(57)【要約】哺乳動物における免疫性を調節する方法が、その哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節することによって得られる。免疫の増進または増強は、その哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激することによって、例えばガレクチン−９アゴニストをその哺乳動物に投与することによって行うことができる。このアゴニストは、ガレクチン−９に結合する多量体の可溶性ＰＤ−Ｌ２またはアゴニスト抗体であることができる。免疫の抑制または妨害は、その哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断することによって、例えばガレクチン−９に結合するか、またはＰＤ−Ｌ２の多量体化および／もしくはガレクチン−９との結合を妨害もしくは阻害するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントを投与することによって達成することができる。上記方法は、ガレクチン−９活性の調節に応答する疾患、障害、または状態を予防または治療するのに適していることができる。ガレクチン−９活性を調節することによって免疫を調節するのに役立ち得るガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、またはアンタゴニストを設計する、選別する、操作する、または他に産生する方法がまた提供される。
2017521445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における免疫性を調節する方法であって、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節して、それにより前記哺乳動物における免疫性を調節するステップを含む、方法。
【請求項２】
哺乳動物における免疫性を増進または増強する方法であって、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激して、それにより前記哺乳動物における免疫性を刺激または増強するステップを含む、方法。
【請求項３】
前記哺乳動物にガレクチン−９アゴニストを投与して、それにより前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔｈ１に仲介される免疫応答および免疫記憶の少なくとも一方を刺激し、または開始させ、あるいはその両方を行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）多量体の可溶性ＰＤ−Ｌ２または１以上のその多量体で生物学的に活性なフラグメント；および、
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＤ−Ｌ２の多量体化を誘導するか、または多量体ＰＤ−Ｌ２を模倣する作用物質、
の少なくとも一方を、前記哺乳動物に投与するステップを含み、多量体ＰＤ−Ｌ２が二量体ではない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＤ−Ｌ２の多量体化を誘導する前記作用物質が抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多量体ＰＤ−Ｌ２を模倣する前記作用物質がアプタマーである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ガレクチン−９に結合するアゴニスト抗体または抗体フラグメントを前記哺乳動物に投与するステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物の疾患、障害、または状態を治療または予防する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物における免疫性を抑制または妨害する方法であって、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を少なくとも部分的に阻害または遮断して、それにより前記哺乳動物における免疫性を抑制または妨害するステップを含む、方法。
【請求項１１】
ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストを前記哺乳動物に投与して、それにより前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との間の結合相互作用に干渉する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストがＰＤ−Ｌ２に結合して、それによりガレクチン−９との結合を阻害する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストがＰＤ−Ｌ２に結合して、ＰＤ−Ｌ２の多量体化を妨害または阻害する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストが、抗ＰＤ−Ｌ２抗体または抗体フラグメントである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストが、可溶性ガレクチン−９もしくはその生物学的に活性なフラグメント、および、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するＰＤ−Ｌ２の単量体または二量体形、の少なくとも一方を含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストが、ガレクチン−９に結合して、それにより前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物の疾患、障害、または状態を治療または予防する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物の疾患、障害、または状態を治療または予防する方法であって、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節して、それにより前記疾患、障害、または状態を治療または予防するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記疾患、障害、または状態が、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激することにより免疫性を増進または増強させることに応答する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物にガレクチン−９アゴニストを投与するステップを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患、障害、または状態が癌であるか、または病原体によって引き起こされるか、あるいはその両方である、請求項９および１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患、障害、または状態が、前記哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断することにより免疫性を抑制または妨害することに応答する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物にガレクチン−９アンタゴニストまたはインヒビターを投与するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患、障害、または状態が、自己免疫疾患および炎症性疾患の少なくとも一方である、請求項１８、１９、２３、および２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、またはアンタゴニストを設計する、選別する、操作する、あるいは産生する方法であって、
（ｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を活性化または刺激し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を刺激または増強することができるアゴニストであるかどうかを判断するステップ；または
（ｉｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を遮断または阻害し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害することができるアンタゴニストま
たはインヒビターであるかどうかを判断するステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
ステップ（ｉ）において前記候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を模倣する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｉｉ）において前記候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を遮断または阻害する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ガレクチン−９が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞によって発現する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法によって産生されるガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビター。
【請求項３２】
ガレクチン−９アゴニストと免疫原とを含む組成物。
【請求項３３】
ガレクチン−９アンタゴニストまたはインヒビターを含む組成物。
【請求項３４】
前記ガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターが、請求項３１に記載のガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターである、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法に従って使用するための、請求項３１に記載のガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビター、または請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法に関する。より詳細には、本発明は、ガレクチン−９を標的にして免疫応答を調節し、およびそれにより１つまたは複数の疾患、障害、または状態を予防または治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞機能を下方制御することが知られている分子の拡張ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１は、２種類の既知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）（非特許文献１；非特許文献２）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）（非特許文献３：非特許文献４）を有する。これらは両方ともＢ７共シグナル伝達分子のファミリーに属する。ＰＤ−１の発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、および活性化単核細胞上で観察され得る（非特許文献５）。ＰＤ−１は、休止Ｔ細胞上では発現しないが、活性化すると誘発される（非特許文献６）。ＰＤ−１結合反応の機能的な効果は、Ｔ細胞の活性化後、数時間以内に観察することができるが、ＰＤ−１細胞表面タンパク質の上方制御には２４時間を要する（非特許文献７）。ＰＤ−１が単独で架橋するときにはシグナル伝達は起きないものの、ＰＤ−１がＴ細胞受容体シグナルと同時に関与する場合、それは阻害シグナルを誘発することができる（非特許文献８）。一般に、Ｔ細胞上のＰＤ−１とそのリガンドとの間の相互作用は、末梢Ｔ細胞トレランスの誘発および維持を制御するとともに、病原体または癌に対する免疫応答の間の増殖およびＴ細胞によるサイトカイン産生について負の調節をする（非特許文献８）。ＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１の別のリガンドである。これは、ＰＤ−１との結合に関してＰＤ−Ｌ１と競合すると一般に考えられている。一般に、ＰＤ−Ｌ２の免疫学的機能は、ＰＤ−Ｌ１と重複すると思われ、およびＰＤ−Ｌ２自体に帰属する可能性のある特定の役割または機能は存在しないと思われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ドング（Ｄｏｎｇ）ら、１９９９年
【非特許文献２】フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら、２０００年
【非特許文献３】ラッチマン（Ｌａｔｃｈｍａｎ）ら、２００１年
【非特許文献４】ツェング（Ｔｓｅｎｇ）ら、２００１年
【非特許文献５】カイル（Ｋｅｉｒ）ら、２００８年
【非特許文献６】アガタ（Ａｇａｔａ）ら、１９９６年
【非特許文献７】チェムニッツ（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ）ら、２００４年
【非特許文献８】シャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）ら、２００７年
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は、プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）およびプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭマラリアに対する保護免疫を調節する。（ａ）ＷＴのコホート（ｎ≧９）および（ｂ）ＰＤ−１ＫＯマウスを非致死性の１０５個のプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）または致死性の１０４個のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ  ｐＲＢＣに感染させ、血液塗沫標本を１〜２日ごとに採取して寄生虫血症を監視した。次いで４０日後、すべての生存しているマウスを１４０日間休養させ、同じ寄生虫で再攻撃感染させた（ｘ目盛上の矢印）。エラーバー：±Ｓ．Ｅ．Ｍ。対数目盛は無症状感染を強調する。すべての野生型マウスは、致死性攻撃感染から７日間以内に死亡した（†）。（ｃ）プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させたＢ６ＷＴ（●）マウスおよびＰＤ−Ｌ１ＫＯ（▲）マウス由来の全ＣＤ１１ｃ＋ＤＣをナイーブマウスに移植し、次いで致死用量のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、それらマウス（合計ｎ＝９）を１〜３日ごとに６０日間超にわたって調べた。ＷＴ  ＤＣを与えられたすべてのマウスが９日目までに死亡し、一方、ＰＤ−Ｌ１ＫＯ  ＤＣを与えられたすべてのマウスが生存した。
【図２】ＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡが、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭおよびプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染後７日目から得た全脾臓ＤＣにおけるリアルタイムＰＣＲによる３種類のハウスキーピング遺伝子の平均と比較された。データは、２つの独立した実験で調製されたＲＮＡを使用して得られたｍＲＮＡレベルの平均および範囲として示される。有意性は反復実験からのプールされたデータに対するノンパラメータｔ−検定を使用して解析された。
【図３】非致死性感染におけるＰＤ−Ｌ２の遮断は感染を悪化させる。対照ＩｇＧによる処理（黒丸）または抗ＰＤ−Ｌ２抗体（白四角）の遮断の後のＷＴマウスの寄生虫血症の平均パーセント。データはＷＴ（合計ｎ＝１０）マウスまたはＰＤ−１ＫＯ（合計ｎ＝１０）マウスにおける２つの独立した実験のうちの１つを表す（＊ｐ＝０．００４８）。
【図４】可溶性合成多量体ＰＤ−Ｌ２は、致死性マラリアから保護し、持続性免疫を生じさせる。Ｂ６マウス（ｎ＝１２）のコホートを致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、３、５、および７日目にマウスに可溶性八量体ＰＤ−Ｌ２またはヒトＩｇＧ（対照Ｉｇ）のいずれかを与えた。感染のクリアランスおよび３ヶ月間の休養の後、生存しているマウスを再び致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭで再攻撃感染させた（矢印：追加のｓＰＤＬ２なし）。
【図５】可溶性合成多量体ＰＤ−Ｌ２は脳マラリアの症状から保護し、生存期間を延ばす。Ｂ６マウス（ｎ＝９）のコホートをプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）マラリアに感染させた。これは８日目までに脳症状を生じ、３、５、および７日目にマウスに可溶性ＰＤ−Ｌ２またはヒトＩｇＧ（対照Ｉｇ）のいずれかを与えた。マウスは、（ａ）脳症状および（ｂ）生存に関して毎日監視された。マウスは、過剰ＴＮＦが原因のＤＣ機能の欠如により最終的には死亡した（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）２００７年）。
【図６】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇化の研究は、重症マラリアに対する防御におけるこれらの細胞の役割を示す。（ａ）致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、ｒＩｇ（黒丸）による処理、またはＣＤ４＋Ｔ細胞（白四角）もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞（白丸）の枯渇したｓＰＤ−Ｌ２（黒四角）による処理の後のＷＴマウスの平均生存比率。
【図７】ｓＰＤ−Ｌ２による防御はＰＤ−Ｌ１の遮断を介さない。ＷＴおよびＰＤ−Ｌ１ノックアウトマウスのコホートを致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、対照ＩｇＧまたはｓＰＤ−Ｌ２のいずれかで処理した。マウスは寄生虫血症に関して監視された。
【図８】固定化ＰＤ−Ｌ２によってＴ細胞からガレクチン−９を免疫沈降させる。全マウスＴ細胞集団のライゼートを固定化ＩｇＧまたはＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。質量分光光度計分析のためにそのバンドを切断し、消化した。ガレクチン−９（２）は、ＰＤ−Ｌ２による免疫沈降に特有のものであった。
【図９】固定化ＰＤ−Ｌ２によってＴ細胞から免疫沈降させたガレクチン−９のウェスタンブロット。全マウスＴ細胞集団のライゼートを固定化ＩｇＧまたはＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。そのゲル上のタンパク質が、ガレクチン−９について免疫標識したニトロセルロースに移された。
【図１０】ｓＰＤ−Ｌ２はＴ細胞上でガレクチン−９に結合する。ナイーブマウスの脾臓から全Ｔ細胞集団を単離し、ビオチン化ｓＰＤ−Ｌ２およびＡＰＣ−スプレプトアビジンまたはＰＥ−抗ガレクチン−９と共にインキュベートした。Ｔ細胞はまた、ビオチン化ｓＰＤ−Ｌ２およびＡＰＣ−スプレプトアビジンで標識する前に、標識されていない抗ガレクチン−９抗体と共にインキュベートされた。すべての試料がまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を識別するために標識された。
【図１１】可溶性ＰＤ−Ｌ２は、ナイーブマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の分化と、ガレクチン−９によって仲介されるそれらのＴＢＥＴレベルとを増大させる。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３、ＩＬ−２、およびグラフ上に示した刺激物と一緒に培養した。ｓＰＤ−Ｌ２は、ラットＩｇＧ処理と比較して（ａ）ＴＢＥＴを発現させるＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｏ細胞の割合と、（ｂ）細胞内のＴＢＥＴのレベルとを増加させた。この効果は、ガレクチン−９インヒビターであることが確定している抗ガレクチン−９（クローン１０８Ａ）抗体によって遮断された。クローンＲＧ９．１もまた、ＴＢＥＴを発現させるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｏ細胞の割合を増加させた。
【図１２】可溶性合成ＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９抗体は、致死性マラリアの症状から守る。Ｂ６マウス（ｎ＝３）のコホートを致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、３、５、および７日目にマウスに可溶性ＰＤ−Ｌ２、抗ガレクチン−９、またはヒトＩｇＧ（対照Ｉｇ）のいずれかを与えた。マウスを毎日監視し、疾患の症状および生存にスコアを付けた。スコアが４に達したときにマウスを安楽死させた。臨床スコアに及ぼすｓＰＤＬ２のプラス効果は、ガレクチン−９刺激物質（作動性抗体（ａｇｏｎｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））であることが確定しているＲＧ１によって模倣され、かつそれによって改善される。
【図１３】マウスＰＤ−Ｌ２−ガレクチン−９は高度に安定であり、それはガレクチン−９およびＰＤ−Ｌ２の多量体化を伴う。ガレクチン−９とＰＤ−Ｌ２との間の結合の生化学的性質を決定するためにオクテット・レッド（Ｏｃｔｅｔ  ｒｅｄ）による研究が実施された。ｓＰＤ−Ｌ２をプローブと結合させ、そのｓＰＤ−１およびｓガレクチン−９との相互作用を測定した。ＰＤ−Ｌ２−ＰＤ−１結合曲線は、０．０２秒未満（アッセイの検出感度）でＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１に結合し、かつ０．０２秒未満で解離することを示す。このＰＤ−Ｌ２−Ｇａｌ−９曲線は、ガレクチン−９結合が、会合に２９９．９９秒を、および解離に６１４．２１秒を要することを示し、これはＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との間の極めて安定な相互作用を表す。ピークの高さは、ＰＤ−１では見られないガレクチン−９の大きい集合体を示し、これはガレクチン−９およびＰＤＬ２が結合の間に多量体化することを表す。
【図１４】マウスｓＰＤ−Ｌ２または抗ガレクチン−９抗体で処理したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌されるサイトカイン。ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓から単離し、抗ＣＤ３および刺激物と一緒に３日間培養し、上清を回収してサイトカイン、インターフェロン−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αを測定した。エラーバーはＳＥＭを表し、およびデータは２回の実験のうちの１つを表す。
【図１５Ａ】ヒトｓＰＤ−Ｌ２で処理したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌されるサイトカイン。ヒトＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＴＣＲの活性化に似せるようにＰＭＡおよびイオノマイシンと一緒に３日間培養した。次いで細胞をｓＰＤ−Ｌ２または対照と一緒に培養し、３日目に上清を回収してサイトカイン、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４を測定した。エラーバーはＳＥＭを表し、およびデータは２回の実験からのプールされたデータを表す。
【図１５Ｂ】抗マウスガレクチン−９で処理したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γ。ヒトＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＴＣＲの活性化に似せるように準最適濃度の抗ＣＤ３と一緒に３日間培養した。次いで細胞をヒトｓＰＤ−Ｌ２または抗マウスガレクチン−９と一緒に培養し、３日目に上清を回収してサイトカインを測定した。エラーバーはＳＥＭを表し、およびデータは１回の実験を表す。
【図１６】抗ガレクチン−９活性化抗体（しかし、抗Ｔｉｍ３遮断抗体ではない）は致死性マラリアから防御する。感染後３、５、および７日目に対照ラットＩｇＧで処理し、抗Ｔｉｍ３抗体を遮断するまたは抗ガレクチン−９抗体を活性化させるＷＴマウスにおけるプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭマラリアの典型的な過程の寄生虫血症の平均パーセント。エラーバーはＳＥＭを表し、およびデータはＴｉｍ３については２回の実験のうちの１つ、抗ガレクチン−９については３回の実験のうちの１つを表す。
【図１７】抗ガレクチン−９処理は乳腺癌の進行を軽減する。マウスのコホートに（ａ）ＰＹＭＴ由来の乳癌、または（ｂ）ＥＯ７７１  ＬＭＢ乳癌を異所移植し、対照ＩｇＧまたは抗ガレクチン−９抗体のいずれかで処理した。マウスを１〜２日ごとに監視して腫瘍の進行を監視した。ＱＩＭＲ−Ｂの倫理は、胸部に移植した腫瘍が約５２５ｍｍ２に達した場合、マウスを安楽死させることを必要とする。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１８】ＰＤ−Ｌ２の遮断は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染したマウスの脾臓中の寄生虫特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害する。プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染させ、ラットＩｇＧまたは抗ＰＤ−Ｌ２遮断抗体で処理したＷＴマウスにおける様々なパラメータの分析。すべてのデータは、バーが中央値を表す散布図に示される。（ａ、ｂ）は、（ａ）７日目（ｎ＝４）および（ｂ）１４日目（ｎ＝７）の脾臓当たりのＴｂｅｔ発現ＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉおよびＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の数。（ｃ）は、ナイーブＤＣ（ｎ＝７）の存在下で寄生虫抗原（ＭＳＰ１１９）に応答してＥＬＩＳＰＯＴ培養物中でインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌したＣＤ４＋Ｔ細胞の数。（ｄ、ｅ）は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染マウス（ｎ＝７）の血清中の（ｄ）ＩＦＮ−γおよび（ｅ）ＩＬ−１０のレベル。（ｆ）は、脾臓（ｎ＝７）当たりのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現させるＣＤ４＋Ｔ細胞（調節Ｔ細胞）の数。１４日目のデータは、２つのプールされる独立した実験を表す。有意性は、両側検定に基づくノンパラメトリックマン−ホイットニーＵ検定を使用して解析された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。Ｆ検定は、群間の有意に異なる分散を見出した。
【図１９】ＰＤ−Ｌ２は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬマラリアの期間中のＴｈ１免疫を調節する。（Ａ、Ｂ）は、（Ａ）ＷＴマウスおよびＰＤ−Ｌ２ＫＯマウス（ｎ＝４）または（Ｂ）ラットＩｇＧまたは抗ＰＤ−Ｌ２遮断抗体で処理したマウス（ｎ＝５）におけるプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬマラリアの典型的な過程の間の臨床症状のスコア。（Ｃ〜Ｆ）散乱図は、ラットＩｇＧまたは抗ＰＤ−Ｌ２遮断抗体で処理したＷＴマウス、またはプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染させたＰＤ−Ｌ２ＫＯマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の１４日間の解析を示す。（Ｃ）は、脾臓当たりのＴｂｅｔ発現ＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉまたはＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の平均数。（Ｄ）は、ナイーブＤＣの存在下で寄生虫抗原（ＭＳＰ１１９）に応答してＥＬＩＳＰＯＴ培養物中でＩＦＮ−γを分泌した脾臓当たりＣＤ４＋Ｔ細胞の平均数。（Ｅ〜Ｆ）は、ナイーブＤＣの存在下で寄生虫抗原（Ｐｂ１）に応答してＥＬＩＳＰＯＴ培養物中でＩＦＮ−γを分泌した脾臓当たりＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数。（Ｅ）ＰＤ−Ｌ２遮断ありおよびなしでプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染後１４日目に採取した細胞（ｎ＝７）。（Ｆ）ＰＤ−Ｌ２ＫＯマウスおよび対照由来のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染後１４日目に採取した細胞。データは、一度行われたＰＤ−Ｌ２ＫＯマウス以外は２つの独立した実験からプールされる。エラーバーはＳＥＭを表す（＊Ｐ＜０．０５）。有意性は、ノンパラメトリックマン−ホイットニーＵ検定を使用して解析された。
【図２０】ｓＰＤ−Ｌ２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を介して保護および生存を仲介する。（ａ）は生存曲線、（ｂ〜ｄ）は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染後３、５、および７日目に対照のヒトＩｇＧ（ｈＩｇ）またはｓＰＤ−Ｌ２で処理したＷＴマウスにおける寄生虫血症の平均パーセント。次いでマウスは、感染後１日目に始まり、感染後１４〜１８日目まで、３〜４日ごとの（ｂ）ラットＩｇ、（ｃ）枯渇化抗ＣＤ４抗体、または（ｄ）枯渇化抗ＣＤ８抗体（ｎ＝４）で同時処理された。データは、２回の独立した実験（類似した結果が得られた）のうちの１つを表す。ｓＰＤ−Ｌ２＋ラットＩｇＧ処理群と対照群（ラットおよびヒトＩｇＧを与えた）との間の、またはｓＰＤ−Ｌ２＋ラットＩｇＧ処理群とＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇したｓＰＤ−Ｌ２処理群との間の生存の有意性を、プールされた実験からのデータに基づくログ−ランク（マンテル−コックス）検定を使用して解析した。
【図２１】ｓＰＤ−Ｌ２は、Ｔｈ１  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能を促進させることによって致死性マラリアからマウスを保護する。プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、感染後３、５、および７日目に対照ヒトＩｇＧまたはｓＰＤ−Ｌ２で処理したＷＴマウス（ｎ＝８）における様々なパラメータの分析（感染後７日目）。すべてのデータは散布図中に示され、バーは中央値を表す。（ａ）ナイーブＤＣの存在下で寄生虫抗原ＭＳＰ１１９に応答してＥＬＩＳＰＯＴ培養物中でＩＦＮ−γを分泌したＣＤ４＋Ｔ細胞の数。（ｂ）ＥｄＵを取り込むことによって測定される、ナイーブＤＣの存在下で寄生虫抗原ＭＳＰ１１９に応答して培養物中で増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞の数。（ｃ）脾臓当たりのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現させるＣＤ４＋Ｔ細胞の数。（ｄ）脾臓当たりの寄生虫特異的Ｐｂ１−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。（ｅ）ナイーブＤＣの存在下で寄生虫ペプチドＰｂ１に応答して培養物中でＩＦＮ−γを分泌したＣＤ８＋Ｔ細胞の数（ＥＬＩＳＰＯＴによって求められる）。（ｆ）ＣＤ１１ａ（最新の活性化のマーカ）およびグランザイムＢを発現させたＣＤ８＋Ｔ細胞の数。データは、それまでに始められた四量体およびグランザイムＢの標識化以外は２つのプールされた独立した実験を表す。有意性は、両側検定に基づくノンパラメトリックマン−ホイットニーＵ検定を使用して解析された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５）。Ｆ検定は、群間の有意に異なる分散を見出した。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的には、ガレクチン−９がＰＤ−Ｌ２の受容体であるという予期しない発見から生じた。したがって、ＰＤ−Ｌ２の免疫学的効果の少なくとも幾つかは、ＰＤ−１によってというよりもむしろ、ガレクチン−９との多量体ＰＤ−Ｌ２の結合によって仲介され得る。したがって、本発明は、広義には、ガレクチン−９を標的にして、それにより免疫システムを調節することに向けられる。１つの広範な実施形態では、本発明は、ガレクチン−９を活性化または刺激することによって哺乳動物における免疫性を増進または増強することに向けられる。別の広範な実施形態では、本発明は、ガレクチン−９を阻害または遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）することによって哺乳動物における免疫性を抑制または妨害することに向けられる。
【０００６】
本発明の態様は、哺乳動物における免疫性を調節する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節して、それにより哺乳動物における免疫性を調節するステップを含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明の特定の態様は、哺乳動物における免疫性を増進または増強する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激して、それにより哺乳動物における免疫性を刺激または増強するステップを含む、方法を提供する。
【０００８】
好適には、この方法は、哺乳動物にガレクチン−９アゴニストを投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
一実施形態では、この方法は、可溶性ＰＤ−Ｌ２またはその生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
【０００９】
好適には、可溶性ＰＤ−Ｌ２は、ｎ個のモノマー（ここで、ｎ≧３である）を含む多量体である。
一実施形態では、この方法は、ガレクチン−９に結合するアゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
【００１０】
好適には、これは、Ｔｈ１に仲介される免疫応答および／または免疫記憶を刺激かつ／または開始させる。
本発明の別の特定の態様は、哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を少なくとも部分的に阻害または遮断して、それにより哺乳動物における免疫性を抑制または妨害するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
好適には、この方法は、ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または妨害するステップを含む。好ましくは、インヒビターまたはアンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との間の結合相互作用を少なくとも部分的に妨害するか、またはそれに干渉する。
【００１２】
一実施形態では、この方法は、可溶性ガレクチン−９またはその生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む。
【００１３】
一実施形態ではこの方法は、ガレクチン−９に結合するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む。
【００１４】
本発明の関連する態様は、哺乳動物の疾患、障害、または状態を治療または予防する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節して、それにより疾患または状態を予防または治療するステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、その疾患、障害、または状態は、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激することによる免疫の増進または増強に応答する。好ましくは、この方法は、ガレクチン−９に結合するアゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
【００１６】
別の実施形態では、その疾患、障害、または状態は、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断することによる免疫の抑制または妨害に応答する。１つの特定の実施形態では、この方法は、可溶性ガレクチン−９またはその生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む。別の特定の実施形態では、この方法は、ガレクチン−９に結合するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、ガレクチン−９アゴニストと免疫原とを含む組成物を提供する。好適には、組成物は、免疫原に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物またはワクチンである。その免疫原は、病原体（例えば、不活化ウィルスもしくは弱毒細菌）またはその病原体の分子成分であることができる。好適には、組成物は、適切な担体、増量剤、または賦形剤を含む。
【００１８】
本発明の更なる態様は、ガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、またはアンタゴニストを設計する、選別する、操作する、あるいは産生する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を活性化または刺激し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を刺激または増強することができるアゴニストであるかどうかを判断するステップ、または（ｉｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を遮断または阻害し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害することができるア
ンタゴニストまたはインヒビターであるかどうかを判断するステップを含む。
【００１９】
一実施形態では、ステップ（ｉ）において候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を模倣する。
一実施形態では、ステップ（ｉｉ）において候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を遮断または阻害する。
【００２０】
本発明の更なる態様は、先の態様の方法に従って産生されるガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、またはアンタゴニストを提供する。
本発明の更なる態様は、先の態様のガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、またはアンタゴニストを含む組成物を提供する。好適には、組成物は、適切な担体、増量剤、または賦形剤を含む。
【００２１】
本明細書の全体を通じて、別段の指示がない限り「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包含的に使用され、したがって述べられる整数または整数群は、１つまたは複数の他の述べられていない整数または整数群を含むことができる。
【００２２】
本明細書中で使用される「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」などの不定冠詞は、単一要素または単数形要素を指すかまたは指定するのではなく、１つまたは複数の要素を指すかまたは指定する。
【００２３】
（詳細な説明）
ＰＤ−Ｌ２は、プログラム死の受容体−１（ＰＤ１）およびＲＧＭｂのリガンドであり、ガレクチン−９（Ｇａｌ−９）が、これまで知られていないＰＤ−Ｌ２の受容体であることを本明細書中で提言する。可溶性ＰＤ−Ｌ２で処理したマウスは、致死性マラリア株で攻撃感染された場合に死亡しない。ＰＤ−Ｌ２に仲介される防御はＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇すると失われるため、ＰＤ−Ｌ２がＣＤ４＋Ｔ細胞を介して防御を仲介することを提言する。したがって、可溶性ＰＤ−Ｌ２（ｓＰＤＬ２）または作動性（ａｇｏｎｉｓｉｎｇ）抗ガレクチン−９抗体の投与は、免疫刺激物質としての役割を果たすことができ、かつ／またはＴｈ１に仲介される免疫応答および免疫記憶の少なくとも一方を開始させることができる。これは、免疫記憶の発生および維持を含む癌、感染因子、および寄生虫、特に癌に対する免疫応答の刺激に有効である可能性がある。また、ガレクチン−９に対するブロッキングまたはアンタゴニスト抗体の投与が、ＰＤ−Ｌ２で見られる効果を妨害または阻害する可能性があることを提言する。ＰＤ−Ｌ２と結合し、そのガレクチン−９との相互作用を遮断する抗体は、ガレクチン−９アンタゴニスト抗体と同様の効果を有することができる。これは免疫の抑制を補助することができ、例えば自己免疫疾患、炎症、および／またはアレルギーの治療または予防に役立ち得る。
【００２４】
本発明の目的では「単離された」とは、その自然の状態から取り出された、または人間の操作を受けた物質を意味する。単離された物質は、その自然の状態で通常それに随伴する成分を実質的にまたは本質的に含まなくてもよく、または人工的状態において、その自然の状態で通常それに随伴する成分と一緒になるように操作することもできる。単離された物質は、天然の、化学合成の、または組換え型の形態であることができる。
【００２５】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野でよく理解されている天然または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であることができる。
「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００２６】
「ポリペプチド」は、５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質である。
本明細書中で使用される「ガレクチン−９」または「Ｇａｌ−９」は、β−ガラクトシド糖、例えばＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に対するそれらの結合特異性によって定義されるガレクチンファミリーのタンパク質のうちのタンパク質を指す。これらのタンパク質はまた、それらが安定性および糖結合性についてジスルフィド結合に依存しているためにＳ型レクチンとも呼ばれる。ＬＧＡＬＳ遺伝子によってコードされる１５種類のガレクチンが哺乳動物中で発見されており、そのうちのガレクチン−１、−２、−３、−４、−７、−８、−９、−１０、−１２、および−１３は、ヒトにおいて同定されている。ヒトガレクチン−９は、一般には３５５個のアミノ酸配列（基準配列または「ロングフォーム（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）」配列と呼ばれる）を含むが、１４９〜１８０番の残基を欠く「ショートフォーム（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）」変異型が存在する。好適には、本発明に関連して、ガレクチン−９は、リンパ球またはＮＫ細胞によって発現される。リンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＢ細胞であることができる。ヒトガレクチン−９のアミノ酸配列の非限定的な例は、ユニプロット・ＫＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＫＢ）受託番号Ｏ００１８２で見出すことができ、マウスガレクチン−９のアミノ酸配列の非限定的な例は、ユニプロット・ＫＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＫＢ）受託番号Ｏ０８５７３で見出すことができる。
【００２７】
本明細書中で使用される「抗体」は、免疫グロブリンであるか、免疫グロブリンを含む。用語「免疫グロブリン」には、哺乳類の免疫グロブリン遺伝子複合体の任意の抗原結合タンパク質産物が挙げられ、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＥと、その抗原結合フラグメントとを含む。用語「免疫グロブリン」には、キメラのまたはヒト化された免疫グロブリンが含まれ、または別の方法では天然に産出されようと、ヒトの介入（例えば組換えＤＮＡ技術による）によって産生されようと、改変されまたは変異型のアミノ酸の残基、配列、および／または糖鎖付加を含む。
【００２８】
抗体フラグメントには、ＦａｂおよびＦａｂ’２フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、および一本鎖抗体のフラグメント（例えばｓｃＶｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に抗体は、それぞれがＣＤＲ１、２、および３アミノ酸配列を含む個別の軽鎖および重鎖可変領域を含む。好ましい抗体フラグメントは、少なくとも１個の軽鎖可変領域ＣＤＲおよび／または少なくとも１個の重鎖可変領域ＣＤＲを含む。
【００２９】
抗体および抗体フラグメントはポリクローナル、または好ましくはモノクローナルであることができる。モノクローナル抗体は、ガレクチン−９またはそのフラグメントを接種された産生種から得られる脾臓または他の抗体産生細胞を固定化することによる、例えばケラーおよびミルステイン（Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）による論文、１９７５年、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６号、ｐ．４９５〜４９７に記載されているような標準的な方法を使用して、または例えばコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）らの著「免疫学における最近のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」の第２章に記載されているようなその最近の修正法によって産生させることができる。これらの抗体は、その抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を適切な宿主細胞中で発現させることによって組換え合成抗体または抗体フラグメントとして産生し得ることも理解されるはずである。組換え合成抗体または抗体フラグメントの重鎖または軽鎖は、同じ宿主細胞中で様々な発現ベクターから共発現させることも、または宿主細胞中で一本鎖抗体として発現させることもできる。組換え抗体の発現および選択技術の非限定的な例は、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら著「免疫学における最近のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」の第１７章、およびツベルブラー（Ｚｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒ）らの論文、２００９年、プロテイン・エンジニアリング・デザイン・アンド・セレクション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、第２２巻、ｐ．１６９中で得られる。
【００３０】
これらの抗体および抗体フラグメントは、別の種中で産生させまたは別の種が起源であって、「異質の」抗体に対して有害な免疫応答を顕在化させることなく、ある種に投与可能であるように修飾することができる。ヒトに関連して、これは、別の種中で産生させた抗体、または別の種が起源の抗体の「ヒト化」である。このような方法は当技術分野でよく知られており、一般には非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のヒト抗体の骨格またはバックボーン上への組換え「移植」を伴う。
【００３１】
幾つかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは標識される。
標識は、色素原、触媒、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、蛍光団、化学発光分子、放射性同位元素、薬剤または他の化学療法剤、磁気ビーズ、および／または直接可視標識を含む群から選択することができる。
【００３２】
本発明の態様は、哺乳動物における免疫性を調節する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を調節して、それにより哺乳動物における免疫性を調節するステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では「免疫性を調節する」とは、哺乳動物における免疫性を増進または増強することを意味する。これに関連して、ガレクチン−９活性は、例えばアゴニストによって刺激または増大される。
【００３４】
別の実施形態では「免疫性を調節する」とは、哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制、阻害、または妨害することを意味する。これに関連して、ガレクチン−９活性は、例えばガレクチン−９アンタゴニストまたはインヒビターによって少なくとも部分的に遮断または阻害される。
【００３５】
したがって本発明の１つの特定の態様は、哺乳動物における免疫性の増進または増強する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化、増加、または刺激して、それにより哺乳動物における免疫性を刺激または増強するステップを含む、方法を提供する。
【００３６】
好適には、この方法は、哺乳動物にガレクチン−９アゴニストを投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
これに関連して、「アゴニスト」とは、ガレクチン−９活性を少なくとも部分的に活性化、増加、または刺激する分子を意味する。アゴニストは、ＰＤ−Ｌ２などのガレクチン−９の天然のリガンドであってもよく、またはＰＤ−Ｌ２などの天然のリガンドの作用を模倣していてもよい。１つの特定の実施形態では、この方法は、哺乳動物に可溶性ＰＤ−Ｌ２またはその生物学的に活性なフラグメントを投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。好適には、ＰＤ−Ｌ２は多量体であり、好ましくはｎ個のモノマー（ここで、ｎ≧３である）を含む。好ましくは、多量体ＰＤ−Ｌ２は、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のＰＤ−Ｌ２モノマーを含む。１つの特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２は、８個のモノマーを含む（すなわち、ｎ＝８、すなわち八量体である）。これに関連して、多量体ＰＤ−Ｌ２は、各モノマーの共有結合を容易にするためのリンカーアミノ酸またはペプチドの使用を含む例えばモノマーの化学的架橋によって、共有結合により誘導または形成することができる。他の実施形態では、多量体ＰＤ−Ｌ２の効果は、ペプチドもしくは核酸（例えばオリゴヌクレオチド）アプタマーなどの作用物質によって、またはＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との両方に結合する二重特異性抗体によって模倣することもでき、またはペプチドもしくは核酸（例えばオリゴヌクレオチド）のアプタマーなどの作用物質によって模倣することもできる。アゴニストは、ガレクチン−９と結合して、それによりガレクチン−９活性を活性化または
刺激することができる任意の他の分子、例えばアゴニスト抗体または抗体フラグメントであることができる。１つの特定の実施形態では、この方法は、ガレクチン−９に結合するアゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を活性化または刺激するステップを含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、アゴニストは、哺乳動物に投与されると免疫応答を刺激または増強することができる。免疫応答には、癌または病原体、例えば感染症および／または寄生虫性疾患を引き起こすもの（特にその病原体が免疫記憶を無効にし、消去し、または回避することによって免疫システムを回避する場合）に対する免疫記憶の誘発を挙げることができる。非限定的な例は、免疫記憶を消去してそれにより後に再感染を可能にするマラリアである。
【００３８】
癌に関連して、アゴニストの癌患者への投与は、免疫記憶を創出、誘発、かつ／または維持することができ、その結果、そうでなければ非自己シグナルが低いかまたは不足しているが、腫瘍細胞が異物として認識されるようになる。
【００３９】
別の実施形態では、ガレクチン−９アゴニストは、ワクチンまたは他の免疫原性組成物中で免疫原と組み合わせてアジュバントとして投与することができる。これは、ワクチンまたは免疫原性組成物の効力を高めることができ、かつまたブースタワクチン接種の必要性を取り除くか、できるだけ少なくすることができる。この実施形態の特定の形態では、アゴニストの投与は、免疫原または病原体の免疫記憶を十分に刺激しない不成功または準最適なワクチンまたはワクチン接種を救出または回復させることができる。免疫原は、病原体の成分分子（例えば、細胞表面タンパク質、免疫原性ペプチドまたは「サブユニットワクチン」の場合などのその他の成分、複数のＢ−および／またはＴ−エピトープ、ＶＬＰ、カプシド、またはキャプソメア）、不活化病原体（例えば、不活化ウィルス、弱毒化した寄生虫感染ＲＢＣ、または弱毒化細菌）、または病原体に対する免疫応答を誘発することができる任意の他の分子または構造体であることができる。例えば、マラリア免疫感作の向上におけるＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９抗体アゴニスト投与の有効性を実証する実施例を参照されたい。
【００４０】
哺乳動物へのアゴニストの投与は、ナイーブＴ−細胞を刺激してＴｈ１の系統の選択および／または関与を行わせることができる。当業者は理解するはずであるように、Ｔｈ１の系統には、これらに限定されないがインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αを含む多くの因子のうちの１つを産生、分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔｈ１細胞は、細胞内細菌、寄生原虫、およびウィルスに対する免疫応答において特に重要である。Ｔｈ１細胞はＩＬ−１２およびＩＬ−２によって誘発され、続いて免疫エフェクター細胞、例えばマクロファージ、顆粒球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩｇＧを発現するＢ細胞、樹状細胞、および他のＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する。
【００４１】
前述から、例えば本明細書中で開示されるアゴニストによるガレクチン−９の活性化または刺激は、哺乳動物の疾患、障害、または状態を治療または予防することができる。
本明細書中で使用される「治療すること」、「治療する」、または「治療」とは、少なくとも症状が現れ始めた後、その疾患、障害、または状態の症状を少なくとも改善する治療的介入、一連の行動、またはプロトコルを指す。本明細書中で使用される「予防すること」、「予防する」、または「予防」とは、疾患、異常、もしくは状態、または症状の発症または進行を予防、阻害、または遅延するようにその疾患、障害、または状態の症状の発現前に開始される治療的介入、一連の行動、またはプロトコルを指す。このような予防的治療は、「感染予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」または「感染予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」処置と呼ぶことができる。特定の実施形態では、免疫接種または予防接種は、予防的または感染予防的免疫療法である。
【００４２】
広範な実施形態において、疾患、障害、または状態は、病原体によって引き起こされる。その病原体は、ウィルス、細菌、または寄生虫であることができる。寄生虫の非限定的な例には、これらに限定されないが、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、サルマラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉｉ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）などのプラモジウム種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ）を含むマラリア寄生虫などの原虫が挙げられる。他の寄生虫には、これらに限定されないが、バベリア種（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ）、赤痢アメーバ種（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ）、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ）と、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ）を含むトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）とが挙げられる。
【００４３】
ウィルス性病原菌の非限定的な例には、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、エボラウィルス、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、乳頭腫ウィルス、麻疹ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、風疹ウィルス、ライノウィルス、フラビウィルス（例えばＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ））、西ナイルウィルス、日本脳炎ウィルスおよびデングウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、およびエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【００４４】
細菌病原体の非限定的な例は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボリデテラ（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｏｒｉｏ）、およびトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）などの属のものであることができ、これらには黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、口腔レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・パラサングィニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、緑色レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・ムルチシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｃｉｄａ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・アシアティカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉ
ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、リケッチア・リケッチィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、イヌ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｏｐｈｉｌａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔａｎｕｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ピンタトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｃａｒａｔｅｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）などの種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
別の広範な実施形態では、その疾患、障害、または症状は癌である。本明細書中で一般に使用される用語「癌」、「腫瘍」、「悪性」、および「悪性腫瘍」とは、腫瘍形成、腫瘍マーカの発現、腫瘍サプレッサーの発現または活性の喪失、および／または非正常または異常な細胞表面マーカの発現と関係のある１つまたは複数の遺伝子突然変異または他の遺伝的変化を含む、非正常または異常な分子の表現型を伴うことが多い非正常または異常な細胞の増殖、分化、および／または移動によって特徴付けられる疾患または状態、あるいはその疾患または状態と関係のある細胞または組織を指す。癌および腫瘍の非限定的な例には、肉腫、癌腫、腺腫、白血病およびリンパ腫、肺癌、大腸癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、神経芽腫および神経膠芽腫および他の神経癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、頭部および頸部癌、腎臓癌、前立腺癌、および黒色腫が挙げられる。好適には、その癌は、例えば本明細書中で開示されたアゴニストによるガレクチン−９の活性化または刺激に応答する。幾つかの実施形態では、その癌は、ガレクチン−９の活性化または刺激の結果として生じる免疫記憶の誘発または増強に応答する。
【００４６】
本発明の別の特定の態様は、哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害する方法であって、哺乳動物におけるガレクチン−９活性を少なくとも部分的に阻害または遮断して、それにより哺乳動物における免疫性を抑制または妨害するステップを含む、方法を提供する。
【００４７】
好適には、この方法は、ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるガレクチン−９活性を阻害または遮断するステップを含む。好ましくはそのインヒビターまたはアンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との間の結合相互作用を少なくとも部分的に妨害するか、またはそれに干渉する。これに加えてまたはこれに代わって、ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストは、通常はＰＤ−Ｌ２結合に応答して生じることになるガレクチン−９のシグナル伝達を少なくとも部分的に妨害するか、またはそれに干渉する。幾つかの実施形態では、ガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストは、ガレクチン−９（例えば、抗ガレクチン−９抗体または抗体フラグメント）に直接結合する作用物質であってもよく、またはＰＤ−Ｌ２（例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体フラグメント）に直接結合してＰＤ−Ｌの多量体化および／またはガレクチン−９との結合を阻害または遮断してもよい。特定の実施形態では、そのガレクチン−９インヒビターまたはアンタゴニストには、（ｉ）可溶性ガレクチン−９またはその阻害性フラグメント、（ｉｉ）ガレクチン−９に結合して、それによりＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との結合、および／またはガレクチン−９のシグナル伝達を
阻害または遮断するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、あるいは他の作用物質、（ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との結合、および／またはガレクチン−９のシグナル伝達を阻害または遮断する単量体または二量体ＰＤ−Ｌ２、（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ２と結合して、それによりＰＤ−Ｌ２がガレクチン−９と結合するのを妨げる抗体または抗体フラグメント、あるいは他の作用物質、および／または（ｖ）ＰＤ−Ｌ２と結合してＰＤ−Ｌ２の多量体化を妨害または阻害する抗体または抗体フラグメント、あるいは他の作用物質を挙げることができる。
【００４８】
したがって、一実施形態では、この方法は、可溶性ガレクチン−９またはその阻害性フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物のＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との結合を阻害または妨害するステップを含む。一実施形態では、この方法は、ガレクチン−９に結合するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との結合、および／またはガレクチン−９のシグナル伝達を阻害または妨害するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、単量体または二量体ＰＤ−Ｌ２を哺乳動物に投与して、それにより哺乳動物におけるＰＤ−Ｌ２とガレクチン−９との結合、および／またはガレクチン−９のシグナル伝達を阻害または遮断するステップを含む。更なる実施形態では、この方法は、ＰＤ−Ｌ２と結合する抗体または抗体フラグメントを哺乳動物に投与して、それによりＰＤ−Ｌ２がガレクチン−９と結合するのを妨害するステップを含む。更なる実施形態では、この方法は、ＰＤ−Ｌ２と結合する抗体または抗体フラグメント、あるいは他の作用物質を哺乳動物に投与して、哺乳動物中のＰＤ−Ｌ２の多量体化を妨害または阻害するステップを含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では、哺乳動物における免疫性の抑制または妨害は、疾患、障害、または状態の予防または治療を容易にするか、または補助することができる。特定の実施形態では、その疾患、障害、または状態は、アレルギー性の疾患、障害、または状態を含む、自己免疫性の疾患、障害、または状態、および炎症性の疾患、障害、または状態であることができる。
【００５０】
自己免疫性および／または炎症性の疾患、障害、および状態を引き起こす根本的な免疫的機序の共通性のために、自己免疫性疾患、障害、または状態と、炎症性のそれとの間には重複が存在し得ることが理解されるはずである。しかしながら、単に一例として自己免疫性の疾患、障害、または状態には、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、強直性脊髄炎、橋本病、クローン病、筋萎縮性側索硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、グレーブス病、アジソン病、ベーチェット症候群、フォークト小柳−原田（ＶＫＨ：ＶｏｇｔＫｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ）病、関節リウマチ、および乾癬性関節炎が挙げられるが、これらに限定されない。炎症性の疾患、障害、または状態の非限定的な例には、炎症性大腸炎、アテローム性動脈硬化症、骨盤内炎症性疾患、セリアック病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
１つの特定の実施形態では、その疾患、障害、または状態は、Ｔ−ｂｅｔの、またはＴ−ｂｅｔを含むシグナル伝達経路の遮断または阻害に対応する。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｔ−ｂｏｘ転写因子であるＴ−ｂｅｔは、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞だけでなく、ＴおよびＢリンパ球中でエフェクター細胞の運命の確立および／または維持において重要な役割を果たす１型様免疫の主要な調節因子である。Ｔ−ｂｅｔは、これに限定されないが、ＣＤ４Ｔ細胞およびγδＴ細胞中でのＩＦＮ−γ産生を含むＴｈ１エフェクターの機能および分化の維持において重要な役割を果たすことができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔの欠乏は、自己免疫性および／または炎症性の疾患から防御し、一方、Ｔ−ｂｅｔの過剰発現は、自己免疫性および／または炎症性の疾患を促進させる。実施例中でより詳細に述べるように、ＰＤ−Ｌ２／ガレクチン−９経路の遮断はＴ−ｂｅｔを遮断し、したがって、これは自己免疫性お
よび／または炎症性の疾患の治療の新しい方法を提供する可能性を有する。
【００５２】
先に述べたように、ガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、およびインヒビターの投与は、ガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、およびインヒビターを適切な担体、増量剤、または賦形剤と共に含む医薬組成物を投与することによって行うことができる。
【００５３】
一般論として、担体、増量剤、または賦形剤は、全身的投与に安全に使用することができる固体または液体の充填剤、増量剤、緩衝剤、結合剤、またはカプセル充填用物質であることができる。投与の特定の経路に応じて当技術分野でよく知られている様々な担体、増量剤、および賦形剤を使用することができる。これらは、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸塩、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水および塩類（例えば、塩酸塩、臭化物、および硫酸塩を含む鉱酸塩）、糖、糖アルコール、有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、およびマロン酸）、および発熱性物質を含まない水を含む群から選択することができる。薬学的に許容できる担体、増量剤、および賦形剤について記述した有用な参考文献は、「レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）米国ニュージャージ州、１９９１年）である。
【００５４】
幾つかの実施形態では、その組成物は、アジュバントおよび免疫刺激核酸を含む１つまたは複数の免疫調節剤をさらに含むことができる。それらには、これらに限定されないがＴＬＲアゴニスト、リポ多糖およびその誘導体（例えば、ＭＰＬ）、完全または不完全フロイントアジュバント、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジクオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール、ポリアミン（例えばピラン）、硫酸デキストラン、ポリＩＣカーボポール、ペプチド（例えばムラミルジペプチドおよび誘導体）、ジメチルグリシン、タフトシン、オイルエマルジョン、ミネラルジェル（例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバン）、リンホカイン、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ガーディキモド（Ｇｕａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ＱｕｉｌＡ、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ：ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が挙げられる。
【００５５】
ガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターを含む組成物を対象に与えるには、任意の安全な投与経路を使用することができる。例えば、経口、直腸、腸管外、舌下、口内、静脈内、関節内、筋内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、側脳室内、経皮などを使用することができる。
【００５６】
哺乳動物に投与されるガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターの濃度または量は、当業者が容易に決めることができ、治療される疾患、障害、または状態の性質、ならびに／あるいはその哺乳動物の体重、年齢、性別、および／または総合的な健康および生活状態などの要因が考慮される。
【００５７】
一実施形態では、医薬組成物は、ワクチンまたは他の免疫原性組成物であることができる。好適には、ワクチンまたは免疫原性組成物は、ガレクチン−９アゴニストと、適切な担体、増量剤、または賦形剤と、哺乳動物における免疫性応答を誘発することができる免疫原とを含む。好ましくは、その免疫応答は、免疫記憶の誘発を含む防御免疫応答である。免疫原は、病原体の成分分子（例えば、細胞表面タンパク質、「サブユニットワクチン」における場合などの免疫原性ペプチドまたはその他の成分、複数のＢ−および／または
Ｔ−エピトープを含むポリトープ、ＶＬＰ、カプシド、あるいはキャプソメア）、不活化病原体（例えば、不活化ワクチン、弱毒化した寄生虫感染ＲＢＣ、または弱毒化細菌）、または病原体に対する免疫応答を誘発することができる任意の他の分子であることができる。例えば、マラリア免疫感作の改善におけるＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９抗体アゴニストの投与の有効性を実証する実施例を参照されたい。
【００５８】
本発明の更なる態様は、ガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、および／またはアンタゴニストを設計する、選別する、操作する、あるいは産生する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を活性化または刺激し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を刺激または増強することができるアゴニストであるかどうかを判断するステップ、または（ｉｉ）候補分子が、ガレクチン−９活性を遮断または阻害し、かつそれにより哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害することができるアンタゴニストまたはインヒビターであるかどうかを判断するステップを含む。
【００５９】
広くは、この方法に従って設計される、選別される、操作される、あるいは産生されるガレクチン−９アゴニスト、インヒビター、および／またはアンタゴニストは、本明細書中で先に述べたように、哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に刺激または増強することができるか、または哺乳動物における免疫性を少なくとも部分的に抑制または妨害することができる。
【００６０】
１つの特定の実施形態では、ステップ（ｉ）において候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を模倣する。
１つの特定の実施形態では、ステップ（ｉｉ）において候補分子は、ＰＤ−Ｌ２によるガレクチン−９の刺激または活性化を少なくとも部分的に遮断または阻害する。
【００６１】
候補分子は、これらに限定されないが、本明細書中で以前に述べたような抗体または抗体フラグメントなどのペプチドまたはポリペプチドを含むタンパク質、小有機分子、モノ−、ジ−、トリ−、またはポリ−サッカリドなどの炭水化物、脂質、核酸、アプタマー、またはこれらのうちの１つまたは複数を含む任意の分子であることができる。
【００６２】
候補モジュレータの設計および／または選別に適用できる技術の非限定的な例は、当技術分野でよく知られているＸ線結晶学、ＮＭＲ分光法、コンピュータによる構造データベースの選別、コンピュータによるモデリング、あるいは分子の結合相互作用を検出する生化学的または生物物理学的手法を採用することができる。
【００６３】
分子の相互作用を同定する生物物理学的および生化学的手法には、例えばコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編「タンパク質の科学における最近のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ）」（ジョン・ウィリー・アンド・ソンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９７〜２０１３年）の第２０章中で得られる、競合放射線リガンド結合アッセイ、共免疫沈降法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）結合アッセイを含む蛍光ベースのアッセイ、電気生理学、超遠心分析法、ラベルトランスファー、化学的架橋、質量分光学、微量熱量測定法、表面プラズモン共鳴および光バイオセンサを用いる方法、および量子ドットバイオセンサが挙げられる。ツーハイブリッドおよびファージディスプレイ選別法は、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編「タンパク質の科学における最近のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ
ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ）」（ジョン・ウィリー・アンド・ソンズ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）１９９７〜２０１３年）の第１９章中で得られる。
【００６４】
したがって、この方法の最初のステップは、広範な構造的および／または機能的属性、
例えば、ガレクチン−９に結合する能力および／または、そうでない場合はＰＤ−Ｌ２のガレクチン−９との結合と競合する能力、あるいはＰＤ−Ｌ２の多量体化を妨害または阻害する能力、に従って選択される複数の候補分子の同定を含むことができる。
【００６５】
この方法は、その候補分子に応じたガレクチン−９と関係のある１つまたは複数の生物学的活性の変化を測定または検出する更なるステップを含むことができる。それらには、これらに限定されないがガレクチン−９細胞内シグナル伝達と、サイトカイン産生と、腫瘍の攻撃からの防御と、病原体または病原体由来の分子（例えばワクチン）による免疫感作の増強と、自己免疫、炎症、またはアレルギー反応の抑制と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞記憶の誘発との活性化または阻害が挙げられ得る。ガレクチン−９と関係のある１つまたは複数の生物学的活性のこのような変化を測定または検出するための方法およびプロトコルは、当業者によく知られており、それらの少なくとも幾つかを下記の実施例中で詳細に示す。
【００６６】
本明細書中で以前に述べた方法によればガレクチン−９アゴニスト、アンタゴニスト、および／またはインヒビターが有用であることが分かるはずである。
本明細書中で開示される本発明は、ガレクチン−９またはその機能的ホモログを発現させる任意の哺乳動物において実施することができる。好ましくは、その哺乳動物はヒトである。
【００６７】
本発明の特定の実施形態が容易に理解および実施され得るように、下記の非限定的実施例が参照される。
（実施例）
ＰＤ−Ｌ２およびガレクチン−９
ｓＰＤ−Ｌ２は有益な効果を有することができるが、それはＰＤ−１に関するリガンドの競合によるものであるというのが科学的コンセンサスであった。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合すると、それは免疫応答を中断し、一方、ＰＤＬ２は、ＰＤ１の結合に関してＰＤ−Ｌ１と競合することによって拮抗作用を有することができる。ＰＤ−Ｌ２自体のプラスの刺激効果についてはほとんど報告がないように思われる。ガレクチン−９に関して、これはＴｉｍ３のリガンドであると考えられているが、Ｔｉｍ３はガレクチン−９の結合によって誘導または仲介されるＴ細胞の枯渇の一因となる免疫モジュレータである。Ｔ細胞の枯渇を回避するために、多くの開発作業は、ガレクチン−９／Ｔｉｍ３相互作用を抗体で遮断して、それにより免疫応答を高めることに注力している。それは、ガレクチン−９を作動させて免疫応答の向上を達成することを追求する本発明とはやや反対の方向に進んでいる。しかしながら、最近の研究論文は、ガレクチン−９とＴｉｍ３とが相互に作用しない（少なくともヒトでは）ことを認識しており（ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ）ら、２０１３年）、したがって、このコンセンサスは変わりつつある可能性がある。ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら、２００９年による概説では、ガレクチン−９のマウス、ウサギ、およびラットへの投与は、本明細書中で述べたものと逆の効果を有する（少なくとも活性化Ｔ細胞において）ことが示唆され、ナイーブＴ細胞においても逆の効果を有することが予想されている。さらにガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）らは、胸腺微小環境ではガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−８、およびガレクチン−９が、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−）またはダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）の胸腺細胞のアポトーシスを誘発すると結論を下し、これは中枢性トレランスの調節においてこれらのガレクチンが果たし得る役割を示唆している。ここでもまた、この概説は本発明と著しく異なっている。
【００６８】
マラリア
マラリア、ＨＩＶ、およびＴＢなどの幾つかの疾患は、世界中で毎年数百万人の個体の病的状態および死亡を引き起こしている。これらの病原体は免疫性を回避する幾つかのメ
カニズムを進化させているため、ワクチンの開発が大きい課題となっていることが分かっている。ＨＩＶおよびプラモジウム種（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ）（マラリアの原因物質）が免疫性を逃れるメカニズムとして、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）の経路が関与しているとされてきた。したがって、本発明者らは、マラリアのマウスモデルを使用して、この経路が免疫性をどのように損ない得るかを調べた。
【００６９】
マラリアは、毎年３〜５億人の個体に感染し、数百万人を殺す。抗体に仲介される防御に主に基づくマラリアワクチンの４０超の臨床試験が行われているが、１つのみが第ＩＩＩｂ相に達した。マラリアへの終生曝露でさえ保護的抗体反応を誘発しないことがあり（エガン（Ｅｇａｎ）ら、１９９５年；エガン（Ｅｇａｎ）ら、１９９６年）、血液期の熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（Ｐｆ）に感染した幼児は、事前に存在する抗マラリア抗体のレベルの急速な減退を経験する（アクポゲネータ（Ａｋｐｏｇｈｅｎｅｔａ）ら、２００８年；キンヤンジュイ（Ｋｉｎｙａｎｊｕｉ）ら、２００７年）。２２０人の個体から採取した血漿で精査した、約２３％の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）タンパク質プロテオームを含有するタンパク質マイクロアレイを使用したより詳細な研究は、これらのタンパク質に対する抗体の応答性がマラリアの季節の期間には劇的に上昇するが、短命であることを確かめた（クロンプトン（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ）ら、２０１０年）。マラリア流行地の子供から採取した抗原特異的記憶Ｂ細胞（ＭＢＣ：ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ）を測定した以前の研究は、マラリアへの多数回曝露が、循環性抗原特異的ＭＢＣの安定な集団を発生させないことを見出した（ドルフマン（Ｄｏｒｆｍａｎ）ら、２００５年）。さらに長期にわたる研究は、最近、Ｐｆ特異的ＭＢＣおよび抗体の両方の力価が急性のマラリアの後に増加した後、６ヶ月以内には感染前のレベルよりわずかに高い点にまで縮小することを示しており、これはＰｆ特異的ＭＢＣおよび長命抗体区分の両方の非効率的な段階的な増殖を示唆しており、それは子供ではなぜ免疫が不十分であるか、また発生させるのに数年を要するかを説明し得る（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、２０１０年）。主にアフリカに拠点を置くこれらの研究とは対照的に、マラリアの地方的流行がはるかに低いタイでは、過去６年間に熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および／または三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）の文書化された臨床的発症があったことが知られている個体は、抗原特異的抗体および／または安定した頻度の抗原特異的ＭＢＣを有した（ウィパサ（Ｗｉｐａｓａ）ら、２０１０年）。
【００７０】
ＣＤ＋４Ｔ細胞は、特定の病原体に対して急激な免疫応答を形成する数種類のヘルパーサブタイプからなる。マラリアの期間中、ＣＤ＋４Ｔ細胞サブセットは、防御、発症機序（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）、かつまた免疫応答からの逃避において複数の役割を有する。ＣＤ＋４Ｔ細胞は、マウスでの実験的マラリアの期間中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の両方（これらはこの疾患に対する防御に関与する）の主要な源であることが実証された（ムクセル（Ｍｕｘｅｌ）ら、２０１１年）。プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）マラリアに感染したマウスでの研究は、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとが協働して脾臓中で一酸化窒素合成酵素の発現を誘発して、寄生虫負荷のピークを制御することを示した（ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ）ら、１９９６年）。同様にヒトにおいて、Ｐｆに対する早期ＩＮＦ−γ応答は、より良好な抗寄生虫免疫性と相関する（マッコール（ＭｃＣａｌｌ）ら、２０１０年）。ＩＮＦ−γは、マラリアに対する防御反応の広大なネットワークに貢献する。これは、マッコール（ＭｃＣａｌｌ）およびサワーベイン（Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ）、２０１０年によって要約されている。特に注目すべきなのはＭＳＰ１特異的トランスジェニックＣＤ＋４Ｔ細胞に及ぼす慢性マラリアの影響を調べた研究である（スティーヴンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）およびラングホーン（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ）、２０１０年）。これらの寄生虫特異的Ｔ細胞をＴｈｙ１．１コンジェニックマウスに播種し、次いでそれを１０５個のプラスモディウム・シャバウディ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｃｈａｂａｕｄｉ）に感染した赤血球に感染
させた。これらのマウスの２分の１を３０〜３４日目にクロロキンで処理して慢性マラリアを除去した。６０日後、トランスジェニックＴ細胞のフローサイトメトリ解析により、未処理マウスでは、感染が除去された薬剤処理マウスと比較して記憶ＣＤ４４＋ＩＬ−７Ｒ＋ＣＤ＋４Ｔ細胞の約２５％が失われたことを見出した（スティーヴンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）およびラングホーン（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ）、２０１０年）。この研究は、進行中の感染症が、再感染から防御する能力のある幾らかの寄生虫特異的記憶Ｔ細胞の喪失を引き起こすことを浮き彫りにする。
【００７１】
プログラム死−１（ＰＤ−１）およびマラリア
ＰＤ−１はマラリアの発症機序に関与している。慢性および致命的マラリア、ならびに再感染からの長期の防御に対する免疫性におけるＰＤ−１の役割を理解するために、Ｃ５７／Ｂ１６（ＷＴ）マウスおよびＰＤ−１遺伝子が欠失したＣ５７／Ｂ１６マウス（ＰＤ−１ＫＯ）のコホートを非致死性の１０５個のプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）（慢性マラリア）または致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭが寄生した赤血球（ｐＲＢＣ）に感染させ、血液を１〜２日ごとに寄生虫血症について調べた。４０日後、すべての生存しているマウスを１４０日間休養させて、一次免疫細胞を、記憶細胞のみが生存している小康状態にさせた。次いで１８０日目にこれらのマウスを対応する寄生虫に再感染させた（図１ａおよびｂ中の矢印）。本発明者らは、非致死性プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）に感染させたすべてのＷＴマウスの一次感染が約３５日間で除去されたことを見出した（図１ａ）。これらのＷＴマウスを１８０日目に再感染させた場合、すべてのマウスが、最初の感染よりもはるかに低いレベルではあるが寄生虫血症を発症した（図１ａ）。それとは対照的に、ＰＤ−１ＫＯマウスのプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）感染は１５日間で除去され、マウスの２０％のみが３０日目前後に悪性度の低い再発感染を経験した（図１ｂ）。再感染時に９／９のＰＤ−１ＫＯマウスは寄生虫血症を示さず（図１ｂ）、血液をナイーブマウスに移植した場合、無菌免疫を有した（データは示さない）。
【００７２】
ＷＴマウスを致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させた場合、すべてのマウスが感染から７日間以内に死亡した（図１ａ）。それとは対照的に、１０／１０のＰＤ−１ＫＯマウスは、致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染および１８０日後の再感染から生存した。注目すべきことに、再攻撃されたマウスの４０％のみが低レベルの寄生虫血症を経験した（図１ｂ）。これらの研究は、ＰＤ−１経路が慢性および致死性マラリアを促進させ、再感染に対する最善の長期にわたる防御を妨害することを示す。
【００７３】
マラリアの期間中のＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇
マラリアの期間中のＰＤ−１の発現を調べた最初の研究の１つは、マウスモデルを使用して、ＩＬ−７Ｒｌｏ発現ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現を示した（チャンデレ（Ｃｈａｎｄｅｌｅ）ら、２０１１年）。これらのＰＤ−１を発現する細胞（特にＣＤ８＋Ｔ細胞）は、感染から３０日間以内にほとんど完全に失われた（チャンデレ（Ｃｈａｎｄｅｌｅ）ら、２０１１年）。しかしながら、この研究は、Ｔ細胞の枯渇を同定するために機能的応答を測定していなかった。同様に後続の研究は、ＰＤ−１が、マリおよびケニアのＰｆに感染した個体の血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、２０１２年；イリングウォース（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ）ら、２０１３年）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（イリングウォース（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ）ら、２０１３年）上でも発現したことを示したが、枯渇の機能的証明は提供されなかった。
【００７４】
これらの観察結果を立証するために、赤血球期マラリアのネズミモデルを採用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼすＰＤ−１およびＬＡＧ−３の発現の増加の影響を調査した（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、２０１２年）。マウスのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅ
ｌｉｉ）およびプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）マラリアの期間中における抗体によるＰＤ−Ｌ１およびＬＡＧ−３阻害性分子の複合遮断は、寄生虫血症の除去を促進した（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、２０１２年）。このＰＤ−Ｌ１およびＬａｇ−３の二重遮断は、抗体に仲介される高い免疫性と相関関係があるＣＤ４＋濾胞性Ｔヘルパー細胞（ＴＦＨ）の数を向上させた（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、２０１２年）。さらに、感染後８および９日目に抗マラリア薬のクロロキンで処理した感染マウスは、より低いレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞の機能不全を示した（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、２０１２年）。これらの研究は、リンパ球の枯渇がマラリアに対する免疫性を調節することを示した。
【００７５】
後続の研究は、ＰＤ−１が欠失したマウス（ＰＤ−１ＫＯ）を使用し、ＰＤ−Ｌ１がＢ７−１（ブッテ（Ｂｕｔｔｅ）ら、２００７年）およびＰＤ−１（イワイ（Ｉｗａｉ）ら、２００３年）の両方と特異的に相互に作用してＴ細胞活性化を阻害することができると想定して、ＰＤ−１が免疫性を調節する役割を有するかどうかに確定的に判断を下した。プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）マラリアが、その感染が慢性感染を生じさせるので調べられた。マラリアの慢性期の期間中（３５日目）において、増殖しかつＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌するという寄生虫特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の能力の低下（これは、これらの細胞の枯渇を表している）を、ＰＤ−１が仲介することが示された（ホーン−デベット（Ｈｏｒｎｅ−Ｄｅｂｅｔｓ）ら、２０１３年）。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１／Ｌａｇ−３複合遮断の研究とは対照的に、ＴＦＨの数の変化は観察されなかった。この明白な矛盾についての１つのあり得る説明は、ＰＤ−１ＫＯマウスの制御性Ｔ濾胞性細胞（ＴＦＲ細胞）の比率がＷＴマウスと比べて著しく高かったことである（ホーン−デベット（Ｈｏｒｎｅ−Ｄｅｂｅｔｓ）ら、２０１３年）。ＴＦＲ細胞は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで抑制性であることと、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＦＨ細胞およびＧＣＢ細胞の数を制限することとが知られている（リンターマン（Ｌｉｎｔｅｒｍａｎ）、２０１１年）。あるいは、ＰＤ−Ｌ１もＢ７−１と特異的に相互に作用してＴ細胞活性化を阻害することができる（ブッテ（Ｂｕｔｔｅ）ら、２００７年）ため、この経路がＰＤ−１ＫＯマウスのＴＦＨ数を制御するのかもしれない。
【００７６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞および枯渇
ＰＤ−１が仲介する細胞の枯渇は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇と最もよく関連付けられている。しかしながら、前に述べたように、脳マラリアの発症機序および脾臓構造の損傷におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の役割（ビーティ（Ｂｅａｔｔｉｅ）ら、２００６年）は知られているが、血液期マラリアの除去におけるそれらの役割はそれほど広く認められていない。極めて重要なことに、ＰＤ−１は、急性期のマラリアの期間中の寄生虫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数および機能的能力の９５％の損失を仲介し、感染を悪化させて慢性マラリアを引き起こすことが最近示された（ホーン−デベット（Ｈｏｒｎｅ−Ｄｅｂｅｔｓ）ら、２０１３年）。この研究は、１００％のマウスが慢性感染症を発症する野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）と比較して、ＰＤ−１ＫＯマウスの慢性マラリアの進行を調べた。興味深いことに、ＰＤ−１ＫＯマウスの３０％未満が慢性感染症を発症し、これらのマウスの寄生虫血症レベルは、ＷＴマウスの１００分の１未満であった。しかしながら、ＰＤ−１ＫＯマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇は、寄生虫血症のピークを２倍に増加させ、ＰＤ−１ＫＯマウスの１００％が慢性マラリアを発症した（ホーン−デベット（Ｈｏｒｎｅ−Ｄｅｂｅｔｓ）ら、２０１３年）。全体としてＰＤ−１は、マラリアの慢性期の間の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔ細胞の数の８０％の減少、およびＣＤ８＋Ｔ細胞が寄生虫に応答して増殖する能力の９５％の減少を仲介した（ホーン−デベット（Ｈｏｒｎｅ−Ｄｅｂｅｔｓ）ら、２０１３年）。特に注目すべきことは、たとえＰＤ−１ＫＯマウスがＷＴマウスよりも多くの機能的ＣＤ４＋Ｔ細胞および同様の力価の寄生虫特異的抗体を有したとしても、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇した場合、それらが依然として慢性マラリアを発症したことである。
【００７７】
最後に、ＰＤ−１ＫＯマウスは、ＷＴマウスよりも多いグランザイムＢ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を有しており、これは感染細胞の細胞傷害性の死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ−ｋｉｌｌｉｎｇ）が関係していることを示唆している。これらの観察結果は、慢性マラリアに対する防御におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の決定的な役割を浮き彫りにする。それとは対照的に、以前の研究は、ＰＤ−Ｌ１の遮断が、病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって仲介される実験的脳マラリアを増加させることを見出しており（ハファラ（Ｈａｆａｌｌａ）ら、２０１２年）、これは、その経路が脳マラリアから防御することを表している。これらの発見の臨床的意義は、マラリアに感染した個体由来のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＤ−１を発現していることを見出したケニアでの研究によって浮き彫りにされた（イリングウォース（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ）ら、２０１３年）。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の役割については、強烈なＰｆの伝染に数年曝露したにもかかわらず、なぜ後天的な無菌免疫の証拠が存在しなかったかを説明することができるような特定の検討材料が必要である（トラン（Ｔｒａｎ）ら、２０１３年）。それは、抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、症候性マラリアに対する防御を与えるが、無菌免疫のためにはＣＤ８＋Ｔ細胞が必要であるということであり得る。したがって、ＰＤ−１に仲介されるＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇の場合、最近報告されたように無菌免疫は決して得られない（トラン（Ｔｒａｎ）ら、２０１３年）。
【００７８】
ＤＣおよびマラリア
マラリアの期間中にＣＤ４＋Ｔ細胞が寄生虫血症の一次ピークを除去し、Ｂ細胞が残りの寄生虫を除去することが立証されている。Ｔ細胞活性化はＤＣを必要とするため、本発明者らは、マウス寄生虫の５種類の株のＤＣ機能を比較し、再検討されているように（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）およびグッド（Ｇｏｏｄ），２００８年）、寄生虫の致死性および非致死性の株と種との間に、ＤＣの表現型および機能の二分対立（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ａ；ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ｂ）を見出した。これらの研究はまた、非致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬおよびプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）による感染症由来のＤＣが完全に機能的であり、具体的には、多量のＩＬ−１２を分泌することを発見した（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ａ；ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ｂ）。それに反して、寄生虫の３種類の致死性株、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ、プラスモディウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）、およびプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）に感染したマウス由来のＤＣは、それらがＴ細胞を刺激したりＩＬ−１２を分泌したりすることができないため、機能性を欠く（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ａ；ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ｂ）。非致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染させたマウス由来のＤＣをナイーブマウスに移植した場合、受容マウスは致死性感染による攻撃から生存し、この効果はＩＬ−１２によって仲介された（ワイクス（Ｗｙｋｅｓ）ら、２００７年ａ）。さらに他のグループもまた、マラリアの期間中にＤＣ機能が損なわれることを示した（グッド（Ｇｏｏｄ）ら、２００５年；オカナ−モーグナ（Ｏｃａｎａ−Ｍｏｒｇｎｅｒ）ら、２００３年；アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら、１９９９年；アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら、２００１年）。
【００７９】
ＰＬ−Ｌ２は主にＤＣによって発現し、一方、ＰＤ−Ｌ１はＤＣを含む一連の細胞上で発現することが知られている。したがって、ナイーブおよび感染マウス由来のＤＣが、次にＰＤ−Ｌ２の発現について調べられた。ＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡレベルが、ナイーブマウス由来の、および非致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬまたは致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染したマウス由来のＤＣ中で測定された（図２）。致死性の感染由来のＤＣは、ＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡの約５０％の増加を示し、一方、非致死性の感染由来のＤＣは、タンパク質発現の３００％近い増加で応答した。この研究は、ＰＤ−Ｌ２の発現が高いほど、より良好なマラリアか
らの生存と相関関係があることを示した。
【００８０】
マラリアの期間中のＰＤ−Ｌ２の保護的役割
ＤＣによって発現したＰＤ−Ｌ２が保護的であるかどうかに取り組むために、ＷＴマウスを非致死性マラリアに感染させ、ＰＤ−Ｌ２特異的遮断抗体で処理して、この分子の機能を阻害した。この実験のためにＷＴマウスの数個のコホートをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬおよびプラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）に感染させ、感染から１日後および感染後１４〜１８日目まで、３〜４日ごとに抗ＰＤ−Ｌ２または対照ラットＩｇＧ（対照Ｉｇ）のいずれかで処理した。
【００８１】
対照Ｉｇを受けたすべてのＷＴマウス（図３ａおよびｂ）は、３０〜３７日間で特許（ｐａｔｅｎｔ）感染が除去された。しかしながら、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬとＰＤ−Ｌ２遮断抗体とを与えられたすべてのマウスは２５日間以内に、重い症状のために死亡するか安楽死させた（図３ａ）。それとは対照的に、慢性プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）マラリアを有するすべてのマウスは、ＰＤ−Ｌ２の遮断から生存したが、それらは対照マウスよりも１６％高い寄生虫血症の一次ピーク（対数スケールに注意されたい、＊はｐ＝０．００４８を意味する）、感染の慢性期の間のより高い寄生虫血症レベルを有するとともに、感染を除去するのに４日間長くかかった（図３ｂ）。
【００８２】
ＤＣ上のＰＤ−Ｌ２の発現が不在であるか、または低いためにプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭまたはプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）の感染が致死的であるかどうかを判断するために、それらのマウスにｓＰＬ−Ｌ２を補った（図４および５）。このために、ＷＴマウスの数個のコホートをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭまたはプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）に感染させ、感染後３、５、および７日目にそれらに可溶性の組換えＰＤ−Ｌ２ヒトＦｃ合成タンパク質を与えた。プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、対照ヒトＩｇＧ（対照Ｉｇ）を与えられたすべてのＷＴマウスは１１日間以内に死亡し、多量体ｓＰＤ−Ｌ２を与えられたマウスの９２％は生存し、２５日間で感染は除去され、寄生虫血症のピークは有意に低かった（図４ａおよびｂ、ｐ＜０．００１）。次いで、すべての生存しているマウスを１５０日間休養させ、同じ用量の致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭマラリアで再度攻撃感染させた（追加のＰＤ−Ｌ２なし、図４ａ）。すべてのマウスが最小限の寄生虫血症（１％未満）の状態で生存し、一方、すべての新しい対照マウス（対照Ｉｇ−Ｒ）は感染のために死亡した。興味深いことに、二量体ＰＤ−Ｌ２はマイナスの効果を有し、一方、より高い多量体（例えば十量体ｓＰＤ−Ｌ２）は強い有益な効果を有した。
【００８３】
プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）マラリアを有するマウスの分析は、すべての対照マウスが８日間以内に脳マラリア症状（被毛の逆立ち、筋スパズム、昏睡を含む）を発症し（図５ａ）、１０日目までに感染のために死亡する（図５ｂ）ことを見出した。それとは対照的に、ｓＰＤ−Ｌ２で処理されたすべてのプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）感染マウスは脳症状を発症せず、約１５日間感染を制御下に置いたが、すべてがコントロール不能の寄生虫血症により２５日目に死亡した。追加の用量はテストされなかった。
【００８４】
これらの研究は、ＰＤ−Ｌ２の発現が免疫性にとって、かつマラリアからの生存にとって必要であることを確かめた。このタンパク質を発現しているマウス中のＰＤ−Ｌ２の遮断は、致死を仲介するか感染を悪化させた。それとは対照的に、マウスは、それらのＤＣがＰＤ−Ｌ２を発現しないときにｓＰＤ−Ｌ２を補った場合、致死性の感染から生存するか、脳症状がないままであった。
【００８５】
ＰＤ−Ｌ２はＣＤ４Ｔ細胞による防御を仲介する
ｓＰＤ−Ｌ２がＴ細胞を介して免疫を向上させるかどうかを判断するために、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染マウスにＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の不在下または存在下でｓＰＤ−Ｌ２を与えた。この実験の場合、ＷＴマウスは、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染の１日前および感染後１４〜１８日目まで、３〜４日ごとにＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇化抗体を与えるか、ラットＩｇ（Ｒａｔ  Ｉｇ）で処理された。次いでマウスは、感染後３、５、および７日目にｓＰＤ−Ｌ２または対照ヒトＩｇを与えられた。
【００８６】
対照Ｉｇを受けたすべてのＷＴマウス（図６ａ）は１４日目までに死亡するか、安楽死させる必要があった。それとは対照的に、ｓＰＤ−Ｌ２を与えられたプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染マウスの６０％は生存し、３０日間で感染が除去された。しかしながら、感染ＷＴマウスはｓＰＤ−Ｌ２を与えられたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇した場合、すべてのマウスが重い臨床症状を発症したために、それらは死亡するか、安楽死させる必要があった（図６ａおよびｂ）。それとは対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、ｓＰＤ−Ｌ２処理による致死性マラリアからの生存に影響を与えなかったが、マウスはより高い寄生虫血症を経験した（図６ｃ）。総合すれば、これらの観察結果は、ｓＰＤ−Ｌ２が、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能に及ぼす幾つかの影響を伴ってＣＤ４＋Ｔ細胞による防御および生存を仲介することを実証した。これらの研究は、ｓＰＤ−Ｌ２処理後の生存期間中央値が成体マウスの場合よりも低い非常に若いマウスで始められた（成熟マウスを利用できないため）。
【００８７】
ｓＰＤ−Ｌ２による防御はＰＤ−Ｌ１機能の遮断によって仲介されない
ＤＣ上でのＰＤ−Ｌ２の発現またはｓＰＤ−Ｌ２処理が防御免疫を仲介することができると想定して、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ−Ｌ１に仲介される免疫性の阻害を遮断することによって防御を仲介することができるという仮説を立てた。この仮説をテストするために、ＰＤ−Ｌ１ノックアウトマウス（ＰＤ−Ｌ１ＫＯ、ｎ＝４）の２つのコホートをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、ＰＤ−Ｌ２の３種類の用量または対照ＩｇＧのいずれかで処理した。すべての対照マウスが、重い臨床症状および高い寄生虫血症レベル（約７８％）により７日目までに死亡した（図７）。これとは対照的に、ＰＤ−Ｌ２で処理した感染ＰＤ−Ｌ１ＫＯマウスは寄生虫血症を制御下に置いた（２４％）が１０日目までに死亡した。この研究は、ＰＤ−Ｌ２によって仲介される防御がＰＤ−Ｌ１から独立していることを示した。
【００８８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞上のガレクチン−９はＰＤ−Ｌ２の新規な受容体である
ＰＤ−Ｌ２がＰＤ−Ｌ１から独立してマラリアに対して保護的であると想定して、本発明者らは、それがナイーブＴ細胞上に第二の受容体を有するという仮説を立てた。この仮説をテストするために、本発明者らは、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス由来の単離Ｔ細胞のライゼートを調製し、固定化ＰＤ−Ｌ２またはヒトＩｇＧを使用して受容体を免疫沈降させた（図８）。３回の独立した実験において、重鎖および軽鎖免疫グロブリン（バンド１および４）、ｓＰＤ−Ｌ２（バンド５）、およびアクチン（バンド３）を含む５本の再現可能なバンドを繰り返し免疫沈降させた。ガレクチン−９（バンド２）は、ＰＤ−Ｌ２によって免疫沈降されたが、それは３回の独立した実験ではヒトＩｇＧによって同等のバンドを免疫沈降させなかった。対照中でＮ２０およびＮ２と呼ばれるバンドはヒストンタンパク質であった。最後に、ｓＰＤ−Ｌ２によって免疫沈降したバンド２がガレクチン−９であることを確かめるために実験が繰り返されたが、そのゲルをニトロセルロースに転写し、そのウェスタンブロットを抗ガレクチン−９抗体で標識した（図９）。これらの研究は、Ｔ細胞から免疫沈降させたバンド２の配列決定によって見出された３９ｋＤのバンドがガレクチン−９であり、および潜在的にＰＤ−Ｌ２の新規な結合相手であることを確
かめた。
【００８９】
ナイーブＴ細胞上のガレクチン−９はＰＤ−Ｌ２の受容体である
ｓＰＤ−Ｌ２が無傷Ｔ細胞上でガレクチン−９に結合したかどうかを判断するために、ナイーブマウスの脾臓から全Ｔ細胞集団を単離し、それをビオチン標識したｓＰＤ−Ｌ２およびＡＰＣ−ストレプトアビジンまたはＰＥ−抗ガレクチン−９と共にインキュベートした（図１０）。フローサイトメトリ解析は、ｓＰＤ−Ｌ２がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の約１２．８％に結合したが、ガレクチン−９はこれらの細胞の約１．９％上で発現されたに過ぎないことを見出した。過剰な標識していない抗ガレクチン−９抗体によるナイーブＴ細胞の前処理は、ｓＰＤ−Ｌ２による標識化を約３％減少させ、これによりｓＰＤ−Ｌ２がＴ細胞上でガレクチン−９に結合したことが確認された。以前に公表された研究は、ナイーブマウスの脾臓から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞の約１０〜２０％が、ＰＤ−Ｌ２に結合することができるＰＤ−１を発現することを示した。最終的にこのアッセイでは、ｓＰＤ−Ｌ２は有意な数のＣＤ８＋Ｔ細胞には結合しなかった。
【００９０】
ｓＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９はナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中での生存および分化を仲介する
ナイーブマウスから単離したＴ細胞を、抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）でコーティングした９６ウェルプレート中で培養してＩＬ−２と共に抗原シグナルを得た。この培養物はまた、（ａ）対照としてのプレートに結合させたラットＩｇＧ、（ｂ）プレートに結合させたｓＰＤ−Ｌ２、（ｃ）プレートに結合させたｓＰＤ−Ｌ２並びに抗ガレクチン−９（クローン１０８Ａ）抗体の形態のガレクチン−９インヒビターで処理された細胞、（ｄ）ガレクチン−９アゴニスト抗体（クローンＲＧ９．１）、および（ｅ）抗ガレクチン−９（クローンＲＧ９．３５）のいずれかで補われた。ｓＰＤ−Ｌ２は、ラットＩｇＧ対照と比べて、ＴＢＥＴを発現させるＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｏ細胞の割合（図１１ａ）および（ｂ）細胞内のＴＢＥＴレベル（図１１ｂ）を増加させた。この効果は、抗ガレクチン−９（クローン１０８Ａ）抗体によって遮断された。クローンＲＧ９．１もまた、ＴＢＥＴを発現させるＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｏ細胞の割合および細胞内のＴＢＥＴのレベルを増加させた（図１１ａおよびｂ）。
【００９１】
プレートに結合させたＰＤ−Ｌ２およびＲＧ．１（ＲＧ９．１）で処理された細胞の生存率は、３６時間後では他の培養物よりも高く、したがってこれらの培養実験の幾つかは、はるかに低いＣＤ３レベルの刺激（１μｇ／ｍＬ）による７２時間培養で繰り返した。図１２に見られるように、ｓＰＤ−Ｌ２およびＲＧ１（ＲＧ９．１）抗体は両方とも対照培養物と比較してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存率を向上させる。
【００９２】
可溶性ＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９抗体は致死性マラリアに対して保護する
ガレクチン−９のシグナル伝達が可溶性ＰＤ−Ｌ２と同じ効果を有するかどうかを判断するために、ＷＴマウスの３つのコホートをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、感染後３、５、および７日目に２００μｇのｓＰＤ−Ｌ２、抗ガレクチン−９、またはラットＩｇＧを静脈内に投与した。マウスは毎日監視され、被毛の逆立ち、ハンチング、または活動減退を含む疾患の臨床症状についてスコアを与えられた。ｓＰＤ−Ｌ２または作動性抗ガレクチン−９（クローンＲＧ９．１）を与えられたマウスは最小限の症状を示し、すべての対照マウスが死亡するか安楽死させられたとき、これらの群の２／３のマウスが生存した（図１２）。
【００９３】
ガレクチン−９はｓＰＤＬ２の結合相手である
マウスガレクチン−９とマウスＰＤ−Ｌ２との結合の生化学的性質を決定するために、オクテット・レッドによる研究が始められた。ｓＰＤ−Ｌ２がプローブと結合され、そのｓＰＤ−Ｌ２およびｓガレクチン−９との相互作用が測定された。図１３に示すように、
その結果は、ＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との間のほとんど瞬時の結合および解離を示す。これとは対照的に、ガレクチン−９の結合は、ＰＤ−Ｌ２と会合するのに約２００秒、および解離するのに６１４秒超を要し、これは極めて安定な相互作用を示す。最も注目すべきことに、ＰＤ−Ｌ２−ＰＤ−１相互作用は１：１の分子比であり、ガレクチン−９とＰＤ−Ｌ２との相互作用は、結合の間のガレクチン−９の凝集または多量体化を伴う。これは、なぜ、ｓＰＤ−Ｌ２の多量体形がマラリアに対して保護的である一方で、単量体または二量体形が保護することができないかを説明するのに役立つ。単量体および多量体ｓＰＤ−Ｌ２による保護を比較した本発明者らの研究は、マウスの７７〜９２％を保護する多量体ｓＰＤ−Ｌ２と比較して、単量体ｓＰＤ−Ｌ２が致死性のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭマラリアからマウスを保護しない（ｎ＝４）、または脳マラリアを防がない（ｎ＝３）ことを見出した（図４）。さらに、単量体ｓＰＤ−Ｌ２は脳マラリアを悪化させ、これは単量体ｓＰＤ−Ｌ２がｓＰＤ−Ｌ２のガレクチン−９との相互作用を遮断することを示唆する。したがって、適用されるｓＰＤ−Ｌ２の形態は、免疫応答の性質を制御するために使用することができる（例えば、多量体形を投与してマラリアまたは癌に対して防御することができ、単量体形を投与して免疫システムを下方制御し、喘息またはクローン病などの炎症性または自己免疫性疾患を治療することができる）。この点では、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＤ−Ｌ２の多量体化を促進させる作用物質、例えばアプタマーおよび二重特異性抗体の使用も本発明において役立つ。アプタマーは、広範囲の標的分子と特異的に結合することができる小型のオリゴヌクレオチドであり、治療薬として抗体を上回る幾つかの利点を提供する。それらは多量体ＰＤ−Ｌ２を模倣し得る。
【００９４】
抗ガレクチン−９抗体は培養中にマウスＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化してＴｈ１サイトカインを分泌させる
ＤＣによって発現したガレクチン−９はまた、Ｔ細胞上のＴＩＭ−３のリガンドでもある（ズー（Ｚｈｕ）ら、２００５年）。可溶性ガレクチン−９に誘導されるＴｈ１細胞の死は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＴＩＭ−３によって決まり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのガレクチン−９タンパク質の投与は、インターフェロン−γを産生するＴ細胞の選択的喪失を引き起こす（ズー（Ｚｈｕ）ら、２００５年）。Ｔ細胞によって発現されるガレクチン−９の役割はあまり明確ではない。本発明者らは、最初に３種類の抗ガレクチン−９抗体をテストし、２／３が活性化していることを見出した（データは示されない）。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精製されたＴ細胞に及ぼす最強の刺激活性を有する同時刺激抗ガレクチン−９抗体の影響を分析した。本発明者らは、マウスの脾臓から単離し、抗ＣＤ３抗体でコーティングしたプラスチックプレート上で培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼす対照ＩｇＧ、可溶性のマウスＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ、または抗マウスガレクチン−９  ｍＡｂの影響を評価した。培養の３日後、上清をサイトカインについてテストした。ＩｇＧによる対照培養物と比較して固定化ＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９の両方が、ＩＬ−２（約４倍）、ＩＦＮ−γ（約４倍）、およびＴＮＦ−α（６０％）の分泌を有意に増加させることができた。これらの研究は、マウスＰＤ−Ｌ２について以前に報告された（シン（Ｓｈｉｎ）ら、２００３年）ように、ＰＤ−Ｌ２および抗ガレクチン−９の両方がマウスＴ細胞に同時刺激シグナルを与えてＴｈ１応答を向上させていることを確かめた。
【００９５】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞について実施された同様のアッセイもまた、ｓＰＤ−Ｌ２がＴｈ１サイトカインの分泌を増加させ得ることを示した（図１５Ａ）。
本発明者らは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を刺激する抗ヒトガレクチン−９抗体を発見することができなかったため、本発明者らは抗マウスガレクチン−９抗体をテストした（図１５Ｂ）。この抗マウスガレクチン−９抗体は、インターフェロン−γ（他のサイトカインではなく）の分泌をヒトｓＰＤ−Ｌ２によって誘導されるレベルまで誘導した。
【００９６】
抗ガレクチン−９はマラリアに対して防御する
抗ガレクチン−９抗体が、可溶性ＰＤ−Ｌ２で処理することによって見られるのと同じ防御を提供し得ることを確かめる（図４）ために、ＷＴマウスを致死性プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、対照ラットＩｇ、ブロッキング抗Ｔｉｍ−３、または抗マウスガレクチン−９のいずれかで処理した（図１６ａおよびｂ）。反復実験では、抗体に仲介されるＴＩＭ−３（ガレクチン−９の別の受容体）の遮断によって防御が与えられないのに対し、抗ガレクチン−９抗体の３回投与はマウスの７５％の生存を仲介した。Ｔｉｍ−３の遮断は、対照ラットＩｇ処理マウスと比較して顕著な防御を提供しなかった。
【００９７】
抗ガレクチン−９は腫瘍の進行を緩和する
Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫も腫瘍を除去するのに極めて重要であると想定して、次に２種類の同系マウスの乳癌モデルにおいて抗ガレクチン−９抗体の活性化をテストした。各受容マウスの第四左乳腺脂肪体中に同所性注射される抗ガレクチン−９抗体の４回投与は、触診可能なＰＹＭＴ由来の乳癌の成長を遅らせることができた（図１７ａ）。１６〜２２日目に与えられた抗ガレクチン−９処理は、アイソタイプ対照群と比較して２７日目〜３５日目の腫瘍の進行を遅らせた。以前の研究は、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断と組み合わされたＴｒｅｇ細胞除去が、同じ同所性移植されたＰＹＭＴで引き起こされる乳癌に影響を与えるかどうかを調べた（ボス（Ｂｏｓ）ら、２０１３年）。Ｔｒｅｇ細胞除去は、原発性および転移性腫瘍の進行を有意に遅らせるが、チェックポイント阻害は癌遺伝子で引き起こされる腫瘍の成長に影響を与えないことが見出された。次いで本発明者らは、８〜１０日目に与えた抗ガレクチン−９の３回投与が侵攻性の転移ＥＯ７７１．ＬＭＢ乳腺腺癌の成長を遅らせることができるかどうかをテストした（ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ）ら、２０１５年）。すべての対照マウスが１５日目までに安楽死させられたが、１５日目の対照マウスと比較して１５〜１６日目の処理マウスの腫瘍は３５％小さかった（図１７ｂ）。全体的に見て、抗ガレクチン−９活性化処理は、同所性移植された乳癌の進行を緩和した。
【００９８】
ＰＤ−Ｌ２の遮断はＴｂｅｔ＋Ｔｈ１応答を阻害しうる
ＰＤ−Ｌ２がｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｂｅｔおよびＴｈ１免疫を制御したことを確かめるために、本発明者らは、マウスをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬマラリアに感染させ、血中で寄生虫が検出可能になったときにモノクローナル抗体でＰＤ−Ｌ２を遮断した。この実験の場合、ＷＴマウスをプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染させ、感染後（ｐ．ｉ．：ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）４日間および感染後１４〜１８日目まで、３〜４日ごとに抗ＰＤ−Ｌ２または対照ラットＩｇＧのいずれかを与えた。まずＴｂｅｔ、すなわちマラリアに対する防御を仲介することが知られているＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞のエフェクター機能に必要とされる転写因子の発現について、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調べた（イング（Ｉｎｇ）およびスティーヴンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、２００９年；スティーヴンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）およびラングホーン（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ）、２０１０年）。Ｔ細胞はまた、ＣＤ６２Ｌ、すなわちナイーブＴ細胞上で見出され、かつまたセントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌｈｉ）Ｔ細胞とエフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌｌｏ）Ｔ細胞を区別するマーカの発現についても評価された。感染から７日後のＰＤ−Ｌ２の遮断により、脾臓Ｔｂｅｔ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は下がる傾向がある（図１８ａ）。しかしながら、１４日目までに、対照マウスは、脾臓１個当たりのＴｂｅｔ発現ＣＤ６２ＬｈｉおよびＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ２を遮断されたマウスのそれぞれ２．２倍および３倍で有していた（図１８ｂ）。同様に、１４日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定された対照マウスのＩＦＮ−γを分泌する寄生虫特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ＰＤ−Ｌ２を遮断されたマウスの５倍超であった（図１８ｃ）。複数の細胞により分泌され得る血清ＩＦＮ−γのレベルは、ＰＤ−Ｌ２を遮断したマウスでは７日目に減少し、１４日目までにマウスの両方の群で低くなった（図１８ｄ）。これとは対照的に、ＰＤ−Ｌ２を遮断したマウスの血清ＩＬ−１０は、１４日
目までに対照マウスの２倍超になった（図１８ｅ）。この結果は、脾臓１個当たりの制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の数が２．６倍と高いことと相関関係がある（図１８ｆ）。プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬに感染させたＰＤ−Ｌ２ＫＯマウスによる研究はまた、Ｔｂｅｔを発現しかつＩＦＮ−γを分泌する寄生虫特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の脾臓１個当たりの数が、１４日目において感染ＷＴマウスと比較して有意に低いことを見出した（図１９ｃ、ｄ）。最後に、ＰＤ−Ｌ２ＫＯマウスまたは抗体によるＰＤ−Ｌ２の遮断のいずれかにより、感染から１４日目までにＩＦＮ−γを分泌する寄生虫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が下がる傾向があった（図１９ｅ、ｆ）。
【００９９】
総合すると、本発明者らのデータは、ＰＤ−Ｌ２の発現がプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬマラリア感染の期間中の効果的なＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞応答にとって必要であることを示した。意義深いことには、ＰＤ−Ｌ２の遮断は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬ感染から７日目〜１４日目におけるこれらの細胞数の増加を妨害するので、Ｔｂｅｔ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の最適増殖のためにはＰＤ−Ｌ２を必要とする。注目すべきことに、機能的な寄生虫特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は７日目には存在したが、ＰＤ−Ｌ２シグナルの不在下では１４日目までに減少し、このことは、そうしたシグナルがこれら重要なエフェクター細胞の増殖および生存を向上させたことを示している。これらの発見に照らすと、プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）感染マウスは、寄生虫の大部分が１０日間以内に除去されるため、ＰＤ−Ｌ２遮断から生存する可能性が高いが、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＮＬ実験は、ＰＤ−Ｌ２のみが最初の１週間後の長期的な免疫を向上させることを示した。したがって、ＰＤ−Ｌ２は感染から最初の１週間後のみ、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞数を維持するのに必要である。
【０１００】
Ｔ−ｂｏｘ転写因子Ｔ−ｂｅｔは、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞だけでなく、ＴおよびＢリンパ球中でエフェクター細胞の運命の確立および／または維持において重要な役割を果たす１型様免疫性の主要な調節因子として出現した。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１のエフェクター機能の維持において重要な役割を果たしていると考えられる。Ｔ−ｂｅｔ欠乏マウスは、主としてＣＤ４およびγδＴ細胞の欠陥ＩＦＮ−γの産生を含む、正常に機能しないＴｈ１の分化を実証する。
【０１０１】
Ｔｈ１応答は、長い間にわって自己免疫症候群と関連付けられてきた。一般に、Ｔｈ１関連症候群と考えられてきたセリアック病およびクローン病の両方が、高いＴ−ｂｅｔ活性および／または発現を示す。Ｔｈ１関連ＩＢＤマウスモデルにおいて重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ：ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）受容体中へのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞の養子移植は、Ｔ−ｂｅｔの欠乏が疾患から防御する一方で、Ｔ−ｂｅｔ過剰発現は疾患を促進させることを示した。これはまた、多発性硬化症（ラック（Ｒａｃｋ）ら、２０１４年）、炎症性関節炎（ワング（Ｗａｎｇ）ら、２００６年）、糖尿病（ジューデス（Ｊｕｅｄｅｓ）ら、２００４年）、ベーチェット症候群（リー（Ｌｉ）ら、２００６年Ｔ）、およびフォークト小柳−原田（ＶＫＨ）病（リー（Ｌｉ）ら、２００５年）にも当てはまる。したがって、ＰＤ−Ｌ２／ガレクチン−９経路の遮断は、Ｔｂｅｔを遮断するため、自己免疫疾患の治療の新しい方法を提供することが期待できる。
【０１０２】
致死性マラリアからのｓＰＤ−Ｌ２を介した生存はＣＤ４＋Ｔ細胞を必要とする
プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭマラリアからの多量体ｓＰＤ−Ｌ２に仲介される生存へのＴ細胞の貢献を判断するために、ｓＰＤ−Ｌ２で処理した感染マウスのＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。この実験の場合、ＷＴマウスの複数群をプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭに感染させ、ｓＰＤ−Ｌ２またはヒトＩｇＧ（ｈＩｇ）で処理した。これらのマウスはまた、感染後１日目および１４〜
１８日目まで、３〜４日ごとにＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇化抗体またはラットＩｇを与えられた。以前の研究は、その使用される抗体がそれらの細胞を枯渇させることになることを確認した。ｈＩｇおよびラットＩｇを受けた感染ＷＴマウスのすべてが１４日目までに死亡するか、安楽死させる必要があった（図２０ａおよびｂ）。これとは対照的に、ｓＰＤ−Ｌ２および対照ラットＩｇを与えられたプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染マウスの７５％は、３０日間以内に寄生虫血症が除去され、モニタリングが終了したときに５０日間超にわたって生存した（図６ａおよびｂ）。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇した場合、ｓＰＤ−Ｌ２によって保護されず、臨床症状の重症度のために安楽死させる必要があった（図２０ａ、ｃ）。これとは対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、ｓＰＤ−Ｌ２によって与えられる保護効果に有意な影響を与えなかったが、これらのマウスの１１〜２１日目前後の寄生虫血症は対照マウスよりも一貫して高かった（図２０ａ、ｄ）。総合すると、これらの発見は、ｓＰＤ−Ｌ２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によりプラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染からの防御、生存、および寄生虫防除を推進することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞からの可能な貢献は比較的重要でないことを実証する。
【０１０３】
ｓＰＤ−Ｌ２はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能の向上により防御および生存を仲介する
ｓＰＤ−Ｌ２がその治療効果を発揮するメカニズムを確定するために、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ感染マウスを３日目および５日目に対照ＩｇまたはｓＰＤ−Ｌ２で処理し、対照マウスにおいて重い臨床症状が始まる前の７日目に脾臓を回収した。脾臓からＴ細胞を単離し、それをナイーブマウス由来の脾臓ＤＣと、寄生虫特異的抗原（ＭＳＰ１１９）またはペプチド（Ｐｂ１、ＳＱＬＬＮＡＫＹＬ）と共に、または追加の抗原なしで培養した。ｓＰＤ−Ｌ２による処理は、培養中にＭＳＰ１１９に応答することができる寄生虫特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増加させ、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定される）は対照Ｉｇで処理したマウスの約２．７倍であった（図２１ａ）。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥｄＵ取込みアッセイは、ｓＰＤ−Ｌ２処理マウスの寄生虫抗原に応答して増殖する寄生虫特異的Ｔ細胞の数がより多いことを確かめた（図２１ｂ）。しかしながら、コホート間のＴＲＥＧの数には差がなかった（図２１ｃ）。さらに、ｓＰＤ−Ｌ２処理マウスの寄生虫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数（すなわち、寄生虫特異的ペプチドＦ４を表すＭＨＣ四量体（Ｄｂ）に結合したもの（ラウ（Ｌａｕ）ら、２０１１年））がまた、対照群の６倍であることを示した（図２１ｄ）。しかしながら、７日間以内のこれらの細胞によるＩＮＦ−γ分泌（図２１ｅ）またはグランザイムＢ発現（図２１ｆ）の有意な増加はなかった。総合すると、これらの結果は、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の発達（これは、マラリアに対する防御に欠かせないことが知られているＴｈ１エフェクター機能の向上を表す）を促進させることにより、ｓＰＤ−Ｌ２が致死性マラリアからマウスを守ることを示す（クマー（Ｋｕｍａｒ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９９０年；スティーヴンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）およびラングホーン（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ）、２０１０年；スー（Ｓｕ）およびスティーヴンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、２００２年）。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、ｓＰＤ−Ｌ２で処理したマウスで１１〜２１日目前後に見られる防御の若干の向上を説明した（図１８ｄ）。
【０１０４】
本明細書の全体を通してその目的は、本発明の好ましい実施形態をいずれか１つの実施形態または特定の特徴の集合に本発明を限定することなく記述することであった。本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中で記述または例示した実施形態に対する様々な変更形態および修正形態をなし得る。
【０１０５】
本明細書中で参照したすべてのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、および科学文献は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
参考文献
【０１０６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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