(57)【要約】【課題】本明細書では、癌細胞運動性及び／または転移を阻害する組成物及び方法を提供する。【解決手段】特定の実施形態では、癌細胞運動性を阻害する、転移を阻害する、かつ／または癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌など）を治療するため、ＫＢＵ２０４６（または、その類似体）及び１種以上の追加療法（例えば、癌療法（例えば、ホルモン療法））を提供する。
2017534627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している対象の治療方法及び／または癌細胞運動性の阻害方法であって、癌を有する対象に、すなわち大腸癌、肺癌または乳癌に罹患している対象に、式：
【化１】
2017534627.tif 000014
またはその類似体を有する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記化合物が、腫瘍の外科的切除前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、腫瘍の外科的切除後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、第２の癌治療薬と共投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の癌治療薬がホルモン療法剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の癌治療薬が化学療法剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
癌に罹患している対象の治療方法及び／または癌細胞運動性の阻害方法であって、
（ａ）式：
【化２】
2017534627.tif 000015
を有する化合物またはその類似体、及び
（ｂ）ホルモン療法剤を共投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
前記対象が、前立腺癌、大腸癌、肺癌、または乳癌に罹患している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ホルモン療法剤が、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、エンザルアトミド、リュープロン、ゾラデックス、睾丸切除術、アビラテロン、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、レトロゾールからなる一覧から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）及び（ｂ）を逐次投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）及び（ｂ）を同時に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）及び（ｂ）を合剤化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リンカー部分によって機能性部分と結合された、式：
【化３】
2017534627.tif 000016
またはその類似体を有する化合物を含む組成物。
【請求項１４】
式：
【化４】
2017534627.tif 000017
（式中、Ｌはリンカー部分であり、Ｒは機能性部分である）を有する化合物を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１５】
前記機能性部分が、抗体またはその断片、親和性タグ、ペプチドまたはタンパク質、オリゴヌクレオチド、固体担体、薬物、金属配位基、造影剤、ナノ粒子、架橋性基、ビオチン、蛍光色素分子、及び免疫原性分子からなる一覧から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカー部分が、場合により１つ以上のヘテロ原子及び分枝鎖または主鎖置換基を含んでいる、炭素原子１〜３０個の直鎖または分枝鎖を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リンカー部分が１つ以上の（ＣＨ２）２Ｏ基を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リンカー部分が１つ以上のＣＯＮＨ基を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リンカー部分が、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ［（ＣＨ２）２Ｏ］２または（ＣＨ２）４ＣＯＮＨ［（ＣＨ２）２Ｏ］４を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
式：
【化５】
2017534627.tif 000018
を有する化合物を含む、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／０７６，２９７号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府資金援助に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１２２９８５に基づく政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書では、癌細胞運動性及び／または転移を阻害する組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、癌細胞運動性を阻害する、転移を阻害する、かつ／または癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌など）を治療するため、ＫＢＵ２０４６（または、その類似体）及び１種以上の追加療法（例えば、癌療法（例えば、ホルモン療法、化学療法））を提供する。
【背景技術】
【０００４】
起源となる原発臓器から癌細胞が移動すると、治癒の見込みが著しく低減する（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。癌細胞運動性の増加は、転移表現型の典型的な特徴であり、転移カスケードの初期段階に相当し、起源となる原発臓器から遠隔転移部位に癌細胞が移動するのに不可欠である（Ｔａｌｍａｄｇｅ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ，２０１０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遠隔転移の発現は、大多数の癌関連の罹患及び死亡の主因である（Ｍｉｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，２００８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細胞運動性の増加及び転移の発現を促す過程は、治療標的として高い潜在的価値を有する。しかしながら、癌細胞運動性及び結果として生じる転移を選択的に阻害することを目的とした広範囲にわたる試みは失敗に終わっている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋｒｉｓｈｎａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，２０１４；Ｓｔｅｅｇ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細胞運動性及び転移を調節する多数の経路が示されたが、それらが構成する経路は調節効果が多面発現性である（Ｋｒｉｓｈｎａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，２０１４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、標的化操作を支援する十分な選択性を有する細胞運動性及び転移の調節因子を同定することは不可能であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書では、癌細胞運動性及び／または転移を阻害する組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、癌細胞運動性を阻害する、転移を阻害する、かつ／または癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌など）を治療するため、ＫＢＵ２０４６（または、その類似体）及び１種以上の追加療法（例えば、癌療法（例えば、ホルモン療法、化学療法））を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
転移に至る癌細胞運動性の増加は、大多数の癌関連死の原因である。小分子を生物学的プローブとして使用し、ＫＢＵ２０４６が、ＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体の形成によって生じるクレフト内に結合し、その複合体を安定化させ、ＨＳＰ９０β−Ｓｅｒ２２６リン酸化を阻害し、それにより癌細胞運動性の阻害を示したことを実証した。これらの分子摂動は、ヒト癌細胞運動性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害、ならびにナノモル濃度のＫＢＵ２０４６の経口投与後に観察される効果により、ヒト前立腺癌転移及び乳癌転移のマウス正所性モデルでの転移の阻害をもたらした。広範な分子、細胞、及び全身を基にしたアッセイは、プローブの作用がＳｅｒ２２６リン酸化の阻害に対して高い選択性があり、得られた結果が細胞運動性及び転移に対して有効であることを示している。
【０００７】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験は、ヒト乳癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞及び肺癌細胞の移動の阻害を実証した。更に、癌細胞運動性を調節するタンパク質を同定し、またこれが重要な薬理学的標的であることを実験で実証している。更に、薬理学的に阻害することができるタンパク質に対する特異的な修飾を同定し、それにより細胞運動性を阻害する。更に、癌細胞運動の治療的な阻害が化学療法及びホルモン療法と効果的に併用できるとともに、この方法がヒト前立腺癌のためのホルモン療法の有効性を向上させ、ホルモン耐性の克服に適用できることが実験から実証されている。
【０００８】
特に、本明細書に記載する実施形態の開発中に実施した実験は、化合物ＫＢＵ２０４６がヒト前立腺癌、乳癌、大腸癌及び乳癌の細胞運動性を阻害すること、ヒト前立腺癌転移及び乳癌転移を阻害すること、ＨＳＰ９０βのセリン２２６のリン酸化を減少させること、細胞浸潤性を阻害すること、ならびにＨＳＰ９０のＣＤＣ３７との結合性を増加させることを実証している。同時に、これらの結果はＨＳＰ９０の機能がこれらの操作によって変化し得ることを示している。このＨＳＰ９０の機能を変化させる方法は、癌（例えば、前立腺癌などの）治療のためのホルモン療法の有効性を増強する。このＨＳＰ９０の機能を変化させる方法は、細胞毒性癌治療の有効性を阻害せず、むしろ相加作用及びその個別の作用機序により療法の相乗作用が全身にもたらされることがデータから示されている。
【０００９】
癌細胞運動性及び転移の複合生物学を小分子が効率的にプローブできることを実証する実験を本明細書に記載する実施形態の開発中に実施した。この方法によって、ＨＳＰ９０βのＳｅｒ２２６のリン酸化が、癌細胞運動性の調節因子であると同定された。その過程の薬理学的に修飾可能な調節因子としての重要性も示された。加えて、Ｓｅｒ２２６のリン酸化を選択的に阻害する小分子プローブを開発し、それにより細胞運動性及び転移を選択的に阻害する。更に、小分子を使用したＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体の安定化を実証した。同時に、本明細書に記載する実施形態の開発中に実施した実験は、癌転移及びそれに付随する高い死亡率と直接関連する重要な生物学的過程の選択的で化学修飾可能な調節機構を解明した。
【００１０】
図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ及び図２０に示したように、一連の有意な証拠は、提案モデルであるＫＢＵ２０４６が、ＣＤＣ３７のＨＳＰ９０βへの結合により形成されるクレフト内に結合することをまさに裏付けている。これには、ＫＢＵ２０４６がＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βのいずれかとは個別に結合せず、ＣＤＣ３７とＨＳＰ９０βの両方が存在するときのみ物理的安定化をもたらすという事実を含む。更に、図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ及び図２０に示す、構造的及び生物物理学的な情報の広範囲にわたる分析は、２つのタンパク質間にクレフトを形成し、それにＫＢＵ２０４６が立体（ｓｔｅｎｃ）相互作用を不安定化させることなく結合することができることを示している。最後に、ＫＢＵ２０４６の機能は、異なった部位との結合と一致し、それにより異なった機能を及ぼす従来のＨＳＰ９０阻害剤（Ｎｅｃｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，２０１２；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の機能とは完全に異なっている。具体的には、従来のＨＳＰ９０阻害剤は細胞の細胞毒性を誘導するが（Ｎｅｃｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，２０１２；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＫＢＵ２０４６はこの機能が完全に欠如している。
【００１１】
本明細書に記載する実施形態の開発中に実施した実験は、ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化が、細胞浸潤性の重要な調節因子であること、またＣＤＣ３７−ＨＳＰ９０βの境界を調節する化合物または手法が、重要な生物学的関連性と潜在的な翻訳の関連性を有することを実証している。いくつかの実施形態では、癌細胞運動性を阻害する、前癌病変の浸潤性を阻害する、転移を阻害する、ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化を減少させるなどのために、ＫＢＵ２０４６またはその類似体（例えば、米国特許第８，４８１，７６０号及び米国特許第８，４８１，７６０号、第８，７４２，１４１号を参照；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を癌治療法として提供する。いくつかの実施形態では、１種以上の癌（例えば、固形腫瘍癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌など））に罹患している対象に、ＫＢＵ２０４６またはその類似体を、単独でまたは１種以上の追加療法（例えば、ホルモン療法、化学療法など）と併用して投与する。
【００１２】
本明細書では、癌細胞運動性を阻害するための方法であって、癌を有する対象に式：
【００１３】
【化１】
2017534627.tif 000003
【００１４】
またはその類似体を有する化合物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、肺癌、大腸癌及び乳癌からなる一覧から選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、腫瘍の外科的切除前に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、腫瘍の外科的切除後に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、第２の癌治療薬と共投与される。いくつかの実施形態では、第２の癌治療薬はホルモン療法剤である。いくつかの実施形態では、第２の癌治療薬は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、投与は転移を阻害する。
【００１５】
本明細書のいくつかの実施形態では、癌に罹患している対象の治療方法及び／または癌細胞運動性の阻害方法であって、癌を有する対象に、すなわち大腸癌、肺癌または乳癌に罹患している対象に、式：
【００１６】
【化２】
2017534627.tif 000004
【００１７】
またはその類似体を有する化合物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、腫瘍の外科的切除前に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、腫瘍の外科的切除後に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、第２の癌治療薬と共投与される。いくつかの実施形態では、第２の癌治療薬はホルモン療法剤である。いくつかの実施形態では、第２の癌治療薬は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、投与は転移を阻害する。
【００１８】
本明細書のいくつかの実施形態では、癌に罹患している対象の治療方法及び／または癌細胞運動性の阻害方法であって、（ａ）式：
【００１９】
【化３】
2017534627.tif 000005
【００２０】
またはその類似体を有する化合物、及び（ｂ）ホルモン療法剤を共投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、前立腺癌、大腸癌、肺癌または乳癌に罹患している。いくつかの実施形態では、ホルモン療法剤は、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、エンザルアトミド（ｅｎｚａｌｕａｔｍｉｄｅ）、リュープロン、ゾラデックス、睾丸切除術、アビラテロン、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、レトロゾールからなる一覧から選択される。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）を逐次投与する。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）を同時投与する。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）を合剤化する。
【００２１】
本明細書のいくつかの実施形態では、（ａ）式：
【００２２】
【化４】
2017534627.tif 000006
【００２３】
またはその類似体を有する化合物と、（ｂ）ホルモン療法剤との合剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホルモン療法剤は、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、エンザルアトミド、リュープロン、ゾラデックス、睾丸切除術、アビラテロン、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、レトロゾールからなる一覧から選択される。
【００２４】
本明細書のいくつかの実施形態では、リンカー部分によって機能性部分と結合された、式：
【００２５】
【化５】
2017534627.tif 000007
【００２６】
またはその類似体を有する化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、式：
【００２７】
【化６】
2017534627.tif 000008
【００２８】
（式中、Ｌはリンカー部分であり、Ｒは機能性部分である）を有する化合物を含む。いくつかの実施形態では、機能性部分は、抗体またはその断片、親和性タグ、ペプチドまたはタンパク質、オリゴヌクレオチド、固体担体、薬物、金属配位基、造影剤、ナノ粒子、架橋性基、ビオチン、蛍光色素分子、及び免疫原性分子からなる一覧から選択される。本明細書の実施形態に用いられる他の例示的な機能性部分としては、アミノ酸（例えば、天然アミノ酸または非天然アミノ酸）、抗体またはその断片を含むペプチドまたはポリペプチド（タンパク質）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、酵素、補助因子、補酵素、酵素に対するペプチドまたはタンパク質基質（例えば、分岐ペプチド基質（例えば、Ｚ−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−４−ニトロベンジルアミド（ＮＢＡ）など））、自殺基質、受容体、その類似体を含む１つ以上のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰまたはＧＤＰ）、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ）、糖タンパク質、多糖類、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、固体担体（例えば、磁性粒子などの沈降粒子、セファロースもしくはセルロースビーズ、膜、ガラス（例えば、スライドガラス）、セルロース、アルギン酸、プラスチックもしくは他の合成的に調製されたポリマー（例えば、エッペンドルフ管またはマルチウェルプレートのウェル）、自己組織化単分子層、表面プラズモン共鳴チップ、または電子伝導性表面を有する固体担体）、薬物（例えば、ドキソルビシン、５−フルオロウラシルまたはカンプトサール（ＣＰＴ−１１；イリノテカン）などの化学療法剤）、ｐＨ感受性剤、放射性核種、電子不透過である分子、造影剤（例えば、バリウム、ヨウ素または他のＭＲＩもしくはＸ線造影剤）、活性酸素に感受性である分子、ナノ粒子（例えば、免疫金粒子、常磁性ナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子または量子ドット）、酵素に対する非タンパク質基質、酵素の阻害剤、キレート剤、架橋性基（例えば、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、グルタチオンなど）、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、アビジン、ストレプトアビジン、ｃＡＭＰ、ホスファチジルイノシトール、ヘム、ｃＡＭＰに対するリガンド、金属、１種以上の色素（例えば、キサンテン色素、カルシウム感受性色素、ナトリウム感受性色素、ＮＯ感受性色素または他の蛍光色素分子）、ハプテンまたは免疫原性分子（例えば、その分子に対して特異的な抗体によって結合されているもの）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、場合により１つ以上のヘテロ原子及び分枝鎖または主鎖置換基を含んでいる、炭素原子１〜３０個の直鎖または分枝鎖を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される原子の多原子直鎖または分枝鎖を含む。リンカー部分に含まれる官能基は、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、＝Ｃ＝、ＣＯ、ＣＯＮＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−、−Ｓ−などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカー部分は１つ以上の（ＣＨ２）２Ｏ基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は１つ以上のＣＯＮＨ基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ［（ＣＨ２）２Ｏ］２または（ＣＨ２）４ＣＯＮＨ［（ＣＨ２）２Ｏ］４を含む。いくつかの実施形態では、組成物は式：
【００２９】
【化７】
2017534627.tif 000009
【００３０】
を有する化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】例示的なプローブ開発手順の模式的フローである。化学的足場である４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン（ゲニステイン）を出発物質とし、引き続き断片を基にした化学的多様化合成方法を行い、並行して細胞浸潤性及び細胞成長阻害の生物学的アッセイを繰り返した。細胞浸潤性を阻害したが、細胞成長を阻害しなかった化合物を選択して、更に修飾及び評価を行った。最初の合成は、個々の化学断片の除去を試験するように設計した。この方法では、有効性（細胞浸潤性の阻害）を媒介する際の官能基の重要性を判定した。以降、構造活性相関（ＳＡＲ）の正確な知見に基づいて有効性の改善を試みると同時に、毒性（細胞成長の阻害）を除外した。最初のアッセイはＰＣ３及びＰＣ３−Ｍ細胞を用いて実施した。しかしながら、これらの試験でも類似した結果が得られたため、以降のスクリーニングアッセイはＰＣ３−Ｍ細胞のみを利用した。化学合成経路の設計に関しては、有効性及び毒性パラメーターを優先した。化学合成経路に追加の設計機能を含めたが、これは有効性及び毒性パラメーターを損なわない場合に限り組み込んだ。このような追加の設計機能としては、エストロゲン受容体（ＥＲ）とゲニステインの結合を媒介する断片の除去が挙げられ、これはＥＲ−ゲニステインの３Ｄ  Ｘ線結晶構造（タンパク質データベースＩＤ：結合したゲニステインを有するＥＲα及びＥＲβそれぞれの結晶構造に対して１Ｘ７Ｒ及びＩＸ７Ｊ）によって決定される。これらの機能には、急速な代謝、特にシトクロムＰ４５０（ＣＹＦ）経路による代謝に対する感受性を増加させると考えられる化学断片の除去も含まれていた。最後の機能は、Ｌｉｐｉｎｓｋｉらにより記載されたもの（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含め、効果的な薬物との関連性が以前に示され、一般により好ましい薬学的特性も一緒に付与する化学的特性の組み込みを伴うものであった。
【図２】ＫＢＵ２０４６は、細胞運動性を選択的に阻害する。（図２Ａ）細胞浸潤性。ヒト前立腺転移細胞（ＰＣ３、ＰＣ３−Ｍ）ならびにＨＰＶ形質転換正常細胞（１５３２ＮＰＴＸ、Ｉ５４２ＮＰＴＸ）及び原発癌細胞（１５３２ＣＰＴＸ、１５４２ＣＰＴＸ）を１０μＭのゲニステイン（Ｇ）、ＫＢＵ２０４６（４６）またはビヒクル（ＣＯ）で処置し、３日後に細胞浸潤性を測定した。値は平均±ＳＥＭである。（図２Ｂ）単一の細胞遊走。１０μｍＭのＫＢＵ２０４６またはビヒクル（対照）で３日間処置した後、細胞遊走を測定した。値は平均±ＳＥＭである。＊対照との比較によるスチューデントｔ検定Ｐ値＜／＝０．０５。（図２Ｃ）細胞成長阻害。ＫＢＵ２０４６またはゲニステインが３日後に細胞成長を２０％（ＩＣ２０）及び５０％（ＩＣ５０）阻害した濃度、ならびに５０μｍでの成長阻害率を示す。値は平均±ＳＥＭである。（図２Ｄ）ヒト臍帯血造血幹細胞コロニー形成アッセイ。値はＫＢＵ２０４６による処置後１４日目の総ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭまたはＢＦＵ−Ｅコロニーの平均±ＳＤ数である。（図２Ｅ）エストロゲン応答遺伝子の誘導。値は平均±ＳＤである。
【図３】ＫＢＵ２０４６は癌転移を阻害し、寿命を延長する。（Ａ、Ｂ）ＰＣａ転移の誘導。ヒトＰＣａ  ＰＣ３−Ｍ細胞を正所性移植した無胸腺マウス（Ａ）のコホートまたは腫瘍を持たない無胸腺マウス（Ｂ）のコホートを、食餌混合したＫＢＵ２０４６で処置し、結果として生じる肺転移（Ａ）またはＫＢＵ２０４６の血漿濃度（Ｂ）を測定した。値は平均±ＳＥＭである。用量と転移間の関係を双方向ＡＮＯＶＡによって評価した（Ａ）。（Ｃ）ＫＢＵ２０４６の薬物動態の包括的な特性決定。ＣＤ１マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＫＢＵ２０４６を経口胃管栄養または静脈内注射（ｉｖ）により投薬し、指定された時点で血液を採取した。水平点線は２４ｎＭの濃度を示したが、これは転移が９２％抑制されたマウスの血液で測定されたＫＢＵ２０４６の濃度（Ａ、Ｂ）であった。（Ｄ）ＢＣａを有するマウスの寿命延長。マウスにヒト乳癌ＬＭ２−４Ｈ２Ｎ細胞を正所性移植し、結果として生じる原発腫瘍を切除して、１日１回の経口胃管栄養法によるＫＢＵ２０４６の投与を週５回行うことによって補助治療を開始した。
【図４】ＫＢＵ２０４６はＭＫＫ４経路を阻害しない。（Ａ）ヒトＰＣａ細胞転移を調節する確立されたＭＫＫ４経路を示す。（Ｂ）蛍光によるサーマルシフトアッセイで測定されるように、ＫＢＵ２０４６はＭＫＫ４と結合しない。値は、指定濃度のＫＢＵ２０４６またはゲニステインで誘導された精製済み組み換えＭＫＫ４の融解温度（ΔＴｍ）の平均±ＳＤ増加である。（Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、ＫＢＵ２０４６はＭＫＫ４を阻害しない。指定濃度のＫＢＵ２０４６を組み換え活性化ＭＫＫ４に添加し、細胞死キナーゼｐ３８ａ  ＭＡＰＫ（Ｋ５３Ａ）のリン酸化能を、総量（ｐ３８  ＭＡＰＫ）及びリン酸化（ｐｐ３８  ＭＡＰＫ）形態のｐ３８  ＭＡＰＫのウエスタンブロットにより測定した。（Ｄ、Ｅ）ＫＢＵ２０４６は、細胞内のｐ３８  ＭＡＰＫまたはＨＳＰ２７の下流リン酸化を阻害しない。ＰＣ３−Ｍ細胞は、記載のように５０μＭのＫＢＵ２０４６またはゲニステインで２４時間前処理した後、ＴＧＦβで処理し、ウエスタンブロットを実施した。
【図５】ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化は、細胞浸潤性の調節因子及びＫＢＵ２０４６有効性の媒介因子であると同定される。（Ａ）ＫＢＵ２０４６が誘導するタンパク質リン酸化の変化についてのプローブ。ＰＣ３−ＭまたはＰＣ３細胞をＫＢＵ２０４６で前処理した後、±ＴＧＦβで処理して、得られた細胞溶解物のタンパク質リン酸化の変化をＫｉｎｏｍｅＶｉｅｗ（登録商標）アッセイを用いてプローブした。示されたウエスタンブロットは、ＫｉｎｏｍｅＶｉｅｗ（登録商標）のリン酸化モチーフ抗体、ＢＬ４１７６を利用している。矢印はリン酸化がＫＢＵ２０４６によって阻害される８３ｋＤａのバンドを示している。（Ｂ）プロテオーム解析。ＰＣ３細胞をＫＢＵ２０４６またはビヒクルで前処理した後、ＴＧＦβで処理し、得られた細胞溶解物由来のタンパク質をＢＬ４１７６によって免疫沈降させ、ＨＳＰ９０βをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって同定した。抗体によって認識されたリン酸化モチーフに下線が引かれている。Ｓ＊はＳｅｒ２２６を意味し、そのリン酸化はＫＢＵ２０４６によって減少している。（Ｃ、Ｄ）ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化状態は、ヒトＰＣａ細胞浸潤性を調節するとともに、ＫＢＵ２０４６の作用に必要である。ＰＣ３−Ｍ細胞にＳ２２６Ａ−、Ｓ２２６Ｄ−もしくはＷＴ−ＨＳＰ９０β、または空のベクター（ＶＣ）でトランスフェクトし、ＫＢＵ２０４６またはビヒクルで処理して細胞浸潤性を測定した。値は、複数の実験のうち代表的な実験の平均±ＳＥＭである。
【図６】ＫＢＵ２０４６はＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体を安定化させる。（Ａ）ＤＡＲＴＳアッセイにおいて、ＫＢＵ２０４６はＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体を安定化している。等モル量のＨＳＰ９０Ｂ及びＣＤＣ３７タンパク質をＫＢＵ２０４６とともに前インキュベートし、得られたテモリシン（ｔｈｅｍｌｏｌｙｓｉｎ）反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色法によって検出した。矢印で示されたタンパク質バンドの平均値を各レーンの下に示しており、これは無処置の対照の比率として表されている。濃度によるバンド強度の変化のＡＮＯＹＡ  Ｐ値を示す。（Ｂ）ＨＳＰ９０βのＧｌｎｌ１９とのＫＢＵ２０４６水素結合を表す、ＣＤＣ３７及びＨＳＰ９０βのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデル。（Ｃ）ＫＢＵ２０４６と結合するＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βのリガンド結合ポケットの計算モデルの親油性ポテンシャル面。（Ｄ）ＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０β二量体全体のポテンシャル面。
【図７】ＫＢＵ２０４６の例示的合成。
【００３２】
図７Ａ〜Ｈは合成過程番号１のものである。この足場が抗細胞浸潤有効性であったことから、個々の官能基を欠く一連の化合物を合成し、その細胞浸潤及び細胞成長阻害に対する効果を評価することによって、どの化学的断片が活性に必要であるかを最初に評価した。有益な知見として、環状Ｃ４’−ヒドロキシル基が活性に必要であること（化合物１と２との比較）、Ｃ７−ヒドロキシル基（ＥＲとの結合を媒介する）の除去が活性に影響しないこと（化合物２と８の比較）が挙げられる。他の関連する知見は、Ｃ４’−ヒドロキシルの移動が活性の保持と関係すること（化合物２と５との比較）、及び浸潤性への影響を最小限に抑えながら成長阻害を達成できることである（化合物１、３、４及び６を検討する）。細胞内の脱メチル化は推定することができない。したがって、機能の欠損は単に、メチル化化合物に有益であると考えられた。例えば、化合物７では、Ｃ４’−ヒドロキシル基のメチル化が浸潤性の欠損をもたらしている（例えば、化合物８との比較）。これは更に、活性にとってのＣ４’−ヒドロキシルの重要性を表している。対照的に、化合物１６のＣ７−及びＣ４’−ヒドロキシル基はメチル化されているが、抗浸潤性活性が保持されている。これは、おそらく細胞内部の脱メチル化が結果に影響している可能性があることを示している。細胞浸潤性に関しては、ＰＣ３−Ｍ細胞を１０μＭの化合物で合計３日間処理し、化合物存在下で、３日目の終わりに細胞浸潤性アッセイを実施した。値は平均±ＳＥＭである。３日間のＭＴＴ細胞成長阻害アッセイをＰＣ３−Ｍ細胞で実施した。値は平均±ＳＥＭである。
【００３３】
図７Ｊ〜Ｍは、合成過程番号２のものである。最初の構造活性相関（ＳＡＲ）データから２回目の化合物合成の情報を得た。主要な生物学的結果：細胞成長の阻害に与える影響を最小限に抑えながら、抗浸潤性の有効性を保持することができる（化合物２２）。加えて、Ｃ２−Ｃ３二重結合の還元は、活性欠損を与えず（化合物２２）、細胞のオフターゲット毒性を低減すると思われる。その他の結果：クマリン核を生成するＣ４カルボニル基の移動は、活性の欠損をもたらす（例えば、化合物２３、２４及び２５）。
【００３４】
図７Ｎ〜Ｑは合成過程番号３のものである。ハロゲンによるＣ４’−ヒドロキシル基の置換は、活性の維持と関係している（化合物３７及び３８）。化学成分は強い抗浸潤効果を有するが、依然として成長阻害効果も保持することが確認されている（化合物３８）。
【００３５】
図７Ｒ〜Ｕは、合成過程番号４ＫＢＵ２０４６（化合物４６）のものである。これは、出発化合物、４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボンの有効性と少なくとも同等の抗浸潤有効性をもつが、成長阻害効果を有しないことが同定された。４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボンと比較して、ＫＢＵ２０４６は、非平面状で、ヒドロキシル基（特にＥＲ結合を媒介するもの）がなく、ハロゲン置換されており、明らかに異なる生物学的プロファイルを有している。これらの特徴により、出発化合物と比較して、ＫＢＵ２０４６は化学的に異なるクラスのものとされている。
【図８】ＫＢＵ２０４６は、ＮＣＩ  ６０細胞株パネルにおいて最小〜無の細胞毒性を有する。ＫＢＵ２０４６に対して、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＴＰ）を行い、ＤＴＰのプロトコルに従ってＮＣＩ  ６０細胞株パネルを網羅する初期スクリーニング（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を実施した。その結果を比較図に示している。ＮＣＩは、細胞毒性の欠如に基づいて、ＫＢＵ２０４６を選択して複数用量試験を開始しなかった。
【図９】ＫＢＵ２０４６は、エストロゲン受容体（ＥＲ）を活性化しない。エストロゲン受容体陽性のＭＣＦ−７細胞をｐＥＲＥ−Ｌｕｃまたは空の対照ベクターで、構成的活性化β−ｇａｌとともにトランスフェクトし、エストロゲンのない条件下で成長させ、記載のようにナノモル濃度のエストラジオール、またはマイクロモル濃度のゲニステインまたはＫＢＵ２０４６で２４時間、前処理した。ルシフェラーゼ活性を測定して、β−ｇａｌの値を基に正規化し、無処置のベクターの対照細胞の比として値を表した。値は平均±ＳＤである。
【図１０】ＫＢＵ２０４６の化学的特性は、全身に送達されたとき細胞標的への到達能に有利である。低分子化合物のプローブは、全身レベルで生物学的有効性を示すには、身体内部のタンパク質標的に到達できる必要があるため、有利な薬理学的プロファイルを有していなければならない。有利な薬理学的属性と関連する認識された化学的特性（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を、ＫＢＵ２０４６の関連する化学的特性とともに表に示す。
【図１１】ＫＢＵ２０４６の広範囲な薬物動態学的（ＰＫ）分析。ＣＤ１マウスに２５または１００ｍｇ／ｋｇのＫＢＵ２０４６を経口胃管栄養または静脈内注射（ｉｖ）によって投薬し、血液を投薬後０（投薬前）、５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３６０、４８０および９６０分に採取した。（上部グラフ）時間に対する濃度をプロットし、ｎｇ／ｍｌで表した。１００ｍｇの投薬データを再プロットし、ｎＭで表した。（下部の表）結果として生じる薬物動態学的パラメーター。値は、個々の動物で測定した単一の血漿濃度を両方の用量の両方の投与経路についてプールして、同時にモデル化した、ｎａｉｖｅ  ｐｏｏｌｅｄ  ｄａｔａ法からのパラメーター推定値である。
【図１２】ＫＢＵ２０４６を示すグラフは、原発腫瘍細胞の成長を阻害しない。
【図１３】ＫＢＵ２０４６の治療は、全身のオフターゲット効果を伴わない。組織の組織学的検査のために、正所性移植を受けなかった６〜８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃ無胸腺マウスのコホート（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処置した。処置の３５日後に、以下の臓器を剖検で採取し、Ｈ＆Ｅ（指定されている別の染色方法）によって染色した：心臓、肺、食道、胃、大腸、小腸、肝臓（トリクローム染色）、腎臓（トリクローム染色）、副腎、膀胱、前立腺、脾臓、膵臓、脳、精巣ならびに骨髄血及び末梢血（ギムザ染色）。半定量的な組織学的評価法（Ｋｎｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、臓器の損傷を検査した。対照マウス及び処置マウスのいずれの肝臓を除いて臓器損傷は観察されなかった。対照マウスで観察された肝臓の変化は、ＫＢＵ２０４６の治療によって増加しなかった。マウスは免疫不全であり、肝臓の変化は、既往感染症と一致する偶発性の軽微な壊死巣の影響を反映し、臨床的にマウスはすべて健康であった。臓器機能を検査する試験には、２２〜２４ｇｍのＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）のコホートを使用した。尚、２２〜２４ｇｍ／マウスは、５〜７週齢の雌性及び４．５〜５．５週齢の雄性に相当する。マウスには、０（ビヒクル）、１５、７５または１２５ｍｇ／ｋｇ（体重）のＫＢＵ２０４６を１回静脈内投与した。８日目及び１４日目に、全重要臓器を計量し、血中の以下のパラメーターを測定した：コレステロール、トリグリセライド、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、ブドウ糖、リン、全タンパク質、カルシウム、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルブミン、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、白血球（分画）、赤血球、ヘモグロビン、血小板。これらのパラメーターのいずれにも異常な変化は観察されなかった。また処置マウスと対照マウスとの間に有意差はなかった。
【図１４】キノームに対するＫＢＵ２０４６の効果のプロテオーム解析。キノームに対する効果のスクリーニング。ＰＣ３−Ｍ細胞を１０μＭのＫＢＵ２０４６、ゲニステインまたはビヒクル対照で３日間前処理した後、記載のようにＴＧＦβを用いて、または用いずに処理した。得られた細胞溶解物、及び１５０ｍｇ／ｋｇのＫＢＵ２０４６で処置したマウスまたは対照マウスから得た（図３Ａの原稿の）腫瘍由来の溶解物を更に、ＫｉｎｏｍｅＶｉｅｗ（登録商標）抗体パネルを用いてウエスタンブロットによりプローブした。ＫＢＵ２０４６が細胞内及び腫瘍内のタンパク質リン酸化を阻害していた例では、ＰＣ３−Ｍ細胞の実験を繰り返し実施した。ＰＣ３−Ｍ細胞の追加に加えて、実験を拡張してＰＣ３細胞に対する効果を調べた。（Ａ）目的とする８３ｋＤａバンドの同定は、複数の実験にわたって再現性のあった変化のみで構成され、これは、ＰＣ３及びＰＣ３−Ｍ細胞、ならびに腫瘍組織において観察された。（Ｂ）最初の目的とするバンドが再現されなかった。（Ｃ、Ｄ）最初のスクリーニングで評価されたリン酸化モチーフ抗体の他のすべてのウエスタンブロット。ＮＩ＝有益ではない腫瘍；これは、異常なクマシーブルー染色パターンをもたらした腫瘍サンプルを示す。
【図１５】ＫＢＵ２０４６は、ＴＧＦβ処理の条件下で、より大きな有効性を示す。ＫＢＵ２０４６またはビヒクル対照（ＣＯ）、次いでＴＧＦβを用いて、または用いずに前処理したＰＣ３−Ｍ細胞の浸潤性を測定した。
【図１６】プロテオーム方法を使用した８３ｋＤａのバンドの同定。ＰＣ３細胞を１０μＭのＫＢＵ２０４６またはビヒクル（対照）で３日間、前処理した後、ＴＧＦβで１時間処理し、得られた細胞溶解物をＢＬ４１７６（Ｋｉｎｏｖｉｅｗ（登録商標）のリン酸化モチーフ抗体）を用いて免疫沈降させた。この方法で結合するタンパク質をＰｈｏｓｐｈｏＳｃａｎ（商標）技術を使用して分析した。この分析から、３０６の親タンパク質由来の４８３の固有のリンペプチド割り当てを同定した。平均の誤検出率は０．３０％であった（前方及び後方タンパク質エントリの複合ヒトデータベースのＳｏｒｃｅｒｅｒ検索による推定）。処置群及び対照群の平均値がバックグラウンドの各々３倍であったタンパク質のみを考慮した。更に、各反復値（平均の算出に使用した）が上記バックグラウンドの２．５倍以上であることを必要とした。これらのパラメーターによると、対照と比較してＫＢＵ２０４６で処理された細胞で発現が減少したリン酸タンパク質は１９であった。
【図１７】ＨＳＰ９０βのノックダウンは、細胞浸潤性を減少させ、ＫＢＵ２０４６の有効性を阻害する。ＰＣ３−Ｍ細胞は、ＨＳＰ９０βを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＳＰ９０β）または非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯ）でトランスフェクトした。（上部）ＨＳＰ９０βのレベル及びＨＳＰ９０α（ＨＳＰ９０α）転写物レベルはｑＲＴＩＰＣＲで測定し、ＧＡＰＤＨのものと比較して表した。（下部）細胞をＫＢＵ２０４６（４６）またはビヒクルで処理し、細胞浸潤性を測定した。値は平均±ＳＥＭである。
【図１８】ＫＢＵ２０４６は、ＨＳＰ９０βまたはＣＤＣ３７と結合する。試験では、精製した組み換えＨＳＰ９０ＢまたはＣＤＣ３７を使用した。等温滴定型カロリメトリーによって、または蛍光によるサーマルシフトアッセイによって測定したところ、ＫＢＵ２０４６がＨＳＰ９０βまたはＣＤＣ３７のいずれかと結合することは証明されなかった。ＤＡＲＴＳアッセイでは、ＨＳＰ９０βまたはＣＤＣ３７を個別にＫＢＵ２０４６でプレインキュベートして、テノリシン（ｔｈｅｎｎｏｌｙｓｉｎ）を添加し、反応生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離して銀染色法により可視化した（上部に示す）。ＮＴｃｏ＝非テノリシン対照。
【図１９】ＫＢＵ２０４６は、無傷細胞には結合するが、単離されたタンパク質には結合しない。（Ａ）ビオチンと結合されたＫＢＵ２０４６の化学構造（ＫＢＵ２０４６−ビオチン）。（Ｂ）ＫＢＵ２０４６−ビオチンは生物学的に活性である。ＰＣ３−Ｍ細胞を１０μＭのＫＢＵ２０４６またはＫＢＵ２０４６−ビオチンで、３日間前処理し、単一の細胞運動性アッセイを実施した。データは平均±ＳＥＭである。（Ｃ）ＫＢＵ２０４６−ビオチンは、競合可能な方法で細胞を標識する。ＰＣ３−Ｍを１μＭのＫＢＵ２０４６−ビオチン＋／−１０μＭの遊離ＫＢＵ２０４６で標識した後、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンによる検出、及び蛍光顕微鏡検査法での可視化を行った（曝露時間は同一）。（Ｄ）タンパク質配列のハイブリダイゼーション。ＫＢＵ２０４６−ビオチンを０．５及び１０μＭで、１０倍の過剰な遊離ＫＢＵ２０４６を添加して、または添加せずに、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ヒトタンパク質マイクロアレイにハイブリダイズした。まず以下の基準を満たしたタンパク質を探索し、これを濃度０．５及び１０μＭ両方のＫＢＵ２０４６−ビオチン（遊離ＫＢＵ２０４６を含まない）で同様に行った：Ｚスコア２．５超、Ｚ因子０．５超、ＣＩ  Ｐ値０．０５未満、陰性対照値２，０００未満（相対蛍光単位；ＲＦＵ）、ならびに１０μＭ及び０．５μＭ条件下でのシグナル／陰性対照シグナルがそれぞれ１０超及び５超。これにより、０．０３％の初期ヒット率で３つのタンパク質を得た（表に示す）。更に、遊離ＫＢＵ２０４６が、残り２つの候補の結合を７５％超阻害してイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）を除去する必要があった。結合シグナルは０．５から１０へと２倍になり、一方で遊離ＫＢＵ２０４６による競合率は著しく減少した。非特異的結合はビオチンリンカー部分によるものと推測される。タンパク質配列に使用した陽性対照はスタウロスポリンであった。スタウロスポリンは、いずれも広域キナーゼ阻害剤である小分子複合天然生成物であるという点でゲニステインと類似している。ＫＢＵ２０４６−ビオチンによる結合がない場合とは対照的に、スタウロスポリンは、バックグラウンドのレベルよりも１０倍以上のレベルで２１４のタンパク質と結合した。このようなタンパク質の大多数はキナーゼであった。ＨＳＰ９０β及びＣＤＣ３７の両方がタンパク質配列に存在し、ＫＢＵ２０４６−ビオチンによって結合しなかった。
【図２０】結合阻害剤とのＨＳＰ９０ヌクレオチド結合部位表面を示した（パネルＡ）（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤＣ３７と複合体化されると、境界に大きなクレフトが形成される（パネルＢ）。ＣＤＣ３７  Ａｒｇ１６７残基は、２つの異なるサブポケットにクレフトを分裂させる（パネルＣ）。ヌクレオチド結合面（Ｃ）は保持されるが、新たにサブポケットが形成される。ＫＢＵ２０４６は新たに形成された部位（Ｃ）にドッキングされることがわかる。ＫＢＵ２０４６化合物を新たに形成されたポケットにドッキングした。種々の方法論及び手法に相当する一連のドッキングソフトウェアを適用した。ドッキング手順で許容される場合、ＨＳＰ９０β−ＣＤＣ３７複合体からの側鎖は完全な柔軟性であった。複合体との立体的衝突を呈さない、全原子にわたる根平均二乗距離（ＲＭＳＤ）が１．１オングストローム未満でコンセンサス位置に達した。このモデルは、分子がこの二次部位と結合できることを示唆している。閉構造のＨＳＰ９０β構造の二量体は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＳＰ９０Ａ（ＰＤＢ  ｉｄ＝２ｃｇ９）からモデル化された。この二量体の構造では、ＨＳＰ９０β−ＣＤＣ３７境界の相互作用が維持された。拡張されたＣＤＣ３７領域の位置及び配向は、残基５３〜３４７、１０７〜３４７及び６９〜２８６間のドメイン間架橋を示した架橋データに従った。この結果生じる構造は、他の報告された構造（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）との一致を示す。このモデルで、ＡＴＰ及び提案するＫＢＵ２０４６ポケットはいずれも、二量体化複合体において元のままである。
【図２１】ＫＢＵ２０４６は、オステオネクチンの発現を阻害する。ＰＣ３細胞を１０ｕＭのＫＢＵ２０４６を用いて／用いずに３日間処理し（Ａ）、またオステオネクチンを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＯＳＴ）または非ターゲティング（ｓｉＣＯ）でトランスフェクトし（Ｂ）、オステオネクチン／ＧＡＰＤＨ発現をｑＲＴ／ＰＣＲで測定した。（Ｃ）ＰＣ３細胞をｓｉＯＳＴ、ｓｉＣＯでトランスフェクトし、ＫＢＵ２０４６を用いて／用いずに処理し、細胞浸潤性を測定した。
【図２２】ＫＢＵ２０４６はＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体と結合し、ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６リン酸化を阻害することによって細胞浸潤性を阻害する。（Ａ）ＤＡＲＴＳアッセイにおいて、ＫＢＵ２０４６はＨＳＰ９０β及びＣＤＣ３７タンパク質を安定化させる。サーモリシンを、組み換え精製されたＨＳＰ９０βとＣＤＣ３７との等モル混合物に添加し、ＫＢＵ２０４６でプレインキュベートした後、銀染色法による検出を行った。矢印で示されたタンパク質バンドの平均値を各レーンの下に示す。ｐ値はＡＮＯＶＡである。（Ｂ）ＫＢＵ２０４６はＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７／ＣＫを安定化させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、ＨＳＰ９０β、ＣＤＣ３７及びカゼインキナーゼ（ＣＫ）を添加し、続いてホスホセリン（Ｐ−ｓｅｒ）、またはＨＳＰ９０βのリン酸化されたｓｅｒ２２６（Ｐ−ｓｅｒ２２６）に対して特異的なＡｂでウエスタンブロットを行った。ＨＳＰ９０βの一次分解産物は、ＣＫが差次的に接触できるセリン残基を曝露する。最下部パネルでは、シグナルがＣＫの存在に依存することを示す。（Ｃ）ＣＤＣ３７−ＨＳＰ９０βヘテロ複合体と結合したＫＢＵ２０４６のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデル。
【図２３】ＫＢＵ２０４６ビオチンリンカー。（Ａ）ビオチンと結合したＫＢＵ２０４６の化学構造（ＫＢＵ２０４６−ビオチン）。（Ｂ）ＫＢＵ２０４６−ビオチンは、生物学的に活性である。ＰＣ３−Ｍ細胞を１０μＭのＫＢＵ２０４６またはＫＢＵ２０４６−ビオチンで３日間前処理し、単一の細胞運動性アッセイを実施した。（Ｃ）ＫＢＵ２０４６−ビオチンは細胞を染色し、１０倍の遊離ＫＢＵ２０４６と競合させる。
【図２４】ＫＢＵ２０４６は、ＡＲ−シャペロン経路、ならびにアンドロゲン作動性のシグナル伝達及び成長を阻害する。（Ａ）ＫＢＵ２０４６は、約６２ｋＤａのタンパク質のＨＳＰ９０βとの結合を減少させる。ＰＣ３−Ｍ細胞をＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０βでトランスフェクトし、１０ｕＭのＫＢＵ２０４６で２４時間処理し、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０βを免疫沈降させ、銀染色法によりタンパク質を検出した。（Ｂ）ＫＢＵ２０４６は、ＨＯＰのＨＳＰ９０βとの結合を減少させる。同一条件（Ａ）で、引き続きＨＯＰのウエスタンブロットを行った。（Ｃ）ＫＢＵ２０４６は、ＡＲ転写活性を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞をチャコール処理済み血清（ＣＳＳ）中で、１０ｕＭのＫＢＵ２０４６（４６）、１０ｕＭのビカルタミド（Ｂ）または１．０ｎＭのＲ１８８１で処理し、２４時間後にｑＲＴ／ＰＣＲによってＰＳＡを測定した（ＧＡＰＤＨ及び無処置対照に基づいて正規化）。（Ｄ）ＫＢＵ２０４６はアンドロゲン作動性の成長を阻害し、ビカルタミドの有効性を増加させる。ＬＮＣａＰ及びＶＣａＰ細胞はＣＳＳ中で３日間プレインキュベートした後、示されるよう３または６日間処理し、細胞数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、特定の治療のレシピエントとなる、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物などを含むがこれらに限定されない。通常、用語「対象」及び「患者」は、ヒト対象に関して本明細書で同義に使用される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「癌を有する疑いがある対象」は、癌の指標である１つ以上の症状（例えば、顕著なしこりまたは腫瘤）が表れている対象、または癌のスクリーニングを受ける対象（例えば、日常的な健康診断時）を指す。癌を有する疑いがある対象は、１つ以上の危険因子を有する場合もある。癌を有する疑いがある対象は通常、癌検査を受けていない。ただし、「癌を有する疑いがある対象」には、予備的診断（例えば、腫瘤を映すＣＴスキャン）は受けたが、確定検査（例えば、生検及び／または組織学検査）は受けていない、または癌のステージが不明である個人を包含する。この用語は更に、過去に癌であった人（例えば、寛解期にある個人）を含む。「癌を有する疑いがある対象」は癌と診断される場合もあれば、癌を有していないことが判明する場合もある。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「癌と診断された対象」は、検査を受けて、癌細胞を有すると判明した対象を指す。癌は、生検、Ｘ線、血液検査及び本発明の診断方法を含むがこれらに限定されないが、任意の好適な方法を使用して診断することができる。「予備的診断」は、目視（例えば、ＣＴスキャンまたはしこりの存在）及び／または分子スクリーニング検査のみに基づくものである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「初期診断」は、（例えば生検及び組織学検査を使用して）癌細胞の有無を明らかにする初期の癌診断の検査結果を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍組織」は、対象内部の癌組織を指し、更に腫瘍範囲の起源細胞の位置に応じて、「前立腺腫瘍組織」、「肺腫瘍組織」、「乳房腫瘍組織」などと称する場合もある。いくつかの実施形態では、腫瘍組織は、「術後腫瘍組織」であり、これは（例えば、手術中に）対象から切除された癌組織を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「該腫瘍の転移リスクを特定すること」は、腫瘍転移の相対的リスク（例えば、確率または相対的スコア）を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「該腫瘍の再発リスクを特定すること」は、原発腫瘍と同じ臓器で腫瘍が再発する相対的リスク（例えば、確率または相対的スコア）を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「癌のリスクがある対象」は、特定の癌の発現させる１つ以上の危険因子を有する対象を指す。危険因子としては、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、及び過去の癌病歴、癌以外の既存疾患及び生活様式が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「対象の癌の特性を決定する」は、良性、前癌性または癌性組織の存在及び癌のステージを含むがこれに限定されないが、対象の癌サンプルの１つ以上の特性の同定を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「癌のステージ」は、癌の進行度の定性的または定量的評価を指す。癌のステージの決定に使用する基準は、腫瘍のサイズ、他の身体部分への腫瘍の拡散の有無、及び癌の拡散の有無（例えば、同一の臓器もしくは身体領域内、または他の臓器への）を含むが、これらに限定されない。いくつかの病期分類方法が一般に使用されている。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「対象の組織の特性を決定する」は、組織サンプルの１つ以上の特性の同定を指す（例えば、限定されないが、癌組織の存在、癌になる可能性が高い前癌組織（例えば、前立腺上皮内腫瘍形成、すなわちＰＩＮ）の存在、転移の可能性が高い癌組織の存在を含む）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「予後を判定する」は、癌の存在（例えば、本発明の診断方法により特定されたもの）が対象の将来的な健康（例えば、予測される罹患率または死亡率、癌にかかる可能性及び転移リスク）に与える影響に関する情報を提供することを指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は最も広義に使用される。ある意味では、これは、任意の源から得た検体または培養物、ならびに生体サンプル及び環境サンプルを含むことを意味する。生体サンプルは、動物（ヒトを含む）から得ることができ、流体、固体、組織及び気体を包含し得る。生体サンプルには、血液製剤、例えば血漿、血清などを含む。環境サンプルには、環境物質、例えば表面物質、土壌、水及び工業サンプルを含む。ただし、このような例は、本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとは解釈されない。
【００４９】
本明細書では、癌細胞運動性及び／または転移を阻害する組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、癌細胞運動性を阻害する、転移を阻害する、かつ／または癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌など）を治療するため、ＫＢＵ２０４６（または、その類似体）及び１種以上の追加療法（例えば、癌療法（例えば、ホルモン療法））を提供する。
【００５０】
本明細書のいくつかの実施形態では、細胞運動性及び／または転移を阻害する１種以上の薬剤（例えば、ＫＢＵ２０４６）を含んでいる治療組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このような化合物の投与（または、共投与）による癌の治療、癌細胞運動性の阻害、転移の阻害、ヒトの寿命延長などの方法を提供する。
【００５１】
加えて、本明細書に記載する薬剤（例えば、ＫＢＵ２０４６及びその類似体）を、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、化学療法剤、ホルモン療法、抗体または抗生物質を含むがこれらに限定されない他の治療薬とともに使用することができる。使用できる特定の治療薬としては、以下の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない：アゾベンゼン化合物（米国特許第４，３１２，８０６号、参照により本明細書に組み込まれる）、ベンジル置換ローダミン誘導体（米国特許第５，２１６，００２号、参照により本明細書に組み込まれる）、亜鉛Ｌ−カルノシン塩（米国特許第５，２３８，９３１号、参照により本明細書に組み込まれる）、３−フェニル−５−カルボキシピラゾール及びイソチアゾール（米国特許第５，２９４，６３０号、参照により本明細書に組み込まれる）、ＩＬ−１０（米国特許第５，３６８，８５４号、参照により本明細書に組み込まれる）、キノリンロイコトリエン合成阻害剤（米国特許第５，３９１，５５５号、参照により本明細書に組み込まれる）、２’−ハロ−２’デオキシアデノシン（米国特許第５，５０６，２１３号、参照により本明細書に組み込まれる）、フェノール及びベンズアミド化合物（米国特許第５，５５２，４３９号、参照により本明細書に組み込まれる）、トリブチリン（米国特許第５，５６９，６８０号、参照により本明細書に組み込まれる）、ある特定のペプチド薬（米国特許第５，７５６，４４９号、参照により本明細書に組み込まれる）、オメガ−３多不飽和酸（米国特許第５，７９２，７９５号、参照により本明細書に組み込まれる）、ＶＬＡ−４遮断薬（米国特許第５，９３２，２１４号、参照により本明細書に組み込まれる）、プレドニゾロンメタスルホベンゾエート（米国特許第５，８３４，０２１号、参照により本明細書に組み込まれる）、サイトカイン抑制剤（米国特許第５，８８８，９６９号、参照により本明細書に組み込まれる）、ｐ３８阻害剤（Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  １０．１０２１／ｊｍ８００５４１７；Ｃｕｅｎｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６４：２２９−３３；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２８４：６８７−９２；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｔ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１２１１６−２１；Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：３５６３−７１；Ｂｕｏ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：６４−８；ＷＯ／２００７／１２６８７１；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ８：１２７６−８２；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）及びニコチン（米国特許第５，８８９，０２８号、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５２】
治療薬（例えば、ＫＢＵ２０４６）は、細胞の生存率または増殖可能性を低減する薬剤とともに使用することができる。細胞の生存率または増殖可能性を低減する薬剤は、例えば、ＤＮＡ合成の阻害、細胞分裂の阻害、アポトーシスの誘導、または非アポトーシス細胞死の誘導を含む、多様な方法で機能することができる。細胞毒性及び細胞増殖抑制性剤の具体例としては、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン及びその各Ａ鎖、ドキソルビシン、シスプラスチン、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、タキソール、５−フルオロウラシルＶＰ−１６、ブレオマイシン、メトトレキサート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＢＣＮＵ、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、ミトキサントロン及びシクロホスファミド、ならびにＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどの特定のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、細胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤には、例えば、放射性核種、化学療法剤、タンパク質及びレクチンを含むことができる。
【００５３】
ホルモンに感受性である細胞（例えば、前立腺及び乳癌）の生存率及び増殖可能性を低減する薬剤は、ホルモンの作用に拮抗すること、及びホルモンの標的、特にホルモン受容体及びその付随する共調節因子の機能を排除または変更することによって、例えば、アンドロゲン及びエストロゲンを含めたホルモンの産生阻害、ホルモンの代謝増加を含む、多様な方法で機能することができる。ホルモン剤の具体例としては、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、エンザルアトミド、リュープロン、ゾラデックス、睾丸切除術、アビラテロン、タモキシフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、レトロゾール及び卵巣切除術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の文脈の範囲内で「治療すること」は、障害もしくは疾患に伴う症状のすべてもしくは一部の緩和、またはそれらの症状の更なる進行もしくは悪化の緩徐化、阻害もしくは停止、または疾患もしくは障害の発現リスクのある対象の疾患もしくは障害の防止もしくは予防を意味する。したがって、例えば、転移癌を治療することは、癌の転移の阻害もしくは防止、転移の速度及び／もしくは数の減少、転移した前立腺癌の腫瘍量の減少、転移した前立腺癌の完全なもしくは部分的な寛解、または他の任意の治療的利点を含むことができる。本明細書で使用される場合、本発明の化合物の「治療的有効量」は、障害もしくは疾患に伴う症状のすべてもしくは一部を緩和する、またはそれらの症状の更なる進行もしくは悪化を緩徐化、阻害もしくは停止する、または疾患もしくは障害の発現リスクのある対象の疾患もしくは障害を防止もしくは予防する化合物量を指す。
【００５５】
本発明で使用される本明細書に記載の化合物の治療的有効量は、投与経路及び剤形に応じて変更してよい。発明化合物の有効量は通常、約０．００１〜最大１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、より一般的には約０．０５〜最大１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。通常、本発明で使用する化合物または複数の化合物は、高い治療指数を示す製剤を提供するように選択される。治療指数とは毒性と治療効果との間の用量比であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比で表すことができる。ＬＤ５０は集団の５０％が死に至る用量であり、ＥＤ５０は集団の５０％に治療的に有効な用量である。ＬＤ５０及びＥＤ５０は、動物細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順で測定される。
【００５６】
治療はまた、本発明の化合物または医薬製剤を他の療法と組み合わせて投与することを含んでもよい。本発明の組み合わせは、同時に、個別にまたは逐次的に投与してよい。例えば、本発明の化合物及び医薬製剤は、外科的手技及び／または放射線療法の前、その間、またはその後に投与してもよい。あるいは、本発明の化合物はまた、本明細書に記載する他の抗癌剤とともに投与することもできる。追加する活性剤の具体的な量は、使用する特定の薬剤、治療または管理する病状の種類、病状の重度及びステージ、ならびに化合物及び場合により対象に同時に投与される任意の追加の活性剤の量（複数可）に依存する。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態において、１種以上の化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）及び追加の活性剤（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）は、化合物が他の薬剤と相互作用し、それ以外の方法で投与された場合に得られる利点よりも、増強された利点を提供できるような時間間隔で連続して対象（より一般的にはヒト）に投与される。例えば、追加の活性剤は、合剤によって共投与することも、同時に投与することも、または異なる時点に任意の順序で逐次的に投与することもできるが、同時に投与しない場合は、所望の治療効果または予防効果を与えるような十分に近い間隔で投与する必要がある。いくつかの実施形態では、化合物及び追加の活性剤は重複する時点で効果を示す。各追加の活性剤は、任意の適切な形態、及び任意の好適な経路で個別に投与することができる。他の実施形態では、化合物は、追加の活性剤の投与前、それと同時、またはその後に投与される。
【００５８】
種々の例において、化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）及び追加の活性剤（複数可）（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）は、約１時間未満の間隔で、約１時間間隔で、約１時間〜約２時間間隔で、約２時間〜約３時間間隔で、約３時間〜約４時間間隔で、約４時間〜約５時間間隔で、約５時間〜約６時間間隔で、約６時間〜約７時間間隔で、約７時間〜約８時間間隔で、約８時間〜約９時間間隔で、約９時間〜約１０時間間隔で、約１０時間〜約１１時間間隔で、約１１時間〜約１２時間間隔で、２４時間以下の間隔で、または４８時間以下の間隔で投与される。いくつかの実施形態では、療法は、１週間以上（例えば、１週、２週、１か月、２か月、３か月、４か月及びその範囲内）の投与間隔で逐次的に実施される。例えば、化学療法剤を毎月５サイクルで投与した後、その翌月にＫＢＵ２０４６による治療を行う。他の例では、化合物及び追加の活性剤を同時に投与する。更に他の例では、化合物及び追加の活性剤を合剤によって同時に投与する。
【００５９】
他の例では、化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）及び追加の活性剤（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）を約２〜４日間隔で、約４〜６日間隔で、約１週間隔で、約１〜２週間隔で、または２週超の間隔で投与する。
【００６０】
ある特定の例では、化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）及び場合により追加の活性剤（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）を対象に周期的に投与する。サイクル療法には、第１の薬剤の一定期間の投与と、それに続く第２の薬剤及び／または第３の薬剤の一定期間の投与、及びこの逐次的投与の繰り返しを伴う。サイクル療法は、例えば、１種以上の療法に対する耐性の発生を低減し、１種以上の療法の副作用を回避もしくは低減し、かつ／または治療の有効性を向上させるといった様々な利点をもたらすことができる。
【００６１】
他の例では、化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）及び場合により追加の活性剤（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）を約３週未満、２週毎に約１回、１０日毎に約１回、または毎週約１回のサイクルで投与する。１回のサイクルには、サイクル毎に約９０分、サイクル毎に約１時間、サイクル毎に約４５分、サイクル毎に約３０分、またはサイクル毎に約１５分にわたる注入による、本発明の化合物及び場合により第２の活性剤の投与を含み得る。各サイクルは、少なくとも１週の安静、少なくとも２週の安静、少なくとも３週の安静を含み得る。投与サイクル数は、約１〜約１２サイクル、より一般的には約２〜約１０サイクル、より一般的には約２〜約８サイクルである。いくつかの実施形態では、化合物（例えば、ＫＢＵ２０４６）は、長期間にわたり毎日投与される（例えば、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、その範囲内）。
【００６２】
一連の治療薬は同時に対象に実施することができ、例えば、個々の用量の追加の活性剤を、個別に、しかし薬剤（例えば、ＫＢＵ２０４６）が追加の活性剤（例えば、ホルモン療法剤、化学療法剤など）と相互作用できるような時間間隔内で投与される。例えば、ある成分を、２週毎に１回または３週毎に１回投与できる他の成分と併用して、１週間に１回投与することができる。換言すれば、療法剤が同時にまたは同日中に投与されない場合であっても、投与計画は同時に実施される。
【００６３】
活性剤（複数可）（例えば、ＫＢＵ２０４６、ホルモン療法剤、化学療法剤など）は相加的に、すなわちより一般的には相乗的に作用することができる。一例では、第１の薬剤（例えばＫＢＵ２０４６）は、同じ医薬組成物中の１種以上の第２の活性剤と同時に投与される。別の例では、第１の薬剤（例えばＫＢＵ２０４６）は、別の医薬組成物中の１種以上の第２の活性剤と同時に投与される。更に別の例では、本発明の化合物は、第２の活性剤の投与前または投与後に投与される。本発明は、同じまたは異なる投与経路、例えば経口及び非経口による、本発明の化合物及び第２の活性剤の投与を企図する。ある特定の実施形態では、第１の薬剤（例えばＫＢＵ２０４６）は、毒性を含むがこれに限定されない有害な副作用が生じる可能性がある第２の活性剤と同時に投与され、第２の活性剤は有害な副作用が誘発される閾値以下の用量で有利に投与することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＫＢＵ２０４６を含む）は、特定の薬剤、特にホルモン剤に対する耐性の阻害または逆転に有効である。これは、ＫＢＵ２０４６がＨＳＰ９０βの機能を阻害すること、ＨＳＰ９０βがホルモン受容体、特にアンドロゲン受容体を活性状態に維持すること、及びいくつかの耐性機構がアンドロゲン受容体の発現または変異したアンドロゲン受容体の発現の増加に関与することと関連している。両方の例において、ＫＢＵ２０４６は、活性化アンドロゲン受容体を除去する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物（例えば、ＫＢＵ２０４６）は、癌の初期発現を防止する際に有用であり、特に癌の「リスクがある」対象において有用である。その薬理学的作用はまた、癌予防剤としても好適なものとなり得る（例えば、細胞浸潤性を阻害するため）。癌細胞が発生している臓器の基底膜を介する癌細胞の浸潤は、癌の定義に必要な条件である。したがって、ＫＢＵ２０４６は癌の初期発現を阻害する。例えば、前立腺上皮内腫瘍形成（ＰＩＮ）をもつ男性は、その前立腺に存在する癌細胞を有する。それらの細胞はまだ基底膜に侵入していない。ＰＩＮを有する対象は、前立腺癌を発現するリスクが高い。一旦細胞が基底膜に侵入すると、診断はＰＩＮから前立腺癌に変わる。基底膜に侵入していない癌に使用される別の用語は、上皮内癌（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｎｃｅｒまたはｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ（ＣＩＳ））である。上皮内癌は前立腺、乳房（乳管または小葉；ＤＣＩＳ、ＬＣＩＳ）、肺及び大腸に見られる。各臓器でのＣＩＳの存在は浸潤癌の発現リスクを高くする。
【００６６】
本明細書では、本明細書に記載する１種以上の化合物、その薬学的に許容される塩、その立体異性体、その互変異性体またはその溶媒和物を、薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することによって調製できる、原発性及び／または転移性前立腺癌を阻害または治療するための医薬組成物及び医薬品を提供する。このような組成物は、例えば顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐剤、注射、エマルジョン、エリキシル、懸濁液または溶液の形態であり得る。組成物は、例えば経口、非経口、局所、直腸、経鼻、または埋込式リザーバー経由などによる種々の投与経路に合わせて製剤化することができる。非経口または全身投与には、皮下、静脈内、腹腔内及び筋肉注射を含むが、これらに限定されない。以下の剤形は例示を目的として示しており、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００６７】
経口、頬側及び舌下投与には、固体剤形として粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ジェルキャップ及びカプレットが許容される。これらは、例えば、本発明の１種以上の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはその互変異性体を、少なくとも１種の添加剤、例えばデンプンまたはその他の添加剤と混合することにより調製することができる。好適な添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマー、またはグリセリドである。場合により、経口剤形は、投与を補助するための他の成分、例えば不活性な希釈剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、またはパラベンもしくはソルビン酸などの防腐剤、またはアスコルビン酸、トコフェロールもしくはシステインなどの酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、矯味剤または香料を含有することができる。錠剤及びピルは更に、当技術分野で既知の好適なコーティング材料で処理されていてもよい。
【００６８】
経口投与のための液体剤形は薬学的に許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液及び溶液の形態であってよく、これには不活性な希釈剤、例えば水を含有してよい。医薬製剤及び医薬品は、無菌液、例えば限定されないが、油、水、アルコール及びこれらの組み合わせを使用して、懸濁液または溶液として調製されていてもよい。経口または非経口投与のため、薬学的に適した界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤を添加してもよい。
【００６９】
上記のように懸濁液に油が含まれていてもよい。このような油としては、ラッカセイ油、胡麻油、綿実油、コーン油及びオリーブ油が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁製剤はまた、脂肪酸のエステル、例えばオレイン酸エチル、イソプロピルミリステート、脂肪酸グリセリド及びアセチル化脂肪酸グリセリドを含有してもよい。懸濁製剤は、アルコール、例えば限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール及びプロピレングリコールを含んでもよい。懸濁製剤にはまた、例えばこれに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）などのエーテル、鉱油及びペトロラタムなどの石油炭化水素、ならびに水を使用してもよい。
【００７０】
注射可能な剤形は、一般に、好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を使用して調製できる水性懸濁液または油性懸濁液を含む。注射可能な形態は、溶媒または希釈剤によって調製される溶液相、または懸濁液の形態であってよい。許容される溶媒またはビヒクルは、滅菌水、リンゲル液または等張生理食塩水溶液を含む。あるいは、滅菌油を溶媒または懸濁化剤として使用してもよい。通常、天然油または合成油、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドを含む、油または脂肪酸は不揮発性である。
【００７１】
注射用の医薬製剤及び／または医薬品は、上記の適切な溶液を用いた復元に適した粉末であってもよい。これらの例としては、凍結乾燥粉末、回転乾燥粉末、もしくは噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。注射用の製剤は場合により、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤及びこれらの組み合わせを含有してもよい。
【００７２】
直腸投与用の医薬製剤及び医薬品は、腸、Ｓ状結腸及び／または直腸内で化合物を放出するための坐剤、軟膏、浣腸、錠剤またはクリームの形態であってよい。直腸坐剤は、本発明の１種以上の化合物、または化合物の薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、許容されるビヒクル、例えば、通常の保存温度では固相で存在し、直腸内などの体内での薬物放出に適した温度では液相で存在するカカオバターまたはポリエチレングリコールと混合することにより調製される。油はまた、軟質ゼラチンタイプの製剤及び坐剤の調製に用いてもよい。緩衝液及び防腐剤に加えて、懸濁化剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースも含有することができる懸濁製剤の調製に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、ならびにグリセロールを用いてもよい。
【００７３】
本発明の化合物は、経鼻または経口吸入によって肺に投与してもよい。吸入に適した医薬製剤は、任意の適切な溶媒、及び場合により他の化合物、例えば限定されないが、安定剤、抗微生物剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤及びこれらの組み合わせを含有する溶液、スプレー、乾燥粉末またはエアゾールを含む。吸入投与用の製剤は、例えば、ラクトース、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートなどを賦形剤として含有する。通常、吸入による発明化合物の送達に水性及び非水性エアゾールが使用される。
【００７４】
通常、水性エアゾールは、従来の薬学的に許容される担体及び安定剤とともに化合物の水溶液または懸濁液を製剤化することにより製造される。担体及び安定剤は、個々の化合物の要件に応じて異なるが、通常は非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ、プルロニックまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールを含む。エアゾールは一般に等張溶液から調製される。非水性懸濁液（例えば、フルオロカーボン噴射剤の状態）を本発明の化合物の送達に使用することができる。
【００７５】
本発明による使用のための化合物を含有するエアゾールは、吸入器、噴霧器、加圧パックまたはネブライザー、及び好適な噴射剤、例えば限定されないが、加圧したジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、窒素、空気または二酸化炭素を使用して好都合に送達される。加圧エアゾールの場合、計量された量を送達するバルブを設けることにより、投与量単位を制御することができる。化合物と好適な粉末塩基、例えばラクトースまたはデンプンとの混合粉末を含有する、吸入器または通気器で使用されるゼラチンなどのカプセル及びカートリッジを製剤化することができる。超音波ネブライザーを使用した、本発明のエアゾールの送達は、化合物の崩壊を引き起こし得る剪断力に薬剤が曝露されることをネブライザーが最小限に抑えるため有利である。
【００７６】
経鼻投与の場合、医薬製剤及び医薬品は、適切な溶媒（複数可）及び場合により他の化合物、例えば限定されないが、安定剤、抗微生物剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤及びこれらの組み合わせを含有するスプレー、点鼻剤またはエアゾールであってよい。点鼻剤の形態での投与の場合、化合物は油性溶液中で、またはゲルとして配合されてよい。点鼻エアゾール投与の場合、圧縮した空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素系の低沸点溶媒を含む、任意の好適な噴射剤を使用してもよい。
【００７７】
本発明の化合物の局所（頬側及び舌下を含む）投与または経皮投与のための剤形は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液及びパッチを含む。活性成分は無菌条件下で、薬学的に許容される担体または賦形剤、及び任意の防腐剤または必要な場合は緩衝液と混合することができる。粉末及びスプレーは、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末などの賦形剤、またはこれらの物質の混合物によって調製することができる。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルはまた、賦形剤、例えば動物性及び植物性油脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有してもよい。
【００７８】
経皮パッチは、本発明の化合物の体内への送達の制御をもたらすという付加的な利点を有する。このような剤形は、適した媒体に薬剤を溶解または分散させることによって製造することができる。本発明化合物の皮膚全体への浸透を増加させるために、吸収促進剤を使用することもできる。このような浸透の速度は、速度制御膜を設けること、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに化合物を分散させることによって制御することができる。
【００７９】
上記の代表的な剤形以外の薬学的に許容される賦形剤及び担体は一般に当業者に既知であり、そのため本発明に含まれる。このような賦形剤及び担体は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本発明の製剤は、後述するような短時間作用型、高速放出型、長時間作用型及び徐放型であるように設計してもよい。したがって、医薬製剤はまた、制御放出用または遅延放出用に製剤化してもよい。
【００８１】
本組成物はまた、例えば、ミセルもしくはリポソーム、ナノ製剤または何らかの他のカプセル化形態を含んでもよいか、または延長放出形態で投与して、長時間の保存及び／または送達効果を与えてもよい。したがって、医薬製剤及び医薬品は、ペレットまたはシリンダーに圧縮してもよいか、デポー注射として、またはステントなどのインプラントとして筋肉内または皮下に埋め込んでもよい。このようなインプラントには、既知の不活性材料、例えばシリコーン及び生分解性ポリマーを用いることができる。
【００８２】
具体的な投与量は、疾患の病状、対象の年齢、体重、全身健康状態、性別及び食事、用量間隔、投与経路、排泄率、ならびに併用薬物に応じて調整してよい。有効量を含有する上記剤形はいずれも、十分に規定実験の範囲内のものであり、したがって十分に本発明の範囲内のものである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、１種以上の薬剤（例えば、ＫＢＵ２０４６）は、（例えば、細胞運動性を阻害するため、前癌病変の浸潤を阻害するため、転移を阻害するためなどに）１種以上の追加治療、療法、療法剤及び／または処置（例えば、癌治療などのため）と併用投与される。本明細書に記載する実施形態はこれらの追加治療、療法、療法剤及び／または処置の範囲に限定されないが、ホルモン療法、化学療法、放射線、手術などを含む場合があり、本明細書に記載する薬剤（例えばＫＢＵ２０４６及びその類似体）とともに使用するのに適した薬剤としては以下が挙げられる。
【００８４】
アルキル化剤は、ＤＮＡ上の負電荷部位（例えば、酸素、窒素、リン及び硫黄原子）を攻撃してＤＮＡと結合し、それによって複製、転写及び更には塩基対合を変更する化学療法剤である。ＤＮＡのアルキル化はまた、ＤＮＡ鎖の切断及びＤＮＡ鎖の架橋も引き起こすと考えられている。この方法でＤＮＡを変更することによって、細胞活性が効果的に停止され、癌細胞は死滅する。一般的なアルキル化剤としては、プロカルバジン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、クロランブシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ブスルファン、チオテパなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述したようなアルキル化剤を、１種以上の他のアルキル化剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００８５】
白金化学療法剤は、ＤＮＡサブユニットを架橋することによってＤＮＡ合成、転写及び機能を阻害すると考えられている（架橋はＤＮＡの２つの鎖の間、またはＤＮＡの一方の鎖内で生じ得る）。一般的な白金化学療法剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、Ｅｌｏｘａｔｉｎなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述のような白金化学療法剤は、１種以上の他の白金及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００８６】
代謝拮抗化学療法剤は、新たなＤＮＡの作製に必要なものを含む、通常の代謝経路を妨げると考えられている。一般的な代謝拮抗剤としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（例えば、カペシタビン）、ゲムシタビン（２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン（β−異性体）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、シタラビン、テガフール、ラルチトレキセド、シトシンアラビノシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。硝酸ガリウムは、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する別の代謝拮抗剤である。上述のような代謝拮抗剤は、１種以上の他の代謝拮抗剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００８７】
アントラサイクリンは、遊離酸素ラジカルの形成を促進する。これらのラジカルは、ＤＮＡ鎖の切断と、それに続くＤＮＡ合成及び機能の阻害を引き起こす。アントラサイクリンはまた、酵素とＤＮＡとの複合体を形成することにより、酵素トポイソメラーゼを阻害する。一般的なアントラサイクリンとしては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなアントラサイクリンは、１種以上の他のアントラサイクリン及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００８８】
タキサンは、細胞周期のＭ期中に微小管と高い親和性で結合し、微小管の通常の機能を阻害する。一般的なタキサンとしては、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、タキソール、タキサズム（ｔａｘａｓｍ）、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、７−Ｌ−アラニルパクリタキセルなどが挙げられるが、これらに限定されないが。上述のようなタキサンは、１種以上の他のタキサン及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００８９】
カンプトテシンはトポイソメラーゼ及びＤＮＡと複合体を形成し、この酵素の阻害及び機能を引き起こす。一般的なカンプトテシンとしては、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンまたはビノレルビン）、アムサクリン、テニポシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなカンプトテシンは、１種以上の他のカンプトテシン及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９０】
ニトロソウレアは、ＤＮＡ修復に必要な変化を阻害する。一般的なニトロソウレアとしては、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなニトロソウレアは、１種以上の他のニトロソウレア及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９１】
ＥＧＦＲ（すなわち、上皮成長因子受容体）阻害剤は、ＥＧＦＲを阻害し、細胞増殖及び分化を含む細胞応答を妨げる。ＥＧＦＲ阻害剤は、１つ以上のＥＧＦＲの機能または産生を阻害する分子を含む。これには、ＥＧＦＲの小分子阻害剤、ＥＧＦＲに対する抗体、アンチセンスオリゴマー、ＲＮＡｉ阻害剤及びＥＧＦＲの発現を低減する他のオリゴマーを含む。一般的なＥＧＦＲ阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ａｍｇｅｎ）ラパチニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＣＩ１０３３またはＰＤ１８３８０５、すなわちカンテルニブ（ｃａｎｔｅｒｎｉｂ）（６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポ−キシ）キナゾリン−４−アミン、Ｐｆｉｚｅｒ）などが挙げられるが、これらに限定されない。他の阻害剤としては、ＰＫＩ−１６６（４−［（１Ｒ）−１−フェニルエチルアミノ］−６−（４−ヒドロキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ−］ピリミジン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）キナゾリン−６−イル］ブト−２−イナミド）、ＥＫＢ−５６９（４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−３−シアノ−６−（４−ジメチルアミノブト２（Ｅ）−エナミド）−−７−エトキシキノリン、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＥＫＢ５０９（Ｗｙｅｔｈ）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、Ａｂｇｅｎｉｘ）、マツズマブ（ＥＭＤ  ７２０００、Ｍｅｒｃｋ）及びモノクローナル抗体ＲＨ３（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ）が挙げられる。上述のようなＥＧＦＲ阻害剤は、１種以上の他のＥＧＦＲ阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９２】
抗生物質は、癌細胞死をもたらすＤＮＡの切断を引き起こす遊離酸素ラジカルの形成を促進する。一般的な抗生物質としては、ブレオマイシン及びラパマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。マクロライド系殺菌剤ラパマイシン（別称ＲＡＰ、ラパミューン及びシロリムス）は、イムノフィリンＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）に細胞内結合し、その結果生じる複合体は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）のセリンタンパク質キナーゼ活性を阻害する。ラパマイシンマクロライドには、天然形態のラパマイシン、ならびにｍＴＯＲを標的として阻害するラパマイシン類似体及び誘導体を含む。他のラパマイシンマクロライドとしては、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、Ｗｙｅｔｈ）、エベロリムス及びＡＢＴ−５７８が挙げられるが、これらに限定されない。上述のような抗生物質は、１種以上の他の抗生物質及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害剤は、ＨＥＲ２受容体を遮断し、腫瘍の生存に必要なカスケード反応を防止する。Ｈｅｒ２阻害剤は、Ｈｅｒ２の機能または産生を阻害する分子を含んでいる。この阻害剤は、Ｈｅｒ２の小分子阻害剤、Ｈｅｒ２に対する抗体、アンチセンスオリゴマー、ＲＮＡｉ阻害剤、及びチロシンキナーゼの発現を低減する他のオリゴマーを含む。一般的なＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害剤としては、トラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などが挙げられるが、これらに限定されない。他のＨｅｒ２／ｎｅｕ阻害剤としては、二重特異性抗体ＭＤＸ−２１０（ＦＣ．ｇａｍｍａ．Ｒ１−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）及びＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられ、上述のようなＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害剤は、１種以上の他のＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９４】
血管新生阻害剤は血管内皮成長因子、すなわちＶＥＧＦを阻害し、それによって腫瘍の生存に必要な新しい血管の形成を阻害する。ＶＥＧＦ阻害剤は、１つ以上のＶＥＧＦの機能または産生を阻害する分子を含む。この阻害剤は、ＶＥＧＦの小分子阻害剤、ＶＥＧＦに対する抗体、アンチセンスオリゴマー、ＲＮＡｉ阻害剤及びチロシンキナーゼの発現を低減する他のオリゴマーを含む。一般的な血管新生阻害剤としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の血管新生阻害剤としては、ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＡＹ−４３−９００６、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ、Ｂａｙｅｒ）、セマキサニブ（ＳＵ５４１６、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＳＵ６６６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＺＤ４１９０（Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）エトキシ］−キナゾリン−４−アミン、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４、Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）エトキシ］キナゾリン−４−アミン、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、モノクローナル抗体ＩＭＣ−１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。上述のような血管新生阻害剤は、１種以上の他の血管新生阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９５】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦ阻害剤に加え、他のキナーゼ阻害剤が化学療法剤として使用される。オーロラキナーゼ阻害剤としては、４−（４−Ｎベンゾイルアミノ）アニリン）−６−メトキシ−７−（３−（１−モルホリノ）プロポキシ）キナゾリン（ＺＭ４４７４３９、Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６７−８０（２００３））、及びヘスペラジン（Ｈａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６１：２８１−９４（２００３））などの化合物が挙げられるが、これらに限定されない。オーロラキナーゼ阻害剤としての使用に適した他の化合物は、Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．２：２８３−９（２００３）に記載されている。ＳＲＣ／Ａｂｌキナーゼ阻害剤としては、ＡＺＤ０５３０（４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２（４−メチルピペラジン−１−イペトックス−ｙ（ｙｐｅｔｈｏｘ−ｙ）］−５−テトラヒクロピラン（ｔｅｔｒａｈｙｃｒｏｐｙｒａｎ）−４−イルオキシキナゾリン）が挙げられるが、これに限定されない。チロシンキナーゼ阻害剤は、１つ以上のチロシンキナーゼの機能または産生を阻害する分子を含む。この阻害剤は、チロシンキナーゼの小分子阻害剤、チロシンキナーゼに対する抗体、及びアンチセンスオリゴマー、ＲＮＡｉ阻害剤及びチロシンキナーゼの発現を低減する他のオリゴマーを含む。ＣＥＰ−７０１及びＣＥＰ−７５１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）は、チロシンキナーゼ阻害剤として作用する。イマチニブメシレートは、ｂｃｒ−ａｂｌのＡＴＰ結合部位と結合して、タンパク質の酵素活性を競合的に阻害することによってｂｃｒ−ａｂｌを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤である。イマチニブはｂｃｒ−ａｂｌに対して極めて選択的であるが、他の標的、例えばｃ−キット及びＰＤＧＦ−Ｒも阻害する。ＦＬＴ−３阻害剤としては、タンデュチニブ（ＭＬＮ５１８、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、スーテント（ＳＵ１１２４８、５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸［２−ジエチルアミノエチル］アミド、Ｐｆｉｚｅｒ）、ミドスタウリン（４’−Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、レフノミド（ｌｅｆｕｎｏｍｉｄｅ）（ＳＵ１０１）などが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＥＫ阻害剤としては、２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド）（ＰＤ１８４３５２／ＣＩ−１０４４、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ１９８３０６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン）、Ｕ０１２６（Ｐｒｏｍｅｇａ）、発酵微生物抽出物由来のＲｏ０９２−２１０（Ｒｏｃｈｅ）、同じく微生物抽出物から単離されたレソルシル酸ラクトンＬ７８３２７７（Ｍｅｒｃｋ）などが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなチロシンキナーゼ阻害剤は、１種以上の他のチロシンキナーゼ阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９６】
プロテアソーム阻害剤は、分解の対象となったタンパク質の一部の分解を阻害する。その結果、細胞の成長停止または細胞死が生じる。一般的なプロテアソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ、オルテゾミブ（ｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）などが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなプロテアソーム阻害剤は、１種以上の他のプロテアソーム阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９７】
免疫療法は、特定の標的と結合して遮断し、それによって腫瘍細胞の増殖に必要な事象の連鎖を断つと考えられている。一般的な免疫療法としては、リツキシマブ、及び他の抗ＣＤ２０抗体、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ及び他の抗ＣＤ−５０抗体、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｍａｂ）及び他の抗ＣＤ−２２抗体、ガリキシマブ及び他の抗ＣＤ−８０抗体、アポリズマブＨＵ１Ｄ１０及び他の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。放射性同位体を抗体と抱合させ、放射線免疫療法に利用することができる。このような抗ＣＤ２０製品としては、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）及びイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）の２つがある。上述のような免疫療法は、１種以上の他の免疫療法及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９８】
ホルモン療法は細胞受容体の遮断、ホルモンのｉｎ  ｖｉｖｏ産生の阻害、及び／または細胞上のホルモン受容体の除去または改変によって、最終的に腫瘍増殖を緩徐化または停止させる。一般的なホルモン療法としては、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェンなど）、プロゲストーゲン（例えば、メゲストロールアセテートなど）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エクセメスタン、ボロゾール、エクセメスタン、ファドロゾール、アミノグルテチミド、エクセメスタン、１−メチル−１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンなど）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルチミド（ｂｉｃａｌｕｔｉｍｉｄｅ）、ニルタミド、フルタミド、シプロテロンアセテートなど）、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ＬＨＲＨアゴニスト）（例えば、ゴセレリン、リュープロリド、ブセレリンなど）；５−アルファ−レダクターゼ阻害剤（例えばフィナステリドなど）が挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなホルモン療法は、１種以上の他のホルモン療法及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【００９９】
光線力学療法は、光感作性薬に特定の波長の光を照射して癌細胞を殺傷する。一般的な光線力学療法としては、例えば、ポルフィマーナトリウム（例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎｅ）などが挙げられる。上述のような光線力学療法は、１種以上の他の光線力学療法及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【０１００】
癌ワクチンは、全不活化腫瘍細胞、全タンパク質、ペプチド断片、ウイルスベクターなどを利用して、癌細胞を標的とする免疫応答を生成すると考えられる。一般的な癌ワクチンとしては、修飾腫瘍細胞、ペプチドワクチン、樹状ワクチン、ウイルスベクターワクチン、熱ショックタンパク質ワクチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、転写活性を調節することが可能であると同時に、血管新生及び細胞周期を妨害し、アポトーシス及び分化を促進することができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤としては、これに限定されないが、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、デプシペプチド（ＦＫ２８８）及び類似体、Ｐｉｖａｎｅｘ（Ｔｉｔａｎ）、ＣＩ９９４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＭＳ２７５  ＰＸＤ１０１（ＣｕｒａＧｅｎ、ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ）ＭＧＣＤ０１０３（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ）、ＬＢＨ５８９、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などが挙げられ、化学療法剤として使用されている。上述のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、１種以上の他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【０１０２】
スフィンゴ脂質代謝のモジュレーターはアポトーシスを誘導することが明らかになっている。概説については、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Ｎ．Ｓ．Ｒａｃｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３７１：２４３−５６（２００３）；Ｄ．Ｅ．Ｍｏｄｒａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ，５：２００−２０８（２００６），Ｋ．Ｄｅｓａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１５８５：１８８−９２（２００２）及びＣ．Ｐ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２０６，１６９−８０（２００４）を参照のこと。スフィンゴ脂質代謝に関与する種々の酵素のモジュレーター及び阻害剤を化学療法剤として使用することができる。セラミドはアポトーシスを誘導することが明らかになっている。その他の類似体としては、Ｃｅｒ  １−グルクロニド、ポリ（エチレングリコール）誘導体化セラミド及びＰＥＧ化セラミドが挙げられるが、これらに限定されない。セラミド合成を刺激するモジュレーターは、セラミドレベルを上昇させるために使用されている。セラミド合成に関与する酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼを刺激する化合物としては、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及び合成類似体、ならびにアナンダミド、天然の哺乳動物カンナビノイドが挙げられるが、これらに限定されない。ゲムシタビン、レチノイン酸及び誘導体、フェンレチニド［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド，（４ＨＰＲ）］）、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、エトポシド、パクリタキセル、ダウノルビシンならびにフルダラビンもまたセラミドレベルを上昇させることが明らかになっている。さらに、バルスポダール（ＰＳＣ８３３、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、シクロスポリンの非免疫抑制性で非腎毒性（ｎｏｎ−ｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ）の類似体、及びｐ−糖タンパク質の阻害剤はセラミドレベルを上昇させる。スフィンゴミエリナーゼのモジュレーターは、セラミドレベルを上昇させることができる。ＧＳＨはスフィンゴミエリナーゼを阻害するため、これにはＧＳＨレベルを低下させる化合物が含まれる。例えば、ベータシン（ｂｅｔａｔｈｉｎｅ）（β−アラニルシステアミンジスルフィド）は、ＧＳＨを酸化し、骨髄腫、黒色腫及び乳癌患者において良好な効果をもたらしている。ＣＯＸ−２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ケトコナゾール、抗真菌薬、ドキソルビシン、ミトキサントロン、Ｄ６０９（トリシクロデカン−９−イル−キサントゲネート）、デキサメタゾン、及びＡｒａ−Ｃ（１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）もスフィンゴミエリナーゼを刺激する。グルコシルセラミドの加水分解を刺激する分子も、セラミドレベルを上昇させる。ゴーシェ病での使用に有用である酵素、ＧｌｃＣｅｒグルコシダーゼは、特にグルコースアクセプター及び／または酵素の活性化因子であるレチノールまたはペンタノールとともに治療薬として使用することができる。サポシンＣ及びその類似体ならびに抗精神病薬、クロロプロマジンの類似体も有用であり得る。グルコシルセラミド合成阻害剤としては、ＰＤＭＰ（Ｎ−［２−ヒドロキシ−１−（４−モルホリニルメチル）−２−フェニルエチルデカンア��ド］）、ＰＭＰＰ（Ｄ，Ｌ−スレオ−（１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）、Ｐ４またはＰＰＰＰ（Ｄ−スレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール）、エチレンジオキシ−Ｐ４、２−デカノイルアミン−３−モルホリノプロフェノン、タミキソフェン（ｔａｍｉｘｏｆｅｎ）、ラロキシフェン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン、及び抗アンドロゲン化学療法（ビカルタミド＋リュープロリドアセテート）が挙げられるが、これらに限定されない。ゴーシェ病の治療に通常使用されるＺａｖｅｓｃａ（１，５−（ブチルイミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシトール）は、グルコシルセラミド合成の別の阻害剤である。セラミダーゼ阻害剤としては、Ｎ−オレオイルエタノールアミン、セラミド切断形態、Ｄ−ＭＡＰＰ（Ｄ−エリスロ−２−テトラデカノイルアミノ−１−フェニル−１−プロパノール）及び関連阻害剤Ｂ１３（ｐ−ニトロ−Ｄ−ＭＡＰＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴシンキナーゼ阻害剤もセラミドレベルの上昇をもたらす。阻害剤としては、サフィンゴール（Ｌ−スレオ−ジヒドロスフィンゴシン）、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、ならびにスフィンゴシンの類似体及び誘導体、例えば、ジヒドロスフィンゴシン、ならびにミリオシンが挙げられるが、これらに限定されない。フモニシン及びフモニシン類似体は、セラミドシンターゼを阻害するが、新規のスフィンゴ脂質生合成の阻害によりスフィンガニンレベルを上昇させ、アポトーシスをもたらす。セラミドレベルを上昇させるその他の分子としては、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン）が挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなスフィンゴ脂質モジュレーターは、１種以上の他のスフィンゴ脂質モジュレーター及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが癌療法として提供されている。これには、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリメルセン、Ｇ３１３９、Ｇｅｎｔａ製）、ｂｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＧ４４６０（ＬＲ３００１、Ｇｅｎｔａ製）、ｃ−ｍｙｂを標的とする別のアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。その他のオリゴマーとしては、ｓｉＲＮＡ、デコイ、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。上述のようなオリゴヌクレオチドは、１種以上の他のオリゴヌクレオチド阻害剤及び／またはクラス（複数可）の異なる１種以上の化学療法剤と併用することができる。
【０１０４】
化学療法剤は、２種以上の薬剤（例えば、ＫＢＵ２０４６と、化学療法剤及び／またはホルモン療法剤）の混合薬を含み得る。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アルキル化剤、白金、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、タキサン、カンプトテシン、ニトロソウレア、ＥＧＦＲ阻害剤、抗生物質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法、癌ワクチン、スフィンゴ脂質モジュレーター、オリゴマー、またはこれらの組み合わせのうちの２つ以上を含む混合薬である。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態では、放射線療法がオリゴヌクレオチド化合物の投与に加えて施される。放射線療法は外部放射線療法及び内部放射線療法の両方を含む。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態では、患者から癌組織を除去するために外科手術が使用される。癌組織は、例えば、腹腔鏡手術、メス、レーザー、ハサミなどを含む、任意の好適な外科的処置を用いて患者から摘出することができる。いくつかの実施形態では、手術は化学療法と組み合わされる。他の実施形態では、外科手術は放射線療法と組み合わされる。更に他の実施形態では、外科手術は化学療法及び放射線療法の両方と組み合わされる。
【０１０７】
ヒト乳癌細胞、肺癌細胞及び大腸癌細胞の運動性を阻害するための実施形態を本明細書に記載する。このような目的の組成物及び方法は、例えば、（１）前癌性病変（例えば、非浸潤病変；別称、上皮内病変または上皮内癌）の浸潤性を阻害し、真性、例えば浸潤癌の形成を阻害すること；（２）臓器限局癌の局所臓器外への浸潤、及び隣接臓器への浸潤を阻害すること（例えば、大動脈への侵入を可能にし、結果として生じる失血死を引き起こし得る、肺癌の胸部中心への浸潤の阻害）；ならびに（３）全身の癌細胞の運動性を阻害すること（例えば、転移の阻害）に使用される。組成物及び方法は、例えば、大腸癌、乳癌及び肺癌など、一般に局所臓器へ浸潤し、それによって罹患及び死を誘発するものすべて、ならびに、全身に転移して罹患及び死を誘発するものすべてに使用される。本明細書に記載する実施形態の開発中に実施した実験は、セリン２２６のリン酸化を阻害することにより、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）の機能の阻害を示す。ＨＳＰ９０の機能は、ＣＤＣ３７との結合能を増加させることによって阻害される。一連の化合物は、ＨＳＰ９０／ＣＤＣ３７相互作用を増加させるように設計され、実験でそれらが癌細胞運動性を阻害することが実証されている。癌細胞運動性の治療的阻害は、細胞毒性化学療法と併用できるとともに、その有効性を増加させることが実証されている。癌細胞運動性の治療的阻害は、前立腺癌のためのホルモン療法と併用できるとともに、その有効性を増加させることが実証された。更に、本明細書に記載する方法を適用すると、ホルモン療法に対する耐性を多種多様な癌において克服することができる。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
材料及び方法
最適化された小分子化学プローブの選択及び合成
機能的スクリーニングは、有効性を得るためのＢｏｙｄｅｎチャンバー細胞浸潤アッセイ（Ｃｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び毒性を得るための３日間の細胞成長阻害アッセイ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で構成された。毒性の機能測定には追加で、ＮＣＩ６０細胞株パネルのＮＣＩ基準のスクリーニング（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ｑＲＴ／ＰＣＲによるエストロゲン応答遺伝子の発現（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ルシフェラーゼアッセイによるエストロゲン応答プロモーターの誘導（Ｂｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｃａｔｈｅｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｊｏｒｄａｎ，１９９５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び造血幹細胞の１４日間のコロニー形成アッセイ（Ｂｅｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含めた。ＥＲと結合するゲニステインの化学基の決定には、タンパク質データベース（ＰＤＢ）のＸ線結晶構造データ（ＰＤＢ  ＩＤ：ＩＸ７Ｒ、ＩＸ７Ｊ）を使用した。個々の細胞の遊走は、タイムラプスビデオ顕微鏡検査によって評価した。
【０１０９】
マウスモデルでのＫＢＵ２０４６の有効性及び薬物動態学の評価
ヒトＰＣａ細胞の正所性移植及び遠隔転移の定量化を記載のように実施した（Ｐａｖｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト乳癌細胞の正所性移植に続いて、生じた原発腫瘍の外科的除去を記載のように実施した（ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＫＢＵ２０４６血漿中濃度の定量化をＬＣＭＳによって実施した。得られた薬物動態学的パラメーターを、ｎａｉｖｅ  ｐｏｏｌｅｄ  ｄａｔａ法を用いた３コンパートメントモデルで算出し（Ｋａｔａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、経口バイオアベイラビリティをＡｖｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように算出し、モデルフィッティングには、観察時点でのモデルに基づくデータ分散の逆数で重み付けしたデータを用いた、拡張した最小ニ乗最尤関数を使用し（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、測定結果及び推定結果の検定によりモデルの誤特定を求めた（Ｃｏｂｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，１９９８；Ｆｏｓｔｅｒ，１９９８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。重要臓器は、半定量的な組織学的評価法（Ｋｎｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて構造損傷を検査すると同時に、その機能を血液サンプルの広範な臨床検査試験によって評価した。すべての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより承認されたプロトコルに基づいて実施した。
【０１１０】
ＫＢＵ２０４６のＭＫＫ４経路の阻害能の評価
低分子化学薬のＭＫＫ４結合能は、蛍光サーマルシフトアッセイ（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及び等温滴定型カロリメトリー（Ｐｏｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｚｕｂｒｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって評価した。ＭＫＫ４キナーゼ活性の阻害能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって評価し、細胞内の細胞シグナル伝達の阻害能は、リン酸化タンパク質のウエスタンブロット（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって評価した。
【０１１１】
プロテオミクスを使用した、ＫＢＵ２０４６の薬理学的作用部位の同定
ＫＢＵ２０４６によって誘導されるキノームの変化のスクリーニングは、Ｋｉｎｏｖｉｅｗ（商標）アッセイ系によって評価した。モチーフ特異的なＫｉｎｏｖｉｅｗ（商標）抗体によって沈降させたタンパク質を、ＳＥＱＵＥＳＴ／Ｓｏｒｃｅｒｅｒデータ分析スイートと連動したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して、ＰｈｏｓｐｈｏＳｃａｎ（商標）技術により同定した（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１２】
ＫＢＵ２０４６が結合するタンパク質クレフトの特定
ＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体の安定化を、ｄｒｕｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ＤＡＲＴＳ）アッセイによって評価した（Ｌｏｍｅｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルの構築には、ＫＢＵ２０４６化合物構造、ＤＡＲＴＳアッセイ、ヒトＨＳＰ９０βの結晶構造（ｐＤＢｓ  ｌｕｙｍ、３ｎｍｑ及び３ｐｒｙ）、及び酵母由来のＨＳＰ８２−ＣＤＣ３７複合体の結晶構造（ＰＤＢ  １ｕｓ７）から得られる実験データを使用し、Ｘ線回折による結晶学的解析、及びＨＳＰ９０β構造の実験的プローブにより特定した。これは、種々の長さの化学的クロスリンカー（Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）と、ＲｅＡＣＴ（Ｗｅｉｓｂｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いたＭＳ３分析とを併用し、推定されるタンパク質相互作用レポーターの質量相関（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を満たす方法で行う。次に、実験的に決定された構造情報を、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｌｅａｄｅｒｓｈｉｐ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで、ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）上に統合して解析した。実験結果に基づき、進化したタンパク質表面分析（Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，２００８；Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、強力な相同性モデリング（Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、複合的手法を使用した超並列ドッキングシミュレーション（Ｄｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，２００８；Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｏｎｉ．ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び高度な物理学ベースの再スコアリング方法論（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，２０１０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を組み合わせることにより、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−リガンド相互作用を考慮した多段階アルゴリズムに従って解析した。
【０１１３】
実施例２
化学合成
４’−フルオロイソフラバノン（ＫＢＵ２０４６）の大規模生成の例示的手順
【０１１４】
【化８】
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【０１１５】
３−（ジメチルアミノ）−１−（２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン。出発材料２’−ヒドロキシアセトフェノン（５０ｍｍｏｌ、６．０２ｍＬ）及びＮ，Ｎジメチルホルムアミドジメチルアセタール（５０ｍｍｏｌ、６．６４ｍＬ）を１０〜２０ｍＬのマイクロ波バイアルに入れた。バイアルに蓋をして、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒマイクロ波シンセサイザー内で、１５０℃、１１ｂａｒで１０分間加熱した。得られた暗橙色の液体を２３℃まで冷却した時点で生じる黄橙色の結晶を溶液から取り出して粉砕した。結晶を回収してヘキサン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥後に計量して、橙黄色の針状結晶である３−（ジメチルアミノ）−Ｉ−（２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−Ｉ−オン（９．０９ｇ、９５％）を得た。生成物をＮＭＲ及び超高速液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＵＰＬＣＭＳ）により確定した。
【０１１６】
【化９】
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【０１１７】
３−ブロモクロモン。Ｇａｍｍｉｌｌから得た手順（Ｇａｍｍｉｌｌ，１９７９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって３−ブロモクロモンを調製した。加熱乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに、３−（ジメチルアミノ）−１−（２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン（３６．６ｍｍｏｌ、７．０ｇ）を入れ、ＣＨＣｌ３（７０ｍＬ）中に溶解させた。反応フラスコを氷浴中で０℃まで冷却した後、滴下漏斗を用いてＢｒ２（３６．６ｍｍｏｌ、１．８７ｍＬ）を滴加した。Ｂｒ２をすべて添加した後、水（７０ｍＬ）を緩徐に反応物に添加し、２３℃で１０分間撹拌した。次に、暗橙色／暗黄色の有機層を水層と分離し、３ｘ５０ｍＬのＣＨＣｌ３によって逆抽出した。次に、混合有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して暗橙色の油を得た。この油をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２  １０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３−ブロモクロモン（５．２６ｇ、６４％）をオフホワイト固体として得た。生成物をＮＭＲ及び超高速液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＵＰＬＣＭＳ）により確定した。
【０１１８】
パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）。４’−フルオロイソフラボンを合成するための鈴木−宮浦クロスカップリング反応用触媒を、Ｃｏｕｌｓｏｎ（Ｃｏｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）による手順を使用して作製した。加熱乾燥した１００ｍＬのシュレンクフラスコに、ＰｄＣｌ２（５ｍｍｏｌ、８９０ｍｇ）及びトリフェニルホスフィン（２５ｍｍｏｌ、６．５６ｇ）を入れた。固体はＤＭＳＯ（６０ｍＬ）に溶解させた後、その混合物をＮ２でパージし、１４５℃まで加熱した時点で明黄橙色に変化した。反応物を熱源から除去し、室温で１５分間撹拌した後、Ｎ２ガスの形成を考慮して定位置に通気針を取り付けたシリンジを用いてヒドラジン水化物（２０ｍｍｏｌ、０．９７２ｍＬ）を添加した。ヒドラジン水化物を添加した後、反応物を２３℃に冷却した。その間に黄色の固体を溶液から取り出して粉砕した。固体をシュレンク濾過条件下で２ｘ５０ｍＬのＥｔＯＨ、次いで２ｘ５０ｍＬのエーテルで洗浄し、鮮黄色の固体としてＰｄ（ＰＰｈ３）４（５．３１ｇ、９４％）を得て、Ｎ２下で保存した。
【０１１９】
【化１０】
2017534627.tif 000012
【０１２０】
４’−フルオロイソフラボン。４’−フルオロイソフラボンを鈴木及び宮浦による手順（Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って大規模調製した。加熱乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、３−ブロモクロモン（５０ｍｍｏｌ、１１．２５ｇ）、４−フルオロフェニルボロン酸（５５ｍｍｏｌ、７．６９ｇ）及びＮａｚＣ０３（１００ｍｍｏｌ、１０．６ｇ）を添加した。固体をベンゼン（１００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）との混合物に溶解させ、系を１０〜１５分間、Ｎ２でパージした。次に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４触媒（２．５ｍｍｏｌ、２．８９ｇ）を添加した時点で、反応物は明橙色に変化した。フラスコに還流冷却管を取り付け、反応物を一晩加熱還流（８０℃）させた。約１６時間後、反応物を２３℃まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で希釈した後、溶出剤としてＥｔＯＡｃを使用したシリカプラグに粗製物を通した。有機物質をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮し、ＤＣＭを使用してシリカゲルに吸着させた暗褐色の固体を得た。物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、４’−フルオロイソフラボン（８．１４ｇ、収率６７％）を黄橙色固体として得た。これは、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって微量の不純物を示した。わずかな不純物質を更に精製することなく次の合成工程で使用した。生成物をＮＭＲ及び超高速液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＵＰＬＣＭＳ）により確定した。
【０１２１】
【化１１】
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【０１２２】
４’−フルオロイソフラバノン（ＫＢＵ２０４６）。加熱乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに４’−フルオロイソフラボン（２５ｍｍｏｌ、６．０１ｇ）を入れ、この固体を乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。溶液を、熱電対によってモニターして、−７８℃まで冷却（ドライアイス／アセトン浴）した。溶液が所望の温度まで冷却されたら、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ（５５ｍｍｏｌ、５５ｍＬ、１ＭのＴＨＦ溶液）を３０〜４５分かけて滴加した。次に、反応物を−７８℃で２時間撹拌し、その後、−７８℃のＭｅＯＨ（５５ｍＬ）でクエンチした。混合物を３００ｍＬの水に注入し、水性層を２ＭのＨＣｌでｐＨ７に調整した。水性層を２ｘ２００ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出し、混合有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して暗褐色の油状固体を得た。この固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１：１のヘキサン：ＤＣＭ）で精製し、４．５ｇの粗製物を得た。これをヘキサン中に再結晶化させ、４’−フルオロイソフラバノン（３．４ｇ、５６％）を綿毛状の白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＨＰＬＣ分析の両方によって固体の純度を検査し、９８％超の純度の物質を動物実験に使用した。
【０１２３】
親４’−フルオロイソフラバノン（ＫＢＵ２０４６）に加えて、関連する類似体化合物を合成した。これらの化合物は、ＫＢＵ２０４６と同じ一般的な方法で調製した。付加的な類似体の構造及び純度は、ＮＭＲ分光法（１Ｈ及び１３Ｃ）ならびにＵＰＬＣＭＳ（最小のイオン開裂）によって確定した。すべての化合物は単離して粉末形態で保存し（無光状態）、使用直前にＤＳＭＯ原液に配合した。
【０１２４】
実施例３
ＫＢＵ２０４６による細胞運動性及び転移の阻害
細胞運動性及び転移の選択的阻害剤の同定
プローブ合成を進めるにあたってプラットフォームとしてフラボノイドを選択した。その理由には、少なくとも、広範囲にわたる生物学的効果を及ぼすこと、及び単一の原子による構造変化が生物活性の範囲に著しく影響を与え得ることがある（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｈａｍ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、フラボノイドは原子レベルの解像能を有する生物学的プローブを構成し、その化学的足場は高度に調整された、選択性のある医薬化学的改良を容易にする。出発点として４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン（ゲニステイン）を選択した。ゲニステインはｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト前立腺癌（ＰＣａ）の細胞浸潤性を阻害すること（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、また前向き臨床試験の状況下で、前立腺組織においてマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＪ＼１Ｐ−２）の発現を下方調節すること（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が実証された。しかしながら、その既知の広範な生物学的効果が、ゲニステインを選択的かつ強力な生物学的プローブとしての使用に適さないものにしている（Ｐａｖｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかし、まさにこの同じ特性は、化学的多様性に応じて広範囲の生物活性部位を選択的にプローブする可能性を最大化する。
【０１２５】
ヒトＰＣａ細胞の浸潤性阻害の反復的選択を用いた、系統的な医薬品化学の多様化法によって、ゲニステインから化学プローブを開発した（図１）。この選択的プロファイリングに加え、主要な目的は細胞成長の阻害（オフターゲット効果の指標）を除外することであった。重要な点として、ゲニステインはエストロゲン効果を呈することが知られており（Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、細胞運動性の選択的な調節にはオフターゲットであると見なされていた。ゲニステインを結合したエストロゲン受容体（ＥＲ）の結晶構造（Ｍａｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って、ＥＲ結合を除外した。この手法を用いて、ハロゲン置換イソフラバノンである（±）−３（４−フルオロフェニル）クロマン−４−オン（ＫＢＵ２０４６）を見出した（図１）。
【０１２６】
ＫＢＵ２０４６は、正常前立腺上皮細胞、ならびに原発性及び転移性ＰＣａ細胞を含む、ゲニステインと同等またはそれを上回るヒト前立腺細胞に対する細胞浸潤性を阻害する（図２Ａ）。細胞遊走は細胞浸潤性の主要決定要素（Ｆｒｉｅｄｌ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，２００３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）であり、ＫＢＵ２０４６はヒト前立腺癌、乳癌、大腸癌及び肺癌細胞の遊走を阻害した（図２Ｂ）。重要な点として、ＫＢＵ２０４６は細胞アッセイにおいて高い選択性を有した。これは、ヒト前立腺細胞（図２Ｃ）に対して、ヒト骨髄幹細胞（図２Ｄ）に対して、またＮＣＩ６０細胞株パネルの細胞（図９）に対しても有毒性ではなかった。骨髄に対する毒性は多種多様な治療薬によって引き起こされ、抗癌剤の頻度の高い用量制限毒性である（Ｇｕｅｓｔ  ａｎｄ  Ｕｅｔｒｅｃｈｔ，１９９９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。更に、エストロゲン応答ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞において、ＫＢＵ２０４６はエストロゲン応答遺伝子を活性化しなかった（図２Ｅ、図９）。
【０１２７】
ＫＢＵ２０４６は転移を選択的に阻害し、生存を延長する。
【０１２８】
プローブは、全身活性小分子と関連することが知られている化学的特性を含むように設計された（図１０）（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ヒトＰＣａ転移の確立された正所性移植マウスモデル（Ｌａｋｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、遠隔転移の形成を阻害するＫＢＵ２０４６の能力を定量化した。ＫＢＵ２０４６は、１．１〜２４ｎＭの血漿中濃度で、用量依存的に転移を最大９２％有意に減少させた（図３Ａ、３Ｂ）。マウスでのＫＢＵ２０４６の薬物動態学の包括的な特性決定により、単回経口投与後９．３時間にわたって血漿中濃度が２４ｎＭ超に維持されたことが実証され、また薬物動態学的パラメーターの特性決定も許容された（図３Ｃ、図１１）。全身レベルで、ＫＢＵ２０４６は選択性の高い転移阻害剤であった。原発腫瘍成長、動物挙動、体重、多臓器の組織学的検査及び血清の化学的プロファイリングの包括的な分析の結果、ＫＢＵ２０４６と関連するオフターゲット効果は同定されなかった（図１２、図１３）。
【０１２９】
ヒトでの転移と生存率の減少との間の確立された関係を考慮して、生存率に対するＫＢＵ２０４６の影響を評価した。正所性ＰＣａモデルは尿生殖路周辺で急速な腫瘍成長を示し、生存率に対する転移負荷の影響の評価を妨げる。しかしながら、ヒト乳癌細胞の正所性移植、及び結果として生じる原発腫瘍のその後の外科的切除により、生存率が転移負荷によって決定されるマウスモデル（ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が得られる。ＫＢＵ２０４６は、術後補助療法で治療されたマウスの生存率を有意に延長した（図３Ｄ）。
【０１３０】
ＫＢＵ２０４６は、ＨＳＰ９０βのＳｅｒ２２６のリン酸化を減少させることによって浸潤性を阻害する。
【０１３１】
低ナノモル濃度のゲニステインは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、キナーゼ４  ＣＭＸＫ．４１ＭＡＰ２Ｋ４／ＭＥＫ４のキナーゼ活性を阻害し（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、それによりｐ３８  ＭＡＰＫの下流リン酸化を阻害する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。また熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）のキナーゼ活性を阻害し（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＭＰ−２発現及び細胞浸潤性を阻害し、マウスでのヒトＰＣａ転移の阻害（Ｌａｋｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びヒト前立腺組織でのＭＭＰ−２発現の阻害（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をもたらす全身作用を与える。ゲニステインとは対照的に、ＫＢＵ２０４６はＭＫＫ４とは結合せず、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＫＫ４のキナーゼ活性を阻害せず、ｐ３８  ＭＡＰＫまたはＨＳＰ２７の細胞内でのリン酸化を阻害しなかった（図４）。驚くべきことだが、この結果はプローブ手法がＭＫＫ４シグナル伝達軸の阻害を除外したことを実証している。これは小分子化学プローブ手法が不偏性である指標となる。
【０１３２】
ＫＢＵ２０４６はＭＫＫ４を標的としないため、生物学的標的（複数可）を同定するための代替方法を検討した。ＫｉｎｏｍｅＶｉｅｗ（登録商標）抗体パネル（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）は、確立されたタンパク質リン酸化モチーフを検出するものであり、ＫＢＵ２０４６によって誘導されたタンパク質リン酸化の変化をプローブすることを目的とした（図５Ａ、図１４Ａ〜Ｄ）。以下の基準を満たすリン酸タンパク質の変化を優先した：（１）処置したマウスの細胞内及び腫瘍内に変化が観察された（図３Ａより）、（２）変化が、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）が誘導する効果を中和し、それが再現可能であった。ＴＧＦβはｉｎ  ｖｉｖｏで遍在性であり、ＰＣａ細胞浸潤性を増加させることが知られている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。またＫＢＵ２０４６の抗浸潤有効性は、ＴＧＦβの存在下でより大きくなる（図１５）。比較のため、ゲニステインを同一処理条件で評価した。その数多くの薬理学的効果は、タンパク質リン酸化の広範な変化を誘導した（図１４Ａ〜Ｄ）。対照的に、ＫＢＵ２０４６では、８３ｋＤａのタンパク質バンドの強度の減少のみが、先に指定した基準を満たした（図５Ａの矢印）。更にＫＢＵ２０４６の高い分子選択性が、３種類のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系において、検査された４００超の異なるタンパク質キナーゼ及び２０のホスファターゼの阻害を回避することにより裏付けられた。
【０１３３】
８３ｋＤａのタンパク質は、ＰＣ３細胞をＫＢＵ２０４６またはビヒクル対照で前処理し、ＴＧＦＢで処理して、図５Ａで使用したＫｉｎｏｍｅＶｉｅｗ（登録商標）抗体によって沈降させたタンパク質に対してＬＣ−ＭＳＩＭＳ分析を実行することにより同定した。得られたデータをＳＥＱＵＥＳＴ／Ｓｏｒｃｅｒｅｒデータ解析スイート（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で解析し、バックグラウンドレベルの３倍以上の発現を含む所定のパラメーターに基づいて、ＫＢＵ２０４６により２．５分の１に減少することを示し、かつ８３ｋＤａの指標バンドの±５ｋＤａの範囲内であるタンパク質を更に選択した。この方法により、単一のタンパク質ＨＳＰ９０βを得るとともに、ＫＢＵ２０４６が、ＨＳＰ９０βのリン酸化したＳｅｒ２２６の存在量を６．６分の１に減少させたことが示された（図５Ｂ、図１６）。
【０１３４】
（Ｓ２２６Ａ）−ＨＳＰ９０β構築物を使用して、Ｓｅｒ２２６の欠損が野生型（ＷＴ）−ＨＳＰ９０βと比較して細胞浸潤性を阻害すること、及びその欠損がＫＢＵ２０４６の有効性を抑制したことを実証した（図５Ｃ）。ｓｉＲＮＡ媒介性のＨＳＰ９０βノックダウンが細胞浸潤性を阻害し、かつＫＢＵ２０４６の有効性を抑制したことを実証することによって、ＫＢＵ２０４６の有効性を媒介する際のＨＳＰ９０Ｂの選択性が更に裏付けられた（図１２）。重要な点として、ＨＳＰ９０β特異的ｓｉＲＮＡはＨＳＰ９０αをノックダウンしなかった。次に、リン酸化されたＳｅｒ２２６の生物学的模倣体をもたらす、（Ｓ２２６Ｄ）−ＨＳＰ９０βでトランスフェクトした細胞が浸潤性の増加を呈し、ＫＢＵ２０４６の効果に感受性がなかったことを実証した（図５Ｄ）。これらの結果は、ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化が細胞浸潤の調節因子であることを同定し、それがＫＢＵ２０４６の有効性を媒介するための必要かつ十分であることを示す。
【０１３５】
ＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体へのＫＢＵ２０４６の結合
ＨＳＰ９０β  Ｓｅｒ２２６のリン酸化がＫＢＵ２０４６作用の調節因子であると同定されたため、ＫＢＵ２０４６とそのタンパク質標的（複数可）との間の相互作用に関する洞察を更に得ることを試みた。ＨＳＰ９０βに加え、ＣＤＣ３７が想定される標的であると考えた。ＣＤＣ３７は、１９０超のキナーゼを含む、３５０超のクライアントタンパク質とＨＳＰ９０βとの結合を媒介するコシャペロンである（Ｔａｉｐａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤＣ３７の柔軟なアーム状構造（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ：２ＷＯＧ）は、多数のキナーゼの動的な結合を可能にし、Ｓｅｒ２２６に対するキナーゼの位置を画定する。ＣＤＣ３７の移動性を示すもう１つの基準は、その構造の変化が、極めて動的なＨＳＰ９０シャペロンサイクルの変化と連動していることである（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤＣ３７及びＨＳＰ９０βの協調した動的な運動は、それと並置され、Ｓｅｒ２２６リン酸化状態を調節することができるキナーゼの範囲を決定する。ＫＢＵ２０４６がＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βのいずれかと結合した場合、結果として生じる新たな化学的相互作用が、この２つのタンパク質の力学及び機能を変化させることができ、それによってキナーゼのＳｅｒ２２６に対する接触性及びそのリン酸化が調節される推論した。
【０１３６】
等温滴定型カロリメトリー、蛍光によるサーマルシフトアッセイ、またはｄｒｕｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ＤＡＲＴＳ）アッセイ（図１８）（Ｌｏｍｅｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって、ＫＢＵ２０４６がＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βのいずれかと結合するという証拠はなかった。ＤＡＲＴＳでは、リガンドがその標的をプロテアーゼ消化から保護する能力を測定することにより、リガンドが誘導するタンパク質の構造及び力学の変化を示す感度の高い測定値が得られる（Ｌｏｍｅｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＫＢＵ２０４６はＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βと個別に結合しなかったが、ＣＤＣ３７とＨＳＰ９０βは、会合して四量体ヘテロ複合体を形成する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤＣ３７とＨＳＰ９０βとを組み合わせたＤＡＲＴＳアッセイにおいて、ＫＢＵ２０４６は両方のタンパク質を消化から保護した（図６Ａ）。ＣＤＣ３７の強度は増加し、ＨＳＰ９０β分解産物の強度は減少した。両方の効果は統計的に有意かつ濃度依存的であり、１００Ｍで顕著であった。ＫＢＵ２０４６とのビオチン化学リンカーを合成することにより、タンパク質結合に対するＫＢＵ２０４６の高い選択性が更に裏付けられた。これは、ＫＢＵ２０４６が生物活性を保持することを示し、（例えば、ＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体を形成する生理学的条件下で）無傷細胞と結合することを示し、一連の９，０００超のヒトタンパク質と結合しないことを示している（図１９Ａ〜Ｄ）。
【０１３７】
同時に、これらの結果は、ＫＢＵ２０４６が従来のＨＳＰ９０阻害剤（Ｎｅｃｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，２０１２；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）とは異なる方法で作用していることを示している。ＨＳＰ９０αと直接結合してシャペロンサイクルを阻害し、それにより細胞毒性を誘導する代わりに、ＫＢＵ２０４６は、ＨＳＰ９０βＳｅｒ２２６のリン酸化を阻害する。この残基はＨＳＰ９０αに存在しない。更に、ＫＢＵ２０４６は単離されたＨＳＰ９０βに結合せず、細胞毒性も誘導しない。最後に重要な点として、ＫＢＵ２０４６はＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体に結合して安定化させる。
【０１３８】
これらの複合的な実験は、ＫＢＵ２０４６が、ＣＤＣ３７とＨＳＰ９０βとが相互作用する場合のみ存在するクレフトに結合していることを示している。Ｘ線結晶学的データ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ｕｙｍ、３ｎｍｑ、３ｐｒｙ、２ｃｇ９及び１ｕｓ７）（Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及び化学的架橋の物理的マッピング解析（Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を含む、ＨＳＰ９０β及びＣＤＣ３７の実験的構造情報の包括的な解析は、ＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体の形成が、新たなポケットの形成をもたらすことを示している。モデリング試験は、この新たなポケットにより、ＫＢＵ２０４６が何らかの高エネルギーの立体相互作用がなくても、有利なエネルギースコアで結合できることを示している（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ；図２０）。この計算配置において、ＣＤＣ３７からＡｒｇ１６７が大きなクレフトへと突出し、ＨＳＰ９０βからのＧｌｕ３３のカルボキシル側鎖と水素結合で連結され、これによりＫＢＵ２０４６が結合する新たなポケットの形成が促進される。
【０１３９】
ＫＢＵ２０４６は、キナーゼまたはホスファターゼ活性を阻害しない。３種類のアッセイ系を用いて阻害を検出した。
【０１４０】
キナーゼアッセイ系番号１。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）アッセイ（Ａｍｂｉｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。このアッセイは、４００種類の親キナーゼに加え、活性または応答性を変更する既知の変異体を含む４４２のキナーゼを評価する。これは、細菌から精製されたキナーゼの、不動化させたリン酸受容体タンパク質基質への結合を阻害する推定上の阻害剤の能力を測定するアッセイと関連して実施する。この方法は、複数のグループによっていくつかの小分子キナーゼ阻害剤のキナーゼ相互作用を同定するために問題なく使用されている（Ｆａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＫＢＵ２０４６は１０μＭで試験した。このアッセイは完全に陰性であった。初回は２例の偽陽性（０．４％の偽陽性率）があったが、その後、これらは専用の追跡分析で陰性であることが判明した。特定の重要な陰性結果には、ＭＫＫ４及びｐ３８  ＭＡＰＫ（α、β及びγアイソフォーム）が含まれる。ＫＢＵ２０４６が、ホスホアクセプターの結合について競合することによってキナーゼ機能を阻害するという証拠はなかった。
【０１４１】
キナーゼアッセイ系番号２。Ｋｉｎｅｘ（商標）キナーゼアッセイ系（Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。このプラットフォームは昆虫発現系で発現させた組み換えヒトタンパク質キナーゼを使用しており、翻訳後修飾の手段を可能とする。また、このプラットフォームはＡＴＰ結合の阻害を測定する。このプラットフォームにより２００種類のキナーゼを推定的に測定した。ＫＢＵ２０４６は１μＭ及び１０μＭで試験した。このアッセイもまた完全に陰性であった。このスクリーニングから複数のキナーゼに関する情報を得た（例えば、対照が活性であり、検出を妨げないＫＢＵ２０４６の濃度である場合）。ＫＢＵ２０４６はｐ３８  ＭＡＰＫ（アイソフォームすべて）もＭＫＫ４も阻害しなかった。ＫＢＵ２０４６が、活性部位でのＡＴＰ結合について競合することによってキナーゼ機能を阻害するという証拠はなかった。
【０１４２】
キナーゼアッセイ系番号３。ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）及びＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）アッセイプラットフォーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。このプラットフォームは放射測定に基づいている（判断基準と見なされるもの）。これはキナーゼに対するＡＴＰ、及びホスファターゼに対する基質タンパク質について競合を測定する。タンパク質の大半は昆虫による系を介して発現させ、２８４のキナーゼ及び２０のホスファターゼのパネルを評価する。最初は２例の偽陽性（０．７％の偽陽性率）があったが、詳細な検査ではいずれも確認されなかった。重要な陰性結果には、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＥＲＫ、ＭＥＫ１、ＪＮＫ１、２及び３、ならびにその他多数のＭＡＰＫカスケード関連キナーゼが含まれる。ＫＢＵ２０４６が、活性部位でのＡＴＰ結合について競合することによってキナーゼ活性を阻害するという証拠はない。ホスファターゼ活性の阻害を裏付ける証拠はない。
【０１４３】
ＨＳＰ９０β、ＣＤＣ３７及びＫＢＵ２０４６の相互作用の構造モデルの構築。
【０１４４】
Ｘ線回折による結晶学的解析で決定された、ヒトＨＳＰ９０β（ｐＤＢｓ  ｌｕｙｍ、３ｎｍｑ及び３ｐｒｙ）及び酵母（ｐＤＢ  Ｉｕｓ７）由来のＨＳＰ８２・ＣＤＣ３７複合体の結晶構造を含む、実験的に決定された構造情報を用いて解析を開始した。前述したような種々の長さの化学的クロスリンカー（Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用い、化学的架橋と質量分析法を併用して、ＨＳＰ９０β構造をプローブした。さらに、ヒト細胞において、タンパク質相互作用レポーター（ＰＩＲ）と呼ばれる化学的クロスリンカー（Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、ＨＳＰ９０β構造をプローブした。架橋されたペプチドサンプルをＲｅＡＣＴ（Ｗｅｉｓｂｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して分析した。これにより、期待されるＰＩＲ質量相関を満たす各放出ペプチドに対して、標的化されたＭＳ３を効率的に実施することができるようになる（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４５】
ＫＢＵ２０４６はＨＳＰ９０βまたはＣＤＣ３７と直接結合しない（図１８）が、ＨＳＰ９０β−ＣＤＣ３７複合体とは結合する（図６Ａ）ことがわかった。したがって、この複合体は、いずれかのタンパク質には個別に存在しない好適な結合ポケットをもたらす。ＨＳＰ９０βの完全なＸ線結晶学的構造モデルがない場合には、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの既存の構造を用いた相同性ベースのモデルに依存した。ヒトＨＳＰ９０βのＮ末端ＡＴＰａｓｅドメイン（ＰＤＢ  ｉｄ＝ｌｕｙｍ、３ｎｍｑ）及び中間ドメイン（ＰＤＢ  ｉｄ＝３ｐｒｙ）の構造を使用した。非隣接モデルは一次配列の６５％を包含し、ＡＴＰ結合ドメインの末端にある６３の残基かの極めて不規則な領域によって分断されている。Ｃ末端領域の実験モデルは存在しない。次に、ＨＳＰ９０β構造全体を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＨＳＰ８２テンプレート（ＰＤＢ  ｉｄ＝２ｃｇ９）（Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に対してモデル化した。ＨＳＰ９０β−ＣＤＣ３７複合体のモデルを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＳＰ８２−ＣＤＣ３７複合体（ＰＤＢ  ｉｄ＝ｌｕｓ７）の構造上にＨＳＰ９０βモデルを重ね合わせて完成させた。ＨＳＰ９０βとＨＳＰ８２との配列同一性はＣＤＣ３７境界で９４％（タンパク質全体で８６％）であり、したがって相互作用の完全性を保持している。ＨＳＰ９０構造の顕著な特徴はヌクレオチド結合部位である。４９６．２オングストローム２の溶媒露出面積、及び３０１．３オングストローム３の容積を有する（Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）この部位は、十分に特性が決定されており、抗癌活性のための種々の化合物により標的とされている。ＣＤＣ３７と複合体化されると、１４４６．４オングストローム２の溶媒露出面積及び２０８２．６オングストローム３の容積を有する拡大表面が境界に形成される（図２０Ｂ）。Ａｒｇ１６７ｃｄｃ３７は、ヌクレオチド結合ポケットに引き込まれ、Ｇｌｕ３３ＨＳＰ９０のカルボキシル側鎖と水素結合を形成する（Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｒｇ１６７ｃｄｃ３７は、ヌクレオチド結合部位への接触を妨害することも、任意の結合リガンドを移動させることもない（Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ただし、大きなクレフトを２つの別々のポケット、すなわち新たに形成されたポケットと、元の状態だが、より小さいヌクレオチド結合部位に分割する。新たなポケットは、４２９．２オングストローム２の溶媒露出面積、及び８３２．５オングストローム３の容積を有し、ＨＳＰ９０β−ＣＤＣ３７複合体化状態でのみ存在する構造特徴の基準を満たす。
【０１４６】
実施例４
下流調節因子
Ｓｅｒ２２６のリン酸化の阻害が、細胞運動性を阻害するためのＫＢＵ２０４６の分子標的であると同定した後、その作用の下流調節因子を同定する実験を本明細書の実施形態の開発中に実施した。ＰＣ３細胞をＫＢＵ２０４６で処理して、２種類のＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ）遺伝子アレイプラットフォーム、すなわちヒト転移アレイ、ならびにヒト細胞外マトリックス及び吸着分子アレイを使用して発現遺伝子を差次的にスクリーニングした。ＫＢＵ２０４６は、オステオネクチン発現を２．０倍有意に抑制することを見出した。それ以外の有意な効果は同定されなかった。独立した実験で、遺伝子特異的なｑＲＴ／ＰＣＲにより差次的な発現を確認した（図２１Ａ）。オステオネクチンは、ＰＣａ内で過剰発現したとき、細胞運動性及び浸潤性の両方の増加させることを示した細胞外マトリックスタンパク質である。臨床的に、原発性ＰＣａでのオステオネクチンの過剰発現は、骨への転移の発現と関連している。加えて、これらの結果は、オステオネクチンの抑制により、少なくとも部分的にＫＢＵ２０４６の抗転移有効性が媒介されることを示している。これは、オステオネクチンのｓｉＲＮＡ媒介性の抑制がヒトＰＣａ細胞の浸潤性を阻害するとともに、ＫＢＵ２０４６の治療有効性を阻害することを実証することにより確認された（図２１Ｂ及びＣ）。
【０１４７】
ＫＢＵ２０４６は、ＨＳＰ９０βシャペロン機能を阻害する。
【０１４８】
本明細書の実施形態の開発中に実施した実験中に生化学的方法を使用して、結果が確証的であるモデル系全体、組み換え精製タンパク質を利用して厳密に定義されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系、及び無傷の細胞系と同様に、ＫＢＵ２０４６がＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体の形成、及び結果として生じるシャペロン機能を変化させることを実証した。少なくとも後者は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の生物学に対する一次作用によって、ＰＣａに関連した臨床関連シナリオに関与する。これは、ＡＲが、その機能にＨＳＰ９０シャペロン活性を必要とするクライアントタンパク質であるという事実と関連する。更に結果は、ＨＳＰ９０βとそのコシャペロンであるＣＤＣ３７との境界間に形成されるクレフト内にＫＢＵ２０４６が結合することを示している。
【０１４９】
コシャペロンであるＣＤＣ３７は、１９０超のキナーゼを含む、３５０超のクライアントタンパク質のＨＳＰ９０βとの結合を媒介する。そのアーム様構造（ｐｄｂ  ＩＤ：２ＷＯＧ）は、Ｓｅｒ２２６と並置される、多数のキナーゼの結合に関連する極めて動的で運動性の構造変化を可能にする。ＫＢＵ２０４６がＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βのいずれかと結合した場合、結果として生じる化学結合は、この２つのタンパク質の動的な機能、及びＳｅｒ２２６に対するキナーゼ接触性の調節を変化させる役割を果たし得ることが企図された。ＨＳＰ９０β、ＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体と結合しているＫＢＵ２０４６を検出するように設計された包括的な一連のアッセイを実施した。これには、蛍光によるサーマルシフトアッセイ、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、バイオレイヤー干渉分光法が含まれる。結合の物理的測定に基づくアッセイは陰性であった。しかしながら、いくつかの生化学方法は結合を検出した。
【０１５０】
ｄｒｕｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ＤＡＲＴＳ）アッセイは、標的タンパク質をプロテアーゼ消化から保護するリガンドの結合能を測定し、リガンドが誘導するタンパク質構造の変化に対して感度の高い、特にタンパク質柔軟性の変化に対して感度の高い測定値をもたらす。ＣＤＣ３７とＨＳＰ９０βが結合してヘテロ複合体を形成することを考慮すると、ＫＢＵ２０４６がヘテロ複合体と結合したことが実証された。ＤＡＲＴＳアッセイにおいて、いずれのタンパク質も存在するとき、ＫＢＵ２０４６は両方をプロテアーゼ消化から保護し、濃度依存的方法で、ＣＤＣ３７タンパク質を有意に増加させ、ＨＳＰ９０β分解産物を減少させた（図２２Ａ）。ＣＤＣ３７またはＨＳＰ９０βを個別に（例えば、ヘテロ複合体ではなく）試験したとき、保護は観察されなかった。
【０１５１】
化学的リンカーと結合されたＫＢＵ２０４６（図２３）は、生物活性を保持し、無傷細胞に（例えば、生理学的ＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体と）結合した。また実験では、それは、ＨＳＰ９０β及びＣＤＣ３７を含む９，０００のヒトタンパク質アレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合しなかったことが示された。
【０１５２】
本明細書の実施形態の開発中に実施した実験は、ＫＢＵ２０４６がヘテロ複合体機能を調節することを実証した。組み換えＨＳＰ９０β、ＣＤＣ３７及びカゼインキナーゼ（ＣＫ）タンパク質（本発明者らによる遺伝子操作）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、ＫＢＵ２０４６は、ＣＫ媒介性のＨＳＰ９０βのリン酸化を増加させた（図２２Ｂ）。ＣＤＣ３７は、ＣＫがクライアントタンパク質キナーゼであるクライアントタンパク質のＨＳＰ９０βとの結合を媒介する。ＫＢＵ２０４６は、ＣＫキナーゼ活性を調節しない。ＣＫは、Ｓｅｒ２２６のリン酸化を増加させなかった。これらの結果はすべて、細胞内部でＫＢＵ２０４６がＣＤＣ３７／ＨＳＰ９０βヘテロ複合体の形成を安定化させ、これにより特定のクライアントタンパク質の結合を増加させ、それによってＳｅｒ２２６をリン酸化する他のクライアントタンパク質の結合を阻害することを示している。
【０１５３】
ＨＳＰ９０β及びＣＤＣ３７の構造情報は、（種々の長さ及びリガンド結合能の）化学的架橋プローブをＭＳ３ベースの分析法と組み合わせた架橋法、Ｘ線結晶学的構造情報（タンパク質データベースＩＤ：１ｕｙｍ、３ｎｍｑ、３ｐｒｙ及び１ｕｓ７）、及び上記のＤＡＲＴＳ実験で得られたリガンド結合情報により得た。構造情報は、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｌｅａｄｅｒｓｈｉｐ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＡＰＰＬＩＥＤ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅプラットフォームによって統合した。これには、タンパク質表面解析、強力な相同性モデリング、複合的手法を使用した超並列ドッキングシミュレーション、及び高度な物理学ベースの再スコアリング方法論が統合されている。得られた情報に基づいたモデルは、ＨＳＰ９０βとＣＤＣ３７の結合が新たなポケットを形成し、これにＫＢＵ２０４６が高エネルギーの立体相互作用がなくても、有利なエネルギースコアで結合することを示した（図２２Ｃ）。ＣＤＣ３７からＡｒｇ１６７が大きなクレフトに突出し、ＨＳＰ９０βのＧｌｕ３３と水素結合して新たなポケットを形成する。このモデルは、ＫＢＵ２０４６がタンパク質−タンパク質相互作用を促進することを示している。このモデルは、ＫＢＵ２０４６がＨＳＰ９０β／ＣＤＣ３７ヘテロ複合体を安定化させるが（図２２Ａ）、ＨＳＰ９０βまたはＣＤＣ３７を個別に安定化しないことを実証する実験的ＤＡＲＴＳデータと一致している。
【０１５４】
ＫＢＵ２０４６が無細胞系においてシャペロン機能に影響を与えることが実証されているため、分子及び細胞ベースのアッセイを使用して細胞内での効果を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を実施した。ＨＳＰ９０のシャペロン作用はその活性構造でＡＲを維持しており、ＨＳＰ９０機能の阻害剤はリガンドに依存しないＡＲシグナル伝達を遮断する。したがって、ＫＢＵ２０４６がＨＳＰ９０機能を阻害する場合、実施した実験が示すように、ＫＢＵ２０４６はＡＲに関連するシャペロン機能を阻害し、ＡＲ依存的な転写活性を阻害し、ＡＲ依存的な細胞成長を阻害して、ＡＲを標的とする療法の治療有効性を強化する。本明細書の実施形態の開発中に実施した実験は、そのことを実証している。
【０１５５】
従来のＨＳＰ９０を標的とする薬剤は直接ＨＳＰ９０と結合し、そのシャペロンサイクルを遮断するため、中核細胞過程で比較的重大な変化を呈し、その結果、直接的な細胞毒性を誘発する。全身レベルでのこのような重大な薬理学的効果は、正常な細胞機能を妨害し、全身毒性を誘発するため、最終的な治療有効性が制限される。これは、細胞毒性化学療法による状況と類似している。対照的に、ＫＢＵ２０４６は、ＨＳＰ９０機能に対してより選択的な作用を示し、毒性が全身に及ばない治療的処置である。ただし、ＫＢＵ２０４６の機構的効果の１つの結果は、その効果が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系での高速読み出し時に、細胞毒性化学療法または従来のＨＳＰ９０阻害剤よりも強力ではないことである。これに基づき、ＫＢＵ２０４６を媒介したＡＲシグナル伝達の阻害に関する本明細書に記載する実験では、短期的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、観測されたような小規模な効果が生じる（ｐｒｏｃｕｄｅ）と予測した。しかしながら、分子相互作用、細胞シグナル伝達、及び細胞成長の測定に関する複数のアッセイにわたって確証的な効果が実証された。更に、短期的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系に関連して、治療時間の増加に伴い有効性が増強したことが観察された。
【０１５６】
具体的には、ＦＬＡＧ−ＨＳＰ９０βでトランスフェクトした、かつＫＢＵ２０４６で処理した／処理しなかった細胞を使用して、ＦＬＡＧ  ＩＰの実施後に銀染色法を実施した。ＫＢＵ２０４６は、約６０ｋＤａのタンパク質の結合を阻害した（図２４Ａ）。ＭＳによるプロテオーム解析で、ＨＯＰが同定された。これは非常に重要な発見である。ＨＯＰは、ＡＲをＨＳＰ９０にもたらすシャペロン複合体のメンバーである。この結果はＨＯＰに特異的なウエスタンブロットによって確認された（図２４Ｂ）。このように、ＫＢＵ２０４６は、シャペロンを媒介した活性ＡＲの保持に必要とされる既知の分子相互作用を阻害する。ＡＲと関連するシャペロン活性のＫＢＵ２０４６による阻害は、ＡＲ応答遺伝子活性を減少させる（図２４Ｃ）。ホルモンを含まないチャコール処理済み血清（ＣＳＳ）条件下で、ＡＲ陽性のＬＮＣａＰ細胞を成長させ、ＫＢＵ２０４６、Ｒ１８８１（例えば、アンドロゲン）及び／またはビカルタミドで１日または３日間処理し、ＡＲ応答性の前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）の発現をｑＲＴ／ＰＣＲで測定した。ＫＢＵ２０４６単独では効果を有しなかったが、Ｒ１８８１を媒介したＰＳＡ発現を阻害し、その効果は３日でさらに増強された。ビカルタミドは、単独ではＬＮＣａＰ細胞（ＡＲ  Ｔ８６８Ａ突然変異体によるもの）内で弱いアゴニストであるが、Ｒ１８８１の強いアゴニスト作用を機能的に阻害し、その結果、Ｒ１８８１を媒介したＰＳＡの増加を減少させる。重要な点として、ＫＢＵ２０４６による３日間の治療は、ビカルタミドの治療有効性を増加させる。ＫＢＵ２０４６は、アンドロゲン作動性の細胞成長を阻害するように作用し、ビカルタミドの有効性を強化し、治療期間が３日間から６日間へと増加することに伴い、その効果が増幅される（図２４Ｄ）。アッセイはＬＮＣａＰ（突然変異体ＡＲ）及びＶＣａＰ細胞の両方でこれを実施した。
【０１５７】
参考文献
以下の参考文献ならびに本明細書内の上記参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｏ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｋ  Ｒ，ｅｄｓ．（２００６）．Ｆｌａｖａｎｏｉｄｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  （Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）．
Ａｖｒａｍ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｓｐｙｋｅｒ，Ｄ．Ａ，Ｈｅｎｔｈｏｒｎ，Ｔ．Ｋ，ａｎｄ  Ｃａｓｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｖ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｒｅａｔｈ  ｔｏ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８５，  ７１−７７．
Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｃｏｂｅｌｌｉ，  Ｃ．，  Ｇｏｌｄｅ，  Ｈ．，  Ｓｃｈｕｍｉｔｚｋｙ，  Ａ，  Ｖｉｃｉｎｉ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．（１９９８）．ＳＡＡＭ  ＩＩ：  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｅｒ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ４７，  ４８４−４９２．
Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ，  Ｈａｋｉｍ，  Ｆ．，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｇ．  Ｎ．，  Ｋｙｌｅ，  Ｅ．，  Ｃｅｐａｄａ，  Ｒ，  Ｓｚａｂｏ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｆｏｗｌｅｒ，  Ｄ．，  Ｇｒｅｓｓ，Ｒ，  ａｎｄ  Ｎｅｃｋｅｒｓ，  Ｌ．  （１９９６）．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｕｒｇｉｎｇ．  Ｂｌｏｏｄ  ８８，  ７３１−７４１．
Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ，  Ｔ．  Ａ，  Ａｄａｍｉａｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ，  Ｊ．  （２００３）．  Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｌｏｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．  Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３２，  ５０５５２６．
Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ，  Ｔ．  Ａ，  ａｎｄ  Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，  Ａ．  （２００８）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ：  ｇｌｏｂａｌ  ｓｈａｐｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．  ＢＭＣ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，  ４５．
Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ，  Ｔ．  Ａ，  Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，  Ａ，  ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ，  Ｊ．  （２００５）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ：  ａ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １４，２９７２−２９８１．
Ｂｒｅｅｎ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｍｏｒａｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｌｉｕ，  Ｗ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．，  Ｖａｒｙ，  Ｃ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２０１３）．Ｅｎｄｏｇｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖｉｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，  ｅ７２４０７．
Ｃａｔｈｅｒｉｎｏ，  Ｗ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｊｏｒｄａｎ，  Ｖ．  Ｃ．  （１９９５）．  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ９２，３９−４７．
Ｃｈａｖｅｚ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｗｅｉｓｂｒｏｄ，  Ｃ．  Ｒ，  Ｚｈｅｎｇ，  Ｃ．，  Ｅｎｇ，  Ｊ．  Ｋ，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，  Ｊ．  Ｅ．  （２０１３）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：  ＭＣＰ  １２，１４５１−１４６７．
Ｃｏｂｅｌｌｉ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．  （１９９８）．  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ：  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＡＡＭ  ＩＩ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４５，  ７９−１０１．
Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，  Ｌ．  Ｍ．，  Ｆｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，  Ｌ．  Ｍ．  （２００２）．  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｂｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，２３８７−２３９２．
Ｃｒａｆｔ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｒｏｍｅｒｏ，  Ｄ．，  Ｖａｒｙ，  Ｃ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ．  Ｃ．  （２００７）．  Ｅｎｄｏｇｌｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＬＫ２−Ｓｍａｄｌ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，  ７２４０−７２５０．
Ｄｅｎｇ，  Ｙ，  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｂ．  （２００８）．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｒａｎｄ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｈｙｓｉｃｓ  １２８，  １１５１０３．
Ｄｉｎｇ，  Ｙ．，  Ｘｕ，  Ｌ．，  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，  Ｂ．  Ｄ．，  Ｈｅｌｅｎｏｗｓｋｉ，  １．  Ｂ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｃａｔａｌｏｎａ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．  Ｊ．，Ｐｉｎｓ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２００７）．  Ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  １８，３２１−３３０．
ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｆｒａｎｃｉａ，  Ｇ．，  Ｍａｎ，  Ｓ．，  Ｍｏｓｓｏｂａ，  Ｍ．，  Ｍｅｄｉｎ，  Ｊ．  Ａ，  Ｖｉｌｏｒｉａ−Ｐｅｔｉｔ，  Ａ，  Ｈｉｃｋｌｉｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｅｍｍｅｎｅｇｇｅｒ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｅｒｂｅｌ，  Ｒ．  Ｓ．  （２００６）．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌａｙｉｎｇ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ａｎ
ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ９０４−９１６．
Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．  （１９９８）．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐａｒｔｒｎｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｉｎｐｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｏｕｔｐｕｔ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＡＡＭ  ＩＩ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４５，  ５９−７８．
Ｆｒｉｅｄｌ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，  Ｋ．  （２００３）．  Ｔｕｍｏｕｒ−ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ：  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｓｃａｐｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３，３６２−３７４．
Ｇｒａｖｅｓ，  Ａ．  Ｐ．，  Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｂｏｙｃｅ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｃａｓｅ，  Ｄ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，  Ｂ．Ｋ．  （２００８）．  Ｒｅｓｃｏｒｉｎｇ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｈｉｔ  ｌｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｓｉｔｅｓ：  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７７，９１４−９３４．
Ｇｕｅｓｔ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｕｅｔｒｅｃｈｔ，  Ｊ．  （１９９９）．  Ｄｒｕｇｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ／ａｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｍａｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ５３，  １４５−１５１．
Ｈｕａｎｇ，  ｘ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｘｕ，  Ｌ．，  Ｌｉｕ，  Ｙ  Ｑ．，  Ｄｅｂ，  Ｄ．  Ｋ．，  Ｐｌａｔａｎｉａｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２００５）．Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ＭＭＰ−２，  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，  ３４７０−３４７８．
Ｊｉａｎｇ，  Ｗ．，  Ｈｏｄｏｓｃｅｋ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｒ  （２００９）．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｗｉｔｈ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｐｅｌ１ｕｒｂａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｒｅｐｌｉｃａ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  （ＦＥＰＩＲＥＭＤ）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ５，  ２５８３−２５８８．
Ｊｉａｎｇ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｂ．  （２０１０）．  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ  Ｒｅｐｌｉｃａ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  （ＦＥＰＩＨ−ＲＥＭＤ）  ｆｏｒ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ６，２５５９−２５６５．
Ｋａｔａｒｉａ，  Ｂ．  Ｋ．，  Ｖｅｄ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ，  Ｈ．  Ｆ．，  Ｈｏｙ，  Ｇ．  Ｒ，  Ｌｅａ，  Ｄ．，  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｍ．  Ｙ．，  Ｍａｎｄｅｍａ，  １．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｓｈａｆｅｒ，  Ｓ．  Ｌ．  （１９９４）．  Ｔｈｅ  ｐｈａｎｎａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｐｏｆｏｌ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  ８０，  １０４−１２２．
ＫｎｏｄｅＩｌ，  Ｒ．  Ｇ．，  Ｉｓｈａｋ，  Ｋ．  Ｇ．，  Ｂｌａｃｋ，  Ｗ．  Ｃ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｔ．  Ｓ．，  Ｃｒａｉｇ，  Ｒ，  Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ，  Ｎ．，  Ｋｉｅｒｎａｎ，  Ｔ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｗｏｌｌｍａｎ，  Ｊ．  （１９８１）．  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １，  ４３１−４３５．  Ｋｒｉｓｈｎａ，  Ｓ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ．  Ｃ．  （２０１４）．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｆｕｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，  ２２３−２３９．
Ｋｒｉｓｈｎａ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｌｕａｎ，  Ｃ．  Ｒ．，  Ｍｉｓｈｒａ，  Ｒ  Ｋ．，  Ｘｕ，  Ｌ．，  Ｓｃｈｅｉｄｔ，  Ｋ．  Ａ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｗ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ．  Ｃ．  （２０１３）．  Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ４．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，  ｅ８１５０４．
Ｌａｋｓｈｍａｎ，  Ｍ．，  Ｘｕ，  Ｌ．，  Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎ，  Ｙ，  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｊ．，  Ｔａｋｉｍｏｔｏ，  Ｃ．  Ｒ．，  Ｈｅｌｅｎｏｗｓｋｉ，  Ｉ．，  Ｐｅｌｌｉｎｇ，  Ｊ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２００８）．  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，２０２４−２０３２．
Ｌａｎｇ，  Ｐ．  Ｔ．，  Ｂｒｏｚｅｌｌ，  Ｓ．  Ｒ，  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｓ．，  Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍｅｎｇ，  Ｅ．  Ｃ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｖ．，  Ｒｉｚｚｏ，  Ｒ．  Ｃ．，  Ｃａｓｅ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｊａｍｅｓ，  Ｔ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｋｕｎｔｚ，  Ｉ．  Ｄ．  （２００９）．  ＤＯＣＫ  ６：  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｍｏｄｅｌ  ＲＮＡ−ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  ＲＮＡ  １５，１２１９−１２３０．
Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙ，  Ａ．，  Ｔｙｋａ，  Ｍ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｌａｎｇｅ，  Ｏ．  Ｆ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｊａｃａｋ，  Ｒ，  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｋ．，  Ｒｅｎｆｒｅｗ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｓｈｅｆｆｌｅｒ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  ＲＯＳＥＴＴＡ３：  ａｎ  ｏｂｊｅｃｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４８７  ５４５−５７４．
Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｌｏｍｂａｒｄｏ，  Ｆ．，  Ｄｏｍｉｎｙ，  Ｂ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，  Ｐ．  Ｊ．  （２００１）．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ４６，  ３−２６．
Ｌｉｕ，  Ｙ，  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，  Ｒ，  Ｐｉｎｓ，  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２００２）．  Ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｌｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ，  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，  ８２７２−８２８１．
Ｌｏｍｅｎｉｃｋ，  Ｂ．，  Ｈａｏ，  Ｒ，  Ｊｏｎａｉ，  Ｎ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ａｇｈａｊａｎ，  Ｍ．，  Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．，  Ｗｕ，  Ｒ．  Ｐ．，  Ｇｏｍｅｚ，  Ｆ．，  Ｌｏｏ，  １．  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｔａｒｇｅｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ａｆ：ｆｍｉｔｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  （ＤＡＲＴＳ）．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａ！  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，２１９８４−２１９８９．
Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，  Ｄ．  Ｈ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｈ．，  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｍ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｈａｎ，  Ｄ．  Ｋ．  （２００９）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｏｒｃｅｒｅｒ  ２  ａｎｄ  ＳＥＱＵＥＳＴ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，  Ｕｎｉｔ  １３  １３．
Ｍａｎａｓ，  Ｅ．  Ｓ．，  Ｘｕ，  Ｚ．  Ｂ．，  Ｕｎｗａｌｌａ，  Ｒ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｏｍｅｒｓ，  Ｗ．  Ｓ．  （２００４）．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｕｓｉｎｇ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １２，  ２１９７−２２０７．
Ｍｅｓｓｉｎａ，  Ｍ．，  ＭｃＣａｓｋｉｌｌ−Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｌａｍｐｅ，  Ｊ．  Ｗ．  （２００６）．  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｙ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：  ｒｅｖｉｅｗ，  ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ，  ａｎｄ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９８，  １２７５−１２８４．
Ｍｉｎｎ，  Ａ  １．，  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．  （２００８）．  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｉｎ  ＣＡＮＣＥＲ：  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｖ．Ｔ．  ＤｅＶｉｔａ，  Ｔ．Ｓ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｓ．Ａ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ｅｄｓ．  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ），  ｐｐ．  １３５−１４６．
Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｈｕｅｙ，  Ｒ，  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｗ．，  Ｓａｎｎｅｒ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｂｅｌｅｗ，  Ｒ  Ｋ．，  Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ａ  Ｊ．  （２００９）．  ＡｕｔｏＤｏｃｋ４  ａｎｄ  ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓ４：  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，２７８５−２７９１．
Ｎｅｃｋｅｒｓ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，  Ｐ．  （２０１２）．  Ｈｓｐ９０  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａｒｅ  ｗｅ  ｔｈｅｒｅ  ｙｅｔ？  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ａｎ  ｏｆ  ｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，６４−７６．
Ｐａｖｅｓｅ，  Ｊ．，  Ｏｇｄｅｎ，  Ｉ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２０１３）．  Ａｎ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：  ＪｏＶＥ，  ｅ５０８７３．
Ｐａｖｅｓｅ，  １．  Ｍ．，  Ｆａｒｍｅｒ，  Ｒ  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ  Ｃ．  （２０１０）．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ２９，  ４６５−４８２．
Ｐｏｌｉｅｒ，  Ｓ．，  Ｓａｍａｎｔ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｗｏｒｋｍａｎ，  Ｐ．，  Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌ，  Ｌ．  Ｈ．  （２０１３）．  ＡＴＰ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｓｐ９０−Ｃｄｃ３７  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，３０７−３１２．
Ｒｏｅ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ａｌｉ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｐ．，  Ｖａｕｇｈａｎ，  Ｃ．  Ｋ．，  Ｐａｎａｒｅｔｏｕ，  Ｂ．，  Ｐｉｐｅｒ，  Ｐ．  Ｗ．，  Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌ，  Ｌ．  Ｈ．  （２００４）．  Ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｐ５０（ｃｄｃ３７）．  Ｃｅｌｌ  １１６，  ８７−９８．
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，  Ｒ．  Ｈ．  （２００６）．  Ｔｈｅ  ＮＣＩ６０  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，８１３−８２３．
Ｓｔｅｅｇ，  Ｐ．  Ｓ．  （２００６）．  Ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，  ８９５−９０４．
Ｔａｉｐａｌｅ，  Ｍ．，  Ｋｒｙｋｂａｅｖａ，  Ｉ．，  Ｋｏｅｖａ，  Ｍ．，  Ｋａｙａｔｅｋｉｎ，  Ｃ．，  Ｗｅｓｔｏｖｅｒ，  Ｋ．  Ｄ．，  Ｋａｒｒａｓ，  Ｇ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．  （２０１２）．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＳＰ９０−ｃｌｉｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １５０，  ９８７−１００１．
Ｔａｌｍａｄｇｅ，  Ｊ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ，  Ｉ．  Ｊ．  （２０１０）．  ＡＡＣＲ  ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  ｓｅｒｉｅｓ：  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，  ５６４９−５６６９．
Ｔａｎｇ，  ｘ．，  Ｍｕｎｓｋｅ，  Ｇ．  Ｒ．，  Ｓｉｅｍｓ，  Ｗ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，  １．  Ｅ．  （２００５）．  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉａｂｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７，  ３１１３１８．
Ｖａｕｇｈａｎ，  Ｃ．  Ｋ．，  Ｇｏｈｌｋｅ，  Ｕ．，  Ｓｏｂｏｔｔ，  Ｆ．，  Ｇｏｏｄ，  Ｖ  Ｍ．，  Ａｌｉ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，  Ｃ．，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｖ，  Ｓａｉｂｉｌ，  Ｈ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌ，  Ｌ．  Ｈ．  （２００６）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｈｓｐ９０−Ｃｄｃ３７−Ｃｄｋ４  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ２３，  ６９７−７０７．
Ｗａｎｇ，  Ｊ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｙ，  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｂ．  （２００６）．  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒａｉｎｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ９１，  ２７９８−２８１４．
Ｗｅｉｓｂｒｏｄ，  Ｃ．  Ｒ．，  Ｃｈａｖｅｚ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｅｎｇ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｙａｎｇ，  Ｌ．，  Ｚｈｅｎｇ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，  Ｊ．  Ｅ．  （２０１３）．  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｗｅｌｌｓ，  Ａ．，  Ｇｒａｈｏｖａｃ，  Ｊ．，  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｍａ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，  Ｄ．  （２０１３）．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３４，  ２８３−２８９．
Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ，  Ｌ．，  Ｓａｎｔａｇａｔａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎ，  Ｎ．  Ｕ．  （２０１２）．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＨＳＰ９０  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，１１０８−１１２４．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｌ．，  Ｂａｒｒｉｌ，  ｘ．，  Ｄｙｍｏｃｋ，  Ｂ．，  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，  Ｌ．，  Ｓｕｒｇｅｎｏｒ，  Ａ，  Ｂｅｓｗｉｃｋ，  Ｍ．，  Ｄｒｙｓｄａｌｅ，  Ｍ．，  Ｃｏｌｌｉｅｒ，  Ａ，  Ｍａｓｓｅｙ，  Ａ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｐｕｒｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＨＳＰ９０  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ＩＩ，  ７７５−７８５．
Ｘｕ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇａｎ，  Ｒ．  Ｃ．  （２００６）．  Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２−２７−ｋＤａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７０，８６９−８７７．
Ｘｕ，  Ｌ．，  Ｄｉｎｇ，  Ｙ．，  Ｃａｔａｌｏｎａ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｗ．  Ｆ．，  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，  Ｂ．  Ｄ．，  Ｗｅｌｌｍａｎ，  Ｋ．，ＫｕＭｅｒ，  Ｊ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．，  Ｓｃｈｅｉｄｔ，  Ｋ．  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  ＭＥＫ４  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １０１，  １１４１１１５５．
Ｚｕｂｒｉｅｎｅ，  Ａ，  Ｇｕｔｋｏｗｓｋａ，  Ｍ．，  Ｍａｔｕｌｉｅｎｅ，  １．，  Ｃｈａｌｅｃｋｉｓ，  Ｒ．，  Ｍｉｃｈａｉｌｏｖｉｅｎｅ，  Ｖ，  Ｖｏｒｏｎｃｏｖａ，  Ａ．，Ｖｅｎｃｌｏｖａｓ，  Ｃ．，  Ｚｙｌｉｃｚ，  Ａ．，  Ｚｙｌｉｃｚ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｕｌｉｓ，  Ｄ．  （２０１０）．  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｃｉｃｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｈｓｐ９０  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５２，  １５３−１６３．
【図１】
2017534627.tif 000019
【図２Ａ】
2017534627.tif 000020
【図２Ｂ】
2017534627.tif 000021
【図２Ｃ】
2017534627.tif 000022
【図２Ｄ】
2017534627.tif 000023
【図２Ｅ】
2017534627.tif 000024
【図３Ａ】
2017534627.tif 000025
【図３Ｂ】
2017534627.tif 000026
【図３Ｃ】
2017534627.tif 000027
【図３Ｄ】
2017534627.tif 000028
【図４Ａ】
2017534627.tif 000029
【図４Ｂ】
2017534627.tif 000030
【図４Ｃ】
2017534627.tif 000031
【図４Ｄ】
2017534627.tif 000032
【図４Ｅ】
2017534627.tif 000033
【図５Ａ】
2017534627.tif 000034
【図５Ｂ】
2017534627.tif 000035
【図５Ｃ】
2017534627.tif 000036
【図５Ｄ】
2017534627.tif 000037
【図６Ａ】
2017534627.tif 000038
【図６Ｂ】
2017534627.tif 000039
【図６Ｃ】
2017534627.tif 000040
【図６Ｄ】
2017534627.tif 000041
【図７Ａ】
2017534627.tif 000042
【図７Ｂ】
2017534627.tif 000043
【図７Ｃ】
2017534627.tif 000044
【図７Ｄ】
2017534627.tif 000045
【図７Ｅ】
2017534627.tif 000046
【図７Ｆ】
2017534627.tif 000047
【図７Ｇ】
2017534627.tif 000048
【図７Ｈ】
2017534627.tif 000049
【図７Ｉ】
2017534627.tif 000050
【図７Ｊ】
2017534627.tif 000051
【図７Ｋ】
2017534627.tif 000052
【図７Ｌ】
2017534627.tif 000053
【図７Ｍ】
2017534627.tif 000054
【図７Ｎ】
2017534627.tif 000055
【図７Ｏ】
2017534627.tif 000056
【図７Ｐ】
2017534627.tif 000057
【図７Ｑ】
2017534627.tif 000058
【図７Ｒ】
2017534627.tif 000059
【図７Ｓ】
2017534627.tif 000060
【図７Ｔ】
2017534627.tif 000061
【図７Ｕ】
2017534627.tif 000062
【図８】
2017534627.tif 000063
【図９】
2017534627.tif 000064
【図１０】
2017534627.tif 000065
【図１１】
2017534627.tif 000066
【図１２】
2017534627.tif 000067
【図１３】
2017534627.tif 000068
【図１４Ａ】
2017534627.tif 000069
【図１４Ｂ】
2017534627.tif 000070
【図１４Ｃ】
2017534627.tif 000071
【図１４Ｄ】
2017534627.tif 000072
【図１５】
2017534627.tif 000073
【図１６】
2017534627.tif 000074
【図１７】
2017534627.tif 000075
【図１８】
2017534627.tif 000076
【図１９Ａ】
2017534627.tif 000077
【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
2017534627.tif 000093
【図２４Ｂ】
2017534627.tif 000094
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2017534627.tif 000097