(57)【要約】  真菌細胞のゲノム中の標的部位でのゲノム改変用の組成物および方法が提供される。方法および組成物の態様は、真菌宿主細胞ゲノム中における所望の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入を促進するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌細胞のゲノム中の標的部位でドナーＤＮＡを挿入する方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノムのゲノム遺伝子座中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記ゲノム遺伝子座中の前記標的部位での前記ドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
【請求項２】
前記挿入が前記ドナーＤＮＡと前記真菌細胞の前記ゲノムとの間の相同組換えにより起きていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナーＤＮＡが前記ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列を含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナーＤＮＡの挿入により前記ゲノム遺伝子座の発現または機能が妨げられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナーＤＮＡが目的の遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーＤＮＡが目的の遺伝子産物をコードする発現カセットを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の遺伝子産物が目的のタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目的の遺伝子産物が表現型マーカーである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記表現型マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、優性な異種選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーＤＮＡが前記ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列を含み、前記ゲノム配列および前記標的部位がゲノム欠失標的領域に隣接しており、前記ドナーＤＮＡの挿入により、前記ゲノム配列および前記ゲノム配列に対して相同な配列が、前記ゲノム欠失標的領域を含むループアウト標的領域に隣接する、請求項１、２および４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｃ）前記ループアウト標的領域のループアウトを可能にする条件下で前記少なくとも１個の同定した真菌細胞を培養すること、および
ｄ）前記ループアウト標的領域のループアウトが起きている、前記培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を更に含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
真菌細胞のゲノム中の標的領域を欠失させる方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができ、および前記ドナーＤＮＡが前記標的部位で挿入されることを可能にすることができ、前記ドナーＤＮＡが前記真菌細胞のゲノム配列に対して相同な配列を含み、前記ゲノム配列および前記標的部位が前記真菌細胞ゲノム中の前記標的領域に隣接している、導入すること、
ｂ）前記ゲノム配列と前記ゲノム配列に対して相同な配列との間の相同組換えを可能にする条件下で前記真菌細胞の集団を培養すること、ならびに
ｃ）前記標的領域の欠失が起きている、前記培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
【請求項１３】
工程ａ）とｂ）との間に、前記集団から、前記標的部位での前記ドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定する工程を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドナーＤＮＡが前記ドナーＤＮＡと前記真菌細胞ゲノムとの間の相同組換えにより前記標的部位で挿入されない、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、およびＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項１〜１７および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、請求項１〜１８および２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号８に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項の記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１６、ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１４、およびＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１８（全てが２０１４年１２月１６日に出願されている）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に従って）ＥＦＳを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。ＥＦＳを介して提出した配列表テキストファイルには、２０１５年１２月１１日に作成したファイル「４０５３２−ＷＯ−ＰＣＴ−５＿２０１５−８３１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１４６キロバイトのサイズである）が含まれている。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌は、配列特異的にＤＮＡ中に二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｅａｋ）を導入することができる群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させている。Ｃａｓシステムは、短いＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）と（ｃｒＲＮＡにおいて可変ターゲティングドメインと呼ばれる一部に対する相同性によって）特定のＤＮＡ配列を標的とするＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）とを含むリボ核タンパク質複合体の活性により機能を発揮し、標的中で二本鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲの遺伝子座は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で初めて認識され（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３、Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６）、その後、同様の散在した短い配列反復が多くの細菌種（ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられるがこれらに限定されない）で同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。
【０００４】
ゲノムＤＮＡ中における特定の標的部位での切断の誘導を使用して、この部位でまたはこの部位付近で改変を導入することができることは公知である。例えば、遺伝子ターゲティングのための相同組換えは、標的とするＤＮＡ部位が二本鎖切断を含む場合に増強されることが分かっている（例えばＲｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４、Ｓｍｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９を参照されたい）。Ｃａｓシステムの部位特異的性質を前提して、例えば哺乳動物細胞中での、このシステムに基づくゲノム改変／操作技術が説明されている（例えば「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という表題のＨｓｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．１５７，ｐ１２６２−１２７８，５  Ｊｕｎｅ  ２０１４を参照されたい）。Ｃａｓベースのゲノム操作の力は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡターゲティング領域（可変ターゲティングドメイン）がゲノム中の所望の標的部位に対して相同である組換えｃｒＲＮＡ（または同等に機能するポリヌクレオチド）を設計し、この組換えｃｒＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを宿主細胞中で（あらゆる好都合な手段によって）機能的複合体へと組み合わせることにより、複雑なゲノム内での任意の特定の位置を事実上標的とする能力に由来する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｃａｓベースのゲノム操作技術は多くの異なる宿主細胞型に適用されているが、真菌細胞中でのそのようなシステムの効率的な使用は困難であることが判明している。そのため、真菌細胞中でゲノム標的部位を改変するための／変更するための効率的で効果的なＣａｓベースのゲノム操作法および組成物を開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）のゲノム中の標的部位でドナーＤＮＡを挿入するためのガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの使用に関する組成物および方法が提供される。
【０００７】
本開示の態様は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でドナーＤＮＡを挿入する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノムのゲノム遺伝子座中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）この集団から、ゲノム遺伝子座中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞の集団に一時的に導入される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、この挿入はドナーＤＮＡと真菌細胞のゲノムとの間の相同組換えにより起きていない。
【０００９】
ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡはゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列を含まない。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、少なくとも１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個または５００個のヌクレオチドの長さを超えてゲノム配列に対して相同である配列を含まない。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、少なくとも２００個のヌクレオチドの長さを超えてゲノム配列に対して相同である配列を含まない。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入によりゲノム遺伝子座の発現または機能が妨げられる。ある特定のその他の実施形態では、この挿入によりゲノム遺伝子座の発現または機能は妨げられない。
【００１１】
この方法の一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは目的の遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡは目的の遺伝子産物をコードする発現カセットを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、目的の遺伝子または発現カセットは目的のタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は酵素である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、これらの多様体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。更にその他の特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、これらの多様体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、目的の遺伝子または発現カセットは表現型マーカーをコードし、例えば、検出可能マーカー、選択可能マーカー、優性な異種選択可能マーカー（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）、レポーター遺伝子、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー等をコードする（下記の説明を参照されたい）。あらゆる好都合な表現型マーカーを使用することができる。
【００１４】
この方法の一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列（本明細書では「反復配列」と称される場合がある）を含むが、または（例えばドナーＤＮＡが目的の遺伝子または発現カセットを含む実施形態では）更に含むが、この反復配列は、ゲノム遺伝子座中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入には使用されない。一部の実施形態では、この反復配列は少なくとも約１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個のヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態では、ゲノム配列（即ち、ドナーＤＮＡ中の反復配列が相同である配列）および標的部位はゲノム欠失標的領域に隣接する。このゲノム欠失標的領域は使用者により画定される領域である。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入により、ゲノム配列およびこのゲノム配列に対して相同な配列（ドナーＤＮＡに含まれる）が、ゲノム欠失標的領域を含むループアウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）標的領域に隣接する。本明細書では、ゲノム配列およびこのゲノム配列に対して相同な配列が両方とも「反復配列」と称される場合がある。表現型マーカーをコードする発現カセットをドナーＤＮＡが含む一部の実施形態では、ゲノム配列およびこのゲノム配列に対して相同な配列は、ゲノム欠失標的領域と表現型マーカー（例えば検出可能マーカー）とを含むループアウト標的領域に隣接する。（ドナーＤＮＡおよびゲノム遺伝子座の構造的特徴の例を示す概略図に関する図１を参照されたい）。
【００１５】
ある特定の実施形態では、この方法は、真菌細胞のゲノムからゲノム配列（ゲノム欠失標的領域）を欠失させる方法である。本開示のそのような態様では、この方法は、ｃ）ループアウト標的領域（即ち、ゲノム配列とこのゲノム配列に対して相同であるドナーＤＮＡ中の反復配列との間の領域）のループアウトを促進するまたは可能にする条件下にて、標的部位で挿入されているドナーＤＮＡを有する真菌細胞を培養すること、およびｄ）ループアウト標的領域のループアウトが起きている、培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定することを更に含む。このことを、選択可能マーカーを失っている真菌細胞のみが増殖することができる条件下で真菌細胞を培養することにより達成することができる。なぜならば、この選択可能マーカーはループアウト標的領域の一部だからである。
【００１６】
本開示の別の態様は、真菌細胞のゲノム中の標的領域を欠失させる方法であって、ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができ、およびドナーＤＮＡが標的部位で挿入されることを可能にすることができ、ドナーＤＮＡが真菌細胞のゲノム配列に対して相同な配列を含み、ゲノム配列および標的部位が真菌細胞ゲノム中の標的領域に隣接している、導入すること、ｂ）ゲノム配列とこのゲノム配列に対して相同な配列との間の相同組換えを可能にする条件下で真菌細胞の集団を培養すること、ならびにｃ）標的領域の欠失が起きている、培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞の集団に一時的に導入される、方法に関する。本明細書では、真菌細胞のゲノム配列に対して相同なドナーＤＮＡ上の配列が「反復配列」と称される場合がある。一部の実施形態では、この反復配列は、ゲノム遺伝子座中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入には使用されない。一部の実施形態では、この反復配列は少なくとも約１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個のヌクレオチドの長さである。
【００１７】
真菌細胞のゲノム中の標的領域を欠失させる方法のある特定の実施形態では、この方法は、工程ａ）とｂ）との間に、集団から、標的部位でのドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定する工程を更に含む。この方法の一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、このドナーＤＮＡと真菌細胞ゲノムとの間の相同組換えにより標的部位で挿入されない。
【００１８】
本明細書で説明する方法のある特定の実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）またはこの多様体である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種およびＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む。特定の実施形態では、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、例えば配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、少なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一性を有し、例えば最大で１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体を用いることができる。その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。
【００１９】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを真菌細胞に導入することは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の、ガイドＲＮＡ用のまたは両方用の発現カセットを含む１種または複数種のＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入することを含む。この１種または複数種のＤＮＡ構築物がいったん真菌細胞中に入ると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡが発現される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、導入する工程は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド、ガイドＲＮＡまたは両方を真菌細胞に直接導入することを含む。直接導入とＤＮＡ構築物の使用との任意の組み合わせを用いることができる（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを有するＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入し、同時にまたは望ましい場合には連続的に、この細胞にガイドＲＮＡを直接導入する）。
【００２１】
本明細書で説明する方法のある特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物中のＣａｓ発現カセットは、真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子を含む。例えば、糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子は、配列番号８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（配列番号１）をコードする）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００２２】
ある場合では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１種または複数種の核ターゲティングシグナル（核局在化シグナル／配列とも称される、ＮＬＳ）に作動可能に連結されている。配列番号９および配列番号１０はそれぞれ、Ｎ末端およびＣ末端でＮＬＳ配列を有する糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９遺伝子の一例とコードされるアミノ酸配列とを提供する。真核生物では多くの異なるＮＬＳが知られている。このＮＬＳとして、１分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）型、２分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）型および３分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）型が挙げられる。あらゆる好都合なＮＬＳを使用することができるが、例としてＳＶ４０  ＮＬＳ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子（ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）２）遺伝子に由来するＮＬＳまたは両方の組み合わせが挙げられる１分節型がやや好都合である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ用の発現カセットは、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、このプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、このプロモーターはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する。一部の実施形態では、このプロモーターは、配列番号１１または１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターは配列番号１１または１２の配列を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を含む。
【００２４】
本方法で使用される真菌細胞は糸状真菌細胞種であることができる。一部の実施形態では、この真菌細胞はユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である。ある特定の実施形態では、この真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される種である。一部の実施形態では、糸状真菌細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から選択される。酵母種等のその他の真菌細胞も用いることができる。
【００２５】
本開示の方法の使用者により選択される標的部位は、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置することができる。目的の遺伝子の例として、アセチルエステラーゼをコードする遺伝子、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子、アミラーゼをコードする遺伝子、アラビナーゼをコードする遺伝子、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、キシペプチダーゼをコードする遺伝子、カタラーゼをコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、クチナーゼをコードする遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、エピメラーゼをコードする遺伝子、エステラーゼをコードする遺伝子、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、α−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルカンリアーゼをコードする遺伝子、エンド−β−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルコアミラーゼをコードする遺伝子、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子、グルクロニダーゼをコードする遺伝子、ヘミセルラーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子、ヒドロラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、イソメラーゼをコードする遺伝子、ラッカーゼをコードする遺伝子、リパーゼをコードする遺伝子、リアーゼをコードする遺伝子、マンノシダーゼをコードする遺伝子、オキシダーゼをコードする遺伝子、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ペクテートリアーゼをコードする遺伝子、ペクチンアセチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチンデポリメラーゼをコードする遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチン分解酵素をコードする遺伝子、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子、フィターゼをコードする遺伝子、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、ラムノ−ガラクツロナーゼをコードする遺伝子、リボヌクレアーゼをコードする遺伝子、トランスフェラーゼをコードする遺伝子、輸送タンパク質をコードする遺伝子、トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子、キシラナーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞シグナル伝達、形態、増殖速度およびタンパク質分泌に関与する遺伝子に加えて、転写因子、リプレッサー等の制御タンパク質をコードする標的遺伝子、キナーゼ等のその他のタンパク質を改変するタンパク質をコードする標的遺伝子、翻訳後改変（例えばグリコシル化）に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子にも、Ｃａｓ媒介型編集を施すことができる。これに関して制限は意図されていない。
【００２６】
本方法の一部の実施形態では、目的の部位でゲノム改変を有する真菌細胞を同定する工程は、標的部位での改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む。そのような条件として、抗生物質選択条件、栄養要求性細胞（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌ）を選択するためのまたはスクリーニングするための条件および同類のものが挙げられる。
【００２７】
本開示の態様は、上記で説明した方法により製造されている組換え真菌細胞と、この方法の実施において親細胞として使用するための組換え真菌細胞とに関する。
【００２８】
本開示の方法および組成物の追加の実施形態を本明細書で示す。
【００２９】
下記の詳細な説明および本出願の一部を形成する添付図面から、本開示をより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での遺伝子欠失への純粋ＳｐｙＣａｓ９媒介型ＤＮＡ挿入（ｐｕｒｅ  ＳｐｙＣａｓ９  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）の使用のワークフローを示す図である。
【図２】ｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９のプラスミドマップを示す図である。
【図３】ｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）のプラスミドマップを示す図である。
【図４】ＳｐｙＣａｓ９ヌクレアーゼアッセイを示す写真である。レーン１、ＤＮＡラダー；レーン２およびレーン３、それぞれ水およびＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２の存在下でのＳｐｙＣａｓ９アッセイ。
【図５】フォーゲル−デンプン（グルコースフリー）プレートアッセイでの形質転換体の形態を示す写真である。ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡで処理したプレートから形質転換体１〜１４を選び、コントロールプレートから形質転換体Ｄ１〜Ｄ５を無作為に選択した。パネルＡ、通常のフォーゲル寒天プレート。パネルＢ、フォーゲル−デンプン（グルコースフリー）プレート。
【図６Ａ−６Ｃ】目的の遺伝子（ＧＯＩ）中の標的部位（またはプロトスペーサー「ＰＳ」）の位置に基づく挿入方向非依存性欠失カセットの設計（ドナーＤＮＡ）を示す図である。ゲノム配列を図６Ａ〜６Ｃそれぞれの上部で示し、ドナーＤＮＡをこれらの図それぞれの下部で示す。ＧＯＩのＣ末端／３’末端付近のＰＳ用のドナーＤＮＡの設計（図６Ａ）、ＧＯＩの中央のまたはこの中央付近のＰＳ用のドナーＤＮＡの設計（図６Ｂ）、ＧＯＩのＮ末端／５’末端付近のＰＳ用のドナーＤＮＡの設計（図６Ｃ）を示す。ＵＴＲ＝非翻訳、ＧＯＩ＝目的の遺伝子、Ｒ１＝反復配列１、Ｒ２＝反復配列２、ｐｙｒ２  ｅｘｐカセット＝ｐｙｒ２遺伝子用の発現カセット。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入で使用される組成物および方法を含む。この方法は、所望の標的部位を認識するおよびこの部位で二本鎖切断を導入して標的部位でのドナーＤＮＡ挿入を可能にする機能的ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を用いる。
【００３２】
本組成物および本方法をより詳細に説明する前に、本組成物および本方法は説明されている特定の実施形態に限定されず、当然のことながらそれ自体が変わり得ることを理解すべきである。本組成物および本方法の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定され得ることから、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明することを目的とするのみであり、限定することを意図されていないことも理解すべきである。
【００３３】
ある範囲の値が記載されている場合、この範囲の上限と下限との間に介在する各値（別途文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで）ならびにこの言及した範囲中におけるあらゆるその他の言及した値または間に介在する値が本組成物および本方法に包含されることが理解される。言及した範囲における任意の特定の除外された限度を条件として、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲にふくまれ得、本組成物および本方法にも包含され得る。言及した範囲が一方のまたは両方の限度を含む場合、これらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本組成物および本方法に含まれる。
【００３４】
本明細書では、ある特定の範囲が用語「約」に先行される数値で示される。用語「約」は本明細書において、この用語が先行する正確な数およびこの用語が先行する近いまたは近似的な数である数を文字通り補強するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近い数または近似的な数であるかどうかの判定では、列挙されていない近いまたは近似的な数は、この数が示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、この数値の−１０％〜＋１０％の範囲を意味する。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を意味する。
【００３５】
本明細書に記載した見出しは、本明細書全体の参照により有することができる本組成物および本方法の様々な態様または実施形態を限定するものではない。従って、真下で定義する用語は、本明細書全体の参照により更に完全に定義される。
【００３６】
本文書は、読みやすくするために多くの節に分かれているが、読者は、ある節での記載をその他の節に適用することができることを認識するだろう。このように、本開示の様々な節に使用される見出しは限定的に解釈されるべきではない。
【００３７】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本組成物および本方法が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本組成物および本方法の実施または試験では、本明細書で説明するものと類似のまたは等価のあらゆる方法および材料も使用することができるが、代表例の方法および材料をこれより説明する。
【００３８】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により援用されると具体的におよび個々に示されたかのように参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示するためにおよび説明するために参照により本明細書に援用される。引用したあらゆる刊行物はその開示が本出願日前であるが、本組成物および本方法が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないということを認めると解釈すべきはない。更に、記載されている公開日は、個々に確認する必要があるであろう実際の公開日とは異なる場合がある。
【００３９】
この詳細な説明に従って、下記の略語および定義を適用する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。そのため、例えば「酵素」への言及には複数のそのような酵素が含まれ、「投与量」への言及には、１回または複数回の投与量および当業者に既知のこの等量等への言及が含まれる。
【００４０】
あらゆる任意選択的な要素を除外するように特許請求の範囲を作成することができることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙または「消極的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用に関連して「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」および同類のもののような排他的な用語を使用するための先行する根拠として機能することが意図されている。
【００４１】
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で説明されているおよび示されている個々の実施形態はそれぞれ、個別の成分と、本明細書で説明する本組成物および本方法の範囲および趣旨から逸脱することなくその他のいくつかの実施形態の内のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたはこの特徴と容易に組み合わされ得る特徴とを有する。任意の列挙された方法を、列挙した事象の順序でまたは論理的に可能であるあらゆるその他の順序で実行することができる。
【００４２】
定義
本明細書で使用する場合、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドに関し、Ｃａｓタンパク質は、１種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的ＤＮＡ配列を切断することができる（例えば「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」という表題の米国特許第８６９７３５９号明細書を参照されたい）。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するＣａｓエンドヌクレアーゼの多様体もこの定義に含まれる。本明細書で詳述するドナーＤＮＡ挿入方法で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドにより導かれて二本鎖ＤＮＡ中の特定の標的部位（例えば、細胞のゲノム中の標的部位）を認識して切断する。いくつかの異なる型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが説明されており、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムおよびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに分類され得る（例えばＬｉｕ  ａｎｄ  Ｆａｎ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１４）８５：２０９−２１８での説明を参照されたい）。ある特定の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはあらゆる好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼであることができ、この好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））。Ｃａｓ９に関して多くのその他の種を使用することができる。例えば、機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体であって、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、例えば配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、少なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一���を有し、例えば最大で１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体を用いることができる。その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴により頑強なＤＮＡ干渉を媒介する。Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを欠いており、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを用いる。Ｃｐｆ１は、千鳥足状のＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。例えばＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３：７５９-７７１を参照されたい。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することできるおよびＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識して切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関する。このガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であることができる。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であることができる。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは「ガイドＲＮＡ」とも称される。
【００４４】
このガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも称される）であることができる。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の別々の分子を含む。この２個の別々の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができる。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。一実施形態では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはより多くのヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【００４５】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチドドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む単分子であることもできる。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができるヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。本開示の一実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。
【００４６】
二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して単一ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、標的細胞中で単一ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【００４７】
用語「可変ターゲティングドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書において互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性の％は少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、または１００％相補的である。ＶＴドメインは、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドの長さであることができる。一部の実施形態では、ＶＴドメインは１２〜３０個のヌクレオチドの連続ストレッチを含む。ＶＴドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４８】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば本明細書で説明する改変を参照されたい）またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４９】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドの長さであることができる。別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定されないがＧＡＡＡテトラループ配列等のテトラループ配列を含むことができる。
【００５０】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変を、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用のまたはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更および細胞透過性の増加の群から選択される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」（および等価物）には、ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断を誘導することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチド（単一または二重）との複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の極めて近くでＤＮＡ二本鎖をほどき、ガイドＲＮＡによる標的配列の認識時に両方のＤＮＡ鎖を切断するが、但し、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端で適切に配向されている場合に限られる。
【００５２】
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、「機能的に等価な断片」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの一部または部分配列を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的断片は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的断片は親ポリペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００５３】
用語「機能的多様体」、「機能的に等価である多様体」、「機能的に等価な多様体」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの多様体を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的多様体は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的多様体は親ペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００５４】
断片および変異体を、部位特異的な変異誘発および合成構築等のあらゆる好都合な方法により得ることができる。
【００５５】
用語「ゲノム」は、真菌細胞に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えばミトコンドリア）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【００５６】
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先（ｃｏｄｏｎ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子および変異遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、従って、これに関して制限は意図されていない。
【００５７】
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「制御配列」は、コーディング配列の上流（５’−非コーディング配列）、コーディング配列内またはコーディング配列の下流（３’−非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を意味しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５８】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は近位のおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントであってもよいしプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもいし天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、および／または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができることが当業者に理解される。ほとんどの場合では制御配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが更に認識される。当分野で公知であるように、プロモーターを、このプロモーターの強度および／またはこのプロモーターが活性である条件に従って、例えば構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性／抑制性プロモーター、組織特異的に／発達的に制御されるプロモーター、細胞周期依存性プロモーター等に分類することができる。
【００５９】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を意味する。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であるおよび逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むおよび細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であるおよびある特定の条件下で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列）との相補性であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを意味する。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「機能的に付着している」または「作動可能に連結されている」は、既知のまたは所望の活性を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の制御領域または機能的ドメイン（例えばプロモーター、エンハンサー領域、ターミネーター、シグナル配列、エピトープタグ等）が、この既知のまたは所望の活性に従って、制御領域または機能的ドメインが標的（例えば遺伝子またはポリペプチド）の発現、分泌または機能を制御することを可能にするような様式でこの標的に付着しているまたは連結されていることを意味する。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現を制御することができる場合には、このコーディング配列に作動可能に連結されている（即ち、このコーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）。
【００６１】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は当分野で公知である。
【００６２】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなり、当分野で公知である。
【００６３】
用語「組換え」は、生物学的な成分または組成物（例えば細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクター等）に関して使用される場合、この生物学的な成分または組成物が天然では見出されない状態にあることを示す。換言すると、この生物学的な成分または組成物は、ヒトの介入により天然の状態から改変されている。例えば、組換え細胞には、天然の親（即ち非組換え）細胞中で見出されない１種もしくは複数種の遺伝子を発現する細胞、天然の親細胞とは異なる量で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞、および／または天然の親細胞とは異なる条件下で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞が包含される。組換え核酸は、１個もしくは複数個のヌクレオチドで天然配列と異なり得る、異種配列（例えば異種プロモーター、非天然のもしくは変異のシグナル配列をコードする配列等）に作動可能に連結され得る、イントロン配列を欠くことができる、および／または単離型であり得る。組換えポリペプチド／酵素は、１個もしくは複数個のアミノ酸で天然配列と異なり得る、異種配列と融合され得る、トランケートされ得る、もしくはアミノ酸の内部欠失を有し得る、天然細胞中では見出されない様式で発現され得る（例えば、このポリペプチドをコードする発現ベクターの細胞中の存在に起因して、このポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から発現され得る）、および／または単離型であり得る。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチド／酵素は、野生型対応物と同一であるが非天然型（例えば単離型または富化型）である配列を有することが強調される。
【００６４】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、目的のポリヌクレオチド配列（例えば、細胞中で発現させる目的の遺伝子）を担持する染色体外エレメント（「発現ベクター」または「発現カセット」）を意味する。そのようなエレメントは概して、二本鎖ＤＮＡの形態であり、多くのヌクレオチド配列が連結されているまたは目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に組み換えられている（任意の起源に由来する）一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの（線状のまたは環状の）自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞中で発現させようとするポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする遺伝子であることができる。発現カセット／ベクターは概して遺伝子を含み、この遺伝子は、この遺伝子の宿主細胞中での発現を可能にするエレメントに作動可能に連結されている。
【００６５】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかでの機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を意味する。
【００６６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への挿入（例えば組換えＤＮＡ構築物／発現構築物）に関する「導入される」は、そのような課題を実施するためのあらゆる方法を意味しており、所望の生体分子の導入を達成するための「遺伝子導入」、「形質転換」、「形質導入」、物理的手段または同類のものの内のいずれかの手段を含む。
【００６７】
「一時的に導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）」、「一時的に導入される（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」、「一時的導入」、「一時的に発現する」および同類のものは、非永続的な方法で生体分子が宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入されることを意味する。二本鎖ＤＮＡに関して、一時的導入として、導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれず、そのため増殖中に全ての娘細胞に伝達されない状況と、導入されたＤＮＡ分子（染色体に組み込まれている可能性がある）が、あらゆる好都合な方法を使用して（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて、エピソームＤＮＡ構築物に関する陽性選択圧を除去することにより、選択培地を使用して染色体からの組込みポリヌクレオチドの全てまたは一部のループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ  ｏｕｔ）を促進することにより等）所望の時間で除去される状況とが挙げられる。これに関して制限は意図されていない。一般に、ＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボザイム等）またはポリペプチド（例えばＣａｓポリペプチド）の宿主細胞への導入は、この生体分子が複製されず、細胞増殖中に娘細胞に不確定に伝えられるという点で一時的と考えられる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体に関して、一時的導入は、標的とされたＣａｓエンドヌクレアーゼ活性を発揮するために両方の生体分子が必要とされることから、いずれかの成分が一時的に導入される状況をカバーする。そのため、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の一時的導入として、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの内のいずれか一方または両方が一時的に導入される実施形態が挙げられる。例えば、ガイドＲＮＡが一時的に導入される、ゲノムに組み込まれたＣａｓエンドヌクレアーゼ用発現カセット（そのため導入は一時的でなはない）を有する宿主細胞は、一時的に導入されたＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体（またはシステム）を有すると言うことができ、なぜならば、この機能的複合体は一時的に宿主細胞中に存在するからである。ある特定の実施形態では、導入する工程は、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む。逆を言えば、導入する工程は、（ｉ）ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にＣａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含むことができる。
【００６８】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチド）を意味する。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在している）を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るがこれに限定されない。
【００６９】
「安定した形質転換」は、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両方が挙げられる宿主生物のゲノム中への核酸断片の移動を意味しており、遺伝的に安定した遺伝がもたらされる（結果として得られる宿主細胞が本明細書で「安定した形質転換体」と称される場合もある）。対照的に、「一過性の形質転換」は、組み込まれることなくまたは安定して遺伝することなく遺伝子が発現される、宿主生物の核中へのまたはその他のＤＮＡ含有細胞小器官中への核酸断片の移動を意味している（本明細書では「不安定な形質転換」と称される場合もあり、結果として得られる宿主細胞が本明細書で「不安定な形質転換体」と称される場合もある）。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。
【００７０】
「真菌細胞」、「真菌」、「真菌宿主細胞」および同類のものは、本明細書で使用する場合、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とを含む。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｙｅａｓｔ）、および不完全菌（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を意味する。従って、酵母宿主細胞として、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞が挙げられる。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。
【００７１】
用語「糸状真菌細胞」は、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態を含む。糸状真菌属の適切な細胞として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
糸状真菌種の適切な細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・インターメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、チ��ラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）
およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
用語「標的部位」、「標的配列」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」（および等価物）は本明細書において互換的に使用され、ゲノム改変（例えばドナーＤＮＡの挿入およびその後の目的のゲノム領域の欠失）を促進するためにＣａｓエンドヌクレアーゼ切断が望ましい真菌細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、この用語が使用される文脈では、この用語の意味がわずかに変更され得る。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の標的部位は一般に非常に特異的であり、正確なヌクレオチド位置に定義され得ることが多いが、ある場合では、所望のゲノム改変用の標的部位は、ＤＮＡ切断が起こる部位のみと比べて広く定義され得る（例えばゲノムから欠失されるゲノム遺伝子座または領域）。そのため、ある特定の場合（Ｃａｓ／ガイドＲＮＡの活性により起こるゲノム改変）では、ＤＮＡ切断が「標的部位でまたは標的部位付近で」起こると説明される。標的部位は真菌細胞ゲノム中の内在性部位であり得る、或いは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、または標的部位を、天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドも含むことができる。そのため、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含む。ヌクレオチド（通常は５’−モノフォスフェート形態で見出される）は下記のように一文字記号で言及される：アデノシンまたはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）の場合の「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンの場合の「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンの場合の「Ｇ」、ウリジンの場合の「Ｕ」、デオキシチミジンの場合の「Ｔ」、プリンの場合の「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンの場合の「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴの場合の「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴの場合の「Ｈ」、イノシンの場合の「Ｉ」およびあらゆるヌクレオチドの場合の「Ｎ」。
【００７５】
用語「に由来する」は、用語「を起源とする」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」および「から生成される」を包含しており、別の特定の材料中に起源が見出されるまたは別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有するある特定の材料を一般に示す。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション反応を行う条件を意味する。この条件は概して、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度により分類される。このストリンジェンシーの程度は、例えば核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとすることができる。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。或いは、または加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの塩強度条件もしくはイオン強度条件ならびに／または１回もしくは複数回のストリンジェンシー洗浄（例えば、６×ＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中間のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中間ストリンジェンシーおよび０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシー）をベースとすることができる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定することができ、高ストリンジェンシー条件が使用されるとプローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列が同定される。高選択性を必要とする用途の場合、ハイブリッドを形成するのに比較的ストリンジェントな条件を使用することが概して望ましい（例えば、比較的に低い塩条件および／または高い温度条件が使用される）。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、当分野で既知であるように、核酸の鎖が塩基対合により相補鎖と結合するプロセスを意味する。より具体的には、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術中におよびＰＣＲ技術中に起こるように核酸の一本鎖が相補鎖と二本鎖（即ち塩基対）を形成するプロセスを意味する。中間〜高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の下で２種の配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸が結合する複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとする。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定することができ、中間のまたは低いストリンジェンシー条件を使用してポリヌクレオチド配列相同体を同定することができる、または検出することができる。
【００７８】
中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当分野で公知である。例えば、中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストランおよび２０ｍｈ／ｍＬの変性されて剪断されたサケ精子（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓｈｅａｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベートし、続いて約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣでフィルタを洗浄することにより実行することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）でのハイブリダイゼーションであることができる。或いは、高ストリンジェンシー条件を、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性担体ＤＮＡ中で約４２ｏＣにて実行することができ、続いて、室温にて２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで２回洗浄し、４２ｏＣにて０．１×ＳＳＣおよび０．５×ＳＤＳで更に２回洗浄する。そして、非常に高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃および０．１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションであることができる。プローブ長および同類のもの等の因子を適応させるために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法が当業者に知られている。
【００７９】
少なくとも２種の核酸またはポリペプチドの文脈における語句「実質的に類似」または「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、親配列もしくは参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは更に少なくとも９９％同一である配列を含むこと、または機能性を付加することなく本明細書を回避するためにのみ行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失もしくは修飾を含まないことを意味する。
【００８０】
核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。
【００８１】
用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を意味しており、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列を最適にアラインさせるために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ちギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。配列同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。この同一性を、本明細書で説明するプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
【００８２】
配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは類似性計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるだろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化された場合にソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味することができる。
【００８３】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用のおよび同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００８４】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００８５】
別途述べない限り、本明細書で提供される配列の同一性／類似性の値は、下記のパラメータを使用するＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を意味する：ギャップ生成ペナルティの重み（ｐｅｎａｌｔｙ  ｗｅｉｇｈｔ）５０、ギャップ長伸長ペナルティの重み３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列に関する同一性％および類似性％；ＧＡＰ生成ペナルティの重み８およびギャップ長伸長ペナルティの重み２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）を使用するアミノ酸配列に関する同一性％および類似性％。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化するおよびギャップの数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
【００８６】
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の同定で有用であることが当業者に理解されるだろう。同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性は本開示の説明に有用であり得、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。
【００８７】
「遺伝子」は、機能的分子（限定されないが、例えば特定のポリペプチド（例えば酵素）または機能的ＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等））をコードし、または発現させることができ、このコーディング配列に先行する制御配列（５’−非コーディング配列）および／または後続する制御配列（３’−非コーディング配列）を含む核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列と共に天然で見出される遺伝子を意味する。組換え遺伝子は、異なる生物または同一の生物に由来するであろう別の遺伝子の制御配列により制御される遺伝子を意味する。
【００８８】
「変異遺伝子」とは、人の介入により変更されている遺伝子のことである。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失または置換により、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異真菌細胞とは、変異遺伝子を含む真菌細胞のことである。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示するまたは当分野で既知である標的配列のＤＮＡ中で二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することにより行われた天然遺伝子中の変異のことである。
【００９０】
用語「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸配列」または「ドナーポリヌクレオチド」は、一般にはＣａｓ／ガイドポリヌクレオチド複合体の活性（上記で詳述したようにガイドポリヌクレオチドが標的部位を画定する）と関連して、真菌細胞のゲノム中の標的部位で挿入される目的のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、ゲノム遺伝子座中のゲノム配列（反復配列とも呼ばれる）に対して相同な配列を更に含む。「相同」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム配列に対する相同領域」とは、真菌細胞ゲノムの所与の「ゲノム配列」と類似する配列を有するＤＮＡの領域のことである。まとめると、本明細書では、ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列およびゲノム配列自体が「反復配列」と称される場合がある。相同領域は、反復配列と相同なゲノム配列（選択培養条件下で選択され得る）との間の相同組換えによりループアウト標的領域のループアウトを促進するのにまたは可能にするのに十分である任意の長さであることができる。例えば、反復配列は、少なくとも５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１１００、５０〜１２００、５０〜１３００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１６００、５０〜１７００、５０〜１８００、５０〜１９００、５０〜２０００、５０〜２１００、５０〜２２００、５０〜２３００、５０〜２４００、５０〜２５００、５０〜２６００、５０〜２７００、５０〜２８００、５０〜２９００、５０〜３０００、５０〜３１００個またはより多くの塩基の長さを含むことができる。「十分な相同性」は、２種のポリヌクレオチド配列（例えばドナーＤＮＡ中のおよび真菌細胞のゲノム中の直接反復配列）が、例えば適切な選択培養条件下で、反復配列間において配列をループアウトさせるのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性として、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とが挙げられる。配列類似性を、配列の全長にわたる配列同一性パーセントで、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチド等の局在化した類似性を含む保存領域および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「ゲノム領域」または「ゲノム遺伝子座」とは、標的部位（例えば、ゲノム欠失標的、およびドナーＤＮＡ中の反復配列に対して相同であるゲノム反復配列が挙げられる）のいずれかの側上に存在する或いは標的部位の一部も含む真菌細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことである。このゲノム領域は、少なくとも５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１１００、５０〜１２００、５０〜１３００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１６００、５０〜１７００、５０〜１８００、５０〜１９００、５０〜２０００、５０〜２１００、５０〜２２００、５０〜２３００、５０〜２４００、５０〜２５００、５０〜２６００、５０〜２７００、５０〜２８００、５０〜２９００、５０〜３０００、５０〜３１００個またはより多くの塩基を含むことができる。
【００９２】
「ゲノム欠失標的」および等価物とは、使用者が本開示の態様に従って欠失させようとする真菌ゲノム中の配列のことである（図１を参照されたい）。「ループアウト標的領域」および等価物とは、真菌ゲノム中において直接反復配列間の相同組換えによりループアウトされる、直接反復配列（例えばゲノム反復配列およびこのゲノム反復配列に相同であるドナーＤＮＡ中の反復配列）の間の領域のことである。ある特定の実施形態では、ループアウト標的領域は、ゲノム欠失標的、および真菌ゲノム中の標的部位で挿入されるドナーＤＮＡ上の選択可能マーカーを含む。表現型マーカーとは、陽性選択可能マーカーであるか陰性選択可能マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカーおよび選択可能マーカーが挙げられるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーのことである。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。具体的には、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合は特定の条件下で、ある分子またはこの分子を含む細胞を同定すること、この分子または細胞を選択することまたはこの分子または細胞を有利にもしくは不利にスクリーニングすることを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは活性（限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生等）をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物もしくは組成物および同類のものの結合部位を提供することができる。
【００９３】
選択可能マーカーの例として、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；クロリムロンエチル、ベノミル、バスタおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）等の別の毒性化合物および抗生物質に対する耐性を付与する生成物をコードするＤＮＡセグメント；普通はレシピエント細胞で欠失している生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、優性異種マーカー−ａｍｄＳ）をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定され得る生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ等の表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＲＰ）、青緑色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）および細胞表面タンパク質等の蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；ＰＣＲ用の新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていない２種のＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ改変酵素、化学物質等が作用するまたは作用しないＤＮＡ配列の包含；ならびに同定を可能にする特定の改変（例えばメチル化）に必要なＤＮＡ配列の包含が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９４】
真菌細胞ゲノムを改変するための方法および組成物
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）のゲノム中の標的部位でドナーＤＮＡを挿入するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。
【００９５】
本開示の態様は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体をドナーＤＮＡと一緒に真菌細胞に一時的に導入することによる、この細胞のゲノム中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入方法を含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は、真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することができる
【００９６】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチド、およびドナーＤＮＡの導入を、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突技術、細胞融合技術等が挙げられるあらゆる好都合な方法で行うことができる。これらの成分それぞれを、使用者が望むように同時にまたは順次に導入することができる。例えば、最初に、真菌細胞をＣａｓ発現ＤＮＡ構築物で安定的に遺伝子導入し、続いて、安定した遺伝子導入体に（直接的にまたはガイドポリヌクレオチド発現ＤＮＡ構築物を使用して）ガイドポリヌクレオチドを導入することができる。この仕組みは、使用者が、様々なガイドポリヌクレオチドを独立して導入することができる（ある場合では、複数種のガイドポリヌクレオチドを、このことが望まれるべき同一の細胞に導入することができる）安定したＣａｓ遺伝子導入真菌細胞の集団を生成することができることから有利でさえあり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ発現真菌細胞は使用者により得られ、そのため、使用者は、この細胞に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現することができる組換えＤＮＡ構築物を導入する必要がなく、むしろこのＣａｘ発現細胞にガイドポリヌクレオチド導入することのみが必要である。
【００９７】
ある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする発現カセット（または遺伝子）を含む組換えＤＮＡ構築物を導入することにより、ガイドポリヌクレオチドを真菌細胞に導入する。一部の実施形態では、この発現カセットは真核生物のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。このプロモーターは、ＲＮＡｐｏｌＩＩ依存性プロモーターからＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写時に起こる５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化をＲＮＡｐｏｌＩＩＩによる転写が生じないことから特に興味深い。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは、糸状真菌細胞のＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、配列番号１１およびこの機能的多様体、例えば配列番号１２）である。
【００９８】
（例えば、標的部位でのＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体（この複合体は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する）の活性により）宿主細胞のゲノムＤＮＡ中で二本鎖切断が導入される場合、細胞のＤＮＡ修復メカニズムは、（このエラーを起こしやすい性質に起因して）二本鎖切断部位での変異を起こし得る切断修復のために活性化される。破損した末端を結合させるための最も一般的な修復メカニズムは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は概して、この修復により維持されるが、欠失、挿入またはその他の再配列も起こり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）。
【００９９】
驚いたことに、本発明者らは、糸状真菌では、二本鎖切断での形質転換ＤＮＡの非相同挿入が、二本鎖切断での染色体ＤＮＡの２つの末端の間の単純な末端結合よりも高度に有利であることを発見した。従って、発現カセット含有ＤＮＡ構築物による形質転換によりＣａｓエンドヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡが提供される場合では、このＤＮＡ構築物またはこの断片が高頻度にて二本鎖切断で挿入される。この挿入は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ上のまたはガイドＲＮＡ発現構築物上のＤＮＡ配列と二本鎖切断の周りの配列との間に相同性がない場合に起こる。
【０１００】
このプロセスを利用して、あらゆる相同領域を必要とすることなく標的部位にドナーＤＮＡ全体を挿入するための効率的なメカニズムを提供することができる。
【０１０１】
形質転換により取り込まれたＤＮＡは、安定した様式にてゲノム中で一体化し得る、または一時的に維持され得る。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡがゲノム中に安定的に組み込まれることが望ましいが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットまたはガイドＲＮＡ発現カセットの組み込みは望ましくない。そのような実施形態では、この目標を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡの一時的な直接導入またはＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび／もしくはガイドＲＮＡ発現カセットの一時的導入により達成することができる。（例えば、ドナーＤＮＡによりコードされる遺伝子産物／マーカーを使用して）ドナーＤＮＡの組み込みに関して安定した形質転換体を選択することができ、またはスクリーニングすることができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットまたはガイドＲＮＡ発現カセットの組み込みに関して不安定な形質転換体（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットもしくはガイドＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ構築物上でコードされている別の遺伝子産物／マーカーの喪失）を選択することができる、またはスクリーニングすることができる。一部のその他の実施形態では（特に、宿主ゲノムから標的配列を欠失させる方法では）、たとえドナーＤＮＡであってもゲノム中に安定的に組み込まれることは望ましくないが、標的領域をループアウトさせるために相同組換えが起きるまで、一時的に組み込まれる必要がある。そのような場合では、ドナーＤＮＡの組み込みに関して不安定な形質転換体（例えばドナーＤＮＡによりコードされる遺伝子産物／マーカーの喪失）を選択することができる、またはスクリーニングすることができる。
【０１０２】
一時的な維持を不安定な表現型により認識することができる。例えば、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子の選択によりＤＮＡ取込みを認識することができる。形質転換および選択の後、形質転換体を数世代にわたり非選択条件下で増殖させた後に選択条件に戻すことができる。安定した形質転換体は、選択条件に戻した後に増殖することができるが、不安定な形質転換体は、形質転換ＤＮＡの喪失に起因して、選択条件に戻した後は増殖することができない。本発明者らは、真菌細胞／不安定な形質転換体中でＣａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを一時的に発現させることができることを実証している。
【０１０３】
不安定な形質転換体が望まれる実施形態では、自律複製を促すテロメア配列を有するプラスミドを使用することができる。自律複製用に設計されているその他のタイプのプラスミド（例えば、自利複製配列、セントロメア配列またはその他の配列を有するプラスミド）も用いることができる。驚いたことにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、複製開始点、自律複製配列、セントロメア配列またはテロメア配列が未知であるプラスミドを使用することができることを本発明者らは発見した。選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体をスクリーニングすることにより、ベクターＤＮＡが挿入されていない効率的な標的部位遺伝子改変が得られる（例えば、ドナーＤＮＡ中の相同領域との相同組換え）。
【０１０４】
本開示のある特定の実施形態は、真菌のゲノム中でＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび第１の選択可能マーカー（この発現カセットおよび第１の選択可能マーカーのその後の除去（ループアウト）を可能にするために反復配列が任意選択で隣接している）を組み込んでＣａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を製造することを含む。この細胞を様々な方法で用いて、標的部位でドナーＤＮＡの挿入等の目的の遺伝子改変を得ることができる。
【０１０５】
例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を、第２の選択可能マーカー（および任意選択で別のドナーＤＮＡ）を含むガイドＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ構築物で形質転換することができる。第２の選択可能マーカーを使用するために選択された宿主細胞は、このＤＮＡ構築物からガイドＲＮＡを発現することができ、このガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された目的の標的部位の標的化を可能にする。この宿主細胞を、第２の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体に関してスクリーニングすることにより、ＤＮＡ構築物が挿入されていない目的の改変部位（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）を有する宿主細胞を得ることができる。
【０１０６】
別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された部位の標的化を可能にするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたガイドＲＮＡを取り込むように誘導され得る。ある場合では、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡが取り込まれているおよび高頻度でガイドＲＮＡが同時に取り込まれていると予想される細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を担持する別のＤＮＡ構築物との両方の取込みを誘導することが望ましいであろう。上記のように、ベクターＤＮＡが挿入されていない目的の遺伝子改変（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）用の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体のスクリーニングが得られる。
【０１０７】
更に別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を使用して、「標的株」にＣａｓエンドヌクレアーゼをｉｎ  ｔｒａｎｓで供給することができる「ヘルパー株（ｈｅｌｐｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）」を生成することができる。簡潔に言うと、例えば、各株からのプロトプラストの融合により、または糸状真菌の種に応じた菌糸の吻合により、このヘルパー株と標的株との間で異核共存体を生成することができる。異核共存体の維持は、適切な栄養もしくはその他のマーカー遺伝子または各親株中の変異、および親株は増殖することができないが異核共存体は相補性に起因して増殖することができるような適切な選択培地上での増殖に依存するだろう。異核共存体形成時またはその後のいずれかで、ガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡを遺伝子導入により導入する。ガイドＲＮＡを直接導入してもよいし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子を有するＤＮＡ構築物を介して導入してもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはヘルパー株の核中で遺伝子から発現され、異核共存体の細胞質中に存在する。ＣａｓエンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡと会合し、ドナーＤＮＡが挿入されるゲノム中の所望の標的部位を標的とする活性複合体を生成する。その後、この異核共存体から胞子を回収し、標的部位で挿入されているドナーＤＮＡを有する標的株を回収するために選択またはスクリーニングにかける。発現カセットを使用してガイドＲＮＡを導入する場合、ガイドＲＮＡ発現構築物が安定的に維持されていない異核共存体を選択する。
【０１０８】
真菌細胞でのＤＮＡ修復に関して、本発明者らは、機能しているＮＨＥＪ経路の存在下では、エラーを起こしやすい修復が二本鎖切断部位での相同組換えよりも高度に有利であることを発見した。換言すると、糸状真菌細胞での二本鎖切断のＤＮＡ修復に関して、本発明者らは、機能しているＮＨＥＪ経路の存在下では、切断でのドナーＤＮＡの非相同挿入が（１）ＤＮＡ挿入を伴わない非相同末端結合および（２）所望の相同組換え部位を有するドナーＤＮＡによる二本鎖切断部位での相同組換えよりも高度に有利であることを発見した。
【０１０９】
ある場合では、ドナーＤＮＡは、真菌細胞のゲノム中の対応する第１のおよび第２の領域に対して相同である第１の領域および第２の領域を含み、これらの相同領域は一般に、ゲノムＤＮＡがＣａｓエンドヌクレアーゼにより切断される標的部位を含む、またはこの標的部位を囲む。これらの相同領域は、対応するゲノムの相同領域との相同組換えを促進し、またはこの相同組換えを可能にし、この相同組換えにより、ドナーＤＮＡとゲノムとの間でＤＮＡが交換される。そのため、この提供される方法により、真菌細胞ゲノム中での標的部位における切断部位でまたはこの切断部位付近でドナーＤＮＡの目的のポリヌクレオチドが組み込まれ、それによって元々の標的部位が変更され、それによって変更ゲノム標的部位が生じる。
【０１１０】
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同領域との間の構造的類似性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および真菌細胞ゲノムの「ゲノム領域」により共有される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更に１００％の配列同一性であることができる。
【０１１１】
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対する相同性を有することができる。一部の実施形態では、相同領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対して更に５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。更にその他の実施形態では、相同領域は、下流のゲノム領域に加えて標的部位の断片との相同性も有することができる。一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片を更に含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。
【０１１２】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドの発現構築物と同様に、（本明細書の他の箇所で論じているように）ドナーＤＮＡをあらゆる好都合な手段で導入することができる。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである（例えば「ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」という表題の国際公開第２０１３１４１６８０号パンフレットを参照されたい）。Ｃａｓエンドヌクレアーゼの例として、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））に由来するものが挙げられる（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼを参照されたい）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば真菌細胞中での発現に最適化されている最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（例えば、下記で説明するように、配列番号８を含むＣａｓ９コーディング遺伝子（例えば配列番号９））によりコードされる。
【０１１４】
ある特定の場合には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、核局在化シグナルをコードする１種または複数種のポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、その結果、細胞中で発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は核へと効率的に運ばれる。あらゆる好都合な核局在化シグナル、例えばＣａｓコドン領域の上流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＳＶ４０核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣａｓコドン領域の下流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来する核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。その他の核局在化シグナルを用いることができる。
【０１１５】
本開示のある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ領域（またはｃｒＲＮＡ断片）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含むガイドＲＮＡである。上記で示したように、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＣａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞のゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ある場合では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと独立したｔｒａｃｒＲＮＡとを含む二本鎖である。その他の場合では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域の両方を含む単一ＲＮＡ分子（本明細書において融合ガイドＲＮＡと称される場合がある）である。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対して融合ガイドＲＮＡを使用する利点の１つは、融合ガイドＲＮＡを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１１６】
本明細書で開示する方法で用いる宿主細胞は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とに由来するあらゆる真菌宿主細胞であることができる。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞である。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。追加の実施形態では、真菌細胞は糸状真菌細胞であり、糸状真菌細胞としてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、糸状真菌Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を本開示の方法の態様で使用する。
【０１１７】
標的部位が必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（またはＰＡＭ）を含む限り、本開示の方法を使用して真菌細胞ゲノム中の実質的にいかなる標的部位も標的とすることができる。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（５’から３’へ、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）を有し、そのため、ゲノム中の標的部位の選択に対する相当な制限を加えない。その他の既知のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは異なるＰＡＭ部位を有する（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼＰＡＭ部位を参照されたい）。
【０１１８】
標的部位の長さは変動することができ、例えば、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはより多くのヌクレオチドの長さである標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であることができ、換言すれば、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることが更に可能である。切断部位は標的配列内に存在することができる、または切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバージョンでは、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みが千鳥足状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであることができる一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。
【０１１９】
ある場合では、真菌細胞のゲノム中の活性多様体標的配列も使用することができ、このことは、標的部位が（ガイドポリヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列内の）ガイドポリヌクレオチド中の関連配列と１００％同一ではないことを意味する。そのような活性多様体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を含むことができ、活性多様体標的配列は生物学的活性を保持しており、従ってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の二本鎖切断を確認するためのアッセイは当分野で既知であり、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１２０】
目的の標的部位として、目的の遺伝子の領域内に位置する標的部位が挙げられる。目的の遺伝子内の領域の非限定的な例として、オープンリーディングフレーム、プロモーター、転写制御エレメント、翻訳制御エレメント、転写ターミネーター配列、ｍＲＮＡスプライス部位、タンパク質コーディング配列、イントロン部位およびイントロン強化モチーフ（ｉｎｔｒｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）が挙げられる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、真菌細胞のゲノム改変により検出可能な表現型効果が生じ、多くの場合には使用者の所望の結果である。非限定的な例として、選択可能な細胞増殖表現型（例えば抗生物質に対する耐性または感度、栄養要求性特性の獲得または喪失、増殖率の増加または低下等）、検出可能マーカー（例えば蛍光マーカー、細胞表面分子、発色酵素等）の発現、および培養上清中で活性が検出され得る酵素の分泌が挙げられる。
【０１２２】
真菌細胞のゲノムの改変により表現型効果が生じる場合、表現型マーカーである（または表現型マーカーをコードする）目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを用いることが多い。あらゆる好都合な表現型マーカーを使用することができ、この表現型マーカーとして、多くの場合は特定の培養条件下で、任意の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーを含む真菌細胞を同定する、選択するまたはこの真菌細胞を有利にもしくは不利にスクリーニングすることを可能にする、この任意の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーが挙げられる。そのため、本発明の一部の態様では、所望のゲノム改変を有する真菌細胞の同定は、標的部位で改変を有する細胞を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチド（ならびに任意選択でドナーＤＮＡ）が与えられている真菌細胞集団を培養することを含む。真菌細胞中の酵素活性（選択可能マーカーとも称される）の獲得または喪失（例えば抗生物質耐性の取得または栄養要求性マーカーの獲得／喪失）に関して評価すること等のあらゆるタイプの選択システムを用いることができる。
【０１２３】
ある場合では、真菌細胞中でのゲノム改変をあらゆる好都合な方法を使用して直接検出し、この方法として、シークエンシング、ＰＣＲ、サザンブロット、制限酵素分析および同類のもが挙げられ、そのような方法の組み合わせも挙げられる。
【０１２４】
一部の実施形態では、特定の遺伝子を本開示の方法を使用して改変の標的とし、この遺伝子として、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびこれらの組み合わせ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１２５】
本明細書で説明する方法を実行するための多くのバリエーションが存在する。例えば、真菌宿主細胞中で外来性配列として存在するＣａｓ発現カセットを有する代わりに、このカセットを真菌宿主のゲノムに組み込むことができる。この親細胞株の生成により、本明細書の他の場所で詳述するように、使用者が、後に目的のゲノム部位を標的とするであろう所望のガイドＲＮＡを（例えばガイドＲＮＡ発現ベクターとして）簡単に導入することが可能になるだろう。これらの実施形態の内の一部では、組み込まれたＣａｓ遺伝子を、必要に応じてゲノムからのその後のループアウト／除去のためにこのＣａｓ遺伝子に隣接するポリヌクレオチド複製配列を含むように設計することができる。
【０１２６】
本明細書で開示する組成物および方法の非限定的な例または実施形態は下記の通りである。
１．真菌細胞のゲノム中の標的部位でドナーＤＮＡを挿入する方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノムのゲノム遺伝子座中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記ゲノム遺伝子座中の前記標的部位での前記ドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
２．前記挿入が前記ドナーＤＮＡと前記真菌細胞の前記ゲノムとの間の相同組換えにより起きていない、実施形態１に記載の方法。
３．前記ドナーＤＮＡが前記ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列を含まない、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記ドナーＤＮＡの挿入により前記ゲノム遺伝子座の発現または機能が妨げられる、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．前記ドナーＤＮＡが目的の遺伝子を含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．前記ドナーＤＮＡが目的の遺伝子産物をコードする発現カセットを含む、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．前記目的の遺伝子産物が目的のタンパク質である、実施形態６に記載の方法。
８．前記目的の遺伝子産物が表現型マーカーである、実施形態６に記載の方法。
９．前記表現型マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、優性な異種選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子からなる群から選択される、実施形態８に記載の方法。
１０．前記ドナーＤＮＡが前記ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列を含み、前記ゲノム配列および前記標的部位がゲノム欠失標的領域に隣接しており、前記ドナーＤＮＡの挿入により、前記ゲノム配列および前記ゲノム配列に対して相同な配列が、前記ゲノム欠失標的領域を含むループアウト標的領域に隣接する、実施形態１、２および４〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．ｃ）前記ループアウト標的領域のループアウトを可能にする条件下で前記少なくとも１個の同定した真菌細胞を培養すること、および
ｄ）前記ループアウト標的領域のループアウトが起きている、前記培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を更に含む実施形態１０に記載の方法。
１２．真菌細胞のゲノム中の標的領域を欠失させる方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、ドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができ、および前記ドナーＤＮＡが前記標的部位で挿入されることを可能にすることができ、前記ドナーＤＮＡが前記真菌細胞のゲノム配列に対して相同な配列を含み、前記ゲノム配列および前記標的部位が前記真菌細胞ゲノム中の前記標的領域に隣接している、導入すること、
ｂ）前記ゲノム配列と前記ゲノム配列に対して相同な配列との間の相同組換えを可能にする条件下で前記真菌細胞の集団を培養すること、ならびに
ｃ）前記標的領域の欠失が起きている、前記培養中の少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
１３．工程ａ）とｂ）との間に、前記集団から、前記標的部位での前記ドナーＤＮＡの挿入が起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定する工程を更に含む実施形態１２に記載の方法。
１４．前記ドナーＤＮＡが前記ドナーＤＮＡと前記真菌細胞ゲノムとの間の相同組換えにより前記標的部位で挿入されない、実施形態１２または１３に記載の方法。
１５．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体である、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、およびＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、実施形態１５に記載の方法。
１７．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態１〜１７および１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、実施形態１〜１８および２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、実施形態１８に記載の方法。
２３．前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号８に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列である、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．前記真菌細胞が糸状真菌細胞である、実施形態１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、実施形態１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．実施形態１〜２８のいずれか一つの記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
【実施例】
【０１２７】
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は摂氏である。この実施例は本開示の実施形態を示すが例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこの実施例から、当業者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させることができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１２８】
実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＣＲＩＳＰＲ  ＳｐｙＣａｓ９の異種発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）遺伝子を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によりＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位で発現ベクターｐＥＴ３０ａに挿入し、結果としてプラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９を得た（図２）。図２のプラスミドマップで示すように、発現カセットの完全なコーディング配列は、５’から３’への方向で、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域をコードする配列（配列番号１３は開始コドンメチオニンを含む）、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードする配列（配列番号１４）、ＳｐｙＣａｓ９をコードする配列（配列番号１５）、およびＢＬＲ核局在化シグナルをコードする配列（配列番号１６）を含み、全てが作動可能に連結されている。この全コーディング配列を配列番号１７に示す。配列番号１３によりコードされるＮ−末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列を配列番号１８（１位でメチオニンを含む）に示し、配列番号１４によりコードされるＳＶ４０核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、配列番号１５によりコードされるＳｐｙＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号１に示し、配列番号１６によりコードされるＢＬＲ核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。配列番号１７によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【０１２９】
ｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９プラスミドをＲｏｓｅｔｔａ２（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に形質転換し、形質転換産物を、３４ｐｐｍのクロラムフェニコールおよび５０ｐｐｍのカナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ａｇａｒプレート上に広げた。コロニーを採取し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）２５ｍｌで２５０ｍｌの振とうフラスコ中にて２４時間にわたり培養した。
【０１３０】
実施例２：ＳｐｙＣａｓ９の精製
ＳｐｙＣａｓ９の精製に、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の組み合わせを適用した。簡潔に言うと、ＳｐｙＣａｓ９を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（（Ｒｏｓｅｔｔａ２（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳ、上記で説明した）を２４時間にわたりＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）２５ｍｌで２５０ｍｌの振とうフラスコ中にて培養し、遠心分離により回収した。細胞（約４０グラム）をペレット化し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＴＣＥＰ、Ｒｏｃｈｅから購入したプロテアーゼ阻害剤カクテル）４００ｍｌに再懸濁させ、超音波処理器（３５％パワー、２０分、２秒オン／３秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で溶解させた。溶解物を、４０分にわたる２００００ｇでの遠心分離により清澄化した。
【０１３１】
清澄化した溶解物  約４００ｍｌを、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ｋｙｌｉｎ−Ｂｅｌｌ  Ｌａｂ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｈａｉｍｅｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用して３０ｒｐｍ／分で振とうしつつ、４℃で一晩、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍｌと共にインキュベートした。遠心分離後、この樹脂をＸＫ２６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。平衡緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で広範囲に洗浄し、続いて洗浄緩衝液（平衡緩衝液中の２５ｍＭのイミダゾール）で広範囲に洗浄した後、平衡緩衝液中の２５０ｍＭのイミダゾールで標的タンパク質を溶出させた。
【０１３２】
親和性工程から集めた活性画分に０．８Ｍの最終濃度まで硫酸アンモニウムを添加し、２０ｍｌのフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。このカラムを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中の０．８Ｍから０．０Ｍへの硫酸アンモニウムの勾配で溶出させ、フロースルーを集めた。
【０１３３】
最後に、このタンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび１０％のグリセロール中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。最高純度の画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ＫＤａメンブランフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。最終タンパク質試料を、使用するまで４０％のグリセロール中にて−２０℃の冷凍庫で保存した。
【０１３４】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ切断アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＳｐｙＣａｓ９ＤＮＡ切断アッセイ用の基質ＤＮＡ断片の調製
ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｄ６００５）を使用して、ＲＬ−Ｐ３７に由来するならびにセロビオヒドロラーゼ１遺伝子、セロビオヒドロラーゼ２遺伝子、エンドグルカナーゼ１遺伝子およびエンドグルカナーゼ２遺伝子が欠失しているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１およびΔｅｇｌ２株、「四重欠失株」とも呼ばれる、国際公開第９２／０６１８４号パンフレットおよび国際公開第０５／００１０３６号パンフレットを参照されたい））からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ  １ｎｇを用い、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８４８３８９５）およびこの部分的な５’−ＵＴＲ（配列番号２２）を含むＤＮＡ断片を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＰＣＲキット（東洋紡株式会社、日本）とそれぞれ０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー：５’−ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ−３’（配列番号２３）および５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’（配列番号２４）とを使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏのＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キット（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｄ４０１３（５０））で精製して濃縮し、濃縮後のＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で測定した。
【０１３５】
配列番号２２（下記）は基質ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ＵＴＲ配列を小文字で示し、ＴｒＧＡ遺伝子を大文字で示す。選択したＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）を太字で示し（配列番号２５）、更なるループアウト実験に用いられる５００ｂｐの断片に下線を引いている（配列番号２６）。
【化１】
2017537647.tif 000003
【化２】
2017537647.tif 000004
【化３】
2017537647.tif 000005
【０１３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写およびＳｐｙＣａｓ９  ＤＮＡ切断アッセイ
ＴｒＧＡ遺伝子中の１つのＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２（配列番号２５））およびこのＶＴドメインに特有のＰＡＭを、下流のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび形質転換実験のために同定した。オリゴヌクレオチドをＧｅｎｅｒａｙによりｐＭＤ１８Ｔベクターに挿入し、結果としてｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）（図３）を得た（Ｔ７プロモーター配列、ＣＥＲドメイン配列およびＶＴドメインＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２配列に関して下記の配列番号２７を参照されたい）。それぞれ０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー：５’−ｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃ−３’（配列番号２８）および５’−ａａａａｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇ−３’（配列番号２９）を用いるＰＣＲにより、ｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）からｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写用のＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏのＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キット（Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｄ４０１３）で精製して濃縮し、濃縮後のＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度を測定した。
【０１３７】
上記の特定のＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．のＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キットを製造業者の指示に従って使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により、ＶＴドメインＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２のＲＮＡを生成した。転写されたＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．のＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを使用して精製した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）で測定した。
【０１３８】
ＳｐｙＣａｓ９ｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ切断アッセイを実施して、合成した単一ガイドＲＮＡの活性を確認した。このアッセイを開始するために、精製したＳｐｙＣａｓ９  １μｇ、基質ＤＮＡ断片２００ｎｇおよび単一ガイドＲＮＡ（またはコントロールとしての水）２００ｎｇを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む反応緩衝液１５μｌ中で一緒に混合した。アッセイを２０分にわたり摂氏３７で実行し、続いてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ６５５６）２μｇを添加した。反応を２０分にわたり４０℃で継続し、２０分にわたる８０℃での更なるインキュベーションにより終了させた。反応結果を、０．８％のアガロースゲル、３０分にわたる１４０ボルトでの泳動を使用して分析した。
【０１３９】
図４で示すように、特定の単一ガイドＲＮＡの存在下では、ＳｐｙＣａｓ９は基質ＤＮＡ断片を所望のサイズへと成功裏に切断することができ（レーン３）、このことから、合成したＲＮＡの機能が確認される。このガイドＲＮＡ（ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）の非存在下では基質ＤＮＡの切断が観測されない（レーン２）。
【０１４０】
配列番号２７は、Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２からなる転写用のテンプレート配列を示す。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示した。
【化４】
2017537647.tif 000006
【０１４１】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ取込み実験
プロトプラストの調製
プロトプラストを調製するために、アルファ−アミラーゼが更に欠失しているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の四重欠失株（上記で説明した）５×１０８個の胞子（３０℃で５日にわたりＰＤＡプレート上で増殖させた）を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコ中で発芽培地（米国特許第８，６７９，８１５号明細書で説明されているレシピ）５０ｍｌ中に播種し、１７０ｒｐｍで１７時間にわたり２７℃でインキュベートした。この液体体積を５０ｍｌのコニカルチューブ中に移して１０分にわたり３０００ｒｐｍで回転させることにより、菌糸体を回収した。上清をデカントし、菌糸体ペレットを１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液を使用して２回洗浄し、溶解酵素緩衝液１５ｍｌに再懸濁した。トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｌ１４１２））を、１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．８）に溶解させた、５０ｍｇ／ｍｌ）。細胞懸濁液を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコに移し、２００ｒｐｍで少なくとも２時間にわたり室温で振とうした。ガラス漏斗中で折り畳まれたＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｒｔ．Ｎｏ．４７５８５５）に通すろ過によって、プロトプラストをＧｒｅｉｎｅｒチューブに回収した。ろ過したプロトプラストの上に、０．６Ｍのソルビトール−０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を慎重に添加した。４０００ｒｐｍでの１５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集めた。プロトプラストを含む中間相を新しいチューブに移し、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を少なくとも等体積で添加した。４０００ｒｐｍでの５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集め、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して２回洗浄した。ペレットを、少なくとも１ｍｌの１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５−１０ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液に再懸濁し、顕微鏡下でプロトプラストの数を計数した。プロトプラスト懸濁液を、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−１０ｍＭのＣａＣｌ２  ４部および２５％のＰＥＧ６０００−５０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １部を使用して、将来の形質転換用に１ｍｌ当たり５×１０８個まで希釈した。
【０１４２】
検出カセットの調製
ＴｒＧＡ欠失カセットは、ｐｙｒ２プロモーター、ｐｙｒ２ＣＤＳおよびｐｙｒ２ターミネーターを含むｐｙｒ２（オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ）発現カセット、続いて更なるループアウト用の５００ｂｐの反復配列を含んだ。このＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列を配列番号３０で示す。
【０１４３】
下記の配列番号３０は、ＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列を示す。ｐｙｒ２プロモーター（配列番号３１）、ｐｙｒ２ＣＤＳ（配列番号３２）、ｐｙｒ２ターミネーター（配列番号３３）および５００ｂｐの反復配列（配列番号３４）をそれぞれ、小文字、イタリック体、太字および下線で示す。
【化５】
2017537647.tif 000007
【０１４４】
形質転換
取込み実験を開始するために、ＳｐｙＣａｓ９タンパク質２０μｇとｓｇＲＮＡ（ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２、実施例３で説明している）１６μｇおよびＮＥＢ緩衝液＃３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）２μｌとを混合し、最終体積を２０μｌに調整した。室温での３０分間のインキュベーション後、このＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプレミキサー（またはコントロールとしてのヌクレアーゼフリー水１８μｌに溶解したＮＥＢ緩衝液＃３  ２μｌ）と欠失カセット１０μｇとを混合し、最終体積が３０μｌであるプレミキサー溶液を形成した。このプレミキサーをプロトプラスト２００μＬ（１×１０８個）に添加し、３０分にわたり氷上で維持した。インキュベーション後、プロトプラストを、最少フォーゲルプレートの最上層とする冷却した溶融ソルビトール／フォーゲル寒天（最少フォーゲル寒天の１．１Ｍソルビトール）に添加した（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ，ｐｐ．７９−１４３およびＤａｖｉｓ，Ｒｏｗｌａｎｄ，ＮＥＵＲＯＳＰＯＲＡ，ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＯＦ  Ａ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））。このプレートを１週間にわたり３０℃でインキュベートした。詳細な工程は米国特許第８，６７９，８１５号明細書（参照により本明細書に援用される）で説明されている。
【０１４５】
数百の形質転換体を有するコントロールプレート（即ち、ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプレミックスを添加していない）と比べて、ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプレミキサーで処理したプロトプラストからは１４個しか形質転換体が得られなかった。フォーゲル−デンプン（グルコースフリー）プレートアッセイに基づくと、これら１４個の形質転換体の内の１３個（＞９０％）がＴｒＧＡノックアウト表現型を示した（図５）（ＴｒＧＡノックアウト表現型を有するコロニーは通常のフォーゲル寒天プレート上で増殖することができる（パネルＡ、全てのクローンが増殖した）が、グルコースフリーのフォーゲル寒天プレート上では増殖することができない（パネルＢ、ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプレミキサー処理からのクローン１〜４および６〜１４は増殖せず、このことから、これらのクローンはＴｒＧＡ欠損であることが実証された）。
【０１４６】
ＴｒＧＡノックアウト表現型を示す１３個全ての形質転換体（１〜４、６〜１４、図５）を、下流のループアウト実験のために新しいフォーゲルプレートに移して増殖させた。７日間の増殖後、全ての胞子を集めて所望の濃度まで希釈し（表１）、続いて１．２ｇ／ＬのＦＯＡを補充したフォーゲル寒天プレート上で広げてｐｙｒ２発現カセットのループアウトを選択した。コントロールプレートから無作為に選択した形質転換体（Ｄ１〜Ｄ５、表４）も同様に処理した。フォーゲル−ＦＯＡ上での７日間の増殖後、ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡで処理した形質転換体ではコロニーを観察したが、コントロール（ＳｐｙＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ処理なし）からは形質転換体が見られなかった（表１を参照されたい）。このことは、ｐｙｒ２発現カセットが、ｐｙｒ２発現カセットの単なる自然変異ではなくゲノム中に存在する反復配列とＴｒＧＡノックアウトカセットに存在する反復配列（配列番号３４）との間の組換え事象によりがループアウトされたことを示す。自然変異が根本的な原因であった場合、実験試料およびコントロール試料の両方がＦＯＡ耐性コロニーを有するはずである。
【０１４７】
【表１】
2017537647.tif 000008
【０１４８】
ループアウト株の検証
フォーゲル−ＦＯＡプレートから３２個のコロニーを無作為に選択し、それぞれ０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー：５’−ｇｇｔｇｔｔｔｇｇｔａｇｔａｇｃａａｔｇ−３’（配列番号３５）および５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’（配列番号３６）によるＰＣＲで確認した。各ＣＰＲ産物のシークエンシング後、予想されるループアウト配列（配列番号３７）を示す３個のコロニーを確認し、このことから、ＳｐｙＣａｓ９、特定のｓｇＲＮＡおよび欠失カセットの組み合わせを使用したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での標的遺伝子欠失の成功が実証された。
【０１４９】
配列番号３７は、ループアウト株のＰＣＲ産物の予想されるヌクレオチド配列を示す。上流および下流のＵＴＲ配列を小文字で示し（それぞれ配列番号３８および３９）、部分的なＴｒＧＡ  ＯＲＦ断片を大文字で示す（配列番号４０）。ループアウト実験後に保持される５００ｂｐの断片に下線を引いており（配列番号４１）、この断片は、ゲノム中におよびＴｒＧＡノックアウトカセット中に存在する反復配列（配列番号３４）と同一である。
【化６】
2017537647.tif 000009
【化７】
2017537647.tif 000010
【０１５０】
追加の実施形態
上記の実施例では、ドナーＤＮＡ（配列番号３０）が、一方向下でのみ挿入された場合にループ反応中で機能するように設計されたことに留意されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ断片の挿入はどちらの方向でも起こり得たという事実を考慮すると、両方の状態で機能するであろうドナーＤＮＡを設計することができた。図６Ａ〜６Ｃは、標的部位（図６Ａ〜６Ｃそれぞれにおいて「ＰＳ」と示す）での挿入方向にかかわらずループアウト反応中で機能するであろう３つの代替ドナーＤＮＡ設計を提供する。ドナーＤＮＡの配置についてのこれら３つの例は標的部位（またはプロトスペーサー、ＰＳ）の位置に基づく。
【０１５１】
図６Ａでは、標的部位は目的の遺伝子（ＧＯＩ）の３’末端付近に存在する。従って、ドナーＤＮＡは、ＧＯＩの上流（５’）であるゲノム配列に由来する２種の異なる反復配列（Ｒ１およびＲ２）を含む（矢印の方向は反復配列の５’から３’への方向を示す）。ドナーＤＮＡ中のＲ１反復配列およびＲ２反復配列はｐｙｒ２発現カセットに隣接しており、間にｐｙｒ２発現カセットを含む頭対頭の配置で配向されている。（任意の所望の検出可能／選択可能マーカーを用いることができることに留意されたい。また、図６Ａ〜６Ｃに示す要素の全般的な方向が重要であるが、これらの要素はＧＯＩに対して正確な位置に存在する必要はない。例えば、これらの要素は非コーディング領域中に存在することができる（例えばエンハンサー要素））。
【０１５２】
図６Ｂでは、標的部位はＧＯＩの中心付近に存在する。従って、ドナーＤＮＡは、尾対尾の配置でドナーＤＮＡの３’末端で配向されている２種の異なる反復配列（Ｒ１およびＲ２）を含む。ゲノムＲ１部位はＧＯＩの上流に存在し、ゲノムＲ２配列はＧＯＩの下流である。
【０１５３】
図６Ｃでは、標的部位は目的の遺伝子（ＧＯＩ）の５’末端付近に存在する。従って、ドナーＤＮＡは、ＧＯＩの下流（３’）であるゲノム配列に由来する２種の異なる反復配列（Ｒ１およびＲ２）を含む。ドナーＤＮＡ中のＲ１反復配列およびＲ２反復配列はｐｙｒ２発現カセットに隣接しており、間にｐｙｒ２発現カセットを含む尾対尾の配置で配向されている。
【０１５４】
図６Ａ〜６Ｃの各シナリオでは、いずれかの方向でのドナーＤＮＡの挿入により、ｐｙｒ２発現カセットおよび標的としたＧＯＩの相当な領域のループアウトを可能にすることができる。具体的には、いずれかの方向でのドナーＤＮＡの挿入により、所望の領域をループアウトするように機能することができる直接反復配列（Ｒ１：Ｒ１またはＲ２：Ｒ２のいずれか）を生成することができる。
【０１５５】
本開示では、所望の標的部位でのＳｐｙＣａｓ９媒介型ＤＮＡ断片挿入の適用、続いて反復配列間での組換え事象による下流のループアウトにより、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中でＴｒＧＡ遺伝子を成功裏に欠失させた。上記で説明した方法は、精製したＳｐｙＣａｓ９酵素およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したｓｇＲＮＡを使用して、これらの持続的な機能を有意に低下させるが、一時的な形質転換条件下で組換えＤＮＡによりコードされたＣａｓおよび／またはガイドＲＮＡのいずれかを用いる方法も使用することができる（即ち、不安定な形質転換体が選択される）。本開示の教示の適用により、広範囲の所望の結果のために用いることができる非常に効率的なおよび配列特異的なゲノム改変が可能になる。
【０１５６】
上述の組成物および方法は、理解を明確にするために例示および実施例により若干詳細に説明されているが、本明細書の教示を考慮して、添付した特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく上述の組成物および方法に対してある程度の変更および改変を行うことができることは当業者に容易に明らかである。
【０１５７】
従って、上述は本組成物および本方法の原理を単に例示しているにすぎない。本明細書で明確に説明されていないまたは示されていないが本組成物および本方法の原理を具体化するならびに本組成物および本方法の趣旨および範囲に含まれる様々な構成を当業者は考案することができることが認識されるだろう。更に、本明細書で列挙した全ての例および条件付き文言は、本組成物および本方法の原理ならびに当分野の促進に寄与する本発明者らによる概念の理解で読者を助けることが主に意図されており、そのように具体的に列挙された例および条件に限定されないと解釈すべきである。更に、本明細書において本組成物および本方法の原理、態様および実施形態を列挙する全ての記載ならびにこの具体例は、この構造および機能の両方の等価物を包含することが意図される。加えて、そのような等価物が、現在知られている等価物と将来創出される等価物（即ち、構造にかかわらず同じ機能を発揮する、創出されるあらゆる要素）との両方を含むことが意図される。従って、本発明および本組成物の範囲は、本明細書で示されたおよび説明された典型的な実施形態に限定されることが意図されていない。
【０１５８】
配列：
配列番号１
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ＮＬＳなし（配列番号８によりコードされる）
【化８】
2017537647.tif 000011
配列番号２
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９  Ｃａｓ９
【化９】
2017537647.tif 000012
配列番号３
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９  Ｃａｓ９
【化１０】
2017537647.tif 000013
配列番号４
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９
【化１１】
2017537647.tif 000014
配列番号５
ナイセリア・メニンジティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９
【化１２】
2017537647.tif 000015
配列番号６
フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜種ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化１３】
2017537647.tif 000016
配列番号７
パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化１４】
2017537647.tif 000017
配列番号８
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、ＮＬＳなし
【化１５】
2017537647.tif 000018
【化１６】
2017537647.tif 000019
配列番号９
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列あり
【化１７】
2017537647.tif 000020
【化１８】
2017537647.tif 000021
【化１９】
2017537647.tif 000022
配列番号１０
Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号９によりコードされる）
【化２０】
2017537647.tif 000023
配列番号１１
完全なＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化２１】
2017537647.tif 000024
配列番号１２
トランケートされた／短いＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化２２】
2017537647.tif 000025
配列番号１３
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のポリヌクレオチド配列（開始コドンあり）、配列番号１８をコードする
【化２３】
2017537647.tif 000026
配列番号１４
ＳＶ４０  ＮＬＳコーディング配列（配列番号１９をコードする）
ｃｃａａａａａａｇａａａｃｇｃａａｇｇｔｔ
配列番号１５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子（終止コドンなし）
【化２４】
2017537647.tif 000027
【化２５】
2017537647.tif 000028
配列番号１６
ＢＬＲ２核局在化シグナルコーディング配列（配列番号２０をコードする）
ａａｇａａｇａａａａａａｃｔｇａａａｃｔｇ
配列番号１７
プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９中におけるＳｐｙＣａｓ９合成遺伝子のヌクレオチド配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグをコードするオリゴヌクレオチド、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチド、およびＢＬＲ核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
【化２６】
2017537647.tif 000029
【化２７】
2017537647.tif 000030
配列番号１８
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列（開始メチオニンあり）
Ｍｈｈｈｈｈｈｓｓｇｌｖｐｒｇｓｇｍｋｅｔａａａｋｆｅｒｑｈｍｄｓｐｄｌｇｔｄｄｄｄｋａｍａ
配列番号１９
ＳＶ４０  ＮＬＳ
ＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号２０
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子（ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）２）遺伝子のＮＬＳ
ＫＫＫＫＬＫＬ
配列番号２１
プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９から発現されるＳｐｙＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、ＳＶ４０核局在化シグナルおよびＢＬＲ核局在化シグナルをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
【化２８】
2017537647.tif 000031
配列番号２２
基質ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ＵＴＲ配列を小文字で示し、ＴｒＧＡ遺伝子を大文字で示す。選択したＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２）を太字で示し、更なるループアウト実験に用いられる５００ｂｐの断片を下線で示す。
【化２９】
2017537647.tif 000032
【化３０】
2017537647.tif 000033
【化３１】
2017537647.tif 000034
配列番号２３
配列番号２２用のフォワードプライマー：
５’−  ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ−３’
配列番号２４
配列番号２２用のリバースプライマー：
５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’
配列番号２５
ＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２  ＶＴドメイン
ＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣ
配列番号２６
更なるループアウト実験に用いられる５００ｂｐの断片
【化３２】
2017537647.tif 000035
配列番号２７
Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿Ｓｔｈ＿ｓｇＲ２からなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写用のテンプレート配列。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
【化３３】
2017537647.tif 000036
配列番号２８
フォワード
５’−ｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃ−３’
配列番号２９
リバース
５’−ａａａａｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇ−３’
配列番号３０
ＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列。ｐｙｒ２プロモーター、ｐｙｒ２  ＣＤＳ、ｐｙｒ２ターミネーターおよび５００ｂｐの反復配列をそれぞれ小文字、イタリック体および下線、太字ならびに下線で示した。
【化３４】
2017537647.tif 000037
配列番号３１
ｐｙｒ２プロモーター
【化３５】
2017537647.tif 000038
配列番号３２
ｐｙｒ２  ＣＤＳ
【化３６】
2017537647.tif 000039
配列番号３３
ｐｙｒ２ターミネーター
【化３７】
2017537647.tif 000040
配列番号３４
５００ｂｐの反復配列
【化３８】
2017537647.tif 000041
配列番号３５
ｇｇｔｇｔｔｔｇｇｔａｇｔａｇｃａａｔｇ
配列番号３６
ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ
配列番号３７
ループアウト株のＰＣＲ産物の予想されるヌクレオチド配列。ＵＴＲ配列を小文字で示し、部分的なＴｒＧＡ  ＯＲＦ断片を大文字で示し、ループアウト後に保持される５００ｂｐの断片（反復配列）に下線を引いている。
【化３９】
2017537647.tif 000042
【化４０】
2017537647.tif 000043
配列番号３８
配列番号３７から上流のＵＴＲ配列
【化４１】
2017537647.tif 000044
配列番号３９
下流のＵＴＲ配列
配列番号３７からのＴｇａａｔｃｇｇｃａａｇｇｇｇｔａｇｔａｃｔａｇｔａｇａｃｔｔｇｔａｇｔｃｔｇｃｃ
配列番号４０
配列番号３７からの部分的なＴｒＧＡ  ＯＲＦ断片
【化４２】
2017537647.tif 000045
配列番号４１
配列番号３７からのループアウト後に保持される５００ｂｐの断片
【化４３】
2017537647.tif 000046
【図１】
2017537647.tif 000047
【図２】
2017537647.tif 000048
【図３】
2017537647.tif 000049
【図４】
2017537647.tif 000050
【図５】
2017537647.tif 000051
【図６Ａ−６Ｃ】
2017537647.tif 000052
【配列表】
2017537647000001.app
【国際調査報告】
2017537647.tif 000053
2017537647.tif 000054
2017537647.tif 000055
2017537647.tif 000056
2017537647.tif 000057
2017537647.tif 000058