(57)【要約】  本発明は、野生型対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で増強された生物活性を示す糖タンパク質ホルモンの長時間作用性かつ超活性な類似体を提供する。この類似体は、低い受容体発現、または良好でない受容体反応性を示す対象を処置するのに、および糖タンパク質ホルモン活性と関連している任意の状態の処置に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファサブユニットのアルファ−Ｌ１ループにおける少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換、およびアルファサブユニットのＮ末端近くの１つまたは複数の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンであって、前記挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4が独立に任意のアミノ酸である修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２】
前記挿入断片のそれぞれがＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓを含み、Ｘ1およびＸ2が独立に、プロリンを除く任意のアミノ酸である、請求項１に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３】
前記挿入断片のそれぞれがＮＸ1Ｔを含む、請求項１または２に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項４】
前記挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのＦ６とＴ７の間にあり、野生型糖タンパク質が、配列番号２、３、４、５、４７、および５０からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項５】
単一の挿入断片があり、前記挿入断片がΝΧ1ΤｙΝΧ1であり、ｙがＶまたはＩである、請求項１から４のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項６】
前記挿入断片がＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）である、請求項１から５のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項７】
Ｘ1およびＸ2が独立にＶ、Ｉ、またはＡである、請求項１から６のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項８】
前記挿入断片が２つのＮＸ1Ｔグリコシル化部位をアルファサブユニットに導入する、請求項１から７のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項９】
２つのＮＸ1Ｔグリコシル化部位が単一アミノ酸ＶまたはＩによって隔てられている、請求項８に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１０】
前記挿入断片のそれぞれがＮＮを含み、Ｘ3およびＸ4が独立にＴまたはＳである、請求項１から９のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１１】
Ｘ3Ｘ4がＴＴ、ＴＳ、ＳＴ、またはＳＳである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１２】
ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、およびＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化における少なくとも１つのアミノ酸が前記挿入断片の一部ではない、請求項１から１１のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１３】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、または２４での少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１４】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、または２４での少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１５】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、または２４での少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１６】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、または２４での少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１７】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、および２４での５つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１８】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、または２４Ｋでの少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号２、３、４、５、４７、５０、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６７、および６９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項１９】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、または２４Ｋでの少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号２、３、４、５、４７、５０、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６７、および６９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２０】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、または２４Ｋでの少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号２、３、４、５、４７、５０、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６７、および６９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２１】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、または２４Ｋでの少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号２、３、４、５、４７、５０、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６７、および６９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から２０のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２２】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、および２４Ｋでの５つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号２、３、４、５、４７、５０、５３、５５、５７、６７、および６９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２３】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、および２４Ｋでの４つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号５９、６１、および６３から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から２２のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２４】
野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１２Ｋ、１４Ｋ、１５Ｅ、１７Ｎ、および２１Ｋでの５つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが配列番号６５のアミノ酸配列を有する、請求項１から２３のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２５】
黄体ホルモン（ＬＨ）のベータサブユニットをさらに含む、請求項１から２４のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２６】
絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータサブユニットをさらに含む、請求項１から２５のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２７】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２８】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む、請求項１から２７のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項２９】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１から２８のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３０】
アルファサブユニットが哺乳動物アルファサブユニット由来である、請求項１から２９のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３１】
アルファサブユニットがヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トラ、ライオン、パンダ、オポッサム、またはウサギアルファサブユニット由来である、請求項３０に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３２】
アルファサブユニットが鳥類アルファサブユニット由来である、請求項１から３１のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３３】
アルファサブユニットが魚アルファサブユニット由来である、請求項１から３２のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか１項に記載の修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与することを含む、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法。
【請求項３５】
動物が哺乳動物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物がウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
動物が鳥類である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
鳥類がニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
動物が魚類である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
魚類がコイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタである、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、スーパーアゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質ホルモン、および糖タンパク質ホルモン活性と関連している状態の処置におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、野生型アルファサブユニットと比較して、アルファサブユニットにおけるアミノ酸置換、および１つまたは複数の挿入ペプチドを含有する修飾糖タンパク質分子であって、野生型糖タンパク質と比較して、増強された薬理学的特性を示す修飾糖タンパク質分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピンであるフォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体ホルモン、ＬＨ）、およびサイロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）は、糖タンパク質ホルモンのファミリーを構成する。各ホルモンは、２つの非共有結合サブユニット、アルファおよびベータのヘテロ二量体である。同じ種内で、アルファサブユニットのアミノ酸配列は、全てのホルモンにおいて同一である一方、ベータサブユニットの配列は、ホルモン特異的である（Pierce, Ann. Rev. Biochem. 50:465-495 (1981)）。サブユニットの配列が魚類から哺乳動物まで高度に保存されているという事実は、これらのホルモンが共通の祖先タンパク質から進化してきたことを暗示している（Fontaine, Gen. Comp. Endocrinol. 32:341-347 (1977)）。動物のスペクトルにわたって糖タンパク質ホルモンが広範に分布して存在することも、ホルモンまたはホルモンの任意の修飾バージョンが様々な種における使用の可能性がかなりあることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
修飾糖タンパク質ホルモンを用いた以前の研究からは、有望なデータが得られた。例えば、増加した活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンが提供されたことに加えて、さらなる変異は、受容体アフィニティー結合の増加を示した（例えば、ＷＯ２００５／０８９４４５およびＷＯ２００５／１０１０００を参照されたい）。しかしながら、アフィニティーが増加した一方、研究では、修飾糖タンパク質ホルモンが、それらの野生型対応物よりも速いわけではないものの同じくらいの迅速さで排除されることが実証された。増強された活性を有する臨床的に有用なスーパーアゴニストを得るために、修飾糖タンパク質スーパーアゴニストは、改善された受容体結合性アフィニティーに加えて、改善された生物学的半減期を有するべきである。しかしながら、半減期を増加させ、生物学的利用能を改善するために糖タンパク質ホルモンをさらに修飾する以前の試みは、満足のいくものではなく、その代わりに、修飾糖タンパク質ホルモンは、減弱された反応しか示さなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＱ１３、Ｅ１４、Ｐ１６またはＱ２０での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびＤ３とＱ５の間のＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｑ１３、Ｐ１６およびＱ２０での少なくとも２つのまたは少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｅ１４での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号１１との少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、ヒトアルファサブユニット（配列番号６）に由来する。
【０００５】
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｋ１７、Ｋ２０またはＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびＦ６とＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｋ１５、Ｋ１７、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つの、または少なくとも３つの、または少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｅ１８での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号７との少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。
【０００６】
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのＫ１５、Ｅ１８、Ｋ２０またはＫ２４での少なくとも１つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびＦ６とＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入断片または代わりにＦ６とＴ７の間のＮＶの挿入断片に加えてＴ７とＴ８の間のＩＮＶの挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Ｋ１５、Ｅ１８、Ｋ２０およびＫ２４での少なくとも２つの、または少なくとも３つの、または少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのＦ６とＴ７の間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）の挿入断片を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのＦ６とＴ７の間のＮＶの挿入断片に加えてＴ７とＴ８の間のＩＮＶの挿入断片を含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、ヒスチジンのアルギニンである。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
【０００７】
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号４との少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、ウマアルファサブユニット（配列番号４）に由来する。
本発明は、アルファサブユニットのアルファ−Ｌｌループにおける少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換、およびアルファサブユニットのＮ末端近くの１つまたは複数の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンであって、挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4が独立に任意のアミノ酸である修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
【０００８】
一部の実施形態では、挿入断片のそれぞれは、１つまたは複数のＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位であって、Ｘ1およびＸ2が独立に、プロリンを除く任意のアミノ酸であるＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、挿入断片は、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4部位をアルファサブユニットに導入するが、導入されたＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4部位におけるアミノ酸の少なくとも１つが挿入断片の一部ではない。一部の実施形態では、挿入断片は、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのＦ６とＴ７の間にある。一部の実施形態では、挿入断片は、ＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入してもよく、ここで、Ｘ3、およびＸ4は、独立にＴまたはＳである。
【０００９】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５、１７、１８、２０、または２４での少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置１５Ｋ、１７Ｋ／１７Ｇ／１７Ｌ、１８Ｋ／１８Ｅ、２０Ｋ、または２４Ｋでの少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含む。
本発明は、修飾アルファサブユニットを含み、黄体ホルモン（ＬＨ）のベータサブユニット、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータサブユニット、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニット、または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のベータサブユニットをさらに含む修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
【００１０】
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、野生型ヒトアルファサブユニット（配列番号６）、野生型ウシアルファサブユニット（配列番号２）、野生型ブタアルファサブユニット（配列番号５）および野生型ヒツジアルファサブユニット（配列番号３）、野生型イヌアルファサブユニット（配列番号４７）、野生型ネコアルファサブユニット（配列番号５０）、野生型ウサギアルファサブユニット（配列番号５３）、野生型ヤギアルファサブユニット（配列番号５５）、野生型オポッサムアルファサブユニット（配列番号５７）、野生型コイアルファサブユニット（配列番号６７）、野生型サケアルファサブユニット（配列番号６９）、野生型ウマアルファサブユニット（配列番号４）、野生型ニワトリアルファサブユニット（配列番号５９）、野生型シチメンチョウアルファサブユニット（配列番号６１）、野生型ダチョウアルファサブユニット（配列番号６３）、または野生型ナマズアルファサブユニット（配列番号６５）に由来する。
【００１１】
本発明は、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法であって、上記の修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与することを含む方法を包含する。動物は、哺乳動物、鳥類、または魚類とすることができ、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、ヤク、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、ダチョウ、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一過性トランスフェクションによって産生させた、選択されたｂＦＳＨ類似体によるＣＨＯ−ＦＳＨＲ細胞におけるｃＡＭＰ刺激を示す図である。図１Ａは、ｂＦＳＨ−５Ｒ類似体とのＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（ｐＦＳＨ）、ｂＦＳＨ−ＷＴ（野生型）の比較を示す。図１Ｂは、２つのＮ末端伸長（ＡＮＩＴＶ、ＮＩＴＶ）および１つの内部ネオグリコシル化（Ｖ７８Ｎ）によるｈＦＳＨ−ＴＲ４４０２類似体（一過性４４０２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の弱毒化を示す（ＳＰＡ  ｃＡＭＰアッセイ）。図１Ｃは、挿入断片１（５Ｒ＋挿入断片１）および挿入断片２（５Ｒ＋挿入断片２）とのｂＦＳＨ−５Ｒ類似体の比較を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】マウスにおける単回皮下注射後の様々なｂＦＳＨ類似体のＰＫスクリーニングアッセイを示す図である。各実験では、５匹のマウスを各調製物に使用した。血液試料を注射後２４、３２および４８時間で採取し、血漿レベルを推論し、データを注射用量の％（％ＩＤ）として表した。血漿試料中のＦＳＨレベルをＦＳＨ  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｄｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してアッセイした。
【図３Ａ−Ｄ】ＴＲ５５６０１産生の種々のロットの分析を示す図である。図３Ａは、ＩＥＦ後のウエスタンブロットを使用した電荷不均一性分析を例証する。ロット３（レーン２および３）の最適以下のシアリル化は、ロット４（レーン５および６）において検出された最適な高度に酸性のアイソフォームと著しく対照的である。レーン１、ＩＥＦ３−１０マーカー；レーン２、ＴＲ５５６０１／ロット３（８μｇ）；レーン３、ＴＲ５５６０１／ロット３（４μｇ）；レーン４および８、ＴＲ４４０１（１μｇ）；レーン５、ＴＲ５５６０１／ロット４（８μｇ）；レーン６、ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン８、ＩＥＦ３−１０マーカー。図３Ｂは、ノイラミニダーゼ（コレラ菌）、ＩＥＦおよびウエスタンブロットを使用した荷電アイソフォームの分析を例証する。非処置ＴＲ５５６０１／ロット４試料（レーン２および３）および３−１０ＩＥＦゲルに適用する前にノイラミニダーゼで処置したＴＲ５５６０１／ロット４試料（レーン４〜６）。レーン１、ＩＥＦ３−１０マーカー；レーン２、非処置ＴＲ５５６０１／ロット４（８μｇ）；レーン３、非処置ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン４、処置ＴＲ５５６０１／ロット４（４μｇ）；レーン５、処置ＴＲ５５６０１／ロット４（２μｇ）；レーン６、処置ＴＲ５５６０１／ロット４（１μｇ）。ノイラミニダーゼ消化アイソフォームに関するＩＥＦプロファイルは、７．８から１０．０のｐＩ範囲にシフトした。ｐＩの平均シフトは、約５ｐＨ単位であり、複数のバンド（１０バンドに近い）が１つの主要なバンド（ｐＩ約９．５）および３つの微量なバンド（ｐＩ７．８〜１０．０）に変換され、これは、観察された電荷不均一性（図３Ａ−ロット４）の大部分が脱アミドおよび／またはタンパク質分解などの他の修飾の微量な構成要素を有する末端シアル酸残基に依存していることを示している。３Ｂに示された残りの塩基性バンド（ｐＩ４．８〜５．５）は、非特異的であり、ノイラミニダーゼ調製物に由来する。図３Ｃは、ｐＩ勾配ゲル（ＩＥＦ３−１０）中のＩＥＦ３−１０、その後のウエスタンブロット法によるＴＲ５５６０１−ロット５の荷電アイソフォームの分析を示す。レーン１、ＩＥＦ３−１０マーカー；レーン２、ＴＲ５５６０１−ロット５（４μｇ）；レーン３、ＴＲ５５６０１−ロット５（４μｇ）；レーン４、ＴＲ５５６０１−ロット４（４μｇ）；レーン５、ＴＲ５５６０１−ロット４（８μｇ）；レーン６、ＴＲ５５６０１−ロット３（４μｇ）；レーン７、ＴＲ５５６０１−ロット３（８μｇ）。図３Ｄは、ＴＲ５５６０１ロット４およびＦｏｌ−Ｖと比較した、ＴＲ５５６０１ロット５のＳＤＳ−ウエスタンブロット分析を例証する。レーン１、タンパク質マーカー；レーン２：ロット４、５００ｎｇ；レーン３：ロット５、１ｕｌ；レーン４：空レーン；レーン５：ロット４、４ｕｇ；レーン６：ロット５、１５ｕｌ；レーン７：Ｆｏｌ−Ｖ、６７３ｎｇ；レーン８：タンパク質マーカー。
【図４】未成熟（２２日齢）スプラーグドーリー雌ラットにおける卵巣質量のｈＣＧ増大を用いた古典的Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイからの結果を示す図である。卵巣質量を投薬後７２時間で測定した。データを２つの卵巣の平均総卵巣質量＋ＳＥＭ（群当たり、用量当たりｎ＝５）として示す。４０ＩＵのｈＣＧを補充した試験物品またはビヒクルの１回の単回注射でラットを刺激した。以下の投薬量群を使用した：群１は、ｈＣＧのみ（ＦＳＨなし）を投与され、群２〜５は、ＴＲ５５６０１ロット４（それぞれ、左から右に、０．３３μｇ、１．０μｇ、３．３３μｇ、および１０μｇ）を投与され、群６〜８は、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）（それぞれ、左から右に、３，３３３μｇ、１０，０００μｇ、および３０，０００μｇ）を投与され、群９〜１０は、ＴＲ４４０１（１．０μｇおよび３．３３μｇ）を投与された。
【図５】過剰排卵、排卵の誘導および固定時間人工授精に関する卵胞波同調プロトコールを示す図である。Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−ＶＲ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ）の８回の注射をＴＲ５５６０１の単回または二重注射で置き換える。
【図６】単回Ｉ．Ｍ．注射によって与えられた６０μｇ  ｒＦＳＨまたは４日にわたる１日２回のＩ．Ｍ．注射で与えられた３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で処置された食用牛における、超刺激（ｓｕｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）処置中の卵胞（直径が３〜５ｍｍ）の平均数を示す図である（３つの実験を組み合わせたもの）。
【図７】単回Ｉ．Ｍ．注射によって与えられた６０μｇ  ｒＦＳＨまたは４日にわたる１日２回のＩ．Ｍ．注射で与えられた３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で処置された食用牛における、超刺激処置中の直径が６〜８ｍｍの卵胞の平均数を示す図である（３つの実験を組み合わせたもの）。
【図８】単回Ｉ．Ｍ．注射によって与えられた６０μｇ  ｒＦＳＨまたは４日にわたる１日２回のＩ．Ｍ．注射で与えられた３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で処置された食用牛における、超刺激処置中の直径が＞９ｍｍの卵胞の平均数を示す図である（３つの実験を組み合わせたもの）。
【図９】単回Ｉ．Ｍ．注射によって与えられた６０μｇ  ｒＦＳＨまたは４日にわたる１日２回のＩ．Ｍ．注射で与えられた３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）で処置された食用牛における、超刺激処置中の直径が≧３ｍｍの全ての卵胞の平均直径プロファイルを示す図である（３つの実験を組み合わせたもの）。
【図１０Ａ】ヒトアルファサブユニットにおける挿入断片（Ａ２）、アミノ末端バリンを有さない挿入断片（挿入断片２）、挿入断片を有さない５アルギニン置換のみ（５Ｒ）および培地のみの対照に関するｃＡＭＰ生成における比較を示す図である。
【図１０Ｂ】試験された３つの構築物に関するＥＣ５０を示す図である。
【図１１Ａ】配列番号１の挿入断片を有するヒト修飾アルファサブユニット、および挿入断片を欠くウシ修飾アルファサブユニットに反応したｃＡＭＰ生成の比較を示す図である。
【図１１Ｂ】様々な挿入断片を有するまたは有さないヒト修飾アルファサブユニット、およびウシサブユニットに反応したｃＡＭＰ生成の比較を示す図である。
【図１２】野生型ラットＬＨ受容体（ｒＬＨＲ）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ刺激に基づくｅＣＧ類似体（＃２、＃３および＃４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＬＨ生物活性を示す図である。
【図１３】ラットＬＨ受容体（ｒＬＨＲ）を発現するＭＬＴＣ−１細胞におけるプロゲステロン刺激に基づくｅＣＧ類似体（＃２、＃３および＃４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＬＨ生物活性を示す図である。
【図１４】野生型ヒトＦＳＨ受容体（ｈＦＳＨＲ）を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ刺激に基づくｅＣＧ類似体（＃２、＃３および＃４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＦＳＨ生物活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、それらの野生型対応物と比較して、驚くほど増強された効力および増加した生物学的半減期を示す修飾超活性糖タンパク質ホルモン分子を提供する。修飾されていることは、タンパク質が野生型糖タンパク質ホルモンとは異なるアミノ酸配列を含有すると同時に、配列が、別の種の既知の糖タンパク質ホルモン配列と同一ではないように変えられていることを意味する。超活性は、効力および有効性を含めたいろいろなパラメーターに従って評価されてもよい。効力は、最大半量反応を測定することによって決定される生物活性のパラメーターである。効力における差は、ベースラインと最大値の中間（ＥＣ50）である類似体の糖タンパク質ホルモン反応の値、対、野生型糖タンパク質ホルモンの値を比較することによって決定される。糖タンパク質ホルモン反応は、精製タンパク質を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されても、または修飾タンパク質をコードする核酸の一過性トランスフェクション後に推定されてもよい。糖タンパク質ホルモン反応は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち前記糖タンパク質ホルモン類似体に反応性である動物において測定されてもよい。かかる反応は、その受容体に結合する糖タンパク質ホルモンの任意の既知の細胞または生物学的および定量的または定性的反応、例えばｃＡＭＰ生成、プロゲステロンなどのタンパク質の合成、受精率、胚盤胞形成率、受精卵母細胞当たりの胚発生などを包含する。有効性（Ｖｍａｘ）または最大反応は、生物活性の別のパラメーターである。ここで考察されるように、生物活性のパラメーターは、アッセイ細胞系における受容体数および受容体カップリングに依存して変動し得る。より低い受容体数または障害性のカップリングを有する系では、差は、Ｖｍａｘ（有効性）の観点からより識別可能である。受容体が過剰発現される系では、効力における差は、より明らかである。
【００１４】
例えば、修飾糖タンパク質ホルモンが修飾ＦＳＨまたはＣＧ分子である例では、卵母細胞の量、受精率ならびに胚盤胞および胚形成率などのｉｎ  ｖｉｖｏ定量的および定性的パラメーターは、卵母細胞数に関する最大有効量で測定されてもよい。卵母細胞数に関する最大有効量は、卵母細胞の質と量の両方に関する超活性ＦＳＨの最適な量である。卵母細胞数に関する最大有効量は、動物の質量および代謝速度に依存する。例えば、より遅い代謝速度を有するより大きい動物に関する最大有効量は、より高い代謝速度を有するより小さい動物に関する最大有効量よりも大きい。最大有効量は、各動物に関して経験的に決定される。
【００１５】
しかしながら、使用される系にかかわらず、本発明の修飾超活性糖タンパク質ホルモンタンパク質は、野生型対応物と比較して、効力の少なくとも約２〜１０倍の増加もしくは効力の少なくとも約２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくはさらに１００倍の増加、または野生型対応物と比較して、最大有効性の約２〜１０％の増加、もしくは最大有効性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはさらに１００％の増加を示し得る。本発明の超活性な類似体は、野生型ＦＳＨと比較して、効力の約５〜１０倍の増加または最大有効性の５％〜１０％の増加ももたらし得る。本発明の修飾タンパク質のいくつかは、野生型と比較して、効力の少なくとも約３０〜５０倍の増加または最大有効性の３０％〜５０％の増加を示し得る。したがって、本発明の修飾タンパク質は、低受容体数または反応を有する系においてさえ、効力の少なくとも１０倍の増加または最大有効性の１０％の増加を維持し得るので、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、低受容体数または受容体反応における欠損を有する対象を処置するのに有用であり得る。
【００１６】
修飾超活性糖タンパク質ホルモンの吸収速度は、作用の期間増加をもたらし得る。減少した吸収速度および作用の期間増加を有する修飾糖タンパク質ホルモン類似体は、受胎障害に罹患したものなどの感受性が低下した対象に有益であり得る。吸収速度は、Ｋaによって測定される。排出速度は、Ｋeによって測定される。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、哺乳動物、鳥類、および魚類などの全ての動物種の修飾タンパク質を含む。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンは、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トラ、ライオン、パンダ、オポッサム、ウサギ、マウス、鳥類、または魚アルファサブユニット由来のアルファサブユニットを含んでもよい。魚類糖タンパク質ホルモン（ＧＴＨ−１としても既知である）は、水産養殖において、すなわち、絶滅危惧または飼育されている他の魚類種の成長を補助するために、使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの他の種は、農業育種に、さらに、様々な雄および雌糖タンパク質ホルモン関連状態に及ぼす種々の複合変異の効果を試験するための実験室環境に使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、トラ、ライオン、およびシマウマなどであるがこれらに限定されない絶滅危惧種の保護および促進にも使用され得る。
【００１７】
修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型アルファサブユニットに由来する変異アルファサブユニットを含んでもよい。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、野生型ヒトアルファサブユニット（配列番号６）、野生型ウシアルファサブユニット（配列番号２）、野生型ブタアルファサブユニット（配列番号５）および野生型ヒツジアルファサブユニット（配列番号３）、野生型イヌアルファサブユニット（配列番号４７）、野生型ネコアルファサブユニット（配列番号５０）、野生型ウサギアルファサブユニット（配列番号５３）、野生型ヤギアルファサブユニット（配列番号５５）、野生型オポッサムアルファサブユニット（配列番号５７）、野生型コイアルファサブユニット（配列番号６７）、野生型サケアルファサブユニット（配列番号６９）、野生型ウマアルファサブユニット（配列番号４）、野生型ニワトリアルファサブユニット（配列番号５９）、野生型シチメンチョウアルファサブユニット（配列番号６１）、野生型ダチョウアルファサブユニット（配列番号６３）、または野生型ナマズアルファサブユニット（配列番号６５）に由来する。
【００１８】
修飾糖タンパク質ホルモン分子は、本明細書で開示された、修飾ヒト（例えば配列番号１１）、ウシ（例えば配列番号７）、イヌ（例えば配列番号４８）、ネコ（例えば配列番号５１）、ウマ（例えば配列番号９）、ブタ（例えば配列番号１０）、ヒツジ（例えば配列番号９）、オポッサム（例えば配列番号５８）、ウサギ（例えば配列番号５４）、鳥類（例えば配列番号６０、６２、および６４）、および魚類（例えば配列番号６６、６８、７０、および７１）分子における位置に相当する位置での置換を有してもよく、これは、Ｇａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎおよびＣｏｍｐａｒｅなどのＤＮＡＳＩＳ、ＡＬｌＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧＣＧプログラムを含むが、これらに限定されない任意のアラインメントプログラムを使用して同定されてもよい。
【００１９】
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、アルファサブユニットのアルファ−Ｌ１ループにおける少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含む修飾アルファ−サブユニットを少なくとも含む。ヒトアルファサブユニットでは、塩基性アミノ酸は、野生型ヒトアルファサブユニット（配列番号６）の位置１３、１４、１６および／または２０で導入されてもよい。他の種では、塩基性アミノ酸は、野生型ウシアルファサブユニット（配列番号２）、野生型ブタアルファサブユニット（配列番号５）および野生型ヒツジアルファサブユニット（配列番号３）、野生型イヌアルファサブユニット（配列番号４７）、野生型ネコアルファサブユニット（配列番号５０）、野生型ウサギアルファサブユニット（配列番号５３）、野生型ヤギアルファサブユニット（配列番号５５）、野生型オポッサムアルファサブユニット（配列番号５７）、野生型コイアルファサブユニット（配列番号６７）、および野生型サケアルファサブユニット（配列番号６９）の位置１５、１７、１８、２０および／または２４、野生型ウマアルファサブユニット（配列番号４）の位置１５、１８、２０および／または２４、野生型ニワトリアルファサブユニット（配列番号５９）、野生型シチメンチョウアルファサブユニット（配列番号６１）、および野生型ダチョウアルファサブユニット（配列番号６３）の位置１５、１７、１８、および／または２４、ならびに野生型ナマズアルファサブユニット（配列番号６５）の位置１２、１４、１５、１７、および／または２１に相当する位置で導入されてもよい。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、および／またはリシンとすることができる。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンおよび／またはヒスチジンとすることができる。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンとすることができる。
【００２０】
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、アルファサブユニットのＮ末端近くの１つまたは複数の挿入断片を含んでもよい。挿入断片は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＸ3Ｘ4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、独立に任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ1およびＸ2は、独立にＶまたはＩまたはＡである。一部の実施形態では、Ｘ3およびＸ4は、独立にＴまたはＳであり、Ｘ3Ｘ4は、ＴＴ、ＳＳ、ＴＳ、またはＳＴである。一部の実施形態では、挿入断片は、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位の少なくとも１つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。一部の実施形態では、２つ以上のＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位がアルファユニットに導入される。一部の実施形態では、２つ以上のＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位は、単一アミノ酸によって隔てられており、ここで、一部の実施形態では、アミノ酸は、ＶまたはＩである。
【００２１】
配列ＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）またはＴＮＶＴＩＮＶ（配列番号１２）またはＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）を有するペプチドは、ヒトアルファサブユニット（配列番号６）のアミノ酸Ｄ３とＱ５の間、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコアルファサブユニットのＦ６とＴ７の間、ウサギアルファサブユニットのＦ６とＡ７の間、ヤギアルファサブユニットのＦ６とＭ７の間、オポッサムアルファサブユニットのＦ６とＩ７の間、ニワトリ、シチメンチョウ、およびダチョウアルファサブユニットのＦ６とＬ７の間、およびナマズアルファサブユニットのＮ３とＤ４の間に挿入されてもよい。代わりに、ウマの修飾糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットは、Ｆ６とＴ７の間のＮＶの挿入断片に加えてＴ７とＴ８の間のＩＮＶの挿入断片を含んでもよい。本発明の修飾タンパク質は、さらなる置換、特にタンパク質の増強された特性を改変しない保存的置換も含有してもよい。しかしながら、典型的には、かかる修飾タンパク質は、上記で列挙したもの以外の位置での５つ未満の置換を含有することになり、上記で列挙した位置以外の位置における相当する野生型糖タンパク質ホルモンアルファとの完全なアミノ酸配列同一性を示し得る。
【００２２】
塩基性アミノ酸は、アミノ酸リシン、アルギニン、およびヒスチジン、ならびにこれら３つのアミノ酸のいずれかへの修飾形とすることができる任意の他の塩基性アミノ酸、通常天然に見出されない合成塩基性アミノ酸、または中性ｐＨで正に荷電している任意の他のアミノ酸を含む。とりわけ、塩基性アミノ酸は、リシンおよびアルギニンからなる群から選択される。
【００２３】
塩基性アミノ酸置換およびペプチド挿入断片を有する例示的修飾アルファ分子は、配列番号１１および２１（ヒト）、配列番号７、１４〜１９、および２２（ウシ）、配列番号８、４６、７９〜８０（ヒツジ）、配列番号１０、４５、および７７〜７８（ブタ）、配列番号９、３８〜４２、および７２〜７６（ウマ）、配列番号４８〜４９（イヌ）、配列番号５１〜５２（ネコ）、配列番号５４（ウサギ）、配列番号５６（ヤギ）、配列番号５８（オポッサム）、配列番号６０（ニワトリ）、配列番号６２（シチメンチョウ）、配列番号６４（ダチョウ）、配列番号６６（ナマズ）、配列番号６８（コイ）、ならびに配列番号７０〜７１（サケ）に示されている。本発明は、配列番号７〜１１、１４〜１９、２１〜２２、３８〜４２、４５〜４６、４８〜４９、５１〜５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および７０〜８０のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００２４】
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の修飾アルファサブユニットは、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの塩基性アミノ酸置換を含むアルファサブユニットを有してもよい。置換アミノ酸は、任意の非塩基性アミノ酸とすることができる。一部の実施形態では、非塩基性アミノ酸は、リシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基またはグルタミン残基とすることができる。例えば、野生型ウシアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０、２４での１つまたは複数のリシンおよび位置１８でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヒトアルファサブユニットでは、位置１３および２０での１つまたは複数のグルタミンならびに位置１４でのグルタミン酸および位置１６でのプロリンは、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ブタアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のリシンおよび位置１８でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヒツジアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のリシンおよび位置１８でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ウマアルファサブユニットでは、位置１５、２０および２４での１つまたは複数のリシンおよび位置１８でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。
【００２５】
さらに、野生型イヌアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ネコアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ウサギアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヤギアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型コイアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型サケアルファサブユニットでは、位置１５、１７、２０および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ニワトリアルファサブユニットでは、位置１５、１７および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型シチメンチョウアルファサブユニットでは、位置１５、１７および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ダチョウアルファサブユニットでは、位置１５、１７および２４での１つまたは複数のアミノ酸および位置１８でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ダチョウアルファサブユニットでは、位置１２、１４、１７、および２１での１つまたは複数のアミノ酸および位置１５でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。
【００２６】
例えば、修飾ウシアルファサブユニットは、配列番号７、１４〜１９、および２２に示される配列に示されている。本発明は、配列番号７、１４〜１９および２２のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウマアルファサブユニットは、配列番号９、３８〜４２および７２〜７６に示される配列に示されている。本発明は、配列番号９、３８〜４２および７２〜７６のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００２７】
例えば、修飾ヒツジアルファサブユニットは、配列番号８、４６、および７９〜８０に示される配列に示されている。本発明は、配列番号８、４６、および７９〜８０のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ブタアルファサブユニットは、配列番号１０、４５、および７７〜７８に示される配列に示されている。本発明は、配列番号１０、４５および７７〜７８のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾イヌアルファサブユニットは、配列番号４８〜４９に示される配列に示されている。本発明は、配列番号４８〜４９のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００２８】
例えば、修飾ネコアルファサブユニットは、配列番号５１〜５２に示される配列に示されている。本発明は、配列番号５１〜５２のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウサギアルファサブユニットは、配列番号５４に示される配列に示されている。本発明は、配列番号５４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００２９】
例えば、修飾ヤギアルファサブユニットは、配列番号５６に示される配列に示されている。本発明は、配列番号５６との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾オポッサムアルファサブユニットは、配列番号５８に示される配列に示されている。本発明は、配列番号５８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００３０】
例えば、修飾ニワトリアルファサブユニットは、配列番号６０に示される配列に示されている。本発明は、配列番号６０との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾シチメンチョウアルファサブユニットは、配列番号６２に示される配列に示されている。本発明は、配列番号６２との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ダチョウアルファサブユニットは、配列番号６４に示される配列に示されている。本発明は、配列番号６４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００３１】
例えば、修飾ナマズアルファサブユニットは、配列番号６６に示される配列に示されている。本発明は、配列番号６６との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾コイアルファサブユニットは、配列番号６８に示される配列に示されている。本発明は、配列番号６８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾サケアルファサブユニットは、配列番号７０〜７１に示される配列に示されている。本発明は、配列番号７０〜７１のいずれかとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
【００３２】
目的のアルファサブユニットのアミノ酸配列を他の種のものと比較して、他の種のタンパク質における相当する塩基性残基を同定することによって、さらなる修飾アルファサブユニットを設計してもよい。かかる方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３６１，９９２号に開示されている。比較および置換のためにどの種を選択するべきかに関して、様々な種からの糖タンパク質ホルモンの相対的生物活性も考慮に入れることができる。さらに、関連糖タンパク質ホルモンの構造に基づくホモロジーモデリングは、表面曝露アミノ酸残基を同定するのに有用である。追加のアミノ酸位置を修飾するために、ヒトおよび非ヒトからの糖タンパク質ホルモン配列は、ＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）などの標準的コンピュータソフトウェアプログラムまたはＧａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎおよびＣｏｍｐａｒｅなどのＡＬＩＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧＣＧプログラムを含むが、これらに限定されない、上記で列挙した他のアラインメントプログラムのいずれかを使用して整列され得る。次いで、ヒトおよび非ヒト糖タンパク質ホルモン間で異なるアミノ酸残基は、上記の技法の１つを使用して置換され、生じた糖タンパク質ホルモンは、本明細書で言及したアッセイの１つを使用してその抗力に関してアッセイされ得る。
【００３３】
したがって、本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＦＳＨよりも増加した効力を有する修飾ＦＳＨタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＬＨよりも増加した効力を有する修飾ＬＨタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＴＳＨよりも増加した効力を有する修飾ＴＳＨタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型ＣＧよりも増加した効力を有する修飾ＣＧタンパク質も提供する。
【００３４】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモンを投与することを含む、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＦＳＨ類似体）を投与することを含む、動物における過剰排卵を誘導するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＦＳＨ類似体）を投与することを含む、動物における自然もしくは人工授精または胚移植が後に続く体外受精を促進するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＦＳＨ類似体）を投与することを含む、動物における不妊症を処置するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＦＳＨ類似体）を投与することを含む、動物に関する卵子保存を改善するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ類似体）を投与することを含む、動物における胚性胎児消失を防ぐための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ類似体）を投与することを含む、動物の妊娠を維持するための方法であって、動物が妊娠し得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ類似体）を投与することを含む、動物における停留睾丸を処置するための方法であって、動物がこの状態によって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ類似体）を投与することを含む、動物における性腺機能低下症を処置するための方法であって、動物がこの状態によって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＣＧ類似体）を投与することを含む、動物における発情期までの期間を減らし、これを同期させるための方法であって、動物が発情期を有する任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＴＳＨ類似体）を投与することを含む、動物の代謝的健康状態を評価するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＴＳＨ類似体）を含む、動物における甲状腺および／または他のがんを診断するかつ／または処置するための方法であって、動物がかかるがんによって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
【００４４】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えば、ＦＳＨ類似体）は、自然もしくは人工授精または胚移植の前に、体外受精を用いる獣医学的過剰排卵に使用され得る。一部の種（例えばヒト）では、修飾糖タンパク質ホルモンは、不妊症を有する対象を処置するために、および卵子バンキング（ｅｇｇ  ｂａｎｋｉｎｇ）に使用され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えば、ＬＨ類似体）は、獣医学的胚性胎児消失を防ぎ、妊娠を維持するために使用され得る。一部の種（例えばヒト）では、修飾糖タンパク質ホルモンは、停留睾丸における精巣の下垂を促進し、性腺機能低下症を処置するために使用され得る。
【００４５】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えば、ＣＧ類似体）は、未交尾のブタ、周期がない未経産雌ブタ（ｎｏｎ−ｃｙｃｌｉｎｇ  ｇｉｌｔ）、周期がある未経産雌ブタ（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｇｉｌｔ）、分娩後または離乳後無発情期を有する雌ブタ、通常の繁殖期にない経産雌ヒツジ、およびウシ胚移植レシピエントを含むが、これらに限定されない様々な動物における発情の期間を減らす、これを同期させる、または誘導するために使用され得る。
【００４６】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＴＳＨ類似体）は、全ての種における甲状腺および／または他のがんを診断するかつ／または処置するために使用され得る。
本発明は、水産養殖において使用され得る薬剤および方法も提供する。アルファユニットにおける挿入および置換は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＣＧ、およびＬＨの活性を著しく増強する。ある種からの修飾糖タンパク質は、著しいヘテロ甲状腺刺激効果（ｈｅｔｅｒｏｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）とともに別の種を処置するために使用され得る。例えば、修飾ヒトＴＳＨ（ＴＲ−１４０１）および修飾ヒトＦＳＨ（ＴＲ−４４０１）は、キンギョの血漿Ｔ４レベルに及ぼす著しい効果を有することが研究において示された。Miller et al., Thyrotropic activity of recombinant human glycoprotein hormone analogs and pituitary mammalian gonadotropins in goldfish (Carassius auratus): Insights into the evolution of thyrotropin receptor specificity, General and Comparative Endocrinology, 166 (2012), 70-75の図５、表１、および図８を参照されたい。その全体が組み込まれているこの研究も、修飾糖タンパク質ホルモンに関する拡大された潜在的使用を実証しているが、これはなぜならある種由来のスーパーアゴニストは、著しい効果とともに他の種、例えば魚類に使用され得るからである。特に、魚類または他の種由来の修飾糖タンパク質ホルモンは、魚類成長を補助し、繁殖を改善し、魚類集団を維持かつ／または拡大するために使用され得る。
【００４７】
本発明は、絶滅危惧種を保護するために使用され得る薬剤および方法も提供する。修飾糖タンパク質ホルモンの交差活性化（ｃｒｏｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）効果により、ある動物種、例えばヒトまたはウシからのスーパーアゴニストは、著しい効果とともに別の種、例えばトラまたはライオンに投与され得る。したがって、修飾糖タンパク質ホルモンは、絶滅危惧種の繁殖を促進し、絶滅危惧種の集団を拡大するために使用され得る。
【００４８】
本発明は、スーパーアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する本明細書で記載された類似体の断片も包含する。例えば、本発明の修飾アルファ鎖の断片は、スーパーアゴニスト化合物を創出するために単独でまたは断片もしくは全長ベータ鎖と組み合わせて使用され得る。一部の場合では、本発明の修飾アルファサブユニット分子の断片は、例えば、それが投与された後に糖タンパク質ホルモン療法の活性の持続時間を限定するために、アンタゴニストとしても使用され得る。
本発明は、本明細書で記載された修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸配列も提供する。本発明は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする核酸も提供する。単離核酸は、上記で同定された配列との少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードしてもよい。単離核酸は、上記で同定された受託番号によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。輸送体をコードする単離核酸は、上記で同定された核酸配列にハイブリダイズしてもよい。
【００４９】
修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸は、発現のために発現調節配列に遺伝的に融合していてもよい。適した発現調節配列は、標的宿主生物において適用可能であるプロモーターを含む。かかるプロモーターは、原核および真核生物からの多様な宿主に関して当業者に既知であり、文献に報告されている。例えば、かかるプロモーターは、自然発生の遺伝子から単離されても、または合成もしくはキメラプロモーターであってもよい。
【００５０】
本発明は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸をベクターなどの標的核酸分子に挿入するための発現カセットも提供する。この目的のために、発現カセットは、例えば、制限酵素認識部位、または例えばリコンビナーゼによって触媒される相同組換えのための標的配列などの特定の配列位置から除去され、特定の配列位置に挿入されるように、５’−および３’−隣接領域にあるヌクレオチド配列が加えてある。本発明の核酸分子または発現カセットに加えて、ベクターは、適した宿主細胞における適した条件下での前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含有してもよい。一般に、ベクターは、１つまたは複数の複製開始点も含有する。ベクターは、本発明の輸送体をコードする核酸を超えた転写の長さを限定するための転写終結配列を含んでもよい。
【００５１】
有利なことには、ベクターに含有される核酸分子は、原核または真核細胞における発現を可能にする、すなわち翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を保証する発現調節配列に作動可能に連結している。
単離されたという用語は、巨大分子の天然源に存在する他の細胞／組織成分（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）から分離された分子を表す。本明細書では、単離されたという用語は、組換えＤＮＡ技法によって産生された場合、細胞物質、ウイルス物質、および培養培地を実質的に含まない核酸あるいはペプチド、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸あるいはペプチドも表す。さらに、単離核酸またはペプチドは、天然に断片としてあるのではなく、天然状態で見出されない核酸またはペプチド断片を含んでもよい。
プラスミドおよびベクターという用語は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形であるので、互換的に使用される。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たす、現時点以降に当技術分野で既知になる発現ベクターの他の型を含むことが意図されている。ベクターは、望ましい配列が種々の遺伝的環境間の輸送または宿主細胞における発現に関する制限およびライゲーションによって導入されていてもよい多くの核酸のいずれかとすることができる。ベクターは、ＲＮＡベクターも利用可能であるけれども、典型的にはＤＮＡからなる。ベクターは、プラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することができるクローニングベクターであって、ベクターを決まったかたちで切断し、そこに望ましいＤＮＡ配列を、新しい組換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するようにライゲートできる１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるクローニングベクターである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数が増加するにつれて多数回、または宿主が有糸分裂によって繁殖する前に宿主あたり単回のみ生じてもよい。ファージの場合、複製は、溶解段階中に活発に、または溶原段階中に受動的に生じ得る。
【００５２】
ベクターは、プロモーター配列をさらに含有してもよい。プロモーターは、核酸の転写を開始するための部位を含有するコード領域の上流に通常位置している非翻訳核酸配列を含んでもよい。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして働く他のエレメントも含んでもよい。本発明のさらなる実施形態では、発現ベクターは、組み込まれた発現ベクターを有する細胞の選択を助ける追加の領域を含有する。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によってしばしば（包括的に）結合されており、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含むように上流（５’方向）に伸びている。プロモーター配列内では、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を司るタンパク質結合性ドメインが見出されることになる。真核生物プロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＴボックスをしばしば含有することになるが、常にではない。プロモーターの活性化は、例えばいくつかの組織においてのみ発現される転写因子によって、いくつかの細胞もしくは組織に特異的であってもよいか、またはプロモーターはユビキタスであり、大部分の細胞もしくは組織における発現の能力があってもよい。
【００５３】
ベクターは、ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞の同定および選択における使用に適した１つまたは複数のマーカー配列をさらに含有してもよい。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物への抵抗性または感受性を増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で既知の標準的アッセイによって検出可能である酵素（例えば、βガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクト細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に見かけ上影響する遺伝子を含む。ベクターは、自律複製の能力、およびそれが作動可能に結合されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物を発現させる能力があるベクターとすることができる。発現ベクターは、それが制御配列に作動可能に結合または作動可能に連結し、ＲＮＡ転写物として発現され得るように、望ましい核酸配列が制限およびライゲーションによってそこに挿入され得る発現ベクターである。発現は、細胞における内在性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳を表す。
【００５４】
コード配列および制御配列は、それらがコード配列の発現または転写を制御配列の影響または調節下に置くような方法で共有結合している場合、作動可能に結合している。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらし、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を方向付ける能力に干渉せず、（３）相当するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉もしない場合、作動可能に結合していると言われる。したがって、プロモーター領域が、生じた転写物が望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるようにそのＤＮＡ配列の転写に影響する能力がある場合、プロモーター領域は、コード配列に作動可能に結合している。
【００５５】
本発明の一部の態様は、核酸の形質転換および／またはトランスフェクションを含む。形質転換は、原核細胞の内部への外来性または異種性核酸の導入である。トランスフェクションは、真核細胞の内部への外来性または異種性核酸の導入である。形質転換するまたはトランスフェクトする核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）ていてもいなくてもよい。原核生物では、例えば、形質転換する核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのエピソームエレメント上で維持されてもよい。真核細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトする核酸が染色体複製を介して娘細胞に遺伝するように染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、真核細胞がトランスフェクト核酸を含有する娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを樹立する能力によって実証される。
【００５６】
核酸挿入断片の発現に有用である当業者に既知の多数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））発現ベクターがある。使用に適切な他の微生物宿主は、枯草菌などの桿菌、ならびにサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌を含む。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製開始点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系などの任意の数のいろいろな既知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列とともに発現を調節し、例えば、転写および翻訳を開始し、完了するためのリボソーム結合部位配列を有する。必要な場合、アミノ末端メチオニンが、下流核酸挿入断片とともに５’およびインフレームのＭｅｔコドンの挿入によって提供され得る。また、核酸挿入断片のカルボキシ末端伸長は、標準的オリゴヌクレオチド突然変異誘発手順を使用して除去され得る。
【００５７】
加えて、酵母発現が使用され得る。酵母発現系のいくつかの利点がある。第一に、酵母分泌系において産生されたタンパク質が正確なジスルフィド対形成を示すという証拠が存在する。第二に、翻訳後グリコシル化は、酵母分泌系によって効率的に行なわれる。出芽酵母プレプロアルファ因子（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−ｆａｃｔｏｒ）リーダー領域（ＭＦ”−１遺伝子によってコードされる）は、酵母からのタンパク質分泌を方向付けるために常法に従って使用される（Brake, Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 4642-4646 (1984)）。プレプロアルファ因子のリーダー領域は、ＫＥＸ２遺伝子によってコードされる酵母プロテアーゼに関する認識配列を含むシグナルペプチドおよびプロセグメントを含有する：この酵素は、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシ側上の前駆体タンパク質を切断する。ＦＳＨコード配列は、プレプロアルファ因子リーダー領域にインフレームで融合していてもよい。次いで、この構築物は、アルコール脱水素酵素Ｉプロモーターまたは解糖プロモーターなどの強力な転写プロモーターの調節下に置かれる。核酸コード配列の後ろには、翻訳終止コドンが続き、この後ろには、転写終止シグナルが続く。代わりに、核酸コード配列は、Ｓｊ２６またはベータガラクトシダーゼなどの第２のタンパク質コード配列に融合していてもよく、これは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するために使用され得る。融合タンパク質の構成要素を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母における発現に使用される構築物に適用可能である。効率的な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現は、バキュロウイルス系においても達成され得る。
【００５８】
哺乳動物細胞は、フォールディングおよびシステイン対形成などの重要な翻訳後修飾を好む環境におけるタンパク質の発現、複合炭水化物構造体の付加、および活性タンパク質の分泌を可能にする。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルの間のタンパク質コード配列の挿入によって特徴付けられる。ベクターは、ハイグロマイシン抵抗性、ゲンタマイシン抵抗性を与える遺伝子、または選択マーカーとしての使用に適切な他の遺伝子もしくは表現型、または遺伝子増幅のためのメトトレキサート抵抗性を含有してもよい。キメラタンパク質コード配列は、メトトレキサート抵抗性コードベクターを使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、または適した選択マーカーを使用して他の細胞系に導入されてもよい。形質転換細胞におけるベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット分析によって確認されてもよい。挿入断片コード配列に相当するＲＮＡの産生は、ノーザンブロット分析によって確認されてもよい。インタクトなヒトタンパク質を分泌する能力があるいくつかの他の適した宿主細胞系が当技術分野で開発され、これらは、ＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、Ｊｕｒｋａｔ細胞などを含む。これらの細胞に関する発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要な情報プロセシング部位を含んでもよい。例示的発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。目的の核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主の型に依存して変動する既知の方法によって宿主細胞中に移されてもよい。例えば、塩化カルシウム形質転換は、一般に原核細胞に利用され、一方、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、もしくはリポフェクチン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションが、他の細胞宿主に使用され得る。
【００５９】
哺乳動物細胞における遺伝子の発現に関する代替のベクター、ヒトガンマインターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、凝固因子ＶＩＩＩ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸性主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものと同様のものが用いられてもよい。さらに、ベクターは、ＣＭＶプロモーター配列および哺乳動物細胞（ＣＯＳ−７など）における挿入された核酸の発現に利用可能なポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【００６０】
遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ合成は、ベクターのための宿主細胞として役立ち得る原核または真核細胞を形質転換することを含む。代わりに、遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において行ってもよい。例えば、比較的大きな量のｍＲＮＡを合成するために常法に従って使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系が市販されている。かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系では、糖タンパク質ホルモンをコードする核酸は、転写プロモーターに隣接する発現ベクター中にクローニングされる。例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩクローニングおよび発現ベクターは、強力な原核転写プロモーターが隣接する複数のクローニング部位を含有する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどのＤＮＡ鋳型からのＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のための全ての必要な試薬を含有するキットが入手可能である（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。次いで、このような系によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製されたＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されて、望ましい糖タンパク質ホルモンを生ずる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【００６１】
糖タンパク質ホルモンを作製する別の方法は、タンパク質化学技法によって２つのペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学的手法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、現在入手可能な実験装置を使用して化学的に合成され得る。当業者は、ハイブリッド糖タンパク質ホルモンに相当するペプチドまたはポリペプチドが標準的化学反応によって合成され得ることを容易に理解することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され、その合成樹脂から切断されなくてもよく、一方、ハイブリッドペプチドの他の断片は、合成され、その後樹脂から切断されてもよく、それによって他の断片上で機能的にブロックされている末端基が曝露される。ペプチド縮合反応によって、これら２つの断片は、それぞれ、それらのカルボキシおよびアミノ末端でのペプチド結合を介して共有結合されてハイブリッドペプチドが形成され得る（Grant, Synthetic Peptides: A User Guide, W.H. Freeman (1992)およびBodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1993)）。代わりに、ペプチドまたはポリペプチドは、上記のようにｉｎ  ｖｉｖｏで独立に合成されてもよい。いったん単離されると、これらの独立的なペプチドまたはポリペプチドは、連結されて、同様のペプチド縮合反応を介して糖タンパク質ホルモンを形成し得る。例えば、クローニングされたまたは合成ペプチドセグメントの酵素的または化学的ライゲーションは、比較的短いペプチド断片が連結されて、より大きいペプチド断片、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を作製することを可能にし得る（Abrahmsen, Biochemistry, 30:4151 (1991)； Dawson, Science, 266:776-779 (1994)）。
【００６２】
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、そのポリペプチド断片を産生する能力がある発現系においてポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質とすることができる。例えば、ベータサブユニットと一緒に、糖タンパク質ホルモン受容体と相互作用し、糖タンパク質ホルモンと関連する生物学的効果を引き起こすことができる修飾アルファサブユニットの活性ドメインを決定することができる。一例では、糖タンパク質ホルモンの活性または結合特異性もしくはアフィニティーに寄与することが見出されていないアミノ酸は、それぞれの活性を減少させることなく欠失させ得る。
【００６３】
例えば、アミノまたはカルボキシ末端アミノ酸は、天然または修飾糖タンパク質ホルモンから順次除去され、それぞれの活性が上記の多くの利用可能なアッセイの１つにおいて試験され得る。別の例では、本発明の修飾タンパク質は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端アミノ酸の部分、または修飾糖タンパク質ホルモンの精製を促進することができるポリペプチド断片もしくはビオチンなどの他の部分と置き換えられているホルモンの内部領域さえも有してもよい。例えば、修飾糖タンパク質は、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドをもたらすように、２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を発現ベクター中にクローニングするペプチド化学的手法によりマルトース結合性タンパク質に融合していてもよい。ハイブリッドポリペプチドは、それをアミロースアフィニティーカラム上を通過させることによってアフィニティー精製されてもよく、次いで、修飾糖タンパク質は、特異的プロテアーゼ因子Ｘａでハイブリッドポリペプチドを切断することによって、マルトース結合性領域から分離されてもよい。
【００６４】
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子の活性断片は、直接的に合成されてもまたはより大きい糖タンパク質ホルモンの化学的もしくは機械的破壊によって得られてもよい。活性断片は、関連する活性、例えば、結合または制御活性を有する、自然発生のアミノ酸配列由来の少なくとも約５つの連続的アミノ酸のアミノ酸配列と定義される。断片は、他の配列に結合していようといまいと、ペプチドの活性が修飾糖タンパク質ホルモンと比較して著しく改変または障害されないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾も含んでもよい。これらの修飾は、ジスルフィド結合の能力があるアミノ酸を除去する／付加する、その生物寿命を増加させるなどのいくつかの追加の特性を提供してもよい。いずれにせよ、ペプチドは、結合活性、結合ドメインでの結合の制御などの生物活性特性を有さなければならない。糖タンパク質ホルモンの機能性または活性領域は、ホルモンの特定の領域の突然変異誘発、その後の発現および発現されたポリペプチドの試験によって同定され得る。かかる方法は、当業者に容易に明らかであり、受容体をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含み得る。
【００６５】
本発明は、例えば、ＦＳＨ糖タンパク質への融合を含めた本明細書で記載された変異を含む融合タンパク質およびキメラタンパク質も包含する。かかる融合タンパク質は、正しいコードフレームで、当技術分野で既知の方法によって望ましいアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートし、上記の手段のいずれかによって融合タンパク質を発現させることによって産生させてもよい。代わりに、かかる融合タンパク質は、例えば、ペプチド合成機を使用して、タンパク質合成技法によって作製されてもよい。本発明の単鎖類似体およびキメラタンパク質は、アルファとベータサブユニット間、またはキメラタンパク質の種々の部分間のペプチドリンカーを組み込んでもよい。
【００６６】
糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニストの特徴付け
本明細書で記載された野生型糖タンパク質ホルモンの修飾の効果は、多くの方法で確認され得る。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の第２のメッセンジャー系への変化は、測定され、かつ野生型糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた同様の細胞と比較され得る。代わりに、修飾糖タンパク質ホルモンの活性は、受容体結合性アッセイから、チミジン取込みアッセイから、プロゲステロン産生アッセイから、またはＴ４分泌アッセイから決定され得る。当業者は、野生型または修飾糖タンパク質ホルモンの活性を決定するために用いる任意の適切なアッセイを容易に決定することができる。
本発明の一実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの効力よりも増加した効力を有する。この増加した効力は、上記の技法のいずれかによってまたは当業者によって容易に決定される任意の他の適切なアッセイで評価され得る。増加した効力は、アッセイ間、または細胞系間で一貫している必要はなく、これらは当然、変動することになる。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの最大有効性よりも増加した最大有効性を有する。この増加した最大有効性は、上記の技法のいずれかによってまたは当業者によって容易に決定される任意の他の適切なアッセイで評価され得る。増加した最大有効性は、アッセイ間、または細胞系間で一貫している必要はなく、これらは当然、変動することになる。
本明細書で記載された類似体を特徴付けるのに適した他のアッセイは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ９９／０５９０８に報告されている。例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技法を使用した競合および非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない様々なイムノアッセイが使用され得る。
【００６８】
例えば、ベータサブユニットがＦＳＨのものである場合、卵母細胞の質および量の改善は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって評価され得る。超活性ＦＳＨは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、ヤク、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、ダチョウ、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、およびハタを含むが、これらに限定されない動物からの卵母細胞の質および量を改善するために使用され得る。
一部の実施形態では、超活性ＦＳＨは、ヒトまたは任意の動物に投与される。それは、卵母細胞形成、卵母細胞受精、および胚盤胞形成などの体外受精プロセスの種々のエンドポイントを使用して決定される卵母細胞量および質の改善に共通である。体外受精実験は、対象が本発明による超活性ＦＳＨ類似体で処置され，これが複数の卵母細胞の放出および成熟につながる「過剰排卵プロトコール」に続いてもよい。体外受精実験では、ＦＳＨ（超活性ＦＳＨおよび組換え野生型ＦＳＨ）は、排卵をトリガーするためのｈＣＧとともに投与されてもよい。ｈＣＧまたは妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）のみを投与される対照動物が使用され得る。卵母細胞の質は、動物における卵母細胞の受精率を増加させることによって改善され得る。超活性卵胞刺激ホルモンの受精率は、超活性ＦＳＨで達成された受精率を同量の組換え野生型ＦＳＨで達成された受精率と比較することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されてもよい。ｈＣＧを投与される対照動物も使用され得る。受精率は、卵母細胞の総数あたりの発達する２細胞期胚のパーセントによって測定され得る。受精がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる場合、２細胞期胚は、受精皿において計数され得る。マウスでは、２細胞期胚は、受精後約２４時間で発達する。受精率は、投与される超活性ＦＳＨの量に基づいて変動する。動物は、超活性ＦＳＨの複数用量を投与されてもよい。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約１０パーセント増加する。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加し得る。
【００６９】
超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚盤胞形成率を改善することによって卵母細胞の質を改善し得る。胚盤胞形成率は、胚盤胞を形成する２細胞期胚のパーセンテージを決定することによって測定され得る。胚盤胞形成率は、胚盤胞がｉｎ  ｖｉｖｏで形成しようとｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成しようと増加する。胚盤胞形成率は、投与される超活性卵胞刺激ホルモンの量に依存する。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として、少なくとも約１０パーセント増加する。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加し得る。
【００７０】
超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚の総数を増加させることによって卵母細胞の質を改善し得る。受精卵母細胞あたりの胚の総数の増加は、受精がｉｎ  ｖｉｖｏで起ころうとｉｎ  ｖｉｔｒｏで起ころうと増加する。受精卵母細胞あたりの胚の総数の増加は、投与される超活性卵胞刺激ホルモンの量に依存する。受精卵母細胞あたりの胚の総数は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として少なくとも約１０パーセント増加する。受精卵母細胞あたりの胚の総数は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性ＦＳＨの投与の結果として、少なくとも約２０パーセント、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加し得る。
【００７１】
一部の実施形態では、ベータサブユニットがＣＧのものである場合、強力な黄体ホルモン（ＬＨ）様活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイによって評価され得る。超活性ＣＧは、一部の種において排卵を誘導し、黄体の寿命を延ばし、プロゲステロン合成を増加させ、付属黄体（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｏｒｐｏｒａ  ｌｕｔｅａ）の形成を促進する。かかる作用は、一部の種におけるより効果的な卵母細胞収集、卵母細胞の質の増加、妊娠および妊娠維持率の増加をもたらす。
【００７２】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＦＳＨ類似体）は、自然もしくは人工授精または胚移植が後に続く体外受精を用いる獣医学的過剰排卵に使用され得る。一部の種（例えばヒト）では、修飾糖タンパク質ホルモンは、不妊症を有する対象を処置するためおよび卵子バンキングに使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、過剰排卵、自然または人工授精、不妊症および卵子保存に及ぼす効果によって評価され得る。
【００７３】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ類似体）は、獣医学的胚性胎児消失を防ぎ、妊娠を維持するために使用され得る。一部の種（例えばヒト）では、修飾糖タンパク質ホルモンは、停留睾丸における精巣の下垂を促進し、性腺機能低下症を処置するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、胎児消失、妊娠維持、停留睾丸における精巣の下垂、および性腺機能低下症処置に及ぼす効果によって評価され得る。
【００７４】
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＣＧ類似体）は、未交尾のブタ、周期がない未経産雌ブタ、周期がある未経産雌ブタ、分娩後または離乳後無発情期を有する雌ブタ、通常の繁殖期にない経産雌ヒツジ、およびウシ胚移植レシピエントを含むが、これらに限定されない、様々な動物における発情の期間を減らす、これを同期させる、またはこれを誘導するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、発情期の期間および同期化に及ぼす効果によって評価され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン（例えばＴＳＨ類似体）は、全ての種における甲状腺および／または他のがんを診断するかつ／または処置するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、かかる診断および処置に及ぼす効果によって評価され得る。
【００７５】
増加した血清半減期を有する糖タンパク質ホルモン類似体
また、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、血漿半減期が野生型対応物と比較して増加するように、さらに修飾されてもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、Ｎ−グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化部位を含む配列を含めた潜在的なグリコシル化部位をさらに含んでもよい。ネオグリコシル化部位は、野生型アルファサブユニットのＮ末端近くのペプチドの挿入によって導入され得る。グリコシル化部位は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、アルファサブユニットに導入されるＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位を含んでもよく、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、独立に任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ1およびＸ2は、独立にＶまたはＩまたはＡである。一部の実施形態では、Ｘ3およびＸ4は、独立にＴまたはＳである。一部の実施形態では、挿入断片は、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、ＮＸ1Ｔ、ＮＸ2Ｓ、またはＮＮＸ3Ｘ4グリコシル化部位の少なくとも１つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。一部の実施形態では、２つ以上のＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位がアルファユニットに導入される。一部の実施形態では、２つ以上のＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓグリコシル化部位は、単一アミノ酸によって隔てられており、ここで、一部の実施形態では、アミノ酸は、ＶまたはＩである。例えば、グリコシル化部位は、ＮＶＴ、ＮＶＴＩＮＶＴ、ＮＩＴ、ＮＩＴＩＮＩＴ、ＮＮＴＴ、ＮＮＴＳ、ＮＮＳＳ、またはＮＮＳＴを含んでもよい。
【００７６】
例えば、アルファサブユニットにおいてペプチドＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）またはＶＮＶＴＩＮＶＴ（配列番号２０）を含めると、アルファサブユニットの潜在的なグリコシル化部位となる。配列番号１または配列番号２０のペプチドは、ヒト野生型配列においてＤ３とＱ５の間に含めることができる。配列番号１または配列番号２０のペプチドは、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジ野生型配列においてＦ６とＴ７の間に含めることができる。挿入ペプチドは、アミノ末端での追加のトレオニン残基をさらに含んでもよい。グリコシル化を改変するために挿入するさらなるペプチドは、ＮＶ、ＩＮＶ、およびＴＮＶペプチド、ならびにＴＮＶＴＩＮＶ（配列番号１２）を含む。上記のように、目的は、ＮＶＴなどのグリコシル化部位をアルファサブユニットに導入することである。一部の実施形態では、グリコシル化部位における全てのアミノ酸は、挿入断片由来である。一部の実施形態では、グリコシル化部位における少なくとも１つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。例えば、グリコホルモン（ｇｌｙｃｏｈｏｒｍｏｎｅ）の修飾アルファサブユニットは、Ｆ６とＴ７の間のＮＶの挿入断片に加えてＴ７とＴ８の間のＩＮＶの挿入断片（例えば配列番号３８および３９）を含んでもよく、これは、アルファサブユニットにグリコシル化部位ＮＶＴＩＮＶＴを導入するが、ＮＶＴＩＮＶＴにおける全てのアミノ酸が挿入断片由来とは限らない。
【００７７】
一部の実施形態では、グリコシル化部位は、ＮＮＳＳ、ＮＮＴＴ、ＮＮＴＳ、およびＮＮＳＳ（例えば配列番号７２〜８０を参照されたい）などであるが、これらに限定されない、重複シークオンを含んでもよい。例えば、野生型ウマアルファユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモンでは、配列番号７２〜７６におけるタンパク質配列は、ＮＮＴＴ（配列番号７２および７３）、ＮＮＳＴ（配列番号７４）、ＮＮＳＳ（配列番号７５）、またはＮＮＴＳ（配列番号７６）グリコシル化部位を含み、ここで、グリコシル化部位のアミノ酸は、挿入断片の一部であってもなくてもよい。野生型ブタアルファサブユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモンでは、配列番号７７および７８におけるタンパク質配列は、ＮＮＴＴを含んでもよく、ここで、配列番号７７では、挿入断片は、Ｆ６とＴ７の間のＮＮＴであり、配列番号７８では、挿入断片は、Ｆ６とＴ７の間のＮＮＴＴである。さらに、例えば、野生型ヒツジアルファサブユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモン（配列番号７９および８０）は、ＮＮＴＴ部位を含んでもよい。ＮＮＸ3Ｘ4部位をアルファサブユニットに導入する挿入断片は、野生型サブユニットのＮ末端近くに挿入されてもよい。例えば、ＮＮＴ、ＮＮＳ、ＮＮＴＴ、またはＮＮＴＳは、野生型ウマ、ブタ、またはヒツジアルファサブユニットのＦ６とＴ７の間に挿入されてもよい。
【００７８】
増加した半減期は、他の適切な化学基のペグ化もしくはコンジュゲーションによってまたは増加した半減期を有する融合タンパク質を構築することもしくは任意の他の方法によっても、提供され得る。かかる方法は、例えばそのそれぞれがその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，６１２，０３４号、米国特許第６，２２５，４４９号、および米国特許第６，５５５，６６０号に報告されているように当技術分野で既知である。
半減期は、分子内の負に帯電した残基の数、例えば、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基の数を増加させることによっても増加され得る。かかる改変は、部位特異的突然変異誘発によって達成され得る。かかる改変は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質への１つまたは複数の負に帯電した残基を含有するアミノ酸配列の挿入によっても達成され得る。
【００７９】
タンパク質の半減期は、タンパク質安定性の測定値であり、タンパク質の濃度の半分の減少に必要な時間を示す。本明細書で記載された修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の血清半減期は、例えば、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の投与後の期間にわたって採取された血清試料中のレベルを測定するために抗体を使用したイムノアッセイなどであるが、これに限定されない、対象からの試料中のホルモンレベルを経時的に測定するのに適した任意の方法によって、または標識糖タンパク質ホルモンの投与後に対象から採取された試料中の標識ホルモン分子、すなわち、放射性標識分子の検出によって決定され得る。
【００８０】
処置の方法
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、糖タンパク質ホルモン活性と関連している任意の状態を処置するために使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。対象は、哺乳動物、爬虫類、魚類、鳥類および両生類などであるが、これらに限定されない動物とすることができる。対象は、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、およびヤクなどであるが、これらに限定されない哺乳動物とすることができる。動物は、ネコおよびイヌなどの家畜および飼い慣らされたペットを含む。対象は、改善された糖タンパク質ホルモン活性を必要としているヒト患者または動物とすることができる。糖タンパク質ホルモン活性と関連している状態は、改変糖タンパク質ホルモン反応性によって完全にもしくは部分的に引き起こされるもの、または糖タンパク質ホルモンの投与から利益を得るものである。例えば、かかる状態は、排卵機能不全、黄体期欠損、未解明の不妊症、雄因子不妊症、時間が限定された受胎、低いＦＳＨ受容体発現、低ＦＳＨ受容体感受性、ＦＳＨ受容体結合欠損、ＦＳＨ受容体カップリング欠損、低テストステロン産生、男性型脱毛症、および下垂体機能低下症または損傷を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
例えば、卵母細胞の量および質は、本明細書に記載の超活性ＦＳＨ類似体を動物に投与することによって改善され得る。例えば、驚くべきことに、出願者は、修飾アルファサブユニットを含有する超活性ＦＳＨを投与することによって、卵母細胞の量および質の劇的な増加が得られることを発見した。卵母細胞量および質に及ぼす超活性ＦＳＨの効果は、超活性ＦＳＨのＦＳＨ血清半減期を増加させることによってさらに増強され得る。ＦＳＨ血清半減期は、超活性ＦＳＨをさらに修飾することによって増加され得る。上記のものを含むがこれらに限定されないさらなる修飾がＦＳＨ血清半減期を増加させるために使用され得る。
【００８２】
本発明の修飾ＦＳＨ、ＣＧ、ＬＨ、またはＴＳＨ糖タンパク質ホルモンタンパク質は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の補助量を対象に投与することを含む、雄または雌対象における補助生殖の治療レジメンにも使用され得る。かかる方法では、類似体は、単独でまたは例えば、クエン酸クロミフェンおよびＧｎＲＨ（ゴノトロピン（ｇｏｎｏｔｒｏｐｉｎ）放出ホルモン）を含むが、これらに限定されない他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、１つまたは複数の糖タンパク質の組合せとして投与されてもよい。例えば、修飾アルファサブユニットは、一緒にまたは別々に、ＦＳＨベータサブユニット、ＣＧベータサブユニット、ＴＳＨベータサブユニット、および／またはＬＨベータサブユニットと組み合わせてもよく、次いで、修飾糖タンパク質が対象に投与される。例えば、単離ゴナドトロピン欠損（ＩＧＤ）を有する対象では、修飾ＦＳＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、およびＬＨが正常な性腺機能を回復するために対象に投与されてもよい。ＦＳＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＬＨなどの糖タンパク質ホルモンが雌生殖生理学において不可欠であり、これらの糖タンパク質ホルモンがいくつかの繁殖障害を克服し、それによって繁殖を補助するために対象に投与され得ることは、当技術分野で広く知られている。
【００８３】
単回および複数回注射投与レジメンが修飾ウマＣＧ糖タンパク質に関して試験される。マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクにおけるウマＣＧ（ｅＣＧ）類似体を使用した超刺激に関して、ここで、単回または２：１分割ｅＣＧ類似体注射が使用される。ｅＣＧ類似体に関する用量決定研究は、３０、４５、６０、７５、９０、１０５および１２０ｍｃｇの単回ｉｍ．注射を含む。最適化用量が２：１比で試験され、任意選択の第２の分割用量が第６日または別の日におけるＰＧＦ２アルファ処置と一致することになる。修飾ｅＣＧでの処置は、マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクにおける過剰排卵を生ずる。
【００８４】
当業者は、投与する糖タンパク質ホルモンの有効量を容易に決定することができ、これは、質量、サイズ、特定の状態の重症度、および対象自体の型などの因子に依存することになる。治療有効量は、通例の最適化手順によって容易に決定され得る。本発明は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、増加した効力を有する糖タンパク質ホルモンを提供する。これらの修飾糖タンパク質ホルモンは、当業者が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、修飾糖タンパク質ホルモンのより低い用量を投与して、同様の治療効果を達成すること、または代わりに、野生型糖タンパク質ホルモンの用量と同様の修飾糖タンパク質ホルモンの用量を投与して、増加した治療効果を達成することを可能にすることになる。
【００８５】
糖タンパク質ホルモンが経口、非経口、または他の方式で投与されるかどうかに依存して、プロスタグランジンの投与は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、液剤、クリーム、および懸濁剤などの固形、半固形、または液体剤形の形とすることができ、好ましくは正確な投薬量の送達に適した単位剤系である。糖タンパク質ホルモンは、薬学的に許容される担体と組み合わせた有効量の選択された糖タンパク質ホルモンを含んでもよく、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。「薬学的に許容される」は、生物学的にまたは別の意味で望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、その物質は、容認できない生物学的効果を引き起こすとも、糖タンパク質ホルモンとの容認できない相互作用もなく、選択された糖タンパク質ホルモンとともに個体に投与され得る。かかる剤形を調製する実際の方法が当業者に既知である、または明らかとなろう；例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, latest edition (Mack Publishing)を参照されたい。
【００８６】
以下の例は、本発明を説明し、例示するために提供される。したがって、これらは、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。当業者は、それが上記および特許請求の範囲に記載されているので、多くの他の実施形態も本発明の範囲内にあるとよく認識するはずである。
【実施例】
【００８７】
アルファサブユニット類似体の設計
野生型β−サブユニットを有し、Ｑ１３Ｒ＋Ｅ１４Ｒ＋Ｐ１６Ｒ＋Ｑ２０Ｒ（ヒト４Ｒ）でのα−サブユニットへの修飾を有するヒトＦＳＨスーパーアゴニスト糖タンパク質は、それらの野生型対応物を著しく上回る結合を示した。
表１は、ヒトアルファ野生型（ＷＴ）および選択されたｈＦＳＨスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ヒトアルファ野生型（９２総残基のアミノ酸残基１〜２８）および変異型のＮ末端部分を示す。アルギニン（Ｒ）への４つのスーパーアゴニスト置換の位置は、影を付けた領域にある。１つまたは２つの追加のＮ連結炭水化物鎖を導入する選択された４つの異なる挿入断片は、野生型配列のアミノ酸Ｄ３とＱ５の間にマークを付けてある。
【００８８】
【表１】
2017502079.tif 000002
表１におけるセグメントを以下に列挙する：配列番号４３：ｈＦＳＨ  ＷＴ；配列番号３３、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ）；配列番号３４、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ１）；配列番号３５、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ２）；配列番号３６、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ３）；配列番号３７、ｈＦＳＨアルファ（４Ｒ＋Ｉｎｓ４）。
一部の実施形態におけるウシＦＳＨ（ｂＦＳＨ）置換は、ヒトＦＳＨアルファサブユニットにおいて以前突然変異誘発された残基と非常に類似しており、「５Ｒ」（Ｋ１５Ｒ＋Ｋ１７Ｒ＋Ｅ１８Ｒ＋Ｋ２０Ｒ＋Ｋ２４Ｒ）と称される５つの変異の組合せを含む。例えば配列番号７。導入されたグリコシル化認識配列（ＮＸ1ＴまたはＮＸ2Ｓ）がＮ連結炭水化物鎖の付着につながる可能性を増加させるため、１８の異なるウシアルファサブユニット構築物を確立し、以前開発された発現ベクター中にクローニングした。１２の構築物は、Ｎ末端伸長ペプチド配列ＡＮＩＴＶ、ＡＮＴＴＡ、ＡＮＴＳＡ、ＡＮＩＴＶＮＩＴＶ、ＡＮＴＳＡＮＴＴＡおよびＡＮＴＳＡＮＴＳＡを含有していた。
表２は、ウシアルファ野生型（ＷＴ）および選択されたｂＦＳＨスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ウシアルファ野生型（９６総残基のアミノ酸残基１〜３２）および変異ウシアルファのＮ末端部分を示す。アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）への５つのスーパーアゴニスト置換の位置は、４Ｒ＋１Ｋの５Ｒとしてコードされる、アミノ酸Ｃ１４とＰ２５の間の影を付けた領域でマークを付けてある。１つまたは２つの追加のＮ連結炭水化物鎖を導入する選択された４つの異なる挿入断片は、野生型配列のアミノ酸Ｆ６とＴ８の間にマークを付けてある。
【００８９】
表２におけるセグメントを以下に列挙する：配列番号４４、ＷＴ  ｂＦＳＨ；配列番号２３、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ）；配列番号２４、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ）；配列番号２５、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ１）；配列番号２６、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ２）；配列番号２７、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ３）；配列番号２８、ｂＦＳＨアルファ（５Ｒ＋Ｉｎｓ４）；配列番号２９、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ１）；配列番号３０、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ２）；配列番号３１、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ３）；配列番号３２、ｂＦＳＨアルファ（４Ｒ＋１Ｋ＋Ｉｎｓ４）。
【００９０】
【表２】
2017502079.tif 000003
変異を含むウマ糖タンパク質アルファサブユニットも作製した。一部の実施形態は、Ｋ１５Ｒ、Ｅ１８Ｒ、Ｋ２０Ｒ、およびＫ２４Ｒの置換を含む。例えば、配列番号９；配列番号３８〜４０。さらに、Ｋ１５Ｒ、Ｅ１８Ｈ、Ｋ２０Ｒ、およびＫ２４Ｒを有するウマ糖タンパク質アルファサブユニットも作製した（例えば配列番号４１；配列番号４２）。これらの変異アルファサブユニットは、サブユニットのＦ６とＴ７の間のＮＶＴＩＮＶの挿入断片（例えば配列番号９、４０、および４２）、またはＦ６とＴ７の間のＮＶ挿入断片に加えてＴ７とＴ８の間のＩＮＶ（例えば配列番号３８、３９、および４１）も含有する。
【００９１】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したｂＦＳＨ類似体の一過性トランスフェクションは、リポフェクタミンベースの方法と比較して、ｂＦＳＨ類似体発現の３．７〜４．５倍の増加をもたらした（データは示さず）。ヘテロ二量体特異的ＥＬＩＳＡに基づく様々なＦＳＨ類似体の発現レベルは、ＦＳＨ二量体形成の大きな減少は示さず、単鎖構築物が高レベル発現を達成するのに必要であるという以前の主張は支持されない。
【００９２】
一過性に発現されたｂＦＳＨ類似体の選択は、ｃＡＭＰベースｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイおよびＰＫスクリーニングアッセイを含んだ（図１および２を参照されたい）。ブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ−Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ）およびｂＦＳＨ対照と比較して、５Ｒ置換を有するｂＦＳＨの効力の著しい３〜４倍の増加があった（図１Ａ）。特筆すべきことには、多くの以前の研究とは対照的に（図１Ｂ）（Heikopp, Eur. J. Biochem 261: 81-84, 1999；Trousdale, Fertil. Steril. 91 : 265-270, 2009）、新規なネオグリコシル化挿入断片は、ウシＦＳＨ  ５Ｒ類似体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を減少させないことが見出された（図１Ｃ）。Ｎ末端に加えられた同一のネオグリコシル化部位は、ｂＦＳＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を減少させたがこれは、エリスロポエチンの内因性活性に及ぼすネオグリコシル化の減弱効果（Elliott, Exp. Hematol. 32: 1146-1155, 2004；Elliott, Nat. Biotechnol. 21 : 4144-421, 2003； Sinclair, J. Pharm. Sci. 94: 1626-1635, 2005）および部位特異的ペグ化を含めた半減期手法の多くの他の延長の効果（Fishburn, J.Pharm. Sci. 97: 4167-4183, 2008；Uchiyama, Vet. J. 184: 208-211, 2010）と類似する。マウスにおける２日間のＰＫスクリーニング研究は、全てのネオグリコシル化ウシＦＳＨ「５Ｒ」類似体が、ｂＦＳＨ−ＷＴおよびＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖと比較して、末端の半減期を増加させたことを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。ＰＫスクリーニングアッセイからのデータは、ｂＦＳＨ−ＷＴ、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−ＶおよびＴＲ４４０１対照と比較して、１つまたは２つの導入されたネオグリコシル化部位（挿入断片１および２）のグリコシル化が、血漿半減期を大きく延長したことを示した。観察されたレベルは、２９アミノ酸リンカーおよび４−５Ｏ連結炭水化物鎖を有するｂＦＳＨ−単鎖分子に匹敵した。「挿入断片１および２」と称される、組み合わせたスーパーアゴニストおよびネオグリコシル化挿入断片として作製された、２つの最初に試験された類似体は、５Ｒスーパーアゴニスト対照単独に匹敵するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有していたが（図１Ｃ）、マウスにおける半減期は長いままであった（図２Ｂ）。スーパーアゴニスト活性が減少していないかかる長時間作用性の類似体は前例がないことから、乳牛におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの素晴らしい成績が期待される。
【００９３】
数百ミリグラムの様々なヒトＦＳＨおよびＴＳＨを、フラスコ、振盪機、ローラーボトルおよびバイオリアクターを使用して、ＣＨＯ細胞で組換え体として産生させた（ｒＦＳＨまたはｒＴＳＨ）。研究の初期に、ジシストロニックなレトロウイルスベクター系をＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるＦＳＨおよびＴＳＨ類似体の高レベル発現のために最適化した。ヒトｒＦＳＨ調製物を試験した。単回６０μｇ用量のｒＦＳＨは、卵胞発達を誘導し、４日にわたって１日２回投与される以前最適化されたＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖ（３００ｍｇ）の８回の注射に相当する、質の高い多数の胚をもたらした。これから、Ｉ．Ｍ．注射後の吸収遅延、および増強されたＦＳＨ受容体駐在時間などのそのユニークな特性がさらに支持される。図３および５〜８を参照されたい。１０μｇ用量でのｒＦＳＨスーパーアゴニストは、１２日にわたって、成長中の卵胞、特に、低ＦＳＨ受容体数を有することがヒトにおいて既知でもある、３〜５ｍｍのサイズ範囲の卵胞の増強されたプールを動員し、維持する別格の能力を示した（データは示さず）。対照Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖの以前最適化された投薬では観察されなかった、ｒＦＳＨによる小卵胞のこの予想外の増強および補助は、サイクルの任意の段階でＦＳＨ反応性卵胞を動員し、減少したＦＳＨ受容体数または機能に起因する多くの良好でない反応者において、ＩＶＦおよび過剰排卵を成功させる可能性を増加させるための新しい方法となる（Perez Mayorga, J. Clin. Endocrinology 152: 3268-3369, 2000；Levallet, Arch. Med. Red. 30: 486-494, 1999；Rannikko, Mol. Hum. Reprod. 8: 311-317, 2002；Cai, Feril. Steril. 87: 1350-1356, 2007）。しかしながら、４アルギニン置換を有するウシＦＳＨとヒトＦＳＨベースのアルファサブユニット間の４０アミノ酸相違のために、同じ乳牛におけるｒＦＳＨでの以前の処置からの持ち越し効果が観察され、これは、ウサギおよびアカゲザルにおけるヒトＦＳＨの免疫原性特性を示す以前のデータ研究と一致した（Cai, Int. J. Toxicol. 30: 153-161, 2011；De Castro, Theriogenology 72: 655-662, 2009）。
【００９４】
共通のアルファサブユニットの特定の修飾許容領域へのアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）残基の導入は、進化の過程で糖タンパク質ホルモンの活性を調節し（Szkudlinski, Nat. Biotechnol. 14: 1257-1263, 1996；Szkudlinski, Physiol. Rev. 82: 473-502, 2002）、糖タンパク質ホルモン受容体のヒンジ領域に位置する負に帯電したクラスターとの静電相互作用において重要な役割を果たす（Mueller, Trends Endocrinol. Metab. 21 : 111-122, 2010；Mueller, J. Biol. Chem. 284: 16317-16324, 2009；Mueller, Endocrinol. 152: 3268-3278, 2011）ことが以前示された。特異的ｂＦＳＨスーパーアゴニスト開発は、本明細書でのデータならびにｈＦＳＨおよび他の糖タンパク質ホルモン類似体に関する他の研究（Szkudlinski, Physiol. Rev. 82: 473-502, 2002）に示されたような、作用の持続時間を増加させる吸収遅延の可能性を伴う、より強力かつ有効な分子を作製するための、４〜５Ｒおよび／またはＫへの最小の置換を含む。増加したスーパーアゴニスト効力／有効性を減少させることなく、単回注射類似体を作製するために、半減期を増加させるための１つまたは２つの炭水化物ネオグリコシル化部位を含有する最小の長さのアミノ酸挿入断片も検討されてきた（図４を参照されたい）。さらなる分析のために、野生型配列のアミノ酸６と８の間に位置するペプチド挿入断片ＮＶＴＩＮＶ、ＮＶＴＩＮＶＴ、ＮＶおよびＮＶＴを含有する８つの構築物が使用され得る。本明細書でのデータに示されるように、以前のネオグリコシル化およびペグ化研究（Trousdale, Feril. Steril. 91 : 265-270, 2009；Uchiyama, Vet J. 184: 208-211, 2010；Perlman, J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3227-3235, 2003）とは対照的に、増加したスーパーアゴニスト効力／有効性を減らすことなく、半減期を増加させるための複合炭水化物を含有する最小の長さのアミノ酸挿入断片を設計することが可能である。これらの新規な類似体は、ＰＥＩおよびローラーボトルを使用した最適化高発現系の方法を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性トランスフェクションによって発現され得る。
【００９５】
一過性トランスフェクションによって発現された、選択された４〜６類似体の精製は、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用した捕獲ステップを使用して行なわれてもよく、その後に、Ｍｏｎｏ  Ｑイオン交換クロマトグラフィーによる類似体の選択、およびその後のゲルろ過を使用した最終精錬が続く。ｂＦＳＨ類似体の純度は、９８％よりも大きくてもよい。累積回収は、総計５０倍の精製で５０％に達し得る。全ての類似体は、ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、ＣＨＯ−ＦＳＨＲ細胞系を使用したロバストｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃＡＭＰバイオアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分析によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けられ得る。選択された精製類似体は、逆相ＨＰＬＣによる厳密な定量化、炭水化物組成分析ならびに安定性および凝集状態の評価によっても分析され得る。
【００９６】
さらなる実験では、ウシＦＳＨ類似体ＴＲ５５６０１（アルファサブユニット：配列番号７）を作製したがこれは、アルファサブユニットの１５Ｋ、１７Ｋ、１８Ｋ、２０Ｋ、および２４Ｋにおけるアルギニン（Ｒ）への置換、およびアルファサブユニットの６Ｆと７Ｔの間のＮＶＴＩＮＶ（配列番号１）挿入断片を含む。ＴＲ５５６０１のいくつかのロットを得、ＩＥＦおよびウエスタンブロット分析を使用して試験した。図３Ａ〜Ｄは、分析の例示的な結果を示す。図３Ａ〜３Ｄから、部分的に、ＴＲ５５６０１／ロット４およびロット５が最適な分布を示すことが実証され、このロットにおける変異の有効性が確認させる。ロット４および５ならびに同様のスクリーニング結果を有するロットを動物処置において使用した。例えば、ＩＥＦ−ウエスタンブロット分析は、図３Ａ〜Ｃにおけるロット４およびロット５のＴＲ５６００１の最適化酸性アイソフォームを例示する。一方、図３Ａおよび３Ｃに示すように、ロット３では完全な確証は得られなかったので、動物処置に使用しなかった。ｂＦＳＨ類似体および特にＴＲ５５６０１の試料もマウスにおけるＰＫスクリーニングアッセイで研究した。マウスに選択されたｂＦＳＨ試料を皮下注射し、血液試料を注射後２４、３２、および４８時間で採取した。血漿を単離し、ｂＦＳＨ  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で分析した。ＴＲ５５６０１試料のロット４の延長された半減期をＰＫスクリーニングアッセイで確認した。データは示していない。
【００９７】
選択された候補類似体の完全な薬物動態学的プロファイルは、ラットあたり１０μｇの単回用量のｓｃ投与および分布と排出期の両方にわたる１０の異なる血液採取時間（１、５、１５、３０分ならびに１、２、６、２４および４８時間）によって実行してもよい。ウシＦＳＨ血漿レベルは、ｂＦＳＨ−ＥＬＩＳＡを使用して血漿において定量化され得る。完全なＰＫ分析を行なってもよい。
【００９８】
バイシストロニック発現ベクターを構築するため、ならびに大規模産生、精製およびウシにおける過剰排卵研究のための調製におけるＣＨＯ−ＤＧ４４細胞での類似体発現の選択および増幅のために、類似体を選択した。ＣＨＯ−ＤＨＦＲ（−）ＤＧ４４細胞を発現ベクターで同時トランスフェクトし、メトトレキサート（ＭＴＸ）の段階的増加を含有する培養培地中での遺伝子増幅に供した。細胞は、再び多角形形態をとったら（２〜３週）、次の増幅ステップに適格とした。＞２ｐｇ／細胞／日の分泌レベルを示すクローンを、ＧＳマーカー遺伝子（ＭＳＸ）の増幅を誘導する第２の処置に供してもよい。さらに２〜５倍増加し、最大１０ｐｇ／細胞／日の分泌レベルに達することがある。
【００９９】
調製およびアルファサブユニット類似体での実験
ｒＦＳＨは、単回筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射後に過排卵反応を誘導し、６０μｇが最適用量に非常に近いと思われるが、乳牛を３回以上ｒＦＳＨに曝露した場合、過排卵反応の著しい減少があった。したがって、「５Ｒ」置換、およびＦ６とＴ７の間のＮＶＴＩＮＶの挿入断片を有するアルファサブユニット（配列番号７）を含む、ＴＲ５５６０１  ｒＦＳＨと称される新しいｒＦＳＨ製剤を試験するために実験を設計した。目的は、食用牛における過排卵反応を誘導するｒＦＳＨでの単回または分割用量処置の効果を最初に決定し、次いでｒＦＳＨの単回注射の過排卵反応をさらに評価して、乳牛をｒＦＳＨに２または３回曝露した場合に過排卵反応が高いままであるかどうかを決定することであった。
ＴＲ５５６０１  ＦＳＨ試料を、古典的Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ  ＦＳＨバイオアッセイ（Steelman et al., Endocrinol. 53: 604-616, 1953）によりラットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで分析した。４０ＩＵのｈＣＧを補充した試験物品（例えばｂＦＳＨ）またはビヒクルの単回用量を、雌スプラーグドーリーラット（２００〜２２０ｇ）に注射した。卵巣質量を投薬後７２時間で測定した。図４を参照されたい。各群をｈＣＧで処置して、ベースラインを提供する。全ての濃度でのＴＲ５５６０１  ｂＦＳＨは、卵巣質量を著しく増加させる。
【０１００】
図５は、過剰排卵、排卵の誘導および固定時間人工授精に関する卵胞波同調プロトコールを示し、ここで、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−ＶＲ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ）の８回の注射をＴＲ５５６０１の単回または二重注射で置き換える。処置は、第０日のプロゲステロン（Ｐ４）放出腟内デバイスの挿入およびベンゾエートエストラジオール（ＢＥ）の投与を含んだ。過排卵処置を単回または二重注射として与えられるＴＲ５５６０１で第４日に開始した。第２の分割用量注射は、第６日のＰＧＦ2a処置と同時であった。プロゲステロンデバイスを第７日の最後のＦＳＨ注射とともに除去した。第８日に、ドナーにブタＬＨを投与し、１２および２４時間後にまたは第８日（ｐＬＨ後１６時間）に１回、発情期検出なしに授精させた。卵子／胚を第１５日に非外科的に採取した（２、３）。Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（登録商標）を対照として使用した；総計３００ｍｇ*を４日にわたる１日２回の８回の筋肉内（ＩＭ）注射で投与した（ｍｇ*−高度に不純なＮＩＨ−ＦＳＨ−Ｐ１参照標準に基づく）。
【０１０１】
特に、３０頭の非泌乳Ｒｅｄ  Ａｎｇｕｓ乳牛をそれらの以前の胚作製歴に基づいて階層化し、ブロック化し、３つの処置群の１つにランダムに割り当てた。対照群（ｎ＝１０）の乳牛に、３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖを４日の期間にわたって投与される１日２回の減少用量プロトコールでＩ．Ｍ．で投与した。具体的には：第４日、３．０ｍＬ（ａｍおよびｐｍ）；第５日、２．５ｍＬ（ａｍおよびｐｍ）；第６日、１．５ｍＬ（ａｍおよびｐｍ）および第７日、０．５ｍＬ（ａｍおよびｐｍ）。ｒＦＳＨ  ６０μｇ処置群の乳牛に６０μｇ  ｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射を投与し、ｒＦＳＨ  ４０〜２０μｇ処置群の乳牛に第４日に４０μｇ  ｒＦＳＨのＩ．Ｍ．注射、その後第６日に２０μｇ  ｒＦＳＨの別のＩ．Ｍ．注射を投与した。
【０１０２】
次いで、３０頭の乳牛のうち２５頭をＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）または６０μｇのｒＦＳＨの単回注射で再び超刺激した。対照群（ｎ＝１０）の動物は、対照群のままであり、実験１におけるｒＦＳＨ  ６０μｇの１０頭の乳牛のうち８頭をｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射によって再び処置した。さらに、ｒＦＳＨの分割単回注射（ｓｐｌｉｔ−ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で以前処置した１０頭の乳牛のうち７頭をｒＦＳＨの単回Ｉ．Ｍ．注射で処置した。胚採取間の間隔は、２９日であった。
第２の実験において使用した２５頭の乳牛のうち２４頭をＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ（対照）または６０μｇのｒＦＳＨの単回注射で再び超刺激した。ここでも、対照乳牛は対照群のまま、ｒＦＳＨ乳牛はｒＦＳＨ群のままとした。胚採取間の間隔は、３０日である。
【０１０３】
第０日（実験の開始）に、全ての動物に５ｍｇエストラジオール−１７βに加えて５０ｍｇプロゲステロンおよびプロゲステロンを含浸させた腟内デバイス（Ｃｕｅ−Ｍａｔｅ，Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を与えた。第４日（卵胞波出現の予想日）に、全ての乳牛を上記の群に従って超刺激した。単回Ｉ．Ｍ．注射ｒＦＳＨに関する６０μｇ用量は、７．５ｍＬを構成し、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖを減少用量プロトコールで８回のＩ．Ｍ．注射で投与した。全ての動物に５００μｇのクロプロステノール（Ｃｙｃｌａｓｅ、Ｓｙｎｔｅｘ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を朝および夕方に第６日にＩ．Ｍ．で与えた。Ｃｕｅ−ｍａｔｅを第６日の夕方に除去した。第８日の朝に、乳牛に１００μｇのゴナドレリン（Ｇｏｎａｓｙｎ、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を与え、１２および２４時間後に授精させた。全ての乳牛を同じ雄ウシからの凍結精液で授精させた。卵子／胚を第１５日に非外科的に採取し、ＩＥＴＳ推奨に従って評価した。
【０１０４】
全ての乳牛をＣＬの存在ならびに卵胞サイズおよび数に関して第０、４、６および８日に超音波的に試験して、卵胞成長プロファイルを決定した。排卵反応を、第１５日に超音波検査および直腸触診によってＣＬおよび直径が＞１０ｍｍの卵胞の数を計数することによって、確認した。
各実験では、データポイントを分散の正規性および均一性に関して最初に評価した。分散は、群間で異なったので、データを平方根によって変換し、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。３つ実験が終わった後、全体的な反応の分析を二元配置ＡＮＯＶＡによって行なって、実験数および処置ならびにそれらの相互作用の効果を検出することになる。平均を保護されたＬＳＤ検定によって比較した。卵胞データをＭＩＸＥＤ手順によって分析して、卵胞数および成長プロファイルに及ぼす処置、日およびそれらの相互作用の効果を検出した。全ての分析をＩｎｆｏｓｔａｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を使用して行なった。
【０１０５】
過排卵反応および卵子／胚データを表３に要約する。ＣＬおよび卵子／胚採取日に≦２ＣＬを有する乳牛の平均数は、群間で異ならなかったが、ｒＦＳＨの分割注射は、より高い（Ｐ＜０．０５）数の非排卵卵胞をもたらした。総卵子／胚、受精卵および移植可能な胚（グレード１、２＆３）の平均数も異ならなかった。
表３は、ＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）の単回または分割単回用量での過剰排卵を示す。
【表３】
2017502079.tif 000004
第２の投薬に関する過排卵反応および卵子／胚データを表４および５に要約する。ＣＬ、＞１０ｍｍの卵胞および卵子／胚採取日に≦２ＣＬを有する乳牛の平均数は、群間で異ならなかった。総卵子／胚、受精卵および移植可能な胚（グレード１、２および３）の平均数も群間で異ならなかった。
表４および５は、ＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）の単回用量での過剰排卵を示す。
【０１０６】
【表４】
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【表５】
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最終投薬実験に関して、卵胞データのみが今回入手可能である。ｒＦＳＨとＦｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖ群間に授精前日での卵胞成長プロファイルおよび卵胞の数における有意差はなかった。排卵および卵子／胚データは、まもなく入手可能となり、実験３に関して別々に示し、次いで実験１および２と組み合わせることになる。実験３に関する卵胞データは、入手可能であり、実験１および２のものと組み合わせており、表６に示す。
表６は、３０日間隔でのＴＲ５５６０１（ｒＦＳＨ）での３つ過剰排卵を示す。
【０１０７】
【表６】
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処置の開始から人工授精直前までの卵胞特徴を表７および図６〜９に示す。
表７は、非泌乳乳牛における過剰排卵モデルの卵胞数を示す。卵胞発達（平均±ＳＥＭ）を単回Ｉ．Ｍ．注射によって与えた６０μｇのｒＦＳＨまたは４日にわたる１日２回のＩ．Ｍ．注射によって与えた３００ｍｇ  Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標）−Ｖで処置した食用牛の超音波検査によって検出した。
【表７】
2017502079.tif 000008
直径が３〜５ｍｍの卵胞の数は、処置群間で異ならなかった（図６）。直径が６〜８ｍｍの卵胞（図７）、＞９ｍｍの卵胞（図８）の数も処置日にわたる平均卵胞直径も異ならなかった（図９）。
【０１０８】
この一連の実験で得られた結果は、ｒＦＳＨ産物が、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖのものと異ならない、食用牛における過排卵反応を誘導するということを示唆すると解釈され得る。乳牛を連続的に３回処置した場合、Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ−Ｖと比較して、過排卵反応の減少を示す証拠もない。最終投薬における過排卵反応は、最初の２回と同様であると思われ、これは、後の卵子／胚採取で確認されることになる。ｒＦＳＨで処置した乳牛における非排卵（＞１０ｍｍ）卵胞がより多数であることに関する懸念があり（主に２頭の乳牛における非排卵卵胞の多さによる）、これについてはさらに検討すべきである。食用および酪農乳牛を過剰排卵させるためのｒＦＳＨの最適な投薬量を決定するため、およびｒＦＳＨで３回より多く連続的に処置することの長期効果を決定するためのさらなる研究も必要である。
【０１０９】
改善された半減期に関する挿入断片の特異性
観察された、改善された半減期が配列番号１の挿入断片の配列に特異的であるかどうかを決定するために、挿入断片を有するヒトアルファサブユニットを修飾して、アミノ末端バリンを除去した。次いで、２つを、挿入断片を欠く類似体とともにｃＡＭＰを生成するそれらの能力に関して試験した。研究において、この挿入断片が配列特異的であり、優れた結合および半減期をアルファサブユニットに与えることが示された（図１０を参照されたい）。次いで、生成条件を、生成が最大になるように最適化するために、様々な成長条件において試験した（表８を参照されたい）。
表８は、ヒトアルファサブユニットの産生の最適化を示す。
【０１１０】
【表８】
2017502079.tif 000009
次いで、挿入断片をウシ対応物とともに試験したが、増加した半減期が挿入断片の配列に特異的であることが確認される（図１１を参照されたい）。
例示的ｅＣＧ類似体
試料変異ウマアルファサブユニットを野生型ウマサブユニットに基づいて構築した。変異ウマアルファサブユニットを用いて機能的ｅＣＧを産生させた。以下の表９は、ウマアルファサブユニットにおける置換（下線でマークを付けた）および挿入（下線およびイタリック体でマークを付けた）を示す。変異アルファサブユニットに基づくｅＣＧ類似体を類似体＃２、＃３および＃４として標識した。
【表９】
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ｅＣＧでのＬＨ受容体アッセイ
黄体ホルモン（ＬＨ）受容体を発現する細胞に及ぼすウマＣＧ類似体の効果を試験するために実験を行なった。
【０１１１】
図１２は、野生型および変異ウマＣＧによる３時間のげっ歯類ＬＨ受容体を発現する２９３細胞におけるｃＡＭＰ刺激を示す。特に、ＣＨＯ−ｒＬＨＲ細胞を刺激の２４時間前に９６ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を３７℃で３時間、１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のｅＣＧ調製物および負の対照Ｇｏｎａｌ−Ｆ（精製ヒトＦＳＨ）と共にインキュベートした。培地中に蓄積したｃＡＭＰを、市販のｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡ（ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって測定した。全ての類似体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０、１０ｋＤａを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマＣＧ  Ｅｌｉｓａ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。ＰＭＳＧ（妊馬血清性ゴナドトロピン、ウマＣＧ）を、メタリン酸でのｐＨ分画および二段階エタノール沈降によって得た。
【０１１２】
図１３は、ラットＬＨ受容体（ｒＬＨＲ）を発現するＭＬＴＣ−１細胞におけるプロゲステロン刺激に基づくｅＣＧ類似体（＃２、＃３および＃４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＬＨ生物活性を示す。具体的には、ＭＬＴＣ−１−ｒＬＨＲ細胞を刺激の２４時間前に９６ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を３７℃で６時間、１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のｅＣＧ調製物および対照Ｇｏｎａｌ−Ｆ（ヒトＦＳＨ）と共にインキュベートした。培地中に蓄積したプロゲステロンを市販のプロゲステロンＥＬＩＳＡ（ＥＩＡ  Ｋｉｔ、ＤＲＧ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。全ての類似体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０、１０ｋＤａを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマＣＧ  Ｅｌｉｓａ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して決定した。生物活性対免疫反応性（Ｂ／Ｉ）比を計算し、対照ＰＭＳＧ調製物に関するＢ／Ｉ比と比較した。
【０１１３】
図１２〜１３に示すように、野生型および変異ウマＣＧは、げっ歯類ＬＨ受容体を活性化する能力がある。図１２〜１３からは、位置１５、１８、２０および２４での置換を含む変異ウマＣＧが野生型ウマＣＧおよびＰＭＳＧと比較して増強された生物活性を示したことも分かる。
ｅＣＧでのＦＳＨ受容体アッセイ
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体を発現する細胞に及ぼすウマＣＧ類似体の効果を試験するために実験を行なった。
【０１１４】
図１４は、野生型ヒトＦＳＨ受容体（ｈＦＳＨＲ）を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ刺激に基づくｅＣＧ類似体（＃２、＃３および＃４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＦＳＨ生物活性を示す。ＰＭＳＧ（妊馬血清性ゴナドトロピン、ウマＣＧ）は、メタリン酸でのｐＨ分画および二段階エタノール沈降によって得る。具体的には、ＣＨＯ−ｈＦＳＨＲ細胞を刺激の２４時間前に９６ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を３７℃で２時間、１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のｅＣＧ調製物および対照Ｇｏｎａｌ−Ｆ（高精製ヒトＦＳＨ）と共にインキュベートした。培地中に蓄積したｃＡＭＰを、市販のｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡ（ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって測定した。全ての類似体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０、１０ｋＤａを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマＣＧ  Ｅｌｉｓａ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。
【０１１５】
図１４に示すように、野生型および変異ウマＣＧには、ヒトＦＳＨ受容体を活性化する能力がある。図１４から、位置１５、１８、２０および２４での置換を含む変異ウマＣＧが野生型ｅＣＧおよびＰＭＳＧと比較して増強された生物活性を示したことも分かる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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