(57)【要約】  サンプル中における全ての配列不明の線形二本鎖の核酸分子を増幅するのに用いられるアダプターを開示する。上記アダプターは、(1) 5'末端にリン酸を有し、3'末端に追加のチミンヌクレオチドを有さない第一オリゴヌクレオチド(P-オリゴ)と、(2) 追加の3'-Tを有し、5'-リン酸を有さない第二オリゴヌクレオチド(T-オリゴ)からなる。P-オリゴ及びT-オリゴは、T-オリゴにおける3'-T(チミン)を除いて、互いに相補的である。上記アダプターを、3'末端の追加のA(3'-Aオーバーハング)を有する配列不明の核酸に連結して、アダプター連結標的核酸を形成する。次に、T-オリゴを、T-オリゴプライムポリメラーゼ連鎖反応法(TOP-PCR)のための単一プライマーとして使用し、配列不明の核酸を全長増幅する。【選択図】図７
2017500032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  配列不明の線形二本鎖の核酸を提供する提供ステップと、
(b)  1つのアデニンヌクレオチド(A)を配列不明の線形二本鎖の核酸の3'-末端に追加して、3'-アデニンヌクレオチド(3'-A)オーバーハングを有する配列不明の標的核酸を取得する追加ステップと、
(c)  5'-リン酸(5'-p)を有する第一ストランドオリゴヌクレオチド(オリゴ)を提供する提供ステップと、
(d)  5'-リン酸(5'-p)は有さず、3'-チミンヌクレオチド(3'-T)を有する第二ストランドオリゴヌクレオチド(オリゴ)を提供する提供ステップと、
(e)  上記第一及び第二ストランドオリゴをアニーリングして、1つの3'-T-オーバーハングを有する同種アダプターを生成するアニーリングステップと、
(f)  3'-Aオーバーハングを有する配列不明の上記標的核酸と上記同種アダプターを連結させて、各末端に連結した上記アダプターを有する配列不明のアダプター連結標的核酸を形成する連結ステップと、
(g)  テンプレートとしての配列不明の上記アダプター連結標的核酸と、単一プライマーとしての3'-Tを有する上記第二ストランドオリゴとを用いたポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を実行して、PCR産物を取得する実行ステップと、を有し、
3'-Tを有する上記第二ストランドオリゴは、上記第二ストランドオリゴの3'-Tを除いて5'-pを有する上記第一スタンドオリゴと相補的であり、
配列不明の上記核酸は、その完全長が増幅される、配列不明の線形二本鎖の核酸を増幅する方法。
【請求項２】
1つの連結ステップだけを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アダプターは、自己連結反応をしない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
配列不明の前記線形二本鎖の核酸は、体液DNAである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
配列不明の前記線形二本鎖の核酸は、がん患者の血漿から得られた循環DNAである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アダプターは、1つの3'-Tオーバーハング及び1つの3'-非Aオーバーハングを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプターは、1つの3'-オーバーハング及び1つの平滑末端を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
(i)  請求項1に従って配列不明の線形二本鎖の核酸の完全長を増幅して、PCR産物を取得する増幅ステップであって、上記線形二本鎖の核酸は、患者由来の体液循環DNA(ctDNA)である、増幅ステップと、
(ii)  上記PCR産物の配列を決定して、上記体液ctDNAの配列を取得する配列決定ステップと、
(iii)  公知のゲノム配列データベースに対して上記流体ctDNAの配列をマッピングして、配列バリエーションの存在又は不存在を同定するマッピングステップと、
(iv)  配列バリエーションの存在が同定される場合、バフィーコート又は白血球由来のDNAと体液ctDNAとの間のクロスライブラリー比較を実施する実施ステップと、
(v)  上記クロスライブラリー比較の結果に基づく正常バリエーション又はがん特異的変異の存在又は不存在を評価する評価ステップと、を有する、がん特異的変異の評価のための及び/またはがん診断のための方法。
【請求項９】
(1)  上記配列決定ステップは、同じ対象由来のバフィーコート又は白血球由来のゲノムDNAと並行して実行される、
(2)  上記マッピングステップは、上記公知のゲノム配列データベースに対して、上記体液ctDNAの配列及びバフィーコート又は白血球のゲノムDNAの配列をマッピングすることによって実行され、
(3)  上記クロスライブラリー比較は、上記体液ctDNA中の及び上記バフィーコート又は白血球DNA中のバリエーションを同定し、
(4)  上記評価ステップは、上記バフィーコート又は白血球DNA中の上記バリエーションを、上記体液ctDNAで見つかった上記バリエーションから除く除去ステップを更に有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記バリエーションは、SNP、挿入及び欠失からなる群より選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(b)の前に、配列不明の上記線形二本鎖の核酸又は上記体液ctDNAにエンドリペア反応を実行する実行ステップを更に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記体液は、血液、唾液、精液、腟液及び羊水からなる群より選択される、請求項４又は８に記載の方法。
【請求項１３】
配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、20コピー以下である、請求項１又は８に記載の方法。
【請求項１４】
配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、10コピー以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、5ピコグラム以下である、請求項１又は８に記載の方法。
【請求項１６】
配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、0.01ピコグラム以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列不明の上記アダプター連結標的核酸は、環状化せず、環状核酸も形成しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記PCRは、異種プライマーの非存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記連結ステップは、異種アダプターの非存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野本発明は、概して、DNA増幅に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
配列決定技術の進歩によって、がん変異の検出に関する優れた代わりの方法が提供されている。次世代配列決定法(NGS)は、単一のヌクレオチドレベルにまで達することができる優れた分解能を有する、従来技術に取って代わる技術である。しかしながら、少量の循環DNA(ctDNA)を保持可能な循環血漿DNA(ctDNA)由来のがん変異の分析において、NGSの使用は、まだ初期段階である。これは、血漿のDNAレベルが極めて低く、血漿由来の少量のDNAを増幅する信頼性が高い方法が多くないという事実に起因する。ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)による従来型のDNA増幅は、標的領域の境界を規定する1又は複数のプライマーの「ペア」を利用して、好熱性DNAポリメラーゼによる合成を引き起こす。
【０００３】
ペアのプライマーを使用する戦略において、各標的DNA断片の末端は、繰返しDNAを増幅するためには種々のPCRプライマーの結合を可能にする2つの異なるアダプターとの連結が必須という、線形DNAの全長を増幅する際に本質的に不利な点が存在する。あらゆる末端は、いずれかのアダプターに結合する機会が等しいため、DNA断片の半分には、1つのタイプのアダプターだけが連結し、その結果、かかる断片は、指数関数的速度で増幅することができないため、配列情報の50%が潜在的に失われてしまうことから、配列決定及び下流の分析において誤って実際より少なく表示されてしまうだろう。この問題は、大多数の標的DNA又はRNA種において配列決定ライブラリー構築のために、又は、従来型の実験機器による定量化のために必要とされる最小レベルよりも遥かに低い、低存在量のDNA分子(例えば単細胞トランスクリプトーム中のもの又は体液試料(例：血漿)中のもの)のNGS分析に関して言えば、問題となり得る。この問題は、疾患診断に関する場合は、膨大な数の臨床DNAサンプルが毎日検討され、これらのサンプルの重要な部分が、様々な理由(例えばパラフィンに包埋されている、長期若しくは不適当な保管又は小容量若しくは低濃度)で低量又は低品質であるため、更に重篤な問題になり得る。従って、サンプルにおいて、配列選別なしに、「全ての」DNA/RNA分子を目標として、増幅することが可能である、効果的且つ非選択的なDNA増幅方法が強く望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、TOP-PCR(T-オリゴプライムPCR)と称する、新規のアプローチの開発に関する。
【０００５】
一つの態様では、本発明は、配列不明の線形二本鎖の核酸を増幅する方法に関する。本方法は、
(a)  配列不明の線形二本鎖の核酸を提供する提供ステップと、
(b)  1つのアデニンヌクレオチド(A)を配列不明の線形二本鎖の核酸の3'-末端に追加して、3'-アデニンヌクレオチド(3'-A)オーバーハングを有する配列不明の標的核酸を取得する追加ステップと、
(c)  5'-リン酸(5'-p)を有する第一ストランドオリゴヌクレオチド(オリゴ)を提供する提供ステップと、
(d)  5'-リン酸(5'-p)は有さず、3'-チミンヌクレオチド(3'-T)を有する第二ストランドオリゴヌクレオチド(オリゴ)を提供する提供ステップと、
(e)  上記第一及び第二ストランドオリゴをアニーリングして、1つの3'-T-オーバーハングを有する同種アダプターを生成するアニーリングステップと、
(f)  3'-Aオーバーハングを有する配列不明の上記標的核酸と上記同種アダプターを連結させて、各末端に連結した上記アダプターを有する配列不明のアダプター連結標的核酸を形成する連結ステップと、
(g)  テンプレートとしての配列不明の上記アダプター連結標的核酸と、単一プライマーとしての3'-Tを有する上記第二ストランドオリゴとを用いたポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を実行して、PCR産物を取得する実行ステップと、を有し、
3'-Tを有する上記第二ストランドオリゴは、上記第二ストランドオリゴの3'-Tを除いて5'-pを有する上記第一スタンドオリゴと相補的であり、
配列不明の上記核酸は、その全長が増幅される。
【０００６】
本発明の一実施形態において、上記方法は、1つの連結ステップだけを有する。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、上記アダプターは、自己連結反応をしない。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸は、体液DNAである。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸は、がん患者の血漿から得られた循環DNAである。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、上記アダプターは、1つの3'-Tオーバーハング、及び、1つの3'-非Aオーバーハングを備える。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、上記アダプターは、1つ3'-オーバーハング及び1つの平滑末端を有する。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、がん特異的変異の評価のための及び/またはがん診断のための方法に関する。上記方法は、
(i)  請求項1に従って配列不明の線形二本鎖の核酸の全長を増幅して、PCR産物を取得する増幅ステップであって、上記線形二本鎖の核酸は、患者由来の体液循環DNA(ctDNA)である、増幅ステップと、
(ii)  上記PCR産物の配列を決定して、上記体液ctDNAの配列を取得する配列決定ステップと、
(iii)  公知のゲノム配列データベースに対して上記流体ctDNAの配列をマッピングして、配列バリエーションの存在又は不存在を同定するマッピングステップと、
(iv)  配列バリエーションの存在が同定される場合、バフィーコート又は白血球由来のDNAと体液ctDNAとの間のクロスライブラリー比較を実施する実施ステップと、
(v)  上記クロスライブラリー比較の結果に基づく正常バリエーション又はがん特異的変異の存在又は不存在を評価する評価ステップと、を有する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、上述の方法は、
(1)  上記配列決定ステップは、同じ対象由来のバフィーコート又は白血球由来のゲノムDNAと並行して実行され、
(2)  上記マッピングステップは、上記公知のゲノム配列データベースに対して、上記体液ctDNAの配列及びバフィーコート又は白血球のゲノムDNAの配列をマッピングすることによって実行され、
(3)  上記クロスライブラリー比較は、上記体液ctDNA中の及び上記バフィーコート又は白血球DNA中のバリエーションを同定し、
(4)  上記評価ステップは、上記バフィーコート又は白血球DNA中の上記バリエーションを、上記体液ctDNAで見つかった上記バリエーションから除く除去ステップを更に有する、構成要素を必要とする。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記バリエーションは、SNP、挿入及び欠失からなる群より選択される。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、上記方法は、ステップ(b)の前に、配列不明の上記線形二本鎖の核酸又は上記体液ctDNAにエンドリペア反応を実行する実行ステップを更に有する。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、上記体液は、血液、唾液、精液、腟液及び羊水からなる群より選択される。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、20コピー以下である。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、10コピー以下である。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、5ピコグラム以下である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記線形二本鎖の核酸の量は、0.01ピコグラム以下である。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、配列不明の上記アダプター連結標的核酸は、環状化せず、環状核酸も形成しない。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、上記PCRは、異種プライマーの非存在下で実行される。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、上記連結ステップは、異種アダプターの非存在下で実行される。
【００２４】
配列不明の上記核酸の長さは、約100bp-2kbであってもよい。PCR効率は、核酸テンプレートの長さが2kbより大きい場合、低下する可能性がある。
【００２５】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その中の変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００２６】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は、BIOANALYZER(登録商標)によって測定された転移性卵巣がん患者由来のオリジナル血漿DNAサンプルを示す。1マイクロリットルのオリジナル(非常に濃縮された)血漿DNAサンプルを、BIOANALYZER(登録商標)によるこの定量化において用いた。35bpと10,380bpのピークは、サイズマーカーである。全てのDNA分子は、血漿サンプル中に存在する場合、血漿中の公知のDNAサイズ分布に基づいて、これらの2つのマーカー間に存在すると予想される。FUは、「蛍光ユニット」を表す。Bioanalyzerは、DNA濃度を検出するために、蛍光標識を使用する。T-オリゴプライムPCR(TOP-PCR)増幅血漿DNAの量(BIOANALYZER(登録商標)によって算定。図2を参照)に基づいて、この図において示される血漿DNAの合計量は、1マイクロリットル当たり〜0.1フェムトグラム(fg)であると算定された。
【図２】図2は、20サイクルTOP-PCR増幅後の血漿DNAを示す。合計8μlの血漿DNAを16μlストックから取得して、エンドリペア、A尾部化及び同種アダプターへの連結のために用いて、AMPURE(登録商標)XPビーズ用いた精製を行った。精製されたDNAサンプルを、20サイクルのPCRによって増幅して、AMPURE(登録商標)を用いて再び精製した。溶出液を5μlのヌクレアーゼフリー水に保持して、その1μlをBIOANALYZER(登録商標)分析のために使用した。(424bpにピークを有する)DNAの合計量は、BIOANALYZER(登録商標)による定量化で102pg/μlであった。このデータに基づいて、ストックのオリジナル16μlの血漿DNA濃度は、〜0.1 fg/μlであった(図1を参照)。
【図３】図3は、30サイクルTOP-PCR増幅後の血漿DNAを示す。合計8μlのオリジナル血漿DNAをエンドリペアして、A尾部化し、同種アダプターに連結して、次に、アダプターのTオリゴを用いて30サイクル増幅を行った。1μlの増幅後血漿DNAをBIOANALYZER(登録商標)で測定した。DNA分子のサイズは、〜100bpから2,000bp超にわたる。
【図４】図4は、30サイクルTOP-PCR増幅及び音波処理後の血漿DNAを示す。音波処理は、COVARIS(登録商標)によって実施した。DNA断片のサイズは、〜100から1,000にわたる。
【図５】図5は、血漿DNA分析の作業全体の流れを示している。
【図６】図6は、TOP-PCRによって救われた血漿ctDNAサンプル、がん患者由来のゲノムDNAサンプル及び正常な新しい血漿ctDNAコントロールのミトコンドリアDNAプロファイルを示している。様々な起源由来の血漿DNAサンプルを、同種アダプターシステムによって増幅し、MISEQ(登録商標)シーケンサーによって配列決定した。得られた配列を、hg19に含まれるヒトミトコンドリアゲノム(UCSCデータベース)に対してマッピングして表示させた。A) TOP-PCR増幅した、卵巣がん患者の(劣化した)血漿DNA由来のmtDNAプロファイル。B) 同じ卵巣がん患者のバフィーコートDNA由来のmtDNAプロファイル。C) 同じ卵巣がん患者の腫瘍組織由来のmtDNAプロファイル。D) TOP-PCR増幅された、若年性乳がん患者の(劣化した)血漿DNA由来のmtDNAプロファイル。E) TOP-PCR増幅された、正常雌コントロールの(新しい)血漿DNAからのmtDNAプロファイル。
【図７】図7は、TOP-PCRによる血漿DNA増幅を示している模式図である。相補的なオリゴ(T-オリゴ及びP-オリゴと表記)は、オリゴ合成機によって合成される。P-オリゴだけは、5'-末端にリン酸基を有する。室温でのアニーリングによって、これらの2つのオリゴが、同種の付着アダプターを形成することができる。これは、血漿DNA分子の末端(終端)だけに連結することができる。T-オリゴに5'-リン酸基が存在しないため、上記付着アダプターの自己連結反応が防止される。唯一のPCRプライマーとしてT-オリゴを使用するPCR増幅は、配列決定及びその後の分析のために標的血漿DNA分子を効率的に増幅することができる。
【図８】図8は、アダプターの設計を示している模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、解説だけを意図する以下の実施例に特に記載されている。これは、その中の多数の修正形態及び変更変更は、当業者にとって明らかなためである。以下、本発明の様々な実施形態を詳細に説明する。図面を参照する。同じ数字は、図面全体にわたって、同じ構成要素を指す。本願明細書の記述において、そして、添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられているように、「a」、「an」及び「the」の意味は、文脈で別途明記されていない限り、複数を含むものである。また、本願明細書の記述において、そして、添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられているように、「in」の意味は、文脈で別途明記されていない限り、「in」及び「on」を含むものである。更に、表題又は副題は、読者の便宜のために明細書において使用しており、本発明の範囲に影響を及ぼすものではない。加えて、本明細書において使用するいくつかの用語は、以下でより詳細に規定している。
【００２９】
定義
本明細書において使用する用語は、一般的に、本発明の文脈内における、及び、各用語が用いられる特定の文脈における、この技術でのそれらの通常の意味を有する。本発明を記載するために用いるある種の用語は、本発明の記述に関する実践者に追加のガイダンスを提供するために、以下で、そうでなければ、明細書中で述べている。便宜上、ある種の用語は、強調、例えばイタリック及び/または引用符を使用して強調さている場合がある。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に対して影響を及ぼすものではなく、用語の範囲及び意味は、それが強調されていようがいまいが、同じ文脈において同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、代わりの言葉及び同義語を、本願明細書に述べられる任意の1又は複数の用語に用いてもよいが、この用語が本願明細書に詳しく述べられているか議論されているかに関わりなく、置き換えには、如何なる特別な重要性も存在しない。ある種の用語の同義語は、提供される。1又は複数の同義語の記載は、他の同義語の使用を除外しない。本願明細書に述べられる任意の用語の例を含む、本明細書での如何なる場所での例の使用は、解説のためだけにあり、本発明又は任意の例証された用語の範囲及び意味を決して制限するものではない。同様に、本発明は、この明細書において与えられる様々な実施形態に限定されない。
【００３０】
別途定義されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、一般に、本発明と関係がある当業者によって理解するものと同じ意味を有する。不一致の場合、(定義を含む)本書が支配的であろう。
【００３１】
本明細書で用いられるように、「およそ」、「約」又は「大体」は、一般的に、所定の値又は範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、より好ましくは、5パーセント以内を意味する。本願明細書で与えられる数量は、「大体」であり、はっきりと明言されていない場合は、用語「およそ」、「又は」又は「大体」は、推定することができることを意味する。
【００３２】
配列決定の「包括度」という用語は、「何回、特定の位置を配列決定するか」を意味する。例えば、特定の遺伝子位置にマップされる合計30配列(配列決定装置によって生産されるもの)がある場合、この位置の(配列決定)包括度は30倍である。他の例に関して、10番染色体の位置1,000,000が「A」であり、そして、ライブラリーにおいて、我々は、このサイトにマッピングする25配列を有する(即ち、25個は、この位置をカバーしている)場合、この位置は、25倍の包括度を有する。ユニットは、「包括度の回数又は倍数」でなければならない。しかしながら、「包括度」は、それ自体で、ゲノム研究において既に広い意味を有する用語である。
【００３３】
用語「不連続パターン」及び「セグメント化パターン」は、互いに置換可能である。
【００３４】
用語「がん変異」及び「がん遺伝子変異」は、互いに置換可能である。最初に、がん変異は、がん細胞又はがん組織で見つかる遺伝子変異(例えば単一塩基の逸脱、挿入、欠失、逆位等)に関する。集約的ながん研究から生じた知識の増加に関連して、がんが、遺伝的及び後成的修飾での改変、ミトコンドリア及び核DNA異常、染色体不安定並びに代謝異常を含む、複数のレベルでの複数タイプの障害から生じる非常に複雑な疾患であることが明らかとなりつつある。
【００３５】
「アダプター」は、アニーリングされたオリゴヌクレオチドの2つのストランドからなる。オリゴの長さは、10-20ヌクレオチド、好ましくは20ヌクレオチドであってもよい。長さが10未満のヌクレオチドは、アニーリングでの特異性を低下させる可能性がある。長さ20を超えるヌクレオチドは、効果対費用が低くなる可能性がある。本発明の一例において、Tオリゴは、11bpの長さ(例えば、配列：5'-AGACTCCGACT-3'(配列番号: 2))を有する。示しているPオリゴ配列は、5'-GTCGGAGTCTgcgc-3'(配列番号: 1)である。アダプターの例は、米国特許公開番号20120231508に開示されており、その全てを本願明細書に引用したものとする。
【００３６】
「同種アダプター」という用語は、1つの単一タイプのアダプターを意味する。
【００３７】
「異種アダプター」という用語は、互いに異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも2種類のアダプターを意味する。
【００３８】
「単一」プライマーは、プライマーのペアの代わりに、1つのタイプのプライマーだけが存在していることを意味する。「異種プライマー」という用語は、少なくとも2種類の異なるプライマーを意味する。
【００３９】
「オーバーハング」は、DNA分子の末端における、ペアになっていないヌクレオチドの延在部である。これらペアになっていないヌクレオチドは、3'又は5'末端において、3'又は5'オーバーハングを形成する。オーバーハング末端が回文構造である場合、それは、オーバーハングのヌクレオチド配列がパリンドロームであることを意味する。
【００４０】
「3'-非Aオーバーハング」という用語は、非アデニンオーバーハング、即ち、追加のアデニンヌクレオチドを有しない3'-オーバーハングを有する3'-末端を意味する。
【００４１】
体液ctDNAという用語は、体液から得られる循環DNAをいう。
【００４２】
我々は、効率的且つ非選択的な、微量線形DNAの全長増幅のために設計した「Tオリゴプライムポリメラーゼ連鎖反応法(TOP-PCR)」と称する強力なDNA増幅戦略を開発した。しばしば追加の「A」を標的DNAの両3'末端に加える、現代の分子的クローニング及びNGS配列決定戦略との調和性のために、我々は、全ての標的DNA断片に付着末端連結のための3'末端の追加の「T」(即ち、3'-Tオーバーハング)を保持する同種二本鎖アダプター戦略を採用した。我々は、低存在量のDNA断片又は部分的に劣化した血漿DNAサンプルを、全長増幅することができた。これによって、配列分析の分解能は、劇的に増加し、古いサンプルを救うことができた。
【００４３】
本発明の方法によれば、核酸の配列情報は、不明又は利用不可である。核酸の両不明末端は、適切な同種アダプターに連結することによって与えられる。上記アダプターは、公知の配列の2つのオリゴ(P-オリゴ及びT-オリゴ)からなり、T-オリゴは、わずか1つのPCRプライマーとしての役割を果す。そして、上記核酸は、同種アダプターのP-オリゴとアニーリングされるT-オリゴによって増幅する。サンプル中の配列不明の全ての核酸は、完全に増幅することができる。
【実施例】
【００４４】
本発明の範囲を制限する意図なしに、本発明の実施形態による例示的な機器、装置、方法及びそれらの関連した結果を以下に示す。表題又は副題は、読者の便宜のために実施例において使用しており、発明の範囲を決して限定すべきでないことに留意されたい。更に、ある種の理論は、本願明細書に提唱及び開示されているが、それらが正しいか間違っているかにかかわらず、任意の特定の理論又は動作スキームにかかわらず本発明が実施される限り、それらが、本発明の範囲を決して限定すべきではない。
【００４５】
本発明は、血漿中に存在し得る、遺伝子内又は遺伝子間の任意の腫瘍変異を発見することができる新規の検出法に関する。循環血漿DNAは、チャネルとして作用し、このチャネルによって、我々は、任意のがん変異に接近して分析することが、上記変異が上記チャネルを通じて流れている限りできる。血漿DNA増幅は、大きな課題を示しており、強力な分子的増幅戦略を必要とする。我々は、転移性卵巣がん患者から得られた血漿由来のctDNAを増幅するTOP-PCRを使用する戦略を成功裏に試験した。増幅されたctDNAサンプルは、クロス組織比較のための腫瘍(ゲノム)DNAと並行して配列決定した。我々は、有意な数の同時点変異(即ち、血漿DNA及び腫瘍DNAの両方で見つかる変異)を同定することで、ctDNAと腫瘍DNAの間における変異位置に検出可能なデータ的オーバーラップを示した。まとめると、これらの概念実証実験からの結果により、腫瘍変異の血漿DNA媒介検出のための及びがん診断のための、TOP-PCRにおける単一プライマーとしてのTオリゴ及び同種アダプターを使用することの実現可能性が証明される。この方法は、迅速且つ強力である。
【００４６】
BIOANALYZER(登録商標)を使用した転移性卵巣がん患者由来の、予め増幅されたオリジナル血漿DNAサンプルの評価
血漿DNAの量は、BIOANALYZER(登録商標)下で測定可能に予測はできないが、初期記録のために、全ての血漿DNAサンプルを、BIOANALYZER(登録商標)又は同等のデバイスによって定量化することが必要である。qPCRを、BIOANALYZER(登録商標)の代わりに、初期定量のために選択することができるが、後者が推奨される。理由は、qPCRよりもBIOANALYZER(登録商標)のほうが、実施が容易であり、そして、本発明の同種アダプターとの増幅の効果が、BIOANALYZER(登録商標)を使用する増幅前及び増幅後のサンプルの比較によって、容易に特徴づけることができるためである。
【００４７】
実験手順
卵巣がん患者由来の1mlのオリジナル血漿DNA(ddH2O中に調製)を、BIOANALYZER(登録商標)(Agilent 2100)によって質的に評価し、量的に算定した。BIOANALYZER(登録商標)で測定した増幅前血漿DNAサンプルを図1に示している。このサンプルにおける血漿DNAの量は、BIOANALYZER(登録商標)の最小検出可能レベル以下であることがわかった。
【００４８】
エンドリペア及びA尾部化
血漿DNA分子をエンドリペアして、全ての3'末端を「A」尾部化し、本発明の同種アダプターに連結した。
【００４９】
同種アダプター及びTオリゴを用いた血漿DNAの増幅
PCR増幅は、上記アダプターのTオリゴを用いて実施した。本発明の一実施形態において、図7に示すように、T-オリゴ配列は、5'-AGACTCCGACT-3'である。
【００５０】
DNA精製
TOP-PCR増幅血漿DNAサンプルは、AMPURE(登録商標)XPキット又はゲル切除によって精製することができる。
【００５１】
DNA音波処理
Corvarisソニケーターを使用した。配列ライブラリーを作成するために、音波処理された増幅血漿DNAサンプルを、BIOANALYZER(登録商標)によって測定し(図4)、エンドリペアして、A尾部化し、そして、配列決定アダプターに連結した。
【００５２】
配列ライブラリー構築の間、配列決定アダプター連結DNAサンプルを、AMPURE(登録商標)XPビーズを用いて精製して、アダプター連結DNAを伸長させる従来型のPCR方法によって増幅し、次に、AMPURE(登録商標)XPビーズを用いて精製し、300bp-500bpのDNA断片を選択した。
【００５３】
配列ライブラリーを、qPCRを用いて定量化し、クラスター生成のためにMISEQ(登録商標)配列決定装置にロードした。作成されたライブラリーは、250×250(bp)PE配列決定によって配列決定された。次に、生成された配列を分析した。
【００５４】
作業全体の流れ
分析のための作業の流れを図5に概略的に示している。
【００５５】
TOP-PCR増幅戦略によって明らかにしたがん患者特異的ミトコンドリアDNAプロファイルの不連続性
ここで、我々は、同種アダプター増幅戦略の強力さを証明する一例としてmtDNAプロファイリングを使用する。図6に示すように、mtDNAプロファイル中の隙間(不連続)の存在は、古い血漿DNAサンプルだけで見つかった。
【００５６】
T-オリゴプライムPCR増幅で用いるためのアダプター設計
上記アダプターは、オリゴヌクレオチドの二本鎖からなる。1つのストランドは、T-オリゴと称し、3'-末端に追加のチミンヌクレオチド(T)を有する。他のストランドは、5'-末端にリン酸基を有するP-オリゴと称し、その3'-末端ヌクレオチドは追加のTを有しない。上記アダプターは、平滑-付着(即ち、一方の末端が平滑で、他方の末端が付着)又は二重付着(即ち、両端が付着)アダプターであってもよい。それぞれ、図8の上側パネル及び下側パネルを参照。「平滑-付着」アダプターに関して、P-オリゴは、T-オリゴに対して1塩基短く、T-オリゴの3'-末端がTであることを除いて相補的である。「二重付着」アダプターに関して、P-オリゴは、T-オリゴよりも長い(図8)。「アダプター」に関して、以下の5つの要件が存在する：1) 1つのストランド(T-オリゴと称される)は、追加の3'-T(即ち、3'末端の「T」オーバーハング)を有する必要があり、2) T-オリゴは、5'-リン酸を有さず、3) 他のストランド(P-オリゴ)は、5'-リン酸を必要とし4) その3'-末端のTを除いて、T-ストランドの長さは、P-ストランドの長さよりも短い又は同じであり、5) T-オリゴだけが、TOP-PCR増幅のためのPCRプライマーとして用いられる。
【００５７】
がん遺伝子変異の評価
バフィーコートDNA(正常コントロールとして使用)及び血漿DNAの両方は、試験される同じがん患者又は個人から収集する必要がある。血漿DNAは、その初期濃度に応じてTOP-PCRによって増幅できたり増幅できなかったりするが、その次に配列決定を行なう一方で、バフィーコートDNAは、TOP-PCR増幅を必要とすることなく、直接配列決定される。そして、血漿DNA配列及びバフィーコート配列の両方を、参照ゲノム(例えばUCSCデータベースのhg19)に対してマッピングし、血漿DNA及びバフィーコートDNAのバリエーション(特にSNP、挿入及び欠失)を同定する。バフィーコートDNAのバリエーションは、血漿DNAで見つかったバリエーションから除いた。あるバリエーション(例えば、正常で健常な個人で見つかるSNP)は、「通常のバリエーション」と考えられ、例えば、無視しなければならない。血漿DNA中の残りのバリエーションは、がん細胞(即ち、潜在的ながん遺伝子変異)由来の可能性がある。
【００５８】
クロスライブラリー比較
ケース#1
正常ゲノム配列データベース：nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
（１）がん組織：            nnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnn
（２）血漿ＤＮＡ：          nnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnn
（３）ＷＢＣ  ＤＮＡ：      nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
クロスライブラリー比較の結果は、がん変異を示している。
【００５９】
ケース#2(変異なし)
正常ゲノム配列データベース：nnnnnnnnnnnnnnGnnnnnnnn
（１）がん組織：            nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
（２）血漿ＤＮＡ：          nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
（３）ＷＢＣ  ＤＮＡ：      nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
クロスライブラリー比較の結果は、変異を示していない。
【００６０】
本発明固有の特徴/既存の技術と比較した場合の利点
他のグループ(例えばドーソン外及びフォルショウ外)が以前に採用した手順は、時間がかかり、商業機器に深く依存していたことから、遺伝子変異スクリーニング能力が非常に限られた範囲となっていた。それらのアプローチは、非常に限られた数の公知のがん遺伝子だけを分析することができることから、公知及び不明の新規のがん変異のグローバルな検出に適してはいない。本発明の方法は、がん変異に関してスクリーニングすることができる又は血漿DNA分析を経たがん診断のために用いることができる遺伝子の位置(遺伝子内及び遺伝子間の位置は検出可能)又は遺伝子の数によって制限されることはない。
【００６１】
本発明の固有の特徴は、以下の通りである：
(1)  従来型のPCRプライマーとは異なり、Tオリゴは、PCRにおいて使用する唯一のプライマーである、
(2)  TOP-PCRを用いたPCR増幅は、高効果である、
(3)  本発明の手順は、極めて単純且つ直接的である、
(4)   以前の方法は、いくつかの公知の遺伝子に限定されている一方で、本発明の方法は、遺伝子内及び遺伝子間の(公知又は新規の)がん変異を含む全てのタイプの変異を検出する、
及び、
(5)   他の方法は、より多くの機器(例えばデジタルPCR又はrtPCR装置)を必要とする一方で、本発明の方法は、現在、最も感度が高いDNA配列決定機器であり、また、配列決定アダプターとの連結のための標的DNAのA尾部化にも使用する、NGS配列決定装置と調和して機能する。
【００６２】
本発明の有用性
バイオテクノロジーの進化の間、最も強力且つ最も単純なアプローチは、進化の選択から生き残る機会が高い。本発明によれば、本方法には、他の方法に勝る十分な利点があることから、早期のがん検出のために、更には研究室での通常の使用のために、臨床サンプルでの使用に選択される機会が非常に高い。キットは、本発明による検出法での使用のために作り出してもよい。
【００６３】
RNA分子をcDNAに変換する場合は、TOP-PCRは、RNAを増幅することができる。
【００６４】
いくつかの血漿サンプルは、既に十分なDNAを有していることから、TOP-PCRによってこれらのサンプルを増幅する必要がない。TOP-PCRは、特に低存在量の血漿DNAサンプル(例えば長期間保管されたもの(例えば、3又は4年にわたって)又は繰り返しの凍結解凍サイクルされたもの)に有効である。
【００６５】
本発明の例示的な実施形態に関する前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示しており、網羅的であったり開示される厳密な形態に本発明を制限したりすることを意図するものではない。上記説明の観点から多くの修正形態及び変更形態が可能である。
【００６６】
実施形態及び実施例は、本発明及びそれらの実用的な応用の原理を説明する目的で選択し記載しており、他の当業者が本発明及び各種実施形態を、予想される特定の用途に適している各種変更形態を伴って利用することができるようにしている。代わりの実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、関係する当業者にとって明らかになるだろう。従って、本発明の範囲は、ここで記載されている前述の記述及び例示的な実施形態よりは、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００６７】
特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得るいくつかの参考文献は、本発明の記述に引用され論じられている参考文献の引用又は議論は、単に本発明の記述を明確にするためだけに提供されているものであり、かかる任意の参考文献が本願明細書に記載の本発明に対する「先行技術」であるという自認でない。この明細書中で引用され議論されている全ての文献は、それらの全体が本願明細書に引用によって組み込まれており、各文献が引用によって個々に組み込まれているのと同程度に組込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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