(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を有する、植物または動物細胞で姉妹染色分体の分離を調節する能力をもつ化合物を特定する方法：
セパリンを、セパリン切断部位ＥｘｘＲを含む基質の存在下で被験化合物とともに保温し、さらに前記セパリンのタンパク質分解活性に対する前記被験化合物の調節効果を決定する。
【請求項２】
前記セパリンがリコンビナントである請求項１の方法。
【請求項３】
前記セパリンがヒトのセパリンである請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記基質が、オカダイク酸の存在下でバキュロウイルスで遺伝子組み換えによって製造されたリン酸化ＳＣＣ１である請求項１の方法。
【請求項５】
前記基質がヒトのＳＣＣ１またはセパリン切断部位ＥｘｘＲを含むそのフラグメントもしくはその変種である請求項１の方法。
【請求項６】
前記基質が配列番号：１に記載のアミノ酸配列をもつペプチドである請求項１の方法。
【請求項７】
前記セパリンが植物セパリンである請求項１または２の方法。
【請求項８】
前記基質がタンパク質分解活性による切断生成物の量に比例して検出可能なシグナルを発生する標識を有し、さらに前記シグナルが前記被験化合物の存在下および非存在下で測定される請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項９】
前記標識が蛍光である請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、真核細胞における有糸分裂および減数分裂に影響を与える化合物、および前記化合物を特定する方法に関する。特に本発明は、主に姉妹染色分体の分離を調節することによって人間の疾患を治療および予防することに関する。
【０００２】
従来技術
細胞分裂の過程で、姉妹染色分体は、細胞の背後の紡錘体極から発する微小管によって細胞の向き合う半分側に引っ張られる。一組の微小管は対抗する極から発する他方の微小管と組み合わされている。これら微小管の役割は２つの極を分離させておく（さらに操縦する）ことである。一方、第二の微小管の一組は、動原体と称される特殊化された構造物を介して染色体に付着し、それらを極へと牽引する。姉妹染色分体は、動原体が背中合わせの極から発する微小管に付着するので互いに分離される（Rieder et al., 1998)。この過程の進行中、染色体は単なる乗客ではない。分裂中期の間、姉妹染色分体を分離させようとする微小管の性向は、姉妹染色分体を一緒に保持しようとする粘着によって無効にされる。粘着はしたがって、細胞が姉妹染色分体を赤道板上に整列させる張力を生じる。もし姉妹染色分体が紡錘体形成前に分離したら、相同である染色分体と姉妹染色分体を細胞が区別するのは困難であろう。微小管の力の増加ではない粘着の突然の喪失は、分裂後期における姉妹染色分体の分離の引き金となると考えられる（Miyazaki et al., 1994)。粘着はまた、二本鎖の破壊のために染色体がバラバラになるのを防止し、組換えによるその修理を促進する。
【０００３】
染色体の分離異常を回避するために、分裂後期は、各々二重化された染色体の姉妹染色分体が背後の分裂紡錘体極に付着した後で開始しなければならない。微小管は、"検索と捕捉"メカニズム（これは全染色体で同時に完了させることはできない）によって動原体を"発見"すると考えられる（Hayden et al., 1990; Merdes & De Mey, 1990）．細胞は、したがって最後の染色体が二極との結合を達成するまで姉妹染色分体の分離を送らせる調節メカニズムを有する。中期から後期に移るときに姉妹染色分体の凝集が消滅するのは、したがって真核細胞の細胞周期における高度に調節された工程である。
【０００４】
姉妹染色分体の凝集は、コヘッシン（Losoda et al., 1998)と称されるマルチサブユニット複合体に依存している。この複合体は少なくとも４つのサブユニット、Ｓｍｃ１ｐ、Ｓｍｃ３ｐ、Ｓｃｃ１ｐおよびＳｃｃ３ｐ（これらは全て酵母とヒトとの間で保存されている）を含む。まだ証明されていないが、コヘッシンは姉妹染色分体を一緒に保持するつなぎ綱の重要な構成成分であるらしい。コヘッシンと染色体との間の結合は、Ｓｃｃ２（Ｍｉｓ４）タンパク質に依存することが最近分かった。凝集はＤＮＡ複製時に完成される（Uhlman & Nasmyth, 1998）。Ｅｃｏ１（Ｃｔｆ７）タンパク質はＳ期における凝集の完成に必要であるが、コヘッシンとは異なりＧ２およびＭ期の凝集の維持には要求されないことが最近になって判明した。酵母では、コヘッシンは中期まで強固に染色体と結合している。すなわち、中期の染色体アラインメントの間コヘッシンは染色体上に存在する。動物細胞では、しかしながらコヘッシン集合体は前期において染色体から解離する（Losada et al., 1998)）。存在するとしてどれくらいのコヘッシンが中期に染色体上に残存するかは明らかではない。したがって、動物細胞の中期において姉妹染色分体を一緒に束ねる結合の性質は明らかではない。依然として染色体と結合したままの少量のコヘッシンが必要なのか、またはいくつかの他のタンパク質複合体が必要なのかもしれない。
【０００５】
酵母では、少なくとも２つのコヘッシンのサブユニット（Ｓｃｃ１ｐおよびＳｃｃ３ｐ）が、姉妹染色分体が分離する正確な位置で突然染色体から消失する（Michaelis et al., 1997))。このことから、少なくとも酵母では、コヘッシンの突然の状態変化が後期開始の引き金となるのではないかと考えられた。ショウジョウバエでは、前中期に染色体と結合するｍｅｉＳ３３２タンパク質もまた後期の開始時に消失する。ＭｅｉＳ３３２は減数分裂時の姉妹染色分体の凝集に必要であるが、有糸分裂時には必要ではない（Moore et al., 1998; Kerrebrock et al., 1995)）。ＭｅｉＳ３３２はおそらくコヘッシンのサブユニットではなく、ヒトでそれと相同なタンパク質が存在するか否かは明らかではない。
【０００６】
Ｓｃｃ１ｐの染色体からの解離も姉妹染色分体の分離もともに、Ｅｓｐ１ｐと称される特殊化された姉妹染色分体分離タンパク質（セパリン）に依存している（Ciosk et al., 1998))。Ｅｓｐ１と相同なセパリンが、分裂酵母シゾサッカロミケス＝ポンベ（Schizosaccharomyces pombe)、真菌アスペルギルス＝ニジュランス（Aspergillus nidulans）、線虫ケノラブディティス＝エレガンス（Caenorhabditis elegans）、果実蠅のドロソフィラ＝メラノガスタ−（Drosophila melanogaster)、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびヒトで存在する。このことは、セパリンが、植物、真菌および動物で保存されている染色体分離において基本的な役割を有することを強く示唆している。Ｅｓｐ１はＰｄｓ１ｐと称される抑制タンパク質と強固に結合しているが、中期から後期への移行直前におけるＰｄｓ１ｐの破壊は、後期促進複合体（ＡＰＸ）によって仲介されるユビキティネ−ションによって惹起される（Cohen-Fix et al., 1996))。ＡＰＣは大きなマルチサブユニット複合体で、そのサブユニットのほとんどは酵母とヒトとの間で保存されている。Ｃｄｃ２０ｐおよびＣｄｈ１ｐと称されるアクチベ−タ−タンパク質と一緒になって、ＡＰＣはユビキティネ−ションを仲介し、それによって多くの異なる細胞周期タンパク質（Ｐｄｓ１および有糸分裂サイクリンのような後期抑制物質を含む）の破壊を仲介する。Ｐｄｓ１の破壊は、アクチベ−タ−Ｃｄｃ２０が結合したＡＰＣの一形態によって仲介される。この形態はＡＰＣCdc20と称される（概説として以下を参照されたい：Peters, 1998))。
【０００７】
Ｐｄｓ１と同様な特性をもつタンパク質が、分裂酵母（Ｃｕｔ２ｐ）、ツメガエル（Xenopus)およびヒトで見出された（Funabiki et al., 1996; Zou et al., 1999)）。ＡＰＣは、ほとんどの真核生物（全部でないとしても）の姉妹染色分体分離に必須である。酵母では、姉妹染色分体分離の促進におけるその主要な役割はＰｄｓ１を破壊することである（Ｐｄｓ１はＥｓｐ１を遊離させ、おそらくコヘッシンによって仲介される姉妹染色分体間の物理的結合を破壊することによってＥｓｐ１に姉妹染色分体の凝集を破壊する）。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、姉妹染色分体の分離メカニズムをさらに解明することであった。特に、本発明の目的は、Ｅｓｐ１が発芽酵母において染色体からＳｃｐ１の解離を仲介するメカニズムを理解し、ヒトの治療、特に癌の治療で、さらに姉妹染色分体分離の調節が治療的にまたは別な態様で有益である全ての他の状況で標的として前記メカニズムを用いることによって前記仲介メカニズムを利用することを目的とする。
本発明の基礎となるこの問題を解明するために以下のアプロ−チを採用した。
後期開始時の染色体からのＳｃｃ１ｐの解離はＥｓｐ１に依存するという観察は、Ｅｓｐ１はこの過程で直接的な役割を果たすか、またはＥｓｐ１はＳｃｃ１ｐの解離をもたらす過程の開始に間接的に関与するという可能性を示唆した。本発明の実験では、Ｅｓｐ１はまたＧ１期のＳｃｃｐ１と染色体との結合を妨げることが判明した（実施例１参照）。このことは、Ｅｓｐ１の役割は非常に直接的である可能性を強く示唆している。Ｓｃｃ１は不安定なタンパク質で、後期の開始時に染色体から解離した後迅速に破壊され、次回のＤＮＡ複製で凝集が生じるために次の細胞周期のＧ１期に再合成されねばならない（Michelis et al., 1997)）。Ｇ２期に合成されたＳｃｃ１ｐはまた酵母の染色体に結合できるが、このような環境下では凝集を起こすことはできないことが判明した（Uhlmann & Nasmyth, 1998)）。しかしながら、初期Ｇ１期に合成されたＳｃｃｐ１は完全に結合できないにしても弱く染色体に結合することが観察された。図１に示したように、Ｅｓｐ１の不活化は、初期Ｇ１期のＳｃｃｐ１と染色体との効果的な結合を可能にする。それは、Ｅｓｐ１は後期の開始時にＳｃｃｐ１の染色体からの解離を惹起するだけでなく、その後に続くＧ１期におけるＳｃｃ１ｐと染色体との安定な結合を妨げることを暗示している。このことは、Ｅｓｐ１は、Ｓｃｃ１ｐと染色体との結合の制御において相当に直接的な役割を有することを強く示唆している。
【０００８】
この発見から出発して、Ｅｓｐ１活性をin vitroで測定できるアッセイを完成させた。ノコダゾ−ルで中期様状態に拘束した細胞から単離した酵母クロマチンの粗調製物を、ＧＡＬプロモ−タ−によりＥｓｐ１を過剰産生している細胞から調製した可溶性抽出物とともに保温した（図２）。Ｓｃｃ１ｐを検出するために、マルチＨＡまたはＭｙｃエピトープ（これらはモノクローナル抗体で容易に検出できる）をもつそのＣ−末端にそのＳｃｃ１タンパク質が付加されている細胞を用いた。ノコダゾールでブロックした細胞の全Ｓｃｃ１ｐの約７０％がクロマチンと強固に結合し、したがって使用したクロマチン分画に存在している。ｅｓｐ１−１変異体細胞から調製した抽出物と保温した後、ほとんどのＳｃｃ１ｐはクロマチンと強固に結合したままであるが、高レベルの野性型Ｅｓｐ１タンパク質を含む抽出物と保温した場合は大半はクロマチン分画から消失する。少々驚いたことには、Ｅｓｐ１タンパク質によって解離させられたＳｃｃ１ｐタンパク質は、切断生成物として"可溶性"上清分画に出現した。この切断物のＣ−末端フラグメントは基質としてＣ−末端に付加されたＳｃｃ１タンパク質を用いて検出され、切断物のＮ−末端フラグメントは基質としてＮ−末端付加Ｓｃｃ１タンパク質を用いて検出された。これらの切断生成物のサイズによって、Ｅｓｐ１は１０ｋｄ以内の間隔に１つまたは２つ以上の固有のＳｃｃ１ｐ切断を誘発することが示唆された。このＥｓｐ１依存切断は、Ｐｄｓ１を翻訳生成した網状赤血球溶解物の添加によって抑制されたが、無関係のコントロ−ルタンパク質を翻訳生成したその他の点では同一の網状赤血球溶解物の添加では抑制されなかった。切断アッセイによって検出されるＥｓｐ１活性はしたがってＰｄｓ１によって抑制されるが、このことは、Ｐｄｓ１は実際にＥｓｐ１の抑制物質であることを初めて直接的に示した。
【０００９】
Ｓｃｃ１ｐのＥｓｐ１誘発切断はまた後期の開始時にin vivoで発生するか否かを知るために、ＡＰＣアクチベ−タ−Ｃｄｃ２０ｐの発現がガラクト−ス誘発性ＧＡＬ１−１０プロモ−タ−の制御下にある酵母株を構築した。この株はまた、マルチＨＡまたはｍｙｃエピトープをもつそのＣ−末端に付加されたＳｃｃ１タンパク質を発現させていた。この株の細胞をガラクトースを含まない培養液で保温して中期に拘束し、続いてガラクトースを添加することによって高度に同期化しつつ後期を開始させた。図３は、ほとんどの細胞で１５分以内に姉妹染色分体が分離し、Ｓｃｃ１ｐが全く同じではないにせよ類似の経時的変化を示しながら染色体から解離することを示している。低レベルのＳｃｃ１切断生成物が検出されたが、これはin vitroで細胞周期が進行している場合に見られるものと同一であるが、中期で拘束された細胞では存在しないものであった。この切断生成物は、ガラクトースによる誘発に際して突然出現し、この出現の経時的変化は、姉妹染色分体の分離と染色体からのＳｃｃ１ｐの解離と全く同じでないにせよ類似していた。このin vivo切断がＥｓｐ１活性に依存しているか否かを確認するために、３５．５℃（ｅｓｐ１−１の制限温度）で拘束したｃｄｃ２０から放出させた場合の野性型およびｅｓｐ１−１のＳｃｃ１ｐの切断の程度を比較した。Ｓｃｃ１ｐ切断の程度はｅｓｐ１−１変異体では大きく低下した。Ｅｓｐ１は、Ｓｃｃ１ｐの切断並びにin vivoおよびin vitroの両方における染色体からのその解離を促進すると結論された。
【００１０】
Ｅｓｐ１によって仲介されるＳｃｃ１の切断が姉妹染色分体の分離または染色体からのＳｃｃ１ｐの解離のどちらに重要であるかを知るために、切断部位をマッピングし、続いてその変異体を得た。Ｃｄｃ２０の発現誘発によって後期に入るように刺激した細胞から得たエピトープ付加Ｓｃｃ１ｐタンパク質を免疫沈澱させ、この免疫沈澱させたタンパク質をＳＤＳゲル電気泳動で分離した。続いて、Ｃ−末端切断フラグメントのＮ−末端アミノ酸の短いストレッチをエドマン分解で調べた。これによって、in vivoでの切断は２６８位と２６９位の一対のアルギニン間で生じることが示された。これらのアルギニン残基のＮ−末端をアスパラギン酸に変異させ、続いてＨＡを付加した変種を酵母細胞でＧＡＬ１−１０プロモーターから発現させた。この酵母細胞は、その内因性Ｓｃｃ１タンパク質にｍｙｃが付加されている。このただ１つの変異タンパク質のガラクトースによる誘発発現は細胞の増殖にほとんど影響を与えなかった。
【００１１】
実際にこの変異によって切断が生じなかったのか否かを確認するために、前記変異タンパク質を発現している細胞からクロマチンを単離し、Ｅｓｐ１アッセイの基質として用いた。この実験によって、２６８位の切断はアスパラギン酸変異によって阻止されることが示された。しかしながら、前記変異タンパク質はＥｓｐ１依存態様でやはり切断された。変異タンパク質のＣ−末端切断生成物は、野性型に由来するものよりも約１０ｋＤａ長かった。これらの結果は、Ｓｃｃ１ｐは実際に約１０ｋＤａ離れた２つの箇所で切断されることを意味している。よりＣ−末端に近い部位での切断が高度に効果的で、これが、よりＮ−末端に近い部位で切断されたＣ−末端付加タンパク質だけが稀にしか検出されなかった理由である。
【００１２】
第二の切断部位を特定するために、既知のＣ−末端切断部位を取り囲む配列とその配列が類似するＳｃｃ１ｐ内の配列を探した。１８０位で７つのうち５つが適合するアミノ酸マッチが見出された。さらに、この可能な部位と既知の切断部位との間の距離は、そのＣ−末端部位（Ｒ２６８）が変異したタンパク質からin vitroで得られた切断生成物の大きな長さと一致する。このマッチ配列はまた一対のアルギニンを含み、したがってよりＮ−末端に近いアルギニンがアスパラギン酸に変異した。次に、野性型Ｓｃｃ１ｐのＨＡ付加型（酵母のＧＡＬ１プロモーターの制御下での単変異タンパク質および二重変異タンパク質の両方）の発現の影響を比較した。これらの実験のホストとして、ｍｙｃがその内因性Ｓｃｃ１ｐに付加されている株を使用した。野性型もいずれの単変異体も細胞の増殖を阻止しなかったが、二重変異タンパク質の発現は致死的であった。一過性にこれらタンパク質を発現している細胞から調製したクロマチンによって、ＨＡ付加二重変異タパク質はＥｓｐ１含有抽出物中で保温した場合もはや切断されないが、一方、ｍｙｃ付加野性型タンパク質は効率的に切断されることが示された。切断できないＳｃｃｐ１タンパク質（Ｒ１８０Ｄ−Ｒ２６８Ｄ二重変異体）を発現している細胞が増殖できない理由を解明するために、遠心溶出を用いて、ガラクトースの非存在下で増殖させた培養からＧ１細胞を単離した。続いて前記細胞をガラクトースの存在下および非存在下で保温した（図４）。変異タンパク質の発現時間を最小限にするために、ガラクトース存在下で増殖した細胞をほとんどの細胞がそれらのＤＮＡを複製した後（１３５分）でグルコース含有培養液に移した。ガラクトースの非存在下で、姉妹染色分体の分離および内因性ｍｙｃ付加Ｓｃｃ１ｐの染色体からの分離は同時に発生した（ＤＮＡ複製後約６０分）。二重変異タンパク質の一過性発現は姉妹染色分体の分離を顕著に低下させたが（図４ｂ）、内因性ｍｙｃ付加野性型タンパク質の解離には影響を与えなかった（図４ｃおよびｄ）。
【００１３】
さらに、内因性野性型タンパク質が消失した後も長時間、変異タンパク質は染色体に堅固に結合したままであった。変異タンパク質の発現は細胞周期の進行から顕著には遅れず、ほとんどの細胞が細胞質分裂を通過して少ない量の（０−０．５Ｃ）ＤＮＡを含む子孫および２Ｃ未満のＤＮＡ含有量を含む細胞を生じた（図４ａ）。野性型タンパク質が予定どおりに染色体から解離するということにより、切断不能のＳｃｃ１ｐを発現している細胞での姉妹染色分体の分離が認められないのはＥｓｐ１活性の欠如のためではないことが分かる。総合すれば、これまでに得られたデータは、２つの部位のうち１つの部位でのＳｃｃ１ｐの切断が姉妹染色分体の分離とＳｃｃ１ｐの染色体からの分離の両方に必要であることを示唆している。
【００１４】
得られた結果から、ＤＮＡ複製中に完成され、中期まで維持される姉妹染色分体間の連結をコヘッシンは直接仲介すると結論することができる。さらに、Ｐｄｓ１のタンパク質分解による（さらにまだ特定されていない他のメカニズムによる）Ｅｓｐ１の活性化は、コヘッシンのＳｃｃ１ｐサブユニットを切断する細胞内活性をもたらし、さらにこの事象によって姉妹染色分体の凝集が破壊され、Ｓｃｃ１ｐおよびおそらくは他のコヘッシンサブユニットが染色体から解離させられると結論することができよう。
【００１５】
上記の結果から、姉妹染色分体の分離は、染色体に結合したＳｃｃ１ｐのＥｓｐ１依存タンパク分解活性（後期の開始時に細胞内に出現する）による切断に依存することは明瞭である。次に、単離タンパク質としての（染色体結合物としてではなく）Ｓｃｃ１ｐは、Ｅｓｐ１依存切断反応のための基質として機能できるのか否かを調べた。図５は、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞で過剰発現させた後のリコンビナントＳｃｃ１の精製を示している。Ｓｃｃ１は、同期化せずに増殖させた感染昆虫細胞集団（図５ａ、レーン１−４）またはホスファターゼ抑制物質オカダイク酸（okadaic acid）で処理した感染昆虫細胞から精製した。オカダイク酸による処理は昆虫細胞内に中期様状態を誘発し、その結果として有糸分裂の場合のように燐酸化された形態でＳｃｃ１が得られる（図５ａ、レーン５）。酵母のＳｃｃ１は有糸分裂に固有の態様で燐酸化されるようである。続いて、このようなＳｃｃ１分画（ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクーマシーブリリアントブルーによるゲル染色で判定したとき９０％以上純粋である）を上記のようにＳｃｃ１切断アッセイで用いた（図５ｂ）。非燐酸化および燐酸化精製Ｓｃｃ１の両方をin vitroでＥｓｐ１依存態様で切断したが、Ｓｃｃ１ｐが有糸分裂の場合のように燐酸化された状態のときには切断効率ははるかに高かった。この実験から、コヘッシン複合体の一部分でもなく染色体に結合してもいない単離Ｓｃｃ１は、少なくともそれが有糸分裂のように燐酸化された状態であるならば、Ｅｓｐ１による切断の基質となると結論された。
【００１６】
続いて、Ｅｓｐ１はそれ自体Ｓｃｃ１を切断するプロテアーゼであるか否かを調べた。抑制物質実験によって、in vitro切断活性は、触媒としてシステイン残基を用いるプロテアーゼに固有の抑制物質であるＮ−エチルマレイミドによって抑制できることが示された。進化の間に保存されたＣ−末端側のＥｓｐ１二等分部分のアミノ酸配列を精査したとき、全ての既知のセパリン相同体において正確に１つのシステインおよび１つのヒスチジン残基が保存されていることが判明した。したがってこれら２つの残基は、新規なシステインプロテアーゼサブクラスの触媒二分子を形成するのかもしれない。この潜在的触媒二分子を取り囲むアミノ酸配列をさらに分析したとき、疎水性ベータシートを形成すると予測される配列ストレッチがシステインおよびヒスチジン残基の両方に先行していることが判明した。さらにまた、ヒスチジンは常に２つのグリシン残基に隣接し、グリシンはシステインに先行してこの触媒残基の前または後にしっかりと固定されたターンを作ることができる可能性を提供している。疎水性ベータシートの２つの近傍の鎖の末端に固定されたヒスチジンおよびシステイン触媒二分子残基のこの配置は、プロテアーゼのカスパーゼ類で用いられ、おそらく同じような配置がセパリン様Ｅｓｐ１でも用いられると思われる。
【００１７】
Ｅｓｐ１は、Ｓｃｃ１を切断するための触媒二分子としてこれら２つのアミノ酸残基であるヒスチジン（アミノ酸１５０５位）およびシステイン（１５３１位）を実際に使用することを立証するために、これらアミノ酸のいずれかをアラニンに変異させた。前記タンパク質を過剰産生させた後得られた酵母抽出物のタンパク分解活性は、両アミノ酸の変異によって完全に失われた（図６）。同様なレベルに過剰産生させた野性型Ｅｓｐ１はＳｃｃ１基質を完全に切断した。ヒスチジン１５０５およびシステイン１５３１はおそらく触媒二分子を形成し、Ｅｓｐ１にＳｃｃ１を切断するタンパク分解活性を与えると結論した。
これらの結果を総合すると、Ｅｓｐ１セパリンがコヘッシンＳｃｃ１を切断するタンパク分解反応は、ビール酵母菌（S. cerevisiae)の有糸分裂の中期から後期への移行において姉妹染色分体の分離のための開始事象であるという強力な証拠が提供される。
【００１８】
次に、減数分裂での２回の核分裂時に染色体分裂を開始させるために同じタンパク分解メカニズムが作用するのか否かを調べた。前減数分裂ＤＮＡ複製時に、Ｓｃｃ１相同体（Ｒｅｃ８と称される）がコヘッシン複合体のＳｃｃ１の代わりとなる（Klein et al., 1999）。Ｓｃｃ１と同様にＲｅｃ８は２つのセパリン認識部位を含み、このことは、Ｅｓｐ１／セパリンは減数分裂時にＲｅｃ８を切断し、減数分裂時の染色体分裂を開始させることを示唆している。これを調べるために、Ｒｅｃ８内の両セパリン切断部位を変異させて、このタンパク質の非切断型を作製した。減数分裂時のＲｅｃ８非切断型の発現は、第一回目の減数核分裂を阻止し（図７Ａ）、Ｒｅｃ８の切断は第一回目の減数分裂における姉妹染色分体アームの分離に必要であることを示唆している。同様に、ｅｓｐ１−２変異（Ｅｓｐ１遺伝子の温度感受性変異）をもつ酵母株で減数分裂をモニターしたとき、第一回目の核分裂の温度依存性阻止が認められた（図７Ｂ）。セパリンは、有糸分裂時にＳｃｃ１を切断するように減数核分裂時にコヘッシンＲｅｃ８を切断すると結論した。
【００１９】
発芽酵母のＥｓｐ１、Ｐｄｓ１およびＳｃｃ１のヒト相同体の配列は既に公的データベースに発表されている。Ｅｓｐ１およびＰｄｓ１のヒト相同体は、それぞれセパリン（Nagase et al., 1996;タンパク質配列はNCBI Acc. No.BAA11482 ；ＤＮＡ配列はNCBI Acc. No.D79987)およびセクリン（Zou et al., 1999, Dominguez et al., 1998）と称され、さらにＳｃｃ１のヒト相同体はＳＣＣ１（McKay et al., 1996; ＤＮＡ配列はNCBI Acc. No. X98294; タンパク質配列はNCBI Acc. No. CAA66940）と称される。動物細胞では、ＳＣＣ１の大半は、姉妹染色分体が後期に分離するずっと以前の前期にクロマチンから解離し、ＳＣＣ１の切断はこの過程では認められなかった（Lasada et al., 1999)。
【００２０】
本発明の実験の別の目的は、いくらかのＳＣＣ１が凝縮染色体に結合したままで残留し、さらに後期の開始まで姉妹染色分体の凝集を維持するか否かを調べ、さらにＳＣＣ１の染色体結合形は後期の開始時にタンパク分解切断を受けているのか否かを調べることである。
これらの疑問に答えるために、以下のアプローチを用いた：ヒトのＨｅＬａ細胞を対数増殖させることによって間期の細胞を、さらにノコダゾール処理によって中期の細胞を増加させ、粗クロマチンおよび上清分画を弁別遠心によって調製して、定量的免疫ブロッティングによってＳＣＣ１の存在を分析した（図８）。クロマチンに結合している細胞のＳＣＣ１の総量は、対数増殖細胞の５６％から中期拘束細胞の１３％まで減少した。すべてではないがほとんどのＳＣＣ１は中期の前にクロマチンから解離するという結論が得られ、これは、ＳＣＣ１は後期の開始まで姉妹染色分体の凝集を維持するために必要であろうという考えと一致する。
【００２１】
ＳＣＣ１の中期染色体結合形は後期に切断されるか否かを調べるために、チミジン２回処理によってＨｅＬａ細胞をＳ期の開始時に拘束し、細胞周期を同期化させた。同期化後の種々の時点で細胞周期の進行を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によるＤＮＡ含有量の分析および全細胞溶解物の免疫ブロット分析によりモニターした。図９は、１００ｋＤａの仮想ＳＣＣ１切断生成物がＳＣＣ１のＣ−末端に特異的な抗体により認識されることを示している。重要なことには、ＦＡＣＳ分析並びにセクリン、サイクリンＢおよびＣＤＣ２０（これらは後期に特異的に分解することが知られているタンパク質である）の消失によって判定されたとおり、このバンドはＨｅＬａ細胞が後期に入ったときに特異的に出現した。
【００２２】
後期特異的１００ｋＤａバンドはＳＣＣ１の切断生成物で、使用した抗体の非特異的交差反応ではないことを確認するために、以下の２つの実験を実施した：第一に、ＳＣＣ１のＮ−末端に特異的な抗体を作製し、免疫ブロッティングによってＨｅＬａ細胞の細胞周期分画を調べるために用いた。２５ｋＤａのバンドは後期に特異的に認められ（図９）、これはＳＣＣ１はＣ−末端の１００ｋＤａとＮ−末端の２５ｋＤａフラグメントとに切断されるという説明と一致する。第二に、Ｃ−末端でｍｙｃエピトープタグと融合したマウスＳＣＣ１（ＳＣＣ１−ｍｙｃ）を安定的に発現しているＨｅＬａ細胞株を細胞周期の同期化によって上記のように調べた。これらの細胞で発現されるＳｃｃ１−ｍｙｃの量は内因性ＳＣＣ１の１０％未満で、この異所性タンパク質は１４Ｓコヘッシン複合体中に完全に取り込まれる（図１０Ａ）。同期化細胞では、ｍｙｃエピトープに対する抗体は、ＳＣＣ１抗体によって認識される１００ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンドと類似の経時的変化をしめしながら後期に出現するバンド（予想サイズは１２０ｋＤａ）を認識し、これは哺乳類ＳＣＣ１は後期で切断されるということを明瞭に示している（図１０Ｂ）。さらに、これらの免疫ブロットによって、ＳＣＣ１−ｍｙｃの第二の後期特異的フラグメントが明らかにされ、ＳＣＣ１切断は少なくとも２つの部位で生じることが示唆された（図１０Ｂ、下図）。
【００２３】
ツメガエルの生化学実験では、後期の開始はＡＰＣCDC20によって仲介されるセクリンのタンパク質分解に依存することが示された（Zou et al., 1999）。発芽酵母のＰｄｓ１およびＥｓｐ１のように、セクリンおよびセパリンは複合体を形成し、ＡＰＣCDC20に依存するセクリンのタンパク質分解によってセパリンが活性化されるという仮説と一致する。ＳＣＣ１切断がＡＰＣCDC20の活性化およびそれに続くセクリンのタンパク質分解に依存するか否かを調べるために、ＨｅＬａ細胞をチミジン２度処理によって同期化しノコダゾールの存在下で細胞周期を開始させた。ノコダールは、ＡＰＣCDC20の抑制を間接的に惹起し、それによって細胞を中期に拘束することが分かっている薬剤である（Peters(1998)による総説）。ヒトのセクリンに特異的な抗体を作製し、前述の条件下ではセクリンは分解されないことが示された（図１１）。重要なことには、ＳＣＣ１の切断はノコダゾールの存在下では認められなかった。ノコダゾールによって拘束された細胞での後期の開始はセクリンの分解およびＳＣＣ１切断生成物の形成と相関するので、前記薬剤の作用は可逆性であった（図１２）。これらの結果は、ＳＣＣ１切断はＡＰＣCDC20の活性化に依存し、さらに、セクリン分解およびそれに続くセパリンの活性化はＳＣＣ１の切断のために必要であるという仮説と一致する。
【００２４】
ＳＣＣ１切断の調節をさらに調べるために、さらに先ず最初の工程としてこの反応抑制物質のスクリーニングアッセイを開発するために、ＳＣＣ１−ｍｙｃおよびツメガエルの卵から調製した細胞周期抽出物を用いるin vitroアッセイを確立した。これらの抽出物は以下のどちらかの状態を表すように操作した：ＡＰＣCDC20が不活性である安定な間期の状態、またはＡＰＣCDC20が活性をもち、姉妹染色分体分離がin vitroで生じる安定な有糸分裂状態（Murray et al., 1991)）。安定にＳＣＣ１−ｍｙｃを発現しているＨｅＬａ細胞から単離したクロマチンをツメガエルの抽出物とともに保温したとき、２つの別々の部位でのＳＣＣ１の切断が有糸分裂期の抽出物で検出されたが、間期の抽出物では検出できず、ＡＰＣCDC20活性はこの事象に必要であることがさらに確認された（図１３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、in vitroで形成された切断生成物はin vivoで形成された切断生成物と同じように移動し、抽出物での切断は生理学的に妥当な場所で生じることを示唆している。重要なことには、いくらかのＳＣＣ１切断は、ＨｅＬａ細胞のクロマチンを含まない上清分画を有糸分裂抽出物と混合したときにも観察された（図１３）。このことは、可溶性ヒトＳＣＣ１は切断のための基質となり、したがって、薬剤スクリーニングのために単純化したクロマチン非含有切断アッセイを開発することが可能なことを示している。
【００２５】
ＳＣＣ１のよりＮ−末端側の切断部位をマッピングするために、一連のＮ−末端およびＣ−末端欠失変異体を作製し、この切端タンパク質の移動度を、in vivoで生成されたＮ−末端およびＣ−末端切断生成物の移動度と比較した（図１４）。欠失変異体をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作製し、35Ｓ−標識リコンビナントタンパク質をこのＰＣＲ生成物からin vitro転写および翻訳によって作製した。これを分析して、ＳＳＣ１はアミノ酸残基１６９と１８３の間で切断されることが分かった。この部位は配列モチーフＥｘｘＲ172を含み、このモチーフは多様な種の多くのＳＣＣ１相同体で保存されており、発芽酵母のＳｃｃ１の両方のＮ−末端切断部位でも見出される。同じマッピング技術を用いた予備実験の結果は、ＳＣＣ１のＣ−末端切断部位はアミノ酸残基４５０の辺りに位置することを示唆した。この位置でもまたモチーフＥｘｘＲが見出されている。
【００２６】
本発明の実験結果から、セパリン依存ＳＣＣ１切断は発芽酵母からヒトで保存されているメカニズムであり、この同じメカニズムはおそらく全ての真核生物に存在するであろうと結論することができる。発芽酵母で実施された実験で得られた発見は、したがってより高等な真核生物、特にヒトでも有効である。
本発明の実験で得られたデータの解釈によって、Ｅｓｐ１／セパリンそれ自体はＳｃｃ１ｐ／ＳＣＣ１の切断に必要なプロテアーゼであるという証拠が提供される。
【００２７】
本発明の実験で得られた結果から、とりわけ、Ｓｃｃ１ｐ／ＳＣＣ１はＥｓｐ１／セパリンによって切断される凝集複合体の単一サブユニットであるという結論が得られる。しかしながら、このことは、他のタイプのタンパク質（例えば分裂紡錘体を調節する他の凝集タンパク質）もまたセパリンの標的／基質となることができるという可能性を排除するものではない。この疑問に答える１つの方法は、１つの切断部位を外来プロテアーゼのための切断部位で置換した（もう一方の切断部位は除去する）Ｓｃｃ１ｐの変化型を作製するものである。使用に都合のよいプロテアーゼの例はＴＥＶプロテアーゼ（Daugherty et al., 1989）で、これは非常に特異的な切断部位を有する（Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）。以下を含む株を構築することができる：ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むＳＣＣ１遺伝子、染色体のｃｄｃ２０−３変異、およびＧＡＬ１−１０誘発性制御下にあるＴＥＶプロテアーゼ遺伝子。制限温度でガラクトースの存在下で（ｃｄｃ２０−３細胞がＰｄｓ１を破壊できないために中期で拘束されているとき）、Ｓｃｃ１ｐの染色体からの除去に対するＳｃｃ１ｐの人工的切断作用をアッセイできる（沈降させた染色体ＤＮＡ分画中のＳｃｃ１ｐの存在によって測定可能）。姉妹染色分体分離のためにはこれで十分であるのか否かもまた、ＣｅｎＶ−ＧＦＰシステムを用いて顕微鏡によって調べることができる（Ciosk et al., 1998；実施例３を参照）。これらの実験によって、セパリン分画の非存在下でこのような条件下で有糸分裂の残りの部分が進行するのか否かを決定することが可能になる（セパリンは、制限温度ではその抑制物質Ｐｄｓ１の存在のためにｃｄｃ２０−３変異体では不活性であることに留意されたい）。このような環強下で外来プロテアーゼが、染色分体からＳｃｃ１ｐの解離を引起し、さらに姉妹染色分体を酵母細胞の対抗する極に分離させるならば、Ｓｃｃ１の切断は、姉妹染色分体分離のために要求されるセパリンの唯一の機能であると結論することができる。しかしながら、クロマチンから取り除かれているＳｃｃ１ｐ変種であるにもかかわらず、姉妹染色分体が細胞の対抗する極に分離されない場合は、セパリンはＳｃｃ１ｐの切断の他に１つまたは２つ以上の機能をもつと結論することができる。これらの機能に関する手がかりはこれらの細胞から得ることができ、この手がかりはＥｓｐ１のための他の可能な基質を特定するために用いることができる。
【００２８】
本発明の実験での発見は、真核細胞で姉妹染色分体を分離させる分子的メカニズムについて最初の重要な手がかりを提供した。公表された文献（これらには姉妹染色分体が分離されるメカニズムについてなんらのヒントも含まれていない）を考慮しても、タンパク分解活性の付与によってセパリンが作用するという発見は極めて驚くべきことである。
Ｓｃｃ１／ＳＣＣ１切断に必要なプロテアーゼとしてＥｓｐ１／セパリンを確認すること、および潜在的補助因子の特定は、姉妹染色分体の分離に干渉する化合物（これは新規な治療手段のための基礎である）を見つけることを可能にするアッセイ方法をデザインするために前もって必要なことである。
【００２９】
本発明の第一の特徴は、植物または動物細胞で姉妹染色分体の分離を調節する能力をもつ化合物を特定する方法に関する。本方法は以下を特徴とする：セパリン様システインエンドペプチダーゼ活性をもつプロテアーゼをそのタンパク質分解活性に対する基質および場合によってその補助因子の存在下で被験化合物と一緒に保温し、システインエンドペプチダーゼのタンパク質分解活性に対する前記被験化合物の調節効果を決定する。
直接調節により、特にセパリンのタンパク分解活性を抑制することにより（すなわちセパリンに特異的なプロテアーゼ抑制物質であることにより）、その作用を示す化合物を特定する方法を提供することによって、本発明は、姉妹染色分体の分離メカニズムに干渉する手段を提供し、したがって急速に分裂する動物細胞、特に腫瘍細胞の増殖を抑制する新規な手段を提供する。
以下では（特に別に記載が無ければ）、"セパリン"という用語は、セパリン様活性をもつ任意のシステインエンドペプチダーゼの同義語として用いられ、酵母のＥｓｐ１相同体が含まれる。同様に、"ＳＣＣ１"という用語はヒトのセパリン基質に限定されず、コヘッシン型の任意の類似体基質を包含しようとするものである。
【００３０】
課題を解決するための手段
第一の実施態様では小規模の適用のために、酵母成分に向けて実施例２で述べたアッセイタイプを用いてセパリン活性を抑制する化合物を特定することができる。ヒトでＥｓｐ１相同体（すなわちセパリン）が存在するとすれば、セパリンはヒトでもまた後期開始の引き金として重要な役割を果たすと結論することができる。したがって、酵母成分のための実験で概略した原理を用いて、酵母成分の代わりにヒトのセパリンとＳＣＣ１を用いるセパリン依存切断アッセイを確立することができる。そのようなアッセイは、その本質的な特徴として以下の工程を含む：クロマチンの粗調製物をセパリン活性を含む調製物と一緒に保温し、被験物質の存在下または非存在下でＳＣＣ１切断生成物を調べる。
【００３１】
一般に、スクリーニングアッセイをセットアップする場合、先ず最初にアッセイ成分として酵母の構成成分を用いて予備的にスクリーニングアッセイを構成し、続いて中間生物（例えばＳ．ポンベまたはアフリカツメガエル）由来のプロテアーゼおよび／または基質を、さらに最終的にはヒトの同等な基質を用いて段階的に確立させていくのが有効である。例えば、ＳＣＣ１のＳ．ポンベ相同体（Ｒａｄ２１と称される）は、ＳＣＣ１内の既知の２つの切断部位に類似する２つの配列を含み、したがってＲａｄ２１由来配列は、Ｓ．ポンベＥｓｐ１（Ｃｕｔ１と称される）のための基質を産出するために用いることができる。より高等生物へと進むこの方法は、ヒトの系に到達するまで段階的に用いることができる。ヒトのセパリンのための新規ないずれの基質の切断部位も切断生成物を精製し、エドマン分解によってそのＮ−末端配列を上記で述べたように決定することにより調べることができる。
【００３２】
好ましい実施態様では、本発明の方法は大規模処理量で実施される。このような実施態様のためには、主要なアッセイ成分（特にセパリン）はリコンビナントが用いられる。
特定されるべきセパリン抑制物質の所望される使用方法にしたがって、用いるアッセイ成分は、それらが供給される種に関して変動可能である。動物またはヒトの治療に用いられる場合は、アッセイ成分は好ましくは哺乳類またはヒト由来である。農業的な使用が意図される場合にはアッセイ成分は植物に由来する。
【００３３】
セパリンは、標準的方法にしたがって、例えば酵母もしくは昆虫細胞、または他の適切なホスト細胞で、文献またはデータベースの配列情報を基にして遺伝子組換えによって製造できる。得られたタンパク質は、セパリンを過剰産生している酵母細胞を通常のように生化学的に分画することによって、または過剰産生されたタンパク質に特定のリガンドに対して固有の親和性をもつポリペプチド配列を付加することによって（アフィニティー精製）精製できる。例えば、セパリンにマルチヒスチジン残基が付加されている場合はニッケル＝アガロースカラムで精製できるが、一方、ＧＳＴが付加されている場合はグルタチオン＝アガロースカラムで精製できる。そのようなアフィニティー精製は、位置特異的プロテアーゼまたは自己切断インテイン（intein）を用いてセパリンをタグから切断することを必要とする。このようにして得たリコンビナントタンパク質を用い、タンパク質分解活性をアッセイする既知の方法にしたがって、セパリン単独でＳｃｃＰ１またはそれに由来するペプチド基質を切断できるか否かを決定する。セパリンが単独でＳＣＣ１またはＳＣＣ１由来ペプチドを切断できる場合には、プロテアーゼとしてセパリン（好ましくはリコンビナント）およびその基質ＳＣＣ１を主剤とするアッセイは、下記で述べるような他の特定のプロテアーゼについて標準的な方法により大規模処理様式に容易に応用できる。
【００３４】
このアッセイで有用なプロテアーゼ基質は天然に存在する基質と同等または類似のもの、例えば粗クロマチン調製物、ＳＣＣ１（好ましくは遺伝子組換えによって製造される）、またはタンパク質分解のための切断部位を含むＳＣＣ１ペプチドであろう。
酵母またはヒトのセパリンのタンパク分解切断部位の配列固有性に関する情報を基にして、前記プロテアーゼのための他の可能な基質（これらは本発明のスクリーニングアッセイでの基質として有用である）を他の生物（ヒトを含む）で見つけることができる。これはまたこれら基質に由来するペプチドのデザインを可能にする。
【００３５】
好ましい実施態様では、前記基質は、天然に存在する基質の切断部位を含むペプチドである。タンパク分解切断の配列固有性は、多様な種々のペプチドを検査することによって決定できる。このペプチドは天然に由来、すなわち天然のＳＣＣ１または変種に由来するであろう。天然のペプチドの例は、配列番号：１で示したヒトＳＣＣ１ペプチド、またはセパリン切断部位を含むそのフラグメントである。変種は、変種ペプチドの合成、または凝集タンパク質をコードする遺伝子に由来するＤＮＡ配列を変異させることによって作製できる。より具体的には、セパリンのための他の基質は、通常のＳｃｃ１切断部位と置き換えることができる小さなＤＮＡフラグメントを酵母ゲノムまたはオリゴヌクレオチドライブラリーで検索して特定できる。オリゴヌクレオチドは、動原体プラスミドでＧＡＬプロモーターの制御下でＳｃｃ１遺伝子（天然の切断部位を両方とも欠いている）に挿入できる。酵母細胞をそのような構築物のライブラリーで形質転換する。セパリン活性によってその改変Ｓｃｃ１タンパク質を切断できるプラスミドのみがガラクトースの存在下での増殖を可能にするであろう。陽性構築物によってコードされるペプチドは本発明のスクリーニングアッセイでセパリンの基質として有用であろう。
【００３６】
前記基質、例えばＳＣＣ１タンパク質またはそのペプチドフラグメントに関しては、基質が効率的に切断されるように注意が必要である。特にＳＣＣ１の酵母相同体を用いる場合には、効率的な切断は、有糸分裂で見られるように基質が燐酸化された状態のときにのみ生じるらしいということは考慮されねばならない。したがって、ペプチド基質をデザインする場合、または遺伝子組換えによってＳＣＣ１を製造する場合、基質がセパリンによって効率的に切断されるか否かを検査する必要がある。リコンビナントタンパク質の場合には、ホスファターゼ抑制物質（例えばオカダイク酸）で処理した感染昆虫細胞で前記タンパク質を製造することにより燐酸化形のタンパク質を得ることができる。この方法は、実施例５（方法の項ｅ）で酵母Ｓｃｃ１タンパク質について例証されているが、他のＳＣＣ１分子について必要な場合はこれらの分子のために応用できる。
【００３７】
セパリンが単独ではなく補助因子と協力して作用する場合には、ＳＣＣ１（またはペプチド基質）を単にセパリンと保温する代わりに、それらをセパリンとその補助因子の混合物と保温することができる。全ての成分は、セパリンについて上記で概略した標準的な方法にしたがって製造および精製できる。
大規模処理様式の場合には、セパリン抑制物質を特定する本発明のスクリーニング方法は、プロテアーゼ抑制物質を特定するために当技術分野で知られているアッセイ方法にしたがって実施できる。そのようなアッセイは基質の切断生成物の検出を基本とする。これを達成するために、セパリンプロテアーゼの切断部位を含むＳＣＣ１ペプチドまたはタンパク質基質を検出可能な標識（例えば放射能または蛍光標識）で修飾し、プロテアーゼによって基質を切断してその切断生成物を測定することができる。被験物質がプロテアーゼの抑制物質である場合には、検出系に応じて、さらに被験物質が抑制作用をもつか活性化作用を持つかに応じて検出シグナルの低下または増加が見られるであろう。
大規模処理様式では、セパリンまたはセパリン様システインエンドペプチダーゼに対して調節作用をもつ化合物は、既知のアッセイ原理（例えばマイクロタイタープレートでの自動化系）にしたがって、化合物ライブラリーから被験化合物をスクリーニングすることによって特定できる。
【００３８】
プロテアーゼ抑制物質を特定する種々のアッセイ方法が、大規模処理様式における自動化に馴染みやすいことが最近報告された。そのような方法は例えば以下の方法である：Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼのための放射能測定方法（Cerrentani et al., 1999)、蛍光消光による方法（Ambrose et al., 1998；Taliani et al., 1996）、ＨＩＶ−１プロテアーゼのためのマイクロタイター比色アッセイ（Stebbins & Debouck, 1997）、蛍光偏光アッセイ（Levine et al., 1997;総論はJolley, 1996）、固定ペプチド基質を用いる方法（Singh et al., 1996）、ビオチン化およびシステイン修飾ペプチドを使用するカテプシンＧの抑制を調べるために用いられるアッセイ（Brown et al., 1994）。さらに別の適切なアッセイのための例は、蛍光共鳴エネルギート伝達（ＦＲＥＴ）の現象を基にする（Gershkovich et al., 1996; Matayoshi et al., 1990）。セパリン活性の抑制物質を特定する大規模処理スクリーニング方法のために本発明で用いることができるアッセイのまた別の例は文献に記載されている（Gray et al., 1994; Murray et al., 1993; Sarubbi et al., 1991）。
【００３９】
蛍光または放射能標識および大規模処理で酵素反応を実施するための他の試薬は市販されており、供給元の指示にしたがって用いることができる（例えばMolecular Probes, Wallac）。個々のアッセイデザインは種々のパラメーター、例えば使用する基質の大きさに左右される。短いペプチドを用いる場合には、蛍光消光または蛍光共鳴エネルギー伝達法が適切なアッセイ技術の例である。
蛍光消光（共鳴エネルギー伝達"ＲＥＴ"）アッセイは合成基質を用い、これら合成基質は、基質の加水分解の程度に比例する直接的で持続的なシグナルを発生させることができる。基質ペプチドは一方の末端近くに蛍光供与部を、さらに他方の末端近くに受容部を有する。基質の蛍光は、先ず初めに供与部と受容部間の分子内ＲＥＴによって消光される。プロテアーゼによる基質の切断時に、切断生成物がＲＥＴ消光から放出され、切断基質の量に比例する蛍光が検出される。
【００４０】
このタイプのアッセイは以下のように実施できる：アッセイ緩衝液中の標識基質の溶液をピペットで黒色の９６穴（ウェル）マイクロタイタープレートのウェルに入れる。標識基質は、例えば一方の末端を４−〔〔４'−（ジメチルアミノ）フェニル〕アゾ〕安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）で標識し、他方の末端を５−〔（２'−アミノエチル）アミノ〕ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）で標識するか、または一方の末端をベンジルオキシカルボニルで標識し、他方の末端を４−アミノメチルクルマリンで標識したペプチドである。被験物質を特定の濃度で添加したあと、セパリン溶液をウェルに加える。タンパク分解切断反応のために充分な条件および時間（例えば室温で１時間）保温した後、例えば３４０ｎｍの励起波長および例えば４８５ｎｍの放射波長で蛍光を蛍光計で測定する。
ＦＲＥＴアッセイを用いる場合には、以下の市販標識対が本発明の方法に適している：ヨーロピウム（Ｅｕ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＥｕおよびＣｙ５。ＥｕおよびＰＥ（Wallac, Turku, Finland）。
【００４１】
上記の方法で特定された化合物（これらはまた本発明の目的である）は、セパリン様システインエンドペプチダーゼのタンパク分解活性を調節することによって姉妹染色分体分離に干渉する能力を有する。
好ましい実施態様では、本発明の化合物はセパリン様システインエンドペプチダーゼの抑制物質である。
好ましくは本化合物はセパリンの特異的な抑制物質である。
本発明はまた、人間の治療、特に癌治療で使用するセパリン抑制物質として作用する化合物に関する。
さらに別の特徴では、本発明は、セパリンのタンパク分解活性を抑制することにより姉妹染色分体分離に干渉またはこれを調節する、１つまたは２つ以上の化合物を活性成分として含有する医薬組成物に関する。
【００４２】
本発明はまた、セパリンとの配列類似性のためにセパリン様プロテアーゼと認められる一切のプロテアーゼの抑制物質を包含する。前記一切のプロテアーゼは、触媒二分子を取り囲むアミノ酸配列が現在知られているいずれの種類のプロテアーゼよりもセパリンにより類似している全てのプロテアーゼのことである。
好ましい実施態様では、本発明は、医薬的に活性な化合物および治療におけるそれらの使用を含む。それら化合物は、本発明のスクリーニング方法でセパリン抑制物質として特定された小型の化学物質である。
また別には、セパリン抑制物質は生物学的分子、例えばペプチドまたはペプチドミメティクス（pepidomimetics）のようなペプチド由来分子でもよい。
【００４３】
カスパーゼ類（おそらくセパリンはこの種類に属する）のプロテアーゼは、ペプチド由来抑制物質との不可逆的結合および抑制のための良好な標的であることが示された（Nicholson et al., 1995; Faleiro et al., 1997）。原則として、カスパーゼ抑制物質について記載されたアプローチは、セパリンの活性部位のシステイン残基と不可逆的に結合してこれを抑制させるために利用することができる（カスパーゼ抑制物質は、切断部位にアルデヒド、ハロゲノメチルまたはアシルオキシメチル基を含むように改変することによって"認識部位ペプチド"として機能する）。このタイプの抑制ペプチド誘導体は合理的な抑制物質デザインのための出発点となることができる（そのような誘導体は、例えばＳＣＣ１または別のセパリン基質のプロテアーゼ認識部位のアミノ酸配列を含むペプチド配列の誘導体である）。そのようなデザインのために考えられるペプチドの例は、ヒトＳＣＣ１（ＭＤＤＲＥＩＭＲＥＧＳＡＦＥＤＤＤＭ（配列番号：１))に由来するペプチド（これはセパリン切断部位を含む）またはその変異体もしくはそのフラグメントである。抑制物質のデザインはまた、Ｘ線結晶学を用いてＥｓｐ１の触媒ドメインについての構造的情報を得ることによって支援される。最初に、Ｅｓｐ１の触媒ドメインの構造は、カスパーゼ類プロテアーゼの２つのプロテアーゼの既知の構造に似せて作ることができる。
【００４４】
セパリン抑制物質として特定された化合物の有効性は、酵母細胞または哺乳類細胞でin vivoの有効性について検査することができる。有効な化合物は姉妹染色分体の分離を阻止（または少なくともなんらかの方法で干渉）するはずで、これは、例えば酵母でＣｅｎＶ−ＧＦＰを用いて（Ciosk et al., 1998）、または哺乳類細胞で標準的な細胞学的技術を用いて測定できる。有効な化合物は細胞増殖抑制または細胞毒性を示す。治療的な使用の有望性がそのような二次的スクリーニングで確認された物質は、さらに腫瘍細胞に対するそれらの効果を調べることができる。腫瘍細胞増殖抑制をテストするために、原発性ヒト腫瘍細胞をスクリーニングで特定した化合物と保温し、腫瘍細胞増殖抑制を通常の方法、例えばブロモデオキシウリジンまたは3Ｈの取り込みによってテストする。これらのアッセイで抗増殖作用を示す化合物をさらに担癌動物モデルでテストし、腫瘍の治療に用いることができる。
【００４５】
本発明の方法によって候補薬剤として特定された化合物の毒性および治療効果は標準的な医薬的方法によって決定できる。この方法は、細胞培養実験および動物実験を実施し、ＩＣ50、ＬＤ50、ＥＤ50を決定することを含む。得られたデータはヒトの投与量の範囲を決定するために用いられるが、この投与量範囲はまた投薬形態（錠剤、カプセル、エアロゾルスプレー、アンプルなど）および投与ルート（経口、頬側、鼻腔、非経口、または直腸）に左右される。活性成分として前記化合物を含む医薬組成物は、１つまたは２つ以上の生理学的に活性な担体を用いて通常の態様で製剤化できる。そのような製剤を製造する方法は、入門書（例えば"Remington Pharmaceutical Sciences"）に記載されている。
【００４６】
姉妹染色分体分離の過程に影響を与えることはまた、ヒトの減数分裂における染色体の分離異常によって惹起される出産異常を防止するために有益である。例えば、ヒトの異数性症例（例えばダウン症候群）は姉妹染色分体の未熟な分離によって生じるので（Griffin, 1996)、セパリン活性を抑制する薬剤の使用は早熟な姉妹染色分体の分離を減少させ、したがってヒト胎児の異数性の発生率を低下させることができるかもしれない。
したがって、本発明の別の特徴は、ヒトの減数分裂における染色体の分離異常によって惹起される出産異常の防止のためのセパリン抑制物質に関する。
【００４７】
セパリン抑制物質はまた、作物育成のための意図的な植物細胞の倍数体化を目的とする応用で有用である。酵母では、セパリン活性の抑制は、細胞周期の進行を阻止することなく染色体分離を妨げ、したがって倍数性が増加した細胞を生じる。セパリンのプロテアーゼ活性を阻止する抑制物質は、したがって全ての植物細胞を含む任意の真核細胞の倍数性を増加させるために用いられる。植物細胞の倍数性の増加は以下のために有用である：１）より大きな植物の産出、２）育種用ストックの倍数性の増加、および３）繁殖能力をもつハイブリッドの作製。
したがって、本発明の別の特徴は、植物細胞の倍数性の増加のために植物細胞を処置するセパリン抑制物質に関する。
【００４８】
上記の農業的目的のために有用なセパリン抑制物質を特定するために、本発明のスクリーニング方法は、植物成分（すなわち植物セパリンおよびＳＣＣ１の植物相同体）を用いることによって容易に応用できる。植物セパリンおよびＳＣＣ１の配列相同体は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のゲノムのデータベースで見出される。
姉妹染色分体分離を障害するセパリン抑制物質はまた、例えば染色体構造の医学的診断で染色体の細胞学的分析で用いることができる。
【００４９】
別に規定されないかぎり下記の材料および方法が本発明の実験で用いられた。
ａ）酵母のプラスミドおよび株：
ＳＣＣ１コード配列（サッカロミセスゲノムデータベースYDL003W)をＹＩｐｌａｃ１２８由来ベクター（Gietz & Sugino, 1988）によりＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下で、さらにＹＣｐｌａｃ１１１（Gietz & Sugino, 1988）でそれ自身のプロモーターの制御下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてクローニングした。マルチＨＡおよびｍｙｃエピトープをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって導入したＳＣＣ１のＮ−末端およびＣ−末端の制限部位に挿入した。位置特異的変異誘発は、所望のヌクレオチド変化を含むプライマーを用いてＰＣＲによって実施した。全ての構築物の有効性はヌクレオチド配列決定によって立証した。
【００５０】
使用した全ての株はＷ３０３（HMLa HMRa ho ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3, 112 his3-11, 15 ura3）の誘導体であった。内因性Ｓｃｃ１ｐのエピトープタグは、ＰＣＲ一工程付加法（Michaelis et al., 1997）によって作製した。ＧＡＬ１−１０プロモーターからＥｓｐ１を過剰発現している株は文献に報告されており（Ciosk et al., 1998）、ｅｓｐ１−１変異を含む株（McGrew et al., 1992)と交雑させた。ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下でＣｄｃ２０ｐの唯一の供給源を発現している株は文献に報告されている（Lim et al., 1998）。姉妹染色分体を可視化させるために、Ｖ染色体の動原体近くのＵＲＡ３遺伝子座に組み込んだＴｅｔオペレーター配列クラスターと結合するＴｅｔリプレッサー＝ＧＦＰ融合タンパク質を、文献（Michaelis et al., 1997）に記載されたように前記細胞で合成した。
【００５１】
実施例７で用いた全ての減数分裂酵母株は迅速に胞子を形成するＳＫ１の誘導体である。Ｒｅｃ８４３１／４５３変異体（E428R R431E R453E)は、ＲＥＣ８野性型完全プラスミドから位置特異的変異を誘発するＰＣＲによって作製した。このＹＩｐｌａｃ１２８−由来プラスミド（Gietz & Sugino, 1988）は、そのＣ−末端にＲＥＣ８遺伝子およびプロモーターおよび３つのＨＡエピトープ配列を含んでいる。このプラスミドをＭＩｕｌ直線化プラスミドで形質転換することによってｒｅｃ：：ＫａｎＭＸ４遺伝子座に組み込んだ。
【００５２】
ｅｓｐ１−２対立遺伝子座（McGrew et al., 1992)は、文献（Guthrie & Fink, 1991）にしたがってギャップ修復法を用いてＫ８４９３株から回収した。回収した対立遺伝子座を形質転換と５−ＦＯＡカウンター選別によってＳＫ１に移入した（Guthrie & Fink, 1991）。得られた温度感受性株をＨＯ遺伝子を含むプラスミドｃ１７４３で形質転換して二倍体化した。胞子形成実験のために、これらの株を−８０℃ストックからＹＥＰＧｌｙｃｅｒｏｌ平板に線条に塗り付け、２５℃で６０時間増殖させた。単一コロニーをＹＥＰＤにあて布で移し、定常相まで８時間増殖させた。培養をＹＥＰＡで洗浄し、ＹＥＰＡ中で一晩増殖させた。細胞を２％酢酸カリウムで洗浄し、続いて１４−２４時間同じ培養液で保温した。サンプルを２時間毎に採取し、ＤＡＰＩ染色によって核を可視化するために７０％エタノールで固定した。
【００５３】
ｂ）酵母細胞の増殖および細胞周期実験
別に記載がなければ、細胞は２５℃で完全培地（Rose et al., 1990)で増殖させた。Ｃｄｃ２０ｐ、Ｅｓｐ１またはＳｃｃ１ｐをＧＡＬ１−１０から発現させている株を炭素供給源として２％のラフィノースを含む完全培地で増殖させた。ＧＡＬ１−１０プロモーターは２％ガラクトースの添加により誘発した。Ｇ１様拘束は、培地に１μｇ／ｍｌのフェロモンアルファ因子を添加して実施した。中期拘束のためには、１５μｇ／ｍｌのノコダゾールを１％ＤＭＳＯとともに添加した。Ｃｄｃ２０ｐ枯渇に依る中期拘束は、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下で唯一のＣｄｃ２０ｐ供給源をもつ細胞で得られた。ラフィノースおよびガラクトースを含む完全培地中の対数増殖培養を濾過し、ラフィノースのみを含む培養液で洗浄し、同じ培養液に再懸濁させた。拘束からの開放のためには、２％ガラクトースを培養に加えた。
【００５４】
ｃ）酵母Ｅｓｐ１活性のためのin vitroアッセイ
トリトンＸ−１００不溶性粗クロマチン調製物を記載（Liang & Stillman, 1997）にしたがって酵母細胞から得た。沈澱させたクロマチンを、クロマチン調製物の上清分画と同様に調製した酵母細胞抽出物中に再懸濁させた。１／１０容量のＡＴＰ再生系を添加した（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＡＴＰ、６００ｍＭのクレアチン燐酸、１．５ｍｇ／ｍｌのホスホクレアチンキナーゼ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％グリセロール）。反応物を震盪しながら１０分間２５℃で保温し、氷上で反応を停止させた。クロマチン分画を上清から遠心によって再度分離し、ＥＢＸ緩衝液（Liang & Stillman, 1997）に再懸濁させた。上清およびクロマチンペレットの同等量の部分標本をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで分析した。Ｓｃｃ１−ＨＡは抗ＨＡモノクローナル抗体１６Ｂ１２（Boehringer Mannheim)で検出した。
ＧＡＬ１−１０プロモーターからＥｓｐ１を過剰発現させることは細胞にとって有毒であるので、過剰産生Ｅｓｐ１を含む抽出物は、ラフィノースのみを含む培養液中で予備増殖させた培養をガラクトースで誘発した後２時間で調製した。
【００５５】
ｄ）酵母Ｓｃｃ１ｐ切断部位のタンパク質配列決定
Ｃ−末端に１８の縦並びｍｙｃエピトープを付加したＳｃｃ１ｐを含む細胞からＣ−末端Ｓｃｃ１ｐ切断フラグメントを単離した。Ｃｄｃ２０拘束／開放法を用いて、高い割合で切断形Ｓｃｃ１ｐを含む細胞を得た。中期拘束から開放後１５分してから５×１０9細胞のタンパク質抽出物をガラスビーズで破砕して調製した。ｍｙｃエピトープ付加タンパク質を変性条件下で２０ｍｇの抗ｍｙｃ９Ｅ１１モノクローナル抗体を用いて免疫沈澱させ、サイズマーカーの隣でＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。Ｓｃｃ１ｐ切断フラグメントに対応するバンドのＮ−末端の配列決定によって、ＲＬＧＥＳＩＭのアミノ酸配列（Ｓｃｃ１ｐアミノ酸２６９から前方）が得られた。
【００５６】
ｅ）バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現される酵母Ｓｃｃ１の精製
Ｓｃｃ１コード配列をバキュロウイルス移入ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Gibco Life Technologies)でクローニングした。そのＣ−末端にＦＬＡＧエピトープタグを付加し、その後に酵母ＶＭＡインテインおよびキチン結合ドメイン（New England Biolabs)を含むカセットが続いた。リコンビナントバキュロウイルスを製造元の指示にしたがって得た。ＨｉＦｉｖｅ昆虫細胞（Invitrogen）を増殖させてコンフルエントな単層培養を得、感染多重度２でリコンビナントバキュロウイルスを感染させた。中期様燐酸化を得るために、０．１  Ｍのオカダイク酸を感染後４０時間で添加した。感染後４３時間で細胞を採集した。細胞質および核抽出物を文献（Cai et al., 1996）にしたがって得た。一緒にした抽出物から製造元の指示に従いキチンアフィニティークロマトグラフィーで、さらにその後モノＱカラム（Amersham Pharmacia）で２回のイオン交換クロマトグラフィー工程によってＳｃｃ１を精製しした。
【００５７】
ｆ）酵母Ｅｓｐ１の触媒二分子の変異
ａ）に記載したようにＥｓｐ１を過剰発現させた。保存残基ヒスチジン１５０５およびシステイン１５３１（Ｅｓｐ１プロテアーゼの仮想触媒二分子を構成する）をＰＣＲによる変異誘発を用いてアラニンに変えた。変異タンパク質を酵母でＧＡＬプロモーターから発現させ、ｃ）で述べたように切断活性についてアッセイした。
ｇ）酵母に関する他の方法
ＤＮＡ含有量の分析は記載（Epstein & Cross, 1992)にしたがいベクトン＝ディッキソン＝ファクスキャン（Becton Dickison FACScan)で実施し、染色体分散は記載（Michaelis et al., 1997）にしたがい、顕微鏡写真は、ツァイスアキシフォト（Zeiss Axiphot)顕微鏡に据え付けたフォトメトリクスＣＣＤカメラで撮影した。Ｐｄｓ１ｐのin vitro翻訳は網状赤血球溶解物でＴＮＴシステム（Prpmega)を用いて実施した。
ｈ）ヒト細胞
ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
いくつかの実験では、９つのｍｙｃエピトープがそのＣ−末端に融合されているマウスＳＣＣ１を安定的に発現しているＨｅＬａ細胞を用いた。
【００５８】
ｉ）ヒトの細胞周期実験
細胞周期の同期化のためにチミジン２回処理を用いた。最初ＨｅＬａ細胞を２ｍＭのチミジンで１８時間処理した。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、新しい培養液を添加し細胞をさらに８時間増殖させた。続いてさらに細胞を２ｍＭのチミジンで１８時間再度処理し、その後洗浄して新しい培養液で保温した。サンプルは種々の時間に採取した。サンプルを分割し、ファックスキャン分析および免疫ブロッティングに用いた。細胞抽出物は氷冷緩衝液中でガラス＝テフロンポッターで作製した。前記緩衝液は以下を含む：５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．７）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのｂ−グリセロホスフェート、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＮａＦ、０．１−０．２％のトリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴおよびプロテアーゼ抑制物質。
いくつかの実験では、対数増殖ＨｅＬａ細胞を０．１％ＤＭＳＯに溶解させた３３０ｎＭのノコダゾールで１８時間処理するか、またはチミジン２回処理によって同期化した細胞をノコダゾール含有培養液に種々の時間遊離させた。コントロール実験では、ノコダゾールを含まない０．１％ＤＭＳＯを加えた。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためには等量の総抽出物をロードした（通常サンプル当たり５０  ｇのタンパク質）。ウェスタンブロッティングのためには、以下の抗体を用いた：マウス抗セパリンモノクローナル抗体（ヒトセパリンのＣ−末端フラグメントはｐＥＴ２８ベクターで発現させ、ヒスチジン付加タンパク質を精製して免疫に用いた）；ウサギ抗ＳＣＣ１（ヒトのＳＣＣ１のＮ−末端またはＣ−末端ペプチドをＫＬＨと共役させ、免疫に用いた）；ウサギ抗セクリン（ヒトセクリンをｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターで発現させ、Ｈｉｓ／ｍｙｃ付加タンパク質を精製して免疫に用いた）。全ての抗体はアフィニティー精製した。ＣＤＣ２７、ＣＤＣ２０およびプロテアゾーム抗体は文献に記載されている（Gieffers et al., 1999)。マウス抗サイクリンＢ１（＃ＳＣ−２４５）は、Santa Cruz Biotechnology(USA）から入手した。ウサギ抗サイクリンＡ（＃０６−１３８）およびウサギ抗フォスフォ−ヒストンＨ３（＃０６−５７０）はUpstate Biotechnology(USA)から入手した。ウサギ抗ｍｙｃエピトープ抗体（ＣＭ−１００）はGramsch(ドイツ）から入手した。
【００６０】
ｊ）ＳＣＣ１のin vitro切断
マウスＳＣＣ１−ｍｙｃを異所的に発現しているノコダゾール拘束ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物（２５０μｇのタンパク質を含む）を遠心によってクロマチンと上清分画に分離した。１２．５μｌの上清分画またはクロマチンペレット（以下を含む緩衝液５μｌに再懸濁：０．００５％のトリトンＸ１００、２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．７）、２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2）を２５μｌの間期または有糸分裂期のツメガエル卵抽出物とともに室温で保温した。種々の時点でサンプルを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ｍｙｃ抗体で免疫ブロッティングを実施した。ツメガエル抽出物は文献（Murray, 1991）の記載にしたがって調製した。
【００６１】
ｋ）ヒトＳＣＣ１のＮ−末端切断部位のマッピング
ヒトＳＣＣ１のｃＤＮＡの切端形を作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた。Ｎ−末端欠失のためには、Ｔ７プロモーター領域、開始コドン、および適切なＳＣＣ１配列を含む種々の５'−プライマーを用いた。Ｃ−末端欠失のためには、適切なＳＣＣ１配列および終止コドンをもつ種々の３'−プライマーを用いた。得られたＰＣＲフラグメントは、網状赤血球溶解物で35Ｓ−メチオニンの存在下でin vitroで転写および翻訳した（ＴＮＴシステム、Promega)。in vitro翻訳生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｃ−末端またはＮ−末端特異的ＳＣＣ１抗体を用いて免疫ブロッティングを実施した。
【００６２】
実施例
実施例１：Ｇ１期における酵母Ｓｃｃ１ｐの染色体結合はＥｓｐ１依存性である：
Ａ）未改変内因性Ｓｃｃ１のコピーおよびＧＡＬプロモーターの制御下にある第二のｍｙｃ付加コピーを含む細胞（ＥＳＰ１について野性型またはｅｓｐ１変異を含む）を交尾フェロモンアルファ因子で１２０分拘束した。続いて全ての細胞を細胞周期のＧ１期（実験の０時点）に拘束した。ＤＮＡ含有量のファックスキャン像によって、全ての細胞がこの実験でその後１２０分間拘束状態を維持することが示された。Ｓｃｃ１ｍｙｃは２％ガラクトースを添加することによって６０分間誘発され、続いて細胞を２％グルコース含有培養液に移してＳｃｃ１ｍｙｃの発現を抑圧した（図１Ａ）
Ｂ）Ｓｃｃ１ｍｙｃの発現は、in situハイブリダイゼーションで完全細胞で観察された（白丸）。Ｓｃｃ１ｍｙｃの染色体結合は分散染色体を用いて観察された（黒四角）。Ｓｃｃ１ｍｙｃ発現について陽性の細胞およびＳｃｃ１ｍｙｃが染色体に結合した細胞の百分率はグラフに示されている（図１Ｂ）。
【００６３】
実施例２：酵母Ｓｃｃ１ｐの切断およびクロマチンからの解離についてのin vitroアッセイ
クロマチンは、ノコダゾールで中期に拘束したＨＡエピトープ付加Ｓｃｃ１ｐを含む株から調製した。クロマチン調製物中のタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、Ｓｃｃ１−ＨＡはウェスタンブロッティングで検出した（図２、レーン１）。このクロマチン調製物を表示した抽出物に再懸濁させ、表示にしたがいin vitro翻訳生成物を添加または添加しなかった。保温は２５℃で１０分実施し、その後でクロマチンを遠心によって上清から再度分離した。各反応物の上清分画およびクロマチン分画の部分標本を分析した。
【００６４】
実施例３：同期化した中期から後期に移行している細胞の酵母Ｓｃｃ１ｐのin vivo切断生成物の検出：
使用細胞は、唯一のＣｄｃ２０ｐの供給源としてＧＡＬプロモーターの制御下でＣｄｃ２０ｐを発現していた。Ｓｃｃ１ｐはＨＡエピトープが付加されており、姉妹染色分体は、染色体Ｖの動原体に挿入されたｔｅｔＯ配列に結合したｔｅｔＲ−ＧＦＰによって可視化した。細胞は、ガラクトースを欠く培養液で細胞からＣｄｃ２０ｐを１２０分枯渇させることによって中期に拘束した。続いて２％ガラクトースを添加してＣｄｃ２０ｐの合成を誘発した。
Ａ）時間経過におけるファックスキャン像は図３Ａに示されている。
【００６５】
Ｂ）発芽（図３ｂ、黒四角）を採点した。１２０分後には全ての細胞が拘束され大きな発芽が認められ、細胞質分離は、Ｃｄｃ２０ｐ合成の誘発後３０分から４５分の間にほとんどの細胞について発生した。染色体に結合したＳｃｃ１−ＨＡは拘束されたほとんどの細胞の分散染色体上で認められた（図３Ｂ、白丸）。Ｓｃｃ１−ＨＡは、拘束開放後１５分以内に染色体から消失した。１つの細胞体中の２つの分離したＧＦＰドットの出現として認められる分離姉妹染色分体をもつ細胞の百分率が提示されている（図３Ｂ、黒三角）。
Ｃ）拘束１２０分の時点および拘束開放後１５分の細胞例。姉妹染色分体の同期化分離が分離ＧＦＰドットとして認められる（図３Ｃ）。
Ｄ）表示の時間における全細胞抽出物のウェスタンブロット分析。Ｓｃｃ１−ＨＡの切断フラグメントは、中期封鎖から後期への拘束開放後まもなく１３５分の時点で明瞭である（図３Ｄ）。
【００６６】
実施例４：酵母Ｓｃｃ１ｐの非切断性変種の発現は、in vivoでの染色体からのＳｃｃ１ｐの解離および姉妹染色分体分離を妨げる
Ａ）Ｓｃｃ１ＲＲ−ＤＤ変異体の誘発とともに、または誘発せずに非発芽Ｇ１細胞の細胞周期を再開させたときのＤＮＡ含有量のファックスキャン像（図４Ａ）。
Ｂ）Ｓｃｃ１ＲＲ−ＤＤを誘発しないとき（図４Ｂ、白四角）または誘発したとき（図４Ｂ、白三角）の発芽インデックス。細胞の姉妹染色分体は２つの分離ＧＦＰドットを含む細胞の百分率を数えることによってモニターした（図４Ｂ、黒四角はＳｃｃ１ＲＲ−ＤＤを発現していないコントロール培養で、黒三角はＳｃｃ１ＲＲ−ＤＤを発現している培養）。
Ｃ）Ｓｃｃ１ｐの染色体結合は分散染色体上で測定した。内因性野性型Ｓｃｃ１ｍｙｃがコントロール細胞（白四角）について、さらにＳｃｃ１ＲＲ−ＤＤを発現している細胞（図４ｃ、白三角）について示されている。Ｓｃｃ１ＲＲ−ＤＤはＨＡを付加されており、誘発培養の分散染色体上で検出された（図４Ｃ、黒三角）。
Ｄ）中期１５０分の時点における培養、およびコントロール培養のほとんどの細胞が後期に入っている１８０分の時点における培養の分散染色体の例。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色し、Ｓｃｃ１ｍｙｃはウサギ抗ｍｙｃ抗血清および抗ウサギＣｙ５共役二次抗体で検出した。Ｓｃｃ１ＲＲ−ＤＤ−ＨＡはマウスモノクローナル抗体１６Ｂ１２および抗マウスＣｙ３共役二次抗体で検出した。動原体Ｖの姉妹染色分体はＧＦＰドットによって可視化した（図４Ｄ）。
【００６７】
実施例５：精製酵母Ｓｃｃ１はＥｓｐ１依存切断のための基質である。
図５Ａ：バキュロウイルス感染昆虫細胞のＳｃｃ１の精製。レーン１：コントロールＨｉＦｉｖｅ全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクマシーブリリアントブルーによる染色、レーン２：Ｓｃｃ１を発現するウイルスに感染させた後の全細胞抽出物、レーン３：キチンアフィニティーカラムの溶出物、レーン４：第二のモノＱクロマトグラフィー工程のプール分画。同様な態様で精製したが中期様燐酸化は含まないＳｃｃ１はレーン５に示されている。
図５Ｂ：精製Ｓｃｃ１を用いる切断アッセイ。非燐酸化および中期様燐酸化形の両精製Ｓｃｃ１を切断アッセイで基質として用いた。Ｅｓｐ１を含む細胞抽出物は図２のものと同様であったが、Ｅｓｐ１の力価測定のためにコントロール抽出物と種々の割合で混合して用いた。Ｓｃｃ１は、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Sigma)を用いてウェスタンブロッティングによって検出した。
実施例６：酵母Ｅｓｐ１の触媒二分子の変異はその切断活性を失わせる
野性型Ｅｓｐ１並びに変異型Ｈ１５０５ＡおよびＣ１５３１Ａを酵母で過剰発現させ、検出のためにＦＬＡＧエピトープを付加した。図６Ａ：２つの変異Ｅｓｐ１タンパク質が野性型タンパク質と同様なレベルで安定なタンパク質として発現されていることを示す細胞抽出物のウェスタンブロット。図６Ｂ：結合Ｓｃｃ１切断活性は実施例２のようにアッセイした。
【００６８】
実施例７：その切断部位の変異またはｅｓｐ１変異による減数分裂凝集タンパク質Ｒｅｃ８の切断妨害は減数分裂における核分裂を抑制する
図７Ａ：Ｒｅｃ８について野性型であるか、または両切断部位が変異しているＲｅｃ８を発現している二倍体酵母株で胞子を形成させた。実験を通して１核、２核、３核または４核を含む細胞の百分率を示した。
図７Ｂ：ｅｓｐ１−２変異についてホモ接合体である二倍体酵母株で２５℃または３５℃で胞子を形成させた。１核、２核、３核または４核を含む細胞の百分率を示した。
実施例８：ヒトＳＣＣ１とクロマチンの結合
対数増殖中またはノコダゾールで中期に拘束したＨｅＬａ細胞からクロマチン分画および上清分画を調製した。これらの分画の同等な部分標本からタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、放射能標識抗体を用いて免疫ブロッティングによってＳＣＣ１の有無を分析し（図８、上図）、ＳＣＣ１バンドの濃さを定量した（図８、下図）。
【００６９】
実施例９：ヒトＳＣＣ１は有糸分裂で切断される
ＨｅＬａ細胞は、チミジン２回処理によってＳ期の開始時点に拘束し、同期化して細胞周期を再開させた。表示の時点でサンプルを採取した。ファックスキャンによってＤＮＡ含有量を（図９Ａ）、さらに表示の抗体を用いて全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによって細胞を分析した（図９Ｂ）。ＡＰＣサブユニット、ＣＤＣ２７の燐酸化によって左右される電気泳動移動度のシフトを、有糸分裂開始のマーカーとして使用した。サイクリンＡの消失を中期のマーカーとして用い、ＣＤＣ２０、セクリンおよびサイクリンＢの消失を後期のマーカーとして用いた。プロテアゾームレベルはローディングコントロールとして測定した。図９Ｂの上から３番および４番のパネルの矢印は、ＳＣＣ１のそれぞれＣ−末端およびＮ−末端に特異的な抗体によって認識される１００および２５ｋＤａのバンドを示している。
【００７０】
図１０：異所的に発現されたＳＣＣ１ｍｙｃはコヘッシン複合体に取り込まれ、有糸分裂で切断される
図１０Ａ：安定的にＳＣＣ１ｍｙｃを発現している対数増殖中のＨｅＬａ細胞の抽出物を、５−２０％のシュクロース密度勾配遠心によって分離した。各グラディエント分画のタンパク質を、ＳＣＣ１、ｍｙｃエピトープおよびヒトコヘッシンサブユニットＳＡ１に対する抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによって分析した。９Ｓおよび１４Ｓコヘッシン複合体の位置は表示されている。内因性および異所的に発現させたＳＣＣ１ｍｙｃは、１４Ｓコヘッシン複合体を含む分画でもっぱら見出された。
図１０Ｂ：安定的にＳＣＣ１ｍｙｃを発現しているＨｅＬａ細胞をチミジン２回処理によって拘束し、同期化して細胞周期を再開させた。表示の時点でサンプルを採取し、ｍｙｃエピトープおよびＳＣＣ１のＣ−末端に対する抗体を用いて全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによって分析した。ＳＣＣ１切断生成物は矢印で示されている。より大きな電気泳動移動度をもつ第二のＳＣＣ１ｍｙｃ切断生成物（これはより長時間の露光によってのみ検出可能である）を示すために、ｍｙｃ免疫ブロットの２度露光を示した（下図）。
【００７１】
図１１：ヒトＳＣＣ１は中期で拘束されたヒト細胞ではノコダゾール処理によって切断されない
安定的にＳＣＣ１ｍｙｃを発現しているＨｅＬａ細胞をチミジン２回処理によって同期化し、さらにＤＭＳＯ（結果は図１１ＡおよびＣ）またはＤＭＳＯに溶解したノコダゾール（結果は図１１ＢおよびＤ）の存在下で細胞周期を再開させた。表示の時点でサンプルを採取した。ファックスキャン（図１１ＡおよびＢ）および表示の抗体を用いて全細胞抽出物を免疫ブロッティング（図１１ＣおよびＤ）によって細胞を分析した。ＳＣＣ１のＣ−末端に特異的な抗体を用いた。実施例９で用いた抗体の他に、有糸分裂期の燐酸化ヒストンＨ３（ホスホＨ３）に特異的な抗体を有糸分裂マーカーとして用いた。
【００７２】
実施例１２：ＳＣＣ１は後期に切断される
安定的にＳＣＣ１ｍｙｃを発現しているＨｅＬａ細胞をノコダゾールで中期に拘束し同期化して後期を開始させた。表示の時点でサンプルを採取した。ファックスキャン（図１２Ａ）および表示の抗体を用いて全細胞抽出物の免疫ブロッティング（図１２Ｂ）によって細胞を分析した。ＳＣＣ１のＣ−末端に特異的な抗体を用いた。
実施例１３：ＳＣＣ１ｍｙｃはin vitroで切断される
安定的にＳＣＣ１ｍｙｃを発現しているノコダゾール拘束ＨｅＬａ細胞から弁別遠心によってクロマチン分画と上清分画を単離した。有糸分裂期および後期ツメガエル卵抽出物中でクロマチン分画を、さらに有糸分裂期のツメガエル卵抽出物中で上清分画を保温した。図１３に表示した時点でサンプルを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、さらにｍｙｃエピトープに対する抗体を用いて免疫ブロッティングによって分析した。Ｓ期または後期（チミジン２回処理による６時間および１１．５時間の拘束から開放することによってそれぞれ得られた）のＳＣＣ１ｍｙｃ発現ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物を横に並べて分析した。有糸分裂期のツメガエル抽出物で特異的に形成されるＳＣＣ１ｍｙｃの切断生成物は矢印で示されている。
【００７３】
実施例１４：ヒトＳＣＣ１のＮ−末端切断部位のマッピング
ヒトＳＣＣ１ｃＤＮＡの切端形をＰＣＲ並びにin vitro転写および翻訳によって作製した。ＳＣＣ１抗体による免疫ブロッティング（上図）によって、さらにホスホイメージング（下図）によって、35Ｓ標識in vitro翻訳生成物（35Ｓ−ＩＶＴ）を分析した。ＳＣＣ１のＣ−末端に特異的な抗体による免疫ブロッティングによってＮ−末端欠失変異体を（図１４、左図）、さらにＳＣＣ１のＮ−末端に特異的な抗体によりＣ−末端欠失変異体を（図１４、右図）分析した。後期またはＧ１期（チミジン２回処理による拘束から開放することによって得られた）のＳＣＣ１ｍｙｃ発現ＨｅＬａ細胞の抽出物を横に並べて分析した。ＨｅＬａ抽出物で検出されるＳＣＣ１切断生成物は矢印で示されている。
【００７４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｇ１期のＳｃｃ１ｐの染色体結合はＥｓｐ１に依存することを示している。
【図２】  図２は、Ｓｃｃ１ｐの切断およびクロマチンからの解離についてのin vitroアッセイを示す。
【図３】  図３は、中期から後期に同期化されて移行している細胞におけるＳｃｃ１ｐのin vivo切断生成物の検出を示す。
【図４】  図４は、非切断型Ｓｃｃ１ｐ変種の発現は、in vivoでの染色体からのＳｃｃ１ｐの解離および姉妹染色分体分離を妨げることを示す。
【図５】  図５は精製Ｓｃｃ１はＥｓｐ１依存切断反応のための基質であることを示す。
【図６】  図６は、Ｅｓｐ１プロテアーゼドメインの仮想触媒二分子における変異は切断活性を消失させることを示す。
【図７】  図７は、コヘッシンＲｅｃ８のセパリン切断は減数分裂における核分裂時に必要であることを示す。
【図８】  図８はヒトＳＣＣ１とクロマチンの結合を示す。
【図９】  図９はヒトＳＣＣ１は有糸分裂で切断されることを示す。
【図１０】  図１０は、異所的に発現させたＳＣＣ１ｍｙｃはコヘッシン複合体に取り込まれ、有糸分裂で切断されることを示す。
【図１１】  図１１は、ヒトＳＣＣ１はノコダゾール処理で中期に拘束したヒトの細胞で切断されないことを示す。
【図１２】  図１２はヒトＳＣＣ１は後期に切断されることを示す。
【図１３】  図１３はヒトＳＣＣ１ｍｙｃはin vitroで切断されることを示す。
【図１４】  図１４はヒトＳＣＣ１のＮ−末端切断部位のマッピングを示す。
【配列表】
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【図１ａ】
0004377073.tif 000003
【図１ｂ】
0004377073.tif 000004
【図２】
0004377073.tif 000005
【図３ａ−ｂ】
0004377073.tif 000006
【図３ｃ−ｄ】
0004377073.tif 000007
【図４ａ】
0004377073.tif 000008
【図４ｂ−ｃ】
0004377073.tif 000009
【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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