(57)【要約】  本発明は、機能性タイプＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素と、クラスＩＩホスホリブロキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ）とを発現するように改変された酵母細胞に関する。これらの酵素の発現により、酵母にカルビン回路が再形成され、酵母が二酸化炭素を使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）適切なプロモータの転写制御下において、バクテリアのフォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＬサブユニットをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｂ）適切なプロモータの転写制御下において、前記ＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＳサブユニットをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｃ）適切なプロモータの転写制御下において、前記ＲｕＢｉｓＣＯ酵素の特異的シャペロンＲｂｃＸをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｄ）適切なプロモータの転写制御下において、一般的なバクテリアシャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｅ）適切なプロモータの転写制御下において、一般的なバクテリアシャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を包含する発現カセットと、を含む、形質転換酵母細胞。
【請求項２】
前記シャペロンＲｂｃＸ、前記ＧｒｏＥＳ、及び前記ＧｒｏＥＬは、少なくとも２つの異なる生物種に由来する、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記シャペロンＲｂｃＸはシアノバクテリアシャペロンである、請求項１又は請求項２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
前記一般的なシャペロンＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬとのうちの少なくとも１つは、シアノバクテリアにもＲｕＢｉｓＣＯ複合体を発現する他のバクテリアにも由来しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項５】
請求項１のｃ）、ｄ）、及びｅ）に記載の３つの前記発現カセットは、遺伝子情報の連続的ブロックを形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
請求項１のｃ）、ｄ）、及びｅ）に記載の前記発現カセットは、単一のエピソーム遺伝要素によって保持される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
前記酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記バクテリアのフォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素はシアノバクテリアのＲｕＢｉｓＣＯ酵素である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記シアノバクテリアはシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
適切なプロモータの転写制御下において、ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）をコードする配列を包含する発現カセットをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記ＰＲＫはクラスＩＩＰＲＫである、請求項１０に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記クラスＩＩＰＲＫは、スピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、又はシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）のＰＲＫから選択される、請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記ＰＲＫをコードする配列の転写を制御する前記プロモータは誘導型プロモータである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改変酵母株の作製に関し、該改変酵母株に炭素源として二酸化炭素を使用させることを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
人間や産業活動により二酸化炭素量が増加しており、これは深刻な気候変動を引き起こすと考えられる地球温暖化の原因となる温室効果の主な要因となっている。
【０００３】
二酸化炭素の回収と有機化合物への転換は、特に光合成を背景として、自然に所定の有機体によりおこなわれている。
【０００４】
光合成では、第１段階において光化学反応が介入し、その結果として光エネルギーがＡＴＰとＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨとの形態において化学エネルギーに変換され、第２段階はカルビン回路と呼ばれ、化学エネルギーが二酸化炭素からの炭素を有機分子に取り込むために用いられる、という２つの段階が含まれる。
【０００５】
カルビン回路の主要な酵素は、二酸化炭素分子を捕捉することでリブロース１，５−２リン酸を２分子の３−ホスホグリセラートに変換するリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）複合体である。
【０００６】
種々のフォームのＲｕＢｉｓＣＯがあり（Ｔａｂｉｔａ等、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ、５９、１５１５〜２４、２００８年）、最も代表的なものはフォームＩとフォームＩＩとである。フォームＩは、大サブユニット（ＲｂｃＬ）と小サブユニット（ＲｂｃＳ）との２つのタイプのサブユニットからなる。この機能的酵素複合体は８つの大サブユニットと８つの小サブユニットとからなるヘキサデカマー（ｈｅｘａｄｅｃａｍｅｒ）である。これらのサブユニットの適切な会合には、少なくとも１つの特異的シャペロン、ＲｂｃＸの介入をさらに必要とする（Ｌｉｕ等、Ｎａｔｕｒｅ、４６３、１９７〜２０２、２０１０年）。フォームＩＩはより単純であり、２つの同一のＲｂｃＬサブユニットから形成される二量体である。
【０００７】
ＲｕＢｉｓＣＯの基質であるリブロース−１，５−２リン酸は、リブロース−５−リン酸とＡＴＰとの反応によって形成され、この反応はホスホリブロキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ、ＰＲＫ）により触媒される。２つのクラスのＰＲＫが知られ、プロテオバクテリアに見受けられるクラスＩ酵素は八量体である一方で、シアノバクテリア及び植物に見受けられるクラスＩＩ酵素は四量体又は二量体である。
【０００８】
酵母などの非光合成生物体はＲｕＢｉｓＣＯもホスホリブロキナーゼも有さないが、一方で、ペントースの一般的代謝に介入することから他のカルビン回路酵素を含有する。
【０００９】
カルビン回路を再構成し、二酸化炭素を使用させるために、酵母にＲｕＢｉｓＣＯとＰＲＫとを導入することが提案されている。例として、Ｇｕａｄａｌｕｐｅ-Ｍｅｄｉｎａ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ、６、１２５、２０１３年）は、チオバシラス・デニトリフィカンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）からのフォームＩＩのＲｕＢｉｓＣＯ酵素とスピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）からのＰＲＫとのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現が、グリセロール形成を低減することによってエタノール産生を向上させることを報告している。
【００１０】
しかしながら、酵母においてバクテリアのフォームＩのＲｕＢｉｓＣＯ酵素を発現することは今までできなかった。実際に、このフォームが複雑であるため、機能的酵素の再構築には、ＲｂｃＬ及びＲｂｃＳサブユニット並びにシャペロンＲｂｃＸの適切なストイキオメトリにおける同時発現と、酵素複合体におけるこれらのサブユニットの適切な会合とが必要とされる。しかしながら発現ストイキオメトリの真核生物への転位（原核生物ではオペロンへの遺伝子の構造化によってもたらされる）は問題をもたらす。さらに、細胞内環境について真核生物と原核生物とに既に存在する相違点は、特に、酵素サブユニットを構成するペプチド鎖の折りたたみ及び／又はこれらのサブユニットの会合を妨げる翻訳後修飾にあらわれ得る。
【００１１】
だが、発明者等は、これらのサブユニットを特異的シャペロンＲｂｃＸ並びに一般的なバクテリアシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬと同時発現させることで、酵母において、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）からのフォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素の種々のサブユニットを発現することと、酵素複合体を再構築するためにこれらのサブユニットを会合することとに成功した。
【発明の概要】
【００１２】
このように、本発明は、形質転換された酵母細胞、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を目的とし、該細胞は、
ａ）適切なプロモータの転写制御下において、バクテリアのフォームＩのＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＬサブユニットをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｂ）適切なプロモータの転写制御下において、前記ＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＳサブユニットをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｃ）適切なプロモータの転写制御下において、前記ＲｕＢｉｓＣＯ酵素の特異的シャペロンＲｂｃＸをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｄ）適切なプロモータの転写制御下において、バクテリアシャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を包含する発現カセットと、
ｅ）適切なプロモータの転写制御下において、バクテリアシャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を包含する発現カセットと、を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の特に新規の特徴は、上述のｃ）、ｄ）、及びｅ）において言及されるシャペロンが、２つの異なる生物種に由来するということである。好ましくは、３つのシャペロンは、その少なくとも１つがシアノバクテリアである少なくとも２つの遠隔のグラム陰性バクテリア種に由来する。例として、一般的なシャペロン（ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来であり、「特異的な」シャペロン（ＲｂｃＸ）はシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来である。シャペロンの配列類似性（アライメントにおける同一アミノ酸の割合）は、Ｓ・エロンガタスのＧｒｏＥＬ１と大腸菌のＧｒｏＥＬとで６１％、Ｓ・エロンガタスのＧｒｏＥＬ２と大腸菌のＧｒｏＥＬとで５６％、Ｓ・エロンガタスのＧｒｏＥＬ１とＧｒｏＥＬ２とで６３％である。このように、６５％の同一性しきい値により、大腸菌の一般的シャペロンとＳ・エロンガタスとは区別される。本明細書において、「ＧｒｏＥＳ」と「ＧｒｏＥＬ」とは、シャペロン活性を有し、且つそれぞれ大腸菌Ｋ１２のＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬと６５％〜１００％のアミノ酸同一性を有する、任意のタンパク質を指す。大腸菌からの一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの変異体のシャペロン活性は、例えば、記載される本発明の実施形態の種々の実施例において、大腸菌からの天然ＧｒｏＥＳ又はＧｒｏＥＬをコードする発現カセットを、評価されるシャペロンの変異体によって置き換えることにより検証され得る。
【００１４】
シャペロンＲｂｃＸは、ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳとから非常に隔たりがあり、その配列はこれら２つのシャペロンの配列とアライメントされることができない。本明細書において、「ＲｂｃＸ」とは、配列番号３によりコードされるシャペロンＲｂｃＸと（アミノ酸において）５０％を超える配列同一性を有し、且つ、このタンパク質の特異的シャペロン活性を保持する（これは本発明の配列番号３を包含する発現カセットを評価される任意の他の配列で置換することと、得られたＲｕＢｉｓＣＯ活性を細胞抽出物におけるインビトロテストで測定することとにより、Ｓ・エロンガタスのＲｕＢｉｓＣＯのＲｂｃＬ及びＲｂｃＳサブユニットを発現する酵母において検証可能である）、任意のシアノバクテリアシャペロンを指す。好ましくは、本発明は、配列番号３によりコードされるシャペロンＲｂｃＸに対する（アミノ酸における）配列同一性が８０％より高く、特に９０％より高いシャペロンＲｂｃＸで実施される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、シャペロンＲｂｃＸは、例えばシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）からの、シアノバクテリアシャペロンである。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施形態において、一般的なシャペロンＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬとの少なくとも１つは、シアノバクテリアにもＲｕＢｉｓＣＯ複合体を発現する他のバクテリアにも由来しない。
【００１７】
有利な実施形態において、３つの発現カセットは遺伝子情報の連続的ブロックを形成する。また、３つのシャペロンの発現カセットは単一のエピソーム遺伝要素により保持されることも有利であり得る。
【００１８】
好ましくは、バクテリアのフォームＩのＲｕＢｉｓＣＯ酵素は、有利にはシネココッカス属のシアノバクテリアからの、最も好ましくはシネココッカス・エロンガタスからの、シアノバクテリアＲｕＢｉｓＣＯ酵素である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前述の細胞は、ｆ）適切なプロモータの転写制御下において、ＰＲＫ、好ましくは、例えばスピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、又はシネココッカス・エロンガタスなどのクラスＩＩＰＲＫをコードする配列を包含する、発現カセットをさらに含む。
【００２０】
酵母細胞において目的の遺伝子を発現するために使用可能な広範な種々の手段（プロモータ、発現ベクターカセット、形質転換法）が当該技術分野において利用可能である（参考として例えば「酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」Ｄ．Ａｍｂｅｒｇ、Ｄ．Ｂｕｒｋｅ及びＪ．Ｓｔｒａｔｈｅｍ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００５年）。
【００２１】
本発明の文脈において使用可能なプロモータは、構成型プロモータ、即ち大部分の細胞状態と環境条件とで活性であるプロモータと、外因性の物理的又は化学的刺激によって活性化又抑制され、これらの刺激の存否の結果として種々のレベルの発現を誘導する誘導型プロモータとを含む。
【００２２】
発現カセットａ）〜ｅ）について、例えばＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＰＧＩ１、ＰＧＫ、ＡＤＨ１などの構成型プロモータが好ましくは用いられる。好適には、これらのプロモータはカセットによって異なり得る。
【００２３】
ＰＲＫ発現カセットｆ）について、誘導型プロモータが好ましくは用いられ得る。例として、ドキシサイクリンによって発現が抑制され、故にその非存在下で誘導されるＴｅｔＯ−７プロモータが言及され得る。
【００２４】
本発明の文脈において使用可能な他の誘導型プロモータは、特にｔｅｔＯ−２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１０−ｃｙｃ１、ＰＨＯ５プロモータである。
【００２５】
本発明の発現カセットは、転写ターミネータや、必要であれば増幅因子などの他の転写調節要素など、このタイプの構成に一般的な配列をさらに含む。
【００２６】
種々の発現カセットによって発現されるタンパク質の相対的なストイキオメトリは、本発明の最適な実施形態において多くは重要な役割を果たす。以下の実験の項に記載される酵母における同時発現のシステムは特にこれに関連する。しかしながら、本発明はこのシステムの使用に限定されず、少なくとも同等の作用を有する記載の要素の発現の任意の変形で適用可能であり、それらは例えば以下に記載の実施例のうちの１つを再現することによって測定可能である。
【００２７】
本発明の発現カセットは宿主細胞の染色体ＤＮＡに挿入されるか、及び／又は１つ以上の染色体外複製単位（レプリコン）によって保持されることが可能である。
【００２８】
本発明の酵母株は、同一種の株について共通の培地条件下で成長可能である。有利には、これらの培地は少なくとも９０％二酸化炭素を含む雰囲気下で調製される。
【００２９】
本発明は、サッカロマイセス・セレビシエにおけるＲｕＢｉｓＣＯ複合体とＰＲＫとの発現を記述する非限定的実施例を示す、以下のさらなる説明により理解が深まる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、形質転換株の溶解物全体の解析を示す。図１Ａは、１１．５、１１．１５、１１．７、１１．１７、１１．９、１１．１９、１１．５、１１．１９株の溶解物全体のＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析を示す。図１Ｂは、１４．５、１４．１２、１４．６、１４．７、１６．３、１６．５、１６．６株の溶解物全体の抗ＨＡ免疫検出による解析を示す。
【図２】図２は、溶解物全体（図面左側の四角）と、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲｂｃＸを同時発現する１６．５株の、分子量により分類された画分と、ＲｂｃＸを発現する対照株１６．３との免疫検出による解析を示す。
【図３】図３は、１１．９、１８．３、及び２２．２株の抽出物全体と、Ｓ・エロンガタスと大腸菌のシャペロンとからのＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲｂｃＸを同時発現する２２．２株の分子量によって分類された画分との、非変性ゲルにおける、そして抗ＲｂｃＬ抗体を用いた免疫検出による解析を示す。同時に、１８．３株（左側）及び２２．２株（右側）の分子量によって分類された画分も示される。
【図４】図４は、種々の反応時間（０、１０及び６０分）で得られた、検出３−ホスホグリセラートの量（１８５及び１８６のｍ／ｅ、即ちＥＳ−の炭素における非標識３−ホスホグリセラートと１３Ｃ標識３−ホスホグリセラートのイオン）を示す。左側には１３ＣＯ２の存在下でおこなわれた実験が示され、右側には１２ＣＯ２の存在下でおこなわれたものが示される。
【図５】図５は、通常の雰囲気での、細胞の生存性における種々のＰＲＫの発現の影響を示す。２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含むＣＳＭ選択培地における液体内で各株を成長させる。２ＯＤの当量（６００ｎｍでのＯＤ）を収集し、２回洗浄してドキシサイクリンを除去する。１０倍希釈物を調製する。１０μｌの希釈物を、（２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含有又は非含有の）寒天平板上に細胞懸濁剤の滴（一連の段階希釈）の形態で堆積させ、通常の雰囲気において２８℃でインキュベートする。
【図６】図６は、ＣＯ２豊富な雰囲気での、細胞の生存性における種々のＰＲＫの発現の影響を示す。２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含むＣＳＭ選択培地における液体内で各株を成長させる。２ＯＤの当量（６００ｎｍでのＯＤ）を収集し、２回洗浄してドキシサイクリンを除去する。１０倍希釈物を調製する。１０μｌの希釈物を、（２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含有又は非含有の）寒天平板上に、細胞懸濁剤の滴（一連の段階希釈）の形態で堆積させ、少なくとも９０：１０（ｖ／ｖ）の二酸化炭素／空気を含有する雰囲気を含む閉じた袋内において２８℃でインキュベートする。
【図７】図７は、各株について最大成長率μ（μｍａｘ）の比率を示す。濃い灰色の棒は、ｔｅｔＯプロモータの誘導状態（高発現レべル）を示し（ドキシサイクリン非含有培地）、薄い灰色の棒は、ｔｅｔＯプロモータの（部分的な）抑制状態（低発現レべル）を示す（２μｇ／ｍｌドキシサイクリン含有培地）。
【図８】図８は、種々の抽出物において、溶出時間の関数としてのリブロース−１，５−２リン酸（モル質量３０９ｇ／モル）の検出を示す。左側のパネルはＣＳＭ選択培地を含有する閉管において成長させたＷ３０３−１Ｂ株のクロマトグラムを示し、真ん中のパネルは閉管及びＣＳＭ選択培地において成長させたＣＥＮＰＫ株のクロマトグラムを示し、右側のパネルは閉管及び最小培地において成長させたＣＥＮＰＫ株について得られたクロマトグラムを示す。
【図９】図９は、ＣＥＮ．ＰＫ３と４との株における合成ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の酵素活性の評価を示す。ＰＲＫはホスホリブロキナーゼであり、ＲｂｃＳＬＸはＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲＢＣＸ遺伝子の産生物であり、ＧｒｏＥＳＬは大腸菌からのＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳ遺伝子の産生物である。
【図１０】図１０は、ウシ炭酸脱水酵素の存在下及び非存在下における、完全エンジニアリング（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む酵母ＣＥＮ−ＰＫ３の抽出物のＲｕＢｉｓＣＯ活性を示す。
【図１１】図１１は、嫌気培養時のエタノールとバイオマスとの濃度における変化を示す（Ｒｕｂ：ＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ、Ｐｒｋ：ホスホリブロキナーゼ、シャペロン：ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）。■はＣＥＮ．ＰＫ１３ｂ株、□はＣＥＮ．ＰＫ３株を示す。
【図１２】図１２は、好気培養時のバイオマス、ホルマート、及びグルコースの濃度における変化を示す（Ｒｕｂ：ＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ、Ｐｒｋ：ホスホリブロキナーゼ、シャペロン：ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）。バイオマス生成（ｇ／ｌ、左側縦軸）について、■はＣＥＮ．ＰＫ２株（ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ＿ｃｏｌｉ、ＧｒｏＥＬ＿ｃｏｌｉ）、□はＣＥＮ．ＰＫ３株（ＰＲＫ、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ＿ｃｏｌｉ、ＧｒｏＥＬ＿ｃｏｌｉ）を示す。グルコース消費（ｇ／ｌ、左側縦軸）について、●はＣＥＮ．ＰＫ２株、○はＣＥＮ．ＰＫ３株を示す。ホルマート消費（ｇ／ｌ、右側縦軸）について、▲はＣＥＮ．ＰＫ２株、△はＣＥＮ．ＰＫ３株を示す。
【図１３】図１３は、完全エンジニアリング（ＣＥＮ．ＰＫ３（ＰＲＫ、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ＿ｃｏｌｉ、ＧｒｏＥＬ＿ｃｏｌｉ））を含む株か、又はＰＲＫなし（ＣＥＮ．ＰＫ２（ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ＿ｃｏｌｉ、ＧｒｏＥＬ＿ｃｏｌｉ））でおこなわれたメタボローム解析の抜粋である。解析は、特に、フラクトース−６Ｐ（Ｆ６Ｐ）、フラクトース−１，６ｄｉＰ（ＦＢＰ）、グルコース−６Ｐ（Ｇ６Ｐ）、セドヘプツロース−７Ｐ（Ｓ７Ｐ）、キシルロース−５Ｐ（Ｘｙｌｕ５Ｐ）、リブロース−５Ｐ（Ｒｉｂｕ５Ｐ）、リボース−５Ｐ（Ｒｉｂ５Ｐ）、リブロース−１，５ｄｉＰ（ＲｉｂｕＤＰ）、グリセラート−３Ｐ（Ｇｌｙ３Ｐ）の激しい蓄積を示す。
【図１４】図１４は、本発明の改変酵母細胞についての代謝シミュレーションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（実施例）
［実施例１：サッカロマイセス・セレビシエ（ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ  ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ）酵母におけるシネココッカス・エロンガタス（ＳＹＮＥＣＨＯＣＯＣＣＵＳ  ＥＬＯＮＧＡＴＵＳ）ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の発現と会合］
シネココッカス・エロンガタスｐＣＣ６３０１からのＲｕＢｉｓＣＯのＲｂｃＳ及びＲｂｃＬサブユニットと特定のシャペロンＲｂｃＸとをコードし、酵母における発現に最適化された合成遺伝子を調製し、プラスミドｐＢＳＩＩ（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ社）にクローニングした。また、コード配列の３′末端にＨＡタグを追加した変異体も構築した。
【００３２】
これらの合成遺伝子の配列（ＨＡタグ無し）は、添付の配列表において配列番号１（ＲｂｃＬ）、配列番号２（ＲｂｃＳ）、及び配列番号３（ＲｂｃＸ）の番号のもとに示される。
【００３３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬをコードする配列を、大腸菌培養から増幅し、プラスミドｐＳＣ-Ｂ-ａｍｐ／ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。
【００３４】
クローニングベクターから収集された配列を酵母発現ベクターに導入した。以下の表１にこれらの宿主ベクターを示す。
【００３５】
【表１】
2017502682.tif 000002
【００３６】
注：ｐＧＡＬ１０-ＣＹＣ１はＧＡＬ１０遺伝子のＵＡＳとＣＹＣ１遺伝子の転写開始点からなる合成プロモータである（Ｐｏｍｐｏｍ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２７２、５１‐６４、１９９６年）。
【００３７】
このように得られた発現カセットは以下の表２に示される。
【００３８】
【表２】
2017502682.tif 000003
【００３９】
特定のベクターにおいて、２又は３つのカセットを挿入した。そのため、プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αバクテリアにおいて増幅し、マキシプレップによって調製し、そして適切な制限酵素で消化した。最後に、フラグメントをＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）によってライゲーションで宿主ベクターに組み込む。構築ベクターのリストは以下の表３に示される。
【００４０】
【表３】
2017502682.tif 000004
【００４１】
*は逆方向を示す。
【００４２】
Ｓ．セレビシエ酵母細胞（Ｗ３０３．１Ｂ株）を形質転換するために種々のベクター又はベクターの組合せを用いた。
【００４３】
これらのベクター及びベクターの組合せを以下の表４に示す。
【００４４】
【表４】
2017502682.tif 000005
【００４５】
注：ｐＣＭ１８５はプラスミドＡＴＣＣ８７６５９、ｐＦＬ３６はプラスミドＡＴＣＣ７７２０２を示す。
【００４６】
形質転換に用いられたプラスミドの選択マーカに適した市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で補完したＹＮＢ培地（６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、寒天用２０ｇ／ｌ寒天で補完した窒素源非含有酵母（ｙｅａｓｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ））において、形質転換細胞を、周囲空気下３０℃で成長させた。培養を、対数期終了の一世代前に４℃で冷却することで停止した。
【００４７】
各培養から一定分量を取り、変性ＳＤＳゲルにおいて全タンパク質を解析するため、細胞をＳＤＳの存在下においてソーダで溶解する。
【００４８】
培養の残余を遠心分離し、スフェロプラストを、高張性ソルビトール培地（１．２Ｍソルビトール）においてザイモリエース・サイトへリカーゼ混合物で細胞壁の酵素消化をすることで調製する。スフェロプラストを、飽和濃度のＰＭＳＦ及びＥＤＴＡ（プロテアーゼ阻害剤）の存在下で高張性ソルビトール培地において洗浄し、等張性ソルビトール培地（０．６Ｍ）においてピペッティングの反復と弱い音波処理とで破砕する。大きな破片を除くための低速（１５００ｒｐｍ）で、そして中程度のサイズの破片とミトコンドリアとを収集するために中速（４０００ｒｐｍ）で遠心分離した後、上清を収集し、ｐＨを６．５〜７．０に維持した８０％飽和の硫酸アンモニウムでタンパク質を沈殿させた。沈殿物を再溶解し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で透析し、そしてセファクリルＳ３００カラム（ＧＥヘルスケア社）において分子ふるいにより分画する。ゲル解析のため、溶出された画分をプールにおいて合わせる。
【００４９】
全溶解物と、分子量により分類された画分（１０４〜１．５×１０６ダルトンの天然球状タンパク質の範囲）とを変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル及び非変性ゲルにおいて解析する（クマシーブルーＰＡＧＥで予備染色）。全タンパク質の解析のため、ゲルをクマシーブルーで染色し、ポンソーレッドでブロットを染色する。ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲｂｃＸタンパク質を、電荷ナイロンへの電気移動後に免疫検出によって検出する。ＲｂｃＬの場合、検出は抗ＲｂｃＬ抗体を用いて直接的におこなわれ、ＲｂｃＳとＲｂｃＸとの場合には抗ＨＡタグ抗体を介して非直接的におこなわれることができる。タグの存在により複合体の折りたたみ又は会合が影響を受けないことを検証するために、タグタンパク質の同時発現あり又はなしを交互におこないながら種々の実験を繰り返した。
【００５０】
図1は、形質転換株の全溶解物の解析を示す。
【００５１】
２つのサブユニットを酵母において発現させる。ＲｂｃＬは、（抽出物の全タンパク質の非特異的染色によって可視である）高レベルで発現される。ＲｂｃＳ発現レベルは定量化されていないが、抗ＨＡ免疫検出に基づきＲｂｃＬのものと同様であると考えられる。２つのタンパク質は分解の兆候を示さず（不鮮明な又は複数のバンドはない）、優れた折りたたみの質と内在性プロテアーゼに対する抵抗性とを示す。シャペロンＲｂｃＸも発現され、分解の兆候を示さない。３つの成分を同時発現するためのプラスミド系が運用され、種々の成分の発現との干渉を特に示さない。
【００５２】
図２は、全溶解物（図面左側の四角）と、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲｂｃＸを同時発現する１６．５株及びＲｂｃＸを発現するその対照１６．３株の分子量によって分類された画分との免疫検出による解析を示す。
【００５３】
ＲｂｃＬサブユニットの単峰性分布が５００ｋＤａ以上のサイズの複合体内で観察されるものの、単離されたサブユニットの質量は５５ｋＤａである。反対に、ＲｂｃＳとＲｂｃＸとの分布は二峰性であり、一方はＲｂｃＬについて観察されるものと同様のサイズであり、他方は単離されたＲｂｃＳ及びＲｂｃＸタンパク質のものと近い小さいサイズに相当する。天然ＲｕＢｉｓＣＯ複合体は、これらの条件下で、天然ゲルや非特異的染色により、予期されるサイズ（約５００ｋＤａ）でしっかりとは可視されない。しかし、非常に大きい複合体はＲｂｃＬの免疫検出によって（予期されるサイズよりも大きい）約７５０〜１０００ｋＤａで検出可能である。
【００５４】
図３は、１１．９、１８．３、及び２２．２株の全抽出物と、Ｓ．エロンガタスからのＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、及びＲｂｃＸ並びに大腸菌からのシャペロンを同時発現する２２．２株の分子量で分類された画分との、非変性ゲルにおける解析と次の抗ＲｂｃＬ抗体を用いる免疫検出との結果を示す。同時に、１８．３株（左側）及び２２．２株（右側）の分子量によって分類された画分も示される。
【００５５】
結果は、シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬとの同時発現がこれらのシャペロンの非存在下で検出された高分子量複合体（約７５０〜１０００ｋＤａ）のサイズ低下をもたらし、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ、及びＧｒｏＥＬを同時発現する細胞において、天然ＲｕＢｉｓＣＯ複合体について予期されるサイズ（約５００ｋＤａ）に対応する明確に定義されたバンドが観察されることを示す。
【００５６】
これらの結果は、原核生物のフォームＩのＲｕＢｉｓＣＯ複合体がＳ．セレビシエ細胞において発現及び適切に会合されることが可能であり、この会合が一般シャペロンＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬとの存在によって向上されることを示す。
【００５７】
インビトロにおけるＲｕＢｉｓＣＯ活性の解析のため、ｙＦＢ３株の可溶性タンパク質抽出がおこなわれる。用いられたプラスミドの選択マーカに適した（ｙＦＢ３株用ロイシン、ウラシル、及びトリプトファン非含有培地）、市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を含んで６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、寒天用２０ｇ／ｌ寒天で補完された、ＹＮＢ（窒素源非含有酵母）培地において、細胞を、周囲空気下３０℃で成長させる。対数期終了の一世代前に４℃で冷却することで、培養を停止する。培養物を遠心分離し、スフェロプラストを、高張性ソルビトール培地（１．２Ｍソルビトール）においてザイモリエース・サイトへリカーゼ混合物で細胞壁の酵素消化をすることで調製する。スフェロプラストを、１ｍＭのＰＭＳＦ及びＥＤＴＡ（プロテアーゼ阻害剤）の存在下で高張性ソルビトール培地において洗浄し、等張性ソルビトール培地（０．６Ｍ）において反復ピペッティングと弱い音波処理とで破砕する。大きな破片を除くために低速（２００ｇで５分間）で、そして中程度のサイズの破片とミトコンドリアとを収集するために中速（１５００ｇで１０分間）で遠心分離した後、上清を収集する。
【００５８】
タンパク質抽出物における活性のテストを、２ｍＭリブロース２リン酸（ＲｉＤＰ）とｙＦＢ３抽出物の０．５ｍｇ／ｍｌ全タンパク質との存在下で、５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＮａＨＣＯ３（１３Ｃ又は１２Ｃ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２においておこなう。ｔ＝１０分及びｔ＝６０分で１００μｌの反応混合物を取り出し、２μｌのＨＣｌを添加することで反応を停止し、そして試料を９３００ｇで１０分間遠心分離してＨＰＬＣ／ＭＳにより解析する（１０ｍＭのトリブチルアミンアセテート／アセトニトリル、ｐＨ６．０勾配を伴う逆相イオン対Ｃ１８）。代謝物を負イオンエレクトロスプレー質量分析により検出し、基準化合物のものと比較したそのｍ／ｅ比と溶出時間とに基づいて特定する。
【００５９】
結果を図４に示す。
【００６０】
１３ＣＯ２の存在下において、６０分で形成された３−ホスホグリセラートのラべル比は、予期されたように５２％である。図４の下部に示されるように、実際にＲｕＢｉｓＣＯにより触媒された反応は、１つのＣＯ２分子と１つのＲｉＤＰ分子からの２つの３−ホスホグリセラート分子の形成である。１２ＣＯ２の存在下において、３−ホスホグリセラートは形成されるが、その非ラベル化形態においてのみである。
【００６１】
このように、抽出物内に存在するＲｕＢｉｓＣＯはＣＯ２の炭素を取り込んで、３−ホスホグリセラートを産生することが可能である。
【００６２】
［実施例２：サッカロマイセス・セレビシエ酵母におけるホスホリブロキナーゼ発現］
シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｓｐｈ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｐａｌ）、スピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｓｏｌｅ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｇｒａ）である５つの異なる由来のＰＲＫをコードし、酵母における発現に最適化され、そしてＣ末端ＨＡタグを有するか又は有しない、合成遺伝子を調製した。これら合成遺伝子の配列（ＨＡタグ無し）は、添付の配列表において、それぞれ配列番号４〜８の番号のもとに示される。
【００６３】
ＲｓｐｈとＲｐａｌとのＰＲＫは、Ｒｓｐｈでは八量体として、Ｒｐａｌでは六量体として、天然形態において存在するクラスＩＰＲＫである。Ｓｏｌｅ、Ｅｇｒａ、及びＳｙｎキナーゼは、その天然形態がＳｏｌｅ、Ｅｇｒａについては二量体、Ｓｙｎについては四量体であるクラスＩＩキナーゼである。
【００６４】
ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｓｐｈ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｐａｌ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｇｒａ）、及びスピナシア・オレラセア（Ｓｏｌｅ）配列は、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ社により合成され、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ＋プラスミドで提供された。プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αバクテリアにおいて増幅した。各プラスミドについて、マキシプレップ抽出をおこない、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ酵素で消化する。そして消化産生物をＳＹＢＥＲ  Ｓａｆｅを含む０．８％アガロースゲルに堆積させた。５０Ｖで３０分間、１倍のＴＡＥ緩衝剤内で移動をおこなう。オープンリーディングフレームに対応するバンド（ＲｐａｌからのＰＲＫでは９７２ｂｐ、Ｒｓｐｈでは９６６ｂｐ、Ｅｇｒａでは１４６１ｂｐ、Ｓｏｌｅでは１２７７ｂｐ）をゲルから切り出し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社のゲル抽出キットでＤＮＡを抽出する。最後に、ドキシサイクリンで抑制可能なｔｅｔＯプロモータの制御下において、フラグメントをＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）によってライゲーションでベクターｐＣＭ１８５、ｐＣＭ１８８−２、及びｐＣＭ１８８−７に組み込み、それぞれ発現ベクターｐＦＰＰ２０、ｐＪＬＰ１、ｐＪＬＰ２、ｐＪＬＰ３、ｐＪＬＰ４を得る。
【００６５】
得られたカセット及び発現ベクターは以下の表５に示される。
【００６６】
【表５】
2017502682.tif 000006
【００６７】
これらのベクターを、Ｓ．セレビシエのＷ３０３．１Ｂ株と、ＣＮＰＫ株との細胞を形質転換するために用いた。これらの株の前者は典型的な実験株、後者は準産業的株である。
【００６８】
Ｃｈｅｎ等（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９２年、２１、８３-４）のプロトコルに従って形質転換をおこない、各形質転換及びサブクローニング段階では、ｔｅｔＯプロモータの抑制に適した２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン濃度が維持された。形質転換細胞を、２μｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下、−８０℃で、グリセロール含有培地（５０％グリセロール）において保存した。
【００６９】
得られた形質転換株を以下の表６に示す。
【００７０】
【表６】
2017502682.tif 000007
【００７１】
ＰＲＫ発現の抑制に適する２μｇ／ｍｌ濃度のドキシサイクリンを含有し且つプラスミド選択の支援に適する市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を含むＹＮＢ培地（６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、寒天用２０ｇ／ｌ寒天で補完された窒素源非含有酵母）において、ストックした形質転換細胞を前培養にする。
【００７２】
細胞生存性における種々のＰＲＫ発現の影響を、ドキシサイクリンの存在又は非存在下において寒天培地上で評価した。各株を、２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含むＣＳＭ選択培地の液体において成長させる。２ＯＤの当量（６００ｎｍでのＯＤ）を収集し、２回洗浄してドキシサイクリンを除去する。１０倍希釈物を調製する。１０μｌの希釈物を、（２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含有又は非含有の）寒天平板上に、細胞懸濁剤の滴（一連の段階希釈）の形態で堆積させ、通常の雰囲気、又は代替的に閉じた袋内においてその雰囲気が少なくとも９０：１０（ｖ／ｖ）の二酸化炭素／空気を含有するものにおいて、２８℃でインキュベートする。
【００７３】
通常の雰囲気での結果を図５に示し、ＣＯ２豊富な雰囲気での結果を図６に示す。
【００７４】
すべてのＰＲＫは、（誘導された）高発現レベルのＷ３０３１Ｂ株においていくらか毒性があるということが言及される。しかし、ＣＥＮＰＫ株では毒性は相当低いと見られ、ＳｙｎＰＲＫのみが誘導状態において毒性を有する。
【００７５】
他の実験では、Ｗ３０３．１Ｂ株において、酸素が少なく且つ二酸化炭素が豊富な雰囲気においては毒性が大きく弱められることが示される。
【００７６】
細胞成長における種々のＰＲＫ発現の影響を液体培地内の培養において評価した。株を、（２μｇ／ｍｌドキシサイクリン含有又は非含有の)閉管内のＣＳＭ選択培地において成長させる。６００ｎｍで光学密度を測定することで固定相に入るまで成長をモニターする。各株について、株と対照株（株＋空のプラスミド）との最大成長率μ（単位時間毎の個体群の増加）の関係が測定される。
【００７７】
各株についての最大成長率μ（μｍａｘ）の比率を図７に示す。
【００７８】
これらの結果において、ＣＮＰＫ  １１３-７Ｄ株についてのキナーゼの毒性がＷ３０３．１Ｂ株のものよりも低いことが確認される。
【００７９】
用量（誘導レベル）反応（成長率）毒性作用はＷ３０３．１ＢのＳｏｌｅキナーゼのみについて観察される。
【００８０】
Ｗ３０３．１Ｂにおいて、弱くそして強く発現されたＲｐａｌ、Ｒｓｐｈ、Ｓｙｎキナーゼの重大な毒性が観察される。毒性はＥｇｒａキナーゼではより低いと見られる。
【００８１】
炭素循環の中心であるリブロース−１，５−ビスリン酸代謝の解析のため、細胞を洗浄してドキシサイクリンを除き、そして、使用されるプラスミドの選択マーカに適した市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で補完されて６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、（寒天用２０ｇ／ｌ寒天）で補完されたＹＮＢ（窒素源非含有酵母）培地における３０℃の培養液に細胞を入れる。培養物を、培地量１に対して３〜１０の容積の空気（補充されない）を超えた酸素供給のない閉管内で調製する。このように、培養に由来する二酸化炭素は培養管の容積内に維持される。この手順により、発現の毒性は抑えられる。
【００８２】
Ｌｕｏ他（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １１４７：１５３-１６４、２００７年）が記載したプロトコルに従って、代謝を、−８０℃で６０：４０（ｖ／ｖ）のメタノール・水に培養物を希釈することで遮断した（混合物はドライアイス・アセトニトリル浴で−４０℃に維持される）後、高速の遠心分離（温度は−２０℃に維持される）をおこない、０．３Ｍのソーダを含有するメタノール・水（６０：４０ｖ／ｖ）混合物内の細胞溶解物を−８０℃で凍結する。
【００８３】
解凍後、一定分量を氷酢酸で中和し、遠心分離して、上清をＨＰＬＣ／ＭＳ（ｐＨ６．０勾配、トリブチルアミンアセテート／アセトニトリルでの逆相イオン対Ｃ１８）により解析する。代謝物を負イオンエレクトロスプレー質量分析により検出し、基準化合物のものと比較したそのｍ／ｅ比と溶出時間とに基づいて特定する。
【００８４】
結果を図８に示す。
【００８５】
反応から産生されたリブロース−１，５−２リン酸の蓄積レベルにより推定される活性レベル（発現レベルに対して標準化されない）は、
・ＳｙｎＰＲＫでは抑制条件においてすら非常に高く（５０％の誘導レベル）、この活性は細胞内ＡＴＰのレベルの重大な降下が付随する毒性を伴い、
・最小培地におけるＥｇｒａとＳｏｌｅとのＰＲＫについては検出可能であるがより弱く、
・ＲｓｐＨとＲｐａｉとのＰＲＫに用いられた条件下では検出不可能であり、
・ＳｙｎＰＲＫについては、培地次第で、リブロース−１，５−２リン酸蓄積レベルが富栄養培地より栄養の乏しい培地においてはるかに高い、
ということが見受けられる。
【００８６】
これらの観察全体から、クラスＩＩキナーゼのみがＳ．セレビシエにおいて高レベルのリブロース２リン酸の蓄積をもたらすということが示される。
【００８７】
［実施例３：酵母に発現されたＲｕＢｉｓＣＯ複合体の機能性及びそれを制御するパラメータの調査による、インビトロにおける「カーボイースト（ｃａｒｂｏｙｅａｓｔ）」エンジニアリングを含む株の表現型特性］
図４に記載されるように、人工的ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の機能性は、完全又は部分的エンジニアリングを含む酵母抽出物からの合成基質（リブロース２リン酸）におけるＲｕＢｉｓＣＯ活性をテストすることと、それが触媒する反応産生物、つまり３−グリセロリン酸の出現を評価することによって、インビトロにおいて示された。
【００８８】
＜３．１．使用構成と使用株＞
本実施例は、以下の表７〜表９に記載の構成と形質転換株とを用いておこなわれた。
【００８９】
表７は発現カセットを示す。
【００９０】
【表７】
2017502682.tif 000008
【００９１】
表８は発現ベクターを示す（カセットについては表７を参照）。
【００９２】
【表８】
2017502682.tif 000009
【００９３】
＊は逆方向を示す。
【００９４】
表９はプラスミドと株との組合せを示す（表８を参照）。
【００９５】
【表９】
2017502682.tif 000010
【００９６】
（ＳｙｎはＳ．エロンガタス、ｃｏｌｉは大腸菌、Ｌ２ｓｙｎはＳ．エロンガタスのＧｒｏＥＬ２を表す）
備考
１．ｐＣＭ１８５は市販のプラスミド（ＡＴＣＣ８７６５９）である。
【００９７】
２．ｐＦＬ３６は市販のプラスミド（ＡＴＣＣ７７２０２）である。
【００９８】
３．ＰＹｅＤＰ５１は「空の」プラスミドであり、Ｕｒｂａｎ  Ｐ、Ｍｉｇｎｏｔｔｅ  Ｃ、Ｋａｚｍａｉｅｒ  Ｍ、Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｆ、Ｐｏｍｐｏｍ  Ｄの、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの２種の遠い関係にあるＮＡＤＰＨ‐チトクロームＰ４５０レダクターゼのクローニング、酵母での発現、及びＰ４５０  ＣＹＰ７３Ａ５とのカップリングの特性化（Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｙｅａｓｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＮＡＤＰＨ-ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７３Ａ５、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、１９９７年８月１日、２７２（３１）：１９１７６-８６）の文献に記載される。
【００９９】
４．他の省略形は、データバンクに記載されるＳ．セレビシエ遺伝子に関する。
【０１００】
５．合成遺伝子について、ＲｕＢｉｓＣＯ会合（ＲｂｃＸ）に特異的なシャペロンと、一般的シャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ１、及びＧｒｏＥＬ２とをコードするシネココッカス・エロンガタス遺伝子は、独自の不均質なコドンバイアスがある酵母のために再コードした後、再合成され、ｐＣＣ６３０１（市販）にクローニングした。
【０１０１】
６．大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬをバクテリアから増幅し、ｐＳＣ-Ｂ-ａｍｐ／ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングし、発現ベクターにおいて再コードすることなく会合した（実施例１を参照）。
【０１０２】
７．シネココッカス・エロンガタスＲｂｃＳ、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＸ、及びＰＲＫ配列は実施例１と実施例２とに記載した。
【０１０３】
８.シネココッカス・エロンガタスシャペロンをコードするｃＤＮＡの再コード配列は、配列表（配列番号９〜１１）に記載され、酵母の２分子を同時形質転換することで、予め線状化されたベクターｐＵＣ５７に相同組換えにより挿入される。同様に、ＯＲＦを、以前の構成からＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＦＰＰ５６によって保持されるプロモータとターミネータとに相同である側部領域を生成する。このため、酵母株に対してＰＣＲ産生物と予め線状化されたベクターｐＦＰＰ５６とで同時形質転換することによって相同組換えによるクローニングが可能になり、表７に記載のカセットによって表８に記載の種々の発現ベクターを生成する。
【０１０４】
＜３．２．合成ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の酵素活性の評価＞
ＣＥＮ−ＰＫ３とＣＥＮ−ＰＫ４株の可溶性タンパク質の抽出のため、用いられるプラスミドの選択マーカに適した（ロイシン、ウラシル、及びトリプトファン非含有培地）市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を含んで６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、寒天用２０ｇ／ｌ寒天で補完された、ＹＮＢ（窒素源非含有酵母）培地において、細胞を、振動させながら周囲空気下３０℃で成長させる。対数期終了の一世代前に４℃で冷却することで、培養を停止する。培養物を遠心分離し、スフェロプラストを、高張性ソルビトール培地（１．２Ｍソルビトール）においてザイモリエース・サイトへリカーゼ混合物で細胞壁の酵素消化をすることで調製する。スフェロプラストを、１ｍＭのＰＭＳＦ及びＥＤＴＡ（プロテアーゼ阻害剤）の存在下で高張性ソルビトール培地において洗浄し、等張性培地（０．６Ｍソルビトール）において反復ピペッティングと弱い音波処理とで破砕する。大きな破片を除くために低速（２００ｇで５分間）で、そして中程度のサイズの破片とミトコンドリアとを収集するために中速（１５００ｇで１０分間）で遠心分離した後、上清を収集する。
【０１０５】
タンパク質抽出物における活性のテストを、２ｍＭリブロース二リン酸（ＲｉＤＰ）と抽出物の０．０５ｍｇ／ｍｌ全タンパク質との存在下で、５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＭｇＣｌ２においておこなう。種々の時間で６０μｌの反応混合物を取り出し、２μｌのＨＣｌ（１２．１Ｍ）を添加することで反応を停止し、試料を９３００ｇで１０分間遠心分離してＨＰＬＣ／ＭＳにより解析する（１０ｍＭのトリブチルアミンアセテート／アセトニトリル、ｐＨ６．０勾配を伴う逆相イオン対Ｃ１８）。代謝物を負イオンエレクトロスプレー質量分析により検出し、基準化合物のものと比較したそのｍ／ｅ比と溶出時間とに基づいて特定する。
【０１０６】
結果を図９に示す。図面は、横座標の種々の反応時間で得られた検出３−ホスホグリセラートのモル数（１８５のｍ／ｅ）を縦座標において表す。
【０１０７】
「カーボイースト（ｃａｒｂｏｙｅａｓｔ）」エンジニアリングとして言及される完全エンジニアリング（ＣＥＮ−ＰＫ３のＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ＋ＰＲＫ＋シャペロンＲｂｃＸと大腸菌のＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬ）と、非制限基質とについて、合成ＲｕＢｉｓＣＯ酵素の触媒活性からもたらされる産生物量は、時間について直線的に増加するということが注目される。このように、エンジニアリングによって酵母に発現されたＲｕＢｉｓＣＯ複合体は機能的且つ安定的である。
【０１０８】
ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の折りたたみに特化したシャペロンＲｂｃＸと一般バクテリアのシャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬとのペアの会合は不可欠である（図９及び表１０）ことが明らかに見て取れる。
【０１０９】
しかしながら、記載のテスト条件下において、Ｓ．エロンガタスからの特異的シャペロンＲｂｃＸと会合された、大腸菌からの一般的バクテリアのシャペロン（ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ）の組合せの同時発現は、すべての要素が同一の有機体であるＳ．エロンガタスに由来する同様の会合よりも、Ｓ．エロンガタスから、ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の機能性を再構築するためにさらに効果的である（表１０、１及び３行）。
【０１１０】
表１０において、インビトロにおけるＲｕＢｉｓＣＯ活性のテストを、グルコース上で成長させ且つ第１列に示されたエンジニアリングを含むＣＥＮ−ＰＫ株の抽出物から、前述されたものと同様の手順に従っておこなった。室温で、２ｍＭリブロース二リン酸を含む２００μｌの反応量における、酵母の可溶性抽出物からの０．０１〜０．０２ｍｇのタンパク質との８０分のインキュベーションの間にテストをおこなう。活性を、形成３−ホスホグリセラートのｎｍｏｌ／分／抽出物における全タンパク質のｍｇで示される。
【０１１１】
【表１０】
2017502682.tif 000011
【０１１２】
＜３．３．合成ＲｕＢｉｓＣＯは１３Ｃ標識ＣＯ２を取り込んで、反応産生物に組込む＞
上述（図４）された同位体取込み実験は、標識３−グリセロリン酸の定量化によって表され、これは、１３Ｃ標識バイカーボネート分子から炭素を固定することによりリブロース二リン酸から標識３−グリセロリン酸を産生するＲｕＢｉｓＣＯ複合体の能力を示す。
【０１１３】
＜３．４．ＲｕＢｉｓＣＯ活性は炭酸脱水酵素の存在によって増加する＞
炭酸脱水酵素は、溶媒和二酸化炭素へのバイカーボネートの相互変換を触媒することによって既知の反応補助因子である。この実施例では、そうした反応の予期される挙動を確認する。興味深いことに、インビトロにおける活性テストは、上述されたＲｕＢｉｓＣＯ活性テストの反応量に１０μｇ／ｍｌの最終濃度のウシ炭酸脱水酵素を添加することで、ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の能力を３〜４倍増加させることを示す（図１０）。複合体周囲のＣＯ２濃度の最適化により、再構成された活性の最小値を示す前述のテストで観察された活性が顕著に増加されることが提示される。その他の因子もインビボにおいて寄与し得り、故に測定値は単なる最小値である。
【０１１４】
［実施例４：エンジニアリングを含む株の表現型特性］
＜４．１．嫌気培養はエタノール産生の増加を示す＞
前培養を化学的合成培地において調製した。１ｍｌのストック管（−８０℃）を解凍後、これを用いて、（２０ｇ／ｌグルコースで補完された０．１ｇ／ｌギ酸を含有する）１０ｍｌの培地を含むペニシリンボトル（１００ｍｌ）に植え付けをおこない、１８時間３０℃で、１２０ｒｐｍにおいてインキュベートした。ＰＲＫ遺伝子の存在下で見受けられる毒性の問題を避けるため、前培養物を、嫌気状態において（事前に窒素を流したボトル）、ドキシサイクリン（２μ／ｍｌ）の存在下で調製した。
【０１１５】
そして、前培養物を生理食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／ｌ）で３回洗浄し（遠心分離、再懸濁、１５秒間の撹拌）、細胞のペレットをドキシサイクリン非含有培地に再懸濁した。
【０１１６】
前培養物に由来するこれらの細胞を、０．０５（又は０．１ｇ／ｌ）の初期光学密度を得るために植え付けた。開始培養量は、好気状態において５０ｍｌ（２５０ｍｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）又は嫌気状態において３５ｍｌ（１００ｍｌペニシリンボトル）であった。
【０１１７】
すべてのグルコースが消費されるか又はエタノール産生が停止した後、培養を停止した。
【０１１８】
嫌気培養は、酵母におけるその影響を評価するために、完全カーボイーストエンジニアリング又は単離要素を含む株を表現型的に特徴づけることを可能にした。
【０１１９】
図１１と表１１とは、グルコース上の嫌気培養時に、完全カーボイーストエンジニアリング（ＲｕＢｉｓＣＯ＿ＰＲＫ＿シャペロン）又は（ＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ＋ＰＲＫ＋ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）が、カルビン回路を組み込まない同一株（ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）と比較して、エタノール産生の向上をもたらしたことを示す。バイオマス産生量の損失に対し（０．０３５対０．０５１ｇ／ｇ）、消費グルコースから産生されたエタノールの産生量は７％増加し（０．４９ｇ／ｇ対０．４６ｇ／ｇ）、エタノール産生に対する炭素の明らかな再分配を示す。
【０１２０】
表１１は、嫌気培養時のエタノールとバイオマスとの産生量（ＰＲＫはホスホリブロキナーゼである）。
【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
＜４．２．インビボにおけるＲｕＢｉｓＣＯ複合体機能の研究＞
実験プロトコル
前培養を化学的合成培地において調製した。１ｍｌのストック管（−８０℃）を解凍後、これを用いて、（２０ｇ／ｌグルコースで補完された０．１ｇ／ｌギ酸を含有する）１０ｍｌの培地を含むペニシリンボトル（１００ｍｌ）に植え付けをおこない、３０℃で１８時間、１２０ｒｐｍにおいてインキュベートした。ＰＲＫ遺伝子の存在下で見受けられる毒性の問題を避けるため、前培養物を、嫌気状態において（事前に窒素を流したボトル）、ドキシサイクリン（２μ／ｍｌ）の存在下で調製した。
【０１２３】
そして、前培養物を生理食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／ｌ）で３回洗浄し（遠心分離、再懸濁、１５秒間の撹拌）、細胞のペレットをドキシサイクリン非含有培地に再懸濁した。
【０１２４】
前培養物に由来するこれらの細胞を、０．５ｇ／ｌギ酸と０．５ｇ／ｌグルコースとを含有する培地に植え付けた。開始培養量は２５ｍｌであった（２５０ｍｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）。
【０１２５】
非標識グルコースで補完又は非補完の１３Ｃ標識又は非標識ホルマートにおいて、種々の酵母株を成長させる。ホルマートからの炭素同位体の取込みを示すため、安定的な細胞代謝物の同位体成分、エルゴステロールを解析する。細胞培養物を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ペレットを７ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）再懸濁し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を２ｍｌのＴＥで補完し、１００００ｒｐｍで５分間の遠心分離後にクロロホルム相を収集し、窒素流のもとで蒸発させた。残渣を５００μｌのメタノールに再懸濁する。試料を、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ８７‐Ｈ＋（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）カラムを備えたクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０）において高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により解析する。
【０１２６】
結果
酵母において細胞の外部から内部へのＣＯ２輸送は自然なプロセスではなく、Ｓ．エロンガタスにおける特殊化されたアクアポリンなどのトランスポータの同時発現によりこれをおこなうことが可能な補足的エンジニアリングが待たれることから、酵母デヒドロゲナーゼによって二酸化炭素へと酸化可能であるギ酸が、細胞内二酸化炭素源として用いられた。この二酸化炭素は、ＲｕＢｉｓＣＯ複合体を介して有機材料に再取込みされる可能性がある。つまり、１３Ｃ標識ホルマートの存在下において、バイオマスに同位体を取込むことが期待される。しかし、酵母に他の自然なアナプレロティック反応（ＣＯ２を固定可能）があることから、これらの条件下において、ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の非存在下においてすら１３Ｃ取込みから顕著なバックグラウンドノイズ（標識の３〜４％）が観察され、観察される同位体取込みにおけるＲｕＢｉｓＣＯの寄与がはっきりと分からない理由が説明される。代謝経路の解析は、この第１の実験に使用された条件がインビボにおけるＲｕＢｉｓＣＯ活性の同位体測定に実際には適さないことを示す。しかしながら、炭素源としてホルマートではなくグルコースを用いて培地に添加されるときに標識バイカーボネートのインビボにおける取込みがなかったことは、実際にはＣＯ２（又はバイカーボネート／カーボネート）輸送の問題を理由とするものであり、代謝の問題のためではないということが、この実験により確認できたということが言及される必要がある。
【０１２７】
故に、ギ酸消費の動態や、エンジニアリングあり又はなしの株の生存性維持などのコンセプトを示す他の証拠が言及される。唯一の炭素源としてギ酸を使用することについて、少なくともホルマートデヒドロゲナーゼの補足的エンジニアリングのない場合においては、エネルギー源が不十分であるため株は成長できないということに触れておく必要がある。生存性の維持のみがこれらの条件において観察可能である。しかしながら、このエネルギーバランスは少量のグルコースを添加することで改善可能である。
【０１２８】
炭素源としてのホルマートの使用
ギ酸における成長を評価するため、ギ酸（０．４５ｇ／ｌ）とグルコース（０．５５ｇ／ｌ）とにおける好気培養を用いて、完全カーボイーストエンジニアリング又は単離要素を含む株を表現型的に特性化した。ギ酸は酵母においてＣＯ２に代謝されることができ、ホルマートデヒドロゲナーゼによってパワーが減少（Ｈ２）するが、酵母は唯一の炭素源としてのギ酸において成長することができない。
【０１２９】
図１２は、好気培養時に、ＲｕＢｉｓＣＯの基質を産生できないＰＲＫ（ＣＥＮ．ＰＫ２：ＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ＋ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）を欠失した同一株と比較して、完全カーボイーストエンジニアリング（ＣＥＮ．ＰＫ３：ＲｂｃＳ＋ＲｂｃＬ＋ＰＲＫ＋ＲｂｃＸ＋（ＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ）大腸菌）が、ギ酸の完全消費を導いたということを示す。同時に、バイオマス産生の向上が観察されるが、グルコース消費は同様なままである。このように、完全エンジニアリングを有する株はギ酸を形質転換するより優れた能力を有する。
【０１３０】
＜４．３．酵母におけるＲｕＢｉｓＣＯ依存カルビン回路の導入は中心代謝における生合成経路の均衡をインビボにおいて変える＞
この研究の課題は、ＲｕＢｉｓＣＯ（及びシャペロン）とホスホリブロキナーゼとの機能的同時発現による、酵母におけるカルビン回路の導入が、インビボにおけるエンジニアリングの機能性と合致する方向に内部代謝プロファイルを大きく改変するということを示すことである。この代謝プロファイルは、完全又は部分のみのエンジニアリングを保持する株の培養と、ＨＰＬＣ（逆相イオン対クロマトグラフィ）に連結された質量分析によるリン酸メタボロームの比較分析との後に評価された。
【０１３１】
テスト株は、完全エンジニアリング含有株（ＣＥＮ．ＰＫ３）とそのＰＲＫ欠失株（ＣＥＮ．ＰＫ２）である。用いられるプラスミドの選択マーカに適した（ロイシン、ウラシル、及びトリプトファン非含有培地）市販のＣＳＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を含んで６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、寒天用２０ｇ／ｌ寒天で補完されたＹＮＢ（窒素源非含有酵母）培地において、細胞を、振動させながら周囲空気下３０℃で成長させる。対数期終了の一世代前に４℃で冷却することで、培養を停止する。５ｍｌの８０％（ｖ／ｖ）メタノール／水＋１０ｍＭのＡｃＮＨ４でクエンチした、１ｍｌの対数増殖期細胞由来のタンパク質抽出物において、解析をおこなう。遠心分離後、ペレットを−８０℃で保管する。１３Ｃで標識した純代謝物標準物質の混合物１５０μｌが直ちに添加された、５ｍｌの７５％（ｖ／ｖ）エタノール／水、１０ｍＭＡｃＮＨ４にペレットを懸濁することによって抽出をおこなう（ＩＤＭＳ法）。８０℃で５分のインキュベーションと液体窒素浴における急冷後に、遠心分離を用いて破片を取り除く。
【０１３２】
絶対的定量化のためＩＤＭＳ法を用いる。この解析において、リブロース−１，５−ビスリン酸の絶対的定量化は、適切な標準物質が利用不可のため得られなかったが、酵母におけるこの化合物の濃度を推測する（おそらくは低く推測する）ことが可能な非同位体の外部キャリブレーションによって置き換えられた。
【０１３３】
図１３に示される結果は、カルビン回路の再構築が考えられる細胞内合成経路の再均衡化を示唆し、これは図１４の代謝シミュレーションにより示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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