(57)【要約】  その必要がある対象において選択した脳組織の血液脳関門透過性を増大させる方法は、（ａ）温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された関門開放タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含む組換え核酸を含む、脳組織に遊走する幹細胞を対象に非経口投与するステップと、次いで、（ｂ）選択した脳組織において血液脳関門の透過性を増大させるために有効な量の関門開放タンパク質またはペプチドの発現を誘導するのに十分な程度に、選択した脳組織を選択的に加温するステップにより実施される。このような方法の実施に有用な核酸、ベクター、幹細胞、および組成物もまた記載する。
2017506884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｂ）に操作可能に結合された温熱誘導性プロモーターと、
（ｂ）（ｉ）幹細胞誘引ケモカインまたは（ｉｉ）血液脳関門開放タンパク質もしくはペプチドである活性薬をコードする核酸と
を含む組換え核酸。
【請求項２】
前記プロモーターが温熱誘導性タンパク質プロモーターである、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
前記温熱誘導性プロモーターが、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止遺伝子プロモーター、およびＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記活性薬が、ＴＮＦ−アルファ、ストロマ細胞由来因子１アルファ、腫瘍関連増殖因子、形質転換増殖因子アルファ、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞由来化学誘引物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される幹細胞誘引ケモカインであり、ただし、前記組換え核酸が形質転換した幹細胞中にない場合はＶＥＧＦを除く、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記活性薬が、ブラジキニン、トロンビン、エンドセリン−１、サブスタンスＰ、血小板活性化因子、サイトカイン、マクロファージ炎症性タンパク質、および補体由来ポリペプチドＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇからなる群から選択される血液脳関門開放タンパク質またはペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むベクター。
【請求項７】
ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の異種組換え核酸または請求項６または７に記載のベクターで形質転換された幹細胞。
【請求項９】
前記幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項８に記載の幹細胞。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体中にある、請求項８または９に記載の幹細胞を含む組成物。
【請求項１１】
その必要がある対象における治療的処置のために組織を準備する方法であって、
（ａ）前記組織へ遊走する事前調整された幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記事前調整された幹細胞が組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された幹細胞誘引ケモカインをコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）前記対象に非経口投与された治療用幹細胞の遊走を増強させるために有効な量の前記幹細胞誘引ケモカインの発現を前記治療用幹細胞において誘導するために十分な程度に、前記組織を選択的に加温するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記組織が脳、乳房、皮膚、前立腺、肺、網膜、筋肉、肝臓、膵臓、骨格、または軟骨組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が新生物組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記新生物組織が脳腫瘍、乳がん、皮膚がん、前立腺がん、または肺がん組織である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロモーターが温熱誘導性タンパク質プロモーターである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記温熱誘導性プロモーターが、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止遺伝子プロモーター、およびＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞誘引ケモカインが、ＴＮＦ−アルファ、ストロマ細胞由来因子１アルファ、腫瘍関連増殖因子、形質転換増殖因子アルファ、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞由来化学誘引物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択的に加温するステップが、超音波、レーザー、高周波、マイクロ波、またはウォーターバスにより実施される、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択的に加温するステップが、高密度焦点式超音波により実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記非経口投与するステップが全身的に投与するステップである、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
その必要がある対象における組織を処置する方法であって、
（ａ）前記組織へ遊走する治療用幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記治療用幹細胞が組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された治療薬をコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）治療に有効な量の前記治療薬の発現を誘導するために十分な程度に前記組織を選択的に加温するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記治療薬が、毒素、毒素の断片、薬物代謝酵素、およびアポトーシスの誘導因子からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療薬が、（ａ）細菌毒素、植物毒素、真菌毒素およびこれらの組合せからなる群から選択される毒素、（ｂ）キナーゼを含む薬物代謝酵素、または（ｃ）ＰＵＭＡ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢｃＩ−ＸＳ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＡｄＥ１Ｂ、ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ、ＴＲＡＩＬ、ＳＡＲＰ−２、およびアポプチンからなる群から選択されるアポトーシスの誘導因子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織が脳、乳房、皮膚、前立腺、肺、網膜、筋肉、肝臓、膵臓、骨格、または軟骨組織である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織が新生物組織である、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記新生物組織が脳腫瘍、乳がん、皮膚がん、前立腺がん、または肺がん組織である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞が胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロモーターが温熱誘導性タンパク質プロモーターである、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記温熱誘導性プロモーターが、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止遺伝子プロモーター、およびＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択的に加温するステップが、超音波、レーザー、高周波、マイクロ波、またはウォーターバスにより実施される、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記選択的に加温するステップが、高密度焦点式超音波により実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記非経口投与するステップが全身的に投与するステップである、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
その必要がある対象における組織の処置の準備をする方法およびそれを処置する方法であって、
（ａ）前記組織へ遊走する事前調整された幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記事前調整された幹細胞が組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された幹細胞誘引ケモカインをコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）前記対象に非経口投与された治療用幹細胞の遊走を増強させるために有効な量の前記幹細胞誘引ケモカインの発現を誘導するために十分な加温を前記組織について選択的に行うステップと、次いで、
（ｃ）前記組織へ遊走する治療用幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記治療用幹細胞が組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された治療薬をコードする核酸を含み、次いで、
（ｄ）治療に有効な量の前記治療薬の発現を誘導するのに十分な加温を前記組織について選択的に行うステップと
を含む方法。
【請求項３５】
前記幹細胞誘引ケモカインが、ＴＮＦ−アルファ、ストロマ細胞由来因子１アルファ、腫瘍関連増殖因子、形質転換増殖因子アルファ、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞由来化学誘引物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療薬が、毒素、毒素の断片、薬物代謝酵素、およびアポトーシスの誘導因子からなる群から選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬が、（ａ）細菌毒素、植物毒素、真菌毒素およびこれらの組合せからなる群から選択される毒素、（ｂ）キナーゼを含む薬物代謝酵素、または（ｃ）ＰＵＭＡ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢｃＩ−ＸＳ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＡｄＥ１Ｂ、ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ、ＴＲＡＩＬ、ＳＡＲＰ−２、およびアポプチンからなる群から選択されるアポトーシスの誘導因子である、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織が脳、乳房、皮膚、前立腺、肺、網膜、筋肉、肝臓、膵臓、骨格、または軟骨組織である、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記組織が新生物組織である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記新生物組織が脳腫瘍、乳がん、皮膚がん、前立腺がん、または肺がん組織である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
いずれかのまたは両方の前記幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロモーターが温熱誘導性タンパク質プロモーターである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
いずれか一方のまたは両方の前記温熱誘導性プロモーターが、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止遺伝子プロモーター、およびＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
いずれか一方のまたは両方の前記選択的に加温するステップが、超音波、レーザー、高周波、マイクロ波、またはウォーターバスにより実施される、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
いずれか一方のまたは両方の前記選択的に加温するステップが、高密度焦点式超音波により実施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
いずれか一方のまたは両方の前記非経口投与するステップが全身的に投与するステップである、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
その必要がある対象において選択した脳組織の血液脳関門透過性を増大させる方法であって、
（ａ）脳組織に遊走する幹細胞を対象に非経口投与するステップと、ここで、前記幹細胞は組換え核酸を含み、前記組換え核酸は、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された関門開放タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）前記選択した脳組織における血液脳関門の透過性を増大させるために有効な量の前記関門開放タンパク質またはペプチドの発現を誘導するのに十分な加温を、前記選択した脳組織について選択的に行うステップと
を含む方法。
【請求項４８】
前記選択した組織が新生物組織である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記幹細胞誘引ケモカインが、ＴＮＦ−アルファ、ストロマ細胞由来因子１アルファ、腫瘍関連増殖因子、形質転換増殖因子アルファ、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞由来化学誘引物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記血液脳関門開放タンパク質またはペプチドが、ブラジキニン、トロンビン、エンドセリン−１、サブスタンスＰ、血小板活性化因子、サイトカイン、マクロファージ炎症性タンパク質、および補体由来ポリペプチドＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇからなる群から選択される、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロモーターが温熱誘導性タンパク質プロモーターである、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記温熱誘導性プロモーターが、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止遺伝子プロモーター、およびＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記幹細胞が前記対象における治療薬の細胞毒性効果を増大させるのに有効な量で投与され、前記対象に前記治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療薬が、テモゾロミド（「Ｔｍｚ」）、ＶＰ−１６、パクリタキセル、カルボプラチン、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（「ＴＲＡＩＬ」）、トログリタゾン（「ＴＧＺ」）、ピオグリタゾン（「ＰＧＺ」）、ロシグリタゾン（「ＲＧＺ」）およびシグリタゾン（「ＣＧＺ」）、プロカルバジン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、サリドマイド、イリノテカン、イソトレチノイン、イマチニブ、エトポシド、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ビンブラスチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
それ自体、前記請求項のいずれか１項に記載の方法において使用するための、または前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施する際に使用するための医薬の調製において使用するための、前記請求項のいずれか１項に記載される核酸、ベクター、または幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１４年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／９２８，５２６号の利益を主張するものであり、この開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
本発明は、幹細胞などの活性剤または治療剤を、脳における新生物組織などの、対象とする組織に送達するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も一般的な高悪性度の原発性脳腫瘍であり、極めて予後不良である（Ｐ．Ｗｅｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３５９（５）：４９２−５０７（２００８））。この予後不良は、正常な脳組織に近接して存在するもしくは正常な脳組織に浸潤する残存細胞または浸潤性細胞を、標準的治療では根絶できないという現実が直接的な原因である。幹細胞は、腫瘍指向性の遊走能を有することから、治療上の標的である原発性および浸潤性腫瘍細胞への実行可能な送達担体として頭角を現している。実際に、我々や他の者により、インビボにおいて、原発性ＧＢＭ腫瘍、ならびに正常な脳組織と混ざり合う浸潤性腫瘍細胞に向かう幹細胞の遊走能が実証されている（Ｉ．Ｇｅｒｍａｎｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１０５、８８−９５（２００６）；Ｊ．Ｄｏｒｓｅｙら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８、３２８５−３２９５（２００９）；Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０４、１５５−１６２（１９９９）；Ｄ．Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７、３８３−３８５（２００１）；Ｈ．Ｗａｌｃｚａｋら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．５、１５７−１６３（１９９９）；Ａ．ＰａｎｎｅｒＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５、８８０９−８８２３（２００５）；Ｓ．Ｋｉｄｄら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９；２７（１０）：２６１４−２６２３（２００９））。
【０００４】
治療用媒体としての幹細胞を制限する主な問題として、（１）腫瘍への遊走に加え、幹細胞が高い毒性治療効果を非選択的に発現すると、損傷を受け得る体内の正常領域へさらに誘引されること（Ｓ．Ｋｉｄｄら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７（１０）：２６１４−２６２３（２００９））、および（２）臨床状況において治療的反応を誘導するには、大量かつ非現実的な数の遺伝子操作された幹細胞を注射する必要があると考えられるため、腫瘍へ遊走する治療用に遺伝子操作された幹細胞の注入分画が少量であると、それらが有する治療能力が制限されることの２つが挙げられる。したがって、多形神経膠芽腫などの脳腫瘍、および幹細胞治療により治療可能なこの他の状態の両方に対し、幹細胞治療薬の送達を増強する新規の方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、本明細書において、多形神経膠芽腫の治療に関係する一実施形態に関して記載されることがあるが、当業者であれば、本発明ががんおよび非がん組織の両者を含む多種多様なタイプの組織の治療に適用しうることを理解するであろう。したがって、本明細書における多形神経膠芽腫に特異的な考察は、本発明を限定するものではなく、本発明の多様な態様の例証として扱われるものとする。
【０００６】
よって、下記で考察するように、本発明は、処置を必要とする対象における組織の処置の準備をする方法、およびそれを処置する方法を提供する。まとめると、この方法は、
（ａ）前記組織へ遊走する事前調整された幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記事前調整された幹細胞は組換え核酸を含み、前記組換え核酸は、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された幹細胞誘引ケモカインをコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）前記対象に非経口投与された治療用幹細胞の遊走を増強させるために有効な量の前記幹細胞誘引ケモカインの発現を誘導するために十分な加温を前記組織について選択的に行うステップと、次いで、
（ｃ）前記組織へ遊走する治療用幹細胞を、対象に非経口投与するステップと、ここで、前記治療用幹細胞は、場合により（好ましくは幾つかの実施形態において）組換え核酸を含み、前記組換え核酸は、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された治療薬をコードする核酸を含み、次いで、場合により（好ましくは幾つかの実施形態において）、
（ｄ）治療に有効な量の前記治療薬の発現を誘導するのに十分な加温を前記組織について選択的に行うステップと
を含む。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、その必要がある対象において、選択した脳組織の血液脳関門透過性を増大させる方法であって、
（ａ）脳組織に遊走する幹細胞を対象に非経口投与するステップと、ここで、前記幹細胞は組換え核酸を含み、前記組換え核酸は、温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された関門開放タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含み、次いで、
（ｂ）前記選択した脳組織における血液脳関門の透過性を増大させるために有効な量の前記関門開放タンパク質またはペプチドの発現を誘導するのに十分な加温を、前記選択した脳組織について選択的に行うステップと
を含む方法である。
【０００８】
また本明細書では、上述のような幹細胞を含む医薬製剤について、さらに下記では、本明細書に記載の方法の実施の際に使用する薬学的に許容される担体中の医薬製剤について説明する。
【０００９】
また本明細書では、本明細書に記載したような医薬製剤の調製において使用するための、および本明細書に記載したような方法において使用するための幹細胞についても記載する。
【００１０】
本発明を、本明細書における図面および後述の具体例において、より詳細に説明する。本明細書において引用したすべての米国特許文献の開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすこととする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】インビトロにおける、腫瘍細胞が分泌した化学誘引物質に反応にした神経幹細胞（ＮＳＣ）の遊走能を示す図である。蛍光顕微鏡（ＦＭ）および光学顕微鏡（ＬＭ）によるフィルターの代表的な顕微鏡写真は、遊走したＮＳＣを示しており、細胞がＴＲＡＮＳＷＥＬＬからプレートへ遊走したことを示している。蛍光顕微鏡下での写真撮影、およびＴＲＡＮＳＷＥＬＬからプレート表面（矢印）へ遊走した細胞をカウントすることにより、遊走を定量した。ＧＢＭが存在する条件培地における遊走を、コントロール（ＣＴＲＬ、無血清培地）と比較したヒストグラムは、ＧＢＭ存在条件培地において遊走が有意に増加したことを示している。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表し、＊はＰ＝０．０４３２、スチューデントのｔ検定である。
【図１Ｂ】インビボにおいてＧＦＰ発現ＮＳＣが神経膠芽腫に向かって遊走することを示す図である。様々な断面画像より、ＧＦＰ発現ＮＳＣ（矢印）が原発性腫瘍（破線）および（ＤｓＲｅｄを発現する）浸潤性突起と共存することが明らかとなったが、これは正常細胞では見られず、これはインビボにおけるＮＣＳのＧＢＭ指向性を示している。
【図２Ａ】比例的に発現するように配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）で隔てられているレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）の発現を促進するＨＳＰ７０プロモーター（ＰＨＳＰ７０）を含むレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰの概略図である。ＨＳＰ７０で促進される発現に加え、プラスミドはまた、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をＲＳＶプロモーター（ＰＲＳＶ）を介して構成的に発現して、形質導入が成功した細胞を可視化して選択する。
【図２Ｂ】様々な温度で加温した後のＨＳＰ７０促進レポーター遺伝子の発現を示す図である。ジャーカット細胞をｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰで形質導入して、ＰＣＲサーマルサイクラーの中で表記の温度で３０分間加温した。細胞を９６ウェルプレートに再播種し、通常の培養条件で１８時間培養した。細胞をルシフェリンに曝露させて、ＩＶＩＳ１００イメージングシステムを用いて画像化した。ウェル周辺の対象領域（ＲＯＩ）を描出、および光強度をヒストグラムにプロットすることにより、光シグナルを定量化した。
【図３Ａ】ジャーカット細胞における、ＨＳＰ７０促進Ｆ−Ｌｕｃ／ＧＦＰおよび構成的ＲＦＰ（Ｃｏｎｓｔ．）の二重レポーターの発現を示す図である。ジャーカット細胞にウイルスを感染させ、ＲＦＰ発現によりいったん形質導入を確認した後、細胞をＰＣＲサーマルサイクラーの中で表記の時間、４３℃に加温した。加温後、細胞を再播種し、通常の培養条件で２４時間培養した。ルシフェリンに曝露させた後、生物発光および多色蛍光（ＧＦＰとＲＦＰ）画像を記録した（ＲＦＰは左上、位相コントラストは右上、ＧＦＰは左下、混色は右下）。光シグナルを定量化して、ヒストグラムにプロットした。
【図３Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞におけるＨＳＰ７０促進Ｆ−Ｌｕｃ／ＧＦＰおよび構成的ＲＦＰ（Ｃｏｎｓｔ．）の二重レポーターの発現を示す図である。黒色腫細胞にウイルスを感染させ、ＲＦＰ発現によりいったん形質導入を確認した後、ＰＣＲサーマルサイクラーの中で表記の時間、４３℃に細胞を加温した。加温後、細胞を再播種し、通常の培養条件で２４時間培養した。ルシフェリンに曝露させた後、生物発光および多色蛍光（ＧＦＰとＲＦＰ）画像を記録した（ＲＦＰは左上、位相コントラストは右上、ＧＦＰは左下、混色は右下）。光シグナルを定量化し、ヒストグラムにプロットした。
【図４】ＮＳＣにおけるＨＳＰ７０促進レポーター遺伝子発現を示す図である。ＮＳＣにｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰウイルスに感染させて形質導入し、２４時間後、プラスミドの発現をＲＦＰの構成的発現により確認した。その後、ＮＳＣは、ＰＣＲサーマルサイクラーの中で３０分間、４３℃に加温した後、再播種し、通常の細胞培養条件で２４時間培養した。多色蛍光画像化により、加温がＨＳＰ７０プロモーターを誘導し、その結果、ＧＦＰが発現したことが示された。ＲＦＰは左上、位相コントラストは右上、ＧＦＰは左下、混色は右下。
【図５】インビボにおける、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）調節下で加温した後の移植細胞におけるＨＳＰ７０促進ホタルルシフェラーゼ発現を示す図である。ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰベクターを安定的に発現したＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（８×１０５）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右下腿部に皮下移植した。細胞移植から７日後、注入部位を磁気共鳴温度測定（ＭＲＴ）ガイド下ＨＩＦＵで３０分間、４３℃に加温した。ＨＩＦＵ誘導から８時間後、マウスを麻酔し、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（キセノゲン）を腹腔内注入した後、生物発光で画像化した。生物発光は、ＩＶＩＳ１００インビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した（上の枠）。Ｂ１６注入部位全面にわたり対象領域（ＲＯＩ）を描出した後、ＲＯＩ全体について、光子束を定量してグラフ化した（下の枠）。
【図６Ａ】インビボにおけるＭＲＴガイド下ＨＩＦＵを示す図である。選択した焦点スポット（矢印）に連続的な超音波曝露を行い、ラット死骸の脳組織を加温した。周囲温度：３７℃、ＴＥ／ＴＲ：８．７／３０ｍｓ、５スライス、１０ｃｍＦＯＶ、１２８×１２８マトリックス、０．７８×０．７８ｍｍ２平面内解像度、５ｍｍスライス厚、１８秒時間分解能のＭＲＴを用いて、温度をリアルタイムでモニターした。
【図６Ｂ】ＭＲＴガイド下ＨＩＦＵのフィードバックループを示すグラフである。ＨＩＦＵシークエンスを適用した（上の枠）。リアルタイムＭＲＴを用いて、１５分間のＨＩＦＵ実験中の標的スポット内における温度（破線）および熱照射量（実線）の変化を厳密にモニターした（下の枠）。グラフにおける熱照射量は、４３℃での累積等価分を表す。
【図７Ａ】リアルタイムＭＲＴを示す図である。Ｔ２強調画像（ＴＥ／ＴＲ５．７／１７ｍｓ、８８スライス、１０ｃｍＦＯＶ、２５６×２５６マトリックスおよび０．４ｍｍ等方性空間分解能）を用いて腫瘍位置の特定（矢印）を行い、ＭＲＴ（ＴＥ／ＴＲ８．７／３０ｍｓ、５スライス、１０ｃｍＦＯＶ、１２８×１２８マトリックス、０．７８×０．７８ｍｍ２平面内解像度、５ｍｍスライス厚、および１８秒時間分解能）を用いて頭蓋内温度をリアルタイムでモニターした。ＨＩＦＵ実験中の腫瘍コア（９ボクセル）内の温度変化を示す（右枠）。
【図７Ｂ】ＨＩＦＵ後のｐＨＳＰ７０促進レポーター発現を示す図である。ＨＩＦＵ誘導から８および４８時間後に、ラットを麻酔し、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（キセノゲン）を腹腔内注入した後、生物発光で画像化した。シグナルから、レポーター構築物を有するがＨＩＦＵで加温していない腫瘍細胞を同数持つ対照と比較して、ＨＩＦＵ処置したラットでは強いＦ−Ｌｕｃ発現（円）を示した。
【図７Ｃ】生物発光シグナルの定量を示すグラフである。脳部位全面にわたり対象領域を描出した後、ＨＩＦＵ治療から８および４８時間後に、光子束を定量してグラフ化した。
【図８】標的を定めたＨＩＦＵ活性化治療薬送達ストラテジーの概略図である。ステップ１：休止期の組換え幹細胞を静脈注射する。ステップ２：幹細胞が原発性腫瘍（Ｔ）、浸潤性突起、およびマイクロサテライト腫瘍に向かって一方向的に遊走する。ステップ３：ＭＲＴによる継続的なモニタリングのもと、ＨＩＦＵ波で腫瘍および周辺組織を４３℃に非侵襲的に加温する。ステップ４：ＨＩＦＵ誘導加温により、熱ショックプロモーターを介して幹細胞の強力な治療薬の発現が活性化される。ＮＢは正常脳、ＴＺは浸潤性腫瘍域、ＨＺはＨＩＦＵ誘導処置域。
【図９】画像誘導ＨＩＦＵと併用した治療薬構築物の概略図である。レンチウイルスベクターは、比例的に発現するように配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）で隔てられているｓＴＲＡＩＬおよびＦ−Ｌｕｃの発現を促進する、ＨＳＰ７０プロモーター（ＰＨＳＰ７０）を含む。さらに、ベクターはまた、形質導入が成功した細胞を可視化して選択するための赤色蛍光タンパク質を構成的に発現する。
【図１０Ａ】ＣＭＶプロモーター制御下のｓＴＲＡＩＬおよびｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子をコードするベクターでトランスフェクトしたＧＦＰ発現ＮＳＣが、トランスフェクトから７２時間後、ＮＳＣの死細胞または円形化細胞を伴わずｓＴＲＡＩＬ、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を発現することを示す図である。
【図１０Ｂ】ｓＴＲＡＩＬによりトランスフェクトされたＮＳＣの培養物由来の培地がＧＢＭ細胞を殺滅することを示すグラフである。ＣＭＶプロモーターの制御下、ｓＴＲＡＩＬおよびｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子をコードするベクターによりトランスフェクトされたＮＳＣを培養培地中で増殖させ、その培地をＧＢＭ細胞を含むウェルに分注し、その後、細胞死を観察した。この分析により、濃縮していない培地中に存在する極めて低量のｓＴＲＡＩＬでも、ＧＢＭ細胞を殺滅しうることが示された。これに比べ、ｍＣｈｅｒｒｙのみ発現する空ベクターで模擬的にトランスフェクトしたＮＳＣからの対照培地（ＣＴＲＬ）では、ＧＢＭ細胞に対する影響は何もなかった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝１６）として表す。＊＊＊はＰ＝０．０００８、スチューデントのｔ検定。
【図１０Ｃ】ｓＴＲＡＩＬを安定的に発現するＮＳＣはＧＢＭ細胞を殺滅することを示す図である。Ｆ−Ｌｕｃを構成的に発現するＵ２５１ＭＧ  ＧＢＭ細胞（１×１０３）を、ｓＴＲＡＩＬを安定的に発現するＮＣＳ（１×１０３）と共にインキュベートした。４８時間後、ＧＢＭの生細胞率を生物発光を用いて測定した。結果より、ｓＴＲＡＩＬを発現しない対照細胞と共にインキュベートしたＧＢＭ細胞と比べ、ｓＴＲＡＩＬ分泌細胞に曝露させたＧＢＭ細胞は完全に消滅したことが示された。
【図１１】ラット脳内の頭蓋内ヒトＧＢＭ腫瘍の磁気共鳴画像である。
【図１２Ａ】比例的に発現するように配列内リボソーム進入部位で隔てられているホタルルシフェラーゼおよびサイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦβ１）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を促進するＨＳＰ７０プロモーターを含む、レンチウイルスベクター、ｐＬｅｎｔｉ−ＨＳＰ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−サイトカイン）の概略図である。ＨＳＰ７０で促進される発現に加え、プラスミドはまた、形質導入が成功した細胞を可視化して選択するための赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）およびブラストサイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）も構成的に発現する。５’ＬＴＲ：５’末端反復配列、Ψ：パッケージングシグナル、ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答エレメント、ｃＰＰ：中央ポリプリン管、ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、３’ＬＴＲ（ＳＩＮ）：ＳＩＮ変異を有する３’末端反復配列。
【図１２Ｂ】ヒト間葉系幹細胞（上の枠）、ならびにＧＦＰ、サイトカイン、およびＲＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＮＳＣ細胞の図である（下の枠）。
【図１３】幹細胞遊走の分析を説明する図である。ｐＬｅｎｔｉ−ＨＳＰ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−サイトカイン）により形質導入した後、無血清ＤＭＥＭに懸濁した幹細胞を、ヒートブロック、超音波、または赤外光により２０分間、４３℃に穏やかに加温し、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬプレートのウェルの下側コンパートメントに播種した。無血清ＤＭＥＭにおいてＧＦＰを発現する幹細胞を上側コンパートメントに播種した。このＴＲＡＮＳＷＥＬＬシステムをＣＯ２インキュベーター内でインキュベートし、蛍光顕微鏡下で下側コンパートメントに遊走した細胞数をカウントした。対照として、温熱誘導していない幹細胞を下側コンパートメントに播種した。
【図１４】インビトロにおける、ヒートブロック（ＨＢ）、超音波（ＵＳ）および赤外光（ＩＲ）による穏やかな加温で誘導されたｈＭＳＣが分泌したサイトカインに反応した、ｈＭＳＣの遊走を示す図である。１ｍｍ２あたりの細胞総数を示す。
【図１５】インビトロにおける、ヒートブロック（ＨＢ），超音波（ＵＳ）および赤外光（ＩＲ）による穏やかな加温で誘導されたＮＳＣが分泌したサイトカインに反応した、ＮＳＣの遊走を示す図である。１ｍｍ２あたりの細胞総数を示す。
【図１６Ａ】ＨＳＰ７０プロモーター制御下ＴＮＦαをコードするレンチウイルスベクターで形質導入したＳＦ７６７ヒトグリア腫瘍細胞からの培地中のＴＮＦαの存在を示すグラフである。加温１回（第１回）の細胞は、高レベルのＴＮＦαを示した。初回加温から２４時間後に追加した加温過程（第２回）により亢進された細胞は、より一層高いレベルのＴＮＦα発現を示した。各回の加温から１６時間後に、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて培地中のＴＮＦαを測定した。非誘導細胞を対照（ＣＴＲＬ）として用いた。
【図１６Ｂ】形質転換されてＨＳＰ７０プロモーター制御下でＴＮＦαを発現するＳＦ７６７細胞からの条件培地に反応したＮＳＣの遊走を示す図である。ＮＳＣのＴＮＦαへの遊走反応を評価するために、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬプレート（８μｍ孔）の中で、ＲＦＰ発現ＮＳＣをＳＦ７６７細胞と共に２４時間インキュベートした。蛍光顕微鏡下での写真撮影により遊走を定量化して、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬからプレート表面に遊走した細胞数をカウントした。アッセイは３通り行った。表示したフィルターの顕微鏡写真（上の枠）から、（矢印で示した）ＮＳＣがＴＲＡＮＳＷＥＬＬからＳＦ７６７細胞を含むプレートに遊走したことが分かった。データより、対照（ＣＴＲＬ）の非加温細胞（下の枠）からの培地と比べ、温熱誘導したＳＦ７６７細胞からの条件培地はＮＳＣ遊走を誘導することが実証された。
【図１７Ａ】レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）、サイトカイン（ＴＮＦα）の発現を促進するＨＳＰ７０プロモーター、ならびにＲＦＰおよび選択マーカーブラストサイジン遺伝子の発現を促進するＲＳＶプロモーターを含むレンチウイルスプラスミドの概略図である。
【図１７Ｂ】ｐＬｅｎｔｉ−ＨＳＰ７０（ＴＮＦα−Ｌｕｃ）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）で形質導入したＭＳＣ（赤）の図である。
【図１７Ｃ】加温活性化ルシフェラーゼ発現およびＴＮＦα発現を示すグラフである。
【図１８Ａ】ラット脳内に移植したＭＳＣと組み合わせて、ＭＲＩガイド下ＨＩＦＵにより活性化したＦ−Ｌｕｃ発現を示す図である。ＨＩＦＵ誘導から１８時間後、ラットを麻酔し、１５０ｍｇ／ｋｇのｄ−ルシフェリンを腹腔内注入した後、生物発光で画像化した。
【図１８Ｂ】ラット脳内に移植したＭＳＣと組み合わせて、ＭＲＩガイド下ＨＩＦＵにより活性化したＢＢＢ開放を示す図である。ＨＩＦＵ誘導後、コントラストを強調したＴ１画像を得るには２日かかった。造影剤は静注投与する。
【図１９】ラット脳内に移植したＭＳＣと組み合わせて、ＭＲＩガイド下ＨＩＦＵで活性化したＢＢＢ開放の定量化分析のグラフである。Ａ）ＭＳＣ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）を有し、ＨＩＦＵ処置したラット（Ｎ＝６）、Ｂ）ＭＳＣ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）を移植されて、ＨＩＦＵ処置していないラット（Ｎ＝４）、およびＣ）ＭＳＣ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）を移植されて、ＨＩＦＵ処置したラット（Ｎ＝４）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、主にヒトを対象とした治療に関するが、本発明はまた、獣医学的目的で動物の対象、特に、イヌ、ネコ、家畜およびウマなどの哺乳動物を対象に実施してもよい。対象は任意の好適な年齢であってもよいが、対象は、幾つかの実施形態において、新生児、乳児、若年、青年、成人、老人の対象である。
【００１３】
本明細書において使用される場合、「処置する」とは、患者に利益を付与する任意のタイプの治療、特に、疾患の進行の遅延もしくは阻止、またはその疾患の症状の改善を指す。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」とは、化合物または組成物が、疾患の重症度および治療の必要度に照らし、過度に有害な副作用なく、対象に投与して本明細書に記載の治療を達成するために好適であることを意味する。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「並行して」とは、併用効果を産するに十分な時間的近接を意味する（すなわち、並行しては、同時にであってもよく、または互いの事象の前または後の短時間内に生じる２つ以上の事象であってもよい）。
【００１６】
「核酸」とは、一本鎖型または二本鎖型のいずれかのデオキシリボ核酸またはリボ核酸およびそれらのポリマーを指す。特段の限定がない限り、この用語は、参照核酸として類似の結合特性を有し、天然に生じる核酸に類似の方法で代謝される、天然核酸の既知のアナログを含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列には、保存的に改変されたそれらの変異体（例えば縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明示された配列も無条件に包含される。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされｍＲＮＡと同義で用いる。
【００１７】
「異種核酸」は、一般的に、単離されてクローン化され、本来組み合わされることのない核酸と連結され、および／または、前記核酸またはタンパク質が、本来、通常見られるであろう細胞または細胞外環境以外の細胞または細胞外環境へ導入、および／またはそこで発現された核酸を表す。この用語は、異なる生物からまたはその核酸が発現される細胞のタイプとは異なるタイプの細胞から独自に得られる核酸、および核酸が発現される細胞株と同じ細胞株から得られる核酸のいずれも包含する。
【００１８】
「コードする核酸」とは、ｒＲＮＡなどの構造的ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列の配列情報、またはトランス作動性調節因子の結合部位を含む核酸を指す。この句は、具体的には、天然配列の縮重コドン（すなわち、１つのアミノ酸をコードする多様なコドン）、または特定の宿主細胞に導入され好ましいコドンに順応しうると考えられる配列を包含する。
【００１９】
核酸に関して使用される場合、「組換え体」とは、一般的に、組成物、または前記核酸もしくはタンパク質の一次配列が、当業者に周知である実験操作法を用いて、天然に生じる配列から改変されていることを表す。組換え体はまた、核酸またはタンパク質が、単離されてベクター内へクローン化されていること、または、前記核酸またはタンパク質が本来見られるであろう細胞または細胞外環境以外の細胞または細胞外環境へ導入、および／またはそこで発現された核酸を表してもよい。
【００２０】
細胞に関して使用される場合、「組換え体」とは、細胞が、その細胞外に起源をもつ核酸を複製または発現すること、またはその細胞外に起源をもつ核酸にコードされるペプチドまたはタンパク質を産生することを示す細胞を指す。組換え細胞は、天然型（非組換え体）の細胞内では見られない核酸を発現することができる。組換え細胞はまた、天然型の細胞で見られる核酸を発現することができ、核酸は、人為的手段により細胞内へ再導入される。このような細胞は、このような外来核酸が細胞膜の内側に導入された場合、外来核酸により「形質転換され」る。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構築している染色体ＤＮＡ内に組み込まれて（共有結合されて）いてもいなくてもよい。外来ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム因子上に保持されてもよい。真核細胞においては、安定的に形質転換された細胞は、一般的には、外来ＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体複製を通して娘細胞に遺伝するような細胞、または、安定的に保持された染色体外プラスミドを有する細胞である。真核細胞で外来ＤＮＡを含む娘細胞集団からなる細胞株またはクローンを樹立できることから、この安定性は実証される。
【００２１】
＜温熱誘導性プロモーター＞
任意の好適な温熱誘導性プロモーターを本発明の実施のために使用してもよく、例えば、ＨＳＰ７０プロモーター、ＨＳＰ９０プロモーター、ＨＳＰ６０プロモーター、ＨＳＰ２７プロモーター、ＨＳＰ２５プロモーター、ユビキチンプロモーター、増殖停止またはＤＮＡ損傷遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、それだけに限定されない。例えば、米国特許第７，１８６，６９８号、第７，１８３，２６２号および第７，２８５，５４２号を参照されたい。Ｉ．Ｂｏｕｈｏｎら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１３１−１３７（２０００）（ｇａｄ１５３プロモーター）も参照されたい。
【００２２】
＜遊走促進性サイトカイン＞
様々な遊走促進性サイトカイン（「幹細胞誘引ケモカイン」としても言及されることもある）およびこれらをコードする核酸は既知であり、本発明の実施のために使用することができる。例えば、ＴＮＦ−アルファ、ストロマ細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、腫瘍関連増殖因子、形質転換増殖因子アルファ、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞由来化学誘引物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、およびインテグリンが挙げられるが、それだけに限定されない。例えば、米国特許第８，５６９，４７１号（すべてヒトなどの哺乳動物と思われる）を参照されたい。
【００２３】
＜血液脳関門開放薬＞
様々な薬が、血中投与した治療薬または診断薬の脳組織への送達の増強に有益な方法で、血液脳関門を開くことが知られている。例えば、参照にされたい。このような薬の例として、ブラジキニン、トロンビン、エンドセリン−１、サブスタンスＰ、血小板活性化因子、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦアルファ）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２）、および補体由来ポリペプチドＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇからなる群から選択された開放タンパク質またはペプチドが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００２４】
＜治療薬＞
様々な種類の治療薬（一般的にはタンパク質またはペプチド治療薬）およびそれらをコードする核酸が、本発明を実施するために使用されうることが知られている。一般的に、このような薬は、毒素、毒素の断片、薬物代謝酵素、アポトーシスの誘導因子などである。具体的な例として、細菌毒素、植物毒素、真菌毒素およびこれらの組合せ、キナーゼ、ならびにＰＵＭＡ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢｃＩ−ＸＳ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＡｄＥ１Ｂ、ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳＡＲＰ−２、およびアポプチンなどのアポトーシス誘導因子が（それらの活性断片を含み）挙げられるが、それだけに限定されない。一般的には、米国特許出願公開第２０１３０３１０４４６号を参照され、また米国特許第８，４５０，４６０号、第７，９７２，８１２号、第７，７３６，６３７号、および第５，７６３，２３３号も参照されたい。
【００２５】
＜組換え核酸およびベクター＞
上述のようなプロモーターを上述のような遊走促進性サイトカイン、血液脳関門開放薬または治療薬をコードする核酸と操作可能に結合した組換え核酸の作製技術は公知である。例としては、Ｍｏｏｎｅｎへの米国特許第７，１８６，６９８号およびＬｉらへの米国特許第７，１８３，２６２号に記載の例が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００２６】
このような組換え核酸が挿入、連結、または別な方法により結合した、かつ本発明の実施に有用であるベクターは、同様に既知である。例として、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター、プラスミド、弾道的粒子などが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００２７】
＜幹細胞および形質転換した幹細胞＞
幹細胞は、上述のようなベクターを使用したまたは使用しない、任意の好適な手段により、組換え核酸で安定的にまたは一過性に形質転換してもよい。好適な幹細胞、ならびにそれらの形質転換、増殖、製剤および投与のための方法およびベクターは既知である。例として、米国特許第６，３６８，６３６号、第６，３８７，３６７号、第７，０２２，３２１号、第８，０３４，３２９号、第８，０５７，７８９号、第８，２１６，５６６号、および第８，５１８，３９０号に記載の例が挙げられるが、それだけに限定されない。幹細胞は、任意の好適な組織、または胎盤、羊水、血液、臍帯血などの生物学的液体から捕集してもよい。一般的に、幹細胞は、目的にあった特定の条件および／または組織に応じて、特定の幹細胞を選択してもよく、胚性幹細胞、成体幹細胞または、人工多能性幹細胞であってもよい。
【００２８】
＜医薬製剤、用量および投与＞
本発明の実施において使用する（上述のような幹細胞を含むがそれだけに限定されない）幹細胞は、公知技術に従い薬学的に許容される担体中で投与するように製剤化してもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版、１９９５）を参照されたい。非経口投与に好適な本発明の製剤は、活性化合物の無菌の水性および非水性注入溶液を含み、調製物は、好ましくは対象のレシピエントの血液と等張である。これらの調製は、場合によって、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい。水性および非水性の無菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでいてもよい。
【００２９】
幹細胞含有医薬製剤の非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内および腹腔内注入を含む任意の好適な経路を介してもよいが、それだけに限定されない。任意の特定の投与において送達される幹細胞の数は、例えば、投与される幹細胞の種類、対象の年齢、体重および状態、組織、ならびに治療状況などの様々な因子に依存することとなるが、一般的には、１００万、５００万または１０００万個の細胞から１０億、５０億、１００億もしくは５００億個の細胞まで、もしくはそれ以上となる。
【００３０】
＜治療対象組織＞
新生物および非新生物組織を含む多種多様な種類の組織が、幹細胞治療の標的として既知である。例えば、Ｖ．ＳｅｇｅｒｓおよびＲ．Ｌｅｅ、Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎａｔｕｒｅ  ４５１、９３７−９４２（２００８）；Ｓ．ＫｉｍおよびＪ．ｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８７、２１８３（２００９）；Ａ．Ｃａｐｌａｎ、Ｒｅｖｉｅｗ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１、１１９８−１２１１（２００５）などを参照されたい。
【００３１】
したがって、上注のように、幾つかの実施形態において、治療対象の組織は、新生物またはがん組織であり、例えば、脳がん組織または腫瘍（例えば、多形神経膠芽腫などの神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫など）、乳がん組織または腫瘍、皮膚がん組織または腫瘍（例えば、黒色腫、基底細胞の皮膚がん、扁平細胞の皮膚がんなど）、前立腺がん組織または腫瘍、肺がん組織または腫瘍、卵巣がん組織または腫瘍、大腸および結腸直腸がん組織または腫瘍、膵臓がん組織または腫瘍などが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３２】
他の実施形態において、治療対象の組織は、非新生物または非がん性組織であるが、幹細胞治療に好適である損傷組織または罹患組織である。このような組織には、例えば、中枢神経、末梢神経、網膜、骨格筋、心筋、上皮、肝臓、膵臓、骨格、内分泌、および外分泌組織（例えば、前記組織が急性傷害、無酸素性傷害、代謝疾患、または自己免疫疾患に侵されている場合）が挙げられるが、それだけに限定されない。具体的な例として、急性または慢性の脳損傷、急性の脊髄損傷、心臓障害、造血発生、脱毛症、喪失歯、難聴、失明および視覚不全、運動ニューロン疾患、移植片対宿主病、クローン病、神経行動先天性欠損、糖尿病などを治療することが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３３】
＜選択した組織の加温＞
選択した組織を（温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された遺伝子の発現を誘導するのに十分に）加温する具体的な方法は、加温される特定の組織または標的組織に依存することとなる。一般的には、選択的に加温するステップは、超音波、レーザー、高周波、マイクロ波、またはウォーターバスを用いて実施してもよい。Ｍｏｏｎｅｎへの米国特許第７，１８６，６９８号およびＬｉらへの米国特許第７，１８３，２６２号を参照されたい。したがって、（例えば、脳内または他の内臓内に位置する）深部組織については、位置設定したまたは選択した加温を、侵襲的または非侵襲的に実施することができる。好適な別の方法には、熱先端付きカテーテル、光線またはレーザー光線（例えば赤外光）誘導による光導波型カテーテル、および焦点式超音波（様々な異なる種類の装置のいずれかにより導出しうる、例えば、米国特許第５，９２８，１６９号、第５，９３８，６０８号、第６，３１５，７４１号、第６，６８５，６３９号、第７，３７７，９００号、第７，５１０，５３６号、第７，５２０，８５６号、第８，３４３，０５０号を参照されたい。）による方法が含まれるが、それだけに限定されない。選択した組織の加温の程度は、特定のプロモーターの選択、加温時間、加温のために選択された組織などの因子に依存することとなるが、一般的には、１、５、１０もしくは１５分間またはそれ以上の時間で、約１または２摂氏度から５または６摂氏度までとしてもよい。
【００３４】
＜血液脳関門透過性の増強＞
血液脳関門透過性の増強は、目下の目標であり（例えば、米国特許第８，３４９，８２２号を参照されたい）、本明細書に記載の材料および方法を、血液脳関門透過性の増強の方法に使用または適応させることができる。必要とする対象において、選択した脳組織の血液脳関門透過性を増大させるこのような方法は、一般的には、（ａ）温熱誘導性プロモーターに操作可能に結合された関門開放タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含む組換え核酸を含む、脳組織に遊走する幹細胞を対象に非経口投与するステップと、次いで、（ｂ）前記選択した脳組織において血液脳関門の透過性を増大させるために有効な量の前記関門開放タンパク質またはペプチドの発現を誘導するのに十分な程度に、前記選択した脳組織を選択的に加温するステップとを含む方法である（例えば、選択した組織に、活性治療薬または診断薬を並行してまたは続けて送達することを増強するような、本明細書に記載のような事前調整もしくは治療用幹細胞、または治療用抗体もしくは化学治療薬などのその他の活性薬を含むが、それだけに限定されない）。
【００３５】
例えば、幹細胞（および選択的加温）は、前記対象における治療薬の細胞毒性効果を増大させるために有効な量で投与することができ、前記方法には、対象に治療薬を投与することもさらに含まれる。ＢＢＢ透過性の増強に有利であると考えられる任意の好適な治療薬を用いてもよく、例えば、治療用幹細胞（上述のものを含むが、それだけに限定されない）、タンパク質およびペプチドの治療薬または診断薬（例えば、診断用および治療用モノクローナル抗体（それらの活性のある結合断片を含む））、または化学治療薬が挙げられるが、それだけに限定されない。具体的な例としては、テモゾロミド（「Ｔｍｚ」）、ＶＰ−１６、パクリタキセル、カルボプラチン、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（「ＴＲＡＩＬ」）、トログリタゾン（「ＴＧＺ」）、ピオグリタゾン（「ＰＧＺ」）、ロシグリタゾン（「ＲＧＺ」）およびシグリタゾン（「ＣＧＺ」）、プロカルバジン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、サリドマイド、イリノテカン、イソトレチノイン、イマチニブ、エトポシド、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ビンブラスチン、およびそれらの組合せが挙げられるが、それだけに限定されない。幹細胞の組成物、用量および投与、ならびに加温は上述の通りでもよく、他の治療用または診断用活性薬の幹細胞の組成物、用量および投与を、特定の薬剤に対する公知技術に従い、あるいは当業者においても明らかになるであろうこれらの変形形態に従い実施してもよい。例えば、米国特許第８，４５０，４６０号を参照され、また米国特許第８，６２８，７７８号、第８，５８０，２５８号、第８，４４９，８８２号、第８，４４５，２１６号、第８，４０９，５７３号、第５，６２４，６５９号および第５，５５８，８５２号も参照されたい。
【００３６】
本発明を、以下の非限定的な実施例において、より詳細に説明する。
【実施例１】
【００３７】
＜材料および方法＞
ジャーカット細胞およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の形質導入。ウイルス粒子は、Ｇｅｎｔａｒｇｅｔ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に特注して作製した。２４ウェルプレート中で、粒子２０マイクロリットル（１×１０７ＩＦＵ／ｍｌ）（１：１比でポリブレンと混合）を細胞に接触させ、６０分間、遠心分離（３２℃で１２００ＲＰＭ）した。続いて、細胞は通常の細胞培養条件下（３７℃／５％ＣＯ２）で一晩インキュベートした。構成的ＲＳＶプロモーターにより促進されるＲＦＰ発現により、ウイルス形質導入が成功したことを確認した。ウイルス感染を確認した後、細胞は、適正時間（例えば、５〜５０分）、ＰＣＲサーマルサイクラー（Ｔ−ｇｒａｄｉｅｎｔ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて適正温度（３７℃〜４５℃）に正確に加温した。ｐＨＳＰ７０促進Ｆ−Ｌｕｃ／ＧＦＰによる生物発光およびＧＦＰシグナルは、標準方法で測定した。例えば、Ｊ．Ｄｏｒｓｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８（１２）：３２８５−３２９５（２００９）、Ｓ．Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（１０）：１６４９−５３（２００７）を参照されたい。
【００３８】
組換え幹細胞。（ａ）ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）の発現を促進する温熱誘導性プロモーターＨＳＰ７０プロモーター、および幹細胞の遊走を誘引しうる様々なサイトカイン、ならびに（ｂ）赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、および場合によってブラストサイジン選択マーカー（ＢＳＤ）の発現を促進するＲＳＶプロモーターを含む、レンチウイルス発現プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｓｐ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−サイトカイン）−ＰＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）を構築した。本研究において使用される誘引サイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）を含む。ＲＦＰレポーターおよびＢＳＤを用いて、定型のＲＳＶプロモーターの制御の下で、フローサイトメトリーまたはブラストサイジン（ＢＳＤ）抗生物質を使用する中で長期発現する形質導入細胞を選別および／または選択した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはラット神経幹細胞（ｒＮＳＣ）を、レンチウイルスベクター（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた本構築物で形質転換した。簡潔に説明すると、２４ウェルプレートに幹細胞をウェルあたり１×１０４個細胞を播種し、一晩増殖させた。培地は新鮮で温かい完全培地（０．５ｍｌ）と交換し、その後、適正量のレンチウイルス溶液を加えて所望の感染多重度（ＭＯＩ）を得た。次に、細胞は、８００×ｇで３４℃で１時間遠心分離した後、３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿環境にさらに７２時間置いた。細胞の蛍光を蛍光顕微鏡下でチェックした。さらに、適正量のブラストサイジンを加えて、形質導入された細胞をスクリーニングした。ＮＳＣまたはｈＭＳＣはまた、緑色蛍光タンパク質を発現させるためにｐＬｅｎｔｉ（ＧＦＰ）で形質導入した。
【００３９】
幹細胞の遊走。ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ  ＦＬＵＯＲＯＢＬＯＫ  ＴＲＡＮＳＷＥＬＬチャンバーシステムを用いて、インビトロにおける細胞遊走の分析を行い、幹細胞の遊走に対する様々なサイトカインの影響を比較した。ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｓｐ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−サイトカイン）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）で形質導入したｈＭＳｃを、Ｔ−７５フラスコ内で６０〜８０％コンフルエントになるまで増殖させた。この細胞をトリプシン処理して無血清ＤＭＥＭに懸濁した後、一定分量で２分割した。一方の一定分量の幹細胞は、ヒートブロック（ＨＢ）、超音波（ＵＳ）または赤外光ランプ（ＩＲ）により、２０分間、４３℃に穏やかに加温したのに対し、もう一方の一定分量は、対照として３７℃でインキュベートした。温熱誘導したｈＭＳＣは、無血清ＤＭＥＭ７００μｌ中に希釈して、総計２０，０００個を２４ウェルチャンバーの下側コンパートメントのウェルに播種し、またＧＦＰ発現ｈＭＳＣ（約５×１０３）を上側コンパートメントに、３通り播種した。陰性対照として、温熱誘導せずに無血清ＤＭＥＭに懸濁した幹細胞を下側コンパートメントのウェルに播種した。このＴＲＡＮＳＷＥＬＬシステムをＣＯ２インキュベーターでインキュベートし、４８時間インキュベートした後、下側コンパートメントに遊走した細胞を蛍光顕微鏡下でカウントした。
【実施例２】
【００４０】
＜神経幹細胞の腫瘍指向性＞
ＧＢＭ細胞株からの条件培地に反応したＧＦＰ発現神経幹細胞（ＮＳＣ、（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）の遊走能（２４時間）を、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬプレート（８μｍ孔）を用いて測定した。この分析より、ＮＳＣがインビトロにおいてＧＢＭ指向性を示すことが明らかとなった（図１Ａ）。この反応がインビボにおいても起こるのかどうかを明らかにするために、胸腺欠損ヌードマウスにＤｓＲｅｄを発現するヒトＧＢＭ腫瘍細胞を注入した。腫瘍移植から７日後、腫瘍から２ｍｍの位置に５×１０５個のＧＦＰ発現ＮＳＣを移植した。腫瘍注入後１５日目に動物を屠殺し、脳をＰＦＡ（４％）に固定して分析した。この分析より、ＮＳＣがインビボにおいてもＧＢＭ指向性を示すことが明らかとなった（図１Ｂ）。これらの分析結果は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＮＳＣを含む幹細胞がインビボにおいてＧＢＭ指向性を示すことを実証した先行結果と一致する（Ｉ．Ｇｅｒｍａｎｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１０５（１）：８８−９５（２００６）；Ｊ．Ｄｏｒｓｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８（１２）：３２８５−３２９５（２００９）；Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（２）：１５５−１６２（１９９９）；Ｄ．Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（４）：３８３−３８５  ２００１）；Ｈ．Ｗａｌｃｚａｋら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（２）：１５７−１６３（１９９９）；Ａ．Ｐａｎｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５（２０）：８８０９−８８２３（２００５）；Ｋ．Ａｂｏｏｄｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（２３）：１２８４６−１２８５１（２０００）；Ｓ．Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（４）：４４７−４５０（２０００）；Ｆ．Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８８（１）：１−１０（１９９８）；Ｌ．Ｓａｓｐｏｒｔａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（１２）：４８２２−４８２７（２００９）；Ｍ．Ｅｈｔｅｓｈａｍら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．３（６）：８８３−８９５（２００３）；Ｐ．Ｋａｂｏｓら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（５）：７５９−７７０（２００３）；Ｍ．Ｅｈｔｅｓｈａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２４）：７１７０−７１７４（２００２）；Ａ．Ｂｉｒｂｒａｉｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６８１６（２０１１）；Ａ．Ｂｉｒｂｒａｉｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１０（１）：６７−８４（２０１３）；Ａ．Ｂｉｒｂｒａｉｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１９（１）：４５−６３）。
【実施例３】
【００４１】
＜インビトロにおけるｐＨＳＰ７０発現の制御＞
ＨＳＰ７０発現は、高度に調節されており、非毒性の穏やかな加温により誘導することができる（Ｇ．ＬｉおよびＪ．Ｍａｋ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５（８）：３８１６−３８２４（１９８５）；Ｊ．Ｌａｎｄｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２（６）：２４５７−２４６１（１９８２）；Ｊ．Ｌａｎｄｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．８（１）：５９−６２（１９８２）；Ｊ．ＳｕｂｊｅｃｋおよびＴ．Ｓｈｙｙ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５０（１  Ｐｔ  １）：Ｃ１−１７（１９８６）；Ｓ．Ｆｌａｎａｇａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８（１  Ｐｔ  ２）：Ｒ２８−３２（１９９５）；Ｋ．Ｋｒｅｇｅｌら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７９（５）：１６７３−１６７８（１９９５）；Ｋ．Ｄｉｌｌｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．８：４０３−４２４（２００６））。したがって、ＨＳＰ７０を使用して、インビボにおける治療用遺伝子発現を、空間的かつ時間的に制御された様式に、非侵襲的に、人為的に変えることできると仮定された。このように、構築上の組込みを確認する、構成的に発現する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）レポーターと併せて、ｐＨＳＰ７０で制御されるホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を並行して発現するように設計したウイルス構築物を調製した（図２Ａ）。このベクターを用いて、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰと名付けたウイルス粒子をＧｅｎｔａｒｇｅｔ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に特注して作製し、ジャーカット細胞に感染させた。細胞をＰＣＲサーマルサイクラー（Ｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ，Ｂｉｏｍｅｔｒａ）内で３０分間、様々な温度で加温し、９６ウェルプレートに再播種して、通常の細胞培養条件で１８時間置いた。続いて、細胞をルシフェリンに曝露させて、レポータータンパク質の発現を分析した。その結果、ＨＳＰ７０で促進されるルシフェラーゼの発現は、温度に密接に依存しており、ジャーカット細胞では４３〜４４℃が最大であることが実証された（図２Ｂ）。ＨＳＰ７０促進遺伝子発現のタイミングを明らかにするために、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰをジャーカット細胞（図３Ａ）およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（図３Ｂ）に形質導入し、４３℃で、時間の長さを変えて加温した。この分析結果より、温熱曝露時間の増加に伴い生物発光シグナルの増大が得られることが明らかとなった。シグナルは３０〜４０分で最大となり、その後は減少したが、おそらく加温時間の長さが５０分を超えると生細胞率が低下するためであろう。
【００４２】
幹細胞におけるｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰの使用を実証するために、ＮＳＣをこのウイルスベクターで形質導入して、穏やかな加温（４３℃、３０分間）に反応したｐＨＳＰ７０促進のルシフェラーゼ発現を測定した（図４）この分析により、二重のプロモーターの設計は、幹細胞において使用可能であり、したがって、腫瘍指向性の治療用担体として有用であることが確認された。
【実施例４】
【００４３】
＜被移植細胞における、インビボでのＨＳＰ７０促進ホタルルシフェラーゼ発現＞
高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は、腫瘍および／または周辺の正常組織を非毒性温度（約４３℃）に穏やかに加温する、非侵襲的なトランスレーショナルな方法である。幾つかのモデルシステムを用いて、正常脳組織を含む組織を非毒性温度に正確に加温するＨＩＦＵの能力が実証されている（Ｂ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ３５（５）：１１６９−１１７８（２０１２）；Ｂ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．３５（３）：４１６−４２４ （２００９）；Ｋ．Ｈｙｎｙｎｅｎら、Ｊ．Ａｃｏｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．１３２（３）：１９２７（２０１２）；Ｋ．ＨｙｎｙｎｅｎおよびＪ．Ｓｕｎ、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｕｌｔｒａｓｏｎ．Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ．Ｆｒｅｑ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．４６（３）：７５２−７５５（１９９９））。したがって、インビボにおいて磁気共鳴温度測定（ＭＲＴ）ガイド下ＨＩＦＵを安全に使用して、組換え幹細胞を非侵襲的に加温することができ、ｐＨＳＰ７０で促進される導入遺伝子の発現を誘導できるかを検討した。この分析のために、Ｂ１６黒色腫細胞をｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰに安定的に感染させて、マウスの皮下に移植した。ＨＩＦＵを用いて腫瘍組織を穏やかに加温し、生物発光シグナルを測定した。この分析により、ＨＩＦＵ誘導８時間後に、非常に特異的かつ強力な生物発光シグナルの誘導が見られたことが分かった（図５）。対照的に、非加熱の腫瘍では、有意なルシフェラーゼシグナルは示されず、これは、本アプローチの特異性を示すものである。
【００４４】
皮下実験に加えて、形質導入したＢ１６細胞をラットの脳内に頭蓋内移植し、移植後７日後に、ＭＲ温度測定でガイドしながらＨＩＦＵを用いて移植細胞を加温した。ラット死骸の分析により、生物発光シグナルが示したように（図６Ａおよび６Ｂ）、ＭＲ温度測定ガイド下ＨＩＦＵ治療のプロトコールにより、頭蓋内細胞の加温が成功してＦ−Ｌｕｃレポーターの発現が誘導されたことが明らかとなった。これらのデータは、ＭＲＴがＨＩＦＵの調整についてフィードバックとしての役目を果たし、目標温度をほぼ一定に維持しうることを実証している。
【００４５】
インビボでＭＲＴガイド下ＨＩＦＵが使用できることは定着しているため、レポーター構築物、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＦＬｕｃ／ＧＦＰ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰを安定的に発現する移植されたＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞における、ＨＩＦＵ誘導によるＨＳＰ７０促進ルシフェラーゼ遺伝子発現を分析した。形質導入したＢ１６Ｆ１０細胞（５×１０５細胞）を、胸腺欠損ヌードラットの右前頭葉に定位移植し、移植から７日後、ＭＲＴガイド下ＨＩＦＵを用いて、腫瘍を３０分間、４３℃に加温した。ＨＩＦＵ誘導後８および４８時間後、ラットを生物発光について画像化した（図７Ａおよび７Ｂ）。生物発光の定量化（図７Ｃ）から、頭蓋内環境における画像ガイド下ＨＩＦＵを用いたレポーター遺伝子誘導の実行性および特異性が明らかとなった。
【実施例５】
【００４６】
＜ＨＳＰ７０で促進されるｓＴＲＡＳＬ発現およびインビボにおける有効性＞
ＧＢＭは、高悪性度の性質を有する上に、有力な治療薬が提供される利便性もほとんどないため、例外なく致命的な悪性腫瘍である。全身的に投与された治療薬は、通常、血液脳関門（ＢＢＢ）を有意に透過する能力が制限され、その結果、中枢神経系（ＣＮＳ）内で治療レベルに到達する前に、全身性毒性度の尤度が高くなっていた。局所送達などの他のアプローチは、一貫性のない送達や、腫瘍に近接する正常脳組織が一様に高濃度に達することによる高い局所毒性に悩まされることがよくある（Ｓ．Ｋｕｎｗａｒら、Ｎｅｕｒｏ．Ｏｎｃｏｌ．１２（８）：８７１−８８１（２０１０）；Ｊ．Ｓａｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１１３（２）：３０１−３０９（２０１０））。対照的に、腫瘍指向性細胞ベースの治療は、治療薬が原発腫瘍内または浸潤腫瘍細胞に近接して集まる傾向があるため、高濃度の治療薬を腫瘍の微小環境まで送達することができる（Ｓ．Ｋｉｄｄら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（１０）：２６１４−２６２３（２００９）；Ａ．Ｎａｋａｍｉｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（８）：３３０７−３３１８（２００５））。しかし、治療薬の構成的発現に頼る細胞ベースのストラテジーでは、非腫瘍細胞を毒性を有する可能性がある治療薬に曝露させる可能性がある。このことは、治療薬を全身的に送達した場合は特に言えることであり、それは、大量の細胞が正常組織を通過することが実証されているからである（Ｓ．Ｋｉｄｄら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（１０）：２６１４−２６２３（２００９））。比較すると、本発明は、画像でガイドする一時的に標的とした腫瘍および腫瘍周囲領域においてのみ組換え幹細胞を活性化して、（例えばＨＳＰ７０プロモーターを介して）強力な抗がん治療薬を発現させる、画像ガイド下ＨＩＦＵの使用を包含する。図８を参照されたい。有利なことには、ヒト頭蓋を通過して操作者が選択する深さにＨＩＦＵを送達する技術は、別の適用のために病院で用いられている（Ｒ．Ｍｅｄｅｌら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ７１（４）：７５５−７６３（２０１２））。
【００４７】
ＨＩＦＵ遠隔活性化プラットホームを使用して治療薬を送達することを実証するために、可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）を、ＧＢＭの治療のためのプロトタイプ治療薬として用いる。ｓＴＲＡＩＬをコードするオープンリーディングフレームをレンチウイルス構築物に挿入して、（ａ）ＨＳＰ７０プロモーターの制御下にあるｓＴＲＡＩＬ、および（ｂ）画像化レポーターとしてのＦ−Ｌｕｃを並行して発現する、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ｓＴＲＡＩＬ／ＦＬｕｃ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰ（図９）を作製した。さらに、構築物はＲＦＰを構成的に発現するため、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いてｓＴＲＡＩＬ発現細胞を濃縮することが可能となる。この構築物を使用して、様々なタイプの幹細胞（例えば、ＭＳＣおよびＮＳＣ）を治療用ウイルス構築物に感染させる。ｐＨＳＰ７０制御発現および生細胞率を最大化するために、細胞を様々な温度で誘導する。（加温後８および２４時間後の）幹細胞における治療的誘導を評価するために、分泌されたｓＴＲＡＩＬの発現を、誘導されたＦ−Ｌｕｃ発現に起因する生物発光シグナルだけでなく、ウエスタンブロット解析でも測定する。さらに、ＭＴＳ／ＰＭＳ標準比色アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ｓＴＲＡＩＬ／ＦＬｕｃ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰで形質導入した幹細胞から得たｓＴＲＡＩＬ含有培地の、インビトロにおける抗腫瘍活性を決定する（Ａ．Ｍｉｎｔｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．６４（１−２）：１１７−１２３（２００３）；Ａ．Ｍｉｎｔｚら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ４（５）：３８８−３９９（２００２）；Ｖ．Ｎｇｕｙｅｎら、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４（６）：３９０−４００（２０１１）；Ｖ．Ｎｇｕｙｅｎら、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１２３９）。加温したｓＴＲＡＩＬ発現幹細胞はＧＢＭ細胞を殺滅することとなると予測される。実際に、ＮＳＣは、形質導入された後、ｓＴＲＡＩＬを発現して培地中に分泌し、ＧＢＭ細胞を殺滅することができることが分かった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ｓＴＲＡＩＬ発現によりＧＢＭに向かう腫瘍指向的遊走が変わらないことを確認するために、本明細書に記載のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ法を用いて、樹立ＧＢＭ細胞株（例えば、Ｕ２５１、Ｕ８７、Ｇ４８ａ）を用いて、形質導入したＮＳＣおよびＭＳＣの条件培地における遊走を試験する。
【００４８】
インビボの分析については、浸潤同所性ＧＢＭ腫瘍を産するラットを使用する（Ｇ．Ｋｉｔａｎｇｅら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．９２（１）：２３−３１（２００９）；Ｊ．Ｓａｒｋａｒｉａら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６（３）：１１６７−１１７４（２００７）；Ｊ．Ｓａｒｋａｒｉａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２（７  Ｐｔ  １）：２２６４−２２７１（２００６））。この臨床的に意義のあるモデルは、ヌードマウスまたはラットの側腹部へ患者の腫瘍試料を直接生着させることを含む。これらの腫瘍は、取り出して、げっ歯類の側腹部において引き続き連続継代することにより増殖／維持する。説明図のように、１０μのＬＰＢＳ中の１×１０６個のヒトＧＢＭ細胞を胸腺欠損ラットに頭蓋内移植した。定位注入は、３０ゲージ針の１０μＬシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を用いて行い、穿頭孔を通して３．５ｍｍの深さに挿入し、デジタル定位装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）に載せた。外科用ドリル（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を使って、頭皮切開全体の冠状縫合の正中線の左１．５〜２ｍｍおよび後方１〜１．５ｍｍに、５ｍｍの穿頭孔を開けた。注入速度は２μＬ／分で、注入完了から６秒後に針を抜いて、切開を縫合した。頭蓋内腫瘍移植から約２５日後、各動物を７テスラ小動物用ＭＲＩシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化した（図１１）。コントラスト強調のために、Ｇｄ−ＤＴＰＡを５〜７秒を超える時間をかけて尾静脈注射（０．０５〜２．５ｍｍｏｌ／ｋｇ）により投与した後、Ｔ１強調画像を得た。この分析により、ヒトＧＢＭ腫瘍をラット脳内で発生させうることが明らかとなった。
【００４９】
モニタリングを容易にするために、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを発現するＧＢＭ細胞（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、から購入したウイルス粒子）を用いて、生物発光により非侵襲的に頭蓋内腫瘍形成を測定する。ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）は、Ｆ−ＬｕｃレポーターのｐＨＳＰ７０誘導を画像化するのに用いるルシフェリン基質とは異なり、セレンテラジンを触媒する。これらの違うルシフェラーゼは、異なる基質を使用するため、２つの別々のプロセス（幹細胞でのｐＨＳＰ７０活性化に対するＦ−Ｌｕｃと、腫瘍細胞増殖に対するＲ−Ｌｕｃ）で評価する。浸潤同所性ＧＢＭ腫瘍を産するラットに、腫瘍移植から約２０日後、ｓＴＲＡＩＬを発現するように形質転換した幹細胞を注入し、腫瘍の増殖を画像化して確認する（生物発光および／またはＭＲＩ）。ｓＴＲＡＩＬを分泌する幹細胞の抗腫瘍効果は、移植腫瘍に対して様々な場所で、様々な量の組換え幹細胞（１〜１０×１０６）を注入することにより決定する。例えば、ｓＴＲＡＩＬまたは対照（レポーター構築物で形質導入した）を発現するようにＦＡＣＳで濃縮した組換え幹細胞を、同じ注入部位を用いて直接腫瘍に注入し、腫瘍移植として同等にする。これによって、抗腫瘍効力、および腫瘍部位で治療効果が見られる必要最少細胞数を実証する。さらに、別々のラット群に、腫瘍部位から３ｍｍ、腫瘍部位の対側、および全身的に、組換え幹細胞（または対照）を注入する。幹細胞移植から４８時間後、ＨＩＦＵを用いて標的部位を約４３℃に加温する。ＨＩＦＵ加温を厳密に制御して実行するために、ＭＲＩ／ＭＲ温度測定ガイド下ＨＩＦＵシステム（ＲＫ１００、ＦＵＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＣＡ）を用いて、強力な超音波エネルギーをラット脳へ送達して、ｐＨＳＰ７０を誘導する。このシステムは、経頭蓋の治療、薬物送達および活性化などの適用に対し、強力な連続超音波処理（熱凝固）からパルス超音波処理までの範囲の超音波曝露を送達することができる。このシステムのプローブは、中心周波数が１ＭＨｚで、焦点スポットのサイズが直径約１〜２ｍｍおよび長さ５〜６ｍｍの、球状に収束する超音波トランスデューサーである。処置の間、ＳｉｅｍｅｎｓのＳｋｙｒａ３Ｔスキャナーの寝台上で、焦点スポットをラット右上頭蓋（腫瘍部位）に対して設定した。焦点スポット周囲の音響強度およびＨＩＦＵ誘導温熱療法は、ＭＲ温度測定を用いて制御し、リアルタイムでモニターする。ＭＲ温度測定により、５秒毎の１．８８×１．８８２×５ｍｍ３の空間分解能で、リアルタイム温度マッピングができる。ＭＲ温度測定で非侵襲的に得たリアルタイム温度マッピングを、さらに、ＭＲ両立式光ファイバー温度計でキャリブレーションする。
【００５０】
ｐＨＳＰ７０活性化は生物発光を画像化して確認し、またｓＴＲＡＩＬ発現は免疫組織化学法を用いて確認する。生物発光の画像化については、Ｆ−Ｌｕｃ基質であるＤ−ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇをラットに静注した後、すぐにＩＶＩＳ生物発光スキャナー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で加温後の画像化を行う。加温および非加温の腫瘍全体でＲＯＩを描出して、定量化する。生物発光に加え、ＨＩＦＵ処置後の一定時点（０、１２、２４および４８時間後）にラットの亜集団を屠殺した後、注入された幹細胞がｐＨＳＰ７０誘導ＧＦＰの発現に加えてＲＦＰを構成的に発現するので、多色蛍光顕微鏡を用いて、腫瘍に対する注入幹細胞の位置を特定する。誘導の測定は、非活性化幹細胞によっても構成的に発現されるＲＦＰを発現する幹細胞と比較した、誘導されたＧＦＰ発現細胞の比を算出することにより行った。 ラットの正常脳組織および腫瘍において、４３℃の温度を正確に調節できることが予想される。
【００５１】
活性化幹細胞による治療的発現の確認後、ｓＴＲＡＩＬを発現する幹細胞の腫瘍増殖への効果を（レポーターだけで形質導入された、または非加温の対照と比較して）評価する。抗腫瘍効果は、ＭＲＩによる腫瘍体積（週毎）、生物発光（週毎）、および生存率（カプランマイヤー法）を測定して、注入後最大２００日間モニターする。さらに、動物は、治療後、幹細胞注入またはＨＩＦＵ処置により生じる予期せぬ臨床的帰結がないことを確認するために、３回／週、モニターする。レポーター遺伝子で感染させた幹細胞または非加温幹細胞と比べて、ＨＳＰ７０プロモーター制御下でｓＴＲＡＩＬを発現する幹細胞のみが抗腫瘍活性を示すことが予想される。
【実施例６】
【００５２】
＜組換え幹細胞のサイトカイン産生および遊走の温熱制御＞
腫瘍指向性遊走の特性により、幹細胞は、単離した腫瘍に対する、および転移性疾患に対する有効な標的治療を送達する担体として働くことができる。例えば、ヒト間葉系幹細胞は、インターフェロンβ、Ｓ−ＴＲＡＩＬおよび腫瘍退縮ウイルスを含む生物学的抗グリオーマ剤を、生存優位性を示しつつ、グリオーマに送達するよう形質転換されている。腫瘍に対する幹細胞療法の治療的効果は、送達部位から移行して腫瘍領域に到達する幹細胞の数に依存する。さらに、幹細胞の遊走は、サイトカインの分泌に大きく影響をされる。例えば、間葉系幹細胞の遊走は、様々なサイトカイン／受容体のペア、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲ、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２、およびＨＭＧＢ１／ＲＡＧＥに依存する。ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）およびその受容体であるＣＸＣケモカイン受容体−４（ＣＸＣＲ４）は、腫瘍へ神経幹細胞を動員する重要な仲介物質である。遺伝子操作によるストラテジーを用いることにより、腫瘍組織におけるサイトカイン発現を制御して、幹細胞遊走を誘引することができる。腫瘍組織への幹細胞送達を増強することができると、治療効果の達成に必要な幹細胞数はかなり減ると考えられ、おそらく患者により良好な転帰をもたらすであろう。これに関しては、本組成物および方法は、標的部位に集まった幹細胞内での特定のサイトカインの産生の誘導を、空間的かつ時間的に制御することができる。産生されたサイトカインにより、より多くの組換え幹細胞が標的部位に誘引されて効果の増幅を導くことを意図している。
【００５３】
サイトカイン産生の制御を実証するために、ＮＳＣおよびＭＳＣをｐＬｅｎｔｉ−ＨＳＰ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−サイトカイン）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）で形質導入して（図１２Ａ）、ブラストサイジン抵抗性についてスクリーニングした。ブラストサイジン抵抗性ＮＳＣおよびＭＳＣは、持続的に赤色蛍光を示した（図１２Ｂ）。ＨＳＰ７０促進サイトカインをコードする組換え細胞を、ヒートブロック、超音波または赤外光により２０分間、４３℃に加温して、サイトカイン（ＴＮＦα、ＶＥＧＦまたはＴＧＦβ１）の発現を誘導した（図１３）。その後、組換え細胞をＴＲＡＮＳＷＥＬＬチャンバーの下側コンパートメントのウェルに播種し、ＧＦＰ発現ＮＳＣおよびＭＳＣを上側コンパートメントに播種した。下側コンパートメントへ遊走した細胞を、蛍光顕微鏡下でカウントした。図１４に示したように、温熱誘導したｈＭＳＣ（すなわち、サイトカイン発現細胞）は、非誘導の対照ｈＭＳＣに比べて、幹細胞のＴＲＡＮＳＷＥＬＬの上側コンパートメントからプレートへの遊走を有意に誘引した。同様に、温熱誘導したＮＳＣ（すなわち、サイトカイン発現細胞）は、誘導していない対照のＮＳＣに比べて、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの上側コンパートメントからプレートへのＮＳＣの遊走を有意に誘引した（図１５）。
【実施例７】
【００５４】
＜治療用幹細胞の第二増幅波を誘引するサイトカインの使用＞
幹細胞の腫瘍指向性遊走は、腫瘍が分泌する可溶因子により仲介される（Ａ．Ｂｅｌｍａｄａｎｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６（１２）：３１８２−３１９１（２００６））。したがって、これら遊走促進性因子を分泌する組換え幹細胞は、組換え幹細胞の第二波の腫瘍への遊走を誘導することができる。したがって、幹細胞の第一波は、ＨＩＦＵ制御下で幹細胞を誘引するケモカイン／サイトカインを選択的に発現するように作製する。いったんこの第一波が腫瘍に到達すると、ＨＩＦＵを使用して、遊走促進性可溶性因子を腫瘍内および腫瘍周辺で発現させるように、幹細胞を一時的に誘導する。この誘導された可溶因子は、その結果、腫瘍単独の場合に考えられるよりも効果的に、治療用に遺伝子操作された幹細胞の第二波を腫瘍近傍に有意に誘引し、よって、幹細胞の第二波が有する治療能力を増幅させる。例証として、幹細胞遊走を誘引するサイトカインとしてＴＮＦαを使用するが、なぜならば、（ｉ）ＴＮＦαは、周知の炎症性因子であり、幹細胞を効果的に誘引することが知られている（Ｇ．Ｋｉｔａｎｇｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．９２（１）：２３−３１（２００９）；Ｊ．Ｓａｒｋａｒｉａら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６（３）：１１６７−１１７４（２００７）；Ｊ．Ｓａｒｋａｒｉａら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２（７  Ｐｔ  １）：２２６４−２２７１（２００６））、（ｉｉ）ＴＮＦαは、ＢＢＢを開放する可能性を有する（Ｎ．Ｔｓａｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０（９）：８１２−８２１（２００１）；Ｒ．Ｒｅｙｅｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１１０（６）：１２１８−１２２６（２００９）；Ｊ．Ｍｕｌｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（７）：２１７２−２１７６（１９９０）；Ｍ．Ｌｏｐｅｚ−Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（６）：３１３０−３１３９（２０１２））、そして（ｉｉｉ）ｐＨＳＰ７０で制御される構築物は、インビトロにおいてＮＳＣを殺滅することなくＮＳＣ遊走を効率的に増大させるからである（図１５）。したがって、ＴＮＦαをコードする幹細胞の第一波は、腫瘍に向かう幹細胞遊走の第二波を誘引して増幅させることができる。ＴＮＦαに加えて、他の炎症性因子、例えばＳＤＦ−１（Ｋ．Ｃａｒｂａｊａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７（２４）：１１０６８−１１０７３（２０１０）；Ｊ．Ｉｍｉｔｏｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（５２）：１８１１７−１８１２２（２００４））；腫瘍関連増殖因子、例えば散乱因子／肝細胞増殖因子（ＳＦ／ＨＧＦ）、ＴＧＦαおよび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｏ．Ｈｅｅｓｅら、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．７（４）：４７６−４８４（２００５））；ならびにＰＤＧＦ−ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ−ＴＡＣ、ＮＡＰ−２、ＧＲＯα、Ａｎｇ−２およびＭ−ＣＳＦなどの内皮細胞由来化学誘引物質（Ｎ．Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２６８：２４−３７（２００９））を、インビボにおける治療用幹細胞の第二波の誘引に用いることができる。
【００５５】
サイトカインが組換え幹細胞の第二波の遊走能を増幅する効果を、ＴＮＦαを発現するウイルスで感染させた細胞からの条件培地を用いてインビトロにおいて実証した。ＨＳＰ７０プロモーターの制御下ＴＮＦαをコードするレンチウイルスを作製した。ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＴＮＦα／ＦＬｕｃ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰと名付けたこのベクターを（図１２Ａを参照されたい）、ＳＦ７６７ヒト膠腫瘍細胞に形質導入した。組換えＳＦ７６７細胞を４３℃で３０分間穏やかに加温してＴＮＦα発現を誘導した後、培地中へのＴＮＦαの分泌が認められた。（図１６Ａ）。さらに、ｐＬｅｎｔｉ−ｐＨＳＰ７０：ＴＮＦα／Ｆ−Ｌｕｃ−ｐＲＳＶ：ＲＦＰベクターに感染させたこれらの温熱活性化細胞から調製した条件培地は、温熱誘導していない細胞からの対照条件培地と比較して、一方向性のＮＳＣ遊走を有意に増大させたことが実証された（図１６Ｂ）。
【実施例８】
【００５６】
＜追加的な全身的治療に対してＢＢＢを限局的に透過化するためのＨＩＦＵ誘導サイトカイン産生の使用＞
ＧＢＭの治療に対する障害の一つは、治療薬が腫瘍ＢＢＢをほとんど通過できないことである。サイトカインおよびケモカインは、腫瘍が関連したＢＢＢ通過に重大な影響を及ぼしうること、また、ＢＢＢに排除されることを理由に、現在はＧＢＭ治療に使用されていない有効な抗がん療法の利用を可能にしうることが分かっている（Ｎ．Ｔｓａｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０（９）：８１２−８２１（２００１）；Ｒ．Ｒｅｙｅｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１１０（６）：１２１８−１２２６（２００９）；Ｊ．Ｍｕｌｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（７）：２１７２−２１７６（１９９０）；Ｍ．Ｌｏｐｅｚ−Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（６）：３１３０−３１３９（２０１２））。したがって、ＧＢＭ腫瘍領域において、組換え幹細胞によるＨＩＦＵ活性化促進性炎症性因子産生を用いることにより、ＢＢＢ透過性、および全身的に投与した薬剤の腫瘍内濃度を有意に増大させることができる。重要なことには、組換え幹細胞からのサイトカイン発現を制御する、厳密に制御されたＨＩＦＵ誘導は、短時間かつ制御可能な誘導により、意図しない有害作用または腫瘍増殖の助長が生じる可能性をより低く抑えるため、このアプローチを可能とする。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の発現を促進する温熱誘導性ＨＳＰ７０プロモーター、ならびに赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）およびブラストサイジン選択マーカー（ＢＳＤ）の発現を促進するＲＳＶプロモーターを含む、レンチウイルス発現プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｓｐ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）（図１７Ａ）を構築した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、レンチウイルスベクター（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、このプラスミド構築物で形質導入して遺伝子操作した。インビトロにおいて、ウォーターバスを用いて、ＴＮＦαの温熱活性化遺伝子発現を確かめ、温度および継続時間について最適化した。インビボの研究について、Ｈｓｐ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）で形質導入したＭＳＣを胸腺欠損ヌードラットの脳内に定位移植した（ラット１匹あたり１×１０６細胞）。細胞移植から２日後、注入部位の領域を、ＭＲＩガイド下ＨＩＦＵによって、３０分間、４３℃に加温し、ＴＮＦα発現を誘導した。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェリン注入後、生物発光によりモニターした。４８時間後、ＭＲＩ造影剤（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ、０．１２５ｍｍｏｌ／ｋｇ）を尾静脈より静注した後、Ｔ１強調画像上でＢＢＢの開放を確認した。ＨＩＦＵ処置していないＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）を移植したラット、およびＨＩＦＵ処置したＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）を移植したラットを、対照として用いた。
【００５８】
ＭＳＣは、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｓｐ７０（Ｆ−Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）−ＲＳＶ（ＲＦＰ−ＢＳＤ）による形質導入を成功させた後、ブラストサイジンでスクリーニングした。遺伝子操作されたＭＳＣ細胞は、定常的に赤色蛍光を示した（図１７Ｂ）。ＨＳＰ７０で促進される導入遺伝子発現は、温度および継続時間に強く依存した。４３℃、１５分間の活性化で、ＴＮＦαおよびＦ−Ｌｕｃの発現は最大となった（図１７Ｃ）。次に、遺伝子操作されたＭＳＣをラット脳内に定位移植した後、ＭＲＩガイド下ＨＩＦＵで活性化した。図１８Ａに示したように、４３℃、２０分間のＨＩＦＵ処置したＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）移植ラットまたはＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）移植ラットは、ＨＩＦＵ処置しなかったＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）移植ラットに比べて、脳内で有意により強い生物発光シグナルを示した。対象領域の定量化より、ＨＩＦＵ活性化後、ラット脳内のＦ−Ｌｕｃ発現は１０倍高いことが分かった。生物発光画像化に続き、ＭＲ造影剤を尾静脈注入して、コントラストを強調したＴ１強調画像でＢＢＢ透過性の変化をモニターした。ＨＩＦＵ処置したＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）移植ラットの脳の標的領域で、対照と比べて、ＭＲＩシグナルの有意な増強が観察された（図１８Ｂ）。対象領域の定量化より、対照と比べて、ＭＲＩシグナル強度が３倍高いことが実証され、これは、ＨＩＦＵ処置したＭＳＣｓ−ＨＳＰ７０（Ｌｕｃ−２Ａ−ＴＮＦα）移植ラットの脳におけるＭＲＩ造影剤に対するＢＢＢ透過性が増大したこと（Ｐ＜０．０１）を示している（図１９）。
【００５９】
前述は、本発明を例証するものであって、それらを限定するものとして解釈されるものではない。本発明は、特許請求の範囲に含まれるその同等物と共に、以下の特許請求の範囲により定義される。
【図１Ａ】
2017506884.tif 000003
【図１Ｂ】
2017506884.tif 000004
【図２Ａ】
2017506884.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ．１０Ｂ．１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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