(57)【要約】三次元の人工的で生物学的な、乳房組織モデル、脂肪組織モデル、および腫瘍モデル（乳癌モデルを含む）を記載する。2017518070.tif 000003
2017518070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、三次元の人工的な生物学的乳癌モデル：
a．ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、乳房間質組織；ならびに
b．乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、該三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、乳癌腫瘍組織；
ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであるか、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がそれらの各バイオインクからバイオプリントされたものである。
【請求項２】
あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項1に記載の乳癌モデル。
【請求項３】
前記乳癌細胞が乳癌細胞株に由来する、請求項1に記載の乳癌モデル。
【請求項４】
前記乳癌細胞が、患者腫瘍由来の原発性癌細胞である、請求項1に記載の乳癌モデル。
【請求項５】
前記乳癌腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を前記乳房間質組織によって完全に囲まれている、請求項1に記載の乳癌モデル。
【請求項６】
以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを製造する方法：
a．間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が押出化合物、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、工程；
b．腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが押出化合物および1つの乳癌細胞型を含む、工程；
c．該腫瘍バイオインクが、該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに
d．該押出化合物を除去しかつ細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【請求項７】
前記バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記乳癌細胞型が乳癌細胞株を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記癌細胞型が、患者腫瘍由来の原発性乳癌細胞を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a．表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；
b．一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；
c．該区画内に腫瘍バイオインクの節（node）を堆積させる工程；および
d．該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
個体における癌に対する治療剤を同定する方法であって、該方法が、
a．複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；
b．該個体由来の原発性癌細胞を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；
c．該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；
d．細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程；
e．該構築物に治療剤候補を適用する工程；
f．該癌細胞の生存率を測定する工程；ならびに
g．測定された該癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程
を含み、ただし、該構築物の少なくとも1種の構成要素がバイオプリンティングによって堆積したものである、前記方法。
【請求項１３】
前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a．表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；
b．一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；
c．該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程；および
d．該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
個体における乳癌に対する治療剤を同定する方法であって、該方法が、
a．複数の乳房間質細胞型を含む乳房間質バイオインクを調製する工程；
b．該個体由来の原発性乳癌細胞を含む乳房腫瘍バイオインクを調製する工程；
c．該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；
d．細胞を密着させて三次元の人工的な乳癌腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程；
e．該乳癌腫瘍モデルに治療剤候補を適用する工程；
f．該乳癌細胞の生存率を測定する工程；ならびに
g．測定された該乳癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程
を含み、ただし、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクがバイオプリンティングによって堆積したものである、前記方法。
【請求項１８】
前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a．表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；
b．一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；
c．該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程；および
d．該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイであって、各乳癌モデルが、
a．ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、間質組織；ならびに
b．乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、腫瘍組織
を含み、ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイ。
【請求項２２】
各乳癌モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項21に記載のアレイ。
【請求項２３】
各乳癌モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項21に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記乳癌細胞が、患者の腫瘍由来の原発性癌細胞である、請求項21に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を間質組織によって完全に囲まれている、請求項21に記載のアレイ。
【請求項２６】
a．間質組織；および
b．腫瘍組織
を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、該三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており；
ただし、該間質組織が、分化シグナルに曝露されたヒト前駆脂肪細胞を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものである、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデル。
【請求項２７】
前記腫瘍組織が、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項1に記載の腫瘍モデル。
【請求項２８】
前記腫瘍組織が、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項2に記載の腫瘍モデル。
【請求項２９】
あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項1に記載の腫瘍モデル。
【請求項３０】
前記間質組織が、
a．内皮細胞、
b．線維芽細胞、ならびに
c．脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方
を含む、請求項1に記載の腫瘍モデル。
【請求項３１】
前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項1に記載の腫瘍モデル。
【請求項３２】
前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項1に記載の腫瘍モデル。
【請求項３３】
a．間質組織；および
b．腫瘍組織
を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、該三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており；
ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであり；
ただし、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクがそれぞれ、細胞の密着前に該腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために利用される可逆的に架橋可能な押出化合物を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデル。
【請求項３４】
前記腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項8に記載の腫瘍モデル。
【請求項３５】
前記腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項9に記載の腫瘍モデル。
【請求項３６】
あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項8に記載の腫瘍モデル。
【請求項３７】
前記間質組織が、
a．内皮細胞、
b．線維芽細胞、ならびに
c．脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方
を含む、請求項8に記載の腫瘍モデル。
【請求項３８】
前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項8に記載の腫瘍モデル。
【請求項３９】
前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項8に記載の腫瘍モデル。
【請求項４０】
以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法：
a．ヒト前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程；
b．間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が該ヒト前駆脂肪細胞を含む、工程；
c．腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが1つの癌細胞型を含む、工程；
d．該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに
e．細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【請求項４１】
前記腫瘍組織が、全側面を間質組織によって囲まれる、請求項15に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍組織が、全側面を間質組織によって完全に囲まれる、請求項16に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項15に記載の方法。
【請求項４４】
前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍バイオインクが内皮細胞をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項４６】
前記間質バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質バイオインクが、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質バイオインクであり、かつ前記腫瘍バイオインクがヒト乳房腫瘍バイオインクである、請求項15に記載の方法。
【請求項５０】
以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法：
a．可逆的に架橋可能な押出化合物および複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；
b．可逆的に架橋可能な押出化合物および1つの癌細胞型を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；
c．該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；
d．細胞の密着前に該腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために、該押出化合物を架橋する工程；ならびに
e．該押出化合物を除去しかつ細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【請求項５１】
前記腫瘍組織が、全側面を前記間質組織によって囲まれる、請求項25に記載の方法。
【請求項５２】
前記腫瘍組織が、全側面を前記間質組織によって完全に囲まれる、請求項26に記載の方法。
【請求項５３】
前記バイオインクがバイオプリンティングによって堆積する、請求項25に記載の方法。
【請求項５４】
前記押出化合物がアルギネートを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項５５】
前記押出化合物が酵素消化によって除去可能である、請求項25に記載の方法。
【請求項５６】
細胞の密着後に、架橋された前記押出化合物を酵素分解によって除去する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
【請求項５７】
前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞または前駆脂肪細胞を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍バイオインクが内皮細胞をさらに含む、請求項25に記載の方法。
【請求項５９】
前記間質バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項６０】
前記腫瘍バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質バイオインクが、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質バイオインクであり、かつ前記腫瘍バイオインクがヒト乳房腫瘍バイオインクである、請求項25に記載の方法。
【請求項６３】
三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており；ただし、該間質組織が、分化シグナルに曝露されたヒト前駆脂肪細胞を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、前記アレイ。
【請求項６４】
前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項38に記載のアレイ。
【請求項６５】
前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項39に記載のアレイ。
【請求項６６】
各腫瘍モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項38に記載のアレイ。
【請求項６７】
各腫瘍モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項38に記載のアレイ。
【請求項６８】
前記間質組織が、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む、請求項38に記載のアレイ。
【請求項６９】
前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項38に記載のアレイ。
【請求項７０】
各腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項38に記載のアレイ。
【請求項７１】
三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており；ただし、該間質組織が、可逆的に架橋可能な押出化合物を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が、可逆的に架橋可能な押出化合物を含む腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、前記アレイ。
【請求項７２】
前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項46に記載のアレイ。
【請求項７３】
前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項47に記載のアレイ。
【請求項７４】
各腫瘍モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項46に記載のアレイ。
【請求項７５】
各腫瘍モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項46に記載のアレイ。
【請求項７６】
前記間質組織が、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む、請求項46に記載のアレイ。
【請求項７７】
前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項46に記載のアレイ。
【請求項７８】
各腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項46に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月4日に提出された米国特許出願第61/975,640号および2014年4月8日に提出された米国特許出願第61/976,895号の恩典を主張するものであり、これらはいずれもその全体が参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、米国における死亡原因の第2位であってそれを上回るのは心臓疾患のみであり、4人当たりほぼ1人の死亡に相当する。アメリカ人女性の8人中1人は、一生涯の間に乳癌を発症すると考えられる。アメリカがん協会（American Cancer Society）は、2014年中に米国内の女性で232,670件の浸潤性乳癌の新たな症例が診断されるであろうと見積もっており；男性では約2,360件の新たな症例が予想されている。標的化された安全な乳癌治療法（特に難治性疾患）について緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
癌細胞と、その周辺の、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および免疫細胞から構成される間質細胞との間の相互作用は、癌の発生、進行、および転移において重大な役割を果たす。間質細胞は、細胞シグナル伝達を調節し、癌細胞に対する構造を支持する役割を果たし、かつ血管新生および遠位標的組織への転移に影響する。そのため、間質細胞は、癌治療の効力に影響する。例えば、乳癌の発生および進行をより正確にモデル化し、標的化された治療法をより効率的に規定するために、三次元の組織微小環境に取り組まなければならない。線維芽細胞、内皮細胞、および脂肪細胞から構成される乳房間質は、発癌および転移の過程において主要な役割を果たす。これらの細胞型は、治療剤がどのように癌細胞に接近して癌細胞を標的とするかに影響を及ぼす細胞外マトリックス、増殖因子、およびホルモンを分泌する。
【０００４】
二次元の癌細胞株培養は、抗癌剤を試験するためのモデルとしていくつかの不足を抱えている。第一に、現在の二次元癌モデルは、疾患の発生および進行を正確にモデル化することができない。第二に、現在の二次元癌モデルは、生理学的に関連する間質環境を提供することができない。結果として、現在の二次元癌モデルは、抗癌治療剤に対する天然様応答を充分には示さない。例えば、二次元の細胞培養モデルは、典型的に、臨床的観察と比べて、治療剤に対して過度の応答を示す。
【０００５】
さらに、多くの関連組織の天然間質は、脂肪細胞を含む。多くの場合、生理学的に関連する間質環境を有する天然様腫瘍疾患モデルは、生存可能な脂肪細胞を含む。既存の組織製造方法は、生存可能な脂肪細胞を含む人工的な組織を産生し得る充分な能力を欠いている。分化した脂肪細胞は脆弱であり、かつ以前の技術は、これらの重要な間質細胞を、それらに損傷を与えるまたは破壊することなく堆積させることができない。
【０００６】
二次元細胞株および三次元動物モデルの使用の間の隔たりを埋めることを含む、効率的な薬物開発までのハードルを乗り越えるための、前臨床腫瘍学モデルの改善についての満たされていない必要性が存在する。具体的には、標的化された治療剤のより正確かつ効率的なスクリーニング、およびより早期の検出のための新たな画像診断法の開発を可能にする、乳癌を含む癌の進行に生理学的に関連する複数の細胞型を組み入れたモデルシステムの開発についての満たされていない必要性が存在する。本開示の目的には、（1）標的化された癌治療法をスクリーニングするおよび新たなイメージング剤を開発する目的のための、ヒト癌細胞が、線維芽細胞、脂肪細胞、および内皮細胞を含む間質細胞によって囲まれている発明を提示すること；ならびに（2）標的化された癌治療法をスクリーニングするおよび新たなイメージング剤を開発する目的のための、正常上皮から生じるヒト乳癌細胞が、線維芽細胞、脂肪細胞、および内皮細胞を含む間質細胞によって囲まれている発明を提示することが含まれる。
【０００７】
本明細書において開示される腫瘍疾患モデルは、組織微小環境における癌細胞ならびに種々の細胞型に対する小分子の効果を同時に測定し得る能力を含む、現在のスクリーニングツールを上回るいくつかの利点を有する。本明細書において開示されるバイオプリントされた新生組織（neotissue）についての組織形態学的解析により、それらは、培養下で少なくとも14日間安定でありかつ生存可能であり、脂肪、間質、および上皮構成要素の明確な区画化を特徴とすることが示された。バイオプリンティングプロセス中に、三次元組織デザインの構成要素として内皮細胞を用いて、堅牢な微小血管網が創出された。
【０００８】
一局面において、間質組織および腫瘍組織を含む三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み；該腫瘍組織が、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれており；ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであるか、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がそれぞれのバイオインクからバイオプリントされたものである、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが、本明細書において開示される。一部の態様において、前記モデルは、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない。一部の態様において、前記間質組織は、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む。さらなる態様において、前記間質組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍組織は癌細胞株の細胞を含む。他の態様において、前記腫瘍組織は、患者腫瘍由来の原発性癌細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍組織は内皮細胞を含む。さらなる態様において、前記腫瘍組織は、65〜85％の癌細胞および15％〜35％の内皮細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍モデルは、その最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、前記間質組織はヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織はヒト乳房腫瘍である。一部の態様において、前記腫瘍組織は、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を間質組織によって完全に囲まれている。
【０００９】
別の局面において、以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法が本明細書において開示される：押出化合物および複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；押出化合物および1つの癌細胞型を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；腫瘍バイオインクが間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で間質バイオインクと接触するように、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに、押出化合物を除去しかつ細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。一部の態様において、前記バイオインクはバイオプリンティングによって堆積する。一部の態様において、前記押出化合物はアルギネートを含む。一部の態様において、前記押出化合物は、酵素消化によって除去可能である。さらなる態様において、前記方法は、細胞の密着前に腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために、堆積したバイオインクを架橋する工程をさらに含む。なおさらなる態様において、前記方法は、細胞密着後に、架橋されたバイオインクを酵素分解によって除去する工程をさらに含む。一部の態様において、前記間質細胞型は、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞または前駆脂肪細胞を含む。さらなる態様において、前記間質バイオインクは、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記癌細胞型は癌細胞株を含む。他の態様において、前記癌細胞型は患者腫瘍由来の原発性癌細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍バイオインクは内皮細胞をさらに含む。一部の態様において、前記間質バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、前記細胞培養培地は、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む。一部の態様において、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程は、表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；該区画内に腫瘍バイオインクの節（node）を堆積させる工程；および該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程、をさらに含む。一部の態様において、前記腫瘍モデルは乳癌モデルである。
【００１０】
別の局面において、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、乳房間質組織；ならびに、乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を間質組織によって囲まれている、乳癌腫瘍組織；を含み、ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであるか、または該間質組織および該腫瘍組織がそれぞれのバイオインクからバイオプリントされたものである、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルが本明細書において開示される。一部の態様において、前記モデルは、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない。一部の態様において、乳房間質組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、乳癌細胞は乳癌細胞株に由来する。他の態様において、乳癌細胞は、患者腫瘍由来の原発性癌細胞である。一部の態様において、乳癌腫瘍組織は、65〜85％の癌細胞および15％〜35％の内皮細胞を含む。一部の態様において、乳癌モデルは、その最小寸法が250μm〜5mmである。一部の態様において、乳癌腫瘍組織は、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を乳房間質組織によって完全に囲まれている。
【００１１】
別の局面において、以下の工程を含む三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを製造する方法が本明細書において開示される：間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が押出化合物、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、工程；腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが押出化合物、乳癌細胞型、およびヒト内皮細胞を含む、工程；該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに、該押出化合物を除去しかつ該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。一部の態様において、バイオインクはバイオプリンティングによって堆積する。一部の態様において、押出化合物はアルギネートを含む。一部の態様において、押出化合物は、酵素消化によって除去可能である。さらなる態様において、前記方法は、細胞密着前に、乳癌モデルの構造の維持を容易にするために、堆積したバイオインクを架橋する工程をさらに含む。なおさらなる態様において、前記方法は、細胞密着後に、架橋されたバイオインクを酵素分解によって除去する工程をさらに含む。一部の態様において、間質バイオインクは、55％〜75％のヒト乳腺線維芽細胞、15％〜35％のヒト内皮細胞、および1％〜20％のヒト脂肪細胞を含む。一部の態様において、乳癌細胞型は乳癌細胞株を含む。他の態様において、癌細胞型は患者腫瘍由来の原発性乳癌細胞を含む。一部の態様において、間質バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、腫瘍バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、細胞培養培地は、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む。一部の態様において、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程は、表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程；および該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程、をさらに含む。一部の態様において、脂肪細胞は前駆脂肪細胞であり、かつ前記方法は、前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程をさらに含む。
【００１２】
別の局面において、以下の工程を含む、個体における癌に対する治療剤を同定する方法が本明細書において開示される：複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；個体由来の原発性癌細胞を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程；該構築物に治療剤候補を適用する工程；該癌細胞の生存率を測定する工程；ならびに測定された該癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程；ただし、該構築物の少なくとも1種の構成要素がバイオプリンティングによって堆積したものである。一部の態様において、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクはバイオプリンティングによって堆積する。一部の態様において、バイオインクは押出化合物をさらに含む。さらなる態様において、押出化合物は、酵素消化によって除去可能である。なおさらなる態様において、前記方法は、細胞密着前に、腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために、堆積したバイオインクを架橋する工程をさらに含む。さらにさらなる態様において、前記方法は、細胞密着後に、架橋されたバイオインクを酵素分解によって除去する工程をさらに含む。一部の態様において、間質細胞型は、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞または前駆脂肪細胞を含む。さらなる態様において、間質バイオインクは、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、腫瘍バイオインクは内皮細胞をさらに含む。一部の態様において、間質バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、腫瘍バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、細胞培養培地は、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む。一部の態様において、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程は、表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程；一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程；該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程；および該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程、をさらに含む。一部の態様において、三次元の人工的な生物学的構築物は乳癌構築物である。
【００１３】
別の局面において、生存可能な分化した脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的組織が本明細書において開示される。一部の態様において、前記組織はバイオプリントされたものである。一部の態様において、前記組織は、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない。一部の態様において、前記組織は、少なくとも5％の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。さらなる態様において、前記組織は、少なくとも10％の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記脂肪細胞の少なくとも50％は、製造後24時間生存可能である。さらなる態様において、前記脂肪細胞の少なくとも75％は、製造後24時間生存可能である。一部の態様において、前記脂肪細胞は、製造後少なくとも1週間レプチンを分泌する。一部の態様において、前記組織は脂肪組織である。一部の態様において、前記脂肪細胞は皮下脂肪細胞である。他の態様において、前記脂肪細胞は、前駆脂肪細胞または間葉系幹細胞に由来する。
【００１４】
別の局面において、以下の工程を含む、脂肪組織を含有する三次元の人工的な生物学的構築物を製造する方法が本明細書において開示される：前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程；前駆脂肪細胞および少なくとも1つの他の細胞型を含む前駆脂肪細胞バイオインクを調製する工程；表面上に該バイオインクを堆積させる工程；ならびに細胞を密着させて、生存可能な分化した脂肪細胞を含む三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。一部の態様において、前記バイオインクはバイオプリンティングによって堆積する。一部の態様において、前記構築物は、少なくとも5％の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。さらなる態様において、前記構築物は、少なくとも10％の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記脂肪細胞の少なくとも50％は、製造後24時間生存可能である。さらなる態様において、前記脂肪細胞の少なくとも75％は、製造後24時間生存可能である。一部の態様において、前記脂肪細胞は、製造後少なくとも1、2、3、4、5、6、または7日間レプチンを分泌する。一部の態様において、前記脂肪細胞は、製造後少なくとも1、2、または3週間レプチンを分泌する。一部の態様において、前記構築物は脂肪組織である。一部の態様において、前記前駆脂肪細胞は皮下前駆脂肪細胞である。
【００１５】
別の局面において、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的乳房組織であって；ただし、該細胞が、バイオインクからバイオプリントされ、かつ密着して三次元の人工的な生物学的乳房組織を形成しており；ただし、該組織が、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、三次元の人工的な生物学的乳房組織が本明細書において開示される。一部の態様において、前記組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記組織は、その最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、前記組織を、疾患を引き起こす作用物質に曝露して、乳房組織疾患モデルを創出する。さらなる態様において、前記疾患を引き起こす作用物質は、ウイルス、細菌、化学的化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１６】
別の局面において、以下の工程を含む三次元の人工的な生物学的乳房組織を製造する方法が本明細書において開示される：ヒト前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程；バイオインクを調製する工程であって、該バイオインクが複数の乳房細胞型を含み、該乳房細胞型がヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト前駆脂肪細胞を含む、工程；生体適合性表面上に該バイオインクを堆積させる工程；ならびに該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳房組織を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。一部の態様において、前記バイオインクはバイオプリンティングによって堆積する。一部の態様において、前記バイオインクは、55％〜75％のヒト乳腺線維芽細胞、15％〜35％のヒト内皮細胞、および1％〜20％のヒト前駆脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約3億個の細胞を含む。一部の態様において、前記細胞培養培地は、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、および脂肪細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む。一部の態様において、前記方法は、三次元の人工的な生物学的乳房組織を、疾患を引き起こす作用物質に曝露して、乳房組織疾患モデルを創出する工程をさらに含む。さらなる態様において、前記疾患を引き起こす作用物質は、ウイルス、細菌、化学的化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１７】
別の局面において、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれており；ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイが本明細書において開示される。一部の態様において、各腫瘍モデルは、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない。一部の態様において、各腫瘍モデルは、マルチウェルプレートのウェル内にある。一部の態様において、前記間質組織は、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む。一部の態様において、前記間質組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍組織は、患者腫瘍由来の原発性癌細胞を含む。一部の態様において、前記腫瘍組織は内皮細胞を含む。さらなる態様において、前記腫瘍組織は、65〜85％の癌細胞および15％〜35％の内皮細胞を含む。一部の態様において、各腫瘍モデルは、その最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、前記間質組織はヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織はヒト乳房腫瘍である。一部の態様において、前記腫瘍組織は、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている。
【００１８】
別の局面において、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイであって、各乳癌モデルは、間質組織であって、該間質組織がヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、間質組織；ならびに腫瘍組織であって、該腫瘍組織が乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、該腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、腫瘍組織、を含み、ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイが本明細書において開示される。一部の態様において、各乳癌モデルは、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない。一部の態様において、各乳癌モデルは、マルチウェルプレートのウェル内にある。一部の態様において、前記間質組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。一部の態様において、前記乳癌細胞は、患者腫瘍由来の原発性癌細胞である。一部の態様において、前記腫瘍組織は、65〜85％の癌細胞および15％〜35％の内皮細胞を含む。一部の態様において、各乳癌モデルは、その最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、前記腫瘍組織は、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている。
【００１９】
別の局面において、ヒト癌細胞を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍組織であって；ただし、該細胞が密着して三次元の人工的な生物学的腫瘍組織を形成しており；ただし、該腫瘍組織が、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、三次元の人工的な生物学的腫瘍組織が本明細書において開示される。一部の態様において、前記腫瘍組織は、癌細胞バイオインクからバイオプリントされたものである。一部の態様において、前記腫瘍組織は、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、および免疫細胞のうちの1種または複数種をさらに含む。一部の態様において、前記腫瘍組織は、その最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、前記腫瘍組織は、前記細胞を形質転換するために発癌物質に曝されたものである。さらなる態様において、疾患を引き起こす作用物質は、ウイルス、細菌、化学的化合物、またはそれらの組み合わせを含む。一部の態様において、細胞の製造後かつ細胞を密着させて腫瘍組織を形成させる前に、腫瘍組織を物理的に安定化させるために、架橋可能な押出化合物が用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本特許または本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含有する。カラーの図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、要求および必要な料金の支払いがあれば、庁によって提供されるであろう。
【００２１】
【図１】バイオプリントされた乳房組織構築物（この場合は、上皮細胞の内側領域が、線維芽細胞、内皮細胞、および骨髄由来間葉系幹細胞の外側領域によって囲まれている、実質的に6層状の立方体である構築物）の構築を示した概略図の非限定的な例を示している。
【図２】図1の構築物についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）染色された標本を示す顕微鏡写真）を示している。
【図３Ａ】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヒト乳腺線維芽細胞を可視化するためにビメンチン（緑色）およびTE7に対する抗体によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図３Ｂ】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヒト乳腺線維芽細胞を可視化するためにビメンチン（緑色）およびTE7に対する抗体によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図３Ｃ】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヒト乳腺線維芽細胞を可視化するためにビメンチン（緑色）およびTE7に対する抗体によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図３Ｄ】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヒト乳腺線維芽細胞を可視化するためにビメンチン（緑色）およびTE7に対する抗体によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図４】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、正常なヒト乳腺線維芽細胞およびヒト乳腺上皮細胞の相対的位置を可視化するために、ビメンチン（赤色）およびパンサイトケラチン（緑色）に対する抗体、ならびにDAPI（青色）によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図５】図1の構築物（製造後7日目）についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、正常なヒト乳腺線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞の相対的位置を可視化するために、ビメンチン（赤色）およびCD31（緑色）に対する抗体、ならびにDAPI（青色）によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図６】図1の構築物についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、マッソン・トリクローム染色によって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図７】バイオプリントされた乳房組織構築物の非限定的な例（概略および写真：この場合は、細長い一片のヒト乳腺上皮細胞を取り囲む、（製造後に脂肪細胞に分化する）骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞の境界を有する構築物であって、境界と細長い一片との間の空間は、正常なヒト乳腺線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞で充填されている）を示している。
【図８】図7の構築物についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）染色された標本を示す顕微鏡写真）を示している。
【図９】図7の構築物についての非限定的な一連の代表的な顕微鏡写真（この場合は、内皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、および上皮細胞を可視化するために、CD31、ビメンチン、FABP4、およびパンサイトケラチンに対する抗体、ならびにDAPIによって染色された構築物を示す顕微鏡写真）を示している。
【図１０】バイオプリントされた乳癌腫瘍モデルの非限定的な例（概略および写真：この場合は、乳癌細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞を含む腫瘍組織中核部が、正常なヒト乳腺線維芽細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、および生存可能な脂肪細胞を形成するように分化させた皮下前駆脂肪細胞を含む間質組織によって全側面を取り囲まれている、腫瘍モデル）を示している。
【図１１】前分化した皮下前駆脂肪細胞の非限定的な例（この場合は、図10の腫瘍モデルの製造の3日前に脂肪細胞分化培地に曝露され、かつ脂質滴の早期形成を示している皮下前駆脂肪細胞）を示している。
【図１２】図10の腫瘍モデルによる経時的なレプチン分泌を示した折れ線グラフの非限定的な例を示しており、それは、バイオプリントされた構築物内での脂肪細胞の継続的な分化を示唆している。
【図１３】図10の腫瘍モデルの非限定的な例示的な顕微鏡写真（この場合は、バイオプリントされた区画化された構造の保持、および天然組織における観察結果を模倣する、薬物化合物の透過を示す顕微鏡写真）を示している。
【図１４】様々な薬物化合物および対照による処理後の、図10の腫瘍モデルの構築物の生存率を示した棒グラフの非限定的な例を示している。
【図１５】バイオプリントされた乳癌腫瘍モデルの非限定的な例（概略および写真：；この場合は、ヒト乳癌細胞の節が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む間質区画によって囲まれている、腫瘍モデル）を示している。
【図１６】図15の腫瘍モデルの非限定的な例示的な顕微鏡写真（この場合は、組織構造の組織学的解析および細胞型の相対的位置を示す顕微鏡写真であって、乳癌細胞は緑色に標識されている）を示している。
【図１７】図15の腫瘍モデルの非限定的な例示的な顕微鏡写真（この場合は、ECM、細胞型、間質区画、および微小脈管構造を含む組織構造の組織学的解析を示す顕微鏡写真）を示している。
【図１８】図15の腫瘍モデルによる経時的なレプチン分泌（製造後2日目〜製造後8日目）を示した棒グラフの非限定的な例を示しており、それは、バイオプリントされた構築物内での脂肪細胞の継続的な分化を示唆している。
【図１９】図15の腫瘍モデル3つについての2つの代謝アッセイを示した棒グラフの非限定的な例を示しており、両方の代謝アッセイは、構築物間のばらつきが低いことを示している。
【図２０】二次元の乳癌細胞培養と比較した、図15の腫瘍モデルについての薬物応答アッセイ（タモキシフェン）を示した棒グラフの非限定的な例を示している。
【図２１】MCF7細胞単独と比較した、化学療法用化合物による処理後の、図15の腫瘍モデルについての代謝活性を示した棒グラフの非限定的な例を示している。
【図２２】図15の腫瘍モデルの非限定的な例示的な顕微鏡写真（この場合は、シスプラチンによる処理後のアポトーシスについての査定を示す顕微鏡写真）を示している。
【図２３】バイオプリントされた脂肪組織の非限定的な例示的な顕微鏡写真（この場合は、脂質に対するオイルレッドO染色を示す顕微鏡写真）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
一部の態様において、本明細書において開示される腫瘍疾患モデルは、2つの主な部分である（1）ヒト乳腺線維芽細胞、内皮細胞、および骨髄由来間葉細胞または前駆脂肪細胞を含む間質区画；ならびに（2）ヒト乳腺上皮および/または乳房腺癌細胞を含む上皮区画、から構成される乳癌腫瘍モデルである。さらなる態様において、上皮/腺癌区画が全側面を間質区画によって囲まれるような方式で、Novogen Bioprinter（Organovo）を用いて細胞を堆積させる。なおさらなる態様において、構造体は、バイオインクまたは細胞（後に分解または除去されるハイドロゲルなどの支持用生体材料と混合されている）の、空間的に制御された堆積によって、創出される。
【００２３】
ある特定の態様において、間質組織および腫瘍組織を含む三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれており；ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものである、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がそれぞれのバイオインクからバイオプリントされたものである、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが本明細書に記載される。
【００２４】
ある特定の態様において、以下の工程を含む三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法も本明細書に記載される：押出化合物および複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；押出化合物および1つの癌細胞型を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに該押出化合物を除去しかつ該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【００２５】
ある特定の態様において、乳房間質組織であって、該間質組織がヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、乳房間質組織；ならびに乳癌腫瘍組織であって、該腫瘍組織が乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、該腫瘍組織が三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、乳癌腫瘍組織、を含み、ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであるか、または該間質組織および該腫瘍組織が、それぞれのバイオインクからバイオプリントされたものである、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルも本明細書に記載される。
【００２６】
ある特定の態様において、以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを製造する方法も本明細書に記載される：間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が押出化合物、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、工程；腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが押出化合物、乳癌細胞型、およびヒト内皮細胞を含む、工程；該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；ならびに、該押出化合物を除去しかつ該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【００２７】
ある特定の態様において、以下の工程を含む、個体における癌に対する治療剤を同定する方法も本明細書に記載される：複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程；個体由来の原発性癌細胞を含む腫瘍バイオインクを調製する工程；該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程；該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程；該構築物に治療剤候補を適用する工程；該癌細胞の生存率を測定する工程；ならびに測定された該癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程；ただし、該構築物の少なくとも1種の構成要素がバイオプリンティングによって堆積したものである。
【００２８】
ある特定の態様において、生存可能な分化した脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的組織も本明細書に記載される。
【００２９】
ある特定の態様において、以下の工程を含む、脂肪組織を含有する三次元の人工的な生物学的構築物を製造する方法も本明細書に記載される：前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程；該前駆脂肪細胞および少なくとも1つの他の細胞型を含む前駆脂肪細胞バイオインクを調製する工程；表面上に該バイオインクを堆積させる工程；ならびに、細胞を密着させて生存可能な分化した脂肪細胞を含む三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【００３０】
ある特定の態様において、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的乳房組織であって；ただし、該細胞が、バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ密着して三次元の人工的な生物学的乳房組織を形成しており；ただし、該組織が、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、三次元の人工的な生物学的乳房組織も本明細書に記載される。
【００３１】
ある特定の態様において、以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的乳房組織を製造する方法も本明細書に記載される：ヒト前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程；バイオインクを調製する工程であって、該バイオインクが複数の乳房細胞型を含み、該乳房細胞型が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、および該ヒト前駆脂肪細胞を含む、工程；生体適合性表面上に該バイオインクを堆積させる工程；ならびに、該細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳房組織を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。
【００３２】
ある特定の態様において、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれており；ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイも本明細書に記載される。
【００３３】
ある特定の態様において、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイであって、各乳癌モデルが、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、間質組織；ならびに腫瘍組織であって、該腫瘍組織が乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、該腫瘍組織が各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、腫瘍組織、を含み、ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたたものであり；ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイも本明細書に記載される。
【００３４】
ある特定の態様において、ヒト癌細胞を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍組織であって；ただし、該細胞が密着して三次元の人工的な生物学的腫瘍組織を形成しており；ただし、該腫瘍組織が、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、三次元の人工的な生物学的腫瘍組織も本明細書に記載される。
【００３５】
ある特定の定義
別段の定めのない限り、本明細書において用いられるすべての技術的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形の形態は、文脈上別段の明示がない限り、複数形の参照物を含む。本明細書における「または」への任意の言及は、別段の記載がない限り、「および/または」を包含することが意図される。
【００３６】
本明細書において使用するとき、「脂肪細胞」（「脂質細胞（lipocyte）」または「脂細胞（fat cell）としても知られる）とは、脂肪組織を主として構成する細胞を指し、それはエネルギーを脂として貯蔵することに特化している。
【００３７】
本明細書において使用するとき、「前駆脂肪細胞」とは、刺激されて脂肪細胞を形成し得る任意の細胞を指す。
【００３８】
本明細書において使用するとき、「間質」とは、生物学的な細胞、組織、または器官の結合性の支持構造を指す。
【００３９】
本明細書において使用するとき、「組織」とは、細胞の凝集体を意味する。
【００４０】
本明細書において使用するとき、「バイオインク」とは、バイオプリンティングにおいて使用するための、液体、半固体、または固体の組成物を意味する。一部の態様において、バイオインクは、細胞溶液、細胞凝集体、細胞を含むゲル、多細胞体、または組織を含む。一部の態様において、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞性材料をさらに含む。一部の態様において、バイオインクは押出化合物を含む。
【００４１】
本明細書において使用するとき、「バイオプリンティング」とは、自動化または半自動化されたコンピューター支援による三次元プロトタイピング装置（例えば、バイオプリンター）と適合する方法論による細胞（例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞凝集体、多細胞体など）の三次元の精確な堆積を利用することを意味する。
【００４２】
本明細書において使用するとき、「足場」とは、ポリマー足場および多孔質ハイドロゲルなどの合成足場、あらかじめ形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織などの非合成足場、ならびに人工的な組織の物理的構造に不可欠でありかつ該組織の損傷/破壊なしには該組織から除去され得ない他の任意のタイプのあらかじめ形成された足場を指す。さらなる態様において、脱細胞化組織による足場には、脱細胞化天然組織、または任意の様式で培養細胞によって生成された脱細胞化細胞材料；例えば、それらが生きている間に産生したECMを後に残して死滅したまたは脱細胞化された細胞層が含まれる。したがって、「足場なし」という用語は、使用の時点で、足場が人工的な組織の不可欠な部分ではなく、除去されている、または人工的な組織の不活性構成要素として残存していることを暗示することが意図される。「足場なし」は、「足場を含んでいない」および「あらかじめ形成された足場を含んでいない」と互換可能に用いられる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「アッセイ」とは、有機的または生物学的なサンプル（例えば、細胞凝集体、組織、器官、生物など）中の物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など）の存在または活性を試験するまたは測定するための手法を意味する。
【００４４】
バイオプリンティング
一部の態様において、人工的な組織、構築物、またはそれらのアレイの少なくとも1種の構成要素をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達装置（例えば、バイオプリンター）による、生体適合性支持表面（例えば、ハイドロゲルおよび/または多孔質膜から構成される）上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体（例えば、円柱、スフェロイド、リボンなど）を含む細胞、および任意で閉じ込め材料の、三次元の自動化されたコンピューター支援による堆積に基づく、迅速なプロトタイピング技術を利用する方法を用いて作製される。本明細書において使用するとき、一部の態様において、「人工的な」という用語は、組織または構築物を指すために用いられる場合、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞凝集体、およびそれらの層を、コンピュータースクリプトに従ったコンピューター支援装置（例えば、バイオプリンター）によって位置付けして、三次元構造体を形成させることを意味する。さらなる態様において、コンピュータースクリプトとは、例えば、実行可能命令を含む、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。なおさらなる態様において、三次元の組織構造体は、細胞または多細胞体のプリンティング後の融合を通じて形成され、それは、ある場合には、初期形態形成における自己組織化現象に類似している。
【００４５】
手作業による配置を含む、生体適合性表面上に細胞、細胞凝集体、および細胞含有材料を配置して三次元構造体を産生するいくつかの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの自動化されたコンピューター支援機械が有利である。この技術による、細胞、細胞凝集体、および細胞含有材料の送達の利点には、細胞、細胞凝集体、および/またはそれらの層と様々な組成物との計画されたまたはあらかじめ決定された配向またはパターンを呈する構築物を産生する、細胞または多細胞体の迅速で正確かつ再現可能な配置が含まれる。利点には、細胞損傷を最小限に抑えながら保証された高い細胞密度も含まれる。脂肪細胞は、剪断力および他の生体力学的ストレスによる損傷をとくに受けやすく；ゆえに、実施例2〜4で強調されるように、本明細書に記載されるバイオプリンティングプロセスは、バイオプリントされた組織における脂肪細胞の好ましい生存率によって強調されるように、代替技術を上回る際立った利点を提供する。
【００４６】
一部の態様において、バイオプリントする方法は、連続的かつ/または実質的に連続的である。連続的バイオプリンティング法の非限定的な例は、バイオインクの貯留槽につながれた分注チップ（例えば、シリンジ、針、毛細管など）を通じて、バイオプリンターからバイオインク（すなわち、細胞、賦形剤もしくは押出化合物と組み合わせた細胞、または細胞の凝集体）を分注することである。さらなる非限定的な態様において、連続的バイオプリンティング法は、機能単位の反復パターンでバイオインクを分注することである。様々な態様において、反復機能単位は、例えば円形、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な形状を含む任意の適切な形状を有し、それによって、個別のバイオインクおよび/または空の空間の空間的パターン形成によって達成される平面的形状を有する1つまたは複数の組織層がもたらされる。さらなる態様において、バイオプリントされる機能単位の反復パターンには層が含まれ、かつ複数の層を近接してバイオプリントして（例えば、積層して）、薄層状の人工的な組織を形成させる。様々な態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれを上回る数の層を近接してバイオプリントして（例えば、積層して）、人工的な組織を形成させる。さらなる態様において、薄層状の組織の1つまたは複数の層は、平面的形状も有する。
【００４７】
一部の態様において、連続的バイオプリンティングは、任意でシリンジ機構を用いて、バイオインクの大きな貯留槽からより大きな組織をプリントすることを容易にする。連続的バイオプリンティングは、押出化合物、ハイドロゲル、ポリマー、バイオインク、またはプリンティング後にその形を保持し得る任意のプリント可能な材料を用いて、空間的に規定された境界を一緒にプリントする好都合な方式でもあり；創出される境界は、任意で、1種または複数種のバイオインクのバイオプリンティングにより充填され、それによって、空間的に規定された平面的形状を有するモザイク組織が創出される。
【００４８】
一部の態様において、連続的バイオプリンティングにおける方法は、プリントの高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに対して最適化する工程および/またはバランスを取る工程を伴う。ある特定の場合には、堆積用のバイオプリンターのヘッド速度は3mm/sであり、最初の層についての分注の高さは0.5mmであり、後続の各層についての分注の高さを0.4mm増加させた。一部の態様において、分注の高さは、バイオプリンター分注チップの直径におよそ等しい。限定するものではないが、適切かつ/または最適な分注距離は、材料を平坦にすることも分注針に付着させることもない。様々な態様において、バイオプリンター分注チップは、その中の増分を含めて、約20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μmまたはそれを上回る長さの内径を有する。様々な態様において、バイオプリンターのバイオインク貯留槽は、その中の増分を含めて、約0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方センチメートルまたはそれを上回る大きさの容量を有する。ある場合には、ポンプ速度は、システム内で築き上げられた残圧が低い場合に適切かつ/または最適である。ある場合には、好ましいポンプ速度は、貯留槽の断面積と分注針の断面積との比率に依存し、当該比率が大きいほど必要なポンプ速度が低い。一部の態様において、適切かつ/または最適なプリント速度は、材料の機械的完全性に影響を及ぼすことなく、一様な線の堆積を可能にする。
【００４９】
本明細書において開示される本発明は、業務用の方法を含む。一部の態様において、本明細書において開示される技法および方法の速度および拡張性を利用して、インビトロアッセイなど、研究および開発のための細胞ベースのツールの作出において使用するための、人工的な乳房組織および/または腫瘍疾患モデルの産生のための産業用および/または商業用の設備を設計し、建設し、かつ操業する。さらなる態様において、人工的な組織および/またはモデル、ならびにそれらのアレイは、例えば生物学的アッセイおよびハイスループット薬物スクリーニングのための、細胞アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、組織アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、およびキットとして産生され、保管され、流通され、市場に出され、宣伝され、かつ販売される。他の態様において、人工的な組織および/またはモデル、ならびにそれらのアレイを産生しかつ利用して、生物学的アッセイおよび/または薬物スクリーニングをサービスとして行う。
【００５０】
バイオインク
ある特定の態様において、脂肪組織、乳房組織を含む三次元の生組織、腫瘍モデル、それらのアレイ、および細胞をバイオプリントする工程を含む方法が本明細書において開示される。一部の態様において、細胞は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させるまたは押し出すことによってバイオプリントされる。一部の態様において、「バイオインク」は、複数種の細胞を含む液体、半固体、または固体の組成物を含む。一部の態様において、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮物を含む。さらなる態様において、細胞溶液、懸濁液、または濃縮物は、液体または半固体の（例えば、粘性のある）キャリアおよび複数種の細胞を含む。なおさらなる態様において、キャリアは、適切な細胞栄養培地（本明細書に記載されるものなど）である。一部の態様において、バイオインクは、バイオプリンティング前に任意で多細胞凝集体へと密着する複数種の細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは複数種の細胞を含み、特定の平面状かつ/または薄層状の形状をもたらすようにバイオプリントされ；バイオインク内の個々の細胞の密着は、バイオプリンティングの前、間、および/または後に生じる。
【００５１】
一部の態様において、バイオインクは、複数種の細胞を一定体積で収集することによって産生され；細胞性構成要素は、総体積の少なくとも約30％かつ多くても約100％に相当する。一部の態様において、バイオインクは、半固体または固体の多細胞凝集体または多細胞体を含む。さらなる態様において、バイオインクは、（1）複数種の細胞または細胞凝集体と生体適合性の液体またはゲルとを、バイオインクをもたらすあらかじめ規定された比率で混合し、かつ（2）所望の細胞密度および粘度を有するバイオインクを産生するようにバイオインクを圧縮することによって産生される。一部の態様において、バイオインクを圧縮する工程は、遠心分離、タンジェンシャルフローろ過（「TFF」）、またはそれらの組み合わせによって達成される。
【００５２】
一部の態様において、本明細書において開示されるバイオインクは、体積あたりの細胞充実度（cellularity by volume）が高いこと、例えば高濃度の生細胞を特徴とする。さらなる態様において、バイオインクは、1ミリリットルの溶液あたり、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、またはそれを上回る数×100万個の細胞を含む。特定の態様において、バイオインクは、約5000万〜約3億個の細胞/mLを含む。一部の態様において、体積あたりの細胞充実度が高いバイオインクを用いて、高い細胞密度を有する人工的な組織および構築物をバイオプリントする。さらなる態様において、人工的な組織および構築物における細胞の割合は、少なくとも約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80パーセントまたはそれを上回る。
【００５３】
一部の態様において、バイオインクの圧縮は、押出可能な組成物をもたらし、多細胞凝集体または多細胞体の形成を可能にする。一部の態様において、「押出可能」とは、噴き出し口または開口部（例えば、1つまたは複数の穴または管）を（例えば、圧力をかけて）強引に通すことによって成形され得ることを意味する。一部の態様において、バイオインクの圧縮は、細胞を適切な密度まで増やすことにより生じる。バイオインクに必要な細胞密度は、用いられる細胞および産生される組織または器官によって異なる。
【００５４】
一部の態様において、バイオインクの細胞を密着および/または接着させる。一部の態様において、「密着させる」、「密着した」、および「密着」とは、細胞、多細胞凝集体、多細胞体、および/またはそれらの層に結合する細胞間接着特性を指す。さらなる態様において、前記用語は、「融合させる」、「融合した」、および「融合」と互換可能に用いられる。一部の態様において、バイオインクは、支持材料、細胞培養培地（または、その添加物）、細胞外マトリックス（または、その構成要素）、細胞接着剤、細胞死阻害剤、抗アポトーシス剤、抗酸化物質、押出化合物、およびそれらの組み合わせをさらに含む。
【００５５】
一部の態様において、バイオインクは癌細胞（例えば、腫瘍細胞）を含む。さらなる態様において、癌細胞は、1種または複数種の細胞株の細胞である。他の態様において、癌細胞は、患者の腫瘍に由来する原発性癌細胞である。一部の態様において、バイオインクは、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞および/または前駆脂肪細胞などの間質細胞を含む。
【００５６】
一部の態様において、バイオインクは、非プリンティング製造方法論に適したバイオゲルである。一部の態様において、バイオゲルは癌細胞（例えば、腫瘍細胞）を含む。さらなる態様において、癌細胞は、1種または複数種の細胞株の細胞である。他の態様において、癌細胞は、患者の腫瘍に由来する原発性癌細胞である。一部の態様において、バイオゲルは、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞および/または前駆脂肪細胞などの間質細胞を含む。
【００５７】
押出化合物
一部の態様において、バイオインクは押出化合物（すなわち、バイオインクの押出特性を改変する化合物）を含む。押出化合物の例には、ゲル、ハイドロゲル、ペプチドハイドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性ポリオール（例えば、プルロニックF-127またはPF-127）、熱応答性ポリマー、ヒアルロネート、アルギネート、細胞外マトリックス構成要素（および、それらの誘導体）、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己組織化ナノファイバーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。一部の態様において、押出化合物は、バイオプリンティングの後に、バイオプリントされた細胞の密着後に、またはバイオプリントされた構築物の成熟後に、物理的、化学的、または酵素的な手段によって除去される。
【００５８】
適切なハイドロゲルには、コラーゲン、ヒアルロネート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギネート、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものが含まれる。他の態様において、適切なハイドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、適切なハイドロゲルには、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびそのコポリマー、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせに由来するものが含まれる。様々な具体的な態様において、閉じ込め材料は、ハイドロゲル、NovoGel（登録商標）、アガロース、アルギネート、ゼラチン、マトリゲル（商標）、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドハイドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリレート（PEG-DA）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン、シルク、またはそれらの組み合わせより選択される。
【００５９】
一部の態様において、ハイドロゲルベースの押出化合物は、架橋可能なゲルである。さらなる態様において、架橋可能なゲルには、化学的手段によって架橋可能なものが含まれる。例えば、一部の態様において、適切なハイドロゲルには、アルギネートを含有する架橋可能なハイドロゲルが含まれる。様々な態様において、適切なハイドロゲルは、約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10パーセントまたはそれを上回る割合のアルギネートを含む。一部の態様において、バイオプリンティング後、細胞密着前に、バイオプリントされた構造を保存するために、構築物を、任意で、ハイドロゲルを化学的に架橋する作用物質（例えば、CaCl2溶液）とともにインキュベートする。さらに、一部の態様において、バイオプリントされた構築物を、任意で、ハイドロゲルを酵素分解するアルギネートリアーゼとともにインキュベートする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物を、任意で、ハイドロゲルを酵素分解する約0.2〜0.5mg/mlの濃度のアルギネートリアーゼとともにインキュベートする。
【００６０】
一部の態様において、適切なハイドロゲルにはゼラチンが含まれる。様々な態様において、適切なハイドロゲルは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20％またはそれを上回る割合のゼラチンを含む。
【００６１】
一部の態様において、押出化合物またはハイドロゲル中、ゼラチンの濃度は約5〜15％であり、かつアルギネートの濃度は約0.5〜5％である。特定の態様において、押出化合物またはハイドロゲル中、ゼラチンの濃度は10％であり、かつアルギネートの濃度は1％である。
【００６２】
一部の態様において、ハイドロゲルベースの押出化合物は、熱可逆性ゲル（熱応答性ゲルまたはサーモゲルとしても知られる）である。一部の態様において、適切な熱可逆性ハイドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な態様において、適切なハイドロゲルのゲル化温度（Tゲル）は、その中の増分を含めて、約10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃である。ある特定の態様において、適切なハイドロゲルのTゲルは、約10℃〜約40℃である。さらなる態様において、適切なハイドロゲルのTゲルは、約20℃〜約30℃である。一部の態様において、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ハイドロゲル、1つまたは複数の細胞型、および他の添加物などを含む）は、室温で液体ではない。一部の態様において、適切な熱可逆性ハイドロゲルは、哺乳類の体温で液体ではない。具体的な態様において、適切なハイドロゲルのゲル化温度（Tゲル）は、その中の増分を含めて、約22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、41℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃である。ある特定の態様において、適切なハイドロゲルのTゲルは、約22℃〜約52℃である。さらなる態様において、適切なハイドロゲルのTゲルは、約32℃〜約42℃である。一部の態様において、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ハイドロゲル、1つまたは複数の細胞型、および他の添加物などを含む）は、哺乳類の体温で液体ではない。具体的な態様において、本明細書に記載されるバイオインクのゲル化温度（Tゲル）は、その中の増分を含めて、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃である。
【００６３】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンから構成されるポリマーは、水溶液中に組み入れられた場合に熱可逆性ゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器において維持可能な温度で、液体状態からゲル状態に変化し得る能力を有する。液体状態からゲル状態への相転移は、ポリマー濃度および溶液中の成分に依存している。
【００６４】
一部の態様において、本明細書において提示されるハイドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段によって測定される。例えば、一部の態様において、LVDV-II+CPコーンプレート型粘度計およびコーンスピンドル型CPE-40を用いて、ハイドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出する。他の態様において、ブルックフィールド（スピンドル型およびカップ型）粘度計を用いて、ハイドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出する。一部の態様において、本明細書において言及される粘度範囲は、室温で測定される。他の態様において、本明細書において言及される粘度範囲は、体温で（例えば、健常なヒトの平均体温で）測定される。
【００６５】
さらなる態様において、ハイドロゲルおよび/またはバイオインクは、約500〜1,000,000センチポアズ、約750〜1,000,000センチポアズ、約1000〜1,000,000センチポアズ、約1000〜400,000センチポアズ、約2000〜100,000センチポアズ、約3000〜50,000センチポアズ、約4000〜25,000センチポアズ、約5000〜20,000センチポアズ、または約6000〜15,000センチポアズの粘度を有することを特徴とする。
【００６６】
一部の態様において、バイオインクの非細胞性構成要素（例えば、押出化合物など）は、使用前に除去される。さらなる態様において、非細胞性構成要素は、例えばハイドロゲル、ペプチドハイドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロネート、アルギネート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然もしくは合成のポリマーである。なおさらなる態様において、非細胞性構成要素は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって除去される。一部の態様において、使用の時点で、ある割合の非細胞性構成要素は、依然として細胞性構成要素と結び付いたままである。
【００６７】
あらかじめ形成された足場
一部の態様において、いかなるあらかじめ形成された足場をも含んでいないまたは実質的に含んでいない、人工的な組織および腫瘍モデルが本明細書において開示される。さらなる態様において、「足場」とは、ポリマー足場および多孔質ハイドロゲルなどの合成足場、あらかじめ形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織などの非合成足場、ならびに人工的な組織および/または器官の物理的構造に不可欠でありかつ該組織および/または器官から除去されない他の任意のタイプのあらかじめ形成された足場を指す。なおさらなる態様において、脱細胞化組織による足場には、脱細胞化天然組織、または任意の様式で培養細胞によって生成された脱細胞化細胞材料；例えば、それらが生きている間に産生したECMを後に残して死滅したまたは脱細胞化された細胞層が含まれる。
【００６８】
一部の態様において、人工的な組織および腫瘍モデル（そのアレイを含む）は、例えば、組織の形成、組織の任意の層の形成、または組織の形の形成のために、いかなるあらかじめ形成された足場をも利用しない。非限定的な例として、本開示の人工的な乳房組織および脂肪組織は、製造の時点または使用の時点で、いかなるあらかじめ形成されたポリマー足場などの合成足場、あらかじめ形成された細胞外マトリックス層、または他の任意のタイプのあらかじめ形成された足場をも利用しない。一部の態様において、人工的な乳房組織および脂肪組織は、いかなるあらかじめ形成された足場をも実質的に含んでいない。さらなる態様において、組織の細胞性構成要素は、検出可能であるが微量のまたはわずかな量の足場、例えば、組成物全体の2.0％未満、1.0％未満、0.5％未満、または0.1％未満の足場を含有する。なおさらなる態様において、微量のまたはわずかな量の足場は、組織もしくはそのアレイの長期にわたる挙動に影響を与えるには、またはその主たる生物学的機能に干渉するには不十分である。付加的な態様において、プリンティング後に、物理的、化学的、または酵素的な方法によって足場構成要素が除去され、足場構成要素を含んでいないまたは実質的に含んでいない人工的な組織が産出される。
【００６９】
アレイ
一部の態様において、人工的な乳房組織のアレイ、および人工的な腫瘍モデル（乳癌腫瘍モデルを含む）のアレイが本明細書において開示される。一部の態様において、「アレイ」とは、1つのサンプルに対して複数の試験が実施されるのを可能にする、複数のサンプルに対して1つまたは複数の試験が実施されるのを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された複数種の要素の関連付けを含む、科学的ツールである。一部の態様において、アレイは、ミディアムまたはハイスループットスクリーニングと関連するものを含む、スクリーニング方法および装置に適している、つまり適合している。さらなる態様において、アレイは、複数の試験が同時に実施されるのを可能にする。さらなる態様において、アレイは、複数のサンプルが同時に試験されるのを可能にする。一部の態様において、アレイは細胞マイクロアレイである。さらなる態様において、細胞マイクロアレイとは、固体支持体の表面上の生細胞の多重照合を可能にする実験ツールである。他の態様において、アレイは組織マイクロアレイである。さらなる態様において、組織マイクロアレイは、多数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的な解析の実施を可能にする、アレイにおいて組織化された複数の別個の組織または組織サンプルを含む。
【００７０】
一部の態様において、人工的な組織および/または腫瘍モデルはそれぞれ、生体適合性マルチウェル容器のウェル内に存在する。一部の態様において、各組織をウェル内に置く。他の態様において、各組織をウェル内にバイオプリントする。さらなる態様において、ウェルをコーティングする。様々なさらなる態様において、ウェルを、生体適合性ハイドロゲル、1種または複数種のタンパク質、1種または複数種の化学物質、1種または複数種のペプチド、1種または複数種の抗体、および1種または複数種の増殖因子のうちの1つまたは複数（それらの組み合わせを含む）でコーティングする。一部の態様において、ウェルをNovoGel（登録商標）でコーティングする。他の態様において、ウェルをアガロースでコーティングする。一部の態様において、各組織は、生体適合性マルチウェル容器のウェル内の、多孔質の生体適合性の膜上に存在する。一部の態様において、マルチウェル容器の各ウェルは、2種以上の組織を含有する。
【００７１】
一部の態様において、人工的な組織および/または腫瘍モデルを、1つまたは複数の側面で生体適合性表面に固着させる。多くの方法が、組織を生体適合性表面に固着させるのに適している。様々な態様において、組織を、例えば1つもしくは複数の側面全体に沿って、1つもしくは複数の側面の端のみで、または1つもしくは複数の側面の中心のみで、生体適合性表面に適切に固着させる。様々なさらなる態様において、ホルダーまたはキャリアが表面に組み込まれたまたは表面と結び付けられた生体適合性表面に、組織を適切に固着させる。様々なさらなる態様において、1つまたは複数の締め付けクランプまたはプラスチックの小突起が表面に組み込まれたまたは表面と結び付けられた生体適合性表面に、組織を適切に固着させる。一部の態様において、多孔質膜への細胞接着によって、生体適合性表面に組織を適切に固着させる。一部の態様において、人工的な組織および/または腫瘍モデルは、1つまたは複数の側面での生体適合性表面への固定によってアレイ構成で保たれる。さらなる態様において、組織を、1、2、3、4つまたはそれを上回る数の側面で、生体適合性表面に固定する。一部の態様において、生体適合性表面とは、組織または組織と接触する生物に傷害または毒性の重大なリスクをもたらさない任意の表面である。さらなる態様において、生体適合性表面とは、従来の組織培養法に適した任意の表面である。適切な生体適合性表面には、非限定的な例として、処理されたプラスチック、膜、多孔質膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、処理されたガラス、およびコーティングされたガラスが含まれ、適切なコーティングには、ハイドロゲル、ECM構成要素、化学物質、タンパク質などが含まれ、かつコーティングまたは処理は、生体適合性表面への細胞および組織の接着を刺激するまたは阻止する手段を提供する。
【００７２】
一部の態様において、人工的な組織および/または腫瘍モデルのアレイは、2種以上の要素の関連付けを含む。様々な態様において、アレイは、その中の増分を含めて、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、または500種の要素の関連付けを含む。さらなる態様において、各要素は、1種もしくは複数種の細胞、多細胞凝集体、組織、腫瘍モデル、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７３】
一部の態様において、人工的な組織モデルおよび/または腫瘍モデルのアレイは、あらかじめ規定されたパターンで空間的に配置された多数の要素を含む。さらなる態様において、パターンとは、要素の任意の適切な空間的配置である。様々な態様において、配置のパターンには、非限定的な例として、二次元格子、三次元格子、1つまたは複数の直線、円弧、または円形、一連の行または列などが含まれる。さらなる態様において、パターンは、ミディアムまたはハイスループットの生物学的アッセイまたはスクリーニング方法または装置との適合性に対して選定される。
【００７４】
様々な態様において、アレイにおいて1種または複数種の組織または腫瘍モデルを製造するために用いられる細胞型および/または細胞の供給源は、具体的な研究の目標または目的に基づいて選択される。さらなる様々な態様において、アレイにおける特定の組織または腫瘍モデルは、具体的な研究の目標または目的に基づいて選択される。一部の態様において、特定の疾患または病状についての検討を容易にする、1種または複数種の特定のな人工組織がアレイに含まれる。一部の態様において、特定の対象の疾患または病状についての検討を容易にする、1種または複数種の特定の人工組織がアレイに含まれる。さらなる態様において、アレイ内の1種または複数種の特定の人工組織は、2人以上の個別のヒトドナーに由来する1つまたは複数の細胞型を用いて生成される。一部の態様において、アレイ内の各組織は、細胞型、細胞の供給源、細胞の層、細胞の比率、構築の方法、サイズ、形などに関して実質的に類似している。他の態様において、アレイ内の組織のうちの1種または複数種は、細胞型、細胞の供給源、細胞の層、細胞の比率、構築の方法、サイズ、形などに関して特有である。
【００７５】
一部の態様において、アレイ内の各組織および/または腫瘍モデルは、培養下で独立して維持される。さらなる態様において、アレイ内の各組織の培養条件は、それらが他の組織から単離され、かつ培地または培地中で可溶な因子を交換し得ないようなものである。他の態様において、アレイ内の2種以上の個々の組織は、可溶性因子を交換する。さらなる態様において、アレイ内の2種以上の個々の組織の培養条件は、それらが、他の組織と培地および培地中で可溶な因子を交換するようなものである。様々な態様において、その中の増分を含めて、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300種またはそれを上回る種類は、培地および/または可溶性因子を交換する。他の様々な態様において、その中の増分を含めて、アレイ内の組織のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％は、培地および/または可溶性因子を交換する。
【００７６】
人工的な乳房組織
一部の態様において、乳房細胞を含む、三次元の人工的な生物学的乳房組織が本明細書に記載される。多くの乳房細胞は、人工的な乳房組織に包含されるのに適している。例えば、様々な態様において、人工的な乳房組織は、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。様々な態様において、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。さらなる態様において、人工的な乳房組織は、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。なおさらなる態様において、人工的な乳房組織は、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞のそれぞれを適切に含む。
【００７７】
一部の態様において、ヒト内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞である。一部の態様において、脂肪細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞を含む間葉系幹細胞などの前駆体細胞に由来する。さらなる態様において、脂肪細胞は、前駆脂肪細胞などの前駆体細胞に由来する。そのような場合、脂肪細胞前駆体細胞を、バイオインクの調製に使用する前またはバイオプリンティングに使用する前に、分化シグナルに曝露する。さらなる態様において、脂肪細胞前駆体細胞を、バイオインクの調製に使用する前またはバイオプリンティングに使用する前に、細胞を部分的に前分化させる（pre-differentiate）分化シグナルに曝露する。なおさらなる態様において、脂肪細胞前駆体細胞または前駆脂肪細胞は、バイオプリンティング後に分化を完了する。一部の態様において、ヒト脂肪細胞はヒト皮下脂肪細胞である。
【００７８】
本発明者らは、驚くべきことに、生存可能な分化した脂肪細胞が天然様の人工的な乳房組織の鍵であることを発見した。ある場合には、これらの細胞が組織の間質に存在しないと、組織は発育せずに崩壊し、結果として生じる微小構造は天然組織を再生（recapitulate）しない。本発明者らは、分化した脂肪細胞は脆弱すぎて既存の組織製造法に伴う圧迫および剪断力には耐えられないため、既存の組織製造法は分化した脂肪細胞の堆積には適していないことも認識した。本明細書に記載される対象物は、これらの問題の両方に対する解決策を提供する。
【００７９】
一部の態様において、細胞をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた細胞は密着して、人工的な乳房組織を形成する。なおさらなる態様において、人工的な乳房組織は、製造の時点または使用の時点で、あらかじめ形成された足場を含んでいないまたは実質的に含んでいない。一部の態様において、人工的な乳房組織には神経分布がない。さらなる態様において、人工的な乳房組織は、インタクトな神経系および/または成熟した神経組織を欠いている。一部の態様において、人工的な乳房組織は、インタクトな血管系および/または成熟した脈管構造を欠いている。さらなる態様において、人工的な乳房組織は、赤血球を含んでいない。
【００８０】
多くの細胞組成および比率が、人工的な乳房組織に適している。一部の態様において、人工的な乳房組織は、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および1％〜20％の脂肪細胞を含む。特定の態様において、人工的な乳房組織は、65％の線維芽細胞、25％の内皮細胞、および10％の脂肪細胞を含む。別の特定の態様において、人工的な乳房組織は、65％の線維芽細胞、25％の内皮細胞、および10％の脂肪細胞を含む。
【００８１】
多くの形およびサイズが、人工的な乳房組織に適している。例として、一態様において、人工的な乳房組織は、シートの形態でバイオプリントされる。さらなる例として、他の態様において、人工的な乳房組織は、立方体またはブロックの形態でバイオプリントされる。さらなる例として、別の態様において、人工的な乳房組織は、球体の形態でバイオプリントされる。最後に、他の態様において、人工的な乳房組織は、円柱またはリボンの形態でバイオプリントされる。一部の態様において、人工的な乳房組織は、それらの最小寸法が約250μm〜約5mmである。一部の態様において、人工的な乳房組織は、それらの最大寸法が約250μm〜約5mmである。特定の態様において、人工的な乳房組織は、各側面で2または3mmである立方体の形態でバイオプリントされる。そのような態様において、組織は、細胞培養条件における成熟の期間の後、球体を形成する。
【００８２】
一部の態様において、薬物スクリーニングアッセイ、薬物発見アッセイ、薬物安全性および毒性アッセイ、薬物効力アッセイなど、ミディアムまたはハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的乳房組織のアレイも本明細書に記載される。一部の態様において、前記アレイは、人工的な乳房組織の格子が形成されるように該組織をマルチウェルプレートの各ウェル内に堆積させることによって創出される。
【００８３】
本明細書において開示される人工的な乳房組織を製造する方法は、バイオプリントする工程を含む。一部の態様において、前記方法は、脂肪細胞前駆体細胞（間葉系幹細胞、前駆脂肪細胞など）に、それらが実質的な損傷なしで堆積し得、かつ後に脂肪細胞に完全に分化し得るような脂肪細胞分化シグナルを提供する工程を含む。
【００８４】
続いて、一部の態様において、前記方法は、押出化合物（ハイドロゲルなど）ならびに乳房細胞型（ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、および脂肪細胞分化シグナルに曝露されたヒト前駆脂肪細胞など）を含むバイオインクを調製する工程を含む。特定の態様において、前記バイオインクは、例えば55％〜75％のヒト乳腺線維芽細胞、15％〜35％のヒト内皮細胞、および1％〜20％のヒト前駆脂肪細胞を含む。さらなる態様において、前記バイオインクは、1mLあたり約5000万個〜約4億個の細胞を含む。
【００８５】
さらに、一部の態様において、前記方法は、バイオプリンターなどの自動化または半自動化された堆積装置によって生体適合性表面上にバイオインクを堆積させる工程を含む。一部の態様において、人工的な乳房組織の1種または複数種の構成要素をバイオプリントする。他の態様において、人工的な乳房組織の各構成要素をバイオプリントする。特定の態様において、人工的な乳房組織をバイオプリンティングによって層ごとに築き上げて、三次元構造体を形成させる。
【００８６】
なおさらに、一部の態様において、前記方法は、細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳房組織を形成させるために、堆積したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。一部の態様において、細胞培養培地はバイオインクのハイドロゲルを除去し、実質的に細胞性構築物が残る。一部の態様において、細胞培養培地は、バイオインクに含まれる細胞型に適した培地の混合物を含む。例えば、特定の態様において、細胞培養培地は、ヒト線維芽細胞培地、ヒト内皮細胞培地、およびヒト脂肪細胞分化培地を含む。
【００８７】
本明細書に記載される人工的な乳房組織は、多くの有利な用途を有する。例えば、任意で、人工的な乳房組織内に癌細胞を導入して、乳癌腫瘍モデルを形成させる。さらなる例として、任意で、人工的な乳房組織に発癌性作用物質を適用して発生事象をもたらし、乳癌モデルを作出する。なおさらなる例として、罹患した乳房組織を製造して、罹患した乳癌モデルを作出する。さらに、この例では、罹患した乳房組織を、任意で、1種もしくは複数種のウイルス（ウイルス負荷になるように）または1種もしくは複数種の細菌（細菌負荷になるように）などの病原体に曝露する。そのような構築物は、腫瘍学の分野における研究、および癌の治療法の検討に有用である。
【００８８】
人工的な腫瘍モデル
一部の態様において、間質組織および腫瘍組織を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが本明細書に記載される。一部の態様において、間質組織は間質細胞を含む。一部の態様において、腫瘍組織は癌細胞を含む。本明細書に記載される人工的な腫瘍モデルは、区画化された構造を有する。例えば、一部の態様において、腫瘍モデルの間質組織は、腫瘍組織を取り囲む。さらなる態様において、腫瘍モデルの間質組織は、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上の側面で腫瘍組織を取り囲む。なおさらなる態様において、腫瘍モデルの間質組織は、腫瘍組織が間質組織に埋め込まれて人工的な腫瘍モデルを形成するように、腫瘍組織を完全に取り囲む。
【００８９】
多くの間質細胞は、人工的な腫瘍モデルに包含されるのに適している。例えば、様々な態様において、人工的な腫瘍モデルは、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、およびマクロファージなどの免疫細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。様々な態様において、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。多くの癌細胞は、人工的な腫瘍モデルに包含されるのに適している。例えば、様々な態様において、人工的な腫瘍モデルは、癌細胞株、および患者腫瘍から切除された原発性癌細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。一部の態様において、腫瘍組織は、内皮細胞、および/またはマクロファージなどの免疫細胞をさらに含む。
【００９０】
一部の態様において、細胞をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた間質細胞は密着して、人工的な間質組織を形成する。さらなる態様において、バイオプリントされた癌細胞は密着して、人工的な腫瘍組織を形成する。なおさらなる態様において、間質組織および腫瘍組織は密着して、人工的な腫瘍モデルを形成する。一部の態様において、人工的な腫瘍モデルは、製造の時点または使用の時点で、あらかじめ形成された足場を含んでいないまたは実質的に含んでいない。一部の態様において、人工的な腫瘍モデルには神経分布がない。さらなる態様において、人工的な腫瘍モデルは、インタクトな神経系および/または成熟した神経組織を欠いている。一部の態様において、人工的な腫瘍モデルは、インタクトな血管系および/または成熟した脈管構造を欠いている。さらなる態様において、人工的な乳房組織は、赤血球を含んでいない。
【００９１】
一部の態様において、薬物スクリーニングアッセイ、薬物発見アッセイ、薬物安全性および毒性アッセイ、薬物効力アッセイなど、ミディアムまたはハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイも本明細書に記載される。一部の態様において、アレイは、人工的な腫瘍モデルの格子が形成されるように該腫瘍モデルをマルチウェルプレートの各ウェル内に堆積させることによって創出される。
【００９２】
一部の態様において、腫瘍モデルは乳癌腫瘍モデルである。例えば、そのような態様において、間質組織は、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む。一部の態様において、間質組織はヒト乳腺上皮細胞をさらに含む。一部の態様において、間質組織は、マクロファージなどの免疫細胞をさらに含む。一部の態様において、ヒト内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞である。一部の態様において、ヒト内皮細胞はヒト乳腺内皮細胞である。一部の態様において、脂肪細胞は、皮下脂肪細胞、または間葉系幹細胞および/もしくは前駆脂肪細胞などの脂肪細胞前駆体に由来する脂肪細胞である。さらに、そのような態様において、腫瘍組織は乳癌細胞を含む。一部の態様において、乳癌細胞は乳癌細胞株の細胞である。他の態様において、乳癌細胞は、切除された患者腫瘍に由来する細胞である。一部の態様において、腫瘍組織は、内皮細胞、および/またはマクロファージなどの免疫細胞をさらに含む。
【００９３】
身体における多数の組織は、特徴的な「腺」または「分泌」の構造および機能を有し、組織内の特化した上皮細胞は、他の細胞および組織に対して局所的かつ/または全身的な作用を発揮するホルモン、タンパク質、酵素、または物質を産生する。分泌組織は、産生される物質が、典型的に、身体の外側へ、または相互接続された管系を通じて一方の場所からもう一方へ運ばれる外分泌腺であり得る。ここでの例には、膵外分泌腺による消化酵素の産生、エクリン汗腺による汗、および皮脂腺による油が含まれるであろう。分泌組織は、膵内分泌腺、卵巣、精巣、甲状腺、下垂体、および副腎を含む、身体のホルモン産生組織である内分泌腺でもあり得る。
【００９４】
内分泌組織には、以下の特質が存在しているという点において、共通の構造「テーマ」が存在する。特化した上皮細胞は、凝集体内、または内腔を有する空洞構造体内に共局在し、これらの細胞は、1つまたは複数のメカニズムによって調節物質または排泄物質を分泌し、上皮細胞の共会合は、上皮細胞の相対的割合が他の細胞型の相対的割合よりも大きい「区画」を形成する。上皮細胞の区画は、支持間質によって囲まれる。間質の組成は組織型に応じて異なり得る。最小限に、組織間質は、典型的にいくらかの血管細胞および線維芽細胞を含有する。一部の組織において、支持間質は、平滑筋細胞、高度に特化した間葉細胞、神経細胞、免疫細胞、リンパ細胞、および/または脂肪細胞も含み得る。間質の特定の細胞性構成要素も、線維性間質、筋間質、線維性血管間質、または脂肪組織の個別のエリアが存在し得るという点において、区画化され得る。上皮細胞含有腫瘍は、しばしば、上記で記載されるものと類似した空間的体系化パターンを呈し、腺癌、管癌腫、奇形腫、および肝芽腫はすべて、間質および上皮の特徴的な区画化パターンを所有し得る腫瘍型の例である。同様に、区画化された分泌組織において形成される腫瘍は、典型的に、体系化の区画化されたパターンを有し、正常組織に固有の間質および上皮パターンは何らかの様式で妨害され、正常組織と比較して、上皮:間質の全体的比率の全面的乱れによる、全体的組織パターンの推移を引き起こす。したがって、一部の態様において、腫瘍モデルは、「腺」または「分泌」組織癌腫瘍モデルである。
【００９５】
本明細書において開示される人工的な腫瘍モデルを製造する方法は、バイオプリントする工程を含む。一部の態様において、前記方法は、ハイドロゲルなどの押出化合物および複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程を含む。さらなる態様において、間質細胞型には、例えば内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および/もしくは脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞と前駆脂肪細胞との組み合わせが含まれる。前駆脂肪細胞の場合、細胞を分化シグナルにあらかじめ曝露する。一部の態様において、前記方法は、ハイドロゲルおよび1つの癌細胞型を含む腫瘍バイオインクを調製する工程も含む。一部の態様において、癌細胞型は癌細胞株である。他の態様において、癌細胞は、切除された患者腫瘍、つまり患者腫瘍の生検に由来する原発性癌細胞である。一部の態様において、腫瘍バイオインクは、内皮細胞、および/またはマクロファージなどの免疫細胞をさらに含む。
【００９６】
続いて、一部の態様において、前記方法は、腫瘍バイオインクが間質バイオインクによって囲まれかつ間質バイオインクと接触するように、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程を含む。さらなる態様において、腫瘍モデルの間質組織は、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上の側面で腫瘍組織を取り囲む。なおさらなる態様において、腫瘍バイオインクは、間質バイオインクによって完全に囲まれ、かつ全側面で間質バイオインクと接触している。一部の態様において、バイオインクの堆積は、バイオプリンターなどの自動化または半自動化された堆積装置によって達成される。
【００９７】
一部の態様において、人工的な腫瘍モデルをバイオプリンティングによって層ごとに築き上げて、三次元構造体を形成させる。さらなる態様において、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程は、間質バイオインクの第一のシートを形成させるために表面上に間質バイオインクの1つまたは複数の層を堆積させる工程；一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界の1つまたは複数の層を堆積させる工程；腫瘍バイオインクの節を形成させるために該区画内に腫瘍バイオインクの1つまたは複数の層を堆積させる工程；および、該区画の開いた側面を閉じるように間質バイオインクの第二のシートを形成させるために間質バイオインクの1つまたは複数の層を堆積させる工程、をさらに含む。
【００９８】
さらに、一部の態様において、前記方法は、細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。一部の態様において、細胞培養培地中での成熟は、ハイドロゲルを除去し、実質的に細胞性構築物が残る。
【００９９】
一部の態様において、ハイドロゲルは架橋可能または可逆的に架橋可能であり、かつ前記方法は、細胞密着前に、腫瘍モデルの構造の維持を容易にするために、堆積したバイオインクを架橋する工程を含む。さらなる態様において、前記方法は、細胞密着後に、架橋されたハイドロゲルを酵素分解によって除去する工程を含む。本発明者らは、本明細書に記載される腫瘍モデルの構造が、そのような架橋可能な押出化合物（例えば、ハイドロゲル）を用いて最良に達成され、それがないと、区画化された構造は、腫瘍モデルの融合前にしばしば喪失されることを発見した。
【０１００】
本明細書に記載される、乳癌腫瘍モデルを含む人工的な腫瘍モデルは、多くの有利な用途を有する。例えば、患者の腫瘍から切除された原発性癌細胞を利用して腫瘍組織を形成させて、その患者の疾患を検討するためにカスタマイズされたインビトロ腫瘍モデルを創出することができるであろう。任意で、そのような個人向け腫瘍モデルを用いて、潜在的治療法を評価し、かつ患者の疾患を治療するのに有効である化学療法用化合物および生物製剤などの治療法を同定する。そのような構築物は、腫瘍学の分野における研究、および癌の治療法の検討に有用である。
【０１０１】
乳腺腫瘍モデルをマルチウェルプレート内に直接製造し、かつそれを用いて、エストラジオール、プロゲスチン、プロラクチン、およびHGF、ならびに標準的な化学療法剤であるシスプラチン、パクリタキセル、メトトレキサート、およびタモキシフェンを含むシグナル仲介物質に対する生物学的応答プロファイルを確立した。新生組織内の特定の細胞型に対する化学療法薬物の効果を、蛍光による生/死アッセイおよび細胞毒性アッセイに加えて、細胞型特異的マーカーで染色することによって査定した。増殖因子、ホルモン、および化学療法剤に対する三次元の乳癌腫瘍モデルの応答を、二次元の乳癌細胞株の応答と比較した。本明細書に記載されるモデルは、インビボ微小環境の背景における癌細胞の標的化に対するより良好な効率および正確性を有しており、新たな抗癌標的をスクリーニングするために用いられる既存のモデルよりも優れている。
【０１０２】
本明細書に記載される人工的な腫瘍モデルの利点には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
・該腫瘍モデルは、間質と癌細胞との間の相互作用を有する区画化された構造体を保持する。
・間質区画のバイオプリンティングの後、内皮ネットワークの形成および脂肪細胞の分化が観察された。
・該腫瘍モデルは、天然様の薬物透過および化学療法用化合物に対する応答を示した。同じ用量のタモキシフェンで同じ持続時間処理した場合、単離された二次元の癌細胞は、三次元のバイオプリントされた構築物中に組み入れられた細胞よりも、タモキシフェン誘導による毒性に対する感受性が高かった。
【０１０３】
アッセイ
一部の態様において、本明細書に記載される、（乳房組織を含む）人工的な組織および（乳癌腫瘍モデルを含む）腫瘍モデルは、インビトロアッセイにおける使用のためのものである。一部の態様において、「アッセイ」とは、有機的または生物学的なサンプル（例えば、細胞凝集体、組織、器官、生物など）中の物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など）の存在または活性を試験するまたは測定するための手法である。さらなる態様において、アッセイには、定性的アッセイおよび定量的アッセイが含まれる。なおさらなる態様において、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
【０１０４】
様々な態様において、本明細書に記載される、（乳房組織を含む）人工的な組織および（乳癌腫瘍モデルを含む）腫瘍モデルは、非限定的な例として、画像に基づくアッセイ、分泌タンパク質の測定、マーカーの発現、およびタンパク質の産生における使用のためのものである。様々なさらなる態様において、本明細書に記載される、（乳房組織を含む）人工的な組織および（乳癌腫瘍モデルを含む）腫瘍モデルは、分子結合（放射性リガンド結合を含む）、分子取り込み、活性（例えば、酵素活性および受容体活性など）、遺伝子発現、タンパク質発現、受容体活性化作用、受容体拮抗作用、細胞シグナル伝達、アポトーシス、化学感受性、トランスフェクション、細胞遊走、走化性、細胞生存率、細胞増殖、安全性、効力、代謝、毒性、および乱用傾向（abuse liability）のうちの1つまたは複数を検出するまたは測定するアッセイにおける使用のためのものである。
【０１０５】
一部の態様において、本明細書に記載される、（乳房組織を含む）人工的な組織および（乳癌腫瘍モデルを含む）腫瘍モデルは、免疫アッセイにおける使用のためのものである。さらなる態様において、免疫アッセイは、競合的免疫アッセイまたは非競合的免疫アッセイである。競合的免疫アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体と結合する標識化抗原と競合し、次いで、抗体部位に結合している標識化抗原の量を測定する。非競合的免疫アッセイ（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）では、例えば、サンプル中の抗原を抗体部位に結合させ、その後、標識化抗体を該抗原に結合させ、次いで該部位上の標識化抗体の量を測定する。
【０１０６】
一部の態様において、本明細書に記載される、（乳房組織を含む）人工的な組織および（乳癌腫瘍モデルを含む）腫瘍モデルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）における使用のためのものである。さらなる態様において、ELISAとは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために用いられる生化学的技法である。ELISAでは、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも1種の抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有するサンプルを、非特異的に（表面への吸着によって）または特異的に（「サンドイッチ」ELISAでは、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉によって）、固体支持体（例えば、ポリスチレン製マイクロタイタープレート）上に固定化する。なおさらなる例として、抗原を固定化した後、検出抗体を添加し、抗原との複合体が形成される。検出抗体は、例えば、酵素に共有結合的に連結された、またはバイオコンジュゲーションにより酵素に連結された二次抗体によって、それ自体が検出される。
【０１０７】
例えば、一部の態様において、細胞、多細胞凝集体、または組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは薬物発見に用いられる。さらなる態様において、組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは薬物発見のためのキットの一部として用いられる。一部の態様において、1つまたは複数の自動化された薬物スクリーニング手法および/または装置に適合している生体適合性マルチウェル容器のウェル内に各血管壁断片が存在する。さらなる態様において、自動化された薬物スクリーニング手法および/または装置には、コンピューターまたはロボットを利用した任意の適切な手法または装置が含まれる。
【０１０８】
一部の態様において、薬物スクリーニングアッセイまたは薬物発見アッセイのためのアレイを用いて、任意の治療エリアにおいて潜在的に有用な薬物を探求または開発する。なおさらなる態様において、適切な治療エリアには、非限定的な例として、感染性疾患、血液学、腫瘍学、小児学、心臓学、中枢神経系疾患、神経学、消化器学、肝臓学、泌尿器学、不妊症、眼科学、腎臓学、整形外科学、疼痛制御、精神医学、呼吸器学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒物学、および免疫学が含まれる。
【０１０９】
一部の態様において、治療法スクリーニングアッセイまたは治療法発見アッセイのためのアレイを用いて、特定の個体または個体群の疾患または病状において潜在的に有用な治療法を同定する。例えば、一部の態様において、本明細書に記載される方法は、特定の個体の細胞を利用して、組織、疾患モデル、または腫瘍モデルを人工的に作り出す工程を含む。さらなる態様において、前記方法は、組織またはモデルに治療剤候補を適用する工程；細胞の生存率を測定する工程；および測定された細胞の生存率に基づいて、個体に対する治療剤を選択する工程を含む。なおさらなる態様において、治療剤候補は、1種もしくは複数種の化学療法用化合物、1種もしくは複数種の放射性医薬品化合物、放射線療法、またはそれらの組み合わせである。したがって、医療を個体または個体群向けに個別化する方法が本明細書において開示される。
【０１１０】
人工的な脂肪細胞含有組織
本明細書に記載されるように、以前の組織製造技術は、主として脂肪細胞の脆弱性および損傷に対する感受性が理由で、十分に生存可能な分化した脂肪細胞を含有する人工的な組織を充分に提供することができていない。一部の態様において、生存可能な分化した脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが本明細書に記載される。生存可能な脂肪細胞は、一部の組織において、天然様微小構造の形成における重要な因子である。
【０１１１】
一部の態様において、組織は、脂肪が豊富なまたは脂肪依存的な組織である。さらなる態様において、組織は脂肪組織である。一部の態様において、組織は、例えば少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％またはそれを上回る割合の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。特定の非限定的な態様において、組織は、少なくとも約5％または少なくとも約10％の生存可能な分化した脂肪細胞を含む。
【０１１２】
一部の態様において、例えば、脂肪細胞の少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％またはそれを上回る割合は、製造後に生存可能である。特定の非限定的な態様において、脂肪細胞の少なくとも約50％または少なくとも約75％は、製造後に生存可能である。様々な態様において、脂肪細胞の生存は、製造後約1、2、3、4、5、6、7、8日間またはそれを上回る日数にまで及ぶ。さらなる態様において、脂肪細胞は、製造後に、検出可能な量のレプチンを分泌する。様々な態様において、レプチン分泌は、製造後約1、2、3、4、5、6、7、8日間またはそれを上回る日数にまで及ぶ。
【０１１３】
一部の態様において、脂肪細胞をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた脂肪細胞は密着して人工的な組織を形成する。一部の態様において、人工的な脂肪細胞含有組織は、製造の時点または使用の時点で、あらかじめ形成された足場を含んでいないまたは実質的に含んでいない。一部の態様において、人工的な脂肪細胞含有組織には神経分布がない。
【０１１４】
一部の態様において、脂肪細胞は皮下脂肪細胞である。一部の態様において、脂肪細胞は、間葉系幹細胞（骨髄由来間葉系幹細胞を含む）または前駆脂肪細胞などの脂肪細胞前駆体細胞に由来する。
【０１１５】
本明細書に記載される方法は、多くの組織および腫瘍モデルにおける主要な間質構成要素である、生存可能な分化した脂肪細胞を含有する組織のバイオプリンティングを可能にする。
【０１１６】
本明細書において開示される人工的な脂肪組織を製造する方法は、バイオプリントする工程を含む。一部の態様において、前記方法は、幹細胞または前駆脂肪細胞などの脂肪細胞前駆体に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程を含む。さらなる態様において、幹細胞または前駆脂肪細胞などの脂肪細胞前駆体は、バイオプリンティングの時点で、少なくとも部分的に前分化している。
【０１１７】
その後に、一部の態様において、前記方法は、ハイドロゲルなどの押出化合物、前駆脂肪細胞、および内皮細胞などの少なくとも1つの他の細胞型を含むバイオインクを調製する工程を含む。
【０１１８】
さらに、一部の態様において、前記方法は、バイオプリンターなどの自動化または半自動化された堆積装置によって表面上にバイオインクを堆積させる工程を含む。特定の態様において、人工的な組織をバイオプリンティングによって層ごとに築き上げて、三次元構造体を形成させる。
【０１１９】
さらに、一部の態様において、前記方法は、細胞を密着させて、生存可能な分化した脂肪細胞を含む三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。さらなる態様において、細胞培養培地中での成熟は、また、ハイドロゲルを除去し、実質的に細胞性構築物が残る。
【０１２０】
図23に言及すると、脂肪組織は、本明細書に記載される方法によりバイオプリントされた。この態様において、脂肪細胞は、分化し、生存可能であり、かつオイルレッドOで染色することによって明らかとなる特徴的な脂質堆積物を産生した。
【実施例】
【０１２１】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載されるソフトウェアアプリケーション、システム、および方法の態様についての代表的なものであり、決して限定的であることを意図されるものではない。
【０１２２】
実施例1−人工的なヒト乳房組織モデル
製造
図1に示された概略図に従って、3mm×3mm×3mmの寸法を有する6層の立方体を、6ウェル組織培養プレート内のトランスウェル膜上にバイオプリントした（構造体1）。底部2層および上部2層は、75％の正常ヒト乳腺線維芽細胞（NHMF）および25％のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）から構成された。中央部2層は、5000万〜3億個の細胞/mLを含むバイオインクを産生するようにアルギネートおよびゼラチンを含有するハイドロゲル（Novogel（登録商標）2.0システム；Organovo, CA）中に再懸濁されたヒト乳腺上皮細胞（HMEC）の中核部を75％ NHMF/25％ HUVECが取り囲むバイオプリントされた正方形から構成された。バイオプリンティングの直後に前記構造体を50mM CaCl2とともに2分間インキュベートし、6日間培養した。培養の6日目に、前記構築物を、ハイドロゲルを分解するアルギネートリアーゼとともにインキュベートし、さらに24時間インキュベートした。
【０１２３】
結果
構造体1についての査定を、細胞型特異的マーカーに対する組織学的染色によって実施した。構造体1の代表的なH＆E染色が図2に示されている。図2に言及すると、H＆E染色された標本は、製造後7日目に調製された；上の行（A〜D）は倍率2×を示しており、下の行（E〜H）は倍率20×を示している；左から右に、1列目（AおよびE）はハイドロゲルを含み、2列目（BおよびF）はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理され、3列目（CおよびG）はECMを含み、最後の列（DおよびH）はECMを含みかつリアーゼで処理された。
【０１２４】
構築物を、ヒト乳腺線維芽細胞のマーカーであるビメンチンおよびTE7について染色したところ（製造後7日目）、該細胞は、該構築物の外側部分に局在しており、HMEC細胞がバイオプリントされた内側部からは除かれていた。図3A〜3Dを参照されたい。図3A〜3Dのそれぞれにおいて、上の行（A〜C）はビメンチン（緑色）を示しており、下の行（D〜F）はTE7（緑色）を示している；1列目（AおよびD）は倍率10×を示しており、2列目（BおよびE）は倍率20×を示しており、最後の列（CおよびF）は倍率60×を示している。図3Aの構築物はECMを含み、図3Bの構築物はハイドロゲルを含み、図3Cの構築物はECMを含みかつリアーゼで処理され、図3Dの構築物はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理された。
【０１２５】
構築物におけるNHMFおよびHMEC細胞の相対的位置を可視化するために、DAPI（青色）に加えて、ビメンチン（赤色）およびパンサイトケラチン（緑色）に対する抗体で組織を染色した。図4を参照されたい。予想されたとおり、上皮細胞は構築物の中心に向かって濃縮された。図4に言及すると、1列目（A、H、およびL）は倍率5×を示しており、2列目（B、E、I、およびM）は倍率10×を示しており、3列目（C、F、J、およびN）は倍率20×を示しており、最後の列（D、G、およびK）は倍率60×を示している；1行目の構築物（A〜D）はECMを含み、2行目の構築物（E〜G）はECMを含みかつリアーゼで処理され、3行目の構築物（H〜K）はハイドロゲルを含み、最後の行の構築物（L〜N）はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理された。
【０１２６】
構築物におけるNHMFおよびHUVEC細胞の相対的位置を可視化するために、ビメンチン（赤色）およびCD31（緑色）に対する抗体、ならびにDAPI（青色）で組織を染色した。図5を参照されたい。図5に言及すると、1列目（A、D、G、およびJ）は倍率10×を示しており、2列目（B、E、H、およびK）は倍率20×を示しており、最後の列（C、F、I、およびL）は倍率60×を示している；1行目の構築物（A〜C）はECMを含み、2行目の構築物（D〜F）はECMを含みかつリアーゼで処理され、3行目の構築物（G〜I）はハイドロゲルを含み、最後の行の構築物（J〜L）はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理された。
【０１２７】
CD31+細胞の堅牢なネットワークが、解析されたすべての構築物において見出され、一部のエリアは微小脈管構造形成の証拠を示した。CD31+細胞は、主に構築物の外側表面に向かって見出され、構築物の内側方向に約1〜2mmであることが見出された。全体的なECM堆積を評価するために、マッソン・トリクローム染色を実施した。図6を参照されたい。リアーゼで処理された組織において、有意なECM堆積が観察された。図6に言及すると、1列目（AおよびD）は倍率5×を示しており、2列目（BおよびE）は倍率10×を示しており、最後の列（CおよびF）は倍率20×を示している；1行目の構築物（A〜C）はECMを含みかつリアーゼで処理され、2行目の構築物（D〜F）はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理された。
【０１２８】
実施例2−脂肪組織を有する人工的なヒト乳房組織モデル
製造
図7Aに示されたように、5mm×5mm×500μmの寸法を有する四角形を、6ウェル組織培養プレート内のトランスウェル膜上にバイオプリントした（構造体2）。まず、90％の骨髄由来間葉系幹細胞（bmMSC）および10％のHUVECから構成される500μmの間質バイオインク円柱をバイオプリントして、四角形の形を形成させた。HMEC細胞を10％ゼラチンハイドロゲルと混合して上皮バイオインクを形成させ、間質バイオインク四角形の中央部にバイオプリントした。この際、HMECバイオインクは間質バイオインク境界に接触しなかった。75％のNHMFおよび25％のHUVECから構成される第三のバイオインクを用いて、中間部における間質バイオインク境界とHMECバイオインクとの間の空間を充填した。構築物を10日間インキュベートした。図7Bは製造の直後の構造体2を描写しており、図7Cおよび7Dは製造後10日目の構造体2を描写している。インキュベーション中、bmMSCに脂肪細胞分化シグナルを提供して、生存可能な分化したヒト脂肪細胞を生成した。
【０１２９】
結果
構造体2についての査定を、細胞型特異的マーカーに対する組織学的染色によって実施した。構造体2の代表的なH＆E染色が図8に示されている。図8に言及すると、H＆E染色された標本は、製造後10日目に調製された；1行目（AおよびB）は倍率5×を示しており、2行目（CおよびD）は倍率10×を示しており、最後の行（EおよびF）は倍率20×を示している。
【０１３０】
いくつかの異なる細胞マーカーに対する染色が図9に示されている（CD31、内皮細胞；ビメンチン、線維芽細胞；FABP4、脂肪細胞；パンサイトケラチン、上皮）。オイルレッドO染色を用いて、構築物の外側にあるbmMSCから分化した脂肪細胞における脂質滴の存在を示した。
【０１３１】
図9に言及すると、1行目（A〜D）は倍率5×を示しており、2行目（E〜H）は倍率10×を示しており、3行目（E〜H）は倍率20×を示しており、最後の行（M）は倍率60×を示している；1列目の構築物（A、E、およびI）はCD31（緑色）、ビメンチン（赤色）に対して染色され、ならびにDAPI（青色）で処理され、2列目の構築物（B、F、およびJ）はFABP4（緑色）に対して染色され、ならびにDAPI（青色）で処理され、3列目の構築物（C、G、およびK）はパンサイトケラチン（緑色）、ビメンチン（赤色）に対して染色され、ならびにDAPI（青色）で処理され、最後の列の構築物（D、H、L、およびM）はオイルレッドOを用いて染色された（凍結切片化された）。
【０１３２】
すべての細胞型が構造体に存在し、CD31+内皮細胞のネットワークが構造体全体にわたって形成された。上皮は構築物の内側に制限された。脂肪細胞分化のマーカー（オイルレッドOおよびFABP4）は構築物の外側に向かって見出され、バイオインクにおけるbmMSC由来脂肪細胞の存在と一致した。
【０１３３】
実施例3−人工的なヒト乳癌腫瘍モデル
MCF7乳癌細胞およびヒト臍帯静脈内皮（HUVEC）細胞から構成される癌細胞節が、正常ヒト乳腺線維芽細胞（NHMF）、HUVEC細胞、および皮下前駆脂肪細胞（SPA）から構成される間質区画によって全側面を取り囲まれている、バイオプリントされた乳癌構築物を作出した。細胞と、可逆的に架橋可能なアルギネートを含有するハイドロゲル（Novogel（登録商標）3.0システム；Organovo, CA）とを組み合わせることによって、バイオインクを産生した。
【０１３４】
図10Aは、構築物の構築を示した概略図を示している（構造体3）。図10Bは、バイオプリンティングおよびハイドロゲルの架橋の直後の構築物の写真を示している。図10Cは、ハイドロゲルを除去する酵素処理の2日後の構築物を示しており、該構築物は、組織の凝縮および滑らかな充実性結節の生成を示している。
【０１３５】
細胞培養
正常なヒト乳腺線維芽細胞（NHMF）をScienCell（Carlsbad, CA）から入手し、メーカーの指示に従って培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をBD Biosciences（San Jose, CA）から入手し、EGM-2内皮細胞培地（Lonza, Allendale, NJ）中で培養した。
【０１３６】
皮下前駆脂肪細胞（SPA）をZen-Bio（Research Triangle Park, NC）から入手し、増殖のために皮下前駆脂肪細胞培地中で培養した。バイオプリンティングの3日前に、細胞を脂肪細胞分化培地（Zen-Bio）中で培養した。図11は、バイオプリンティングの日までに細胞内に蓄積するのが見られた早期脂質滴（矢印）を示している。
【０１３７】
MCF7細胞をSigma-Aldrich（St. Louis, MO）またはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（Manassas, VA）から入手し、メーカーの指示に従って培養した。
【０１３８】
バイオプリンティング
構築物の間質区画は、65％のNHMF、25％のHUVEC、および10％のSPA（部分的に前分化した）から構成された。構築物の癌区画は、75％のMCF7、25％のHUVECから構成された。各区画について、細胞を表示される比率で一緒に混合し、1億5000万個の細胞/mlの濃度でNovogel（登録商標）3.0中に再懸濁した。3mm×3mm×0.75mmの寸法を有する3層状の構造体として、構築物をプリントした。バイオプリンティングの直後に、構築物を架橋により安定化させた。2分後、カルシウム架橋溶液を吸引し、培養培地で置き換えた。培養下で2日後、培養培地中に溶解された酵素で構築物を一晩処理して、Novogel（登録商標）3.0を除去した。次いで、構築物をさらに最高9日間インキュベートした。
【０１３９】
化学療法用化合物による構築物の処理
すべての化合物をSigma-Aldrichから入手し、DMSO中に溶解した。化合物を培地中10μMまたは100μMの最終濃度に希釈した。最終DMSO濃度は0.1％であり、それをビヒクル処理に用いた。alamarBlueアッセイ（Life Technologies, Carlsbad, CA）またはCellTiter Gloアッセイ（Promega, Madison, WI）によって、構築物を代謝活性について査定した。構築物を、標識された化合物の取り込み調査に関して24時間、または代謝活性の査定に関して4日間処理した。
【０１４０】
レプチンELISA
構築物由来の培養上清を9日間毎日回収した。培地を1:2希釈し、メーカー（Life Technologies）の指示に従って、レプチン分泌について査定した。
【０１４１】
組織学
2％パラホルムアルデヒド溶液（PBS中、2％パラホルムアルデヒド、10mM塩化カルシウム、50mMスクロース）中、室温で24時間、構築物をインサイチューで固定した。24時間後、固定液を除去しかつ70％エタノールで置き換えた。自動化された組織プロセッサー（Tissue-Tek、Sakura Finetek Europe BV, the Netherlands）を用いて、構築物をパラフィン包埋のために加工した。パラフィンによる浸透後、構築物をパラフィン鋳型中に包埋し、回転式ミクロトーム（Jung Biocut 2035、Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL）を用いて、5μm切片を生成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色に関しては、スライドをキシレン中で脱ろうし、100％、95％、70％、および50％エタノールを通じて再水和し、蒸留水中でリンスした。スライドをギルヘマトキシリン（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）中に浸した。蒸留水でリンスした後、スライドを0.2％ v/vの水酸化アンモニウム中に短時間浸した。蒸留水でリンスした後、スライドをエオシン水溶液（American MasterTech）中に浸した。次いで、スライドをエタノール勾配を通じて再水和し、キシレン中で一掃し、樹脂性封入媒体（CytoSeal、Fisher Scientific）で封入した。メーカーの指示（American MasterTech）に従って、マッソン・トリクローム染色を実施した。
【０１４２】
免疫組織化学解析に関しては、スライドをキシレン中で脱ろうし、蒸留水中で最終的に洗浄する前に、それらを100、95、70、および50％エタノール中に逐次的に浸すことによって再水和した。再水和した切片を、溶液およびスライドを沸点以下（subboil）まで加熱する標準的な電子レンジを用いて、10mMクエン酸ナトリウムpH6.0中での加熱による抗原賦活化に供し、その後に30分間の徐冷が続いた。次いで、スライドをトリス緩衝生理食塩水（TBS）中10％ヤギ血清で1時間ブロッキングし、その後に一次抗体との4℃で一晩のインキュベーションが続いた。以下の一次抗体を利用した：マウス抗サイトケラチン8（1:100；Abcam, Cambridge, MA）；ウサギ抗CD31（1:100；Abcam）；マウス抗TE7（1:250；EMD Millipore, Billerica, MA）；マウス抗コラーゲン4（1:250；Abcam）。次いで、切片を、0.1％ Tween 20を含むTBS中で3回洗浄し、TBS中に1:200希釈されたAlexaFluor 488またはAlexaFluor 568抱合型二次抗体（Life Technologies, Carlsbad, CA）とともにインキュベートした。次いで、切片をTBS-0.1％ Tween 20中で3回洗浄し、蒸留水でリンスし、DAPI含有封入媒体（Vector Labs, Burlingame, CA）で封入した。
【０１４３】
凍結切片化のための構築物の調製
構築物をDPBSで1回リンスし、Tissue-Tek OCT化合物（Sakura Finetek Europe B.V., The Netherlands）中に浸し、急速冷凍した。次いで、冷凍したブロックをクライオスタット（Leica Cryocut 1800、Leica Microsystems）で5μmに切片化した。切片化したスライドを-20℃液体アセトン中で瞬間固定し、室温で20分間空気乾燥させた。オイルレッドO染色に関しては、スライドを蒸留水中で再水和し、60％イソプロパノール中に2分間浸した。スライドを、60％イソプロパノール中0.3％ w/vのオイルレッドO（Sigma-Aldrich）で室温にて15分間染色し、その後に60％イソプロパノールによる1分間のリンスが続いた。スライドをギルヘマトキシリン中に短時間浸して、対比染色した。スライドを蒸留水でリンスし、水性媒体（American MasterTech）で封入した。蛍光化合物のイメージングに関しては、スライドをDAPI含有封入媒体で封入した。
【０１４４】
顕微鏡法
H＆E、トリクローム、およびオイルレッドOで染色されたスライドを、Zeiss Axioskop顕微鏡（Zeiss, Jena, Germany）を用いて撮像した。画像を、Insight 2カメラおよびSpot 5.0ソフトウェア（Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI）で入手した。蛍光染色されたスライドを、Zeiss AxioImager顕微鏡で撮像し、画像をZeiss ICM-1カメラおよびZen Proソフトウェアで入手した。
【０１４５】
結果
バイオプリントされた乳癌腫瘍モデルは、経時的なレプチン分泌を示した。バイオプリントされた乳癌構築物由来の培養上清を9日間毎日回収し、レプチン分泌についてELISAアッセイによって査定した。レプチンは、9日間の培養期間を通じて産生され、それは、バイオプリンティング後の前駆脂肪細胞の継続的分化を反映している。図12を参照されたい。
【０１４６】
標識化化学療法用化合物による、バイオプリントされた癌腫瘍モデルの処理は、構築物構造の保持および天然様パターンの薬物透過を示した。構築物を100μMの化合物で24時間処理し、全体にわたって凍結切片化して、標識化薬物の透過を査定した。図13Aは、MCF7乳癌細胞のマーカーとしてサイトケラチン8に対して染色された組織切片を示しており、構築物の中心における癌細胞の保持を表している。図13Bは、OregonGreen 488フルオロフォア単独で処理された構築物を示しており、蛍光は構築物全体にわたって観察された。図13Cは、OregonGreen 488-パクリタキセルで処理された構築物を示しており、化合物の透過は構築物の外側約200μmに限定された。
【０１４７】
薬物処理後の構築物生存率についての査定は、天然様薬物応答を示した。構築物を10μMの化合物で3日間、それに続いて100μMの化合物で24時間処理した。図14に言及すると、生存率をalamarBlueアッセイによって査定し、より高い蛍光強度は、代謝的に活性な細胞の指標である。シスプラチンおよびパクリタキセルは、培地またはビヒクル対照と比べて、構築物生存率を減少させた。
【０１４８】
実施例4−人工的なヒト乳癌腫瘍モデル
製造
図15Aに示された概略図に従って、乳癌腫瘍モデルをバイオプリントした（構造体4）。乳癌腫瘍モデルは、ヒト間葉系幹細胞から分化したヒト脂肪細胞、ヒト乳腺線維芽細胞、およびヒト内皮細胞を含む、生理学的に関連する間質層によって囲まれたヒト乳癌細胞の節を含んだ。脂肪細胞は、単離されかつバイオインクの調製およびバイオプリンティングの前に脂肪細胞分化に曝露された間葉系幹細胞に由来した。図15Bは、バイオプリンティング直後の構築物の写真を示している。
【０１４９】
結果
構造体4についての組織学的解析を、細胞型特異的マーカーに対して染色することによって実施して、組織構造、および細胞型の相対的位置を査定した。図16に言及すると、上の行は、H＆E染色（A）およびマッソン・トリクローム染色（B）を描写しており、乳癌細胞は、CellTracker Green CMFDAで標識された。図16Cは、内皮細胞（CD31、赤色）、癌細胞（緑色）に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図16Dは、線維芽細胞（TE7、赤色）、癌細胞（緑色）に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図16Eは、コラーゲンIV（赤色）、癌細胞（緑色）に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図17に言及すると、上の行は、H＆E染色（A）およびマッソン・トリクローム染色（B）を描写しており、コラーゲンは青色染色によって表されている。下の行において、E-カドヘリン（緑色）およびTE7（赤色）染色は、それぞれ癌細胞および線維芽細胞を表しており（C）、CD31（緑色）染色は、線維芽細胞（TE7、赤色）を含有する間質区画における微小脈管構造形成のエリアを表している（D）。
【０１５０】
構築物中の脂肪細胞はレプチンを分泌し、それは、バイオプリントされた構築物内での脂肪細胞の継続的分化を示唆している。図18に言及すると、構築物由来の培養上清を24時間ごとに回収し、レプチン分泌についてELISAによって査定した。示されるデータは、平均±標準偏差を表す。
【０１５１】
構築物間のばらつきを査定するために、3種の乳癌腫瘍モデルに対して代謝アッセイを実施した。図19に言及すると、3種の個々の腫瘍モデルを、時間の関数としてalamarBlue基質の代謝について評価し（A）、3種の個々の腫瘍モデルをCellTiter Glo試薬中に可溶化し、相対的ルシフェラーゼ強度について査定した（B）。細胞代謝アッセイによって、構築物のばらつきが低いことが観察された。
【０１５２】
乳癌腫瘍モデルを化学療法用化合物に曝露して、薬物応答を査定した。図20に言及すると、二次元の細胞培養下で増殖した乳癌細胞（A）およびバイオプリントされた乳癌腫瘍モデル（B）を、培地単独、DMSO、または10μMのタモキシフェンで48時間処理し、生存率についてATPルシフェラーゼアッセイによって査定した。各グラフに関して、*は、対照と比較して、処理に対するp＜0.05を表している。同じ用量のタモキシフェンで同じ持続時間処理した場合、単離された二次元の癌細胞は、三次元のバイオプリントされた構築物中に組み入れられた細胞よりも、タモキシフェン誘導による毒性に対してより感受性が高かった。
【０１５３】
図21に言及すると、100μMの化学療法用化合物による処理後の代謝活性も査定した。MCF7細胞単独（黒色のバー）または乳癌腫瘍モデル（灰色のバー）を、化合物で48時間（MCF7）または4日間毎日（三次元のバイオプリントされた乳癌腫瘍モデル）処理し、生存率についてCellTiter Glo ATPルシフェラーゼアッセイによって査定した。示されるデータは、ビヒクル対照についての平均パーセント±標準偏差を表す。
【０１５４】
図22に言及すると、バイオプリントされた組織をビヒクル（A〜C）または100μMのシスプラチン（D〜F）で4日間処理した。1列目（AおよびD）および2列目（BおよびE）は、TUNEL染色（緑色）および癌細胞に対するマーカー（CK8、赤色）によってアポトーシスについて査定された組織を描写している。最後の列（BおよびE）は、TUNEL染色（緑色）および線維芽細胞に対するマーカー（TE7、赤色）によってアポトーシスについて査定された組織を描写している。図22は、シスプラチンが、癌区画においてよりも、バイオプリントされた組織の間質区画において、より大きなアポトーシスを誘導することを示している。
【０１５５】
実施例5−人工的な脂肪組織
製造
90％の骨髄由来間葉系幹細胞（脂肪細胞の前駆体）および10％のHUVECから構成されるバイオインクを調製した。インクを、存在している他の細胞型を有しない四角形としてNovogen Bioprinter（Organovo；San Diego, CA）で堆積させ、脂肪生成分化培地中で10日間成熟させた。
【０１５６】
結果
成熟した脂肪組織を、中性脂質のマーカーであるオイルレッドOで染色した。図23は、染色された組織の顕微鏡写真を示しており、有意な脂質産生を示している。
【０１５７】
本発明の好ましい態様が本明細書において示されかつ記載されているものの、そのような態様は、単なる例として提供されていることは当業者に明白であろう。本発明から逸脱することなく、無数の変動、変化、および置換がここで当業者に生じるであろう。本発明の実施において、本明細書に記載された本発明の態様に関する様々な代替物を採用し得ることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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