(57)【要約】  本開示は、筋量及び／又は筋力の増加を、それを必要とする対象に行うための、無毒性のタンパク質分解性破傷風毒素Ｃフラグメント及びそのようなタンパク質フラグメントをコードするプラスミドの使用に関する。従って筋肉の量、発達、又は代謝活性の減少によって少なくとも部分的に特徴付けられる病態の重症度を改善する方法が提供される。開示される組成物及び方法はまた、美容用途を含め、筋量及び筋力の増加が望ましい状態の治療にも有用である。2017521408.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋量及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量のＴＴＣを前記対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）前記疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
【請求項２】
前記疾患又は状態は、（ｉ）悪液質、食欲不振、筋ジストロフィー、若しくは神経筋疾患から選択される消耗性障害、又は（ｉｉ）硬直化、慢性疾患、癌、若しくは傷害の後遺症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋量の増加は、（ｉ）消耗性障害、硬直化、若しくは加齢によりもたらされる消耗を補うため、又は（ｉｉ）美容目的のためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＴＣは、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号５の配列を含むポリペプチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、あるいは
（ｃ）それらの組み合わせ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＴＴＣは、
（ａ）融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｂ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが前記治療部分のうちの１つである、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｃ）融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、核酸、
（ｄ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが前記治療部分のうちの１つのである、核酸、又は
（ｅ）それらの組み合わせ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＴＴＣは、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは、ヒト化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト化ＤＮＡは、配列番号８の配列、又はその変異型、フラグメント、若しくは誘導体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡは、配列最適化ｍＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列最適化ｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（１ｍΨ）、５−メチルシチジン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍＲＮＡは、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１の配列、又はそれらのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＴＣは、固定用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＴＣは、２種類以上の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＴＣは、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、又は１ヶ月に１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＴＣは、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内、又はそれらの組み合わせで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物においてインビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加の治療法を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は状態は、筋肉病変である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記筋肉病変は、急性又は慢性の筋肉病変である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記筋肉病変は、機械的病変、熱病変、化学的病変、職業上若しくは繰り返されるストレスによる病変、医原性病変、運動競技による筋肉病変、又はそれらの組み合わせである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
前記筋肉病変は、治療有効量のＴＴＣを前記病変の部位に直接注射することによって治療される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願と共に提出されているＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表（名称：ＴＴＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ、サイズ：２１，６２０バイト、及び作成日：２０１５年６月２５日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物の多くの障害、例えば、神経筋障害、筋ジストロフィー、又はＨＩＶ感染は、筋組織の減少若しくはその機能障害、又は筋肉の消耗と関連付けられている。床上安静中の患者の筋肉消耗は、重大かつ一般的な臨床上の問題である。集中治療室にいる患者は、そこに入ってからほとんど直ぐに、異化する、すなわち、筋組織が破壊されることが既知である。脚が２週間ギプスに固定されていただけの健常な若年ボランティアですら、筋肉の著しい損失が見られている。例えば、Ｈｅｓｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３６：６２５〜６３３（２００１）（非特許文献１）を参照されたい。筋組織の著しい損失は、悪液質と呼ばれる状態をもたらすが、これは、癌、外傷、及び熱傷の患者に見られることが多い。
【０００３】
筋量の損失は、正常な加齢の一部として起こり得るものであり、測定値が異常であればそれを食い止め、代謝をより同化促進性の状態に移行させる必要がある。そのような筋肉の損失及び／又は筋緊張の損失はまた、美容上重要な影響も有し得る。
【０００４】
筋肉発達の強化は運動選手にも有益となり得る。トレーニング、特に、無酸素性閾値に達するために十分に激しいウエイトトレーニング又は心血管トレーニングの際、運動選手は、筋繊維の破壊（異化）と筋繊維の再構築（同化）を絶えず行っている。
【０００５】
これまでに、筋肉の成長（すなわち、筋肉の質量若しくは体積の増加）及び／又は筋力の増加を促進するための信頼できる治療法も効果的な治療法もほとんど存在していない。筋肉損失と関連している状態を治癒することがないとは言え、そのような障害を患う患者において筋組織の量を増加させる治療法により、これらの患者の生活の質を大幅に向上させ、これらの疾患の効果の一部を緩和することができる。したがって、筋組織の全体的な増加に寄与することができる、又はこれらの状態、疾患、若しくは障害を患う患者において筋肉の損失を予防することができる、新しい治療法を特定することが当該技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｓｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３６：６２５〜６３３（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、筋量及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、この方法は、治療有効量の、無毒性の破傷風毒素Ｃフラグメント（ＴＴＣ）を対象に投与することを含み、該投与は、（ｉ）対象における筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）対象における筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０００８】
本明細書に開示される方法はまた、筋量の損失を治療、予防、若しくは緩和するか、筋量の損失速度を減少させるか、筋量の損失と関連する症状を治療、予防、若しくは緩和するか、筋力の低下を治療、予防、若しくは緩和するか、筋力の低下と関連する症状を治療、予防、若しくは緩和するか、この疾患若しくは状態により引き起こされる線維症を治療、予防、若しくは緩和するか、又は、疾患若しくは状態により引き起こされる線維症と関連する症状を治療、予防、若しくは緩和することもできる。一部の態様では、疾患又は状態は消耗性障害である。一部の態様では、消耗性障害は、悪液質及び食欲不振からなる群から選択される。他の態様では、消耗性障害は、筋ジストロフィー及び神経筋疾患からなる群から選択される。一部の態様では、状態は、硬直化、慢性疾患、癌、又は傷害の後遺症である。
【０００９】
また、対象にＴＴＣを投与することを含む、筋量の増加を必要とする対象において筋量を増加させる方法も提供される。一部の態様では、筋量の増加は、消耗性障害、硬直化、又は加齢によりもたらされる消耗を補うためのものである。他の態様では、筋量の増加は、美容目的のためのものである。
【００１０】
本開示はまた、筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法も提供し、この方法は、患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１（コラーゲンα−１（ＸＩＸ）鎖）及び／又はＳｎｘ１０（ソーティングネキシン１０）のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０レベルを上回った場合に、対象に治療有効量のＴＴＣを投与することを含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは障害により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【００１１】
筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法もまた提供され、この方法は、（ａ）患者から得た試料を、Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定にかけること、並びに（ｂ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、治療有効量のＴＴＣを対象に投与すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【００１２】
加えて、本開示は、筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定に、患者から得た試料をかけること、（ｂ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回ったか、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回ったかどうかを判定すること、並びに（ｃ）対象に治療有効量のＴＴＣを投与することを医療提供者に勧告すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【００１３】
筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を治療するかどうかを判定する方法もまた提供され、この方法は、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣを投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示をすること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【００１４】
本開示は、筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を、ＴＴＣ治療レジメンを用いた治療のための候補として選択する方法もまた提供し、この方法は、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣを投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【００１５】
一部の態様では、患者から得た試料は筋組織を含む。一部の態様では、対象はヒトである。他の態様では、ＴＴＣは、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号５の配列を含むポリペプチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、あるいは、
（ｃ）それらの組み合わせを含む。
【００１６】
他の態様では、ＴＴＣは、
（ａ）（ａ）融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｂ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つである、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｃ）融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、核酸、
（ｄ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つのである、核酸、あるいは、
（ｅ）それらの組み合わせを含む。
【００１７】
一部の態様では、ＴＴＣは、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡとして投与される。一部の態様では、ＤＮＡ又はＲＮＡは、ヒト化されている。一部の態様では、ヒト化ＤＮＡは、配列番号８の配列、又はその変異型、フラグメント、若しくは誘導体を含む。一部の態様では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは、配列最適化ｍＲＮＡである。一部の態様では、配列最適化ｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（１ｍΨ）、５−メチルシチジン、又はそれらの組み合わせを含む。一部の態様では、ｍＲＮＡは、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含む。
【００１８】
他の態様では、ＴＴＣは、固定用量で投与される。一部の態様では、ＴＴＣは、２種類以上の用量で投与される。一部の態様では、ＴＴＣは、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、又は１ヶ月に１回投与される。他の態様では、ＴＴＣは、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内、又はそれらの組み合わせで投与される。一部の態様では、本明細書に開示される方法は、哺乳動物においてインビボで行われる。一部の態様では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの追加の治療法を含む。
【００１９】
一部の態様では、疾患又は状態は筋肉病変である。一部の態様では、筋肉病変は急性又は慢性の筋肉病変である。一部の態様では、筋肉病変は、機械的病変、熱病変、化学的病変、職業上若しくは繰り返されるストレスによる病変、医原性病変、運動競技による筋肉病変、又はそれらの組み合わせである。
【００２０】
一部の態様では、筋肉病変は、治療有効量のＴＴＣを病変の部位に直接注射することによって治療される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】無毒性破傷風毒素フラグメントＣ（ＴＴＣ）の発現を検出するためのＰＣＲ増幅を示す。プラスミドｐＣＭＶ−ＴＴＣ（ｎ＝２、レーン１及び２）並びに空のプラスミドｐＣＭＶ（ｎ＝２、レーン３及び４）の筋肉内注射から１０日後に、ＲＮＡを筋肉から抽出し、逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＴＴＣ遺伝子に関してＰＣＲで増幅させた。レーン５は、陽性対照（ｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミド）を示し、ブランク反応はレーン６で実施した。レーンＭは、１００ｂｐサイズのマーカーに相当する。
【図２】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａモデルマウス（筋萎縮を特徴とする疾患であるＡＬＳのモデル系であり、筋萎縮には筋量の低減、筋衰弱の増加、及び筋肉機能の全般的な低下が含まれる）における神経筋症状の開始への、ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡを用いた治療の効果を示す。症状の現れは、ＴＴＣ処置群（ｎ＝１０）では、対照群（ｎ＝１０）と比べて大幅に遅延された。累積確率は、カプラン・マイヤー生存分析（ＳＰＳＳ１３．０）を用いて計算した。
【図３】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａモデルマウスの生存への、ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡを用いた治療の効果を示す。生存率は、ＴＴＣ処置群（ｎ＝１０）では、対照群（ｎ＝１０）と比べて大幅に増加した。累積確率は、カプラン・マイヤー生存分析（ＳＰＳＳ１３．０）を用いて計算した。
【図４】ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡを用いた治療の効果を示す。運動活動性は、１４ｒｐｍの一定速度のロータロッドを最大１８０秒の発達時間で用いて判定した。運動活動性の向上は、対照（ｎ＝１０）と比べて、ＴＴＣ処置群（ｎ＝１０）で観察された。
【図５】ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡの筋肉内注射の効果を表す。マウスの力及び運動機能は、各群１０匹のマウスを用いて（ｎ＝１０）ハンギングワイヤ試験で試験した。
【図６】ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡの筋肉内注射の効果を表す。各群から１０匹のマウス（ｎ＝１０）を用いて、ＴＴＣを用いて処置したトランスジェニックマウスの体重を測定。
【図７】１１０日齢の症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄におけるアポトーシスのシグナル伝達経路に関与する遺伝子の発現に関する分析を示す。対照（白色）及びＴＴＣ処置マウス（灰色）における遺伝子Ｃａｓｐ１、Ｃａｓｐ３、Ｂａｘ、及びＢｃｌ２のメッセンジャーＲＮＡの平均値の表示。これらの群のマウスを、野生型マウス（黒色）と比較した（１群当たりのマウス数ｎ＝５）。
【図８】１１０日齢の症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄におけるアポトーシスのシグナル伝達経路に関与するタンパク質の分析を示す。ＴＴＣ処置マウス（灰色の線）及び対照マウス（黒色の線）の脊髄溶解物を、野生型マウス（黒色）と比較したタンパク質ｐｒｏ−Ｃａｓｐ３、活性Ｃａｓｐ３、Ｂａｘ、及びＢｃｌ２のウエスタンブロット分析（１群当たりのマウス数ｎ＝５）。
【図９】タンパク質Ａｋｔ及びＥｒｋ１／２のリン酸化のウエスタンブロット分析を示す。１群当たり５匹のマウスの試料を分析した。ＩＤＶ（強度密度値）。ウエスタンブロットを使用して分析した量は、野生型マウスの値と比べたベータチューブリンの比として表される。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、エラーバーは平均値の標準誤差を示す）。バーは、前の見出しに記載されるものと同じ群を示す。
【図１０】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａモデルマウスの生存への、ＴＴＣポリペプチドを用いた腹腔内処置の効果を示す。生存率は、対照群（ｎ＝３、実線）に対して、ＴＴＣ処置群（ｎ＝３、点線）において大幅に増加した。累積確率は、カプラン・マイヤー生存分析（ＳＰＳＳ１３．０）を用いて計算した。
【図１１】ＴＴＣを注射したマウスの筋肉内処置が、トランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄におけるカルシウムの恒常性に関連する遺伝子の発現に影響を与えることを示す。ＴＴＣ（灰色）又は空のプラスミド（白色）を用いて処置したトランスジェニックマウスにおけるＮｃｓｌ及びＲｒａｄ遺伝子の発現レベルが判定された。上述のマウス群におけるメッセンジャーＲＮＡのレベルの変化を、野生型マウス（黒色）と比較した。（＊Ｐ＜０．０５、エラーバーは平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝５）。
【図１２】１２〜１６週齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの後肢筋におけるＭ波の振幅を示す。図のパネルは、前脛骨筋から記録したＭ波の代表的な記録を示す。図１２Ａは、１６週齢の野生型マウスの記録を示す。図１２Ｂは、１２週齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの記録を示し、図１２Ｃは、１６週齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの記録を示す。時間と共に進行する異常性として、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける振幅の顕著な減少と刺激からＭ波の発生までの潜時の僅かな増加に留意されたい（図１２Ｂと図１２Ｃとを比較）。記録内のマス目は、縦が１０ｍＶで横が１ミリ秒である。図１２Ｄは、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの前脛骨筋及び足底筋における平均ＣＭＡＰ（Ｍ波）振幅のヒストグラムである。振幅は、１２週では対照（ビヒクル−プラスミドマウス）及びＴＴＣ処置マウス（ＳＯＤ−ＴＴＣ）で類似していたが、１６週では対照マウスでは処置マウスよりも大幅に減少した。神経生理学的結果を、表３に示す。
【図１３】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける運動ニューロンの生存を示す。図１３Ａは、クレシルバイオレットで染色した野生型及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス由来のＭＮの顕微鏡写真を示す。ＳＯＤ１Ｇ９３ＡのＭＮにおけるニッスル物質の空胞化及び崩壊に留意されたい。バー＝４０μｍ。図１３Ｂは、１６週齢の、野生型、対照のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ処置マウス、及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＴＴＣ（ＳＯＤ−ＴＴＣ）処置マウスの、クレシルバイオレットで染色した腰髄の断面を示す、代表的な顕微鏡写真を示す。バー＝５００μｍ。図１３Ｃは、各腹角の側索内の染色された（クレシルバイオレット）ＭＮの数を数えることによって評価した、運動ニューロンの生存を示す。結果は、野生型、対照のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ビヒクル−プラスミドマウス）及びＴＴＣ処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ＳＯＤ−ＴＴＣ）（１群当たりの数ｎ＝５）のＬ２、Ｌ３及びＬ４脊髄分節の腹角において数えたＭＮの平均数を示す。＊Ｐ＜０．０５対野生型、＃Ｐ＜０．０５対対照ＳＯＤ１。
【図１４】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける膠細胞の反応性の分析を示す。図１４Ａは、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）及び小膠細胞（Ｉｂａ１）に対するマーカーで免疫標識した、野生型、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＴＴＣ（ＳＯＤ−ＴＴＣ）処置マウスの、脊髄腹角の代表的な顕微鏡写真を示す。バー＝１００μｍ。図１４Ｂは、マウスの３つの群におけるＧＦＡＰ及びＩｂａ１免疫反応性（ＩＲ）の定量化を示すヒストグラムを示す。＊Ｐ＜０．０５対野生型、＃Ｐ＜０．０５対対照ＳＯＤ１。
【図１５】重鎖及び軽鎖の位置並びにそれらそれぞれの機能的役割を示す、破傷風毒素前駆体タンパク質のドメイン構造の略図を示す。破傷風毒素の重鎖のＣ末端領域内の、配列番号２（ＴＴＣポリペプチド）及び配列番号５の相対的位置（ＴＴＣポリペプチドフラグメント）もまた示される。
【図１６】攣縮刺激記録（左パネル）及び強直刺激記録（右パネル）に相当する、等尺性の筋緊張記録の追跡を示す。
【図１７】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日の時点で記録された、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）の攣縮刺激によって誘導されたＴＡ（図１７Ａ）及びＥＤＬ（図１７Ｂ）における筋力に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ≦０．００５。
【図１８】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日の時点で記録された、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）の強直刺激によって誘導されたＴＡ（図１８Ａ）及びＥＤＬ（図１８Ｂ）における筋力に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図１９】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日の時点で記録された、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）の攣縮刺激によって誘導されたＴＡ（図１９Ａ）及びＥＤＬ（図１９Ｂ）における筋収縮に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図２０】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日の時点で記録された、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）の攣縮刺激によって誘導されたＴＡ（図２０Ａ）及びＥＤＬ（図２０Ｂ）における筋弛緩に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図２１】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日の時点で記録された、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）の強直刺激によって誘導されたＴＡ（図２１Ａ）及びＥＤＬ（図２１Ｂ）における正規化した強直力：質量比に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図２２】ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて１２０日目での、対照（空のｐｃＤＮＡ３．１を週１回及びＴＢＳを週１回）及びＴＴＣ処置後（ｐｃＤＮＡ３．１ＴＣＣを単回投与、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣを週１回投与、及び１０マイクログラムのＴＴＣタンパク質を週１回投与）のＴＡ（図２２Ａ）及びＥＤＬ（図２２Ｂ）における筋量比に関する定量分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、１群当たりのマウス数ｎ＝７〜８であり、各対象から２か所の筋肉を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．００５。
【図２３】ＴＴＣタンパク質処置後の筋肉特異的効果を示す、高倍率顕微鏡画像を示す。ビヒクル（左）及びＴＴＣ（右）を用いて処置したマウスの浅部下腿三頭筋を示す。点線のマス目は、下部パネルにより高倍率で示される対象領域の位置を示す。１００μｍのスケールバー。
【図２４】ＥＤＬ筋についての、８０日齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの遺伝子のバイオマーカー評価を示す。グラフは、野生型と比べて、８０日目でのトランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＥＤＬ筋において試験した、選択された遺伝子の転写レベルの変化倍率を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．０１。ｗｔ：野生型マウス、ｔｇ：未処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス、ｔｔｃ：６０日及び７５日の時点で、１０μｇ／注射の２回の腹腔内投与を用いて処置したＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス。
【図２５】ヒラメ筋についての、８０日齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの遺伝子のバイオマーカー評価を示す。グラフは、野生型と比べて、８０日目でのトランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスのヒラメ筋において試験した、選択された遺伝子の転写レベルの変化倍率を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＝＜０．０１。ｗｔ：野生型マウス、ｔｇ：未処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス、ｔｔｃ：６０日及び７５日の時点で、１０μｇ／注射の２回の腹腔内投与を用いて処置したＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス。
【図２６】外傷１５日後の、攣縮力（パネルＡ）及び強直力（パネルＢ）へのＴＴＣタンパク質の筋肉内注射の効果を示す。対照：外傷なし。
【図２７】ＴＴＣ処置、ＰＢＳ処置、及び外傷なし（対照）群における、ＴＡ筋の力・収縮頻度曲線（１５日）を示す。データは、平均±平均値の標準誤差で表した。
【図２８】外傷３０日後の、攣縮力（パネルＡ）及び強直力（パネルＢ）へのＴＴＣタンパク質の筋肉内注射の効果を示す。
【図２９】ＴＴＣ又はＰＢＳ処置群における、ＴＡ筋の力・収縮頻度曲線（３０日）を示す。データは、平均±平均値の標準誤差で表した。
【図３０】外傷１５日後の、攣縮力（パネルＡ）及び強直力（パネルＢ）へのＴＴＣ−プラスミドの筋肉内注射の効果を示す。対照：外傷なし。
【図３１】ＴＴＣ、空のプラスミド処置群及び外傷なし（対照）群（１５日）における、ＴＡ筋の力・収縮頻度曲線を示す。データは、平均±平均値の標準誤差で表した。
【図３２】外傷３０日後の、攣縮力（パネルＡ）及び強直力（パネルＢ）へのＴＴＣ−プラスミドの筋肉内注射の効果を示す。
【図３３】ＴＴＣプラスミド又は空のプラスミド処置群（３０日）における、ＴＡ筋の力・収縮頻度曲線を示す。データは、平均±平均値の標準誤差で表した。
【図３４】Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞増殖（４８時間、ｎ＝８）へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す。分裂促進能を、ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。Ｃｏ：ＤＭＥＭ中で４８時間維持された細胞。対照：ＧＭ［ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）、４８時間］中の細胞。データは、平均±標準誤差で表した、＊Ｐ＜０．０５対対照値。
【図３５】７日間にわたる、分化するＣ２Ｃ１２細胞上のミオゲニンのタンパク質発現への、ＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（ｎ＝３）。ミオゲニンのレベルは、ＧＭ（対照）におけるそれぞれの発現の倍率として示した。データは、独立した実験の強度走査から得た平均±標準誤差として表した。＊ＤＭ値に対してＰ＜０．０５。
【図３６】７日間にわたる、分化するＣ２Ｃ１２細胞上のＭＨＣのタンパク質発現への、ＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（ｎ＝３）。ＭＨＣのレベルは、ＧＭ（対照）におけるそれぞれの発現の倍率として示した。データは、独立した実験の強度走査から得た平均±標準誤差として表した。＊ＤＭ値に対してＰ＜０．０５。
【図３７】７日間にわたる、分化するＣ２Ｃ１２細胞へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す。刺激後７日の時点での、ＤＭ（対照）又はＤＭ＋ＴＴＣ下のＣ２Ｃ１２筋管細胞におけるＭＨＣ及びＤＡＰＩの免疫蛍光検出。上部パネル、１０倍の対物倍率。下部パネル、代表領域の倍率。
【図３８】刺激後７日の時点での、筋管領域（μｍ２）へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図３９】刺激後７日の時点での、筋管領域（μｍ）へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図４０】刺激後７日の時点での、融合指数へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図４１】刺激後７日の時点での、１個のＭＨＣ＋細胞当たりの筋核の数への、ＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図４２】刺激後７日の時点での、筋管配向へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図４３】筋管の、凝集した（パネルＡ）又はアライメントした（パネルＢ）配向を示す免疫蛍光画像、及び刺激後７日の時点での、Ｃ２Ｃ１２筋管における細胞核分布へのＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）の用量反応効果（＊、Ｐ＜０．０５）（パネルＣ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
破傷風毒素は、強力な神経毒である。構造的には、破傷風毒素（１５０ｋＤａ）は、重鎖（１００ｋＤａ）及び軽鎖（５０ｋＤａ）の２つのポリペプチド鎖から構成されている。１つのジスルフィド架橋がこれらの２つのポリペプチドを接合している。重鎖は、この毒素の結合ドメイン及び転移ドメインを含み、一方で軽鎖はシナプトブレビンを切断するプロテアーゼである。この毒素は、まず、末梢神経の終端部でガングリオシドに結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって内部移行する。この毒素は、次いで、軸索内輸送によって腹角へと移動する。そこから、ニューロン間の空間に放出され、運動ニューロンの細胞体に隣接する阻害性介在ニューロンによって取り込まれる。
【００２３】
重要なフラグメントである破傷風毒素Ｃフラグメントは、この毒素がパパインによって酵素で切断されたときに生成される。このＣフラグメント（５０ｋＤａ）は、破傷風毒素重鎖のＣ末端の４５１個のアミノ酸に相当する。Ｃフラグメントは、毒素全体の結合、内部移行、及び経シナプス輸送を保持するため、有用である。しかしながら、いずれの神経プロセスも破壊しないことから、無毒である。破傷風毒素の重鎖の無毒性カルボキシ末端ドメイン（当該技術分野においてＴＴＣとして知られている）は、神経を介して逆行的に輸送される融合タンパク質の作製を通じて、治療剤の担体として治療目的で使用されている。例えば、Ｃｉｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｎｔ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．３：１０５〜１１２（２００８ａ）、Ｃｉｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２６：４５９〜６５（２００８ｂ）、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０１１：７〜１３（２００４）、米国特許第ＵＳ７９２３２１６号、同第ＵＳ７９７２６０８号、同第ＵＳ８７０３７３３号、及び同第ＵＳ７４３５７９２号、又は国際公開第ＷＯ２００５０００３４６号、同第ＷＯ２０１１１４３５５７号、及び同第ＷＯ１９９９００９０５７号を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。更に、ＴＴＣは、最近、その神経保護能力のため、ＡＬＳを治療するための治療剤として提案されている。国際公開第ＷＯ／２００９／０４３９６３号及び米国第ＵＳ８９４５５８６号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本開示は、ＴＴＣ（すなわち、ＴＴＣポリペプチド、そのようなＴＴＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の投与が筋肉に直接影響を与えること、すなわち、（ｉ）対象における筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）対象における筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少を示す証拠を提供する。本明細書に開示される方法は、筋量の損失を治療、予防、低減、若しくは緩和するか、筋量の損失速度を減少させるか、筋量の損失と関連する症状を治療、予防、低減、若しくは緩和するか、筋力の低下を治療、予防、低減、若しくは緩和するか、筋力の低下と関連する症状を治療、予防、低減、若しくは緩和するか、疾患若しくは状態により引き起こされる線維症を治療、予防、低減、若しくは緩和するか、又は疾患若しくは状態により引き起こされる線維症と関連する症状を治療、予防、低減、若しくは緩和することもできる。
【００２５】
したがって、本開示は、ＴＴＣの投与を含む、（ｉ）対象における筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）対象における筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。
【００２６】
本開示は、筋量及び／又は筋力の低下を予防又は低減する方法もまた提供する。加えて、本開示は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患（例えば、神経筋疾患、ＨＩＶ）又は状態（例えば、加齢、例えば手術後の創傷治療、骨折後の硬直化、筋肉病変など）の症状を治療する方法、又はＴＴＣ（すなわち、ＴＴＣポリペプチド、そのようなＴＴＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を対象に投与することによって、それを必要とする対象における筋量及び／又は筋力の低下を予防又は低減する方法を提供する。ＴＴＣの投与は、筋量及び／又は筋力の増加、筋量及び／又は筋力の低下の予防、回復又は治癒の速度の上昇、該疾患又は状態により引き起こされる線維症の減少、並びにそれらの組み合わせに関連する治療用途及び／又は美容用途のためであり得る。概して、本明細書に開示される方法は、筋量又は筋力の増加が望ましいとき（例えば、加齢若しくは無重量状態による筋量の減少を妨げるため、正常で健常な対象における運動能力を向上させるため、又は非ヒト動物における筋量を増加させるため）にいつでも適用することができる。
【００２７】
本開示は、処置した対象から得た試料において、少なくとも１つのバイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、又はＣｏｌ１Ａ１）のレベルを決定することを含む、筋肉へのＴＴＣの効果（例えば、筋量及び／又は筋力への効果）を監視する方法もまた提供する。具体的には、所定の閾値レベルを上回るか又は下回るバイオマーカーのレベルの存在が、例えば、（ｉ）筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は状態を患う患者が、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた特定の治療に関して適格か不適格かを判定するため、（ｉｉ）筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は状態のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた特定の治療が、開始、停止、又は修飾されるべきであるかどうかを判定するため、（ｉｉｉ）筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は状態が、特定のＴＴＣ組成物（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いて治療可能であるか、又は治療不可能であるかを診断するため、（ｉｖ）特定のＴＴＣ組成物（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は状態の治療結果の予後を判定するために使用され得る。
【００２８】
本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語をまず定義する。追加の定義は詳細な説明全体に記載されている。
【００２９】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。「１つの（a）（又は「１つの（an）」）」という用語、並びに「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００３０】
更に、本明細書に使用される「及び／又は」は、２つの指定された特徴又は構成要素が、もう一方の有無にかかわらずそれぞれ具体的に開示されると見なされるべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられる「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられる「及び／又は」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【００３１】
態様が、用語「含む（comprising）」で本明細書に記載されている場合は、「からなる（consisting of）」及び／又は「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語で記載される他の類似する態様もまた提供される。
【００３２】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、数値と関連して使用される用語「約（about）」は、当業者に知られており、許容可能な精度の間隔を示す。概して、そのような精度の間隔は±１５％である。
【００３３】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本開示に使用される多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。
【００３４】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの、国際単位系（ＳＩ）に受け入れられた形式で示される。数の範囲は、その範囲を定義する数を含む。他に指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで、左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は態様の制限ではなく、本明細書全体を参照することによって得ることができる。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００３５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して本明細書に互換的に使用される。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であってもよく、これには修飾されたアミノ酸が含まれてもよく、また非アミノ酸によって中断してもよい。これらの用語には、自然に、又は本発明によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分（例えば、色素）、治療剤（例えば、神経筋疾患の治療剤）、又は化粧剤とのコンジュゲートなどを受けているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸など）、並びに当該技術分野で既知の他の修飾を含むポリペプチドも、この定義に含まれる。
【００３６】
「組み換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって生成されたポリペプチド又はタンパク質を指す。組み換え宿主細胞で発現した、組み換えで生成されるポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって、分離、分画、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組み換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると見なされる。本明細書に開示されるポリペプチドは、当業界で既知の方法を使用して、組み換えで生成され得る。代わりに、本明細書に開示されるタンパク質及びペプチドが、化学的に合成され得る。
【００３７】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、若しくは塩基、及び／又はそれらの類似体、あるいはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって、ポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。前述の記載は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で参照される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３８】
タンパク質配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又はアミノ酸配列を指すために使用される用語「配列」は、表現において互いに隣り合う残基が、ポリペプチドの一次構造において近接している、アミノ末端からカルボキシ末端への方向におけるポリペプチドのアミノ酸成分の線形表現を意味する。
【００３９】
「単離された」、本明細書に開示されるポリペプチド、タンパク質、封入体、又は他の組成物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、又は自然界においては見られない形態の本明細書に開示される他の組成物である。単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、又は本明細書に開示される他の組成物は、それらがもはや自然界において見られる形態ではない程度に精製されているものを含む。一部の態様では、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、単離されたとして本明細書に開示される他の組成物は、実質的に純粋である。
【００４０】
ポリペプチド及びポリヌクレオチドを指すとき、用語「フラグメント」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも一部の特性を保持する、任意のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。例えばＴＴＣの場合、用語フラグメントは、例えば少なくともある程度まで、参照ポリペプチドの望ましい特性、具体的には、筋量及び／又は筋力の増加を必要とする対象に投与したとき、それを引き起こすポリペプチドの能力を保持する任意のポリペプチドを指すであろう。ポリヌクレオチドの場合、用語フラグメントは、筋量及び／又は筋力の増加を引き起こす能力を保持するＴＴＣポリペプチドをコードする、任意のポリヌクレオチドを指すであろう。ポリペプチドのフラグメントは、無毒性のタンパク質分解性フラグメント（破傷風毒素の酵素的又は化学的タンパク質分解によりもたらされる）、欠損発現フラグメント（例えばＴＴＣフラグメントをコードするフラグメントポリヌクレオチドの発現によりもたらされる）、及び化学的に合成されるフラグメント（例えば、固相ペプチド合成を介して）を含む。
【００４１】
本明細書に使用される用語「変異型」は、少なくとも１つの修飾、例えば、ヌクレオチド修飾又はアミノ酸修飾により、親配列のものとは異なるＴＴＣ配列を指す。変異型は自然に生じることができるか、又は自然には存在しない。自然に生じない変異型は、当業界に既知の突然変異誘発技術を使用して生成され得る。変異型ポリペプチドは、保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は付加を含むことができる。
【００４２】
天然ポリペプチド又はポリヌクレオチドには見られない追加の特徴を提示するように改変されているＴＴＣポリペプチド又はポリヌクレオチドの「誘導体」。また「誘導体」として含まれるものは、２０個の標準アミノ酸の１つ以上の自然に生じるアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。指定されたポリペプチドに「由来する（derived from）」ポリペプチド又はアミノ酸配列は、ポリペプチドの源を指す。
【００４３】
別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドに対する１つ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、又は１つ以上のアミノ酸残基挿入又は欠失を有する１つ以上のアミノ酸残基を有することができる。一部の態様では、ポリペプチドは自然には生じないアミノ酸配列を含む。そのような変異型は、出発ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有する。一部の態様では、変異型は、例えば、変異型分子の長さにわたる、出発ポリペプチドのアミノ酸配列との約７５％〜１００％未満の、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、及び最も好ましくは約９５％〜１００％未満の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。一態様では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列との間に、１つのアミノ酸の差異が存在する。この配列に関する同一性又は類似性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、出発アミノ酸残基と同一（すなわち同じ残基）である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として本明細書で定義される。
【００４４】
同様に、別のポリヌクレオチドに由来するポリヌクレオチド（例えば、野生型ＴＴＣポリヌクレオチドの配列に由来するヒト化ＴＴＣポリヌクレオチド又はＴＴＣをコードする野生型若しくはヒト化ＲＮＡ配列に由来する最適化ｍＲＮＡ）は、出発ポリヌクレオチドに対する１つ以上の変異、例えば、別のヌクレオチド若しくはコドンで置換されたか、又は１つ以上のヌクレオチド若しくはコドン挿入若しくは欠失を有する、１つ以上のヌクレオチド若しくはコドンを有することができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは自然には生じないポリヌクレオチド配列を含む。そのような変異型は、出発ポリヌクレオチドとの１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有する。一部の態様では、変異型は、変異型分子の長さにわたる、出発ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列との約４０％〜１００％未満のヌクレオチド配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を有するであろう。一部の態様では、変異型は、変異型分子の長さにわたる、出発ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列との約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の、ヌクレオチド配列同一性又は類似性を有する。一態様では、出発ポリヌクレオチド配列とそれに由来する配列との間に、１つのヌクレオチドの差異が存在する。この配列に関する同一性又は類似性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、出発ヌクレオチドと同一（すなわち同じヌクレオチド）である候補配列内のヌクレオチドの百分率として本明細書で定義される。
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当業界で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、置換は保存的であると見なされる。別の態様では、アミノ酸の鎖は、順番の異なる構造的に同様な鎖及び／又は側鎖ファミリーメンバーの組成物で保存的に置き換えられ得る。
【００４６】
非保存的置換は、（ｉ）陽性の側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、若しくはＬｙｓ）を有する残基が、陰性の残基（例えば、Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ）を、又はそれによって置換されるもの、（ｉｉ）親水性の残基（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）が、疎水性の残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、若しくはＶａｌ）を、又はそれによって置換されるもの、（ｉｉｉ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基を、又はそれによって置換されるもの、あるいは（ｉｖ）より小さい側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）を有するもの若しくは側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）を置換するか、又はそれらによって置換される、かさばった疎水性若しくは芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、若しくはＴｒｐ）を有する残基を含む。
【００４７】
他の置換は、当業者によって容易に特定され得る。例えば、アミノ酸アラニンについて、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、ベータアラニン、Ｌ−システイン、及びＤ−システインのうちの任意のものから得ることができる。リジンについて、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オミチン（omithine）、又はＤ−オルニチンのうちの任意のものであり得る。概して、単離されたポリペプチドの特性における変化を誘導すると予想され得る、機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリン若しくはトレオニンが、疎水性の残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、若しくはアラニンを置換する（又は、それによって置換される）もの、（ｉｉ）システイン残基が、任意の他の残基を置換する（又はそれによって置換される）もの、（ｉｉｉ）陽性の側鎖、例えば、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジンを有する残基が、陰性の側鎖、例えば、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸を有する残基を置換する（又はそれによって置換される）もの、あるいは（ｉｖ）かさばった側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、そのような側鎖、例えば、グリシンを有しないものを置換する（又はそれによって置換される）ものである。前述の非保存的置換のうちの１つが、タンパク質の機能的特性を変化させ得る可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置にも相関し、一部の非保存的置換は、生物学的特性へ効果をほとんど有しないか、又は全く有しない場合がある。
【００４８】
２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の「配列同一性パーセント」という用語は、これら２つの配列の最適なアライメントのために導入すべき付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を考慮して、これらの配列が比較ウインドウ全体で共有する同一な一致位置の数を指す。一致の位置は、同一なヌクレオチド又はアミノ酸が標的配列と参照配列の両方に存在する任意の位置である。標的配列に提示されるギャップは、ヌクレオチドでもアミノ酸でもないため、数えない。同様に、参照配列に提示されるギャップも、標的配列のヌクレオチド又はアミノ酸配列を数え、参照配列からはヌクレオチドもアミノ酸も数えないため、数えない。
【００４９】
配列同一性の百分率は、同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が両方の配列に生じる位置の数を判定して、一致位置の数を得、一致位置の数を比較ウインドウの全位置数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって、計算される。２つの配列間の配列の比較及び配列同一性パーセントの判定は、オンラインでの使用とダウンロードの両方で容易に入手可能なソフトウェアを用いて達成することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給元から入手可能であり、タンパク質及びヌクレオチドの両方の配列のアライメントに利用できる。配列同一性パーセントを判定するために好適なプログラムの１つには、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴのウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴププログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に用いられ、一方でＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に用いられる。他の好適なプログラムには、バイオインフォマティクスプログラムＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａで入手可能なＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒがある。
【００５０】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアライメントする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれが、それら独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセントの値は、最も近似する小数点第一位に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられ、一方で８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数となることにも留意されたい。
【００５１】
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列と第２の配列アミノ酸の百分率同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメントにおける同一な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数（目視検査又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントされるように）であり、Ｚは、第２の配列における残基の合計数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列と第２の配列同一性パーセントは、第２の配列と第１の配列同一性パーセントよりも高くなるだろう。
【００５２】
当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が、一次配列データによって独占的に行われる二進法の配列−配列比較に制限されないことを理解するであろう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントに由来し得る。複数の配列アラインメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇで入手可能な、ＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／で入手可能な、ＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、代わりに、例えばＥＢＩから入手可能である。
【００５３】
配列アラインメントが、構造的データ（例えば、結晶学的なタンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の位置）、又は系統発生学的なデータなどの、異種情報源からのデータを、配列データに組み込むことによって生成され得ることもまた理解されるであろう。異種データを組み込み複数の配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅであり、代わりとしては、例えばＥＢＩから、入手可能である。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アラインメントが、自動又は手動のいずれかで精選され得ることもまた理解されるであろう。
【００５４】
本明細書で使用される用語「薬学的組成物」は、活性成分（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、組成物が投与される対象に対して容認しがたく有毒性である追加の構成要素を含有しない、製剤を指す。そのような組成物は、無菌性であり得る。
【００５５】
本明細書に使用される用語「治療する（treat）」、「治療（treatment）」、若しくは「〜の治療（treatment of）」は、特定の疾患若しくは障害の可能性の低減、特定の疾患若しくは障害の発症の低減、及び／又は特定の疾患若しくは障害の重症度の低減、好ましくは、対象が、もはや不快感及び／又はそれによって改変された機能を患うことがない程度への低減を指す。例えば、治療することは、特定の疾患若しくは障害の発症を防止するため、及び／又は特定の疾患症状、兆候、若しくは原因を、治療若しくは緩和するために、対象に施されるときの、治療法の能力（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、それらの組み合わせ）を指すことができる。治療することは、少なくとも１つの臨床症状の軽減若しくは減少、及び／又は状態の進行の阻害又は遅延、及び／又は疾患若しくは疾病の発生の予防又は遅延（例えば、筋量若しくは筋力の低下の遅延、又は疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の発生の遅延）もまた指す。したがって、用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、若しくは「〜の治療（treatment of）」（又は文法的に同等な用語）は、予防的及び治療的処置計画の両方を指す。一部の態様では、そのような疾患若しくは障害は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害である。組成物及び本明細書に開示される方法を使用して治療され得る疾患及び状態が、以下により詳細に記載される。
【００５６】
本開示は、概して治療的効果を提供する方法及びシステムを提供する。治療的効果は、特定の疾患若しくは障害を必ずしも治療しないが、むしろ、疾患若しくは障害の緩和、又は増加した生存率、疾患若しくは障害の除去、疾患若しくは障害と関連する症状の低減、二次疾患、障害、又は一次疾患若しくは障害の発症によりもたらされる状態の予防若しくは緩和、及び／あるいは疾患若しくは障害の予防を最も典型的に含む結果を包含する。
【００５７】
本明細書に使用される用語「対象」又は「患者」は、疾患又は障害の診断、予後、又は治療法が必要とされている任意の対象、特に哺乳類の対象を指す。本明細書に使用される用語「対象」又は「患者」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、馬、牛、熊、鶏、両生類、爬虫類、などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含む。本明細書に使用される用語は、治療法の実行、画像診断若しくは診断手順、及び／又は疾患若しくは障害の予防的治療が有益となるであろう、哺乳類の対象などの対象を含む。一部の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、動物の対象、例えば、家畜の筋量を増加させるために使用され得る。他に指示がない限り、用語「それを必要とする対象」は、少なくとも部分的に、年齢、不活動、疾患若しくは障害、状態、又はそれらの組み合わせによって、筋肉の損失及び／又は筋力の低下を提示するヒトを含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【００５８】
本開示の一部の態様では、対象は未処置の対象である。未処置の対象は、治療法、例えば、筋肉の成長及び／若しくは筋力を促進するため、並びに／又は筋量の損失を防止するための治療剤を投与されていない対象である。一部の態様では、未処置の対象は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、若しくはそれらの組み合わせ）を投与される前に、筋肉の成長及び／若しくは筋力を促進する、並びに／又は筋量の損失を防止する治療剤、例えば小分子薬物を用いて治療されていない。別の態様では、対象は、ＴＴＣが投与される前に、治療を受けている、並びに／又は１若しくは複数用量の、筋肉の成長及び／若しくは筋力を促進する、並びに／若しくは筋量の損失を防止する治療剤、例えば小分子薬物を受けている。一部の態様では、対象は、ＴＴＣの投与と同時に、筋肉の成長及び／若しくは筋力を促進する、並びに／又は筋量の損失を防止する治療剤、例えば小分子薬物を受けることができる。
【００５９】
本明細書に使用される用語「治療法」は、例えば、治療剤、器具類、対症療法、及び外科的又はリハビリテーション手順を含む、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を、治療、軽減、又は防止するための、任意の方法を含む。この点で、用語、治療法は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、若しくは障害の予防、管理、治療、及び／又は緩和に使用され得る、任意のプロトコル、方法及び／又は治療的又は診断的なものを包含する。
【００６０】
本明細書に使用される用語「線維症」は、臓器又は組織の通常成分としての繊維組織の形成とは対照的に、修復又は反応プロセスとしての、臓器又は組織における余分な繊維結合組織の形成又は発達として理解されるべきである。
【００６１】
本明細書に使用される用語「治療剤」は、所望の、通常は有益である効果を生成するために、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を有する対象に投与される任意の治療的活性物質を指す。用語、治療剤は、例えば、一般的に、抗体又はその活性フラグメント、ペプチド、脂質、タンパク質薬物、タンパク質コンジュゲート薬物、酵素、オリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子材料、プリオン、ウイルス、細菌、及び真核細胞を含むが、これらに限定されない、小分子薬物及び生物製剤として参照される、標準的な低分子量治療剤を含む。治療剤は、対象に投与されたとき、所望の治療的活性物質へと代謝される前駆薬物でもあり得る。一部の態様では、治療剤は予防剤である。加えて、治療剤は、薬学的に配合され得る。治療剤は、光又は超音波エネルギーなどの一部の他の形態のエネルギー、又は全身的に投与され得る他の循環分子によって活性化される、放射性同位元素又は薬剤でもあり得る。
【００６２】
本明細書に使用される「治療有効」量は、一部の改善又は利益を、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を有する対象に提供する、治療剤の量である。したがって、「治療有効」量は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、若しくは障害の、少なくとも１つの臨床症状に、一部の緩和、軽減、及び／又は減少を提供する量である。当業者は、一部の利益が対象に提供されている限り、治療効果は、完了するか又は治癒的である必要がないことを理解する。
【００６３】
一部の態様では、用語「治療有効」は、（ａ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患若しくは状態からの回復若しくは治癒の速度の向上、（ｈ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の減少、又は、（ｊ）それらの組み合わせが可能な、治療剤の量を指す。
【００６４】
本明細書に使用されるとき、「十分な量」又は「〜に十分な量」は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を有する患者において特定の結果を達成し、随意に、治療効果（すなわち、治療有効量の投与によって）である、所望の効果を生成するために有効である治療剤（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の量を指す。一部の態様では、そのような特定の結果は、
（ａ）筋量の増加、
（ｂ）筋力の増加、
（ｃ）疾患又は状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、
（ｄ）疾患又は状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、
（ｅ）疾患又は状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、
（ｆ）疾患又は状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、
（ｇ）疾患又は状態からの回復若しくは治癒の速度の上昇、
（ｈ）疾患又は状態によって引き起こされる線維症の予防、
（ｉ）疾患又は状態によって引き起こされる線維症の減少、あるいは、
（ｊ）それらの組み合わせである。
【００６５】
本明細書に使用される用語「試料」は、任意の生物学的液体又は組織、例えば対象から得た筋組織を含む。試料は、当業界で既知の任意の方法によって得ることができる。一部の態様では、試料は、多くの対象から生物学的試料を採取すること、及びそれらを貯留すること、又は各対象の生物学的試料の一定分量を貯留することによって得ることができる。貯留した試料は、単一の対象からの試料として取り扱われ得る。用語、試料は、前述のもの全てのうちの、実験的に分離された画分も含む。
【００６６】
一部の態様では、試料は、対象からの試料、例えば異なる筋肉からの筋組織試料の組み合わせであり得る。一部の態様では、試料は、対象の個体群からの試料の組み合わせであり得る。一部の態様では、複数の試料は、例えば、筋量及び／若しくは筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害の進行を監視するため、並びに／あるいはＴＴＣが、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を有する対象に投与されたとき、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療の効果、又はそれらの欠如を監視するために、異なる時間間隔で、単一の対象から得ることができる。
【００６７】
本開示の方法及びシステムを適用するために、患者からの試料は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は障害を治療するための治療法の実行、例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせの投与の前若しくは後に得ることができる。一部の事例では、連続する試料は、患者治療法が開始された後、又は治療法が中止された後に、患者から得ることができる。
【００６８】
試料は、例えば医療提供者（例えば、医師）又は医療給付提供者によって要求され得、同じか若しくは別の医療提供者（例えば、看護師、病院）又は臨床検査室によって得られ及び／又は処理され得、処理後、結果は、元の医療提供者又は更に別の医療提供者、医療給付提供者又は患者に送られ得る。同様に、１つ以上のスコアの測定／定量、スコア間の比較、スコア及び治療決定の評価は、１つ以上の医療提供者、医療給付提供者、及び／又は臨床検査室によって行われ得る。
【００６９】
機能的特徴に関する用語「増加した」は、比較可能な状態下で定量するとき、参照のものと比べて、関連性のある機能的特徴が大幅に増加したことを示すために使用される。一部の態様では、機能的特徴（例えば、全体的な筋収縮力の増加、攣縮力、強直力、筋量、力：質量比、又はそれらの組み合わせなどの、筋肉機能の増加）の増加は、比較可能な状態下で判定したとき、参照と比べて、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％高い。
【００７０】
一部の態様では、機能的特徴（例えば、全体的な筋収縮力の増加、攣縮力、強直力、筋量、力：質量比、又はそれらの組み合わせなどの、筋肉機能の増加）の増加は、比較可能な状態下で判定したとき、参照と比べて、例えば、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加した。
【００７１】
機能的特徴に関する用語「減少した」は、比較可能な状態下で定量するとき、参照のものと比べて、関連性のある機能的特徴が大幅に減少したことを示すために使用される。一部の態様では、機能的特徴の減少（例えば、筋肉機能の低下の減少若しくは予防、及び／又は筋量の損失の減少若しくは予防）は、比較可能な状態下で判定したとき、参照と比べて、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％低い。
【００７２】
一部の態様では、機能的特徴の減少（例えば、筋肉機能の低下の減少若しくは予防、及び／又は筋量の損失の減少若しくは予防）は、比較可能な状態下で判定したとき、参照と比べて、例えば、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍減少した。
【００７３】
本明細書に使用される用語「医療提供者」は、生きている対象、例えば、ヒト患者と直接相互作用し、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与する、個人又は機関を指す。医療提供者の非限定的な例としては、医師、看護師、技術者、治療専門家、薬剤師、カウンセラー、代替医療医、医療施設、診察室、病院、救急処置室、診療所、外来治療施設、代替医療診療所／施設、並びに一般及び／若しくは専門治療、診断、維持、治療法、薬物療法、並びに／又は全てに関連する勧告を提供する任意の他の主体、あるいは一般医療、専門医療、外科的、及び／又は任意の他の種類の治療、診断、維持、治療法、薬物療法及び／若しくは勧告を含むが、これらに制限されない患者の健康状態の任意の部分が挙げられる。
【００７４】
本明細書に使用される用語「臨床検査室」は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を使用して、治療しているか又は治療が有益となり得る生きている対象、例えばヒトに由来する材料の試験又は処理のための施設を指す。
【００７５】
処理の非限定的な例としては、例えば、任意の疾患若しくは機能障害の診断、予防、又は治療のための情報を提供する目的のため、又は生きている対象、例えばヒトの健康評価のための、生物学的、生化学的、血清学的、化学的、免疫血液学的、血液学的、生物物理学的、細胞学的、病理学的、遺伝学的、又は人体に由来する材料、例えば筋肉試料の他の試験が挙げられる。これらの試験は、試料を採取するか又は別の方法で得る手順、生きている対象、例えばヒトの体内における様々な物質の在否、又は生きている対象、例えばヒトの体から得た試料を、調製、判定、測定するか、又は他の方法で記載する手順もまた含むことができる。
【００７６】
本明細書に使用されるとき、「医療給付提供者」という用語は、１つ以上の医療給付、給付制度、健康保険、及び／又は医療費管理プログラム（healthcare expense account program）の提供、提案、供給、全額若しくは一部の費用負担を行うか、又はそれらの利用を患者に提供することと関連する、個々の団体、組織、又はグループを包含する。
【００７７】
一部の態様において、医療提供者は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を治療するための治療を施す、例えば、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与してもよく、又はそのように別の医療提供者に指示してもよい。
【００７８】
医療提供者は、例えば、次の動作を実行してもよく、又はそれらを行うように別の医療提供者若しくは患者に指示してもよい：試料の取得、試料の処理、試料の提出、試料の受領、試料の移送、試料の分析若しくは測定、試料の定量化、試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の提供、試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の受領、１つ以上の試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の比較／スコア付け、１つ以上の試料の比較／スコアの提供、１つ以上の試料の比較／スコアの取得、治療法の実行、治療法の実行の開始、治療法の実行の中止、治療法の実行の継続、治療法の実行の一時的な中断、治療剤の投与量の増加、治療剤の投与量の減少、ある量の治療剤の投与の継続、治療剤の投与頻度の増加、治療剤の投与頻度の減少、同じ治療剤投薬頻度の維持、ある治療法若しくは治療剤との少なくとも別の治療法若しくは治療剤との置き換え、ある治療法若しくは治療剤と少なくとも別の治療法若しくは追加の治療剤との組み合わせ。
【００７９】
一部の実施形態では、医療給付提供者は、例えば、試料の採取、試料の処理、試料の提出、試料の受領、試料の移送、試料の分析若しくは測定、試料の定量化、試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の提供、試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の移送、１つ以上の試料の分析／測定／定量化の後に得られた結果の比較／スコア付け、１つ以上の試料の比較／スコアの移送、治療法若しくは治療剤の投与、治療法若しくは治療剤の投与の開始、治療法若しくは治療剤の投与の中止、治療法若しくは治療剤の投与の継続、治療法若しくは治療剤の投与の一時中断、治療剤の投与量の増加、治療剤の投与量の減少、ある量の治療剤の投与の継続、治療剤の投与頻度の増加、治療剤の投与頻度の減少、同じ治療剤投薬頻度の維持、ある治療法若しくは治療剤の少なくとも別の治療法若しくは治療剤との置き換え、又はある治療法若しくは治療剤と少なくとも別の治療法若しくは追加の治療剤との組み合わせを承認又は否認することができる。
【００８０】
加えて、医療給付提供者は、例えば、治療法の処方を承認又は否認すること、治療法の保険適用を承認又は否認すること、治療法の費用の払い戻しを承認又は否認すること、治療法への適格性を決定又は否認することなどができる。
【００８１】
一部の態様では、臨床検査室は、例えば、試料の採取若しくは取得、試料の処理、試料の提出、試料の受領、試料の移送、試料の分析若しくは測定、試料の定量化、試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の提供、試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の受領、１つ以上の試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の比較／スコア付け、１つ以上の試料の比較／スコアの提供、１つ以上の試料の比較／スコアの取得、又は他の関連する活動を行うことができる。
【００８２】
ＩＩ．ＴＴＣポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に使用される「ＴＴＣ」という用語は、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド（すなわち、ＴＴＣポリペプチドをコードし、発現するとＴＴＣポリペプチドを生成するポリヌクレオチド）、及び／又はそれらの組み合わせを指す。ＴＴＣポリペプチドは、破傷風毒素のカルボキシ末端部分を指し、具体的には、破傷風毒素がパパインによって酵素で切断されたときに生成される無毒性破傷風毒素Ｃフラグメントを指す。このＣフラグメント（５０ｋＤａ）は、破傷風毒素重鎖のＣ末端にあるアミノ酸位８６５〜１３１５（配列番号５）の４５１個のアミノ酸に相当する。したがって、本開示の文脈において、ＴＴＣという用語は、ポリペプチドを指している場合、パパインによる生来のタンパク質の消化によって得られた破傷風のフラグメント、及び他のプロテアーゼによる酵素消化又はフラグメントの組み換え発現により得られる同等のフラグメントに相当する。ＴＴＣの組み換え発現は、米国特許第５，４４３，９６６号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
一部の態様において、ＴＴＣ、及び具体的にはＴＴＣポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド配列を含む。他の態様では、ＴＴＣは、配列番号５のポリペプチド配列を含む。他の態様では、ＴＴＣ、及び具体的にはＴＴＣポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチド配列は、配列番号２のポリペプチド配列をコードする。他の態様では、ＴＴＣは、配列番号６のポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチド配列は、配列番号５のポリペプチド配列をコードする。配列番号２は、破傷風毒素をパパインにより酵素で切断したときに生成された破傷風毒素Ｃフラグメントのアミノ末端のアミノ酸バリン（Ｖ）から、破傷風毒素をパパインにより酵素で切断したときに生成された破傷風毒素Ｃフラグメントのカルボキシ末端のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）まで、すなわち、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０４９５８の破傷風タンパク質配列のＶ８５４からＤ１３１５を包含する。配列番号５は、Ｎ末端配列ＶＦＳＴＰＩＰＦＳＹＳがない、配列番号２のフラグメントである。
【００８４】
本開示は、上述のプログラムのうちの任意のものを用いて判定される、配列番号２及び配列番号５（ＴＴＣフラグメント）として本明細書に提示されるアミノ酸配列との配列同一性の程度が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％であるＴＴＣポリペプチドを包含する。
【００８５】
ストリンジェントな条件下で破傷風毒素遺伝子に由来する天然のＴＴＣ配列とハイブリダイズすることができるＴＴＣポリヌクレオチドもまた、ＴＴＣという用語の定義に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば次のようなものである：４２℃、６×ＳＳＣ緩衝液１×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、及び２５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡの存在下で４〜６時間（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍのクエン酸ナトリウムに相当し、１×デンハルト溶液は、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のポリビニルピロリドン、及び０．０２％ウシ血清アルブミンに相当する）。０．１×ＳＣＣ及び０．１％ＳＤＳの存在下において、室温で２回の洗浄ステップを行う。
【００８６】
一部の態様では、ＴＴＣという用語は、ＴＴＣ遺伝子を指し、これには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びそれらのフラグメントが含まれる。一部の態様では、ＴＴＣオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、又はＵとは異なる核酸塩基、例えば、ユニバーサル塩基を含む。ＴＴＣポリヌクレオチドの変異型を、ゲノム又はｃＤＮＡクローニング方法を用いて組み換え技法によって作製してもよい。部位特異的かつ領域指向性の変異生成技法を用いてもよい。加えて、リンカースキャニング及びＰＣＲに媒介される技法を、変異生成に用いてもよい。ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ１９８９）を参照されたい。上述の技法のうちの任意のものと共に使用するためのタンパク質の配列決定、構造、及びモデル化のアプローチは、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ｖｏｌ．１，ｃｈ．８（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８９  ＆  Ｓｕｐｐ．１９９０〜９３）、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｏｘｅｎｄｅｒ  ＆  Ｆｏｘ  ｅｄｓ．，Ａ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）に開示されており、これらを参照されたい。所望される場合、コンビナトリアル化学、バイオパニング、及び／又はファージディスプレイを用いて、ＴＴＣへの他の変形が行われてもよい。ＴＴＣのペプチド模倣体は、例えば、Ｓａｒａｇｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：７９２〜９５（１９９１）及び他の文献に概説されているアプローチによって生成することができる。模倣体は、タンパク質の二次元構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ」ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）を参照されたい。
【００８７】
一部の態様では、用語ＴＴＣは、ＴＴＣポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変異型をコードする合成ポリヌクレオチド、例えば、合成ＤＮＡ、又は合成ｍＲＮＡなどの合成ＲＮＡを指す。合成ポリヌクレオチドは、例えば、骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート）及び／又はヌクレオチド類似体を含むことができる。一部の態様では、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、ｃＥｔモノマー、ｃＭＯＥモノマー、５’−Ｍｅ−ＬＮＡモノマー、２’−（３−ヒドロキシ）プロピル−ＲＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、インターカレーター性核酸（ＩＮＡ）モノマー、及び２つ以上の該ヌクレオチド類似体の組み合わせからなる群から選択される。
【００８８】
一部の態様では、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、１つ以上のウリジン及び／又はシチジンを置き換える、シュードウリジン（Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（１ｍΨ）、又は５−メチルシチジンを含む、「配列最適化」ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡ配列は、置き換え、例えば２５％、５０％、又は１００％のウリジンを、４−チオウリジン又は２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）で置き換えることによって配列され得る。ＴＴＣを、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の配列でコードする例示的なＲＮＡ分子が、本明細書に開示される。
【００８９】
用語、ＴＴＣは、野生型ＴＴＣポリペプチド又はＴＴＣポリヌクレオチドのフラグメント及び変異型（例えば、欠失、挿入、置換、逆位などを含む変異体）並びにそれらの誘導体（例えば、ＴＴＣタンパク質のグリコシル化又は非グリコシル化（aglycosilated）タンパク質形態、又は該タンパク質の他の方法で化学的に修飾された形態、ヌクレオチド変異型を含むポリヌクレオチド）もまた含む。
【００９０】
当業者は、本明細書に開示される方法を行うためのＴＴＣフラグメント及び変異型の設計が、１９９７年から知られている、ＴＴＣの３次元構造についての多くの知識（Ｕｍｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｈｃ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：７８８〜７９２を参照されたい）によって導かれ得ることを理解するであろう。ＴＴＣ単独又は複合体の一部としての追加の結晶構造は、それ以降生成されている（例えば、Ｆｏｔｉｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ  Ｈｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＧＴ１ｂ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｎ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７６：３２２７４〜３２２８１、２００１を参照されたい）。大量の生化学的データ、生物物理学的データ、機能的データと共に、利用可能な３次元的データは、親ＴＴＣ分子の特性を保存するフラグメント、変異型、及び誘導体の設計のための多くの指導を提供する。そのようなＴＴＣフラグメント、変異型、及び誘導体は、次いで試験され得、それらが、当業界で既知の方法又は本開示に開示される方法を使用して、筋量及び／若しくは筋力を増加させること並びに／又は筋肉の損失を予防することができることを実証する。
【００９１】
治療剤、免疫原、又は検出可能な部分（例えば、ＧＦＰ）のための担体分子としてのＴＴＣポリペプチドの使用、並びに遺伝子融合又はコンジュゲートを介して、ＴＴＣをそのような分子と連結させる方法は、当業界で既知である。例えば、化学的接合を介するＴＴＣ誘導体の生成は、Ｄｏｂｒｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２２９７〜２３０１（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３４〜１５４４２（１９９５）、Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９：７６２〜７６９（１９９９）、又はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１５８４〜１５９２（２０００）に開示されている。同様に、遺伝子融合を通したＴＴＣ誘導体の生成は、例えば、Ｃｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９４００〜９４０５（１９９７）、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７４：２５２８〜２５３６（２０００）、Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１５５〜１６６（２０００）、及びＫｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６２７〜６３７（２００２）に記載されている。ヒト化型のＴＴＣの生成は、国際公開第ＷＯ２０１１／１４３５５７号、及び米国特許第ＵＳ８７０３７３３号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
上で論じたように、ＴＴＣは破傷風毒素重鎖のアミノ酸８６５〜１３１５を含む。ＴＴＣの野生型形態に対して、ニューロン膜への結合において違いを示さないことが当業界で既知の変異体形態は、Ｄ１３０９Ａ、Ｆ１３０５Ａ、Ｗ１３０３Ａ、Ｒ１１６８Ａ、Ｙ１１７０Ａ、Ｅ１３１０Ｑ、Ｄ１３０９Ｎ、Ｅ１３１０Ｑ／Ｄ１３０９Ｎ、Ｒ１１６０Ｋ、Ｎ１２９２Ａ、Ｋ１２９５Ａ、及びＫ１２９７Ａを含む。Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ４９３：４５〜４９（２００１）を参照されたい。変異体形態Ｔ１３０８Ａ、Ｄ１３０９Ａ、及びＥ１３１０、並びに欠失ΔＶ１３０６−Ｄ１３１５又はΔＧ１３１１−Ｄ１３１５を含むＴＴＣフラグメントは、ＴＴＣの野生型形態で観察される結合の８０％を超える結合能を有する。ＴＴＣ欠失フラグメントΔＶ１３０６−Ｄ１３１５は、ニューロン細胞の結合に加えて、運動ニューロンへの結合及び逆行輸送が可能であることが示されている。
【００９３】
ＴＴＣのアミノ酸残基１２７４〜１２７９は、β−三つ葉状のドメイン内で２つのβシートに連結するループを形成する。この領域は、これらの残基を欠失している変異体が、ガングリオシド及びニューロン細胞の両方への大幅に低減された結合を提示し、逆行輸送を受けないため、生物学的活性のために必須である。
【００９４】
β−三つ葉状のドメイン内の２つのβシートとも結合する第２のループは、生物学的活性のために必須でもある。このループ（ΔＤ１２１４−Ｎ１２１９）内の６個の残基の欠失を含有する変異体タンパク質は、ガングリオシド及びニューロン細胞と不十分に結合する。Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７：１０４１〜１０５１（２０００）を参照されたい。
【００９５】
用語「ＴＴＣ誘導体」は、コンジュゲート（例えば、化学的又は酵素的接合によって生成されるコンジュゲート）を含み、異種ポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、ＴＴＣポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによって生成され得るキメラポリペプチドも含む。キメラポリペプチドを生成する技術は、当業界で周知の標準的な技術である。そのような技術は、配列が同じ読み枠内及び同じプロモーター（複数可）及び終結剤の制御下での融合ポリペプチドの発現であるように、多くの場合、配列の結合を必要とする。一部の態様では、ＴＴＣ誘導体は、化学的合成、すなわち、核酸合成又はペプチド合成を使用して生成することができる。
【００９６】
本明細書に使用される「異種ポリペプチド」とは、任意の非ＴＴＣポリペプチド配列を指す。例示的な異種配列には、異種シグナル配列（例えば、天然型ラットアルブミンシグナル配列、修飾型ラットシグナル配列、若しくはヒト成長ホルモンシグナル配列）又はＴＴＣポリペプチドの精製に使用される配列（例えば、ヒスチジンタグ）が挙げられる。異種シグナル配列ペプチドは、例えば、成長因子シグナル配列ペプチド、ホルモンシグナルペプチド、サイトカインシグナルペプチド、及び免疫グロブリンシグナルペプチド（ＩｇＳＰ）からなる群から選択され得る。したがって、シグナルペプチドの例としては、ＴＧＦβシグナルペプチド、ＧＤＦシグナルペプチド、ＩＧＦシグナルペプチド、ＢＭＰシグナルペプチド、ニューロトロフィンシグナルペプチド、ＰＤＧＦシグナルペプチド、及びＥＧＦシグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチド、ホルモンシグナルペプチド（該ホルモンは、成長ホルモン、インスリン、ＡＤＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＡＣＴＨ、ＭＳＨ、ＴＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、及びＤＨＥＡから選択される）又はインターロイキンシグナルペプチドから選択されるシグナルペプチドがある。一態様では、シグナルペプチドは、アルブミンシグナルペプチド、修飾アルブミンシグナルペプチド、並びにラットアルブミンシグナルペプチド、修飾型ラットアルブミンシグナルペプチド、並びにラットアルブミンシグナルペプチド及びヒト成長ホルモンシグナルペプチドなどのヒト成長ホルモンシグナルペプチド、からなる群から選択されるシグナルペプチドなどの、成長ホルモンシグナルペプチドからなる群から選択される。一部の態様では、ＴＴＣは、有利な薬物動態学的特性、例えば低減した排出能又は延長した血漿半減期を与える分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＨＡＰ、ＰＡＳ、ＸＴＥＮ、アルブミンなどのペプチドと、一般的に融合され得るか、又は一般的に接合され得る。
【００９７】
一部の態様では、ＴＴＣポリヌクレオチドは、追加のポリヌクレオチド、例えばプロモーター、終結剤、サイレンサー配列、染色体又は任意の種類の遺伝子材料などの組織的構造におけるその統合を促進する配列に融合され得る。他の態様では、ＴＴＣポリヌクレオチドは、（ｉ）少なくとも１つの５’キャップ構造（例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、又は２−アジド−グアノシン）、（ｉｉ）５’−ＵＴＲ、及び（ｉｉｉ）３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡであり得る。一部の態様では、ｍＲＮＡはポリＡテールも含み得る。
【００９８】
一部の態様では、ＴＴＣはベクターの一部であり得る。「ベクター」という用語は、目的とされる１つ以上の遺伝子又は配列を、宿主細胞、例えば真核生物宿主細胞に送達し、一部の態様ではそこで発現することができる、構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、若しくはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、アデノウイルス、レトロウイルス、及び自己複製が可能な任意の他の種類のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、並びにプロデューサー細胞などのある特定の真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
本明細書に使用されるとき、「ベクター」という用語は、単数形の「ベクター」並びに複数の「ベクター」を包含することが意図される。ベクターは、細胞、例えば筋細胞に、所望される組み換えＴＴＣポリペプチドを発現させるように、トランスフェクトすることができる。
【０１００】
一部の態様では、ＴＴＣポリペプチド（又はそれをコードするＴＴＣポリヌクレオチドを含むベクター）を用いて、所望される組み換えポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞、例えば、筋細胞を生成することができる。したがって、一部の事例では、ＴＴＣポリヌクレオチドを、細胞のゲノム、例えば、染色体に組み込んで、ＴＴＣポリペプチドを発現することができる細胞を得てもよい。そのような細胞（例えば、自家細胞又は異種細胞）を、次いで、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を患う対象に移植してもよい。そのような遺伝子療法アプローチのためのＴＴＣポリヌクレオチドの細胞への移入は、インビボ（例えば、アデノウイルスを介してＴＴＣポリヌクレオチドを投与することにより）又はエキソビボ（例えば、まず対象から筋細胞を抽出し、その後で筋細胞にＴＴＣポリヌクレオチドをトランスフェクトすることにより）で行うことができる。
【０１０１】
目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／又は細胞株の遺伝子組み換えを行うための方法及びベクターは、当業者に周知であり、例えば、様々な技法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ａｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、及び年４回の更新）並びにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に示されている。
【０１０２】
ＩＩＩ．ＴＴＣを用いた処置方法
本開示は、筋量及び／又は筋力の低下と関連する疾患、状態、又は障害を治療するための方法を提供し、この方法は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の投与を含み、ＴＴＣの投与は、（ａ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患若しくは状態からの回復若しくは治癒の速度の向上、（ｈ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の減少、又は（ｊ）それらの組み合わせに有効である。
【０１０３】
本開示は、筋量及び／又は筋力の低下に関連する疾患、状態、又は障害を治療するためのＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を含有する組成物も提供する。筋量の損失に関連する疾患を治療するための医薬産物の調製における、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の使用もまた提供される。ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を含有し、（ａ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患若しくは状態からの回復若しくは治癒の速度の向上、（ｈ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の減少、又は、（ｊ）それらの組み合わせに有効である組成物もまた提供される。
【０１０４】
（ａ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患若しくは状態からの回復若しくは治癒の速度の向上、（ｈ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の減少、又は、（ｊ）それらの組み合わせのための、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の使用もまた提供される。
【０１０５】
一部の態様では、対象は、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を患っていないが、筋量の増加が望ましい（例えば、ＴＴＣは、肉の製造を増加させるために、筋量を増加させるため、動物対象に使用され得るか、又は美容目的のために、筋量を増加させるため、ヒト対象に使用され得る）。
【０１０６】
本発明は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の投与を含み、対象における（ａ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患若しくは状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患若しくは状態からの回復若しくは治癒の速度の向上、（ｈ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患若しくは状態によって引き起こされる線維症の減少、又は、（ｊ）それらの組み合わせによって、治療、緩和、又は改善され得る、状態又は苦痛を治療する方法もまた含む。
【０１０７】
概して、本明細書に開示される方法は、以下の所望の効果：（ｉ）筋量の増加、（ｂ）筋力の増加、（ｃ）疾患又は状態によって引き起こされる筋量の損失の低減、（ｄ）疾患又は状態によって引き起こされる筋力の低下の低減、（ｅ）疾患又は状態によって引き起こされる筋量の損失の予防、（ｆ）疾患又は状態によって引き起こされる筋力の低下の予防、（ｇ）疾患又は状態からの回復若しくは治癒の速度の上昇、（ｈ）疾患又は状態によって引き起こされる線維症の予防、（ｉ）疾患又は状態によって引き起こされる線維症の減少、又は、（ｊ）それらの組み合わせを、それを必要とする対象へのＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の１種類以上の用量の投与後に達成する。一部の態様では、所望の効果は筋再生である。一部の態様では、これらの所望の効果が達成される機序には、（ａ）筋形成の増加、（ｂ）筋芽細胞増殖の増加、（ｃ）筋芽細胞分化の増加、（ｄ）筋芽細胞サイズ（例えば、筋芽細胞領域又は筋芽細胞直径）の増加、又は（ｆ）それらの組み合わせが含まれる。したがって、本開示は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋形成を増加させる方法、筋芽細胞増殖を増加させる方法、筋芽細胞分化を増加させる方法、及び筋芽細胞サイズ（筋管肥大）を増加させる方法もまた提供する。
【０１０８】
本開示の文脈において、「筋肉」は、好ましくは、骨格筋細胞／組織、並びに心臓筋細胞（心筋細胞）及び心臓筋組織などの横紋筋組織又は横紋筋組織に由来する筋細胞を意味する。
【０１０９】
他に指示がない限り、用語「筋力」は、最大力の急性試験、若しくは筋持久力の経時的試験、筋疲労の経時的試験、又は筋持久力及び筋疲労の経時的試験のいずれかにおいて用いられ得る、筋肉の力の量、又は合計の筋肉群を指す。
【０１１０】
本開示に使用される用語「筋量」は、筋肉の重量及び筋肉の体積の両方を包含する。他に指示がない限り、用語「筋肉機能」は、筋量、筋力、及び筋肉の質のうちの少なくとも１つを指す。
【０１１１】
本明細書に使用される用語「筋肉の質」は、対応する筋肉、筋肉群、又は腕部若しくは脚部の、単位体積当たりの筋力の量、断面積、又は質量を指し、すなわち、用語「筋肉の質」は、対応する筋肉の体積当たりの筋力、対応する筋肉の断面積当たりの筋力、又は対応する筋量当たりの筋力を指す。例えば、脚の筋肉の質は、例えば、脚の筋力／脚の筋肉の体積又は脚の筋力／脚の筋量を指し得る。
【０１１２】
本明細書に使用される「筋肉の消耗」は、一次的又は永続的な筋量の損失を指す。筋肉の消耗が生じ得る疾患又は状態（すなわち、消耗性障害又は状態）としては、例えば、悪液質、食欲不振、筋ジストロフィー、神経筋疾患；硬直化、慢性疾患、癌、加齢、若しくは傷害の後遺症が挙げられる。
【０１１３】
様々な神経筋疾患は、概して筋量の損失と関連する。例えば、実際の筋繊維への損傷に関与するミオパチーは、これらの筋疾患の重要な群であり、それらの中でも、進行性筋ジストロフィーは筋肉の萎縮を特徴とし、並びに筋肉生検における異常性が組織の修飾を示す。この群には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（又はＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（又はＢＭＤ）、及び肢帯型筋ジストロフィーが特に含まれる。筋量の損失が観察されている他の疾患及び障害としては、多発脳梗塞性認知症、脳卒中、傷害、感染症、髄膜炎、脳炎、ピック病、前頭葉変性症、皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、レビー小体病、神経炎症疾患、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ニューロエイズ、クローン病、ハンチントン病、神経膠腫、癌（脳転移を含む）、ＨＩＶ−１関連痴呆症（ＨＡＤ）、ＨＩＶ関連神経認知障害（ＨＡＮＤ）、麻痺、多発性硬化症（ＭＳ）、ＣＮＳ関連心血管疾患、プリオン病、代謝障害、及びリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が挙げられるが、それらに制限されない。筋量の損失は、制限なく、ゴーシェ病、ポンペ病、ニーマン・ピック病、ハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症、ゴーシェ病、サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）、テイ・サックス病、サンドホフ病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、及びファブリー病などの、リソソーム蓄積症において観察されている。
【０１１４】
加えて、悪液質又は消耗症もまた、本明細書に開示される方法及び組成物によって標的とされる健康状態である。この状態は、特に筋肉の損失、遷延性の疾病、又は不十分なカロリー若しくはタンパク質摂取により引き起こされる極端な痩せを特徴とする。この状態は、癌若しくはエイズなどの慢性疾患の場合、又は患者の６０％において骨格筋の萎縮が存在する心不全、又は尿失禁のいずれかを有する固体において特に見られる。実際には病理学としては見なされないが、加齢、遷延性の硬直化などの一部の状況は筋量の損失と関連し、したがって、繰り返して言うが、筋量を増加させる理由が存在する。本開示の方法は、動物肉の製造の増加、又は筋量及び／若しくは筋力及び／若しくは筋肉機能の増加が望ましい美容用途にも使用され得る。
【０１１５】
本明細書に開示される方法は、治癒及び／又は治癒の促進が必要な組織の創傷を治療するために適用され得る。指定されない限り、用語「創傷」は、本明細書ではその一般的な意味で使用され、全ての種類の創傷及び傷害を包含することを意味する。用語「創傷」は、熱傷、潰瘍、裂傷、切開などを包含する。「創傷」及び「病変」は、本明細書では互換的に使用され得、文脈により特に示されない限り、違いは意図されない。病変／創傷は、急性又は慢性であり得る。急性創傷の例としては、外科的創傷（すなわち、切開）、貫通創傷、剥離傷害、粉砕傷害、剪断傷害、熱傷傷害、裂傷、及び咬創傷が挙げられるが、それらに限定されない。慢性創傷の例としては、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、褥瘡、及び糖尿病性潰瘍などの潰瘍が挙げられるが、これらに限定されない。当然ながら、急性創傷は慢性創傷になり得る。
【０１１６】
本明細書に開示されるＴＴＣ組成物（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、開放性創傷又は非開放性創傷に適用され得る。本明細書に開示される組成物は、任意の創傷、創傷治癒を促進することが望ましい任意の場所に投与され得る。したがって、本明細書に開示される組成物は、回復若しくは治癒の速度を上昇させるために適用され得る。組成物は、創傷が閉じた及び／又は治癒した後の瘢痕を低減するためにも有用である。
【０１１７】
ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）などの、筋量及び／又は筋力及び／又は筋肉機能を増加させる組成物は、例えば、関節置換又は修復などのため、患者が外科手術を受けている（又は外科手術を受けるであろう）状況で使用され得る。そうして、筋量の救済を促進するために投与されるＴＴＣ組成物は、理想的には創傷治癒などの外科的回復の他の態様に干渉しないであろう。
【０１１８】
本明細書に開示される方法は、治癒及び／又は治癒の促進が必要な筋肉病変を治療するために適用され得る。本明細書に使用される用語「筋肉病変」は、組織筋肉構造の正常な統合性を破壊し、及び／又は組織筋肉構造の正常な機能を破壊し、及び／又は筋肉の病理学的な変化を引き起こす、身体傷害を指す。一部の態様では、筋肉病変は、急性又は慢性であり得る。機能的筋肉病変は、一般的に、筋断裂の巨視的な証拠（例えば、ＭＲＩ又は超音波によって測定される）を示さない。一方で、構造的筋肉病変は筋断裂の巨視的な証拠を示す。
【０１１９】
用語、筋肉病変は、切り傷、穿通傷害、咬創傷、銃創、擦過傷、挫傷、又は裂傷などの、機械的病変を包含する。用語、筋肉病変は、低温（例えば、凍傷）又は高温（例えば、熱傷）への曝露によって引き起こされる熱病変も含む。また用語、筋肉病変によって包含されるものは、例えば、酸又はアルカリへの曝露によって引き起こされる化学的病変である。
【０１２０】
用語、筋肉病変は、医原性の筋肉病変も含む。用語「医原性の筋肉病変」は、医者又は他の医療介護者の活動、様式、若しくは治療法によって、患者に誘発された筋肉病変、例えば、医療手順（例えば、注射、切開、穿刺、骨切断、切除など）に誘発されるか、又は起因する病変を指す。
【０１２１】
用語、筋肉病変は、繰り返される行為（例えば、機械又はオフィス機器の操作によって引き起こされる、例えば職業上の又は繰り返されるストレス傷害）に関連する筋肉傷害及び運動競技による筋肉病変（例えば、筋挫傷、筋断裂、又は挫傷）も包含する。一部の態様では、用語、筋肉病変は、疲労誘発筋肉障害（タイプ１Ａ筋肉傷害）、遅発性筋肉痛（ＤＯＭＳ）（タイプ１Ｂ筋肉傷害）、脊椎関連神経筋肉障害（タイプ２Ａ筋肉傷害）、筋肉関連神経筋肉障害（タイプ２Ｂ筋肉傷害）、軽度部分的筋断裂（タイプ３Ａ筋肉傷害）、中程度部分筋断裂（タイプ３Ｂ筋肉傷害）、（副）総筋断裂／腱剥離（タイプ４筋肉傷害）、又は直接的筋肉傷害（挫傷）などの、運動競技による筋肉傷害を指す。筋肉病変の定義に包含される、一部の運動競技による筋肉傷害は、「筋挫傷」、「肉離れ」、「硬化症」、「筋緊張亢進」などとしても、広く知られている。全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｓｏｌｏｇｙ  ２３：１２５３〜１２６０、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｗｏｌｌｈｆａｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．４７（６）：３４２〜５０を参照されたい。
【０１２２】
本明細書に開示されるＴＴＣ組成物（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、筋肉病変（例えば、スポーツ関連筋挫傷、医原性の筋肉病変、傷害性筋肉病変など）を治療するために適用され得る。本明細書に開示される組成物は、任意の筋肉病変、病変を治癒する又はその治癒を促進することが望ましい任意の場所に投与され得る。したがって、本明細書に開示される組成物は、治癒のため、及び／又は筋肉病変の回復若しくは治癒の速度を上昇させるために適用され得る。一部の態様では、筋肉病変は、治療有効量のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を、例えば注射によって、病変の部位又は病変の部位に極めて接近している位置に直接投与することによって、治療され得る。他の態様では、筋肉病変は、例えば注射によって、末端位置にＴＴＣを投与することによって治療され得る。
【０１２３】
一部の態様では、ＴＴＣの投与は、ＴＣＣポリペプチド（例えば、野生型ＴＴＣ、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体）、ＴＴＣポリヌクレオチド（例えば、野生型ＴＴＣ、ヒト化ＴＴＣ、配列最適化ＴＴＣ、又はそれらのフラグメント、変異型、若しくは誘導体）、又はそれらの組み合わせの投与を含む。一部の態様では、ＴＴＣは、配列番号２若しくは配列番号５の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含むポリペプチドである。一部の態様では、ＴＴＣは、配列番号２又は配列番号５の配列からなるポリペプチドである。一部の態様では、ＴＴＣは、配列番号２又は配列番号５の配列から本質的になるポリペプチドである。
【０１２４】
他の態様では、ＴＴＣは、配列番号１若しくは配列番号６の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含むポリヌクレオチドである。他の態様では、ＴＴＣは、配列番号１又は配列番号６の配列からなるポリヌクレオチドである。他の態様では、ＴＴＣは、配列番号１又は配列番号６の配列から本質的になるポリヌクレオチドである。一部の態様では、ＴＴＣは、組み換えタンパク質、融合タンパク質、又はコンジュゲートの一部である。他の態様では、ＴＴＣは、組み換えタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸の一部である。
【０１２５】
一部の態様では、ＴＴＣは、例えば、配列番号７の配列（クローニングを促進するＸｈｏ  Ｉ部位を含む２つの隣接している配列を含む、ヒト化ＴＴＣヌクレオチド配列）、又は配列番号８の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含む、ヒト化ポリヌクレオチドである。一部の態様では、ＴＴＣは、配列番号８の配列又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体からなるポリヌクレオチドを含むか、そのポリヌクレオチドからなるか、又はそのポリヌクレオチドから本質的になる。
【０１２６】
一部の態様では、ＴＴＣは、例えば、配列番号：９、１０、又は１１の配列を含むｍＲＮＡポリヌクレオチド配列である。
【０１２７】
一部の態様では、ＴＴＣは、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号５の配列を含むポリペプチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、
（ｂ）配列番号２若しくは配列番号５の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号６の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１若しくは配列番号６の配列、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体からなるポリヌクレオチド、あるいは、
（ｅ）それらの組み合わせを含む。
【０１２８】
他の態様では、ＴＴＣは、
（ａ）（ａ）融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｂ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つである、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｃ）融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、核酸、
（ｄ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つのである、核酸、あるいは、
（ｅ）それらの組み合わせを含む。
【０１２９】
一部の態様では、ＴＣＣは、ネイキッドＤＮＡとして投与されるポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、ＴＣＣは、経口、非経口、筋肉内、又は経鼻的に投与され得る。一部の態様では、ＴＴＣポリヌクレオチド又はＴＴＣポリペプチドは、筋肉内に投与され得る。特定の態様では、そのようなＴＴＣポリヌクレオチドは、インビボで、該筋肉内で、ＴＴＣポリペプチドを発現することができる。一部の態様では、ＴＴＣポリヌクレオチドは、発現ベクター内に挿入され得る。一部の態様では、そのようなベクターは、インビボでの発現が可能である。一部の態様では、ベクターは、該ベクターによってコードされるＴＴＣポリペプチドを発現することが可能であるプロモーターを含むことができる。一部の態様では、発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターである。一部の特定の態様では、プロモーターはｐＣＭＶである。一部の態様では、方法は、インビボで、哺乳動物対象に行われる。一部の態様では、そのような哺乳動物対象はヒトである。一部の態様では、そのような哺乳動物対象は、非ヒトであり、一部の態様では、方法は、筋細胞がＴＴＣポリペプチドを発現するように、ＴＴＣポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入すること及び筋細胞をトランスフェクトすることを含む。一部の態様では、細胞は過渡的にトランスフェクトされる。他の態様では、細胞は安定的にトランスフェクトされる。一部の態様では、トランスフェクトした細胞は、自家細胞である。他の態様では、トランスフェクトした細胞は、異種細胞である。更に他の態様では、トランスフェクトした細胞は、幹細胞である。一部の態様では、トランスフェクションは、インビボで対象に行われ得る。他の態様では、トランスフェクションは、エキソビボで行われ得る。
【０１３０】
対象に投与され得るＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の量は、一般的に治療有効量である。そのような治療有効量のＴＴＣは、以下のパラメータ：体重、筋量（例えば、前脛骨筋（ＴＡ）質量、腓腹筋（ＧＡ）質量、四頭筋筋量など）、筋力／力、筋肉機能、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の検出可能な増加を引き起こし得る。例えば、治療有効量のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、それを必要とする対象（例えば、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害を患う対象）に投与されたとき、上記のパラメータの任意の組み合わせの増加、例えばＴＡ又はＧＡにおいて、対照処置対象と比較して、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又はそれ以上の増加を引き起こし得る。
【０１３１】
一部の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、ＴＣＣがＴＴＣポリペプチドであるとき、約０．０４ｍｇ／ｋｇの用量で、又はＴＣＣがＴＣＣポリヌクレオチド（例えば、実施例の節で開示されるｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミドなどの、プラスミド形態のＴＴＣ）であるとき、約１．２２ｍｇ／ｋｇで、ここで開示される方法に従って投与され得る。一部の態様では、ＴＴＣポリペプチドは、約０．０１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６０ｍｇ／ｋｇ、約０．０６５ｍｇ／ｋｇ、約０．０７０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。他の態様では、ＴＴＣポリヌクレオチド（例えば、実施例で開示される、ＴＴＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミド）は、約０．１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３０ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ、約０．４０ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ、約０．６０ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ、約０．７０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．８０ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．９０ｍｇ／ｋｇ、約０．９５ｍｇ／ｋｇ、約１．００ｍｇ／ｋｇ、約１．０５ｍｇ／ｋｇ、約１．１０ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約１．２０ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約１．３０ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ、約１．４０ｍｇ／ｋｇ、約１．４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５５ｍｇ／ｋｇ、約１．６０ｍｇ／ｋｇ、約１．６５ｍｇ／ｋｇ、約１．７０ｍｇ／ｋｇ、約１．７５ｍｇ／ｋｇ、約１．８０ｍｇ／ｋｇ、約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．９０ｍｇ／ｋｇ、約１．９５ｍｇ／ｋｇ、約２．００ｍｇ／ｋｇ、約２．０５ｍｇ／ｋｇ、約２．１０ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．２０ｍｇ／ｋｇ、約２．２０ｍｇ／ｋｇ、約２．２５ｍｇ／ｋｇ、約２．３０ｍｇ／ｋｇ、約２．３５ｍｇ／ｋｇ、約２．４０ｍｇ／ｋｇ、約２．４５ｍｇ／ｋｇ、又は約２．５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
【０１３２】
一部の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、固定用量で投与され得る。他の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、可変用量で投与され得る。一部の態様では、ＴＴＣは、単一用量として投与され得る。他の態様では、ＴＴＣは、複数用量で、例えば２種類以上の用量で１日１回、１週間に１回、２週間に１回、又は１ヶ月に１回投与される。
【０１３３】
ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）は、この開示の方法に従って、例えば、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、及び細胞毒性薬／細胞分裂阻害剤を含む１つ以上の追加の治療剤と共に投与され得る。追加の治療剤（複数可）は、ＴＴＣの投与の前、同時、又は後に投与され得る。
【０１３４】
ＩＶ．ＴＴＣ効果を検出するためのバイオマーカー
本開示は、例えば、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の効果を評価するため、対象が、ＴＴＣでの治療に対する候補であるかどうかを判定するため、ＴＣＣを用いた治療の前、間、後に、疾患又は障害の進行を監視するためのバイオマーカーも提供する。一部の態様では、本明細書に開示される方法は、Ｃｏｌ１９ａ１（コラーゲンアルファ−１（ＸＩＸ）鎖；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４９９３）、Ｓｎｘ１０（ソーティングネキシン１０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｘ０）、Ｃａｌｍ１（カルモジュリン１（ホスホリラーゼキナーゼ、デルタ）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６２１５８）、Ｍｅｆ２Ｃ（筋細胞エンハンサー因子２Ｃ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０６４１３）、及びＣｏｌ１Ａ１（コラーゲン、タイプＩ、アルファ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２４５２）からなる群から選択されるバイオマーカーのレベルの測定を必要とする。
【０１３５】
用語「バイオマーカーのレベル」は、例えば、生物学的試料中の、本明細書に開示されるバイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、又はＣｏｌ１Ａ１）の存在又は発現（タンパク質発現又は遺伝子発現）を検出するための任意の分析的方法を使用して行われ、かつその生物学的試料中のバイオマーカーの、それに関する、又はそれに対応する存在、不在、絶対量若しくは濃度、相対量若しくは濃度、滴定量、発現レベル、測定されたレベルの比などを示す、測定を指す。「値」又は「レベル」の正確な性質は、バイオマーカー（例えば、免疫測定法、質量分光分析法、インビボでの分子イメージング、遺伝子発現解析、アプタマー系測定法など）を検出するために用いられる具体的な分析的方法の特定の設計及び構成要素に依存する。
【０１３６】
本明細書に開示されるバイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、又はＣｏｌ１Ａ１）への参照と共に本明細書で使用されるとき、用語「上昇した」、「上昇したレベル」、又は「高いレベル」は、正常なレベル又は範囲よりも高い、生物学的試料（例えば、筋組織試料）におけるレベルを指す。本明細書に開示されるバイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、又はＣｏｌ１Ａ１）に関する正常なレベル又は範囲は、標準的技法に従って定義される。したがって、特定の生物学的試料において測定されたレベルは、同様な正常な試料において判定されるレベルのレベル又は範囲と比較され得る。この文脈では、正常な試料は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療を受けていない固体から得た試料である。バイオマーカーのレベルは、上昇していると言われ、バイオマーカーは、正常な試料におけるものよりも高いレベル又は範囲で試験試料中に存在する。
【０１３７】
バイオマーカーレベル（発現したタンパク質レベル、又はｍＲＮＡレベルなどの核酸レベルのいずれか）は、当業者に周知の多くの方法によって、検出及び定量化され得る。これらの方法は、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超分散クロマトグラフィー、質量分析法などの、分析的生化学的方法、又は液体又はゲル沈降反応、免疫拡散法（単純又は２重）、免疫組織化学的検査、親和性クロマトグラフィー、免疫電気泳動法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法、ウエスタンブロット法などの、様々な免疫学的方法を含む。
【０１３８】
一態様では、バイオマーカーは、電気泳動的ポリペプチド分離（例えば、１又は２次元的電気泳動法）において、検出及び／又は定量化され得る。電気泳動的技術を使用してポリペプチドを検出する方法は、当業者に周知である（概して、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。この態様の変形は、試料中のバイオマーカーの存在を検出及び定量化するために、ウエスタンブロット（免疫ブロット）分析を利用する。この技術は概して、分子量を基にするゲル電気泳動法によって試料ポリペプチドを分離すること、分離したポリペプチドを、好適な固体支持体（ニトロセルロースフィルタ、ナイロンフィルタ、又は誘導体化ナイロンフィルタなどの）へ移送すること、及び試料を分析物と特異的に結合する抗体でインキュベートすることを含む。分析物と特異的に結合する抗体は、直接標識化され得るか、又は代替的に、その後に一次抗体のドメインと特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化羊抗マウス抗体）を使用して検出され得る。
【０１３９】
一部の態様では、試料及び／又はバイオマーカーは、検出及び／又は定量化測定法の経過において、いくつかの様式で形質転換される。例えば、試料は、バイオマーカーが少なくとも１つの他の試料の構成要素から分離されるように、分画され得る。一部の態様では、バイオマーカーは、液体画分中に回収され得るか、又はゲルなどの分離媒体中に埋め込まれる間に検出され得る。
【０１４０】
特定の態様では、バイオマーカーは、免疫測定法を使用して、生物学的試料中で検出及び／又は定量化される。免疫測定法の一般的な批評については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｓａｉ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．（１９９１）も参照されたい。一部の態様では、免疫測定法は、特定のバイオマーカーを認識する１つ以上の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することができる。
【０１４１】
ある特定の態様では、免疫測定法は、第１の「捕捉」抗体又はその抗原結合フラグメントが、固体支持体に取り付けられ、試料又は標準物質からの抗原が捕捉抗体と結合することが可能であり、次いで第２の「検出」抗体又はその抗原結合フラグメントが、酵素反応、ＥＣＬ反応、放射活性、又は他の検出方法のいずれかによって、添加及び検出される、サンドイッチ式免疫測定法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はサンドイッチ式電気化学発光免疫（ＥＣＬ）測定法を含む。
【０１４２】
既知の対照試料との比較に基づいて、「バイオマーカー閾値レベル」が決定され得、バイオマーカー閾値レベル（例えば、Ｓｎｘ１０タンパク質発現及び／又は遺伝子発現閾値レベル）より上に入る試験試料は、試料が採取された患者が、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療から有益を得る場合があることを示すことができる。バイオマーカー閾値レベル（例えば、タンパク質発現レベル、又は遺伝子発現レベル）は、既定されているべきであり、試料の種類、疾患の種類、及び一部の例では、使用される測定法について一致しているべきである。例えば、Ｃｏｌ１０ａ１又はＳｎｘ１０についての閾値レベルは、本開示に提供される実験的データから決定され得る。
【０１４３】
特定の態様では、本明細書に開示される方法は、バイオマーカー測定法の結果及び／又は少なくとも部分的にバイオマーカーレベル（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせのレベル）に基づく診断の結果を対象に告知することを含む。患者は、口頭で、書面で、及び／又は電子技術を使って告知され得る。この診断は、患者医療記録にもまた記録され得る。
【０１４４】
本明細書に開示される方法は、例えば、筋量の損失及び／又は筋力の低下が生じる疾患又は障害の予防法及び／又は治療法を、処方すること、開始すること、及び／又は変更することもまた含む。ある特定の態様では、方法は、１つ以上の追加の測定法を順番付ける及び／又は行うことを伴い得る。
【０１４５】
Ｖ．バイオマーカーを使用する診断及び治療方法
本開示は、筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法も提供し、この方法は、患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１（コラーゲンα−１（ＸＩＸ）鎖）及び／又はＳｎｘ１０（ソーティングネキシン１０）のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０レベルを上回った場合に、対象に治療有効量のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与することを含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは障害により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０１４６】
筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法もまた提供され、この方法は、（ａ）患者から得た試料を、Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定にかけること、並びに（ｂ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、治療有効量のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を対象に投与すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０１４７】
本開示は、筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法もまた提供し、この方法は、（ａ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定に、患者から得た試料をかけること、（ｂ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回ったか、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回ったかどうかを判定すること、並びに（ｃ）対象に治療有効量のＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与することを医療提供者に勧告すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０１４８】
筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を治療するかどうかを判定する方法もまた提供され、この方法は、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示をすること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０１４９】
筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を、ＴＴＣ治療レジメンを用いた治療のための候補として選択する方法もまた提供され、この方法は、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示すること、を含み、該投与は、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である。
【０１５０】
一部の態様では、上で開示されたバイオマーカーを使用する診断及び治療方法は、少なくとも追加のバイオマーカー、例えば、Ｃａｌｍ１（カルモジュリン１（ホスホリラーゼキナーゼ、デルタ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６２１５８）、Ｍｅｆ２Ｃ（筋細胞エンハンサー因子２Ｃ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０６４１３）、又はＣｏｌ１Ａ１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  Ｉ、Ａｌｐｈａ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２４５２）のレベルを判定することもまた含む。
【０１５１】
一部の態様では、患者のバイオマーカーレベル（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせのレベル）が、特定のバイオマーカーを認識する１つ以上の抗体又はそれらの抗原結合フラグメントを用いる免疫測定法で測定され得る。他の態様では、患者のバイオマーカーレベル（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡレベル）は、特定のバイオマーカー遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能な、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いる測定法で測定される。
【０１５２】
ある特定の態様では、検出測定法（例えば、免疫測定法）は、患者を治療する（例えば、「ポイントオブケア」診断キットとして処方される本明細書に記載される免疫測定法を使用して）医療専門家によって、患者（例えば、筋組織試料）から得た試料に行われ得る。一部の態様では、試料は患者から得られ、医療専門家の指示に従って（例えば、本明細書に記載される免疫測定法を使用して）、例えば、試料中のバイオマーカーレベルの測定のために、臨床検査室へ提出される。ある特定の態様では、測定法を行う臨床検査室は、患者が、患者のバイオマーカーレベルが所定のバイオマーカー閾値値より高いか、又は１つ以上の対照試料に関して上昇したことのいずれかに基づいて、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療から利益を得ることができるかどうかについて、医療提供者に勧告するであろう。
【０１５３】
本明細書で提供される治療態様の全ての方法のある特定の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）の「負荷」用量が用途され、患者において所望の治療的レベルを達成する。負荷用量が、患者のバイオマーカーレベル（例えば、タンパク質発現レベル又は遺伝子発現レベル）又は患者のバイオマーカーレベルの減少に大幅に影響を与えない場合、治療を中断する決定がなされ得る。負荷用量が、患者において安定又は増加したバイオマーカーレベルをもたらさない場合、用量サイズ又は周期を「維持」用量へと低減する決定がなされ得る。ここで提供される方法が、治療を施すための医療提供者への指針であり、及び最終治療決定が、医療提供者の健全な判断に基づくであろうことに留意することは重要である。
【０１５４】
ある特定の態様では、本明細書に提供される免疫測定法の結果は、医療給付提供者に提出され得、患者の保険が、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療を補償するかどうかを決定する。
【０１５５】
同様に、本開示は、対象においてＴＴＣ治療レジメンの治療的効果を監視する方法を提供し、この方法は、患者から得た第１の試料中のバイオマーカーレベル（例えば、タンパク質発現レベル又は遺伝子発現レベル）を測定すること、又は臨床検査室にそれを測定するように指示すること、第１の試料中の患者のバイオマーカーレベル（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせのレベル）が所定の閾値バイオマーカーレベルより低いか、又は１つ以上の対照試料中のバイオマーカーレベル（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせのレベル）と比べて上昇した場合、患者にＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を投与すること、又は医療専門家にそれを投与するように指示すること、患者から得た第２の試料中のバイオマーカーレベルを測定することであって、患者のバイオマーカーレベルが再度測定され、第２の試料中の患者のバイオマーカーレベルが、第１の試料中で測定したバイオマーカーレベルより高いか、ほとんど同じか、又は低いかどうかを示す結果を判定するか又は得る、患者から得た第２の試料中のバイオマーカーレベルを測定すること、を含み、第２の試料中の患者のバイオマーカーレベルが、第１の試料中のバイオマーカーレベルより高いか、ほとんど同じである場合、ＴＴＣ治療レジメンは有効である。
【０１５６】
一部の態様では、閾値は、対照の状態に対して、タンパク質又は遺伝子発現において約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。一部の態様では、閾値は、対照の状態に対して、タンパク質又は遺伝子発現において約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。
【０１５７】
一部の態様では、閾値は、患者の個体群の中央値に対して、タンパク質又は遺伝子発現において約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。一部の態様では、閾値は、患者の個体群の中央値に対して、タンパク質又は遺伝子発現において約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。
【０１５８】
ある特定の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療のための候補として、患者を特定するために使用される１つ以上の対照試料は、正常で健常な固体から得られる。他の態様では、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を用いた治療のための候補として、患者を特定するために使用される１つ以上の対照試料は、患者として同じ疾患又は状態を有する対象の個体群の平均値から得られる。
【０１５９】
ＶＩ．薬学的組成物
本開示は、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）が希釈剤、担体、又は賦形剤と共に配合された、配合物を提供する。本開示はまた、ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）が薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤と共に配合された、薬学的組成物を提供する。そのような配合物又は薬学的組成物には、例えば、例としてＴＴＣポリペプチドとＴＴＣポリヌクレオチドであるがこれに限定されない、２つ以上の異なるＴＴＣ化合物の１つ以上の組み合わせが含まれてもよい。例えば、本明細書に開示される配合物又は薬学的組成物は、異なる作用機序を有するＴＴＣ化合物の組み合わせ（例えば、投与後すぐに有効なＴＴＣポリペプチドとインサイツで発現する必要があるＴＴＣポリヌクレオチド）、又は相補的な活性を有するＴＴＣ化合物の組み合わせ（例えば、血漿半減期が短いＴＴＣポリペプチドと作用期間が長いＴＴＣポリペプチドポリペプチドとのコンジュゲート）を含んでもよい。
【０１６０】
ＴＴＣを含む薬学的又は無菌性の組成物を調製するために、ＴＴＣが薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合され得る。治療的及び診断用薬の配合物は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁液の形態の、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することによって調製され得る。
【０１６１】
ＴＴＣ（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）を含む薬学的組成物は、他の薬剤との組み合わせなどの、組み合わせ治療法でもまた投与され得る。例えば、組み合わせ治療法は、少なくとも１つの他の治療法と組み合わせたＴＴＣを含むことができ、この治療法は、外科手術、免疫治療法、化学治療法、放射線治療、又は薬物治療法であり得る。
【０１６２】
薬学的化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性無機酸、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒性無機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、並びにΝ，Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、プロカイン、ジエタノールアミン、エチレンジアミンなどの無毒性有紀アミンに由来するものが挙げられる。
【０１６３】
薬学的組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤もまた含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（ｉ）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（ｉｉ）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、及び（ｉｉｉ）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。
【０１６４】
本明細書に開示される薬学的組成物に用いられ得る、好適な水性及び非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に、必要とされる粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【０１６５】
これらの薬学的組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの免疫賦活剤も含有し得る。微生物の存在の予防は、無菌化手順並びに様々な抗菌剤及び抗かび剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの組み入れの両方によって確実にされ得る。砂糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を、組成物内に含むこともまた望ましい。加えて、注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の組み入れによってもたらされ得る。
【０１６６】
薬学的組成物は、無菌性であり得、製造及び貯蔵状態下で安定であり得る。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の規則構造として配合され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に、必要とされる粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合では、等張剤、例えば、砂糖；マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物中に含むことが好適であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中へ含めることによってもたらされ得る。
【０１６７】
無菌注射可能な溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込むことによって、調製され得、必要に応じて無菌化マイクロフィルター法が続く。概して、分散液は、活性化合物の、塩基性の分散媒体、及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルへの組み込みによって、調製され得る。無菌性の注射可能な溶液の調製のための無菌粉体の場合、適切な調製方法は、活性成分に加えて以前に無菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉体を得る、真空乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）を含む。
【０１６８】
一態様では、本明細書の組成物は、発熱物質を含まない配合物であり、それは菌体内毒素及び／又は関連する発熱性の物質を実質的に含まない。菌体内毒素は、微生物内部に制限され、微生物が分解又は死亡したときに放出される毒素を含む。発熱性の物質は、細菌及び他の微生物の外膜から熱安定性の物質（糖タンパク質）を誘発する発熱もまた含む。これらの物質の両方は、ヒトに投与された場合、発熱、低血圧、及びショック症状を引き起こし得る。潜在的な有害な効果のため、少量の菌体内毒素であっても、静脈内に投与された薬学的薬物溶液から適正に除去され得る。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内の薬物適用に関して、単回の１時間の期間において、体重１キログラム当たりの１用量当たりにつき、５菌体内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している。治療的タンパク質が、体重１キログラム当たり数百又は数千ミリグラムの量で投与されるとき、痕跡量の菌体内毒素であっても、適正に除去され得る。
【０１６９】
一態様では、組成物中の菌体内毒素及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、１ＥＵ／ｍｇ未満、０．１ＥＵ／ｍｇ未満、０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。ある特定の実施形態では、組成物中の菌体内毒素レベル及び発熱物質レベルは、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、約５ＥＵ／ｍｇ未満、約１ＥＵ／ｍｇ未満、又は約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、約０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０１７０】
様々な送達系が既知であり、本開示の薬学的組成物を投与するため、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、ＴＴＣを発現することが可能な組み換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照されたい）などへのカプセル封入に使用され得る。投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、それらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路、例えば輸液又はボーラス注射によって、上皮内層又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜など）を通しての吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。
【０１７１】
本開示の薬学的組成物は、標準的な針及びシリンジで、皮下又は静脈内に投与され得る。加えて、皮下投与に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の送達において、容易に用途を見出す。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、又は使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般的に、薬学的組成物を含有する交換式のカートリッジを利用する。一旦カートリッジ内部の薬学的組成物の全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄され得、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換される。したがって、ペン型送達デバイスは再利用され得る。使い捨てペン型送達デバイスには、交換式のカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、薬学的組成物で事前に充填され、デバイス内部のリザーバ内に保たれる。一旦リザーバの薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０１７２】
多数の再利用可能なペン型及び自動注入装置送達デバイスは、本開示の薬学的組成物の皮下投与において、用途を見出す。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、数例として挙げられるが、それらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下投与において用途を見出す、使い捨てペン型送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注入装置（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  ＰａｒｋＩｌｌ．）が数例として挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７３】
ある特定の状況では、本開示の薬学的組成物は、制御された放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ：Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用され得、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａを参照されたい。更に別の実施形態では、制御された放出系が、組成物の標的に接近して配置され得、したがって、全身性の用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５〜１３８を参照されたい）。他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３の批評において論じられる。
【０１７４】
ＶＩＩ．製造物品及びキット
本開示は、本明細書に開示される組成物のうちのいずれか１つ、例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせ、及びＴＴＣを含む薬学的組成物を１つ以上の容器内に含む製造物品も提供する。一部の態様では、製造物品は、ユーザ（例えば、配給業者又はエンドユーザ）に、筋肉の成長、及び／筋力の増加、及び／又は筋量の損失の予防、及び／又は筋力の低下の予防を促進するために、それを必要とする対象において、製造物品の組成物を、組み合わせる及び／又は使用するように指示する、例えば小冊子、印刷された説明書、標識、又は添付文書を含む。一部の態様では、製造物品は、ユーザ（例えば、配給業者又はエンドユーザ）に、美容目的のため又は動物における筋肉の成長を促進するために、製造物品の組成物を、組み合わせる及び／又は使用するように指示する、例えば小冊子、印刷された説明書、標識、又は添付文書を含む。
【０１７５】
一部の態様では、製造物品は、例えばボトル（複数可）、小瓶（複数可）、カートリッジ（複数可）、箱（複数可）、シリンジ（複数可）、注射器（複数可）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、標識は、本明細書に開示される方法に従う製造物品における、組成物（例えば、ＴＴＣポリペプチド、ＴＴＣポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせ、及びＴＴＣを含む薬学的組成物）の使用又は投与について言及する。一部の態様では、標識は、例えば、使用についてのレジメン、筋量及び／又は筋力の低下が生じる疾患、状態、又は障害の治療、予防、又は寛解させることについてのレジメンを示唆する。
【０１７６】
本開示は、例えば免疫測定法方法又は核酸検出方法を通じて、ＴＴＣの有効性を検出するための（例えば、１つ以上のバイオマーカー上のタンパク質発現レベル又は遺伝子発現レベルを判定するための）キットを提供する。そのようなキットは、容器を含み得、１つ以上の様々な試薬（例えば、濃縮形態で）を有する各々が、例えば、少なくとも１つのバイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせ）と特異的に結合することが可能な１つ以上の抗体、又は少なくとも１つのバイオマーカーに関して、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブを含む方法において利用される。少なくとも１つのバイオマーカー、例えば、捕捉抗体、又はオリゴヌクレオチドプローブに対する１つ以上の抗体が、固体支持体に既に取り付けられて提供され得る。少なくとも１つのバイオマーカー、例えば、検出抗体、又はオリゴヌクレオチドプローブに対する１つ以上の抗体が、検出可能な標識、例えば、ビオチン又はルテニウムキレートと既にコンジュゲートして提供され得る。
【０１７７】
キットは、本明細書で提供される測定法の実行を指支持するための、試薬及び器具類も提供することができる。ある特定の態様では、標識化二次抗体は、検出抗体に結合して提供され得る。本開示に従って提供されるキットは、好適な容器、プレート、及び本明細書で提供される測定法を行うために必要な任意の他の試薬又は材料を更に含むことができる。
【０１７８】
一部の態様では、キットは、バイオマーカー（例えば、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｓｎｘ１０、Ｃａｌｍ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｃｏｌ１Ａ１、又はそれらの任意の組み合わせのうちの全て又は一部をコードする核酸）の部分列と、高い厳密性状態でハイブリダイズすることが可能な、１つ以上の核酸プローブ（例えば、自然に生じる及び／又は化学的に修飾されたヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド）を含む。一部の態様では、バイオマーカーの部分列と、高い厳密性状態下でハイブリダイズすることが可能な、１つ以上の核酸プローブ（例えば、自然に生じる及び／又は化学的に修飾されたヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド）は、マイクロアレイチップに取り付けられる。
【０１７９】
本開示に従って提供されるキットは、処理を記載する小冊子又は説明書もまた含むことができる。試験キットは、１つ以上のバイオマーカー検出測定法、例えば、免疫測定法又は核酸検出測定法を実行するための説明書を含むことができる。キット内に含まれる説明書は、包装材料に貼り付けられるか、又は添付文書として含まれ得る。説明書は、典型的には書面又は印刷物であるが、そのようなものに限定されない。任意の媒体は、そのような説明書を補完すること及びエンドユーザにそれらを伝えることが可能であると企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に使用される用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１８０】
ＶＩＩＩ．実施形態
Ｅ１．筋量及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量のＴＴＣを前記対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象における筋量及び／又は筋力の増加、及び／又は回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は前記疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ２．疾患又は状態は、消耗性障害である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．消耗性障害が、悪液質及び食欲不振からなる群から選択される、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４．消耗性障害が、筋ジストロフィー及び神経筋疾患からなる群から選択される、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ５．状態が、硬直化、慢性疾患、癌、又は傷害の後遺症である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ６．対象にＴＴＣを投与することを含む、それを必要とする対象において筋量を増加させる方法。
Ｅ７．筋量の増加が、消耗性障害、硬直化、又は加齢によりもたらされる消耗を補うためのものである、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ８．筋量の増加が、美容目的のためである、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ９．筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法であって、患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１（コラーゲンα−１（ＸＩＸ）鎖）及び／又はＳｎｘ１０（ソーティングネキシン１０）のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０レベルを上回った場合に、対象に治療有効量のＴＴＣを投与することを含み、該投与が、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは障害により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ１０．筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法であって、（ａ）患者から得た試料を、Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定にかけること、並びに（ｂ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、治療有効量のＴＴＣを対象に投与すること、を含み、該投与が、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ１１．筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態を有する患者を治療する方法であって、（ａ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルの測定に、患者から得た試料をかけること、（ｂ）Ｃｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回ったか、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回ったかどうかを判定すること、並びに（ｃ）対象に治療有効量のＴＴＣを投与することを医療提供者に勧告すること、を含み、該投与が、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ１２．筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を治療するかどうかを判定する方法であって、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣを投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示をすること、を含み、該投与が、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ１３．筋量の損失及び／又は筋力の低下と関連する疾患又は状態と診断された患者を、ＴＴＣ治療レジメンを用いた治療のための候補として選択する方法であって、（ａ）患者から得た試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０のレベルを測定すること又は測定するように臨床検査室に指示すること、並びに（ｂ）試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／又はＳｎｘ１０の患者のレベルが、所定のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０閾値レベルを上回った場合に、又は１つ以上の対照試料中のＣｏｌ１９ａ１及び／若しくはＳｎｘ１０のレベルを上回った場合に、ＴＴＣを投与することによって患者を治療すること又は治療するように医療提供者に指示すること、を含み、該投与が、対象における（ｉ）筋量の増加、及び／又は（ｉｉ）筋力の増加、及び／又は（ｉｉｉ）回復若しくは治癒の速度の上昇、及び／又は（ｉｖ）該疾患若しくは状態により引き起こされる線維症の減少に有効である、方法。
Ｅ１４．患者から得た試料が筋組織を含む、実施形態Ｅ９〜Ｅ１３のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．対象がヒトである、実施形態Ｅ１〜Ｅ１４のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６．ＴＴＣが、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号５の配列を含むポリペプチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド、又はそのフラグメント、変異型、若しくは誘導体、あるいは、
（ｃ）それらの組み合わせ
を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１５のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．ＴＴＣが、
（ａ）融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｂ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質若しくはコンジュゲートであって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つである、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、
（ｃ）融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが唯一の治療部分である、核酸、
（ｄ）少なくとも２つの治療部分を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、ＴＴＣポリペプチドが治療部分のうちの１つである、核酸、あるいは、
（ｅ）それらの組み合わせ
を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１６のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８．ＴＴＣが、ネイキッドＤＮＡとして投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１７のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９．ＴＴＣが固定用量で投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０．ＴＴＣが２種類以上の用量で投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２１．ＴＴＣが、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、又は１ヶ月に１回投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２０のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２．ＴＴＣが、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内、又はそれらの組み合わせで投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２１のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．哺乳動物においてインビボで行われる、実施形態Ｅ１〜Ｅ２２のうちのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２４．少なくとも１つの追加の治療法を更に含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
本開示において参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【０１８２】
本開示の態様は、本開示のある特定の抗体の調製及び本開示の抗体を使用するための方法を詳細に記載する、以下の非限定的な実施例への参照によって更に定義され得る。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対する多くの修飾が行われ得ることは、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１）
ネイキッドＤＮＡの筋肉内注射によるＴＴＣの投与
異なる変異を有するスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ−１）のヒト遺伝子を過剰発現するトランスジェニック動物の生成により、他の症状の中でも筋肉機能の低下を特徴とする疾患であるＡＬＳの研究のための動物モデルを得た。これらの動物モデルは、ＡＬＳ患者と同じ臨床及び病理特徴を呈する。
【０１８４】
材料及び方法
１．１  ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡ
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン − ４６２個のアミノ酸で構成される配列番号２）をコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下で真核生物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１｛Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングした。ベクターを、化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５α）において作製し、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧｅｎＥｌｕｔｅ  ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて精製した。
【０１８５】
１．２  トランスジェニックマウス
変異Ｇ９３Ａを伴ったヒトＳＯＤ１（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）を過剰発現するＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。ヘミ接合体変異体を全ての実験に使用した（変異体の雄を非トランスジェニックの雌と交配させた）。Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１７７２〜５（１９９４）に記載されるように、トランスジェニックマウスを、尾部から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。動物を、Ｚａｒａｇｏｚａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｘｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔで保持した。動物には、食餌と水を自由に摂取させた。全ての実験及び動物の世話は、Ｚａｒａｇｏｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの規則及び実験動物の世話と使用に関する国際的指針に則って行った。
【０１８６】
１．３  ネイキッドＤＮＡの筋肉内注射及び筋肉摘出
８週齢のトランスジェニックＳＯＤｌＧ９３Ａマウスに、３００μｇのｐＣＭＶ−ＴＴＣを四頭筋（筋肉１か所につき５０μｇで２回の注射）及び三頭筋（筋肉１か所につき５０μｇで１回の注射）に筋肉内注射した。対照群のマウスには、同量の空のプラスミドを注射した。プラスミドを筋肉内注射した１０日後に、接種した筋肉を摘出し、液体窒素中で予備凍結させた後、−７０℃で保管した。
【０１８７】
１．４  ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲによる増幅
筋肉中の転写されたＴＣＣ産物の存在を特定するために、筋組織試料を液体窒素中で凍結させ、低温の乳鉢と乳棒で微粉砕した。筋肉の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って抽出した。ｃＤＮＡの合成については、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のキットを使用し、最終体積２０μＬ中１μｇのＲＮＡで開始した。ＰＣＲ反応は、最終体積２０μＬ中、１５０ｎＭの各プライマー、１５０μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１倍の緩衝液、０．２ＵのＴａｑ  ｐｏｌ、及び反応毎に２μＬのｃＤＮＡ（ＴＴＣ遺伝子のフラグメントの増幅のために１０倍希釈）で行った。全てのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ２７２０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において行った。熱サイクルのパラメータは、次の通りであった：９４℃で３分間インキュベートし、９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３５回。ＴＴＣ遺伝子の増幅の存在は、２％で臭化エチジウムにより染色したアガロースゲルにおいて観察された。使用した順方向プライマー及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号３及び配列番号４であった。増幅のサイズは、３５５ｂｐに相当する。
【０１８８】
１．５  ロータロッドグリッド試験
８週齢から週１回、この試験を動物に行った。従来のケージの蓋として機能するグリッドの上に各マウスを置いた。次いで、グリッドを１８０°上下に回転させ、負傷を回避するために柔らかい表面からおよそ６０ｃｍの距離で保持した。各マウスが落下するまでの経過時間を計測した。各マウスに３回まで、ひっくり返したグリッドを最大１８０秒間で保持させ、最も長かったものを記録した。
【０１８９】
運動協調性及び平衡感覚を評価するために、ロータロッド試験を用いた。デバイス（ＲＯＴＡＲＯＤ／ＲＳ，ＬＥ８２００，ＬＳＩ−ＬＥＴＩＣＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の回転ロッドの上に動物を置いた。動物が１４ｒｐｍの一定速度で該バーの上にいることができた時間を記録した。各マウスは、１８０秒を任意に制限時間として、３回試みて動物が転落しなかった最も長い時間を記録した。動物を仰臥位にして、自力で向き直ることができなかった時点を、マウスの生命のエンドポイントと見なした。
【０１９０】
結果
２．１  筋肉におけるＴＴＣプラスミドの発現の検出
構築したベクターｐＣＭＶ−ＴＴＣがトランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの筋細胞においてコーディング遺伝子を発現する能力を確認した。これらのマウスではＴＴＣ遺伝子の内因性発現は存在しないため、該分子のｍＲＮＡの発現を検出するために、注射した筋肉にこの遺伝子のフラグメントのＰＣＲ増幅を適用した。図１に示されるように、空のプラスミドを注射した対照群ではＴＴＣ遺伝子の発現は観察されない。しかしながら、ＴＴＣ遺伝子をコードするベクターを接種した筋肉における同遺伝子の増幅の存在がＰＣＲにより明らかとなり、ベクターが筋細胞に到達することが成功していること、及び該遺伝子の転写プロセスが行われていることを示している。
【０１９１】
２．２  トランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＴＴＣの効果
ＴＣＣをコードするネイキッドＤＮＡを用いた筋肉内処置により、神経筋症状の開始が遷延し、モデルマウスにおける生存率が増加する。症状の現れは、ひっくり返したグリッドに３分間捕まっていられなくなった日を初日として記録した。症状の開始は、ＴＴＣを注射した動物群ではおよそ８日の差で、対照群に対して著しく低減された（図２及び表１）。図３及び表１に示されるように、最大生存は、ＴＴＣを用いて処置したマウスの群で検出され、平均で１３６日にも達し、対照群よりも１６日間長かった。１２週目〜１３週目には、対照群のロータロッド活動の発達に著しい減少が観察され、一方で処置動物群ではこれらの欠如は１６週目まで観察されなかった（図４）。
【０１９２】
（表１）対照群及びＴＴＣ処置群の両方の症状の出現（筋機能の低下）及び生存
2017521408.tif 000003
【０１９３】
また、筋機能を監視する別の試験である「ハンギングワイヤ」試験（図５）を用いて、８週齢で処置の評価を開始した。１４週齢で、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは衰弱の最初の兆候を見せたが、ＴＴＣを用いて処置したマウスの群は、１４週目〜１６週目はより抵抗性であることが示された。また、対照群のマウスは、１４週齢の時点で疾患に関連して体重が減り始めた。しかしながら、ＴＴＣを用いた処置は、体重減少を有意に妨げ、１５週目で最高体重を示した（図６）。
【０１９４】
（実施例２）
ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡの注射による、脊髄におけるアポトーシスの阻害
材料及び方法
１．１  ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡ
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン−配列番号１）をコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下で真核生物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングした。ベクターを、化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５α）において作製し、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧｅｎｅｌｕｔｅ  ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて生成した。
【０１９５】
１．２  トランスジェニックマウス
変異Ｇ９３Ａ（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤｌ−Ｇ９３Ａ］ｌＧｕｒ）を伴ったヒトＳＯＤ１過剰発現するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。ヘミ接合体変異体を全ての実験に使用した（変異体の雄を非トランスジェニックの雌と交配させた）。Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）に記載されるように、トランスジェニックマウスを、尾部から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。動物を、Ｚａｒａｇｏｚａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｘｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔで保持した。動物には、食餌と水を自由に摂取させた。全ての実験及び動物の世話は、Ｚａｒａｇｏｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの規則及び実験動物の世話と使用に関する国際的指針に則って行った。合計で１２匹の動物を使用した：野生型（ｎ＝５）、ｐｃＤＮＡ３．１を注射したＳＯＤｌＧ９３Ａマウス（対照、ｎ＝５）、及びＴＴＣ（ｎ＝５）を用いて処置したＳＯＤｌＧ９３Ａマウス。
【０１９６】
１．３  ネイキッドＤＮＡの筋肉内注射及び脊髄摘出
８週齢のトランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスに、３００μｇのｐＣＭＶ−ＴＴＣを四頭筋（筋肉１か所につき５０μｇで２回の注射）及び三頭筋（筋肉１か所につき５０μｇで１回の注射）に筋肉内注射した。対照群のマウスには、同量の空のプラスミドを注射した。
【０１９７】
プラスミドの筋肉内注射の１１０日後に脊髄を摘出した。液体窒素中で予備凍結させた後、−７０℃で保管した。組織を液体窒素中で凍結させ、次いで低温の乳鉢と乳棒で微粉砕した。試料の半分をＲＮＡ抽出のために使用し、残りの半分をタンパク質抽出のために使用した。
【０１９８】
１．４  脊髄からのＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡの合成
脊髄の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って抽出した。ｃＤＮＡの合成については、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、最終体積２０μＬ中、２０μｇのＲＮＡで開始した。
【０１９９】
１．５  リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ反応を、ＩＸ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ．Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、研究中の各遺伝子について非標識のプライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とのｌＸ混合物、及び反応当たり１μＬの１０倍に希釈されたｃＤＮＡを含む、最終体積１０μＬ中で行った。正規化のため、３つの内因性遺伝子を使用した（１８ｓ  ｒＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ、及びβ−アクチン）。研究中の遺伝子の各々を増幅させるために使用した、プライマーとプローブとの混合物の参照は、カスパーゼ−３（Ｍｍ０１１９５０８５＿ｍ１）、カスパーゼ−ｌ（Ｍｍ００４３８０２３＿ｍ１）、ＮＣＳ−ｌ（Ｍｍ００４９０５５２＿ｍ１）、Ｒｒａｄ（Ｍｍ００４５１０５３＿ｍ１）、１８ｓ  ｒＲＮＡ（Ｈｓ９９９９９９０１）、ＧＡＰＤＨ（４３５２９３２Ｅ）、及びβ−アクチン（４３５２９３３Ｅ）であり、括弧の間の数は、測定した遺伝子のＴａｑＭａｎ（登録商標）測定法識別番号に対応する。
【０２００】
全てのＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。熱サイクルのパラメータは、次の通りであった：９５℃で１０分間のインキュベート、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクルを４０回。カスパーゼ−３、カスパーゼ−ｌ、ＮＣＳ−ｌ、及びＲｒａｄの相対的発現を、３つの内因性遺伝子の幾何的平均値を適用することによって正規化した。
【０２０１】
１．６  脊髄タンパク質抽出及びウエスタンブロット分析
野生型マウス及びＴＴＣを用いて処置したＳＯＤｌＧ９３Ａマウスの脊髄試料を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１％のデオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、１％のトリトンＸ１００、１ｍＭのＮａＯＶａ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン及びアプロチニン、並びに１μｇ／ｍＬのペプスタチンからなる抽出緩衝液で、液体窒素中で均質化した。それを、４℃で、１０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。各試料の上澄み中のタンパク質の濃度を、ＢＣＡ方法（９６４３  Ｓｉｇｍａ）を使用して定量化した後、２５μｇのタンパク質を、１０％のアクリルアミドで、ゲル中に充填した。５％の脱脂粉乳（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５、０．１％のＴｗｅｅｎ）での、ＴＴＢＳ溶液で１時間遮断された、ＰＶＤＦ膜を移送のために使用した。後に、それらを一次抗体で一晩、４℃でインキュベートした（抗ＧＡＰＤＨ（ｓｃ−２５７７８，Ｓｔａ，Ｃｒｕｚ））。
【０２０２】
一次抗体を用いたインキュベートに続いて、膜をＴＴＢＳで洗浄し、二次抗体で１時間、室温でインキュベートした。最終的に、化学発光（ウエスタンブロット法ルミノール試薬、ｓｃ−２０４８  Ｓｔａ．Ｃｒｕｚ）による、顕色が存在した。フィルムを、ＡｌｐｈａＥａｓｅ  ＦＣ（Ｂｏｎｓａｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して走査及び分析した。統計的分析を、ＡＮＯＶＡ試験及びＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を使用して行った。
【０２０３】
結果
ＡＬＳの影響のうちの１つは、運動ニューロン、すなわち、筋肉を神経支配し筋肉機能を一部担うニューロンの変性である。症候年齢のこれらのマウスの脊髄のレベルでの転写性の研究が図７に示されており、この図では、カスパーゼ−１遺伝子（Ｐ＜０．０５）、カスパーゼ−３遺伝子（Ｐ＜０．０５）、及びＢｃｌ２遺伝子（Ｐ＜０．０１）の転写制御と比べて、野生型と比較した場合に対照ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＢａｘ遺伝子の発現プロファイルにおいて有意な差異は見られなかった（Ｐ＞０．０５）（図７）。
【０２０４】
ＴＴＣを用いた治療を受けたマウスの群において、カスパーゼ−１及びカスパーゼ−３の発現のレベルは野生型に維持され、未処置のマウスの群と比較したときにのみ、有意な差異が見出された（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。しかしながら、Ｂａｘ及びＢｃｌ２遺伝子の発現は、これらのトランスジェニックマウスの脊髄において、ＴＴＣの治療による影響を受けなかった（Ｐ＞０．０５）（図７）。
【０２０５】
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄における細胞死を誘発し得るアポトーシスを元に戻す機序へのＴＴＣの効果を評価するために、タンパク質研究もまた行われた。データは、カスパーゼ−３遺伝子（Ｐ＜０．０５）の活性化が、対照群に対して、ＴＴＣを用いて処置したマウスにおいて感知できる程度に減少し、野生型マウスのものと同様なレベルに達したが、プロカスパーゼ−３タンパク質のレベルは、トランスジェニック動物において影響を受けなかったことを明らかにした。発現分析から得た結果とは対照的に、ウエスタンブロットにおいて、Ｂａｘ及びＢｃｌ２タンパク質が、ＴＴＣを用いて処置したマウスにおいて、より少ない量であることを観察した（図８）。
【０２０６】
ＴＴＣの作用機序は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼによって媒介される経路の遮断に関与する様々な増殖因子によって活性化されるキナーゼタンパク質であるＡｋｔのリン酸化である。Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７３：６１３〜６２０（２００３）。リン酸特異的抗体の使用を通したウエスタンブロット分析によって判定されたように、濃度測定による定量化は、ＴＴＣを用いて処置した動物の、Ｓｅｒ４７３がリン酸化したＡｋｔのレベルが、空のベクターの対照と比較して、２倍を超えるものであったことを示した（Ｐ＜０．０５）（図９）。
【０２０７】
タンパク質の等モルの電荷を、抗チューブリン抗体を用いた検出によって確認した。培養皮質ニューロンにおける、ＴＴＣによるＥＲＫ１／２のリン酸化を、以前に記載されている。Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７３：６１３〜６２０（２００３）。ＭＡＰキナーゼ経路におけるＴＴＣの影響を確認するために、１１０日齢の、処置及び未処置のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄抽出物にウエスタンブロット分析を行った。結果は、ＴＴＣ処置群と比較して、対照マウスにおいてＥＲＫ１／２の活性化の増加を示したが（図９）、発現のレベルは、野生型マウスのものと同様であった。
【０２０８】
（実施例３）
腹腔内注射を通したＴＴＣポリペプチドの投与
材料及び方法
１．１  ＴＴＣポリペプチドの抽出
使用したＴＴＣポリペプチドは、破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメインに対応し、４５１アミノ酸を含んだ（配列番号２）。ＴＴＣを、Ｇｉｌｅｔ  ａｌ．，２００３によって記載される方法に従って取得した。
【０２０９】
１．２  トランスジェニックマウス
変異Ｇ９３Ａを伴ったヒトＳＯＤ１（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）を過剰発現するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。ヘミ接合体変異体を全ての実験に使用した（変異体の雄を非トランスジェニックの雌と交配させた）。Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）に記載されるように、トランスジェニックマウスを、尾部から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。動物を、Ｚａｒａｇｏｚａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｘｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔで保持した。動物には、食餌と水を自由に摂取させた。全ての実験及び動物の世話は、Ｚａｒａｇｏｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの規則及び実験動物の世話と使用に関する国際的指針に則って行った。
【０２１０】
１．３  動物における、ＴＴＣポリペプチドの腹腔内注射
１２週齢のランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスに、２５０μＬ、０．５μＭの濃度のＴＴＣポリペプチドを腹腔内注射した。注射を、生存中１週間に１回繰り返した。
【０２１１】
１．４  動物の生存率の測定
動物を仰臥位にして、自力で向き直ることができなかった時点を、マウスの生命のエンドポイントと見なした。
【０２１２】
結果
２．１  ＴＴＣは、トランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの生存を延長する
図１０及び表２で見られるように、最大生存は、ＴＴＣ処置群のマウスにおいて検出され、平均で１３５日に達し、対照群より９日多かった。
【０２１３】
（表２）対照群及びＴＴＣ処置群の生存データ
2017521408.tif 000004
【０２１４】
（実施例４）
ＴＴＣの投与が、脊髄中のカルシウムに関連する遺伝子の発現における変化を引き起こす
ニューロンタンパク質ＮＣＳ１は、カルシウム依存性の様式（ＭｃＦｅｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２７６８〜２２７７２（１９９８））で神経分泌を調節し、それはまた、ニューロンのシグナル伝達（Ｓｃｈａａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９２５３〜９２５８（１９９６））に関与する、カルシウム／カルモジュリン依存性の酵素の調整にも関連している。ＮＣＳ１の発現を、ＴＴＣを用いた治療の５０日後の、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄からの組織を使用して試験した。
【０２１５】
ＲＴ−ＰＣＲ実験において、ＮＣＳ１遺伝子の発現が、同じ年齢の野生型マウスに対して、遅発性症状を有するトランスジェニックマウスにおいて抑制（Ｐ＜０．０５）されたことが見出された。同時に、ＴＴＣを用いた筋肉内処置を受けたマウスは、野生型のものに迫る、より高いレベルのＮＣＳＩを有した（Ｐ＜０．０５）。同じ試料で、Ｒａｓに関連し、糖尿病遺伝子（Ｒｒａｄ）と関連する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定した。この実施例は、Ｒｒａｄのレベルが、同様な年齢の野生型マウスと比較したとき、対照トランスジェニックマウスの脊髄において、ほぼ２倍に増加したことを示す。しかしながら、対照マウスとの比較において、ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＴＴＣを用いた治療は、Ｒｒａｄの発現を感知できる程度に低減し（Ｐ＜０．０５）、これは、野生型マウスにおいて得られたレベルと同様な値に達する（図１１）。
【０２１６】
（実施例５）
神経筋機能に対するＴＴＣの保護効果
材料及び方法
１．１  ＴＴＣ  ＤＮＡを輸送する組み換えプラスミドの構築
ＴＴＣをコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期のプロモーターの制御下で、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．Ａ．，Ｐｒａｔ  ｄｅ  Ｌｌｏｂｒｅｇａｔ，Ｓｐａｉｎ）真核発現プラスミドへとクローニングした。ＴＴＣ遺伝子を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で、ｐＧｅｘ−ＴＴＣプラスミド（Ｃｉｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ）から除去し、ｐＣＭＶに挿入して、ｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミドを作製した。配列決定後、ベクターを化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５α）中で増やし、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｑｕｉｍｉｃａ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を使用して精製した。
【０２１７】
１．２  トランスジェニックマウス
Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）を有するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。ヘミ接合体を、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａの雄を同腹仔の雌と交配させることによって維持した。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｈＳＯＤ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ（ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｐｕｂ−ｃｇｉ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｓｈ？ｏｂｊｔｙｐｅ＝ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ｉｄ＝５２３で入手可能）に記載されるように、子を、尾部組織から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＺａｒａｇｏｚａのＵｎｉｄａｄ  Ｍｉｘｔａ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎに収容した。食餌と水は、自由に摂取可能であった。全ての実験的手順は、生命倫理委員会の組織によって承認され、ＡＬＳ／ＭＮＤに関する薬理学的活性薬物の前臨床のインビボ評価に関する指針に基づいて、実験動物の使用に関する国際的指針に従った。
【０２１８】
１．３  電気生理学的試験
雄のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの２つの群に、組み換えプラスミドｐＣＭＶ−ＴＴＣ又は空のプラスミドを、後足に注射した。神経筋機能を査定するために、１２及び１６週齢で、神経伝導試験を行った。同年齢の野生型マウス（ｎ＝８）の第３の群もまた、比較のために試験した。運動神経伝導試験のために、坐骨神経を、坐骨切痕の近くに配置される一対の針電極で経皮的に刺激し、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ、Ｍ波）を、微小針電極で、前脛骨筋及び足底筋から記録した。
【０２１９】
感覚神経伝導試験のために、記録用電極を第４趾の指神経の近くに配置して、複合感覚神経活動電位（ＣＮＡＰ）を記録した。誘発電位を増幅させ、適切な設定でデジタルオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ４５０Ｓ）上に表示して、ベースラインから最大の負ピークまでの振幅及び刺激から第１の陰性波の発生までの潜時を測定した（Ｎａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２９：２１７〜２２４（１９９４）、Ｖｅｒｄｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ１２９：２１７〜２２４（１９９４）、Ｕｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｉａ４７：１２０〜１２９（２００４））。７回の電気生理学的試験の間に、動物を、水循環ポンプによって制御される暖かく平らなスチーマの上に配置して、体温を維持した。
【０２２０】
結果
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの神経筋機能を、疾患が発病する頃の直前である１２週齢及び疾患が遅発性症候段階である１６週齢の、２つの時点で評価した。１２週齢までには、ＴＴＣ処置マウス及びビヒクル−プラスミドトランスジェニックマウスの両方の、前脛骨筋及び足底筋のＭ波の振幅における４０％〜５０％の減少によって証明される、運動神経伝導試験における顕著な異常性が存在した（図１２、表３）。
【０２２１】
（表３）野生型（ＷＴ）、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ対照（ＳＯＤ対照）、及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  ＴＴＣ処置（ＳＯＤ＋ＴＴＣ）マウス群における神経生理学的結果。値は平均±平均値の標準誤差である
2017521408.tif 000005
＊ＷＴ群に対して、Ｐ＜０．０５。
ＣＭＡＰ、複合筋活動電位；ＣＮＡＰ、複合神経活動電位。
【０２２２】
同年齢の野生型マウスと比較して、潜時の僅かだが明らかな増加（約１４％長い）も存在した（表３）。１６週目に、ビヒクル処置ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＭ波において、正常値の約２０％〜２５％への、振幅の明らかな低減が存在した（図１２）。この減少は、ＴＴＣ処置マウスにおいて明白さが減る（３０％〜３８％へ）が、差異は有意性を獲得しなかった。Ｍ波発生の潜時は、１２週と１６週の間に正常なマウスにおいて生じる、伝導速度の軽度の短縮及び結果として生じる増加（Ｖｅｒｄｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １７：７３〜７７（１９９６））とは対照的に、この年齢の間で、ビヒクル処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（表３）において、僅かに増加した。
【０２２３】
線維自発電位が、１２週目に、試験した筋肉において中程度の存在量で検出され、これらは１６週目に増加した。運動神経異常性とは対照的に、感覚神経伝導試験は、群間の足指の指神経から記録したＣＮＡＰの振幅において著しい差異を示さなかった（表３）。感覚性のＣＮＡＰの潜時は、同年齢の野生型動物と比較して、ビヒクル−プラスミドＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて僅かに遅延した。これらの発見は、ＴＴＣの遺伝子送達が、神経筋機能に関して、Ｇ９３Ａ変異体ヒトＳＯＤ１遺伝子を発現するＡＬＳマウスモデルに対して保護効果を有することを示す。
【０２２４】
（実施例６）
ＴＴＣは、脊髄の運動ニューロンの損失を防ぎ、小神経膠細胞症の低減を促進する
材料及び方法
１．１  ＴＴＣ  ＤＮＡを輸送する組み換えプラスミドの構築
ＴＴＣをコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期のプロモーターの制御下で、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．Ａ．，Ｐｒａｔ  ｄｅ  Ｌｌｏｂｒｅｇａｔ，Ｓｐａｉｎ）真核発現プラスミドへとクローニングした。ＴＴＣ遺伝子を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で、ｐＧｅｘ−ＴＴＣプラスミド（Ｃｉｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ）から除去し、ｐＣＭＶに挿入して、ｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミドを作製した。配列決定後、ベクターを化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５α）中で増やし、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ  ｍａｘｉｐｒｅｐ−ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｑｕｉｍｉｃａ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を使用して精製した。
【０２２５】
１．２  トランスジェニックマウス
Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）を有するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。ヘミ接合体を、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａの雄を同腹仔の雌と交配させることによって維持した。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｈＳＯＤ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ（ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｐｕｂ−ｃｇｉ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｓｈ？ｏｂｊｔｙｐｅ＝ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ｉｄ＝５２３で入手可能）に記載されるように、子を、尾部組織から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＺａｒａｇｏｚａのＵｎｉｄａｄ  Ｍｉｘｔａ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎに収容した。食餌と水は、自由に摂取可能であった。全ての実験的手順は、生命倫理委員会の組織によって承認され、ＡＬＳ／ＭＮＤに関する薬理学的活性薬物の前臨床のインビボ評価に関する指針に基づいて、実験動物の使用に関する国際的指針に従った。
【０２２６】
１．３  組織学的及び免疫組織化学的な処理
雄のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスに、組み換えプラスミドｐＣＭＶ−ＴＴＣ又は空のプラスミドを、後足に注射した。神経筋機能を査定するために、１６週齢で、神経伝導試験を行った。電気生理学的試験に続いて、動物（ｎ＝５）を、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。脊髄の腰椎分節を除去し、２４時間の固定後、３０％のスクロース中で凍結保存した。横径４０μｍの厚さの切片を、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４分節レベルで、サイロトーム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で連続的に切断した。
【０２２７】
各分節について、一連の１０切片の各切片を、別々のゼラチンコーティングスライド上に経時的に採取した。１枚のスライドを、水道水で１分間再水和し、３．１ｍＭのクレシルバイオレットの酸性化溶液で１時間染色した。次いで、スライドを、蒸留水で１分間洗浄し、脱水し、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）でマウントした。運動ニューロンを、染色した脊髄切片の側方の腹角におけるそれらの局在性によって特定し、厳密なサイズ及び形態学的基準に従って数えた。
【０２２８】
側方の腹角全体を含む、重複画像を、４０倍で撮像し、２０μｍの正方形のグリッドを、各顕微鏡写真上に重ね焼きした。２０μｍを超える直径を有し、多角形及び顕著な核小体を有する運動ニューロンのみを数えた。両方の腹角内に存在する運動ニューロンの数を、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４分節各々の４つの連続切片において数えた。別の一連の切片を、ＴＢＳ−トリトン−ＦＢＳでブロックし、一次抗体抗膠細胞原線維の酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、１：１０００、Ｄａｋｏ）又はウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１、１：２０００、Ｗａｋｏ）で、２日間、４℃でインキュベートして、星状膠細胞及び小膠細胞それぞれを標識した。
【０２２９】
洗浄後、切片を、１日間、４℃で、Ｃｙ３−コンジュゲートした二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。マウスの３つの群からの切片を、免疫組織化学的検査と並行して処理した。腹角の灰白質の顕微鏡写真を４００倍で撮像し、バックグランド補正に関する閾値を定義した後、ＧＦＡＰ又はＩｂａ１標識付けの総密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｐｅｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍ  ２６：７６３〜７７９（２００９））を使用して測定した。総密度は、平均密度からバックグラウンドを差し引いたものに関する閾値を超える面積である。
【０２３０】
結果
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス運動ニューロンによって起こった変性事象を、光学顕微鏡で観察した。ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける運動ニューロンの顕著な特徴は、活発な変性を示す、細胞質の空胞化であった（図１３Ａ）。これらの空胞は、異なるサイズ及び透明な内容物を有した。ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス運動ニューロンは、ニッスル物質の欠乏も示し、蒼白色及び見え難くなる。対照的に、野生型マウスにおける運動ニューロンは、濃く染色されたニッスル物質の凝集体を有し、細胞質の空胞は有しなかった（図１３Ａ）。運動ニューロン変性の程度を、１６週齢の野生型及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腰髄切片の側方の腹角における、染色された運動ニューロンの数を数えることによって、判定した。
【０２３１】
３つの区分された腰椎分節は、後肢の異なる筋肉の運動核を含有し；８週目にプラスミド注射が行われる、大腿四頭筋の核は、主にＬ２に位置し；一方電気生理学的に試験した前脛骨筋及び足底筋の運動核は、それぞれ、主にＬ３及びＬ４レベルに表れる（ＭｃＨａｎｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２９３：４７７〜５０８（１９８１））。図１３Ｂは、野生型、対照ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス、及びＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＴＴＣ処置マウスの代表的な脊髄切片を示す。運動ニューロンの基準を満たしたニューロンのみを、計算に含めた。小型ニューロンを計算から除外し、これらのニューロンが、実際は、萎縮性運動ニューロンであったとしても、それらは機能的運動ニューロンではなさそうであった。残存する運動ニューロンの数は、野生型で同年齢の対照と比較して、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ群の両方において、腰髄で著しく低減した（図１３Ｃ）。
【０２３２】
それにも関わらず、ビヒクルプラスミドを注射したマウスにおける運動ニューロンの損失の程度（野生型マウスに対して、約４３％の残存運動ニューロン）は、ＴＴＣ処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（約６０％）よりも著しく高かった。結果は、ＴＴＣの神経保護効果が、脊髄分節に沿って広がり、四頭筋運動神経のプールを含有する分節のみに影響を与えるわけではないことを示した。しかしながら、ＴＴＣによって誘導される運動ニューロンの生存における改善は、運動ニューロンの割合が、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ対照マウスと比較して、ＴＴＣを用いて処置したマウスにおいて、Ｌ２で約２２％、Ｌ３で１６％、及びＬ４で１２％増加したため、僅かな勾配を示した（図１３Ｃ）。
【０２３３】
腰椎運動ニューロンの状態及び反応性膠細胞の反応を間接的に検査するために、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）又は小膠細胞（Ｉｂａ１）のためのマーカーで脊髄切片を染色した。膠細胞の反応性を、Ｌ２切片において測定した。なぜならば、この分節が運動ニューロンの生存の最も高い増加率を有するからである。反応性星状細胞増多症及び小神経膠細胞症は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ群両方において、これらのマーカーに関するより低い基礎標識付けを有する野生型マウスよりも、著しく高いレベルで明白であった（図１４Ａ）。免疫反応性の定量分析により、ＴＴＣ処置は星状膠細胞反応性に対して効果を有さなかったが、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、増加した小膠細胞反応性の著しい低減を促進することが可能であることが示された（図１４Ｂ）。
【０２３４】
（実施例７）
筋収縮力に対するＴＴＣの効果
ＴＴＣは、組み換えタンパク質として筋肉内に送達しても、又はプラスミド（ネイキッドＤＮＡ）によって発現しても、モデルマウスにおける筋収縮力を向上させることが観察された。
【０２３５】
材料及び方法
１．ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡ
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン、配列番号：２）をコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期のプロモーターの制御下で、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）真核発現プラスミドへとクローニングした。ＴＴＣ遺伝子を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で、ｐＧｅｘ−ＴＴＣプラスミドから除去し、ｐＣＭＶに挿入して、ｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミドを作製した。配列決定後、ベクターを、化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５）中で増やし、ＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドＭＥＧＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０２３６】
全ての試験したパラメータは、薬物物質に関する許容基準（外観、濃度、純度、プラスミド及びｐＤＮＡ配列の同一性及びサイズ）の範囲内であった。
【０２３７】
２．ＴＴＣタンパク質
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン、配列番号：２）としてコードされたタンパク質を、高い細胞密度配置で、流加プロセスにおいて、大腸菌の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、バイオリアクター中で作製した。大腸菌ＢＬ２１細胞を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、ＴＴＣタンパク質を発現するように誘導した。細胞を、リゾチーム及びＤＮＡａｓｅ−Ｉの存在下で溶解させ、硫酸アンモニウムを用いた還元塩析プロセス後、液体クロマトグラフィー（金属親和性、疎水性の相互作用及びイオン交換）によってタンパク質を単離し、精製した。純度及び菌体内毒素レベル（Ｌａｌ試験）もまた判定した。
【０２３８】
前もって、大腸菌のコドン使用頻度を適合させることによって、遺伝子配列を合成し、遺伝子配列を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）酵素を用いた制限処理によって、発現プラスミドｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。発現ベクターを、生産菌株ＢＬ２１  ＤＥ３に変化させ、それを用いてバイオリアクター中で生産を行った。
【０２３９】
３．トランスジェニックマウス
Ｇ９３Ａ変異を伴ったヒトＳＯＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ）から入手した。雌のＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウスを、全ての分析のために独占的に使用し、性差を排除し、研究のために必要とされる動物の数を最小化した。雄のＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウス（ＪＡＸから購入）を、全ての実験的な雌のトランスジェニックマウスを生成するために、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ×ＳＪＬ交差の雌のＦ１子孫と異種交配させた。トランス遺伝子発現を、離乳後に採取した耳生検組織のＰＣＲ分析によって確認した。動物には、水と食餌を自由に摂取させた。全ての実験を、実験動物の使用に関する国際的指針に従って展開した。
【０２４０】
４．化合物の筋肉内投与
全ての化合物を、特定の体積（６０μＬの全注入量）で、生後７０日目（症候段階）に開始する以下の後肢筋内への両側筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって、送達した：
前脛骨筋（ＴＡ）＝４μｌ×２
大腿４頭筋＝１４μｌ×２
下腿三頭筋（腓腹筋）＝１２μｌ×２
【０２４１】
長指伸筋（ＥＤＬ）には直接注射をしなかったが、ＴＡ筋へのその極めて近い接近度は、拡散による注入物への曝露を確実にした。全ての筋肉内注射を、標的筋肉への正確な送達を確実にし、覚醒状態／応答性のマウスにおいて針によって誘発される損傷を低減し、不必要な痛みを避けるために、イソフルラン麻酔下で行った。注入量を、圧力に関連する筋肉損傷すなわち筋区画症候群の誘発を避けるために、全ての筋肉の体積の１５％未満に保った。
【０２４２】
研究に使用した用量は、プラスミドに関して３００μｇ（単回又は１週間に１回の投与）であり、タンパク質に関して１０μｇ（１週間に１回の投与）であった。
【０２４３】
５．筋収縮力（攣縮及び強直力）の測定
坐骨神経を、電極の上に配置する前に、中大腿部において露出させ、近位で切断した。筋長を、最大攣縮力に関して調整した。次いで坐骨神経を、最大単攣縮力を記録するために、０．０２ｍｓの矩形波パルスで刺激した。４０、８０、及び１００Ｈｚでの、連続した刺激で坐骨神経を刺激することによって、最大強直力を判定した。記録された最大攣縮力から、収縮のピークに達するまでの時間（ピークまでの時間、ＴＴＰ）及び弛緩の半分に達するまでの時間（１／２ＲＴ）の測定によって、筋収縮特徴を判定した。図１６を参照されたい。
【０２４４】
結果
１．筋収縮力
攣縮（図１７）及び強直筋収縮力データ（図１８）は、１２０日目の、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド及びＴＴＣタンパク質を用いて処置したＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、それらのそれぞれの対照と比較して、筋収縮力が、ＴＡ（図１７Ａ、図１８Ａ）及びＥＤＬ筋（図１７Ｂ、図１８Ｂ）両方で、著しく上昇したことを示した。強直力値は、最大筋力生成能力を表すが、攣縮値は主に収縮率の特徴に関して使用される。筋収縮力における最も優れた改善は、ＴＴＣタンパク質（１０μｇ）処置マウスにおいて観察され、それはＴＡ及びＥＤＬ筋において、ＴＢＳ（ビヒクル）処置マウスと比較して、それぞれ２．０７倍及び２．０９倍の強直力の増加をもたらす。最大ＴＡ及びＥＤＬ筋収縮力は、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド（１週間に１回の筋肉内注射）処置マウスにおいても、ｐｃＤＮＡ３．１空プラスミド処置マウスと比較して２．１５倍及び１．８８倍に増加した。興味深いことに、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミドの１週間に１回の筋肉内注射は、単回の注射のみを受けたマウスと比較して、ＴＡ強直力における有意な増加をもたらさなかったが、しかしながら、中程度だが有意な差異（ｐ＝＜０．０４）がＥＤＬ筋強直力において観察された。
【０２４５】
２．筋収縮特徴
筋収縮特徴データは、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド（１週間に１回の筋肉内注射）での治療が、ｐｃＤＮＡ３．１空プラスミド（１週間に１回の筋肉内注射）処置対照と比較して、ＴＡ（図１９Ａ、図２０Ａ）及びＥＤＬ筋（図１９Ｂ、図２０Ｂ）の両方に関して、ＴＴＰ（図１９）及び１／２ＲＴ値（図２０）における著しい改善をもたらすことを示す。更に、筋収縮特徴のデータは、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミドの１週間に１回の投与が、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける７０ｄでの単回投与と比較して、より優れた効果を及ぼすことを示す。同様な又は一層優れた改善も、ＴＴＣタンパク質（１０μｇ、１週間に１回の筋肉内注射）処置マウスにおいて観察されたが、しかしながら、ＴＢＳ（ビヒクル）処置対照は、筋収縮特徴を予想よりも早く示した。
【０２４６】
（実施例８）
力の増加：ＴＴＣ投与後の筋量比
本明細書で提供される実験的データは、ＴＴＣが、組み換えタンパク質として筋肉内に送達されても、又はプラスミド（ネイキッドＤＮＡ）によって発現されても、モデルマウスにおける筋量及び筋力：筋量比において改善をもたらすことを示す。
【０２４７】
材料及び方法
１．ＴＴＣをコードするネイキッドＤＮＡ
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン、配列番号：２）をコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期のプロモーターの制御下で、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）真核発現プラスミドへとクローニングした。ＴＴＣ遺伝子を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で、ｐＧｅｘ−ＴＴＣプラスミドから除去し、ｐＣＭＶに挿入して、ｐＣＭＶ−ＴＴＣプラスミドを作製した。配列決定後、ベクターを、化学的に適合性のある大腸菌（ＤＨ５）中で増やし、ＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドＭＥＧＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０２４８】
全ての試験したパラメータは、薬物物質に関する許容基準（外観、濃度、純度、プラスミド及びｐＤＮＡ配列の同一性及びサイズ）の範囲内であった。
【０２４９】
２．ＴＴＣタンパク質
ＴＴＣ（破傷風毒素の重鎖のＣ末端ドメイン、配列番号：２）としてコードされたタンパク質を、高い細胞密度配置で、流加プロセスにおいて、大腸菌の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、バイオリアクター中で生成した。大腸菌ＢＬ２１細胞を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、ＴＴＣタンパク質を発現するように誘導した。細胞を、リゾチーム及びＤＮＡａｓｅ−Ｉの存在下で溶解させ、硫酸アンモニウムを用いた還元塩析プロセス後、液体クロマトグラフィー（金属親和性、疎水性の相互作用及びイオン交換）によってタンパク質を単離し、精製した。純度及び菌体内毒素レベル（Ｌａｌ試験）もまた判定した。
【０２５０】
前もって、大腸菌のコドン使用頻度を適合させることによって、遺伝子配列を合成し、遺伝子配列を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）酵素を用いた制限処理によって、発現プラスミドｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。発現ベクターを、生産菌株ＢＬ２１  ＤＥ３に変化させ、それを用いてバイオリアクター中で生産を行った。
【０２５１】
３．トランスジェニックマウス
Ｇ９３Ａ変異を伴ったヒトＳＯＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ）から入手した。雌のＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウスを、全ての分析のために独占的に使用し、性差を排除し、研究のために必要とされる動物の数を最小化した。雄のＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウス（ＪＡＸから購入）を、全ての実験的な雌のトランスジェニックマウスを生成するために、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ×ＳＪＬ交差の雌のＦ１子孫と異種交配させた。トランス遺伝子発現を、離乳後に採取した耳生検組織のＰＣＲ分析によって確認した。動物を、ＵＣＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙの施設で保護した。動物には、水と食餌を自由に摂取させた。全ての実験を、実験動物の使用に関する国際的指針に従って展開した。
【０２５２】
４．化合物の筋肉内投与
全ての化合物を、特定の体積（６０μＬの全注入量）で、生後７０日目（症候段階）に開始する以下の後肢筋内への両側筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって、送達した：
前脛骨筋（ＴＡ）＝４μｌ×２
大腿４頭筋＝１４μｌ×２
下腿三頭筋（腓腹筋）＝１２μｌ×２
【０２５３】
長指伸筋（ＥＤＬ）には直接注射をしなかったが、ＴＡ筋へのその極めて近い接近度は、拡散による注入物への曝露を確実にした。全ての筋肉内注射を、標的筋肉への正確な送達を確実にし、覚醒状態／応答性のマウスにおいて針によって誘発される損傷を低減し、不必要な痛みを避けるために、イソフルラン麻酔下で行った。注入量を、圧力に関連する筋肉損傷すなわち筋区画症候群の誘発を避けるために、全ての筋肉の体積の１５％未満に保った。
【０２５４】
研究に使用した用量は、プラスミドに関して３００μｇ（単回又は１週間に１回の投与）であり、タンパク質に関して１０μｇ（１週間に１回の投与）であった。
【０２５５】
５．筋収縮力（攣縮及び強直力）の測定
坐骨神経を、電極の上に配置する前に、中大腿部において露出させ、近位で切断した。筋長を、最大攣縮力に関して調整した。次いで坐骨神経を、最大単攣縮力を記録するために、０．０２ｍｓの矩形波パルスで刺激した。４０、８０、及び１００Ｈｚでの、連続した刺激で坐骨神経を刺激することによって、最大強直力を判定した。記録された最大攣縮力から、収縮のピークに達するまでの時間（ピークまでの時間、ＴＴＰ）及び弛緩の半分に達するまでの時間（１／２ＲＴ）の測定によって、筋収縮特徴を判定した。図１７及び図１８を参照されたい。
【０２５６】
結果
ＴＡ筋量が、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド（単回及び１週間に１回の筋肉内注射の両方）及びＴＴＣタンパク質（１０μｇ、１週間に１回の筋肉内注射）処置マウスにおいて、それらのそれぞれの対照と比較して、著しく増加することが見出された（図２２Ａ）。ＥＤＬ筋量も、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド（１週間に１回の筋肉内注射）処置マウスにおいて有意に増加したが、ＴＴＣタンパク質治療の効果はより小さかった（図２２Ｂ）。これは、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、ＴＡ筋が、ＥＤＬ筋よりも初期段階で典型的により激しく影響を受け、ＥＤＬ筋の小さいサイズのため、どのような質量の変化も、ＴＡで観察されるものより一般的に微細であるという事実を反映したものであり得る。
【０２５７】
顕微鏡データも、ＴＴＣ注射に続く筋量の増加を示した（図２３）。１２０ｄ  ＳＯＦ１Ｇ９３Ａマウスの浅部下腿三頭筋を、ビヒクル又はＴＴＣタンパク質（１０μｇ、１週間に１回の筋肉内注射）を用いて処置した。顕微鏡写真は、ＴＴＣ処置筋肉中の非常に肥大化した筋繊維を示し、それは、下腿三頭筋内部の同じ位置のビヒクル処置筋肉中には存在しなかった。
【０２５８】
力：質量比データは、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミド（１週間に１回の筋肉内注射）及びＴＴＣタンパク質（１０μｇ、１週間に１回の筋肉内注射）治療の両方が、それらのそれぞれの対照と比較して、ＴＡ及びＥＤＬ筋機能の著しい改善をもたらすことを実証する（図２１Ａ及び図２１Ｂを参照されたい）。ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミドの単回用量の筋肉内投与は、ＴＡ筋力：筋量比を著しく増加させるが、しかしながら、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミドの１週間に１回のみの投与は、ＥＤＬ筋において筋力：筋量比を増加させる。更に、ＴＴＣタンパク質（１０μｇ）の１週間に１回の投与は、ＥＤＬ筋において、１週間に１回のｐｃＤＮＡ３．１ＴＴＣプラスミドの送達と比較して、筋力：筋量比への著しく優れた効果を及ぼすが、ＴＡ筋に関しては及ぼさない。
【０２５９】
（実施例９）
筋肉バイオマーカー評価
損なわれ／消耗した筋肉（ＥＤＬ）における、ＴＴＣタンパク質での腹腔内治療は、健常な動物の値に近いＡＬＳ疾患進行のマーカーの発現レベルをもたらし、酸化的ストレスを減少させることを示した。一方で、ＴＴＣ治療は、疾患へのより優れた抵抗性を有する筋肉内の筋肉の統合性に関連する遺伝子の発現を上昇させる。
【０２６０】
骨格筋生検に基づいて、Ｍｅｆ２ｃ、Ｇｓｒ、Ｃｏｌ１９ａ１、Ｃａｌｍ１、及びＳｎｘ１０が、トランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける長寿命の潜在的遺伝的バイオマーカーであることを提案している。Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ７（３）：ｅ３２６３２（２０１２）を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。転写レベルの著しい発現増加が、Ｃａｌｍ１を除いて、早期無症候期から末期段階までの遺伝子の全てにおいて見出された。
【０２６１】
収縮が速い長指伸筋（ＥＤＬ）及び収縮が遅いヒラメ筋を、ＴＴＣでの治療後に、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける遺伝子バイオマーカーの発現を研究するために使用した。これらの組織の選択は、前駆症状のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける以前の観察に基づいており、検出可能な末梢神経の機能不全は存在せず、筋病理が運動ニューロンの機能不全に対して２次的である証拠を提供するが、しかし、疾患の末期では、単回の筋繊維収縮分析は、ＡＬＳ誘発除神経によって速い攣縮筋繊維及び神経筋接合部が優先的に影響を受け、それらの同年齢の対照からの筋繊維としてカルシウムによって活性化されたとき、同じレベルの力を生成することが不可能であることを実証する。Ａｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ１５：３７７〜３８８（２００５）を参照されたい。
【０２６２】
材料及び方法
１．トランスジェニックマウス
Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）を有する、トランスジェニックマウストランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。ヘミ接合体を、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａの雄を同腹仔の雌と交配させることによって維持した。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｈＳＯＤ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅに記載されるように、子を、尾部組織から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅によって特定した。マウスを、内部手順に従って収容し、食餌と水は、自由に摂取可能であった。全ての実験的手順は、生命倫理委員会によって承認され、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）に関する薬理学的活性薬物の前臨床のインビボ評価に関する指針に基づいて、実験動物の使用に関する国際的指針に従った。
【０２６３】
２．ＴＴＣタンパク質
Ｈｉｓ−標識ＴＴＣを、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｒｒａｎｄｏ−Ｇｒａｂｕｌｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２４（１）：３６〜４４（２０１３）に記載される、（６×Ｈｉｓ）−標識ＴＣＣをコードするベクターで以前にトランスフェクトした大腸菌ＢＬ２１細胞から得た。
【０２６４】
大腸菌ＢＬ２１細胞を、（６×Ｈｉｓ）−標識ＴＴＣについてコードするｐＱＥ３（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）ベクターで形質転換し、以前に報告したように、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地で増殖させた。０．４ｍＭのイソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、タンパク質発現を誘導した。３時間後、細胞を、２０分間、４℃、４０００ｇでの遠心分離によってペレット状にし、溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び１％のトリトンＸ１００；ｐＨ８）中で再懸濁し、３０秒で６回、氷の上で超音波処理した。懸濁液を、３０分間、４℃、３００００ｇで遠心分離した。Ｈｉｓ−標識タンパク質を含有する透明な上澄みを、コバルト親和性クロマトグラフィーによって精製した。混合タンパク質を、コバルトアガロース樹脂（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有し、事前に平衡化した（５０ｍＭのＮａＨ２−ＰＯ４．Ｈ２Ｏ及び３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に注入した。Ｈｉｓ−標識なしのタンパク質を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）を用いて樹脂を洗浄することにより溶出させた。ＴＴＣは６個のヒスチジンを含有し、かつこれは共複合体を形成する樹脂中に保持した。ＴＴＣを、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び１５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７）を用いて溶出させた。採取した断片は、０．５ｍＬの体積であった。溶出プロセスには、ＦＰＬＣシステムが続き得、それは絶えず２８０ｎｍでの吸光度を測定する。
【０２６５】
タンパク質を、１２％でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。ゲルを、ＧｅｌＣｏｄｅ青色染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で染色し、精製したＴＴＣタンパク質を含有するそれらの断片を、４℃で一晩透析し（４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、新しい緩衝液で２時間透析した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸測定法（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及び凍結乾燥を使用して判定した。ＴＴＣを、−２０℃で、一定分量で保管した。
【０２６６】
３．腹腔内投与
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、６０日齢および７５日齢で、インスリンシリンジ（２５ＧＡ５／８Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＳＡ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を使用して、１０μｇのＴＴＣ／注射（注入量は２００μＬであった）を腹腔内注射された。野生型マウス（対照群として使用した）も、同じプロトコルを用いて治療した。
【０２６７】
４．生物学的試料の摘出
マウス（雄及び雌について釣り合いをとった）を、８０日齢で、ＣＯ２チャンバで窒息させることによって安楽死させた。その後、組織（ヒラメ筋及び長指伸筋）を収集し、液体窒素中で急速凍結させ、次いでベクター発現検出のために−８０℃で保管した。野生型で同年齢のマウスの組織もまた摘出した。
【０２６８】
５．遺伝子の発現の分析
組織を液体窒素中で凍結させ、次いで低温の乳鉢で微粉砕した。筋繊維におけるバイオマーカー遺伝子の発現を判定するために、ＴＲＩｚｏｌ試薬プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．Ａ．）に従って均質化した筋肉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、クロロホルム、低温のイソプロパノール、及び低温のエタノールでの分画後に得た。一旦Ｔｕｒｂｏ−ＤＮＡ  ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）によって残留ＤＮＡを除去して、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した、ＲＮＡの逆転写によって得た。
【０２６９】
ＴＴＣ治療による組織における遺伝子発現変動を、リアルタイムＰＣＲによって測定した。２つの内因性遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチン）を、正規化のために使用した。対象とする各遺伝子についてのプライマーとプローブとの混合物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給された（表４）。ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。
【０２７０】
（表４）遺伝子発現測定法に使用したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
2017521408.tif 000006
正規性試験及びスチューデントのｔ分布を、ＳＰＳＳ  ｖ１９．０によって計算した。全ての値を、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表した。統計的有意性閾値を、ｐ＜０．０５（＊）及びｐ＜０．０１（＊＊）に設定した。レベルは、野生型の結果を参照した。
【０２７１】
結果
ＥＤＬ筋（疾患において最も影響を受け、この段階では再生能はない）において、Ｇｓｒ、Ｃｏｌ１９ａ１、及びＳｎｘ１０のｍＲＮＡ発現は、腹腔内ＴＴＣ治療後に野生型値近くまで低減され、この低減がトランスジェニックＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）における長寿命の予測因子として仮定されているため、それは筋肉に有益であると予想される（図２４を参照されたい）。
【０２７２】
ヒラメ筋において、ＴＴＣの腹腔内注射は、野生型マウスと比較して、ＳＯＤ１Ｇ９３マウスにおけるＣｏｌ１９ａ１及びＳｎｘ１０の発現の増加を誘導する（図２５を参照されたい）。この結果は、ＴＴＣが疾患進行（ＥＤＬ）によって最も影響を受ける筋肉及び未だに完全に影響を受けていない筋肉（ヒラメ筋）で、異なる保護効果を及ぼし得ることを示唆する。したがって、ＥＤＬにおいて、ＴＴＣの投与はバイオマーカーのレベルの低減を引き起こし、それは筋量の損失の予防と関連し、改善した生存率をもたらす。ヒラメ筋において、筋量の増加に関連した、バイオマーカータンパク質の発現を誘導するためのＴＴＣの投与を観察した。
【０２７３】
Ｇｓｒバイオマーカーの結果は、トランスジェニックＳＯ１Ｇ９３Ａにおける筋肉の酸化的ストレスの制御におけるＴＴＣの関与に関連し得る。
【０２７４】
（実施例１０）
筋力へのＴＴＣ−タンパク質及びＴＴＣ−プラスミドの投与の効果
方法
１．実験計画
全ての動物で、１個の前脛骨筋（ＴＡ）を低温破壊（cryolesioned）した。動物（１０週齢）を、異なる群（ｎ＝５）に割り当て、それらを低温破壊して、外傷後すぐに治療し、外傷を受けた７日後及び１４日後（タンパク質）又は外傷のすぐ後及び外傷を受けた１５日後（プラスミド）に治療した。測定を１５日目及び３０日目に行った。
【０２７５】
治験薬を、筋肉内注射（０．６７μｇのタンパク質／注射又は２０μｇのプラスミド／注射）によって投与した。リン酸塩緩衝液生理食塩水及び空の（分類せず）プラスミドを、それぞれの陰性の対照として使用した。未損傷の動物もまた監視した。
【０２７６】
麻酔下で、マウスの後肢を剃毛し、両方の前脛骨筋（ＴＡ）を、筋肉を覆っている無菌的に調製した皮膚の１ｃｍの長さの切開部を介して露出させた。ドライアイスの温度（−７９℃）に予備冷却した、１２０ｍｍの直径の鋼製プローブを、１０秒間、ＴＡ筋の腹部に適用することによって、外傷性凍傷を誘発した。外傷手順の後、皮膚の切開部を、６−０絹縫合糸を使用して縫合した。この手順は、脛骨の隆起から遠位に延在し、筋肉のおよそ３分の１にわたって広がる、局所的な外傷を誘発する。エバンスブルー標識付けによって評価された病変部位の平均の長さ及び最大断面積は、それぞれ３２０２±１４μｍ及び３８７５７８９±２７５０１μｍ２であった（平均±平均値の標準誤差）。その後、動物を１時間、暖かいプレート（３７℃）上に維持し、体温低下を避けた。
【０２７７】
２．力の測定
スイスマウスを、動物体重１０ｇ当たり、２．２ｍｇのケタミン／０．４ｍｇのキシラジン／０．２２ｍｇのアセプロマジンの腹腔内注射によって麻酔した。マウスを、加熱パッド上に置き、体及び筋肉を３７℃に維持した。ＴＡ筋の遠位の腱を、Ｇｒａｓｓ  ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈ（Ｍｏｄｅｌ７９Ｄ，Ｇｒａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＵＳＡ）に接続した、ＦＴ０３  ＧｒａｓｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ力変換器に取り付けた。ポリグラフの出力も、デジタルデータ収集システム（ＫＣＰＩ３１０４，Ｋｅｉｔｈｌｅｙ，ＵＳＡ）に接続され、５ｋＨｚの試料採取率で力を取得した。ＴＡを、１１８．５ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、３．１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、及びＯ２：ＣＯ２（９５：５）の混合気体中に連続して曝した５．５ｍＭのＤ−グルコースを含有する生理的溶液を用いて湿気を保たせ、ｐＨ＝７．４を維持した。収縮を、腓骨神経の短い部分で０．６ｃｍ離間した２本の白銀製ワイヤを使用する領域刺激によって、１００秒毎に誘発させた。白銀製電極を、Ｇｒａｓｓ  Ｓ８８Ｘ刺激装置及びＧｒａｓｓ  ＳＩＵＶ隔離ユニット（Ｇｒａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＵＳＡ）に接続した。単回の攣縮を、１０Ｖで、１回の０．３ミリ秒の矩形パルスを用いて誘発した。最大力を、２００Ｈｚで、２００ミリ秒の連続したパルスを用いた強直収縮の間に測定した。
【０２７８】
結果
１．筋力へのＴＴＣの投与の効果
ＴＴＣ又はＰＢＳ（ビヒクル）を、凍傷を施したＴＡ筋に、筋肉内注射を介して投与した（１５日の間、３３．５μｇ／体重１ｋｇ／７日）。ＴＴＣ−タンパク質の筋肉内注射は、外傷１５日後の、攣縮及び強直力における増加を引き起こした（図２６）。攣縮力は、凍傷を施したＴＡ筋とＴＴＣ−タンパク質を用いて処置した筋肉との間で、外傷３０日後で著しく異なってはいないが、（図２８、パネルＡ）、しかし強直力における増加があった（図２８、パネルＢ）。
【０２７９】
外傷１５日後で、ＴＴＣ処置及び対照（外傷を受けてＰＢＳ処置、及び外傷なし）群におけるＴＡ筋の力・収縮頻度曲線は、ＴＴＣ−タンパク質群において、ＰＢＳを用いて処置した外傷を受けた群に対して一貫して高い力の値を示した（図２７）。外傷３０日後で、力・収縮頻度曲線は、ＴＴＣ−タンパク質処置群は、より低い周波数でより低い力の値を示す（およそ１００Ｈｚ未満）が、ＰＢＳ処置群に対してより高い周波数でより高い力の値を示す（およそ１００Ｈｚを超える）ことを示した（図２９）。
【０２８０】
２．筋力へのプラスミド−ＴＴＣの投与の効果
ＴＴＣをコードするプラスミド又は空のプラスミドを、凍傷を施したＴＡ筋に、筋肉内注射を介して投与した（外傷後、１ｎｇ／体重１ｋｇの単回注射、１５日の間）。図３０及び図３２は、外傷１５日後及び３０日後の、攣縮及び強直力への、ＴＴＣ−プラスミドの筋肉内注射の効果をそれぞれ示す。両方の展開において、ＴＴＣをコードするプラスミドの投与は、攣縮及び強直力を、ＰＢＳを用いて処置した外傷を有する群に対して著しく増加させた。
【０２８１】
図３１及び図３３は、外傷１５日後及び３０日後の、ＴＴＣ処置、空のプラスミド処置、及び外傷なし（対照）群における、ＴＡ筋の力・収縮頻度曲線をそれぞれ示す。両方の展開において、ＴＴＣをコードするプラスミドの投与は、ＴＴＣ−プラスミド処置群における力を、空のプラスミド処置群に対して著しく増加させた。
【０２８２】
（実施例１１）
ＴＴＣの筋原性の効果：Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞のインビトロでの研究
材料及び方法
１．材料
抗ＭＨＣ及び抗ミオゲニン抗体を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＧＡＤＰＨを、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手した。二次抗体を、ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びウマ血清（ＨＳ）を、Ｌｏｎｚａ（Ｐｏｎｔｅｖｅｄｒａ，ＳＰ）から入手した。全ての他の化学的試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）からのものである。
【０２８３】
２．細胞培養及び分化
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏを通じて供給元（ＥＣＡＣＣ，Ｗｈｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって説明される通りに培養した。簡潔に言えば、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを補充した、ＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン）を含有する増殖培地（ＧＭ）内に維持した。定期的な分化のため、細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させ、特に明記しない限り、ＧＭを７日間分化培地（ＤＭ；２％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）と交換した。この期間の間、ＴＴＣを、ＤＭに、２４時間毎に１、１０、及び１００ｎＭで投与した。
【０２８４】
３．ＢｒｄＵ技術を使用する増殖測定法
増殖測定法を、ＥＬＩＳＡ  ＢｄｒＵ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ、ＩＮ，ＵＳＡ）を使用して展開した。細胞を、４８時間、ＧＭ又はＴＴＣ（１、１０、及び１００ｎＭ）を補充したＧＭ内で、９６穴型ウェルプレート［１０．０００細胞／ウェル］中で培養した。試料を、製造業者の説明書に従って処理した。ＢｒｄＵの組み込みを、ＶｅｒｓａＭａｘＰＬＵＳ読み取り装置（λ＝３７０ｎｍ、２１分）を使用して測定した。
【０２８５】
４．免疫ブロット分析
細胞を、３７℃で、提示された回数、異なる治療を用いて刺激した。細胞試料を、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０、０．２５％（ｗ／ｖ）のＮａ−デオキシコレート、プロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）、ホスファターゼ阻害剤反応混液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）］中に直接溶解させた。溶解物を遠心分離（１４，０００×ｇ、４℃で１５分間）によって解析し、タンパク質濃度を、ＱｕａｎｔｉＰｒｏＴＭ  ＢＣＡ測定法キット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）を使用して定量化した。免疫ブロットのために、タンパク質の等量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、ニトロセルロース膜上に移した。免疫反応性バンドを、改良された化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳ）によって検出した。定量化を、ＩｍａｇｅＪ６４分析ソフトウェアを使用して行った。
【０２８６】
５．免疫細胞化学
Ｃ２Ｃ１２細胞を培養し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＤＥ）上で分化させた。無処置の細胞を、４％緩衝パラホルムアルデヒド−ＰＢＳを用いて固定し、洗浄し、３０分間、ＰＢＳ／トリトンＸ１００を用いて透過処理及び遮断した。細胞を、４℃で一晩、ＰＢＴ中で希釈した一次抗体（抗ＭＨＣ抗体）を用いて染色した。次いで細胞を洗浄し、３７℃で４５分間、ＰＢＳ／トリトンＸ１００中の二次抗体を用いてインキュベートした。ＤＡＰＩを、細胞核（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳ）を対比染色するために使用した。細胞培養のデジタル画像を、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５分光共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＤＥ）を用いて取得した。３つの独立した実験からの５つの領域を、各治療のためランダムに選択した。領域の定量化、直径及び筋核の凝集を、ＩｍａｇｅＪ６４分析ソフトウェアを使用して行った。
【０２８７】
６．データ分析
データ分析。全ての値を、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。スチューデントのｔ検定を行い、二元配置分析の統計的有意性を査定した。＊Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。
【０２８８】
結果及び考察
１．筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞へのＴＴＣの分裂促進能
筋形成の異なる段階のＴＴＣの役割を判定するために、筋芽細胞増殖及び／又は分化、ＴＴＣの分裂促進的な活性を、増殖状態（ＧＭ）における用量効果実験（１〜１００ｎＭ）によって調査した。
【０２８９】
図３４に示されるように、用量試験に関して著しい増加が存在したが、用量試験間で著しい差異は観察されなかった（１〜１００ｎＭ）。ＴＴＣ治療は、１、１０、及び１００ｎＭに関して、対照（ＧＭ）と比較して、それぞれ、３７．７±０．７、３８．８±０．７、及び３６．８±０．６の増加をもたらす。対照（Ｐ＜０．０５）に対して統計学的に有意であるこの増加は、１ｎＭで最大であることを示した。
【０２９０】
２．Ｃ２Ｃ１２細胞へのＴＴＣの筋原性能
筋原性のプログラムは、一連の転写に集中する細胞内経路、及び遺伝子を描写するクロマチン再構成因子、及び筋原性の同一性の限界を定めるマイクロＲＮＡ発現プログラムによって定義される。筋原性の転写因子を、時空間的に活性化されるか又は分化系列進行の間に阻害される階層的な遺伝子発現ネットワークにおいて体系化する（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ９３：２３〜６７；Ｔｉｄｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ａｍ，Ｊ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９８：Ｒ１１７３〜Ｒ１１８７）。具体的には、ミオゲニンは筋芽細胞分化系列決定のために必須である。
【０２９１】
ＴＴＣ刺激筋形成かどうかを調査するために、７日の分化期間の間に、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、ＤＭ＋ＴＴＣ（１〜１００ｎＭ）下で、それを用いて処置した。図３５に示されるように、免疫ブロットによって検出されたミオゲニンのタンパク質レベルは、ＤＭ中の対照細胞を超える、用量依存的な増加を示した。この事実は、筋原性プロセスの間、ミオゲニン発現へのＴＴＣの役割を除外する。これらの状態下で、ミオゲニンのタンパク質レベルは、分化プロセスの初期段階の間に対照細胞（ＤＭ）と比較して、ＴＴＣ処置Ｃ２Ｃ１２細胞（１０及び１００ｎＭ）において下方制御された。
【０２９２】
筋原性の制御因子は、他の転写制御因子と関連して、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）などの筋肉特異的遺伝子の発現を誘導し、それは末端筋原性分化（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ９３：２３〜６７；Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｎａｔ，Ｒｅｖ，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１２：３４９〜３６１）を判定する。
【０２９３】
ＭＨＣ発現のプロモーターとしてのＴＴＣの活性を査定するために、Ｃ２Ｃ１２細胞を、７日間、ある範囲の濃度（１〜１００ｎＭ）で、ＴＴＣを補充したＤＭに切り替えた。図３６に示されるように、免疫ブロットによって検出されたＭＨＣのタンパク質レベルを、対照の分化細胞（ＤＭ）と比較して１ｎＭで上方制御した。免疫ブロット分析は、対照細胞と比較した１０ｎＭでのＭＨＣの正常なタンパク質発現を明らかにする。注目すべきは、ＭＨＣのタンパク質発現への阻害作用が、分化プロセスの間、１００ｎＭのＴＴＣ濃度で示されたことである。
【０２９４】
３．分化段階へのＴＴＣ効果の評価
筋管肥大へのＴＴＣの活性もまた評価した。この試験において、Ｃ２Ｃ１２細胞を、７日間、ある範囲の濃度（１〜１００ｎＭ）でＴＴＣを補充したＤＭに切り替え、分化段階を、共焦点顕微鏡を使用する免疫蛍光法（ＭＨＣ／ＤＡＰＩ）によって検査して、分化及び融合指数、並びに筋管領域及び配向を判定した（図３７）。
【０２９５】
７日後、ＴＴＣ処置細胞の筋管領域（μｍ２）が、１、１０、及び１００ｎＭのＴＴＣに関して、対照細胞（ＤＭ）と比較して、それぞれ２６８．７±６、３１０．０±５、及び５６．４±２に著しく増加した（ＤＭ：９８９５．６±４７．５μｍ２、ＤＭ＋１ｎＭのＴＴＣ：３６４８８．１±５５０μｍ２、ＤＭ＋１０ｎＭのＴＴＣ：３９６９６．０±４４８μｍ２、ＤＭ＋１１０ｎＭ：１５４７２．８±１８０μｍ２）（図３８）。
【０２９６】
これらの測定法に関して、ＴＴＣ処置細胞の筋管直径（μｍ）が、１、１０、及び１００ｎＭのＴＴＣに関して、対照細胞（ＤＭ）と比較して、それぞれ１５０．２±１．２、１７９．０±１．４、及び３３．７±０．３に著しく増加した（ＤＭ：１８．８３±０．１μｍ、ＤＭ＋１ｎＭのＴＴＣ：４７．１±０．２μｍ、ＤＭ＋１０ｎＭのＴＴＣ：５２．５±０．３μｍ、ＤＭ＋１１０ｎＭ：２５．２±０．２μｍ、図３９）。更に、融合指数は、対照細胞（ＤＭ：６９±５、ＤＭ＋１ｎＭ：８１±４、ＤＭ＋１０ｎＭ：８６±１、ＤＭ＋１１０ｎＭ：９０±１、図４０）と比較して、１０及び１００ｎＭのＴＴＣに関する、著しい増加を示す。
【０２９７】
ＴＴＣ処置細胞の筋管当たりの核の数（ＭＨＣ陽性細胞：ＭＨＣ＋、図４１）が、対照細胞（ＤＭ：４．５±０．１、ＤＭ＋１ｎＭのＴＴＣ：１３．７±２．６、ＤＭ＋１０ｎＭのＴＴＣ：１５．８±０．９、ＤＭ＋１ｎＭのＴＴＣ：１１．８±１．４）と比較して、著しく増加した。まとめると、これらのデータは、ＴＴＣが１及び１０ｎＭで、筋管の成長量を制御することを示す。これは、面積、直径、融合指数、及び筋管に関連する筋核の数への有効な活動によって推奨される。注目すべきは、１００ｎＭのＴＴＣが、筋管への特定の活動を示すものの、１及び１０ｎＭのＴＴＣ処置細胞と比較して、筋管領域及び直径を減少させることを示したことである。しかしながら、この用量は、融合指数及び／又は筋管に関連する筋核の数の著しい増加を示す。
【０２９８】
これらの状態下で、筋管伸長の明らかな硬化を観察した（図４２）。実際に、垂直軸に対する角度の測定による筋管配向の推定は、筋管の分散における著しい減少を示す（図４３）。更に、１００ｎＭのＴＴＣ下の筋管の８３．６±１．２％は、筋管又は核アラインメント全体にわたる細胞核分布を示し、ちょうど１０．０±１．０％は、凝集した細胞核分布を示し、それは筋管機能性における増加と相関し得る（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：１２０〜１２４）（核アラインメントを有する全筋管の百分率：ＤＭ：２１．８±１．０、ＤＭ＋１ｎＭのＴＴＣ：５６．３±１．４、ＤＭ＋１０ｎＭのＴＴＣ：５５．８±０．８）と比較して、著しく増加した。正確な筋核アラインメント及び筋管配向は、構造的及び筋原性両方の効果を、筋肉機能的出力に及ぼす（Ｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ，１８：９５７〜９６７）。
【０２９９】
核凝集を示す筋管集合は、１及び１０ｎＭのＴＴＣで、それぞれ３４．２±１．５及び３４．８±０．８％であり、それは肥大へのより優れた効果を示す。まとめると、実験的データは、低用量のＴＴＣが筋管への肥大性の効果を有することを示す。
【０３００】
結論
ＴＴＣは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞増殖への効果を示す。ＴＴＣは、筋管領域及び融合指数の増加と関連した、低用量での肥大性の効果もまた示す。更に、高用量では、ＴＴＣは適切な筋核位置及び筋管配向における役割を果たす。
【０３０１】
課題を解決するための手段及び要約の節ではなく、詳細な説明のセクションは、請求項を解釈するために使用されることが意図されていることを理解されたい。課題を解決するための手段及び要約の節は、本発明者（複数可）によって考えられるように、本発明の１つ以上だが全てではない例示的な実施形態を示し得るが、決して本発明及び添付の特許請求の範囲を限定するものではない。
【０３０２】
特定の機能の実施及びそれらの関係を例示する機能的構成要素の助けにより、本発明を上で説明してきた。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能及びそれらの関係が適切に行われる限り、代替の境界を定義することができる。
【０３０３】
特定の実施形態の前述の説明は、当業者が知識を適用することにより、他の人にも可能である、そのような特定の実施形態を様々な用途に容易に変更及び／又は適合させ、過度の実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示された教示及び指導に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の表現法又は用語法は、本明細書の用語法又は表現法が教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるように、説明の目的のためであって限定のためではないことを理解されたい。
【０３０４】
本発明の広がり及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではないが、特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ規定されるべきである。
【０３０５】
本出願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書は、全ての目的のために参照によって組み込まれるために、個々の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書の各々が個別に示されているのと同じ程度に、全ての目的のために参照によってその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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