(57)【要約】本開示は、高活性パンクレアチン酵素を含む高力価医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＨＡ−パンクレアチン酵素を作製する工程およびその組成物または剤形、およびそれらの使用のための方法を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、高活性パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）。
【請求項２】
少なくとも約１５０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
【請求項３】
少なくとも約２００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
【請求項４】
少なくとも約５００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
【請求項５】
請求項１、２、３、または４に記載のＨＡ−パンクレアチンを含む、高力価医薬組成物。
【請求項６】
前記パンクレアチンがブタ由来である、請求項１、２、３、４、または５に記載の組成物。
【請求項７】
投与単位あたり少なくとも約９，０００、約２０，０００、約４０，０００、約６０，０００、約８０，０００、または約１００，０００ＵＳＰ  ＩＵリパーゼを含む、請求項５、または６に記載の組成物。
【請求項８】
ＨＡ−パンクレアチンの複数の被覆粒子を含み、前記被覆粒子が少なくとも１つの腸溶性ポリマーで被覆されるコアを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
粉末、ペレット、ミクロスフェア、カプセル、サシェ、錠剤、液体懸濁液または溶液の形態の、請求項５、６、７、または８に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンの調製のための工程であって、２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒でパンクレアチンを処理することを含み、前記溶媒が単一の有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、工程温度が室温を下回る、工程。
【請求項１１】
前記溶媒が２８〜３８（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項１０に記載の工程。
【請求項１２】
前記溶媒が２８〜３４（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項１０に記載の工程。
【請求項１３】
前記溶媒が３４〜３８（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項１０に記載の工程。
【請求項１４】
前記溶媒が３４〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項１０に記載の工程。
【請求項１５】
前記溶媒が３８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項１０に記載の工程。
【請求項１６】
少なくとも約１５０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
【請求項１７】
少なくとも約２００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
【請求項１８】
少なくとも約２５０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
【請求項１９】
次の：
ａ１）パンクレアチンを懸濁し、不溶性部分を３４〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で沈殿させる段階；
ａ２）段階ａ１の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；
ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階、
を含む、請求項１０に記載の工程。
【請求項２０】
段階１ａ）が約４℃の温度で約６０分間行われる、請求項１９に記載の工程。
【請求項２１】
次の：
ａ１．１）パンクレアチンを撹拌しながら水性溶媒中に懸濁する段階；
ａ１．２）前記少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を段階ａ１．１の懸濁液に添加することによって不溶性部分を沈殿させる段階；
ａ２）段階ａ１．２の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；
ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階、
を含む、請求項１０、１９、または２０に記載の工程。
【請求項２２】
次の：
ａ１．１）パンクレアチンを撹拌しながら水性溶媒中に懸濁する段階；
ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を不溶性部分から分離する段階；
ａ１．３）前記少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を段階ａ１．２の可溶性部分に添加することによって不溶性部分を沈殿させる段階；
ａ２）段階ａ１．３の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；
ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階、
を含む、請求項２１に記載の工程。
【請求項２３】
段階ａ１．３が約３０分間行われ、工程温度が４℃である、請求項２２に記載の工程。
【請求項２４】
次の：
ａ１．１）パンクレアチンを懸濁し、不溶性部分を３８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で沈殿させる段階；
ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を前記不溶性部分から分離する段階；
ａ１．３）前記少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を段階ａ１．２の可溶性部分に添加することによって不溶性部分を沈殿させて２８〜３６の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する混合物を得る段階；
ａ２）段階ａ１．３の前記不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；
ａ３．１）段階ａ１．２の不溶性部分を乾燥させる段階；
ａ３．２）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階；
ａ４）段階ａ３．１の不溶性部分と一緒に段階ａ３．２の不溶性部分を混合する段階、
を含む、請求項１９に記載の工程。
【請求項２５】
段階ａ１．１のパンクレアチンが０．０５〜０．３ｇ／ｍＬの間に含まれる量である、請求項２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
【請求項２６】
段階ａ．１の水性溶媒およびａ１．２または段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項２１、２２、または２３に記載の工程。
【請求項２７】
段階ａ１．１の溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有し、段階ａ１．３の溶媒が３６（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する、請求項２４、または２５に記載の工程。
【請求項２８】
前記有機溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、炭素四塩化物、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ジメチルスルホキシドブチルアルコール、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン、およびメチレンクロリドの群から選択される、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項２９】
前記有機溶媒がアセトン、イソプロパノール、およびエタノールの群から選択される、請求項２８に記載の工程。
【請求項３０】
前記水性溶媒が緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項３１】
前記緩衝溶液がｐＨ＝７またはｐＨ＝４を有する、請求項３０に記載の工程。
【請求項３２】
前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒がｐＨ＝７を有する緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項３３】
前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒がｐＨ＝７を有する緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項３４】
前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒がｐＨ＝４を有する緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項３５】
前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒がｐＨ＝４を有する緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に記載の工程。
【請求項３６】
段階ａ．１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有し、前記溶媒がアセトンおよびｐＨ＝７を有する緩衝溶液の混合液であり、段階１．１ａのパンクレアチンが０．１ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項３７】
段階ａ１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度を有し、前記溶媒がアセトンおよびｐＨ＝４を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．１ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項３８】
段階ａ１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度を有し、前記溶媒がエタノールおよびｐＨ＝４を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．１ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項３９】
段階ａ１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度を有し、前記溶媒がアセトンおよびｐＨ＝７を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．３ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項４０】
段階ａ１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度を有し、前記溶媒がアセトンおよびｐＨ＝４を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．３ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項４１】
段階ａ１．１の水性溶媒および段階ａ１．３の有機溶媒により構成される溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度を有し、前記溶媒がエタノールおよびｐＨ＝４を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．３ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項４２】
段階ａ１．１の溶媒が３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有し、それがアセトンおよびｐＨ＝７を有する緩衝溶液の混合液であり、段階ａ１．１のパンクレアチンが０．１ｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の工程。
【請求項４３】
微生物および／またはウイルスの負荷量減少の段階を含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の工程。
【請求項４４】
前記細菌および／またはウイルス負荷量減少がろ過、加熱、電離放射線、高圧によるかまたはアルキル化により行われる、請求項４３に記載の工程。
【請求項４５】
膵臓酵素不全に関連する生理学的状態に陥っている患者の処置の方法であって、前記患者に医薬的に許容可能な量の請求項５、６、７、８または９に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
飽和硫酸アンモニウムを用いてネイティブパンクレアチンの溶液からパンクレアチンを沈殿させることを含む、ＨＡ−パンクレアチンを調製する方法。
【請求項４７】
次の：
ａ）ネイティブパンクレアチンを水性緩衝液中に懸濁する段階；
ｂ）ネイティブパンクレアチンの前記懸濁液を遠心する段階；
ｃ）段階ｂの上清を静かに移す段階；
ｄ）硫酸アンモニウム溶液を前記上清に添加して沈殿物を生成させる段階；
ｅ）段階ｄの懸濁液を遠心してＨＡ−パンクレアチンを含むペレットを生成させる段階、
を含む、ＨＡ−パンクレアチンを調製する方法。
【請求項４８】
前記硫酸アンモニウム溶液が飽和硫酸アンモニウム溶液である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
５０〜７５％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度になるように飽和硫酸アンモニウムが前記上清に添加される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
６０％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度になるように飽和硫酸アンモニウムが前記上清に添加される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
次の：
ｆ）前記ペレットを硫酸アンモニウムで洗浄する段階、
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペレットを水性緩衝液中で可溶化してＨＡ−パンクレアチンの溶液を生成させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＡ−パンクレアチン溶液がゲルろ過により脱塩される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ゲルろ過が架橋デキストランゲルを含むカラム上で行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも６０％を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのアミラーゼ活性の少なくとも７５％を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのプロテアーゼ活性の少なくとも５０％を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのタンパク質濃度の２〜５倍のタンパク質濃度を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも６０％、アミラーゼ活性の少なくとも７５％、およびプロテアーゼ活性の少なくとも５０％を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＨＡ−パンクレアチンが前記ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも６０％、アミラーゼ活性の少なくとも７５％、およびプロテアーゼ活性の少なくとも５０％ならびに前記ネイティブパンクレアチンのタンパク質濃度の２〜５倍のタンパク質濃度を有する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の工程によって調製されるＨＡ−パンクレアチンを含む、高力価医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、開示を全ての目的のためにその全体において参照により本明細書中に組み込む、２０１３年１１月５日提出の米国仮出願第６１／９００，０９２号の３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、高活性パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）酵素を含む高力価医薬組成物を対象とする。本開示はまた、ＨＡ−パンクレアチン酵素を作製する工程およびその組成物または剤形およびそれらの使用のための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
２００，０００人を超える米国人が罹患しているとＦＤＡが推定する膵外分泌不全（ＥＰＩ）は、個体がその膵臓により産生される酵素を欠くがゆえに食物を適正に消化できないという生理学的障害を含む。この消化酵素の欠失は、消化不良および栄養吸収不良などの障害につながり、これは、それに伴う、栄養不良および他の結果的なおよび望ましくない生理状態へと至る。これらの障害は、嚢胞性線維症（ＣＦ）ならびに膵臓癌、膵切除、および膵炎などの膵臓の外分泌機能を損なう他の状態に罹患する者に対してよく見られる。栄養不良は、特に乳幼児およびＣＦ患者の場合は、処置を行わないと生命に関わり得る。本障害は、成長不良，免疫反応不全、および寿命短縮につながり得る。
【０００４】
パンクレリパーゼ酵素および他の膵臓酵素産物（ＰＥＰ）などの消化酵素は、少なくとも部分的にＥＰＩを治療するために投与され得る。投与される消化酵素によって、患者はより効率的に食物を消化できるようになる。
【０００５】
ＥＰＩを処置するために使用されるパンクレリパーゼ酵素は、とりわけエラスターゼ、ホスホリパーゼ、およびコレステラーゼを含む他の酵素および様々な補助因子および補酵素を伴う、主に３種類の酵素クラス：リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼの組み合わせである。これらの酵素は、天然では膵臓で産生され、脂肪、タンパク質および炭水化物の消化に重要である。この酵素は、グリセロールおよび脂肪酸への脂肪の加水分解、デキストリンおよび糖へのデンプンの加水分解、ならびにアミノ酸および派生物質へのタンパク質の加水分解を触媒する。しかし、消化は、正確な消化機能に寄与する多くの他の酵素および基質を含み、全ての消化産物を産生することに関与する複雑な過程である。
【０００６】
パンクレリパーゼ酵素は、ブタ膵腺から調製され得る。他のパンクレリパーゼ供給源としては、ウシ膵腺および／または膵液が挙げられる。これらの酵素の天然の哺乳動物供給源によって、ヒト膵臓により分泌されるものと同様の酵素組成の産物が得られる。他の非哺乳動物供給源も使用され得、例えばＵ．Ｓ．６，０５１，２２０、Ｕ．Ｓ．２００４／００５７９４４、２００１／００４６４９３、および／またはＷＯ２００６０４４５２９に記載のものがある。
【０００７】
パンクレリパーゼ含有産物が効果的な治療となり得る一方で、それに伴う問題がある。食事ごとに複数（４から９個）の比較的大型のカプセル（高薬物負荷量（ｈｉｇｈ  ｐｉｌｌ  ｌｏａｄ））が必要とされることから、患者の服用順守が不良になる。高薬物負荷量（ｈｉｇｈ  ｐｉｌｌ  ｌｏａｄ）の結果生じる潜在的な微生物およびウイルス混入も望ましくないものとして注意すべきである。これらの問題は全て、酵素抽出物の純度が低いことと関連する。純度の問題は、粗製の水性混合物またはスラリーの生成、アルコール沈殿、遠心およびろ過を含む、長年にわたり用いられてきた酵素抽出手順の結果である。このような抽出工程から得られる最終産物の保持タンパク質は僅か２５％であり得る。例えば、これらのパンクレリパーゼ抽出物の有効性に関して重要な酵素であるリパーゼは、１００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇの範囲の活性を有する。これは、およそ２５，０００ＩＵ／ｍｇの活性を有する純粋なブタリパーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な純粋なブタリパーゼなど）の活性と対照をなす。計算の基礎としてこれらの近似を用いて、この生成物は、０．５％未満の活性リパーゼを含有すると推測され得る。さらに、過剰な不活性物質の存在のさらなる結果は、何らかの感染物質混入が回避不能にこの容積の一部分となり得、その結果、混合物の所望の活性構成要素と一緒にまた取り込まれ得ることである。過剰な不活性物質はまた、例えば膜フィルターまたはろ過カラムの目詰まりおよびその潜在的な感染バーデンを減少させるのに有用な電離放射線から抽出物を遮蔽することを通じて、バイオバーデンを減少させることを目的とした技術を妨害する。
【０００８】
ある事例において、多数の純粋な単一酵素および３種類の単一酵素の混合物がＥＰＩの処置のための臨床開発に入っている。これらは、組み換え胆汁塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）（ＥＸＩＮＡＬＤＡ（商標）／ＫＩＯＢＲＩＮＡ（登録商標））；母乳に含有されるヒトリパーゼの組み換え体ＭＥＲＩＳＰＡＳＥ（登録商標）；組み換えイヌ胃リパーゼＭＳ１８１９；組み換えリパーゼおよびリプロタマーゼ；化学的架橋組み換え細菌リパーゼからなる混合物；および微生物供給源から抽出されるプロテアーゼおよびアミラーゼである。これらの実験的治療薬は全て、今までのところ、ＺＥＮＰＥＰ（登録商標）またはＵＬＴＲＥＳＡ（登録商標）などのブタ膵臓からの市販の酵素抽出物と同等の治療効果レベルを示すことができていない。同様に、パンクレリパーゼ抽出産物で以前に得られたものと比較して脂肪吸収係数（ＣＦＡ）の上昇に関してその有効性がより低かったので、２０１１年１月１２日のＦＤＡの諮問会議はリプロタマーゼの承認に反対票を投じた。
【０００９】
既存のパンクレリパーゼ含有製品と比較してより濃縮され、精製されており、さらにＥＰＩの処置に対するその有効性を維持している生成物があればより好都合で潜在的により安全な製品を産生できるようになるため、このような生成物が明らかに必要とされている。プロテアーゼ、リパーゼまたはアミラーゼの単離のための出発物質としてパンクレリパーゼの使用を記載する多くの文献の報告がある。しかし、治療的使用のための改善された生成物を生成する目的のために精製されるＰＥＰまたは類似の生成物において見出されるタイプのパンクレリパーゼの報告はない。各事例において、これまでの努力は、全体的な酵素活性を実質的に上昇させることなく、他のものを凌ぐ特定の酵素または酵素分画を精製することまたはある種の構成要素を除去することであった。全ての事例において、治療剤としての使用のためのＨＡ−パンクレアチン産物を生成するための方向性もない。
【００１０】
タンパク質精製のための先行技術の方法は、パンクレリパーゼにより例示されるように、単純なタンパク質に富む分画を抽出および単離するか、または単一タンパク質もしくは単一クラスのタンパク質、例えばリパーゼもしくはプロテアーゼを分離することの何れかを目的とする。
【００１１】
例えば、本明細書中で参照により組み込まれるＨｗａｎｇら（Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００７，４６，４２８９）は、膵臓酵素溶解度と溶媒極性との間の関係を開示し、膵臓タンパク質からのリパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの選択的沈殿について報告している。Ｈｗａｎｇらは、極性が低い溶媒が使用される場合パンクレアチン沈殿が促進されること、および溶媒のヒルデブランド溶解度パラメーターが２８（ＭＰａ）０．５を下回る場合に沈殿が最大化されることを示す。３４（ＭＰａ）０．５を下回って溶媒極性が低下すると同時にアミラーゼおよびプロテアーゼの選択的沈殿が増加し、一方でリパーゼの選択的沈殿は溶液極性に依存せず、回収されるのは混合物中に存在するリパーゼの６５％以下である。これらの結果から、ＨＡ−パンクレアチンを得るために一緒に膵臓酵素の混合物を精製する動機はなく、当業者には、精製中に様々な酵素クラスの混合物を維持する動機はない。６０年間にわたり首尾よく治療製品中で使用されてきたパンクレリパーゼを精製するための試みがなかったという事実は、これを行う利益が構想または認識されることがなかったということを強く示すものである。パンクレリパーゼ製品を改善するための試みは全て、非膵臓供給源からの単一酵素に集中しており、これはさらに、改善された生成物の製造のためにより純度が高い、および／またはより濃縮された酵素の供給源としてパンクレリパーゼを使用することが以前には認識されていなかったことを強調する。
【００１２】
現在、製薬学的およびクリーニング適用において使用されているので、数倍高い酵素濃度で実質的に同等の酵素活性の定性的および定量的プロファイルを有する生成物を生成させる目的で、パンクレリパーゼを精製する動機または理由はない。実際に、現在の製品は、適正に、および実質的に６０年間にわたり不変のままであるものとして、それらの役割を果たしており、当技術分野において、著しく改善した生成物または本明細書中に記載の関連する調製工程の記載はないと思われる。ＥＰＩの処置のための純粋な酵素を含有する製品は全て、単一酵素をベースにしてきたか、またはある事例においては、組み換え技術または微生物供給源からの３種類の純粋で化学的に修飾される単一酵素の混合物をベースにしてきた。ＥＰＩの処置、クリーニングおよび組織消化のために使用される、粗製膵腺抽出物からプロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼを含む混合物を精製することには努力が払われてこなかった。同様に、個々に精製され、後に組み合わせられる膵臓供給源からの酵素の動機または報告はなかった。このようなアプローチは、単離酵素または酵素クラスを達成する目的とは逆である。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、ＨＡ−パンクレアチン酵素および高力価医薬組成物またはその剤形を対象とする。本開示はまた、ＨＡ−パンクレアチンを生成させる高収率工程およびこのような生成物を使用するための方法も対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、パンクレアチン抽出物のＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図２】図２は、実施例１５に記載のパンクレアチンの硫酸アンモニウム沈殿から得られた上清（Ａ）および再溶解沈殿物（Ｂ）のＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図３】図３は、実施例１５の未洗浄および洗浄硫酸アンモニウム沈殿物のＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図４】図４は、実施例１５の硫酸アンモニウム分画の溶出プロファイルを示す。分画４〜８は、２８０ｎｍでの吸収を示し、これはタンパク質の存在を示唆する。
【図５】図５は、実施例１５の分画６および１０のＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、実施例１７の硫酸アンモニウム分画の溶出プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、有効で顕著に高い治療活性を有する、より具体的には、不要な生物学的構成要素および／または望ましくない潜在的に感染性のある構成要素のバイオバーデンも減少している、必須酵素クラスを含む高活性−パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）を対象とする。本開示はまた、ＨＡ−パンクレアチンを、とりわけ非常に高い収率で、産生するための工程も対象とする。ＨＡ−パンクレアチンは、処方物をより小型でより好都合な剤形に、特に１個の丸剤として送達させ得る剤形、懸濁用の小粒子の剤形および単一投与単位中で他の治療剤または有用な成分と組み合わせることができる剤形にできる。本開示の組成物は、嚢胞性線維症患者など、ＥＰＩに罹患している患者に対して特定の価値があり得る。本開示はまた、患者の年齢または状態がカプセル以外の代替的な投与形式、例えば懸濁液、および／または粒子を必要とし得る場合に、処方物に製剤化するために有用でもあり得る。より濃縮された、ゆえにより小型の剤形、単位または粒子は、この患者群にとって大きな価値がある。本開示はまた、上で概説した理由のために、微生物および何らかの関連毒素などの不要なまたは望ましくない生物学的構成物を減少させるかまたは除去するために設計される技術の適用も可能にする。
【００１６】
本開示は、ＨＡ−パンクレアチン酵素（ＨＡ−パンクレアチン）およびその高力価医薬組成物を対象とする。特定の実施形態において、ＨＡ−パンクレアチンはブタ由来である。ＨＡ−パンクレアチンとしては、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼが挙げられ、少なくとも約１２０、または少なくとも約１５０、または少なくとも約２００または、少なくとも約４００、または少なくとも約５００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する。
【００１７】
本明細書中で使用される「消化酵素」という用語は、生物により摂取され得るかまたは吸収され得るように食物の構成要素を分解する消化管中の酵素を指す。消化酵素の非限定例としては、パンクレリパーゼ酵素（パンクレリパーゼまたはパンクレアチンとも呼ばれる）、リパーゼ、コ−リパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、パンクレアトペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、グリセロールエステルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、エラスターゼ、キニノゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−アミラーゼ、パパイン、キモパパイン、グルテナーゼ、ブロメライン、フィシン、β−アミラーゼ、セルラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１８】
「膵臓酵素」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、またはそれらの混合物などの、膵臓分泌液中に存在する酵素タイプの何れか１つ、またはパンクレアチンなどの、酵素活性を有する膵臓由来物の何らかの抽出物を指す。
【００１９】
「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレリパーゼ」または「パンクレアチン」という用語は、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼ酵素を含む、いくつかのタイプの酵素の混合物を指す。パンクレリパーゼ酵素は、例えばＮｏｒｄｍａｒｋ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  ＧｍｂＨ、またはＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＬＣから市販されている。
【００２０】
本明細書中で使用される「ＡＰＩ」という用語は、「消化酵素」または「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレアチン」を指す。
【００２１】
「リパーゼ」という用語は、グリセロールおよび単純な脂肪酸への脂質の加水分解を触媒する酵素を指す。適切なリパーゼの例としては、動物リパーゼ（例えばブタリパーゼ）、細菌リパーゼ（例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼおよび／またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）リパーゼ）、真菌リパーゼ、植物リパーゼ、組み換えリパーゼ（例えば、培養中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主細胞のうち何れか１つから選択される適切な宿主細胞による組み換えＤＮＡ技術を介して産生されるものであるかまたは、天然の配列と相同であるかもしくは実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換えリパーゼ、天然のリパーゼコード核酸と相同であるかもしくは実質的に同一である核酸によりコードされるリパーゼなど）、合成リパーゼ、化学的に修飾されたリパーゼ、およびそれらの混合物が挙げられるが限定されない。「脂質」という用語は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質などを含む天然の分子を広く含む。
【００２２】
「アミラーゼ」という用語は、デンプンを分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素を指し、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プチアリンなどの唾液アミラーゼなどである。本開示での使用に適切なアミラーゼとしては、動物アミラーゼ、細菌アミラーゼ、真菌アミラーゼ（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）アミラーゼ、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アミラーゼ）、植物アミラーゼ、組み換えアミラーゼ（例えば、培養中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主細胞のうち何れか１つから選択される適切な宿主細胞による組み換えＤＮＡ技術を介して産生されるか、または、天然の配列と相同であるかもしくは実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換えアミラーゼ、天然のアミラーゼコード核酸と相同であるかもしくは実質的に同一である核酸によりコードされるアミラーゼなど）、化学的に修飾されたアミラーゼ、およびそれらの混合物が挙げられるが限定されない。
【００２３】
「プロテアーゼ」という用語は、一般に、タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を破壊する酵素（例えば、プロテイナーゼ、ぺプチダーゼ、またはタンパク質分解性酵素）を指す。プロテアーゼは、それらの触媒型によって一般に同定され、例えば、アスパラギン酸ぺプチダーゼ、システイン（チオール）ぺプチダーゼ、メタロぺプチダーゼ、セリンぺプチダーゼ、スレオニンぺプチダーゼ、アルカリまたはセミアルカリプロテアーゼ、中性および未知の触媒機序のぺプチダーゼである。本開示での使用に適切なプロテアーゼの非限定例としては、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えばプラスメプシン）メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。さらに、本開示での使用に適切なプロテアーゼとしては、動物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼ、真菌プロテアーゼ（例えばアスペルギルス・メルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）プロテアーゼ）、植物プロテアーゼ、組み換えプロテアーゼ（例えば、培養中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物宿主細胞のうち何れか１つから選択される適切な宿主細胞による組み換えＤＮＡ技術を介して産生されるか、または、天然の配列と相同であるかもしくは実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換えプロテアーゼ、天然のプロテアーゼコード核酸と相同であるかもしくは実質的に同一である核酸によりコードされるプロテアーゼなど）、化学的に修飾されたプロテアーゼ、およびそれらの混合物が挙げられるが限定されない。
【００２４】
本開示の組成物のパンクレリパーゼ酵素は、１つ以上のリパーゼ（すなわち１つのリパーゼ、または２つ以上のリパーゼ）、１つ以上のアミラーゼ（すなわち１つのアミラーゼまたは２つ以上のアミラーゼ）、１つ以上のプロテアーゼ（すなわち１つのプロテアーゼまたは２以上のプロテアーゼ）、および様々な組み合わせおよび比率でのこれらの酵素の混合物を含み得る。
【００２５】
本開示の組成物中のリパーゼ活性は、約６５０〜約１００，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）であり得る。それは約６７５〜約８２５ＩＵ、約２，５００〜約２８，０００ＩＵ、約２，７００〜約３，３００ＩＵ、約４，５００〜約５，５００ＩＵ、約８，０００〜約１１，０００ＩＵ、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵ、および約１８，０００〜約２２，０００ＩＵ、約２２，５００〜約２７，５００ＩＵ、約３６，０００〜約４４，０００ＩＵ、およびそれらの間の全ての範囲およびサブ範囲であり得る。
【００２６】
本開示の組成物は、好ましくは、少なくとも約６５０ＩＵ（ＵＳＰ法）、少なくとも約９，０００を含有し得、さらにより好ましくはそれらは約２０，０００、約４０，０００、約６０，０００、約８０，０００、または約１００，０００ＵＳＰ  ＩＵ単位リパーゼ／投与単位を含有する。
【００２７】
本開示によるＨＡ−パンクレアチン組成物は、粉末形態であり得るかまたは圧縮形態、例えば錠剤であり得るか、または複数の被覆および／または非被覆粒子を含み得る。この粒子は、少なくとも１つの腸溶性コーティングで被覆されたコアを含み得、ここでこのコーティングは腸溶性ポリマーを含有する。被覆粒子以外の上記の組成物はまた、パンクレリパーゼの非被覆粒子を含み得る。特に、粒子はミニ錠剤、マイクロ錠剤、微粒子、ミクロスフェア、マイクロカプセル、および／またはマイクロペレットである。粒子の直径は約５ｍｍ以下であり得る。それらは、あらゆる適切な粒径または形態を有し得る。例えば、粒子の粒径は約２５〜５，０００μｍの範囲であり得る。例えば、それらは約２〜５ｍｍの範囲の名目粒径を有する「ミニ錠剤」の形態であり得るか、またはそれらは約２ｍｍ未満の、例えば約１〜２ｍｍの名目粒径を有する「ミクロ錠剤」であり得る。この粒子の平均粒径は約８００μｍ未満、好ましくは約５００μｍ未満、より好ましくは約２００μｍ未満であり得る。この粒子の体積直径（ｄ（ｖ，０．１））（体積分布の１０％がこの値を下回り、９０％がこの値を上回る直径として定義される）は４００μｍ以上であり、体積直径ｄ（ｖ，０．９）（体積分布の９０％がこの値を下回り、１０％がこの値を上回る直径として定義される）は約８００μｍ以下であり得る。
【００２８】
パンクレリパーゼコアが腸溶性コーティングにより取り囲まれている実施形態において、このコーティングは、医薬を胃の酸性環境から保護し、医薬が小腸に到達するまでその放出を実質的に妨げる障壁として作用する。薬物放出または治療効果にわたる所望のタイプの制御を提供するために、腸溶性コーティング組成物と他のコーティング組成物との適切な組み合わせを使用し得る。腸溶性コーティングは、少なくとも１つの腸溶性ポリマーおよびさらに賦形剤を含む。「腸溶性ポリマー」という句は、例えば酸性ｐＨで安定であるが、より高いｐＨで迅速に分解し得るポリマー、または、それが胃にあるときは消化酵素と胃内容物の接触が比較的小さく、胃腸管の残りの部分では逆であることを確実にするよう水和もしくは侵食速度が十分遅い、胃内容物から消化酵素を保護するポリマーを意味する。
【００２９】
腸溶性ポリマーの非限定例としては、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセテートフタレート、メタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートのエステル、メチルメタクリレートコポリマー、およびメタクリル酸／メチルメタクリレートコポリマー、メタクリル酸−エチルアクリレートコポリマー（１：１）、セラック、およびエチルセルロースが挙げられる。これらのポリマーは、セラセフェート（酢酸フタル酸セルロース）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００、Ｓ１００、Ｌ３０Ｄ、ＦＳ３０Ｄ、Ｌ１００−５５、Ｌ３０Ｄ５５（メタクリル酸のコポリマー）、ＡＱＵＡＴＥＲＩＣ（登録商標）（酢酸フタル酸セルロース）、ＡＱＯＡＴ（登録商標）（酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、およびＨＰ５５（登録商標）（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）など、様々なブランド名で市販されている。腸溶性コーティングは、タルクなどの他の賦形剤をさらに含み得る。好ましくは、腸溶性コーティングは１０から２０ｗｔ．％の少なくとも１つの腸溶性ポリマーを含み、この各ｗｔ．％は被覆粒子の総重量に基づく。コーティングは、脂肪族カルボン酸およびアルコール、好ましくはＣ１４−Ｃ１８カルボン酸またはアルコール、例えばステアリン酸、ミリスチン酸、ミリスチンアルコール、またはステアリルアルコールなどから選択される、脂溶性物質、例えばＣ６−Ｃ３０脂溶性低分子量分子などをさらに含み得る。コーティングの他の任意の成分は、可塑剤、固化防止剤（ａｎｔｉ−ｔａｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（タルク、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素およびそれらの組み合わせなど；さらに場合によっては低粘度エチルセルロース）である。適切な可塑剤の非限定例としては、トリアセチン、クエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリ−ｎ−ブチル、フタル酸ジエチル、セバシン酸ジブチル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒマシ油、アセチル化モノ−およびジ−グリセリド、セチルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。好ましい可塑剤は、非フタル酸系可塑剤またはそれらの混合物である。
【００３０】
公知の工程に従い、ＨＡ−パンクレアチン被覆または非被覆粒子を調製し得る。例えば、ＨＡ−パンクレアチンに適切な結合剤を添加し、続いて適切な溶媒の存在下で押出成形し、その後球形化することによって、マイクロペレットコアを調製し得る。小さいサイズのＨＡ−パンクレアチン粒子を生成するために、制御球形化が適用され得る。不活性コアを被覆することを通じてビーズを調製するために、噴霧コーティング、粉末層状化および流動床技術を使用し得る。被覆パンクレリパーゼ粒子の調製のために、コアセルベーション工程も有用であり得る。
【００３１】
賦形剤不含の圧縮錠剤を調製するために直接圧縮を使用し得る。ある特定の例において、錠剤は、胃液との接触時に疎水性コーティング層のｉｎ  ｓｉｔｕ形成のために胃耐性を呈し得る。
【００３２】
ＨＡ−パンクレアチンを含む組成物は、消化酵素を含有する治療剤の投与に適した任意の形態であってよく、例えばそれらは粉末、ペレット、ミクロスフェア、カプセル、サシェ、錠剤、液体懸濁液および溶液の形態であり得る。
【００３３】
本開示のある実施形態において、ＨＡ−パンクレアチンを含む剤形、特に、ＨＡ−パンクレアチンを含むより小さい剤形および／または単一の剤形を調製し得る。ＨＡ−パンクレアチンのアベイラビリティによって、例えば、２５０〜２７５ｍｇのＡＰＩが充填される２０，０００単位強度ＺＥＮＰＥＰ（登録商標）サイズ０カプセルの典型的な処方組成物と比較して、カプセルのサイズを小型化でき、および／または食事あたりのカプセル数を減少させてその用量を送達できるようになる。成人患者は、１回の食事あたり４〜１０個のこのようなカプセルを摂取し得る。２００，０００ＵＳＰ  ＩＵのリパーゼの総１日投与量の場合、患者は、ここで１０個のカプセルを摂取し、薬物製品摂取量は約２，５００〜２，７５０ｍｇである。少なくとも約２倍の精製は、必要とされる薬物製品の量を実質的に減少させるので有意義な改善をもたらし、より高い精製度はさらにより有益となる。実際に、本開示のＨＡ−パンクレアチン医薬剤形は、経口投与されるカプセルの形態をとり、約１００〜１１０ｍｇの薬物の含量（ｖｓ２５０から２７５ｍｇ）を有し、したがって２００，０００ＵＳＰ  ＩＵのリパーゼの総１日投与量のための患者の薬物製品摂取は約１，０００〜１，１００ｍｇ（ｖｓ２，５００〜２，７５０ｍｇ）である。さらに、ＨＡ−パンクレアチンカプセルでは、サイズ２（ｖｓサイズ０）が使用され得、したがって投与されるカプセルの総数も劇的に減少させ、またはあるいはサイズ０のカプセルを維持してその含量を適切に調整し、したがって１日摂取量を顕著に減少させる。ＥＰＩ処置は幼少期に開始されることが多い長期治療なので、より小さい投与単位に含有され、および／または食事あたりの投与単位数が減少されて摂取され得るようにパンクレリパーゼを処方できることは、患者にとって非常に有益である。
【００３４】
本開示の新規剤形はまた、小型の粒子剤形も含み得る。単位体積あたりの効力が向上したパンクレリパーゼ製品によって、ビーズの寸法縮小に関する重大な問題が克服される。市販パンクレリパーゼ剤形の大部分は、腸溶性ポリマーで被覆されるパンクレリパーゼビーズが充填されるカプセルである。このコーティングが適用されるのは、膵臓リパーゼが酸性媒体中で不可逆的に不活性化されるからである。本カプセルは開くことができ、ある種の食事上にビーズを振りかけることができるが、これは、年少患者または嚥下もしくは高い薬物バーデン（ｐｉｌｌ  ｂｕｒｄｅｎ）に対処するのが困難な者にとって重要な選択肢である。この選択肢は、しかし、ビーズの直径がかなり大きく、最大２ｍｍであり得るので、全患者のニーズに対処するものではない。これは、乳児または経管栄養を必要とする患者のための液体中でビーズが容易に懸濁されないことを意味する。ビーズの直径を縮小する試みの結果、総表面積が大きく拡大し、結果的に、粒子の拡大した表面積を効率的に被覆するためにはるかに多くの腸溶性ポリマーが必要となる。これによって、剤形のかさが薬物バーデン（ｐｉｌｌ  ｂｕｒｄｅｎ）をさらに向上させてコーティング賦形剤のレベルがそれらの１日摂取量に設定される確立された限界を超え得るという程度まで、剤形のかさおよび摂取されるポリマーの量が大きく増加する。
【００３５】
かさが大幅に縮小したＨＡ−パンクレアチンのアベイラビリティによって、単一投与単位中またはより少数の投与単位中に全体的用量を含有させることができるようになるだけでなく、パンクレリパーゼを他の化合物と組み合わせることも可能になる。例えば、制酸緩衝剤、例えば重炭酸ナトリウムなどおよびＨＡ−パンクレアチンを単一投与単位中で組み合わせ得る一方で、現在のパンクレリパーゼを用いる膵臓酵素および胃ｐＨを上昇させる物質のこのような組み合わせは、さらなるカプセル／錠剤が必要とされ、および／またはカプセル／錠剤のサイズが大きすぎるので既に非常に高い薬物バーデン（ｐｉｌｌ  ｂｕｒｄｅｎ）を劇的に上昇させるため、企図できない。
【００３６】
本開示のＨＡ−パンクレアチンはまた、緩衝液がパンクレアチンのリパーゼ構成要素の酸−不活性化を防ぐので、腸溶性コーティングがない分散可能な剤形を提供する選択肢も提供する。さらに、ＥＰＩ患者では一般に重炭酸塩分泌が低下するので、重炭酸塩補充もまた治療的有用性をもたらす。この新規剤形は、即時または遅延放出のために処方され得、液状媒体中で分散され得る。この後者の特性は、構成要素が食事または別の好都合な媒体中に容易に分散可能なので、流動食を要する患者にとって顕著な有益性をもたらす。これらの組み合わせは、カプセル、錠剤、サシェ、ビーズおよび液体など、様々な従来の体裁で送達され得る。上述のように、パンクレリパーゼ剤形を腸溶性ポリマーで被覆する必要があるのは、リパーゼ酵素が酸性媒体中で不安定である結果である。しかし、プロトンポンプ阻害剤の使用を通じて胃のｐＨが上昇する場合、リパーゼが活性状態のままであることが明らかになっており、これはおそらく、リパーゼを不活性化するのに十分低いｐＨレベルに曝露されないからである。このアプローチは、薬物バーデン（ｐｉｌｌ  ｂｕｒｄｅｎ）を増大させ、別の短所を克服するためにさらなる慢性投薬を使用するので好都合ではなく、必ずしも医学的に望ましくない。胃のｐＨは、重炭酸ナトリウムなどの単純な制酸薬で一時的に中和され得、薬物ＺＥＧＥＲＩＤ（登録商標）の構成要素であるＰＰＩオメプラゾールなど、酸に不安定な薬物を保護することにおいて有効であることが示されている。この薬物中の重炭酸ナトリウムレベルは１．１ｇであり、オメプラゾールのレベルは２０ｍｇまたは４０ｍｇの何れかであり、これらの構成要素は硬殻カプセル中に含有される。
【００３７】
ＨＡ−パンクレアチンおよび少なくとも１つの他の活性化合物、例えばＨ２アンタゴニスト、プロトンポンプ阻害剤または胆汁塩などの組み合わせを含有する単一剤形も本開示中で開示される。
【００３８】
本開示により製品改善が得られる。実際に、ＨＡ−パンクレアチンの調製によって、単純にこのバイオバーデンを保有する物質の量が減少する結果としてバイオバーデンが減少する。しかし、さらに、調製工程に対して使用される方法もバイオバーデンを減少させることができ、顕著に妨害度が減少した生成物が結果として生成されよう。さらに、生成物からの大量の不活性物質の除去によって、適用しようとする注射用生物製剤に対して使用される滅菌技術、例えば、ろ過、紫外線（ＵＶ）光曝露などの使用が可能になる。繰り返すが、これは、生成物の特徴の顕著なかつ予想外の改善に当てはまる。
【００３９】
本開示の組成物または経口剤形中に存在するＨＡ−パンクレアチンは、本明細書中で開示される工程に従い調製される。
【００４０】
出発物質はパンクレアチンである。本開示において、発明者らは、これをまた「ＡＰＩ」、または「出発パンクレアチン」、または「出発膵臓酵素」、または「ネイティブパンクレアチン」、「出発パンクレリパーゼ」、または「ネイティブパンクレリパーゼ」という用語を使用することによって呼び得る。
【００４１】
好都合な出発物質はブタ由来パンクレリパーゼであり；出発物質の例は、例えばＮｏｒｄｍａｒｋ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  ＧｍｂＨ、またはＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＬＣからの市販の物質である。ウシまたは他の哺乳動物供給起源からの同様の抽出物も使用され得る。好ましい出発物質は、ブタ由来パンクレリパーゼである。粗製抽出物を生成させるために使用される抽出手順は、次の段階を含むものとして要約できる：ブタ腺を湿潤状態で磨り潰し；パンクレリパーゼ「活性化因子」を添加；タンパク質を沈殿させて脂質を除去するために冷たいイソプロパノールおよび熱いイソプロパノールで「粗製酵素スラリー」を処理；繊維状物質を除去して圧縮および濃縮するための遠心およびろ過段階；「湿潤ケーキ」の真空乾燥；かさ密度および粒径のための「湿潤ケーキ」の脱塊状化および粉末化。この乾燥生成物が、現在の製品で使用されるパンクレアチンである。
【００４２】
本開示のＨＡ−パンクレアチンは、出発パンクレアチン（ネイティブパンクレアチン）を処理することによって調製される。これによって、膵臓酵素ベース製品の有効性に対して重要な要素が維持され、必須でない要素が除去される。本開示の工程から得られる物質はＨＡ−パンクレアチンである。このＨＡ−パンクレアチンは、少なくとも約１２０、または少なくとも約１５０、または少なくとも約２００、または少なくとも約４００、または少なくとも約５００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する。
【００４３】
本開示のＨＡ−パンクレアチンは、溶媒によってまたは硫酸アンモニウムによって誘導され得る沈殿を含む工程により得られてもよい。
【００４４】
少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して得られ、この溶媒は２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液、または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。本開示の溶媒誘導性沈殿工程は、ＨＡ−パンクレアチンを得るための、パンクレアチンの懸濁、不溶性部分の沈殿、不溶性部分の乾燥を含むことを特徴とする。
【００４５】
ある具体的な実施形態において、少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンが、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を用いて調製され、この溶媒は２８〜３８（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。
【００４６】
別の具体的な実施形態において、少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンが、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を用いて調製され、この溶媒は２８〜３４（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。
【００４７】
別の具体的な実施形態において、少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンが、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を用いて調製され、この溶媒は３４〜３８（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。
【００４８】
別の具体的な実施形態において、少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンが、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を用いて調製され、この溶媒は３４〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。ある具体的な実施形態において、少なくとも約１２０ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンが、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を用いて調製され、この溶媒は３８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有し、かつこの溶媒は１つの有機溶媒または有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり、この工程は低温で、好ましくは室温を下回る温度で行われる。
【００４９】
本開示の工程で得られるＨＡ−パンクレアチンは、少なくとも約１２０、または少なくとも約１５０、または少なくとも約２００、または少なくとも約４００、または少なくとも約５００ＵＳＰ  ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する。
【００５０】
ヒルデブランド溶解度パラメーターは、具体的な溶媒の相対的な溶解挙動を示す数値である。それは溶媒の凝集エネルギー密度から導かれ、一方、凝集エネルギー密度は気化熱から導かれる。ヒルデブランド値は、Ｂａｒｔｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８３などの文献から入手可能である。本開示の工程溶媒は、１つの有機溶媒またはより多くの有機溶媒の混合液または少なくとも１つの有機溶媒および水性溶媒の混合液であり；この有機溶媒および水性溶媒の混合液は、１つ以上の有機溶媒および１つ以上の水性溶媒を含み得る。本明細書中で使用される「溶媒」という用語は、別段の断りがない限り、本明細書中上記の全ての可能な混合液を指す。本溶媒は次の溶解度の値：４５、４２、４０、３８、３６、３５、３４、および２８を有し得、好ましい溶解度の値は３８および３６である。
【００５１】
有機溶媒は、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、炭素四塩化物、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ジメチルスルホキシド  ブチルアルコール、メタノール、アセトニトリル、ジオキサンおよびメチレンクロリドを含む溶媒の群から選択され得る。好ましい有機溶媒は、アセトン、イソプロパノール、エタノール、およびそれらの組み合わせである。
【００５２】
水性溶媒は、水、または緩衝溶液からなる群から選択され得る。好ましい緩衝液はｐＨ＝７またはｐＨ＝４を有する。それらは、それぞれｐＨ＝７：１０ｍＭリン酸緩衝液およびｐＨ＝４．０：１０ｍＭ酢酸緩衝液であり得る。
【００５３】
本開示のある実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、２８〜４５（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５４】
本開示の実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、２８〜３８（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５５】
ある具体的な実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、２８〜３４（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５６】
ある具体的な実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、３４〜３８（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５７】
別の実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、３４〜４５（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５８】
ある具体的な実施形態において、溶媒は、１つ以上の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合液であり、この混合液は、３８〜４５（ＭＰａ）０．５の範囲のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する。
【００５９】
溶媒混合液の溶解度パラメーター（ＳＰ）は、ヒルデブランド溶解度パラメーターを用いて計算される。
【００６０】
ある実施形態において、溶媒は、３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、水性溶媒と有機溶媒の混合液である。ＳＰ＝３８を有するこのような二元溶媒のいくつかの例は次のものである。
アセトン−緩衝液：ｐＨ＝７緩衝液に対するアセトンの体積比が３５：６５；ｐＨ＝４．０緩衝液に対するアセトンの体積比が３５：６５；ここでＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９；
エタノール−緩衝液：ｐＨ＝７緩衝液に対するエタノールの体積比が４５：５５；ｐＨ＝４．０緩衝液に対するエタノールの体積比が４５：５５；ここでＳＰ（エタノール）＝２６．０、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９；
【００６１】
別の実施形態において、ＳＰ＝３４（ＭＰａ）０．５である二元溶媒は：アセトン−緩衝液：ｐＨ＝７緩衝液に対するアセトンの体積比が５０：５０であり；ここでＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９である。
【００６２】
さらに別の実施形態において、ＳＰ＝３５（ＭＰａ）０．５である二元溶媒は、アセトン−緩衝液：ｐＨ＝７緩衝液に対するアセトンの体積比が４５：５５であり；ここでＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９である。
【００６３】
本開示のある実施形態において（一段階工程）、２８〜４５（ＭＰａ）０．５のＳＰを有する溶媒でのパンクレアチンの処理は、次の：ａ１）パンクレアチンを撹拌しながら懸濁し、２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる段階；ａ２）不溶性部分（ペレット）を段階ａ１の混合物の可溶性部分（上清）から分離する段階；ａ３）段階ａ２で得られた不溶性部分を乾燥させる段階を含み、これらの段階ａ１−ａ３は室温を下回る温度で行われる。本工程を行うための適切な温度は４℃である。
【００６４】
本開示のある実施形態において（一段階工程）、３４〜４５（ＭＰａ）０．５を有する溶媒でのパンクレアチンの処理は、次の：ａ１）パンクレアチンを撹拌しながら懸濁し、３４〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる段階；ａ２）段階ａ１の混合物の不溶性部分（ペレット）を可溶性部分（上清）から分離する段階；ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階を含み、これらの段階ａ１−ａ３は室温を下回る温度で行われる。本工程を行うための適切な温度は４℃である。
【００６５】
本開示のある実施形態において（一段階工程）、３４〜３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有する溶媒でのパンクレアチンの処理は、次の：ａ１）パンクレアチンを撹拌しながら溶媒中に懸濁し、３４〜３８（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる段階；ａ２）不溶性部分（ペレット）を段階ａ１の混合物の可溶性部分（上清）から分離する段階；ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階を含み、これらの段階ａ１−ａ３は室温を下回る温度で行われる。本工程を行うための適切な温度は４℃である。
【００６６】
段階ｌａは、好ましくは約６０分間行われ、好ましい温度は４℃である。分離段階（段階ａ２）は、遠心、沈殿またはろ過などの様々な方法により行われ得る。乾燥段階（ａ３）は、例えば高性能乾燥装置、真空ポンプ、または凍結乾燥装置中で行われ得る。他の方法も使用され得る。段階ａ１の溶媒中のパンクレアチン濃度は、好ましくは０．０５０〜０．３ｇ／ｍＬ、好ましくは０．０６５〜０．１ｇ／ｍＬの間に含まれる量、好ましくは０．０６５または０．１ｇ／ｍＬである。
【００６７】
一段階工程のある具体的な実施形態において、溶媒は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトンおよびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンの濃度は０．１ｇ／ｍＬである。
【００６８】
パンクレアチンを懸濁して不溶性部分を沈殿させるための本開示において、２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有する溶媒（または溶媒混合液）が使用される。この溶媒は、同時懸濁して沈殿させるための１回の添加として、または２つの連続的添加：懸濁するための第一の添加（懸濁溶媒）および不溶性部分を沈殿させるための第二の添加（沈殿溶媒）として使用され得る。この第二のケースにおいて、第一の添加は、好ましくは水性溶媒であり、第二の添加は有機溶媒（または混合液）である。第一の添加（懸濁溶媒）の水性溶媒および第二の添加の有機溶媒（沈殿溶媒）により構成される溶媒混合液は、２８〜４５の間に含まれる溶解度パラメーターを有する。
【００６９】
溶媒が有機溶媒および水性溶媒の混合液である本開示のある実施形態（２段階工程）において、パンクレアチンを最初に水性溶媒（懸濁溶媒）中に分散させ、次いで有機溶媒（沈殿溶媒）をその後に添加する。この実施形態において、段階ａ１は、次の：ａ１．１パンクレアチンを撹拌しながら水性溶媒中に懸濁する（懸濁）段階；ａ１．２  段階ａ１．１の懸濁液に有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させる（沈殿）段階を含む。したがって、この２段階工程は、次の：ａ１．１）パンクレアチンを撹拌しながら水性溶媒中に懸濁する段階；ａ１．２）ａ１．１の懸濁液に少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させる（沈殿）段階；ａ２）段階ａ１．２の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階を含む。
【００７０】
段階ａ１−ａ３は、室温を下回る温度で行われる。段階ａ１．１の混合物を静止状態に維持する。段階ａ１．１の持続時間は、スケールおよび装置に依存して約１０〜約３０分間であり、段階ａ１．２の持続時間は約３０分間である。
【００７１】
水性溶媒中のパンクレアチンは、好ましくは０．０５０〜０．３ｇ／ｍＬの間、好ましくは０．１〜０．３ｇ／ｍＬの間に含まれる量、好ましくは０．１または０．３ｇ／ｍＬである。有機溶媒は好ましくはエタノールまたはアセトンの何れかであり、水性溶媒は好ましくはｐＨ＝４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）またはｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）である。
【００７２】
２段階工程のある具体的な実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（それぞれ段階ａ１．１およびａ１．２で使用される溶媒）により構成される溶媒のＳＰは３８（ＭＰａ）０．５であり、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．１ｇ／ｍＬの濃度である。
【００７３】
２段階工程の別の具体的な実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（それぞれ段階ａ１．１およびａ１．２で使用される溶媒）により構成される溶媒のＳＰは３８（ＭＰａ）０．５であり、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ４緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．１ｇ／ｍＬの濃度である。
【００７４】
本発明のまた別の実施形態（多段階工程）において、溶媒が有機溶媒および水性溶媒の混合液である場合、パンクレリパーゼを最初に水性溶媒中に分散させ、次いで有機溶媒をこの水性分散液の可溶性部分に添加する。この実施形態において、工程段階ａ１）は、３段階：ａ１．１）懸濁する段階、ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分（上清）を不溶性部分（ペレット）から分離する段階、ａ１．３）沈殿させる段階を含む。この多段階工程は、次の：ａ１．１）パンクレアチンを撹拌しながら水性溶媒中に懸濁する段階；ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を不溶性部分から分離する段階；ａ１．３）段階ａ１．２の可溶性部分に少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させる（沈殿）段階；ａ２）段階ａ１．３の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；ａ３）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階を含む。
【００７５】
段階ａ１．１は、好ましくは約３０分間行われる。段階ａ１．３の混合物を約１５分間、静止状態で維持し、この段階に対する好ましい温度は４℃である。
【００７６】
水性溶媒中のパンクレアチンは、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜０．３ｇ／ｍＬの間に含まれる量、好ましくは０．１または０．３ｇ／ｍＬである。使用される懸濁溶媒および沈殿溶媒から構成される溶媒（それぞれ段階ａ１．１および段階ａ１．３で使用される溶媒）のＳＰは好ましくは３８である。有機溶媒は、好ましくはエタノールまたはアセトンの何れか（沈殿溶媒）であり、水性溶媒は、好ましくはｐＨ＝４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）またはｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）である。
【００７７】
多段階工程のある具体的な実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（それぞれ段階ａ１．１および段階ａ１．３で使用される溶媒）により構成される溶媒は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．３ｇ／ｍＬの濃度である。
【００７８】
多段階工程のまた別の実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒から構成される溶媒（それぞれ段階ａ１．１およびａ１．３で使用される溶媒）は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはエタノール（沈殿溶媒）およびｐＨ４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．３ｇ／ｍＬの濃度である。
【００７９】
多段階工程のまた別の実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒から構成される溶媒（それぞれ段階ａ１．１およびａ１．３で使用される溶媒）は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．１ｇ／ｍＬの濃度である。
【００８０】
多段階工程のまた別の実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（それぞれ段階ａ１．１および段階ａ１．３で使用される溶媒）から構成される溶媒は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ｌａのパンクレアチンは０．３ｇ／ｍＬの濃度である。
【００８１】
分離段階（一段階工程および多段階工程の段階）は、遠心またはろ過などの様々な方法によって行われ得る。ＨＡ−パンクレアチン調製工程の全工程段階は温度制御下で行われ、それは常に室温を下回り、好ましくは約４℃である。湿度もまた制御され得る。
【００８２】
本開示のある実施形態において（二重沈殿工程）、パンクレアチンを２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーター（ＳＰ）を有する溶媒で処理する段階は、次の：ａ１．１）パンクレアチンを懸濁して２８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる（懸濁および沈殿）段階；ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を不溶性部分から分離する段階、ａ１．３）段階ａ１．２の可溶性部分に少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させ、ａ１．１（沈殿）の使用溶媒のＳＰ値よりも低いＳＰ値を有する混合液を得る段階；ａ２）段階ａ１．３の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；ａ３．１）段階ａ１．２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ３．２）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ４）段階ａ３．１の不溶性部分を段階ａ３．２の不溶性部分と一緒に混合する段階を含む。
【００８３】
段階ａ１．３の溶媒のＳＰ値は、ａ１．１で使用される溶媒のＳＰ値とは異なり；それは常にａ１．１での溶媒のＳＰ値よりも少なくとも約２単位低い。例えば、ａ１．１における溶媒のＳＰが３８である場合、段階１．３における溶媒のＳＰは３６以下であり、それは好ましくは２７〜３６の間であり得る。
【００８４】
本開示のある実施形態において（二重沈殿工程）、パンクレアチンを３８〜４５（ＭＰａ）０．５のＳＰを有する溶媒で処理する段階は、次の：ａ１．１）パンクレアチンを懸濁して３８〜４５（ＭＰａ）０．５の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる（懸濁および沈殿）段階；ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を不溶性部分から分離する段階；ａ１．３）段階ａ１．２の可溶性部分に少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させ、２８〜３６の間に含まれるヒルデブランド溶解度パラメーターを得る（沈殿）段階；ａ２）段階ａ１．３の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；ａ３．１）段階ａ１．２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ３．２）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ４）段階ａ３．１の不溶性部分を段階ａ３．２の不溶性部分と一緒に混合する段階を含む。
【００８５】
本開示のある好ましい実施形態（二重沈殿工程）において、パンクレアチンを３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有する溶媒で処理する段階は、次の：ａ１．１）パンクレアチンを懸濁して３８（ＭＰａ）０．５のヒルデブランド溶解度パラメーターを有する溶媒中で不溶性部分を沈殿させる（懸濁および沈殿）段階；ａ１．２）段階ａ１．１の可溶性部分を不溶性部分から分離する段階；ａ１．３）段階ａ１．２の可溶性部分に少なくとも１つの有機溶媒またはそれらの混合液を添加することによって不溶性部分を沈殿させ、３６のヒルデブランド溶解度パラメーターを得る（沈殿）段階；ａ２）段階ａ１．３の不溶性部分を可溶性部分から分離する段階；ａ３．１）段階ａ１．２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ３．２）段階ａ２の不溶性部分を乾燥させる段階；ａ４）段階ａ３．１の不溶性部分を段階ａ３．２の不溶性部分と一緒に混合する段階を含む。
【００８６】
乾燥段階ａ３．１およびａ．３．２は、真空下で４８時間室温で行われ；段階ａ１．１、ａ１．２、ａ１．３、ａ２は室温を下回る温度で行われる。本工程を行うための適切な温度は４℃である。
【００８７】
分離段階は、遠心、沈殿またはろ過などの様々な方法により行われ得る。乾燥段階は、例えば高効率乾燥器、真空ポンプ、または凍結乾燥器中で行われ得る。他の方法もまた使用され得る。段階ａ１の溶媒中のパンクレアチンの濃度は、好ましくは０．０５〜０２ｇ／ｍＬの間に含まれる量、好ましくは０．１ｇ／ｍＬである。
【００８８】
二重沈殿工程のある具体的な実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（段階ａ１．１で使用される溶媒）により構成される溶媒は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、ＳＰが３６（ＭＰａ）０．５である段階ａ１．３の溶媒はアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは５０ｇ／５００ｍＬの濃度である。
【００８９】
二重沈殿工程のある具体的な実施形態において、懸濁溶媒および沈殿溶媒（段階ａ１．１で使用される溶媒）により構成される溶媒は３８（ＭＰａ）０．５のＳＰを有し、それはアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１．３の溶媒は３６（ＭＰａ）０．５のＳＰを有しアセトン（沈殿溶媒）およびｐＨ７緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液など）（懸濁溶媒）の混合液であり、段階ａ１のパンクレアチンは０．１ｇ／ｍＬの濃度である。
【００９０】
本開示のさらなる実施形態において、硫酸アンモニウムにより誘導される沈殿工程によってパンクレアチン抽出物を精製する。本開示の別の実施形態において、パンクレアチンを水中または、リン酸緩衝食塩水などであるが限定されない緩衝液中に分散させる。遠心および上清の回収を通じて、または何らかの他の適切な方法を通じての何れかで、存在し得るあらゆる固形物を除去する。次いで溶解内容物が沈殿するように調製された飽和硫酸アンモニウムの溶液の適切な量を、パンクレアチン溶液に添加する。沈殿物を、遠心および／またはろ過などであるが限定されない何らかの適切な方法を通じて回収する。次いで回収沈殿物を、水中またはリン酸緩衝食塩水などであるが限定されない適切な緩衝液中に再溶解させる。
【００９１】
本開示のさらなる実施形態において、パンクレアチンをＰＢＳなどの適切な水性媒体中で分散させ、分散物を時折撹拌しながら約５〜約１５分間、氷上でインキュベートする。次いで分散物を１６，０００ｘｇで約３〜約８分間遠心し、上清を静かに移す。次いで、約５０％〜約７５％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度とするために飽和硫酸アンモニウムの溶液を上清に添加する。次に、懸濁液を１６，０００ｘｇで約３〜約８分間遠心し、上清を除去し、ペレットをＰＢＳ中に再溶解させる。またさらなる実施形態において、再溶解前にペレットを飽和硫酸アンモニウムで洗浄する。
【００９２】
本開示の工程はまた、ＨＡ−パンクレアチンの滅菌およびウイルス不活性化またはウイルス負荷量減少も含み得、これらは例えば、ろ過、加熱、照射（紫外線、Ｘ線、ベータ線およびガンマ線）、高圧処理および／またはβ−プロプリオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）を用いるなどの核酸のアルキル化によって行われ得る。８５℃を上回る温度、好ましくは８５℃〜１００℃の間などの温度での、１８時間を上回る時間および好ましくは１８〜４８時間、さらにより好ましくは１８〜３０時間などの適切な時間にわたる加熱も、ウイルス混入を減少させることにおいて有効であり得る。０．５重量％以下の残留水分を有する固形ＨＡ−パンクレアチンに対して、より低温（８４℃、好ましくは８０℃）での加熱が行われ得る。
【００９３】
膵臓酵素不全に関連する生理学的状態に陥っている患者の処置の方法が本明細書中で開示される。処置の方法には、医薬的に許容可能な量の本明細書中で開示される組成物を患者に投与することが含まれる。飽和硫酸アンモニウムを用いてネイティブパンクレアチンの溶液からパンクレアチンを沈殿させることを含む、ＨＡ−パンクレアチンを調製する方法が本明細書中で開示される。ＨＡ−パンクレアチンを調製する方法は、次の：ａ）ネイティブパンクレアチンを水性緩衝液中に懸濁する段階；ｂ）ネイティブパンクレアチンの懸濁液を遠心する段階；ｃ）段階ｂの上清を静かに移す段階；ｄ）上清に硫酸アンモニウム溶液を添加して沈殿物を生成させる段階；ｅ）段階ｄの懸濁液を遠心してＨＡ−パンクレアチンを含むペレットを生成させる段階を含み、ここで硫酸アンモニウム溶液は飽和硫酸アンモニウム溶液であり、飽和硫酸アンモニウムは約５０〜７５％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度、好ましくは６０％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度になるように上清に添加される。本方法は、ペレットを硫酸アンモニウムで洗浄すること、水性緩衝液中にペレットを溶解させてＨＡ−パンクレアチンの溶液を生成させることをさらに含み、ＨＡ−パンクレアチン溶液はゲルろ過によって脱塩し、ゲルろ過は架橋デキストランゲルを含むカラム上で行う。ＨＡ−パンクレアチンは、ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも約５０％、６０％、または７０％を有し、ネイティブパンクレアチンのタンパク質濃度の２〜５倍のタンパク質濃度を有し、ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも約６０％、アミラーゼ活性の少なくとも約７５％、およびプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有する。ＨＡ−パンクレアチンは、ネイティブパンクレアチンのリパーゼ活性の少なくとも約６０％、アミラーゼ活性の少なくとも約７５％、およびプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有し、ネイティブパンクレアチンのタンパク質濃度の２〜５倍のタンパク質濃度を有する。
【００９４】
上記から、本開示で開示される懸濁−沈殿アプローチに多くの長所があることが明らかである。これによって、高酵素活性のパンクレアチンの調製が可能になる。それは消化液中に存在する消化酵素を保持し、出発物質の消化挙動を維持する。それは、粗製抽出工程の結果として残存する消化に必要でない物質を除去し、このようにしてＡＰＩのかさを低下させる。それは細菌またはウイルス混入の減少または除去を可能にする。それは、混合酵素クラスの互いに対する比率の調節を可能にする。さらに、それは、高い効力を有する多くの剤形でＡＰＩを処方することを可能にする。
【００９５】
本発明の高活性パンクレアチンの調製について、懸濁−沈殿アプローチ（一段階、二段階、多段階、二重沈殿工程）は、硫酸アンモニウム沈殿を使用する工程よりも好ましく；二重沈殿工程は、本発明のより好ましい工程である。
（実施例）
【００９６】
材料
パンクレリパーゼ（ＡＰＩ、出発パンクレリパーゼまたはパンクレアチン、ネイティブパンクレリパーゼまたはパンクレアチン）はＮｏｒｄｍａｒｋにより提供され、ブタ膵臓から抽出される。それは、一般的には約３０％のタンパク質を含有し（ブラッドフォード法で定量）、９４．４ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇのリパーゼ活性、２５３．２ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇのプロテアーゼ活性、４２０．３ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇのアミラーゼ活性を有し；Ｐ／Ｌ比は２．７であり、Ａ／Ｌ比は４．５であり、水含量は０．３％である。
【００９７】
この物質を一次元および二次元電気泳動とそれに続くＭａｌｄｉ  Ｔｏｆ特性評価によって分析してパンクレリパーゼ構成成分を同定する（Ｍａｒｉｏ  Ｎｅｇｒｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）。この抽出物の二次元電気泳動から、水中で明らかに容易に溶解される分画中に少なくとも５０個のタンパク質／ペプチドスポットがあり、水中で容易に溶解されにくい分画中に３０個のタンパク質／ペプチドスポットがあることが示される。溶解度決定は、活性な酵素が、パンクレリパーゼの非水溶性構成要素上に吸着し得るかまたはそうでなければこれに捕捉され得るという事実によって混乱する。溶解度はまたｐＨの関数でもある。混合物中の個々のタンパク質に対応するスポット、ならびにより溶解性が高い、およびより溶解性が低い分画を用いて調製されるゲルの画像を、主要なスポットを切り出してウシトリプシンで消化し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびザイモグラフィーを用いて分析することにより分析する。ペプチド質量フィンガープリントをライブラリ参照物質からのものと比較し、アミラーゼ、リパーゼ、コリパーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１およびＢ、エラスターゼ２Ａおよび１、キモトリプシン、トリプシン、およびホスホリパーゼＡ２を同定する。抽出物は明らかに比較的粗製であり、かつ多数の活性酵素種に加えて多くの外来タンパク質を含有してもいる。
腸溶性処方物：ＰＥＰＴＡＭＥＮ（登録商標）Ｊｕｎｉｏｒ  １．０  Ｃａｌ（Ｎｅｓｔｌｅ、２５０ｍＬ包装）：脂肪含量：３．８ｇ／１００ｍＬ、タンパク質含量：３ｇ／１００ｍＬ、炭水化物含量：ＭＬＭＬ１３．８ｇ／１００ｍＬ。
【００９８】
方法
脂肪分解活性：測定はパンクレリパーゼ酵素ＵＳＰモノグラフに記載のリパーゼアッセイの公定手順に基づく方法を用いて行い、この方法は使用される基質（オリーブオイル）中のエステル化脂肪酸の加水分解から生成される遊離脂肪酸の、ｐＨ−スタット法による滴定に基づく。それは次の原理に基づく：リパーゼは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成につながるトリグリセリドの加水分解を触媒する。時間に従い生成するＦＦＡの滴定によってリパーゼの酵素活性の決定が可能になり、これは単位：１Ｕ＝１μｍｏｌのＦＦＡ生成／分で表され得る。この反応は、固定値と比較してｐＨ値が変化した場合にＮａＯＨ（滴定剤）の添加を提供する実験系を通じて一定のｐＨ値を維持することによって生じる（ｐＨスタット法）。時間に従い添加される滴定剤の量は、トリグリセリドに対するリパーゼ作用により生成するＦＦＡの量に対応する。曲線の傾き｛添加滴定剤＝ｆ（体積（ｍＬ）／時間（分））｝はリパーゼ酵素活性を与える。
【００９９】
本明細書中の以下で報告されるリパーゼ活性（ＬＡ）は常にＩＵ  ＵＳＰとして表される。本明細書中の以下で報告されるリパーゼ比活性（ＬＳＡ）は常にＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇとして表される。
【０１００】
タンパク質分解およびアミロース分解活性：測定はパンクレリパーゼ酵素ＵＳＰモノグラフに記載の公定手順に従い行う。本明細書中の以下で報告される酵素比活性（ＳＡ）は常にＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇとして表される。
【０１０１】
水含量は、８０℃で４時間、ＴＧＡにより（試料１８、１９および２０）、またはカール・フィッシャー法（試料２６、２７および２８）により測定する。
【０１０２】
トリグリセリドは、内部標準としてパルミチン酸コレステロールを用いてヘキサン：イソプロパノール（３：２）で抽出し、ＨＰＬＣにより分析する。ピークは標準的なトリオレイン溶液を用いて全ての保持時間を比較することによって同定する。
【０１０３】
タンパク質分析：総タンパク質含量はブラッドフォードアッセイで定量する。
【０１０４】
炭水化物分析：１）短鎖糖は、内部標準としてキシリトールを用いてＨＰＬＣによって分析し；ピークは糖標準物質、すなわちマルトースを用いて全ての保持時間を比較することによって同定する。２）マルトデキストリンはＣａｒｒｅｚ  ＩおよびＣａｒｒｅｚ  ＩＩの存在下で抽出してＨＰＬＣにより分析する。ピークはマルトデキストリン標準物質、すなわち、マルトース一水和物、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースを用いて全ての保持時間を比較することによって同定する。
【０１０５】
飽和硫酸アンモニウム：飽和硫酸アンモニウム溶液は次のとおり調製する：４℃に対して飽和を計算し、溶液を室温で調製し、次いで氷上で冷却する。例えば２ｍＬの室温ＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１．４３ｇ硫酸アンモニウムを添加し、混合して溶解し、２．７６ｍＬの最終体積とする。硫酸アンモニウムが溶解した後、溶液を氷上に置く。
【０１０６】
パンクレアチン抽出：４０ｍｇ／ｍＬパンクレアチンの抽出物を次のとおり調製する：粉末状パンクレアチン（約４０〜５０ｍｇ）を微小遠心管に添加し、続いて冷ＰＢＳ緩衝液を添加する。この遠心管を振盪して粉末状物質を再懸濁し、時折混合しながら氷上で約１５分間インキュベートする。あるいは、約２００ｍｇの粉末状パンクレアチンを冷却した小型のビーカーに添加し、続いて５ｍＬ冷ＰＢＳを添加してもよい。混合物を氷上で約１５〜３０分間マグネチック撹拌装置で撹拌し、１．５ｍＬ微小遠心管に移す。微小遠心管を室温または４℃の何れかで１６，０００ｇで５分間回転させる。室温で回転させた場合、この遠心管を冷却し、上清を静かに移し、抽出物を氷上で保存する。
【０１０７】
硫酸アンモニウム沈殿：硫酸アンモニウム沈殿は次のとおり行う：微小遠心管中で、７５０μＬの冷却飽和硫酸アンモニウムを上記で論じたとおり調製された５００μＬの冷却パンクレアチン抽出物にゆっくりと添加する。混合物をよく混合し、時折混合しながら氷上で２０分間インキュベートする。混合物を１６，０００ｇで５分間遠心し、上清を静かに移し、氷上で保存する。
【０１０８】
ペレット洗浄：ペレットを次のとおり洗浄し得る：硫酸アンモニウム沈殿からのペレットを５００μＬの冷却６０％飽和硫酸アンモニウム（ＰＢＳ緩衝液中）中に再懸濁する。懸濁液を氷上で５分間インキュベートし、次いで１６，０００ｇで５分間遠心し、氷上に戻す。次いで、上清を静かに移して洗浄ペレットを残し得る。硫酸アンモニウムペレットを次のとおり再溶解し得る：１ｍＬの冷却ＰＢＳをペレットに添加し、次いで試験管を穏やかに振盪して溶解させる。得られる混合物を氷上で１５分間インキュベートし、次いで１６，０００ｇで５分間遠心して不溶性物質を全て除去する。ペレットはまた、０．５ｍＬのＰＢＳ中に再溶解させてより濃縮された溶液を得てもよい。
【０１０９】
脱塩：４ｍＬ  Ｇ−２５セファデックスカラムを脱イオン水中で平衡化し、２０００ｇで２分間、回転乾燥させる。脱塩しようとする試料（０．７５ｍＬ）を添加し、カラムを２０００ｇで２分間回転させる。
【０１１０】
オレイン酸４−メチルウンベリフェリルアッセイ：エタノール中のオレイン酸４−メチルウンベリフェリルの２０ｍＭ保存溶液を調製し、−２０℃で保存する。実験用希釈液はＰＢＳでエタノール保存溶液を０．１ｍＭの濃度まで希釈することによって、アッセイ日に調製する。次のものを混合する：５０μＬの０．１ｍＭオレイン酸４−メチルウンベリフェリル保存溶液；２５μＬのＰＢＳ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣ１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６中の２５μＬの〜０．４μｇパンクレアチン。３５５ｎｍで励起した４５０ｎｍでの発光をプレートリーダー中で測定する。アッセイは、約１０分後に１ｍＬの５ｍＭ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加して反応を停止させることによって、エンドポイントアッセイとして行い得る。
【０１１１】
アミラーゼアッセイプロトコール：アミラーゼアッセイ用の材料：アミラーゼアッセイは、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチオゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉｏｚｏｌｉｎｅ）−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デンプンおよびダイズペルオキシダーゼ（Ｒｚ＝１．６３）を必要とする。ＡＢＴＳは、４℃で５０ｍＭリン酸−クエン酸ｐＨ７緩衝液中で保存する。ダイズペルオキシダーゼは、４℃でＰＢＳ  ｐＨ７．４中で保存する。グルコースオキシダーゼは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ５中で保存する。α−グルコシダーゼおよびデンプンは、４℃で脱イオン水中で保存する。全ての試薬は、一旦溶液としたら４℃で維持する。０．１ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳ、３９μｇ／ｍＬダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、１０Ｕ／ｍＬまたは８０．６μｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、７Ｕ／ｍＬまたは６３μｇ／ｍＬグルコシダーゼ、および１ｍｇ／ｍＬデンプンの１００μＬ反応混合物を４℃または氷上で調製する。デンプンは、他の構成要素とは異なり、反応混合物に添加する前に室温で調製し、またプレートで用いる直前に反応混合物に添加する。反応混合物の構成要素は、この順序：ＡＢＴＳ、ＳＢＰ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、およびデンプンで添加すべきである。反応は、１ｍＭ  ＰＢＳ／３０ｍＭ  ＣａＣｌ２中で希釈される５μＬパンクレアチンを９５μＬの反応混合物に添加することによって開始させる。アッセイ中のパンクレアチンの最終濃度は４μｇ／ｍＬである。４０５ｎｍでの吸収を約１５分まで記録する。データ点を時間の関数としてプロットする。遅滞期があり、曲線の直線部は通常、アッセイを行っている間の約８〜１２分の間に見られる。曲線の直線部の勾配を計算し、最終データとして使用する。
【０１１２】
（実施例１）：多段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；多段階：懸濁、分離、沈殿；（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：水性溶媒＝４５：５５）
段階ａ１．１−懸濁：出発パンクレリパーゼを４℃にて水性溶媒中に０．１ｇ／ｍＬの濃度で分散させ、３０分間撹拌しながら維持する。実験は出発パンクレリパーゼの６５０ｍｇ（有機溶媒がアセトンである場合）または５５０ｍｇ（有機溶媒がエタノールである場合）の何れかを用いて、実験室で行う。パンクレリパーゼ懸濁液について４種類の異なる水性溶媒を試験する：１）ｐＨ＝４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液）；２）ｐＨ＝７．０緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液）；３）脱イオン水（ＤＷ）；４）ＮａＣｌ（０．５Ｍ）入りのｐＨ＝４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液）。
【０１１３】
段階ａ１．２−分離：段階ａ１．１からの懸濁液を遠心し（１０分間、４℃、約１１，０００ｇ）、上清（ＳＮ）をペレット（Ｐ）から分離する。
【０１１４】
段階ａ１．３−沈殿：有機溶媒を段階ａ１．２の上清に添加し、混合物を静止状態で４℃で１５分間維持する。有機溶媒はアセトンまたはエタノールの何れかである。アセトンを３５部（体積）／各６５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。エタノールを４５部（体積）／各５５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。
【０１１５】
段階ａ２−分離：混合物を遠心（１０分間、４℃、約１１，０００ｇ）して上清をペレットから分離し、これはパンクレリパーゼ酵素を含有する。ペレットを段階ａ１．１で使用される水性溶媒中に再懸濁する（再懸濁、沈殿後のペレット中のＬＡ）。
【０１１６】
異なる段階の材料を分析する。リパーゼ活性（ＬＡ）として表されるパンクレリパーゼの量を測定する：
−段階ａ１．１の懸濁液中（懸濁液中のＬＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）；
−段階ａ２で得られる上清中（ＳＮ中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−ＳＮ）；
−段階ａ２で得られ、その後出発媒体中に再懸濁されるペレット中（ペレット中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−Ｐ）。
結果を表１、２、３、４で報告する。
【表１】
2017500885.tif 000002
【０１１７】
表１は、パンクレリパーゼの沈殿（段階ａ１．３）は沈殿物部分（ペレット）中のリパーゼ活性の良好な回収を可能にし、それは約６７〜約７７％の範囲であることを示す。収率は、最初の懸濁パンクレリパーゼのリパーゼ活性に対する段階ａ２の総リパーゼ活性（ペレットおよび上清）の％であり、段階ａ１．１の懸濁液中のリパーゼ活性（Ｓａ１．１）：（ＬＡ−ＳＮ＋ＬＡ−Ｐ）／（ＬＡ−Ｓａ１．１）として表される。
表２
【表２】
2017500885.tif 000003
【０１１８】
工程収率は約３７〜約５６％の範囲である。収率％は、段階ａ１．１で使用されるパンクレリパーゼの理論的リパーゼ活性に対する、段階ａ２のペレット中および上清中の総リパーゼ活性であり、これは、未処理原材料の比活性（すなわち、公定ＵＳＰ法に従い決定される場合、９４．４ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ）およびその初期重量を因数として含めることによって計算される。
表３
【表３】
2017500885.tif 000004
【０１１９】
濃縮係数（ｐＨ非依存性）は、段階ａ２のペレット中のリパーゼ活性と出発パンクレアチンのリパーゼ活性（９４．４ＩＵ／ｍｇである）との間の比を計算することによって決定される。この工程によって２．５以下の濃縮係数が得られ；濃縮はＨＰＬＣプロファイル分析によっても確認される。
【０１２０】
他の消化酵素に関して、最終ペレット（段階ａ２の沈殿物）中のアミラーゼ含量は、出発パンクレリパーゼ中のアミラーゼ含量より少ない。
（実施例２）：多段階工程
【０１２１】
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．３ｇ／ｍＬ；多段階：懸濁液、分離、沈殿（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：水性溶媒＝４５：５５）
【０１２２】
段階ａ１．１−懸濁：パンクレリパーゼ（ＡＰＩ）を４℃にて水性溶媒中に０．３ｇ／ｍＬの濃度で分散させ、３０分間撹拌する。実験は出発パンクレリパーゼの０．６５０ｍＬ（有機溶媒がアセトンである場合）または０．５５０ｍＬ（有機溶媒がエタノールである場合）の何れかを用いて、実験室スケールで行う。異なる水性溶媒中でそれぞれ２回の実験を行う：１）ｐＨ＝４．０緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液）；２）ｐＨ＝７．０緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液）。
段階ａ１．２−分離：段階ａ１からの懸濁液を遠心し（１０分間、４℃、約１１，０００ｇ）、上清（ＳＮ）をペレット（Ｐ）から分離する。
段階ａ１．３−沈殿：有機溶媒を段階ａ１．２の上清に添加し、混合物を静止状態で４℃で１５分間維持する。有機溶媒はアセトンまたはエタノールの何れかである。アセトンを３５部（体積）／各６５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。エタノールを４５部（体積）／各５５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。
段階ａ２−分離：混合物を遠心（１０分間、４℃、約１１，０００ｇ）して上清をペレットから分離し、これはパンクレリパーゼ酵素を含有する。ペレットを出発水性溶媒中に再懸濁する（再懸濁、沈殿後のペレット中のＬＡ）。
段階ａ３−乾燥：段階ａ２のペレットを乾燥させる。
異なる段階の材料を分析する。パンクレリパーゼの量はリパーゼ活性（ＬＡ）として表し、これを：
−段階ａ１．１の懸濁液中（懸濁液中のＬＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）；
−段階ａ２で得られた上清中（ＳＮ中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−ＳＮ）；
−段階ａ２で得られ、次いで出発水性媒体中に再懸濁されたペレット中（ペレット中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。結果を表４、５、６で報告する。
表４
【表４】
2017500885.tif 000005
【０１２３】
表４は沈殿後の回収が非常に良好であることを示す（７３〜９２％）。
表５
【表５】
2017500885.tif 000006
【０１２４】
０．３ｇ／ｍＬパンクレリパーゼ濃度で行われた多段階工程のペレットに対する収率は約５６〜約６４の範囲である。
表６
【表６】
2017500885.tif 000007
【０１２５】
濃縮係数は、段階ａ２のペレット中のリパーゼ活性と段階ａ１．１の出発パンクレリパーゼのリパーゼ活性（９４．４ＩＵ／ｍｇである）との間の比を計算することによって決定される。濃縮係数は１．９〜３．０の範囲である。
【０１２６】
（実施例３）：二段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；２段階：懸濁、沈殿（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：水性溶媒＝４５：５５、ここでＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（エタノール）＝２６．０、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９）
段階ａ１．１−懸濁：パンクレリパーゼを４℃で水性溶媒中に０．１ｇ／ｍＬの濃度で分散させ、３０分間撹拌し続ける。実験は６５０ｍｇ（有機溶媒がアセトンである場合）または５５０ｍｇ（有機溶媒がエタノールである場合）の何れかの出発パンクレリパーゼを用いて、実験室スケールで行う。異なる水性溶媒中でそれぞれ２回の実験を行う：ｐＨ＝４．０、１０ｍＭ酢酸緩衝液；２）ｐＨ＝７．０、１０ｍＭリン酸緩衝液。
段階ａ１．２−沈殿：有機溶媒を段階ａ１．１の懸濁液に添加し、この混合物を４℃で１５分間維持する。有機溶媒はアセトンまたはエタノールの何れかである。アセトンを３５部（体積）／各６５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。エタノールを４５部（体積）／各５５部（体積）の水性溶媒の量で添加する。
段階ａ２−分離：混合物を遠心（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。ペレットを出発水性溶媒中に再懸濁する（再懸濁、分離後のペレット中のＬＡ）。
【０１２７】
異なる段階の物質を分析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を全工程に沿って：
−段階ａ１．１の懸濁液中（懸濁液中のＬＳＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）；
−段階ａ２で得られた上清中（ＳＮ中のＬＡ、分離、ＬＡ−ＳＮ）；
−段階ａ２で得られ、次いで出発媒体中に再懸濁されたペレット中（ペレット中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。
【０１２８】
結果を表７、８、９で報告する。
表７
【表７】
2017500885.tif 000008
【０１２９】
沈殿後の回収率は高く、二段階工程でほぼ完全な回収が達成される。
表８
【表８】
2017500885.tif 000009
【０１３０】
ペレットに対する工程収率は７３．１〜８０．４の範囲であり、これは多段階工程で得られるものよりも高い。収率％は、段階ａ１．１で使用されるパンクレアチンの理論的リパーゼ活性に対する、段階ａ２のペレット中および上清中の総リパーゼ活性であり、これは、出発物質の比活性（すなわち公定ＵＳＰ法に従い決定した場合、９４．４ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ）およびその初期重量を因数として含めることによって計算される。
表９
【表９】
2017500885.tif 000010
【０１３１】
結果は、２段階工程でのｐＨ＝７の水性緩衝液およびアセトンの使用によって、興味深い収率（ペレットに対する工程収率が約７６％）が得られ、濃縮係数が２．１〜２．９の範囲であることを示す。
（実施例４）：二段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；二段階：懸濁、沈殿；パイロット（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５）
段階ａ１．１−懸濁：６．５ｇの出発パンクレリパーゼ（６１，４００Ｕリパーゼ）を４℃にて４５ｍＬのｐＨ＝７．０緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液）中に分散させ、各サイクルに対して１分間撹拌し（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ、３サイクル）、撹拌装置を１０ｍＬの冷緩衝液で２回洗浄して残留パンクレリパーゼを回収する。
段階ａ１．２−沈殿：３５ｍＬのアセトンを段階ａ１．１の懸濁液に添加し、混合物を静止状態下で４℃で３０分間維持する。
段階ａ２−分離：混合物を遠心（１０分間、４℃、約２，７００ｇ）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３−乾燥：ペレットを２種類の異なるプロトコールに従い乾燥させ、平均乾燥ペレット重量は１．５５ｇであり、リパーゼ活性（ＬＡ）は３６５，０００ＩＵリパーゼであり、比活性（ＬＳＡ）は２３５ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇである。
【０１３２】
表１０は、２種類のプロトコールで得られた各物質に対して測定される、リパーゼ（Ｌ）、プロテアーゼ（Ｐ）、およびアミラーゼ（Ａ）比活性を報告する。ペレット中のリパーゼ活性（１ｍＬの緩衝液中でのその懸濁後に測定）は乾燥処理前にも測定し；その量は２３３．７ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇである。
表１０
【表１０】
2017500885.tif 000011
【０１３３】
分析は、乾燥工程それ自身はＬＳＡに影響を及ぼさないこと、および異なる５種類のプロトコールにより同じ酵素活性を有する物質が得られることを示す。先行する実施例におけるように計算した濃縮係数は常に２を上回り、異なるプロトコール間で一定である。それは、２．５（試料１８）、２．７（試料１９）、２．３（試料２０）であり、平均値は２．５である。乾燥処理前に測定されたペレット中のリパーゼ活性は２３３．７ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ（試料１８）である。
表１１
【表１１】
2017500885.tif 000012
Ｌ＝リパーゼ；Ｐ＝プロテアーゼ；Ａ＝アミラーゼ；Ａ＝活性；Ｙ＝収率（％）；Ｗ＝乾燥後に測定したペレットに対する重量（ｇ）。
【０１３４】
異なるプロトコールで得られる試料のＨＰＬＣプロファイルは重ね合わせられ；出発物質のＨＰＬＣプロファイルに関連する質的相違は観察されなかった。
【０１３５】
（実施例５）：２段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；２段階：懸濁、沈殿；スケールアップ（ＳＰ＝３８：エタノール：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝４５：５５、試料２１）；（ＳＰ＝３４：アセトン：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝５０：５０試料２２）；（ＳＰ＝３５：アセトン：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝４５：５５、試料２３）。実施例４の調製工程は、様々な量の出発パンクレリパーゼ、様々な体積の緩衝溶液および様々な体積のアセトン（ＳＰ＝３４または３５）または体積のエタノール（ＳＰ＝３８）に適用される。乾燥プロトコールは、２４時間、６〜８℃、０．２ｍｂａｒであり、全ての他のパラメーターおよび条件は実施例４と同じである。
表１２
【表１２】
2017500885.tif 000013
【０１３６】
結果を表１３、１４で報告する。
表１３
【表１３】
2017500885.tif 000014
【０１３７】
先行する実施例におけるように計算された濃縮係数は、１．６（試料２１）、１．３（試料２２）、１．７（試料２３）である。
【０１３８】
表１４は、ここで適用されるスケールアップ工程で得られる最終精製物質の酵素活性および酵素収率を示す。
表１４
【表１４】
2017500885.tif 000015
Ｌ＝リパーゼ；Ｐ＝プロテアーゼ；Ａ＝アミラーゼ；Ａ＝活性；Ｙ＝収率（％）；Ｗ＝乾燥後に測定したペレットに対する重量（ｇ）。
【０１３９】
出発物質のＨＰＬＣプロファイルとの、関連する質的相違は観察されなかった。
【０１４０】
異なるプロトコールで得られた試料２２および２３は、プロトコール（ＳＰ＝３８）で生成された試料２０に対して、より低い特異的ＬＡおよびより高いＰＡおよびＡＡを示す。
【０１４１】
（実施例６）：一段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．０６５および０．１ｇ／ｍＬ；一段階；実験室スケール（ＳＰ＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５）
段階ａ１−懸濁−沈殿：６５０ｍｇ（試料２４）または１０００ｍｇ（試料２５）のネイティブパンクレリパーゼを、４℃で６０分間撹拌しながら、１０ｍＬの、緩衝液（ｐＨ＝７  １０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの６５：３５混合液（６５体積の緩衝液および３５体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（１０，０００ｇ、４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３−乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
【０１４２】
物質を分析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を全工程に沿って：
−段階ａ２で得られた上清中（ＳＮ中のＬＡ、分離、ＬＡ−ＳＮ）；
−段階ａ２で得られ、次いで出発媒体中に再懸濁されたペレット中（ペレット中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−Ｐ）
−懸濁−沈殿段階ａ１のＬＡ（懸濁液中のＬＡ；ＬＡ−ＳＮ）中
で測定する。結果を表１５および１６で報告する。
表１５
【表１５】
2017500885.tif 000016
【表１６】
2017500885.tif 000017
【０１４３】
一段階工程は良好な収率および促進係数を提供した。これは、遂行が容易で単純なので工業化に有用である。
【０１４４】
表１６ａは、異なる懸濁−沈殿時間で得られた精製物質に対して、リパーゼ比活性（ＬＳＡ）を報告する。
表１６ａ．様々な時間でのリパーゼ活性
【表１７】
2017500885.tif 000018
【表１８】
2017500885.tif 000019
【０１４５】
データは、使用される方法それ自身は相の間のリパーゼ分配に影響を及ぼさないことを示した。
【０１４６】
（実施例７）：一段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；一段階；パイロットスケール（ＳＰ＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５）。
段階ａ１−懸濁−沈殿：１０ｇのネイティブパンクレリパーゼを、４℃で６０分間撹拌しながら、１００ｍＬの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの溶媒混合液（６５体積の緩衝液および３５体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３−乾燥：試料２６のペレットをペトリ皿に注ぎ、一方で試料２７および２８のペレットを遠心管中で維持し、０．２ｍｂａｒで高効率ポンプを用いて直接乾燥させる。
【０１４７】
物質を分析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を、
−段階ａ２で得られ、段階ａ３に従い乾燥させたペレット中で測定する。
結果を表１７および１８で報告する。
表１７
【表１９】
2017500885.tif 000020
【０１４８】
リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ活性に関する良好な再現性が得られた。
表１８
【表２０】
2017500885.tif 000021
【０１４９】
非常に高いリパーゼ収率が得られ、濃縮係数は高かった（２を上回る。）。例えば、濃縮係数は２．２（試料２６）、２．４（試料２７）、２．３（試料２８）であった。
【０１５０】
一段階工程によって良好な収率が得られた。４．２ｇのＨＡ−パンクレアチンが得られ（出発パンクレリパーゼの４２％）、リパーゼの総単位は９４０，０００ＩＵ  ＵＳＰ（初期ＬＡの９９から１００％）である。得られたＨＡ−パンクレアチンは、２７と２８との間での平均とみなして２２１ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇの比活性を有する。
【０１５１】
異なるプロトコールで得られた試料２６〜２８の、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰａｇｅプロファイルおよびＵＶスペクトルは重なり合った。出発物質のＨＰＬＣプロファイルに関連する質的相違は観察されなかった。
表１８ａ
【表２１】
2017500885.tif 000022
【０１５２】
データは、表１８ａにおいて、スケールは相の間のリパーゼ分配に影響を及ぼさず、工程は状況に応じて拡大縮小が可能となることを示す。
【０１５３】
表１８ｂで列挙される異なるパンクレリパーゼ原材料を用いて、一段階工程の再現性を評価した。
表１８ｂ．パンクレアチン原材料
【表２２】
2017500885.tif 000023
【表２３】
2017500885.tif 000024
【０１５４】
表１８ｃのデータは、異なる出発ＬＳＡを有するネイティブ原材料は促進係数に関して精製工程の結果に影響を及ぼさず、良好な収率が得られたことを示す。
【０１５５】
（実施例８）：比較例
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；懸濁、沈殿、分離；比較例（ＳＰ＝３８−アセトン：水＝３５：６５）。
段階１−懸濁：パンクレリパーゼを、撹拌しながら約３０分間、４℃（試料２９）で水性溶媒（蒸留水）中に０．０４５ｇ／ｍＬの濃度で分散させる。
段階２−沈殿：８０ｍＬの溶媒混合液（アセトン：水＝３５：４５）を２０ｍＬの段階ａ１．１の懸濁液に添加する（最終溶媒混合液中でＳＰ＝３８（ＭＰａ）０．５を得るため）。混合物を静止状態で２５℃で６０分間維持する。
段階３−分離：混合物を遠心（３，０００ｇで２５℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
【０１５６】
異なる段階の物質を分析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を全工程に沿って：
−段階１の懸濁液中（懸濁液中のＬＡ；ＬＡ−Ｓａｌ）；
−段階２で得られた上清中（ＳＮ中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−ＳＮ）；
−段階３で得られ、次いで出発蒸留水中に再懸濁されたペレット中（ペレット中のＬＡ、沈殿、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。
【０１５７】
結果を表１９−２０で報告する。直接的な比較目的のために、先行する実施例において二段階および一段階法で得られた結果もここで報告する。
表１９
【表２４】
2017500885.tif 000025
【表２５】
2017500885.tif 000026
【０１５８】
この比較工程により得られた収率は少なく、酵素の不活性化が顕著であり、リパーゼ濃縮は全く得られなかった。
【０１５９】
（実施例９）精製ＨＡ−パンクレアチン（試料２０）の特徴評価
ＨＡ物質をその消化能について試験し、出発パンクレリパーゼと比較する。２０ｍｇのＨＡ−パンクレアチンおよび５０ｍｇの出発パンクレリパーゼ（２３００ＩＵ  ＵＳＰリパーゼに対応）をそれぞれ１ｍＬの脱イオン水中に懸濁し、３７℃で５０ｍＬの経腸栄養剤ＰＥＰＴＡＭＥＮ（登録商標）Ｊｕｎｉｏｒ１．０に添加し、１００ｒｐｍで６０、１２０および２４０分間撹拌する。１、２および４時間後に消化試験を行った。各パンクレリパーゼ試料に対してこの試験を６回反復する。
【０１６０】
トリオレインの消化（トリオレインピークの低下）を測定することによって脂質栄養を監視し；ブラッドフォード法によって総タンパク質消化を監視する。短鎖糖の生成を測定することによってアミロース分解性（Ａｍｙｌｉｏｌｉｔｉｃ）工程を監視する。４時間消化後にネイティブおよびＨＡ材料の消化性能を比較することによって、消化度の相違を得る。
表２１
【表２６】
2017500885.tif 000027
【０１６１】
活性の相違は、式：
（ネイティブパンクレアチンの活性−ＨＡ−パンクレアチンの活性）／ネイティブパンクレリパーゼの活性
で計算する。消化の相違は、次の式：
（ネイティブパンクレアチンの消化の％−ＨＡ−パンクレアチンの％消化）
により計算する。
【０１６２】
このインビトロ試験は、ＨＡ−パンクレアチンの脂質、タンパク質および炭水化物消化の分析を可能にする。リパーゼ消化は、反応容器中に存在する酵素活性の相違に非常に感受性があり、ゆえに活性における１０％の相違は消化量における１０％の相違に対応する。消化キネティクスは同様の傾向を示す。これらの結果は、ネイティブおよびＨＡ−パンクレアチンが同様の脂質消化パターンを有することを示唆する。
【０１６３】
タンパク質消化プロファイルは殆ど重なり合い、ＨＡ−パンクレアチンのプロテアーゼ活性はネイティブパンクレリパーゼと同レベルでの消化を維持することを示唆している。プロテアーゼに関する活性の約６０％の相違は、タンパク質消化度に何ら影響を与えない。
【０１６４】
ＨＡ−パンクレアチンにおいてマルトース生成がより低いので、炭水化物消化プロファイルが異なる。アミラーゼ活性における相違の比較および消化産物の量の比較から、ＨＡ−パンクレアチンにおいてアミロース分解も起こることが示される。
【０１６５】
（実施例１０）：一段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；一段階；スケールアップ（ＳＰ＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５）。
この例の場合、次の特徴を有するネイティブパンクレリパーゼ（ｃｏｄｅ  ００５Ａ）を使用した：リパーゼ比活性８１．１ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ、プロテアーゼ活性２８４．２ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇおよびアミラーゼ活性５１７．９ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ；Ｐ／Ｌ比が３．５であり、Ａ／Ｌ比が６．４であるもの。
段階ａ１）懸濁−沈殿：１００ｇのネイティブパンクレリパーゼを４℃で６０分間撹拌しながら、１Ｌの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの溶媒混合液（６５体積の緩衝液および３５体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ２）分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１５分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３）乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
【０１６６】
物質を分析した。表２２は、様々なスケールを用いて得た試料に対して測定したリパーゼ（Ｌ）、比活性を報告する。
表２２
【表２７】
2017500885.tif 000028
【０１６７】
表２２は、本明細書中で適用されるスケールアップ工程で得られた最終精製物質のリパーゼ活性を示す。このスケールの結果はパイロットスケールと一貫する。
表２３
【表２８】
2017500885.tif 000029
【０１６８】
リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ活性に関して良好な再現性が得られる。
【０１６９】
（実施例１１）：二重沈殿工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；二重沈殿；パイロットスケール（ＳＰ（ａ１．１）＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５；ＳＰ（ａ１．３）＝３６）。
【０１７０】
次の特徴を有するネイティブパンクレリパーゼ（コード００５Ａ）を使用した：リパーゼ比活性８１．１ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ、プロテアーゼ活性２８４．２ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇおよびアミラーゼ活性５１７．９ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ；Ｐ／Ｌ比が３．５であり、Ａ／Ｌ比が６．４であるもの。
段階ａ１．１−懸濁−沈殿：１０ｇのネイティブパンクレリパーゼを４℃で６０分間撹拌しながら、１００ｍＬの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの溶媒混合液（６５体積の緩衝液および３５体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ１．２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３．１−乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
段階ａ１．３−沈殿：アセトンを４℃で６０分間撹拌しながら、段階ａ１．２の上清に添加する（３６のＳＰに到達するまで）。
段階ａ２−分離：段階ａ４の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３．２−乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
段階ａ４−混合：段階ａ３．１およびａ３．２からの乾燥ペレットを一緒に混合する。
【０１７１】
物質を分析する。表２４は、各試料に対して測定される、リパーゼ（Ｌ）、プロテアーゼ（Ｐ）およびアミラーゼ（Ａ）比活性を報告する。
表２４．
【表２９】
2017500885.tif 000030
【０１７２】
（実施例１２）：二重沈殿工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；二重沈殿；スケールアップ（ＳＰ（ａ１．１）＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５；ＳＰ（ａ１．３）＝３６）。
【０１７３】
次の特徴を有するネイティブパンクレリパーゼを使用した：リパーゼ活性１２８．７ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ、プロテアーゼ活性３２４．６ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇおよびアミラーゼ活性４０８．０ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ；Ｐ／Ｌ比が２．５であり、Ａ／Ｌ比が３．２であるもの。
段階ａ１．１−懸濁−沈殿：１００ｇのネイティブパンクレリパーゼを４℃で６０分間撹拌しながら、１Ｌの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの溶媒混合液（６５体積の緩衝液および３５体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ１．２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１５分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３．１−乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
段階ａ１．３−第二の沈殿：アセトンを静止状態で４℃にて１２０または１８０分間、段階ａ１．２の上清（３６のＳＰ）に添加する。
段階ａ２−分離：段階ａ１．３の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１５分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３．２−乾燥：ペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
段階ａ４−混合：段階ａ３．１およびａ３．２からの乾燥ペレットを一緒に混合する。
【０１７４】
物質を分析する。表２５は、各試料に対して測定される、リパーゼ（Ｌ）、プロテアーゼ（Ｐ）およびアミラーゼ（Ａ）比活性を報告する。
表２５
【表３０】
2017500885.tif 000031
【０１７５】
（実施例１３）：一段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；一段階；パイロットスケール（ＳＰ＝３６−アセトン水性溶媒＝４３：５７）
この実施例に対して、次の特徴を有するネイティブパンクレリパーゼを使用した：リパーゼ活性８５．５ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ、プロテアーゼ活性３３７．８ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇおよびアミラーゼ活性４３４．０ＩＵ  ＵＳＰ／ｍｇ；Ｐ／Ｌ比が２．５であり、Ａ／Ｌ比が３．２であるもの。
段階ａ１−懸濁−沈殿：１０ｇのネイティブパンクレリパーゼを４℃で６０分間撹拌しながら、１００ｍＬの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびアセトンの溶媒混合液（５７体積の緩衝液および４３体積のアセトン）中に分散させる。
段階ａ２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３）−乾燥：段階ａ２のペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
【０１７６】
物質を分析する。段階ａ３からのペレット中で、リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を測定する。
表２６
【表３１】
2017500885.tif 000032
【０１７７】
表２６で報告される結果は、ＳＰ＝３８が良好な結果をもたらしたことを示した。
【０１７８】
（実施例１４）：一段階工程
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；一段階；パイロットスケール（ＳＰ＝３８−イソプロピル−アルコール：水性溶媒＝４０：６０）。
段階ａ１−懸濁−沈殿：１０ｇのネイティブパンクレリパーゼを４℃で６０分間撹拌しながら、１００ｍＬの、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭリン酸緩衝液）およびイソプロピルアルコールの溶媒混合液（６０体積の緩衝液および４０体積のイソプロピルアルコール）中に分散させた。
段階ａ２−分離：段階ａ１の混合物を遠心（２，７００ｇで４℃で１０分間）して上清をペレットから分離し、これは膵臓酵素を含有する。
段階ａ３−乾燥：段階ａ２のペレットを０．２ｍｂａｒにて高効率ポンプで乾燥させる。
表２７
【表３２】
2017500885.tif 000033
【０１７９】
表２７で報告される結果は、イソプロピル−アルコールと比較して、リパーゼ活性および促進に関して、アセトン沈殿がより良好な結果をもたらしたことを示した。
【０１８０】
（実施例１５）：硫酸アンモニウム沈殿
パンクレアチンの水溶性抽出物を、４０ｍｇ／ｍＬの濃度への冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での分散によって調製した。分散液を時折撹拌しながら氷上でインキュベートし、次いで１６，０００ｘｇで５分間遠心した。溶解パンクレアチンを含有する上清を静かに移した。上清は、２５９ｎｍにピークを有する吸収でＵＶにおいて強く吸収し、このことから溶解核酸の存在が示唆される（図１）。
【０１８１】
次いで上清を、約６０％飽和硫酸アンモニウムの最終濃度となるように飽和硫酸アンモニウムと混合した。得られた沈殿物を遠心によって回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。再溶解沈殿物の適切な希釈液のＵＶスペクトルを図２Ｂに示す。２８０ｎｍでのピークはタンパク質溶液の典型である。上清の吸収ピークは２６０ｎｍであり、溶解核酸の典型であった。濃度および吸収値の比較（図１および図２）は、２６０ｎｍ領域で吸収する物質の約６０〜９０％が除去されることを示す。スペクトルの位置および形状は、タンパク質および／またはペプチド構成要素の濃縮物と一致する。水溶性パンクレアチン抽出物の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸収比は１．４であるのに対し、硫酸アンモニウムによって沈殿しない物質を含有する上清（図２Ａ）の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸収比は１．７である（図１）。この２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比の上昇は、硫酸アンモニウムにより沈殿しない物質中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの濃縮物と一致する。
【０１８２】
特定の理論に縛られるものではないが、これらの結果は、硫酸アンモニウム沈殿がパンクレアチンのタンパク質構成要素、すなわちアミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼを含有する分画から、かなりの量のＤＮＡ／ＲＮＡ物質を除去することを示唆する。
【０１８３】
硫酸アンモニウム沈殿から回収されたペレットを６０％飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄した。スペクトルは、沈殿物の洗浄後に２７２ｎｍから２７５ｎｍへのピークシフト（図３）を示し、２６０ｎｍに吸収ピークをもつ物質のさらなる除去を示唆している。
【０１８４】
溶液のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでのその吸収に基づき推定され得る。タンパク質アッセイ（標準物質としてウシ血清アルブミンを使用）は、２８０ｎｍで１．０吸収の溶液（路長１ｃｍ）の溶液が０．１９ｍｇ／ｍＬタンパク質に対応すると決定した。
【０１８５】
パンクレアチン原抽出物は４０ｍｇ／ｍＬを含有し、このうち０．５ｍＬを０．７５ｍＬ飽和硫酸アンモニウムと混合して、実験セクションに記載のように沈殿物を生じさせた。次に、この沈殿物を１ｍＬ  ＰＢＳ中に再溶解させた。１．２ｍＬ  ＰＢＳ中に希釈した再溶解沈殿物の５μＬの溶液の吸収を測定した。図３は、未洗浄のおよび洗浄した硫酸アンモニウム沈殿物のスペクトルを示し、２８０ｎｍでの記録された吸収値は、希釈（１／２４０）後、それぞれおよそ０．０８５および０．０７５（１ｃｍ路長）である。
【０１８６】
１．０吸収は０．１９ｍｇ／ｍＬタンパク質に対応するので、未洗浄ペレットのタンパク質濃度は３．９ｍｇ／ｍＬ（２４０ｘ０．０８５ｘ０．１９）であり、洗浄ペレットのタンパク質濃度は３．４ｍｇ／ｍＬである。精製工程を通じて２０ｍｇの物質（４０ｍｇ／ｍＬを含有する０．５ｍＬの溶液）を採取したので、これはおよそ２０／３．９＝５倍の精製に相当する。タンパク質濃縮沈殿物中のリパーゼおよびアミラーゼの活性を決定した。表２８および２９で見られるように、未洗浄ペレット中に平均でリパーゼ活性の８１％およびアミラーゼ活性の８３％が回収される。ペレットを６０％硫酸アンモニウムで洗浄することでリパーゼ回収率が６８％に低下する。これらのパーセンテージを、パンクレリパーゼの元の水溶性分画中の活性レベルに対して正規化する。
表２８
【表３３】
2017500885.tif 000034
【０１８７】
リパーゼアッセイは抽出物と比較した回収である。
ＵＶ物質は２４５〜３２５ｎｍの積分面積であり、抽出物に対する回収である。
ピーク値は硫酸アンモニウム分画に対するＵＶピークである。
リパーゼは抽出５時間以内にアッセイした。
１．リパーゼ＞＞１００％、データ排除
２．プレートリーダーの異常、その日の酵素アッセイなし。
３．平均に含まれないデータ。典型的な回収体積よりも濃縮された体積中に再懸濁されたペレットは通常よりも顕著に大きかった。
４．体積補正を適用、典型的なものよりも濃縮された体積中に再懸濁されたペレット。
表２９
【表３４】
2017500885.tif 000035
【０１８８】
ペレットの活性をミリグラムベースあたりで決定する前に、沈殿物を適切なカラムで脱塩した。ゲルろ過クロマトグラフィーを行って硫酸アンモニウム沈殿生成物を脱塩した。未洗浄硫酸アンモニウムペレットを２体積のＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、得られた懸濁液の０．５ｍＬをＧ−２５セファデックスカラムに適用し、重力により溶出させた。硫酸アンモニウム分画の溶出プロファイルを図４に示す。分画４〜８は２８０ｎｍで吸収を示し、タンパク質の存在を示唆している。リパーゼの活性を測定するためのメチルウンベリフェロンアッセイもまた、分画４〜８で活性を示した。
【０１８９】
後のほうで溶出する物質（分画１０、図５、１ｃｍキュベット中で水中に１／２０希釈してスキャン）は２６０ｎｍの最大吸収を有し、ＤＮＡの吸収プロファイルと一致する。このことは、脱塩に加えて、Ｇ−２５カラムを使用して２６０ｎｍＵＶ物質（例えばＤＮＡ）の残存量を除去し得ることを示唆する。
【０１９０】
（実施例１６）：硫酸アンモニウム沈殿
脱塩はＧ−２５セファデックススピンカラムを用いて行うこともできる。乾燥重量回収は、脱塩した物質を濃縮せずに行うことができる。
【０１９１】
６０％飽和硫酸アンモニウム分画を、実施例で上述のように調製し、硫酸アンモニウムペレットを１体積のＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した（抽出物と比較）。硫酸アンモニウム分画の一部を、前に記載のように水中で平衡化された２本のＧ−２５セファデックススピンカラムにより脱塩した。続く乾燥を促進するために１ｍＬの脱塩物質（３７ｍｇのパンクレアチンと同等）を２体積のイソプロパノールで沈殿させ、１６Ｋで５分間遠心した。上清を除去し、ペレットを室温で一晩風乾し、７．９ｍｇの固形物を回収した。
【０１９２】
イソプロパノール沈殿の間に、ＵＶ吸収物質のおよそ１７％の損失が観察された。ＵＶ吸収物質が、ペレット中のものと同等のタンパク質質量に相当する場合、これに対する補正は、脱塩物質が９．５ｍｇの固形物を含有したことを意味する。これはパンクレアチン出発物質の３７／９．５＝３．９倍濃度に相当する。抽出物に対して７８％および８３％のリパーゼおよびアミラーゼ活性（表２８および２９）を仮定すると、これは、リパーゼおよびアミラーゼに対して、約３の比活性の上昇に相当する。抽出手順中にリパーゼ活性の９０％が回収されることが観察されており、したがって比活性の上昇は２．７倍となる。回収物質の乾燥は完全でなかったが、さらなる乾燥時に比活性のさらなる上昇が期待される。
【０１９３】
より高熱でのさらなる乾燥とともに乾燥重量決定の反復を行った。上記のように６０％飽和硫酸アンモニウム分画を調製し、硫酸アンモニウムペレットを１体積のＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した（抽出物と比較）。硫酸アンモニウム分画の一部を、実験セクションに記載のように水中で平衡化された２本のＧ−２５セファデックススピンカラムにより脱塩した。続く乾燥を促進するために１ｍＬの脱塩物質（３７．５ｍｇのパンクレアチンと同等）を２体積のイソプロパノールで沈殿させ、１６Ｋで５分間遠心した。上清を除去し、ペレットを８０℃で一晩風乾し、４．６ｍｇの固形物を回収した。
【０１９４】
イソプロパノール沈殿の間に、ＵＶ吸収物質のおよそ１７％の損失が観察された。このＵＶ吸収物質が、ペレット中のものと同等のタンパク質質量に相当する場合、これに対する補正は、脱塩物質が５．４ｍｇの固形物を含有したことを意味する。これは、パンクレアチン出発物質の３７．５／５．４＝７倍濃度に相当する。リパーゼおよびアミラーゼ活性は、抽出物に対して７４％および７８％であった。これは、リパーゼおよびアミラーゼに対して約５の比活性の上昇に相当する。抽出手順中にリパーゼ活性の９０％が回収されることが観察されており、したがって比活性の上昇は４．５倍となる。
【０１９５】
ＰＢＳで平衡化されたカラムにおけるリパーゼ回収率は８７〜１０３％であり、一方で水で平衡化されたカラムにおけるリパーゼ回収率は５２〜７２％であったことは、水と比較してＰＢＳでカラムが平衡化された場合より大きい酵素活性が保持されることを示唆している。
【０１９６】
より長時間のカラム作動時間もまた、おそらく存在するプロテアーゼによる、タンパク質の自己加水分解の証拠を示した。これは、プロテアーゼ阻害剤の添加を通じてまたはｐＨおよび温度などの条件の調整を通じて減弱され得る。
【０１９７】
最終乾燥段階を含め、処理中にタンパク質を安定化するための構成要素を添加することが好ましい。これらの安定化剤は、塩、炭水化物、抗酸化剤、ポリマーおよびプロテアーゼ阻害剤、例えばＥＤＴＡおよびダイズトリプシン阻害剤などを含み得る。ｐＨ７．４で緩衝された５ｍＭリン酸の塩溶液は、ｐＨを維持して、おそらくカルシウムを結合するように機能し、これはタンパク質分解を阻害し得る。イソプロパノール沈殿後の最終乾燥段階は、リパーゼ活性の顕著な低下をもたらすことが見出された。最終物質を凍結乾燥することが好ましいであろう。
【０１９８】
（実施例１７）：硫酸アンモニウム沈殿
硫酸アンモニウム抽出および沈殿を４℃で卓上遠心機で上記のように行った。得られた固形物を実施例で既に記載のようにＧ−２５セファデックススピンカラム上で脱塩した。４．５ｍＬ  Ｇ−２５カラムに０．５ｍＬの再懸濁沈殿物を載せた。硫酸アンモニウムによってパンクレアチン全てが沈殿したと仮定すると、再懸濁化沈殿物は、１６ｍｇのパンクレアチンを含有すると推定される。図６は、各分画中のリパーゼ、アミラーゼ、およびトリプシンの活性、ならびに回収物質のｍｇ単位での重量を示す。抽出、硫酸アンモニウムでの沈殿およびＧ−２５カラム上での脱塩後に、分画４および５中におよそ５ｍｇの固形物を回収した。これにより、元のパンクレアチン水性懸濁液／溶液と比較して、分画４および５中での約３倍のリパーゼ比活性の上昇、約１．７倍のアミラーゼ活性の上昇、および約２倍のトリプシン活性の上昇という計算値が得られる。
【０１９９】
脱塩を３３．３ｍｇの出発物質からの１３．４ｍｇの物質を用いて２本の脱塩カラム上で行った場合、リパーゼの比活性は約１．２倍上昇し、アミラーゼの比活性は約１．５倍上昇した。特定の理論に縛られるものではないが、この活性低下は、延長した処理時間の延長した脱塩工程による、重要な安定化塩の除去のためであり得る。
【０２００】
前述の詳細な説明は単に理解を明確にするために与えられており、改変は当業者にとって明白であるので、不必要な制限が全くないことを理解されたい。具体的なその実施形態と関連付けて本発明を記載してきたが、さらなる改変が可能であり、一般に本発明の原理に従い、本願が本発明のあらゆる変更、使用または適応を包含するものであり、本発明が属する技術分野内の公知のまたは慣習的な実施内に入るように、および本明細書中で前に示される必須の特性に適用され得るように、および添付の特許請求の範囲において従うように、本開示からのこのような逸脱が含まれることを理解されたい。それぞれおよび全ての特許、特許出願および本明細書中で引用される刊行物の、特許請求の範囲、図および／または図面を含め、本開示は、それらの全体において参照により本明細書中によって本明細書中に組み込まれる。
【図１】
2017500885.tif 000036
【図２Ａ】
2017500885.tif 000037
【図２Ｂ】
2017500885.tif 000038
【図３】
2017500885.tif 000039
【図４】
2017500885.tif 000040
【図５】
2017500885.tif 000041
【図６】
2017500885.tif 000042
【国際調査報告】
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