(57)【要約】Ｔ細胞エピトープのレパートリーの効率的かつ組織的な同定のための方法及びシステムが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
【請求項２】
５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、請求項１に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項３】
５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、請求項１に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項４】
それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分であって、前記発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む、単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞の前記発現産物を発現する、膜結合部分。
【請求項６】
微小胞またはエキソソームである、請求項４または５に記載の細胞の膜結合部分。
【請求項７】
前記細胞が、前記免疫グロブリンＦｃドメインの配列を含む前記発現産物を発現する、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項８】
前記細胞が、前記蛍光タンパク質を含む前記発現産物を発現する、請求項４、５、または６のいずれか一項に記載の、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項９】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項１０】
前記異種核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１〜３、７、８、または９のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項１１】
前記発現産物が、前記哺乳動物膜貫通ドメインに関してＣ末端側であるウイルスパッケージング配列を更に含む、請求項４〜９のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項１２】
ウイルス様粒子である、請求項１１に記載の細胞の前記発現産物を発現する膜結合部分。
【請求項１３】
前記β２ミクログロブリンがヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項１４】
主要組織適合性複合体重鎖配列がヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項１５】
膜貫通ドメインが、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項１６】
少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む、複数の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の複数の膜結合部分。
【請求項１７】
少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む、請求項１６に記載の複数のもの。
【請求項１８】
コードされた前記ペプチドが、１つの九量体若しくは複数の九量体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、若しくは前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、または、請求項１６若しくは１７に記載の複数の単離された懸濁適合細胞若しくは膜結合部分。
【請求項１９】
コードされた１つのペプチド若しくは複数の前記ペプチドが前記細胞の細胞外表面上に提示される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、若しくはその膜結合部分、または、請求項１６、１７、若しくは１８のいずれか一項に記載の複数の単離された懸濁適合細胞若しくはその膜結合部分。
【請求項２０】
前記発現産物を発現する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞の膜結合部分。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項２２】
異種核酸が前記ウイルスパッケージング配列をコードし、かつ、前記細胞が、前記異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされる、請求項１０〜１９、または２１のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項２３】
それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合する、請求項２２に記載の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【請求項２４】
前記細胞がレトロウイルストランスフェクションシステムを用いてトランスフェクトされる、請求項２３に記載の（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【請求項２５】
前記トランスフェクションがレンチウイルストランスフェクションシステムを用いて実施される、請求項２３に記載の（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【請求項２６】
前記レトロウイルストランスフェクションシステムがパッケージングプラスミドを含み、前記パッケージングプラスミドがその中に、１つまたは複数のエンベロープタンパク質をコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列の代わりに、
５〜２０アミノ酸のペプチドをコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む、請求項２３、２４、または２５のいずれか一項に記載の（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【請求項２７】
前記細胞から出芽した、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
【請求項２８】
前記細胞から出芽した、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の単離されたウイルス様粒子。
【請求項２９】
組換えレトロウイルスである、前記細胞から出芽した単離された請求項２７に記載のウイルス。
【請求項３０】
複数の請求項２７または２９に記載の単離されたウイルス。
【請求項３１】
複数の請求項２８に記載の単離されたウイルス様粒子。
【請求項３２】
それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっている複数のウイルスを含む、前記複数の単離されたウイルス。
【請求項３３】
それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっている複数のウイルス様粒子を含む、前記複数の単離されたウイルス様粒子。
【請求項３４】
５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸。
【請求項３５】
前記蛍光タンパク質をコードする前記オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の組換え核酸。
【請求項３６】
前記免疫グロブリンＦｃドメインをコードする前記オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の組換え核酸。
【請求項３７】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項３４、３５、若しくは３６のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項３８】
前記組換え核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項３９】
ベクターである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項４０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３９に記載の組換え核酸。
【請求項４１】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項４０に記載の組換え核酸。
【請求項４２】
前記ベクターがプラスミドである、請求項４１に記載の組換え核酸。
【請求項４３】
前記核酸がｃＤＮＡを含む、請求項１〜１５、１８、１９、２１、若しくは２２のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または請求項１６および１７のいずれか一項に記載の複数の単離された懸濁適合細胞、または請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項４４】
５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
【請求項４５】
それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分であって、前記発現産物が組換えポリペプチド構築物を含み、前記組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを有する、アミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
【請求項４６】
５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
【請求項４７】
前記第３のアミノ酸リンカーが発現後に自己切断する、請求項４４または４６に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項４８】
それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインによって物理的に会合する、請求項４６に記載の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、前記組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有するアミノ酸配列に、一つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【請求項４９】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項４４、４５、４６、若しくは４７のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞または請求項４８に記載の（ｉ）ウイルス様粒子若しくは（ｉｉ）ウイルス。
【請求項５０】
前記異種核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項４４または４７に記載の単離された懸濁適合細胞。
【請求項５１】
前記事前に選択された第２のペプチドが、Ｔ細胞調節ドメイン、抗体エピトープ、蛍光タンパク質、核酸結合タンパク質、または同時調節タンパク質である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞または請求項４８若しくは４９に記載の（ｉ）ウイルス様粒子若しくは（ｉｉ）ウイルス。
【請求項５２】
５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸。
【請求項５３】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項５２に記載の組換え核酸。
【請求項５４】
前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項５２または５３に記載の組換え核酸。
【請求項５５】
Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、各々の細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、前記発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、前記複数の単離された懸濁適合細胞または前記膜結合部分が前記細胞または前記膜結合部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分とを接触させる工程であって、前記発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、前記複数の単離された懸濁適合細胞またはその膜結合部分が前記細胞または前記部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【請求項５７】
複合体を形成しているＴ細胞がフローサイトメトリーにより回収される、請求項５４または５６に記載の方法。
【請求項５８】
配列決定する工程の前に、回収した前記ＤＮＡを増幅する工程を含む、請求項５５、５６、または５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅する工程が、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行われる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ユニバーサルプライマーの１つ以上が、前記異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、前記細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔ細胞が、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の単離された懸濁適合細胞の前記ＤＮＡにおける前記５〜２０アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収した前記ＤＮＡでは濃縮されている、前記ＤＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドのいずれかを同定して、それにより、１つ以上の免疫優性のＴ細胞エピトープを同定する工程を更に含む、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記単離された懸濁適合細胞がＨＥＫ細胞である、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記単離された懸濁適合細胞が使用される、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記発現産物を発現する前記細胞である懸濁適合細胞の単離された前記膜結合部分が使用される、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子またはウイルスとを接触させる工程であって、前記細胞または前記膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、前記発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、前記複数の単離された懸濁適合細胞、または前記細胞の前記膜部分に会合した複数の前記ウイルス様粒子若しくは複数の前記ウイルスが前記細胞または前記ウイルス様粒子若しくは前記ウイルスの中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、複数のウイルス様粒子と、または複数のウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、前記ウイルス様粒子または前記ウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【請求項６９】
Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または、そのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、前記発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、前記複数の単離された懸濁適合細胞、前記ウイルス様粒子、または前記ウイルスがそれらの細胞の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合したウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、または、前記ウイルス様粒子若しくは前記ウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【請求項７０】
複合体を形成しているＴ細胞がフローサイトメトリーにより回収される、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
配列決定する工程の前に、回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを増幅する工程を含む、請求項６８、６９、または７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記増幅する工程が、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行わる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ユニバーサルプライマーの１つ以上が、前記異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、前記細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞が、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む、請求項６８〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象がヒトである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記複数の単離された懸濁適合細胞の前記ＤＮＡにおける前記５〜２０アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収した前記ＤＮＡでは濃縮されている、前記ＤＮＡにコードされた前記５〜２０アミノ酸のペプチドのいずれかを同定し、それにより、１つ以上の免疫優性Ｔ細胞エピトープを同定する工程を更に含む、請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
（ｉ）複合体を形成しているＴ細胞と、Ｔ細胞表面マーカー分子に対して作製された抗体または抗体フラグメントを磁気ビーズの外部表面に結合させた前記磁気ビーズとを接触させること、および（ｉｉ）前記磁気ビーズを回収するように前記ビーズに磁場を印加することにより、前記複合体を形成しているＴ細胞が回収される、請求項５５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｔ細胞表面マーカー分子がＣＤ８分子である、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記懸濁適合細胞またはその膜部分が前記蛍光タンパク質を発現し、かつ複合体を形成しているＴ細胞が、前記蛍光タンパク質の蛍光に基づく蛍光活性化細胞選別により回収される、請求項５５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ウイルス様粒子または前記ウイルスが、二次抗体ベースシステムにより回収され、前記二次抗体が、発現した前記構築物中のエピトープに対して作製されている、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１４年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／９２９，６５１号の利益を主張し、本内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、ＮＩＧＭＳ、国立衛生研究所により授与された認可番号３Ｕ５４ＧＭ０９４６６２−０２及び５Ｕ０１ＧＭ０９４６６５−０２の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本出願を通して、様々な出版物が角括弧で参照される。これらの参考文献の完全な引用は、明細書の最後に見出すことができる。本発明が関連する先行技術をより十分に説明するために、これらの出版物、並びに本明細書において参照される全ての特許、特許出願公開、及び書籍の開示は、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
臨床的に重要な疾患状態及び治療への差動応答に関連する分子署名を同定するためのゲノム技術［１３〜１５］及びプロテオミクス技術［１６−１９］の開発及び応用は、過去１０年間に著しく成長している。これらの進歩により、診断が個別化される可能性がある［２０］。一例として、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、試料内のＴＣＲレパートリーの完全な分析を研究者に提供するため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖の超可変ドメインの高スループットシークエンシングを利用する［２１］。このベンチャーキャピタルが出資する取り組みは現在、バイオマーカー発見のために３億ドルが見積もられた市場深度を有する出来高払いの事業である。高スループット技術の急速な進歩は、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体、治療用タンパク質、及びペプチド）の段階的な臨床開発と並行して行われ［２２〜２５］、免疫媒介性疾患の治療に革命をもたらした。例えば、主に抗体反応を介して免疫力を高める従来のワクチンとは異なり、Ｇｅｎｏｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、細胞内病原体に対する強固なＴ細胞応答を引き起こすことに焦点が置かれた、新規の生物製剤ベースのワクチンを開発している。同様に、欧州のバイオテクノロジー企業のＡｐｉｔｏｐｅ社は、Ｔ細胞が重要な病原性の役割を果たす自己免疫疾患の治療のための治療用ペプチドを開発している。Ａｐｔｉｏｐｅ社は最近、治療用の主力ＭＳペプチドの継続的な開発のためにＭｅｒｃｋ−Ｓｅｒｏｎｏ社と提携した。Ｔ細胞免疫をモニター、強化、または変更しようとする試みは、臨床的に関連するＴ細胞エピトープを同定する能力に大きく依存する。
【０００５】
ＣＤ８媒介の適合免疫応答を含む分子事象の中核には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、Ｔ細胞エピトープと呼ばれる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により非共有結合的に提示される小ペプチド抗原との関与がある。これは、免疫系の標的化機構を示し、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能のために必要な分子間相互作用である。Ｔ細胞の発生の間、ゲノム編集処理は、３００万個以上の非反復配列の推定深さを有する、すべての免疫細胞上の固有のＴＣＲの発現をもたらし［１］、かつＴ細胞が応答することができる抗原の膨大な多様性を占めている。しかし、Ｔ細胞エピトープは従来、各々のＴＣＲが、特異性に対して、及び更なる研究のためのカスタム試薬の開発（例えば、四量体）に対して、個々の特性評価を必要とするため、研究が困難であった。臨床的には、この課題は、免疫応答が、一般的には、多数のＴ細胞特異性、例えば、単一の病原体応答のためのウイルス除去に効果をもたらすための標的となる複数のウイルス抗原を伴うという事実により悪化する。それ故、所与の疾患状態のためにエピトープ全体のアンサンブルを体系的に識別する能力は、診断法の開発、並びに感染症、自己免疫、及び癌に対する潜在的な標的をかなり絞った治療薬の開発のための独自の機会ということになる。
【０００６】
発現［３，４］及び合成ペプチドライブラリー［５，６］、位置スキャンライブラリ［７］、ｐＭＨＣマイクロアレイ［８］のスクリーニング、並びに自然発生するエピトープの質量分析同定［９〜１１］を含む、エピトープ発見のための実験的手法が多数存在する。Ｍａｒｒａｃｋ及びＫａｐｐｌｅｒは、潜在的なペプチドミモトープのライブラリーに共有結合したＭＨＣクラス−Ｉ分子のためのディスプレイプラットフォームとして、バキュロウイルス感染昆虫細胞戦略を開発した［４］。ミモトープは、未知のペプチドエピトープの配列と異なるが、それにもかかわらず、特異的ＣＤ８Ｔ細胞受容体により認識される。しかし、多くの場合、同定されたミモトープを天然エピトープに結合させることは困難である。また、バキュロウイルスディスプレイシステムは、同族ＴＣＲを精製して四級化するための要件と相まって、ミモトープを溶解するために、細胞選別、ウイルス発生、拡大、及び再感染に５〜１０回の時間のかかるラウンドを必要とする。部分的にこれらの問題に対処することにより、Ｎｅｗｅｌｌらは、驚異的な感度を有するヒト血液試料から直接、ｐＭＨＣ四量体の組み合わせの小さなセットをスクリーニングするために、フローサイトメトリー及び質量分析と組み合わせた従来のＭＨＣ四量体の重同位体タッギング（マスサイトメトリーと呼ばれている）を活用したが、この技術では、現在、そのような組み合わせは、アッセイ１回あたり約１００個までに限定されている［１２］。これらの手法のそれぞれは、Ｔ細胞エピトープに対する貴重な洞察に寄与しているが、これらの方法は、時間のかかる労働集約型であり、高いユーザ熟練度を必要とする。
【０００７】
本発明は、Ｔ細胞エピトープのレパートリーの効率的かつ体系的同定のための新規で改良された技術の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞を提供する。
【０００９】
本発明はまた、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する、単離された懸濁適合細胞を提供し、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
これに隣接する８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む。
【００１０】
また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含む、組換え核酸が提供される。
【００１１】
また、Ｔ細胞と、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞がそれらの細胞の中で、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
回収したＴ細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。
【００１２】
また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００１３】
また、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する、単離された懸濁適合細胞が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む。
【００１４】
５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む、組換え核酸が提供される。
【００１５】
また、Ｔ細胞と、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞がそれらの細胞の中で、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することに可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
回収したＴ細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピドープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。
【００１６】
また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００１７】
また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む。
【００１８】
また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む。
【００１９】
また、複数の単離された懸濁適合細胞、または、複数の発現産物を発現するような細胞の膜結合部分が提供され、当該複数が、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。
【００２０】
本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞により産生される、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスが、それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合し、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む。
【００２１】
また、記載された複数のウイルス様粒子または記載された複数のウイルスが提供される。
【００２２】
また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。
【００２３】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００２４】
また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０のアミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。
【００２５】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００２６】
それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合する、請求項４６に記載の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
【００２７】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。
【００２８】
Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、各々の細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞または膜結合部分がこれらの細胞または膜結合部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【００２９】
Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現し、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞またはその膜結合部分がこれらの細胞または部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【００３０】
Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む単離された懸濁適合細胞、またはこのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または細胞の膜部分に会合した複数のウイルス様粒子またはウイルスがこれらの細胞またはウイルス様粒子またはウイルスの中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、複数のウイルス様粒子と、または複数のウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子またはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【００３１】
Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、複数のウイルス様粒子、またはウイルスがそれらの細胞の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合したウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子またはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの高スループット同定のための「ｅｐｉＣＥＬＬ」免疫モニタリングプラットフォームの概要を示す。ｓｃ−ｐＭＨＣベクターのライブラリーを、プールして、ｅｐｉＣＥＬＬプールを産生する懸濁適合ＨＥＫ２９３細胞に、まとめてトランスフェクトする。プールされた発現ライブラリーは、患者由来の末梢Ｔ細胞と混合し、複合体を形成できるが、これは、磁気分離により、または従来のフローサイトメトリー選別法により回収される。磁気ビーズは、使用される場合、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ８、及びＭｉｌｔｅｎｙｉからのＣＤ８マイクロビーズ（ＭＡＣＳ）を含む、任意の商業的供給源から得ることができる。例えば、全血液、骨髄、軟膜、単核細胞（ＭＮＣ）、及び組織消化物を含む、任意の試料から直接ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の容易な単離または枯渇を可能にする抗ヒトＣＤ８抗体と結合した超常磁性ビーズである。濃縮されたプールメンバーからのエピトープ配列は、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、取得プロセスにより濃縮されたエピトープを同定するために、次世代の大規模シークエンシングに供する。
【図２】膜結合型クラスＩ  ｓｃ−ｐＭＨＣ構築物のデザインである。構築物は、直後に候補エピトープ（ペプチドと表記）が続き、これがさらに、リンカー領域（第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカーのそれぞれに対しての４個の反復ＧＧＧＧＳ、及び任意に蛍光タンパク質とＨＣ  ＴＭとの間の第４のリンカーとしての２個の反復ＧＧＧＧＳ）を介して、天然Ｂ２Ｍ分子、ヒトＨＬＡ−Ａ０２：０１、及び表面に露出したｍＣｈｅｒｒｙの発現プロキシに結合されている、ヒト天然Ｂ２Ｍリーダー配列を用いている。全体の構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＨＣ  ＴＭ）を介して膜に保持されている。ユニバーサルプライマー（順方向、逆方向として表示）は、疾患関連エピトープを直接同定するために、Ｔ細胞投与後、非反復２７ヌクレオチド配列（九量体ペプチド）を増幅するために使用される。
【図３】ＭＨＣ対照の表面発現の検証である。本発明者らのｓｃ−ｐＭＨＣ  ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームに表示される４つの独立したウイルス性病原体に結合された、４つの既知の病原性ＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープの発現の検証である。検査される構築物は、ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質の残基４９５〜５０４［ＣＭＶ］、インフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６［ＦＬＵ］、ＨＴＬＶ  Ｔａｘ  １１〜１９［ＨＴＬＶ］、及びＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ１７  ７６〜８４［ＨＩＶ］である。構築物の表面発現は、ｍＣｈｅｒｒｙのプロキシ発現及び抗ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現をモニターする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により検証された。特に、この図の作成の後に、追加（第５）の対照エピトープは、同定され、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１残基２５９〜２６７［ＥＢＶ］に設定されたコードを試験するために加えられた。ＥＢＶの表面発現プロファイルは、他の４つの対照で観察されるものを反映している（データは図示せず）。
【図４】適切な折り畳み及びＭＨＣ対照のエピトープ提示の検証である。ここでは、Ｗ６／３２抗ＭＨＣクラスＩ  ｍＡｂを使用した、クラス−Ｉ  ＨＬＡ：Ｂ２Ｍ錯体の原形質膜表面染色が示され、１）クラスＩ  ＭＨＣの内因性発現（親として表示）；２）天然ヒトＢ２Ｍの５'ＵＴＲをターゲットにするｓｈＲＮＡのレンチウイルス送達による約９５％ノックダウン（ノックダウン）；及び３）本発明者らのｓｃ−Ｐ構築物の添加時のクラス−Ｉ  ＭＨＣ発現のレスキュー（レスキュー）が図示されている。特に、このように５'ＵＴＲを含有していない構築物は、ｓｈＲＮＡの下方制御に影響されない。使用したｍＡｂ  Ｗ６／３２では、ＭＨＣ及びＢ２Ｍの両方が適切に折り畳まれ、かつ膜が結合のため局在化されることが必要である。
【図５】ＨＥＫ細胞におけるＴＣＲ発現及び膜局在化のために使用された構築物である。対照ＴＣＲの発現を可能にするために、１つのレンチウイルス構築物が、種々のウイルス２Ａペプチドにより結合された完全なＣＤ３遺伝子カセット（上部）を保有する、レンチウイルスの同時形質導入技術を用いた。使用された２Ａ「自己切断型」ペプチドは、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、及びウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）に由来したものであった。第２の構築物（下部）は、ブタテシオウイルス−１（Ｐ２Ａ）ペプチドで結合されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖を担持して、各鎖の化学量論的な発現を可能にするが、これは、このペプチドが、哺乳動物細胞で最も高い「切断」効果を示すためである［２］。ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（ＢＬＵＥ）発現プロキシは、β鎖の膜貫通セグメントに従う。
【図６】ＨＥＫ細胞の原理証明研究における、活性ヘテロダイマーＴＣＲの制御構造の表面発現を示す。これは、上述のＨＬＡ分子について５個の同族ＴＣＲ（ＴＣＲ  ＲＡ１４［ＣＭＶペプチドに特異的に結合する］、ＪＭ２２［ＦＬＵ］、ＡＳ０１［ＥＢＶ］、Ａ０６［ＨＴＬＶ］、及び１８０３［ＨＩＶ］）を用いる。表面発現及び活性Ｔ細胞複合体の形成は、表面抗−ＣＤ３（ＦＩＴＣで標識：ｘ軸）、表面ＭＨＣ五量体染色（フィコエリトリン［ＰＥ］、ｙ軸）に対するＦＡＣＳ分析により確認した。形質導入されていない細胞は、陰性対照（ＣＮＴＲＬ）として使用した。
【図７】ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの初期検証のために配置された細胞−細胞のＦＡＣＳ分析である。５個のＴＣＲ（ＲＡ１４、ＪＭ２２、ＡＳＯｌ、１８０３、Ａ０６）は、個別に５個の同族ｓｃ−ｐＭＨＣ  ｅｐｉＣＥＬＬ（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）を補完するために発現した。細胞質ｍＣｈｅｒｒｙを（ＣＹＴＯ）及び表面が発現したｍＣｈｅｒｒｙ（ＭＨＣ、ＳＴＡＬＫなし）は、陰性対照として使用した。個人及び混合集団のＦＡＣＳ分析からのヒストグラムは、同族ＭＨＣ：ＴＣＲペアを発現する細胞が両方存在し、かつ従来の五量体投与と相関するとき（図６）にのみ特定の細胞間相互作用を表すシグナルが、顕著に増加したのを明示した（Ａ０６：ＨＴＬＶ相互作用の１００倍）。正の相互作用は赤い矢印でマークされている。
【図８】ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの結果である。２つのｅｐｉＣＥＬＬ構築物（ＣＭＶ及びＦＬＵ）は、プールされ、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（ＪＭ２２）とともに投与され、形成された複合体において選別された（ＴＣＲ発現プロキシとしてｅｐｉＣＥＬＬ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎを追跡するために、ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現プロキシを使用した）。（蛍光タンパク質は、磁気分離が使用されているとき、構造物の必要な部分ではないが、手動または低スループットプロセスのためには便利である）。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、そしてエピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。事前選別されたｅｐｉＣＥＬＬプール（Ｐｒｅとして表示）及びＪＭ２２が投与されたセットに対して得られたＰＣＲバンドが（上部）に示されている。これらのアンプリコンは、ライブラリーの調整のために提示され、続いて、次世代シークエンシングがイルミナＭｉＳｅｑプラットフォーム上で実施された。シークエンシングファイルを分析して、エピトープを容易に同定した。各々に対して、観察されたエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ読み取りの割合として計算され、標準化された。標識は、ＣＭＶ及びＦＬＵ（下）のための病原体のエピトープを表す。
【図９】５個のｅｐｉＣＥＬＬ構築物（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）をプールし、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（Ｒ１４、ＪＭ２２、ＡＳ０１、Ａ０６）とともに投与し、形成した複合体において選別した（ＴＣＲ発現プロキシとしてｅｐｉＣＥＬＬ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎを追跡するために、ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現プロキシを使用した）。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りに隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドのためのバイオアナライザーの出力は、事前選別されたｅｐｉＣＥＬＬプール（Ｐｒｅとして表示）及びＴＣＲ投与セットのために（上部）に示されている。これらのアンプリコンはライブラリーの調整のために提示され、続いて、次世代シークエンシングを、イルミナＭｉＳｅｑプラットフォーム上で実施した。シークエンシングファイルを分析して、エピトープを容易に同定した。事前選別した集団（ライブラリー）内で同定されたエピトープは、１６〜２３％の範囲内であった（データは図示されず）。ＴＣＲ投与セットデータそれぞれでは、すべての観測したエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ読み取りの割合として計算されて標準化され、かつＺスコアを計算するために使用された。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｅｐｉＣＥＬＬ及びその誘導体、例えば、ビラトープにおいて使用するための、例示的な代替の表面発現構築物である。変異体は、直後に候補エピトープ（ペプチドとして表示）が続き、これがさらに、リンカーＬ１を介してＢ２Ｍ分子に結合されている、天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列を用いている。１０Ａ：Ａ（ｌ）は、先端のＣ末端にウイルスパッケージングシグナル（例えば、ＧＰ４１のｅｎｖ残基７０６〜７１３など、ＶＰとして表示）を付加した「従来の」ｅｐｉＣＥＬＬベースの提示に類似する。二価の表示を可能にするために、Ｆｃ融合ベースの構築物は、用いられてＡ（２）、再度、ＶＰパッケージングシグナルで終了する。この例では、従来の抗体用のエピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等）は、表面検知を可能にするためにリンカーＬ４に配置されている。最後に、ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームのモジュール性／柔軟性を高めるために、ｓｙｎＴａｃベースの発現構築物が用いられる。ｓｙｎＴａｃは、ＭＨＣを、ペプチド及びタンパク質の両方を様々な末端（例えば、Ａ（３）及び図式的にパネル１０Ｂに示されている構築物）に融合することにより、重鎖と軽鎖のそれぞれに分割する。全ての成分が、真核細胞（例えば、ＨＥＫ、ＣＨＯ）及び自己組織化内で産生中に会合する。個々の鎖は、ジスルフィド結合（赤線で示す）を介して共有結合的に連結されている。すべての構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＴＭ）を介して膜に保持される。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ及びビラトープ粒子からの次世代配列を示す。各ビラトーププールからのゲノムＲＮＡを、溶解を介して抽出した。各ビラト―ププールからのゲノムＲＮＡは、細胞溶解により抽出され、一連の逆転写（室温、４２℃、２０分間）に供され、その後、エピトープの周囲の隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドをパネル１１Ａに示す。特に、ＰＣＲバンドは、最初のＲＴステップ（レーン１）の存在下でのみ観察され、ＲＴが省略された場合（レーン２）存在せず、ｅｐｉＣＥＬＬ由来のコンピテントレトロウイルスの再生を支援する。これらのアンプリコンは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）及びエピトープが容易に識別されるために提示された（パネル１１Ｂ）。
【図１２】図１２Ａ及びＢは、ビラトープ：抗原特異的Ｔ細胞集団を検出するためのペプチドＨＬＡ−Ａ＊０２０１Ｆｃ融合タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルス粒子である。β２ミクログロブリンに結合したペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃからなる単鎖構築物（図１０Ａ、番号２）は、第３の世代のレンチウイルストランスフェクションシステムの包絡線成分と置換された。構築物はまた、二次抗体（Ｌ４リンカー領域に配置された）による検出のためのＦＬＡＧエピトープタグを含んでいた。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の関連で提示されたペプチドエピトープは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドエピトープ、または、インフルエンザ（ＦＬＵ）からのＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドエピトープのいずれかであった。採取されたレンチウイルスを濃縮し、特定のまたは無関係のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかで以前にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞に適合させた。余分なレンチウイルスを細胞から洗浄し、細胞に結合した残りのレンチウイルスを、ＰＥ結合抗ＦＬＡＧ抗体を介して検出した。レンチウイルスは、特定のペプチド−ＭＨＣ五量体による染色に匹敵するような手法で、それぞれの同族ＴＣＲ発現ＨＥＫ細胞に結合した無関係なエピトープでなく、同族エピトープでシュードタイプ化された。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
単離された懸濁適合細胞が提供され、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。
【００３４】
本明細書において考察した、免疫グロブリンＦｃドメインを含む細胞、他の細胞、及び構築物の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇ  Ｆｃの配列、好ましくはヒトＩｇＧ１  Ｆｃの配列を有することができる。別の実施形態では、かかる免疫グロブリンＦｃドメインは、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃの配列を有することができる。特に、各々が免疫グロブリンＦｃドメインを含む発現した構築物が存在する場合、自発的な二価融合が生じる可能性がある。従って、考察された、形質導入またはトランスフェクトされた細胞、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、並びに本明細書中に記載のウイルス様粒子及びウイルスによって、発現した免疫グロブリンＦｃドメインの二価融合を実証することができる。
【００３５】
本明細書中に記載のコードまたは発現された５〜２０アミノ酸のペプチドの実施形態において、ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長のうちの１つである。実施形態において、ペプチドは、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸長である。実施形態では、ペプチドは、九量体（即ち、９アミノ酸長）である。配列を要望通りに事前に選択することができる。
【００３６】
哺乳動物膜貫通ドメインを含む本明細書中で考察される細胞並びに他の細胞及び構築物の実施形態では、膜貫通ドメインは、哺乳動物膜貫通ドメインの配列を有するが、哺乳動物自体から取得されるものではなく、例えば、哺乳動物膜貫通ドメインタンパク質の配列と同一若しくは類似した配列を有するように設計した配列である。実施形態では、配列は、哺乳動物ＭＨＣ膜貫通配列と同一である。実施形態では、配列は、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。実施形態では、配列は、クラスＩ主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。ＭＨＣＩα３配列は、当該分野で公知である。実施形態では、配列は、ヒトのクラスＩ主要組織適合性複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。本明細書で使用される、２つのヌクレオチド配列に関する「〜に隣接する」は、第１の配列が、例えば、ホスホジエステル結合を介して、第２の配列と連続していることを意味する。本明細書で使用される、２つのペプチド／オリゴペプチド配列に関する「〜に隣接する」は、第１の配列が、例えば、ペプチド結合を介して、第２の配列と連続していることを意味する。
【００３７】
任意の核酸でコードされた蛍光タンパク質は、本明細書に記載の本発明で使用可能である。そのようなタンパク質は、当該分野で公知である。非限定の例としては、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＦＲＵＩＴ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ−単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及び  Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅが挙げられる。
【００３８】
懸濁適合細胞は、懸濁培養液中で生存または増殖することができるものである。異種核酸は、それがトランスフェクトまたは形質導入された細胞に対して異種であるものであり、異種核酸は全体として、トランスフェクションまたは形質導入の前の細胞内には天然に存在しない。
【００３９】
リンカー配列は、当該分野で公知の短い反復ペプチド配列を含む短いペプチド配列である。リンカー配列は一般的に、それらが結合するドメインまたは領域の他のコードされたペプチド機能に干渉しないか、それに最小限の機能的影響を与えるにすぎない。例えば、リンカーは、１つ以上のリンカーについてＧＧＧＧＳの４反復であってよい。本明細書に記載されるリンカーは、本明細書に参照される自己切断型リンカーの特定の例外は別として、自己切断しない点において安定している。参照する例外に関しては、自己切断型リンカー、例えば、そのようなものの非限定的な例は、ウイルスＰ２Ａペプチドであり、このペプチドは、哺乳動物細胞における良好な自己切断効率を示す。
【００４０】
単離された懸濁適合細胞の実施形態では、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。
【００４１】
単離された懸濁適合細胞の実施形態では、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。
【００４２】
また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する、第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列、
これに隣接する、第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む。
【００４３】
実施形態では、細胞の発現産物を発現する膜結合部が提供される。実施形態では、膜結合部分は、微小胞またはエキソソームである。
【００４４】
実施形態では、細胞は免疫グロブリンＦｃドメインの配列を含む発現産物を発現する。
【００４５】
本発明はまた、そのリンカー、例えば第４のリンカーが表面発現のためのプロキシとして公知の抗体（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ）のための蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、またはエピトープに更に結合される場合を除く、記載された細胞、または膜結合部分を提供する。実施形態では、記載される細胞のリンカーまたは膜結合部分は、そのようなものを含まず、リンカーのみである（例えば、本明細書の他の箇所に記載される通り）。
【００４６】
単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、細胞は、蛍光タンパク質を含む発現産物を発現する。
【００４７】
単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、細胞は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む発現産物を発現する。
【００４８】
単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。
【００４９】
実施形態では、異種核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、発現産物は更に、哺乳動物膜貫通ドメインに関してＣ末端側であるウイルスパッケージング配列を含む。
【００５１】
本明細書に記載の形質導入された細胞、組換え核酸、またはウイルスパッケージング配列をコードする異種核酸の実施形態において、関連する核酸は、実施形態では、ＲＮＡ配列であり得る。実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列である。
【００５２】
実施形態では、本明細書に記載の細胞の発現産物を発現する膜結合部、及びウイルス様粒子が提供される。
【００５３】
本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。
【００５４】
本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、主要組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。
【００５５】
本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。
【００５６】
また、記載の複数の単離された懸濁適合細胞が提供される。また、発現産物を発現するようなそのような細胞の複数の膜結合部分が提供され、当該複数が、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。
【００５７】
複数についての実施形態では、当該複数が、少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。
【００５８】
また、記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、またはコードされたペプチドが九量体若しくは九量体である、記載の複数の単離された懸濁適合細胞、若しくは膜結合部分が提供される。実施形態では、コードされた５〜２０アミノ酸の１つのペプチド若しくは複数のペプチドは、細胞の細胞外表面に提示される。
【００５９】
また、発現産物を発現する記載の単離された懸濁適合細胞の膜結合部分が提供される。
【００６０】
また、記載の単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００６１】
単離された懸濁適合細胞の実施形態では、異種核酸は、ウイルスパッケージング配列をコードし、細胞は、異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入されるか、または異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターでトランスフェクトされる。
【００６２】
また、本明細書に記載の形質導入若しくはトランスフェクトされた細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスは、それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合し、発現産物は、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む。
【００６３】
（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、細胞は、レトロウイルストランスフェクションシステムを用いてトランスフェクトする。（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態では、トランスフェクションは、レンチウイルストランスフェクションシステムを使用して実施される。
【００６４】
（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、レトロウイルストランスフェクションシステムはパッケージングプラスミドを含み、パッケージングプラスミドがその中に、１つ以上のエンベロープタンパク質をコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列の代わりに、
５〜２０アミノ酸のペプチドをコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を有する。
【００６５】
また、本明細書に記載の細胞から出芽した単離されたウイルスが提供される。出芽したウイルスは、それらが一緒になって細胞の膜の一部を受け入れるか、または細胞の膜の一部に会合されて、その結果、本明細書に記載の発現し膜に配置された構築物に会合される。
【００６６】
また、本明細書に記載の細胞から出芽した単離されたウイルス様粒子が提供される。出芽したウイルスは、それらが一緒になって細胞の膜の一部を受け入れるか、または細胞の膜の一部に会合されて、その結果、本明細書に記載の発現し膜に配置された構築物に会合される。
【００６７】
実施形態では、ウイルスは、レトロウイルスである。実施形態では、ウイルスはレンチウイルスである。実施形態では、レトロウイルスは、組換え体である。
【００６８】
また、本明細書に記載の複数の単離されたウイルスが提供される。実施形態では、当該複数が、それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっているウイルスを含む。
【００６９】
また、本明細書に記載の複数の単離されたウイルス様粒子が提供される。実施形態では、当該複数が、それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっているウイルス様粒子を含む。
【００７０】
ウイルスの実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質を含む。ウイルスの実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。ウイルス様粒子の実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質を含む。ウイルス様粒子の実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
【００７１】
また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。
【００７２】
実施形態では、組換え核酸は、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列を含む。実施形態では、組換え核酸は、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列を含む。実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、哺乳動物のＨＬＡ−Ａ＊０２０１ドメインと同一のドメインを有する。実施形態では、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１はヒトである。
【００７３】
実施形態では、組換え核酸は、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む。実施形態では、組換え核酸は、ベクターである。実施形態において、組換え核酸は、ウイルスベクターである。実施形態において、組換え核酸は、レトロウイルスベクターである。実施形態では、組換え核酸はレンチウイルスベクターである。実施形態では、組換え核酸ベクターは、プラスミドである。
【００７４】
組換え核酸または単離された懸濁適合細胞の実施形態では、異種核酸または組換え核酸は、ｃＤＮＡを含む。
【００７５】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列に同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物貫通膜ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。
【００７６】
実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、免疫系のエフェクター分子である。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、検出可能なエピトープである。非限定的な実施例では、検出可能なエピトープは、ＦＬＡＧエピトープ、または、ＭＹＣエピトープである。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、本明細書に記載される蛍光タンパク質である。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、例えば、細胞表面グリカン、または他の翻訳後修飾（例えば、硫酸化）を標的とする自然発生のまたは合成された親和性試薬であり得る。例としては、ＴＮＦ／ＴＮＦＲのファミリー（ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＦＡＳＬ、ＬＴＡ、ＬＴＢ  ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１５３、ＴＮＦＳＦ９、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０）、または、ＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーメンバー向けの親和性試薬；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（ＶＩＳＴＡ、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＬ２、Ｂ７１、Ｂ７２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＴＩＭ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、Ｔ細胞受容体鎖、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＢＴＬＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＩｇＳＦ；ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＩＣＡＭ−１を含むＣＡＭＳ）；白血球免疫グロブリン様受容体（ＬIＬＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様授与体（ＫＩＲ））、レクチンスーパーファミリーメンバー、セレクチン、サイトカイン／ケモカイン及びサイトカイン／ケモカイン受容体、成長因子及び成長因子受容体）、接着分子（インテグリン、フィブロネクチン、カドヘリン）、または、マルチスパン内在性膜タンパク質の細胞外ドメイン、または、免疫グロブリンスーパーファミリー及び列挙された遺伝子産物向けの親和性試薬が挙げられるが、それに限定されない。更に、これらの遺伝子産物の活性ホモログ／オルソログは、ウイルス配列（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ）、細菌配列、真菌の配列、真核生物の病原体（例えば、住血吸虫、マラリア原虫、バベシア、アイメリア、タイレリア、トキソプラズマ、アメーバ、リーシュマニア、及びトリパノソーマ）、並びに哺乳動物由来のコード領域が挙げられるが、それらに限定されない。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、Ｔ細胞刺激性ドメインであり得るか、またはＴ細胞抑制ドメインであり得る。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインであってもよい。
【００７７】
また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物は組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを有する、アミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列、及びその他の成分は、本明細書の他の箇所に記載の通りである。
【００７８】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。ウイルスパッケージング配列またはシグナルは、当該分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。実施形態では、第３のアミノ酸リンカーは発現後に自己切断する。自己切断型リンカーは、ウイルスＰ２Ａペプチドとして、本明細書に記載されている。
【００７９】
また、インスタント細胞により産生された（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスは、それらに結合された細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合され、発現産物は、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する免疫グロブリＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有する、アミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。（ｉ）ウイルス様粒子、または、（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。実施形態において、異種核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。（ｉ）ウイルス様粒子、または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、事前に選択された第２のペプチドは、Ｔ細胞調節ドメイン、抗体エピトープ、蛍光タンパク質、核酸結合タンパク質、または、同時調節タンパク質である。
【００８０】
また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。
【００８１】
組換え核酸の実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。組換え核酸の実施態様において、組換え核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。
【００８２】
また、Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分の各々が、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または膜結合部分がこれらの細胞または膜結合部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピドープのを同定する方法が提供される。
【００８３】
本明細書に記載の方法においてＴ細胞を回収する実施形態では複合体を回収する。
【００８４】
また、Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分がこれらの細胞または部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡの配列を決める工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。
【００８５】
本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、フローサイトメトリーにより回収される。本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、蛍光活性化細胞選別により回収される。
【００８６】
方法の実施形態において、本方法は、配列決定する工程の前に、回収したＤＮＡを増幅する工程を含む。本方法の実施形態において、増幅する工程は、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いることにより達成する。本方法の実施形態において、ユニバーサルプライマーの１つ以上は、異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない。
【００８７】
本方法の実施形態において、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。本方法の実施形態において、Ｔ細胞は、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む。本方法の実施形態において、対象はヒトである。
【００８８】
本方法の実施形態において、本方法は更に、複数の単離された懸濁適合細胞のＤＮＡにおける５〜２０アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収したＤＮＡでは濃縮されている、ＤＮＡをコードする５〜２０アミノ酸のペプチドのいずれかを同定して、それにより１つ以上の免疫優性のＴ細胞エピトープを同定する工程を含む。
【００８９】
本方法の実施形態において、本方法は更に、組換え技術によって設計されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現対照細胞である対照のレベルとＴ細胞複合体のレベルとを比較する工程を含み、対照を超えるレベルは、免疫優性エピトープを示す。
【００９０】
本方法の実施形態では、単離された懸濁適合細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、単離された懸濁適合細胞は、ＨＥＫ細胞である。
【００９１】
本方法の実施形態において、単離された懸濁適合細胞が使用される。本方法の実施形態において、発現産物を発現する細胞である懸濁適合細胞の単離された膜結合部分が使用される。
【００９２】
また、Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはこのような細胞の膜部分に会合されるウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または細胞の膜部分に会合された複数のウイルス様粒子若しくはウイルスがこれらの細胞、またはウイルス様粒子若しくはウイルスの中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、ウイルス様粒子と、またはウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子若しくはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。
【００９３】
また、Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列によって結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合によって結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、ウイルス様粒子、またはウイルスがそれらの細胞の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合しウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子若しくはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡをコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。
【００９４】
実施形態では、細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子またはウイルスは、そのような細胞から出芽している。
【００９５】
本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、フローサイトメトリーにより回収される。本方法の実施形態では、Ｔ細胞複合体は、ＦＡＣＳまたは二次抗体染色方法により回収される。実施形態では、二次抗体は、事前に選択された第２のペプチド配列に対して作製されている。
【００９６】
実施形態では、本方法は、配列決定する工程の前に、回収したＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する工程を含む。実施形態において、増幅する工程は、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行われる。
【００９７】
実施形態では、（ｉ）複合体を形成しているＴ細胞と、Ｔ細胞表面マーカー分子に対して作製された抗体または抗体フラグメントを磁気ビーズの外部表面に結合させた磁気ビーズとを接触させること、および（ｉｉ）磁気ビーズを回収するようにビーズに磁場を印加することにより、複合体を形成しているＴ細胞は回収される。
【００９８】
実施形態では、Ｔ細胞表面マーカー分子は、ＣＤ８分子である。
【００９９】
本方法の実施形態では、懸濁適合細胞、またはその膜部分は、構築物を形成する蛍光タンパク質を発現し、複合体を形成しているＴ細胞は、該蛍光タンパク質の蛍光に基づく蛍光活性化細胞選別により回収される。
【０１００】
本方法の実施形態では、ウイルス様粒子またはウイルスは、二次抗体ベースシステムにより回収され、二次抗体は、発現した構築物中のエピトープに対して作製されている。そのようなエピトープの非限定的な例としては、ＦＬＡＧ及びＭＹＣエピトープが挙げられる。
【０１０１】
記載された本発明の単離された懸濁適合細胞の実施形態では、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。単離された懸濁適合細胞の実施形態では、組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。単離された懸濁適合細胞の実施形態では、組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインは、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。
【０１０２】
記載された本発明の実施形態では、複数は、少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含むことができる。実施形態では、ペプチドは、８、９、１０、１１、または、１２アミノ酸のペプチドである。実施形態では、複数は、少なくとも１０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１０,０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１００,０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数、少なくとも１×１０６個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１×１０７個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１×１０８個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。
【０１０３】
単離された懸濁適合細胞、または複数の単離された懸濁適合細胞の実施形態では、コードされたペプチドは九量体（９アミノ酸長）である。
【０１０４】
記載された本発明の実施形態では、コードされたペプチドは、細胞の細胞外表面上に提示される。
【０１０５】
実施形態では、組換え核酸はベクターである。実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１０６】
単離された懸濁適合細胞、複数の懸濁適合細胞、または組換え核酸の実施形態において、核酸はＤＮＡを含む。
【０１０７】
実施形態において、ユニバーサルプライマーの１つ以上は、異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない。
【０１０８】
実施形態において、Ｔ細胞は、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む。
【０１０９】
本明細書に記載の方法の実施形態では、対象はヒトである。
【０１１０】
実施形態では、本方法は、得られた結果と、組換え技術によって設計されたＴＣＲ発現対照細胞の結果とを比較する工程を含む。実施形態では、組換え技術によって設計されたＴＣＲ発現対照細胞は、ＨＥＫ細胞である。
【０１１１】
細胞の実施形態では、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。実施形態では、組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。実施形態では、組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインは、ヒトの主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。
【０１１２】
少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む、複数の単離された懸濁適合細胞が提供される。
【０１１３】
同質遺伝子細胞株（細胞１個当たりの単一の組込み）の分野では、実用限界は使用するライブラリーの複雑さと同じである。言い換えれば、反応における細胞数、例えば、１０６〜１０８個に基づいて、スケール変更される。
【０１１４】
本発明の実施形態において、β２ミクログロブリンと主要組織適合複合体重鎖との間のリンカーを除去することにより、２つの分離した産物をもたらすことができる。これらは、細胞内で自然に集合する。
【０１１５】
実施形態では、核酸は以下の配列を含み、
（ｎ）ｘは、８、９、１０、１１または１２アミノ酸をコードするヌクレオチド配列であり、ｘは、それぞれ２４、２７、３０、３３、または３６ヌクレオチドである：
2017506882.tif 000002
。実施形態では、２４、２７、３０、３３、または３６ヌクレオチドは、それぞれ、８、９、１０、１１、または、１２個のコドンまたは等価物で構成されている。
【０１１６】
実施形態では、組換え核酸は、レンチウイルス送達のためには最大約３０００ｎｔである。実施形態では、組換え核酸は、プラスミド送達のためには最大約１０，０００ｎｔである。
【０１１７】
実施形態では、核酸は以下の配列をコードするか、または発現産物は以下の配列を含み、Ｘ（ｎ）は、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチド配列であり得る：
2017506882.tif 000003
。（ｎ）は、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つ、あるいはその部分範囲であり得る。
【０１１８】
リーダー配列は、哺乳動物細胞で処理することができる任意のシグナルペプチドを含む。このような配列は、当該分野で公知である。
【０１１９】
本発明で使用可能な蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＦＲＵＩＴを含む。任意の核酸コード可能な蛍光タンパク質は、例えば、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ−単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＧＦＰを使用することができる。
【０１２０】
例示的な非限定的Ｂ２Ｍリーダーは、
2017506882.tif 000004
である。
【０１２１】
例示的な非限定的Ｂ２Ｍ配列は、
2017506882.tif 000005
である。
【０１２２】
例示的な非限定的ＭＨＣ重鎖配列は、
2017506882.tif 000006
である。
【０１２３】
例示的な非限定的免疫グロブリンＦｃドメイン配列は、
2017506882.tif 000007
である。
【０１２４】
例示的な非限定的ウイルスパッケージング（ＶＰ）配列（シグナル）は、
2017506882.tif 000008
である。一実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、８〜２０アミノ酸長である。一実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、８アミノ酸長である。
【０１２５】
一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜４０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜２０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ２０アミノ酸長である。
【０１２６】
本明細書中で使用される通り、「同一の配列」を有することは、参照配列の確立された機能または既知の機能を妨げることなく、参照配列との９５％以上の配列類似性を有することを意味する。実施形態では、同一の配列を有することは、参照配列と完全に同一の配列を有することを意味する。
【０１２７】
本明細書に記載の種々の要素の組み合わせの全ては、本明細書に示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内にある。
【０１２８】
本発明は、以下の実施例の詳細からより良く理解されるであろう。しかし、当業者は、考察される特定の方法及び結果が、以下の特許請求の範囲により完全に記載される本発明を単に示すものであることを、容易に理解するであろう。
【０１２９】
実験の詳細
本明細書において、患者試料の高スループットＴ細胞エピトープマッピングのための候補Ｔ細胞エピトープ（「ｅｐｉＣＥＬＬ」）を提示するための、好ましくは、読み出し用として高感度かつ大量並列型の次世代シーケンシングを用いた新規な哺乳動物細胞ディスプレイプラットフォーム（免疫モニタリング）が記載されている。
【０１３０】
この手法では、例えば、ＨＥＫ細胞の表面上にクラスＩ  ＭＨＣに関連する多数のＴ細胞エピトープが提示されるのを可能にするために、新規な膜結合型単鎖ペプチドＭＨＣ（ｓｃ−ｐＭＨＣ）の哺乳動物細胞ディスプレイプラットフォームの使用に重点が置かれている。これらの発現プールには、非限定的実施例において、カテゴリーＡ〜Ｃの病原体の疾患、治療、及び中和に直接関連するそれらのエピトープを同定するために、例えば、健康な患者、感染した患者、治療した患者、免疫化された患者由来のＴ細胞を投与している。病原体から同定された免疫優性署名は、集合させられて病原体エピトープコレクションを構築し、迅速かつポータブル診断ツールとして使用して全血から直接検出することができる。
【０１３１】
好ましい戦略は、疾患関連エピトープを直接同定するために、哺乳動物細胞の表面に表示されかつ患者／コホートの特異的な末梢Ｔ細胞に対して投与された、ｓｃ−ｐＭＨＣ構築物のライブラリーを活用する。図１に示すように、ｓｃ−ｐＭＨＣベクターのライブラリーはプールされ、ＨＥＫ２９３細胞などの懸濁適合細胞に一斉にトランスフェクトされること（または、例えば、レンチウイルスプールの場合、形質導入されること）ができ、このようにしてｅｐｉＣＥＬＬプールが生成される。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
ｅｐｉＣＥＬＬプールを、患者由来の末梢Ｔ細胞と混合して（標準的なプロトコールを使用して全血試料から精製［２６］）、ＴＣＲと、ｅｐｉＣＥＬＬプールによって発現されたそれらの同族ｓｃ−ｐＭＨＣリガンドとが特異的に会合することによって複合体を形成することを可能にする。次いで、例えば、複数の患者の試料を同時に処理するための磁気分離、または単一の試料用のより一般的なフローサイトメトリー選別法により、複合体を回収する。濃縮されたプールメンバー由来のエピトープ配列を、ＰＣＲ（ユニバーサルプライマーを使用する）により増幅させ、大規模な次世代シークエンシングに供して、取得プロセスにより濃縮されたエピトープを同定する。これらの濃縮されたエピトープにより、免疫優性のＴ細胞エピトープが直接同定される。更に、所望の場合、その後の検証を、生体外の方法（例えば、サイトカインＥＬＩＳｐｏｔ、ＦＡＣＳ）により、実行することができる［２７］。この戦略によって、単一の患者試料から、すべての疾患に関連する免疫優性エピトープを迅速に同定することが可能になる。注目すべきことに、この手法を、インデックス付きのアダプタ、例えば、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）の使用により多重化して、スループットを大幅に向上させてコストを削減することができる（例えば、複数の患者の試料は、ＮＧＳフローセルの単一レーン上で実行することができる）。
【０１３３】
構築物：膜に固定されたクラスＩ  ｓｃ−ｐＭＨＣ分子の１つの全体的なデザインは、図２に示される。簡単に言えば、この構築物は、直後に候補エピトープ（ペプチドとして表示）が続く、プラズマ膜局在化を可能にするための天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列を用いている。ＥＲでリーダー配列を完全に除去すると、ＭＨＣ結合ポケット中にペプチドを提示することができる。これは更に、天然Ｂ２Ｍ分子、ヒトＨＬＡ−Ａ０２：０１対立遺伝子、及びリンカー領域を介して、表面に露出したｍＣｈｅｒｒｙ発現プロキシに結合している（各リンカーについて
2017506882.tif 000009
の４個の反復）。全体の構築物を、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＨＣ  ＴＭ）を介して膜に保持する。ＭＨＣクラス−Ｉ分子への抗原性ペプチドの共有結合は、十分に確立されており、生体外及び生体内の両方で非常に有効である［２８〜３０］。この戦略は、非共有結合ペプチド複合体の交換（交差提示）、特に弱く結合しているものの交換から生じる、意図しないＴ細胞結合／活性化に関連する困難さを排除する。更に、このモジュール設計は、所定のＭＨＣ対立遺伝子に関連する異なるペプチド配列をコードする大きなライブラリーの生成（及びその後の照合）のための高スループットの分子生物学的操作（例えば、クローニング／シークエンシング）に容易に受け入れられる。このプラットフォームは、一本鎖構造の「普遍的」な性質を利用する。このパラダイムでは、ライブラリーの中での唯一の違いは、九量体ペプチド自体をコードする２７ヌクレオチドの配列である（例えば、エピトープ）。この非反復配列は、「ユニバーサルプライマー」（図２において順方向／逆方向として表示）を用いて増幅することができ、かつ、大規模シークエンシング、及びそれに続くＴ細胞投与後の翻訳によって、容易に識別されることができる［３１〜３４］。特に、「ユニバーサル」プライマーアニーリングのためのコンセンサス領域を形成するヌクレオチド配列は、内因性Ｂ２Ｍプールからバックグラウンド増幅を回避するために、天然Ｂ２Ｍヌクレオチド配列から離れて改変されている（すなわち、ＨＥＫ細胞からのＢ２Ｍ）。
【０１３４】
ＭＨＣ対照。本発明者らのグループレバレッジの５個の既知病原性のＨＬＡ−Ａ０２限定エピトープ内の初期実行可能性調査は、５つの独立したウイルス性病原体（サイトメガロウイルスｐｐ６５タンパク質残基４９５〜５０４［以後ＣＭＶと呼ばれる］、インフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６［ＦＬＵ］、エプスタイン・バーウイルスＢＭＬＦ１  ２５９〜２６７［ＥＢＶ］、ヒトＴリンパ球向性ウイルスタックス１１〜１９［ＨＴＬＶ］、及び、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ１７  ７６〜８４［ＨＩＶ］）に結合されている。ＨＥＫ２９３の安定な細胞株を、図２に示す天然のヒトクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメインを介して膜に固定された表面ｍＣｈｅｒｒｙの発現プロキシを有するｓｃ−ｐＭＨＣ構築物を担持しているウイルスのレンチウイルス形質導入により作製した。本発明者らの構築物の表面発現を、ｍＣｈｅｒｒｙのプロキシ発現及び抗ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現をモニタリングする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を介して検証して（図３に示されているもの４つ）、そして、構築物が発現して適切に形質膜を標的とすることを立証する。特に、ＥＢＶ対照ペプチドは、この図の生成後に添加したが、ＥＢＶの表面発現プロファイルは、他の４つの対照で観察されるものを反映している（データは図示せず）。
【０１３５】
このシステムでは、ｍＣｈｅｒｒｙの表面提示は、変性タンパク質がより頻繁にＥＲ／ゴルジに閉じ込められている／保持されているにつれて、ＭＨＣ構築物の適切な折り畳みの指標となるが［３５］、しかしながらＭＨＣの折り畳みの直接評価がもちろん望ましい。ＨＥＫ２９３細胞が、自然にＨＬＡ及びＢ２Ｍ分子を発現するため、表面Ｂ２ＭまたはＨＬＡを直接染色して適切な折り畳みをモニターすることは困難である。単鎖膜を固定したＭＨＣデザインによって、天然ヒトＢ２Ｍの５'非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的とする、適切に折り畳まれた材料ｓｈＲＮＡヘアピン（ｐＧＩＰＺクローンＶＡ２８２［カタログ番号：ＲＨＳ４４３０−１０１０９８３４５］がもたらされることを確実にするために、ＥｉｎｓｔｅｉｎのｓｈＲＮＡコア施設によって提供されるノックダウン細胞）を活用して、Ｂ２Ｍ及びＨＥＫ細胞内の表面ＭＨＣの内因性発現を下方調節した（Ｂ２Ｍは、ＭＨＣのアイソタイプに関係なく、ＭＨＣ折り畳み／局在化には不可欠であるので、下方制御のために選択した）。この実装には、統合された構築物の持続的な発現を促進するために、５'ＵＴＲが含まれていない。図４で示す通り、天然ＨＬＡの９５％超を、立体配座依存性の抗ＭＨＣクラスＩ抗体に対する表面染色によりモニターした通り、ｓｈＲＮＡ戦略を使用して効果的に下方制御した（使用したｍＡｂ  Ｗ６／３２は、ＭＨＣとＢ２Ｍの両方が結合するために適切に折り畳まれていることが必要である［３６］。特に、リーダーペプチドの及びエピトープ提示の適切な処理は、ＭＨＣの安定性／折りたたみの要件である。）。ＭＨＣ表面の発現は、ライブラリー（ＣＭＶ）からの代表的な構築物による形質導入により回復された。まとめると、これは、構築物が適切に局在すること（抗ｍＣｈｅｒｒｙよりモニターされる通り）、及び十分に折りたたまれていること（抗ＨＬＡでモニターした通り、図４）の両方を示唆する。
【０１３６】
ＴＣＲ対照。この実験室内での懸濁適合ＨＥＫ細胞株の広範囲な使用を考え、当然、ＨＥＫ細胞を、対照ＴＣＲ株の生成のために発現宿主として必然的に選択した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＴＣＲ遺伝子を内因的に発現せず、また修飾なしにＴＣＲ構築物を発現することもできない（本発明者ら自身［データは示されていない］、及び他者により観察される通り［３７］）。ＴＣＲは、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される、ジスルフィドで結合した膜固定ヘテロ二量体（α／β鎖）である。ＣＤ３鎖はＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを形成する。完全な複合体は、適切な発現及び形質膜局在化のために必要とされる。対照ＴＣＲの発現を可能にするために、レンチウイルス同時形質導入技術を用いたが、この技術は、１つのレンチウイルス構築物が、種々のウイルス２Ａ「自己切断型」ペプチドで結合された完全なＣＤ３遺伝子カセットを保有し［３７］（図５、上部）、第２のレンチウイルス構築物が、単一のＰ２Ａペプチドによって結合されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖を担持して、Ｐ２Ａペプチドが哺乳動物細胞中で最も高い「切断」効率を示すときに化学量論的発現を可能にする、［２］。ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（ＢＬＵＥ）発現プロキシは、β鎖の膜貫通セグメント（図５、下部）に従う。原理証明の研究は、以上で考察されたＨＬＡ分子のために５個の同族ＴＣＲ（ＴＣＲ  ＲＡ１４［ＣＭＶペプチドに特異的に結合する］、ＪＭ２２［ＦＬＵ］、ＡＳ０１［ＥＢＶ］、Ａ０６［ＨＴＬＶ］、及び１８０３［ＨＩＶ］）を用いる。構築物の表面発現を、同族ＭＨＣ五量体染色（図６、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅから購入した五量体）により確認された抗ＴＣＲ、及び抗ＣＤ３抗体染色（データは図示せず）並びに活性Ｔ細胞複合体形成により確認した。形質導入されていない細胞を陰性対照として使用した。
【０１３７】
ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォーム。従来のＭＨＣ四量体（またはより最近の五量体）ベースの提示によって、単一のタンパク質に対する結合活性が強化されるが、真核細胞の細胞膜上でクエリータンパク質が発現することにより、抗原密度がより大きくなり、結合活性が顕著により高くなり、かつより微弱なｐＭＨＣ：ＴＣＲの相互作用を検出するためのダイナミックレンジが拡大することが期待される。５個のＴＣＲを個別に発現させて、５個の同族ｓｃ−ｐＭＨＣのｅｐｉＣＥＬＬを補完した。細胞質ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＹＴＯとして表示）、及び表面発現したｍＣｈｅｒｒｙを（ＭＨＣなし、ＳＴＡＬＫとして表示）を、陰性対照として使用した。個体集団及び混合集団のフローサイトメトリー分析によって、同族ＭＨＣ：ＴＣＲ対を発現する細胞は、両方提示されるときのみ（図７）、特定の細胞−細胞間の相互作用を表すシグナルが顕著に増加する（１００倍、Ａ０６：ＨＴＬＶ相互作用）ことが明示された。次に、２つのｅｐｉＣＥＬＬ（ＣＭＶ及びＦＬＵ）はプールされ、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（ＪＭ２２のみ）を用いて投与され、かつ、形成された複合体上で選別された。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いて、ＰＣＲの約３０サイクル実施した（図２、上部）。得られたＰＣＲバンドは、図８（上部）に示され、これらのアンプリコンは、ライブラリー調製（例えば、多重ＴｒｕＳｅｑでインデックス付けされたアダプタの追加）のために提示し、その後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を実施した（イルミナＭｉＳｅｑ）。ライブラリー調製及びシークエンシングは、Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図８、下部）。それぞれでは、観測されたエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳの読み取りの割合として計算して標準化した。注目すべきは、これらは、ライブラリー内の第１の検証された構築物であったので、ＣＭＶ及びＦＬＵは、最初のスクリーニングのために選択したことである。
【０１３８】
更なる実施例において、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１タンパク質を表す全ての重複九量体（約４００個のｅｐｉＣＥＬＬの１プール）に対する完全なスクリーンは、ＥＢＶ感染患者からの免疫優性署名を同定するために調査することができる（３５歳未満の成人の約９５％がＥＢＶ反応性末梢Ｔ細胞を維持するため、この対象が選択された）。
【０１３９】
ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームは、ヒト疾患に関連する生体関連Ｔ細胞エピトープの全体集合を定義するのに使用することができる。エピトープマッピングのための、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）をベースとするｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームは、より大規模な「コンビナトリアル」ライブラリーと組み合わせて、選択したＴＣＲに対するミモトープスクリーニングの拡張を可能にし、それによって親和性／反応速度が変更された結合物質を同定することができ、更に、同時に包括的な適用範囲に匹敵する感度で単一の患者試料内の全ての免疫学的反応性の調査にまで拡大適用することができる。ペプチド抗原エピトープ（及びミモトープ）の同定は、保護及び病理学的免疫応答に関与するクラスＩＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の同定、単離、及び調節における重要な第１のステップである。特に、記載される方法は、クラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）反応性の類似する徹底的な調査に容易に拡大適用／変更することができる。
【０１４０】
実施例２
この実験では、５個のＭＨＣを保有する全てのｅｐｉＣＥＬＬ用のレンチウイルス（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）を、個別に形質導入し、等しい比率でプールし、４個の同族ＴＣＲを有する細胞（ＲＡ１４、ＪＭ２２、ＡＳ０１、Ａ０６）に対して別々に投与して、形成された複合体上で選別した。各プールからのゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドは、図９（上部）に示されており、これらのアンプリコンは、ライブラリー調製のために提示し（例えば、多重ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）のインデックス付きアダプタの追加）、その後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を実施した（イルミナＭｉＳｅｑ）。ライブラリーの調製及びシークエンシングは、アルバート・アインシュタイン医科大学のエピゲノミクスのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図９、下部）。事前に選別された集団（ライブラリー）内で同定されたエピトープは、１６〜２３％の範囲内であった（データは図示せず）。ＴＣＲ投与データセットのそれぞれでは、観察されたエピトープ配列の絶対数は、ＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ割合として計算して標準化し、事前に選別したプールから採取された平均及び標準偏差パラメータを用いて、Ｚスコアを計算するために使用した。これらの結果は、ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの有用性を強調し、更には非最適化結合／洗浄プロトコールを使用するスクリーンの頑強性を示す。
【０１４１】
実施例３
ｅｐｉＣＥＬＬの有用性は、単一鎖構築物（Ｆｃ融合による二価の提示の有り及び無し）だけではなく、分割構築物（ｓｙｎＴａｃ）も含み、それによってｅｐｉＣＥＬＬに関連する複合タンパク質またはペプチド断片の部分提示を可能にするように拡大することができる。また、ｅｐｉＣＥＬＬプール由来の断片を含有する小細胞膜（例えば、微小胞、エキソソーム、ウイルス様粒子［ＶＬＰ］、及びレトロウイルス［例えば、レンチウイルスなど］）の使用により、スクリーニングのための反応体積の大幅な減少が可能となっている（これらのウイルス粒子ベースの手法は、しばしば、本明細書において、「ビラトープ」と称される）。これらの発現プール（ｅｐｉＣＥＬＬまたはビラトープ）に、健康な患者、感染した患者、治療された患者、免疫を与えられた患者由来のＴ細胞を投与して、疾患、診断、治療、中和、並びに疾患の進行及び治療応答のモニタリングに直接関連するそれらのエピトープを同定する。
【０１４２】
例示的な変異体は、直後にリンカーＬ１を介してＢ２Ｍ分子に共有結合されている候補ペプチドエピトープが続く、天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列と同一の配列を、引き続き用いている（図１０Ａに図示されている）。しかし、３つの新しい構築物は、それらの全体的な構築様式、及び、共有組織が異なる。第１の変異体（図１０Ａ（１）参照）は、従来のｅｐｉＣＥＬＬベースの提示に類似するが、先端のＣ末端にウイルスパッケージングシグナルが加えられている（例えば、ＶＰとして表示されたＧＰ４１エンベロープタンパク質の残基７０６〜７１３）。ＶＰ配列の存在は、従来のｅｐｉＣＥＬＬベースのスクリーニングの分野では影響がないが、ｅｐｉＣＥＬＬプールから出芽したとき、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）へのパッケージングを可能にする。表面発現した構築物の局所的結合価を高めるために、ＶＰ配列で再度終結するＦｃ融合ベースの構築物を使用して（図１０Ａ（２）、ヒトＩｇＧｌ  Ｆｃ、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃなど）、ウイルスパッケージングを可能にする。表面発現のプロキシ（すなわち、ｍＣｈｅｒｒｙ）を、この変異体から除去しているので、従来の抗体のためのエピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等）を、リンカーＬ４中に置き、それにより、抗体染色を介して細胞膜の局在化を検出することができるようになっている。現在記載されているこれらの構築物（Ａ.ｌ及びＡ.２）は、一本鎖構造を利用しており、したがって、スクリーニング目的のために代替タンパク質結合を介してシステムを拡張する能力に制限される。追加のタンパク質またはペプチド結合の包含を介してｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームのモジュール性／柔軟性を高めるために、この実験室においてまた開発されたｓｙｎＴａｃベースの発現構築物を用いる。簡単に言えば、戦略の基礎的をなすｓｙｎＴａｃは、ＭＨＣ構築物を、ペプチドとタンパク質の両方を様々な末端に（図１０Ａ.（３）及び図１０Ｂに図示する）に融合することにより、重鎖と軽鎖のそれぞれに分割する。この構築物によって、ペプチドエピトープが軽鎖（Ｂ２Ｍ）のＮ末端に共有結合的に融合し、次いで、軽鎖のカルボキシ末端が本発明者らのＭＯＤエフェクター分子に延長する、図１０Ｂ。このシナリオにおいて、重鎖（ＨＬＡ分子）は、Ｆｃドメインに融合される。すべての成分は、真核細胞（例えば、ＨＥＫ、ＣＨＯ）の産生中に会合して、自己組織化する。特に、２つの鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている（赤線で示す）。この場合のＭＯＤは、任意のタンパク質、ペプチド、またはスクリーニングのために必要な他の化学物質であり得る。例としては、二次染色のための抗体のエピトープ（ＦＬＡＧ、ＭＹＣなど）、直接蛍光検出のための蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＦｒｕｉｔなど）、核酸結合タンパク質、または、同時調節タンパク質がある。全ての構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメインを介して細胞膜（ＴＭ、これは、任意のヒト、マウス、または他のＴＭドメインであってよい）に局在化する。ユニバーサルプライマーを使用して、Ｔ細胞投与後にこの構築物で見出される非反復２７ヌクレオチド配列（九量体ペプチド）を��幅し、それによって、疾患関連エピトープを直接同定する。しかし、５〜２０アミノ酸で変動するがそれに限定されていない長さのペプチドは、候補エピトープである。
【０１４３】
レンチウイルスディスプレイ用ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームの拡張：ビラトープ。完全なコンビナトリアルスクリーニングの分野において（例えば、ペプチド配列が完全にランダム化されたとき）、従来のｅｐｉＣＥＬＬを用いたとき、完全なライブラリーの適用範囲を確保にする体積（すなわち、１０９個のエピトープ）は、１０〜１００ミリリットルの範囲であり得る。この要件は、主として、高濃度（例えば、１ｍｌあたり１千万超の濃度）での乏しい細胞生存性に加えて、ｅｐｉＣＥＬＬディスプレイに使用されるＨＥＫ細胞の比較的大きなサイズに起因する。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、日常的に、エンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇなど）と共に、特定のウイルスがコードされた遺伝子（ヘルパープラスミドと呼ばれる）を含有するパッケージングプラスミドでのトランスフェクションを介してＨＥＫ細胞から生成する。注目すべきことに、これらの細胞から出芽したレトロウイルス粒子は、極端な濃度（１ｍｌ当たり１０億超の）で安定している。減少した反応体積及び強化された安定性を利用するために、表面発現ＭＨＣ構築物内で、ウイルスパッケージングシグナル（ＶＰ）を活用して、ヘルパープラスミド単独での（エンベローププラスミドの添加なしの）ｅｐｉＣＥＬＬプールのトランスフェクション後のウイルス粒子へのパッキングを可能にし、それによって、ペプチドＭＨＣにより出芽レンチウイルスを効果的にシュードタイプ化させる。具体的には、単鎖構築物（図１０Ａ.（２））は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合されたペプチドエピトープから成り、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、第３世代のレンチウイルストランスフェクションシステムのエンベロープ成分と置換した。構築物はまた、（Ｌ４リンカー領域に配置された）二次抗体による検出のためのＦＬＡＧエピトープタグを含有した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との関連で提示されるペプチドエピトープは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の
2017506882.tif 000010
ペプチドエピトープ、またはインフルエンザ（ＦＬＵ）由来の
2017506882.tif 000011
ペプチドエピトープのいずれかである。採取したレンチウイルスを、超遠心分離により１００倍濃縮して４℃で保存した。各ビラトーププールからのゲノムＲＮＡ（ＤＮＡとは対照的）は、抽出して、一連の逆転写（ＲＴ）を行い、続いて、エピトープの周囲の隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドは、図１１Ａに示されている。特に、ＰＣＲバンドは、最初のＲＴステップ（レーン１）の存在下でのみ観察され、逆転写酵素を省略したときは（レーン２）、存在せず、それによって、コンピテントな（例えば、ＲＮＡを負荷した）レトロウイルスの生成が実証される。これらのアンプリコンは、ライブラリーの調製のために提示され（例えば、多重化ＴｒｕＳｅｑのインデックス付きアダプタの追加）、及びその後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングとのプロセスの互換性を確保するために実施した（ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ）。ライブラリー調製及びシークエンシングは、Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図１１Ｂ）。続いて、以前のｅｐｉＣＥＬＬ結合実験と同様に、ビラトープを、特定の、または、無関係のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に適合した。余分なビラトープ粒子を細胞から洗浄し、残りの細胞に結合したレンチウイルスは、ＰＥ結合抗ＦＬＡＧ抗体を介して検出した。無関係なエピトープではなく、同族体によりシュードタイプ化したビラトープは、特定のペプチドのＭＨＣ五量体による染色に匹敵する方法（図１２）で、それぞれのＴＣＲ発現ＨＥＫ細胞に結合し、それによって、特異性、及び、エピトープスクリーニングのためのｅｐｉＣＥＬＬプール由来のビラトープ粒子の特異性及び一般的な有用性が実証された。
【０１４４】
エピトープマッピングのための現行の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ベースのｅｐｉＣＥＬＬ／ビラトーププラットフォームは、より大きな「コンビナトリアル」ライブラリーと組み合わせて、選択したＴＣＲに対するミモトープスクリーニングの拡張を可能にし、それによって親和性／反応速度が変更された結合物質を同定することができ、更に、同時に、包括的な適用範囲に匹敵する感度で、単一の患者試料内の全免疫学的反応性の調査にまで拡大適用することができる。ペプチド抗原エピトープ（及びミモトープ）の同定は、保護及び病理学的免疫応答に関与するクラスＩＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の同定、単離、及び調節において重要である。上述の方法は、クラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）反応性の類似する調査に容易に拡大適用される。
【０１４５】
参考文献
2017506882.tif 000012
2017506882.tif 000013
2017506882.tif 000014
2017506882.tif 000015
2017506882.tif 000016
【図１】
2017506882.tif 000017
【図２】
2017506882.tif 000018
【図３】
2017506882.tif 000019
【図４】
2017506882.tif 000020
【図５】
2017506882.tif 000021
【図６】
2017506882.tif 000022
【図７】
2017506882.tif 000023
【図８】
2017506882.tif 000024
【図９】
2017506882.tif 000025
【図１０】
2017506882.tif 000026
【図１１】
2017506882.tif 000027
【図１２】
2017506882.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月11日(2016.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017506882000001.app
【国際調査報告】
2017506882.tif 000029
2017506882.tif 000030
2017506882.tif 000031
2017506882.tif 000032