(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドであって、該ペプチドのN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含む、上記ペプチドおよび治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸複合体、並びに組成物、およびそれらの使用に関する。また、本発明は、眼性疾患または状態の治療または予防における使用のための、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドにも関する。さらに、本発明は、ヒアルロン酸結合物質を検出する方法であって、ヒアルロン酸の試料を設けること、該ヒアルロン酸の試料を検査物質に接触させること、および前記検査物質と前記ヒアルロン酸との結合の存在を検出することを含む方法にも関する。
2017506220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドであって、
該ペプチドのN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含む、前記ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分もしくは断片を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドのN末端は、D-アミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドのN末端は、保護基を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
前記保護基は、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、tert-ブトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、p-メトキシベンジルカルボニル、p-メトキシベンジル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジル、p-メトキシフェニル、トシル、およびノシルからなる群より選択される、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記保護基はアセチルである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記機能的部分もしくは断片は、配列番号1から少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項２〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは、表１に示すいずれかの配列を有する機能的部分もしくは断片であり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項２〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドおよび治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体であって、
ここで該ペプチドのN末端は、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含み、
ここで前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している、前記コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１０】
前記ペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分もしくは断片である、請求項９に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１１】
前記保護基は、前記ペプチドのN末端アミノ酸の窒素に位置している窒素保護基であり、かつ、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、tert-ブトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、p-メトキシベンジルカルボニル、p-メトキシベンジル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジル、p-メトキシフェニル、トシル、およびノシルからなる群より選択される、請求項９または１０に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１２】
前記保護基はアセチルである、請求項１１に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１３】
前記治療剤もしくは診断剤は、前記ペプチドに共有結合する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１４】
前記治療剤もしくは診断剤は、前記ペプチドに非共有的に結合する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１５】
前記治療剤もしくは診断剤は、ビオチン-ストレプトアビジン複合体により前記ペプチドに非共有的に結合する、請求項１４に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１６】
前記ペプチドは、場合により、リンカーを介して、ビオチン部分に共有結合し、かつ、前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーを介して、ストレプトアビジン部分に共有結合する、請求項１５に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１７】
前記ペプチドは、場合により、リンカーを介して、ストレプトアビジン部分に共有結合し、かつ、前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーを介して、ビオチン部分に共有結合する、請求項１５に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１８】
存在する場合、前記リンカーは、短鎖ペプチド、ポリエチレングリコールオリゴマー、C1-20アルキレン基、C2-20アルケニレン基、マレイミド、およびC1-20アルキレンまたはC2-20アルケニレン基により分離されたヒドラジド官能基、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなる、請求項９〜１７のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項１９】
前記リンカーの短鎖ペプチドは、アミノ酸グリシン、セリン、リジン、システイン、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸を含む、請求項１８に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２０】
存在する場合、前記リンカーは、前記ペプチドのC末端に位置する、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２１】
前記機能的断片は、配列番号1から少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２２】
前記ペプチドは、表１に示すいずれかの配列を有する機能的部分もしくは断片であり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２３】
前記診断剤は、蛍光、発光、または放射性核種標識を含んでなる、請求項９〜２２のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２４】
前記治療剤は、VEGF阻害剤、α2-アドレナリンアゴニスト、β-アドレナリンアンタゴニスト、アンギオテンシンIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、NSAID、抗マラリア薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、レチノイド、DMARD、生物製剤、硝酸塩、プロスタグランジン、およびエンドセリンアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９〜２２のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項９〜２４のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２６】
VEGF阻害剤、α2-アドレナリンアゴニスト、β-アドレナリンアンタゴニスト、アンギオテンシンIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、NSAID、抗マラリア薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、レチノイド、DMARD、生物製剤、硝酸塩、プロスタグランジン、およびエンドセリンアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの追加的非複合性治療剤を更に含んでなる、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９〜２４のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、あるいは請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、緑内障、全身性エリテマトーデス、関節炎、関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、または皮膚筋炎の予防または治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか1項に記載のペプチド、請求項９〜２４のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、あるいは請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を調製するための、
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドであって、該ペプチドのN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含む、前記ペプチドの使用。
【請求項３０】
前記ペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分もしくは断片を有する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記機能的部分もしくは断片は、配列番号1から少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記ペプチドは、表１に示すいずれかの配列を有する機能的部分もしくは断片であり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、請求項３０または３１に記載の使用。
【請求項３３】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態の予防または治療に使用するための、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチド。
【請求項３４】
前記ペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分もしくは断片である、請求項３３に記載の使用のためのペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドのN末端は、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含む、請求項３３または３４に記載の使用のためのペプチド。
【請求項３６】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態の予防または治療に使用するための、
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドおよび治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体であって、
ここで、前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している、前記コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体。
【請求項３７】
ヒアルロン酸の試料を設けること、該ヒアルロン酸の試料を検査物質に接触させること、および、前記検査物質と前記ヒアルロン酸との結合の存在を検出することを含む、ヒアルロン酸結合物質を検出する方法。
【請求項３８】
前記ヒアルロン酸は、固体支持体に非共有的に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体は、アミン表面である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ウシ血清アルブミンをブロッキング剤および／または希釈剤として使用する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ビオチン化検査基質およびストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを用い、ペルオキシダーゼ基質を添加して検出を行う、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、緑内障、全身性エリテマトーデス、関節炎、関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、または皮膚筋炎に関連する状態を予防または治療する方法であって、
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９〜２４のいずれか１項に記載のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、あるいは請求項２５または２６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態を予防または治療する方法であって、
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態を予防または治療する方法であって、
アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドおよび治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を、それを必要とする対象に投与することを含み、
ここで前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達システムに関する。本発明は特に、これらに限定されないが、デポ薬物送達システムとしてのコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸結合複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物を硝子体液（「硝子体」）へ直接注射することにより眼の中へ送達することは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎、および緑内障などの多くの消耗性眼性状態の管理に革命をもたらした。主なブレークスルーは、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の開発を伴うものであった。これらの薬剤は他の送達方法では吸収されにくいので、通常、硝子体内への注射により投与される。しかし、VEGF阻害剤が必要な疾患は本質的に慢性である場合が多いので、投与を何回も繰り返す必要があることが多い。それにもかかわらず、VEGF阻害剤は、この薬剤が無かった従前には少なくとも部分的に盲目になったであろうような視力を保存または改善すらできる。
【０００３】
眼性状態を治療するための次世代の薬物の開発に強い関心がもたれている。しかし、眼性状態を治療するための薬物は急速に硝子体から拡散して網膜を通過し、脈絡膜の空間内で除去(クリアランス)されるため、眼内における半減期によりその有用性が非常に制限される。抗体などの大きな治療剤であっても、硝子体内での半減期は2〜4日である、つまり、最大の治療効果をもたらすためには年間9〜12回の注射をしなくてはならない。多くの開発中のより小さな分子だと、硝子体内での滞留時間は時間単位である。
【０００４】
頻繁に硝子体内に注射するのは、患者および医療提供者にとって高価で時間がかかる。また、感染症や網膜剥離といった注射に関連する合併症の小さいが重要なリスクにもつながり、患者の視力の質を脅かしかねない。反復注射により、リスクが累積的に増大する。
【０００５】
従って、硝子体内に投与された薬物の作用を延長する方法への関心が高まっている。このような方法は、注射の頻度（及びその後の合併症の頻度）を低減するだけでなく、保健サービス提供の負担を軽減するのに役立つであろう。また、VEGFアンタゴニストは、例えば、このような状況における網膜神経の損失を悪化させることが示されているので、網膜への高濃度の薬物の暴露を減少させるのにも役立つだろう。
【０００６】
検討中の方法は多数存在する(Anderson et al. Delivery of anti-angiogenic molecular therapies for retinal disease. Drug Discov Today. 2010 Apr; 15(7-8): 272-282)。かかる方法として、硝子体内への放出を遅らせるために、マトリックスまたはインプラント中の活性剤を分離することが挙げられる。これらは、生分解性であっても非生分解性であってもよい。インプラントは硝子体に直接注射してもまたは外科的に移植してもよい(Haller et al. Randomized, sham-controlled trial of dexamethasone intravitreal implant in patients with macular edema due to retinal vein occlusion. Ophthalmology 2010; 117(6): 1134-1146、およびPavesio et al. Evaluation of an intravitreal fluocinolone acetonide implant versus standard systemic therapy in noninfectious posterior uveitis. Ophthalmology 2010; 117(3): 567-575)。開発中の別の技術としては、ウイルス遺伝子のトランスフェクションにより薬理学的に活性な分子を内因的に産生させる方法がある(Bainbridge et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. N. Engl. J. Med. 2008; 358: 2231-2239)。しかし、薬理学的に適切なレベルの治療剤に達するために、その後の遺伝子発現を制御する必要がある。
【０００７】
ステロイド剤の硝子体内への送達は、外科的な移植（例えば、RetisertTM, Bausch & Lomb, Inc.)または注射（例えば、IluvienTM, Alimera Sciences/pSivida, Inc.)のいずれであっても、リザーバデポデバイスを用いて達成できることが示されている。しかし、眼内にそのような薬物を送達するには特定の注射デバイスまたは外科的手順が必要である。さらに、これらの薬物（RetisertTMおよびIluvienTM)は、非生分解性であり、そして治療に関係ない成分が長時間眼内に残ってしまう。また、これらの薬物に用いるデバイスはペイロードの点で限定されるので、上記手段の使用は、ステロイドなどの非常に強力な分子に限られる。ポリ乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）ミクロスフェアなどの生分解性の粒子が開発中であるが、ペイロード、製造に用いられる有機溶剤に対する不適合性、及び患者の視力の障害など、現在いくつかの欠点がある。
【０００８】
薬物の薬物動態学的特性に影響を与える結合分子の使用が、眼科学の分野以外で研究されてきた。一例として、アルブミンなどの特定の標的に結合するように設計されているペプチドの使用が挙げられる。アルブミンは、腎臓の糸球体で濾過されない、つまり血液循環中で保持される比較的大きな分子である。アルブミン結合ペプチドに結合した薬物は、結合していない薬物と比較してより長い時間、循環中に保持される。その結果、より少ない頻度で投与できる。
【０００９】
ヒアルロン酸に有効な結合親和性を示すことが示されているかかる結合部分は、HABP35である。これは、マウスRHAMM受容体（receptor for hyaluronan mediated motility：ヒアルロン酸媒介性運動の受容体）に由来する短いペプチドである。このペプチドは、ヒアルロン酸（HA）結合ドメインI配列、およびそれに続くマウスHA結合ドメインII配列から構成され、その配列は、公的に利用可能なソースから決定された。RHAMM受容体は、腫瘍学、免疫学、および血管新生の分野で以前から研究されており、HABP35は、創傷感染に及ぼす影響のため具体的に検討されてきた（Zaleski et al. Hyaluronic acid binding peptides prevent experimental staphylococcal wound infection. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50(11); 3856-3860）。しかし、かかる結合分子は、眼科、皮膚科や関節学の分野での薬物送達について検討されたことがない。
【００１０】
従って、本発明の一実施形態では、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドを提供する、ここで、該ペプチドは、N末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含む。好ましくは、該ペプチドは、モチーフB1-X3-10-B2を２つまたは３つ、より好ましくは４つ有する。かかるモチーフは、連続的に、順番に、または重複して配置されてもよい。好ましくは、かかるモチーフは重複している。さらに、好ましいモチーフは、構造B1-X5-10-B2またはB1-X6-8-B2、またはB1-X6-B2、B1-X7-B2、またはB1-X8-B2、最も好ましくB1-X7-B2(すなわち、B1およびB2が７つの同一または異なる非酸性アミノ酸の配列により隔てられている)を有する。
【００１１】
好ましい実施形態では、前記ペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分／断片を有する。
【００１２】
配列番号1のアミノ酸配列（HABP35として知られている）は、ヒアルロン酸媒介性運動のマウス受容体(RHAMM)に関し、マウスRHAMMヒアルロン酸結合ドメインI配列およびそれに続くマウスRHAMMヒアルロン酸結合ドメインIIから構成され、これらのドメインはリンカー(すなわちVVV)により隔てられている。配列番号1の特異的アミノ酸配列は、LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQNである。
【００１３】
硝子体の２つの主要な成分はコラーゲンおよびヒアルロン酸なので、本発明は、コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸に結合する能力を有する結合複合体（binding conjugate）であって、それにより活性治療剤もしくは診断剤を可逆的に結合できる固定基質として作用する結合複合体を提供する。加えて、コラーゲンおよびヒアルロン酸は、上皮および神経組織に豊富に存在する結合成分であることを考えると、このような結合複合体は、一定の関節および皮膚状態、並びに一定の眼性状態の治療において重要な用途がある。
【００１４】
例えば、VEGF阻害剤、抗体、又は新規の標的小分子といった薬物を、硝子体内の成分、主にコラーゲンおよび/またはヒアルロン酸、に結合する複合体に連結させることにより、硝子体からの薬物のクリアランス率が低減され、該薬物が長期間にわたって放出される。眼内における薬物の半減期を増加させることは、網膜への薬物の送達がより長期になることを意味する。これは、経済上の利点（注射のための通院数の減少）および患者の安全上の利点（注射数の減少は注射に関連する合併症のリスクの低下を意味する）の両方をもたらす。現在、VEGF阻害剤（例えば、ラニビズマブ、ペガプタニブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプト）の送達について、臨床現場にはデポ送達デバイスがない。
【００１５】
驚くことに、アミノ酸のこれらの配列は、繊維、結合、上皮、及び神経組織、並びに、眼の硝子体液内に見られるようなコラーゲンおよび/またはヒアルロン酸の化学構造に対し可逆的な親和性を有するペプチドになることが発見された。加えて、N末端にD-アミノ酸を存在させるおよび/または保護基を含ませることにより、例えば、生体内における酵素分解に対する安定性がより優れたペプチドを提供できる可能性がある。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドおよび治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を提供する、ここで、該ペプチドは、N末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含み、該治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している。有利なことに、複合体の結合作用により、治療剤もしくは診断剤の除去速度（ひいては排出速度）が非常に遅らせることが発見された。一態様では、複合体は、デポ薬物送達システムとして作用する。
【００１７】
好ましくは、コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体は、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列を有するペプチド、またはその機能的部分もしくは断片、および治療剤もしくは診断剤を含んでなり、ここで該治療剤もしくは診断剤は場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している。
【００１８】
本発明における保護基は、N末端アミノ酸のα-アミノ基を保護するものを指す。好適な保護基としては、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、tert-ブトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、p-メトキシベンジルカルボニル、p-メトキシベンジル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジル、p-メトキシフェニル、トシル、およびノシルからなる群より選択されるものが挙げられる。好ましくは、保護基は、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、tert-ブトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、p-メトキシベンジルカルボニル、p-メトキシベンジル、3,4-ジメトキシベンジル、またはp-メトキシフェニルである。最も好ましくは、保護基はアセチルである。
【００１９】
本明細書で使用する用語「コラーゲン」は、ヒトおよび動物の、特に肉および結合組織において見られる天然のタンパク質群を指す。細長いフィブリルの形態で、腱、靱帯、および皮膚のような線維性組織に主に見られ、また、角膜、軟骨、骨、血管、腸、および椎間板にも豊富に存在する。
【００２０】
用語「ヒアルロン酸(hyaluronic acid, HA)」は、結合、上皮、および神経組織全体に広く分布する、アニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンを指す。また、硝子体液中にも見られる。ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主要成分の一つであり、細胞の増殖および遊走に大きく寄与し、そして、いくつかの悪性腫瘍の進行に関与することもある。この用語は、用語「ヒアルロン酸（hyaluronan）」と「ヒアルロン酸（hyaluronate）」と同義的に使用されてもよい。これは、以下に示すようなD-グルクロン酸及びD-N-アセチルグルコサミンの反復単位からなる直鎖状で非分岐の分子である。
【００２１】
【化１】
2017506220.tif 000003
【００２２】
用語「硝子体（vitreous）」は、ヒトおよび他の脊椎動物の眼球のレンズと眼球の裏側を裏打ちする網膜との間のスペースを埋める無色透明のゲル状物を指す。この用語は、「硝子体液（vitreous humour）」および「硝子体（vitreous body）」と同義的に使用できる。
【００２３】
用語「軟骨」は、ヒトまたは動物の骨間の関節、胸郭、耳、鼻、気管支、及び椎間板を含む体の多くの場所で見られる柔軟な結合組織を指す。この組織は、骨ほど硬く剛性ではないが、筋肉よりは堅く柔軟性がない。これは、コラーゲン線維、プロテオグリカンに富む大量の基質、及びエラスチン繊維からなる細胞外マトリックスを大量に生産する軟骨細胞と呼ばれる特殊化した細胞から構成されている。軟骨は、上記3つの主要な成分の相対量が異なる弾性軟骨、硝子軟骨、および線維軟骨の3種類に分類される。
【００２４】
本発明は、治療対象の特定の部位を標的とし、治療剤もしくは診断剤を可逆的に付着させるためにコラーゲンおよび/またはヒアルロン酸結合複合体が使用できる薬物送達システムに関する。この付着の結果として、治療剤もしくは診断剤が治療部位から容易に除去されず、従って、それらの効果を発揮する滞留時間がより長くなる。
【００２５】
驚くことに、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドであって、該ペプチドのN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含み、好ましくは、タンパク質配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列、またはその機能的部分もしくは断片を有するペプチドを使用することにより達成できることが発見された。しかし、配列番号1の正確な配列は当該技術分野において公知であり、ペプチド自体では特許請求される主題とはならない。そうであるものの、特定の状況での薬物送達システムとしてのその有用性は、以前に検討されていない。
【００２６】
ペプチドの機能的断片および部分には、親ペプチドの１つまたは複数の機能を維持するそれらの断片および部分が含まれる。ペプチドをコードするcDNAの遺伝子は１つまたは複数のペプチド機能を実質的に変えずに、著しく変異し得ることが認識されている。第一に、一般的なコードは縮重する（degenerate）ので、したがって、異なるコドンが同じアミノ酸をコードすることが知られている。第二に、アミノ酸の置換が導入されている場合でも、変異は保存的でありタンパク質の本質的な機能に重大な影響を与えない。第三に、ペプチド鎖の一部は、そのすべての機能を損なうかまたは失うことなく欠失し得る。第四に、例えば、エピトープタグを付加することにより、その機能を損なうかまたは失うことなく、ペプチド鎖の挿入または欠失が起こりうる。また、機能的フラグメントおよび部分には、機能が向上したものも含まれる。
【００２７】
ペプチドの１つまたは複数の機能を実質的に損なうことなく行うことができる他の修飾として、例えば、インビボまたはインビトロの化学的および生化学的な修飾または異常なアミノ酸の組み込みが挙げられる。かかる修飾として、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種（32P等）による標識化、および種々の酵素的修飾が挙げられる。
【００２８】
ペプチドは、修飾の結果として分岐状であってもよく、分岐または非分岐の環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。
【００２９】
実施形態では、ペプチドのC末端またはその機能的部分もしくは断片は、アミドに変換し得る。特に、ペプチドの機能的断片および部分に関し、親ペプチドの同部位が電荷を持つことはないようなペプチド中の部位において荷電基の不自然な導入が回避される。さらに、このことは、ペプチドが選択された全タンパク質の一部であるかのように、該ペプチドが認識されやすくなり得ることを意味する。加えてまたは代替的に、C末端におけるかかる官能基の存在により、エキソペプチダーゼの作用に起因する破壊（breakdown）に対しより耐性を強くすることが可能になる。
【００３０】
本発明のタンパク質ホモログは、典型的には、NCBI Basic Protein Blast 2.0を用いてアミノ酸配列全長にわたりアラインすることでカウントする場合、少なくとも60%、例えば少なくとも70%、80%、90%、95%、またはさらには98%もの配列相同性（homology）を有するという特徴がある。好ましくは、単離されたペプチドは、配列番号1に対し少なくとも80%の相同性、より好ましくは90%の相同性、最も好ましく95%の相同性を有するタンパク質配列、またはその機能的部分もしくは断片を有する。好ましくは、本明細書で使用する用語「相同性」は、同一のアミノ酸又は同一の化学クラス、例えば、極性、塩基性、酸性、疎水性アミノ酸の種類が同じアミノ酸の存在を指す。アミノ酸の種類の特徴付けは、当業者に知られている。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質ホモログは、典型的には、NCBI Basic Protein Blast 2.0を用いてアミノ酸配列全長にわたりアラインすることでカウントする場合、少なくとも60%、例えば少なくとも70%、80%、90%、95%、またはさらには98%もの配列同一性（identity）を有するという特徴がある。好ましくは、単離されたペプチドは、配列番号1に対し少なくとも80%の同一性、より好ましくは90%の同一性、最も好ましく95%の同一性を有するタンパク質配列、またはその機能的部分もしくは断片を有する。
【００３２】
配列番号1の機能的断片もしくは部分の点では、本発明のペプチドは、配列番号1から少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでもよいが、但し、かかる断片または部分が、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示すことを条件する。好ましい態様では、本発明のペプチドは、少なくとも６、７、８、または９個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０、１１、または１２個の連続するアミノ酸を含み、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す。本ペプチドの機能的断片もしくは部分は、モチーフB1-X3-10-B2を有するアミノ酸の配列を少なくとも１つ、好ましくは２つまたは３つ含有する。
【００３３】
ペプチドの親和性は、ヒアルロン酸および／またはコラーゲンに対するその結合親和性の観点で定義され得て、硝子体物質（例えば、ヒアルロン酸）を含有するマイクロ平衡透析の一方のチャンバから、このような結合ペプチドが存在しない硝子体物質を含有する他方のチャンバへの拡散により評価し得る。したがって、時間の経過と共に最初のチャンバ内に残っているペプチドの濃度が、硝子体中に残存するペプチドの量を評価するための定量的なパラメータを提供し、このパラメータは、本質的にヒアルロン酸に対するペプチドの結合特性によって支配される。配列番号1のペプチドの結合特性を比較することにより、相対的な親和性が決定できる（例えば、図３参照）。
【００３４】
本発明のペプチドまたはその機能的部分もしくは断片の親和性は、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す。しかし、親和性はこれよりも強力であってもよく、例えば、少なくとも75％、80％、および95％といったレベルの親和性が挙げられる。好ましい実施形態では、ペプチドの親和性は、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも85%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも85%の親和性を示し、より好ましくは、親和性は、少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%または97%である。
【００３５】
本願に記載の配列番号1の特定の断片もしくは部分としては、表１に挙げるものが含まれる。これらのペプチドのN末端は、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含み、かつ、C末端はアミドに変換し得る。
【００３６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【００３７】
本発明の一部を形成するペプチドは、生物の細胞中で天然に生じる可能性のある他の生物学的成分、すなわち他の染色体又は染色体外DNAおよびRNA、タンパク質、細胞小器官等から実質的に隔離されているという意味で単離された生物学的成分である。単離された核酸およびタンパク質としては、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。また、用語「単離された」は、宿主細胞における組換え発現によって生じた核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質をも包含する。
【００３８】
本発明のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体における治療剤もしくは診断剤は、共有結合または非共有結合によりペプチドに結合し得る。
【００３９】
治療剤もしくは診断剤が非共有的にペプチドに結合する場合、結合は、ビオチン-ストレプトアビジン複合体によって成され得る。例えば、ペプチドは、場合により、リンカーを介して、ビオチン部分に共有結合により結合することができ、そして、治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーを介して、ストレプトアビジン部分に共有結合により結合することができる。あるいは、ペプチドは、場合により、リンカーを介して、ストレプトアビジン部分に共有結合により結合することができ、そして、治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーを介して、ビオチン部分に共有結合により結合することができる。この例における任意のリンカー基は、場合によりペプチドを治療剤もしくは診断剤へ結合するリンカーと同じであってもよい。
【００４０】
コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体は、ペプチドを治療剤もしくは診断剤に結合するリンカーを含み得る。任意の市販のクロスリンカーは、適切なリンカーであってもよい。このようなクロスリンカーは、典型的には、各末端に化学的に反応性のある基を有する直鎖状分子である。適切な条件下で、これらのクロスリンカーは、２つの分子、つまり、ペプチドと治療剤もしくは診断剤との間に共有結合を形成できる。重要なことに、これらのクロスリンカーは、それぞれの生物学的機能を維持しながら、一端をペプチドに結合させ他端を治療剤もしくは診断剤に結合させる。好ましくは、存在する場合、本発明のリンカーは、両端に異なる反応性基を有するヘテロ二官能性クロスリンカーである。これにより、より特異的かつ順次的な（specific and sequential）（２段階の）結合が可能になり、類似する基、例えば治療剤と治療剤との結合またはペプチドとペプチドとの結合による重合または二量体化の可能性を最小限に抑える。
【００４１】
特に、存在する場合、リンカーは、短鎖ペプチド（例えば、１〜１０個のアミノ酸)、ポリエチレングリコールオリゴマー（例えば、２〜１０個のポリエチレングリコール単位)、C1-20アルキレン基（例えば、C1-10アルキレン基）、C2-20アルケニレン基（例えば、C2-10アルケニレン基）、C1-10アルキレン基（例えば、C1-10アルキレン基）またはC2-10アルケニレン基（例えば、C2-10アルケニレン基）により隔離されたマレイミドおよびヒドラジド官能基（例えば、図9参照）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。好ましくは、リンカーは、１〜１０個のアミノ酸の短鎖ペプチド、C1-10アルキレン基により隔離されたマレイミドおよびヒドラジド官能基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。このようなリンカーは、ペプチドと治療剤もしくは診断剤との間の立体障害の発生を防ぐ。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「Cx-yアルキレン」とは、ｘ〜ｙ個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基である二価の炭化水素基（例えば、-CH2-または>CCH3)を指す。C1-10アルキレン基の例として、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ヘキシレン、等が挙げられる。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「Cx-yアルケニレン」とは、１つまたは複数の炭素-炭素二重結合を含み、ｘ〜ｙ個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の炭化水素基である二価の炭化水素基（例えば、-CH=CH-または>C=CH2)を指す。C2-10アルケニレン基の例として、ビニレン、プロペニレン、ブテニレン、ヘキセニレン、等が挙げられる。
【００４４】
リンカーの一部を形成することができるポリエチレングリコールオリゴマーは、２〜１０個のエチレンオキシドの繰り返し単位を有するオリゴマー、すなわち式H-(O-CH2-CH2)n-OH（式中、nは２〜１０の整数である）を指す。
【００４５】
好ましくは、短鎖ペプチドは、アミノ酸グリシン、セリン、リジン、システイン、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸、例えば、-GGGS-、GGGSK、GGGSKC、等を含む。また、存在する場合、前記リンカーは、好ましくはペプチドのC末端に位置する。
【００４６】
また、リンカーは、更に標識部分を含んでもよい。好適な標識部分としては、蛍光、発光、または放射性核種標識が挙げられる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を、結合特性の定量的な分析をするための蛍光標識として用いてもよい。他の好適な標識部分としては、アレクサフルオロ色素、シアニン色素、および量子ドットが挙げられる。さらに、ビオチンを検出のための標識として用いてもよい。
【００４７】
本発明のペプチドは、硝子体における様々な治療剤を保持するために使用できる。このような物質としては、抗体（例えば、ベバシズマブ）、FAB抗体断片（例えば、ラニビズマブ）、融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト）、ペプチド（例えば、kinestatin）、アプタマー（例えば、ペガプタニブ）、および小分子治療剤が挙げられる。
【００４８】
特に、治療剤は、VEGF阻害剤、α2-アドレナリンアゴニスト、β-アドレナリンアンタゴニスト、アンギオテンシンIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、NSAID、抗マラリア薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、レチノイド、DMARD、生物製剤、硝酸塩、プロスタグランジン、およびエンドセリンアンタゴニストからなる群より選択されてもよい。
【００４９】
好適なVEGF阻害剤としては、モノクローナル抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、抗体誘導体、例えばラニビズマブ（ルセンティス）、VEGFによって刺激されたチロシンキナーゼを阻害する分子、例えば、ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブ、およびパゾパニブが挙げられる。これらの薬剤のいくつかは、VEGFではなくVEGF受容体を標的とする。テトラヒドロカンナビノール（THC）及びカンナビジオールの両者はVEGFを阻害し神経膠腫の成長を遅らせる。
【００５０】
好適なα2-アドレナリンアゴニストとしては、アプラクロニジン、ブリモニジン、クロニジン、デトミジン、デクスメデトミジン、グアナベンズ、グアンファシン、ロフェキシジン、メデトミジン、ロミフィジン、チザニジン、トロニジン、キシラジン、ファドルミジン、キシロメタゾリン、およびオキシメタゾリン（部分α2アゴニスト）が挙げられる。
【００５１】
好適なβ-アドレナリンアンタゴニストとしては、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、杜仲、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、ブトキサミン、ICI-118,551、およびSR 59230Aが挙げられる。
【００５２】
好適なアンギオテンシンIIアンタゴニストとしては、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、およびテルミサルタンが挙げられる。
【００５３】
好適なACE阻害剤としては、カプトプリル（カポテン）、ゾフェノプリル、エナラプリル（Vasotec/Renitec）、ラミプリル（Altace/Prilace/Ramace/Ramiwin/Triatec/Tritace）、キナプリル（Accupril）、ペリンドプリル（Coversyl/Aceon）、リシノプリル（Listril/Lopril/Novatec/Prinivil/Zestril）、ベナゼプリル（Lotensin）、イミダプリル（Tanatril）、ゾフェノプリル（Zofecard）、トランドラプリル（Mavik/Odrik/Gopten）、およびフォシノプリル（Fositen/Monopril）が挙げられる。
【００５４】
好適なNSAIDとしては、アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジフルニサル、サルサレート、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、ニメスリド、リコフェロン、リジンクロニキシン、ハイパーフォリン、及びゴマノハグサが挙げられる。
【００５５】
好適な抗マラリア薬としては、キニーネ、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン（及びその誘導体）、ハロファントリン、ドキシサイクリン、およびクリンダマイシンが挙げられる。
【００５６】
好適なコルチコステロイドとしては、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ピバル酸チキソコルトール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルオコルトロン、ヒドロコルチゾーン-17-吉草酸、アルクロメタゾンジプロピオナート、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プレドニカルバート、クロベタゾン-17-ブチレート、クロベタゾール-17-プロピオネート、カプロン酸フルオコルトロン、フルオコルトロンピバレート、フルプレドニデン酢酸、ヒドロコルチゾーン-17ブチレート、17-アセポナート、17-ブテプレート、およびプレドニカルベートが挙げられる。
【００５７】
好適な免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（DOCA）、アルドステロン、細胞増殖抑制剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソウレア、白金化合物等、葉酸類似体（メトトレキサート）、プリン類似体（アザチオプリン及びメルカプトプリン）、ピリミジン類似体、細胞傷害性抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、およびミトラマイシン、カルシニューリン阻害剤（CNIS）、例えば、タクロリムスおよびシクロスポリン、マクロライドラクトン、例えば、シロリムス（ラパマイシン、商品名ラパミューン）、インターフェロン、例えば、IFN-β、オピオイド、例えば、コデイン、モルヒネ、テバイン、オリパビン、ジアセチルモルヒネ、ニコモルヒネ、ジプロパノイルモルヒネ、ジアセチルジヒドロモルヒネ、アセチルプロピノイルモルヒネ、デソモルヒネ、メチルモルデソルフィン、ジベンゾイルモルヒネ、ジヒドロコデイン、エチルモルヒネ、ヘテロコデイン、ブプレノルフィン、エトルフィン、ヒドロコドン、ヒドロモルフォン、オキシコドン、オキシモルフォン、フェンタニル、αメチルフェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、カーフェンタニル、オーメフェンタニル、ペチジン（メペリジン）、ケトベミドン、アリルプロジン、プロジン、プロポキシフェン、デクストロプロポキシフェン、デクストロモラミド、ベジトラミド、ピリトラミド、メタドン、ジピパノン、酢酸レボメタジル（LAAM）、ジフェノキシン、ジフェノキシラート、ロペラミド、デゾシン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ブプレノルフィン、ジヒドロエトルフィン、エトルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、レボルファノール、レボメトルファン、レフェタミン、メプタジノール、チリジン、トラマドール、タペンタドール、ナルメフェン、ナロキソン、およびナルトレキソン、TNF結合タンパク質、例えば、インフリキシマブ（レミケード）、エタネルセプト（エンブレル）、アダリムマブ、クルクミン（ウコンの原料）、およびカテキン類（緑茶に見られる）、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素(IMPDH)阻害剤、例えば、ミコフェノール酸、および他の小さな生物剤、例えば、フィンゴリモド、およびミリオシンが挙げられる。
【００５８】
好適なモノクローナル抗体としては、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、およびオマリズマブが挙げられる。
【００５９】
好適なレチノイドとしては、レチノール、レチナール、トレチノイン（レチノイン酸、レチンA）、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチナート及びその代謝物アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、およびアダパレンが挙げられる。
【００６０】
好適な疾患修飾性抗リウマチ薬物（DMARD）としては、アダリムマブ、アザチオプリン、シクロスポリン、クロロキンおよびヒドロキシクロロキン、D-ペニシラミン、エタネルセプト、ゴリムマブ、金塩（アウロチオマレイン酸ナトリウム、オーラノフィン）、インフリキシマブ、レフルノミド、メトトレキサート（MTX）、ミノサイクリン、リツキシマブ、およびスルファサラジン（SSZ）が挙げられる。
【００６１】
好適な生物製剤としては、アブシキシマブ、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（レミケード）、リツキシマブ（リツキサン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、およびオクリプラスミン（Jetrea）が挙げられる。
【００６２】
好適な硝酸塩としては、ニトログリセリン（GTN）、硝酸イソソルビド、および一硝酸イソソルビドが挙げられる。
【００６３】
好適なプロスタグランジンとしては、プロスタサイクリンI2(PGI2)、プロスタグランジンE2(PGE2)、およびプロスタグランジンF2α(PGF2α)が挙げられる。
【００６４】
好適なエンドセリンアンタゴニストとしては、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、BQ-123、ジボテンタン、ボセンタン、マシテンタン、テゾセンタン、BQ-788、およびA192621が挙げられる。
【００６５】
特に、本発明の結合複合体は、VEGF阻害剤と組み合わせて用いてもよい。この組み合わせは、いくつかの状態に対し他の可能性のある治療法よりも優れた多くの利点を有する。例えば、VEGF阻害剤を長期的に硝子体内へ送達する可能性のある遺伝子治療法とは異なり、単純な生物学的薬物の副作用プロファイルが比較的よく理解されている（ラニビズマブ、ペガプタニブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトを用いた世界的な経験則）。よって、本発明の技術を使用してこのような生物学的薬物を送達することは、投与された薬物の生物学的プロファイルを正確に予測および管理できることを意味する。さらに、副作用が生じることがわかっている例では、本発明の製剤を除去するための硝子体切除術を実施できるものの、遺伝子治療を用いた類似の治療的切除術（abrogation）は現在利用可能でない。
【００６６】
コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体の診断剤は、蛍光、発光、または放射性核種標識を含んでもよい。例えば、特定の診断剤として、フルオレセインナトリウムとインドシアニングリーンが挙げられる。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、本発明のペプチド、または本発明のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００６８】
特に、ヒトまたは動物の身体の特定の組織を標的とする結合部分の能力のため、本発明のペプチド、本発明のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、または本発明の医薬組成物は、治療法、特に、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、緑内障、全身性エリテマトーデス、関節炎、関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、または皮膚筋炎の予防または治療における使用に好適である。好ましくは、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態に適用可能である。特に、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎、および緑内障が、本発明のペプチド、複合体または医薬組成物を用いて予防または治療し得る好ましい医学的症状である。
【００６９】
本医薬組成物は、結合複合体が使用に関連する部位に送達されることを可能にする賦形剤を含んでもよい。賦形剤は、特定の部位を標的とするか、あるいはその部位への送達を改善し得る。また、結合複合体を安定化する賦形剤を含んでもよい。任意の適切な安定剤を使用してもよい。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、任意の医薬的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでもよい。本医薬組成物に使用可能な医薬的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的に、直腸から、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または移植リザーバーを介して投与されてもよい。好ましくは、医薬組成物は、局所的に、移植リザーバーを介して、または注射により（より好ましくは、注射により）投与される。本医薬組成物は、任意の従来の非毒性の医薬的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでもよい。本明細書で使用する非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、眼内、病巣内、および頭蓋内への注射または注入技術を含む。好ましくは、本組成物の投与経路は、眼内または関節内投与が好ましい。
【００７２】
本医薬組成物は、例えば滅菌注射用の水性または油性懸濁液といった滅菌注射用製剤の形態であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Tween 80など）や懸濁化剤を用いて、当該技術分野で公知の技術に従って調合できる。滅菌注射用製剤は、非経口的に許容される非毒性の希釈剤または溶媒の滅菌注射溶液または懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオール溶液として、存在してもよい。許容されるビヒクルおよび溶媒の中でも、マンニトール、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が使用できる。さらに、滅菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のため、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意のブランドの固定油を使用してもよい。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンといった医薬的に許容される天然の油なので、注射剤の調製に有用である。また、これらの油溶液または懸濁液は、Ph. Helvまたは類似のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含んでもよい。
【００７３】
所望の治療が局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器を含む場合、本発明の医薬組成物の局所投与は特に有用である。皮膚への局所適用には、活性成分が担体中に懸濁または溶解した適切な軟膏を用いて本医薬組成物を調合すべきである。本発明の分子の局所投与用の担体としては、鉱油、液体石油、白色石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本医薬組成物は、活性化合物が担体中に懸濁または溶解した適切なローションまたはクリームを用いてもよい。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の医薬組成物は、局所的に、直腸坐薬製剤または適切な浣腸製剤により腸管下部に適用してもよい。局所経皮パッチも本発明に含まれる。
【００７４】
特に、本発明の結合複合体は、透明な溶液に調合できる。したがって、眼性状態を治療するために使用されるとき、確実に視覚的濁りが発生しないようにし、既存の治療に関するペイロードの問題を軽減する。
【００７５】
結合複合体が本発明のペプチドを含む場合、有利なことに、本製剤は固有の抗菌/抗炎症特性を有することが見出された。本製剤が非経口投与される場合、外部かの感染の可能性がさらに低減される。
【００７６】
１の実施形態では、医薬組成物が、少なくとも１つの追加の非複合性の治療剤（additional unconjugated therapeutic agent）、つまり、コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体に共有結合していない治療剤、を含むことが望ましいことがある。この場合、複合性および非複合性の両方の治療剤の混合物を含む製剤により、短期作用成分（すなわち、非複合性剤）と長期作用成分（すなわち複合性剤）の両方が同じ製剤中に存在することが可能になる。
【００７７】
好適な追加の非複合性治療剤としては、VEGF阻害剤、α2-アドレナリンアゴニスト、β-アドレナリンアンタゴニスト、アンギオテンシンIIアンタゴニスト、ACE阻害剤、NSAID、抗マラリア薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、レチノイド、DMARD、生物製剤、硝酸塩、プロスタグランジン、およびエンドセリンアンタゴニストからなる群より選択されるものが挙げられる。
【００７８】
本発明の更なる実施態様では、コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を調製するための、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドであって、該ペプチドのN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含むペプチドの使用が提供される。
【００７９】
好ましくは、該使用は、コラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を調製するための、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列を有するペプチド、またはその機能的部分もしくは断片に関する。より好ましくは、前記機能的部分もしくは断片は、配列番号1から少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなり、そして、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す。追加的にまたは代替的に、該ペプチドは、表１に示すいずれかの配列を有する機能的部分もしくは断片であり、かつ、ヒアルロン酸に対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す、および／または、コラーゲンに対し、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する前記ペプチドの少なくとも70%の親和性を示す。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態の予防または治療に使用するための、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなる単離されたペプチドが提供される。好ましくは、このように使用するためのペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の相同性を有する配列を有する単離されたペプチドまたはその機能的部分もしくは断片である。また、該ペプチドのN末端は、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含むことが好ましい。
【００８１】
また、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態の予防または治療に使用するための、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチド、並びに治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体が提供される、ここで、前記治療剤もしくは診断剤は場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒアルロン酸結合物質を検出する方法であって、ヒアルロン酸の試料を設けること、該ヒアルロン酸の試料を検査物質に接触させること、および前記検査物質と前記ヒアルロン酸との結合の存在を検出することを含む方法が提供される。特に、ヒアルロン酸は、固体支持体に非共有的に結合され得る。この場合、固体支持体は、好ましくは、アミン表面である。
【００８３】
追加的または代替的に、本方法は、好ましくは、ウシ血清アルブミンをブロッキング剤および／または希釈剤として使用する。
【００８４】
本検出手段として特に限定されないが、類似の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）に使用される任意の一般的な検出方法が挙げられる。しかし、好ましくは、本検出方法は、例えば、ビオチン化基質（例えば、ビオチン化組換えタンパク質）およびストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼに、塩化テトラメチルベンジジン等のペルオキシダーゼ基質を添加して実施する。ビオチン化組換えヒトアグリカンを陽性対照として使用してもよい。
【００８５】
本発明の別の実施形態では、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、緑内障、全身性エリテマトーデス、関節炎、関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、または皮膚筋炎に関連する状態を予防または治療する方法であって、本発明のペプチド(すなわち、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドであってN末端に、D-アミノ酸を含んでなるおよび／または保護基を含むペプチド、本発明のコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体、または本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法が提供される。
【００８６】
また、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態を予防または治療する方法であって、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法も提供される。
【００８７】
更なる実施形態では、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的な近視性黄斑浮腫、黄斑毛細血管拡張症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、または緑内障等の眼性疾患もしくは状態を予防または治療する方法であって、アミノ酸配列B1-X3-10-B2（式中、B1およびB2はそれぞれが同一または異なる塩基性アミノ酸であり、X3-10は、3〜10個の同一または異なる非酸性アミノ酸の配列である）を有する少なくとも１つのモチーフを含んでなるペプチド、並びに治療剤もしくは診断剤を含んでなるコラーゲンもしくはヒアルロン酸結合複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法が提供される、ここで前記治療剤もしくは診断剤は、場合により、リンカーにより前記ペプチドに結合している。
【００８８】
本発明を、例示目的のみで以下の実施例および図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を示す。各透析装置は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製で、100kDaの分子量カットオフ(MWCO)のセルロースアセテート膜の両側にそれぞれ250μlのチャンバを有する。チャンバを最大8時間室温でインキュベートし、一方のチャンバから他方のチャンバへの拡散を評価した。ペプチドが配置される側を供与チャンバと呼ぶ。ペプチドが拡散するに方向である反対側を収容チャンバと呼ぶ。
【００９０】
【図２】図２は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたウサギ硝子体内におけるHABP35-F（最も上側及び最も下側の線）およびRP2-F（中央の二本の線）の拡散を示す。実験開始時、供与チャンバにはHABP35-FまたはRP2-Fのいずれか20mole/mlを有する200μlのウサギ硝子体が含まれていた。収容チャンバには、ペプチドを含まない200μlのウサギ硝子体が含まれていた。100kDaのMWCOの酢酸セルロースフィルターを通り抜けるペプチド拡散を経時的に測定した。各時点で、各チャンバから硝子体を除去し、蛍光を測定することによってペプチド濃度を定量した。各時点（ｎ＝４）に４つのチャンバを用意した。供与チャンバ内でのHABP35-F濃度は、2、4、6、8時間で、RP2-Fよりも有意に高い(*p<0.05：一元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定)。したがって、HABP35-Fは、対照ペプチドRP2-Fよりも有意に多く供与チャンバ内に保持された。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９１】
【図３】図３は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたウサギ硝子体内におけるHABP35-F（下側の線）およびRP2-F（上側の線）の拡散を示す。このグラフは、各時点での供与チャンバと収容チャンバとの間の濃度勾配（濃度差）を示す。濃度勾配=供与チャンバ内の濃度-収容チャンバ内の濃度。2、4、6、8時間でHABP35-Fの濃度勾配は、対照ペプチドRP2-Fよりも、有意に高い(*p<0.05：一元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定)。したがって、HABP35-Fは、対照ペプチドRP2-Fよりも有意に多く供与チャンバ内に保持された。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９２】
【図４】図４は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたヒアルロン酸内におけるHABP35-F（それぞれ左側のバー）およびRP2-F（それぞれ右側のバー）の拡散を示す。ウサギ硝子体の代わりに、各チャンバに2.5mg/mlのヒアルロン酸（HA）またはHEPES緩衝食塩水（HBS）を投入した。供与チャンバおよび収容チャンバにおけるHABP35-FまたはRP2-Fの濃度を8時間の時点で測定した（ｎ＝３）。濃度勾配をその後決定した(供与チャンバと収容チャンバ間の濃度差)。HAの存在下では、有意に高い濃度勾配によって示されるように、HABP35-Fは、対照ペプチドRP2-Fよりも有意に多く供与チャンバ内に保持された(*p<0.05：一元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定)。HBS単独での存在下ではそのようにならなかった。従って、ウサギ硝子体におけるHABP35-Fの保持は、HAとの相互作用によるものである。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９３】
【図５】図５は、48時間後のラット硝子体内のHABP35-FおよびRP2-Fの保持を示す。2.5μlのHABP35-FまたはRP2-F(250 nmole/ml)を雄Sprague Dawleyラットの硝子体に注入した。48時間後、眼を取り出した。角膜とレンズを除去し、アイカップは、マルタ十字に開いた。硝子体と網膜を（同じ露出設定を使用した）落射蛍光顕微鏡を用いて撮影した。A) 注射後48時間における硝子体内のHABP35-Fの蛍光。B) 注射後48時間における硝子体内のRP-Fの蛍光。C) 注射後48時間における硝子体内のHABP35-Fの蛍光を示すコラージュ写真。48時間後、対照ペプチドRP2-Fと比べて、HABP35-Fの硝子体内への注射では目に見えて多くの蛍光性ペプチドが見られる。
【００９４】
【図６】図６は、ラット硝子体内のHABP35-FP（上側の線）およびRP2-F（下側の線）の継時的なin vivo拡散試験を示す。2.5μlの250nmole/mlペプチドを含むHBSを雄Sprague Dawleyラットの硝子体に注入した。異なる時点（0、8、24、72、168時間）でラットを屠殺し、硝子体内のペプチド濃度を蛍光により測定した。各ペプチド（ｎ＝３）にそれぞれ眼を３つ使用した。経時的に、ラットの硝子体内におけるHABP35-FPの保持がRP2-Fよりも増加した。２つのペプチド間の濃度差は、24、72、および168時間において統計的に有意であった(それぞれ対応のないt検定によりp=0.034、0.011、および0.006)。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９５】
【図７】図７は、Pep1-B、HABP42-B、HABP35-B、およびRP-BのHAへの非共有的な結合を示す。４つのグラフは、HAの存在（それぞれ上側の線）および不存在（それぞれ下側の線）下において、ブロックされたウェルへの結合を示す（それぞれ全結合および非特異的結合）。各濃度（ｎ＝３）に３つのELISAを実施した。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９６】
【図８】図８は、HABP35-B、HABP42-B、Pep1-B、およびRP-BのHAへの非共有的な特異的結合を示す（原点における最大初期応答の順で（in order of greatest initial response at the origin））。特異的結合は、図７に示される読み取り値より、HAを投入したウェルのA450からブランクウェルのA450を差し引くことで得た。各濃度（ｎ＝３）に３つのELISAを実施した。HABP42-BとPepl-Bのいずれもヒアルロン酸に対し特異的な結合を示し、25〜50nmole/mlの濃度で飽和に達した（プラトー形成によって示される）。RP-Bと比較すると、HABP42-BとPepl-Bのいずれも、検査した全ての濃度において有意に高い特異的結合を示した（p<0.0001：一元配置分散分析）。HABP35-Bは、HABP42-BまたはPepl-Bよりも10倍以下の濃度で特異的結合を示した。しかし、非特異的結合が増すため、その特定のシグナルは濃度が高くなるにつれ悪化した。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９７】
【図９】図９は、架橋の化学的構造を示す。A) 抗IL-1β抗体(マウス抗ヒト)（左）は、クロスリンカー（EMCH）（中）を使用して、ヒアルロン酸結合ペプチド（HABP35）（右）に共有結合された。反応基を３文字の省略形で示す: Ald = アルデヒド、Hyd = ヒドラジド、Mal = マレイミド、Sul = スルフヒドリル。反応１は反応２の前に起こった。B) 反応１：HABP35を、C末端にシステイン残基を用いて作製した。これにより、システイン残基のスルフヒドリル基とクロスリンカーのマレイミド反応基との間に架橋がおこり、安定なチオエーテル結合が形成された。C) 反応２：抗体の糖残基を酸化してアルデヒド基を形成した。その後、これらは、クロスリンカーのヒドラジド反応基と架橋し安定なヒドラゾン結合を形成した（図９ＢおよびＣは、Piercenet社より提供）。メタ過ヨウ素酸ナトリウムにより多糖翻訳後修飾を酸化（グリコシル化）することによりケトンまたはアルデヒド基が糖タンパク質内で作成できる。カルボニル基が抗体の糖残基上に存在するので、これらの基の架橋は、抗体の抗原結合部位を変えないという利点を有する。
【００９８】
【図１０】図１０は、ウサギ硝子体によるHABP35-Fの分解に対するベスタチンの効果を示す。ウサギ硝子体におけるインキュベーションから6時間後、ベスタチン(250 μM)により、UPLC-MSによって検出可能なHABP35-F(10 nmole/ml)の量が有意に増加した(p=0.01)。UPLC-MS=超高速液体クロマトグラフィー質量分析。
【００９９】
【図１１】図１１は、ウサギ硝子体におけるインキュベーションから6時間後の、UPLC-MSによるHABP35-Fの検出に対するプロテアーゼ阻害剤アプロチニン(8μM)、ベスタチン(500μM)、E-64(150μM)、およびロイペプチン(200μM)の効果を示す。このプロテアーゼ阻害剤カクテルにより、検出されるHABP35-Fの量が増加したようだ。実験は３回行った（ｎ＝３）。UPLC-MS=超高速液体クロマトグラフィー質量分析。
【０１００】
【図１２】図１２は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたウサギ硝子体内におけるHABP35-FPの拡散を示す。各時点で、各チャンバから硝子体を除去し、蛍光を測定することによってペプチド濃度を定量した。HABP35-FPは供与チャンバ内に大幅に残留し、（いずれかのチャンバ内における）ペプチドの総量により、ペプチドの分解が最小であることが示された。TC-Aは供与チャンバに相当し、BC-Aは収容チャンバに相当する。T-Aは、ペプチドの総量に相当する。
【０１０１】
【図１３】図１３は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたヒアルロン酸内におけるHABP35-Fの拡散を示す。各時点で、各チャンバからヒアルロン酸を除去し、蛍光を測定することによってペプチド濃度を定量した。HABP35-Fは供与チャンバ内に大幅に残留し、（いずれかのチャンバ内における）ペプチドの総量により、ペプチドの分解が最小であることが示された。TC-Aは供与チャンバに相当し、BC-Aは収容チャンバに相当する。T-Aは、ペプチドの総量に相当する。
【０１０２】
【図１４】図１４は、Harvard高速マイクロ平衡透析装置を用いたウサギ硝子体内におけるHABP35-Fの拡散を示す。各時点で、各チャンバから硝子体を除去し、ペプチド濃度を測定した。HABP35-Fは供与チャンバ内に残留していたが、供与チャンバおよび収容チャンバ内におけるHABP35-Fの濃度が一定ではなかったので、一部のペプチドが分解したことが示された。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０３】
実施例１：硝子体内におけるHABP35-Fの拡散特性
標識分子とHABP35の間に発生する立体障害を防止するために、標識HABP35を、リンカー配列（GGGS）を用いてC末端領域に付加して作成した(GenScript Inc, USA)。C末端のリジン残基をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した。修飾HABP35ペプチド(HABP35-F)の配列は、以下の通りである。
HABP35-F
LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(FITC)-アミド
純度:95.3%
分子量:4013.9
【０１０４】
HABP35と同様の分子量を有する対照ペプチド(RP2-F)も作成した。これは、ヒアルロン酸への結合があまりないことが既に示されている配列を使用して設計した(Mummert et al. Development of a peptide inhibitor of hyaluronan-mediated leukocyte trafficking. J Exp Med. 2000; 18; 192(6): 769-779):
RP2-FSATPASAPYPLAGGGSSATPASAPYPLAGGGS-K(FITC)-アミド
純度:95.1%
分子量:3305.61
【０１０５】
両ペプチドの純度を、高速液体クロマトグラフィーを用いて確認した。分子量は、エレクトロスプレー質量分析法を用いて確認した。ペプチドは、それぞれ、HABP35-FとRP2-Fと命名した。
【０１０６】
硝子体内におけるHABP35-Fの拡散特性を研究するために、高速マイクロ平衡透析装置(チャンバ体積：250μl)をHarvardApparatus Ltd (UK)から購入した。各透析装置は、酢酸セルロース膜（100kDaの分子量カットオフ）によって分離された２つの250μlチャンバを有していた（図１）。20nmole/mlのHABP35-FまたはRP2-Fを含む200μlのウサギ硝子体(Pel-freez Ltd, USA)を、透析装置の一方の側（供与チャンバ）に配置し、200μlのウサギ硝子体（ペプチドを含まず）をもう一方の側（収容チャンバ）に配置した。HABP35-FおよびRP2-Fが、透析装置の一方の側から他方の側へ拡散する速度を経時的に評価した。2、4、6、8時間でのサンプリングを可能にするために、４つの透析装置を各拡散の実行に用意した（１時点につき１台）。
【０１０７】
各時点において、１台の透析装置の各側から硝子体を採取した。各チャンバ内におけるペプチドの濃度は、蛍光（励起波長490nm、発光波長510-570nm（フルオレセインのピーク蛍光に対応する））を測定することによって定量した。濃度値を得るために、蛍光を、各ペプチドの標準濃度曲線と比較した。
【０１０８】
対照ペプチドRP2-Fは、8時間かけて膜を横切って拡散しほぼ平衡（供与チャンバ内の濃度と収容チャンバ中の濃度が等しい）に達した（図２）。濃度勾配（供与チャンバと収容チャンバ間の濃度差）がほぼゼロに達した（図３）。HABP35-Fは、ゆっくりと膜を横切って拡散し、8時間後には、（RP2-Fと比較して）有意に高い濃度が供与チャンバに残っていた（図２）。HABP35-Fでは、濃度勾配も有意に高いままであり、供与チャンバ内に多く保持されていることが示された（図３）。
【０１０９】
若いウサギの硝子体液を、上述の実験に用いた(Pel-freez Biologicals Ltd)。最初に解凍、等分し、その後-20℃で再凍結した。解凍したい試料をその後1.8％のHClを添加して7.4-7.2の生理的pHにした。ウサギ硝子体を、その後、Heraeus Biofuge Fresco遠心分離機（Kendro Laboratory Products Ltd)で、13000で10分間遠心分離して不溶性物質を除去した。
【０１１０】
実施例２：HABP35-Fのヒアルロン酸への結合特性
供与チャンバ内の保持が、ヒアルロン酸（HA）との相互作用によるものであったか否かを評価するために、ウサギの硝子体の代わりに、2.5mg/mlのHA溶液(HEPES緩衝化生理食塩水中)を各チャンバに加えた。20nmole/mlのHABP35-FまたはRP2-Fを供与チャンバに添加し、8時間にわたって拡散を測定した。各時点に３つのチャンバを使用した（ｎ＝３）。対照としてHEPES緩衝化生理食塩水(HBS)単独における拡散を評価した。8時間後に、HA内では、HABP35-FがRP2-Fと比べて有意に高い濃度勾配を示した。これは、ペプチドの拡散をHBS単独で評価した場合には見られなかった（図４）。これは、ウサギの硝子体におけるHABP35-Fの保持が、少なくとも部分的に、HAとの相互作用に起因し得ることを示している。
【０１１１】
実施例３：分解評価
ウサギ硝子体内に存在するプロテアーゼによるHABP35-Fの分解を評価するために、HABP35-Fをウサギの硝子体内で12時間インキュベートした。ウサギの硝子体におけるHABP35-Fのサンプルを0および12時間の時点で採取し、HABP35-Fについての質量スペクトルトレースを比較した。0時間では、質量スペクトルは、無傷のHABP35-Fを表すイオンを含有していた。12時間でもこれらのイオンがまだ存在していた（502.3, 574.1, 669.5、および803.7のm/z値、4012のMWの分子を表す）。しかし、12時間では、新しいイオンのセットも検出された（557.9, 651.0および781.0のm/z値、3899のMWの新しい分子を表す）。この新しい分子は、無傷のHABP35-Fより軽い113Daであった。ペプチド加水分解によるN末端ロイシン残基の損失が、HABP35-Fよりも軽いペプチド断片113Daとなったのであろう。したがって、この新しい分子はHABP35-FからN末端ロイシンを除いたものである考えられた。
【０１１２】
この新しい分子はHABP35-Fが存在しない場合には表れないので、当該分子がこのペプチドに由来することが示された。この断片化がN末端（C末端と反対側）で発生したことを確認するために、HABP35-Bをウサギの硝子体内で12時間インキュベートした。HABP35-Bの場合も、HABP35-Fで見られたものと同等の分子量の損失を含む新しいイオンが現れた。これにより、HABP35-FとHABP35-Bの両者とも、それぞれ異なるC末端（ぞれぞれ標識の修飾が異なることにより異なる）と反対側の同じN末端に変化を受けたことが示された。
【０１１３】
HABP35-FがN-末端で酵素的に分解されたことを更に確認するために、インキュベーション後に検出可能なHABP35-Fの比率をベスタチン有り無しの場合で評価した。ベスタチンは、アミノペプチダーゼ阻害剤である。アミノペプチダーゼは、ペプチド/タンパク質のN末端からアミノ酸の切断を触媒する。ベスタチンにより、ウサギ硝子体を用いたインキュベーションの6時間後に検出されたHABP35-Fの割合が有意に増加した(p=0.01：対応のないｔ検定）（図１０）。これにより、アミノペプチダーゼがHABP35-Fの酵素分解に関与していたことが確認された。
【０１１４】
この分解によりペプチドが臨床治療には有効でなくなるが、ウサギの硝子体における酵素分解に対するN末端ロイシン残基の弱さに問題があった。これは、SIMモードでの質量分析を用いる残りの全ペプチド（無傷および断片化バージョンの両方）を定量する能力を低下させるためである。SIMモードを用いてHABP35-Fを走査してもHABP35-F断片は検出できないだろう。検出を最適化するために、さらに別のプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン、ベスタチン、E-64、ロイペプチン）を加えた。これらのプロテアーゼ阻害剤はHABP35-Fを保護する傾向を示した（図１１）。
【０１１５】
ペプチドのN末端にD-アミノ酸を含んでなるおよび/または保護基を含む場合、この分解は見られなかった。例えば、ウサギの硝子体内における拡散研究ではHABP35-FPのレベルは、供与および収容チャンバとの間でほぼ一定であることが観察され、供与チャンバ内に保持されていることは明らかであった（図１２）。同様の結果がヒアルロン酸内でのHABP35-Fの拡散について観察されたが（図１３）、ウサギ硝子体内でのHABP35-Fの拡散ではペプチドの総量が大幅な減少を示した（図１４）。
【０１１６】
実施例４：HABP35保持のin vivoモデル
末端ロイシンを変換してD-構成にし、アセチル化することにより、HABP-35-Fを修飾して酵素分解からN末端を保護した。新しいペプチドはHABP35-FPと呼ばれた。成体雄Sprague Dawleyラットをin vivoモデルとして使用した。2.5μlの250nmole/ml HABP35-FPまたはRP2-Fを硝子体内に注射し、動物を様々な時点で選別した。硝子体液を抽出し、抽出された硝子体の蛍光を評価することによってペプチド濃度を測定した。各時点で、3つの眼を各ペプチドに評価した。加えて、落射蛍光顕微鏡を使用しアイカップフラットマウントで硝子体の蛍光を直接評価した。
【０１１７】
48時間後、落射蛍光顕微鏡下でHABP35-FPの保持がRP2-Fよりも多かった（図５）。この保持は、注射から少なくとも168時間まで続いた（図６）。
【０１１８】
実施例５：ペプチド-抗体複合体の調製
各システイン標識ペプチド（HABP35-CまたはRP2-C）を、1000μlの脱気リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.2、Invitrogen Ltd）に溶解し、250μΜの濃度にした。50μlの50mM 3,3´-N-[ε-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩(EMCH)をジメチルスルホキシド(DMSO, Sigma-Aldrich Ltd)で溶解したものをすぐに添加した。混合物をアルゴンでカバーし、密封してジスルフィド結合の酸化形成を防いだ。これを光から保護し、室温で2時間インキュベートした。
【０１１９】
未結合のEMCHを除去するために、3mlの2kDaの分子量カットオフ（MWCO）Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific/Pierce Ltd）内で、反応混合物を500mlのPBSに対して透析した。PBSを6および12時間後に交換し24時間までに透析を完了した。透析は4℃で行った。
【０１２０】
250μgのマウスモノクローナル抗ヒトIL-1β抗体（R&D Systems Ltd) を500μlの冷滅菌PBSに溶解した。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific/Pierce Ltd）を酸化緩衝液（20mM酢酸ナトリウム、pH5.5）に溶解し、20mMの濃度にした。体積は、抗体の体積（500μl）と等しく調製した。この溶液を氷上で保持し、光から保護した。500 μlの冷メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を、500μlの抗体溶液に添加した。すぐに室温に移し、30分間インキュベートし、光から保護し、20rpm（Stuart Ltd）のSB3可変速度ロータリーミキサーにかけた。5mlの7kDa MWCO Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Fisher Scientific/Pierce Ltd)を用い、製品プロトコルに従って緩衝液の交換を行った（酸化緩衝液をPBSに置換）。
【０１２１】
ペプチド-EMCH複合体を酸化抗体と混合した。混合物をオービタルシェーカー（Heidolph Ltd）で30rpmにて2時間室温でインキュベートした。未結合のペプチド-EMCH複合体を除去するために、3 mlの20kDaのMWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific/Pierce Ltd）内で、反応混合物を500 mlのPBSに対して透析した。PBSを6および12時間後に交換し24時間までに透析を完了した。透析は4℃で行った。
【０１２２】
その後、ペプチド-EMCH-抗体複合体を、Costar Spin-X 0.22 μmのセルロースアセテート遠心チューブフィルター（Corning Ltd)を用いて濾過滅菌した。これをAmicon Ultra 30 kDaのMWCO遠心分離フィルターユニット（Millipore Ltd）を用いて濃縮した。
【０１２３】
実施例６：HA結合剤のスクリーニング方法
透明なポリスチレンアミン表面の96ウェルELISAプレート(Corning Life Sciences Ltd)のウェルに、100μlの1mg/ml HAナトリウム塩(Sigma-Aldrich Ltd) を含む0.1Mの2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES、pH4.5-5、Sigma-Aldrich Ltd)を載せた。ウェルは、オービタルシェーカーで3時間室温でインキュベートした。すべてのさらなるインキュベーションは、オービタルシェーカーで室温にて行った。
【０１２４】
次いで、ウェルを洗浄緩衝液(0.05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Ltd)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.2〜7.4）で3回洗浄した。PBSは、以下の組成に調製した：137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、8.1mMのリン酸ナトリウム二塩基、1.5mMのリン酸二水素カリウム、pH7.2〜7.4、0.22μmで濾過。300μlの3%BSA(Sigma-Aldrich Ltd)を含むPBSを使用して各ウェルをブロックした。90分間のインキュベーション後、ウェルを再度3回洗浄した。その後、異なる濃度のビオチン化HA結合ペプチドまたは対照ペプチドを添加し、100μlの3%BSA PBSに溶解し、1時間インキュベーションした。再度3回の洗浄を行った。100μlのストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(S-HRP)(R&D Systems Ltd)(PBSで1:200 の作業濃度に希釈した)を各ウェルに添加して、結合したビオチン化ペプチドを検出した。ウェルを20分間インキュベートし、光から保護し、さらに３回洗浄した。100μlのテトラメチルベンジジン(TMB)/H2O2を各ウェルに添加した。ウェルは、10分間インキュベートし、光から保護した。反応は、50μlの1M H2SO4で停止した。450nmに設定したModulusマイクロプレートリーダーセットを使用して、各ウェルの光学密度をすぐに読み取った。一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、グループ間の統計的有意性を決定した(GraphPad Prism 5, GraphPad software Ltd)。
【０１２５】
表2は、本方法のパラメータをまとめたものである。
【０１２６】
【表２】
2017506220.tif 000012
【０１２７】
略語:HA＝ヒアルロン酸、MES＝2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、PBS＝リン酸緩衝生理食塩水、S-HRP＝ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ、TMB＝テトラメチルベンジジン
【０１２８】
実施例７：ペプチドおよび複合体
HABP35:
LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-アミド (配列番号1)
HABP35-F:
LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(FITC)-アミド (配列番号239)
HABP35-FP:
アセチル D-(L) KQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(FITC)-アミド (配列番号240)
HABP35-C:
アセチル D-(L) KQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(ビオチン)-C-アミド (配列番号241)
N末端におけるビオチン標識:
ビオチン-LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-アミド (配列番号242)
C末端におけるビオチン標識:
LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(ビオチン)-アミド (配列番号243)
N末端の保護:
アセチル D-(L) KQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-K(FITC)-アミド (配列番号244)
Kinestatin-HABP35:
｛pGlu｝IPGLGPLR-GGGS-LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-アミド (配列番号245)
HABP35-Kinestatin:
アセチル-｛d-Leu｝KQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN-GGGS-QIPGLGPLR-アミド (配列番号246)
参照ペプチド:
HABP42-F:
D-(STMMSRSHKTRSHHV) L-(GGGS-K(FITC)-アミド) (配列番号247)
Pep1-B:
GAHWQFNALTVR-GGGS-K(ビオチン)-アミド (配列番号248)
RP-F:
SATPASAPYPLA-GGGS-K(FITC)-アミド (配列番号249)
RP2-F:
SATPASAPYPLAGGGSSATPASAPYPLAGGGS-K(FITC)-アミド (配列番号250)
RP2-C:
SATPASAPYPLA-GGGS-K(ビオチン)-C-アミド (配列番号251)
【図１】
2017506220.tif 000013
【図５Ａ】
2017506220.tif 000014
【図５Ｂ】
2017506220.tif 000015
【図５Ｃ】
2017506220.tif 000016
【図９Ａ）】
2017506220.tif 000017
【図９Ｂ）】
2017506220.tif 000018
【図９Ｃ）】
2017506220.tif 000019
【図２】
2017506220.tif 000020
【図３】
2017506220.tif 000021
【図４】
2017506220.tif 000022
【図６】
2017506220.tif 000023
【図７】
2017506220.tif 000024
【図８】
2017506220.tif 000025
【図１０】
2017506220.tif 000026
【図１１】
2017506220.tif 000027
【図１２】
2017506220.tif 000028
【図１３】
2017506220.tif 000029
【図１４】
2017506220.tif 000030
【国際調査報告】
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2017506220.tif 000032
2017506220.tif 000033
2017506220.tif 000034
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