(57)【要約】バイオプリントされた三次元生体皮膚組織であって：真皮線維芽細胞を含む真皮層と；ケラチノサイトを含む表皮層とを含み、表皮層が真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成している、バイオプリントされた三次元生体皮膚組織を開示する。人工皮膚組織のアレイおよび人工皮膚組織の製造方法も開示する。2017537654.tif 000003
2017537654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a．真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが線維芽細胞を含む、真皮層；および
b．表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層
を含む、三次元人工生体皮膚組織であって、
但し、該表皮層が該真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成している、
三次元人工生体皮膚組織。
【請求項２】
真皮層が真皮線維芽細胞から本質的になる、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３】
表皮層がケラチノサイトから本質的になる、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４】
表皮層が初代ケラチノサイトから本質的になる、請求項3記載の皮膚組織。
【請求項５】
表皮層が初代ケラチノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項６】
表皮層が実質的に単層である、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項７】
表皮層が多層であり、ケラチノサイトの複数の層を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項８】
表皮層が、バイオプリンターからのエアロゾルスプレー付着によって真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項９】
表皮層が、真皮層のバイオプリントの直後に真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１０】
表皮層が、真皮層のバイオプリントおよびその後の融合の後に真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１１】
表皮層が真皮層と途切れることなく接触している、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１２】
表皮層の90%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１３】
表皮層の70%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１４】
表皮層の50%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１５】
表皮層が20〜500μm厚である、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１６】
表皮層が約150μm厚である、請求項15記載の皮膚組織。
【請求項１７】
真皮層が10〜1000μm厚である、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項１８】
真皮層が約500μm厚である、請求項17記載の皮膚組織。
【請求項１９】
表皮層が押し出し化合物を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項２０】
真皮層が押し出し化合物を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項２１】
表皮層がメラノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項２２】
表皮層がケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる、請求項21記載の皮膚組織。
【請求項２３】
ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する、請求項21記載の皮膚組織。
【請求項２４】
ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する、請求項21記載の皮膚組織。
【請求項２５】
分泌細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項２６】
分泌細胞が脂腺細胞を含む、請求項25記載の皮膚組織。
【請求項２７】
免疫細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項２８】
免疫細胞がランゲルハンス細胞を含む、請求項27記載の皮膚組織。
【請求項２９】
毛包幹細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３０】
癌細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３１】
人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３２】
真皮層および表皮層と接触している基底層を含み、基底層が基底ケラチノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３３】
基底層の細胞がKRT14(CK14)に対して陽性に染色される、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３４】
予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３５】
線維芽細胞およびケラチノサイトがヒト細胞である、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３６】
真皮層が少なくとも30体積%の生細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３７】
真皮層が少なくとも70体積%の生細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３８】
真皮層の腹側にある皮下層を含み、皮下層が皮下バイオインクを含み、皮下バイオインクが内皮細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項３９】
少なくとも1つのバイオインクが複数のオルガノイドを含み、オルガノイドが腺細胞または毛包細胞（follicle cell）を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４０】
表皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４１】
表皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４２】
表皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項40記載の皮膚組織。
【請求項４３】
真皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４４】
真皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４５】
真皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項44記載の皮膚組織。
【請求項４６】
試験物質を含み、試験物質が、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項４７】
試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項４８】
試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項４９】
試験物質が表皮層の頂端面と接触している、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項５０】
試験物質が表皮層と真皮層との間にある、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項５１】
試験物質が真皮層とプリント表面との間にある、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項５２】
試験物質が外側表面と接触している、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項５３】
試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント（discreet compartment）内にある、請求項46記載の皮膚組織。
【請求項５４】
治療物質を含む、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項５５】
治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項５６】
治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項５７】
治療物質が表皮層の頂端面と接触している、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項５８】
治療物質が表皮層と真皮層との間にある、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項５９】
治療物質が真皮層とプリント表面との間にある、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項６０】
治療物質が外側表面と接触している、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項６１】
治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内にある、請求項54記載の皮膚組織。
【請求項６２】
少なくとも1つの層の付着が、前の層の付着後に時間的に遅らされた、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項６３】
時間的遅延が10ミリ秒を超える、請求項62記載の皮膚組織。
【請求項６４】
皮膚組織が遺伝キメラである、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項６５】
皮膚組織が種キメラである、請求項1記載の皮膚組織。
【請求項６６】
インビトロアッセイ、薬物スクリーニングアッセイ、または化粧品アッセイを容易にするようにアレイに構成された、複数の請求項1記載の皮膚組織。
【請求項６７】
各組織間に少なくとも20μmのスペースを空けるように構成された、請求項66記載の複数の皮膚組織。
【請求項６８】
a．真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；
b．ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；
c．表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；
d．表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程；および
e．細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程
を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法。
【請求項６９】
真皮バイオインクを押し出しバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
表皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
真皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
【請求項７２】
支持材料をエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
【請求項７３】
真皮バイオインクが少なくとも30体積%、生細胞である、請求項68記載の方法。
【請求項７４】
表皮バイオインクが少なくとも30体積%、生細胞である、請求項68記載の方法。
【請求項７５】
表皮バイオインクが初代ケラチノサイトを含む、請求項68記載の方法。
【請求項７６】
表皮バイオインクが初代ケラチノサイトから本質的になる、請求項68記載の方法。
【請求項７７】
表皮バイオインクがメラノサイトを含む、請求項68記載の方法。
【請求項７８】
表皮バイオインクがケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
真皮バイオインクまたは表皮バイオインクが癌細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８２】
真皮バイオインクまたは表皮バイオインクが、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８３】
付着されたバイオインク中へ複数のオルガノイドを付着させる工程を含み、オルガノイドが腺細胞または毛包細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８４】
皮下バイオインクを調製する工程を含み、皮下バイオインクが内皮細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８５】
皮下バイオインクを少なくとも1つの表面上の表面上に付着させ、続いて真皮バイオインクを付着させる、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
表皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８７】
表皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項８８】
表皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
真皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９０】
真皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９１】
真皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
真皮バイオインクが押し出し化合物を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９３】
表皮バイオインクが押し出し化合物を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９４】
いずれかのバイオインクが分泌細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９５】
分泌細胞が脂腺細胞を含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
いずれかのバイオインクが免疫細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９７】
免疫細胞がランゲルハンス細胞を含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
いずれかのバイオインクが毛包幹細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項９９】
いずれかのバイオインクが癌細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項１００】
いずれかのバイオインクが、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項68記載の方法。
【請求項１０１】
真皮層および表皮層と接触している基底層を付着させる工程を含み、基底層が、基底ケラチノサイトを含むバイオインクを含む、請求項68記載の方法。
【請求項１０２】
組織をスキャフォールド上に付着させない、請求項68記載の方法。
【請求項１０３】
線維芽細胞およびケラチノサイトがヒト細胞である、請求項68記載の方法。
【請求項１０４】
試験物質を付着させる工程を含み、試験物質が、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項68記載の方法。
【請求項１０５】
試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１０７】
試験物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１０８】
試験物質を表皮層と真皮層との間に付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１０９】
試験物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１１０】
試験物質を、外側表面と接触した状態で付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１１１】
試験物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる、請求項104記載の方法。
【請求項１１２】
治療物質を付着させる工程を含む、請求項68記載の方法。
【請求項１１３】
治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１５】
治療物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１６】
治療物質を表皮層と真皮層との間に付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１７】
治療物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１８】
治療物質を、外側表面と接触した状態で付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１１９】
治療物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる、請求項112記載の方法。
【請求項１２０】
真皮バイオインク上への表皮バイオインクの付着において時間的遅延を含む、請求項68記載の方法。
【請求項１２１】
遅延が10ミリ秒を超える、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
a．人工皮膚組織である第1の人工組織であって、人工皮膚組織が：真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが真皮線維芽細胞を含む、真皮層と；表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層とを含み、該表皮層が該真皮層と接触して人工皮膚組織を形成している、第1の人工組織；ならびに
b．皮膚組織ではない第2の人工組織であって、前記人工皮膚組織と物理的にまたは流体的に接触して多組織システムを形成しており、第2の組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、第2の人工組織
を含む、三次元人工生体多組織システム。
【請求項１２３】
第1の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、請求項122記載の多組織システム。
【請求項１２４】
第2の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、請求項122記載の多組織システム。
【請求項１２５】
第2の人工組織が、肝臓組織、腎臓組織、骨組織、肺組織、脈管組織、脳組織、腸組織、胃組織、または食道組織である、請求項122記載の多組織システム。
【請求項１２６】
人工皮膚組織が、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項122記載の多組織システム。
【請求項１２７】
第2の人工組織が、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項122記載の多組織システム。
【請求項１２８】
真皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、真皮が真皮線維芽細胞を含み；但し、真皮は、真皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織。
【請求項１２９】
表皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮がケラチノサイトを含み；但し、表皮は、表皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組。
【請求項１３０】
a．真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；
b．ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；
c．表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；
d．表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程であって、表皮バイオインクの付着が、真皮バイオインクの付着後10ミリ秒を超えてかつ21日未満で生じる、工程
を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年11月5日に出願された米国出願第62/075,703号および2015年3月30日に出願された米国出願第62/140,381号の恩典を主張し、それらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
医薬品および化粧品産業では、毒物学スクリーニング、バリア機能分析、色素沈着研究のための皮膚モデル、ならびに腐食、刺激、炎症、および感染のためのモデルが利用される。
【発明の概要】
【０００３】
ヒト皮膚の三次元(3D)組織モデルは、医薬品産業および化粧品産業の両方における動物モデルの代替物として、ならびに臨床的には治療用組織移植片として、有益である。本明細書に記載される全層ヒト皮膚モデルは、線維芽細胞および結合組織を含む真皮コンパートメント、ならびに重層ケラチノサイトを含む表皮コンパートメントを含有する。モデルの複雑性は、追加の特殊な細胞タイプを組み入れることによって任意で増加され、例えば、色素沈着をモデル化するためにメラノサイトを表皮層中へ追加することができる。さらに、複雑性は、内皮細胞を含む皮下コンパートメントの追加によって加えられる。三次元環境において発達させた皮膚等価物を利用することの利点は、それらが二次元環境と比べてより生理学的に関連していることである。三次元コンフォーメーションにある細胞は、その後、二次元単層において培養される細胞とは異なる様式で、例えば、代替のシグナル伝達経路または異なる細胞外マトリックス相互作用によって、分化し得る。
【０００４】
本明細書に記載される人工組織は、バイオインク製剤化技術と、連続的付着プリント法およびエアロゾルスプレープリント法(例えば、インクジェット)とを組み合わせて、皮膚をモデル化するための新規の3D組織システムを作る。既存の皮膚モデルと比較した、皮膚をバイオプリントすることの一つの主な利点は、自動化プロセスの再現性である。皮膚をプリントすることの別の主な利点は、層状構造体が作製され得る時間枠である。現在の皮膚モデルは、成熟した層状構造体を得るために最低でも3週間を必要とすることが多い。本明細書に記載されるバイオプリントアプローチは、同時に細胞のシートを重ね合わせて真皮層および表皮層を作り、これらを次いで所定の期間成熟および分化させる。本開示に提示される新規の皮膚組織方法は、12日間以内に層状構造を示す。
【０００５】
ある態様において、本明細書に記載されるのは、三次元人工生体皮膚組織であって：真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが線維芽細胞を含む、真皮層と；表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層とを含み、但し、表皮層が真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。ある態様において、真皮層は真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、表皮層はケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮層は初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮層は初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮層は実質的に単層である。ある態様において、表皮層は多層であり、ケラチノサイトの複数の層を含む。ある態様において、表皮層は、バイオプリンターからのエアロゾルスプレー付着によって真皮層上へバイオプリントされている。ある態様において、表皮層は、真皮層のバイオプリントの直後に真皮層上へバイオプリントされている。ある態様において、表皮層は、真皮層のバイオプリントおよびその後の融合の後に真皮層上へバイオプリントされている。ある態様において、表皮層は真皮層と途切れることなく接触している。ある態様において、表皮層の90%超が真皮層と接触している。ある態様において、表皮層の70%超が真皮層と接触している。ある態様において、表皮層の50%超が真皮層と接触している。ある態様において、表皮層は20〜500μm厚である。ある態様において、表皮層は約150μm厚である。ある態様において、真皮層は10〜1000μm厚である。ある態様において、真皮層は約500μm厚である。ある態様において、表皮層は押し出し化合物を含む。ある態様において、真皮層は押し出し化合物を含む。ある態様において、表皮層はメラノサイトを含む。ある態様において、表皮層は、ケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる。ある態様において、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する。ある態様において、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する。ある態様において、皮膚組織は分泌細胞を含む。ある態様において、分泌細胞は脂腺細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は免疫細胞を含む。ある態様において、免疫細胞はランゲルハンス細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は毛包幹細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は癌細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層および表皮層と接触している基底層を含み、基底層は基底ケラチノサイトを含む。ある態様において、基底層の細胞はKRT14(CK14)に対して陽性に染色される。ある態様において、組織は、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。ある態様において、線維芽細胞およびケラチノサイトはヒト細胞である。ある態様において、真皮層は少なくとも30体積%の生細胞を含む。ある態様において、真皮層は少なくとも70体積%の生細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の腹側にある皮下層を含み、皮下層は皮下バイオインクを含み、皮下バイオインクは内皮細胞を含む。ある態様において、少なくとも1つのバイオインクは複数のオルガノイドを含み、オルガノイドは腺細胞または毛包細胞（follicle cell）を含む。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮膚組織は試験物質を含み、試験物質は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して前記皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、試験物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する。ある態様において、試験物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する。ある態様において、試験物質は表皮層の頂端面と接触している。ある態様において、試験物質は表皮層と真皮層との間にある。ある態様において、試験物質は真皮層とプリント表面との間にある。ある態様において、試験物質は外側表面と接触している。ある態様において、試験物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント（discreet compartment）内にある。ある態様において、皮膚組織は治療物質を含む。ある態様において、治療物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する。ある態様において、治療物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する。ある態様において、治療物質は表皮層の頂端面と接触している。ある態様において、治療物質は表皮層と真皮層との間にある。ある態様において、治療物質は真皮層とプリント表面との間にある。ある態様において、治療物質は外側表面と接触している。ある態様において、治療物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内にある。ある態様において、少なくとも1つの層の付着が、前の層の付着後に時間的に遅らされている。ある態様において、時間的遅延は10ミリ秒を超える。ある態様において、皮膚組織は遺伝キメラである。ある態様において、皮膚組織は種キメラである。ある態様において、皮膚組織は、インビトロアッセイ、薬物スクリーニングアッセイ、または化粧品アッセイを容易にするようにアレイに構成されている。ある態様において、アレイは、各組織間に少なくとも20μmのスペースを空けるように構成されている。
【０００６】
ある態様において、本明細書に記載されるのは、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であり、方法は以下を含む：真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程；および、細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。ある態様において、真皮バイオインクを押し出しバイオプリントによって付着させる。ある態様において、表皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる。ある態様において、真皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる。ある態様において、支持材料をエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる。ある態様において、真皮バイオインクは少なくとも30体積%、生細胞である。ある態様において、表皮バイオインクは少なくとも30体積%、生細胞である。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクまたは表皮バイオインクは癌細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクまたは表皮バイオインクは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む。ある態様において、方法は、付着されたバイオインク中へ複数のオルガノイドを付着させる工程を含み、オルガノイドは腺細胞または毛包細胞を含む。ある態様において、方法は、皮下バイオインクを調製する工程を含み、皮下バイオインクは内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクを少なくとも1つの表面上の表面上に付着させ、続いて真皮バイオインクを付着させる。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは押し出し化合物を含む。ある態様において、表皮バイオインクは押し出し化合物を含む。ある態様において、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する。ある態様において、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する。ある態様において、いずれかのバイオインクは分泌細胞を含む。ある態様において、分泌細胞は脂腺細胞を含む。ある態様において、いずれかのバイオインクは免疫細胞を含む。ある態様���おいて、免疫細胞はランゲルハンス細胞を含む。ある態様において、いずれかのバイオインクは毛包幹細胞を含む。ある態様において、いずれかのバイオインクは癌細胞を含む。ある態様において、いずれかのバイオインクは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む。ある態様において、方法は、真皮層および表皮層と接触している基底層を付着させる工程を含み、基底層は、基底ケラチノサイトを含むバイオインクを含む。ある態様において、組織をスキャフォールド上に付着させない。ある態様において、線維芽細胞およびケラチノサイトはヒト細胞である。ある態様において、方法は、試験物質を付着させる工程を含み、試験物質は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる。ある態様において、試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる。ある態様において、試験物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる。ある態様において、試験物質を表皮層と真皮層との間に付着させる。ある態様において、試験物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる。ある態様において、試験物質を、外側表面と接触した状態で付着させる。ある態様において、試験物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる。ある態様において、方法は、治療物質を付着させる工程を含む。ある態様において、治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる。ある態様において、治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる。ある態様において、治療物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる。ある態様において、治療物質を表皮層と真皮層との間に付着させる。ある態様において、治療物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる。ある態様において、治療物質を、外側表面と接触した状態で付着させる。ある態様において、治療物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる。ある態様において、方法は、真皮バイオインク上への表皮バイオインクの付着において時間的遅延を含む。ある態様において、遅延は10ミリ秒を超える。
【０００７】
別の局面において、本明細書に記載されるのは、以下を含む三次元人工生体多組織システムである：人工皮膚組織である第1の人工組織であって、人工皮膚組織が：真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが真皮線維芽細胞を含む、真皮層と；表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層とを含み、表皮層が真皮層と接触して人工皮膚組織を形成している、第1の人工組織；ならびに、皮膚組織ではない第2の人工組織であって、前記人工皮膚組織と物理的にまたは流体的に接触して多組織システムを形成しており、第2の組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、第2の人工組織。ある態様において、第1の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントは、バイオプリントされている。ある態様において、第2の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントは、バイオプリントされている。ある態様において、第2の人工組織は、肝臓組織、腎臓組織、骨組織、肺組織、脈管組織、脳組織、腸組織、胃組織、または食道組織である。ある態様において、人工皮膚組織は、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。ある態様において、第2の人工組織は、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。
【０００８】
ある態様において、本明細書に記載されるのは、真皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、真皮が真皮線維芽細胞を含み；但し、真皮は、真皮バイオインクからバイオプリントされて、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【０００９】
別の局面において、本明細書に記載されるのは、表皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮がケラチノサイトを含み；但し、表皮は、表皮バイオインクからバイオプリントされて、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【００１０】
別の局面において、本明細書に記載されるのは、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であり、方法は以下を含む：真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程であって、表皮バイオインクの付着が、真皮バイオインクの付着後10ミリ秒を超えてかつ21日未満で生じる、工程。
【００１１】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、真皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、真皮が真皮線維芽細胞を含み；但し、真皮は、真皮バイオインクからバイオプリントされて、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【００１２】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、表皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮がケラチノサイトを含み；但し、表皮は、表皮バイオインクからバイオプリントされて、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【００１３】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、試験物質を含む三次元人工生体皮膚組織であり、試験物質は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して前記皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。試験物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一にまたは不均一に存在し得る。試験物質は、表皮層の頂端面と接触した状態で、表皮層と真皮層との間に、真皮層とプリント表面との間に、真皮層、表皮層、もしくは真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に、または組織の任意の外側表面と接触した状態で、存在し得る。
【００１４】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、治療物質を含む三次元人工生体皮膚組織である。治療物質は、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一にまたは不均一に存在し得る。治療物質は、表皮層の頂端面と接触した状態で、表皮層と真皮層との間に、真皮層とプリント表面との間に、真皮層、表皮層、もしくは真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に、または組織の任意の外側表面と接触した状態で、存在し得る。
【００１５】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、真皮層および表皮層間の付着における時間的遅延を伴って構築された、三次元人工生体皮膚組織である。
【００１６】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であり、方法は以下を含む：真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程；および、細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。ある態様において、真皮バイオインクをバイオプリントによって付着させ、バイオプリントは、半固体または固体真皮バイオインクの押し出しを含む。ある態様において、真皮バイオインクの濃度は1 mL当たり500万〜5億個の細胞である。ある態様において、真皮バイオインクをバイオプリントによって付着させ、バイオプリントは、液体真皮バイオインクをインクジェットするまたはスプレーすることを含む。ある態様において、真皮バイオインクの濃度は1 mL当たり5万〜5000万個の細胞である。ある態様において、表皮バイオインクをバイオプリントによって付着させ、バイオプリントは、半固体または固体表皮バイオインクの押し出しを含む。ある態様において、表皮バイオインクの濃度は1 mL当たり500万〜5億個の細胞である。ある態様において、表皮バイオインクをバイオプリントによって付着させ、バイオプリントは、液体表皮バイオインクをインクジェットするまたはスプレーすることを含む。ある態様において、表皮バイオインクの濃度は1 mL当たり5万〜5000万個の細胞である。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは初代ヒトケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ヒトケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる。ある態様において、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する。ある態様において、方法は、付着されたバイオインク中へ複数のオルガノイドを付着させる工程を含み、オルガノイドは、脂腺細胞、腺細胞、または毛包細胞を含む。ある態様において、方法は、皮下バイオインクを調製する工程を含み、皮下バイオインクは内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクを、真皮バイオインクの付着前に表面上に付着させる。ある態様において、いずれかのバイオインクは癌細胞を含む。ある態様において、方法は、試験物質を付着させる工程を含み、試験物質は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、試験物質を表皮層の頂端面上に付着させる。ある態様において、表皮バイオインクを、真皮バイオインクが成熟する前に、真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に付着させる。ある態様において、表皮バイオインクを真皮バイオインク��に付着させ、真皮バイオインクの付着と表皮バイオインクの付着との間に100 msを超える遅延が存在する。ある態様において、付着されたバイオインクを少なくとも24時間成熟させる。ある態様において、任意の付着されたバイオインクは、任意のバイオインクの付着後少なくとも7日で、少なくとも70体積%の生細胞を含有し、但し、細胞は試験物質で処理されなかった。ある態様において、組織は、2つの異なるドナー起源の細胞を含む。ある態様において、成熟した組織神経支配、灌流可能なリンパ組織、および／または灌流可能な血管は、製作や成熟の間に形成されず、かつ、人工組織に存在しない。
【００１７】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であり、方法は以下を含む：真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程であって、バイオインクが半固体または固体であり、真皮バイオインクの濃度が1 mL当たり500万〜5億個の細胞である、工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程であって、表皮バイオインクの濃度が1 mL当たり5万〜5000万個の細胞である、工程；真皮バイオインクの押し出しによって表面上へ真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクをインクジェットするまたはスプレーすることによって、表皮バイオインクを付着させる工程；および、細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【００１８】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であり、方法は以下を含む：真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程であって、バイオインクが半固体または固体であり、真皮バイオインクの濃度が1 mL当たり500万〜5億個の細胞である、工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程であって、バイオインクが半固体または固体であり、表皮バイオインクの濃度が1 mL当たり500万〜5億個の細胞である、工程；真皮バイオインクの押し出しによって表面上へ真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクの押し出しによって、表皮バイオインクを付着させる工程；および、細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
特許または出願ファイルはカラーで作成された少なくとも1つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、請求および必要費用の支払いに応じて特許庁によって提供されるだろう。
【００２０】
【図１】本明細書に記載される人工皮膚組織の任意的な特徴を描写する図式的な構造体ダイヤグラムの非限定的な例を示す。
【図２】通常の皮膚組織において見られる重層表皮層、および特定の層を可視化するために適している例示的なバイオマーカーを示すダイヤグラムの非限定的な例を示す。
【図３】皮膚組織を製作する方法を描写する図式的なフローダイヤグラムの非限定的な例を示し；この場合、層状の人工皮膚組織を製作する方法は、連続的付着技術を使用して、表面上へ真皮細胞の層を付着させる工程、および連続的付着バイオプリント技術を使用して、真皮細胞の層上へ表皮細胞の層を付着させる工程を含む。
【図４】人工皮膚組織のマクロスケール写真の非限定的な例を示し；この場合、プリント後48時間での、連続的付着バイオプリント技術によって付着された、真皮層および表皮層を含む人工皮膚組織。
【図５】皮膚組織を製作する方法を描写する図式的なフローダイヤグラムの非限定的な例を示し；この場合、層状の人工皮膚組織を製作する方法は、連続的付着バイオプリント技術を使用して、表面上へ真皮細胞の層を付着させる工程、およびエアロゾルスプレーバイオプリント技術を使用して、真皮細胞の層上へ表皮細胞の単層(A)または複数の層(B)を使用して、付着させる工程を含む。示される他の態様(C)において、真皮細胞の層を、連続的付着バイオプリント技術を使用して表面上へバイオプリントし、続いて細胞外マトリックスの層を追加し、続いて表皮細胞の単層または複数の層を追加する。
【図６】皮膚組織を製作する方法を描写する図式的なフローダイヤグラムの非限定的な例を示し；この場合、層状の人工皮膚組織を製作する方法は、インクジェット付着バイオプリント技術を使用して、表面中へ真皮細胞の層を埋め込むために、付着させる工程、および、エアロゾルスプレーバイオプリントまたは連続的付着技術を使用して、真皮細胞の層上へ表皮細胞を付着させる工程を含む。
【図７】実験設計の非限定的な例を示し；この場合、実験設計は、本明細書に記載される人工皮膚組織を達成するために使用される様々なバイオプリント技術を描写する。
【図８】人工皮膚組織のマクロスケール写真の非限定的な例を示し；この場合、プリント直後(A)およびプリント後1日(B)での、真皮層を含む人工皮膚組織。
【図９】人工皮膚組織のマクロスケール写真の非限定的な例を示し；この場合、真皮層のプリント直後(A)、真皮層のプリント後24時間(B)、表皮層のプリント直後(C)、表皮層のプリント後24時間(D)、気液界面への組織の曝露後96時間(E)、および気液界面への組織の曝露後216時間(F)での、人工全層皮膚組織。
【図１０】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第2日での実施例1の組織のH&E染色(AおよびB)およびCK14の可視化のための免疫組織化学(CおよびD)を描写する。
【図１１】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第2日(A〜D)、プリント後第4日(E〜H)、およびプリント後第8日(I〜L)での実施例1の組織のH&E染色(A、C、E、G、I、およびK)およびCK14の可視化のための免疫組織化学(B、D、F、H、J、およびL)を描写する。
【図１２】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、直接的に表面上へエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着された上皮層のH&E染色(A)およびCK14の可視化のための免疫組織化学(B)を描写する。
【図１３】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例2の組織の2つ(第1の組織：A；第2の組織 B)のH&E染色を描写する(矢印は別個の基底層を示す)。
【図１４】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例2の組織の2つ(第1の組織：A〜D；第2の組織 E〜H)の、H&E染色(A、C、E、およびG)およびCK14の可視化のための免疫組織化学(B、D、F、およびH)を描写する。
【図１５】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例2の第3の組織のCK5/IVL/Dapi(AおよびC)およびCK10/Dapi(BおよびD)の可視化のための免疫組織化学を描写する。
【図１６】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、異なる方法論を使用してバイオプリントされた組織の比較を描写する(第10日での第1の組織(A)；第12日での第2の組織(B))。
【図１７】本明細書に記載される人工皮膚組織内の遺伝子発現についての例示的な実験データを示し；この場合、コラーゲン(COL1およびCOL4)、フィラグリン(FLG)、およびサイトケラチン(CK1およびCK10)についての遺伝子発現データ。
【図１８】真皮組織が表皮組織化および分化に対して有する効果を示す。(A)実験の略図である。(B)プリントされた組織の巨視的視点を示す。(CおよびF)真皮ペースト(バイオインク)を用いずに(C)または用いて(F)プリントされたH&E染色細胞の低倍率。(DおよびG)真皮ペースト(バイオインク)を用いずに(D)または用いて(G)プリントされたH&E染色細胞のより高い倍率。分化ケラチノサイトの別個の層は、真皮ペースト(バイオインク)を用いずに(E)または用いて(H)プリントされた細胞中において、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される。
【図１９】第12日でのバイオプリントされた皮膚組織の組織学的解析。H&E染色(A)、CK5/IVLに対する染色(B)、CK10(C)、トリクローム染色(D)、PCNAおよびコラーゲン(E)、ならびにTUNEL染色(F)を示す。
【図２０】第12日でのバイオプリントされた皮膚組織の遺伝子発現解析を示す。
【図２１】1% Triton X-100（商標）で処理されたバイオプリントされた皮膚組織のLDH活性(A)、IL-1α産生(B)およびアラマーブルーアッセイ(C)を示す。
【図２２】PBS処理対照(A、B、C、D、E、F)と比較しての、1% Triton X-100（商標）(G、H、I、J、K、L)で処理されたバイオプリントされた皮膚組織の組織学的解析を示す。細胞をH&E(AおよびG)、CK5(緑色)およびIVL(赤色)(BおよびH)、CK10(CおよびI)、トリクローム(DおよびJ)、PCNA(緑色)およびコラーゲン(赤色)(EおよびK)ならびにTUNEL(FおよびL)について染色した。
【図２３】48時間1% Triton X-100（商標）およびPBSで処理した後のバイオプリントされた皮膚組織からの真皮マーカーの遺伝子発現解析を示す。
【図２４】1% Triton X-100（商標）またはPBSでの処理後48時間後のバイオプリントされた皮膚組織からのIL1A遺伝子発現を示す。
【図２５】1% Triton X-100（商標）または5% SDSで処理されたバイオプリントされた皮膚組織のLDH活性(A)、IL-1α産生(B)およびアラマーブルーアッセイ(C)を示す。
【図２６】プリントされた組織へ試験物質を適用するためのプリント構成の非限定的な例を示す。
【図２７】プリントされた組織へ治療物質を適用するためのプリント構成の非限定的な例を示す。
【図２８】実施例6においてプリントされた三次元人工生体皮膚組織の2つの非限定的な例を示す。組織例1(A、C、E、G)および組織例2(B、D、F、H)。組織をH&E(AおよびB)；B(CK5)、(緑色)、およびインボルクリン(IVL)(赤色)(CおよびD)；コラーゲン4(COL4)(EおよびF)；ならびにコラーゲン7(COL7)(GおよびH)について染色した。
【図２９】天然の組織(A)、および三次元人工生体皮膚組織の非限定的な例(B)のH&E染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されるのは、ある態様において、真皮線維芽細胞を含む真皮層とケラチノサイトを含む表皮層とを含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮層が真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成しており、但し、真皮層が真皮バイオインクからバイオプリントされたか、表皮層が表皮バイオインクからバイオプリントされたか、または真皮層および表皮層が両方ともそれぞれのバイオインクからバイオプリントされた、三次元人工生体皮膚組織である。
【００２２】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、三次元人工生体皮膚組織のアレイであって、各皮膚組織は、真皮線維芽細胞を含む真皮層とケラチノサイトを含む表皮層とを含み、表皮層が真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成しており、但し、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方ともがバイオプリントされ、但し、アレイがスクリーニングアッセイにおける使用に適応している、三次元人工生体皮膚組織のアレイである。
【００２３】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であって、真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程；および、細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法である。
【００２４】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、以下を含む三次元人工生体多組織システムである：人工皮膚組織である第1の人工組織であって、人工皮膚組織が、真皮線維芽細胞を含む真皮層と、ケラチノサイトを含む表皮層とを含み、表皮層が真皮層と接触して人工皮膚組織を形成しており、皮膚組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、第1の人工組織；ならびに、皮膚組織ではない第2の人工組織であって、第2の人工組織が、前記人工皮膚組織と物理的にまたは流体的に接触して多組織システムを形成しており、第2の組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、第2の人工組織。
【００２５】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、真皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、真皮が真皮線維芽細胞を含み、但し、真皮は、真皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【００２６】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、表皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮がケラチノサイトを含み、但し、表皮は、表皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織である。
【００２７】
また、本明細書に記載されるのは、ある態様において、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法であって、真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程；ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程；表面上に真皮バイオインクを付着させる工程；表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程であって、表皮バイオインクの付着が、真皮バイオインクの付着後10ミリ秒を超えて生じる工程、を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法である。
【００２８】
特定の定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明確に特に指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのあらゆる言及は、特に明記のない限り、「および／または」を包含するように意図される。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「組織」は、細胞の集合体を意味する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「アレイ」は、複数の試験が1つのサンプルに対して行われることを可能にする、1つまたは複数の試験が複数のサンプルに対して行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された複数の要素の連合体（association）を含む科学的ツールを意味する。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「アッセイ」は、有機的または生物学的サンプル(例えば、細胞集合体、組織、器官、生物など)中における物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「コンパートメント」は、別個のタイプまたはサブタイプの組織、例えば、表皮、真皮、皮下もしくは基底；または特殊なオルガノイド、例えば、毛包（follicle）を作るように密着された細胞または細胞外マトリックス成分の連合体を意味する。オルガノイドは、専門機能を行う細胞の連合体である(例えば、毛包)。コンパートメントは、層状ジオメトリーを含み得るが、任意の幾何学的なまたは不規則な形状を有する細胞集塊も含み得る。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「層」は、複数細胞厚であるXおよびY面における細胞または細胞外マトリックス成分の連合体を意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は、1つの層を含む。他の態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は、複数の層を含む。様々な態様において、層は、細胞および／または細胞外マトリックス成分の隣接した、実質的に隣接した、または隣接していないシートを形成する。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織の各層は、X、Y、およびZ軸において複数の細胞を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は、細胞の層のみを含む。他の態様において、細胞外マトリックス成分の層が、細胞の層の間にプリントされ得る。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「バイオインク」は、バイオプリントにおいて使用するための液体、半固体、または固体組成物を意味する。いくつかの態様において、バイオインクは、細胞溶液、細胞集合体、細胞含有ゲル、多細胞体、または組織を含む。いくつかの態様において、バイオインクは固体または半固体であり得る。いくつかの態様において、バイオインクは、バイオプリントを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞性材料をさらに含む。いくつかの態様において、バイオインクは押し出し化合物を含む。いくつかの場合において、押し出し化合物は、バイオプリントプロセス後に除去されるように操作される。他の態様において、押し出し化合物の少なくとも一部分は、プリント後、細胞と共に取り込まれたままであり、除去されない。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「バイオプリント」は、自動化されたまたは半自動化された、コンピューター支援される、三次元のプロトタイピングデバイス(例えば、バイオプリンター)と適合性がある方法論を介して、細胞(例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞ペースト、細胞濃縮物、多細胞集合体、多細胞体など)の三次元の正確な付着を利用することを意味する。バイオプリントは、生きている細胞のプリントと適合性の方法、例えば、連続的および／または非連続的様式での押し出しを包含する。本文脈における押し出しは、オリフィスを通して半固体または固体バイオインクを押し進めることを意味し、バイオインクは、オリフィスを通して押し進められた後、ある程度、ある期間の間、その形状を保持する。バイオプリントはまた、エアロゾルスプレー法を包含し、細胞は、実質的に低い粘度の液体をミスト、スプレー、または液滴で表面上へイジェクトすることによって適用される。好適なバイオプリンターとしては、Organovo, Inc. (San Diego, CA)製のNovogen Bioprinter（登録商標）が挙げられる。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織の物理的構造体にとって不可欠でありかつ前記組織の損傷／破壊無しでは組織から除去することができない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料；例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。従って、用語「スキャフォールドレスの」は、予め形成されたスキャフォールドが、使用時に、人工組織の不可欠な部分ではなく、除去されているか、または人工組織の不活性コンポーネントとして残っていることを示唆するように意図される。「スキャフォールドレスの」は、「スキャフォールドフリーの」および「予め形成されたスキャフォールドを含まない」と交換可能に使用される。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒト、非ヒト動物、任意の哺乳動物、または任意の脊椎動物である、任意の個体を意味する。この用語は、「患者」、「レシピエント」および「ドナー」と交換可能である。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「試験物質」は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して前記皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている任意の生物学的、化学的または物理的な物質を指す。皮膚組織における変化の非限定的な例は、アレルギー反応、中毒反応、刺激反応；規定の分子状態によって測定される変化、例えば、mRNAレベルもしくは活性の変化、タンパク質レベルの変化、タンパク質修飾の変化もしくは後成的変化；または測定可能な細胞アウトカムを生じさせる変化、例えば、増殖、アポトーシス、細胞生存性、細胞分裂、細胞運動性、細胞骨格再配列、染色体数もしくは組成の変化であり得る。試験物質としては；全体的に、部分的に、単離された、または精製された、活性または不活性成分を含有する化学的組成物；物理的ストレッサー、例えば、光、UV光、機械的ストレス、熱、または冷気；生物学的な因子、例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、または真菌が挙げられるが、これらに限定されない。「試験物質」はまた、混合されたまたは別々に適用される複数の物質を指す。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「治療物質」は、対象における状態を治療するために使用され得る、活性成分を含有する任意の組成物を指す。活性成分の例としては、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、鎮痛薬、アヘン剤、血管収縮薬、血管拡張薬、ステロイド、ビタミン混合物またはサプリメント混合物が挙げられるが、これらに限定されない。「治療物質」はまた、混合されたまたは別々に適用される複数の物質を指す。治療物質はまた、皮膚を保護するかまたはその付着と移植部位で成長するその能力とを促進するために使用される任意の物質であり得る。これらとしては、皮膚保護薬、保湿剤、接着剤(生分解性もしくは非生分解性)、物理的バリア(生分解性もしくは非生分解性)、多孔性膜、または非多孔性膜が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「毒物学」は、組織と接触した場合の害についての任意の、生物学的な、化学的なまたは物理的な因子の評価を指す。毒物学試験についての因子の投与量は、推奨される、生理学的なまたは治療的な用量と考えられるものを上回るまたは下回る投与量範囲を含み得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「使用」は、当業者によって認識されるであろう組織の様々な可能な使用を包含する。これらの使用としては、非限定的な例として以下が挙げられる；対象中または上への人工組織のインプランテーションまたは移植；生物学的な、生物工学的なまたは薬理学的な発見の目的のために生物学的アッセイにおいて組織を含めること；催奇形物質試験を含む、毒物学試験；薬物動態ならびに薬物代謝および吸収ならびに皮膚浸透を決定するための試験を含む、薬理学試験；紫外線を含む任意の化学的または非化学的試験因子に対する、感作、真皮の任意の層の刺激または腐食を引き起こす可能性を決定するための試験を含む、美容的試験。「使用」はまた、バイオプリント後のインビトロでの、成熟、または組織密着のプロセスを指し得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「実質的に含まない」は、示される物質、組織タイプ、細胞タイプ、または構造体を2.0%未満、1.0%未満、0.1%未満、微量だけ含むか、または全く含まないことを意味する。
【００４３】
人工三次元皮膚組織
本明細書に開示される三次元皮膚組織は、技術水準に対する改善を示す。ヒト皮膚についての組織モデルは、毒性ポテンシャル、毒性効力を決定するための、および化学物質の危険同定のための、インビボモデルの代替物として、化粧品産業および医薬品産業の両方において価値がある。皮膚モデルは、インビボモデルの代替物として毒物学評価のために開発された。これらの皮膚モデルは、一般に、再構築されたヒト表皮の皮膚刺激および腐食について、それぞれ、経済協力開発機構(OECD)試験ガイドライン(TG)439および431に詳述される方法に従う。皮膚刺激は、最大4時間の試験化学物質の適用後に皮膚に可逆的な損傷を引き起こすことを指す[国連(UN)の化学品の分類および表示に関する世界調和システム(GHS)による定義]。皮膚腐食は、試験材料の適用後、表皮を通って真皮中への目に見える壊死として現れる、皮膚に不可逆的な損傷を引き起こすことを指す(UN GHS)。本明細書において提供されるのは、毒物学をモデル化するためのインビトロシステムとしての人工3D皮膚組織についての使用法の非限定的な例である。刺激剤または腐食剤としての試験物質の予測および分類に加えて、本明細書において提供されるのは、ネイティブな皮膚の形態、細胞反応性およびバリア機能を模倣するために十分に複雑であり、光毒性、遺伝毒性、感作、浸透、吸収、吸着を予測するために、および経皮的な薬物送達をモデル化するために使用することができる、インビトロヒト皮膚モデルである。
【００４４】
現在の皮膚モデルおよび天然の皮膚と比較して、本明細書に開示されるバイオプリントプラットフォームを用いて皮膚を製作することは、プロセスが自動化されることである。これはより大きな再現性およびスケーラビリティを可能にする。例えば、ハイスループットスクリーニング適用を含むスクリーニング適用において使用するための6、12、24、48、96、384または1536-ウェルプレートなどのウェルプレートフォーマット中へバイオインクをプリントするために、組織ジオメトリーを小型化することが可能である。自動化されたプラットフォームの別の主な利点は、それが、組織をバイオプリントすることに加えて、毒性試験について物質を投与するために利用され得ることである。皮膚モデルにおける現在の試験は、組織を製作するためおよびその組織へ試験材料を適用するための両方に必要な手動アプローチによって制限され、局所投与への適用が制限される。プリントプラットフォームの柔軟性は、手動アプローチでは可能でない、適用、付着、および組織中への組み入れのための様々な方法を可能にする。例えば、試験物は、インクジェット技術を使用して微細なミストでスプレーされ得るか、または連続的付着モジュールを使用して真皮層中へ注入され得る。皮膚毒物学モデルにおけるバイオプリントの第3の主な利点は、層状構造体が作製および試験され得る時間枠である。現在の3D皮膚モデルは、層状皮膚様構造体を得るために最低でも4週間を必要とすることが多い。バイオプリントアプローチは、同時にまたは遅れて細胞のシートを重ね合わせて真皮層および表皮層を作ることができ、これらを次いで所定の期間の間成熟および分化させることができる。バイオプリントプラットフォームは、手動アプローチでは可能でない縦断的研究を可能にし、何故ならば、試験物質が、プリントする間、組織へ曝露され得るかもしくは組織中へ組み入れられ得るか、または後の時点で成熟組織へ投与され得るためである。本開示に提示される皮膚組織試験方法は、層状構造を示す組織に対する潜在的に有毒な試験物質の適用および分析を可能にする。
【００４５】
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工生体皮膚組織は、1つまたは複数のコンパートメントまたは細胞層を含む。いくつかの態様において、人工皮膚組織は、真皮層または真皮コンパートメントから本質的になる。他の態様において、人工皮膚組織は、表皮層または表皮コンパートメントから本質的になる。さらに他の態様において、人工皮膚組織は、真皮層または真皮コンパートメントおよび表皮層または表皮コンパートメントを含む全層皮膚組織である。さらに他の態様において、人工皮膚組織は、真皮層または真皮コンパートメントおよび表皮層または表皮コンパートメントから本質的になる全層皮膚組織である。さらなる態様において、表皮層またはコンパートメントは重層化されている。いくつかの態様において、人工皮膚組織は、皮下層またはコンパートメントを含む。いくつかの態様において、人工皮膚組織は、基底層またはコンパートメントを含む。さらに他の態様において、皮膚組織は、表皮層、真皮層および皮下層から本質的になる。
【００４６】
いくつかの態様において、本明細書に記載される組織、アレイおよび方法は、1つまたは複数の接着細胞タイプ、またはその使用を含む。多くの細胞タイプが、人工皮膚組織中に含めるのに適している。例として、いくつかの態様において、人工皮膚組織は、真皮線維芽細胞およびケラチノサイトを含む。さらなる例として、いくつかの態様において、人工皮膚組織はメラノサイトを含む。さらなる例として、いくつかの態様において、人工皮膚組織は、分泌細胞および／または免疫細胞を含む。特定の態様において、人工皮膚組織は癌細胞を含む。特定の態様において、人工皮膚組織は、人工多能性幹(iPS)細胞または胚性幹(ES)細胞由来の細胞を含む。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は初代ヒト細胞である。
【００４７】
いくつかの態様において、細胞をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた細胞を密着させて人工皮膚組織を形成する。なおさらなる態様において、人工皮膚組織は、製作時または使用時に、予め形成されたスキャフォールドを含まないかまたは実質的に含まない。いくつかの場合において、バイオプリントは、ネイティブな組織の適切な細胞性を模倣する組織の製作を可能にする。いくつかの態様において、細胞を押し出し法によってバイオプリントする。いくつかの態様において、細胞をエアロゾルスプレー法によってバイオプリントする。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、それらが、三次元であり、予め形成されたスキャフォールドを含まず、細胞から本質的になり、かつ／または高い細胞密度(例えば、30%を超えて細胞性、40%を超えて細胞性、50%を超えて細胞性、60%を超えて細胞性、70%を超えて細胞性、80%を超えて細胞性、または90%を超えて細胞性)を有するという事実によって、先行技術によって製作された組織と区別される。
【００４９】
ネイティブな組織との区別
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、それらが、神経支配されない(例えば、神経組織を実質的に含まない)、成熟した血管を実質的に含まない、かつ／または血液成分を実質的に含まないという事実によって、ネイティブな(例えば、人工でないまたは製作されていない)組織と区別される。ある態様において、組織は灌流可能な血管を欠いている。例えば、様々な態様において、三次元人工皮膚組織は、血漿、赤血球、血小板などおよび／または内生的に生じた血漿、赤血球、血小板などを含まない。ある態様において、組織はヘモグロビンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、神経支配またはニューロンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、以下のいずれかのような神経細胞マーカーを発現する細胞を欠いている：βIIIチューブリン、MAP2、NeuNおよびニューロン特異性エノラーゼ。ある態様において、組織はリンパ管を含まない。ある態様において、組織は免疫細胞を含まない。ある態様において、組織はランゲルハンス細胞を含まない。ある態様において、組織はT細胞を含まない。ある態様において、細胞は、以下のタンパク質によってマークされる免疫細胞のいずれかを実質的に含まない：CD11c、DC-SIGN、CD11b、CD4、CD8、CD28、CD3、CD19、CD80、および／またはCD86。
【００５０】
本開示の組織は、培養下での長期の生存性によって特徴付けられる。伝統的な組織外植片は、インビトロ培養下で低い生存性を示す。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、培養下で7日以上後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、培養下で10日以上後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、培養下で14日以上後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、培養下で21日以上後も生存可能である。ある態様において、バイオプリントされた組織は、直接的にエクスビボでの組織よりも高い基礎代謝率を有する。ある態様において、バイオプリントされた組織は、直接的にエクスビボでの組織またはインビボでの組織よりも高い増殖率を有する。
【００５１】
ある態様において、バイオプリントの7日後、三次元人工皮膚組織の50%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの7日後、三次元人工皮膚組織の70%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの7日後、三次元人工皮膚組織の90%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの14日後、三次元人工皮膚組織の50%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの14日後、三次元人工皮膚組織の70%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの14日後、三次元人工皮膚組織の90%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの21日後、三次元人工皮膚組織の50%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの21日後、三次元人工皮膚組織の70%を超える細胞が生きている。ある態様において、バイオプリントの21日後、三次元人工皮膚組織の90%を超える細胞が生きている。
【００５２】
本開示の方法によって製作される組織の一つの利点は、新規かつ有利なキメラを形成する能力である。いくつかの態様において、人工皮膚組織は種キメラであり、組織の少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の別の細胞または細胞タイプとは異なる哺乳動物種に由来する。例えば、真皮バイオインクはマウス、ラット、または霊長動物起源の細胞を含有し、表皮バイオインクはヒト起源の細胞を含有する。いくつかの態様において、人工皮膚組織は遺伝キメラであり、少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の任意の他の細胞または細胞タイプの遺伝的背景とは異なる遺伝的背景(例えば、異なる遺伝子型など)に由来する。例えば、真皮バイオインクの真皮線維芽細胞は、特定のドナーに由来し得、表皮バイオインクのケラチノサイトまたはメラノサイトは、異なるドナーに由来し得、遺伝キメラが作られる。いくつかの態様において、人工皮膚組織は他のタイプのキメラである。例えば、真皮バイオインクは、形質転換された真皮線維芽細胞を含み得、表皮バイオインクは、形質転換されていない初代ケラチノサイトまたはメラノサイトを含み得る。ある態様において、真皮バイオインクは、非真皮起源の線維芽細胞を含有し得る。ある態様において、皮下バイオインクは、非真皮起源の内皮細胞を含有し得る。
【００５３】
図1はネイティブな皮膚組織の断面図を示す。図1に示されるように、ネイティブなヒト皮膚は、表皮層(ケラチノサイト)1(角質層1a、顆粒層1b、有棘層1c、および基底層1dをさらに含む)、真皮層2(真皮乳頭層2aおよび真皮網状層（peticular dermal layer）2bをさらに含む)、皮下脂肪組織層3、結合組織層4、ならびに筋肉層5を含む。
【００５４】
さらに、図1に示されるように、ネイティブなヒト皮膚は、ケラチノサイト6、メラノサイト7、線維芽細胞8(乳頭真皮線維芽細胞8aおよび網状真皮線維芽細胞8bを含む)、メルケル細胞9、ランゲルハンス細胞10、マクロファージ11、幹細胞12、内皮細胞13、上皮細胞14、脂肪細胞15、筋細胞16、ならびに感覚ニューロン17を含む。
【００５５】
さらに、図1に示されるように、ネイティブなヒト皮膚は、オルガノイド18、血管19、リンパ管20、毛包21、皮脂腺22、汗腺23、孔24、筋肉28、立毛筋29、マイスネル小体30、パチーニ小体31、ルフィーニ小体32、疎性結合組織33、密性結合組織34、および基底膜35を含む。
【００５６】
さらに、図1に示されるように、ネイティブなヒト皮膚は、いくつかの場合において、基底細胞癌25、扁平上皮癌26、および黒色腫27を含む。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織の1つまたは複数のコンポーネントはバイオプリントされ、これは、付加的な製造プロセスを含む。従って、そのような態様において、製造方法によって、製造者は、本明細書に記載される結果として生じる人工皮膚組織の組成を著しく制御する。従って、本明細書に記載される人工皮膚組織は、ネイティブな組織の層、構造体、コンパートメント、および／または細胞のいずれかを任意で含む。逆に、本明細書に記載される人工皮膚組織は、ネイティブな組織の層、構造体、コンパートメント、および／または細胞のいずれかを任意で欠く。
【００５８】
図1を参照して、いくつかの態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は、以下のいずれかより選択される層またはコンパートメントを含まない(例えば、欠く)：角質層1a、顆粒層1b、有棘層1c、および基底層1d；真皮乳頭層2aおよび真皮網状層2b、皮下脂肪組織層3、結合組織層4、ならびに筋肉層5。さらに、ある態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は：ケラチノサイト6、メラノサイト7、線維芽細胞8(乳頭真皮線維芽細胞8aおよび網状真皮線維芽細胞8bを含む)、メルケル細胞9、ランゲルハンス細胞10、マクロファージ11、幹細胞12、内皮細胞13、上皮細胞14、脂肪細胞15、筋細胞16、および感覚ニューロン17より選択される細胞を含まない。さらに、ある態様において、本明細書に記載される人工皮膚組織は：オルガノイド18、血管19、リンパ管20、毛包21、皮脂腺22、汗腺23、孔24、基底細胞癌25、扁平上皮癌26、黒色腫27、筋肉28、立毛筋29、マイスネル小体30、パチーニ小体31、ルフィーニ小体32、疎性結合組織33、密性結合組織34、および基底膜35より選択される構造体を含まない。
【００５９】
図2を参照して、通常のヒト皮膚組織は、基底層、有棘層、顆粒層、および角化層に重層化された表皮層を含み、これは基底膜上にあり、これは次に結合組織の層上にある。様々なバイオマーカーが、これらの層を可視化するために任意で利用される。
【００６０】
バイオインク
本明細書に記載される組織、アレイおよび方法は、3D皮膚組織構造体を作るためにバイオインク製剤およびバイオプリント法を伴う。ある態様において、バイオインクは、真皮、表皮、皮下、基底非細胞性バイオインク、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００６１】
本明細書に記載される組織、アレイおよび方法は、ケラチノサイト、線維芽細胞、および／またはメラノサイトまたは内皮細胞の組成物を含有する3D皮膚組織構造体を作るためにバイオインク製剤およびバイオプリント法を伴う。プリント法は、層またはコンパートメントをもたらしネイティブな皮膚を模倣するジオメトリーを作るためにバイオインクを利用する。バイオプリントされた組織は、任意で、真皮、表皮、または両方の組み合わせをモデル化する。様々な態様において、バイオインクは、ある割合のケラチノサイト、線維芽細胞、および／またはメラノサイトの細胞混合物を含有し、任意で生体材料サポートを含有する。他の態様において、バイオインクは、ある部分のケラチノサイト、メラノサイト、線維芽細胞(乳頭真皮線維芽細胞および網状真皮線維芽細胞を含む)、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、筋細胞、および感覚ニューロン細胞を含有し、任意で生体材料サポートを含有する。様々な態様において、プリント法は、コラーゲンなどのマトリックス支持材料で任意でコーティングされる、様々な細孔サイズを有する様々なプリント表面を利用する。いくつかの態様において、ヒドロゲルは任意で添加され、生体材料を支持するか、または細胞が存在しない省スペースの領域を構成する。様々な態様において、皮膚組織は、表皮バイオインク、真皮バイオインクまたは両方を含む。ある態様において、バイオインクは、特定の細胞タイプから本質的になる。
【００６２】
本質的になるとは、指定される細胞タイプが、存在する唯一の細胞タイプであるが、バイオインクが、他の非細胞性材料（押し出し化合物、ヒドロゲル、細胞外マトリックス成分、栄養および培地成分、無機塩および有機塩、酸および塩基、緩衝化合物、ならびに細胞生存、接着、増殖を促進するかまたはプリントを容易にする他の非細胞性成分を含むがこれらに限定されない）を含有してもよいことを意味する。
【００６３】
いくつかの態様において、バイオインクは、押し出し化合物(即ち、バイオインクの押し出し特性を変更する化合物)をさらに含む。押し出し化合物の例としては、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール(例えば、Pluronic F-127またはPF-127)、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリックス成分(およびその誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成ポリマー、ナノ繊維、および自己集合性ナノ繊維が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、押し出し化合物は、物理的、化学的、または酵素的手段によって、バイオプリント後に除去される。
【００６４】
好適なヒドロゲルとしては、コラーゲン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖類、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)およびプロテオグリカン（これは、例えば、コンドロイチン硫酸（chrondroitin sulfate）、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグレカン、パールカンを含有し得る）またはそれらの任意の組み合わせから誘導されるものが挙げられる。他の態様において、好適なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、好適なヒドロゲルとしては、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられる。様々な具体的な態様において、閉じ込め材料（confinement material）は：ヒドロゲル、NovoGel（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Matrigel（商標）、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリラート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン（silicon）、シルク、またはそれらの組み合わせより選択される。
【００６５】
ある態様において、バイオインクは粘稠液である。ある態様において、バイオインクは半固体である。ある態様において、バイオインクは固体である。ある態様において、バイオインクは半固体または固体である。ある態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズ未満である。
【００６６】
真皮バイオインク
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、真皮バイオインクを含む。ある態様において、真皮バイオインクは線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクはヒト真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは非真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクはヒト真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは非真皮線維芽細胞から本質的になる。
【００６７】
ある態様において、真皮バイオインクは、50体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、60体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、70%体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、80体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、90体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、95体積%を超える生細胞を含む。
【００６８】
ある態様において、真皮バイオインクは、エアロゾルスプレー法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり200万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり300万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり400万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個未満の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり4000万個未満の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり3000万個未満の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万個未満の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万個未満の細胞を含む。
【００６９】
ある態様において、真皮バイオインクは、押し出し法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜1億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜5億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜4億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜3億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜2億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個を超える細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億個を超える細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2億個を超える細胞を含む。
【００７０】
表皮バイオインク
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、表皮バイオインクを含む。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトおよびメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトおよび初代メラノサイトを含む。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は表皮バイオインクから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは初代メラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよび初代メラノサイトを含む、から本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒトケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒトメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒトメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒト初代ケラチノサイトおよびヒト初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒトケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒトメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒトメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代メラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒト初代メラノサイトを含む、から本質的になる。
【００７１】
ある態様において、表皮バイオインクは、指定される比率での、ケラチノサイトおよびメラノサイト（初代または非初代）を含む、から本質的になる、またはからなる。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約75:25〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約80:20〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約85:15〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約88:12〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約89:11〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約90:10〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約91:9〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約94:6〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約95:5〜約99:1である。ある態様において、ケラチノサイト対メラノサイトの比率は、約96:4〜約99:1である。
【００７２】
ある態様において、表皮バイオインクは、50体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、60体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、70体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、80体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、90体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、95体積%を超える生細胞を含む。
【００７３】
ある態様において、表皮バイオインクは、エアロゾルスプレー法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり200万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり300万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり400万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個未満の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり4000万個未満の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり3000万個未満の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万個未満の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万個未満の細胞を含む。
【００７４】
ある態様において、表皮バイオインクは、押し出し法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜1億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜5億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜4億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜3億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜2億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個を超える細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり1億個を超える細胞を含む。ある態様において、表皮バイオインクは、1ミリリットル当たり2億個を超える細胞を含む。
【００７５】
皮下バイオインク
ある態様において、皮下バイオインクは、内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞および線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞およびヒト線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞およびヒト初代線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクは線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞および線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞およびヒト線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞およびヒト初代線維芽細胞から本質的になる。
【００７６】
ある態様において、皮下バイオインクは、50体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、60体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、70体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、80体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、90体積%を超える生細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、95体積%を超える生細胞を含む。
【００７７】
ある態様において、皮下バイオインクは、エアロゾルスプレー法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり5万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり10万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり50万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり100万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり200万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり300万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり400万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個未満の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり4000万個未満の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり3000万個未満の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万個未満の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万個未満の細胞を含む。
【００７８】
ある態様において、皮下バイオインクは、押し出し法によって層または個々のコンパートメントとして適用することができる。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり500万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜1億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万〜5000万個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜5億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜4億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜3億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1億〜2億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり2500万〜2億個の細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万個を超える細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり1億個を超える細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは、1ミリリットル当たり2億個を超える細胞を含む。
【００７９】
非細胞性バイオインク
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、非細胞性バイオインクを含む。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、細胞外マトリックスタンパク質またはペプチド、例えば、コラーゲンまたはフィブリノーゲン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖類、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)およびプロテオグリカン（これは、例えば、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグレカン、パールカンを含有し得る）またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の態様において、好適なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、好適なヒドロゲルとしては、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられる。様々な具体的な態様において、閉じ込め材料は：ヒドロゲル、NovoGel（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Matrigel（商標）、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリラート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン、シルク、またはそれらの組み合わせより選択される。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、ヒドロゲルまたは他の支持材料、クッション材料もしくは閉じ込め材料を含む。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、無機または合成ポリマーを含まない。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは死細胞残屑を含まない。
【００８０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織、アレイ、および方法は、3D皮膚モデルへ連続的付着プリントを組み入れる。連続的付着は、真皮および／または表皮を模倣する単一のまたは複数の層をもたらすために任意で利用される。一態様において、線維芽細胞から構成されるバイオインクは、真皮を模倣する組織をもたらすためにプリントされる。他の態様において、ケラチノサイトまたはケラチノサイトおよびメラノサイトの混合物から構成されるバイオインクは、表皮を模倣する組織をもたらすためにプリントされる。第3の態様は、バイオインクを組み合わせて、真皮バイオインクの上部に表皮バイオインクを同時に付着させる。連続的付着プリントは、細胞が正確なジオメトリー内に置かれることを可能にし、かつ、Novogel（登録商標）2.0、Novogel（登録商標）3.0、および細胞ペーストを含むがこれらに限定されない複数のバイオインク製剤の使用を可能にする点で、現在の3D皮膚モデルに対する利点を提供する。連続的付着は、Novogel（登録商標）製剤および様々なプリント表面中への様々な生体材料の任意的な組み入れを可能にし、細胞外マトリックスの産生および分化を促進する。
【００８１】
組織構造
本明細書に記載される三次元人工皮膚組織、アレイ、および方法は、多層の、コンパートメント化された人工構築物の作製を可能にする。これらの層は、表面上に配置されるバイオインクによって形成される。バイオインクは、次いで、密着し、複数の層および／または不連続コンパートメントを有する単一の組織を形成する。ある態様において、組織層またはコンパートメントは構造的に別個である。ある態様において、皮膚組織は表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は真皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は皮下層を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された、非細胞性層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された（deposed）、真皮層の上部に配置された非細胞性層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、組織層は構造的に別個である。ある態様において、皮膚組織は表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は真皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は皮下層からなる。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された、非細胞性層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された非細胞性層の上部に配置された表皮層からなる。
【００８２】
本明細書に記載される三次元人工皮膚組織、アレイ、および方法は、多層の、コンパートメント化された人工構築物の作製を可能にする。ある態様において、コンパートメントは、組織内にまたはx、yおよびz面に広がる組織の層内に埋め込まれた不連続の構造体である。ある態様において、単一のコンパートメントが単一の層内に埋め込まれている。ある態様において、単一のコンパートメントが複数の層内に埋め込まれている。ある態様において、複数のコンパートメントが複数の層内に埋め込まれている。ある態様において、皮膚組織は、複数のコンパートメントを含む。ある態様において、コンパートメントは、互いに接触している。ある態様において、皮膚組織は、コンパートメント間で10μm以上分離して配置された複数のコンパートメントを含む。ある態様において、コンパートメントは、表皮、真皮、皮下または非細胞性バイオインクを含む。ある態様において、コンパートメントまたは複数のコンパートメントは、特殊な細胞タイプ、例えば、皮脂腺細胞、毛包細胞（follicular cell）、内皮細胞、筋細胞、平滑筋細胞、リンパ節を含む。ある態様において、コンパートメントは表皮層中に埋め込まれている。ある態様において、コンパートメントは真皮層中に埋め込まれている。ある態様において、コンパートメントは、皮下層中に埋め込まれている。コンパートメントは、球状、立方体様、長方形、菱形または任意の不規則な形状であり得る。ある態様において、コンパートメントは、1つまたは複数の層を通って延び、表面で開いている管を形成する。
【００８３】
ある態様において、コンパートメントは複数の細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは10個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは100個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは500個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは1,000個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは5,000個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは10,000個を超える細胞の集塊である。ある態様において、コンパートメントは50,000個を超える細胞の集塊である。
【００８４】
ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で1細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で10細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で20細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で50細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で100細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で500細胞厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で5000細胞厚を超える。
【００８５】
ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で5μm厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で10μm厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で20μm厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で50μm厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で100μm厚を超える。ある態様において、コンパートメントは、その最小の寸法で500細胞厚を超える。
【００８６】
ある態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織、アレイ、および方法は、真皮層および表皮層と接触している基底層を含む。ある態様において、基底層は表皮層と真皮層との間にある。ある態様において、基底層は基底ケラチノサイトを含む。ある態様において、基底層は、分離した構造的に別個の層である。ある態様において、基底ケラチノサイトは、非基底ケラチノサイトと比較してKRT14(CK14)の増加した発現を示す。ある態様において、基底ケラチノサイトは、非基底ケラチノサイトと比較してKRT5(CK5)の増加した発現を示す。ある態様において、基底層は1細胞厚である。ある態様において、基底層は2細胞厚を超える。ある態様において、基底層は3細胞厚を超える。ある態様において、基底層は5細胞厚を超える。ある態様において、基底層は10細胞厚を超える。ある態様において、基底層は50細胞厚を超える。ある態様において、基底層は100細胞厚未満である。ある態様において、基底層は50細胞厚未満である。ある態様において、基底層は10細胞厚未満である。
【００８７】
ある態様において、表皮層は単層である。ある態様において、表皮層は1細胞厚を超える。ある態様において、表皮層は2細胞厚を超える。ある態様において、表皮層は3細胞厚を超える。ある態様において、表皮層は10細胞厚を超える。ある態様において、表皮層は50細胞厚を超える。ある態様において、表皮層は100細胞厚を超える。
【００８８】
ある態様において、真皮層は単層である。ある態様において、真皮層は1細胞厚を超える。ある態様において、真皮層は2細胞厚を超える。ある態様において、真皮層は3細胞厚を超える。ある態様において、真皮層は10細胞厚を超える。ある態様において、真皮層は50細胞厚を超える。ある態様において、真皮層は100細胞厚を超える。
【００８９】
ある態様において、皮下層は単層である。ある態様において、皮下層は1細胞厚を超える。ある態様において、皮下層は2細胞厚を超える。ある態様において、皮下層は3細胞厚を超える。ある態様において、皮下層は10細胞厚を超える。ある態様において、皮下層は50細胞厚を超える。ある態様において、皮下層は100細胞厚を超える。
【００９０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織、アレイ、および方法は、独特な組織構造を可能にする。バイオインクを付着させ、層または不連続コンパートメントを形成する。ある態様において、表皮組織層および真皮組織層は、直接接触しているか、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20μmもしくはそれ以上（その中のインクリメントを含む）分離している、分離した構造的に別個の層である。ある態様において、分離は、2つの層間における細胞外マトリックスの分泌および付着に起因し、これは、本開示の目的において接触と見なされる。ある態様において、非細胞性バイオインクの層が、表皮層と真皮層との間に位置している。ある態様において、非細胞性バイオインクの層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100μmまたはそれ以上の厚さである。ある態様において、表皮細胞層は、真皮層と接触している。
【００９１】
ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントと途切れることなく接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの99%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの98%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの95%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの90%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの80%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの70%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層またはコンパートメントの60%超は、真皮層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、表皮細胞層は単層である。ある態様において、表皮細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、表皮細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、表皮細胞層は単層である。ある態様において、真皮細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、真皮細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の細胞を上回る厚さである。ある態様において、表皮細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を下回る厚さである。ある態様において、表皮細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の層を下回る厚さである。ある態様において、真皮細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を下回る厚さである。ある態様において、真皮細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の細胞を下回る厚さである。
【００９２】
ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントは、皮下細胞層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントは、皮下細胞層またはコンパートメントと途切れることなく接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの99%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの98%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの95%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの90%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの80%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの70%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、真皮細胞層またはコンパートメントの60%超は、皮下層またはコンパートメントと接触している。ある態様において、皮下細胞層は単層である。ある態様において、皮下細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、皮下細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、皮下細胞層は単層である。ある態様において、皮下細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を上回る厚さである。ある態様において、真皮細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の細胞を上回る厚さである。ある態様において、皮下細胞層は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の層を下回る厚さである。ある態様において、皮下細胞層は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の層を下回る厚さである。
【００９３】
ある態様において、三次元人工皮膚組織の表皮層の厚みは変えることができる。ある態様において、表皮層の厚みは約20〜約500μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約20〜約400μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約20〜約300μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約20〜約200μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約50〜約500μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約100〜約500μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約100〜約200μmである。ある態様において、表皮層の厚みは約20μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約30μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約40μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約50μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約75μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約100μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約125μmを超える。ある態様において、表皮層の厚みは約500μm未満である。ある態様において、表皮層の厚みは約400μm未満である。ある態様において、表皮層の厚みは約300μm未満である。ある態様において、表皮層の厚みは約200μm未満である。ある態様において、表皮層の厚みは約150μmである。
【００９４】
ある態様において、三次元人工皮膚組織の真皮層の厚みは変えることができる。ある態様において、真皮層の厚みは約10〜約1000μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約100〜約1000μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約200〜約1000μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約300〜約1000μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約400〜約1000μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約100〜約900μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約100〜約800μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約100〜約700μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約100〜約600μmである。ある態様において、真皮層の厚みは少なくとも約100μmである。ある態様において、真皮層の厚みは少なくとも約200μmである。ある態様において、真皮層の厚みは少なくとも約300μmである。ある態様において、真皮層の厚みは少なくとも約400μmである。ある態様において、真皮層の厚みは約2000μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約1500μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約1000μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約900μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約800μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約700μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約600μm未満である。ある態様において、真皮層の厚みは約500μmである。
【００９５】
ある態様において、三次元人工皮膚組織の皮下層の厚みは変えることができる。ある態様において、皮下層の厚みは約20μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約30μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約40μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約50μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約75μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約100μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約200μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約300μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約400μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約500μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約125μmを超える。ある態様において、皮下層の厚みは約500μm未満である。ある態様において、皮下層の厚みは約400μm未満である。ある態様において、皮下層の厚みは約300μm未満である。ある態様において、皮下層の厚みは約200μm未満である。ある態様において、皮下層の厚みは約150μmである。
【００９６】
ある態様において、真皮層を生体適合性表面へ付着させ、表皮層を真皮層の上部に配置する。ある態様において、表皮層は真皮層を完全に覆う。ある態様において、表皮層は、真皮層の95%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの90%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの90%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの70%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの60%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの50%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの40%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの30%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの20%超を覆う。ある態様において、表皮層またはコンパートメントは、真皮層またはコンパートメントの10%超を覆う。
【００９７】
ある態様において、皮下層を生体適合性表面へ付着させ、真皮層を真皮層の上部に配置する。ある態様において、真皮層は皮下層を完全に覆う。ある態様において、真皮層は皮下層の95%超を覆う。ある態様において、真皮層は皮下層の90%超を覆う。ある態様において、真皮層は真皮層の90%超を覆う。ある態様において、真皮層は皮下層の70%超を覆う。ある態様において、真皮層は皮下層の60%超を覆う。ある態様において、真皮層は皮下層の50%超を覆う。
【００９８】
いくつかの局面において、三次元人工皮膚組織は、実質的に平らである。いくつかの局面において、皮膚組織は、10%未満の曲率で平らである。いくつかの局面において、皮膚組織は、20%未満の曲率で実質的に平らである。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.01 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.02 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.03 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.04 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.05 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.06 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.07 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.08 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.09 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.10 cm2である。いくつかの態様において、尿細管モデルの表面積は少なくとも0.11 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は少なくとも0.12 cm2である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は0.2 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は0.4 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は0.5 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は0.8 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は1.0 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は2.0 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は3.0 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は4.0 cm2未満である。いくつかの態様において、皮膚組織の表面積は5.0 cm2未満である。
【００９９】
ある態様において、組織は、任意の好適な形状、例えば、正方形、楕円形、楕円体、円形、台形、菱形、球状、立方体様などであり得る。
【０１００】
製造方法
図3を参照して、例えば、特定の態様において、連続的付着バイオプリント技術は、コラーゲンコーティングプリント表面上へ層状組織をプリントするために使用される。この態様において、真皮細胞がトランスウェル表面上へバイオプリントされ、真皮層が形成される。その後、表皮細胞が真皮細胞の上部にバイオプリントされ、表皮層が形成される。最後に、層状組織を細胞培養環境において成熟させる。
【０１０１】
図4を参照して、特定の態様において、連続的付着技術を使用してバイオプリントされた真皮層および表皮層を含有する人工皮膚組織を、プリント後48時間成熟させた。
【０１０２】
本明細書に記載される人工組織および方法論の利点は、それらが、元の細胞タイプの機能性を損なうことなく、構造体の形状の保持を可能にすることである。バイオプリントされた構造体の形状は、有利なことに複数のアプローチによって維持される。実施例1において、プリントされたバイオインク構造体は、Novogel（登録商標）3.0を利用し、これを、形状を維持するためにプリント時に架橋し、37℃で成熟させながら後の時点でリアーゼ処理する。架橋工程は、ケラチノサイト生物学に影響を与え得る、高濃度のカルシウムイオンへの曝露を伴うため、本発明者らは表皮層の付着からこの架橋工程を分離しようとした。本発明はまた、3D組織モデルへ新規のエアロゾルスプレープリント法を組み入れる。エアロゾルスプレーアプローチは、より薄い層を作ることを可能にし、成熟期間後、既存の組織層上へ材料を容易に付着させることを可能にする点で、連続的付着法と比較して独特な方法を提供する。これは有利であり得、何故ならば、それは、インビボでネイティブな組織をよりよく模倣する組織をもたらし得るためである。これはまた有利であり得、何故ならば、それは、必要とされる細胞の数を減らすことができ、限られた細胞集団でバイオプリントを可能にするためである。このエアロゾルスプレー法は、複数の時点で複数の層を作るために適用することができる。例えば、この方法は、先ず未分化ケラチノサイトでスプレーし、続いて分化ケラチノサイトでスプレーし、ネイティブな皮膚をよりよく模倣するために使用することができる(図5)。
【０１０３】
本明細書に記載されるエアロゾルスプレーバイオプリント技術は、例えば、細胞懸濁液、培地、バイオインク、生体支持材料、またはそれらの組み合わせを含む材料のスプレーを可能にする。実施例1において、エアロゾルスプレーアプローチは、表皮細胞の薄層をスプレーするために利用される。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織および方法論は、一細胞層厚みの分解能で単一の細胞をスプレーする能力および細胞集合体をスプレーする能力が特色である。しかしながら、スプレーされる層はまた、スプレー材料速度、距離、時間、体積、および粘度を含むがこれらに限定されないパラメーターを変えることによって、改変され得る。表皮層の作製について、細胞は、任意で、全層モデルを得るために他のバイオプリントされた層上へ、または、特に表皮モデルを得るために直接トランスウェルもしくは他のマトリックスコーティング表面上へ、スプレーされる。スプレー法は、スプレーされる材料を生体支持材料またはNovogel（登録商標）などの柔らかい表面中へ埋め込むために任意で利用される。例えば、真皮層は、コラーゲンゲル中へ線維芽細胞をスプレーすることによって作ることができる(図6)。いくつかの態様において、このアプローチは、ネイティブな真皮にさらに厳密によく似ている真皮層を生じさせ、連続的付着法によって通常達成されるものと比べてより希薄な細胞密度が観察される。
【０１０４】
エアロゾルスプレー法は、x、y、およびz-軸において最初のプリント位置をゼロにするために、トランスウェル膜などの、平らなプリント表面を必要としない点で、連続的付着プリントと比較した場合に独特である。エアロゾルスプレー法は、連続的付着によって前にプリントされた構造体などの平坦でない表面へ層を適用するために任意で使用される。例えば、実施例2において、本明細書に記載されるエアロゾルスプレーバイオプリント方法論は、前にプリントされた真皮細胞の層上へ表皮細胞の薄層をスプレーするために利用される。いくつかの態様において、この時間的に間隔を空けることにより、最初の層が、その後の表皮層の接着および適切な重層化を可能にする特定のタンパク質を発現することが可能になる。
【０１０５】
使用されるプリント法にかかわらず、様々な因子が、プリントされた組織細胞の増殖および／または分化を促進するために任意で改変される。いくつかの場合において、真皮培地、表皮培地、または真皮培地および表皮培地の組み合わせが、皮膚組織構築物へ添加される。さらに、培地組成は、所望の生物学を促進するために組織寿命における異なる時点で任意で変えられる。組織構築物は、任意で、気液界面へ移されるか、または湿度もしくはCO2の改変などの雰囲気変化へ供される。両方のプリントアプローチを組み合わせる仮定の実験設計を図7に示す。
【０１０６】
ある態様において、本明細書に開示される三次元人工生体皮膚組織は、付加的な製造プロセスによってもたらされる。本明細書における三次元人工生体皮膚組織の付加的な製造プロセスは、インビトロ目的および治療目的のための三次元人工生体皮膚組織のカスタマイズされた製作を可能にする。これは、組織が使用者指定設計により製作されるという点で、有意義である。ある態様において、三次元人工生体皮膚組織は、使用者が指定する細胞のみを含有する(例えば、付加的な製造プロセスへのインプットとしての使用)。ある態様において、三次元人工生体皮膚組織は、使用者が指定する細胞タイプのみを含有する。ある態様において、三次元人工生体皮膚組織は、使用者が指定する数の細胞または濃度の細胞のみを含有する。ある態様において、三次元人工生体皮膚組織は、製作前または製作中に小分子、治療分子、または治療物質で処理された細胞を含有する。ある態様において、三次元人工生体皮膚組織は、生体適合性または組織培養プラスチック、生体適合性合成ポリマー、架橋性ゲル、可逆的に架橋されたゲルおよび他の非細胞性構成要素を含有する。
【０１０７】
バイオプリント
いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物およびそのアレイの少なくとも1つのコンポーネントをバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達デバイス(例えば、バイオプリンター)による、生体適合性支持表面(例えば、ヒドロゲルおよび／または多孔性膜から構成される)上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体(例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど)を含む細胞、および、任意で、閉じ込め材料の、三次元の、自動化された、コンピューター支援される付着に基づく迅速なプロトタイピング技術を利用する方法を用いて作られる。本明細書において使用される場合、いくつかの態様において、用語「人工」は、組織および／または器官を指すために使用される場合、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞集合体、ならびにそれらの層が、コンピュータースクリプトに従ってコンピューター支援されるデバイス(例えば、バイオプリンター)によって三次元構造体を形成するように位置決めされることを意味する。さらなる態様において、コンピュータースクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。なおさらなる態様において、三次元組織構造体は、細胞または多細胞体のプリント後の接着によって形成し、これは、いくつかの場合において、初期形態形成における自己集合現象に類似している。
【０１０８】
手動での配置を含む、三次元構造体をもたらすために、細胞、多細胞集合体、および／またはそれらの層を生体適合性表面上に配置する多数の方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化された、コンピューター支援される機器による位置決めが有利である。この技術での細胞または多細胞体の送達の利点は、様々な組成を有する、細胞、多細胞集合体、および／またはそれらの層の、計画されたまたは予め決められた配向またはパターンを示す構築物をもたらすための、細胞または多細胞体の、迅速、正確、かつ再現可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながらの、確実な高い細胞密度を含む。
【０１０９】
いくつかの態様において、バイオプリントの方法は連続的および／または実質的に連続的である。連続的バイオプリント法の非限定的な例は、バイオインクのリザーバに接続された分配先端(例えば、注射器、注射針、キャピラリーチューブなど)を介してバイオプリンターからバイオインク(即ち、細胞、賦形剤もしくは押し出し化合物と組み合わされた細胞、または細胞の集合体)を分配することである。さらなる非限定的な態様において、連続的バイオプリント法は、機能単位の繰り返しパターンでバイオインクを分配することである。様々な態様において、繰り返し機能単位は、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則なジオメトリーを含む、任意の好適なジオメトリーを有し、それによって、1つまたは複数の組織層が生じ、平面ジオメトリーは、別個のバイオインクの空間的パターニングおよび／または空所によって達成される。さらなる態様において、バイオプリントされた機能単位の繰り返しパターンは層を含み、複数の層が、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、積層ジオメトリーを有する人工組織または器官が形成される。様々な態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、またはそれ以上の層が、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、人工組織または器官が形成される。さらなる態様において、積層ジオメトリーを有する組織の1つまたは複数の層はまた、平面ジオメトリーを有する。
【０１１０】
いくつかの態様において、バイオプリントの方法は非連続的である。非連続的バイオプリントの非限定的な例は、バイオインクまたは細胞が分配され、次いでバイオインクまたは細胞の流れが停止され、ある時間の間休止され、次いで再開される場合である。これは、異なるバイオインクもしくは細胞、または同じバイオインクもしくは細胞が、層のプリントにおいて遅れて積層されることを可能にし得る。いくつかの態様において、非連続的バイオプリントは、エアロゾルスプレータイプのバイオプリントを使用して達成され、細胞は、エアロゾルスプレー技術を使用して既存の組織層または表面へ適用される。いくつかの態様において、真皮細胞またはバイオインクの単一の層または複数の層が付着され、続いて、表皮細胞またはバイオインクの単一の層または複数の層が時間的に遅れて付着される。いくつかの態様において、表皮細胞の付着はエアロゾルスプレーによる。
【０１１１】
本開示の異なるバイオインクのいずれもが、様々な技術によって付着され、三次元人工生体皮膚組織の層が形成され得る。任意の層が、押し出し(連続的（continues）または非連続的)、スプレーイング(インクジェッティングまたはエアロゾルスプレーイング)によって付着され得る。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させる。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させる。ある態様において、真皮バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させる。ある態様において、表皮バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させる。ある態様において、非細胞性マトリックスバイオインクを表面上へ押し出しによって付着させる。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させる。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させる。ある態様において、真皮バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させる。ある態様において、表皮バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させる。ある態様において、非細胞性マトリックスバイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させる。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させない。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させない。ある態様において、真皮バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させない。ある態様において、表皮バイオインクを表面上へ押し出しによって付着させない。ある態様において、非細胞性マトリックスバイオインクを表面上へ押し出しによって付着させない。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させない。ある態様において、皮下バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させない。ある態様において、真皮バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させない。ある態様において、表皮バイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させない。ある態様において、非細胞性マトリックスバイオインクを表面上へスプレーイングによって付着させない。
【０１１２】
ある態様において、表皮バイオインクの付着は、真皮バイオインクの付着後に生じる。ある態様において、表皮バイオインクの付着は、付着された真皮バイオインクの成熟前に生じる。ある態様において、表皮層の付着は、それが真皮バイオインク上に付着される前に、時間的に遅らされる。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は10ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、20、30、40、50、60、70、80、90または100ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、200、300、400、500、600、700、800、900または1000ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒を超える。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60秒を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間を超える。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60分間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、または7日間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、または4週間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は10ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、20、30、40、50、60、70、80、90または100ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、200、300、400、500、600、700、800、900または1000ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒未満である。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60秒未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間未満である。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60分間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、または7日間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、または4週間未満である。
【０１１３】
ある態様において、皮膚組織はまた、試験物質または薬剤を含み、図26に示されるような多くの方法で組織へ投与され得、試験物質は、バイオプリントされた任意の単一の層または任意の複数の層の頂端、腹側、基底、または外側表面へ適用され得る。試験物質は、表面の全部または表面の一部へ適用され得る。試験物質は、同じ細胞タイプもしくは異なる細胞タイプである2つの層の間に添加され得るか、単一の層もしくは複数の層内に埋め込まれ得るか、または単一の層もしくは複数の層の全体にわたって均一にもしくは不均一に混合され得る。試験物質は、エアロゾルスプレータイプ機構、押し出し機構、注射器  ピペット先端、または鈍化された物体によって適用され得る。
【０１１４】
本発明は、インクジェットエアロゾル化スプレー、分配ノズル、および連続的付着を含むがこれらに限定されないバイオプリントプラットフォームの利用による、毒物学試験のための物質の自動化された投与を開示する。バイオプリントは、プリント表面上への所定の体積およびジオメトリーの空間的に規定された正確な付着を可能にする。一態様において、組織は、プリントされた試験物質を含有する表面上へプリントされる。第2の態様において、物質は、プリントされた組織上へプリントすることによって投与される。いくつかの場合において、試験物質は、プリント中に同時に、他の場合においてはプリントの直後に、およびさらに他の場合においては成熟組織へ後の時点で、組織へ局所適用され得る。例えば、試験物質は、経皮投与をモデル化するために成熟組織へ添加され得、物質は、バリア機能を有する完全に形成された角質層を通過しなければならない。第3の態様において、物質は組織中へ組み入れられ得る。いくつかの場合において、試験物質は、プリントされた組織間の層として添加され得る。他の場合において、物質は、皮膚組織の任意の層内の、または皮膚組織の全ての層内の、均一な混合物としてプリントされる。さらに他の場合において、物質は組織層内に埋め込まれ得る。例えば、試験物質は、非経口皮下注射をモデル化するためにシリンジ付着によって全層皮膚組織の真皮層中へ埋め込まれ得る。
【０１１５】
試験物質は、経皮送達をモデル化しそしてバリア機能を試験するために組織の頂端面へ直接適用され得、または、勾配としての浸透または分散をモデル化するために組織の腹側または外側の面へ投与され得る。他の適用において、組織は物質中に完全に浸される。いくつかの場合において、バイオプリントされたマトリックスまたは膜は、接着剤として作用し得るか、または経皮パッチと同様に試験物質を投与、分配もしくは分散するのを促進し得る。他の場合において、添加または接着は、ガーゼまたはナイロンメッシュなどのバイオプリントされていない材料のパッチによって組み合わせてまたは別々に促進され得る。物質はまた、例えば、ピペット先端によって分配される、スワブされる、または鈍化された物体によって適用されるように、手動で投与され得る。
【０１１６】
試験物質は、溶液、懸濁液、および乳濁液を含む、液体であり得る。物質はまた、粉末および顆粒などの固体、またはペーストなどの半固体であり得る。試験される物質は、可変レベルの粘度を伴って含水または無水であり得、これらに限定されないが、液体、オイル、ゲル、フォーム、軟膏、またはクリームの形態で投与される。物質は、スプレーまたは霧などの液体エアロゾルにエアロゾル化されて適用され得る。物質はまた、スモークまたはダストなどの固体エアロゾルとして投与され得る。物質はまた、Novogel（登録商標）と組み合わせて投与され得る。これらの試験物質のいずれもが、自動化された方法で、バイオプリントによってまたは手動で、適用され得る。
【０１１７】
いくつかの態様において、試験物質は、毒物学、医薬品または化粧品試験を必要とする任意の物質である。試験物質は、化学的混合物の任意の全部、一部、活性または不活性成分を含有する組成物、刺激原、化学物質、医薬品、アルコール、脂質、リン脂質、酸、塩基、過酸化物、酸化剤、還元剤、洗剤、界面活性剤、栄養機能食品、ビタミン、プロビタミン、ミネラル、アミノ酸、DNA、RNA、タンパク質、酵素、アレルゲン、ペットアレルゲン、植物に基づくアレルゲン、カビ、塵、昆虫毒、ウイルス、細菌、真菌、免疫アジュバント、抗生物質、抗真菌薬、日焼け止め、虫除け、化粧品、植物の、リップクリーム、口紅、マスカラ、アイシャドウ、ファンデーション、パウダー、メイクアップリムーバー、石鹸、ボディウォッシュ、洗顔料、ハンドソープ、食器用洗剤、シャンプー、コロン、香水、アフターシェイブローション、シェービングローション、シェービングジェル、シェービングクリーム、潤滑剤、コンディショナー、染毛剤、脱毛剤、保湿剤、しわ取りクリーム、洗濯用洗剤、柔軟剤またはラテックスである。ある態様において、試験物質は、性質が化学的ではなく、例としては、光、日光、紫外線、X線、電磁放射線、組織もしくは組織周辺へ適用される電気的インパルス、レーザー、熱、冷気、音波、または機械的ストレスが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、試験物質は、同時にまたは順に適用される複数の物質である。適用される組成物は、任意の薬学的に、皮膚科学的にまたは美容的に許容される物質であり得る。物質は、ローション、軟膏、水溶液、エアロゾル、ミスト、懸濁液、コロイド、チンキ、アルコールベースのまたは脂質ベースの溶液であり得る。ある態様において、組成物はDMSOを含有する。
【０１１８】
予め形成されたスキャフォールド
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも含まないかまたは実質的に含まない人工の移植可能な皮膚組織である。さらなる態様において、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織および／または器官の物理的構造体にとって不可欠でありかつ組織および／または器官から除去されない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。なおさらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料；例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物およびそのアレイは、例えば、組織の形成、組織の任意の層の形成、または組織の形状の形成のために、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも利用しない。非限定的な例として、本発明の人工皮膚組織は、いかなる予め形成された、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックス層、または任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドをも、製造時にまたは使用時に利用しない。いくつかの態様において、人工皮膚組織は、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも実質的に含まない。さらなる態様において、組織の細胞性コンポーネントは、検出可能であるが微量または僅かな量のスキャフォールド、例えば、総組成物の2.0%未満、1.0%未満、または0.5%未満、を含有する。なおさらなる態様において、微量または僅かな量のスキャフォールドは、組織またはそのアレイの長期挙動に影響を与えるか、またはその主要な生物学的機能に干渉するには不十分である。追加の態様において、スキャフォールドコンポーネントは、物理的、化学的、または酵素的方法によって、プリント後に除去され、スキャフォールドコンポーネントを含まないかまたは実質的に含まない人工組織が得られる。
【０１２０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される、予め形成されたスキャフォールドを含まないか、または実質的に含まない人工皮膚組織は、組織工学の特定の他の方法で開発されたものとは全く対照的であり、ここでは、例えば、スキャフォールド材料が最初に形成され、次いで、細胞がスキャフォールド上へ播種され、その後、細胞は増殖し、スキャフォールドを満たしそしてスキャフォールドの形状をとる。一局面において、本明細書に記載されるバイオプリントの方法は、予め形成されたスキャフォールドを含まないかまたは実質的に含まない生存可能で有用な組織の作製を可能にする。別の局面において、本発明の細胞は、いくつかの態様において、閉じ込め材料を使用して所望の三次元形状に保持される。閉じ込め材料は、少なくとも、閉じ込め材料が一時的なものでありかつ／または細胞および／または組織から除去可能であるという事実において、スキャフォールドとは異なる。
【０１２１】
生体適合性表面
いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物は、1つまたは複数の面上において生体適合性表面へ固定される。いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物は、生体適合性表面の1、2、3、4個、またはそれ以上の面へ固定される。多くの方法が、組織を生体適合性表面へ固定するのに適している。様々な態様において、組織は、生体適合性表面へ、例えば、1つまたは複数の面全体にわたって、1つまたは複数の面の端でのみ、または1つまたは複数の面の中央でのみ、適切に固定される。様々なさらなる態様において、組織は、表面へ一体化されたまたは表面と結合されたホルダーまたはキャリアーを用いて、生体適合性表面へ適切に固定される。様々なさらなる態様において、組織は、表面へ一体化されたまたは表面と結合された1つまたは複数のピンチ-クランプまたはプラスチックノブを用いて、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、組織は、多孔性表面への細胞付着によって、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、表面の細孔サイズは0.2μmを超え得る。いくつかの態様において、表面の細孔サイズは1μmを超え得る。いくつかの態様において、組織は、多孔性膜への細胞付着によって、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物は、1つまたは複数の面上における生体適合性表面への貼り付けによってアレイ構成で保持される。さらなる態様において、組織は、1、2、3、4個、またはそれ以上の面上において生体適合性表面へ貼り付けられる。いくつかの態様において、生体適合性表面は、組織または組織に接触する生物に対して傷害または毒性の大きな危険をもたらさない任意の表面である。さらなる態様において、生体適合性表面は、伝統的な組織培養法に適した任意の表面である。好適な生体適合性表面は、非限定的な例として、処理されたプラスチック、膜、多孔性膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、処理されたガラス、およびコーティングされたガラスを含み、好適なコーティングは、ヒドロゲル、ECM成分、化学物質、タンパク質などを含み、コーティングまたは処理は、生体適合性表面への細胞および組織接着を促すまたは妨げる手段を提供する。ある態様において、生体適合性表面は柔軟である。ある態様において、生体適合性表面は、バイオプリント時に非静的である（動いている）。ある態様において、生体適合性表面は平らでない。生体適合性表面は、ヒトまたは他の哺乳動物の身体部分のように形作られた型もしくは形態であり得るか、または曲線状である。
【０１２２】
いくつかの態様において、1つまたは複数の面上において、生体適合性表面へ人工組織を固定することは、流体の流れによって引き起こされる剪断力へ組織を供することを容易にする。さらなる態様において、人工皮膚組織／構築物は、流体の流れによって引き起こされる剪断力へ供される。様々な態様において、人工皮膚組織は、1、2、3、4個、またはそれ以上の面において剪断力へ供される。さらなる態様において、人工皮膚組織／構築物は、1つまたは複数の露出した表面において組織と接触する液体栄養素の再循環、灌流あるいは撹拌へ供される。
【０１２３】
アレイ
いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物のアレイを本明細書に開示する。いくつかの態様において、「アレイ」は、複数の試験が1つのサンプルに対して行われることを可能にする、1つまたは複数の試験が複数のサンプルに対して行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された複数の要素の連合体を含む科学的ツールである。いくつかの態様において、アレイは、ミディアム-またはハイ-スループットスクリーニングに関連するものを含むスクリーニング方法およびデバイスに、適応しているかまたは適合性がある。さらなる態様において、アレイは、複数の試験が同時に行われることを可能にする。さらなる態様において、アレイは、複数のサンプルが同時に試験されることを可能にする。いくつかの態様において、アレイは、細胞マイクロアレイである。さらなる態様において、細胞マイクロアレイは、固体支持体の表面上の生きている細胞の多重の問い合わせを可能にする実験用ツールである。他の態様において、アレイは、組織マイクロアレイである。さらなる態様において、組織マイクロアレイは、アレイにおいて集められた複数の分離した組織または組織サンプルを含み、これによって、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的解析の実施が可能となる。
【０１２４】
いくつかの態様において、人工皮膚組織／構築物は各々、生体適合性マルチウェル容器のウェル中に存在する。いくつかの態様において、各組織はウェル中へ置かれる。他の態様において、各組織はウェル中へバイオプリントされる。さらなる態様において、ウェルはコーティングされる。様々なさらなる態様において、ウェルは、以下のうちの1つまたは複数でコーティングされる：生体適合性ヒドロゲル、1つまたは複数のタンパク質、1つまたは複数の化学物質、1つまたは複数のペプチド、1つまたは複数の抗体、および1つまたは複数の成長因子（それらの組み合わせを含む）。いくつかの態様において、ウェルはNovoGel（登録商標）でコーティングされる。他の態様において、ウェルはアガロースでコーティングされる。いくつかの態様において、各組織は、生体適合性マルチウェル容器のウェル内の、多孔性の生体適合性の膜上に存在する。いくつかの態様において、マルチウェル容器の各ウェルは、2つ以上の組織を含有する。
【０１２５】
いくつかの態様において、皮膚組織／構築物を含む人工組織のアレイは、2つ以上の要素の連合体を含む。様々な態様において、アレイは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500または1,000個の要素（その中のインクリメントを含む）の連合体を含む。さらなる態様において、各要素は、1つまたは複数の細胞、多細胞集合体、組織、器官、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、皮膚組織／構築物を含む人工組織のアレイは、所定のパターンで空間的に配置された複数の要素を含む。さらなる態様において、パターンは、要素の任意の好適な空間的配置である。様々な態様において、配置のパターンは、非限定的な例として、二次元のグリッド、三次元のグリッド、1つまたは複数の線、弧、もしくは円、一連の行または列などを含む。さらなる態様において、パターンは、ミディアム-もしくはハイ-スループット生物学的アッセイもしくはスクリーニング方法またはデバイスとの適合性について選択される。
【０１２７】
様々な態様において、アレイにおける1つまたは複数の組織を製作するために使用される細胞タイプおよび／または細胞源は、具体的な研究目標または目的に基づいて選択される。さらなる様々な態様において、アレイにおける具体的な組織は、具体的な研究目標または目的に基づいて選択される。いくつかの態様において、1つまたは複数の具体的な人工皮膚組織は、特定の疾患または状態の検査を容易にするために、アレイに含まれる。いくつかの態様において、1つまたは複数の具体的な人工皮膚組織は、特定の対象の疾患または状態の検査を容易にするために、アレイに含まれる。さらなる態様において、アレイ内の1つまたは複数の具体的な人工皮膚組織は、2人以上の別個のヒトドナーに由来する1つまたは複数の細胞タイプを用いて作製される。いくつかの態様において、アレイ内の各組織は、細胞タイプ、細胞源、細胞の層、細胞の比率、および構築の方法、サイズ、形状などに関して実質的に同様である。他の態様において、アレイ内の組織のうちの1つまたは複数は、細胞タイプ、細胞源、細胞の層、細胞の比率、構築の方法、サイズ、形状などに関して独特である。様々な態様において、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300個、またはそれ以上（その中のインクリメントを含む）は、独特である。他の様々な態様において、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%（その中のインクリメントを含む）は、独特である。
【０１２８】
いくつかの態様において、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。さらなる態様において、アレイ内の各組織の培養条件は、それらが他の組織から単離されており、培地または培地中の可溶性因子を交換することができないような条件である。他の態様において、アレイ内の2つ以上の個々の組織は、可溶性因子を交換する。さらなる態様において、アレイ内の2つ以上の個々の組織の培養条件は、それらが培地および培地中の可溶性因子を他の組織と交換するような条件である。様々な態様において、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300個、またはそれ以上（その中のインクリメントを含む）は、培地および／または可溶性因子を交換する。他の様々な態様において、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%（その中のインクリメントを含む）は、培地および／または可溶性因子を交換する。
【０１２９】
ある態様において、アレイ内の組織は、繰り返しパターンで一定間隔で置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも10μmしかし多くとも1000μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも10μmしかし多くとも500μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも10μmしかし多くとも200μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも20μmしかし多くとも1000μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも50μmしかし多くとも1000μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも100μmしかし多くとも1000μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも20μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも50μm離れて置かれている。ある態様において、アレイ内の組織は、少なくとも100μm離れて置かれている。
【０１３０】
インビトロアッセイ
いくつかの態様において、本明細書に開示される人工皮膚組織およびアレイは、インビトロアッセイにおいて使用するためのものである。いくつかの態様において、「アッセイ」は、有機的または生物学的サンプル(例えば、細胞集合体、組織、器官、生物など)中における物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる態様において、アッセイは定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。なおさらなる態様において、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
【０１３１】
様々な態様において、人工皮膚組織およびアレイは、非限定的な例として、画像に基づくアッセイ、分泌されたタンパク質、マーカーの発現、および脂質、タンパク質またはmRNAの産生の測定において使用するためのものである。様々なさらなる態様において、人工皮膚組織およびアレイは、以下のうちの1つまたは複数を検出または測定するためのアッセイにおいて使用するためのものである：バリア機能、分子結合(放射リガンド結合を含む)、細胞取り込み、活性(例えば、酵素活性および受容体活性など)、遺伝子発現、タンパク質発現、タンパク質修飾(非限定的な例としては：リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、グリコシル化、脂質化などが挙げられる)、受容体アゴニズム、受容体拮抗、細胞シグナル伝達、アポトーシス、DNA損傷、ストレス応答、凝集力、浸透性、炎症、色素沈着、化学感受性、トランスフェクション、細胞移動、化学走性、細胞生存性、細胞増殖、安全性、効能、代謝、毒性、感染性、および乱用傾向。様々な態様において、皮膚組織は、毒物学、医薬品または化粧品試験のためのものである。
【０１３２】
いくつかの態様において、人工皮膚組織およびアレイは、イムノアッセイにおいて使用するためのものである。イムノアッセイとしては、例えば、フローサイトメトリー、ハイスループットまたはロースループット画像解析、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISA、ウエスタンブロット、均質アッセイ、例えばAlphaLISA（商標）、および時間分解蛍光法または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に頼る関連技術が挙げられる。さらなる態様において、イムノアッセイは、競合的なイムノアッセイまたは非競合的なイムノアッセイである。競合的なイムノアッセイにおいて、例えば、サンプル中の抗原は、抗体と結合するために標識抗原と競合し、次いで、抗体部位へ結合された標識抗原の量が測定される。非競合的なイムノアッセイ(「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる)において、例えば、サンプル中の抗原が抗体部位へ結合され；その後、標識抗体が抗原へ結合され、次いで、部位上の標識抗体の量が測定される。
【０１３３】
いくつかの態様において、人工皮膚組織およびアレイは、代謝変換または浸透性アッセイにおいて使用するためのものである。アッセイは、例えば、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)、レサズリン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、カルセインAM基質、関連色素、および蛍光または吸光度に頼る技術を含む。
【０１３４】
いくつかの態様において、人工皮膚組織およびアレイは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)において使用するためのものである。さらなる態様において、ELISAは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的技術である。ELISAにおいて、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも1つの抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有するサンプルは、非特異的に（表面への吸着を介して）または特異的に(「サンドイッチ」ELISAにおいて、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して)のいずれかで、固体支持体(例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート)上で不動化される。なおさらなる例として、抗原が不動化された後、検出抗体が加えられ、抗原との複合体が形成される。検出抗体は、例えば、酵素へ共有結合されているか、またはバイオコンジュゲーションを介して酵素へ結合されている二次抗体によってそれ自体が検出される。
【０１３５】
例えば、いくつかの態様において、細胞、多細胞集合体、または組織の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは創薬のために使用される。さらなる態様において、組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは創薬のためのキットの一部として使用される。いくつかの態様において、それぞれの人工皮膚組織／構築物は、生体適合性マルチウェル容器のウェル内に存在し、容器は、1つまたは複数の自動化された薬物スクリーニング手順および／またはデバイスと適合性がある。さらなる態様において、自動化された薬物スクリーニング手順および／またはデバイスは、コンピューターまたはロボット支援される任意の好適な手順またはデバイスを含む。
【０１３６】
さらなる態様において、薬物スクリーニングアッセイまたは創薬アッセイのためのアレイは、任意の治療分野に潜在的に有用な薬物を研究また開発するために使用される。なおさらなる態様において、好適な治療分野は、非限定的な例として、感染性疾患、血液学、腫瘍学、小児科学、心臓学、中枢神経系疾患、神経病学、消化器病学、肝臓学、泌尿器科学、不妊症、眼科学、腎臓病学、整形外科学、疼痛管理、精神医学、肺臓学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒物学、および免疫学を含む。
【０１３７】
いくつかの態様において、人工皮膚組織およびアレイは、細胞ベースのスクリーニングにおいて使用するためのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、ウイルス、真菌、細菌または寄生生物感染症などの、1つまたは複数の感染性疾患についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、黒色腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む、皮膚癌についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、神経皮膚炎および脂漏性皮膚炎を含む、皮膚炎についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは乾癬についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、乾燥性湿疹、円板状湿疹、静脈性湿疹、および自家湿疹化（autoeczematization）を含む、特定の湿疹についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、光線角化症(日光角化症としても公知)、炭化水素角化症、毛孔角化症(KP、毛包性角化症としても公知)、および脂漏性角化症を含む、角化症についてのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングはざ瘡についてのものである。他の態様において、人工皮膚組織およびアレイは、癌の発生、進行、または転移の研究において使用するためのものである。なおさらなる態様において、人工皮膚組織およびアレイは、癌細胞、病原体保有細胞、病原性細胞、免疫細胞、血液由来細胞、または幹細胞／前駆細胞などの、他の細胞タイプの相互作用の研究において使用するためのものである。
【０１３８】
いくつかの態様において、構築物またはそのアレイは、抗体、哺乳動物細胞、細菌、生物学的に活性なタンパク質、ホルモンなどを含む、生物製剤の性能の評価に使用するためのものである。いくつかの態様において、構築物またはそのアレイは、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、T細胞またはB細胞から隣接する皮膚細胞への、グラム陰性またはグラム陽性抗原刺激シグナル伝達の効果を含む、ランゲルハンス細胞による免疫学的サンプリングの検出、定量化、および研究に使用するためのものである。他の態様において、皮膚構築物またはそのアレイは、癌の発生、進行、または転移の研究において有用である。他の態様において、皮膚構築物またはそのアレイは、構築物と1つまたは複数の追加の細胞タイプ（病原体保有細胞、生きている病原性細胞、癌細胞、免疫細胞、血液細胞、幹細胞／前駆細胞、または遺伝子操作細胞を含むが、これらに限定されない）とを含む哺乳動物皮膚細胞／組織間の細胞-細胞および細胞-組織相互作用の研究において有用である。
【０１３９】
いくつかの態様において、アレイは、人工皮膚組織構築物および追加の組織構築物を含む。さらなる態様において、皮膚組織構築物は、1つまたは複数の表面において追加の組織構築物と直接接触している。なおさらなる態様において、皮膚組織は、流体路または共通の流体リザーバを介して1つまたは複数の追加の組織構築物または細胞へ接続されている。なおさらなる態様において、人工皮膚組織構築物と接触する液体培地は、生きている哺乳動物細胞、例えば、免疫細胞、血液由来細胞、または腫瘍由来細胞を含有する。他の態様において、人工皮膚組織構築物と接触する液体培地は、細菌、真菌、ウイルス、寄生生物、または他の病原体を含有する。
【０１４０】
治療適用
ある態様において、本出願の皮膚組織は、皮膚状態を有する対象の治療において使用するためのものである。ある態様において、三次元皮膚組織は、対象への移植のためのものである。皮膚状態は、皮膚移植片が利用される任意の状態であり得る。状態は、熱または化学物質によって引き起こされる熱傷などの外傷に起因し得る。状態は、開放創または以前に閉じた傷の再開放を生じる外傷によって引き起こされ得る。状態は、皮膚の除去を生じる外傷によって引き起こされ得る。状態は皮膚癌であり得る。状態は、壊死性筋膜炎または電撃性紫斑病などの感染症に起因し得る。状態は、皮膚壊死によって引き起こされ得る。状態は、美容的であり得る。状態は、美容的欠陥であり得る。状態は、加齢に起因し得る。ある態様において、三次元皮膚組織は、創傷治癒を助ける処置において使用するためのものである。
【０１４１】
ある態様において、三次元人工皮膚組織中に使用される皮膚細胞は、治療される対象に由来する(例えば、自己)。ある態様において、三次元人工皮膚組織において使用される皮膚細胞は、組織適合性であると見なされたドナーに由来する。ある態様において、三次元人工皮膚組織において使用される皮膚細胞は、組織不適合性であると見なされたドナーに由来する。ある態様において、三次元人工皮膚組織は、レシピエントに対して同系、同種異系または異種であると見なされる。ある態様において、三次元人工皮膚組織において使用される細胞は、幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉幹細胞、または成体幹細胞を含む、多能性細胞である。
【０１４２】
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞は、改変される。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞は、免疫系による移植片の拒絶を減らすように改変される。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞は、三次元人工皮膚組織とレシピエント対象との組織適合性を促進するように改変される。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞は、先天的欠陥を修正するように改変される。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞の改変は、生物学的、化学的または物理的である。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織中において利用される細胞の改変は遺伝的である。いくつかの態様において、遺伝的改変は、トランスジーン、オープンリーディングフレーム、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)またはマイクロRNA(miRNA)の発現の結果である。
【０１４３】
いくつかの態様において、治療物質は、バイオプリント前に細胞を処理するために使用される。いくつかの態様において、治療物質は、細胞と共にバイオプリントされ、三次元人工皮膚組織中に含められる。いくつかの態様において、三次元皮膚組織は、バイオプリント後しばらくして治療物質で処理される。いくつかの態様において、治療物質は、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、鎮痛薬、アヘン剤、血管収縮薬、血管拡張薬、ステロイド、またはビタミン混合物である。ある態様において、治療物質はまた、皮膚を保護するかまたはその付着もしくは移植部位で成長する能力を促進するために使用される任意の物質であり得る。これらとしては、皮膚保護薬、保湿剤、接着剤(生分解性もしくは非生分解性)、物理的バリア、多孔性膜、もしくは非多孔性膜、ゲルまたはスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
ある態様において、皮膚組織はまた、治療物質を含み、図27に示されるような多くの方法で組織へ投与され得、治療物質は、バイオプリントされた任意の単一の層または任意の複数の層の頂端、腹側、基底、または外側表面へ適用され得る。治療物質は、表面の全部または表面の一部へ適用され得る。治療物質は、同じ細胞タイプもしくは異なる細胞タイプである2つの層の間に添加され得るか、単一の層もしくは複数の層内に埋め込まれ得るか、または単一の層もしくは複数の層の全体にわたって均一にもしくは不均一に混合され得る。治療物質は、エアロゾルスプレータイプ機構または押し出し機構によって適用され得る。他の適用において、組織は、治療物質中に完全にまたは部分的に浸される。いくつかの態様において、組織は、縫合、ステープリング、または接着剤もしくはフィルムの使用によって適用され得る。いくつかの場合において、バイオプリントされたマトリックスまたは膜は、接着剤として作用し得るか、または経皮パッチと同様に治療物質を投与、分配もしくは分散するのを助け得る。他の場合において、添加または接着は、ガーゼまたはナイロンメッシュなどのバイオプリントされていない材料のパッチによって組み合わせてまたは別々に助けられ得る。物質はまた、例えば、ピペット先端によって分配される、スワブされる、または鈍化された物体によって適用されるように、手動で投与され得る。治療物質は、溶液、懸濁液、および乳濁液を含む液体であり得る。治療物質はまた、粉末および顆粒などの固体、またはペーストなどの半固体であり得る。治療物質は、可変レベルの粘度を伴って含水または無水であり得、これらに限定されないが、液体、オイル、ゲル、フォーム、軟膏、またはクリームの形態で投与される。物質は、スプレーまたは霧などの液体エアロゾルにエアロゾル化されて適用され得る。物質はまた、スモークまたはダストなどの固体エアロゾルとして投与され得る。物質はまた、Novogel（登録商標）などのヒドロゲルと組み合わせて投与され得る。
【０１４５】
本明細書における開示はインビトロスクリーニングのためのシステムを含む。本明細書における開示はビジネス方法を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティは、移植のための人工皮膚組織および／または器官の作製、またはインビトロアッセイなどの、研究開発のための細胞ベースのツールの作製における使用のための、産業施設および／または商業施設を設計、建築、および運営するために利用される。さらなる態様において、人工皮膚組織および／または器官ならびにそのアレイは、例えば、細胞アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、組織アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、ならびに生物学的アッセイおよびハイスループット薬物スクリーニングのためのキットとして、製造、保管、分配、市販、宣伝、および販売される。他の態様において、人工皮膚組織および／または器官ならびにそのアレイは、サービスとして生物学的アッセイおよび／または薬物スクリーニングを行うために製造および利用される。
【実施例】
【０１４６】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載されるソフトウェア・アプリケーション、システム、および方法の態様を代表し、限定であるようには決して意図されない。
【０１４７】
実施例1−アルギナートを含有する真皮バイオインクを使用する連続的付着およびエアロゾルスプレー法による表皮バイオインク付着によって全層皮膚組織をバイオプリントする
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチンおよび1%アルギナート(Novogel（登録商標）3.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。上部を縁取る1mm壁を有する4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、カップに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。プリント後、構築物を、2〜5分間5 mlの50 mM塩化カルシウム中に沈めることによって、直ちに架橋した。次いで、塩化カルシウムを吸引し、構築物を5 mlの線維芽細胞増殖培地(10% FBSおよびP/S/Aを含有するDMEM)中に沈めた。構築物を、加湿されていない37℃インキュベーター中において24時間成熟させた。24時間後、真皮組織構築物をインキュベーターから取り出し、BSCフード中に置いた。培地をエアロゾルスプレー適用の直前に吸引した。1ミリリットル培地当たり100万個の細胞の濃度で、90%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)および10%初代成人ヒト表皮メラノサイト(HEMa)の細胞懸濁液混合物によって、表皮バイオインクを作製した。使用した培地は、90%ケラチノサイト増殖培地および10%メラノサイト培地を含有した。細胞を無菌様式でBSCフード中の滅菌ガラス瓶中へ分配し、手動で撹拌し、懸濁液を維持した。細胞懸濁液を含有する瓶を、堅く密封された蓋を通って出ている2つのチューブへ付けた。チューブの一方のセットは、細胞懸濁液の体積をフード内部のスプレーノズルへ連結した。瓶の蓋の内部から出ているチューブの別のセットは、23〜25 psiへ調節されたフード外部の圧縮空気タンクへ連結した。スプレーの直径をスプレーノズルの高さによって制御した。チューブを調節可能なスタンドへ付けることによって、スプレーノズルの高さを手動で調節した。高さをおよそ3 cmに設定し、6ウェルプレートの高さを可能にした。スプレー直径は、およそ2.5 cm、またはプレート中の1つのウェルの幅であった。スプレーノズルの流速を、1スプレー当たり100 msまたは200 msのパルス化分配によってデジタル制御した。バイオプリントされた真皮線維芽細胞組織構築物を含有するウェルプレートを、24時間後、37℃インキュベーターから取り出した。構築物培地を吸引した。真皮構築物を含有する各ウェルを、スプレーノズルの真下に個々に置いた。100 msまたは200 msでのシングル、ダブル、またはマルチプルパルスの適用を、構築物の表面上へスプレーした。対照として、スプレーをトランスウェル膜単独のものへも投与した。エアロゾルスプレー後、2 mlの培地を、トランスウェルバスケットの外部領域へ添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:40:10比率のHDFa:HEKa:HEMa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。スプレー体積を、分配された体積を1.5 mlチューブ中へ集めることによってプリント後に測定した。スプレー体積は、平均すると、200 msで1���プレーパルス当たり23μl、および100 msで1スプレー当たり8.7μlであった。生存性は、トリパンブルー色素排除アッセイによって90%と測定された。細胞数は、平均すると1 ml当たり140万個の細胞であり、このため、200 msで1スプレー当たり32,200個の細胞、および100 msで1スプレー当たり12,180個の細胞と再計算された。組織を第3日(エアロゾルスプレー適用後48時間)に4時間、1ウェル当たり3 mlの体積で0.34 mg/mlアルギナートリアーゼで処理した。培地をトランスウェルの外部領域へ添加した。リアーゼ培地の体積のメニスカスは、構築物を沈めることなく構築物の面の上部に達するのに十分であった。リアーゼ処理に続いて、培地を吸引し、1mlの新鮮な培地を各ウェルの外部領域へ添加し、組織構築物を気液界面へもっていった。培地を、その後最長12日間、1ウェル当たり1 mlで毎日変えた。インキュベーション後、構築物を組織学のために2%パラホルムアルデヒド(PFA)中に固定した。
【０１４８】
結果
バイオプリントされた真皮構築物を、線維芽細胞培地中で増殖させ、培地中でのインキュベーション後、これは密着性構造体を維持した。構築物を、第0日での架橋工程の直後に、および第1日でのエアロゾルスプレー適用の前に、画像化した(図8)。線維芽細胞から構成されるバイオインクを、連続的付着によってプリントし、真皮層を作り、続いてこれに、24時間の成熟期間後、ケラチノサイトおよびメラノサイトの細胞混合物をスプレーし、上部に表皮層を作る。全ての構築物が、連続的付着およびエアロゾルスプレー適用でのプリント後、密着性構造体を維持した。構築物は経時的に収縮した(図9)。皮膚組織をトランスウェルの面に対して垂直に切断し、真皮カップ構造体の底部および壁を示した。断面をH&Eによって染色した(図10)。エアロゾルスプレーによって付着された表皮層中のケラチノサイトを、ケラチノサイト特異的マーカーであるサイトケラチン14(CK14)を使用する免疫組織化学によって可視化した(図10)。CK14は、通常のヒト表皮皮膚中の基底層ケラチノサイトについてのマーカーであり、線維芽細胞やメラノサイトは染色されない。画像は、赤色で陽性CK14染色(ケラチノサイト)を示し、青色でdapi対比染色核(線維芽細胞)を示す。陽性染色は、エアロゾルスプレーが適用された構築物の頂端面上においてのみ見られ得る。染色は、エアロゾルスプレーが細胞の薄層を表面へ首尾よく適用することができることを示す。本適用は1層厚の細胞を示す。陽性CK14染色は、第2、4、および6日に構築物中に見られる(図11)。ケラチノサイトがより丸くなってそして潜在的に塊で現れるにつれて(矢印)、線維芽細胞組織は経時的により平らになる。ケラチノサイト形態の差異は、経時的な潜在的分化を示唆している。ケラチノサイトをトランスウェル膜の表面上にもスプレーした(図12)。細胞は、第8日に、真皮組織構築物上へスプレーされたケラチノサイトの形態と比較した場合、トランスウェル表面上において同様のグルーピングを形成する。
【０１４９】
実施例2−ゼラチンを含有する真皮バイオインクおよび細胞ペーストを含有する表皮バイオインクを使用する連続的付着によって全層皮膚組織をバイオプリントする
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチン(Novogel（登録商標）)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。上部を縁取る1mm壁を有する4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、カップに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。95%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)および5%初代成人ヒト表皮メラノサイト(HEMa)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって90.5%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって160,000細胞と推定された。次いで、培地をトランスウェルの外部ウェルへ2 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:40:10比率のHDFa:HEKa:HEMa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。48時間後に培地を変え、続いてその後毎日変えた。第2、9、および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
【０１５０】
結果
第12日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図13、矢印、および14)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。このアプローチでの予想外の知見は、観察された層状構造の程度である。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する(矢印)。この層はCK14に対して特異的に染色され、これは、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置されたことを示している。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5およびインボルクリン(IVL)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。層状構造はまた、中期分化におけるCK10-陽性有棘および顆粒ケラチノサイトを含む(図15)。以前のプリント法は表皮層のCK14陽性染色を生じさせたが、観察されたパターンは、第10日で、層の全体にわたって広がっており、基底領域に非特異的である。本アプローチにおいて、予想外であることは、第12日において、ネイティブなヒト皮膚と同様に、染色が表皮層の底部での規定の領域に限定されることである(図16)。遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、経時的に表皮分化マーカーCK1、CK10、および特に後期マーカーFLGの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲン4レベルが経時的に増加することを示しており、これは基底膜の形成を示唆している。コラーゲンIレベルは実験の時間経過にわたって維持され、これは真皮層が生存可能のままであることを示唆している(図17)。
【０１５１】
実施例3−ゼラチンを含有する真皮バイオインクおよび細胞ペーストを含有する表皮バイオインクを使用する連続的付着によって全層皮膚組織をバイオプリントする追加の例
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel（登録商標）)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞：ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。別のしかし同一の表皮ペースト構造体を、真皮シートの隣りに、直接的にトランスウェルプリント表面上へ同時に付着させた。この構造体は、表皮ケラチノサイトペーストのみから構成され、真皮組織を含有しなかった。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって87.1%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって60,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。これは、Novogel（登録商標）を強固にするための重要な工程であり、これは、プリントされた形状を維持し、構築物間の均一性を改善するのを助ける。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ3 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり1.5 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。その後続いて、培地を、48時間(第4日)で1.5 mlの体積で変えた。第5日に、培地を変え、1ウェル当たり1mlへさらに減らし、その後毎日変えた。第0および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
【０１５２】
結果
トランスウェル表面上に直接プリントされる場合に対して、真皮シートの上部にプリントされたペーストの表皮層パターニングを比較するためのその後の組織学的解析は、予想外の知見をもたらした(図18AおよびB)。第12日での皮膚組織のH&E染色は、表皮ペーストが真皮層の上部にプリントされた構造体においてのみ、別個の層状構造を示す(図18CおよびD対FおよびG、図19A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される(図18E対H、図19B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。増殖マーカーPCNAに対する染色(図19E、緑色)は、真皮線維芽細胞および基底層ケラチノサイトの両方において増殖が高いが、分化中のケラチノサイトにおいては高くないことを示している。このパターンは、ネイティブな皮膚において見られるものと類似している。TUNELによるアポトーシスに対する染色(図19F)もまた、真皮層または表皮層のいずれにおいてもごくわずかな陽性染色細胞を低く示している。まとめて、PCNAおよびTUNEL染色は、全層組織の真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントの両方が第12日に生存可能であることを実証している。遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、第0日と比較しての第12日での、中期表皮分化マーカーCK1、CK10、および後期マーカーIVL、ロリクリンの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲンIおよび4レベルは実験の時間経過にわたって維持され、一方、コラーゲン3レベルは増加することを示しており、これは、真皮層が生存可能かつ機能的のままであることを示唆している(図20)。多くの驚くべき結果がこれから決定された；例えば、表皮ペーストは別個の層状構造中へ重層化することができること。現在の3D皮膚モデルは、これを達成するために、長期間にわたる単一のケラチノサイト単層の分化に頼る。ここで、本発明者らは、重層化がペーストで達成することが可能であることを示す。ペーストの厚みは単層よりも大きく、細胞がペースト内で自己組織化し、層として分化し得ることを示す。また、本発明者らは、真皮組織の存在無しでトランスウェル表面上へ直接プリントされたケラチノサイトペーストが、重層化層へ組織化しなかったことを示す。同じ分化マーカーに対する染色は、規定された層を含まないかまたは別個の細胞形態を含まない混合発現を示す。この予想外の知見は、真皮層が表皮ケラチノサイトの分化および／または重層化を指示すること、ならびに表皮細胞単独には存在しない、真皮細胞および表皮細胞の組み合わせの独自性があることを示している。3)表皮細胞および真皮細胞の両方から構成された組織中において観察された層状構造の程度は、CK5-陽性基底層の染色を含み、これは、ネイティブなヒト皮膚と同様に、表皮層の底部での規定の領域に限定される。層状構造はまた、中期分化におけるCK10陽性(図19C)有棘および顆粒ケラチノサイトを含み、その上にH&Eおよびトリクローム染色(それぞれ図19AおよびD)によって可視であるケラチノサイトの形態学的に別個の角化層を含む。このアプローチの注目すべき利点は、真皮層の外観である。H&E染色は、真皮線維芽細胞が、前の実施例1および2におけるような薄いシートを形成しないが、より厚い構造体を形成することを示している。コラーゲン付着（これは、真皮中における通常の線維芽細胞機能の重要な指標である）が、トリクローム染色(青色)および真皮細胞間のコラーゲン3についての免疫蛍光染色(赤色)の両方によって理解され得る(図19)。
【０１５３】
実施例4−公知の刺激原1% Triton X-100（商標）への1時間の曝露を伴う毒物学モデルにおいて、バイオプリントされた全層皮膚組織を利用する
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel（登録商標）2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞：ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって87.1%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって60,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ3 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり1.5 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地を、続いてその後48時間(第4日)で1.5 mlの体積で変えた。第5日に、培地を変え、1ウェル当たり1mlへさらに減らし、その後毎日変えた。第10日に、皮膚組織を、1% Triton X 100を使用する皮膚刺激試験法へ供した。1% Triton X-100（商標）は、他の3D皮膚モデルにおいて現在使用される公知の刺激原および参照化学物質である。方法は、インビトロ皮膚刺激または腐食へヒト皮膚モデルを適用するためのOECDガイドライン439および431にそれぞれ基づいた。第10日に、馴化培地を保存し(指定時間=0)、1 mlの新鮮な培地をトランスウェルの外部ウェルへ添加した。プリントされた皮膚組織を、次いで、陰性対照としての20μlのPBSで、または陽性対照および公知の刺激原としての20μlの1% Triton X-100（商標）で処理した。試験物質をピペットによって手動で組織の頂端面へ移した。Triton X-100（商標）を脱イオン水中の1%水溶液へ希釈し、使用前に20ミクロンフィルターで無菌濾過した。サンプルを、37℃で30分間、続いて室温で30分間、合計60分間、インキュベートした。培地を保存した(指定時間=1時間)。次いで、サンプルをPBSすすぎによって徹底的に洗浄した。次いで、トランスウェルを新しい6-ウェルプレート中に置き、新鮮な培地(1 ml)を外部ウェルへ添加し、次いで、一晩37℃へ戻した。次いで、処理後24時間および48時間で培地を変えた。収集した全培地は、時点 = -48、0、1、24、および48時間を含んだ。IL-1α産生(R&D Systems)を、製造業者のプロトコールに従って比色アッセイにおいて分析した。培地を、細胞傷害性についてのマーカーとしての乳酸デヒドロゲナーゼについて分析した。IL-1α産生を古典的な細胞傷害性試験の補足的なエンドポイントとして評価し、刺激原の予測可能性を改善した。ケラチノサイトは、通常、化学的または物理的なストレスに応答して炎症性サイトカインIL-1αを産生し、放出する。処理後48時間(第12日)で、組織を、RNA抽出およびその後のqPCR解析のために溶解させたか、またはアラマーブルーアッセイによって生存性について試験し、次いで、PBS中でリンスし、組織学的解析のために2% PFAで固定した。アラマーブルー(Life Technologies)を、製造業者の説明書に従って培地へ添加し、組織構築物(1 ml)と共に37℃で3時間インキュベートした。生存性をレサズリンからレゾルフィンへの変換による培地中の蛍光として測定した。
【０１５４】
結果
生存性／細胞傷害性に対するTriton X-100処理の効果を、アラマーブルーアッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、およびIL-1α産生によって定量化した。1% Triton X 100で1時間処理された皮膚組織は、処理後に試験された1時間、24時間、および48時間の時点でPBS対照と比較してLDH活性のおよそ2倍の誘導を示した。対照的に、PBS対照は0時間での初期ベースラインと同様である(図21A)。IL-1α活性もまた、PBS対照と比較してTriton X処理に応答して増加し、最大差は処理後1時間で観察された。IL-1αレベルは、処理後24時間で高いままであったが、48時間でベースラインへ戻った(図21B)。処理後48時間での組織の比較は、PBS対照と比較して生存性の80%減少を示す(図18C)。第12日でのPBS対照群における皮膚組織のH&E染色は、別個の層状構造を示す(図22A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される(図22B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。層状構造はまた、中期分化におけるCK10-陽性有棘および顆粒ケラチノサイトを含む(図22C)。コラーゲン付着（これは、真皮中における通常の線維芽細胞機能の重要な指標である）が、トリクローム染色(図22D)(青色)および真皮細胞間のコラーゲン3についての免疫蛍光染色(赤色)(図22E)の両方によって理解され得る。増殖マーカーPCNAに対する染色(緑色)は、真皮線維芽細胞および基底層ケラチノサイトの両方において増殖が高いが、分化中のケラチノサイトにおいては高くないことを示している。このパターンは、ネイティブな皮膚において見られるものと類似している。TUNELによるアポトーシスについての染色もまた、真皮層または表皮層のいずれにおいてもごくわずかな陽性染色細胞を低く示している(図22F)。まとめて、PCNAおよびTUNEL染色は、全層組織の真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントの両方が第12日に生存可能であることを実証している。Triton Xで処理された組織は、肉眼ではPBS対照組織と同様に見えた。しかしながら、組織学的解析は、H&Eによる表皮層および真皮層の分離を明らかにし(図22G)、これは、基底膜および／または基底ケラチノサイト層の可能性のある壊死を示唆している。ケラチノサイト分化マーカーCK5、IVL、およびCK10が見られ得るが(図22HおよびI)、CK5陽性基底ケラチノサイト層が断片化されている。コラーゲン3染色もまたPBS対照と比較し、これは、真皮線維芽細胞機能の減少を示している(図22K)。生存性もまた減少し、生化学的データと一致している。これは、真皮線維芽細胞中のより少ないPCNA陽性染色および基底層中の染色の欠如によって明白な、増殖の減少によって実証される。真皮層中のTUNEL陽性染色によって実証されたようなアポトーシスの増加(図22L)と組み合わせて、組織学は、1% Triton Xはバイオプリントされた皮膚に対する刺激原であることを示唆している。遺伝子発現解析は組織学的および生化学的知見を支持している。データは、第0日での組織と比較してのPBS対照群における経時的な表皮分化マーカーCK1、CK10、ならびに後期マーカーIVL、ロリクリン、およびFLGの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲンIおよび4レベルは実験の時間経過にわたって維持され、一方、コラーゲン3レベルは増加することを示しており、これは、真皮層が生存可能のままであることを示唆している(図23)。1% Triton Xでの処理は、曝露後48時間での表皮マーカーおよび真皮マーカーの両方の発現を劇的に減少させた(図23)。CK1およびCK10が減少し、これは、表皮の有棘層／顆粒層に対する可能性のある効果を示唆している。1型、3型、および4型コラーゲンのコラーゲン産生が減少し、これは、同様に、真皮線維芽細胞の機能に対する負の影響を示唆している。炎症性サイトカインIL1a遺伝子発現もまた分析し、これはPBS対照と比較して約3倍増加することが分かり、これは、処理後48時間において、ケラチノサイトはTriton Xへの曝露によって依然としてストレスをかけられていることを示唆している(図24)。
【０１５５】
実施例5−公知の刺激原5% SDSおよび1% Triton Xへの15分間の曝露を伴う毒物学モデルにおいて、24ウェルプレートフォーマットへ小型化された場合の、バイオプリントされた全層皮膚組織を利用する
手順
1ミリリットル当たり5000万個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel（登録商標）2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞：ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度をさらに減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。2 mm x 2 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。より小さな注射針を使用し、より小さなサイズでより大きな分解能を達成した。500um直径注射針で1つの0.5 mmシートをプリントする代わりに、250um直径針で0.25 mmシートの2つの層をプリントした。24ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって96.0%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって11,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。これは、Novogel（登録商標）を強固にするための重要な工程であり、これは、プリントされた形状を維持し、構築物間の均一性を改善するのを助ける。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ1 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり0.25 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地をその後毎日変えた。皮膚組織を、1% Triton X 100および5% SDSを使用する皮膚刺激試験法へ供した。1% Triton X 100および5% SDSは、他の3D皮膚モデルにおいて現在使用される公知の刺激原および参照化学物質である。方法は、インビトロ皮膚刺激または腐食へヒト皮膚モデルを適用するためのOECDガイドライン439および431にそれぞれ基づいた。第13日に、培地を変えた。馴化培地を保存し(指定時間=0)、1 mlの新鮮な培地をトランスウェルの外部ウェルへ添加した。プリントされた皮膚組織を、次いで、陰性対照としての5μlのPBSで、または陽性対照および公知の刺激原としての5μlの1% Triton X 100でもしくは5μlの%% SDSで処理した。試験物質をピペットによって手動で組織の頂端面へ移した。Triton X 100およびSDSの両方を脱イオン水中の水溶液に希釈し、使用前に20ミクロンフィルターで無菌濾過した。サンプルを室温で15分間インキュベートした。培地を保存した(指定時間=15分)。次いで、サンプルをPBSすすぎによって徹底的に洗浄した。次いで、トランスウェルを新しい6-ウェルプレート中に置き、新鮮な培地(0.25 ml)を外部ウェルへ添加し、次いで、一晩37℃へ戻した。次いで、処理後24時間および42時間で培地を変えた。収集した全培地は、時点 = 0、15分、24時間、および42時間を含んだ。IL-1α産生(R&D Systems)を、製造業者のプロトコールに従って比色アッセイにおいて分析した。培地を、細胞傷害性についてのマーカーとしての乳酸デヒドロゲナーゼについて分析した。IL-1α産生を古典的な細胞傷害性試験の補足的なエンドポイントとして評価し、刺激原の予測可能性を改善した。ケラチノサイトは、化学的または物理的なストレスに応答して炎症性サイトカインIL-1αを産生し、放出する。処理後42時間(第15日)で、組織を、RNA抽出およびその後のqPCR解析のために溶解させたか、またはアラマーブルーアッセイによって生存性について試験し、次いで、PBS中でリンスし、組織学的解析のために2% PFAで固定した。アラマーブルー(Life Technologies)を、製造業者の説明書に従って培地へ添加し、組織構築物(0.25 ml)と共に37℃で3時間インキュベートした。生存性をレサズリンからレゾルフィンへの変換による培地中の蛍光として測定した。
【０１５６】
結果
皮膚組織は、曝露後42時間でのPBS対照組織と比較してのSDSおよびTriton Xの両方に対する上昇したLDH反応を示した(図25A)。SDS処理群におけるLDH活性は、PBSよりも約1.7倍高く、一方、Triton Xは約1.4倍高く、これは、5% SDSでの15分間の曝露は、1% Triton Xよりも顕著な効果を構築物生存性に対して有したことを示唆している。IL-1a産生も両方の刺激原によって誘導され、しかしながら、SDS処理は、LDH活性と一致して、遥かにより強い反応をもたらした(図25B)。SDSおよびTriton Xで処理された組織は両方とも、アラマーブルーアッセイによって生存性の減少を示した(図25C)。SDSで処理された組織はPBS対照と比較して2.45%だけ生存可能であり、一方、Triton Xで処理された組織は68.75%生存可能であった。このデータは、LDH活性およびIL1a産生と一致しており、これは、5% SDSはこれらの試験条件下で1% Triton Xよりも遥かに強い刺激原であることを示唆している。実施例5と比較しての実施例4におけるTriton Xに応答しての差は、刺激原と共のより短いインキュベーション時間に起因し得る。
【０１５７】
本発明の好ましい態様が本明細書において表示および記載されたが、そのような態様はほんの一例として提供されていることは当業者に明白であろう。多数の変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によってここで想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の態様の様々な代替案が、本発明を実施する際に用いられ得ることが理解されるべきである。
【０１５８】
実施例6−ゼラチンを含有する真皮バイオインク、細胞外マトリックス、および細胞ペーストを含有する表皮バイオインクを使用する連続的付着によって全層皮膚組織をバイオプリントする追加の例
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel（登録商標）)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。3 mm x 3 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントした。12ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。IV型コラーゲン、ラミニン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンの混合物を含有する細胞外マトリックス(ECM)を、1ミリリットル当たり120マイクログラムの濃度で、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。100%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、ECMの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって94.4%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって14,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ0.5 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。培地を、ウェル中合計1 mlのために0.5 mlの体積で、90分後に再び添加した。培地を48時間後に1 mlの体積で変えた。培地をさらに24時間後(第3日)に0.5 mlの体積で再び変え、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地を、続いてその後一日おきに、0.5 mlの体積で変えた。第10日に、構築物を組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
【０１５９】
結果
第10日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図28AおよびB)。真皮層中の線維芽細胞は底部で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部に観察される。分化ケラチノサイトの別個の層状構造は、基底細胞マーカーCK5および分化マーカーインボルクリン(IVL)に対して同時に染色されることによって可視化される。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである(図28AおよびB)。以前のプリント法は基底ケラチノサイト層のCK5陽性染色を生じさせたが、表皮層と真皮層との間の界面または真皮-表皮接合部の境界は明らかには定められなかった。表皮ケラチノサイトの基底層と真皮層との間の界面に基底膜がある。IV型およびVII型コラーゲンは両方とも基底膜形成の特異的マーカーである。本アプローチにおいて、予想外であることは、基底膜マーカーであるIV型およびVII型コラーゲンの発現および組織化の程度である。予想外であることは、両方のマーカーの染色パターンが、ネイティブなヒト皮膚と同様に、真皮-表皮接合部での表皮ケラチノサイトの基底層の正確に底部での、規定の領域または線に限定されることである(図28E〜H)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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