(57)【要約】対象において肝炎ウイルス感染を検出及び診断するためのアッセイ、システム及びキットが本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を肝炎ウイルス抗原を含むと特定するためのアッセイであって、
前記試料を複数の抗体と接触させることであって、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、前記接触させること、
前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、
随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに
前記複数の抗体の前記抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が、存在するとして検出される場合に、前記試料を肝炎ウイルス抗原を含むと特定すること、及び前記複数の抗体の前記抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が存在しない場合に、前記試料を肝炎ウイルス抗原を含んでいないと特定すること
を含み、
前記肝炎ウイルス抗原が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原または両方である、前記アッセイ。
【請求項２】
前記検出ステップより前に、前記試料が免疫複合体を解離する条件にかけられる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記検出ステップより前に、前記試料が免疫複合体を解離する条件にかけられない、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記試料が尿である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記試料が全血、血清または血漿である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ＨＣＶ抗原が、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ＨＣＶ抗原が、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、前記ＨＣＶ抗原の少なくとも１つがＨＣＶｃＡｇである、請求項１から５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記ＨＣＶ抗原が、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る、請求項１から５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記複数の抗体が第１の抗体及び第２の抗体を含み、前記第１及び第２の抗体が、同じ肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、請求項１から５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記試料を前記複数の抗体と混合して混合物を形成し、次いで前記混合物を、前記検出ステップの前に、前記肝炎ウイルス抗原に結合していても、結合していなくてもよい前記複数の抗体に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材と接触させることをさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記検出ステップが、前記複数の抗体の各抗体に検出可能な標識を付けることを含む、請求項１または請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断する方法であって、
請求項３もしくは請求項４に記載のアッセイ方法に従って、前記対象由来の試料がＨＣＶ抗原を含むと特定された場合に、前記対象を活動性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を有すると診断すること、
請求項３もしくは請求項４に記載のアッセイ方法に従って、前記対象由来の前記試料がＨＢＶ抗原を含むと特定された場合に、前記対象を活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有すると診断すること、または
請求項３もしくは請求項４に記載のアッセイ方法に従って、前記対象由来の前記試料が肝炎ウイルス抗原を含まないとして特定された場合に、前記対象を活動性肝炎ウイルス感染を有さないと診断すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
複数の対象から対象を活動性肝炎ウイルス感染を有するまたは有さないと特定する方法であって、
請求項３もしくは請求項４に記載のアッセイ方法に従って、前記複数の対象由来の試料を試験すること、及び
前記対象由来の試料がＨＣＶ抗原を含むと特定された場合に、前記対象を活動性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を有すると特定すること、
前記対象由来の前記試料がＨＢＶ抗原を含むと特定された場合に、前記対象を活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有すると特定すること、または
前記対象由来の前記試料が肝炎ウイルス抗原を含まないと特定された場合に、前記対象を活動性肝炎ウイルス感染を有さないと特定すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると、または過去の肝炎ウイルス感染を有していた且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断するための方法であって、
前記対象から第１及び第２の試料を得ることであって、前記第１の試料は、免疫複合体を有し得ても、または有し得なくてもよく、前記第２の試料は、免疫複合体を有し得る、前記得ること、
免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない前記第１の試料を複数の抗体と接触させることであって、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、前記接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、並びに随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、
免疫複合体を解離する条件にかけられた前記第２の試料を前記複数の抗体と接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに
前記複数の抗体の前記抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が、前記第１の試料中に存在するとして検出される場合に、前記対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断すること、及び前記複数の抗体の前記抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が前記第２の試料中に検出され、肝炎ウイルス抗原が前記第１の試料中で検出されない場合に、前記対象を過去の肝炎ウイルス感染を有する且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断すること
を含み、
前記肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、前記肝炎ウイルス抗原がＨＣＶ抗原である、または前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であり、前記肝炎ウイルス抗原がＨＢＶ抗原である、前記方法。
【請求項１５】
活動性肝炎ウイルス感染を有していた、有する、または有する可能性がある対象のモニター方法であって、
前記対象から第１及び第２の試料を得ることであって、第１時点で、少なくとも前記第２の試料が免疫複合体を有し得る、前記得ること、
免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない前記第１の試料を複数の抗体と接触させることであって、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、前記接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス肝炎ウイルスの有無を検出すること、並びに随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、
免疫複合体を解離する条件にかけられた前記第２の試料を前記複数の抗体と接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、
第３及び第４の試料を前記対象から得ることであって、第２の時点で、少なくとも前記第４の試料が免疫複合体を有し得る、前記得ること、
免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない前記第３の試料を複数の抗体と接触させることであって、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、前記接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、並びに随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、
免疫複合体を解離する条件にかけられた前記第４の試料を前記複数の抗体と接触させること、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、前記複数の抗体の前記抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに
前記第１、第２、第３及び第４の試料の間の、前記複数の抗体の前記抗体に結合した肝炎ウイルス抗原の差を計算すること
を含み、
前記肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、前記肝炎ウイルス抗原がＨＣＶ抗原である、または前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であり、前記肝炎ウイルス抗原がＨＢＶ抗原である、前記方法。
【請求項１６】
複数の抗体であって、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、前記複数の抗体を含む容器、並びに
前記複数の抗体及び／または前記複数の肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する、コーティングまたは固定化された捕獲試薬を有する基材
を含み、
前記肝炎ウイルス抗原が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、または両方である、前記キット。
【請求項１７】
前記複数の抗体が、天然に見られない濃度及び／または純度の前記複数の抗体を有する組成物である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
検出可能な標識が付けられたモノクローナル抗体、検出可能な標識が付けられたポリクローナル抗体または両方をさらに含み、前記検出可能な標識を有する前記抗体が前記複数の抗体に特異的に結合する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
試料装填領域、試験領域及び対照領域を有するラテラルフロー試験基材であって、捕獲試薬が前記試験領域に固定化され、前記捕獲試薬が複数の抗体であり、前記複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合し、
前記肝炎ウイルス抗原が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）または両方である、前記ラテラルフロー試験基材。
【請求項２０】
請求項１９に記載のラテラルフロー試験基材、及び
検出試薬
を含む、キット。
【請求項２１】
試験試料中の分析物に対するイムノアッセイであって、
前記分析物に特異的に結合する１種または複数の検出抗体と前記試験試料を混合すること、次いで前記混合物を、アッセイ基材の表面にコーティングまたは固定化された、前記分析物に特異的に結合する捕獲抗体を有する前記アッセイ基材と接触させること
を含む、前記イムノアッセイ。
【請求項２２】
試験試料中の分析物に対するラテラルフロー試験アッセイであって、
コロイド金とコンジュゲートした、前記分析物に特異的に結合する検出抗体と前記試験試料を混合すること、次いで
前記混合物を、試験ラインに固定化され、前記分析物に特異的に結合する捕獲抗体と、前記試験ラインの下流にある対照ラインに固定化された、前記検出抗体に特異的に結合する抗体とを有する試験ストリップに装填すること
を含む、前記ラテラルフロー試験アッセイ。
【請求項２３】
前記分析物がＨＢｓＡｇであり、並びに第１の抗体及び第２の抗体であって、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する、前記第１及び第２の抗体が使用される、請求項２１または請求項２２に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活動性肝炎ウイルス感染を検出及び診断するためのアッセイ及びアッセイシステム及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界中でおよそ１億７０００万の人々及び米国で４００〜５００万の人々に影響を及ぼす。ＨＣＶ感染は、Ｃ型慢性肝炎（ＣＨＣ）、肝硬変及び肝細胞癌（ＨＣＣ）と関連している。最近の研究によって、ＨＣＶ感染は、スクリーニング及び診断が不十分なままであり、これによって、多くの対象において医学的経過観察及び有効な治療へアクセスするのが遅れることになることが示された。さらに、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、１９４５〜１９６５年に生まれたすべての者がＨＣＶ感染のスクリーニングを受けることを推奨している。
【０００３】
ＨＣＶゲノムの発見以来、ＨＣＶ感染をスクリーニングするための様々な抗ＨＣＶ抗体試験が開発されている。抗ＨＣＶ抗体試験は、ＨＣＶ感染個体によって産生される抗ＨＣＶ抗体の存在を検出する。したがって、抗ＨＣＶ抗体試験は、免疫応答及び抗体形成のための時間を必要とする。したがって、抗ＨＣＶ抗体試験は、急性ＨＣＶ感染を検出するのに使用することができない。第３世代の抗ＨＣＶ抗体試験は、前の世代の抗ＨＣＶ抗体試験と比較して、感度及び特異性を著しく改善したが、これは、進行中の活動性ＨＣＶ感染を以前のＨＣＶ感染と区別することができず、これは、ウイルスの排除後に残る抗ＨＣＶ抗体が原因である。さらに、抗ＨＣＶ抗体試験は、免疫無防備状態である、免疫抑制療法を受けている、または血液透析を受けている対象について、偽陰性結果の発生率が高い。したがって、抗ＨＣＶ抗体試験を使用してＨＣＶ感染の試験結果が陽性となる者において、活動性ＨＣＶ感染を確認するために、さらなる試験、例えばＨＣＶ  ＲＮＡに対するＰＣＲアッセイが必要とされる。残念ながら、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試験は時間がかかり、高価であり、ＨＣＶ感染のスクリーニング試験として現在推奨されていない。
【０００４】
他のＨＣＶ試験は、ＨＣＶコア抗原（ＨＣＶｃＡｇ）を検出する。ＨＣＶｃＡｇは、完全なＨＣＶビリオン及びＨＣＶ  ＲＮＡを含まないコアタンパク質構造の両方に存在する。ＨＣＶｃＡｇは活動性ＨＣＶ複製のマーカーとみなされ、抗ＨＣＶ抗体よりも早く検出可能である。主なＨＣＶｃＡｇ試験システムは、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  Ａｇ  ＥＩＡ試験（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＨＣＶｃＡｇ試験（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）及びＭｏｎｏｌｉｓａ  ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ  ＵＬＴＲＡアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）である。
【０００５】
Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  Ａｇ  ＥＩＡ試験は、抗ＨＣＶ陰性から陽性へのセロコンバージョンの「空白期間」に由来する、考えられる陰性の抗ＨＣＶ試験結果をカバーするために、抗ＨＣＶ試験と組み合わせて、供血者のスクリーニング試験として最初開発された。これは、ヒトの血清または血漿中のＣ型肝炎コア抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡ）である。このアッセイは、ＨＣＶコア抗原の異なる領域に特異的ないくつかのモノクローナル抗体を利用して、マイクロプレートの固相をコーティングし、被検血清試料中に存在するＨＣＶｃＡｇを捕獲する。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたさらなるＨＣＶｃＡｇ特異的モノクローナル抗体を次いで使用して、捕獲されたＨＣＶｃＡｇを検出する。この試験（ＨＣＭ  Ｖ２．０アッセイ）の感度は、９，７０７ＩＵ／ｍＬのＨＣＶ  ＲＮＡに相当する、１．４８ｐｇ／ｍＬのＨＣＶｃＡｇであると報告された（１）。文献レビューは、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲ陽性の場合は、この試験による高い割合の偽陰性結果と結論を下した。したがって、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  Ａｇ  ＥＩＡが低感度であることによって、その臨床的価値が制限される。
【０００６】
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＨＣＶｃＡｇ試験は、ヒトの血清及び血漿試料において、ＨＣＶｃＡｇを定量的に測定するための、２段階の化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）である。このアッセイは、液相のアクリジニウム標識マウス抗ＨＣＶ抗体を使用し、固相としてモノクローナル抗ＨＣＶコーティング常磁性微粒子を使用する。この試験の報告された検出限界は、３．０〜２０，０００ｆｍｏｌ／Ｌの範囲での動的ＨＣＶｃＡｇ定量化を用いて、３ｆｍｏｌ／Ｌすなわち０．０６ｐｇ／ｍＬのＨＣＶｃＡｇである。臨床的に、これは、ＨＣＶの遺伝子型判定に応じて、４２８〜２７００ＩＵ／ｍＬの範囲で血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに対応する。いくつかの研究によって、この試験は非常に高感度であることが報告されたが、他の研究によって、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲの結果とのその全体的相関はわずか７９．７％であり、これは、＜３ｌｏｇの血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する対象で低くて１９．７％の可能性があることも報告された。検出限界以下のＨＣＶ  ＲＮＡを有する９／４０５（２．２％）の対象において、ＨＣＶｃＡｇが陽性（ＨＣＶｃＡｇ＞３ｆｍｏｌ／Ｌ）と報告されたことも報告され、これは、これらの対象における偽陽性のＨＣＶｃＡｇの試験結果を示す。さらに、血清ＨＣＶ  ＲＮＡが極めて低いレベル（＜１５ＩＵ／ｍＬ）である場合、より多くの偽陽性の結果が生じる可能性がある。さらに、この試験は販売業者から供給される特別且つ高価な機器によって自動化される必要があるが、これは、特に発展途上国において、広範な臨床応用のために、通常の研究室に容易に採用されない。現在、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＨＣＶコア抗原試験は米国及び多くのほかの国で承認されていない。したがって、このＨＣＶｃＡｇ試験システムは、経済的でも、高感度でも、特異的でも、実用的でもなく、且つ広範な臨床応用には難しい。
【０００７】
Ｍｏｎｏｌｉｓａ  ＨＣＶ  Ａｇ−Ａｂ  ＵＬＴＲＡアッセイは、ヒトの血清及び血漿試料において抗ＨＣＶ及びＨＣＶｃＡｇの両方を同時に検出するための、２段階のＥＬＩＳＡである。これは、抗ＨＣＶに対する間接的な試験とＨＣＶｃＡｇ検出のためのサンドイッチ試験の組み合わせに基づく。Ｍｏｎｏｌｉｓａ  ＨＣＶＡｇ−Ａｂ  ｕｌｔｒａアッセイは、ＨＣＶｃＡｇと抗ＨＣＶ抗体の両方を同時に検出することによる改善された性能をともなって報告されているが、これは、ＨＣＶ−ＡｂシグナルをＨＣＶｃＡｇシグナルと区別することができず、したがって、進行中の活動性ＨＣＶ感染を回復したまたは過去のＨＣＶ感染と鑑別することができない。さらに、この試験は、急性ＨＣＶ感染の診断率を高めるように設計されたが、このアッセイにおけるＨＣＶｃＡｇ成分の比較的低い感度が原因で、およそ２９％の急性ＨＣＶ感染の対象がこの試験によって見落とされるであろうことが研究によって示された。
【０００８】
ＨＣＶ  ＲＮＡ負荷が低い試料における低い試験感度のほかに、現在のＨＣＶｃＡｇアッセイのほかの主な制限のうちの一つは、血清抗ＨＣＶに対して陽性であるが、ＰＣＲ試験によれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性である対象における、高い陽性率であることに留意されたい。これらの者は、一般的には、過去のＨＣＶ感染であるが、活動性でないＨＣＶ感染を有するので、これらの対象におけるＨＣＶｃＡｇに関する陽性試験は、偽陽性とみなされるべきである。これによって、現在のＨＣＶｃＡｇ試験は活動性ＨＣＶ感染を過去の感染と鑑別することができない。換言すれば、現在のＨＣＶｃＡｇ試験を使用する場合、対象がＨＣＶｃＡｇの試験結果が陽性であったどうか判断できないのは、活動性ＨＣＶ感染または過去のＨＣＶ感染が原因である。
【０００９】
したがって、十分な感度及び特異性を有して、対象において活動性肝炎ウイルス感染を検出するのに使用することができる、安全且つ簡便な試験に対する必要性がある。
【発明の概要】
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料を１種または複数の肝炎ウイルス抗原を含むと特定するためのアッセイを提供し、このアッセイは、１種または複数の肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する複数の抗体と試料を接触させること、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が存在するとして検出される場合に、試料が肝炎ウイルス抗原を含んでいると特定すること、及び複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が存在しない場合に、試料を肝炎ウイルス抗原を含んでいないと特定することを含む。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原はＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、試料は、検出ステップより前に、免疫複合体を解離する条件にかけられる。いくつかの実施形態では、試料は検出ステップより前に免疫複合体を解離する条件にかけられない。いくつかの実施形態では、試料は尿である。いくつかの実施形態では、試料は全血、血清または血漿である。いくつかの実施形態では、複数の抗体は第１の抗体及び第２の抗体を含み、前記第１及び第２の抗体は、同じ肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アッセイは、試料を複数の抗体と混合して混合物を形成し、次いでその混合物を、検出ステップの前に、肝炎ウイルス抗原に結合していても、結合していなくてもよい複数の抗体に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、複数の抗体の各抗体に検出可能な標識を付けることを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のように本発明のアッセイを使用して、変性条件にかけられていない、対象由来の尿試料または対象由来の別の試料（例えば、全血、血清、血漿試料など）が、遊離肝炎ウイルス抗原を含むと特定された場合に、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断することを含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、試料を遊離肝炎ウイルス抗原を含むと特定するためのものであり、これは、試料を複数の抗体の接触させること（ここでは、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する）、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が、存在するとして検出される場合に、試料を遊離肝炎ウイルス抗原を含むと特定すること、及び複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が存在しない場合に、試料を遊離肝炎ウイルス抗原を含んでいないと特定することを含む。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染である。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、複数の抗体は第１の抗体及び第２の抗体を含み、前記第１及び第２の抗体は、同じ肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アッセイは、試料を複数の抗体と混合して混合物を形成し、次いでその混合物を、検出ステップの前に、肝炎ウイルス抗原に結合していても、結合していなくてもよい複数の抗体に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、複数の抗体の各抗体に検出可能な標識を付けることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の対象から対象を活動性肝炎ウイルス感染を有するまたは有さないと特定するのに使用される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると、または過去の肝炎ウイルス感染を有していた且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断するための方法に関し、この方法は、対象から第１及び第２の試料を得ること（ここでは、少なくとも第２の試料が免疫複合体を有し得る）、免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない第１の試料を、複数の抗体と接触させること（ここでは、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する）、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、免疫複合体を解離する条件にかけられた第２の試料を複数の抗体と接触させること、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が、第１の試料中に存在するとして検出される場合に、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断すること、及び複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原が第２の試料中に検出され、肝炎ウイルス抗原が第１の試料中で検出されない場合に、対象を過去の肝炎ウイルス感染を有する且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると、または過去の肝炎ウイルス感染を有していた且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断するための方法に関し、この方法は、対象由来の１種または複数の試料において遊離肝炎ウイルス抗原を検出及び／または測定すること並びに総肝炎ウイルス抗原を検出及び／または測定すること、並びに遊離肝炎ウイルス抗原が存在するとして検出される場合に、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断すること、及び総肝炎ウイルス抗原が存在するとして検出され、遊離肝炎ウイルス抗原が存在しない場合に、対象を過去の肝炎ウイルス感染を有する且つ肝炎ウイルス感染を排除したと診断することを含む。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染である。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の試料は全血、血清または血漿である。いくつかの実施形態では、第１の試料は尿であり、第２の試料は全血、血清または血漿である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の試料は同じ検体のアリコートでもよい。いくつかの実施形態では、複数の抗体は第１の抗体及び第２の抗体を含み、前記第１及び第２の抗体は、同じ肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アッセイは、試料を複数の抗体と混合して混合物を形成し、次いでその混合物を、検出ステップの前に、肝炎ウイルス抗原に結合していても、結合していなくてもよい複数の抗体に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、複数の抗体の各抗体に検出可能な標識を付けることを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、活動性肝炎ウイルス感染を有していた、有する、または有する可能性がある対象のモニター方法に関し、この方法は、対象から第１及び第２の試料を得ること（ここでは、第１時点で、少なくとも第２の試料が免疫複合体を有し得る）、免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない第１の試料を複数の抗体と接触させること（ここでは、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する）、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス肝炎ウイルスの有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、免疫複合体を解離する条件にかけられた第２の試料を複数の抗体と接触させること、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、第３及び第４の試料を対象から得ること（ここでは、第２の時点で、少なくとも第４の試料が免疫複合体を有し得る）、免疫複合体を有し得ない及び／または免疫複合体を解離する条件にかけられていない第３の試料を複数の抗体と接触させること（ここでは、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する）、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、免疫複合体を解離する条件にかけられた第４の試料を複数の抗体と接触させること、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原の有無を検出すること、及び随意に、複数の抗体の抗体に結合した任意の肝炎ウイルス抗原を測定すること、並びに第１、第２、第３及び第４の試料の間の、複数の抗体の抗体に結合した肝炎ウイルス抗原の差を計算することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１期間での、対象由来の１種または複数の試料における遊離肝炎ウイルス抗原及び総肝炎ウイルス抗原の有無及び／または量を、第２期間での、対象由来の１種または複数の試料における遊離肝炎ウイルス抗原及び総肝炎ウイルス抗原の有無及び／または量と比較する。いくつかの実施形態では、第１期間由来の遊離肝炎抗原と総肝炎抗原の比を、第２期間由来の遊離肝炎抗原と総肝炎抗原の比と比較する。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染である。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、試料は全血、血清または血漿である。いくつかの実施形態では、第１及び第３の試料は尿であり、第２及び第４の試料は全血、血清または血漿である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の試料は同じ検体のアリコートである。いくつかの実施形態では、第３及び第４の試料は同じ検体のアリコートである。いくつかの実施形態では、複数の抗体は第１の抗体及び第２の抗体を含み、前記第１及び第２の抗体は、同じ肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アッセイは、試料を複数の抗体と混合して混合物を形成し、次いでその混合物を、検出ステップの前に、肝炎ウイルス抗原に結合していても、結合していなくてもよい複数の抗体に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、複数の抗体の各抗体に検出可能な標識を付けることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、試験試料中の分析物に対するイムノアッセイを提供し、これは、分析物に特異的に結合する１種または複数の検出抗体と試験試料を混合すること、次いでその混合物を、アッセイ基材の表面にコーティングまたは固定化された、分析物に特異的に結合する捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは酵素イムノアッセイである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、試験試料中の分析物に対するラテラルフロー試験アッセイを提供し、これは、試験試料を、検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした、分析物に特異的に結合する検出抗体と混合すること、次いで、試験ラインに固定化され、分析物に特異的に結合する捕獲抗体と、試験ラインの下流にある対照ラインに固定化された、検出抗体に特異的に結合する抗体とを有する試験ストリップに混合物を装填することを含む。
【００１６】
本発明による対象は、哺乳類対象、例えばヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は本発明によるアッセイを必要としている。本発明によるアッセイを必要としている対象としては、活動性及び／または過去の肝炎ウイルス感染を有する疑いがあるもの、並びに肝炎ウイルスに曝露されたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料装填領域（例えば、ここで、試料がラテラルフロー試験基材に最初に接触する）、試験領域及び対照領域を有するラテラルフロー試験基材を提供し、ここでは、捕獲試薬が試験領域に固定化され、前記捕獲試薬が複数の抗体であり、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、複数の抗体（ここでは、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する）及び複数の抗体、複数の肝炎ウイルス抗原または両方に特異的に結合する、コーティングまたは固定化された捕獲試薬を有する基材を含む容器を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、複数の抗体は、天然に見られない濃度及び／または純度の複数の抗体を有する組成物である。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識またはコンジュゲートが付けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体をさらに含み、前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、複数の抗体に特異的に結合する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、検出試薬とともにパッケージ化され、試料装填領域（例えば、ここで、試料がラテラルフロー試験基材に最初に接触する）、試験領域及び対照領域を有し、ここでは、捕獲試薬が試験領域に固定化され、前記捕獲試薬が複数の抗体であり、複数の抗体中の各抗体が、複数の肝炎ウイルス抗原のうちの１つの肝炎ウイルス抗原に特異的に結合するラテラルフロー試験基材を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、１種または複数の肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原及び／またはＨＢＶ抗原である。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＢｓＡｇを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、肝炎ウイルス抗原は、ＨＣＶ抗原を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択され、ＨＣＶ抗原の少なくとも１つはＨＣＶｃＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、複数の抗体は、天然に見られない濃度及び／または純度を有する複数の抗体の組成物である。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識が付けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体をさらに含み、前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、複数の抗体に特異的に結合する。
【００２０】
肝炎ウイルス抗原が、複数の抗原、例えばＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａから本質的になる実施形態では、フレーズ「から本質的になる」は、他の抗原の検出が、複数の抗原、例えばＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａにおける抗原の検出に悪影響を与えない限り、アッセイ、システム及びキットが、肝炎ウイルス抗原であってもよく、そうでなくてもよいほかの抗原の検出を含むことができることを意味する。
【００２１】
本発明の実施形態では、１種または複数の抗体に結合している１種または複数の肝炎ウイルス抗原の検出は、結合肝炎ウイルス抗原それ自体を直接的に検出することによってでもよいし、肝炎ウイルス抗原に結合した１種または複数の抗体を検出することによって間接的にでもよい。例えば、所与の肝炎ウイルス抗原を直接的に検出するのに、所与の肝炎ウイルス抗原に特異的に結合する標識された抗体を使用することができる。あるいは、抗原に結合した抗体に特異的に結合する標識された抗体を、間接的な検出に使用することができる。
【００２２】
前述の概説及び以下の詳細な説明の両方は例示的且つ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図される。添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ且つ本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を図示し、説明とともに本発明の原理を説明する役割を果たす。
【００２３】
本発明は、以下の図面を参照することによりさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】どのようにＨＣＶポリタンパク質前駆体がＨＣＶゲノムから翻訳され、次いで、様々なＨＣＶ構造及び非構造タンパク質に切断させるかを概略的に示す図である。Ｃ：コアタンパク質；Ｅ：エンベロープタンパク質；ＮＳ：非構造タンパク質。
【図２】本明細書に例示されるＬＦＴアッセイで使用されるイムノクロマトグラフィーストリップの模式図である。Ａ．試料パッド；Ｂ．バッキングカード；Ｃ．コンジュゲートパッド；Ｄ．コロイド金粒子とコンジュゲートした捕獲抗体；Ｅ．ニトロセルロース膜；Ｆ．試験ライン；Ｇ．対照ライン；及びＨ．吸収パッド。
【図３Ａ】血清試料において、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ（コンボ）が、ＨＣＶｃＡｇだけ（コア）を検出するＥＩＡアッセイと比較して有意に増大しているＯＤ値、従って感度を有することを示す棒グラフである。これらは、ＨＣＶ感染中の血液試料において、ＨＣＶｃＡｇのほかにＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａ抗原の存在も確認した。陰性：抗ＨＣＶ及びＰＣＲアッセイによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡが陰性である血清検体を使用した、陰性対照；Ｓ：ＰＣＲアッセイによれば陽性の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する試験血清検体。各セットの最初の棒は「コア」であり、各セットの２番目の棒は「コンボ」である。
【図３Ｂ】尿試料において、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ（コンボ）が、ＨＣＶｃＡｇだけ（コア）を検出するＥＩＡアッセイと比較して有意に増大しているＯＤ値、従って感度を有することを示す棒グラフである。これらは、ＨＣＶ感染中の尿試料において、ＨＣＶｃＡｇのほかにＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａ抗原の存在も確認した。陰性：抗ＨＣＶ及びＰＣＲアッセイによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡが陰性である尿検体を使用した、陰性対照；Ｓ：ＰＣＲアッセイによれば陽性の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する試験尿検体。各セットの最初の棒は「コア」であり、各セットの２番目の棒は「コンボ」である。
【図４】血清検体を試験した場合に、さらなるＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂの付加がコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ（実施例２）の感度を改善したことを示す棒グラフである。「１コア」＝１種のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂを使用する、ＨＣＶｃＡｇだけに対するＥＩＡアッセイ；「１コア＋コンボ」＝１種のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ＋ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する抗体を用いるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ；「２コア」＝第１のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ及び第２のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂを使用する、ＨＣＶｃＡｇだけに対するＥＩＡアッセイ；並びに「２コア＋コンボ」＝第１のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ及び第２のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ＋ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する抗体を用いる、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ。ＰＢＳ：ＰＢＳバッファーの使用；陰性対照：抗ＨＣＶ及びＰＣＲアッセイによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡが陰性である血清検体の使用；試料：ＰＣＲアッセイによれば陽性の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する試験血清検体。
【図５】ＨＣＶｃＡｇのほかに、変性によるＨＣＶ  ＲＮＡ陽性の血清検体の前処理が、ＨＣＶｃＡｇ（パネルＡ）、ＮＳ３（パネルＢ）、ＮＳ４ｂ（パネルＣ）及びＮＳ５ａ（パネルＤ）に対するＥＩＡによる測定ＯＤ値または感度も増大させることを示すグラフである（パネルＡ〜Ｄ）。これらは、ＨＣＶ感染中の血液検体において、これらすべてのＨＣＶ−Ａｇｓのそれぞれを含む免疫複合体の存在も確認した。処理試料：試験血清試料（Ｓ１−Ｓ３）を変性により前処理した（実施例２、ステップ５で）；未処理試料：試験血清試料（Ｓ１−Ｓ３）を前処理しなかった（実施例２、ステップ５を省略して）。
【図６Ａ】段階希釈を試験する血清試料における、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界（ＰＣＲによれば約１８８ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当する）を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】別の段階希釈を試験する血清試料における、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界（ＰＣＲによれば約３２８ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当する）を示す棒グラフである。
【図６Ｃ】異なるＨＣＶ遺伝子型に対するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界（ＰＣＲによれば約２５０ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当する）を示す棒グラフである。グラフは、異なるＨＣＶ遺伝子型に感染した対象由来の５試料の平均を表す。
【図７Ａ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性の３８個及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陽性（９４ＩＵ／ｍＬ〜１４，４００，０００ＩＵ／ｍＬに及ぶ）の８３個を含む、試験した１２１個の血清検体において、血清試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイが、１００％の感度及び１００％の特異性をもたらすことを示す表である。
【図７Ｂ】コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの光学密度によって決定された、血清中のＨＣＶ−Ａｇｓレベルが、慣例的なＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲによって決定された血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルと有意に相関があった（ｒ２＝０．８１２、ｐ＜０．０１）ことを示すグラフである。
【図８Ａ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性の２０個及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陽性の８０個（６２，０００ＩＵ／ｍＬ〜９，９６０，０００ＩＵ／ｍＬに及ぶ）を含めた、試験した１００個の血清検体において、尿試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイが、９８．７％の感度及び１００％の特異性をもたらすことを示す表である。試験した１００個の対象のうち、１つの偽陰性が、血液透析（ＨＤ）を受けている末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の対象から生じた。
【図８Ｂ】コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの光学密度によって決定された、尿試料のＨＣＶ−Ａｇｓレベルが、慣例的なＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲによって決定された血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルと有意に相関があった（ｒ２＝０．８２１、ｐ＜０．０１）ことを示すグラフである。
【図９】血清抗ＨＣＶに対して陽性であるが、ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性の１５個体における、血清検体（上２列）及び尿検体（下２列）についてのコンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡ試験の結果をまとめる表である。表に記載されるように、変性（方法Ｉ）の後、これらの血清検体のうちの６／１５（４０％）が陽性の結果を示したが、変性ステップを省略した場合（方法ＩＩ）、これらの同じ検体のすべて（１００％）が陰性の結果を示した。これらの結果は、血清検体の変性は、ＩＣ−ＨＣＶ複合体からＩＣ−ＨＣＶ抗原を遊離させ、これらの個体において、偽陽性の試験結果をもたらすことを示す。しかし、同じ１５個体由来の尿検体の変性は、１００％陰性の試験結果をもたらし、非変性の同じ検体と完全に一致した。したがって、変性しようが、しまいが、尿検体を使用するコンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡ試験の結果に影響しない。
【図１０Ａ】実施例５．５に従って試験（血清）試料と検出抗体とを混合することに起因する、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの感度の予期しない増大を示す棒グラフである。ＮＣ：抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性の血清検体を使用する陰性対照；２コアＡｂｓ：ＥＩＡについて２種類の抗ＨＣＶｃＡｇ抗体の使用；コンボ：コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡ（実施例２）。測定ＯＤ値に基づくと、捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触させるより前に、試験試料を検出抗体と混合することは、混合なしのコンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡと比較して、約２７％感度を改善し、一方実施例５．５による混合ステップは、混合ステップなしの同じ方法と比較して、２コアＥＩＡの感度を８％改善した。
【図１０Ｂ】コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイを使用した際の、ＰＣＲによれば陽性の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する２対象由来の連続希釈した血清検体における、図１０Ａに記載されている混合ステップを用いたＨＣＶ−Ａｇｓの検出を示す棒グラフである。捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触する前に、試料及び検出抗体を一緒に混合した。ＮＣ：陰性対照、すなわち、抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性の対象由来の血清検体。変性方法がより高いＯＤを有するが、両方の方法が、例えば、１４０ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当する、同等の検出限界を有する。
【図１０Ｃ】コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイを使用した際の、ＰＣＲによれば陽性且つ低い血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する５対象由来の尿検体における、図１０Ａに記載されている混合ステップをともなうＨＣＶ−Ａｇｓの検出を示す棒グラフである。捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触させるより前に、試料及び検出抗体を一緒に混合した。ＮＣ：陰性対照、すなわち、抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である対象の尿検体。ＯＤ値は、検出限界が６３〜９４ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当することを示した。
【図１０Ｄ】急性Ｃ型肝炎ウイルス感染と臨床的に診断された対象、すなわち、ＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となるが、抗ＨＣＶ抗体について陰性である対象由来の２つの血清試料のコンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡ試験の結果を示すグラフである。ＰＢＳ：ＰＢＳ陰性対照；ＮＣ：抗ＨＣＶについて及びＲＴ  ＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性の血清検体由来の陰性対照。Ｓ１及びＳ２：急性ＨＣＶ感染を有する被検血清試料１及び２。Ｓ１及びＳ２のグラフは、コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡ試験を使用して抗ＨＣＶ試験が陽性になる５９日前（Ｓ２）及び６５日（Ｓ１）前において、陽性の試験結果を示した。したがって、本発明によるコンボＨＣＶ−Ａｇｓアッセイは、抗ＨＣＶ抗体が出現する前に、急性肝炎ウイルス感染を検出することができる。したがって、本発明による遊離肝炎ウイルス抗原の検出は、対象の免疫応答の発生及び／または存在、例えば抗体形成と無関係である。
【図１１Ａ】ＬＦＴアッセイの試験ストリップの写真である。パネルＡ）ＬＦＴ試験ストリップでのＨＣＶｃＡｇ単独の使用は、いかなる陽性シグナルも検出できなかった。パネルＢ）コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴ試験ストリップを使用して、血清試料において特異的なシグナルが検出可能であった。パネル３）コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴ試験ストリップを使用して、尿試料において特異的なシグナルが検出可能であった。これらは、ＨＣＶ感染中の血清及び尿試料の両方において、ＨＣＶｃＡｇのほかに、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａ抗原の存在も確認した。活動性ＨＣＶ感染を有する対象由来の試料は、ＰＣＲを使用して血清ＨＣＶ  ＲＮＡによって確認した。各パネル中、ストリップ１：陰性対照としてのＰＢＳバッファー；ストリップ２：陰性対照としての、抗ＨＣＶの試験結果が陽性となるが、ＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である試料；ストリップ３〜５は活動的にＨＣＶ感染した試料である。
【図１１Ｂ】尿試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの試験ストリップの写真である。これは、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴ試験ストリップへのＨＣＶｃＡｇに対するさらなるｍＡｂの付加が、さらに感度を増大させることを示す。パネルＡは、１種のＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ＋ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する抗体を使用する試験ストリップを示す。パネルＢは、２種の異なるＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂｓ＋ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する抗体を使用する試験ストリップを示す。各パネル中、ストリップＣ＝陰性対照、すなわち、抗ＨＣＶ及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡが陰性である尿試料；及びストリップ１〜５は、それぞれＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４及び６である。ＧＴ−５を用いて同様の結果が示された（非表示）。
【図１２Ａ】コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイを使用する試験ストリップの写真である。これは、実施例６．３に従って、試験パッドに加える前に試験血清試料をコロイド金溶液（コロイド金とコンジュゲートした検出抗体）と混合することによって、血清試験試料について、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度が著しく改善されたことを示す。
【図１２Ｂ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルが低い５つの血清検体についての、実施例６．３による混合ステップを有するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイを使用した試験結果を示す図である。コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴの検出下限は、２６〜６３ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに相当する範囲内である。Ｃ：抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である血清検体を用いる陰性対照。
【図１２Ｃ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性の２０個及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陽性の４０個（２４０ＩＵ／ｍＬ〜１，７４０，０００ＩＵ／ｍＬに及ぶ）を含めた、試験した６０個の血清検体において、血清試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイが、１００％の感度及び１００％の特異性をもたらすことを示す表である。
【図１３Ａ】コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイを使用する試験ストリップの写真である。これは、試験パッドに加える前に試験尿試料をコロイド金溶液（コロイド金とコンジュゲートした検出抗体）混合することによって、尿試料について、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度が著しく改善されたことを示す。
【図１３Ｂ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡが少ない５つの尿検体についての、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイを使用した試験結果を示す図である。尿検体におけるＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＰＴの検出下限は６３〜９４ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに相当する範囲内である。Ｃ：抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である尿検体を用いる陰性対照。
【図１３Ｃ】ＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性の１５個及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陽性の７８個（５７０ＩＵ／ｍＬ〜９，９６０，０００ＩＵ／ｍＬに及ぶ）を含めた、試験した９３個の尿検体において、尿試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイが、１００％の感度及び１００％の特異性をもたらすことを示す表である。
【図１４Ａ】血清ＨＢｓＡｇに対して陽性の５対象由来の尿検体（＃１〜５）及び陰性対照（＃６）を使用する、実施例５．５による混合ステップを有するコンボＨＢｓＡｇ  ＥＩＡアッセイのＯＤ値を示すグラフである。試料１〜５については、最初の棒は、ＨＢｓＡｇに対する１種の抗体を使用した際の結果であり、２番目の棒は、ＨＢｓＡｇに対する２種の異なる抗体を使用した際の結果である。陰性対照は陰性の血清ＨＢｓＡｇ試験をともなう尿検体である。
【図１４Ｂ】ＨＢｓＡｇに対する１種の抗体を使用する（「ａ」と表示されたストリップ）、及びＨＢｓＡｇに対する２種の異なる抗体を使用する（「ｂ」と表示されたストリップ）、実施例６．３による混合ステップを有する、陽性の血清ＨＢｓＡｇを有する６対象由来の尿試料のＬＦＴ試験ストリップを示す図である。ＮＣは、陰性の血清ＨＢｓＡｇ試験をともなう陰性対照尿検体である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１で示すように、ＨＣＶの複製と生活環の間、大きなＨＣＶ前駆タンパク質が翻訳され、構造（エンベロープ及びコアタンパク質）及び非構造（ＮＳ）タンパク質を含めた、様々なＨＣＶタンパク質を生成するのに使用される。これらのタンパク質のいくつかは高度に保存され、抗原性であり、これは、ＨＣＶに感染した対象において、感染が排除された後でさえも、それらの対応する抗体が検出可能であるからである。
【００２６】
本明細書で開示されるように、ＨＣＶコア抗原（ＨＣＶｃＡｇ）に加えて、高度に保存されたＨＣＶ非構造（ＨＣＶ  ＮＳ）タンパク質、例えばＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａを含めた、いくつかのほかのＨＣＶタンパク質は、活動性ＨＣＶ感染を有する対象、例えば、ＰＣＲを使用して血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象の血液及び尿において、遊離ＨＣＶ抗原として絶えず発現していることが分かる。本明細書で使用する場合、「遊離抗原」は、対象の天然の免疫複合体の一部にまだなっていない、例えば、所与の対象の免疫応答によって作出される抗体にまだ結合していない、抗原を指す。用語「遊離肝炎ウイルス抗原」は、対象の免疫複合体の一部にまだなっていない肝炎ウイルス抗原を指す。用語「遊離ＨＣＶ抗原」は、対象の免疫複合体の一部にまだなっていないＨＣＶ抗原を指す。本明細書で使用する場合、「ＩＣ複合体」は、抗原と対象の免疫応答によって生じる１種または複数の抗体との間の複合体を指す。「ＩＣ−ＨＣＶ複合体」は、ＨＣＶ抗原と対象の免疫応答によって生じる１種または複数の抗体との間のＨＣＶ抗原免疫複合体を指す。便宜上、本明細書で開示されるように、対象の免疫複合体の一部である及び／または一部であったＨＣＶ抗原を、「ＩＣ−ＨＣＶ抗原」と呼ぶ。ＩＣ−ＨＣＶ抗原は、まだＩＣ複合体の一部であるＨＣＶ抗原、及び非天然の条件、例えば、ＩＣ−ＨＣＶ複合体を変性させる実験用アッセイによってＩＣ−ＨＣＶ複合体から未結合状態になった（または遊離された）ＨＣＶ抗原を含む。本明細書で使用する場合、「総ＨＣＶ抗原」は、すべての遊離ＨＣＶ抗原の合計＋すべてのＩＣ−ＨＣＶ抗原の合計を指す。ＩＣ−ＨＣＶ抗原は、活動性ＨＣＶ感染を有する（すなわち、ＰＣＲを使用してＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる）対象及び過去のＨＣＶ感染を有していたが、ＨＣＶ感染を排除した（すなわち、ＰＣＲを使用してＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陰性となる）対象由来の試料（尿以外）中に見られ得る。遊離ＨＣＶ抗原は、活動性ＨＣＶ感染を有する対象の（血液及び尿の両方を含めた）試料中に見られる。
【００２７】
本発明は、試料中の遊離肝炎ウイルス抗原としての複数の肝炎ウイルス抗原及び／またはＩＣ−肝炎ウイルス抗原（係り受け）の存在を検出するための、アッセイ、システム及びキットに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の複数の遊離ＨＣＶ抗原及び／または複数のＩＣ−ＨＣＶ抗原の存在を検出するためのアッセイ、システム及びキットに関する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は同時に検出され、及び／または同じアッセイステップにおいて検出される。試料は、遊離ＨＣＶ抗原及び／またはＩＣ−ＨＣＶ抗原が見つけられ得る生体試料、例えば全血、血清、血漿、尿もしくは他の体液または組織でもよいし、合成的試料、例えば、対照実験として使用される研究室で作製された試料でもよい。いくつかの実施形態では、試料は尿試料である。
【００２８】
適切なＨＣＶ抗原としては、ＨＣＶｃＡｇ、ＨＣＶ  Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の総ＨＣＶ抗原（すなわち、遊離ＨＣＶ抗原＋ＩＣ−ＨＣＶ抗原）が検出される。複数のＨＣＶ抗原は、遊離ＨＣＶ抗原及び／またはＩＣ−ＨＣＶ抗原であり得る。いくつかの実施形態では、複数の遊離ＨＣＶ抗原のみが検出される。本明細書で使用する場合、「複数の遊離ＨＣＶ抗原」の特定のＨＣＶ抗原への言及は、遊離ＨＣＶ抗原であるとして各ＨＣＶ抗原を特に示すことがなくてさえも、言及された各複数のＨＣＶ抗原が遊離ＨＣＶ抗原であることを意味する。いくつかの実施形態では、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原はＨＣＶｃＡｇを含む。いくつかの実施形態では、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ並びにＥｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂタンパク質の１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶｃＡｇ、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａタンパク質からなる。
【００２９】
本明細書で提供される場合、アッセイ、システムまたはキットに関連した用語「コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ」の使用は、本発明によるアッセイ、システムまたはキット（例えば、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原が検出されるアッセイ）を指す。したがって、例えば、「コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイ」は、複数の遊離または総ＨＣＶ抗原が検出されるアッセイを指す。本発明のアッセイのアッセイプラットフォームは、当技術分野で既知の、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、マイクロプレートベースのイムノアッセイ（ＭＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフロー試験（ＬＦＴ）を含めた任意のイムノアッセイでもよく、且つ自動化されてもよいし、手動でもよい。様々なアッセイは、任意の適切な標識及び検出システムを用いることができる。本明細書で使用する場合、「検出可能な標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な化合物または組成物である。物質を修飾するために「標識された」の使用、例えば、標識された抗体は、物質が、付け加えられた検出可能な標識を有することを意味する。検出可能な標識を有する物質、例えば抗体は、通常は物質に連結またはコンジュゲートされていない検出可能な標識が、人の手によって物質に連結またはコンジュゲートされていることを意味する。本明細書で使用する場合、フレーズ「人の手によって」は、人、またはそれ自体の性質ではなく、人の管理下にある物体（例えば、人によって操作またはプログラムされるロボットまたは機械）が特定の行為を実施したことを意味する。したがって、特許請求の範囲に記載されるステップは、人の手、例えば、人または人の管理下にある物体によって実施される。
【００３０】
本明細書で開示されるように、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイは、わずか１種のＨＣＶ抗原が検出されるアッセイについて著しい感度の改善をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象をＨＣＶ感染を有するまたは有していたと診断するためのアッセイ、システム及びキットに関し、これは、対象から得られた試料において複数のＨＣＶ抗原の存在（または非存在）を検出すること、及び複数のＨＣＶ抗原が存在する場合に、対象をＨＣＶ感染を有するまたは有していたと診断することを含む。
【００３１】
さらに、本明細書で開示されるように、被検試料をＩＣ−ＨＣＶ複合体を解離する条件、例えば変性条件にかけることによって、アッセイ感度の増大がもたらされる。実際に、本明細書で示すように、検出前に試験試料を変性条件にかけることによって、１００％の感度がもたらされる。以下の実験の結果に基づくと、おそらく、結合部位が免疫複合体の抗体に占有されているという理由で、まだ免疫複合体の一部であるＩＣ−ＨＣＶ抗原は、加えられるさらなる抗体、例えば検出抗体によって容易には検出されない、またはそうした抗体に結合しないことが考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、検出より前に、被検試料をＩＣ−ＨＣＶ複合体を解離する変性条件にかける。そのような変性条件は、約０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、約１．５％の３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及び約１５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約８．５のｐＨを有する変性溶液で、約５６℃で約３０分間、血清検体を前処理することを含む。同様の効果をもたらす条件は、当業者なら容易に決定することができ、本明細書で意図される。
【００３２】
本明細書で開示されるように、ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ感染を排除した対象、例えば、抗ＨＣＶ抗体の試験結果が陽性であり、ＰＣＲを使用してＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陰性である対象の血液中に、ＩＣ−ＨＣＶ複合体として残存し得る。したがって、検出より前に、ＩＣ−ＨＣＶ複合体を有する可能性がある試料を変性条件にかけることは、過去のＨＣＶ感染を有していたが、ＨＣＶ感染を排除した対象において、活動性ＨＣＶ感染に関して偽陽性に繋がり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＣ−ＨＣＶ抗原の検出を回避するために、本発明の方法は、検出より前に、ＩＣ−ＨＣＶ複合体からＨＣＶ抗原を解離する変性条件に被検試料をかけない。換言すれば、変性したＩＣ−ＨＣＶ抗原の検出が回避されることになる場合は、本発明の方法は、検出より前に試料中に存在し得るＩＣ−ＨＣＶ複合体を変性することを除外する。または、言い換えれば、本発明のそのような方法は、検出より前にＩＣ−ＨＣＶ複合体からＨＣＶ抗原を解離する条件を回避する。
【００３３】
本明細書で開示されるように、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイを使用する、変性条件（例えば、ＩＣ複合体を解離する条件）にかけられていない試料における複数の遊離ＨＣＶ抗原の検出は、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲを使用する場合の血清ＨＣＶ  ＲＮＡ  １４０ＩＵ／ｍＬと同等なレベルで、活動性ＨＣＶ感染の検出をもたらす。換言すれば、変性条件を除外する本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイは、血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対するＰＣＲアッセイに匹敵する、活動性ＨＣＶ感染の検出に対する感度及び特異性を有する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象を活動性ＨＣＶ感染を有すると診断するためのアッセイ、システム及びキットに関し、これは、対象から得られた変性条件にかけられていない試料中において、複数の遊離ＨＣＶ抗原の存在（または非存在）を検出すること、及び複数の遊離ＨＣＶ抗原が存在する場合に、対象を活動性ＨＣＶ感染を有すると診断することを含む。
【００３４】
本明細書で開示されるように、ＨＣＶ抗原は、ＰＣＲを使用して血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象の尿試料で検出可能であるが、ＰＣＲを使用して血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陰性となる対象の尿試料では検出不可能である。さらに、ＩＣ−ＨＣＶ複合体は尿試料中に存在せず、これは、過去のＨＣＶ感染を有していたが、ＨＣＶ感染を排除した対象由来の尿試料において、検出前の尿試料の変性によって、任意のＨＣＶ抗原（遊離または総ＨＣＶ抗原）の試験結果が陽性にならないからである。したがって、いくつかの実施形態では、対象からの尿試料を、遊離ＨＣＶ抗原のみの有無を検出するのに使用することができる。次いで、尿試料中に遊離ＨＣＶ抗原の存在が検出される場合に、対象を活動性ＨＣＶ感染を有すると診断することができ、または尿試料中に遊離ＨＣＶ抗原が検出されない場合に、活動性ＨＣＶ感染を有さないと診断することができる。
【００３５】
本明細書で示すように、所与の単一抗原を検出するために２種の異なる抗体を使用することは、アッセイ感度及び特異性の予期しない優れた増大をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、同じ肝炎ウイルス抗原に対して２つ以上の異なる抗体を使用することを含む、肝炎ウイルス抗原を検出するためのアッセイ、システム及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、同じ肝炎ウイルス抗原に対して２つ以上の異なる抗体を用いるアッセイ、システム及びキットは、本明細書で開示されるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイ、システムまたはキットである。
【００３６】
本明細書で示すように、複数のＨＣＶ抗原に対する検出抗体が一緒に混合され、被検試料とともにインキュベートされる場合、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイの感度は、著しく増大した。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、コーティングまたは固定化された捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触する前に試験試料及と検出抗体が一緒に混合される、イムノアッセイを提供する。
【００３７】
図１０Ｄで示すように、遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）の検出は、対象の免疫応答の発生及び／または存在、例えば抗体形成と無関係である。肝炎ウイルス抗原に対する抗体を検出または測定するアッセイと異なり、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイは、抗ＨＣＶ抗体が出現する前に急性肝炎ウイルス感染を検出するのに使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象が肝炎ウイルスに対する抗体を発生させる前に、対象の急性肝炎ウイルス感染を検出する方法、対象を急性肝炎ウイルス感染を有すると診断する方法、または両方の方法に関する。
【００３８】
本発明によるアッセイ、システム及びキットの感度及び特異性は、アッセイ条件、例えば、反応時間及び温度を最適化すること、並びに／または当技術分野で既知の方法を使用して用いられる、例えば異なる検出及び標識系を使用して、試薬を修飾または置換することによって、さらに改善することができる。
【００３９】
要約すると、本発明は、１種または複数の肝炎ウイルス抗原に対する、免疫ベースのアッセイ、システム及びキットを提供し、ここでは、（１）所与の単一肝炎ウイルス抗原に対する２種以上の抗体を、同じ検出ステップにおいて同時に使用し、（２）複数の肝炎ウイルス抗原を、同じ検出ステップにおいて同時に検出し、（３）捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触させるより前に、肝炎ウイルス抗原（複数可）に対する検出抗体を試料と混合し、（４）遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）のみが検出され、及び／または（５）総肝炎ウイルス抗原が検出される。
【００４０】
科学的及び臨床的研究に使用されることに加えて、本発明のアッセイ及びシステムは、（１）対象において遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）の存在をスクリーニングするため（その存在は、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断するのに使用することができる）；（２）肝炎ウイルスＲＮＡについての確認ＰＣＲ試験の必要なく、単純な１試験アプローチを使用して、進行中の活動性肝炎ウイルス感染を回復した過去のＨＣＶ感染／曝露と区別するため；（３）感染初期、例えば、遊離肝炎ウイルス抗原の存在並びに抗肝炎ウイルス抗体及び／または肝炎ウイルス抗原免疫複合体の非存在によって特徴づけられる、セロコンバージョン前の空白期間に、活動性肝炎ウイルス感染を特定するため；（４）免疫無防備状態であり、抗肝炎ウイルス抗体を産生することができない個体、例えば、免疫抑制治療または血液透析を受けている対象において、肝炎ウイルス感染を特定するため；（５）肝炎ウイルスＲＮＡのレベルをモニターするため（例えば、肝炎ウイルスＲＮＡのレベルの指標として遊離肝炎ウイルス抗原の量を使用する）；並びに（６）対象において肝炎ウイルス感染への治療の効果をモニターするために使用することができる。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態は、肝炎ウイルス抗原（複数可）の存在を検出するために、単一ステップ、例えば、ＬＦＴ試験ストリップの試験パッドに試験試料を装填することによって実施することができるので、そうしたアッセイ、システム及びキットは、費用対効果が大きく、簡便であり、時間節約的であり、手頃な価格であり、且つ研究室で、またはクリニックでの医師による及び自宅での対象によるポイントオブケアにおいて、容易に実施することができる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００４３】
材料
本明細書の実験で例示されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を以下のように表Ａに記載する：
【表Ａ】
2017506339.tif 000002
【００４４】
方法
実施例１−ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲ
本明細書で開示されるように、当技術分野で既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を使用して、血清ＨＣＶ  ＲＮＡの存在をアッセイした。特に、血清ＨＣＶ  ＲＮＡは、検出下限が４３ＩＵ／ｍＬ及び定量限界が１００ＩＵ／ｍＬであるＲｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を使用して、または検出下限及び定量限界の両方が１２ＩＵ／ｍＬであるＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって定量化した。
【００４５】
実施例２−ＥＩＡプロトコール
別段指示がない限り、本明細書に開示されるＥＩＡ実験において、以下のプロトコールを使用した。
【００４６】
ステップ１．アッセイ基材のコーティング。９６ウェルＰＶＣマイクロタイタープレートをアッセイ基材として使用した。しかし、当技術分野で既知のほかの基材、例えばアッセイビーズを使用してもよい。マイクロタイタープレートの各試験ウェルを、炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ約７．０〜９．５、例えば約９．０）で希釈した、十分な量、すなわち５０〜２００μＬ、例えば約１００μＬの捕獲抗体でコーティングした。捕獲抗体は、ＨＣＶｃＡｇ−１（約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬ）、ＨＣＶｃＡｇ−２（約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬ）、ＮＳ３（約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約５μｇ／ｍＬ）、ＮＳ４ｂ（約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約５μｇ／ｍＬ）及びＮＳ５ａ（約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約５μｇ／ｍＬ）に対するモノクローナル抗体の混合物であった。
【００４７】
ステップ２．インキュベーション。ステップ１のマイクロタイタープレートに覆いをし、４℃で一晩（または３７℃で約１５〜１２０分間、例えば約６０分）インキュベートした。
【００４８】
ステップ３．洗浄。ステップ２の後、約１００〜４００μＬ、例えば約３００μＬのＴＢＳ−Ｔ溶液（洗浄液）で各ウェルを満たし、シンク上でプレートをはじくことによって、マイクロタイタープレートを３回洗浄した。次いで、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて、残った洗浄液を除去した。
【００４９】
ステップ４．非特異的結合のブロッキング。次いで、約１〜５％、例えば約３％のＢＳＡを含む、約１５０〜３００μＬ、例えば約３００μＬのブロッキングバッファーを加えることによって、各ウェルを処理した。次いで、プレートを室温で約１５〜９０分間、例えば約６０分インキュベートして、コーティングしたウェル中の残りのタンパク質結合部位をブロックした。
【００５０】
随意ステップ５．試験試料の前処理。例えば血清または血漿試料について実施する場合は、約２５〜１５０μＬ、例えば約１００μＬの試験試料を、約５０〜２００μＬ、例えば約５０μＬの前処理溶液（０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５％の３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及び約１５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））と１．５ｍＬの遠心管中で混合し、次いで、５６℃で約３０〜６０分間、例えば約６０分間インキュベートした。
【００５１】
ステップ６．血清／血漿または尿検体の装填。マイクロタイタープレートの各ウェルからブロッキングバッファーを除去した後、約５０〜３００μＬ、例えば約１００μＬの前処理した血清もしくは血漿試料または約５０〜３００μＬ、例えば約１００μＬの未処理の尿試料を各ウェルに加えた。次いで、プレートに覆いをし、軽く撹拌しながら、室温で約３０〜１２０分間、例えば約９０分間インキュベートした。
【００５２】
ステップ７．洗浄。次いで、約１５０〜３００μＬ、例えば約３００μＬのＴＢＳ−Ｔ溶液で各ウェルを満たし、シンク上でプレートをはじくことによって、ウェルを３回洗浄した。次いで、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて、残った洗浄液を除去した。
【００５３】
ステップ８．検出抗体の装填。ステップ７の後、約５０〜３００μＬ、例えば約１００μＬの検出抗体を各試験ウェルに加えた。本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイについては、第１の検出抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対するポリクローナル抗体の混合物であった。従来技術によるアッセイについては、検出抗体は、抗ＨＣＶｃＡｇ抗体のみから成っていた。次いで、マイクロタイタープレートに覆いをし、軽く撹拌しながら、室温で約３０〜１２０分間、例えば約９０分間インキュベートした。
【００５４】
ステップ９．洗浄。未結合の検出抗体を除去するために、約１５０〜３００μＬ、例えば約３００μＬのＴＢＳ−Ｔ溶液で各ウェルを満たし、シンク上でプレートをはじくことによって、ウェルを３回洗浄した。次いで、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて、残った洗浄液を除去した。
【００５５】
ステップ１０．ＨＲＰコンジュゲート抗体の装填。検出抗体種に対して特異的な、約５０〜３００μＬ、例えば約１００μＬのＨＲＰコンジュゲートＩｇＧ抗体を各試験ウェルに加えた。ＨＲＰコンジュゲートＩｇＧ抗体を、使用直前にブロッキングバッファー中で、１：３０００〜１：５０００、例えば約１：４０００希釈の濃度に希釈した。次いで、プレートに覆いをし、室温で約１５〜９０分間、例えば約３０分インキュベートした。
【００５６】
ステップ１１．洗浄。未結合の抗体を除去するために、約１５０〜３００μＬ、例えば約３００μＬのＴＢＳ−Ｔ溶液で各ウェルを満たし、シンク上でプレートをはじくことによって、ウェルを３回洗浄した。次いで、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて、残った洗浄液を除去した。
【００５７】
ステップ１２．呈色反応。約５０〜３００μＬ、例えば約１００μＬの基質溶液（ＯＰＤ）を各試験ウェルに加え、室温で約５〜３０分間、通常約１５分間インキュベートし、続いて約２５〜５０μＬ、例えば約５０μＬの停止液を加えて、酵素反応を停止した。
【００５８】
ＥＬＸ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で、一次波長として４５０ｎｍを使用して、光学密度を測定した。カットオフ値を、平均陰性ＯＤ値＋３×標準偏差（ＳＤ）によって決定した。試験したＯＤ値が＞カットオフ値であった場合、試験結果を陽性とみなし；試験したＯＤ値が＜カットオフ値であった場合、試験結果を陰性とみなし；試験したＯＤ値が＝カットオフ値であった場合、試験結果を不確かであるとみなした。
【００５９】
実施例３−ＬＦＴプロトコール
Ａ．試験ストリップ
図２で示すように、本明細書の実験で例示されるＬＦＴ試験ストリップは、以下の構成要素を含む：Ａ＝試料パッド、Ｂ＝バッキングカード、Ｃ＝コンジュゲートパッド、Ｄ＝コロイド金粒子とコンジュゲートした捕獲抗体、Ｅ＝ニトロセルロース膜、Ｆ＝試験ライン、Ｇ＝対照ライン、Ｈ＝吸収パッド。別段指示がない限り、以下のように試験ストリップを構築した。しかし、当技術分野で知られているほかの試験ストリップ、ディップスティックなどを本発明に従って使用してもよい。したがって、本明細書では、用語「試験ストリップ」は、以下に記載のように、試験試料が装填され、次いで、捕獲抗体を有するような試験ライン及び対照ラインを通って流動する試料パッドを有する、ＬＦＴアッセイに使用されるアッセイ基材を一般的に指す。本明細書のＬＦＴ実験は、コロイド金標識系の使用を例示するが、当技術分野で知られているほかの標識系を使用してもよい。
【００６０】
ステップ１．検出抗体のコロイド金コンジュゲーション。使用するコロイド金溶液のｐＨ値を、０．２Ｍ炭酸カリウムで約７．４〜９．０、例えば約８．５に調整した。ＨＣＶｃＡｇのみを単独で検出するアッセイについては、ＨＣＶｃＡｇに対するモノクローナル抗体を、５．４ｍＬの全量でコロイド金溶液と混合して、約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬの濃度を得た。本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイについては、次いで、ＨＣＶｃＡｇ−１、ＨＣＶｃＡｇ−２、ＮＳ３、Ｎｓ４ｂ及びＮＳ５ａに対するモノクローナルまたはポリクローナルＩｇＧ抗体を、５．４ｍＬの全量でコロイド金溶液と混合した。これらの抗ＨＣＶ抗体のそれぞれの濃度は、約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬであった。この混合物を約１５〜６０分間、例えば約３０分間室温で激しく攪拌した後、０．６ｍＬの約５〜２０％、例えば約１０％のＢＳＡ（ｐＨ９．０）を加えて、金コロイドの過剰な反応性をブロックした。次いで、この混合物を約１５〜６０分、例えば約３０分、室温で攪拌した。次いで、この混合物を１２，０００ｒｐｍで、４℃で約１５〜６０分間、例えば約３０分間遠心分離し、得られたコンジュゲートされたペレットを再懸濁し、２ｍＭホウ砂バッファー（ｐＨ９．０、約１〜５％、例えば約１％のＢＳＡを含む）で２回洗浄した。このコンジュゲートを１：１００希釈した後、５４０ｎＭの波長で１０±０．５に達するようにＯＤ値を調整した。ペレットをホウ砂バッファー（約１〜５ｍＭ、例えば約２ｍＭ、ｐＨ９．０、２０％ショ糖及び約１〜５％、例えば約１％のＢＳＡを含む）中に再懸濁し、使用するまで４℃で維持した。
【００６１】
ステップ２．コンジュゲートパッドの処理。コンジュゲートパッド（図２「Ｃ」）を、約１〜５％、例えば約３％のＢＳＡ、約０．５〜５％、例えば約１％のＴｗｅｅｎ２０、約０．１〜１．５％、例えば約０．３％のポリビニルピロリドンＫ３０及び約０．０２％のアジ化ナトリウムを含む、約１０〜５０ｍＭ、例えば約２０ｍＭのリン酸バッファー（約７．０〜８．０、例えば約７．４のｐＨ）で、約５〜６０分間、例えば約１０分間室温で処理し、次いで、３７℃で約１５〜６０分間、例えば約３０分間乾燥した。
【００６２】
ステップ３．処理済みコンジュゲートパッドへのコロイド金とコンジュゲートした検出抗体の装填。図２「Ｄ」で示すように、次いで、ステップ１でコロイド金粒子とコンジュゲートしたＨＣＶ−Ａｇｓ特異的検出抗体を、ＢｉｏＤｏｔ  ＸＹＺプラットフォーム（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、約１０〜３０μＬ／ｃｍ、例えば約１０μＬ／ｃｍの割合で、（ステップ２で調製した）処理済みコンジュゲートパッドへ分注し、次いで、３７℃で約１５〜６０分間、例えば約３０分間乾燥した。
【００６３】
ステップ４．試験ラインへのＨＣＶ抗原に対して特異的な捕獲抗体の装填。約０．５〜２ｍｇ／ｍＬ、例えば約１ｍｇ／ｍＬの捕獲抗体を、約０．１〜２μＬ／ｃｍ、例えば約０．９μＬ／ｃｍの割合及び約２〜１０ｃｍ／秒、例えば約４ｃｍ／秒の速度で、ニトロセルロース膜上の試験ラインへ分注した。本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイについては、捕獲抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに特異的なポリクローナル捕獲モノクローナルまたはポリクローナル抗体の混合物であった。ＨＣＶｃＡｇのみを検出するアッセイについては、捕獲抗体は、ＨＣＶｃＡｇに対する抗体のみから成っていた。
【００６４】
ステップ５．対照ラインへのマウスＩｇＧに対して特異的な捕獲抗体の装填。図２「Ｇ」で示すように、約０．５〜２ｍｇ／ｍＬ、例えば約１ｍｇ／ｍＬの、マウスＩｇＧに対して特異的なポリクローナル捕獲抗体を、約０．１〜２μＬ／ｃｍ、例えば約０．９μＬ／ｃｍの割合及び約２〜１０ｃｍ／秒、例えば約４ｃｍ／秒の速度で、ニトロセルロース膜上の対照ラインに分注し、次いで、３７℃で約１５〜９０分間、例えば約３０分間乾燥した。
【００６５】
ステップ６．ラテラルフローストリップの組み立て。吸収パッド（図２「Ｈ」）、ニトロセルロース膜（ステップ４及び５と同様に処理した、図２「Ｅ」）、コンジュゲートパッド（ステップ３と同様に処理した、図２「Ｃ」）及び試料パッド（図２「Ａ」）を、次いで、バッキングカード（図２「Ｂ」）上にストリップとして組み立て、次いで、これを、順次、約１〜２ｍｍが部分的に重なった状態で、プラスチックのスケールボードに取り付ける。組み立てたプレートを、ＣＭ４０００カッター（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、約２〜１０ｍｍ、例えば約３ｍｍ幅の断片に切断した。作製した試験ストリップを、乾燥剤とともにプラスチック袋中にパッケージ化し、実験用に４℃または室温で保管した。
【００６６】
Ｂ．ＬＦＴアッセイプロトコール
希釈した試験試料（約１００〜３００μＬ、例えば約２５０μＬ）または陰性対照（例えば、ＰＢＳ溶液またはＰＣＲで判定した場合にＨＣＶ感染がない対象由来の試料）を試料パッドに加え、室温で約５〜４５分間、通常約１５分間放置した。
【００６７】
試験検体を試料パッド（図２「Ａ」）に装填した後、試験検体はコンジュゲートパッド（図２「Ｃ」）中に急速に拡散する。試験試料が所与のＨＣＶ抗原を含む場合は、抗原は、コロイド金粒子にコンジュゲートされ、図２「Ｄ」の領域に装填されたＨＣＶ検出モノクローナル抗体と反応する。こうしたＨＣＶ  Ａｇｓ／Ａｂｓ複合体は、毛細管作用によって、クロマトグラフ的にニトロセルロース膜上に沿って移動する（図２「Ｅ」）。最終的に、こうしたＨＣＶ  Ａｇｓ／Ａｂｓ複合体は、あらかじめ装填されたＨＣＶ特異的捕獲モノクローナルまたはポリクローナル抗体と反応し、試験ライン領域に固定化されて、陽性の試験結果を示す呈色したバンドを形成する（図２「Ｆ」）。過剰な（または、試験検体がＨＣＶ−Ａｇｓを含んでいない場合は、未反応の）ＨＣＶ特異的検出抗体コンジュゲートは、膜に沿って移動し、あらかじめ装填されたヤギ抗マウス抗体によって対照ライン領域で固定化され、対照ラインに呈色したバンドをもたらす（図２「Ｇ」）。したがって、陽性の試料は、１つは試験ライン領域に、もう１つは対照ライン領域に、２本のバンドを示すが、陰性試料は対照ライン領域に１本だけのバンドを示す。
【００６８】
したがって、試験ライン及び対照ラインの両方で呈色したラインがあれば、試験試料は所与のＨＣＶ抗原（複数可）について陽性であると考えられる。試験ライン領域に呈色したラインがなければ、試験試料は所与のＨＣＶ抗原（複数可）について陰性であると考えられる。しかし、対照ライン領域に呈色したラインがなければ、試験結果は無効であると考えられる。
【００６９】
実施例４−試料中のＨＣＶ抗原の検出
４．１血液試料
ＨＣＶｃＡｇに加えて、ＨＣＶ抗原が活動性ＨＣＶ感染を有する対象の血清試料中に存在するかどうかを判定するために、以下の実験を行った。特に、血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象から得られた血清試料を、実施例１に記載されるように試験した。
【００７０】
ウェスタンブロットは、６つすべてのＨＣＶ遺伝子型について、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａが活動性ＨＣＶ感染を有する対象の血清試料中に存在することを示す（データ非表示）。
【００７１】
４．２尿試料
活動性ＨＣＶ感染を有する対象の尿試料中にＨＣＶ抗原が存在するかどうかを判定するために、以下の実験を行った。特に、血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性であった対象から無作為に尿試料を収集し、使用するまで−８０℃で保管した。
【００７２】
ウェスタンブロットは、６つすべてのＨＣＶ遺伝子型について、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａが活動性ＨＣＶ感染を有する対象の尿試料中に存在することを示す（データ非表示）。ＩＣ−ＨＣＶ複合体は尿中に存在しないので、尿中に存在するＨＣＶ抗原はすべて遊離ＨＣＶ抗原である。
【００７３】
実施例５−ＥＩＡ実験
５．１血清試料
１試料中の複数のＨＣＶ抗原の同時検出が実行可能かどうか、及びＨＣＶ感染に対して十分な感度及び特異性をもたらすかどうかを判定するために、ステップ５を用いる実施例２のＥＩＡプロトコールを使用して、血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象由来の血清及び尿試料を試験したが、ＨＣＶｃＡｇのみを検出するアッセイについては、ＨＣＶｃＡｇに対するモノクローナル抗体のみをアッセイ基材上にコーティングし、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓアッセイについては、アッセイ基材上にコーティングした捕獲抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対するモノクローナル抗体を含んでいた。
【００７４】
図３Ａ及び３Ｂに提供されるデータは、単一のＥＩＡアッセイシステム（例えば、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ）における複数のＨＣＶ抗原の複合検出が、血清試料について実行可能であることを示す。さらに、図３Ａに提供されるように、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの感度は、１つのみのＨＣＶ抗原、例えばＨＣＶｃＡｇを検出するＥＩＡアッセイのもののほぼ２倍である。
【００７５】
コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界を、（ＰＣＲで決定した場合の）既知量の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する２つの血清試料の段階希釈をアッセイするためにステップ５を用いる実施例２のＥＩＡプロトコールを使用して、決定した。試料をＰＢＳで希釈した。ＰＢＳ並びに活動性ＨＣＶ感染の試験結果が陰性となる（すなわち、抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である）対象由来の血清試料の両方を陰性対照として使用した。無希釈の血清（対照）は、ベースラインのＨＣＶ  ＲＮＡ４７，０００または８２，０００ＩＵ／ｍＬを有していた。図６Ａ及び６Ｂで示すように、ＨＣＶ抗原は、１８８及び３２８ＩＵ／ｍＬに相当する血清ＨＣＶ  ＲＮＡに等しい１：２５０の希釈で、検出可能なままであった。
【００７６】
検出限界がＨＣＶ遺伝子型と無関係であるかどうかを判定するために、各ＨＣＶ遺伝子型について既知量の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する血清試料の段階希を同様にアッセイした。図６Ｃは、各遺伝子型について得られた結果を代表するものであり、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイは、２５０ＩＵ／ｍＬ程の低さの血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに対応する検出下限が可能であり、ＨＣＶ遺伝子型と無関係であることを示す。図７Ａは、血清試料を使用するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイが１００％の感度及び１００％の特異性をもたらすことを示す表である。
【００７７】
図７Ｂで示すように、血清試料についてコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイシステムを使用して決定した光学密度（ＯＤ）値は、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲによって決定した血清ＨＣＶ  ＲＮＡ量に対応する（ｒ２＝０．８１２、ｐ＜０．０１）。
【００７８】
５．２尿試料
実施例２のＥＩＡプロトコールをステップ５なしで実施したことを除いては、上記の５．１に記載されるものと同様の実験を尿試料について実施した。図８Ａに記載するように、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイは、尿試料を使用して、９８．７％の感度及び１００％の感度を有する。試験した１００対象のうち、１つの偽陰性が、血液透析（ＨＤ）を受けている末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する対象から生じた。図８Ｂで示すように、コンボＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥｌＡアッセイの光学密度で決定した尿試料のＨＣＶ−Ａｇｓレベルは、ＨＣＶ  ＲＮＡ  ＰＣＲによって決定した血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルと有意に相関があった（ｒ２＝０．８２１、ｐ＜０．０１）。
【００７９】
５．３血清試験試料の前処理
血清試料を前処理して、ＩＣ−ＨＣＶ複合体からＨＣＶ抗原を解離することができる。抗ＨＣＶに対して陽性であるが、血清ＨＣＶ  ＲＮＡに対して陰性であることが知られている１５対象（例えば、過去のＨＣＶ感染を有し、活動性ＨＣＶ感染を有さない対象）からの血清試料の結果は、ステップ５を用いる実施例２（方法Ｉ、変性される）に従ってアッセイされ、これを、ステップ５なしの実施例２（方法ＩＩ、変性されない）に従ってアッセイされた同じ１５対象からの血清試料の結果と比較した。図９で示すように、血清試料の変性（方法Ｉ）は、試験した血清検体の６／１５（４０％）で陽性の試験結果をもたらす。これらのデータは、ＩＣ−ＨＣＶ抗原が、以前のＨＣＶ感染を有していたが回復した、ＨＣＶ感染を解決した対象の血液中に存在し得ることを示した。これらの対象が活動性ＨＣＶ感染を有していなかったので、これらの陽性の試験結果は偽陽性である。一方で、図９で示すように、ＩＣ−ＨＣＶ抗原が尿検体中に存在しないので、同じ１５対象からの尿検体の変性は、そのような偽陽性の結果をもたらさなかった。
【００８０】
したがって、総肝炎ウイルス抗原（複数可）の検出が所望される（例えば、遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）のみを検出する必要がない、または遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）をＩＣ−肝炎ウイルス抗原（複数可）と区別する必要がない）場合、検出より前に被検試料を変性条件にかけることによって、アッセイ感度を増大させることができる。尿試料は肝炎ウイルス免疫複合体を含まないので、尿試料を変性条件にかけることは、アッセイ感度を増大させないことに留意されたい。
【００８１】
一方で、例えば、対象を活動性肝炎ウイルス感染を有すると診断するために、遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）のみの検出が所望される（例えば、ＩＣ−肝炎ウイルス抗原は、検出されることにならない）場合、免疫複合体が通常は見つからない試料（例えば尿試料）を試験すること、または検出より前に、ＩＣ−肝炎ウイルス抗原を含む可能性がある試料を変性条件にかけないことにより、アッセイの特異性を増大させることができる。
【００８２】
場合によっては、対象の遊離肝炎ウイルス抗原（複数可）と総肝炎ウイルス抗原（複数可）の両方をアッセイすることが所望され得る。例えば、ＨＣＶ感染が進行中の対象において、対象の臨床症状を鑑別するため、並びに対象の免疫応答、臨床経過及び治療応答をモニターするために、遊離ＨＣＶ抗原（複数可）の量は総ＨＣＶ抗原（複数可）と比較した。例えば、対象におけるＩＣ−ＨＣＶ抗原量の増大及び遊離ＨＣＶ抗原量の低下は、例えば、ＨＣＶ排除の好機、肝損傷の可能性の低下、ＨＣＶ治療への様々な応答及び／または他の臨床的合併症の危険性の低下を示し得る。一方で、対象におけるＩＣ−ＨＣＶ抗原量の低下及び遊離ＨＣＶ抗原量の増大は、例えば、ＨＣＶ感染を排除する対象の能力または対象の免疫システムに対する陽性または陰性の影響が損なわれてきていることを示し得る。
【００８３】
５．４  ２種の異なる抗体を使用する、ＨＣＶｃＡｇの検出
第２のＨＣＶｃＡｇ検出抗体の付加が、コンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥｌＡ（ここでは、検出される複数の遊離ＨＣＶ抗原には、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａが含まれる）のアッセイ感度をさらに増大させることができるかどうかを判定するために、ステップ５を用いる実施例２のＥＩＡプロトコール及び第２の抗ＨＣＶｃＡｇ検出抗体を使用して、ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象由来の試料を試験した。図４の棒グラフで示すように、血清検体のためのコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ（実施例２）への第２の抗ＨＣＶｃＡｇ検出抗体の付加は、アッセイ感度を増大させ（２コア＋コンボ対１コア＋コンボ）、ＨＣＶｃＡｇに特異的な２種の異なる抗体を使用してＨＣＶｃＡｇのみを測定するＥＩＡアッセイより優れている（２コア＋コンボ対２コア）。
【００８４】
したがって、いくつかの実施形態では、同じ抗原に対する１種を超える抗体、例えば第２の抗体が、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ、システム及びキットで使用される。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体の両方は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体であり、第２の抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、捕獲抗体、検出抗体または両方である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原に対する第２のセットの第１及び第２の抗体が、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ、システム及びキットで用いられる。本明細書で使用する場合、所与の抗原に特異的に結合する抗体は、所与の抗原に対して産生されるもの、または他の抗原よりも所与の抗原に優先的に結合するものである。
【００８５】
５．５試験試料との検出抗体の混合
複数のＨＣＶ抗原に対するすべての検出抗体を一緒に混合し、被検試料とともにインキュベートすることができるかどうかを判定するために、（ステップ５を用いる、または用いない）実施例２のＥＩＡプロトコールを使用して、以下の修正を用いて、ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陽性となる対象由来の血清及び尿試料の両方を試験した：ステップ１に記載されているように抗ＨＣＶ特異的抗体をコーティングする代わりに、炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ約７．０〜９．５、例えば約９．０）中に希釈した、十分な量、すなわち５０〜２００μＬ、例えば約１００μＬの捕獲抗体、例えば、抗マウスＩｇＧ抗体で、マイクロタイタープレートの試験ウェルをコーティングした。濃度は、約０．５〜１．５μｇ／ｍＬ、例えば約１．０μｇ／ｍＬであった。マイクロタイタープレートを４℃で一晩（または３７℃で約１５〜１２０分間、例えば約６０分）インキュベートした。次いで、ステップ６〜８の代わりに、被検試料を、試験ウェルに装填する前に、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する第１及び第２の検出抗体（例えば、２つの異なるＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂ及びＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対するポリクローナル抗体を含む）と混合した。手短に言えば、約２５〜１５０μＬ、例えば約１００μＬの試験試料（血漿または尿）を、それぞれ約５〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬの濃度のすべての検出抗体と混合し、合計で約１００〜３００μＬ、例えば約２５０μＬの最終量にした。ブロッキングバッファーを試験ウェルから除去した後、試験混合物（検出抗体と混合した試験試料）を約１５０〜３００μＬ、例えば約２５０μＬの量で、捕獲抗体を有する試験ウェルに加えた。
【００８６】
図１０Ａで示すように、すべての抗体を一緒に混合し、試験試料とインキュベートすることによって、有意にアッセイ感度が増大され、且つ試験時間が約３０分短縮された。したがって、本発明はまた、試験試料を検出抗体と混合し、次いで、コーティングまたは固定化された捕獲抗体を有するアッセイ基材にその混合物を加えるＥＩＡアッセイ方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイ方法は、試験試料と検出抗体を混合すること、次いで、試験試料、次いで検出抗体を別々に装填する代わりに、コーティングまたは固定化された捕獲抗体を有するアッセイ基材にその混合物を加えることを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＥＩＡアッセイを実施するためのキットを提供し、これは、複数の抗体（ここでは、複数の抗体中の各抗体が複数のＨＣＶ抗原の１つのＨＣＶ抗原に特異的に結合する）を含む容器、検出試薬を含む容器、並びに複数の抗体、検出試薬及び被検試料を混合することができる容器、並びにコーティングまたは固定化された、複数のＨＣＶ抗原に特異的に結合する捕獲試薬を有する基材を含む。いくつかの実施形態では、混合用の容器は、複数の抗体を有する容器、または検出試薬を有する容器である。
【００８７】
コーティングされた捕獲抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を有するアッセイ基材と接触する前に試験試料をすべての検出抗体と混合する、このコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界を、既知量のＨＣＶ  ＲＮＡを有する２つの血清試料の段階希釈を使用して決定した。抗ＨＣＶについて及びＰＣＲによればＨＣＶ  ＲＮＡについて陰性である血清試料を陰性対照として使用した。無希釈の血清（対照）は、１，１２４〜１，１４０ＩＵ／ｍＬというベースライン血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有していた。図１０Ｂで示すように、ＨＣＶ抗原は、約１４０ＩＵ／ｍＬに相当する血清ＨＣＶ  ＲＮＡへの希釈において、実施例２のステップ５に従って試料を変性させたかどうかを問わず、検出可能なままである（ＯＤ値は変性した試料について高かったが、検出限界は、変性及び未変性の試料の両方について同等である）。
【００８８】
同様に、コーティングされた捕獲抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を有するアッセイ基材と接触する前に、尿試験試料をすべての検出抗体と混合するコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＥＩＡアッセイの検出限界を、ＲＴ  ＰＣＲによって既知である量の血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する対象由来の５つの尿試料の段階希釈を使用して決定した。抗ＨＣＶの及びＰＣＲによれば血清ＨＣＶ  ＲＮＡの試験結果が陰性となる対象由来の尿試料を陰性対照として使用した。図１０Ｃで示すように、検出限界は、約６３〜９４ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡに相当する範囲内であった。
【００８９】
実施例６−ＬＦＴ実験
本明細書に例示されるすべてのＬＦＴ実験は、検出より前に試料を変性条件にかけないので、遊離抗原（複数可）のみを検出するが、検出より前に試験試料、例えば血清試料を変性することによって、総抗原（複数可）を検出することができる。
【００９０】
６．１複数のＨＣＶ抗原の検出
ＬＦＴアッセイシステムを使用してＨＣＶｃＡｇ単独または複数のＨＣＶ抗原（例えばＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａ）を検出することの実行可能性を判定するために、試験ストリップを構築し、実施例３に記載されるように試験した。
【００９１】
図１１ＡのパネルＡで示すように、ＨＣＶｃＡｇに対する単一のモノクローナル抗体を用いるＬＦＴアッセイシステムは、高い力価の血清ＨＣＶ  ＲＮＡ、例えば１４，４００，０００ｌＵ／ｍＬを有する対象から得られた尿試料では、陽性シグナルをもたらすのに不十分であった。しかし、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイシステム、すなわち、複数のＨＣＶ抗原に対する抗体を含む試験ストリップを使用した場合、血清ＨＣＶ  ＲＮＡを有する対象由来の血清（図１１Ａ、パネルＢ）及び尿（図１１Ａ、パネルＣ）試料の両方に対する陽性シグナルが得られた。カラム１及び２は陰性対照であった。
【００９２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される、少なくとも２種の異なるＨＣＶ抗原に対して特異的な捕獲及び留置抗体を含むＬＦＴ試験ストリップを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＶｃＡｇ並びにＥｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される１種または複数の抗原に対する捕獲及び留置抗体を含むＬＦＴ試験ストリップを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＶｃＡｇ、ＮＳ３、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５ａに対する捕獲及び検出抗体を含むＬＦＴ試験ストリップを提供する。
【００９３】
６．２  ２種の異なる抗体を使用する、ＨＣＶｃＡｇの検出
ＨＣＶｃＡｇに対するさらなる抗体の使用が、実施例６．２のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度を増大させることができるかどうかを判定するために、実施例３に記載されるように試験ストリップを構築及び試験し、ＨＣＶｃＡｇに対する第２の抗体を複数のＨＣＶ抗原に対する抗体の混合物に加えた。図１１Ｂで示すように、ＨＣＶｃＡｇに対する第２の抗体の付加は、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度を増大させ（２種の抗ＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂを用いるパネルＢ対１種の抗抗ＨＣＶｃＡｇ  ｍＡｂを用いるパネルＡ）、この結果は、遺伝子型と無関係である（列Ｃ、対照；ストリップ１〜５は、それぞれ、ＨＣＶ  ＧＴ１、２、３、４及び６を表す）。
【００９４】
したがって、いくつかの実施形態では、同じ抗原に対する１種を超える抗体、例えば第２の抗体が本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイ、システム及びキットで使用される。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体の両方は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体であり、第２の抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、捕獲抗体、検出抗体または両方である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原に対する第２のセットの第１及び第２の抗体が、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイ、システム及びキットで用いられる。
【００９５】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、同じ抗原に対する１種を超える抗体、例えば第２の抗体を含むＬＦＴ試験ストリップを提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体の両方は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体であり、第２の抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、捕獲抗体、検出抗体または両方である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＨＣＶｃＡｇに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原に対する第２のセットの第１及び第２の抗体が、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴ試験ストリップで用いられる。
【００９６】
６．３金コンジュゲート溶液と試験試料の混合
複数のＨＣＶ抗原に対する検出抗体を、試験ストリップにあらかじめ装填するのではなく、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイのアッセイ感度及び特異性が損なわれることなく被検試料と混合することができるかどうかを判定するために、実施例３のステップ３を省略した。コンジュゲートパッド上でコロイド金にコンジュゲートした検出抗体を有さない試験ストリップを使用してアッセイを実施するために、試験試料を実施例３のステップ１で生成したコロイド金溶液と混合し、次いで、試験パッドに加えた。
【００９７】
図１２Ａ及び１２Ｂで示すように、試料パッドに加える前に、試験血清試料をコロイド金溶液（コロイド金とコンジュゲートした検出抗体）と混合することによって、血清試験試料について、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度が著しく改善され、検出限界は２６〜６３ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに相当する範囲内であった。このコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイは、血清試料を使用して、１００％の感度及び１００％の特異性を示す（図１２Ｃ）。
【００９８】
同様に、図１３Ａ及び１３Ｂで示すように、試料パッドに加える前に、試験尿試料をコロイド金溶液（コロイド金とコンジュゲートした検出抗体）と混合することによって、尿試験試料について、本発明によるコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイの感度が著しく改善され、検出限界は、６３〜９４ＩＵ／ｍＬの血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに相当する範囲内であった。このコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイは、尿試料を使用して、１００％の感度及び１００％の特異性を示す（図１３Ｃ）。
【００９９】
したがって、本発明はまた、試験ストリップのＬＦＴ試料パッドに加える前に、試験試料を検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした検出抗体と混合するＬＦＴアッセイ方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコンボ−ＨＣＶ−Ａｇｓ  ＬＦＴアッセイ方法は、試験試料と検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした検出抗体とを混合すること、次いで、検出可能な標識にコンジュゲートした検出抗体が装填された試験ストリップを使用する代わりに、その混合物を試験ストリップの試料パッドに加えること、及び未混合の試験試料を試料パッドに加えることを含む。しかし、いくつかの実施形態では、検出可能な標識にコンジュゲートした検出抗体と混合された試験試料を試験するために、検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした検出抗体が装填された試験ストリップが使用される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明は、検出可能な標識、例えばコロイド金溶液を含む組成物、抗体、及び検出可能な標識を抗体と混合して検出可能な標識にコンジュゲートした検出抗体を得ることができ、試験ストリップに装填する前に被検試料と混合することができる容器とともにパッケージ化された試験ストリップを含む、ＬＦＴアッセイを実施するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした検出抗体、及び被検試料と検出抗体とを混合することができる容器とともにパッケージ化された試験ストリップを含む。キット中に提供される試験ストリップは、検出可能な標識、例えばコロイド金にコンジュゲートした検出抗体であらかじめ装填されていてもよいし、装填されていなくてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、キットは活動性ＨＣＶ感染を検出するためのものであり、したがって、検出抗体は、ＨＣＶｃＡｇ、Ｅｌ、Ｅｌ、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂからなる群から選択される少なくとも２種のＨＣＶ抗原に特異的に結合する抗体の混合物を含み、例えば、前記混合物は、第１のＨＣＶ抗原に対して特異的な第１の抗体、第２のＨＣＶ抗原に対して特異的な第２の抗体などを含む。
【０１０２】
実施例７−ＨＢｓＡｇに対する２種の異なる抗体を使用する、ＨＢＶアッセイ
血清ＨＢｓＡｇに対して陽性の対象由来の尿試料におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の存在。特に、ステップ５なしの実施例５．５のＥＩＡプロトコール（捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触させるより前に、試料を検出抗体と混合する）及びＨＢｓＡｇに対する１種または２種の抗体の使用。ＨＢｓＡｇに対する抗体を表Ａに記載する。他のＨＢＶ抗原は検出されなかった。図１４Ａで示すように、ＨＢｓＡｇに対する２種の異なる抗体の使用は、アッセイ感度を約０．２６〜１．６倍増大させた。
【０１０３】
血清ＨＢｓＡｇに対して陽性の対象由来の尿試料におけるＨＢｓＡｇの存在。特に、実施例６．３のＬＦＴプロトコール（試験ストリップと接触させるより前に、試料を検出抗体と混合する）及びＨＢｓＡｇに対する１種または２種の抗体の使用。ＨＢｓＡｇ抗体を表Ａに記載する。他のＨＢＶ抗原は検出されなかった。図１４Ｂで示すように、ＨＢｓＡｇに対する２種の異なる抗体を使用するＬＦＴアッセイ（「ｂ」と表示された試験ストリップを参照されたい）は、ＨＢｓＡｇに対する１種のみの抗体を使用するＬＦＴアッセイ（「ａ」と表示された試験ストリップを参照されたい）と比較して、著しく優れた結果をもたらした。
【０１０４】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる抗体、例えば、ＨＢｓＡｇに対する第１の抗体及びＨＢｓＡｇに対する第２の抗体の使用を含む、試料中のＨＢｓＡｇを検出するための免疫ベースのアッセイ、システム及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体の両方は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体であり、第２の抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、捕獲抗体、検出抗体または両方である。いくつかの実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、捕獲抗体を有するアッセイ基材と接触する前に、試験試料と混合される。いくつかの実施形態では、試料は、検出より前に変性される。いくつかの実施形態では、試料は尿試料である。いくつかの実施形態では、試料は全血、血清または血漿試料である。いくつかの実施形態では、アッセイはＥＩＡアッセイである。いくつかの実施形態では、アッセイはＬＦＴアッセイである。
【０１０５】
本発明の開示を理解するまたは完成するために必要な範囲において、本明細書で言及するすべての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれが個々に組み込まれる場合と同じ程度に、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１０６】
このように、本発明の例示的実施形態を説明してきたが、開示内のものは例示的なものにすぎず、本発明の範囲内で、様々なほかの代替案、改変及び修正を行うことができることに当業者は留意されたい。したがって、本発明は、本明細書で例示するような特定の実施形態に制限されないが、以下の特許請求の範囲のみによって制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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