(57)【要約】本発明は、生体分子-薬剤-抱合体を合成する固相方法に関する。とくに、本発明は抗体-薬剤-抱合体（ＡＤＣｓ：antibody-drug-conjugates）を合成する固相方法に関する。本発明は、さらに、固定化され、かつ化学修飾された生体分子、例えば、抗体を産生する仲介方法にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子-薬剤-抱合体を合成する方法であって、
a)  随意的に、生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i)  ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ、又は
ii)  ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c)  随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を産生するステップと、
d)  随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子；ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子；又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した固定化した生体分子を、緩衝剤で洗浄して、余分な若しくは未反応の化学修飾剤、酵素修飾剤、又は余分な若しくは未反応の活性剤を除去する洗浄ステップと、
e)  随意的に、ステップ(c) 及びステップ(d) を繰り返すステップと、
f)  随意的に、薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分を産生するステップと、
g)
i)  ステップ(f) を実施するとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した生体分子を、前記ステップ(f) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップ、又は
ii)  ステップ(f) を実施しないとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び／若しくは活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップと、
h)  随意的に、ステップ(g) の前記固定化した生体分子-薬剤-抱合体を、緩衝剤で洗浄し、余分な又は未反応の試薬を除去して、精製した固定化した生体分子-薬剤-抱合体を産生するステップと、
i)  前記精製した生体分子-薬剤-抱合体を、前記捕捉樹脂から剥離させるステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ステップ(a) を省略する、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記ステップ(a) を実施する、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記ステップ(a) は前記生体分子を還元するステップを含む、方法。
【請求項５】
請求項３記載の方法において、前記ステップ(a) は前記生体分子を、架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）である、方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(b) は前記捕捉樹脂とインキュベーションするステップを含み、随意的に、前記インキュベーションは、約５℃〜約５０℃の範囲における温度で実施する、及び／又は、随意的に、前記インキュベーションは、約１０分〜約１８時間の範囲における期間にわたるものである、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(c) を省略する、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(c) を実施する、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記ステップ(c) は前記生体分子を還元するステップを含む、方法。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、前記ステップ(c) は前記生体分子を架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）である、方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(d) を省略する、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(d) を実施し、随意的に、前記洗浄ステップは、緩衝剤で洗い流すステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(f) を省略する、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(f) を実施する、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した薬剤成分を産生する前記ステップは、前記薬剤成分を、架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）である、方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(g) は、(1) 前記薬剤成分の化学修飾、酵素修飾、又は活性化の実施、並びに(2) 前記固定化した生体分子、又は化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した、固定化した生体分子に対する接触、を同時に行うステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(g) は、ｐＨが約５〜約８で前記成分を接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(h) を省略する、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２０のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(h) を実施し、随意的に、前記洗浄ステップは緩衝剤で洗い流すステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(i) は、 a) 支持体-生体分子合成物を剥離剤に曝すステップ；及び／又は b) ｐHを変化させて前記支持体-生体分子合成物を破壊するステップを含む、方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のうちいずれか一項記載の方法において、前記捕捉樹脂は、ファブゾーベント（Fabsorbent（登録商標））F1PHF樹脂又はマブゾーベント （Mabsorbent(登録商標)）Ａ１Ｐ又はＡ２Ｐ樹脂である、方法。
【請求項２５】
化学的に若しくは酵素で修飾した、又は活性化した、固定化した生体分子を合成する方法であって、
a)   随意的に生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)  
i)  ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ又は
ii)  ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c)  ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、若しくは活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を産生するステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子-薬剤-抱合体を合成する固相方法に関する。とくに、本発明は抗体-薬剤-抱合体（ＡＤＣｓ：antibody-drug-conjugates）を合成する固相方法に関する。本発明は、さらに、固定化され、化学修飾された生体分子、例えば抗体、を産生する中間段階の方法にも関する。
【０００２】
上述の方法に加えて、本発明は、本発明方法における、捕捉樹脂、生体分子-薬剤-抱合体、中間生成物、及び組成物の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗毒素及び抗体-薬剤-抱合体（ＡＤＣｓ）はタンパク質薬剤であって、標的特異性結合ドメイン（領域）を、細胞毒性として分類し得る十分な潜在的毒性を有する薬剤（薬物）分子に結合する、タンパク質薬剤である。抗体は、高い抗原親和性とともに高い特異性を兼備し、所望投与部位に向けて細胞毒性薬剤を輸送することができる標的系を創生するというこの目的のための理想的な生体分子である。これら薬剤の創製は、腫瘍学における特別な罹患率が見られる疾患に対する潜在的な治癒効果がある。
【０００４】
抗体-薬剤-抱合体（ＡＤＣ）における主な基準は、毒素「弾頭(‘warhead’)」（薬剤）が極めて低レベル（picoM）の活量を有することである。さらに、有利な点は、サイクルにおける時点に無関係に腫瘍細胞に対して効力をもつことにある。この目的のため、ＤＮＡ活性薬剤は、修復不能でない限りＤＮＡ損傷がサイクルにおける時点に無関係にアポトーシスに駆り立てるときの毒素候補として有益であることが分かっている。
【０００５】
原理上は、ＡＤＣにおける適正な細胞毒性又は細胞増殖抑制性の薬剤ペイロードは、Ｌ０１ ＡＴＣ分子（‘Anatomical Therapeutic Chemical Classification System’であって、Ｌ０１は、ＷＨＯの薬物統計学的方法論共同研究センターが規定した、抗新生物薬剤及び免疫抑制薬剤を定義するサブグループである）として定義された任意の部分であり得る。代替的に、ＡＤＣｓ用に適正なペイロードとして分類し得る他の部分は、単に、内在化した後の細胞に毒性を有する任意なものとして定義することができる。後者のカテゴリーに入る多くの部分は、有効である十分な効能に欠けている。したがって、「超効能」物質を同定及び開発する業界動向がある。本明細書作成時点において、臨床試験において３３より多くのＡＤＣｓが存在し、初期臨床評価においては２５０より多いＡＤＣｓも存在する。
【０００６】
抗毒素の論理的根拠、設計及び有効性及びＡＤＣリサーチに対する専門家の報告は、非特許文献１〜３に見ることができる。
【０００７】
多数の溶液相方法を用いて、生体分子-薬剤-抱合体（共役体）、例えば抗体-薬剤-抱合体（ＡＤＣｓ）を製造できる。しかし、溶液相方法自体は、多量の廃棄物を生ずる点でムダが多く、また合成中における生体分子-薬剤-抱合体の凝集の観点では問題がある。
【０００８】
生体分子-薬剤-抱合体を製造する溶液相方法の第１ステップは、概して、生体分子の化学修飾又は活性化のステップを含む。例えば、生体分子が抗体である場合、抗体は、抗体を還元する又は部分的に還元することによって、「化学修飾」又は「活性化」することができる。抗体の部分的還元に適したプロセスは非特許文献４に記載されている。ＴＣＥＰのような還元剤が一般的に還元プロセスに採用される。
【０００９】
抗体の化学修飾又は活性化、例えば還元後に、次のステップとして、いかなる過剰な活性剤／化学修飾剤、例えば、いかなる過剰還元剤をも除去することが行われる。このステップは極めて時間がかかり、これはすなわち、サンプル（試料）を分離カラムに多数回も通すことをしばしば必要とするからである。このことは、生体分子の安定性が問題になる場合、劣化の観点からも問題である。代替的に、透析濾過ステップを適用できるが、このことは処理中に物質損失を招くおそれがある。
【００１０】
上述の精製ステップ後に、化学修飾した／活性化した、例えば、還元した抗体は、薬剤部分と抱合（共役）させる。このステップの大きな問題は、生体分子-薬剤-抱合体における凝集の確率が高い点である。このことは、疎水性が高い薬剤ペイロードをプロセスに使用するとき、とくに問題である。
【００１１】
凝集は、生体分子-薬剤-抱合体を使用不可にするおそれがあるため、大きな問題である。最良ケースのシナリオにおいて、生体分子-薬剤-抱合体の凝集体で汚染された生体分子-薬剤-抱合体は、さらに凝集体を除去する精製をしなければならず、このことは時間がかかりかつ時間の浪費することの双方となる。薬剤は凝集した生体分子-薬剤-抱合体の一部を形成するため、精製中に大きな薬剤割合を損失することになる。生体分子-薬剤-抱合体のバッチ全体が生体分子-薬剤-抱合体の凝集体により完全に使用できなくなるような高い度合いまで汚染された最悪のケースでは、生体分子-薬剤-抱合体のバッチ全体を廃棄しなければならない生体分子-薬剤-抱合体の精製ステップは、それをカラムに多数回通す必要がしばしばあるので、極めて時間がかかるものとなり得る。
【００１２】
腫瘍学者は、モノクローナル抗体が存在している限り腫瘍部位に細胞毒性薬剤を送給するため、標的特異性モノクローナル抗体を利用することに、ほぼ３０年にわたり取り組んできた。現在に至るまで、３つの毒素クラス、すなわち、カリケアマイシン、マイタンシン及びオーリスタチンがこの分野を支配してきた。これら細胞毒性薬剤クラスは、すべて事実上一般的に疎水性である。抗体と抱合するとき、それらの存在は、抗体の全体的疎水性を大幅に増加し、場合によっては抱合体間の疎水性相互作用が抱合体の凝集を招く程度まで増加する（非特許文献５参照）。この問題の大きさの順番は、カリケアマイシン＞マイタンシン＞オーリスタチンであり、これは、マイロターグ及びＣＭＣ-５４４双方に対するプロセスがクロマトグラフ凝集体除去ステップを含むという知見に基づく。マイタンシンプロセスの約５０％は凝集体除去ステップを含み、オーリスタチンプロセスは極めて少数の凝集体除去ステップを含む。
【００１３】
より最近では、デュオカルマイシン（www.syntarga.com）、ピロレベンゾジアゼペン（ＰＢＤ：pyrollebenzodiasepene）二量体（www.spirogen.com参照）、及びα-アマニチン（www.heidelberg-pharma.com参照）に基づく細胞毒性毒素ペイロードは抗体に抱合されており、また予備臨床評価を受けている。これら新しい毒素クラスは、先行の細胞毒性薬剤クラスよりも一層疎水性であり、また抗体と抱合するとき確率論的に一層凝集を受け易い（非特許文献６参照）。
【００１４】
凝集は、物理的不安定性が原因であり、またＡＤＣのような抗体抱合生成物の安定性制限パラメータとなり得る。凝集体量は生成物内で最小限度に維持すべきであり、これはすなわち、生成物材料が患者に対して重要な効能及び毒性効果を有するからである（非特許文献７参照）。
【００１５】
親水性リンカーを組み込むことによる薬剤の疎水性調節に多大な努力が、集中されてきた（非特許文献８参照）。凝集体形成を制御できない場合、開発者は、治療学に基づくタンパク質から凝集体を除去するための周知の技術に頼ってきた。これら技術には、イオン交換、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイトを含む異なる一連のクロマトグラフ分離（特許文献１参照）及び当業者にはよく知られている他の分離方法（非特許文献９参照）がある。最近では、接線流濾過精製が有益であることが分かってきた（特許文献２参照）。このようなクロマトグラフ精製技術に取り組むことは、適切な生成物品質を達成する成果をもたらすが、困難なことであり、またプロセス収率を犠牲にすることがよくある。製造上の背景において、抗体及び抗体ベースの治療学と連携するとき、曖昧で偶発的な副反応、又は凝集体形成での望ましくない生理化学的相互作用による材料の物理的損失は、極めて多大な経済的打撃となる。
【００１６】
マニング氏ら（非特許文献１０参照）は、凝集体を以下のように、すなわち、(i) 急速可逆性の非共有結合小オリゴマー（二量体、三量体、四量体等）、(ii) 不可逆的非共有結合オリゴマー、(iii) 共有結合オリゴマー（例えば、ジスルフィド結合した）、(iv) 非共有結合である場合に可逆性であり得る大きな凝集体（＞１０量体）、(v) 非共有結合である場合に可逆性であり得る極大凝集体（５０ｎｍ〜３０００ｎｍの直径）、(vi) おそらく不可逆性であろう可視的な粒子（「スノー（snow）」）、と定義している。凝集は、非共有結合相互作用から又は共有結合した種から生じ得る。モノマー（単量体）抗体の抱合体における生物学的活性を対応の凝集体における生物学的活性と比較すると、これら高い分子量の種は抱合体の効能を著しく損なうおそれがある。このようなケースでは、生成物の有効性は低下し得る（非特許文献１１参照）。
【００１７】
凝集体形成は、生体分子又は抗体抱合体におけるモノマー（単量体）純度に直接的かつ否定的な効果を持つ。凝集は、生体分子及び抗体抱合体を使用不能にするおそれがあるため、大きな問題である。最悪のケースでは、抱合体が完全に使用不能かつマルチパス精製に不適合となり、したがって、廃棄しなければならないような高い程度にまで、抱合体のバッチ全体が凝集体で汚染される。
【００１８】
抗体-薬剤-抱合体における凝集の度合いは、抗体に組み込まれる疎水性薬剤毒素の程度に直接的に比例する。抗体が細胞毒性ペイロードで誘導体化される確率論的抱合（共役）にとって、結果として生ずる抱合体は、多様な薬剤抗体比（ＤＡＲ：Drug Antibody Ratio）の種を有する。４であるＤＡＲを標的にするとき、ＤＡＲ種の多様性はガウス分布を示し、一般的に０〜８である。凝集し易い抱合体に対しては、一般的にこれらより高いＤＡＲ種が凝集体内に存在する。製造にあたり、この現象は、全体的な抱合体におけるＤＡＲを低下させる作用を有し、プロセスを標的ＤＡＲ仕様から外れるように作用する。したがって、凝集は、抗体抱合体のための標的ＤＡＲを達成する上で否定的影響を有する。
【００１９】
ＡＤＣ世界会議の参加者は、ＡＤＣ開発にとって何がＣＭＣにおける最大のハードルであると見ているかを探し出す調査を受けた。参加者の半分以上（５２％）は望ましくない凝集を大きな問題と見なしていた。参加者の４０％は、さらにＤＡＲ制御に対する気遣いを強調し、その２０％が抱合体生成物質から余分な未結合薬剤を除去することへの関心をかき立てられていた（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第０３／０５７１６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０８６７３３号パンフレット
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】J. Adair et al, Expert Opin. Biol. Ther., 2012, 12(9): P1191-206
【非特許文献２】G. Casi et al, Journal of Controlled Release, 2012, 161, 2, P422-428
【非特許文献３】F. Dosio et al, Toxins, 2011, 3, P848-883 and S. Panowski et al mAbs 2014, 6:1, 34-45
【非特許文献４】“Bioconjugate Techniques”, page 96/97, Greg T. Hermanson, Academic Press; 2nd edition, 2008, ISBN-13:  978-0123705013
【非特許文献５】Y. Adem et al, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 656?664
【非特許文献６】S. Jeffrey et al, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1256?1263
【非特許文献７】M. Manning et al, Pharm. Res; 2010, 27, 544?75
【非特許文献８】Zhao et al, J. Med. Chem., 2011, 54, 10, 3606-3623
【非特許文献９】A. Wakankar et al MAbs, 2011 Mar-Apr; 3, 2, 161
【非特許文献１０】Pharm. Res., 2010, 27, 4, 544
【非特許文献１１】(M. Vazquez-Rey et al, Biotechnology and Bioengineering, 2011, Vol. 108, 7, 1495
【非特許文献１２】Antibody-Drug Conjugates Industry Outlook 2014 “Insight and analysis of the major trends, challenges and opportunities within the ADC field” Hanson Wade, page 10
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
ＡＤＣの均質性に対するＦＤＡの要望が増大しており、開発者は抱合イベントの精密な場所を証明するよう促されている。これらの要望に対処するため、現行の従来型抗体抱合技術は部位特異性抱合技術を実施しており、この場合、抱合イベントは、改変システイン残基（ThioMab, ジェネンテック社製）、非天然アミノ酸（Azido, シンアフィクス(SynAfix)社製）で、又は抗体における特定場所における改変マーカーによる酵素手段（SMARTag, レッドウッド・バイオサイエンス(Redwood Bioscience)社製）を介してのみ生ずる。部位特異性抱合は、薬剤抗体比（ＤＡＲ）制御によるより高い均質性ＡＤＣの結果として生じた。ＤＡＲを改善することは、抱合体安定性、生体内忍容性、薬物動態（ＰＫ：pharmacokinetic）特性及び有効性に肯定的な効果をもたらす。
【００２３】
一般的に、部位特異性抱合技術は、低ＤＡＲ、代表的にはＤＡＲ２を標的にする。有効性を実現し、また治療濃度域を達成するためには、抗体あたりの抱合イベントの数は限定されているので、細胞毒性ペイロードは優れた効能を示すものでなければならない。一般的に、このような優れた効能がある細胞毒性ペイロードは、天然では高い疎水性を示し、したがって、凝集作用を受け易い。これら部位特異性抱合の利点にも係わらず、凝集の問題は依然として優勢である。
【００２４】
凝集傾向があるすべての抗体抱合技術に対して、抱合プロセスは、比較的低い濃度で、一般的には１ｇ／Ｌ程度で着手される。希釈溶液相方法の使用は、凝集作用を回避しようと試みる直接的な手法である。しかし、このような濃度でさえも、凝集作用は依然として観測され、またプロセスバッチ全体の精製を必要とする生成物品質に有害であり得る。製造のための希釈溶液及び精製のための追加プロセス媒剤の使用は、細胞毒性の廃棄物として処分しなければならない多量のムダな溶剤を累積する。したがって、廃棄物のこのような累積を回避する製造プロセスは、環境的により好ましく、かつ効率的である。
【００２５】
したがって、生体分子-薬剤-抱合体を製造する従来型の溶液相プロセスは、多くの困難さに見舞われており、生体分子-薬剤-抱合体を製造する改良したプロセスを得るのが望ましい。
【００２６】
本発明は、従来型の溶液相方法における上述した問題のうち１つ又はそれ以上に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
生体分子-薬剤-抱合体の合成方法
本発明によれば、生体分子-薬剤-抱合体を合成する方法を提供し、この本発明方法は、
a)   随意的に、生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i)  ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ、又は
ii)  ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c)  随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を産生するステップと、
d)  随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子；ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子；又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した固定化した生体分子を、緩衝剤で洗浄して、余分な若しくは未反応の化学修飾剤、酵素修飾剤、又は余分な若しくは未反応の活性剤を除去する洗浄ステップと、
e)  随意的に、ステップ(c) 及びステップ(d) を繰り返すステップと、
f)  随意的に、薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分を産生するステップと、
g)
i)  ステップ(f) を実施するとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した生体分子を、前記ステップ(f) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップ、又は
ii)  ステップ(f) を実施しないとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び／若しくは活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップと、
h)  随意的に、ステップ(g) の前記固定化した生体分子-薬剤-抱合体を、緩衝剤で洗浄し、余分な又は未反応の試薬を除去して、精製した固定化した生体分子-薬剤-抱合体を産生するステップと、
i)  前記精製した生体分子-薬剤-抱合体を、前記捕捉樹脂から剥離させるステップと、
を備え、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である。
【００２８】
本発明における上述した方法の重要な特徴は、プロセスに採用する捕捉樹脂が一貫性及び再現性を持って生体分子を固定化できる点である。生体分子の捕捉樹脂に対する一貫した固定化は、上述の方法により産生される結果としての生体分子-薬剤-抱合体における変動が減少することになる。例えば、薬剤成分が固定化した生体分子に付着するポイントの変動が減少し、これにより、薬剤成分と固定化した生体分子との間の付着ポイントの一貫性が高まることになる。部位特異性のこのような向上は、結果として生ずる生体分子-薬剤-抱合体生成物の一貫性を高める点で望ましい。
【００２９】
上述の方法の望ましい特徴は、生体分子の固定化が分子内相互作用ひいては凝集を減少する点である。抗体のような三次構造を有する複雑な生体分子にとって、捕捉樹脂への固定化は、生体分子の捕捉樹脂に対する多重付着ポイントによりアンフォールディングを少なくする。したがって、樹脂と生体分子との間の付着ポイントの数は、固定化ステップにより得られる安定性の向上に相関する。
【００３０】
生体分子捕捉部分として、そのままのプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬを採用するのに反して、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬの模倣剤を採用することにより、普通のプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬをベースとする系に対する模倣剤の向上した部位特異性に起因して、生体分子の固定化の一貫性が比較的向上する。生体分子のタンパク質に対する固定化の部位特異性が低いケースでは、そのままのプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬを生体分子捕捉樹脂として採用することは、本来的に捕捉樹脂に対する生体分子の固定化を変動させる結果となる。例えば、そのままのプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬは、タンパク質の他の部位による非特異性結合を示し、このことは全体的相互作用を複雑にし得る。上述したように、本発明で予想される生体分子の捕捉樹脂に対する一貫性のある固定化は、上述の方法で産生される結果としての生体分子-薬剤-抱合体における変動を減少することとなり得る。このことは有利である。本発明の樹脂系の他の利点は、普通のプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬをベースとする系の場合よりも、より広範囲の薬剤が樹脂と抱合し得る点にある。例えば、疎水性分子の場合、そのままのプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬをベースとする系で生じ得る他の非特異性結合が、このような薬剤の効果的な抱合を分裂させる又は阻害することがあり得る。
【００３１】
実施形態において、捕捉樹脂は非タンパク質捕捉樹脂である。実施形態において、捕捉樹脂の生体分子捕捉部分は、約１０００Ｄａ以下、随意的に約５００Ｄａ以下、約３００Ｄａ以下、又は約２００Ｄａ以下の分子量を有する。実施形態において、捕捉樹脂は非タンパク質捕捉樹脂であり、また捕捉樹脂の生体分子捕捉部分は約１０００Ｄａ以下の分子量を有する。さらに他の実施形態において、捕捉樹脂は非ペプチドをベースとする捕捉樹脂であり、また捕捉樹脂の生体分子捕捉部分は約１０００Ｄａ以下の分子量を有する。
【００３２】
生体分子捕捉部分としてそのままのプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬを採用するのに反して、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬの模倣剤を採用することの他の利点は、模倣剤生体分子捕捉部分が広範囲にわたる共通抗体抱合体化学物質と相溶性（適合性）があり、産業レベルまで拡大できる点である。このことは、プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬをベースとする生体分子捕捉部分、及びペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬ捕捉部分とは対照的である。
【００３３】
例えば、固定化した抗体におけるリシル側鎖官能基を標的にすると望ましいことがよくある。現在臨床開発されている２８個の抗体-薬剤-抱合体のうちほぼ半数（以下の表でクレーで網掛けしてある）は、リジン標的抱合化学物質を採用している。プロテインＡ、Ｇ又はＬの表面における固定化リガンドのタンパク質の性質は、結果として、タンパク質捕捉樹脂におけるリシル側鎖官能基を意図的でなく標的にする。プロテインＡ（swiss-prot P02976参照）は５９個のリジン残基を有し、プロテインＧ（swiss-prot P919909参照）は５９個のリジン残基を有し、プロテインＬ（swiss-prot Q51918参照）は１３２個のリジン残基を有する。
【表１】
2017537975.tif 000003
【００３４】
上述したように、リガンドと抗体リシル残基との間における競合に加えて、プロテインＡ、Ｇ及びＬをベースとする捕捉樹脂に関する他の問題もある。これら問題としては、タンパク質の浸出及び浸出した付加物の免疫原性がある。このことは、これら親和性支持体を製造プロセスの終了時付近で（精製又は抱合のために）採用できないことを意味する。プロテインＡ、Ｇ及びＬをベースとする捕捉樹脂を採用するこのようなプロセスから仕上げられるいかなる抱合体物質も、抗体精製及び生成物品質に関する現行の規制ガイドラインを満たさない。
【００３５】
生体分子-薬剤-抱合体を合成するプロセス
本発明によれば、生体分子-薬剤-抱合体を合成するプロセスを提供する。本発明のプロセスは、以下の表に示す。以下の表の開示は、特許請求の範囲及び本発明の内容を制限するものではなく、本発明を使用するプロセスを説明するための可視的表示として供するものである。
【表２】
2017537975.tif 000004
【００３６】
化学的に修飾若しくは酵素で修飾した又は活性化した、固定した化生体分子を合成する方法
本発明によれば、化学的に若しくは酵素で修飾した、又は活性化した、固定化した生体分子を合成する方法を提供し、前記方法は、
a)   随意的に生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)  
i)  ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ又は
ii)  ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c)  ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、若しくは活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を産生するステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。
【００３７】
タンパク質及びより厳密には抗体との抱合は、しばしば研究、診断法及び治療学に使用される。生体抱合体技術の第２版（グレッグ・Ｔ・ハーマンソン著）では、標識付け又は抱合分子を産生する化学的性質、試薬系及び実際的用途についての高度に詳細な情報を提供している。さらに、数百もある市販試薬における細目との数十の反応、及びペプチドとタンパク質、糖類と多糖類、核酸とオリゴヌクレオチド、脂質、及び合成ポリマー、の修飾又は架橋結合を行うためのこれら試薬の使用について記載している。抗体に適用される重要な抱合（共役）の概要を以下に提示する。
【００３８】
天然鎖間ジスルフィドの還元後の遊離チオールとの抱合は、市販ＡＤＣであるADCetris（登録商標）に採用される抗体抱合及び化学的性質に対する共通の手法である。プロセスは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、メルカプトエチルアミンのような還元剤、又は当業界でよく知られている他の適当な還元剤に抗体を接触させるステップを備え、これに続いて薬剤、リガンド、標識との化学式Ｄ−Ｘで表される抱合ステップが行われ、ここでＤは、薬剤、リガンド又は標識であり、またＸは、マレイミド、ハロアルカン、ピリジルジスルフィド、エン、ビニルスルホン、bis-スルホン、アクリル酸塩、及び従来既知の他のチオール反応性化学物質から選択した反応基である。
【００３９】
抗体とのチオール抱合に対する代替的手法は、抗体の特定部位における反応性システイン残基を（遺伝子的に）操作して、薬剤、リガンド又は標識が、鎖間ジスルフィド結合を分裂させることなく、規定の化学量論で抱合できるようにすることである。操作したシステインは、システイン又はグルタチオンの混合ジスルフィドとして存在することがよくある。付加物は、完全な還元後に透析濾過によって除去する。このことは鎖間ジスルフィドを破壊し、この鎖間ジスルフィドは、空気、ＣｕＳＯ４又はデヒドロアスコルビン酸を用いた酸化によって再形成しなければならない。
【００４０】
抱合の他の共通部位は、リジン残基の側鎖に存在するアミノ基である。最も簡単な手法は、抗体を、化学式Ｄ−Ｙで表される、薬剤、リガンド、標識又はリンカーに対する接触させることである。Ｄは上述したのと同一であり、またＹは、イソシアン酸塩、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、エポキシド、及び当業者には既知の他の試薬から選択される反応基である。
【００４１】
リジンに対する間接的抱合もよく採用される。リジン側鎖のアミノ基は、相補的反応性化学物質を含む、薬剤、リガンド又は標識と抱合する前に、ヘテロ二官能基型リンカーで先ず活性化させる。このようなカプレットの例としては、新たなチオールの産生に続く上述したチオール反応性薬剤リンカー（Ｄ−Ｘ）のうちの任意なものを用いた抱合をする、2-イミノチオランを用いたリジンの修飾を含む。他のカプレットは、リジン結合マレイミドの産生に続くリガンド又は標識のない遊離チオールを含む約剤との抱合をする、ヘテロ二官能基型架橋剤ＳＭＣＣによるリジンの修飾である。間接的リジン抱合に有用な潜在的カプレットの完全な報告に関しては、ハーマンソン社及びピアース／テルモ・サイエンティフィック社の架橋剤カタログを参照されたい。
【００４２】
２０個のタンパク新生アミノ酸側鎖に対して、化学的に直交する側鎖を有する非天然アミノ酸をタンパク質に取り込む方法を、幾つかのグループが開発した。
【００４３】
レッドウッド・バイオサイエンス社（www.redwoodbioscience.com参照）は、同社がアルデヒド・タギング（Aldehyde Tagging）と称している技術を開発した。この技術において、ホルミルグリシン酵素（ＦＧＥ）と称され、通常高度に保存された１３個のアミノ酸配列内のＣｙｓ残基をＩ型スルファターゼにおいてホルミルグリシン（アルデヒド）に変換する天然酵素を活用する（Wu et al, PNAS, 2009, 106, 9, 3001参照）。このような修飾した抗体に抱合された薬剤、リガンド又は標識は、オキシアミン又はヒドラジンのようなアルデヒド反応性化学物質を含んでいなければならない。アルデヒド反応官能性に関する完全な開示は、ハーマンソン及びパーバイオ（Hermanson and Perbio）社のカタログに見ることができる。
【００４４】
アムブリクス（Ambryx）社は、同社がEuCodeと称する技術を開発した（Liu et al, Anu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413参照）。EuCodeは、細胞を操作して非天然アミノ酸を異種タンパク質内に取り込むプラットフォームであり、この取込みは、発現系内に３つの非天然成分を包接させることによって行うものであり、３つの非天然成分とは、
1.  媒剤に追加される非天然アミノ酸
2.  直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）
3.  直交性ｔＲＮＡ
である。
【００４５】
直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡの対は、アンバー終結コドンによる読み取りを促進し、また非天然アミノ酸をその位置に取り込むよう操作／選択しておく。この手法を用いて、７０個もの多くのｎｎＡＡがタンパク質内に取り込まれてきた。以下の図は、直交性アミノ酸側鎖及び反応性化学物質のあり得る組合せを詳細に示すものである（Ambryx presentation at Hanson Wade ADC summit meeting in Feb 2012参照）。
【００４６】
ストロ（Sutro）社は、オープン無細胞合成（ＯＣＦＳ）技術を用いる抗体及びサイトカインの産生を記載している。ＯＣＦＳの特徴は、非天然アミノ酸をタンパク質内に荷電ｔＲＮＡｓとともに取り込む能力であり、これら荷電ｔＲＮＡは、特定コドンに向けて導かれ、非天然アミノ酸をタンパク質における特定場所に送給することができ、これによりタンパク質が特定修飾を受け易くなる、又は新たな所望特性を付与し易くなる（Goerke et al, Biotechnol. Bioeng., 2008, 99: 351-367参照）。
【００４７】
固定化した抗体抱合は、１つの条件付きで、すべての非天然アミノ酸側鎖及び相補的反応性化学物質と相溶性がある。抗体捕捉リガンドは、非天然アミノ酸側鎖の一部として取り込まれた新規化学物質を含むものであってはならない。
【化１】
2017537975.tif 000005
【００４８】
糖タンパク質内における多糖類残基の過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化は、薬剤、リガンド又は標識のような分子を含むアミン又はヒドラジドに対するその後の抱合のために、反応性アルデヒド基を産生する穏やかで効率的な方法を提供する。プロセスは、先ず抗体を過ヨウ素酸ナトリウムに接触させるステップと、及び次にアミン、ヒドラジド、アミノオキシ又は従来既知の他のアルデヒド反応性化学物質から選択される反応基と抱合させるステップとを有する。この抱合ステップは、代表的には酸性条件の下で行って、オキシム及びヒドラゾン結合を形成する。関連する手法において、ヒドラジノ・イソ・ピクテ・スペングラー（ＨＩＰＳ）連結反応（ライゲーション）も、反応性アルデヒド基を置換したヒドラジンと抱合させて、安定したアザカルボリン（azacarboline）抱合体を形成する。
【００４９】
ステップ(a)
【００５０】
実施形態において、前記ステップ(a) を実施する。
【００５１】
代替的実施形態において、前記ステップ(a) を省略する。
【００５２】
実施形態において、生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した生体分子を産生するステップは、生体分子を還元するステップを含む。実施形態において、生体分子の還元は完全還元を行う。実施形態において、生体分子の還元は部分還元を行う。実施形態において、生体分子の還元は、完全還元に続いて再酸化を行う
【００５３】
実施形態において、生体分子は、還元剤、例えば、tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン、又は他の適当な還元剤に生体分子を接触させることによって還元する。好適には、還元剤はtris(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）とする。
【００５４】
実施形態において、還元した生体分子は、空気、ＣｕＳＯ４又はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）のような酸化剤に生体分子を接触させることによって再酸化する。好適には、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）とする。
【００５５】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。
【００５６】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、ｐＨが約５〜約１０、好適には約７〜約８、好適には約７.４で行う。
【００５７】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００５８】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を還元剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００５９】
実施形態において、生体分子を化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した生体分子を産生するステップは、生体分子を架橋剤部分と反応させるステップを含む。例えば、架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）、例えば両側端部にＮＨＳエステル及びマレイミド反応基を有する架橋剤とすることができる。生体分子を効果的に修飾又は活性化するこの方法により、結果として生体分子-リンカー-薬剤-抱合体を生ずる。適当な架橋剤によれば、概して薬剤群における第１級アミン基と反応し（反応性ＮＨＳエステル端部を介して）、また生体分子におけるシステイン残基と反応する（反応性マレイミド端部を介して）こともできる。この特別な実施例において、マレイミド端部は固定化済み生体分子におけるシステインと反応する。このような架橋剤の例は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である。
【００６０】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。代案として、架橋剤との反応プロセスは、リン酸ナトリウム緩衝剤、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「修飾緩衝液」（Modification Buffer）内で行う。
【００６１】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ｐＨが約７〜約９、好適には約７〜約８、好適には約８.０で行う。
【００６２】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００６３】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を架橋剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００６４】
実施形態において、生体分子を化学修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した生体分子を産生するステップは、生体分子をトラウト試薬と反応させるステップを含む。
【００６５】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。
【００６６】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、ｐＨが約７〜約９、好適には約７〜約８、好適には約８.０で行う。
【００６７】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００６８】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を還元剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００６９】
実施形態において、活性化した生体分子は、いかなる修飾／活性剤をも除去するよう洗浄する。実施形態において、洗浄は、緩衝剤ですすぎ洗いするステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とする。他の適当な緩衝剤としては、リン酸カリウム緩衝剤、リン酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、ビス−トリス  プロパン緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、カコジル酸緩衝剤、酢酸アンモニウム緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ビシン緩衝剤、及び2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤がある。例えば、生体分子は、ｐＨが約７〜約８、好適には約７.４でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液で洗浄することができる。随意的に、活性化した生体分子のすすぎ洗いは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。活性化した生体分子をすすぎ洗いする他の例としては、樹脂をＰＢＳのような緩衝剤ですすぎ洗いし、これに続いてクエン酸ナトリウム、ＮａＣｌ及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「抱合緩衝剤」（Conjugation Buffer）によってすすぎ洗いする。
【００７０】
ステップ(b)
ステップ(a) を実施するとき、ステップ(b) は、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させることを含む。
【００７１】
ステップ(a) を省略するとき、ステップ(b) は、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させることを含む。
【００７２】
実施形態において、生体分子を捕捉樹脂に接触させる接触ステップは、生体分子を前記捕捉樹脂とともにインキュベーションするステップを含む。
【００７３】
インキュベーションは、約０℃〜約１００℃の範囲における温度、好適には、約５℃〜約５０℃の範囲における温度、随意的に約１０℃〜約４０℃の範囲における温度、で実施することができる。理想的には、インキュベーションは約１５℃〜約３７℃の範囲における温度で行い、例えば、インキュベーションは、約２１℃のような室温で行う。代案として、インキュベーションは約３７℃の温度で行う。
【００７４】
インキュベーションは、約１分〜約３日間の期間にわたり、例えば約１０分〜約１８時間の期間にわたり行うことができる。好適には、インキュベーションは、約２０分〜約１時間の期間にわたり行うことができる。
【００７５】
実施形態において、インキュベーションは、水性媒剤内で行う。他の実施形態において、インキュベーションは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液、又は所望の結合ｐＨ及び化学物質と相溶性のある任意な緩衝塩の下で行い、随意的に、インキュベーションは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。実施形態において、インキュベーションは、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ又はＤＭＦのような溶媒を含む共溶媒を使用して行う。この共溶媒は、０.５〜８０体積％の範囲内、例えば０.５〜５０体積％範囲内で存在し得る。
【００７６】
実施形態において、インキュベーションは、ｐＨが約５〜約１０の範囲、好適にはｐＨが約５〜約８の範囲、より好適にはｐＨが約６〜約８の範囲で行う。好適な実施形態において、インキュベーションはｐＨが約６〜約７.５の範囲、理想的にはｐＨが約６.５で行う。他の好適な実施形態において、インキュベーションはｐＨが約７〜約８の範囲、理想的にはｐＨが約７.４で行う。この結果として、誘導体化支持体に対する抗体の改善した結合を生ずる。
【００７７】
実施形態において、固定化済みの生体分子（すなわち、捕捉樹脂に固定化された生体分子）を洗浄して、捕捉樹脂に固定化されなかったいかなる生体分子をも除去する。固定化済みの生体分子の洗浄は、新鮮な溶剤ですすぎ洗いすることによって影響を受けることができる。例えば、固定化済みの生体分子の洗浄は、ＰＢＳのような緩衝溶液ですすぎ洗いすることによって影響を受けることができる。随意的に、固定化済みの生体分子のすすぎ洗いは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。代案として、固定化済みの生体分子の洗浄は、リン酸ナトリウム緩衝剤、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「修飾緩衝液」ですすぎ洗いすることによって影響を受けることができる。
【００７８】
ステップ(c)
実施形態において、ステップ(c) を実施する。
【００７９】
代替的実施形態において、ステップ(c) を省略する。
【００８０】
このステップ(c) は、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を産生することを含む。
【００８１】
実施形態において、固定化した生体分子を、化学修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した固定化した生体分子を産生するステップは、生体分子を還元するステップを含む。実施形態において、生体分子の還元は完全な還元を含む。実施形態において、生体分子の還元は部分的還元を含む。実施形態において、生体分子の還元は完全還元、及びこれに続く再酸化を含む。
【００８２】
実施形態において、生体分子は、tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン、又は他の適当な還元剤に生体分子を接触させることによって還元する。好適には、還元剤はtris(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）とする。
【００８３】
実施形態において、還元した生体分子、空気、ＣｕＳＯ４又はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）のような酸化剤に生体分子を接触させることによって再酸化する。好適には、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）とする。
【００８４】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。
【００８５】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、ｐＨが約５〜約１０、好適には約７〜約８、好適には約７.４で行う。
【００８６】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００８７】
実施形態において、生体分子を還元するプロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、及びさらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を還元剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００８８】
実施形態において、固定化した生体分子を化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した固定化済み生体分子を産生するステップは、生体分子を架橋剤部分と反応させるステップを含む。例えば、架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）、例えば両側端部にＮＨＳエステル及びマレイミド反応基を有する架橋剤とすることができる。生体分子を効果的に修飾又は活性化するこの方法により、結果として生体分子-リンカー-薬剤-抱合体を生ずる。適当な架橋剤によれば、概して薬剤における第１級アミン基と反応し（反応性ＮＨＳエステル端部を介して）、また生体分子におけるシステイン残基と反応する（反応性マレイミド端部を介して）こともできる。この特別な例において、マレイミド端部は固定化済み生体分子におけるシステインと反応する。このような架橋剤の例は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である。
【００８９】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。代案として、架橋剤との反応プロセスは、リン酸ナトリウム緩衝剤、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「修飾緩衝液」内で行う。
【００９０】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ｐＨが約７〜約９、好適には約７〜約８、好適には約８.０で行う。
【００９１】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００９２】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を架橋剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００９３】
実施形態において、固定化済み生体分子を化学修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した固定化済み生体分子を産生するステップは、生体分子をトラウト試薬と反応させるステップを含む。
【００９４】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。
【００９５】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、ｐＨが約７〜約９、好適には約７〜約８、好適には約８.０で行う。
【００９６】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【００９７】
実施形態において、トラウト試薬との反応プロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、生体分子を還元剤によりインキュベーションするステップを含む。
【００９８】
ステップ(d)
実施形態において、ステップ(d)を実施する。
【００９９】
代替的実施形態において、ステップ(d)を省略する。
【０１００】
実施形態において、
ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子；ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子；又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した固定化した生体分子を洗浄して、いかなる修飾剤／活性剤をも除去する。
【０１０１】
実施形態において、洗浄ステップは緩衝剤ですすぎ洗いするステップを含み、随意的に、この緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とする。他の適当な緩衝剤としては、リン酸カリウム緩衝剤、リン酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、ビス−トリス  プロパン緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、カコジル酸緩衝剤、酢酸アンモニウム緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ビシン緩衝剤、及び2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤がある。例えば、固定化済み生体分子は、ｐＨが約７〜約８、好適には約７.４でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液で洗浄することができる。随意的に、活性化した固定化済み生体分子のすすぎ洗いは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。活性化した固定化済み生体分子をすすぎ洗いする他の例としては、樹脂をＰＢＳのような緩衝剤ですすぎ洗いし、これに続いてクエン酸ナトリウム、ＮａＣｌ及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「抱合緩衝剤」（Conjugation Buffer）によってすすぎ洗いする。
【０１０２】
ステップ(e)
実施形態において、ステップ(c) を、１回、２回又は３回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を１回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を２回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を３回繰り返す。
【０１０３】
実施形態において、ステップ(d) を、１回、２回又は３回繰り返す。実施形態において、ステップ(d) を１回繰り返す。実施形態において、ステップ(d) を２回繰り返す。実施形態において、ステップ(d) を３回繰り返す。
【０１０４】
ステップ(f)
実施形態において、ステップ(f) を実施する。
【０１０５】
代替的実施形態において、ステップ(f) を省略する。
【０１０６】
ステップ(f) は、薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾及び／又は活性化した薬剤成分を産生するステップを含む。
【０１０７】
実施形態において、前記薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した薬剤成分を産生するステップは、薬剤成分を架橋剤部分と反応させるステップを含む。例えば、架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤（amine-to-sulfhydryl crosslinker）、例えば両側端部にＮＨＳエステル及びマレイミド反応基を有する架橋剤とすることができる。薬剤成分を効果的に修飾又は活性化するこの方法により、結果として生体分子-リンカー-薬剤-抱合体を生ずる。適当な架橋剤によれば、概して生体分子、例えば、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子におけるシステイン残基と反応し（反応性マレイミド端部を介して）、また薬剤成分におけるアミン部分と反応する（反応性ＮＨＳエステル端部を介して）こともできる。この特別な例において、マレイミド端部は固定化済み生体分子におけるシステインと反応する。このような架橋剤の例はサクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）である。
【０１０８】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液内で行う。代案として、架橋剤との反応プロセスは、リン酸ナトリウム緩衝剤、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「修飾緩衝液」内で行う。
【０１０９】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ｐＨが約７〜約９、好適には約７〜約８、好適には約８.０で行う。
【０１１０】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【０１１１】
実施形態において、架橋剤との反応プロセスは、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、薬剤成分を架橋剤によりインキュベーションするステップを含む。
【０１１２】
ステップ(g)
ステップ(g)は、前記固定化した生体分子、又は前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を、前記ステップ(f) （ステップ(f)を実施するとき）の前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分に接触させて、又は前記固定化した生体分子、又は前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び／又は活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成することを含む。
【０１１３】
実施形態において、前記固定化した生体分子、又は前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した生体分子を、前記ステップ(f) （ステップ(f)を実施するとき）の前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分に接触させるステップは、(1) 前記薬剤成分の化学修飾、酵素修飾又は活性化の実施、及び(2) 前記固定化済み生体分子、又は化学修飾、酵素修飾及び／又は活性化した固定化済み生体分子に接触させることを、同時に行うステップを含む。換言すれば、生体分子は、その場で生ずる化学修飾、酵素修飾又は活性化した薬剤成分に接触する。この実施形態において、ステップ(f) 及び(g) は別個のステップではなく、単独の複合したステップである。
【０１１４】
実施形態において、前記固定化済みの生体分子、あるいは前記化学修飾、酵素修飾、及び／又は活性化した、固定化済みの生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップは、前記化学修飾、酵素修飾、及び／若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、ステップ(c) につき上述した緩衝溶液内で薬剤成分に接触させるステップを含む。
【０１１５】
実施形態において、前記固定化済みの生体分子、又は前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップは、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、ｐＨが約５〜約８、好適には約７〜約８、より好適には約７.４の薬剤成分に接触させるステップを含む。
【０１１６】
実施形態において、前記固定化済みの生体分子、又は前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【０１１７】
実施形態において、前記固定化済みの生体分子、又は前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップは、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した固定化済みの生体分子を、約２０分〜約３日間、随意的に約１時間〜約２日間、さらに随意的に約６時間〜約１８時間の期間にわたり、薬剤成分によりインキュベーションするステップを含む。
【０１１８】
ステップ(h)
実施形態において、ステップ(h) を実施する。
【０１１９】
代替的実施形態において、ステップ(h) を省略する。
【０１２０】
実施形態において、前記生体分子-薬剤-抱合体を前記捕捉樹脂から剥離させるステップの前に、前記固定化済み生体分子-薬剤-抱合体を洗浄する。洗浄は、いかなる未反応薬剤成分をも除去する。実施形態において、洗浄は、緩衝剤ですすぎ洗いするステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び他の溶剤とする。他の適当な緩衝剤としては、リン酸カリウム緩衝剤、リン酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、ビス−トリス  プロパン緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、カコジル酸緩衝剤、酢酸アンモニウム緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ビシン緩衝剤、及び2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤がある。例えば、固定化済み生体分子-薬剤-抱合体は、ｐＨが約５〜約７であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）のような緩衝溶液で洗浄することができる。随意的に、固定化済み生体分子-薬剤-抱合体のすすぎ洗いは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。
【０１２１】
実施形態において、前記固定化済み抱合体は、捕捉樹脂から精製した抱合体を剥離させるステップの前に緩衝剤で洗浄し、随意的に、前記緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は製剤に適した他の緩衝剤とする。洗浄は、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ又はＤＭＦのような有機溶剤のいかなる残留又は過剰分をも除去する。
【０１２２】
ステップ(i)
実施形態において、前記生体分子-薬剤-抱合体を前記捕捉樹脂から剥離させるステップは、
a)  支持体-生体分子化合物を剥離剤に曝すステップ、及び／又は
b)  ｐＨを変化させて支持体-生体分子結合を破壊するステップ
を含む。
【０１２３】
実施形態において、剥離剤は、水素結合分裂剤、例えばヘキサフルオロイソプロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の共溶媒とする。
【０１２４】
実施形態において、剥離剤は、支持体-生体分子でインキュベーションする。
【０１２５】
インキュベーションは、約０℃〜約１００℃の範囲における温度、好適には、約５℃〜約５０℃の範囲における温度、随意的に約１０℃〜約４０℃の範囲における温度、で実施することができる。理想的には、インキュベーションは約１５℃〜約３７℃の範囲における温度で行い、例えば、インキュベーションは、約２１℃のような室温で行う。代案として、インキュベーションは約３７℃の温度で行う。
【０１２６】
インキュベーションは、約１分〜約３日間の期間にわたり行うことができる。好適には、インキュベーションは、約３０分〜約２時間の期間にわたり行うことができる。
【０１２７】
インキュベーションは、水性媒剤内で行うことができる。他の実施形態において、インキュベーションは、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ、又はＭｅＣＮのような溶剤内で行うことができる。代案として、溶剤が８０体積％にも達するまでの、好適には０.５体積％〜５０体積％、及び最も好適には０.５体積％〜１０体積％の、水-溶剤混合物内で行うことができる。若干のケースでは、水を含んで上述の溶剤のうち１つ以上の混合物が適切であり得る。必要な場合、安定剤も含ませて抱合体が未変化状態を確実に維持できるようにする。
【０１２８】
実施形態において、前記生体分子-薬剤-抱合体を前記捕捉樹脂から剥離させるステップは、ｐＨを変化させるステップを含む。ｐＨは、支持体-生体分子結合を破壊するが、分子の活量、完全性又３Ｄ構造には影響しない任意な量だけ変化させることができる。
【０１２９】
例えば、ｐＨは、酸性であるように調整することができる。実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ２〜ｐＨ６の間で減少する。随意的に、ｐＨは約ｐＨ５未満に調整する。例えば、約ｐＨ３〜約５、例えば、約ｐＨ４未満に調整する。実施形態において、ｐＨは約ｐＨ３まで減少させる。
【０１３０】
代案として、ｐＨは塩基性であるように調整することができる。実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ８〜約ｐＨ１０の間で増加する。随意的に、ｐＨは、ｐＨ８より高いものに調整する。例えば、ｐＨは約ｐＨ９まで増加することができる。ｐＨは、ｐＨ９よりも高い値に増加することができる。ｐＨは、約ｐＨ１０まで増加することができる。ｐＨは、ｐＨ１０よりも高い値に増加することができるが、通常ｐＨ１４未満となるようにする。
【０１３１】
生体分子-薬剤-抱合体は、剥離剤による処理を１回以上受けることができる。有利には、新鮮な剥離剤により２回又はそれ以降の処理を用いることにより、捕捉樹脂から剥離した生体分子-薬剤-抱合体の量を増大する結果を生ずる。新鮮な剥離剤は、それまでに固定化済み生体分子-薬剤-抱合体でインキュベーションされていなかった剥離剤である。
【０１３２】
実施形態において、前記生体分子-薬剤-抱合体を前記捕捉樹脂から剥離させるステップは、生体分子-薬剤-抱合体を塩に接触させるステップを含む。例えば、生体分子-薬剤-抱合体をＮａＣｌに接触させることができる。塩の濃度は、約０.１〜約１０Ｍの範囲、好適には、約０.１〜約１Ｍにわたるものとすることができる。
【０１３３】
実施形態において、溶離した生体分子-薬剤-抱合体は、抱合体を捕捉樹脂から剥離するステップ後に中和する。例えば、抱合体は、１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕捉することができる。
【０１３４】
洗浄ステップ
実施形態において、本発明の中間生成物を洗浄するステップは、捕捉樹脂に結合されていない物質、例えば汚染物を除去するステップを含む。代表的な汚染物としては、固定化済み生体分子を活性化するのに使用された過剰試薬、捕捉樹脂に固定化されなかった生体分子、及び活性化した固定化済み生体分子と反応しなかった薬剤成分、又は余分に残留した溶剤若しくは共溶媒がある。生体分子の活量、完全性若しくは３Ｄ構造、又は固定化済み生体分子と捕捉樹脂との間における結合の完全性に影響を与えない任意の媒剤を、中間生成物の洗浄に使用することができる。
【０１３５】
好適には、緩衝剤は、等張性のあるものとし、また生理学的ｐＨ及びイオン強度を模倣することによって、抗体のような生体分子に安定的な環境を誘導するものとする。実施形態において、活性化した固定化済み生体分子は、濾過によって線上する。随意的に、結果として生じた濾液は、例えば、薄膜カートリッジを使用する遠心分離によって、緩衝液交換する。
【０１３６】
代表的には、添加剤を緩衝剤媒体に導入する。これら添加剤は、緩衝剤系及びこれに含まれる生体分子を制御するレベルに誘導する。トリス又はヒスチジンのような添加剤を緩衝プロセス流内に導入し、ｐＨを維持しかつ不慮の酸性化を最小限にする。代表的には、生体分子プロセス流のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ９.５の間に維持し、長い期間にわたるｐＨ限界範囲の極限を回避すべきである。０.１ＭのＮａＣｌのような無機塩類を添加して、プロセス流のイオン強度を維持することができる。ツイーン（ポリソルベート）のようなイオン系及び非イオン系の界面活性剤を緩衝剤に添加して、有利にも溶解性が乏しい生体分子の緩衝剤媒体における溶解性を高め、また凝集を最小限にすることができる。
【０１３７】
捕捉樹脂及び活性剤を含む混合物
本発明によれば、
(i)  抗体、修飾抗体、又は抗体断片の捕捉部分であって、非ペプチドベースのプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤からなるグループから選択した捕捉部分を含む捕捉樹脂と、及び
(ii)  化学修飾剤若しくは活性剤と
を備える混合物を提供する。
【０１３８】
実施形態において、捕捉樹脂は、捕捉樹脂の表面上に、固定化抗体、修飾抗体、又は抗体断片を有する。
【０１３９】
生体分子-薬剤-抱合体の合成における捕捉樹脂の使用
本発明によれば、抗体、修飾抗体、又は抗体断片の捕捉部分であって、非ペプチドベースのプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはプロテインＬの模倣剤からなるグループから選択した、該捕捉部分を含む捕捉樹脂を、生体分子-薬剤-抱合体の合成に使用する方法を提供する。
【０１４０】
捕捉樹脂
長年にわたって、研究者は、従来型プロテインＡ、Ｇ又はＬに親和性を有する精製支持体に対する代替物として、多様な完全長抗体、断片又は融合体に対して親和性を有するリガンドを開発しようと試みてきた。上出来なリガンド発見／開発の主な基準としては、
1.  高い初期精製をもたらす抗体に対する高い選択性
2.  有用な動的結合能力
3.  抗体完全性の保持に適合する溶離条件
4.  多重溶離／清浄化サイクル中における支持体の安定性
5.  プロテインＡ、Ｇ又はＬの支持体よりも低いコスト
であった。
【０１４１】
これらリガンドを固相抗体抱合に用いる状況において、上述の基準１は、抱合プロセスを精製した抗体で開始するときには、重要ではない。しかし、リガンドは、残り４つの基準を完全に満たすものでなければならない。加えて、リガンドは、理想的には、抱合のための安定した親和性結合強度をもたらすよう、規定された抗体との相互作用部位を有していなければならない。この属性は、抗体が支持体に結合し、また緩衝剤補充中に時間とともに不慮に溶離しないようにする点で必要である。さらに、相互作用の規定部位は、結合した抗体の錯体における周囲の溶液相に対して一貫性のある立体配座供覧を推測し、一貫性及び再現性のある抱合化学物質を得るための手段を提供する効果を有することが望ましい。抗体は、親和性精製に活用される多数の明確に規定された結合ドメイン（領域）を有する、明確に特徴付けされた生体分子である。
【０１４２】
第１規定領域はプロテインＡ及びプロテインＧの結合ポケットであって、この結合ポケットは、プロテインＡ／Ｇ及びプロテインＡ／Ｇ支持体の模倣剤を用いる親和性クロマトグラフィに活用される。プロテインＡは、アミノ酸残基、すなわち、Thr 250、Leu 251、Met 252、IIe 253、His 310、Gln 311、Leu 314、Asn 315、Lsn 338、Glu 345、Ala 431、Leu 432、His 433、Asn 434、及びHis 435との多数の非共有相互作用を介して、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ ＣＨ３の鎖間ドメインと相互作用する。プロテインＡ模倣剤支持体は、上述のように規定したアミノ酸のうち１つ以上を介してこのドメインと相互作用するよう合理的に設計されている。これら模倣剤支持体は、IgＧ結合及び抱合のための適正な親和性リガンドをもたらす。プロテインＡ模倣剤支持体は、サブクラスにおいて、非ペプチド、ペプチド又はアミノ酸をベースとしたリガンドを取り込むものとして定義することができる。同様に、プロテインＧは、アミノ酸残基、すなわち、Ile 253、Ser 254、Gln 311、Glu 380、Glu 382、His 433、Asn 434、及びHis 435との多数の非共有相互作用を介して、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ ＣＨ３の鎖間ドメインと相互作用する。プロテインＧ模倣剤支持体は、上述のように規定したアミノ酸のうち１つ以上を介してこのドメインと相互作用するよう合理的に設計されている。やはり、これら模倣剤支持体は、IgＧ結合及び抱合のための適正な親和性リガンドをもたらす。プロテインＧ模倣剤支持体は、サブクラスにおいて、非ペプチド、ペプチド又はアミノ酸をベースとしたリガンドを取り込むものとして定義することができる。実施形態において、捕捉樹脂は、生体分子におけるプロテインＡ又はプロテインＧの結合ポケットに結合することができる。プロテインＡ模倣剤の市販の実施形態は、Mabsorbent（登録商標）A1P、A2P及びA3P（プロメティック・バイオサイエンシズ(ProMetic Biosciences)社製）である。これら親和性支持体は、プロテインＡ模倣剤の基準を満たし、なぜならこれら非ペプチド支持体は、プロテインＡの疎水性コア構造におけるPhe-132、Tyr-133のジペプチド結合部位を模倣するからである。
【０１４３】
第２規定領域は、プロテインＬ親和性マトリクスが標的とする抗体軽鎖である。プロテインＬは特異的にΚ（カッパ）Ｉ、II及びIVの軽鎖と結合するが、Κ（カッパ）III又はγ（ガンマ）の軽鎖には結合しない。プロテインＬドメインの合計１１個の親水性アミノ酸残基、すなわち、Ala、Asp、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Tyrは、これら結合を形成するのに重要である。プロテインＬ模倣剤親和性支持体は、構造的に上述した１１個のアミノ酸に類似する化合物を用いて、トリアジン骨格組合せライブラリを作成することによって開発された（国際公開第２００４／０３５１９９号参照）。特許文献である国際公開第２００４／０３５１９９号には、プロテインＬ模倣剤は、抗体又は断片のためのプロテインＬ親和性及びＦａｂ断片の結合によって証明される軽鎖特異性の５０％を有するリガンドとして定義されている。この特許文献に記載された又は当業者に既知である任意の適当な骨格は、軽鎖の親和性及び特異性の特徴が保持される限り、トリアジン骨格に置換することができる。このような樹脂は、κＩ、II及びIVの軽鎖を含む抗体及び断片の固定化に有用である。プロテインＬ模倣剤の市販されている１つの実施形態はFabsorbent（登録商標） F1P Hp（プロメティック・バイオサイエシズ社製）である。この親和性支持体は、プロテインＬ模倣剤の基準を満たすだけでなく、抗体及び断片を含むγ軽鎖をも結合する。したがって、この親和性支持体は、抗体親和性結合及び抱合に汎用的に適用可能である。実施形態において、捕捉樹脂は、プロテインＬ親和性マトリクスが標的とする抗体軽鎖に結合することができる。
【０１４４】
第３規定領域は、広範囲の種にわたるすべての抗体アイソタイプのFabアームにおける保存ヌクレオチド・ドメインである。結合部位は４つのアミノ酸残基を有し、１つはTyr又はPheのいずれかであり、残りの３つはTyr、Tyr、及びTrpである。結合ポケット場所及びアミノ酸側鎖配向が結晶構造に保存されるとともに、抗体毎の全体的主鎖配列変異及び番号付けスキームには僅かな差異がある。このことを、以下の表で市販抗体であるハーセプチン（Herceptin）及びリツキシマブ（Rituximab）の保存ヌクレオチド結合部位を比較することによって示す。上述のアミノ酸のうち１つ以上を介してこのドメインと相互作用するよう合理的に設計されたヌクレオチド模倣剤（非ペプチド、ペプチド、ヌクレオチド類似体及びアミノ酸）は、IgＧ結合及び抱合のための適正な親和性リガンドに適している。
【表３】
2017537975.tif 000006
【０１４５】
実施形態において、捕捉樹脂は、抗体のＦａｂアームにおける保存ヌクレオチド・ドメインに結合することができる。
【０１４６】
第４規定領域は、無欠（インタクト）抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるAsn297に存在するグリカン構造である。親和性リガンドとして作用するm-アミノフェニルボロン酸は、糖タンパク質分子のサッカリド（単糖類）部分に存在するマンノース、ガラクトース又はグルコースのような糖類残基におけるシスジオール基に結合する。可逆的五員環錯体がこの相互作用により得られる。代表的な抗体グリカン構造を、以下に抗体グリカンにおけるマンノース及びガラクトースの存在を強調して示す（Adapted from Arnold et al, Advances in Experimental Medicine and Biology, 2005, 564, 27-43参照）。実施形態において、捕捉樹脂は、無欠抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるAsn297に存在するグリカン構造に結合することができる。
【表４】
2017537975.tif 000007
【０１４７】
リガンドは、親和性クロマトグラフィの分野でよく知られている様々な固体支持マトリクスに付着することができる。これら固体支持マトリクスとしては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール若しくはポリスチレンのような合成ポリマー、とくに架橋合成ポリマー、シリカをベースとする支持体のような無機支持体、及びとくにスターチ、セルロース及びアガロースのような多糖類支持体がある。
【０１４８】
抗体結合に適する特異的リガンド支持体を以下に示す。
【０１４９】
「非ペプチド」プロテインＡ、Ｇ及びＬの模倣剤親和性支持体
【０１５０】
合成化学ライブラリのスクリーニングと併用されるプロテインＡ、Ｇ又はＬの相互作用の分子モデリングは、これらタンパク質の小分子模倣剤における半合理的設計を可能にした（Li et al, Nature Biotechnology, 1998, 16, 190-195参照）。このような樹脂の例としては、市販の支持体であるmAbsorbent A1P及びFAbsorbent F1P HF（プロメティック・バイオサイエシズ社製）がある。
【０１５１】
mAbsorbent A1P、mAbsorbent A2PHF及びFAbsorbent F1P HFの支持体は、合成芳香族トリアジン骨格である（www.prometicbioscience.com参照）。
【０１５２】
米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号は、イミノ二酢酸塩（ＩＤＡ）型骨格に集合したプロテインＡ模倣剤リガンド錯体を開示している。ＩＤＡ骨格は、トリアジルリガンドで誘導体化し、多価トリアジルリガンド錯体をもたらす。
【０１５３】
国際公開第９８０８６０３号は、親和性樹脂を用いる細胞培養上澄み、血清、血漿又は初乳からの免疫グロブリン単離を記載している。これら親和性樹脂は、単環式若しくは二環式芳香族又は複素環式芳香族のリガンドを有し、免疫グロブリン精製を容易にする。
【０１５４】
抗体親和性樹脂として見込みがある他のリガンドは、スルファメタジンである。スルファメタジンと結合したデキストラン微粒子は特異的に抗体を結合する（Yi et al, Prep. Biochem. Biotechnol., 2012, 42, 6, 598-610参照）。
【０１５５】
上述した主要候補リガンドの選択において、多くのリガンドは抗体特異性欠如に基づいて除外された。本明細書において、特異性は、固相抗体抱合体樹脂に対する結合の効率、能力及び安定性よりも重要ではないことを開示し、またしたがって、これらのことを無視するものではない。
【０１５６】
「ペプチド」プロテインＡ、Ｇ又はＬの模倣剤親和性支持体
【０１５７】
多数のプロテインＡ模倣剤ペプチドが開示されている。メネガッティ氏は、抗体Ｆｃ領域に結合する配列HWRGWVを有するヘキサペプチドを同定した（Menegatti et al, Journal of Separation Science, 2012, 35, 22, 3139-3148参照）。ファッシーナ氏らは、四座リジンコアを有する無作為化された合成分子からなる合成多量体ペプチドライブラリの合成及びスクリーニングによりプロテインＡ模倣剤ペプチドTG191318を同定した（Fassina et al, J. Mol. Recognit., 1996, 9, 564参照）。欧州特許第１９９７８２６号は、X1-Arg-Thr-Tyrを有するペプチドを開示している。ルンド氏らは、抗体親和性クロマトグラフィに適した２つのペプチドリガンドを開示している（Lund et al, J Chromatogr. A, 2012, 1225, 158-167参照）。DAAG及びD２AAGは、Ｌ-アルギニン、Ｌ-グリシン及び合成芳香族酸の2, 6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンジル・アクリル酸塩（DBHBA）を含む。
【０１５８】
アミノ酸プロテインＡ、Ｇ又はＬの模倣剤親和性支持体
【０１５９】
上述の錯体微粒子リガンドの他に、簡単なアミノ酸が、同一方法で抗体に結合するプロテインＡ模倣剤として提案された（Naik et al, J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1756-1766参照）。この例は、ＡｂＳｅｐ、すなわち抗体のＦｃ領域におけるプロテインＡ結合部位に高い親和性を有するポリメタクリレート樹脂を含むトリプトファンである。アミノ酸のチロシン、ヒスチジン及びフェニルアラニンを含む樹脂も、抗体の固定化及び抱合に適している（Bueno et al, J. Chromatogr. B, Biomed. Appl., 1995; 667, 1, 57-67参照）。
【０１６０】
ヌクレオチド結合部位親和性支持体
【０１６１】
抗体精製リガンドを開発する他の戦略は、抗体のＦａｂ可変領域におけるよく知られていない保存ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）を利用した（Alves et al, Anal. Chem., 2012, 84, 7721-7728参照）。ヌクレオチド類似体であるインドール酪酸を東洋パールAF-650-アミノＭ樹脂に結合して、上述の基準１〜５を満たす支持体を調合した。抗体親和性クロマトグラフィに有用な極めて多様な他のヌクレオチド類似体は国際公開第２０１２／０９９９４９号に記載されている。
【０１６２】
炭水化物結合樹脂
【０１６３】
様々な支持体に固定化されるリガンドであるｍ-アミノフェニルボロン酸を用いて、糖タンパク質を精製した。このリガンドは、可逆的五員環錯体を形成する抗体を含む糖タンパク質分子のサッカリド（単糖類）部分内に存在するマンノース、ガラクトース又はグルコースのような糖類残基におけるシスジオール基に結合する。この錯体は、ｐＨを低下させることによって、又はトリス若しくはソルビトールを含む溶離緩衝剤を使用することによって、解離することができる。
【０１６４】
捕捉樹脂のリガンドは、リガンドと、生体分子、例えばタンパク質、抗体、修飾抗体又は抗体断片との間の特異性がある可逆的及び非共有結合の相互作用によって生体分子と相互作用することができる。非共有結合相互作用は、イオン、ファン・デル・ワールス、水素結合又は疎水性によるものとして分類することができる。これら相互作用は３次元的に機能して、捕捉樹脂におけるリガンドに対する標的生体分子の順応性及び立体配座を支援する。リガンドに密に接近するとき、生体分子は、リガンド-生体分子錯体を生ずるこれらの相互作用のうち１つ又は幾つか又はすべてを察知する。リガンドと生体分子との間の距離、並びにリガンドの極性及び電子陰性度がこれら相互作用の強度を決定する。さらに、これら相互作用の強度は親和力として定義することができる。リガンドと生体分子との間の高親和力は安定性が向上したリガンド-生体分子錯体を構成する（米国特許出願公開第２００９／０２４００３３号参照）。
【０１６５】
実施形態において、捕捉樹脂は、非ペプチドをベースとするプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬの模倣剤を有する。捕捉樹脂は抗体、修飾抗体又は抗体断片に結合することができる。
【０１６６】
非ペプチドベースのプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬの模倣剤を色素リガンドクロマトグラフィ内で使用したが、この色素リガンドクロマトグラフィは、タンパク質を精製するため、アガロースのような固体支持体に固定化される共有結合テキスタイル用色素（染料）を利用する親和性クロマトグラフィの様式である。これら色素は、タンパク質が親和性を有する天然物質／タンパク質リガンドと似ている。精製及び分離のこの様式は、疑似親和性クロマトグラフィと称されることがよくある。色素リガンドクロマトグラフィは非特異性ではあるが、この技術は種々のタンパク質に対して幅の広い結合範囲を有する点で有利である。精製技術における進歩は、タンパク質通常物質／リガンド用の競合的阻害剤として作用する修飾色素を採用した（P. Dean et al, J. Chromatography, 1979, 165, 3, 301-319参照）。Cibacron Blue 3GA、Procion Red H-3B、Procion Blue MX 3G、Procion Yellow H-A等のような、トリアジニルをベースとしたリガンドは、一般的に使用され、またブルーデキストランのような元々の市販色素の純度、漏れ及び毒性に対する心配に対処する（Lowe et al, Trends Biotechnology, 1992, 10, 442-448参照）。トリアジニル・リガンドは、アルブミン、オキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）、デカルボキシラーゼ（脱炭酸酵素）、糖分解酵素、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）、ヒドロラーゼ（加水分解酵素）、リアーゼ、シンテターゼ（合成酵素）、及びトランスフェラーゼ（転移酵素）の精製に成功裏に使用されてきた（N. Labrou, Methods Mol. Biol. 2002, 147, 129-139）。生体分子色素リガンド親和性クロマトグラフィの限界は、生体分子毎に親和性強度が相当変動し、また多くの場合、タンパク質の強い親和性強度をもたらすリガンドは、他のタンパク質に適用できないことがあり得る。したがって、徹底的及び経験的なスクリーニングプロセスに取り組み、関心対象生体分子のための所望親和性を有する適正な合成リガンドを同定する必要がよくある。
【０１６７】
したがって、生体分子に対する親和性結合をもたらす適正なリガンドの構造解明を支援するために、多価の骨格モチーフをリガンド構造に取り込んで構成体を得るようにしてきたが、この構成体に対してリガンドライブラリがリガンドの支持体からの厳格な空間的隔離との組合せで導入及びスクリーニングされる。
【０１６８】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第９８／０８６０３号の開示に記載された構造による構造を有する。国際公開第９８／０８６０３号記載の捕捉樹脂は、免疫グロブリン精製を容易にする合成単環式若しくは二環式芳香族又は複素環式芳香族のリガンドを有する。捕捉樹脂の構造に関連する国際公開第９８／０８６０３号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。国際公開第９８／０８６０３号は、親和性樹脂を用いる細胞培養上澄み、血清、血漿又は初乳からの免疫グロブリン単離を記載している。
【０１６９】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは国際公開第２００９／１４１３８４号の開示に記載の構造による構造を有する。国際公開第２００９／１４１３８４号の捕捉樹脂は以下の一般化学式、すなわち、
【化２】
2017537975.tif 000008
を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１５〜１０００g/molの分子量である有機部分を表し、全体で２００〜２０００g/molの分子量であり、これらに対してリガンドがＲ１、Ｒ２及びＲ３のうち１つによるアミド結合を介して固相支持体に固定化される。捕捉樹脂の構造に関連する国際公開第２００９／１４１３８４号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。国際公開第２００９／１４１３８４号は、リガンドがタンパク質因子VIIポリペプチドに結合することを記載している。
【０１７０】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号に開示に記載された構造による構造を有する。米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号の捕捉樹脂は、イミノ二酢酸塩（ＩＤＡ）型骨格に集合したプロテインＡ模倣剤リガンド錯体である。捕捉樹脂構造に関連する米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。ＩＤＡ骨格はトリアジルリガンドで誘導体化し、多価トリアジルリガンド錯体をもたらす。米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号で定義された事例的トリアジルリガンド錯体を以下に示す。
【化３】
2017537975.tif 000009
【０１７１】
このプロテインＡ模倣剤は、IgＧのような免疫グロブリンのための親和性精製媒体として有用性があることが実証されている。リガンド-錯体における隣接のトリアジンリガンドの分子ジオメトリがＩＤＡ骨格を使用する上で好都合であることを前提とする。
【０１７２】
米国特許出願公開第２００１／００４５３８４号で定義された他の事例的錯体を以下に示す。
【化４】
2017537975.tif 000010
【０１７３】
この分岐多価フタル酸-リガンド骨格のプロテインＡ模倣剤リガンド-錯体は免疫グロブリンに対する親和性を有することが実証された。
【０１７４】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第９７／１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号の開示に記載された構造による構造を有する。捕捉樹脂の構造に関連する国際公開第９７／１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。国際公開第９７／１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号は、以下のタイプのトリアジル-リガンド親和性構成体を開示している。
【化５】
2017537975.tif 000011
ここで、(A) は、随意的に、リガンドと固体支持体との間に介在するスペーサアームを介しての多糖類固体支持体に対するトリアジン骨格の共有結合ポイントを表し、またＲ１及びＱは、随意的に、タンパク質材料の代わりに親和性を有する置換リガンドである。有機部分はプロテインＡ模倣剤として表され、またタンパク質材料を精製するためのプロテインＡの代替的精製媒体として提案されまれ例示される。
【０１７５】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは国際公開第２００４／０３５１９９号の開示に記載の構造による構造を有する。国際公開第２００４／０３５１９９号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。国際公開第２００４／０３５１９９号は、以下の一般化学式、すなわち、
【化６】
2017537975.tif 000012
の分岐リガンド骨格を有するプロテインＬ模倣剤の使用を開示しており、ここでＲ１及びＲ２は、互いに同一又は異なり、かつそれぞれ随意的に、置換したアルキルリガンド又はアリールリガンドであり、またＲ３は、スペーサモチーフが随意的に、付着する固体支持体である。トリアジル-リガンド骨格は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの断片抗体（ｆＡｂ）における親和性結合のために適したプロテインＬ模倣剤リガンドとして開示されている。さらに、これらトリアジル-リガンド骨格は、免疫グロブリンΚ及びλ軽鎖に対する選択的結合親和性を有すると開示されている。
【０１７６】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号の開示に記載の構造による構造を有する。捕捉樹脂の構造に関連する米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号は、産生媒剤からの断片抗体（ｆＡｂ）の精製を開示している。断片抗体はプロテインＡ媒剤において精製できない。ｆＡｂは、抗体に結合できる結合ドメインを有するものとして特徴付けされ、多くの実施形態において、１つの重鎖（Ｖｈ）又はその重鎖の機能性断片、及び１つの軽鎖（Ｖｌ）又はその軽鎖の機能性断片、とともに少なくとも１つの他の鎖から構成されると記載されている。ｆＡｂのための親和性リガンドは以下の化学式、すなわち、
【化７】
2017537975.tif 000013
の分岐トリアジル骨格からなるものと定義されており、ここでＱは、随意的にスペーサモチーフを有する固体支持体マトリクスに対する付着ポイントを表し、基Ａ及びＢは、水素結合できる１つ以上の置換基、好適には−ＯＨ、−ＳＨ、又は−ＣＯ２Ｈのうち１つ以上で置換したフェニル基又はナフチル基である。プロメティック・バイオサイエンシズ社からMAbsorbent A1P及びMAbsorbent A2P及びFAbsorbent F1Pの商品名の下で市販入手可能な支持親和性リガンドを用いて優れた結果が報告されている。
【０１７７】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは次式の構造を有する、すなわち、
【化８】
2017537975.tif 000014
【０１７８】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは次式の構造を有する、すなわち、
【化９】
2017537975.tif 000015
【０１７９】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは次式の構造を有する、すなわち、
【化１０】
2017537975.tif 000016
【０１８０】
実施形態において、捕捉樹脂はビーズの形式である。実施形態において、ビーズ直径で見たビーズサイズは、約１０μｍ〜約２０００μｍ、好適には約５０μｍ〜約１０００μｍ、最も好適には約７５μｍ〜約５００μｍである。
【０１８１】
実施形態において、捕捉樹脂としては、ポリスチレン、ジビニルベンゼン（マクロ多孔性であると言われる、０.１〜５.０％ＤＶＢ）で軽度架橋したポリスチレン（ＰＳ-ＤＶＢ）、ジビニルベンゼン（マクロ多孔性であると言われる、５〜６０％ＤＶＢ）で高度架橋したポリスチレン（ＰＳ-ＤＶＢ）、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールでグラフト化したポリスチレン（ＰＳ-ＰＥＧコポリマー）、ポリアクリルアミド、制御孔ガラス（ＣＰＧ）ビーズ、シリカ、珪藻土、ポリプロピレン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリエチレン、セルロース、ポリメタクリレート、機能化モノリス、機能化繊維、一体型カラム（Nikzad et al, OPRD, 2007, 11, 458-462に記載のような）、機能化薄膜、アガロース、セファロース及び磁気回収可能なポリマービーズがある。
【０１８２】
好適な実施形態において、捕捉樹脂は、アガロース、セファロース及びセルロースよりなるグループから選択した材料で形成した可動支持体とする。
【０１８３】
実施形態において、捕捉樹脂は、Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂のような市販の捕捉樹脂とする。実施形態において、捕捉樹脂は、Mabsorbent（登録商標） A1P又はA2P樹脂のような市販の捕捉樹脂とする。
【０１８４】
生体分子
実施形態において、生体分子は生命有機体内で自然に生ずるものである。代案として、生体分子は、生命有機体内で自然に生ずる化合物の誘導体とすることができる。例えば、生体分子は、生理学的活量に影響を与えないよう化学的又は遺伝的に改変した生体分子であり得る。したがって、実施形態において、生体分子は、組み換え型生体分子、例えば、組み換え技術操作した又は組み換え式に修飾した生体分子である。
【０１８５】
実施形態において、生体分子は抗体である。
【０１８６】
実施形態において、生体分子は、修飾抗体、例えば非天然アミノ酸を含む抗体である。
【０１８７】
実施形態において、生体分子は抗体断片である。
【０１８８】
実施形態において、生体分子はモノクローナル抗体である。
【０１８９】
実施形態において、生体分子はトラスツズマブである。
【０１９０】
実施形態において、抗体、修飾抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン（Ig）、例えば５つのヒト免疫グロブリンクラス、すなわち、IgＧ、IgＡ、IgＭ、IgＤ及びIgＥのうち１つである。用語「抗体」はモノクローナル抗体を包含する。用語「抗体」はポリクローナル抗体を包含する。用語「抗体」は、所望の生理学的活量を示す限り抗体断片を包含する。抗体は、ヒト抗体、動物抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、又はヒト配列及び動物配列を有するキメラ抗体であり得る。
【０１９１】
抗体構造の基本単位は、少なくとも２０，０００ダルトン、例えば、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体である。抗体は、長さが少なくとも９００個のアミノ酸、例えば１４００個のアミノ酸である。抗体は、非共有結合性会合及びジスルフィド結合の双方によって架橋した２個の同一軽鎖及び２個の同一重鎖を有する。重鎖及び軽鎖それぞれは、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有する。各重鎖は約５０，０００ダルトンである。各重鎖は、長さが少なくとも３００個のアミノ酸、例えば、長さが約４５０個のアミノ酸である。抗体は、重鎖のみを有する抗体であり得る。各軽鎖は約２０，０００ダルトンである。各軽鎖は、長さが少なくとも１００個のアミノ酸、例えば、長さが約２５０個のアミノ酸である。
【０１９２】
抗体生体分子は、２対の同一ポリペプチド鎖を含むことができ、各対は、１個の軽鎖及び１個の重鎖を有する。軽鎖及び重鎖それぞれは、２つの領域、すなわち、標的抗原を結合することに関与する可変（「Ｖ」）領域、及び免疫系の他の成分と相互作用する定常（「Ｃ」）領域からなる。軽鎖及び重鎖における可変領域は、一緒に３次元的空間内で抗原を結合する可変領域（例えば、細胞表面の受容体）を形成する。
【０１９３】
実施形態において、生体分子は抗体断片である。抗体断片は、完全長抗体の一部、概して、完全長抗体の抗原結合領域又は可変領域を有する。
【０１９４】
抗体断片の例としては、Fab、pFc’、F(ab’)2、及びscFvの断片；二重特異性抗体；dsFvリニア抗体；アフィボディ；ミニボディ、一本鎖抗体の生体分子があり、ナノボディ及び可変新規抗原受容体（VNARs）並びに抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。抗体断片は、長さが少なくとも１０個のアミノ酸である場合があり、例えば、抗体断片は、長さが少なくとも２０個、４０個、６０個、８０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、２２０個、２４０個、２６０個、２８０個、３００個のアミノ酸であり得る。
【０１９５】
実施形態において、生体分子は修飾抗体又は修飾抗体断片である。「修飾抗体」又は「修飾抗体断片」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾の理由から親抗体とは異なる抗体を意味する。修飾抗体又は修飾抗体断片は、本発明方法を受けさせる前に、（例えば、非天然アミノ酸等に対して）予め化学修飾した又は酵素修飾した又は遺伝子操作した抗体又は抗体断片である。
【０１９６】
修飾抗体又は修飾抗体断片は、野生型抗体との比較でサイズの異なる抗体、又は糖鎖付加の点で異なるが、野生型抗体と同様の親和性を有する抗体に言及する。
【０１９７】
薬剤
【０１９８】
用語「薬剤」は、生命有機体内に投与されるとき、通常の生体機能を変化させるいかなる物質をも含む。概して、薬剤は、疾患の処置、治癒、予防、若しくは診断に使用される、又はその他に身体的若しくは精神的な健全性を向上するのに使用される物質である。実施形態において、薬剤は細胞毒性薬物である。
【０１９９】
今日までに至る先進的な「特効」（薬）候補は、２つのカテゴリー、すなわち、(i) チューブリン阻害剤、及び(ii) ＤＮＡ相互作用剤のうち１つで定義されている。チューブリン阻害剤はチューブリン重合を調整する。ＤＮＡ相互作用剤は細胞ＤＮＡを標的にする。
【０２００】
実施形態において、薬剤はチューブリン阻害剤である。
【０２０１】
実施形態において、チューブリン阻害剤は、(a) オーリスタチン、及び(b) メイタンシン誘導体よりなるグループから選択される。
【０２０２】
実施形態において、薬剤はオーリスタチンである。
【０２０３】
オーリスタチンは、天然由来化合物であるドラスタチン−１０の合成誘導体を含む。オーリスタチンは、抗腫瘍性／細胞毒性擬ペプチド群である。ドラスタチンは、天然生合成生成物において同定されている４個の異常アミノ酸（Dolavaine, Dolaisoleuine, Dolaproine 及び Dolaphenine）を取り込むことにより構造的に独特である。さらに、天然生成物のこのクラスは、ペティット氏らによる全体的合成研究によって定義された多くの非対称中心を有する（米国特許第４，９７８，７４４号参照）。構造活性の関係性から、Dolaisoleuine及びDolaproine残基は抗腫瘍性活量に必要であることが分かっている（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号参照）。
【０２０４】
実施形態において、オーリスタチンは、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、vcＭＭＡＥ、及びvcＭＭＡＦよりなるグループから選択される。
【０２０５】
実施形態において、薬剤はメイタンシン又はメイタンシンの構造的類似体である。
【０２０６】
実施形態において、薬剤はメイタンシンである。
【０２０７】
メイタンシンは複雑構造の抗有糸分裂性ポリケチドを含む。メイタンシンは、腫瘍細胞のアポトーシスに導く微小チューブリン集合体に対する効能がある阻害剤である。
【０２０８】
実施形態において、メイタンシンは、メルタンシン（ＤＭ１）、及びＤＭ３又はＤＭ４のようなメイタンシンの構造的類似体よりなるグループから選択される。好適には、薬剤はメルタンシン（ＤＭ１）である。
【０２０９】
実施形態において、薬剤はＤＮＡ相互作用剤である。ＤＮＡ相互作用剤は「特効」（ultra-potent）（薬）候補として知られている。
【０２１０】
実施形態において、ＤＮＡ相互作用剤は、(a) カリケアマイシン、(b) デュオカルマイシン、及び(c) ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）よりなるグループから選択される。
【０２１１】
実施形態において、薬剤はカリケアマイシンである。
【０２１２】
カリケアマイシンは、二重鎖ＤＮＡを破壊して細胞死を生ぜしめる効き目がある細胞毒性薬である。カリケアマイシンは、天然由来のエンジイン抗生物質である（A. L. Smith et al, J. Med. Chem., 1996, 39,11, 2103-2117参照）。カリケアマイシンは、土壌微生物であるミクロモノスポラ・エキノスポラで発見された。
【０２１３】
実施形態において、カリケアマイシンは、カリケアマイシンγ１である。
【０２１４】
実施形態において、薬剤はデュオカルマイシンである。
【０２１５】
デュオカルマイシンは効き目のある抗腫瘍抗生物質であり、ＤＮＡ二本鎖の副溝に対して配列選択的に結合し、またアデニンのＮ３をアルキル化することによって生理学的効果を発揮する（D. Boger, Pure & Appl. Chem., 1994, 66, 4, 837-844参照）。
【０２１６】
実施形態において、デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、シクロプロピルベンゾインドール（ＣＢＩ）デュオカルマイシン、センタナマイシン、レイチェルマイシン（CC-1065）、アドゼレシン、ビセレシン、及びカルゼレシンよりなるグループから選択される。
【０２１７】
実施形態において、薬剤はピロロベンゾジアゼピンである。
【０２１８】
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）は、天然由来の抗腫瘍抗生物質のクラスである。ピロロベンゾジアゼピンはストレプトマイセスで発見されている。ＰＢＤｓは、プリン・グアニン・プリンの単位に特異的な副溝におけるＤＮＡに共有結合することによって、その抗腫瘍活性を発揮する。動物連携を介してグアニンのＮ２に挿入し、それらの形状に起因してＤＮＡ螺旋に対して最小分裂を引き起こす。ＤＮＡ−ＰＢＤ付加物形成は、核酸合成を阻害し、またＤＮＡ螺旋に切除による一本鎖及び二本鎖破壊を引き起こす。合成誘導体として、可撓性ポリメチレンのテザーを介する２つのＰＢＤ単位の結合によれば、ＰＢＤ二量体を対向するＤＮＡ鎖を架橋して、高度な致死傷害を生ずることができる。
【０２１９】
実施形態において、薬剤は、可撓性ポリメチレンのテザーを介して結合された２つのピロロベンゾジアゼピン単位の合成誘導体である。
【０２２０】
実施形態において、ピロロベンゾジアゼピンは、アントラマイシン（及びその二量体）、マゼトラマイシン（及びその二量体）、トメイマイシン（及びその二量体）、プロトラカルシン（及びその二量体）、チカマイシン（及びその二量体）、ネオトラマイシンＡ（及びその二量体）、ネオトラマイシンＢ（及びその二量体）、ＤＣ−８１（及びその二量体）、シビロマイシン（及びその二量体）、ポロトラマイシンＡ（及びその二量体）、ポロトラマイシンＢ（及びその二量体）、シバノマイシン（及びその二量体）、アビーマイシン（及びその二量体）、ＳＧ２０００、及びＳＧ２２８５よりなるグループから選択される。
【０２２１】
実施形態において、薬剤は、アルキル化によりＤＮＡ鎖間架橋を標的とする薬剤である。アルキル化によりＤＮＡ鎖間架橋を標的とする薬剤は、ＤＮＡ標的マスタード、グアニン特異的アルキル化剤、及びアデニン特異的アルキル化剤から選択される。
【０２２２】
実施形態において、薬剤はＤＮＡ標的マスタードである。例えば、ＤＮＡ標的マスタードは、オリゴピロール、オリゴイミダゾール、ビス-（ベンズイミダゾール）担体、ポリベンズアミド担体、及び9-アニリノアクリジン-4-カルボキサミド担体よりなるグループから選択することができる。
【０２２３】
実施形態において、薬剤は、ネトロプシン、ジスタマイシン、レキシトロプシン、タリムスチン、ジブロモタリムスチン、ＰＮＵ157977、及びＭＥＮ10710よりなるグループから選択される。
【０２２４】
実施形態において、薬剤はビス-（ベンズイミダゾール）担体である。好適には、薬剤はヘキスト33258である。
【０２２５】
グアニン特異性アルキル化剤は、特異ヌクレオチド位置で反応する高度に部位特異的アルキル化剤である。
【０２２６】
実施形態において、薬剤は、Ｇ−Ｎ２アルキル化剤、Ａ−Ｎ３アルキル化剤、ミトマイシン、カルメチゾール類似体、エクテイナシジン類似体よりなるグループから選択される部位特異的アルキル化剤である。
【０２２７】
実施形態において、ミトマイシンは、ミトマイシンＡ、ミトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、及びＫＷ-2149から選択される。
【０２２８】
実施形態において、カルメチゾール類似体は、ビス-（ヒドロキシメチル）ピロリジジン、及びＮＳＣ602668から選択される。
【０２２９】
実施形態において、エクテイナシジン類似体はエクテイナシジン７４３である。
【０２３０】
アデニン特異的アルキル化剤は、ポリピリミジン配列におけるアデニンのＮ３に反応する部位特異的かつ配列特異的副溝アルキル化剤である。シクロプロパインドロン（Cyclopropaindolones）及びデュオカルマイシンは、アデニン特異的アルキル化剤として定義することができる。
【０２３１】
実施形態において、薬剤はシクロプロパインドロン類似体である。好適には、薬剤は、アドゼレシン及びカルゼルシンから選択される。
【０２３２】
実施形態において、薬剤はベンズインドロン（benz[e]indolone）である。好適には、薬剤はＣＢＩ-ＴＭＩ、及びイソ-ＣＢＩから選択される。
【０２３３】
実施形態において、薬剤はビセレシンである。
【０２３４】
実施形態において、薬剤は海洋性抗腫瘍薬である。海洋性抗腫瘍薬は、抗腫瘍薬開発活動領域における発展しつつある分野となっている（(I. Bhatnagaret al,Mar. Drugs 2010, 8, P2702-2720 and T. L. Simmons et al, Mol. Cancer Ther. 2005, 4(2), P333-342参照）。海綿、海綿微生物共生群集、ヤギ目サンゴ虫、放線菌、及び軟質サンゴを含む海洋生物は、潜在的能力がある抗がん剤として広く調査されてきた。
【０２３５】
実施形態において、薬剤は、シタラビン、Ａｒａ-Ｃ、トラベクテジン（ＥＴ-734）、及びエリブリンメシル酸塩から選択される。
【０２３６】
実施形態において、エリブリンメシル酸塩は、（Ｅ7389）、ソブリドチン（TZT 1027）、乳酸スクアラミン、セマドチン・プリナブリン（ＮＰＩ-2358）、プリチデプシン、エリシデプシン、ザリプシス（Zalypsis）、トラシドチン、シンサドチン、（ＩＬＸ-651）、ディスコデルモリド、ＨＴ1286、ＬＡＦ389、カハラリドＦ、ＫＲＮ7000、ブリオスタチン１、ヘミアステルリン（Ｅ7974）、マリゾミブ、サリノスポラミドＡ、ＮＰＩ-0052、ＬＹ355703、CRYPTO52、デプシペプチド（ＮＳＣ630176）、エクテイナシジン743、シンサドチン、カハラリドＦ、スクアラミン、デヒドロジデムニンＢ、ジデムニンＢ、セマドチン、ソブリドチン、Ｅ7389、NVP-LAQ824、ディスコデルモリド、HTI-286、LAF-389、KRN-7000（アジェラスフィン誘導体）、クラシンＡ、ＤＭＭＣ、サリノスポラミドＡ、ラウリマライド、ビチレブアミド、ジアゾナミド、エリュテロビン、サルコジクチン、ペロルシドＡ、サリチルハラミドＡ及びＢ、チオコラリン、アシジデミン、ヴァリオリン（Variolin）、ラメラリンＤ、ジクチオデンドリン、ES-285（スピスロシン）及びハリコンドリンＢから選択される。
【０２３７】
以下の薬剤、すなわち、テングタケ属の担子菌、例えばグリーン・デスキャップ・マッシュルームによって産生されるアマトキシン（α-アマニチン）-二環式オクタペプチド、ツブリシン、サイトリシン、ドラベラニン、エポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆも本発明に包含される。
【０２３８】
エポチロンは、非タキサンチューブリン重合剤のクラスを構成し、粘液細菌ソランギウム・セルロサムの自然発酵によって得られる。これら部分は、微小管の安定化に関連し、また結果としてＧ２／Ｍ遷移部における有糸分裂停止を生ずる強力な細胞毒性活量を有する。エポチロンは、がん細胞株団にわたる強力な細胞毒性が実証され、またしばしばパクリタキセルよりも強い効力を示していた（X. :Pivot et al, European Oncology,2008;4(2), P42-45参照）。
【０２３９】
実施形態において、薬剤はアマトキシンである。
【０２４０】
実施形態において、薬剤はチューブリシン（tubulysin）である。
【０２４１】
実施形態において、薬剤は細胞溶解素である。
【０２４２】
実施形態において、薬剤はドラベラニン（dolabellanin）である。
【０２４３】
実施形態において、薬剤はエポチロンである。
【０２４４】
以下の薬剤も本発明によって包含される。実施形態において、薬剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、デトルビシン、モルホリノ-ドキソルビシン、メトトレキサート、メトプテリン、ブレオマイシン、ジクロロメトトレキサート、5-フルオロウラシル、シトシン-β-Ｄ-アラビノフラノシド、タキソール、アングイジン、メルファラン、ビンブラスチン、ホモプシンＡ、リボソーム-不活化タンパク質（RIPs）、ダウノルビシン、ビンカ・アルカロイド、イダルビシン、メルファラン、シス-プラチン、リシン、サポリン、アントラサイクリン、インドリノ-ベンゾジアゼピン、6-メルカプトプリン、アクチノマイシン、ロイロシン、ロイロシデイン（Leurosidein）、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、エトポシド、ヘアピンポリアミド、リン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸タキソテール、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、エスペラミシン、及びエン-ジインから選択される。
【０２４５】
実施形態において、薬剤はドキソルビシンである。
【０２４６】
実施形態において、薬剤はエピルビシンである。
【０２４７】
実施形態において、薬剤はエソルビシンである。
【０２４８】
実施形態において、薬剤はデトルビシンである。
【０２４９】
実施形態において、薬剤はモルホリノ-ドキソルビシンである。
【０２５０】
実施形態において、薬剤はメトトレキサートである。
【０２５１】
実施形態において、薬剤はメトプテリンである。
【０２５２】
実施形態において、薬剤はブレオマイシンである。
【０２５３】
実施形態において、薬剤はジクロロメトトレキサートである。
【０２５４】
実施形態において、薬剤は5-フルオロウラシルである。
【０２５５】
実施形態において、薬剤はシトシン-β-Ｄ-アラビノフラノシドである。
【０２５６】
実施形態において、薬剤はタキソールである。
【０２５７】
実施形態において、薬剤はアングイジンである。
【０２５８】
実施形態において、薬剤はメルファランである。
【０２５９】
実施形態において、薬剤はビンブラスチンである。
【０２６０】
実施形態において、薬剤はホモプシンＡである。
【０２６１】
実施形態において、薬剤はリボソーム-不活化タンパク質（RIPs）である。
【０２６２】
実施形態において、薬剤はダウノルビシンである。
【０２６３】
実施形態において、薬剤はビンカ・アルカロイドである。
【０２６４】
実施形態において、薬剤はイダルビシンである。
【０２６５】
実施形態において、薬剤はメルファランである。
【０２６６】
実施形態において、薬剤はシス-プラチンである。
【０２６７】
実施形態において、薬剤はリシンである。
【０２６８】
実施形態において、薬剤はサポリンである。
【０２６９】
実施形態において、薬剤はアントラサイクリンである。
【０２７０】
実施形態において、薬剤はインドリノ-ベンゾジアゼピンである。
【０２７１】
実施形態において、薬剤は6-メルカプトプリンである。
【０２７２】
実施形態において、薬剤はアクチノマイシンである。
【０２７３】
実施形態において、薬剤はロイロシンである。
【０２７４】
実施形態において、薬剤はロイロシデイン（Leurosidein）である。
【０２７５】
実施形態において、薬剤はカルミノマイシンである。
【０２７６】
実施形態において、薬剤はアミノプテリンである。
【０２７７】
実施形態において、薬剤はタリソマイシンである。
【０２７８】
実施形態において、薬剤はポドフィロトキシンである。
【０２７９】
実施形態において、薬剤はエトポシドである。
【０２８０】
実施形態において、薬剤はヘアピンポリアミドである。
【０２８１】
実施形態において、薬剤はリン酸エトポシドである。
【０２８２】
実施形態において、薬剤はビンブラスチンである。
【０２８３】
実施形態において、薬剤はビンクリスチンである。
【０２８４】
実施形態において、薬剤はビンデシンである。
【０２８５】
実施形態において、薬剤はレチノイン酸タキソテールである。
【０２８６】
実施形態において、薬剤はN8-アセチルスペルミジンである。
【０２８７】
実施形態において、薬剤はカンプトテシンである。
【０２８８】
実施形態において、薬剤はエスペラミシンである。
【０２８９】
実施形態において、薬剤はエン-ジインである。
【０２９０】
生体分子-薬剤-抱合体
本発明によれば、本発明プロセスによって得られる生体分子-薬剤-抱合体を提供する。
【０２９１】
本発明の実施形態をさらに添付図面につき以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】実施例２によって産生された固相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＨＩＣ分析である。図の底部から頂部に向かってハーセプチン-vcE１.３、ハーセプチン-vcE２.４、ハーセプチン-vcE３.４、ハーセプチン-vcE４.４の出力波形。溶離プロファイルのピークは、ＲＴ４.３分−未抱合ハーセプチン、ＲＴ５.９分−薬剤対抗体比２、ＲＴ７.５分−薬剤対抗体比４、ＲＴ８.９分−薬剤対抗体比６、ＲＴ９.８分−薬剤対抗体比８。
【図２】実施例２によって産生された固相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＳＥＣ分析である。図の底部から頂部に向かってハーセプチン-vcE１.３、ハーセプチン-vcE２.４、ハーセプチン-vcE３.４、ハーセプチン-vcE４.４の出力波形。
【図３】実施例３で産生されたクロマトグラフ流固相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＨＩＣ分析である。溶液相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＨＩＣ分析（上側パネル）、カラムＡで製造したハーセプチンvcMMAE（中間パネル）、カラムＢで製造したハーセプチンvcMMAE（下側パネル）。
【図４】実施例３で産生されたクロマトグラフ流固相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＳＥＣ分析である。溶液相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＳＥＣ分析（上側パネル）、カラムＡで製造したハーセプチンvcMMAE（中間パネル）、カラムＢで製造したハーセプチンvcMMAE（下側パネル）。
【図５】左列は、実施例５におけるMabsorbent A1P HF（登録商標）樹脂で産生されたハーセプチンvcMMAE抱合体のＨＩＣクロマトグラムを示す。右列は、同一ハーセプチンvcMMAE抱合体のＳＥＣクロマトグラムを示す。クロマトグラフデータは、ＴＣＥＰ対抗体比の増加が平均薬剤対抗体比（ＤＡＲ）を増加させ、またＤＡＲが増加するとき固相技術を使用するモノマー含有量の減少がないことを示す。
【図６】実施例８において固相で抗体の化学修飾及び抱合により合成した固相ハーセプチンvcMMAE抱合体のＨＩＣ分析。ＨＩＣプロファイルは、確率論的抱合における種々のＤＡＲ種（０〜８）を示す。
【図７】実施例９で産生された固相手段により合成した、遺伝子組み換えシステイン- vcMMAE抱合体を有するハーセプチン。モノマーレベルを決定するためのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）が分析した抱合体（上側パネル）。疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ、中間パネル）が分析した抱合体及び薬剤対抗体比（ＤＡＲ）を形成するためのＰＬＲＰ（下側パネル）。
【図８】実施例１０で産生されたHerzuma（登録商標）-MCC-DM1及びセツキシマブ-MCC-DM1の抱合体（サンプルＡ〜Ｆ）のＳＥＣ出力波形。「１ステップ手法」を用いる固相で合成した抱合体。２８０ｎｍで分析。
【発明を実施するための形態】
【０２９３】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体にわたり、用語「備える（comprise）」及び「含む（contain）」並びにそれらの活用形は、「限定しないが有する（including but not limited to）」を意味し、またそれらは、他の部分、添加物、成分、完全体（integer）又はステップを排除することは意図しない（及び排除しない）。本明細書の記載及び特許請求の範囲全体にわたり、単数形は、文脈が他に必要としない限り、複数形を包含する。とくに、不定冠詞を使用する場合、明細書は、文脈が他を必要としない限り、単数形と同様に複数形をも考慮するものと理解されたい。
【０２９４】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例につき説明される特徴、完全体、特性、化合物、化学的部分又は基は、不適合でない限り、本明細書に記載のいかなる他の態様、実施形態又は実施例にも適用可能であると理解されたい。本明細書におけるすべての特徴、及び／又は任意の方法若しくはプロセスのすべてのステップは、このような特徴及び／又はステップの少なくとも幾つかが互いに排他的である組合せを除いて、任意の組合せで組み合わせることができる。本発明は、いかなる上述の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（特許請求の範囲の任意な請求項、要約書及び図面も含めて）に記載の特徴における任意な新規の１つ、又は任意な新規の組合せ、又は記載された任意の方法若しくはプロセスのすべてのステップにおける任意な新規の１つ、又は任意な新規の組合せに拡張される。
【０２９５】
読者は、本件出願に関連して本明細書と同時又は先行して出願された、また本明細書とともに公衆縦覧向けに公開されているすべての文書及び文献に傾注されたく、並びにこれらすべての文書及び文献の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【０２９６】
以下の技術を実施例で使用する。
【０２９７】
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィは、東ソー・バイオサイエンス社製ＴＳＫ-Ｇｅｌ（登録商標）GW3000SWxlカラムを用いて、ｐＨ６.９５の０.２Ｍリン酸カリウムを０.２５ｍＭの塩化カリウム及び１０％ＩＰＡとともに０.５ｍｌ／分の流量にして実施した。抱合体の凝集状態は、溶離ピーク領域吸収度を２８０ｎｍで積分することによって決定した。
【０２９８】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィは、東ソー社製ＴＳＫ-Ｇｅｌ（登録商標）ブチルＮＰＲカラムを用いて、緩衝液ＡからＢに０〜１００％にわたる直線形的勾配で１２分間にわたり０.８ｍｌ／分の流量にして実施した。ここで、緩衝液Ａは２５ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ６.９５の１.５Ｍ酢酸アンモニウムであり、緩衝液Ｂは２５％ＩＰＡを含むｐＨ６.９５の２５ｍＭリン酸ナトリウムである。抱合体の抗体薬剤比は、溶離ピーク領域吸収度を２８０ｎｍで積分することによって決定した。
【０２９９】
逆相クロマトグラフィ（ＲＰ-ＰＬＲＰ）
逆相クロマトグラフィ（ポリマー・ラボラトリーズ社ＰＬＲＰ）は、Agilent PLRP-S PL1912-1502カラムを用いて、緩衝液ＡからＢに２５〜９５％にわたる勾配で３１分間にわたり０.２５ｍｌ／分の流量にして実施した。ここで、緩衝液Ａは０.０５％ＴＦＡを有する水であり、緩衝液Ｂは０.０４％ＴＦＡを有するＡＣＮである。サンプルは、５０ｍＭＤＴＴを含むｐＨ８.４の２０ｍＭホウ酸ナトリウムで１５分間にわたり３７℃にして予注入分を還元した。抱合体の抗体薬剤比は、溶離ピーク領域吸収度を２８０ｎｍで積分することによって決定した。
【０３００】
ＵＶ分析による薬剤対抗体比
ＵＶ分析のために、サンプルを、１ｃｍの経路長を有する４００μｌ石英キュベットに添加し、また２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸収度をサーモ・サイエンティフィック社製Multiskan GOを有する分光光度計で測定した。２５２ｎｍ及び２８０ｎｍデータを使用し、これらの波長におけるハーセプチン及びＤＭ１の公表されたモル吸光係数に基づいて薬剤抗体比を計算した。
【０３０１】
実施例１−固相抗体薬剤抱合体スクリーニング
この実施例は、プロセス開発の必要がない一般プロセスにより固定化抗体が規定薬剤装荷（ローディング）に抱合することができることを実証する。この手法は、９６ウェルプレートの高いスクリーニング処理能力に適合させるのに適している。
【０３０２】
ハーセプチン（ＰＢＳにおける１ｍｇ／ｍｌの０.５ｍｌ、ｐＨ７.４）は、樹脂スラリー及び抗体溶液を穏やかに３０分間混合することにより、ＰＢＳ内で平衡状態にあるFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂の１００μｌ（沈降樹脂体積）と結合した。未結合ハーセプチンは樹脂をＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡで洗浄することによって除去し、また樹脂は、最終的に０.５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁させた。
【０３０３】
結合したハーセプチン（Ｈｅｒ）は、tris-(2-カルボキシルエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加して２ｍＭの最終濃度にし、次いで周囲温度で１８時間にわたり懸濁液をインキュベーションすることによって還元した。樹脂は、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄して未反応ＴＣＥＰを除去し、またこの後４７５μｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ内で再懸濁させた。
【０３０４】
vcMMAE（vcＥ）、N-エチルマレイミド（ＮＥＭ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を添加して１ｍＭマレイミド（vcＥ及びＮＥＭの合計）及び５体積％ＤＭＡの最終濃度にした。vcＥ対ＮＥＭの比は、１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５及び１００：０に変化させた。樹脂懸濁液を周囲温度で６０分間にわたりインキュベーションすることにより、還元抗体を抱合させた。樹脂は、この後ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンで洗浄した。
【０３０５】
抱合体は、ｐＨ３.０の０.１Ｍグリシンで溶離した。溶離抱合体は１Ｍのtris（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕集して、それらを中和した。
【０３０６】
中和した抱合体は、次にサイズ排除クロマトグラフィ及び逆相クロマトグラフィ（ポリマー・ラボラトリーズ社ＰＬＲＰ）によって分析し、凝集体割合及び平均薬剤装荷（ローディング）を決定した。
【０３０７】
その結果を以下の表１にまとめて挙げる。
【表５】
2017537975.tif 000017
【０３０８】
最も高く薬剤が装荷された凝集体の内容物でさえも、凝集体の割合は抗原結合及び細胞ベースの検定におけるさらなる評価に対して容認可能である。ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンによるその後の洗浄により、最終抱合体が未反応薬剤リンカー、ＮＥＭ及び溶剤がなく、また生物学的検定データ解釈を損なわないことを確実にする。Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂に関して、この手法は、それに続く抗体薬剤抱合体開発のための誘導選択（リードセレクション）の一部としてモノクローナル抗体団をスクリーニング0する、又は無欠抗体及びＦａｂ断片抗体双方を含む組織インキュベーション上澄みから直接ＡＤＣを産生するのに有用である。
【０３０９】
実施例２−バッチモードでの固相部分的ＴＣＥＰ還元
この実施例は、鎖間ジスルフィド結合の部分的還元、それに続くvcMMAEとの抱合によって固定化済み抗体を規定薬剤装荷に抱合できること、及び生成物品質が溶液内で形成される同一抱合体よりも高まることを示す。
【０３１０】
ハーセプチン（２ｍｇ／ｍｌＰＢＳの０.５ｍｌ、ｐＨ７.４）は、樹脂スラリー及び抗体溶液を穏やかに３０分間混合することにより、ＰＢＳ内で平衡状態にあるFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂の１００μｌ（沈降樹脂体積）と結合した。未結合ハーセプチンは樹脂をＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡで洗浄することによって除去し、また樹脂は、最終的に０.５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁させた。
【０３１１】
結合したハーセプチンは、tris-(2-カルボキシルエチル)ホスフィン塩酸塩を添加して、ハーセプチンのモルあたりのＴＣＥＰのモルが１〜４の比となるようにし、次いで周囲温度で２時間にわたり懸濁液をインキュベーションすることによって還元した。
【０３１２】
vcMMAE及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を添加して、ハーセプチンのモルあたりのvcMMAEのモルが２.５：１０、５％体積ＤＭＡとなるようにして、その抱合を３０分間周囲温度で進行させた。N-アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加して未反応vcMMAEの反応をおさえ、また２０分間反応させてから、樹脂を順次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンで洗浄した。
【０３１３】
抱合体は、ｐＨ３.０の０.１Ｍグリシンで溶離し、また１Ｍのtris（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕集して、それらを中和した。
【０３１４】
適合ＤＡＲでのハーセプチンのvcMMAEに対する溶液相抱合体の対応するシリーズを産生し、固相及び溶液相による抱合体品質を比較するよう分析した。
【０３１５】
溶離した抱合体は、次に疎水性相互作用クロマトグラフィ（図１参照）及びサイズ排除クロマトグラフィ（図２参照）によって分析し、凝集体割合及び平均薬剤装荷（ローディング）を決定した。
【０３１６】
その結果を以下の表２にまとめて挙げる。
【表６】
2017537975.tif 000018
【０３１７】
データは、固体支持体におけるＴＣＥＰ：抗体の比と最終薬剤装荷との間の関係が直線形的であることを示す。さらに、溶液内で形成した対応の抱合体と比較するとき、固相抱合体はより低い割合の凝集を示す。
【０３１８】
実施例３−カラムでの固相部分的ＴＣＥＰ還元
この実施例は、固定化済み抗体抱合体が優れた再現性を持ってクロマトグラフのフロープロセスに適合できることを示す。
【０３１９】
ハーセプチン（２mg/mlＰＢＳの５ml、ｐＨ７.４）は、１２０ｃｍ／時間の割合で装荷（ローディング）することによってFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂の１mlのカラム（ＰＢＳ内で予め平衡状態にしておく）と結合した。結合したハーセプチンは、樹脂をＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡと平衡状態にすることによって還元用に調合した。
【０３２０】
微小蠕動ポンプを使用して、カラムを経る少量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ循環ループ（カラム外部で約２００μｌ）を生じ、この循環ループに対してＴＣＥＰを添加し、ハーセプチンのモルあたりのＴＣＥＰのモル比が２となるようにした。このことにより、１２０分間にわたり周囲温度で再循環させてハーセプチンを還元できた。
【０３２１】
リザーバ及びカラムの内容物はフラッシュ洗浄して廃棄し、またＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡと交換し、これに対してvcMMAEを添加し、還元したハーセプチンのモルあたりの５vcMMAEのモル比が５となるようにした。このことにより、６０分間にわたり周囲温度で再循環させて還元したハーセプチンを抱合できた。
【０３２２】
N-アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加して未反応vcMMAEの反応を抑え、また２０分間反応させてから、順次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンで洗浄した。
【０３２３】
抱合体は、ｐＨ３.０の０.１Ｍグリシンで溶離し、また１Ｍのtris（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕集して、それらを中和した。
【０３２４】
このプロセスは、第２カラム／オペレータを使用して独立した第２実験を繰り返した。
【０３２５】
溶離した抱合体は、次に疎水性相互作用クロマトグラフィ（図３参照）及びサイズ排除クロマトグラフィ（図４参照）によって分析し、凝集体割合及び平均薬剤装荷（ローディング）を決定した。
【０３２６】
その結果を以下の表３にまとめて挙げる。
【表７】
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【０３２７】
データは、クロマトグラフのフローモードに適用するとき、ハーセプチンに対するvcMMAEの抱合は、平均薬剤装荷、還元パターン及び凝集体生成に関して一貫していることを示す。バッチモード及びクロマトグラフモードで得られるＤＡＲはＴＣＥＰ対抗体比を合致させるとき同一である。
【０３２８】
実施例４−リジン側鎖のSMCC活性化を経るバッチモードでのDM１に対する固相ハーセプチン抱合体
この実施例は、固定化済み抗体が、ＳＭＣＣで修飾し、これに続いてのＤＭ１との抱合によって、リジン側鎖に抱合できること、また生成物品質が溶液内で形成される同一抱合体に比べて高まることを示す。
【０３２９】
ハーセプチン（４mg/mlＰＢＳの０.５ml、ｐＨ７.４）は、樹脂スラリー及び抗体溶液を３０分間穏やかに混合することにより、Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂の１００μｌ（沈降した樹脂体積）と結合した。未結合ハーセプチンは樹脂をＰＢＳで、続いて「修飾緩衝液」（５０ｍＭのＮａＰｉ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６.７）によって洗浄することによって除去し、また樹脂は最終的に５体積％のＤＭＡを含む修飾緩衝液内に再懸濁させた。
【０３３０】
結合したハーセプチンは、サクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキシル-1-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）を添加して、ハーセプチンのモルあたりＳＭＣＣのモル比が５〜２０となるようにし、またその後周囲温度で２時間にわたり懸濁液をインキュベーションすることによって、修飾した。未反応ＳＭＣＣは、ＰＢＳ／５体積％ＤＭＡで、続いて「抱合緩衝液」（３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５.０）で洗浄することにより除去し、また樹脂は、最終的に３体積％のＤＭＡを含む抱合緩衝液内に再懸濁させた。
【０３３１】
ＤＭ１を添加してハーセプチンのモルあたりＤＭ１を１５モルにし、１８時間にわたり周囲温度で抱合を進行させた。この後、樹脂を、順次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンで洗浄した。
【０３３２】
抱合体は、ｐＨ３.０の０.１Ｍグリシンで溶離し、また１Ｍのtris（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕集して、それらを中和した。
【０３３３】
約３.５の平均ＤＡＲでのハーセプチン-ＤＭ１の溶液相抱合体は、ハーセプチンを７.６モルのＳＭＣＣと反応させ、次いでハーセプチンのモルあたり５モルのＤＭ１と反応させることによって産生し、固相及び溶液相の抱合体品質の比較を得るよう分析した。修飾及び抱合の反応中におけるハーセプチン濃度は、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌであった。
【０３３４】
溶離した抱合体は、この後サイズ排除クロマトグラフィ及びＵＶによって分析し、凝集体割合及び平均薬剤装荷（ローディング）を決定した。
【０３３５】
その結果を以下の表４にまとめて挙げる。
【表８】
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【０３３６】
データは、固体支持体におけるリジン側鎖抱合体が可能であることを示し、またＳＭＣＣ対抗体の比と、最終薬剤装荷（ローディング）との関係が直線形的であることを示す。
【０３３７】
さらに、溶液内で形成した対応の抱合体と比較するとき、固相抱合体は、抱合反応中のタンパク質濃度が４倍であるにも係わらず同等の凝集体割合を示す。
【０３３８】
実施例５−プロテインＡ模倣剤樹脂、プロテインＬ模倣剤樹脂及び従来型溶液相と比較してのバッチモードにおける固相部分的ＴＣＥＰ還元
この実施例は、抗体をプロテインＡ模倣剤樹脂又はプロテインＬ模倣剤樹脂のいずれかに固定化することに続いて抗体抱合体が得られることを示す。これと並行して、比較目的用に同一条件にして、従来型溶液相方法論を採用した。
【０３３９】
ハーセプチン（２mg/mlＰＢＳの０.５ml、ｐＨ７.４）は、樹脂スラリー及び抗体溶液を３０分間穏やかに混合することにより、Fabsorbent（登録商標） A1P HF樹脂及びMabsorbent（登録商標） A1P HF樹脂の１００μｌ（沈降した樹脂体積）と結合した。未結合ハーセプチンは、樹脂をＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡで洗浄することによって除去し、また樹脂は最終的に０.５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ内に再懸濁させた。結合したハーセプチンは、tris-(2-カルボキシルエチル)ホスフィン塩酸塩を添加して、ハーセプチンのモルあたりＴＣＥＰのモル比が１〜４となるようにし、またその後周囲温度で２時間にわたり懸濁液をインキュベーションすることによって、還元した。
【０３４０】
vcMMAE及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を添加して、ハーセプチンモルあたりのvcMMAEのモルが２.５〜１０、及び５体積％ＤＭＡとなるようにした。その抱合は１５〜３０分間周囲温度で進行させた。N-アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加して未反応vcMMAEの反応を抑えた。２０分間周囲温度でインキュベーションした後、各樹脂は、順次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５体積％ＤＭＡ及びｐＨ５.０の０.１Ｍグリシンで洗浄した。ＡＤＣ抱合体は、ｐＨ３.０の０.１Ｍグリシンで溶離し、また１Ｍのtris（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）の２体積％内に捕集して、それらを中和した。
【０３４１】
溶液相反応のため、同一の還元及び抱合条件を採用し、また比較分析の前に、最終抱合体を、Ｇ２５バッチ脱塩カラムによりＰＢＳとなるよう脱塩した。
【０３４２】
すべての抱合体は、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析し、凝集体割合及び平均薬剤装荷（ＤＡＲ）を決定した。
【０３４３】
得られたデータを以下の表５にまとめて挙げる。
【表９】
2017537975.tif 000021
【０３４４】
Mabsorbent（登録商標） A1P HF樹脂を用いる固相手段によって合成した、ハーセプチン- vcMMAE抱合体の溶離プロファイルを図５に示す。
【０３４５】
データは、高品質の抗体薬剤抱合体がプロテインＡ模倣剤樹脂又はプロテインＬ模倣剤樹脂で製造できることを実証する。さらに、これらデータは、先のデータ（実施例２参照）とよく一致している。双方のデータセットは、固相方法によって合成された抱合体が、同一平均ＤＡＲの抱合体を比較するとき、類似の溶液相方法によって合成された抱合体よりも高いモノマー含有量を有することを実証している。
【０３４６】
実施例６−カラムにおける抗体薬剤抱合体の固相抱合の拡張性
フローモード合成は大量生産にとって魅力的である。この実施例は、抱合体の固相合成が拡張可能であり、様々なカラムサイズにわたり生成物品質及び収率に関して一貫性があることを証明する。
【０３４７】
一連の実験を行い、カラム／フローモードでのFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂に適合するトラスツズマブ／ＴＣＥＰ／vcMMAE抱合モデルを使用して、３.６±０.２のＤＡＲを得る抱合プロセスを開発した。このモデルは、この後、カラム直径、カラム長さ、及びタンパク質装荷（mg/ml）を増加させるとともに、線形的流量、ＴＣＥＰ／vcMMAE対抗体の比、及び反応時間のような因子を維持することによってスケールアップした。小規模では、剥離した抱合体が、Ｇ２５緩衝剤交換（ＰＤ１０又はHiPrep XK16/10）によって調剤され、また大規模ではＴＦＦ透析濾過によって、５ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、０.０１％ツイーン２０にｐＨ６で調剤された（種々の検査条件の概要は以下の表６参照のこと）。
【０３４８】
Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂は、１０ｍＭトリス／２ｍＭＥＤＴＡ  ｐＨ７.５のカラムランニングバッファーで洗浄することによってカラムパッキングのために調合した。カラムは、１０ｃｍ／分で５０％スラリーとしてパッキングした。最終的な床体積よりも１０％過剰分を使用し、パッキング中の樹脂圧縮を可能にした。
【０３４９】
装荷（ローディング）、洗浄、反応及び溶離のステップすべては、２ｃｍ／分の一定の直線形的流量で実施した。
【０３５０】
トラスツズマブ抗体は、２４.１ｍｇ／ｍｌの濃度で供給された。トラスツズマブは、２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、また１０ｍＭのトリス／２ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７.５緩衝液内におけるFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂に装荷し、必要な樹脂装荷量にした。抗体の装荷後に、このカラムは、１０ｍＭのトリス／２ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７.５緩衝液の５カラム容積分（ＣＶ：column volume）で洗浄した。装荷ブレークスルーのＵＶ分析及びその後の洗浄は、すべての標的装荷におけるトラスツズマブの完璧な結合を確証した。
【０３５１】
主カラムの外部の反応剤リザーバ／再循環ループは、微小蠕動ポンプ及び主カラムの頂部及び底部における３方弁を用いて確立した。リザーバ容積は、主カラムの５０％容積となるよう調整し、またすべてのプロセス反応剤が充填される場所である。
【０３５２】
ジスルフィド還元は、ＴＣＥＰ（トラスツズマブに関して２.２４当量）をリザーバに添加し、また２時間にわたり周囲温度で再循環させて得られた。還元したトラスツズマブは、１０ｍＭのトリス／２ｍＭのＥＤＴＡ／５％ＤＭＡのｐＨ７.５緩衝液の５ＣＶで洗浄した。抱合は、ＤＭＡ中１０ｍＭのvcMMAE（５当量）をリザーバに添加し、また合計６０分間にわたり周囲温度で再循環させることによって開始した。
【０３５３】
未反応vcMMAEは、N-アセチルシステイン（ＮＡＣ、１０当量）をリザーバに添加することによって反応を抑えた。結果として生じた混合物を２０分間再循環させてから、最終洗浄ステップを行った。
【０３５４】
カラムは、１０ｍＭのトリス／２ｍＭのＥＤＴＡ／５％ＤＭＡのｐＨ７.５緩衝液の５ＣＶで、次いで１０ｍＭのトリス／２ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７.５緩衝液の５ＣＶで洗浄し、この後、ｐＨ３の０.１Ｍグリシンで１０ＣＶの段階溶離を使用して溶離した。ＵＶ分光光度計分析を用いて、Ｇ２５又はＴＦＦを介した最終緩衝液交換のために結合される、規模に応じた画分を含むタンパク質を決定した。すべてのＡＤＣは、５ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、０.０１％ツイーン２０にｐＨ６で調剤され、１ｍｇ／ｍｌに希釈された。
【０３５５】
ＨＩＣ、ＳＥＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラフィ方法を用いて、平均ＤＡＲ、還元パターン及びモノマー含有量を決定し、その後最終製剤を行う。ＲＰ−ＨＰＬＣによる残留溶剤及び残留vcMMAEの定量化は、Ｇ２５又はＴＦＦのいずれかの前に溜めた剥離画分に対して行った。
【０３５６】
直接比較として、３つの溶液相抱合は、トラスツズマブ及びvcMMAEを用いて同様にして実施した。トラスツズマブは、５００ｍＭのホウ酸塩、２５ｍＭのＥＤＴＡを用いてｐＨ８.２に調整した。ジスルフィドの部分的還元は、ＴＣＥＰを有するトラスツズマブ（抗体に関して１.９４当量）を９０分間２０℃でインキュベーションすることによって得られた。ＴＣＥＰを有する還元したトラスツズマブ（４.８５当量）の抱合は、３０分間２０℃で達成された。次に、ＮＡＣ（４.８５当量）により２０分間周囲温度で、過剰vcMMAEの反応を抑えた。抱合体は、小規模固相抱合用に使用される同一のＧ２５カラム／プロセスを用いて精製／製剤して、３.６±０.２の目標ＤＡＲにおけるトラスツズマブ−vcMMAE抱合体を結果として生じた。
【０３５７】
以下の表６におけるデータは、溶液相及び固相双方の合成が標的ＤＡＲを一貫して達成できることを実証している。しかし、様々な規模での固相合成から生じたデータと直接比較すると、溶液相から生じた抱合体の品質の方が低い。溶液相方法は、抱合体に測定可能なレベルの遊離毒素リンカー及び溶剤の双方を配給する。残留毒素リンカーは、抱合体を任意なインビトロ細胞検定に使用する前に更なる精製によって除去する必要がある。
【０３５８】
以下の表６のデータは、さらに溶液相抱合と固相抱合との間における重要な相違を際立たせている。固相方法論は、一貫して抱合体に検出不能なレベルの遊離毒素及び遊離溶剤を抱合体に配給する。要するに、固相技術は、抱合体の洗浄により余分な試薬を除去して純化するとともに、固相樹脂に固定化して純度の優れた抱合体を提供する。
【０３５９】
以下の表６は、固相方法及び溶液相方法により合成されたトラスツズマブ−vcMMAE抱合体の合成を比較及び対照する。
【表１０】
2017537975.tif 000022
【０３６０】
Ides/EndoH/DTT処理に続くＭＳ分析
表６からの選択した抱合体サンプルは、Ides（FabRICATOR（登録商標）、ジェノビス社製）、RemoveiT（登録商標） Endo S（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）及びＤＴＴでの処理に続くＭＳにより分析した。重複するイオンのシリーズは、素の及び抱合された（毒素）抗体断片よりなる断片質量を与えるよう解析し、この断片質量から信号強度を用いてＭＳによるＤＡＲを計算した。収集したデータを以下の表に示す。
【表１１】
2017537975.tif 000023
【０３６１】
このＭＳ技術を用いて計算した平均ＤＡＲは、トラスツズマブ−vcMMAE抱合体の合成に採用された種々の固相規模にわたり一貫している。さらに、ＭＳによるＤＡＲ及びＨＩＣによるＤＡＲは素晴らしく一致した。還元パターンは、素のＬＣ及びＦｄ断片対抱合したＬＣ及びＦｄ断片のための一貫した応答画分によって示されるように一貫している。この分析は、溶液相抱合体と固相抱合体との間における還元パターンの微妙な相違を際立たせている。溶液では、固相及び溶液相に対する異なる平均ＬＣ／ＬＣ+ｖｃＥ比によって示されるように、ＨＬジスルフィドでの還元が多い。
【０３６２】
抱合体の細胞死滅分析
表６からの選択した抱合体サンプルは、抗原陽性細胞死滅検定で効力を分析した。ＳＫ−ＢＲ３細胞をトリプシン／ＥＤＴＡとともに採取し、また次に検定媒剤で洗浄し、この後より多くの検定媒剤で０.９×１０５／ｍｌまで希釈する。この細胞ストックの１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、このプレートを３７℃／５％ＣＯ２で３時間培養し、細胞を定着させる。サンプル及び基準物は検定媒剤で適正となるよう希釈し、また１００μｌをウェルに適正に添加する。細胞／サンプルを７２時間培養し、この後、％細胞細胞毒性を市販のＬＤＨ検定キットを用いて測定した。
【０３６３】
ＳＫ−ＢＲ３ Ｈｅｒ２による陽性細胞死滅検定（ＬＤＨ検定）において、固相樹脂又は溶液内で形成されたか否かで等効力を示した。このデータを以下の表８にまとめて挙げる。
【表１２】
2017537975.tif 000024
【０３６４】
検定１は２つの複製サンプルで行った。検定２は３つの複製サンプルで行った。表８における平均の列は、検定１及び２からの５つすべてのデータポイントにおける平均である。
【０３６５】
この結果は、固相手段又は溶液相手段によって合成したＡＤＣ抱合体間で抗原陽性細胞死滅検定におけるＡＤＣ効能に相違がないことを示す。
【０３６６】
実施例７−ＳＭＣＣで予活性化したＤＭ１を有する固相ハーセプチン抱合体
この実施例は、固定化済み抗体は、予活性化したＤＭ１-ＳＭＣＣ細胞毒性薬剤リンカーでの修飾によってリジンの側鎖に抱合できることを実証している。この方法論は、抱合体産生のための「１ステップ手法」と称される。活性化したＤＭ１-ＳＭＣＣは、過剰なＤＭ１-ＳＨをＳＭＣＣでインキュベーションし、結合反応を完了まで駆り立てることによって調合し、次にこの生の混合物を抱合用に使用する。
【０３６７】
チオール機能化細胞毒素ＤＭ１は、ＤＭＡにおけるヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＣＣ（ＳＭＣＣに関して１.６当量のＤＭ１）により５時間にわたり周囲温度で予活性化した。理論的ＤＭ１-ＳＭＣＣ濃度は、ＤＭ１からＤＭ１-ＳＭＣＣへの１００％変換に基づいて決定される。
【０３６８】
Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂（１００μｌ）を、１又は２ｍｇのハーセプチンに装荷し、５０ｍＭのＮａＰｉ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡよりなるｐＨ６.７の修飾緩衝液（３６０μｌ）内に懸濁させた。ＤＭ１-ＳＭＣＣ薬剤リンカーをＤＭＡとともにスラリーに添加し、１０体積％の最終濃度にした。５、１０及び１５当量の３つの異なるＤＭ１-ＳＭＣＣ過剰分をｍＡｂ結合に関して使用した。抱合は回転体上において２時間周囲温度で撹拌した。
【０３６９】
抱合後に上澄みを除去し、また樹脂をこの後ＰＢＳ内で１０体積％のＤＭＡで、次にｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液のみで洗浄した。抱合体は、ｐＨ２.６の０.１Ｍコハク酸（２×５００μｌを周囲温度で５分間インキュベーション）によって樹脂から開裂させた。この結果として生じた抱合体をＵＶ及びＳＥＣ分析によって分析し、平均ＤＡＲ及びモノマー含有量を決定した。この結果を以下の表９にまとめて挙げる。
【表１３】
2017537975.tif 000025
【０３７０】
使用したＤＡＲとＤＭ１-ＳＭＣＣ過剰分との間で直線形的関係が観測されるとともに、増加するＤＭ１-ＳＭＣＣ過剰分がＤＡＲの増大を引き起こすことも観測された。ＤＡＲは、固相樹脂に対するハーセプチン装荷を増加させることによっても増大することができる。
【０３７１】
モノマーレベルは、すべての抱合体でＤＡＲに関係なく９９.５％より高いレベルである。
【０３７２】
実施例８−抗体薬剤抱合体の固相合成に対する化学修飾抗体の適用
この実施例は、固相抱合技術に関連して化学修飾抗体を用いるＡＤＣ合成について実証する。抗体は、インキュベーションし、また抱合プロセス後に樹脂に生ずる固相樹脂への結合前に、溶液内で化学的に還元する。
【０３７３】
ハーセプチン抗体（ＰＢＳ、ｐＨ７.４、２ｍＭＥＤＴＡ１ｍｇ／ｍｌの１ｍｌ）を、還元剤である１ｍＭのＴＣＥＰ（抗体に関して２当量）により９０分間周囲温度で還元した。
【０３７４】
Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂（１００μｌ）を、５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ８の緩衝液の４倍アリコートで洗浄した。過剰緩衝液を除去して湿った樹脂にし、この樹脂に対して、１ｍｌの還元したハーセプチンをＰＢＳ、ｐＨ７.４、２ｍＭのＥＤＴＡに充填した。この結果生じた抗体樹脂スラリーを回転体において３０分間周囲温度で撹拌した。次にこのスラリーを遠心分離し、上澄みを除去し、ＵＶによって分析し、減法吸収度によって抗体結合を決定した。抗体樹脂は、次に１ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７.４、２ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる緩衝液で洗浄した。洗浄画分も分析し、樹脂に結合した抗体の全体濃度を確認した。
【０３７５】
還元した抗体樹脂は、ＰＢＳ、ｐＨ７.４、２ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液（９５０μｌ）内に懸濁させた。ＤＭＡ（１０ｍＭ、３.３μｌ）内の細胞毒素薬剤リンカーｍｃＦ又はvcＭＭＡＥを樹脂スラリーに充填して、ＰＢＳ、ｐＨ７.４、２ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる媒剤において、全体で５体積％ＤＭＡとなるようにした。抱合反応は、回転体上における穏やかな撹拌とともに、３０分間周囲温度で進行させた。
【０３７６】
抱合反応は、ＮＡＣ（１０ｍＭ、３.３μｌ）のスラリーへの添加により反応を抑え、またこの結果生じた混合物を２０分間周囲温度で穏やかに撹拌した。
【０３７７】
樹脂は、この後濾過し、また２×５体積％ＤＭＡ  ｉｎ  ＰＢＳ、ｐＨ７.４で洗浄した。
【０３７８】
ＡＤＣ抱合体は、ｐＨ３の０.１Ｍグリシン（９８０μｌ）により５分間周囲温度で処理することによって、固相樹脂から剥離させた。樹脂スラリーは、この後遠心分離し、また上澄みを除去した。１Ｍのトリス緩衝液２０ｍｌを単独充填で上澄みに添加し、回収率を決定するためのＵＶ分析に適した１ｍｌサンプルを形成した。
【０３７９】
次に、Ｇ２５をパッキングしたカラムにおける脱塩前に、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によってサンプルを直接分析し、薬剤対抗体比（ＤＡＲ）を計算した。
【０３８０】
図６は、固相抱合からのＤＡＲ種の拡散を示す。このデータは、２８０ｎｍで正規化した２.２の平均ＤＡＲを計算する。図６のＨＩＣプロファイルは溶液相又は固相による確率論的抱合の特性である。
【０３８１】
実施例９−組み換え操作チオール抗体を用いる固相部位特異的抱合
この実施例は、組み換え操作したチオール抗体とともに固相樹脂を用いる抗体薬剤抱合体の合成を例示する。この実施例において、この組み換え操作した抗体は、ＴｈｉｏＭａｂ抗体技術（ジェネテック社製）に類似の部位特異的抱合技術を容易にする２つの付加的システイン残基を含む。
【０３８２】
操作したシステイン（V205C Kabatの番号付けをしている）を有する１ｍｌのハーセプチンを、５ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、及び０.０１体積％のＰＳ２０（濃度２０ｍｇ／ｍｌ）よりなる製剤緩衝液に供給した。１ｍｌの抗体溶液を、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液４ｍｌで希釈した。この結果生じた抗体溶液を、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液内で予め平衡状態にしたFabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂（沈降樹脂体積１ｍｌ）でインキュベーションした。この抗体は、スラリーの回転体における１０分間周囲温度での穏やかな撹拌により樹脂に結合した。
【０３８３】
操作したシステインを有する結合したハーセプチンを、相当過剰な還元剤ＤＴＴ（抗体に関して２０当量）で処理することによって完全に還元した。還元した懸濁液をローテーターで１６時間周囲温度で穏やかに撹拌した。樹脂は、次に５０ｍＭのトリス、２.５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８の緩衝液、２×５ｍｌで洗浄し、次に１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液２×５ｍｌですべてのＤＴＴ痕跡を除去した。樹脂は、最終的に１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液５ｍｌに懸濁させた。
【０３８４】
操作したシステインを有する固定化済み抗体は、次にＤＭＡ中のデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）（抗体に関して１０当量）を添加し、樹脂スラリーをローテーター上において１時間周囲温度で穏やかに撹拌することによって、再酸化した。ＤＭＡ中の細胞毒素薬剤リンカーvcMMAE（抗体に関して１０当量）の充填を、樹脂上の操作したシステインを有する固定化済み抗体に添加し、緩衝液混合物に５体積％ＤＭＡの最終組成を得た。抱合は、回転とともに１時間周囲温度で進行させた。
【０３８５】
この後過剰vcMMAEを樹脂スラリーから除去し、この除去は、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液内の５体積％ＤＭＡ３×５ｍｌで、次に１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５の緩衝液３×５ｍｌで樹脂を洗浄することによって行った。
【０３８６】
ＡＤＣ抱合体は、ｐＨ２.９６の０.１Ｍグリシン（５ｍｌ）で１０分間回転とともにインキュベーションすることによって、樹脂から剥離した。操作したシステイン−ｖｃＭＭＡＥ抱合体を有する剥離済みハーセプチンは、即座に高トラップ脱塩カラム（ＧＥ・ヘルスケア社製）を介して、５ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、０.０１体積％のＰＳ２０、ｐＨ６の緩衝液として製剤した。
【０３８７】
剥離した抱合体サンプルは、この後サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析し、モノマーレベルを決定した。疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）及びＲＰ−ＰＬＲＰを使用して薬剤対抗体比（Ｄｒｕｇ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算した。これら分析のデータを図７に示す。
【０３８８】
分析ＳＥＣクロマトグラフィは、組み換え修飾した抗体に関連する固相技術が、極めて高いモノマー含有量で明らかなように、優れた純度のＡＤＣ抱合体を生ずることを実証している。ＨＩＣプロファイルも、２.１の平均ＤＡＲ、０、１、２及びそれより高いＤＡＲの分布がＴｈｉｏＭａｂの公表されている結果と一致していることを示す。このことは、固相を使用して、操作した抗体内に操作したシステイン残基を取り込んだ部位特異性ＡＤＣを産生できることを実証している。
【０３８９】
実施例１０−DM1-SMCCを有する固相Herzuma（登録商標）及びCetuximab (Erbitux（登録商標）)抱合体
この実施例は、「１ステップ手法」による抗体薬剤抱合体の合成を実証している。Herzuma（登録商標）は、トラスツズマブ（ロッシュ社製のハーセプチン）におけるバイオ後続品であるモノクローナル抗体である。本明細書において、本発明者らは、予め適格化かつ活性化したＤＭ１毒素リンカーＭＣＣ-ＤＭ１の使用を介する固相抱合手法を用いて、抗体薬剤抱合体であるHerzuma（登録商標）-ＤＭ１を合成できることを実証する。
【０３９０】
ストックサンプル（２５.６ｍｇ／ｍｌ）からＰＢＳ、ｐＨ７.４の緩衝液で希釈することによって、３種類、すなわち２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌの濃度のHerzuma（登録商標）を調合した。これと並行して、ストックサンプル（１５.５ｍｇ／ｍｌ）からＰＢＳ、ｐＨ７.４の緩衝液で希釈することによって、３種類、すなわち２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌの濃度のCetuximab (Erbitux（登録商標）)を調合した。各サンプルのＵＶ吸収度測定は、２８０ｎｍ及び３２０ｎｍで行った。
【０３９１】
Fabsorbent（登録商標） F1P HF樹脂（１００μｌ）の６つの個別サンプルを、５０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ８の緩衝液４×５０μｌアリコートで洗浄し、上澄みを除去した。各抗体濃度における０.５ｍｌアリコートを樹脂により、ローテーター上における１時間にわたる穏やかな撹拌とともに周囲温度でインキュベーションした。別途、各樹脂サンプルを遠心分離し、上澄みを除去した。各上澄みをＵＶによって２８０ｎｍ及び３２０ｎｍで分析した。各樹脂上の抗体の添加は、減法UVで決定した。各樹脂は、この後ＰＢＳの１アリコートで洗浄し、いかなる余分な抗体をも除去した。
【０３９２】
抱合緩衝液は、３つの別個のｐＨで、すなわち、０.１ＭのＮａＰｉ、ｐＨ７.５の緩衝液、０.１ＭのＮａＰｉ、ｐＨ８の緩衝液、及び０.１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８.５の緩衝液として調製した。結合済み抗体を有する樹脂サンプルを、各緩衝液で個別にインキュベーションした。
【０３９３】
各スラリーに対して毒素リンカーＭＣＣ-ＤＭ１をＤＭＡに充填した。抗体に関して５〜１０当量範囲にわたるＭＣＣ-ＤＭ１の過剰当量を使用した。総じて、ＭＣＣ-ＤＭ１充填により、緩衝液における５体積％ＤＭＡの抱合媒剤を生じた。
【０３９４】
抱合反応は、ローテーター上における穏やかな撹拌とともに２時間にわたり周囲温度で実施した。
【０３９５】
この持続時間後に、上澄みを除去し、各樹脂を、ＰＢＳ，ｐＨ７.４における５体積％ＤＭＡの４×５０μｌで、次いでＰＢＳ，ｐＨ７.４の３×５０μｌで洗浄した。
【０３９６】
抗体薬剤抱合体は、各樹脂を、ｐＨ３の０.１Ｍグリシン内の５０体積％プロピレングリコール５０μｌにおいて、３０分間周囲温度でインキュベーションすることによって固相樹脂から除去した。上澄みを個別に捕集して、ＳＥＣによって２１４ｎｍで分析し、収率及びモノマー含有量を決定した。２５２ｎｍ及び２８０ｎｍでのＳＥＣ分析は、ＤＡＲ計算を容易にした。固相樹脂から除去した直後における抱合体のデータを、以下の表１０に（溶離）で示す。
【０３９７】
【表１４】
2017537975.tif 000026
【０３９８】
すべての抱合体は、この後脱塩して製剤緩衝液にした。Herzuma（登録商標）抱合体に対しては、５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、０.０１％ＰＳ２０、ｐＨ６の製剤緩衝液を採用した。Cetuximabに対しては、２０ｍＭコハク酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５.５の製剤緩衝液を採用した。
【０３９９】
すべての抱合体は、ＮＡＰ５カラムを用いて脱塩した。脱塩後のサンプルは、次いでＳＥＣクロマトグラフィによって再分析し、最終物質におけるモノマー純度を決定した。製剤緩衝液における最終抱合体のデータを表１０に（製剤）で示す。
【０４００】
Herzuma（登録商標）-MCC-DM1及びCetuximab-MCC-DM1の抱合体に対するＳＥＣトレースを図８に示し、高いモノマー含有量を示している。
【０４０１】
データは、一貫して、固相抱合技術を用いて高いモノマー生成物が得られることを示している。毒素リンカー過剰分を変化させることによって、ＤＡＲが変動する様々な抱合体を容易に得ることができる。
【図１】
2017537975.tif 000027
【図２】
2017537975.tif 000028
【図３】
2017537975.tif 000029
【図４−１】
2017537975.tif 000030
【図４−２】
2017537975.tif 000031
【図５−１】
2017537975.tif 000032
【図５−２】
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【図６】
2017537975.tif 000034
【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月21日(2017.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
より最近では、デュオカルマイシン（www.syntarga.com）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ：pyrrolobenzodiazepine）二量体（www.spirogen.com参照）、及びα-アマニチン（www.heidelberg-pharma.com参照）に基づく細胞毒性毒素ペイロードは抗体に抱合されており、また予備臨床評価を受けている。これら新しい毒素クラスは、先行の細胞毒性薬剤クラスよりも一層疎水性であり、また抗体と抱合するとき確率論的に一層凝集を受け易い（非特許文献６参照）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
天然鎖間ジスルフィド結合の還元後の遊離チオールとの抱合は、市販ＡＤＣであるADCetris（登録商標）に採用される抗体抱合及び化学的性質に対する共通の手法である。プロセスは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、メルカプトエチルアミンのような還元剤、又は当業界でよく知られている他の適当な還元剤に抗体を接触させるステップを備え、これに続いて薬剤、リガンド、標識との化学式Ｄ−Ｘで表される抱合ステップが行われ、ここでＤは、薬剤、リガンド又は標識であり、またＸは、マレイミド、ハロアルカン、ピリジルジスルフィド、エン、ビニルスルホン、bis-スルホン、アクリル酸塩、及び従来既知の他のチオール反応性化学物質から選択した反応基である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
抗体とのチオール抱合に対する代替的手法は、抗体の特定部位における反応性システイン残基を（遺伝子的に）操作して、薬剤、リガンド又は標識が、鎖間ジスルフィド結合を分裂させることなく、規定の化学量論で抱合できるようにすることである。操作したシステインは、システイン又はグルタチオンの混合ジスルフィドとして存在することがよくある。付加物は、完全な還元後に透析濾過によって除去する。このことは鎖間ジスルフィドを破壊し、この鎖間ジスルフィド結合は、空気、ＣｕＳＯ４又はデヒドロアスコルビン酸を用いた酸化によって再形成しなければならない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
実施形態において、固定化済みの生体分子（すなわち、捕捉樹脂に固定化された生体分子）を洗浄して、捕捉樹脂に固定化されなかったいかなる生体分子をも除去する。固定化済みの生体分子の洗浄は、新鮮な溶剤ですすぎ洗いすることによってなすことができる。例えば、固定化済みの生体分子の洗浄は、ＰＢＳのような緩衝溶液ですすぎ洗いすることによってなすことができる。随意的に、固定化済みの生体分子のすすぎ洗いは、ＥＤＴＡのようなキレート剤の存在下で行う。代案として、固定化済みの生体分子の洗浄は、リン酸ナトリウム緩衝剤、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む「修飾緩衝液」ですすぎ洗いすることによってなすことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号の開示に記載の構造による構造を有する。捕捉樹脂の構造に関連する米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。米国特許出願公開第２０１１／００４６３５３号は、産生媒剤からの断片抗体（ｆＡｂ）の精製を開示している。断片抗体はプロテインＡ媒剤において精製できない。ｆＡｂは、抗原に結合できる結合ドメインを有するものとして特徴付けされ、多くの実施形態において、１つの重鎖（Ｖｈ）又はその重鎖の機能性断片、及び１つの軽鎖（Ｖｌ）又はその軽鎖の機能性断片、とともに少なくとも１つの他の鎖から構成されると記載されている。ｆＡｂのための親和性リガンドは以下の化学式、すなわち、
【化７】
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の分岐トリアジル骨格からなるものと定義されており、ここでＱは、随意的にスペーサモチーフを有する固体支持体マトリクスに対する付着ポイントを表し、基Ａ及びＢは、水素結合できる１つ以上の置換基、好適には−ＯＨ、−ＳＨ、又は−ＣＯ２Ｈのうち１つ以上で置換したフェニル基又はナフチル基である。プロメティック・バイオサイエンシズ社からMAbsorbent A1P及びMAbsorbent A2P及びFAbsorbent F1Pの商品名の下で市販入手可能な支持親和性リガンドを用いて優れた結果が報告されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
抗体構造の基本単位は、少なくとも２０，０００ダルトン、例えば、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体である。抗体は、長さが少なくとも９００個のアミノ酸、例えば１４００個のアミノ酸である。抗体は、非共有結合性会合及びジスルフィド結合の双方によって架橋した２個の同一軽鎖及び２個の同一重鎖から構成されていてもよい。重鎖及び軽鎖それぞれは、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有する。各重鎖は約５０，０００ダルトンである。各重鎖は、長さが少なくとも３００個のアミノ酸、例えば、長さが約４５０個のアミノ酸である。抗体は、重鎖のみを有する抗体であり得る。各軽鎖は約２０，０００ダルトンである。各軽鎖は、長さが少なくとも１００個のアミノ酸、例えば、長さが約２５０個のアミノ酸である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）は、天然由来の抗腫瘍抗生物質のクラスである。ピロロベンゾジアゼピンはストレプトマイセスで発見されている。ＰＢＤｓは、プリン・グアニン・プリンの単位に特異的な副溝におけるＤＮＡに共有結合することによって、その抗腫瘍活性を発揮する。アミナール結合を介してグアニンのＮ２に挿入し、それらの形状に起因してＤＮＡ螺旋に対して最小分裂を引き起こす。ＤＮＡ−ＰＢＤ付加物形成は、核酸合成を阻害し、またＤＮＡ螺旋に切除による一本鎖及び二本鎖破壊を引き起こす。合成誘導体として、可撓性ポリメチレンのテザーを介する２つのＰＢＤ単位の結合によれば、ＰＢＤ二量体を対向するＤＮＡ鎖を架橋して、高度な致死傷害を生ずることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
抱合体の細胞死滅分析
表６からの選択した抱合体サンプルは、抗原陽性細胞死滅検定で効力を分析した。ＳＫ−ＢＲ３細胞をトリプシン／ＥＤＴＡとともに採取し、また次に検定媒剤で洗浄し、この後より多くの検定媒剤で０.９×１０５／ｍｌまで希釈する。この細胞ストックの１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、このプレートを３７℃／５％ＣＯ２で３時間培養し、細胞を定着させる。サンプル及び基準物は検定媒剤で適正となるよう希釈し、また１００μｌをウェルに適正に添加する。細胞／サンプルを７２時間培養し、この後、％細胞細胞毒性を市販のＬＤＨ検定キットを用いて測定した。
【国際調査報告】
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