(57)【要約】  本発明は、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の生産方法に関し、上記方法は、（ａ）サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを用いて、動物血清を含まない培地中で樹状細胞の前駆体を培養して、樹状細胞に分化させる工程と、（ｂ）アポトーシス細胞を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた樹状細胞を、抗炎症活性を有する化合物の存在下で培養する工程と、（ｄ）樹状細胞によるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスを刺激するために、工程（ｄ）から得られた樹状細胞と、工程（ｃ）から得られたアポトーシス細胞とを共培養する工程と、（ｅ）表現型評価に基づく特定によって、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の生産を判定する工程とを含んでいる。本発明はまた、上記方法によって生産されたｔｏｌＤＣ細胞、および全身性エリテマトーデスの治療に適した薬剤の生産における特異抗原を有する上記ｔｏｌＤＣの使用にも関する。
2017518080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の生産方法であって、
（ａ）サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを用いて、動物血清を含まない培地において、樹状細胞前駆体を培養して、樹状細胞に分化させる工程と、
（ｂ）アポトーシス細胞を生産する工程と、
（ｃ）工程ａ）で得られた樹状細胞を、抗炎症活性を有する化合物の存在下で培養する工程と、
（ｄ）樹状細胞によるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスを促進するために、工程ｃ）の樹状細胞と、工程ｂ）のアポトーシス細胞とを共培養する工程と、
（ｅ）特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）が得られたことを、表現型の特定による特定を介して判定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ａ）の上記樹状細胞前駆体は、単球、骨髄前駆体から選択され、あるいは末梢血または臍帯血から直接選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３０〜４５℃および１〜１０％のＣＯ２の条件下で、前駆体、並びにサイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを培養する場合に分化が行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）の上記アポトーシス細胞は、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）放射、スタウロスポリン、メトトレキサートから選択された化学物質の存在、ＦＡＳ−ＦＡＳリガンド相互作用等の特異受容体の活性化、またはヘプタクロルもしくはロテノンを用いたミトコンドリア電子伝達の阻害から選択されたアポトーシス刺激に細胞を曝すことによって生産されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシス細胞の由来となる上記細胞は、血液細胞、筋肉細胞、表皮細胞、上皮細胞、幹細胞、またはヒト細胞株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血液細胞は、末梢血リンパ球、血小板、好中球、または単球であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｄ）の抗炎症活性を有する化合物の存在下での樹状細胞の培養が、５〜４８時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記抗炎症活性を有する化合物が、ロシグリタゾン（ＲＺＧ）およびデキサメタゾン（ＤＥＸＡ）、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
５〜３０μＭのロシグリタゾンの存在下、および０．５〜５μＭのデキサメタゾンの存在下で上記樹状細胞が培養されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｅ）の、樹状細胞とアポトーシス細胞との上記共培養が、５〜２０μｇ／ｍｌのＤＮＡ量として表される、アポトーシス細胞の量を考慮して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記共培養が、動物血清を含まない培地で行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
樹状細胞とアポトーシス細胞との上記共培養が、５〜４８時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）免疫原性成熟ＤＣと比べて少なくなければならないサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産と、ｉｉ）表面マーカーの発現がない、または免疫原性成熟ＤＣと比べて少ないこととを評価することによって、工程ｆ）において、ｔｏｌＤＣの特定が行われ、上記表面マーカーが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産の評価、並びにＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの組み合わせの表面マーカーの発現が、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたメッセンジャーＲＮＡの転写レベルから選択された技術を用いて行われることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法を用いて得られる、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項１６】
上記寛容性樹状細胞が、単球、骨髄前駆体に由来し、あるいは末梢血または臍帯血から直接的に得られることを特徴とする、請求項１５に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項１７】
上記特異抗原が自己抗原であることを特徴とする、請求項１５に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項１８】
上記特異抗原がアポトーシス細胞に由来することを特徴とする、請求項１５に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項１９】
上記アポトーシス細胞がアポトーシス刺激を受けた細胞に由来することを特徴とする、請求項１５に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２０】
上記細胞が受ける上記アポトーシス刺激が、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）放射、スタウロスポリン、メトトレキサートから選択された化学物質の存在、ＦＡＳ−Ｆａｓリガンド相互作用等の特異受容体の活性化、またはヘプタクロルもしくはロテノンを用いたミトコンドリア電子伝達の阻害から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２１】
アポトーシス細胞が、血液細胞、筋肉細胞、表皮細胞、上皮細胞、幹細胞、またはヒト細胞株に由来することを特徴とする、請求項１９に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２２】
上記血液細胞は、末梢血リンパ球、血小板、好中球、または単球であることを特徴とする、請求項２１に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２３】
上記細胞が、表現型評価を用いて特定されることを特徴とする、請求項１５に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２４】
ｉ）免疫原性成熟ＤＣと比べて少なくなければならないサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産と、ｉｉ）表面マーカーの発現がない、または免疫原性成熟ＤＣと比べて少ないこととを評価することによって、ｔｏｌＤＣの特定が行われ、上記表面マーカーが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２５】
ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産の評価、およびＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの組み合わせの表面マーカーの発現が、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたメッセンジャーＲＮＡの転写レベルから選択された技術を用いて行われることを特徴とする、請求項２４に記載の特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）。
【請求項２６】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための療法の構築における、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の使用。
【請求項２７】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療に有用な薬剤の生産における、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療に用いるために構成された特異抗原に関する寛容性樹状細胞の生産に関する。
【０００２】
〔技術水準〕
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、１００，０００人当たり１２４人の有病率を有する、主に出産適齢期の女性が患う原因不明の慢性自己免疫疾患である。臨床的な観点から見ると、ループス（lupus）は、特に、腎臓、心臓、肺、皮膚、筋骨格系、および血液学系を含む多数の器官に影響する。また、ループスは、寛解期と交互に起こる再活性化または発症という特徴を有する予測不可能な臨床的進行を示す。過去５０年間におけるＳＬＥの死亡率は大きく減少したが、２０歳でＳＬＥにかかった患者は、ループス自体、または関連する合併症により、３５歳までに死亡する確率が１５％ある。ＳＬＥは高い総罹患率も示す。例えば、患者の生存および生活の質への影響に関して、最も関連する合併症の１つは、ループス患者の５０％以下に影響するループス腎炎（ＬＮ）である。この症状の治療の効果を最大化するための多大な努力にもかかわらず、いまだに１０〜３０％のＬＮ患者が末期腎不全にかかり、その結果、透析および／または腎臓移植を必要とすることとなる。さらに、ループス患者は、一般的な集団よりも２〜５倍高い死亡率を有し、２３％以下の就労不能を示し、出産適齢期の女性の場合は、妊娠が困難になり、健康な女性に比べて妊娠中の罹患率‐死亡率が高くなる。
【０００３】
さらに、ＦＤＡは２０１１年に３０年振りにＳＬＥ治療の新薬（ベリムマブ）を承認した。それにもかかわらず、上記新薬、およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、シクロホスファミド、およびステロイドを含むＳＬＥ用のその他の通常使用される薬は、日和見感染等の重大な合併症に関する非治癒的かつ免疫抑制的な非特異治療である。最近、ループス腎炎におけるＭＭＦの使用を研究しているプロジェクトＡＬＭＳ（NCT00377637）の研究チームが、ＭＭＦ薬とアザチオプリンとを比較した上記研究の維持期の結果を公表した。上記研究によると、アザチオプリンを使用した３３．３％の患者、およびＭＭＦを使用した２３．５％の患者が重篤な副作用を示し、それによって、それぞれ３９．６％の患者、および２５．２％の患者が研究から辞退することとなったことを示している。リツキシマブ等の他の自己免疫疾患における使用が承認された他の生物学的薬剤は、ループスの制御された臨床研究における有効性を示さず、従来の免疫抑制剤と同様に、日和見感染の発現に寄与し得る。
【０００４】
本発明は、ＳＬＥの免疫療法のためのアポトーシス細胞に由来する抗原に特異的な自己樹状細胞（ＤＣ）を取得する方法にある。従来技術を調査すると、免疫学的疾患を治療するための樹状細胞の提供および使用に関するいくつかの文献が発見された。研究が行われた本技術に最も類似する文献は特許公開WO2001085207であり、当該文献においては、Ｔ細胞アネルギーの誘導を介して細胞性応答を刺激するために、アポトーシス細胞を使用してＤＣ細胞の能力を低下させることが提案されている。また、上記文献は、ＤＣによるアポトーシス抗原の提示を調整するための多様な選択肢、およびＤＣの成熟化因子の使用を含んでいる。この場合、アポトーシス細胞は、樹状細胞の機能における調整活動を働かせる細胞である。上記文献には、アポトーシス細胞と全身性エリテマトーデスとの関係は記載されていない。アポトーシス細胞の使用自体がＤＣの機能の直接的な調整を意図しておらず、アポトーシス細胞の使用が、Ｔ細胞アネルギーを誘導することが可能なＤＣによってどのようにアポトーシス抗原がもたらされるかということに関係していないため、本発明におけるアポトーシス細胞の使用目的は異なっている。アポトーシス細胞の使用目的は、本発明のＤＣが、アポトーシス細胞に含まれる抗原に対するＴ細胞の反応を調整することのみに特異的であることを実現することであり、このことは全身性エリテマトーデスの病理において関連する役割を有している。さらに、実験中、アポトーシス細胞がＤＣの成熟を誘導しない、つまり、アポトーシス細胞は、ＤＣの免疫原性を調整するという目的で使用されないため、アポトーシス細胞は免疫原性能力を向上させないということを示すための評価が行われた。ＤＣの機能の調整は、ロシグリタゾン（ＲＧＺ）およびデキサメタゾン（ＤＥＸＡ）を使用して達成される。
【０００５】
Carreno et al.による文献“Induction of Tolerogenic Dendritic Cells by NF-κB Blockade and Fcg Receptor Modulation”には、多発性硬化症のマウスモデルの治療のためにロシグリタゾンおよびアンドログラホリドを用いて処置したＤＣを使用することが記載されており、抗原が未知であるループス等の他の自己免疫疾患のためにＤＣを使用できることが示唆されている。上記の薬剤を用いて直接的に動物を処置し、ロシグリタゾンおよびアンドログラホリドを用いて寛容性ＤＣ（ｔｏｌＤＣ）を生成するためのプロトコルが記載されている。本発明においては、ロシグリタゾンおよびデキサメタゾンを共に用いて、寛容性ＤＣを生成することが提案されているが、このことはCarreno et al.の文献には開示されていない。また、上記の文献は、ＮＦ−κＢ阻害薬、ロシグリタゾン、およびアンドログラホリドを用いて（本発明において提案されている上記の薬剤を用いて処置されたＤＣを用いるのではなく）直接的にマウスを治療することを提案している。処置されたＤＣを用いて多発性硬化症のマウスモデルの治療が行われている。寛容性ＤＣを用いたＳＬＥ治療の可能性に対する単なる言及はわずかなものであり、上記の細胞から抗原を認識するＴリンパ球におけるアネルギーを誘導するために、アポトーシス細胞を含むという考えを含んでいない。さらに、ループス抗原は未知であることが明確に記載され、抗原源としてアポトーシス細胞を使用することができることは全く提案されていない。さらに、アポトーシス細胞が障害となる可能性すら示されている。
【０００６】
国際特許出願公開公報WO2012160200は、寛容性特性を有する成熟ＤＣを生成するために、ステロイドおよびビタミンＤを使用することを提案している。ステロイド中での培養時間は４日間で、これは「成熟ＤＣを得るため」と明確に示してある。その後、上記の細胞は、炎症誘発性サイトカインを含む環境において培養され、上記環境においては、成熟ＤＣは、その表面上のＣＤ１４の存在によって特定され、寛容性細胞は、ＭＥＲＴＫの発現によって特定される。本発明は、デキサメタゾン（グルココルチコイド）およびロシグリタゾン（チアゾリジンジオン）を用いて、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を得ることを提案しており、このことは本特許出願に記載されており、ビタミンＤに類似していない。上記の細胞が、ロシグリタゾンおよびデキサメタゾンと共に培養されるため、本発明の方法は異なっている。上記文献においては、ある特異抗原における治療のために、ＤＣが特定の特異性を有するべきであることが全く示唆も提案もされていない。さらに、ＳＬＥの場合、抗原源としてアポトーシス細胞を使用可能であることが全く示唆されていない。本発明のＤＣはＣＤ１４（−）であり、すなわち、異なる方法によって生じた異なる生成物に関するものであるため、ＭＥＲＴＫは発現されず、ＭＥＲＴＫの存在は評価されない。
【０００７】
ＤＣに基づく免疫療法の創出については、この種の療法の特徴の１つが、外用剤に対する効果的な反応に影響することなく、自己抗原に対する反応を低減させることであるため、抗原特異性が関連している。それにもかかわらず、現在、ＳＬＥの免疫療法の発展を困難にしている主な障害の１つは、この病気の進行の原因となる特異自己抗原に関する知識が不足していることである。ループスを患っている患者は、アポトーシス過程において生成される細胞残屑の除去が不完全であるため、細胞残屑が自己抗原源であると仮定される。したがって、本発明は、寛容性ＤＣ（ｔｏｌＤＣ）の活性を、自己反応性リンパ球のみに向けるために、自己抗原源としてアポトーシス細胞を使用することを提案している（図１）。
【０００８】
〔図面の説明〕
〔図１〕樹状細胞の表現型。低免疫原性の未成熟細胞は、ＬＰＳ等の炎症誘発性刺激の存在下で成熟し、Ｔリンパ球を活性化する能力が向上した表現型が得られ、表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現の増加が見られる。しかし、未成熟細胞が抗炎症性刺激を受けた場合、未成熟細胞は、免疫原性を変化させることなく、Ｔリンパ球における寛容性を誘導する寛容性細胞に変化し得る。
【０００９】
〔図２〕アポトーシス細胞を用いてパルスした未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）および寛容性細胞（ｔｏｌＤＣ）を生成するための実験計画。
【００１０】
〔図３〕ＵＶ−Ｂ照射を用いたアポトーシス細胞の生成。Ａ：ＵＶ−Ｂ光が照射されていないリンパ球のドットプロットを示す（基準）。Ｂ：２４時間、スタウロスポリン（Novex、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）（１μＭ）を用いて処置（＋アポトーシスに対するコントロール）。Ｃ：５６℃で５０分間処置（＋ネクローシスのコントロール）。Ｄ：ＵＶ−Ｂ放射に１時間半曝す。Ｅ：コントロール個体をＵＶ−Ｂ放射に１．５時間曝した後、ＰＩおよびＡｎｅｘ−Ｖ−ＦＩＴＣを用いて処置した各象限のリンパ球の分布率。
【００１１】
〔図４〕アポトーシス細胞を取り込むＤＣの能力を判定するための実験計画。
【００１２】
〔図５〕単球由来ＤＣへのアポトーシス細胞の結合のフローサイトメトリー分析。Ａ：細胞の自家蛍光ヒストグラムおよびＣＤ１１ｃ＋集団の判定。Ｂ：ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ＋）の陽性信号を判定するヒストグラム。Ｃ：コントロール個体のＣＤ１１ｃ＋集団。Ｄ：コントロール個体からの細胞におけるＣＤ１１ｃ＋集団から得たＦＩＴＣ＋集団のヒストグラム。
【００１３】
〔図６〕自己アポトーシス細胞の存在下における、ＳＬＥ患者から得た単球由来ＤＣによるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスの共焦点顕微鏡検査。図の左側のパネルにおいては、生細胞のゴルジ装置と共に、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ  Ｃｅｒａｍｉｄｅで染色されたＤＣが見られる。中央のパネルは、ＣＦＳＥで染色されたアポトーシス細胞を示している。右側のパネルは、ＤＣによるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスを示す前画像の重複部分（白色矢印）を示している。
【００１４】
〔図７〕S. typhimurium（１μｇ／ｍｌ）リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて処置し、ＲＧＺ（１０μＭ）およびＲＧＺ＋Ｄｅｘａ（１μＭ）存在下において、自己アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量）、ＵＶ−Ｂ放射によって生成される）と共培養した単球由来のヒト樹状細胞における表面マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現（ｎ＝１４ＬＥＳ患者)。アスタリスクは、ＬＰＳによる刺激と、アポトーシス細胞と共培養され、ＬＰＳで刺激された、ＲＧＺおよびＤＥＸＡを用いて処置したＤＣとを比較した時の＊Ｐ＜０．０５（フリードマン検定）を示している。ラインは、賦形剤を用いて処置したＤＣに対応する値を示している。Ａｐｏｃｅｌｌ：アポトーシス細胞、ＤＥＸＡ：デキサメタゾン、ＲＧＺ：ロシグリタゾン。
【００１５】
〔図８〕S. typhimurium（１μｇ／ｍｌ）リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて処置し、ＲＧＺ（１０μＭ）およびＤｅｘａ（１μＭ）存在下において、自己アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量）、ＵＶ−Ｂ放射によって生成される）と共培養した単球由来のＳＬＥ患者の樹状細胞の培養上清におけるサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の分泌プロファイル。図８は、上記処置の両方を行ったＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の分泌の著しい減少を示している。ＩＬ−６は、処置を行っていない条件と比較した「増加倍率」として示される。＊ｐ＜０．０５。ウィルコクソン検定。
【００１６】
〔図９〕ＳＬＥ患者のＤＣに関するＸＴＴ細胞生存率アッセイ。図９は、賦形剤（ＶＥＨ）のみを受けた未処置のＤＣと比較した時、ＤＣの細胞生存率は、免疫抑制剤（ｎ＝６）を用いた処置の存在下で変化しないことを示している。ＵＶ−Ｂ放射によって生成されたアポトーシス細胞（Apocell）は、生存率のネガティブコントロールとして用いられた。
【００１７】
〔図１０〕実験室で２４時間培養されたＤＣの上清で処置した後の、ＣＤ６９およびＣＤ７１マーカーを有する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の活性判定。図１０は、各条件におけるＣＤ６９＋細胞およびＣＤ７１＋細胞の割合を示している。ｎ＝１健常コントロール。ポジティブコントロール：コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ、１０μＬ／ｍｌ）を用いて２４時間処置した細胞、ＳＮ：上清、Ａｐｏｃｅｌｌ：アポトーシス細胞。
【００１８】
〔図１１〕混合リンパ球反応アッセイの実験計画。ｉＤＣは未成熟樹状細胞に対応し、ｍＤＣは成熟樹状細胞に対応し、ｔｏｌＤＣは寛容性樹状細胞に対応する。
【００１９】
〔図１２〕同種異系Ｔリンパ球を用いた混合リンパ球反応におけるｔｏｌＤＣの機能アッセイ。ｔｏｌＤＣとの共培養５日目におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のＣＤ２５の発現（図Ａ）、ＣＤ７１の発現（図Ｂ）、および増殖によるＣＦＳＥプローブの希釈度が定量化された。グラフは、共培養５日目におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ７１＋Ｔリンパ球の割合を表している（ｎ＝１）。αＣＤ３＋αＣＤ２８はＴリンパ球活性のポジティブコントロールである。Ｒ＋Ｄ：デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【００２０】
〔図１３〕同種異系Ｔリンパ球を用いた混合リンパ球反応におけるｔｏｌＤＣの機能アッセイ。ｔｏｌＤＣとの共培養５日目におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のＣＤ７１の発現（図Ａ）、および増殖によるＣＦＳＥプローブの希釈度（図Ｂ）が定量化された。グラフは、共培養５日目におけるＣＤ４＋ＣＤ７１＋Ｔリンパ球、および増殖（ＣＤ４＋ＣＤＦＳＥｌｏｗ）の割合を示している（ｎ＝１）。ＵＴ：未処置、Ｒ／Ｄ：デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【００２１】
〔発明の概要〕
本発明は、自己器官に対する免疫系の寛容性を回復させる特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）、自己器官に対する免疫系の寛容性を回復させる特異的方法、特異抗原を用いて上記ｔｏｌＤＣを生産する方法、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための療法の構築における特異抗原を有する上記ｔｏｌＤＣの使用から成る。
【００２２】
〔発明の説明〕
本発明は３つの主な態様について考察している。第１の態様においては、本発明は、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の生産方法に対応する。第２の態様においては、本発明は、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）を必要とする患者に当該寛容性樹状細胞を投与した時の、自己器官に対する免疫系の寛容性を回復させる上記寛容性樹状細胞に対応する。最後に、本発明の第３の態様は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療における特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の使用に対応する。
【００２３】
本発明の第１の態様の実施形態は、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の生産方法に対応する。特定の実施形態においては、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の上記生産方法は、
（ａ）サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを用いて、動物血清を含まない培地において、生体外で樹状細胞前駆体を培養して、当該樹状細胞前駆体を樹状細胞に分化させる工程と、
（ｂ）アポトーシス細胞を生産する工程と、
（ｃ）工程ａ）で得られた樹状細胞を、抗炎症活性を有する化合物の存在下で培養する工程と、
（ｄ）樹状細胞によるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスを抑えるように、工程ｃ）の樹状細胞と、工程ｂ）から得られたアポトーシス細胞とを共培養する工程と、
（ｅ）特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の獲得を、表現型の評価の特定を介して判定する工程とを含んでいる。
【００２４】
特定の実施形態においては、工程ａ）の上記樹状細胞前駆体は、単球、骨髄前駆体から選択され、あるいは末梢血または臍帯血から直接選択される。
【００２５】
他の特定の実施形態においては、３０〜４５℃および１〜１０％のＣＯ２の条件下（より具体的には、３７℃で５％のＣＯ２）で、前駆体、並びにサイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを培養する場合に、分化が行われる。
【００２６】
他の実施形態においては、工程ｃ）の上記アポトーシス細胞は、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）放射、化学物質（スタウロスポリン、メトトレキサート）の存在、特異受容体の活性化（Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用）、またはミトコンドリア電子伝達の阻害（ヘプタクロル、ロテノン）から選択されたアポトーシス刺激に細胞をさらすことによって生成される。他の実施形態においては、アポトーシス細胞が生じる上記細胞は、血液細胞、筋肉細胞、表皮細胞、上皮細胞、幹細胞、またはヒト細胞株に対応する。特定の実施形態においては、血液細胞は、末梢血リンパ球、血小板、好中球、または単球である。より具体的な実施形態においては、血液細胞は末梢血リンパ球である。
【００２７】
他の実施形態においては、工程ｄ）の抗炎症活性を有する化合物の存在下での樹状細胞の培養が、５〜４８時間行われる。より具体的な実施形態においては、上記抗炎症活性を有する化合物が、ロシグリタゾン（ＲＧＺ）、デキサメタゾン（ＤＥＸＡ）、またはそれらの組み合わせから選択される。より具体的な実施形態においては、５〜３０μＭのＲＧＺの存在下、および０．５〜５μＭのＤＥＸＡの存在下で樹状細胞が培養される。
【００２８】
特定の実施形態においては、工程ｅ）の、樹状細胞とアポトーシス細胞との共培養が、５〜２０μｇ／ｍｌのＤＮＡ量として表される、アポトーシス細胞の量を考慮して行われる。このために、ＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）  ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）等の、動物血清を含まない培地が使用される。
【００２９】
他の実施形態においては、樹状細胞とアポトーシス細胞との共培養が、５〜４８時間行われる。
【００３０】
本発明の他の実施形態においては、ｉ）成熟免疫原性ＤＣと比べて減少するはずのサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産と、ｉｉ）表面マーカーの発現がない、または成熟免疫原性ＤＣと比べて少ないことを評価することによって、工程ｆ）のｔｏｌＤＣの特定が行われ、上記表面マーカーが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの組み合わせから選択される。より具体的な実施形態においては、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産の評価、および表面マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの組み合わせの発現が、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡの転写レベルから選択された技術を用いて行われる。
【００３１】
本発明の第２態様は、前述の方法を使用して得られた特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）に対応する。特定の実施形態においては、上記特異抗原は自己抗原である。これは、上記特異抗原が患者から得られるものであるという理由からではなく、自己免疫疾患においては、免疫学的反応は自己要素に対するものであるという理由からであり、それゆえ、抗原は自己抗原である。本発明の特定の実施形態においては、樹状細胞が、単球、骨髄前駆体に由来する、あるいは末梢血または臍帯血から直接的に得られる。他の実施形態においては、上記特異抗原がアポトーシス細胞に由来する。より具体的な実施形態においては、上記アポトーシス細胞がアポトーシス刺激を受けた細胞に由来する。特定の実施形態においては、上記細胞が受ける上記アポトーシス刺激が、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）放射、化学物質（スタウロスポリン、メトトレキサート）の存在下、特異受容体の活性化（Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用）、またはミトコンドリア電子伝達の阻害（ヘプタクロル、ロテノン）から選択される。より具体的には、上記刺激は、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）放射である。
【００３２】
他の実施形態においては、アポトーシス細胞が得られる上記細胞が、血液細胞、筋肉細胞、表皮細胞、上皮細胞、幹細胞、またはヒト細胞株に対応する。特定の実施形態においては、上記血液細胞は、末梢血細胞、血小板、好中球、または単球である。
【００３３】
特定の実施形態においては、本発明の寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）が、表現型評価によって特定される。より具体的な実施形態においては、ｉ）免疫原性成熟ＤＣと比べて減少するはずのサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産と、ｉｉ）表面マーカーの発現がない、または成熟免疫原性ＤＣと比べて少ないことを評価することによって、ｔｏｌＤＣの特定が行われ、上記表面マーカーが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの組み合わせから選択される。より具体的な実施形態においては、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の生産の評価、並びに表面マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの組み合わせの発現が、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたメッセンジャーＲＮＡの転写レベルから選択された技術を用いて行われる。
【００３４】
本発明の第３の態様においては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための療法の構築における、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の使用が記載されている。
【００３５】
特定の実施形態においては、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療に有用な薬剤の調製において利用可能な、特異抗原を有する寛容性樹状細胞（ｔｏｌＤＣ）の使用を記載している。
【００３６】
〔実施例〕
＜実施例１：ＳＬＥに関する抗原に特異的なＤＣの取得＞
（末梢血リンパ球における紫外線タイプＢ（ＵＶ−Ｂ）放射を用いたアポトーシス誘導）
本段階においては、ＵＶ−Ｂ放射の様々な曝露時間を評価して、最初に健常な個体、次にＳＬＥ患者の末梢血から得たリンパ球からアポトーシス細胞を得た。アポトーシス誘導を確認するため、染料としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシンＶ（Ａｎｅｘ）を使用し、フローサイトメトリーを使用してサンプルを分析した。アポトーシス状態の上記の細胞は、その後、自己抗原を提供する目的でＤＣをパルスするために利用される（図２）。図３は、上記の細胞において、１．５時間のＵＶ−Ｂ放射の曝露時間が、アポトーシスを誘導するのに適していることを示している（ＰＩ＋Ａｎｅｘ＋）。
【００３７】
（ＳＬＥ患者のＤＣの、アポトーシス細胞をエンドサイトーシスする能力の評価）
その後、上記の実施例において生成されたＤＣが、抗原を処理するために、アポトーシス細胞をエンドサイトーシスし、そして抗原を自己反応Ｔリンパ球に提示する能力を有しているか否かを評価した。細胞染料カルボキシフルオロセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Invitrogen、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＵＶ−Ｂ放射への曝露によって生成されたアポトーシス細胞を標識し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出した。ＤＣをＣＦＳＥで標識されたアポトーシス細胞と２４時間インキュベートした。この実験は、ＤＣを特定できるように、ＣＤ１１ｃ＋集団を選択した。ＣＤ１１ｃ＋集団におけるＣＦＳＥの検出（３９．５％）は、ＤＣによるアポトーシス細胞の貪食作用を示している（図４および図５）。簡潔に言うと、ＵＶ−Ｂ放射によって生成されたアポトーシス細胞をＣＦＳＥで標識し、ＤＣと２４時間共培養した。生体染料ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ(Life Technologies)でＤＣを標識した。図６に見られるように、画像の構図は、ＤＣが、ＳＬＥ患者（パネルＣ）と同様に、コントロール個体（パネルＢ）においてもアポトーシス細胞をエンドサイトーシスすることが可能であることを示している。
【００３８】
（ＤＣ免疫表現型におけるアポトーシス細胞とＤＣとの共培養の効果）
ＤＮＡ分子は、ループス患者の自己抗原としての役割を果たし、ＤＮＡ分子は、ヌクレオソームの形態におけるヒストン等のタンパク質に関連するアポトーシスの間、細胞外空間に曝されることが広く報告されている（１）。したがって、ＤＮＡを判定することは、アポトーシス細胞を定量化する方法であり、この方法は他の研究者によって従来利用されている（２）。
【００３９】
本発明において示される結果に関して、合計１４人のＳＬＥ患者が含まれた。患者の臨床的特徴は表１に詳述されている。上記患者からＤＣが生成され、分析の前の６日目に、アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量））を２４時間パルスした。最終的なＤＣの成熟状態を、複合抗体の抗ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲを用いてフローサイトメトリーによって分析した（図７）。
【００４０】
【表１】
2017518080.tif 000003
【００４１】
表１：ＤＣの生成およびアポトーシス細胞との共培養の実験に関するＳＬＥ患者の臨床的特徴。上記の実験に含まれる各患者の病気の活動度を、ＳＬＥＤＡＩ指数（高スコアは高活性を示し、６より高いＳＬＥＤＡＩスコアを有すると活動性疾患と定義される）を用いて判定した。各患者の平均年齢、および平均ＳＬＥ基準も表に含まれている。Ａｒｔ．関節炎、Ｉｍｍ．＝免疫学的（抗ＤＮＡ、抗Ｓｍ、または抗カルジオリピン抗体の存在）、ＳＮ：神経系障害（痙攣または精神疾患）、Ｈｅｍ：血液学的障害、Ｓｅｒｏ．＝漿膜炎、ＭＣ＝粘膜・皮膚、ＡＮＡ＝抗核抗体。
【００４２】
（アポトーシス細胞と共にパルスしたＤＣにおけるＲＧＺおよびＤＥＸＡの影響）
ＳＬＥ患者およびコントロール個体から得た単球に由来するＤＣをＲＧＺ（１０μＭ）およびＤＥＸＡ（１μＭ）で２４時間処置し、その後、さらに２４時間、アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量））と共培養した。そして、マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲの発現を合計１４人のＳＬＥ患者において評価した（表１）。
【００４３】
図７は、アポトーシス細胞存在下において、ＤＣは実験した成熟マーカーのいずれのタイプも変化させないことを示している。一方、ＲＧＺおよびＤＥＸＡ薬を用いた処置を行い、アポトーシス細胞と共培養した場合、S. typhimurium  ＬＰＳで処置した細胞と比較して、ＳＬＥ患者由来のＤＣにおける成熟マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現が著しく減少し（ｐ＜０．０５、フリードマン検定）、ＤＣ表現型の変化における免疫抑制剤を用いた処置の効果を示している。
【００４４】
（ＤＣの活性判定：炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの分泌）
ＤＣの寛容状態の導入を確認し、可能な限り最も完全な特徴付け、および機能的アプローチを可能とするより多くの成分を得るために、上記の実験の上清における、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）等の複数の関連するサイトカイン（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、寛容性樹状細胞によって細胞外培地に分泌される）の定量化を行った。
【００４５】
図８は、S. typhimurium  ＬＰＳを用いて処置したＤＣと比較して、ＩＬ−６の分泌において大きな減少（ｐ＜０．０５）を誘導するＲＧＺ＋ＤＥＸＡを用いた処置を示しており、ＩＬ−６は、炎症状態の制御において、明白に定義された特性を有する多機能サイトカインであり（３）、抗原提示の間、いくつかのエフェクター表現型に対するＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化および分化において重要な役割を果たす（４）。また、上記図面から、ＩＬ−１２ｐ７０の分泌の減少も見られる。ＩＬ−１２ｐ７０サイトカインは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の細胞傷害活性、およびＣＤ４＋Ｔリンパ球の炎症誘発性表現型の発達だけでなく、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害活性を高めるうえで重要な役割を果たす。
【００４６】
表２は得られた結果をまとめた表であり、生産物ｔｏｌＤＣ（ＲＧＺおよびＤＥＸＡを用いて処置し、アポトーシス細胞と共にパルスした寛容性ＤＣ）が、ＬＰＳを用いて刺激した場合、成熟、および免疫原性表現型に関する多くの関連する表面マーカーを減少させ、ＲＧＺおよびＤＥＸＡを用いて処置していないＤＣと比較した場合、炎症誘発性サイトカインの生産を減少させることを示している。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
表２：成熟ＤＣおよびｔｏｌＤＣに見られる表現型の概要。
【００４９】
自己寛容性ＤＣによるＳＬＥ治療に関する毒性および細胞生存率の実験
生存率および細胞代謝における薬剤の効果を評価するために、ＸＴＴ生存率アッセイを行った。ＸＴＴ生存率アッセイは、細胞代謝活性を評価する比色アッセイである。その基本原理は、代謝的活性細胞のミトコンドリアデヒドロゲーゼ酵素活性の活性によって、ホルマザンへ変換されるテトラゾリウムＸＴＴ塩の減少にある。ホルマザンは、着色化合物の生産物として生存細胞においてのみ生成され、その量はサンプルにおける生存細胞の数に比例する量で生産される。
【００５０】
図９は、上記の薬剤を用いた処置によって、ＳＬＥ患者のＤＣの細胞生存率の割合が変化しないことを示している。
【００５１】
同じ流れで、生成されたＤＣが、治療を受ける生物の細胞の生存率に影響し得る潜在的に毒性のある物質を細胞外培地に分泌したかどうかを評価するための実験を行った。このアッセイを行うために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、アネキシンＶ（Ａｎｅｘ  Ｖ）と共に使用した。これらは免疫調節剤を使用した我々のプロトコルの条件下で培養したＤＣの上清を用いて事前に処理したコントロール個体の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を標識するために使用したが、ＤＣは他のコントロール固体からもたらされたものであるため、２４時間の実験期間の間、ＬＰＳ刺激を与えなかった。
【００５２】
一方、生成されたＤＣの上記の上清が、リンパ球において、活性化反応を生成可能かどうかを判定し、マーカーＣＤ６９（初期活性化マーカー）、ＣＤ７１（後期活性化マーカー）を判定した。マーカーＣＤ６９およびＣＤ７１はリンパ球細胞株における活性化刺激に反応して発現される。
【００５３】
図１０は、マーカーＣＤ７１が、賦形剤を用いて処置したＤＣの上清を用いて処置された場合、その発現が変化せず、薬剤およびアポトーシス細胞を用いて処置したＤＣの上清を用いて処置された場合も変化しないことを示している。マーカーＣＤ６９に関して、活性化された細胞の割合にわずかな増加が見られたが、この増加はコンカナバリンＡ（Ｔリンパ球における細胞分裂促進活性を誘導し、細胞産物の合成を増加させる能力を有するタンパク質）を用いて刺激したＰＢＬに対応するポジティブコントロールの活性化レベルには程遠く、上記のわずかな増加は、賦形剤を用いて処置したＤＣから得た上清を用いて得られた結果に類似している。
【００５４】
上記２つの結果から、ＤＣの上清は、ＰＢＬの生存率を変化させず、上記細胞の活性化反応を発生させることもないと結論付けられる。
【００５５】
＜実施例２：ＤＣの寛容能力の機能評価＞
上述の実施例においては、ｔｏｌＤＣの免疫表現型の質および安定性を、ｔｏｌＤＣによる治療の可能性を評価する基準として特徴付け、ｔｏｌＤＣの免疫表現型の質および安定性は、サイトカイン分泌を実験した時の機能的アプローチを有している。臨床前段階のｔｏｌＤＣの成功を判定するためには、ＣＤ４＋Ｔリンパ球における生成されたｔｏｌＤＣの調整能力を評価するために、生体外機能分析自体が必要とされる。
【００５６】
したがって、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）同種異系アッセイを、異なる健常個体から得たＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して行った（図１１および図１２）。
【００５７】
ＣＦＳＥで事前に標識した、個体から得たｔｏｌＤＣ、および異なる個体から得たＴ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ（比１：５）の培地（２００μＬ）で５日間培養した。コントロールとして、実験が終わるまで、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）、成熟ＤＣと共培養したＴリンパ球、またはＤＣと共培養していないＴリンパ球を使用した。ＣＤ２５およびＣＤ７１の発現を制御しながらフローサイトメトリーを使用して、５日目にＴリンパ球の活性を評価した（図１２）。
【００５８】
薬剤の一方、または両方の薬剤に同時に誘導されたｔｏｌＤＣの存在下で培養されたＴ細胞のＣＤ２５およびＣＤ７１（Ｔリンパ球活性化マーカー）の発現は、未成熟ＤＣと共培養された細胞に見られる発現より小さい。この結果は、ＤＣの寛容性機能が、ＮＦ−κＢ抑制剤を用いた処置によって誘導されたことを示している。
【００５９】
ＣＦＳＥで事前に標識した、ＳＬＥ患者から得たｔｏｌＤＣ、および健常個体から得たＴ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ（比１：５）の培地（２００μＬ）で５日間培養して、同様のアッセイを行った。コントロールとして、実験が終わるまで、未成熟ＤＣ、成熟ＤＣと共培養したＴリンパ球、またはＤＣと共培養していないＴリンパ球を使用した。ＣＦＳＥの希釈度およびＣＤ７１の発現を測定することによって、５日目のＴリンパ球の増殖および活性を、フローサイトメトリーを用いて評価した（図１３）。
【００６０】
薬剤の一方、または両方に同時に誘導されたｔｏｌＤＣの存在下で培養されたＴ細胞のＣＤ７１（Ｔリンパ球活性化マーカー）の発現は、未成熟ＤＣと共培養された細胞に見られる発現より小さい。さらに、Ｔリンパ球は、ｔｏｌＤＣ存在下で、成熟ＤＣ存在下よりも増殖が少ないことが分かった。
【００６１】
＜実施例３：全身性エリテマトーデスにおけるｔｏｌＤＣ生成プロトコル＞
Ａ．末梢血またはバフィーコートの分離は８時間以下で行われるべきであり、ヘパリンを追加するべきではない。
１．５０ｍｌの円錐形チューブに血液を入れ、総量が３５ｍｌに達するまでＰＢＳ（１Ｘ）を用いて希釈した。
２．１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅリンパ球分離媒体を、空の５０ｍｌの円錐形チューブの底部に加えた。
３．Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ媒体を含む５０ｍｌの円錐形チューブに、希釈した血液をそれぞれ慎重に移した。
４．上記の円錐形チューブを２０℃で２５分間、１０００ｘｇで遠心分離機にかけた。
５．上層を吸引し（血清）、相間の変化しない単核細胞層を残した。
６．単核細胞層を新しい５０ｍｌの円錐形チューブに慎重に移した。
７．単核細胞層を含む５０ｍｌの円錐形チューブをＰＢＳ（１Ｘ）で満たし、２０℃で１０分間、３００ｘｇで遠心分離機にかけた。上清を慎重に除去して捨てた。
８．５ｍｌのＲＢＣ溶解バッファ（ＡＣＫ（１Ｘ））中に、室温で５分間、ペレットを再懸濁した。
９．５０ｍｌの円錐形チューブをＰＢＳ（１Ｘ）で満たし、慎重に混合した。
１０．上記の円錐形チューブを１０分間３００ｘｇで遠心分離機にかけ、上清を捨てた。
１１．工程７、８、９をもう一度繰り返した。
１２．５ｍｌの予め加熱した培地ＡＩＭ−Ｖ中にペレットを再懸濁した。細胞数を数えた。
１３．１ｍｌの培地ＡＩＭ−Ｖにて、１０ｘ１０６ＰＢＭＣの６ウェルプレートで細胞を培養した。
１４．５％のＣＯ２、３７℃にて２時間インキュベーションを行い、セクションＢに続いた。
【００６２】
Ｂ．末梢血リンパ球の取得およびＤＣへの分化
１．上記チューブの底部に接触することなく、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を得るために上清を慎重に除去した（ＰＢＬはアポトーシス細胞が生成されるまで保存した）。３７℃に予め加熱した１ｍｌのＰＢＳ（１Ｘ）で、チューブを３回洗浄した。
２．ＩＬ−４（１０００ＵＩ／ｍＬ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＵＩ／ｍＬ）を含有する１．５ｍＬの予め加熱したＡＩＭ−Ｖ培地を加えた（１日目）。上記を５％のＣＯ２で、３７℃にてインキュベートした。
３．培地を交換することなく、培養の最終濃度（１０００ＵＩ／ｍＬ）になるまで、３日目と５日目とに新鮮なサイトカイン（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ）を加えた。
【００６３】
Ｃ．アポトーシス細胞の生成
１．非接着片（ＰＢＬ）を５０ｍＬの円錐形チューブに移し、ＰＢＳ（１Ｘ）で満たした。
２．上記円錐形チューブを６分間、３００ｘｇで遠心分離機にかけた。
３．上記非接着片を５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地で再懸濁し、５％のＣＯ２で、３７℃にて、Ｔ−２５培養フラスコ内で培養した。ＡＩＭ−Ｖ培地を毎日交換した。
４．ＵＶランプを生物学的に安全なキャビネット内に設置し、該ランプを予め１０分間加熱した。
５．ＰＢＬを慎重に６０ｘ１５ｍｌの滅菌プレートに移した。
６．２．０ｍＷ／ｃｍ２で１．５時間、リンパ球を照射した。セクションＤに続いた。
【００６４】
Ｄ．ＤＣおよびアポトーシス細胞の共培養（７日目）
１．アポトーシス細胞を均質化し、ＵＶ処理の後、最終量を判定した。４００μＬのアポトーシス細胞の調製物を用いてＤＮＡ濃度を判定した。
２．円錐形チューブに細胞を移し、１０分間、５００ｘｇで遠心分離機にかけた。
３．上清を慎重に捨てて、１μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度になるまでペレットを再懸濁した。
４．１８．７５μＬのアポトーシス細胞の調製物を、セクションＡで調製したＤＣの培養培地に加えた。
【００６５】
Ｅ．寛容性ＤＣの誘導（６日目）
１．ＤＭＳＯにロシグリタゾンを溶かしてストック溶液（１００μＬのＤＭＳＯ／１．７９ｍｇのロシグリタゾン）を調製した。５μＬのストック溶液を４９５μＬのＰＢＳ（１Ｘ）で希釈して、作業溶液を調製した。３０μＬの作業溶液をＤＣ細胞培養物に加えた（最終濃度＝１０μＭ）。
２．ＤＭＳＯにデキサメタゾンを溶かしてストック溶液（１００μＬのＤＭＳＯ／０．２ｍｇのデキサメタゾン）を調製した。５μＬの原液を２０μＬのＰＢＳ（１Ｘ）で希釈して、作業溶液を調製した。１．５μＬの作業溶液をＤＣ細胞培地に加えた（最終濃度＝１μＭ）。
【００６６】
〔参考文献〕
(1) Rosen A, Casciola-Rosen L. Autoantigens in systemic autoimmunity: critical partner in pathogenesis. Journal of internal medicine. Jun 2009;265(6):625-631.
(2) Fehr EM, Spoerl S, Heyder P, et al. Apoptotic-cell-derived membrane vesicles induce an alternative maturation of human dendritic cells which is disturbed in SLE. J Autoimmun. Feb 2013;40:86-95.
(3) Wolf J, Rose-John S, Garbers C. Interleukin-6 and its receptors: a highly regulated and dynamic system. Cytokine. 2014 Nov;70(1):11-20. doi: 10.1016/j.cyto.2014.05.024. Epub 2014 Jun 28. Review. PubMed PMID: 24986424.
(4) Zhu J, Paul W. CD4 T cells: Fates, functions and faults. Blood, 2008; 112(5):1557-1569.
(5) Nagy ZS, Czimmerer Z, Szanto A, Nagy L. Pro-inflammatory cytokines negatively regulate PPARγ mediated gene expression in both human and murine macrophages via multiple mechanisms. Immunobiology. 2013 Nov;218(11):1336-44. doi: 10.1016/j.imbio.2013.06.011. Epub 2013 Jul 1. PubMed PMID: 23870825.
(6) Hontelez S, Karthaus N, Looman MW, Ansems M, Adema GJ. DC-SCRIPT regulates glucocorticoid receptor function and expression of its target GILZ in dendritic cells. J Immunol. 2013 Apr 1;190(7):3172-9. doi: 10.4049/jimmunol. 1201776. Epub 2013 Feb 25. PubMed PMID: 23440419.
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】樹状細胞の表現型。低免疫原性の未成熟細胞は、ＬＰＳ等の炎症誘発性刺激の存在下で成熟し、Ｔリンパ球を活性化する能力が向上した表現型が得られ、表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現の増加が見られる。しかし、未成熟細胞が抗炎症性刺激を受けた場合、未成熟細胞は、免疫原性を変化させることなく、Ｔリンパ球における寛容性を誘導する寛容性細胞に変化し得る。
【図２】アポトーシス細胞を用いてパルスした未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）および寛容性細胞（ｔｏｌＤＣ）を生成するための実験計画。
【図３】ＵＶ−Ｂ照射を用いたアポトーシス細胞の生成。Ａ：ＵＶ−Ｂ光が照射されていないリンパ球のドットプロットを示す（基準）。Ｂ：２４時間、スタウロスポリン（Novex、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）（１μＭ）を用いて処置（＋アポトーシスに対するコントロール）。Ｃ：５６℃で５０分間処置（＋ネクローシスのコントロール）。Ｄ：ＵＶ−Ｂ放射に１時間半曝す。Ｅ：コントロール個体をＵＶ−Ｂ放射に１．５時間曝した後、ＰＩおよびＡｎｅｘ−Ｖ−ＦＩＴＣを用いて処置した各象限のリンパ球の分布率。
【図４】アポトーシス細胞を取り込むＤＣの能力を判定するための実験計画。
【図５】単球由来ＤＣへのアポトーシス細胞の結合のフローサイトメトリー分析。Ａ：細胞の自家蛍光ヒストグラムおよびＣＤ１１ｃ＋集団の判定。Ｂ：ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ＋）の陽性信号を判定するヒストグラム。Ｃ：コントロール個体のＣＤ１１ｃ＋集団。Ｄ：コントロール個体からの細胞におけるＣＤ１１ｃ＋集団から得たＦＩＴＣ＋集団のヒストグラム。
【図６】自己アポトーシス細胞の存在下における、ＳＬＥ患者から得た単球由来ＤＣによるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスの共焦点顕微鏡検査。図の左側のパネルにおいては、生細胞のゴルジ装置と共に、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ  Ｃｅｒａｍｉｄｅで染色されたＤＣが見られる。中央のパネルは、ＣＦＳＥで染色されたアポトーシス細胞を示している。右側のパネルは、ＤＣによるアポトーシス細胞のエンドサイトーシスを示す前画像の重複部分（白色矢印）を示している。
【図７】S. typhimurium（１μｇ／ｍｌ）リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて処置し、ＲＧＺ（１０μＭ）およびＲＧＺ＋Ｄｅｘａ（１μＭ）存在下において、自己アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量）、ＵＶ−Ｂ放射によって生成される）と共培養した単球由来のヒト樹状細胞における表面マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現（ｎ＝１４ＬＥＳ患者）。アスタリスクは、ＬＰＳによる刺激と、アポトーシス細胞と共培養され、ＬＰＳで刺激された、ＲＧＺおよびＤＥＸＡを用いて処置したＤＣとを比較した時の＊Ｐ＜０．０５（フリードマン検定）を示している。ラインは、賦形剤を用いて処置したＤＣに対応する値を示している。Ａｐｏｃｅｌｌ：アポトーシス細胞、ＤＥＸＡ：デキサメタゾン、ＲＧＺ：ロシグリタゾン。
【図８】S. typhimurium（１μｇ／ｍｌ）リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて処置し、ＲＧＺ（１０μＭ）およびＤｅｘａ（１μＭ）存在下において、自己アポトーシス細胞（１２．５μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ量）、ＵＶ−Ｂ放射によって生成される）と共培養した単球由来のＳＬＥ患者の樹状細胞の培養上清におけるサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の分泌プロファイル。図８は、上記処置の両方を行ったＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０の分泌の著しい減少を示している。ＩＬ−６は、処置を行っていない条件と比較した「増加倍率」として示される。＊ｐ＜０．０５。ウィルコクソン検定。
【図９】ＳＬＥ患者のＤＣに関するＸＴＴ細胞生存率アッセイ。図９は、賦形剤（ＶＥＨ）のみを受けた未処置のＤＣと比較した時、ＤＣの細胞生存率は、免疫抑制剤（ｎ＝６）を用いた処置の存在下で変化しないことを示している。ＵＶ−Ｂ放射によって生成されたアポトーシス細胞（Apocell）は、生存率のネガティブコントロールとして用いられた。
【図１０】実験室で２４時間培養されたＤＣの上清で処置した後の、ＣＤ６９およびＣＤ７１マーカーを有する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の活性判定。図１０は、各条件におけるＣＤ６９＋細胞およびＣＤ７１＋細胞の割合を示している。ｎ＝１健常コントロール。ポジティブコントロール：コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ、１０μＬ／ｍｌ）を用いて２４時間処置した細胞、ＳＮ：上清、Ａｐｏｃｅｌｌ：アポトーシス細胞。
【図１１】混合リンパ球反応アッセイの実験計画。ｉＤＣは未成熟樹状細胞に対応し、ｍＤＣは成熟樹状細胞に対応し、ｔｏｌＤＣは寛容性樹状細胞に対応する。
【図１２】同種異系Ｔリンパ球を用いた混合リンパ球反応におけるｔｏｌＤＣの機能アッセイ。ｔｏｌＤＣとの共培養５日目におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のＣＤ２５の発現（図Ａ）、ＣＤ７１の発現（図Ｂ）、および増殖によるＣＦＳＥプローブの希釈度が定量化された。グラフは、共培養５日目におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ７１＋Ｔリンパ球の割合を表している（ｎ＝１）。αＣＤ３＋αＣＤ２８はＴリンパ球活性のポジティブコントロールである。Ｒ＋Ｄ：デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【図１３】同種異系Ｔリンパ球を用いた混合リンパ球反応におけるｔｏｌＤＣの機能アッセイ。ｔｏｌＤＣとの共培養５日目におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のＣＤ７１の発現（図Ａ）、および増殖によるＣＦＳＥプローブの希釈度（図Ｂ）が定量化された。グラフは、共培養５日目におけるＣＤ４＋ＣＤ７１＋Ｔリンパ球、および増殖（ＣＤ４＋ＣＤＦＳＥｌｏｗ）の割合を示している（ｎ＝１）。ＵＴ：未処置、Ｒ／Ｄ：デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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