(57)【要約】  本発明は、肉腫を治療するための組成物および方法を提供する。その組成物は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに結合する抗体ならびにｍＴＯＲ阻害剤を含む。ｍＴＯＲ阻害剤は、ＡＺＤ２０１４またはラパマイシンであってもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉腫を治療するための医薬組成物であって、有効量のｍＴＯＲ阻害剤、ならびにインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）の少なくとも１つに特異的に結合する有効量の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体がＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つを中和する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、
配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；
配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する前記抗体が、配列番号７および配列番号８で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の可変領域を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株７．１５９．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２４）によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がＡＺＤ２０１４である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫からなる群から選択される肉腫を治療するために用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
肉腫細胞の生存または増殖を低下させるための方法であって、
少なくとも１つの肉腫細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物に接触させるステップ
を含み、前記肉腫細胞の生存または増殖が低下する、方法。
【請求項１１】
被験体における肉腫を治療するための方法であって、ｍＴＯＲ阻害剤ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記抗体がＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つを中和する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、
配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；
配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する前記抗体が、配列番号７および配列番号８で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の可変領域を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムスのうちの少なくとも１つである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記肉腫が、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫のうちの１つ以上である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体における腫瘍成長を参照に対して少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれを超えて阻害する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
肉腫細胞の増殖を阻害する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与するステップが静脈注射または経口投与によるものである、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体および前記ｍＴＯＲ阻害剤が、約１時間〜約２４時間以内、または約１日〜約３日以内に同時投与される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法であって、前記被験体に有効量の抗体およびラパマイシンを投与し、それにより前記被験体における前記ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を治療するステップを含み、前記抗体は、
配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；
配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、方法。
【請求項２３】
ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法であって、前記被験体に有効量の抗体およびＡＺＤ２０１４を投与し、それにより前記被験体における前記ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を治療するステップを含み、前記抗体は、
配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；
配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、方法。
【請求項２４】
肉腫を治療するためのキットであって、有効量のｍＴＯＲ阻害剤と、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２に特異的に結合する抗体と、肉腫を治療するための前記キットを用いるための使用説明書とを含む、キット。
【請求項２５】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンまたはＡＺＤ２０１４であり、かつ前記抗体が、
配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；
配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、アスキーフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１４年１２月１６日に作製された前記アスキーコピーは、ＩＧＦ−１１０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが９，９２１バイトである。
【背景技術】
【０００２】
肉腫は、骨肉腫および軟部組織肉腫を含む、間葉起源の形質転換細胞に由来する腫瘍である。軟部組織肉腫は２０歳未満の小児で５番目に一般的な固形腫瘍であり、横紋筋肉腫が最も一般的なタイプである。骨肉腫は青年期での３番目に一般的ながんであり、その２つの一般的なタイプが骨肉腫およびユーイング肉腫である。肉腫は成人も発症するが、頻度は低めである。
【０００３】
肉腫は、多種多様な組織型を呈し、体内の随所で発生し得る。現在、治療選択肢は手術であり、加えて補助放射線療法が高グレードの不完全に切除された病変に対して選択的に用いられる。化学療法は、利点が限定的であり、再発までの時間を遅延させるが全生存に影響しないことが示されている。
【０００４】
化学療法、手術、および放射線の併用における進歩により、限局性疾患を有する横紋筋肉腫患者の生存が改善されている。１９７５〜２００２年の間での５年生存率は、１５歳未満の小児で５３％から６５％に、また１５〜１９歳の青年で３０％から４７％に増加している。しかし、横紋筋肉腫患者では、転移性疾患の転帰不良の予測因子が不明なままであり、併用療法による影響を有意に受けていない。
【０００５】
骨肉腫患者においては、現在の治療選択肢には、診断時に大部分の患者で存在するが検出不能である微小転移疾患に対する手術および化学療法がある。放射線療法は軟部組織肉腫に対する重要な治療であるが、骨肉腫は放射線に対して一様に耐性を示す。併用療法を用いての限局性骨肉腫における治癒率は６０〜７０％の範囲内であるが、転移性または多巣性疾患を呈する患者は不良な予後を有する。長期生存率が２５％未満であることで、骨肉腫は小児がんにおける最も低い生存率のうちの１つを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、肉腫細胞の増殖および生存を低下させ、また肉腫を治療するための組成物および方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
下記のように、本発明は、肉腫、特に肉腫内部の増殖する腫瘍細胞（例えばＩＧＦ−１／−２によって誘導される）を治療するための組成物および方法を特徴とする。本組成物は、ｍＴＯＲ阻害剤、ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、有効量のｍＴＯＲ阻害剤、ならびにインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）の少なくとも１つに特異的に結合する有効量の抗体を含む、肉腫を治療するための医薬組成物を示す。一部の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つを中和する。
【０００９】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、配列番号７および配列番号８で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、ハイブリドーマ細胞株７．１５９．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２４）によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるｍＴＯＲ阻害剤を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中のｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンを含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中のｍＴＯＲ阻害剤はＡＺＤ２０１４を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫からなる群から選択される肉腫を治療するために用いられる。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、肉腫細胞の生存または増殖を低下させるための方法を指す。本方法は、少なくとも１つの肉腫細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物に接触させるステップと；医薬組成物と接触した肉腫細胞の生存または増殖および医薬組成物と接触していない肉腫細胞の生存または増殖を測定するステップと；医薬組成物と接触した肉腫細胞の生存または増殖を医薬組成物と接触していない肉腫細胞の生存または増殖と比較するステップとを含み、医薬組成物で治療された肉腫細胞の生存または増殖は、医薬組成物で治療されていない肉腫細胞の生存または増殖と比べて低下する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、被験体における肉腫を治療するための方法であって、ｍＴＯＲ阻害剤ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、方法に関する。本発明の特定の実施形態では、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つを中和する。
【００１５】
特定の実施形態では、肉腫を治療するための本方法で用いられる抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。本発明の特定の実施形態では、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つに特異的に結合する抗体は、配列番号７および配列番号８で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の可変領域を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、肉腫を治療するための本方法で用いられるｍＴＯＲ阻害剤は、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムスのうちの少なくとも１つである。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の方法によって治療される肉腫は、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫のうちの１つ以上である。
【００１８】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、本発明の肉腫を治療する方法は、被験体における腫瘍成長を参照に対して少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれを超えて阻害する。特定の実施形態では、本発明の肉腫を治療する方法は、肉腫細胞の増殖を阻害する。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈注射または経口投与によって施される。特定の実施形態では、本発明の治療方法では、抗体およびｍＴＯＲ阻害剤は、約１時間〜約２４時間以内、または約１日〜約３日以内に同時投与される。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法を指す。特定の実施形態では、本方法は、有効量のＭＥＤＩ−５７３およびラパマイシンを被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法は、有効量のＭＥＤＩ−５７３およびＡＺＤ２０１４を被験体に投与するステップを含む。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、肉腫を治療するためのキットに関する。キットは、有効量のｍＴＯＲ阻害剤と、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２に特異的に結合する抗体と、肉腫を治療するためのキットを用いるための使用説明書とを含む。本発明の特定の実施形態では、キットは、ＭＥＤＩ−５７３抗体およびラパマイシンを含む。本発明の特定の実施形態では、キットは、ＭＥＤＩ−５７３抗体およびＡＺＤ２０１４を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、小児肉腫由来の一次腫瘍異種移植片における定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって検出されたｍＲＮＡレベルを用いて算出された、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＩＲＡ：ＩＲＢ比に対する算出ΔＣｔを示す。図１Ａは、ＩＧＦ−１に対して算出されたΔＣｔを示す。図１Ｂは、ＩＧＦ−２に対して算出されたΔＣｔを示す。図１Ｃは、ＩＧＦ−１Ｒに対して算出されたΔＣｔを示す。図１Ｄは、算出されたΔＣｔ  ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比を示す。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、肉腫細胞株におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって検出されたｍＲＮＡレベルを用いて算出された、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＩＲＡ：ＩＲＢ比に対する算出ΔＣｔを示す。図２Ａは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ２Ｒに対して算出されたΔＣｔを示す。図２Ｂは、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比に対して算出されたΔＣｔを示す。
【図３−１】図３Ａ−３Ｃは、肉腫細胞株におけるＥＬＩＳＡを用いて検出されたＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ−１Ｒのタンパク質レベルを示す。図３Ａは、ＩＧＦ−１のレベルを示す。図３Ｂは、ＩＧＦ−２のレベルを示す。
【図３−２】図３Ａ−３Ｃは、肉腫細胞株におけるＥＬＩＳＡを用いて検出されたＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ−１Ｒのタンパク質レベルを示す。図３Ｃは、ＩＧＦ−１Ｒのレベルを示す。
【図４】図４Ａ−４Ｆは、自己分泌駆動型の肉腫細胞株における細胞生存度に対するＭＥＤＩ−５７３の効果を示す。図４Ａは、ＲＤ−ＥＳ細胞の細胞生存度を示す。図４Ｂは、ＴＣ−７１細胞の細胞生存度を示す。図４Ｃは、ＳＪＣＲＨ３０細胞の細胞生存度を示す。図４Ｄは、ＳＫ−ＥＳ−１細胞の細胞生存度を示す。図４Ｅは、ＳＪＳ１細胞の細胞生存度を示す。図４Ｆは、ＲＤ細胞の細胞生存度を示す。
【図５】図５Ａ−５Ｆは、ＩＧＦ誘導性のユーイング肉腫細胞株の成長および増殖に対するＭＥＤＩ−５７３処置の効果を示す。図５Ａは、ＩＧＦ−１で刺激されたＲＤ−ＥＳ細胞の細胞生存度を示す。図５Ｂは、ＩＧＦ−２で刺激されたＲＤ−ＥＳ細胞の細胞生存度を示す。図５Ｃは、ＩＧＦ−１で刺激されたＳＫ−ＥＳ−１細胞の細胞生存度を示す。図５Ｄは、ＩＧＦ−２で刺激されたＳＫ−ＥＳ−１細胞の細胞生存度を示す。図５Ｅは、ＩＧＦ−１で刺激されたＴＣ−７１細胞の細胞生存度を示す。図５Ｆは、ＩＧＦ−２で刺激されたＴＣ−７１細胞の細胞生存度を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、ＩＧＦ誘導性の骨肉腫細胞株の成長および増殖に対するＭＥＤＩ−５７３処置の効果を示す。図６Ａは、ＩＧＦ−１で刺激されたＳＡＯＳ２細胞の細胞生存度を示す。図６Ｂは、ＩＧＦ−２で刺激されたＳＡＯＳ２細胞の細胞生存度を示す。図６Ｃは、ＩＧＦ−１で刺激されたＭＧ−６３細胞の細胞生存度を示す。図６Ｄは、ＩＧＦ−２で刺激されたＭＧ−６３細胞の細胞生存度を示す。
【図７】図７Ａ−７Ｃは、自己分泌ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２シグナル伝達を伴う肉腫異種移植片モデルにおけるＭＥＤＩ−５７３の有効性を示す。図７Ａは、ＲＤ−ＥＳ細胞における腫瘍体積を示す。図７Ｂは、ＳＪＳＡ−１細胞における腫瘍体積を示す。図７Ｃは、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞における腫瘍体積を示す。
【図８】図８Ａ−８Ｃは、ｈＩＧＦ−１またはｈＩＧＦ−２誘導性シグナル伝達を伴う肉腫異種移植片モデルに異なる量のＭＥＤＩ−５７３を添加する効果を示す。図８Ａは、ＲＤ−ＥＳ細胞におけるｈＩＧＦ−１レベルを示す。図８Ｂは、ＳＪＳＡ−１細胞におけるｈＩＧＦ−２レベルを示す。図８Ｃは、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞におけるｈＩＧＦ−２レベルを示す。
【図９−１】図９Ａ−９Ｃは、ＲＤ−ＥＳ、ＳＫ−ＥＳ−１、ＴＣ−７１、およびＫＨＯＳ細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、およびＡｋｔの自己リン酸化に対するＭＥＤＩ−５７３の添加の効果を示す。各グラフでは、１番目のバーは未処置対照からの結果を表し；２番目のバーはアイソタイプ対照の培養液への添加からの結果を表し；また３番目のバーは細胞をＭＥＤＩ−５７３で処置した結果を表す。図９Ａは、ｐＩＧＦ−１Ｒのレベルを示す。図９Ｂは、ｐ１Ｒ−Ａのレベルを示す。
【図９−２】図９Ａ−９Ｃは、ＲＤ−ＥＳ、ＳＫ−ＥＳ−１、ＴＣ−７１、およびＫＨＯＳ細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、およびＡｋｔの自己リン酸化に対するＭＥＤＩ−５７３の添加の効果を示す。各グラフでは、１番目のバーは未処置対照からの結果を表し；２番目のバーはアイソタイプ対照の培養液への添加からの結果を表し；また３番目のバーは細胞をＭＥＤＩ−５７３で処置した結果を表す。図９Ｃは、ｐＡＫＴのレベルを示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、インビトロでのＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２誘導性シグナル伝達に対するＭＥＤＩ−５７３の添加の効果を示す。図１０Ａは、ｐＩＧＦ−１Ｒのレベルを示す。図１０Ｂは、ｐ１Ｒ−Ａのレベルを示す。図１０Ｃは、ｐＡＫＴのレベルを示す。
【図１１】約４００ｍｍ３のＲＤ−ＥＳ腫瘍を有するマウスの組織から得られるｐＡＫＴおよびリン酸化された真核翻訳開始因子４Ｅ−結合タンパク質１（ｐ４ＥＢＰ１）のリン酸化レベルを示すイムノブロットを示す。左３つのレーンはＭＥＤＩ−５７３が添加されず、右３つのレーンはＭＥＤＩ−５７３が添加された。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｄは、ＭＥＤＩ−５７３による処置の前および後でのＲＤ−ＥＳ腫瘍および血漿中のｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−２のレベルを示すグラフを示す。
【図１３】未処置マウス、ＩＧＦ−１で誘導後のマウス、ＩＧＦ−２で誘導後のマウス、ＩＧＦ−１で誘導しかつＭＥＤＩ−５７３で処置した後のマウス、およびＩＧＦ−２で誘導しかつＭＥＤＩ−５７３で処置した後のマウスにおけるｐＡＫＴ、ｐ４ＥＢＰ１、およびｐＳ６Ｋのリン酸化レベルを示すイムノブロットを示す。３つの異なるマウス由来の試料が各群において示される。
【図１４】ＭＥＤＩ−５７３およびｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシンまたはＡＺＤ２０１４）単独または互いに組み合わせたもので処置されたＲＤ−ＥＳ細胞の成長および増殖を示す。
【図１５】未処置細胞、ＭＥＤＩ−５７３単独で処置された細胞、ラパマイシン単独で処置された細胞、ＭＥＤＩ−５７３と組み合わせたラパマイシンで処置された細胞、ＡＺＤ２０１４単独で処置された細胞、およびＡＺＤ２０１４と組み合わせたＭＥＤＩ−５７３で処置された細胞におけるｐＡＫＴ、ｐ４ＥＢＰ１、およびｐＳ６Ｋのリン酸化レベルを示すイムノブロットを示す。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｂは、ＡＺＤ２０１４、ＭＥＤＩ−５７３、ＭＥＤＩ−５７３と組み合わせたＡＺＤ２０１４、および対照で処置されたＲＤ−ＥＳ腫瘍異種移植片における肉腫細胞の成長および増殖を示す。図１６Ａは、細胞の成長および増殖である。図１６Ｂは、処置されたマウスの体重である。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂは、ラパマイシン、ＭＥＤＩ−５７３、ＭＥＤＩ−５７３と組み合わせたラパマイシン、および対照で処置されたＲＤ−ＥＳ腫瘍異種移植片における肉腫細胞の成長および増殖を示す。図１７Ａは、細胞の成長および増殖である。図１７Ｂは、処置されたマウスの体重である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＭＥＤＩ−５７３重鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を示す。
【００２４】
配列番号２は、ＭＥＤＩ−５７３重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を示す。
【００２５】
配列番号３は、ＭＥＤＩ−５７３重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を示す。
【００２６】
配列番号４は、ＭＥＤＩ−５７３軽鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を示す。
【００２７】
配列番号５は、ＭＥＤＩ−５７３軽鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を示す。
【００２８】
配列番号６は、ＭＥＤＩ−５７３軽鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を示す。
【００２９】
配列番号７は、ＭＥＤＩ−５７３重鎖可変ポリペプチドのアミノ酸配列：
【化１】
2017502025.tif 000003
を示す。
【００３０】
配列番号８は、ＭＥＤＩ−５７３軽鎖可変ポリペプチドのアミノ酸配列：
【化２】
2017502025.tif 000004
を示す。
【００３１】
配列番号９は、ＭＥＤＩ−５７３軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列：
【化３】
2017502025.tif 000005
を示す。
【００３２】
配列番号１０は、ＭＥＤＩ−５７３重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列：
【化４】
2017502025.tif 000006
を示す。
【００３３】
本発明は、肉腫を治療し、予防するのに有用な医薬組成物および方法を特徴とする。本発明の肉腫を治療するための医薬組成物は、有効量のｍＴＯＲ阻害剤ならびにインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）の少なくとも１つに特異的に結合する有効量の抗体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の少なくとも１つを中和する。本発明はまた、肉腫を有する患者を監視（モニタリング）するための組成物および方法を提供する。
【００３４】
本発明は、少なくとも部分的には、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ＡＺＤ２０１４、ラパマイシン）を組み合わせる場合にＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２を中和する抗体が、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２を自己分泌的に分泌する細胞を含むＩＧＦ応答性肉腫細胞の増殖、生存を低下させ、ならびに／あるいは細胞死を増加させるのに有用であるという発見に基づく。
【００３５】
ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１に対する交差反応を伴う、ＩＧＦ−２に結合する完全ヒトモノクローナル抗体である。ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を中和し、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ−Ａ経路の両方を介したシグナル伝達を阻害する。ＭＥＤＩ−５７３を発現するハイブリドーマ細胞株（７．１５９．２）は、２００６年３月７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、特許寄託指定番号（Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  Ｎｏ．）ＰＴＡ−７４２４を受けた。本抗体およびその調製物に関する説明は、２０１１年５月１０日に発行された米国特許第７，９３９，６３７号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）中に見出される。
【００３６】
他の箇所で説明されるように、大部分の肉腫細胞株がＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−１を発現するが、ＩＧＦ−２を分泌するのは、骨肉腫細胞株といくつかの横紋筋肉腫細胞株にすぎない。ＭＥＤＩ−５７３は、多数の肉腫細胞株のインビトロ増殖を阻害し、ユーイング肉腫細胞株が最も感受性が高い。ここで提示されるデータは、肉腫細胞が分泌型ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による自己分泌またはパラ分泌成長刺激に応答することを示す。さらに、ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２誘導性の肉腫細胞の成長を阻害し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２誘導性のＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴ経路の活性化を有意に遮断した。ＭＥＤＩ−５７３による肉腫異種移植片の成長阻害は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２リガンドの中和と相関した。
【００３７】
本明細書に記載の通り、ＭＥＤＩ−５７３はまた、ラパマイシン誘導性のＡＫＴ活性化を阻害した。ＭＥＤＩ−５７３とｍＴＯＲ阻害剤とを組み合わせた結果、インビボでの抗腫瘍活性が有意に高まった。要するに、そのデータは、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシンまたはＡＺＤ２０１４）と組み合わせたＭＥＤＩ−５７３によりＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を阻害した結果、様々な肉腫に対して強力な抗腫瘍活性がもたらされたことを示している。有利には、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２を標的化することは、インスリン機能を撹乱する可能性を有するＩＧＦ受容体を標的化することと異なり、ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて肉腫を治療するのに有用であることが見出されている。したがって、本発明は、肉腫を有するか、あるいは肉腫を発生する、肉腫の再発をきたす、および／または転移性肉腫を発生する傾向を有するような被験体を治療するのに有用である医薬組成物および方法を提供する。特に、本発明の医薬組成物は、ユーイング肉腫および一部の横紋筋肉腫を治療するのに有用である。
【００３８】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）  −  ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２
インスリン様成長因子ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、細胞増殖、生存、分化、および形質転換の調節に関与する成長因子である。両方のリガンドは、広範に発現され、内分泌、パラ分泌、および自己分泌成長因子として作用する（Ｐｏｌｌａｋ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８，８（１２）：９１５−２８；ＤｅＭｅｙｔｓ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２００４，２６（１２）：１３５１−１３６２，２００４；Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ．４（１０）：５９１−６０２．；Ｒｙａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｓｓ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００８，１３（１）：１６−２４）。インスリン様成長因子−１およびＩＧＦ−２は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリン受容体Ａアイソフォーム（ＩＲ−Ａ）への結合を介してそれらの様々な作用を発揮し、ＩＲＳタンパク質、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫ経路を含む複数の細胞内シグナルカスケードを活性化する（Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９９，１８（１５）：２４７１−９；Ｃｈｉｔｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，１４（２０）：６３６４−７０；Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２００９，３０，５８６−６２３；Ｂａｓｅｒｇａ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２００９，５（１）：４３−５０）。ＩＧＦリガンドに対する受容体は、ＩＧＦ受容体１型および２型（ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒ）、インスリン受容体ＡおよびＢ（ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂ）、およびハイブリッド受容体（ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ−ＡおよびＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ−Ｂ）を含む。ＩＧＦ−２ＲはＩＧＦ−２に優先的に結合する。しかし、ＩＧＦ−２Ｒは、細胞内キナーゼドメインを欠損しており、細胞シグナル伝達を媒介しない。特定の理論に拘束されないが、ＩＧＦ−２Ｒの欠損の結果、おそらくはＩＧＦ−１Ｒに結合するＩＧＦ−２の利用性が高まることにより、腫瘍形成能が増大する。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方は、６つのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）のうちの１つに結合された、循環系内の複合体として存在する。第３の分子である酸不安定サブユニットと連結されたＩＧＦＢＰ−３は、循環ＩＧＦの大部分を占める複合体を形成する。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦに対してその同種受容体よりも高い親和性を有し、ＩＧＦを受容体から隔離する力を有する。しかし、他のモデルによると、その結合タンパク質は、循環系内でのその半減期を延長するかまたは細胞表面上の特定の分子に結合するかのいずれかによりＩＧＦ活性を増強することができ、したがって、細胞に対して利用可能なＩＧＦの貯蔵所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を提供することが示されている。
【００３９】
高レベルの循環ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、乳がん、前立腺がん、膵臓がんおよび結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、および肉腫を含む数種の一般的ながんの発生におけるリスクの増大に関連している（Ｒｅｎｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００４，３６３（９４１８）：１３４６−５３）。またＩＲ−ＡおよびＩＧＦ−２の過剰発現が、ＩＧＦ−１Ｒに向けられた治療法に対する耐性を誘導し得る潜在的な機構として提示されている（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｕｓｋａ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９，１０（１０）：１０３２−４０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：３９１−３９７）。極めて多数の前臨床試験が、ＩＧＦ−１Ｒ発現の下方制御またはシグナル伝達の遮断がインビトロおよびインビボの両方で腫瘍成長の阻害を誘導することを報告している（Ｒｙａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｓｓ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００８，１３（１）：１６−２４；Ｓａｃｈｄｅｖ  ａｎｄ  Ｙｅｅ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００７，６（１）：１−１２；Ｂａｓｅｒｇａ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２００５，９（４）：７５３−６８）。また、ＩＧＦシグナル伝達の阻害が、インビボで腫瘍細胞の化学療法剤に対する感受性を増加させることが示されている（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．４：５９１−６０２；Ｃｈｉｔｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：６３６４−６３７０；Ｒｙａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｓｓ，２００８  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １３：１６−２４；Ｙｕｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｃａｕｌａｙ，２００８  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １２：５８９−６０３）。ＩＲ−ＡおよびＩＧＦ−１Ｒ受容体の両方の二重阻害は、ＩＧＦ駆動型のがんに対する治療有効性を増強し得る（Ｓａｃｈｄｅｖ  ａｎｄ  Ｙｅｅ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００７，６（１）：１−１２）。
【００４０】
肉腫
肉腫は、骨から発生する骨肉腫、および脂肪、筋肉、神経、線維組織、血管、または深部皮膚組織のような軟部組織から発生する軟部組織肉腫を含む、間葉起源の形質転換細胞に由来する腫瘍である。肉腫は、最も酷似する組織のタイプに基づいて命名される場合がある。例えば、骨肉腫は骨に類似し、軟骨肉腫は軟骨に類似し、脂肪肉腫は脂肪に類似し、また平滑筋肉腫は平滑筋に類似する。肉腫は、限定はされないが、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫を含む。
【００４１】
ＩＧＦ−１ＲおよびそのリガンドＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方を含む自己分泌ループは、肉腫細胞の増殖および生存を駆動する主要な機構として実証されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ９６（７）：５２−６０）。ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１、またはＩＧＦ−２の高発現は、大部分のユーイング肉腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫において示されている。ユーイング肉腫はより多くのＩＧＦ−１を分泌し、一方、横紋筋肉腫はより多くのＩＧＦ−２を分泌する。ＩＧＦ−１は、高度に発現され、骨肉腫細胞の成長を刺激する。ＩＧＦ経路内での遺伝子変異もまた、多数の肉腫腫瘍内で蔓延している。ＩＧＦ−２遺伝子座でのインプリンティングの消失は一般に胚性ＲＭＳ内で検出され、キメラ転写因子（ＰＡＸ３−ＦＫＨＲまたはＰＡＸ７−ＦＫＨＲ）を誘導する遺伝子変化は、肺胞型の横紋筋肉腫におけるＩＧＦ−１Ｒの発現の増大を引き起こす。逆に、ＩＧＦ−１シグナル伝達のリプレッサーであるインスリン成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）を上方制御するＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子変化を有するユーイング肉腫患者においては、これらの患者は改善された予後を有する。ＩＧＦシグナル伝達経路と疾患との関連が強いとの仮定の下、ＭＡｂを用いてＩＧＦ−１Ｒ受容体を阻害する標的化治療アプローチがいくつかのタイプの肉腫において探求されている。これらのＩＧＦ−１Ｒを標的化したＭＡｂは、ＩＧＦ１Ｒおよびヘテロ二量体ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲを介したＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２シグナル伝達を阻害するが、ＩＲ−Ａを介したＩＧＦ−２シグナル伝達を阻害しないことから、制限され得る。
【００４２】
ユーイング肉腫
ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、およびアスキン腫瘍は、集合的に腫瘍のユーイング肉腫ファミリー（ＥＳＦＴ）と称される腫瘍のグループを形成する。これらの腫瘍は、ＲＮＡ結合タンパク質ＥＷＳのＮ末端と転写因子のＥＴＳファミリーの１つのメンバー、最も一般的にはフレンド白血病インテグレーション１（Ｆｒｉｅｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  １）転写因子（ＦＬＩ１）のＣ末端との融合を引き起こす特定の染色体転座によって特徴づけられる。融合産物の発現は、発がんに関与している。
【００４３】
ＥＦＳＴ細胞株は、ＩＧＦ−１Ｒを発現し、自己分泌ループ内でＩＧＦ−１を分泌する。ＥＦＳＴ内でのＩＧＦ−１Ｒ発現の普及度は極めて高く、大部分の細胞株および臨床試料は発現が陽性である。マウス線維芽細胞内では、ＥＷＳ−ＦＬＩ１腫瘍性タンパク質は、形質転換のためにＩＧＦ−１Ｒを必要とする。いくつかの証拠によると、無再発生存が血清ＩＧＦＢＰ−３対ＩＧＦ−１の比と相関し得ることが示される。この理論の裏付けとして、ＥＷＳ−ＦＬＩ１はＩＧＦＢＰ−３の発現および分泌を直接的に低下させ、外来性ＩＧＦＢＰ−３はＥＳＦＴ細胞の成長を阻害する。ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫを含む、ＩＧＦ−１Ｒの下流経路は、活性化され、ＥＳＦＴ細胞の生存にとって重要である。ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫの両方の阻害剤は、ＥＳＦＴ細胞における成長停止を引き起こす。
【００４４】
横紋筋肉腫
横紋筋肉腫は、横紋筋を形成する発生する細胞に起因する、最も一般的な小児の軟部組織肉腫である。ＩＧＦ−２は正常な筋肉成長に関与し、横紋筋肉腫を有する患者由来の腫瘍生検標本の分析により、高レベルのＩＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現が示された。特定の理論に拘束されないが、ＩＧＦ−２の上方制御は、潜在的にはこれらの腫瘍の制御されない成長における役割を果たす。加えて、横紋筋肉腫細胞株から分泌されるＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２の結合が自己分泌成長・増殖および細胞運動性の増大をもたらしたことが観察されている。
【００４５】
ＩＧＦ−２の過剰発現を生じる、ＩＧＦ−２遺伝子座のインプリンティングの消失（ＬＯＩ）を引き起こすエピジェネティック変化が同定されている。さらに、特定の横紋筋肉腫を特徴づけるＰＡＸ３−ＦＫＨＲ転座はＩＧＦ−１Ｒプロモーターをトランス活性化し、したがってそれは、ＩＧＦ経路が横紋筋肉腫の進行において重要な役割を果たすというさらなる証拠を提供する。すべての横紋筋肉腫細胞株は、ある程度のＩＧＦ−１Ｒの発現を示すが、定量的タンパク質分析に基づくと３０倍程度の差が生じる場合がある。
【００４６】
骨肉腫
骨肉腫の最高発生率は、青年期の間に生じ、循環ＧＨおよびＩＧＦ−１の成長期および最高濃度の両方に対応する。高レベルのＩＧＦ−１は、骨肉腫の病因において重要な役割を果たすと思われる。前臨床データは、骨肉腫におけるＩＧＦ−１の役割を示している。骨肉腫細胞は細胞表面に機能的ＩＧＦ−１Ｒを発現し、また骨肉腫患者試料の大部分がＩＧＦリガンドを発現し、４５％がＩＧＦ−１Ｒを発現する。外来性ＩＧＦ−１が骨肉腫細胞の増殖を刺激し、またＩＧＦ−１依存性成長がＩＧＦ−１Ｒに対するモノクローナル抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害され得る。さらに、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いたマウスの処置により、２つの骨肉腫異種移植片モデルにおいて腫瘍縮小が生じた。
【００４７】
ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）
ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）は、細胞の成長、増殖、および生存の調節に重要な役割を果たすセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。ｍＴＯＲは、インスリン、成長因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２など）、およびアミノ酸を含む、上流経路からの入力を統合する。ｍＴＯＲはまた、細胞内栄養、酸素、およびエネルギーレベルを感知する。ｍＴＯＲ経路は、ヒト疾患、例えば糖尿病、肥満、抑うつ、および特定のがんにおいて調節不全になる。ｍＴＯＲは、抗真菌剤のラパマイシンに感受性を示すものとして同定された。ラパマイシンは、その細胞内受容体ＦＫＢＰ１２と会合することによってｍＴＯＲを阻害し得る細菌産物である。ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体は、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインに直接結合し、その活性を阻害する。
【００４８】
ｍＴＯＲの活性化は、下流のリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ−１（Ｓ６Ｋ）および真核翻訳開始因子４Ｅ−結合タンパク質１（４Ｅ−ＢＰ１）のリン酸化を誘導する。ｍＴＯＲシグナル伝達は、がん治療法にとって魅力的な治療標的であり続けている。ｍＴＯＲ阻害剤のテムシロリムスおよびエベロリムスは各々、転移性腎細胞がんおよび膵神経内分泌腫瘍の治療用に認可されている。リダフォロリムスは現在、肉腫患者における第ＩＩＩ相試験の段階である。しかし、ラパマイシンおよびその誘導体は、Ｓ６ＫとＩＲＳ／ＰＩ３Ｋとの間に負のフィードバックを放出することによってＡｋｔ活性化を誘導し、結果的にＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を再活性化する。これは、ｍＴＯＲ阻害剤に対する考えられる耐性機構に寄与し、またラパマイシンとＩＧＦ経路を標的化する作用物質とを組み合わせることの潜在的利益を示唆している。数種のＩＧＦ−１Ｒ標的化剤と異なるラパマイシン類似体との組み合わせは、初期相臨床試験の段階である。第１世代のｍＴＯＲ阻害剤として、限定はされないが、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダフォロリムス（ＡＰ−２３５７３）が挙げられる。第２世代のｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲの触媒部位においてＡＴＰと競合するように設計される。かかるＡＴＰと競合的なｍＴＯＲキナーゼ阻害剤として、限定はされないが、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７が挙げられる。ｍＴＯＲ阻害剤のＡＺＤ２０１４およびラパマイシンの構造は、次のように示される。
【化５】
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【化６】
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【００４９】
抗体
ＩＧＦ−１／−２に選択的に結合し、かつＩＧＦ−１／−２に対する受容体の結合または活性化を阻害する抗体は、本発明の方法において有用である。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１／−２に対する抗体は、インスリンに結合しないかまたはインスリンの生物学的活性を阻害する。
【００５０】
一実施形態では、抗体は組換えモノクローナル抗体である。組換えモノクローナル抗体は、限定はされないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む宿主細胞から調製される。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、組換えモノクローナル抗体はヒト抗体である。さらに別の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ抗体である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、限定はされないが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体を含むＩｇＧ抗体である。
【００５１】
別の実施形態では、抗体は、抗体のＦｃ領域上に少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位および抗体のＦａｂ領域上に少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を含む。別の実施形態では、抗体は、抗体のＦｃ領域上に１つのみのＮ−結合グリコシル化部位および抗体のＦａｂ領域上に１つのみのＮ−結合グリコシル化部位（すなわち全部で３つのＮ−結合グリコシル化部位）を有する。
【００５２】
抗体は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって作製することができる。
【００５３】
次に、当該技術分野で公知の任意の方法によって作製された抗体は、宿主から精製することができる。抗体精製方法は、塩沈殿（例えば硫酸アンモニウムを用いる）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、好ましくは中性ｐＨで動作し、階段状勾配で増加するイオン強度で溶離する陽イオンまたは陰イオン交換カラム上）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過ＨＰＬＣを含む）、ならびにプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンなどの親和性樹脂上でのクロマトグラフィーを含んでもよい。
【００５４】
抗体は、抗体を発現するように操作されたハイブリドーマ細胞から好都合に産生することができる。ハイブリドーマを作製する方法は、当該技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は好適な培地中で培養することができ、また使用済みの培地は抗体供給源として用いることができる。ここで目的の抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、次に抗体はこれらのＤＮＡ配列から合成的または組換え的に産生することができる。大量の抗体の産生には、腹水を得ることが一般により便利である。腹水を産生する方法は、一般にハイブリドーマ細胞を免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫寛容性のある哺乳動物、特にマウスに注射することを含む。その哺乳動物は、腹水生成のため、好適な組成物（例えばプリスタン）の事前投与により予備刺激してもよい。
【００５５】
本発明の方法によって産生されるモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、当該技術分野で公知の方法によって「ヒト化」することができる。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリンにより類似するように、その初期形態から改変されている抗体である。抗体をヒト化するための技術は、非ヒト動物（例えばマウス）抗体が作製される場合、特に有用である。マウス抗体をヒト化するための方法の例が、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第５，８５９，２０５号明細書に提示されている。
【００５６】
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を有する抗体に関連する問題の一部を回避する。かかるマウスまたはラット誘導タンパク質の存在は、抗体の急速な排除を引き起こすか、または患者による抗体に対する免疫応答の生成を引き起こし得る。マウスまたはラットに由来する抗体の利用を回避するため、齧歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、機能的なヒト抗体遺伝子座の齧歯類、他の哺乳動物または動物への導入を介して完全ヒト抗体を作製することができる。
【００５７】
完全ヒト抗体を作製するための一方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の１０００ｋｂサイズ未満の生殖系列で構成される断片を含むように操作されているマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の使用を介するものである。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から入手可能である。
【００５８】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、１９９０年１１月８日に出願された米国特許出願第０７／６１０，５１５号明細書、１９９２年７月２４日に出願された米国特許出願第０７／９１９，２９７号明細書、１９９２年７月３０日に出願された米国特許出願第０７／９２２，６４９号明細書、１９９３年３月１５日に出願された米国特許出願第０８／０３１，８０１号明細書、１９９３年８月２７日に出願された米国特許出願第０８／１１２，８４８号明細書、１９９４年４月２８日に出願された米国特許出願第０８／２３４，１４５号明細書、１９９５年１月２０日に出願された米国特許出願第０８／３７６，２７９号明細書、１９９５年４月２７日に出願された米国特許出願第０８／４３０，９３８号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６４，５８４号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６４，５８２号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６３，１９１号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６２，８３７号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４８６，８５３号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４８６，８５７号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４８６，８５９号明細書、１９９５年６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６２，５１３号明細書、１９９６年１０月２日に出願された米国特許出願第０８／７２４，７５２号明細書、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書、２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願公開第２００３／００９３８２０号明細書、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、米国特許第６，１１４，５９８号明細書、米国特許第６，０７５，１８１号明細書、および米国特許第５，９３９，５９８号明細書、ならびに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、日本特許第３０６８５０６Ｂ２号公報、および日本特許第３０６８５０７Ｂ２号公報にさらに考察され、詳述されている。また、１９９６年６月１２日に付与公開された欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、１９９４年２月３日に公開された国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、１９９６年１０月３１日に公開された国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号パンフレットを参照のこと。上で引用された特許、出願、および参考文献の各々の開示内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
【００５９】
他の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他社は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」手法を利用している。ミニ遺伝子座の手法では、外来性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）の組込みにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および通常は第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）を、動物への挿入のための構築物へと形成する。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書（Ｓｕｒａｎｉらに交付）、ならびに米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，６２５，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、および米国特許第６，２５５，４５８号明細書（各々、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、米国特許第５，５９１，６６９号明細書および米国特許第６，０２３．０１０号明細書（ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓに交付）、米国特許第５，６１２，２０５号明細書、米国特許第５，７２１，３６７号明細書、および米国特許第５，７８９，２１５号明細書（Ｂｅｒｎｓらに交付）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３（ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎに交付）、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、１９９０年８月３１日に出願された米国特許出願第０７／５７５，９６２号明細書、１９９１年１２月１７日に出願された米国特許出願第０７／８１０，２７９号明細書、１９９２年３月１８日に出願された米国特許出願第０７／８５３，４０８号明細書、１９９２年６月２３日に出願された米国特許出願第０７／９０４，０６８号明細書、１９９２年１２月１６日に出願された米国特許出願第０７／９９０，８６０号明細書、１９９３年４月２６日に出願された米国特許出願第０８／０５３，１３１号明細書、１９９３年７月２２日に出願された米国特許出願第０８／０９６，７６２号明細書、１９９３年１１月１８日に出願された米国特許出願第０８／１５５，３０１号明細書、１９９３年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／１６１，７３９号明細書、１９９３年１２月１０日に出願された米国特許出願第０８／１６５，６９９号明細書、１９９４年３月９日に出願された米国特許出願第０８／２０９，７４１号明細書（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。また、欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレ���ト、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、および国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号明細書（これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用される）も参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）（これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用される）も参照のこと。
【００６０】
またＫｉｒｉｎは、微小核融合（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ）により、染色体の大型断片、または全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の産生を実証している。欧州特許出願欧州特許第７７３２８８号明細書および欧州特許第８４３９６１号明細書（これらの開示は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。加えて、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑育種の結果としてのＫＭ（商標）−マウスが作製されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨ導入染色体およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖導入遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。
【００６１】
ヒト抗体はまた、インビトロな方法によって誘導することができる。好適な例として、限定はされないが、ファージディスプレイ（ＣＡＴ，Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，Ｄｙａｘ，Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｘｏｍａ，Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ，Ａｌｅｘｉｏｎ（前Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイなどが挙げられる。
【００６２】
抗体は、本明細書に記載される場合、下記のように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用により調製された。次に、かかるマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することが可能であり、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生能が欠如している。それを得るために利用される技術は、本明細書の背景セクションに開示される特許、出願、および参考文献に開示されている。しかし、特に、トランスジェニックマウスの作製およびそれに由来する抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書、および１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号パンフレットおよび２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に開示されている。また、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）（その開示は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００６３】
かかる技術を用いることにより、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が作製されている。本質的に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は目的の抗原（例えばＩＧＦ−１７ＩＩ）で免疫され、リンパ管細胞（Ｂ細胞など）は過免疫マウスから回収され、また回収されたリンパ球は、不死ハイブリドーマ細胞株を調製するため、脊髄型細胞株と融合される。これらのハイブリドーマ細胞株は、目的の抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を同定するため、スクリーニングされ、選択される。本明細書で提供されるのは、ＩＧＦ−１／−２に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製するための方法である。さらに、本明細書で提供されるのは、かかる抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、かかる細胞株によって産生される抗体の特徴づけである。
【００６４】
あるいは、Ｂ細胞は、ハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞に融合される代わりに、直接的にアッセイすることができる。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、過免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離することができ、また増殖して抗体分泌形質細胞に分化することが可能であり得る。次に、同細胞上清由来の抗体は、ＩＧＦ−１／−２免疫原に対する反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングされる。上清はまた、異なる抗体をＩＧＦ−１７ＩＩ上の機能的対象ドメインへの結合についてさらにマッピングする場合、ＩＧＦ−１／−２の断片に対する免疫反応性についてスクリーニングしてもよい。抗体はまた、他の関連のヒトケモカインに対して、またラット、マウス、および非ヒト霊長類、例えばカニクイザルにおいて、種交差反応性を測定するのではなく、ＩＧＦ−１／−２の相同分子種に対してスクリーニングしてもよい。目的の抗体を含有するウェル由来のＢ細胞は、ハイブリドーマを個別のウェルまたはプールしたウェルのいずれかから作製することを意図した、融合を含む様々な方法により、あるいはＥＢＶの感染または公知の不死化遺伝子によるトランスフェクションとそれに続く好適な培地へのプレーティングにより、不死化してもよい。あるいは、次に所望される特異性を有する抗体を分泌する単一の形質細胞がＩＧＦ−１／−２に特異的な溶血性プラークアッセイを用いて単離される（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６））。溶解用に標的化される細胞は、好ましくはＩＧＦ−１／−２抗原でコーティングされたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【００６５】
目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養液の存在下で、プラークの形成は、目的の形質細胞を取り囲むヒツジ赤血球の特異的ＩＧＦ−１／−２媒介性溶解を示す。プラーク中央部の単一の抗原に特異的な形質細胞は単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝子情報は単一の形質細胞から単離される。逆転写とそれに続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡはクローン化することができる。次に、かかるクローン化ＤＮＡは、好適な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを有するようなｐｃＤＮＡベクターにさらに挿入することができる。次に、作製されたベクターは、宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、転写を誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地で培養することができる。
【００６６】
一般に、融合されたハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒトκまたはλ軽鎖を伴うヒトＩｇＧ２重鎖であった。本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖およびＩｇＧ２重鎖を有する。抗体はまた、ＩｇＧｌを含む他のヒトアイソタイプであり得る。抗体は高親和性を有し、固相および液相技術によって測定される場合、典型的には約１０６〜約１０１２Ｍ以下のＫｄを有した。少なくとも１０１１ＭのＫＤを有する抗体が、ＩＧＦ−１／−２の活性を阻害するのに望ましい。
【００６７】
容易に理解されるように、抗ＩＧＦ−１／−２抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現され得る。特定の抗体をコードする配列用いて、好適な哺乳動物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えばウイルスへの（またはウイルスベクターへの）ポリヌクレオチドのパッケージングおよびウイルス（またはベクター）の宿主細胞への形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法により、あるいは当該技術分野で公知のトランスフェクション法により、行うことができ、それは米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，９１２，０４０号明細書、米国特許第４，７４０，４６１号明細書、および米国特許第４，９５９，４５５号明細書（これら特許は参照により本明細書に援用される）で例示される。用いられる形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔、リポソームへの１つもしくは複数のポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを含む。
【００６８】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で周知であり、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えばＨｅｐＧ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および多数の他の細胞株を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞株を含む。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的ＩＧＦ−１／−２結合特性を有する抗体を産生するかを判定することにより選択される。
【００６９】
他の実施形態では、本発明は「非従来型抗体（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」を提供する。非従来型抗体は、限定はされないが、ナノボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２，１９９５）、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、および複数価を有する抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および五重特異性抗体）を含む。ナノボディは、軽鎖の不在下で完全に機能的であるように進化している天然の重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、従来の抗体の親和性および特異性を有するが、サイズが一本鎖Ｆｖ断片の半分にすぎない。その極端な安定性およびヒト抗体フレームワークとの高度な相同性と組み合わされたこの独特の構造の結果は、ナノボディが従来の抗体に接近不能な治療標的に結合できることである。複数価を有する組換え抗体断片は、がん細胞に対する高結合活性および独特の標的化特異性をもたらす。サイズが約６０〜１００ｋＤａの小分子はより迅速な血中クリアランスおよび急速な組織内取り込みをもたらすことから、これらの多量体ｓｃＦｖ（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）は、親抗体を超える改善をもたらす。Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０７，３３５−５０，２００３）；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎ、４，４７−５８，１９９９）を参照のこと。
【００７０】
非従来型抗体を作製するための様々な技術については記載がなされている。ロイシンジッパーを用いて産生される二重特異性抗体は、Ｋｏｓｔｅｌｎｙらにより記載がなされている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３，１９９２）。二重特異性抗体技術は、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらにより記載がなされている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８，１９９３）。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の方法は、Ｇｒｕｂｅｒらにより記載がなされている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４）。三重特異性抗体は、Ｔｕｔｔらにより記載がなされている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０，１９９１）。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎらによって記載のように（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３，１９８８）、直接連結されるかまたはペプチドをコードするリンカーにより連結された、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現され得る共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。また、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書および米国特許第４，９５６，７７８号明細書；ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号明細書および米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号明細書も参照のこと。
【００７１】
一実施形態では、抗体、例えば米国特許第７，９３９，６３７号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に開示される抗体は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）との交差反応を伴い、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ＩＧＦ−１との交差反応を伴い、ＩＧＦ−２に結合し、ｍＡｂ７．２５１．３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ７．３４．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ７．１５９．２／ＭＥＤＩ−５７３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群から選択されるヒトモノクローナル抗体である。
【００７２】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲｌ）；配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ）を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、配列番号７および配列番号８で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、ハイブリドーマ細胞株７．１５９．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４２４）によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する。
【００７４】
ＭＥＤＩ−５７３は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）技術を用いて作製され、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で作製される完全ヒト免疫グロブリンＧ２ラムダ（ＩｇＧ２）抗体である。ＭＥＤＩ−５７３は、ヒトインスリン様成長因子ｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−２に選択的に結合し、腫瘍細胞内でのインスリン様成長因子ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２媒介性のシグナル伝達を阻害し、それにより腫瘍成長を阻害する。同抗体は、米国特許第７，９３９，６３７号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた可溶性組換えヒトｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−２で交互に免疫されたマウスから単離された。ＭＥＤＩ−５７３は２つの軽鎖および２つの重鎖から構成され、全分子量は約１５１キロダルトンである。
【００７５】
ＭＥＤＩ５７３は、ヒトインスリン様成長因子（ｈＩＧＦ）−１およびｈＩＧＦ−２に選択的に結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はヒト腫瘍細胞内でのシグナル伝達および増殖を媒介する。ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２リガンドを標的にし、それによりＩＧＦ媒介性シグナル伝達を阻害する。ヒトがん細胞における非臨床試験によると、ＭＥＤＩ５７３は、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ−Ａ経路の両方を阻害するその能力のために、広範な抗腫瘍有効性を達成する可能性を有することが示唆される。さらに、ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１Ｒを標的にする治験薬で認められる有害な効果であるグルコース恒常性の撹乱を伴うことなく、これを達成する潜在力を有する。インビトロ試験の結果によると、ＭＥＤＩ−５７３が、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＩＧＦ−１／−２のいずれかを発現するようにトランスフェクトされたいくつかの操作されたマウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株において、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２刺激性のＩＧＦ−１Ｒのリン酸化ならびにＡｋｔおよびＭＡＰＫを含む下流シグナル伝達タンパク質のリン酸化の両方を阻害したことが示されている。さらに、ＭＥＤＩ−５７３は、これらのシグナル伝達分子の自己分泌リン酸化を阻害した。機能的には、ＭＥＤＩ−５７３は、いくつもの操作されたＮＩＨ３Ｔ３およびヒト腫瘍細胞株の成長をインビトロで有効に阻害した。ＭＥＤＩ−５７３を用いた腫瘍担持マウスのインビボ処置により、ｈＩＧＦＩＩおよびヒトインスリン様成長因子１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）ならびにｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１Ｒを各々過剰発現する、移植されたクローン３２（Ｃ３２）およびクローンＰ１２（Ｐ１２）腫瘍の成長が有意に阻害された。
【００７６】
治療
がん治療が在宅、診療所、クリニック、病院の外来部門、または病院で実施される場合には常に、治療を提供してもよい。一実施形態では、本発明は、治療としてｍＴＯＲ阻害剤と組み合わされた抗ＩＧＦ−１／−２抗体（例えばＭＥＤＩ−５７３）の使用を提供する。
【００７７】
医師が治療の効果を精密に観察し、必要とされるあらゆる調整を行うことができるように、治療は一般に病院で開始される。治療期間は、治療中のがんの種類、患者の年齢および状態、患者の疾患のステージおよびタイプ、ならびに患者の身体が治療にいかに応答するかに依存する。薬剤投与は、異なる間隔で（例えば、毎日、毎週、または毎月）実施される場合がある。治療は、患者の身体が健常な新たな細胞を構築し、その力を回復する機会を有するように、休息時間を含む断続的周期でなされる場合がある。
【００７８】
がんの拡散を遅らせるか、がんの成長を遅延させるか、元の腫瘍から身体の他の部分まで拡散している可能性があるがん細胞を殺滅するかまたは停止させるか、がんによって引き起こされる症状を緩和させるか、あるいはがんを初期段階で予防するため、がんのタイプおよびその発生ステージに応じて治療を用いることができる。がんの成長は、制御されることなく進行性があり、正常細胞の増殖を誘発することがないか、または正常細胞の休止を引き起こすことになる条件下で生じる。
【００７９】
上記のように、必要に応じて、本発明の組成物を用いる処置は、増殖性疾患の処置のための治療法（例えば、放射線療法、手術、または化学療法）と組み合わせてもよい。
【００８０】
医薬組成物の製剤化
肉腫を治療するための本発明の組み合わせ（例えば、ＩＧＦ−１／−２に結合する抗体とｍＴＯＲ阻害剤）の投与は、他の構成成分と組み合わせて、肉腫の予防、寛解、または低減に有効である治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によるものでもよい。化合物は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、また一般に組成物の全重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口的（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に適した剤形で提供してもよい。医薬組成物は、従来の薬務に従って製剤化してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．）、ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００８１】
本発明に記載の医薬組成物は、実質的に投与直後または投与後の任意の所定時刻もしくは期間に活性化合物を放出するように製剤化してもよい。後者のタイプの組成物は、一般に徐放製剤として公知であり、（ｉ）体内で長期間にわたって薬剤の実質的に一定の濃度をもたらす製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間後、体内で長期間にわたって薬剤の実質的に一定の濃度をもたらす製剤；（ｉｉｉ）所定の期間中、活性物質の血漿レベル中での変動（のこぎり歯状の動力学的パターン）に関連した付随する望ましくない副作用の極小化とともに体内で比較的一定の有効レベルを維持することにより作用を維持する製剤；（ｉｖ）例えば肉腫近辺または肉腫内での徐放組成物の空間的配置により作用を局在化する製剤；（ｖ）用量が例えば１週間毎または２週間毎に１回投与されるように便宜的投与を可能にする製剤；ならびに（ｖｉ）治療薬を肉腫細胞に送達するような担体または化学的誘導体を用いることにより、増殖性腫瘍細胞を標的化する製剤を含む。一部の用途において、徐放製剤は、日中での頻回投与の必要性を失くし、治療レベルでの血漿レベルを維持する。
【００８２】
対象の化合物の放出速度が代謝速度を上回るような徐放性を得るため、いくつかの方法のいずれも探求可能である。一例では、徐放性は、例えば様々なタイプの徐放組成物およびコーティング剤を含む、様々な製剤パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、投与時、制御された方法で治療薬を放出する医薬組成物中に適切な賦形剤と製剤化される。例として、単回または複数回単位の錠剤またはカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【００８３】
本発明の組成物は、薬学的に許容できる希釈剤、担体、または賦形剤中に単位剤形で含まれるように投与してもよい。従来の薬務は、化合物を過剰な細胞増殖によって誘発される疾患を患う患者に投与するのに適した製剤または組成物を提供するように用いてもよい。投与は、患者が症候性である前に開始してもよい。
【００８４】
任意の適切な投与経路を用いてもよく、例えば、投与は、非経口投与、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、脳室内、肝内、関節内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐剤、または経口投与であってもよい。例えば、治療製剤は、溶液または懸濁剤の形態で経口投与用であってもよく、製剤は、錠剤またはカプセル剤の形態；および鼻腔内製剤用で散剤、点鼻薬、またはエアロゾルの形態であってもよい。上記の任意の適用方法おいて、本発明の組成物は、望ましくは静脈内に投与されるかまたは必要とされるアポトーシス事象の部位に（例えば注射により）適用される。
【００８５】
製剤を作製するための当該技術分野で周知の方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｕｒｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２０００に見出される。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含有してもよい。化合物の放出を制御するため、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。作用物質を送達するための他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームを含む。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、あるいは例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、あるいは点鼻の形態でまたはゲルとして投与するための油性溶液であってもよい。
【００８６】
製剤は、疾患または状態に対して治療を施すため、治療有効量（例えば、病的状態を予防するか、排除するか、または低下させる量）でヒト患者に投与することができる。本発明の組成物の好ましい用量は、障害のタイプおよび程度、特定の患者の健康状態全般、賦形剤化合物の配合、およびその投与経路のような変数に依存する可能性が高い。
【００８７】
本明細書に記載の任意の治療におけるヒト用量は、ヒトにおける用量を動物モデルと比べて変更することが当該技術分野で一般的なものであることを当業者が理解している通り、マウスで用いられる化合物の量から外挿することにより、最初に決定することができる。特定の実施形態では、約１ｍｇ化合物／Ｋｇ体重〜約５０００ｍｇ化合物／Ｋｇ体重；または約５ｍｇ／Ｋｇ体重〜約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重または約１０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約１００ｍｇ／Ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／Ｋｇ体重で用量が変化し得ることは想定される。他の実施形態では、この用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。他の実施形態では、より高用量を用いてもよく、かかる用量が約５ｍｇ化合物／Ｋｇ体重〜約２０ｍｇ化合物／Ｋｇ体重の範囲内であってもよいことは想定される。他の実施形態では、用量は、約８、１０、１２、１４、１６または１８ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。当然ながら、用量は、かかる治療プロトコルでは初期臨床試験の結果および特定の患者の必要性に応じて一般的に行われるように、高くまたは低く調節してもよい。
【００８８】
特定の実施形態では、用量は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２に結合する抗体の少なくとも２回用量を含む。用量は、約１週毎、または約３週毎に分割され、また各用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重を上回る抗体量および約５０ｍｇ  ｋｇの患者体重を下回る抗体量を含む。ＭＥＤＩ−５７３に関する投与は、例えば国際公開第２０１２０６８１４８号パンフレット（その全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【００８９】
キット
本発明は、肉腫を治療または予防するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、有効量の抗体および１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤を含有する治療用または予防用組成物を含む。抗体抗体は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２に特異的に結合することができ、またそれらの活性を阻害し得る。一実施形態では、抗体はＭＥＤＩ−５７３であってもよい。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＡＺＤ２０１４、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上であってもよい。特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンである。特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤はＡＺＤ２０１４である。特定の実施形態では、キットは、有効量のＭＥＤＩ−５７３およびラパマイシンを単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。特定の実施形態では、キットは、有効量のＭＥＤＩ−５７３およびＡＺＤ２０１４を単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、キットは治療用または予防用組成物を含有する無菌容器を含み；かかる容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスター包装、または当該技術分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または薬剤の保持に適した他の材料で作ることができる。
【００９１】
本発明の抗体は、抗体およびｍＴＯＲ阻害剤を、肉腫を有するかまたは発生リスクがある被験体に投与するための使用説明書とともに提供してもよい。使用説明書は、一般に肉腫の治療用または予防用組成物の使用についての情報を含んでもよい。他の実施形態では、使用説明書は、以下、すなわち、治療薬の説明；肉腫またはその症状を治療または予防するための投与計画および投与；注意事項；警告；効能；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験；および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。使用説明書は、容器上に直接印刷するか（存在する場合）、またはラベルとして容器に貼付するか、あるいは別紙、パンフレット、カード、またはフォルダとして容器内にまたは容器とともに供してもよい。
【００９２】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法を構築し、使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するように示され、また本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１  肉腫の異種移植片および細胞におけるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ−１ＲレベルならびにＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比
小児肉腫（年齢：６か月〜２５年）由来の２３個の異種移植片中のインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。これらの分析結果を図１Ａ〜図１Ｄに示す。図１Ａに見られるように、ＩＧＦ−１のｍＲＮＡレベルは、ユーイング肉腫では骨肉腫（ｐ＝０．０２９）および横紋筋肉腫（ｐ＝０．００２４）よりも有意に高いことが見出された。それに対し、図１Ｂに見られるように、ＩＧＦ−２のｍＲＮＡレベルは、横紋筋肉腫ではユーイング肉腫（ｐ＝０．０００５）および骨肉腫（ｐ＝０．００６６）よりも有意に高いことが見出された。図１Ｃに示すように、肉腫の３つのサブタイプ全部がＩＧＦ−１ＲのｍＲＮＡを高レベルで発現した。アッセイ対象の肉腫異種移植片試料の大部分が、インスリン受容体Ａアイソフォーム 対 インスリン受容体Ｂアイソフォームの比（ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ）で高いサイクル閾値（ΔＣｔ）差を有し（ΔＣｔ＜−４）、横紋筋肉腫が最高であった（図１Ｄ）。
【００９４】
またｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＩＧＦリガンドおよび受容体のｍＲＮＡレベルを、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含むいくつかの肉腫細胞株において測定した。結果を下の表１に示す。異種移植片試料における結果と一致し、ユーイング肉腫細胞が最高のＩＧＦ−１レベルを有する一方、横紋筋肉腫細胞は最高レベルのＩＧＦ−２を発現した。ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ２Ｒについて算出したΔＣｔを表すグラフを図２Ａに示す。ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比に対して算出したΔＣｔを図２Ｂに示す。
【００９５】
【表１】
2017502025.tif 000009
【００９６】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＩＧＦ−１Ｒのタンパク質レベルを、同一肉腫細胞株においてＥＬＩＳＡにより測定した。これらの結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。結果によると、大部分の肉腫細胞株がＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−１タンパク質を発現することが示された（図３Ａおよび図３Ｃ）。骨肉腫細胞株およびいくつかの横紋筋肉腫細胞株のみがＩＧＦ−２を分泌した（図３Ｂ）。ユーイング肉腫細胞株はいずれも、検出可能な量のＩＧＦ−２を発現しなかった。
【００９７】
実施例２  ＭＥＤＩ−５７３は自己分泌またはパラ分泌ＩＧＦリガンドによって駆動される肉腫細胞の成長および増殖を阻害した
腫瘍細胞の成長に対するＭＥＤＩ−５７３抗体を用いる処置の効果を判定するため、３つの横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ、ＳＪＣＲＨ３０、およびＨｓ７２９）、３つのユーイング肉腫細胞株（ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、およびＳＫ−ＥＳ−１）、および４つの骨肉腫細胞株（ＳＪＳＡ−１、ＫＨＯＳ、ＭＧ−６３、およびＳＡＯＳ２）を、外来性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の不在下で抗ＩＧＦ抗体ＭＥＤＩ−５７３で処置した。
【００９８】
３つのユーイング肉腫細胞株全て（ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、およびＳＫ−ＥＳ−１）および１つの横紋筋肉腫細胞株（ＳＪＣＲＨ３０）の成長は、外来性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の不在下でＭＥＤＩ−５７３抗体により阻害された。特定の理論に拘束されないが、この結果によると、これらの株が内因性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を分泌してそれらの成長を駆動する（自己分泌駆動型）ことが示される。ＲＤおよびＳＪＳＡ−１細胞において、中等度の成長阻害（試験した最高用量で約３０％）があった。結果を下の表２、および図４Ａ〜図４Ｆに示し、ここで、図４ＡはＭＥＤＩ−５７３で処置したＲＤ−ＥＳ細胞の細胞生存度のグラフを示し；図４ＢはＭＥＤＩ−５７３で処置したＴＣ−７１細胞の細胞生存度のグラフを示し；図４ＣはＭＥＤＩ−５７３で処置したＳＪＣＲＨ３０細胞の細胞生存度のグラフを示し；図４ＤはＭＥＤＩ−５７３で処置したＳＫ−ＥＳ−１細胞の細胞生存度のグラフを示し；図４ＥはＭＥＤＩ−５７３で処置したＳＪＳＡ−１細胞の細胞生存度のグラフを示し；また図４ＦはＭＥＤＩ−５７３で処置したＲＤ細胞の細胞生存度のグラフを示す。
【００９９】
【表２】
2017502025.tif 000010
【０１００】
ＩＧＦの添加がＭＥＤＩ−５７３の抗増殖活性に対する効果を有するか否かを判定するため、アッセイを、外来的に添加したＩＧＦで刺激されたいくつかの肉腫細胞株において繰り返した。これらのアッセイの結果を下の表３に示す。
【０１０１】
【表３】
2017502025.tif 000011
【０１０２】
表３からのデータを、図５Ａ〜図５Ｆおよび図６Ａ〜図６Ｄに示す。この表および図によると、ＩＧＦ−１の添加が、ユーイング肉腫細胞株のＲＤ−ＥＳ（図５Ａ）、ＴＣ−７１（図５Ｅ）、およびＳＫ−ＥＳ−１（図５Ｃ）における細胞増殖を約２倍誘導したことが示される。同様に、ＩＧＦ−２の添加は、ユーイング肉腫細胞株のＲＤ−ＥＳ（図５Ｂ）、ＴＣ−７１（図５Ｆ）、およびＳＫ−ＥＳ−１（図５Ｄ）における細胞増殖を約２倍誘導した。ＩＧＦ−１の添加は、骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（図６Ｃ）およびＳＡＯＳ−２（図６Ａ）における細胞増殖を誘導した。ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２刺激性の細胞成長を強力に阻害した。相対的比較では、ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ−２刺激性の増殖に対して、ＩＧＦ−１刺激性の増殖に対する（ＩＣ５０は２０〜２２３μＭの範囲であった）よりも大きな効果（ＩＣ５０は２〜２０μＭの範囲であった）を示した。一部の細胞株、例えばＫＨＯＳおよびＲＤ細胞は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２刺激に対して応答しなかった。ＭＥＤＩ−５７３は、ＩＧＦ刺激の有無にかかわらず、ＫＨＯＳおよびＲＤ細胞の成長を調節する上で有意な効果を全く有しなかった。特定の理論に拘束されないが、これによると、ＩＧＦシグナル伝達がこれらの非応答性株における成長または生存を駆動しないことが示される。
【０１０３】
ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、ＳＪＳＡ−１、およびＫＨＯＳ細胞に対するＭＥＤＩ−５７３の細胞傷害性効果についての基礎を評価するため、細胞を、漸増濃度のＭＥＤＩ−５７３で４８時間処置し、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の活性化を測定することにより分析した。ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、およびＳＪＳＡ−１細胞では、ＭＥＤＩ−５７３による処置が、アイソタイプ対照と比べて、カスパーゼ−３／−７の活性を用量依存性に増強した。カスパーゼ−３／−７の活性化はＫＨＯＳ細胞内で検出されなかった（データは示さず）。
【０１０４】
実施例３  ＭＥＤＩ−５７３は肉腫異種移植片モデルにおける腫瘍成長を阻害した
ＲＤ−ＥＳ（ユーイング肉腫）異種移植片を有するマウスに対するＭＥＤＩ−５７３を用いた週２回の処置により、１０ｍｇ／ｋｇで２５％、３０ｍｇ／ｋｇで４４％、および６０ｍｇ／ｋｇで５２％の腫瘍成長阻害が生じた（図７Ａ）。同様の効果が、ＴＣ−７１異種移植片を有するマウス（別のユーイング肉腫モデル）を同様に処置したとき見られた。同等の結果が、ＳＪＳＡ−１（骨肉腫モデル）異種移植片を有するマウスをＭＥＤＩ−５７３で処置したときに得られた（図７Ｂ）。ＳＫ−ＥＳ−１およびＳＪＣＲＨ３０細胞の増殖が、外来性ＩＧＦの不在下、インビトロでＭＥＤＩ−５７３により阻害されたが、これら２つのモデルのインビボでの成長は、ＭＥＤＩ−５７３処置による影響を受けなかった。インビトロでの知見に一致して、ＫＨＯＳ細胞は、インビボでＭＥＤＩ−５７３に対していずれも応答しなかった（図７Ｃ）。体重減少は認められなかったことから、ＭＥＤＩ−５７３処置は、マウスにおいて耐容性は良好であった。
【０１０５】
未処置のマウスおよび異なる量のＭＥＤＩ−５７３で処置したマウスにおける異種移植片腫瘍内の遊離ＩＧＦリガンドを測定した。ＲＤ−ＥＳ腫瘍では、ＭＥＤＩ−５７３用量依存性のＩＧＦ−１抑制が存在し（図８Ａ）、ＩＧＦ−２のレベルは検出するには低すぎた。それに対し、ＳＪＳＡ−１腫瘍は、検出可能なレベルのＩＧＦ−２を示したが（図８Ｂ）、ＩＧＦ−１は示さなかった（データは示さず）。ＳＪＳＡ−１腫瘍内の遊離ＩＧＦ−２は、ＭＥＤＩ−５７３により、１０ｍｇ／ｋｇの最低用量であってもほぼ完全に中和された。これは、ＭＥＤＩ−５７３のＩＧＦ−２に対する結合親和性（Ｋｄ＝２ｐｍｏｌ／Ｌ）が、ＩＧＦ−１（Ｋｄ＝２９４ｐｍｏｌ／Ｌ）と比べて高いことを反映している可能性がある。ＫＨＯＳ細胞がＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２刺激に対して非応答的であるにもかかわらず、ＩＧＦ−２レベルをＫＨＯＳ／ＮＰモデルで試験した。ＫＨＯＳ／ＮＰモデルにおけるヒトＩＧＦ−２レベルの用量依存性阻害が認められたが、遊離ＩＧＦ−２のいくらかのレベルが６０ｍｇ／ｋｇの最高用量で検出可能であり、それはＳＪＳＡ−１腫瘍内のベースラインＩＧＦ−２レベルと同等であった（図８Ｃ）。
【０１０６】
実施例４  ＭＥＤＩ−５７３は肉腫細胞内のＩＧＦシグナル伝達を阻害した
ＭＥＤＩ−５７３は、ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、ＳＫ−ＥＳ−１、およびＳＪＳＡ−１細胞内でのＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、およびタンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）の自己リン酸化を阻害したが、ＫＨＯＳ細胞内では阻害しなかった（図９Ａ〜図９Ｃ）。
【０１０７】
外来性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を細胞に添加したとき、試験対象の全細胞内でＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ−Ａのリン酸化が誘導された。図１０〜図１０Ｃに見られるように、ＭＥＤＩ−５７３での前処理により、ＩＧＦ−１／−２誘導性のＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ−Ａの活性化が阻害された。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はまた、ＲＤ−ＥＳ、ＴＣ−７１、ＳＫ−ＥＳ−１、およびＳＪＳＡ−１細胞内でのＡｋｔのリン酸化を刺激した。ＭＥＤＩ−５７３はこの効果を遮断する。しかし、ＫＨＯＳ細胞内では、受容体のリン酸化がＩＧＦ−１／−２刺激とともに認められたが、Ａｋｔの誘導はなかった。
【０１０８】
ＩＧＦシグナル伝達に対するＭＥＤＩ−５７３のインビボでの効果についても、肉腫異種移植片において試験した。インビトロ実験に一致するように、インビボでの薬力学的試験を２つの方法で実施した。第１に、自己分泌的に腫瘍により分泌されるＩＧＦリガンドによって誘導されるシグナル伝達に対するＭＥＤＩ−５７３の効果を試験した。単回用量のＭＥＤＩ−５７３を、約４００ｍｍ３のＲＤ−ＥＳ、ＳＪＳＡ−１、またはＫＨＯＳ／ＮＰ腫瘍を有するマウスに与えた。ＭＥＤＩ−５７３の投与により、ｐＡＫＴの自己リン酸化およびリン酸化ｐ４ＥＢＰ１がＲＤ−ＥＳ腫瘍内では阻害されたが、ＫＨＯＳ／ＮＰ腫瘍内では阻害されなかった。ＲＤ−ＥＳ腫瘍を有するマウス由来の試料でのイムノブロットの画像を図１１に示す。
【０１０９】
成体マウスはマウスＩＧＦ−２を生成せず、またＭＥＤＩ−５７３はマウスＩＧＦ−１に対して低い結合親和性を有する。したがって、内分泌またはパラ分泌での分泌によって送達される場合に腫瘍成長を駆動するときのＩＧＦリガンドの役割、およびこの機能の阻害におけるＭＥＤＩ−５７３の効果の理解を試みるべく、ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２（ＩＧＦ−１／−２）をマウスに注射した。ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の注射から１５分後、高レベルのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がＲＤ−ＥＳ腫瘍および血漿の両方で検出された。腹腔内へのＭＥＤＩ−５７３での６時間の前処理により、腫瘍ライセートおよび血漿中のＩＧＦ−１レベルが約５０％低下し（図１２Ａおよび図１２Ｂを参照）、ＩＧＦ−２レベルはほぼ完全に低下した（図１２Ｃおよび図１２Ｄを参照）。
【０１１０】
同様に、Ａｋｔおよびリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ−１（Ｓ６Ｋ）のリン酸化が、ＩＧＦ−１／−２を受けなかったマウスと比べて増強された（図１３）。ＭＥＤＩ−５７３での前処理は、特にＩＧＦ−２の注射に対し、ＩＧＦ誘導性のｐＡＫＴおよびｐＳ６Ｋの激減を引き起こした。ＩＧＦ−１／−２の注射により、ｐ４ＥＢＰ−１のベースラインレベルが明らかに変化した。ＭＥＤＩ−５７３処置により、ベースラインレベル未満であってもｐ４ＥＢＰ−１が阻害された。
【０１１１】
実施例５  ｍＴＯＲｉと組み合わされたＭＥＤＩ−５７３がインビトロで肉腫細胞成長を阻害した
ｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシンおよびＡＺＤ２０１４と組み合わせたＭＥＤＩ−５７３の効果を、細胞傷害性アッセイにおいて評価した。ＲＤ−ＥＳ細胞は、ＭＥＤＩ−５７３およびラパマイシン、またはＭＥＤＩ−５７３およびＡＺＤ２０１４で処置した。図１４に見られるように、ＭＥＤＩ−５７３単独での処置により細胞生存度の５６％の低下が引き起こされ、またラパマイシン単独での処置により細胞生存度の３４％の低下が引き起こされた。ＭＥＤＩ−５７３とラパマイシンとの組み合わせにより生存度の８０％の低下が得られた（Ｐ＜０．０１）。ｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ２０１４単独での処置により細胞生存度が５５％低下し、またＡＺＤ２０１４とＭＥＤＩ−５７３との組み合わせにより細胞生存度の８５％の低下が引き起こされた（Ｐ＜０．０１）。上で示した結果に一致して、それはＭＥＤＩ−５７３がＫＨＯＳ細胞の増殖に対する効果を有しないことを示し（表３）、ＭＥＤＩ−５７３といずれかのｍＴＯＲｉとの組み合わせは、いずれのＫＨＯＳ細胞においても活性の増強を全く示さなかった。
【０１１２】
ＩＧＦシグナル伝達に対するＭＥＤＩ−５７３、ｍＴＯＲｉ、および両方の組み合わせの効果を試験するため、ＲＤ−ＥＳ、ＳＪＳＡ−１、およびＫＨＯＳ細胞をこれらの作用物質で４時間処置した。ゲル電気泳動による細胞溶解物の分離後、免疫ブロットによりタンパク質を検出した。図１５は、ＭＥＤＩ−５７３がＲＤ−ＥＳおよびＳＪＳＡ−１細胞内でのＳ６Ｋのリン酸化を阻害したが、ＫＨＯＳ細胞内では阻害しなかったことを示す。ラパマイシン単独およびＭＥＤＩ−５７３との組み合わせは、３つの細胞株全部でｐＳ６Ｋを完全に阻害した。ＭＥＤＩ−５７３単独またはラパマイシン単独は、４ＥＢＰ１のリン酸化に対する効果を有しなかった。両方での併用処置は、２つの応答性のある株（ＲＤ−ＥＳおよびＴＣ−７１）においてｐ４ＥＢＰ１の低下をもたらしたが、非応答性の株（ＫＨＯＳ）では効果を全く有しなかった。ラパマイシン処置により、３つの細胞株全部でＡＫＴのリン酸化が誘導された。ＭＥＤＩ−５７３の存在下で、ラパマイシン誘導性のＡＫＴ活性化は、ＲＤ−ＥＳおよびＴＣ−７１細胞内で未処置対照において認められたレベルまで有意に阻害されたが、ＫＨＯＳ細胞内では阻害されなかった（図１５）。
【０１１３】
ＡＺＤ２０１４での処置によりＲＤ−ＥＳ内でのｐＳ６Ｋのリン酸化が阻害された一方、ＡＺＤ２０１４は、ＳＪＳＡ−１またはＫＨＯＳ細胞内でｐＳ６Ｋのリン酸化を阻害しなかった。ＭＥＤＩ−５７３とＡＺＤ２０１４との組み合わせにより、ＳＪＳＡ−１細胞内でのｐＳ６Ｋのリン酸化が阻害された。ｐＡＫＴのリン酸化に対する効果は、ＭＥＤＩ−５７３をＡＺＤ２０１４と組み合わせるとき、ＭＥＤＩ−５７３をラパマイシンと組み合わせるときよりも顕著であるように思われた（図１５）。
【０１１４】
実施例６  ｍＴＯＲｉと組み合わせたＭＥＤＩ−５７３はＲＤ−ＥＳ腫瘍異種移植片における肉腫細胞成長を阻害する
ＭＥＤＩ−５７３単独でのＲＤ−ＥＳ異種移植片モデルの処置により、５２％の腫瘍成長阻害が生じた。ＡＺＤ２０１４単独でのＲＤ−ＥＳ異種移植片モデルの処置により、５１％の腫瘍成長阻害が生じた。ＭＥＤＩ−５７３とＡＺＤ２０１４との組み合わせでのＲＤ−ＥＳ異種移植片モデルの処置により、９６％の腫瘍成長阻害がもたらされ、それはいずれの作用物質単独よりも有意に優れていた（ｐ＜０．００１）（図１６Ａ）。体重に対する処置の効果を図１６Ｂに示す。腫瘍成長阻害に対する同様の効果が、ＳＪＳＡ−１異種移植片モデルにおいて認められた。ＭＥＤＩ−５７３とＡＺＤ２０１４との組み合わせでのＫＨＯＳ異種移植片モデルの処置により、それら作用物質単独での処置と比べての腫瘍成長阻害の増大は生じなかった。
【０１１５】
ＭＥＤＩ−５７３とラパマイシンとの組み合わせについてもＲＤ−ＥＳ異種移植片モデルで試験し、その結果を図１７Ａに示す。ＭＥＤＩ−５７３とラパマイシンとの組み合わせの効果はＭＥＤＩ−５７３とＡＺＤ２０１４との組み合わせの場合よりやや低かったが、併用処置により、いずれかの作用物質単独（ＭＥＤＩ−５７３では５９％、またラパマイシンでは４４％）と比べて、抗腫瘍活性が増強された（７９％の腫瘍成長阻害）（図１７Ａ）。有意な体重減少は認められなかったことから、併用処置は耐容性があった（図１７Ｂ）。
【０１１６】
本明細書に記載の結果は、以下の材料および方法を用いて得られた。
【０１１７】
細胞および試薬
肉腫細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（マナッサス、バージニア州）から購入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬はＰｒｏｍｅｇａ（マディソン、ウィスコンシン州）から入手した。ｐＩＧＦ−１Ｒ、ｐＩＲ−Ａ、およびｐＡＫＴ用の全細胞溶解物キットはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；ロックビル、メリーランド州）から購入した。全ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒ用のＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。全ＩＧＦ−２用のＥＬＩＳＡキットはＩｎｓｉｇｈｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（フォールズチャーチ、バージニア州）から購入した。遊離ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を検出するためのＥＬＩＳＡキットは社内で開発した。ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手した。ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−４ＥＢＰ１、ホスホ−Ｓ６Ｋ、およびＧＡＰＤＨを検出するための抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ベバリー、マサチューセッツ州）から得た。
【０１１８】
ＩＧＦ−１／−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、ＩＲ−ＢのｍＲＮＡレベルを測定するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイ
全ＲＮＡを、ＺＲ  ＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、アーバイン、カリフォルニア州）を用いて製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０１１９】
一本鎖ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡの試料を、ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｅ−Ａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて製造業者の使用説明書に従って予備増殖した。反応物は、２０μＬの最終反応体積で、５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＰｒｅ−Ａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、および（アッセイ対象の全プライマー／プローブからなる）５μＬの０．２×遺伝子発現アッセイミックスを含有した。反応物を推奨される１４サイクルプログラムで循環させ、次にＴＥ緩衝液で１：５に希釈した。予備増殖したｃＤＮＡは、直ちに用いるか、または処理まで摂氏−２０度（−２０℃）で貯蔵した。
【０１２０】
試料を調製するための反応ミックスは、４８×４８ダイナミックアレイチップに負荷し、２．５μＬの２×ユニバーサルマスターミックス、０．２５μＬのサンプルローディングバッファー、および２．２５μＬの予備増幅ｃＤＮＡを含有した。プライマー／プローブ用の反応ミックスは、２．５μＬの２０×ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイおよび２．５μＬのアッセイローディングバッファーを含有した。試料およびアッセイ試薬を入口に負荷する前に、チップをＩＦＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒで予備刺激した。試料（５μＬ）をダイナミックアレイチップの各試料入口に負荷し、５μＬの１０×ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイミックスを各検出器入口に負荷した。チップを、負荷および混合のためにＩＦＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ上に置いた。ＩＦＣプライミングステップの完了時、チップをＢｉｏＭａｒｋ  ＲＴ−ＰＣＲシステムに熱サイクル期間（摂氏９５度で１０分間、摂氏９５度で１５秒間を４０サイクル、摂氏６０度で１分間）負荷した。試料の反復数および組成物は、特定の実験に応じて変化したが、測定が３通りより少ないことは決してなかった。平均サイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて設計したプローブを定量した。ΔＣｔの算出用に、試料中のすべての利用可能な参照遺伝子アッセイの平均Ｃｔ値を用いた。
【０１２１】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂのレベルを試験した。ＩＲ−ＡおよびＩＲ−ＢのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイは、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（１０）：ｅ２６１７７）に記載されている。この方法は、ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂを互いに独立に特異的増幅することを可能にする。他のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１２２】
インビトロ細胞増殖アッセイ
肉腫細胞株は、通常の成長培地中で一晩培養した。翌日、０．１％チャコール処理（ｃｈａｒｃｏａｌ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培地を添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な量のＭＥＤＩ−５７３で処置し、培養液を３日間インキュベートした。増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて定量化した。
【０１２３】
ＩＧＦ誘導性の増殖に対するＭＥＤＩ−５７３の効果を評価するため、ＭＥＤＩ−５７３またはアイソタイプ対照を、細胞に摂氏３７度で３０分間添加した。次に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を適切なウェルに添加し、３日間インキュベートした。ＣＴＧ試薬を用いて増殖を定量化した。
【０１２４】
ｐＩＧＦ−１Ｒ、ｐＩＲ−Ａ、およびｐＡＫＴ用アッセイ
肉腫株を完全培地中で一晩培養した。翌日、０．１％チャコール処理（ｃｈａｒｃｏａｌ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培地を培養液に添加し、培養液を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な治療薬で５分間処置した。培地を除去し、細胞を洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有する１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ溶解用緩衝液で溶解した。約８〜２０μｇの総タンパク質を、ＭＳＤ  ９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴプレート上に負荷し、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−ＡおよびＩＲＳ−１の総タンパク質およびリン酸化タンパク質のレベルを、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（総タンパク質）およびＩｎｓｕｌｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（リン酸化タンパク質）Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。総ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴのレベルを、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｓｅｒ４７３）／Ｔｏｔａｌ  ＡＫＴ  Ａｓｓａｙ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅキットを用いて、製造業者の標準プロトコルに従って測定した。
【０１２５】
マウスにおける異種移植片試験
インビボ有効性試験においては、５０％マトリゲル中の５００万の肉腫細胞を、雌胸腺欠損ヌードマウスの各々に皮下接種した。腫瘍が約１５０〜２００ｍｍ３に達するときに、マウスを無作為に数群に割り当てた（１群あたりマウス１０匹）。ＭＥＤＩ−５７３を、指定用量で週２回、腹腔内に投与した。ＡＺＤ２０１４についての用量レジメンは１日１回の経口投与であり、ラパマイシンについては３日毎の腹腔内注射であった。腫瘍体積をノギスで週２回測定した。腫瘍成長阻害は、試験の最終日に、対照群の初日および最終日の平均腫瘍体積と比較して算出した。
【０１２６】
インビボでの作用機序（ＭＯＡ）試験については、腫瘍が約４００ｍｍ３に達したとき、単回用量のＭＥＤＩ−５７３を投与した。ＭＥＤＩ−５７３の自己分泌ＩＧＦシグナル伝達に対する効果を評価するため、腫瘍および血漿試料を投与から４時間後に採取した。別のマウスセットでは、ＭＥＤＩ−５７３の投与から６時間後、ヒトＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を尾静脈に注射した。ＭＥＤＩ−５７３のＩＧＦ−１／−２誘導性シグナル伝達に対する効果を評価するため、腫瘍および血漿試料をＩＧＦの注射から１５分後に採取した。
【０１２７】
他の実施形態
前述の説明から、様々な利用および条件に対して採用するために、本明細書に記載の本発明に対する改変形態および修飾形態をなし得ることが明らかになるであろう。かかる実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０１２８】
本明細書中の変数の任意の定義における要素の列挙に関する記述は、その変数の列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての定義を含む。本明細書中の実施形態に関する記述は、任意の単一の実施形態あるいは任意の他の実施形態またはその一部との組み合わせとしての実施形態を含む。
【０１２９】
本明細書中に記述されるすべての特許、刊行物、ＣＡＳ、および受託番号は、あたかも各々の独立した特許、刊行物、および受託番号が詳細かつ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
2017502025.tif 000012
【図２】
2017502025.tif 000013
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2017502025.tif 000020
【図９−１】
2017502025.tif 000021
【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
2017502025.tif 000024
【図１２】
2017502025.tif 000025
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2017502025.tif 000028
【図１６】
2017502025.tif 000029
【図１７】
2017502025.tif 000030
【配列表】
2017502025000001.app
【国際調査報告】
2017502025.tif 000031
2017502025.tif 000032