(57)【要約】  本発明は、メチオニン並びに/又はその誘導体の発酵産生のために最適化した組換え微生物に関し、前記組換え株において、メチオニン排出は大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子の相同遺伝子を過剰発現させることによって強化される。本発明は、a.発酵性炭素源並びに硫黄源を含む適当な培地中で組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物においてメチオニン排出が大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子を過剰発現させることによって強化される工程と、b.培地からメチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する工程とを含む、メチオニン又はその誘導体の発酵産生を最適化する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生のための組換え微生物であって、前記組換え株において大腸菌(Escherichia coli)由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子が過剰発現され、ただし、前記過剰発現が、大腸菌(E. coli)由来の遺伝子metH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム(C. glutamicum)由来のその相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQ遺伝子の中の少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされず、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属(Citrobacter)種、赤痢菌属(Shigella)種、ラオウルテラ属(Raoultella)種、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種並びにフォトラブダス属(Photorhabdus)種の群の中から選ばれる組換え微生物。
【請求項２】
ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)又はシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)を起源とする、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項３】
ygaZH相同遺伝子が、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
【請求項４】
以下の遺伝子:S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンに対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、metA*対立遺伝子並びに/又はトレオニンに対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA若しくはthrA*対立遺伝子のうち少なくとも1つの発現も増加する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記遺伝子の少なくとも1つが、誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項4に記載の組換え微生物。
【請求項６】
以下の遺伝子:metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA又はudhAのうち少なくとも1つの前記発現も減弱される、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
a.前記ygaZ及びygaH相同遺伝子が、過剰発現され、
b.前記遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpycの前記発現が強化され、
c.前記遺伝子metJ、pykA、pykF、purU、dgsA、metE及びyncAの前記発現が減弱される、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
a.発酵性炭素源及び硫黄源を含む適当な培地中で組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子が、過剰発現され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来のその相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中の少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされず、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属(Citrobacter)種、赤痢菌属(Shigella)種、ラオウルテラ属(Raoultella)種、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種並びにフォトラブダス(Photorhabdus)種の群の中から選ばれる工程と、
b.前記培地からメチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する工程と
を含む、メチオニン又はその誘導体の発酵産生を最適化する方法。
【請求項９】
前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)又はシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)を起源とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え微生物の増殖が、培地中の1つ若しくはいくつかの無機基質、特にリン酸及び/若しくはカリウムの制限又は欠乏にさらされる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
メチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する前記工程が、前記発酵ブロス中のメチオニン並びに/又はその誘導体の濃縮の工程を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
メチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生のために遺伝子操作された微生物であって、前記組換え株において大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子が、過剰発現され、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属(Citrobacter)種、赤痢菌属(Shigella)種、ラオウルテラ属(Raoultella)種、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種並びにフォトラブダス属(Photorhabdus)種の群の中から選ばれる微生物。
【請求項１３】
ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)又はシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)を起源とする、請求項12に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
a.発酵性炭素源及び硫黄源を含む適当な培地中で組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子が過剰発現され、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属(Citrobacter)種、赤痢菌属(Shigella)種、ラオウルテラ属(Raoultella)種、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種並びにフォトラブダス属(Photorhabdus)種の群の中から選ばれる工程と
b.前記培地からメチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する工程と
を含む、メチオニン又はその誘導体の発酵産生を最適化する方法。
【請求項１５】
前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)又はシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)を起源とする、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-メチオニン及び/又はその誘導体の産生に有用な組換え微生物並びにL-メチオニンの調製の方法に関する。本発明の微生物は、組換え微生物において大腸菌(E.coli)由来ygaZ及びygaH遺伝子の相同遺伝子を過剰発現させることによってメチオニン/炭素供給源収率が増加するように修飾される。
【背景技術】
【０００２】
システイン、ホモシステイン、メチオニン又はS-アデノシルメチオニン等の含硫化合物は、細胞代謝に極めて重要である。特にL-メチオニン、即ち動物が合成できない必須アミノ酸は、多くの身体機能において重要な役割を果たす。産業的に産生されるメチオニンのほとんどは、動物飼料及び食品添加物として広く使用されている。
【０００３】
BSE及び鶏インフルエンザの結果として動物由来タンパク質の使用が減少したことに伴い、高純度メチオニンに対する需要が増加した。一般に、D,L-メチオニンは、アクロレイン、メチルメルカプタン及びシアン化水素から化学的に生産される。しかしながら、ラセミ混合物は、高純度L-メチオニンと同様には機能しない(Saunderson、1985年)。更に、高純度L-メチオニンは、例えば、N-アセチル-D,L-メチオニンのアシラーゼ処理によってラセミメチオニンから生産することができるが、これは生産費用を劇的に増加させる。従って、環境問題と連動した高純度L-メチオニンに対する需要の増加は、メチオニンの微生物生産に魅力的な期待を与える。
【０００４】
リシン、トレオニン及びトリプトファン等他の重要なアミノ酸は、動物飼料用に発酵によって生産される。従って、これらのアミノ酸は、出発物質としてグルコース及び他の再生可能資源を使用して製作することができる。発酵によるL-メチオニンの産業的な生産は今のところ成功していないが、技術の開発は継続している。
【０００５】
微生物におけるL-メチオニン産生を最適化するための異なる手法について、以前に記述されている(例えば、特許又は特許出願、米国特許第7,790,424号、第7,611,873号、WO2002/10209、WO2005/059093及びWO2006/008097を参照のこと);しかしながら、微生物からのL-メチオニンの産業的な生産には、更なる改善が必要である。
【０００６】
L-メチオニンが、特定のレベル又はより多く合成されると、フィードバックループによりそれ自身の更なる産生が阻害され、細胞の生理が妨げられる。従って、これらの改善のうちの1つは、組換えL-メチオニン過剰産生微生物におけるL-メチオニン排出を強化することにより、微生物内でのL-メチオニン蓄積を減少させて、効果的な産生を確保することである。
【０００７】
メチオニン輸出は、大腸菌(Escherichia coli)において複合体YgaZHにより及びコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)において相同な複合体BrnFEにより、媒介される(Trotschelら、2005年)。YgaZは、L-バリン及びL-メチオニンの輸出に関与する分岐鎖アミノ酸エクスポーター(LIV-E)ファミリーのメンバーである。YgaZは、予測される内膜タンパク質であるYgaHと複合体を形成して、アミノ酸レベルが細胞に有毒になるであろう条件下でそれを輸出する。
【０００８】
特許出願欧州特許第1239041号並びにWO2008/082211は、大腸菌におけるL-バリン及びL-メチオニンの輸出に関与する分岐鎖アミノ酸エクスポーター(YgaZH)の過剰発現について記述している。この過剰発現は、大腸菌におけるメチオニン産生の改善をもたらす。
【０００９】
本発明者らは、メチオニン産生について大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子より驚く程効果的である大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子に対する相同遺伝子をいくつか同定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第7,790,424号
【特許文献２】米国特許第7,611,873号
【特許文献３】WO2002/10209
【特許文献４】WO2005/059093
【特許文献５】WO2006/008097
【特許文献６】欧州特許第1239041号
【特許文献７】WO2008/082211
【特許文献８】WO2004/076659
【特許文献９】WO2007/011939
【特許文献１０】WO2005/111202
【特許文献１１】WO2007/077041
【特許文献１２】WO2009/043803
【特許文献１３】WO2010/020681
【特許文献１４】WO2011/073738
【特許文献１５】WO2011/080542
【特許文献１６】WO2011/080301
【特許文献１７】WO2012/055798
【特許文献１８】WO2013/001055
【特許文献１９】WO2013/190343
【特許文献２０】WO2015/028675
【特許文献２１】WO2015/028674
【特許文献２２】WO2011/073122
【特許文献２３】JP2000/157267
【特許文献２４】WO2012/090021
【特許文献２５】WO2009/043372
【特許文献２６】WO2005/007862
【特許文献２７】WO2005/059155
【特許文献２８】欧州特許第2573189A1号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、組換え微生物並びにメチオニン及び/又はその誘導体の産生を最適化する方法に関し、メチオニン輸出が強化される。組換え微生物において、メチオニン排出は、大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子の相同遺伝子を過剰発現させることによって強化される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、本発明は、組換え微生物並びにメチオニン及び/又はその誘導体の産生を最適化する方法におけるその使用に関し、前記組換え微生物において、メチオニン排出が大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子のygaZH相同遺伝子を過剰発現させることによって強化され、ただし、この過剰発現は、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされず、前記ygaZH相同遺伝子は、シトロバクター属(Citrobacter)種、赤痢菌属(Shigella)種、ラオウルテラ属(Raoultella)種、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種並びにフォトラブダス属(Photorhabdus)種の群の中から選ばれる。
【００１３】
本発明の組換え微生物は、
-  以下の遺伝子:S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンに対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、metA*対立遺伝子及び/若しくはトレオニンに対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA若しくはthrA*対立遺伝子のうち少なくとも1つの発現の増加、並びに/又は
-  以下の遺伝子:metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、udhA、dgsA、metE又はyncAのうち1つの発現の減弱
等他の遺伝子組換えを含むこともできる。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、a)シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)又はシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)を起源とする大腸菌由来のygaZH遺伝子の相同遺伝子が過剰発現され、ただし、この過剰発現は、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、或いはそれらと組み合わされ、b)遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*及びpycのうち少なくとも1つの発現が強化され、並びにc)遺伝子metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、dgsA、metE及びudhAのうち少なくとも1つの発現が減弱される組換え微生物に関する。
【００１５】
好ましくは、組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明について詳細に記述する前に、本発明が、特に例示された方法に限定されるものではなく、当然変形し得ることは理解されよう。本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施形態だけを記述することを目的とし、限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになることも理解されよう。
【００１７】
本明細書に引用される刊行物、特許及び特許出願の全ては、前後を問わず、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００１８】
更にまた、本発明の実践は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内にある従来の微生物学的及び分子生物学的技術を利用する。そのような技術は当業者に周知であり、文献において詳細に説明されている。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」及び「the」が、文脈に別段の明確な指図がない限り複数への言及を含む点に注意しなければならない。従って、例えば、「微生物(a microorganism)」への言及は、そのような微生物の複数を含み、「内因性遺伝子(an endogenous gene)」への言及は、1つ以上の内因性遺伝子への言及である、等である。別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述される材料及び方法と類似の又は同等の任意のそれらを使用して、本発明を実践若しくは試験することができるが、好ましい材料並びに方法については次に記述される。
【００２０】
明確な言葉若しくは必要な意味により文脈が別段に要求する場合を除き、後に続く特許請求の範囲及び本発明の連続した説明において、単語「含む(comprise)」、「含有する(contain)」、「含む(involve)」若しくは「含む(include)」又は「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含有している(containing)」、「含まれる(involved)」、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」等の変形は、全てを含む意味で使用され、即ち記載されている特徴の存在を明示するが、本発明の様々な実施形態において更なる特徴の存在若しくは追加を排除するものではない。
【００２１】
用語「メチオニン」及び「L-メチオニン」は、特定のL-異性体に対し化学式HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3並びにCAS番号59-51-8又は63-68-3を持つ必須含硫アミノ酸を示す。
【００２２】
「メチオニンの誘導体」とは、同じ化学的骨格を示すが、少なくとも1つの化学基でメチオニンと異なるメチオニンに対する分子類似体のことを指す。本発明において、好ましいメチオニン誘導体は、N-アセチルメチオニン(NAM)、S-アデノシルメチオニン(SAM)及びヒドロキシメチオニン(又はメチオニンヒドロキシ類似体若しくはMHA)である。
【００２３】
本明細書で使用される用語「微生物」とは、人工的に修飾されていない細菌、酵母又は真菌のことを指す。優先的には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)及びコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より優先的には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パントエア属(Pantoea)、サルモネラ属(Salmonella)又はコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。更により優先的には、本発明の微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカム種のいずれかである。
【００２４】
本明細書で使用される用語「組換え微生物」若しくは「遺伝子操作微生物」とは、天然に見られず、天然に見られる同等物と遺伝的に異なる細菌、酵母又は真菌のことを指す。それは、遺伝要素の導入若しくは欠失又は修飾のいずれかによる修飾のことを意味する。指向性突然変異誘発と特定の選択圧下における進化とを組み合わせることによって新たな代謝経路の開発及び進化を推し進めることにより形質転換することもできる(例えば、WO2004/076659又はWO2007/011939を参照のこと)。
【００２５】
これらの遺伝子が、宿主微生物における発現を可能にする全ての要素と共に微生物に導入されれば、微生物は、外因性遺伝子を発現するように修飾できる。外因性DNAによる微生物の修飾又は「形質転換」は、当業者にとって日常的な作業である。
【００２６】
微生物を修飾して、内因性遺伝子の発現レベルを変調させることができる。
【００２７】
用語「内因性遺伝子」は、遺伝子が、任意の遺伝子組換えの前に微生物内に存在したことを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節エレメントに加えて若しくはそれと置き換えて異種配列を導入することにより、又は染色体若しくはプラスミドに1つ又は複数の追加コピーの遺伝子を導入することにより過剰発現させることができる。内因性遺伝子を修飾して、コードされている対応するタンパク質の発現及び活性を変調させることもできる。例えば、突然変異をコード配列に導入して遺伝子産物を修飾することができ、又は内因性調節エレメントに加えて若しくはそれと置き換えて異種配列を導入することができる。内因性遺伝子の変調は、遺伝子産物の活性の上方調節及び/若しくは強化をもたらすことができ、或いは、内因性遺伝子産物の活性を下方調節並びに/又は弱めることができる。
【００２８】
発現を変調させるための別の方法は、遺伝子の内因性プロモーター(例えば、野生型プロモーター)をより強い又はより弱いプロモーターと交換して、内因性遺伝子の発現を上方若しくは下方調節することである。これらのプロモーターは、相同又は異種であることができる。適当なプロモーターを選択することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００２９】
一方で、「外因性遺伝子」は、当業者に周知の手段により遺伝子が微生物に導入されたことを意味し、この遺伝子は微生物中に天然には存在しない。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれる、又はプラスミド若しくはベクターにより染色体外で発現させ得る。複製起点及び細胞内でのコピー数に関して異なる様々なプラスミドが、当技術分野において周知である。これらの遺伝子は相同であり得る。
【００３０】
本発明の文脈において、用語「相同遺伝子」は、理論的に共通の遺伝的祖先を有する遺伝子を指すことに限定されず、類似の機能を実行する及び/又は類似の構造を有するタンパク質をコードするように進化したにもかかわらず、遺伝的に無関係であり得る遺伝子も含む。従って、本発明の目的で用語「機能的相同体」は、特定の酵素活性が、定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質だけではなく、他の関連する(しない)微生物由来の類似の配列のタンパク質によっても提供され得るという事実に関する。
【００３１】
公知の遺伝子に対してGenbankから得られる参照を使用して、当業者は、他の生物、菌種、酵母、真菌、哺乳動物、植物等にある同等の遺伝子を決定することが可能である。この日常的な業務は、他の微生物から得られる遺伝子との配列整列化を実施することにより決定できる共通配列を使用し、縮重プローブを設計して別の生物中にある対応する遺伝子をクローニングして有利に行われる。分子生物学のこれらの日常的な方法は、当業者に周知である。
【００３２】
本明細書で使用される、用語「改善したメチオニン産生」、「メチオニン産生を改善する」及び文法上のその等価物は、メチオニン/炭素供給源収率の増加のことを指す(消費された炭素供給源g/mol当たりの産生されたメチオニンg/molの比であり、パーセントで表すことができる)。消費された炭素供給源及び産生されたメチオニンの量を決定する方法は、当業者に周知である。収率は、対応する無修飾微生物と比較すると組換え微生物においてより高い。
【００３３】
用語「メチオニンの発酵産生について最適化された微生物」とは、進化及び/又は遺伝子操作されて対応する野生型微生物の内因性産生と比較して改善されたメチオニン産生を示す微生物のことを指す。メチオニン産生について「最適化された」そのような微生物は、当技術分野において周知であり、特許出願WO2005/111202、WO2007/077041、WO2009/043803、WO2010/020681、WO2011/073738、WO2011/080542、WO2011/080301、WO2012/055798、WO2013/001055、WO2013/190343、WO2015/028675及びWO2015/028674において特に開示されている。
【００３４】
本発明によれば、用語「発酵産生」、「培養」又は「発酵」は、細菌の増殖を意味するために使用される。この増殖は、使用される微生物に適合され、少なくとも1つの単純な炭素供給源及び必要に応じて補基質を含有する適当な培地を含む発酵槽内で一般に行われる。
【００３５】
「適当な培地」は、炭素供給源若しくは炭素基質、窒素供給源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム;リン供給源、例えば、一カリウムリン酸若しくはリン酸二カリウム;微量元素(例えば、金属塩)、例えばマグネシウム塩、コバルト塩及び/若しくはマンガン塩;及びアミノ酸及びビタミン等の増殖因子等細胞の維持並びに/又は増殖に必須の若しくは有益な栄養分を含む培地(例えば、無菌の、液体培地)を指す。
【００３６】
本発明による用語「炭素供給源」若しくは「炭素基質」若しくは「炭素源」は、単糖(グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトース又は乳糖等)、オリゴ糖、二糖(ショ糖、セロビオース又はマルトース等)、糖蜜、澱粉又はその誘導体、ヘミセルロース及びその組み合わせを含めた微生物の正常な増殖を支持する当業者によって使用できる任意の炭素源を意味する。特に好ましい単一の炭素供給源は、グルコースである。別の好ましい単一の炭素供給源は、ショ糖である。炭素供給源は、再生可能な供給原料から得ることができる。再生可能な供給原料は、短い遅れの範囲で及び所望の産物への転換を可能にするのに充分な量で再生できる特定の産業的過程に必要とされる原料と定義される。処理された又はされていない植物性バイオマスは、興味深い再生可能な炭素供給源である。
【００３７】
本発明による用語「硫黄源」とは、硫酸、チオ硫酸、硫化水素、ジチオン酸、亜ジチオン酸、亜硫酸、メチルメルカプタン、硫化ジメチル及び他のメチルキャップ硫化物又は異なる供給源の組み合わせのことを指す。より優先的には、培地中の硫黄供給源は、硫酸若しくはチオ硫酸又はその混合物である。
【００３８】
用語「窒素源」は、アンモニウム塩又はアンモニアクガスのいずれかに対応する。窒素供給源はアンモニウム又はアンモニアクの形で供給される。
【００３９】
この文脈において用語「減弱」又は「減弱した発現」は、遺伝子の発現及び/若しくは酵素の産生が、非修飾の微生物と比較して低下若しくは抑制され、非修飾の微生物と比較してリボ核酸、タンパク質若しくは酵素の細胞内濃度の低下をもたらすこと意味する。当業者は、例えば、リボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の使用並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特定の抗体の使用を含めた、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための異なる手段及び方法を知っている。
【００４０】
酵素の産生の減少又は抑制は、前記酵素をコードしている遺伝子の発現の減弱により得られる。
【００４１】
遺伝子の減弱は、当業者に公知の手段及び方法により実現することができる。一般に、遺伝子発現の減弱は、
-  コード領域若しくはプロモーター領域を突然変異させる、又は
-  遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部若しくは一部を欠失させる、又は
-  相同組換えにより遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させる、又は
-  コード領域若しくはプロモーター領域へ外部要素を挿入する、又は
-  弱いプロモーター若しくは誘導可能なプロモーターの制御下で遺伝子を発現させることにより実現できる。
【００４２】
当業者は、異なる強さを呈する様々なプロモーターを知っており、弱い又は誘導可能な遺伝子発現にどのプロモーターを使用すべきかを知っている。
【００４３】
用語、酵素の「活性」は、用語「機能」と互換的に使用され、本発明の文脈において、酵素により触媒される反応を指す。当業者は、前記酵素の酵素活性を測定する方法を知っている。
【００４４】
用語、酵素の「減弱された活性」若しくは「減少した活性」は、アミノ酸配列の突然変異により得られるタンパク質の特定の触媒活性の減少及び/又はヌクレオチド配列の突然変異若しくは遺伝子のコード領域の欠失により得られる細胞内のタンパク質の濃度の低下のいずれかを意味する。
【００４５】
用語、酵素の「強化された活性」若しくは「増加した活性」は、例えば酵素をコードしている遺伝子を過剰発現させることにより得られる酵素の特定の触媒活性の増加及び/又は細胞内における酵素の量/有用性の増加のいずれかを指す。
【００４６】
用語「増加した発現」、「強化された発現」又は「過剰発現」及びその文法上の等価物は、本文において互換的に使用され、類似の意味を有する。これらの用語は、遺伝子の発現又は酵素の産生が、非修飾の微生物と比較して増加し、非修飾の微生物と比較してリボ核酸、タンパク質若しくは酵素の細胞内濃度の増加をもたらすことを意味する。当業者は、例えば、リボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の使用並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特定の抗体の使用を含めた、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための異なる手段及び方法を知っている。
【００４７】
酵素の産生の増加は、前記酵素をコードしている遺伝子の発現を増加させることにより得られる。
【００４８】
遺伝子の発現を増加させるために、当業者は:
-  微生物中の遺伝子のコピー数を増加させる。遺伝子は、染色体又は染色体外にコードされる。遺伝子が染色体上に位置する場合、本分野の専門家に公知の組換え(遺伝子置き換えを含む)方法により数コピーの遺伝子を染色体上に導入することができる。遺伝子が染色体外に位置する場合、遺伝子は、プラスミドの複製起点、従って細胞内におけるそのコピー数について異なる、異なる型のプラスミドに保有され得る。これらのプラスミドは、プラスミドの性質に応じて1〜5コピー若しくは約20コピー又は500コピー以下で微生物中に存在する:複製が厳密な低コピー数プラスミド(pSC101、RK2)、低コピー数プラスミド(pACYC、pRSF1010)又は高コピー数プラスミド(pSK bluescript II)。
-  遺伝子の高レベルの発現をもたらすプロモーターを使用する。当業者は、どのプロモーターが最も簡便か知っており、例えば、プロモーターPtrc、Ptac、Plac、又はλプロモーターPR及びPLが広く使用される。これらのプロモーターは、特定の化合物又は温度若しくは光の様な特定の外部条件により「誘導可能」であり得る。これらのプロモーターは、相同又は異種であり得る。
-  遺伝子の特異的又は非特異的転写リプレッサーの活性若しくは発現を減弱する。
-  対応するメッセンジャーRNAを安定化する要素(Carrier及びKeasling、1999年)又はタンパク質を安定化する要素(例えば、GSTタグ、GE Healthcare社)を使用する。
等異なる技術を知っている。
【００４９】
用語「コードしている」又は「コードする」とは、ポリヌクレオチドが、転写及び翻訳の機序によってアミノ酸配列を産生する過程のことを指す。酵素をコードしている遺伝子は、外因性又は内因性であり得る。
【００５０】
用語「フィードバック感度」又は「フィードバック阻害」とは、物質が特定のレベルまで蓄積したときに、細胞内で特定の物質の産生を触媒する1つ若しくはいくつかの酵素が、阻害される若しくは活性が低くなる細胞機序制御のことを指す。従って、用語「フィードバック感度が減少している」又は「フィードバック阻害が減少している」は、そのような機序の活性が、非修飾の微生物と比較して低下する又は抑制されることを意味する。当業者は、この結果を得るためにどのように酵素を修飾するか知っている。そのような修飾については、特許出願WO2005/111202又は米国特許第7,611,873号に記述されている。
【００５１】
本発明の第1の態様において、組換え微生物は、前記微生物におけるメチオニン排出を強化することによりメチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生について最適化される。好ましくは、組換え微生物は、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科の中から選ばれる。より好ましくは、組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカムの中から選ばれる。更により好ましくは、本発明の微生物は、大腸菌の組換え株である。
【００５２】
上記の通り、アミノ酸産生微生物において、メチオニンは特異的排出輸送体により排出される。特に、大腸菌において、この輸送体はYgaZHと呼ばれ、ygaZ及びygaH遺伝子にコードされるが、C.グルタミカムにおいてはBrnFEと命名され、brnF並びにbrnE遺伝子にコードされる。このメチオニン排出系の機能的相同体が、他のいくつかの微生物において特定されている。或いは、本発明の組換え微生物は、YgaZH又はBrnFE系の機能的相同体を過剰発現することができる。YgaZ及びYgaH相同タンパク質が、Table 1(表1)並びにTable 2(表2)にそれぞれ示される。
【００５３】
【表１Ａ】
2017525379.tif 000002
【００５４】
【表１Ｂ】
2017525379.tif 000003
【００５５】
【表１Ｃ】
2017525379.tif 000004
【００５６】
【表１Ｄ】
2017525379.tif 000005
【００５７】
【表１Ｅ】
2017525379.tif 000006
【００５８】
【表２Ａ】
2017525379.tif 000007
【００５９】
【表２Ｂ】
2017525379.tif 000008
【００６０】
【表２Ｃ】
2017525379.tif 000009
【００６１】
【表２Ｄ】
2017525379.tif 000010
【００６２】
【表２Ｅ】
2017525379.tif 000011
【００６３】
各相同体について表に開示した受託番号により、当業者は例えばNCBIデータベース上でアミノ酸配列及びそのヌクレオチドコード配列を得ることが可能である。
【００６４】
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列から、これら相同体をコードしている遺伝子を得ることは、当業者にとって日常的な作業である。それは、そのアミノ酸配列からの対象となるタンパク質をコードする遺伝子の人工的な合成か又は対応するゲノムDNAからの対象となるコード領域のPCR増幅かいずれかにより行うことができる。本発明の文脈において、これらの遺伝子は、「ygaZ又はygaH相同遺伝子」と呼ばれる。これらのygaZH相同遺伝子の配列は、宿主微生物のコドンバイアスに合わせることができる。
【００６５】
本発明によると、組換え微生物は、配列が配列番号1及び配列番号2にそれぞれ開示されているタンパク質をコードしている大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子の相同遺伝子を過剰発現し、ただし、この過剰発現は、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、或いはそれらと組み合わされる。好ましくは、ygaZ及びygaH相同遺伝子は同じ生物を起源とする遺伝子の対により構成され、ygaZの相同遺伝子とygaHの相同遺伝子により構成される。しかしながら、第1の生物由来のygaZ相同遺伝子と第2の生物由来のygaH相同遺伝子との不適当な組合せの対も使用し得る。
【００６６】
ygaZH相同遺伝子は、Table1(表1)並びにTable2(表2)にそれぞれ開示するYgaZ及びYgaH相同体をコードしている遺伝子の中から選ばれる。好ましくは、ygaZH相同遺伝子は、シトロバクター属種、赤痢菌属種、ラオウルテラ属種、エンテロバクター属種、エルシニア属種及びフォトラブダス属種由来のYgaZH相同体をコードしている遺伝子の中から選ばれる。より好ましくは、ygaZH相同遺伝子は、シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とする。最も好ましくは、ygaZH相同遺伝子はシトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー又はエンテロバクター属種を起源とする。
【００６７】
従って、ygaZH相同遺伝子は、シトロバクター・コセリ由来の配列番号3及び配列番号4、シゲラ・フレクスネリ由来の配列番号5及び配列番号6、ラオウルテラ・オルニチノリティカ由来の配列番号7及び配列番号8、エンテロバクター属種(R4-368)由来の配列番号9及び配列番号10、エルシニア・エンテロコリチカ亜種エンテロコリチカ由来の配列番号11若しくは配列番号12並びに配列番号13若しくは配列番号14、フォトラブダス・ルミネッセンス亜種ラウモンディイ由来の配列番号15及び配列番号16、シトロバクター・ヤンガエ由来の配列番号17及び配列番号18、シトロバクター・フロインディー由来の配列番号19及び配列番号20によってそれぞれ定義されるYgaZH相同体の対をコードする遺伝子の中から選ばれる。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態において、これらの遺伝子又は一般にygaZH相同遺伝子は、誘導可能なプロモーターの制御下で過剰発現される。当業者は、そのような誘導可能なプロモーターを知っている。例えば、本発明の組換え微生物において、λPR若しくはλPLの様なプロモーターを使用して、ygaZH相同遺伝子、特にシトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子を過剰発現させることができる。
【００６９】
任意選択で、内因性ygaZH又はbrnFE遺伝子は、本発明の組換え微生物において欠失される。
【００７０】
アミノ酸産生微生物においてygaZH相同遺伝子を単独で若しくは以下に開示する他の遺伝子組換えと組み合わせて過剰発現させること、特にTable1(表1)並びにTable2(表2)にそれぞれ開示されるYgaZ及びYgaH相同体をコードしているygaZH相同遺伝子を単独で又は以下に開示する他の遺伝子組換えと組み合わせて過剰発現させることが、本発明の好ましい実施形態である。
【００７１】
メチオニン生合成経路の最適化
本発明による組換え微生物は、メチオニンの産生を改善するために修飾される。メチオニン産生に関係する遺伝子は、当技術分野において周知であり、メチオニン特異的生合成経路に関係する遺伝子並びに前駆体生成経路に関係する遺伝子及びメチオニン消費経路に関係する遺伝子を含む。
【００７２】
メチオニンの効果的な産生には、メチオニン特異的経路及びいくつかの前駆体生成経路の最適化が必要になる。メチオニン産生株については、特に、特許出願WO2005/111202、WO2007/077041及びWO2009/043803に既に記述されている。これらの出願は、この出願へ参照により組み込まれる。
【００７３】
特に明記しない限り、メチオニン生合成経路の最適化について以下に述べる遺伝子の全ては、大腸菌由来のものを指す。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、組換え微生物は、下記の通り修飾される:S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンに対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、metA*対立遺伝子並びに/又はトレオニンに対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA及びthrA*対立遺伝子、から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現が増加する。
・ptsGは、特許出願WO2013/001055に記載のPTS酵素IICBGlcをコードする。
・pycは、特許出願WO2013/001055に記載のピルビン酸カルボキシラーゼをコードする。好ましい実施形態において、pyc遺伝子は異種であり、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)又はコリネバクテリウム属種由来のpyc遺伝子から選ばれる、
・pntABは、特許出願WO2012/055798に記述されるような膜結合性トランスヒドロゲナーゼのサブユニットをコードし、
・cysPは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるペリプラズム硫酸結合タンパク質をコードし、
・cysUは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される硫酸ABC輸送体の成分をコードし、
・cysWは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される膜結合硫酸輸送タンパク質をコードし、
・cysAは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される硫酸透過酵素をコードし、
・cysMは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるO-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードし、
・cysI及びcysJは、WO2007/077041並びにWO2009/043803に記述される亜硫酸レダクターゼのα及びβサブユニットをそれぞれコードする。好ましくは、cysI及びcysJは、一緒に過剰発現され、
・cysHは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるアデニリル硫酸レダクターゼをコードする。
【００７５】
C1代謝を増加させることも、メチオニン産生の改善をもたらす修飾である。それは、GcvTHP、Lpd又はMetFの中から選ばれるC1代謝に関係する酵素のうち少なくとも1つの活性の増加に関する。本発明の好ましい実施形態において、1つの炭素代謝は、以下のうち少なくとも1つの発現及び/又は活性を強化することにより増加する。
・特許出願WO2007/077041に記述されるグリシン開裂複合体をコードするgcvT、gcvH、gcvP及びlpd。グリシン開裂複合体(GCV)は、グリシンの酸化を触媒し、二酸化炭素、アンモニア、メチレン-THF及び還元型ピリジンヌクレオチドを生じる多酵素複合体である。GCV複合体は、4つのタンパク質成分、前記P-タンパク質(GcvP)であるグリシン脱水素酵素、前記H-タンパク質(GcvH)であるリポイル-GcvH-タンパク質、前記T-タンパク質(GcvT)であるアミノメチルトランスフェラーゼ及び前記L-タンパク質(GcvL又はLpd)であるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼからなる。P-タンパク質は、ピリドキサールリン酸依存的なグリシンからのCO2遊離を触媒し、メチルアミン部分が残る。メチルアミン部分はH-タンパク質のリポ酸基へ移され、そのメチルアミン部分はグリシンの脱炭酸前にはP-タンパク質に結合している。T-タンパク質は、メチルアミン基からのNH3の放出を触媒し、残ったC1単位をTHFへ移し、メチレン-THFを形成する。Lタンパク質は、次いでH-タンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をNAD+へ移して、NADHを形成する;
・特許出願WO2007/077041に記載のメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードしているmetF。
【００７６】
セリン生合成に関係する以下の遺伝子のうちの少なくとも1つの過剰発現も、副産物イソロイシンの産生を減少させる。
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserA、
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるホスホセリンホスファターゼをコードするserB、
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC。
【００７７】
以下の遺伝子の過剰発現がメチオニンの産生を改善することは、すでに示されている:
・cysEは、セリンアシルトランスフェラーゼをコードする;WO2007/077041に記述される通り、その過剰発現は、メチオニン産生の増加を可能にする。
・metAは、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする。対立遺伝子metA*は、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンに対するフィードバック感度が減少している酵素をコードする。優先的には、特許出願WO2005/111202に記述される対立遺伝子metA*が使用される;
・thrAは、アスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする;WO2005/111202に記載の通り、thrA*対立遺伝子は、トレオニンに対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードする。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、遺伝子は誘導可能なプロモーターの制御下にあることができる。本発明の好ましい実施形態において、これらの遺伝子のうちの少なくとも一つは、温度誘導可能なプロモーターの制御下にある。好ましくは、遺伝子thrA、cysE、metAのうち少なくとも1つの発現は、直接又は間接的に、誘導可能なプロモーターの制御下にある。より好ましくは、遺伝子thrA、cysE及びmetAは、直接又は間接的に誘導可能なプロモーターの制御下にある。本発明の好ましい実施形態において、thrA遺伝子の発現は、誘導可能なプロモーターの直接の制御下にあり、cysE遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導可能な発現の極性効果下にある。本発明の別の好ましい実施形態において、thrA遺伝子の発現は、誘導可能なプロモーターの直接の制御下にあり、cysE及びmetA遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導可能な発現の極性効果下にある。
【００７９】
最も好ましい実施形態において、温度誘導可能なプロモーターは、PRプロモーターのファミリーに属する。誘導可能なプロモーターの制御下に遺伝子を有するメチオニン産生株については、特許出願WO2011/073122に記述されている。
【００８０】
本発明の別の特定の実施形態において、微生物は更に修飾され、以下の遺伝子のうち少なくとも1つの発現が減弱される:metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA又はudhA。
・遺伝子metJは、特許出願JP2000/157267において示唆された通りメチオニンレギュロンの下方調節に関与するリプレッサータンパク質MetJ(GenBank1790373)をコードし、
・遺伝子pykA及びpykFは、酵素「ピルビン酸キナーゼ」をコードする。ピルビン酸キナーゼの少なくとも一方又は両方の発現の減弱は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)の消費を低下させる。WO2007/077041及びWO2009/043803に記載の通り、PEPの利用可能性の増加は、アスパラギン酸の重要な前駆体であり、即ちメチオニンの前駆体であるオキサロ酢酸の産生を増加させ得る。
・purUは、ホルミル-THFデホルミラーゼ反応を触媒する酵素であるホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードする。デホルミラーゼ活性の減弱は、ホモシステインのメチル化に必要とされるメチル-THFの産生を増加させる。脱ホルミル化によるC1代謝物の消失は、メチオニンに転換され得ないホモシステインの産生の増加をもたらす。WO2007/077041及びWO2009/043803に記載の通り、ホモシステインは次いで、ホモランチオニンを産生するO-スクシニルホモセリンとホモシステインの間の反応を触媒できる酵素シスタチオニンγシンターゼ(MetB)の基質になることができ、
・ybdLは、特許出願WO2012/090021に記載のアミノトランスフェラーゼをコードし、
・yncAは、特許出願WO2010/020681に記載のN-アシルトランスフェラーゼをコードし、
・metEは、特許出願WO2013/190343に記載のコバラミン非依存的メチオニンシンターゼをコードし、
・Mlcとして公知のdgsAは、特許出願WO2013/001055に記載のホスホトランスフェラーゼ(PTS)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)系の酵素をコードしている遺伝子の発現を制御する転写デュアルレギュレーターをコードし、
・udhAは、特許出願WO2012/055798に記載の可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする。
【００８１】
本発明のより好ましい実施形態において、メチオニン排出が強化されている組換え微生物による、主要な炭素供給源であるグルコースからメチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生は、前記微生物において上で検討した修飾、例えば:
>遺伝子metJの発現が減弱され、S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニン(metA*)に対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているmetA*対立遺伝子の発現が強化される;
>遺伝子metJの発現が減弱され;S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニン(metA*)に対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているmetA*対立遺伝子の発現が強化され;トレオニン(thrA*)に対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA*対立遺伝子の発現が強化される;
>遺伝子metJの発現が減弱され;S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニン(metA*)に対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているmetA*対立遺伝子の発現が強化され;トレオニン(thrA*)に対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA*対立遺伝子の発現が強化され;遺伝子cysEの発現が強化される;
>遺伝子metJの発現が減弱され;S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニン(metA*)に対するフィードバック感度が減少している酵素をコードしているmetA*対立遺伝子の発現が強化され;トレオニン(thrA*)に対するフィードバック阻害が減少している酵素をコードしているthrA*対立遺伝子の発現が強化され;遺伝子cysEの発現が強化され;遺伝子metFの発現が強化される;の組み合わせによって実現することができる。
【００８２】
本発明の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpycの発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA及びyncAの発現が減弱される。
【００８３】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現される;
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpycの発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA及びyncAの発現が減弱される。
【００８４】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE及びthrA*の発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF及びpurUの発現が減弱される。
【００８５】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現される;
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE及びthrA*の発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF及び  purUの発現が減弱される。
【００８６】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE及びthrA*の発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF、metE、yncA及びpurUの発現が減弱される。
【００８７】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現される;
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、及びthrA*の発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pyk、metE、yncA及びpurUの発現が減弱される。
【００８８】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中から選ばれる少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされない、
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*及びpycの発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pykF、metE、yncA及びpurUの発現が減弱される。
【００８９】
本発明の別の特定の態様において、組換え微生物は、次の遺伝子組換えを含む:
・シトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とするygaZH相同遺伝子が過剰発現される;
・遺伝子metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*及びpycの発現が強化される、並びに
・遺伝子metJ、pykA、pyk、metE、yncA及びpurUの発現が減弱される。
【００９０】
最も好ましくは、ygaZH相同遺伝子はシトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー又はエンテロバクター属種を起源とする。
【００９１】
本発明の特定の実施形態において、組換え微生物は、細菌ファミリー腸内細菌科又はコリネバクテリウム科由来である。
【００９２】
優先的には、組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカムである。より優先的には、本発明の組換え微生物は、大腸菌である。
【００９３】
培養条件
本発明の第2の態様において、方法は、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生に最適化される。方法は:
-  発酵性炭素源及び硫黄源を含む適当な培地中で組換え微生物を培養する工程であって、メチオニン排出が、ygaZH相同遺伝子を過剰発現させることによって強化され、ただし、この過剰発現が、大腸菌由来のmetH、任意選択でfldA及びfpr遺伝子若しくはC.グルタミカム由来の相同遺伝子の過剰発現とも、metN、metI若しくはmetQの中の少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱とも組み合わされず、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属種、赤痢菌属種、ラオウルテラ属種、エンテロバクター属種、エルシニア属種並びにフォトラブダス属種の群の中から選ばれる工程と、
-  培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程と
を含む。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明の方法は、
-  発酵性炭素源及び硫黄源を含む適当な培地中で組換え微生物を培養する工程であって、メチオニン排出が、大腸菌由来のygaZH遺伝子のygaZH相同遺伝子を過剰発現させることによって強化され、前記ygaZH相同遺伝子が、シトロバクター属種、赤痢菌属種、ラオウルテラ属種、エンテロバクター属種、エルシニア属種並びにフォトラブダス属種の群の中から選ばれる工程と、
-  培地からメチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する工程と
を含む、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵産生に最適化された方法である。
【００９５】
当業者は、本発明による微生物の培養条件を定義することが可能である。特に、細菌は、20℃〜55℃の間、優先的には25℃〜40℃の間、より具体的にはC.グルタミカムの場合約30℃及び大腸菌の場合約37℃の温度で発酵される。
【００９６】
大腸菌の場合、培地は、M9培地(Anderson、1946年)、M63培地(Miller、1992年);又は、Schaeferら(1999年)によって定義された培地等と同一のもの若しくは類似の組成物であることができる。
【００９７】
C.グルタミカムの場合、培地は、BMCG培地(Lieblら、1989年)又は、Riedelら(2001年)により記述される培地等と同一のもの若しくは類似の組成物であることができる。
【００９８】
本発明の特定の態様によると、方法は、大腸菌由来のygaZH遺伝子のygaZH相同遺伝子、特にTable1(表1)及びTable2(表2)のYgaZHタンパク質をコードしているそれらの過剰発現を含む組換え微生物で実行される。
【００９９】
本発明の方法において、組換え微生物において過剰発現されるygaZH相同遺伝子は、シトロバクター属種、赤痢菌属種、ラオウルテラ属種、エンテロバクター属種、エルシニア属種及びフォトラブダス属種、より好ましくはシトロバクター・コセリ、シゲラ・フレクスネリ、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブダス・ルミネッセンス、シトロバクター・ヤンガエ又はシトロバクター・フロインディーを起源とする相同遺伝子からなる群の中から好ましくは選ばれる。
【０１００】
本発明の方法の別の特定の態様によると、本方法において培養しようとする組換え微生物において過剰発現される前記ygaZH相同遺伝子は、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー又はエンテロバクター属種由来の相同遺伝子からなる群の中から選ばれる。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、組換え微生物の増殖は、培地中の1つ若しくはいくつかの無機基質、特にリン酸及び/若しくはカリウムの制限又は飢餓にさらされる。それは、微生物の増殖が、まだ弱い増殖を可能にする供給された無機化学物質の量により支配される状態のことを指す。微生物増殖におけるそのような制限については、特許出願WO2009/043372に記述されている。本発明の好ましい実施形態において、培養はリン酸制限にさらされる。
【０１０２】
本発明の方法の特定の実施形態において、組換え微生物は、細菌ファミリー腸内細菌科又はコリネバクテリウム科由来である。優先的には、組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウムグルタミカムであり、より優先的には、本発明の組換え微生物は、大腸菌である。
【０１０３】
「培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する」行為は、L-メチオニン及び/又はその誘導体の1つ、特にN-アセチルメチオニン(NAM)及びS-アデノシルメチオニン(SAM)並びにヒドロキシメチオニン(又は、メチオニンヒドロキシ類似体若しくはMHA)等有用であり得る他の全ての誘導体を回収する行為を指す。「培地からメチオニンを回収する」行為は、その純度が何であれ発酵培地からメチオニンを回収する行為を指定する。「回収する」は、対象とする産物(この場合メチオニン)を含有する発酵過程(発酵しなければならない)から直接得られる第1の産物及び概ね受け入れられる純度で発酵の他の副産物を回収することを意味する。
【０１０４】
「精製」工程は、対象となる産物(この場合メチオニン)を特異的に精製して、改善された純度で対象となる前記産物を得る工程からなる。
【０１０５】
メチオニンは、蒸留、イオン交換クロマトグラフィー法、沈殿、結晶化又は塩、特にカルシウム塩若しくはアンモニウム塩による複合体形成の様な当業者に周知の技術及び手段により回収し、精製され得る。産生された化合物の回収及び精製のそのような方法は、特にWO2005/007862並びにWO2005/059155に開示されている。好ましくは、メチオニン及び/若しくはその誘導体を回収する工程は、発酵ブロス中のメチオニン並びに/又はその誘導体の濃縮の工程を含む。
【０１０６】
発酵培地中の産物の量は、当技術分野において公知のいくつかの方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又はガスクロマトグラフィー(GC)を使用して決定することができる。例えば、培地中に得られるメチオニンの量は、標準としてL-メチオニン(Fluka社、参照番号64319)を使用してOPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより測定される。NAMの量は、標準としてNAM(Sigma社、参照番号01310)を使用して屈折率HPLCを使用して決定される。
【実施例】
【０１０７】
以下の実験は、背景である大腸菌組換えL-メチオニン産生株とは異なる様々な微生物由来のL-メチオニン排出系をコードしている遺伝子の過剰発現の有益性を実証する。
【０１０８】
以下の実施例において、当技術分野において周知の方法を使用して、複製ベクター並びに/又はDatsenko及びWanner(2000年)によってよく記述されている相同組換えを使用する様々な染色体挿入、欠失及び置換を含有する大腸菌株を構築した。
【０１０９】
同じ方法で、組換え微生物中で1つ若しくはいくつかの遺伝子を発現若しくは過剰発現させるためのプラスミド又はベクターの使用が当業者に周知である。
【０１１０】
適当な大腸菌発現ベクターの例には、pTrc、pACYC184n pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236等がある。
【０１１１】
手順
いくつかの手順を使用して、以下の実施例において記述されるメチオニン産生株を構築した。
【０１１２】
本発明において使用される手順1(相同組換え、組換え体の選抜及び抗生物質カセットの切り出しによる染色体修飾)及び手順2(ファージP1の形質導入)については、特許出願WO2013/001055に完全に記述されている。
【０１１３】
手順3:組換えプラスミドの構築
組換えDNA技術についてはよく記述されており、当業者に公知である。簡潔には、DNA断片は、オリゴヌクレオチド(当業者は、設計することができる)及びマトリックスとしてMG1655ゲノムDNAを使用してPCR増幅される。DNA断片及び選抜したプラスミドは、適合する制限酵素で消化され、ライゲートされ、コンピテント細胞に次いで形質転換される。形質転換体は分析され、対象となる組換えプラスミドがDNA塩基配列決定により検証される。
【０１１４】
【表３】
2017525379.tif 000012
【０１１５】
(実施例1)
大腸菌L-メチオニン過剰産生組換え株における内因性L-メチオニン分泌系の過剰産生-株1の説明及び株2〜7の構築
株1-参照株
特許出願WO2013/001055(本出願へ参照により組み込む)に記述されるメチオニン産生株17を、この本出願において株1と名前を変更した。注意のために、この株は、その内因性座においてmetH遺伝子の前方に組み込まれた人工プロモーター及びリボゾーム結合部位によりmetHを過剰発現した(詳細については、特許出願WO2007/077041を参照のこと)。この株は、特許出願WO2013/190343に開示されるmetE遺伝子内にも突然変異を含有する。
【０１１６】
株6の構築
コバラミン依存的メチオニンシンターゼ、metHをコードしている遺伝子並びにMetHの再活性化系をコードしている遺伝子fldA及びfprは、株1の遺伝的背景において全て過剰発現された。
【０１１７】
株1を使用する前に、Datsenko及びWanner、2000年に記述されるFlpリコンビナーゼ(手順1による)を使用して、抗生物質カセットをΔdgsA修飾から除去した。カナマイシン感受性形質転換体を選抜し、ΔdgsA座における抗生物質カセットの非存在を、適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。得られた株を、株2と命名した。
【０１１８】
過剰発現metHを実現するために、Datsenko及びWanner、2000年に記述される相同組換え戦略(手順1による)を使用した。特許出願WO2007/077041に記載の同じプロモーター及びリボゾーム結合部位に作動的に連結した遺伝子metHを、2つの異なる座ybeM並びにypjC(特許出願WO2011/073122に開示されるリストから選択し、その欠失は、メチオニン産生に影響がない)で染色体に組み込んだ。
【０１１９】
両方の染色体組み込みについて、標的した組み込み座ybeM又はypjCに相同なDNA配列に隣接している人工プロモーター及び抵抗性マーカーの両方に連結されたmetH遺伝子を保有する断片を、オーバーラッピングPCR技術(オーバーラッピングオリゴヌクレオチド)によりPCR増幅した。ybeM及びypjCへ組換えるための配列は、ybeM及びypjCそれぞれについて配列番号21及び配列番号22並びに配列番号23及び配列番号24(Table3[表3]に挙げる)に参照される。得られたPCR産物「ΔybeM::metH::Km」及び「ΔypjC::metH::Cm」を、エレクトロポレーションにより株MG1655 metA*11(pKD46)に次いで別々に導入した。抗生物質抵抗性形質転換体を選抜し、標的した座における抵抗性カセットを伴うmetH遺伝子の挿入を、適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。得られた株を、MG1655 metA*11  ΔybeM::metH::Km及びMG1655 metA*11  ΔypjC::metH::Cmと称した。最後に、ΔybeM::metH::Km及びΔypjC::metH::Cm染色体組み込みを、P1ファージ形質導入によりMG1655 metA*11  ΔybeM::metH::Km並びにMG1655 metA*11  ΔypjC::metHから株2へ連続して両方移した(手順2による)。クロラムフェニコール又はカナマイシン抵抗性形質導入体を選抜し、ΔybeM::metH::Km及びΔypjC::metH::Cm染色体組み込みの存在を適当なオリゴヌクレオチドを用いてPCR分析により検証した。得られた株を、株3と命名した。
【０１２０】
抗生物質のカセットを、Datsenko及びWanner、2000年(手順1による)に記述されるFlpリコンビナーゼを使用して株3においてybeM及びypjC座に製作した染色体組み込みから除去した。カナマイシン及びクロラムフェニコール感受性形質転換体を選抜し、両方の座における抗生物質カセットの非存在を、適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。得られた株を、株4と命名した。
【０１２１】
fldA並びにfprを過剰発現させるために、これらの遺伝子を人工プロモーター及び人工リボゾーム結合部位に作動的に連結し、ytfA座で染色体上へ組み込んだ(ybeM及びypjC座と同じ選抜基準、上記を参照のこと)。fldA用として人工プロモーターを配列番号25で構築した。fprの場合、株に使用した人工プロモーターは、cysPUWAMオペロンの過剰発現用として特許出願WO2009/043803に記述されている。両方の遺伝子について、人工リボゾーム結合部位は、特許出願WO2013/001055に開示されている株17においてptsG遺伝子を過剰発現させるために記述されているものと同じである。
【０１２２】
染色体上へfldA及びfpr過剰発現のコピーを導入するために、Datsenko及びWanner、2000年(手順1による)に記述される相同組換え戦略を使用した。組み込み座ytfAに相同なDNA配列に隣接しているそれぞれのプロモーター及び抵抗性マーカーの両方を伴うfldA並びにfpr遺伝子を保有する断片を、オーバーラッピングPCR技術(オーバーラッピングオリゴヌクレオチド)によりPCR増幅した。ytfA座へ組換えるための配列は、配列番号26及び配列番号27に参照される(Table3[表3]に挙げる)。得られたPCR産物「ΔytfA::fldA-fpr::Km」を、エレクトロポレーションによりMG1655 metA*11(pKD46)株に次いで導入した。抗生物質抵抗性形質転換体を次いで選抜し、ytfA座における抵抗性カセットを伴うfldA-fpr遺伝子の挿入を、適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により確認した。得られた株を、MG1655 metA*11  ΔytfA::fldA-fpr::Kmと称した。最後に、ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体組み込みを、P1ファージ形質導入によりMG1655 metA*11  ΔytfA::fldA-fpr::Kmから株4へ移した(手順2による)。カナマイシン抵抗性形質導入体を選抜し、ΔytfA:fldA-fpr:Km染色体組み込みの存在を適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。得られた株を、株5と呼んだ。
【０１２３】
抗生物質のカセットを、Datsenko及びWanner、2000年(手順1による)に記述されるFlpリコンビナーゼを使用して株5においてytfA座に製作した染色体組み込みから除去した。カナマイシン感受性形質転換体を選抜し、ytfA座における抗生物質カセットの非存在を、適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。得られた株を、株6と命名し、次の実施例に対して遺伝的背景Aに対応することにした。
【０１２４】
株7の構築-内因性ygaZH遺伝子の過剰発現
メチオニンのエクスポーターをコードしている大腸菌由来遺伝子ygaZHを、ygaZの天然のプロモーターを使用して中コピー数プラスミドpCL1920(Lerner及びInouye、1990年)にクローニングした。このプラスミドを、pME1247と命名した。最後に、プラスミドpME1247を株6に形質転換し、株7を得た。
【０１２５】
(実施例2)
コバラミン依存的メチオニンシンターゼ(MetH)を過剰産生する大腸菌L-メチオニン産生株における様々な微生物由来の異なるL-メチオニン分泌系の過剰産生-8株〜15の構築
シトロバクター属種、ラオウルテラ属種、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、エルシニア属種及びフォトラブダス属種由来のygaZH相同遺伝子を遺伝的背景Aにおいて過剰発現させて、ygaZH大腸菌遺伝子を保有する株7と比較した。
【０１２６】
株8〜15の構築-Table4(表4)に挙げた属及び種由来のygaZH相同遺伝子の過剰発現
L-メチオニン産生株においてTable4(表4)に挙げたタンパク質をコードしているygaZH相同遺伝子を過剰発現させるために、大腸菌のygaZH遺伝子についてすでに上述したように、大腸菌ygaZ遺伝子の天然のプロモーター及びリボゾーム結合部位を使用して各遺伝子の対を中コピー数プラスミドpCL1920(Lerner及びInouye、1990年)にクローニングした。Table5(表5)に定めた通り、ygaZH相同遺伝子を対応する株のゲノムDNAから増幅した又は大腸菌に対するコドン使用頻度の最適化の有り無しで化学的に合成した(GeneOptimizer[登録商標]ソフトウェア、Lifetechnologies社によるGeneArt[登録商標]Gene Synthesisサービスにより提案される通り)。ygaZH相同遺伝子を含む増幅したDNA断片を、Table5(表5)に示した配列番号で開示する。得られたプラスミドを、Table5(表5)で述べた通り命名した。最後に各プラスミドを株6に形質転換し、Table5(表5)で述べた通り株8〜15を得た。
【０１２７】
【表４】
2017525379.tif 000013
【０１２８】
【表５】
2017525379.tif 000014
【０１２９】
(実施例3)
いくつかのL-メチオニン過剰産生株おける様々な微生物由来の異なるL-メチオニン分泌系の過剰産生-株16及び17、並びに株18〜53の構築
L-メチオニン産生に対する相同なygaZH遺伝子の過剰発現の有益な効果を、特許内で前述した異なる背景で評価した。それらは以下である:
-  遺伝的背景B:MG1655 metA*11  ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP  ΔpykA  ΔpykF  ΔpurU::Km(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)本出願において株17と命名した。
本出願において株16と命名したpME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ベクターがないその母親、及びMG1655 metA*11  ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP  ΔpykA  ΔpykF  ΔpurU::Km(pME101-thrA*1-cysE)(pCC1BAC-serB-serA-serC)については、特許出願WO2009/043803に記述されている。株17、より正確にはプラスミドpME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11を得るために、プラスミドpCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11の構築について特許出願WO2011/073122に記述されているものと類似方法論により、metA*11遺伝子をgapA遺伝子プロモーター(Thouvenotら、2004年)と一緒にpME101-thrA*1-cysEプラスミドのcysE遺伝子の下流にクローニングした。次いで、pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ベクターを株16に導入し、株17を得た。
-  遺伝的背景C:特許出願WO2012/055798に記述される株10
-  遺伝的背景D:特許出願WO2012/090021に記述される株3
-  遺伝的背景E:特許出願WO2013/001055に記述される株17、及びこの本出願において株1と命名した。
【０１３０】
過剰発現されるygaZH相同遺伝子に対するレシピエントとして使用したL-メチオニン過剰産生株のいくつかは、pCL1920型プラスミドを既に保有していた(先の背景B及びD)。従って、大腸菌のPygaZプロモーターに連結された内因性又は異種性いずれかのygaZHオペロンをクローニングする戦略は、レシピエントの遺伝的背景に従って適合された。正確には、(i)遺伝的背景C及びEの場合、内因性又は異種性ygaZHオペロンを空のpCL1920プラスミドにクローニングし、(ii)遺伝的背景Bの場合、内因性又は異種性ygaZHオペロンをpME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11プラスミドにクローニングし、及び(iii)遺伝的背景Dの場合、内因性又は異種性ygaZHオペロンをpCL1920-PgapA-pycRe-TT07プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドを、Table6(表6)に述べたとおり命名した。
【０１３１】
Table6(表6)に見られるように、同じ種由来のygaZHオペロンを保有するプラスミドの場合、プラスミドの参照番号は同一であり、命名法における唯一の変更は、ygaZHオペロンをクローニングするのに使用されるpCL1920の型によるアルファベットの接尾辞(b又はc)である。
【０１３２】
この実施例において試験した異なるL-メチオニン過剰産生大腸菌株の場合、株6遺伝的背景について記述され、Table5(表5)に示した通り、ygaZH相同遺伝子を対応する株のゲノムDNAから増幅した又は大腸菌に対するコドン使用頻度を最適化することの有り無しで化学的に合成した(GeneOptimizer[登録商標]ソフトウェア、Lifetechnologies社によるGeneArt[登録商標]Gene Synthesisサービスにより提案される通り)。
【０１３３】
【表６】
2017525379.tif 000015
【０１３４】
最後に、株18〜53を、以下の背景にTable6(表6)に挙げた異なるプラスミドを導入することにより得た。
-  遺伝的背景Bの場合:pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11-PygaZ-ygaZHプラスミド型を株16に導入して株18〜26を得た、
-  遺伝的背景Cの場合:pCL1920-PygaZ-ygaZHプラスミド型をWO2012/055798出願の株10に導入して株27〜35を得た、
-  遺伝的背景Dの場合:pCL1920-PgapA-pycre-TT07-PygaZ-ygaZHプラスミド型をWO2012/090021出願の株3に導入して株36〜44を得た、及び
-  遺伝的背景Eの場合:pCL1920-PygaZ-ygaZHプラスミド型を株1に導入して株45〜53を得た。
【０１３５】
L-メチオニン産生の特定の遺伝的背景を1対の特定の相同なygaZH遺伝子の過剰発現を保有する特定のプラスミドと組み合わせて得た株を、下のTable7(表7)に挙げた。
【０１３６】
【表７】
2017525379.tif 000016
【０１３７】
(実施例4)
metH並びにfldA及びfpr遺伝子の過剰発現を含有しないいくつかのL-メチオニン過剰産生株における様々な微生物由来の異なるL-メチオニン分泌系の過剰産生-株54〜73の構築
L-メチオニン産生に対する相同なygaZH遺伝子の過剰発現の有益な効果も、metH並びにfldA及びfpr遺伝子の過剰発現とは独立して評価した。metHの発現の天然の低レベルは、背景B及びEへと回復し、株17〜26への拡張により、株1及び株45〜53へと回復した。
【０１３８】
metHの天然の発現レベルを回復するために、その天然のプロモーターをmetH遺伝子の前方で置き換え、従って、Datsenko及びWanner、2000年により、手順1に記述される相同組換え戦略を使用して人工プロモーターを同時に除去した。第一に、抗生物質抵抗性遺伝子を、自身のプロモーターの制御下にある非修飾metHを所有する野生型株へmetH遺伝子の下流に追加した。より正確には、抗生物質耐性遺伝子(テトラサイクリンの場合Tc)をFRT部位と一緒に保有し、metH遺伝子の下流及びyjbB遺伝子の上流領域を相同な配列(配列番号28及び配列番号29)に囲まれるPCR産物を生成し、pKD46ベクターを事前に形質転換したMG1655 metA*11に導入した。抗生物質抵抗性形質転換体を適当なオリゴヌクレオチドを用いて検証し、得られた株はMG1655 metA*11 metH::Tcであった。最後に、metH::Tc染色体修飾を、P1ファージ形質導入(手順2による)によりMG1655 metA*11 metH::Tcから株17〜26へ並びに株1及び株45〜53へと移した。テトラサイクリン抵抗性形質導入体を選抜し、metH::Tc染色体組み込みの存在、及びmetH座に閉じられているレシピエント株の染色体修飾の完全性を適当なオリゴヌクレオチドを用いるPCR分析により検証した。下記のTable8(表8)に挙げた通り、得られた株を株54〜73と命名した。
【０１３９】
【表８】
2017525379.tif 000017
【０１４０】
(実施例5)
L-メチオニンの産生
産生株を、小型エルレンマイアーフラスコにおいて評価した。株17並びに18〜26及び54〜63と命名したその誘導体株の場合、培養条件は欧州特許第2573189A1号に記述されており、WO2012/055798出願の株10及び27〜35と命名されたその誘導体株、WO2012/090021出願の株3及び36〜44と命名されたその誘導体株の場合、培養条件は各それぞれの特許に記述されている。
【０１４１】
他の株(株1並びに45〜53及び64〜73と命名されたその誘導体株)の場合、前培養5.5mLを、混合培地(2.5g.L-1グルコースを含む10%LB培地[Sigma社  25%]及び90%最少培地PC1、Table9[表9])中で、30℃で21時間増殖させた。それを使用して、培地PC1中でOD600 0.2になるように50mL培養に植菌した。必要に応じて、50mg.L-1の濃度でスペクチノマイシン及びカナマイシンを、10mg.L-1の濃度でゲンタマイシンを並びに5mg.L-1の濃度でテトラサイクリンを添加した。必要に応じて、IPTGを、0.0048g.L-1の濃度で添加した。培養温度は37℃であり、撹拌速度は200RPMであった。培養がOD600 5〜7に達したら、細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量化し、他の関連代謝物を屈折率検出(有機酸及びグルコース)を備えるHPLC及びシリル化後にGC-MSを使用して分析した。
【０１４２】
【表９】
2017525379.tif 000018
【０１４３】
【表１０】
2017525379.tif 000019
【０１４４】
上のTable10(表10)から分かるように、異なる微生物に由来する相同なYgaZH対を保有する試験した株のL-メチオニン産生能力は、大腸菌由来の内因性YgaZHを保有する同等の株と等しいか又はより高いかいずれかであった(株7と比較した株8〜15)。更に、例えば株15、26、35、44及び53を株7、18、27、36及び45とそれぞれ比較すると、相同なL-メチオニン分泌系を過剰生産させるために使用した遺伝的背景が何であれこれらの結果を得られる。L-メチオニン産生の最良の結果は、シトロバクター・コセリ、エンテロバクター属種、シトロバクター・ヤンガエ及びシトロバクター・フロインディーに由来するygaZH遺伝子で達成され、L-メチオニン過剰産生株において過剰発現される。
【０１４５】
メチオニン収率を以下の通り表した:
【０１４６】
【数１】
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【０１４７】
【表１１】
2017525379.tif 000021
【０１４８】
上のTable11(表11)から分かるように、異なる微生物に由来する相同なYgaZH対を保有する試験した株のL-メチオニン産生能力は、大腸菌由来の内因性YgaZHを保有する同等の株と等しいか又はより高いかいずれかであった(例えば株55と比較した株56〜63を参照のこと)。更に、例えば株63及び73を株55及び65、より具体的にはmetHの過剰発現なし、とそれぞれ比較すると、遺伝的背景が何であれこれらの結果を得られる。L-メチオニン産生の点で最良の結果は、シトロバクター・コセリ、エンテロバクター属種、シトロバクター・ヤンガエ及びシトロバクター・フロインディーに由来するygaZH遺伝子で達成され、L-メチオニン過剰産生株において過剰発現される。
【０１４９】
結論として、組換えL-メチオニン産生株における相同なYgaZHタンパク質の過剰生産は、metH及びfldA-fpr遺伝子の過剰発現に関係なくアミノ酸産生に有益である。シトロバクター・コセリ、エンテロバクターsp、シトロバクター・ヤンガエ及びシトロバクター・フロインディーに由来するygaZH遺伝子の過剰発現による産生の増進は、大腸菌由来の内因性ygaZH遺伝子の過剰発現より高い。
(参考文献)
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【配列表】
2017525379000001.app
【国際調査報告】
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2017525379.tif 000025
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