(57)【要約】  本発明は、唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップを提供する。その中、レクチンチップがＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせを少なくとも含む。また、上記レクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット、及び上記レクチンチップを利用して、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出する用途を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト用レクチンプローブ群を含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせを少なくとも含むことを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項２】
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項３】
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項４】
テスト用レクチンプローブ群と対照プローブを含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＩ、ＩＩ及びＩＩＩ群を含み、上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ群がそれぞれＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせ、ＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせとＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせであることを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項５】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項１に記載のレクチンチップの使用。
【請求項６】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項２に記載のレクチンチップの使用。
【請求項７】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項３に記載のレクチンチップの使用。
【請求項８】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項４に記載のレクチンチップの使用。
【請求項９】
請求項２に記載のレクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
【請求項１０】
請求項４に記載のレクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患を識別するレクチンチップに関し、具体的には、唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の最新情報によると、肝臓癌は世界で最もよく見られる５つの悪性腫瘍の１つであり、２００８年に世界の肝臓癌患者は７４．９万に達し、肝臓癌により死亡した患者数が６９．５万であり、そのうち、中国の肝臓癌患者は４０．２万に達し、肝臓癌により死亡した患者数が３７．２万であることが分かる（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｏｃａｎ．ｉａｒｃ．ｆｒ／）。中国衛生部の「中国衛生統計年鑑２０１２」によると、２０１ｌ年に悪性腫瘍は中国の主な疾患死亡率の首位を占め、その中、肝臓癌が悪性腫瘍死亡率の第二位を占めることが開示された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ）。肝臓癌の死亡率が高い原因の１つは現在の肝臓癌が通常末期で確診されるので、最適治療期間を逃がし、また臨床診断後に患者の平均生存期間が１２ヶ月未満である。α−フェトプロテイン（Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）は現在の肝臓癌診断の特異的なマーカーであるが、ＡＦＰ測定には偽陽性と偽陰性の問題が存在する。約２０％の末期肝臓癌患者は病沒までに、ＡＦＰ測定が陰性のままである。病理組織学検査はなお現在の診断の最高基準であるが、組織学検査の固有の欠陥、例えば侵襲性検査、動的検出ができないこと、及びサンプリングの違いが存在することなどに鑑み、従って非侵襲性検査を求め、肝臓癌の早期診断を行うことは肝臓癌の予防の鍵である。
【０００３】
社会の進歩、科学技術の発展に伴い、人々の医学検査に対する要求も益々高くなり、創傷なし、簡単且つ迅速な疾患検査・診断方法が求められる。血清標本に比べ、唾液の採取は安全且つ便利で、創傷がなく、病気の血行性伝播の恐れもない。また、近年、唾液は臨床サンプルとして様々な疾患、例えばＡＩＤＳ、自己免疫疾患、アルコール性肝硬変、嚢胞性線維症、糖尿病、心血管疾患、虫歯などの薬物濃度モニタリング、病状監視及び治療効果の評価に広く用いられている。文献と本願発明者らの従来の研究によると、唾液には十分なＮ−結合糖タンパク質とＯ−結合糖タンパク質が含まれ、唾液のタンパク質のグリコシル化の変化と疾患の発生及び進展とは高い関連性を持っている。変化した唾液の糖タンパク質糖鎖から疾患に関するバイオマーカーを見出すことができ、唾液検査に基づく新しい技術と新しい方法も今後非侵襲性臨床診断の発展の１つの方向になりつつある。核酸と同様に、糖質は重要な生物情報分子であるとともに、遺伝子情報の継続である。分子生物学および細胞生物学の発展に伴い、糖質の他の多くの生物学的機能が認識されつつあり、糖質は多糖または遊離オリゴ糖の形で生命過程に直接に関与できるだけではなく、糖複合体、例えば糖タンパク質、プロテオグリカン及び糖脂質などとして多くの重要な生命活動に関与できる。その他、糖複合体は多くの疾患、例えば癌症、細菌感染及びウイルス感染などの疾患に密接に関連している。
【０００４】
中国の９０％以上の肝臓癌は肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）であり、７５％〜８０％のＨＣＣ発症が肝臓の慢性ウイルス性感染に関わり、世界中、肝線維化を伴うＨＣＣ患者が８０％〜９０％である。今までの研究によると、肝疾患の炎症、線維化、癌化の過程において、患者の肝組織と血清に糖タンパク質糖鎖の構造と機能の変化が発生されたことが判明された。糖鎖はその構造が複雑で且つ機能が多様であるため、膨大な情報量を含み、一旦翻訳後修飾の過程で糖鎖の修飾乱れが発生すると、深刻な結果をもたらすことになる。例えば、病理的な状態において、糖代謝酵素類の活力の変化や欠陥により、糖タンパク質における糖鎖の発現レベルに異常を生じさせることができ、それにより細胞機能が異常になり、さらに悪性化進展をもたらす。
【０００５】
国内外の研究状況及び解析：
（１）肝炎、肝線維化／肝硬変と肝臓癌の発生及び進展の過程において、患者の血清／肝組織における糖タンパク質糖鎖が変化することから、血清と組織における糖タンパク質糖鎖の変化は肝臓癌の発生及び進展に関わることが分かる。
【０００６】
中国は慢性肝炎、特にＢ型肝炎の高発症地域であり、約１．２億人が長期的にＢ型肝炎ウイルスを持って、慢性肝炎患者数が約３０００万である。約３０万の慢性肝炎患者は最終に肝硬変患者と肝臓癌患者になる。研究によると、８０％〜９０％の肝臓癌患者は「 慢性肝炎−肝硬変−肝臓癌 」という過程を経ることが見出された。既にある研究は、肝炎から肝線維化／肝硬変になる過程中に、患者の血清における糖タンパク質糖鎖に変化が発生されることが開示された[５]。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染後に、肝線維化患者の血清におけるＧａｌ化２分岐型Ｎ−糖鎖レベルが明らかに健康志願者より高いとともに、血清における２分岐型及び３分岐型Ｎ−糖鎖レベルが肝線維化の程度の悪化に伴って低下する。他の研究によると、肝線維化の進展に伴い、血清におけるバイセクト型コアα（１，６）Ｆｕｃ化２分岐型Ｎ−糖鎖レベルが高くなるが、３分岐型Ｎ−糖鎖レベルが低くなり、これによって、血清における特定のＮ−糖鎖のレベルの変化は線維化の進展を監視するために用いられることが判明された。KａｍなどはＭＡＬＤＩ−Ｔ０Ｆ質量分析法で、慢性ＨＢＶ感染と程度の異なる肝線維化患者の血清におけるＮ−結合糖鎖プロファイルの変化を定量的に解析したところ、１７個の糖鎖のマススペクトルピークが肝線維化／肝硬変検出の潜在的なバイオマーカーになることができ、また、１３４１．５、１８２９．７、１９３３．３と２１３０．３ｍ／ｚという４つの糖鎖のマススペクトルピークが肝線維化と肝硬変を識別・診断することができ、且つ正確率が８５％に達することが見出された。ＱｕなどはＤＮＡシーケンサーの蛍光体支援糖質電気泳動法（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を利用し、慢性ＨＢＶ患者の血清におけるＮ−糖鎖プロファイルの変化を評価したところ、糖鎖プロファイルにおけるピーク１、２、８及び１０がある程度に肝線維化の異なる段階を区別することができることが見出された。研究によると、血清におけるヒアルロン酸（ＨＡ）の濃度変化と肝線維化の異なる段階との間に相関性を持つことも見出された。
【０００７】
肝線維化／肝硬変と肝臓癌の発生及び進展の過程において、患者の血清と肝組織における糖タンパク質糖鎖に変化が発生され、例えば、ＬｉｕなどはＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用して肝線維化、肝硬変及び肝臓癌患者の血清における９種類の糖鎖構造を検出したところ、肝臓癌患者の血清におけるα−１，３Ｆｕｃ化３分岐型糖鎖構造の存在量が最も高く、肝硬変患者の血清におけるバイセクト型α−１，６コアＦｕｃ化２分岐型糖鎖構造の存在量が比較的に高いことが見出され、これによって、血清におけるこの２種類の糖鎖の存在量の変化は腫瘍の進展の段階に密接に関連していることが判明された。Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ）とα１，６−フコシル転移酵素（α１−６ＦＴ）は肝臓癌患者の血清及び癌化組織において高発現され、肝臓癌に関する３つの重要な異常発現酵素であり、且つ肝臓癌患者の体内の糖タンパク質糖鎖の構造の変化を引き起こさせることができる。研究によると、Ｓｉａα−２，６糖鎖構造は肝臓癌組織において高発現されるが、肝硬変組織には明らかな変化がないことも見出され、これは肝硬変と肝臓癌を区別する根拠の１つになることができる。
【０００８】
現在、肝臓癌の診断マーカーの研究において、いくつかの新しい技術が肝臓癌患者の血清における糖タンパク質糖鎖の構造の研究に用いられ、肝臓癌の発生及び進展の過程において、患者の血清における特有の糖タンパク質糖鎖がいくつか見出された。例えば、イオンモビリティー質量分析（ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＩＭ−ＭＳ）技術を利用して健康者、肝硬変患者と肝臓癌患者の血清における糖タンパク質糖鎖の構造を解析したところ、肝硬変と肝臓癌に異なる糖鎖が存在することが見出された。Ｌｉｕなどはレクチンチップ（１６種類のレクチンを含む）技術を利用してＨＣＣ患者と肝硬変患者の血清における糖タンパク質糖鎖の構造の相違を解析したところ、ＨＣＣ患者の血清にはＦｕｃ化糖タンパク質の存在量が比較的に高いことが見出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを利用し、ランダムに選んだ７７名の健康志願者、５２名の慢性肝疾患の患者及び７３名の肝臓癌患者の血清における糖タンパク質上の８３個のＮ−糖鎖を定量的に比較したところ、肝臓癌患者の血清における糖タンパク質上の５７個のＮ−糖鎖の存在量が明らかに変化されたことが見出され、その中の６種類の糖鎖はそれぞれ肝臓癌の診断に用いられ、検出感度が３６％〜９１％である。３種類のＮ−糖鎖の併用は慢性肝疾患の患者から肝臓癌患者を診断することができ、感度が９０％であり、特異性が８９％である。肝臓癌（腫瘍の直径が３ｃｍ未満）の早期診断マーカーの研究において、中国の科学者により血清におけるグリピカン−３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、ＧＰＣ３）が早期肝臓癌を検出するための分子マーカーになれることが見出された。ＧＰＣ３は肝臓癌の早期発見に寄与するだけではなく、肝臓癌の特異性を十分に有し、例えばＡＦＰの補充として、ＨＣＣの確診率の向上に寄与する。
【０００９】
上記の研究によると、肝炎、肝線維化／肝硬変と肝臓癌の発生及び進展の過程において、患者の血清／肝組織における糖タンパク質糖鎖が変化することから、血清／組織における糖タンパク質糖鎖の変化は肝臓癌の発生及び進展に関わることが判明され、血清により肝炎、肝硬変と肝臓癌を区別して検出することができる。しかし、血液検査の固有の欠陥、例えば侵襲性及び病気の血行性伝播の恐れがあることに鑑み、さらに研究して肝炎、肝硬変と肝臓癌を非侵襲的に識別・診断する新しい技術と新しい方法を求めることが必要である。
【００１０】
（２）唾液は疾患を非侵襲的に診断する理想的なメディアであるが、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化と肝臓癌の発生及び進展との関連性について、まだ研究の余地がある。
【００１１】
人間の唾液は耳下腺、顎下腺、舌下腺および他のいくつかの小さな腺により分泌され、核酸、タンパク質、脂質、ミネラルおよび他の小分子物質を含む。唾液は口腔内環境の安定を維持し、口腔壁を潤滑し、咀嚼、話し及び食べ物を飲み込むことに寄与する役割を果たす。また、唾液には細菌やウイルスを抑制・消滅する物質も存在する。局所の口腔病変か体の全体的な状態かによる唾液の含有量と組成の変化は、いずれも唾液機能不全を引き起こす可能性がある。研究によると、唾液には唾液を構成する基本的なタンパク質（異なる性別と年齢層にはほとんど無差別に発現されるタンパク質や糖タンパク質）が少し含まれる以外、人間の健康と生理的状態を反応できるタンパク質も少し含まれ、これらのタンパク質はよく年齢層、性別、病理と生理的状態が異なる人々に差次的に発現されることが見出された。唾液における差次的に発現されるこれらのタンパク質を解析することは、人間の健康状態の評価と疾患に関するバイオマーカーの研究の基礎である。血液における一部のタンパク質成分は同様に唾液に存在し、唾液が血液における一部のタンパク質レベルの変化を反応できる。従って、唾液に対する検出により疾患を診断することができる。
【００１２】
腫瘍は内分泌器官と同様に、ホルモン、リンホカインとサイトカインを分泌することができ、血液により遠隔器官に送られ、全身に影響を与える。一旦これらの因子が唾液腺に到達したり、唾液分泌に伴って口腔に入ったり唾液における遺伝子転写プロファイルに変化を発生させると、若干のタンパク質の存在量や種類の変化が引き起こされるので、唾液における腫瘍バイオマーカーになる。今までの研究によると、人間の唾液には１９３９種類のタンパク質があり、人間の血漿には３０２０種類のタンパク質があり、且つ唾液プロテオームと血漿プロテオームが一致するのは２７％であることが見出された。これは、血液循環における多くのバイオマーカーは唾液に同定され得ることを示し、唾液が疾患の診断に用いられることをさらに説明している。血漿プロテオミクスにより見出された心血管疾患に関する１７７個の潜在的なバイオマーカーのタンパク質の中に、４０％のタンパク質は唾液プロテオームにも存在し、また、見出された１０５８個の潜在的な癌関連バイオマーカーのタンパク質の中に、３４％のタンパク質は唾液プロテオームにも存在する。唾液プロテオームと血漿プロテオームを比較した結果によると、いくつかのタンパク質は唾液プロテオームにのみ存在し、血漿プロテオームには存在しないことが示され、両方におけるタンパク質の種類が完全に一致するものではないことが判明された。唾液ヒトプロテオーム、血漿ヒトプロテオームと全ヒトプロテオームのＧＯ（ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ）アノテーションを比較することによって、唾液プロテオームと血漿プロテオームには細胞外マトリックス成分が多いが、細胞内液成分が少ないことが見出され、これにより、唾液プロテオームと血漿プロテオームはプロテオームを分泌する特徴があることを示唆している；生物学的プロセスと分子機能に関わる解析の結果によると、唾液プロテオームと血漿プロテオームは類似の生物学的機能を持つことが示唆されている。従って、唾液から腫瘍マーカーを選別することは科学性と実行可能性を有するとともに、非侵襲的に検出する利点を有する。
【００１３】
レクチンの親和精製、化学修飾法による糖タンパク質の捕捉及びタンデム質量分析技術の発展に伴い、最近の５年間に、唾液糖タンパク質プロテオームの研究が急速に発展され、腫瘍に関する唾液糖タンパク質の選別と同定が促進された。２００６年には、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎなどはヒドラジド化学法を利用して唾液から４５個のＮ−糖タンパク質を同定し、２年後に当該研究チームは、さらに唾液、耳下腺、顎下腺と舌下腺のＮ−糖タンパク質をそれぞれ同定することによって、同定されたＮ−糖タンパク質の数を７７個に高めた。最新の研究によると、ヘキサペプチドライブラリーに基づくダイナミックレンジ圧縮技術、ヒドラジド化学及びタンデム質量分析法を利用して、唾液から合計１９３個のＮ−糖タンパク質が同定されたことが示された。現在、唾液から年齢と性別に関する代表的な糖タンパク質を探すことも新しい研究焦点になっている。例えば、唾液における免疫グロブリンＡ、糖タンパク質３４０とムコタンパク質５Ｂなどの存在量は年齢の増加とともに増加するが、ムコタンパク質７の存在量は年齢の増加とともに減少する。そのうち、ムコタンパク質５Ｂにおける糖鎖プロファイルは血液型の相違により少し違う。
【００１４】
レクチンチップ技術：サンプルにおける糖タンパク質糖鎖の構造と接続方式の変化を高スループットで検出することができる。
【００１５】
レクチンは、異なる糖鎖構造を特異的に識別できるとともに、多価の形で糖鎖と高親和性結合を形成することができる特性によって、グライコミクスの研究に広く用いられている。レクチンチップは、チップに固定されたレクチンプローブによりサンプルにおける糖タンパク質糖鎖と特異的に結合することで、サンプルにおける糖タンパク質糖鎖の構造と接続方式の変化を高スループットで検出できるので、糖タンパク質糖鎖の構造変化を研究する最も有効な解析ツールの１つであり、疾患を診断・監視する新しい方法の開発に寄与する。
【００１６】
中国特許出願第２０１１１００２１４４７．３号には、本願発明者らは事前にチップ用マイクロアレイヤーを用いてエポキシ誘導化されたスライドガラスにレクチンをスポット作製し、固定化処理を経って、被覆率の高いレクチンチップを調製した。レクチンチップ技術により臨床サンプルにおける糖タンパク質糖鎖とレクチンに対して特異的な結合の研究を行い、様々なサンプルにおける糖タンパク質糖鎖プロファイル及びそれを識別するレクチンを解析した。また、遺伝子チップによるデータ解析方法を参考し、糖タンパク質糖鎖の発現プロファイルに対してデータの統計と解析を行い、臨床サンプルと正常対照グループにおける糖タンパク質糖鎖の異なる構造を確定した。まず、本願発明者らは標準的な糖タンパク質ＲＮａｓｅ  ＢとＦｅｔｕｉｎを用い、糖タンパク質糖鎖の検出におけるレクチンチップの実行可能性と信頼性を検証したとともに、レクチンチップによりＣｈａｎｇ’ｓ  ｌｉｖｅｒ正常肝細胞の総タンパク質における糖タンパク質に対して初期解析を行ったところ、糖タンパク質には多価ＳｉａやＧｌｃＮＡｃ、末端α−１，３ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃとＧａｌβｌ−４ＧｌｃＮＡｃ糖鎖構造があることが見出された。そして、被覆率の高いレクチンチップを利用して転写成長因子が活性化された肝星状細胞（ＬＸ−２）における糖タンパク質糖鎖プロファイルの変化を研究したところ、活性化状態の細胞の細胞膜には、ＡＡＬ、ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン−Ｅ）とＥＣＡにより識別されたＦｕｃ、Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌ糖鎖構造の発現は明らかに強くなることが見出された。チップ技術を利用し、ＣＣ１４により誘導されたマウスの肝線維化モデルにおける糖の遺伝子発現と肝細胞表面の糖鎖プロファイルとの間の関連性を研究したところ、線維化した肝臓には１０個の糖基転移酵素遺伝子の転写レベルに変化が発生されたことが見出された。肝線維化が発生される過程において、Ｏ−Ｇｌｙｃａｎの合成ルート「Ｔｎ  ａｎｔｉｇｅｎ→Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｃｏｒｅ−１）→ｓｉａｌｙｌ−Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ」はアクティブになることが初めて開示された。グライコミクスの点から、肝線維化が形成される過程においてタンパク質のグリコシル化に変化を発生させる分子機構が開示された。
【００１７】
上述のように、本発明は「Ｂ型肝炎−Ｂ型肝炎後肝硬変−肝臓癌」という進展の３つの段階から、確立されたグライコミクス技術と方法で、Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎後肝硬変及び肝臓癌患者の唾液における共有の糖タンパク質糖鎖と特有の糖タンパク質糖鎖を探し、肝炎、肝硬変と肝臓癌を非侵襲的に識別することに新しい方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を非侵襲的に且つ迅速に識別でき、肝炎、肝硬変と肝臓癌を非侵襲的に識別することに新しい方法を提供する、唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ及びその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の技術的な解決方案は以下の通りである。
テスト用レクチンプローブ群と対照プローブを含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせを少なくとも含むことを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせを含む。唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせを含む。
上記レクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するキット。
唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
テスト用レクチンプローブ群と対照プローブを含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＩ、ＩＩ及びＩＩＩ群を含み、上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ群がそれぞれＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせ、ＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせとＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせであることを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
上記レクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するキット。
唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の有益な効果は、唾液における糖タンパク質及び糖鎖の変化を高スループットで、非侵襲的に且つ迅速に識別でき、肝炎、肝硬変と肝臓癌を非侵襲的に識別することに新しい方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】レクチンチップにおけるレクチンプローブのレイアウト図である；
【図２】健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液における糖タンパク質糖鎖の蛍光検出結果である。
【図３】唾液チップの検証結果である。Ａは唾液チップのレイアウト図であり、Ｎ１−Ｎ７は健康者の唾液であり、ＨＢ１−ＨＢ６はＢ型肝炎患者の唾液であり、ＨＣ１−ＨＣ７は肝硬変患者の唾液であり、ＨＣＣ１−ＨＣＣ７は肝臓癌患者の唾液である。ＢはレクチンＬＴＬと唾液チップとの結合による蛍光検出の結果図である。ＣはＬＴＬと健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者及び肝臓癌患者の唾液との結合強度の比較である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．実験部分
１．１  試薬と材料
グリシン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０とプロテアーゼ阻害剤はいずれも米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はドイツのＭｅｒｃｋ社から購入される。Ｃｙ３蛍光はいずれも米国のＡｍｅｒｈｓｍａ社から購入される。Ｔ−ＰＥＲ（動物組織からのタンパク質抽出試薬）は米国のＰＩＥＲＣＥ社から購入される。他の化学試薬はいずれも分析用純度であり、使用前にさらに精製されなかった。全ての実験用水はＭｉｌｌｉ−Ｑ５０純水システム（米国のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により処理された超純水である。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５脱塩カラムは米国のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入される。チップハイブリダイゼーションキットは米国のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入される。ＰＶＤＦ膜は米国のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入される。他の一般的なガラス製品はいずれも中国製である。３７種類のレクチン（具体的な名称は表１を参照）はそれぞれＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社とドイツのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入される。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
１．２  実験機器
電気送風乾燥ボックス：Ｔａｉｓｉｔｅ社（天津）；オートクレーブ：ＴＯＭＹ社（日本）；高速冷却遠心機５８０４Ｒ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社（ドイツ）；微量核酸・タンパク質測定装置：Ｉｍｐｌｅｎ社（ドイツ）；バイオチップスキャナー４０００Ｂ：Ａｘｏｎ社（米国）；チップ用マイクロアレイヤー：博奥晶芯製のＳｍａｒｔＡｒｒａｙｅｒ４８マイクロアレイヤー；チップハイブリダイゼーションボックスＨＬ−２０００：ＵＶＰ社（米国）。
【００２５】
１．３  研究対象と全唾液の採取
志願者は他の疾患がなく、一週間以内にいずれかの薬を服用していない。確診されたＢ型肝炎患者は３６名であり、Ｂ型肝炎後肝硬変患者は２７名であり、Ｂ型肝炎による肝臓癌患者は２７名である。肝疾患患者の平均年齢は５７〜６５歳であるため、２０名の健康志願者の平均年齢は６２歳となる。唾液における糖タンパク質糖鎖が血液型の影響を受けないことを確保するために、各グループにはＡ型、Ｂ型、ＡＢ型とＯ型の血液型の割合は個々一致している。食事後の２時間以内に、およそ九時から十時までの間に、生理食塩水で３回口をすすいだ後に、自然に分泌した全唾液を迅速に採取する。少なくとも１ｍｌの唾液を採取したらすぐ氷に置い、タンパク質分解を防ぐためにプロテアーゼ阻害剤を入れる（１ｍｌの唾液あたり１μｌを入れる）。
【００２６】
【表２】
2017502307.tif 000004
【００２７】
１．４  唾液タンパク質の処理と蛍光標識
採取された全唾液を１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心処理した後に、上澄みを掬って不溶の沈殿物を除去する。０．２２μｍのポアサイズを有する濾過膜によって上澄みにおける細菌と他の微生物をろ過する。個体差を減らして個々のサンプルを正規化させるために、グループによって、サンプルごとにそれぞれ１００μｌ採取して混合し、ＢＣＡ法でタンパク質定量を行う。混合されたサンプルはＣｙ３蛍光色素で標識された後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５脱塩カラムによりフリー蛍光が除去される。標識されたタンパク質はレクチンチップの培養用に備える。個々のサンプルは唾液チップのスポット作製用である。
【００２８】
１．５  レクチンチップとデータ解析
レクチンチップの調製、Ｃｙ３蛍光標識の試料タンパク質とレクチンチップの培養工程、及びレクチンチップのデータの取得と正規化解析は上記の中国特許出願第２０１１１００２１４４７．３号における開示と同様である。
【００２９】
１．６  唾液チップの調製とデータ解析
図３を参照し、唾液チップは個々の唾液サンプルのスポット作製によるもので、サンプルが健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者に基づいて４つのグループに分けられ、それぞれが７名、６名、７名と７名である。Ｃｙ３標識のレクチンは、これらの唾液サンプルにおけるレクチンにより特異的に識別された糖鎖構造の発現レベルを検出するために用いられる。唾液タンパク質はスポッティングバッファー（０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡが１×ＰＢＳに溶解し、ｐＨ７．４）で最終濃度がｌｍｇ／ｍＬになるように溶解し、チップ用マイクロアレイヤーによりエポキシ修飾されたスライドガラスにスポット作製される。唾液チップのレイアウト図を図３におけるＡ部分に示す。各サンプルエリアに３回繰り返し、各フィルムベースには３つの繰り返しエリアがある。スポット作成されたフィルムベースは湿度５０％において培養され、１晩を経ってから３７℃で３時間真空乾燥して固定され、固定されたチップが予備に４℃で密閉且つ遮光保存されることができる。チップはまず常温で、ブロッキングバッファーに１時間密閉され、１×ＰＢＳＴと１×ＰＢＳでそれぞれ２回（毎回５ｍｉｎ）洗浄された後に、遠心乾燥される。次いで、配合されたＣｙ３標識レクチンを含む培養バッファーを加え、チップハイブリダイゼーションボックスにて４ｒｐｍで３時間ゆっくり回転され、１×ＰＢＳＴと１×ＰＢＳでそれぞれ２回（毎回１０ｍｉｎ）洗浄された後に、遠心乾燥される。チップスキャナーによって光電子増倍管を７０％、レーザー強度を１００％に設定し、波長５３２ｎｍにおいてチップ画像をスキャンする。画像をＧｅｎｅｐｉｘ３．０ソフトウェアで解析することでオリジナルデータが取得される。オリジナルデータには、バックグラウンド値の標準偏差の２倍未満の値を除去し、各チップにおける各サンプルの９個の繰り返し点の有効値から平均値（Ａｓ）を求め、各グループの平均値をグループにおける各サンプルの平均値（ＡＳ）の平均値（ＡＧ）±標準偏差（ＳＤＧ）で示す。任意の２つのグループや複数のグループの間に、顕著な差を探すようにＳＰＳＳ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９ソフトウェアでｔ検定や一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）が行われ、図３におけるＢ部分とＣ部分を参照されたい。
【００３０】
２．結果部分
２．１  Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液における糖タンパク質糖鎖プロファイルの変化
レクチンチップを利用し、健康志願者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液をそれぞれ検出し、専門のソフトウェアによりチップのデータを取得し正規化処理をした後、まず３つの肝疾患患者グループの結果と健康者グループの結果を比較し、即ち健康者グループ（Ｈ）に比べて、Ｂ型肝炎患者グループ（ＨＢ）、肝硬変患者グループ（ＨＣ）と肝臓癌患者グループ（ＨＣＣ）において、各レクチンに応じる正規化後の蛍光強度（ＮＦＩ）はそれぞれＦｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ値を取得した。本願発明者らは、Ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ＞２とＦｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ＜０．５が健康者に対して肝疾患患者の唾液に高発現する糖鎖と低発現する糖鎖であることと考える。
【００３１】
結果によると、ＨＢ患者、ＨＣ患者とＨＣＣ患者の唾液における糖鎖の差次的発現はそれぞれ２３種類、２０種類と２４種類のレクチンにより識別されたことが見出された（表３と図２）。そのうち、ＪａｃａｌｉｎとＶＶＡにより識別されたＴ／Ｔｎ抗原、シアリルＴ／Ｔｎ抗原；ＰＴＬ−Ｉ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＳＪＡとＧＳＬ−Ｉなどより識別されたαＧａｌＮＡｃとαＧａｌ（特に末端）糖鎖構造；ＬＣＡ、Ｃｏｎ−ＡとＧＮＡにより識別された高マンノース、α−Ｄ−Ｍａｎ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎ構造；及びＧＳＬ−ＩＩとＤＳＡより識別されたβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡ、（ＧｌｃＮＡｃβ１−４）ｎなどは３種類の肝疾患患者の唾液に高発現される。また、ＡＡＬ、ＰＳＡとＵＥＡ−１により識別されたコアフコース、Ｆｕｃα−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ−ＭａｎとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）などの構造；ＭＡＬ−ＩＩにより識別されたＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）／Ｇｌｃ；ＷＧＡにより識別された多価シアル酸と（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ構造などは３種類の肝疾患患者の唾液に低発現される。
【００３２】
そのほか、ＳＮＡにより識別されたＳｉａ２−６Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃはＢ型肝炎にのみ高発現される；ＰＨＡ−Ｅにより識別されたバイセクト型ＧｌｃＮＡｃと２分岐型Ｎ−糖鎖、ＭＰＬにより識別されたＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃはＢ型肝炎にのみ低発現される。ＥＥＬにより識別されたＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌ、ＰＷＭにより識別された分岐型（ＬａｃＮＡｃ）ｎは肝臓癌にのみ高発現される；ＷＦＡにより識別された末端ＧａｌＮＡｃα／β１−３／６Ｇａｌ、ＬＴＬにより識別されたＦｕｃα１−３（Ｇａｌβ１−４）ＧｌｃＮＡｃは肝臓癌にのみ低発現される。
【００３３】
２．２  Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液における糖タンパク質糖鎖プロファイルの間の比較
Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液のレクチンチップの結果を比較することにより、ＰＮＡにより識別されたＴ抗原、ＭＰＬにより識別されたＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＮＰＡにより識別された高マンノースとＭａｎα１−６Ｍａｎの肝硬変患者の唾液における発現レベルはＢ型肝炎患者より明らかに高いが、ＤＳＡとＷＧＡにより識別された多価シアル酸、（ＧｌｃＮＡｃ）ｎと（ＧｌｃＮＡｃβ１−４）ｎの肝硬変患者の唾液における発現レベルはＢ型肝炎患者より明らかに低いことが見出された。ＰＨＡ−Ｅにより識別されたバイセクト型ＧｌｃＮＡｃと２分岐型Ｎ−糖鎖、ＬＥＬにより識別された（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ、ＷＧＡにより識別された多価シアル酸、（ＧｌｃＮＡｃ）ｎと（ＧｌｃＮＡｃβ１−４）ｎの肝臓癌患者の唾液における発現レベルは肝硬変患者より明らかに高いが、ＷＦＡにより識別された末端ＧａｌＮＡｃα／β１−３／６Ｇａｌ、ＰＮＡにより識別されたＴ抗原、ＮＰＡにより識別された高マンノースとＭａｎα１−６Ｍａｎ、ＰＳＡにより識別されたＦｕｃα−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ−Ｍａｎの肝臓癌患者の唾液における発現レベルは肝硬変患者より明らかに低い。
【００３４】
【表３】
2017502307.tif 000005
【００３５】
本発明のレクチンプローブの選別の結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
2017502307.tif 000006
【００３７】
２．３  レクチンチップの結果の検証
レクチンチップの結果をさらに検証するために、レクチンプローブと健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液サンプルにおける識別される糖鎖との結合を検証する。レクチンＬＴＬを例にして、Ｃｙ３蛍光標識のＬＴＬとスポット作製された唾液チップを培養し、チップスキャナーによるスキャン（図３Ｂを参照）とＧｅｎｅｐｉｘ３．０ソフトウェアによる解析を経って、上記１．６に記載された方法に基づいてオリジナルデータを徹底的に解析する。結果によると、ＬＴＬと７つの肝臓癌の唾液サンプルにおける識別される糖鎖との結合強度は、それがほかのサンプルとの結合より明らかに低いことが示され（図３Ｃを参照）、スチューデントのｔ検定によりＰ値が０．０５未満であることが見出された。ほかのレクチンプローブの検証方法はこの方法を参照し、その結果、いずれもレクチンチップの結果と一致していることが示された。これによって、これらのレクチンはプローブとして唾液における糖タンパク質糖鎖に対する検出により肝疾患を識別できることが判明された。
【図１】
2017502307.tif 000007
【図２】
2017502307.tif 000008
【図３】
2017502307.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月6日(2016.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト用レクチンプローブ群を含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群が二つの部分から構成され、一つの部分はＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせであり、もう一つの部分はＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせ又はＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせのいずれかであることを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項２】
テスト用レクチンプローブ群と対照プローブを含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＩ、ＩＩ及びＩＩＩ群から構成され、上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ群がそれぞれＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせ、ＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせとＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせであることを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
【請求項３】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項１に記載のレクチンチップの使用。
【請求項４】
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする請求項２に記載のレクチンチップの使用。
【請求項５】
請求項１に記載のレクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
【請求項６】
請求項２に記載のレクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
中国は慢性肝炎、特にＢ型肝炎の高発症地域であり、約１．２億人が長期的にＢ型肝炎ウイルスを持って、慢性肝炎患者数が約３０００万である。約３０万の慢性肝炎患者は最終に肝硬変患者と肝臓癌患者になる。研究によると、８０％〜９０％の肝臓癌患者は「 慢性肝炎−肝硬変−肝臓癌 」という過程を経ることが見出された。既にある研究は、肝炎から肝線維化／肝硬変になる過程中に、患者の血清における糖タンパク質糖鎖に変化が発生されることが開示された。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染後に、肝線維化患者の血清におけるＧａｌ化２分岐型Ｎ−糖鎖レベルが明らかに健康志願者より高いとともに、血清における２分岐型及び３分岐型Ｎ−糖鎖レベルが肝線維化の程度の悪化に伴って低下する。他の研究によると、肝線維化の進展に伴い、血清におけるバイセクト型コアα（１，６）Ｆｕｃ化２分岐型Ｎ−糖鎖レベルが高くなるが、３分岐型Ｎ−糖鎖レベルが低くなり、これによって、血清における特定のＮ−糖鎖のレベルの変化は線維化の進展を監視するために用いられることが判明された。KａｍなどはＭＡＬＤＩ−Ｔ０Ｆ質量分析法で、慢性ＨＢＶ感染と程度の異なる肝線維化患者の血清におけるＮ−結合糖鎖プロファイルの変化を定量的に解析したところ、１７個の糖鎖のマススペクトルピークが肝線維化／肝硬変検出の潜在的なバイオマーカーになることができ、また、１３４１．５、１８２９．７、１９３３．３と２１３０．３ｍ／ｚという４つの糖鎖のマススペクトルピークが肝線維化と肝硬変を識別・診断することができ、且つ正確率が８５％に達することが見出された。ＱｕなどはＤＮＡシーケンサーの蛍光体支援糖質電気泳動法（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を利用し、慢性ＨＢＶ患者の血清におけるＮ−糖鎖プロファイルの変化を評価したところ、糖鎖プロファイルにおけるピーク１、２、８及び１０がある程度に肝線維化の異なる段階を区別することができることが見出された。研究によると、血清におけるヒアルロン酸（ＨＡ）の濃度変化と肝線維化の異なる段階との間に相関性を持つことも見出された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の技術的な解決方案は以下の通りである。
テスト用レクチンプローブ群を含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせを少なくとも含むことを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせを含む。唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
上記テスト用レクチンプローブ群が、さらにＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせを含む。
上記レクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
テスト用レクチンプローブ群と対照プローブを含むレクチンチップであって、上記テスト用レクチンプローブ群がＩ、ＩＩ及びＩＩＩ群を含み、上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ群がそれぞれＪａｃａｌｉｎ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＴＬ−Ｉ、ＳＪＡ、ＧＳＬ−Ｉ、ＬＣＡ、Ｃｏｎ−Ａ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＤＳＡ、ＶＶＡ、ＧＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ＋Ｌ、ＭＡＬ−ＩＩ、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ及びＵＥＡ−Ｉレクチンプローブの組み合わせ、ＷＦＡ、ＬＴＬ、ＬＥＬ、ＥＥＬ及びＰＷＭレクチンプローブの組み合わせとＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＭＰＬ、ＤＢＡ、ＮＰＡ、ＢＳ−Ｉ及びＳＮＡレクチンプローブの組み合わせであることを特徴とする唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ。
上記レクチンチップを利用し、作製され、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するキット。
唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を検出するために用いられることを特徴とする上記レクチンチップの使用。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の有益な効果は、唾液における糖タンパク質糖鎖の変化を高スループットで、非侵襲的に且つ迅速に識別でき、肝炎、肝硬変と肝臓癌を非侵襲的に識別することに新しい方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】レクチンチップにおけるレクチンプローブのレイアウト図である。
【図２】健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者と肝臓癌患者の唾液における糖タンパク質糖鎖の蛍光検出結果である。
【図３】唾液チップの検証結果である。Ａは唾液チップのレイアウト図であり、Ｎ−１〜Ｎ−７は健康者の唾液であり、ＨＢ−１〜ＨＢ−６はＢ型肝炎患者の唾液であり、ＨＣ−１〜ＨＣ−７は肝硬変患者の唾液であり、ＨＣＣ−１〜ＨＣＣ−７は肝臓癌患者の唾液である。ＢはレクチンＬＴＬと唾液チップとの結合による蛍光検出の結果図である。ＣはＬＴＬと健康者、Ｂ型肝炎患者、肝硬変患者及び肝臓癌患者の唾液との結合強度の比較である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【表１】
2017502307.tif 000010
【国際調査報告】
2017502307.tif 000011
2017502307.tif 000012
2017502307.tif 000013
2017502307.tif 000014