(57)【要約】本発明では、アッセイされているプロテアーゼによって選択的に認識及び開裂されるコロイド状金ナノ粒子及びペプチド基質を用いるプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の検出のための方法及びアッセイが開示される。このアッセイでは、シグナル生成のメカニズムが、ペプチド配列によって誘発される、シグナルレポーターとして用いられる金ナノ粒子の凝集に依拠する。凝集を誘発するペプチド配列は未変化のペプチド基質又は未変化のペプチド基質のタンパク質分解断片のいずれかであり、タンパク質分解断片はアッセイされているプロテアーゼによって生成される。本発明は、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の可視的及び定量的な検出を可能とする新規、簡素、高感度かつ安価なコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイを提供する。【選択図】  図１ａ
2017518050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼの加水分解活性を検出するための方法であって、
（ａ）凝集されていないコロイド状金ナノ粒子の溶液を提供する工程であって、前記コロイド状金ナノ粒子が、表面電荷及び凝集されない場合には視認可能なピンク−赤色であって凝集された場合には視認可能な紫−青色となる特性を有する、工程、
（ｂ）以下の特性：前記金ナノ粒子上の前記表面電荷とは無関係に前記金ナノ粒子に結合する少なくとも１つの第１の官能基、前記金ナノ粒子の前記表面電荷とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、前記第１の官能基と前記第２の官能基の間に配置されて前記プロテアーゼについての少なくとも１つの開裂部位を有するアミノ酸配列を有し、前記第１及び前記第２の官能基による前記金ナノ粒子の架橋によって変化しない場合に前記ペプチド基質が前記金ナノ粒子を凝集し、前記開裂部位における前記プロテアーゼによる開裂後の前記金ナノ粒子を凝集しない特性を有するペプチド基質を提供する工程、
（ｃ）前記金ナノ粒子の溶液に前記ペプチド基質の溶液を付加することによって第１の混合物を形成し、前記金ナノ粒子の凝集を示す前記第１の混合物における色変化を検出する工程、
（ｄ）前記ペプチド基質の溶液に前記プロテアーゼの溶液を付加することによって反応混合物を形成し、前記反応混合物を所定の温度で所定の時間にわたって培養する工程であって、前記所定の温度及び前記所定の時間が、前記プロテアーゼによる前記ペプチド基質における前記開裂部位の開裂を可能とするのに充分である、工程、
（ｅ）前記金ナノ粒子の溶液に工程（ｄ）での培養後の前記反応混合物を付加することによって第２の混合物を形成し、前記金ナノ粒子の凝集を示す前記第２の混合物における色変化を検出する工程、及び
（ｆ）前記第２の反応混合物の色を前記第１の混合物の色と比較して前記ペプチド基質において前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を示す前記金ナノ粒子の凝集の減少を特定する工程、
を備える、方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、負の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、
工程（ｂ）が、ペプチド基質を提供する工程を備え、前記第２の官能基がアルギニン、リシン、ヒスタジン又はその混合物の少なくとも１つからなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、正の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、
工程（ｂ）が、ペプチド基質を提供する工程を備え、前記第２の官能基がアスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物の少なくとも１つからなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スブチリシン又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物における色変化を視覚的に検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物の色を前記第１の混合物の色と視覚的に比較する工程を備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって前記第１及び前記第２の混合物における色変化を検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物のスペクトルを前記第１の混合物のスペクトルと比較する工程を備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）が、一連の異なるペプチド基質濃度を各々同じ濃度で一連の金ナノ粒子に付加することによって凝集基準曲線を準備する工程をさらに備え、
工程（ｆ）が、前記第２の反応混合物の色を前記基準曲線と比較して凝集の減少を特定するとともに前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を定量的に特定する工程を備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物における色変化を視覚的に検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物の色を前記基準曲線の色と視覚的に比較する工程を備える、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって前記第１及び前記第２の混合物における色変化を検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物のスペクトルを前記基準曲線のスペクトルと比較する工程を備える、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｄ）の前に、前記プロテアーゼの阻害物質を、所定の温度で所定の期間にわたって前記プロテアーゼの前記溶液を用いて前記プロテアーゼ阻害物質の溶液を培養することによって検出して、抑制されたプロテアーゼ溶液を形成する工程、
工程（ｄ）において前記プロテアーゼの前記溶液として前記抑制されたプロテアーゼ溶液を付加する工程、及び、
工程（ｅ）の後であって工程（ｆ）において、前記抑制されたプロテアーゼ溶液から形成された前記第２の反応混合物の色を前記プロテアーゼ阻害物質で培養されていない同量の前記プロテアーゼで形成された第２の反応混合物と比較して前記プロテアーゼによってもたらされた凝集の前記減少の低下を検出する工程をさらに備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼの加水分解活性を検出するための方法であって、
（ａ）凝集されていないコロイド状金ナノ粒子の溶液を提供する工程であって、前記コロイド状金ナノ粒子が、表面電荷及び凝集されない場合には視認可能なピンク−赤色であり、凝集された場合には視認可能な紫−青色となる特性を有する、工程、
（ｂ）以下の特性：前記金ナノ粒子上の前記表面電荷とは無関係に前記金ナノ粒子に結合する少なくとも１つの第１の官能基、前記金ナノ粒子の前記表面電荷でイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、前記第１の官能基と前記第２の官能基の間の前記ペプチド配列の外側に配置され、前記プロテアーゼについての少なくとも１つの開裂部位を有するアミノ酸配列を有し、前記ペプチド基質が、未変化の場合には前記金ナノ粒子を凝集させず、前記第１の官能基及び前記第２の官能基を含有する少なくとも１つのタンパク質分解断片が、前記開裂部位における前記プロテアーゼによる開裂後に前記金ナノ粒子を凝集する特性を有するペプチド基質を提供する工程、
（ｃ）前記金ナノ粒子の溶液に前記ペプチド基質の溶液を付加することによって第１の混合物を形成し、前記金ナノ粒子の未凝集を示す前記第１の混合物の色を検出する工程、
（ｄ）前記ペプチド基質の溶液に前記プロテアーゼの溶液を付加することによって反応混合物を形成し、前記反応混合物を所定の温度で所定の時間にわたって培養する工程であって、前記所定の温度及び前記所定の時間が、前記プロテアーゼによる前記ペプチド基質における前記開裂位置の開裂を可能とするのに充分である、工程、
（ｅ）前記金ナノ粒子の溶液に工程（ｄ）での培養後の前記反応混合物を付加することによって第２の混合物を形成し、前記金ナノ粒子の凝集を示す前記第２の混合物における色変化を検出する工程、及び、
（ｆ）前記第２の反応混合物の色を前記第１の混合物の色と比較して前記ペプチド基質において前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を示す前記金ナノ粒子の凝集の度合いを特定する工程、
を備える、方法。
【請求項１３】
工程（ａ）が、負の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、
工程（ｂ）が、ペプチド基質を提供する工程を備え、前記第２の官能基がアルギニン、リシン、ヒスタジン又はその混合物の少なくとも１つからなる、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）が、正の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、
工程（ｂ）が、ペプチド基質を提供する工程を備え、前記第２の官能基がアスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物の少なくとも１つからなる、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）が、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スブチリシン又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の各々の色を視覚的に検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物の色を前記第１の混合物の色と視覚的に比較する工程を備える、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって前記第１及び前記第２の混合物の色を検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物のスペクトルを前記第１の混合物のスペクトルと比較する工程を備える、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）が、一連の異なる濃度の前記凝集しているペプチド基質タンパク質分解断片を各々同じ濃度で一連の金ナノ粒子に付加することによって凝集基準曲線を準備する工程をさらに備え、
工程（ｆ）が、前記第２の反応混合物の色を前記基準曲線と比較して凝集の度合いを特定するとともに前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を定量的に特定する工程を備える、
請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の色を視覚的に検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物の色を前記基準曲線の色と視覚的に比較する工程を備える、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）及び（ｅ）が、前記第１及び前記第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって前記第１及び前記第２の混合物の色を検出する工程を備え、
工程（ｆ）が、前記第２の混合物のスペクトルを前記基準曲線のスペクトルと比較する工程を備える、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）の前に、前記プロテアーゼの阻害物質を、所定の温度で所定の期間にわたって前記プロテアーゼの前記溶液を用いて前記プロテアーゼ阻害物質の溶液を培養することによって検出して、抑制されたプロテアーゼ溶液を形成する工程、
工程（ｄ）において前記プロテアーゼの前記溶液として前記抑制されたプロテアーゼ溶液を付加する工程、及び、
工程（ｅ）の後であって工程（ｆ）において、前記抑制されたプロテアーゼ溶液から形成された前記第２の反応混合物の色を前記プロテアーゼ阻害物質で培養されていない同量の前記プロテアーゼで形成された第２の反応混合物と比較して前記プロテアーゼによってもたらされた凝集の低下を検出する工程をさらに備える、
請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼのタンパク質分解活性を検出するためのアッセイキットであって、
（ａ）各々が表面電荷を有する複数の非凝集金ナノ粒子、
（ｂ）ペプチド配列を備えるペプチド基質であって、該ペプチド基質が、前記金ナノ粒子の１つに共有結合することができる少なくとも１つの第１の官能基、前記金ナノ粒子の１つの前記表面電荷とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、及び前記第１の官能基と前記第２の官能基の間のペプチド配列内又は前記第１の官能基と前記第２の官能基の間の前記ペプチド配列外のいずれかの場所にある、前記プロテアーゼについての開裂部位を備え、前記開裂部位が前記第１の官能基と前記第２の官能基の間の前記ペプチド配列内の位置にある場合には前記ペプチド基質が前記金ナノ粒子を架橋して前記ナノ粒子を凝集することができ、前記プロテアーゼによる前記ペプチド基質の開裂後に形成される前記ペプチド基質の加水分解断片のいずれも前記金ナノ粒子を架橋することができず、前記開裂部位が前記第１の官能基と前記第２の官能基の間の前記ペプチド配列外の位置にある場合には前記ペプチド基質が前記金ナノ粒子を架橋することができずに前記ナノ粒子を凝集できず、前記第１及び前記第２の官能基を含有する加水分解断片が、前記プロテアーゼによる前記ペプチド基質の開裂後の形成の後に前記金ナノ粒子を架橋することができ、前記加水分解断片が前記金ナノ粒子の凝集をもたらす、ペプチド基質、
（ｃ）５２０ナノメートル±５ナノメートルにおいて最大吸光ピークを有する吸光スペクトルを有する前記非凝集金ナノ粒子であって、前記非凝集金ナノ粒子の溶液はピンク−赤の可視色を有し、前記金ナノ粒子の凝集が６００ナノメートルから７５０ナノメートルまでの範囲における新たな吸光ピークの形成を伴う前記吸光スペクトルのシフト及び５２０ナノメートル±５ナノメートルにおける前記吸光度の減少をもたらし、前記シフトが紫−青色への前記可視色の変化を引き起こす、前記非凝集金ナノ粒子、及び、
（ｄ）選択的に、前記ペプチド基質を開裂する前記プロテアーゼの標準化調製物を含み、前記標準化調製物が前記プロテアーゼのタンパク質分解活性の基準曲線を準備するのに有用である、標準化調製物、
を備えた、アッセイキット。
【請求項２４】
前記金ナノ粒子が、少なくとも１つの寸法における１〜２００ナノメートルのサイズ及び球体、棒、角柱、立方体、円盤、コアシェル構造体、枠、骨組み又はその組合せからなるグループから選択された形状を有する、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項２５】
前記金ナノ粒子が、水、メタノール、エタノール、アセトン、生体緩衝液又はその混合物の１つにおける溶液として提供される、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項２６】
前記金ナノ粒子が、前記金ナノ粒子によって少なくとも部分的に被覆されたナノ構造体として提供される、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの第１の官能基が、チオール基、アミン基、ホスフィン基、ジスルフィド基又はその組合せからなる、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの第２の官能基が、アルギニン、リシン、ヒスタジン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物からなる、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項２９】
前記表面電荷が負電荷である場合には前記少なくとも１つの第２の官能基がリシン、アルギニン、ヒスタジン及びその混合物からなるグループから選択され、
前記表面電荷が正電荷である場合には前記少なくとも１つの第２の官能基がアスパラギン酸、グルタミン酸及びその混合物からなるグループから選択される、
請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項３０】
前記開裂部位が、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ又はその混合物の少なくとも１つによって開裂可能である、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項３１】
前記開裂部位が、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スブチリシン又はその混合物の少なくとも１つによって開裂可能である、請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項３２】
前記プロテアーゼの前記標準化調製物をさらに備え、
前記プロテアーゼが前記ペプチド基質を開裂させることができ、
前記キットが、前記標準化プロテアーゼのプロテアーゼ阻害物質の活性を検出するのに使用可能であり、
前記プロテアーゼ阻害物質の活性が、前記プロテアーゼ阻害物質の存在下で前記標準化プロテアーゼの前記タンパク質分解活性の減少をモニタすることによって測定される、
請求項２３に記載のアッセイキット。
【請求項３３】
前記プロテアーゼ阻害物質が、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ボセプレビル、テラプレビル、ウシ膵臓トリプシン阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ１、α１抗トリプシン又はその混合物の少なくとも１つからなる、請求項３２に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年５月３０日出願の米国仮特許出願第６２／００５１７５号の利益を主張し、同出願の開示全体が本願の開示の一部とみなされ、参照によりここに取り込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
特になし。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、アッセイされている（Ａｓｓａｙｅｄ）プロテアーゼにより選択的に認識及び開裂されるコロイド状金ナノ粒子及びペプチド基質を使用してプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質を検出するための方法及びアッセイに関する。いくつかの実施形態において本発明は、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の活性の視覚的でかつ定量的な検出を可能とする簡素、高感度かつ安価なコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイを提供する。このアッセイにおいてシグナル発生のメカニズムは、特異的なプロテアーゼによるペプチド基質の加水分解開裂又はプロテアーゼ阻害物質による開裂の阻害に依拠し、金ナノ粒子の凝集の状態、及びその結果得られるコロイド状金ナノ粒子の溶液の色を判定する。
【０００４】
プロテアーゼはペプチド配列内の特定の部位でのペプチド配列及びタンパク質を加水分解的に開裂する酵素の一種であり、すなわち、ペプチド配列の末端からアミノ酸を除去する。プロテアーゼはヒトゲノムの２％を構成し、タンパク質合成のためのアミノ酸の生成又は他の代謝経路での利用だけでなく、タンパク質活性化、細胞調節及びシグナル伝達において重要な役割を担うことで生体内の生物学的プロセスの多様なアレイを制御すると推定される。
【０００５】
したがって、プロテアーゼ活性の摂動が癌、神経変性障害、炎症及び心血管疾患などの多数の病態に関連するのは驚くべきことではない。改変されたプロテアーゼ活性は癌の予後を示し得るため、癌のバイオマーカーとして特定のプロテアーゼの使用を有効なものとすることができる。例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、セリンプロテアーゼは、前立腺癌バイオマーカーとして最も広く知られ、ある人のそのレベルは潜在的な前立腺癌の早期発見の一形態として使用される。
【０００６】
プロテアーゼは生物学、医学及びバイオテクノロジーに密接な関連があるため、プロテアーゼのタンパク質分解活性の検出が可能な高感度のアッセイは非常に価値が高く、薬剤スクリーニング、診断、及び種々多様な用途への有効かつ選択的な治療法の開発において幅広い用途がある。
【０００７】
過去数十年では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性同位体ベースのアッセイ及び蛍光発生基質ベースのアッセイなどの多数のアッセイ方法が開発され、プロテアーゼ活性の検出のために利用されてきた。しかしながら、放射性同位体の使用に関して起こり得るアッセイの安全性の問題、アッセイの感度、アッセイの特異性、特定の機器のための要件といった制約によって、及び労力とともに時間がかかるために、プロテアーゼ活性の検出のためのこれらのアッセイの有用性及び適用性を高める試みが妨げられる。したがって、プロテアーゼ活性のオンサイト検出が可能な簡素、低コスト、高感度なアッセイへの切迫した需要がある。この切迫した需要に取り組むため、様々なプロテアーゼ活性の検出のためのコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの新しい設計を本発明で開示する。
【０００８】
コロイド状金ナノ粒子とは、分散媒体、後述のように他の媒体も使用可能ではあるが通常は水中で分散させた金ナノ粒子である。（ｉ）紫外線（ＵＶ）波長から近赤外（ＮＩＲ）波長全域で同調可能であり、大きさ及び形状に依存する強力な光減衰及び散乱；（ｉｉ）機能的リガンドへの接合のための大きな表面積、及び（ｉｉｉ）生体系における高い許容レベルを可能にする、僅か又は長期ではない毒性又は生体内の他の副作用、といった金ナノ粒子固有の物理的、化学的及び表面の特性のため、一世紀以上にわたって科学者から多くの関心を集めている。金ナノコロイドともいうコロイド状金ナノ粒子は、造影剤（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６，８３及びＮａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５，５，８２９）、治療薬（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００７，７，１９２９及びＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１０，２）、生物センサ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００８，３７，２０２８）、細胞標的ベクター（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００７，７，２４７）のような、生物学的及び医学的な幅広い種類の用途における可能性ある使用のために現在研究されている。
【０００９】
現在では金ナノコロイドの大多数は塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）方法論の標準的湿式化学的クエン酸ナトリウム還元法を使用して調製される。この方法は、負帯電のクエン酸イオンによってキャップされ、又は覆われた５〜２００ナノメートル（ｎｍ）の範囲の直径を有する球状の金ナノ粒子の合成を引き起こす。クエン酸イオンキャッピングは、ナノ粒子上に負の表面電荷を生成し、ナノ粒子間に静電斥力を供給することでナノ粒子が凝集することを防ぐ。
【００１０】
コロイド状金ナノ粒子を形成する他の湿式化学的方法には、Ｂｒｕｓｔ法、Ｐｅｒｒａｕｌｔ法及びＭａｒｔｉｎ法が含まれる。Ｂｒｕｓｔ法は、トルエン中のテトラオクチルアンモニウムブロミド及び水素化ホウ素ナトリウムを用いた塩化金酸の反応に依存する。Ｐｅｒｒａｕｌｔ法は、ヒドロキノンを使用して金ナノ粒子の種を含む溶液中でＨＡｕＣｌ４を還元する。Ｍａｒｔｉｎ法はＮａＢＨ４による水中でのＨＡｕＣｌ４の還元を利用するものであり、安定化剤ＨＣｌ及びＮａＯＨは正確な比率で存在する。湿式化学的方法の全ては、まず強酸を用いて金（Ａｕ）を原子式ＨＡｕＣｌ４に変換し、次にこの原子形態を利用してボトムアップ型プロセスでナノ粒子をビルドアップすることに依拠する。方法の全ては安定化剤の存在を必要とし、金ナノ粒子が溶液から凝集及び沈殿するのを防止する。
【００１１】
湿式化学的方法に加えて、金属ナノ粒子を作製するためのいくつかの物理的方法が存在する。金属ナノ粒子を作製するこれらの物理的方法の１つは、液体に浸漬する金属ターゲットのパルスレーザアブレーションに基づき、ますます広範囲に及ぶ関心を集めている。化学的手法と比較して、液体に浸漬する金属ターゲットのパルスレーザアブレーションは、金属ナノ粒子の後続の機能化及び安定化に対してそれら全てが問題となり得る化学的前駆物質、還元剤及び安定化リガンドを用いずに、安定したナノコロイドを生成することの可能性を与える。したがって、ＨｅｎｇｌｅｉｎとＦｏｊｔｉｋによって有機溶剤又は水溶液いずれかでのナノサイズの粒子の調製が開発され、同様に１９９３年にＣｏｔｔｏｎによって露出面を有する水性表面増強ラマン散乱活性金属ナノ粒子の調整が開発されてから、液体中の金属ターゲットのパルスレーザアブレーションの用途は大きな関心を集めてきた。初期の手法で用いられたレーザはナノ秒レーザであった。ナノ秒レーザの使用に関するいくつかの問題を解消することができるフェムト秒レーザの出現により、これらの手法への関心が増した。ナノ秒パルスを用いるレーザアブレーションと比較すると、フェムト秒レーザーパルスによる金属ターゲットの照射は正確なレーザ誘起ブレイクダウン閾値を与え、フェムト秒レーザーパルスがターゲット中の電子に電子格子の熱化プロセスによって非常に高速にエネルギーを放出するので、効果的に熱影響部を最小化することができる。手法の容易性、金属又は溶媒に関する汎用性、及び制御可能で混在物の無い環境でのナノ粒子の成長により特徴付けられて、固体ターゲットからのパルスレーザ誘起アブレーションは、金属コロイドナノ粒子を得るのに最も重要な物理的手法の１つとして発展した。
【００１２】
上述の金ナノコロイド固有の光学及び電子特性の中で、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）は特別な関心を受けている。ＬＳＰＲの物理的起源は、ナノ粒子のサイズ、形状及び凝集状態に；周囲の媒体の絶縁特性に；並びにナノ粒子表面上のイオン吸着に非常に敏感である正確なＬＳＰＲ帯を有する光との相互作用に応じた金ナノ粒子表面上の伝導帯電子のコヒーレント振動と関連付けられる。例えば、平均粒径が２０ナノメートル（ｎｍ）の金（Ａｕ）ナノコロイドについて、このＡｕナノコロイドの局在表面プラズモン共鳴の最大吸光度は５２０ｎｍ±５ｎｍである。金ナノ粒子の凝集で、平均粒径が２０ｎｍのＡｕナノコロイドの局在表面プラズモン共鳴は、５２０ｎｍ±５ｎｍでの吸収帯の減少、及び凝集体を形成した結果ピンク−赤の初期色から紫−青色へと溶液の色変化をもたらす周囲の粒子の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）間の双極子カップリングの結果、最大がより長い６００〜７００ｎｍの間の波長の新しい吸収帯の出現とともに大幅に修正される。これらの色変化は目視可能であり、金ナノ粒子の凝集の度合いの定性的測度を与えることができる。
【００１３】
金ナノ粒子の凝集時に粒子間の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）カップリングから生じる金ナノコロイド溶液のピンク−赤から紫−青への色変化を利用して、シグナルレポーターとしての金ナノ粒子を用いる吸収ベースの比色アッセイは、標的検体の検出又は金ナノ粒子凝集を直接的又は間接的に誘起することが可能な生物学的プロセスのため本発明において設計された。金ナノ粒子は極めて高い吸光係数を有するため、例えば、２０ｎｍの球状金ナノ粒子に対して５２０ｎｍ±５ｎｍにおいて、有機色素のそれよりも１０００倍高い８．８×１０８Ｍ−１ｃｍ−１であり、金ナノ粒子ベースの比色アッセイは蛍光シグナルを使用する従来のバイオ検出アッセイよりも非常に高い感度を有する。加えて、金ナノ粒子凝集でピンク−赤から紫−青への金ナノコロイド溶液の色変化は目視で観察可能であり、したがって金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用する定性分析では高度な機器を必要としない。金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用する定量分析では金ナノコロイドの吸収スペクトルは標準的な分光光度計又はプレートリーダーを使用して記録することができる。分散する金ナノ粒子に対応する５２０ｎｍ±５ｎｍでの吸光度と凝集した金ナノ粒子に対応するより長い波長（６００〜７００ｎｍの間）の吸光度の比は、凝集プロセス又は色変化を定量化するのに使用されることが多い。例えば６００〜７００ｎｍの間の積分吸光度の偏差を測定する凝集パラメータは時には定性分析に使用され、この方法はより高い感度を与えることができる。
【００１４】
金ナノ粒子ベースの比色アッセイは、容易性及び高感度のため、臨床診断、薬物発見、薬剤スクリーニング及び環境汚染物質の分析などの広い用途での注目の度合いが高まっている。最初の金ナノ粒子ベースの比色アッセイはＣｈａｄ  Ｍｉｒｋｉｎと共同研究者によってＤＮＡ検出のために開発され（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，２７７，１０７８）、このプラットフォームは、タンパク質、小分子、金属イオン及び細胞でさえも含む多種多様な標的検体の検出に次第に適用されて、急速に従来の検出技術の重要な代替技術となっている。
【００１５】
本発明において、我々は、ペプチド基質が誘起した金ナノ粒子の凝集及び脱凝集の固有メカニズムに基づいて、金ナノコロイド及びペプチド基質を使用して高感度のプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質を検出するための方法及びアッセイを開発した。ペプチド基質が誘起した金ナノ粒子を利用するプロテアーゼ検出のための金ナノ粒子の応用は、Ｐａｏｌｏ  Ｓｃｒｉｍｉｎ及び共同研究者によって報告されている（米国特許アカデミー紀要  ２００６、１０３、３９７８）。彼らのプロセスにおいて、検出で使用するペプチド基質は、ペプチド基質のアミノ末端に位置する一方のシステインと、ペプチド基質のカルボキシル末端に位置する他方のシステインの、２つのシステインを含有しなければならない。システインは硫黄−金結合を介して金ナノ粒子に結合するので、２つのシステインを特徴付ける未変化のペプチド基質は２つのシステインアームを通して金ナノ粒子と架橋し、未変化のペプチド基質による金ナノ粒子の凝集のため、コロイド状金ナノ粒子溶液の色がピンク−赤から紫−青に変化する。反対に、特異的なプロテアーゼにより未変化のペプチド基質の分裂後、アミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかに位置するただ１つのシステインを含むタンパク分解したペプチド断片は、金ナノ粒子を架橋しないので比色変化が生じない。したがって、Ｐａｏｌｏ  Ｓｃｒｉｍｉｎ及び共同研究者のプロセスにおいて、プロテアーゼ活性は、対象のプロテアーゼの存在による金ナノ粒子凝集の減少を測定することによって判別することができる。しかしながら、我々の研究において、驚くべきことに、アミノ末端、カルボキシル末端又はいくつかの例においてはペプチド基質の内部に位置し得る、ただ１つのシステインを含むペプチド基質もまた一定条件下で金ナノ粒子の凝集を誘起するのに使用され得ることを我々は発見した。この現象を利用して、我々は本発明においてプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の視覚的かつ定量的な検出を可能とする簡素、高感度かつ安価なコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの新案を開示する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、対応のプロテアーゼ阻害物質の検出のためにアッセイ又は使用されているプロテアーゼによって選択的に認識及び開裂される金ナノ粒子及びペプチド基質を用いてプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質を検出するための方法及びアッセイに関する。ペプチド基質は、対象となるプロテアーゼによって認識及び開裂されるアミノ酸配列；少なくとも１つの官能基であって金ナノ粒子に結合することができ、カルボキシル末端、アミノ末端、又は加水分解開裂によって曝露される場合の内側に位置する少なくとも１つの官能基；及び未変化のペプチド基質又はその開裂生成物の少なくとも１つが金ナノ粒子の凝集をもたらす特性を含む。これらの固有のペプチド基質は、対象となるプロテアーゼ及びこれらのプロテアーゼの特異的な阻害物質の双方を検出及び定量化するのに使用され得る。使用される金ナノ粒子は、ペプチド基質との相互作用の前に、負又は正いずれかの表面電荷を有し得る。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は、金ナノ粒子の凝集をもたらす未変化のペプチド基質の能力に依拠する、プロテアーゼの量を検出するための方法を提供する。この実施形態では、未変化のペプチド基質は、金ナノ粒子に対する親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基であって、好ましくは金ナノ粒子との共有結合を形成することができる第１の官能基；完全に未変化の場合に、ナノ粒子とのイオン結合を形成することができ、それにより金ナノ粒子の凝集をもたらす能力をペプチド基質に与える少なくとも１つの第２の官能基；及びアッセイされているプロテアーゼによって選択的に認識及び開裂され、第１の官能基と第２の官能基の間に位置し、そのために、プロテアーゼによる開裂後にペプチド基質はナノ粒子を凝集することができない、少なくとも１つのアミノ酸配列を備える。金ナノ粒子は、ペプチド基質において第２の官能基を形成するのに必要なアミノ酸をある程度特定する正又は負のいずれかの表面電荷を有し得る。第１の工程では、プロテアーゼを含有すると疑われる生体液又は他の液体などの液体が、既知量のペプチド基質を含有する溶液と混合されて混合物を生成する。第２の工程では、混合物が、プロテアーゼによってペプチド基質のいくらかの加水分解開裂を可能とするのに充分な時間にわたって所定の温度で培養される。一般に、所定の温度は少なくとも２０℃であるが、本発明は、耐熱性及び耐寒性プロテアーゼの両方を検出するのにも使用可能であり、したがって、反応温度は検討されているプロテアーゼに必要とされるように調整され得る。一般に、培養時間は１０分から３時間までの範囲となるが、アッセイされているプロテアーゼの培養温度及び量に応じてその他の時間が必要となることもある。第３の工程では、加水分解開裂培養工程後に、ピンク−赤色の金ナノ粒子のコロイド状懸濁物、すなわち非凝集のナノ粒子が混合物に付加され、それにより、ナノ粒子の凝集が残りの未変化のペプチド基質によって誘発され、３０分以内に最初のピンク−赤から紫−青への特徴色シフトとともに最終溶液の形成がもたらされる。第４の工程では、最終溶液の色を既知量のペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する基準試料の色に比較することによって、液体における上記プロテアーゼの量を定性的に検出する。さらに、ＵＶ−ＶＩＳ分光計又はプレートリーダーを用いて測定される最終溶液の吸光度を既知量のペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する試料を用いて準備された基準曲線の吸光度と比較することによって液体におけるプロテアーゼの量を定量的に特定する。
【００１８】
ある実施形態では、本発明は、プロテアーゼの検出について上述したのと同様のプロセスを用いて金ナノ粒子の凝集をもたらす未変化のペプチド基質の能力に依存する、試料中のプロテアーゼ阻害物質の量を検出するための方法を提供する。使用される金ナノ粒子は、ペプチド基質に必要となるアミノ酸をある程度特定する正又は負いずれかの表面電荷を有し得る。第１の工程は、ペプチド基質の加水分解開裂がアッセイ中のプロテアーゼ阻害物質によってブロックされる適切なプロテアーゼを識別することである。上述したように、未変化のペプチド基質は、金ナノ粒子に対する親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基；プロテアーゼによって選択的に認識及び開裂される少なくとも１つのアミノ酸配列；及び完全に未変化であるがプロテアーゼによる開裂後ではないときに第２の官能基によって金ナノ粒子の凝集をもたらす能力を備える。第２の工程は、プロテアーゼ阻害物質を含有すると疑われる生体液などの液体が、既知量のプロテアーゼを有する溶液と混合すること、及び溶液を所定の温度で、一般には上記のように約２０℃以上の温度で、上記プロテアーゼ阻害物質がペプチド基質の加水分解開裂に関するプロテアーゼの機能を遮断することを可能とするのに充分な時間にわたって培養することを含む。第３の工程は、プロテアーゼに対して特異的なペプチド基質の水溶液を被疑プロテアーゼ阻害物質及びプロテアーゼの溶液に付加して、プロテアーゼ、被疑プロテアーゼ阻害物質及びペプチド基質を含有する混合物を生成すること、及び混合物を所定の温度、上述のように一般には約２０℃以上の温度で、プロテアーゼによるペプチド基質のいくらかの加水分解開裂を可能とするのに充分な時間にわたって培養することを含む。第４の工程は、ピンク−赤色の金ナノ粒子のコロイド状懸濁物、すなわち非凝集のナノ粒子を混合物に付加することを含み、それにより、ナノ粒子の凝集が残りの未変化のペプチド基質によって誘発され、３０分以内に特徴色シフトとともに最終溶液の形成がもたらされる。第５の工程は、最終溶液の色を既知量のプロテアーゼ阻害物質、プロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する基準試料の色と比較することによって、液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定性的に特定することを含む。さらに、ＵＶ−ＶＩＳ分光計又はプレートリーダーを用いて測定される最終溶液の光吸光度を既知量のプロテアーゼ阻害物質、プロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する試料を用いて準備された基準曲線の吸光度と比較することによって液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定量的に特定する。本発明のアッセイ方法の上記開示から分かるように、このアッセイ処理はまた、未知のプロテアーゼ又はプロテアーゼ阻害物質を検出するのに使用可能である。未知のプロテアーゼの検出は、プロテアーゼを含有すると疑われる試料の一連の希釈物の存在下での凝集度と不存在下での凝集度を比較することによって達成可能である。同様の態様で、未知のプロテアーゼ阻害物質活性を発見するのに、一連のプロテアーゼ希釈物によってもたらされる凝集状態への被疑プロテアーゼ阻害物質の一連の希釈物の影響が特定される。
【００１９】
ある実施形態では、本発明は、未変化のペプチド基質が金ナノ粒子の凝集をもたらす能力がないこと及び金ナノ粒子の凝集をもたらす開裂ペプチド基質の能力に依存するプロテアーゼ検出のための方法を提供する。本実施形態では、未変化のペプチド基質は、金ナノ粒子に対する親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基であって好ましくは金ナノ粒子と共有結合を形成することができる第１の官能基；アッセイ中のプロテアーゼによって選択的に認識及び開裂される少なくとも１つのアミノ酸配列；及び金ナノ粒子とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基であって開裂部位が第１の官能基と第２の官能基の間の配列外にあるように位置する第２の官能基を備える。第２の官能基は、未変化のペプチド基質における金ナノ粒子と相互作用しないようにブロックされているが、開裂後に露出されるので、完全に未変化の場合には未変化のペプチドに金ナノ粒子の凝集をもたらす能力はないが、プロテアーゼによる開裂後に金ナノ粒子の凝集をもたらす能力がある。第２の官能基は、未変化のペプチド配列における構造的干渉に起因して、又は単にその内側位置のために金ナノ粒子との相互作用を利用できないために「ブロック」され得る。金ナノ粒子は、ペプチド基質に必要となるアミノ酸をある程度特定する正又は負いずれかの表面電荷を有し得る。第１の工程では、プロテアーゼ阻害物質を含有すると疑われる生体液又は他の液体などの液体が、既知量のペプチド基質を含有する溶液に混合されて混合物を生成する。第２の工程では、混合物が所定の温度で、一般には上記の約２０℃以上の温度で、いくらかのペプチド基質の加水分解開裂を可能とするのに充分な時間にわたって培養される。第３の工程では、ピンク−赤色の金ナノ粒子のコロイド状懸濁物、すなわち非凝集のナノ粒子が溶液に付加され、それにより、ナノ粒子はペプチド開裂生成物の１以上によって凝集可能となり、３０分以内にピンク−赤から紫−青への特徴色シフトとともに最終溶液の形成がもたらされる。最終溶液の色を既知量のプロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する基準試料の色に比較することによって、液体におけるプロテアーゼの量を定性的に検出する。代替的に、基準物が、金ナノ粒子及び既知量の凝集加水分解断片を用いて調製されてもよい。さらに、ＵＶ−ＶＩＳ分光計又はプレートリーダーを用いて測定される最終溶液の光吸光度を既知量のプロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する試料を用いて準備された基準曲線の吸光度と比較することによって液体におけるプロテアーゼの量を定量的に特定する。基準物は、上述のように、金ナノ粒子及び凝集加水分解断片を用いても調製され得る。この実施形態では、金ナノ粒子に結合する第１の官能基は、アミノ又はカルボキシル末端などの未変化のペプチド基質に露出され、又は加水分解開裂後に露出され得る。同様に、第２の官能基は、加水分解断片に確実に露出されつつ、未変化のペプチドに対して露出又はブロックされ得る。したがって、一実施形態では、第１及び第２の官能基の双方が未変化のペプチドにおいて有効ではなく双方とも加水分解断片の１つにおいて有効であり、又は第１若しくは第２の官能基の一方が未変化のペプチド基質において有効ではないが加水分解断片の１つにおいて第１及び第２の官能基の他方で露出される。例えば、未変化のペプチドの内側に位置するアミノ又はカルボキシル末端のシステインを有するために未変化のペプチド基質におけるナノ粒子に結合できない開裂生成物を想到することができる。
【００２０】
ある実施形態では、本発明は、プロテアーゼの検出について上述したのと同様のプロセスを用いて、未変化のペプチド基質が金ナノ粒子の凝集をもたらすことができないことに依拠する、試料中のプロテアーゼ阻害物質の量を検出するための方法を提供する。使用される金ナノ粒子は、ペプチド基質に必要となるアミノ酸をある程度特定する正又は負いずれかの表面電荷を有し得る。第１の工程は、ペプチド基質の加水分解開裂がアッセイ中のプロテアーゼによってブロックされる適切なプロテアーゼを識別することである。未変化のペプチド基質は、金ナノ粒子に対する親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基であって好ましくは金ナノ粒子と共有結合を形成する第１の官能基；プロテアーゼによって選択的に認識及び開裂される少なくとも１つのアミノ酸配列；及び完全に未変化の場合には金ナノ粒子の凝集を引き起こすことができないが、プロテアーゼによる開裂後に金ナノ粒子の凝集を引き起こす能力を備える。第２の官能基の位置及びその特性は、プロテアーゼを検出するのにこの種のペプチド基質が使用される実施形態について上述した通りである。第２の工程は、プロテアーゼ阻害物質を含有すると疑われる生体液又は他の液体となり得る液体を、既知量のプロテアーゼを有する溶液と混合すること、及び溶液を所定の温度で、一般には上記の約２０℃以上の温度で、上記プロテアーゼ阻害物質がペプチド基質の加水分解開裂に関するプロテアーゼの機能を遮断することを可能とするのに充分な時間にわたって培養することを含む。第３の工程は、プロテアーゼに対して特異的なペプチド基質の水溶液を被疑プロテアーゼ阻害物質及びプロテアーゼの溶液に付加して、プロテアーゼ、被疑プロテアーゼ阻害物質及びペプチド基質を含有する混合物を生成すること、及び混合物を所定の温度、一般には上記の約２０℃以上の温度で、プロテアーゼによるペプチド基質のいくらかの加水分解開裂を可能とするのに充分な時間にわたって培養することを含む。第４の工程は、ピンク−赤色の金ナノ粒子のコロイド状懸濁物、すなわち非凝集のナノ粒子を混合物に付加することを含み、それにより、ナノ粒子の凝集が開裂ペプチド基質によって誘発され、３０分以内に最初のピンク−赤から紫−青への特徴色シフトとともに最終溶液の形成がもたらされる。第５の工程は、最終溶液の色を既知量のプロテアーゼ阻害物質、プロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する基準試料の色と比較することによって、液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定性的に検出することを含む。代替的に、上述したように、金ナノ粒子及び既知量の凝集ペプチド断片だけで基準物が調製され得る。さらに、ＵＶ−ＶＩＳ分光計又はプレートリーダーを用いて測定される最終溶液の光吸光度を既知量のプロテアーゼ阻害物質、プロテアーゼ、ペプチド基質及び金ナノ粒子を含有する試料を用いて準備された基準曲線の吸光度と比較することによって液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定量的に特定する。
【００２１】
ある実施形態では、本発明は、プロテアーゼの量を検出するためのアッセイシステムに向けられ、アッセイシステムは、コロイド状金ナノ粒子；金ナノ粒子に対して親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基を有する有効ペプチド基質、アッセイ中のプロテアーゼによって選択的に認識及び開裂されるアミノ酸配列、及び未変化のペプチド基質として、又は開裂されたペプチド基質として第２の官能基によって金ナノ粒子の凝集をもたらす能力；並びに基準曲線の作成を可能とするアッセイ中の既知量のプロテアーゼ及びペプチド基質を含有する基準試料を備える。代替的に、基準物は、金ナノ粒子及び既知量の凝集ペプチド配列を用いて調製される。アッセイシステムはまた、ペプチド基質及び基準試料を溶解するための液体並びに適切な反応容器を選択的に含んでいてもよい。ある実施形態では、アッセイシステムは、プロテアーゼの量の迅速な視覚的推定を可能とするように、金ナノ粒子の色及び対応の凝集度を示す色カードを含んでいてもよい。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、プロテアーゼ阻害物質の量を検出するためのアッセイシステムに向けられ、アッセイシステムは、コロイド状金ナノ粒子；適切なプロテアーゼ、すなわちペプチド基質の開裂がプロテアーゼ阻害物質によってブロックされるもの；金ナノ粒子に対する親和性を有する少なくとも１つの第１の官能基を有するプロテアーゼに対する有効ペプチド基質；プロテアーゼによって認識及び開裂されるアミノ酸配列、及び未変化のペプチド基質として、又は開裂されたペプチド基質として第２の官能基によって金ナノ粒子の凝集をもたらす能力；並びに基準曲線の作成を可能とする既知量のプロテアーゼ阻害物質及びプロテアーゼ及びペプチド基質を含有する基準試料を備える。アッセイシステムは、プロテアーゼ、ペプチド基質及び基準試料を溶解するための液体並びに適切な反応容器を選択的に含み得る。ある実施形態では、アッセイシステムは、プロテアーゼ阻害物質の量の迅速な視覚的推定を可能とするように、金ナノ粒子の色及び対応の凝集度を示す色カードを含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】トリプシンのようなプロテアーゼの活性を検出するのに使用する本発明によるコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイのいくつかの実施形態を概略的に図示する。
【図１ｂ】トリプシンのようなプロテアーゼの活性を検出するのに使用する本発明によるコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイのいくつかの実施形態を概略的に図示する。
【図１ｃ】トリプシンのようなプロテアーゼの活性を検出するのに使用する本発明によるコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイのいくつかの実施形態を概略的に図示する。
【図１ｄ】トリプシンのようなプロテアーゼの活性を検出するのに使用する本発明によるコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイのいくつかの実施形態を概略的に図示する。
【図２】本発明による液体中のコロイド状金ナノ粒子のトップダウン式生成のためのレーザベースのアブレーションシステムを概略的に図示する。
【図３】脱イオン水中の大量の金ターゲットのレーザアブレーションによって本発明によって調製された安定したコロイド状金ナノ粒子のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを図示し、平均粒径が２０ナノメートルの安定したコロイド状金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像を挿入図に示す。
【図４ａ】ペプチド基質溶液の添加により平均粒径２０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子の誘起された凝集を示し、溶液に添加されるＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのアミノ酸配列を有するペプチド基質の濃度によって異なる色を有する凝集したコロイド状金ナノ粒子溶液の生成を示す一連の写真であり、コロイド状金ナノ粒子溶液の色調は、凝集が無い場合のピンク−赤から、溶液に添加されるペプチドの濃度が増加すると紫−青に変化する。
【図４ｂ】ペプチド基質溶液の添加により平均粒径２０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子の誘起された凝集を示し、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの様々な濃度でのコロイド状金ナノ粒子溶液の紫外可視光スペクトルを示す。
【図４ｃ】ペプチド基質溶液の添加により平均粒径２０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子の誘起された凝集を示し、ペプチド基質が５００ｎＭから１０００ｎＭの範囲で、金コロイド粒子溶液に添加されるペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの濃度でのコロイド状金ナノ粒子溶液の６５０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度の比の線形的依存関係を示す。
【図５ａ】ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓがプロテアーゼトリプシンに前曝露された期間上のコロイド状金ナノ粒子のペプチド誘起凝集の依存関係を示し、０分（□）、１５分（〇）、３０分（◇）、及び６０分（☆）にわたって濃度２００ｐＭのトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの１０００ｎＭ溶液に添加された後のコロイド状金ナノ粒子溶液の紫外可視光スペクトルを示す。
【図５ｂ】ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓがプロテアーゼトリプシンに前曝露された期間上のコロイド状金ナノ粒子のペプチド誘起凝集の依存関係を示し、前露光期間の関数として、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液の６５０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍの吸光度の比を示す。
【図６ａ】プロテアーゼトリプシンの濃度上でのコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの凝集の依存関係をし、６０分間にわたって２ｎＭまでの異なる濃度のトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液の紫外可視光スペクトルを示す。
【図６ｂ】プロテアーゼトリプシンの濃度上でのコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの凝集の依存関係を示し、トリプシンの濃度の関数として、６０分間にわたってトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液の６５０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度の比を示す。
【図７ａ】ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓがトリプシンに前露光された期間の増加によって金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用したトリプシン検出の限界を改善できたことを図示しており、３時間にわたって２００ｐＭまでの異なる濃度のトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液の紫外可視光スペクトルを示す。
【図７ｂ】ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓがトリプシンに前露光された期間の増加によって金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用したトリプシン検出の限界を改善できたことを図示しており、トリプシンの濃度の関数として、３時間にわたってトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液の６５０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度の比を示す。
【図８ａ】より大きな粒径を有する金ナノ粒子の使用により金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用したトリプシン検出の限界がさらに改善できたことを図示しており、３時間にわたって２００ｐＭまでの異なる濃度のトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後の平均粒径３０ｎｍを有するコロイド状金ナノ粒子溶液の紫外可視光スペクトルを示す。
【図８ｂ】より大きな粒径を有する金ナノ粒子の使用により金ナノ粒子ベースの比色アッセイを使用したトリプシン検出の限界がさらに改善できたことを図示しており、トリプシンの濃度の関数として、３時間にわたってトリプシンに前露光されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に添加後の３０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子溶液の６５０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度の比を示す。
【図９ａ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼであるプロテイナーゼＫのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、アッセイの概要を図示する。
【図９ｂ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼであるプロテイナーゼＫのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、２０°Ｃで６０分間にわたって３００ｐＭまでプロテイナーゼＫの異なる濃度で前露光された７５０ｎＭで図９（ａ）に示すペプチド基質溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液紫外可視光スペクトルを示す。
【図９ｃ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼであるプロテイナーゼＫのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、プロテイナーゼＫの濃度の関数として、６０分間にわたってプロテイナーゼＫに前露光されたペプチド基質溶液に添加後の金ナノ粒子の溶液の７００ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度との比のグラフである。
【図１０ａ】負の表面電荷を有する２０ｎｍ金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトロンビンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、アッセイの概要を図示する。
【図１０ｂ】負の表面電荷を有する２０ｎｍ金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトロンビンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、２０°Ｃで６０分間にわたって３０ｎＭまでトロンビンの異なる濃度で前露光された５００ｎＭで図１０（ａ）に示されるペプチド基質溶液に添加後のコロイド状金ナノ粒子溶液紫外可視光スペクトルを示す。
【図１０ｃ】負の表面電荷を有する２０ｎｍ金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトロンビンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、トロンビンの濃度の関数として６０分間にわたってトロンビンに前露光されたペプチド基質溶液に添加後の金ナノ粒子の溶液の６２０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍでの吸光度との比のグラフである。
【図１１ａ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトリプシンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、未変化のペプチド基質は金ナノ粒子を凝集せずに加水分解断片が金ナノ粒子を凝集するアッセイの概要を図示する。
【図１１ｂ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトリプシンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、２０°Ｃで６０分間にわたって５００ｐＭまでのトリプシンの異なる濃度で前露光された６００ｎＭで図１１（ａ）に示されるペプチド基質溶液を添加後のコロイド状金ナノ粒子の紫外可視光スペクトルを示す。
【図１１ｃ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトリプシンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、トロンビン濃度の関数として６０分間にわたってトリプシンに前露光されたペプチド基質溶液に添加後の金ナノ粒子の溶液の６１０ｎｍでの吸光度と５２０ｎｍの吸光度との比のグラフである。
【図１１ｄ】負の表面電荷を有する２０ｎｍの金ナノ粒子を用いるプロテアーゼトリプシンのアッセイにおいて本発明の使用を図示しており、加水分解断片のレベルの増加に伴いナノ粒子が凝集するために起こる色変化を示す溶液の一連の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
プロテアーゼは、ペプチド認識配列内の特定部位における他のタンパク質を開裂させ、又はペプチド配列の端部からアミノ酸を除去する酵素の一種である。プロテアーゼについての認識配列は、単一のアミノ酸となり、又はアミノ酸の配列となり得る。多くのプロテアーゼはいくつかのアミノ酸配列を認識することができるので、いくつかのアミノ酸の１つに続くペプチド結合を切断することができる。他のものは非常に特異であり、酵素の特異性を保持するのに、より長い認識配列が必要となり得る。例えば、トリプシンのような消化酵素は、アミノ酸配列のすべてのアルギニン又はリジンのカルボキシル側を、それらがＣ末端プロリンに結合されない限り切断するので、広範なタンパク基質で作用することができる。一方、血液凝固にかかわるプロテアーゼは、それらの特異性を保持するのに非常に特殊でかつ長い認識配列を有する。本明細書及び特許請求の範囲において、プロテアーゼについての認識配列はいくつかの構造的に関連した配列を備えること、及びペプチドの開裂はプロテアーゼに応じて配列に隣接して又はその内部のアミノ酸で発生し得ることが理解されるべきである。プロテアーゼは、ヒトゲノムの２％を構成するとともに、タンパク質活性化、細胞調整及びシグナル伝達において、同様に他の代謝経路におけるタンパク質の合成又は利用のためのアミノ酸の生成において中枢的役割を果たすことによって生体における生物学的プロセスの多様なアレイを制御するものと推定されている。現在のところ６個の広義のプロテアーゼ基があり、それらは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼである。各基内に、それらの構造、メカニズム及び触媒残基順序並びに配列類似性によってグループ分けされた数百のプロテアーゼがある。それらは生物学、医学及びバイオテクノロジーに密接に関係するため、様々なプロテアーゼを検出することができる高感度なアッセイ方法は非常に重要であり、薬剤スクリーニング、診断及び効果的かつ選択的な治療法の開発において広範な用途を有する。酵素結合免疫吸着アッセイ、放射性同位体ベースのアッセイ及び蛍光発生基質ベースのアッセイを含むいくつかの現行の標準的アッセイでは、放射性同位体の安全性の問題、充分な感度の不足、特異性検出に対する能力の不足がもたらされ、労力と時間の浪費となってしまう。したがって、高い特異性を有するプロテアーゼ活性をオンサイト検出できる簡素、低コストかつ高感度なアッセイが切望されている。
【００２５】
紫外（ＵＶ）波長から近赤外（ＮＩＲ）波長まで全体に調整可能な、サイズ及び形状に依存する局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）など、その固有の光学的及び電子的特性のために、金ナノ粒子は、世紀にわたって科学者達の大きな興味を引き付けてきており、現在では、画像造影剤（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８、２６、８３及びＮａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５、５、８２９）、治療薬（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００７、７、１９２９及びＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１０、２）、生物学センサ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００８、３７、２０２８）及び細胞標的ベクター（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００７、７、２４７）を含む様々な生物学的及び医学的用途においてそれらの可能な使用について広く検証されている。
【００２６】
ＬＳＰＲの物理的起源は、正確なＬＳＰＲ帯域の光との相互作用に応じた金ナノ粒子表面上の導通帯域電子のコヒーレントな発振が金ナノ粒子のサイズ及び形状だけでなく金ナノ粒子の凝集状態に非常に敏感であることに関連付けられる。例えば、凝集後、平均粒径が２０ｎｍの金（Ａｕ）ナノコロイドの局在表面プラズモン共鳴は、５２０ｎｍ±５ｎｍにおける吸光帯域の減少、及び凝集体を形成する隣接粒子の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）間の双極子カップリングに起因する６００〜７００ｎｍの長い波長における新たな吸光帯域の出現とともに大幅に修正されるので、溶液のピンク−赤から紫−青への色変化がもたらされる。金ナノ粒子の凝集中に粒子間の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）から起こるピンク−赤から紫−青への金ナノコロイド溶液の色変化を利用して、シグナルレポーターとして金ナノ粒子を用いる吸光ベースの比色アッセイは、金ナノ粒子の凝集を直接又は間接的にトリガすることができるターゲット検体又は生物学的プロセスの検出のために設計され得る。
【００２７】
トリプシンは、分子重量が２４キロダルトン（ｋＤａ）の膵臓セリンプロテアーゼである。血流中の免疫反応性トリプシンの増加したレベルは膵臓不全を示し、この指標は新生児の嚢胞性線維症をスクリーニング及び診断するのに使用されるので、トリプシンの検出には医療的な意義がある。例としてトリプシン、トロンビン及びプロテアーゼＫなどのプロテアーゼの検出を用いて、我々は、本発明において、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の視覚的及び定量的検出の双方に対する簡素、高感度、特異かつ安価な手法を提供するコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイを開示する。セリンプロテアーゼの生物学的意義によって、本発明では試験のための１つのモデルとしてトリプシンを選択するが、その結果はすべてのプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質に適用可能である。我々はまた、後述するようにプロテアーゼトロンビン及びプロテアーゼＫを用いて本発明の態様を試験した。我々は、記載するアッセイ方法がすべての既知のプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の活性を検出するのに使用できると考えている。さらに、発明のアッセイ方法は、試料における新たなプロテアーゼの検出及び新たなプロテアーゼ阻害物質の検出のための手段を与える。本方法を用いる新たなプロテアーゼ及び新たなプロテアーゼ阻害物質の検出は必ずしも最初は定量的でなくてもよいが、アッセイ方法の定量的性質によって、ここに記載する方法を用いて試験ペプチド基質上のタンパク質分解活性があったか、及び既知又は未知のプロテアーゼ活性の抑制があったかを判別することができるようになる。本発明による以降のアッセイは、定量測定を行うのに使用され得る。我々はまた、本方法は、プロテアーゼの活性部位の特異性を試験する際に有用となると考えている。例えば、異なる配列の様々なペプチド基質を用いて、対象となるプロテアーゼのアミノ酸配列要件及び特異性を検証することができ、カルボキシル末端プロリンがトリプシン活性に対するように、潜在的な抑制アミノ酸も検出可能となる。配列要件を知ることは、プロテアーゼの活性部位配列を説明する際に役立ち得る。迅速な視覚的シグナルを供給すること及び定量的データを可能とすることによる本方法は、タンパク質分解活性及びタンパク質分解活性の抑制の双方を検証するために、そして広範なプロテアーゼに対するアッセイの開発においても重要なツールとなる。
【００２８】
図１ａ〜１ｄに示すように、本アッセイのシグナル生成のメカニズムは、対象となるプロテアーゼによってペプチド基質の加水分解開裂に依拠する。このアッセイは、ペプチド基質又はその加水分解断片の１以上のいずれかが金ナノ粒子の凝集をもたらすことができることを要件とする。初期のコロイド状金ナノ粒子は、正又は負いずれかの表面電荷を有し得る。電荷は、ある調製工程から他の調製工程までに変化し得るものであり、例えば、本発明によって調製されたある負帯電ナノ粒子の試料は−４０ミリボルトに帯電した。ペプチド基質は、金ナノ粒子に共有結合することができる少なくとも第１の官能基；対象のプロテアーゼについての認識配列、すなわち開裂部位；及び未変化のペプチド基質又はその加水分解断片の少なくとも１つのいずれかを架橋メカニズムで金ナノ粒子を凝集させる能力を含まなくてはならない。ペプチド基質は、システイン又はメチオニンからのチオール結合を介して、任意数のアミノ酸及び金ナノ粒子の間のアミン結合を介して、又は金ナノ粒子へのホスフィン若しくはジスルフィドを含む変性アミノ酸を介して、金ナノ粒子に共有結合することができる。上述のように、ナノ粒子に共有結合するペプチド基質における官能基は、端部の一方にあるか、又は開裂断片の１つの端部に露出され得る。ペプチド配列はまた、対象のプロテアーゼについての認識部位又は開裂部位を含む必要がある。上述のように、認識配列のアミノ酸識別は、対象のプロテアーゼについての構造活性データを説明するのに使用できる。あるプロテアーゼは単一のアミノ酸に基づいて開裂する能力を有する一方で、他のプロテアーゼは２以上のアミノ酸の配列を必要とする。本アッセイにおけるアミノ酸配列は、対象のプロテアーゼが測定されているものであることを把握できるようにアッセイの特異性を作り出すのに役立つ。最後に、開始ペプチド配列又はその加水分解断片の少なくとも１つのいずれかは、金ナノ粒子の凝集を誘発することができる必要がある。凝集は金ナノ粒子の架橋を介して起こると考えられており、凝集種の１つのアミノ酸が第１の金ナノ粒子に共有結合し、凝集種の第２の部分が他の金ナノ粒子の表面電荷とイオン結合を形成することにより２つの粒子を架橋すると考えられている。第２の部分は、ナノ粒子の表面電荷の純電荷と逆の純電荷を有する１以上のアミノ酸を備える。
【００２９】
本明細書及び特許請求の範囲では、各アミノ酸についての許容されている３文字の略語又はその１文字の略語のいずれかが使用され、いずれの配列も、配列の左端がアミノ末端であり、右端がカルボキシル末端であるという慣習によって記載される。上述のように、誘発される凝集の正確な性質は知られていないが、金ナノ粒子の表面への凝集誘発種の共有結合、及びナノ粒子の表面電荷と、そのナノ粒子と特定のアミノ酸配列の間のイオン結合の形成をもたらす凝集誘発種の逆極性電荷との間の電気的電荷相互作用の双方を伴うことが理論付けられている。したがって、例えば、後述するように、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓは、負の表面電荷を有する金ナノ粒子の凝集を誘発する。プロテアーゼトリプシンへのペプチド基質の曝露後に、誘発される凝集は減少し、これは、加水分解断片はナノ粒子を架橋することができないことを実証している。ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓは、プロテアーゼトリプシンによって、完全な消化の後に以下の断片：Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓに開裂されることになる。Ｃｙｓは、共有チオール結合を介して非常に高い親和力で金ナノ粒子の表面に結合することになる。各金ナノ粒子は、チオール結合を介してＣｙｓによってそれに結合した複数のペプチド基質を収容することができると予想される。生理学上中性のｐＨ７．４において、アミノ酸Ａｓｐ及びＧｌｕは、それらの側鎖上に純負電荷を有すると予想される。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓは、ｐＨ７．４においてそれらの側鎖上に純正電荷を有すると予想されるが、そのｐＫａを考慮すると、Ｈｉｓが、９０％を中性とした状態で利用可能な側鎖の約１０％のみに正電荷を伝達すると予想される。したがって、現実的な目的のために、配列におけるＨｉｓ側鎖の大部分は中性のｐＨにおいて電気的に中性となる。したがって、中性のＰｈにおいて、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓは、Ｃｙｓからのチオール結合を介して金ナノ粒子に結合すると予想され、２個がペプチド基質のアミノ末端にある合計３個の正電荷に対して２個のＬｙｓ及び１個のＡｒｇからの正電荷を有することになる。Ａｓｐは、負電荷をペプチド基質に与えると予想される。第２の結合は、１以上のアミノ酸とナノ粒子の表面電荷との間のイオン結合として起こると理論付けられる。したがって、本実施例では、第２の結合は、各々が正電荷を伝達する２つの末端Ｌｙｓ及び金ナノ粒子の負の表面電荷を介する可能性が高いイオン性となる。内側のＡｒｇとの相互作用が起こり得るが、これは末端Ｌｙｓと比較して微小であると理論付けられる。トリプシンがペプチド基質を開裂させるにつれて、断片は、ナノ粒子とのイオン結合を形成する能力を大幅に失っているか、その能力を有さない。１つのＬｙｓを喪失しても結合する１つのＬｙｓが残るが、２つ目のＬｙｓを喪失した後は、内側のＡｒｇは結合の多くを形成しにくくなり、架橋及び凝集は消失する。金ナノ粒子に結合される最終ペプチド基質は、開裂が完全であると仮定すると、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓとなる。Ａｓｐは純負電荷を伝達することになるので、これは、結合したペプチド断片を有するナノ粒子が元のナノ粒子よりも一層相互に反発し、それが純負表面電荷を伝達することを意味する。現在の理論に従うと、その末端の一方にアミノ酸Ｇｌｕ又はＡｓｐの１つ以上を、他方にＣｙｓを有するペプチド基質を作成することを想到することができる。このペプチド基質は、上記と同様のメカニズムによって正の表面電荷を有する金ナノ粒子の凝集を誘発可能であるべきである。唯一の相違は、ここでは、ペプチド基質は負電荷を有し、正に帯電したナノ粒子とのイオン結合を形成することができることである。ここでも、適切に配置されたＬｙｓ及びＡｒｇを有するペプチド基質を設計すれば、トリプシンによるＡｓｐ及びＧｌｕの開裂、並びにそのペプチド基質による金ナノ粒子を架橋及び凝集する能力の喪失を引き起こすことができる。
【００３０】
上記と同じ理論的方向に従うと、配列が、例えばＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕとなり得るペプチド基質を作成することを想到し得る。これは、アミノ酸Ｃｙｓによって負表面電荷を有する金ナノ粒子を共有結合することになると想定されるが、末端Ａｓｐ及びＧｌｕは、未変化のペプチドが、負表面電荷を有する他の金ナノ粒子とイオン結合を形成することを阻害することになる。したがって、未変化のペプチドは、金ナノ粒子の凝集をもたらすことができないはずである。トリプシンへの曝露に続き、そして完全な開裂の後に、結果として得られるタンパク質分解断片は、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｇｌｕｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕを備えるべきである。ここで第１の断片は金ナノ粒子の凝集をもたらすことが予想される。一方の結合はＣｙｓとナノ粒子の間のチオール共有結合となり、他方は正電荷を伝達する末端Ａｒｇと金ナノ粒子の負表面電荷との間でイオン性となる。ここで、正表面電荷を有する金ナノ粒子を使用することを除いて、同じ凝集原理が当てはまることを可能とする配列を有するペプチド基質を想到することもでき、未変化のペプチドが１以上のＡｒｇを末端に有し、酵素の作用がＡｒｇを除去してＡｓｐ又はＧｌｕなどの負に帯電したアミノ酸を露出させる。
【００３１】
上述の発明をさらに説明するために、コンセプトのいくつかを図１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄに模式的に示す。図１ａ及び１ｃに示すように、本発明の一実施形態では、未変化のペプチド基質が、負表面電荷又は正表面電荷のいずれかをそれぞれ有する金ナノ粒子の凝集をもたらす。未凝集状態において、分散金ナノ粒子溶液はピンク−赤色を有し、平均粒径２０ｎｍのナノ粒子について吸光帯域ピークは約５２０ｎｍ±５ｎｍである。凝集すると、金ナノ粒子溶液の色は、裸眼で検出可能な紫−青色に変化する。この色変化は、吸光帯域最大値の、６００から７５０ｎｍまでの範囲のより高い波長への移動として見ることもできる。一定レベルの金ナノ粒子を有するペプチド基質の一連の既知の濃度を用いて、試験溶液におけるペプチド基質の量を定量化する基準曲線を作成することができる。また、図面に示すように、加水分解断片は金ナノ粒子の凝集を誘発することができないので、対象のプロテアーゼの存在及び量は、ナノ粒子への付加の前のプロテアーゼ溶液に対するペプチド基質の前曝露の後に、基準レベルのペプチド基質によって引き起こされる凝集における減少をもたらすそれ自体の能力によって検出される。図示するように、アッセイ処理は、正及び負の表面帯電金ナノ粒子の双方で使用され得る。図１ｃ及び１ａにそれぞれ示すように、金ナノ粒子が正の表面電荷を有するのか負の表面電荷を有するのかに応じて、上述したようなイオン結合を可能とする適切なアミノ酸を与えるようにペプチド配列を変えなければならない。上述のアッセイ処理を理解すれば、対象となる既知量のペプチド基質及び既知量のプロテアーゼを用いてプロテアーゼ阻害物質の存在を検出するのにどのようにアッセイを用いるのかが明らかとなる。阻害物質の存在によって加水分解の量が減少し、したがって既知量のペプチド基質及びプロテアーゼを用いて調製された基準試料と比較して凝集の度合いを変える。本発明のアッセイの柔軟性は高い。測定されているプロテアーゼ又は阻害物質のレベルに応じて、ペプチド基質の量、反応又は曝露時間、反応及び曝露温度並びに他の反応パラメータを変化させてアッセイの感度をシフトさせることができる。一般に、哺乳類の酵素について、加水分解開裂反応のための反応温度及びプロテアーゼ阻害物質とプロテアーゼとの相互作用のための反応温度は、１０分〜３時間の時間に対して１０〜６５℃である。耐寒プロテアーゼについては、反応温度は０℃まで低下されてもよく、耐熱プロテアーゼは同じ期間にわたって９５〜１００℃で測定され得る。
【００３２】
図１ｂ及び１ｄに代替実施形態を示す。ここでは、未変化のペプチド配列は金ナノ粒子の凝集をもたらさない代わりに、加水分解断片が凝集をもたらす。本実施形態では、ペプチド基質が凝集をもたらした前述の実施形態とは逆の方向に移動することを除いて、やはりプロテアーゼ活性の定量化の指標又は定量化のための指標として吸光帯域最大値の移動を測定する。ここでも、金ナノ粒子が正又は負の表面電荷を有する場合にこのアッセイを利用することができる。このアッセイは、プロテアーゼ阻害物質の存在及び量を検出するのに同様に有用である。この実施形態では、ペプチド基質のイオン結合部分は未変化のペプチド基質における末端の一方又はその付近にはないので、形成されている架橋結合はない。実際に、図示する例について、未変化のペプチドは、ナノ粒子の表面電荷と同じ電荷を一端に帯びているので、ナノ粒子間の反発を強めるように作用する。開裂すると、断片の１つは、金ナノ粒子への共有結合を可能とするＣｙｓ、及びナノ粒子の表面電荷に応じて正に帯電したアミノ酸又は負に帯電したアミノ酸のいずれか、の双方を含む。上述したように、Ｃｙｓはまた、未変化ペプチド基質において内側に配置され、プロテアーゼの作用を介してのみ露出されるようにしてもよい。この場合においても、未変化のペプチド基質が、露出した金ナノ粒子との共有結合又はイオン結合のいずれかを形成することができる基の１つのみを有するか又は１つも有さないという状況が起こる。そして、加水分解断片の１以上は、結合に利用可能な共有結合基及びイオン結合基の双方を有するので、架橋反応が起こり、ナノ粒子が加水分解断片の１以上によって凝集される。
【００３３】
上述のように、市販の金ナノ粒子の圧倒的多数は、標準クエン酸ナトリウム還元反応によって調製される。この方法は、ボトムアップ方法であり、負に帯電したクエン酸塩イオンでキャップ形成された１から２００ナノメートル（ｎｍ）までの範囲の直径を有する球状金ナノ粒子の合成を可能とする。キャップ形成は、レート、最終サイズ、幾何学形状の観点においてナノ粒子の成長を制御し、静電反発が凝集に対してナノ粒子を安定化させる。
【００３４】
湿式化学プロセスを用いるボトムアップ作製の従来のプロセスに対して、本発明で使用される金ナノ粒子は、トップダウンのナノ作製アプローチによって好適に生成される。本発明のトップダウン作製方法は液体のバルク材料から開始し、物理的エネルギーをその材料に付加することによってその液体においてバルク材料をナノ粒子に粉砕する。物理的エネルギーは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電界アーク放電エネルギー、磁界エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、又はバルク材料のレーザアブレーションを含むレーザビームエネルギーであればよい。トップダウンプロセスは、アブレーション液において安定であり、残留化学前駆体、安定剤及び還元剤の湿式化学の問題を回避する純曝露コロイド状金ナノ粒子を生成する。これらの粒子は、自然に負の表面電荷を帯びる傾向にある。それらは、当業者には知られているように、界面活性剤の使用によって正の表面電荷に変換されてナノ粒子を被覆し得る。
【００３５】
トップダウンナノ作製手法はすべて、バルク材料からのナノ粒子の生成が懸濁媒体の存在下で起こることを要件とする。一実施形態では、プロセスは、バルクの金への機械的エネルギー、熱エネルギー、電界アーク放電エネルギー、磁界エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、又はレーザエネルギーなどの物理エネルギー源の印加が懸濁媒体において行われる１工程プロセスからなる。バルク源が懸濁媒体に置かれ、物理エネルギーが印加されて、それらが形成されるにつれて懸濁媒体において直ちに懸濁されるナノ粒子を生成する。他の実施形態では、本発明は、（１）本技術分野で周知のフォト電子ビーム、合焦イオンビーム、ナノインプリント又はナノ球体リソグラフィを用いて金ナノ粒子のアレイを基板上に作製する工程、及び（２）金ナノ粒子アレイを上述の物理エネルギー法の１つを用いて基板から懸濁液に除去する構成を含む２工程プロセスである。Ｔａｂｏｒ、Ｃ．、Ｑｉａｎ、Ｗ．及びＥｌ−Ｓａｙｅｄ、Ｍ．Ａ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃ、Ｖｏｌ  １１１（２００７）、８９３４−８９４１；Ｈａｅｓ、Ａ．Ｊ．；Ｚｈａｏ、Ｊ．；Ｚｏｕ、Ｓ．Ｌ．；Ｏｗｎ、Ｃ．Ｓ．；Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｄ．；Ｓｃｈａｔｚ、Ｇ．Ｃ．；Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ、Ｒ．Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ、Ｖｏｌ  １０９（２００５）、１１１５８。１工程方法及び２工程方法の双方において、物理エネルギー法の１つを用いて懸濁媒体においてナノ粒子を生成することによって、コロイド状の金が元の位置に形成される。
【００３６】
本発明の少なくとも一実施形態では、金ナノコロイドが、懸濁媒体として脱イオン水においてバルク金ターゲットのパルスレーザアブレーションによって生成された。図２は、本発明による、パルスレーザアブレーションを用いて液体中の金などの錯体化合物のナノ粒子のコロイド状懸濁物を生成するためのレーザベースのシステムを模式的に示す。一実施形態では、レーザビーム１は、不図示の超高速パルスレーザ源から生成され、レンズ２によって合焦される。レーザビーム１の発生源は、後述するような適切なパルス持続時間、反復レート及び／又はパワーレベルを与えるパルスレーザ源又は他の任意のレーザ源であればよい。そして、合焦されたレーザビーム１は、レンズ２から、レーザビーム１をバルク材料のターゲット４に向けるためのガイド機構３まで通過する。代替的に、レンズ２は、ガイド機構３とバルク材料のターゲット４の間に配置されてもよい。ガイド機構３は、圧電ミラー、音響光学デフレクタ、回転ポリゴン、振動ミラー又はプリズムを含む、本技術分野で周知のガイド機構のいずれかであればよい。好ましくは、ガイド機構３は、レーザビーム１の制御された速い動きを可能とする振動ミラー３である。ガイド機構３は、レーザビーム１をターゲット４に向ける。一実施形態では、ターゲット４は、バルク金ターゲットである。ターゲット４は、数ミリメートルから好ましくは１センチメートル未満の距離だけ、懸濁液５の液面下に浸漬している。ターゲット４は、その上部に取外し可能ガラス窓６をさらに有するが必ずしも有していなくてもよい容器７内に配置される。選択的に、Ｏリング型シール８は、ガラス窓６と容器７の上部との間に配置されて液５が容器７から漏出するのを防止する。さらに、ただし、必ずしもではないが、容器７は入口１２及び出口１４を含むので、液体５はターゲット４上を流通され、それにより循環される。容器７は、ターゲット４及び液体５を有する容器７をレーザビーム１に対して平行移動させることができる移動ステージ９上に選択的に配置される。液体５の流れは、コロイド状懸濁物として収集されるターゲット４から生成されたナノ粒子１０を容器７から流出させるのに用いられる。ターゲット４上の液体５の流れはまた、レーザ焦点体積部を冷却する。液体５は、レーザビーム１の波長に対して高い透過性を有してターゲット材料４に対するコロイド状懸濁媒体として作用する任意の液体であればよい。一実施形態では、液体５は、０．０５Ｍオーム．ｃｍよりも高く、好ましくは１Ｍオーム．ｃｍよりも高い抵抗率を有する脱イオン水である。他の実施形態では、液体５は、例えば、生理学的な緩衝溶液、リン酸緩衝塩類溶液又は他の適切な媒体を含む他の懸濁液からなるものであってもよい。したがって、システムによって、コロイド状金ナノ粒子懸濁物が形成されるように懸濁液における元の場所においてコロイド状金ナノ粒子を生成することが可能となる。形成される金ナノ粒子は、液体中に直ちにかつ安定的に懸濁されるので、コロイド状懸濁物を安定状態に保持するのに分散剤、安定剤、界面活性剤又は他の材料は必要ではない。この結果によって、露出した金ナノ粒子を含有する固有のコロイド状金懸濁物の生成が可能となる。一般に、この方法によって形成される金ナノ粒子は、負の表面電荷を有する。当業者には知られているように、通常通り負に帯電したナノ粒子から正に表面帯電したナノ粒子を得たい場合には、界面活性剤コーティングを用いて表面電荷を変えればよい。
【００３７】
脱イオン水においてバルク金ターゲットのパルスレーザアブレーションによって金（Ａｕ）ナノコロイドを作製するのに、以下のレーザパラメータ：１０マイクロジュール（μＪ）のパルスエネルギー、１００ｋＨｚのパルス反復レート、７００フェムト秒（ｆｓ）のパルス持続時間、及び約５０ミクロン（μ）のアブレーションターゲット上のレーザスポットサイズが用いられた。本発明によるＡｕナノコロイドの調製については、長さ１６ミリメートル（ｍｍ）、幅８ｍｍ及び厚さ０．５ｍｍのＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ製のＡｕの長方形ターゲットが使用された。便宜上、Ａｕターゲット材料が、ガラススライド、他の金属基質又はＳｉ基板などのバルク材料のより大きな断片に付着されるものとする。
【００３８】
より一般的には、本発明で用いられる金ナノコロイドの作製について、適切なレーザアブレーションパラメータは以下の通りである。パルス持続時間が約１０ｆｓから約５００ピコ秒（ｐｓ）まで、好ましくは約１００ｆｓから約３０ｐｓまでの範囲であり、パルスエネルギーが約１μＪから約１００μＪまでの範囲であり、パルス反復レートが約１０ｋＨｚから約１０ＭＨｚまでの範囲であり、レーザスポットサイズが約１００μｍ未満となり得る。ターゲット材料は、少なくとも１つの寸法において、ターゲット材料の表面におけるレーザスポットのスポットサイズより大きいサイズを有する。
【００３９】
脱イオン水においてレーザアブレーションによって調製されたコロイド状金ナノ粒子の試料は、ＵＶ−ＶＩＳ吸光スペクトル、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を含む市販の一連の分析計測器及び技術によって特徴付けされた。ＵＶ−ＶＩＳ吸光スペクトルは、島津製作所製ＵＶ−３６００  ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ分光光度計で記録された。ＤＬＳ測定は、Ｎａｎｏ−ＺＳ９０  Ｚａｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を用いて実行された。金ナノ粒子は、１００キロボルト（ｋＶ）の加速電圧で透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ  ２０１０Ｆ、日本）を用いて可視化された。すべての測定及び処理は、室温、約２０℃で行われた。
【００４０】
図３は、本発明による脱イオン水におけるレーザアブレーションによって調製された安定的な露出コロイド状金ナノ粒子調製物のＵＶ−ＶＩＳ吸光スペクトル及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す。調製されたコロイド状金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の最大値は、５２０ｎｍ±５ｎｍにある。ナノ粒子の平均フェレ径は、挿入図に示す画像のようなＴＥＭ画像から測定されるように２０．８ｎｍであると特定された。この溶液は、視認可能なピンク−赤色を有する。本明細書では、金ナノ粒子が関与する実験のすべてが、１ナノモル（ｎＭ）の濃度での金ナノコロイドを用いて行われた。
【００４１】
トリプシン、すなわちモル重量２４ｋＤａの膵臓セリンプロテアーゼは、膵臓不全の診断の観点において、及び嚢胞性線維症の診断のためのスクリーニングマーカとして大きな医学的意義を有するので、トリプシン活性の検出が、本発明の実施形態を実証するためのモデルシステムの１つとして用いられた。さらに、本発明は、後述するようなプロテアーゼトロンビン及びプロテアーゼＫを用いて実証された。他のプロテアーゼも、それらのタンパク質分解活性の検出のための発明のコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの開発及び適用に対して同様に作用すると考えられる。ただし、本発明のコロイド状金ナノ粒子ベースのアッセイの使用について述べられた検出戦略は一般的性質のものであり、以下に限定されないが、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ及びスブチリシンを備えるものなど、他のプロテアーゼの検出に同様に当てはまる。
【００４２】
本発明における第１の工程は、対象となるプロテアーゼ、例えばトリプシンに特有のペプチド基質の設計及び調製である。適切なペプチド基質は、いくつかの基準を満たす必要がある。まず、それは、金ナノ粒子に共有結合するそのアミノ末端若しくはカルボキシル末端又はその付近に、少なくとも１つの第１の官能基を含む必要がある。上述したように、チオール基、アミン官能基、ホスフィン官能基及びジスルフィド官能基はすべて種々の度合いで金ナノ粒子に共有結合する。チオール基は約２００キロジュール／モル（ｋＪ／ｍｏｌ）の金表面に対する高い親和性を呈すると考えられているので、金ナノ粒子表面機能化の大部分はチオール−Ａｕ結合を介して金ナノ粒子の表面に結合するチオール基を有するリガンド分子を用いることによって起こる。したがって、トリプシンによって選択的に認識及び開裂され得るペプチド基質の我々の設計では、システイン、すなわち少量のチオールを含有するアミノ酸がアミン末端又はカルボキシル末端において含まれ、ペプチド基質がシステイン残基のチオール基を介して金ナノ粒子の表面上に結合された。上述したように、１以上の加水分解断片が凝集をもたらす実施形態では、Ｃｙｓはペプチド基質に内部的に位置し得る。使用され得た他のチオール含有アミノ酸は、メチオニンである。他の官能基が使用されてもよいが、システインは金に対する比較的低コストな高親和性バインダであるという利点を有するのでそれが選択された。ペプチド基質の残りは２つのタスクを達成する必要があり、それには、プロテアーゼによって認識される開裂部位を有する必要があり、未変化のペプチド基質又はその加水分解断片の１以上のいずれかが金ナノ粒子の凝集をもたらす必要がある。上述したように、凝集は、本発明では共有結合との関連でイオン結合を介して起こると理論付けられる。したがって、金ナノ粒子の正又は負いずれかの表面電荷は、イオン結合を形成するのに、どちらに帯電したアミノ酸がペプチド基質にあるべきかを特定することによって、ペプチド基質配列の残りの設計に影響し得る。トリプシン、すなわち本実験で用いられるモデルプロテアーゼについての開裂部位は、カルボキシル末端プロリンに隣接しないアルギニン及びリシン残基のカルボキシル側となる。２０ｎｍのサイズの非凝集金ナノ粒子は、ピンク−赤色及び５２０ｎｍ±５ｎｍ付近の吸光帯域最大値を有する。これらのナノ粒子が凝集するにつれて、ペプチド基質に応じて、色が紫−青にシフトし、吸光帯域は約６５０ｎｍの波長での新たな最大吸光度に移動する。
【００４３】
図１ａ〜１ｄは、本発明による４つの主なタイプのアッセイを示す。図１ａ及び１ｃでは、ペプチド基質は、負のナノ粒子表面電荷及び正のナノ粒子表面電荷の両方で金ナノ粒子の凝集をもたらす。表面電荷の相違のために、ペプチド基質は、これを達成するのに異なるものである必要があった。ペプチド基質は、正に帯電したアミノ酸又は負に帯電したアミノ酸のいずれかを一端に有する。図１ｂ及び１ｄに示すように、代替の実施形態は、金ナノ粒子を凝集しないペプチド基質に依存し、加水分解断片が凝集をもたらす。これらの実施形態では、開裂活性は、未変化のペプチドにおいて内側となるイオン結合基を露出させる。ここでも、露出した電荷は、ナノ粒子の表面電荷とは逆の符号のものとなる。
【００４４】
上記のペプチド基質に対する設計基準に基づいて、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのペプチド基質におけるアミノ酸の配列が、図１ａの後にパターン化されたアッセイで用いられた。金ナノ粒子の溶液に対するこのペプチド基質の効果を図４ａ、４ｂ及び４ｃに示す。特に断りがない限り、本明細書において報告されるすべての培養及び反応は２０℃で行われている。本明細書で説明するすべての実験における最終反応体積は、特に断りがない限り、５００マイクロリットルであり、金ナノ粒子濃度は１ｎＭであった。図面及び明細書で説明するペプチド基質、プロテアーゼ及び阻害物質の濃度は、５００マイクロリットル反応体積における最終濃度である。凝集反応は非常に速く、３０分以内で完了する。したがって、説明する実験のすべてにおいて、いずれの金ナノ粒子溶液の凝集状態も３０分以内後に測定できた。当業者には知られているように、酵素反応は一般に、温度が酵素の変性温度に近づくまで温度の増加とともに増加する。多くの哺乳類の酵素について、酵素は、約１０℃から６５℃までの範囲の温度で機能することができる。一方、本アッセイは、耐寒タンパク質分解酵素及び耐熱タンパク質分解酵素の双方を検証するのにも使用可能である。例えば、ある温度的に安定したバクテリアは９５〜１００℃の温度で機能することができるタンパク質分解酵素を有し、他のバクテリアは０℃の低温で機能する酵素を有することが分かっている。これらのすべては、本発明のアッセイ方法を用いて評価され得る。図４ａ〜４ｃに示す実験データは、このペプチド基質が、裸眼でも充分に視認可能な線形的で濃度依存的な態様では、コロイド状の金ナノ粒子の溶液に付加された後の平均径２０ｎｍの金ナノ粒子の凝集を誘発しなかったことを裏付けている。図４ａは、金ナノ粒子溶液に付加されたペプチド基質の濃度に依存して異なる色でコロイド状金ナノ粒子溶液が生成されることを実証する一連の写真である。コロイド状金ナノ粒子の溶液の色調は、ペプチド基質０ｎＭ及び凝集なしでの左側のピンク−赤から、溶液におけるペプチド基質の３００ｎＭから１０００ｎＭへの濃度の増加とともに、及び金ナノ粒子の凝集の増加とともに、紫−青に変化する。図４ｂは、０から１０００ｎＭまでを範囲とする異なる濃度でのペプチド基質の存在下でのコロイド状金ナノ粒子の溶液の対応の紫外線−可視（ＵＶ−ＶＩＳ）スペクトルを示す。金ナノ粒子が凝集するにつれて、コロイド状金ナノ粒子の溶液におけるペプチド基質の濃度が３００ｎＭから１０００ｎＭに増加するにつれて増加する、凝集物を形成する隣接粒子の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の間での双極子結合に起因して、平均粒径２０ｎｍのＡｕナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴は、５２０ｎｍ±５ｎｍでの吸光帯域の減少及び約６５０ｎｍの長い波長での新たな吸光帯域の出現とともに大幅に修正される。図４ｂに示す結果は図４ｃにまとめられ、これは、５００ｎＭから１０００ｎＭまでの範囲におけるコロイド状金ナノ粒子の溶液に付加されたペプチド基質の濃度に対するコロイド状金ナノ粒子の溶液の５２０ｎｍでの吸光度対６５０ｎｍでの吸光度の比の線形依存性を示す。この範囲���線形性は、プロテアーゼ検体の既知量を含有する基準試料の紫外線−可視スペクトルの５２０ｎｍの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比を、トリプシンの既知量を有する試料からの実験結果の比と比較することによって、この吸光度比６５０ｎｍ／５２０ｎｍがプロテアーゼトリプシンの量の定量分析に使用できたことを示している。
【００４５】
ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓが負の表面帯電金ナノ粒子の凝集を誘発しなかったことを確認した後、我々は、コロイド状金ナノ粒子の溶液の、それらが０分から６０分までの異なる期間にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質の溶液に付加された後の紫外線−可視スペクトルを検証する他の実験を実施した。この実験の目的は、トリプシンによるペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの加水分解開裂後のタンパク質分解ペプチド断片は負に帯電した金ナノ粒子を架橋できなかったことを確認すること、トリプシンによるペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの加水分解開裂の反応速度を特定することである。ペプチド基質及びトリプシン双方の濃度が加水分解開裂の反応の速度を支配するので、この実験で用いられるペプチド基質及びトリプシンの濃度はそれぞれ１０００ｎＭ及び２００ピコモル（ｐＭ）に固定され、温度は２０℃に維持された。この実験の結果を図５ａ及び５ｂに示す。図５ａは、０分（□）、１５分（○）、３０分（◇）及び６０分（☆）について、上述のようにトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の紫外線−可視スペクトルを示す。ペプチド基質がトリプシンに前曝露された期間が長いほど、ペプチド基質の付加によって誘発された金ナノ粒子の凝集度が低いことが、図５ａにおいて明示されており、これは、トリプシンによる加水分解開裂後のペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのタンパク化ペプチド断片が負帯電金ナノ粒子を架橋しないことを証明している。前曝露の時間が増加するにつれて、吸光度スペクトルは５２０ｎｍ±５ｎｍでの最大値の非凝集ナノ粒子に戻る。予想される断片は図１ａに示されており、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓを含む。図５ａの結果は、ペプチド基質の量がトリプシンへのより長い前曝露によって減少されるにつれて６５０ｎｍから５２０ｎｍ±５ｎｍに吸光度最大値がシフトすることを示している。図５ａに示す結果が図５ｂにまとめられ、これは、コロイド状金ナノ粒子の溶液の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比を、トリプシンへのペプチド基質の前曝露の時間の関数として示すものである。２００ｐＭの濃度でトリプシンによるペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの１０００ｎＭの溶液の完全な加水分解開裂に６０分よりも長くかかったことが示されている。
【００４６】
上述の結果は、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓが負帯電金ナノ粒子の凝集を誘発できたこと、トリプシンによるその加水分解開裂後のペプチド基質のタンパク化ペプチド断片が負帯電金ナノ粒子を架橋できなかったこと裏付け、トリプシンによるペプチド基質の加水分解開裂の反応速度を示している。
【００４７】
次に、我々は、トリプシンの検出のためのこのコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの検出の限界に興味を持った。このアッセイを用いてプロテアーゼを検出する方法は、一連の工程からなる。最初に、トリプシンを含有する生体液又は含有しているものと疑われる生体液などの液体がペプチド基質の水溶液と混合されて混合物を生成し、これが、例えば０．５〜３時間の充分な時間にわたって約２０℃の室温で培養され、トリプシンによるペプチド基質の部分の加水分解開裂が可能となる。基質を枯渇させないこと、又は加水分解反応速度の非線形部分に入らないことが、判定を正確なものとするために重要である。選択された時間にわたる培養後の第２の工程では、ピンク−赤色の金ナノ粒子の、すなわち非凝集のコロイド状懸濁物が混合物に付加され、液体のトリプシンの量に依存する非開裂で残るペプチド基質の量に依存して、金ナノ粒子の凝集の特定状態が誘発され、３０分以内に特徴色の最終溶液の形成がもたらされる。第３の工程は、最終溶液の特徴色を、同条件に曝露された既知量のトリプシン及びペプチド基質を含有する基準試料の色と比較することを介して、生体液におけるトリプシンの量を定性的に検出する。最後の工程は、最終溶液の紫外線−可視スペクトルを検査すること、及び最終溶液の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比を、同条件に曝露された既知量のトリプシン及びペプチド基質を含有する基準試料の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比と比較することによって、液体におけるトリプシンの量を定量的に検出する。
【００４８】
図６ａ及び６ｂに示す実験的結果は、アッセイ方法についての検出の感度及び限界を特定することに向けられた。この実験では、ペプチド基質のレベルは７５０ｎＭで一定に維持され、反応時間は６０分に設定され、反応温度は２０℃であった。トリプシンの量は、２０ピコモル（ｐＭ）から２ｎＭに変化した。図６ａは、トリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後にコロイド状金ナノ粒子の溶液の紫外線−可視スペクトルを示す。使用された金ナノ粒子は、負の表面電荷及び平均粒径２０ｎｍを有した。図６ａに示す結果は図６ｂにまとめられ、これは、６０分にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比を前曝露におけるトリプシンの濃度の関数として示す。図６ａ及び６ｂに示すデータは、これらの反応条件について、トリプシンを検知するための本発明で開発されたコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイの検出限界は、約２０ｐＭのトリプシンであることを示唆している。トリプシンが存在せず、７５０ｎＭの濃度のペプチド基質があれば、６５０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度の比は実質的に１であり、２つの吸光度は等しかったことを意味する。トリプシンが増量されるにつれて、吸収帯域は、いずれのペプチドもない場合に金ナノ粒子が示すものに向けてシフトし、比は約０．０５の値に近づく。
【００４９】
上述の実験では、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓは、６０分にわたってトリプシンに曝露された。アッセイ感度の範囲を拡げる試みにおいて、我々は、同じレベルのペプチド基質及び金ナノ粒子並びに同じ温度を用いてトリプシンへの前曝露の時間を１時間から３時間に増加した他の実験を実施した。図７ａ及び７ｂに示す実験データは、金ナノ粒子ベースの比色アッセイを用いたトリプシンの検出限界が、ペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓがトリプシンに曝露される期間を増加することによって向上できたことを示す。これらの実験では、トリプシンのレベルは、５００フェムトモル（ｆＭ）から２００ｐＭまでの範囲において変化した。図７ａは、５００ｆＭから２００ｐＭまでの異なる濃度で３時間にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の紫外線−可視スペクトルを示す。使用された金ナノ粒子は平均径２０ｎｍを有していた。図７ａに示す結果は図７ｂにまとめられており、これは、３時間にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比をトリプシンの濃度の関数として示す。データは、前曝露の反応時間を６０分から３時間に増加させることによって、本発明で開発されたコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイによるトリプシンの検出限界が２０ｐＭから約２〜１０ｐＭに向上したことを実証している。
【００５０】
図３〜７で説明及び図示した実験では、金ナノ粒子は、平均径２０ｎｍを有していた。他の実施形態では、検出限界に対するナノ粒子の効果が検証された。図８ａ及び８ｂに示す実験データは、この金ナノ粒子ベースの比色アッセイによるトリプシンの検出限界は、平均径２０ｎｍの金ナノ粒子で得られた結果と比較して、より大きな平均径３０ｎｍの金ナノ粒子を用いてさらに改善されたことを示す。図８ａは、２００ｐＭまでの異なる濃度で２０℃の温度で３時間にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の紫外線−可視スペクトルを示す。使用されたペプチド基質の濃度は７５０ｎＭであり、使用された負帯電金ナノ粒子は平均径３０ｎｍを有していた。図８ａに示す結果は図８ｂにまとめられており、これは、３時間にわたってトリプシンに前曝露されたペプチド基質Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの溶液に付加された後のコロイド状金ナノ粒子の溶液の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比をトリプシンの濃度の関数として示す。金ナノ粒子の平均径を２０ｎｍから３０ｎｍに増加させることによって、本発明で開発されたコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイによるトリプシンの検出限界が約２〜１０ｐＭから５００ｆＭ〜２ｐＭの範囲にさらに改善されたことが示されている。
【００５１】
本明細書において上述した実験では、本発明のコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイを用いてトリプシン活性を検出するのに図１ａに示す検出戦略が用いられ、説明の目的のみのためにこの戦略が選択された。本発明は、図１ａに示す検出戦略のみの使用に限定されない。図１ｂ、１ｃ及び１ｄにそれぞれ示す他の３つの検出戦略も、このコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイを用いたプロテアーゼ活性の検出のために使用され得る。図１ｂの手法の使用例を、以下、図１１ａ〜１１ｄに示す。さらに、アッセイは、後述する図９及び１０のデータから示されるように他のプロテアーゼの検出にも容易に適応可能である。
【００５２】
アッセイは、プロテアーゼＫなどの他のプロテアーゼでの使用に容易に適用可能である。プロテアーゼＫはタンパク質を劣化させる広範な能力を有し、主な開裂部位は、遮られたαアミノ基を有する脂肪族及び芳香族のアミノ酸のカルボキシル基に隣接するペプチド結合部である。プロテアーゼＫ活性を検出するその能力についてアッセイを試験するのに使用されたペプチド基質を図９ａに示す。使用された金ナノ粒子は、２０ｎｍの平均径及び負の表面電荷を有する。ペプチド基質は、その未変化状態における金ナノ粒子の凝集をもたらす能力を有していた。架橋反応は、ペプチド基質のアミノ端におけるアミノ酸Ｃｙｓへの第１の金ナノ粒子の共有結合によって発生すると考えられている。第２の金ナノ粒子とのイオン結合は、Ａｒｇ及びペプチド基質のカルボキシル端付近のＬｙｓアミノ酸からの正電荷の結果である。結果は、アミノ酸を形成するイオン結合はアミノ又はカルボキシル末端になくてもよく、それらは内側にあってなおも凝集をもたらすように機能し得ることを実証している。プロテアーゼＫがペプチド基質を完全に開裂すると、図９ａに示す加水分解断片が予想される。開裂後に見られるように、Ｃｙｓはもはやペプチド基質においてＡｒｇ又はＬｙｓアミノ酸に結合されず、架橋は消失する。図９ｂは、元の金ナノ粒子についてのＵＶ−ＶＩＳ吸光スペクトル、７５０ｎＭのペプチド基質の存在によってもたらされ、一連のプロテアーゼＫの濃度に対して前曝露された一連のペプチド基質についてのスペクトルを示す。データは、７５０ｎＭのペプチド基質の存在下で凝集が５２０ｎｍ±５ｎｍの初期値から７００ｎｍの新たな値に吸光最大値がシフトし、７００ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度の比は約１．５４であることを示している。図９ａ及び９ｂに示すように、プロテアーゼＫの量が増加すると、スペクトルシフトは金ナノ粒子だけの場合に見られる元のスペクトルに向かって戻り、比はほぼ０に低下する。結果は、他のプロテアーゼでの使用にアッセイを適応させる能力、及びプロテアーゼ活性に対する迅速な定性的及び定量的データを取得する能力を実証している。プロテアーゼＫの阻害物質は、ペプチド基質の前曝露の前にプロテアーゼＫを阻害物質溶液で予め培養する工程を付加することによって同じアッセイで測定することができた。阻害物質の活性は、同じレベルのプロテアーゼＫについて、吸光スペクトルの少ないシフト及び高い７００ｎｍ／５２０ｎｍの比をもたらすことになる。
【００５３】
図１０ａ〜１０ｃは、プロテアーゼトロンビンの活量を測定するアッセイ、ここでも手法１ａのアッセイの使用からのデータを示す。トロンビンについての実際の開裂部位は、ＡｒｇとＧｌｙの間で起こる開裂を有する配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒである。図１０ａに示すように、我々が用いたペプチド基質は、この配列の中央部、すなわちＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有していた。図示するように、凝集のシフトは他のペプチド基質ほどは大きくなかったが、元のペプチド配列は金ナノ粒子を架橋及び凝集することができた。凝集によるシフトは、６２０ｎｍでの新たな吸光ピークの出現をもたらした。図１０ｂ及び１０ｃに示すように、トロンビンの活性の後に、６２０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度の比をモニタしてもよい。
【００５４】
図１ｂに示す検出戦略について、負の表面電荷を有するコロイド状金ナノ粒子がトリプシン活性の検出に用いられ、未変化のペプチド基質は負帯電金ナノ粒子の凝集を誘発することができなかった。ペプチド基質はＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕのアミノ酸配列を有し、未変化のペプチド基質が負帯電金ナノ粒子に付加されたときにコロイド状金ナノ粒子の溶液の色変化はなかった。本発明の理論に従うと、このペプチド基質は末端Ｃｙｓとのチオール結合を介して金ナノ粒子に共有結合するが、ペプチド基質の他の端部はＡｓｐ及びＧｌｕからの２つの負電荷を有するので、結合されたペプチドを有するナノ粒子は元のナノ粒子よりもさらに相互に反発する。プロテアーゼ検体、本実施例ではトリプシン、による元のペプチド基質の加水分解開裂後に、加水分解されたペプチド断片は負帯電金ナノ粒子を架橋することができ、コロイド状金ナノ粒子の溶液のピンク−赤から紫−青への色変化をもたらした。これは、５２０ｎｍ±５ｎｍから６１０ｎｍへの吸光帯域最大値のシフトによって達成される。完全な開裂の後に、断片Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、Ｃｙｓによって、及び正に帯電したアミノ酸Ａｒｇによるイオン結合を介して、金ナノ粒子に結合することができる。図１１ａ及び１１ｃのデータは、加水分解開裂によってもたらされた吸光スペクトル及び６１０／５２０の比のシフトを示す。図１１ｄは、加水分解断片による凝集を伴う視覚的色変化を示す一連の写真である。
【００５５】
図１ｃに示す検出戦略について、正の表面電荷を有するコロイド状金ナノ粒子が検出に用いられ、元のペプチド基質が正帯電金ナノ粒子の凝集を誘発し、ペプチド基質は、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕのアミノ酸配列を有し、未変化のペプチドによるコロイド状金ナノ粒子の溶液のピンク−赤から紫−青への色変化をもたらした。結合は、末端Ｃｙｓ共有結合架橋によって、並びに末端Ａｓｐ及びＧｌｕを介してイオン的に行われた。プロテアーゼ検体、本実施例ではトリプシン、による元のペプチド基質の加水分解開裂後に、加水分解されたペプチド断片は正帯電金ナノ粒子を架橋することはなく、コロイド状金ナノ粒子の溶液の色の変化は観察されなかった。図１ｄに示す検出戦略について、正の表面電荷を有するコロイド状金ナノ粒子が検出に用いられ、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのアミノ酸配列を有する元のペプチド基質は正帯電金ナノ粒子の凝集を誘発できず、コロイド状金ナノ粒子の溶液の色変化をもたらさなかった。Ｃｙｓは金ナノ粒子に結合できたが、末端Ｌｙｓは他の正帯電ナノ粒子を反発させる。プロテアーゼ検体、本実施例ではトリプシン、による元のペプチド基質の加水分解開裂後に、加水分解されたペプチド断片は正帯電金ナノ粒子を架橋することができ、コロイド状金ナノ粒子の溶液のピンク−赤から紫−青への色変化をもたらした。他のプロテアーゼは、例示したものとは異なるペプチド配列を必要とする可能性があり、例示したペプチド基質配列は説明の目的のためだけのものであり、発明はこれらの配列に限定されない。
【００５６】
我々の研究における観察に基づいて、我々は、図１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄに示すコロイド状金ナノ粒子ベースのアッセイの上述の検出戦略は一般的な性質のものであり、プロテアーゼ阻害物質の検出にも使用され得るものと考えている。このアッセイ手順の使用では、種々のレベルのプロテアーゼに前曝露されたペプチド基質で組合せられた金ナノ粒子の試料を用いて基準曲線を準備する。そして、プロテアーゼ阻害物質は、プロテアーゼ阻害物質を含有するように懸濁された試料の存在下の同じ基準曲線への変化を観察することによって検出される。阻害物質が存在する場合には、測定される変化は、いずれのプロテアーゼの不存在下において未変化のペプチド基質を金ナノ粒子に組み合わせることによって見られるものに近づくはずである。したがって、説明の便宜上、２０ｎｍナノ粒子についてのピンク−赤から紫−青への色変化及び５２０ｎｍ±５ｎｍから６５０ｎｍへの吸光帯域最大値のシフトに見られるような、その加水分解断片ではなく未変化のペプチド基質が金ナノコロイド粒子の凝集をもたらすペプチド基質を選択した場合には、プロテアーゼの存在が、ペプチド基質によって通常もたらされる凝集のレベルの減少をもたらすことになる。基準曲線が、所与の所定温度において所定量の時間にわたって一連のプロテアーゼ濃度に一定レベルのペプチド基質を前曝露してから、その前曝露した溶液を金ナノ粒子に付加して吸光スペクトルを測定することによって準備された。そして、プロテアーゼ阻害物質を含有しているものと疑われる生体液などの液体がプロテアーゼの水溶液と混合されて、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の双方を含有する溶液を生成する。液体は、任意の生体液又は生体組織からの抽出物であればよい。プロテアーゼ及び可能性あるプロテアーゼ阻害物質の溶液は、所定の温度、一般的には約２０℃以上の温度で充分な時間、例えば、０．５〜３時間にわたって培養されて、上記プロテアーゼ阻害物質がプロテアーゼの加水分解機能を阻止することを可能とする。次の工程では、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質及びペプチド基質を含有する混合物を生成するように、そのプロテアーゼに対して特異的なペプチド基質の水溶液が溶液に付加される。そして、混合物は、所定の温度で充分な時間、例えば０．５〜３時間の時間にわたって培養されて、プロテアーゼによるペプチド基質のいくらかの加水分解開裂が可能となる。そして、ピンク−赤色の、すなわち凝集していない金ナノ粒子のコロイド状懸濁物が混合物に付加され、３０分以内の期間にわたって培養される。そして、凝集の状態が、被疑プロテアーゼ阻害物質の不存在下で行われる同じ手順においてもたらされる凝集と比較される。液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量に依存する開裂されずに残るペプチドの量が、誘発される金ナノ粒子の凝集の状態を決定し、３０分以内に特徴色を有する最終溶液の形成がもたらされる。次に、最終溶液の特徴色を既知量のプロテアーゼ阻害物質を含有する基準試料の色と比較することによって液体におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定性的に検出し、最終溶液の紫外線−可視スペクトルを検証し、最終溶液の５２０ｎｍ±５ｎｍでの吸光度に対する新たな最大値、本実施例��は６５０ｎｍでの吸光度の比を、既知量のプロテアーゼ阻害物質を含有する基準試料の５２０ｎｍでの吸光度に対する６５０ｎｍでの吸光度の比と比較することによって生体液におけるプロテアーゼ阻害物質の量を定量的に検出する。同様の手順が、上述のような加水分解断片が凝集をもたらすとともに未変化のペプチドが凝集をもたらさない実施例に準用される。
【００５７】
一般に、この種の手法で最良の結果を達成するには、ペプチド基質及び金ナノ粒子のレベルが、ペプチド基質のレベルによって金ナノ粒子のほぼ最大凝集をもたらすように選択される。そして、いくつかのレベルのプロテアーゼが開裂の範囲を与えるように選択され、一般にそれによって、ほぼ最大開裂がプロテアーゼの最も高いレベルで起こり、プロテアーゼの存在及び不存在による結果を用いることで基準に対して最も広い範囲が与えられる。そして、いくつかのレベルの被疑プロテアーゼ阻害物質が各レベルのプロテアーゼに対して選択され、それにより阻害物質のレベルの１以上での結果が基準の範囲内に入る。上記説明を読めば分かるように、本発明の進歩的なアッセイ方法は、金ナノ粒子の測定凝集状態についてのプロテアーゼ及びペプチド基質の基準曲線に対して被疑プロテアーゼ阻害物質を含有する一連のレベルの液体を付加することの効果を特定することによって、新たな未知のプロテアーゼ阻害物質を検出するのにも使用され得る。
【００５８】
本発明において開発されたコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイによって検出され得る特殊な対象プロテアーゼ阻害物質は、以下に限定されないが、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ボセプレビル、テラプレビル、ウシ膵臓トリプシン阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ１及びα１抗トリプシンからなる。
【００５９】
本アッセイ方法はまた、既知のペプチド基質を採用すること、開裂部位のいずれかの側での提示される認識配列すなわちアミノ酸配列を変更すること、及びこれがどのように金ナノ粒子の測定凝集状態の変化によって見られるようなペプチド基質を開裂する能力に影響するかを特定することによってプロテアーゼの活性部位を調査するのにも使用可能である。さらに、アッセイ方法は、アミノ酸配列を変更すること、及び金ナノ粒子の測定凝集状態への影響を特定することによって開裂部位を特定するのに使用可能である。
【００６０】
本明細書に記載される実験では、金ナノ粒子、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質、ペプチド基質及びアッセイプロセスのための液体媒体として脱イオン水が選択される。一方、これらの成分のいずれか及び反応のための溶解媒体として、さらに他の生体液も使用され得る。例えば、生体液は、以下に限定されないが、血液、血漿、唾液、尿、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、高性能キャピラリー電気泳動のための緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、クエン酸−リン酸−ブドウ糖溶液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ＤＬ乳酸ナトリウム溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン四酢酸（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水又はその混合物から選択されればよい。血清など、生体液によっては、それ自体が金ナノ粒子の凝集をもたらし得る血清タンパク質を除去する何らかの予精製を行わなければならないこともある。場合によっては、本アッセイシステムでの分析の前に、元の生体液からプロテアーゼ又はプロテアーゼ阻害物質を除外することが必要なこともある。
【００６１】
本明細書に記載される実験では、実験で使用される金ナノ粒子は、２０又は３０ｎｍの平均径の球状金ナノ粒子である。一方、少なくとも１つの寸法を１から２００ｎｍまでの範囲で有する棒、角柱、円盤、立方体、コアシェル構造、骨組み及び枠を含む他の形状及び構成のコロイド状金ナノ粒子も、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の検出のための本発明において開発されたコロイド状金ナノ粒子ベースの比色アッセイにおいて作用し得る。さらに、金で部分的にのみ被覆された外面を有するナノ構造体も、本発明において開発された金比色アッセイにおいて作用するはずである。
【００６２】
液体が脱イオン水である実施形態において、コロイド状懸濁液におけるバルク金ターゲットのレーザアブレーションによるコロイド状金ナノ粒子の作製の上記プロセスを説明したが、他の液体において上記プロセスを実行することも可能である。例えば、バルク金ターゲットのレーザアブレーションは、水、メタノール、エタノール、アセトン及び他の有機溶剤において実行され得る。
【００６３】
本明細書で説明した実験では、混合物が約２０℃の温度で培養された。原則として、この温度は、プロテアーゼが他の任意の哺乳類の酵素である場合にプロテアーゼによるペプチド基質の加水分解開裂の効率を最適化するために約２０〜５０℃で変動し得る。上述のように、アッセイが耐熱又は耐寒源からのプロテアーゼで行われる場合にはこの範囲外の温度範囲が使用され得る。同じ考えが、プロテアーゼ阻害物質活性の特定のための本アッセイ方法の使用に当てはまる。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、プロテアーゼの加水分解活性を検出するための方法であって、凝集されていないコロイド状金ナノ粒子の溶液を提供する工程であって、コロイド状金ナノ粒子が、表面電荷及び凝集されない場合には視認可能なピンク−赤色であり、凝集された場合には視認可能な紫−青色となる特性を有する、工程；以下の特性：金ナノ粒子上の表面電荷とは無関係に金ナノ粒子に結合する少なくとも１つの第１の官能基、金ナノ粒子の表面電荷とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、第１の官能基と第２の官能基の間に配置されてプロテアーゼについての少なくとも１つの開裂部位を有するアミノ酸配列を有し、第１及び第２の官能基による金ナノ粒子の架橋によって変化しない場合にペプチド基質が金ナノ粒子を凝集し、開裂部位におけるプロテアーゼによる開裂後に金ナノ粒子を凝集しない特性を有するペプチド基質を提供する工程；金ナノ粒子の溶液にペプチド基質の溶液を付加することによって第１の混合物を形成し、金ナノ粒子の凝集を示す第１の混合物における色変化を検出する工程；ペプチド基質の溶液にプロテアーゼの溶液を付加することによって反応混合物を形成し、反応混合物を所定の温度で所定の時間にわたって培養する工程であって、所定の温度及び所定の時間はプロテアーゼによるペプチド基質における開裂部位の開裂を可能とするのに充分である、工程；金ナノ粒子の溶液に培養後の反応混合物を付加することによって第２の混合物を形成し、金ナノ粒子の凝集を示す第２の混合物における色変化を検出する工程；及び第２の反応混合物の色を第１の混合物の色と比較してペプチド基質においてプロテアーゼのタンパク質分解活性を示す金ナノ粒子の凝集の減少を特定する工程を備える。
【００６５】
１以上の実施形態において、本発明は、１から２００ナノメートルまでの範囲に少なくとも１つの寸法を有する金ナノ粒子を提供する工程を備える。
【００６６】
１以上の実施形態において、本発明は、球体、棒、角柱、立方体、円盤、コアシェル構造体、骨組み、枠又はその組合せから選択された形状を有する金ナノ粒子を提供する工程を備える。
【００６７】
１以上の実施形態において、本発明は、水、メタノール、エタノール、アセトン、生体緩衝液又はその混合物の１つにおいて懸濁された金ナノ粒子の溶液を提供する工程を備える。
【００６８】
１以上の実施形態において、本発明は、金ナノ粒子を、該金ナノ粒子によって少なくとも部分的に被覆されたナノ構造体として提供する工程を備える。
【００６９】
１以上の実施形態において、本発明は、チオール基、アミン基、ホスフィン基、ジスルフィド基又はその組合せを第１の官能基として有するペプチド基質を提供する工程を備える。
【００７０】
１以上の実施形態において、本発明はペプチド基質を提供する工程を備え、第１の官能基はシステイン、メチオニン又はその混合物の少なくとも１つからなる。
【００７１】
１以上の実施形態において、本発明はペプチド基質を提供する工程を備え、第２の官能基はアルギニン、リシン、ヒスタジン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物の少なくとも１つからなる。
【００７２】
１以上の実施形態において、本発明は、負の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、ペプチド基質を提供する工程をさらに備え、第２の官能基はアルギニン、リシン、ヒスタジン又はその混合物の少なくとも１つからなる。
【００７３】
１以上の実施形態において、本発明は、正の表面電荷を有する金ナノ粒子を提供する工程を備え、ペプチド基質を提供する工程をさらに備え、第２の官能基はアスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物の少なくとも１つからなる。
【００７４】
１以上の実施形態において、本発明は、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える。
【００７５】
１以上の実施形態において、本発明は、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スブチリシン又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される開裂部位を有するペプチド基質を提供する工程を備える。
【００７６】
１以上の実施形態において、本発明は、反応混合物を１０℃〜６５℃の温度で１０分〜３時間の期間にわたって培養する工程を備える。
【００７７】
１以上の実施形態において、本発明は、第１及び第２の混合物における色変化を視覚的に検出する工程を備え、第２の混合物の色を第１の混合物の色と視覚的に比較する工程をさらに備える。
【００７８】
１以上の実施形態において、本発明は、第１及び第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって第１及び第２の混合物における色変化を検出する工程を備え、第２の混合物のスペクトルを第１の混合物のスペクトルと比較する工程をさらに備える。
【００７９】
１以上の実施形態において、本発明は、一連の異なるペプチド基質濃度を各々同じ濃度で一連の金ナノ粒子に付加することによって凝集基準曲線を準備する工程を備え、第２の反応混合物の色を基準曲線と比較して凝集の減少を特定するとともにプロテアーゼのタンパク質分解活性を定量的に特定する工程をさらに備える。
【００８０】
１以上の実施形態において、本発明は、第１及び第２の混合物における色変化を視覚的に検出する工程を備え、第２の混合物の色を基準曲線の色と視覚的に比較する工程をさらに備える。
【００８１】
１以上の実施形態において、本発明は、第１及び第２の混合物の紫外線−可視スペクトルを測定することによって第１及び第２の混合物における色変化を検出する工程を備え、第２の混合物のスペクトルを基準曲線のスペクトルと比較する工程をさらに備える。
【００８２】
本発明の１以上の実施形態において、プロテアーゼの溶液は、脱イオン水、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、高性能キャピラリー電気泳動溶液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ）、クエン酸−リン酸−ブドウ糖溶液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ＤＬ乳酸ナトリウム溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンエチレンジアミン四酢酸Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水、血液、血漿、唾液、尿又はその混合物のうちの１つからなる緩衝液からなる。
【００８３】
１以上の実施形態において、本発明は、プロテアーゼの阻害物質を、所定の温度で所定の期間にわたってプロテアーゼの溶液を用いてプロテアーゼ阻害物質の溶液を培養することによって検出して、抑制されたプロテアーゼ溶液を形成する工程、その後、プロテアーゼの溶液として抑制されたプロテアーゼ溶液を付加する工程、及び抑制されたプロテアーゼ溶液から形成された第２の反応混合物の色をプロテアーゼ阻害物質で培養されていない同量のプロテアーゼで形成された第２の反応混合物と比較してプロテアーゼによってもたらされた凝集の低下を検出する工程をさらに備える。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、プロテアーゼの加水分解活性を検出するための方法であって、凝集されていないコロイド状金ナノ粒子の溶液を提供する工程であって、コロイド状金ナノ粒子が、表面電荷及び凝集されない場合には視認可能なピンク−赤色であり、凝集された場合には視認可能な紫−青色となる特性を有する、工程；以下の特性：金ナノ粒子上の表面電荷とは無関係に金ナノ粒子に結合する少なくとも１つの第１の官能基、金ナノ粒子の表面電荷でイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、前記第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列の外側に配置され、プロテアーゼについての少なくとも１つの開裂部位を有するアミノ酸配列を有し、ペプチド基質が、未変化の場合には金ナノ粒子を凝集させず、第１の官能基及び第２の官能基を含有する少なくとも１つのタンパク質分解断片が、開裂部位におけるプロテアーゼによる開裂後に金ナノ粒子を凝集する特性を有するペプチド基質を提供する工程；金ナノ粒子の溶液にペプチド基質の溶液を付加することによって第１の混合物を形成し、金ナノ粒子の未凝集を示す第１の混合物の色を検出する工程；ペプチド基質の溶液にプロテアーゼの溶液を付加することによって反応混合物を形成し、反応混合物を所定の温度で所定の時間にわたって培養する工程であって、所定の温度及び所定の時間が、プロテアーゼによるペプチド基質における開裂部位の開裂を可能とするのに充分である、工程；金ナノ粒子の溶液に培養後の反応混合物を付加することによって第２の混合物を形成し、金ナノ粒子の凝集を示す第２の混合物における色変化を検出する工程；及び第２の反応混合物の色を第１の混合物の色と比較してペプチド基質においてプロテアーゼのタンパク質分解活性を示す金ナノ粒子の凝集の度合いを特定する工程を備える。
【００８５】
本発明の１以上の実施形態において、プロテアーゼ阻害物質は、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ボセプレビル、テラプレビル、ウシ膵臓トリプシン阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ１、α１抗トリプシン又はその混合物の少なくとも１つからなる。
【００８６】
１以上の実施形態において、本発明は、プロテアーゼのタンパク質分解活性を検出するためのアッセイキットであって、各々が表面電荷を有する複数の非凝集金ナノ粒子；ペプチド配列を備えるペプチド基質であって、ペプチド基質が、金ナノ粒子の１つに共有結合することができる少なくとも１つの第１の官能基、金ナノ粒子の１つの表面電荷とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、及び第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列内又は第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列外のいずれかの場所にある、プロテアーゼについての開裂部位を備え、開裂部位が第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列内の位置にある場合にはペプチド基質が金ナノ粒子を架橋してナノ粒子を凝集することができ、プロテアーゼによるペプチド基質の開裂後に形成されるペプチド基質の加水分解断片のいずれも金ナノ粒子を架橋することができず、開裂部位が第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列外の位置にある場合にはペプチド基質が金ナノ粒子を架橋することができずにナノ粒子を凝集できず、第１及び第２の官能基を含有する加水分解断片はプロテアーゼによるペプチド基質の開裂後の形成の後に金ナノ粒子を架橋することができ、加水分解断片が金ナノ粒子の凝集をもたらす、ペプチド基質；並びに５２０ナノメートル±５ナノメートルにおいて最大吸光ピークを有する吸光スペクトルを有する非凝集金ナノ粒子であって、非凝集金ナノ粒子の溶液はピンク−赤の可視色を有し、金ナノ粒子の凝集が６００ナノメートルから７５０ナノメートルまでの範囲における新たな吸光ピークの形成を伴う吸光スペクトルのシフト及び５２０ナノメートル±５ナノメートルにおける吸光度の減少をもたらし、シフトが紫−青色への可視色の変化を引き起こす、非凝集金ナノ粒子を備える。
【００８７】
１以上の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの寸法における１〜２００ナノメートルのサイズを有する金ナノ粒子を備える。
【００８８】
１以上の実施形態において、本発明は、球体、棒、角柱、立方体、円盤、コアシェル構造体、枠、骨組み又はその組合せからなるグループから選択された形状を有する金ナノ粒子を備える。
【００８９】
１以上の実施形態において、本発明は、水、メタノール、エタノール、アセトン、生体緩衝液又はその混合物の１つにおける溶液として提供される金ナノ粒子を備える。
【００９０】
１以上の実施形態において、本発明は、金ナノ粒子によって少なくとも部分的に被覆されたナノ構造体として提供される金ナノ粒子を備える。
【００９１】
本発明の１以上の実施形態において、少なくとも１つの第１の官能基は、チオール基、アミン基、ホスフィン基、ジスルフィド基又はその組合せからなる。
【００９２】
本発明の１以上の実施形態において、少なくとも１つの第１の官能基は、システイン、メチオニン又はその混合物からなる。
【００９３】
本発明の１以上の実施形態において、少なくとも１つの第２の官能基は、アルギニン、リシン、ヒスタジン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はその混合物からなる。
【００９４】
１以上の実施形態において、本発明は金ナノ粒子を備え、表面電荷が負電荷であり、少なくとも１つの第２の官能基はリシン、アルギニン、ヒスタジン及びその混合物からなるグループから選択される。
【００９５】
１以上の実施形態において、本発明は金ナノ粒子を備え、表面電荷が正電荷であり、少なくとも１つの第２の官能基はアスパラギン酸、グルタミン酸及びその混合物からなるグループから選択される。
【００９６】
１以上の実施形態において、本発明はペプチド基質を備え、開裂部位は、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される。
【００９７】
１以上の実施形態において、本発明はペプチド基質を備え、開裂部位は、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、前立腺特異抗原、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、エラスターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スブチリシン又はその混合物の少なくとも１つによって開裂される。
【００９８】
１以上の実施形態において、本発明は、脱イオン水、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、高性能キャピラリー電気泳動溶液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ）、クエン酸−リン酸−ブドウ糖溶液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ＤＬ乳酸ナトリウム溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンエチレンジアミン四酢酸Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水又はその混合物からなる緩衝液をさらに備える。
【００９９】
１以上の実施形態において、本発明は、プロテアーゼのタンパク質分解活性の阻害を検出するためのアッセイキットであって、プロテアーゼ；各々が表面電荷を有する複数の非凝集金ナノ粒子；ペプチド配列を備えるペプチド基質であって、ペプチド基質が、金ナノ粒子の１つに共有結合することができる少なくとも１つの第１の官能基、金ナノ粒子の１つの表面電荷とイオン結合を形成することができる少なくとも１つの第２の官能基、及び第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列内又は第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列外のいずれかの場所にある、プロテアーゼについての開裂部位を備え、開裂部位が第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列内の位置にある場合にはペプチド基質が金ナノ粒子を架橋してナノ粒子を凝集することができ、プロテアーゼによるペプチド基質の開裂後に形成されるペプチド基質の加水分解断片のいずれも金ナノ粒子を架橋することができず、開裂部位が第１の官能基と第２の官能基の間のペプチド配列外の位置にある場合にはペプチド基質が金ナノ粒子を架橋することができずにナノ粒子を凝集できず、第１及び第２の官能基を含有する加水分解断片はプロテアーゼによるペプチド基質の開裂後の形成の後に金ナノ粒子を架橋することができ、加水分解断片が金ナノ粒子の凝集をもたらす、ペプチド基質；並びに５２０ナノメートル±５ナノメートルにおいて最大吸光ピークを有する吸光スペクトルを有する非凝集金ナノ粒子であって、非凝集金ナノ粒子の溶液はピンク−赤の可視色を有し、金ナノ粒子の凝集が６００ナノメートルから７５０ナノメートルまでの範囲における新たな吸光ピークの形成を伴う吸光スペクトルのシフト及び５２０ナノメートル±５ナノメートルにおける吸光度の減少をもたらし、シフトが紫−青色への可視色の変化を引き起こす、非凝集金ナノ粒子を備える。
【０１００】
本発明の１以上の実施形態において、プロテアーゼ阻害物質は、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ボセプレビル、テラプレビル、ウシ膵臓トリプシン阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ１、α１抗トリプシン又はその混合物からなる。
【０１０１】
発明は以降の特許請求の範囲によってのみ限定され、上述した特定の実施形態及びそれらの変形例及び組合せによっては限定されないことが意図されている。
【図１ａ】
2017518050.tif 000003
【図１ｂ】
2017518050.tif 000004
【図１ｃ】
2017518050.tif 000005
【図１ｄ】
2017518050.tif 000006
【図２】
2017518050.tif 000007
【図３】
2017518050.tif 000008
【図４ａ】
2017518050.tif 000009
【図４ｂ】
2017518050.tif 000010
【図４ｃ】
2017518050.tif 000011
【図５ａ】
2017518050.tif 000012
【図５ｂ】
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【図６ａ】
2017518050.tif 000014
【図６ｂ】
2017518050.tif 000015
【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
2017518050.tif 000019
【図９ａ】
2017518050.tif 000020
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
2017518050.tif 000023
【図１０ｂ】
2017518050.tif 000024
【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【国際調査報告】
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