(57)【要約】  本発明は、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを、哺乳動物に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍又は癌に対する直接注射又は全身投与若しくは膀胱内投与により送達することを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌を処置するための方法であって、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍に対する直接注射又は対象に対する全身投与により、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを送達することを含む、前記方法。
【請求項２】
対象における膀胱癌を処置するための方法であって、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを送達することを含む、前記方法。
【請求項３】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAが、ピコルナウイルス科から成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAが、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合するピコルナウイルス科のウイルスから成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAが、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合するエンテロウイルス属から成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAが、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合するコクサッキーウイルスA群から成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAがコクサッキーウイルスA21である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
免疫賦活剤が、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合する薬剤から成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
免疫賦活剤が、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合するモノクローナル抗体から成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
直接注射又は全身投与若しくは膀胱内投与による腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの送達が、全身経路による免疫賦活剤の投与前である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１１】
直接注射又は全身投与若しくは膀胱内投与による腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの送達が、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の投与後である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
癌又は腫瘍が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ系の癌、白血病、脳の癌、肺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、腎臓の癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、膵臓癌、神経膠芽腫、及びメラノーマから成る群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１３】
癌又は腫瘍がメラノーマである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１４】
癌を有する対象を処置するための医薬を製造するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの使用であって、前記医薬は、全身経路により対象に送達される免疫賦活剤と併用して使用するためのものであり、前記医薬は、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与により送達するためのものである、前記使用。
【請求項１５】
膀胱癌を有する対象を処置するための医薬を製造するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの使用であって、前記医薬は、全身経路により対象に送達される免疫賦活剤と併用して使用するためのものであり、前記医薬は、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により送達するためのものである、前記使用。
【請求項１６】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAが、哺乳動物に対する全身経路による免疫賦活剤の投与前に、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により対象に投与するためのものである、請求項１４又は１５記載の使用。
【請求項１７】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを含む医薬が、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の投与後に、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により対象に投与するためのものである、請求項１４又は１５記載の使用。
【請求項１８】
癌を有する対象の処置において使用するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAであって、前記使用が免疫賦活剤との併用であり、前記使用において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍に対する直接注射又は対象に対する全身投与により前記対象に投与し、前記免疫賦活剤は全身経路により対象に投与する、前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA。
【請求項１９】
膀胱癌を有する対象の処置において使用するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAであって、前記使用は免疫賦活剤との併用であり、前記使用において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により前記対象に投与し、前記免疫賦活剤は全身経路により対象に投与する、前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA。
【請求項２０】
前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの投与が、免疫賦活剤の投与前である、請求項１８又は１９記載の使用のための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA。
【請求項２１】
前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの投与が、免疫賦活剤の投与後である、請求項１８又は１９記載の使用のための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA。
【請求項２２】
対象がヒトである、請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを、哺乳動物に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍又は癌に対する直接注射又は全身投与により送達することを含む方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、その全内容が参照によって本明細書に援用される、2014年2月27日付の、「癌を処置するための併用方法」と題されたオーストラリア仮特許出願第2014900647号の優先権の利益を請求する。
【背景技術】
【０００３】
メラノーマを処置するためのいくつかの新しい免疫治療上の取組みが、最近の臨床試験において有望な結果を示している。抗体ベースの治療法であるイピリムマブは、2011年3月に米国食品医薬品局(FDA)によって認可され、フェーズIII臨床試験において転移性メラノーマを有する患者における全生存の改善を実証した。イピリムマブ(商品名:Yervoy(登録商標)、Bristol-Myers Squibb)は、タンパク質細胞毒性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)(CD152)を標的とするモノクローナル抗体である。CTLA-4を介したシグナリングは、細胞毒性Tリンパ球(CTL)に対する阻害効果を有することが知られており、この阻害性のシグナルをイピリムマブでブロックすることにより、CTLは癌細胞の破壊を上首尾に標的化することができる。メラノーマ患者では、イピリムマブ単独での全生存は10.1か月であり、それに対して糖タンパク質100(gp100)ペプチドワクチンで処置した患者では6.4か月であった[Hodiら、2010年]。フェーズIII試験では、以前に処置した進行メラノーマ患者の応答率は、イピリムマブ処置単独後では11%、イピリムマブ及びカルバジン治療の処置を受けたことがなかった患者では15%であった[Hodiら、2010年; Robertら、2011年]。これら両方の試験において、死亡率の低下が34%(ワクチンと比較して)及び28%(ダカルバジン単独と比較して)であったことにより証明される通り、イピリムマブでの全生存の改善が明らかに示された。イピリムマブをダカルバジンと併用して使用した場合、最良全奏功期間の中央値は19.3か月であり、それに対してダカルバジン単独療法では8.1か月だった。
【０００４】
癌の免疫療法において標的とされる別の免疫チェックポイント分子は、活性化T細胞、B細胞、及び骨髄細胞の表面上に見出されるプログラム細胞死1(PD-1)(CD279)である[Keirら、2008年]。プログラム細胞死1リガンド1(PD-L1)(CD274)又はPDL-2(CD273)分子がPD-1受容体に結合すると、T細胞が阻害され、それにより潜在的な抗腫瘍応答が制限される。現在、抗腫瘍T細胞の免疫を刺激する手段としてPD-1及びPD-L1を標的とするようデザインされている、ある範囲の抗体、すなわちニボルマブ(BMS-936558、Bristol-Myers Squibb)及び抗PD-L1抗体BMS-936559がある[Brahmerら、2012年; Topalianら、2012年]。PD-1及びPD-L1に対するこれらの抗体は、CTLA-4と併用したある範囲の前臨床試験において、及びフェーズIIIヒト試験において用いられている[Curranら、2010年; Merelli、2014年; Ottら、2013年]。
【０００５】
コクサッキーウイルスA21(CVA21)は、ウイルス-細胞侵入受容体細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)を有する悪性細胞に優先的に感染し、破壊する能力を有する、天然に存在するピコルナウイルスである。以前、本発明者らは、免疫欠損マウスを用いたある範囲の前臨床異種移植片モデルにおいてメラノーマ細胞に対する、並びに乳癌、前立腺癌、直腸結腸癌、及び卵巣癌などの他の癌に対する[Shafrenら、2004年; Auら、2005年; Auら、2007年; WO2001/037866]、並びに血液の癌に対する[WO/2006/017914]CVA21の有効性を実証した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌を処置し、軽減し、又は防止するための新たな、改善された方法、及び腫瘍又は癌を有する対象における生存を改善する方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、CVA21の感染、及び引き続き起こる腫瘍細胞の溶解は、抗腫瘍免疫を刺激するメラノーマ抗原を含む細胞デブリの放出をもたらし、そのため個別化されたインサイチューの癌ワクチンとして作用することを提唱する。最初に、本発明者らは、CVA21に対して通常抵抗性であるB16細胞にヒトICAM-1をトランスフェクトしてB16細胞を感染に許容性にした、免疫適格性B16-ICAM-1メラノーマモデルを確立した。殆どの癌ワクチンは抗腫瘍免疫の誘導が一般的に不完全であるので[Blanchardら、2013; Garbeら、2011]、本発明者らは、CVA21ウイルス療法と併用の免疫賦活性抗PD-1抗体の使用、並びに別個に、CVA21ウイルス療法と併用の免疫賦活性抗CTLA-4抗体の使用、並びに抗PD-1抗体及び抗CTLA-4抗体の両方と併用のCVA21ウイルス療法の使用を別々に調べた。
【０００８】
本明細書において実証する通り、腫瘍崩壊性CVA21と併用の、マウス抗PD-1抗体及びマウス抗CTLA-4抗体の使用によって本明細書に例示される、免疫チェックポイント分子を標的とする免疫賦活剤の使用は、腫瘍負荷の減少、腫瘍の潰瘍化率、及びメラノーマのB16-ICAM-1マウスモデルにおける生存の延長において治療上有益である。
【０００９】
一態様において、本発明は、対象における癌を処置するための方法を提供し、この方法は、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍に対する直接注射又は対象に対する全身投与により、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを送達することを含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、対象における膀胱癌を処置するための方法を提供し、この方法は、対象に対する全身経路による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍に対する直接注射又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを送達することを含む。
【００１１】
一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、ピコルナウイルス科からなる群から選択される。一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合するピコルナウイルス科のウイルスからなる群から選択される。一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合する、エンテロウイルス属からなる群から選択される。一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍細胞表面上の細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は崩壊促進因子(DAF)に結合するコクサッキーウイルスA群からなる群から選択される。一実施形態において、エンテロウイルスはヒトエンテロウイルスCである。一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、コクサッキーウイルスA21である。
【００１２】
一実施形態において、免疫賦活剤は、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD134、CD134L、CD137、CD137L、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、B7RP1、ICOS、TIM3、GAL9、CD28、又はOX-40からなる群から選択される免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤である。一実施形態において、免疫賦活剤は、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合する薬剤からなる群から選択される。一実施形態において、免疫賦活剤は、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合するモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態において、この方法は、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを、免疫賦活剤の全身経路による投与前に、直接注射、又は全身投与若しくは膀胱内投与により送達することを含む。
【００１４】
一実施形態において、この方法は、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを、免疫賦活剤の全身経路による対象への投与後に、直接注射、又は全身投与若しくは膀胱内投与により送達することを含む。
【００１５】
一実施形態において、処置は、前記処置の非存在下の推定生存時間と比較して、対象に対する生存時間の延長をもたらす。一実施形態において、処置は、前記処置の非存在下の推定される腫瘍の成長と比較して、腫瘍の成長の遅延をもたらす。
【００１６】
一態様において、本発明は、癌を有する対象を処置するための医薬を製造するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの使用を提供し、前記医薬は、全身経路により対象に送達される免疫賦活剤と併用して使用するためのものであり、前記医薬は、腫瘍に対する直接注射又は対象に対する全身投与により送達するためのものである。
【００１７】
一態様において、本発明は、膀胱癌を有する対象を処置するための医薬を製造するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの使用を提供し、前記医薬は、全身経路により対象に送達される免疫賦活剤と併用して使用するためのものであり、前記医薬は、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により送達するためのものである。
【００１８】
前記使用の一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、哺乳動物に対する全身経路による免疫賦活剤の投与前に、直接注射、又は全身若しくは膀胱内投与により腫瘍に投与するためのものである。前記使用の一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを含む医薬は、哺乳動物に対する全身経路による免疫賦活剤の投与後に、直接注射、又は全身若しくは膀胱内投与により腫瘍に投与するためのものである。
【００１９】
一態様において、本発明は、癌を有する対象の処置において使用するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを提供し、前記使用は免疫賦活剤との併用であり、前記使用において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与により前記対象に投与し、前記免疫賦活剤は全身経路により対象に投与する。
【００２０】
一態様において、本発明は、膀胱癌を有する対象の処置において使用するための腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを提供し、前記使用は免疫賦活剤との併用であり、前記使用において、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAは、腫瘍に対する直接注射、又は対象に対する全身投与若しくは膀胱内投与により前記対象に投与し、前記免疫賦活剤は全身経路により対象に投与する。
【００２１】
一実施形態において、前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの投与は、免疫賦活剤の投与前である。一実施形態において、前記腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの投与は、免疫賦活剤の投与後である。
【００２２】
一実施形態において、哺乳動物又は対象はヒトである。
【００２３】
一実施形態において、癌又は腫瘍は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ系の癌、白血病、脳の癌、肺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、腎臓の癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、膵臓癌、神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群から選択される。
【００２４】
一実施形態において、癌又は腫瘍はメラノーマである。
【００２５】
一実施形態において、癌又は腫瘍は、転移性の癌又は転移性の腫瘍である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】免疫適格性マウスメラノーマプロトコールの概要を示す図である。A)処置群を示す流れ図。動物を最初に、CVA21(1×108TCID50 [5×109TCID50/kg])腫瘍内、UV-不活化CVA21、又は食塩水のいずれかで処置し、引き続きマウスアイソタイプ対照抗体又は抗PD-1抗体(12.5mg/kg)を腹腔内注射した。B)処置のスケジュール(緑色三角及び橙色星型)、並びにモニタリング手順を示すタイムライン。45日目に実験を終了した(NTC=腫瘍なし対照)。
【図２】マウスの平均体重(g)対、時間(日)を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。12、15、18、及び21日目の点線は、治療の各サイクルを示す。複数の比較に対して補正した複数のt検定を用いると(Holm-Sidak法)、31日目のUV-CVA21+抗PD-1群以外、処置群の平均体重と腫瘍なし対照(NTC)マウスとの間に統計学的に有意差がなかった。試験期間にわたるマウスの安楽死のため、平均体重における変動がいくらか観察された。
【図３−１】マウスの個々の体重(g)対、時間(日)を示す図である。点線は、12、15、18、及び21日目の4ラウンドの治療を示す。A)腫瘍なし対照群、B)食塩水+対照Ab、C)食塩水+抗PD-1、D)UV-CVA21+対照Ab、E)UV-CVA21+抗PD-1、F)CVA21+対照Ab、G)CVA21+抗PD-1。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図４−１】B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後の各マウスからの個々の腫瘍体積を示す図である(各群n=8)。C57BL/6マウスの後側腹上にB16-ICAM-1細胞を皮内注射した。12、15、18、及び21日目、腫瘍を、対照又は抗PD-1抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水、CVA21(1×108TCID50 [5×109TCID50/kg])、又はUV-不活化CVA21(1×108TCID50 [5×109TCID50/kg])のいずれかを腫瘍内注射した。処置日を点線によって示す。処置期間の間、抗PD-1処置群対対照抗体群に腫瘍成長の遅延の注目すべき傾向があった。食塩水+抗PD-1処置群における腫瘍取込み率(tumor take rate)は極めて変動的であり、治療の経過が完了する前に少なくとも3匹の動物を安楽死させた。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図５】抗PD-1免疫療法と併用のCVA21腫瘍崩壊ウイルス療法後の、A)ウイルス血症、及びB)抗CVA21中和抗体の検出を示す図である。グラフは、平均値+SEM(試験開始時n=8)を示す。CVA21+抗PD-1抗体対CVA21+対照抗体の間の中和抗体レベルにおける差は、33日目に有意であった(p=0.04片側t検定)。
【図６】対照抗体又は抗PD-1と併用の、食塩水、UV-CVA21、又はCVA21処置後のC57BL/6マウスの生存を示す図である。45日目の点線は、実験の終わり/終了を示す。
【図７−１】対照抗体又は抗PD-1抗体と併用の、食塩水、UV-不活化CVA21、CVA21いずれかの処置後のC57BL/6マウスの生存を示す図である。A)食塩水+対照Ab対CVA21+対照Ab、B)食塩水+抗PD-1対CVA21+抗PD-1、C)食塩水+対照Ab対食塩水+抗PD-1、D)CVA21+対照Ab対CVA21+抗PD-1、E)食塩水+対照Ab対CVA21+抗PD-1、F)UV-CVA21+抗PD-1対CVA21+抗PD-1間の生存曲線の比較。点線は、50%生存のカットオフ、及び対応する生存時間の中央値を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図７−４】図７−３の続きである。
【図７−５】図７−４の続きである。
【図８】実施例2に記載する免疫適格性マウスメラノーマプロトコールの概要を示す図である。処置のスケジュールを示すタイムライン(青色円[抗PD-1抗体]、橙色四角[CVA21])及びモニタリング手順(赤色三角[採血]並びに緑色三角[腫瘍測定値及び体重測定値])。動物を最初に、食塩水又はCVA21(1×108TCID50/注射[5.56×109TCID50/kg])のいずれかで処置し、引き続きマウスアイソタイプ対照抗体又は抗PD-1抗体(12.5mg/kg)を腹腔内注射した。66日目に実験を終了した。
【図９】B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後、各マウスからの個々の腫瘍体積を示す図である(各群n=12)。A)食塩水+対照Ab、B)食塩水+抗PD-1、C)CVA21+対照Ab、D)CVA21+抗PD-1。C57BL/6マウスの後側腹上にB16-ICAM-1細胞を皮内注射した。6、9、12、及び15日目、腫瘍を、対照又は抗PD-1抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水又はCVA21(1×108TCID50[5:56×109TCID50/kg])のいずれかを腫瘍内注射した。処置日を点線によって示す。さらなる腫瘍内ウイルス注射(1×108TCID50 [5:56×109TCID50/kg)を、19、26、33、及び40日目に投与した。処置期間の間、抗PD-1処置群対対照抗体群において腫瘍成長が遅延するという、注意をひく傾向があった。
【図１０】B16腫瘍二次小節の腫瘍体積を示す図である。31日目、右後側腹上にB16腫瘍細胞(1×105)を再負荷した後の、各マウスからの個々の腫瘍体積。A)食塩水+対照Ab、B)食塩水+抗PD-1、C)CVA21+対照Ab、D)CVA21+抗PD-1。動物は全て、触知できる腫瘍を最終的に発症したが、B16腫瘍成長の開始はCVA21+抗PD-1療法による遅れを示す傾向があった。
【図１１】対照抗体又は抗PD-1と併用して、食塩水又はCVA21で処置後のC57BL/6マウスの生存を示す図である。食塩水+抗PD-1の生存曲線をCVA21+抗PD-1処置群と比較した場合、統計学的な差があった(p=0.0026ログランク[マンテルコックス]検定)。B)抗PD-1抗体と併用してCVA21を用いると、有意な延命効果がもたらされた(食塩水+抗PD-1及びCVA21+抗PD1に対してそれぞれ生存の中央値45日対60日)。66日目に実験を終了した。
【図１２】免疫適格性マウスメラノーマプロトコールの概要を示す図である。処置のスケジュールを示すタイムライン(青色円[抗CTLA-4抗体]及び橙色四角[CVA21])、並びにモニタリング手順(赤色三角[採血]及び緑色三角[腫瘍測定値及び体重測定値])。77日目に実験を終了した。
【図１３−１】B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後の腫瘍体積を示す図である。(A)食塩水+対照抗体、食塩水+抗CTLA-4、CVA21+対照抗体、又はCVA21+抗CTLA-4のいずれかで処置した後の平均腫瘍体積(mm3)±S.E.M.。(B及びC)B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後の各マウスからの個々の腫瘍体積。C57BL/6マウスの後側腹上にB16-ICAM-1細胞を皮内注射した。7、10、13、及び16日目、腫瘍を、対照又は抗CTLA-4抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水又はCVA21(1×108TCID50[5:56×109TCID50/kg])のいずれかを腫瘍内注射した。処置日を点線によって示す。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１４】B16腫瘍二次小節の腫瘍体積を示す図である。試験終結時(77日目)、食塩水+対照抗体、食塩水+抗CTLA-4、CVA21+対照抗体、及びCVA21+抗CTLA-4処置したマウスにおける二次腫瘍発症のパーセント発生率。(B)腫瘍発生率対日数のグラフ。37日目にマウスの後側腹上にB16腫瘍細胞を再負荷し、77日目まで腫瘍をモニタリングした。(C)右後側腹上にB16腫瘍細胞(2×105)を再負荷した後、各マウスからの個々の腫瘍体積。
【図１５】対照抗体又は抗CTLA-4と併用の、食塩水又はCVA21処置後のC57BL/6マウスの生存を示す図である。(A)対照抗体又は抗CTLA-4と併用して、食塩水又はCVA21での処置後のC57BL/6マウスの生存。実験の終わり/終了は77日目であった。(B)各処置群からのマウスの生存の中央値を示す表。
【図１６−１】B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後の腫瘍体積を示す図である。(A)食塩水+対照抗体、食塩水+抗CTLA-4、食塩水+抗PD-1、CVA21+対照抗体、CVA21+抗CTLA-4、CVA21+抗PD-1、又はCVA21+抗CTLA-4+抗PD-1で処置したマウスからの試験27日目の平均腫瘍体積(mm3)±S.E.M.、(B)食塩水+対照抗体、食塩水+抗CTLA-4、食塩水+抗PD-1、CVA21+対照抗体、CVA21+抗CTLA-4、CVA21+抗PD-1、又はCVA21+抗CTLA-4+抗PD-1のいずれかで処置した後の平均腫瘍体積(mm3)±S.E.M.、(C)B16-ICAM-1マウスメラノーマ腫瘍に対する、併用の免疫療法及びCVA21ウイルス療法後の各マウスからの個々の腫瘍体積。C57BL/6マウスの後側腹上にB16-ICAM-1細胞を皮内注射した。7、10、13、及び16日目、マウスに、対照、抗PD-1、抗CTLA-4、又は抗CTLA-4+抗PD-1抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水又はCVA21(1×108TCID50 [5.56×109TCID50/kg])のいずれかを静脈内注射した。処置日を点線によって示す。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１６−３】図１６−２の続きである。
【図１７】Pt12-002:注射した病変及び非注射の病変上の85日目の効果を示す、男性患者の脚上の転移性メラノーマ病変の腫瘍内CVA21注射を示す図である。Pt03-032:非注射の86日目の遠位内臓応答を示す、左頸部及び肺への転移性のメラノーマを有する男性。左頸部のみにCVA21を腫瘍内注射した。
【図１８】CALMフェーズII試験を示す図である。予備分析:血清サイトカイン活性(客観的応答を有する患者)。開始の腫瘍内CVA21注射後、示した時間に、個々の患者から血清試料を採取した。血清試料を、製造元の指示にしたがってBio-Plex Pro(商標)Human Cytokine 17-plex Assay (#M50-00031YV) BioRad、Richmond、VA、USAを用いてマルチプレックス免疫アッセイにより、炎症性サイトカインレベルに対して評価した。患者の腫瘍応答を、免疫関連のRECIST 1.1基準を用いて評価した。
【図１９】静脈内投与したCVA21(図上CAVATAK(商標)とも記載した)は、腫瘍細胞の遺伝子発現の変化を誘発することを示す図である。BALBマウスにCVA21又は食塩水を投与し、投与後3、6、24、及び72時間に安楽死させ、遺伝子発現に対して分析した(右の4パネル)。CVA21の複製の動態を、左の単一のパネルに示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
略語
【００２８】
Ab 抗体
【００２９】
ACEC 動物飼育倫理委員会(Animal Care and Ethics Committee)
【００３０】
ANOVA 分散分析
【００３１】
ATCC アメリカ培養細胞系統保存機関
【００３２】
BSA ウシ血清アルブミン
【００３３】
CI 併用係数
【００３４】
CO2 二酸化炭素
【００３５】
CD 表面抗原分類
【００３６】
CPE 細胞変性効果
【００３７】
CTL 細胞毒性Tリンパ球
【００３８】
CVA21 コクサッキーウイルスA21
【００３９】
DAF 崩壊促進因子
【００４０】
dH2O 蒸留水
【００４１】
DMEM ダルベッコ変法イーグル培地
【００４２】
DNA デオキシヌクレオチドリン酸
【００４３】
EtOH エタノール
【００４４】
FCS ウシ胎児血清
【００４５】
g ガンマ
【００４６】
ICAM-1 細胞間接着分子-1
【００４７】
i.p. 腹腔内
【００４８】
i.t. 腫瘍内
【００４９】
i.v. 静脈内
【００５０】
irPFS 免疫関連の無増悪生存期間
【００５１】
MAb モノクローナル抗体
【００５２】
nAb 中和抗体
【００５３】
MOI 感染多重度
【００５４】
PBS リン酸緩衝食塩水
【００５５】
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
【００５６】
PD-1 プログラム細胞死1
【００５７】
PD-L1 プログラム細胞死1リガンド1
【００５８】
p.i. 接種後
【００５９】
p.t.i 腫瘍接種後
【００６０】
RNA リボ核酸
【００６１】
RPMI ロイヤルパーク記念研究所(Royal Park Memorial Institute)
【００６２】
RT 室温
【００６３】
RT-PCR 逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
【００６４】
s.c. 皮下
【００６５】
SCID 重症複合免疫不全
【００６６】
SD 標準偏差
【００６７】
SE 標準誤差
【００６８】
sICAM-1 可溶性細胞間接着分子-1
【００６９】
TCID50 50%組織培養感染量
【００７０】
UV 紫外線
【００７１】
XTT 2,3-Bis-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド
【００７２】
単位
℃  セルシウス度
【００７３】
d 日
【００７４】
g 重力
【００７５】
g グラム
【００７６】
h 時間
【００７７】
L リットル
【００７８】
m メートル
【００７９】
M モル濃度
【００８０】
min 分
【００８１】
mol モル
【００８２】
rpm 毎分回転数
【００８３】
s 秒
【００８４】
U 単位
【００８５】
V ボルト
【００８６】
v/v 単位体積あたりの体積
【００８７】
w/v 単位体積あたりの重量
【００８８】
ヌクレオチド
A アデニン
【００８９】
C シトシン
【００９０】
G グアニン
【００９１】
T チミン
【００９２】
接頭語
k キロ  103
【００９３】
m ミリ  10-3
【００９４】
μ  マイクロ  10-6
【００９５】
n ナノ  10-9
【００９６】
p ピコ  10-12
【００９７】
実施形態の記載
本発明を次に、以下の例に関して、単なる例示によるものを含め、より詳しく記載する。
【００９８】
以下は、本発明の記載の理解を助け得るいくつかの定義である。これらは、一般的な定義を意図するものであり、本発明の範囲をこれらの語だけに決して限定してはならず、以下の記載をより十分に理解するために記載するものである。
【００９９】
本発明の方法は、治療有効量の腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの、及び免疫賦活剤の投与を伴うのが典型的である。本明細書で用いる「治療有効量」の語は、その意味の範囲内に、所望の治療効果を提供するために本発明において用いるための、非毒性であるが十分な量の腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA、及び免疫賦活剤を含む。必要とされる正確な量は、処置する種、対象の年齢及び全身状態、処置する状態の重症度、投与する特定の薬剤、及び投与様式などの因子に応じて対象毎に変動する。よって、正確な「有効量」を規定するのは可能ではない。しかし、あらゆる所与の場合に対して、好適な「有効量」は、当業者であればルーチンの実験のみを用いて決定することができる。
【０１００】
本明細書の文脈において、「処置(治療)(treatment)」の語及び関連の語、例えば、「処置する」、「処置される」、及び「処置(treat)」は、疾患状態若しくは症状を癒し、若しくは軽減し、疾患の確立を防ぎ、又は別の方法で疾患若しくは他の望ましくない症状の進行を、どのような方法であれ、防ぎ、妨げ、遅延し、若しくは逆転する、ありとあらゆる使用を意味する。誤解を避けるために、本明細書で用いる「処置(treatment)」及び関連の語は、処置する疾患の完全な治癒又は寛解を必要としないことに留意されたい。
【０１０１】
本明細書の文脈において、「含む(comprising)」の語は「主に含む(including)が、それだけを含むとは限らない」を意味する。さらに、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの「含む」の言葉の変形は、対応して変動する意味を有する。
【０１０２】
許容される限り、本明細書に言及する文献の内容は、参照によって援用される。
【０１０３】
本明細書の文脈において、「対象」又は「患者」の語は、これらに限定されないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長動物、齧歯動物の属のメンバーを含めた、ヒト、及び社会上、経済上、又は研究上重要なあらゆる種の個体を含む。好ましい実施形態において、対象又は患者はヒトである。
【０１０４】
文脈が他の方法を必要とせず、又は反対のことを特に述べなければ、単数形の整数、ステップ、又はエレメントとして本明細書に列挙する、本発明の整数、ステップ、又はエレメントは、単数形及び複数形両方の、列挙する整数、ステップ、又はエレメントを明らかに包含する。
【０１０５】
本明細書の文脈において、特定の文脈によってそうでないことが示される場合以外は、単数形は複数形も包含する。例えば、本発明が、免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAの投与によって癌を処置するための方法を含む場合、これは1種以上のこのようなウイルス及びウイルスのRNAの投与を包含し、1種以上の免疫賦活剤の投与を包含することが理解されよう。
【０１０６】
本明細書の文脈において、「約」の語は、数値に関して用いられる場合、記載されている尺度に対して当技術分野では公知の、通常の変動の度合いを伝えることが理解されよう。当技術分野が尺度に対して通常の度合いの変動を認めない場合、又は当技術分野がそれを認め、且つさらなる指示がそれでもやはり望ましい場合、本明細書で用いる「約」の語は、「約」の語が用いられる数値のプラス又はマイナス10%の変動を伝えることが理解されよう。
【０１０７】
本明細書における先行技術文献のあらゆる記載、又はこれらの文献に由来し、若しくは基づく本明細書の記載は、文献又は由来する記載が、オーストラリア又は他所における関連技術の通常の一般的知識の一部であることを認めるものではない。
【０１０８】
当業者であれば、本明細書に記載する本発明は、特に記載するもの以外の変形及び修飾を受けやすいことを理解されよう。本発明はこのような変形及び修飾を全て含むと理解されたい。本発明は、本明細書に対して言及し、又は本明細書において示すステップ、特徴、組成物、及び化合物の全ても個々に、又は集合的に含み、且つ前記ステップ又は特徴の、ありとあらゆる組み合わせ、又はあらゆる2つ以上の組み合わせを含む。
【０１０９】
本明細書の文脈において、数の範囲を提供する場合、これらの終点内のあらゆる部分範囲を含めた、記載する範囲の終点、及びこれらの終点の間の全ての値を包含することが理解されよう。
【０１１０】
本発明者らは、本明細書において、マウス抗PD-1抗体及びマウス抗CTLA-4抗体の使用により本明細書に例示する、腫瘍崩壊性CVA21と併用の、免疫チェックポイント分子を標的とする免疫賦活剤の使用は、メラノーマのマウスB16-ICAM-1モデルにおいて、腫瘍負荷、腫瘍の潰瘍化率を低減し、生存を延長する上で治療上有益であることを実証する。免疫賦活剤の使用による免疫系の増強は、免疫クリアランスが増強される又はウイルスを標的とすることなどにより、腫瘍崩壊ウイルスの有効性を不利にすることが予想されるが、本発明者らは本明細書において、驚くべきことに、且つ直感に反することに、腫瘍崩壊ウイルス及び免疫賦活剤の併用は、薬剤ウイルス(agent virus)又は免疫賦活剤の単独いずれかと比較して改善された抗腫瘍効果をもたらすことを実証する。本明細書に記載する本発明は、よって、哺乳動物への全身投与による免疫賦活剤の同時投与と併用して、腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNAを直接注射により、又は全身投与により腫瘍に送達することを含む、腫瘍を処置する方法を提供する。処置するのが望ましい癌は、ウイルス又は薬剤の送達の特定のメカニズムが有利であり得、送達方法が好ましいものである。例えば、方法が、膀胱癌又は転移性膀胱癌の処置のためである場合、少なくともウイルス又はウイルスRNAの投与は、膀胱内経路によるのが有利である。
【０１１１】
CVA21は、ヒトエンテロウイルスC(HEC)ファミリーのウイルスのメンバーである。HECファミリーの注目すべき他のメンバーには、コクサッキーウイルス、例えば、CVA13、CVA15、及びCVA18が含まれる。CVA13、CVA15、CVA18、及びCVA21は各々、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、及びメラノーマなどの様々な固形癌の処置において(その全文の内容が参照によって本明細書に援用される、Shafrenら、2004年; Auら、2005; Auら、2007年; 2000年11月27日出願の「A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same」と題されたWO2001/037866)、並びに多発性骨髄腫などの血液の癌において(その全文の内容が参照によって本明細書に援用される、2005年8月22日出願の「Methods and compositions for treatment of hematologic cancers」と題されたWO/2006/017914)、腫瘍崩壊効果があることが実証された。各々が、宿主細胞の感染のためのICAM-1受容体と相互作用し(Shafrenら、1997年)、崩壊促進因子(DAF)は共同の隔離場所(cooperative sequestration site)として作用する(Shafrenら、1997年)。したがって、CVA21の免疫賦活剤との同時投与の、癌モデルにおける有益な効果の本明細書の実証は、CVA21に機能的に関連するウイルス、例えば、CVA13、CVA15、及びCVA18、並びに他のヒトエンテロウイルスCにもあてはまる。
【０１１２】
あらゆる適切なウイルスの供給源を、本発明の方法において用いることができる。例えば、ウイルスの様々な適切な系統を、以下に提供する日にブダペスト条約の下に寄託された材料など、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)、10801 University Blvd.、Manassas、Va. 20110-2209 USAから得てもよく、ブダペスト条約の条項にしたがって入手できる。コクサッキーA群ウイルス、CVA13株ATCC No.: PTA-8854、2007年12月10日寄託20;コクサッキーA群ウイルスCVA15株(G9) ATCC No.: PTA-8616寄託日2007年8月15日;コクサッキーA群ウイルスCVA18株ATCC No. :PTA-8853 2007年12月20日寄託;コクサッキーA群ウイルス、CVA21株(Kuykendall) ATCC No.: PTA-8852 2007年12月20日寄託。
【０１１３】
本明細書に記載する通り、この方法は、腫瘍崩壊ウイルスとして投与されるウイルス薬剤、及び腫瘍崩壊ウイルスのRNAの形態で投与されるウイルス薬剤、例えば、CVA21に対応するウイルスRNAを包含する。癌の処置において腫瘍崩壊ウイルスRNAを使用するための方法は、その内容が参照によって本明細書に援用される、「Method and composition for treatment of neoplasms」と題されたWO2006/074526に記載されている。
【０１１４】
腫瘍崩壊ウイルスは、感染後、直接的な溶菌感染、アポトーシスの誘導により、又はウイルス抗原に対する免疫応答を開始することにより、癌細胞を死滅させることができる。腫瘍崩壊ウイルスは、このように、単一の投入用量に制限されず、複数サイクルの感染を受けることができ、大量の子孫ウイルスの生成をもたらす。これらの子孫は、腫瘍細胞に隣接して局所的に、又は遠位の転移部位に全身的に、のいずれかで伝播することができる。腫瘍崩壊療法のこの特徴は、到達できない腫瘍、又は診断未確定のマイクロ転移の処置に特に魅力的である。例えば、患者の頸部上のメラノーマへのCVA21の腫瘍内投与が、注射した病変及び遠位の非注射の病変の両方における抗腫瘍活性に関連する(図17)という本明細書の実証は、全身効果が生じることに一致する。本明細書に実証する通り、病変内CVA21は、切除不能のステージIIIC-IVM1cメラノーマを処置するのに有望な新規の腫瘍崩壊性免疫治療薬であり、本明細書において実施例5の試験の下に記載する臨床試験は、6か月のirPFSの主要エンドポイントを満たす。CVA21は耐容性が良く、局所及び遠位両方の腫瘍の持続的応答を示した。
【０１１５】
特に非注射の病変における抗腫瘍活性の本明細書の知見は、全身性の宿主免疫媒介性抗腫瘍応答と一致する。本明細書の実施例は、CVA21媒介性の非注射の遠位転移病変活性は、血清IL-8及びg-IFNの増大レベルの可能な新規の血清サイトカインシグナチャーによって証明される、宿主産生性免疫応答と関係することを示唆するものである(図18)。メラノーマ細胞(SK-Mel28)を側腹部に埋め込んだマウスモデルにおけるCVA21の静脈内送達は、腫瘍生検の時間経過とその後のウイルスの投与によって評価される、腫瘍細胞によるインターフェロン-γ誘導性タンパク質10(IP-10)及びPD-L1の発現における増大に関連した(図19)。IP-10は、IFN-gに暴露された細胞が分泌するケモカインであり、活性化T細胞を組織炎症部位中にリクルートする上で重要な役割を果たす。進行中の臨床試験では、腫瘍がより高レベルの免疫チェックポイント分子、例えばPD-L1を発現する患者は、抗PD-1又は抗PD-L1遮断を用いた処置後に腫瘍のPD-L1発現がない患者と比較して、優れた腫瘍応答を示すことがますます明らかになっている。これは、ICAM-1発現性の癌、例えばメラノーマ、NSCLC、転移性膀胱癌、腎臓、多発性骨髄腫、膵臓、神経膠芽腫、及び前立腺の癌などにおいて、免疫チェックポイントインヒビター抗体と併用して腫瘍免疫アジテーター(tumor immune-agitator)として作用するCVA21に対する潜在性を実証するものである。
【０１１６】
本発明の方法は、治療有効量のウイルス及び治療有効量の免疫賦活剤の投与を伴うのが典型的である。本明細書で用いる「治療有効量」の語は、その意味内に、非毒性であるが所望の治療効果を提供するのに十分な量のウイルス又は免疫賦活剤が含まれる。本明細書に記載する通り、相乗効果のため、用いるウイルス及び免疫賦活剤の量は、単独療法(ウイルス又は免疫賦活剤の一方のみを使用して対象における癌を処置する)において用いるよりも少なくてよい。必要とされる正確な量は、処置する種、対象の年齢及び全身状態、処置する状態の重症度、投与する特定の薬剤、及び投与様式などの因子に応じて対象毎に変動する。よって、理論上、正確な「有効量」を特定するのは可能ではない。しかし、あらゆる所与の場合に対して、好適な「有効量」は、当業者がルーチンにすぎない実験を用いて決定することができる。
【０１１７】
腫瘍崩壊ウイルス又は腫瘍崩壊ウイルスのRNA、及び免疫賦活剤は、一態様において、腫瘍を有し、又は癌を有する対象を処置するために相互に組み合わせて用いられる。方法が、ウイルス及び免疫賦活剤の、対象に対する「同時投与」を伴う実施形態において、この語は、重複性の治療活性を有するように薬剤を投与することを意味し、薬剤を同時に対象に投与することを必ずしも意味するわけではないことが理解されよう。薬剤は、投与前の、物理的な併用でもよく、又は物理的な併用でなくてもよい。薬剤は、投与前又は投与時に物理的な併用ではないのが典型的である。一実施形態において、ウイルス及び免疫賦活剤(複数可)を対象に、同時に、又はおよそ同時に投与する。一実施形態において、免疫賦活剤(複数可)を投与する前に、ウイルスを対象に投与する。
【０１１８】
ウイルスは、ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で対象に投与するのが典型的である。組成物は、あらゆる適切な濃度のウイルス、例えば、1mlあたりウイルス粒子約105個から1mlあたりウイルス粒子約1015個までの濃度範囲において、又は1mlあたりウイルス粒子約106個、又は1mlあたりウイルス粒子約107個、又は1mlあたりウイルス粒子約107個、又は1mlあたりウイルス粒子約108個、又は1mlあたりウイルス粒子約109個、又は1mlあたりウイルス粒子約1010個、又は1mlあたりウイルス粒子約1011個、又は1mlあたりウイルス粒子約1012個、1mlあたりウイルス粒子約1013個、又は1mlあたりウイルス粒子約1014個、又は1mlあたりウイルス粒子約1015個を含むことができる。
【０１１９】
ウイルス組成物の貯蔵物を、投薬に適する好適な体積に希釈して、例えば、所望の体積中に投与されるウイルス粒子の所望の用量を実現してもよい。例えば、対象に、ウイルス粒子約105個からウイルス粒子約1015個、又はウイルス粒子約106個、又はウイルス粒子約107個、又はウイルス粒子約108個、又はウイルス粒子約109個、又はウイルス粒子約1010個、又はウイルス粒子約1011個、又はウイルス粒子約1012個、又はウイルス粒子約1013個、又はウイルス粒子約1014個、又はウイルス粒子約1015個を含むウイルスの用量を投与してもよい。ウイルスを投与する体積は、投与様式による影響を受ける。例えば、注射によるウイルスの投与は、約0.5mlから約10mlなど、より小体積であるのが典型的であり、それに対して、膀胱癌の処置の場合の膀胱内注入による投与では、典型的に、約10mlから約100ml、例えば、約20ml、約30ml、約40ml、約50ml、約60ml、約70ml、約80ml、若しくは約90ml、又は膀胱癌を処置するためのBCGの点滴注入のための公知の手順と同様の体積を用いてもよい。さらなる一例として、ウイルスの静脈内投与は、通常の食塩水中に希釈したウイルス約100mlから約500mlを使用してもよいのが典型的であり、およそ30分かけて自動ポンプによって注入する。
【０１２０】
組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び/又は補助剤をさらに含むことができる。担体、希釈剤、賦形剤、及び補助剤は、組成物の他の成分と相溶性であるという点で「許容され」なければならず、許容できないほど受け手の対象に有害であってはならない。
【０１２１】
ウイルスは、PCT/AU2006/000051(その内容全体が参照によって本明細書に援用される、WO2006/074526として公開される、2006年1月17日出願の、「Methods and composition for the treatment of neoplasms」と題された)などに記載される通り、ウイルス粒子というよりむしろ、ウイルスをコードするネイキッドのウイルスRNAとして投与され得る。このような一実施形態において、ウイルスRNAはリポソームの形態で投与してもよい。リポソームは、リン脂質又は他の脂質物質に由来するのが一般的であり、水性媒体中に分散されている単層又は多層状の水和した液状結晶により形成される。リポソームを形成することができる、あらゆる非毒性の、生理学的に許容され、代謝可能な(metabolisable)脂質を用いることができる。リポソーム形態の組成物は、安定化剤、保存剤、賦形剤などを含むことができる。好ましい脂質は、天然及び合成両方の、リン脂質及びホスファチジルコリン(レシチン)である。リポソームを形成する方法は当技術分野では公知であり、これに関して、その内容が参照によって本明細書に援用される、Prescott編集、Methods in Cell Biology、第XIV巻、Academic Press、New York、N.Y. (1976)、33頁以下を特に参照されたい。
【０１２２】
ウイルスは、注射などのあらゆる好適な手段によって対象に投与することができる。注射は、全身的、非経口的、癌の中への直接注射、又は静脈内であってよい。膀胱癌の処置において、ウイルスの投与が膀胱内である(膀胱中に直接注入する)のが典型的である。
【０１２３】
腫瘍の病変内注射は、処置する腫瘍のタイプ、腫瘍のサイズ及び位置、直接注射に対する腫瘍の到達性などの因子を考慮に入れて、当業者には公知の、あらゆる好適な手段によって行うことができる。腫瘍にわたってウイルスの分布を増大し、又は最大にする注射技術は、治療結果の改善をもたらし得る。例えば、メラノーマ及び他の固形腫瘍の処置では、複数の病変に、多分割パターンの用量において、最大病変(複数可)から始めて(2.5cm超の腫瘍中に2.0mL注射、1.5から2.5cm中に1.0mL;0.5から1.5cm中に0.5mL)最大4.0mLまで注射することができる。CVA21を最初に注射した後、直径<0.5cmに低減したあらゆる注射した病変に、病変が完全に消散するまで記載した処置スケジュールにしたがってCVA21 0.1mLを注射してもよい。
【０１２４】
最初に感染させる、癌細胞数及び腫瘍にわたる領域を最大にすれば、理論的に、破壊される癌細胞の量が増大する。これは、腫瘍によって生成されるウイルス子孫の量も増大し、したがって遠隔腫瘍の播種のための進行中のウイルス血症の機会を増大する。投与したウイルスが腫瘍全体にわたって所望の分布を実現するのにあらゆる好適な手段を用いることができ、これらの好適な手段は当業者にとっては明らかである。以下は、本発明者らが本明細書に報告する実験において用いた、CVA21を腫瘍に投与する状況における例示的な一手段を記載するものである。
【０１２５】
必要とされるCVA21などのウイルスの体積を収容するシリンジ、及び25ゲージ針を投与に用いる。投与しようとするCVA21の体積は、上記に記載した通り、注射しようとする腫瘍の直径に基づいて決定することができる。シリンジにCVA21を充填するには、バイアルを個々の紙箱から取り出し、室温(18〜25℃)で解凍する。内容を解凍するのに必要とされるより長くバイアルをRTに放置してはならない。バイアルを5秒間、穏やかに混和する。好適な体積のルアーロックシリンジ及び21ゲージ針を用いて必要な体積を引き上げる。気泡を除去する。取り外し針(withdrawal needle)を除去し、キャップの付いた25ゲージ針で置き換える。必要とされるまで氷上に保持する(2〜8℃)。以下に記載した通り、腫瘍中に分配したシリンジに充填してから3時間以内に投与する。
【０１２６】
注射は、各注射日に腫瘍内の9領域中であってよい。領域は重複せず、以下の目印を用いることにより選択してもよい。ウイルス溶液の分布は、最初の注射である1日目に対して以下の通りであってよい:(i)腫瘍の中心を推定し、印をつけ、(ii)腫瘍の外縁周囲に45度の放射状の印をつけ、(iii)針を挿入する部位は中心の印と270度の放射との間、およそ中間点であり、これが第1用量の注射部位であり、(iv)分配体積を10で割り、腫瘍内9ゾーン中に分配する。注射のためのターゲットゾーンは、腫瘍の「へり」のおよそ20%外側内と推定される、放射状の印に隣接する腫瘍内の領域である。これにより8回注射を行う。これら最初の8回の注射は、超音波によって導かれる、腫瘍の正中線平面まで深くなるように狙わなければならない。最後の注射は、予想される腫瘍の中心まで深くなるように直接行い、この時、最初の用量は正中線上部の深さを狙い、注射体積の20%を含む。
【０１２７】
投与しようとするウイルスの前述の量の計算、及びウイルスを投与することができる記載した方法は、例示の目的で提供するにすぎず、本明細書に記載する本発明に対して制限しようとするものではないことが理解されよう。
【０１２８】
本発明は癌を処置するための方法を提供し、この方法は、免疫賦活剤と併用の、CVA21などのヒトエンテロウイルスCの使用を含む。ごく最近の研究及び臨床開発の対象である免疫賦活剤は、いわゆるチェックポイントインヒビターを標的とするものである。チェックポイントの遮断では、ヒト化モノクローナル抗体を用いて、宿主の免疫チェックポイント分子及びその天然のリガンドを妨害する。PD-1、PDL1/L2、及びCTLA-4を含めたこのような分子の遮断は、多数の進行癌患者(メラノーマ、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び腎臓癌)において劇的な抗腫瘍応答をもたらした。免疫チェックポイント分子は通常、宿主の免疫系のバランスを保ち、自己寛容を維持するように機能する。免疫チェックポイント分子を特異的に遮断すると、負のフィードバック系が緩まり、特に癌細胞及び抗原に対する、宿主の免疫系の活性を高めてより活性にする。簡単に言えば、これは、宿主の免疫系の「生物学的なハンドブレーキ」を取るものである。免疫チェックポイントの遮断は、耐久性のある腫瘍応答の改善をもたらし、これは延命効果の意味に翻訳される。多数の癌患者における劇的に広範な腫瘍応答に関わらず、免疫チェックポイントの遮断により誘発される腫瘍応答の比率及び耐久性を増大することが依然として必要とされている。
【０１２９】
本明細書に実証する通り、CVA21などの腫瘍崩壊性ヒトエンテロウイルスCの、抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体などの免疫チェックポイント遮断分子(免疫賦活剤)との併用は、好ましい腫瘍応答を誘発する上で驚くべき利点をもたらす。驚くべきことに、ウイルスの投与が、免疫チェックポイント分子の発現レベル及び宿主の免疫細胞浸潤物に対する影響に関して、腫瘍の微小環境の均衡状態に対し変化を誘発することが確認されたのは重要である。数々のこれらの免疫の上方制御プロセスは、インターフェロン、特にインターフェロン-γなどの免疫賦活剤の直接的な活性を伴うため、CVA21などのヒトエンテロウイルスCを投与して細胞内ウイルス複製を誘発することを伴う治療取組みは、宿主の免疫系の活性の繊細なバランスの標的化されたかく乱を開始する、魅力的なプロセスである。
【０１３０】
免疫賦活剤(複数可)は、あらゆる好適な薬剤から選択することができる。本発明の文脈において、免疫賦活剤は、個体に投与した場合に腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激することができるあらゆる薬剤と理解されよう。本発明の好ましい実施形態において、免疫賦活剤は、免疫チェックポイント分子と相互作用して、この免疫チェックポイント分子、又はこの免疫チェックポイント分子を含む複合体が、生得的な免疫ベースの個体の抗腫瘍応答を低減する能力をブロックし、低減し、又は対抗するあらゆる薬剤であってよい。よって、免疫賦活剤は、免疫チェックポイント分子が抗腫瘍応答時に有する「ハンドブレーキ」効果を低減する。例えば、免疫賦活剤は、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD134、CD134L、CD137、CD137L、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、B7RP1、ICOS、TIM3、GAL9、CD28、又はOX-40からなる群から選択される免疫チェックポイント分子を標的とする任意の薬剤であってよい。本明細書で用いる「免疫賦活剤」は、免疫賦活剤が免疫チェックポイントを標的とする場合、免疫チェックポイントインヒビターとも呼ぶことができることが理解されよう。
【０１３１】
典型的に、免疫賦活剤は抗体であってよく、又は好ましい実施形態においてモノクローナル抗体であってよい。本発明において用いるための抗体の調製は、周知の技術を用いてモノクローナル抗体を調製し、高親和性抗体に対してスクリーニングし、又は理にかなって高い親和性を有するモノクローナル抗体を最初に同定し、次いで周知の方法を用いて親和性を改善することによるものを含めた、当技術分野では周知の方法によって行うことができる[例えば、Huse, W. D.ら、Internat'l Rev. Immunol.、10巻、129〜137頁(1993); Yelton, D. E.ら、J. Immunol.、155巻、1994〜2004頁(1995); Wu, H.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、95巻、6037〜6042頁(1998); Crameri, A.ら、Nature Medicine、2巻、100〜103頁(1996); Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、91巻、10747〜10751頁(1994); Stemmer、Nature、370巻、389〜391頁(1994)、抗体の調製と関係がある各々の部分が参照により本明細書に援用される]。或いは、薬剤は調製するよりむしろ入手してもよい。チェックポイントインヒビター分子に対する抗体の例には、完全ヒト免疫グロブリンG4(IgG4)モノクローナルPD-1抗体であるニボルマブ(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)が含まれ、これはこのクラスで初めて、転移性メラノーマを有する患者107人のフェーズI試験において試験されたものである[Sosmanら、2012年b]。ヒト化モノクローナルIgG4 PD-1抗体であるラムブロリズマブ(Lambrolizumab)(MK-3475)は、転移性メラノーマを有する患者132人が含まれるフェーズI試験において試験された[Iannoneら、2012年]。完全ヒトIgG4 PD-L1抗体であるBMS-936559は、フェーズI試験の一部として転移性メラノーマを有する患者55人において試験された[Brahmerら、2012年]。
【０１３２】
特定のタイプの癌に対する患者の処置において、当業者であれば、処置のさらなる方法又はステップも好適であり得ることを知っている。例えば、膀胱癌に対する患者の処置において、本発明の方法は、膀胱をすすぎ、又は洗い流した後、ウイルスを投与して、例えば、ウイルスの有効性を低減し得る薬剤の存在を除去し、又は低減することにより、ウイルスの改善された受容性に対して膀胱を整えることを、任意選択により含むことができる。例えば、尿路上皮はグリコサミノグリカン(GAG)層によって保護されているが、グリコサミノグリカン層の破壊により、ウイルスは細胞により効率的に結合できるようになり、よって細胞をより効率的に形質導入できるようになり得る。非限定的な例において、食品添加物及び可溶化剤として用いられる、非イオン性の弱い洗剤であるDDM(n-ドデシル-β-D-マルトシド)を、濃度約0.1%などのあらゆる好適な濃度で用いて、GAG層を破壊又は除去し、それによって形質導入の促進を助けてもよい。
【０１３３】
本発明の方法を、癌の外科処置と併用して使用してもよい。例えば、腫瘍切除後、本発明による併用方法を使用して対象を処置してもよい。これは腫瘍の再発を防止又は低減し得ることが予測される。
【０１３４】
方法は、単一又は複数の用量の、あらゆる1つ若しくは複数のウイルス、又は免疫賦活剤、例えば、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合するモノクローナル抗体などの薬剤を含むことができる。
【０１３５】
本発明は、本発明の方法において用いるためのキットにも関する。基本的な形態では、キットは、ヒトエンテロウイルスC及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、並びに患者における癌を処置するための化学療法剤又は放射と併用して組成物を用いるための指示を含むことができる。組成物は、例えば、バイアル、アンプル、又はシリンジなど、あらゆる適切な容器において提供することができる。組成物は、凍結乾燥、フリーズドライ、液体形態、又は凍結状態において提供することができる。
【０１３６】
キットは、あらゆる数のさらなる構成成分を含むことができる。非限定的な例により、さらなる構成成分は、(i)1種以上の抗ウイルス薬、例えばPlecornil、(ii)腫瘍崩壊ウイルスを含む、1種以上のさらなる医薬組成物、(iii)腫瘍崩壊ウイルスのRNAを含む、1種以上のさらなる医薬組成物、(iv)患者における癌の処置において有用な、1種以上のさらなる治療薬を含むことができる。キットは、表面に発現されるPD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、又はOX-40に特異的に結合するモノクローナル抗体など、併用治療において使用するための免疫賦活剤をさらに含むことができる。キットはまた、静脈内注入用に生理学的溶液中に希釈されている、単回使用のバイアル、ヒトに直接投与するための予め充填したシリンジ中に、又は生理学的溶液で適切に希釈できるようにする濃縮形態において含まれている組成物からなっていてもよい。このような溶液は、例えば、リン酸緩衝食塩水、又は生理学的濃度のNaCl2でもよい。
【０１３７】
本明細書で用いる「キット」の語は、材料を送達するためのあらゆる送達系を意味する。医薬組成物の文脈において、このような送達系は、治療薬(例えば、好適な容器中の腫瘍崩壊ウイルス、若しくは好適な容器中の免疫刺激薬)及び/又は支持材料(例えば、緩衝液、組成物を使用するための書面の指示など)の、ある場所から別の場所までの、貯蔵、輸送、又は送達を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連の構成成分及び/又は支持材料を含んでいる、箱などの1つ以上の封入物を含む。
【０１３８】
キットは、細分化されたキットでもよい。本明細書で用いる「細分化されたキット」の語は、各々が全キット構成成分のサブポーションを含む、2つ以上の別々の容器を含む送達系を意味する。容器は、意図する受け手に一緒に、又は別々に送達され得る。細分化されたキットが適しており、例えば、ウイルス又は免疫賦活剤などの1つ以上の構成成分が、1つ以上の他の構成成分と比較して、異なる温度などの異なる条件下で、最適に貯蔵され、及び/又は輸送されてもよい。実際、各々が全キット構成成分のサブポーションを含む2つ以上の別々の容器を含むあらゆる送達系が、「細分化されたキット」の語に含まれる。対照的に、「一体化された(combined)キット」は、単一の容器(例えば、所望の構成成分の各々を収容する単一の箱)中に反応アッセイの構成成分を全て含む送達系を意味する。「キット」の語は、細分化されたキット及び一体化されたキットの両方を含む。
【実施例】
【０１３９】
実施例1:免疫賦活抗体抗PD-1と併用の腫瘍崩壊CVA21ウイルス療法
本試験は、悪性メラノーマのB16-ICAM-1マウスモデルにおける、免疫賦活抗体抗PD-1と併用のCVA21腫瘍崩壊ウイルス療法の有効性を調査したものである。マウスに腫瘍を、皮内に埋め込み(2×105細胞)、12日間確立させた後、治療を開始した。12、15、18、及び21日目、マウスを、マウス抗PD-1抗体又はマッチさせた対照抗体のいずれかと併用して、食塩水、CVA21、又はUV不活化CVA21のいずれかで処置した。食塩水、CVA21、又はUV不活化CVA21処置は腫瘍内投与し、抗PD-1及び対照抗体は腹腔内投与した。抗PD-1抗体と併用してCVA21で処置した動物は、対照群(食塩水+対照抗体)の動物と比較して、腫瘍の潰瘍化のエンドポイント、又は10%を超える体重の減少に基づいて、わずかな延命効果を示した。12日目から21日目の間の処置期間の間、CVA21+抗PD-1の併用は腫瘍抑制(tumoristatic)効果を示したが、治療を停止すると、腫瘍の体積は徐々に増大した。これにもかかわらず、この群の動物は、食塩水+対照抗体、UV-CVA21+対照抗体、及びUV-CVA21+抗PD-1抗体処置群と比較して、統計学的に有意な生存効果を示した。本試験により、抗CVA21中和抗体レベルはCVA21+抗PD-1対CVA21+対照抗体を投与したマウスにおいてより高レベルで検出されたため、抗PD-1抗体の免疫賦活性の性質も確認された。まとめると、本試験の主な知見は、CVA21+抗PD-1で処置した担癌マウスは、腫瘍成長の減速及び腫瘍の潰瘍化の低減に関する全体的な延命効果を示した。
【０１４０】
試験材料:ウイルス
試験物品であるコクサッキーウイルスA21(CVA21)[商品名:CAVATAK(商標)]はViralytics Ltdによって提供された。in vitro使用のための研究用株(research stock)は、調製された市販のCAVATAK(商標)のバイアルから作製した。バッチ:CCVA2115、濃度:1×109TCID50/ml (1.1mlバイアル)、再試験日:実施例2及び3に対して2008年12月、2014年1月、貯蔵の推奨:-70℃未満で貯蔵する。
【０１４１】
UV不活化CVA21を、同じCAVATAK(商標)バッチ:CVA2115製品7mlを、バイオハザードフード中、1時間、UV光線に暴露することによって調製した。ウイルスを最初に、オリジナルの製品バイアルから6ウエルプレートのウエルに移し、およそ10cmの距離のUV光源に1時間暴露した。UV不活性化したウイルスを、次いで、アリコートにし、-80℃で凍結した。
【０１４２】
抗体
対照抗体
実施例1及び2における対照抗体として、BioXCellからの抗体InVivoMAb Rat IgG2aを用いた。クローン: 2A3。カタログ番号: BE0089。ロット: 4807/0713。内毒素: <0.35EU/mg。製剤: PBS、pH6.5。滅菌: 0.2umろ過。純度: >95%。貯蔵:  希釈せずに暗所で4℃。実施例3における対照抗体として、BioXCellからの抗体InVivoMAb Rat IgG2bを用いた。クローンMPC-11。カタログ番号BE0086。ロット4700-2/0414。内毒素: <2.0EU/mg。製剤: PBS、pH7。滅菌: 0.2umろ過。純度: > 95%。貯蔵:  希釈せずに暗所で4℃。
【０１４３】
抗PD-1
活性抗マウスPD-1抗体をBioXCellから得た。製品名: InVivoMAb抗m PD-1。クローン: RMP1-14。カタログ番号: BE0416。ロット: 4781/0813。内毒素: <0.61EU/mg。製剤: PBS、pH7。滅菌: 0.2 umろ過。純度: >95%。貯蔵:  希釈せずに暗所で4℃。
【０１４４】
抗CTLA-4
活性抗マウスCTLA-4抗体をBioXCellから得た。製品名: InVivoMAb抗m CTLA-4。クローン: 9D9。カタログ番号: BE0164。ロット: 5159/0414。内毒素: <2.0EU/mg。製剤: PBS、pH7。滅菌: 0.2um  ろ過。純度: >95%。貯蔵:  希釈せずに暗所で4℃。
【０１４５】
細胞
本試験では、ヒトメラノーマ細胞株SK-Mel-28、並びにマウスメラノーマ細胞株B16及びB16-ICAM-1を用いた。メラノーマ細胞株SK-Mel-28は、ATCC (アメリカ培養細胞系統保存機関)から得た。Mel-RMは、P. Hersey博士(University of Newcastle、New South Wales、Australia)より贈られた。B16マウスメラノーマ細胞は、当初A. Shurbier博士(Queensland Institute for Medical Research、Brisbane、Queensland、Australia)から得、次いで、ヒトICAM-1遺伝子を安定にトランスフェクトしてB16-ICAM-1細胞株を作製した。細胞株は全て、10%ウシ胎児血清(FCS) (SAFC Biosciences(商標)、Australia)、10mM滅菌N-2-ヒドロキシエチルピペラジンN'-2-エタンスルホン酸(HEPES) (ThermoScientific、Australia)、2mM L-グルタミン(ThermoScientific、Australia)、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen、Australia)、及び100IU/mlペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen、Auckland、NZ)を含むDMEM (Thermo Scientific)中に維持した。細胞は全て、5%CO2環境中37℃で培養した。
【０１４６】
動物
動物実験は全て、ニューキャッスル大学動物飼育倫理委員会(ACEC)により承認番号: A-2013-327の下に承認された。6から8週齢のC57BL/6メスマウス(n=52)を、ニューキャッスル大学動物サービスユニット(Animal Services Unit)によって得た。マウスを、動物供給施設内の、特定の無病原菌領域における、個別換気ケージ内に維持した。マウスを、PC2実験室内のTechni-Plast Slim Line空気調節システムに接続した、HEPA-filtered Techni-Plast Cages (1145 IVC)内、4匹の群で、12/12時間の明/暗周期で収容した。マウスに、Specialty Feeds、WA、Australia製造のマウスキューブ/ペレットを自由に摂取させた。標準マウス食は、低脂肪含量(およそ5%)に調合され、肉を含んでいない。室内の気流は、1時間あたり12から15回空気交換を行ったが、IVCケージ内の気流は1時間あたり70回交換する割合であった。マウスの尾にマジックで印をつけることにより識別した。動物試験は全て、動物倫理委員会によって承認されたプロトコールにしたがって行った。試験終結時、又はマウスが人道的なエンドポイントに到達した場合、CO2窒息によりマウスを安楽死させた。
【０１４７】
方法
ウイルスTCID50アッセイ
96ウエル組織培養プレート中、コンフルエント単層のSK-Mel-28細胞を、CVA21の10倍の段階希釈(100μL/ウエルを繰返し4つずつ)に接種し、5% CO2環境中37℃で72時間インキュベートした。マウス血清を、2%ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM中、1:102から1:108までの範囲で10倍段階希釈した。ウエルを、倒立顕微鏡下、肉眼で細胞変性効果(CPE)に対してスコア付けした。検出可能なCPEを有したウエルを陽性とスコア付けし、ウイルスのエンドポイント力価の50%を、Karber法(Dougherty、1964年)を用いて算出した。
【０１４８】
ウイルス中和アッセイ
中和抗体の存在に対して試験するために、熱不活化したマウス血清試料を最初に、DMEM (2% FCS)中1:32から1:2048に希釈した。各血清希釈物100マイクロリットルを、CVA21 (100TCID50) 100μLと、37℃で1時間インキュベートした。この血清/ウイルス混合物50マイクロリットルを、次いで、384ウエルフォーマットにおいてSK-Mel-28細胞上に3つずつプレーティングした。A+IgG (陽性対照)は、Commonwealth Serum Laboratories (Sandoglobulin NF Liquid、バッチ番号:4322800002)から購入した。ウエルを、倒立顕微鏡下、肉眼でウイルス中和の存在(CPEがない)に対してスコア付けした。次いで、中和抗体の力価を、Karber法(Dougherty、1964年)を用いて算出した。
【０１４９】
メラノーマの免疫適格性B16-ICAM-1マウスモデル
6週齢から8週齢の間のC57BL/6メスマウス(Animal Services Unit、The University of Newcastle、Australia)52匹を、上記に記載したものと同じ条件下で収容した。腫瘍細胞を注射する3日前、マウスの後側腹を、電気バリカンを用いて剪毛して、十分な回復時間を与えた。B16-ICAM-1細胞をトリプシンで回収し、2回洗浄し、無菌PBS中に再懸濁した。調製した細胞の生存性を、トリパンブルー染色及びTC-10自動細胞計数機(Biorad、Hercules、California、USA)で分析することによって評価し、95%超の生存性を有する細胞調製物のみを異種移植に用いた。腫瘍移植前、動物を5%イソフルランで麻酔した。PBS体積50μL中B16-ICAM-1細胞2×105個を、マウスの後側腹に腫瘍を単回注射して皮内接種した。
【０１５０】
実施例1〜3において用いた処置群及びプロトコールの概要は、簡潔に述べると以下の通りである。
【０１５１】
実施例1において、動物を、対照抗体又は抗PD-1抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水、CVA21 (1×108/1回注射)、又はUV-不活化CVA21 (1×108/1回注射)のいずれかで処置した。腫瘍細胞埋込み後12日目に処置を開始し、動物に腫瘍内処置(0.1ml)を最初に与え、引き続き、直後に腹腔内抗体(0.2ml)を与えた。12日目に開始し、4コースの治療を3日毎にマウスに与え、腫瘍接種後21日目に終わった。実施例1に用いた処置スケジュールの概要を図1に示す。
【０１５２】
実施例2において、動物を、対照抗体又は抗PD-1抗体(それぞれ12.5mg/kg)のいずれかと併用して、食塩水、又はCVA21 (1×108TCID50/1回注射)のいずれかで処置した。腫瘍細胞埋込み後6日目に処置を開始し、動物に腫瘍内処置(0.1ml/1匹)を最初に与え、引き続き、直後に腹腔内抗体(0.2ml/1匹)を与えた。6日目に開始し、4コースの治療を3日毎にマウスに与え、腫瘍接種後15日目に終わった。その後、4週間の期間、毎週の間隔で、動物にCVA21(1×108TCID50/1回注射)の食塩水のさらなる追加の注射を与えた。実施例2に用いた処置スケジュールの概要を図8に示す。
【０１５３】
実施例3において、動物を、対照抗体又は抗CTLA-4抗体(それぞれ12.5mg/kg)と併用して、食塩水、CVA21 (1×108TCID50/1回注射)のいずれかで処置した。腫瘍細胞埋込み後7日目に処置を開始し、動物に腫瘍内処置(0.1ml)を最初に与え、引き続き、直後に腹腔内抗体(0.2ml)を与えた。10日目に開始し、間を3日離して4処置をマウスに与え、腫瘍接種後16日目に終わった。実施例3に用いた処置スケジュールの概要を図12に示す。
【０１５４】
実施例4において、7、10、13、及び16日目に、マウスを、上記に記載した通り(12.5mg/kg)、マウス抗PD-1、又は抗CTLA-4、又は抗PD-1+抗CTLA-4抗体、又はマッチさせた対照抗体のいずれかと併用して、静脈内食塩水又は静脈内CVA21 (1×108TCID50 [マウス18gと仮定して5.56×109TCID50/kg])のいずれかで処置した。食塩水又はCVA21処置は静脈内投与し、抗CTLA-4、抗PD-1、及び対照抗体は腹腔内投与した(1群あたりn=12〜14)。当業者であれば理解される通り、腹腔内投与は、抗体を血流中に入れる効果的な方法であり、そうして全身投与に好適なモデルを提供する。
【０１５５】
腫瘍を週2回測定し、腫瘍体積を、球状体の体積V=Π/6.a.b2に基づいて推定したが、式中、「a」及び「b」はそれぞれ腫瘍の最長及び最短の垂直直径である。毎週ベースで全てのマウスから、伏在静脈の静脈穿刺により採血し、室温で5分間、10000rpmで遠心分離して血清を回収した。血清試料を、さらなる試験まで-80℃で貯蔵した。腫瘍が潰瘍化した場合、又は体重の減少が10%を超えた場合、動物をCO2窒息によって人道的に安楽死させ、その他の場合はマウスを試験のエンドポイント時に安楽死させた(実施例1では45日目、実施例2では66日目、実施例3では77日目)。
【０１５６】
【表１】
2017506662.tif 000002
【０１５７】
統計学的分析
データは全て、GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software Inc.)を用いて分析及びプロットした。動物データの分析には、GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software Inc.)を用いて、処置群間の腫瘍体積における差を、二元配置のANOVA(反復測定あり)及びボンフェローニの事後検定を用いて比較した。生存曲線の比較を、ログランク(マンテルコックス)検定を用いて行った。
【０１５８】
結果
免疫適格性マウスモデルにおける併用の腫瘍崩壊ウイルス療法及び抗PD-1免疫療法のin vivo評価
CVA21及び抗PD-1の併用治療の取組みが、メラノーマの免疫適格性マウスモデルにおいて有効であるか否かを評価するために、C57BL/6マウスの後側腹上にマウスB16-ICAM-1腫瘍細胞(2×105)を、皮内に埋め込んだ。腫瘍を確立させた後、腫瘍接種後12、15、18、及び21日目に治療を開始した(図1を参照されたい)。食塩水又はCVA21は示した時間点に腫瘍内投与し、対照抗体又は抗PD-1抗体は腹腔内投与した。マウスを毎日モニタリングし、1週間に最高3回体重測定し、腫瘍体積を週2回、電気ノギスによって測定した。毎週の間隔で、伏在静脈からの血液サンプリングを行った。腫瘍接種後45日目に試験を終了した。
【０１５９】
抗PD-1又は対照抗体と併用の、食塩水、CVA21、又はUV不活化CVA21いずれかでの処置後の体重
1週間に最高3回、動物の体重を測り、結果を、FileMaker Pro及び記録保持用の自社開発の動物モニタリングデータベースを用いて電子的に記録した(Internal Ref: Experiment #53)。体重の生データを表2から10に見出すことができる。本発明者らの施設の動物飼育倫理委員会の要求を満たすために、体重を、また、動物モニタリングチェックリスト/記録に書き写した。いかなる時間点に処置群とNTCマウスとの間に、平均体重における統計学的な有意差は観察されなかった(Holm-Sidak法を用いて複数の比較用に補正した複数のt検定)が、31日目のUV-CVA21+抗PD-1群は例外であった(Prism 6 for Mac OS X Version 6.0c、GraphPad Software、La Jolla California USA、www.graphpad.com)。動物はCVA21及び抗PD-1療法に良好に耐容したと思われ、観察できる処置からの毒性はなかった。合計9匹の動物を、腫瘍の潰瘍化及び/又は10%を超える体重減少のため安楽死させた。体重の減少は、殆どの場合、腫瘍の潰瘍化及び関連する腫瘍負荷と関係していた。
【０１６０】
【表２】
2017506662.tif 000003
【０１６１】
【表３】
2017506662.tif 000004
【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
【表６】
2017506662.tif 000007
【０１６５】
【表７】
2017506662.tif 000008
【０１６６】
【表８】
2017506662.tif 000009
【０１６７】
表9、10、及び11は、本明細書の図の項に含まれる。
【０１６８】
抗PD-1又は対照抗体と併用の、食塩水、CVA21、又はUV不活化CVA21いずれかでの処置後の腫瘍体積データ
腫瘍体積を週2回、電気ノギスを用いて測定した。31日目までに、食塩水+対照抗体で処置したマウスは全て、腫瘍体積腫瘍の潰瘍化によって証明される進行性疾患のため、安楽死させた。図4に示す通り、UV-CVA21+対照抗体で処置した腫瘍における抗腫瘍活性は殆ど観察されなかった。35日目までに、腫瘍体積は全て増大し、人道的な最大のエンドポイントに到達し、安楽死を必要とした。最初の腫瘍開始体積に高度の変動性が存在し、活性CVA21+抗PD-1に最も好適な対照は、食塩水+抗PD-1よりむしろUV-CVA21+抗PD-1処置群とみなされた(治療が完了する前に3匹が安楽死を必要とした)。UV-CVA21+抗PD-1とCVA21+抗PD-1処置との間の24日目の腫瘍体積の比較により、両側のt検定を用いて有意差があったことが明らかになった(p<0.0039)。処置の活動期の間、UV不活化CVA21と比較して、生のCVA21+抗PD-1群におけるマウス間の腫瘍の有意な低減が最も顕著であり、最終的に殆どの群で腫瘍が再発した。
【０１６９】
免疫適格性マウスからのウイルスの排除、及び抗CVA21中和抗体のレベルの増大
12日目にウイルスを腫瘍内注射し、およそ45分後、ウイルス処置したマウスの血清中に感染性のCVA21が検出された。CVA21でさらに腫瘍内処置したにもかかわらず、血中を循環するウイルスは、第1週以内19日目までに排除された。生のCVA21で処置した動物は、最高レベルのCVA21中和抗体を生成し、26日目に最大に到達した。これらのマウスが機能的な免疫系を有していたことを考慮すると、血流からのCVA21の排出は予想外ではなかった。驚くべきことに、抗PD-1抗体の投与は抗ウイルス免疫応答を増強すると思われ、これらのマウスは1:228中和単位を超える抗CVA21抗体のレベルの増大を示し、45日目まで続いた。これは、より大きな度合いのウイルス複製及び後続の抗ウイルス抗体の生成を可能にする、抗PD-1抗体の作用の結果であり得る。この知見から、増強されたレベルの抗ウイルス抗体が生成されただけでなく、より高レベルの特異的な抗腫瘍抗体がこのプロセスにおいて産生された可能性が生じ、このような抗腫瘍抗体は、腫瘍負荷を低減する結果として臨床上の利点をもたらし得る(抗体依存的な細胞の細胞毒性)。
【０１７０】
抗PD-1と併用のCVA21、対、食塩水及び抗PD-1、で処置したマウスにおける生存の増強
抗PD-1抗体と併用のCVA21は、食塩水+対照抗体群と比較して、全生存における統計学的に有意な改善を実証した(p=0.014ログランク[マンテルコックス]検定)(図7E)。食塩水+抗PD-1と食塩水+対照抗体群とを比較すると、統計学的な有意差はなかった。これは、対照抗体と抗PD-1抗体との間に、生存に対する差がなかったことを示唆する。食塩水+抗PD-1の生存曲線を、CVA21+抗PD-1処置群と比較した場合、統計学的な差はなかった(p=0.4901ログランク[マンテルコックス]検定)(図7B)。この知見は、生存の主な効果は優先的に抗PD-1ベースであったことを示唆するが、抗PD-1を伴った場合、UV不活化CVA21と活性CVA21群との間を比較すると、生のCVA21がさらなる有意な生存時間の利点をもたらしたことが明らかになったのは若干意外であった。開始の腫瘍の変動性が高度であり、初期に安楽死させたため、相対的な延命効果を厳密に分析することは極めて困難であった。しかし、食塩水+抗PD-1群と比較した、生のCVA21+抗PD-1処置群の注目すべき延命効果の傾向が、活性な処置期間の間に観察された。
【０１７１】
考察
生のCVA21を抗PD-1抗体と併用して使用すると、食塩水+対照抗体処置群と比較して最良の全生存をもたらすことを、結果は示した。CVA21を抗PD-1抗体と併用すると、食塩水+対照抗体群と比較して全生存の統計学的に有意な改善を実証した(p=0.014ログランク[マンテルコックス]検定)(図7E)。食塩水+抗PD-1と食塩水+対照抗体群とを比較すると、統計学的な有意差はなかった。これは、対照抗体と抗PD-1抗体との間に、生存に対する差がなかったことを示唆する。食塩水+抗PD-1の生存曲線を、CVA21+抗PD-1処置群と比較すると、有意差がなかった(p=0.4901ログランク[マンテルコックス]検定)(図7B)。この知見は、本発明者らの限られた群のサイズに基づいて、生存の主な効果は優先的に抗PD-1ベースであったが、CVA21を加えても、食塩水ベースと比較して有意に増強しなかったことを示唆する。興味深いことに、抗PD-1を伴った場合、UV不活化CVA21と活性CVA21群との間の比較は、生のCVA21がわずかに長い生存時間をもたらし、統計学的に有意であったことを示した。これは、積極的に複製するCVA21、及び腫瘍細胞の溶解は、不活化したウイルス粒子と比較して、抗腫瘍免疫性を、免疫賦活性抗PD-1抗体の存在下でより有効に刺激し得るという本発明者らの仮説と整合的である。UV不活化CVA21+抗PD-1抗体群の生存は、UV不活化CVA21+対照抗体、又はCVA21+対照抗体群の生存と統計学的に差がなかった。
【０１７２】
本試験の重要な知見は、CVA21+抗PD-1で処置した担癌マウスは、腫瘍成長の減速及び腫瘍の潰瘍化の低減に関連する全体の延命効果を示したことである。処置の活性期の間、CVA21+抗PD-1抗体で処置した動物は、対照群に対して疾患の進行の緩徐化を示した。
【０１７３】
実施例2:免疫賦活抗体抗PD-1と併用の腫瘍崩壊CVA21ウイルス療法:腫瘍再負荷試験
本試験は、実施例1に記述した実験の延長であり、悪性メラノーマのB16-ICAM-1マウスモデルにおける、免疫賦活抗体抗PD-1と併用の、コクサッキーウイルスA21(CVA21)腫瘍崩壊ウイルス療法の有効性を調査するものである。実施例2のタイムライン表示を図8に示す。実施例1と異なり、実施例2の全体のタイムラインは66日であり、以下により詳しく記載する「腫瘍再負荷」が含まれた。実施例2で用いる材料と方法は、別の点では実施例1において記載した通りであったが、実施例2に用いるマウスは4週齢から6週齢の間であった。
【０１７４】
マウスの右後側腹上にB16-ICAM-1腫瘍を皮内に埋め込み(細胞2×105個)、6日間確立させた後、治療を開始した。6、9、12、及び15日目、マウスを、マウス抗PD-1抗体又はマッチさせた対照抗体(12.5mg/kg)のいずれかと併用の、食塩水又はCVA21(1×108TCID50[5.56×109TCID50/kg])のいずれかで処置した。食塩水又はCVA21処置は腫瘍内に投与し、抗PD-1及び対照抗体は腹腔内投与した(1群あたりn=12)。その後、4週間の期間、毎週の間隔で、食塩水又はCVA21(1×108TCID50[5.56×109TCID50/kg])のさらなる追加の注射を投与した。原発のB16-ICAM-1メラノーマ腫瘍を、デジタルノギスを用いて2日から3日毎に定期的にモニタリングし、腫瘍体積の算出は腫瘍のx/y平面における2本の最長の直交軸を用いて球状体に対する式に基づいた。潰瘍化、10%超の体重減少、又は2500mm3を超える腫瘍体積の徴候を示す腫瘍を有する動物を安楽死させた。
【０１７５】
31日目、残りの動物にB16マウスメラノーマ細胞(ヒトICAM-1受容体がないもの)1×105個を皮内に再負荷して、抗PD-1治療と併用のCVA21ウイルス療法後にマウスが頑強な抗腫瘍免疫応答を発症させたか否かを決定した。再負荷した動物37匹中、全動物が触知できる腫瘍を最終的に発症したが、B16腫瘍成長の開始が、既存のB16-ICAM-1腫瘍のCVA21+抗PD-1治療により遅れたことが示される傾向があった。
【０１７６】
抗PD-1抗体と併用のCVA21で処置した動物は、食塩水+抗PD-1抗体及び食塩水+対照抗体群における動物と比較して、生存における統計学的に有意な延長を示し(それぞれ、生存の中間値60日対45日対28日)、CVA21+抗PD-1は臨床上の設定において有益であり得ることが示唆された。CVA21+抗PD-1の使用は、メラノーマのこの免疫適格性マウスモデルにおいて良好に耐容されることが見出され、試験した薬剤に関する有害事象はなかった。
【０１７７】
抗PD-1又は対照抗体と併用の、食塩水又はCVA21いずれかでの処置後の体重
個々の動物の体重を収集し、実施例1に記載した通りに分析した。あらゆる時間点で、処置群とNTCマウスとの間に、平均体重における統計学的な有意差は観察されなかった(結果は示さず、Holm-Sidak法を用いて複数の比較用に補正した複数のt検定)[Prism 6 for Mac OS X Version 6.0c、GraphPad Software、La Jolla California USA、www.graphpad.com]。動物はCVA21及び抗PD-1治療に良好に耐容したと思われ、処置からの観察できる毒性はなかった。体重の減少は大多数の場合、腫瘍の潰瘍化及び関連する腫瘍負荷と関係していた。
【０１７８】
B16-ICAM-1一次小節の腫瘍体積
腫瘍体積を週3回、電気ノギスを用いて測定した。42日目までに、食塩水+対照抗体で処置したマウスは全て、腫瘍体積腫瘍の潰瘍化によって証明される進行性疾患のため、安楽死させた。図9に示す通り、食塩水+対照抗体処置した腫瘍における抗腫瘍活性は殆ど観察されなかった。腫瘍体積は全て増大し、人道的な最大のエンドポイントに到達し、安楽死を必要とした。CVA21+抗PD-1処置群は最良の応答を示し、腫瘍開始は顕著に遅延し、6匹だけが、試験の後半に向けて原発腫瘍の成長の徴候を示した。
【０１７９】
B16二次小節の腫瘍体積
抗PD-1処置と併用のCVA21治療後に、頑強な抗腫瘍の免疫応答が発生したか否かを確立するために、B16マウスメラノーマ細胞をマウスに再負荷した。B16細胞にはヒトICAM-1受容体がなく、したがってCVA21治療に抵抗性である。これらの細胞は、B16-ICAM-1細胞株を産生するのに用い、原発腫瘍の後続の腫瘍崩壊を生じた可能性がある抗腫瘍の免疫応答の存在を同定するのに用いたB16細胞に抗原性が似ている。図10に見られる通り、B16腫瘍は、B16細胞を再負荷した全てのマウスに最終的に発症したが、45日目、食塩水+対照抗体群の平均腫瘍体積は、食塩水+抗PD-1、CVA21+対照抗体、及びCVA21+抗PD-1抗体群より統計学的に大きかった(二元配置のANOVA)。
【０１８０】
抗PD-1と併用のCVA21、対、食塩水及び抗PD-1、で処置したマウスにおける生存の増強
抗PD-1抗体と併用のCVA21は、食塩水+対照抗体群と比較して、全生存における統計学的に有意な改善を実証した(p<0.0001ログランク[マンテルコックス]検定)(図11)。CVA21+対照抗体及び食塩水+対照抗体群を比較すると、統計学的な有意差はなかった。食塩水+抗PD-1の生存曲線をCVA21+抗PD-1処置群と比較した場合、統計学的な差が存在した(p=0.0026ログランク[マンテルコックス]検定)(図11)。この知見は、CVA21は抗PD-1抗体と併用して使用すると、有意な生存効果をもたらしたことを示唆する(食塩水+抗PD-1及びCVA21+抗PD-1に対してそれぞれ生存の中間値は、45日対60日)。
【０１８１】
考察
実施例2の結果は、CVA21を抗PD-1抗体と併用して使用すると、食塩水+抗PD-1抗体処置を投与した動物群と比較して、担癌マウスの全生存を改善したことを示した。CVA21を抗PD-1抗体と併用すると、食塩水+対照抗体群と比較して、全生存における統計学的に有意な改善を実証した(p<0.0001ログランク[マンテルコックス]検定)(図11)。CVA21の抗PD-1との併用の処置レジメンは良好に耐容され、試験物品に起因する有害事象はなかった。本試験の主な知見は、CVA21+抗PD-1で処置した担癌マウスは、腫瘍成長の減速に関連する全体の延命効果を示したことであった。CVA21+抗PD-1抗体で処置した動物は、対照群に対して疾患の進行の緩徐化を示し、二次性B16腫瘍での再負荷に対して、より抵抗性であった。
【０１８２】
実施例3:免疫賦活抗体抗CTLA-4と併用の腫瘍崩壊CVA21ウイルス療法:腫瘍再負荷試験
本試験は、悪性メラノーマのB16-ICAM-1マウスモデルにおける免疫賦活抗体抗CTLA-4と併用の、コクサッキーウイルスA21(CVA21)腫瘍崩壊ウイルス療法の有効性を調査するものである。
【０１８３】
マウスの右後側腹上にB16-ICAM-1腫瘍を皮内に埋め込み(細胞2×105個)、7日間確立させた後、治療を開始した。7、10、13、及び16日目、マウスを、マウス抗CTLA-4抗体又はマッチさせた対照抗体(12.5mg/kg)のいずれかと併用の、食塩水又はCVA21のいずれか(1×108TCID50[マウス18gと仮定して、5.56×109TCID50/kg])で処置した。食塩水又はCVA21処置は腫瘍内に投与し、抗CTLA-4及び対照抗体は腹腔内投与した(1群あたりn=12)。原発B16-ICAM-1メラノーマ腫瘍を、デジタルノギスを用いて2日から3日毎に定期的にモニタリングし、腫瘍の体積を腫瘍のx/y平面における2本の最長の直行軸を用いて球状体に対する式に基づいて算出した。潰瘍化、10%超の体重減少、又は2500mm3を超える腫瘍体積の徴候を示す腫瘍を有する動物を安楽死させた。B16-ICAM-1担癌マウスにおけるCVA21+抗CTLA-4治療は、他の処置群全てと比較して耐久性のある腫瘍の退行をもたらした。
【０１８４】
37日目、残りの動物にB16マウスメラノーマ細胞(ヒト-ICAM-1受容体がない)2×105個を皮内に再負荷して、抗CTLA-4治療と併用のCVA21ウイルス療法後にマウスが頑強な抗腫瘍免疫応答を発症したか否かを決定した。再負荷した動物34匹中、6匹以外の全ての動物が最終的に触知できる腫瘍を発症した(食塩水+抗CTLA-4、2匹、及びCVA21+抗CTLA-4、4匹は依然として腫瘍なしであった)。
【０１８５】
抗CTLA-4抗体と併用してCVA21で処置した動物は、食塩水+対照抗体群における動物と比較して、生存における統計学的に有意な延長を示し(生存の中間値72日対39日)、CVA21及び抗CTLA-4抗体単独の単一薬剤も同様であった。CVA21+抗CTLA-4と抗CTLA-4単一薬剤との間に統計学的な差はなかったが、CVA21+抗CTLA-4併用は、CVA21単独に対して生存の改善をもたらし(生存の中央値72日対56.5日)、この併用は臨床上の設定において有益であり得ることが示唆された。CVA21+抗CTLA-4の使用は、このメラノーマの免疫適格性マウスモデルにおいて良好に耐容されることが見出され、試験した薬剤に関する有害事象はなかった。
【０１８６】
抗CTLA-4又は対照抗体と併用の、食塩水又はCVA21いずれかでの処置した後の体重
個々の動物の体重を収集し、実施例1に記載した通りに分析した。あらゆる時間点で、処置群とNTCマウスとの間に、平均体重における統計学的な有意差は観察されなかった(結果は示さず、Holm-Sidak法を用いて複数の比較用に補正した複数のt検定) [Prism 6 for Mac OS X Version 6.0c、GraphPad Software、La Jolla California USA、www.graphpad.com]。動物はCVA21及び抗CTLA-4治療に良好に耐容したと思われ、処置からの観察できる毒性はなかった。体重の減少は大多数の場合、腫瘍の潰瘍化及び関連する腫瘍負荷と関係していた。
【０１８７】
B16-ICAM-1一次小節の腫瘍体積
腫瘍体積を週2回、電気ノギスを用いて測定した。45日目までに、腫瘍体積及び腫瘍の潰瘍化によって証明される進行性疾患のため、食塩水+対照抗体処置したマウスは全て安楽死させた。図13に示す通り、食塩水+対照抗体処置した腫瘍における抗腫瘍活性は殆ど観察されなかった。腫瘍体積は全て増大し、人道的な最大のエンドポイントに到達し、安楽死を必要とした。CVA21+抗CTLA-4処置群は最良の応答を示し、腫瘍開始における注目すべき遅延があり、試験の後半の間原発腫瘍の成長の徴候を示した動物はなかった。完全な腫瘍の退行とそれに続く永続的な応答が、いずれかの単独療法で処置した動物の60%に観察された。より興味深いことに、CVA21+抗CTLA-4併用治療で処置した動物全てが、原発腫瘍に対する完全な拒絶反応を実証した。
【０１８８】
B16二次小節の腫瘍体積
抗CTLA-4処置と併用のCVA21治療後に、頑強な抗腫瘍の免疫応答が発生したか否かを確立するために、B16マウスメラノーマ細胞をマウスに再負荷した。B16細胞にはヒトICAM-1受容体がなく、したがってCVA21治療に抵抗性である。これらの細胞は、B16-ICAM-1細胞株を得るのに用い、原発腫瘍の後続の腫瘍崩壊を生じた可能性がある抗腫瘍の免疫応答の存在を同定するのに用いたB16細胞に抗原性が似ている。77日目、抗CTLA-4+CVA21併用治療で処置した動物は、腫瘍の再負荷に対して40%の保護を実証し、それに比べて単一薬剤の抗CTLA-4抗体で処置した動物では25%の保護だった(図14)。
【０１８９】
抗CTLA-4と併用のCVA21、対、食塩水及び抗CTLA-4、で処置したマウスにおける生存の増強
試験中の動物の全生存。食塩水で処置した動物に対して比較した場合、全処置群が動物の全生存を有意に延長した。単一薬剤の抗CTLA-4(p=0.0068)、単一薬剤のCVA21(p=0.0067)、及びCVA21+抗CTLA-4+CVA21(p=<0.0001)。抗CTLA-4抗体と併用のCVA21は、食塩水+対照抗体群と比較して、全生存における統計学的に有意な改善を実証した(p<0.0001ログランク[マンテルコックス]検定)(図15)。CVA21+対照抗体と食塩水+対照抗体群とを比較すると、統計学的な有意差はなかった。食塩水+抗CTLA-4の生存曲線をCVA21+抗CTLA-4処置群と比較すると、統計学的な差があった(p=0.0026ログランク[マンテルコックス]検定)(図15)。この知見は、CVA21を、抗CTLA-4抗体と併用して使用すると、有意な延命効果をもたらしたことを示唆する(食塩水+抗CTLA-4及びCVA21+抗CTLA-4それぞれに対して生存の中間値45日対60日)。試験中の動物の生存の中間値を図15(B)に示す。CVA21+抗CTLA-4の併用治療を投与した動物は、生存の中間値が最長であった(72日)。
【０１９０】
考察
実施例3の結果は、CVA21を抗CTLA-4抗体と併用して使用すると、CVA21+対照抗体処置を投与した動物群と比較して、担癌マウスの全生存を改善したことを示した。CVA21+抗CTLA-4処置したB16-ICAM-1腫瘍は全て、77日までに退行した。CVA21を抗CTLA-4抗体と併用すると、食塩水+対照抗体群と比較して、全生存における統計学的に有意な改善を実証した(p<0.0001ログランク[マンテルコックス]検定)(図15)。45日目までに、食塩水+対照抗体処置したマウスは全て、腫瘍の進行及び/又は潰瘍化のため、安楽死させた。抗CTLA-4抗体と併用のCVA21の処置レジメンは良好に耐容され、試験物品に起因する明らかな有害事象はなかった。
【０１９１】
実施例3において提示する本試験の主な知見は、CVA21+抗CTLA-4で処置した担癌マウスは、B16-ICAM-1腫瘍成長の減速に関連する全体の延命効果を示したことであった。CVA21+抗CTLA-4抗体で処置した動物は、対照群に対して疾患の進行の阻害を示し、単一薬剤で処置した群と比較してB16二次腫瘍での再負荷に対して、より抵抗性であった。
【０１９２】
実施例4:免疫賦活抗体抗PD-1、抗CTLA-4、及び抗PD-1+抗CTLA-4腫瘍試験と併用の、静脈内腫瘍崩壊CVA21ウイルス療法
本試験は、悪性メラノーマのB16-ICAM-1マウスモデルにおける、免疫賦活抗体抗PD-1、抗CTLA-4、及び抗PD-1+抗CTLA-4と併用の、コクサッキーウイルスA21(CVA21)腫瘍崩壊ウイルス療法の有効性を調査する。
【０１９３】
マウスの右後側腹上に、B16-ICAM-1腫瘍を皮内に埋め込み(細胞2×105個)、7日間確立させた後、治療を開始した。7、10、13、及び16日目、マウスを、マウス抗PD-1又は抗CTLA-4又は抗PD-1+抗CTLA-4抗体又はマッチさせた対照抗体いずれか(12.5mg/kg)と併用の、静脈内食塩水又は静脈内CVA21のいずれか(1×108TCID50[マウス18gと仮定して、5.56×109TCID50/kg])で処置した。食塩水又はCVA21処置は腫瘍内投与し、抗CTLA-4及び対照抗体は腹腔内投与した(1群あたりn=12〜14)。原発B16-ICAM-1メラノーマ腫瘍を、デジタルノギスを用いて2日から3日毎に定期的にモニタリングし、腫瘍の体積を腫瘍のx/y平面における2本の最長の直行軸を用いて球状体に対する式に基づいて算出した。潰瘍化、10%超の体重減少、又は2500mm3を超える腫瘍体積の徴候を示す腫瘍を有する動物を安楽死させた。
【０１９４】
B16-ICAM-1一次小節の腫瘍体積
腫瘍体積を週2回、電気ノギスを用いて測定した。図16に示す通り、試験27日目、食塩水+対照抗体処置した腫瘍における抗腫瘍活性は殆ど観察されなかった。単一薬剤群は全て(CVA21、抗PD-1、及び抗CTLA-4)、食塩水群と比較して有意な腫瘍の低減を示した。併用処置群は全て、食塩水群と比較して腫瘍の低減を示したが、全般的に単一薬剤処置に関して有意にレベルが高かった。図16Bにおいて、試験の時間経過全体を通して平均腫瘍体積を分析することで、食塩水の対照動物と比較して、単一薬剤及び併用群の両方に有意な腫瘍の低減がやはり示された。注目すべき傾向が同定され、抗PD-1及びCVA21の併用は、単一薬剤のCVA21及び抗PD-1処置単独と比較して、腫瘍発生の動態の低減を示した。腫瘍発生の個々のスパイダープロットを図16Cに表す。データは、食塩水対照群と比較して、全処置群における触知できる腫瘍発生の発生率における有意な低減を示す。特に注目すべきは、単一薬剤の抗PD-1又は抗CTLA-4で処置した動物における検出できる腫瘍の存在と比較した、静脈内CVA21投与と併用した場合の抗PD-1及び抗CTLA-4両方における腫瘍の発生率の低下である。CVA21+抗PD-1+抗CTLA-4の併用治療で処置した動物は全て、試験27日目に原発腫瘍の発生に対する完全な拒絶を実証したという観察は、より驚くべきことである。
【０１９５】
実施例5:遠位腫瘍に対するCVA21の腫瘍内注射の全身効果
腫瘍内(i.t.)注射後、CVA21はICAM-1発現性腫瘍細胞に優先的に感染し、腫瘍細胞の溶解、及び全身性の免疫媒介性抗腫瘍応答をもたらす。進行メラノーマ患者における、i.t.送達されるCVA21のフェーズII試験は、注射した病変及び遠位の非注射の病変の両方における抗腫瘍活性を強調した(図17)。
【０１９６】
CALM試験(後期メラノーマにおけるCAVATAK(商標))は、処置又は非処置の切除不能ステージIIIC-IVM1cメラノーマを有する患者57人において、CVA21の腫瘍内投与の有効性及び安全性を調査するものであった。各患者に、最大体積4.0mL中、合計用量最高3×108.0TCID50のCVA 21(70kgの患者に対して約4.5×106TCID50/kg)を、1、3、5、8、22、43、64日目及びさらなる週3回の間隔で(最大10セットの注射まで)、疾患の進行又は過剰の毒性の発生が確認されるまで、i.t.投与により投与した。計画された各来所時の注射で、可能であれば、最大病変(複数可)から始めて(CVA21 2.0mLを2.5cm超の腫瘍中に注射、CVA21 1.0mLを1.5から2.5cm中に、CVA21 0.5mLを0.5から1.5cm中に)最大4.0mLまで、必要であれば超音波ガイドを用いて、用量多分割(hyper-fraction)のパターンで複数の病変に注射した。注射しようとする各腫瘍の長さを測定し、各腫瘍中に注射しようとするCVA21の体積を決定する。これらの体積の和が、投与に必要なCVA21の合計体積である。投与しようとするCVA21の最大体積は4.0mLである。CVA21での開始の注射後、直径<0.5cmまで低減したあらゆる注射病変に、病変が完全に消散するまで、記載した処置スケジュールにしたがってCVA21 0.1mLを注射した。6か月に免疫関連の無増悪生存期間(irPFS)を示す患者又はそれより良好な患者を、さらなる9シリーズの注射に適格とした。主要な適格基準は、18歳以上、ECOG 0〜1、及び少なくとも1つの注射可能な皮膚の、scの、又は結節状の腫瘍>1.0cmであった。主要エンドポイントが、処置後6か月のirPFSを有する評価できる患者54人中9人超で達成され、二次エンドポイントには1年生存及び観察可能な奏功率が含まれた。2段階のSimonのミニマックスデザインを使用した。ステージ1の患者35人を処置し、無意味条項(futility clause)は、これらの患者をステージ2に進行させる基準である、固形腫瘍における修正された応答評価 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) (RECIST 1.1;Eisenhauerら、2009年) 基準によって評価された3以上の客観的な応答の観察を必要とした(完全又は部分的、それぞれCR又はPR)。さらなる患者22人をステージ2に登録した。
【０１９７】
試験の主要エンドポイントは、6か月目にirPFSを示す評価できる患者57人中21人(38.6%)で実現され、irPFSの中央値は4.2か月(mos)であった。全奏功率(irRECIST)は28.1%(評価できる患者57人中16人)、6か月以上の耐久性の応答率は19.3%(57人中11人)であった。応答までの時間の中央値は2.8か月、1年生存率は75.4%であった(57人中43人)。フォローアップの中間値およそ16.5か月後、応答者における応答期間の中間値、及び全患者に対する全生存(OS)の中央値には到達しなかった。最も一般的な有害事象(AE)はグレード1の疲労、悪寒、局所注射部位反応、及び発熱であった。製品関連のグレード3又は4のAEは観察されなかった。
【０１９８】
患者における、注射した病変及び遠位の非注射の病変両方における抗腫瘍活性は明らかであり(図17)、後者の観察は特に、全身性の免疫媒介性抗腫瘍応答と一致した。CVA21媒介性の非注射の遠位の転移病変活性は、血清IL-8及びg-IFNの上昇したレベルという新規の血清サイトカインシグナチャーの可能性と関連付られたが、このことから、潜在的な活性全身性抗腫瘍免疫応答が生じたことが示される。
【０１９９】
転移性メラノーマを有する患者におけるプログラム死1(PD-1)及びCTLA-4の遮断は、腫瘍誘発性T細胞抑制の逆転に関与するメカニズムを介した実質的な腫瘍応答をもたらす。本明細書において実証する通り、CVA21及びPD-1又は抗CTLA-4の併用の遮断は抗腫瘍応答を増強し、それにより臨床活性の改善をもたらす。
【０２００】
実施例6:静脈内投与したCVA21は腫瘍細胞の遺伝子発現変化を誘発する
Balb-C SCIDマウスの左側腹上にSK Mel28細胞を埋め込んだ(0日目)。尾静脈中への注射により、マウスにCVA21又は食塩水のいずれかを静脈内投与した(14日目)。処置後3時間、6時間、24時間、及び72時間にマウスを安楽死させ、ウイルス及び細胞の遺伝子プロファイリング用に腫瘍を切除した。CVA21で処置したマウスからの腫瘍細胞に、インターフェロンg誘導性タンパク質10(IP-10)及びPD-L1の上方制御が観察された(図19)。
【０２０１】
細胞、培養条件、及びウイルスは、全般的に実施例1に記載した通りであった。6〜8週齢のSCID-BALB/cメスマウスをARC(Perth、Australia)から得、大学の動物維持施設内で、SPF条件下で収容した。SK-Mel-28細胞を、10%FCSを含むDMEM中で増殖させた。細胞を収集し、滅菌PBS中で2回洗浄した。細胞生存性>95%には異種移植が必要であったため、細胞の生存性をトリパンブルー染色によって評価した。細胞を滅菌PBS中に再懸濁し、氷上に維持して生存性を維持した。異種移植前、マウスをイソフルラン吸入によって麻酔した(4L/分、2%に維持)。マウスの後側腹中に、SK-Mel-28細胞2×106個を皮下注射した。マウスを毎日肉眼でモニタリングし、3日から4日毎に体重測定した。腫瘍の発生を、触知により3日から4日毎にモニタリングした。電気ノギスを用いて腫瘍を測定し、腫瘍体積の推定値は上記に記載した通りであった(実施例1)。
【０２０２】
腫瘍が触知可能になったら(体積およそ50mm3)、マウスをイソフルランで麻酔し(4L/分、2%に維持)、CVA21 1×107TCID50又は滅菌PBS(合計体積100μL)を眼窩後の経路によって投与した。各腫瘍モデルからのマウス4匹(そのうち2匹はPBSで処置し、2匹はCVA21で処置した)を引き続き、処置後3、6、24、及び72時間に、CO2窒息によって安楽死させた。心穿刺によって血液を採取した。腫瘍を切除し、RNAを安定化させるために4℃のRNALater(QIAGEN)中に貯蔵した。血清(開始時の希釈1:10〜1:100)を、以下の通り、3回ずつ、エンドポイントウイルス感染性アッセイによって感染性ウイルスの存在に対してアッセイした。
【０２０３】
感染した試料中のCVA21の力価を決定するために、SK-Mel-28細胞を96ウエルプレートに接種し、2%FCSを含むDMEM中、50〜80%の培養密度で増殖させた。細胞の単層を、精製したCVA21の10倍段階希釈で、2%FCSを含むDMEM中3つずつ又は4つずつ接種し、5%CO2環境中、37℃で72時間インキュベートした。鏡検時にCPEを示したウエルを陽性とスコア付けした。50パーセント感染のエンドポイント力価を、Karber法(Dougherty、1964年)を用いて算出した。全RNAを、RNEasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、製造元のプロトコールにしたがって、異種移植片組織から抽出した。ウイルスRNAを、Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)を用いて、製造元のプロトコールにしたがって、血清から抽出した。
【０２０４】
腫瘍及び血清試料から抽出したRNAを分析して、リアルタイム定量RT-PCRを用いて存在するCVA21 RNAのレベルを決定した。1ステップRT-PCRを、SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen)を用いて行った。プライマー及びプローブは、CVA21(Kuykendall)ゲノムのVP3領域に特異的であり、Primer Express 1.5 Software (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いてデザインされた。フォワードプライマー(KKVP3fwd)に対する配列は5'-GAGCTAAACCACCAACCAATCG-3'であり、リバースプライマー(KKVP3rev)は5'-CGGTGCAACCATGGAACAA-3'であった。使用した、FAM標識化したプローブ(KKVP3)は6FAMCACACACATCATCTGGGA-MGBであった。25μLの体積中、反応混合物は、1×SuperScript反応混合物、フォワードプライマー500nM、リバースプライマー500nM、プローブ250nM、ROX 500nM、SuperScript III RT/Platinum Taq Mix 0.5μL、及び抽出したRNA 5μLを含んでいた。RT-PCR反応は、ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いて行った。サイクル条件は、60℃30分、引き続き95℃5分、次いで95℃5秒及び60℃1分を50サイクルであった。試料を、既知濃度の予め確認したCVA21 RNA標準に対して定量し、結果を、血清RNAに対して等価のTCID50/mL又は異種移植組織RNAに対してTCID50/mgとして記録した。
【０２０５】
cRNAを増幅し、ビオチン-dUTP標識を組み入れた。SK-Mel-28異種移植片から得たビオチン化cRNA試料を、製造元のプロトコールにしたがって、22000超の転写物に対応しているHumanRef-8 v2 Expression BeadChips (Illumina)にハイブリダイズさせた。ビーズチップアレイを、BeadStation 500 System (Illumina)を用いてスキャニングした。マイクロアレイのデータを、GeneSpring 7.0ソフトウエア(Silicon Genetics、USA)を用いて分析した。データセットを、測定値<0.01から0.01を設定することによって変換し、次いでチップ毎に50パーセンタイルに、及び遺伝子毎に中央値に、さらに標準化した。各異種移植片モデル内で、各処置(PBS及びCVA21)並びに時間点(3、6、24、及び72時間)に対して得た各ペアのマウスからのデータセットを、複製-試料として分析した。複製-試料の少なくとも一方において、遺伝子を、陽性遺伝子発現(シグナル強度)に基づいてフィルターにかけた。
【０２０６】
細胞内ウイルス複製は、宿主の免疫系活性の微妙なバランスの標的化破壊(targeted disruption)を開始させる、魅力的なプロセスである。図19において、CVA21の、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ異種移植片への全身送達は、特に全身投与後24時間に始めて眼窩後の経路により、試験の期間を通して腫瘍組織内のCVA21特異的RNAのレベルを増大することによって証明される通り、著しい標的化ウイルス複製を誘発した。CVA21後3、6、24、及び72時間に遺伝子発現を分析することで、腫瘍の微小環境内のインターフェロン応答遺伝子の、特に、IFN-gに暴露された細胞から分泌されるケモカインであり、活性化T細胞を組織炎症部位中にリクルートする上で重要な役割を果たす、インターフェロン誘導タンパク質-10(IP-10)の著しい上方制御が明らかになった。活性化T細胞により提供されるIFN-gは免疫チェックポイント分子を上方制御することが分かっているので、PD-L1遺伝子の発現レベルをモニタリングした。図19に示す通り、CVA21の複製は全身投与後24〜72時間にピークに到達し、平行してIP-10及びPD-L1発現の増大が伴い、IFN-g活性が示された。メラノーマ腫瘍組織における標的化CVA21複製によって誘発される免疫アジテーション(immune agitation)に基づいて、本発明者らは、この免疫賦活性の事象は、両薬剤を併用して用いた場合に、免疫チェックポイント遮断の抗腫瘍活性を増大し得ることを予測する。
【０２０７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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