(57)【要約】本発明は、免疫治療のための（キメラ抗原受容体T細胞のような）操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法に関する。本発明は、治療的または予防的な処置において使用するための、好ましくは、調節可能/調整可能なキメラ抗原受容体を含む、本発明の方法によって入手された細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法であって、
（a）外部リガンドによってインビボおよび/またはインビトロで活性化され得かつ第1の結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
（b）1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの第2の結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をさらにトランスフェクトする工程
を含み、それによって該免疫細胞が、該CARおよび該阻害性膜タンパク質（IMP）複合体を共発現し、かつ
（c）該CARによってシグナルが伝達されるよう、操作された免疫細胞を外部リガンドと接触させる工程
を含み、次いで、
（d）該IMPの結合ドメインおよび該CAR分子の結合ドメインに結合して該IMPおよび該CARを共局在させる可溶性化合物を添加することによって、該CARのシグナル伝達のレベルを低下させる工程
を含み、それによって、操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する、方法。
【請求項２】
CARの伝達のシグナルが免疫細胞の活性化であり、免疫細胞が活性化される、請求項1記載の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項３】
IMPおよびCARの共局在がCARシグナル伝達のスイッチをオフにする効果を有する、請求項1または請求項2記載の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項４】
IMP複合体が、可溶性化合物が結合する結合ドメインを各々含む少なくとも2つの膜貫通ポリペプチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項５】
第1および第2の結合ドメインがCID結合ドメインである、請求項1〜4のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項６】
活性化レベルの低下の工程（d）が、阻害性膜タンパク質（IMP）複合体の2つの異なるポリペプチド上に保持された2つの阻害性シグナリングドメインIL10RAおよびIL10Bの共局在によって実施される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
活性化レベルの低下の工程（d）が、可溶性化合物を通したIMP構造およびCAR構造の共局在によって実施される、請求項1〜5のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項８】
同一の可溶性化合物がCARおよびIMPに共に結合し得るよう、CARが第2の結合ドメインを含む、請求項1〜5または7のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項９】
工程（b）の後、免疫細胞を患者へ注入する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１０】
免疫細胞がT細胞である、請求項1〜9のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１１】
CARが単鎖CARである、請求項1〜10のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１２】
CARが多鎖CARである、請求項1〜10のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１３】
結合ドメインが細胞外にある、請求項1〜12のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１４】
両方の結合ドメインが細胞内にある、請求項1〜12のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１５】
阻害性シグナリングドメインがPD1に由来する、請求項1〜5または7〜14のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１６】
可溶性化合物が低分子である、請求項1〜15のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１７】
可溶性化合物がラパログである、請求項16記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１８】
低分子がラパマイシンである、請求項17記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項１９】
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項２０】
可溶性化合物が二重特異性抗体である、請求項1〜19のいずれか一項記載の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
【請求項２１】
（a）キメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
（b）阻害性ドメインを転位させる可溶性化合物と接触させられる1つの阻害性シグナリングドメインおよび1つの結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、
（c）第1および第2のポリペプチドが膜において共発現されている免疫細胞を選択する工程
を含む、CARによる活性化のレベルが阻害性膜タンパク質（IMP）複合体によって制御される操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項２２】
トランスフェクションがレトロウイルスベクターの使用によって実施される、請求項21記載の操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項２３】
トランスフェクションが多シストロン性のCAR/IMPをコードするmRNAの使用によって実施される、請求項21記載の操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項２４】
T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子の不活化によって同種免疫細胞を作製する工程をさらに含む、請求項21〜23のいずれか一項記載の操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項２５】
同種免疫細胞作製の工程がTALEヌクレアーゼの使用によって実施される、請求項24記載の操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項２６】
少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチドを含む阻害性二重CAR/IMP複合体であって、
第1の膜貫通キメラポリペプチドが、1つの二量体形成結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードし、
第2の膜貫通キメラポリペプチドが、1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの二量体形成結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする、
阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２７】
両方の二量体形成結合ドメインが細胞外に位置する、請求項26記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２８】
CARが多鎖CARである、請求項26または請求項27のいずれか一項記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２９】
CARが単鎖CARである、請求項26または請求項27記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項３０】
阻害性ドメインがPD-1である、請求項26〜29のいずれか一項記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項３１】
二量体形成ドメインがFKBPまたはFRBである、請求項26〜30のいずれか一項記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項３２】
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、請求項31記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項３３】
阻害性ドメインおよび結合ドメインを各々少なくとも含む少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチドを含む阻害性膜タンパク質（IMP）複合体であって、それぞれの阻害性ドメインが可溶性化合物の添加によって共局在するよう、両方の結合ドメインが可溶性化合物と相互作用する、阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
【請求項３４】
阻害性ドメインが、IL10Rα/IL10Rβ、TGFβ、VEGF、TNFR、またはDR3である、請求項33記載の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
【請求項３５】
二量体形成ドメインがFKBPまたはFRBである、請求項33または34記載の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
【請求項３６】
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、請求項35記載の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
【請求項３７】
請求項33〜36のいずれか一項記載の阻害性膜複合体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項33〜37のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、レトロウイルスベクター。
【請求項３９】
請求項33〜36記載の阻害性膜複合体を含むか、または請求項37記載のポリヌクレオチドもしくは請求項38記載のレトロウイルスベクターによってトランスフェクトされた、操作された免疫細胞。
【請求項４０】
キメラ抗原受容体（CAR）をさらに発現する、請求項39記載の操作された免疫細胞。
【請求項４１】
CARおよび阻害性膜貫通ポリペプチドが結合ドメインを各々含み、両方の結合ドメインが同一の可溶性化合物と相互作用する、表面上に阻害性膜タンパク質（IMP）と共にCARを発現する操作された免疫細胞。
【請求項４２】
IMPキメラポリペプチドの阻害性ドメインが、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、LAIR1、SIGLEC10、2B4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3の中から選択される、請求項41記載の操作された免疫細胞。
【請求項４３】
両方の結合ドメインが細胞外にある、請求項41または請求項42記載の操作された免疫細胞。
【請求項４４】
両方の結合ドメインが細胞内にある、請求項41または請求項42記載の操作された免疫細胞。
【請求項４５】
キメラ抗原受容体（CAR）が多鎖CAR（mcCAR）である、請求項39〜44のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４６】
多鎖キメラ抗原受容体（mcCAR）が、α鎖（FCεRα）、β鎖（FCεRβ）、およびγ鎖（FCεRγ）を少なくとも含む、請求項45記載の操作された免疫細胞。
【請求項４７】
結合ドメインがα鎖（FCεRα）の一部である、請求項46記載の操作された免疫細胞。
【請求項４８】
多鎖に基づくキメラ抗原受容体（CAR）が、
（a）シグナル配列および抗原特異的ターゲティング領域、
（b）結合ドメイン、
（c）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（d）膜貫通ドメイン
を少なくとも含有しているα鎖（FCεRα）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）共刺激リガンド
を少なくとも含有しているβ鎖（FCεRβ）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）シグナル伝達ドメイン
を少なくともを含有しているγ鎖（FCεRγ）
を含む、請求項46または請求項47記載の操作された免疫細胞。
【請求項４９】
（a）請求項39〜48のいずれか一項記載の免疫細胞を準備する工程、
（b）免疫細胞を患者へ投与する工程、
（c）患者における免疫細胞の活性化を調節するため、二量体形成の化学的誘導剤（CID）を投与する工程
を含む、その必要のある患者を処置するための方法。
【請求項５０】
二量体形成の化学的誘導剤（CID）がラパマイシンである、請求項49記載の患者を処置するための方法。
【請求項５１】
免疫細胞がドナーから回収される、請求項50記載の患者を処置するための方法。
【請求項５２】
免疫細胞が患者自身から回収される、請求項48記載の患者を処置するための方法。
【請求項５３】
キメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド、および
請求項27〜32のいずれか一項記載の操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする第2のポリヌクレオチド
を含む、活性化のレベルが調節可能であるよう免疫細胞を操作するためのキットまたはベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
記載の分野
本発明は、CAR（キメラ抗原受容体）の伝達シグナルを調節する方法に関する。この伝達シグナルのレベルは、免疫治療において使用されるキメラ抗原受容体T細胞のような操作された免疫細胞の活性化のレベルを決定する。具体的には、本発明者らは、特に、化学誘導二量体形成（CID）を介して、阻害性シグナリングドメインおよび活性化シグナリングドメインの共局在を誘導する可溶性化合物の投与によって、細胞の調整可能な活性化を可能にする、分子スイッチ系および新たなCAR構成を開発した。従って、キメラ抗原受容体（CAR）によって誘発される操作された免疫細胞の活性化を、必要に応じて、阻害性シグナリングドメインを介してモニタリングするかまたは切り替えることが可能である。本発明は、調整可能でかつより安全な養子免疫治療の見込みへの道を開く。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで生成された自己抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al.2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010）。
【０００３】
CAR修飾T細胞の第一世代は、前臨床試験において成功を示し、第I相臨床試験に入った。臨床試験は、卵巣癌、神経芽細胞腫、ならびに様々な型の白血病およびリンパ腫において開始されている（https://clinicaltrials.gov/）。臨床試験は、抗腫瘍活性の証拠をほとんど示さず、活性化、持続性、および癌組織へのホーミングは不十分であった。共刺激の非存在下での一部の第一世代CARは、アネルギーおよびインビボ増大の失敗に至ることを、多様な研究が報告している。
【０００４】
これらの限界を克服するため、前臨床試験におけるCAR修飾T細胞の活性化シグナル、増殖、サイトカインの産生、およびエフェクター機能を増強するため、第2世代および第3世代のCAR修飾T細胞が設計された。CD28、OX40、および4-1BBのような1種以上の共刺激分子の細胞内ドメインがエンドドメイン（endodomain）内に組み込まれた第二世代CARが開発され、これらは抗原特異的なT細胞の活性化および増大を改善した。第三世代CARは、共刺激エンドドメインの組み合わせを含む。第2世代および第3世代のCAR修飾T細胞は、いずれも、現在臨床試験に入っている。4-1BB共刺激ドメインおよび活性化シグナリングドメインとしてのCD3ζと抗CD19結合ドメインが組み合わせられたCARを発現するT細胞を含む最初の臨床試験は、何人かの患者を完全寛解ヘと導き、それは処置の10ヶ月後に進行中であった。CAR修飾T細胞は、これらの患者において1000倍に増大し、癌組織に浸潤し癌組織を溶解することが見出された。興味深いことに、これらの細胞の一部は、予防的腫瘍再発のためのT細胞の記憶表現型を示した。これらのCAR修飾T細胞は有意な治療効果を生じたが、それらの活性は、CAR修飾T細胞の最初の注入の3週間後に重篤な腫瘍溶解に至った。
【０００５】
最近、第2世代および第3世代のCAR修飾T細胞を使用する際に特に用心する必要があることを強調する、有害イベントが報告された。シクロホスファミドによる化学療法の後に、抗原ERBB2（HER-2/neu）を認識するCAR修飾T細胞を注入した後、5日目に、1人の患者が死亡した（Morgan et al.2010）。毒性は、臨床的に有意な炎症誘発性サイトカインの放出、肺毒性、多臓器不全、および最終的な患者の死亡に至る。腫瘍関連抗原に対する抗体とは異なり、これらの細胞は短時間内には身体から排除されないため、CAR修飾T細胞を利用する時には注意の必要があることを、これおよびその他の有害イベントは強調している。
【０００６】
より安全なCARに基づく免疫治療を開発するため、多くの研究が進行中である。いくつかの研究が、T免疫治療の効力および安全性を改善することを目的とする多様な系を報告している。健常者におけるT細胞によって媒介される免疫は、免疫応答を微調整する共刺激シグナルと阻害性シグナルとのバランスによって制御される複数の連続的な工程を含む。（CTLA-4またはPD-1のような）免疫チェックポイントと呼ばれる阻害性シグナルは、自己寛容の維持のため、そして免疫によって媒介される付随的な組織傷害を制限するためにも、重大である（Dolan et al,2014）。
【０００７】
最近、オフターゲット細胞に遭遇した時にT細胞機能にブレーキをかけることを目的として有する阻害性キメラ抗原受容体（iCAR）が設計された。iCARは、T細胞阻害性シグナリングドメインに融合した抗原特異的単鎖可変断片（scFv）から作製されている。腫瘍関連抗原を発現する細胞は、オンターゲット細胞を死滅させるため、T細胞の活性化、細胞傷害、およびサイトカインシグナリングを誘導するが、正常組織抗原を発現する細胞は、それを誘導しない。研究（Federov et al.2013）において、CTLA-4またはPD-1に基づくiCARが、内在性T細胞受容体または活性化キメラ受容体を通して誘導されるサイトカイン分泌、細胞傷害、および増殖を選択的に制限することが示された。従って、iCARテクノロジーは、機能するために、2種の抗原：腫瘍関連抗原および正常組織抗原の予備選択に頼る。さらに、PD-1またはCTLA-4の阻害効果は、オフターゲット細胞に対してのみ働く。
【０００８】
CD20キメラ抗原受容体が誘導可能カスパーゼ9（iC9）自殺スイッチと組み合わせられた別の系が、Budde et al.(2013)に記載されている。出願US2014/0286987において、後者の遺伝子は、変異型FK506結合タンパク質（FKBP1）に結合することによって、プロドラッグAP1903（タクロリムス）の存在下で機能性になる。GD2を標的とする第3世代CAR T細胞が前記のカスパーゼテクノロジー（CaspaCID（商標））によって操作された臨床試験が、Bellicum社による後援を受けて進行中である。ウイルス形質導入がベクターから標的細胞へDNAを移し、ベクター由来DNAが、化学誘導二量体形成（CID）およびアクセサリータンパク質の発現を指図する。AP1903薬物の存在下では、CIDタンパク質の二量体形成が起こり、従って、シグナルカスケードがオンになるであろう。投与されたT細胞によって重篤な毒性が引き起こされた場合には、CaspaCID（商標）によって能力を与えられた細胞の急速な破壊および排除を誘発するため、AP1903が注入されるであろう。一つの重要な特徴は、この発現が細胞の細胞質に制限されるということである。さらに、Bellicumの系によると、薬物と接触したCaspaCID（商標）の発現は、T細胞の死に至るため、T細胞の活性を調節することは不可能である。多量体形成剤に基づく類似のアポトーシス誘導系は、出願WO2014/152177に記載されている。
【０００９】
可溶性化合物の添加によって、死滅させることなくキメラ抗原受容体（CAR）免疫細胞の活性化を阻害するかまたは調節することができ；可溶性化合物の効果が細胞内であってもよいしまたは細胞外であってもよいためフレキシブルであり、かつオン/オフターゲット細胞選択に依存しない、CARに基づく免疫治療テクノロジーが必要とされている。
【００１０】
本発明は、細胞傷害が起こった場合（即ち、必要時）に、特定の可溶性化合物の投与によって、活性化を特異的に阻害/調節することができる、そのような免疫治療をここで提供する。
【発明の概要】
【００１１】
一つの局面において、本発明は、可溶性化合物の投与によって、CAR-T細胞のようなキメラ抗原受容体が操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する方法を提供する。
【００１２】
好ましい局面において、（ラパログのような）低分子または二重特異性抗体であり得る可溶性化合物は、少なくとも1つの結合ドメインの共局在を誘発し、従って、阻害性シグナリングドメインの作用を介したCARが操作された免疫細胞の調節を増強する。
【００１３】
本発明の一つの局面によると、結合（または二量体形成）ドメインを含む阻害性膜タンパク質（IMP）は、免疫細胞においてCARと共発現される。CARおよびIMPは、いずれも、特に、CARに含まれる第2の結合ドメインを通して、可溶性化合物に対して反応性であるよう作製されており、それによって、IMPに保持された阻害性シグナリングドメインおよびCARに保持されたシグナル伝達ドメインの二量体形成またはリガンド認識による共局在を可能にし、CAR活性化を低下させる効果を有する。阻害性シグナリングドメインは、好ましくは、T細胞受容体（TCR）によって媒介されるIL-2産生の活性化およびT細胞増殖を減弱させるプログラム死（programmed death）1（PD-1）である。Sheppard et al.(2004)において、T細胞機能のPD-1による調節は、TCRによって媒介されるZAP70を通したリン酸化およびCD3ζとの会合の阻害を含むことが示されている。
【００１４】
本発明は、例えば、使用される可溶性化合物の型、結合（または二量体形成）ドメインが細胞外であるか細胞内であるかに依って、本発明の範囲内に含まれる数種のコンフォメーションを提供する（図1および2）。他方で、免疫細胞において発現されるキメラ抗原受容体（CAR）は、多鎖CARまたは単鎖CARのいずれかであり得る。本発明は、第2の結合ドメインまたは二量体形成ドメインのCARへの包含を必ずしも必要としない、選択されたCAR構成に非依存性のスイッチ系も提供する。この後者の局面によると、第1および第2の結合（または二量体形成）ドメインは、免疫細胞の表面に発現された少なくとも2つの異種阻害性膜タンパク質（IMP）の一部であり、CARによって誘導される活性化を阻害する（間接）分子スイッチとして作用する阻害性シグナリングドメインの二量体形成および活性化を可能にする。そのようなスイッチの例は、図3に示されるIL-10経路を含む。ラパマイシンのような二量体形成誘導剤が、2つの二量体形成ドメインの共局在を可能にする。二量体形成後、IL-10Rは、IFNγ、IL-2、IL-3、TNFα、およびGM-CSFのような炎症誘発性サイトカインの合成を阻害する。Finbloom et al.(1995)に記載されるように、この阻害は、STATタンパク質のチロシンリン酸化に至る、受容体関連ヤーヌスキナーゼ1（Jak1）およびチロシンキナーゼ2（Tyk2）キナーゼのようないくつかの中間体を含む反応のカスケードによって媒介されるようである。
【００１５】
また、本発明は、本発明の方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株、より具体的には、本明細書に記載されたタンパク質、ポリペプチド、対立遺伝子バリアント、改変遺伝子、欠失遺伝子、またはベクターを含むかまたは発現する単離された免疫細胞を包含する。本出願人らによって実施され、WO2013176915に記載された以前の開発によると、本発明の免疫細胞または細胞株は、例えば、T細胞受容体を破壊することによって、患者への同種移植のためにさらに操作され得る。
【００１６】
前記のことから、本発明のさらなる局面は、CAR誘導免疫細胞が患者において病理学的細胞を標的とするために有用であり、可溶性化合物を使用して免疫細胞増殖を制御下に維持する必要がある、癌のような状態を処置するかまたは防止する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】阻害性膜タンパク質（IMP）複合体および多鎖キメラ抗原受容体（CAR）の結合ドメインの両方が細胞外に局在する時の、阻害性シグナリングドメインとしてPD-1を使用した細胞外に基づく化学誘導二量体形成（CID）戦略の模式図。系は二つの部分からなり：第1の部分は、阻害性膜タンパク質（IMP）と呼ばれるポリペプチドを含み、第2の部分は、キメラ抗原受容体（CAR）に相当する。IMPは、化学誘導二量体形成（CID）剤に結合することができる二量体形成ドメインである細胞外モエティと、阻害性シグナリングドメイン（ここではPD1）を含有している細胞内モエティとを有する膜貫通タンパク質である。図中に表されたCARは、WO2014039523に記載されたFc受容体に由来する3本の鎖（α、β、およびγ）を有する多鎖CAR（ここではmcCAR）である。α鎖は、表面マーカーリガンドを認識するscFv結合ドメインを保持し、β鎖は、共刺激ドメイン（ここでは41-BB）を保持し、γ鎖は、細胞内伝達シグナリングドメイン（ここではCD3ζ）を保持する。図1Aは、γ鎖の細胞外部分に保持された二量体形成ドメインを示し；図1Bは、α鎖の細胞外部分に保持された二量体形成ドメインを示す。IMP分子およびmcCARを発現する免疫細胞がCID剤に接していない時、mcCARは、正常に機能することができる、即ち、scFv特異的モエティによって認識される標的細胞を破壊することができる。mcCARの作用が不適切であるかまたは過剰である場合には、後に説明される調節可能阻害スイッチを誘発するため、CID剤（ここではラパマイシン）が患者へ投与され得る。両方の配置（図1Aおよび図1B）において、ラパマイシンの存在は、2つの二量体形成ドメイン（一方はIMP分子上、他方はmcCARのα鎖上またはγ鎖上）の共局在を可能にする、即ち、これらの2つの二量体形成ドメインは相互に接近する。この作用によって、阻害性シグナリングドメインPD1は、mcCARの伝達シグナリングドメインCD3ζと共局在する。後者の脱リン酸は、CD3ζから始まる反応カスケードを増強し、最終的に、mcCARの阻害に至る。
【図２】阻害性膜タンパク質（IMP）複合体および多鎖キメラ抗原受容体（CAR）の結合ドメインの両方が細胞内に局在する時の、阻害性シグナリングドメインとしてPD-1を使用した細胞内に基づく化学誘導二量体形成（CID）戦略の模式図。系は、図1に提示される二つの部分から構成され、図2Aおよび図2Bは、二量体形成ドメインがそれぞれmcCARのα鎖およびγ鎖に保持されるケースに相当する。図1との違いは、IMPタンパク質およびmcCARの二量体形成ドメインが細胞内に位置する点である。機能する過程は、ラパマイシンが結合ドメインに結合することができるよう免疫細胞の膜を横切る必要があることを除き、図1のものと同一である。
【図３】阻害性膜タンパク質（IMP）P複合体の両方の結合ドメインが細胞外に局在する時の、阻害性シグナリングドメインとしてIL-10Rを使用した細胞外に基づく化学誘導二量体形成（CID）戦略の模式図。ここに提示された系は、二量体形成ドメインがIMP複合体上に保持されmcCAR上には保持されない点で、図1および2に提示されたものと異なる。それは、IMP複合体およびキメラ抗原受容体（ここではmcCAR）に基づく。IMP複合体は、2つの独立したタンパク質から構成され、各々の膜貫通が、二量体形成ドメインを細胞外に有し、IL-10R阻害性シグナリングドメインのモノマー（モノマーIL10RαおよびモノマーIL10Rβ）を細胞内に有する。mcCARは、図1および2に提示されたものと同一である。
【図４】IMP分子およびscCARの結合ドメインの両方が細胞外に局在する時の、IMP分子内の阻害性シグナリングドメインとしてのPD-1および単鎖CARを使用した、細胞外に基づく化学誘導二量体形成（CID）戦略の模式図。低分子の非存在下で、scCARは、腫瘍細胞表面抗原に遭遇した時、機能することができる。低分子の存在下では、CID結合ドメインの二量体形成が起こり、2つのポリペプチド鎖の「共局在」が可能になり、次いで、PD-1がscCARに対して阻害的な役割を果たすことができるようになる。後者は機能を停止する。
【図５】IMP分子およびscCARの結合ドメインの両方が細胞内に局在する時の、IMP分子内の阻害性シグナリングドメインとしてのPD-1および単鎖CARを使用した、細胞内に基づく化学誘導二量体形成（CID）戦略の模式図。これは、低分子が、2つの細胞内CID結合ドメインを二量体形成させることができるよう膜を通過しなければならないことを除き、図4に示された細胞外のものと同一の原理である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
必要である時、即ち、CARの効果が不適切であるかまたは過剰である場合に、ラパマイシンが患者に投与される。ラパマイシンは、IMP複合体上に保持された2つの二量体形成ドメインの二量体形成を可能にする。これは、IL-10Rの2つのモノマーの共局在を増強し、従って、インターフェロンIFNγおよびJAK-STATシグナリング経路を含む反応カスケードを介してCARに対する阻害活性を増強する。従って、機能性のIL-10R二量体は、キメラ抗原受容体（CAR）による免疫細胞の活性化を間接的にモニタリングするかまたは切り替えることができる。
【００１９】
以下の表は、IMP複合体およびキメラ抗原受容体（CAR）の構築において包含される全ての成分についての配列を示す。
【００２０】
（表１）図1に提示されたPD-1阻害性シグナリングドメインに基づく調節可能/調整可能な多鎖CARの例示的な配列。CIDタンパク質がγ鎖に位置する時の細胞外CID戦略。
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【００２１】
（表２）図1に提示されたPD-1阻害性シグナリングドメインに基づく調節可能/調整可能な多鎖CARの例示的な配列。CIDタンパク質がα鎖に位置する時の細胞外CID戦略。
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【００２２】
（表３）図1に提示されたPD-1阻害性シグナリングドメインに基づく調節可能/調整可能な多鎖CARの例示的な配列。CIDタンパク質がα鎖に位置する時の細胞内CID戦略。CIDタンパク質（二量体形成部分）およびPD1タンパク質の位置付けに依って数種のIMP分子が可能である。
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【００２３】
（表４）図3に提示されたIL-10R阻害性シグナリングドメインに基づく調節可能/調整可能な多鎖CARの例示的な配列
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【００２４】
発明の詳細な説明
養子T細胞治療における機能的応答を制御する能力は、重要な問題である。そのような治療戦略において、T細胞は、高度の腫瘍特異的な標的細胞認識を達成する表面に露出したキメラ抗原受容体（CAR）を発現させることによって操作される。しかしながら、可能性のある毒性効果を制御し最小化するため、調節可能なスイッチ系の設計が高度に望ましい。
【００２５】
本発明者らは、ラパログのような可溶性化合物の添加を通してキメラ抗原受容体（CAR）を不活化することができるキメラ多重タンパク質複合体の設計に基づく、そのような免疫細胞を操作する方法を開発した。
【００２６】
具体的には、本発明は、操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する方法を提供し、本方法は、
（a）外部リガンドによってインビボおよび/またはインビトロで活性化され得かつ第1の結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって免疫細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
（b）少なくとも1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの第2の結合ドメインを含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって免疫細胞をさらにトランスフェクトする工程
を含み、それによって免疫細胞が、CARおよび阻害性膜タンパク質（IMP）複合体を共発現し、かつ
（c）CARによってシグナルが伝達されるよう、操作された免疫細胞を外部リガンドと接触させる工程
を含み、次いで、
（d）IMPの結合ドメインおよびCAR分子の結合ドメインに結合してIMPおよびCARを共局在させる可溶性化合物を添加することによって、CARのシグナル伝達のレベルを低下させ、それによって、操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する工程
を含む。
【００２７】
活性化のレベルを「調節すること」とは、可溶性化合物の投与によってCARが操作された免疫細胞に対する阻害応答が入手され、好ましくは、先行技術からの他の系とは対照的に、それが破壊的な応答でないことを意味する。これは、CARによって誘導される活性化を患者の必要性に適合させるため、より重要なことには、有害イベントの重症例が患者において存在する時、特に有用である。
【００２８】
好ましい態様によると、CARの伝達のシグナルは免疫細胞の活性化であり、免疫細胞が活性化される。
【００２９】
別の好ましい態様によると、IMP分子およびCAR分子の共局在は、CARシグナル伝達のスイッチをオフにする効果を有する。
【００３０】
本発明の系の一つの興味深い特色は、タンパク質の共局在、即ち、非共有結合性の結合に基づくフレキシビリティである。従って、（ラパログのような）可溶性化合物の投与の中止の後、短時間で、可溶性化合物はもはや結合ドメインに結合せず、「スイッチオフ」は機能を停止し、CARが操作された免疫細胞が能力を回復することができるであろうと予想することができる。
【００３１】
好ましい態様によると、第1および第2の結合ドメインはCID結合ドメインである。
【００３２】
本発明において、CAR伝達シグナルの「微調整」を達成する可能性も企図され：患者へ投与されるCARが操作された免疫細胞の不適切な/過剰の活性の後の有害イベントの重症度に依って；可溶性の用量を補正することができる。
【００３３】
操作された免疫細胞においてCARによって伝達されるシグナルは、シグナルの性質に依って、操作された免疫細胞に対する活性化シグナルまたは不活化シグナルであり得る。これは、免疫細胞によって発現されるCARに含まれる伝達シグナリングドメイン（活性化シグナリングドメインであるか阻害性シグナリングドメインであるか）に依る。免疫細胞が、ITAM成分を含む活性化ドメインを一般的に含む「正のCAR」を発現し、腫瘍表面特異的抗原の認識によって細胞（即ち、その免疫機能）を活性化する効果を有する時、IMPは、細胞活性化に対するブレーキとして、さらには、「スイッチオフ」系として作用するであろう。反対に、伝達シグナルが、例えば、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ITIM）のような阻害性シグナリングドメインを含む「負のCAR」によって生成される場合、阻害は、部分的にまたは完全に解除され、「スイッチオン」系として作用するであろう。
【００３４】
阻害性膜タンパク質（IMP）複合体
別の局面によると、本発明は、少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチドを含む阻害性二重CAR/IMP複合体を開示し：
第1の膜貫通キメラポリペプチドは、1つの二量体形成結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードし；
第2の膜貫通キメラポリペプチドは、少なくとも1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの二量体形成結合ドメインを含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする。
【００３５】
好ましい態様によると、阻害性二重CAR/IMP複合体は、細胞外に位置する二量体形成結合ドメインを含む。
【００３６】
一態様によると、阻害性二重CAR/IMP複合体の一部であるCARは、多鎖CARである。
【００３７】
一態様によると、阻害性二重CAR/IMP複合体の一部であるCARは、単鎖CARである。
【００３８】
一つの態様において、操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体の一部である内部阻害性ドメインは、（「プログラム細胞死タンパク質1」またはCD279とも呼ばれる）PD-1タンパク質である。
【００３９】
好ましい態様によると、二量体形成結合ドメインはFKBPまたはFRBである。より好ましい態様によると、第1および第2の結合ドメインは、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15との少なくとも80％の同一性を有する。
【００４０】
本発明によると、阻害性膜（IMP）複合体は、少なくとも1つの膜貫通キメラタンパク質に相当し；後者は、少なくとも1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの結合ドメインを含有している。
【００４１】
一つの態様において、IMP複合体は、少なくとも1つの阻害性シグナリングドメインと、可溶性化合物の存在を通してキメラ抗原受容体（CAR）に保持された第2の結合ドメインに結合することができる第1の結合ドメインとを含む、1つの膜貫通キメラタンパク質を含む（図1および2）。
【００４２】
これらの阻害性シグナリングドメインは、「免疫チェックポイント」分子に属し、免疫応答を下方調節するかまたは阻害するために「ブレーキ」として効果的に役立つ。
【００４３】
これらの阻害性シグナリングドメインのうち、いくつかは、例えば、脱リン酸機序によって（可逆的な）翻訳後修飾によって相互作用することができるため「機能的」阻害剤であり得（即ち、PD-1の場合）、いくつかは、タンパク質を物理的に阻止することができる抗体（好ましくは、ヒト化イントラボディ（intrabodies））のような「構造的」阻害剤であり得る。
【００４４】
本発明によると、これらの阻害性シグナリングドメインは、免疫細胞活性化を阻害する能力を有することが記載されているタンパク質、プログラム死1（PDCD1またはCD279としても公知のPD-1、アクセッション番号：NM_005018）、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CD152としても公知のCTLA-4、GenBankアクセッション番号AF414120.1）、LAG3（CD223としても公知、アクセッション番号：NM_002286.5）、Tim3（HAVCR2としても公知、GenBankアクセッション番号：JX049979.1）、BTLA（CD272としても公知、アクセッション番号：NM_181780.3）、BY55（CD160としても公知、GenBankアクセッション番号：CR541888.1）、TIGIT（VSTM3としても公知、アクセッション番号：NM_173799）、LAIR1（CD305としても公知、GenBankアクセッション番号：CR542051.1（Meyaard,Adema et al.1997））、SIGLEC10（GeneBankアクセッション番号：AY358337.1）、2B4（CD244としても公知、アクセッション番号：NM_001166664.1）、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7（Nicoll,Ni et al.1999）、SIGLEC9（Zhang,Nicoll et al.2000；Ikehara,Ikehara et al.2004）、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF（Quigley,Pereyra et al.2010）、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3に由来し得るが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
具体的な好ましい阻害性シグナリングドメインは、PD-1に由来し、好ましくは、SEQ ID NO：23との少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４６】
（PD-1のような）これらの免疫チェックポイントの他に、免疫応答に対する他の阻害剤：例えば、いくつかのサイトカインが、本発明に包含される。
【００４７】
別の態様によると、本発明のIMP複合体は、可溶性化合物が結合することができる結合ドメインを各々含む、2つの膜貫通キメラタンパク質を含む（図3）。
【００４８】
一つの好ましい態様によると、阻害性シグナリングドメインは、インターロイキンIL10RαモノマーおよびIL10Rβモノマーであり、好ましくは、それぞれSEQ ID NO：59およびSEQ ID NO：60との少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
一般に、IL-10Rは、活性を有するために2つのサブユニット：IL-10Rα（Ref.Uniprot：Q13651；RefSeq：NP_001549）；およびIL-10Rβ（ヒト種について、Ref.Uniprot：Q08334、RefSeq：NM_000628）から構成される。Satoshi et al.1999によると、本発明のCARリンパ球Tのような免疫細胞に対するIL-10の阻害作用は、インターフェロンαによって誘導される遺伝子およびインターフェロンγによって誘導される遺伝子の両方の発現の阻害を介して入手される。
【００５０】
典型的には、本発明のIL10RA/IL10Bポリペプチドは、それぞれSEQ ID NO：59およびSEQ ID NO：60との少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む。
【００５１】
IL-10Rの阻害作用は、IL10RA/IL10Bポリペプチドの二量体形成の後に起こり、JAK-STATシグナリング経路を含む、インターフェロンIFNγ、IL-2、IL-3、またはTNFαのようなサイトカインの阻害に至る（Finbloom et al.1995）。従って、機能性のIL-10R二量体は、キメラ抗原受容体（CAR）による免疫細胞の活性化を間接的にモニタリングするかまたは切り替えることができる。
【００５２】
IL-10Rインターロイキンに加えて、スイッチの他の例も、免疫細胞に対する負の制御剤であって、かつ多量体である限り、図3に提示された系に従って使用され得る。それらの中には、TGFβ（トランスフォーミング増殖因子β）、VEGF（血管内皮増殖因子）、またはTNFR（腫瘍壊死因子受容体）もしくはDR3（デスレセプター3）のようなアポトーシスを誘導する多量体受容体が見出され得る。
【００５３】
以上のことを考慮すると、IL-10Rのような阻害性シグナリングドメインを含む本発明によるIMPの特殊性のうちの一つは、この阻害系が、作用を開始するために、CARに由来する成分を必要としないということである。従って、それは、「ユニバーサル」スイッチとして作用し、活性化されたCAR T細胞をダウンレギュレートするために、特異性および構成に関わらず任意のCARと組み合わせて使用され得る。従って、本発明は、CARによって標的とされる抗原が何であっても、上記のCARおよび分子スイッチの組み合わせ使用を企図する。
【００５４】
IMP複合体の膜貫通部分は、以下のセクション「キメラ抗原受容体」に提示されるキメラ抗原受容体（CAR）のために使用されるもののみならず、そのような多成分ポリペプチドの構築において適当であると当業者が考える他の多くの中からも選ばれる。
【００５５】
本発明によるIMP複合体の結合ドメインは、シグナリングドメインを介してCARの活性化に対する調節を媒介する可溶性化合物に結合することができるタンパク質である。好ましくは、本発明の系は、可溶性化合物の介入によって共局在するかまたは二量体形成する2つの結合ドメインから構成される。
【００５６】
本発明の結合ドメインは、好ましくは、二量体形成ドメインである。
【００５７】
一つまたは他の前記の態様によると、使用される阻害性シグナリングドメインの型および作用に依って、これらの2つの結合ドメインは2つの異なるIMPに保持されているか、または一方の結合ドメインは1つのIMPの一部であり、他方はCAR上にある。
【００５８】
好ましい態様によると、両方の結合ドメインが同一の可溶性化合物と相互作用する。
【００５９】
2つの結合ドメインの（「化学誘導二量体形成」またはCIDとも呼ばれる）「共局在」または「二量体形成」とは、2つのタンパク質が、ある種の低分子、酵素、またはその他の二量体形成剤の存在下で、接近して、非共有結合によって結合した高分子複合体を作製することを意味する。このCID系は、本発明の場合、シグナリング経路の操作を可能にする。
【００６０】
一つの態様によると、結合ドメインまたは二量体形成ドメインは細胞外にある。この配置は、二量体形成剤として作用する低分子が、免疫原性でなくかつ/または免疫細胞の膜を容易に超えることができない時、好都合/より好都合である。第1および第2の結合ドメインまたは二量体形成ドメインは、使用される阻害性シグナリングドメイン（例えば、IL10RであるかPD-1であるか）に依って、それぞれIMPタンパク質およびCAR構造に保持されていてもよいし（図1）、または両方がIMP複合体由来の2つの別々のポリペプチドに保持されていてもよい（図3）。IMP複合体が、CARによる活性化と無関係であると見なされる免疫細胞活性化に対する阻害的な機能を有する第2の状況とは対照的に、1つの結合ドメインがCAR構造に存在する第1の状況においては、阻害性シグナリングドメインの作用は、CARに対して直接であろう。
【００６１】
別の態様によると、結合ドメインまたは二量体形成ドメインは細胞内にある。このコンフォメーションは、一方の結合ドメインまたは二量体形成ドメインが（阻害性シグナリングドメインを有する）1つのIMPの一部であり、第2のものがCARの一部である時に当てはまる（図2）。例えば、免疫原性の可能性のある低分子が使用される時、この化学誘導二量体形成（CID）戦略が好ましいであろう。
【００６２】
結合/二量体形成ドメインのα鎖における局在は、構造またはコンフォメーションの理由のために有利であり得る。
【００６３】
さらに本発明の範囲内において、二量体形成ドメインが好ましい結合ドメインであり、従って、二量体形成剤の存在下に置かれた時、一方の結合ドメインが、他方のドメインに結合する。
【００６４】
企図され得る結合ドメインの中には、二量体形成剤FK1012によるFKBP/FKBP（Spencer et al,1993）；二量体形成剤FK506によるFKBP/CAN（Ho et al,1996）；二量体形成剤FKCsAによるFKBP/CyP-Fas（Belshaw et al,1996）；二量体形成剤ラパマイシンによるFKBP/FRB（Rivera et al,1996）；二量体形成剤クーママイシンによるGyrB/GyrB（Farrar et al,1996）；二量体形成剤ジベレリンによるGAI/GID1（Miyamoto et al,2012）のような多数の対を見出すことができる。最近の発表において、系は、高等植物のみならず哺乳動物細胞においても機能することが示された。
【００６５】
好ましい態様によると、結合ドメインはFKBP/FRBであり、かつ二量体形成剤はラパログであり、より好ましい態様によると、ラパログはラパマイシンである。
【００６６】
具体的な態様によると、結合ドメインFKBP/FRBは、それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15との少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６７】
一つの態様によると、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターに関する。
【００６８】
可溶性化合物
「可溶性化合物」とは、患者の血清に可溶性であるため、沈殿せず、患者の血液循環中に存在する様々な操作された免疫細胞に対して作用する化合物を意味する。本発明による可溶性化合物は、好ましくは、低分子であるが、二重特異性抗体であってもよい。「低分子」とは、本明細書において使用されるように、低分子量（＜2000ダルトン）の有機化合物である。本発明において適用可能な低分子の非限定的な例には、マクロライド系のラパマイシン、ならびにAP21967、デフォロリムス（AP23573）、エベロリムス（RAD001）、およびテムシロリムス（CCI-779）のような「ラパログ」としても公知のその類似体が含まれる。本発明において適用可能な低分子の他の非限定的な例には、タクロリムス（FK506）、FK1012のようなFK506誘導体、AP1903のようなFK506類似体が含まれる。本発明において適用可能な低分子のさらに他の非限定的な例には、クーママイシン、ジベレリン、HaXs、AP1510、AP20187、およびAP21967が含まれる。これらの「低分子」は、細胞膜を介して急速に拡散することができるため、細胞内の作用部位に到達し、特異的なタンパク質に結合することができ；タンパク質の機能の活性を修飾するエフェクターとして作用する。そのような化合物のライブラリーは、例えば、http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=Small+Molecule+Librariesに見出され得る。
【００６９】
好ましい低分子の中で、本発明に特に適しているものは、ラパログのような、二量体形成剤とも呼ばれる、結合ドメインを二量体形成させることができる薬剤である。
【００７０】
ラパログは、ラパマイシン（シロリムス）、CCI779（テムシロリムス）、およびRAD001（エベロリムス）を含むラパマイシン類似体に相当する。ラパマイシンは、イースター島の土壌中に発見された細菌ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によって産生される大環状抗生物質である。ラパマイシンは、強力な抗真菌剤として発見されたが、免疫抑制効果も示した。免疫抑制効果は、当初は望ましくないと見なされたが、後に、臨床的に有用な薬物としての開発に至った。本発明によって構想される「可溶性化合物」の中で、抗体、より具体的には、二重特異的抗体およびモノクローナル抗体の使用も企図され得る。低分子および二量体形成剤と同様に、二重特異性モノクローナル抗体は、それらのエピトープがIMP複合体および/またはCAR構造に保持された結合ドメインの両方に同時に結合することができるよう設計される。それらの結合は、一般に、IMP複合体の阻害性シグナリングドメインおよび/またはCARの共局在を可能にし、従って、CARに対する調節された作用を可能にする。
【００７１】
少数の例として、好ましい二重特異性モノクローナル抗体は、FRBタンパク質のエピトープおよびFKBPタンパク質のエピトープ；またはFKBPタンパク質の2つの異なるエピトープ；またはKBPタンパク質上のエピトープおよびCANタンパク質上のエピトープ；またはFKBPタンパク質上のエピトープおよびCyP-Fasタンパク質上のエピトープ；またはGyrBタンパク質の2つの異なるエピトープ；またはGAI上のエピトープおよびGID1タンパク質のエピトープに対するものであり得る。二重特異性モノクローナル抗体を入手する方法は、当技術分野において周知である（Springer T.A,1985）。
【００７２】
キメラ抗原受容体
本発明は、IMP/CAR系を通して活性化のレベルを調節することができる操作された免疫細胞を作製することを目的とする。この調節を可能にするため、本発明は、直接（図1〜2）または間接的に（図3）より迅速にIMP複合体と相互作用するキメラ抗原受容体（CAR）の作製のための具体的な設計を提供する。
【００７３】
一般に、CARは、別記されるように（WO2010025177A、WO2012079000A、WO2013126712A、EP2126054A）、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインと融合した細胞外単鎖抗体（scFv）（scFv:ζ）からなり、T細胞において発現された時、モノクローナル抗体の特異性に基づき抗原認識を向け直す能力を有する。本発明において使用され得るCARのいくつかの例は、CD123（Cellectisのクローン#43および#32716）、CS1、ならびにTPBG（5T4）に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5を含み得る。
【００７４】
AML細胞の免疫表現型決定における最近の進歩は、将来の治療のための標的として作用し得る数種のAML関連細胞表面抗原を明らかにした。インターロイキン3受容体α鎖（IL-3Rα；CD123−NCBIリファレンス：NP_001254642）は、正常な造血幹細胞と比較してAML腫瘍細胞において過剰発現されるため、可能性のある免疫治療の標的として同定された。さらに、CD123特異的な治療薬について2件の第I相試験が完了しており、いずれの薬物も良好な安全性プロファイルを示した（ClinicalTrials.gov ID：NCT00401739およびNCT00397579）。
【００７５】
結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、および胃腫瘍を含む固形腫瘍、ならびに小児急性リンパ芽球性白血病（ALL）のような非固形腫瘍のための免疫治療の一つの候補抗原は、TPBGまたは5T4としても公知の栄養膜糖タンパク質（UniProt：Q13641）である。5T4は、（それが最初に発見された）胎児栄養膜における発現のため、しばしば、癌胎児性抗原または栄養膜糖タンパク質（TPBG）と呼ばれる。5T4タンパク質は、7つのロイシンリッチ反復領域を含有しているNグリコシル化膜貫通72kDa糖タンパク質である（Hole et al,1988）。5T4抗原は、胃癌（Starzynska et al.1995）、卵巣癌（Wrigley et al.1995）を含む多数の癌において発現されることが見出された。5T4癌胎児性抗原は、小児プレB急性リンパ芽球性白血病の再発の高リスク時にも発現される（Castro et al.2012）。それは、正常組織においては極めて限定された発現を有するが、悪性腫瘍においては、発症の間中、広範囲に及ぶ（Carsberg et al.1995）。
【００７６】
CS1（Gene ref：CS1 UNQ576/PRO1138、Uniprot ref：Q9NQ25）は、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）のCD2サブセットに属する細胞表面糖タンパク質であり、多発性骨髄腫細胞によって高度に発現されており、正常細胞によっては最小にしか発現されていない（Chu et al.2013）。本発明による新しいキメラ抗原受容体構成は、標的細胞上に存在する成分に対する抗原認識ドメインとは異なり、IMPタンパク質に対して作用する同一の可溶性成分と反応性である付加的な結合ドメインを含む。
【００７７】
本発明による単鎖CARは、基本的には、従来の単鎖世代CARであり、可溶性分子との結合（または二量体形成）ドメインを補足的に含有している。
【００７８】
使用されるCID戦略に依って、結合（または二量体形成）ドメインは、細胞外に位置していてもよいしまたは細胞内に位置していてもよい。
【００７９】
第2世代CAR（共刺激分子の組み合わせなし）および第3世代CAR（共刺激分子の組み合わせ）の両方が、本発明の範囲において企図される。
【００８０】
結合（または二量体形成）ドメインが細胞外にある本発明の一つの配置において、本発明によるCARは、以下の成分のうちの1つまたは数個を含有していてよい：
（a）シグナル配列、および2つの抗原特異的ターゲティング領域のうちの1つ（scFVの重鎖または軽鎖のいずれか）；
（b）任意で、リンカー；
（c）結合（または二量体形成）ドメイン
（d）残りの抗原特異的ターゲティング領域（scFVの重鎖または軽鎖のいずれか）；
（e）任意で、ヒンジ（またはインタースペーサー）；
（f）膜貫通ドメイン；
（g）少なくとも1つの共刺激分子を含有している細胞内ドメイン。
【００８１】
前記の構造から、他の細胞外成分に対する結合（または二量体形成）ドメインの位置は変化してもよい。
【００８２】
本発明は、WO2014039523AまたはPCT/EP2014/059662において本出願人らによって以前に記載されたような多鎖CARも含むことができる。
【００８３】
多鎖キメラ抗原受容体（mcCAR）配置および単鎖キメラ抗原受容体（scCAR）配置の両方が、本発明の範囲に包含される。本発明による多鎖CAR構造は、可溶性化合物に対して感受性である結合（または二量体形成）ドメインの導入によって、以前の多鎖CARから改造され得る。
【００８４】
使用されるCID戦略に依って、結合ドメインは、図1〜2に示されるように、細胞外に位置していてもよいしまたは細胞内に位置していてもよい。
【００８５】
多鎖CARがWO2014039523Aに記載されたようなFc受容体に由来する状況において、結合（または二量体形成）ドメインは、α鎖（FCεRα）、β鎖（FCεRβ）、またはγ鎖（FCεRγ）のいずれかに位置付けられ得る。
【００８６】
具体的な態様によると、操作された免疫細胞は、二量体形成ドメインのうちの1つがα鎖の一部である多鎖に基づくキメラ抗原受容体（CAR）によってトランスフェクトされている。
【００８７】
そのようなmcCARは、以下の成分のうちの1つまたはサブセットを含んでいてよい：
−以下のものを含有しているα鎖（FCεRα）：
（a）シグナル配列および抗原特異的ターゲティング領域；
（b）結合（または二量体形成）ドメイン；
（c）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（d）膜貫通ドメイン；
−以下のものを含有しているβ鎖（FCεRβ）：
（a）シグナル配列；
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（c）膜貫通ドメイン；
（d）共刺激リガンド；
−以下のものを含有しているγ鎖（FCεRγ）：
（a）シグナル配列；
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（c）膜貫通ドメイン；
（d）シグナル伝達ドメイン。
【００８８】
別の具体的な態様によると、操作された免疫細胞は、二量体形成ドメインのうちの1つがγ鎖の一部である多鎖に基づくキメラ抗原受容体（mcCAR）によってトランスフェクトされており；そのようなmcCARは、以下の成分のうちの1つまたはサブセットを含んでいてよい：
−以下のものを含有しているα鎖（FCεRα）：
（a）シグナル配列および抗原特異的ターゲティング領域；
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（c）膜貫通ドメイン；
（d）任意で、1つ以上の細胞内ドメイン；
−以下のものを含有しているβ鎖（FCεRβ）：
（a）シグナル配列；
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（c）膜貫通ドメイン；
（d）共刺激リガンド；
−少なくとも以下のものを含有しているγ鎖（FCεRγ）：
（a）シグナル配列；
（b）結合（または二量体形成）ドメイン；
（c）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）；
（d）膜貫通ドメイン；
（e）シグナル伝達ドメイン。
【００８９】
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。
【００９０】
細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された特定の標的抗原に対して特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）である。非限定的な例として、ラクダもしくはサメの（VNAR）シングルドメイン抗体断片、または血管内皮増殖因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリン、もしくはIL-13ムテイン（mutein）のような受容体リガンド、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループ、またはCDRのような、scFv以外の特定の抗原に対して特異的な結合ドメインも、リンパ球の予め定義されたターゲティングのために使用され得る。
【００９１】
第1の膜貫通ポリペプチドは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含んでいてよい。本明細書において使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインについて、より多くのフレキシビリティおよび到達可能性を提供するために使用される。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含んでいてよい。ストーク領域は、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のストーク配列であってもよい。好ましい態様において、ストーク領域は、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）の一部である。
【００９２】
従って、免疫細胞における多鎖CARの発現は、それぞれの腫瘍関連表面抗原を保持する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を保持するウイルス感染細胞、または系統特異的もしくは組織特異的な表面抗原を保持する標的細胞を含むが、これらに限定されるわけではない定義された標的を選択的に排除する修飾された細胞をもたらす。
【００９３】
本発明による多鎖CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するため、数個の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてよい。細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれていてよく、任意で、リンカーによって分離されていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチドに置かれていてもよい。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARの集団に関する場合もある。
【００９４】
また、本発明には、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARの集団を細胞の表面に発現する操作された免疫細胞が包含され得る。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている操作された免疫細胞に関する場合もある。多鎖CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上の多鎖CARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。
【００９５】
本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的との結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも一つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の一部分をさす。多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協力して作用するFc受容体またはT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の二つの別個のクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するため抗原非依存的に作用するものを含む。一次細胞質シグナリング配列は、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知のシグナリングモチーフを含むことができる。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、多鎖CARのシグナリング伝達ドメインには、CD3ζシグナリングドメイン、またはFcεRIのβ鎖もしくはγ鎖の細胞質内ドメインが含まれ得る。
【００９６】
本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含んでいてよい。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００９７】
「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子にTCR/CD3複合体が結合することによって提供される一次シグナルに加えて、シグナルを提供し、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されるわけではないT細胞応答を媒介する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれる。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されるわけではないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体も包含される。
【００９８】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、以下に限定されるわけではないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族の結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。
【００９９】
シグナル伝達ドメインは、TNFR関連因子2（TRAF2）結合モチーフ、共刺激TNFRメンバーファミリーの細胞質内テールであり得る。共刺激TNFRファミリーメンバーの細胞質テールは、主要保存モチーフ（P/S/A)X(Q/E)E）またはマイナーモチーフ（PXQXXD）（Xは任意のアミノ酸である）からなるTRAF2結合モチーフを含有している。TRAFタンパク質は、受容体三量体形成に応答して多くのTNFRの細胞内テールにリクルートされる。
【０１００】
本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133）である共刺激シグナル分子の一部を含んでいてよい。
【０１０１】
適切な膜貫通ポリペプチドの特徴的な特色は、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指図するために共に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多鎖CARの異なる膜貫通ポリペプチドは、標的リガンドとの結合の後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導するために共に相互作用する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来してもよいしまたは合成起源に由来してもよい。膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、またはζのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を主に含んでいてもよい。
【０１０２】
多鎖CARは、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメインに交換されているFcεRIα鎖のようなFcεRI鎖に由来する膜貫通ポリペプチドを含み得る。
【０１０３】
多鎖CARは、FcεRI鎖が自然に共に二量体形成して二量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部およびFcεRIβ鎖の一部またはそれらのバリアントを含んでいてよい。多鎖キメラ抗原は、FcεRI鎖が自然に共に三量体形成して三量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部およびFcεRIγ鎖の一部またはそれらのバリアントを含んでいてもよい。別の代替物は、FcεRI鎖が自然に共に四量体形成して四量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部、FcεRIβ鎖の一部、およびFcεRIγ鎖の一部、またはそれらのバリアントを含んでいてよい多鎖キメラ抗原受容体である。
【０１０４】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明は、本発明による前記の調節可能/調整可能なIMP複合体およびCARポリペプチド構造をコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。本発明は、多鎖CARまたは単鎖CARに含まれ得る本明細書に開示された膜貫通ポリペプチドをコードするDNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、前記の多鎖/単鎖CARを構成する少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、前記の多鎖/単鎖CARを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）に含まれていてよい。
【０１０６】
一つの態様によると、操作された免疫を作製するための本発明の方法において実行されるトランスフェクションは、免疫細胞ゲノムへのCARおよび/またはIMPの安定的な組み込みのため、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して実施される。
【０１０７】
別の態様によると、トランスフェクションは、一過性発現のため、CAR/IMPをコードする多シストロン性mRNAの使用によって実施される。
【０１０８】
2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む1つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列が含まれていてもよい。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成することなく、1つのコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007)を参照すること）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳される、mRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上）の3ヌクレオチドを意味する。従って、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によってポリペプチドが分離されている時、mRNA内の単一の連続的なオープンリーディングフレームから2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のため、いくつかのベクターによって使用されることが公知である。
【０１０９】
FcεRのような膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるため、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列において提供される。分泌シグナル配列は、FcεRのものであってもよいし、または別の分泌タンパク質（例えば、t-PA）に由来するかもしくは新規合成されてもよい。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される、即ち、2つの配列は正確なリーディングフレーム内で接合され、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるために位置付けられる。分泌シグナル配列は、一般的に、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置付けられるが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置付けられてもよい（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照すること）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、FcεRIα鎖（NP_001992.1）の残基1〜25を含む。
【０１１０】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子の間には相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に希少なコドンを、交換されるコドンと同一のアミノ酸をコードする、そのような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することをさす。
【０１１１】
操作された免疫細胞
本発明は、少なくとも操作された（IMP）阻害性膜タンパク質を有するキメラ抗原受容体（CAR）である単離された免疫細胞にも関する。
【０１１２】
本発明に従って使用される免疫細胞は、例えば、T細胞、細胞傷害性T細胞、制御性T細胞、またはNK細胞であり得る。
【０１１３】
具体的な態様によると、免疫細胞はT細胞である。
【０１１４】
操作された免疫細胞は、IMP複合体トランスフェクションの工程の後、（表面抗原のような）外部リガンドとのインキュベーションの工程の前に、患者へ注入されてよい。
【０１１５】
ある種の態様によると、本発明は、同種となるようにも操作された調節可能/調整可能なCAR免疫細胞を提供する。この非自己特徴は、同種の治療用細胞が予め製造され、患者への即時投与のために利用可能であり得る、標準化された治療の開発のために特に有用である。
【０１１６】
そのような方法は、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子、具体的には、TCRα遺伝子、TCRβ遺伝子を不活化する工程を含む。
【０１１７】
例えば、TCR成分の不活化の工程は、本発明の調節可能/調整可能なCARが操作された免疫細胞の製造における任意の時点で実施され得る。しかしながら、細胞の成長/増大に対して過度に相互作用しないよう、トランスフェクション工程の前に実施することが望ましい。
【０１１８】
プリンヌクレオチド類似体（クロファラビン、フルダラビン等）のような化学療法薬に対して耐性にするため、免疫細胞（即ち、T細胞）をさらに操作する可能性も、本発明の範囲において包含される。
【０１１９】
これらの遺伝子不活化を実現するための本発明によって特に適当な一つの方式は、TALEヌクレアーゼのようなエキソヌクレアーゼの使用である。これは、別記されるようにして（WO2012138927および次のセクション「定義」において引用される先行技術）実施され得る。
【０１２０】
免疫細胞を操作する方法
本発明は、2種のトランスフェクション、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドの第1のトランスフェクション；および阻害性膜タンパク質（IMP）複合体を有する第2のポリヌクレオチドの第2のトランスフェクションの工程を含み、最後に、ポリヌクレオチドを共発現している免疫細胞を選択する工程を含む、調節可能/調整可能なCARが操作された免疫細胞を作製する方法にも関する。
【０１２１】
別の態様において、本発明は、CAR/IMPを構成する異なるポリペプチドを細胞へ導入する工程、および細胞を増大させる工程を含む、免疫治療のための操作された免疫細胞を作製する方法に関する。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、細胞において安定的に発現されることを考慮してレンチウイルスベクターに含まれる。そのようなレンチウイルスベクターは、GFPおよび/またはホタルルシフェラーゼのようなマーカー遺伝子を含んでいてよい。
【０１２２】
さらに別の態様において、操作された免疫細胞を作製する方法におけるトランスフェクション工程（a）は、組換え、好ましくは、相同組換えの過程を介した、CARおよびIMPのポリヌクレオチドの挿入によって実施される。この態様は、より特異的な組み込みおよびより少ない異所挿入という利点を有する。好ましい態様において、そのような部位特異的な挿入は、外来性の特異的エンドヌクレアーゼを発現させ、CAR/IMPペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド鋳型を添加することによって作製される。一例として、TCR（T細胞受容体）機能の低下または無効化を可能にし、免疫細胞、特に、T細胞のアロ反応性を低下させる効果を有する部位特異的挿入を、TCR遺伝子において実施することができる。後者の局面は、具体的には、免疫細胞が同種である免疫治療の状況においてGVHDのリスクを低下させるために求められる。
【０１２３】
特異的ヌクレアーゼは、一般的には、ゲノム内の所望の位置において二本鎖破損（DSB）を作出し、相同組換え（HR）および非相同末端結合（NHEJ）の天然の過程によって、誘導された破損を修復するために、細胞の内在性の機序を利用する。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、およびCRISPR/Cas系、CPF1系、またはArgonaute系のようなRNAまたはDNAによってガイドされるエンドヌクレアーゼのような操作されたヌクレアーゼが、本発明による遺伝子の挿入または不活化を実施するために特に適切である。
【０１２４】
多数の参照の中でも特に、TALEN系およびCas9系は、それぞれWO2013/176915およびWO2014/191128に記載されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、Kim,YG;Cha,J.;Chandrasegaran,S.(1996).「ハイブリッド制限酵素：Fok I切断ドメインとのジンクフィンガー融合物（Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to Fok I cleavage domain）」Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-60に最初に記載された。
【０１２５】
送達方法
前記の異なる方法は、IMP複合体、キメラ抗原受容体（CAR）のような関心対象のタンパク質を細胞において発現させる工程を含む。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として細胞において発現され得る。あるいは、細胞外でポリペプチドを作製し、次いで、細胞へ導入することもできる。細胞へポリヌクレオチド構築物を導入する方法は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的な形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性の形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入されてよい。例えば、一過性の形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれていてよい。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーを含んでいてよい。異なるトランスジーンが1つのベクターに含まれていてもよい。ベクターは、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成することなく、1つのコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007)を参照すること）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳される、mRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上）の3ヌクレオチドを意味する。従って、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によってポリペプチドが分離されている時、mRNA内の単一の連続的なオープンリーディングフレームから2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のため、いくつかのベクターによって使用されることが公知である。
【０１２６】
本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、電気穿孔によって細胞へ直接導入されるmRNAであり得る。本発明者らは、T細胞におけるmRNA電気穿孔のための最適条件を決定した。本発明者らは、細胞への材料の送達のために一時的に生細胞を透過性にすることをパルス電場の使用によって可能にするcytoPulseテクノロジーを使用した。PulseAgile（BTX Havard Apparatus,84 October Hill Road,Holliston,MA 01746,USA）電気穿孔波形の使用に基づくテクノロジーは、パルスの持続時間、強度、およびパルス間隔の正確な制御を与える（米国特許第6,010,613号および国際PCT出願WO2004083379）。これらのパラメータは、全て、最小の死亡率での高いトランスフェクション効率のための最適条件に到達するために修飾され得る。基本的には、最初の高電場パルスが孔形成を可能にし、その後のより低い電場パルスが、ポリヌクレオチドを細胞へ移動させることを可能にする。
【０１２７】
T細胞の活性化および増大
T細胞の遺伝子修飾の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開番号20060121005に記載されるような方法を使用して、一般に、T細胞を活性化し増大させることができる。T細胞はインビトロまたはインビボで増大させられ得る。一般に、本発明のT細胞は、T細胞の活性化シグナルを作出するため、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激する薬剤との接触によって増大させられる。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような細胞分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞の活性化シグナルを作出するために使用され得る。非限定的な例として、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロでT細胞集団を刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖の刺激のために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するため、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在してもよいし、または表面にカップリングされていてもよい。当業者が容易に理解することができるように、細胞に対する粒子の比率は、標的細胞に対する粒子のサイズに依り得る。
【０１２８】
T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、IL-21、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の成長のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存のために必要な因子を含有していてよい適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の成長のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチルシステインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセット、ならびに/もしくはT細胞の成長および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、オプティマイザーが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象へ注入されるべき細胞の培養物には含まれない。標的細胞は成長を支持するのに必要な条件；例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）の下で維持される。様々な刺激回に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。
【０１２９】
治療的適用
別の態様において、上記のようにして入手された単離された免疫細胞を、養子細胞免疫治療において使用することができる。
【０１３０】
別の態様によると、免疫細胞は患者自身から回収される。一つの態様によると、免疫細胞はドナーから回収される。
【０１３１】
別の態様によると、免疫細胞は、ドナー自身のみならず患者のパネルへも投与され得る細胞のバッチを調製するため、同種にされる。経済的に実際の利点を表すこの特色は、移植片拒絶のリスクを低下させるのに必須である。
【０１３２】
この目的を達成するため、T細胞のような免疫細胞は、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識を担うT細胞受容体（TCR）遺伝子のノックアウト（KO）を受ける。TCR遺伝子を不活化することによって、後者は、抗原性ペプチドおよびMHC（ペプチド/MHC）と会合することができず、従って、Tリンパ球の活性化は起こらない。
【０１３３】
一態様によると、ノックアウト（KO）によるTCR遺伝子の不活化は、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、TALEヌクレアーゼによって実施される。
【０１３４】
具体的には、本発明によるT細胞を、その必要のある患者において、癌、感染、または自己免疫疾患を処置するために使用することができる。
【０１３５】
別の局面において、本発明は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に頼る：
（a）上記の方法のいずれか一つによって入手可能な単離されたT細胞を準備する工程；
（b）細胞を患者へ投与する工程。
【０１３６】
本発明のT細胞は、頑強なインビボの増大を受けることができ、長時間にわたり存続することができる。
【０１３７】
処置は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。これは標準的なプロトコルの下で実施されてよく、必要とされる回数だけ繰り返されてよい。得られた修飾T細胞は、「既製の」治療用生成物としての利用可能性に依って、ある患者に投与されてもよいし、または1人もしくは数人の患者に投与されてもよい。
【０１３８】
開示された方法と共に使用され得る細胞は、上記セクションに記載されている。処置は、癌、ウイルス感染、および自己免疫障害を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌には、血管形成されていないか、または未だ実質的には血管形成されていない腫瘍も含まれるし、血管形成された腫瘍も含まれる。癌には、（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫のような）非固形腫瘍も含まれ得るし、または固形腫瘍も含まれ得る。本発明の薬物に対して耐性の同種T細胞によって処置される癌の型には、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されるわけではない。成人腫瘍/癌および小児腫瘍/癌も含まれる。本発明の一態様において、小児急性リンパ芽球性白血病（ALL）および筋萎縮症骨髄腫白血病（AML）疾患は、本発明による同種薬物耐性T細胞によって典型的に処置される。これは、薬物耐性KO TRAC CD19+CAR T細胞および薬物耐性KO TRAC CD123+T細胞をそれぞれ使用することによって達成され得る。「TRAC」とは「T細胞受容体α定常」をさし、TCRαサブユニット定常遺伝子に相当する。
【０１３９】
それは、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせられた処置であり得る。
【０１４０】
処置は、薬物耐性遺伝子の発現または薬物感作遺伝子の不活化のいずれかによって少なくとも1種の薬剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団のような免疫抑制処置を受けている患者へ投与され得る。この局面において、薬物処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するはずである。
【０１４１】
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、内服、輸液、植え込み、または移植を含む、任意の便利な様式で、実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、頭蓋内、静脈内注射、リンパ内注射、または腹腔内によって、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０１４２】
細胞または細胞の集団の投与は、体重1kg当たり103〜1010個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり105〜106個の細胞（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）の投与からなっていてよい。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が単回投与される。別の態様において、有効量の細胞がある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断内にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手されてよい。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適の範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、および望まれる効果の性質に依るであろう。
【０１４３】
有効量の細胞または薬学的組成物は、好ましくは、非経口投与され得る。投与は、静脈内投与であり得る。腫瘍内注射によって直接投与を行うこともできる。
【０１４４】
細胞は、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与され得る。本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびFK506のような免疫抑制剤、CAMPATH、抗CD3抗体、またはその他の抗体治療のような抗体またはその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al.,Cell 66:807-815,11；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Citrr.Opin.mm n.5:763-773,93）。本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外照射療法（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体を使用したT細胞除去治療と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与されてもよい。本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与されてもよい。例えば、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。移植の後、対象は、本発明の増大した免疫細胞の注入を受容することができる。増大した細胞は、手術の前に投与されてもよいしまたは後に投与されてもよい。
【０１４５】
薬学的組成物
本発明の単離されたT細胞は、単独で投与されてもよいし、または希釈剤および/もしくはその他の成分と組み合わせられた薬学的組成物として投与されてもよい。簡単に説明すると、本発明の薬学的組成物は、1種以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるT細胞を含んでいてよい。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のような緩衝液；グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでいてよい。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。本発明の薬学的組成物は、処置（または防止）すべき疾患にとって適切な様式で投与され得る。適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患の型および重症度のような因子によって決定されるであろう。
【０１４６】
キットおよびベクター
本発明は、以下のものを含む、調節可能な活性化のレベルを有するよう免疫細胞を操作するためのキットまたはベクターを包含する：
−キメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド；および
−前記の「阻害性膜複合体」のパラグラフに記載された操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする第2のポリヌクレオチド。
【０１４７】
定義
前記の説明において、多数の用語が広範囲に使用される。以下の定義は、本発明の態様の理解を容易にするために提供される。
【０１４８】
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードに従って本明細書において表記され、例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０１４９】
ヌクレオチドは以下のように表記され：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
【０１５０】
本明細書において使用されるように、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片のようなヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドをさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成されていてよい。核酸は一本鎖であってもよいしまたは二本鎖であってもよい。
【０１５１】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメント、小さいRNA等をコードする、染色体上に直鎖状に配置されたDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つ以上のコード配列（エクソン）、任意で、イントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー、および/またはサイレンサーをさらに含んでいてもよい。
【０１５２】
「ゲノム」とは、核ゲノム、葉緑体ゲノム、ミトコンドリアゲノムのような細胞内に含有されている全遺伝材料を意味する。
【０１５３】
「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチド配列における1つ以上のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を意味する。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造/安定性に影響を与える場合もある。
【０１５４】
「TALEヌクレアーゼ」とは、TALエフェクタータンパク質（TALE）に典型的に由来するDNA結合ドメインのエンドヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合に起因する操作されたタンパク質をさす。そのような触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体ヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載されたI-TevIの触媒ドメインと操作されたDNA結合ドメインとの融合物のような、特異的な認識および切断のために二量体形成を必要としないヌクレアーゼである。別の具体的な態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、FokIに融合したDNA結合ドメインを好ましくは含む、二量体TALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子修飾を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010）。そのような操作されたTALEヌクレアーゼは、商品名TALEN（商標）（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）の下で市販されている。
【０１５５】
「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破壊をさす。ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むが、これらに限定されるわけではない、多様な方法によって、切断を開始させることができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、二つの別個の一本鎖切断イベントの結果として起こり得る。二本鎖のDNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドの切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。
【０１５６】
「キメラ抗原受容体」（CAR）とは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含むキメラ受容体を意味する。
【０１５７】
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択されてよい。
【０１５８】
好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原に特異的なモノクローナル抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。好ましい態様において、scFVは、CD123抗体、5T4抗体、またはCS1抗体に由来する。
【０１５９】
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす細胞外リガンド結合ドメインの標的との結合の後の細胞内シグナリングを担う。CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合の後のシグナル伝達を開始するために協力して作用する、T細胞受容体および共受容体の細胞質配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の二つの別個のクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するものを含む。第一の細胞質シグナリング配列は、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含むことができる。具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンド等が含まれる。
【０１６０】
本発明によるCARは、細胞の表面膜において発現される。従って、CARは、膜貫通ドメインを含むことができる。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色は、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指図するために共に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含むことができる。「ストーク領域」という用語は、本明細書において使用されるように、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインのために、より多くのフレキシビリティおよび到達可能性を提供するために使用される。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のストーク配列であってもよい。
【０１６１】
癌細胞においては、抗原欠損エスケープバリアントを作出する標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異が、一般に観察される。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞をより特異的に標的とすることができるよう、CD19特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するため、別の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。CD19特異的CARの例は、ScFv FMC63（Kochenderfer JN,Wilson WH,Janik JE,et al. CD19を認識するよう遺伝学的に操作された自己T細胞によって処置された患者におけるB系統細胞の根絶およびリンパ腫の退縮（Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19）Blood 2010;116(20):4099-410）または（番号PCT/EP2014/059662の下で出願された出願に記載された）ScFv 4G7 CARである。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれていてよく、任意で、リンカーによって分離されていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれていてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関する。
【０１６２】
「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、または合成核酸からなっていてよい、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましいベクターは、連結された核酸の自律複製（エピソームベクター）および/または発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
【０１６３】
「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤/化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内コンパートメントへ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを意味する。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波コントラスト剤）、ナノ粒子、エマルション、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１６４】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae：The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
【０１６５】
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、一般的には、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドの産生細胞への一過性トランスフェクションの後に生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖の直鎖状ウイルスDNAであり、それが、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる。「組込み型レンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれることができるそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込み型レンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０１６６】
細胞とは、任意の真核生物の生細胞、インビトロ培養のためのこれらの生物に由来する初代細胞および細胞株を意味する。
【０１６７】
「初代細胞」とは、持続的な腫瘍形成性の細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、それらが由来する組織の主要な機能的成分および特徴をより代表している、生組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの成長のために確立された細胞を意味する。非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；Jurkat細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt4細胞からなる群より選択される。
【０１６８】
これらのポリペプチドが由来するゲノムデータから何らかの可変性が発生する可能性があるため、そして有意な活性の喪失なしにこれらのポリペプチドに存在するアミノ酸のいくつかが置換される可能性（機能性バリアント）も考慮に入れると、本発明は、本願において提供された配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、さらに好ましくは、少なくとも95％の同一性を共有する前記のポリペプチドのポリペプチドバリアントを包含する。
【０１６９】
従って、本発明は、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：60からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
【０１７０】
「同一性」とは、2つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化されていてよい各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同一の塩基によって占有される時、その分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸の配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有された位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能なFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび/またはプログラムを、2つの配列の間の同一性を計算するために使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載された具体的なポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有し、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。
【０１７１】
dcK遺伝子のエンドヌクレアーゼ不活化による、プリンヌクレオチド類似体（PNA）薬物、具体的には、クロファラビンおよびフルダラビンに対して耐性となるようT細胞を操作するための一般的な方法に加えて。
【０１７２】
一般的な方法
初代細胞
健常ボランティアドナー（Etablissement Francais du Sang）に由来するバフィーコートから、密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞を単離する。次いで、EasySepヒトT細胞濃縮キット（Stemcell Technologies）を使用してTリンパ球を精製し、20ng/ml IL-2（Myltenyi）および5％ヒトAB血清（Seralab）が補足されたX-Vivo 15培地（Lonza）においてDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies）によって活性化する。
【０１７３】
細胞株
多発性骨髄腫（MM）についてのKG1aまたはMOLM13のようなCD123陽性細胞株およびRPMI-8226のようなCD123陰性細胞株は、American Type Culture Collectionから入手される。典型的には、細胞は、10〜20％熱不活化FCS、2mmol/L L-グルタミン、および100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補足されたRPMI 1640において培養される。
【０１７４】
IMP/CARをコードするmRNAの合成
CAR構成の全ての個々の鎖を、mRNA合成の前に、T7プロモーターおよび終止コドン配列を導入するため、PCRによって増幅した。関心対象のタンパク質をコードするmRNAを、PCR産物からインビトロで転写し、製造業者の説明書に従って、mMessage mMachine T7 Ultraキット（Life technologies）を使用してポリアデニル化した。RNAをRNeasyカラム（Qiagen）によって精製し、cytoporation medium Tに溶出させ、Nanodrop ND-1000分光光度計を使用して、260nmで吸光度を測定することによって定量化した。RNAの品質を、変性ホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲルにおいて確認した。
【０１７５】
T細胞における一過性発現
CARおよび操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする第2のポリヌクレオチドから構成された本発明のスイッチ系を、多シストロン性mRNAの電気穿孔の後にヒトT細胞において発現させる。mMESSAGE mMACHINEキットおよび鋳型としての直鎖化されたプラスミドを使用して作製された、キャッピングされポリアデニル化された多シストロン性mRNAによって、T細胞を電気穿孔した。鋳型として使用されたプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの後に異なるCAR/IMPバリアントをコードする多シストロン性DNA配列を含有していた。
【０１７６】
多シストロン性mRNAのヒトT細胞への電気穿孔は、以下のプロトコルに従って、CytoLVT-S装置（Cellectis）を使用して進められる：抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよびIL2によって数日（3〜5）予備活性化された5×106個のT細胞を、cytoporation buffer Tに再懸濁させ、45μgのmRNAによって電気穿孔する。電気穿孔の24時間後、多鎖CARをコードする多シストロン性mRNAを使用して操作されたヒトT細胞を、固定可能な生存判定色素eFluor-780および特異的なPEコンジュゲートヤギ抗マウスIgG F(ab')2断片によって標識し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１７７】
多シストロン性mRNAを使用して操作された生T細胞は、表面上に多鎖CARを発現する。
【０１７８】
T細胞におけるレンチウイルス発現
CAR特異的IMP/CARのインビトロスクリーニング
CARをコードする多シストロン性遺伝子および操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする第2のポリヌクレオチドを、以前に報告されたように、レンチウイルスベクターを使用して、ヒトT細胞においてベクター化する。まず、形質導入されたT細胞において前記の2つのポリヌクレオチドによってコードされたペプチドの細胞表面発現プロファイルを、経時的に査定する。その目的のため、抗CD123 scFv/Fc融合タンパク質を使用することができる。典型的には、両方のペプチドが、形質導入の3日後に細胞表面に高度に発現され、2週間にわたり高度に発現され続けることが観察される。次いで、両方のペプチドの抗原依存性T細胞活性化を媒介する能力を評価する。この問題に取り組むため、CD123陽性細胞株（KG1またはMOLM13）およびCD123陰性細胞株（RPMI-8226）を使用して、活性アッセイを実施する。脱顆粒アッセイ、細胞傷害アッセイ、およびIFNγ分泌アッセイの結果によって示されるように、両方のペプチドが、CD123陽性細胞株の存在下では、T細胞を活性化することができ、CD123陰性細胞株の存在下では、活性化し得ないことが一般に観察される。
【実施例】
【０１７９】
実施例1.IMP（スイッチオフ受容体）および操作された多鎖CAR（mcCAR）の組み立て
［Engler C,Kandzia R,Marillonnet S;(2008)「高い処理能力を有する1容器1工程の正確なクローニング法（A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability）」PLoS One.3(11)のような］発表されたプロトコルに従って、Golden Gateアセンブリー戦略を使用して、構築物の組み立てを行う。従って、スイッチオフ受容体および操作されたCARを、分離されたシャトルクローニングプラスミドへクローニングする。組み立てられた構築物についての非網羅的な例は、以下の表5に与えられ；ここに提示された系は全て「スイッチオフ」である。
【０１８０】
IMP（スイッチオフ受容体）を組み立てるためのモジュールの配列は、SEQ ID NO：61〜64（細胞外CID結合ドメイン）または83〜98（細胞内CID結合ドメイン）、およびSEQ ID NO：65〜76（細胞外CID結合ドメイン）または99〜106（細胞内CID結合ドメイン）を有する操作されたmcCARから入手される。それらの配置は図2Aおよび2Bに示される。
【０１８１】
（表５）スイッチオフ受容体および操作されたCAR
2017531430.tif 000019
2017531430.tif 000020
2017531430.tif 000021
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【０１８２】
スイッチオフ受容体およびmcCARの付加的な適切な鎖（βおよびγまたはα）を含む操作されたCARを、レンチウイルス産生プラスミドにおいて、レポーターマーカー（例えば、蛍光タンパク質）または（RQR8のような）膜タンパク質が後続する2Aシス作用性加水分解酵素要素（GSG-P2AおよびGSG-T2Aリボソームスキップペプチド）のおそらく上流に、別々に、または2Aシス作用性加水分解酵素要素によって分離して共に、さらにサブクローニングする。PCR、酵素的制限消化、およびライゲーションのような標準的な分子生物学的技術を、全ての構築を作出するために適用する。
【０１８３】
実施例2.初代T細胞におけるスイッチオフ受容体および操作されたmcCARのレンチウイルス送達
ウイルスベクターは、標準的なプロトコルに従って、または外部契約者によって作製される。初代T細胞を、スイッチオフ受容体および操作されたmcCARのレンチウイルス粒子を使用して同時にまたは連続的に形質導入する。形質導入されたT細胞を、バルクFACSソーティングまたは磁気分離を使用して、操作されたmcCARおよびスイッチオフ受容体の陽性発現について精製する。次いで、バルク操作mcCAR/スイッチオフ受容体陽性集団全体を、低分子（ラパマイシン、ラパログ、または合成ラパログ）の非存在下で、操作されたCAR標的抗原を発現するモデル細胞株を使用して、操作されたmcCARによって駆動される活性化（脱顆粒/細胞傷害）、増殖、およびサイトカイン放出について査定する。次いで、系の阻害特性を査定するため、同一の実験を低分子の存在下で繰り返す。
【０１８４】
実施例3.スイッチオフ受容体および操作されたscCAR（単鎖CAR）の組み立て
IMP（スイッチオフ受容体）を組み立てるためのモジュールの配列は、前記の表5に示されたような、SEQ ID NO：61〜64（細胞外CID結合ドメイン）または83〜98（細胞内CID結合ドメイン）およびSEQ ID NO：77〜82（細胞外CID結合ドメイン）または107〜112（細胞内CID結合ドメイン）を有する操作されたscCARから入手される。それらの配置は、図4（細胞外CID結合ドメイン）および図5（細胞内CID結合ドメイン）に示される。
【０１８５】
発表されたプロトコルに従って、Golden Gateアセンブリー戦略を使用して、構築物の組み立てを行う。従って、スイッチオフ受容体および操作されたscCARを、分離されたシャトルクローニングプラスミドにクローニングする。スイッチオフ受容体および操作されたCARを、レンチウイルス産生プラスミドにおいて、レポーターマーカー（例えば、蛍光タンパク質）が後続する2Aシス作用性加水分解酵素要素のおそらく上流に、別々に、または2Aシス作用性加水分解酵素要素によって分離して、さらにサブクローニングする。PCR、酵素的制限消化、よびライゲーションのような標準的な分子生物学的技術が、全ての構築を作出するために適用される。
【０１８６】
実施例4.初代T細胞におけるスイッチオフ受容体および操作されたscCARのレンチウイルス送達
ウイルスベクターは、標準的なプロトコルに従って、または外部契約者によって作製された。初代T細胞を、スイッチオフ受容体および操作されたscCARのレンチウイルス粒子を使用して同時にまたは連続的に形質導入する。形質導入されたT細胞を、バルクFACSソーティングまたは磁気分離を使用して、操作されたscCARおよびスイッチオフ受容体の陽性発現について精製する。次いで、バルク操作scCAR/スイッチオフ受容体陽性集団全体を、低分子（ラパマイシン、ラパログ、または合成ラパログ）の非存在下で、操作されたCAR標的抗原を発現するモデル細胞株を使用して、操作されたscCARによって駆動される活性化（脱顆粒/細胞傷害）、増殖、およびサイトカイン放出について査定する。次いで、系の阻害特性を査定するため、同一の実験を低分子の存在下で繰り返す。
【０１８７】
参照
2017531430.tif 000033
2017531430.tif 000034
2017531430.tif 000035
【図１】
2017531430.tif 000036
【図２】
2017531430.tif 000037
【図３】
2017531430.tif 000038
【図４】
2017531430.tif 000039
【図５】
2017531430.tif 000040
【配列表】
2017531430000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月12日(2017.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法であって、
（a）外部リガンドによってインビボおよび/またはインビトロで活性化され得かつ第1の二量体形成ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程；ならびに
（b）免疫細胞がCARおよび阻害性膜タンパク質（IMP）複合体を共発現するように、1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの第2の二量体形成ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をさらにトランスフェクトする工程；
（c）CARによってシグナルが伝達されるように、操作された免疫細胞を外部リガンドと接触させる工程；ならびに、次いで、
（d）IMPとCARの非共有結合的に結合した高分子複合体を形成するために、IMPの二量体形成ドメインおよびCAR分子の二量体形成ドメインに結合する可溶性化合物を添加することによって、CARのシグナル伝達のレベルを低下させる工程
を含み、それによって、操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する、方法。
【請求項２】
CARの伝達のシグナルが免疫細胞の活性化であり、免疫細胞が活性化される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
IMPとCARの非共有結合的に結合した高分子複合体の形成が、CARシグナル伝達のスイッチをオフにする効果を有する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
第1および第2の二量体形成ドメインがCID二量体形成ドメインである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
免疫細胞がT細胞である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
CARが単鎖CARである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
CARが多鎖CARである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
二量体形成ドメインが細胞外にある、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
両方の二量体形成ドメインが細胞内にある、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
阻害性シグナリングドメインがPD1に由来する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
可溶性化合物がラパログである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
可溶性化合物がラパマイシンである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
第1および第2の二量体形成ドメインが、それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
可溶性化合物が二重特異性抗体である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
（a）第1の二量体形成ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程；
（b）阻害性ドメインを転位させる可溶性化合物と接触させられる1つの阻害性シグナリングドメインおよび1つの第2の二量体形成ドメインを少なくとも含む操作されたIMP複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程；ならびに
（c）第1および第2のポリペプチドが膜において共発現されている免疫細胞を選択する工程
を含み、
両方の二量体形成ドメインが、可溶性化合物の存在を介して互いに非共有結合的に結合可能である、CARによる活性化のレベルが阻害性膜タンパク質（IMP）複合体によって制御される、操作された免疫細胞を作製するための方法。
【請求項１６】
トランスフェクションがレトロウイルスベクターの使用によって実施される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
トランスフェクションが多シストロン性のCAR/IMPをコードするmRNAの使用によって実施される、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活化する工程をさらに含む、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活化する工程が、TALEヌクレアーゼの使用によって実施される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチド：
− 1つの二量体形成ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする、第1の膜貫通キメラポリペプチド；
− 1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの二量体形成ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする、第2の膜貫通キメラポリペプチド
を含む、阻害性二重CAR/IMP複合体であって、
両方の二量体形成ドメインが、可溶性化合物の存在を介して互いに非共有結合的に結合可能である、阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２１】
両方の二量体形成ドメインが細胞外に位置する、請求項20記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２２】
CARが多鎖CARである、請求項20または21記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２３】
CARが単鎖CARである、請求項20または21記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２４】
阻害性ドメインがPD-1である、請求項20〜23のいずれか一項記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２５】
二量体形成ドメインがFKBPまたはFRBである、請求項20〜24のいずれか一項記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２６】
第1および第2の二量体形成ドメインが、それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、請求項25記載の阻害性二重CAR/IMP複合体。
【請求項２７】
CARおよび阻害性膜貫通ポリペプチドが二量体形成ドメインを各々含み、両方の二量体形成ドメインが、阻害性膜タンパク質（IMP）とCARの非共有結合的に結合した高分子複合体を形成するために同一の可溶性化合物と相互作用する、表面上でIMPと共にCARを発現する、操作された免疫細胞。
【請求項２８】
IMPキメラポリペプチドの阻害性ドメインが、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、LAIR1、SIGLEC10、2B4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3の中から選択される、請求項27記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
両方の二量体形成ドメインが細胞外にある、請求項27または28記載の操作された免疫細胞。
【請求項３０】
両方の二量体形成ドメインが細胞内にある、請求項27または28記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
CARが多鎖CAR（mcCAR）である、請求項27〜30のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３２】
mcCARが、α鎖（FCεRα）、β鎖（FCεRβ）、およびγ鎖（FCεRγ）を少なくとも含む、請求項31記載の操作された免疫細胞。
【請求項３３】
二量体形成ドメインがα鎖（FCεRα）の一部である、請求項32記載の操作された免疫細胞。
【請求項３４】
mcCARが、
（a）シグナル配列および抗原特異的ターゲティング領域、
（b）二量体形成ドメイン、
（c）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（d）膜貫通ドメイン
を少なくとも含む、α鎖（FCεRα）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）共刺激リガンド
を少なくとも含む、β鎖（FCεRβ）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）シグナル伝達ドメイン
を少なくともを含む、γ鎖（FCεRγ）
を含む、請求項32または33記載の操作された免疫細胞。
【請求項３５】
免疫細胞がドナーから回収されたものである、請求項27〜34のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３６】
免疫細胞が患者自身から回収されたものである、請求項27〜34のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３７】
その必要のある患者を処置するための方法において使用するための、操作された免疫細胞であって、該方法が、
免疫細胞を患者へ投与する工程、
患者における免疫細胞の活性化を調節するために、二量体形成の化学的誘導剤（CID）を投与する工程
を含む、請求項27〜36のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３８】
二量体形成の化学的誘導剤（CID）がラパマイシンである、請求項37記載の使用のための操作された免疫細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
前記のことから、本発明のさらなる局面は、CAR誘導免疫細胞が患者において病理学的細胞を標的とするために有用であり、可溶性化合物を使用して免疫細胞増殖を制御下に維持する必要がある、癌のような状態を処置するかまたは防止する方法に関する。
[本発明1001]
操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法であって、
（a）外部リガンドによってインビボおよび/またはインビトロで活性化され得かつ第1の結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
（b）1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの第2の結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をさらにトランスフェクトする工程
を含み、それによって該免疫細胞が、該CARおよび該阻害性膜タンパク質（IMP）複合体を共発現し、かつ
（c）該CARによってシグナルが伝達されるよう、操作された免疫細胞を外部リガンドと接触させる工程
を含み、次いで、
（d）該IMPの結合ドメインおよび該CAR分子の結合ドメインに結合して該IMPおよび該CARを共局在させる可溶性化合物を添加することによって、該CARのシグナル伝達のレベルを低下させる工程
を含み、それによって、操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節する、方法。
[本発明1002]
CARの伝達のシグナルが免疫細胞の活性化であり、免疫細胞が活性化される、本発明1001の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1003]
IMPおよびCARの共局在がCARシグナル伝達のスイッチをオフにする効果を有する、本発明1001または本発明1002の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1004]
IMP複合体が、可溶性化合物が結合する結合ドメインを各々含む少なくとも2つの膜貫通ポリペプチドを含む、本発明1001〜1003のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1005]
第1および第2の結合ドメインがCID結合ドメインである、本発明1001〜1004のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1006]
活性化レベルの低下の工程（d）が、阻害性膜タンパク質（IMP）複合体の2つの異なるポリペプチド上に保持された2つの阻害性シグナリングドメインIL10RAおよびIL10Bの共局在によって実施される、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
活性化レベルの低下の工程（d）が、可溶性化合物を通したIMP構造およびCAR構造の共局在によって実施される、本発明1001〜1005のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1008]
同一の可溶性化合物がCARおよびIMPに共に結合し得るよう、CARが第2の結合ドメインを含む、本発明1001〜1005または1007のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1009]
工程（b）の後、免疫細胞を患者へ注入する工程をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1010]
免疫細胞がT細胞である、本発明1001〜1009のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1011]
CARが単鎖CARである、本発明1001〜1010のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1012]
CARが多鎖CARである、本発明1001〜1010のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1013]
結合ドメインが細胞外にある、本発明1001〜1012のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1014]
両方の結合ドメインが細胞内にある、本発明1001〜1012のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1015]
阻害性シグナリングドメインがPD1に由来する、本発明1001〜1005または1007〜1014のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1016]
可溶性化合物が低分子である、本発明1001〜1015のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1017]
可溶性化合物がラパログである、本発明1016の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1018]
低分子がラパマイシンである、本発明1017の操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1019]
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1018のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1020]
可溶性化合物が二重特異性抗体である、本発明1001〜1019のいずれかの操作された免疫細胞の活性化のレベルを調節するための方法。
[本発明1021]
（a）キメラ抗原受容体（CAR）をコードする少なくとも第1のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
（b）阻害性ドメインを転位させる可溶性化合物と接触させられる1つの阻害性シグナリングドメインおよび1つの結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする少なくとも第2のポリヌクレオチドによって、免疫細胞をトランスフェクトする工程、
（c）第1および第2のポリペプチドが膜において共発現されている免疫細胞を選択する工程
を含む、CARによる活性化のレベルが阻害性膜タンパク質（IMP）複合体によって制御される操作された免疫細胞を作製するための方法。
[本発明1022]
トランスフェクションがレトロウイルスベクターの使用によって実施される、本発明1021の操作された免疫細胞を作製するための方法。
[本発明1023]
トランスフェクションが多シストロン性のCAR/IMPをコードするmRNAの使用によって実施される、本発明1021の操作された免疫細胞を作製するための方法。
[本発明1024]
T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子の不活化によって同種免疫細胞を作製する工程をさらに含む、本発明1021〜1023のいずれかの操作された免疫細胞を作製するための方法。
[本発明1025]
同種免疫細胞作製の工程がTALEヌクレアーゼの使用によって実施される、本発明1024の操作された免疫細胞を作製するための方法。
[本発明1026]
少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチドを含む阻害性二重CAR/IMP複合体であって、
第1の膜貫通キメラポリペプチドが、1つの二量体形成結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードし、
第2の膜貫通キメラポリペプチドが、1つの細胞内阻害性シグナリングドメインおよび1つの二量体形成結合ドメインを少なくとも含む操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする、
阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1027]
両方の二量体形成結合ドメインが細胞外に位置する、本発明1026の阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1028]
CARが多鎖CARである、本発明1026または本発明1027のいずれかの阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1029]
CARが単鎖CARである、本発明1026または本発明1027の阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1030]
阻害性ドメインがPD-1である、本発明1026〜1029のいずれかの阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1031]
二量体形成ドメインがFKBPまたはFRBである、本発明1026〜1030のいずれかの阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1032]
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1031の阻害性二重CAR/IMP複合体。
[本発明1033]
阻害性ドメインおよび結合ドメインを各々少なくとも含む少なくとも2つの膜貫通キメラポリペプチドを含む阻害性膜タンパク質（IMP）複合体であって、それぞれの阻害性ドメインが可溶性化合物の添加によって共局在するよう、両方の結合ドメインが可溶性化合物と相互作用する、阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
[本発明1034]
阻害性ドメインが、IL10Rα/IL10Rβ、TGFβ、VEGF、TNFR、またはDR3である、本発明1033の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
[本発明1035]
二量体形成ドメインがFKBPまたはFRBである、本発明1033または1034の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
[本発明1036]
第1および第2の結合ドメインが、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1035の阻害性膜タンパク質（IMP）複合体。
[本発明1037]
本発明1033〜1036のいずれかの阻害性膜複合体をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1038]
本発明1033〜1037のいずれかのポリヌクレオチドを含む、レトロウイルスベクター。
[本発明1039]
本発明1033〜1036の阻害性膜複合体を含むか、または本発明1037のポリヌクレオチドもしくは本発明1038のレトロウイルスベクターによってトランスフェクトされた、操作された免疫細胞。
[本発明1040]
キメラ抗原受容体（CAR）をさらに発現する、本発明1039の操作された免疫細胞。
[本発明1041]
CARおよび阻害性膜貫通ポリペプチドが結合ドメインを各々含み、両方の結合ドメインが同一の可溶性化合物と相互作用する、表面上に阻害性膜タンパク質（IMP）と共にCARを発現する操作された免疫細胞。
[本発明1042]
IMPキメラポリペプチドの阻害性ドメインが、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、LAIR1、SIGLEC10、2B4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3の中から選択される、本発明1041の操作された免疫細胞。
[本発明1043]
両方の結合ドメインが細胞外にある、本発明1041または本発明1042の操作された免疫細胞。
[本発明1044]
両方の結合ドメインが細胞内にある、本発明1041または本発明1042の操作された免疫細胞。
[本発明1045]
キメラ抗原受容体（CAR）が多鎖CAR（mcCAR）である、本発明1039〜1044のいずれかの操作された免疫細胞。
[本発明1046]
多鎖キメラ抗原受容体（mcCAR）が、α鎖（FCεRα）、β鎖（FCεRβ）、およびγ鎖（FCεRγ）を少なくとも含む、本発明1045の操作された免疫細胞。
[本発明1047]
結合ドメインがα鎖（FCεRα）の一部である、本発明1046の操作された免疫細胞。
[本発明1048]
多鎖に基づくキメラ抗原受容体（CAR）が、
（a）シグナル配列および抗原特異的ターゲティング領域、
（b）結合ドメイン、
（c）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（d）膜貫通ドメイン
を少なくとも含有しているα鎖（FCεRα）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）共刺激リガンド
を少なくとも含有しているβ鎖（FCεRβ）；
（a）シグナル配列、
（b）細胞外スペーサードメイン（ヒンジ）、
（c）膜貫通ドメイン、
（d）シグナル伝達ドメイン
を少なくともを含有しているγ鎖（FCεRγ）
を含む、本発明1046または本発明1047の操作された免疫細胞。
[本発明1049]
（a）本発明1039〜1048のいずれかの免疫細胞を準備する工程、
（b）免疫細胞を患者へ投与する工程、
（c）患者における免疫細胞の活性化を調節するため、二量体形成の化学的誘導剤（CID）を投与する工程
を含む、その必要のある患者を処置するための方法。
[本発明1050]
二量体形成の化学的誘導剤（CID）がラパマイシンである、本発明1049の患者を処置するための方法。
[本発明1051]
免疫細胞がドナーから回収される、本発明1050の患者を処置するための方法。
[本発明1052]
免疫細胞が患者自身から回収される、本発明1048の患者を処置するための方法。
[本発明1053]
キメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド、および
本発明1027〜1032のいずれかの操作された阻害性膜タンパク質（IMP）複合体をコードする第2のポリヌクレオチド
を含む、活性化のレベルが調節可能であるよう免疫細胞を操作するためのキットまたはベクター。
【国際調査報告】
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