(57)【要約】  細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）を活性成分として含有する組成物、該組成物を用いるスタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療方法、および該組成物にて活性成分として使用され得る可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの調製方法が提供される。本発明の組成物は、抗原−抗体反応に起因するオプソニン貪食作用、および感染の初期段階でのＴ細胞の活性化に起因する好中球介在性食作用により、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療に効果的に使用され得る。
2017518373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）を活性成分として含む、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療用組成物。
【請求項２】
ＷＴＡ−ＰＧＮが、下記の一般式１：
【化１】
2017518373.tif 000008
［式中、ｎは１０〜５０の整数であり；ｍは１〜３の整数であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３は、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；およびＲ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である］
で示される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＡとＢが相互にβ位で結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｎが３５〜４５の整数であり；ｍが３であり；ＡがＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢがＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰが、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３が、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであって；Ｒ４がヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ｎが４０であり；ｍが３であり；ＡがＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢがＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰが、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、テトラペプチドであり；Ｒ３がヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであって；Ｒ４がヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
テトラペプチドがＡ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４であって、ここでＡ１がＡｌａまたはＧｌｙであり、Ａ２がＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ａ３がＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであって、Ａ４がＡｌａまたはＧｌｙである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
テトラペプチドが−（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ａｌａ）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
スタフィロコッカス・アウレウスが、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）または病原性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
スタフィロコッカス・アウレウス感染病が、軟部組織感染症、化膿性関節炎、化膿性骨髄炎、中耳炎、肺炎、肺血症、急性呼吸器感染症、カテーテル関連感染症、術後感染症、菌血症、心内膜炎および食中毒からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
一の対象でのスタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療方法であって、その必要とする対象に請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
オプソニン貪食作用および食作用を同時に誘発する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物を対象に投与した後の２４時間以内に、該対象においてγδ−Ｔ細胞の数、ＩＬ−１７Ａの産生量およびＩＬ−１βの産生量を増大させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
組成物を投与した１２時間後に、対象においてＩＬ−１０の産生量を増大させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
可溶性細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）の調製方法であって、
（１）リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）およびＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子が野生型スタフィロコッカス・アウレウスから欠失されている二重変異菌株を得る工程；
（２）二重変異の菌株を破壊し、その破壊した菌株から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程；
（３）不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理する工程；
（４）工程（３）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションを得る工程；
（５）可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションをリゾチームまたはムタノリシンで処理する工程；および
（６）工程（５）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程
を含む、方法。
【請求項１５】
可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを精製する工程を工程（６）の後にさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）感染病を予防または治療するための組成物、より具体的には活性成分として細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（以下、ＷＴＡ−ＰＧＮという）を含む組成物に、該組成物を用いるスタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療方法に、およびその組成物の活性成分として使用され得る可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スタフィロコッカス・アウレウスは、ヒトの皮膚、軟組織および血流にて重度の感染症を惹起し得る（Lowy FD, The New England journal of medicine, 339: 520-532, 1998）。さらには、スタフィロコッカス・アウレウスは、メチシリン、β−ラクタム系抗生物質に対して耐性であるメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）菌株に修飾され得る。かかるＭＲＳＡ感染症は治療が困難であり、予後不良であって、そのために大きな社会問題となる。特に、市中感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）は、入院していない子供等が発症し、従来の院内感染型ＭＲＳＡ（ＨＡ−ＭＲＳＡ）と相まってその治療を困難なものとする。近年、米国で広まったＵＳＡ３００のＭＲＳＡ菌株は子供または免疫不全の人々において重篤な疾患を誘発し、かくしてＭＲＳＡ感染症に対して予防または治療効果のある新規なワクチンの開発が必要とされる。
【０００３】
外国人研究者により開発されたスタフィロコッカス・アウレウスに対するワクチン候補は臨床試験にて予後は良好であったが、それらはすべて臨床試験をパスできず、よってスタフィロコッカス・アウレウスに対して臨床的に効果的なワクチンはこれまで開発されていない。
【０００４】
最近の研究は、体液性免疫と細胞性免疫の両方がスタフィロコッカス・アウレウスのワクチンとして機能するのに不可欠であり、ここで体液性免疫は特定のワクチン候補物質に特異的な血清抗体を産生することによりオプソニン貪食作用を促進し、細胞性免疫は好中球を動員し、ＭＲＳＡ感染症の初期段階でＴ細胞媒介のＩＬ−１７Ａを産生することによって食作用を促進するものであり、そしてＴ細胞の活性化による食細胞のエフェクター機能の促進がスタフィロコッカス・アウレウスの感染からの保護を提供し得ることを示唆した。さらには、外国人研究者はスタフィロコッカス・アウレウス感染がマウス実験にてメモリーγδ−Ｔ細胞の数を増やすことができ、それによりその感染に拮抗する保護作用が示されることを報告した（J.Immunol., 192 (8）：3697-3708, 2014）。この結果は、スタフィロコッカス・アウレウスへの暴露が、αβ−Ｔ細胞と同様の様式で、γδ−Ｔ細胞の記憶応答を誘発し、ＩＬ−１７Ａを産生するメモリーγδ−Ｔ細胞の誘発がスタフィロコッカス・アウレウスに拮抗する強い宿主保護作用を示し得ることを示唆する。しかしながら、これまで、スタフィロコッカス・アウレウスのどの物質がかかる保護作用を示すのかについては分かっていなかった。
【０００５】
グラム陰性菌と異なり、スタフィロコッカス・アウレウスなどのグラム陽性菌の細胞壁は、主に、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、細胞壁タイコ酸（ＷＴＡ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）および莢膜多糖類（ＣＰ）を含む、４種の成分からなる。
【０００６】
宿主の生体防御タンパク質により侵入病原体を迅速に認識すること、および補体系などの先天性免疫を選択的に免疫化することによって病原体を速やかに除去することは極めて重要な反応である。しかし、宿主においてインビボ防御タンパク質により認識される細菌のリガンド物質は明確には同定されておらず、そのために病原体により惹起される感染病を保護および治療には困難がある。
【０００７】
特に、スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁成分である、ＷＴＡ、ＬＴＡ、ＰＧＮ、ＣＰなどのリガンドは、ほとんどが、複雑な構造を有する糖重合体であり、他の物質と一緒に精製され、そのために単一の材料として単離／精製するのは困難である。さらには、細胞壁の種々の成分は外部に曝されるため、成分のうちのいずれの成分が宿主のインビボ防御タンパク質のリガンドとして作用する可能性があるかを同定するのは容易ではない。
【０００８】
本発明の発明者らは、ＷＴＡ−ＰＧＮをスタフィロコッカス・アウレウスの特定の変異菌株から単離し、そのＷＴＡ−ＰＧＮがスタフィロコッカス・アウレウス感染に拮抗して初期のインビボ免疫応答の誘発能を有する宿主のインビボ防御タンパク質のリガンドとして機能し、かくしてスタフィロコッカス・アウレウス感染症の予防および治療にて効果的であり得ることを確かめた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的はスタフィロコッカス・アウレウス感染病を予防または治療するための組成物を提供することである。
【００１０】
スタフィロコッカス・アウレウス感染病を該組成物を用いて予防または治療する方法を提供することが本発明のもう一つ別の目的である。
【００１１】
組成物の活性成分として用いることのできる可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの製造方法を提供することも本発明のさらにもう一つ別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＷＴＡ−ＰＧＮを活性成分として含む、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療方法であって、その予防または治療を必要とする対象に上記の組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
さらには、本発明は、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの調製方法であって、
（１）リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）遺伝子およびＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子が野生型スタフィロコッカス・アウレウスから欠失されている二重変異の菌株を得る工程；
（２）二重変異の菌株を破壊し、その破壊した菌株から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程；
（３）不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理する工程；
（４）工程（３）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションを得る工程；
（５）可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションをリゾチームまたはムタノリシンで処理する工程；および
（６）工程（５）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の上記の目的および特徴は、本発明の以下の記載から、下記に示される個々の添付図面と併せて考慮した場合にさらに明らかになるであろう。
【００１６】
【図１】スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁の構造を示す模式図である。
【００１７】
【図２】ＲＮ４２２０Δｌｇｔ／Δｏａｔ変異の菌株から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮ、可溶性ＷＴＡ、および可溶性ＰＧＮを個々に得る方法を示すフローチャートである。
【００１８】
【図３】不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理した後にハイトラップ（HiTrap）−Ｑカラムで分離された不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（Ａ）および溶出フラクションのゲル移動度（Ｂ）；ならびにβ−溶菌酵素で処理したＷＴＡ−ＰＧＮをリゾチームで処理した後にハイトラップ−Ｑカラムにより分離されたＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（Ｃ）およびゲル移動度（Ｄ）を示す。
【００１９】
【図４】セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００ＨＲカラムで分離されたＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（Ａ）およびゲル移動度（Ｂ）；ならびにＷＴＡ−ＰＧＮをマウスに腹腔内注射した際のＩＬ−１７Ａの産生量を定量した結果（Ｃ）を示す。
【００２０】
【図５】第１逆相カラムで分離されるＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（５Ａ）およびゲル移動度（５Ｂ）；第２逆相カラムで分離されるＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（５Ｃ）およびゲル移動度（５Ｄ）；ならびにＷＴＡ−ＰＧＮをマウスに腹腔内注射した際に誘発されるＩＬ−１７Ａの産生量を定量した結果（５Ｅ）を示す。
【００２１】
【図６】不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理した後にハイトラップ−Ｑカラムで分離されたＷＴＡ−ＰＧＮの溶出パターン（Ａ）およびゲル移動度（Ｂ）を示す。
【００２２】
【図７】ハイトラップ−Ｑカラムで分離された可溶性ＰＧＮの溶出パターンを示す。
【００２３】
【図８】トヨパール（Toyopearl）ＨＷ５５Ｓカラムにより分離された可溶性ＰＧＮの溶出パターンを示す。
【００２４】
【図９】ＷＴＡ−ＰＧＮおよびＷＴＡの各々の、２７％ＰＡＧＥおよび硝酸銀染色（Ａ）、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｂ）、およびホスファートおよびＧｌｃＮＡｃの残存量（Ｃ）を示す。
【００２５】
【図１０】γδ  Ｔ細胞誘発の初期免疫応答（細胞性免疫）および記憶免疫応答を観察するために、ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮで３回腹腔内免疫付与に供し、そしてＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）感染に付すタイム・スケジュールを示す。
【００２６】
【図１１】ＰＢＳ、ＷＴＡ−ＰＧＮ、およびＷＴＡとＰＧＮの混合物の各々を、様々な濃度および時間で、腹腔内注射することで誘発されるマウス内でのＩＬ−１７Ａ（１１Ａ）およびＩＬ−１β（１１Ｂ）の産生を示す。
【００２７】
【図１２】ＷＴＡ−ＰＧＮを注射した後のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の経時的な産生を示す。
【００２８】
【図１３】ＰＢＳおよびＷＴＡ−ＰＧＮの注射後にフローサイトメトリー分析によって解析されるＩＬ−１７Ａの産生能を有するγδ  Ｔ細胞の分布割合を示す。
【００２９】
【図１４】ＰＢＳおよびＷＴＡ−ＰＧＮの注射後にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が介在するＩＬ−１７Ａの産生を示す。
【００３０】
【図１５】ＰＢＳ、ＷＴＡ−ＰＧＮ、およびＷＴＡとＰＧＮの混合物で処理した野生型およびＶγ２／４−／−マウスにおけるＩＬ−１７Ａ産生（１５Ａ）およびＩＬ−１β産生（１５Ｂ）を示す。
【００３１】
【図１６】ＰＢＳ、ＷＴＡ、ＰＧＮ、およびＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した各マウスにおいて、ＵＳＡ３００菌株を感染させることで誘発されるＩＬ−１７Ａ（１６Ａ）、ＩＬ−１β（１６Ｂ）、ＩＬ−２３（１６Ｃ）、ＩＦＮγ（１６Ｄ）およびＩＬ−１０（１６Ｅ）の産生を示す。
【００３２】
【図１７】ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスのγδ  Ｔ細胞でのＣＤ４４およびＣＤ２７、記憶γδ  Ｔ細胞マーカーの発現（１７Ａ）；およびこれらの記憶γδ  Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａの発現レベル（１７Ｂ）を示す。
【００３３】
【図１８】ＰＢＳ、ＷＴＡ−ＰＧＮ、ＰＧＮおよびＷＴＡで予め処理した各マウスにおける記憶γδ  Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａの発現であって、ＦＡＣＳにより測定される細胞内ＩＬ−１７Ａの産生量（１８Ａ）およびＥＬＩＳＡにより測定される細胞外ＩＬ−１７Ａの産生量（Ｂ）を示す。
【００３４】
【図１９】ＷＴＡで予め処理した後のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびγδ  Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａの発現を示す。
【００３５】
【図２０】記憶γδ  Ｔ細胞を産生する時点でのγδ  ＴＣＲの部分集合の集団の分化結果を示す。
【００３６】
【図２１】ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスの、およびＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理されていないマウスの樹状細胞でのＩＬ−２３発現を示す。
【００３７】
【図２２】ＰＢＳ、ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した後にＵＳＡ３００菌株に感染したマウスの臓器形状および腹膜内での膿瘍形成の画像を示す。
【００３８】
【図２３】ＵＳＡ３００感染の後に、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供することで記憶γδ  Ｔ細胞が誘発された、マウスの生存を示す。
【００３９】
【図２４】ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供した後にメチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）（エス・アウレウス（S.aureus）ＮＲＳ１８４菌株）に感染したマウスでの膿瘍の形状（２４Ａ）および体積（２４Ｂ）を示す。
【００４０】
【図２５】ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供した後にＭＲＳＡに感染したＮＺＷウサギでの皮膚膿瘍の形成の有無（２５Ａ）、真皮壊死（dermonecrosis）の面積、および膿瘍の体積（２５Ｃ）を示す。
【００４１】
【図２６】ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供した後のＮＺＷウサギ（Ａ）およびモルモット（Ｂ）での皮膚膿瘍の形成の有無、真皮壊死の面積、および膿瘍の体積を示す。
【００４２】
【図２７】ＭＲＳＡ感染の後にＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供したモルモットの腹膜での膿瘍および溶血の画像を示す。
【００４３】
【図２８】ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供した各々の野生型マウス、ＴＬＲ−９遺伝子欠損のマウス、およびカスパーゼ（Caspase）−１遺伝子欠損のマウスでのＩＬ−１７Ａ（２８Ａ）およびＩＬ−１β（２８Ｂ）の産生を示す。
【００４４】
【図２９】ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した後に得られるマウスのマクロファージ、樹状細胞、およびγδ  Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａ（２９Ａ）、ＩＬ−１β（２９Ｂ）、ＩＬ−２３（２９Ｃ）およびＩＦＮγ（２９Ｄ）の発現を示す。
【００４５】
【図３０】ＷＴＡ−ＰＧＮ注射により誘発される野生型マウスおよびＮＬＲＰ３遺伝子欠損のマウスにおける遺伝子発現の特徴を示す（３０Ａ〜３０Ｊ）。
【００４６】
【図３１】抗ＩｇＧ産生による体液性免疫応答を観察するのに各マウスの尾静脈にてＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００で感染させた、ＷＴＡ、ＰＧＮ、およびＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供したマウスで実験するタイムスケジュールを示す。
【００４７】
【図３２】ＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮの各々で免疫付与に供したマウスでの抗ＩｇＧの産生量を示す。
【００４８】
【図３３】ＵＳＡ３００細胞に１週間感染させた後に、ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮの各々での免疫付与に供したマウスの体重の変化を示す。
【００４９】
【図３４】ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮの各々での免疫付与に供したマウスの腎臓の画像、ならびに細菌負荷（ＣＦＵ）を示す。図３４Ａは（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＷＴＡおよび（ｉｉｉ）ＷＴＡ−ＰＧＮの各々での免疫付与に供したマウスの腎臓の画像を示し、図３４Ｂは（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＷＴＡおよび（ｉｉｉ）ＷＴＡ−ＰＧＮの各々での免疫付与に供したマウスの腎臓に存在するＭＲＳＡ菌株のＣＦＵ（腎臓１ｇ当たりのＣＦＵ）を示す。
【００５０】
【図３５】ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮの各々での免疫付与に供した後に血流を通してＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）に感染させたマウスの腎臓での組織病理学的画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
下記において、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。以下の実施例は、発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに詳しく説明するものとする。
【００５２】
以下、本発明にて使用される用語を定義する。
【００５３】
本明細書にて使用される「細胞壁タイコ酸（ＷＴＡ）」なる語は、スタフィロコッカス・アウレウス（エス・アウレウス）の細胞壁の成分の１つであり、Ｎ−アセチルマンノサミン−（β−１,３）−Ｎ−アセチルグルコサミンと、グリセロリン酸の反復単位およびリビトールリン酸の反復単位とからなる糖ポリマーをいう。
【００５４】
本明細書にて使用される「ペプチドグリカン」なる語は、ステムペプチドが結合により連結されるＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の反復糖ポリマーをいう。
【００５５】
本明細書にて使用される「細胞壁タイコ酸の結合したペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）」なる語は、細胞壁タイコ酸とペプチドグリカンが共有結合した構造をいい、本発明においては、「ＷＴＡ−ＰＧＮ」と区別することなく使用される。
【００５６】
本発明は、ＷＴＡ−ＰＧＮを活性成分として含有する、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療用の組成物を提供する。
【００５７】
本発明の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは、下記の一般式１：
【化１】
2017518373.tif 000003
［式中、ｎは１０〜５０の整数であり；ｍは１〜３の整数であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３は、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；およびＲ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である］
で示されてもよい。
【００５８】
本発明のもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは上記の一般式１で示されてもよく、ここでｎは１０〜５０の整数であり；ｍは１〜３の整数であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３は、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；Ｒ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）であり；そしてＡとＢは相互にβ位で結合している。
【００５９】
本発明のさらにもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは上記の一般式１で示されてもよく、ここでｎは３５〜４５の整数であり；ｍは３であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜３の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３は、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；Ｒ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である。
【００６０】
本発明のさらにもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは上記の一般式１で示されてもよく、ここでｎは４０であり；ｍは３であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、テトラペプチドであり；Ｒ３はヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；Ｒ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である。
【００６１】
本発明のさらにもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは上記の一般式１で示されてもよく、ここでｎは４０であり；ｍは３であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、テトラペプチドであり；Ｒ３はヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであって、そのテトラペプチドは−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４であり、その内のＡ１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ａ２はＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ａ３はＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり；およびＡ４はＡｌａまたはＧｌｙであり；ならびにＲ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である。
【００６２】
本発明のさらにもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮは上記の一般式１で示されてもよく、ここでｎは４０であり；ｍは３であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、テトラペプチドであり；Ｒ３はヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり、そのテトラペプチドは−（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｒ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である。
【００６３】
本発明のさらにもう一つ別の具体的な実施態様において、ＷＴＡ−ＰＧＮのＲ１〜Ｒ３のいずれかがもう一つ別のＷＴＡ−ＰＧＮのＲ１〜Ｒ３のいずれかと架橋を形成してもよく、かくしてＷＴＡ−ＰＧＮは２つのＷＴＡ−ＰＧＮが一緒に連結する二量体の形態で存在してもよい。
【００６４】
本発明の組成物はスタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療に用いられてもよく、スタフィロコッカス・アウレウス感染病を誘発するスタフィロコッカス・アウレウスは、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）または病原性スタフィロコッカス・アウレウスであってもよい。
【００６５】
スタフィロコッカス・アウレウス感染病の例として、軟部組織感染症、化膿性関節炎、化膿性骨髄炎、中耳炎、肺炎、肺血症、急性呼吸器感染症、カテーテル関連感染症、術後感染症、菌血症、心内膜炎および食中毒が挙げられてもよいが、それらに限定されない。
【００６６】
本発明の組成物は、ＷＴＡ−ＰＧＮの他に、医薬的に許容される担体、希釈体、および／またはアジュバントをさらに含んでもよい。
【００６７】
本発明の組成物は、医薬的に許容される担体、希釈体、および／またはアジュバントをさらに含有してもよい。
【００６８】
本発明の組成物中に使用される担体は、投与方法および経路、ならびに標準的な薬物組成物に基づいて決定されてもよい。例えば、担体は、キャリアタンパク質（すなわち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびキーホールリンペットヘミシアニン（ＫＬＨ））、可溶化剤（すなわち、エタノール、ポリソルベート、およびクレモホールＥＬ（登録商標））、等張剤、保存剤、酸化防止剤、賦形剤（すなわち、ラクトース、澱粉、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽質無水ケイ酸、および炭酸カルシウム）、結合剤（すなわち、澱粉、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびアラビアガム）、滑沢剤（すなわち、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等）、および溶解剤（すなわち、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゾール、ポリオキシエチレン、および硬化ヒマシ油）であってもよい。必要に応じて、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤または塩基性材料（すなわち、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸水素ナトリウム、アルギニン、メグルミン（登録商標）、およびトリスアミノメタン）が含有されてもよい。具体的には、抗原性を高めるために、本発明のワクチン組成物は、キャリアタンパク質として知られるＫＬＨ溶液（Calbiotec、１２５ｍｇ／ｍＬ  ５０％グリセロール溶液）と組み合わされてもよい。
【００６９】
本発明に係る組成物に使用される希釈剤は、投与方法および経路、ならびに実際の標準薬の組成物に基づいて選択される。希釈剤の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、および炭酸水素塩溶液が挙げられる。
【００７０】
本発明に係る組成物に使用されるアジュバントは、投与方法および経路、ならびに実際の標準薬の組成物に基づいて選択される。アジュバントの例として、コレラ毒素、イー・コリの易熱性エンドトキシン（ＬＴ）、リポソーム、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。
【００７１】
投与経路は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した危険のある投与されるべき対象の年齢、体重、性別および一般的健康状態に応じて変化してもよい。しかし、投与は経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与および局所投与）のいずれでなされてもよく、好ましくは非経口投与である。
【００７２】
経口および非経口投与用の処方型、ならびにその製造方法は当業者に知られている。経口および非経口投与用の処方型は、慣用的方法により、例えば、上記される医薬的に許容される担体と混合することにより調製され得る。経口投与用の処方型の例として、溶剤、錠剤、顆粒、散剤またはカプセルなどの固形剤または液剤を挙げることができる。非経口投与用の処方型の例として、溶剤、懸濁液、軟膏、クリーム、坐剤、点眼剤、点鼻剤、および点耳剤を挙げることができる。本発明の製剤を持続的に放出するために、生分解性ポリマー（例えば、ポリ−Ｄ,Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドまたはポリグリコリド）をバルク基剤に添加してもよい（例えば、米国特許第５,４１７,９８６号、第４,６７５,３８１号および第４,４５０,１５０号を参照のこと）。経口投与の場合、矯味矯臭剤および着色剤を添加してもよい。その使用に適する医薬担体、希釈剤、および医薬的に必要な材料は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載される。
【００７３】
本発明に係る組成物の投与量は、アジュバントの種類、投与方法および頻度、ならびに所望の効果に応じて決定されてもよく、その用量は、一般に、成人で各投与に付きＷＴＡを１μｇ〜１００ｍｇの量とすることができる。必要に応じて、投与を数回行うこともできる。例えば、組成物を最初に投与してから、補充を目的として、組成物を再び一定の間隔で３回投与することもできる。１回目と２回目の補充のための組成物は、選択的に、同じ処方を用いて、各々、８週目から１２週目に、および１６週目から２０週目に投与されてもよい。
【００７４】
さらには、本発明は、対象におけるスタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療方法であって、上記した組成物をその必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００７５】
上記されるように、スタフィロコッカス・アウレウス感染病は、本発明に係る組成物を投与し、それにより対象にてオプソニン貪食作用および食作用を同時に誘発することで予防または治療され得る。
【００７６】
本発明の方法は、該組成物を投与してから２４時間以内に、対象にてγδ−Ｔ細胞の数、ＩＬ−１７Ａの産生量、およびＩＬ−１βの産生量を増やすことができる。さらには、本発明の方法は、該組成物を投与して１２時間後に、対象においてＩＬ−１０の産生量を増やすこともできる。
【００７７】
さらには、本発明は、可溶性の細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）の調製方法であって、
（１）リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）およびＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子が野生型スタフィロコッカス・アウレウスから欠失されている二重変異菌株を得；
（２）二重変異の菌株を破壊し、その破壊した菌株から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得；
（３）不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理し；
（４）工程（３）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションを得；
（５）可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションをリゾチームまたはムタノリシンで処理し；および
（６）工程（５）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得ること
を含む、方法を提供する。
【００７８】
以下、本発明に係る可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの調製方法を詳細に記載する。
【００７９】
本発明の方法において、工程（１）では、リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）とＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子が野生型スタフィロコッカス・アウレウスから欠失されている二重変異の菌株を得る。
【００８０】
工程（１）において得られた二重変異の菌株、すなわち、リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）とＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子を欠いたΔｌｇｔΔｏａｔＡは、ｌｇｔ遺伝子を欠くためにリポタンパク質の汚染の可能性がほとんどなく、かくして同じ材料からより純度の高いＷＴＡ−ＰＧＮを容易に得ることができる。加えて、工程（１）にて使用される二重変異の菌株はｏａｔＡ遺伝子を欠くためにＰＧＮのＭｕｒＮＡｃ残基にアセチル基がなく、かくして上記にて産生されるＷＴＡ−ＰＧＮは工程（２）にてリソスタフィンまたはβ−溶菌酵素により容易に分解され得る。
【００８１】
二重変異の菌株は、野生型スタフィロコッカス・アウレウス、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）または病原性スタフィロコッカス・アウレウスより昔から知られている一般的な変異誘発により得ることができる。例えば、二重変異の菌株は、リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）遺伝子の欠失しているＴ３６３菌株（Nakayama Mら、Journal of Immunology 189: 5903-591, 2012）、およびエリスロマイシン耐性があり、Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子の欠失しているＴ０００３菌株（Park KHら、Journal of Biological Chemistry 285, 27167-27175, 2010）をファージ８０を媒介体として用いて形質転換することにより調製されてもよい。
【００８２】
本発明の方法において、工程（２）では、二重変異の菌株を破壊し、その破壊した菌株から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る。
【００８３】
工程（２）は、参考文献［Park KHら、Journal of Biological Chemistry 285, 27167-27175, 2010；Jung DJら、Journal of Immunology 2012, 189: 4951-4959, 2012］に記載の方法を参考にして行われてもよい。
【００８４】
例えば、工程（２）は、工程（１）で得られた二重変異の菌株を培養し、その培養体から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを取得することを含んでもよい。
【００８５】
本発明の方法において、工程（３）では、不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理する。
【００８６】
β−溶菌酵素は、工程（２）で得られる不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮのＭｕｒＮＡｃ残基において存在するステムペプチドをつなぐペンタグリシン（（Ｇｌｙ）５）架橋を分解し、それで不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮに変換する役割を果たす。
【００８７】
β−溶菌酵素は商業的に入手可能であるか、あるいは参考文献［Liら. Journal of Biochemistry 122, 772-778, 1997］に記載の方法に従って単離かつ精製されてもよい。β−溶菌酵素の例として、リソスタフィンが挙げられるが、それに限定されない。
【００８８】
工程（３）は、工程（２）で得られる不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを緩衝溶液に懸濁させ、β−溶菌酵素を添加し、３０ないし４０℃の温度で１０時間ないし１４時間攪拌しながらそれらを反応させることにより行われてもよい。
【００８９】
本発明の方法において、工程（４）では、工程（３）の酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションを得る。
【００９０】
上記の工程において、β−溶菌酵素処理の産物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に通してフラクションを得、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションを上記のフラクションより選択する。
【００９１】
可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションは、工程（３）の酵素処理産物をＨＰＬＣに通すことで得ることができる。ＨＰＬＣに通すことで得られるフラクションの中で、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションはＰＡＧＥまたは硝酸銀染色法により確認され得る。
【００９２】
ＨＰＬＣ精製にて使用され得るカラムの例として、ＷＴＡのリビトールリン酸のアニオンに結合するアニオン交換樹脂である、ハイトラップＱ（HiTrap-Q）（GE Healthcare）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００９３】
本発明の方法において、工程（５）では、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションをリゾチームまたはムタノリシンで処理する。
【００９４】
上記において使用されるリゾチームまたはムタノリシンは、ＷＴＡ−ＰＧＮにおけるＰＧＮのＭｕｒＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ間の結合を破壊し、それによりポリマーＰＧＮをオリゴマーＰＧＮに変換しうる。
【００９５】
工程（５）は、工程（３）にて得られる可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを緩衝液に懸濁させ、リゾチームまたはムタノリシンを添加し、３０℃ないし４０℃で１０時間ないし１４時間攪拌することによりなされてもよい。
【００９６】
本発明の方法において、工程（６）では、工程（５）の酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る。
【００９７】
可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮは、工程（５）の酵素処理産物をＨＰＬＣに通すことにより得られ得る。
【００９８】
上記の工程において、リゾチームまたはムタノリシン酵素処理の産物をＨＰＬＣに通してフラクションを得、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含有するフラクションを上記のフラクションより選択する。上記のフラクションの選択は、各フラクションをマウスに腹腔内注射した後に産生されるＩＬ−１７Ａの量に基づいてなされてもよい。
【００９９】
ＨＰＬＣ精製にて使用され得るカラムの例として、ハイトラップＱ（GE Healthcare）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【０１００】
本発明に係る可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの調製方法は、工程（６）の後にＷＴＡ−ＰＧＮのさらなる精製をさらに含んでもよい。
【０１０１】
ＷＴＡ−ＰＧＮのさらなる精製は、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは逆相液体クロマトグラフィーによりなされうる。
【０１０２】
本発明の具体的な実施態様において、工程（６）にて調製される可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮは、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００ＨＲカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによるか、シンメトリー・シールド（Symmetry Shield）（登録商標）ＲＰ１８カラムを用いる逆相液体クロマトグラフィーによりさらに精製されてもよい。
【０１０３】
本発明のもう一つ別の具体的な実施態様において、工程（６）にて調製される可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮは、セファクリルＳ−２００ＨＲカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーと、シンメトリー・シールド（登録商標）ＲＰ１８カラムを用いる逆相液体クロマトグラフィー（２回）とによりさらに精製されてもよい。
【０１０４】
クロマトグラフィーに通すフラクションは、マウスに腹腔内注射した後に産生されるＩＬ−１７Ａの量に基づいて選択されてもよい。
【０１０５】
本発明は、下記の実施例にてさらに記載かつ説明されるが、それは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０６】
実施例１：ＷＴＡ誘導体を取得するための菌株の調製
ＷＴＡ−ＰＧＮを単離するために、エス・アウレウスＴ３８４菌株（ＲＮ４２２０ΔｌｇｔΔｏａｔＡ二重変異株）が参考文献［Kazue Takahashiら、Plos One 8: e69739, 2013］に記載の方法に従って調製された。
【０１０７】
簡単に言えば、エス・アウレウスＴ３８４菌株は、リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）遺伝子の欠失しているＴ３６３菌株（Nakayama Mら、Journal of Immunology 189: 5903-591 , 2012）、およびエリスロマイシン耐性があり、Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子の欠失しているＴ０００３菌株（Park KHら、Journal of Biological Chemistry 285, 27167-27175, 2010）をファージ８０を媒介体として用いて形質転換することにより調製された。該菌株は、ｌｇｔ遺伝子が欠失しているためにリポタンパク質を汚染することなく、ＷＴＡ、ＷＴＡ−ＰＧＮ、およびＰＧＮを単離するのに使用することができ、その単離されたＰＧＮはｏａｔＡ遺伝子が欠失していることからＰＧＮ  ＭｕｒＮＡｃ残基の６位にある酸素にアセチル基が存在しないためにリゾチームによって容易に分解され得る。
【０１０８】
実施例２：可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの単離および精製
不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮは、実施例１にて調製されたΔｌｇｔ／ΔｏａｔＡ変異株より得られ、可溶性ＷＴＡはその不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮより単離して精製された（図２を参照のこと）。
【０１０９】
＜２−１＞不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体の単離および精製
不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮは、参考文献［Park KHら、Journal of Biological Chemistry 285, 27167-27175, 2010；Jung DJら、Journal of Immunology 2012, 189: 4951-4959, 2012］に記載の方法を修飾することにより単離かつ精製された。
【０１１０】
具体的には、実施例１のΔｌｇｔΔｏａｔＡ変異株をインキュベーターを用いて培養し、得られた細菌細胞を回収した。回収した細菌細胞（１０ｍＬ）を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５；３０ｍＬ）に懸濁させ、その内の５０μＬを４００倍に希釈し、分光光度計を用いてＯＤ６００ｎｍが０.８となるように調節した。次に、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.７）を除去するのに、その得られた懸濁液を高速遠心分離機を用いて４℃で５分間１０,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付した。その後で、細菌ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４.５；３０ｍＬ）を添加した２０ｍＭクエン酸緩衝液に懸濁させ、その懸濁液をガラスビーズ（１２ｇ）を含有する６個のステンレス製の破壊ボトルにアリコートして分けた。その破壊ボトルを、その各々のボトルの容積が２０ｍＬになるように、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４.７；２０ｍＬ）を添加した２０ｍＭクエン酸緩衝液で洗浄した。過熱を防止するのに、破壊されるボトルを氷上で保管し、細菌を破壊する２分間の工程および氷上で保管する２分間の工程を７回繰り返した。その破壊菌を新たな５０ｍＬの管に移し、高速遠心分離機を用いて４℃で１５分間３,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付した。次に、上清を５０ｍＬの円錐管に移し、高速遠心分離機を用いて４℃で１０分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付した。そのペレットを２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４.７；１０ｍＬ）に懸濁させ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.７；１０ｍＬ）に添加し、最終ＳＤＳ濃度を０.５％に調整した。得られた懸濁液を６０℃に保持した定温の水浴にて３０分間の熱処理に供し、４℃で５分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付し、得られた上清を取り除いた。アニオン性界面活性剤のＳＤＳで処理した後、ペレットの色が青くなる現象が観察された。ＳＤＳを除去するために、それを２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４.７；２０ｍＬ）に懸濁させ、高速遠心分離機を用いて２０℃で５分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付し、上清を除去した。ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.７；３０ｍＬ）で洗浄した。残りのＳＤＳを完全に除去するために、該ペレットを注射水に懸濁させ、それを３０℃に加熱し、２０℃で５分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付した。ペレットに注射水を加え、震盪した時に、泡が発生しなくなるまで、洗浄を繰り返した。泡のない状態のペレットを注射水（１０ｍＬ）に懸濁させ、室温で１０分間保存した。沈んでいるガラスビーズが移動しないようにしながら、上清を新たな５０ｍＬの管に移し、２０℃で５分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付してペレットを調製した。凍結乾燥のために、該ペレットを注射水（１５ｍＬ）に懸濁させ、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させて不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得た。
【０１１１】
＜２−２＞β−溶菌酵素の調製
不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮから可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを調製するのに使用されるβ−溶菌酵素を調製するのに、参考文献［Liら、Journal of Biochemistry 122, 772-778, 1997］に記載の方法を参照した。
【０１１２】
最初に、粗製品のアクロモペプチダーゼ（５ｇ）を１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０；５００ｍＬ）に溶かし、４℃で１５分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付した。その上清を１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）と平衡にした後、上清をＣＭ−セファロース・ファースト・フロー（CM-Sepharose Fast Flow）カラム（３ｃｍ（長さ）ｘ１８ｃｍ（幅））に負荷し、つづいて０.５Ｍ  ＮａＣｌの濃度まで線形勾配に供することによりそれを溶出させた。溶出した溶液の吸光度を２８０ｎｍで測定し、溶菌活性を示すフラクションを集めて濃縮した。その濃縮サンプルをセファクリルＳ−１００（Sephacryl S-100）カラム（１.６ｃｍ（長さ）ｘ８７ｃｍ（幅））において２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに供した。濾液の吸光度を２８０ｎｍで測定し、溶菌活性を示すフラクションを集めて濃縮した。そのフラクションのうち、β−溶菌酵素のフラクションは、Liら（1997）の結果に基づいて選択された。次に、β−溶菌酵素は、スーパーデックス−７５（Superdex-75）カラム（１ｃｍｘ３０ｃｍ）において２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより得られた。
【０１１３】
こうして得られたβ−溶菌酵素の溶菌活性または溶解活性は、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）（ＡＴＣＣ９３４１）を、あるいはＰＧＮ懸濁液および不溶性スタフィロコッカス・アウレウスより誘導されるカラムフラクションを培養することにより確かめられた。Procise（登録商標）プロテインシークエンサー（カタログ番号４９１−０、Applied Biosystems、Stafford、TX、USA）によりＮ−末端配列を分析した結果、そのＮ−末端配列はＳ−Ｐ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｑ−Ｆ−Ｐ−Ｆであることが確認され、電気泳動分析の結果、約２５ｋＤａの分子量を有する単結合が観察され、こうして得られるβ−溶菌酵素がβ−溶菌酵素であることをこのように確認した。
【０１１４】
＜２−３＞可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮの精製
［１］β−溶菌酵素処理およびＨＰＬＣ
実施例＜２−１＞にて凍結乾燥させた不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）に１００ｍｇ／１０ｍＬの割合で懸濁させ、遠心分離により上清を取り除く工程を３回繰り返し、その上清のｐＨが７.０であることを確認した。次に、その不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを、ブラッドフォード法により定量したβ−溶菌酵素と、３５０μｇのβ−溶菌酵素／１００ｍｇのＷＴＡ−ＰＧＮの割合で混合し、それらを１８０ｒｐｍの速度で攪拌しながら、３７℃のインキュベータにて１２時間にわたって反応させた。次に、反応物を６０℃で定温の水浴中に１０分間入れ、酵素を不活性化し、４℃で１０分間１５,０００ｒｐｍの速度で遠心分離に付し、上清を得た。その上清を０.４５μｍのフィルターに通し、濾液を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）で平衡にしたハイトラップＱカラムに負荷し、１Ｍ  ＮａＣｌを線形勾配で含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）で溶出した。図３Ａに示されるように、溶出の結果として、合計で３本のピークを得た。各ピークをＡ，ＢおよびＣと名付け、２７％ＰＡＧＥを行った（図３Ｂ）。その中で、電気泳動にて硝酸銀で染色された番号１のフラクションをアセトンで沈殿させ、凍結乾燥させて可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得た。
【０１１５】
［２］リゾチーム処理およびＨＰＬＣ
凍結乾燥させたＷＴＡ−ＰＧＮ（１００ｍｇ）を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０；１０ｍＬ）に溶かし、リゾチーム（カタログ番号６２９７０、Sigma-Aldrich Co. LLC., Saint Louis, MO, USA；１.２５ｍｇ）と混合し、３７℃のインキュベータにて、１８０ｒｐｍの速度で攪拌しながら１２時間反応させた。次に、反応物を６０℃の一定温度の水浴中に１０分間置き、酵素を不活性化して上清を得た。上清を０.４５μｍのフィルターに通し、その濾液を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）で平衡にしたハイトラップＱカラムに負荷し、１Ｍ  ＮａＣｌを線形勾配で含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）で溶出した。溶出の結果として、図３Ｃに示されるように、合計で４本のピークを得た。そのピークをアセトンで沈殿させ、次に電気泳動に供した（図３Ｄ）。その内、番号３および４のフラクションは電気泳動にて硝酸銀で染色され、それを集め、凍結乾燥に付して可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得た。
【０１１６】
［３］セファクリルＳ−２００ＨＲカラムを用いるＷＴＡ−ＰＧＮの精製
単離したＷＴＡ−ＰＧＮをセファクリルＳ−２００ＨＲカラムでさらに精製した。この工程にて、ＨＰＬＣ装置（805 MANOMETRIC MODULE、811C DYNAMIC MIXER、305 PUMP、306 PUMP、151 UV/VIS Detector、Gilson、USA）およびセファクリルＳ−２００ＨＲの２５μｍ〜７５μｍ（カタログ番号１７−０５８４−０１、GE Healthcare Life Sciences, England）カラムを用いた。
【０１１７】
上記にて単離した、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮ（５３.５ｍｇ）を蒸留水（４００μＬ）に溶かし、ＨＰＬＣインジェクターに加えた。試料を溶出する前に、セファクリルＳ−２００ＨＲカラムをＨＰＬＣインジェクターに接続し、蒸留水で洗浄して平衡状態にし、実験の間の不純物の流入による誤差を防止するために、ＵＶ検出装置が安定するまで、溶媒をカラムの中に０.３ｍＬ／分の流速で流し、感度２、１０.０秒間のピーク幅、および２２０ｎｍのＵＶ吸光度とした。ＵＶ値が安定化したならば、インジェクターを負荷モードに変更することにより試料をゆっくりと注入し、溶出の開始に応じてインジェクターを注入モードに変更し、それによりカラムに流し込み、溶出液を得た。該工程は平衡化の工程と同じ条件で行われた。溶出の結果として、図４Ａに示されるように、合計で４本のピーク（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）が同定された。図４Ｂに示されるように、ピークをＰＡＧＥ解析に付した結果、可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮがピークＢ、ＣおよびＤに存在することが確かめられた。
【０１１８】
こうして得られた４本のピークを、各々、凍結乾燥させ、それをマウスの腹膜に注射した。結果として産生されたＩＬ−１７Ａの量を比較し、ピークＢが最も活性の高いことが判明し（図４Ｃ）、それでピークＢをその後の実験にて用いた。
【０１１９】
［４］Ｃ１８逆相カラムを用いるＷＴＡ−ＰＧＮの精製
単離したＷＴＡ−ＰＧＮをＣ１８逆相カラムによりさらに精製した。ＨＰＬＣ装置（805 MANOMETRIC MODULE、811C DYNAMIC MIXER、305 PUMP、306 PUMP、151 UV/VIS Detector、Gilson, USA）、シンメトリー・シールド（Symmetry Shield）（登録商標）ＲＰ１８（５μｍ、４.６ｍｍｘ２５０ｍｍ）カラム（カタログ番号１８６０００１１２、Waters, Ireland）およびエムエフ（MF）（登録商標）膜フィルター０.４５μｍ（カタログ番号ＨＡＷＰ０４７００、Merck、Germany）を用いた。さらには、スピード・バク（Speed Vac）（カタログ番号ＣＶＥ−１００、EYELA, Japan）、エバポレーター（Evaporator）カタログ番号ＣＣＡ−１１１０、EYELA, Japan）および凍結乾燥装置（カタログ番号ＦＤＵ−２２００、EYELA, Japan）を用いた。
【０１２０】
Ｃ１８逆相カラムを用いてＷＴＡ−ＰＧＮを精製するためには、セファクリルＳー２００カラムで分離されるフラクションＢ（図４を参照のこと）を３ｍｇの量で固定相溶媒（２００μＬ）に溶かし、試料として用いた。流速は１ｍＬ／分であり、ＵＶ吸光度を２０２ｎｍで測定した。試料を１の感度および４０℃のカラム温度の条件下で負荷した。移動相の濃度勾配を０％で１０分間、４１.７％で２５分間、１００％で２分間、そして１００％で１０分間に設定することにより溶出を行った。溶出の結果として、図５Ａに示されるように、６本のピーク（Ａ〜Ｆ）が同定された。そのピークをＰＡＧＥ解析に供し、その結果を図５Ｂに示す。溶出した各々のピークのｐＨを１Ｍトリス−ＨＣｌで約ｐＨ６.５ないし７.５の中性ｐＨに調整し、エバポレータを用いて３００μＬに濃縮し、冷アセトン（９００μＬ）と混合し、氷上で１時間沈殿させた。得られた沈殿物を１５,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で２５分間供してペレットを回収し、残りのアセトンをスピード・バク（speed vac）により乾燥させ、蒸留水（２０μＬ）に溶かし、ついで凍結乾燥させた。
【０１２１】
各フラクション（２ｍｇ）をＣ１８カラムに再び負荷することによりそれを再度分離し、それによりさらに精製されたＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥフラクションを得た（図５Ｃ）。ピークをＰＡＧＥ分析に供し、結果を図５Ｄに示す。さらには、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのフラクションを、各々２０μｇの量で、マウスの腹腔に注射した。注射して６時間後に誘発されるＩＬ−１７Ａの量をＥＬＩＳＡにより定量し、その結果を図５Ｅに示す。図５Ｅに示されるように、フラクションＣが最も多い量のＩＬ−１７Ａを有することが判明し、そのようなフラクションＣをその後に実験に使用した。
【０１２２】
実施例３：可溶性ＷＴＡの精製
ＷＴＡの精製のために、不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮ（８０ｍｇ）を２０ｍＭのクエン酸緩衝液（８０ｍｇ）（ｐＨ４.５；１９ｍＬ）に懸濁させ、トリクロロ酢酸（１００ｍｇ／ｍＬ；１ｍＬ）に添加し、５ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。懸濁液を１８０ｒｐｍで攪拌しながら、３０℃のインキュベータで１２時間反応させ、次に１０,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で１０分間供した。上清を５０ｍＬの管に移し、アセトンで１時間にわたって沈殿させ、１５,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で２５分間供した。得られたペレットを１.５ｍＬのマイクロ遠心分離管の移し、アセトンを除去して２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０；１ｍＬ）に懸濁させた。
【０１２３】
次に、その得られた懸濁液をハイトラップＱカラムを用いるＨＰＬＣに供した。あらゆるラインおよびカラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）の緩衝液）で洗浄し、感度１の下で検出し、２２０ｎｍでの吸光度を測定するように検出装置を設定して平衡状態にした。負荷用の試料を０.４５μｍのフィルターを通して濾過して負荷した。試料がハイトラップＱカラムに結合しうるように流速は０.５ｍＬ／分に設定され、そのハイトラップＱカラムを洗浄し、平衡状態が達成されるまで初めの流速を維持しながら、不純物を除去した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７.０）からなる、緩衝液Ｂに必要とされる時間を設定することにより勾配を適用し、５０分間で０％〜１００％となるようにし、ハイトラップＱカラムに結合したＷＴＡを溶出させてから、試料を各ピークより回収した。その溶出の結果として、図６（Ａ）に示されるように、２本のピーク（ピーク１および２）が得られた。溶出液を５０ｍＬの円錐管にアリコートして、各管にて１０ｍＬ未満が含有されるようにし、冷アセトンで１時間沈殿させた。アセトン沈降の間に、ピーク１は１５ｍｇの収量を示し、ピーク２は０.８８ｍｇの収量を示した。溶出液を１５,０００ｒｐｍの遠心分離に２５分間供してペレットを回収し、すべてのアセトンを蒸発により除去し、ペレットを注射水に溶かし、凍結乾燥させた。その凍結乾燥生成物をストック液に調製し（１０ｍｇ／ｍＬ）、２７％ＰＡＧＥにより２０μｇの量で分離し、硝酸銀で染色した。その結果、ピーク１がピーク２よりも多くの数のリビトールを有し、また多量で有すると予測され（図６（Ｂ））、かくしてピーク１が可溶性ＷＴＡとして使用された。
【０１２４】
実施例４：可溶性ＰＧＮの精製
＜４−１＞ＷＴＡを除去するためのＴＣＡ処理
ＰＧＮを凍結乾燥させた不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮから得るために、ＷＴＡをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で除去した。ＷＴＡを得るためにＴＣＡを用いて処理した不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５；１９ｍＬ）に添加して再懸濁させ、ＴＣＡ（１００ｍｇ／ｍＬ；１ｍＬ）をそれに加え、最終濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。得られた混合物を１８０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃のインキュベータにて１２時間反応させ、１０,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で１０分間供した。得られたペレットを滅菌蒸留水（３０ｍＬ）に懸濁させ、１０,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で１０分間供し、洗浄し、全工程を５回繰り返すことによりＴＣＡを完全に除去した。得られた混合物を注射水（１５ｍＬ）に懸濁させ、凍結乾燥させて不溶性ＰＧＮを得た。
【０１２５】
＜４−２＞不溶性ＰＧＮを精製して可溶性ＰＧＮにするためのβ−溶菌酵素処理
凍結乾燥させた不溶性ＰＧＮ（１００ｍｇ）を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０；１０ｍＬ）に懸濁させて１０ｍｇ／ｍＬの濃度とし、１５,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で１０分間供し、得られたペレットを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０；３０ｍＬ）で３回洗浄した。洗浄した不溶性ＰＧＮを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.０；２０ｍＬ）に懸濁させ、１００ｍｇの不溶性ＰＧＮに付き３５０μｇの精製されたβ−溶菌酵素を添加し、ｐＨが７.０となるように調整し、１８０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃のインキュベータで１２時間反応させた。次に、不活性化のために、得られた混合物を１００℃で１０分間熱処理し、室温で少なくとも１０分間冷却し、１５,０００ｒｐｍの遠心分離に４℃で１０分間供した。得られた上清を０.４５μｍのフィルターを用いて濾過し、凍結乾燥させた。
【０１２６】
＜４−３＞ゲル濾過クロマトグラフィーによる可溶性ＰＧＮの精製
凍結乾燥させて可溶化させたＰＧＮを注射水に溶かして２０ｍｇ／ｍＬの濃度とし、次にイオン交換カラムであるハイトラップＱに負荷し、その中に微量に含まれるＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮを除去した。ＨＰＬＣ条件については、平衡状態は、２０ｍｇ／ｍＬで添加された緩衝液Ａである注射水で、１ｍＬ／分の流速、２２０ｎｍの吸光度および１の感度の下で調節され、勾配は１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ｂの注射水が３０分間にわたって０％から１００％となるように設定された。
【０１２７】
溶出結果を図７に示す。図７に示されるように、通過した溶液（フラクションＡ）はＷＴＡが取り除かれている可溶性ＰＧＮを含有するフラクションであると考えられ、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ｂで溶出するフラクション（フラクションＢ）はＷＴＡが除去されていないＷＴＡ−ＰＧＮまたはＷＴＡであると推測された。従って、フラクションＡだけを集めて凍結乾燥させた。
【０１２８】
次に、所定の長さのグリカンを有する可溶性ＰＧＮを精製するために、凍結乾燥させた生成物を注射水に溶かして２０ｍｇ／ｍＬの濃度とし、トヨパールＨＷ５５Ｓ（カタログ番号１４６８６、TOSOH Bopscience, 日本）カラムに負荷し、ゲル濾過を行った。ゲル濾過条件に関して、平衡状態は注射水で調節され、０.５ｍＬ／分の流速、２１５ｎｍの吸光度、１の感度、および５０分間にわたる操作で実施された。ゲル濾過による溶出パターンを図８に示す。図８に示されるように、２本のピークがゲル濾過の間に確認された。そのピークの間で、ピークＢが可溶性ＰＧＮであることを確認するために、昆虫のテネブリオ・モリトール（Tenebrio molitor）のプロフェノールオキシダーゼシステムを用いた。そのピークを連続して１０６倍にまで希釈した。正の対照としてβ−１,３を用い、基線として負の対照のＯＤ値を考慮して比較する際に、ピークＡとＢの両方で活性が示されることを確認した（図８）。トヨパールＨＷ５５Ｓカラムの特徴により低分子量の物質が後にくるため、ピークＢがピークＡよりも分子量が小さい、すなわち少数の糖類の可溶性ＰＧＮであると確認され得る。ピークＢを分離し、凍結乾燥させ、その後の実験に用いた。
【０１２９】
実施例４：ＷＴＡ−ＰＧＮおよびＷＴＡの生化学的性質の検証
【０１３０】
単離／精製されたＷＴＡ−ＰＧＮおよびＷＴＡの生化学的性質を検証するために、２７％ＰＡＧＥおよび硝酸銀染色を行った。Ｄ−Ａｌａの存在をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより分析し、ＷＴＡに存在するリン酸およびＧｌｃＮＡｃ残基の量を既知の分析方法により定量した。
【０１３１】
具体的には、Ｄ−Ａｌａの存在を確認するために、２μＬの同定用試料（１０ｍｇ／ｍＬ）および１Ｍ  ＮａＯＨ（０.２μＬ）をマイクロ遠心分離管に加え、１８０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃のインキュベータ中で２時間培養した。薄層クロマトグラフィーのフィルムを５ｃｍ（長さ）ｘ１０ｃｍ（幅）の大きさに切断し、ＴＬＣ溶液に直接触れないように試料（２μＬ）を頂部から約２ｃｍに負荷し、１時間３０分にわたって展開させた。次に、薄層クロマトグラフィーフィルムを完全に乾燥させ、ニンヒドリンスプレー試薬（１ｍＬ）を噴霧し、赤紫色のスポットが現れるまで、ヒートブロックにて熱処理した。
【０１３２】
さらに、ホスファートを定量するために、試料（２μＬ〜４μＬ）、蒸留水（１００μＬ）、および消化剤（１７５μＬ）をガラス管に加えてかき混ぜた。該管を外から加熱した後、試料の色が濃い黄色になったことを確認し、その色相が薄くなるまで該管を再び加熱した。得られた混合物を室温で１０分間冷却し、蒸留水（１２５μＬ）および１％モリブデン酸アンモニウムを添加して攪拌した。次に、還元剤（５０μＬ）をそこに添加し、定温水浴にて１０分間加熱し、分光光度計を用いてＯＤ値を７５０ｎｍで測定した。標体としてホスファートを用いた。
【０１３３】
さらに、ＧｌｃＮＡｃを定量するために、マイクロ遠心分離により分離された試料、蒸留水、および６.４５Ｎ  ＨＣｌを添加して最終容量を１００μＬとし、かき混ぜ、小型のガラス管（０.５ｃｍ（直径）ｘ５ｃｍ（高さ））に移し、試料中に含まれる気泡をすべて真空ポンプ装置を用いて除去した。得られた試料を１００℃のオーブンで３時間熱処理に付し、室温で冷却した。次に、その得られた試料をパスツールピペットを用いて大型のガラス管（１.８ｃｍ（直径）ｘ１８ｃｍ（高さ））に移し、それを真空下に置き、それによって試料を乾燥させることにより、真空状態を調製しながら加熱した。その後で、溶液（エタノール：蒸留水：トリエチルアミン＝２：２：１）を５０μＬの量で各管に加え、２回乾燥させた。試料に含まれるＨＣｌそのものはすべて除去され、蒸留水（１００μＬ）、無水酢酸（２０μＬ）およびホウ酸塩緩衝液（１００μＬ）を加えて混合し、９５℃の定温水浴にて８分間煮沸し、室温で冷却した。ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（７５０μＬ）および２−エトキシエタノール（５０μＬ）をそこに添加し、２０℃の定温水浴にて１５分間培養し、分光光度計を用いて５８５ｎｍでＯＤ値を測定した。標体として、Ｎ−アセチルグルコサミンを用いた。
【０１３４】
結果として、図９Ａに示されるように、精製されたＷＴＡのゲル移動は精製されたＷＴＡ−ＰＧＮよりも速いことが明らかにされ、このことはＷＴＡが、ＰＧＮを取り除くことにより、ＷＴＡ−ＰＧＮよりも分子量が低いことを確認する。加えて、図９Ｂに示されるように、Ｄ−Ａｌａ残基はＷＴＡ−ＰＧＮとＷＴＡの両方と結合することが示された。さらには、図９Ｃに示されるように、ホスファート含量は１μｇのＷＴＡ−ＰＧＮ中に１.５ナノモル、１μｇのＷＴＡ中に１.８ナノモルであることが示され、ＧｌｃＮＡｃ含量は１μｇのＷＴＡ−ＰＧＮ中に２.５ナノモル、１μｇのＷＴＡ中に２.２ナノモルであることが示された。
【０１３５】
実施例５：ＷＴＡ−ＰＧＮの効果を分析するための実験方法
＜５−１＞マウス実験および飼育の計画
実験動物として、５週齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雌のマウス（体重；１５±０.５ｇ）をコリア・リサーチ・インスティツート・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオテクノロジー（ＫＲＩＢＢ）のバイオメディカル・マウス・リソース・センター（韓国、チュンチョンブクド、Ohchang Campus、ｒｅａ遺伝子欠損）より入手した。実験用動物を、実験の前に、市販の固形飼料（カタログ番号５Ｌ７９、Orient Bio Inc.、ｒｅａ遺伝子欠損）を該動物に与えながら、動物実験の実験室環境（定温で定湿度の動物用ケージ、カタログ番号ＡＡＡＣ２０５１、JEIO TECH Co., Ltd.、ｒｅａ遺伝子欠損；２０℃ないし２５℃の５５％湿度）に１週間適合させた。マウスを体重により完全に無作為の計画で各群（一群６〜１２匹のマウス）に割り当て、それらの動物を飼育ケージに入れ（６匹のマウス／群）、食餌および飲料水を自由に与えた。各実験動物の体重および食餌摂取量を一日に一回測定し、照明を１２時間の間隔で切り換えた。
【０１３６】
＜５−２＞インビボ感染の研究に使用され得るＭＲＳＡ（エス・アウレウスＵＳＡ３００菌株）およびＭＳＳＡ（エス・アウレウスＮＲＳ１８４菌株）の調製
ＭＲＳＡ（エス・アウレウスＵＳＡ３００菌株）およびＭＳＳＡ（エス・アウレウスＮＲＳ１８４菌株）はドイツのテュービンゲン大学から提供された。グリセロールストック中−８０℃で貯蔵された菌株をエル・ビー・ブロス・レンノックス（LB Broth LENNOX）（カタログ番号４０５.１、Bioshop, Canada）上に固定し、３７℃のインキュベータにて少なくとも１２時間平板培養した。次に、その培養した平板を４℃で貯蔵した。その菌株を用いる１日前に、バクト（Bacto）（登録商標）トリプシン・ソイ・ブロス・ソイビーン−カゼイン・ダイジェスト・メディウム（カタログ番号２１１８２５、ＢＤ、USA New Jersey；２ｍＬ）を１４ｍＬの丸底管に加え、１つのコロニーを接種し、３７℃のインキュベータ中で少なくとも１２時間攪拌しながら培養した。その後、動物を感染させる３時間前に、３７℃で１２時間培養した細菌培養ブロス（４００μＬ）をＴＳＢ（２０ｍＬ）に加え、３７℃のインキュベータ中にて攪拌しながら培養し、対数中期へと発展させた。細菌培養ブロスを、培養の完了した後に、貯蔵して細胞増殖を防止し、さらに進化させた。第１に、得られた培養物を３,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に４℃で１０分間供し、上清を取り除いた。得られた物をＰＢＳに懸濁させ、１５,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に４℃で１分間供した。遠心分離の後、上清を取り除き、ＰＢＳ（１ｍＬ）に再度懸濁させ、分光光度計（カタログ番号２０６−２５４００−５８、島津製作所、日本）を用いて６００ｎｍで吸光度を測定した。各動物モデルおよび感染方法に従って、必要とされる細胞数を考慮して懸濁液を希釈し、その実験に用いた。
【０１３７】
＜５−３＞熱死滅菌の調製
ＩＬ−１７Ａの量は、表１に示される加熱殺菌されたエス・アウレウス菌株を用いて測定された。
【０１３８】
【表１】
2017518373.tif 000004
【０１３９】
（１）Novick RP、Ross HF、Projan SJ、Kornblum J、Kreiswirth B、Moghazeh S. (1993）「スタフィロコッカス病原性因子の合成の調節ＲＮＡ分子により制御」（Synthesis of Staphylococcal Virulence Factors Is Controlled by a Regulatory Rna Molecule.）EMBO J. 12 (10）: 3967-75；
（２）ドイツ、テュービンゲン大学、インターファカルティ・インスティテュート・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・メジシン、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・デビジョン（Molecular Microbiology Division、Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine、University of Tubingen、Germany）から入手
（３）Kurokawa K、Kim MS、Ichikawa R、Ryu KH、Dohmae N、Nakayama H、Lee BL. (2012）「スタフィロコッカス・アウレウスにおけるジアシルリポタンパク質のそのトリアシルカウンターパートより多くの環境介在的蓄積」（Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus） J Bacteriol. 194 (13）: 3299-306；
（４）Park KH、Kurokawa K、Zheng L、Jung DJ、Tateishi K、Jin JO、Ha NC、Kang HJ、Matsushita M、Kwak JY、Takahashi K、Lee BL. (2010）「ヒト血清マンノース結合レクチンは、幼虫において制限される、スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁タイコ酸の糖重合体を感知する」（Human serum mannose-binding lectin senses wall teichoic acid Glycopolymer of Staphylococcus aureus、which is restricted in infancy） J Biol Chem. 285 (35）: 27167-75；
（５）Nakayama M、Kurokawa K、Nakamura K、Lee BL、Sekimizu K、Kubagawa H、Hiramatsu K、Yagita H、Okumura K、Takai T、Underhill DM、Aderem A、Ogasawara K. (2012）「抑制性受容体のペア型Ｉｇ様受容体Ｂはスタフィロコッカス・アウレウスにより病原性について活用される」（Inhibitory receptor paired Ig-like receptor B is exploited by Staphylococcus aureus for virulence.） J Immunol. 189 (12）: 5903-11；
（６）Kaito C、Sekimizu K. (2007）「スタフィロコッカス・アウレウスにて広がるコロニー」（Colony spreading in Staphylococcus aureus） J Bacteriol. 189 (6）: 2553-7
（７）Takahashi K、Kurokawa K、Moyo P、Jung DJ、An JH、Chigweshe L、Paul E、Lee BL. (2013） PLoS One. 8 (8）: e69739
【０１４０】
ＬＢ１０ブロス培地（２ｍＬ）に上記の表１に記載の菌株を用いて抗生物質を添加した。遺伝子型に関して、Ｅｒｍはエリスロマイシン（カタログ番号Ｅ６３７６、米国、ＭＯ、セント・ルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を示し、Ｋｍはカナマイシン（カタログ番号１７９２４、米国、ＯＨ、ＵＳＢ（登録商標））を示し、それらは、各々、１０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの濃度で使用された。ＰｈｌｅＯはフレオマイシン（カタログ番号Ｐ９５６４、米国、ＭＯ、セント・ルイス、Sigma-Aldrich Co.）を示し、菌株の調製の間に各変異型を分類および確認するために１０μｇ／ｍＬの濃度で使用されるが、細菌を培養するのに使用されなかった。各菌株のコロニーを植菌して１２時間培養し、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコにＬＢ１０（１００ｍＬ）を調製することにより継代培養した各菌株の１ｍＬの細菌培養ブロスをそこに添加し、１８０ｒｐｍの速度で攪拌しながら増殖温度で培養した。
【０１４１】
ＯＤ６００ｎｍが１.２に達するまで細菌を培養し、得られた細菌培養物を１０,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に４℃で１０分間供した。得られた細菌ペレットを生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ；３０ｍＬ）に懸濁させ、１０,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に４℃で１０分間供し、上清を取り除いた。生理食塩水で２回洗浄した後、ペレットを塩水（１０ｍＬ）に再び懸濁させた。その懸濁液を５０ｍＬの試験管中にて希釈し、ＯＤ６００ｎｍを０.３に調整し、６０℃で定温の水浴中に添加し、３０分間の熱処理に付した。その熱処理に付した細菌を室温で十分に冷却し、１０,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に４℃で１０分間供し、上清を取り除き、そのペレットを注射水（３０ｍＬ）に懸濁させる工程を繰り返し、注射水で２回洗浄した。該ペレットを注射水（２ｍＬ）に懸濁させ、凍結乾燥に付した後の重量を測定した。次に、得られた懸濁液を２００μｇ／ｍＬの濃度でマウスに腹腔内投与に供した。
【０１４２】
＜５−４＞マウス実験においてＷＴＡ−ＰＧＮにより誘発される細胞性免疫
【０１４３】
（ｉ）ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮにより誘発される腹膜炎、細胞性免疫および免疫応答
加熱死菌またはＷＴＡ誘導体を、５０μｇ、１００μｇおよび２００μｇの量で、１００μＬのＰＢＳ（カタログ番号１７−５１６Ｑ、米国、ＭＤ、LONDA、Bio Whittaker（登録商標））に懸濁させ、それをマウスに腹腔内注射し、それにより腹膜炎を誘発させか、またはマウスに免疫を付与し、各実験で必要ならば０、３、６、９、１２、２４、４８および７２時間の試料採取の時点でマウスを殺し、実験に使用した。腹膜炎の誘発および記憶応答の反復についての実験モデルは、１００μｇのＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮ／ＰＢＳ（１００μＬ）にて、各々、０日目、７日目、および１４日目に腹腔内注射を施し、２１日間の回復期間を経て、３５日目にＭＲＳＡ（エス・アウレウスＵＳＡ３００菌株、１ｘ１０８ＣＦＵ／１００μＬ  ＰＢＳ）を腹腔内注射して感染させた。対照群のマウスに１００μＬのＰＢＳを腹腔内注射し、ナイーブなマウスを対照として用いた。細菌の抗原攻撃の後、マウスを０、３、６、９、１２、２４、４８および７２時間の時点で殺し、感染の全身性レベルおよび免疫応答を評価した。その一方で、生存した群に、ＭＲＳＡ（エス・アウレウスＵＳＡ３００菌株）およびＭＳＳＡ（エス・アウレウスＮＲＳ１８４菌株）を５ｘ１０８ＣＦＵ／ＰＢＳ（１００μＬ）で腹腔内注射した。
【０１４４】
（ｉｉ）腹膜流体浸出液と腹膜浸出細胞（ＰＥＣ）の分離
マウス腹膜流体浸出液に関して、腹膜を２ｍＬのＰＢＳ（カタログ番号１７−５１６Ｑ、米国、LONZA、Bio Whittaker（登録商標））で洗浄し、２,０００ｒｐｍの遠心分離に１０分間供した。上清を−８０℃で貯蔵し、ＥＬＩＳＡによるサイトカインの分析に用い、ペレットを完全ＲＰＭＩ１６４０培地（ｃＲＰＭＩ；ＲＰＭＩ  １６４０：Gibco（登録商標）；１０％  ＦＢＳ：Gibco（登録商標）；１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン：Gibco（登録商標）；および１００ｍｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン：Gibco（登録商標））に懸濁させた。赤血球を除去するために、赤血球を赤血球溶血緩衝液(Cat. No. 420301、Bio legend、San Diego、CA、USA）を用いて溶血させ、細胞をｃＲＰＭＩに再び懸濁させた。
【０１４５】
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析
ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０およびＩＮＦγに関して、Ｒ＆Ｄのデュオセット（Duoset）（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（米国、ＭＮ、ミネアポリス、R&D Systems Inc.）およびイーバイオサイエンスのELISA Ready-SET-Go！ Kit（米国、ＣＡ、San Diego、eBioscience）を用い、腹膜流体浸出液の上清中にあるそれらを測定した。各サイトカインのＥＬＩＳＡキットの情報を以下に示す。最後に、４５０ｎｍで測定した吸光度をマイクロプレートリーダー（カタログ番号５１１１９０００、米国、ＭＡ、ウォルサム、Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて５５０ｎｍで測定した吸光度に修正した。
【０１４６】
（ｉｖ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
表面を染色するのに、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーＡｂを用いて染色した。さらに、細胞内染色のために、細胞を集める前に、タンパク質輸送阻害剤であるゴルギストップ（GolgiStop）（カタログ番号５５４７２４、米国、ＣＡ、サンノゼ、BD Bioscience）を含むｃＲＰＭＩ１６４０培地の存在下で細胞を再び刺激した。集めた細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬの細胞内（ＩＣ）固定緩衝液（カタログ番号００−８２２２−４９、米国、ＣＡ、サンディエゴ、eBioscience）を用いて３０分間室温で固定し、次に透過化緩衝液（カタログ番号００−８３３３−５６、米国、ＣＡ、サンディエゴ、eBioscience）で洗浄した。ついで、該細胞を１００μＬの透過化緩衝液で再び懸濁させ、細胞内染色性Ａｂを用いて室温で２０分間培養した。次に、細胞を各工程毎に透過化緩衝液およびＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで再び懸濁させた。細胞をフローサイトメトリー（BD FACS Canto II、米国、ＣＡ、サンノゼ、BD Biosciences）により検出し、フロージョ（FlowJo）ソフトウェアｖＸ０.７（米国、ＯＲ、アシュランド、FlowJo LLC.）を用いて解析した。表面分子および細胞内分子の各々の具体的情報を以下の表２に示す。
【０１４７】
（ｖ）細胞分取、ならびにＷＴＡ誘導体の免疫付与に供されるマクロファージ、樹状細胞、および精製されたγδ  Ｔ細胞のインビトロにおける共培養
ナイーブなマウス、およびＷＴＡ誘導体の免疫処理に付したマウスのＰＥＣを上記されるように単離し、そのＰＥＣを９６−ウェルの底部が平坦なプレートに移し（２〜３ｘ１０５細胞／ウェル）、マクロファージおよび樹状細胞がそれと結合しうるように、ｃＲＰＭＩ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件で（カタログ番号ＭＣＯ−１７Ａ、日本、ＳＡＮＹＯにて）１.５時間培養した。次に、培地を吸引により取り出し、抗生物質を含まないＲＰＭＩと置き換えた。
【０１４８】
ＦＡＣＳ分取は、マクロファージおよび樹状細胞ではネズミのＰａｎ  Ｔ細胞分取用キットＩＩ（カタログ番号１３０−０９５−１３０、ドイツ、ベルギッシュグラートバハ、Miltenyi Biotec）を用い、γδ  Ｔ細胞ではγδ  ＴＣＲ特異的Ａｂを用いてＣＤ３＋  Ｔ細胞の陰性選択を施すことによりなされた。
【０１４９】
染色細胞をセルストレーナースナップ式キャップの丸底試験管（カタログ番号３５２２３５、米国、ＭＡ、Tewksbury）を通して加圧下に置き、フローセルソーター（MoFlo（登録商標）AstriosＴＭセルソーター、米国、ＣＡ、Beckman Coulter, Inc., South Kraemer Boulevard Brea）を用いて分取した。分取した細胞の純度は９５％以上であった。
【０１５０】
（ｖｉ）ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（カタログ番号ＴＲ１１８、米国、ＯＨ、シンシナティ、Molecular Research Center, Inc.）を用いてトータルＲＮＡを単離した。ＲＮＡの単離は製造業者のプロトコルに従ってなされ、ｃＤＮＡ合成では、ＲＴ−ＰＣＲ装置（Ｃ１０００ＴｏｕｃｈＴＭＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、米国、ＷＩ、ハーキュリーズ、Bio-Rad）を用いて、オリゴ（ｄｔ）プライマー（カタログ番号Ｃ１１０１、米国、ＷＩ、マディソン、Promega Corporation）およびＩｍｐｒｏｍ−ＩＩシステム（カタログ番号Ａ３８００、米国、ＷＩ、マディソン、Promega Corporation）を含め、２０μＬの総容量にて、ｍＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写された。転写されたｃＤＮＡはｑＲＴ−ＰＣＲ装置（カタログ番号９００１８７０、米国、ＣＡ、バレンシア、Rotor-Gene Q, QIAGEN Inc.）をＲＴ−ＰＣＲと一緒に用いて増幅された。そのデータを、各条件について、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル基転移酵素（ＨＰＲＴ）を用いて正規化した。各遺伝子についてのプライマー情報を以下の表３に示す。
【０１５１】
【表２】
2017518373.tif 000005
【０１５２】
【表３】
2017518373.tif 000006
【表４】
2017518373.tif 000007
【０１５３】
＜５−５＞ＮＺＷウサギおよびモルモットの実験においてＷＴＡ−ＰＧＮにより誘発される細胞性免疫
【０１５４】
（ｉ）ＮＺＷウサギの皮膚にＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与することによるＭＲＳＡ感染に対する保護効果の測定
【０１５５】
実験動物として、体重が２±０.１ｋｇのＮＺＷ雌ウサギ（Ｙａｃ；ＮＺＷ（ＫＢＬ））をOrient Bio Inc.（韓国、キョンギド）より購入し、実験に入る前に、該動物に市販の固形飼料（カタログ番号３８３０２−ＮＭ、Cargill Agri Purina、ｒｅａ遺伝子欠損）を与えながら、該動物を１週間にわたり動物実験の実験室環境（ウサギ用ケージ、カタログ番号ＤＪ１１７、韓国、Daejong Instrument Industry Co.,Ltd.；２０℃〜２５℃、５５％湿度）に適合させた。実験動物を各ケージに一羽ずつ飼育ケージに入れ、飼料および飲料水を自由に与えた。各実験動物の体重および飼料摂取量を一日に一回測定し、照明を１２時間間隔で切り換えた。
【０１５６】
ＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与を施し、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）をＮＺＷウサギの皮膚に感染させる前に、ＮＺＷウサギの背部の毛を１５ｃｍ（幅）ｘ１０ｃｍ（長さ）の大きさで電気カミソリ（カタログ番号ＥＲ８０６、日本、パナソニック株式会社）を用いて除き、その剃った領域を滅菌アルコールコットンおよびポビドンヨード溶液（カタログ番号Ｐ６９８９００、カナダ、ＴＲＣ）で消毒して実験に用いた。
【０１５７】
動物を麻酔処理に供するのに、ゾレチル（Zoletil）（登録商標）５０（韓国、Virbac Korea Co., Ltd.）および塩酸キシラジン（カタログ番号１２５１、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を、各々、動物の体重を考慮して、３０ｍｇ／０.６ｍＬ／２ｋｇおよび９.３２８ｍｇ／０.４ｍＬ／２ｋｇの濃度で混合し、筋肉内注射を施した。
【０１５８】
毛を剃った面積を半分に分け（７.５ｃｍ（長さ）ｘ１０ｃｍ（幅））、区分化した。左側を対照として皮内注射によりＰＢＳ（１００μＬ）で免疫付与し、右側をＷＴＡ−ＰＧＮ（２０μｇ／１００μＬ）で免疫付与した。一羽のウサギを３時間後にＵＳＡ３００（１ｘ１０８ＣＦＵ）で皮内注射することにより感染させ、もう一羽のウサギを６時間後にＵＳＡ３００（１ｘ１０８ＣＦＵ）で皮内注射することにより感染させ、皮膚膿瘍の病変の大きさを幅（ｗ）および長さ（ｌ）で測定し、７日間の真皮壊死（dermonecrosis）の面積（ｃｍ２）および膿瘍の体積（ｃｍ３）を定量した。その膿瘍体積（ｃｍ３）は、楕円球形についての式［ｖ＝（π／６）ｘｌｘｗ２］により計算された。
【０１５９】
（ｉｉ）モルモットの皮膚にＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与することによるＭＲＳＡ感染に対する保護効果の測定
【０１６０】
実験動物として、体重が２±０.１ｋｇの雌のモルモット（ＣｒｌＯｒｉ；ＨＡ）をOrient Bio Inc.（韓国、キョンギド）より購入し、実験に入る前に、該動物に市販の固形飼料（カタログ番号５０２６、韓国、Orient Bio Inc.）を与えながら、該動物を１週間にわたり動物実験の実験室環境（定温定湿度の動物用ケージ、カタログ番号ＡＡＡＣ２０５１、韓国、JEIO TECH Co., Ltd.；２０℃〜２５℃、５５％湿度）に適合させた。実験動物を各ケージに一匹ずつ飼育ケージに入れ、飼料および飲料水を自由に与えた。各実験動物の体重および飼料摂取量を一日に一回測定し、照明を１２時間間隔で切り換えた。
【０１６１】
ＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与を施し、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）をモルモットの皮膚に感染させる前に、モルモットの背部の毛を１５ｃｍ（幅）ｘ１０ｃｍ（長さ）の大きさで電気カミソリ（カタログ番号ＥＲ８０６、日本、パナソニック株式会社）を用いて除き、その剃った領域を滅菌アルコールコットンおよびポビドンヨード溶液（カタログ番号Ｐ６９８９００、カナダ、ＴＲＣ）で消毒して実験に用いた。
【０１６２】
動物を麻酔処理に供するのに、ゾレチル（登録商標）５０（韓国、Virbac Korea Co., Ltd.）および塩酸キシラジン（カタログ番号１２５１、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を、各々、動物の体重を考慮して、３ｍｇ／０.０６ｍＬ／１００ｇおよび０.９３２８ｍｇ／０.０４ｍＬ／１００ｇの濃度で混合し、筋肉内注射を施した。
【０１６３】
毛を剃った面積を半分に分け（３ｃｍ（長さ）ｘ６ｃｍ（幅））、区分化した。左側を対照として皮内注射によりＰＢＳ（１００μＬ）で免疫付与し、右側をＷＴＡ−ＰＧＮ（２０μｇ／１００μＬ）で免疫付与した。６時間後に、ＵＳＡ３００（５ｘ１０８ＣＦＵ）で皮内注射することにより感染させ、皮膚膿瘍の病変の大きさを幅（ｗ）および長さ（ｌ）で測定し、７日間の真皮壊死の面積（ｃｍ２）および膿瘍の体積（ｃｍ３）を定量した。その膿瘍体積（ｃｍ３）は、楕円球形についての式［ｖ＝（π／６）ｘｌｘｗ２］により計算された。
【０１６４】
（ｉｉｉ）モルモットの腹膜にＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与することによるＭＲＳＡ感染に対する保護効果の測定
【０１６５】
実験動物の飼育はＩＩ.５.２）に記載されるのと同様の方法にて行われた。モルモットを用いて、対照群（ｎ＝２）にＰＢＳ（１００μＬ）を腹腔内注射することで免疫付与し、ＷＴＡ−ＰＧＮ群（ｎ＝２）にＷＴＡ−ＰＧＮ（２００μｇ／１００μＬ）を腹腔内注射することにより免疫付与に供した。３時間後、そのモルモットにＵＳＡ３００（１.５ｘ１０９ＣＦＵ）を腹腔内注射することで感染させ、体重、飼料摂取量、行動等を７日間にわたってモニター観察した。次に、そのモルモットを解剖し、膿瘍の存在およびその大きさ、器官の状態等を観察した。
【０１６６】
＜５−６＞ＷＴＡ−ＰＧＮにより誘発される体液性免疫
【０１６７】
（ｉ）ＷＴＡ、ＰＧＮおよびＷＴＡ−ＰＧＮによる皮膚への免疫付与およびＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）感染
【０１６８】
実験動物をＰＢＳ（カタログ番号１７−５１６Ｑ、米国, ＭＤ, Lonza Walkersville, Inc.）および２０μｇのＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を、各々、５０μＬの量で、０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に合計で５回皮内注射することにより免疫付与に供した。免疫付与に供する前に、および７日目、２１日目、３５日目、４９日目および６３日目、すなわち、個々に免疫付与した７日後に、尾部をカットすることで２０μＬの血液飼料を集めた。５回目の免疫付与した１４日後の７０日目に、ＵＳＡ３００（１ｘ１０７ＣＦＵ／１００μＬのＰＢＳ）を静脈内注射することで動物を感染させ、その７日後の７７日目に、動物を殺した。実験に用いられるタイムスケジュールを体系化し、図３１に示した。殺す１２時間前にはマウスを空腹状態とし、次に１００ｍｇの２,２,２-トリブロモエタノール（カタログ番号Ｔ４８４０２、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）および２００μＬのｔ-アミルアルコール（カタログ番号１５２４６３、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を０.９％ＮａＣｌ溶液（カタログ番号Ｓ３０１４、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）に添加することで調製された麻酔剤（１μＬ／ｇＢＷ）を用いてマウスに麻酔処理を施した。ついで、ヘパリン処理の滅菌シリンジを用いて心臓から血液試料を集め、８,０００ｒｐｍの速度の遠心分離に１０℃で１０分間供し、こうして得られた血漿を試料として用いた。肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺等からの組織を摘出し、その重量を測定した。腎臓組織をＣＦＵ測定に用い、残りの組織を液体窒素に浸し、後で試料として用いるために−８０℃で貯蔵した。
【０１６９】
（ｉｉ）ＷＴＡ誘導体で免疫付与に供した血清中の抗原特異的抗体のＥＬＩＳＡによる定量化
【０１７０】
９６ウェルのマイクロプレートの各ウェルを５ナノモルのＷＴＡ−ＰＧＮ（５０μＬ）で処理し、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＦＣ（カタログ番号Ｇ−２０２−Ｃ、米国、ＭＮ、ミネアポリス、R&D systems Inc.）をＳＴＤと１：５００の割合に希釈して用いて４℃で一夜被覆した。ＴＢＳ緩衝液（２００μＬのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ（カタログ番号Ａ２１５３、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（カタログ番号ＳＯＤ００１.１、カナダ、Bioshop；ｐＨ７.４））を含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（カタログ番号Ｔ３２５３、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を各ウェルに添加することで各細胞を室温で２時間ブロックした後、各ウェルをＴＢＳ緩衝液（２００μＬの洗浄緩衝液（０.０５％ツィーン（Tween）２０；カタログ番号Ｐ９４１６、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を含有する）を用いて室温で５回洗浄した。連続希釈したＷＴＡ、ＷＴＡ−ＰＧＮ、およびＰＢＳで免疫処理した血漿（５０μＬ）をそれに添加し、室温で２時間培養し、マウス対照血清（カタログ番号ＲＳ１９−１０１、米国、ＴＸ、モンゴメリー、Bethyl Laboratories, Inc.）を標体として用いた。各細胞を洗浄緩衝液（２００μＬ）を用いて室温で５回洗浄し、５０μＬのヤギ抗マウス−ＩｇＧ（カタログ番号Ｗ４０２１、米国、ＷＩ、マディソン、Promega Corporation）で処理し、それを１：２５００に希釈し、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させ、室温で１時間インキュベートした。得られたウェルを洗浄緩衝液（２００μＬ）で再び５回洗浄し、１００μＬの３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン（カタログ番号Ｔ０４４０、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）を基質として添加し、室温で１０分間インキュベートし、それを停止緩衝液である５０μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（カタログ番号２５８１０５、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）で処理し、４５０ｎｍで測定した吸光度をマイクロプレートリーダー（カタログ番号５１１１９０００、米国、ＭＡ、ウォルサム、Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて５５０ｎｍで測定した吸光度に修正した。
【０１７１】
（ｉｉｉ）腎臓組織における細菌負荷の定量化
【０１７２】
膿瘍形成が観察された腎臓組織を１０ｍＬの１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：カタログ番号ＥＤＴ００１.５００、カナダ、Bioshop）および０.９％ＮａＣｌ（カタログ番号１４００２、韓国、JW Pharmaceutical）を含有する溶液で均質にした。ホモジネートを連続して希釈させ、その希釈した５０μＬのホモジネートをヒツジ血液寒天培地（カタログ番号ＡＭ６０１−０１、Asan Pharm Co., Ltd.、ｒｅａ遺伝子欠損）上に広げ、３７℃のインキュベータ（カタログ番号ＳＢ−９、日本、EYELA）中にて２４時間培養し、コロニーの数を計数した。
【０１７３】
（ｉｖ）腎臓組織における病理学的観察
【０１７４】
実験で使用したマウス腎臓組織から、腎皮質および腎髄質の部分を集めた。皮質、ならびに多形核白血球、マクロファージおよびリンパ球における糸球体嚢の壊死を含め、免疫細胞の浸潤および膿瘍を確かめるのに、組織切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｓ）染色に供した。
【０１７５】
すなわち、集めた組織を１０％ホルマリン（カタログ番号ＨＴ５０１１２８、米国、ＭＯ、セントルイス、Sigma-Aldrich Co. LLC.）に固定し、次にパラフィンブロックを調製した。そのパラフィンブロックを３μｍの切片に調製し、スライドガラスの上部に載せ、６０℃ないし７０℃のオーブンで１時間乾燥させ、Ｈ＆Ｅ染色に供した。操作の完了したスライドガラスを光学顕微鏡下に置き、２００倍の写真において組織病理学的変化が観察された。
【０１７６】
実施例６：γδ  Ｔ細胞を媒介するインビボにおけるＩＬ−１７Ａの分泌および精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体によるＭＲＳＡ感染に対する保護作用
＜６−１＞ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体による細胞性免疫の誘発
【０１７７】
（６−１−１）精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ、ＷＴＡおよびＰＧＮをマウスに腹腔内注射すると、該マウスは１２時間以内にＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βを分泌した。
【０１７８】
精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体の生理活性を詳細に試験するために、単離／精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を種々の濃度（１００μＬのＰＢＳ中に０、５０、１００および２００μｇの量）でマウスに腹腔内注射した時に、腹膜内で産生されるＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βの量を経時的に観察し、その各々の結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βなどのサイトカインの発現に関する時間的な疫学的作用がＥＬＩＳＡにより観察された。
【０１７９】
ＷＴＡ−ＰＧＮ注射した３時間後からＩＬ−１７Ａの発現の増加が始まり、６時間で最大限誘発され、その後は迅速に減少し、２４時間ではＩＬ−１７Ａは発現されなかった。ＷＴＡとＰＧＮの等量の混合物を注射した場合に、あらゆる時点でＩＬ−１７Ａは産生されず、かくしてＩＬ−１７Ａを誘発するには、ＷＴＡとＰＧＮが共有結合しているＷＴＡ−ＰＧＮの構造が不可欠であることを確認する。さらには、ＩＬ−１７Ａの発現が濃度依存的様式にて増加することを確認した（図１１Ａ）。
【０１８０】
ＩＬ−１βの発現量がＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を注射した３ないし６時間後に最大であることも示され、２４時間で対照レベルにまで減少した。その一方で、ＷＴＡとＰＧＮの混合物は注射した３時間後にＩＬ−１βの最大の発現レベルを示したが、注射した６時間後にＩＬ−１βの発現は迅速に減少した。ＩＬ−１７Ａと同様に、ＩＬ−１βの発現量も濃度依存的様式にて増加することが示された（図１１Ｂ）。
【０１８１】
宿主の特定の領域でのスタフィロコッカス・アウレウス感染がトキシンの分泌またはバイオフィルムの形成をもたらし、それにより好中球介在の食作用が阻害されうることは周知であるため、好中球を収集するサイトカインが感染の初期段階で分泌され、感染の定着する前にスタフィロコッカス・アウレウスの食作用による除去能のあることが示唆される。しかしながら、感染の初期段階でＩＬ−１７Ａの分泌を選択的に誘発しうる免疫モジュレータはこれまでに同定されていない。
【０１８２】
今日までの基本的な研究結果に起因して、Ｔｈ１７細胞がインビボにてＩＬ−１７Ａを産生し得るＴ細胞として知られている。しかしながら、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７Ａの持続的分泌は、特定の領域における好中球の過度な蓄積を惹起し、宿主での組織または器官を破壊して、それにより狼瘡、関節リウマチ等などの自己免疫疾患を誘発しうることが報告されている。したがって、Ｔｈ１７細胞が介在するＩＬ−１７Ａ発現を誘発しうる物質は効果的なワクチンまたは免疫モジュレータとして使用され得ないことを示唆する。
【０１８３】
（６−１−２）ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体による初期段階でのＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βの誘発は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０により制御された。
【０１８４】
ＷＴＡ−ＰＧＮを注射したマウスにてその１２時間後にＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βが分泌されないことを説明するために、本発明者らは、単離／精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体（２００μｇ／１００μＬ）をマウスに注射した後の時間（０、３、６、９、２４、４８、７２および９６時間）に応じて、腹膜流体浸出液を集めることでＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の量を、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０がこれらの炎症性サイトカインを制御しうるとの前提の下で分析した（図１２）。
【０１８５】
ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を注射した３時間後に増大を開始するＩＬ−１７Ａの産生は６時間で最大レベルを示すが、注射した９時間後から減少が始まり、１２時間後には産生を示さなかった。ＩＬ−１βはＩＬ−１７Ａの発現様式と同様の発現様式を示したが、ＩＬ−１βの発現は、注射した６時間後に最大レベルを示した後に、減少し始め、注射した１２時間後まで相対的に高レベルを維持したが、２４時間後には産生を示さなかった。しかしながら、興味深いことに、ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を注射した後は、ＩＬ−１０の産生は、注射した３時間後から徐々に増加し、１２時間で最大レベルに達し、２４時間から減少し始めるが、４８時間まで高レベルを維持し、その後に迅速に減少し始め、７２時間後にはＩＬ−１０の産生ははとんど示されない。
【０１８６】
これらの結果は、スタフィロコッカス・アウレウスより精製されたＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体のマウスへの腹腔内注射が、３時間ないし６時間の短時間の期間内にＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βなどの炎症性ケモカインの分泌をマウスにて生じさせて好中球を集め、それによって食作用により炎症領域の周辺のスタフィロコッカス・アウレウスを除去することができるとの予想を惹起した。さらに、ＷＴＡ−ＰＧＮによるＩＬ−１７Ａの分泌は感染の１２時間後に制御され得ることが示され、その後で、ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体が過剰なＩＬ−１７Ａ分泌による自己免疫応答による宿主における組織または器官の喪失を誘発しない、新規な免疫モジュレータであることをこのように確認した。
【０１８７】
（６−１−３）γδＴ誘導のＩＬ−１７ＡがＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体により産生された。
【０１８８】
図１３はフローサイトメトリーを用いて行われた実験の結果を示しており、それはＷＴＡ−ＰＧＮを注射した場合に産生されるＩＬ−１７ＡがγδＴ細胞より誘導されるＩＬ−１７Ａであることを確認した。ＷＴＡ−ＰＧＮ注射の後で、腹膜にある細胞を時間通りに集め、まずＣＤ３＋Ｔ細胞を集めた。次に、γδＴ細胞受容体（γδ  ＴＣＲ）を有するＴ細胞を集め、これらのＴ細胞のＴ細胞全体に対する割合を試験した。結果として、ＷＴＡ−ＰＧＮ注射の６時間後に、その割合は、ＰＢＳ群に比べて、１２.２％に増えた。γδＴ細胞内で産生されるＩＬ−１７Ａをモノクローナル抗体を用いて定量した場合に、注射して３時間後に腹膜に蓄積したγδＴ細胞の５６％がＩＬ−１７Ａ産生細胞であり、注射して６時間後に腹膜に蓄積したγδＴ細胞の７８％がＩＬ−１７Ａ産生細胞であることを確認した。
【０１８９】
これらの結果はＷＴＡ−ＰＧＮがγδＴ細胞により選択的に媒介されるＩＬ−１７Ａの発現を誘発しうる新規な免疫モジュレータであることを確認した。
【０１９０】
（６−１−４）ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるＩＬ−１７Ａの産生を誘発できなかった。
【０１９１】
ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を注射することでＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞より誘導されるＩＬ−１７Ａの産生があることを試験するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分類し、これらの細胞より分泌されるＩＬ−１７Ａの量を定量した。結果を図１４に示す。
【０１９２】
ＷＴＡ−ＰＧＮ注射の３時間および６時間後には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞より誘導されるＩＬ−１７Ａの産生は観察されなかった。これらの結果は、ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞より誘導される適応免疫に関連することなく、γδＴ細胞より誘導されるＩＬ−１７Ａだけを産生することによって好中球による細胞性免疫応答を制御しうる新規な免疫モジュレータであることを確認した。
【０１９３】
（６−１−５）ＷＴＡ−ＰＧＮ注射はγδＴＣＲ欠損のマウスにおいてＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１β産生を誘発できなかった。
【０１９４】
ＷＴＡ誘導体はγδＴ細胞誘導のＩＬ−１７Ａを産生するため、Ｖγ２／４遺伝子の欠損したＶγ２／４−／−マウス（γδＴＣＲの主な部分集合）および野生型マウスを用いて、ＷＴＡ−ＰＧＮがγδＴ細胞から由来のＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βの発現を誘発しうるかどうかが試験された。
【０１９５】
結果として、図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、予想通り、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βがＷＴＡ−ＰＧＮを注射した野生型マウスの群にて発現され、一方でこれらのサイトカインはＶγ２／４−／−マウスの群では産生されなかった。ＷＴＡおよびＰＧＮの混合物を注射した場合、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βの発現は野生型マウスの群でもＶγ２／４−／−マウスの群のいずれにおいても観察されなかった。これらの結果から、ＷＴＡ−ＰＧＮが主たる部分集合であるＶγ２／４を活性化することによりＩＬ−１７Ａの産生を誘発しうることを確認した。
【０１９６】
（６−１−６）ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理することによる記憶（メモリ−）γδＴ細胞の産生および関連するサイトカイン発現の特徴
【０１９７】
ｉ）ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体で予め３回処理した後にＭＲＳＡ細菌で再び感染させた後のサイトカイン発現様式を試験した結果
【０１９８】
スタフィロコッカス・アウレウスの再感染について、記憶γδ  Ｔ細胞の産生は、新規なワクチン候補材料が効果的な臨床的有用性を有するための必須要件であるか、あるいは新たなスタフィロコッカス・アウレウス感染に対する免疫モジュレータであるため、本発明者らは腹膜にてＵＳＡ３００菌株（ＭＲＳＡ菌株）に再び感染したマウスが、１週間の間隔でＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体に３回感染させた２１日後に、記憶γδ  Ｔ細胞を産生し得るかどうかを試験した（図１６）。
【０１９９】
第一に、炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインにおける変化を、ＷＴＡ−ＰＧＮ、ＷＴＡおよびＰＧＮ誘導体で予め３回処理した、マウスにおいて試験した。その結果、ＩＬ−１７Ａの発現レベルはＵＳＡ３００菌株に感染させた６時間後が最も高く、２４時間でその発現量は対照群の発現量と同様のレベルまで減少することが判明した（図１６Ａ）。ＩＬ−１７ＡをＷＴＡ−ＰＧＮ、ＷＴＡおよびＰＧＮ誘導体で予め３回処理したマウスにおいて発現させたが、その発現レベルはＷＴＡ−ＰＧＮの発現レベルと比べて約半分であり、特に３回の予備処理は、１回の処理と比べて、ＩＬ−１７Ａ発現のレベルの約１０倍増をもたらした。
【０２００】
ＩＬ−１βの産生量はＵＳＡ３００感染の６時間後に最大の発現レベルに達し、その発現レベルは感染の２４時間後には有意に減少した。予めＷＴＡおよびＰＧＮで処理した群は、感染の６時間後に、ＷＴＡ−ＰＧＮ群のＩＬ−１β発現レベルと同様のレベルを示した。これらの結果はＷＴＡおよびＰＧＮで予め３回処理したマウスにおいてＵＳＡ３００に再び感染することがＷＴＡ−ＰＧＮ群の発現量と同様の発現量を示し得ることを確認した（図１６Ｂ）。
【０２０１】
興味のあることに、ＩＬ−２３の産生がＵＳＡ３００菌株に再び感染させた６時間後にＷＴＡ−ＰＧＮ群だけで示され、その産生は２４時間で示されなかった。これらの結果はＩＬ−２３の産生が、記憶γδ  Ｔ細胞により媒介されるＩＬ−１７Ａの産生と密接に関連付けられることを示唆する（図１６Ｃ）。
【０２０２】
ＩＦＮγの産生量は、ＷＴＡおよびＰＧＮで予め処理したマウスにおいて、ＵＳＡ３００菌株に感染した６時間後に最大発現レベルに達し、その発現レベルは感染から２４時間後に有意に減少した。ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスにおけるＩＦＮγの発現は、ＩＬ−１７Ａの発現と異なり、ＷＴＡ−ＰＧＮ群の中で最も低いことが分かった。これらの結果はＩＦＮγの産生が記憶γδ  Ｔ細胞により媒介されるＩＬ−１７Ａ産生と関係しないことを示唆する（図１６Ｄ）。
【０２０３】
その一方で、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現レベルがＵＳＡ３００菌株に感染した３時間後に有意に増加し、感染から１２時間後までわずかに減少し、２４時間で再び最大レベルを示し、感染から４８時間および７２時間後にわずかに減少したが、なお高レベルを維持した。前に観察されるように、炎症性サイトカインである、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２３の発現が感染の２４時間後に最大レベルに達したことを考慮して、ＩＬ−１０がＩＬ−１７Ａの発現を効果的に阻害しうることが確認された（図１６Ｅ）。
【０２０４】
ｉｉ）ＷＴＡ−ＰＧＮで予め３回処理したマウスは、ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２７ｌｏｗマーカーを有する記憶γδ  Ｔ細胞を産生した。
【０２０５】
ＷＴＡ−ＰＧＮで予め３回処理したマウス腹膜の記憶γδ  Ｔ細胞の産生を試験するために、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスのγδ  Ｔ細胞をＵＳＡ３００感染の３時間後に集め、記憶γδ  Ｔ細胞のマーカーである、ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２７ｌｏｗγδ  Ｔ細胞の発現を試験した。結果として、その発現レベルは予め処理していない群よりも高く、記憶γδ  Ｔ細胞は対照群よりも高いＩＬ−１７Ａの発現レベルを示したのに対して、ＩＬ−１７Ａの発現はＣＤ２７＋γδ  Ｔ細胞にて観察されないことが確認された（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
【０２０６】
ｉｉｉ）ＣＤ３＋γδ  Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａ産生
【０２０７】
ＣＤ３＋γδ  Ｔ細胞での細胞内および細胞外ＩＬ−１７Ａの発現が、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め３回処理し、それによりＵＳＡ３００菌株に感染させることによって記憶γδ  Ｔ細胞を産生したマウスにおいて、各々、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡで観察された。結果として、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスは、感染の３時間ないし９時間後の間に、ＩＬ−１７Ａの高い発現レベルを示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。これらの結果はＷＴＡ−ＰＧＮが記憶γδ  Ｔ細胞を効果的に誘発することができ、その誘発された記憶γδ  Ｔ細胞がＩＬ−１７Ａを産生するための主たる細胞として作用しうることを確認する。
【０２０８】
ｉｖ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａ産生
【０２０９】
ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した後にＩＬ−１７Ａを産生する主たる細胞が、免疫応答を誘発するγδ  Ｔ細胞であるとの上記の結果を再確認するために、ＩＬ−１７Ａの発現を適応免疫応答と関与するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞から誘導させた（図１９）。ＣＤ３＋γδ  Ｔ細胞から由来のＩＬ−１７Ａが９０％以上で産生されるが、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理したマウスからＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した後にＩＬ−１７Ａの発現を試験した場合、発現は観察されなかった。これらの結果から、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め３回処理した後にマウスをＭＲＳＡに感染させた場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞などの適応免疫応答関連細胞の代わりに、細胞性免疫だけがγδ  Ｔ細胞により誘発されることが再確認された。
【０２１０】
ｖ）ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理することで分化されるγδ  ＴＣＲ部分母集団の検証
【０２１１】
ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体で予め３回処理し、それにより記憶γδ  Ｔ細胞を産生したマウスをＵＳＡ３００菌株に感染させた場合に、γδ  ＴＣＲのどのサブセットが増加するかを試験した。結果として、Ｖγ４サブセットが最も多く発現することを確認した（図２０）。抗−Ｖγ４−Ａｂは現在のところ市販のＶγ４サブセットにて利用できないため、Ｖγ１.１とＶγ２の二重否定の母集団領域がＶγ４母集団としてゲートすること（gating）により確認された。ＵＳＡ３００菌株感染の近年の研究の結果に従って、Ｖγ１.１＋とＶγ２＋の迅速な流入が最初に観察され、γδ  ＴＣＲサブセットのＶγ１.１＋とＶγ４＋γδ  Ｔ細胞へのシフトが続いた。さらには、Ｖγ４＋細胞に関して、エス・アウレウス感染および記憶応答が持続的に誘発される場合に、母集団はさらにもっと増大し、ＩＬ−１７Ａの産生と直接関連付けられると報告された（J Immunol 2014；192: 3697-3708）。
【０２１２】
ｖｉ）樹状細胞でのＩＬ−２３の発現
【０２１３】
ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理することにより発現されることが予め分かっているＩＬ−２３をいずれの細胞が発現するかを試験するために、本発明者らは、樹状細胞の可能性に焦点を当てて研究を行った（図２１）。ＷＴＡ−ＰＧＮで予め３回処理し、つづいてＵＳＡ３００菌株に感染させた後に、樹状細胞内でのＩＬ−２３の発現を確認した。結果として、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した群は、予め処理していない群と比べて、ＩＬ−２３の発現の増加を示したが、感染から２４時間後、発現は全く観察されなかった。これらの結果から、ＩＬ−２３はＭＲＳＡ感染の初期段階で樹状細胞にて産生され、それによりγδ  Ｔ細胞がＩＬ−１７Ａの発現を誘発するきっかけとなることを示唆した。
【０２１４】
＜６−２＞ＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与によって誘発される記憶応答によるＭＲＳＡ（エス・アウレウスＵＳＡ３００菌株）およびＭＳＳＡ（エス・アウレウスＮＲＳ１８４菌株）感染に対するインビボでの保護作用
【０２１５】
マウスをＷＴＡ−ＰＧＮで腹腔内にて３回免疫付与に供し、３５日目にＵＳＡ３００菌株（１ｘ１０８細胞）に感染させ、器官の形状が腹膜で生成され、膿瘍の形成が感染から７２時間後に観察された。結果を図２２に示す。
【０２１６】
対照群において、膿瘍が腹膜において観察されたが、ＷＴＡ−ＰＧＮ群にて膿瘍は全く観察されず、このように、γδ  Ｔ細胞により媒介されるＩＬ−１７Ａの産生は好中球の蓄積を誘発し、食作用を増大させ、それにより宿主をＵＳＡ３００感染から効果的に保護することを示唆する。その一方で、ＷＴＡで処理された群にて膿瘍は観察されなかったが、肝組織にて異常所見があった。ＰＧＮで処理された群は、膿瘍が観察されたが、対照群よりも状態は良さそうであった。
【０２１７】
さらには、ＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与することにより記憶応答が誘発されているマウスの生存率を試験するために、ＵＳＡ３００菌株に感染させた後、マウスをＷＴＡ−ＰＧＮで腹腔内注射を通して３回免疫付与に供し、３５日目にＵＳＡ３００菌株（５ｘ１０８細胞）に感染させ、９日間モニター観察した。結果を図２３に示す。ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供された群のマウスはすべて生存したのに対して、ＰＢＳ群、すなわち対照群のマウスはすべて８日目に死亡した。これらの結果から、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供されたマウスは、感染の初期段階で細胞性免疫および記憶応答が誘発される結果、高濃度でのＭＲＳＡ感染に対してインビボでの防御を効果的に行うことができる。
【０２１８】
その一方で、ＭＲＳＡ感染に対して保護作用を示したＷＴＡ−ＰＧＮが、ＭＳＳＡ感染に対しても保護作用を示しうるかどうかを試験するために、マウスを腹腔内注射を通してＷＴＡ−ＰＧＮで３回免疫付与に供し、３５日目にエス・アウレウスＮＲＳ１８４菌株（５ｘ１０８細胞）に感染させ、腹膜における膿瘍の存在が７日目に観察された（図２４Ａおよび２４Ｂ）。図２４に示されるように、ＰＢＳ群（対照群）では腹膜にて膿瘍の存在が観察されたが、ＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理された群では膿瘍はまったく観察されず、このように、ＷＴＡ−ＰＧＮがＭＲＳＡ菌株感染に対するのと同様に、ＭＳＳＡ菌株感染に対しても強力な保護作用を示し得ることを確認した。
【０２１９】
＜６−３＞ＮＺＷウサギおよびモルモットにおけるＭＲＳＡ感染に対する宿主におけるＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与の保護効果
【０２２０】
記憶γδ  Ｔ細胞の産生に関するＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与の効果およびＭＲＳＡ感染に対する保護作用がマウス実験モデルにて確認されたため、ＷＴＡ−ＰＧＮが、マウスモデルの代わりに、ＮＺＷウサギおよびモルモットなどの動物モデルにてＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与に供した後にＭＲＳＡ感染に対して保護作用を示し得るかどうかを試験した。
【０２２１】
第一に、ＮＺＷウサギの皮膚を皮下注射により２０μｇのＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与に供し、免疫付与から３時間後に、皮下注射によりＭＲＳＡ（１ｘ１０８ＣＦＵ、ＵＳＡ３００）に感染させ、保護作用を観察した。結果を図２５Ａ〜２５Ｃに示す。
【０２２２】
その結果として、ＰＢＳ（１００μＬ）で免疫化した対照群と比べて、免疫付与に供したウサギの皮膚壊死領域および膿瘍体積の大きさは有意に小さく、速やかに回復し、かくして６日目には膿瘍組織はほとんど観察されなかった。これらの結果から、ＷＴＡ−ＰＧＮはマウスモデルと同様にＮＺＷウサギにおいてさえ細胞性免疫を誘発し、またＭＲＳＡ感染に対して保護作用を示すことを確認した。
【０２２３】
さらには、ＮＺＷウサギおよびモルモットを皮下注射によりＷＴＡ−ＰＧＮ（２０μｇＷＴＡ−ＰＧＮ／１００μＬ  ＰＢＳ）で免疫付与に供し、免疫付与から６時間後、ＭＲＳＡ（５ｘ１０８ＣＦＵ、ＵＳＡ３００）で皮下注射により感染させ、保護作用の存在を観察した。
【０２２４】
その結果として、ＷＴＡ−ＰＧＮ（２０μｇのＷＴＡ−ＰＧＮ／１００μＬのＰＢＳ）の免疫付与に供した、ＮＺＷウサギおよびモルモットの両方の動物において、膿瘍の大きさは有意に小さく、速やかに回復することも分かった（図２６Ａおよび２６Ｂ）。従って、ＷＴＡ−ＰＧＮが、ヒトの免疫系と似ている免疫系を有すると仮定される、ＮＺＷウサギおよびモルモットにおけるＭＲＳＡ感染に対して保護作用を有することが確認され、かくして宿主はＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理することによりＭＲＳＡ感染より保護され得ることが確認された。
【０２２５】
モルモットの腹膜にＷＴＡ−ＰＧＮを注射した後、ＭＲＳＡ感染に対する宿主の保護作用を観察するために、モルモットをＰＢＳおよび２００μｇのＷＴＡ−ＰＧＮの各々で腹腔内注射による免疫付与に供し、その３時間後に、１.５ｘ１０９ＣＦＵのＵＳＡ３００に感染させた。免疫付与の７日後に、動物を解剖して組織を観察し、その結果として、膿瘍の大きさは、ＰＢＳで免疫を付与した対照群と比べて、ＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与に供した動物では有意に減少し、ＭＲＳＡによる溶血がほとんどなかった（図２７）。
【０２２６】
上記の結果から、マウスの腹膜をＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理することによりＭＲＳＡ感染に対して保護作用を示すＷＴＡ−ＰＧＮもまた、モルモットの腹膜を用いるモデル系にてＭＲＳＡ感染に対して保護作用を有することが確認された。
【０２２７】
＜６−４＞野生型マウス、ＴＬＲ−９遺伝子欠損のマウス、およびカスパーゼ−１遺伝子欠損のマウスにおけるＷＴＡ−ＰＧＮ免疫付与におけるＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βの産生
【０２２８】
ＷＴＡ−ＰＧＮがγδ  Ｔ細胞から由来のＩＬ−１７Ａをどのように産生するかについてシグナル伝達経路を研究するために、樹状細胞においてＩＬ−２３およびＩＬ−１β発現の誘発に関与することが知られている、トール様受容体（ＴＬＲ）経路およびインフラマソーム経路の各々で研究を行った。
【０２２９】
ΔｏａｔＡΔｌｇｔより単離されたＷＴＡ−ＰＧＮおよび野生型細菌より単離されたＷＴＡ−ＰＧＮを、野生型マウス、ＴＬＲ−９遺伝子の欠損したマウス、およびカスパーゼ−１遺伝子の欠損したマウスに注射し、免疫付与に供した６時間後に、ＩＬ−１７Ａ産生を腹膜流体浸出液中で測定した。その結果として、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１βはΔｏａｔＡΔｌｇｔより単離されたＷＴＡ−ＰＧＮを注射した一群のマウスにおいてのみ発現し、これらのサイトカインはＴＬＲ−９遺伝子の欠損したマウス、およびカスパーゼ−１遺伝子の欠損したマウスでは産生されないことが確認された（図２８Ａおよび２８Ｂ）。
【０２３０】
これらの結果は、ΔｏａｔＡΔｌｇｔより単離されたＷＴＡ−ＰＧＮがγδ  Ｔ細胞より由来のＩＬ−１７Ａを産生する場合に、ＴＬＲ−９経路およびインフラマソーム経路が関連付けられるであろうことを示唆した。
【０２３１】
＜６−５＞マクロファージ、樹状細胞、およびγδ  Ｔ細胞におけるＷＴＡ−ＰＧＮで予め処理した後に誘発されるサイトカインおよびケモカインの発現の特徴の比較
【０２３２】
γδ  Ｔ細胞に依存するＩＬ−１７Ａの分泌に不可欠な高レベルのシグナル伝達系およびＷＴＡ−ＰＧＮの生物学的機能および機構を理解するために、マクロファージ、樹状細胞、およびγδ  Ｔ細胞を腹膜浸出細胞（ＰＥＣ）より分離し、これらの細胞より由来のサイトカインを試験した（図２９）。
【０２３３】
その結果として、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与で、各々、ＩＬ−１７Ａがγδ  Ｔ細胞にて発現され、ＩＬ−１βが樹状細胞およびγδ  Ｔ細胞にて発現され、ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−２３）が樹状細胞にて発現され、そしてＩＦＮγがγδ  Ｔ細胞にて発現されることが確認された。
【０２３４】
近年において、樹状細胞におけるＩＬ−２３およびＩＬ−１βの発現が、非古典的なＴ細胞、すなわち、γδ  Ｔ細胞においてＩＬ−１７Ａの発現に重要な役割を有することを確認する多数の報告がある。従って、サイトカインが、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与で、リガンドをどのようにして認識し、相互に作用するかについて、より具体的に研究する必要があると決定付けられた。
【０２３５】
さらには、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与は野生型マウスおよびＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスを用いてなされ、マクロファージ、樹状細胞、およびγδ  Ｔ細胞を分離し、ＮＬＲＰ３、サイトカインおよびＴＬＲ１ないしＴＬＲ９遺伝子の発現状態をｑＲＴ−ＰＣＲで試験した。その結果として、ＮＬＲＰ３は主として樹状細胞およびγδ  Ｔ細胞にて産生され、何ら処理していない対照群で高度に発現され、野生型マウスおよびＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスにてわずかに減少するが、その発現レベルは、ＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスの発現レベルと比べて、野生型マウスにおいて高いことが確認された（図３０）。
【０２３６】
一般に、ＮＬＲＰ３は樹状細胞内のインフラマソームにて発現されることが知られており、それによりＩＬ−１βの産生に影響を及ぼす。ＩＬ−１βが前の実験にて樹状細胞およびγδ  Ｔ細胞の両方で高く示されている結果、およびＮＬＲＰ３遺伝子の発現レベルが樹状細胞およびγδ  Ｔ細胞でほとんど同じであるとの結果を鑑みれば、ＮＬＲＰ３を含むインフラマソームもまたγδ  Ｔ細胞中に存在してもよく、これらのことはこれまでに報告されたことのない新たな知見であると思われる（図３０Ａ）。
【０２３７】
ＩＬ−１７Ａは対照群では全く発現されなかったが、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与でＩＬ−１７Ａの発現レベルは、野生型マウスおよびＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスより得られるγδ  Ｔ細胞だけで増加しており、ＩＬ−１７Ａの発現レベルはＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウス群と比べて、野生型マウスにおいてより高かった。これらの結果は、ＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスの場合には、ＩＬ−１βの産生が樹状細胞のインフラマソーム内で阻害され、かくしてγδ  Ｔ細胞を刺激できず、それによりＩＬ−１７Ａの発現レベルが低下することを示唆する（図３０Ｂ）。
【０２３８】
ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ｐ４０と、ＩＬ−２３ｐ１９とからなるヘテロダイマーの形態を有する。これらの遺伝子の発現の試験に際し、ＩＬ−１２ｐ４０はＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供された野生型マウスにおいて高度に発現され、ＩＬ−２３ｐ１９はＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスのマクロファージおよび樹状細胞にて高度に発現されたが、ＩＬ−２３ｐ１９の発現レベルはＩＬ−１２ｐ４０の発現レベルと比べて無視できる程度であった（図３０Ｃおよび３０Ｄ）。
【０２３９】
ＩＬ−１βはＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供された対照群にて全く発現されなかったが、ＩＬ−１βの発現レベルは、野生型マウスの群にて樹状細胞＞γδ  Ｔ細胞＞マクロファージの順序で高度に示され、ＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスにてγδ  Ｔ細胞＞樹状細胞＞マクロファージの順序で高度に示された（図３０Ｅ）。ＩＦＮγ発現はＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供された野生型マウスの群において有意に阻害されたが、対照群およびＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスのγδ  Ｔ細胞にて高度に発現された（図３０Ｆ）。
【０２４０】
上記の結果から、γδ  Ｔ細胞でのＩＬ−１７Ａの発現と、樹状細胞でのＩＬ−２３の発現との間に密接な関係があるであろうし、それに対してγδ  Ｔ細胞でのＩＦＮγ発現とＩＬ−１７Ａ発現は相互に相反する関係にあることが示唆された。
【０２４１】
さらには、γδ  Ｔ細胞に依存するＩＬ−１７Ａの分泌に不可欠な高級シグナル伝達系を理解するために、ＴＬＲ１ないしＴＬＲ９遺伝子の発現を確認した。ＴＬＲ３、４、５および６遺伝子は確認されず、ＴＬＲ１、２、７および９遺伝子の場合においてさえ、対照群と、ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与に供された野生型マウスの群、ＮＬＲＰ３遺伝子の欠損したマウスの群の間でも何ら有意な違いは観察されなかった（図３０Ｇないし３０Ｊ）。特に、ΔｏａｔＡΔｌｇｔ変異体より単離されたＷＴＡ−ＰＧＮの場合には、エンドソームに存在するＴＬＲ９により認識され、それによりＩＬ−２３を分泌することが期待された。しかしながら、上記の図面に示されるように、野生型がＷＴＡ−ＰＧＮで免疫付与に供されると、ＴＬＲ９遺伝子はほとんど示されず、かくして別のより高級なシグナル伝達系が存在すると考えられた。
【０２４２】
実施例７：ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体による体液性免疫
＜７−１＞マウスモデルにおけるＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮ産生の抗−ＷＴＡ−ＩｇＧによる皮下免疫付与
【０２４３】
ＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮでの免疫付与に供した後、各々の抗原特異的抗体の産生を確認するために、９６ウェルプレートをＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮで被覆し、抗−ＷＴＡ−ＩｇＧおよび抗−ＷＴＡ−ＰＧＮ−ＩｇＧの産生量を免疫付与に供したマウスの血清を用いて滴定した（図３２）。
【０２４４】
その結果として、ＷＴＡの場合には、免疫付与に５回供した時に、抗−ＷＴＡ−ＩｇＧの血中量は約３倍に増加した。それに対して、ＷＴＡ−ＰＧＮの場合には、免疫付与に３回供した時に、抗−ＷＴＡ−ＰＧＮ−ＩｇＧは約５倍の量に有意に増加した（図３２）。
【０２４５】
これらの結果は、ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を用いる免疫付与が、抗原特異的抗体を産生し、古典的補体経路を活性化し、オプソニン貪食作用を誘発して、それにより保護作用を提供するであろうとの考えを可能とした。そこで、ＷＴＡおよびＷＴＡ−ＰＧＮでの免疫付与に５回供したマウスを尾静脈を通してＭＲＳＡ菌株に感染させ、宿主での保護作用を試験した。
【０２４６】
＜７−２＞ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体を皮下注射して免疫付与に供した後のＭＲＳＡ感染による体重の変化
【０２４７】
ＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体での免疫付与に５回供した後、７０日目に動物をＵＳＡ３００菌株（１ｘ１０７ＣＦＵ）に感染させ、体重を１週間にわたってモニター観察した結果を図３３に示す。
【０２４８】
ＰＢＳを注射した群は、注射した後に、２日目に１５％以上の体重の減少を示し、持続して低体重を維持した。対照的に、ＷＴＡ群およびＰＧＮ群はＰＢＳ群と比べて体重の減少速度が低く、ＷＴＡ−ＰＧＮ群は最初に５％の体重減を示したが、６日目には元の体重を回復した。
【０２４９】
上記の結果は、ＭＲＳＡ感染では、抗原特異的抗体の産生によって、オプソニン貪食作用が誘発され、感染の初期段階の中に細菌を除去することによりマウス保護作用が示されたことを示唆する。
【０２５０】
＜７−３＞ＷＴＡ−ＰＧＮの免疫付与による宿主でのＭＲＳＡ保護作用
【０２５１】
スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁より単離したＷＴＡ、ＰＧＮ、およびＷＴＡ−ＰＧＮ誘導体での免疫付与に供した後、７０日目にＵＳＡ３００菌株を静脈内注射することでマウスを感染させ、腎臓を単離し、そのマウスの腎臓にあるＵＳＡ３００のＣＦＵと、膿瘍形成の存在とを試験した。結果を図３４Ａおよび３４Ｂに示す。
【０２５２】
マウスの腎臓で膿瘍形成の存在を観察した結果として、図３４Ａに示されるように、ＷＴＡ−ＰＧＮ群が、ＰＢＳ対照群と比べて、膿瘍形成について有意な阻害を示すことが確認された。腎臓を粉砕し、その腎臓中に存在するＭＲＳＡ菌株のＣＵＦを計算すると（図３４Ｂ）、予想通り、ＷＴＡ−ＰＧＮ群がマウスにてＭＲＳＡ感染に対して保護作用を有する抗原として作用する物質であると仮定された。
【０２５３】
一方で、マウスの腎臓の組織病理学的現象について観察した結果を図３５に示す。腎皮質においては糸球体嚢の壊死が確認されるのに対して、腎髄質においては膿瘍、ならびに多形核白血球、マクロファージおよびリンパ球を含有する免疫細胞の浸出液が観察された。皮質の場合には、ＷＴＡ−ＰＧＮでの免疫付与に供したマウスの群にて糸球体嚢が対照群のマウスの形状と同様の形状を維持するのに対して、ＰＢＳおよびＰＧＮでの免疫付与に供したマウスの群において糸球体嚢の壊死が観察された。髄質の場合には、ＷＴＡ−ＰＧＮでの免疫付与に供したマウスの群において少量の免疫細胞の浸出液が観察され、対照群のマウスの特徴とほとんど同じ特徴が示されたが、膿瘍はまったく認められず、正常な組織のパターンに近いパターンを示した。その一方で、ＰＢＳ群およびＰＧＮ群においては大きな膿瘍が観察され、腎臓の損傷度は、皮質および髄質の両方において、ＷＴＡ−ＰＧＮ＞ＷＴＡ＞ＰＧＮ＞ＰＢＳの群の順序で減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
2017518373.tif 000028
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
2017518373.tif 000055
【図２９Ｃ】
2017518373.tif 000056
【図２９Ｄ】
2017518373.tif 000057
【図３０Ａ】
2017518373.tif 000058
【図３０Ｂ】
2017518373.tif 000059
【図３０Ｃ】
2017518373.tif 000060
【図３０Ｄ】
2017518373.tif 000061
【図３０Ｅ】
2017518373.tif 000062
【図３０Ｆ】
2017518373.tif 000063
【図３０Ｇ】
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【図３０Ｈ】
2017518373.tif 000065
【図３０Ｉ】
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【図３０Ｊ】
2017518373.tif 000067
【図３１】
2017518373.tif 000068
【図３２】
2017518373.tif 000069
【図３３】
2017518373.tif 000070
【図３４Ａ】
2017518373.tif 000071
【図３４Ｂ】
2017518373.tif 000072
【図３５】
2017518373.tif 000073
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月9日(2017.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）を活性成分として含む、スタフィロコッカス・アウレウス感染病の予防または治療用組成物。
【請求項２】
ＷＴＡ−ＰＧＮが、下記の一般式１：
【化１】
2017518373.tif 000074
［式中、ｎは１０〜５０の整数であり；ｍは１〜３の整数であり；ＡはＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰは、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３は、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであり；およびＲ４はヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である］
で示される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＡとＢが相互にβ位で結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｎが３５〜４５の整数であり；ｍが３であり；ＡがＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢがＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰが、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１〜Ｒ３が、各々独立して、ヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであって；Ｒ４がヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ｎが４０であり；ｍが３であり；ＡがＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）であり；ＢがＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり；ＯおよびＰが、各々独立して、０〜５の整数であり；Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、テトラペプチドであり；Ｒ３がヒドロキシ、テトラペプチドまたはペンタペプチドであって；Ｒ４がヒドロキシまたはＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
テトラペプチドがＡ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４であって、ここでＡ１がＡｌａまたはＧｌｙであり、Ａ２がＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ａ３がＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであって、Ａ４がＡｌａまたはＧｌｙである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
テトラペプチドが−（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ａｌａ）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
スタフィロコッカス・アウレウスが、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）または病原性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
スタフィロコッカス・アウレウス感染病が、軟部組織感染症、化膿性関節炎、化膿性骨髄炎、中耳炎、肺炎、敗血症、急性呼吸器感染症、カテーテル関連感染症、術後感染症、菌血症、心内膜炎および食中毒からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
オプソニン貪食作用および食作用を同時に誘発するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
対象に投与された後の２４時間以内に、対象においてγδ−Ｔ細胞の数、ＩＬ−１７Ａの産生量およびＩＬ−１βの産生量を増大させるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
対象に投与された１２時間後に、対象においてＩＬ−１０の産生量を増大させるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
可溶性細胞壁タイコ酸結合ペプチドグリカン（ＷＴＡ−ＰＧＮ）の調製方法であって、
（１）リポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ｌｇｔ）およびＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｏａｔＡ）遺伝子が野生型スタフィロコッカス・アウレウスから欠失されている二重変異菌株を得る工程；
（２）二重変異の菌株を破壊し、その破壊した菌株から不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程；
（３）不溶性ＷＴＡ−ＰＧＮをβ−溶菌酵素で処理する工程；
（４）工程（３）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションを得る工程；
（５）可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを含むフラクションをリゾチームまたはムタノリシンで処理する工程；および
（６）工程（５）における酵素処理産物から可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを得る工程を含む、方法。
【請求項１４】
可溶性ＷＴＡ−ＰＧＮを精製する工程を工程（６）の後にさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
スタフィロコッカス・アウレウス感染病の例として、軟部組織感染症、化膿性関節炎、化膿性骨髄炎、中耳炎、肺炎、敗血症、急性呼吸器感染症、カテーテル関連感染症、術後感染症、菌血症、心内膜炎および食中毒が挙げられてもよいが、それらに限定されない。
【国際調査報告】
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