(57)【要約】糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）の治療における、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞を使用する方法が、本明細書で提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性足部潰瘍を有する対象を治療する方法であって、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象が、１つより多い糖尿病性足部潰瘍を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、末梢動脈疾患を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
胎盤幹細胞を含む前記組成物が、筋肉内投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、１×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、または５×１０９〜１×１０１０の胎盤幹細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、約１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０の胎盤幹細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、約３×１０６の胎盤幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、約１×１０７の胎盤幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、約３×１０７の胎盤幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍のサイズの低減をもたらす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の閉鎖をもたらす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の１つ以上の症状の改善をもたらす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の症状が、前記対象の足及び／または下腿の傷、潰瘍、または水疱；前記対象の足（複数可）及び／または下腿の疼痛；歩行困難；前記対象の足（複数可）の変色；ならびに／または、前記対象の足（複数可）の感染、である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の閉鎖までの時間の増加、前記対象の足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善、前記対象の足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善、前記対象の経皮酸素レベルの改善、前記対象の脈容量記録の改善、主要の切断までの時間の低減、Ｗａｇｎｅｒの評価尺度の改善、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善、及び／または、前記対象の脚の安静時疼痛スコアの改善、をもたらす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
治療の必要な対象のＤＦＵを治療するための方法であって、（ａ）前記対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること；（ｂ）前記対象に、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物を投与すること；及び、（ｃ）前記胎盤幹細胞の投与後の、前記対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、胎盤幹細胞の投与前の循環内皮細胞の数と比較した、胎盤幹細胞の投与後の循環内皮細胞の数の減少が、前記対象のＤＦＵの治療が有効であることを示す、前記方法。
【請求項１６】
治療の必要な対象のＤＦＵを治療するための方法であって、（ａ）前記対象に、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物を投与すること；（ｂ）前記胎盤幹細胞の投与後の第１の時点で、前記対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること；及び、（ｃ）前記胎盤幹細胞の投与後の第２の時点で、前記対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、前記第１の時点で測定された循環内皮細胞の数と比較した、前記第２の時点で測定された循環内皮細胞の数の減少が、前記対象のＤＦＵの治療が有効であることを示す、前記方法。
【請求項１７】
前記対象が、前記対象のＤＦＵの治療が有効である場合、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量を投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、１×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、または５×１０９〜１×１０１０の胎盤幹細胞を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、約１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０の胎盤幹細胞を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０５６，００８号、２０１５年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１４５，５５１号、２０１５年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，７２６号、２０１５年６月４日に出願された米国仮特許出願第６２／１７０，７５７号、及び、２０１５年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２２０，６２０号、に対する優先権を主張し、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
１．分野
糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）の治療における、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞を使用する方法が、本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
胎盤は特に、魅力的な幹細胞の供給源である。哺乳動物胎盤は、豊富であり、通常は医療廃棄物として廃棄されるので、医学的に有用な幹細胞の特有の供給源である。
【発明の概要】
【０００４】
３．概要
糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法が提供され、該方法は、治療的有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、対象に投与することを含む。具体的な実施形態では、該胎盤細胞は、医薬組成物として製剤化される。
【０００５】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療されるＤＦＵを有する対象は、Ｉ型糖尿病に罹患している。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療されるＤＦＵを有する対象は、ＩＩ型糖尿病に罹患している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、１つより多いＤＦＵを有し、例えば、対象は、片足に１つより多いＤＦＵ、または各足に少なくとも１つのＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、片足または両足の裏に１つ以上のＤＦＵを有する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、末梢ニューロパチー、例えば、脚及び／または足の神経のうちの１つ以上への損傷、を有する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、対象の末梢血管系に血液の流れの中断を引き起こす状態のＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する。ある特定の実施形態では、該ＤＦＵが、ＰＡＤに起因及び／または関連する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患ＰＡＤを有しない。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される方法に従って治療された対象において、ＤＦＵの１つ以上の症状を検出可能に改善することをもたらす。ＤＦＵの例示的症状としては、脚及び／または下腿の傷、潰瘍、または水疱；脚（若しくは足）及び／または下腿疼痛；歩行困難；足（または両足）の変色、例えば、足（または両足）が黒く、青く、及び／または赤く見える：ならびに感染の徴候（例えば、熱、皮膚の赤み、及び／または腫れ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、改善の１つ以上の徴候における検出可能な改善のために十分な量及び時間で、ＤＦＵを有する対象に、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）を投与することを含み、改善の該徴候は、（ｉ）潰瘍サイズの低減；（ｉｉ）潰瘍閉鎖：ドレナージまたはドレッシングの必要性のない１つ以上の潰瘍の皮膚閉鎖；（ｉｉｉ）閉鎖後の特定の期間、例えば、閉鎖後２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間、の潰瘍閉鎖の保持；（ｉｖ）潰瘍閉鎖時間の増加；（ｖ）、対象が静止している間に足首及び腕の血圧を測定し、次に、対象が動いている（例えば、トレッドミルで歩く）間に繰り返される、ＰＡＤの重症度を予測／評価するために使用することができる検査である足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善；（ｖｉ）足首血圧ではなく足趾血圧を使用するＡＢＩに類似した検査である足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善；（ｖｉｉ）経皮酸素レベル、すなわち、潰瘍に近い皮膚の下の組織の酸素レベルの改善（例えば、Ｒｕａｎｇｓｅｔａｋｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，  ２０１０，  １９（５）：２０２−６を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）血液測定用カフ及び手持ち式超音波装置が、腕及び脚の動脈血流量についての情報を得るために使用される非侵襲的血管検査である、脈容量記録の改善；（ｉｘ）大切断、例えば、足首の上での切断の時間；（ｘ）評価システム：グレード０（潰瘍性病変の前または後）、グレード１（部分／全層潰瘍）、グレード２（腱または被膜に達する）、グレード３（骨髄炎を伴う深部）、グレード４（部分的な足の壊疽）、及びグレード５（全足壊疽）、を使用して、潰瘍の深さ及び骨髄炎または壊疽の存在を評価するＷａｇｎｅｒの評価尺度の改善；（ｘｉ）７つの分類ステージ、すなわちステージ０：無症状、ステージ１：軽度跛行、ステージ２：中等度跛行、ステージ３：高度跛行、ステージ４：安静時疼痛、ステージ５：足指の壊疽を超えない虚血性潰瘍形成、及びステージ６：高度虚血性潰瘍または明らかな壊疽、を有する、末梢動脈疾患のステージングのために使用されるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善：ならびに、（ｘｉｉ）脚の安静時疼痛スコア、すなわち０が無痛であり、１０が最大の疼痛を表す疼痛の０〜１０尺度の改善、を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍の、生活の質への影響を測定する糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（例えば、Ｂａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  ２００３，  ２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）経時的なニューロパチーの変化を評価するための、変化尺度の患者の全体的印象（例えば、Ｋａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍａｎ．  Ｍａｎｉｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，  １７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；ならびに／または、（ｉｖ）患者の健康状態に対する記述的プロファイル及び単一の指標値を得るために使用される健康質問票であるＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度、で評価される場合の対象の生活の質における検出可能な改善のために十分な量及び時間で、ＤＦＵを有する対象に、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）を投与することを含む。
【００１１】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、注射で投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、治療されている対象に、胎盤細胞を含むマトリックスまたは足場の該対象への移植により投与される。
【００１２】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、筋肉内投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、静脈内投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、皮下投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、局所投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、全身投与される。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０の胎盤細胞の投与を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、または５×１０９〜１×１０１０の胎盤細胞の投与を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０６の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約１×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０７の胎盤細胞の投与を含む。
【００１４】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、１週間の投与間隔で１回より多く、対象に筋肉内投与され、例えば、胎盤細胞は１日目（投与の最初の日）に投与され、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）の２回目投与が、１週間後（すなわち、８日目）に投与される。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、１日目及び８日目）の、約３×１０６の胎盤幹細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、１日目及び８日目）の、約１×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、３日目及び８日目）の、約３×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞は、約１週間の投与間隔で少なくとも３つの異なる機会に、対象に投与される。別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与される対象は、ＰＡＤを有する。
【００１５】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、１ヶ月の投与間隔で１回より多く、対象に投与され、例えば、胎盤細胞は１日目（投与の最初の日）に投与され、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）の２回目投与が、約１ヶ月後（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３日目）に投与される。具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日における約３×１０６の胎盤幹細胞の投与を含む（例えば、３×１０６胎盤幹細胞が１日目に投与され、約３×１０６胎盤幹細胞が１日目から１ヶ月後に、例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３日目に投与される）。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日における約３×１０７の胎盤細胞の投与を含む（例えば、３×１０７胎盤幹細胞が１日目に投与され、約３×１０７胎盤幹細胞が１日目から１ヶ月後に、例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３日目に投与される）。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞は、約１ヶ月の投与間隔で少なくとも３つの異なる機会に、対象に投与される。別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与される対象は、ＰＡＤを有する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、対象の治療の有効性を評価するための手段として、本明細書に記載のＤＦＵを治療する方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数が測定される。本明細書で提供される方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数は、治療中の任意の時、または治療開始前に測定することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数は、（ｉ）治療開始前に（すなわち、胎盤幹細胞が、ＤＦＵを有する対象に投与される前に）、例えば、胎盤幹細胞の投与の日（であるが、投与前）に、治療の開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日前に、または治療開始の１、２、３、４、若しくは５週後に、または治療開始の１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月後に、及び、（ｉｉ）治療中に、例えば、治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日後に、治療開始の１、２、３、４、若しくは５週後に、または治療開始の１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月後に少なくとも１回、測定される。治療開始後に、測定される循環内皮細胞の数が、治療前に測定された循環内皮細胞の数よりも少ない場合、ＤＦＵを有する対象の治療は、有効とみなすことができる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数は、（ｉ）治療開始後の第１の時点で（すなわち、胎盤幹細胞が、ＤＦＵを有する対象に投与された後に）、例えば、胎盤幹細胞の投与の日（であるが、投与後）に、治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日後に、または治療開始の１、２、３、４、若しくは５週後に、または治療開始の１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月後に、及び、（ｉｉ）治療開始後の第２の時点で、例えば、治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日後に、治療開始の１、２、３、４、若しくは５週後に、または治療開始の１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月後に測定され、第２の時点は、第１の時点よりも時間的に後にある。第２の時点の治療で測定された循環内皮細胞の数は、第２の時点で測定された循環内皮細胞の数よりも少ない場合、ＤＦＵを有する対象の治療は、有効とみなすことができる。
【００１８】
具体的な実施形態では、治療の必要な対象のＤＦＵを治療するための方法が本明細書で提供され、方法は、（ａ）対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること；（ｂ）対象に、１つ以上の用量の胎盤幹細胞を投与すること；及び、（ｃ）胎盤幹細胞の投与後の、対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、胎盤幹細胞の投与前の循環内皮細胞の数と比較した、胎盤幹細胞の投与後の循環内皮細胞の数の減少は、該対象のＤＦＵの治療が有効であることを示す。ある特定の実施形態では、対象のＤＦＵの治療が有効である場合、該対象に、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与される。
【００１９】
別の具体的な実施形態では、治療の必要な対象のＤＦＵを治療するための方法が本明細書で提供され、方法は、（ａ）対象に、１つ以上の用量の胎盤幹細胞を投与すること；（ｂ）胎盤幹細胞の投与後の第１の時点で、対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること；及び、（ｃ）胎盤幹細胞の投与後の第２の時点で、対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、第１の時点で測定された循環内皮細胞の数と比較した、第２の時点で測定された循環内皮細胞の数の減少は、該対象のＤＦＵの治療が有効であることを示し、対象のＤＦＵの治療が有効である場合、該対象に、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与される。ある特定の実施形態では、対象のＤＦＵの治療が有効である場合、該対象に、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与される。
【００２０】
組織培養プラスチックに接着した、本明細書に記載される方法で使用される胎盤細胞は、例えば、フローサイトメトリーで検出できるようなＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋である。本明細書で提供される方法で使用される胎盤細胞のさらなる特徴は、セクション５．１に記載されている。本明細書で提供される方法で使用されるべき組成物、例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、セクション５．３に記載されている。
【００２１】
３．１  定義
本明細書で使用される場合、記載された数値に言及する時の「約」という用語は、記載された数値の±１０％以内の値を示す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の胎盤由来接着細胞に関する「血管新生の」という用語は、細胞が、血管若しくは血管様発芽を形成することができること、または、細胞が、別の細胞の集団、例えば、内皮細胞、における血管新生（例えば、血管若しくは血管様構造の形成）を促進することができることを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、から単離されるまたは別途精製される、を意味する。例えば、胎盤由来接着細胞は、胎盤から単離される。「由来する」という用語は、組織、例えば、胎盤、から直接単離された細胞から培養される細胞、及び初代分離株から培養された、または拡大した細胞を包含する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語、例えば、「単離胎盤細胞」、「単離胎盤幹細胞」などは、幹細胞が由来する組織、例えば、胎盤、の他の異なる細胞から実質的に分離される細胞を意味する。幹細胞が自然に結合する細胞、例えば、非幹細胞、または異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が、例えば、幹細胞の収集及び／または培養中に、幹細胞から除去される場合、細胞は単離される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「単離細胞の集団」という用語は、細胞集団が誘導される組織、例えば、胎盤、の他の細胞から実質的に分離される細胞集団を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「胎盤細胞」という用語は、初代培養後の継代数に関わらず、初代分離株または培養された細胞のいずれかとして、例えば、下記セクション５．１に記載されるように、哺乳動物胎盤から単離される、または、哺乳動物胎盤から単離される細胞から培養される幹細胞若しくは前駆細胞を指す。しかし、ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「胎盤細胞」という用語は、栄養芽細胞、細胞性栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞、アンジオブラスト、ヘマンジオブラスト、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、または後期胚の生殖巣堤から得られる細胞、例えば、胚性生殖細胞を指さない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、胎盤細胞は、特定のマーカーが、バックグラウンドを超えて検出できる場合、マーカーに対して「陽性」である。特定のマーカーの検出は、例えば、抗体の使用、または、マーカーをコードする遺伝子若しくはｍＲＮＡの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマーのいずれかにより達成することができる。例えば、胎盤細胞は、例えば、ＣＤ７３が、（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドを検出可能に超える量で、胎盤細胞上に検出できるので、ＣＤ７３に対して「陽性」である。また、マーカーが、細胞により提示または発現される時に、少なくとも１つの他の細胞型と識別するために使用することができる、または、細胞を選択若しくは単離するために使用することができる場合、細胞は、そのマーカーに対しても陽性である。例えば、抗体を介する検出との関連で、特定の細胞表面マーカーが存在する指標としての「陽性」は、マーカーが、マーカーに特異的な抗体、例えば、蛍光標識抗体を使用して検出できることを意味し；「陽性」は、例えば、サイトメーターで、バックグラウンドを超えて検出できるシグナルを発生させる量のマーカーを示す細胞も指す。例えば、細胞が、ＣＤ２００に特異的な抗体で検出可能に標識され、かつ、抗体からのシグナルが、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のシグナルよりも検出可能に高い場合、細胞は、「ＣＤ２００＋」である。逆に、同じ文脈における「陰性」は、細胞表面マーカーが、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）と比較して、マーカーに特異的な抗体を使用して検出できないことを意味する。例えば、細胞が、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）よりも大きい程度に、ＣＤ３４に特異的な抗体で、再現可能で検出可能に標識されない場合、細胞は、「ＣＤ３４−」である。抗体を使用して検出されない、または検出できないマーカーは、適切な対照を使用して、同様の仕方で陽性または陰性と判定される。例えば、細胞または細胞の集団由来のＲＮＡで検出されるＯＣＴ−４ＲＮＡの量が、例えば、ＲＮＡを検出する方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、スロットブロットなど、で測定される場合、バックグラウンドよりも検出可能に多い時、細胞または細胞の集団は、ＯＣＴ−４＋であると判定することができる。本明細書において別途記載のない限り、分化抗原群（「ＣＤ」）マーカーは、抗体を使用して検出される。ある特定の実施形態では、ＯＣＴ−４が、ＲＴ−ＰＣＲを使用して検出できる場合、ＯＣＴ−４が存在すると判定され、細胞は「ＯＣＴ−４＋」である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、本明細書に記載の治療方法で治療される哺乳動物を指すために、同じ意味で使用され得る。具体的な実施形態では、治療されるべき対象は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】胎盤由来接着細胞による、選択された血管新生タンパク質の分泌を示す。
【００３０】
【図２】ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管腔形成に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の血管新生効果を示す。
【００３１】
【図３】ヒト内皮細胞遊走に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の血管新生効果を示す。
【００３２】
【図４】ヒト内皮細胞増殖に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の効果を示す。
【００３３】
【図５】ＨＵＶＥＣ及び胎盤由来接着細胞の管腔形成を示す。
【００３４】
【図６】低酸素及び正常酸素条件下での、胎盤由来接着細胞による、ＶＥＧＦ及びＩＬ−８の分泌を示す。
【００３５】
【図７】ニワトリ漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生に対するＰＤＡＣの正の効果を示す。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子（陽性対照）ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳癌細胞株（陽性対照）Ｙ軸：血管形成の程度。
【００３６】
【図８】ニワトリ漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生に対するＰＤＡＣ馴化培地（上清）の正の効果を示す。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子（陽性対照）ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳癌細胞株（陽性対照）Ｙ軸：血管形成の程度。
【００３７】
【図９】アストロサイトの培養物、またはアストロサイト及びＰＤＡＣの共培養物に存在する、過酸化水素から発生した活性酸素種。ＲＦＵ  ＲＯＳ活性：活性酸素種に対する相対蛍光単位。
【００３８】
【図１０】後肢虚血の糖尿病モデルのマウスへの、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞投与後の、増加した血流（図１０Ａ）及び血管造影スコア（図１０Ｂ）を示す。
【００３９】
【図１１】ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で処置されたマウスの後肢虚血手術後の、ＣＤ３１及びα平滑筋アクチン抗体の両方を使用した血管染色の増加を示す。２つのマーカーのレベルは、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、蛍光イメージング（図１１Ａ及び１１Ｂ）を使用して分析され、定量化された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【００４０】
【図１２】ビヒクルまたは２投薬量のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で処置されたｄｂ／ｄｂマウスにおける後肢虚血手術後の、マウス大腿四頭筋のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。
【００４１】
【図１３】Ｍ２マクロファージの２つのマーカーであるＡｒｇ１及びＣＤ２０６について、後肢虚血及びＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与後の脂肪組織の染色を示す。染色は、手術後の３日目及び１４日目に実施された。
【００４２】
【図１４】後肢虚血手術及びＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与後の、ＬＰＳ刺激を用いる及び用いない単離脂肪細胞におけるサイトカインレベルを示す。
【００４３】
【図１５】ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与後の、ＤＦＵを治癒している対象（１５Ａ）及びＤＦＵを治癒していない対象（１５Ｂ）における、循環内皮細胞の数の基準からの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を治療することを、それらを必要とする対象において行う方法が本明細書で提供され、該方法は、治療的有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、対象に投与することを含む。具体的な実施形態では、該胎盤細胞は、医薬組成物として製剤化される。
【００４５】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療されるＤＦＵを有する対象は、Ｉ型糖尿病に罹患している。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療されるＤＦＵを有する対象は、ＩＩ型糖尿病に罹患している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、１つより多いＤＦＵを有し、すなわち、対象は、片足に１つより多いＤＦＵ、または各足に少なくとも１つのＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、片足または両足の裏に１つ以上のＤＦＵを有する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、末梢ニューロパチー、例えば、脚及び／または足の神経のうちの１つ以上への損傷、を有する。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、対象の末梢血管系に血液の流れの中断を引き起こす状態のＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する。ある特定の実施形態では、該ＤＦＵが、ＰＡＤに起因及び／または関連する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有しない。
【００４８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される方法に従って治療された対象において、ＤＦＵの１つ以上の症状を検出可能に改善することをもたらす。ＤＦＵの例示的症状としては、脚及び／または下腿の傷、潰瘍、または水疱；脚（若しくは足）及び／または下腿疼痛；歩行困難；足（または両足）の変色、例えば、足（または両足）が黒く、青く、及び／または赤く見える：ならびに感染の徴候（例えば、熱、皮膚の赤み、及び／または腫れ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、改善の１つ以上の徴候における検出可能な改善のために十分な量及び時間で、ＤＦＵを有する対象に、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）を投与することを含み、改善の該徴候は、（ｉ）潰瘍サイズの低減；（ｉｉ）潰瘍閉鎖：ドレナージまたはドレッシングの必要性のない１つ以上の潰瘍の皮膚閉鎖；（ｉｉｉ）閉鎖後の特定の期間、例えば、閉鎖後２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間、の潰瘍閉鎖の保持；（ｉｖ）潰瘍閉鎖までの時間；（ｖ）対象が静止している間に足首及び腕の血圧を測定し、次に、対象が動いている（例えば、トレッドミルで歩く）間に繰り返される、ＰＡＤの重症度を予測／評価するために使用することができる検査である足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善；（ｖｉ）足首血圧ではなく足趾血圧を使用するＡＢＩに類似した検査である足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善；（ｖｉｉ）経皮酸素、すなわち、潰瘍に近い皮膚の下の組織の酸素レベルの改善（例えば、Ｒｕａｎｇｓｅｔａｋｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，  ２０１０，  １９（５）：２０２−６を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）血液測定用カフ及び手持ち式超音波装置が、腕及び脚の動脈血流量についての情報を得るために使用される非侵襲的血管検査である脈容量記録の改善；（ｉｘ）大切断、例えば、足首の上での切断、までの時間；（ｘ）評価システム：グレード０（潰瘍性病変の前または後）、グレード１（部分／全層潰瘍）、グレード２（腱または被膜に達する）、グレード３（骨髄炎を伴う深部）、グレード４（部分的な足の壊疽）、及びグレード５（全足壊疽）、を使用して、潰瘍の深さ及び骨髄炎または壊疽の存在を評価するＷａｇｎｅｒの評価尺度の改善；（ｘｉ）７つの分類ステージ：ステージ０：無症状、ステージ１：軽度跛行、ステージ２：中等度跛行、ステージ３：高度跛行、ステージ４：安静時疼痛、ステージ５：足指の壊疽を超えない虚血性潰瘍形成、及びステージ６：高度虚血性潰瘍または明らかな壊疽、を有する、末梢動脈疾患のステージングのために使用されるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善：ならびに、（ｘｉｉ）脚の安静時疼痛スコア、０が無痛であり、１０が最大の疼痛を表す疼痛の０〜１０尺度の改善、を含む。
【００５０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍の、生活の質への影響を測定する糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（例えば、Ｂａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  ２００３，  ２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）経時的なニューロパチーの変化を評価するための、変化尺度の患者の全体的印象（例えば、Ｋａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍａｎ．  Ｍａｎｉｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，  １７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；ならびに／または、（ｉｖ）患者の健康状態に対する記述的プロファイル及び単一の指標値を得るために使用される健康質問票であるＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度、で評価される場合の対象の生活の質における検出可能な改善のために十分な量及び時間で、ＤＦＵを有する対象に、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）を投与することを含む。
【００５１】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、注射で投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、胎盤細胞を含むマトリックスまたは足場の対象への移植により治療されている該対象に投与される。
【００５２】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、筋肉内投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、静脈内投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、皮下投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、局所投与される。本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、全身投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０の胎盤細胞の投与を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、または５×１０９〜１×１０１０の胎盤細胞の投与を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０３の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０４の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０５の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０６の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約１×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のＤＦＵの治療方法は、約３×１０７の胎盤細胞の投与を含む。
【００５３】
本明細書に記載のＤＦＵの治療方法の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）は、１週間の投与間隔で筋肉内投与され、例えば、胎盤細胞は１日目（投与の最初の日）に投与され、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）の２回目投与が、１週間後（すなわち、８日目）に投与される。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、１日目及び８日目）の、約３×１０６の胎盤幹細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、１日目及び８日目）の、約１×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日（すなわち、３日目及び８日目）の、約３×１０７の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与される対象は、ＰＡＤを有する。
【００５４】
組織培養プラスチックに接着した、本明細書に記載される方法で使用される胎盤細胞は、例えば、フローサイトメトリーで検出できるようなＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋である。本明細書で提供される方法で使用される胎盤細胞のさらなる特徴は、セクション５．１に記載されている。本明細書で提供される方法で使用されるべき組成物、例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、セクション５．３に記載されている。
【００５５】
５．１  単離胎盤細胞及び単離胎盤細胞集団
本明細書ではＰＤＡＣと称される場合がある、本明細書で提供されるＤＦＵの治療方法に有用である単離胎盤細胞は、胎盤またはその一部から得ることができ、組織培養基質に接着し、多分化能細胞または幹細胞の特徴を有するが、栄養芽細胞ではない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法に有用である単離胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。
【００５６】
本明細書に開示の方法に有用である単離胎盤細胞は、由来が胎児または母体のいずれかであることができる（つまり、それぞれ、胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有することができる）。好ましくは、単離胎盤細胞及び単離胎盤細胞の集団は、由来が胎児である。本明細書で使用される場合、「由来が胎児」または「由来が非母体」という表現は、単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団が、胎児に関連する、すなわち、胎児遺伝子型を有する、臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細書で使用される場合、「由来が母体」という表現は、細胞または細胞の集団が、母親と関連する、例えば、母体遺伝子型を有する、胎盤構造体から得られることを示す。単離胎盤細胞、例えば、ＰＤＡＣまたは単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、胎児若しくは母体単独である単離胎盤細胞を含むことができる、または胎児由来及び母体由来の両方の単離胎盤細胞の混合集団を含むことができる。単離胎盤細胞、及び単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態的特徴、マーカー特徴、及び培養特徴により特定及び選択することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、のいずれも、レシピエント、例えば、ＤＦＵを有する個体、にとって自己由来である。他のある特定の実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、のいずれも、レシピエント、例えば、ＤＦＵを有する個体、にとって異種である。
【００５７】
５．１．１  物理的及び形態的特徴
本明細書に記載の単離胎盤細胞（ＰＤＡＣ）は、初代培養または細胞培養で培養される時、組織培養基質、例えば、培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に、または、ラミニン、コラーゲン（例えば、天然若しくは変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード））などの細胞外マトリックス若しくはリガンドでコーティングされた組織培養表面に、接着する。培養中の単離胎盤細胞は一般に、中心細胞体から延びる多くの細胞質突起を有する、線維芽細胞様星状外観を呈する。しかし、単離胎盤細胞は、線維芽細胞よりも多数のこのような突起を示すので、細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に識別できる。形態学的に、単離胎盤細胞はまた、培養中に、より丸みのある、または丸石の形態を一般に呈する造血幹細胞と識別できる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法に有用である単離胎盤細胞は、成長培地中で培養される時、胚様体様体を発達させる。胚様体様体は、増殖した単離胎盤細胞の接着層の上部で成長することができる細胞の非連続的な塊である。細胞の塊が、胚性幹細胞の培養物から成長する細胞の塊である胚様体に似ているので、「胚様体様」という用語が、使用される。胚様体様体が、単離胎盤細胞の増殖培養物中で発生することができる成長培地は、例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏ製）；２％のウシ胎児血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．製）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍのデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；上皮成長因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）；及び、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、を含む培地を含む。
【００５９】
５．１．２  細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝子マーカー
本明細書の開示の方法、例えば、対象のＤＦＵの治療方法、に有用な単離胎盤細胞、例えば、単離多分化能胎盤細胞または単離胎盤幹細胞、及びこのような単離胎盤細胞の集団は、多分化能細胞または幹細胞の特徴を有する組織培養プラスチック接着ヒト胎盤細胞であり、幹細胞を含む細胞または細胞の集団を特定及び／または単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。ある特定の実施形態では、ＰＤＡＣは、例えば、インビトロまたはインビボの血管新生性である。本明細書に記載の単離胎盤細胞、及び胎盤細胞集団（つまり、２つ以上の単離胎盤細胞）は、胎盤またはそれらの任意の部分（例えば、絨毛膜、胎盤絨毛叢など）から直接得られる胎盤細胞及び胎盤細胞含有細胞集団を含む。単離胎盤細胞集団は、培養中の単離胎盤細胞の複数集団（つまり、２つ以上）、及び容器、例えば、バッグ中の集団も含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、臍帯血、胎盤血、または末梢血から得られる骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、または間葉系細胞ではない。本明細書に記載の方法及び組成物に有用な胎盤細胞、例えば、胎盤多分化能細胞及び胎盤細胞は、本明細書、及び例えば、米国特許第７，３１１，９０４号、同第７，３１１，９０５号、及び同第７，４６８，２７６号、ならびに米国特許公開公報第２００７／０２７５３６２号に記載されており、これらの開示は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤幹細胞である。他のある特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤多分化能細胞である。一実施形態では、単離胎盤細胞、例えば、ＰＤＡＣは、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ３４−、ＣＤ１０＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、及び／または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性がある。別の具体的な実施形態は、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ４５−及びＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋及びＣＤ４５−であり、すなわち、細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋及びＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態は、該ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらに、ＣＤ８０−及びＣＤ８６−である。
【００６１】
ある特定の実施形態では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋、ならびに、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１３３−、ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ−、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＰＤＬ１＋、ＡＢＣ−ｐ＋、及び／またはＯＣＴ−４＋のうちの１つ以上である。他の実施形態では、上記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のいずれもさらに、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋、またはＳＨ４＋のうちの１つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ４４＋である。上記単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれの別の具体的な実施形態でも、細胞はさらに、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、若しくはプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００６２】
別の実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、若しくはプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、及びプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００６３】
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＡＢＣ−ｐ＋、またはＲＴ−ＰＣＲで測定されるようなＯＣＴ−４＋（ＰＯＵ５Ｆ１＋）であり、ＡＢＣ−ｐは、（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）及びミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られている）胎盤特異的ＡＢＣトランスポータータンパク質であり、ＯＣＴ−４は、オクタマー４タンパク質（ＰＯＵ５Ｆ１）である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、フローサイトメトリーで測定されるようなＳＳＥＡ３−またはＳＳＥＡ４−であり、ＳＳＥＡ３は、ステージ特異的胚抗原３であり、ＳＳＥＡ４は、ステージ特異的胚抗原４である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、ＳＳＥＡ３−及びＳＳＥＡ４−である。
【００６４】
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）、またはＨＬＡ−Ｇ−のうちの１つ以上である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）、及びＨＬＡ−Ｇ−のうちの１つ以上である。
【００６５】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な、単離胎盤細胞の集団、または、単離胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団、も本明細書で提供される。単離胎盤細胞を含む細胞の集団が好ましく、細胞の集団が、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ３４−胎盤細胞を含む、つまり、該集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ３４−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、上記単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれも、さらに、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋、またはＳＨ４＋のうちの１つ以上である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞または単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ４４＋である。上記単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれの具体的な実施形態においても、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、若しくはプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、及びプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、及びＡＢＣ−ｐ＋のうちの１つ以上、または全てであり、該単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的及び／または酵素的破壊により得られる。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＣＤ３４−であり、該単離胎盤細胞は、次の特徴のうちの少なくとも１つを有する：ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＣＤ３４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＨ２＋、及びＳＨ３＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＣＤ３４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかであり、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−のうちの少なくとも１つである。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。
【００６７】
別の実施形態では、本明細書に開示の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、及びＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、またはＣＤ４５−である。
【００６８】
別の実施形態では、本明細書に開示の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、及びＳＨ４＋であり、該単離胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−のうちの１つ以上である。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ−である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ２００＋及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、幹細胞または多分化能細胞でない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７０】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−幹細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。具体的な実施形態では、該集団は、胎盤細胞の集団である。種々の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。好ましくは、該細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％は、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。より好ましくは、該細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％は、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。細胞集団の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はまた、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はまた、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はまた、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、及びＣＤ１０５＋である。別の実施形態では、該細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体を生じる。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７１】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋胎盤細胞は、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中で、集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞でない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７２】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の該細胞の少なくとも約７０％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。該集団の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、細胞の該集団は、１つ以上の胚様体様体を生じる。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００７３】
他のある特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＨＬＡ−Ｇ−、またはＡＢＣ−ｐ＋のうちの１つ以上である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、及びＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、及びＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、及びＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、及びＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−である。具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、及びＳＳＥＡ４−胎盤細胞はさらに、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、及びＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋及びＣＤ３４−、ならびにＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４−、及びＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである。
【００７４】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ２００＋及びＯＣＴ−４＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、単離細胞を含む胎盤細胞の集団による１つ以上の胚様体様体の産生を、集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、容易にする。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、該細胞の少なくとも約７０％は、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％は、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。単離集団の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体を生じる。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７６】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋、及びＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞は、該細胞を含む胎盤細胞の集団での胚様体様体の形成を、集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、容易にする。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７７】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約７０％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋、及びＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００７８】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋であり、該ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞を含む単離胎盤細胞の集団での１つ以上の胚様体様体の形成を、該集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、容易にする。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００７９】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋であり、該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該細胞を含む単離胎盤細胞の集団での１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする単離胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約７０％は、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％は、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋、及びＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該細胞を含む単離胎盤細胞の集団での１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００８１】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、ＯＣＴ−４＋であり、該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該細胞を含む単離胎盤細胞の集団での１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする単離胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、該単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約７０％は、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％は、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００８２】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、単離ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、及びＣＤ３４−胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、細胞の該単離集団中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％は、単離ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、及びＣＤ３４−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、及びＣＤ３４−胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該単離集団は、母体成分を実施的に含まない、例えば、胎盤細胞の該単離集団での該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。
【００８３】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−、及びＣＤ１３３−胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％は、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−、及びＣＤ１３３−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、該単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−、及びＣＤ１３３−胎盤細胞は、由来が非母体であり、すなわち、胎児遺伝子型を有する。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該単離集団中の該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００８４】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、及びＣＤ１１７−胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富な、細胞の集団であり、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、及びＣＤ１１７−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００８５】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、及びＣＤ１１７−胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、及びＣＤ１１７−胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富な、細胞の集団であり、該集団中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％は、ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、及びＣＤ１１７−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
【００８６】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、及びＣＤ１３３−であり、さらに、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋及び／若しくはＨＬＡ−Ｇ−であり、かつ／またはＣＤ１１７に対し陰性である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、該集団中の細胞の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または約９９％は、ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、さらに、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００に対して陽性であり、かつ／または、ＣＤ１１７及び／若しくはＨＬＡ−Ｇに対して陰性である単離胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
【００８７】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、抗体結合で決定されるようなＣＤ２００＋及びＣＤ１０＋であり、抗体結合及びＲＴ−ＰＣＲの両方で決定されるようなＣＤ１０＋である単離胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９−、ＣＤ５４＋、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＭＨＣクラスＩ＋、及びβ−２ミクログロブリン＋である単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）場合よりも少なくとも２倍高い、胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、由来が非母体である。
【００８８】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２ミクログロブリンｌｏｗ、ＭＨＣ−Ｉｌｏｗ、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇｌｏｗ、及び／またはＰＤＬ１ｌｏｗのうちの１つ以上である単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、少なくともＣＤ２９＋及びＣＤ５４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、少なくともＣＤ４４＋及びＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、少なくともＣＤ２９＋である。
【００８９】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含み、該細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２ミクログロブリンｄｉｍ、ＨＬＡ−Ｉｄｉｍ、ＨＬＡ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇｄｉｍ、及び／またはＰＤＬ１ｄｉｍのうちの１つ以上である単離胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２ミクログロブリンｄｉｍ、ＭＨＣ−Ｉｄｉｍ、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇｄｉｍ、及びＰＤＬ１ｄｉｍである。
【００９０】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、及びＡＢＣ−ｐ＋のうちの１つ以上または全てである単離胎盤細胞であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的ＡＢＣトランスポータータンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）及びミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られている）であり、該単離胎盤細胞は、残留血液を除去するために、臍帯血を排出され、灌流されている哺乳動物の胎盤、例えば、ヒト胎盤、の灌流により得られる。
【００９１】
上記特徴のいずれの別の具体的な実施形態でも、細胞マーカー（例えば、分化抗原群または免疫原性マーカー）の発現は、フローサイトメトリーで決定され；別の具体的な実施形態では、マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲで決定される。
【００９２】
遺伝子プロファイリングにより、単離胎盤細胞、及び単離胎盤細胞の集団は、他の細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞、と識別できることが確認される。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、例えば、１つ以上の遺伝子の発現を基準にして、間葉系幹細胞と識別することができ、これらの発現は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、単離胎盤細胞において、またはある特定の単離臍帯幹細胞において有意に高い。特に、本明細書で提供される治療の方法に有用な単離胎盤細胞は、１つ以上の遺伝子の発現を基準にして、間葉系幹細胞と識別することができ、これらの発現は、細胞が、同等の条件で成長する時、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも、単離胎盤細胞において有意に高く（つまり、少なくとも２倍高く）、１つ以上の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、または上述のもののいずれかの組み合わせである。例えば、米国特許公開公報第２００７／０２７５３６２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ある特定の具体的な実施形態では、該１つ以上の遺伝子の該発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは例えば、Ｕ１３３−Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用したマイクロアレイ分析で決定される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏ製）；２％のウシ胎児血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．製）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍのデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；上皮成長因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）；及び、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を含む培地で、多くの集団倍加、例えば、約３〜約３５の範囲の集団倍加のために培養される時、該１つ以上の遺伝子を発現する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞特異的または単離臍帯細胞特異的遺伝子は、ＣＤ２００である。
【００９３】
これらの遺伝子に対する特異的配列は、２００８年３月の時点で、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬＴ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１ｏｒｆ９）、ＢＣ０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、ＡＦ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（ＥＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（ＩＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）ＫＲＴ１８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、ＢＣ００５０４６（ＶＴＮ）、及びＢＣ００５００１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）に見出すことができる。
【００９４】
特定の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、細胞が、同等の条件で成長する時、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、及びＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを発現する。
【００９５】
具体的な実施形態では、胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）よりも検出可能に高いレベルで、ＣＤ２００及びＡＲＴＳ１（１型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ制御因子）；ＡＲＴＳ−１及びＬＲＡＰ（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；ＩＬ６（インターロイキン−６）及びＴＧＦＢ２（トランスフォーミング成長因子−β２）；ＩＬ６及びＫＲＴ１８（ケラチン１８）；ＩＥＲ３（即時初期応答３）、ＭＥＳＴ（中胚葉特異的転写ホモログ）及びＴＧＦＢ２；ＣＤ２００及びＩＥＲ３；ＣＤ２００及びＩＬ６；ＣＤ２００及びＫＲＴ１８；ＣＤ２００及びＬＲＡＰ；ＣＤ２００及びＭＥＳＴ；ＣＤ２００及びＮＦＥ２Ｌ３（核因子（赤血球由来２）様３）；またはＣＤ２００及びＴＧＦＢ２を発現する。該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離胎盤細胞が経ている継代数と同等の、培養での継代数を経ている。他の具体的な実施形態では、胎盤細胞は、ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＬ６及びＬＲＡＰ；ＡＲＴＳ−１、ＩＬ６、ＴＧＦＢ２、ＩＥＲ３、ＫＲＴ１８、及びＭＥＳＴ；ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、及びＴＧＦＢ２；ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、及びＴＧＦＢ２；またはＩＥＲ３、ＭＥＳＴ及びＴＧＦＢ２を発現する。同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルＢＭ−ＭＳＣで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離胎盤細胞が経ている継代数と同等の、培養での継代数を経ている。
【００９６】
上記参照の遺伝子の発現は、標準的な技術で評価することができる。例えば、遺伝子（複数可）の配列を基準にしたプローブは個別に、従来技術により選択及び構築することができる。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子のうちの１つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  ２．０  ａｒｒａｙ、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０（カリフォルニア州サンタクララ）で評価することができる。特定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に対する配列が補正される場合でも、補正された配列に特異的なプローブが、周知の標準的な技術を使用して、容易に生成することができるので、これらの遺伝子の発現は評価することができる。
【００９７】
これらの遺伝子の発現のレベルは、単離胎盤細胞の集団の識別を確認するため、少なくとも複数の単離胎盤細胞を含む細胞の集団を特定するためなど、使用することができる。識別が確認された単離胎盤細胞の集団は、クローン性、例えば、本明細書に記載されるような、単一の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、例えば、複数の単離胎盤細胞をから拡大した単独の単離胎盤細胞を含む細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団、及び少なくとも１つの他の種類の細胞であることができる。
【００９８】
これらの遺伝子の発現のレベルは、単離胎盤細胞の集団を選択するために使用することができる。例えば、細胞の集団、例えば、クローン拡大細胞は、上記遺伝子のうちの１つ以上の発現が、間葉系幹細胞の同等の集団においてよりも、細胞の集団由来の試料において有意に高い場合、選択されてもよい。このような選択は、複数の単離胎盤細胞集団由来、複数の細胞集団（識別が不明）由来などの集団の選択とすることができる。
【００９９】
単離胎盤細胞は、例えば、１つ以上のこのような遺伝子の発現の、間葉系幹細胞対照における該１つ以上の遺伝子における発現のレベルと比較した、レベル、例えば、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞中の該１つ以上の遺伝子における発現のレベル、を基準にして選択することができる。一実施形態では、同等数の間葉系幹細胞を含む試料における該１つ以上の遺伝子の発現のレベルが、対照として使用される。別の実施形態では、特定の条件下で試験される単離胎盤細胞に対する対照は、該条件下の間葉系幹細胞における該１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に有用な胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ）は、４〜２１日間、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦに曝露した後、免疫局在法で検出されるようなＣＤ３４を発現しない。ある特定の実施形態では、該胎盤接着細胞は、組織培養プラスチックに接着している。別の具体的な実施形態では、細胞の該集団は、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質上、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で培養される時、内皮細胞が新芽または管腔様構造を形成するように誘導する。
【０１０１】
別の態様では、細胞の集団である本明細書で提供されるＰＤＡＣ、例えば、ＰＤＡＣの集団、または細胞の該単離集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９８％がＰＤＡＣである細胞の集団は、細胞（複数可）が成長する培地に、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、またはガレクチン−１のうちの１つ以上または全てを分泌する。別の実施形態では、ＰＤＡＣは、正常酸素条件下（例えば、約２０％または約２１％の０２）と比較して、低酸素条件下（例えば、約５％未満のＯ２）で、増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、及び／またはＶＥＧＦを発現する。
【０１０２】
別の実施形態では、本明細書に記載のＰＤＡＣまたはＰＤＡＣを含む細胞の集団のいずれも、該胎盤由来接着細胞と接触して、内皮細胞の集団における新芽または管腔様構造の形成を引き起こすことができる。具体的な実施形態では、ＰＤＡＣは、例えば、少なくとも４日間、胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質中またはこれ上に、例えば、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに／または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、若しくは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で培養された時、新芽若しくは管腔様構造を形成する、または内皮細胞の新芽の形成をサポートするヒト内皮細胞と共培養される。別の実施形態では、本明細書に記載の胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団のいずれも、例えば、胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質中またはこれ上に、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質の存在下で培養される時、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）などの血管新生因子を分泌し、それにより、ヒト内皮細胞が新芽または管腔様構造を形成するように誘導することができる。
【０１０３】
別の実施形態では、胎盤由来接着細胞（ＰＤＡＣ）を含む細胞の上記集団のいずれかは、血管新生因子を分泌する。具体的な実施形態では、細胞の集団は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び／またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌する。他の具体的な実施形態では、ＰＤＡＣを含む細胞の集団は、１つ以上の血管新生因子を分泌し、それにより、ヒト内皮細胞が、インビトロ創傷治癒アッセイにおいて、遊走するように誘導する。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、または筋芽細胞の成熟、分化、または増殖を誘導する。
【０１０４】
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、初代培養中に、または例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）；２％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）；１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）；上皮成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１００Ｕのペニシリン／１０００Ｕのストレプトマイシンを含む培地で増殖中に、上記特徴（例えば、細胞表面マーカー及び／または遺伝子発現プロファイルの組み合わせ）を示す。
【０１０５】
本明細書に開示の胎盤細胞のいずれかのある特定の実施形態では、細胞は、ヒトである。本明細書に開示の胎盤細胞のいずれかのある特定の実施形態では、細胞マーカー特徴または遺伝子発現特徴は、ヒトマーカーまたはヒト遺伝子である。
【０１０６】
該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、該細胞または集団は、拡大しており、例えば、少なくとも、約、若しくは多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０倍以上継代されている、または、少なくとも、約、若しくは多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０の集団倍加のために増殖されている。該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、該細胞または集団は、初代分離株である。本明細書に開示の単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が胎児である（つまり、胎児遺伝子型を有する）。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、該単離胎盤細胞は、成長培地、すなわち、増殖を促進するために製剤化された培地中での培養中に、例えば、成長培地での増殖中に、分化しない。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、フィーダー層の不存在下での培養中に、分化しない。それは、単にフィーダー細胞層がないためである。
【０１０８】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞は、単離胎盤細胞であり、複数の該単離胎盤細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価される場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に対し陽性である。このようなアッセイは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｂｏｓｔｉａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｔｔｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  １７３，  ７８７，  （１９７８）を参照のこと）。ある特定の実施形態では、該アッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとして、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ，  Ｉｎｃ、オレゴン州アッシュランド）を使用する。ある特定の実施形態では、該複数は、細胞の該集団中の細胞の約３％及び２５％の間にある。別の実施形態では、単離臍帯細胞、例えば、多分化能単離臍帯細胞、の集団が、本明細書で提供され、複数の該単離臍帯細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標としてＡｌｄｅｆｌｕｏ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価される場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼに対し陽性である。具体的な実施形態では、該複数は、細胞の該集団中の細胞の約３％及び２５％の間にある。別の実施形態では、単離胎盤細胞の該集団または単離臍帯細胞は、ほぼ同じ数の細胞を有し、かつ同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも少なくとも３倍、または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
【０１０９】
本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかのある特定の実施形態では、細胞の該集団中の胎盤細胞は、母体遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、該集団中の胎盤細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、胎児遺伝子型を有する。本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの他のある特定の実施形態では、該胎盤細胞を含む細胞の集団は、母体遺伝子型を有する細胞を実施的に含まず、例えば、該集団中の細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、胎児遺伝子型を有する。
【０１１０】
上記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の細胞集団のいずれかのある特定の実施形態では、細胞または該集団の細胞の少なくとも約９５％または約９９％の核型は、正常である。上記胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞または細胞の集団中の細胞は、由来が非母体である。
【０１１１】
マーカーの上記組み合わせのいずれかを持つ単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、任意の比率で組み合わせることができる。上記単離胎盤細胞集団のうちの任意の２つ以上は、単離胎盤細胞集団を形成するために組み合わせることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、上記マーカーの組み合わせのうちの１つにより規定される単離胎盤細胞の第１の集団、及びマーカーの組み合わせのうちの別のものにより規定される単離胎盤細胞の第２の集団を含むことができ、該第１及び第２の集団は、約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、または約９９：１の比率で組み合わされる。同様に、上記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞集団のうちの任意の３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を、組み合わせることができる。
【０１１２】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、例えば、酵素消化を用いるまたは用いない胎盤組織の破壊（セクション５．２．３を参照のこと）、または灌流（セクション５．２．４を参照のこと）により得ることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、臍帯血を排出され、残りの血液を除去するために灌流されている哺乳動物胎盤を灌流すること；該胎盤に灌流液を灌流すること；及び該灌流液を収集すること（灌流後の該灌流液は、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含む）；ならびに、細胞の該集団から、複数の該単離胎盤細胞を単離することを含む方法に従って産生することができる。具体的な実施形態では、灌流液は、臍静脈及び臍動脈の両方を通過し、胎盤から滲出した後に収集される。別の具体的な実施形態では、灌流液は、臍静脈を通過して、臍動脈から収集され、または臍動脈を通過して、臍静脈から収集される。
【０１１３】
種々の実施形態では、胎盤の灌流から得られる細胞の集団内に含有される単離胎盤細胞は、胎盤細胞の該集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態では、灌流により収集される単離胎盤細胞は、胎児及び母体細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流により収集される単離胎盤細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または少なくとも９９．５％の胎児細胞である。
【０１１４】
別の具体的な実施形態では、灌流により収集される本明細書に記載されるような単離胎盤細胞の集団を含む組成物が、本明細書で提供され、該組成物は、単離胎盤細胞を収集するために使用される灌流液の少なくとも一部を含む。
【０１１５】
本明細書に記載の単離胎盤細胞の単離集団は、細胞を含む胎盤細胞の集団を得るために、組織破壊酵素で胎盤細胞を消化すること、及び該胎盤細胞の残部から、複数の胎盤細胞を単離すること、または実質的に単離すること、により産生することができる。胎盤全体、またはその任意の部分を、本明細書に記載の単離胎盤細胞を得るために、消化することができる。具体的な実施形態では、例えば、該胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊膜及び絨毛膜の組み合わせ、または上述のもののいずれかの組み合わせであることができる。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素は、トリプシンまたはコラゲナーゼである。種々の実施形態では、胎盤を消化することにより得られる細胞の集団内に含有される単離胎盤細胞は、胎盤細胞の該集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または少なくとも９９．５％である。
上記胎盤細胞の単離集団、及び単離胎盤細胞の集団は一般に、（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約、少なくとも、若しくは多くとも１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、若しくは１×１０１０単離胎盤細胞、または（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として）約１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、若しくは５×１０９〜１×１０１０の単離胎盤細胞を含むことができる。本明細書に記載の治療方法に有用な単離胎盤細胞の集団は、例えば、トリパンブルー排除法で、例えば、決定される場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生存可能な単離胎盤細胞を含む。
【０１１６】
５．２  単離胎盤細胞を得る方法
５．２．１  幹細胞収集組成物
胎盤細胞、例えば、上記セクション５．１に記載の単離胎盤細胞、を収集及び単離する方法が、さらに本明細書で提供される。一般に、そのような細胞は、生理学的に許容される溶液、例えば、細胞収集組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる。例示的細胞収集組成物は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」という名称の米国特許公開公報第２００７／０１９００４２号で詳細に記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
細胞収集組成物は、細胞、例えば、本明細書に記載の単離胎盤細胞、の収集及び／または培養に適する任意の生理学的に許容される溶液、例えば、食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブス液、変性クレブス液、イーグル液、０．９％のＮａＣｌなど）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）、などを含むことができる。
【０１１８】
細胞収集組成物は、収集時から培養時まで、単離胎盤細胞を保存するのに役立つ、つまり、単離胎盤細胞が死滅するのを防ぐ、または単離胎盤細胞の死滅を遅延させる、死滅する細胞の集団中の単離胎盤細胞の数を低減させるなどの傾向を有する、１つ以上の構成成分を含むことができる。そのような構成成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤、若しくはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬薬物、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン、若しくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、若しくはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；及び／または酸素含有ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であることができる。
【０１１９】
細胞収集組成物は、１つ以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅなどを含むことができる。そのような酵素は、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、ヒアルロニダーゼなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
細胞収集組成物は、殺菌的または静菌的有効量の抗生物質を含むことができる。ある特定の非限定的実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフェキシム、またはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム陽性及び／またはグラム陰性細菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどに対し活性がある。一実施形態では、抗生物質は、ゲンタマイシン、例えば、培地中約０．００５％〜約０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１２１】
細胞収集組成物は、次の化合物のうちの１つ以上を含むこともできる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態では、内皮完全性及び細胞生存率を維持するのに十分な量で存在する２０，０００ダルトンを超える分子量の巨大分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する合成若しくは天然コロイド、デキストランなどの多糖類、またはポリエチレングリコール）；酸化防止剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣ、またはビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；カルシウムが細胞に侵入するのを妨げる薬剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態では、抗は、残留血液の凝固を防ぐことに役立つのに十分な量で存在する、抗凝固剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）；あるいは、アミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、またはイソブチルアミロライド）。
【０１２２】
５．２．２  胎盤の収集及び取り扱い
一般に、ヒト胎盤は、出生後のそれの娩出後に、すぐに回収される。好ましい実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセント後に、かつ患者の完全な病歴が取られ、胎盤に関連づけられた後に、患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後に継続する。そのような病歴は、胎盤またはそこから採取された単離胎盤細胞の後続の使用を調整するために使用することができる。例えば、単離ヒト胎盤細胞は、胎盤と関連する幼児、または幼児の親、兄弟、若しくは他の親族の個別化医療のために、病歴に照らして使用することができる。
【０１２３】
単離胎盤細胞の回収に前に、臍帯血及び胎盤血は、好ましくは除去される。ある特定の実施形態では、分娩後に、胎盤の臍帯血は、回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収プロセスに付すことができる。通常は、胎盤を瀉血するために、重力を用いて、針またはカニューレが使用される（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照のこと）。針またはカニューレは通常、臍静脈中に入れられ、胎盤は、臍帯血を胎盤から排出させるのを助けるために、やさしくマッサージすることができる。そのような臍帯血回収は、商業的に、例えばＬｉｆｅＢａｎｋ  ＵＳＡ、ニュージャージー州シーダーノールズで、実施されてもよい。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収中の組織破壊を最小限に抑えるために、さらなる操作なしに重力で排出される。
【０１２４】
通常、胎盤は、例えば、灌流または組織解離により、臍帯血の回収及び幹細胞の収集のために、分娩または出産室から別の場所、例えば、研究室に輸送される。胎盤は好ましくは、例えば、滅菌ジップロックプラスチックバッグに、隣接する臍帯を固定して胎盤を入れて、次に、断熱容器に入れることにより、（胎盤の温度を２０〜２８℃に維持する）滅菌断熱輸送装置中で輸送される。別の実施形態では、胎盤は、係属中の米国特許第７，１４７，６２６号（この開示は、本明細書に参照により組み込まれる）に実質的に記載されるような臍帯血収集キット中で、輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の４〜２４時間後に、研究室に送達される。ある特定の実施形態では、隣接する臍帯は、好ましくは、臍帯血の回収前に、胎盤ディスクへの付着点の４〜５ｃｍ（センチメートル）の範囲内に固定される。他の実施形態では、隣接する臍帯は、臍帯血回収後であるが、胎盤のさらなる処理前に、固定される。
【０１２５】
胎盤は、細胞収集前に、滅菌条件で、室温または５℃〜２５℃の温度のいずれかで保存することができる。胎盤は、任意の残留臍帯血を除去するために、胎盤を灌流する前に、４〜２４時間の間、多くとも４８時間、または４８時間を超えて保存されてもよい。一実施形態では、胎盤は、娩出の約０時間後〜約２時間後の間に採取される。胎盤は好ましくは、５℃〜２５℃の温度で、抗凝固剤溶液中で保存される。好適な抗凝固剤溶液は、当該技術分野において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液が使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固剤溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、１：１０００溶液中１％（ｗ／ｗ））を含む。瀉血された胎盤は好ましくは、胎盤細胞を収集する前の多くとも３６時間の間保存される。
【０１２６】
一旦収集されて上記のように一般に調製された哺乳動物胎盤またはその部分は、単離胎盤細胞を得るために、技術分野に既知の任意の仕方で処理することができ、例えば、灌流または破壊でき、例えば、１つ以上の組織破壊酵素で消化することができる。
【０１２７】
５．２．３  胎盤組織の物理的破壊及び酵素消化
一実施形態では、幹細胞は、器官の部分または全部の物理的破壊により、哺乳動物胎盤から収集される。例えば、胎盤またはその部分は、例えば、粉砕、剪断、細かく刻む、ダイスカット、チョップ、細かく砕くなどしてもよい。次に、組織は、単離胎盤細胞の集団を得るために培養することができる。通常、胎盤組織は、例えば、培地、食塩水、または幹細胞収集を使用して破壊される。
【０１２８】
胎盤は、物理的破壊及び／または酵素消化ならびに幹細胞回収前に、構成部分に切るすることができる。単離胎盤細胞は、完全な胎盤からを含む、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤絨毛叢、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部から得ることができる。好ましくは、単離胎盤細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。通常、単離胎盤細胞は、胎盤組織の小さなブロックの破壊により得ることができ、例えば、胎盤組織のブロックは、体積が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または約１０００立方ミリメートルである。物理的破壊の任意の方法を使用することができるが、但し、破壊方法は、例えば、トリパンブルー排除法で決定して、生存可能な該器官中の細胞の多数、より好ましくは大半、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を残すことを条件とする。
【０１２９】
単離接着胎盤細胞は一般に、娩出の最初の約３日後以内の任意の時であるが、好ましくは、娩出の約８時間後及び約１８時間後の間に、胎盤またはその部分から収集することができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、破壊された組織は、単離胎盤細胞の増殖に適する組織培地で培養される。
【０１３１】
別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的破壊により収集され、物理的破壊は、１つ以上の組織消化酵素の使用により達成することができる酵素消化を含む。胎盤またはその部分はまた、物理的に破壊されて、１つ以上の酵素で消化されてもよく、次に、得られる材料は、細胞収集組成物に浸漬される、またはこれに混合される。
【０１３２】
好ましい細胞収集組成物は、１つ以上の組織破壊酵素（複数可）を含む。胎盤組織を破壊するために使用することができる酵素は、パパイン；デオキシリボヌクレアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはエラスターゼなどのセリンプロテアーゼ、を含む。セリンプロテアーゼは、血清中のα２ミクログロブリンにより阻害され得る、それ故、消化に使用される培地は通常、無血清である。ＥＤＴＡ及びＤＮａｓｅが一般に、細胞回収の効率を増加させるために、酵素消化手順で使用される。消化液は好ましくは、粘性のある消化物内の細胞を捕捉するのを回避するために、希釈される。
【０１３３】
組織消化酵素の任意の組み合わせが使用することができる。トリプシンを使用した消化に対する代表的な濃度は、０．１％〜約２％のトリプシン、例えば、約０．２５％のトリプシンを含む。プロテアーゼの組み合わせ、つまり、同じ消化反応において２つ以上のプロテアーゼを使用することができる、または、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及び胎盤多分化能細胞を遊離させるため順次使用することができる。例えば、一実施形態では、胎盤またはその部分は、例えば、３０分間、約１〜約２ｍｇ／ｍｌの適切な量のコラゲナーゼＩでまず消化され、続いて、例えば、３７℃で１０分間、約０．２５％の濃度のトリプシンで消化される。セリンプロテアーゼは好ましくは、他の酵素の使用後に、連続して使用される。
【０１３４】
別の実施形態では、組織は、幹細胞を含む幹細胞収集組成物に、または、幹細胞が幹細胞収集組成物で単離される前に組織が破壊及び／若しくは消化される溶液に、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することにより、さらに破壊することができる。
【０１３５】
消化後、消化物は、例えば、培地で３回洗浄され、洗浄された細胞は、培養フラスコに播種される。次に、細胞は、特異な接着により単離され、例えば、生存率、細胞表面マーカー、分化などに対し特徴付けられる。
【０１３６】
胎盤全体または胎盤の部分が、胎児及び母体細胞の両方を含む場合（例えば、胎盤の部分が、絨毛膜または絨毛叢を含む場合）、単離された胎盤細胞は、胎児源及び母体源の両方に由来する胎盤細胞の混合物を含み得ることが理解されるであろう。胎盤の部分（例えば、羊膜）が、母体細胞を含まない、またはこれを無視できる数を含む場合、そこから単離された胎盤細胞は、ほとんど排他的に胎児胎盤細胞を含むことになる（つまり、胎盤細胞は、胎児の遺伝子型を有する）。
【０１３７】
胎盤細胞、例えば、上記セクション５．１に記載されている胎盤細胞は、特異なトリプシン処理（下記セクション５．２．５を参照のこと）、続いて、新しい増殖培地の１つ以上の新しい培養容器中での培養、任意に続いて、第２の特異なトリプシン処理により、破壊された胎盤組織から単離することができる。
【０１３８】
５．２．４  胎盤灌流
胎盤細胞、例えば、上記セクション５．１に記載されている胎盤細胞は、哺乳動物胎盤の灌流により得ることもできる。胎盤細胞を得るために哺乳動物胎盤に灌流する方法は、例えば、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１４８号及び同第７，２５５，７２９号、米国特許公開公報第２００７／０２７５３６２号及び同第２００７／０１９００４２号に開示されており、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
胎盤細胞は、例えば、灌流液として細胞収集組成物を使用する、例えば、胎盤脈管構造中の灌流により収集することができる。一実施形態では、哺乳動物胎盤は、臍動脈及び臍静脈の一方またはその両方を灌流液が通過することにより灌流される。灌流液の胎盤を通る流れは、例えば、胎盤への重力流を使用して達成されてもよい。好ましくは、灌流液は、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを使用して、胎盤を強制的に通過させる。臍静脈は、例えば、滅菌チューブなどの滅菌接続器具に接続されているカニューレ、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレ、をカニューレ挿入することができる。滅菌接続器具は、灌流マニホールドに接続されている。
【０１４０】
灌流の準備では、胎盤は好ましくは、臍動脈及び臍静脈が、胎盤の最高点に位置するように配置される（例えば、吊される）。胎盤は、灌流液の、胎盤脈管構造及び周囲組織中の通過により灌流することができる。胎盤は、灌流液の臍静脈への通過及び臍動脈からの収集、または、灌流液の臍動脈への通過及び臍動脈からの収集により、灌流することもできる。
【０１４１】
一実施形態では、例えば、臍動脈及び臍静脈は、例えば、可撓性コネクタを介して灌流液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続される。灌流液は、臍静脈及び動脈を通過する。灌流液は、胎盤の周囲の組織へ、血管の壁から滲出し、及び／またはこれらを通過し、妊娠中の母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集される。灌流液はまた、臍帯開口部を通して導入されてもよく、母体の子宮壁と接続される胎盤の壁の開口部から流出または浸出させてもよい。「ｐａｎ」法と称することができる本方法により収集される胎盤細胞は通常は、胎児及び母体細胞の混合物である。
【０１４２】
別の実施形態では、灌流液は、臍静脈を通過して、臍動脈から収集される、または、臍動脈を通過して、臍静脈から収集される。「閉回路」法と称することができる本方法により収集される胎盤細胞は通常、ほとんど排他的に胎児である。
【０１４３】
ｐａｎ法を使用する灌流は、つまり、それにより、灌流液が、胎盤の母体側から滲出した後に、収集されるが、胎児及び母体細胞の混合物をもたらすことが理解されるであろう。その結果、本方法により収集された細胞は、由来が胎児及び母体の両方の胎盤細胞の混合集団、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含むことができる。対照的に、閉回路法における胎盤脈管構造単独での灌流は、それにより、灌流液が、１つまたは２つの胎盤血管を通過し、残りの血管（複数可）単独で収集されるが、ほぼ排他的に胎児由来である胎盤細胞の集団の収集をもたらす。
【０１４４】
一実施形態では、閉回路灌流法は、次の通り実施することができる。分娩後の胎盤は、出生後の約４８時間内に得られる。臍帯は、固定され、クランプの上で切断される。臍帯は、廃棄することができる、または、例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び／若しくは生体材料の製造のために臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜は、灌流の間保持することができる、または例えば、指での鈍的切開を使用して、絨毛膜から分離することができる。羊膜は、灌流前に絨毛膜から分離される場合、例えば、廃棄することができ、または例えば、酵素消化により幹細胞を得るために、若しくは例えば、羊膜生体材料、例えば、米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号（この開示はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載の生体材料を製造するために、処理することができる。例えば、滅菌ガーゼを使用して、全ての目に見える凝血塊及び残留血液のある胎盤を清浄した後、臍帯血管は、例えば、臍帯の断面を露出させるために、臍帯膜を部分的に切断することにより、露出する。血管は、識別され、例えば、各血管の切断端を通って、閉じたアリゲータークランプを進めることにより開かれる。次に、器具、例えば、灌流装置または蠕動ポンプに接続されているプラスチックチューブは、胎盤動脈のそれぞれに挿入される。ポンプは、目的に適する任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであることができる。次に、滅菌収集リザーバ、例えば、２５０ｍＬの収集バッグなどの血液バッグに接続されているプラスチックチューブが、胎盤静脈に挿入される。あるいは、ポンプに接続されているチューブは、胎盤静脈に挿入され、収集リザーバ（複数可）へのチューブは、胎盤動脈の一方または両方に挿入される。次に、胎盤は、ある体積の灌流液、例えば、約７５０ｍｌの灌流液、で灌流される。次に、灌流液中の細胞は、例えば、遠心分離により収集される。ある特定の実施形態では、胎盤は、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及び／または胎盤多分化能細胞、を収集するための灌流前に、残留血液を除去するために、灌流液、例えば、１００〜３００ｍＬの灌流液、で灌流される。別の実施形態では、胎盤は、胎盤細胞を収集するための灌流前に、残留血液を除去するために灌流液で灌流されない。
【０１４５】
一実施形態では、隣接する臍帯は、灌流中固定され、より好ましくは、臍帯の胎盤ディスクへの付着点の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定される。
【０１４６】
瀉血プロセス中の哺乳動物胎盤からの灌流液の最初の収集は一般に、臍帯血及び／または胎盤血の残留赤血球で色を帯びる。灌流液は、灌流プロセス時に無色になり、残留臍帯血細胞は、胎盤から洗い流される。一般に、３０〜１００ｍｌ（ミリリットル）の灌流液は、胎盤を最初に瀉血するのに適切であるが、幾分灌流液は、観察された結果に応じて使用されてもよい。
【０１４７】
胎盤細胞を単離するのに使用される灌流液の量は、収集されるべき細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤からなされるべき収集の数などに応じて変化し得る。種々の実施形態では、灌流液の体積は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってよい。通常、胎盤は、瀉血後に、７００〜８００ｍＬの灌流液で灌流される。
【０１４８】
胎盤は、数時間または数日間にわたって複数回灌流することができる。胎盤が複数回灌流される場合、胎盤は、容器または他の好適な容器中、無菌条件下で維持または培養されて、細抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を用いてまたは用いずに、及び／または、抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌ）などの抗生物質）を用いてまたは用いずに、胞収集組成物または標準的な灌流液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）などの生理食塩水）で灌流されてもよい。一実施形態では、胎盤が、灌流及び灌流液の収集の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間前、または、２若しくは３日間、またはそれ以上前に、維持または培養されるように、単離胎盤は、灌流液を収集することなしに、しばらくの間維持または培養される。灌流された胎盤は、１以上のさらなる時間（複数可）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれ以上の時間で維持することができ、２回目、例えば、７００〜８００ｍＬの灌流液で灌流することができる。胎盤は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の回数、例えば、１、２、３、４、５、または６時間ごとに１回、灌流することができる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流及び灌流液、例えば、細胞収集組成物の収集は、回収された有核細胞が１００細胞／ｍｌより低くなるまで繰り返される。異なる時点での灌流液は、細胞、例えば、幹細胞、の時間依存的な集団を回収するために、個別にさらに処理することができる。異なる時点からの灌流液は、プールすることもできる。好ましい実施形態では、胎盤細胞は、娩出後約８時間及び約１８時間の間に１回または何回も、収集される。
【０１４９】
灌流は、好ましくは、該溶液で灌流されていない、かつ（例えば、組織破壊、例えば、酵素消化により）胎盤細胞を得るために別途処理されていない哺乳動物胎盤から得ることができる数よりも有意に多い胎盤細胞の収集をもたらす。本文脈中、「有意に多い」は、少なくとも１０％多いことを意味する。灌流は、例えば、胎盤またはその部分が培養されている培地から単離できる胎盤細胞の数よりも、有意に多い胎盤細胞を生じる。
【０１５０】
胎盤細胞は、１つ以上のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素を含む溶液で灌流により胎盤から単離することができる。ある特定の実施形態では、胎盤若しくはその部分（例えば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉若しくは子葉、臍帯、または上述のいずれかの組み合わせ）は、２５〜３７℃にされ、３０分間、２００ｍＬの培地で、１つ以上の組織破壊酵素とインキュベーションされる。灌流液からの細胞は、収集され、４℃にされ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、及び２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む冷阻害剤混合物で洗浄される。胎盤細胞は、冷（例えば、４℃）幹細胞収集組成物で数分後に洗浄される。
【０１５１】
５．２．５  胎盤細胞の単離、選別、及び特徴づけ
単離胎盤細胞、例えば、上記セクション５．１に記載されている細胞は、灌流または物理的破壊、例えば、酵素消化により得られたものであれ、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により、他の細胞から最初に精製（すなわち、単離）することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度などについて、任意の標準プロトコールに従うことができる。一実施形態では、例えば、胎盤から収集された細胞は、例えば、汚染屑及び血小板から細胞を分離する、１５分間５０００×ｇの遠心分離により、灌流液から回収される。別の実施形態では、胎盤灌流液は、約２００ｍｌまで濃縮され、Ｆｉｃｏｌｌ上に静かに層状にされ、２２℃で２０分間約１１００×ｇで遠心分離され、細胞の低密度界面層は、さらなる処理のために収集される。
【０１５２】
細胞ペレットは、新しい幹細胞収集組成物または細胞維持、例えば、幹細胞維持、に適した培地、例えば、２Ｕ／ｍｌのヘパリン及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ニューヨーク）中に再懸濁することができる。全単核細胞画分は、製造者の推奨手順に従って、例えば、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａノルウェー・オスロ）を使用して単離することができる。
【０１５３】
灌流または消化により得られた胎盤細胞は、例えば、０．０５％のトリプシンの０．２％のＥＤＴＡとの溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、例えば、さらにまたは最初に分別的トリプシン処理により単離することができる。分別的トリプシン処理は、組織培養プラスチック接着性がある単離胎盤細胞は通常、約５分以内にプラスチック表面から離れるので、可能であるが、他の接着集団は通常、２０〜３０分を超えるのインキュベーションを必要とする。離れた胎盤細胞は、例えば、トリプシン中和溶液（ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用して、トリプシン処理及びトリプシン中和後に、採取することができる。接着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約５〜１０×１０６細胞のアリコートは、いくつかのＴ−７５フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンでコーティングされたＴ７５フラスコ、のそれぞれに入れる。そのよう実施形態では、細胞は、市販のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）と培養でき、組織培養インキュベーター（３７℃、５％のＣＯ２）に入れることができる。１０〜１５日後、非接着細胞は、ＰＢＳで洗浄することにより、フラスコから除去される。次に、ＰＢＳは、ＭＳＣＧＭと交換される。フラスコは好ましくは、種々の接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞様細胞のクラスタの特定及び拡大について、毎日試験される。
【０１５４】
哺乳動物胎盤から収集される細胞の数及び種類は、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体で染色する）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの標準細胞検出技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学若しくは共焦点顕微鏡を使用した細胞の形態の試験により、ならびに／または、ＰＣＲ及び遺伝子発現プロファイルなどの当該技術分野において周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することにより、監視することができる。これらの技術は、１つ以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を特定するために、使用することもできる。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、細胞が、検出可能な量のＣＤ３４を含むかどうかを、上記の技術を使用して判定することができ、そうであれば、細胞は、ＣＤ３４＋である。同様に、細胞が、ＲＴ−ＰＣＲにより検出できることに十分なＯＣＴ−４、または成体細胞よりも有意に多いＯＣＴ−４を産生する場合、細胞は、ＯＣＴ−４＋である。細胞表面マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）及びＯＣＴ−４などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当該技術分野で周知である。
【０１５５】
胎盤細胞、特に、Ｆｉｃｏｌｌ分離、分別的接着、または両方の組み合わせにより単離されている細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して選別されてもよい。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ，  １９８７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５１：１５０−１６５）。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起は、混合物からの正及び負の粒子の電磁気的分離を可能にする小さな電荷をもたらす。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドは、明確な蛍光標識で標識される。細胞は、使用される抗体に結合する能力に基づいて、細胞の分離を可能にする細胞選別機により処理される。ＦＡＣＳで選別された粒子は、分離及びクローニングを容易にするために、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接沈着されてもよい。
【０１５６】
１つの選別スキームでは、胎盤からの細胞、例えば、ＰＤＡＣは、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４、及び／またはＨＬＡ−Ｇのうちの１つ以上の発現に基づいて選別される。これは、培養中の接着特性に基づいて、このような細胞を選択するための手順に関連して達成することができる。例えば、組織培養プラスチック接着選択は、マーカー発現に基づく選別の前後で達成することができる。一実施形態では、例えば、細胞は、ＣＤ３４の発現に基づいて最初に選別され、ＣＤ３４−細胞が保持され、さらにＣＤ２００＋及びＨＬＡ−Ｇ−であるＣＤ３４−が、他の全てのＣＤ３４−細胞から分離される。別の実施形態では、胎盤からの細胞は、マーカーＣＤ２００及び／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別され、例えば、ＣＤ２００を示し、かつＨＬＡ−Ｇを欠損する細胞が、さらなる使用のために単離される。例えば、ＣＤ２００を発現し、かつ／または例えば、ＨＬＡ−Ｇを欠損する細胞は、具体的な実施形態では、ＣＤ７３及び／若しくはＣＤ１０５、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３、若しくはＳＨ４により認識されるエピトープの発現、あるいはＣＤ３４、ＣＤ３８、またはＣＤ４５の発現の欠損に基づいてさらに選別することができる。例えば、別の実施形態では、胎盤細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＤ４５の発現またはその欠損により選別され、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、及びＣＤ４５−である胎盤細胞は、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離される。
【０１５７】
選別された胎盤細胞の上記実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、選別後に残る細胞集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、該単離胎盤細胞である。胎盤細胞は、上記セクション５．１に記載のマーカーのいずれかのうちの１つ以上により選別することができる。
【０１５８】
具体的な実施形態では、例えば、（１）組織培養プラスチックに接着し、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ１０５＋である胎盤細胞が、他の胎盤細胞から選別（すなわち、単離）される。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着し、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋である胎盤細胞が、他の胎盤細胞から選別（すなわち、単離）される。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着し、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋である胎盤細胞が、他の胎盤細胞から選別（すなわち、単離）される。
【０１５９】
胎盤細胞のヌクレオチド配列に基づく検出に関しては、本明細書に記載されているマーカーに対する配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどの公的に利用可能なデータベースで容易に入手できる。
【０１６０】
抗体を介する検出、及び胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の選別に関しては、特定のマーカーに特異的な任意の抗体は、任意のフルオロフォアまたは細胞の検出及び選別（例えば、蛍光活性化細胞選別）に適する他の標識と組み合わせて使用することができる。マーカーに特異的な抗体／フルオロフォアの組み合わせとしては、ＨＬＡ−Ｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，  Ｒａｌｅｉｇｈ、ノースカロライナ州から入手）、ＣＤ１０（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンノゼから入手）、ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンノゼから入手）、及びＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、ミネソタ州ミネアポリスから入手）；ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、及びＣＤ１３に対するフィリコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ＣＤ３３及びＣＤ１０に対するフィリコエリトリンＣｙ７（ＰＥ  Ｃｙ７）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートストレプトアビジン及びＣＤ３８に対するモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ならびに、ビオチン化ＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体としては、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｃａｍ）、サイトケラチンＫ−ＦＩＴＣ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡ  ＡＢＣ−Ｆｉｔｃ（ＢＤ）、ＨＬＡ  ＤＲ，ＤＱ，ＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２ミクログロブリンＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）、及びＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体／標識の組み合わせとしては、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルタンパク質）；ＣＤ４４−ＰＥ；ＣＤ１９−ＰＥ；ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆ及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆなどが挙げられるが、これらに限定されない。このリストは、網羅的でなく、他の供給元からの他の抗体も市販されている。
【０１６１】
本明細書で提供される単離胎盤細胞は、例えば、フィリコエリトリン−Ｃｙ５（ＰＥ  Ｃｙ５）コンジュゲートストレプトアビジン及びＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体を使用してＣＤ１１７またはＣＤ１３３についてアッセイすることができ、しかし、この系を使用して、細胞は、比較的高いバックグラウンドのために、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対してそれぞれ陽性であるように見える可能性がある。
【０１６２】
単離胎盤細胞は、単一マーカーに対する抗体で標識して、検出及び選別することができる。胎盤細胞は同時に、異なるマーカーに対する複数の抗体で標識することもできる。
【０１６３】
別の実施形態では、磁気ビーズは、細胞を分離するために使用することができる。細胞は、磁気ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）に結合する能力に基づいて粒子を分離するための方法である磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して選別されてもよい。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を、磁気マイクロスフェア上に実施することができる。次に、ビーズは、結合させるために、細胞と混合される。次に、細胞は、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離するために、磁場を通過する。一実施形態では、次に、これらの細胞は、単離されて、追加の細胞表面マーカーに対する抗体と結合された磁気ビーズと再混合することができる。細胞は再度、両方の抗体に結合された細胞を単離する磁場を通過する。次に、このような細胞は、クローン単離のためのマイクロタイター皿などの別の皿に希釈することができる。
【０１６４】
単離胎盤細胞は、細胞形態及び成長特徴に基づいて特徴付け、かつ／または選別することもできる。例えば、単離胎盤細胞は、例えば、培養中の線維芽細胞様外観を有するものとして特徴付けることができ、及び／または、これに基づいて選択することができる。単離胎盤細胞は、胚様体様体を形成する能力を有するものとして特徴付けることもでき、及び／または、これに基づいて選択することもできる。一実施形態では、例えば、形状が線維芽細胞様であり、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、培養中に１つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養中に１つ以上の胚様体様体を産生するＯＣＴ−４＋胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。
【０１６５】
別の実施形態では、単離胎盤細胞は、特定され、コロニー形成単位アッセイにより特徴付けることができる。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、コロンビア州バンクーバーブリティッシュ）などのコロニー形成単位アッセイは、当該技術分野で周知である。
【０１６６】
単離胎盤細胞は、トリパンブルー排除アッセイ、（生存率を評価するための）ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ、及びチミジン取り込みアッセイ、（増殖をアッセイするための）ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイなどの当該技術分野において既知の標準的な技術を使用して生存率、増殖力、及び寿命に対し評価することができる。寿命は、当該技術分野において周知方法により、例えば、拡大した培養物中の集団倍加の最大数を測定することにより、測定されてもよい。
【０１６７】
単離胎盤細胞、例えば、上記セクション５．１に記載の単離胎盤細胞は、当該技術分野において既知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長（正の選択）、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば、大豆アグルチニンとしての混合集団における特異な細胞凝集に基づく分離、凍結融解手順；濾過；従来の遠心分離及びゾーン遠心分離；遠心水簸（カウンターストリーミング遠心分離）；単位重力分離；向流分配法；電気泳動などを使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
【０１６８】
５．２．６  単離胎盤細胞の集団
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞、例えば、上記セクション５，１に記載の単離胎盤細胞、の集団も本明細書で提供される。単離胎盤細胞の集団は、１つ以上の胎盤から直接単離することができ、つまり、細胞集団は、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団であることができ、単離胎盤細胞は、灌流液から得られる、若しくはこの中に含有される、または、破壊された胎盤細胞、例えば、胎盤組織消化物（つまり、胎盤若しくはその部分の酵素消化により得られた細胞の収集）から得られる、若しくはこの中に含有される。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞の集団を産生するために、培養及び拡大することもできる。単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団は、胎盤細胞集団を産生するために、培養及び拡大することもできる。
【０１６９】
本明細書で提供される治療方法に有用な胎盤細胞集団は、単離胎盤細胞、例えば、本明細書のセクション５．１に記載の単離胎盤細胞を含む。種々の実施形態では、胎盤細胞集団中の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、単離胎盤細胞である。つまり、単離胎盤細胞の集団は、例えば、単離胎盤細胞でない１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ほどの細胞を含むことができる。
【０１７０】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞集団は、例えば、酵素消化または灌流から誘導されるものであろうと、特定のマーカー及び／または特定の培養若しくは形態学的特徴を発現する単離胎盤細胞を選択することにより産生することができる。一実施形態では、例えば、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠損する、胎盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより細胞集団を産生する方法が、本明細書で提供される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠損する胎盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現する胎盤細胞を特定すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００及びＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ２００及びＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、（ｃ）胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、該集団が、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、該集団が、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠損する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠損する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団を産生する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、（ｃ）胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該集団が、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することを含む。別の実施形態では、細胞集団は、ＯＣＴ−４を発現し、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、該集団が、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。
【０１７１】
別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ１０及びＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１０及びＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。
【０１７２】
上記セクション５．１に記載のマーカーの組み合わせのいずれかを有する胎盤細胞を含む細胞集団の選択を、同様に、単離することができる、または得ることができる。
【０１７３】
上記実施形態のいずれにおいても、単離細胞集団の選択は、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的ＡＢＣトランスポータータンパク質、例えば、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８（２３）：５３３７−９  （１９９８）を参照のこと）を発現する胎盤細胞を選択することをさらに含むことができる。方法は、例えば、間葉系幹細胞に特有の少なくとも１つの特徴、例えば、ＣＤ４４の発現、ＣＤ９０の発現、または上述の組み合わせの発現を示す細胞を選択することを含むこともできる。
【０１７４】
上記実施形態では、基質は、細胞、例えば、単離胎盤細胞、の培養及び／または選択が達成することができる任意の表面であることができる。通常、基質は、プラスチック、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングすることができる。
【０１７５】
細胞、例えば、単離胎盤細胞は、細胞選択の当該技術分野において公知の任意の手段により、胎盤細胞集団について選択することができる。例えば、細胞は、１つ以上の細胞表面マーカーに対する抗体（複数可）を使用して、例えば、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳで選択することができる。選択は、磁気ビーズと共に抗体を使用して達成することができる。特定の幹細胞関連マーカー特異的である抗体は、当該技術分野で既知である。例えば、ＯＣＴ−４（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＣＤ２００（Ａｂｃａｍ）、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ７３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カルフォルニア州サンディエゴ）、ＣＤ１０５（Ａｂｃａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、メイン州ソコー）に対する抗体などである。他のマーカーに対する抗体もまた、市販されており、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＤ４５に対するものは、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能である。
【０１７６】
単離胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞、または胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。
【０１７７】
本明細書に記載の胎盤由来接着細胞を含む単離細胞集団は、第２の細胞型、例えば、胎盤由来接着細胞ではない胎盤細胞、または、例えば、胎盤細胞ではない細胞、を含むことができる。例えば、胎盤由来接着細胞の単離集団は、第２型の細胞の集団を含むことができ、例えば、これと組み合わせることができ、該第２型の細胞は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞（例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎盤血由来の有核細胞、臍帯血、または末梢血など）、血液から単離された幹細胞（例えば、胎盤血、臍帯血、または末梢血から単離された幹細胞）、胎盤灌流液由来の有核細胞、例えば、胎盤灌流液の全有核細胞；臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含有される幹細胞の集団、培養細胞、例えば、培養幹細胞、完全分化細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など）の集団、周皮細胞などである。具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、胎盤幹細胞または臍帯由来の幹細胞を含む。第２型の細胞が、血液または血液細胞である、ある特定の実施形態では、赤血球が、細胞の集団から除去されている。
【０１７８】
具体的な実施形態では、第２型の細胞は、造血幹細胞である。このような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤、臍帯血、または末梢血内；胎盤血、臍帯血、または末梢血由来の全有核細胞中；胎盤血、臍帯血、または末梢血由来のＣＤ３４＋細胞の単離集団中；未処理の骨髄中；骨髄由来の全有核細胞中；骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の単離集団中などに含有される可能性がある。
【０１７９】
別の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単離集団は、血管系由来の複数の成体または前駆細胞と組み合わされる。種々の実施形態では、細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、または心筋芽細胞である。
【０１８０】
別の実施形態では、第２の細胞型は、胚性幹細胞と関連する多能性及び機能のマーカーを発現するために、培養中操作された非胚性細胞型である。
【０１８１】
胎盤由来接着細胞の上記単離集団の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞及び第２型の細胞の一方またはその両方は、細胞の意図されるレシピエントに対し自己由来である、または同種異系である。
【０１８２】
別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び胚性幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び間葉系間質または幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質または幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び造血前駆細胞細胞、例えば、骨髄、胎児の血液、臍帯血、胎盤血及び／または末梢血由来の造血前駆細胞細胞、を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び体性幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、該体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、または筋幹細胞である。
【０１８３】
他の具体的な実施形態では、第２型の細胞は、該集団中の細胞の約、少なくとも、または多くとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％を占める。他の具体的な実施形態では、該組成物中のＰＤＡＣは、該組成物中の細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を占める。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞は、該集団中の細胞の約、少なくとも、または多くとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％を占める。
【０１８４】
胎盤由来接着細胞の単離集団中の細胞は、各集団中の全有核細胞の数を比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１；１：２；１：５；１：１０；１：１００；１：２００；１：５００；１：１，０００；１：２，０００；１：５，０００；１：１０，０００；１：２０，０００；１：５０，０００；１：１００，０００；１：５００，０００；１：１，０００，０００；１：２，０００，０００；１：５，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：２０，０００，０００；１：５０，０００，０００；または約１：１００，０００，０００の比率で、別の型の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、組み合わせることができる。胎盤由来接着細胞の単離集団中の細胞は、同様に、複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることができる。
【０１８５】
他の実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、上記ＰＤＡＣ、の集団は、骨形成胎盤接着細胞（ＯＰＡＣ）、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」という名称の２００９年８月２４日に出願された特許出願第１２／５４６，５５６号に記載のＯＰＡＣと組み合わされる、または羊膜由来血管新生細胞（ＡＭＤＡＣ）、例えば、「Ａｍｎｉｏｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」という名称の米国特許出願第１２／６２２，３５２号（この開示は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる）に記載のＡＭＤＡＣと組み合わされる。
【０１８６】
５．３  単離胎盤細胞を含む組成物
本明細書、例えば、セクション５．１、に記載の胎盤細胞は、本明細書に記載の方法及び組成物に使用される、生理学的に許容されるまたは医学的に許容される化合物、組成物、またはデバイスと組み合わせることができる。本明細書で提供される治療の方法に有用な組成物は、本明細書に記載の胎盤細胞のうちの任意の１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される組成物、例えば、薬学的に許容される担体中の胎盤細胞を含む組成物、である。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、単離胎盤細胞を含む組成物は、マトリックス、例えば、脱細胞化マトリックスまたは合成マトリックス、をさらに含む。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、三次元の足場である。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、またはビトロネクチンを含む。別の具体的な一実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、合成化合物を含む。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、生物活性化合物を含む。別の具体的な実施形態では、該生物活性化合物は、成長因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。
【０１８８】
別の実施形態では、本明細書で提供される治療の方法に有用な組成物は、上述の胎盤細胞のいずれか、または上述の胎盤細胞集団のいずれかにより馴化された培地を含む。
【０１８９】
５．３．１  低温保存された単離胎盤細胞
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞集団は、保存、例えば、後で使用するために低温保存することができる。幹細胞などの細胞の低温保存のための方法は、当該技術分野において周知である。単離胎盤細胞集団は、個体に容易に投与することができる形態、例えば、医療用途に適する容器に含有される単離胎盤細胞集団、に調製することができる。そのような容器は、例えば、シリンジ、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、または単離胎盤細胞集団が容易に出すことができる他の容器であることができる。例えば、容器は、血液バッグまたは液体のレシピエントに対する静脈内投与に適する他のプラスチックの医学的に許容されるバッグであることができる。ある特定の実施形態では、容器は、組み合わされた細胞集団の低温保存を可能にするものである。
【０１９０】
低温保存単離胎盤細胞集団は、単一のドナーまたは複数のドナーに由来する単離胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞集団は、意図されるレシピエントに完全にＨＬＡ適合である、または、部分的若しくは完全にＨＬＡ不適合である可能性がある。
【０１９１】
従って、一実施形態では、単離胎盤細胞は、方法に使用することができ、容器中に組織培養プラスチック接着性胎盤細胞集団を含む組成物の形態で本明細書に記載することができる。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存される。別の具体的な実施形態では、容器は、バッグ、フラスコ、または瓶である。別の具体的な実施形態では、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施形態では、該バッグは、例えば、静脈内注入による、該単離胎盤細胞集団の静脈内投与に適する、可能にする、または容易にする。バッグは、投与の前または間に、単離胎盤細胞及び１つ以上の他の溶液、例えば、薬物、の混合を可能にするために相互に連結される複数のルーメンまたはコンパートメントを含むことができる。別の具体的な実施形態では、組成物は、組み合わされた細胞集団の低温保存を容易にする１つ以上の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞集団は、生理学的に許容される水溶液内に含有される。別の具体的な実施形態では、該生理学的に許容される水溶液は、０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞集団は、該細胞集団のレシピエントにＨＬＡ適合である胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、該組み合わされた細胞集団は、該細胞集団のレシピエントに少なくとも部分的にＨＬＡ不適合である胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、複数のドナーに由来する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、容器中の単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤細胞であり、該細胞は、低温保存されており、容器内に含有されている。具体的な実施形態では、該ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はまた、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、該ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はまた、ＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、該ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はまた、ＣＤ４５−及びＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、若しくはプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥカドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、及びプログラム死１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【０１９３】
他のある特定の実施形態では、上述の単離胎盤細胞は、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤細胞であり、該細胞は、低温保存されており、容器内に含有されている。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋幹細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞であり、該単離胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているＯＣＴ−４＋胎盤細胞であり、該細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。
【０１９４】
別の具体的な実施形態では、上述の単離胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ３４−、ＣＤ１０＋及びＣＤ１０５＋（例えば、ＰＤＡＣ）である胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性がある。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ９０＋及びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなＣＤ８０−及びＣＤ８６−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらに、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋、またはＳＨ４＋のうちの１つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ４４＋である。上記単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、及び／またはＰＤＬ１＋のうちの１つ以上である。
【０１９５】
上述の低温保存された単離胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、該容器は、バッグである。種々の具体的な実施形態では、該容器は、約少なくともまたは多くとも１×１０６の該単離胎盤細胞、５×１０６の該単離胎盤細胞、１×１０７の該単離胎盤細胞、５×１０７の該単離胎盤細胞、１×１０８の該単離胎盤細胞、５×１０８の該単離胎盤細胞、１×１０９の該単離胎盤細胞、５×１０９の該単離胎盤細胞、１×１０１０の該単離胎盤細胞、または１×１０１０の該単離胎盤細胞を含む。上述の低温保存された集団のいずれかの他の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、約、少なくとも、または多くとも５回、多くとも１０回、多くとも１５回、または多くとも２０回継代されている。上述の低温保存された単離胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、該容器内で拡大されている。
ある特定の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単回単位用量は、種々の実施形態では、約、少なくとも、または多くとも１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０の胎盤細胞を含むことができる。ある特定の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単回単位用量は、１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、または５×１０９〜１×１０１０の間の胎盤細胞を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、５０％以上の生細胞を含む（つまり、集団中の細胞の少なくとも５０％は、機能しうる、または生きている）胎盤由来接着細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、生存可能である。
【０１９６】
５．３．２  医薬組成物
単離胎盤細胞の集団、例えば、ＰＤＡＣ、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、インビボで、例えば、本明細書で提供される治療方法で、使用される医薬組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、食塩水、または他の許容される、インビボ投与に対し生理学的に許容される溶液中に、単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載の、単離胎盤細胞集団、または単離胎盤細胞のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母体、または胎児及び母体両方の単離胎盤細胞を含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の個体若しくは胎盤から、または、複数の個体若しくは胎盤から得られた単離胎盤細胞をさらに含むことができる。
【０１９７】
本明細書で提供される医薬組成物は、任意の数の単離胎盤細胞を含むことができる。例えば、単回単位用量の胎盤由来接着細胞は、約、少なくとも、若しくは多くとも１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、若しくは１×１０１０の胎盤細胞、または、１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、若しくは５×１０９〜１×１０１０の胎盤細胞を含むことができる。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、糖尿病性足部潰瘍を有する対象に１回投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、糖尿病性足部潰瘍に罹患している対象に、複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回を超えて投与される。投薬間の間隔は、毎週、隔週、毎月、隔月、または毎年であることができる。間隔は、不規則であることもできる。このようなレジメンに従って投与される胎盤幹細胞の用量は、１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、若しくは１×１０１０の胎盤細胞、または、１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、若しくは５×１０９〜１×１０１０の胎盤幹細胞を含むが、これらに制限されない。具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０４の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０５の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０７の胎盤幹細胞である。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−胎盤幹細胞）を含む医薬組成物は、単回投与として、糖尿病性足部潰瘍に罹患している対象に１回投与される。ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−胎盤幹細胞）を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、約１週間後に２回目投与、として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−胎盤幹細胞）を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、約１週間後に２回目投与及びその約１週間後（すなわち、最初の投与の約２週間後）に３回目投与として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。このようなレジメンに従って投与される胎盤幹細胞の用量は、１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、若しくは１×１０１０の胎盤細胞、または、１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、若しくは５×１０９〜１×１０１０の胎盤幹細胞を含むが、これらに制限されない。具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０４の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０５の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０７の胎盤幹細胞である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−胎盤幹細胞）を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、その約１ヶ月後（例えば、最初の投与の約２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３日後）に２回目投与、として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−胎盤幹細胞）を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、約１ヶ月後に２回目投与及びその約１ヶ月後（すなわち、最初の投与の約２ヶ月後、例えば、最初の投与後５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４日目またはその頃）に３回目投与として、糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。このようなレジメンに従って投与される胎盤幹細胞の用量は、１×１０３、３×１０３、５×１０３、１×１０４、３×１０４、５×１０４、１×１０５、３×１０５、５×１０５、１×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、１×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、若しくは１×１０１０の胎盤細胞、または、１×１０３〜３×１０３、３×１０３〜５×１０３、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜３×１０４、３×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜３×１０５、３×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜３×１０７、３×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜３×１０８、３×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、若しくは５×１０９〜１×１０１０の胎盤幹細胞を含むが、これらに制限されない。具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０３の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０４の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０５の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、１×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０６の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、３×１０７の胎盤幹細胞である。
【０２０１】
本明細書で提供される医薬組成物は、５０％以上の生細胞（つまり、集団中の細胞の少なくとも５０％は、機能しうる、または生きている）を含む細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、生存可能である。
【０２０２】
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、移植を容易にする１つ以上の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチル、デンプン、プラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）などの安定剤を含むことができる。
【０２０３】
注射用溶液として製剤化される時、一実施形態では、医薬組成物は、約１％〜１．５％のＨＳＡ及び約２．５％のデキストランを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、５％のＨＳＡ及び１０％のデキストランを含む、任意に、免疫抑制剤、例えば、１０ｍｇ／ｋｇの、例えば、シクロスポリンＡを含む溶液中、約５×１０６細胞／ｍＬ〜約２×１０７細胞／ｍＬを含む。
【０２０４】
他の実施形態では、医薬組成物、例えば溶液、は、複数の細胞、例えば、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含み、該医薬組成物は、約１．０±０．３×１０６細胞／ｍＬ〜約５．０±１．５×１０６細胞／ｍＬを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、約１．５×１０６細胞／ｍＬ〜約３．７５×１０６細胞／ｍＬを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約５０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約４０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約３０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約２０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約１５×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６細胞／ｍＬ〜約１０×１０６細胞／ｍＬを含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、目に見える細胞塊（すなわち、マクロ細胞塊）を含まない、またはこのような目に見える塊を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「マクロ細胞塊」は、拡大なしで目に見える、例えば、裸眼で見える、細胞の凝集を意味し、一般に、約１５０ミクロンよりも大きい細胞凝集を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、または１０％のデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。具体的な実施形態では、該組成物は、約７．５％〜約９％のデキストラン４０を含む。具体的な実施形態では、該組成物は、約５．５％のデキストラン４０を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１％〜約１５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６５、７５、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＨＳＡを含む。具体的な実施形態では、該細胞は、低温保存及び解凍されている。別の具体的な実施形態では、該細胞は、７０μＭ〜１００μＭのフィルタに通して濾過されている。別の具体的な実施形態では、該組成物は、目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、該組成物は、１０６の細胞当たり約２００未満の細胞塊を含み、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡、のみで見える。別の具体的な実施形態では、該組成物は、１０６細胞当たり約１５０未満の細胞塊を含み、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡、のみで見える。別の具体的な実施形態では、該組成物は、１０６細胞当たり約１００未満の細胞塊を含み、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡、のみで見える。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１．０±０．３×１０６細胞／ｍＬ、約５．５％のデキストラン４０（ｗ／ｖ）、約１０％のＨＳＡ（ｗ／ｖ）、及び約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、約５．７５％のデキストラン４０、約１０％のヒト血清アルブミン、及び約２．５％のＤＭＳＯを含む。
【０２０６】
他の実施形態では、医薬組成物は、１０％のデキストラン４０を含む溶液に、複数の細胞、例えば、複数の単離胎盤細胞を含み、医薬組成物は、約１．０±０．３×１０６細胞／ｍＬ及び〜約５．０±１．５×１０６細胞／ｍＬを含み、該組成物は、肉眼で目に見える細胞塊を含まない（すなわち、マクロ細胞塊を含まない）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１．５×１０６細胞／ｍＬ〜約３．７５×１０６細胞／ｍＬを含む。ある特定の実施形態では、該細胞は、低温保存及び解凍されている。別の具体的な実施形態では、該細胞は、７０μＭ〜１００μＭのフィルタに通して濾過されている。別の具体的な実施形態では、該組成物は、１０６の細胞当たり約２００マイクロ未満の細胞塊（つまり、拡大でのみ見える細胞塊）を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１０６の細胞当たり約１５０マイクロ未満の細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１０６の細胞当たり約１００マイクロ未満の細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、若しくは２％未満のＤＭＳＯ、または１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満のＤＭＳＯを含む。
【０２０７】
細胞を含む組成物が、さらに本明細書で提供され、該組成物は、本明細書の開示の方法の１つにより生成される。例えば、一実施形態では、医薬組成物は、細胞を含み、医薬組成物は、濾過された細胞含有溶液を形成するために、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、を含む溶液を濾過すること；例えば、低温保存の前に、約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６細胞／ｍＬまで、第１の溶液で、濾過された細胞含有溶液を希釈すること；及び、該組成物を生成するために、デキストランを含むが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まない第２の溶液で、得られた濾過された細胞含有溶液を希釈すること、を含む方法により生成される。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約１５×１０６細胞／ｍＬまでである。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約１０±３×１０６細胞／ｍＬまでである。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約７．５×１０６細胞／ｍＬまでである。他のある特定の実施形態では、濾過された細胞含有溶液が、希釈前に、約１５×１０６細胞／ｍＬ未満を含む場合、濾過は、任意である。他のある特定の実施形態では、濾過された細胞含有溶液が、希釈前に、約１０±３×１０６細胞／ｍＬ未満を含む場合、濾過は、任意である。他のある特定の実施形態では、濾過された細胞含有溶液が、希釈前に、約７．５×１０６細胞／ｍＬ未満を含む場合、濾過は、任意である。
【０２０８】
具体的な実施形態では、細胞は、第１の希釈液での該希釈及び該第２の希釈液での該希釈の間に、低温保存される。別の具体的な実施形態では、第１の希釈液は、デキストラン及びＨＳＡを含む。第１の希釈液または第２の希釈液中のデキストランは、任意の分子量のデキストラン、例えば、約１０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有するデキストランであることができる。いくつかの実施形態では、該第１の希釈液または該第２の溶液中の該デキストランは、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、または１０％のデキストランである。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液または該第２の希釈液中のデキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液及び該第２の希釈液中のデキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液中の該デキストラン４０は、５．０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液中の該デキストラン４０は、５．５％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、該第２の希釈液中の該デキストラン４０は、１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む該溶液中の該ＨＳＡは、１〜１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む該溶液中の該ＨＳＡは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む該溶液中の該ＨＳＡは、１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液は、ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液中の該ＨＳＡは、１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、該第１の希釈液は、凍結防止剤を含む。別の具体的な実施形態では、該凍結防止剤は、ＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、該第２の希釈液中の該デキストラン４０は、約１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む該組成物は、約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、約１．０±０．３×１０６細胞／ｍＬ〜約５．０±１．５×１０６細胞／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、約１．５×１０６細胞／ｍＬ〜約３．７５×１０６細胞／ｍＬを含む。
【０２０９】
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）濾過された細胞含有溶液を生成するために、低温保存前に、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、を含む細胞含有溶液を濾過すること；（ｂ）約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６細胞／ｍＬの、濾過された細胞含有溶液中の細胞を低温保存すること；（ｃ）細胞を解凍すること；及び、（ｄ）デキストラン４０溶液で、約１：１〜約１：１１（ｖ／ｖ）に、濾過された細胞含有溶液を希釈すること、を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、細胞の数が、ステップ（ａ）の前に、約１０±３×１０６未満細胞／ｍＬである場合、濾過は任意である。別の具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約１０±３×１０６細胞／ｍＬで低温保存される。別の具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラン４０及びＨＳＡを含む溶液中で低温保存される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の該希釈は、多くとも約１５×１０６細胞／ｍＬまでである。
【０２１０】
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）細胞含有溶液を形成するために、１０％のＨＳＡを含む５．５％のデキストラン４０溶液に、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、を懸濁すること；（ｂ）７０μＭのフィルタに通して、細胞含有溶液を濾過すること；（ｃ）約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６細胞／ｍＬまで、５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、及び５％のＤＭＳＯを含む溶液で、細胞含有溶液を希釈すること；（ｄ）細胞を低温保存すること；（ｅ）細胞を解凍すること；ならびに、（ｆ）１０％のデキストラン４０で、１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に、細胞含有溶液を希釈すること、を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の該希釈は、多くとも約１５×１０６細胞／ｍＬである。ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の該希釈は、多くとも約１０±３×１０６細胞／ｍＬである。ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の該希釈は、多くとも約７．５×１０６細胞／ｍＬである。
【０２１１】
別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）細胞を収集するために、複数の細胞を遠心分離すること；（ｂ）５．５％のデキストラン４０中に、細胞を再懸濁すること；（ｃ）細胞を収集するために、細胞を遠心分離すること；（ｄ）１０％のＨＳＡを含む５．５％のデキストラン４０溶液中に、細胞を再懸濁すること；（ｅ）７０μＭのフィルタに通して、細胞を濾過すること；（ｆ）約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６細胞／ｍＬまで、５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、及び５％のＤＭＳＯ中に、細胞を希釈すること；（ｇ）細胞を低温保存すること；（ｈ）細胞を解凍すること；ならびに、（ｉ）１０％のデキストラン４０で、１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に細胞を希釈すること、を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の該希釈は、多くとも約１５×１０６細胞／ｍＬである。ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の該希釈は、多くとも約１０±３×１０６細胞／ｍＬである。ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の該希釈は、多くとも約７．５×１０６細胞／ｍＬである。他のある特定の実施形態では、細胞の数が、約１０±３×１０６未満細胞／ｍＬである場合、濾過は任意である。
【０２１２】
本明細書に記載の組成物、例えば、単離胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書に記載の単離胎盤細胞のいずれかを含むことができる。
【０２１３】
細胞産生物の投与に適する他の注射製剤が使用されてもよい。
【０２１４】
一実施形態では、医薬組成物は、実質的または完全に由来が非母体である、つまり、胎児遺伝子型を有する単離胎盤細胞を含み；例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、または約１００％は、由来が非母体である。例えば、一実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ２００＋及びＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋及びＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋であり、単離胎盤細胞の該集団を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする；若しくは、ＯＣＴ−４＋であり、単離胎盤細胞の該集団を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする；または、上述の組み合わせである単離胎盤細胞の集団を含み、該単離胎盤細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、由来が非母体である。別の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、及びＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ９０＋若しくはＣＤ４５−のうちの少なくとも１つ；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−；ＣＤ２００＋、及びＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋、及びＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、及びＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋及びＣＤ１０５＋であり、該単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする；ＯＣＴ−４＋であり、該単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、１つ以上の胚様体様体の形成を容易にする；または、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−及び／若しくはＰＤＬ１＋のうちの１つ以上である；あるいは、上述の組み合わせである単離胎盤細胞の集団を含み、該単離胎盤細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、由来が非母体である。具体的な実施形態では、医薬組成物はさらに、胎盤から得られない幹細胞を含む。
【０２１５】
本明細書で提供される組成物、例えば、医薬組成物、中の単離胎盤細胞は、単一のドナーまたは複数のドナーに由来する胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、意図されるレシピエントに完全にＨＬＡ適合である、または、部分的若しくは完全にＨＬＡ不適合である可能性がある。
【０２１６】
５．３．３  単離胎盤細胞を含むマトリックス
胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場などを含む組成物がさらに、本明細書で提供される。そのような組成物は、懸濁液中の細胞の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
【０２１７】
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、天然マトリックス、例えば、羊膜材料などの胎盤生体材料上に播種することができる。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接切除された羊膜；固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、２０％未満のＨ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜などであることができる。単離胎盤細胞が播種することができる好ましい胎盤生体材料は、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号に記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、例えば、注射に適するヒドロゲル溶液中に懸濁することができる。そのような組成物に好適なヒドロゲルは、ＲＡＤ１６などの自己組織化ペプチドを含む。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、移植のための、細胞がその内部に分散したマトリックスを形成するために、例えば、鋳型内で、硬化させることができる。そのようなマトリックス中の単離胎盤細胞は、移植前に、細胞が有糸分裂的に拡大するように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋されて、ゲルを形成するために水分子を捕捉する３次元の開格子構造を形成している、有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲル形成材料は、イオン的に架橋される、アルギネート及びその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅｓ）、ならびにポリアクリレート、または、それぞれ温度若しくはｐＨにより架橋されている、ポリエチレンオキシドポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルまたはマトリックスは、生分解性である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、製剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕの重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許公開公報第２００２／００２２６７６号（この開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）；Ａｎｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ７８（１−３）：１９９−２０９  （２００２）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２４（２２）：３９６９−８０  （２００３）を参照のこと）。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、電荷を持つ側鎖基またはそれらの一価のイオン性塩を有する、水、緩衝塩水溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に少なくとも部分的に可溶性である。カチオンと反応することができる酸性側鎖基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン（ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ））、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸及びメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、ならびにスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリルまたはメタクリル酸及びビニルエーテルモノマーまたはポリマーの反応により形成される酸性側鎖基を有するコポリマーを、使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノールＯＨ基、及び酸性ＯＨ基である。
【０２２１】
具体的な実施形態では、マトリックスは、生体吸収材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマー若しくはブレンド、またはヒアルロン酸、から作製されるマルチフィラメントヤーンからなることができるフェルトである。ヤーンは、クリンピング、カッティング、カーディング、及びニードリングからなる標準的な繊維加工技術を使用して、フェルトに作製される。別の好ましい実施形態では、本発明の細胞は、コンポジット構造であり得るフォーム足場上に播種される。加えて、３次元のフレームワークは、修復、交換、または向上されるべき、身体の特定の構造などの有用な形状に成形されてもよい。使用することができる足場の他の例としては、不織布マット、多孔質フォーム、または自己組織化ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸及び乳酸（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマヴィル）合成吸収性コポリマーからなる繊維を使用して形成することができる。例えば、凍結乾燥、または真空凍結乾燥（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照のこと）などのプロセスにより形成されるポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなるフォームも、足場として使用することもできる。
【０２２２】
本明細書に記載の単離胎盤細胞またはその共培養物は、３次元のフレームワークまたは足場上に播種することができ、インビボで移植することができる。そのようなフレームワークは、任意の１つ以上の成長因子、細胞、薬物、または他の構成成分、例えば、組織形成を刺激する成分、と組み合わせて移植することができる。
【０２２３】
使用することができる足場の例としては、不織布マット、多孔質フォーム、または自己組織化ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸及び乳酸（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマヴィル）合成吸収性コポリマーからなる繊維を使用して形成することができる。例えば、凍結乾燥、または真空凍結乾燥などのプロセスにより形成されるポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなるフォーム（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照のこと）も、足場として使用することができる。
【０２２４】
別の実施形態では、単離胎盤細胞は、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマー若しくはブレンド、またはヒアルロン酸などの生体吸収材料から作製されるマルチフィラメントヤーンからなることができるフェルト上に播種することができる、または、これと接触することができる。
【０２２５】
別の実施形態では、本明細書で提供される単離胎盤細胞は、コンポジット構造であり得るフォーム足場上に播種することができる。このようなフォーム足場は、修復、交換、または向上されるべき、身体中の特定の構造の一部のものなどの有用な形状に形成することができる。いくつかの実施形態では、フレームワークは、細胞付着を増強するために、細胞の接種前に、例えば、０．１Ｍの酢酸で処理され、続いて、ポリリシン、ＰＢＳ、及び／またはコラーゲン中でインキュベートされる。マトリックスの外部表面は、例えば、マトリックスを血漿コーティングすること、または、１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、網状繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、（例えば、ヘパリンスルフェート、コンドロイチン−４−スルフェート、コンドロイチン−６−スルフェート、デルマタンスルフェート、ケラチンスルフェートなど）、細胞マトリックス、及び／またはゼラチン、アルギネート、アガー、アガロース、及びゴムなどのこれらに限定されない他の材料の添加により、細胞の付着または成長及び組織の分化を改善するために修飾されてもよい。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、足場は、それを非血栓性にする材料を含む、またはそれらで処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、遊走、及び細胞外マトリックス沈着を促進及び持続することもある。これらの材料及び処理の例としては、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然材料、ＥＰＴＦＥならびにＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークレー）などのセグメント化ポリウレタン尿素シリコーンなどの合成材料、が挙げられるが、これらに限定されない。足場は、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき、足場は、単離胎盤細胞を播種する前に、表面電荷を変えるために処理すること（例えば、血漿でコーティングすること）もできる。
【０２２７】
本明細書で提供される胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ）は、リン酸一カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生物学的に活性なガラス、ならびにそれらの混合物を含むが、これらに限定されない生理学的に許容されるセラミック材料上に播種することもできる、またはこれと接触できる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミック材料は、ＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、カナダ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ、スイス・ベットラッハ）、ならびに、ＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州レイナム）及びＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）、及びＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ、ペンシルベニア州モルバーン）などの石灰化コラーゲン骨移植製品を含む。フレームワークは、天然及び／または合成材料の混合物、ブレンド、またはコンポジットであることができる。
【０２２８】
一実施形態では、単離胎盤細胞は、約０．５×１０６〜約８×１０６細胞／ｍＬで、好適な足場上に播種される、またはこれと接触する。
【実施例】
【０２２９】
６．１  実施例１：胎盤由来接着細胞の表現型の特徴づけ
本実施例は、胎盤細胞（ＰＤＡＣとも呼ばれているＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞）による、血管新生因子の分泌を実証する。
【０２３０】
６．１．１  胎盤由来接着細胞の血管新生能の評価のためのセクレトーム（Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）プロファイリング
マルチプレックスビーズアッセイ：継代６回の胎盤由来接着細胞を、成長培地に、等しい細胞数でプレーティングし、馴化培地を、４８時間後に収集した。細胞馴化培地中の複数の血管新生サイトカイン／成長因子の同時定性分析を、磁気ビーズをベースとするマルチプレックスアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州）を使用して実施した。アッセイは、血清、血漿、及び細胞／組織培養上清を含む多様なマトリックス中の血管新生バイオマーカーの測定を可能にするものである。これらの９６ウェルプレートフォーマットのビーズをベースとするアッセイは、捕捉サンドイッチイムノアッセイと類似している。所望の血管新生標的に対する抗体が、内部染色されたビーズに共有結合的に結合される。結合されたビーズを、血管新生標的を含有する試料と反応させる。結合していないタンパク質を除去するための一連の洗浄後に、異なるエピトープに特異的なビオチン化検出抗体を、反応物に添加する。結果は、血管新生標的の周りの抗体のサンドイッチの形成である。次に、ビーズ表面上のビオチン化検出抗体に結合するために、ストレプトアビジンＰＥを、添加する。要約すると、マルチプレックスアッセイを、製造者の使用説明書に従って実施し、馴化培地中のそれぞれの血管新生成長因子の量を評価した。
【０２３１】
ＥＬＩＳＡ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）製の市販のキットを使用して、細胞馴化培地中の単一の血管新生サイトカイン／成長因子の定量的分析を実施した。要約すると、ＥＬＩＳＡアッセイを、製造者の使用説明書に従って実施し、馴化培地中のそれぞれの血管新生成長因子の量を評価した。
【０２３２】
ＰＤＡＣによる種々の血管新生タンパク質の分泌のレベルを、図１に示す。
血管新生マーカーに対するマルチプレックス及びＥＬＩＳＡの結果
【表１】
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【０２３３】
別の実験では、ＰＤＡＣは、アンジオポイエチン１、アンジオポイエチン２、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１；血小板内皮細胞接着分子）、ラミニン、及びフィブロネクチンを分泌することも確認された。
【０２３４】
６．２  実施例２：胎盤細胞の機能的特徴づけ
本実施例は、血管新生及び分化能力と関連する胎盤細胞（ＰＤＡＣとも呼ばれる、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞）の異なる特徴を実証する。
【０２３５】
６．２．１  ＰＤＡＣの血管新生能の評価のためのＨＵＶＥＣ管腔形成
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３日間、ＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、ニュージャージー州イーストラザフォード）中、継代３回以下で継代培養し、約７０％〜８０％のコンフルエンシーで採取した。ＨＵＶＥＣを、基礎培地／抗生物質（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ））で１回洗浄し、所望の濃度で、同じ培地中に再懸濁した。ＨＵＶＥＣを、調製から１時間以内に使用した。ヒト胎盤コラーゲン（ＨＰＣ）を、１０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ  ２．２５）中で１．５ｍｇ／ｍＬの濃度にし、ｐＨ  ７．２に緩衝液で中和し、使用するまで氷上に保った。ＨＰＣを、４０００細胞／μｌの最終細胞濃度で、ＨＵＶＥＣ懸濁液と組み合わせた。得られたＨＵＶＥＣ／ＨＰＣ懸濁液を、３μｌ／ウェルで、９６ウェルプレートに直ちにピペッティングした（プレート周囲は、蒸発を避けるために、滅菌ＰＢＳで予め充填しなければならない、条件ごとにｎ＝５）。ＨＵＶＥＣ滴を、培地添加なしに、７５〜９０分、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートして、コラーゲンの重合を可能にした。「ドライ」インキュベーションの完了時に、各ウェルに、２００μｌの馴化ＰＤＡＣ培地（ｎ＝２細胞株）または対照培地（例えば、陰性対照としてのＤＭＥＭ／Ｆ１２、及び陽性対照としてのＥＧＭ−２）を静かに充填し、２０時間、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。４〜６時間、成長培地中、継代６回のＰＤＡＣをインキュベートすることにより、馴化培地を調製し；付着させて広げた後、培地を、２４時間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に変更した。インキュベーション後に、培地を、ＨＵＶＥＣ滴を乱すことなく、ウェルから除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次に、ＨＵＶＥＣ滴を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ細胞染色キットを使用して、１０秒間固定して、１分間染色し、続いて、滅菌水で３回すすいだ。染色した滴を空気乾燥させ、Ｚｅｉｓｓ  ＳｔｅＲｅｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ８顕微鏡を使用して、各ウェルの画像を得た。次に、コンピュータソフトウエアパッケージＩｍａｇｅＪ及び／またはＭａｔＬａｂを使用して、画像を分析した。画像を、カラーから８ビットグレースケール画像に変換し、閾値を決定して、白黒画像に変換した。次に、粒子分析機能を使用して画像を分析し、分析は、アッセイにおける内皮管腔形成の量と同等である、カウント（個々の粒子の数）、総面積、（個々の粒子の）平均サイズ、及び面積率を含む、ピクセル密度データを提供した。
【０２３６】
馴化培地は、管腔形成の誘導により実証されるように、内皮細胞に血管新生効果をもたらす（図２を参照のこと）。
【０２３７】
６．２．２  ＨＵＶＥＣ遊走アッセイ
本実験は、胎盤由来接着細胞の血管新生能力を実証した。ＨＵＶＥＣを、フィブロネクチン（ＦＮ）コーティングされた１２ウェルプレート中で、単一層コンフルエンスまで成長させ、単一層を、１ｍＬのプラスチックピペットの先端で「傷つけ」て、ウェル全体に、細胞のない線を作成した。「傷つけた」細胞を、成長の３日後に、ＰＤＡＣから得られた無血清馴化培地（ＥＢＭ２；Ｃａｍｂｒｅｘ）でインキュベートすることにより、ＨＵＶＥＣの遊走を試験した。細胞を含まないＥＢＭ２培地を、対照として使用した。１５時間後に、倒立顕微鏡を使用して、細胞のない部分への細胞遊走を記録した（ｎ＝３）。次に、コンピュータソフトウエアパッケージＩｍａｇｅＪ及び／またはＭａｔＬａｂを使用して、写真を分析した。画像を、カラーから８ビットグレースケール画像に変換し、閾値を決定して、白黒画像に変換した。次に、粒子分析機能を使用して画像を分析し、分析は、アッセイにおける内皮遊走の量に等しい、カウント（個々の粒子の数）、総面積、（個々の粒子の）平均サイズ、及び面積率を含む、ピクセル密度データを提供した。細胞遊走の程度を、最初に記録された創傷線のサイズに対しスコア化し、結果を１ｘ１０６の細胞に正規化した。
【０２３８】
胎盤由来接着細胞により分泌される栄養因子は、細胞遊走の誘導により実証されるように、内皮細胞に血管新生効果をもたらした（図３）。
【０２３９】
別の実験では、ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ２中で、一晩確立させるために、２４ウェルプレートの底部で培養し、続いて、ＥＢＭ中で半日飢餓にした。同時に培地で培養されたＰＤＡＣを解凍し、一晩、トランスウェル（８μＭ）中で培養した。ＥＣ飢餓の後、トランスウェルと共に馴化無血清ＤＭＥＭを、一晩の増殖のために、ＥＣに移した。４回の反復を、各実験に含め、２４時間後の増殖を、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイで評価した。ＥＢＭ−２培地を、陰性対照として使用し、ＥＧＭ−２を、陽性対照として使用した。エラーバーは、分析的反復（ｎ＝３）の標準偏差を表す。
【０２４０】
ＰＤＡＣにより分泌される栄養因子は、ＨＵＶＥＣ細胞数の増加をもたらし、これはＨＵＶＥＣ増殖を示す。図４を参照のこと。
【０２４１】
６．２．３  胎盤由来接着細胞の血管新生能の評価のための管腔形成
一般に細胞の血管新生能及びＶＥＧＦの細胞の分化能における効果を評価するために、ＶＥＧＦを含まない成長培地中、またはＶＥＧＦを含むＥＧＭ２−ＭＶ中のいずれかで、ＰＤＡＣを成長させた。管腔形成に対する対照としてのＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ２−ＭＶ中で成長させた。細胞が７０〜８０％のコンフルエンスに達するまで、細胞を、４〜７日間、各培地中で培養した。冷（４℃）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（５０μＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１２ウェルプレートのウェルに分注し、プレートを、３７℃で６０分間インキュベートして、溶液をゲル化させた。ＰＤＡＣ及びＨＵＶＥＣ細胞を、トリプシン処理し、（ＶＥＧＦを含む及び含まない）適切な培地に再懸濁し、１００μｌの希釈された細胞（１〜３×１０４細胞）を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）含有ウェルのそれぞれに添加した。０．５〜１００ｎｇのＶＥＧＦの存在下または不存在下での、重合されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上の細胞を、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内に４〜２４時間置いた。インキュベーション後に、標準的な光学顕微鏡を使用して、細胞を管腔形成の徴候について評価した。
【０２４２】
ＰＤＡＣは、ＶＥＧＦの不存在下で最小限の管腔形成を示したが、ＶＥＧＦでの刺激を通して、誘導／分化されて、管腔様構造を形成した。図５を参照のこと。
【０２４３】
６．２．４  胎盤由来接着細胞の血管新生能の評価のための低酸素応答性
内皮細胞及び／または内皮前駆細胞の血管新生機能性を評価するために、細胞を、低酸素及び正常酸素条件下での血管新生成長因子を分泌する能力に関して評価することができる。低酸素条件下での培養は通常、内皮細胞または内皮前駆細胞のいずれかによる血管新生成長因子の分泌の増加を誘導し、これは、馴化培地中で測定できる。胎盤由来接着細胞を、標準的な成長培地中、等しい細胞数でプレーティングし、成長させて約７０〜８０％のコンフルエンスに至らせた。続いて、細胞を、無血清培地（ＥＢＭ−２）に切り替え、２４時間、正常酸素（２１％のＯ２）または低酸素（１％のＯ２）条件下でインキュベートした。馴化培地を収集し、市販のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製ＥＬＩＳＡキットを使用して、血管新生成長因子の分泌を分析した。ＥＬＩＳＡアッセイを、製造者の使用説明書に従って実施し、馴化培地中のそれぞれの血管新生成長因子（ＶＥＧＦ及びＩＬ−８）の量を、１×１０６の細胞に正規化した。
【０２４４】
胎盤由来接着細胞は、低酸素条件での種々の血管新生成長因子の分泌の上昇を示した。図６を参照のこと。
【０２４５】
６．２．５  ＰＤＡＣ馴化培地に対するＨＵＶＥＣの応答
ＰＤＡＣを、６０％のＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、４０％のＭＣＢＤ−２０１（Ｓｉｇｍａ）、２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１０ｎｇ／ｍＬのリノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１ｎのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１０ｎｇ／ｍＬの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する成長培地で、４８時間培養し、次に、無血清培地で、さらに４８時間培養した。ＰＤＡＣ培養物由来の馴化培地を、収集し、使用して、５、１５、及び３０分間、血清飢餓ＨＵＶＥＣを刺激した。続いて、ＨＵＶＥＣを、溶解させ、血管新生経路シグナル伝達に関与することが知られているリンタンパク質について、ＢＤ（商標）  ＣＢＡ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｆｌｅｘ  Ｋｉｔ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＰＤＡＣは、ＨＵＶＥＣにおける、ＡＫＴ−１（アポトーシスプロセスを阻害する）、ＡＫＴ−２（インスリンシグナル伝達経路における重要なシグナル伝達タンパク質である）、及びＥＲＫ  １／２細胞増殖経路の強いアクチベーターであることが判明した。これらの結果は、ＰＤＡＣの血管新生能力をさらに実証する。
【０２４６】
６．３  実施例３：ＰＤＡＣによる血管新生の誘導
本実施例は、上記実施例１に記載されるようなＰＤＡＣが、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）を使用して、インビボアッセイで血管新生を促進することを実証する。
【０２４７】
２つの別々のＣＡＭアッセイを行った。第１のＣＡＭアッセイでは、ＰＤＡＣの異なる調製物由来のインタクトな細胞ペレットを評価した。第２のＣＡＭアッセイでは、異なるＰＤＡＣ調製物の上清を評価した。線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、陽性対照として使用し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を参照として、ビヒクル、及び培地対照を陰性対照として使用した。試験のエンドポイントは、全ての治療及び対照群の血管密度を測定することであった。
【０２４８】
６．３．１  ＰＤＡＣを使用したＣＡＭアッセイ
上記のように調製され、低温保存されたＰＤＡＣを使用した。ＰＤＡＣを、投与のために解凍し、ＣＡＭ上に投与される細胞の数を決定した。
【０２４９】
試験デザイン：試験は、各群に１０の胚を含む５群を含んでいた。試験のデザインを、表２に記載する。
試験群：ニワトリ漿尿膜血管新生試験
【表２】
2017537057.tif 000004
【０２５０】
ＣＡＭアッセイ手順：新しい受精能力のある卵を、３日間、３７℃の標準的な卵インキュベーター内で、３日間インキュベートした。３日目に、卵を無菌条件下で割り、胚を、２０枚の１００ｍｍプラスチック皿に置き、一番下の棚上に貯水器を有する胚インキュベーター内で、３７℃で培養した。インキュベーター内の湿度を一定に保つように、小型ポンプを使用して、空気を貯水器に連続的にバブリングした。６日目、滅菌シリコン「Ｏ」リングを、各ＣＡＭ上に置き、次に、７．６９×１０５細胞／４０μＬの培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）の密度のＰＤＡＣを、滅菌フード内の各「Ｏ」リングに供給した。表２Ａ及び２Ｂは、使用された細胞の数及び投与のための各細胞調製物に添加された培地の量を表す。ビヒクル対照胚は、４０μＬのビヒクル（ＰＢＳ／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、１：１）を与えられ、陽性対照は、４０μｌのＤＭＥＭ培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）中の１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを与えられ、培地対照は、４０μｌのＤＭＥＭ培地単独を与えられた。各投与を完了した後に、胚をインキュベーターに戻した。８日目に、胚をインキュベーターから取り出し、１００倍の倍率で画像キャプチャーシステムを使用して、血管密度を、各「Ｏ」リングの下で決定する間、室温に保った。
【０２５１】
血管密度を、ＣＡＭ上の処置部位に存在する血管の数を示すために、算術数０〜５、または指数の数１〜３２を使用した血管新生スコアリングシステムにより測定した。高いスコア数は、高い血管密度を表したのに対し、０は、血管新生が無かったことを示した。各個々の実験について対照試料から得られた平均スコアで割ったその部位で記録されたスコアを使用して、各投与部位での阻害のパーセントを計算した。８〜１０の胚からその投与ついて得られた全ての結果をプールすることにより、所与の化合物の各投与に対する阻害のパーセントを計算した。
投与のための最終細胞懸濁液の正規化のために、各細胞調製物に添加された培地の量
【表３】
2017537057.tif 000005
継代６回のＰＤＡＣを使用した。
【０２５２】
結果
血管密度スコアの結果を、図７に提示する。結果は、ＰＤＡＣ細胞懸濁液、または１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、またはＭＤＡＭＢ２３１乳癌細胞懸濁液で処理されたニワトリ漿尿膜の血管密度スコアは、ビヒクル対照ＣＡＭのものと比較して統計的に有意に高かったことを明確に示す（Ｐ＜０．００１、スチューデントの「ｔ」検定）。ＰＤＡＣを培養するために使用される培地（陰性対照）は、血管密度に何ら影響を及ぼさなかった。さらに、ＰＤＡＣ調製物の血管密度の誘導は、多少の変動を示したが、変動は、統計的に有意ではなかった。
【０２５３】
６．３．２  ＰＤＡＣ上清を使用したＣＡＭアッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＤＡＣからの上清試料を、上記のように第２のＣＡＭアッセイで使用した。ｂＦＧＦ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清を、陽性対照として使用し、培地及びビヒクルを、陰性対照として使用した。
【０２５４】
試験デザイン：試験は、各群に１０の胚を含む５群を含んでいた。試験のデザインを、表４に記載する。
試験デザイン−細胞上清を使用したＣＡＭアッセイ
【表４】
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ＰＤＡＣ上清を、継代６回の細胞から得た。
【０２５５】
ＣＡＭアッセイ手順：アッセイ手順は、上記セクション６．３．１に記載されたものと同じものであった。唯一の違いは、各幹細胞調製物またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの上清が試験材料として使用されたことであった。投与のために、各上清をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（容量で１：１）と混合し、４０μＬの混合物を、各胚に投与した。
【０２５６】
結果：血管密度スコア（図８を参照のこと）は、各幹細胞調製物の上清による血管形成の誘導が異なったことを示す。ＰＤＡＣからの上清試料は、それぞれ、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、及びＰ＜０．０２（スチューデントの「ｔ」検定）の血管誘導に有意な効果を示した。予想通り、陽性対照ｂＦＧＦも、上記ＣＡＭアッセイ番号１（Ｐ＜０．００１、スチューデントの「ｔ」検定）に示されるように血管形成の強力な誘導を示した。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞からの上清は、ビヒクル対照と比較して、血管形成に有意な誘導を示さなかった。先に示したように、培地単独は、何ら影響を及ぼさなかった。
【０２５７】
６．４  実施例４：ＰＤＡＣは、ニューロン保護効果を示す
本実施例は、ＰＤＡＣが、酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）侵襲アッセイを使用して、低酸素及び低グルコース条件で、ニューロン保護効果を有し、活性酸素種を低減させることを実証する。したがって、これらの結果は、ＰＤＡＣが、脳卒中または末梢血管疾患などの虚血状態の治療に有用であろうこと示す。
【０２５８】
ヒトニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ＃１５２０）を、製造業者の推奨により培養した。要約すると、培養容器を、３７℃で１時間、滅菌蒸留水中のポリ−Ｌ−リシン（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。容器を、２回蒸留したＨ２Ｏで３回洗浄した。ニューロン培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を、容器に添加し、インキュベーター内で３７℃に平衡化した。ニューロンを解凍し、遠心分離なしに容器に直接添加した。後続の培養中に、培地を、培養開始の翌日、及びその後１日おきに交換した。ニューロンは通常、４日目までに侵襲の準備ができていた。
【０２５９】
ＯＧＤ培地（ダルベッコ改変イーグル培地−グルコース不含）を、水浴中で培地を最初に温めることにより調製し、部分的に、液体培地中の酸素の溶解性を低減させた。溶存酸素を除去するために、０．５μｍの拡散石を使用して、１００％の窒素を、培地に３０分間バブリングした。ＨＥＰＥＳ緩衝液を、１ｍＭの終濃度で添加した。培地を、スパージの終わりに、直接ニューロンに添加した。ディップ式酸素センサを使用して酸素レベルの確認のために、培地の少量試料を等分した。酸素レベルは通常、０．９％〜約５．０％の酸素に低減した。
【０２６０】
ガス処理の前に、低酸素チャンバを、少なくとも４時間（好ましくは一晩）３７℃のインキュベーター内にチャンバを置くことにより準備した。培養容器中の培地を除去し、脱気された培地と交換し、培養容器を、低酸素チャンバ内に置いた。次に、低酸素チャンバを、少なくとも５分間、２０〜２５Ｌｐｍの速度で系を通した９５％のＮ２／５％のＣＯ２ガスでフラッシュした。系を、４時間、３７℃のインキュベーター内でインキュベーションし、１位時間後にもう一度チャンバを脱気した。
【０２６１】
侵襲手順の終わりに、ＯＧＤ培地を吸引し、温かい培地を、ニューロンに添加した。２４〜２８時間後に、ニューロン培地中に懸濁されたＰＤＡＣ及びニューロンを、６ウェルプレートの１ウェル当たりそれぞれ１００，０００細胞の同等の数でプレーティングし、ニューロンに添加し、６日間共培養した。
【０２６２】
各条件について６ウェルプレート中の無作為な場所の顕微鏡写真を撮った。代表的なニューロン形態を有する細胞を、特定し、神経突起の長さを記録した。神経突起の平均長は、ニューロンの健康状態と正相関し、ニューロン及びＰＤＡＣの共培養において、より長く、ＰＤＡＣが細胞を侵襲から保護していたことを示している。
【０２６３】
活性酸素種アッセイ
ＰＤＡＣは、低酸素時に、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、及びヘムオキシゲナーゼ遺伝子を発現することが見出された。活性酸素種発生剤としての過酸化水素を使用するアッセイにおいて、ＰＤＡＣの、活性酸素種を除去する及び細胞をこのような種から保護する能力を決定した。
【０２６４】
アッセイの説明：標的細胞（アストロサイト、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、６０００／ｃｍ２で、ポリ−Ｌ−リシンでプレコーティングされた９６ウェル黒ウェルプレートに播種した。アストロサイトを、５％の二酸化炭素と共に、３７℃で成長培地中に一晩付着させる。翌日、培地を除去し、細胞を、蛍光発生プローブである細胞透過性色素ＤＣＦＨ−ＤＡ（ジクロロフルオレシンジアセタート）とインキュベートした。過剰な染料を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはハンクの緩衝塩溶液で洗浄することにより除去した。次に、細胞を、３０〜６０分間、１０００μＭの過酸化水素の添加により、活性酸素種で侵襲した。次に、過酸化水素含有培地を除去し、無血清グルコース不含成長培地と交換した。ＰＤＡＣを、６０００／ｃｍ２で添加し、細胞を、さらに２４時間培養した。次に、細胞を、４８０Ｅｘ及び５３０Ｅｍの標準蛍光プレートリーダーで、読み取った。培地の活性酸素種含有量は、細胞サイトゾル中のＤＣＦＨ−ＤＡのレベルに正比例した。予め決定されたＤＣＦ標準曲線との比較により、活性酸素種含有量を測定した。全ての実験を、Ｎ＝２４で行った。
【０２６５】
アッセイのために、ウシ胎児血清を含まない細胞培地中で、２０×ＤＣＦＨ−ＤＡのストック溶液を１×に希釈すること及び均質に撹拌することにより、使用する直前に、１×ＤＣＦＨ−ＤＡを、調製した。過酸化水素（Ｈ２０２）希釈物を、必要に応じてＤＭＥＭまたはＤＰＢＳ中で調製した。細胞培地中で、細胞培地中で、１ｍＭのＤＣＦ標準液を希釈すること、１００μｌのＤＣＦ標準液を、蛍光測定に適する９６ウェルプレートに移すこと、及び、１００μｌの細胞溶解緩衝液を加えることにより、標準的な曲線を、０μＭ〜１０μＭの範囲の濃度の１：１０の希釈系列として、調製した。蛍光を、４８０Ｅｘ及び５３０Ｅｍで読み取った。
【０２６６】
結果：ＰＤＡＣは、アストロサイト共培養物中の活性酸素種の濃度を有意に低減させた。図９を参照のこと。
【０２６７】
６．５  実施例５：治療方法
６．５．１  胎盤幹細胞を使用した糖尿病性足部潰瘍の治療
Ｉ型糖尿病の５２歳男性は、左足に潰瘍を有する。糖尿病性足部潰瘍の診断を行う。診断後に、対象を、次のレジメンに従ってＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で治療する：１×１０６〜３×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、筋肉内投与する。該個人を、特に、ＤＦＵが、サイズが低減しているか、または閉鎖されているかを判定するために、ＤＦＵの任意の症状における改善の徴候について次の２４時間にわたって監視する。ＤＦＵの症状のいずれかが、監視期間中に改善する場合、治療的効果が確立される。
【０２６８】
６．６  実施例６：ＤＦＵ治療プロトコール
１８〜８０歳の、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を伴う糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する対象を、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で治療する。胎盤幹細胞を、次の用量１日目（治療の初日）及び８日目に筋肉内投与する：（ｉ）３×１０６のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞；（ｉｉ）１×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞；または、（ｉｉｉ）３×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞。
【０２６９】
臨床のエンドポイント
ＤＦＵを治療するためのＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性に対する主要臨床エンドポイントは、治療されているＤＦＵ（複数可）の閉鎖とすることができる。潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレッシングの必要性のない皮膚閉鎖により表すことができる。完全閉鎖は、閉鎖の判定後少なくとも４週間の、潰瘍閉鎖の保持により表すことができる。潰瘍閉鎖は、胎盤幹細胞で処理した後３ヶ月で評価することができる。
【０２７０】
ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の、ＤＦＵの治療についての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、（ｉ）治療後２４時間まで評価することができる有害事象の頻度及び重症度の低減；（ｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる潰瘍閉鎖までの時間；（ｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善；（ｉｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善；（ｉｖ）治療後２４ヶ月まで評価することができるＤＦＵのサイズ及び数の低減；（ｖ）治療後６ヶ月で評価することができる経皮酸素レベルの改善；（ｖｉ）治療後６ヶ月で評価することができる脈容量記録の改善；（ｖｉｉ）治療後２４時間まで評価することができる大切断までの時間；（ｖｉｉｉ）治療後２４時間まで評価することができるＷａｇｎｅｒの評価尺度の改善；（ｉｘ）治療後６ヶ月で評価することができるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善；ならびに、（ｘ）治療後２４時間まで評価することができる脚の安静時疼痛スコアの改善；ならびに、（ｘｉ）（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（例えば、Ｂａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  ２００３，  ２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）変化尺度の患者の全体的印象（例えば、Ｋａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍａｎ．  Ｍａｎｉｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，  １７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；及び／または、（ｉｖ）ＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度、で評価される、対象の生活の質の改善、を含むことができる。
【０２７１】
対象選択
次の適格基準が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコールが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮に入れる。
【０２７２】
対象は、治療プロトコールに適格となるために、次の条件を満たすべきである。
少なくとも１８歳以上の男性及び女性。
・関連する任意の試験の前に、インフォームドコンセント文書を理解して、自発的に署名する。
・試験訪問スケジュール及び他のプロトコール要件を厳守できる。
・１型または２型真性糖尿病。
・足趾上に存在する場合を除いて、少なくとも１ｃｍ２のサイズの従来の潰瘍治療に適切に応答していない１ヶ月間を超えるＷａｇｎｅｒの評価尺度のグレード１（全層のみ）またはグレード２の重症度の糖尿病性足部潰瘍。指標潰瘍の最大病変サイズは、≦６．２５ｃｍ２である。指標潰瘍の測定は、スクリーニング訪問時の（必要に応じて）デブリードマン後に、評価及び測定することになる。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の次の基準のうちの１つ以上を満たす対象。
ａ．ＡＢＩ≧０．４及び≦０．８またはＴＢＩ＞０．３０及び≦０．６５の末梢動脈疾患。
ｂ．２０〜４０ｍｍＨｇの間での経皮酸素（ＴｃＰＯ２）測定値。ＴｃＰＯ２で測定されたエリアは、浮腫及び肥厚した皮膚があってはならない。
・スクリーニング訪問後の次の３ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・スクリーニングは、失敗した再灌流介入の少なくとも１４日後及び成功した再灌流介入の少なくとも３０日後までは、始めてはならない。
・対象は、高血圧及び糖尿病ならびに継続的なケアを必要とする他の任意の慢性の病状に対し、適切な医学療法を受けているべきである。
・妊娠可能性のある女性（ＦＣＢＰ）は、スクリーニング時に血清妊娠検査で陰性で、かつ試験療法で治療する前に尿妊娠検査で陰性でなければならない。加えて、性的に活発なＦＣＢＰは、試験期間及びフォローアップ期間に、同時に、次の適切な形態の避妊方法、例えば、経口、注射用、または移植用ホルモン避妊；卵管結紮；ＩＵＤ；殺精子剤を有するバリア避妊具；または精管切除されたパートナー、のうちの２つを使用することに同意しなければならない。
・男性（精管切除術を受けている者を含む）は、試験期間及びフォローアップ期間に、ＦＣＢＰとの生殖性の性行為において、避妊（ラテックスコンドーム）をする時、バリア避妊（ラテックスコンドーム）を使用することに同意しなければならない。
【０２７３】
次の状態のうちの１つ以上を有する対象は、治療プロトコールから除外することができる。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす検査異常の存在を含む任意の状態。
・試験からのデータを解釈する能力を混乱させる任意の状態。
・ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、またはＢ型肝炎ウイルスでの活動性感染について陽性であることが知られている。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において肥満度指数＞４０の対象。
・スクリーニング時における、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）またはＡＬＴ（ＳＧＰＴ）＞２．５×正常上限（ＵＬＮ）。
・腎疾患食事療法試験式（Ｌｅｖｅｙ、２００６）を使用して計算された、スクリーニング時における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２、または過去１年以内に、ｅＧＦＲ低下＞１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の病歴。
・スクリーニング時における、アルカリホスファターゼ＞２．５×ＵＬＮ。
・スクリーニング時における、ビリルビンレベル＞２ｍｇ／ｄＬ（対象が、既知のギルバート病有しない限り）。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は、腹腔内投与の前に１週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指標潰瘍に、またはこれに隣接した活動性骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・スクリーニング／ランイン期間中に、≧３０％サイズが減少した、または増加した指標潰瘍。
・四肢虚血に起因する安静時疼痛。
・指標潰瘍を有する足における経皮酸素測定値≦２０ｍｍＨｇ。
・踵潰瘍。
・非管理高血圧（対象が少なくとも５分間座る及び安静にする間に取られた２回の独立した測定の、スクリーニング時の拡張期血圧＞１００ｍｍＨｇまたは収縮期血圧＞１８０ｍｍＨｇとして定義される）。
・管理不良の真性糖尿病（ヘモグロビンＡ１ｃ＞１２％または血清グルコースのスクリーニング≧３００ｍｇ／ｄｌ）。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名する前の過去６ヶ月間の、悪性心室性不整脈、ＣＣＳクラスＩＩＩ−ＩＶ狭心症、心筋梗塞／経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）／冠状動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）の病歴、次の３ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建、ＩＣＦに署名する前の過去６ヶ月間の、一過性虚血発作／脳血管障害、及び／またはニューヨーク心臓協会［ＮＹＨＡ］のステージＩＩＩ若しくはＩＶうっ血性心不全。
・異常なＥＣＧ：ＩＣＦに署名する前の３ヶ月間の新しい右脚ブロック（ＢＢＢ）≧１２０ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ＩＣＦに署名した時の、２年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ＩＣＦに署名する前の５年以内の悪性腫瘍の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・（ウシまたはブタ産生物、デキストラン４０、及びジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を含む）製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の９０日以内（若しくは５半減期のどちらか長い方）に、治験薬−任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されていない薬剤若しくはデバイス−を与えられている、またはこの試験の完了前に、別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
【０２７４】
臨床結果
１つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、ＤＦＵの治療におけるＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性が確認される。
【０２７５】
６．７  実施例７：代替ＤＦＵ治療プロトコール
少なくとも１８歳の、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を伴う糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する対象を、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で治療する。対象群Ｉ：３×１０６のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、１日目（治療の初日）、２９日目、及び５７日目に筋肉内投与する。対象群ＩＩ：３×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、１日目（治療の初日）、２９日目、及び５７日目に筋肉内投与する。対象群ＩＩＩ：プラシーボを、１日目（治療の初日）、２９日目、及び５７日目に筋肉内投与する。
【０２７６】
臨床のエンドポイント
ＤＦＵを治療するための、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性の主要な臨床エンドポイントは、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）；経皮酸素測定（ＴＣＯＭ）、近赤外線分光法、フルデオキシグルコース陽電子放出断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＦＧＤ  ＰＥＴ／ＣＴ）、ドップラー超音波、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、血管造影法、及び／または酸素測定の測定により評価する場合、四肢の血管機能の改善とすることができる。四肢の血管機能の改善は、治療後約１年で評価することができる。
【０２７７】
ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の、ＤＦＵの治療についての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、（ｉ）治療後約１年で評価することができる、指標潰瘍の潰瘍閉鎖及び完全な創傷閉鎖（潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレッシングの必要性のない皮膚閉鎖により表すことができ；完全閉鎖は、閉鎖の判定後少なくとも４週間は、潰瘍閉鎖の保持により表すことができる）。（ｉｉ）治療後約１年で評価することができる有害事象の頻度及び重症度の低減；（ｉｉｉ）治療後約１年で評価することができる、全ての潰瘍の数、サイズの低減及び指標潰瘍の５０％の閉鎖；（ｉｖ）治療後約１年で評価することができる治療された足の大切断までの時間の低減；（ｖ）治療後約１年で評価することができるＷａｇｎｅｒの評価尺度の改善；（ｖｉ）治療後約１年で評価することができるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善；（ｖｉｉ）治療後約１年で評価することができる脚の安静時疼痛スコアの改善；ならびに、（ｖｉｉｉ）ニューロパチーの変化の患者の全体的印象（ＰＧＩＣＮ）を使用して評価される場合の対象の生活の質の改善、を含むことができる。
【０２７８】
対象選択
次の適格基準が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコールが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮に入れる。
【０２７９】
対象は、治療プロトコールに適格となるために、次の条件を満たすべきである。
・少なくとも１８歳以上の男性及び女性。
・１型または２型真性糖尿病。
従来の潰瘍治療に適切に応答していない１ヶ月間を超えるＷａｇｎｅｒの評価尺度のグレード１（全層のみ）またはグレード２の重症度の糖尿病性足部潰瘍。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の次の基準のうちの１つ以上を満たす対象。
ａ．ＡＢＩ≧０．４及び≦０．８またはＴＢＩ＞０．３０及び≦０．６５の末梢動脈疾患。
ｂ．２０〜４０ｍｍＨｇの間での経皮酸素（ＴｃＰＯ２）測定。
・スクリーニング訪問後の次の３ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・投与は、失敗した再灌流治療の少なくとも１４日後及び成功した再灌流治療の少なくとも３０日後までは、始めてはならない。
【０２８０】
次の状態のうちの１つ以上を有する対象は、治療プロトコールから除外することができる。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす検査異常の存在を含む任意の状態。
・妊娠中または授乳中の女性。
スクリーニング時において肥満度指数＞４０の対象。
・腎疾患食事療法試験式（Ｌｅｖｅｙ、２００６）を使用して計算された、スクリーニング時に推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２、または過去１年以内に、ｅＧＦＲ低下＞１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の病歴。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は、腹腔内投与前の１週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指数潰瘍に、またはこれに隣接した既知の骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・四肢虚血に起因する安静時の四肢疼痛。
・非管理高血圧（対象が少なくとも５分間座る及び安静にする間に取られた２回の独立した測定の、スクリーニング時の拡張期血圧＞１００ｍｍＨｇまたは収縮期血圧＞１８０ｍｍＨｇとして定義される）。
・管理不良の真性糖尿病（ヘモグロビンＡ１ｃ＞１２％または血清グルコースのスクリーニング≧３００ｍｇ／ｄｌ）。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名する前の過去６ヶ月間の、悪性心室性不整脈、ＣＣＳクラスＩＩＩ−ＩＶ狭心症、心筋梗塞／経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）／冠状動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）の病歴、次の３ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建、ＩＣＦに署名する前の過去６ヶ月間の、一過性虚血発作／脳血管障害、及び／またはニューヨーク心臓協会［ＮＹＨＡ］のステージＩＩＩ若しくはＩＶうっ血性心不全。
・異常なＥＣＧ：ＩＣＦに署名する前の３ヶ月間の新しい右脚ブロック（ＢＢＢ）≧１２０ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ＩＣＦに署名した時の、２年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ＩＣＦに署名する前の５年以内の悪性腫瘍の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・（ウシまたはブタ産生物、デキストラン４０、及びジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を含む）製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の９０日以内（若しくは５半減期のどちらか長い方）に、治験薬−任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されていない薬剤若しくはデバイス−を与えられている、またはこの試験の完了前に、別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
【０２８１】
臨床結果
１つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、ＤＦＵの治療におけるＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性が確認される。
【０２８２】
６．８  実施例８：ＤＦＵ治療プロトコールの結果
糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する対象を、上記実施例６で概説したものと同様の第Ｉ相臨床試験において、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で治療した。
【０２８３】
１５人の対象を登録した。胎盤幹細胞を、次のレジメンに従って投与した。（ｉ）３×１０６のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、３人の対象に筋肉内投与した；（ｉｉ）１×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、３人の対象に筋肉内投与した；（ｉｉｉ）３×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、３人の対象に筋肉内投与した；及び、（ｉｖ）１×１０８のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、６人の対象に筋肉内投与した；
【０２８４】
治療に関連する重篤な有害事象（ＳＡＥ）または治療に関連する死亡は、記録されなかった。
【０２８５】
治療された対象のうちの７人が、胎盤幹細胞の投与の３ヶ月以内に陽性結果を示した。５人の対象が、潰瘍閉鎖を示した：２人の対象が、部分的（約５０％）潰瘍治癒を示した。足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の増加傾向が、治療された患者で観察された。さらに、ＡＢＩの増加が、ＤＦＵが治癒しなかった患者と比較して、ＤＦＵが治癒した患者で観察された。
【０２８６】
結果は、糖尿病性足部潰瘍を有するヒト対象への、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の筋肉内投与が安全で、良好な認容されたことを示す。さらに、結果は、糖尿病性足部潰瘍を有するヒト対象の、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での治療が、糖尿病性足部潰瘍の症状の改善、及び糖尿病性足部潰瘍の完全閉鎖をもたらすことができること示す。
【０２８７】
６．９  実施例９：胎盤幹細胞は、末梢動脈疾患の動物モデルにおける創傷治癒を促進する
６．９．１  ＰＤＡＣは、虚血マウスの血流量及び血管造影スコアを促進する
血管再生及び創傷治癒におけるＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性を評価するために、糖尿病性四肢虚血の外科マウスモデルを使用した。糖尿病性四肢虚血の効果をモデリングするために、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスに、後肢虚血（ＨＬＩ）手術を受けさせ、後続のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与あり、なしで、創傷修復、炎症、及び血管再生の種々のレベルについて監視した。
【０２８８】
後肢虚血（ＨＬＩ）手術を、記載されているように実施した。例えば、Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｋａｉ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  ３１（３）：１２８−１３２  （２００６）を参照のこと。
【０２８９】
ＨＬＩ手術の１日後、低温保存された胎盤幹細胞を、３７℃で解凍した。解凍後２時間以内に、５０μｌの胎盤幹細胞または５０μｌのビヒクル対照のいずれかを、外科的創傷の部位の近くに筋肉内投与した。胎盤幹細胞を、３，０００細胞、３０，０００細胞、または３００，０００細胞の投薬量で投与し、血流量及び血管造影スコアを、手術後１日目、１４日目、２８日目、４２日目、及び４９日目に決定した。非接触レーザードップラーを使用して、血流量を測定し、対応する手術をしない四肢の血流量に正規化した。血管造影スコアを、Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １９８１，  ３８（３−４）：３３９−４６に従って測定した。
【０２９０】
図１０Ａに示されるように、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与は、手術の２８日後に、ＨＬＩの開始後の血流量の増加及び観察期間の終わりまで持続することをもたらした。投与された胎盤幹細胞の全投薬量は、２８日目に有効であり、１投与当たり３０，０００細胞の投薬量は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、測定された全ての時点で有効であった。同様に、図１０Ｂに示されるように、３，０００または３０，０００のいずれかの胎盤幹細胞は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、血管造影スコアを改善するのに有効であった。これらのデータは、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与が、末梢動脈疾患及び２型糖尿病の動物モデルにおける虚血性創傷の治癒の臨床手段を改善することができることを示す。
【０２９１】
６．９．２  ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞は、虚血マウスの毛管密度及び血管成熟を促進する
ＨＬＩ手術を実施し、続いて、上記セクション６．９．１のようにＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の筋肉内投与を実施した。（ｉ）ビヒクル対照、（ｉｉ）３，０００のＰＤＡＣ、または（ｉｉｉ）３０，０００のＰＤＡＣ、のいずれかの投与後に、大腿四頭筋を取り出し、ＨＯＰＥ固定剤で固定し、パラフィンに包理した。組織を、標準的な手順に従って切片化及び染色した。各処置群の３つの代表的な動物からの３つの切片部分を、デジタル画像化及び定量化した。図１１に示されるように、いずれの投薬量のＰＤＡＣで処置された動物も、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、血管のＣＤ３１染色の増加（図１１Ａ及び１１Ｃ）ならびに血管壁のα平滑筋アクチンの増加（図１１Ｂ及び１１Ｄ）を示した。これらのデータは、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での虚血四肢の処置が、急性虚血傷害後の新しい血管の成長及び成熟を促進することができることを示した。
【０２９２】
６．９．３  ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞は、虚血組織において、筋肉修復を促進し、脂肪浸潤を低減する
ＨＬＩ手術及びＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での処置、続いて、大腿四頭筋の分離及び切片化を、上記セクション６．９．１及び６．９．２のように実施した。切片化された組織を、標準的な手順に従ってＨ＆Ｅで染色した。図１２に示されるように、胎盤幹細胞で処置された虚血動物は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、中心核を有する筋線維の数が多く、脂肪組織の浸潤が少なかった（矢印を参照のこと）。有核筋繊維は、筋肉再生に関連している一方、筋肉組織の脂肪組織浸潤は、筋肉の弱化及び変性に寄与すると考えられる前炎症性免疫応答に関連している（Ｄｏｎａｔｈ  ＆  Ｓｈｏｅｌｓｏｎ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｆｅｂ；１１（２）：９８−１０７）。合わせると、これらのデータは、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞が、虚血動物の筋肉再生を促進し、急性虚血傷害後の炎症性シグナル伝達を防ぎ得ることを示唆する。
【０２９３】
６．９．４  ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与は、後肢虚血後に、脂肪組織において、マクロファージ分化をＭ２表現型にシフトさせる
ＨＬＩ手術及びＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での処置を、上記セクション６．９．１のように実施した。手術の３日後及び１４日後の鼠径部脂肪パッドを、マクロファージの表現型を判定するために、単離し、ＤＡＰＩ及びＡｒｇ１またはＣＤ２０６のいずれかに対する抗体（Ｍ２マクロファージのマーカー）で染色した。図１３に示されるように、ＰＤＡＣで処置した動物は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、手術の３日後及び１４日後の両方で、抗炎症性Ｍ２マクロファージのレベルが高いことを示した。これらのデータは、Ｍ２マクロファージが、虚血傷害後に、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で処置された動物において非常に高いレベルを呈することを示す。
【０２９４】
６．９．５  ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の投与は、脂肪組織中のアディポカイン（ａｄｉｐｏｋｉｎｅ）産生を調節する
ＨＬＩ手術及びＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での処置、続いて、上記セクション６．９．４のような鼠径部脂肪パッドの分離後に、鼠径部脂肪パッドを、単一細胞懸濁液に解離させ、いくつかのサイトカインの分泌について分析した。要約すると、胎盤幹細胞で処置された及びビヒクル対照で処置された動物からの１×１０１５の脂肪細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし、ウェルの半分を、２４時間、１μｇ／ｍｌのリポ多糖体（ＬＰＳ）で刺激した。次に、刺激及び非刺激細胞からの上清を、単離し、ＭＡＰサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、サイトカインレベルを測定した。図１４に示されるように、前炎症性サイトカインＩＬ−６及びＴＮＦαは、ビヒクル対照で治療された動物と比較して、ＬＰＳ刺激後の胎盤幹細胞で処置された細胞懸濁液中で低減した一方、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、ＬＰＳ刺激後の胎盤幹細胞で処置された細胞懸濁液中で増加した。結果は、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞が、前炎症性サイトカインを阻害すること及び同時に抗炎症性サイトカインを促進することの両方により、脂肪細胞の炎症状態を調節することができること示す。
【０２９５】
６．１０  実施例１０：ＤＦＵ治療プロトコール
１８〜８０歳の、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を伴うまたは伴わない糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する対象を、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞で治療する。胎盤幹細胞を、次の用量で、１日目（治療の初日）及び８日目に筋肉内投与する：（ｉ）３×１０６のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞；（ｉｉ）１×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞；または、（ｉｉｉ）３×１０７のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞。
【０２９６】
臨床のエンドポイント
ＤＦＵを治療するためのＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性に対する主要臨床エンドポイントは、治療されているＤＦＵ（複数可）の閉鎖とすることができる。潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレッシングの必要性のない皮膚閉鎖により表すことができる。完全閉鎖は、閉鎖の判定後少なくとも４週間の、潰瘍閉鎖の保持により表すことができる。潰瘍閉鎖は、胎盤幹細胞で治療した後３ヶ月で評価することができる。
【０２９７】
ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の、ＤＦＵの治療についての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、以下を含むことができる：（ｉ）治療後２４時間まで評価することができる有害事象の頻度及び重症度の低減；（ｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる潰瘍閉鎖までの時間；（ｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善；（ｉｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができる足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善；（ｉｖ）治療後２４ヶ月まで評価することができるＤＦＵのサイズ及び数の低減；（ｖ）治療後６ヶ月で評価することができる経皮酸素レベルの改善；（ｖｉ）治療後２４時間まで評価することができる大切断までの時間；（ｖｉｉ）治療後２４時間まで評価することができるＷａｇｎｅｒの評価尺度の改善；（ｖｉｉｉ）治療後６ヶ月で評価することができるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄの基準の改善；（ｉｘ）治療後２４時間まで評価することができる脚の安静時疼痛スコアの改善；ならびに、（ｘ）（ａ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｂ）糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（例えば、Ｂａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  ２００３，  ２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；及び／若しくは（ｃ）変化尺度の患者の全体的印象（例えば、Ｋａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍａｎ．  Ｍａｎｉｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，  １７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；ならびに／または（ｉｖ）ＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標）尺度で評価される場合の対象の生活の質の改善。
【０２９８】
対象選択
次の適格基準が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞での治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコールが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮に入れる。
【０２９９】
対象は、治療プロトコールに適格となるために、次の条件を満たすべきである。
・少なくとも１８歳以上の男性及び女性。
・関連する任意の試験の前に、インフォームドコンセント文書を理解して、自発的に署名する。
・試験訪問スケジュール及び他のプロトコール要件を厳守できる。
・１型または２型真性糖尿病。
・足趾上に存在する場合を除いて、少なくとも１ｃｍ２のサイズの従来の潰瘍治療に適切に応答していない１ヶ月間を超えるＷａｇｎｅｒの評価尺度のグレード１（全層のみ）またはグレード２の重症度の糖尿病性足部潰瘍。指標潰瘍の最大病変サイズは、≦１０ｃｍ２である。指標潰瘍の測定は、スクリーニング訪問時の（必要に応じて）デブリードマン後に、評価及び測定することになる。
・スクリーニング訪問後の次の３ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・スクリーニングは、失敗した再灌流介入の少なくとも１４日後及び成功した再灌流介入の少なくとも３０日後までは、始めてはならない。
・対象は、高血圧及び糖尿病ならびに継続的なケアを必要とする他の任意の慢性の病状に対し、適切な医学療法を受けているべきである。
・妊娠可能性のある女性（ＦＣＢＰ）は、スクリーニング時に血清妊娠検査で陰性で、かつ試験療法で治療する前に尿妊娠検査で陰性でなければならない。加えて、性的に活発なＦＣＢＰは、試験期間及びフォローアップ期間に、同時に、次の適切な形態の避妊方法、例えば、経口、注射用、または移植用ホルモン避妊；卵管結紮；ＩＵＤ；殺精子剤を有するバリア避妊具；または精管切除されたパートナー、のうちの２つを使用することに同意しなければならない。
・男性（精管切除術を受けている者を含む）は、試験期間及びフォローアップ期間に、ＦＣＢＰとの生殖性の性行為において、避妊（ラテックスコンドーム）をする時、バリア避妊（ラテックスコンドーム）を使用することに同意しなければならない。
【０３００】
次の状態のうちの１つ以上を有する対象は、治療プロトコールから除外することができる。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす検査異常の存在を含む任意の状態。
・試験からのデータを解釈する能力を混乱させる任意の状態。
・ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、またはＢ型肝炎ウイルスでの活動性感染について陽性であることが知られている。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において肥満度指数＞４５の対象。
・スクリーニング時における、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）またはＡＬＴ（ＳＧＰＴ）＞２．５×正常上限（ＵＬＮ）。
・異常な腎機能のための腎臓透析。
・指標潰瘍を有する脚において、ＡＢＩ＜０．４及び／またはＴＢＩ＜０．３。
・スクリーニング時における、アルカリホスファターゼ＞２．５×ＵＬＮ。
・スクリーニング時における、ビリルビンレベル＞２ｍｇ／ｄＬ（対象が、既知のギルバート病有しない限り）。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は、腹腔内投与の前に１週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指標潰瘍に、またはこれに隣接した活動性骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・スクリーニング／ランイン期間中に、≧３０％サイズが減少した、または増加した指標潰瘍。
・四肢虚血に起因する安静時疼痛。
・指標潰瘍を有する足における経皮酸素測定値≦２０ｍｍＨｇ。
・踵潰瘍。
・非管理高血圧（対象が少なくとも５分間座る及び安静にする間に取られた２回の独立した測定の、スクリーニング時の拡張期血圧＞１００ｍｍＨｇまたは収縮期血圧＞１８０ｍｍＨｇとして定義される）。
・管理不良の真性糖尿病（ヘモグロビンＡ１ｃ＞１２％または血清グルコースのスクリーニング≧３００ｍｇ／ｄｌ）。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名する前の過去６ヶ月間の、悪性心室性不整脈、ＣＣＳクラスＩＩＩ−ＩＶ狭心症、心筋梗塞／経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）／冠状動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）の病歴、次の３ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建、ＩＣＦに署名する前の過去６ヶ月間の、一過性虚血発作／脳血管障害、及び／またはニューヨーク心臓協会［ＮＹＨＡ］のステージＩＩＩ若しくはＩＶうっ血性心不全。
・異常なＥＣＧ：ＩＣＦに署名する前の３ヶ月間の新しい右脚ブロック（ＢＢＢ）≧１２０ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ＩＣＦに署名した時の、２年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ＩＣＦに署名する前の５年以内の悪性腫瘍の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・（ウシまたはブタ産生物、デキストラン４０、及びジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を含む）製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の９０日以内（若しくは５半減期のどちらか長い方）に、治験薬−任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されていない薬剤若しくはデバイス−を与えられている、またはこの試験の完了前に、別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
【０３０１】
臨床結果
１つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、ＤＦＵの治療におけるＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞の有効性が確認される。
【０３０２】
６．１１  実施例１１：治療有効性のためのバイオマーカーとしての循環内皮細胞
Ｖｅｒｉｄｅｘ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、上記実施例８に記載された対象の循環内皮細胞の数を、試験期間の１日目、８日目、１４日目、及び２９日目に評価した。試験８日目〜試験２９日目の全体にわたって、治癒したＤＦＵ（ｎ＝５）を有する対象において、循環内皮細胞の統計的に有意な減少を観察した。図１５Ａを参照のこと；中央値の位置のノンパラメトリック検定を使用して、ベースライン（１日目、投与前）からの変化に対するＰ値を計算した。そのような減少は、非治癒のＤＦＵを有する対象では観察されたなかった。図１５Ｂを参照のこと。
【０３０３】
本実施例は、循環内皮細胞の数が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞でのＤＦＵの治療効果を評価するためのバイオマーカーとして使用できることを実証する。
【０３０４】
均等物：
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施形態による範囲に限定されない。実に、本明細書で提供される主題の種々の修正は、記載されているものに加えて、上述の記載及び添付の図から、当業者らには明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０３０５】
種々の刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書で引用され、それらの開示は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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