(57)【要約】  本発明は、細胞のリプログラミング法を施した体細胞を培養することにより、誘導多能性幹細胞(iPS)を産生方法に関し、前記体細胞が、少なくとも細胞のリプログラミング法を開始する際に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の存在下で培養されることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養により、誘導多能性幹細胞(iPSC)を産生する方法であって、
前記体細胞が、前記細胞リプログラミング過程の少なくとも開始時に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の存在下で培養され、
前記ネトリン-1類似体が、ネトリン-1の生物活性を模倣することができることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ネトリン-1類似体が、DCC又はUNC5受容体のアゴニスト抗体から、及びDCC又はUNC5により媒介される細胞死を防止又は阻止することができる、ネトリン-1のポリペプチドフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の誘導多能性幹細胞(iPSC)を産生する方法。
【請求項３】
細胞リプログラミング過程を施した前記体細胞が、少なくとも100ng/mlのネトリン-1を含む培養培地内で培養されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
細胞リプログラミング過程を施した前記体細胞が、前記リプログラミング過程の開始から有効な少なくとも最初の7日間において、ネトリン-1又はネトリン-1類似体を含む培養培地内で培養されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ネトリン-1又はネトリン-1類似体が、少なくとも100ng/mlの濃度で前記培養培地に毎日添加されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リプログラミング過程が、Oct、Sox、Klf及びc-Mycからなる群より選択される1つ又は複数の幹細胞多能性因子の前記体細胞内における発現を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リプログラミング過程が、Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc転写因子の発現を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
iPS細胞の生成及び産生の効率を示すためのレポーター系を、前記体細胞に付加する工程を更に含むことを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞リプログラミング過程が、ゲノムの組込みなしに、及び/又は発癌遺伝子の発現なしに実施されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記体細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、T細胞、肝細胞、臍帯細胞、脂肪細胞、腸管細胞、及び血液細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記体細胞が、特にラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル、及びヒトからなる群から選択される哺乳動物の体細胞であり、有利にはヒト体細胞であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養により誘導多能性幹細胞(iPSC)を調製するため、特に、体細胞のiPS細胞への細胞リプログラミング効率を改善するための、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の使用。
【請求項１３】
前記ネトリン-1類似体が、DCC又はUNC5受容体のアゴニスト抗体から、及びDCC又はUNC5により媒介される細胞死を防止又は阻止することができる、ネトリン-1のポリペプチドフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率が改善しており、得られたiPS細胞の均質性の向上を実現する誘導多能性細胞(iPSC)の産生方法に関する。この改善は、細胞リプログラミング過程の初期段階において、ネトリン-1又はネトリン-1類似体を用いて、ネトリン-1のDCC (deleted in colorectal carcinoma)又はUNC5 (UNC5A、UNC5B、UNC5C、及びUNC5D)受容体により媒介される細胞死を防止又は阻止することにより得られる。
【背景技術】
【０００２】
今日、体細胞が、胚性幹細胞と類似した特徴を示す誘導多能性幹細胞又はiPS細胞と呼ばれる細胞に脱分化可能であることを示す多くの研究が報告されている。
【０００３】
このような誘導多能性幹細胞(iPS細胞又はiPSC)の生成は、再生医療にとって極めて有望となる。
【０００４】
細胞の脱分化又はリプログラミング法では、一般的に、体細胞をリプログラミングして幹細胞の多能性を維持することができるように、1つ又は複数の重要な外性因子を発現させる必要がある。細胞リプログラミング法は文献に広範に記載されているが、この方法では、異なる転写因子の発現を通じて、具体的にはOct、Sox、Klf、及びMycファミリー内の因子の発現を通じて、より具体的にはOct4、Sox2、Klf4、及びc-Myc混合物又はOSKMカクテルの使用を通じて体細胞が多能性となり、その状態に留まるように、体細胞が適する培養培地において培養される。
【０００５】
このような細胞リプログラミング法は、当業者に周知されている。レビューする場合、特記事項として、次の参考文献: Gonzalezら、Nat Rev Genet 2011、12:231〜242頁が挙げられる。
【０００６】
しかし、このような方法は、確率論的であり、またほとんど効率的でないことが証明されており、またリプログラミング法の効率が低いことや、結果が均一でないことから、iPSCの治療応用に向けた開発は限定的である。
【０００７】
発明者らは、この細胞リプログラミング過程全体を通じて、誘発性細胞死の機構を研究することにより、このようなiPS細胞へのリプログラミングがなされる体細胞において、ネトリン-1並びにそのDCC及びUNC5受容体、特にDCCが演ずる役割の重要性を証明することができた。
【０００８】
ネトリン-1又はNtn1は、ラミニンと関連する拡散性分泌タンパク質である。ネトリン-1は、DCC (Deleted in Colorectal Cancer)及びUNC5A〜D (UNCoordinated 5 A、B、C、及びD)受容体のリガンドである。歴史的には、ネトリン-1 (Sanskritによれば「ガイド役」)は、脊髄交連神経の軸索を標的とするその役割により特徴づけられる第1の軸索ガイド因子であった(Serafiniら、1994; Kennedyら、2004; Serafiniら、1996)。軸索ガイド及びニューロン移動を制御するその重要な役割が、神経系のその他のテリトリーにおいてその後確認された(Mooreら、2007)。より最近になって、異なる文献で、血管形成(Luら、2004; Parkら、2004; Wilsonら、2006; Larriveeら2007; Navankasatussasら、2008; Ahmedら、2010; Eptingら、2010)、又は腫瘍形成(Maezeinら、2004; Fitamantら、2008)の制御におけるネトリン-1及びその受容体の役割が立証された。ネトリン-1が、そのDCC又はUNC5受容体に結合することにより、これら非結合型受容体のアポトーシス促進作用を阻止するという事実によって、腫瘍形成の制御におけるネトリン-1のかかわりが証明された(Mehlen及びGoldschneider、Oncogene、2010; Mehlenら、Nature Review Cancer、2011)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Gonzalezら、Nat Rev Genet 2011、12:231〜242頁
【非特許文献２】Mehlen及びGoldschneider、Oncogene、2010
【非特許文献３】Mehlenら、Nature Review Cancer、2011
【非特許文献４】Zhouら、Stem Cells 2009、27:2667〜2674頁
【非特許文献５】Weltnerら、J Virol 2012、86:4463〜4467頁
【非特許文献６】Fusakiら、Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009、85:348〜362頁
【非特許文献７】Nishimuraら、J Biol Chem 2011、286:4760〜4771頁
【発明の概要】
【００１０】
本発明の開示
本発明の主題は、細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養による誘導多能性幹細胞(iPSC)の産生方法であり、前記体細胞が、少なくとも細胞リプログラミング過程の開始時に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の存在下で培養されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の更なる主題は、細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養による誘導多能性幹細胞(iPSC)を産生する、特に、体細胞のiPS細胞への細胞リプログラミング効率を改善するネトリン-1又はネトリン-1類似体を使用することである。
【００１２】
本発明の詳細な説明
本発明は、体細胞をiPSCにリプログラミングするための新規な系を特定することには関しない。本発明は、体細胞のDCC又はUNC5受容体とネトリン-1又はネトリン-1類似体との相互作用に作用することにより、リプログラミング過程によって誘発される細胞死を阻害することに関する。
【００１３】
本発明者らは、細胞リプログラミング過程期間中にネトリン-1の発現が急速に減少するが、一方そのDCC受容体の発現は維持される、というDCC媒介型の細胞死を引き起こす状況を証明することができた。
【００１４】
従って、本発明の目的は、リプログラミング過程開始時、ネトリン-1の発現が減少する時に、培養培地内のそのような減少を補うことにある。
【００１５】
従って、本発明は、体細胞がリプログラミングされる際に、細胞リプログラミングの進行過程において、培養培地内においてネトリン-1又はネトリン-1類似体の存在下で体細胞を培養して、体細胞内のDCC又はUNC5受容体により媒介される細胞死を防止又は阻止することに関する。
【００１６】
本発明は、可溶性分子であるネトリン-1又はネトリン-1類似体を使用するので、体細胞のiPS細胞へのリプログラミングプロセスにより誘発される細胞死を防止又は阻止するために、ゲノムの組込みを追加する必要がなく、実施しやすいという長所を有する。
【００１７】
第1の態様によれば、本発明は、従って、細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養により、誘導多能性幹細胞(iPSC)をin vitroでの産生方法に関し、前記体細胞が、少なくとも細胞リプログラミング過程開始時に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の存在下で培養されることを特徴とする。
【００１８】
従って、本発明は、誘導多能性幹細胞(iPSC)を調製するためのin vitro法を包含し、下記の工程を含む:
-  体細胞を培養する工程;
-  少なくともリプログラミング過程開始時に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体を含む培養培地内で、上記細胞を細胞リプログラミング過程で処理する工程。
【００１９】
本発明では、「誘導多能性幹細胞」又は「iPSC」とは、幹細胞多能性因子(pluripotency factor)が付加された体細胞のin vitro細胞リプログラミングにより取得された細胞を意味する。
【００２０】
細胞リプログラミングとは、体細胞を多能性幹細胞に脱分化させるプロセスを意味する。
【００２１】
本発明者らは、第1に、ネトリン-1が存在すると、体細胞をiPSCにリプログラミングするプロセスの効率が高まることを示すことができた。本発明者らは、ネトリン-1とそのDCC受容体との相互作用を阻止又は阻害すると、ネトリン-1又はネトリン-1/DCC相互作用の阻害剤を添加しない参照プロセスと比較して、体細胞をiPSCにリプログラミングする効率の低下が引き起こされることも明らかにした。
【００２２】
従って、細胞リプログラミング期間中の体細胞生存率の向上を目指す本発明は、用いられるリプログラミング法を問わず実施可能である。
【００２３】
本発明では、ネトリン-1とは、好ましくはヒトネトリン-1を、特に、2006年11月17日付のアクセス番号NP_004813としてGenbankベースに預託されているような下記の604個のアミノ酸からなる配列(配列番号1)に対応するポリペプチド、又はこの配列の25〜604番アミノ酸に対応するその成熟した形態を意味する。
【００２４】
【化１】
2017502679.tif 000002
【００２５】
本発明は、Ntn1のアミノ酸配列、すなわち604個のアミノ酸(aa)からなる前駆体、又は例えば保存的置換等の軽微な修飾を含む成熟した形態(aa25〜aa604)の使用も包含するが、但し、前記修飾は、ネトリン-1の受容体、特にDCCにより誘発される細胞死を防止又は阻止するネトリン-1の作用に有意に影響を及ぼさないことを前提とする。
【００２６】
少なくとも細胞リプログラミング過程開始時に培養培地に含まれるネトリン-1は、天然由来又は組換え体、好ましくは組換え体であり得る。培養培地は、Adipogen社から市販されている組換えネトリン-1 (参照番号: AG-40B-0040-0000)を含有するのが有利である。
【００２７】
ネトリン-1は、培養培地に直接添加可能である、又はNerin-1をエンコードする遺伝子を過剰に発現する細胞であって、リプログラミング期間中に体細胞と共に同時培養される同細胞により産生可能である。ネトリン-1は、特にトランスフェクションにより、体細胞それ自身から発現させることも可能である。
【００２８】
同様に、ネトリン-1について上記したように、ネトリン-1類似体が、培養培地中に直接存在する、又は細胞により産生されることも可能である。ネトリン-1類似体とは、ネトリン-1の生物活性を模倣することができる任意の物質、すなわちネトリン-1の生物活性を適用することができる任意の物質、好ましくはDCC又はUNC5受容体により誘発される細胞死、特にDCC受容体により誘発される細胞死を防止又は阻止することができる任意の物質を意味する。従って、このような類似体は、例えばDCC又はUNC5受容体に結合することができる、又はこのような受容体、特にDCCのオリゴマー化を誘発し、またこのような受容体により媒介される細胞死の誘発を防止することができるネトリン-1のアゴニストである。このような類似体は、当業者にとって公知であり、特に、物質がDCC又はUNC5受容体に結合する能力の測定を可能にする任意の方法を用いて選択することが可能であり、前記方法は、おそらくは特にELISA型の免疫酵素アッセイ法を含む。また、このような類似体は、好ましくは、ネトリン-1がこのような受容体に結合するのを競合的に、又は非競合的に阻害することにより、より好ましくは、ネトリン-1がこのような受容体に結合するのを競合的に阻害する類似体の能力により、ネトリン-1がDCC受容体又はUNC5受容体に結合するのを阻害する物質の能力の検出を可能にする任意の公知の方法を用いて選択することも可能である。このような類似体は、DCC受容体又はUNC5受容体により誘発される細胞死を防止又は阻止する物質の能力の測定を可能にする任意の方法を用いて更に選択可能であり、かかる方法の例は本特許出願に記載されている。ネトリン-1類似体の例の中でも、特記事項として、DCC又はUNC5受容体のアゴニスト抗体、DCC又はUNC5により媒介される細胞死を防止又は阻止することができるネトリン-1のポリペプチドフラグメントを挙げることができる。本発明の方法では、従って、細胞リプログラミング工程で処理される体細胞の培養培地は、1つ又は複数のネトリン-1のフラグメント、特に2006年11月17日付のアクセス番号NP_004813としてGenbankベースに預託されたアミノ酸配列のフラグメントを含有し得るが、但しこの又はこれらのフラグメントは、このような受容体、特に
DCCにより媒介される細胞死を阻害又は阻止する特性を維持していることを前提とする。これらのフラグメントの中でも、少なくとも30個のアミノ酸、又は少なくとも40個のアミノ酸、又は少なくとも50個のアミノ酸、又は少なくとも60個のアミノ酸を有するフラグメントを特に引用する。
【００２９】
DCC又はUNC5により媒介される細胞死の阻害測定を可能にする方法は、当業者に周知されている。
【００３０】
特に、ネトリン-1又はネトリン-1類似体を、培養培地に直接添加するのが有利である。
【００３１】
ネトリン-1の添加が、本方法の有効性に与える効果は、添加した用量に依存し、用量が多いほど、良好な結果が得られる。発明者が実施したアッセイ法では、ネトリン-1の濃度が900ng/mlのとき、最良の結果が得られた。効率の改善だけでなく、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の添加量に関わる方法の経費の両方について考慮しながら、実施される方法に最もふさわしいネトリン-1又はネトリン-1類似体の濃度を選択することは、当業者にとって可能である。
【００３２】
培養培地に含まれるネトリン-1の濃度は、少なくとも100ng/ml、好ましくは150ng/ml又はそれ以上であるのが有利である。
【００３３】
ネトリン-1類似体を用いる際には、当業者は、ネトリン-1と同じ有効性が得られるように、この類似体のしかるべき量を選択することができる。
【００３４】
ネトリン-1又はネトリン-1類似体は、リプログラミング過程開始(D0)から有効な少なくとも最初の7日間、リプログラミングされる過程において体細胞の培養培地に含まれるのが有利である。本発明者らは、この期間を超えてネトリン-1の存在を長引かせても、iPS細胞への効率的なリプログラミングに関して、更なる利点が得られないので、その必要はないことを明確にした。
【００３５】
ネトリン-1又はネトリン-1類似体を培養培地に添加するのに用いられるモードに関連して、当業者は、用いられる培養培地内のネトリン-1又はネトリン-1類似体の安定性、入手可能性を考慮しながら、この添加の頻度を調節することができる。
【００３６】
ネトリン-1を培養培地に直接添加する際には、特にリプログラミング過程期間中に培養培地を変更する必要があるときは常に、特に少なくとも100ng/mlの濃度で毎日添加するのが有利である。
【００３７】
本発明は、用いられる細胞リプログラミング過程を問わず実施可能である。
【００３８】
用いられるリプログラミング過程は、Oct、Sox、Klf、及びMycからなる群より選択される1つ又は複数の幹細胞多能性因子の体細胞内における発現を含み得る。
【００３９】
本発明は、OSKMカクテルとしても知られているOct4、Sox2、Klf4、及びc-Myc転写因子の発現を含み、またこのような発現からなるリプログラミング過程で実施されるのが有利であり、このプロセスは、現在、当業者により最も頻繁に用いられるプロセスである。
【００４０】
これらの幹細胞多能性因子は、異なる技法、例えばウイルス感染、特にリポソーム、エレクトロポレーション、膜タンパク質透過法等を用いたトランスフェクション等によって、体細胞内で発現可能である。
【００４１】
これらの幹細胞多能性因子が、これらの因子をエンコードする核酸配列の発現を可能にするウイルス、とりわけレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスから選択されるウイルスを用いて、体細胞のウイルス感染工程を経由して付加されるのが有利である。このような方法は、当業者に周知されており、特にGonzalezら、Nat Rev Genet 2011、12:231〜242頁; Zhouら、Stem Cells 2009、27:2667〜2674頁; Weltnerら、J Virol 2012、86:4463〜4467頁; Fusakiら、Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009、85:348〜362頁; Nishimuraら、J Biol Chem 2011、286:4760-4771頁に記載されている。
【００４２】
本発明の方法は、iPS細胞の生成及び産生の効率を示すために、レポーター系を体細胞に付加する工程を更に含み得るが、そのような系は、特にGFP等の蛍光系、比色分析系、抗生物質耐性系等の中から選択される。
【００４３】
1つの特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ゲノムの組込み及び/又は発癌遺伝子の発現を行わずに実施される細胞リプログラミング過程を用いて実施される。
【００４４】
本発明の方法において、異なる種類の体細胞、特に線維芽細胞、ケラチノサイト、T細胞、肝細胞、臍帯細胞、脂肪細胞、腸管細胞、及び血液細胞、有利には線維芽細胞が、iPSCにリプログラミングされ得る。
【００４５】
本発明では、哺乳動物iPSCの調製において特別な用途が見出される。従って、本発明の方法で用いられる体細胞は、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル、及びヒトからなる群より選択可能である。用いられる体細胞は、ヒト体細胞、特にヒト線維芽細胞であるのが有利である。1つの特別な態様によれば、用いられる体細胞は、ヒト腸管上皮細胞である。
【００４６】
第2の態様によれば、本発明は、細胞リプログラミング過程を施した体細胞の培養による誘導多能性幹細胞(iPSC)を調製するため、特に、体細胞のiPSCへの細胞リプログラミング効率を改善するための、ネトリン-1又はネトリン-1類似体の使用にも関連する。
【００４７】
iPSC産生方法に関連して上記するような特定の有利な実施形態は、いずれもiPSCを産生するためのネトリン-1又はネトリン-1類似体の使用に関して、やはり有利な実施法である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａは、MEF (マウス胚線維芽細胞)リプログラミング期間中、OSKMをエンコードするレトロウイルス粒子に感染させた後、0、2、4、及び6日目におけるネトリン-1とそのDCC受容体の発現レベルを例示する図である。図１Ｂは、MEF (マウス胚線維芽細胞)リプログラミング期間中、OSKMをエンコードするレトロウイルス粒子に感染させた後、0、2、4、及び6日目におけるネトリン-1のUNC5B及びUNC5C受容体の発現レベルを例示する図である。
【図２】図２Ａは、ネトリン-1の発現を不活性化させたときに、OSKMレンチウイルス粒子に感染させたMEFのリプログラミングに与える効果を例示する図である。図２Ｂは、ネトリン-1の発現を不活性化させたときに、ドキシサイクリン処理によりリプログラミングするために引き起こされた腸管上皮のリプログラミングに与える効果を例示する図である。
【図３】図３Ａは、Ntn1用量増加が、細胞リプログラミング効率に与える効果を例示する図である。図３Ｂは、Ntn1用量増加が、ドキシサイクリン処理によりリプログラミングするために引き起こされた腸管上皮のリプログラミングに与える効果を例示する図である。
【図４】Ntn1の連続添加が、細胞リプログラミング効率に与える効果を例示する図である(D0〜7:最初の7日間、D7〜14: 7日目〜14日目、及びD0〜14:最初の14日間)。
【図５】Ntn1-阻止抗体が、細胞リプログラミング効率に与える効果を例示する図である(D0〜7:最初の7日間、D7〜14: 7日目〜14日目、及びD0〜14:最初の14日間)。
【図６】図６Ａは、DCC受容体の発現を不活性化したときの、細胞リプログラミング効率に与える効果を例示する図である。図６Ｂは、Ntn1の発現を不活性化したときの、細胞リプログラミング効率に与える効果を例示する図である。
【図７】図７Ａは、「対照」条件下又は組換えネトリン-1の存在下で誘導されたiPS細胞のクローンに関するアルカリホスファターゼ活性を例示する図である。図７Ｂは、「対照」条件下又は組換えネトリン-1の存在下で誘導されたiPS細胞のクローンに関するDESeq階層的クラスタリング分析を例示する図である。
【図８】対照iPSC系(白色のヒストグラム)とNtn1の存在下の誘導系(黒色のヒストグラム)の間の主要な染色体異常の分析を例示する図である。
【図９】Ntn1の存在下で誘導されたiPSCクローンのin vivo注射により誘発されたテラトーマの組織学的分析を例示する図である(スケールサイズ: 100μm)。
【図１０】感染から7日後にマイトマイシンCで処理した線維芽細胞上で再培養したヒト包皮線維芽細胞に由来するSSEA4陽性コロニー出現率に対する、組換えネトリン-1の効果(黒色のヒストグラム)を、対照(白色のヒストグラム)と比較して例示する図である(バースケールは、200μmに対応する)。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４９】
細胞培養及びRNAiアッセイ法:
マウス胚線維芽細胞(MEF)は、異なる細胞株のE13.5の胚から誘導した。プレ-iPS、iPS、及びES細胞を、これまでの記載に従い、照射処理されたMEF、又はゼラチンMEF上で培養した。293T及びplat-E細胞を10% FCS及びペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたDMEM中で培養した。iPS細胞をKSR+LIF又はKSR 2i+LIF培地中で培養した。shRNAアッセイを、Sigma社製pLKO.1ベクター及びsiRNAを用いて実施した(Ntn1につきSHCLNG-NM_008744、DccにつきSHCLNG-NM_007831、及びMbd3につきEMU022741)。
【００５０】
抗体:
この免疫蛍光検査法及びFACSに関するアッセイで用いられる抗体は次の通り:抗Oct4 (Santa Cruz社、C10)、抗ネトリン-1 (R&D Systems社、mab1109)、抗thy1 (Ebiosciences社、53-2.1)、抗SSEA1 (Stem cell technologies社、60060PE)、及びNL493コンジュゲート抗SSEA4抗体(R and D Systems社、SC023)。
【００５１】
組換えネトリン-1:
用いた組換えネトリン-1は、Adipogen社から市販されている(参照番号: AG-40B-0040-0000)。
【００５２】
レトロウイルス及びレンチウイルスの産生。
本発明者らによるこれまでの記載に従い、Oct4、Sox2、Klf4、及びc-MycのcDNAをエンコードするpMX-sベクターからレトロウイルス粒子を産生するために、plat-E細胞を用いた。MEF感染効率をモニターするのに、mcherryをエンコードするウイルス粒子を用いた。レンチウイルス粒子を産生するために293T細胞を用いた。
【００５３】
マウスiPS細胞の生成。
MEF細胞を6ウェルディッシュ内で継代した。12時間後に、この細胞を、8μg/mlのポリブレン濃度でポリブレンの存在下で、同等量の各レトロウイルス粒子に感染させた。感染後24時間及び感染後48時間経過したら、培養培地を交換し、MEFを収集し、そしてiPS細胞用培養培地中の照射処理された線維芽細胞上で再培養した。次に、培養培地を新鮮な培地で毎日交換し、そして出現したコロニーを、感染後12〜14日経過して計測、収集した。腸管上皮を分離し、上皮フラグメントを照射処理されたフィーダー細胞層上で培養した。多能性リプログラミング過程は、この場合Oct4、Sox2、Klf4、及びc-Mycリプログラミング因子からなる誘導可能な発現カセットを有するマウスを用いたので、細胞をドキシサイクリン(2μg/ml、14日間)で処理することにより誘発した。
【００５４】
ヒトiPS細胞の生成。
6ウェルプレートのウェル内で培養された5×105個のヒト包皮細胞(HFF、ミリポア社)を用いて、FibroGRO(商標)-LS培養培地(ミリポア社)の存在下、線維芽細胞上で再培養するまで、アッセイを実施した。Oct4、Sox2、Klf4、及びc-Myc (Cytotune(商標)、Life Thechnologies社)をそれぞれエンコードする4種のセンダイウイルスを用いて、MOIを3として、終夜で細胞を感染させた。培養培地を翌日変更し、150又は750ng/mLで組換えネトリン-1を含有する又は含有しない培地に交換した。次に、培地を毎日変更した。感染後7日経過して、TrypLE Express (Life Thechnologies社)を用いて、細胞を分離、計測し、そして1プレート当たりHFFが5×10、1×105、又は2×105個の細胞密度で、マイトマイシンC (Sigma Aldrich社)で処理したMEF上で再培養した。翌日、組換えネトリン-1の存在下又は非存在下、20% PluriQ(商標)Serum Replacement (GlobalStem社)、0.1mmol/Lの非必須アミノ酸、1mmol/LのL-グルタミン、0.1mmol/Lの2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Thechnologies社)、12.5ng/mlのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(Milytenyi Biotec社)が補充されたDMEM/F12 (Life Thechnologies社)で培地を交換した。次に、培地を毎日変更した。26日目に、リプログラミングされたコロニーを、手作業により継代培養し、そして増幅するためにマイトマイシンCにより処理された新規MEF上に移した。
【００５５】
RNA配列決定:
RNAの品質を、Bioanalyser (Agilent社)を用いて分析した。ライブラリーを構築し、Illumina 2000によりHiSeq上で配列決定を行った。
【００５６】
テラトーマの形成:
5×106個のiPS細胞を、7週齢の免疫不全マウス(SCID) (CB17/SCID、Charles River社)の腎被膜下に注射した。3週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を外科的に取り出し、そして凍結切片化するために、4%ホルマリン中、又はPFA中で固定化した。5×105個のiPS細胞を睾丸内に注射した際にも、同一手順を用いた。
【００５７】
(実施例1)
マウス体細胞のリプログラミング期間中のネトリン-1の発現に関する試験
マウス胚線維芽細胞(MEF)を、OSKMをエンコードするレトロウイルス粒子に6日間感染させた。ネトリン-1の発現、DCC、UNC5B及びUNC5C受容体の発現を経時的に測定した(ネトリン-1及びDCCにつき、D0、D2、D4、及びD6、並びにUNC5B及びUNC5Cにつき、D0、D3、及びD6)。
【００５８】
結果を添付の図1に提示する。q-RTPCR分析は、多能状態までの細胞リプログラミングの最初の6日間にわたる、及び樹立されたiPS細胞におけるNtn1、DCC、UNC5B、及びUNC5Cの発現プロファイルを示す。データは、RS17及びL19ハウスキーピング遺伝子に対して正規化されており、またMEFにおける発現レベルと比較して表され、3回の独立したアッセイの平均値±SEMに対応する。
【００５９】
データは、ネトリン-1の2段階発現を示し、細胞リプログラミング過程の最初の6日間において顕著に低下し、その後、iPS細胞において再活性化する。並行して、DCC受容体の発現は、安定なままであるが(図1A)、その他の受容体、例えばUNC5BやUNC5C等の発現は急速に抑制される(図1B)。従って、細胞リプログラミングの初期段階において、Ntn1の発現は低下するが、そのDCC受容体の発現は維持される。
【００６０】
同一の発現プロファイルが、MEFリプログラミング期間中にDox誘導系(Dox-inducible system)についても認められた(結果は添付せず)。
【００６１】
(実施例2)
ネトリン-1の不活性化が、マウス体細胞リプログラミング効率に与える効果
Ntn1の発現の不活性化が細胞リプログラミングに与える効果を、アルカリホスファターゼ陽性コロニー又はNanog陽性コロニーの定量により分析した。AP陽性細胞は、細胞の酵素活性を証明する試験により特徴づけられる; Nanog陽性細胞は、Nanog特異抗体を用いる免疫蛍光検査法により特徴づけられる。MEFを、Ntn1を標的とする3つの異なるshRNAをコーディングするレンチウイルス粒子に、OSKM形質導入2日前に感染させた。ネトリン-1を標的としない対照shRNAを含むshスクランブル配列粒子(shscrambled particle)に感染した対照MEF内で産生したコロニーの数を、各アッセイにつき100%とした。3つの異なるshRNAを用いた(Ntn1 sh#1、Ntn1 sh#2、及びNtn1 sh#3)。提示するデータは、異なるバッチのMEF及びウイルス粒子を用いて実施した3回の独立したアッセイの平均値±SEMに対応する。
【００６２】
結果を添付の図2に一括してまとめる。結果より、胚性マウス線維芽細胞に由来するAP陽性コロニーの数が示すように、ネトリン-1が枯渇すると、細胞リプログラミングの有意な低下が引き起こされることが明らかである(図2A)。
【００６３】
類似した結果が、別の種類の体細胞:腸管上皮を用いて得られた(図2B)。
【００６４】
(実施例3)
Ntn-1欠損補償が細胞リプログラミングに与える効果
異なる濃度の組換えネトリン-1を、細胞に毎日添加し(0.15μg/ml; 1μg/ml、及び4μg/ml)、そしてOSKM感染後の12〜14日経過してAP陽性コロニーの数を計測した。
【００６５】
結果を添付の図3に一括してまとめる。結果より、組換えネトリン-1を外部から供給すると、細胞リプログラミング効率が用量依存的に改善することが明らかである;最高用量では、胚性マウス線維芽細胞について、AP陽性コロニー数を4倍に増加させることが可能である(図3A)。
【００６６】
類似した結果が、別の種類の体細胞である腸管上皮を用いて得られた(図3B)。
【００６７】
細胞リプログラミング過程の全期間を通じてNtn1を必要とするのか又はしないのか調べるために、組換えネトリン-1の連続処理が細胞リプログラミングに与える効果をAP陽性コロニーの定量により調べた。処理無しで得られたコロニーの数を、各アッセイそれぞれについて100%とした。提示するデータは、3回の独立した実験の平均値±SEMに対応する。統計分析には、スチューデントのt検定を用いた。
【００６８】
結果を添付の図4に一括してまとめる。結果より、細胞リプログラミング過程の最初の7日間(D0〜7)にわたり組換えNtn1を添加すれば、リプログラミングの改善効果を得るのに十分であることが明らかである。逆に、リプログラミングの7日目〜14日目(D7〜14)に細胞を処理しても、効率に関してプラスの効果は得られない。
【００６９】
これらの結果より、体細胞をiPS細胞にリプログラミングする際に、ネトリン-1が早期に存在することのプラスの効果が明らかであり、これは、Ntn-1阻止抗体を用いて実施した同一の実験で得られた結果により確認された(図5)。
【００７０】
(実施例4)
Ntn1がより多い又は少ない量で存在する場合に、細胞リプログラミングの早期段階においてDCC発現が低下したときの影響に関する試験
DCC受容体の発現の不活性化の効果について、アルカリホスファターゼ陽性コロニー(AP陽性)の定量によるshRNAレンチウイルス戦略を用いて調べた;結果を添付の図6に一括してまとめるが、この場合対照条件下、shスクランブル配列粒子に感染したMEF内で産生したコロニーの数を、各実験につき100%とした。3つの異なるshRNAを用いた(DCC sh#1、DCC sh#2、及びDCC sh#3)。提示するデータは、異なるバッチのMEF及びウイルス粒子を用いて実施した3回の独立した実験の平均値±SEMに対応する。
【００７１】
結果より、DCCが不活性化すると、細胞リプログラミングが改善することが明らかである(図6A)。更に、Ntn1の不活性化が細胞リプログラミングに与える効果は、DCCの不活性化の逆であり(図6B)、Ntn1/DCCの対は、体細胞をiPS細胞に細胞リプログラミングするための新規の重要なメディエーターであることを示している。
【００７２】
(実施例5)
マウス及びヒト体細胞のiPSCへのリプログラミングを改善するための可溶性因子としての、Ntn1の使用
細胞リプログラミングの最初の7日間において、標準条件(対照)下で、又は600ng/mのNtn1の存在下で誘導したマウスOct4-GFP iPSCクローンを個別に継代、培養した。
【００７３】
測定したAP形態及び活性は、対照iPSCクローンとNtn1の存在下の間で類似したが(図7A)、これは、MEF Oct4-GFP、2つの異なる継代: p5及びp25において、「対照」条件下、又は組換えネトリン-1の存在下で誘導したプレ-iPS及びiPS細胞のDESeq階層的クラスタリング分析により明らかにされた緊密な相関により確認された(図7B)。
【００７４】
異なる幹細胞多能性因子、例えばPou5f1、Sox2、Klf4、Nanog、Fgf4、Esrrb、Utf1、及びDppa3等を用いるリプログラミングプロトコールを用いて得られた結果から、同じ結論を引き出すことができた(結果は添付せず)。
【００７５】
図8に一括してまとめた結果が示す通り、培養内で40回継代した後、主要な染色体異常の定量から、対照iPSC系と組換えNtn1の存在下で誘導されたiPSC系との間で、何らかの有意差は明らかにされなかった。
【００７６】
従って、Ntn1の存在下で、マウス体細胞をiPS細胞にリプログラミングしても、染色体の安定性に対して有害効果を有さない。
【００７７】
Ntn1の存在下で誘導したマウスiPSCの分化能を、組換えネトリン-1の存在下で産生させたiPSC注射から得られたテラトーマの組織学的分析により、in vivoで(図9)、及び胚様体(EB)形成によりin vitroで調べ、3種類の胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)の誘導体出現を実証した(結果は添付せず)。また、Ntn1の存在下で誘導されたマウスiPS細胞が、宿主胚盤胞にしかるべく組み込まれたことも確認した(結果は添付せず).
【００７８】
最後に、SSEA4を標的とする抗体で生存細胞をマーキングした後、組換えNtn1がヒト包皮線維芽細胞のリプログラミングに与える効果を分析した。添付の図10に一括してまとめた結果より、組換えNtn1 (0.15μg/ml)で処理すると、15倍向上した細胞リプログラミング効率が誘発されることが明らかである。
【００７９】
結論として、細胞リプログラミング過程の早期段階において、ネトリン-1の存在下で体細胞のiPS細胞へのリプログラミングを実施すると、特にマウス及びヒトのiPS細胞の生成効率が改善する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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