(57)【要約】  本明細書には、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物の新規な用途が開示される。前記ゲニステイン、エピガロカテキンガレート、これらの誘導体これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、またはこれらの溶媒和物を含む組成物は、メラニン色素形成能増加関連因子の発現を減少させると共に、老化指標蛋白質の発現を減少させ、且つメラニン色素形成関連酵素の発現を調節することによって、メラニン細胞を含む細胞の若返り効果を奏することができる。
2017537072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物からなる群より選択される一つ以上を含む、細胞若返り誘導用組成物。
【請求項２】
前記細胞は、メラニン細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、下記の継代培養系に含まれた細胞株のうち６回以上継代培養した細胞株の状態に該当する生体細胞を、５回以下継代培養した細胞株の状態に戻す、請求項１または２に記載の組成物：
メラニン母細胞株であるＰＡ１細胞株及び前記メラニン母細胞株をそれぞれ１、２、３、４、及び５回継代培養した、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ５、及びＰＡ６細胞株のいずれか一つ以上を含む前期メラニン細胞株；及び
前記メラニン母細胞株をそれぞれ６、７、８、９、１０、及び１１回継代培養した、ＰＡ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２細胞株のいずれか一つ以上を含む後期メラニン細胞株を含む、継代培養系。
【請求項４】
前記継代培養系は、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ５、ＰＡ６、ＰＡ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２細胞株から構成された、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記継代培養した細胞株は、寄託番号ＫＴＣＴ１２９０６ＢＰまたはＫＴＣＴ１２９０７ＢＰの細胞株である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連蛋白質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質−２（ＴＲＰ−２）、ＥＺＨ１（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）、ｐ１６及びｐ２１からなる群より選択された一つ以上の発現を減少させる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素５（Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ５）の発現を増加させる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、薬学、健康食品、または化粧料の組成物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、皮膚に塗布しまたは局所注射するものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、０．００１〜２．０μＭのゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、またはこれらの溶媒和物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、０．００５〜１．５μＭのゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、またはこれらの溶媒和物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）及びエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）の新規な用途が開示される。
【背景技術】
【０００２】
老化を遅延させて退行性疾患が発病することなく健康に病気なしで長生きできることはみんなの所望であって、老化を抑制させる物質を探す努力は過去から現在までも続いてきている。老化を促進させる原因でとしてーパーオキサイド、過酸化水素、水酸化基、及び一重項酸素のような活性酸素種による酸化作用が挙げられる。
【０００３】
活性酸素種の代謝産物として生成されたフリーラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）が生体内で蛋白質、生体膜、ＤＮＡなどに作用して酸化的損傷を与えるが、これらの作用を抑制させるために抗酸化成分についての多くの研究がなされ、抗酸化作用を持つ新しい素材を見出すための研究が国内外で活発に行われている。
【０００４】
しかし、老化現象は酸化のみによって行われるのではなく、テロメア、細胞複製能力、遺伝子損傷、及び回復能力などの数多くの要因によって影響を受けると知られているため、天然物及び薬剤の抗酸化効果でない老化抑制能力の評価のためには細胞の老化を利用する方法が必要である。
【０００５】
細胞老化は、正常体細胞が一定回数分裂してから、それ以上分裂できない現象であって、個体及び組織の老化に寄与し、細胞の異常な増殖と癌形成を抑制する重要な機転である。細胞老化は、繰り返される体細胞の分裂によって染色体の末端部分であるテロメアが短くなることで発生したり、癌遺伝子または癌抑制遺伝子の活性増加、過度な酸化ストレス、紫外線や放射線照射、抗癌剤のような細胞毒性物質、炎症反応などによっても発生したりする。
【０００６】
細胞老化は、単純に個体や組織の老化に寄与するだけでなく、種々の多様な病気の病因に重要な役割をする。老化細胞は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、肝炎、慢性皮膚損傷組織、動脈硬化血管組織などのような炎症性病変組織で多く観察される。また、前立腺増殖症と肝炎、肝臓癌などでも細胞老化現象が観察される。
【０００７】
このように老化細胞が蓄積されると老化細胞は分裂し難くなるため、損傷した組織が適切に復旧できないだけでなく、周囲の組織を分解する酵素や炎症性サイトカインなどを分泌して組織の損傷を加速させるため、老化に関連した病気の病因に寄与する。
【０００８】
細胞性老化が老化の必須原因要素であるとされていたため、細胞性老化を遅延させる方法を開発しようとする努力が続いてきた。その中でも細胞老化を調節できる物質を見出し、これを病気の予防や治療に活用しようとする研究が一部報告されている。
【０００９】
細胞老化を調節すると知られた物質としては、ＳＩＲＴ１活性を増加させると知られている赤ワインに多く入っているレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で細胞性老化を遅延させるためのレチノイン酸の用途などが代表的なものである。さらには、植物抽出物から細胞老化を調節できる物質を同定し分離して、化粧品と健康機能性食品などに活用しようとする研究が報告されている。
【００１０】
しかし、最近までの研究は老化を予防または遅延する方法にとどまるものに過ぎず、老化した細胞を若くて健康な細胞に戻すという積極的な概念の細胞若返り（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）についての研究は報告されたことがない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Harman,D.,Free radical theory of aging:Role of free radicals in the origination and evolution of life,aging and disease processes, 3-49. Alan R Liss,New York（1986）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一側面において、本発明の目的は、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物の細胞若返り誘導用途を提供することである。
【００１３】
他の側面において、本発明の目的は、メラニン色素形成能増加関連因子の発現を減少させることである。
【００１４】
他の側面において、本発明の目的は、メラニン色素形成関連酵素の発現を調節して、細胞の若返りを誘導することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一側面において、本発明は、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物からなる群より選択される一つ以上を含む組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
一側面において、本発明に係るゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物からなる群より選択される一つ以上を含む組成物は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）を含むメラニン色素形成能増加関連因子の発現を減少させると共に、ｐ１６及びｐ２１を含む老化指標の発現を減少させ、且つヒストン脱アセチル化酵素５及びＥＺＨ１（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）を含むメラニン色素形成関連酵素の発現を調節することによって、メラニン細胞を含む細胞の若返り誘導効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン色素形成能増加関連因子の発現変化を測定したものであり、チロシナーゼのｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。
【図１ｂ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン色素形成能増加関連因子の発現変化を測定したものであり、ＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。
【図１ｃ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン色素形成能増加関連因子の発現変化を測定したものであり、ＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。
【図１ｄ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン色素形成能増加関連因子の発現変化を測定したものであり、ＴＲＰ２のｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。
【図２】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、老化指標（ｐ１６及びｐ２１）の変化を観察したものである。
【図３】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン色素形成関連酵素の発現変化を観察したものである。
【図４ａ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン細胞の表現型変化を観察したものであって、顕微鏡観察の結果である。
【図４ｂ】メラニン細胞をゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が含まれた培地で継代培養したときの、メラニン細胞の表現型変化を観察したものであって、全メラニン細胞のうち老化した細胞の比率を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
各図において、ＰＡは各継代を意味し、ＰＡ１１Ｅは７継代からＥＧＣＧが含まれた培地で培養された１１継代メラニン細胞を意味し、ＰＡ１１Ｇは７継代からゲニステインが含まれた培地で培養された１１継代メラニン細胞を意味し、ＰＡ１２Ｅは７継代からＥＧＣＧが含まれた培地で培養された１２継代メラニン細胞を意味し、ＰＡ１２Ｇは７継代からゲニステインが含まれた培地で培養された１２継代メラニン細胞を意味する。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、一観点において、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物からなる群より選択される一つ以上を含む、細胞若返り誘導用組成物である。
【００２０】
本明細書において、「誘導体」は、特定化合物の構造の一部を他の原子や原子団で置き換えて得られる化合物を意味していてよい。本明細書において、「異性体」は、特に光学異性体（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、本質的に純粋なエナンチオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ）、本質的に純粋なジアステレオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）、又はこれらの混合物）だけでなく、配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓｏｍｅｒｓ）（即ち、１つ以上の化学結合のその角度のみ異なる異性体）、位置異性体（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｓｏｍｅｒｓ）（特に、互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒｓ））、又は幾何異性体（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、シス−トランス異性体）を含む。
【００２１】
本明細書において、「本質的に純粋な（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）」とは、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーと関連して用いた場合、エナンチオマー又はジアステレオマーを例として挙げることのできる具体的な化合物が約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、又は約９８％以上、さらに好ましくは約９９％以上、最も好ましくは約９９．５％以上（ｗ／ｗ）存在することを意味する。
【００２２】
本明細書において、「薬学的に許容し得る」とは、通常の医薬的服用量（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｄｏｓａｇｅ）で利用する際に相当な毒性を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに使用することができるという政府またはこれに準ずる規制機構の承認を受けることができ、又は承認を受け、又は薬局方に列挙され、又はその他一般的な処方として認知されることを意味する。
【００２３】
本明細書において、「薬学的に許容し得る塩」は、薬学的に許容し得、且つ親化合物（ｐａｒｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸により形成されるか；または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３-（４-ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２-エタン-ジスルホン酸、２-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４-クロロベンゼンスルホン酸、２-ナフタレンスルホン酸、４-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４-メチルビシクロ［２，２，２］-ｏｃｔ-２-エン-１-カルボン酸、グルコヘプトン酸、３-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ-ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸により形成される酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）、又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換される際に形成される塩を含んでいてよい。
【００２４】
本明細書において、「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」は、ある薬物を化学的に変化させて、物理的、化学的性質を調節した薬物を意味し、それ自体は生理活性を示さないが、投与後に体内において化学的にあるいは酵素の作用によって元来の薬物に変わって薬効を発揮することができる。
【００２５】
本明細書において、「水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）」は、水が結合している化合物を意味し、水と混合物との間に化学的な結合力のない内包化合物を含む広範囲な概念である。
【００２６】
本明細書において、「溶媒和物」は、溶質の分子やイオンと溶媒の分子やイオンとの間にできた高次の化合物を意味する。
【００２７】
本明細書において、ゲニステインは、植物体内に含有された植物性化合物であるイソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）の一つを意味していてよく、大豆、エンジュの木、クローバー及びその他植物種に存在するものであってよい。ゲニステインは、下記の化学式１で表される構造を有する物質を意味するものであってよい。
【００２８】
【化１】
2017537072.tif 000003
【００２９】
本明細書において、ゲニステイン誘導体は、下記の化学式２中、Ｒ１〜Ｒ４が、それぞれ独立して水素、ヒドロキシ、アルキル又は置換されたアルキル、フェニル又は置換されたフェニル、ジフェニルエチル又は置換されたジフェニルエチル、チオフェニル又は置換されたチオフェニル、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルキル基、アリールオキシ、ハロアルコキシ、アリール、ハロアルキル、メトキシル基、ベンジル又は置換されたベンジル、ベンゾイル、オキソ、アルキリデン、カルボニル、アシル基、アルケン基、及びアルキルアミノ、ジアルキルアミノからなる群より選択された一つであってよいが、これらに制限されるものではない。例えば、本明細書において言及されたゲニステインの誘導体は、６”-Ｏ-アセチルゲニスチン（６”-Ｏ-ａｃｅｔｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎ）、６”-Ｏ-アセチルマロニルゲニスチン（６”-Ｏ-ｍａｌｏｎｙｌｇｅｎｉｓｔｉｎ）、６-カルボキシメチルゲニステイン（６-ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）ソホリコシド（ｓｏｐｈｏｒｉｃｏｓｉｄｅ）であってよいが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
【化２】
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【００３１】
本明細書において、エピガロカテキンガレートは、下記の化学式３で表される構造を有する物質を意味するものであってよい。
【００３２】
【化３】
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【００３３】
また、本明細書において言及されたエピガロカテキンガレートの誘導体は、（−）-エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、没食子酸（ＧＡ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、及びガロカテキン（ＧＣ）からなる群より選択されたものであってよいが、これらに制限されるものではない。
【００３４】
本発明の一観点に係る組成物において、細胞株はメラニン細胞株であってよい。
【００３５】
本明細書において、「細胞若返り（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）」は、老化した細胞を若くて健康な細胞に戻すことを意味していてよい。
【００３６】
本明細書において、「メラニン細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）」は、メラニン細胞の培養によって継続して分裂または増殖して代を継ぐことのできる、培養メラニン細胞のクローンを意味していてよい。
【００３７】
また、本明細書において、「継代培養系」は、メラニン母細胞株及び特定の細胞株を１回〜数回継代培養した細胞株のいずれか一つ以上を含む系を意味していてよい。
【００３８】
本明細書において、「メラニン母細胞株」は、継代培養前のメラニン細胞株を意味する。
【００３９】
本明細書において、「前期（または、初期）」及び「後期」は、細胞株の培養回数により分類したことであって、例えば、「前期細胞株」はメラニン母細胞株であるＰＡ１細胞株及び母細胞株をそれぞれ１、２、３、４、及び５回継代培養した、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ５、及びＰＡ６細胞株のいずれか一つ以上を意味していてよく、「後期細胞株」は母細胞株をそれぞれ６、７、８、９、１０、及び１１回継代培養した、ＰＡ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２細胞株のいずれか一つ以上を意味していてよい。該前期メラニン細胞株は、第１の前期メラニン細胞株及び第２の前期メラニン細胞株を含んでいてよく、該後期メラニン細胞株は、第１の後期メラニン細胞株及び第２の後期メラニン細胞株を含んでいてよい。前記第１の前期メラニン細胞株は、ＰＡ１、ＰＡ２、及びＰＡ３細胞株のうちの一つ以上を含んでいてよく、前記第２の前期メラニン細胞株は、ＰＡ４、ＰＡ５、及びＰＡ６メラニン細胞株のうちの一つ以上を含んでいてよい。また、前記第１の後期メラニン細胞株は、ＰＡ７、ＰＡ８、及びＰＡ９細胞株のうちの一つ以上を含んでいてよく、前記第２の後期メラニン細胞株は、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２メラニン細胞株のうちの一つ以上を含んでいてよい。
【００４０】
本明細書において、ｎ継代、継代ｎ（ｐａｓｓａｇｅ  ｎまたはＰＡ  ｎ）は、母細胞株をｎ-１回継代培養した細胞株を意味する。例えば、３継代またはＰＡ３は、母細胞株を２回継代培養した細胞株を意味する。前記ｎは整数である。
【００４１】
前記したような観点において、前記細胞若返りは、後期の継代培養細胞が前期の細胞と同等または類似した状態に戻ることを意味していてよい。例えば、ＰＡ１２細胞株がＰＡ１細胞株の状態に、ＰＡ１２細胞株がＰＡ２細胞株の状態に、ＰＡ１２細胞株がＰＡ３細胞株の状態に、ＰＡ１２細胞株がＰＡ４細胞株の状態に、ＰＡ１２細胞株がＰＡ５細胞株の状態に、ＰＡ１２細胞株がＰＡ６細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ１細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ２細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ３細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ４細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ５細胞株の状態に、ＰＡ１１細胞株がＰＡ６細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ１細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ２細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ３細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ４細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ５細胞株の状態に、ＰＡ１０細胞株がＰＡ６細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ１細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ２細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ３細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ４細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ５細胞株の状態に、ＰＡ９細胞株がＰＡ６細胞株の状態に戻ることを意味していてよい。
【００４２】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、継代培養系に含まれた細胞株のうち６回以上継代培養した細胞株の状態に該当する生体細胞を、５回以下継代培養した細胞株の状態に戻すものであってよい。前記継代培養系は、メラニン母細胞株であるＰＡ１細胞株及び前記メラニン母細胞株をそれぞれ１、２、３、４、及び５回継代培養した、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ５、及びＰＡ６細胞株のいずれか一つ以上を含む前期メラニン細胞株；及び前記メラニン母細胞株をそれぞれ６、７、８、９、１０、及び１１回継代培養した、ＰＡ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２細胞株のいずれか一つ以上を含む後期メラニン細胞株を含む継代培養系であってよいが、これらに制限されるものではない。
【００４３】
本発明の一観点に係る組成物において、前記継代培養系は、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ５、ＰＡ６、ＰＡ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、及びＰＡ１２細胞株から構成されたものであってよいが、これらに制限されるものではない。
【００４４】
前記のような側面において、前記継代培養された細胞株は、寄託番号ＫＣＴＣ１２９０６ＢＰまたはＫＣＴＣ１２９０７ＢＰの細胞株であってよい。例えば、前記メラニン細胞株は、寄託番号ＫＣＴＣ１２９０６ＢＰ細胞株であってよく、後期メラニン細胞株は、ＫＣＴＣ１２９０７ＢＰ細胞株であってよい。具体的に、ＰＡ３細胞株は寄託番号ＫＣＴＣ１２９０６ＢＰ細胞株であり、ＰＡ１１細胞株はＫＣＴＣ１２９０７ＢＰ細胞株である。
【００４５】
本発明の一観点に係る組成物において、前記ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、及びこれらの溶媒和物からなる群より選択される一つ以上を含む組成物は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連蛋白質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質−２（ＴＲＰ−２）、ＥＺＨ１（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）、ｐ１６及びｐ２１からなる群より選択された一つ以上の発現を減少させられるが、これらに制限されるものではない。前記したような観点において、継代培養を繰り返すほど前記チロシナーゼを含む物質の発現量が増加し得るが、本発明の一観点に係る組成物を含む培地において継代培養（例えば、７継代から）した細胞株は、前記チロシナーゼ、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ関連蛋白質−１、及びチロシナーゼ関連蛋白質−２、ＥＺＨ１、ｐ１６及びｐ２１からなる群より選択された一つ以上の発現量が前期の継代培養細胞株（例えば、２継代）での発現量と同等またはそれ以下の水準に減少され得る。
【００４６】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、ｐ１４、ｐ１９、ｐ２７、サイクリンＤ（ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ）、サイクリンＥ（ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ）、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ４、ＣＤＫ４）、カテリシジン抗菌ペプチド（ｃａｔｈｅｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＲＡＭＰ）、スタスミン（ｓｔａｔｈｍｉｎ）、ＥＦ−１ａ、及びキチナーゼ３−様−３（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  ３）からなる群より選択された一つ以上の発現を減少させるものであってよい。前記のような観点において、継代培養を繰り返すほど前記ｐ１４を含む物質の発現量が増加し得るが、本発明の一観点に係る組成物を含む培地において継代培養（例えば、７継代から）した細胞株は、前記ｐ１４などの発現量が前期細胞株での発現量と同等またはそれ以下の水準に減少され得る。
【００４７】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素５（ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ５）の発現を増加させるものであってよい。
【００４８】
前記発現変化の検出は、組織、細胞（例えば、メラニン細胞）、体液（例えば、血液、組織液）で行われてよいが、これらに制限されるものではない。
【００４９】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、薬学、健康食品、又は化粧料の組成物であってよい。
【００５０】
具体的に、薬学又は美容分野において通常の方法により患者の身体内への投与に適合した単位投与型の製剤に剤形化して投与することができる。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射剤又は局所投与用製剤などが好ましい。注射用剤形は、等張性水溶液又は懸濁液が好ましい。しかし、このとき、一般に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を一緒に用いていてよい。このように製造された本発明の製剤は、通常の方法により非経口的に、例えば、特定の部位に直接投与していてよい。このとき、組成物の注入は注射器を利用して行われていてよい。有効成分の実際の投与量は、投与経路、患者の体重、年齢、及び性別などの種々の関連因子に鑑みて決定してよいものと理解されるべきであり、例えば、１回の投与量に含まれる組成物の濃度は１μＭであってよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、局所投与用の組成物であってよい。
【００５２】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、化粧料組成物であってよい。具体的に、化粧料組成物としては、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪用化粧料、ボディー用化粧料などが挙げられ、その剤形は特に制限されず、目的するところに応じて適宜選択すればよい。
【００５３】
例えば、前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及びスプレーなどで剤形化されていてよいが、これらに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、ローション、ボディーローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ジェル、パッチ、水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｏ／Ｗ）型などの基礎化粧料、リップスティック、メーキャップベースまたはファウンデーションなどのポイントメーキャップ化粧料、シャンプー、リンス、ボディークレンザー、歯磨きまたは口腔洗浄剤などの洗浄料、ヘアトニック、ジェルまたはムースなどの整髪剤、養毛剤または染毛剤などの毛髪用化粧料組成物に剤形化されていてよい。
【００５４】
前記化粧料組成物は、化粧品学的に許容し得る媒質または基剤を含有する。前記化粧料組成物は、局所適用に適したあらゆる剤形に、例えば、溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水状物に油状物を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）及び／または非イオン型の小胞性分散剤の形態に、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー、またはコンシーラースティックの形態で提供されていてよい。これらの組成物は、当該分野の通常の方法にて製造されていてよい。
【００５５】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。
【００５６】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガカントなどが用いられていてよい。
【００５７】
本発明の剤形がペースト、クリーム、またはゲルの場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカンド、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが用いられていてよい。
【００５８】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーの場合は、更に、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、またはジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００５９】
本発明の一実施態様において、前記化粧料組成物は、更に粘増剤を含有していてよい。本発明の化粧料組成物に含まれる粘増剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシグアニン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクォータニウム、セテアリルアルコール、ステアリン酸、カラギナンなどが用いられていてよく、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクォータニウムのうちの１種以上が用いられていてよく、より好ましくは、カルボキシビニルポリマーが用いられていてよい。
【００６０】
本発明の一実施態様における前記化粧料組成物は、必要に応じて適切な各種の基剤や添加剤を含有していてよく、これらの成分の種類と量は、発明者によって適宜選定されていてよい。必要に応じて許容し得る添加剤を含有していてよく、例えば、当業界においては通常の防腐剤、色素、添加剤などの成分を更に含んでいてよい。
【００６１】
防腐剤としては、具体的にフェノキシエタノール（Ｐｈｅｎｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）または１,２−ヘキサンジオール（１,２−Ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ）などが挙げられ、香料としては、人工香料などが挙げられる。
【００６２】
そして、本発明の一実施態様における化粧料組成物は、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選択された組成物を含んでいてよい。その他添加していてよい配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００６３】
また、健康食品は、日常食事で欠乏し易い栄養素や人体に有用な機能をもつ原料や成分（機能性原料）を用いて製造したものであって、人体の正常な機能を維持し又は生理機能活性化によって健康を維持し改善する食品を意味するものであってよいが、これに制限されるものではない。前記健康食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸などの形態に製造、加工されるが、これらに限定されるものではなく、法律に従っていかなる形態に製造、加工されていてもよい。
【００６４】
本発明の一側面において、健康飲料組成物は、指示された割合にて必須成分として前記化合物を含有する以外は、他の成分に特別な制限がなく、通常の飲料と同様に種々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有していてよい。天然炭水化物の例としては、単糖類、多糖類、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、クルチルリチン）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。
【００６５】
一般に、健康食品組成物によって投与される有効成分量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ/日〜略１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。好ましい投与量は０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００６６】
なお、その他添加していてもよい配合成分は、これらに限定されるものではなく、また、前記いずれの成分も本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で配合可能なものとする。
【００６７】
本発明の一観点に係る組成物において、前記組成物は、０．００１〜２．０μＭ、または０．００５〜１．５μＭのゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、またはこれらの溶媒和物を含んでいてよいが、これらに制限されるものではない。具体的に、本発明の一観点において、組成物に含まれたゲニステイン、エピガロカテキンガレート、これらの誘導体、これらの異性体、これらの薬学的に許容し得る塩、これらのプロドラッグ、これらの水和物、またはこれらの溶媒和物の濃度は、０．０００１μＭ以上、０．００１μＭ以上、０．００２μＭ以上、０．００３μＭ以上、０．００４μＭ以上、０．００５μＭ以上、０．００６μＭ以上、０．００７μＭ以上、０．００８μＭ以上、０．００９μＭ以上、０．０１μＭ以上、０．１５μＭ以上、０．１５μＭ以上、０．２μＭ以上、０．２５μＭ以上、０．３μＭ以上、０．３５μＭ以上、０．４μＭ以上、０．４５μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１．０μＭ以上、１１μＭ以上、１．２μＭ以上、１．３μＭ以上、１．４μＭ以上、１．５μＭ以上、１．６μＭ以上、１．７μＭ以上、１．８μＭ以上、１．９μＭ以上、２．０μＭ以上であってよいが、これらに制限されず、また、２．１μＭ以下、２．０μＭ以下、１．９μＭ以下、１．８μＭ以下、１．７μＭ以下、１．６μＭ以下、１．５μＭ以下、１．４μＭ以下、１．３μＭ以下、１．２μＭ以下、１．１μＭ以下、１．０μＭ以下、０．９μＭ以下、０．８５μＭ以下、０．８０μＭ以下、０．７５μＭ以下、０．７０μＭ以下、０．６５μＭ以下、０．６０μＭ以下、０．５５μＭ以下、０．５０μＭ以下、０．４５μＭ以下、０．４０μ以下、０．３５μＭ以下、０．３０μＭ以下、０．２５μＭ以下、０．２０μＭ以下、０．１５μＭ以下、０．１０μＭ以下、０．０５μＭ以下、０．０４μＭ以下、０．０３μＭ以下、０．０２μＭ以下、０．０１μＭ以下、０．００５μＭ以下、０．００４μＭ以下、０．００３μＭ以下、０．００２μＭ以下、０．００１μＭ以下、０．０００５μＭ以下であってよいが、これらに制限されない。
【００６８】
以下、下記の実施例によって本発明をより具体的に説明する。なお、下記の実施例は本発明に対する理解に資するための例示の目的から提供されたものであるに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がこれらに限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］メラニン細胞の継代培養
ヒト初代メラニン細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）をヒトメラニン細胞増殖サプリメント（ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＭＧＳ）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ）を添加したＭ−２５４培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ））を利用して１００ｍｍ培養皿で２日間隔で培地を交換し、室温、５％  ＣＯ２培養器で細胞の密度がプレート面積の８０％を占めるまで培養し、別の１００ｍｍ培養皿に１：４の割合で次の継代培養を行った。
【００７０】
前記メラニン細胞を培養するために最初に１００ｍｍ培養皿に盛ったとき、この細胞の継代を１継代（ｐａｓｓａｇｅ  １、ＰＡ１）とみなし、継代培養は最終１１回（ＰＡ１２）まで行った。
【００７１】
［実施例２］メラニン細胞のメラニン色素形成能増加関連因子の発現変化の観察
ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）が後期継代培養メラニン細胞株に及ぼす影響を、メラニン色素形成と関連があると知らされた因子（チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連蛋白質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質−２（ＴＲＰ−２））の発現量の変化から確認した。
【００７２】
対照群は、メラニン細胞を何らの処理を施さずに１１継代及び１２継代まで継代培養を行い、実験群は、６継代までは対照群と同じ環境で継代培養した後、７継代からゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）１μＭを含む培地で１１継代及び１２継代まで代培養を行った。
【００７３】
具体的に、メラニン色素形成と関連があると知らされた因子（チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連蛋白質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質−２（ＴＲＰ−２））の発現量の変化の関係を確認するために、Ｑ−ＰＣＲを行った。ヒトメラニン細胞から分離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、それぞれのプライマリを利用してＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７５００  Ｆａｓｔ）でｍＲＮＡ量の変化を測定した。Ｑ−ＰＣＲの実験は９５℃で１５秒、６０℃で６０秒サイクルを合計４０回繰り返し行い、対照群の遺伝子発現に比べて当該遺伝子発現がどの程度増加したかの相対的な値を測定した。プライマリとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑＭａｎを用いており、それぞれ次のとおりである：チロシナーゼ（ＴＹＲ、製品番号:Ｈｓ０１０９９９６５＿ｍ１）、ＭＩＴＦ（製品番号：Ｈｓ０１１１７２９４＿ｍ１）、ＴＲＰ１（製品番号：Ｈｓ００１６７０５１＿ｍ１）、ＴＲＰ２（製品番号：Ｈｓ０１０９５８５６＿ｍ１）。
【００７４】
その結果（図１）、対照群において継代培養後期で増加したチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連蛋白質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＲＰ−１）及びチロシナーゼ関連蛋白質−２（ＴＲＰ−２）のｍＮＲＡ発現量が、実験群では大きく減少したことを確認することができた（図中のグラフにおける縦軸は各遺伝子のｍＲＮＡ発現量／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量であって当該遺伝子の相対的発現量である）。
【００７５】
［実施例３］メラニン細胞の老化指標の観察
老化した細胞から多量発見されるｐ１６及びｐ２１の発現量が、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）によって影響を受けるかどうかを確認した。対照群と実験群は実施例２と同一であった。
【００７６】
具体的に、多様な継代のメラニン細胞からＲＮＡを収得してｃＤＮＡを作製し、ｐ１６、ｐ２１特異的プライマリを利用してＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７５００  Ｆａｓｔ）でｍＲＮＡ量の変化を測定した。プライマリとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑＭａｎを用いており、それぞれ次のとおりである：ｐ１６（製品番号：Ｈｓ００９２３８９４＿ｍ１）、ｐ２１（製品番号：Ｈｓ００３５５７８２＿ｍ１）。
【００７７】
その結果（図２）、対照群では継代培養後期でｐ１６及びｐ２１の発現が大きく増加したのに対し、実験群では大きく減少したことを確認することができた（図中のグラフにおける縦軸は各遺伝子のｍＲＮＡ発現量／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量であって当該遺伝子の相対的発現量である）。
【００７８】
［実施例４］メラニン色素形成関連酵素の発現変化の観察
ＥＺＨ１（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）蛋白質がメラニン色素形成に影響を及ぼすかどうかを確認するためにｓｉＲＮＡを利用して、ＥＺＨ１の蛋白質発現を抑制した。その結果、形成されたメラニン色素が大きく減少することを確認し、ＥＺＨ１がメラニン色素形成を抑制することが分かった（図３の下図）。
【００７９】
また、前記ＥＺＨ１の発現量がゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）によって影響を受けるかどうかを確認した。対照群と実験群は実施例２と同一であった。
【００８０】
具体的に、対照群と実験群のメラニン細胞からＲＮＡを収得してｃＤＮＡを作製し、ＥＺＨ１特異的プライマリを利用してＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７５００  Ｆａｓｔ）でｍＲＮＡ量の変化を測定した。ＥＺＨ１プライマリは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑＭａｎであって、ＥＺＨ１（製品番号：Ｈｓ００９４０４６３＿ｍ１）である。
【００８１】
その結果（図３）、対照群では継代培養後期にＥＺＨ１の発現量が大きく増加したのに対し、実験群では大きく減少することを確認することができた（図中のグラフにおける縦軸は各遺伝子のｍＲＮＡ発現量／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量であって当該遺伝子の相対的発現量である）。
【００８２】
［実施例５］メラニン細胞の表現型の観察
ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）がメラニン細胞の表現型に影響を与えるかどうかを確認するために、光学顕微鏡（倍率：４００倍）で対照群と実験群のメラニン細胞の表現型を観察した。細胞の表現型は、培地が含まれている生きている状態で、光学顕微鏡で４０倍拡大して観察された。
【００８３】
その結果、図４から確認できるように、メラニン細胞の表現型は、継代培養初期に比べて平らになり、細胞体（ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ）の大きさが増加し、樹枝状晶（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）の個数及び異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｅｔｙ）が増加（老化して模様が変わった細胞個数の増加：細胞体径３μＭ以上である細胞増加）したのに対し、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）またはエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）に長期露出した場合、再び継代培養初期の細胞と類似した状態となることを確認することができた。
【００８４】
以下、本発明に係る組成物の剤形例を説明するが、薬学組成物及び化粧料組成物は種々の剤形に応用可能であり、これらは、本発明を限定するためのものではなく、単に具体的に説明するためのものに過ぎない。
【００８５】
［剤形例１］軟膏
【００８６】
【表１】
2017537072.tif 000006
【００８７】
［剤形例２］マッサージクリーム
【００８８】
【表２】
2017537072.tif 000007
【００８９】
［剤形例３]柔軟化粧水（スキンローション）
【００９０】
【表３】
2017537072.tif 000008
［剤形例４］栄養化粧水（ミルクローション）
【００９１】
【表４】
2017537072.tif 000009
［剤形例５］ヘアーパック
【００９２】
【表５】
2017537072.tif 000010
［剤形例６］注射剤
【００９３】
【表６】
2017537072.tif 000011
【００９４】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であるに過ぎず、これらによって本発明の範囲が制限されるものでないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されると言えよう。
【図１ａ】
2017537072.tif 000012
【図１ｂ】
2017537072.tif 000013
【図１ｃ】
2017537072.tif 000014
【図１ｄ】
2017537072.tif 000015
【図２】
2017537072.tif 000016
【図３】
2017537072.tif 000017
【図４ａ】
2017537072.tif 000018
【図４ｂ】
2017537072.tif 000019
【国際調査報告】
2017537072.tif 000020
2017537072.tif 000021
2017537072.tif 000022
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