(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病の診断及び治療及び予防のための方法であって、アルツハイマー病を有すると疑われる対象から生体サンプルを得るステップ；ＨＳＰ２７の発現のレベルを決定するステップであって、前記サンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質発現の、非アルツハイマー病患者からのサンプルと比較した統計的に有意な増加が、前記対象がアルツハイマー病を有することを示すステップ；及び、標準治療、又はＡβ４２ペプチドに対する免疫応答を引き起こし、これによってＡβ４２ペプチドの蓄積を予防し、したがってアルツハイマー病を予防又は治療する、Ａβ４２三量体ペプチドを発現する単一のベクター及びＡβ４２ペプチドの任意の追加を対象に提供することによる、アルツハイマー病の検出の結果として前記対象の治療を変更するステップを含む、前記方法を含む。
2017521092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の診断、治療又は予防のための方法であって、
アルツハイマー病を有すると疑われる対象から生体サンプルを得るステップ；
ＨＳＰ２７の発現レベルを決定するステップであって、前記サンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質発現の、非アルツハイマーの患者からのサンプルと比較した統計的に有意な増加が、前記対象がアルツハイマー病を有することを示す、ステップ；及び
標準治療又はＡβ４２三量体ペプチドを発現する単一のベクターを含む組成物を前記対象に提供することによる、アルツハイマー病の検出の結果として前記対象の治療を変更するステップであって、前記組成物がＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、ステップ；
を含む、
前記方法。
【請求項２】
組成物が、Ａβ４２ペプチド及びＤＮＡベクターをさらに含み、
前記Ａβ４２ペプチドが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射され、前記Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療が、配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＳＰ２７のレベルが、タンパク質発現を測定することによって決定され、
方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、抗体結合、蛍光活性化ソーティング、検出可能ビーズソーティング、抗体アレイ、マイクロアレイ、酵素アレイ、受容体結合アレイ、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＳＰ２７の発現レベルが、核酸レベルで決定され、
方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、検出可能ビーズソーティング、マイクロアレイ、酵素アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長法、標的特異的プライマー伸長法、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現レベルが、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現レベルが、１０５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
発現したＡβ４２三量体ペプチドが、非炎症性ＩｇＧ１応答をトリガする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ａβ４２ペプチド及び発現したＡβ４２三量体ペプチドが、アジュバントを用いることなくＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アルツハイマー病の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価するための方法であって、
（ａ）アルツハイマー病患者から得られたサンプルからＨＳＰ２７の発現レベルを測定するステップ；
（ｂ）第１サブセットの前記患者に候補薬剤を、第２サブセットの前記患者にプラセボを投与するステップであって、前記候補薬剤がＡβ４２三量体ペプチドをコードする単一のＤＮＡベクターを含む、ステップ；及び
（ｃ）ＨＳＰ２７の発現レベル又はアルツハイマー病の症状が、前記第２サブセットの患者と比較して前記第１セットの患者において低下したか決定するステップであって、統計的に有意な低下が、前記候補薬剤がアルツハイマー病の治療に有用であることを示す、ステップ；
を含む、
前記方法。
【請求項１２】
候補薬剤が、Ａβ４２ペプチドの添加をさらに含み、
Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターと、前記Ａβ４２ペプチドとが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射され、前記Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ａβ４２三量体ペプチドをコードするＤＮＡベクターが、配列番号１であり、Ａβ４２ペプチドが配列番号３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＳＰ２７のレベルが、タンパク質発現を測定することによって決定され、
方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、抗体結合、蛍光活性化ソーティング、検出可能ビーズソーティング、抗体アレイ、マイクロアレイ、酵素アレイ、受容体結合アレイ、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＳＰ２７の発現レベルが、核酸レベルで決定され、
方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、検出可能ビーズソーティング、マイクロアレイ、酵素アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長法、標的特異的プライマー伸長法、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現レベルが、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現レベルが、１０５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルス遺伝子リーダー配列、Ａβ４２三量体配列、及びエンドソームターゲティング配列の順番でこれらの配列を含む単一の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
ウイルス遺伝子リーダー配列が、アデノウイルスＥ３遺伝子リーダー配列である、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
核酸の上流にＣＭＶプロモーターをさらに含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
配列番号１を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
エンドソームターゲティング配列が、ＤＸＸＬＬ（配列番号２）である、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２４】
ベクターが、ＰＶ１-Ｈ３であり、かつ、アルツハイマー病を治療又は予防するための使用に適合されている、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２５】
アルツハイマー病の症状を改善するのに十分な量でＡβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとを含む、アルツハイマー病の症状を改善するための組成物であって、
Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、
前記組成物。
【請求項２６】
ＤＮＡベクター及びＡβ４２ペプチド及びＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
Ａβ４２ペプチドが、準毒性投与量で提供される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
アジュバントを用いることなく提供される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
主にＴｈ２応答を引き起こす、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
ペプチドが配列番号３を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
ベクターが配列番号１を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３３】
ＤＮＡベクターが、単一のＤＮＡベクターである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３４】
Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターの両方を、アルツハイマー病の症状を改善するのに十分な量で含む、アルツハイマー病の症状を改善するための組成物であって、
前記Ａβ４２ペプチド及び前記ＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射され、
前記組成物が、Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、
前記組成物。
【請求項３５】
Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターの両方が、アジュバントを用いることなく提供される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＤＮＡベクターが単一のＤＮＡベクターである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
主にＴｈ２応答を引き起こす、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
ペプチドが配列番号３を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
ベクターが配列番号１を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターの両方を注射することを含む、アルツハイマー病の治療又は予防のための方法であって、
前記Ａβ４２ペプチド及び前記ＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射に適合されており、
前記組成物がＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、
前記方法。
【請求項４２】
注射が、非炎症性ＩｇＧ１応答をトリガする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターの両方が、アジュバントを用いることなく提供される、請求項４１に記載の方法
【請求項４４】
ＤＮＡベクターが、単一のＤＮＡベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
組成物が、主にＴｈ２応答を引き起こす、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
Ａβ４２ペプチドが配列番号３を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
ベクターが配列番号１を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
組成物が、配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にアルツハイマー病の分野、より具体的には、アルツハイマー病の治療及び予防のための診断方法及び組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の範囲を限定することなく、その背景をアルツハイマー病と関連して記載する。
【０００３】
米国特許第７，４７９，５５０号は、Rosenberg, et al.に付与され、名称は“Amyloid β gene vaccines”である。この発明は、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質による遺伝子ワクチン接種のための組成物及び方法を含む。該ワクチンは、アルツハイマー病などの神経変性病に有効な治療を提供すると言われている。ワクチン接種方法は、Ａβに対するＴｈ２タイプ免疫応答を誘導するために使用できる。この免疫応答は、アルツハイマーのモデル系においてＡβ濃度及びＡβ斑サイズを実質的に低減させると言われている。この系の使用に伴う一つの課題は、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系として知られる２つの別個のベクターを使用する必要性である。Ｇａｌ４／ＵＡＳ系は、トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドＡベータ−４２ペプチドに対する免疫応答の誘導に有効であり、アミロイドＡベータ−４２蓄積の阻害をもたらした。しかし、バイナリーベクター系とも呼ばれる２−ベクター系は２つのプラスミドベクターを使用し、より高い生産負荷、滅菌問題、及び患者への準最適な使用を強いる。単一のプラスミドワクチンが生産及びクリニックにおける適用に理想的だろう。
【０００４】
米国特許第４，８１６，３８８号は、Sipe, et al.に付与され、名称は“Human prealbumin and related methods and products”である。簡潔には、この特許は、組換えヒトプレアルブミンに加え、プレアルブミンのバリアント型が関連する医学的状態のハイブリダイゼーション方法論による診断におけるヒトプレアルブミンｃＤＮＡの使用、言い換えると、ヌクレオチド塩基配列5'-ATGCAT-3'を認識する酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼアッセイによるタイプＩ家族性アミロイドポリニューロパチーの診断を教示すると言われている。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１４／００３１２４５号は、Khan, et al.によって提出され、名称は、Alzheimer's Disease-Specific Alterations of the ERK1/ERK2 Phosphorylation Ratio-Alzheimer's Disease-Specific Molecular Biomarkers (ADSMB)である。簡潔には、この出願は、アルツハイマー病を診断する方法並びに対象におけるアルツハイマー病の有無を確認する方法を教示すると言われている。本発明は、非アルツハイマーの細胞をアミロイドベータペプチドと接触させ、プロテインキナーゼＣアクチベーターで細胞を刺激し、細胞をテスト化合物と接触させ、そしてアルツハイマー病特異的分子バイオマーカーの値を決定することにより、アルツハイマー病の治療に有用なリード化合物を特定している。本出願はまた、刺激後の細胞における特異的リン酸化ＭＡＰキナーゼタンパク質と、プロテインキナーゼＣアクチベーターとの比の変化を検出することによる、対象におけるアルツハイマー病を診断する方法を教示すると言われている。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９４号は、Heneka, et al.によって出願され、名称は“Inhibitors of the Nitration of Amyloid Beta Peptides and Their Uses in the Diagnosis and Treatment of Alzheimer's Disease”である。簡潔には、この出願は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）の凝集のインヒビターを特定する方法であって、ａ）少なくとも一つのＡβ−ペプチド及び／又はそのニトロ化形態を、ニトロ化が可能な前記Ａβ−ペプチドにおける領域に潜在的に特異的に結合する少なくとも１つの候補インヒビターと接触させるステップ、及びｂ）前記少なくとも１つのＡβ−ペプチドの凝集の欠如又は低減の検出を通して、前記Ａβ−ペプチドにおける前記領域に特異的に結合している前記インヒビターを検出するステップを含む前記方法を教示すると言われている。本発明はさらに、前記インヒビターに基づく、ニューロン退化及び特にアルツハイマー病を治療するための改善された方法に関連する。本発明はさらに、ニューロン退化及び特にアルツハイマー病の関連における、Ａβ−ペプチドの凝集を診断する方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，４７９，５５０号
【特許文献２】米国特許第４，８１６，３８８号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／００３１２４５号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９４号
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、アルツハイマー病等の病気を有したことがあるか又は生じる可能性が高かった患者からの、組織、血液等の体液又は他の体要素などの患者のサンプルにおける、タンパク質の熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）のタンパク質レベル及び／又はＲＮＡ発現レベルに基づくアルツハイマー病のための診断検査を含む。ＨＳＰ２７のレベルは、ＥＬＩＳＡ、核酸ハイブリダイゼーション、ナノバイオセンサー技術又は他の検出システムを使用して患者のサンプルにおいて決定される。そして、新規な発現ベクターを用いて潜在的な患者及び患者におけるアルツハイマー病の治療又は予防を方向づけるために、上記診断検査が使用された。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる対象から生体サンプルを得るステップ；ＨＳＰ２７の発現のレベルを決定するステップであって、前記サンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質発現の、非アルツハイマーの患者からのサンプルと比較した統計的に有意な増加が、前記対象がアルツハイマー病を有することを示すステップ；及び標準治療又はＡβ４２三量体ペプチドをコードする単一のＤＮＡベクターを含む組成物を前記対象に与えることによる、アルツハイマー病の検出の結果として前記対象の治療を変更するステップであって、前記発現したＡβ４２三量体ペプチドがＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするステップ、を含むアルツハイマー病の診断の方法及び治療及び予防を含む。一態様では、対象がヒトである。別の態様では、ＨＳＰ２７がヒトＨＳＰ２７である。別の態様では、組成物がＡβ４２ペプチドをさらに含み、ＤＮＡベクター及びＡβ４２ペプチドを含む前記組成物が、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射される。別の態様では、ＨＳＰ２７のレベルがタンパク質発現を測定することによって決定され、方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、抗体結合、蛍光活性化ソーティング、検出可能ビーズソーティング、抗体アレイ、マイクロアレイ、酵素アレイ、受容体結合アレイ、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される。別の態様では、ＨＳＰ２７の発現のレベルが核酸レベルで決定され、方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、検出可能ビーズソーティング、マイクロアレイ、酵素アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長法、標的特異的プライマー伸長法、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される。別の態様では、血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現のレベルが、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い。別の態様では、血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現のレベルが、１０５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い。別の態様では、発現したＡβ４２三量体ペプチドが非炎症性ＩｇＧ１応答をトリガするが、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ応答をトリガしない。別の態様では、Ａβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとが、アジュバントを用いることなくＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするのに有効である。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、（ａ）アルツハイマー病患者から得られたサンプルからＨＳＰ２７の発現のレベルを測定するステップ；（ｂ）第１サブセットの前記患者に候補薬剤を、第２サブセットの前記患者にプラセボを投与するステップであって、前記候補薬剤がＡβ４２三量体ペプチドをコードする単一のＤＮＡベクターを含むステップ；（ｃ）ＨＳＰ２７の発現のレベル又はアルツハイマー病の症状が、前記第２サブセットの患者と比較して前記第１セットの患者において低下したか決定するステップであって、統計的に有意な低下が、前記候補薬剤がアルツハイマー病の治療に有用であることを示すステップ、を含むアルツハイマー病の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価するための方法を含む。一態様では、対象がヒトである。別の態様では、候補薬剤がＡβ４２三量体ペプチドをさらに含み、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなくＤＮＡベクター及びＡβ４２三量体ペプチドが筋肉内注射される。別の態様では、ＨＳＰ２７がヒトＨＳＰ２７である。別の態様では、ＨＳＰ２７のレベルがタンパク質発現を測定することによって決定され、方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、抗体結合、蛍光活性化ソーティング、検出可能ビーズソーティング、抗体アレイ、マイクロアレイ、酵素アレイ、受容体結合アレイ、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される。別の態様では、ＨＳＰ２７の発現のレベルが核酸レベルで決定され、方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、検出可能ビーズソーティング、マイクロアレイ、酵素アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長法、標的特異的プライマー伸長法、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される。別の態様では、血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現のレベルが、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い。別の態様では、血液サンプルにおけるＨＳＰ２７の発現のレベルが、１０５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い。別の態様では、ＤＮＡベクターが単一のＤＮＡベクターである。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態は、組成物、方法、医薬品、作製の方法、使用、及び、ウイルス遺伝子リーダー配列、Ａβ４２三量体配列、及びエンドソームターゲティング配列の順番でこれらの配列を含む単一の核酸を含む単一のベクターを含む、アルツハイマー病を治療又は予防するように製造された組成物を含む。一態様では、ウイルス遺伝子リーダー配列がアデノウイルスＥ３遺伝子リーダー配列である。別の態様では、ベクターが核酸の上流にＣＭＶプロモーターをさらに含む。別の態様では、ベクターが配列番号１を含む。別の態様では、エンドソームターゲティング配列が例えばＤＸＸＬＬ（配列番号２）であるか、又はヒトインバリアント（Il）鎖から得ることができる。別の態様では、ベクターがＰＶ１−Ｈ３である。別の態様では、ベクターがＰＶ１−Ｈ３であり、アルツハイマー病を治療又は予防するために使用される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、アルツハイマー病の症状を改善するのに十分な量でＡβ４２三量体ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドをコードするＤＮＡベクターとを含む、アルツハイマー病の症状を改善するための組成物を含む。一態様では、組成物がアジュバントを用いることなく提供される。別の態様では、組成物が主にＴｈ２応答をトリガする。別の態様では、Ａβ４２三量体ペプチド及びＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射される。一態様では、ＤＮＡベクターが単一のＤＮＡベクターである。別の態様では、ペプチドが配列番号３を含む。別の態様では、ベクターが配列番号１を含む。別の態様では、組成物が配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病の症状を改善するのに十分な量でＡβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとを両方含むアルツハイマー病の症状を改善するための組成物であって、Ａβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとが両方とも、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく（及びそれを使用することなく）筋肉内注射され、前記組成物がＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする前記組成物を含む。一態様では、発現したＡβ４２三量体ペプチド及びＤＮＡベクターがアジュバントを用いず提供される。別の態様では、ＤＮＡベクターが単一のＤＮＡベクターである。別の態様では、組成物が主にＴｈ２応答を導く。別の態様では、ペプチドが配列番号３を含む。別の態様では、ベクターが配列番号１を含む。別の態様では、組成物が配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、Ａβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとを両方含む組成物を注射することを含む、アルツハイマー病の治療又は予防のための方法であって、Ａβ４２ペプチド及びＤＮＡベクターが遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく（及びそれを使用することなく）筋肉内注射に適合され、前記組成物がＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする前記方法を含む。別の態様では、注射が非炎症性ＩｇＧ１応答をトリガする。別の態様では、Ａβ４２ペプチド及びＤＮＡベクターがアジュバントを用いず提供される。別の態様では、ＤＮＡベクターが単一のＤＮＡベクターである。別の態様では、組成物が主にＴｈ２応答を導く。別の態様では、Ａβ４２ペプチドが配列番号３を含む。別の態様では、ベクターが配列番号１を含む。別の態様では、組成物が配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のために、発明の詳細な説明並びに付随の図について記載する。
【図１】図１は、金粒子に結合するＤＮＡを示すグラフである。ＤＮＡ対金の最適な比は、４．５μｇのＤＮＡ（ｐ４ｕ−Ａｂ４２三量体）と１ｍｇの金である。この比において、カートリッジ（ブレット）プラス追加として２０％のＣＭＶｉ−Ｇａｌ４ ＤＮＡあたり、約３．８μｇのＡｂ４２三量体ＤＮＡが１．５ｍｇの金に結合できる。
【図２】図２は、アルツハイマー病に対するＤＮＡワクチンのための単一のプラスミドベクターの概略図である。アミロイドＡベータ−４２三量体遺伝子は、上流のＣＭＶ（ｐＣＭＶ）プロモーター及び下流のＳＶ４０ポリＡの間でクローニングされる。
【図３】図３は、本発明の単一のプラスミドがバイナリー系の２Ｘより活性が高いことを示す。
【図４】図４は、非炎症性プロファイルである単一のプラスミドＰＶ１−Ｈ３によって生成される抗体の抗体アイソタイプを示す。
【図５】図５は、三量体ＤＮＡ＋１０μｇＡβペプチド（又は別個の注射）による４筋肉注射（週に一回（２０μｇ）を行い、抗体を６週目に検査した結果を示すグラフである。アジュバントを使用しないＤＮＡ＋ペプチドがより強い免疫応答を引き起こすことが分かった。
【図６】図６は、４筋肉注射４回（週に一回）の筋肉注射（２０μｇの三量体ＤＮＡ＋１０μｇのＡβペプチド）を行い、ＥＬＩＳＡ法を用いて６週目にＡベータアイソタイプ抗体について血清を検査した結果を示すグラフである。アジュバントを使用しないＤＮＡ＋ペプチドが、ペプチド単体と比較してより強い免疫応答を引き起こすことが分かった。より高いアイソタイプ抗体レベルがＤＮＡ＋ペプチドにおいて得られたが、両グループとも、主にＴｈ２（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）に偏って、Ｔｈ１及びＴｈ２反応を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下に詳細に検討しているが、本発明は、広範な特定の状況において具体化できる多くの適用可能な発明コンセプトを提供することが理解されるべきである。ここで検討される特定の実施形態は、発明を作製及び使用するための特定の方法の単なる説明であり、発明の範囲を限定しない。
【００１７】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語が以下に定義されている。ここに定義されている用語は、本発明に関する当業者によって一般的に理解される意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの用語は単数実体のみを指すことを意図せず、特定の例が説明のために使用され得る一般的なクラスを含む。ここでの専門用語は、発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、請求項に概要される場合を除きそれらの使用は発明を限定しない。
【００１８】
ここで教示される「アミロイドＡベータ−４２」なる用語は、記載されているベクター全体（配列番号１）の一部であり、且つ配列番号２のアミノ酸列を有する、ここに教示されるアミロイドＡベータ−４２ペプチドバリアントをコードするヌクレオチドを指す。
【００１９】
ヌクレオチドに関して、「配列番号（＃）で本質的に記載される配列」、「に類似の配列」、「ヌクレオチド配列」なる用語及び類似の用語は、配列番号１としてここに特定されている配列のいずれかの部分に実質的に対応している配列を指す。これらの用語は、合成並びに天然由来の分子を指し、例えば、核酸セグメントによるハイブリダイゼーション、又はアミロイドＡベータ−４２の全て又は一部をコードする能力、又はアミロイドＡベータ−４２活性について等、生物学的に、免疫学的に、実験的に、又はさもなければ機能的に同等の活性を有する配列を含む。当然ながら、これらの用語は、その線形順序によって特定される配列における情報を含むことを意味する。
【００２０】
アミノ酸に関して、「配列番号２に本質的に記載される配列」、「に類似の配列」、「アミノ酸配列」なる用語及び類似の用語は、配列番号２の配列に実質的に対応するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、断片、融合体、誘導体及びその変化したものを指す。これらの用語は、合成並びに天然由来の分子を指し、例えば、抗原決定基として免疫学的活性を有するアミノ酸のセグメントについて等、生物学的に、免疫学的に、実験的に、又はさもなければ機能的に同等の活性を有する配列を含む。当然ながら、これらの用語は、その線形順序によって特定される配列における情報を含むことを意味する。
【００２１】
「遺伝子」なる用語は、機能的なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするユニットを指すために使用される。当分野で理解されるように、この機能的な用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、又はその断片又は組合せ、並びに遺伝子産物を含み、人間の手によって変化され得たものを含む。精製された遺伝子、核酸、タンパク質及び同類のものは、通常伴う少なくとも１つの汚染核酸又はタンパク質から特定及び分離されたこれらの実体を指すときに使用される。
【００２２】
ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、ＤＮＡセグメントをある細胞から別の細胞へ移動させる核酸分子を指す時に使用される。ベクターは、配列を増幅するように設計されたものとして、又はここに教示されるアミロイドＡベータ−４２遺伝子配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターとして、又はそのようなプロモーターが導入されるように設計されたものとしてさらに定義され得る。ベクターは、宿主細胞染色体と独立した状態で存在し得、又は宿主細胞染色体に組み込まれ得る。
【００２３】
「宿主細胞」なる用語は、ここに教示されるアミロイドＡベータ−４２遺伝子の核酸セグメント、又は古細菌的に、原核生物的に、又は真核生物的に変更されたセグメントを含むように設計されている細胞を指す。このように、設計された、又は組換えの細胞は、人間の手によって組み換え導入された遺伝子を含まない天然に生じる細胞と区別できる。
【００２４】
ここで使用される場合、「エンドソームターゲティング配列」なる用語は、ポリペプチド（又はその一部）をターゲットにするアミノ酸配列を指し、ポリペプチドに含まれた場合（例えば、ポリペプチドに融合又はコンジュゲートされる）、ポリペプチドのエンドソーム局在化を増加させる。分子をエンドソームに向けるエンドソームターゲティングシグナルは当分野で知られており、その配列を発現ベクターに組み込み、融合タンパク質がエンドソームターゲティングシグナルを含み生産されるようにすることができる。例えば、エンドソームターゲティングシグナル（インバリアント鎖Ｉｉ及びリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）、及び抗原をエンドソームの及び／又はリソソームの細胞内コンパートメントに向ける場合におけるそれらの使用を記載するSanderson et al.（Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:7217-7221, 1995）、Wu et al.（Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:11671-11675, 1995）及びThomson et al（J. Virol. 72:2246-2252, 1998）を参照のこと。したがって、エンドソームターゲティング配列は、例えばヒトインバリアント鎖などのターゲティング配列の全配列又は少しの部分のみを含んでもよく、一旦ポリペプチドがエンドソームに到達すると外されるプロポリペプチドに含まれてもよい。当業者は容易に、ターゲティング分子のエンドソームターゲティング部分を決定でき、エンドソームターゲティング配列を含む組換え融合タンパク質を作製するためによく知られた分子生物学技術を使用できる。さらなるエンドソームターゲティング配列が、当業者によって特定され、単なる日常の実験を使用して、ＨＬＡクラスIIペプチド提示経路へのターゲティングについて検査され得る。
【００２５】
ＨＳＰ２７。２７キロダルトンの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ２７）は、ＡＴＰ非依存性シャペロンである小熱ショックタンパク質ファミリーに属する。Ｈｓｐ２７の最も重要な機能は、非天然のタンパク質に結合し、リフォールディング−コンピテント状態を維持している正しく折り畳まれなかったタンパク質の凝集を阻害する能力に基づく。さらに、これは抗アポトーシス及び抗酸化作用を有する。
【００２６】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人斑（ＳＰ）、脳アミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）及び神経原線維タングル（ＮＦＴ）等の病変を特徴とし、それぞれ正しく折りたたまれなかったタンパク質のアミロイド−β（Ａβ）及びタウから主になる。Ｈｓｐ２７の細胞外発現は、古典的ＳＰにおいて、及びＳＰ及びＣＡＡ両方に関連するアストロサイトにおいて観察されている。病変内で見られるアミロイド−β（Ａβ）及びタウタンパク質はニューロンの欠失及び認知障害を誘導し、ＡＤの主な原因となると信じられている。アルツハイマー病ＡＤの研究に多大な労力が費やされてきたが、ＡＤの発症を決定するための正確な又は高精度な技術は現在のところない。
【００２７】
本発明者は、アルツハイマー病（ＡＤ）のプロセスの初期に、老人斑（ＳＰ）、脳アミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）及び神経原線維タングル（ＮＦＴ）などの病変内の死細胞及び瀕死細胞がそれらの細胞内容物を放出し、それらは体循環へと向かうことを発見した。Ｈｓｐ２７は病変の高い割合を占めるので、発明者は、アルツハイマー病（ＡＤ）の早期発症を決定するために、Ｈｓｐ２７の簡単で高精度な血液検査を開発した。
【００２８】
バイオマーカーとして熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）を使用。
【００２９】
本発明は、癌及びアルツハイマー病を含むいずれかの疾患を有したことがあるか又は生じる可能性が高かった患者からの、組織、血液等の体液又は他の体要素などの患者のサンプルにおける、タンパク質の熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）のタンパク質レベル及び／又はＲＮＡ発現レベルに基づくアルツハイマー病のための診断検査を含む。ＨＳＰ２７のレベルは、ＥＬＩＳＡ、核酸ハイブリダイゼーション、ナノバイオセンサー技術又は他の検出システムを使用して患者のサンプルにおいて決定される。
【００３０】
ＨＳＰ２７は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ファミリーの２７，０００ダルトンのメンバーである。ＨＳＰタンパク質はＡＴＰ非依存性シャペロンであり、タンパク質のフォールディング等のタンパク質構造の完全性を維持するために働く。このような構造タンパク質の完全性への摂動は、異なる疾患状態に関連する。一例は、Ａβアミロイドの間違ったフォールディングであり、アルツハイマー病の初期段階と関連する。
【００３１】
診断検査は、アルツハイマー病、癌及び他の疾患などの疾患の存在の兆候又は予測として、血液、組織又は他の体要素におけるＨＳＰ２７タンパク質のレベル及び／又はＨＳＰ２７遺伝子の発現レベルを決定するために開発された。ＨＳＰ２７に特異的なＥＬＩＳＡ免疫学検査が、患者のサンプル及び問題の疾患を有してない個体からのサンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質レベルを特定するために採用され、ＨＳＰ２７タンパク質レベルが比較される。疾患を伴う患者からのサンプルが、統計的により高いレベルのＨＳＰ２７（又は疾患によってはより低いレベル）を示した場合、それがその特定の疾患の診断検査の根拠となり得る。疾患（又は疾患前）サンプル及び非疾患サンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質のレベルを比較することに加え、疾患及び非疾患サンプルにおけるＨＳＰ２７のｍＲＮＡのレベルも、ＤＮＡ又は他の核酸プローブを使用したハイブリダイゼーションによって決定できる。診断検査を改善するためのこのような方法論の一例は、ナノバイオセンサー技術（一例は導波モード共鳴センサー技術）であり、放射性同位体等のタグ又はビオチンなどの化学性タグ等を必要とすることなく、ＨＳＰ２７タンパク質又はｍＲＮＡの検出を可能にし、リアルタイムで結果を示すことを可能にする。
【００３２】
血液サンプルにおけるＨｓｐ２７は、早期発症型アルツハイマー病（ＡＤ）を示す。この仮説をテストするために、我々は、臨床記録から決定された早期発症型アルツハイマー病（ＡＤ）を有すると最近決定された８人の患者、及び５人の正常な年齢と性別が適合した対象から血液サンプルを得た。血漿タンパク質を血液から回収し、古典的サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用してリン酸化Ｈｓｐ２７（ｐＨｓｐ２７）の濃度について検査した。簡潔には、血液を患者から採り、ＥＤＴＡを含むチューブに加え、遠心分離して血漿を回収し、アリコートし（aliquoted）、−８０℃で保管した。各アリコート（aliquot）の総タンパク質含有量を、標準としてウシ血清アルブミンを使用したブラッドフォード法により決定した。次いで、サンプルを、穏やかに振盪させながら４℃で１０分間、１％のLubrol WXと混合させ、ｐＨｓｐ２７含有量をスタンダードサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡潔には、９６−ウェルのマイクロタイタープレート（Nunc Immunoplate Maxisorp; Life Technologies）を、４℃で一晩、ｐＨ９．５の炭酸バッファーにおけるマウスモノクローナル抗ヒトｐＨｓｐ２７（２μｇ／ｍＬ）でコートした。次いで、プレートを、１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔにおいて１％ウシ血清アルブミンによるインキュベーションでブロックした。上清を加え、結合したｐＨｓｐ２７をウサギポリクローナル抗ｐＨｓｐ２７抗体の添加によって検出した。結合したポリクローナル抗体を、ウサギ免疫グロブリンに対するアルカリホスファターゼ−コンジュゲート化マウスモノクローナル抗体（Sigma Chemical Co）、次いでｐ−ニトロフェニルリン酸基質（Sigma Chemical Co）により検出した。結果として得られた吸光をBioRad Benmark Plus plate readerを用いて４０５ｎｍで測定した。標準の用量反応曲線をｐＨｓｐ２７（０〜２０，０００ｎｇ／ｍＬ; StressGen）に応じて作成し、ｐＨｓｐ２７の濃度を、これらの標準曲線を参照してASSAYZAP data analysis software（BIOSOFT）を用いて決定した。ｐＨｓｐ２７免疫学的検定のインターアッセイ変動は、＜１０％だった。結果は、５人の正常な対象と比較して、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する８／８の患者の血漿においてｐＨｓｐ２７に有意な増加があることを示した（表１）。
【００３３】
【表１】
2017521092.tif 000003
【００３４】
データは、材料及び方法のセクションに詳細に記載されているように、古典的なｐＨｓｐ２７のＥＬＩＳＡを使用して測定された、コントロール（正常な対象）及びアルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者からの血漿ｐＨｓｐ２７濃度である。データは、ｐＨｓｐ２７の平均濃度（ｎｇ／ｍｌ±ＳＤ）であり、４ウェルずつ（quadruplicates）実施された３つの独立実験の合計である。*、ｐ＜０．００１対コントロール（正常な対象）。
【００３５】
結果は、５つの非アルツハイマー病血液サンプルにおける６０、８５、６５、４５、８２の平均ＨＳＰ２７濃度（ｎｇ／ｍｌ）、及び８つのアルツハイマー病血液サンプルにおける１２５、１４５、２２５、１３８、１４９、３０８、１４９、１０８のＨＰＳ２７濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。このように、非アルツハイマー病患者の血液と比較してアルツハイマー病患者の血液において、ＨＳＰ２７のレベルの統計的に有意（ｐ＜０．００１）な増加がある。したがって、これは、個人からの血液サンプルにおけるＨＳＰ２７のレベルに基づく診断検査が、アルツハイマー病の存在を示し得るという開示である。
【００３６】
大量のアルツハイマー病及び非アルツハイマー病の個人からの大量のサンプルによる比較試験。さらに、決定は、ＰＳ１又はＰＳ２遺伝子異常を保有するが、アルツハイマー病の症状を持たないファミリーメンバーにおけるＨＳＰ４２レベルから成されることができる。ＰＳ１又はＰＳ２遺伝子異常を有する個人は、アルツハイマー病をおよそ４５〜５０の年齢で開始する９０％より高い危険性を有し、該疾患の他の形態で一般的である６５〜７０以上の年齢と対照的である。ＰＳ１又はＰＳ２無症候性患者における高レベルのＨＳＰ２７は、アルツハイマー病を発症するように進行し得、したがって、ＨＳＰ２７のレベルは症状の前にアルツハイマー病を予測し；このように、ＨＳＰ２７レベルを示す診断検査は予測的であり、アルツハイマー病の一般集団の血液をスクリーニングするために使用でき得る。
【００３７】
一旦本方法、又は標準のアルツハイマー病臨床検査を含む他の方法論を使用して診断が為されたら、本発明は、標的細胞への増強された送達、及び機能性Ａβ４２三量体ペプチドの増強された発現を有する新規な核酸ベクターも含む。
【００３８】
プラスミドの構築。
本発明者は、上流のＣＭＶプロモーター及び下流のＳＶ４０ポリＡの間でクローニングされる、アミロイドＡベータ−４２遺伝子の３つのコピーを有する単一のプラスミドベクターを構築した（図２）。驚くべきことに、単一のプラスミドベクターＰＶ１−Ｈ３は、より活性が高く、２ベクター系と比較してアミロイドＡベータ−４２に対する抗体を２倍以上誘導する。これは驚くべきことであり、なぜなら、活性は最初の２−ベクター系とおよそ同じだろうと仮定されていたからである。しかし、本発明は、より高い活性を示す利点に加え、製造、規制当局の承認、及び臨床有用性、単純性において、単一のベクター系であることの利点を見いだす。
【００３９】
図２は、アルツハイマー病に対するＤＮＡワクチンのための単一のプラスミドベクターの概略図である。アミロイドＡベータ−４２三量体遺伝子は、上流のＣＭＶ（ｐＣＭＶ）プロモーター及び下流のＳＶ４０ポリＡの間でクローニングされた。
【００４０】
図３は、本発明の単一のプラスミドがバイナリー系の２Ｘより活性が高いことを示す。簡潔には、８アプリケーションが使用される時、単一のプラスミドＰＶ１−Ｈ３は、アミロイドＡベータ−４２に対して約２Ｘ以上の抗体を誘導することが分かった（単一のベクターＰＶ１−Ｈ３による３３μｇ／ｍｌの抗Ａベータ４２抗体をバイナリー系Ｐ４ｕ−Ｈ３による１６μｇ／ｍｌの抗Ａベータ４２抗体と比較）。
【００４１】
図４は、非炎症性プロファイルである単一のプラスミドＰＶ１−Ｈ３によって生成される抗体の抗体アイソタイプを示す。
【００４２】
驚くべきことに、本発明のＰＶ１−Ｈ３単一のプラスミドは、主にＩｇＧ１抗体及び少量のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを生成したことも分かった。ＩｇＧ１抗体は炎症性応答に関与しない。遺伝子ではなく、ワクチンとしてアミロイドＡベータ−４２ペプチド自体を使用した過去の研究は、同量のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを誘導し、炎症性応答をもたらした。これらの結果は、ＰＶ１−Ｈ３が炎症性ではないＩｇＧ１を主に生成することを裏付ける。
【００４３】
高効率の単一のベクターＰＶ１−Ｈ３が本発明者によって作製され、これは２ベクター系よりアミロイドＡベータ−４２ペプチドに対する抗体を２倍高いレベルで誘導し、生成される抗体は、非炎症性応答を特徴にするＩＧｇ１が９０％である。
【００４４】
Ａβ４２三量体遺伝子を化学的に合成し、免疫付与ベクター系にクローニングした。
１．Ａ．４２ＤＮＡ配列の相補オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡビルダープログラムを使用して設計し、カスタム合成した（Sigma, St. Louis, MO）。
２．これらのオリゴヌクレオチドは、ヘアピン、プライマーダイマー構造及び他のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による遺伝子合成の妨げとなる配列間の不適切なマッチングを避けるために、ヌクレオチド配列のより柔軟性のある設計を可能にする特定のアミノ酸のための複数のコドンを使用して、それぞれのＡβ４２アミノ酸配列をもとに設計した。
３．合計で３２のオリゴヌクレオチド（最終濃度２５０ｎＭ）を、それらを組み合わせるために第１のＰＣＲ反応で混合し、設計した遺伝子配列を作った（３０サイクル：９４℃で１５秒、５５℃で３０秒及び７２℃で４５秒；Platinum（登録商標） Taq DNA Polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA）。
４．第２のＰＣＲを使用し、フォワード及びリバースプライマーを使用して完全長産物を増幅させた（３０サイクル：９４℃で１５秒、５５℃で３０秒及び７２℃で４５秒）。
５．この第２の実行からのＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって精製し、制限酵素で消化し（Promega, Madison, WI）、プラスミドベクターのポリクローニング部位にクローニングした（EcoRI/XbaI digestion）。
６．ライゲーションしたプラスミドで細菌を形質転換し、クローンを配列分析で同定した（Applied Biosystem, CA, Sequencing core of UTSW）。
７．アデノウイルスＥ３遺伝子リーダー配列及びエンドソームターゲティング配列を、Ａβ４２遺伝子の上流及び下流にそれぞれクローニングした。
８．コントロール免疫付与のために、対応するプラスミドを構築した。プラスミドｐＧａｌ４／ＵＡＳ−Ｌｕｃは、ｐＧａｌ４／ＵＡＳ−Ａβ４２三量体又は単量体と同じであるがＥ３リーダー及びエンドソームターゲティング配列が無いバイナリープラスミド系から成り、Ｌｕｃ遺伝子の転写はＧａｌ４転写因子の結合によって駆動される。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃでは、転写はＣＭＶプロモーターによって駆動される。
【００４５】
ＤＮＡ精製。
全てのプラスミドＤＮＡを、市販のplasmid maxi kit（Qiagen, Valencia, CA）を使用して精製した。ＤＮＡの純度及び濃度を、２６０／２８０ｎｍの光学密度測定及びゲル電気泳動で測定した。Qiagen endotoxin-free DNA purification kitが、エレクトロポレーションワクチンに必要であり得る。
【００４６】
ＤＮＡ−金粒子調製（臨床調製のための先進プロトコル）。
１．１．５ｍｌのマイクロフュージチューブ（シリコン処理, Fisher brand #05-541-27）に、６０ｍｇの金マイクロキャリア（Degussa Corporation Comgitm #及びBatch # 33451 60021-05を量る。
２．１００％のアルコールで２回洗浄し、４０℃で乾燥させる。
３．２７０μｇのｐ４ｕ−Ａｂ４２三量体（マウスワクチン用は慣習通りに７０μｇ）及び５４μｇのｐＣＭＶｉ−ｇａｌ４（慣習通りに１４μｇ）、合計ＤＮＡ３２４μｇ（慣習通りに７４μｇ）を加える。
４．１００μｌの０．０５Ｍのスペルミジンを加える。
５．金及びスペルミジン混合物を１０秒間ボルテックスする。
６．中度の速さのボルテックスミキサーで混合物をボルテックスする間、１００μｌの２．５ＭのＣａＣｌ２を混合物に滴加する。
７．混合物を１５分間、氷上で沈殿させる。
８．マイクロキャリア溶液をマイクロフュージで１分間スピンさせ（３０００ｒｐｍ）、金を沈殿させる。
９．上清を除去し、捨てる。
１０．毎回１ｍｌの新しい１００％エタノールを使用して、沈殿物を３回洗浄する。
１１．最後のエタノール洗浄の後、沈殿物を１．５ｍｌのエタノールに再懸濁する。
１２．これにより、懸濁液はチューブ準備のために準備ができた。あるいは、ＤＮＡ／マイクロキャリア懸濁液は、−２０℃で２ヶ月まで保管できる。凍結の前に、蓋をしっかりと堅く締め、チューブの蓋の周りにパラフィルム（登録商標）を巻く。−２０℃での保管後、パラフィルム封を壊す前に、粒子懸濁液を室温にもどす。
１３．Tubing Prep Stationを使用してGold-CoatチューブにＤＮＡ／マイクロキャリア懸濁液をロードする。
１４．マイクロキャリアを３〜５分間落ち着かせる。エタノールを吸い出す。
１５．０．３５〜０．４ＬＰＭの窒素で窒素を流し、Gold-Coatチューブを乾燥させる。
１６．Gold-Coatチューブを３〜５分間、回転させながら引き続き乾燥させる。
１７．チューブをチューブサポートシリンダーから外す。
１８．０．５インチのカートリッジに切断し、容器にいれる。
１９．容器を堅く締め、ラベルを付け、パラフィルムで巻き、−２０℃で保管する。
２０．２４時間の凍結及び１回の解凍の後、カートリッジ（ブレット）あたりの金粒子は、約１．５ｍｇの金に対し約３．８μｇのＰ４Ｕ−Ａｂ４２三量体及び０．９６μｇのＣＭＶｉ−Ｇａｌ４である。ブレットあたりのＤＮＡ量は１週間及び１ヶ月の−２０℃での保管後に検査され、Ｐ４Ｕ−Ａｂ４２三量体はブレットあたり約３．５μｇであるべきである。
【００４７】
図１は、金粒子に結合したＤＮＡを示すグラフである。ＤＮＡ対金の最適な比は、４．５μｇのＤＮＡ（ｐ４ｕ−Ａｂ４２三量体）と１ｍｇの金である。この比において、カートリッジ（ブレット）プラス追加として２０％のＣＭＶｉ−Ｇａｌ４ ＤＮＡあたり、約３．８μｇのＡｂ４２三量体ＤＮＡが１．５ｍｇの金に結合できる。
【００４８】
プラスミドＤＮＡ配列。
Ｐ４Ｕ−Ｈ３（Ａベータ三量体）。
配列：ｐ４ＵＫ−Ｈ３範囲：１〜４６００
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【００４９】
遺伝子銃及び金粒子を必要としない、ａベータ４２アルツハイマー病ＤＮＡワクチンの筋肉内送達。
【００５０】
ＡＤワクチンの商品化の主な障害は、患者送達について無菌条件下及び実用条件下でのＡＤワクチンベクターの送達だった。遺伝子銃は、製薬業界及びＦＤＡ規制機関にとって問題があるように思われる。他の様式の送達が、上記及び他のもの、例えばエレクトロポレーションによって取り組まれてきたが、効果がないと分かった。
【００５１】
驚くべきことに、発明者は、ＡＤ単一ＤＮＡベクター及び低濃度のＡベータ４２ペプチドの筋肉内注射が、図５に示すようにＡベータ４２ペプチドに対してとても高い抗体力価を引き起こすことをここに示す。
【００５２】
図５は、三量体ＤＮＡ＋１０μｇのＡβペプチド（又は別個の注射）による４筋肉注射（週に１回（２０μｇ）を行い、抗体を６週目に検査した結果を示すグラフである。アジュバントを含まないＤＮＡ＋ペプチドがより強い免疫応答を引き起こすことが分かった。
【００５３】
抗体アイソタイププロファイルを分析し、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答のバランスを決定した。驚くべきことに、本発明のアプローチはアジュバントを必要としなかったことが分かった。ここに教示される組成物の注射の簡単で早い方法は、治験及び患者に対する臨床使用を大きく拡大する。
【００５４】
送達されたＤＮＡ及びａベータ４５ペプチドを使用して生成される抗体のアイソタイプ。筋肉内注射によって：三量体単一ＤＮＡベクター（ｐｖ１−ｈ３）２０μｇ＋１０μｇのａベータ４２ペプチドを、合計で４週間、週に１回、マウスの筋肉に注射した。血清をマウスから取得し、ＥＬＩＳＡ方法を使用して６週目にａベータアイソタイプ抗体を検査した。
【００５５】
図６に見られるように、アジュバントを含まない三量体ＤＮＡ＋ペプチドは、ペプチド単体と比較してより強い免疫応答を引き起こした。より高いアイソタイプ抗体レベルが、ＤＮＡ＋ペプチドで得られた。両グループがＴｈ１及びＴｈ２反応を誘導したが、Ｔｈ２が優勢だった（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）。
【００５６】
図６は、４筋肉注射４回（週に１回）の筋肉注射（２０μｇの三量体ＤＮＡ＋１０μｇのＡβペプチド）からの結果を示すグラフであり、血清をＥＬＩＳＡ法により６週目にＡベータアイソタイプ抗体について検査した。アジュバントを含まないＤＮＡ＋ペプチドは、ペプチド単体と比較してより強い免疫応答を引き起こした。より高いアイソタイプ抗体レベルが、ＤＮＡ＋ペプチドで得られたが、両グループとも、主にＴｈ２（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）に偏って、Ｔｈ１及びＴｈ２反応を誘導した。
【００５７】
このように、三量体ＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく、筋肉内注射によって送達できることが分かった。さらに、抗体のレベル（３０μｇ／ｍｌ）は、筋肉内注射又は静脈内注射では、ＤＮＡ（３μｇ／ｍｌ）又はペプチド単体（１０μｇ／ｍｌ）より有意に高い。さらに、生成された抗体は、図５に示すように、主にＴｈ２応答（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）だった。
【００５８】
本明細書において議論した実施形態は、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても実行することができると考えられ、逆もまた同じである。さらに、本発明の組成物は本発明の方法を成し遂げるために使用することができる。
【００５９】
本明細書に記載される特定の実施形態は、例示のために示され、本発明の限定としてではないことが理解される。本発明の主要な特性は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者は、ただの日常の実験を用いて、本明細書に記載の特定の手順の多くの等価物を認識する又は確かめることができる。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲によってカバーされる。
【００６０】
本明細書に述べた、全ての出版物及び特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示している。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されるのと同程度に、本明細書に参照により組み込まれる。
【００６１】
特許請求の範囲及び／又は明細書中で用語「含む（comprising）」と併せて使用した場合、単語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１つの（one）」を意味し得るが、「１又は２以上」「少なくとも１つ」及び「１又は１より大きい」の意味とも一致する。特許請求の範囲中の用語「又は」の使用は、代替物のみ又は代替物が相互に排他的であることを指すとはっきりと示されない限り「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、値がデバイスのエラーの固有の変動を含むことを示すために使用され、本方法は、研究対象中に存在する値又は変動を決定するために用いられる。
【００６２】
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）において使用されるように、単語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、「含む」の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、「有する」の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」など、含むの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」など、含有するの任意の形態）は、包括的であり又は制限がなく、さらなる列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書において提供される任意の組成物及び方法の実施形態において、「含む（comprising）」は「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」で置き換えることができる。本明細書で使用されるように、句「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特定の整数（複数可）又はステップ、並びに請求した本発明の特徴又は機能に実質的に影響しないものを必要とする。本明細書で使用されるように、用語「からなる（consisting）」は、列挙した整数の存在（例えば、特性、要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、又は制限）又は整数の群（例えば、特性（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）、性質（複数可）、方法／プロセスステップ、又は制限（複数可））のみを示すために使用される。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「又はそれらの組合せ」は、用語の前に列挙した項目の全ての並べ替え及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、また特定の文脈において順序が重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図する。この例に続いて、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せが明確に含まれる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、通常いかなる組合せにおいても項目又は用語の数に制限はないことを当技術者は理解する。
【００６４】
本明細書で使用されるように、およその単語、例えば、制限することなく、「約」、「実質的な」、又は「実質的には」は、そのように修飾された場合、必ずしも絶対でも完全でもないと理解されるが、当業者が、条件が存在すると指定することを正当化するのに十分に近いと考えられる条件を指す。記載を変え得る程度は、いかに大きな変化を設定することができるか、及び当業者に、改変した特性が改変していない特性の必要な特徴及び能力を依然として有するとなおも認識させるかによる。先の議論の対象であるが、一般に、「約」など、およその単語によって修飾された本明細書における数値は、少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、又は１５％述べた値から変動し得る。
【００６５】
本明細書において開示及び請求された組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なく作製及び実行できる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記載されているが、変形形態が本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物及び／又は方法並びに方法のステップ又はステップの順序に適用できることが当業者には明らかである。当業者に明らかな全てのそのような類似の代替物及び改変物は、添付の特許請求の範囲により定義したように本発明の精神、範囲及び概念内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月23日(2017.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ４２三量体ペプチドを発現する単一のベクターを含む、アルツハイマー病の診断、治療又は予防のための組成物であって、
Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガし、
以下のステップを含む方法に使用される、前記組成物。
アルツハイマー病を有すると疑われる対象から生体サンプルを得るステップ；
ＨＳＰ２７の発現レベルを決定するステップであって、前記サンプルにおけるＨＳＰ２７タンパク質発現の、非アルツハイマーの患者からのサンプルと比較した統計的に有意な増加が、前記対象がアルツハイマー病を有することを示す、ステップ；及び
前記組成物を前記対象に提供することによる、アルツハイマー病の検出の結果として前記対象の治療を変更するステップ；
【請求項２】
組成物が、Ａβ４２ペプチド及びＤＮＡベクターの少なくとも１つをさらに含み、かつ
前記Ａβ４２ペプチドが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射され、前記Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするか、或いは
治療が、配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドを含むか、
対象がヒトであるか、或いは
Ａβ４２三量体ペプチドが、非炎症性ＩｇＧ１応答をトリガするか、或いは
Ａβ４２ペプチド及び発現したＡβ４２三量体ペプチドが、アジュバントを用いることなくＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＨＳＰ２７の発現レベルが、タンパク質又は核酸の発現を測定することによって決定され、
方法が、蛍光検出、化学発光検出、電気化学発光検出及びパターン化アレイ、抗体結合、蛍光活性化ソーティング、検出可能ビーズソーティング、抗体アレイ、マイクロアレイ、酵素アレイ、受容体結合アレイ、固相結合アレイ、液相結合アレイ、蛍光共鳴移動、又は放射性標識から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
サンプルが、血液サンプルであり、ＨＳＰ２７の発現レベルが、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４５、１５０、２７５、３００、又は３１５ｎｇ／ｍｌＨＳＰ２７より高い、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
Ａβ４２ペプチド及び発現したＡβ４２三量体ペプチドが、アジュバントを用いることなくＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするのに有効である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ウイルス遺伝子リーダー配列、Ａβ４２三量体配列、及びエンドソームターゲティング配列の順番でこれらの配列を含む単一の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターであって、
ウイルス遺伝子リーダー配列が、アデノウイルスＥ３遺伝子リーダー配列であるか、
前記ベクターが、核酸の上流にＣＭＶプロモーターをさらに含むか、
前記ベクターが配列番号１を含むか、
エンドソームターゲティング配列が、ＤＸＸＬＬ（配列番号２）であるか、或いは
前記ベクターが、ＰＶ１-Ｈ３であり、かつアルツハイマー病を治療又は予防するための使用に適合されている、
前記ベクター。
【請求項８】
アルツハイマー病の症状を改善するのに十分な量でＡβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとを含む、アルツハイマー病の症状を改善するための組成物であって、
Ａβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、
前記組成物。
【請求項９】
ＤＮＡベクター及びＡβ４２ペプチドが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射されるように適合されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ａβ４２ペプチドが準毒性投与量で提供されるか、
対象がヒトであるか、或いは
Ａβ４２三量体ペプチドが、非炎症性ＩｇＧ1応答をトリガするか、或いは
Ａβ４２ペプチド及び発現されたＡβ４２三量体ペプチドが、アジュバントを用いることなくＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガするのに有効であるか、或いは
Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターの両方が、アジュバントを用いることなく提供される、
の少なくとも１つである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバントを用いることなく提供される、請求項８〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
主にＴｈ２応答を引き起こす、請求項８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる、請求項８〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
Ａβ４２ペプチドと、Ａβ４２三量体ペプチドを発現するＤＮＡベクターとを含む、アルツハイマー病の治療又は予防のための組成物であって、
前記Ａβ４２ペプチド及び前記ＤＮＡベクターが、遺伝子銃又は金粒子を必要とすることなく筋肉内注射に適合されており、
前記組成物がＡβ４２ペプチドへの免疫応答をトリガする、
前記組成物。
【請求項１５】
配列番号１のベクター及び配列番号３のペプチドから本質的になる、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
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