(57)【要約】  本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む医薬組み合わせ；それを含む医薬組成物：ならびにそのような組み合わせ及び組成物を使用して、それを必要とする対象のリンパ腫を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む、リンパ腫治療のための医薬組み合わせ。
【請求項２】
請求項１の組み合わせであって、前記ＨＤＡＣ６特異的阻害剤が、式Ｉの化合物：
【化１】
2017537164.tif 000030
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれがＯＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキルで置換されていてもよく；
Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルである、前記組み合わせ。
【請求項３】
式Ｉの前記化合物が、
【化２】
2017537164.tif 000031
またはその薬学的に許容される塩である、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
式Ｉの前記化合物が、
【化３】
2017537164.tif 000032
またはその薬学的に許容される塩である、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項５】
請求項１の組み合わせであって、前記ＨＤＡＣ６特異的阻害剤が、式ＩＩの化合物：
【化４】
2017537164.tif 000033
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒｘ及びＲｙは、それぞれが結合する炭素とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルを形成し；
各ＲＡは、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮまたは−ＮＨ２であり；及び
ｍは０、１または２である、前記組み合わせ。
【請求項６】
式ＩＩの前記化合物が、
【化５】
2017537164.tif 000034
またはその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項７】
式ＩＩの前記化合物が、
【化６】
2017537164.tif 000035
またはその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項８】
ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法。
【請求項９】
前記リンパ腫が、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８の方法であって、前記ＨＤＡＣ６特異的阻害剤が、式Ｉの化合物：
【化７】
2017537164.tif 000036
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれがＯＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキルで置換されていてもよく；
Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルである、前記方法。
【請求項１１】
式Ｉの前記化合物が、
【化８】
2017537164.tif 000037
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式Ｉの前記化合物が、
【化９】
2017537164.tif 000038
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８の方法であって、前記ＨＤＡＣ６特異的阻害剤が、式ＩＩの化合物：
【化１０】
2017537164.tif 000039
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒｘ及びＲｙは、それぞれが結合する炭素とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルを形成し；
各ＲＡは、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮまたは−ＮＨ２であり；
ｍは０、１または２である、前記方法。
【請求項１４】
式ＩＩの前記化合物が、
【化１１】
2017537164.tif 000040
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
式ＩＩの前記化合物が、
【化１２】
2017537164.tif 000041
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとが、別々の剤形で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとが、単一剤形で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとが、異なる時間に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとが、実質的に同時に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のアポトーシスの誘導方法。
【請求項２１】
前記アポトーシスの誘導が、活性酸素種の増加を伴う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アポトーシスが、カスパーゼ３、カスパーゼ９、カスパーゼ８及び／またはＰＡＲＰの活性化を伴う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞の生存性の低減方法。
【請求項２４】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のクローン原性生存率の低減方法。
【請求項２５】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞の細胞増殖性の抑制方法。
【請求項２６】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞におけるＢｃｌ−２発現の低減方法。
【請求項２７】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、細胞周期タンパク質ｐ２１及びｐ２７の発現の増加方法、ならびに癌細胞における細胞周期タンパク質サイクリンＤの発現の低減方法。
【請求項２８】
ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の脱リン酸化の誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月５日出願の米国仮特許出願第６２／０８７，８６８号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫は、未だ難治性の進行性疾患であり、この疾患を有する患者の死亡率は死因の上位に位置し続けている。
【０００３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、癌療法の有望な標的である。ＨＤＡＣはヒストン及び非ヒストンタンパク質のリジン残基を脱アセチル化する酵素のファミリーであり、細胞周期の進行及び細胞生存性の調節にとって重要な役割を担っている。残念ながら、非選択的ＨＤＡＣ阻害剤は、患者において用量制限毒性が確認されている。リコリノスタットは、新規の選択的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）阻害剤である。ＨＤＡＣ６は、環境ストレスに対する細胞応答に重要な役割を果たすクラスＩＩＢヒストン脱アセチル化酵素である。
【０００４】
ベンダムスチンは、プリン類似体とアルキル化剤の特性を両立するように設計された抗悪性腫瘍薬である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記療法には用量制限毒性があるため、より有効性が高く、毒性の低いリンパ腫治療用の組成物及び方法が当技術分野で引き続き必要とされている。このようなニーズを満たすため、本明細書ではＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む医薬組み合わせ及びリンパ腫の治療方法を提供する。本発明の組み合わせ及び方法は、許容性に優れ、従来療法での用量制限毒性を呈しない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療するための医薬組み合わせを提供する。本明細書ではまた、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療するためのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを提供する。例えば、本発明の一実施形態は、治療的有効量のヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む、リンパ腫治療のための医薬組み合わせを提供する。本発明の付加的な実施形態では、治療的有効量のヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む、リンパ腫治療のための医薬組み合わせを提供し、該組み合わせが相乗効果を示す投与量で投与される。
【０００８】
他の実施形態では、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とベンダムスチンとを含む有効量の組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法を提供する。例えば、本発明の一実施形態は、ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法を提供する。本発明の付加的な実施形態は、ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法を提供し、該組み合わせが相乗効果を示す投与量で投与される。
【０００９】
具体的な実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式Ｉの化合物：
【化１】
2017537164.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれがＯＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキルで置換されていてもよく；
Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルである。
【００１０】
好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は：
【化２】
2017537164.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１１】
更に他の実施形態では、式Ｉの化合物は：
【化３】
2017537164.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１２】
他の具体的な実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式ＩＩの化合物：
【化４】
2017537164.tif 000005
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒｘ及びＲｙは、それぞれが結合する炭素とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチルを形成し；
各ＲＡは、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮまたは−ＮＨ２であり；
ｍは０、１または２である。
【００１３】
好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は：
【化５】
2017537164.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１４】
他の好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は：
【化６】
2017537164.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンは、薬学的に許容される担体とともに投与される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとは、別々の剤形で投与される。他の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとは、単一剤形で投与される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとは、異なる時間に投与される。他の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとは、実質的に同時に投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとの組み合わせは、それを必要とする対象の治療で相乗効果を達成する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のアポトーシスの誘導方法を含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスの誘導は、活性酸素種の増加を伴う。いくつかの実施形態では、アポトーシスは、カスパーゼ３、カスパーゼ９、カスパーゼ８及び／またはＰＡＲＰの活性化を伴う。
【００２０】
本発明の更に別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞の生存性を低減する方法を含む。
【００２１】
本発明の更に別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のクローン原性生存率を低減する方法を含む。
【００２２】
本発明の更なる実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞内の細胞増殖を抑制する方法を含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞でのＢｃｌ−２の発現を低減する方法を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、細胞周期タンパク質ｐ２１及びｐ２７の発現を増加させる方法、ならびに癌細胞の細胞周期タンパク質サイクリンＤの発現を低減する方法を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞でのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の脱リン酸化を誘導する方法を含む。
【００２６】
それ以外の目的、特徴及び利点は、以降の詳細な説明によって明らかにする。この詳細な説明から、本発明の趣旨及び範囲内での種々の変更及び改変が当業者に明らかとなるため、詳細な説明及び具体的な実施例は例示のみを目的として記載されるにすぎない。更に、本発明の原理を各実施例に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】考察したすべての細胞株でＨＤＡＣ６が高度に発現することを示す。
【図１Ｂ】細胞生存性に対するリコリノスタットの効果を示す。リコリノスタットは、逐次的な投与量のリコリノスタット（０．１〜１００μＭ）で２４〜７２時間処理した６種のリンパ腫細胞株（ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＲＬ、Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｊｅｋｏ−１、Ｈｕｔ−７８及びＫａｒｐａｓ−２９９）のパネルにおいて、用量依存的かつ時間依存的に成長阻害を誘導する。データは、少なくとも３件の独立した実験を代表し、平均±ＳＤを表す。
【図１Ｃ】ベンダムスチンの抗増殖性活性を示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｊｅｋｏ−１及びＨｕｔ−７８細胞をベンダムスチン（２５〜３００μＭ）で２４時間処理した。ベンダムスチンは、細胞生存性の用量依存的阻害を示し、ＩＣ５０は１２７μＭ〜１６８μＭの範囲であった。値は３件の独立した実験を表す。
【図２Ａ】ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞の細胞生存性に対する薬物組み合わせの相乗効果を示す。異なる濃度のリコリノスタット（０、２、２．５、４、５、８及び１０μＭ）をベンダムスチン（０、１０、２０、２５、４０、５０及び１００μＭ）と組み合わせて細胞を処理し、２４時間の時点でＭＴＴによって分析した。
【図２Ｂ】アイソボログラム分析による、図２Ａに示した相乗効果の確認を示す（相互作用指数＜１）。
【図２Ｃ】単独及び組み合わせたリコリノスタット（４μＭ）及びベンダムスチン（２０μＭ）とともに２４時間培養した、３名の健常対象から新鮮に単離されたＰＢＭＣの細胞生存性を示す。
【図２Ｄ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのクローン原性生存率に対する効果を示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞を、最初にリコリノスタット単独（１、５、１０μＭ）（Ｃ）とともに、続いてベンダムスチン（Ｄ）との組み合わせとともに、培養液中で２４時間インキュベートした。処理細胞はメチルセルロース中でインキュベートし、１０日後に５０超の細胞からなるコロニーを計数した。対照細胞に対する相対比を示し、３件の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図２Ｅ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのクローン原性生存率に対する効果を示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞を、最初にリコリノスタット単独（１、５、１０μＭ）（Ｃ）とともに、続いてベンダムスチン（Ｄ）との組み合わせとともに、培養液中で２４時間インキュベートした。処理細胞はメチルセルロース中でインキュベートし、１０日後に５０超の細胞からなるコロニーを計数した。対照細胞に対する相対比を示し、３件の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図３Ａ】リコリノスタット及びベンダムスチンは、ＢＭ−ＭＳＣの保護効果を克服することを示す。ＢＭ−ＭＳＣありで、またはなしで共培養し、単独及び組み合わせたリコリノスタット（Ｒ）及びベンダムスチン（Ｂ）で２４時間処理した、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞の細胞生存性。ＢＭ−ＭＳＣとともに共培養されたとき、薬物組み合わせはリンパ腫細胞株の細胞生存性を抑制した。データはすべて、３件の培養の無処理対照比±ＳＤとして表した。
【図３Ｂ】リコリノスタット（４μＭ）及びベンダムスチン（２０μＭ）を単独で及び組み合わせて処理したＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８細胞、ならびにリコリノスタット（５μＭ）及びベンダムスチン（５０μＭ）を単独で、及び組み合わせて処理したＪｅｋｏ−１細胞の細胞周期プロファイルに対する薬物組み合わせの効果を示す。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４のバーは、それぞれｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期を示す。
【図３Ｃ】処理後２４時間の、リンパ腫細胞株の期別の細胞周期分布比を示す。値はすべて、３件の独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図４】細胞周期の調節性タンパク質に対するリコリノスタット／ベンダムスチンの効果を示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８は、４μＭのリコリノスタット及び２０μＭのベンダムスチンを単独で、及び組み合わせて処理し、Ｊｅｋｏ−１は、５μＭのリコリノスタット及び５０μＭのベンダムスチンを単独で、及び組み合わせて処理した。２４時間の処理後、ウェスタンブロットを実施した。チューブリンは用いて、タンパク質負荷を正規化した。
【図５Ａ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのアポトーシスに対する効果を示す。図５Ａは、リコリノスタット（１、２、５、１０μＭ）単独で２４時間処理し、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムによって染色したＷＳＵ−ＮＨＬ細胞の代表的なドットプロットを示す。
【図５Ｂ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのアポトーシスに対する効果を示す。図５Ｂは、リコリノスタット（１、２、５及び１０μＭ）単独で２４〜４８時間処理した後のＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞株における、アポトーシス細胞率を示す。
【図５Ｃ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのアポトーシスに対する効果を示す。図５Ｃは、リコリノスタット（４μＭ）をベンダムスチン（２０μＭ）と組み合わせて、２４時間処理したＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８、ならびに５μＭのリコリノスタットと５０μＭのベンダムスチンの組み合わせで処理したＪｅｋｏ−１細胞の代表的なドットプロットを示す。フローサイトメトリーは、併用処理によって誘導されるアポトーシスの増加を示す。
【図５Ｄ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのアポトーシスに対する効果を示す。図５Ｄは、４μＭのリコリノスタット（Ｒ）と２０μＭのベンダムスチン（Ｂ）の組み合わせで処理したＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８、ならびに５μＭのリコリノスタットと５０μＭのベンダムスチンの組み合わせで処理したＪｅｋｏ−１細胞のアポトーシス細胞率（初期及び後期アポトーシス）を示す。
【図５Ｅ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせのアポトーシスに対する効果を示す。図５Ｅは、リコリノスタット（１、５、１０μＭ）単独で２４時間処理したＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１からのＲＯＳ生成の代表的なデータ（％）を示す。データはすべて、３件の培養の平均±ＳＤとして表す。
【図６Ａ】薬物組み合わせが、２４時間の時点でＲＯＳの生成に強い効果を引き起こすことを示す。図６Ａは、リコリノスタット（Ｒ）及びベンダムスチン（Ｂ）により２４時間処理した後の、ＷＳＵ−ＮＨＬからのＲＯＳ生成の代表的なデータを示す。
【図６Ｂ】薬物組み合わせが、２４時間の時点でＲＯＳの生成に強い効果を引き起こすことを示す。図６Ｂは、薬物組み合わせによりＲＯＳレベルが増加した細胞の比率を示す。抗酸化剤ＮＡＣの共投与は、ＲＯＳ生成の増加を妨げた。陽性対照としてＨ２Ｏ２を使用した。
【図６Ｃ】薬物組み合わせが、２４時間の時点でＲＯＳの生成に強い効果を引き起こすことを示す。図６Ｃは、薬物組み合わせにより誘導されたＲＯＳ生成がチオレドキシン−１（Ｔｒｘ１）の発現の減少と関連していたことを示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞からの細胞抽出物のウェスタンブロットにより、Ｔｒｘ−１との抗体反応を検出した。
【図６Ｄ】薬物組み合わせが、２４時間の時点でＲＯＳの生成に強い効果を引き起こすことを示す。図６Ｄは、薬物組み合わせがＥＲストレス及びＵＰＲシグナル伝達に影響を与えたことを示す。指定された用量の各薬物を単独でまたは組み合わせて２４時間処理した、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１からの細胞抽出物の代表的なウェスタンブロットである。チューブリンはタンパク質負荷の正規化に使用した。
【図７Ａ】Ｂｃｌ−２タンパク質発現に対する効果を示す。リコリノスタット（Ｒ）及びベンダムスチン（Ｂ）は、Ｂｃｌ−２の発現を減少させる。フローサイトメトリーによって評価した、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞におけるＢｃｌ−２レベルの代表的なデータ（％）である。
【図７Ｂ】Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質との関係を示す。薬物組み合わせは、抗アポトーシスタンパク質の下方調節及びプロアポトーシスタンパク質のリン酸化に影響した。全細胞可溶化物に、指定した抗体を用いたウェスタンブロットを施した。
【図７Ｃ】カスパーゼ経路との関係を示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞からの細胞抽出物における、カスパーゼ−８、−９、−３及びＰＡＲＰ（ＺＶＡＤ−ｆｍｋあり、またはなし）の代表的なウェスタンブロットである。チューブリンを負荷対照として示す。
【図８Ａ】薬物組み合わせがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を制御することを示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８細胞は、４μＭのリコリノスタットと２０μＭのベンダムスチンで処理し、Ｊｅｋｏ−１細胞は５μＭのリコリノスタットと５０μＭのベンダムスチンで処理した。全細胞可溶化物に、指定した抗体を用いたウェスタンブロットを施した。
【図８Ｂ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせの、α−チューブリンのＨＤＡＣ６アセチル化に対する効果を示す。リコリノスタットの処理は、ＨＤＡＣ６発現を低減し、リンパ腫細胞におけるα−チューブリンのアセチル化レベルを誘導した。その程度はベンダムスチンによって更に変化することはなかった。各薬物を単独でまたは組み合わせて２４時間処理した、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１からの細胞抽出物のウェスタンブロットである。チューブリンはタンパク質負荷の正規化に使用した。
【図９Ａ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせが微小管を安定化することを示す。リコリノスタットは単独で蛍光強度の増加を誘導し、これは薬物組み合わせにより更に増加した。抗α−チューブリン染色及びフローサイトメトリーによって評価した、チューブリン重合の分析から得た代表的なデータである。ＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８は、リコリノスタット（Ｒ）４μＭ及びベンダムスチン（Ｂ）２０μＭを単独で及び組み合わせて２４時間処理し、Ｊｅｋｏ−１細胞はリコリノスタット５μＭ及びベンダムスチン５０μＭで処理した。これと合わせ、微小管不安定化剤ノコダゾール（陰性対照）（１μＭ）及び微小管安定化剤パクリタキセル（陽性対照）（１００ｎＭ）により処理した。データは平均±ＳＤで表し、３回にわたり実施した３件の独立した実験から得た。
【図９Ｂ】リコリノスタット単独、及びベンダムスチンとの組み合わせがＩＬ−１０発現を下方調節したことを示す。ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞でのＩＬ−１０分泌に対する薬物組み合わせの効果である。リコリノスタットは単独でＩＬ−１０の下方調節を誘導した。薬物組み合わせは、いずれかの化合物単独と比較して、このサイトカインのレベルを更に低下させた。ＩＬ−１０の分泌はＥＬＩＳＡ法により分析した。データはすべて、重複して実施した、それぞれ少なくとも３件の独立した実験の平均（±ＳＤ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本出願は一般に、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とベンダムスチンとを含む組み合わせ、ならびにリンパ腫の治療方法を対象とする。
定義
本発明の記載に使用する種々の用語の定義を以下に列挙する。特定の事例において、個々に、またはより大きな群の一部として特に制限されない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して用語が使用される場合、その用語にはこの定義が適用される。
【００２９】
用語「約」は、一般に、ある値の１０％、５％、または１％以下の見込まれる変動を示す。例えば、「約２５ｍｇ／ｋｇ」は一般に、その最も広義で２２．５〜２７．５ｍｇ／ｋｇ、すなわち２５±２．５ｍｇ／ｋｇの値を示すことになる。
【００３０】
用語「アルキル」は、特定の実施形態において、それぞれ１〜６個、または１〜８個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素部分を指す。Ｃ１−６アルキル部分の例としては、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分が挙げられ、Ｃ１−８アルキル部分の例としては、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、及びオクチル部分が挙げられる。
【００３１】
アルキル置換基中の炭素原子の数が、接頭辞「Ｃｘ−ｙ」によって示される場合があり、この場合のｘは置換基中の炭素原子の最小数であり、ｙは最大数である。同様に、Ｃｘ鎖とは、ｘ個の炭素原子を含んでいるアルキル鎖を意味する。
【００３２】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル部分を指す。
【００３３】
用語「アリール」は、縮合または非縮合の１つ以上の芳香環を有する単環式もしくは多環式の環状炭素系を指し、例えば、これに限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、及びイデニルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、アリール基は６個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アリール基は６〜１０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アリール基は６〜１６個の炭素原子を有する。
【００３４】
用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香環を有する単環式もしくは多環式（例えば二環系もしくは三環系以上）の縮合もしくは非縮合部分または環系を指し、環を形成する原子のうちの１つ以上が、酸素、硫黄、または窒素などのヘテロ原子である。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は約１〜６個の炭素原子、更なる実施形態では、１〜１５個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は５〜１６個の環原子を含有し、そのうち１個の環原子は酸素、硫黄、及び窒素から選択され、０、１、２、または３個の環原子は酸素、硫黄、及び窒素から独立して選択される追加のヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。ヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル、アクリジニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「ハロ」は、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲンを指す。
【００３６】
用語「組み合わせ」は、本開示に記載される治療的病態または障害を治療するための２つ以上の治療薬を指す。治療薬のそのような組み合わせは、単一丸薬、カプセル剤、または静脈注射溶液の形態であってよい。しかしながら、用語「組み合わせ」はまた、２つ以上の治療薬が別々の丸薬、カプセル剤、または静脈注射溶液中に存在する状況も包含する。同様に、用語「併用療法」は、本開示に記載される治療的病態または障害を治療するための２つ以上の治療薬の投与を指す。このような投与には、一定比の活性成分を有する単一カプセル形態、または活性成分ごとに容器（例えばカプセル）が別である形態など、それらの治療薬を実質的に同時に共投与することを包含する。加えて、そのような投与にはまた、ほぼ同時または異なる時間のいずれかに、各種類の治療薬を逐次的に使用することも包含する。いずれの場合でも、本開示に記載される病態または障害の治療において、治療計画により薬物組み合わせの有益な効果をもたらすことが見込まれる。
【００３７】
用語「ＨＤＡＣ」とは、ヒストン脱アセチル化酵素を指し、これはコアヒストンのリジン残基からアセチル基を除去し、それによって凝縮され、転写的にサイレンシングされたクロマチンの形成をもたらす酵素である。現在１８個の既知のヒストン脱アセチル化酵素が存在し、これらは４つの群に分類される。ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ８を含むクラスＩ  ＨＤＡＣは、酵母ＲＰＤ３遺伝子に関係する。ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、及びＨＤＡＣ１０を含むクラスＩＩ  ＨＤＡＣは、酵母Ｈｄａ１遺伝子に関係する。サーチュインとしても知られるクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣは、Ｓｉｒ２遺伝子に関係し、ＳＩＲＴ１−７を含む。ＨＤＡＣ１１のみを含むクラスＩＶ  ＨＤＡＣは、クラスＩ及びＩＩ両方のＨＤＡＣの特性を有する。用語「ＨＤＡＣ」は、特に指定されない限り、１８個の既知のヒストン脱アセチル化酵素のうちのいずれか１つ以上を指す。
【００３８】
用語「ＨＤＡＣ６特異的」は、化合物が、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２などの他の種類のＨＤＡＣ酵素に対してよりも、５倍、１０倍、１５倍、２０倍以上などの実質的により大きい程度でＨＤＡＣ６に結合することを意味する。すなわち、この化合物は、他のどの種類のＨＤＡＣ酵素よりもＨＤＡＣ６に対して選択的である。例えば、ＨＤＡＣ６に対して１０ｎＭのＩＣ５０で、かつＨＤＡＣ１に対して５０ｎＭのＩＣ５０で結合する化合物は、ＨＤＡＣ６特異的である。他方で、ＨＤＡＣ６に対して５０ｎＭのＩＣ５０で、かつＨＤＡＣ１に対して６０ｎＭのＩＣ５０で結合する化合物は、ＨＤＡＣ６特異的ではない。
【００３９】
用語「阻害剤」は、用語「アンタゴニスト」と同義である。
【００４０】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤
本明細書では、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療するための医薬組み合わせを提供する。本明細書ではまた、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法を提供する。
【００４１】
本発明の組み合わせ及び方法は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。ＨＤＡＣ阻害剤は、どのＨＤＡＣ阻害剤であってもよい。したがって、ＨＤＡＣ阻害剤は、特定の種類のヒストン脱アセチル化酵素に対して選択的であっても、非選択的であってもよい。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は選択的ＨＤＡＣ阻害剤である。より好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤はＨＤＡＣ６阻害剤である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式Ｉの化合物：
【化７】
2017537164.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれがＯＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキルで置換されていてもよく；
Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルである。
【００４３】
式Ｉの代表的な化合物には、
【化８】
2017537164.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
式Ｉによる選択的ＨＤＡＣ６阻害剤の調製及び特性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１９８２（ＷＯ／２０１１／０９１２１３）に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
他の実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式ＩＩの化合物：
【化９】
2017537164.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒｘ及びＲｙは、それぞれが結合する炭素とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチルを形成し；
各ＲＡは、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮまたは−ＮＨ２であり；
ｍは０、１または２である。
【００４６】
式ＩＩの代表的な化合物には、
【化１０】
2017537164.tif 000011
またはその薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
式ＩＩによる選択的ＨＤＡＣ６阻害剤の調製及び特性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０７９１（ＷＯ／２０１２／０６８１０９）に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は溶媒和されていない。他の実施形態では、化合物のうちの１つ以上は溶媒和形態である。当技術分野で既知であるように、溶媒和化合物は、水及びエタノール等の薬学的に許容される溶媒のうちのいずれであってもよい。
【００４９】
ベンダムスチン
本発明の組み合わせ及び方法は、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む：
【化１１】
2017537164.tif 000012
。
【００５０】
ベンダムスチン、すなわち４−［５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル］ブタン酸は、１９６３年に合成されたナイトロジェンマスタードである。その合成については独国特許第３４７２７号及び同第１５９８７７号に記載されており、より最近では国際公開ＷＯ２０１０／０４２５６８に記載されている。以後、ベンダムスチンは、例えば、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫及び乳癌の治療に使用されてきた。ベンダムスチンは通常、注射により投与される。ベンダムスチンを含む医薬組成物は、例えば、米国特許第８，４３６，１９０号、同第８，６０９，８６３号、同第８，７９１，２７０号及び同第８，８９５，７５６号に記載されている。固形形態のベンダムスチンについては、例えば、米国特許第８，４４５，５２４号、同第８，６６９，２７９号及び同第８，８８３，８３６号に記載されている。各々の特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
本明細書で提供する組み合わせまたは方法のいずれかの実施形態では、ベンダムスチンは塩酸ベンダムスチンである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は溶媒和されていない。他の実施形態では、化合物のうちの１つ以上は溶媒和形態である。当技術分野で既知であるように、溶媒和化合物は、水及びエタノール等の薬学的に許容される溶媒のうちのいずれであってもよい。
【００５３】
ベンダムスチンならびに式Ｉ及びＩＩの化合物は中性形態で表されているが、実施形態によっては、これらの化合物は薬学的に許容される塩の形態で使用される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が既存の酸部分または塩基部分を塩の形態に変換することにより修飾されている、開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、及びカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的に許容される塩としては、例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸または遊離塩基の形態の親化合物を、水中もしくは有機溶媒中、または２種の混合物中で化学量論的量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、その溶媒は一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水溶媒が好ましい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８  ａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
別の実施形態は、本明細書に図示される化合物のいずれかの同位体標識化合物である。そのような化合物は、放射性であってもなくてもよい１つ以上の同位体原子（例えば、３Ｈ、２Ｈ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ及び１３１Ｉ）が化合物に導入されている。このような化合物は、治療的応用に加え、薬物代謝試験及び診断に有用である。
【００５５】
組み合わせ／医薬組み合わせ
本明細書では、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療するための組み合わせを提供する。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてリンパ腫を治療するためのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを提供する。ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩の組み合わせは、本明細書で「本発明の組み合わせ」とも称する。
【００５６】
本組み合わせのいくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ６阻害剤またはＨＤＡＣ６特異的阻害剤である。
【００５７】
ある特定の実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式Ｉの化合物：
【化１２】
2017537164.tif 000013
またはその薬学的に許容される塩である。
【００５８】
好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は、
【化１３】
2017537164.tif 000014
またはその薬学的に許容される塩である。
【００５９】
更に他の実施形態では、式Ｉの化合物は、
【化１４】
2017537164.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩である。
【００６０】
他の具体的な実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式ＩＩの化合物：
【化１５】
2017537164.tif 000016
またはその薬学的に許容される塩である。
【００６１】
好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は：
【化１６】
2017537164.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩である。
【００６２】
他の好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は、
【化１７】
2017537164.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩である。
【００６３】
一実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩を含む併用療法を本明細書で提供し、この場合のＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式Ｉの化合物：
【化１８】
2017537164.tif 000019
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂはアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれがＯＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキルで置換されていてもよく；
Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルである。
【００６４】
本組み合わせの具体的な実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、次式：
【化１９】
2017537164.tif 000020
、またはその薬学的に許容される塩である。
【００６５】
別の実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩を含む併用療法を本明細書で提供し、この場合のＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式ＩＩの化合物：
【化２０】
2017537164.tif 000021
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒｘ及びＲｙは、それぞれが結合する炭素とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチルを形成し；
各ＲＡは、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮまたは−ＮＨ２であり；
ｍは０、１または２である。
【００６６】
本組み合わせの具体的な実施形態では、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、次式：
【化２１】
2017537164.tif 000022
、またはその薬学的に許容される塩である。
【００６７】
医薬組成物
別の態様では、本発明の組み合わせ、すなわちＨＤＡＣ阻害剤（例えば、式ＩもしくはＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩）及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、例えば複合製剤を本明細書で提供する。一実施形態では、医薬組成物は１種以上の賦形剤を更に含む。一実施形態では、医薬組成物は１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」としては、あらゆる溶媒、分散溶媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定化剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、甘味剤、矯味剤、色素等及びこれらの組み合わせといった、当業者に既知であると思われるものが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９を参照）。活性成分と非相溶性である場合を除いて、従来的な担体のいずれも治療的組成物または医薬組成物での使用が想定される。
【００６９】
医薬組成物の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩の、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩に対するモル比は、約１：１００〜約１：１である。例えば、モル比は、約１：１００、約１：９５、約１：９０、約１：８５、約１：８０、約１：７５、約１：７０、約１：６５、約１：６０、約１：５５、約１：５０、約１：４５、約１：４０、約１：３５、約１：３０、約１：２５、約１：２０、約１：１５、約１：１０、約１：８、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２または１：１であり得る。ある特定の実施形態では、モル比は約１：５０〜約１：２である。他の実施形態では、モル比は約１：２０〜約１：２である。更なる実施形態では、モル比は約１：１０〜約１：２である。更に他の実施形態では、モル比は約１：５である。
【００７０】
投与／用量
併用療法のいくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤（式ＩまたはＩＩの化合物）は、ベンダムスチンと同時に投与される。同時投与は通常、両方の化合物が全く同時に患者に投入されることを意味する。しかしながら、同時投与はまた、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとが異なる時間に患者に投入される可能性も含むが、その時間差は、第２の投与化合物が投入される前に第１の投与化合物の効果が患者に現れない程度に瞬時である。このような遅延時間は通常、２分未満、及びより典型的には１分未満または３０秒未満に相当する。化合物が溶液中にある場合の一例では、化合物の組み合わせを含有する溶液を投与することにより同時投与を達成することができる。別の例では、一方がＨＤＡＣ阻害剤を含有し、他方がベンダムスチンを含有する別々の溶液の同時投与を用いてもよい。化合物が固体形態である場合の一例では、化合物の組み合わせを含有する組成物を投与することにより同時投与を達成することができる。あるいは、一方がＨＤＡＣ阻害剤を含み、他方がベンダムスチンを含む２種類の組成物を投与することにより同時投与を達成することができる。
【００７１】
他の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとは、同時に投与されない。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はベンダムスチンの前に投与される。他の実施形態では、ベンダムスチンはＨＤＡＣ阻害剤の前に投与される。同時投与でない場合の時間差は、２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間を超える可能性がある。他の実施形態では、第２の投与化合物が投与される前に、第１の投与化合物の効果が患者に現れる時間が与えられる。一般に、この時間差は、第１の投与化合物が患者内でその効果を完了する時間を超えて、または第１の投与化合物が完全にもしくは実質的に患者から排除されるか、または非活性となる時間を超えて延長されることはない。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンの一方または両方は、治療的有効量または治療的有効投与量で投与される。「治療的有効量」とは、単独で患者に投与されたとき、リンパ腫を効果的に治療するＨＤＡＣ６阻害剤（式ＩもしくはＩＩの化合物）またはベンダムスチンの量である。特定の対象にとって所与の事例で「治療的有効量」であると判明している量は、このような投与量が当技術分野の専門家によって「治療的有効量」であると見なされている場合であっても、考察中の疾患または病態を同様に治療された１００％の対象に対して有効ではない場合もある。治療的有効量に相当する化合物量は、癌の種類、癌のステージ、治療される患者の年齢、及びその他の実態に著しく左右される。一般に、これらの化合物の治療的有効量は、当技術分野において周知であり、例えば、先に引用した裏付けとなる参照文献に記載されている。
【００７３】
他の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンの一方または両方は、治療量以下の有効量または投与量で投与される。治療量以下の有効量は、単独で患者に投与されたとき、意図される標的の生物活性を経時的に完全に阻害しないＨＤＡＣ阻害剤（式ＩもしくはＩＩの化合物）またはベンダムスチンの量である。
【００７４】
治療量または治療量以下のいずれで投与されるかに関わらず、ＨＤＡＣ阻害剤とベンダムスチンとの組み合わせは、リンパ腫の治療に効果的である必要がある。例えば、式ＩまたはＩＩの化合物（ＨＤＡＣ阻害剤）と組み合わされたときに、該組み合わせがリンパ腫の治療に効果的であれば、治療量以下のベンダムスチンは有効量であり得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、化合物の組み合わせは、リンパ腫の治療で相乗効果（すなわち相加効果を上回る）を示す。用語「相乗効果」は、例えば、癌またはその症状の症候性の進行を遅延させる効果を生み出す２つの薬剤、例えばＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンなどの作用であって、投与されるそれぞれの薬物単独による効果の単純な加算より大きい作用を指す。相乗効果は、例えばシグモイド−Ｅｍａｘの計算式（Ｈｏｌｆｏｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．６：４２９−４５３（１９８１））、Ｌｏｅｗｅによる相加性の計算式（Ｌｏｅｗｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ，Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１４：３１３−３２６（１９２６））、及びｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ法の計算式（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４））などの好適な方法を使用して算出することができる。上記で参照した各計算式を実験データに適用して、対応するグラフを生成することにより、薬物組み合わせの効果を容易に評価することができる。上記で参照した計算式と関連するグラフは、それぞれ濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、及び組み合わせ指数曲線に対応する。
【００７６】
１種以上の成分間の相乗的相互作用を決定する際、治療を必要とする患者に種々のｗ／ｗ比の範囲及び用量にわたって成分を投与することにより、効果を得るための最適範囲及び効果を得るための各成分の絶対用量範囲を明確に測定できる。ヒトについては、患者に対する臨床試験の実施は複雑でコストがかかるため、この形態の試験を相乗作用の一次モデルとして使用することは実用的でない場合がある。しかしながら、ある特定の実験（例えば、実施例５を参照）での相乗作用の観察から、他の種における効果を予測することができ、存在する動物モデルを使用して相乗効果を更に定量化することができる。また、このような試験結果を利用して、有効用量比の範囲及び絶対用量ならびに血漿濃度を予測することもできる。
【００７７】
本明細書で提供される組み合わせの実施形態では、患者に投与されるＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩の、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩に対するモル比は、約１：１００〜約１：１である。例えば、モル比は約１：１００、約１：９５、約１：９０、約１：８５、約１：８０、約１：７５、約１：７０、約１：６５、約１：６０、約１：５５、約１：５０、約１：４５、約１：４０、約１：３５、約１：３０、約１：２５、約１：２０、約１：１５、約１：１０、約１：８、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２または１：１であり得る。ある特定の実施形態では、モル比は、約１：５０〜約１：２である。他の実施形態では、モル比は約１：２０〜約１：２である。更なる実施形態では、モル比は約１：１０〜約１：２である。更に他の実施形態では、モル比は約１：５である。
【００７８】
異なる実施形態では、使用される組み合わせ及び有効量に応じて、化合物の組み合わせが、癌の成長を阻害すること、癌の静止を達成すること、または実質的もしくは完全な癌の退縮を達成することすらできる。ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンの量は、リンパ腫の効果的な治療をもたらす必要があるが、その量は、組み合わせたときに患者に対して過剰に毒性ではないことが好ましい（すなわち、その量は、医学的ガイドラインに定められた毒性制限内であることが好ましい）。いくつかの実施形態では、過剰な毒性を防止するか、またはより有効なリンパ腫の治療を提供するために、投与される全投与量に制限が定められている。典型的には本明細書で検討する量は１日当たりであるが、半日及び２日または３日周期もまた、本明細書で検討する。毒性を伴わずに有効性をもたらす本発明の組み合わせの組み合わせパートナー（化合物ＡなどのＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩）の最適比、個々の投与量及び併用投与量ならびに濃度は、標的部位の治療薬利用能の動態に基づき、当業者に既知の方法を用いて決定する。
【００７９】
リンパ腫を治療するために、異なる投薬計画を使用することができる。いくつかの実施形態では、１日投与量、例えば上記の例示的な投与量のうちのいずれかを、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、１日１回、２回、３回、または４回投与する。癌のステージ及び重症度に応じて、高投与量による短期間の治療（例えば最大５日間）を用いても、低投与量による長期間の治療（例えば１０日以上、または数週、または１か月、またはそれ以上）を用いてもよい。いくつかの実施形態では、１日１回または１日２回の投与量を隔日で投与する。実施形態によっては、各投与量にＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンの両方を含有して、単一投与量として送達されるが、他の実施形態では、各投与量にＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンのいずれかを含有して、別々の投与量として送達される。
【００８０】
純粋な形態もしくは適切な医薬組成物の形態であるベンダムスチンならびに式Ｉ及びＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和形態を、当技術分野において既知である許容される投与様式もしくは薬剤のいずれかを介して投与することができる。本化合物は、例えば、経口的、経鼻的、非経口的（静脈内、筋肉内、もしくは皮下）、局所的、経皮的、膣内、膀胱内、大槽内、または直腸内に投与することができる。剤形は、例えば固体剤形、半固体剤形、凍結乾燥粉末剤形、または液体剤形、例えば錠剤、丸薬、軟弾性カプセル剤もしくは硬質ゼラチンカプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、坐剤、エアゾール等の、好ましくは正確な投与量の単純な投与に適した単位剤形であり得る。特に好ましい投与経路は経口であり、とりわけ治療すべき疾患の重症度に応じて、毎日の投薬計画を簡便に調節できるようなものである。
【００８１】
上述のように、医薬組み合わせのＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンは、単一の単位用量でも個別の剤形でも投与することができる。したがって、用語「医薬組み合わせ」は、単一剤形または個別の剤形のいずれかである２つの薬物の組み合わせを含む。すなわち、本出願全体を通じて記載される薬学的に許容される担体及び賦形剤は、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンと単一の単位用量に組み合わせることも、ならびにこれらの化合物が個別に投与されるとき、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチンと個別に組み合わせることもできる。
【００８２】
補助剤及びアジュバント剤には、例えば保存剤、湿潤剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味剤、着香剤、乳化剤、及び予製剤を含んでもよい。微生物作用の予防は、一般に、パラベン、クロロブタノール、フェノール、及びソルビン酸等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって提供される。糖及び塩化ナトリウム等の等張剤もまた、含まれていてよい。例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の使用によって、注射用医薬形態の長期にわたる吸収をもたらすことができる。また補助剤としては、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化ヒドロキシトルエン等の湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び抗酸化剤も挙げることができる。
【００８３】
固体剤形を、コーティング及びシェル、例えば腸溶コーティング及び当技術分野において周知のそれ以外のものとともに調製することができる。固体剤形に緩和剤（ｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有することができ、これは活性化合物または複数の化合物が腸管の特定の部分で遅延して放出されるような組成物であり得る。使用できる包埋組成物の例は、ポリマー材料及び蝋である。活性化合物はまた、適切な場合には、１つ以上の上述の賦形剤とともにマイクロカプセル化された形態であり得る。
【００８４】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤が挙げられる。このような剤形は、例えば、本明細書に記載されるＨＤＡＣ阻害剤もしくはベンダムスチン、またはその薬学的に許容される塩と、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、及びエタノール等の担体中の任意の薬学的アジュバント；可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、ならびにグリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物等とを溶解、分散させて、溶液または懸濁液を形成することなどによって調製される。
【００８５】
一般に、目的とする投与様式に応じて、薬学的に許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本明細書に記載される化合物またはその薬学的に許容される塩と、９９重量％〜１重量％の薬学的に許容される賦形剤とを含有する。一例では、組成物は、本明細書に記載される化合物またはその薬学的に許容される塩が約５重量％〜約７５重量％であり、残りは好適な薬学的賦形剤である。
【００８６】
このような剤形の実際の調製方法は当業者に既知であるか、明らかであるだろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）を参照のこと。
【００８７】
治療方法
本発明は、本発明の医薬組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法に関する。したがって、本明細書では、ＨＤＡＣ阻害剤またはベンダムスチンを含む治療的有効量の組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法を提供する。
【００８８】
本明細書で検討する対象は通常、ヒトである。しかしながら、対象は、治療が望ましい任意の哺乳動物であり得る。したがって、本明細書に記載される方法は、ヒト用途及び獣医学的用途の両方に適用することができる。
【００８９】
用語「治療すること」または「治療」は、本方法が少なくとも異常な細胞増殖を軽減させたことを示す。例えば、本方法は、患者のもつリンパ腫の成長速度を低下させること、またはリンパ腫の持続的な成長または拡散を防止すること、またはリンパ腫の及ぶ全体的な範囲を減少させることすらできる。本発明の意味の範囲内では、用語「治療する」はまた、発症（すなわち、疾患の臨床症状が現れる前の期間）の阻止、遅延、及び／または疾患の発現もしくは悪化のリスクの低減を指す。本明細書で使用される場合、用語「防止する」、「防止すること」または「防止」は、防止される状態、疾患または障害に伴う、またはそれを原因とする少なくとも１つの症状の防止を含む。
【００９０】
一実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。
【００９１】
更なる実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。
【００９２】
別の実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の化合物Ｂまたはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法である。
【００９３】
一実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。
【００９４】
更なる実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の化合物Ｃまたはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。
【００９５】
更なる実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の化合物Ｄまたはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩との組み合わせは、それを必要とする対象の治療において相乗効果を達成する。
【００９７】
更なる実施形態では、治療的有効量の併用療法（すなわち、ＨＤＡＣ阻害剤及びベンダムスチン）は、併用係数（ＣＩ）が１未満となる相乗比で、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩とを含む。
【００９８】
したがって、一実施形態では、それを必要とする対象でのリンパ腫の治療方法であって、治療的有効量の化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩、及び治療的有効量のベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含み、併用係数が１未満となる相乗比で、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩が投与される方法を本明細書で提供する。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤または薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のアポトーシスの誘導方法を含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスの誘導は、活性酸素種の増加を伴う。いくつかの実施形態では、アポトーシスは、カスパーゼ３、カスパーゼ９、カスパーゼ８及び／またはＰＡＲＰの活性化を伴う。
【０１００】
本発明の更に別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞の生存性を低減する方法を含む。
【０１０１】
本発明の尚も別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞のクローン原性生存率を低減する方法を含む。
【０１０２】
本発明の更なる実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞内の細胞増殖を抑制する方法を含む。
【０１０３】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞でのＢｃｌ−２の発現を低減する方法を含む。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、細胞周期タンパク質ｐ２１及びｐ２７の発現を増加させる方法、ならびに癌細胞の細胞周期タンパク質サイクリンＤの発現を減少させる方法を含む。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞でのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の脱リン酸化を誘導する方法を含む。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞での微小管の安定性を増強する方法を含む。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組み合わせを細胞に投与することを含む、癌細胞でのＩＬ−１０の発現を下方調節する方法を含む。
【０１０８】
別の態様では、それを必要とする対象での固形腫瘍の治療方法であって、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、及びベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩の治療的有効量の組み合わせを対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。一実施形態では、この腫瘍型は、ベンダムスチンを単剤として用いた治療に応答性である。このような腫瘍の非限定的な例としては、転移性乳癌、小細胞肺癌、難治性軟組織肉腫及び再発性または難治性生殖細胞癌が挙げられる。
【０１０９】
キット
他の実施形態では、キットが提供される。本発明によるキットは、本発明の化合物または組成物を含んでいるパッケージ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＡＣ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ベンダムスチンまたはその薬学的に許容される塩とを含む。
【０１１０】
語句「パッケージ」は、本明細書に提示される化合物または組成物を含んでいる、いずれの容器をも意味する。いくつかの実施形態では、パッケージは箱または包装であり得る。医薬製品の包装に使用されるパッケージ材料は、当業者に周知である。医薬パッケージ材料の例としては、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、注射器、瓶、ならびに選択された製剤と意図された投与及び治療様式とに適した任意のパッケージ材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
キットはまた、パッケージ中には含まれないが、パッケージの外側に結合される物品、例えばピペットを含むことができる。
【０１１２】
キットは更に、本発明の化合物または組成物を患者に投与するための説明書を含むことができる。キットはまた、米国食品医薬品局などの規制機関により承認された、本明細書の化合物の使用に関する説明書を含むことができる。キットはまた、化合物に応じたラベルまたは添付文書を含むことができる。パッケージ（複数可）及び／または任意の添付文書（複数可）は、それ自体が規制機関によって承認されていてもよい。キットは、パッケージ中に固相または液相（提供される緩衝液など）の化合物を含み得る。キットはまた、本方法を実行時に溶液を調製するための緩衝液、及び１つの容器から別の容器へと液体を移すためのピペットを含み得る。
【実施例】
【０１１３】
例示を目的として、本発明のある特定の具体的な実施形態について説明するため、以下に実施例を記載する。ただし、特許請求の範囲は、いかなる方法によっても本明細書に記載される実施例によって限定されるものではない。開示される実施形態に対する種々の変更及び改変は当業者にとって明白であり、そのような変更及び改変は、これに限定されないが、本発明の化学的構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関するものを含め、本発明の趣旨及び添付の特許請求の範囲から逸脱されることなく行うことができる。本明細書のスキーム中の構造における変数の定義は、本明細書に提示される式の対応する位置の定義と相応する。
【０１１４】
式Ｉの化合物の合成は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１９８２に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。式ＩＩの化合物の合成は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０７９１に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
実施例１：２−（ジフェニルアミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソへプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ａ）の合成
【化２２】
2017537164.tif 000023
【０１１６】
中間体２の合成：ＤＭＦ（１００ｍｌ）中で、アニリン（３．７ｇ、４０ｍｍｏｌ）、エチル２−クロロピリミジン−５−カルボキシレート１（７．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１１ｇ、８０ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、１２０℃、Ｎ２下で一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈した後、飽和ブライン（２００ｍｌｘ３）で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固して、シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）によって精製し、目的生成物を白色固体（６．２ｇ、６４％）として得た。
【０１１７】
中間体３の合成：ＴＥＯＳ（２００ｍｌ）中で、化合物２（６．２ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ヨードベンゼン（６．１２ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（９５５ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１６．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、窒素でパージした。得られた混合物を１４０℃で１４時間撹拌した。室温まで冷却した後、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）及び９５％ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）で希釈し、シリカゲル担持ＮＨ４Ｆ−Ｈ２Ｏ［５０ｇ、水（１５００ｍｌ）中のＮＨ４Ｆ（１００ｇ）をシリカゲル（５００ｇ、１００〜２００メッシュ）に添加して前処理した］を添加して、得られた混合物を室温で２時間保存し、凝固した材料を濾過してＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）によって残渣を精製して、黄色固体（３ｇ、３８％）を得た。
【０１１８】
中間体４の合成：２ＮのＮａＯＨ（２００ｍｌ）を、化合物３（３．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２００ｍｌ）溶液に添加した。混合物を６０℃で３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、溶液を２ＮのＨＣｌで中和させて白色沈殿物を得た。懸濁液をＥｔＯＡｃ（２ｘ２００ｍｌ）で抽出し、有機層を分離して、水（２ｘ１００ｍｌ）、ブライン（２ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。溶媒を除去して、褐色固体（２．５ｇ、９２％）を得た。
【０１１９】
中間体６の合成：化合物４（２．５ｇ、８．５８ｍｍｏｌ）、アミノヘプタノエート５（２．５２ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．９１ｇ、１０．３０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４．４３ｇ、３４．３２ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過した後、濾液を蒸発乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝２／１）によって残渣を精製し、褐色固体（２ｇ、５４％）を得た。
【０１２０】
２−（ジフェニルアミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソへプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（リコリノスタットすなわち化合物Ａ）の合成：ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）及びＤＣＭ（２５ｍｌ）中で、化合物６（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（２Ｎ、２０ｍＬ）の混合物を０℃で１０分間撹拌した。ヒドロキシルアミン（５０％）（１０ｍｌ）を０℃まで冷却し、混合物に添加した。得られた混合物を室温で２０分間撹拌した。溶媒を除去した後、混合物を１ＭのＨＣｌで中和させ、白色沈殿物を得た。粗生成物を濾過して、分取ＨＰＬＣで精製し、白色固体（９５０ｍｇ、４８％）を得た。
【０１２１】
実施例２：２−（（２−クロロフェニル）（フェニル）アミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソへプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｂ）の合成
【化２３】
2017537164.tif 000024
【０１２２】
中間体２の合成：実施例１の中間体２の合成を参照のこと。
【０１２３】
中間体３の合成：ＤＭＳＯ（６９０ｍｌ）中で、化合物２（６９．２ｇ、１当量）、１−クロロ−２−ヨードベンゼン（１３５．７ｇ、２当量）、Ｌｉ２ＣＯ３（４２．０４ｇ、２当量）、Ｋ２ＣＯ３（３９．３２ｇ、１当量）、Ｃｕ（１当量、４５μＭ）の混合物を脱気し、窒素でパージした。得られた混合物を１４０℃で撹拌した。反応物を後処理して、９３％の収率で化合物３を得た。
【０１２４】
中間体４の合成：実施例１の中間体４の合成を参照のこと。
【０１２５】
中間体６の合成：実施例１の中間体６の合成を参照のこと。
【０１２６】
２−（（２−クロロフェニル）（フェニル）アミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソへプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｂ）の合成：実施例１の化合物Ａの合成を参照のこと。
【０１２７】
実施例３：２−（（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｃ）の合成
【化２４】
2017537164.tif 000025
【０１２８】
１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリルの合成：２−（３−フルオロフェニル）アセトニトリル（１００ｇ、０．７４ｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１０００ｍｌ）溶液に、１，５−ジブロモペンタン（１７０ｇ、０．７４ｍｏｌ）を添加し、ＮａＨ（６５ｇ、２．２当量）を氷浴で滴加した。添加後、得られた混合物を５０℃で激しく一晩撹拌した。懸濁液を氷水で慎重にクエンチし、酢酸エチル（３＊５００ｍｌ）で抽出した。合一した有機溶液を濃縮して得た粗生成物をフラッシュカラムで精製して、１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリルを淡色固体（１００ｇ、６７％）として得た。
【０１２９】
１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミドの合成：１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリル（１００ｇ、０．４９ｍｏｌ）のＰＰＡ（５００ｍｌ）溶液を１１０℃で約５〜６時間加熱した。完了後、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で、ＰＨ＝８〜９まで慎重に塩基性にした。沈殿物を採取し、水（１０００ｍｌ）で洗浄して、１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミドを白色固体（９５ｇ、８７％）として得た。
【０１３０】
１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンアミンの合成：１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミド（９５ｇ、０．４３ｍｏｌ）のｎ−ＢｕＯＨ（８００ｍｌ）溶液に、ＮａＣｌＯ（２６０ｍｌ、１．４当量）を添加し、次いで３ＮのＮａＯＨ（４００ｍｌ、２．８当量）を０℃で添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。得られた混合物をＥＡ（２＊５００ｍｌ）で抽出し、合一した有機溶液をブラインで洗浄し、乾燥させて得た粗生成物を、更にＨＣｌ塩で処理して白色粉末（７２ｇ、７３％）に精製した。
【０１３１】
エチル２−（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシレートの合成：１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンアミン塩酸塩（２．２９ｇ、１０ｍｍｏｌ）のジオキサン（５０ｍｌ）溶液に、エチル２−クロロピリミジン−５−カルボキシレート（１．８７ｇ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５８ｇ、２．０当量）を添加した。混合物を１１０〜１２０℃で一晩加熱した。得られた混合物をシリカゲルカラムで直接精製し、結合した生成物を白色固体（１．３７ｇ、４０％）として得た。
【０１３２】
２−（（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｃ）の合成：エチル２−（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシレート（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍｌ、１：１）溶液に、水（２ｍｌ、過剰）中の５０％ＮＨ２ＯＨを添加し、次いでＭｅＯＨ（２ｍｌ、過剰）中の飽和ＮａＯＨを０℃で添加し、反応物を３〜４時間撹拌した。完了後、得られた混合物を濃縮し、２ＮのＨＣｌでＰＨ＝４〜５まで酸性にした。沈殿物を採取し、水（１０ｍｌ）で洗浄してＮＨ２ＯＨを除去し、乾燥させて２−（（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシピリミジン−５−カルボキサミドを白色粉末（７０ｍｇ、７３％）として得た。
【０１３３】
実施例４：Ｎ−ヒドロキシ−２−（（１−フェニルシクロプロピル）アミノ）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｄ）の合成
【化２５】
2017537164.tif 000026
【０１３４】
中間体２の合成：化合物１、ベンゾニトリル（２５０ｇ、１．０当量）、及びＴｉ（ＯｉＰｒ）４（１３３０ｍｌ、１．５当量）のＭＢＴＥ（３７５０ｍｌ）溶液を、窒素雰囲気下で約−１０〜−５℃まで冷却した。ＥｔＭｇＢｒ（１６１０ｍｌ、３．０Ｍ、２．３当量）を６０分かけて滴加し、その間、反応物の内部温度を５℃未満に維持した。反応混合物を１５〜２０℃まで１時間温めた。内部温度を１５℃未満に維持したまま、ＢＦ３−エーテル（１３００ｍｌ、２．０当量）を６０分かけて滴加した。反応混合物を１５〜２０℃で１〜２時間撹拌し、少量のベンゾニトリルが残った時点で停止した。内部温度を３０℃未満に維持したまま、１ＮのＨＣｌ（２５００ｍｌ）を滴加した。温度を依然３０℃未満に維持したまま、ＮａＯＨ（２０％、３０００ｍｌ）を滴加して、ｐＨを約９．０にした。反応混合物をＭＴＢＥ（３Ｌｘ２）及びＥｔＯＡｃ（３Ｌｘ２）で抽出し、合一した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、減圧下（４５℃未満）で濃縮し、赤色油を得た。ＭＴＢＥ（２５００ｍｌ）を油に添加して得た透明溶液に乾燥ＨＣｌガスをバブリングさせ、固体を沈殿させた。この固体を濾過して真空で乾燥させ、１４３ｇの化合物２を得た。
【０１３５】
中間体４の合成：化合物２（６２０ｇ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（１０８０ｇ、２．２当量をＮＭＰ（３１００ｍｌ）に溶解し、２０分間撹拌した。化合物３（６８０ｇ、１．０２当量）を添加し、反応混合物を約８５〜９５℃まで４時間加熱した。溶液を室温まで緩徐に冷却させた。この溶液をＨ２Ｏ（２０Ｌ）へ注ぎ入れ、しっかりと撹拌して溶液から多量の固体を析出させた。混合物を濾過し、５０℃、減圧下で２４時間、ケークを乾燥させ、８９６ｇの化合物４（固体、８６．８％）を得た。
【０１３６】
Ｎ−ヒドロキシ−２−（（１−フェニルシクロプロピル）アミノ）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｄ）の合成：ＭｅＯＨ（１０００ｍｌ）溶液を、撹拌しながら約０〜５℃まで冷却した。ＮＨ２ＯＨ  ＨＣｌ（１１０７ｇ、１０当量）を添加し、続いてＮａＯＣＨ３（１０００ｇ、１２．０当量）を慎重に添加した。得られた混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、濾過して固体を除去した。反応混合物に化合物４（４５０ｇ、１．０当量）を一度に添加し、化合物４が消費されるまで１０℃で２時間撹拌した。ＨＣｌ（６Ｎ）を添加することによって反応混合物を約８．５〜９のｐＨに調節し、沈殿を生じさせた。混合物を減圧下で濃縮した。激しく撹拌しながら残渣に水（３０００ｍｌ）を添加し、濾過により沈殿物を採取した。生成物を４５℃のオーブン内で一晩乾燥させた（３４０ｇ、収率７９％）。
【０１３７】
実施例５：リンパ腫細胞株における、ベンダムスチンと併用されたＨＤＡＣ６阻害剤リコリノスタット（化合物Ａ）の前臨床スクリーニング
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、リンパ性悪性腫瘍のための画期的な新しい治療的オプションとして注目されている。リコリノスタット（化合物Ａ）は、新規の選択的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）阻害剤である。ＨＤＡＣ６は、環境ストレスに対する細胞応答に重要な役割を果たすクラスＩＩＢヒストン脱アセチル化酵素である。
【０１３８】
この試験の目的は、リンパ腫細胞株において、ＨＤＡＣ６阻害剤リコリノスタット単独の前臨床活性、及びリコリノスタットのベンダムスチン（アルキル化剤）との併用可能性を評価することである。
【０１３９】
本試験では、以下の方法を使用した。リコリノスタットの抗腫瘍活性を次の６種のリンパ腫細胞株からなるパネルを使用して調べた：２種の濾胞性リンパ腫（ＦＬ）（ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＲＬ）細胞株、２種のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）（Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｊｅｋｏ−１）細胞株、及び２種のＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（ＨＵＴ−７８−皮膚Ｔ細胞リンパ腫及びＫａｒｐａｓ−２９９−未分化リンパ腫細胞）細胞株。各薬物のＩＣ５０値は、２４、４８及び７２時間後のリコリノスタット濃度（０．０１〜１００μＭ）及びベンダムスチン濃度（２５〜３００μＭ）に基づいた曲線から算出した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキットを使用して細胞増殖を測定し、ＭＴＴアッセイによって細胞毒性を測定した。Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法に基づくアイソボログラム分析によって、薬物間の相互作用を評価し、この組み合わせが相加的であったか相乗的であったかを判定した。クローン原性生存率は、メチルセルロースによるクローン原性アッセイによって試験した。アポトーシス、活性酸素種（ＲＯＳ）、細胞周期分析及びＢｃｌ−２タンパク質発現は、フローサイトメトリーによって測定した。カスパーゼ活性化及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１４０】
Ｉ．リコリノスタットはリンパ腫細胞の生存性を阻害した：
リコリノスタットの抗腫瘍活性を次の６種のリンパ腫細胞株からなるパネルを使用して調べた：２種の濾胞性リンパ腫（ＦＬ）（ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＲＬ）細胞株、２種のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）（Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｊｅｋｏ−１）細胞株、及び２種のＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（ＨＵＴ−７８−皮膚Ｔ細胞リンパ腫及びＫａｒｐａｓ−２９９−未分化リンパ腫細胞）細胞株。考察したすべての細胞株でＨＤＡＣ６タンパク質が発現した（図１Ａ）。リコリノスタットを種々の濃度（０．０１、０．１、１、５及び１０μＭ）で各細胞株に投与し、２４、４８及び７２時間の時点で細胞生存性を測定した。図１Ｂは、２種の濾胞性リンパ腫細胞株、２種のマントル細胞リンパ腫細胞株及び２種のＴ細胞リンパ腫細胞株での結果を示す。表１に示すように、２４時間及び４８時間時点の各細胞株でのリコリノスタットのＩＣ５０及びＣＩ９５％を測定した。
【０１４１】
【表１】
2017537164.tif 000027
【０１４２】
リコリノスタットは、１．５１〜６４μＭの範囲のＩＣ５０値で、時間−用量依存的に細胞生存性を阻害した。パネルに提示された６種のリンパ腫細胞株のうち５種で、４８時間の処理後、有意な細胞毒性効果が観察された。最も感受性が高い細胞株はＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８であり（ＩＣ５０：１．９７μＭ〜１．５１μＭ）、また感受性が低い細胞株はマントル細胞リンパ腫細胞株Ｇｒａｎｔａ−５１９（ＩＣ５０：２０〜６４μＭ）であった（図１Ｂ及び表１）。
【０１４３】
ＩＩ．ベンダムスチンの成長阻害：
ベンダムスチンの抗腫瘍活性を次の３種のリンパ腫細胞株のパネルを使用して調べた：濾胞性リンパ腫（ＦＬ）（ＷＳＵ−ＮＨＬ）細胞株、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）（Ｊｅｋｏ−１）細胞株、及びＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（ＨＵＴ−７８−皮膚Ｔ細胞リンパ腫）細胞株。ベンダムスチンを種々の濃度（２５、５０、１００、２００、及び３００μＭ）で各細胞株に投与し、２４及び４８時間の時点で細胞生存性を測定した。図１Ｃは、種々の濃度のベンダムスチン（２５、５０、１００、２００及び３００μＭ）の投与から２４時間後のＷＳＵ−ＮＨＬ、ＨＵＴ−７８及びＪＥＫＯ−１細胞それぞれの細胞生存性を示す。表２に示すように、２４時間時点の各細胞株でのベンダムスチンのＩＣ５０を測定した。
【表２】
2017537164.tif 000028
【０１４４】
図１Ｃ及び表２の結果は、ベンダムスチン（２５〜３００μＭ）が単独で、リンパ腫細胞株において細胞生存性の時間依存的かつ用量依存的阻害を誘導したことを示す。
【０１４５】
ＩＩＩ．リコリノスタット／ベンダムスチンは細胞生存性を相乗的に阻害した。
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法に基づくアイソボログラム分析によって、薬物（リコリノスタット及びベンダムスチン）間の相互作用を評価し、この組み合わせが相加的であったか相乗的であったかを判定した。パネルのうち最も感受性が高い３種のリンパ腫細胞株（ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｈｕｔ−７８及びＪｅｋｏ−１）を、漸増濃度のリコリノスタット（０、２、２．５、４、５、８、１０μＭ）とベンダムスチン（０、１０、２０、２５、４０、５０、１００μＭ）の組み合わせを用いて処理した。この薬物組み合わせは、試験したすべての細胞株で有意な強い細胞毒性効果を誘導した。各細胞株に対する薬物の効果を決定し、併用係数（ＣＩ）を測定した。ＣＩ＜１は相乗作用を意味し、ＣＩ＝１は相加効果を意味し、ＣＩ＞１は拮抗作用を意味する。リコリノスタット（２、４、８μＭ）及びベンダムスチン（１０、２０、４０μＭ）は、ＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８細胞それぞれにおいて、０．０２７〜０．５５３の範囲の併用係数（ＣＩ）を有する相乗的相互作用を示した。リコリノスタット（５、１０μＭ）とベンダムスチン（５０、１００μＭ）の組み合わせは、Ｊｅｋｏ−１細胞において０．０２及び０．０４のＣＩを示した（図２Ａ及び図２Ｂ、表３）。正常なＰＢＭＮＣにおいて、細胞生存性の妨害は観察されなかった（図２Ｃ）。２４時間の時点で、用量４μＭのリコリノスタット及び２０μＭのベンダムスチンでは、ＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８細胞において相乗効果（ＣＩ＜１）が観察され、また５μＭのリコリノスタット及び５０μＭのベンダムスチンでは、Ｊｅｋｏ−１において相乗効果が観察された。
【０１４６】
重要な点として、薬物組み合わせは、正常な末梢血単核球細胞の生存性において、関連する減少を誘導しなかった（図２Ｃ）。
【表３】
2017537164.tif 000029
【０１４７】
ＩＶ．リコリノスタットは単独及び併用によりクローン原性生存率を低減し、ＢＭ−ＭＳＣの保護効果を克服する。
リコリノスタットは、単剤として用量依存的にクローン原性生存率を低減した（図２Ｄ）。リコリノスタット／ベンダムスチンは、単剤と比較してコロニー形成の有意な阻害を誘導した（図２Ｅ）。薬物組み合わせはＢＭ−ＭＳＣとともに共培養されたリンパ腫細胞の細胞生存性を低減させた。これは、この組み合わせが骨髄微小環境の与える抗アポトーシス効果を克服し、ＢＭＳＣに対する細胞毒性効果をほとんど有しないか、全く有しなかったことを示している（図３Ａ）。
【０１４８】
Ｖ．リコリノスタット／ベンダムスチンは、調節性タンパク質ｐ２１及びｐ２７を介して細胞周期に影響を及ぼした。
リコリノスタットは、試験した細胞株すべてにおいて、無処理対照と比較して、Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期である細胞比の増加を誘導し、Ｇ２／Ｍ期の細胞周期である細胞比の減少を誘導した。また薬物組み合わせは、Ｇ０／Ｇ１期及びＳ期の細胞比を減少させ、「ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１」ピークの増加を生じさせた（図３Ｂ及び図３Ｃ）。薬物組み合わせによる２４時間の処理が、リンパ腫細胞におけるサイクリンＤ１及びサイクリンＥの減少を引き起こし、ｐ２１タンパク質及びｐ２７のレベルを増加させた（図４）ことから、細胞周期に対する観察が確認された。
【０１４９】
ＶＩ．薬物組み合わせは、ＲＯＳの生成によりアポトーシスを誘導し、ＥＲストレスを活性化した。
フローサイトメトリーによって測定したところ、リコリノスタット（１〜１０μＭ）は、考察した細胞株すべてにおいて時間依存的かつ用量依存的にアポトーシスを誘導した（図５Ａ及び図５Ｂ）。図５Ａでは、指定した濃度のリコリノスタット、ベンダムスチン、またはリコリノスタット及びベンダムスチンのいずれかでＷＳＵ−ＮＨＬ細胞を処理した。２４時間後、細胞を固定し、ヨウ化プロピジウムで染色して、フローサイトメトリーによって分析した。図５Ｂは、指定した濃度のリコリノスタット（Ｒ）、ベンダムスチン（Ｂ）、またはリコリノスタット（Ｒ）及びベンダムスチン（Ｂ）のうち、いずれかの投与後２４時間の、ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＨＵＴ−７８及びＪｅｋｏ−１細胞株それぞれにおけるアポトーシス率を示している。図５Ａ〜Ｅの結果は、リコリノスタットをベンダムスチンと組み合わせると、２４時間でアポトーシスを誘導したことを示している。この効果は、ベンダムスチンとの組み合わせによって増強された（図５Ｃ及び図５Ｄ）。
【０１５０】
リコリノスタット単独（１、５、１０μＭ）で、２４時間でＲＯＳ生成の増加を誘導し、４８時間後には更に増加した（図５Ｅ）。リコリノスタット／ベンダムスチンは、単剤と比較して、ＲＯＳ陽性細胞の有意な増加を誘導し、ＲＯＳスカベンジャーである抗酸化剤ＮＡＣの共投与はＲＯＳの生成を減少させた（図６Ａ及び図６Ｂ）。薬物組み合わせによって誘導されたＲＯＳの生成は、チオレドキシン−１（Ｔｒｘ１）発現の減少と関係していた（図６Ｃ）。ＥＲストレスの顕著な特徴であるタンパク質の発現レベル、例えばＢＩＰ及びＣＨＯＰに生じ得る変化、ならびにＩＲＥ１、ＡＴＦ６及びＰＥＲＫを含むＵＰＲセンサーの発現を分析した。図６Ｄに示すように、リコリノスタット／ベンダムスチンの併用処理ではＥＲストレス及びＵＰＲセンサーが増加した。
【０１５１】
ＶＩＩ．Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質及びカスパーゼ経路は、リコリノスタット／ベンダムスチンの組み合わせによる影響を受ける。
薬物組み合わせは、Ｂｃｌ−２の発現（図７Ａ）及び抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１の発現（図７Ｂ）を減少させた。また、Ｂｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバー、Ｂａｘ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｂａｄ１１２及びＢａｄ１３６のレベルを上昇させた（図７Ｂ）。薬物組み合わせは、分析した３種すべての細胞株において、ＰＡＲＰ切断ならびにカスパーゼ−８、−９及び−３の活性化を誘導した（図７Ｃ）。ＰＡＲＰ切断はＺＶＡＤ−ｆｍｋの添加により完全に停止し、リコリノスタット／ベンダムスチンがカスパーゼ経路の活性化によりアポトーシスを誘導したことが確認された（図７Ｃ）。
【０１５２】
ＶＩＩＩ．リコリノスタット／ベンダムスチンの同時投与は、ＡＫＴ経路を不活化させる。
リコリノスタット及びベンダムスチンを用いたリンパ腫細胞の併用処理は、ｐ−ＡＫＴ及び複数の下流標的の下方調節を誘導した（図８Ａ）。
【０１５３】
ＩＸ．リコリノスタットの単独及び併用による、α−チューブリンのＨＤＡＣ６アセチル化に対する効果。
リコリノスタットの投与は、ＨＤＡＣ６発現を低減し、リンパ腫細胞におけるα−チューブリンのアセチル化レベルを誘導した。その程度はベンダムスチンによって更に変化することはなかった（図８Ｂ）。
【０１５４】
Ｘ．リコリノスタットは単独でも組み合わせでも微小管を安定化させる。
アセチル化されたα−チューブリンの蓄積は、有糸分裂期に染色体の配置を乱し、アポトーシスをもたらし得る微小管不安定化に対する耐性の増加と関係していた。リコリノスタットを単独で、及びベンダムスチンと組み合わせて、微小管不安定化剤ノコダゾール（１μＭ）及び微小管安定化剤パクリタキセル（１００ｎＭ）とともに、リンパ腫細胞を２４時間処理した。続いて、アルファ−チューブリン染色を用いたチューブリン重合の全細胞ベースの定量的測定を行った。リコリノスタットは単独で、蛍光強度の増加によって示されるチューブリン重合を誘導した。この効果は、ベンダムスチンの添加によって更に増強された（図９Ａ）。
【０１５５】
ＸＩ．リコリノスタットは単独でも組み合わせでもＩＬ−１０発現を下方調節した。
ＩＬ−１０は、免疫及び耐性に重要な役割を果たす多機能サイトカインである。リコリノスタット／ベンダムスチンは、いずれかの化合物単独（図９Ｂ）と比較して、このサイトカインのレベルを低下させた。これは、併用処理の方が微小環境での免疫抑制を低下させることを意味している。
【０１５６】
ＸＩＩ．まとめ
主要な結果を以下に要約する。化合物Ａによる２４〜７２時間のリンパ腫細胞株の処理は、０．１７〜８．６５μｍｏｌ／Ｌの範囲のＩＣ５０値で、細胞成長の時間依存的かつ用量依存的阻害をもたらした。４８時間のリコリノスタットのインキュベート後、ＭＴＴアッセイにより有意な細胞毒性効果が明らかであった。最も感受性が高い細胞株はＷＳＵ−ＮＨＬ及びＨｕｔ−７８（ＩＣ５０：１．９７〜１．５μｍｏｌ／Ｌ）であり、最も感受性の低い細胞株はＧｒａｎｔａ−５１９であった（ＩＣ５０：２０μｍｏｌ／Ｌ）。リコリノスタットは単独で、時間依存的かつ用量依存的なアポトーシスの増加を誘導した。１〜２０μｍｏｌ／Ｌの範囲の用量を用いた４８時間の処理後、初期アポトーシスと後期アポトーシスとのアポトーシス細胞比は、１１％から５６％に増加し、無処理対照と比較して、細胞周期のＧ０／Ｇ１期の細胞比の増加を誘導した。異なる濃度のリコリノスタット（０、２、４及び８μｍｏｌ／Ｌ）をベンダムスチン（０、１０、２０、４０、５０及び１００μｍｏｌ／Ｌ）と組み合わせて処理したＷＳＵ−ＮＨＬ、ＨＵＴ−７８及びＧＲＡＮＴＡ−５１９細胞を使用して相乗性分析を行い、２４時間及び４８時間時点でＭＴＴによりリンパ腫細胞を分析した。それぞれのＩＣ５０値よりも低い、低濃度の２種の薬物を使用してから２４時間後に、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法により確認される明確な相乗的相互作用が観察された。リコリノスタット（４及び８μｍｏｌ／Ｌ）とベンダムスチン（２０及び４０μｍｏｌ／Ｌ）とは、Ｈｕｔ−７８及びＷＳＵ−ＮＨＬ細胞において、０．１３〜０．３４の範囲のＣＩ（併用係数）値を有する相乗的相互作用を示した。リコリノスタット（２０及び４０μｍｏｌ／Ｌ）とベンダムスチン（５０及び１００μｍｏｌ／Ｌ）によるＧＲＡＮＴＡ−５１９細胞の処理は、それぞれ０．２６及び０．２１のＣＩ値を示した。薬物組み合わせは、アネキシンＶ／ＰＩ染色により評価されるようにアポトーシスを増強した。２４時間後のアポトーシス率は、５５〜８０％の範囲であった。更に、リコリノスタットとベンダムスチンは、Ｇ０／Ｇ１期及びＳ期の細胞比を低下させ、「ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１」ピークの増加を引き起こした。最後に、リコリノスタットとベンダムスチンとの組み合わせは、正常な末梢血単核球細胞（ＰＢＭＮＣ）の生存性に関連する減少を誘導しなかった。
【０１５７】
結論として、以上の前臨床結果は、リコリノスタットをベンダムスチンと組み合わせることで、リンパ腫細胞株において顕著な活性を有し得ることを示す。
【０１５８】
参照による組み込み
本出願全体を通して引用される、すべての参考文献（引用文献、発行特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語には、当業者に共通して理解されるものと同じ意味が付与される。
【０１５９】
等価物
当業者は、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解するか、または通常の実験のみを使用して確認することが可能である。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１Ａ】
2017537164.tif 000042
【図１Ｂ】
2017537164.tif 000043
【図１Ｃ】
2017537164.tif 000044
【図２Ａ】
2017537164.tif 000045
【図２Ｂ】
2017537164.tif 000046
【図２Ｃ】
2017537164.tif 000047
【図２Ｄ】
2017537164.tif 000048
【図２Ｅ】
2017537164.tif 000049
【図３Ａ】
2017537164.tif 000050
【図３Ｂ】
2017537164.tif 000051
【図３Ｃ】
2017537164.tif 000052
【図４】
2017537164.tif 000053
【図５Ａ】
2017537164.tif 000054
【図５Ｂ】
2017537164.tif 000055
【図５Ｃ】
2017537164.tif 000056
【図５Ｄ】
2017537164.tif 000057
【図５Ｅ】
2017537164.tif 000058
【図６Ａ】
2017537164.tif 000059
【図６Ｂ】
2017537164.tif 000060
【図６Ｃ】
2017537164.tif 000061
【図６Ｄ】
2017537164.tif 000062
【図７Ａ】
2017537164.tif 000063
【図７Ｂ】
2017537164.tif 000064
【図７Ｃ】
2017537164.tif 000065
【図８Ａ】
2017537164.tif 000066
【図８Ｂ】
2017537164.tif 000067
【図９Ａ】
2017537164.tif 000068
【図９Ｂ】
2017537164.tif 000069
【国際調査報告】
2017537164.tif 000070
2017537164.tif 000071
2017537164.tif 000072