAに対する抗体が、他のグラム陽性菌種、オプソニン化されたスタフィロコッカス・エピデルミディス菌株及びスタフィロコッカス・アウレウス菌株並びにB群連鎖球菌由来の1型のLTAにも結合することを記載している。エンテロコッカス・フェカリスのLTAに対するウサギ抗体による受動免疫化は、マウスにおけるエンテロコッカス・フェカリス及びスタフィロコッカス・エピデルミディスによる菌血症のクリアランスを促進した。LTAは、多くのグラム陽性病原体を標的とする単独のワクチン抗原として機能し得る保存された細菌構造として提案される。
【００１６】
特許文献8は、ポリ-N-アセチルグルコサミン（PNAG）、例えばブドウ球菌のPNAGのアセチル化形、部分アセチル化形及び／又は完全脱アセチル化形に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を開示している。上記抗体は、ブドウ球菌及び大腸菌（E. coli）のようなPNAGを発現する細菌による感染症の診断、予防及び治療において使用することができる。その発明の幾つかの抗体は、ブドウ球菌及び大腸菌のようなPNAGを発現する細菌のオプソニン貪食作用性の殺菌を高めるとともに該細菌に対するinvivoでの保護を強める。
【００１７】
特許文献9は、scFvファージディスプレイライブラリーから選択される腸球菌に特異的に結合する単鎖Fv断片を開示している。オプソニン貪食作用性アッセイを実施することで、腸球菌の臨床分離株12030に対する抗腸球菌のヒトIgG1の殺菌活性が定量化された。試験されたどの抗体も、スタフィロコッカス・アウレウスのリポテイコ酸（LTA）に対しては結合を示さなかった。
【００１８】
上述の従来技術は、グラム陽性細菌の細胞壁のかなり広範な様々な構成成分に対して多かれ少なかれ効果的な抗体を産生するという試みがなされたことを示している。それにもかかわらず、その標的となるものも、感染症に対する保護における上記の抗体のいずれかの効果も事前に確実に予想することができるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第5,571,511号
【特許文献２】米国特許第4,578,458号
【特許文献３】米国特許第7,230,087号
【特許文献４】米国特許第5,233,024号
【特許文献５】国際公開第1998/57994号
【特許文献６】国際公開第2003/059260号
【特許文献７】欧州特許出願公開第2476702号
【特許文献８】国際公開第2005/103084号
【特許文献９】国際公開第2007/141278号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】異種リポテイコ酸（LTA）のポリグリセロールリン酸骨格に対する抗体によるスタフィロコッカス・アウレウスに対する保護（Protection against Staphylococcus aureus by antibody to thepolyglycerolphosphate backbone of heterologous lipoteichoic acid (LTA).）J Infect Dis. 2012 Apr 1;205(7):1076-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
当該技術分野では、ブドウ球菌に対してより高い親和性で結合することができるとともに、該細菌の貪食作用及び殺菌を高めることができ、それによりin vivoでの保護を強めることができる新たな効果的なモノクローナル抗体を提供することが求められている。mAbの開発の場合に、広範の病原体を網羅するためには、交差反応性抗原を認識する可変ドメインを選択することが有利であると考えられる。ヒト化モノクローナル抗体又は他のキメラヒト／マウスモノクローナル抗体と、該抗体のグラム陽性感染症の治療における各々の使用とについて関連の要望が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
当該技術分野におけるこれらの要望に取り組むために、本発明は、グラム陽性細菌に結合するオプソニン作用性及び保護性のモノクローナル抗体及びキメラ抗体を提供する。また、該抗体は、細菌全体にも結合し、そしてin vitroでその細菌の貪食作用及び殺菌を高めるとともに、in vivoでは致死が見込まれる感染症からの保護を強める。
【００２３】
したがって、本発明は、グラム陽性細菌によって引き起こされる細菌感染症の診断、予防及び／又は治療のための反応性が広範なオプソニン作用性の抗体を提供する。本発明の抗体は、グラム陽性細菌との広範な反応性を有する、すなわち、上記抗体は、グラム陽性細菌を選択的に認識して該細菌に結合する。この結合を評価するために、例えば酵素結合免疫吸着アッセイを含む任意の従来の結合アッセイを使用することもできる。本発明によって提供される抗体及び抗体断片の一つの重要な特性は、それらがグラム陽性細菌のオプソニン作用及び貪食作用（すなわち、オプソニン貪食作用）を高める能力である。
【００２４】
一つの態様では、本発明は、少なくとも1つの軽鎖と少なくとも1つの重鎖とを含むグラム陽性細菌に特異的なオプソニン作用性のモノクローナル抗体であって、少なくとも1つの軽鎖は、配列番号1から選択される軽鎖可変領域と少なくとも80 %の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ少なくとも1つの重鎖は、配列番号3、5、7及び9から選択される重鎖可変領域と少なくとも80 %の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、モノクローナル抗体を提供する。
【００２５】
一実施の形態においては、上記単離されたペプチドは、本明細書に開示される抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。重要な実施の形態においては、上記アミノ酸配列は、配列番号1から選択される軽鎖可変領域からなる群から選択され、かつ上記重鎖可変領域は、配列番号3、5、7及び9から選択される1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００２６】
本明細書においてそれぞれ（重鎖に応じて）VH2、VH3、VH4E及びVH8と呼ばれる本発明の特異抗体が好ましい。
【００２７】
抗体及び抗体断片を含む本発明のペプチドは、グラム陽性細菌の検出、グラム陽性感染症の診断、並びにそのような感染症及び該グラム陽性細菌が関連する障害の予防及び治療において特に有用である。
【００２８】
本明細書に記載される抗体の選択法は、機能（すなわち食細胞による病原体の取り込み及び殺菌）に基づいて行われ、大抵のアプローチのように親和性に基づいては行われなかった。本発明においては、健康な個体由来のオプソニン作用性及び保護性の抗体は、多剤耐性病原体を標的とするために同定された。エンテロコッカス・フェカリス12030を用いたオプソニン貪食作用性アッセイを使用したドナープールの予備スクリーニングを用いることで、最高力価のオプソニン作用性の抗体を有するドナーを特定した。そのドナーから全血を採取し、そしてEBVでの感染によってB細胞を不死化した。それらの不死化B細胞を、RNA調製に十分な数に至るまで培養した。それぞれのウェルの上清を回収し、エンテロコッカス・フェカリス12030に対するOPAにおいて使用して、最も高い殺菌が生じたウェルを特定した。このウェルからのB細胞を組織培養ウェル中に入れた。上清を再びOPAによって試験し、再び最も高い殺菌に導くウェルの細胞を、新たなマイクロタイター培養プレート中に分注した。4ラウンドの後に、最も強力な応答のあるウェル中のB細胞を溶解し、そしてmRNA及びcDNAを調製した。
【００２９】
変性されたプライマーセットを使用して、再編成された免疫グロブリンの可変ドメイン（VH及びVL）の遺伝子をPCRによって増幅し、ヒトIgG1の定常ドメインと、軽鎖のためのヒトλ定常ドメインとを含むグラム陽性発現ベクター中にクローニングした。
【００３０】
同定された可変ドメイン配列を含むプラスミドを次いで（then）チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中にトランスフェクションし、そして培養上清を回収し、硫酸アンモニウムで沈殿させ、透析し、そして抗体濃度を測定した。組換えモノクローナル抗体を、幾つかのエンテロコッカス・フェカリス菌株、エンテロコッカス・フェシウム菌株及びスタフィロコッカス・アウレウス菌株に対するOPAによって試験した。約500 pg/ml〜600 pg/mlの濃度で、オプソニン作用性の殺菌は、40 %〜70 %であった。
【００３１】
マウス敗血症モデルを使用して保護効力を評価し、1匹のマウスにつき4 μg/kgが、統計学的に有意な保護をもたらした。
【００３２】
予備実験は、上記抗体が、グラム陽性細胞の表面上の非タンパク質様の、したがって炭水化物の構造を特異的に認識することにより、ヒト患者における使用のための該抗体の安全性の一助となることを示している。
【００３３】
本抗体の有効性は、現在市販されている他の抗感染症抗体[Andabaka T, Nickerson JW, Rojas-Reyes MX, Rueda JD, Bacic Vrca Vら(2013)「小児における呼吸器合胞体ウイルス感染症のリスク低下のためのモノクローナル抗体（Monoclonal antibody for reducing the risk of respiratory syncytialvirus infection in children.）」Cochrane database ofsystematic reviews (Online) 4: CD006602. doi:10.1002/14651858.CD006602.pub4]又は開発中の他の抗感染症抗体[Kelly-Quintos C, Cavacini LA, Posner MR, Goldmann DA, Pier GB (2006)「細菌表面多糖のポリ-N-アセチルグルコサミンに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体のスタフィロコッカス・アウレウスに対するオプソニン作用性及び保護の活性の特性評価（Characterization of the opsonic and protective activity againstStaphylococcus aureus of fully human monoclonal antibodies specific for thebacterial surface polysaccharide poly-N-acetylglucosamine.）」Infect Immun 74: 2742-2750. Wang W, Wang EQ, Balthasar JP (2008)「モノクローナル抗体の薬物動力学及び薬力学（Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Pharmacodynamics.）」Clin Pharmacol Ther 84: 548-558. Fox JL (2013)「抗微生物剤が働かない場合の抗感染症モノクローナル抗体処置（Anti-infective monoclonals step in where antimicrobials fail.）」Nat Biotechnol 31: 952-954.]よりも1000倍優れている。
【００３４】
このように、約500 pg/ml〜600 pg/mlの濃度で40 %〜70%で、より好ましくは60 %〜70 %でオプソニン作用性の殺菌を誘導する、本発明によるモノクローナル抗体が好ましい。
【００３５】
マウス敗血症モデルにおいて、1匹のマウスにつき4 μg/kgで、より好ましくは1匹のマウスにつき3 μg/kg〜2 μg/kgで統計学的に有意な保護をもたらす、本発明によるモノクローナル抗体が更に好ましい。
【００３６】
同一性のパーセンテージが少なくとも90 %であり、より好ましくは少なくとも95 %であり、例えば98 %である、本発明によるモノクローナル抗体が好ましい。最も好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体の可変領域は、配列番号1によるアミノ酸配列と、配列番号3、5、7及び9から選択される1つのアミノ酸配列とからなる。
【００３７】
抗体であって、該抗体の可変領域が配列番号1によるアミノ酸配列（配列番号2のDNAから得られ、ここで、同一性のパーセンテージは少なくとも90 %であり、より好ましくは少なくとも95 %であり、例えば98 %である）と、配列番号3、5、7及び9から選択されるアミノ酸配列（配列番号4、6、8及び10のDNAから得られ、ここで、同一性のパーセンテージは少なくとも90 %であり、より好ましくは少なくとも95 %であり、例えば98 %である）とを含む、及び／又はそれらの配列からなり、その際、該アミノ酸の幾つかが翻訳後修飾のため修飾されている、抗体も本発明に含まれる。これらの修飾は、例えば不完全なジスルフィド結合形成、グリコシル化、N末端ピログルタミン環化、C末端リジンプロセシング、脱アミド化、異性体化及び酸化だけでなく、マレウル酸によるN末端アミノ酸の修飾及びC末端アミノ酸のアミド化のようなあまり一般的でないものも含む。修飾は、in vitro及び／又はin vivoで導入することもできる。当然のことながら、本発明によれば、これらの修飾された抗体は、依然としてin vitroで細菌の貪食作用及び殺菌を高めるとともに、in vivoでは致死が見込まれる感染症からの保護を強める。
【００３８】
代替的な一実施の形態は、少なくとも1つの軽鎖、少なくとも1つの重鎖、又はその両方が本明細書に記載されるようにキメラ型である、本発明によるモノクローナル抗体である。より好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体は、重鎖定常領域を含み、その際、上記定常領域は、ヒトIgG配列（その全てのサブタイプ）、IgA配列、IgM配列又はIgD配列を含み、及び／又はヒトκ配列若しくはヒトλ配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００３９】
一実施の形態においては、本発明による単離された抗体又は抗体断片は、単離されたインタクトな可溶性のモノクローナル抗体であってよい。上記単離された抗体又は抗体断片は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv又はscFvからなる群から選択される単離されたモノクローナル抗体断片であってよい。
【００４０】
本発明の抗体は、非常に強力な結合を示す（したがって高い親和性を有する）、すなわち試験菌株に対する酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンドの約2倍のO.D.を示す。好ましい一実施の形態においては、高い結合レベルは、バックグラウンドの5倍以上である。他の実施の形態においては、高い結合レベルは、バックグラウンドの10倍以上である。当然のことながら、バックグラウンド（抗体以外の全試薬を試験したときに観察されるレベル）を超える意味のある何らかの増加は、当業者によって高い結合として認識されるため、本発明の範囲内にあることとなる。また上記従来技術に記載されるように、高い結合は、オプソニン作用活性と相関することが判明している。
【００４１】
本発明による単離された抗体又は抗体断片は、グラム陽性細菌、例えばブドウ球菌及び／又は腸球菌のオプソニン貪食作用を高める。そのような抗体又は抗体断片は、本明細書においては、「オプソニン作用性の抗体又は抗体断片」と呼ばれる。
【００４２】
本発明の抗体は、グラム陽性細菌に対してオプソニン作用性であるか、又はグラム陽性細菌に対してオプソニン作用活性を示す。当業者が認識するように、「オプソニン作用活性」は、オプソニン（一般的に、抗体又は血清因子C3bのいずれか）が抗原に結合して、抗原の食細胞への結合を促進し、それにより貪食作用を高める能力を指す。幾つかの細菌、特に莢膜の存在のため貪食作用に抵抗性がある被包性細菌は、オプソニン作用性の抗体で被覆されると好中球及びマクロファージのような食細胞をとても引き付けるものとなり、そして該細菌の血流からのクリアランス速度は、顕著に高められる。オプソニン作用活性は、以下に記載される任意の従来の様式で、例えばTheilackerら（以下参照）によって記載されるように測定され得る。
【００４３】
オプソニン化アッセイは、或る物質のオプソニン作用能を測定し、広範に反応性の免疫グロブリンを同定する、比色アッセイ、化学発光アッセイ、蛍光アッセイ若しくは放射性標識取り込みアッセイ、細胞媒介性殺菌アッセイ、又は当該技術分野で既知の任意の他の適切なアッセイであってよい。オプソニン化アッセイにおいては、以下のもの、すなわち感染要因、真核細胞及び試験されるべきオプソニン化物質、又はオプソニン化物質とともにオプソニン化を高めるとされる物質が一緒にインキュベートされる。オプソニン化アッセイは、細胞媒介性殺菌アッセイであるのが好ましい。
【００４４】
選択的に、オプソニン作用能力は、インキュベート前後の生きている生物の数の測定によって決定される。免疫グロブリンの存在下でのインキュベートの後の細菌数の減少は、陽性のオプソニン化能力を示している。細胞媒介性殺菌アッセイにおいて、陽性のオプソニン化は、適切な細菌増殖条件下でインキュベート混合物を培養することによって求められる。インキュベート前の試料とインキュベート後の試料とを比較した場合の、又は免疫グロブリンを含む試料と含まない試料との間で比較した場合の、生きている細菌の数の何らかの有意な減少は、陽性反応である。
【００４５】
グラム陽性細菌による感染症の治療又は予防のための作用物質を同定するもう一つの好ましい方法は、クリアランス及び保護の尺度となる敗血症又は菌血症の動物モデルを使用するものである。そのような作用物質は、免疫グロブリン又は他の抗微生物性物質であってよい。特に有用な動物モデルは、抗体及びグラム陽性生物を免疫無防備状態（例えば未成熟の）動物に投与し、引き続き該抗体がその動物の死亡率を減らすかどうか、又は該動物からのその生物のクリアランスを高めるかどうかを評価することを含む。このアッセイは、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、又は任意の他の適切な研究用動物を含む任意の未成熟の動物を使用してよい。
【００４６】
クリアランスは、医薬組成物が動物からの感染要因のクリアランスを高めるかどうかを求めることによって評価される。これは、一般的に、生物学的流体、例えば血液、腹水若しくは髄液の試料、又は臓器、例えば肝臓、脾臓若しくは腎臓の試料から求められる。上記感染要因は、その生物学的流体又は臓器から、生き残っている感染要因の増殖又は同定に適切なように培養される。処理後或る一定の期間にわたって採取された流体試料から、当業者は、該動物が上記感染要因を浄化する能力に対する上記医薬組成物の効果を求めることができる。更なるデータは、或る一定の時間にわたり、好ましくは或る一定の日数にわたり、上記医薬組成物が投与される動物の生存を測定することによって得ることができる。通例、両方のデータセットが用いられる。
【００４７】
上記医薬組成物がクリアランスを高めるか、又は死亡率を低下させるのであれば、結果は陽性と見なされる。生物のクリアランスが高められるが、試験動物が既に死んでいる状況でも、まだ陽性の結果が示される。
【００４８】
本発明の抗体がグラム陽性細菌に結合し、該細菌をオプソニン化し、それによりin vitroでの貪食作用及び殺細胞を高め、in vivoで保護を強める能力は、予想されるものではない。
【００４９】
このレベルのオプソニン作用活性では、抗体は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌及びコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の両方の貪食作用及び殺細胞を高めるべきである。語句「高められた」とは、有用なレベルでバックグラウンドを測定的に上回る活性を指す。有用であろうと思われるレベルは、細菌の種類及び感染の重症度を含む特定の感染状況に応じて十分に変化し得る。例えば、高められたオプソニン作用活性又は貪食作用活性に関して、好ましい一実施の形態においては、高められた応答は、バックグラウンドを75 %以上だけ上回る。もう一つの好ましい実施の形態においては、高められた応答は、バックグランドを80 %以上だけ上回る。更にもう一つの実施の形態においては、高められた応答は、バックグランドを90 %以上だけ上回る。
【００５０】
オプソニン作用性であると示された抗体がinvivoで保護性であることを確認するために、該抗体をマウスの感染モデルと、ラットの心内膜炎モデルとで評価した。実施例に示されるように、該抗体は、血流及び内臓（例えば肝臓、腎臓及び脾臓）及び心臓疣贅からの細菌のクリアランスを顕著に高める。
【００５１】
本発明のこれらの抗体は、ポリクローナル抗体だけでなく、モノクローナル抗体も含むとともに、他のモノクローナル抗体、その断片及び領域、並びにそれらの誘導体も含む。上記のように、結合の強さは、バックグラウンドより2倍高いものから、バックグラウンドより5倍及び10倍高いものまでの範囲であってよい。
【００５２】
さらに、本発明の抗体、断片、領域及び誘導体は、そのような細菌のオプソニン化を、75 %からそれより高い範囲の比率で高めることができる。本発明の抗体の「断片」は、例えばFab、Fab'、F(ab')2及びscFvを含む。これらの断片は、インタクトな抗体から、当該技術分野でよく知られた方法、例えばパパイン（Fab断片の生成のため）又はペプシン（F(ab')2の生成のため）のような酵素によるタンパク質分解的開裂等を使用して生成される。
【００５３】
本発明の好ましい態様においては、上記領域は、グラム陽性細菌を結合する、少なくとも1つの重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。もう一つの実施の形態においては、これらの2つの可変領域は、単一鎖抗体として一緒に結合させることができる。全長重鎖は、オプソニン作用活性にとって重要なことがあり、そして抗サイトカイン（抗炎症）活性を高めることがあり、一方で、該可変領域を含む抗体断片は、上皮細胞への細菌の結合の阻害に適していることがあり、抗炎症性であることもある。
【００５４】
本発明の特に好ましい態様においては、上記抗体は、ヒト抗体（IgG）の定常領域と一緒に本発明の抗体からの領域から作製された組換えヒト抗体である。例えば、H鎖は、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部に結合された本発明の抗体の重鎖可変領域の抗原結合領域を含み得る。このヒト化又はキメラ型の重鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部に結合された、抗体の軽鎖可変領域の抗原結合領域を含むキメラL鎖と組み合わされてよい。
【００５５】
本発明の組換え抗体は、一価、二価又は多価の免疫グロブリンであってよい。例えば、一価の抗体は、上記のように、L鎖とジスルフィド架橋を通じて会合されたH鎖によって形成された二量体（HL）である。二価の抗体は、少なくとも1つのジスルフィド架橋を通じて会合された2つのHL二量体によって形成された四量体である。多価の抗体は、複数の鎖の集合体を基礎としている。
【００５６】
本発明の特に好ましい抗体は、実施例に記載されており、i）配列番号1による配列を含む軽鎖と配列番号3による配列を含む重鎖とを含み、ii）配列番号1による配列を含む軽鎖と配列番号5による配列を含む重鎖とを含み、iii）配列番号1による配列を含む軽鎖と配列番号7による配列を含む重鎖とを含み、そしてiv）配列番号1による配列を含む軽鎖と配列番号9による配列を含む重鎖とを含む。
【００５７】
当然のことながら、本発明の抗体の種々の区分から構成される他の組換え抗体も本発明の範囲内である。特に、上記重鎖定常領域は、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、IgM抗体又はIgA抗体であってよい。
【００５８】
治療又は予防されるグラム陽性細菌感染症は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus hemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcusmutans）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcuspyogenes）又はストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）からなる群から選択することができる。
【００５９】
次に、本発明によるモノクローナル抗体のもう一つの態様は、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が検出可能な標識に結合されている抗体に関する。エピトープと、細菌と、本発明の抗体又は抗原結合断片との間の複合体の検出に使用するのに適した標識は、例えば放射性同位体、エピトープ標識（タグ）、親和性標識（例えばビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、毒素又は蛍光基若しくは化学発光基を含む。
【００６０】
本発明のもう一つの態様においては、本発明は、また、上記のモノクローナル抗体又はその断片をコードする単離された核酸を含む。該核酸は、RNA、DNA、PNA及び／又はcDNAから選択することができる。本発明の上記核酸（複数の場合もある）は、単離することができ、及び／又はベクター、例えばプラスミド、例えば発現ベクター中にクローニングすることができる。こうして、上記抗体のタンパク質断片及び領域に加えて、本発明は、また、上記抗体をコードする遺伝子のDNA配列及び上記DNAによってコードされるペプチドを含む。
【００６１】
特に好ましいDNA及びペプチド配列は、図面及び添付の配列表において、特に配列番号1、3、5、7及び9（ペプチドについて）、並びに配列番号2、4、6、8及び10（核酸について）に示されており、それらは、好ましい抗体の重鎖及び軽鎖の両方の、相補性決定領域（「CDR」）、すなわち相補性抗原上のアミノ酸と相互作用する抗体可変領域内の超可変性アミノ酸配列を含む可変領域を記述している。
【００６２】
本発明は、これらのDNA配列及びペプチド配列、並びにこれらの配列と相同性である（同一性を共有する）DNA配列及びペプチド配列を含む。好ましい一実施の形態においては、これらの配列は、80%相同であるが、他の好ましい実施の形態は、85 %、90 %及び95 %相同である配列を含む。DNA配列及びペプチド配列の両方についてのこれらの相同性のレベルを決定することは、十分に当業者の通常の技能の範囲内である。
【００６３】
本発明のDNA配列は、当該技術分野でよく知られた手法によって、同定し、単離し、クローニングし、そして原核細胞又は真核細胞へと発現のために移入させることができる。そのような手法は、一般的にSambrookら（上記）及び分子生物学における最新のプロトコール（CurrentProtocols in Molecular Biology）（Ausubelら（編集）、John Wiley & Sons）に記載され、それらは引用することにより本明細書の一部をなす。
【００６４】
さらに、モノクローナル抗体及びキメラ抗体の両方を含む、本発明の抗体のDNA配列及びペプチド配列は、抗体「誘導体」の基礎を成すことができ、上記誘導体は、例えば切断遺伝子又は修飾遺伝子によってコードされるタンパク質又はペプチドを含む。そのようなタンパク質又はペプチドは、本発明の抗体と同様に機能することができる。細菌の貪食作用及び／又は殺菌を含む、エフェクター機能を高め得る他の配列の付加のような他の修飾も本発明の範囲内である。
【００６５】
本発明のもう一つの態様においては、本発明は、また、本発明によるモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系統を含む。一般的に、ハイブリドーマは、適切な不死細胞系統（例えばミエローマ細胞系統）と抗体産生細胞とを融合させることによって作製される。抗体産生細胞は、対象となる抗原で免疫されたヒト又は他の適切な動物の末梢血から、又は好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的な培養条件を使用して単離することができ、そして限界希釈によってクローニングされる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えばELISA）によって選択することができる。
【００６６】
本発明は、また、本発明のモノクローナル抗体又はキメラ抗体、並びにその断片、領域及び誘導体を、医薬的に許容可能なキャリヤーと一緒に含む医薬組成物を開示している。
【００６７】
医薬的に許容可能なキャリヤーは、滅菌液体、例えば水、石油、動物油、植物油、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油を含む油等であってよい。静脈内投与では、水は好ましいキャリヤーである。生理食塩水溶液、水性デキストロース、及びグリセロール溶液は、液体キャリヤーとして、特に注射可能な溶液に使用することもできる。適切な医薬品キャリヤーは、「レミントンの医薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第22版(2012)に記載されており、それらは引用することにより本明細書の一部をなす。
【００６８】
本発明による医薬組成物であって、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）又は鼻腔内投与のための医薬組成物が好ましい。医薬組成物（抗体を含む）の投与は、また、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、くも膜下、筋内、皮下、鼻腔内、膣内、経口によって、又は任意の他の効果的な投与方法によって実現することもできる。上記組成物は、また、局所的に、例えば感染された特定領域への注射によって、筋内又は皮下のいずれかで投与してもよい。投与は、医薬組成物を、患者に直接的に塗るか、浸すか、漬けるか、又は擦り付けることによって投与することを含み得る。上記医薬組成物は、また、患者内に配置される物体に、例えば留置カテーテル、心臓弁（valves）、髄液シャント、関節補綴物、体内への他のインプラント、又はグラム陽性細菌に感染することとなる危険性のある、若しくは患者へのそのような感染を持ち込む危険性のある任意の他の物体、機器若しくは装置に適用することもできる。
【００６９】
最後に、本発明は、グラム陽性細菌によって引き起こされる感染症を治療又は予防する方法であって、グラム陽性細菌、例えばブドウ球菌生物又は腸球菌生物に感染しているか、又は上記グラム陽性細菌に感染していることが疑われる患者へと、治療的有効量又は予防的有効量の本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。該方法は、治療的有効量の本発明のモノクローナル抗体又はキメラ抗体（その断片、領域及びその誘導体を含む）と、医薬的に許容可能なキャリヤーとを含む医薬組成物を投与することを含む。患者は、ヒト又は他の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ又はヤギであってよい。上記患者はヒトであるのが好ましい。
【００７０】
治療的有効量は、感染症の治療において幾らかの軽減又は助力の指標を妥当に提供すると考えられる量である。上記の又は下記のそのような治療は、一次治療であっても、追加治療、例えばブドウ球菌若しくは腸球菌の感染症、種々の要因によって引き起こされる感染症又は無関係の病気のための抗生物質療法に対する補足的な治療であってもよい。実際に、他の抗体との組合せ療法は、明白に、本発明の範囲内と考えられる。
【００７１】
予防的有効量は、グラム陽性細菌による感染症の幾らかの予防の指標を妥当に提供すると考えられる量である。上記の又は下記のそのような治療は、一次治療であっても、追加治療、例えばブドウ球菌の感染症、種々の要因によって引き起こされる感染症又は無関係の病気のための抗生物質療法に対する補足的な治療であってもよい。実際に、他の抗体との組合せ療法は、明白に、本発明の範囲内と考えられる。
【００７２】
治療又は予防されるグラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus hemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcusmutans）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcuspyogenes）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）又はストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）からなる群から選択される。
【００７３】
本発明の方法の好ましい一実施の形態では、グラム陽性細菌は、抗生物質耐性であり、例えばMRSA、VRSA、MDR又はVREである。
【００７４】
本発明の更にもう一つの態様は、被験体においてグラム陽性細菌を検出する方法であって、上記方法は、本発明による単離された抗グラム陽性モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が被験体由来の試料へと結合する試験レベルを求めることと、その結合する試験レベルを対照と比較することとを含み、ここで、結合する試験レベルが対照よりも高いことは、試料においてグラム陽性細菌が存在することを示すものである、方法に関する。
【００７５】
本発明は、保護性のヒトモノクローナル抗体の同定のためだけでなく、腸球菌感染症及びブドウ球菌感染症の予防、治療及び診断のための4種の候補抗体の同定のための選択方法に関する。このために、健康なボランティアの群から血液を採取し、その血清をオプソニン作用活性について分析した。高いオプソニン作用性の殺菌性を有するドナーを選択し、血液を抜き出し、そして全血中のB細胞を、EBVを使用して不死化した。不死化したB細胞を細胞培養プレートへと分散させ、培養した。細胞培養上清をオプソニン貪食作用性アッセイによって分析し、これらのウェルのうち最も高い殺菌性を示したウェルを特定した。このウェル中で増殖した全てのB細胞を次いで別のマイクロタイタープレートへと分散させ、そして再び最も高い殺菌性を有するウェルを特定し、再度播種した。4ラウンド後に、全RNAをその最良のウェルから単離し、cDNAへと転写した。プライマーセット（参考資料1を参照）を使用して、抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインを増幅し、真核性発現ベクター中にクローニングした。該ウェル中には4種の異なる抗体が存在し、かつ全ての抗体は同じ軽鎖（配列番号1）を有することが判明した。4種の構築物をCHO細胞中にトランスフェクションし、そして上清から組換えヒトモノクローナル抗体を精製した。次いでこれらの抗体をオプソニン貪食作用性アッセイにおいて試験すると、50 ng/ml〜500 ng/mlの濃度で殺菌性を示した。その際、該抗体の殺菌性は、試験された幾つかのエンテロコッカス・フェカリス菌株、エンテロコッカス・フェシウム菌株及びスタフィロコッカス・アウレウス菌株のいずれに対しても見られた。次いで、それらの抗体を更にin vivoマウスモデル及びin vivoラットモデルで試験した。
【００７６】
ここで本発明を以下の実施例において更に説明することとするが、当然のことながら、これらの実施例は説明の目的のために含まれているにすぎず、本発明の制限を目的とするものではない。本発明の目的上、引用される全ての参考資料は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。図面及び付属の配列表は、以下を示している。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明による抗体を使用したエンテロコッカス・フェシウムE1162に関するオプソニン貪食作用性アッセイの結果を示す図である。F428は、米国特許第7,119,172号に記載されているシュードモナス・アエルギノーザのムコイド型菌体外多糖に特異的な結合抗体を使用した対照を示している。Opsonophagocytic Assay  オプソニン貪食作用性アッセイE. faecium  エンテロコッカス・フェシウム
【図２】本発明による抗体を使用したエンテロコッカス・フェシウムの患者の分離株に関するオプソニン貪食作用性アッセイの結果を示す図である。F428は図1と同様である。Opsonophagocytic Assay  オプソニン貪食作用性アッセイE. faecium Patient Isolate  エンテロコッカス・フェシウムの患者の分離株% Killing  殺菌（%）
【図３】本発明による抗体を使用したスタフィロコッカス・アウレウスの患者の分離株に関するオプソニン貪食作用性アッセイの結果を示す図である。F428は図1と同様である。Opsonophagocytic Assay  オプソニン貪食作用性アッセイS. aureus Patient Isolate  スタフィロコッカス・アウレウスの患者の分離株% Killing  殺菌（%）
【図４】本発明による抗体を使用したスタフィロコッカス・アウレウスLACに関するオプソニン貪食作用性アッセイの結果を示す図である。F428は図1と同様である。Opsonophagocytic Assay  オプソニン貪食作用性アッセイS. aureus LAC  スタフィロコッカス・アウレウスLAC% Killing  殺菌（%）
【図５】本発明による抗体を使用したエンテロコッカス・フェカリス12030に関するオプソニン貪食作用性アッセイの結果を示す図である。F428は図1と同様である。Opsonophagocytic Assay  オプソニン貪食作用性アッセイE. faecalis 12030  エンテロコッカス・フェカリス12030% Killing  殺菌（%）
【図６】エンテロコッカス・フェカリス12030に関するラット心内膜炎試験の結果を示す図である。ラット心内膜炎モデルは、Haller Cらによって説明されているように成し遂げられ、このモデルにより、独立した動物モデルにおいてエンテロコッカス・フェカリス12030に対する保護が確認される。Rat Endocarditis with E. faecalis 12030  エンテロコッカス・フェカリス12030に関するラット心内膜炎vegetation  疣贅
【図７】スタフィロコッカス・アウレウスLACを有する肝臓中のコロニー数を示すマウスの菌血症モデルの結果を示す図である。細菌マウス敗血症はBaoらによって説明されているように成し遂げられた。それは、VH4E及びVH8が1つのマウスモデルにおいて両方の菌株に対して保護性であることを示している。S. aureus LAC USA300  スタフィロコッカス・アウレウスLAC USA300cfu/100mg liver  肝臓100 mg当たりのcfu
【図８】エンテロコッカス・フェカリスE1162に関するマウス菌血症モデルの結果を示す図である。Mouse Sepsis with E. faecalis E1162  エンテロコッカス・フェカリスE1162に関するマウス敗血症cfu/100mg Kidney  腎臓100 mg当たりのcfuBaby RabbitComplement  仔ウサギ補体
【図９】IgG1 mAbによるスタフィロコッカス・アウレウスNewman株感染に対する保護（1群当たり10匹のマウス）を示す図である。対照として、4 μg/kgの用量のmAb VH8及び200 μlの正常ウサギ血清（NRS）を、細菌による攻撃投与の24時間前に投与した。Newman菌株は、2×108 cfu/マウスの攻撃投与用量で使用した。Percent survival  生存パーセントtime in [h]  時間[h]
【発明を実施するための形態】
【００７８】
配列番号1：本発明により同定された抗体の軽鎖のペプチド配列。
【００７９】
配列番号3、5、7及び9：本発明により同定された抗体の重鎖のペプチド配列。
【００８０】
配列番号2：本発明により同定された抗体の軽鎖のヌクレオチド配列。
【００８１】
配列番号4、6、8及び10：本発明により同定された抗体の重鎖のヌクレオチド配列。
【実施例】
【００８２】
概要
多剤耐性病原体を標的とする健康な個体からのオプソニン作用性及び保護性の抗体を同定した。エンテロコッカス・フェカリス12030に関するオプソニン貪食作用性アッセイ（OPA）を使用したドナープールの予備スクリーニングを用いて、最高力価のオプソニン作用性の抗体を有するドナーを特定した。そのドナーから10ミリリットルの全血を採取し、そしてEBVでの感染によってB細胞を不死化した。それらの不死化B細胞を、RNA調製に十分な数に至るまで48ウェルプレート中で約8週間にわたり培養した。それぞれのウェルの上清を回収し、エンテロコッカス・フェカリス12030に対するOPAにおいて使用して、最も高い殺菌が生ずるウェルを特定した。このウェルからB細胞を新たな48ウェル組織培養プレート中に分注した。上清を再びOPAによって試験し、再び最も高い殺菌に至るウェルの細胞を、新たな48ウェルプレート中に分注した。4ラウンドの後に、最も強力な応答のあるウェル中のB細胞を溶解し、そしてmRNA及びcDNAを調製した。変性されたプライマーセットを使用して、再編成された免疫グロブリンの可変ドメイン（VH及びVL）の遺伝子をPCRによって増幅し、ヒトIgG1の定常ドメインと、軽鎖のためのヒトλ定常ドメインとを含むグラム陽性発現ベクター中にクローニングした1。同定された可変ドメイン配列を含むプラスミドを次いでCHO細胞中にトランスフェクションし、そして培養上清を回収し、硫酸アンモニウムで沈殿させ、透析し、そして抗体濃度を測定した。組換えモノクローナル抗体を、幾つかのエンテロコッカス・フェカリス菌株、エンテロコッカス・フェシウム菌株及びスタフィロコッカス・アウレウス菌株に対するOPAによって試験した。約500 pg/ml〜600 pg/mlの濃度で、オプソニン作用性の殺菌は、40 %〜70 %であった。マウス敗血症モデルを使用して保護効力を評価し、1匹のマウスにつき4 μg/kgが、統計学的に有意な保護をもたらした。
【００８３】
細菌株及びプラスミド
大腸菌をルリアブロス（LB;Roth）又はLBアガー中、37℃で撹拌しつつ増殖させ、その一方で、グラム陽性細菌（スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウム）を、トリプチックソイブロス（TSB）又はトリプチックソイアガー（TSA）中、撹拌せずに37℃で増殖させた。抗生物質（全てSigmaから購入）を示されるように添加した。
【００８４】
EBV不死化及びオプソニン作用性のB細胞クローンの同定
血液（10 ml）を静脈穿刺により健康なボランティアから採取し、B細胞を単離し、そしてTosatoらによって記載されているように不死化させた。不死化された細胞を組織培養プレート中で6日間にわたり培養し、次いで40 μg/mlのTNP-LPS（Biosearch Technologies）、10 U/mlのhIl-1(BD)及び100U/mlのhIl-2(BD)によって刺激した。それぞれのウェルの上清を回収し、エンテロコッカス・フェカリス12030に対するオプソニン貪食作用性殺菌アッセイ（OPA）において使用して、最も高い殺菌が生ずるウェルを特定した。このウェルからB細胞を新たな組織培養プレート中に分注した。上清を再びOPAによって試験し、最も高い殺菌に至るウェルの細胞を、新たなプレート中に分注した。4ラウンドの後に、最も強力な応答のあるウェル中のB細胞を溶解し、そしてmRNA及びcDNAを調製した。
【００８５】
可変ドメインの増幅
それらの不死化B細胞を最後の選択の後に、RNA調製に十分な数が得られるまで約8週間にわたり培養した。RNAを約5×106の不死化細胞からRNeasyキット（QIAGEN）を使用して製造元の指示に従って抽出した。500 ngの容量の全RNAを、Omniscriptキット（QIAGEN）を使用して逆転写し、そして1 μlの容量のcDNA産物をPCRのための鋳型として使用した。それぞれの反応物は、50 μlのPCR Mix（HotStart Taq DNAポリメラーゼ、QIAGEN）と、100 pmolのそれぞれのプライマーと、1 μlのcDNA鋳型とから成っていた。PCR増幅のために、以下のプロトコールによる35サイクルを使用した：まず95℃で30秒間に引き続き、95℃で30秒間と、58℃で30秒間と、68℃で45秒間とのサイクルで、70℃で10分間にわたり最終伸長した。PCR産物をTOPOクローニングベクター2.1（Invitrogen）中にクローニングし、配列決定した。結果配列を、既知の生殖細胞系統配列に対してIgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）を使用して比較した。
【００８６】
可変ドメインの、真核性発現ベクターTCAE6.7へのクローニング
ヒトλ定常領域とIgG1定常領域とを含むTCAE6.7ベクターを先に記載されているように使用した［Preston MJ, Gerceker AA, Reff ME, PierGB (1998)「シュードモナス・アエルギノーザ血清群O6リポ多糖に特異的な同一の可変領域を有する、一組のマウス−ヒトキメラ免疫グロブリンG（IgG）サブクラスとIgAモノクローナル抗体との産生及び特性評価（Production and characterization of a set of mouse-human chimericimmunoglobulin G (IgG) subclass and IgA monoclonal antibodies with identicalvariable regions specific for Pseudomonas aeruginosa serogroup O6lipopolysaccharide.）」Infect Immun 66: 4137-4142. PierGB, Boyer D, Preston M, Coleman FT, Llosa Nら (2004)「ムコイド型菌株及び非ムコイド型菌株の両方による感染に対して保護するシュードモナス・アエルギノーザのアルギン酸塩に対するヒトモノクローナル抗体（Human monoclonal antibodies to Pseudomonas aeruginosa alginate thatprotect against infection by both mucoid and nonmucoid strains.）」J Immunol 173: 5671-5678］。4種の構築物からの重鎖（H）V領域遺伝子を、SalI及びNheI制限酵素（NEB）で消化し、同じ酵素で切断したTCAE6.7中にライゲーションした。ライゲーション反応混合物をコンピテントな大腸菌TOP10細胞（Invitrogen）中に形質転換し、そしてプラスミドを、plasmidMiniprepキット（QIAGEN）を使用して精製した。該ベクターを配列決定し、正しい配列を確認した。軽鎖（L）の場合は、TOPOクローニングベクター2.1中にクローニングされた軽鎖の可変ドメインをBglII及びAvrII制限酵素（NEB）で消化し、そして適合したH鎖可変領域を既に含み、同じ酵素で切断されるTCAE6.7ベクターとライゲーションした。プラスミドを大腸菌TOP10細胞（Invitrogen）中に形質転換し、個々のコロニーを単離し、プラスミドを得て、そして挿入されたDNAを配列決定することで、正しいL鎖V領域が該真核性発現ベクター中にクローニングされていることを確実にした。IgG1は、細菌の補体媒介性殺菌においてIgG3よりも優れていることが報告されているので［BrueggemannM, Williams GT, Bindon CI, Clark MR, Walker MRら (1987)「適合された一組のキメラ抗体を使用したヒト免疫グロブリンのエフェクター機能の比較（Comparison of the effector functions of human immunoglobulins usinga matched set of chimeric antibodies.）」J Exp Med 166:1351-1361］、本発明者らは、IgG1定常ドメインを使用した。
【００８７】
CHO細胞のトランスフェクション及び組換え抗体分子の発現
種々のH鎖（VH2、VH3、VH4E及びVH8、本明細書の配列を参照）と組み合わされてL鎖を含む4種の構築物を作製し、それらを、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)DHFR-/-細胞中にリポフェクタミン2000（Invitrogen）を使用することによって製造元の指示に従って別々にトランスフェクションした。安定的にトランスフェクションされた細胞を、ヌクレオチドを含まない媒体（Biochrom）を使用して選択した。トランスフェクションされたCHO細胞の培養上清を8日間にわたり毎日採収した。モノクローナル抗体を含む上清をプールし、硫酸アンモニウム（35% w/v）で沈殿させ、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Biochrom）に対してSlide-A-Lyzer透析カセット（MWCO 10; Thermo Scientific）を使用して透析した。モノクローナル抗体（mAb）濃度は、ELISAによって標準及びGeneral Bioscience社製のキットを使用して求めた。
【００８８】
オプソニン貪食作用性アッセイ（図1〜図5）
オプソニン貪食作用性の殺菌は、Theilackerら(1,2)によって記載されているように、1.7 %の仔ウサギ血清（Cedar Lane）を補体源として使用し、そしてエンテロコッカス・フェカリス12030由来の精製リポテイコ酸（LTA）に対して惹起されたウサギ血清をポジティブコントロールとして使用して測定した（3〜5）。細菌をインキュベートして、対数増殖中期（mid-exponential）（OD650nm）にまで増殖させた。等容量の細菌懸濁液（1 ml当たりに2.5×107）、白血球（1 ml当たりに2.5×107）、補体源（1.7 %の最終濃度）、及び示された希釈での熱不活性化された免疫ウサギ血清を合わせ、ローターラックにて37℃で90分にわたりインキュベートした。インキュベートした後に、生細菌を連続希釈のアガー培養によって定量化した。殺菌パーセントを、PMNを含まない対照（PMNneg）の90分（t90）でのコロニー数と、4種の全てのアッセイの成分を含んだチューブのコロニー数とを比較することによって、以下の式：｛［t90での平均CFU PMNneg)-(t90での平均CFU)］/(t90での平均CFUPMNneg)｝×100を使用して計算した。
【００８９】
モノクローナル抗体VH2、VH3、VH4E及びVH8による細菌のオプソニン貪食作用性の殺菌を評価した。シュードモナス・アエルギノーザ中のアルギン酸塩を標的とするモノクローナル抗体F428を対照として使用した（Pier Preston JI 2004）。5種の菌株（エンテロコッカス・フェカリス12030、エンテロコッカス・フェシウム1162（VRE）、エンテロコッカス・フェシウム（患者の分離株）、スタフィロコッカス・アウレウスLAC（MRSA）及びスタフィロコッカス・アウレウス（患者の分離株））のオプソニン貪食作用性の殺菌は、モノクローナル抗体の存在下で用量に依存して生じたが、その一方で、対照のモノクローナル抗体F428、好中球及び補体単独は、生菌数を減らさなかった。
【００９０】
動物実験（図6〜図9）
モノクローナル抗体の保護効力は、先に記載されたマウス菌血症モデルにおいてエンテロコッカス・フェカリス12030及びスタフィロコッカス・アウレウスLACに対して試験した（3）。6週齢〜8週齢の8匹の雌のBALB/cマウス（CharlesRiver Laboratories Germany GmbH）を、エンテロコッカス・フェカリス12030（1.8×108 cfu）又はスタフィロコッカス・アウレウス（5.0×107 cfu）を尾の静脈を介して静脈内注射することによって感染させた。感染48時間後に、マウスを屠殺し、臓器を無菌的に取り出し、秤量し、そして均質化させた。細菌数は、一晩インキュベートした後にTSAプレートで連続希釈することによって数えた。統計学的有意性は、マンホイットニーの検定によって評価した。
【００９１】
モノクローナル抗体VH4E及びVH8での受動免疫化は、血流からのエンテロコッカス・フェシウムE1162及びスタフィロコッカス・アウレウスLACのクリアランスを促進する一方で、非免疫ウサギ血清（NRS）は、24時間後に細菌性の血流感染に対して保護しなかった。リポテイコ酸特異的血清（αLTAT5）をポジティブコントロールとして使用した。それというのも、本発明者らは、以前にこの血清がこれらの菌株に対してオプソニン作用性及び保護性であることを実証したからである（4）。
【００９２】
体重200 g〜300 gの雌のウィスターラット（CharlesRiver Laboratories Germany GmbH）をラット心内膜炎モデルにおいて使用した。それらの動物を、5.75 %のケタミン及び0.2 %のキシラジンの皮下適用によって麻酔した。小さいプラスチック製カテーテル（ポリエチレンチューブ；Intramedic PE 10）を、右頸動脈を介して挿入することによって、非細菌性の血栓性心内膜炎を引き起こした。該ポリエチレン製カテーテルを導入し、大動脈弁を通じて左心室中に進め、そしてカテーテルのルーメンを通じた観血的圧力測定により適切な配置を確実にした。カテーテルを適所に固定し、遠位で結紮した。引き続きカテーテル配置の48時間後に、尾の静脈中への注射を介して細菌の接種を行った。ラットを2つの群に割り当て、エンテロコッカス・フェカリス12030（動物1匹当たり1.25×105 cfu）で攻撃投与し、その一方で、4匹の動物に、モノクローナル抗体VH4Eを与え、4匹の動物に正常ウサギ血清（NRS）を与えた。動物を手術後6日目に屠殺し、カテーテルの正しい配置を検証した。固有弁心内膜炎の程度を評価し、肉眼で等級付けし、引き続き弁の疣贅を無菌的に取り除いた。主な評価基準は、疣贅中の細菌数であった（1疣贅当たりのcfu）。それぞれの群について平均及び標準偏差を計算した。
【００９３】
オプソニン貪食作用性アッセイ（OPA）によるドナープールの予備スクリーニングを用いることで、エンテロコッカス・フェカリス12030に対する最高力価のオプソニン作用性の抗体を有するドナーを特定した。健康なドナー2は、1:100血清を使用して最も高いオプソニン作用性の殺菌（82 %）を示した。
【００９４】
ドナー2のB細胞を、EBVを使用して不死化し、組織培養プレートに広げ、そして未希釈の上清をエンテロコッカス・フェカリス12030に対するオプソニン貪食作用性アッセイによって試験した。最も高いオプソニン作用性の殺菌を伴うウェルを選択し、それぞれのウェル中のB細胞を取り出し、培養し、そして引き続き新たな組織培養プレート中に播種した。4回のラウンド後に、最も高い力価を有するウェルの内容物を使用してmRNA及びcDNAを調製した。そして配列決定により、1つの軽鎖可変ドメイン及び4つの異なる重鎖可変ドメイン（本明細書の配列を参照のこと）の存在が明らかになった。これらの重鎖と軽鎖との組をTCAE中にクローニングし、これらの構築物をCHO細胞中にトランスフェクションした後に、上清からの組換えモノクローナル抗体を、4種の菌株:エンテロコッカス・フェカリス12030、エンテロコッカス・フェシウム1162（CC17）、スタフィロコッカス・アウレウスLAC（CA-MRSA）及びスタフィロコッカス・アウレウス（患者の分離株）を使用したオプソニン貪食作用性殺菌アッセイで使用した。オプソニン作用性の殺菌は、モノクローナル抗体の存在下で用量に依存して生じたが、その一方で、mAbが存在せずに好中球及び補体のみが存在する場合には、生菌数は減らなかった。
【００９５】
オプソニン貪食作用性阻害アッセイ（OPIA）を、mAbのうちの2つ（試験された菌株に対して最も高い殺菌性を示すVH4E及びVH8）で実施することで、それらの標的を決定した。エンテロコッカス・フェカリス12030の細胞壁抽出物をプロテイナーゼK又はNaIO4で処理することで、mAbの標的が多糖かタンパク質かを評価した。VH4E及びVH8のオプソニン作用活性は、細菌をNaIO4で処理したときには阻害されなかったが、細菌をプロテイナーゼで処理したときに阻害された。それはmAbの標的が多糖であることを示している。
【００９６】
モノクローナル抗体VH4E及びVH8での受動免疫療法を、マウス菌血症モデルにおいて調査した。このモデルにおいて、本発明者らが実証できたことは、VH4E及びVH8が、エンテロコッカス・フェシウムE1162及びスタフィロコッカス・アウレウスLACのクリアランスを促進する一方で、正常ウサギ血清（NRS）が、細菌性の感染に対して保護しなかったということである。両方の菌株で感染されたマウスの肝臓及び腎臓から回収された細菌の数は、mAbで処理されていないものと比較してかなり低減された。リポテイコ酸特異的血清（αLTAT5）をポジティブコントロールとして使用した。それというのも、本発明者らは、以前にこの血清が腸球菌株に対してオプソニン作用性及び保護性であることを実証したからである。
【００９７】
ラットの心内膜炎モデルにおいてモノクローナル抗体VH4Eと正常ウサギ血清（NRS）とを比較すると、VH4E処理されたラットの細菌性疣贅は、細菌による攻撃投与の前日にVH4Eで処理されていないラットと比較してかなり低減された（1ミリリットル当たりのcfu及び疣贅のミリグラム数で測定）。疣贅中の細菌の全量も、モノクローナル抗体を投与する群においてはより低いものであった。
【００９８】
種々の動物モデルにおいて、細菌を腹腔内注射し、マウスに、細菌による攻撃投与の24時間前にVH8（200 μlの生理食塩水中で1匹のマウスにつき4 μg/kg）を与えた。1匹のマウスにつき2×108の接種量で、NRSを与えた全てのマウスは18時間後に死亡し、その一方でモノクローナル抗体を与えた動物の3/8（37.5 %）は生存していた（図9）。
【００９９】
同定された配列：
軽鎖VL（配列番号1）
LTMAGFPLLLTLLIHCTGSWAQSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSSSNLGNNFASWYQQLPGAAPRLLIYDNDKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLTAYVFGSGTKVT
【０１００】
DNA-軽鎖VL（配列番号2）
CTCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCCTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACCTTGGGAACAATTTTGCATCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAGCAGCCCCCCGGCTCCTCATTTATGACAATGATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGGCTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGACTGCTTATGTCTTCGGAAGTGGGACCAAGGTCACCGT
【０１０１】
重鎖VH2（配列番号3）
GVGAELKKPGASVKVSCKASEYTFTTYDIIWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGDTGFAQKFQDRVTLTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRAPRYDSWSGYYSDFWGQGTLVTVSS
【０１０２】
DNA-重鎖VH2（配列番号4）
ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCCGAATACACCTTCACCACTTATGATATCATCTGGGTGCGGCAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAATCCAAACAGTGGAGACACAGGCTTTGCACAGAAATTCCAGGACAGAGTCACCTTGACCAGAAACACGTCCATTAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGATACGGCCGTCTATTACTGTTCGAGAGCCCCTCGTTACGATTCTTGGAGTGGTTATTACAGTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
【０１０３】
重鎖VH3（配列番号5）
GAGAELKKPGASVKVSCKTSGYSLTNYGINWVRQAPGQGLEWMAWICGYNGDTVFAQKFQGRVTMTTDTSTNTVYMDLRGLTSDDTAVYYCAKERRPFVAPEGGMDAWGQGTTVTVSS
【０１０４】
DNA-重鎖VH3（配列番号6）
ATGGAGCTGGGGCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGTTACAGTTTAACCAACTATGGTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGCGTGGATCTGCGGTTACAATGGTGACACAGTCTTTGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAACACAGTCTACATGGACCTGAGGGGCCTGACATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGAGAGGCGGCCGTTTGTCGCACCAGAAGGAGGTATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACGACAGTCACCGTCTCCTCA
【０１０５】
重鎖VH4E（配列番号7）
GVGAELKKPGSSVKVSCKASGGSFASYAISWVRQAPGQGLEWMGAIIPVFGTASYAQGFQGRVTISADKSTNVVNMELSSLFSEDTAVYFCARTYMWNTGDWFFDLWGRGTLVTVSS
【０１０６】
DNA-重鎖VH4E（配列番号8） 
ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGAGGCTCGTTCGCCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGCGATCATCCCTGTCTTTGGTACAGCAAGCTACGCACAGGGGTTCCAAGGCAGAGTCACCATTTCCGCGGACAAATCCACAAACGTAGTCAACATGGAGCTGAGCAGCCTGTTTTCTGAGGACACGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGGACTTACATGTGGAACACCGGGGACTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
【０１０７】
重鎖VH8（配列番号9）
GAGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEKFKNKGTLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCTRELPGTRYFDVWGAGTTVTVSS
【０１０８】
DNA-重鎖VH8（配列番号10）
ATGGAGCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTAAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTCGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGGCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGAACTACCTGGGACCCGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACTGTCACCGTCTCCTCA
【０１０９】
参考文献
1.  Kelly-Quintos, C., Cavacini, L. A., Posner, M. R.,Goldmann, D. A. & Pier, G. B. Characterization of the opsonic andprotective activity against Staphylococcus aureus of fully human monoclonalantibodies specific for the bacterial surface polysaccharidepoly-N-acetylglucosamine. Infect Immun74, 2742-2750 (2006).
2.  Theilacker, C. et al. Glycolipids are involved in biofilm accumulation andprolonged bacteraemia in Enterococcus faecalis. Mol Microbiol 71,1055-1069 (2009).
3.  Hufnagel, M., Koch, S., Creti, R., Baldassarri, L.& Huebner, J. A putative sugar-binding transcriptional regulator in a novel gene locus in Enterococcusfaecalis contributes to production of biofilm and prolonged bacteremia in mice.J INFECT DIS 189, 420-430 (2004).
4.  Theilacker, C. et al. Protection againstStaphylococcus aureus by antibody to the polyglycerolphosphate backbone ofheterologous lipoteichoic acid. JINFECT DIS 205, 1076-1085 (2012).
5.  Theilacker, C. et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcusfaecalis -Glycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE 6,e17839 (2011).
6.  Haller C, Berthold M, Wobser D, Kropec A, Lauriola M, et al. (2014)Cell-Wall Glycolipid Mutations and Their Effects on Virulence of E. faecalis ina Rat Model of Infective Endocarditis. PLoS ONE 9:e91863.doi:10.1371/journal.pone.0091863.
7.  Bao Y, Li Y, Jiang Q, Zhao L, Xue T, Hu B, Sun B. Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteinenucleosidase (Pfs) of Staphylococcus aureus is essential for the virulenceindependent of LuxS/AI-2 system. Int J Med Microbiol. 2013 May;303(4):190-200.doi:10.1016/j.ijmm.2013.03.004. Epub 2013 Mar 29.
8.  Tosato G, Cohen JI (2007) Generation of Epstein-Barr Virus(EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol Chapter 7:Unit7.22.doi:10.1002/0471142735.im0722s76.
【図１】
2017506063.tif 000002
【図２】
2017506063.tif 000003
【図３】
2017506063.tif 000004
【図４】
2017506063.tif 000005
【図５】
2017506063.tif 000006
【図６】
2017506063.tif 000007
【図７】
2017506063.tif 000008
【図８】
2017506063.tif 000009
【図９】
2017506063.tif 000010
【配列表】
2017506063000001.app
【国際調査報告】
2017506063.tif 000011
2017506063.tif 000012
2017506063.tif 000013
2017506063.tif 000014