(57)【要約】  本発明は、インプラント周縁の病気の状態を決定する方法に関し、エクスビボ試料において、パネルを形成する一群のマーカーのうちの一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル又はそれらの比率を定量する（ただし、前記一つ以上の調節されたマーカーは、プラスミノーゲン系及び／又は炎症及び／又はタンパク質分解活性に関連する）；及び工程ａ）で得られた発現レベルを、参照値と比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程を含むことを特徴とする。本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラント周縁の病気の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）エクスビボ試料において、ｔＰＡ，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量するか、及び／又はｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β及びＩＬ−８；ＩＬ−８及びＰＡＩ−２；ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＩＬ−６；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２のマーカーの組み合わせのうちの一つ以上の発現レベルを定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベルと比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【請求項２】
前記一つ以上の調節されたマーカーが、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルが、ｔＰＡとＰＡＩ−２の間の比率であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーが、ｔＰＡであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記一つ以上の調節されたマーカーが、ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１、及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エクスビボ試料が、体液又は組織であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は唾液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が、インプラント周縁間隙液であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織が、骨、及び／又は結合組織、及び／又は粘膜であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織が、骨、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることを特徴とする、請求項６又は９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の一つ以上の参照発現レベルが、異なる時点で同一の源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であり、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、インプラント周縁の病気の状態の指標であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）の一つ以上の参照発現レベルが、インプラント周縁の炎症の履歴を示す源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であり、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、インプラント周縁の病気の状態の指標であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記定量が、核酸の定量によって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記定量が、ｑＰＣＲ，及び／又はノーザンブロットによって行なわれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定量が、タンパク質の定量によって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記定量が、免疫アッセイ、及び／又はＥＬＩＳＡ、及び／又は放射線免疫アッセイ、及び／又は磁気免疫アッセイ、及び／又は蛍光免疫アッセイ、及び／又は免疫沈降、及び／又は表面プラスモン共鳴、及び／又は免疫組織化学、及び／又はウエスタンブロット、及び／又はこれらの任意の組み合わせによって行なわれることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、一つ以上のインプラントを有する患者から得られることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
インプラントが、骨固定インプラントであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インプラントが、歯科用インプラント、及び／又は股関節インプラント、及び／又は膝関節インプラント、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）で得られた一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルに関する情報をデータキャリアに保管するか、及び／又は工程ｂ）で得られたインプラント周縁の病気の状態に関する情報をデータキャリアに保管する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２２】
キットが、試料採集装置をさらに含むことを特徴とする、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
試料採集装置が、滅菌ペーパーポイント、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
キットが、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
キットが、試料を中央検査室に送付するための箱をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
キットが、ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１，ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上のマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量するために必要な要素をさらに含むか、又は、ＩＬ−１β及びＩＬ−８；ＩＬ−８及びＰＡＩ−２；ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＩＬ−６；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡのマーカーの組み合わせの発現レベルを定量するために必要な要素をさらに含むか、又は、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２のマーカーの発現レベルの比率を定量するために必要な要素をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
前記マーカーがｔＰＡであることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
キットが、データキャリアをさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２７のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病及びインプラント周縁（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔ）の病気の状態を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、多数の歯科用インプラントリハビリテーション法が実行されている。インプラント治療が成功する大多数の場合とは対照的に、特定の数の患者は、インプラント周縁の病気を発展させる。我々は、インプラント周縁の病気の二つの状態を区別する。一つは、粘膜炎であり、これは軟組織の炎症を含む。もう一つは、インプラント周縁の炎症（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）であり、これは、炎症に加えてインプラント支持骨の骨量減少を含む。粘膜炎及びインプラント周縁の炎症は、インプラント周縁の組織の状態ともみなされることができる。両方の状態は、タンパク質分解活性を示しうるが、異なる度合いにある。いくつかの場合では、機械的創面切除及び３％過酸化水素での洗浄を伴う非手術的治療が、十分に効果的な治療であるかもしれない。持続するインプラント周縁の病気の場合には、表面創面切除と組み合わされた切除手術がしばしば実行される。病気のインプラント部位における骨欠陥（例えば、骨ピーク）の手術的矯正によって、ポケットの深さは、減少されることができ、口腔衛生を容易にする軟組織形態を与える。しかし、患者の中には、治療に十分良好に反応せず、良好なプラーク制御及びインプラント周縁の粘膜の最小の炎症の代わりに、化膿及び進行性の骨量減少を含む徴候がいくつかの場合には再発しうる。かかる逆戻りの理由は、わかっていない。インプラント周縁の病気の病理学の理解の向上、及びさらに初期の検出及び介入を可能にするさらに敏感な診断ツールの開発に対する要望が間近になっている。これにより、感受性の患者におけるインプラント治療の予測可能性を増大させる。さらに、骨量減少の徴候を示すインプラントの生存率を増大させるため、病気の進行の初期段階における臨床介入が望ましい。これは、病気の状態の初期の確立を要求し、従って、さらに敏感な技術が必要とされる。
【０００３】
インプラント周縁の病気の診断は、骨量減少の放射線写真の証拠と組み合わされた臨床測定に一般的に基づいている。インプラント周縁の炎症は、しばしば、ポケットの形成及び深化、インプラント周縁の上皮封止の破壊、プロービングでの出血（ＢｏＰ）、化膿、及び進行性の骨量減少に臨床的に解釈される。これらの診断方法は、しばしば、インプラント支持組織における広範囲の病的変化の指標として、インプラント周縁の病気の診断のために組み合わせられて使用される。かかる診断方法の限定された感度及び／又は特異性は、病的変化の初期検出を困難にする。
【０００４】
インプラント周縁の病気のための潜在的な予後及び診断ツールとしてのプラーク試料における歯肉溝滲出液中の遺伝子マーカーの分析を使用することの有効性は、多数の著者によって様々な結果を伴って研究されている。
【０００５】
しばしば研究されているマーカーは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）であり、これは、免疫制御、炎症、及び結合組織の代謝を含むいくつかの生物学的過程に関与するプロ炎症性サイトカインである。ＩＬ−１βは、骨吸収を刺激し、骨形成を阻害する（Ｐａｎａｇａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９６，１１：７９４−７９９）。ＩＬ−１βは、マクロファージによって主に生産されるが、好中球性の顆粒球を含む他の細胞によっても生産される。いくつかの研究によれば、インプラント周縁の病気の徴候を示すインプラントの周りの間隙液中のＩＬ−１βの存在が示されている。有意に上昇したレベルが、健康な部位と比べて（Ｐａｎａｇａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９６，１１：７９４−７９９；Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９５，１０：６９６−７０１；Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：６３７−６４３）、及びインプラント周縁の粘膜炎の部位と比べて（Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：６３７−６４３）、インプラント周縁の炎症について報告されており、インプラント周縁の炎症の初期の徴候を有する患者と進行した徴候を有する患者とを比べたときにも報告されている。しかし、Ｈｕｌｔｉｎら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：３４９−３５８）は、インプラント周縁の炎症と健康な部位との間にＩＬ−１βの発現に差がないという矛盾する結果を示した。
【０００６】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、プロ炎症性マーカーであり、好中球のための化学走化因子である。それは、歯周病（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２，２６８−２７６；Ｇｏｕｔｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｎｔ  ２０１２；２０１２：３６２９０５）及びインプラント周縁の炎症（Ｐｅｔｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２０１０，３９（５）：４７８−８５）における微生物侵入に対する生来の免疫応答の制御に関与する。Ｎｏｗｚａｒｉら（Ｃｌｉｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ  ２００８，１０（３）：１６６−１７３）は、健康な対象におけるインプラント及び歯の周りのサイトカインの存在を研究し、歯と比べてインプラントの周りでＩＬ−８の２倍の増大を見出している。
【０００７】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、造血、炎症、免疫応答、及び骨ホメオスタシスを制御するために様々な細胞によって生産される多機能性サイトカインである（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００８，２８３：１１５３５−１１５４０）。インプラント周縁の病気を有する対象からの唾液試料中のＩＬ−６のレベルは、Ｌｉｓｋｍａｎｎら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ２００６，２１（４）：５４３−５０）の研究において、健康な対象からの唾液試料と比べて有意に上昇した。Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｄｅｎｔ  ２００６，２６：１３５−１４１）は、健康なインプラント部位と比べてインプラント周縁の炎症を有する失敗インプラントにおいて、統計的に高いレベルのＩＬ−６を測定した。
【０００８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、損傷した組織からのコラーゲンの分解及び除去に関与するタンパク質分解酵素である。ＭＭＰは、リポ多糖及びサイトカインなどの刺激への応答において、炎症部位に存在する細胞によって分泌される（Ａｂｏｙｏｕｓｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９８，１３：６８９−６９６）。コラゲナーゼ及びゼラチナーゼは、ＭＭＰスーパーファミリーの二つのサブファミリーである。Ｋｉｖｅｌａｅ−Ｒａｊａｍａｅｋｉら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００３，１４：１５８−１６５）の発見によれば、ＭＭＰ−８（コラゲナーゼ−２）の増大したレベルは、炎症性のインプラント周縁の病気の活性相と関連しているかもしれない。ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）の発現も研究されている。Ｍａら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００３，１４：７０９−７１３）は、ＭＭＰ−９と骨レベルの間の関連を示したが、Ａｂｏｙｏｕｓｓｅｆら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９８，１３：６８９−６９６）は、健康な部位とインプラント周縁の炎症の部位の間に有意差があることを示すことができなかった。
【０００９】
ＭＭＰとマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の間のアンバランスは、細胞外マトリックス、基底膜、及び歯槽骨の分解を引き起こし、従って、歯周病を引き起こすと考えられている（Ｓｏｒｓａ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００４，１０：３１１−３１８）。唾液中のＭＭＰ−８，ＴＩＭＰ−１、及び特にそれらの比率が、進行した歯周病の検出における潜在的な候補であることが示唆されている（Ｇｕｒｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１０，３７：４８７−４９３）。
【００１０】
プラスミノーゲン系は、生理学的及び病理学的な組織再モデル化における細胞外タンパク質分解において、中心的な重要性を有する（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９９，８２：２５９−２７０）。プラスミンは、多くの細胞外タンパク質を分解することができかつ潜在的なコラゲナーゼ及び他のメタロプロテイナーゼを活性化することができる広範囲に活性なプロテアーゼである。（Ｗｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９７７，２９６：１０１７−１０２３；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １９９２，１４：４５５−４６３）。プラスミンは、非コラーゲン性ＥＣＭタンパク質を開裂することによって細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して直接作用し、及び様々な結合組織タンパク質に対する特異性で、他の酵素の全範囲のプロフォーム、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のプロフォームを活性化することによって間接的に作用する。プラスミノーゲン系と他の組織分解系との間の相互作用を通して、プラスミノーゲンは、重要な主要なタンパク質分解の潜在的能力を示し、その活性化の厳密な制御は、組織の一体性を維持するために重要である。プラスミンは、プラスミノーゲンアクチベーター（二つのタイプのセリンプロテアーゼが同定されている：ウロキナーゼ型、ｕ−ＰＡ及び組織型、ｔ−ＰＡ）によって、その不活性な前駆体プラスミノーゲンから形成される。プラスミノーゲンアクチベーターは、プラスミノーゲンアクチベーターのインヒビター（ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２）によって、生物分子１：１共有結合複合体の形成を通して特異的に阻害される。ｔＰＡ及びＰＡＩ−２のレベルは、健康な部位からの歯肉溝滲出液よりも炎症部位からの歯肉溝滲出液において高いことが示されている（Ｋｉｎｎｂｙ，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，３８３：８５−９２）。比較的増大したレベルのＰＡＩ−２は、妊娠及び歯周病における組織保護機能に関連している（Ｋｉｎｎｂｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ  Ｒｅｓ  １９９６，３１：２７１−２７７；Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ  Ｒｅｓ  ２００２，３７：６０−６５）。
【００１１】
インプラント周縁の病気のための様々な治療代替案が提案されている。非手術的治療（例えば、接近手術なしでの創面切除）は、インプラント周縁の粘膜炎の場合には成功するだろうが、インプラント周縁の炎症を示す部位についてはそれほど効果的でないように見える（Ｒｅｎｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００８，３５（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３０５−３１５）。臨床データによれば、全身抗生物質との組み合わせでの表面脱汚染を含む開放創面切除などの手術治療は、インプラント周縁の炎症の障害にとっては有効な治療選択肢でありうる（Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００８，３５（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３１６−３３２）。しかし、現在に至るまで、一般的な治療法は存在せず、進行したインプラント周縁の炎症は、治療するのが困難である。
【００１２】
インプラントの稜領域の周りの周縁骨は、通常、インプラントの健康状態の重要な指標である。稜骨のレベルは、最初のインプラント手術の時点でのインプラントの稜位置から測定されることができる。骨量減少を評価する最も一般的な方法は、放射線写真評価による方法である。従って、骨レベルは、放射線写真上で測定されることができ、固定物と、インプラントに対して中位及び遠位の周縁骨の稜に対するその隣接点との間の接合点からの距離として定義されることができる（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）。もちろん従来の放射線写真は、インプラント本体の周りの骨量減少の中位又は遠位の側面をモニターするにすぎない（Ｍｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ２００８，１７（１）：５−１５）。進行中の骨量減少についての明確な情報の欠如は、インプラント周縁の病気の不要な又は不正確な治療を生じうる。インプラント周縁の骨レベルは、通常、診断時に撮影された放射線写真から決定される。骨レベルは、正常な骨レベルと比較され、より早い時点で撮影された一つ以上の放射線写真が、骨量減少を評価するために使用される。しかし、放射線写真は、骨の状況の静止画像を与える。従って、骨の脱石化の証拠は、進行中の病気の活性を必ずしも意味しない。これは、歯周病の骨レベルについても当てはまる。歯周病の進行についてのデータは、連続的な過程を示さず、代わりに、活性のバースト（悪化）、寛解、及び不活性な期間を示す（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）。それに加えて、放射線写真の限定された感度は、いくつかの病気に関与する病理学的な骨分解過程の極めて初期の段階の検出をほとんど可能にしない。さらに、全ての放射線写真の検査は、適切で再現性のある投影技術を使用して行なわれることが重要である。放射線写真に対して行なわれる測定の精度は、低く、特に、小さな平均骨量減少に関するときはそうである。このことは、これらの解釈に含まれる困難性を示唆する。さらに、骨量減少速度は、長い期間内、通常は一年間かけてのみ測定されることができ（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）、患者を頻繁に放射線にさらすことを必要とする。従って、インプラント周縁の炎症及び歯周病の患者における進行中の骨分解の確立は、個別化された患者治療の精度を増大させるための必要条件であるように見える。特許出願ＧＢ１３０２２５７．９を参照されたい。本明細書に開示される本発明は、インプラント周縁の病気の状態を確立するための異なるアプローチを目指している。
【発明の概要】
【００１３】
進行中の骨量減少についての明瞭な情報の欠如は、骨に影響を与える病気の不必要な、又は不正確な治療をもたらすおそれがあるので、個別化された患者治療及び病気の予後の精度を増大させるために、インプラント周縁の組織の状態を迅速にかつ正確に確立することが極めて望ましい。放射線写真の限定された感度は、治療が患者に与えられた直後の治療効率の確立をほとんど可能にしない。得られた放射線写真は、試験時の周縁骨レベルについての情報を提供するが、進行中の骨分解の明瞭な確立を提供しない。さらに、従来の放射線写真を使用した周縁骨レベル変化の測定についての定量限界は、０．４７ｍｍであると以前に見積もられている（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）。従って、骨に影響を与える病気を有する患者におけるインプラント周縁の病気の状態の迅速な確立は、患者の診断及び治療の精度を増大させるための必要条件である。これは、患者を頻繁に放射線にさらすことも回避する。
【００１４】
従って、本発明は、インプラント周縁の病気の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法を提供する：
ａ）エクスビボ試料において、ｔＰＡ，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量するか、及び／又はｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β及びＩＬ−８；ＩＬ−８及びＰＡＩ−２；ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＩＬ−６；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２のマーカーの組み合わせのうちの一つ以上の発現レベルを定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベルと比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。
【００１６】
用語及び略号
ｃＤＮＡ      相補的ＤＮＡ
Ｃｑ          定量サイクル
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
ＥＣＭ        細胞外マトリックス
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＡＰＤＨ    グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＣＦ        歯肉溝滲出液
ＨＰＲＴ１    ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＩＬ          インターロイキン
ＭＣ          粘膜炎
ＭＭＰｓ      マトリックスメタロプロテイナーゼ
ｍＲＮＡ      メッセンジャーＲＮＡ
ＰＡＩ−２    プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）
ＰＩ          インプラント周縁の炎症
ＰＩＣＦ      インプラント周縁間隙液
ｑＰＣＲ      定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ        リボ核酸
ＳＥＱ        配列
ＴＩＭＰｓ    マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター
ｔＰＡ        組織プラスミノーゲンアクチベーター
ＵＢＣ        ユビキチンＣ
ｕＰＡ        ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
ＹＷＨＡＺ    チロシン３／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、
ゼータポリペプチド
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１〜７中で言及される発現レベルは、対象のインプラント周縁間隙液（ＰＩＣＦ）から採取された試料において測定された。
【００１８】
【図１】得られたＩＬ−１β値の発現レベルは、治療前後にインプラント周縁の炎症を有する対象から採取された試料におけるＰＡＩ−２の発現レベルと比べられる（両方の場合において、正規化された発現）。ＩＬ−１βの発現レベルは、有意に低く、ＰＡＩ−２の発現レベルは、治療後も同様に留まっている。このことは、治療が効果を有し、対象のインプラント周縁の組織は健康であることを示す。
【００１９】
【図２】得られたＩＬ−８値の発現レベルは、治療前後にインプラント周縁の炎症を有する対象から採取された試料におけるＰＡＩ−２の発現レベルと比べられる。ＩＬ−８及びＰＡＩ−２の発現レベルは、治療後に変化せず、インプラント周縁の状態は、変化しなかった。
【００２０】
【図３】ＩＬ−６、ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２の発現レベルは、インプラント周縁の炎症と比べて粘膜炎を有する対象において、反対方向に調節されている（正規化された発現）。
【００２１】
【図４】ｔＰＡの発現レベルは、インプラント周縁の炎症と比べて粘膜炎を有する対象において、反対方向に調節されている（正規化された発現）。
【００２２】
【図５】ｔＰＡについての正規化されたＣｑ値の関数としての、粘膜炎と比べたインプラント周縁の炎症の確率。
【００２３】
【図６】ＩＬ−１βについての正規化されたＣｑ値の関数としての、健康なインプラント周縁の状態と比べたインプラント周縁の炎症の確率。
【００２４】
【図７】ｔＰＡについての正規化されたＣｑ値の関数としての、健康なインプラント周縁の状態と比べた粘膜炎の確率。
【００２５】
【図８】得られたＩＬ−８値の発現レベルは、治療前後にインプラント周縁の炎症を有する対象から採取された試料におけるｔＰＡの発現レベルと比べられる。ＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルは、治療後に変化せず、インプラント周縁の状態は、変化しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な記述は、本発明の個別の特徴の特定の及び／又は好ましい変形例を開示する。本発明は、本発明の二つ以上の特徴について記述された二つ以上の特定の及び／又は好ましい変形例を組み合わせることによって作成された特に好ましい実施形態としても考えられる。本発明は、インプラント周縁の病気の状態を決定する方法を提供する。前記方法は、ａ）エクスビボ試料において、パネルを形成する一群のマーカーのうちの一つ以上の（調節された）マーカーの発現レベル又はそれらの比率を定量する（ただし、前記一つ以上の調節されたマーカーは、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解活性に関連する）；及びｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、参照値（参照発現レベル）と比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【００２７】
バイオマーカー（以下、マーカーと称する）は、客観的に測定されて、正常な生物学的過程、病気の過程、及び治療介入への薬理学的応答の指標として評価される物質として定義されることができる。バイオマーカーは、健康状態、病気の発症、治療応答、及びその結果をモニターするために使用されることができる分子である（Ｚｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１，３（２）：４５−５２）。
【００２８】
プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解活性に関連するマーカー又はその組み合わせ又はその比率は、特に限定されず、ＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１０、及び／又はＩＬ−８、及び／又はＩＬ−６、及び／又はＭＭＰ−８、及び／又はＭＭＰ−２、及び／又はＭＭＰ−９、及び／又はＴＩＭＰ−１、及び／又はｔＰＡ、及び／又はＰＡＩ−２のうちの一つ以上、又はそれらの組み合わせであることができる。好ましくは、ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２である。また、好ましくは、ＩＬ−１β，ＩＬ−４，ＩＬ−８，ｔＰＡ及びＰＡＩ−２である。また、好ましくは、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２である。また、好ましくは、比率ｔＰＡ／ＰＡＩ−２であり、ｔＰＡが好ましい。本発明の好ましいマーカーは、以下のアクセッション番号によって同定されることができる（バイオテクノロジー情報のための国立センター、ＮＣＢＩ）：
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ＮＭ＿０００５７６．２
インターロイキン−８（ＩＬ−８）：ＮＭ＿０００５８４．３
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）：ＮＭ＿０００５７２．２
インターロイキン−４（ＩＬ−４）：Ｍ２３４４２．
マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）：ＮＭ＿００３２５４．２
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）（ＰＡＩ−２）：ＮＭ＿００１１４３８１８．１
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）：ＡＹ２２１１０１
【００２９】
例えば、前記一つ以上の（調節された）マーカーは、ｔＰＡ，ＩＬ−１β，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらの任意の比率である。好ましくは、前記一つ以上の（調節された）マーカーは、ｔＰＡ，ＩＬ−１β，ＰＡＩ−２及びＩＬ−８からなる群から選択される。好ましくは、前記調節されたマーカーは、ｔＰＡである。
【００３０】
好ましくは、前記マーカーの組み合わせは、以下のものである：
2017506069.tif 000003
【００３１】
前記マーカーの比率は、例えば、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２及び／又はＩＬ−１β／ＰＡＩ−２であることができる。
【００３２】
好ましくは、前記マーカーの比率は、以下のものである：
−  ｔＰＡ／ＰＡＩ−２
【００３３】
上記比率によって与えられる情報は、逆の比率（例えば、ＰＡＩ−２／ｔＰＡ）の計算からも得られることができる。
【００３４】
例えば、本発明の方法は、インプラント周縁の病気の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法である：
ａ）エクスビボ試料において、ｔＰＡ，ＩＬ−１β，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベルと比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【００３５】
例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ｔＰＡである。例えば、前記一つ以上の調節されたマーカー又はその比率は、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２である。
【００３６】
例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−１β及びＩＬ−８からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらの任意の比率である。例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−１β及びＩＬ−８からなる。
【００３７】
例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−８及びＰＡＩ−２及び／又はＩＬ−８及びｔＰＡからなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらの任意の比率である。例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−８及びＰＡＩ−２からなる。例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−８及びｔＰＡからなる。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法は、インプラント周縁の病気の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法である：
ａ）エクスビボ試料において、ｔＰＡ，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベルと比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【００３９】
例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらの任意の比率である。例えば、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる。
【００４０】
好ましくは、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらの任意の比率である。
【００４１】
好ましくは、前記一つ以上の調節されたマーカーは、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる。
【００４２】
好ましくは、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルは、ｔＰＡとＰＡＩ−２の間の比率（ｔＰＡ／ＰＡＩ−２）である。
【００４３】
好ましくは、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルは、ｔＰＡである。即ち、方法は、工程ａ）においてｔＰＡの発現レベルを定量することを含む。
【００４４】
所望により、本発明の方法は、工程ａ）で得られた一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルに関する情報をデータキャリア（例えば、電子的データキャリア）に保管するか、及び／又は工程ｂ）で得られたインプラント周縁の病気の状態に関する情報をデータキャリア（例えば、電子的データキャリア）に保管する工程をさらに含む。
【００４５】
本発明者は、プラスミノーゲン系、炎症及びタンパク質分解活性に関連する一つ以上のマーカーの発現レベル、又はこれらのうちの二つ以上のものの間の比率が、インプラント周縁の病気の状態に関連することを示している。これは、粘膜炎及び／又はインプラント周縁の炎症の迅速で高感度の決定を可能にする。このことは、本発明より前には、行なわれることができなかった。マーカーは、骨に影響を与える状態の存在又は非存在の指標でありうる。さらに、インプラント周縁の病気の状態は、患者が特定の治療を受けるべきであるということを示すことができる。
【００４６】
粘膜炎及び／又はインプラント周縁の炎症は、インプラント周縁の組織の状態としても言及されることができる。
【００４７】
本発明は、インプラント周縁の病気の状態の迅速な確立のための方法を提供し、患者が不要な放射線に暴露されることを防止し、診断、好適な治療の選択、及び／又はインプラントの予後の推定のための価値ある情報を臨床医に提供する。
【００４８】
例えば、本発明は、粘膜炎やインプラント周縁の炎症などのインプラント周縁の病気の診断のための方法を提供する。例えば、本発明は、粘膜炎やインプラント周縁の炎症などのインプラント周縁の組織の状態の診断のための方法を提供する。
【００４９】
例えば、本発明は、粘膜炎やインプラント周縁の炎症などのインプラント周縁の病気の予後を決定するための方法を提供する。例えば、本発明は、粘膜炎やインプラント周縁の炎症などのインプラント周縁の組織の状態の予後を決定するための方法を提供する。
【００５０】
本発明の文脈では、インプラント周縁の病気の状態は、進行する骨量減少の測定を使用することなしに粘膜炎又はインプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。換言すれば、病気の状態は、プラスミノーゲン系に関連する一つ以上のマーカーの発現レベル及び／又は一つ以上の炎症及び／又はタンパク質分解活性マーカーの発現レベルの差として規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされており、及び／又はもしＰＡＩ−２が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、病気の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされており、及び／又はもしＰＡＩ−２が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。
【００５１】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡが、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、病気の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡが、インプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。
【００５２】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーＩＬ−６が粘膜炎及び／又は健康な場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、病気の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーＩＬ−６が粘膜炎及び／又は健康な場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００５３】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡがインプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、病気の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡがインプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。
【００５４】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしＰＡＩ−２が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、病気の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしＰＡＩ−２が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００５５】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡが、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、病気の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１マーカーのうちの一つ以上が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡが、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００５６】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーが、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡ及びＰＡＩ−２が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、病気の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーが、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてアップレギュレートされており、及び／又はもしｔＰＡ及びＰＡＩ−２が、粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００５７】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡが粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、病気の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡが粘膜炎の場合における同じマーカーと比べてダウンレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００５８】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーのうちの一つ以上が、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、診断されることができる。例えば、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーが、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、診断されることができる。
【００５９】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーのうちの一つ以上が、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。例えば、もしＩＬ−１β及びＩＬ−８マーカーが、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、インプラント周縁の炎症であるとして規定されることができる。
【００６０】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡが、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、粘膜炎の状態は、診断されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡが、健康な組織における同じマーカーと比べてアップレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。
【００６１】
歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡ／ＰＡＩ−２の比率が、健康な組織及び／又はインプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーの比率と比べてダウンレギュレートされているなら、インプラント周縁の組織の状態は、粘膜炎であるとして規定されることができる。歯科用インプラントの特定の場合には、もしマーカーｔＰＡ／ＰＡＩ−２の比率が、健康な組織及び／又はインプラント周縁の炎症の場合における同じマーカーの比率と比べてダウンレギュレートされているなら、粘膜炎の状態は、診断されることができる。
【００６２】
ｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２などのプラスミノーゲン系のためのマーカー、及び／又はそれらの組み合わせ、及び／又はそれらの比率は、粘膜炎とインプラント周縁の炎症とを区別するために、及び／又はインプラント周縁の炎症及び／又は粘膜炎などのインプラント周縁の組織の状態を診断するために使用されることができる。
【００６３】
ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＩＬ−１０及び／又はＩＬ−１２及び／又はＩＬ１８などの炎症についてのマーカー、及び／又はそれらの組み合わせ、及び／又はそれらの比率は、粘膜炎とインプラント周縁の炎症とを区別するために、及び／又はインプラント周縁の炎症及び／又は粘膜炎などのインプラント周縁の組織の状態を診断するために使用されることができる。
【００６４】
ＴＩＭＰ−１などのタンパク質分解活性インヒビターについてのマーカーは、粘膜炎とインプラント周縁の炎症とを区別するために、及び／又はインプラント周縁の炎症及び／又は粘膜炎などのインプラント周縁の組織の状態を診断するために使用されることができる。
【００６５】
エクスビボ試料は、体液又は組織であることが好ましい。体液は、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は脳脊髄液、及び／又は滑液、及び／又は腹膜液、及び／又は唾液であることができ、好ましくは歯肉溝滲出液であり、より好ましくは、インプラント周縁間隙液である。
【００６６】
組織は、骨、及び／又は骨に隣接する組織、及び／又は結合組織、及び／または骨髄、及び／又は軟骨、及び／又は歯肉、及び／又は粘膜、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることができる。
【００６７】
好ましくは、エクスビボ試料は、体液であり、好ましくは、口腔液であり、好ましくは、歯肉溝滲出液であり、より好ましくは、インプラント周縁間隙液である。
【００６８】
エクスビボ試料（そこから炎症及び／又はタンパク質分解活性についてのマーカーが測定される）は、対象の体液又は組織から得られることができる。好ましくは、エクスビボ試料は、滅菌ペーパーポイント（ｐａｐｅｒ  ｐｏｉｎｔ）などの一つ以上の滅菌吸収体を、インプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入して、その場で少なくとも６０秒間放置することによって得られる。好ましくは、三つ以上の滅菌ペーパーポイントが溝／ポケット中に挿入される。
【００６９】
好ましくは、インプラント周縁の病気の状態についてのさらに正確な情報を得るために、二種、三種、四種、五種、六種、又はそれ以上のマーカーの発現レベル、又はそれらの比率が測定される。
【００７０】
例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ｔＰＡの発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についてのさらに正確な情報を得るために、ＩＬ−１β及びＩＬ−８の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ｔＰＡ及びＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２、及び／又はＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡ，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ及びＩＬ−８、及び／又はＰＡＩ−２及びＩＬ−８の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の病気の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。
【００７１】
例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ｔＰＡの発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についてのさらに正確な情報を得るために、ＩＬ−１β及びＩＬ−８の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ｔＰＡ及びＰＡＩ−２の発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ、及び／又はｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２、及び／又はＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２及び／又はＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルが測定される。例えば、インプラント周縁の状態についての情報を得るために、ｔＰＡ及びＩＬ−８、及び／又はＰＡＩ−２及びＩＬ−８の発現レベルが測定される。
【００７２】
エクスビボ試料中の炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する方法は、特に限定されず、核酸（例えばｍＲＮＡ）を定量する方法、及び／又はタンパク質を定量する方法（例えばＲＴ−ｑＰＣＲ（以下、ｑＰＣＲと称する））、及び／又はノーザンブロット、及び／又は免疫アッセイ、及び／又はＥＬＩＳＡ、及び／又は放射線免疫アッセイ、及び／又は磁気免疫アッセイ、及び／又は蛍光免疫アッセイ、及び／又は免疫沈降、及び／又は表面プラスモン共鳴、及び／又はウエスタンブロット、及び／又は免疫組織化学、及び／又はこれらの任意の組み合わせから選択されることができる。定量のための好ましい方法は、ｑＰＣＲである。実験手順は、通常、試料処理工程（即ち、抽出）を含む。
【００７３】
一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率の定量は、一種以上の参照遺伝子によって正規化されることができる。正規化は、参照遺伝子の発現レベルに対する関心のある遺伝子の発現レベルの比率を報告することを含む。参照遺伝子は、無料で入手できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラムを使用して選択されることができる。好ましくは、参照遺伝子は、安定に発現されるものであり、それらの豊富さが試料中の合計量（ｑＰＣＲの場合は、ｍＲＮＡの合計量）との強い相関を示すものである。より好ましくは、参照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ，ＹＷＨＡＺ，ＵＢＣ、及び／又はＨＰＲＴ−１から選択され、これらの中でもＹＷＨＡＺ及びＵＢＣが好ましい。
【００７４】
本発明の参照遺伝子は、以下のアクセッション番号によって同定されることができる。
ＹＷＨＡＺ（参照遺伝子）：ＮＭ＿００１１３５７０２．１
ＵＢＣ（参照遺伝子）：ＮＭ＿００１１３５７０２．１
【００７５】
本発明の文脈では、マーカーの発現レベルは、（ｉ）濃度、又は（ｉｉ）マーカーについて特異的な検出シグナル、又は（ｉｉｉ）数学的変換による、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に関連する値を意味することができる。
【００７６】
本発明の方法では、インプラント周縁の病気の状態（又はインプラント周縁の組織の状態）は、工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベル（参照値とも称する）と比較することによって決定されることができる。
【００７７】
一つ以上の参照発現レベルは、異なる時点で同一の源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることができる。
【００７８】
一つ以上の参照発現レベルは、インプラント周縁の炎症の履歴を示す源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることができる。
【００７９】
一つ以上の参照発現レベルは、粘膜炎の履歴を示す源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることができる。
【００８０】
一つ以上の参照発現レベルは、健康な組織の履歴を示す源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることができる。
【００８１】
ｑＰＣＲの場合、相対的な遺伝子発現レベルは、各アッセイに対してΔΔＣｑ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０２−４０８）を使用して、そして各遺伝子の遺伝子発現を参照遺伝子によって正規化することによって計算されることが好ましい。参照遺伝子は、例えば、無料で入手できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラム（ｗｗｗ．ｍｄｌ．ｄｋ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍ．Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０）を使用して選択されることができる。正規化された遺伝子発現は、各対象について、対数変換の後で以下の式を使用して計算されることができる：遺伝子ｇの正規化された発現＝（Ｃｑ（ｎ）−Ｃｑ（ｇ））。式中、Ｃｑ（ｇ）は、遺伝子ｇについての増幅サイクル数であり、Ｃｑ（ｎ）は、対象から採集された試料についての正規化因子（選択された参照遺伝子についての増幅サイクルの平均数）である。
【００８２】
ｑＰＣＲの場合、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率は、対応するアンプリコンの定量によっても定量されることができる。アンプリコンは、天然の又は人工の増幅又は複製事象の源及び／又は生成物である一片のＤＮＡ又はＲＮＡとして定義されることができる。本発明の場合は、炎症及びタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率の定量のための好ましいアンプリコンは、以下のものである：
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）：配列番号１
インターロイキン−６（ＩＬ−６）：配列番号２
マトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ８）：配列番号３
インターロイキン−８（ＩＬ８）：配列番号８
マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）：配列番号１０
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）：配列番号１１
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）（ＰＡＩ−２）：配列番号１２
ＹＷＨＡＺ（参照遺伝子）：配列番号１４
ＵＢＣ（参照遺伝子）：配列番号１５
【００８３】
本発明の方法は、骨に影響を与える状態の存在又は非存在、好ましくは、骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える状態の存在又は非存在を示すために使用されることができる。より好ましくは、前記状態は、インプラント周縁の病気、及び／又は歯周病であり、これらの中でも、インプラント周縁の病気が好ましい。
【００８４】
インプラント周縁の病気（骨分解の存在下でのインプラント周縁の炎症とも称される）は、支持骨の減少を生じる、インプラントの周りの組織に機能的に影響を与える炎症過程として定義される（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５：３１−３８）。粘膜炎は、軟組織の炎症、膨張、プロービングに対する出血、及びある場合には化膿としてしばしば言及されるが、骨量減少の徴候は有さない。
【００８５】
本発明の方法は、インプラント又は歯の予後の評価のためにも使用されることができる。
【００８６】
本発明者らは、プラスミノーゲン系、炎症及びタンパク質分解の活性に関連する特定のマーカーの発現レベル、又は二種以上のマーカーの間の比率、又はこれらの組み合わせとインプラント周縁の病気及び／又はインプラント周縁の組織の状態との間の関連について研究し、骨の影響を与える病気のための診断因子としてそれらを使用することを可能にした。従って、本発明によれば、骨に影響を与える病気、好ましくは骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える病気を有するかどうかについて、個別の患者を診断することができる。
【００８７】
例えば、本発明の方法によって、個々の患者は、粘膜炎及び／又はインプラント周縁の炎症を有するか又は有していないかについて診断されることができる。本発明者らは、インプラント治療を受けている患者から得られたインプラント周縁間隙液中のプラスミノーゲン系、炎症及びタンパク質分解の活性に関連する特定のマーカーの発現レベル又は二種以上のマーカーの間の比率が、インプラント周縁の病気に関連することを示した。この方法は、インプラント周縁の病気の状態の迅速な診断及び適切な治療の選択を提供する。
【００８８】
本発明者らは、インプラント治療を受けている患者から得られたインプラント周縁間隙液中のプラスミノーゲン系、炎症及びタンパク質分解の活性に関連する特定のマーカーの発現レベル又は二種以上のマーカーの間の比率が、インプラント周縁の組織の状態に関連することを示した。この方法は、インプラント周縁の組織の状態の迅速な診断及び適切な治療の選択を提供する。
【００８９】
従って、患者を放射線にさらすことは不要であり、臨床医は、治療を選択して患者の予後を確立するために、放射線写真によって評価される測定可能レベルの骨分解が進行するまで待つ必要がない。
【００９０】
インプラント周縁の病気及び／又はインプラント周縁の組織の状態が測定されるエクスビボ試料は、骨に影響を与える病気、好ましくは骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える病気を有していることができるか又は有していないことができる患者から得られることができる。好ましい患者は、一つ以上のインプラントを有する患者である。
【００９１】
好ましくは、患者は、インプラント支持組織に影響を与える病気、及び／又は骨支持インプラントに影響を与える病気、及び／又は歯の周りの組織に影響を与える病気（例えば、インプラント周縁の炎症、及び／又は粘膜炎、及び／又は歯周病、及び／又は歯肉炎）、又はこれらの組み合わせを有するか、及び／又は有する可能性がある。より好ましくは、前記患者は、インプラント周縁の病気を有するか、及び／又は有する可能性がある。例えば、患者は、粘膜炎を有するか、及び／又は有する可能性がある。例えば、患者は、インプラント周縁の炎症を有するか、及び／又は有する可能性がある。
【００９２】
患者のエクスビボ試料中のプラスミノーゲン系及び／又は炎症及び／又はタンパク質分解についてのマーカー、例えばＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１，ＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡの発現レベルは、ｑＰＣＲによって定量されることができる。
【００９３】
どのようにして三つの前記マーカー（ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１）のうちの一つ以上がＰＡＩ−２に対して調節されるかの決定は、もし患者が粘膜炎又はインプラント周縁の炎症を有するのなら、確立されるだろう。どのようにして三つの前記マーカー（ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１）のうちの一つ以上がｔＰＡに対して調節されるかの決定は、もし患者が粘膜炎又はインプラント周縁の炎症を有するのなら、確立されるだろう。患者は、彼／彼女自身のコントロール（参照発現レベル（参照値））であることができる。別の例では、同じマーカーが、別の患者又は他の患者の健康なインプラント部位、及び／又は粘膜炎を有する部位、及び／又はインプラント周縁の炎症を有する部位から採取された同じマーカーの発現レベルと比較される。好ましくは、この情報は、適切な治療及び／又は病気の予後の指標である。
【００９４】
健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較したＰＡＩ−２のアップレギュレーション及びＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１の同様の発現レベルは、ケア口腔衛生（ｃａｒｅ  ｏｒａｌ  ｈｙｇｉｅｎｅ）治療の標準を含む治療及び維持プログラムの指標であることができる。
【００９５】
健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較したｔＰＡのアップレギュレーション及びＩＬ−１β及び／又はＴＩＭＰ−１及び／又はＩＬ−８の同様の発現レベルは、ケア口腔衛生（ｃａｒｅ  ｏｒａｌ  ｈｙｇｉｅｎｅ）治療の標準を含む治療及び維持プログラムの指標であることができる。
【００９６】
健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較したＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１のアップレギュレーション及びＰＡＩ−２の同様の発現レベルは、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラム、及び数ヶ月以内の引き続いての（臨床医／歯科医への）訪問の指標であることができる。
【００９７】
健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較したＩＬ−１β及び／又はＴＩＭＰ−１及び／又はＩＬ−８のアップレギュレーション及びｔＰＡの同様の発現レベルは、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラム、及び数ヶ月以内の引き続いての（臨床医／歯科医への）訪問の指標であることができる。
【００９８】
もしＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１のアップレギュレーションが、最初の訪問の後も又は引き続いての訪問の後も持続するのなら、それは手術治療の指標であることができる。
【００９９】
もし健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較したＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡの同様のレベル及びＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１のアップレギュレーションが、（臨床医又は歯科医への）最初の訪問の後も又は引き続いての訪問の後も持続するのなら、それは手術治療の指標であることができる。
【０１００】
もしＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なインプラント周縁の組織からの参照と比較してＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１と異ならないのなら、それは口腔衛生のための標準プログラムの指標であることができる。
【０１０１】
もしｔＰＡ及び／又はＩＬ−１β及び／又はＴＩＭＰ−１及び／又はＩＬ−８の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと同様であるなら、それは口腔衛生のための標準プログラムの指標であることができる。
【０１０２】
もしｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較してダウンレギュレーションされているなら、それは粘膜炎の指標であることができ、従って口腔衛生のための標準プログラムの指標であることができる。ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の持続するダウンレギュレーション及びＩＬ−１β及び／又はＩＬ−８の持続するアップレギュレーションは、インプラント周縁の炎症の指標であることができ、手術治療の必要性の指標であることができる。
【０１０３】
もしインプラント周縁の組織が赤味及び炎症の徴候を示すのなら、臨床医（歯科医）は、粘膜炎の最初の指標を有することができる。しかし、これらの指標は、患者の状態（粘膜炎）の証明として十分ではない。本発明の方法を使用すれば、もしｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較してアップレギュレーションされ、及び／又はｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較してダウンレギュレーションされているなら、臨床医（歯科医）は、粘膜炎の指標の情報を与えられ、従って、口腔衛生のための標準プログラムに従うように患者に推奨する。
【０１０４】
もしインプラント周縁の組織が赤味、炎症及び化膿の徴候を示すのなら、臨床医（歯科医）は、インプラント周縁の炎症の最初の指標を有することができる。しかし、これらの指標は、患者の状態（インプラント周縁の炎症）の証明として十分ではない。本発明の方法を使用すれば、もしｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較して同様である（即ち、それらの発現レベルが異ならない）のなら、臨床医（歯科医）は、インプラント周縁の炎症の指標の情報を与えられ、従って、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラムに従うように、そして数週間以内に引き続いて訪問するように患者に推奨する。
【０１０５】
もし赤味、膨張及び化膿が持続するなら、臨床医（歯科医）は、インプラント周縁の炎症の最初の指標を有することができる。しかし、これらの指標は、患者の状態（インプラント周縁の炎症）の証明として十分ではない。本発明の方法を使用すれば、もしｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２及び／又はｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルが、健康なＰＩＣＦ及び／又はインプラント周縁の組織からの同じマーカーの発現レベルと比較して同様である（即ち、それらの発現レベルが異ならない）のなら、臨床医（歯科医）は、インプラント周縁の炎症の指標及び手術治療の必要性の情報を与えられる。
【０１０６】
用語「ヒト対象」、「対象」、及び「患者」は、本願では相互に交換可能に使用される。用語「状態」、及び「病気」は、本願では相互に交換可能に使用される。
【０１０７】
さらに、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。特定の治療の指標である炎症性マーカー及び／又はプラスミノーゲン系、タンパク質分解活性についてのマーカー（例えば、ｔＰＡ，ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２、又はそれらの任意の組み合わせ又はそれらの任意の比率）の発現レベルは、このキットを使用して与えられることができる。このキットの助けによって、患者から採取された試料中のプラスミノーゲン系及び／又は炎症及び／又はタンパク質分解の活性についてのマーカーの値が比較されることができる。本発明のキットは、試料採集装置を含むことができる。試料採集装置は、限定されず、体液又は組織などの試料を採集するための装置である。好ましくは、試料採集装置は、インプラント周縁間隙液の試料を採集するために使用される。試料採集装置は、滅菌ペーパーポイントなどの吸収体、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることができる。好ましくは、試料採集装置は滅菌吸収体であり、より好ましくは、滅菌ペーパーポイントである。
【０１０８】
本発明のキットは、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことができる。保存媒地の目的は、生物学的試料を保存することであり、下流の分析のために試料の一体性及び生存性を維持するように処方されたいかなる媒地であることもできる。好ましくは、保存媒地は、ＲＮＡアーゼの阻害剤を含むことができる。より好ましくは、保存媒地は、ＲＮＡＬａｔｅｒ保存媒地（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）である。
【０１０９】
本発明のキットは、本発明の方法を実行するための指示書をさらに含むことができる。
【０１１０】
本発明のキットは、試料を中央検査室に送付するための箱をさらに含むことができる。中央検査室では、プラスミノーゲン系及び／又は炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はこれらの組み合わせが、健康なインプラント部位及び／又は粘膜炎を有する部位及び／又はインプラント周縁の炎症を有する部位から採取された試料中の同じマーカーの発現と比較されることができる。発現レベル値の比較は、中央検査室で実行されることができる。
【０１１１】
代替的に、本発明のキットは、上述したようなプラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はこれらの組み合わせ又はこれらの比率（例えば、上述したようなｔＰＡ，ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２、又はそれらの任意の組み合わせ又はそれらの任意の比率）を定量するために必要な要素をさらに含むことができる。この場合、キットは、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカー又はこれらの組み合わせを特異的に認識する少なくとも一つの基質及び少なくとも一つの検出可能なラベルを含むことができる。例えば、キットは、ＰＡＩ−２の発現レベルを、試料採取部位でのＩＬ−１β，ＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１のうちの一つ以上と比較するために必要な要素をさらに含むことができる。
【０１１２】
好ましくは、キットは、以下のマーカー及び／又はそれらの組み合わせ及び／又はそれらの比率の発現レベルを定量するために必要な要素を含む：
2017506069.tif 000004
【０１１３】
例えば、キットは、ｔＰＡの発現レベルを、試料採取部位でのＩＬ−１β，ＩＬ−８及び／又はＴＩＭＰ−１のうちの一つ以上と比較するために必要な要素をさらに含むことができる。
【０１１４】
例えば、キットは、ｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−２の発現レベルを、試料採取部位でのｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルと比較するために必要な要素をさらに含むことができる。
【０１１５】
例えば、キットは、比率ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の発現レベルを定量するために必要な要素をさらに含むことができる。例えば、キットは、比率ＰＡＩ−２／ｔＰＡの発現レベルを定量するために必要な要素をさらに含むことができる。
【０１１６】
これらの場合、患者は、キットを使用して自宅で試料を採取して比較を行なうことができる。
【０１１７】
定量がｍＲＮＡの定量によって実行される場合、前記キットは、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーを検出して定量するために、一つ以上のプライマー配列も含むことができる。
【０１１８】
定量がタンパク質の定量によって実行される場合、前記キットは、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解の活性に関連する一種以上のマーカーを検出して定量するために、一つ以上の基質も含むことができる。好ましい基質は、抗体であり、この抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はこれらのフラグメントであることができる。キットは、一次抗体、二次抗体、及び標識化された抗体をさらに含むことができる。
【０１１９】
これらの場合、キットは、発現レベルの値を内挿して骨量減少速度を決定するために、骨吸収／再モデル化についてのマーカーに関連する一つ以上の検量線も含むことができる。バイオマーカーを使用した骨量減少速度の定量のためのキットは、同じ発明者によって、特許出願ＧＢ１３０２２５７．９中に以前に記載されている。
【０１２０】
キットは、本発明の実施形態のいずれかの方法において使用されることが好ましいが、キットの用途は、特に限定されない。
【０１２１】
所望により、キットは、（例えば本発明の方法の工程ａ）で得られた）一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルに関する情報を保管するための、及び／又は（例えば本発明の方法の工程ｂ）で得られた）インプラント周縁の病気の状態に関する情報を保管するための電子的データキャリアなどのデータキャリアを含むことができる。
【０１２２】
本明細書中で使用される表現「一つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」は、１及び１以上のいかなる数の個別化された列挙（例えば、２，３，４，５，６など）も含む。本明細書中で使用される表現「一つより大きい（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」又は「いくつかの（ｓｅｖｅｒａｌ）」は、１より大きいいかなる数の個別化された列挙（例えば、２，３，４，５，６など）も含む。
【０１２３】
他に明記されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中では、「含む」によって導入されたリストの部材に加えて、さらなる部材が所望により存在していてもよいということを示すために使用される。しかし、本発明の特定の実施形態として、用語「含む」が、さらなる部材が存在する可能性を包含しないことも想定される。つまり、この実施形態のために、「含む」は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の意味を有するものとして理解されるべきであることも想定される。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：検量線
対象
これは、非無作為の、片側ブラインド（ｂｌｉｎｄｅｄ）の（試料分析者）、制御された臨床実験的研究であり、スウェーデンのＧｏｅｔｅｂｏｒｇ大学の地方論理委員会によって承認された（Ｄｎｒ：６５２−１０）。この研究は、健康なインプラント部位を有する２５人の対象、インプラント周縁の粘膜炎の部位を有する２５人の対象、及びインプラント周縁の炎症の明らかな臨床的徴候を有する２５人の対象を含んでいた。研究は、単一の評価時点に限定された。研究参加者は、スウェーデンのＧｏｅｔｅｂｏｒｇのＢｒａｎｅｍａｒｋ  Ｃｌｉｎｉｃでの計画されたインプラント維持セッションに参加した、歯科用インプラントで以前にリハビリされた対象から選択された。各対象は、研究に関連する手順が実行される前に、インフォームドコンセントのプロセスに参加し、インフォームドコンセント書類（ＩＣＦ）に日付を入れて署名した。対象１人あたり一つのインプラント部位が評価され、選択された部位は、以下に記述される基準に基づいて、健康な（ＨＩ）部位、粘膜炎（ＭＣ）の部位、又はインプラント周縁の炎症（ＰＩ）の部位として分類された。インプラント周縁間隙液（ＰＩＣＦ）は、インプラント部位あたり三つのプールされたペーパーポイントを使用してインプラント部位から採集された。試料分析及び統計に関与する全ての人は、対象の身元を知らされず、試料分析に関与する人は、試料の種類（ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ）を知らされなかった。遺伝子マーカーの発現の分析は、独立した試験検査室（Ｔａｔａａバイオセンター、Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）によって実行された。
【０１２５】
算入／除外基準
本研究に参加するために、各対象は、表１に与えられる一般基準１〜５のそれぞれを満たしていた。ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ群のいずれかに含めるために、対象は、表２，３，４にそれぞれ与えられる算入基準を満たしている必要があった。全ての三つの群についての除外基準は、表５に与えられている。対象の健康状態及び治療（例えば、抗炎症治療、骨粗しょう症、糖尿病、未制御の上皮小体機能亢進症、コルチコイド、及び骨同化治療、悪性腫瘍の病歴、タバコ及び／又は他のニコチン含有製品の使用）は、除外基準ではなかったが、かかる状態、治療、及び使用は、症例報告書（ＣＲＦ）に記録された。抗生物質治療を除く、対象の登録の３０日前より後に受け取られた全ての正規の処方薬物、及び／又は他の正規の治療は、許可され、ＣＲＦに記録された。研究登録の３ヶ月前より後の抗生物質治療は、禁止された。
【０１２６】
対象の年齢、性別、口腔の健康状態、Ｍｏｍｂｅｌｌｉの改変された出血指数（ｍＢＩ）、改変されたプラーク指数（ｍＰＩ）、インプラント周縁のポケットの深さ（ＰＩＰＤ）、付着した粘膜の高さ、及び化膿の存在も、全ての対象についてＣＲＦに記録され、定量された。
【０１２７】
両群における対象の登録は、有資格基準を満たした対象について、引き続いて行なわれた。算入期間は、約１年であり、全ての三つの群の対象は、全期間にわたって登録された。
【０１２８】
無作為化は、適用可能でなかった。臨床試験及びＰＩＣＦ試料採集を行なう臨床研究者は、研究パラメータを知らされていた。試料分析に関与する全ての他の人は、対象の身元を知らされなかった。ＰＩＣＦ試料のｑＰＣＲ分析の実行に関与する人は、試料の種類（ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ）を知らされなかった。統計分析の実行に関与する人は、研究集団を知らされていた。
【０１２９】
健康な群からの一人の対象は、抗生物質の使用のため、スクリーニングの失敗として報告され、新しい対象と置換された。全てのインプラントは、１９８５年〜２０１０年の間に配置された。対象の主要な特徴は、表８に記載されている。機能の平均時間は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群について、それぞれ１４年、１３年及び１４年であった。ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群の対象のうち１９人（７６％）、１６人（６４％）及び１５人（６０％）はそれぞれ、機械加工された表面を有するインプラント（Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）インプラント）を与えられた。ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群の対象のうち１１人（４４％）、９人（３６％）及び８人（３２％）はそれぞれ、陽極酸化された表面を有するインプラント（Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）インプラント）を与えられた。ＨＩ群の５人の対象、及びＭＣ及びＰＩ群のそれぞれの１人の対象は、両方のタイプの表面を持つインプラントを有していた。ＭＣ群の１人の対象及びＰＩ群の３人の対象は、規定できない表面を持つインプラントを有していた。
【０１３０】
インプラントは、上顎及び下顎の両方から選択され、インプラントの配置及びインプラントのタイプ（即ち、デザイン、長さ、幅、表面）についての明らかな相違は、３つの群の間に観察されなかった。歯科状態及び補綴構造物についての臨床上の相違も、群間で観察されなかった。
【０１３１】
骨量減少、及び骨量減少速度、及び平均的なＭｏｍｂｅｌｌｉの改変された出血指数（ｍＢＩ）及びプラーク指数（ｍＰＩ）は、有資格基準を満たしていた。インプラント周縁の炎症の群における対象についての骨量減少及び骨量減少速度、インプラント周縁のポケットの深さ（ＰＩＰＤ）、付着した粘膜の平均高さ、及び化膿を示す対象の数は、表８に与えられている。データは、ＰＩＣＦ試料採取部位に言及している。ＨＩ群の全ての対象は、健康な粘膜を示したが、ＭＣ及びＰＩ群の対象は、中間の状態の粘膜の健康を示した。ＭＣ群における７人の対象（２８％）は、試験部位で化膿を示した。ＰＩＰＤは、ＰＩ群対ＭＣ群における対象について（ｐ＜０．０００１）、ＰＩ群対ＨＩ群における対象について（ｐ＜０．０００１）、及びＭＣ群対ＨＩ群における対象について（ｐ＜０．０００１）有意に異なっていた。
【０１３２】
一般的な健康状態のデータは、ＭＣ及びＰＩ群における多くの対象が、ＨＩ群と比較して中間の健康状態を有することを示した。対象は、健康状態において大きな相違を示し、そこでは、研究集団中の１人又は２人の対象のみが、リウマチ性関節炎などの特定の状態を示し、何人かの対象は、心臓病などの同じ状態を示した。一つ以上の群において研究群当たり３人以上の対象において示された健康状態は、表８に与えられている。健康な群における対象は、粘膜炎の群における対象（ｐ＜０．０００１）及びインプラント周縁の炎症の群における対象（ｐ＜０．０００１）と比較して、有意に良好な口腔衛生を有していた。喫煙は、健康な群においては、粘膜炎の群における対象（ｐ＝０．００４６）及びインプラント周縁の炎症の群における対象（ｐ＝０．０００１）と比較して、有意に一般的でなかった。歯周病及びインプラント周縁の炎症の履歴は、健康な群では、粘膜炎の群における対象（ｐ＝０．０２５）及びインプラント周縁の炎症の群における対象（ｐ＜０．０００１）と比較して、有意に少なかった。インプラント周縁の炎症の履歴は、インプラント周縁の炎症の群では、粘膜炎の群と比較して有意に一般的であった（ｐ＝０．００２３）。
【０１３３】
試料採集
ＰＩＣＦ試料採集は、以下のようにして行なわれた。三つの滅菌ペーパーポイント（Ｒｏｅｋｅ，Ｃｏｌｔｅｎｅ，ドイツ）は、インプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入され、選択されたインプラント部位について少なくとも６０秒間その場に放置された。三つのペーパーポイントは、ＲＮＡＬａｔｅｒ保存媒地（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を含む一つの２ｍｌプラスチックチューブ（マイクロチューブ、２ｍｌ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，ドイツ）に直ちに移された。即ち、三つの試料がプールされた。チューブを取り扱うときは、清潔な手袋が常に使用された。ペーパーポイントは、保存媒地中に完全に浸漬された。プールされた試料は、試料採集日に、常温でＢｒａｎｅｍａｒｋ  Ｃｌｉｎｉｃから、遺伝子マーカーの分析のために地方の検査室に移送された。
【０１３４】
試料の取り扱い及び分析
ｑＰＣＲ試料の分析は、ＴＡＴＡＡバイオセンターＡＢ（Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）で、Ｈａｌｌら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）によって以前に記述された標準手順に従って行なわれた。手短に述べると、ペーパーポイントに付着した細胞からのＲＮＡは、ＴＡＴＡＡバイオセンターで抽出された。次に、細胞は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，スウェーデン）を製造者の指示に従って使用して精製された。キット中に含まれる担持ＲＮＡは、抽出中のＲＮＡの損失を最小限にするために使用された。ＲＮＡは、ＢｉｏＲａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を製造者の指示に従って、５μｌのＲＮＡを使用してｃＤＮＡに変換された。ｃＤＮＡは、５０μｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）中に希釈された。次に、試料の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析が行なわれた。分析された生化学的マーカーは、表６に示される。Ｐｅｒｆｅｃｔａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，米国）、及び２μｌのｃＤＮＡテンプレート、及び０．４μＭのフォワード及びリバースプライマーが、ｑＰＣＲに使用された。各ｃＤＮＡ試料は、二連で定量された。以下の温度プロトコールが使用された：酵素活性化を９８℃で３分間、その後、９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間を４５サイクル。蛍光検出は、最後の温度サイクル中にＦＡＭ／ＳＹＢＲチャネルで行なわれた。実験は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，ドイツ）で行なわれた。増幅後、解離／融解曲線が、特定の生成物が生成されたことを確認するために作成された。相対的遺伝子発現レベルは、Ｃｑ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０２−４０８）を使用して、各アッセイについて９０％の効率を使用して、及び各遺伝子の遺伝子発現を、自由に利用できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラムを使用して選択された二つの参照遺伝子（ＵＢＣ及びＹＷＨＡＺ）によって正規化することによって計算された。二つの遺伝子は、四つの遺伝子ＧＡＰＤＨ，ＹＷＨＡＺ；ＵＢＣ，ＨＰＲＴ−１をプログラム中で実行した後に選択された。四つの正規化遺伝子の選択は、我々の以前の実施可能性研究（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）からの結果に基づいていた。そこでは、九つの参照遺伝子が調査され、ペーパーポイントを使用したＰＩＣＦ試料採集が使用された。主要な基準は、参照遺伝子の発現における変動は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群内及び群間で最小であるべきであるということであった。
【０１３５】
定量限界（ＬＯＱ）は、Ｃｑについて、全ての遺伝子について、分光光度計によって定量された精製ＰＣＲ生成物に基づいて決定された。各点において４連で５点の標準曲線が全てのアッセイについて作成され、１０〜１０６コピー数／μｌの濃度で１０倍希釈シリーズで実行された。決定されたＬＯＱ値より上の全てのデータは、分析から省略された。この手順は、データ分散を減少させ、データ分布を狭くし、これにより三つの対象群間の遺伝子発現の有意差の観察の可能性を増大させた。
【０１３６】
ｑＰＣＲ分析が試料マトリックス（例えば化膿の存在）によって阻害されたかどうかを調査するために、ＰＩ群からの１４個の試料が、ＲＮＡスパイク（＃ＲＳ１２ＪＧ，ＴＡＴＡＡバイオセンターＡＢ）の既知の濃度でスパイク（ｓｐｉｋｅ）され、同じ濃度でスパイクされた水試料と比べられた。一つの試料が、ＰＩ群の１４人の対象から、化膿を示す一つのインプラント部位から滅菌吸引針で採集された。吸引針での試料採集部位は、ペーパーポイントでの試料採集部位と同じではなかったが、類似していた。吸引針（Ｍｅｔａｌ  Ｓｕｃｔｉｏｎ  Ｔｉｐ，０．７×７０ｍｍ  ２２Ｇ，Ｍｅｄｉｐｌａｓｔ，Ｍａｌｍｏｅ，スウェーデン）は、選択された部位のインプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入された。試料を含む針は、プラスチック製注射器（１ｍｌ，ＢＤ  Ｐｌａｓｔｉｐａｋ，Ｍｅｄｉｐｌａｓｔ，Ｍａｌｍｏｅ，スウェーデン）から直ちに除去され、やさしく折り曲げられ、一つの４．５ｍｌプラスチック凍結チューブ（Ｎｕｎｃ  ＣｒｙｏＴｕｂｅ  Ｖｉａｌｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）中に入れられた。チューブの蓋は閉められ、チューブは、液体窒素で魔法瓶中で−１９６℃で凍結され、阻害分析のために検査室（ＴＡＴＡＡバイオセンター）に直ちに移送された。吸引針及びプラスチック製チューブを取り扱うときは、清潔な手袋が常に使用された。
【０１３７】
純粋なスパイクでの抽出と、試料マトリックス＋スパイクでの抽出の間で、有意差は観察されることができなかった。１４個の試験された試料の全てについて、純粋なスパイクとマトリックス＋スパイクとの間の差は、Ｃｑ＜０．３であり、これは、遺伝子発現における２５％未満の差に相当し、試料マトリックスが逆転写又はｑＰＣＲ反応を阻害しなかったことを示す。加えて、二次分析は、ＰＩ群において０．５ｍｍ／年未満の骨量減少速度を有する対象からの試料がＨＩ及びＭＣ対象と比較されたときに、ＴＲＡＰ及びＣａｔＫの平均発現に有意差がないことを示した。
【０１３８】
各群におけるプラスミノーゲン系、炎症及び骨吸収についての遺伝子マーカーの発現は、表９に与えられている。ＴＲＡＰ及びＣａｔＫの発現は、いかなる群においても有意に異ならなかった。
【０１３９】
実施例２〜９についての統計方法
三つの研究群間の遺伝子マーカー発現レベルの差は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して評価された。データ分析において、対数データ変換が行なわれ、独立した試料間の差について９５％の信頼区間が使用された。
【０１４０】
正規化された遺伝子発現は、各対象について、対数変換の後で以下の式を使用して計算された：遺伝子ｇの正規化された発現＝（Ｃｑ（ｎ）−Ｃｑ（ｇ））。式中、Ｃｑ（ｇ）は、遺伝子ｇについての増幅サイクル数であり、Ｃｑ（ｎ）は、対象から採集された試料についての正規化因子（選択された参照遺伝子についての増幅サイクルの平均数）である。分散分析は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群において、正規化された遺伝子発現を使用して行なわれた。
【０１４１】
もしＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群間の可能な差の調査が二つの遺伝子マーカーのみを含むのなら、０．０５未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされるだろう。しかし、研究は、ＬＯＱ分析中にいくつかのマーカーが除外された後に八つの遺伝子マーカーを含んでいたので、集団有意性についてのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正が使用され、０．００６３未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされた。
【０１４２】
各対象について計算された正規化された遺伝子発現は、同じ対象について同じ時点での放射線写真によって与えられる骨量減少についての情報と相関された。放射線写真検査技術は、当該技術分野では周知であり、Ａｈｌｑｖｉｓｔら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）に記載されるようにして行なわれることができる。骨レベルは、放射線写真上で測定されることができ、固定物と、インプラントに対して中位及び遠位の周縁骨の稜に対するその隣接点との間の接合点からの距離として定義される。
【０１４３】
実施例１０及び１１についての統計方法
遺伝子マーカーは、連続変数として処理され、平均、標準偏差（ＳＤ）、中央値、最小値、及び最大値として示された。二つの群の間の比較のために、Ｆｉｓｈｅｒの正確な試験が二分変数について使用された。相関分析は、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関ランク試験を使用して行なわれた。３つの群間で異なる対をなす遺伝子マーカーを同定するために、単一変数ロジスティック回帰分析が行なわれた。独立した遺伝子マーカーを選択するために、単一変数ｐ＜０．１５を有する全てのマーカーは、段階的多数回帰分析に含められた。ロジスティック回帰分析からの結果は、未調整のままで与えられ、９５％の信頼区間及びｐ値でＯｄｄｓ  Ｒａｔｉｏ（確率比、ＯＲ）で調整された。ＯＲは、所定のマーカーについての遺伝子発現における一単位の増加についてのＰ群に属する確率の変化である。独立した遺伝子マーカーの関数としてのＰ群に属する確率は、ロジスティック回帰から計算され、グラフに与えられる。対になったインプラント周縁の組織の状態（ＰＩ，ＭＣ，ＨＩ）を区別するために選択されたマーカーを使用するための適合度として、ＲＯＣ曲線が決定された。ＲＯＣ曲線の下側の面積は、インプラント周縁の炎症を有する無作為に選択された対象が、インプラント周縁の炎症を有さない無作為に選択された対象と比較して、選択されたマーカーのアップ又はダウンレギュレーションを有することになる確率である。もしＲＯＣ曲線の下側の面積が０．５であるなら、それは、所定のマーカーが、インプラント周縁の炎症と、研究された他の二つのインプラント周縁の組織の状態（ＨＩ，ＭＣ）とを区別するために使用されることができないということを意味する。もしＲＯＣ曲線の下側の面積が１であるなら、それは、所定のマーカーが、ＰＩ，ＭＣ及びＨＩ状態を完全に区別するために使用されることができることを意味し、感度＝１．０であり、特異性＝１．０であることを意味する。ｔＰＡと比率ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の間の極めて強い負の相関（ｒｓ＝−０．９７，ｐ＜０．０００１）のため、この比率は、単一変数ロジスティック分析中にのみ含められ、多数ロジスティック分析中には含められなかった。
【０１４４】
無料で入手可能なプログラムＮｏｒｍｆｉｎｄｅｒ  ３０が、データの正規化のための最良の参照遺伝子を同定するために使用された。計算の結果、同等の重みを有する二つの遺伝子の組み合わせＹＷＨＡＺとＵＢＣが、データの正規化のために選択された。なぜなら、両方の遺伝子の平均が使用されたときにＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群内及びこれらの群間で参照遺伝子発現の変動が最小であったからである。正規化された遺伝子発現は、各対象について、対数変換の後で以下の式を使用して計算された：遺伝子ｇの正規化された発現＝（Ｃｑ（ｎ）−Ｃｑ（ｇ））。式中、Ｃｑ（ｇ）は、遺伝子ｇについての増幅サイクル数であり、Ｃｑ（ｎ）＝（Ｃｑ（ＹＷＨＡＺ）＋Ｃｇ（ＵＢＣ））／２は、対象から採集された試料についての正規化因子である。統計分析は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群において、正規化された遺伝子発現を使用して行なわれた。
【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
実施例２
ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２の発現レベルは、インプラント周縁の炎症のための治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２の発現レベルは、実施例１に記載されたように、ｑＰＣＲによって定量される。次に、得られたＩＬ−１βの値は、同じ患者から採取された同じ試料における治療前後のＰＡＩ−２の発現レベルと比較される。図１参照。ＩＬ−１βの発現レベルとＰＡＩ−２の発現レベルは治療によって逆転されたので、治療は効果を有した。
【０１５５】
実施例３
ＩＬ−８及びＰＡＩ−２の発現レベルは、インプラント周縁の炎症のための治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＩＬ−８及びＰＡＩ−２の発現レベルは、実施例１に記載されたように、ｑＰＣＲによって定量される。ＩＬ−８の発現レベルとＰＡＩ−２の発現レベルは治療によって逆転されなかったので、治療は効果を有さなかった。図２参照。
【０１５６】
実施例４
ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２の発現レベルは、インプラント周縁の炎症のための治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２の発現レベルは、実施例１に記載されたように、ｑＰＣＲによって定量される。ＩＬ−６の発現レベルと、ＴＩＭＰ−１の発現レベルと、ＰＡＩ−２の発現レベルは治療によって逆転されたので、治療は効果を有した。図３参照。
【０１５７】
実施例５
ｔＰＡの発現レベルは、粘膜炎のための治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ｔＰＡの発現レベルは、実施例１に記載されたように、ｑＰＣＲによって定量される。ｔＰＡの発現レベルは約３倍減少されたので、治療は効果を有した。図４参照。
【０１５８】
実施例６
実施例２，４及び５の一つ以上において、臨床医は、対象にケア口腔衛生治療の標準プログラムを与えることができる。引き続いての訪問は、数ヶ月内又は一年以内に予定されることができる。
【０１５９】
実施例７
実施例３において、臨床医は、治療は効果を有さなかったと結論付け、対象に追加の口腔衛生治療を与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。もし２回目の引き続いての訪問においてマーカーが変化していなかったなら、臨床医は、その部位の手術治療を行なうことを決定することができる。
【０１６０】
実施例８
実施例２，４及び５の一つ以上において、対象は、インプラント周縁の炎症（即ち、インプラント周縁の炎症、膨張、赤味、化膿、及び病的なクレーター形状の周縁骨量減少）の明らかな徴候を示す。しかし、マーカーは、非手術治療によって変化しており、臨床医は、手術治療は不要であると結論付け、対象に追加の口腔衛生治療、維持プロトコールを与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。
【０１６１】
実施例９
別の実施例では、炎症及びプロービングに対する出血を示す対象から採集された試料は、ＩＬ−１βとＰＡＩ−２の間の比率が２未満であることを示す。臨床医は、タンパク質分解の活性は極めて低く、有意でないと結論付け、対象にケア口腔衛生プログラムの標準を与える。引き続いての訪問は、数ヶ月以内又は一年以内に予定される。
【０１６２】
実施例１〜９の対象を放射線にさらすことは必要ではなく、臨床医は、インプラント周縁の病気の状態を決定するために、骨分解が実施例において放射線写真によって評価される測定可能なレベルに進行するまで待つ必要はなかった。
【０１６３】
実施例１０
ＰＩ群とＭＣ群を区別するための単一変数ロジスティック回帰からの有意なマーカーは、ＩＬ−１βの高い値（ｐ＝０．００６５）、ＩＬ−８の高い値（ｐ＝０．００８２）、ＰＡＩ−２の低い値（ｐ＝０．００８９）、及びｔＰＡの低い値（ｐ＝０．００５４）であった。９５％の信頼区間及びＲＯＣ曲線の下側の面積（ＡＵＣ）での確率比について表１０参照。ｔＰＡが段階的分析中に入れられた後、他のマーカーはモデル中に入れられなかった。ＲＯＣ曲線の下側の面積（ＡＵＣ）は０．８１であった。増大するｔＰＡの関数としてのＭＣ群と比較したＰＩ群に属する確率は、図５に与えられている。
【０１６４】
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【０１６５】
インプラント周縁の炎症を有する対象とＨＩ群の対象を区別するための単一変数ロジスティック回帰からの有意なマーカーは、ＩＬ−１βの高い値（ｐ＝０．０１５）及びＩＬ−８の高い値（ｐ＝０．０３６）であった。表１０参照。ＩＬ−１βが段階的分析中に入れられた後、他のマーカーはモデル中に入れられなかった。ＲＯＣ曲線の下側の面積（ＡＵＣ）は０．８１であった。増大するＩＬ−１βの関数としてのＨＩ群と比較したＰＩ群に属する確率は、図６に与えられている。
【０１６６】
ＭＣ群とＨＩ群を区別するための単一変数ロジスティック回帰からの有意なマーカーは、ｔＰＡの高い値（ｐ＝０．０２１）であった。表１０参照。増大するｔＰＡの関数としてのＨＩ群と比較したＭＣ群に属する確率は、図７に与えられている。
【０１６７】
比率ｔＰＡ／ＰＡＩ−２は、ＨＩ群（ｐ＝０．０２９）及びＰＩ群（ｐ＝０．０２２）と比較してＭＣ群において有意に低かった。表１０参照。ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の比率は、ｔＰＡに対して極めて強い負の相関を有していた（ｒｓ＝−０．９７、ｐ＜０．０００１）。
【０１６８】
ＭＣ群と比較してＰＩ群の対象からの試料では、ＩＬ−１β及びＩＬ−８はアップレギュレーションされており、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２はダウンレギュレーションされていた。ＨＩ群と比較してＭＣ群の対象からの試料では、ｔＰＡはアップレギュレーションされていた。ＨＩ群及びＰＩ群と比較してＭＣ群の対象からの試料では、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２の比率は有意にダウンレギュレーションされていた。
【０１６９】
これらのデータは、粘膜炎及びインプラント周縁の炎症は、タンパク質分解の活性に対する宿主の炎症性応答によって分けられる二つの異なる状態であることを示唆する。インプラントには生体膜が常に存在し、宿主の炎症性応答が常に存在し、これは、健康な対象及び粘膜炎を有する対象では、組織の分解と修復の間でバランスを取られているが、インプラント周縁の炎症を有する対象では、組織の破壊に向かってバランスが病理学的にシフトされている。この研究からの結果は、プラスミノーゲン系がかかるバランスにおいて重要な役割を果たしていることを示す。
【０１７０】
インプラント周縁の炎症の履歴を除いては、対象の健康状態は、粘膜炎及びインプラント周縁の炎症を有する対象の炎症及びプラスミノーゲン系の応答に影響を与えるように見えなかった。表８参照。従って、インプラント周縁の炎症の履歴を除いては、対象の健康状態は、この研究における粘膜炎とインプラント周縁の炎症の間の相違に寄与しなかった。
【０１７１】
貧弱な口腔衛生及び改変されたプラーク指数は、ＭＣ群の対象及びＰＩ群の対象について同様であった。従って、粘膜炎及びインプラント周縁の炎症の治療の成功は、部位から除去された生体膜の品質に依存しておらず、むしろ、生体膜内の微生物活性の除去又は阻害に依存することができる。
【０１７２】
感染した部位における生体膜の除去、及び所望により骨増強手順に加えて、インプラント周縁の炎症の手術的治療は、ポケットを除去して口腔衛生手段を増強することを目的とする。その結果は、いくらか予測不可能であり、我々の経験に基づけば、しばしばではないが、プロービングによる出血であり、膿の存在が短期間の後に出現しうる。これが連続的で活性な軟組織分解及び骨吸収の発現であって、さらなる手術を必要とするのか、又はこれが進行中の有意な組織分解及び骨吸収に相関していない感染及び炎症であるのかを知ることは価値のあることである。もし病気の段階が、感染を有するが進行中の有意な組織分解及び骨吸収を有さない相にあるのなら、手術的介入の使用に疑義を唱えることが合理的であるかもしれない。たぶん、これは歯周病の患者の治療とは対照的である。歯周病の患者の治療の場合、一般的な結果は、予測可能で成功し、この病気が様々な相の活性を示すという事実に気付くことは、臨床上の取り扱いを変化させない。
【０１７３】
さらに、インプラント周縁の炎症のための治療の効果を迅速に評価することができることは価値のあることであるだろう。放射線写真は、０．５ｍｍより大きい骨レベルの変化を評価するために使用されることができる（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  Ｊ，Ｂｏｒｇ  Ｋ，Ｇｕｎｎｅ  Ｊ，Ｎｉｌｓｏｎ  Ｈ，Ｏｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ａｓｔｒａｎｄ  Ｐ．Ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｅｄｅｎｔｕｌｏｕｓ  ｊａｗｓ：ａ  ２−ｙｅａｒ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０；５（２）：１５５−１６３）ので、骨量減少がかかるレベルに到達するには長い時間期間が要求されるだろう。もし放射線写真に依存せずに粘膜炎及びインプラント周縁の炎症の明確な診断が確立されることができるのなら、それは、インプラント周縁の病気の状態及び治療の効果の迅速な評価のための強力なツールを構成することができる。
【０１７４】
この研究における粘膜炎を有する対象及びインプラント周縁の炎症を有する対象についての様々な遺伝子パネルは、プラスミノーゲン系及び炎症についてのマーカーが、進行中の組織及び骨分解の迅速な確立のためのかかる強力なツールを提供することができるということを示唆する。ＲＯＣ曲線の下側の面積は、ＭＩ群の対象と比較してＰＩ群の対象では、ｔＰＡについて０．８１であった。従って、インプラント周縁の炎症を有する、無作為に選択された対象が、粘膜炎を有する、無作為に選択された対象と比較してｔＰＡの低い値を有する確率は８１％であった（表１０参照）。ｔＰＡのアップレギュレーションは、我々の研究では、粘膜炎の強力な予測因子であった。
【０１７５】
結論
ＰＩ群における対象の試料採取部位では、化膿の存在は、ｑＰＣＲ分析を阻害せず、骨吸収マーカーを発現する細胞の移動についてのバリアは、存在しないように見えた。マーカーＩＬ−１β及びＩＬ−８は、ＭＣ群と比較してＰＩ群において有意に高く、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２は、ＭＣ群と比較してＰＩ群において有意に低かった。ｔＰＡは、最も強力なマーカーであり、骨量減少速度とは無関係に、粘膜炎とインプラント周縁の炎症を区別するために使用されることができた。これらの結果は、粘膜炎を有する対象における炎症したインプラント部位において、プラスミノーゲン系は、十分にアップレギュレーションされており、炎症の解消及び治癒を可能にするが、インプラント周縁の炎症を有する対象においては、かかるアップレギュレーションは、不十分であり、損なわれた治癒及び延長された炎症を生じることを示唆した。
【０１７６】
実施例１１
ＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルは、インプラント周縁の炎症のための治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＩＬ−８及びｔＰＡの発現レベルは、実施例１に記載されたように、ｑＰＣＲによって定量される。ＩＬ−８の発現レベルとｔＰＡの発現レベルは治療によって逆転されなかったので、治療は効果を有さなかった。図８参照。
【０１７７】
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【０１７８】
本発明の項目
１．インプラント周縁の病気又は歯周病の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）エクスビボ試料において、パネルを形成する一群のマーカーのうちの一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル又はそれらの比率を定量する（ただし、前記一つ以上の調節されたマーカーは、プラスミノーゲン系、炎症及び／又はタンパク質分解活性に関連する）；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、参照値と比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
２．前記パネルが、タンパク質分解酵素のインヒビターの群から選択されるマーカーを含むことを特徴とする、項目１に記載の方法。
３．前記マーカーが、ＩＬ−１β，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，ＴＩＭＰ−１，ｔＰＡ，ＰＡＩ−２又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、項目１又は２に記載の方法。
４．前記パネルが、少なくともＩＬ−１β，ＩＬ−４，ＩＬ−８，ＩＬ−１２，ＴＩＭＰ−１，ＰＡＩ−２、又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、項目１に記載の方法。
５．エクスビボ試料が、体液又は組織であることを特徴とする、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記体液が、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は唾液であることを特徴とする、項目５に記載の方法。
７．前記体液が、歯肉溝滲出液であることを特徴とする、項目５又は６に記載の方法。
８．前記体液が、インプラント周縁間隙液であることを特徴とする、項目５〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記組織が、骨、及び／又は結合組織、及び／又は粘膜であることを特徴とする、項目５に記載の方法。
１０．前記組織が、骨、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることを特徴とする、項目５又は９に記載の方法。
１１．マーカーが前記パネルにおいてアップ又はダウンレギュレーションされたかどうかを分析するために、異なる時点で同一の源から採取されたエクスビボ試料からの参照値を使用する工程を含むことを特徴とする、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．マーカーが前記パネルにおいてアップ又はダウンレギュレーションされたかどうかを分析するために、歯周病の履歴を示すマーカーを有する参照値を使用する工程を含むことを特徴とする、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
１３．マーカーが前記パネルにおいてアップ又はダウンレギュレーションされたかどうかを分析するために、インプラント周縁の炎症の履歴を示すマーカーを有する参照値を使用する工程を含むことを特徴とする、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
１４．前記定量が、核酸の定量によって行なわれることを特徴とする、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記定量が、ｑＰＣＲ，及び／又はノーザンブロットによって行なわれることを特徴とする、項目１４に記載の方法。
１６．前記定量が、タンパク質の定量によって行なわれることを特徴とする、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
１７．前記定量が、免疫アッセイ、及び／又はＥＬＩＳＡ、及び／又は放射線免疫アッセイ、及び／又は磁気免疫アッセイ、及び／又は蛍光免疫アッセイ、及び／又は免疫沈降、及び／又は表面プラスモン共鳴、及び／又は免疫組織化学、及び／又はウエスタンブロット、及び／又はこれらの任意の組み合わせによって行なわれることを特徴とする、項目１６に記載の方法。
１８．決定された発現レベルが、骨に影響を与える状態の存在又は非存在の指標であることを特徴とする、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．決定された発現レベルが、粘膜、歯肉、骨支持インプラント及び／又は歯に影響を与える状態の存在又は非存在の指標であることを特徴とする、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．試料が、一つ以上のインプラントを有する患者から得られることを特徴とする、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．インプラントが、骨固定インプラントであることを特徴とする、項目２０に記載の方法。
２２．インプラントが、歯科用インプラント、及び／又は股関節インプラント、及び／又は膝関節インプラント、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする、項目２０又は２１に記載の方法。
２３．項目１〜２２のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
２４．キットが、試料採集装置をさらに含むことを特徴とする、項目２３に記載のキット。
２５．試料採集装置が、滅菌ペーパーポイント、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることを特徴とする、項目２４に記載のキット。
２６．キットが、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことを特徴とする、項目２３〜２５のいずれかに記載のキット。
２７．キットが、試料を中央検査室に送付するための箱をさらに含むことを特徴とする、項目２３〜２６のいずれかに記載のキット。
２８．キットが、炎症及び／又はタンパク質分解の活性、又はそれらの任意の組み合わせに関連する一つ以上のマーカーの発現レベルを定量するために必要な要素をさらに含むことを特徴とする、項目２３〜２７のいずれかに記載のキット。
【図１】
2017506069.tif 000018
【図２】
2017506069.tif 000019
【図３】
2017506069.tif 000020
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2017506069000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月9日(2016.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラント周縁の病気の状態を決定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）エクスビボ試料において、ｔＰＡ，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量するか、及び／又はｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＩＬ−１β；ｔＰＡ及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β及びＩＬ−８；ＩＬ−８及びＰＡＩ−２；ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＩＬ−６；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２／ｔＰＡ；ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２のマーカーの組み合わせのうちの一つ以上の発現レベルを定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを、一つ以上の参照発現レベルと比較することによって、インプラント周縁の病気の状態を決定する工程。
【請求項２】
前記一つ以上の調節されたマーカーが、ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルが、ｔＰＡとＰＡＩ−２の間の比率であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーが、ｔＰＡであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記一つ以上の調節されたマーカーが、ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１、及びＰＡＩ−２からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エクスビボ試料が、体液又は組織であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は唾液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が、インプラント周縁間隙液であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織が、骨、及び／又は結合組織、及び／又は粘膜であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織が、骨、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることを特徴とする、請求項６又は９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の一つ以上の参照発現レベルが、異なる時点で同一の源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であり、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、インプラント周縁の病気の状態の指標であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）の一つ以上の参照発現レベルが、インプラント周縁の炎症の履歴を示す源から採取されたエクスビボ試料からの前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率であり、前記一つ以上の調節されたマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、インプラント周縁の病気の状態の指標であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記定量が、核酸の定量によって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記定量が、ｑＰＣＲ，及び／又はノーザンブロットによって行なわれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定量が、タンパク質の定量によって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記定量が、免疫アッセイ、及び／又はＥＬＩＳＡ、及び／又は放射線免疫アッセイ、及び／又は磁気免疫アッセイ、及び／又は蛍光免疫アッセイ、及び／又は免疫沈降、及び／又は表面プラスモン共鳴、及び／又は免疫組織化学、及び／又はウエスタンブロット、及び／又はこれらの任意の組み合わせによって行なわれることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、一つ以上のインプラントを有する患者から得られることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
インプラントが、骨固定インプラントであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インプラントが、歯科用インプラント、及び／又は股関節インプラント、及び／又は膝関節インプラント、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）で得られた一つ以上の調節されたマーカーの発現レベルに関する情報をデータキャリアに保管するか、及び／又は工程ｂ）で得られたインプラント周縁の病気の状態に関する情報をデータキャリアに保管する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２２】
キットが、試料採集装置をさらに含むことを特徴とする、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
試料採集装置が、滅菌ペーパーポイント、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
キットが、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
キットが、試料を中央検査室に送付するための箱をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
キットが、ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ１８，ＴＩＭＰ−１，ｔＰＡ及びＰＡＩ−２からなる群から選択される一つ以上のマーカーの発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせ、又はそれらの任意の比率を定量するために必要な要素をさらに含むか、又は、ｔＰＡ及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＩＬ−１β；ｔＰＡ及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β及びＩＬ−８；ＩＬ−８及びＰＡＩ−２；ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ｔＰＡ及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びＩＬ−６；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６及びＴＩＭＰ−１；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＩＬ−６，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＰＡＩ−２及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ；ＩＬ−１β，ＩＬ−８及びｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びＰＡＩ−２；ＩＬ−１β，ＩＬ−８，ＴＩＭＰ−１及びｔＰＡ；ｔＰＡ／ＰＡＩ−２；ＰＡＩ−２／ｔＰＡ；ＩＬ−１β及びＰＡＩ−２のマーカーの組み合わせの発現レベルを定量するために必要な要素をさらに含むか、又は、ｔＰＡ／ＰＡＩ−２のマーカーの発現レベルの比率を定量するために必要な要素をさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
前記マーカーがｔＰＡであることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
キットが、データキャリアをさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２７のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】
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2017506069.tif 000028
2017506069.tif 000029
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