(57)【要約】本発明は、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１結合領域内に位置するエピトープに結合する抗体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置における使用のためのＢＭＰ４に結合する抗体。
【請求項２】
癌の処置における使用のためのＢＭＰ４に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
癌の処置における使用のための、ＢＭＰ４に特異的に結合する抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
ＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置における使用のための、ＢＭＰ４に結合する抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項５】
毒素と複合化された抗ＢＭＰ４抗体を除外するという条件で、請求項１若しくは２に記載の使用のための抗体、又は請求項３若しくは４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
更に抗癌剤を含む、請求項３又は４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記抗癌剤が白金錯体を含む、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記抗癌剤がシス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ、シスプラチン）、オキサリプラチン若しくはカルボプラチン又はその誘導体である、請求項７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
前記癌が、精巣癌、骨癌、前立腺癌、乳房癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、膵癌、食道癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頚部癌からなる群から選択される、請求項１から２若しくは５のいずれか一項に記載の使用のための抗体、又は請求項３から８のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１結合領域に位置するエピトープに結合する単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内に位置するエピトープの少なくとも４個のアミノ酸残基に結合する単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１２】
配列番号１の残基１０〜１７、４５〜５６及び６９からなる群から選択される少なくとも４個のアミノ酸残基に結合する、請求項１０又は１１に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１３】
ａ．Ｌｙｓ１０、Ａｓｎ１１、Ｌｙｓ１２、Ａｓｎ１３、Ｃｙｓ１４、Ａｒｇ１５、Ａｒｇ１６及びＨｉｓ１７からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びに
ｂ．Ｇｌｙ４５、Ａｓｐ４６、Ｃｙｓ４７、Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３、Ｈｉｓ５４、Ｌｅｕ５５及びＡｓｎ５６からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びに
ｃ．配列番号１のＳｅｒ６９
に結合する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１４】
Ｌｙｓ１２、Ａｒｇ１５、Ａｓｐ４６及びＰｒｏ５０に結合する、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１５】
単鎖抗体である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１６】
ａ．好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号３のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
ｃ．配列番号４のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が２個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１５に記載の単鎖抗体。
【請求項１７】
配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１８】
配列番号１の残基２４〜３１、５７〜６８、７０〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内で結合する、請求項１０又は１１に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１９】
ａ．Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ２５、Ｖａｌ２６、Ｇｌｙ２７、Ｔｒｐ２８、Ａｓｎ２９、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１からなる群から選択される少なくとも１個の残基、
ｂ．Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ６０、Ａｌａ６１、Ｉｌｅ６２、Ｖａｌ６３、Ｇｌｎ６４、Ｔｈｒ６５、Ｌｅｕ６６、Ｖａｌ６７及びＡｓｎ６８からなる群から選択される少なくとも１個の残基、
ｃ．Ｖａｌ７０、Ａｓｎ７１及びＳｅｒ７２からなる群から選択される少なくとも１個の残基、
ｄ．Ｔｙｒ１０３及びＧｌｎ１０４からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びに
ｅ．配列番号１のＭｅｔ８９、Ｔｙｒ９１、Ｌｙｓ１０１及びＭｅｔ１０６からなる群から選択される少なくとも１個の残基
に結合する、請求項１８に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２０】
Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１、Ｌｅｕ６６及びＬｙｓ１０１に結合する、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２１】
単鎖抗体である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２２】
ａ．配列番号５のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号６のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２１に記載の単鎖抗体。
【請求項２３】
配列番号１２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、請求項１０から１１又は１７から２２のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２４】
配列番号１の残基３４、３５、３９、８６〜８８、９０、９７、９８、１００、１０２及び１０９内のエピトープに結合する、単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２５】
少なくともＡｌａ３４、Ｇｌｎ３９、Ｓｅｒ８８、Ｌｅｕ９０、Ｌｅｕ１００に結合する、請求項２４に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２６】
単鎖抗体である、請求項２５に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２７】
ａ．配列番号８のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなるＣＤＲ１、
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなるＣＤＲ２、及び
ｃ．好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなるＣＤＲ３
を含む、請求項２４から２５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２６に記載の単鎖抗体。
【請求項２８】
配列番号１４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体。
【請求項２９】
ＢＭＰ４との結合を請求項１０から２８のいずれか一項に記載の抗体と競合する、単離、合成又は組換え抗体。
【請求項３０】
請求項１０から２９のいずれか一項に記載の少なくとも１種の抗体を含む多量体抗体。
【請求項３１】
請求項１０から２９のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項３０に記載の多量体抗体、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、脊髄損傷、筋肉内血腫、整形外科由来の合併症、乾癬性関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、血清反応陰性関節症、骨増殖症、耳硬化症、あぶみ骨強直症、異所性骨化、心肥大、脳室内出血、慢性腎疾患、外骨腫、アテローム性動脈硬化症、心臓弁膜症、糸球体硬化症、低酸素性肺高血圧、糖尿病、脱毛及び癌の処置における使用のための、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の単離、合成若しくは組換え抗体、請求項３０に記載の多量体抗体、又は請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記癌が、精巣癌、骨癌、前立腺癌、乳房癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、膵癌、食道癌、卵巣癌、頭頚部癌からなる群から選択される、請求項３２に記載の使用のための単離、合成若しくは組換え抗体、多量体抗体、又は医薬組成物。
【請求項３４】
検出可能な剤を含む、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の単離、合成若しくは組換え抗体、又は請求項３０に記載の多量体抗体。
【請求項３５】
固定型の、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の単離、合成若しくは組換え抗体、又は請求項３０に記載の多量体抗体。
【請求項３６】
請求項１０から２９のいずれか一項に記載の単離、合成又は組換え抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
請求項１０から２９のいずれか一項に記載の抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項４０】
請求項１０から２９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３０に記載の多量体抗体を細胞試料に供給するステップを含む、ＢＭＰ４シグナル伝達をインビトロで阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、生物工学及び医薬品の分野に属し、ＳＭＡＤ４欠損癌の処置における使用のための抗ＢＭＰ４抗体及び抗ＢＭＰ４抗体を含む医薬組成物に関する。本発明は、更に、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１ａ結合部位内に位置する立体構造エピトープに結合する抗ＢＭＰ４抗体、及びその薬学的使用に関する。本発明は、単一ドメイン抗体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｍａｄ４は、ＴＧＦβ経路においてシグナル伝達に関与するＳｍａｄ経路の一成分である（非特許文献１、非特許文献２）。この遺伝子は、（「膵癌の減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」のために）ｄｐｃ４としても知られ、癌抑制遺伝子であると思われ、ｓｍａｄ４発現の減少は、膵癌（非特許文献３、非特許文献４）、食道癌（非特許文献２、頚癌（非特許文献５及び他の原発性ヒト癌（非特許文献６を含めた種々の原発癌、並びに膵癌モデル（非特許文献７、非特許文献８）及び結腸癌モデル（非特許文献１）を含めた細胞株癌モデルで認められた。腫瘍におけるｓｍａｄ４の発現の減少は、特にｓｍａｄ４欠損膵臓腺癌患者においては、患者生存の予後不良に関連する（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ｓｍａｄ４遺伝子産物の腫瘍抑制活性の機序は、十分理解されていないが、それは、ＴＧＦβシグナル伝達経路のある種の成分の成長抑制活性と成長活性化活性を調節する「スイッチ」として作用すると考えられる（概説として、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４を参照されたい）。Ｓｍａｄ４欠損腫瘍は、しばしば、化学療法に対する反応が不十分である。
【０００３】
したがって、ＳＭＡＤ４欠損癌を処置する代替療法又は改善された療法を提供する必要がある。
【０００４】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、ＴＧＦβスーパーファミリーに属する成長因子である。それらは、それらの配列相同性及び機能性に応じて異なるサブファミリーに分類される約２０のメンバーを含む。ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−５／ＢＭＰ−６／ＢＭＰ−７は、広範に研究された、骨形成能力を有することが実証されたサブグループを形成する（非特許文献１５）。
【０００５】
ＢＭＰは、最初に、骨及び軟骨の発生を支援するその能力によって同定されたが（非特許文献１６）、器官の発生に関与し、広範な組織においてホメオスタシスを調節する。正常な胚組織及び成体組織におけるその恒常性維持機能に加えて、ＢＭＰは、肥満、糖尿病、癌などの幾つかの疾患の病理においても重要な役割を果たす（非特許文献１７）。それらは、分化、増殖、細胞増殖及びアポトーシスを細胞内及び細胞間レベルで制御することによってその機能を果たす。ＢＭＰは、成熟活性二量体として細胞外基質に分泌され、Ｉ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体の２分子（ＢＭＰＲ１ａ又はＢＭＰＲ１ｂ）及びＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＢＭＰＲ２又はＡｃｔＲ２）の２分子に結合することによって標的細胞に作用し、それによって細胞内シグナル伝達カスケードを惹起する六量体複合体を形成することができる（非特許文献１８）。前もって形成されたＢＭＰＲ複合体の有無に応じて、シグナル伝達は、ＳＭＡＤファミリーを介して明確な標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）経路に従って、又はやや不明確な非標準細胞内エフェクターによって、媒介される（非特許文献１９）。これらの転写因子の核への移動は、ＢＭＰ標的遺伝子の転写を惹起する。
【０００６】
多数の生物学的過程におけるＢＭＰの極めて重要な役割の意義は、恐らく、ＢＭＰ機能の多段階調節の存在によって最も良く表される。転写レベルにおいては、ＢＭＰ発現の制御は、遺伝子メチル化によって（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）、又はミクロＲＮＡ１９６ｂ、ｍＩＲ２０ｂなどの特定のミクロＲＮＡによって（非特許文献２３）媒介され得る。サイトゾルにおいては、Ｓｍａｄ６及び７などの受容体又はＳＭＡＤ結合を競合するｓｍａｄ阻害剤（ｉＳＭＡＤ）の存在も、ＢＭＰ機能を減弱させ得る。プロテインホスファターゼ（ＰＰ１及びＰＰ２：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ）などの別の阻害剤は、受容体とｐＳＭＡＤの両方を脱リン酸化することによってＢＭＰシグナルの強度を弱める（非特許文献２４）。ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰに結合して、ＢＭＰ活性を阻害又は増強する細胞外分子の存在によっても調節することができる（非特許文献２５）。補助受容体は、リガンド結合を強化することによってＢＭＰ機能を増強するが、偽受容体は、ＢＭＰＲ２を隔離し、それがＢＭＰリガンドを利用できなくすることによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する（非特許文献２６）。細胞外ＢＭＰ調節物質の別の十分研究されたグループは、種々のＢＭＰに高い親和性で結合し、受容体とのその相互作用を阻止するＢＭＰ拮抗物質のシステイン−ノットグループである。構造（システインノットのサイズ）に応じて、それらは、３グループに分類される：ＤＡＮファミリー（グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、スクレロスチン）、ねじれた原腸形成（Ｔｓｇ）、並びにコーディン及びノギン。
【０００７】
ＢＭＰとその拮抗物質の相互作用は、発生及び成体組織におけるその効果を決定するのに極めて重要である。ここ数年間、特定のＢＭＰの役割が、多数の非疾患及び疾患組織において扱われている。最も興味深く、理解が不十分であるＢＭＰの一つはＢＭＰ４である。ＢＭＰ４は、癌において相反する役割を有するように思われる（非特許文献２７）。ある種の悪性腫瘍においては、高レベルのＢＭＰ４は、より低い悪性度に関連するように思われ、一方、例えば、乳癌及び結腸癌においては、ＢＭＰ４非標準シグナル伝達がＥＭＴ及び転移挙動に関与した（非特許文献２８、非特許文献２９）。より最近の所見は、細胞分化及び上皮化生に対するＢＭＰ４の役割である（非特許文献３０）。種々の障害におけるＢＭＰの実際の役割を解明するために、多様な疾患モデルにおけるその具体的機能を研究する必要がある。
【０００８】
ＢＭＰシグナル伝達を細胞外受容体レベルで調節する選択肢は、シグナル伝達の細胞外調節を標的にしてその機能を操作することが容易にできるので、大いに魅力的である。したがって、細胞プロセスに対するＢＭＰ効果を調べるために、幾つかの天然拮抗物質が試験された。しかし、この手法は、その作用機序に固有の幾つかの要因のために、個々のＢＭＰの効果を調べる天然ＢＭＰ阻害剤が限定されることによって制限される。一般に、天然ＢＭＰ拮抗物質は、本質的に非選択的であり、種々のＢＭＰだけでなく、アクチビン、ノーダルなどのＴＧＦＢファミリーの他のメンバーのシグナル伝達も調節する（非特許文献３１）。したがって、天然拮抗物質を用いた研究は、個々のＢＭＰの不活性化の結果を反映していない可能性がある。さらに、大部分の拮抗物質は、ＢＭＰ機能に間接的に影響するｗｎｔシグナル伝達経路も妨害し得るので、多標的拮抗作用は、ＴＧＦＢファミリーメンバーに限定されない（非特許文献３２）。また、これらの分子をＢＭＰ機能の阻害において極めて非特異的にする、幾つかの作用機序がこれらの拮抗物質の一部に対して記述された。例えば、コーディンは、細胞表面タンパク質とのその結合、したがって、細胞の完全性の変化のために、ＢＭＰ非依存性機能を有する（非特許文献３３）。ある場合には、ＢＭＰ調節物質は、Ｔｓｇ及びＣＶ２の場合と同様に、抗ＢＭＰ機能又は促進性ＢＭＰ機能の両方として作用することができる、相反する調節モードを有する（非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７）。別の複雑化要因は、ひいては、それらの活性が、メタロプロテアーゼＸｏｌｌｏｉｄ及びＴｏｌｌｏｉｄなどの別のＢＭＰ拮抗物質及び別のタンパク質を含めた細胞外因子によって厳重に調節されることである（非特許文献３８）。したがって、拮抗物質の発現が重複する場合、阻害の代わりに、ＢＭＰシグナル伝達の活性化をもたらすかもしれない。したがって、これらの天然拮抗物質は、各ＢＭＰの個々の作用を阻害又は規定するには不適当であり、種々の障害における特定のＢＭＰの役割を調べるには不適当である。
【０００９】
ＢＭＰ４に結合する利用可能な抗体、抗ＢＭＰ４Ｒ＆Ｄ（クローン６６１１９、マウスＩｇＧ２Ｂ、ＭＡＢ７５７）及び抗ＢＭＰ４Ａｂｃａｍ（ウサギポリクローナル、ａｂ３９９７３）も存在する。特許文献１には、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４に対して親和性を有する抗体が記載されている。既存の抗ＢＭＰ４抗体の欠点は、それらがＢＭＰ４に対して低親和性であり、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害する能力に劣り、及び／又はＢＭＰ４を生体内で機能的に阻止する能力に劣ることである。本発明の目的は、これらの欠点の１つ以上を克服することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８０３０６１１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｖｙ，Ｌ．及びＨｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８１０８〜８１２５（２００５）
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ９５：７３７〜７４３（２００２）
【非特許文献３】Ｌｕｔｔｇｅｓ，Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１６７７〜１６８３（２００１）
【非特許文献４】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５２００〜５２１１（２００４）
【非特許文献５】Ｍａｌｉｅｋａｌ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２：４８８９〜４８９７（２００３）
【非特許文献６】Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１０：１５９７〜１６０４（２００４）
【非特許文献７】Ｌｏｈｒ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：５５０〜５５５（２００１）
【非特許文献８】Ｙａｓｕｔｏｍｅ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ２２：４６１〜４７３（２００５）
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｆ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：３８５３〜３８５６（２００１）
【非特許文献１０】Ｔａｓｃｉｌａｒ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：４１１５〜４１２１（２００１）
【非特許文献１１】Ｔｏｇａ，Ｔ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４：１１７３〜１１７８（２００４）
【非特許文献１２】Ａｋｈｕｒｓｔ，Ａ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１５３３〜１５３６（２００２）
【非特許文献１３】Ｂａｃｈｍａｎ，Ｋ．Ｅ．及びＰａｒｋ，Ｂ．Ｈ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：４９〜５４（２００４）
【非特許文献１４】Ｂｉｅｒｉｅ，Ｂ．及びＭｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ６：５０６〜５２０（２００６）
【非特許文献１５】Ｗｉｌｓｏｎら、２０１３
【非特許文献１６】Ｗｏｚｎｅｙら、１９８８
【非特許文献１７】Ｂｒａｇｄｏｎら、２０１１
【非特許文献１８】Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｋａｍｉｙａ及びＭｏｒｉｋａｗａ、２０１０
【非特許文献１９】Ｍｕｅｌｌｅｒ及びＮｉｃｋｅｌ、２０１２
【非特許文献２０】Ｋｉｍｕｒａら、２００８
【非特許文献２１】Ｗｅｎら、２００６
【非特許文献２２】Ｚｈａｎｇら、２００７
【非特許文献２３】Ｂｒａｉｇら、２０１０
【非特許文献２４】Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、Ｌｉｎ及びＦｅｎｇ、２００９
【非特許文献２５】Ｚａｋｉｎ及びＤｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ、２０１０
【非特許文献２６】Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋら、１９９９
【非特許文献２７】Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ、２０１２
【非特許文献２８】Ｇｕｏ、Ｈｕａｎｇ及びＧｏｎｇ、２０１２
【非特許文献２９】Ｖｏｏｒｎｅｖｅｌｄら、２０１４
【非特許文献３０】Ｍａｒｉら、２０１４
【非特許文献３１】Ｂａｌｅｍａｎｓ及びＶａｎ  Ｈｕｌ、２００２
【非特許文献３２】Ｙａｎａｇｉｔａ、２００５
【非特許文献３３】Ｃｈｅｎら、２００４
【非特許文献３４】Ｇａｚｚｅｒｒｏ及びＣａｎａｌｉｓ、２００６
【非特許文献３５】Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｅｇｅｒら、２０００
【非特許文献３６】Ｒｅｎｔｚｓｃｈら、２００６
【非特許文献３７】Ｗｉｌｌｓ、Ｈａｒｌａｎｄ及びＫｈｏｋｈａ、２００６
【非特許文献３８】Ｐｉｃｃｏｌｏら、１９９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、抗ＢＭＰ４抗体を用いてＢＭＰ４シグナル伝達を抑制することによって、マウスにおけるＳＭＡＤ４欠損腫瘍細胞の成長が抑制されたという驚くべき知見に基づく。したがって、本発明は、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置における使用のためのＢＭＰ４に結合する抗体、及びＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置用医薬品の調製のためのＢＭＰ４に結合する抗体の使用を提供する。本発明の図３７及び３８には、抗ＢＭＰ４抗体（Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８）がシスプラチナムと同程度にＳＭＡＤ４欠損腫瘍増殖を阻害したことが示されている。これは、極めて驚くべきことである。というのは、ＢＭＰ４拮抗物質ノギンを用いた患者由来のＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処理によって、成長が遅くならずに速くなる腫瘍が生成することが、Ｌｏｍｂａｒｄｏら、２０１１、ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ２０１１；１４０：２９７〜３０９によって示されたからである（Ｌｏｍｂａｒｄｏらの図６参照）。したがって、反対に作用するＢＭＰ４は、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍を処置するための適切な選択肢ではないと予想された。特許文献１には、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２に結合する抗体が開示されている（表１参照）。特許文献１の実施例１４においては、腫瘍増殖に対する直接的生体内作用がマウスにおいて毒素複合抗体を用いて得られると仮定された。したがって、この実施例は、抗ＢＭＰ４／２抗体をターゲッティング分子として使用して、複合毒素を腫瘍細胞に送達することを示唆している。ＢＭＰ４シグナル伝達の阻害を利用した癌処置は示唆されていない。
【００１３】
更なる一態様においては、本発明は、癌の処置における使用のための、ＢＭＰ４に特異的に結合する抗体（抗体が、ＢＭＰ４のみに結合し、ＢＭＰ２のような別の抗原に実質的に結合しないことを意味する）を提供する。癌処置用医薬品の調製のためのＢＭＰ４に特異的に結合する抗体の使用も提供する。こうしたＢＭＰ４特異抗体を使用する利点は、ＢＭＰ４に特異的に結合するこれらの抗体がＢＭＰ４とＢＭＰ２の両方に結合する抗体よりも生体内で副作用が少ないことである。特許文献１において使用される抗体はＢＭＰ４とＢＭＰ２に結合するので、特異的抗ＢＭＰ４抗体は特許文献１に開示されていない。Ｓａｔｉｓｈ  Ｋｈｕｒａｎａら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ｖｏｌ．３２、ｎｏ．１１、２０１４年１１月１４日（２０１４−１１−１４）、３０１２〜３０２２ページ）に記載の抗ＢＭＰ４クローン６６１１９、マウスＩｇＧ２Ｂ、Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ７５７、抗ＢＭＰ４  ３Ｈ２（Ａ．Ｂｈａｔｔａｃｈｅｒｊｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．３３、ｎｏ．３、２０１３年１月１６日（２０１３−０１−１６）、１０５０〜１０６１ページに記載のＰｒｅｐｏｔｅｃｈ、５００−Ｍ１２１）、及び抗ＢＭＰ４ＥＰＲ６２１１（Ｋｗａｋ  Ｙｏｕｎｇ−Ｄｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、ｖｏｌ．４４７、ｎｏ．３、２０１４年４月１３日（２０１４−０４−１３）、３９４〜３９ページに記載のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＤ１８８）を含めて、他の抗ＢＭＰ４抗体が公知である。しかし、これらの抗体は、抗腫瘍療法には使用されない。
【００１４】
本発明は、更に、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置における使用のための、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害可能な抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、前記抗体は特異的抗ＢＭＰ４抗体である。一部の実施形態においては、前記医薬組成物は、更に抗癌剤を含む。前記抗癌剤は、好ましくは白金錯体を含む。好ましい一実施形態においては、前記抗癌剤は、シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ、シスプラチン）、オキサリプラチン若しくはカルボプラチン又はその誘導体である。好ましくは、前記癌は、精巣癌、骨癌、前立腺癌、乳房癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、結腸直腸癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、膵癌、食道癌、卵巣癌、扁平上皮癌及び頭頚部癌からなる群から選択される。より好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、食道癌、扁平上皮癌、膵癌及び胃癌からなる群から選択される。これらの癌タイプにおいては、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍が頻繁に生じる。
【００１５】
本発明は、更に、配列番号１のアミノ酸配列を有するＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内に位置するエピトープの少なくとも４個の残基に結合する単離、合成又は組換え抗体を提供する。これは立体構造エピトープである。これらの抗体の利点は、それらがＳＭＡＤ４欠損腫瘍細胞において腫瘍増殖を効果的に阻害することである。さらに、それらは、既存の抗体よりもはるかに強力にＢＭＰ４シグナル伝達を阻害し、したがってはるかに低い濃度で有効である。特許文献１には、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４に対して親和性がある幾つかの抗体が記載されている。抗体８Ｂ３及び７Ｄ６（特許文献１の実施例３、表１及び２）は、ＢＭＰ２のエピトープＩＳＭＬＹＬＯＥＮＥＬＶＶＬＫに結合する。本発明の上記抗体と特許文献１の８Ｂ３及び７Ｄ６抗体の違いは、本発明の前記抗体が、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１ａ結合部位の少なくとも４個の残基に結合することである。このエピトープは、ＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内に位置する。本明細書の実施例１１及び１７においては、ＢＭＰＲ１ａ結合部位に結合する抗体が、既存の抗体よりも実際にはるかに強力にＢＭＰ４シグナル伝達を阻害し、したがってはるかに低い濃度で有効であることがエピトープの違いによって説明されることを示す。特許文献１の実施例７及び図１０ｂにおいては、抗体８Ｂ３及び７Ｄ６が、Ｉ型ＢＭＰ受容体の結合を阻害可能であるが、本発明の抗体よりも高濃度においてであることが分かる。特許文献１に記載の幾つかの抗体が、ＢＭＰＲ１に結合するＢＭＰ４をインビトロで効果的に阻害できる濃度は約１００ｎＭである。これらの抗体のＢＭＰ４シグナル伝達の阻害能力は示されていないが、別の抗ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体のＢＭＰ４シグナル伝達阻害能力が図１１ｂに示されており、濃度２〜４μｇ／ｍｌで有効な阻害に達する。これは、本発明の上記抗体の阻止効率と極めて対照的である。本発明者らは、とりわけ図３２Ｄにおいて、ＢＭＰ４シグナル伝達を濃度約１００〜１０００ｐＭの本発明に係る抗体で効果的に阻害できることを示した。
【００１６】
さらに、本発明の抗体は、ＢＭＰ４シグナル伝達の直接阻害によって腫瘍増殖を阻害することができる。それに対して、特許文献１の教示によれば、抗ＢＭＰ４抗体は、腫瘍増殖に対する生体内抑制効果を有するには毒素と複合化されなくてはならない（実施例１４参照）。
【００１７】
Ｓａｔｉｓｈ  Ｋｈｕｒａｎａら、Ａ．Ｂｈａｔｔａｃｈｅｒｊｅｅら、及びＫｗａｋ  Ｙｏｕｎｇ−Ｄｏｎらに記載された、ＢＭＰ４に結合する他の公知の抗体が存在する。利用可能な他の抗体は、抗ＢＭＰ４Ａｂｃａｍ（ウサギポリクローナル、ａｂ３９９７３）、クローンＰＡ３５４−１６．１．１（マウスモノクローナルＩｇＧ２ａｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＤ４１１）及びクローンＭ９１２２６２（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎｌｉｎｅ、ＡＢＩＮ９３４０７１）である。本発明者らは、本明細書において、Ｓａｔｉｓｈ  Ｋｈｕｒａｎａら、Ａ．Ｂｈａｔｔａｃｈｅｒｊｅｅら、Ｋｗａｋ  Ｙｏｕｎｇ−Ｄｏｎらに開示された抗体、及び表５に要約した３種の別のモノクローナル抗体がＣ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８と同じエピトープに結合しないことを示した（図１６Ｆ、３１、３３Ｄ及び３４Ｃ参照）。本発明者らは、本発明の抗体が、本明細書の図３２Ｄに示すように、ＢＭＰ４シグナル伝達に対して先行技術の抗体よりもはるかに強い抑制効果を有することを見いだした。
【００１８】
本発明者らは、ＢＭＰ４シグナル伝達をより強く及び／又はより低濃度で阻止可能な新規抗体を特定した。
【００１９】
好ましくは、前記抗体のＫＤは、１５９０ｐＭ−１未満、より好ましくは１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７５０、７００、６５０、６３５、６００、５７５、５１３、３９３、３９２、１００、９１、７５、５０、３２、３１、２５、１０ｐＭ−１未満である。好ましくは、前記抗体は、ＩＤ１プロモータ活性アッセイにおいてノギンと少なくとも同等以下のＩＣ５０でＢＭＰ４シグナル伝達を阻害することができる。別の好ましい一実施形態においては、前記抗体は、１．５μＭ、より好ましくは１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２μＭ以下の少なくとも同等以下のＩＣ５０でＢＭＰ４シグナル伝達を阻害することができる。
【００２０】
好ましい一実施形態においては、前記エピトープは、ＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内のリスト（ｗｒｉｓｔ）に位置する。
【００２１】
好ましくは、本発明に係る抗体は、ＢＭＰ４の残基１０〜１７、４５〜５６及び６９内で結合する。このエピトープは、本発明者らがＢＭＰ４特異的結合に重要であると考える疎水性溝を含む。この実施形態に係る抗体の利点は、前記抗体が、ＢＭＰファミリーの別のメンバーに対する親和性が低く、ＢＭＰ４シグナル伝達を特異的に阻害するのに極めて有効であることである。好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７に実質的に結合しない。その更なる利点は、前記抗体が、ＢＭＰ２媒介性シグナル伝達を阻害せず、それによって生体内で使用したときに有害副作用を減らす、又は回避さえすることである。より好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４のＬｙｓ１０、Ａｓｎ１１、Ｌｙｓ１２、Ａｓｎ１３、Ｃｙｓ１４、Ａｒｇ１５、Ａｒｇ１６及びＨｉｓ１７からなる群から選択される少なくとも１個の残基、Ｇｌｙ４５、Ａｓｐ４６、Ｃｙｓ４７、Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３、Ｈｉｓ５４、Ｌｅｕ５５及びＡｓｎ５６からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びにＳｅｒ６９に特異的に結合する。好ましくは、前記抗体は、その４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、好ましくは１６個を超える残基に結合する。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の少なくともＬｙｓ１２、Ａｒｇ１５、Ａｓｐ４６及びＰｒｏ５０に特異的に結合する。
【００２２】
好ましい一実施形態においては、本発明に係る抗体は単鎖抗体である。好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号３のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が２個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３、及び好ましくは更に配列番号２のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１を含む。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の一実施形態においては、本発明に係る抗体は、（配列番号１で示された）ＢＭＰ４の残基２４〜３１、５７〜６８、７０〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内で結合する。この領域は、ＢＭＰ４のリストエピトープ内の「疎水性ポケット」である。この領域に結合する抗体の利点は、これらの抗体がＢＭＰ４及びＢＭＰ２に対する親和性が極めて高く、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２シグナル伝達を効率的に阻害することもできることである。好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４のＳｅｒ２４、Ａｓｐ２５、Ｖａｌ２６、Ｇｌｙ２７、Ｔｒｐ２８、Ａｓｎ２９、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ６０、Ａｌａ６１、Ｉｌｅ６２、Ｖａｌ６３、Ｇｌｎ６４、Ｔｈｒ６５、Ｌｅｕ６６、Ｖａｌ６７及びＡｓｎ６８からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｖａｌ７０、Ａｓｎ７１及びＳｅｒ７２からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｔｙｒ１０３及びＧｌｎ１０４からなる群から選択される少なくとも１個の残基；並びにＭｅｔ８９、Ｔｙｒ９１、Ｌｙｓ１０１、並びにＭｅｔ１０６に特異的に結合する。好ましくは、前記抗体は、その９、１０、１１、１２、１３、好ましくは１４個を超える残基に結合する。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１、Ｌｅｕ６６及びＬｙｓ１０１に特異的に結合する。
【００２４】
好ましい一実施形態においては、前記抗体は単鎖抗体である。好ましい一実施形態においては、前記単鎖抗体は、上述したように、ＢＭＰ４のリストエピトープ内の「疎水性ポケット」領域に結合することができる。好ましい一実施形態においては、本発明に係る抗体は、配列番号７のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、このＣＤＲ３が、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットとの結合相互作用に重要であると考える。好ましくは、前記抗体は、更に、配列番号５のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、及び配列番号６のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２を含む。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明の抗体の更に別の一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の残基３４、３５、３９、８６〜８８、９０、９７、９８、１００、１０２及び１０９内で特異的に結合する。この領域は、ＢＭＰ４のいわゆる「ナックル」エピトープである。この領域の残基に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ４に対する親和性も高く、さらにＢＭＰ２に対する親和性も高く、ＢＭＰ５及びＢＭＰ６に対する親和性がわずかに低い。好ましくは、前記抗体は、Ａｌａ３４、Ｇｌｎ３９、Ｓｅｒ８８、Ｌｅｕ９０及びＬｅｕ１００に特異的に結合する。
【００２６】
好ましい一実施形態においては、前記抗体は単鎖抗体である。好ましい一実施形態においては、上述したように前記ナックルに結合可能な抗体は、配列番号８のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、及び配列番号９のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２を含む。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、これらのＣＤＲが、ＢＭＰ４のナックルとの結合相互作用に重要であると考える。前記抗体は、好ましくは、更に、配列番号１０のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明に係る抗体は、好ましくは、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害することができる。好ましくは、本発明に係る単鎖抗体はＶＨＨである。
【００２８】
本発明者らは、更に、本発明に係る抗体の２種以上を連結すると、抗原に対する抗原親和性が高い、及び／又はＢＭＰシグナル伝達に対する抑制効果が大きい、ヘテロ又はホモ多量体分子が得られることを見いだした。更なる一態様においては、本発明は、したがって、少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種の本発明の抗体を含む多量体抗体を提供する。好ましい一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合可能な少なくとも２種の前記抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体のＢＭＰ４に対する親和性が改善され、ＢＭＰ４シグナル伝達に対する抑制効果も改善されることである。前記多量体抗体は、実施例に記載のＣ４Ｃ４によって例示されるように、ＢＭＰ４に対して極めて高い親和性（ＫＤ９．７ｐＭ）を有することが判明し、それはノギン（ＫＤ９１ｐＭ）の１０倍、ＢＭＰＲ１ａ（ＫＤ６３５ｐＭ）の７０倍である。その結果、それは、ＢＭＰ４シグナル伝達に対して極めて強力な中和活性を示す。別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合可能な少なくとも２種の前記抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体のＢＭＰ４及びＢＭＰ２に対する親和性が改善され、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２シグナル伝達に対する抑制効果も改善されることである。さらに、こうした多量体抗体は、ほぼノギンのレベルまで、ＢＭＰ活性を著しく抑制する能力を有する。別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のナックルに結合可能な少なくとも１種の抗体、及び上述したようにＢＭＰ４の疎水性ポケットに結合可能な１種の抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体がＢＭＰ活性を著しく抑制する能力を有することである。
【００２９】
更なる一態様においては、本発明は、上述の本発明に係る抗体、又は本発明の多量体抗体、及び好ましくは、薬学的に許容される担体を含む、組成物を提供する。
【００３０】
別の一態様においては、本発明は、医学的処置、好ましくは異常な又は高いＢＭＰ４レベルに起因する疾患の処置における使用のための、本発明に係る多量体抗体又は本発明に係る組成物を提供する。好ましくは、前記疾患は、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ：ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｉａ）、脊髄損傷、筋肉内血腫、整形外科由来の合併症、乾癬性関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎（ＡＳ：ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、血清反応陰性関節症、骨増殖症（ｈｙｐｅｒｐｓｔｏｓｉｓ）、耳硬化症、あぶみ骨強直症、骨癌、前立腺癌、乳房癌、肺癌、異所性骨化、心肥大（ｈｙｐｅｒｔｈｒｏｐｈｙ）、脳室内出血、慢性腎疾患、外骨腫（ｅｘｏｔｏｓｅｓ）、アテローム性動脈硬化症、心臓弁膜症、糸球体硬化症、低酸素性肺高血圧、癌及び脱毛からなる群から選択される。好ましくは、前記癌は、精巣癌、骨癌、前立腺癌、乳房癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、膵癌、食道癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頚部癌からなる群から選択される。
【００３１】
更なる一態様においては、本発明は、少なくとも本発明に係る抗体の重鎖をコードする単離核酸分子を提供する。好ましくは、前記核酸分子は、本発明に係る抗体をコードする。一実施形態においては、前記核酸はｃＤＮＡである。
【００３２】
本発明は、更に、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００３３】
本発明は、更に、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３４】
別の一態様においては、本発明は、本発明に係る抗体を発現するハイブリドーマを提供する。
【００３５】
別の一態様においては、本発明は、本発明に係る抗体又は本発明に係る多量体抗体を細胞試料に供給するステップを含む、ＢＭＰ４シグナル伝達をインビトロで阻止する方法を提供する。
【００３６】
本発明の更なる態様及び効果は、以下の記述を考慮して明らかになるはずである。詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示したものであるが、単なる例示にすぎず、本発明の範囲内の様々な変更及び改変が本発明の教示に照らして当業者に明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＢＭＰ４についてアジュバントＳｔｉｍｕｎｅ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、レリスタット、オランダ）の存在下で精製ＢＭＰ−４で免疫されたラマ＃１８−２の血清の滴定を示す図である。ラマは、０日目の免疫前の血清に比べて、４３日目の免疫血清において測定されたシグナルが明らかに増加する。非被覆ウェルにおける４３日目の血清ではシグナルが測定されないことから、シグナルは特異的である。
【図１Ｂ】ＢＭＰ４についてアジュバントＳｔｉｍｕｎｅ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、レリスタット、オランダ）の存在下で精製ＢＭＰ−４で免疫されたラマ＃３１−２の血清の滴定を示す図である。ラマは、０日目の免疫前の血清に比べて、４３日目の免疫血清において測定されたシグナルが明らかに増加する。非被覆ウェルにおける４３日目の血清ではシグナルが測定されないことから、シグナルは特異的である。
【図２】逆転写ＲＮＡ由来のＶＨ及びＶＨＨ断片の特異的増幅を示す図である。ＲＮＡ約４０μｇをｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ用テンプレートとして使用して、古典的ＩｇＧ及び重鎖のみのＩｇＧのＶＨ及びＶＨＨ領域をプライマーを用いてリーダーペプチド部位及びＣＨ２ドメインをアニーリングして増幅させた。重鎖抗体におけるＣＨ１ドメインの欠如のためＶＨＨ（７００ｐｂ）及びＶＨ（９００ｂｐ）に対応する２個のＤＮＡ断片がゲル上に見られる。７００ｂｐ断片をゲルから切除し、精製した。約８０ｎｇをネステッドＰＣＲ用テンプレートとして使用して、ＳｆｉＩ部位を５’に導入した。
【図３】ラマ＃１８．２及び＃３１．２のＰＢＬから単離されたＲＮＡ試料の品質を示す図である。４３日目に採取された血液をフィコール勾配（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ）上に層状に置き、リンパ球バンドを選択し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、細胞を溶解させ、ＲＮＡを２サイクルのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出によって精製した。最後にＲＮＡを沈殿させ、濃度を２６０ｎｍで測定した。ＲＮＡ試料５μｌを１％ＴＢＥアガロースゲル上で分析して、その品質を評価した。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡバンドが明瞭に見られ、ＲＮＡの完全性を確認した。
【図４】クローン化前のＶＨＨ断片の消化を示す図である。増幅された７００ｐｂ断片をＢｓｔＥＩＩ（ＩｇＧの可変領域と定常領域の間のリンカーの直前に存在する制限部位）で消化して、７００ｂｐ断片を約３００及び４００ｂｐの断片に分解した。４００ｂｐ断片をゲルから単離し、プラスミドｐＵＲ８１００にクローン化する前に、反応混合物をＳｆｉＩで更に消化した。
【図５】４００ｂｐ断片３３０ｎｇをｐＵＲ８１００  １μｇ中に連結して転換された大腸菌の数を示す図である。コンピテントな大腸菌株ＴＧを連結混合物を用いて電気穿孔法によって転換した。転換体の数を、転換の１０倍滴定、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２％グルコースを補充したＬＢ寒天上のスポッティング、並びにアンピシリン耐性コロニーの計数から計算した。スポッティングは二つ組であり、コロニー数は、２回のスポッティングの平均であった。
【図６】固定ＢＭＰ４上の２回のパニング選択の産物（ｏｕｔｐｕｔ）を示す図である。１回目の選択（ＲＩ、Ａ）でＭａｘｉｓｏｒｐウェル中に塗布されたＢＭＰ４の量は、２回目（ＲＩＩ、Ｂ）に塗布されたＢＭＰ４の量とは異なった。塗布に用いたＢＭＰ４濃度を上部にμｇ／ｍｌ単位で示す。１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２％グルコースを補充したＬＢ寒天上の感染大腸菌ＴＧ１の滴定及びスポッティングから溶出ファージの数を計算した。
【図７】ＥＬＩＳＡによる個々のクローンと固定ＢＭＰ４の結合を示す図である。マスタープレートＱＶＱ１６のライブラリ１８−２（カラム１〜６）及びライブラリ３１−２（カラム７〜１２）由来の０．２μｇ／ｍｌで塗布されたＢＭＰ４上のＲＩＩの産物から４７種の単一クローンを採取した。ウェルＨ６及びＨ１２は、空のＴＧ１株を含み、負の対照として使用される。種々のＶＨＨを含む細菌を３７℃で増殖させ、ＶＨＨの発現をイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。ＶＨＨを破壊菌から抽出し、２００ｎｇ／ウェルのＢＭＰ４で被覆されたウェルに接触させた。非結合ＶＨＨを洗浄後、結合ＶＨＨを抗ｍｙｃ  ｍＡｂ９Ｅ１０及びペルオキシダーゼに結合した二次抗マウスを用いて検出した。４９０ｎｍで測定された、Ｈ２Ｏ２の存在下のオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ：ｏｒｔｈｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）の比色変換によって結合ＶＨＨの量を定量化した。
【図８】精製抗ＢＭＰ４  ＶＨＨを示す図である。マスタープレートＱＶＱ１６のウェルＡ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ８、Ｅ７及びＦ３中のＶＨＨをサブクローニング及び大規模精製用に選択した。Ａ）精製ＶＨＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって分析した。恐らくはタグの何らかの軽微なプロセシングを除いて、ＶＨＨはすべて純粋であった。Ｂ）精製Ｃ４、Ｃ８及びＥ７と固定ＢＭＰ４の結合を滴定ＥＬＩＳＡによって測定した。３種のＶＨＨの見かけの親和性は、Ｃ８＞Ｃ４＞Ｅ７である。
【図９】抗ＢＭＰ４  ＶＨＨ抗体の機能的特性分析を示す図である。正常な食道扁平細胞株ＥＰＣ２−ｈＥＲＴを１００ｎｇ／ｍｌのヒト（Ａ）又はマウス（Ｂ）ＢＭＰ４を用いて４時間活性化させた。濃度５μｇ／ｍｌのＶＨＨ抗体又はヒトノギンを同時に添加した。ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をウエスタンブロットによって細胞溶解後に検出した。相当するタンパク質負荷をβアクチンの検出によって確認した。バンド強度をＩｍａｇｅＪプログラムによって測定した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。
【図１０】種々のＢＭＰに対する抗ＢＭＰ４  ＶＨＨ特異性を示す図である。ＥＰＣ２−ｈＥＲＴ細胞を１００ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ４（Ａ）、２（Ｂ）、５（Ｃ）、６（Ｄ）又は７（Ｅ）を用いて４時間活性化させた。濃度５μｇ／ｍｌのＶＨＨ抗体をＢＭＰと同時に添加した。ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をウエスタンブロットによって細胞溶解後に検出した。相当するタンパク質負荷をベータアクチンの検出によって確認した。タンパク質定量化をＩｍａｇｅＪによって測定した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。＊＊＊＝＜０．０００１
【図１１】ＶＨＨがＢＭＰレポーター活性化を阻害することを示す図である。Ｃ２Ｃ１２をヒトＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）（Ａ）、ＢＭＰ２（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｂ）、ＢＭＰ５（２００ｎｇ／ｍｌ）（５）、ＢＭＰ６（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｄ）及びＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｅ）を用いて１６時間活性化させた。ＶＨＨ抗体（淡灰色バー）及び濃度５μｇ／ｍｌのヒトＦｃノギン（暗灰色バー）をＢＭＰと同時に添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムによって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性（細胞なし）に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性（黒色バー）に対する比として表した。エラーバーは、各々が３つ組の実験の３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。＊＊＊＝＜０．０００１
【図１２】ＶＨＨ二頭部（ｂｉｈｅａｄｓ）がＢＭＰに対して異なる特異性を示すことを示す図である。ＥＰＣ２−ｈＥＲＴ細胞を１００ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ４（Ａ、Ｃ、Ｅ）又はＢＭＰ２（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を用いて４時間活性化させた。表示濃度のＶＨＨ単頭部（ｍｏｎｏｈｅａｄ）及び二頭部を同時に添加した。ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をウエスタンブロットによって検出した。相当するタンパク質負荷をＧＡＰＤＨの検出によって確認した。タンパク質定量化をＩｍａｇｅＪによって測定した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。＊＊＊＝＜０．０００１、＊＊＝＜０．０１、＊＝＜０．１
【図１３】二頭部がＢＭＰレポーター活性化を阻害することを示す図である。Ｃ２Ｃ１２をヒトＢＭＰ２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ５（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ６（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて１６時間活性化させた。５μｇ／ｍｌのノギン（Ｎ、暗灰色バー）を対照として使用した。Ｃ４Ｃ４（Ａ）、Ｃ８Ｃ８（Ｂ）又はＣ８Ｅ７（Ｃ）をＢＭＰと同時に表示濃度で添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムによって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性（黒色バー）に対する比として表した。エラーバーは、各々が３つ組の実験の少なくとも３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。＊＊＊＝＜０．０００１、＊＊＝＜０．０１
【図１４】生体外腸オルガノイド培養物における内在性ＢＭＰ４機能を阻害する能力を示す図である。Ａ）ノギンの非存在下で３日間培養されたマウス腸オルガノイドにおけるＢＭＰ４、２、５及びＢＭＰ６分泌のＥＬＩＳＡ測定。ＢＭＰ５レベルは検出されなかった（Ｎ．Ｄ）。Ｂ）ノギンのない条件下で成長したマウス腸オルガノイドの溶解物のウエスタンブロット分析。マウス十二指腸、空腸及び回腸由来の溶解物を正の対照として使用した。Ｃ）オルガノイド上清のＢＭＰ活性。様々な条件下で培養されたオルガノイドの馴化培地を用いてＣ２Ｃ１２を培養した：１００ｎｇ／ｍｌのＣ４Ｃ４によるＢＭＰ４阻害；５００ｎｇ／ｍｌのＣ８Ｃ８によるＢＭＰ２、４阻害；５μｇ／ｍｌのＣ８Ｃ８によるＢＭＰ２、４、５阻害；５μｇ／ｍｌのＥ７によるＢＭＰ２、４、５、６阻害。上清を３日目に収集した。ルシフェラーゼ活性を１６時間のインキュベーション後に測定し、値をバックグラウンド活性（細胞なし）に対して正規化し、無刺激Ｃ２Ｃ１２細胞：新しいＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて培養された細胞（Ｕｎｓ．）の活性に対する比として表した。エラーバーは、ノギンなし（黒色バー）と比べた平均の標準偏差である。各々が３つ組の実験の少なくとも５つの実験から収集されたデータ。＊＊＊＝＜０．０００１、＊＊＝＜０．０１、＊＝＜０．１。Ｄ）様々な条件で５日間成長したマウス腸オルガノイドの培養物中で形成されたオルガノイドの数。各々が３つ組の実験の少なくとも５つの実験から収集されたデータ。＊＊＊＝＜０．０００１、＊＊＝＜０．０１、＊＝＜０．１。Ｅ）表示条件下で５日間成長したマウス腸オルガノイドの代表的な明視野画像。
【図１５】ＢＭＰ結合の速度定数を示す図である。ＶＨＨと種々のＢＭＰの結合を直接ＳＰＲアッセイにおいて試験する。ＢＭＰ２（Ａ）、ＢＭＰ４（Ｂ）、ＢＭＰ５（Ｃ）、ＢＭＰ６（Ｄ）及びＢＭＰ７（Ｄ）をＶＨＨ被覆ＩＢＩＳチッププレート上に異なる濃度で注入する。
【図１６】種々のＶＨＨ抗体のエピトープビニングを示す図である。チッププレートをＶＨＨで被覆することによってエピトープマッピングを行い、ＢＭＰ４をチップに注入し、続いて第２のＶＨＨ又は対応する対照を注入する。Ａ）Ｃ８−、Ｂ）Ｅ７−、Ｃ）Ｃ４Ｃ４−、Ｄ）マウスノギン−、Ｅ）ＢＭＰＲ１ａ−、Ｆ）Ｒ＆Ｄ製抗ＢＭＰ４−被覆プレート。
【図１７】ＢＭＰＲに結合するＢＭＰを示す図である。Ａ）ＢＭＰＲ１ａ及びＢＭＰＲ２に結合するＢＭＰ２の空間充填図（ｓｐａｃｅ  ｆｉｌｌｅｄ  ｖｉｅｗ）（ＰＢＤエントリー２Ｈ６２）。ＢＭＰ２は、ＢＭＰＲ１ａにリストを介して結合し、ナックルはＢＭＰＲ２結合に関与する。挿入図は、分子結合界面の各々の拡大画像図である。リストは、２個の接触点によって構成される：（プレβ、β１及びループ２に位置する残基によって形成される）疎水性溝及び（ＢＭＰ２Ａ由来のαヘリックスの残基並びにＢＭＰ２Ｂ由来のループ１、β７及びβ８からの残基で構成される）疎水性ポケット。ナックルは、β鎖β３、β４、β７及びβ８に位置する単量体ＢＭＰ２Ｂの残基によって形成される。Ｂ）種々のＢＭＰの配列アラインメント。ＮＣＢＩ受託番号：ＢＭＰ２、ＮＰ＿００１１９１．１；ＢＭＰ４、ＡＡＨ２０５４６；ＢＭＰ５、ＮＰ＿０６６５５１．１；ＢＭＰ６、ＮＰ＿００１７０９．１、ＢＭＰ７、ＮＰ＿００１７１０．１。β鎖、ループ、αヘリックスなどの二次構造の位置は、（Ｋｉｒｓｃｈ、Ｎｉｃｋｅｌ及びＳｅｂａｌｄ、２０００）から改変されたものである。ダッシュは、同一のアミノ酸を表し、星印は、配列中の間隙を表す。リストの疎水性溝又は疎水性ポケットに位置する残基は、それぞれ暗灰色又は淡灰色で色づけされている。ナックルに位置する残基は四角で囲まれている（Ｋｉｒｓｃｈ、Ｓｅｂａｌｄ及びＤｒｅｙｅｒ、２０００、Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈ、Ｖａｌｅ及びＣｈｌｏｅ、２００６）。太字の残基は、ＢＭＰ４が本発明者らのＶＨＨにＨＡＤＤＯＣＫモデリングによって結合することに関与することが示された残基である。
【図１８】ＶＨＨ配列のアラインメントを示す図である。超可変領域（ＣＤＲ）は太字で下線が引かれている。陰影付きの残基は、ＶのＶ及びＪ遺伝子生殖系列配列から逸脱したもの、又はＤ遺伝子に由来するＣＤＲ３の部分にあるものである。枠で囲まれたのは、高次成熟を示す、生殖系列とは異なる、生殖系列ＤＮＡ配列における２つの変異を必要とする残基である。星印は、同一のアミノ酸を表し、ｄは、配列中の間隙を表す。
【図１９】ＨＡＤＤＯＣＫによって求められたＢＭＰ４−Ｃ４結合の画像図である。Ａ）ＢＭＰ４二量体を緑と赤で示す。Ｃ４を青緑色で示す。Ｂ）ＢＭＰ４とＣ４の分子界面の拡大図。点線は水素結合及び／又は塩橋を表す。相互作用に関与するＢＭＰ４（黄色）及びＣ４（マゼンタ）残基を棒で示す。
【図２０】ＢＭＰ４−Ｃ８結合の画像図である。Ａ）ＢＭＰ４二量体を緑と赤で示す。Ｃ８を青緑色で示す。Ｂ）ＢＭＰ４とＣ８の分子界面の拡大図。点線は水素結合及び／又は塩橋を表す。相互作用に関与するＢＭＰ４（黄色）及びＣ８（マゼンタ）残基を棒で示す。
【図２１】ＢＭＰ４−Ｅ７結合の画像図である。Ａ）ＢＭＰ４二量体を緑と赤で示す。Ｅ７を青緑色で示す。Ｂ）ＢＭＰ４とＥ７の分子界面の拡大図。点線は水素結合及び／又は塩橋を表す。相互作用に関与するＢＭＰ４（黄色）及びＥ７（マゼンタ）残基を棒で示す。
【図２２】ＶＨＨ阻害のモデリングを示す図である。ＢＭＰＲ１ａ及びＢＭＰＲ２（ＰＢＤエントリー２Ｈ６２）に結合するＢＭＰ２のリボンダイアグラムは、受容体結合との３個の接触点を示す。これらの接触点のうち２個は、ＢＭＰＲ１ａとの高親和性結合に関与するいわゆる「リスト」を形成する。ＢＭＰ２残基とＢＭＰ４残基の違いのため、ＢＭＰ４のエピトープはＣ４によって認識されるが、ＢＭＰ２のエピトープは認識されない。リストの疎水性ポケットは、両方のＢＭＰ２単量体由来の残基によって構成される。この領域の残基は、ＢＭＰ２／ＢＭＰ４間で保存されるが、他のＢＭＰとは異なり、Ｃ８結合のための接触域を形成する。第３の接触点は、ＢＭＰ２Ｂ由来の残基によって構成されるナックルエピトープを構成する。この領域の残基がすべてＢＭＰ間で高度に保存されるという考えは、これがＥ７エピトープであることを示す。
【図２３】生成突然変異体（ｍｕｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ）の機能的特性分析を示す図である。Ｃ２Ｃ１２を（Ａ）ＢＭＰ２（５０ｎｇ／ｍｌ）又は（Ｂ）ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて１６時間刺激した。ＶＨＨ又は変異体をＢＭＰと同時に５μｇ／ｍｌで添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムによって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性（黒色バー）に対する比として表した。Ｕｎｓ＝無刺激Ｃ２Ｃ１２細胞。各々が３つ組の実験の３つの独立した実験から計算された値。
【図２４】市販抗ＢＭＰ４抗体の機能比較を示す図である。ＥＰＣ２−ｈＥＲＴ細胞を１００ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ２（Ａ又はＢＭＰ４（Ｂ〜Ｄ）を用いて４時間活性化させた。ノギン、Ｃ８、又はＲ＆Ｄ製（クローン６６１１９）若しくはＡｂｃａｍ製（ａｂ３９９７３）（Ａｂ）市販抗ＢＭＰ４を濃度５μｇ／ｍｌ（Ａ、Ｂ）、１μｇ／ｍｌ（Ｃ）又は０．１μｇ／ｍｌ（Ｄ）で同時に添加した。ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をウエスタンブロットによって細胞溶解後に検出した。相当するタンパク質負荷をβアクチンの検出によって確認した。タンパク質定量化をＩｍａｇｅＪによって測定し、ＢＭＰ刺激細胞に対する比として計算した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。
【図２５】ＶＨＨ二頭部及び単頭部のＩＣ５０曲線を示す図である。Ｃ２Ｃ１２をヒトＢＭＰ４を用いて５ｎｇ／ｍｌで（Ａ、Ｂ、Ｄ）、又はＢＭＰ２を用いて５０ｎｇ／ｍｌで（Ｃ、Ｅ）１６時間活性化させた。ＶＨＨをＢＭＰと同時に表示濃度で添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムによって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性に対する比として表した。データは、各々が３つ組の実験の２つの実験の代表値である。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ラ・ホーヤ、ＣＡ）を用いて非線形回帰モデルでフィッティングされた。
【図２６】ＶＨＨがＢＭＰサブファミリー又はＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーを阻害しないことを示す図である。Ｃ２Ｃ１２をヒトＡ）ＢＭＰ９（２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ）ＢＭＰ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）又はＣ）ＢＭＰ１２（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１６時間活性化させた。ＶＨＨ又はノギンを同時に濃度５μｇ／ｍｌで添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性に対する比として表した。エラーバーは、各々が３つ組の実験の少なくとも３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。＊＝＜０．１。統計解析を両側Ｐ検定によって行った。Ｄ）Ｃ２Ｃ１２を２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１時間活性化させた。表示濃度のＶＨＨを同時に添加した。ホスホＳＭＡＤ２のウエスタンブロットは、２つの実験の代表値である。Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞を１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１時間活性化させた。表示濃度のＶＨＨを同時に添加した。ホスホＳＭＡＤ２のウエスタンブロットは、２つの実験の代表値である。
【図２７】ヘテロ二量体ＢＭＰを用いたエピトープマッピングを示す図である。Ｃ２Ｃ１２をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製の１０ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ４及びＢＭＰ４／６（図２７Ａ）又は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２、ＢＭＰ２／６若しくはＢＭＰ２／７（図２７Ｂ）を用いて活性化させた。エラーバーは、各々が３つ組の実験の少なくとも３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。エラーバーは、３つ組の実験の代表的実験から計算された平均の標準偏差である。Ｎ＝ノギン。
【図２８】図２８（Ａ〜Ｆ）は、抗ＢＭＰ４  ＶＨＨが癌由来のＢＭＰシグナル及び機能を阻害することを示す図である。図２８（Ａ）は、Ｃ２Ｃ１２細胞を種々の結腸癌細胞株の一団由来の馴化培地と一緒にインキュベートしたことを示す図２８（Ｂ）は、Ｃ２Ｃ１２細胞を、示した癌細胞株の馴化培地と一緒にインキュベートしたことを示す。Ｃ４Ｃ４、Ｃ８Ｃ８又はヒトＦｃノギンを濃度５００ｎｇ／ｍｌで１６時間同時に添加した。ＨＴ２９細胞がカルボプラチン（図２８Ｃ）、５’ＦＵ（Ｄ）、またはオキサリプラチン（図２８Ｅ）を用いて表示濃度で、ＶＨＨ又はノギンを用いて、又は用いずに、処理した。４８時間後に生存率を測定した。実験を各々３つ組の実験で少なくとも３回繰り返した。＊＊ｐ＝＜０．０１、＊ｐ＝＜０．１。統計解析を両側Ｐ検定によって行った。
【図２９】図２９（Ａ〜Ｅ）は、本発明の単鎖抗体（ＶＨＨ）が結腸直腸ＳＭＡＤ４細胞株において非標準シグナルを阻害することを示す図である。図２９Ａは、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８がＨＴ２９細胞においてｐＳＭＡＤリン酸化を阻害し得ることを示す図２９Ｂは、ＨＣＴ１１６がＳＭＡＤ４を発現し、ＨＴ２９が発現しないことを示す。Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８がキナーゼｐ３８（２９Ｃ）、Ａｋｔ（図２９Ｄ）のほか、ＥＲＫ（２９Ｅ）のリン酸化を阻害する。
【図３０】図３０（Ａ〜Ｈ）は、本発明の抗体及び市販抗体及び他の阻害剤の特異性の比較を示す図である。図３０Ａは、Ｃ２Ｃ１２細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ２を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。同時に阻害剤を添加した。ＶＨＨ、ｍノギン、ｈノギン及びグレムリンを濃度５００ｎｇ／ｍｌで添加し、ＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）を０．５μＭで添加し、ＤＭＨ１を０．２μＭで添加した。図３０Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞を２００ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ５を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｄは、Ｃ２Ｃ１２細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ６を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｅは、Ｃ２Ｃ１２細胞を２００ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ７を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｆは、Ｃ２Ｃ１２細胞を２５ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ９を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｇは、Ｃ２Ｃ１２細胞を２５ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ１０を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。図３０Ｈは、Ｃ２Ｃ１２細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ１２を用いて１６時間活性化させたことを示す図である。
【図３１】市販抗ＢＭＰ４抗体及びＶＨＨの種々のエピトープを示す図である。利用可能な抗ＢＭＰ４抗体は、ＢＭＰ４内の異なるドメインを介した相互作用によってその標的に結合する。Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８はＢＭＰＲ１ａ結合部位に結合するが、不活性抗体はプロドメインに結合し、弱い抗体はヘパリンドメイン（ＨＤ：ｈｅｐａｒｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）などの成熟タンパク質のある領域に結合する。
【図３２】図３２（Ａ〜Ｄ）は、種々の利用可能な阻害剤と比べた本発明のＶＨＨの有効性を示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞を１０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４（図３２Ａ）または５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２（図３２Ｂ）を用いて刺激し、同時に漸増濃度の抗ＢＭＰ４抗体及びＶＨＨを添加した（０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ）。図３２ＣはＣ８Ｃ８及び天然拮抗物質によるＢＭＰ２媒介性シグナルの阻害のＩＣ５０曲線である。図３２ＤはＶＨＨ、市販抗ＢＭＰ４抗体及び天然拮抗物質によるＢＭＰ４媒介性シグナルの阻害のＩＣ５０曲線である。結果を各々３つ組の実験の３つの独立した実験の相対ＩＤ−１プロモータ活性の平均で表す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図３３】図３３（Ａ〜Ｄ）は、ＢＭＰ４エピトープマッピングを示す図である。図３３Ａは、成熟活性ＢＭＰ４の略図である：完全成熟活性ＢＭＰ４二量体、及びヘパリンドメインのないＢＭＰ４二量体変異体（ΔＢＭＰ４）。図３３Ｂは、未成熟不活性プロＢＭＰ４体の略図である。図３３Ｃは、非還元成熟組換えＢＭＰタンパク質（ｕｎｒｅｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＢＭＰ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のウエスタンブロット検出を示す図である。図３３Ｄは、還元癌細胞株溶解物（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｌｙｓａｔｅｓ）のウエスタンブロット検出を示す図である。ＨＴ２９由来の馴化培地を１０μｇ／ｍｌのＶＨＨ又は抗ＢＭＰ４抗体（クローン６６１１９、クローン３Ｈ２、クローンＰＡ３５４、クローン及びＥＰＲ６２１１並びに抗体ａｂ３９９７３）の存在下でＣ２Ｃ１２細胞に添加した（図３３Ｅ）。
【図３４】図３４Ｃ  Ａは、ｈＢＭＰ２、ｈＢＭＰ４及び変異ＢＭＰ４（ｈΔＢＭＰ４）の模式的アラインメントを示す図である。図３４Ｃ  Ｂは、ＢＭＰ４及びｈΔＢＭＰ４の相対ＩＤ−１プロモータ活性の比較を示す図である。Ｃ２Ｃ１２系を用いて分析されたＶＨＨ又は種々の抗ＢＭＰ４抗体による野生型又は変異ＢＭＰ４（ＨΔＢＭＰ４）の阻害の比較。細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＨＨ及び抗ＢＭＰ４抗体（クローン６６１１９、クローン３Ｈ２及びＭ９１２２６２）を用いて刺激した（図３４Ｃ）。
【図３５】Ｃ４Ｃ４又はＣ４Ｃ４とシスプラチナムで処理された動物の動物重量が対照群に匹敵することを示す図である。
【図３６】Ｃ８Ｃ８又はＣ８Ｃ８とシスプラチナムで処理された動物の動物重量が対照群に匹敵することを示す図である。
【図３７】単一化合物としてのＣ４Ｃ４がｉｓｏ７６−Ａ細胞株に対して生体内で成長抑制効果を有することを示す図である。シスプラチナムと組み合わせて、Ｃ４Ｃ４は、相乗効果を有し、化学療法抵抗性を克服する。
【図３８】単一化合物としてのＣ８Ｃ８がｉｓｏ７６−Ａ細胞株に対して生体内で成長抑制効果を有することを示す図である。シスプラチナムと組み合わせて、Ｃ８Ｃ８は、相乗効果を有し、化学療法抵抗性を克服する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
本明細書では「ＳＭＡＤ４」という用語は、当該技術分野においてその通常の意味を有する。（ＭＡＤＨ４及びＤＰＣ４としても知られる）ＳＭＡＤ４は、Ｓｍａｄファミリーの最もユニークなメンバーである。このタンパク質は、経路が制限されたＳｍａｄとの複合体において共用ヘテロオリゴマー化パートナーとして働く（Ｌａｇｎａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８３、８３２〜８３６；Ｚｈａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９７、７、２７０〜２７６）。最近、ＳＭＡＤ４はＴＧＦベータ受容体と相互作用しないが、Ｓｍａｄシグナル伝達カスケード内で２つの異なる機能を果たすことが示された。ＳＭＡＤ４は、そのＮ末端を介して、Ｓｍａｄ複合体とＤＮＡの結合を促進し、そのＣ末端を介して、ＳＭＡＤ複合体が転写を刺激するのに必要な活性化シグナルを与える（Ｌｉｕら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９７、１１、３１５７〜３１６７）。ＳＭＡＤ４は、最初に、癌抑制遺伝子候補として膵癌の研究中に単離された。ホモサピエンスＳＭＡＤ４遺伝子は、染色体１８ｑ２１．１に局在し（Ｈａｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６、２７１、３５０〜３５３）、その配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋに受託番号ＮＧ＿０１３０１３．１で寄託されている。
【００３９】
本明細書では「ＳＭＡＤ４欠損腫瘍」という用語は、その細胞の少なくとも一部が、ＳＭＡＤ４遺伝子の発現が少なく、ＳＭＡＤ４タンパク質の機能が抑制されることを特徴とする腫瘍を指す。欠損腫瘍は、対照細胞に比べて好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％、３０％、２０％若しくは１０％未満にＳＭＡＤ４タンパク質の量が減少すること、又はＳＭＡＤ４タンパク質の損失、ＳＭＡＤ４遺伝子の機能低下若しくは機能喪失をもたらすＳＭＡＤ４ゲノム異常（変異、欠失など）の存在、ＳＭＡＤ４遺伝子座の過剰メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｉｌａｔｉｏｎ）、又はＳＭＡＤ４のＲＮＡレベルの低下を特徴とし得る。
【００４０】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指し、抗体によって認識される抗原上の部位を意味すると解釈される。
【００４１】
本明細書では「立体構造エピトープ」という用語は、完全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に固有の構造的特徴を有する、完全長タンパク質の一部、又はその類似体若しくは変異体を指す。固有の構造的特徴としては、グリコシル化及び３次元構造が挙げられるが、それだけに限定されない。これらのエピトープは、抗原の３次元形状（例えば、折り畳み）によって形成されると考えられるので、エピトープを規定する配列の長さは大きく変化し得る。したがって、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない場合もあるが、分子の長さ方向に広く分散し、折り畳みによって正しいエピトープ立体構造をとることができる。エピトープを規定する残基間の抗原の部分が、エピトープの立体構造に重要でない場合もある。例えば、これらの介在配列の欠失又は置換は、エピトープの立体構造に重要な配列が維持される限り（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）、立体構造エピトープに影響しないこともある。
【００４２】
立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチド又はタンパク質の３次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて３次元構造を形成すると、立体構造エピトープを形成するある種のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列して、抗体がエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を測定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析２次元核磁気共鳴分光法及び部位特異的スピン標識及び電子常磁性共鳴分光法が挙げられるが、それだけに限定されない。例えば、その開示全体を参照により本明細書に援用する、「分子生物学における方法におけるエピトープマッピング手順（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｖｏｌ．６６、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。
【００４３】
本明細書では（「Ｉｇ」と略記される）「免疫グロブリン」という用語は、当該技術分野でよく知られており、「抗体」という用語と同義である。本明細書では「抗体」という用語は、少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを指す。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体及び単鎖抗体（例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ）を含むが、それだけに限定されない。「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体断片、及び抗原結合機能を保持するＣＤＲを含む他の抗体断片又は他の構築物も含む。一般に、こうした断片は、抗原結合領域（又は「抗原結合部分」、これらの用語は本明細書では区別なく使用される）を含むと考えられる。抗体は、公知の抗体アイソタイプ及びそれらの立体構造、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、若しくはＩｇＭクラスのいずれかとすることができ、又はＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａクラス由来の抗体の混合物などの任意の組合せのそれらの混合物を構成することができる。
【００４４】
実施形態においては、当該技術分野において「免疫グロブリン」とも称する「抗体」という用語は、対の重鎖と軽鎖のポリペプチド鎖から構築されたタンパク質を包含し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含めて、種々のＩｇアイソタイプが存在する。抗体が正確に折り畳まれると、各鎖は、より線状のポリペプチド配列によって連結された幾つかの異なる球状領域に折り畳まれる。例えば、免疫グロブリン軽鎖は、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）領域に折り畳まれ、重鎖は、可変（ＶＨ）及び３個の定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）領域に折り畳まれる。重鎖と軽鎖の可変領域（ＶＨとＶＬ）の相互作用によって、抗原結合領域（Ｆｖ）が形成される。各領域は、当業者によく知られた確立された構造を有する。
【００４５】
軽鎖及び重鎖可変領域は、標的抗原への結合を担い、したがって抗体間で著しい配列多様性を示し得る。定常領域は、配列多様性が低く、重要な生化学的事象を誘発する幾つかの天然タンパク質への結合を担う。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがってその標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列多様性の大部分は、可変重鎖と軽鎖各３つの６つの超可変領域に生じ、超可変領域は合わせて抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合及び認識に寄与する。その抗原に対する抗体の特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそれらのサイズ、形状、及びそれらが抗原に対して示す表面の化学的性質によって決まる。超可変性の領域を同定する様々なスキームが存在し、２つの最も一般的なものは、Ｋａｂａｔ並びにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋのものである。Ｋａｂａｔら（１９９１）は、ＶＨ及びＶＬ領域の抗原結合領域における配列多様性に基づいて「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義している。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）は、ＶＨ及びＶＬ領域における構造ループ領域の位置に基づいて「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義しており、超可変ループの番号付けは、ＶＨＨ領域ではＨ１：２７〜３５、Ｈ２：５２〜５６及びＨ３：９５〜１０２（Ｋａｂａｔの番号付けのＣＤＲ３に相当）と定義された（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７）。これらの個々のスキームは、隣接又は重複するＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義しているので、抗体技術分野の当業者は、しばしば「ＣＤＲ」と「超可変ループ」という用語を区別なく使用し、本明細書でもそのように使用することができる。
【００４６】
ＣＤＲの外側の領域は、フレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と称される。ＦＲは、構造上の完全性を可変領域に付与し、免疫グロブリンフォールドの保持を確実にする。抗体のこの特徴的構造は、安定な足場を与え、その足場の上でかなりの抗原結合多様性を免疫系によって探索して、広範な抗原に対する特異性を得ることができる（Ｐａｄｌａｎら、１９９４）。
【００４７】
本明細書では、抗体の「抗原結合部」（又は「抗原結合断片」）という用語は、抗原（例えば、ＢＭＰ４タンパク質内のエピトープ）に特異的に結合する能力を保持する１個以上の抗体断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって発揮され得ることが示された。抗体断片は、天然抗体の操作によって得ることができ、又は組換え方法によって得ることができる。抗体の「抗原結合部」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩ領域からなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片｛「基礎免疫学（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」（Ｐａｕｌ編、３版、１９９３）参照、（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨＩ領域からなるＦｄ断片、（ｖ）抗体の単一腕のＶＬ及びＶＨ領域からなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨ領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、（ｖｉｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一の可変領域及び２つの定常領域を含む重鎖可変領域が挙げられる。また、Ｆｖ断片の２つの領域ＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ領域とＶＨ領域が一対になって一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）単一タンパク質鎖（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３参照）として生成させることができる合成リンカーを用いて、組換え方法によって連結することができる。こうした単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部」という用語に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来技術によって得られ、断片は、完全抗体と同様に有用かどうか選別される。
【００４８】
非限定的例においては、抗体断片は、天然源由来の単一ドメイン抗体（さらに、単鎖抗体）とすることができる。単一ドメイン又は単鎖抗体という用語は、その多価提示（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）とすることもできる。典型的な単鎖抗体は、ラクダ科動物起源の重鎖抗体であり（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３）、この重鎖抗体は軽鎖がなく、したがってその抗原結合部位はＶＨＨと称する１つの領域からなる。単一ドメイン抗体は、サメでも観察され、ＶＮＡＲと称され（Ｎｕｔｔａｌｌら、２００３）、別の単一ドメイン抗体は、ヒト重鎖又は軽鎖配列に基づいて操作することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４；Ｔｏら、２００５）。本明細書では「単一ドメイン抗体」は、ファージディスプレイ又は別のディスプレイ技術によって任意の起源のＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＮＡＲ貯蔵所から直接単離されたもの、及びヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化（例えば、ラクダ化）、又は抗体工学の別の方法によって、こうした単一ドメイン抗体の更なる改変から生成するものを含む。単一ドメイン抗体の抗原結合機能及び特異性を保持又は改善する相同体、誘導体又は断片も本発明に包含される。
【００４９】
当業者は、単一ドメイン抗体の構造を熟知していると考えられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋにおける３ＤＷＴ、２Ｐ４２参照）。単一ドメイン抗体は、免疫グロブリン折り畳みを保持する単一免疫グロブリンドメインを含み、特に、３つのＣＤＲのみで抗原結合部位を形成する。しかし、すべてのＣＤＲが抗原との結合に必要なわけではない。例えば、限定するものではないが、ＣＤＲの１つ、２つ又は３つが、本発明の単一ドメイン抗体による抗原の結合及び認識に寄与し得る。単一ドメイン抗体のＣＤＲは、本明細書ではＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称し、Ｋａｂａｔの番号付けに基づく（Ｋａｂａｔら、１９９１）。
【００５０】
単一ドメイン抗体はラクダ科動物起源とすることができ、したがってラクダ科動物フレームワーク領域に基づき得る。あるいは、ＣＤＲは、他の抗体ドメインのフレームワーク領域、例えば、それだけに限定されないが、ＶＮＡＲ、ヒトＶＨ又はヒトＶＬフレームワーク領域の上に移植することができる。更に別の選択肢においては、上記ＣＤＲは、別のタイプの抗体断片（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）のフレームワーク領域上に移植することができる。本実施形態は、更に、当該技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、それだけに限定されないが、ＣＤＲ移植及びベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）によって「ヒト化」された抗体断片を包含する。抗体又は抗体断片のヒト化は、配列中のアミノ酸を抗原結合能力や特異性を失わずにヒトコンセンサス配列に見られるそのヒト対応物で置換することを含み、この手法は、ヒト対象に導入すると、抗体の免疫原性を低下させる。ＣＤＲ移植のプロセスにおいては、本明細書に定義した１つ又は１つを超える重鎖ＣＤＲを、ヒト可変領域（ＶＨ又はＶＬ）又は別のヒト抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）に融合又は移植することができる。こうした場合においては、前記１つ又は１つを超える超可変ループの立体構造が保存され、その標的（すなわち、ＢＭＰ４）に対する単一ドメイン抗体の親和性及び特異性も保存される。ＣＤＲ移植は、当該技術分野で公知であり、少なくとも以下に記載されている：米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第５，８５９，２０５号及び欧州特許第６２６３９０号。ベニアリングは、当該技術分野において「可変領域リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」とも称され、抗体又は断片の溶媒暴露位置のヒト化を含み、したがって、ＣＤＲ立体構造に重要であり得る埋没非ヒト化残基が保存され、溶媒暴露領域に対する免疫反応の可能性が最小化される。ベニアリングは、当該技術分野で公知であり、少なくとも以下に記載されている：米国特許第５，８６９，６１９号、米国特許第５，７６６，８８６号、米国特許第５，８２１，１２３号及び欧州特許第５１９５９６号。当業者は、こうしたヒト化抗体断片を調製する方法に十分精通していると考えられる。
【００５１】
本明細書では「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する別の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ＢＭＰ４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＢＭＰ４タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＢＭＰ４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、別の種由来のＢＭＰ４タンパク質などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、好ましくは、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
【００５２】
本明細書では「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。本明細書では「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでの無作為若しくは部位特異的変異誘発によって、又は生体内での体細胞変異によって、導入される変異）。しかし、本明細書では「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないものとする。
【００５３】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態においては、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。本明細書では「組換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入若しくは染色体導入された動物（例えば、マウス）又はそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を別のＤＮＡ配列にスプライスすることを含む任意の別の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されたすべてのヒト抗体を含む。こうした組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある実施形態においては、こうした組換えヒト抗体をインビトロでの変異誘発（又はヒトＩｇ配列を導入した動物を使用するときには、生体内での体細胞変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関係するものの、生体内でのヒト抗体生殖系列レパートリーに天然には存在しないかもしれない配列である。
【００５４】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と区別なく使用される。
【００５５】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変形態、例えば、抗体と別の剤又は抗体の複合物を指す。「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を指すものとする。追加のフレームワーク領域の改変をヒトフレームワーク配列内で行うことができる。
【００５６】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域配列が１種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すものとする。
【００５７】
本明細書では「Ｋａｓｓｏｃ」又は「ｋａ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の会合速度を指し、本明細書では「ＫｄｉＳ」又は「ｋｄ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度を指すものとする。本明細書では「ＫＤ」という用語は、ｋｄとｋａの比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られる、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すものとする。抗体のＫＤ値は、当該技術分野において確立された方法によって決定することができる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用するものである。
【００５８】
本明細書では「ＩＣ５０」という用語は、半値抑制濃度（ＩＣ５０）を表し、これは、生物学的機能の阻害、例えば、本明細書に記載のＣ２Ｃ１２細胞におけるＢＭＰ４シグナル伝達に対する抗体の阻害における、化合物の有効性の尺度である。
【００５９】
あるエピトープに対する抗体の親和性に関連して、本明細書では「高親和性」という用語、こうした親和性は、ＫＤの値が１ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは６ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは３ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは２ｘ１０−９Ｍ以下である。
【００６０】
抗体と抗原の相互作用に関連した本明細書の「結合する（「ｂｉｎｄｓ  ｔｏ」又は「ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ」）」という用語は、解離定数ＫＤ１ｘ１０−６Ｍ以下、好ましくは１ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは６ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは３ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは２ｘ１０−９Ｍ以下で、抗体の免疫グロブリン可変領域によって抗原に結合する抗体の能力を指すものとする。前記抗体は、更に別の抗原に結合してもよいし、結合しなくてもよい。例えば、ＢＭＰ４に結合する抗体は、ＢＭＰ２に結合することもできる。
【００６１】
本明細書では、ある抗原に「特異的に結合する」抗体は、前記ある抗原に結合するが、別の抗原には実質的に結合しない抗体を指すものとする。例えば、ＢＭＰ４に特異的に結合する抗体は、一般に、ＢＭＰ２に実質的に結合しない。
【００６２】
本明細書ではあるエピトープ「内で結合する」という用語は、ＢＭＰ４のエピトープ内の１個の残基に結合するが、好ましくは少なくとも２、３、５、６、７、８個以上に結合する抗体を指す。結合は、上記残基の外側でも起こり得る。しかし、好ましい実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の他のエピトープに実質的に結合しない。
【００６３】
エピトープに「実質的に結合しない」という用語は、本明細書では、エピトープに結合しない、又は高親和性で結合しない、すなわち、エピトープにＫＤ１ｘ１０−６Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−５Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−４Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−３Ｍ以上、更により好ましくは１ｘ１０−２Ｍ以上で結合することを意味する。
【００６４】
ＢＭＰは、その成熟活性型を放出するために細胞外で開裂する必要がある不活性前駆体（プロＢＭＰ）として分泌される。本明細書では「ＢＭＰ２」という用語は、好ましくはヒト起源の、成熟骨形成タンパク質２を指すのに使用される。ヒトプロＢＭＰ２のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２００を参照することによって公的に利用可能である。成熟ＢＭＰ２の対応するアミノ酸配列を本明細書では配列番号１５として示す。
【００６５】
本明細書では「ＢＭＰ４」という用語は、ヒト成熟骨形成タンパク質４を指すのに使用される。ヒトプロＢＭＰ４のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３０８５１を参照することによって公的に利用可能である。成熟ＢＭＰ４の対応するアミノ酸配列を本明細書では配列番号１として示す。本明細書では残基の番号付けは、配列番号１の位置を指す。ＢＭＰ４は個体間で高度に保存されるので、前記エピトープも高度に保存されるが、個体間でわずかに変わり得る。したがって、ＢＭＰ４の変異体の前記エピトープに結合する抗体は、本発明の範囲内である。ＢＭＰ４は、配列番号１のアミノ酸、又はそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である配列によって定義される。
【００６６】
配列相同性は、２個の配列の類似度を評価するのに使用され、２個の配列を残基位置が最も一致するように整列させたときに同じである残基の割合を計算することによって求められる。任意の公知の方法を使用して配列相同性を計算することができ、例えば、コンピュータソフトウェアを利用して、配列相同性を計算することができる。限定するものではないが、配列相同性を、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって維持される（及びｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／に見られる）ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、若しくはＦＡＳＴＡ−Ｎ、又は当該技術分野で公知の任意の他の適切なソフトウェアなどのソフトウェアによって計算することができる。
【００６７】
本明細書ではＢＭＰ４の「リスト」という用語は、ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂなどのＩ型受容体に結合するＢＭＰ４タンパク質内の領域を指す。
【００６８】
本明細書ではＢＭＰ４の「ナックル」という用語は、ＢＭＰＲ２、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢなどのＩＩ型受容体に結合するＢＭＰ４タンパク質内の領域を指す。
【００６９】
本明細書では「ＢＭＰ５」という用語は、ヒト成熟骨形成タンパク質５を指すのに使用される。プロＢＭＰ５のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６６５５１．１を参照することによって公的に利用可能であり、成熟ヒトＢＭＰ５を本明細書では配列番号１６として示す。
【００７０】
本明細書では「ＢＭＰ６」という用語は、ヒト成熟骨形成タンパク質６を指すのに使用される。プロＢＭＰ６のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７０９．１を参照することによって公的に利用可能であり、その成熟型を本明細書では配列番号１７として示す。
【００７１】
本明細書では「ＢＭＰ７」という用語は、ヒト成熟骨形成タンパク質７を指すのに使用される。プロＢＭＰ７のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７１０．１を参照することによって公的に利用可能であり、その成熟型を本明細書では配列番号１８として示す。
【００７２】
「異常ＢＭＰ４発現に関連する疾患」という用語は、対象の試験試料におけるＢＭＰ４発現が異常な、好ましくは健常対照の試験試料よりも高い、任意の疾患を指す。
【００７３】
本明細書では「ＢＭＰ４シグナル伝達」という用語は、標準経路（ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化）及び／又は（ＥＲＫ、ｐ３８及びＡｋｔのリン酸化を含めて、ただしそれだけに限定されない）非標準経路を活性化するＢＭＰ４の能力を指す。
【００７４】
本明細書では「ＢＭＰ２シグナル伝達」という用語は、標準経路（ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化）及び／又は（ＥＲＫ、ｐ３８及びＡｋｔのリン酸化を含めて、ただしそれだけに限定されない）非標準経路を活性化するＢＭＰ２の能力を指す。
【００７５】
本明細書では「Ｃ４」という用語は、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する本発明に係る単鎖抗体を指す。
【００７６】
本明細書では「Ｃ４Ｃ４」という用語は、前記Ｃ４単鎖抗体の二量体を指す。
【００７７】
本明細書では「Ｃ８」という用語は、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する本発明に係る単鎖抗体を指す。
【００７８】
本明細書では「Ｃ８Ｃ８」という用語は、前記Ｃ８単鎖抗体の二量体を指す。
【００７９】
本明細書では、肺癌とは、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌を含めて、ただしそれだけに限定されない肺から始まる癌を指す。
【００８０】
本明細書では、精巣癌とは、精上皮腫及び非精上皮腫を含めて、ただしそれだけに限定されない精巣から始まる癌を指す。
【００８１】
本明細書では、乳癌とは、腺管癌及び小葉癌を含めて、ただしそれだけに限定されない乳房の組織から始まる癌を指す。
【００８２】
本明細書では、結腸癌とは、癌腫、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、黒色腫及び肉腫を含めて、ただしそれだけに限定されない大腸又は直腸から始まる癌を指す。
【００８３】
本明細書では、卵巣癌とは、上皮性腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質性腫瘍を含めて、ただしそれだけに限定されない卵巣から始まる癌を指す。
【００８４】
本明細書では、頭頚部癌とは、唇、口腔、鼻腔、副鼻腔、咽頭及び喉頭を含めて、ただしそれだけに限定されない上気道消化管から始まる癌の一群を指す。
【００８５】
本明細書では、食道癌とは、扁平上皮癌及び腺癌を含めて、ただしそれだけに限定されない食道から始まる癌を指す。
【００８６】
本明細書では、胃癌とは、腺癌、軟部組織肉腫、リンパ腫及びカルチノイド腫瘍を含めて、ただしそれだけに限定されない胃から始まる癌を指す。
【００８７】
本明細書では、抗癌剤という用語は、単独で、又は別の処置と組み合わせて使用することができる、悪性腫瘍又は癌性増殖の処置における使用のための薬物を指す。抗癌剤の例としては、白金錯体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００８８】
本明細書の文脈で使用される白金錯体という用語は、ＤＮＡ上のプリン間のストランド内及びストランド間架橋を形成する白金を含む化合物を指す。例としては、（シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）、すなわちＣＤＤＰとしても知られる）シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン及びそれらの誘導体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００８９】
本明細書では白金錯体に関連した「それらの誘導体という句は、種々のリガンドを含む白金含有化合物を指す。
【００９０】
本発明の種々の態様を以下の項で更に詳細に記述する。
【００９１】
ＳＭＡＤ４欠損腫瘍の処置における使用のためのＢＭＰ４に結合する抗体
Ｓｍａｄ４欠損腫瘍は、当該技術分野で公知の方法、例えば、欧州特許出願公開第２０４６３７４号Ａ２に記載のインビトロスクリーニング法によって確認することができる。Ｓｍａｄ４欠損腫瘍は、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害可能である抗ＢＭＰ４抗体を用いて適切に処置することができる。こうした抗体は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献１に開示されている。一部の実施形態においては、本発明に係る抗ＢＭＰ４抗体を使用する。
【００９２】
ＢＭＰ４のリスト又はナックルに結合する抗体
本発明は、ＢＭＰ４のリスト又はナックルに結合する抗体が、現在利用可能な抗ＢＭＰ４抗体に比べてＢＭＰ４に対する親和性が高いという知見に基づく。本明細書の実施例７においては、本発明に係る幾つかの抗体の親和性を市販抗ＢＭＰ４抗体と比較する。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、これは、利用可能な抗体がＢＭＰ４の種々のエピトープを対象にするということの結果であると考える（実施例８、９及び１０）。したがって、本発明は、ＢＭＰ４のリスト又はナックルに結合する任意の抗体に関する。
【００９３】
一実施形態においては、本発明の抗体は、ＢＭＰ４のリストに結合する。これらの抗体は、ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂなどのＢＭＰ４のＩ型受容体を妨害することができる。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、Ｉ型受容体とのこの相互作用領域が、ＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内に位置すると考える。それに結合可能な任意の抗体が本発明の範囲内である。
【００９４】
１種以上のエピトープに対する抗体の結合能力を評価する標準アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー及びＲＩＡを含めて、当該技術分野で公知である。他の適切なアッセイを実施例で詳述する。抗体の結合動力学（例えば、結合親和性）もＥＬＩＳＡ、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などの当該技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。好ましくは、前記抗体は、表面プラズモン共鳴分析によって求められる、ＢＭＰ４に対する親和性ＫＤが１５９０ｐＭ−１未満である。好ましくは、前記ＫＤは、１０００ｐＭ−１未満、より好ましくは１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７５０、７００、６５０、６３５、６００、５７５、５１３、３９３、１００、９１、７５、５０、３２、２５、１０ｐＭ−１未満である。
【００９５】
さらに、本発明者らは、本発明の抗体が、ノギンと同じ程度にＢＭＰ４シグナル伝達を阻害することを本明細書に記述した。これは、ＢＭＰＲ１ａエピトープとＢＭＰＲ２エピトープの両方を同時にマスクするノギンの広範な接触点によって説明することができる。ノギンのＣ末端指状領域はＢＭＰＲ２結合を阻止する原因であるが、Ｎ末端クリップ状領域はＢＭＰＲ１ａエピトープに結合する。この顕著な構造範囲は、ＢＭＰ拮抗物質の間で保存され、そのＢＭＰ特異性の欠如を説明するかもしれない。
【００９６】
抗体がノギンと競合するかどうかを判断するアッセイは、当該技術分野で公知である。好ましい一実施形態においては、こうしたアッセイとしては、好ましくは本明細書に記載された、ＳＰＲサンドイッチ交差結合又は「エピトープビニング」アッセイが挙げられる。
【００９７】
ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する抗体
本発明は、更に、ノギン及び当該技術分野で公知の抗ＢＭＰ４抗体とは対照的に、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する抗体が、相同性の高いＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ５、６及び７を含めた他のＢＭＰのシグナル伝達に影響しないという驚くべき知見に基づく（実施例５）。本発明者らは、ＢＭＰ４の疎水性溝に結合する抗体が、転写因子ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化の阻害によって、ＩＤ１などのＢＭＰ４反応性遺伝子の転写活性化を防止できることを示した（実施例５）。
【００９８】
本発明者らは、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する抗体が、ＢＭＰ２、５、６及び７も阻害するノギンとは対照的に、ＢＭＰ４媒介性機能のみを阻害することも示した。ホモ二頭部Ｃ４Ｃ４は、ＢＭＰ４に対してノギンよりも１０倍高い最大親和性を有する単一ドメイン抗体であることが判明した。これらの抗体は、他のＢＭＰの重要なホメオスタシス機能を完全に残したまま、ＢＭＰ４機能を効果的に阻害することができる。マウスにおけるＢＭＰシグナル伝達の非選択的阻害は、乳癌細胞の腫瘍量及び転移の休眠状態の活性化を増大させることが示された。したがって、ＢＭＰ阻害を療法として利用するときには、抑制のない癌幹細胞増殖の有害な副作用を回避することが重要である。腸オルガノイド培養物においては、（本明細書では「Ｃ４Ｃ４」とも称する）ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する本発明の抗体によるＢＭＰ４単独の阻害は、幹細胞増殖に影響しない。本発明者らは、ある結腸直腸癌細胞株がＢＭＰ４を厳格に分泌し、これらの細胞における本発明の抗体によるＢＭＰ４の選択的阻害が幾つかの化学療法剤に対する化学感受性を増加させるのに十分であることも見いだした。したがって、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する抗体は、結腸直腸癌だけでなく、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌などのＢＭＰ４が特異的な病原性の役割を果たし得る他の新生物においても、臨床、診断及び治療上の使用に重要である可能性がある。
【００９９】
ＢＭＰ４特異性は、実施例６に明示されており、複数のＢＭＰを阻害すると培養物において幹細胞が増殖するが、（Ｃ４Ｃ４による）ＢＭＰ４の特異的阻害はそのようなことがない。
【０１００】
さらに、本発明者らは、上記効果が、ＢＭＰ４のリストの特定の部分に対する本発明の抗体の特異性に起因することを示した。
【０１０１】
本発明者らのエピトープビニング実験（実施例８）及びそれに続くＨＡＤＤＯＣＫモデリング（実施例９）によれば、この実施形態の抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に特異的に結合することができる。これは、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の残基の違いを示す、ＢＭＰＲ結合に関与する唯一のエリアである。特に、ＨＡＤＤＯＣＫモデリングによって、ＢＭＰ４の疎水性溝残基Ｌｙｓ１２、Ａｒｇ１５、Ａｓｐ４６及びＰｒｏ５０が、Ｃ４のＣＤＲ２及びＣＤＲ３に位置する残基との疎水性相互作用に関与することを確認した。変異実験によって該モデリングを検証した（実施例１０）。
【０１０２】
好ましくは、前記抗体は、好ましくはＢＭＰ４の残基１０〜１７、４５〜５６及び６９内のリストの疎水性溝に結合する。更に好ましい一実施形態においては、この実施形態の前記抗体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７に実質的に結合しない。その更なる利点は、前記抗体がＢＭＰ２媒介性シグナル伝達を阻害しないことである。更に好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４のＬｙｓ１０、Ａｓｎ１１、Ｌｙｓ１２、Ａｓｎ１３、Ｃｙｓ１４、Ａｒｇ１５、Ａｒｇ１６及びＨｉｓ１７からなる群から選択される少なくとも１個の残基、Ｇｌｙ４５、Ａｓｐ４６、Ｃｙｓ４７、Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３、Ｈｉｓ５４、Ｌｅｕ５５及びＡｓｎ５６からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びにＳｅｒ６９に特異的に結合する。好ましくは、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合することができる前記抗体は、その４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、好ましくは１６個を超える残基、最も好ましくはすべての前記残基に結合する。というのは、これが、より良好な結合をもたらすからである。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の少なくともＬｙｓ１２、Ａｒｇ１５、Ａｓｐ４６及びＰｒｏ５０に特異的に結合する。
【０１０３】
好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の残基１５、４９、５０、５１、５２、５３、５４及び６９の少なくとも１個に結合する。好ましくは、前記抗体又はその抗原結合部は、ＢＭＰ４に対する親和性が特に高く、ＢＭＰファミリーの別のメンバーには実質的に結合しない。好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４のシグナル伝達機能を機能的に阻害することができる。
【０１０４】
好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４の少なくともＡｒｇ１５に結合する。別の好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４のＰｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３及びＨｉｓ５４の少なくとも１個、より好ましくは２、３、４、５又は６個の残基に結合する。別の好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４のＳｅｒ６９に結合する。好ましい一実施形態においては、ＢＭＰ４のＡｒｇ１５に、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３及びＨｉｓ５４からなる群から選択される少なくとも１個の残基に、並びにＳｅｒ６９に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部。
【０１０５】
好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝の外側に位置するアミノ酸に実質的に結合しない。その利点は、他のタンパク質との交差反応が起こらないことである。
【０１０６】
ドッキングモデルによれば、保存されない疎水性溝残基は、前記抗体のＣＤＲ２及びＣＤＲ３由来の残基との結合に関与し、したがってそのＢＭＰ４特異性を有効にする。
【０１０７】
好ましい一実施形態においては、本発明は、更に、重鎖可変領域が、配列番号３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含む、本発明に係る抗体を提供する。別の一実施形態においては、配列番号３のＡｒｇ２をＰｒｏ２で置換することができる。別の一実施形態においては、配列番号４のＳｅｒ１をＩｌｅ１で置換することができる。好ましくは、配列番号３と少なくとも８７％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号３と１個以下のアミノ酸が異なる。好ましくは、配列番号４と少なくとも８７％同一である前記アミノ酸配列は、配列番号４と２個以下のアミノ酸、より好ましくは１個以下のアミノ酸が異なる。
【０１０８】
好ましくは、配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、ＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合する抗体。本発明者らは、配列番号１１のＧｌｕ１をＧｌｎ又はＡｓｐで、Ａｒｇ２７をＰｒｏで、Ｓｅｒ５３をＩｌｅで有害作用なしに置換できることを見いだした。
【０１０９】
ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合する抗体
本発明者らは、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合する抗体がＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方のシグナル伝達を阻害することを見いだした。ＢＭＰ４結合に対する及びＢＭＰ２のその親和性は、ノギンで見られるものよりも高い。これらの抗体は、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２シグナル伝達を中和するのにも有効である（実施例５）。
【０１１０】
本発明の抗体のエピトープビニング実験（実施例８）及びそれに続くＨＡＤＤＯＣＫモデリング（実施例９）によれば、この実施形態の抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合することができる。これは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及び他のＢＭＰ（ＢＭＰ５、６及び７）の残基の違いを示す、ＢＭＰＲ結合に関与する唯一のエリアである。特に、ＨＡＤＤＯＣＫモデリングによって、ＢＭＰ４の残基Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１、Ｌｅｕ６６及びＬｙｓ１０１が、Ｃ８のＣＤＲ３に位置する残基との疎水性相互作用に関与することを確認した。変異実験によってこのモデリングを検証した（実施例１０）。
【０１１１】
したがって、好ましい一実施形態においては、前記抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合することができる。好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４の残基２４〜３１、５７〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６内で結合する。好ましくは、前記抗体は、ＢＭＰ４のＳｅｒ２４、Ａｓｐ２５、Ｖａｌ２６、Ｇｌｙ２７、Ｔｒｐ２８、Ａｓｎ２９、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ６０、Ａｌａ６１、Ｉｌｅ６２、Ｖａｌ６３、Ｇｌｎ６４、Ｔｈｒ６５、Ｌｅｕ６６、Ｖａｌ６７及びＡｓｎ６８からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｖａｌ７０、Ａｓｎ７１及びＳｅｒ７２からなる群から選択される少なくとも１個の残基；Ｔｙｒ１０３及びＧｌｎ１０４からなる群から選択される少なくとも１個の残基；並びにＭｅｔ８９、Ｔｙｒ９１、Ｌｙｓ１０１及びＭｅｔ１０６に結合する。好ましくは、前記抗体は、その９、１０、１１、１２、１３を超える、好ましくは１４以上の残基に結合する。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１、Ｌｅｕ６６及びＬｙｓ１０１に特異的に結合する。
【０１１２】
ＨＡＤＤＯＣＫモデリングを用いて、本発明者らは、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合することができる抗体間の結合が、前記抗体のＣＤＲ３領域の残基とＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットとの相互作用によって推進されると結論した。ＢＭＰ４のαヘリックスの疎水性表面においては、Ｌ６６が突出して、前記抗体のＴ１０５と相互作用する。ＢＭＰ４のループ１の残基は、疎水性エリアをもたらし、Ｐ１０９とＢＭＰ４のＷ３１のような相互作用、及びＤ３０と前記抗体のＲ１０６の複塩架橋を可能にする。Ｆ１１０及びＦ１０２も、Ｄ３０が囲まれたエリアと複数の箇所で接触する。Ｙ１０７は、β８鎖の内側に位置するＫ１０１と水素結合を形成する。
【０１１３】
上述したようにＢＭＰ４のリスト内の「疎水性ポケット」領域に結合可能な抗体の好ましい一実施形態においては、したがって、配列番号７のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。当該技術分野ではよく知られているように、ＣＤＲ３領域は、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域（単数又は複数）とは無関係に、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予想どおりに生成させることができる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、８３［ポンド］２）：２５２〜２６０（２０００）［ネズミ抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変領域ＣＤＲ３のみを用いたヒト化抗ＣＤ３０抗体の製造を記載］；Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３〜８４９（２０００）［親ネズミＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いた組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−２）抗体を記載］；Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０〜８９１５（１９９８）［ネズミ抗インテグリン［アルファ］ｖ［ベータ］３抗体ＬＭ６０９の重鎖及び軽鎖可変ＣＤＲ３領域を用いたヒト化抗インテグリン［アルファ］ｖ［ベータ］３抗体の一団を記載。ここで、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３領域の外側にある、親ネズミ抗体と同じエピトープに親ネズミ抗体と同等以上の親和性で結合可能な異なる配列を含む。］；Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１〜２１６２（１９９４）［ＣＤＲ３領域が抗原結合性に対して最も重要な寄与をもたらすことを開示］；Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｊ７．−Ｓ．ｉ４．９２：２５２９〜２５３３（１９９５）［抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上へのヒト胎盤ＤＮＡに対する３種のＦａｂ（ＳＩ−Ｉ、ＳＩ−４０及びＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の移植、それによって既存の重鎖ＣＤ３を置換し、ＣＤＲ３領域が単独で結合特異性を与えることを示したことを記載］；並びにＤｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９〜７４９（１９９６）［親の多特異性Ｆａｂ  ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみが単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイド結合Ｆａｂｐ３１３抗体の重鎖に移動することが親Ｆａｂの結合特異性の保持に十分であった移植研究を記載］を参照されたい。これらの参考文献の各々を参照によりその全体を援用する。
【０１１４】
したがって、ある種の態様内で、本発明は、マウス抗体、ラット抗体などの非ヒト抗体由来の１個以上の重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに特異的に結合することができる。一部の実施形態内で、非ヒト抗体由来の１個以上の重鎖ＣＤＲ３領域を含むこうした発明の抗体は、（ａ）対応する親非ヒト抗体と結合を競合可能であり、（ｂ）該親非ヒト抗体の機能的特性を保持し、（ｃ）該親非ヒト抗体と同じエピトープに結合し、及び／又は（ｄ）該親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。別の態様内で、本発明は、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１個以上の重鎖ＣＤＲ３領域を含むモノクローナル抗体を提供する。ここで、第１のヒト抗体は、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに特異的に結合することができ、第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３領域は、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに対する結合特異性を欠くヒト抗体におけるＣＤＲ３領域を置換して、ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに特異的に結合可能な第２のヒト抗体を産生する。一部の実施形態内で、第１のヒト抗体由来の１個以上の重鎖ＣＤＲ３領域を含むこうした発明の抗体は、（ａ）対応する親の第１のヒト抗体と結合を競合可能であり、（ｂ）該ヒト抗体の機能的特性を保持し、（ｃ）該ヒト抗体と同じエピトープに結合し、及び／又は（ｄ）該ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１５】
好ましくは、前記抗体は、更に、配列番号５のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、及び配列番号６のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２を含む。本発明者らは、配列番号５のＩｌｅ６をＶａｌで置換でき、配列番号６のＡｓｎ５をＳｅｒで置換でき、配列番号７のＰｒ１２をＧｌｎで置換でき、配列番号７のＡｓｐ１４をＧｌｙで置換できることを見いだした。好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、ＢＭＰ４の疎水性ポケットに結合する抗体。本発明者らは、配列番号１２のＧｌｕ１をＧｌｎ又はＡｓｐで、Ｉｌｅ３１をＶａｌで、Ａｓｎ５６をＳｅｒで、Ｐｒｏ１０９をＧｌｎで、Ａｓｐ１１１をＧｌｙで有害作用なしに置換できることを見いだした。
【０１１６】
ＢＭＰ４のナックルに結合する抗体
さらに、本発明者らは、ＢＭＰ４のナックルに特異的に結合可能な抗体が、ＢＭＰ２、４、５及び６に対する特異性を有することを見いだした。機能的実験によれば、これらの抗体は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４シグナル伝達を効果的に阻害することができ、より少ない程度にＢＭＰ５及びＢＭＰ６シグナル伝達も阻害することができる。
【０１１７】
本発明者らのエピトープビニング実験（実施例８）及びそれに続くＨＡＤＤＯＣＫモデリング（実施例９）によれば、この実施形態の抗体は、ＢＭＰ４のナックルに特異的に結合することができる。特に、ＨＡＤＤＯＣＫモデリングによって、ＢＭＰ４の疎水性溝残基Ａｌａ３４、Ｇｌｎ３９、Ｓｅｒ８８、Ｌｅｕ９０、Ｌｅｕ１００が、Ｅ７のＣＤＲ１及びＣＤＲ２に位置する残基との疎水性相互作用に関与することを確認した。変異実験によってこのモデリングを検証した（実施例１０）。
【０１１８】
したがって、本発明の好ましい抗体は、好ましくは残基３４、３５、３９、８６〜８８、９０、９７、９８、１００、１０２及び１０９内の、ＢＭＰ４のナックルに特異的に結合する。好ましくは、前記抗体は、Ａｌａ３４、Ｇｌｎ３９、Ｓｅｒ８８、Ｌｅｕ９０、Ｌｅｕ１００に特異的に結合する。
【０１１９】
本発明者らは、ナックルのコアに位置するすべての結合決定基がＢＭＰ間で不変であり、特に、中央のＳ８８が高度に保存されることを認めた（Ｗｅｂｅｒら、２００７）。これは、この領域のターゲティングが、ＢＭＰ４のナックルに結合する抗体を、ＢＭＰファミリーの別のメンバーに対して交差反応性にする理由を説明するものである。
【０１２０】
Ｈａｄｄｏｃｋモデリングを用いて、本発明者らは、重鎖ＣＤＲ１及びＣＲＤ２が結合に重要であることを見いだした。上述したように前記ナックルに結合可能な抗体の好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号８のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ１、及び配列番号９のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ２を含む。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、これらのＣＤＲが、ＢＭＰ４のナックルとの結合相互作用に重要であると考える。前記抗体は、好ましくは、更に、配列番号１０のアミノ酸配列又はそのアミノ酸が１個を超えて異ならない配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。極めて好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
別の一実施形態においては、配列番号８のＧｌｙ５をＳｅｒで置換することができる。好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、より好ましくは７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％同一である配列を含む、ＢＭＰ４の疎水性ポケットに結合する抗体。本発明者らは、配列番号１４のＧｌｕ１をＧｌｎ又はＡｓｐで、Ｇｌｙ３０をＳｅｒで、Ｇｌｙ５９をＳｅｒで有害作用なしに置換できることを見いだした。
【０１２２】
本発明の抗体の製造
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって製造することができる。当該技術分野で公知の種々の手順を前記エピトープに結合することができるポリクローナル抗体の製造に使用することができる。抗体の製造では、適切な担体に結合したＢＭＰ４タンパク質又はＢＭＰ４ポリペプチド断片を注射することによって種々の宿主動物を免疫することができる。適切な担体としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）及びウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ：ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が挙げられるが、それだけに限定されない。宿主動物は、好ましくは、ＢＭＰ４の残基（配列番号１）又はそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％同一である配列を含むＢＭＰ４ポリペプチドで免疫される。好ましくは、宿主動物は、ＢＭＰ４タンパク質、又はＢＭＰ４のエピトープ若しくは上で定義したその残基のいずれかを含むポリペプチドを注射することによって免疫することができる。好ましい一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の残基１０〜１７、２４〜３１、４５〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６から選択される少なくとも６個、より好ましくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の残基を含む。好ましくは、ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の１０〜１７、４５〜５６及び６９を含む。別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４のＬｙｓ１０、Ａｓｎ１１、Ｌｙｓ１２、Ａｓｎ１３、Ｃｙｓ１４、Ａｒｇ１５、Ａｒｇ１６及びＨｉｓ１７からなる群から選択される１個の残基、Ｇｌｙ４５、Ａｓｐ４６、Ｃｙｓ４７、Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ５１、Ａｌａ５２、Ａｓｐ５３、Ｈｉｓ５４、Ｌｅｕ５５及びＡｓｎ５６からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びにＳｅｒ６９を含む。別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の少なくとも残基少なくともＬｙｓ１２、Ａｒｇ１５、Ａｓｐ４６及びＰｒｏ５０を含む。別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の残基１５、４９、５０、５１、５２、５３、５４及び６９を含む。
【０１２３】
別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の残基２４〜３１、５７〜６８、７０〜７２、８９、９１、１０１、１０３、１０４及び１０６から選択される少なくとも６個、より好ましくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の残基を含む。ＢＭＰ４のＳｅｒ２４、Ａｓｐ２５、Ｖａｌ２６、Ｇｌｙ２７、Ｔｒｐ２８、Ａｓｎ２９、Ａｓｐ３０、Ｔｒｐ３１からなる群から選択される好ましくは少なくとも６個、より好ましくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の残基、Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ６０、Ａｌａ６１、Ｉｌｅ６２、Ｖａｌ６３、Ｇｌｎ６４、Ｔｈｒ６５、Ｌｅｕ６６、Ｖａｌ６７及びＡｓｎ６８からなる群から選択される少なくとも１個の残基、Ｖａｌ７０、Ａｓｎ７１及びＳｅｒ７２からなる群から選択される少なくとも１個の残基、Ｔｙｒ１０３及びＧｌｎ１０４からなる群から選択される少なくとも１個の残基、並びにＭｅｔ８９、Ｔｙｒ９１、Ｌｙｓ１０１及びＭｅｔ１０６。別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、更にＢＭＰ４のＡｓｐ３０、Ｔｒｐ３１、Ｌｅｕ６６及びＬｙｓ１０１を含む。
【０１２４】
別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、ＢＭＰ４の残基３４、３５、３９、８６〜８８、９０、９７、９８、１００、１０２及び１０９から選択される少なくとも６個、より好ましくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の残基を含む。別の一実施形態においては、前記ＢＭＰ４タンパク質又はポリペプチドは、更にＢＭＰ４のＡｌａ３４、Ｇｌｎ３９、Ｓｅｒ８８、Ｌｅｕ９０、Ｌｅｕ１００を含む。
【０１２５】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知のハイブリドーマ法によって製造することができ（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５参照）、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）若しくは当該技術分野において利用可能な別の方法によって製造することができる。一般に、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、ＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）を免疫動物の抗体産生細胞と融合させることによって製造することができる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓又はリンパ節のものは、目的抗原で免疫された動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を利用して単離することができ、限界希釈によってクローン化することができる。ハイブリドーマ細胞が増殖する培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるｍａｂの結合特異性は、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡなどの免疫沈降又はインビトロ結合アッセイによって決定される。所望の結合特性を有する抗体を産生する細胞を、適切なスクリーニングアッセイによって選択することができる。こうした単離及びスクリーニングの方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１２６】
ヒト抗体、人工抗体を含めて、ＢＭＰ４の前記エピトープ内で結合する抗体を産生又は単離する他の適切な方法を使用することができ、例えば、組換え抗体（例えば、単鎖Ｆｖ又はＦａｂ）をライブラリから選択する方法、又はヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化に依拠する方法（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５５、１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８、１９９３；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号参照）が挙げられる。
【０１２７】
ファージディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｄ  Ｊ及びＷｅｌｌｓ  Ｊ  Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６０：１１１３〜７、１９９３）、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１４１３０〜５、１９９８）、細菌ディスプレイ（Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ  Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９６：１２９〜５４、２００２）、酵母ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅ  Ｍ  Ｃら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：１３０３〜１０、１９９７）などの濃縮技術を用いたライブラリからの抗体断片の選択は、古典的ハイブリドーマ技術の成功代替法であることが判明した（例えば、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１：３６４〜７０、２０００参照）。
【０１２８】
特定の立体構造エピトープに結合する抗体を製造する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書で教示する配列の相同配列を、抗体が単離されたラマのＶＨＨレパートリーのＤｅｅｐ配列決定（次世代配列決定（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））によって作製することができ、抗体のホモログを作製することができる。それは、（ＭｃＣｏｙら、Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、１０、ｅ１００４５５２、２０１４に記載のように）中間体配列を確認することによってＶＨＨの成熟プロセスに至る変異さえもたらす。
【０１２９】
本発明の変異抗体は、ファミリー特異的ライブラリをスクリーニングすることによって適切に作製することができる。本明細書に記載の抗体の可変ＣＤＲ３の最終アミノ酸に基づく縮重プライマーを設計し、それをＦＲ１にアニールするプライマーと一緒に使用して、本明細書に記載の抗体のファミリーメンバーの選択に使用されるラマのＲＮＡからサブライブラリを作製することによって、ＶＨＨレパートリー中に存在するが増幅される。こうしたファミリーライブラリから本明細書に記載の同じ条件で選択すると、同じエピトープに結合するＶＨＨが生成する（Ｋｏｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５；１９１１６〜１９１２４、２０１０参照）。
【０１３０】
抗体がエピトープに結合するかどうかを確認する方法は、当該技術分野で公知である。適切には、ある抗体が特定の立体構造エピトープに結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを本明細書に記載のドッキング又は構造決定と組み合わせる。ＢＭＰ４に結合する任意のＶＨＨによって標的とされるエピトープは、例えば、本明細書に記載のＣ４又はＣ８抗体との競合によって試験することができる。ドッキング、Ｐｅｐｓｃａｎ又は最終的にＶＨＨ−ＢＭＰ４共結晶の構造決定を使用して、結合部位を正確に決定することができる。
【０１３１】
変異抗体
本発明の前記エピトープに対して、又は本発明の免疫原性エピトープを含むタンパク質に対して産生される任意の抗体（好ましくは、（例えば、トランスジェニックマウスにおいて産生される）ネズミモノクローナル抗体、ウサギ、ヤギ、ラマ又はヒト抗体）が親抗体である。前記親抗体は、更に、当該技術分野で周知の方法によって改変して、抗体のキメラ体又はヒト化体を形成することができる。こうしたキメラ又はヒト化抗体は、更なる変異又は変異誘発のための親抗体として働き得る。本発明の親抗体は、例えばＣＤＲ領域（単数又は複数）内で、更に変異誘発されて、目的の性質、例えば、結合親和性、ＩＣ５０、特異性などが最適化された変異抗体を生成することができる。アミノ酸置換変異抗体は、好ましいものであり、親抗体分子の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入される。置換変異誘発の最も興味を集める部位としてはＣＤＲ領域が挙げられるが、ＦＲの改変も企図される。保存的アミノ酸置換が好ましい。こうした置換が抗体の生物活性の変化をもたらす場合、より実質的な変化、すなわち、非保存的アミノ酸変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
【０１３２】
置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。手短に述べると、幾つかのＣＤＲ領域部位を変異させて、各部位においてすべての可能なアミノ酸置換を生成させる。こうして作製された抗体変異体は、一価の形で繊維状ファージ粒子から各粒子内に収容されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として示される。次いで、ファージディスプレイ変異体を、本明細書に開示するように、その生物活性（例えば、結合親和性、特異性、ＩＣ５０）についてスクリーニングする。改変のためのＣＤＲ領域部位候補を特定するために、アラニンスキャンニング変異原を実施して、抗原結合性に大きく寄与するＣＤＲ領域残基を特定することができる。あるいは、又はさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とＢＭＰ４の接触点を特定することも有益であり得る。こうした接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述する技術又は当該技術分野で公知の技術による置換の候補である。あるいは、又はさらに、ＣＤＲが可変領域に作動可能に結合している間、又はＣＤＲが他の可変領域配列と無関係である間、ランダム変異導入を１個以上のＣＤＲ配列に対して１個以上の残基位置において実施することができ、次いで改変されたＣＤＲを組換えＤＮＡ技術によって可変領域に戻す。こうした変異抗体が作製され、発現されると、変異体の一団を本明細書に記載のスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた性質を有する抗体を更なる発生のために選択することができる。
【０１３３】
本発明の抗ＢＭＰ４抗体の適切な立体構造の維持に関与しないシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防止することができる。逆に、システイン結合（単数又は複数）を抗体に追加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１３４】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変化させる。変化とは、抗体中に存在する１個以上の炭水化物成分の欠失、及び／又は親抗体中に存在しない１個以上のグリコシル化部位の追加を意味する。
【０１３５】
抗体又はその抗原結合断片のグリコシル化は、一般に、Ｎ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付加を指す。Ｘがプラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物成分の酵素付加のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のどちらかがポリペプチド中に存在すると、潜在的グリコシル化部位が生成する。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖Ｎ−アセチル（ａｃｅｙｌ）ガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１種の付加を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを使用することもできる。
【０１３６】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上記トリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによってなされる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、元の抗体の配列への１個以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０１３７】
本発明に係る抗体は、好ましくは、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体はラクダ科動物起源とすることができ、したがってラクダ科動物フレームワーク領域に基づき得る。あるいは、ＣＤＲは、他の抗体ドメイン、例えば、それだけに限定されないが、ＶＮＡＲ又はヒトＶＨＨフレームワーク領域の上に移植することができる。本発明の好ましい一態様においては、本発明の前記抗体は、単一ドメイン抗体、好ましくはＶＨＨである。それらのより小さいサイズ、及びタンパク質の隠れた溝に達するそれらの能力によって、それらはＢＭＰ特異的阻害の付与に極めて有効である。単一ドメイン抗体の使用は、ハイブリドーマ細胞株から産生される抗体とは対照的に、それらが容易かつ安価に大量に産生できるので有利でもある。さらに、ハイブリドーマ系は、不安定な場合があり、抗体発現レベルを経時的に減少させる。単一ドメイン抗体又は結合断片は、その血漿中半減期が短く、イメージングに必要な速いコントラスト−ノイズ比が得られるので、分子イメージング用途にも有利である。
【０１３８】
好ましくは、本発明の抗体はヒト化抗体である。その利点は、ヒト化抗体が、ヒトに使用されたときに、免疫原性の少ないことである。
【０１３９】
上記配列のＶＨ領域との相同性が高い（すなわち、８０％以上）ＶＨ領域を有する抗体は、配列番号１１、１２及び１４をコードする核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性変異誘発）と、それに続く本明細書に記載のアッセイによるコードされた改変抗体の保持された機能の試験によって得ることができる。
【０１４０】
別の好ましい一実施形態においては、前記抗体は、配列番号１１、１２又は１４と実質的に同一の配列を有し得る。実質的に同一の配列は、１つ以上の保存的アミノ酸変異を含み得る。参照配列に対する１つ以上の保存的アミノ酸変異は、参照配列に比べて生理学的、化学的又は機能的特性が実質的に変わらない変異ペプチドを生成できることが当該技術分野で知られており、こうした場合、参照配列と変異配列は、「実質的に同一の」ポリペプチドであると考えられる。
【０１４１】
保存的アミノ酸変異としては、アミノ酸の付加、欠失又は置換が挙げられ、非限定的一例においては、保存的アミノ酸変異は保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を化学的性質（例えば、サイズ、電荷又は極性）が類似した別のアミノ酸残基で置換することと本明細書では定義される。
【０１４２】
保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性又は酸性アミノ酸を同じグループの別のアミノ酸で置換することができる。「塩基性アミノ酸」という用語は、一般に生理的ｐＨにおいて正に帯電した、側鎖ｐＫ値が７を超える親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が挙げられる。「中性アミノ酸」（さらに、「極性アミノ酸」）という用語は、生理的ｐＨにおいて無電荷である側鎖を有するが、２個の原子によって共有される電子対が原子の一方によってより近くに保持される少なくとも１個の結合を有する、親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が挙げられる。「疎水性アミノ酸」（さらに、「非極性アミノ酸」）という用語は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス疎水性スケール（１９８４）に従って疎水性がゼロを超えるアミノ酸を含むものとする。疎水性アミノ酸としては、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が挙げられる。
【０１４３】
「酸性アミノ酸」とは、一般に生理的ｐＨにおいて負に帯電した、側鎖ｐＫ値が７未満の親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸としては、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が挙げられる。
【０１４４】
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも７０％同一であり得る。別の一例においては、実質的に同一の配列は、本明細書に記載の配列とアミノ酸レベルで少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であり得る。重要なことには、実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。当業者には知られているように、特にフレームワーク領域内の、抗体のアミノ酸残基は、抗体の機能的特性（抗原認識及び結合）に影響せずに、変異（置換又は欠失）させることができる。
【０１４５】
多量体抗体
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１種の抗体を含む多量体抗体に関する。前記多量体抗体は、好ましくは、本発明に係るその少なくとも２種の抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体が、本明細書に定義したエピトープに対してより高い親和性を有することである。
【０１４６】
本発明の多量体抗体の好ましい一実施形態においては、前記多量体抗体は、本発明の抗体のホモ二量体である。より好ましくは、前記抗体は、単一ドメイン抗体、より好ましくはＶＨＨである。前記ホモ二量体の利点は、ＢＭＰ４に対するその高い親和性（ＫＤ＝９．７ｐＭ）であり、これは、ノギン（ＫＤ＝９１ｐＭ、表１）の１０倍、ＢＭＰＲ１ａ（ＫＤ＝６３５ｐＭ）の７０倍である。さらに、ＢＭＰ４下流シグナル伝達に対するその抑制効果及びそれに続く転写阻害は、ノギンに類似していることが判明した（図１３Ａ）。
【０１４７】
好ましくは、前記多量体抗体は、少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種の本発明の抗体を含む。好ましい一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のリストの疎水性溝に結合可能な少なくとも２種の前記抗体を含む。その利点は、この実施形態に係る多量体抗体のＢＭＰ４に対する親和性が改善され、ＢＭＰ４シグナル伝達に対する抑制効果も改善されることである。この実施形態の前記多量体抗体は、実施例に記載のＣ４Ｃ４によって例示されるように、ＢＭＰ４に対して極めて高い親和性（ＫＤ９．７ｐＭ）を有することが判明し、それはノギン（ＫＤ９１ｐＭ）の１０倍、ＢＭＰＲ１ａ（ＫＤ６３５ｐＭ）の７０倍である。その結果、それは、ＢＭＰ４シグナル伝達に対して極めて強力な中和活性を示す。ノギンとは対照的に、この実施形態に係る多量体抗体は、相同性の高いＢＭＰ２、並びにＢＭＰ５、６及び７を含めた他のＢＭＰのシグナル伝達に影響しない。
【０１４８】
別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合可能な少なくとも２種の前記抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体のＢＭＰ４及びＢＭＰ２に対する親和性が改善され、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２シグナル伝達に対する抑制効果も改善されることである。さらに、こうした多量体抗体は、ほぼノギンのレベルまで、ＢＭＰ活性を著しく抑制する能力を有する。特に、低用量のこの実施形態に係る多量体抗体は、腸細胞培養物の維持においてノギンと同程度に有効であることが示された。組換えノギンは高価であるので、この実施形態に係る多量体抗体は、これらのタイプの培養物のより安価な代替品になり得る。
【０１４９】
別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、上述したようにＢＭＰ４のナックルに結合可能な少なくとも１種の抗体、及び上述したようにＢＭＰ４の疎水性ポケットに結合可能な１種の抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体が、ノギンのレベルまで、ＢＭＰ活性を著しく抑制する能力を有することである。この実施形態に係る多量体抗体は、結合し、ＢＭＰ５活性化に対してわずかな効果を示す（図１３Ｃ）。
【０１５０】
多量体抗体を製造する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、欧州特許出願公開第１２９３５１４号Ａ１及び国際公開第１９９４００４６９１号Ａ２に記載されている。
【０１５１】
別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、本発明の前記抗体の少なくとも１種、及びアルブミン又はＩｇＧを含めて、ただしそれだけに限定されない血清タンパク質に結合する１種の抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体の血清中の半減期が長く、それによって治療効果を高めることができることである。
【０１５２】
別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、本発明の前記抗体の少なくとも１種、及び炎症誘発性ペプチドサブスタンスＰなどの障壁を越えるトランスポーターとして役立つ１種の抗体を含む。その利点は、こうした多量体抗体が血中の送達のために経口又は経鼻送達できることである。
【０１５３】
別の一実施形態においては、前記多量体抗体は、本発明の前記抗体の少なくとも１種、及び治療学的Ｉｇ様ドメイン、毒性タンパク質又はペプチド、放射性物質を含めて、ただしそれだけに限定されない治療薬を含む。その利点は、こうした多量体抗体が高い治療効果を有することである。
【０１５４】
本発明の多量体抗体は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によって製造することができる。例えば、決して限定するものではないが、多量体化は、国際公開第２００３／０４６５６０号に記載のように、自己組織化分子を用いて行うことができる（Ｚｈａｎｇら、２００４；Ｍｅｒｒｉｔｔ＆Ｈｏｌ、１９９５）。記載の方法は、本発明の抗体及びＡＢ５毒素ファミリーのＢサブユニットの五量体化ドメインを含む融合タンパク質を発現することによって、五価抗体（ｐｅｎｔａｂｏｄｉｅｓ）を生成する（Ｎｉｅｌｓｏｎら、２０００）。五量体化ドメインは五量体を構築し、それによって抗体の多価ディスプレイが形成される。五量体の各サブユニットは、同じでも異なっていてもよい。さらに、五量体化ドメインは、リンカーを用いて抗体又は抗体断片に連結することができ、こうしたリンカーは、２個の分子の柔軟な付加のために十分な長さ及び適切な組成のものとすべきであるが、抗体の抗原結合性を妨害してはならない。非限定的一例においては、リンカーを本明細書に記載のＧＳリンカーとすることができる。
【０１５５】
本発明の多量体抗体の他の形態も本発明によって包含される。例えば、限定するものではないが、抗体は、二量体、三量体、又は任意の他の適切なオリゴマーとして存在することができる。これは、当該技術分野で公知の方法、例えば、直接連結（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９６）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９６）、「Ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ」相互作用（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６）によって行うことができる。
【０１５６】
多量体化のための当該技術分野で公知の別の方法は、Ｆｃ領域を用いて抗体を二量体化することである。この手法では、発現ベクターに挿入されたＦｃ遺伝子；抗体のＣ末端が余分な残基の付加なしにＦｃのヒンジ領域に連結されるように、抗体のヌクレオチド配列を増幅し、ベクターに挿入することができる。生成したベクターを細胞に移入し、融合タンパク質を組換えによって発現させ、次いでアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡカラム）によって精製することができる。こうした多量体化方法の非限定的一例がＢｅｌｌら（２０１０）及びＩｑｂａｌら（印刷中）によって記述されている。こうした二量体化を実施する技術は、当業者に既知であると考えられる。
【０１５７】
好ましくは、本発明に係る抗体をリンカーを用いて別の抗体に結合させる。好ましい一実施形態においては、前記リンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸を含む。好ましい一実施形態においては、前記リンカーは、各々がアミノ酸（ａｍｉｎｉｎｏ  ａｃｉｄ）配列ＧＧＧＧＳを有する２個の連続ペプチドスペーサを含む。極めて好ましい一実施形態においては、前記多量体抗体は、好ましくは配列番号１１、１２又は１４を含む、ホモ二量体である。
【０１５８】
一部の実施形態内で、非ヒト抗体由来の１個以上の重鎖ＣＤＲ３領域を含む本発明に係るこうした抗体は、（ａ）対応する親非ヒト抗体と結合を競合可能であり、（ｂ）該親非ヒト抗体の機能的特性を保持し、（ｃ）該親非ヒト抗体と同じエピトープに結合し、及び／又は（ｄ）該親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１５９】
本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の一実施形態においては、本発明は、本発明の抗体のいずれかと同じＢＭＰ４のエピトープに結合する抗体を提供する（すなわち、本明細書に教示するように、ＢＭＰ４エピトープとの結合を交差競合する能力を有する抗体を提供する）。一部の実施形態においては、交差競合研究の基準抗体を本発明に係る抗体とすることができる。こうした交差競合抗体は、標準結合アッセイにおいて本明細書に開示した抗体と交差競合するその能力に基づいて同定することができる。
【０１６０】
造影剤
本発明は、検出可能な剤に連結された本発明に係る抗体を含む分子造影剤も包含する。例えば、本発明の抗体は、放射性同位体、ガドリニウム、酸化鉄などの常磁性標識、蛍光団、近赤外（ＮＩＲ：Ｎｅａｒ  Ｉｎｆｒａ−Ｒｅｄ）蛍光色素若しくは染料、エコー源性微泡、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素、又は画像診断法によって検出することができる任意の他の適切な剤に連結することができる。特定の非限定的一例においては、抗体は、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ：ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）造影色素、例えば、限定するものではないが、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０又はＤｙｌｉｇｈｔ８００に連結することができる。
【０１６１】
本発明の抗体は、抗体の発現、検出又は精製を助ける追加の配列を含むこともできる。例えば、限定するものではないが、抗体は、ターゲティング若しくはシグナル配列（例えば、それだけに限定されないが、ｏｍｐＡ）、検出タグ（例えば、それだけに限定されないが、ｃ−Ｍｙｃ）、精製タグ（例えば、それだけに限定されないが、ヒスチジン精製タグ、ＨＨＨＨＨＨ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。好ましい一実施形態においては、抗体は、少なくとも１個の反応性Ｃｙｓ若しくは１個のＬｙｓ又はこれらのアミノ酸の組合せを含むアミノ酸配列［リンカー］をＣ末端に含み、それに種々の標識を連結して、これらの分子を、造影、例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又は光学造影のような技術を用いた非侵襲性造影に適切なものにすることができる。
【０１６２】
医薬組成物
別の一態様においては、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に処方される、１種の抗ＢＭＰ４抗体、又は複数の抗ＢＭＰ４抗体若しくはその抗原結合部（単数又は複数）の組合せ、好ましくは本明細書に教示する抗体を含む、組成物、例えば、医薬組成物を使用した。ＢＭＰ４に結合する抗体又はその抗原結合部を含む医薬組成物は、当該技術分野で周知であり、例えば、特許文献１により詳細に記述されている。しかし、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍に対するそれらの使用は、本発明以前には開示されていない。こうした組成物は、１種又は（例えば、２種以上の）抗体の組合せ又は多量体抗体を含むことができる。適切には、本発明の抗体又は多量体抗体を使用する。本発明の医薬組成物は、併用療法で投与することもでき、すなわち、別の剤と組み合わせることもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１種の別の抗炎症薬又は免疫抑制薬と組み合わせた、好ましくは本明細書に教示した、抗ＢＭＰ４抗体を含むことができる。本明細書では「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などを含む。一般に、担体は、（例えば、注射又は注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に適切である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の抗体、又はその抗原結合断片、又は多量体抗体を、酸の作用、及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護する材料で被覆することができる。
【０１６３】
本発明の医薬化合物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物作用を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ、６６：１〜１９（１９７７）参照）。こうした塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒の無機酸、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
【０１６４】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物において採用することができる適切な水系及び非水系担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及び適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１６６】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などのアジュバントを含むこともできる。微生物の存在の防止は、上記滅菌処置と種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方によって確保することができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用剤形の吸収は、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンなどの吸収を遅らせる剤の包含によって延長することができる。
【０１６７】
薬学的に許容される担体としては、無菌水溶液又は分散物、及び無菌注射液又は分散物を即座に調製するための無菌粉体が挙げられる。薬学的活性物質のためのこうした媒体及び剤の使用は、当該技術分野で公知である。従来の媒体又は剤が活性化合物に不適合な場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補充の活性化合物を組成物に混合することもできる。治療用組成物は、一般に、製造及び貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適切な他の秩序構造物として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収は、吸収を遅らせる剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に入れることによって延長することができる。
【０１６８】
無菌注射液は、必要に応じて、必要量の活性化合物を適切な溶媒中で上記成分の１種類又は組合せと混合し、続いて滅菌精密濾過して調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒及び上記のものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉体の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望成分との粉末を、あらかじめ無菌濾過したその溶液から生成する、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１６９】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置対象及び特定の投与方法に応じて変わる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分約０．０１パーセント〜約９９パーセント、典型的には活性成分約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も典型的には約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１７０】
好ましい実施形態においては、医薬組成物は、更に抗癌剤を含むことができる。
【０１７１】
白金錯体などの抗癌剤は、種々の癌の処置に有用であることが知られている。癌の例示的種類としては、肺癌、精巣癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、頭頚部癌、食道癌又は胃癌が挙げられるが、それだけに限定されない。これらの癌タイプのすべてが、白金錯体に基づく又は白金錯体を含む抗癌剤で処置可能であることが知られており、これらのタイプの癌の処置に使用される抗癌剤に対して耐性を生じることも知られている。
【０１７２】
好ましい一実施形態においては、前記抗癌剤は白金錯体を含む。好ましい一実施形態においては、特異的抗ＢＭＰ４抗体をシスプラチンと併用する。別の好ましい一実施形態においては、前記特異的抗ＢＭＰ４抗体は、配列番号１の残基１０〜１７、４５〜５６及び６９内で結合する抗体、又は前記抗体と競合する抗体である。
【０１７３】
ＢＭＰ４抗体の医学的使用
上記利点のため、本発明に係る抗体は、ＢＭＰ４媒介性シグナル伝達を阻害する必要がある対象の医学的処置における使用に極めて適している。したがって、本発明は、更に、医学的使用のための本明細書に定義した抗体、多量体抗体又は組成物に関する。前記抗体、多量体抗体及び組成物は、ＢＭＰ４媒介性障害の診断及び処置を含む多数のインビトロ及び生体内診断及び治療上の有用性を有する。抗ＢＭＰ４／２抗体の医学的使用は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献１に記載されている。例えば、これらの分子を培養細胞にインビトロ若しくは生体外で、又はヒト対象に、例えば生体内で、投与して、種々の障害を処置、防止及び診断することができる。これらの障害は、好ましくは、本発明に係る抗体を用いて処置、防止又は診断される。本明細書では「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含むものとする。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物を含む。好ましい対象としては、ＢＭＰ４活性によって媒介される障害を有するヒト患者が挙げられる。ＢＭＰ４発現又は機能によって媒介される障害を有するヒト患者を処置する方法が特に適切である。一部の実施形態においては、前記ヒト患者は、ＳＭＡＤ４欠損腫瘍に罹患している。ＢＭＰ４に対する抗体を別の剤と一緒に投与するときには、２つを順に又は同時に投与することができる。
【０１７４】
ＢＭＰ４に対する本発明の抗体の特異的結合を考慮すると、本発明の抗体を使用して、細胞及び組織によるＢＭＰ４発現を特異的に検出することができ、さらに、それを使用して、免疫親和性精製によってＢＭＰ４を精製することができる。
【０１７５】
ＢＭＰ４は、炎症並びに異常な骨形成及び骨化を含む種々の疾患に関連する。これらの疾患としては、共に脊髄の炎症、著しい疼痛、及び機能障害を特徴とする脊椎関節炎（ＳｐＡ）疾患が挙げられる。ＳｐＡ疾患としては、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性脊椎関節炎、反応性脊椎関節炎、炎症性腸疾患に付随する脊椎関節炎、及び未分化脊椎関節炎が挙げられる。特に、本発明の本明細書に定義した抗ＢＭＰ４抗体、多量体抗体又は組成物は、強直性脊椎炎（ＡＳ：ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、別の脊椎関節症、並びに通常は仙腸関節炎及び付着部炎に起因する、炎症性背痛を一般に特徴とする関連する炎症性リウマチ性疾患の処置に有効であり得る。したがって、本発明は、本明細書の本発明に係る抗体、多量体抗体又は組成物を対象に投与するステップを含む上記疾患を処置する方法を包含する。
【０１７６】
さらに、これらの抗体は、糸球体硬化症（Ｔｏｍｉｎａｇａら、２０１１）、低酸素性肺高血圧（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０１０）など、他のＢＭＰではなくＢＭＰ４が特異的な病原性の役割を果たし得るある疾患において、臨床診断及び治療上の使用の可能性さえ有し得る。したがって、極めて好ましい実施形態においては、本明細書に記載の抗体、多量体抗体又は組成物は、他のＢＭＰではなくＢＭＰ４が特異的な病原性の役割を果たし得る疾患の処置に、より好ましくは糸球体硬化症の処置に、使用される。
【０１７７】
さらに、ＢＭＰ４だけでなく、ＢＭＰ２（ＢＭＰ４のリストの疎水性ポケットに結合する抗体など）、ＢＭＰ２、５及び６（ＢＭＰ４のナックルに結合する抗体など）も阻害する本発明の抗体は、複数のＢＭＰが疾患発生において病原性の役割を果たす疾患に使用することもできる。例えば、不特定の化学阻害剤による無差別なＢＭＰ阻害は、乳癌（Ｏｗｅｎｓら、２０１４）、肺癌（Ｈａｉｏら、２０１４）及び前立腺癌（Ｌｅｅｔら、２０１１）における転移の抑制に有効であることが判明した。それらは、慢性腎疾患における内皮障害及び骨形成分化の防止に有効であることも判明し（Ｋａｊｉｍｏｔｏら、２０１４）、関節硬化における血管炎症、石灰化及び骨形成活性を減少させる（Ｄｅｒｗａｌら、２０１２）。ノギンなどの天然阻害剤は、異所性骨化（Ｙｕら、２００８）及び肺癌増殖の抑制（Ｆｅｅｌｅｙら、２００６）に有効であることも判明した。しかし、ＴＧＦβ、ｗｎｔなどの別のシグナル伝達経路の阻害などのその的確でない効果のために、その治療可能性には議論の余地がある。例えば、ＢＭＰ機能の無差別阻害は、休止状態の転移性乳腺腫細胞を活性化し（Ｇａｏら、２０１２）、又は結腸腫瘍量を生体内で増加させ得る（Ｗｈｉｓｓｅｌｌら、２０１４）。幾つかの別の研究は、こうした阻害剤の臨床可能性を更に議論している（Ｖｏｇｔら、２０１１）。
【０１７８】
ノギンよりも親和性が高く、的確でない効果も少ない本発明に係る抗体が提供されるので、それらは、現行のＢＭＰ阻害剤の臨床及び研究適用に影響する制約を克服するのにより適している。
【０１７９】
本発明は、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子も包含する。前記核酸分子の配列は、コドンが最適化されてもよい。本発明は、今記述した核酸を含むベクターも包含する。
【０１８０】
上記開示は、本発明を全般的に説明するものである。別段の記載がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができ、これらの具体例は、単なる説明のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：免疫化
組換えＢＭＰ４をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、製造者の手順に従って処理した。ＢＭＰ４を４ｍＭ  ＨＣｌに０．１ｍｇ／ｍｌで溶解させ、５０μｇをＰＢＳ（１ｍｌ）に希釈し、アジュバントＳｔｉｍｕｎｅ１ｍｌと混合し、以下のスケジュールに従って２匹のラマ（ラマ＃１８−２及びラマ＃３１−２）に筋肉内注射した：０日目、１４日目、２８日目及び３５日目の免疫処置。血液を０日目（免疫前）及び４３日目（免疫）に採取した。４３日目の多量の採血をＰＢＬ単離及びＲＮＡ抽出に使用した。
【０１８２】
免疫応答
ＢＭＰ４に対する免疫応答を４３日目（免疫処置及びＰＢＬ単離の最後）に採取した血清で測定し、０日目（免疫前）の血清で測定したシグナルと比較した。ＢＭＰ４をＭａｘｉｓｏｒｐプレートのウェル１個当たり２００ｎｇで被覆し、免疫前の血清（０日目）及び免疫血清（４３日目）の段階希釈物を用いてＥＬＩＳＡを行った。両方のラマの免疫血清は、免疫前の血清とは対照的に、固定ＢＭＰ４に結合した（図１）。免疫血清の測定シグナルは、非被覆ウェルではシグナルが検出されず、特異的であった（図１）。ポリクローナル抗ＶＨＨ（Ｋ９７６）を検出に使用したので、測定シグナルは重鎖抗体応答のみである。
【０１８３】
実施例２：ライブラリ構築
ＶＨＨライブラリの構築
４３日目に採取した血液から精製したリンパ球からＲＮＡを単離した。血液をフィコール勾配上で層状にし、遠心分離した。リンパ球層を単離し、洗浄し、溶解した。ＲＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍで測定し、ＲＮＡの品質をゲル電気泳動によって評価した（図３）。
【０１８４】
約４０μｇのＲＮＡを逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎｉｇｅｌ  ＰＣＲ清浄化カラム上で清浄化した。ＩＧ  Ｈ（従来と重鎖の両方）断片をプライマーを用いてリーダー配列領域及びＣＨ２領域をアニーリングして増幅させた。それぞれＶＨＨ及びＶＨを表す２個のＤＮＡ断片（約７００ｂｐ及び９００ｂｐ）を増幅させた（図２）。
【０１８５】
増幅されたＶＨＨ断片をゲルから切り取り、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎｉｇｅｌカラムを用いて抽出した。続いて、ネステッドＰＣＲを利用して、７００ｂｐ断片の５’にＳｆｉＩ部位を導入した。生成したＰＣＲ断片をＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎｉｇｅｌカラムを用いて清浄化し、続いて溶出ＤＮＡをＢｓｔＥＩＩ（ＩＧ  Ｈの内部制限部位）及びＳｆｉＩで消化した。消化されたＤＮＡをアガロースゲル上で分離し、４００ｂｐ断片をゲルから単離した（図４）。
【０１８６】
精製４００ｂｐ断片（約３３０ｎｇ）をファージミドｐＵＲ８１００（約１μｇ）に連結し、ＴＧ１中に転換した。形質転換体の数（＝ＶＨＨライブラリのサイズ）を、救出されたＴＧ１培養物の希釈物から計算した（図５）。ライブラリサイズは、両方のライブラリで約２ｘ１０７であった。
【０１８７】
挿入頻度は、１２個のランダムクローンを各ライブラリから選択し、コロニーＰＣＲを行うことによって決定した。挿入頻度は、１００％であることがわかった。
【０１８８】
実施例３：抗ＢＭＰ４の選択
ファージ−ディスプレイ選択
抗ＢＭＰ−４を選択するのに２回の選択を必要とした。１回目の選択（ＲＩ）は、ごく少数のバインダーしか生成せず、抗原なしに比べて溶出ファージはほとんど濃縮されなかったのに対して（図６Ａ）、ＢＭＰ−４に対する２回目（ＲＩＩ）の選択は、ファージ希釈物においてＲＩと比較して産物及び濃縮が大きく改善される（図６Ｂ）。
【０１８９】
モノクローナルＶＨＨのスクリーニング
４７個の単一クローンを０．２μｇ／ｍｌのＢＭＰ４に対して各ライブラリ（ライブラリ１８−２カラム１〜６；ライブラリ３１−２カラム７〜１２）から選択された産物から選択した。ウェルＨ６及びＨ１２は、空のプラスミドを含む大腸菌ＴＧ１を含んだ。クローンをディープウェル９６ウェルプレート中で増殖させ、ＶＨＨ産生をＩＰＴＧを用いて誘導した。これらのクローンから作製されたペリプラズム画分を使用して、ＢＭＰ４との結合についてＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを２μｇ／ｍｌのＢＭＰ４で被覆した。ＰＢＳ中の４％脱脂乳（ＭＰＢＳ：Ｍｉｌｋ  ｉｎ  ＰＢＳ）を用いて１時間ブロッキング後、プレートを２％ＭＰＢＳ中でペリプラズムと一緒に２時間インキュベートした。抗ＶＨＨポリクローナル抗体、続いてペルオキシダーゼに結合した二次抗ウサギによって、結合ＶＨＨを１時間検出した。最終検出及びプレートリーダーを用いた４９０ｎｍにおける読み取りにＯＰＤを使用した。図７は、ＢＭＰ４に対するＶＨＨ  ＥＬＩＳＡの結果であり、幾つかの陽性クローンを識別することができる。免疫応答の結果と一致してライブラリ３１−２よりもライブラリ１８−２により多くのバインダーが見られ、ラマ３１−２に比べてラマ１８−２の血清中でわずかに高い免疫応答を測定した。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡシグナル及びＨｉｎｆＩフィンガープリントに基づいて、１５個のクローン（ライブラリ１８−２から９個のクローン及びライブラリ３１−２から６個のクローン）の配列を決定した。
【０１９１】
ＶＨＨ  Ａ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ８、Ｅ７及びＦ３を大規模製造用に選択した。ＶＨＨ発現をＩＰＴＧを用いて誘導し、ＴＡＬＯＮを用いてペリプラズムから精製した。精製ＶＨＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８Ａ）。
【０１９２】
固定ＢＭＰ４に対するＶＨＨ  Ｃ４、Ｃ８及びＥ７の結合を用量反応ＥＬＩＳＡによって測定して、それらの見かけの親和性を評価した（図８Ｂ）。Ｃ８の見かけの親和性はＣ４よりもわずかに高いように見え、Ｅ７は、３種のＶＨＨのうち親和性が最低であるように見えた。
【０１９３】
実施例４：二頭部構築
ＢＭＰ４に対する二価及び二重特異性ＶＨＨの構築
ＶＨＨ  Ｃ４、Ｃ８及びＥ７のＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅した。種々のプライマーセットを設計してＶＨＨを増幅した。Ｎ末端ＶＨＨの３’及びＣ末端ＶＨＨの５’におけるプライマーは、ペンタペプチド「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」（ＧＳリンカー）の繰り返しを２回コードし、又はペンタペプチドをコードしなかった。これらの同じプライマーは、ユニークな制限部位（ＢａｍＨＩ）を含む。Ｎ末端に位置するＶＨＨの５’におけるプライマー及びＣ末端ＶＨＨの３’におけるプライマーは、コードされたプラスミドである。
【０１９４】
ＰＣＲ増幅後、Ｎ末端に位置するＶＨＨの場合はユニークなＮ末端制限部位（ＳｆｉＩ）及びＢａｍＨＩで、Ｃ末端に位置するＶＨＨの場合はＢａｍＨＩ及びユニークなＣ末端制限部位（ＢｓｔＥＩＩ）で生成断片を消化した。断片を発現ベクターに連結し、ＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化した。
【０１９５】
以下の二頭部：Ｃ４ホモ二頭部、Ｃ８ホモ二頭部及びＣ８−Ｅ７ヘテロ二頭部を２バージョン、すなわちリンカー長さが１０アミノ酸の１つ（２倍ＧＳリンカー）及び２０アミノ酸の別のバージョン（４倍ＧＳリンカー）で構築した。
【０１９６】
このようにして構築されるＶＨＨ二頭部を、ＩＰＴＧ誘導後に大腸菌中で産生することができる。形成された二頭部は、ＰｅｌＢシグナル配列の存在のために、ペリプラズム中に分泌される。
【０１９７】
実施例５：インビトロ活性
抗ＢＭＰ４  ＶＨＨは、ＢＭＰ４媒介性シグナル伝達に結合し、阻害する。
これらの抗ＢＭＰ４  ＶＨＨがＢＭＰ４に結合するだけでなく、そのシグナル伝達も阻害するかどうかを試験するために、本発明者らは、基礎レベルのＳＭＡＤ１／５／８リン酸化のない正常な扁平上皮食道細胞株であるＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞においてＢＭＰ４刺激後にＳＭＡＤのリン酸化を阻害するその能力を試験した。試験したＶＨＨはすべて、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化を阻害することができた（図９Ａ）。ＶＨＨ  Ａ１、Ｃ４、Ｃ８及びＥ７は、ＢＭＰ４媒介性ＳＭＡＤ活性化を完全に阻害することができ、ＶＨＨ  Ｃ３は、それらよりも有効でなかった。ヒトとマウスのＢＭＰ４は相同性の高い分子であるので（それらの成熟領域における相同性９７％）、本発明者らはＶＨＨがマウスＢＭＰ４シグナル伝達も阻害するかどうか試験した。ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞をマウスＢＭＰ４で刺激し、ｐＳＭＡＤ活性化をウエスタンブロット法によって検出した。種々のＶＨＨの同じパターンのシグナル伝達阻害を確認した（図９Ｂ）。これは、本発明者らのＶＨＨがヒトＢＭＰ４媒介性活性化だけでなくマウスＢＭＰ４媒介性活性化も防止できることを示している。
【０１９８】
細胞培養
ヒトｈＴＥＲＴ不死化食道細胞株ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴは、ペンシルベニア大学、フィラデルフィア、ペンシルベニア、ＵＳＡのＡ．Ｒｕｓｔｇｉ教授の好意によって提供された（Ｈａｒａｄａら、２００３）。１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１ｎｇ／ｍｌのヒト組換え上皮成長因子（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＫＳＦＭ培地を用いてＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞を培養した。（ＢＭＰ活性のためのレポータープラスミドが安定に移入された）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞は、Ｄｒ．Ｌ．Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ及びＤｒ．Ｄ．Ｒｉｆｋｉｎの好意によって提供された（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇら、２００７）（ニューヨーク大学、医学部、ニューヨーク、ＮＹ、ＵＳＡ）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び７００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ＳＡＳ、トゥールーズ、フランス）を補充した完全ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中でＣ２Ｃ１２細胞を培養した。
【０１９９】
ウエスタンブロット
ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化をインビトロで検出するために、ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴを２４ウェルプレート中で培養し、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６又はＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、表示濃度のＶＨＨを用いて、又は用いずに、４時間活性化した。活性化後、各ウェルを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｎｄｓｍｅｅｒ、オランダ）を含むＭ−ＰＥＲ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）１００μｌを用いて溶解した。細胞片をペレット化し、上清を収集した。次いで、タンパク質１５μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アムステルダム、オランダ）上に移した。次いで、ブロットを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を補充したトリス緩衝食塩水中の５％乳を用いて室温で１時間ブロックし、ＴＢＳＴで洗浄後、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で抗ホスホＳＭＡＤ１／５／８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗βアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）又は抗ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一緒に４℃で終夜インキュベートした。次いで、ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳＴ中の１：２０００西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化二次抗体中で室温で１時間インキュベートした。最後にＴＢＳＴで洗浄後、ブロットをＬｕｍｉＧｌｏｗ（ＢＩＯＫＥ、ライデン、オランダ）中で５分間インキュベートし、次いで化学発光をＦｕｊｉ  ＬＡＳ４０００イルミネーター（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、スタンフォード、ＣＴ）によって検出した。タンパク質をＩｍａｇｅＪによって定量した。
【０２００】
オルガノイド又は組織溶解物中のＢＭＰを検出するために、以下の抗体を使用した：αＢＭＰ７  ＭＡＢ３５４１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とαＢＭＰ６  ＡＦ５０７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１：１０００、並びに５％ＢＳＡ中のαＢＭＰ５  ａｂ１０８５８（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＵＫ）、αＢＭＰ２  ５００−Ｐ１９５（Ｐｒｅｐｏｔｅｃｈ、ロンドン、ＵＫ）及びαＢＭＰ４  ＭＡＢ７５７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１：５００。ノギンの存在なしで５日間増殖されたオルガノイドを、ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞株の場合に上述したように、氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解させた。マウス腸組織を比１：２０でＴ−ＰＥＲ緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて溶解し、２分間均質化し、次いで氷上で３０分間インキュベートした。細胞片をペレット化し、上清を収集した。ゲル電気泳動及びウエスタンブロット手順は上述した通りであった。
【０２０１】
特異性抗ＢＭＰ４  ＶＨＨ
ＢＭＰ４とＢＭＰファミリーの他のメンバーの成熟領域の類似性が高い（約６０〜８０％）ため、本発明者らは本発明者らの分析を拡張し、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７シグナル伝達に関してＶＨＨの特異性を試験した（図１０Ａ〜Ｅ）。本発明者らは、Ａ１、Ｃ３及びＣ４がＢＭＰ４特異的であったのに対して、Ｃ８がＢＭＰ２媒介性シグナルも阻害できたことを見いだした（図１０Ａ〜１０Ｂ）。興味深いことに、Ｅ７は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ５シグナル伝達に対しても阻害効果を有するように見えたが、これらの差は、静的に（ｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）有意でなかった（図１０Ａ〜Ｂ）。ＶＨＨのうちどれもＢＭＰ６及びＢＭＰ７シグナル伝達を阻害できなかった（図１０Ｄ〜１０Ｅ）。
【０２０２】
ＶＨＨは、ＢＭＰ媒介性転写も阻害する。
【０２０３】
次に、本発明者らは、本発明者らのＶＨＨがＢＭＰ媒介性転写活性も阻害するかどうかを明らかにすることにした。最も研究されたＢＭＰ標的遺伝子の１つは分化１の阻害剤（ＩＤ１：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １）である。これは、リン酸化ＳＭＡＤがそのプロモータ領域に結合することによって活性化される前初期遺伝子である（Ｌｏｐｅｚ−Ｒｏｖｉｒａら、２００２）。したがって、本発明者らは、ｐＧＬ３ルシフェラーゼベクター中にクローン化されたＢＭＰ応答配列（マウスＩＤ１プロモータ）を含むＢＲＥルシフェラーゼベクターが安定に移入されたＢＭＰ応答性Ｃ２Ｃ１２細胞を採用した（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ、２００７）。ＢＭＰＲ１ａはＣ２Ｃ１２中で高度に発現されるのに対して、ＢＭＰＲ１ｂは極低レベルでしか検出されず、したがってこの構成においてＢＭＰ機能におけるある役割を果たすとは考えられない（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ、２００７）。本発明者らのＶＨＨ又はヒトノギンを濃度５μｇ／ｍｌで用いて、又は用いないで、Ｃ２Ｃ１２細胞を種々のＢＭＰで処理した。ルシフェラーゼ活性を１６時間のインキュベーション後に測定した。転写データの大部分は、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化で得られた結果と一致する。すべてのＶＨＨは、天然阻害剤ノギンと同じレベルでＢＭＰ４媒介性転写活性を阻害することができた（図１１Ａ）。以前の実験で観察されたように、Ｃ８及びＥ７のみがＢＭＰ２転写活性化において抑制効果を発揮することができた（図１１Ｂ）。驚くべきことに、Ｅ７は、他のＢＭＰほどではないが、ＢＭＰ５及びＢＭＰ６も阻害することができた（図１１Ｃ〜Ｄ）。どのＶＨＨもＢＭＰ７媒介性転写活性化を阻害できなかった（図１１Ｅ）。
【０２０４】
要するに、これらの実験セットによって、ＳＭＡＤのリン酸化のＶＨＨ媒介性阻害が、ＢＭＰ標的遺伝子ＩＤ１の転写の阻害をもたらすことが確認された。それらは、ＢＭＰ４（Ａ１、Ｃ３及びＣ４）、ＢＭＰ２／４（Ｃ８）及びＢＭＰ２／４／５／６（Ｅ７）特異的ＶＨＨの生成を証明するものである。注目すべきことに、ＢＭＰ５／６シグナル伝達のＥ７媒介性阻害は、ルシフェラーゼ実験においてのみ観察可能である。これは、ＳＭＡＤリン酸化のわずかな阻害がその転写活性の差を生じるのに十分であることを示しているのかもしれない。
【０２０５】
二量体化は、機能活性の増加をもたらす。
【０２０６】
ＶＨＨ単量体の連結は、抗原中和活性が増加したヘテロ又はホモ二量体ＶＨＨをもたらし得るので（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、２０１２）、本発明者らは、２個の連続ペプチドスペーサ（ＧＧＧＧＳ）をリンカーとして用いて３種の二価ＶＨＨを構築した。Ｃ４をＣ４に連結して、ＢＭＰ４特異的ホモ二量体（Ｃ４Ｃ４）を生成させた。Ｃ８をＣ８に連結して、ＢＭＰ２／４特異的ホモ二量体を生成させ、Ｅ７をＣ８に連結して、ＢＭＰ２／４／５／６特異的ヘテロ二量体を生成させた。本発明者らは、それらを単量体と比較することによって、それらが、二量体化後にＢＭＰシグナル伝達を阻害するのにより有効であるかどうか明らかにしようとした。そのために、本発明者らは、ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞においてＳＭＡＤ１／５／８のＢＭＰ２／４媒介性リン酸化を阻害するそれらの能力を試験した。図１２Ａに示すように、Ｃ４Ｃ４は、単量体Ｃ４よりもはるかに低濃度（０．１μｇ／ｍｌ）で有効であるので、Ｃ４の二量体化は、ＢＭＰ４シグナル伝達のより有効な阻害をもたらす。予想どおりに、また、Ｃ４単量体のように、Ｃ４Ｃ４二量体は、ＢＭＰ２シグナル伝達を阻止できなかった（図１２Ｂ）。興味深いことに、Ｃ８二量体化は、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害する有効性を高めなかったが（図１２Ｃ）、Ｃ８Ｃ８はＣ８よりも低濃度でＢＭＰ２由来のｐＳＭＡＤを阻害することができたので、ＢＭＰ２のより有効な阻害をもたらした（図１２Ｄ）。Ｃ８Ｃ８の最も有効な濃度は０．５μｇ／ｍｌであり、その濃度においてＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方のシグナル伝達を阻害することができた。Ｃ８単量体に類似してはいるが、Ｃ８Ｅ７は、Ｅ７単量体に比べてＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方をより良好に阻害することが判明し（図１２Ｅ及び１２Ｆ）、（Ｅ７ではなく）Ｃ８がこのヘテロ二量体における優勢な分子であるかもしれないことを示している。
【０２０７】
したがって、Ｃ４Ｃ４は最強のＢＭＰ４阻害剤であるが、Ｃ８Ｃ８はＢＭＰ２媒介性ＳＭＡＤ活性化を阻害するのに最強である。これらの結果によって、Ｃ４及びＣ８の二量体化が、それぞれＢＭＰ４又はＢＭＰ２／４シグナル伝達の阻害に対してより有効なＶＨＨの生成をもたらすことを確認した。
【０２０８】
二量体によるｐＳＭＡＤシグナル伝達の阻害が、ＢＭＰ標的遺伝子の転写阻害ももたらすかどうかを扱うために、本発明者らは、Ｃ２Ｃ１２細胞においてルシフェラーゼ活性を阻害するそれらの能力を試験した（図１３）。したがって、これらの細胞を種々のＢＭＰで刺激した。漸増濃度の二量体を同時に添加し、ルシフェラーゼ活性を１６時間後に測定した。予想どおり、図１３Ａによれば、より高濃度（５μｇ／ｍｌ）でも、Ｃ４Ｃ４はＢＭＰ２媒介性転写活性を阻害できず、そのＢＭＰ４特異性を示した。０．１μｇ／ｍｌでは、Ｃ４Ｃ４は、ノギンと同程度にＢＭＰ４媒介性転写活性化を阻止することができる。図１３Ｂ及び１３Ｃに示すように、Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７は、ＢＭＰ４媒介性転写活性化を阻害するだけでなく、ＢＭＰ２媒介性転写活性化も阻害し、ｐＳＭＡＤの結果を確認した。Ｃ８Ｃ８は、Ｃ８Ｅ７よりも効率的にＢＭＰ２媒介性転写を阻害する。驚くべきことに、その単量体とは対照的に、Ｃ８Ｃ８は、ＢＭＰ５媒介性転写活性を弱く阻害することが判明した。これは、二量体化後の特異性の喪失によって説明されるかもしれない。Ｅ７は、ｐＳＭＡＤ及びＩＤ１活性のＢＭＰ５媒介性活性化を阻害することが判明したので、Ｃ８Ｅ７がＢＭＰ５転写阻害を阻害する能力は驚くべきことではなかった（図１３Ｃ）。Ｅ７とは対照的に、Ｃ８Ｅ７は、ＢＭＰ６媒介性転写活性化を弱めることができない。Ｃ８がこのヘテロ二量体における優勢な分子であるかもしれないという考えは、この対照的な結果を説明するかもしれない。
【０２０９】
ＢＭＰ活性ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートに５ｘ１０３細胞／ウェルで培養し、細胞を終夜付着させた。０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルに添加した。表示濃度のＶＨＨ抗体及びヒトＦｃノギンを同時に添加した。無刺激細胞を含むウェルを対照として追加した。細胞を３つ組で表示濃度のＢＭＰで１６時間処理した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｅｎｅｌｕｘ、ライデン、オランダ）のルシフェラーゼ基質溶液１００μｌを添加することによってルシフェラーゼ活性を測定した。３分間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキ、ＶＴ、米国）によって測定した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性（細胞のないウェルの活性）に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性に対する比として表した。
【０２１０】
実施例６：生体外活性
ＶＨＨは、オルガノイド培養物において内在性ＢＭＰ活性を生体外で阻害する。
【０２１１】
最後に、ＶＨＨを腸オルガノイド培養系においてＢＭＰ４の機能を生体外で中和するその能力について試験した。ＢＭＰ活性の阻害は、陰窩絨毛構造を模倣した「オルガノイド」として体外培養される腸幹細胞を維持する要件の一つであり、通常は培地へのノギンの添加によって施される。ネズミ小腸オルガノイドをＶＨＨ二頭部の存在又は非存在下で培養し、ノギンと比較した。これらの培養物中に存在するＢＭＰを正確に決定するために、ノギンなしで３日間増殖された腸オルガノイドの馴化培地においてＢＭＰ分泌を測定した。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ６は、ＥＬＩＳＡによって検出することができたが（図１４Ａ）、ＢＭＰ５レベルは、これらの培養物中にＢＭＰ５がないためではなく、恐らくはＥＬＩＳＡアッセイの感度が低い（＞２５０ｐｇ／ｍＬ）ために、負であった。実際、これらのオルガノイドのタンパク質溶解物の分析は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５及びＢＭＰ６の存在を検出した（図１４Ｂ）。次に、ネズミ小腸から新たに単離された陰窩をＶＨＨと一緒に培養し、その内在性ＢＭＰ阻害能力及びオルガノイド培養物を生体外で維持する能力について試験した。これらの培養物の上清におけるＢＲＥルシフェラーゼ活性の分析によって、これらのＶＨＨの機能性を確認した（図１４Ｃ）。Ｃ４Ｃ４による特異的ＢＭＰ４阻害は、ＢＲＥルシフェラーゼ活性の部分的減少をもたらしたが、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の同時阻害は、ＢＲＥルシフェラーゼ活性の完全な阻止をもたらすのに十分であった。これらの培養物におけるＢＭＰ５及びＢＭＰ６の更なる阻害は、ＢＲＥルシフェラーゼ活性の増加をもたらさず、これらの培養物におけるこれら２つのＢＭＰに対する役割が重要でないことを示した。オルガノイドの数を数え、以前の結果と一致して、Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７のみが、オルガノイドの培養増殖を維持することができた（図１４Ｄ）。
【０２１２】
ノギン、Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７によって維持されたオルガノイドは、特性が同じであった（図１４Ｅ）。３つの結論をこれらの実験から引き出すことができる。１つは、本発明者らのＶＨＨ  Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７が、天然阻害剤ノギンと同じレベルに、ＢＭＰ機能を生体外で阻害できることである。結果によれば、Ｃ４Ｃ４はＢＭＰ２シグナル伝達を生体外で弱めず、系は、オルガノイドが成長するためにＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方の阻害を必要とする。最後に、ＢＭＰ４の特異的阻害は、抑制のない幹細胞増殖の有害な副作用がない。
【０２１３】
オルガノイド培養物
オルガノイドを既報の通りに培養した（Ｓａｔｏら、２００９）。手短に述べると、野生型マウスの小腸を単離し、氷冷ＰＢＳで洗い流して糞便を除去した。それらを長軸方向に開いた後、ガラスカバーガラスを使用して絨毛を軽くこすり落とした。次いで、腸を０．５ｃｍ小片に切り、上清がきれいになるまで氷冷ＰＢＳで約１０〜２０回洗浄した。断片をＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡと一緒に３０分間氷上で回転させながらインキュベートした。組織断片を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、６回の激しい懸濁後に上清をＰＢＳ中に収集した。上清を７０μｍ細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に通して、残留絨毛を除去し、単離された陰窩を６００ｒｐｍで５分間遠心分離して、単細胞を除去した。陰窩を数え、Ｍａｔｒｉｇｅｌに再懸濁させた。５００個の陰窩を２４ウェルプレート中の重合Ｍａｔｒｉｇｅｌ５０μｌ／ウェルに再懸濁させた。５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Ｔｅｂｕ−ＢＩＯ、Ｈｅｅｒｈｕｇｏｗａａｒｄ、オランダ）、どちらもＪ．Ｐ  Ｍｅｄｅｍａ教授（ＡＭＣ、アムステルダム）の好意によって提供されたＦｃノギン（１０％）及びｆｃ−Ｒｓｐｏｎｄｉｎ（２０％）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地５００μｌ／ウェルを添加した。示したところでは、ＶＨＨをＦｃノギンの代わりに使用した（１００ｎｇ／ｍｌのＣ４Ｃ４、５００ｎｇ／ｍｌのＣ８Ｃ８、５μｇ／ｍｌのＣ８Ｃ８、５μｇ／ｍｌのＥ７）。対照として、一部の陰窩をノギン及びＶＨＨの非存在下で培養した。３日目に上清（ｓｕｐｅｒｎａｎｔ）を収集し、培地を交換した。タンパク質抽出用の溶解物を５日目に収集した。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡ
馴化マウスオルガノイド培地中に存在するＢＭＰの濃度を製造者の手順に従ってＥＬＩＳＡによって評価した：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製ＢＭＰ２（ＲＡＢ００２８）、ＢＭＰ−４（ＲＡＢ００２９）、ＢＭＰ−５（ＲＡＢ００３１）及びＢＭＰ−６（ＲＡＢ００３２）。手短に述べると、馴化培地１００μｌを抗ＢＭＰ被覆プレートに二つ組で添加し、室温で２．５時間インキュベートした。洗浄溶液で４回洗浄後、調製ビオチン化抗体１００μｌをプレートに添加し、続いて室温で１時間インキュベートした。別の洗浄ステップ後、調製ストレプトアビジン溶液１００μｌを各ウェルに添加し、軽く振とうしながら室温で４５分間インキュベートした。インキュベーションステップ後、ウェルを再度４回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬１００μｌを各ウェルに添加した。次いで、プレートを軽く振とうしながら室温で暗所で３０分間インキュベートした。最後に、停止液５０μｌを各ウェルに添加し、吸光度を４５０ｎｍですぐに読んだ。
【０２１５】
実施例７：親和性測定
ＶＨＨの親和性分析
そのＢＭＰ特異性を確認し、その結合親和性を解明するために、本発明者らのＶＨＨを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析に供した。第１のセットの実験においては、対照及びＶＨＨ（単量体又は二量体として）をＳＰＲチップに取り付け、種々のＢＭＰをプレートに注入することによってＢＭＰ親和性を測定した。
【０２１６】
ノギン及びＢＭＰＲ１ａは、対照として使用され、すべてのＢＭＰに結合し、公表された観察と一致した（表１）（Ｋｅｌｌｅｒら、２００４；Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。すべての測定単量体のうち、Ｃ８及びＥ７は、ＢＭＰ４に対する結合親和性が最も高く、ＢＭＰ２に結合する唯一のものであった（図１５Ａ及び１５Ｂ、左グラフ）。これら２種のＶＨＨでは、ＢＭＰ４に対する親和性がＢＭＰ２よりもわずかに高かった（表１）。予想どおり、Ｃ８の二量体化は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４に対する親和性がその単量体（Ｃ８）よりも高いホモ二量体（Ｃ８Ｃ８）の生成をもたらした（表１）。同様に、Ｅ７とＣ８の二量体化も、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方に結合するのにより有効なＶＨＨを生成した。これらの二量体で認められたより低いＫＤは、主に、単量体よりも低い解離速度（Ｋｄ）に起因する（表１）。この効果は、ＶＨＨ二量体１個当たり２つの結合部位が存在し、したがって、最初の解離後にＢＭＰに再結合する確率がより高いことに起因し得る。興味深いことに、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方に対するＣ８Ｅ７の会合速度（Ｋａ）は、Ｃ８で観測されたものに類似しており、Ｃ８がこの二量体において優勢な分子であるという仮定を確認するものである。このデータは、Ｃ８Ｅ７がＥ７ではなくＣ８のように挙動する機能的実験の結果に対応する。二量体のうち、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８は、ＢＭＰ４結合に対する親和性が最も高いものである。ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ４結合に対するすべての二量体の親和性は、ノギン又は従来の市販抗ＢＭＰ４抗体（ＲａｎｄＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で見られるものよりも高かった（表１）。機能的実験に同調して、Ｅ７、Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７はＢＭＰ５に結合する（図１５Ｃ）。しかし、これらの相互作用に対する親和性は、低会合及び高解離定数の結果として極めて低い（表２）。これらの観察は、これらのＶＨＨによるＢＭＰ５の機能阻害がそう大きくない理由を説明するかもしれない。
【０２１７】
特に、機能的結果とは対照的に、多様なＢＭＰに対する二量体の非特異的結合が認められた。Ｃ４Ｃ４はＢＭＰ２に結合することが判明し、Ｃ８Ｃ８及びＣ８Ｅ７はＢＭＰ７に結合することが判明した（図１５Ａ、１５Ｃ〜Ｅ）。これらの平衡解離定数は、２〜７００ｎＭの範囲であり、ＢＭＰ４結合で認められたもの（約１０〜５００ｐＭ）の１０００倍である。したがって、これらの相互作用の機能的意味の喪失は、著しく低い結合親和性に主に起因し得る。
【０２１８】
したがって、本発明者らは、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２／４、ＢＭＰ２／４／５及びＢＭＰ２／４／５／６特異的の４グループ（表３）に分類することができる幾つかのＶＨＨを作製した。
【０２１９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
精製ＶＨＨの段階希釈物（２．０〜１０μｇ／ｍｌ）を、記述されたように（Ｌｏｋａｔｅら、２００７）、アミン特異的ＳｅｎｓＥｙｅ金フィルムゲルタイプＳＰＲチップ（Ｓｓｅｎｓ）上にＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ソルトレークシティ、ＵＴ、米国）を用いて点在させた。組換えＢＭＰの希釈系列（０．０５〜２．０μｇ／ｍｌ）をＶＨＨ被覆チップ上に注射することによって、ＢＭＰ結合をＩＢＩＳ  ＭＸ９６（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、エンスヘデ、オランダ）機器上で分析した。各注射では、ＢＭＰを注射し、８分間インキュベートし、続いて結合緩衝剤（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０５％アジ化ナトリウム）で１５分間徹底的に洗浄して、解離を測定した。解離ステップ直後にＶＨＨ希釈物（２．０μｇ／ｍｌ）をチップ上に注射することによってエピトープビニングを行った。ブランクの結合緩衝剤の注射を基準として使用した。各連続注射後、チップを１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で再生した。実験データをＳＰＲｉｎｔＸソフトウェア（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、動力学的パラメータをＳｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＡＣＴ、オーストラリア）を用いて求めた。１サイト結合モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）に全体的にフィッティングさせて結合定数を得た。
【０２２０】
【表１】
2017537603.tif 000002
【０２２１】
【表２】
2017537603.tif 000003
【０２２２】
【表３】
2017537603.tif 000004
【０２２３】
実施例８：エピトープマッピング
結合エピトープを決定し、これら３種のＶＨＨ（Ｃ４、Ｃ８及びＥ７）の異なるＢＭＰ特異性を説明する試みにおいて、本発明者らは、ＳＰＲサンドイッチ交差結合又は「エピトープビニング」アッセイを採用した。このアッセイにおいては、ＶＨＨ（又は対照分子）がＳＰＣＲチップ上に点在する。１回の連続サイクルにおいては、リガンド（ＢＭＰ４）をチップに注入し、続いて第２のＶＨＨ（又は対照）を注入する。この第２の分子は、そのエピトープがまだ利用できる場合には、結合ＢＭＰ４のみに結合する。したがって、アロステリックであろうと、又はそれらが同じエピトープを共有するためであろうと、両方の分子が結合を競合する場合には、結合は起きない。ＢＭＰ４交差結合アッセイの結果を表４に要約する。
【０２２４】
【表４】
2017537603.tif 000005
【０２２５】
Ｃ８とＥ７は、互いに両方向に交差結合することができるので、エピトープの同じ残基を共有せず、Ｅ７は、Ｃ８結合ＢＭＰ４に依然として結合することができ（図１６Ａ）、Ｃ８は、Ｅ７結合ＢＭＰ４に依然として結合することができる（図７Ｂ）。Ｅ７は、ＢＭＰＲ１ａ結合ＢＭＰ４に依然として結合することができるが、Ｃ８はできない（図１６Ｃ）。これは、Ｃ８エピトープがＢＭＰ４のＢＭＰＲ１ａ結合部位に存在するのに対して、Ｅ７が、ＢＭＰＲ１ａによって標的にされない領域と相互作用するかもしれないことを示している。Ｃ８とＥ７はどちらも、マウスノギンに結合したＢＭＰ４に結合することができず、これらのＶＨＨがＢＭＰ４結合に関してノギンと競合することを示している（図１６Ｄ）。したがって、Ｃ８のエピトープの残基は、ノギンの残基及びＢＭＰＲ１ａの残基と重複するのに対して、Ｅ７エピトープ内の残基は、ＢＭＰＲ１ａの残基とは異なる、ノギンによって標的にされる別の領域に位置する可能性が高い。ノギンは、ＢＭＰＲ１ａエピトープとＢＭＰＲ２エピトープの両方に結合するので、Ｅ７エピトープ内の残基は、ＢＭＰＲ２結合部位に位置する可能性が高い。
【０２２６】
表３に示すように、Ｃ８及びＥ７は、Ｃ４Ｃ４に結合したＢＭＰ４に弱く結合することができるが、ノギン又はＢＭＰＲ１ａはできない（図１６Ｅ）。逆に、Ｃ４Ｃ４は、Ｃ８及びＥ７結合ＢＭＰ４に結合することができた（それぞれ、図１６Ａ及び１６Ｂ）。これは、Ｃ４Ｃ４がＣ８及びＥ７とは異なるＢＭＰ４の残基に結合するが、そのエピトープの残基がノギン及びＢＭＰＲ１ａの残基と重複することを示している。
【０２２７】
市販抗ＢＭＰ４との交差結合は、すべてのＶＨＨ及び対照で検出され、抗ＢＭＰ４のエピトープがＶＨＨとは著しく異なり、ノギン又はＢＭＰＲ１ａと重複しないエリアに存在することを示している（図１６Ｆ）。特に、大部分のＶＨＨ及びノギンは、交差結合アッセイにおいて弱い自己結合（ｓｅｌｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。
【０２２８】
実施例９：ＶＨＨとＢＭＰ４のモデリング
Ｃ４、Ｃ８及びＥ７の異なる抑制機序を更に理解するために、本発明者らは、ＨＡＤＤＯＣＫソフトウェア（高多義性駆動タンパク質−タンパク質ドッキング（Ｈｉｇｈ  Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤＯＣＫｉｎｇ））（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、２００３）を用いてＢＭＰ４とのそれらの相互作用をモデル化することにした。ＢＭＰ４のスレッドモデルをＢＭＰ２（ＰＢＤ  Ｘ）をテンプレートとして用いＭｏｄｅｌｌｅｒ９．９を使用して作成した。種々のＶＨＨの構造を、４Ｂ５Ｅ（Ｃ４の場合）、ＳＪＸ（Ｅ７及びＣ８の場合）などの別のＶＨＨの解明された結晶構造に基づき、配列レベルにおけるそれらの類似性（約７４％）に基づいてモデル化した。本発明者らの機能及びエピトープビニングデータの解釈は、本発明者らのＨａｄｄｏｃｋモデリングに使用する残基を選択する基礎になった（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ、２０００ｂ）。２つのエリアがＢＭＰリガンドとその受容体の結合に関与する（図１７Ａ）。いわゆる「リスト」は、Ｉ型ＢＭＰ受容体との結合に関与する大きい凹状エリアであるのに対して、ナックルは２型受容体結合に関与する。エピトープビニング実験によれば、Ｃ４及びＣ８は、リスト界面に相当すると考えられるＢＭＰＲ１ａとノギンの両方に重なる領域に結合する。これらの実験は、同じエリアを標的にするものの、これらの分子の正確なエピトープが異なり、ＢＭＰ結合に関して弱く競合することも示した。この知見は、ＶＨＨが本質的に小さく、リストの接触面積が大きく、これら２つの単一ドメイン抗体がＢＭＰ４に同時に結合することができるため、驚くべきことではない。したがって、各ＶＨＨがリスト内の異なるエリアに結合すると仮定するのが妥当である。実際、２個の接触点はリストを形成する（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。
【０２２９】
単量体ＢＭＰ２Ａの残基（図１７Ａにおける緑色の残基）で満たされた疎水性溝によって１つの界面が形成される。プレβ、β１及びプレヘリックスループ（ループ２）に位置する残基は、塩橋、水素結合及び極性接触によって受容体残基と相互作用する（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。
【０２３０】
Ｃ４は結合し、ＢＭＰ４媒介性活性化しか阻害できないので、Ｃ４は、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の残基の差が観察されるＢＭＰＲ１ａ分子界面を標的にしなければならない。ＢＭＰ２とＢＭＰ４の配列を検討すると、この疎水性溝を形成する残基の差が明らかになる（図１７Ｂ）。特に、β１に位置するＢＭＰ２のＫ１５（ＢＭＰ４におけるＲ１５）は、ＢＭＰＲ１ａのアスパラギン４６と塩橋を形成することが判明した。したがって、リストの疎水性溝に関与する残基（図１７）を使用して、Ｃ４をＢＭＰ４にドッキングさせた。一連のＶＨＨ配列と比べたＣ４のアミノ酸配列の分析によって、ＣＤＲ３領域における幾つかの非保存残基が明らかになった（図１８）。したがって、以下の残基をドッキング用に選択した：Ｔ３１、Ｋ５３、Ｉ５７、Ａ１１０及びＰ１１２。さらに、ＢＭＰＲ１ａのアスパラギン４６がＢＭＰ−ＢＭＰＲ１ａ結合に重要であると報告されたので、Ｄ９９も使用した。
【０２３１】
ドッキング結果を１０個のクラスターに分類した。クラスター１は、７８個の構造を含み、ＨＡＤＤＯＣＫスコア−８６．７＋／−８．７であった。このモデルにおいては、ＢＭＰ４のループ２は、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の両方からの残基に対して親水的にまとまる（図１９Ａ）。ＢＭＰ４のＰ５０は、Ｉ５７との親水性疎水性相互作用を維持し、Ｄ４６は、Ｃ４のＳ１０２と水素結合を形成する（図１９Ｂ）。対照的に、プレβ１及びβ１領域は、主に、ＣＤＲ３残基と相互作用する。注目すべきは、Ｋ１２とＲ１５の両方と塩橋を形成するＤ９９であり、ＢＭＰ２のＫ１５とＢＭＰＲ１ａのＤ４６の間で類似の相互作用が認められた（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００）。
【０２３２】
疎水性ポケットは、リストの他の接触点を構成する（図８Ａ）。ＢＭＰ２Ａのαヘリックス内の残基及びＢＭＰ２Ｂのループ１、β７及びβ８の残基は、「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｐｏｃｋｅｔ」のようにＢＭＰＲ１ａ３１の分子のＰｈｅ８５に適合する。Ｃ８は、ＢＭＰ２／４のみに結合し、他のＢＭＰに結合できないので、Ｃ８のエピトープは、ＢＭＰ２／４とＢＭＰ５／６／７の残基の差を示すが、Ｃ４と弱く重なるＢＭＰＲ１ａ結合領域になければならない。したがって、Ｃ８は、少数の不変残基Ｖ２６、Ｗ３０、Ｎ３１、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｍ８９が位置する疎水性ポケットを標的にすると推測したくなる（図１７Ｂ）。Ｃ８に関しては、Ｃ８配列の以下の不変残基をドッキング用に選択した：Ｐ１０９、Ｌ１００、Ｆ１０２、Ｆ１１０、Ｙ１０７、Ｒ１０１、Ｒ１０６、Ｒ１０８（図１８）。ＨＡＤＤＯＣＫは、１９１個の構造を６個のクラスターに分類する。クラスター１は、１３８個の構造を含む−１４２．６＋／−２．９のスコアを示した。このモデルにおいては、Ｃ８−ＢＭＰ４結合は、Ｃ８のＣＤＲ３領域の残基とリストの疎水性ポケットの相互作用によって駆動されるように見える（図２０Ａ）。ＢＭＰ４αヘリックスの疎水性表面においては、Ｌ６６が突出して、Ｃ８のＴ１０５と相互作用する。ＢＭＰ４のループ１の残基は、疎水性エリアをもたらし、Ｐ１０９とＢＭＰ４のＷ３１のような相互作用、及びＤ３０とＣ８のＲ１０６の複塩架橋を可能にする（図２０Ｂ）。Ｆ１１０及びＦ１０２も、Ｄ３０が囲まれたエリアと複数の箇所で接触する。Ｙ１０７は、β８鎖の内側に位置するＫ１０１と水素結合を形成する。
【０２３３】
本発明者らのエピトープビニング実験によれば、Ｅ７は、Ｃ８／Ｃ４及びＢＭＰＲ１ａの結合と重複せず、したがってその結合部位がリスト内に位置しないことを示している。Ｅ７は、それでもＢＭＰ２結合に関してノギンと競合し、ノギンはナックルにも結合するので、ナックルはＥ７によって標的とされる領域であると推測したくなる。「ナックル」エリアは、ＢＭＰ２Ｂのアミノ酸によって形成され（図１７Ａ）、高度に保存された残基を含む４つの領域がＢＭＰＲ２との結合に関与する。本発明者らはＥ７がすべての試験ＢＭＰに結合することを示したので、このエピトープ中に位置するナックル残基をＥ７のドッキングに使用した（Ｎｉｃｋｅｌら、２００１）。ＨＡＤＤＯＣＫは、１７３個の構造を４個のクラスターにする。１５０個の構造を含むクラスター１は、最高スコア−８３．５＋／−５を与えた。このモデルにおいては、Ｅ７のＣＤＲ１残基とＣＤＲ２残基の両方がこの結合に関与する（図２１Ａ）。Ｅ７のＷ４７は、Ｑ３９と相互作用して、水素結合を形成する。Ｅ７中のＴ５６の主鎖の窒素原子は、Ｓ８８と水素結合を形成する。Ｅ７のＬ５７もＳ８８に近接する（図２１Ｂ）。ＣＤＲ１のＶ３２は、β３鎖（Ａ３４）及びβ８鎖（Ｌ９０）の外側に位置する残基によって形成された疎水性エリアに近接する。
【０２３４】
要するに、ＨＡＤＤＯＣＫモデリングは、試験ＶＨＨの特異性の重要な構造上の証拠を提供する（図２２）。これらの結果は、ＢＭＰＲ１ａに関与するＢＭＰ４の疎水性溝の選択的ターゲティングがＢＭＰ４特異性を与えるのに対して、この分子界面の疎水性ポケットの選択的ターゲティングがＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方に対する特異性を支持することを示しているように思われる。ナックルを標的にするＶＨＨは、ＢＭＰ特異性が制限され、ＢＭｐ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７に結合することができる。
【０２３５】
ＨＡＤＤＯＣＫモデリング
ＢＭＰ４の３Ｄ相同性モデルをＢＭＰ２（ＰＢＤ  １ＥＳ７）をテンプレートとして用いＭｏｄｅｌｌｅｒ９．９を使用して作成した。種々のＶＨＨの構造を、４Ｂ５Ｅ（Ｃ４の場合）、ＳＪＸ（Ｅ７及びＣ８の場合）などの別のＶＨＨの結晶構造に基づき、配列レベルにおけるそれらの類似性（約７４％）に基づいてモデル化した。ＨＡＤＤＯＣＫソフトウェア（高多義性駆動タンパク質−タンパク質ドッキング）（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、２００３）を使用して、種々のＶＨＨに結合するＢＭＰ４をモデル化した。コドンにおける１つ以上の変異の結果として生殖系列とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２）に位置する残基、並びにＣＤＲ３の残基を、ドッキング用ＶＨＨ活性部位として選択した。したがって、Ｃ４の場合、これらの残基は、Ｔ３１、Ｋ５３、Ｉ５７、Ｄ９９、Ａ１１０、Ｐ１１２であり、Ｃ８の場合、Ｓ４４、Ｌ１００、Ｒ１０１、Ｆ１０２、Ｒ１０６、Ｙ１０７、Ｒ１０８、Ｆ１１０であり、Ｅ７の場合、Ｒ２９、Ｇ３０、Ｖ３２、Ｇ５５、Ｔ５６、Ｌ５７、Ｇ６８及びＬ９６であった。
【０２３６】
エピトープビニング実験は、Ｃ４が、ＢＭＰ４−ＢＭＰＲ１ａ結合に関与する分子界面と相互作用することを示唆した。Ｃ４は結合し、ＢＭＰ４媒介性活性化を阻害し、ＢＭＰ２媒介性活性化を阻害できないので、Ｃ４は、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の残基の差が観察されるＢＭＰＲ１ａ結合領域を標的にする可能性が高い。ＢＭＰ２とＢＭＰ４の配列を検討すると、リストの疎水性溝は、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の差が存在する唯一のＢＭＰＲ結合エリアであることが明らかになる（Ｋ１２、Ｎ１３及びＲ１５）。したがって、この領域を使用してＣ４をＢＭＰ４にドッキングさせた。この領域に位置し、ドッキングに使用された残基は、Ｓ１２、Ｓ１３及びＫ１５（ＢＭＰ２とＢＭＰ４で異なる）並びにＦ４９、Ｐ５０、Ｌ５１、Ａ５２、Ｄ５３、Ｈ５４及びＳ６９（ＢＭＰ２とＢＭＰ４で同一）であった（図１７Ｂ）。
【０２３７】
Ｃ８は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４のみに結合し、ＢＭＰの残りには結合できないので、Ｃ８のエピトープは、恐らく、ＢＭＰ２、４とＢＭＰ５、６、７の差を示すが、Ｃ４と重複しないＢＭＰＲ１ａ結合領域に存在する。ＢＭＰのこれら２つのサブグループ間の多数の非保存残基がこの領域に見られる（図１７Ｂ）。それらは、Ｃ８特異性の決定基かもしれないので、疎水性ポケット内の、ＢＭＰ２、４とＢＭＰ５、６、７で異なる残基をドッキングに使用した：Ｖ２６、Ｗ３０、Ｎ３１、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｍ８９。ＨＡＤＤＯＣＫは、１９１個の構造を６個のクラスターに分類する。
【０２３８】
本発明者らのエピトープマッピング実験によれば、Ｅ７はナックルに結合する。さらに、この領域の残基はすべてＢＭＰ間で高度に保存され、Ｅ７の非特異性に対応する考え。「ナックル」エリアは、ＢＭＰ２Ｂのみの残基によって形成され、４つの領域がＢＭＰＲ２との結合に関与する（Ｎｉｃｋｅｌら、２００１）。このエリアでは、小さい浅いポケットが、極性及び非極性アミノ酸の輪によって包囲された疎水性残基によって形成される。中心の疎水性残基は、この分子界面の結合決定基であることが示され、したがって、Ｅ７とＢＭＰ４のモデル化に使用された：Ｓ８８、Ｌ９０、Ａ３４、Ｈ３９及びＬ１００（図１７Ｂ）。
【０２３９】
実施例１０：突然変異体（ＭＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＶＡＲＩＡＮＴＳ）を含むモデリングの確認
ＨＡＤＤＯＣＫモデルを検証するために、本発明者らは、各ＶＨＨの突然変異体を作製した。ＶＨＨ−ＢＭＰ４結合に関与することが判明した残基の一部をインビトロ変異誘発によって個々に置換した。Ｅ７−ＢＭＰ４相互作用に関与することが判明した残基の変異は、ＢＭＰ２媒介性転写活性化とＢＭＰ４媒介性転写活性化の両方を阻害することができない変異体を生じた（図２３）。同様に、Ｃ８の変異体Ｙ１０７Ａは、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４機能に対する効果を発揮せず、これらのＢＭＰに結合できないことを示唆している。最後に、Ｃ４のＤ９９Ａは、ＢＭＰ４シグナル伝達を阻害するＣ４の能力に影響することが判明した。予想どおりに、Ｃ４もそのＤ９９Ａ変異体も、ＢＭＰ２機能に対する効果を持たなかった。これらの変異は、種々のＶＨＨの効力に影響するので、これらのデータは、ＨＡＤＤＯＣＫモデルを検証し、変異残基が重要な結合決定基であることを確認するものである。さらに、種々のＶＨＨ及びＢＭＰＲエピトープの結合決定基の配列の分析は、本発明者らのドッキングモデリングの結果を確認するものであると思われる。ＢＭＰ４との結合に関与するＶＨＨのパラトープは、保存されず、それらの領域に対するそれらの特異性の基礎になるかもしれない。例えば、ＢＭＰ４のＰ５０との親水性相互作用を維持するＣ４のＣＤＲ２に位置するＩ５７は、ＶＨＨ生殖系列由来の高次成熟を示す。Ｃ４のＣＤＲ３に位置するＳ１０２及びＳ１０７も、ＢＭＰ４結合の決定基であり、Ｃ８及びＥ７と共有されない。同様に、Ｃ８のパラトープは、Ｃ４及びＥ７と２８．５％の類似性しか共有しない、主にＣＤＲ３に位置する残基によって形成される。同様に、Ｅ７とＢＭＰ４のモデル化結合の結合決定基は、Ｃ４及びＣ８において保存されない（Ｗ４７、Ｖ３２、Ｌ５７など）。注目すべきは、Ｅ７のＣＤＲ１領域とＣ４（２５％）及びＣ８（１２．５％）の低い類似率であり、この領域に対する重要な機能的役割を示唆している。
【０２４０】
部位特異的変異誘発によるＶＨＨ変異体の作製
重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲ（Ｈｏら、１９８９）による部位特異的変異誘発を利用して、指定ＶＨＨにおける単一アミノ酸を置換した。２つの異なる方向の部分的に相補的なプライマーを置換配列を用いて設計した。続いて、これらのプライマーをＶＨＨ外向きプライマーと一緒に使用して、ＶＨＨ配列を有する２個の断片を増幅した。次いで、重複領域を有する作製された２個のＤＮＡ断片を第２のＰＣＲのテンプレートとして使用して、２個の断片を接着させ、完全ＶＨＨ配列を復元した。最終ＰＣＲ断片をＶＨＨのＮ及びＣ末端にユニークな認識部位を有する制限酵素を用いて消化し、発現プラスミドｐＭＥＫ２２２中でクローン化した。置換を配列決定によって確認し、ＶＨＨ変異体を前に示したように作製し、精製した。
【０２４１】
実施例１１：他の市販抗ＢＭＰ４との機能比較
本発明者らのＶＨＨのＢＭＰシグナル伝達を阻害する機能活性を２つの市販抗体抗ＢＭＰ４Ｒ＆Ｄ（クローン６６１１９、マウスＩｇＧ２Ｂ、ＭＡＢ７５７）及び抗ＢＭＰ４Ａｂｃａｍ（ウサギポリクローナル、ａｂ３９９７３）の一つと比較した。これら２つの抗体は、そのデータシートに記載のようにＢＭＰ４特異的であり、図２４Ａにおいて本発明者らによって確認された。その抑制能力をＢＭＰ４によって刺激されたＥＰＣ細胞において試験すると、本発明者らは、より高用量で使用したときにのみ（図２４Ｂ〜Ｃ）、本発明者らのＶＨＨ  Ｃ８又は天然拮抗物質ノギンよりもはるかに低い程度ではあるが、それらがシグナル伝達を阻害できることを認めた。０．１μｇ／ｍｌで使用すると（図２４Ｄ）、それらは、シグナル伝達を完全に阻害することはできなかった。さらに、抗体Ｒ＆Ｄの使用は、別の研究ではＢＭＰ４機能を阻止するのに不十分であり、マウスメサンギウム（ｍｅｓｅｎｇｉａｌ）細胞において細胞外基質タンパク質の発現におけるＢＭＰ４媒介性増加を阻害することができなかった（Ｔｏｍｉｎａｇａら、２０１１）。
【０２４２】
本発明者らのデータ及び以前の結果は、それらのエピトープがＢＭＰ４のリスト又はナックルに位置しないことを示しているように思われる。例えば、Ａｂｃａｍ抗ＢＭＰ４は、未成熟プロＢＭＰ４領域由来の残基５０〜１５０に対応するペプチドを用いて作製された。成熟ＢＭＰ４は残基２９９から始まるので、したがって、Ａｂｃａｍ抗ＢＭＰ４のエピトープは、ＢＭＰ受容体を介してシグナル伝達に関与する領域に対応しない。Ｒ＆Ｄ製抗ＢＭＰ４抗体は、プレβ（図１７Ｂにおける残基１〜９）上流の高度ＢＭＰ４特異的Ｎ末端領域及びＢＭＰＲ結合分子界面を包含する、未成熟プロＢＭＰ４タンパク質の残基２９３〜４０８に対応するペプチドに対して産生された。しかし、本発明者らのエピトープビニングデータは、この抗体がＢＭＰＲ１ａともノギンとも試験ＶＨＨのいずれとも競合しないことを明瞭に示し（図１６）、Ｒ＆Ｄ製抗ＢＭＰ４がＢＭＰＲ結合エピトープを標的にしないことを示した。したがって、そのエピトープを含む可能性がある領域は、受容体との結合に関与せず、ヘパリンとの結合に関与する、成熟ＢＭＰ４タンパク質の高度ＢＭＰ４特異的Ｎ末端部かもしれない。これら２種の抗体を用いた機能的実験によれば、親和性（表１）及びＢＭＰ媒介性ｐＳＭＡＤ活性化の阻害（図２４）は、ノギン又は本発明者らのＶＨＨによるものよりもはるかに低いので、それは、リスト、ナックルなどのＢＭＰＲ結合エリアを標的にすると、より強力な機能的ＢＭＰ阻害に変わる高い親和性を与えることを示している。
【０２４３】
実施例１２：ＶＨＨ二頭部によるより強力な機能阻害
ＥＰＣ２−ｈＴＥＲＴ細胞における実験によれば、二量体は、高い抑制能力を示した（図１２）。この効力の増加の程度を評価するために、種々のＶＨＨのＩＣ５０をＣ２Ｃ１２細胞における用量依存的阻害アッセイにおいて測定した（図２５）。Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートに５ｘ１０３細胞／ウェルで培養し、細胞を終夜付着させた。０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルに添加した。ＶＨＨ抗体を表示濃度で５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４（図２５Ａ〜Ｂ、Ｄ）又は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２（図２５Ｃ、Ｄ）と同時に添加した。ルシフェラーゼ活性を１６時間後に測定した。値をＢＭＰ刺激細胞の活性に対する比で表す。Ｃ４Ｃ４は、ＢＭＰ４媒介性転写活性化の阻害が単量体Ｃ４に比べて９倍増加し、すべての試験ＶＨＨの中で最低のＩＣ５０を示した（１．３ｎｇ／ｍｌ又は４５ｎＭ）。同様に、Ｃ８の二量体化もより強力な二量体をもたらした（図２５Ｂ〜Ｃ）。しかし、その効果は、ＢＭＰ４阻害よりもＢＭＰ２でより著しかった。それでも、Ｃ８Ｃ８は、ＢＭＰ２よりもＢＭＰ４の阻害において１６倍も強力であった。Ｃ８Ｅ７は、Ｅ７よりも良好ではあるが、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の両方の阻害においてＣ８と類似していることが判明し（図２５Ｄ〜Ｅ）、Ｃ８がこのヘテロ二量体における優勢な分子であり得ることが示唆された。要するに、本明細書に記載するＶＨＨはすべて、ＢＭＰ４媒介性阻害のＩＣ５０が１〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＢＭＰ２媒介性阻害のＩＣ５０が０．６〜１．６μｇ／ｍｌの範囲であった。本発明者らのＶＨＨで認められたＢＭＰ４阻害のＩＣ５０値は、Ｒ＆Ｄから市販された抗ＢＭＰ４で観測されたもの（Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４）及び国際公開第２００８／０３０６１１号に記載のものよりもかなり低い。
【０２４４】
二頭部の特異性は、驚くべきことにＢＭＰ５媒介性転写活性をより高用量で弱く阻害するＣ８Ｃ８を除いて、保持される（図１３）。ＢＭＰサブファミリーの残りのメンバーは、ＢＭＰ４との配列類似性が低い（約３０％同一）。それでも、それらを試験して、単頭部及び二頭部の特異性を確認した。予想どおりに、試験ＶＨＨのいずれによっても、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０又はＢＭＰ１２の阻害は観察されなかった（図２６Ａ〜Ｃ）。ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーも試験して、ＶＨＨのＢＭＰ特異性を更に確認した。ＳＭＡＤ２リン酸化の阻害は、ＴＧＦβ又はアクチビンＡ活性化後に観察されなかった（図２６Ｄ〜Ｆ）。
【０２４５】
特異性ＶＨＨ
Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートで培養し、コンフルエントに達したときに、細胞を３つ組で２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ９、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ１０又は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ１２（すべてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）で１６時間処理した。ＶＨＨ又はノギンを濃度５ｕｇ／ｍｌで添加した。Ｃ２Ｃ１２細胞又はＨＥＫ２９３を１２ウェルプレート上で培養し、５時間飢餓状態にし、その後、それぞれ２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激した。表示濃度のＶＨＨを同時に添加した。１時間後に細胞を溶解し、タンパク質単離及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を前述のように行った。タンパク質検出に以下の抗体を使用した：抗ホスホＳＭＡＤ２  １：１０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０２４６】
実施例１３：ヘテロ二量体ＢＭＰを含むモデリングの確認
ＶＨＨのエピトープの性質を更に確認するために、Ｃ２Ｃ１２細胞株を用いたヘテロ二量体ＢＭＰ４及びＢＭＰ２を含む実験を行った。Ｃ８はホモ二量体ＢＭＰ２を阻害することができるが、ＢＭＰ２とＢＭＰ６又はＢＭＰ７のヘテロ二量体を阻害することができない。これは、Ｃ８のエピトープがＢＭＰ２の両方の単量体によって形成された領域に結合することを示す。逆に、Ｃ４は、ＢＭＰ４由来のシグナルを阻害するが、ＢＭＰ４／７シグナルの半分しか阻害しない。同様に、Ｅ７は、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２シグナルを阻害するが、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４ヘテロ二量体の一方の半分しか阻害しない。したがって、これらの実験によって、Ｃ４及びＥ７が、１種のＢＭＰ単量体のみで形成されたエピトープを標的にするのに対して、Ｃ８が、２種の単量体で形成されたエピトープに結合し、ＢＭＰ４又はＢＭＰ２のヘテロ二量体を阻害できないことを確認した（図２７）。
【０２４７】
ヘテロ二量体ＢＭＰを用いたエピトープマッピング
Ｃ２Ｃ１２を１０ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ４及びＢＭＰ４／６又は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２、ＢＭＰ２／６若しくはＢＭＰ２／７を用いて活性化させた。ＶＨＨ又はノギンを同時に濃度５μｇ／ｍｌで添加した。ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。ルシフェラーゼ値をバックグラウンド活性に対して正規化し、ＢＭＰ刺激細胞の活性に対する比として表した。エラーバーは、少なくとも３つの独立した実験から計算された平均の標準偏差である。
【０２４８】
実施例１４：ＶＨＨによるＢＭＰ４の阻害は、ＢＭＰ４＋結腸直腸癌細胞の化学感受性を高める
ＢＭＰシグナル伝達は、結腸直腸癌細胞株において化学療法抵抗性に関係していることが判明した。本発明者らは、この効果が、癌細胞によって分泌されるＢＭＰ４に起因し得るかどうか、したがって、本発明者らのＢＭＰ４特異的ＶＨＨによって阻害できるかどうか判定したかった。結腸直腸癌細胞の一団をその馴化培地における活性ＢＭＰの存在について試験した（図２８Ａ）。そのために、Ｃ２Ｃ１２細胞を種々の癌細胞株からの上清を用いて培養した。正常なウシ胎仔血清中に存在するＢＭＰに対して正規化すると、本発明者らは、ＢＲＥルシフェラーゼ活性が細胞株間で大きく変動し得ることを見いだした。癌細胞株の馴化培地と種々のＶＨＨのインキュベーションは、ある系が、もっぱらＢＭＰ４を分泌し、ＢＭＰ２も他のＢＭＰも分泌せず、Ｃ４Ｃ４がこのシグナルを完全に阻害するのに既に十分であることを示した（図２８Ｂ）。これらの細胞株の１種であるＨＴ２９を使用して、増殖に関するＢＭＰ４阻害の効果を試験した。ＶＨＨ又はノギン単独で培養すると効果は認められなかった（データ示さず）。しかし、ＶＨＨ  Ｃ４Ｃ４とＣ８Ｃ８のどちらも、種々のタイプの化学療法剤と組み合わせると、化学感受性を高めることが判明した。これは、ＶＨＨをカルボプラチン、５’ＦＵ又はオキサリプラチンと組み合わせると、化学療法単独に比べて細胞生存率に対する著しく強力な効果を有することによって実証された（図２８Ｃ、Ｄ及びＥ）。ノギンによる細胞生存率に対する効果は、Ｃ４Ｃ４又はＣ８Ｃ８で認められたものほど有効でなかった。
【０２４９】
化学感受性
ＨＴ２９細胞を９６ウェルプレート中で密度１０，０００細胞／ウェルで培養した。２４時間後、それらを表示濃度の５’フルオロウラシル（５’ＦＵ、オキサリプラチン及びシスプラチン）で４８時間刺激した。ＶＨＨ又はノギンを同時に濃度５００ｎｇ／ｍｌで添加した。Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で２時間添加し、その後に吸光度を５２０ｎｍで測定することによって、細胞生存率を測定した。
【０２５０】
実施例１５：ＶＨＨは、結腸直腸癌細胞において非標準経路を阻害する
ＳＭＡＤ非依存性シグナル伝達は、ＢＭＰ誘導性化学療法抵抗性を媒介することが判明したので、本発明者らは、次に、ＶＨＨがＨＴ２９細胞において非標準ＢＭＰ４シグナルを阻害するかどうか調べた。図２９に示すように、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８は、キナーゼｐ３８、Ａｋｔ及びＥＲＫのリン酸化を阻害する。ＨＴ２９細胞は、ＳＭＡＤ４遺伝子における変異を含み、したがって、ＳＭＡＤ４タンパク質を発現しないので（図２９Ｂ）、ＳＭＡＤ経路はこれらの細胞において不活性であり、したがって、ＶＨＨによるｐＳＭＡＤの阻害は機能的意義を持たない（図２９Ｆ）。総合すると、これらの結果は、ＶＨＨが、非標準ＢＭＰ４シグナルの阻害によってＨＴ２９細胞の化学感受性を高めることを示している。
【０２５１】
非標準経路のウエスタンブロット
ＨＴ２９細胞を終夜飢餓状態にし、濃度５００ｎｇ／ｍｌのＶＨＨ又はノギンで１時間処理した。次にタンパク質単離及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を行った。ＨＴ２９を１００μｌのＭ−ＰＥＲ緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させた。細胞片をペレット化し、上清を収集した。タンパク質検出に以下の抗体を使用した：抗ホスホ−ＳＭＡＤ１／５／８  １：５００；ｐ−ｐ３８（Ｔ１８０／Ｙ１８２）１：５００、ｐＡｋｔ（ｓｅｒ４７３）１：１０００、総Ａｋｔ  １：５００、総ｐ３８  １：５００；（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）；抗ＳＭＡＤ４  １：５００、抗ｐＥＲＫ（Ｙ２０４）１：１０００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；抗ＧＡＰＤＨ  １：５００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
【０２５２】
実施例１６：本発明の抗体及び利用可能な抗体と阻害剤の比較例
ノギンに比べて、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８は特異性が高く、それぞれＢＭＰ４又はＢＭＰ２及び４にのみ結合する。本発明者らは、この優位性が他の天然拮抗物質及びＢＭＰ受容体の化学阻害剤にも及ぶかどうか判定したかった。したがって、本発明者らは、ＢＭＰ応答配列（ＢＲＥ：ＢＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）−ルシフェラーゼレポーターアッセイによって、これら２種のＶＨＨを２種の天然拮抗物質ノギン及びグレムリン並びに２種の化学阻害剤ＬＤＮ及びＤＭＨ１と比較した。このアッセイにおいては、ＢＭＰ−ＳＭＡＤ依存性応答遺伝子ＩＤ１の活性化をルシフェラーゼレポーターＣ２Ｃ１２筋芽細胞において測定した。予想どおりに、図３０に示した結果によって、Ｃ４Ｃ４の特異性がＢＭＰ４に限定され、Ｃ８Ｃ８の特異性がＢＭＰ２及びＢＭＰ４に限定されることを確認した。それに対して、他の阻害剤は、より選択的でない。例えば、ノギン及びグレムリンは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ５シグナルを大きく阻害することができた。さらに、ノギンは、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ１２媒介性ＳＭＡＤ経路を阻害した。化学阻害剤ＬＤＮ及びＤＭＨ１は、ノギンよりも選択性がさらに低いことが判明し、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０由来のシグナルも阻害することが示された。試験濃度においては、阻害剤はすべて、同様にＢＭＰ４由来のシグナルを強力に阻害した。これらの結果によって、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８が現行のＢＭＰ拮抗物質よりも特異的であり、他のＢＭＰのシグナル伝達に影響を及ぼさずに、ＢＭＰ４又はＢＭＰ２／ＢＭＰ４媒介性ＳＭＡＤシグナル伝達のみを中和できることを確認した。
【０２５３】
次に、本発明者らは、本発明者らのＶＨＨの阻害能力を幾つかの抗ＢＭＰ４抗体と比較した（図３２）。この目的のために、幾つかの抗ＢＭＰ４抗体を使用した。例えば、クローンＥＰＲ６２１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を使用して、ＮＴ２／Ｄ１奇形癌腫細胞（Ｋｗａｋら、２０１４）及び成体ラット膣（Ｂｈａｔｔａｃｈｅｒｊｅｅら、２０１３）における発現を調べた。他の抗体を研究用途と機能的実験の両方に使用した。例えば、クローン６６１１９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｒ＆Ｄ及びＡｂｃａｍ製）を使用して、ネズミＢＭ間質由来の細胞株ＳＴ２上のＢＭＰ４の発現を調べ（Ｋｈｕｒａｎａら、２０１４）、ＢＭＰ４媒介性平滑筋細胞増殖を阻害した。別の抗ＢＭＰ４であるクローン３Ｈ２は、ＢＭＰ４媒介性膠細胞分化を阻害することができた（Ｂｈａｔｔａｃｈｅｒｊｅｅら、２０１３）。驚くべきことに、それらの抗体をそれら及び別の刊行物（Ｊｅａｎｐｉｅｒｒｅら、２００８、及びＨｕｅら、２００６）において使用した濃度は、１〜１０μｇ／ｍｌの範囲であり、本発明のＶＨＨが生物学的に活性であることが示されたナノモル範囲とは全く対照的である。これらの相違が実験条件の違いによるものではないかどうかを試験するために、本発明者らは、Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８の活性をルシフェラーゼＣ２Ｃ１２系において現行の抗ＢＭＰ４抗体と比較した。本発明者らは、当該技術分野において記述された幾つかの抗体を比較した。それらのカタログ番号及びそれらのクローン名を表５に見ることができる。異なる会社から利用可能なこれらのクローンの大部分。
【０２５４】
【表５】
2017537603.tif 000006
【０２５５】
これらの実験によって、これらの市販抗体がＢＭＰ２に結合せず、Ｃ８Ｃ８のみがＢＭＰ２媒介性シグナルを阻害することを確認した（図３２Ａ）。例外的に、濃度１００ｎｇ／ｍｌでは、両方のＶＨＨがＢＭＰ４特異的シグナルを完全に阻害したのに対して、クローン６６１１９及び３Ｈ２は、それぞれＢＭＰ４特異的シグナルの３０％及び１％しか阻害することができなかった。クローンＭ９１２２６２もＢＭｐ４媒介性シグナルを極めて弱く阻害した。驚くべきことに、３種の抗ＢＭＰ４抗体は、１０μｇ／ｍｌの高濃度でもＢＭＰ４シグナルを阻害できなかった（図３２Ｂ）。ＶＨＨの機能性の優位性は、これらの抗体のＩＣ５０曲線によって示されるように、モル濃度レベルでも維持される（図３２Ｃ）。注目すべきことに、ＢＭＰ４に対するＣ４Ｃ４（ＩＣ５０＝約６００ｐＭ）並びにＢＭＰ４（ＩＣ５０約４５０ｐＭ）及びＢＭＰ２（ＩＣ５０＝１２０５ｐＭ）に対するＣ８Ｃ８の中和活性は、マウス（ＢＭＰ４  ＩＣ５０約６１５ｐＭ；ＢＭＰ２  ＩＣ５０約２５００ｐＭ）及びヒトノギン（ＢＭＰ４  ＩＣ５０約５４０ｐＭ及びＢＭＰ２  ＩＣ５０約１６００ｐＭ）に類似している（図３２Ｃ及び図３２Ｄ）。これらの結果は、現行の抗ＢＭＰ４抗体よりも中和能力が高い極めて有効な阻害剤としてＣ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８を立証するものである。
【０２５６】
ルシフェラーゼアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレート中で５ｘ１０３細胞／ウェルで培養した。終夜付着後、１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ４（カタログ番号３１４−ＢＰ−０２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ２（カタログ番号３５５−ＢＭ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２００ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ５（カタログ番号６１５−ＢＭＣ−０２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ６（カタログ番号５０６−ＢＰ−０２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２００ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ７（カタログ番号３５４−ＢＰ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ９（カタログ番号３２０９−ＢＰ−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ１０（カタログ番号２９２６−ＢＰ−０２５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ１２（カタログ番号７７９−Ｇ７−０１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、また、ＶＨＨ抗体：Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８  ５００ｎｇ／ｍｌ；天然拮抗物質：ｍノギン（カタログ番号１９６７−ＮＧ−０２５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｈノギン（カタログ番号６０５７−ＮＧ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びｍグレムリン（ｃａｔ＃９５６−ＧＲ−０５０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）５００ｎｇ／ｍｌ；化学拮抗物質：０．５μＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（カタログ番号１１８０２；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）及び０．２μＭ  ＤＭＨ１（カタログ番号Ｓ７１４６；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を用いて、又は用いずに、細胞を刺激した。
【０２５７】
１０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ２を用いて、増加濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）のＶＨＨ及び抗ＢＭＰ４抗体：クローン６６１１９、クローン３Ｈ２、クローンＭ９１２２６２、クローンＰＡ３５４−１６．１．１、クローンＥＰＲ６２１１及び抗ＢＭＰ４（ａｂ３９９７３）を用いて、又は用いずに、細胞を刺激することによって、ＶＨＨの有効性を評価した。各抗体のＩＣ５０を測定し、比較するために、１０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４又は５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ２を用いて、増加モル濃度（０．０４８〜１０００００ｐＭ）の本発明のＶＨＨ、抗ＢＭＰ４抗体（クローン６６１１９、クローン３Ｈ２及びクローンＭ９１２２６２）及び天然拮抗物質（ｍノギン及びｈノギン）を用いて、又は用いずに、細胞を刺激した。無刺激細胞を対照として使用し、細胞を含まないウェルを使用してバックグラウンド活性を正規化した。各状態を３つ組で異なる条件で１６時間処理し、その後、１００μｌのルシフェラーゼ基質（Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｅｎｅｌｕｘ、ライデン、オランダ）を添加することによってルシフェラーゼ活性を測定した。５分間のインキュベーション期間後、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキ、ＶＴ、米国）によって測定した。データを正規化し、ＢＭＰのみで刺激された細胞の活性に対する比として表した。
【０２５８】
実施例１７：現行の抗ＢＭＰ４抗体と比較したＶＨＨのエピトープマッピング  現行の抗ＢＭＰ４抗体と比較したＶＨＨのエピトープマッピング
本発明者らは、幾つかの利用可能な抗ＢＭＰ４抗体によって認識されるエピトープを、本発明の抗体によって認識されるエピトープと比較した。図３３及び図３４は、幾つかの市販抗ＢＭＰ４抗体のエピトープマッピングを示す。上記の以前の実験から、本発明者らは、３つの異なるタイプの抗ＢＭＰ４抗体が存在すると結論付けた：機能的に不活性であるもの、ＢＭＰ４  ＢＲＥシグナルを弱く阻害するもの、及びＢＭＰ４  ＢＲＥシグナルを強く阻害するもの。これらの結果は、エピトープ結合の差によって説明することができた。
【０２５９】
活性成熟型のＢＭＰ４（図３３Ａ）は、分泌不活性型（プロＢＭＰ４）（図３３Ｂ）からのタンパク質切断から生ずる。活性二量体型のＢＭＰ４のみをＣ２Ｃ１２ルシフェラーゼに基づくアッセイに使用するので、一部の抗体の活性の欠如は、活性二量体型ではなくプロＢＭＰ４との結合に起因する可能性がある。実際、ＢＭＰ４の成熟二量体をニトロセルロース膜に固定すると、それらは、機能的に中性な抗体によって認識されなかった。それに対して、機能活性を有する抗体はすべて、成熟ＢＭＰ４二量体に対応する約３４ＫＤａのバンドを検出した（図３３Ｂ）。これらのブロットにおいては、Ｃ８Ｃ８はＢＭＰ２の二量体も確認した（約２６ＫＤａ２８ＫＤａのバンド、図３３Ｂ）。驚くべきことに、クローンＭ９１２２６２３及び３Ｈ２Ｈ２は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ５も認識すると思われる。クローン６６１１９を使用したときには、弱いＢＭＰ５バンドも観察された。実際に不活性抗体が長鎖プロＢＭＰ４に結合するが、成熟ＢＭＰ４に結合しないことを確認するために、種々の癌細胞株の溶解物をこれらの抗体を用いてブロットした（図３３Ｃ）。還元プロＢＭＰ４に対応する約４７ＫＤａの単一の線が観察された。これらの結果は、これらの抗体がＣ２Ｃ１２実験設定において活性型のＢＭＰ４のシグナルを直接阻害しない理由を説明するものである。不活性型のＢＭＰ４を阻止すると、活性ＢＭＰ４へのその切断を阻止するので、ＢＭＰ４活性の低下を間接的にもたらすと仮定することができた。それが本当かどうか試験するために、本発明者らは、ＢＭＰ４を産生し、分泌することが知られている結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９の上清を種々の抗体と一緒にインキュベートした。プロＢＭＰ４を標的にする抗体の添加は、総ＢＭＰシグナルに対して効果がなく、これらの抗体が、タンパク質切断を妨害しないプロドメイン内の領域に結合することを示している。したがって、これらの抗体は、ＢＭＰ４機能に影響せず、それらの生物学的意義は限定的である。他の抗ＢＭＰ４抗体は、内在性ＢＭＰ４活性を異なるレベルで阻害した（図３３Ｄ）。
【０２６０】
Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８は、ＢＭＰＲ１ａに結合するＢＭＰ４分子界面の異なるエリアを標的にする。したがって、本発明者らは、弱い市販抗ＢＭＰ４抗体よりもＶＨＨが優位であるのは、成熟二量体内の別の領域を標的にするのとは対照的に、ＢＭＰＲ１エリアの特異的ターゲティングのためであるかどうかを試験したかった。そのために、本発明者らは、ヘパリンとの相互作用によって細胞外基質との結合に関与することが知られている幾つかの塩基性残基を含むＮ末端領域のない、変異型のＢＭＰ４（図３３Ａ及び３４Ａ）を使用した。Ｃ２Ｃ１２系を使用して、この変異ＢＭＰ４（ＨΔＢＭＰ４）は、ＢＭＰ４媒介性ＩＤ１プロモータ活性の活性化においてＢＭＰ４の完全長成熟二量体よりも低活性であることが判明した（図３４Ｂ）。ＶＨＨはＨΔＢＭＰ４媒介性活性を効率的に阻害し、この領域の欠失がＶＨＨとＢＭＰ４上のそのエピトープの結合に効果がないことを示した（図３４Ｃ）。それに対して、Ｎ末端部の欠失は、別の抗体とＢＭＰ４の結合に対して効果を及ぼした（図３４Ｃ）。例えば、クローン６６１１９は、ＨΔＢＭＰ４媒介性シグナルを阻害できず、欠失領域が実際にこの抗体のエピトープであることを示した。興味深いことに、３Ｈ２及びＭ９１２２６２は、ＢＭＰ４よりもＨΔＢＭＰ４媒介性シグナルを阻害することができ、このＮ末端領域がそれらのエピトープをネガティブに妨害することを示している（図３４Ｃ）。
【０２６１】
本発明者らの研究は、３つのタイプの抗ＢＭＰ４抗体を明らかにした（図３１）。本発明者らは、プロＢＭＰ４を認識する抗体がＢＭＰ４機能を阻害できないことを示した。第１に、それらは、この活性型に結合しないので、成熟ＢＭＰ４の機能活性を直接阻害することができない。そして、第２に、プロＢＭＰ４とそれらの結合は、その切断、したがって、活性型へのその放出に影響せず、したがって、系内のＢＭＰ４活性は不変である。
【０２６２】
本発明者らは、更に、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１ａ結合部位に結合しない抗ＢＭＰ４抗体が、弱い抑制能力しか持たないことも示した。ウエスタンブロットを用いて、本発明者らは、このグループの抗体すべてがＢＭＰ４の成熟領域に結合することを見いだした。特に、以前の結果において確認されたように、クローン６６１１９は、ＢＭＰ４のヘパリンドメインに対応するかもしれないＢＭＰ４のＮ末端領域に結合する。ここで、本発明者らは、この抗体が、本発明のＶＨＨよりもＢＭＰ４媒介性機能を阻害するのに著しく有効でないことを証明した。このグループの他の抗ＢＭＰ４抗体は、ＢＭＰ４を機能的に阻害するのに極めて不十分であるだけでなく、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５などの他のＢＭＰに結合した。これは、それらのエピトープが、これらのＢＭＰによって共有される残基を含む領域内にあることを示している。それらは別のＢＭＰに結合するので、これは、それらのエピトープが、本発明の抗体と重複しないことを示している。総合すると、これらの結果は、このグループの抗体が、機能的に無関係な、ＢＭＰＲ１結合領域に対応しない、成熟ＢＭＰ４内の領域に結合することを示している。実際、ＨΔＢＭＰ４がＣ２Ｃ１２細胞中のＩＤ１プロモータを（はるかに低い濃度にもかかわらず）依然として活性化することができるという知見は、この領域の完全な除去がその受容体を活性化するＢＭＰ４の能力を阻止するのに不十分であることを示唆している。さらに、本発明者らは、これらの抗体の低い生物学的意義も探索した。もっぱらＢＭＰ４を分泌する結腸直腸癌細胞株を用いて、本発明者らは、飽和量の市販抗体の使用がＢＭＰ４媒介性シグナルを阻害しないことを見いだした。
【０２６３】
試験抗体の第３のグループはＣ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８を含む。これらは、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１エピトープに高親和性で結合する、ヒトＢＭＰ４に対して産生されたラマ由来の抗体である。本明細書の結果によれば、これらの抗体は、特異性と有効性の両方に優れている。本発明者らの知る限り、これらは、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１結合領域を標的にすることが記述された最初の抗ＢＭＰ４抗体である。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、したがって、ＢＭＰＲ１結合に関与するＢＭＰ４エリアを標的にするのは、成熟二量体型のＢＭＰ４内の他のエリアを標的にするのとは対照的に、抗ＢＭＰ４抗体に機能的優位性を付与すると仮定した。
【０２６４】
細胞及び細胞培養
マウスＩＤ１プロモータ（ＢＭＰ応答配列）を含むＢＲＥルシフェラーゼベクターが安定に移入されたＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞は、Ｄｒ．Ｌ．Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ及びＤｒ．Ｄ．Ｒｉｆｋｉｎ（２７）の好意によって提供された。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び７００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ＳＡＳ、トゥールーズ、フランス）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＣ２Ｃ１２細胞を培養した。
【０２６５】
食道腺癌細胞株ＯＥ１９、ＯＥ３３及びＳＫＧＴ４並びに結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ２９を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（ＲＰＭＩ）中で培養した。結腸直腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６及び膵臓腺癌細胞株Ｃａｐａｎ−２を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。すべての癌細胞株を少なくとも４日間培養し、培地を２〜３日ごとに変えた。
【０２６６】
ウエスタンブロット法
様々な型のＢＭＰ４を特定するために、組換えタンパク質及び癌細胞株溶解物を使用した。細胞溶解物のタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ  ＵＳＡ）を用いて製造者の手順に従って測定した。等量の試料を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せ（８〜３０μｇ／レーン）、続いてＰＶＤＦ転写膜上にブロットした。膜をブロッキング溶液（５％脱脂乳＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）又は５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋ＴＢＳＴ）でブロックし、続いて適切な一次抗体及び二次抗体と一緒にインキュベートした。その後、膜を洗浄し、化学発光溶液（ＰｉｅｒｃｅＴＭ  ＥＣＬ減算（ｓｕｂｔｒａｃｔ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ  ＵＳＡ）と一緒にインキュベートし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて可視化した。濃度測定分析をＩｍａｇｅ  Ｊ１．４５ｓ（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、国立衛生研究所、ＵＳＡ）を用いて行った。一次抗体としては、抗ＢＭＰ４クローン６６１１９（１μｇ／ｍｌ；カタログ番号ＭＡＢ７５７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＢＭＰ４クローン３Ｈ２（０．５μｇ／ｍｌ；カタログ番号５００−Ｍ１２１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）；抗ＢＭＰ４クローンＭ９１２２６２（０．５μｇ／ｍｌ；カタログ番号ＡＢＩＮ９３４０７１；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｏｎｌｉｎｅ）、抗ＢＭＰ４クローンＥＰＲ６２１１（０．１μｇ／ｍｌ；カタログ番号ａｂ１２４７１５；Ａｂｃａｍ）、抗ＢＭＰ４（０．８μｇ／ｍｌ；カタログ番号ａｂ３９９７３；Ａｂｃａｍ）、Ｃ４Ｃ４（０．１μｇ／ｍｌ）及びＣ８Ｃ８（０．１μｇ／ｍｌ）が挙げられる。二次抗体としては、ＨＲＰ抗ウサギ（１：２００；カタログ番号Ｐ０４４８；Ｄａｋｏ）、ＨＲＰ抗マウス（１：２０００；カタログ番号Ｐ０４４７；Ｄａｋｏ）及びＨＲＰ抗ラマ（１：１０００；カタログ番号ａｂ１１２７８６；Ａｂｃａｍ）が挙げられる。
【０２６７】
ルシフェラーゼアッセイ
様々な型のＢＭＰ４のＩＤ１プロモータの活性を調べるために、増加濃度（０．５〜１０００ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ４及び変異型のＢＭＰ４（ＨΔＢＭＰ４）と一緒に細胞を培養した。さらに、種々のＢＭＰ４、変異及び未変異ＢＭＰ４を用いて、１０μｇ／ｍｌのＶＨＨ及び抗ＢＭＰ４抗体：クローン６６１１９、クローン３Ｈ２及びクローンＭ９１２２６２を用いて、又は用いないで、細胞を刺激することによって、種々の抗ＢＭＰ４抗体に比べたＶＨＨ標的部位の優位性を確認した。ＨＴ−２９細胞株の馴化培地を用いて、１０μｇ／ｍｌのＶＨＨ及び抗ＢＭＰ４抗体：クローン６６１１９、クローン３Ｈ２、クローンＰＡ３５４−１６．１．１、クローンＥＰＲ６２１１及びＡｂｃａｍ抗体ａｂ３９９７３を用いて、又は用いないで、刺激されたＣ２Ｃ１２細胞によって、内在性ＢＭＰ４の結合における種々の抗体の分析を行った。
【０２６８】
すべての実験を各ウェルにおいて０．１％ＢＳＡ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した最終体積１００μｌのＤＭＥＭに対して行った。無刺激細胞を対照として使用し、細胞を含まないウェルを使用してバックグラウンド活性を正規化した。各状態を３つ組で１６時間処理し、その後、１００μｌのルシフェラーゼ基質（Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｅｎｅｌｕｘ、ライデン、オランダ）を添加することによってルシフェラーゼ活性を測定した。５分間のインキュベーション期間後、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキ、ＶＴ、米国）によって測定した。データを正規化し、ＢＭＰのみで刺激された細胞の活性に対する比として表した。
【０２６９】
統計解析
すべての実験データを少なくとも３つの独立した実験で実施した。データを平均±標準誤差平均（ＳＥＭ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｍｅａｎ）として表す。統計解析を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）、続いてダネットの多重比較検定によって分析した。ｐ≦０．０５（＊）、ｐ≦０．０１（＊＊）及びｐ≦０．００１（＊＊＊）の確率を、静的に有意とみなした。統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０２７０】
実施例１８  Ｃ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８抗ＢＭＰ４並びに抗ＢＭＰ２及び４抗体を用いたＳＭＡＤ４陰性癌の生体内処理
インビトロ実験は、様々なタイプの化学療法剤と一緒のＣ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８が腫瘍細胞増殖に対して相乗効果を有することを証明した。生体内でのＣ４Ｃ４及びＣ８Ｃ８と化学療法の治療及び相乗効果を試験するために、以下の実験を行った。
【０２７１】
最近記述された方法（Ｒｅａｄ  Ｍ、Ｌｉｕ  Ｄ、Ｄｕｏｎｇ  ＣＰら、「筋肉内移植は、食道の患者由来の腫瘍異種移植片の移植率を改善する（Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）」、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５。最初にオンラインで発表された：２０１５年２月１８日。ｄｏｉ：１０．１２４５／ｓ１０４３４−０１５−４４２５−３）を用いた患者癌生検材料のＰＤＸに由来する食道腺癌ヒト癌細胞株ＩＳＯ７６−Ａをこの実験に使用した。ＩＳＯ７６−Ａ細胞株はＳＭＡＤ４変異を有することが判明した。６〜８週齢の３０匹の雌性ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスに、各５匹のマウスの６グループに無作為化されたＩＳＯ７６−Ａヒト食道癌細胞株を接種した。各マウスにＩＳＯ７６−Ａ腫瘍細胞を皮下接種した。細胞を５０％：５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＰＢＳ混合物中で調製し、ＮＳＧマウスの右側腹部に皮下注射した（２．５ｘ１０＾６細胞／マウス  １００ｕＬ懸濁物）。腫瘍の体積が＞８０ｍｍ３になったときに処理を開始した。処理前に動物を６グループに無作為化した：グループ１はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ食塩水）を摂取した；グループ２はシスプラチナム２ｍｇ／ｋｇを週１回摂取した；グループ３は毎日１００マイクログラムのＣ４Ｃ４を腹腔内注射（ＩＰ）によって摂取した；グループ４は毎日１００マイクログラムのＣ８Ｃ８を腹腔内注射（ＩＰ）によって摂取した；グループ５はシスプラチナム２ｍｇ／ｋｇを週１回、Ｃ４Ｃ４、毎日１００マイクログラムＩＰと組み合わせて摂取した、及びシスプラチナム２ｍｇ／ｋｇを週１回及びＣ８Ｃ８  １００マイクログラムを毎日ＩＰ摂取したグループ６。すべての製剤を食塩水に溶解させた。
【０２７２】
腫瘍増殖を電子ノギスで隔週観測し、動物重量を記録した。図３５及び３６によれば、すべてのグループで、動物重量増加が対照群に類似し、化合物がこの特定の設定における重量増加に対して負の効果を持たないことを示した。３週目（２１日目）に、図３７及び３８によれば、Ｃ４Ｃ４とＣ８Ｃ８の両方が腫瘍増殖を阻害する。両方の化合物は、こうしてシスプラチナムと相乗作用を示し、化学療法抵抗性を克服し、腫瘍増殖のかなりの減少、更には安定化さえもたらした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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