(57)【要約】ＩＬ１３受容体α−２（ＩＬ１３Ｒα２）に結合するキメラ抗原受容体及びＯ６−メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の両方を発現する免疫細胞に関する組成物及び方法について記載される。ＩＬ１３キメラ抗原受容体（ＩＬ１３ＣＡＲ）又はそのバリアント及びＭＧＭＴタンパク質又はそのバリアントを含有するウイルス粒子は、Ｔ細胞のような免疫細胞をトランスフェクトするために使用され、トランスフェクトされた細胞にＩＬ１３Ｒα２を標的とする活性及び化学療法剤テモゾロミド（ＴＭＺ）に対する抵抗性の両方を付与する。記載された組成物及び方法は、悪性度の高い神経膠腫の治療のようながん治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸配列であって、
ＩＬ１３α２受容体（配列番号４４）に結合するＩＬ１３リガンドドメインと、
膜貫通ドメインと、
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと
を含むＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列；並びに
第２の核酸配列であって、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４３からなる群から選択されたＭＧＭＴポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸配列。
【請求項２】
ＩＬ１３ＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のキメラ核酸配列。
【請求項３】
ＩＬ１３ＣＡＲはヒンジ領域をさらに含む、請求項１又は２に記載のキメラ核酸配列。
【請求項４】
細胞質ドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）からなる群から選択された共刺激ドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項５】
ＣＤ２８共刺激ドメインは配列番号２９に少なくとも９０％同一である、請求項４に記載のキメラ核酸配列。
【請求項６】
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインは配列番号３０に少なくとも９０％同一である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項７】
自己切断リンカーペプチドをコードする第３の核酸配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項８】
第３の核酸配列は第１の核酸と第２の核酸との間に配置される、請求項７に記載のキメラ核酸配列。
【請求項９】
第１の核酸は、ＩＬ１３リガンドドメインとヒンジドメインとの間、ヒンジドメインと膜貫通ドメインとの間、膜貫通ドメインとＣＤ２８シグナル伝達ドメインとの間、又はＣＤ２８シグナル伝達ドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間に配置されるジペプチドリンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項１０】
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインと自己切断ペプチドとの間にリンカーペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項１１】
ＩＬ１３リガンドドメインは、配列番号２６、配列番号３６、及び配列番号３７並びにこれらのバリアントからなる群から選択された配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項１２】
配列番号１のヌクレオチド１０９〜１８３９、配列番号２のヌクレオチド１０９〜１８３９、及び配列番号３のヌクレオチド１０９〜１８３９からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項１３】
配列番号１（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、又はこれらの組み合わせを含む核酸配列。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列を含むベクター。
【請求項１５】
ベクターはウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラ核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項１８】
細胞は哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細胞はＴ細胞である、請求項１７又は１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
細胞は自己由来の細胞又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致細胞である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
細胞は脳腫瘍を有する１以上の個体から入手される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
第１の核酸配列であって、
ＩＬ１３α２受容体（配列番号４４）に結合するＩＬ１３リガンドドメインと、
膜貫通ドメインと、
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと
を含むＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列；並びに
第２の核酸配列であって、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されたＭＧＭＴポリペプチドをコードする核酸配列
を含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
【請求項２４】
第１の核酸配列であって、
ＩＬ１３α２受容体（配列番号４４）に結合するＩＬ１３リガンドドメインと、
膜貫通ドメインと、
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと
を含むＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列；並びに
第２の核酸配列であって、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されたＭＧＭＴポリペプチドをコードする核酸配列
を含む医薬組成物。
【請求項２５】
ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質を発現する哺乳動物細胞を生産する方法であって：
ａ）細胞に、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列を導入するステップであって、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質は、ＩＬ１３α２受容体（配列番号４４）に結合するＩＬ１３リガンドドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含むステップ；並びに
ｂ）ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質が前記細胞によって発現される条件下に細胞を維持するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記核酸配列はウイルスベクターを使用して前記細胞に導入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
治療を必要とする対象者の脳腫瘍を治療する方法であって、前記対象者に、
第１の核酸配列であって、
ＩＬ１３α２受容体（配列番号４４）に結合するＩＬ１３リガンドドメインと、
膜貫通ドメインと、
ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと
を含むＩＬ１３ＣＡＲをＮ末端→Ｃ末端の方向にコードする核酸配列、並びに
第２の核酸配列であって、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されたＭＧＭＴポリペプチドをコードする核酸配列
によってコードされたタンパク質を発現する１つ以上の免疫細胞を投与することを含む方法。
【請求項２９】
脳腫瘍は悪性度の高い神経膠腫である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象者は、ＤＮＡをメチル化する化学療法剤を用いた治療を受けているか、前記化学療法剤を用いて治療済みであるか、又は前記化学療法剤を用いた治療を受ける予定である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡをメチル化する化学療法剤はＴＭＺである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡをメチル化する化学療法剤は、投薬量の前記免疫細胞の投与前、投与中、又は投与後に投与される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、がんを治療するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術
標的免疫療法はこのように悪性病変の治療に関する有望な研究分野として出現し、近年大きく脚光を浴びてきた（非特許文献１及び２）。最も広く研究された標的のうちの１つはインターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）である（非特許文献３）。ＩＬ１３Ｒα２は、遍在性のＩＬ１３Ｒα１には存在するシグナル伝達鎖を欠いておりその結果としてＩＬ１３を介した下流のいかなるシグナル伝達経路も阻止する、インターロイキン１３（ＩＬ１３）のデコイ受容体である（非特許文献４）。ＩＬ１３Ｒα２の発現増大は神経膠腫及び他の腫瘍のモデルにおいて腫瘍の進行を促進することが報告されている。ＩＬ１３Ｒα２の発現は、神経膠腫の悪性度及び低い患者生存率についての予後マーカーである（非特許文献５）。ほぼ２０年前に発見された、そのＭＧ上での選択的発現は、以来ずっと治療法の標的となってきた（非特許文献６）。
【０００３】
神経膠芽腫は成人において最も一般的な原発性脳腫瘍である。毎年米国で悪性原発性脳腫瘍と診断される１８，０００人の患者の半分以上が、多形性神経膠芽腫を有している。多形性神経膠芽腫は、高い増殖指数、微小血管増殖及び巣状壊死を伴う、退形成性で細胞密度の高い腫瘍である。症候及び症状はいくつかの要因（大きさ、成長速度、脳内での腫瘍の局在性）に依存し、主として頭痛、卒中、神経学的欠損、精神状態の変化に代表される。多形性神経膠芽腫の予後は依然不良なままである。生存期間は大多数の患者において２年未満である。
【０００４】
手術、放射線療法、及び化学療法の三部分よりなるレジメンである、神経膠芽腫（ＧＢＭ）についての現在の標準的治療に伴う生存率は漸進的に向上しているにもかかわらず（非特許文献７及び８）、ほとんどの患者の予後は依然として不良である（非特許文献９及び１０）。ＧＢＭの治療における主な妨げは、脳血液関門を横切っての細胞毒性作用薬の送達を妨害する、脳内部における腫瘍の位置（非特許文献８）と、強力な免疫抑制性の環境（非特許文献１１）並びに化学療法抵抗性及び放射線抵抗性の神経膠腫幹細胞（非特許文献１２及び１３）との組み合わせである。その結果として、患者の生存率、生活の質、及び全般的な転帰を改善するために新規な戦略が絶えず試験されている。
【０００５】
従って、本明細書中に記載されるのは、脳腫瘍など、悪性細胞がＩＬ１３Ｒα２を発現又は過剰発現するがんの、より効力の高い治療のための組成物及び方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】カルパンティエ（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ）及びメン（Ｍｅｎｇ）、カレント・オピニオン・イン・オンコロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、２００６年、第１８巻、第６号、ｐ．６３１−６３６
【非特許文献２】ウェーンライト（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ）ら、エキスパート・オピニオン・オン・エマージング・ドラッグズ（Ｅｘｐ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ）、２０１２年、第１７巻、第２号、ｐ．１８１−２０２
【非特許文献３】タチ（Ｔｈａｃｉ）ら、ニューロオンコロジー（Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ）、２０１４年、第１６巻、第１０号、ｐ．１３０４−１３２４
【非特許文献４】アリマ（Ａｒｉｍａ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００５年、第２８０巻、第２６号、ｐ．２４９１５−２４９２２
【非特許文献５】ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１３年、第８巻、第１０号、論文ＩＤ  ｅ７７７６９
【非特許文献６】デビンスキ（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ）ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ）、１９９９年、第５巻、第５号、ｐ．９８５−９９０
【非特許文献７】ロル（Ｒｏｌｌｅ）ら、ニューロサージェリー・クリニクス・オブ・ノースアメリカ（Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  Ｃｌｉｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）、２０１０年、第２１巻、第１号、ｐ．２０１−２１４
【非特許文献８】アシュビー（Ａｓｈｂｙ）及びライケン（Ｒｙｋｅｎ）、ニューロサージカル・フォーカス（Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ  ｆｏｃｕｓ）、２００６年、第２０巻、第４号、ｐ．Ｅ３
【非特許文献９】ストゥップ（Ｓｔｕｐｐ）ら、ザ・ランセット・オンコロジー（Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ）、２００９年、第１０巻、第５号、ｐ．４５９−４６６
【非特許文献１０】オムロ（Ｏｍｕｒｏ）及びデアンジェリス（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ）、米国医師会雑誌（ＪＡＭＡ）、２０１３年、第３１０巻、第１７号、ｐ．１８４２−１８５０
【非特許文献１１】ロル（Ｒｏｌｌｅ）ら、アドバンシズ・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー（Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ）、２０１２年、第７４６巻、ｐ．５３−７６
【非特許文献１２】バオ（Ｂａｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４４巻、第７１２０号、ｐ．７５６−７６０
【非特許文献１３】フロシナ（Ｆｒｏｓｉｎａ）、モレキュラー・キャンサー・リサーチ（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ）、２００９年、第７巻、第７号、ｐ．９８９−９９９
【発明の概要】
【０００７】
１つの態様では、キメラ核酸配列であって、ＩＬ１Ｒα２受容体（ＩＬ１３Ｒα２）に結合するＩＬ１３キメラ抗原受容体（ＩＬ１３ＣＡＲ）をコードする第１の核酸と、Ｏ６−メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質である薬物抵抗性ポリペプチドをコードする第２の核酸とを含むキメラ核酸配列が提供される。
【０００８】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、ＩＬ１３Ｒα２に対するリガンドを含む。別の実施形態では、該リガンドはＩＬ１３である。さらに別の実施形態では、リガンドはＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ１３のフラグメントである。さらに別の実施形態では、リガンドはＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する抗体可変ドメイン又はそのフラグメントである。
【０００９】
一実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質はＰ１４０Ｋ置換を含む。
一実施形態では、キメラ核酸配列は、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする第１の核酸配列と、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列とを含む。
【００１０】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、ＭＧＭＴポリペプチドをコードする第２の核酸配列の５’側にある。代替実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、ＭＧＭＴポリペプチドをコードする第２の核酸配列の３’側にある。
【００１１】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、５’→３’の方向に、ＩＬ１３Ｒα２リガンドドメインをコードする核酸配列と、膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードする核酸配列と、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインをコードする核酸配列とを含む。別の実施形態では、第１の核酸配列は、ヒンジ領域であってＩＬ１３リガンドドメインとＴＭドメインとの間に配置されているヒンジ領域をコードする核酸配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、第１の核酸配列は、ＣＤ２８共刺激ドメインであってＴＭドメインとＣＤ３−ゼータ鎖との間に配置されているＣＤ２８共刺激ドメインをコードする核酸配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、第１の核酸配列は、シグナル配列であってＩＬ１３Ｒα２リガンドドメインのＮ末端側に配置されているシグナル配列をコードする核酸をさらに含む。
【００１２】
一実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８ヒンジドメインである。別の実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは配列番号２７を含む。
一実施形態では、細胞質ドメインは１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。一実施形態では、共刺激ドメインはＣＤ２８共刺激ドメインである。別の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインはＴＭドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間に配置されている。
【００１３】
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＯＸ−４０共刺激ドメイン、ＨＶＥＭ共刺激ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ２７共刺激ドメインからなる群から選択された１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。一実施形態では、追加の共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間に配置されている。
【００１４】
一実施形態では、シグナル配列は異種シグナル配列である。別の実施形態では、シグナル配列はＩＬ１３シグナル配列又はそのバリアントである。さらに別の実施形態では、ＩＬ１３シグナル配列は配列番号２５を含む。さらに別の実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は配列番号９を含む。
【００１５】
一実施形態では、ＩＬ１３リガンド結合ドメインは成熟型ＩＬ１３タンパク質（配列番号２６）を含む。別の実施形態では、ＩＬ１３リガンド結合ドメインは、成熟型ＩＬ１３のフラグメントであって成熟型ＩＬ１３タンパク質（配列番号２６）とほぼ同じ親和性でＩＬ１３Ｒα２タンパク質に結合するフラグメントからなる。
【００１６】
一実施形態では、ＩＬ１３リガンドをコードする核酸配列は、配列番号２６、配列番号３６及び配列番号３７からなる群から選択されたポリペプチドをコードする。別の実施形態では、成熟型ＩＬ１３ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０、配列番号３４、及び配列番号３５からなる群から選択された核酸配列を含む。
【００１７】
一実施形態では、第１の核酸は、５’→３’の方向に、配列番号１０、配列番号３４、又は配列番号３５からなる群から選択された核酸であってＩＬ１３リガンドドメインをコードする核酸、ＴＭドメインをコードする配列番号１４又はそのバリアントを含む核酸、及び、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列番号１８又はそのバリアントを含む核酸を含む。別の実施形態では、第１の核酸は、ＩＬ１３シグナル配列をコードする配列番号９又はそのバリアントをさらに含み、配列番号９の配列はＩＬ１３リガンドドメインをコードする核酸配列の上流にある。別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＤ８ヒンジドメインをコードする配列番号１２又はそのバリアントをさらに含む。さらに別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＤ２８共刺激ドメインをコードする配列番号１６又はそのバリアントの核酸をさらに含む。
【００１８】
一実施形態では、第１の核酸は、５’→３’の方向に、シグナル伝達ドメインをコードする配列番号９又はそのバリアントの核酸配列、ＩＬ１３リガンドドメインをコードする配列番号１０、配列番号３４、又は配列番号３５からなる群から選択された核酸、ＣＤ８ヒンジドメインをコードする配列番号１２又はそのバリアントの核酸配列、ＴＭドメインをコードする配列番号１４又はそのバリアントを含む核酸、ＣＤ２８共刺激ドメインをコードする配列番号１６又はそのバリアントの核酸、及び、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列番号１８又はそのバリアントの核酸配列を含む。
【００１９】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、成熟型ＩＬ１３リガンドとＣＤ８ヒンジドメインとの間のリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、成熟型ＩＬ１３リガンドとＣＤ８ヒンジドメインとの間のリンカーをコードする核酸配列は、配列番号１１からなる。
【００２０】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、配列番号１２と配列番号１４との間のリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、配列番号１２と配列番号１４との間のリンカーをコードする核酸配列は、配列番号１３からなる。
【００２１】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、配列番号１４と配列番号１６との間のリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、配列番号１４と配列番号１６との間のリンカーをコードする核酸配列は、配列番号１５からなる。
【００２２】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列は、配列番号１６と配列番号１８との間のリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、配列番号１６と配列番号１８との間のリンカーをコードする核酸配列は、配列番号１７からなる。
【００２３】
一実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列はＰ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号２２）を含む。別の実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号３３を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２４】
一実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列は、Ｇ１５６Ａ−ＭＧＭＴ（配列番号３８）、ＭＧＭＴ−２（配列番号３９）、ＭＧＭＴ−３（配列番号４０）及びＭＧＭＴ−５（配列番号４１）からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列は、Ｇ１５６Ａ−ＭＧＭＴ（配列番号３８）、ＭＧＭＴ−２（配列番号３９）、ＭＧＭＴ−３（配列番号４０）及びＭＧＭＴ−５（配列番号４１）を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２５】
一実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸配列は配列番号４８を含まない。別の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号４９を含まないＭＧＭＴタンパク質をコードする。
【００２６】
一実施形態では、キメラ核酸配列は、自己切断ペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、自己切断ペプチドをコードする核酸配列は配列番号２１を含む。さらに別の実施形態では、自己切断ペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、キメラ核酸配列はコザック配列をさらに含む。別の実施形態では、コザック配列は配列番号８を含む。さらに別の実施形態では、コザック配列は、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列の上流に位置する。一実施形態では、キメラ核酸配列は、コザック配列の上流にある第１の制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。別の実施形態では、コザック配列の上流の制限エンドヌクレアーゼ部位は配列番号７からなる。一実施形態では、キメラ核酸配列は、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列の下流にある第２のエンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。
【００２８】
一実施形態では、キメラ核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０９〜１８３６、配列番号２のヌクレオチド１０９〜１８３６及び配列番号３のヌクレオチド１０９〜１８３６からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、キメラ核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１３〜１８３６、配列番号２のヌクレオチド１３〜１８３６及び配列番号３のヌクレオチド１３〜１８３６からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、キメラ核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７〜１８４２、配列番号２のヌクレオチド７〜１８４２及び配列番号３のヌクレオチド７〜１８４２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、キメラ核酸配列は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
一実施形態では、キメラ核酸配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
一実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは、野生型のＩＬ１３（配列番号２６）の約１／５、１／１０又は１／１００の低い親和性でＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ−１３のバリアント又はそのフラグメントである。別例の実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは、野生型のＩＬ１３（配列番号２６）よりも約５倍、１０倍又は１００倍の高い親和性でＩＬ１３Ｒα２に結合するＩＬ１３のバリアント又はそのフラグメントである。
【００３１】
一実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは野生型のＩＬ−１３と同一ではない。別の実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは配列番号２６と同一ではない。
一実施形態では、Ｐ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質は、ＩＬ１３−ＣＡＲ−Ｔでトランスフェクトされた細胞が化学療法剤で処理されたときの、該薬物抵抗性ポリペプチドを発現している細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存可能性を、該化学療法剤で処理されるが薬物抵抗性ポリペプチドを発現していない細胞と比較して増大させるのに有効である。
【００３２】
一実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは野生型のＩＬ−１３と同一ではない。別の実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２受容体リガンドは配列番号２６と同一ではない。
別の態様では、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
【００３３】
一実施形態では、該ベクターは、本明細書中に記載されるような、ＩＬ１３ＣＡＲ、自己切断ペプチド、及びＭＧＭＴタンパク質をコードするモノシストロニックな核酸配列を含む。別の実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａペプチドを含む。
【００３４】
別例の実施形態では、ベクターは、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードするポリシストロニックなキメラ核酸配列を含む。別の実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードするポリシストロニックなキメラ核酸配列は、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列とＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列との間に配置された内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。さらに別の実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードするポリシストロニックなキメラ核酸配列は、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列とＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸配列との間に配置されたプロモーターをさらに含む。
【００３５】
一実施形態では、ベクターは細菌性プラスミドベクターである。別の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。
【００３６】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び薬物抵抗性ポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされた細胞が提供される。
【００３７】
一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される。
別例では、Ｎ末端→Ｃ末端の方向に、本明細書中に記載されるような、腫瘍抗原に結合するリガンド、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む組換えポリペプチドが提供される。
【００３８】
一実施形態では、Ｎ末端→Ｃ末端の方向に、腫瘍抗原に結合するリガンド、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む組換えポリペプチドは、ＣＡＲと薬物抵抗性ポリペプチドとの間に配置された自己切断ペプチドをさらに含む。別の実施形態では、薬物抵抗性ポリペプチドはＣＡＲのＮ末端側にある。さらに別の実施形態では、薬物抵抗性ポリペプチドはＣＡＲのＣ末端側にある。
【００３９】
別の態様では、ＴＭＺに曝露された細胞の生存能力を増大させる改変ＭＧＭＴポリペプチドを含む組換えポリペプチドが提供され、前記細胞は、本明細書中に記載されるようなＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、かつ脳腫瘍と診断された患者に投与される細胞である。
【００４０】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなＣＡＲをコードする第１の核酸と、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸とを含む組成物が提供される。
【００４１】
一実施形態では、第１の核酸は、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３リガンドドメイン、本明細書中に記載されるようなＴＭドメイン、及び本明細書中に記載されるようなＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲタンパク質をコードする。別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＡＲタンパク質のＩＬ１３リガンド結合ドメインの上流にあるシグナル配列をさらにコードする。さらに別の実施形態では、第１の核酸は、本明細書中に記載されるようなヒンジ領域であってＣＡＲタンパク質のＩＬ１３リガンドドメインとＴＭドメインとの間に配置されているヒンジ領域をさらにコードする。さらに別の実施形態では、第１の核酸は、ＴＭドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間に配置されているＣＤ２８共刺激ドメインをさらにコードする。さらに別の実施形態では、第１の核酸は追加の共刺激ドメインをさらにコードする。別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＡＲタンパク質をコードする核酸の上流にコザック配列をさらに含む。
【００４２】
一実施形態では、第２の核酸は、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＭＧＭＴタンパク質をコードする。
【００４３】
一実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質は配列番号４９を含まない。
一実施形態では、組成物は、第１の核酸及び第２の核酸を含むキメラ核酸を含む。
一実施形態では、キメラ核酸は、本明細書中に記載されるような自己切断リンカーペプチドをコードする核酸であって、第１の核酸と第２の核酸との間に配置された自己切断リンカーペプチドをコードする核酸を、さらに含む。
【００４４】
一実施形態では、キメラ核酸は、本明細書中に記載されるような内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）であって、第１の核酸と第２の核酸との間に配置されたＩＲＥＳをさらに含む。
【００４５】
一実施形態では、キメラ核酸は、ＣＡＲタンパク質をコードする第１の核酸の上流の第１のプロモーターと、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸の上流の第２のプロモーターとを含むバイシストロニックな構築物である。
【００４６】
一実施形態では、組成物は、ＣＡＲタンパク質をコードする第１の核酸を含む第１のベクターと、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸を含む第２のベクターとを含む。別の実施形態では、第１及び第２のベクターは各々プラスミドベクター又は発現ベクターである。さらに別の実施形態では、第１及び第２のベクターは各々レトロウイルス粒子である。
【００４７】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなＣＡＲをコードする第１の核酸と、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸とを含む宿主細胞。一実施形態では、第１の核酸は、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３リガンドドメインと、本明細書中に記載されるようなＴＭドメインと、本明細書中に記載されるようなＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含むＣＡＲタンパク質をコードする。別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＡＲタンパク質のＩＬ１３リガンド結合ドメインの上流にあるシグナル配列をさらにコードする。さらに別の実施形態では、第１の核酸は、本明細書中に記載されるようなヒンジ領域であってＣＡＲタンパク質のＩＬ１３リガンドドメインとＴＭドメインとの間に配置されたヒンジ領域をさらにコードする。さらに別の実施形態では、第１の核酸は、ＴＭドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間に配置されたＣＤ２８共刺激ドメインをさらにコードする。なおも別の実施形態では、第１の核酸は追加の共刺激ドメインをさらにコードする。別の実施形態では、第１の核酸は、ＣＡＲタンパク質をコードする核酸の上流にコザック配列をさらに含む。
【００４８】
一実施形態では、第２の核酸は、配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＭＧＭＴタンパク質をコードする。別の実施形態では、ＭＧＭＴタンパク質は配列番号４９ではない。
【００４９】
一実施形態では、宿主細胞は、第１の核酸及び第２の核酸を含むキメラ核酸を含む。
一実施形態では、キメラ核酸は、本明細書中に記載されるような自己切断リンカーペプチドをコードする核酸であって、第１の核酸と第２の核酸との間で配置されている、自己切断リンカーペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００５０】
一実施形態では、キメラ核酸は、本明細書中に記載されるような内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）であって、第１の核酸と第２の核酸との間に配置されているＩＲＥＳをさらに含む。
【００５１】
一実施形態では、キメラ核酸は、ＣＡＲタンパク質をコードする第１の核酸の上流の第１のプロモーターと、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸の上流の第２のプロモーターとを含むジシストロニックな構築物である。
【００５２】
一実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＲタンパク質をコードする第１の核酸を含む第１のベクターと、ＭＧＭＴタンパク質をコードする第２の核酸を含む第２のベクターとを含む。別の実施形態では、第１及び第２のベクターはそれぞれ、本明細書中に記載されるようなプラスミドベクター又は発現ベクターである。さらに別の実施形態では、第１及び第２のベクターはそれぞれ、本明細書中に記載されるようなレトロウイルス粒子である。
【００５３】
別の態様では、組換えポリペプチドを含む組成物であって、該組換えポリペプチドは、Ｎ末端→Ｃ末端の方向に、本明細書中に記載されるようなシグナル配列、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３リガンド、本明細書中に記載されるような膜貫通ドメイン、本明細書中に記載されるような細胞質シグナル伝達ドメイン、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物が提供される。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなヒンジドメインであって、ＩＬ１３リガンドドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されているヒンジドメインをさらに含む。さらに別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本明細書中に記載されるような自己切断ペプチドであって、細胞質シグナル伝達ドメインとＭＧＭＴタンパク質との間に配置されている自己切断ペプチドをさらに含む。
【００５４】
一実施形態では、組成物は医薬組成物である。
別の態様では、がんと診察された対象者を治療するための方法が提供される。
一実施形態では、方法は、対象者から細胞を入手することと、細胞を、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ及び本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする１つ以上の核酸を用いて形質導入することと、細胞を、核酸が該細胞によって発現される条件下に維持することと、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質を発現している治療上有効な数の細胞を患者に投与することとを含む。
【００５５】
一実施形態では、細胞内への導入は、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸を含む第１のベクター及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターを使用することを含む。別の実施形態では、細胞内への導入は、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸を含むベクターを使用することを含む。
【００５６】
一実施形態では、細胞は、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴキメラ構築物を含むベクターを用いて形質導入される。
一実施形態では、対象者は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物は霊長類、ヒト、又はマウスである。
【００５７】
一実施形態では、１つ以上の核酸は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はこれらの組み合わせからなる群から選択されたウイルスベクターを使用して細胞内に導入される。
【００５８】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。
一実施形態では、Ｔ細胞はプラズマフェレーシスを使用して入手される。
一実施形態では、対象者は、脳腫瘍、乳がん、膵臓がん、頭頚部がん、卵巣がん及び結腸直腸がんからなる群から選択されたがんであると診断済みである。別の実施形態では、がんは転移している。
【００５９】
一実施形態では、対象者は悪性度の高い神経膠腫であると診断済みである。別の実施形態では、対象者は、多形性神経膠芽腫（ＧＭＢ）、退形成性星細胞腫又は小児神経膠腫であると診断済みである。
【００６０】
一実施形態では、脳腫瘍は神経膠芽腫である。別の実施形態では、脳腫瘍は高悪性度の星細胞腫である。
一実施形態では、乳がんは基底様（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）乳がんである。
【００６１】
一実施形態では、方法は１つ以上の化学療法剤を用いて対象者を治療することをさらに含む。別の実施形態では、方法はテモゾロミド（ＴＭＺ）を用いて対象者を治療することを含む。
【００６２】
一実施形態では、１つ以上の化学療法剤は、１用量の改変細胞の投与前、投与中、及び／又は投与後において対象者に投与される。
一実施形態では、投与は、頭蓋内、髄内、皮内、皮下、局所、又は静脈内投与である。
【００６３】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を発現する細胞を生産する方法であって、細胞にＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴキメラタンパク質をコードする核酸配列を導入することと、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴキメラタンパク質が細胞によって発現される条件下に細胞を維持することとを含む方法が提供される。
【００６４】
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞又はマウス細胞である。
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は、自己由来の細胞又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致細胞である。
【００６５】
一実施形態では、細胞は、脳腫瘍又は悪性腫瘍と診断された１以上の対象者から入手される。
別の態様では、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含む細胞集団が提供される。別の実施形態では、細胞集団中の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０Ｔ、９０％又は９５％の細胞がＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を発現する、が提供される。
【００６６】
１つの態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原に対する１つ以上のリガンド（例えば抗体）を発現するＴ細胞受容体を含む（から本質的になる；からなる）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする（を有する：を含む；から本質的になる；からなる）、（１つ以上の）単離核酸配列に関する。いくつかの態様では、ＣＡＲは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに発現する。
【００６７】
別の態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原（例えばがん抗原結合ドメイン）の１つ以上のリガンド（例えば抗体）を発現するＴ細胞受容体を含むＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む（から本質的になる；からなる）発現構築物に関する。いくつかの態様では、ＣＡＲは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに発現する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原の１つ以上のリガンド（例えば抗体）を発現するＴ細胞受容体を含むＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む発現構築物を含む（から本質的になる；からなる）宿主細胞に関する。いくつかの態様では、ＣＡＲは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに発現する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原の１つ以上のリガンド（例えば抗体）を含むＴ細胞受容体を含む（から本質的になる；からなる）ＣＡＲを発現する細胞を生産する方法に関する。特定の態様では、ＣＡＲは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに含む。
【００７０】
別の態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原の１つ以上のリガンド（例えば抗体）を含むＴ細胞受容体を含む（を有する；から本質的になる；からなる）ＣＡＲポリペプチドに関する。特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに含む。
【００７１】
別の態様では、本発明は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原の１つ以上のリガンド（例えば抗体）を発現するＴ細胞受容体を含むＣＡＲを発現する１つ以上のＴ細胞を投与することを含む（から本質的になる；からなる）、治療を必要とする個体において脳腫瘍を治療する方法に関する。いくつかの態様では、ＣＡＲは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに発現する。
【００７２】
本発明はさらに、本明細書中に提供される組成物を含む医薬組成物にも関する。
先述の内容は、添付の図面において示されるような、以降の本発明の実例の実施形態のより具体的な説明から明白となろう。図面において同様の参照文字は様々な図の全体にわたって同じ部品を指している。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、それよりもむしろ本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ  ＣＡＲ核酸構築物の概略図。
【図１Ｂ】ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ  ＣＡＲを含むｐＭＦＧ宿主プラスミドのプラスミドマップを提示する図。
【図２Ａ】ＩＬ１３．Ｅ１３ＫＲ１０９Ｋ  ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴの概略図。
【図２Ｂ】ＩＬ−１３−ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴを含むｐＭＦＧ宿主プラスミドのプラスミドマップを提示する図。
【図３Ａ】ＩＬ１３ＣＡＲ構築物及びＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含有するウイルスを用いて形質導入されたＰＧ１３細胞のＦＡＣＳ解析を示す図。富化処理前。
【図３Ｂ】ＩＬ１３ＣＡＲ構築物及びＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含有するウイルスを用いて形質導入されたＰＧ１３細胞のＦＡＣＳ解析を示す図。富化処理後。
【図３Ｃ】ＩＬ１３ＣＡＲ構築物及びＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含有するウイルスを用いて形質導入されたＰＧ１３細胞のＦＡＣＳ解析を示す図。細胞溶解産物のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図４】ＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含むレトロウイルスを用いて形質導入され、かつＴＭＺに曝露されたＴ細胞の生存率を示すグラフ。
【図５Ａ】本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−ＭＧＭＴ構築物でトランスフェクトされた細胞におけるＩＬ２に関する部分について示す図。
【図５Ｂ】本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−ＭＧＭＴ構築物でトランスフェクトされた細胞におけるＩＦＮγに関する部分について示す図。
【図６】腫瘍を担持し、かつ本明細書中に記載されるようなキメラ構築物及び／又は化学療法剤を投与されたマウスの生存率を示す図。
【図７Ａ】ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のキメラの核酸配列（配列番号１）を提示する図。
【図７Ｂ】ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のアミノ酸配列（配列番号４）を提示する図。
【図８Ａ】ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のキメラの核酸配列（配列番号２）を提示する図。
【図８Ｂ】ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のキメラのアミノ酸配列（配列番号５）を提示する図。
【図９Ａ】ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のキメラの核酸配列（配列番号３）を提示する図。
【図９Ｂ】ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のキメラのアミノ酸配列（配列番号６）を提示する図。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載されるのは、がんの１つ以上の腫瘍抗原に対する１つ以上のリガンド（例えば、細胞表面タンパク質に対する抗体又はその他のリガンド）を発現するように遺伝子操作によって改変されたＴ細胞受容体を含む（１つ以上の）キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）の生成である。具体的には、本明細書中に記載されたＣＡＲタンパク質は、がん細胞の表面上に発現されるタンパク質に結合するリガンド結合ドメインを備えている。好ましくは、腫瘍抗原は、非疾患細胞若しくは正常細胞の表面上では発現されないか、又は非疾患細胞若しくは正常細胞において、がん若しくは他の疾患の細胞上で発現されるレベルよりはるかに低いレベルで発現される。改変されその結果としてＣＡＲを発現するようになされたＴ細胞は、そのＣＡＲの新たな特異性（ｎｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）によって、ＣＡＲにより認識される表面抗原（例えば受容体）を発現している腫瘍を攻撃するようにリダイレクトされる。同様に本明細書中に示されるのは、ＣＡＲが、脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質（例えば、治療に対する脳腫瘍細胞の抵抗性を克服する作用物質）をさらに含むことが可能であるということである。具体的には、本明細書中に記載された組成物及び方法は、悪性の細胞がＩＬ１３α２受容体（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する脳腫瘍を治療するように設計される。従って、本開示は、サイトカインであるインターロイキン１３（ＩＬ１３）又はＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する抗体の可変ドメインのような、ＩＬ１３Ｒα２のリガンドを発現及び提示するＣＡＲを使用して本明細書中に例証される。ＩＬ１３ＣＡＲは、Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子とともに発現される。一実施形態では、ＭＧＭＴ遺伝子は、脳腫瘍を治療するために使用される化学療法剤であるテモゾロミド（ＴＭＺ）に対する宿主細胞（例えばＴ細胞）の抵抗性を付与又は増強するタンパク質をコードするように改変される。
【００７５】
１つの好ましい実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、１３位（配列番号２６と比較した相対的番号付け）においてグルタミン酸がチロシンに変化するように変異させたＩＬ１３を含む。別例の好ましい実施形態では、ＩＬ１３を、１３位においてグルタミン酸がリジンに変化し、かつ１０９位においてアルギニンがリジンに変化するように変異させる（アミノ酸の１３位及び１０９位は、例えば、配列番号２６に対しての位置である）。一実施形態では、ＩＬ１３を、１０９位のアミノ酸がアルギニンからリジンへと変化するように変異させる。
【００７６】
１つの好ましい実施形態では、改変されたＭＧＭＴ遺伝子は、本明細書中ではＰ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号３３）と称されるＭＧＭＴバリアントをコードし、該ＭＧＭＴバリアントはＴＭＺのようなメチル化剤を用いる治療によって引き起こされる細胞毒性からＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴを発現するＴ細胞を保護する。
【００７７】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＰ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質は、転写されてＮ末端→Ｃ末端方向にＩＬ１３ＣＡＲ、自己切断ペプチド（２Ａ）、及びＰ１４０ＫＭＧＭＴを含む単一タンパク質をコードする単一転写物を生じる、モノシストロニックな構築物から発現される。この融合タンパク質の翻訳後、自己切断ペプチドの切断により、主として核に局在化するＰ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質と、ＩＬ１３リガンドドメインが宿主細胞の表面に提示されるＩＬ１３ＣＡＲとを生じる。しかしながら、当然であるがＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＰ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質が個別の核酸から発現されることも可能である。例えば、ＩＬ１２ＣＡＲタンパク質及びＰ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質をコードしている核酸が、別々のベクター内にあってその後同じ細胞内に導入されてもよいし、又は、個別のモノシストロニックな構築物として（例えば、各々が自身のプロモーターを有して）単一のベクター内にクローニングされることも可能である。
【００７８】
ＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を用いて形質導入されたＴ細胞は、ＴＭＺの存在下において、Ｐ１４０ＫＭＧＭＴを発現しなかったＩＬ１３ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較して、より長く生存した（例えば、実施例６；図６）。従って、本明細書中にさらに開示されるのは、ＣＡＲ及び薬物抵抗性ポリペプチド（ＭＧＭＴタンパク質）をコードする核酸配列、１つ以上の核酸又は該核酸を含むレトロウイルスベクター、１つ以上のベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入された細胞、並びに、遺伝的に改変されたＴ細胞の中で改変ＭＧＭＴ遺伝子を共発現することにより、ＴＭＺのような化学療法剤に曝露された該改変Ｔ細胞の生存可能性を増強するための方法である。
【００７９】
さらに構想されるのは、ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を含むがんであると診察された対象者を治療する方法である。例えば、悪性度の高い神経膠腫のような脳腫瘍及び基底様乳がんの細胞は、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質を同じ組織の非疾患細胞又は非がん細胞と比較して過剰に発現する。特許請求の対象となる組成物は、対象者が、メチル化作用を有する化学療法剤と、ＩＬ１３ＣＡＲ及び改変ＭＧＭＴ遺伝子の両方を発現する遺伝的に改変された免疫細胞（例えばＴ細胞）とをいずれも投与される場合に、特に有用である。この方法は、対象者が単に化学療法剤のみ又は遺伝的に改変されたＴ細胞を用いて治療された場合よりも、治療期間を短縮し、かつ神経膠腫の撲滅をより速くより効果的に達成することが可能である。従って、１つの態様では、本発明は、がんの１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原に対する１つ以上のリガンド（例えば抗体）を発現する、Ｔ細胞で使用するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする（１つ以上の）単離された核酸配列に関する。いくつかの態様では、Ｔ細胞は脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに発現する。
【００８０】
［定義］
本明細書中で使用されるように、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、１つ以上の細胞外のがん抗原結合ドメイン、１つ以上の膜貫通ドメイン、及びＴ細胞活性化のための１つ以上の細胞質シグナル伝達ドメインを含み、かつがんリガンド（例えばがん抗原）を発現している細胞に対する特異性を有する分子を指す。Ｔ細胞内へ導入されると、ＣＡＲはそのＴ細胞の特異性をリダイレクトする。特定の態様では、ＣＡＲは単一の分子として発現される。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、「がん抗原結合ドメイン」とは、がん細胞によって発現された１つ以上の抗原（１つ以上のがん抗原）に結合するドメインを指す。特定の態様では、がん抗原結合ドメインは、がん抗原に特異的に（選択的に）結合し、かつ非がん細胞（例えば正常細胞、健康な細胞、野性型細胞）によって発現されない非特異的な標的には結合しない結合ドメインである。
【００８２】
様々ながん抗原結合ドメインが使用されることが可能であり、かつ既知の方法を使用して生産されることも商業的供給元から入手されることも可能である。がん抗原結合ドメインは、例えば、核酸、ペプチド（タンパク質）、抗体、有機分子、合成分子などであってよい。そのようながん抗原結合ドメインは、例えば、ライブラリに由来するもの、及び／又は天然の供給源から得られるものであってよい。
【００８３】
本明細書中で使用されるような用語「ＩＬ１３ＣＡＲ」は、本明細書中に記載されるか又は当分野で知られているようなＩＬ１３リガンド、例えば、限定するものではないがＩＬ１３のバリアント（例えば、限定するものではないがＩＬ１３の機能性フラグメント（例えばＩＬ１３Ｒα２に結合することが可能なＩＬ１３のフラグメント））、及びＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する免疫グロブリンドメインのような他のＩＬ１３リガンドを含むＣＡＲを包含する。同様に、本明細書中で使用されるような用語「ＭＧＭＴ」は、野性型ＭＧＭＴ及び本明細書中に記載されるか又は当分野で知られているような任意のＭＧＭＴバリアントを包含する。
【００８４】
本明細書中で使用されるように、投薬量又は量に対して適用される用語「治療上有効な」とは、本開示のキメラ受容体を含み、かつ薬物抵抗性ポリペプチドをさらに含む化合物又は医薬組成物（例えばＴリンパ球及び／又はＮＫ細胞のような免疫細胞を含む組成物）の量であって、投与を必要とする対象者に投与されると所望の活性をもたらすのに十分な量を指す。本開示の文脈においては、用語「治療上有効な」は、本開示の方法によって治療される障害の、症状発現を遅延させるか、進行を阻止するか、少なくとも１つの症状を軽減又は緩和するのに十分な、化合物又は医薬組成物の量を指す。有効成分の複合物が投与される場合、該複合物の有効な量は、個別に投与された場合に有効であろうそれぞれの成分の量を含む場合もあれば含まない場合もあることに注意されたい。
【００８５】
本開示の組成物に関して使用されるような「薬学的に許容される」という言葉は、哺乳動物（例えばヒト）に投与された時に生理学的に忍容可能でありかつ典型的には有害反応を生じない、そのような組成物の分子的実体及び他の成分を指す。好ましくは、本明細書中で使用されるように、用語「薬学的に許容される」とは、哺乳動物での、及びより具体的にはヒトでの使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識された薬局方に収載されていることを意味する。
【００８６】
本明細書中で使用されるように、用語「対象者」は任意の哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、対象者はヒトである。
他の態様では、がん抗原結合ドメインは抗体全体又は抗体の生物学的に活性な部分である。本明細書中で使用されるような用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に選択的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本明細書中で使用されるように、「選択的に結合する」とは、抗体が抗原又はそのフラグメントに結合できること及び試料中の他の分子（例えば抗原）にはほとんど結合できないことを指す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、Ｆａｂフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２）、可変フラグメント（例えば、一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、二量体化ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、二重特異性フラグメント（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ））が挙げられる。そのようなフラグメントは、商業的供給元から入手され、及び／又は、例えばペプシンのような酵素を用いて抗体を処理することにより生成されてもよい。
【００８７】
抗体は、がん細胞によって発現される１つ以上の抗原に結合する（例えば、選択的に結合する）ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。本明細書中で使用されるように、「ポリクローナル抗体」は、各々が異なるエピトープを識別して特異性抗原に結合する抗体の集合に由来する抗体である。本明細書中で使用されるように、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、１つ以上の抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位を１種類しか含有していない抗体分子の集団を指す。よってモノクローナル抗体組成物は、典型的には該組成物が免疫反応する特定の抗原についての単一の結合親和性を示す。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の細胞外ドメインのような１つ以上の所望のがん抗原を用いて適切な対象者を免疫することにより上述のようにして調製可能である。免疫された対象者の抗体力価は、固定化されたポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いるなど、標準的な技法によって経時的にモニタリング可能である。必要に応じて、がん抗原に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば組織、血液から）単離され、かつ、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような良く知られた技法によってさらに精製されることが可能である。当業者であれば、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の細胞外ドメインに選択的に結合するポリクローナル抗体を作製することができるであろう。
【００８９】
免疫化の後の適切な時点で、例えば抗体力価が最も高い時に、抗体産生細胞を対象者から得て、標準的技法、例えば、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシテイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５−４９７）によって最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ）、１９８３年、第４巻、ｐ．７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（コール（Ｃｏｌｅ）ら、「モノクローナル・アンタイボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、アラン・アール．リス社（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、１９８５年、ｐ．７７−９６）又はトリオーマ技法によってモノクローナル抗体を調製するために使用することが可能である。ハイブリドーマを生産するための技術はよく知られている（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、「カレント・プロトコール・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、米国ニューヨーク州ニューヨーク、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９４年を一般には参照されたい）。簡潔に述べると、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を、上述のようにして免疫原で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、結果として生じるハイブリドーマ細胞の培養上清を、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。
【００９０】
リンパ球と不死化細胞株とを融合させるために使用される数多くの良く知られたプロトコールのうち任意のものが、がん抗原に対するモノクローナル抗体を生成する目的に適用可能である（例えば、上述の「カレント・プロトコール・イン・イムノロジー」；ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７７年、第２６６巻、ｐ．５５０５２；Ｒ．Ｈ．ケネス（Ｋｅｎｎｅｔｈ）、「モノクローナル・アンタイボディーズ：ア・ニュー・ディメンジョン・イン・バイオロジカル・アナライシズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）」、米国ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム・パブリッシング社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、１９８０年の書中；及びラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、ザ・イェール・ジャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・メディシン（Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、１９８１年、第５４巻、ｐ．３８７−４０２を参照されたい）。さらに、当業者は、同様に有用であろうそのような方法の多数の変法があることを認識するであろう。
【００９１】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製の１つの代替法では、がん抗原に対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）を、ポリペプチドを用いてスクリーニングすることによりがん抗原に結合する免疫グロブリンライブラリの構成メンバーを単離することで、同定及び単離されることが可能である。ファージディスプレイライブラリを生成及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体システム（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）、カタログ番号２７−９４００−０１；及びストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用するのに適した方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号；ＰＣＴ国際公開第９１／１７２７１号；ＰＣＴ国際公開第９２／２０７９１号；ＰＣＴ国際公開第９２／１５６７９号；ＰＣＴ国際公開第９３／０１２８８号；ＰＣＴ国際公開第９２／０１０４７号；ＰＣＴ国際公開第９２／０９６９０号；ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号；フックス（Ｆｕｃｈｓ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第９巻：ｐ．１３７０−１３７２；ヘイ（Ｈａｙ）ら、ヒューマン・アンタイボディーズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、１９９２年、第３巻、ｐ．８１−８５；ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年、第２４６巻、ｐ．１２７５−１２８１；及びグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、ジ・エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、１９９３年、第１２巻、ｐ．７２５−７３４に見出すことが可能である。
【００９２】
加えて、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して作製可能な、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含む、キメラかつヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体も、本発明の範囲内にある。そのようなキメラかつヒト化モノクローナル抗体は、当分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって生産可能である。
【００９３】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を生成するための上記の常套的な方法はいずれも、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の細胞外ドメインに選択的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法に容易に適用可能である。結果として生じた抗体の可変ドメイン又はそのフラグメントはその後、ＩＬ１３リガンドドメイン（配列番号２６）がＩＬ１３Ｒα２タンパク質に結合する親和性とほぼ同じ親和性でＩＬ１３Ｒα２タンパク質に結合するＩＬ１３リガンドドメインを生成するために使用可能である。
【００９４】
［本発明の構築物］
本発明は、少なくとも部分的には、ＩＬ１３Ｒα２に特異的なＣＡＲを発現している免疫細胞であってＴＭＺのような化学療法剤に抵抗性である細胞に基づいている。
【００９５】
ある実施形態では、本発明は、脳腫瘍細胞に対して選択的なＣＡＲタンパク質と、薬物抵抗性ポリペプチドとの両方をコードする核酸（本明細書中ではキメラ核酸配列とも呼ばれる）を提供する。好ましい実施形態では、ＣＡＲタンパク質はＩＬ１３ＣＡＲであり、薬物抵抗性ポリペプチドは該ポリペプチドを発現する細胞に対してＴＭＺ抵抗性を付与することができるＭＧＭＴタンパク質である。キメラ核酸配列は、本明細書中に記載されるようにして、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴ薬物抵抗性タンパク質の両方をコードするように構築されることが可能である。以下に提供されるのは、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質の、及びＭＧＭＴタンパク質のドメイン又は配列領域についての説明、並びに各ドメイン又は領域の非限定的な例である。ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質は、Ｎ末端→Ｃ末端の方向に、脳腫瘍細胞のような疾患細胞上のＩＬ１３Ｒ２αに選択的に結合するＩＬ１３リガンドドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、直線状のキメラ（融合）タンパク質である。ある実施形態では、本明細書中に記載されたＩＬ１３ＣＡＲタンパク質は、ＩＬ１３リガンドドメインのＮ末端側に配置されたシグナルドメイン、及び／又はリガンドドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたヒンジ領域を含むことができる。
【００９６】
ある実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基を含む短いペプチドリンカーが、ＣＡＲタンパク質の領域又はドメイン（例えばシグナル配列、ＩＬ１３リガンドドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン、又は追加の共刺激ドメイン）を分離するためにＩＬ１３ＣＡＲに含められる。当然ながら、短いペプチドリンカーは、他の任意の２つの領域（ドメイン）の間に短いペプチドリンカーが存在するか不在であるかとは関係なく、任意の２つの領域（ドメイン）の間に存在することが可能である。例えば、小さなペプチドリンカーがＣＡＲの中に存在して、該リンカーがシグナル配列（存在する場合）及びＩＬ１３リガンドドメイン、ＩＬ１３リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン、ＩＬ１３リガンドドメイン及びヒンジ領域（存在する場合）、ヒンジ領域（存在する場合）及び膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及びＣＤ２８補助シグナル伝達ドメイン（存在する場合）、ＣＤ２８補助シグナル伝達ドメイン（存在する場合）及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、及び／又は、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン及び追加の共刺激ドメイン（存在する場合）を分離することができる。ペプチドリンカーは、ＩＬ１３ＣＡＲ−自己切断ペプチド−ＭＧＭＴキメラタンパク質のそれぞれの領域又は（モノシストロニックな構築物の場合には）ドメインをコードする核酸のライゲーションを可能にする、制限エンドヌクレアーゼ部位又はその他の機構を含有する核酸配列によってコードされるアミノ酸であってよい。これらのドメイン及びリンカーそれぞれについては、以下により詳細に説明される。
【００９７】
１つの態様では、がん抗原結合ドメインは、ペプチド又はタンパク質（例えば、がん細胞の表面に発現される抗原に結合するリガンド；がん細胞の表面に発現される受容体に結合するリガンド）である。好ましい実施形態では、受容体はＩＬ１３２α受容体であり、ＣＡＲはＩＬ１３２α受容体に選択的に結合するリガンドを含むように構築される。特定の態様では、がん抗原結合ドメインは、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、又は１つ以上の挿入、欠失若しくは点突然変異を有するＩＬ−１３のバリアント（例えばＥ１３Ｋ  ＩＬ１３；Ｒ１０９Ｋ  ＩＬ１３；及び／又はＥ１３Ｙ  ＩＬ１３）である。がん抗原結合ドメインは、別例として、ＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する抗体の可変ドメイン又はそのフラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメントであってよい。
【００９８】
以下の表１及び２はそれぞれ、本発明の組成物（例えばキメラ核酸配列）及び方法において使用することが可能な本明細書中に記載の核酸及びポリペプチドの概要を提示している。一実施形態では、本発明は、表１に参照された核酸配列の任意の組み合わせを含むキメラ核酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、表２に参照されたアミノ酸配列の任意の組み合わせをコードするキメラ核酸配列を含む。
【００９９】
【表１】
2017537622.tif 000002
【０１００】
【表２】
2017537622.tif 000003
【０１０１】
＜リガンド＞
ＩＬ１３ＣＡＲリガンド（あるいは、リガンドドメイン）は、疾患細胞によって発現されるＩＬ１３受容体（例えばＩＬ１３Ｒα２）に選択的に結合するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。疾患細胞は、腫瘍細胞又はその他のがん性若しくは悪性の細胞であってよく、疾患細胞によって発現されるタンパク質は別例として本明細書中ではがん抗原とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、がん抗原は、健康な組織細胞によっては全く又はほとんど（ｍＲＮＡ発現プロファイリングによる決定で５０％、４０％、３０％  ２０％又は１０％未満しか）発現されないタンパク質である。一実施形態では、疾患細胞は神経膠芽腫細胞のような脳腫瘍細胞である。特定の態様では、がん抗原結合ドメインは、ＩＬ−１３Ｒ（例えば、ＩＬ１３Ｒα２、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６３１；配列番号４４）に結合する（例えば、特異的又は選択的に結合する）抗体全体又は抗体の生物学的に活性な部分である。他の態様では、リガンド（がん抗原結合ドメイン）は、ＩＬ−１３Ｒ（例えばＩＬ１３Ｒα２）に対する（に結合する；に特異的又は選択的に結合する）ｓｃＦｖである。
【０１０２】
がん（例えば腫瘍）細胞によって発現される様々な抗原が当分野において知られている。１つの態様では、がん抗原は脳腫瘍抗原であって例えば腫瘍表面上に発現されるものである。特定の態様では、脳腫瘍抗原は悪性度の高い神経膠腫によって発現される（例えば、神経膠腫／悪性脳腫瘍抗原）。悪性度の高い神経膠腫の具体例には、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、退形成性星細胞腫及び小児神経膠腫が挙げられる。悪性度の高い神経膠腫の腫瘍細胞によって発現される抗原の具体例には、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ−２及びＩＬ−１３Ｒ（例えばＩＬ１３Ｒα２）が挙げられる。
【０１０３】
１つの態様では、本発明の方法及び組成物の標的とされるがん抗原は、ＩＬ１３受容体α−２（ＩＬ１３Ｒα２）、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍上で過剰発現されるが正常な脳組織では最小限の発現であるか又は発現されない多形性神経膠芽腫関連タンパク質である（タチ（Ｔｈａｃｉ）ら、ニューロオンコロジー（Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏ）、２０１４年、第１６巻、第１０号、ｐ．１３０４−１３２４；セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）ら、バイオメド・リサーチ・インターナショナル（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ）、２０１４年、第２０１４巻、ｐ．９５２１２８）。１つの態様では、ＩＬ１３ＣＡＲは、ＩＬ１３α２受容体に結合するＩＬ１３及び／又はＩＬ１３突然変異体（例えばＥ１３Ｋ  ＩＬ１３（配列番号３６）及び／又はＲ１０９Ｋ  ＩＬ１３（配列番号３７））であるリガンドドメインを発現するか又は含有する（コン（Ｋｏｎｇ）ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２０１２年、第１８巻、第２１号、ｐ．５９４９−５９６０）。ＩＬ１３Ｒα２タンパク質はさらに、乳がん転移を含む乳がんにおいて（パパジョージス（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｓ）ら、ブレスト・キャンサー・リサーチ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ）、２０１５年、第１７巻、ｐ．９８−１１２）及び頭頚部がんにおいて（ジョーシー（Ｊｏｓｈｉ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２０００年、第６０巻、ｐ．１１６８−１１７２；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、２００３年、第９巻、ｐ．６３８１−６３８８）、アップレギュレートされることも見出されており、かつさらには膵臓がん、卵巣がん、及び結腸直腸がんの浸潤及び転移を促進することも示された（フジサワ（Ｆｕｊｉｓａｗａ）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ）、２００９年、第６９巻、ｐ．８６７８−８６９５；バルデラス（Ｂａｒｄｅｒａｓ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２０１２年、第７２巻、ｐ．２７８０−２７９０）。従って、本明細書中に記載された組成物及び方法は悪性腫瘍と診断された対象者を治療するための方法において有用であり、悪性腫瘍の種類には、限定するものではないが脳腫瘍、頭頚部がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、結腸直腸がんが挙げられる。
【０１０４】
当業者はＩＬ１３Ｒα２に特異的に結合するリガンドを生成することができる。例えば、ＩＬ１３Ｒα２の細胞外ドメインを用いたマウスの免疫化によるか、又はファージディスプレイによるなど、ＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合する抗体を生成するために常套的な実験作業がなされる。所望の選択的結合活性を備えた抗体の可変ドメインはその後、一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）を作出するために使用可能である。一実施形態では、ＩＬ１３Ｒα２に対して野性型ＩＬ１３、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩＬ１３（Ｒ１０９Ｋ）又はＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）と同じ親和性で選択的に結合するｓｃＦｖが、本明細書中に開示されるようなＩＬ１３ＣＡＲ構築物中のリガンドとして使用されることが可能である。
【０１０５】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、配列番号２６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％同一であるＩＬ１３ポリペプチド、又はその機能性フラグメントを含む、ＩＬ１３リガンドドメインを有し、ａ）配列番号２６の１３位のアミノ酸はグルタミン酸であるか；ｂ）配列番号２６の１３位のアミノ酸はチロシンであるか；又は、ｃ）配列番号２６の１３位のアミノ酸はリジンでありかつ配列番号２６の１０９位のアミノ酸はアルギニンである。一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲのＩＬ１３リガンドドメインは、配列番号２６、配列番号３６若しくは配列番号３７、又はこれらの機能性フラグメントを含む。
【０１０６】
本開示による核酸は上述のようなＩＬ１３ポリペプチドをコードする。一実施形態では、ＩＬ１３ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１０、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択される。
【０１０７】
ＩＬ１３ＣＡＲは、任意選択で、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質がプロセシングを受けて宿主細胞表面に提示されることを可能にするシグナル（リーダー）ペプチドをさらに含む。一実施形態では、シグナルペプチドは該リガンドタンパク質についての天然に存在するシグナルペプチドである。例えば、リガンドドメインは、自身のシグナル配列（配列番号２５のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるシグナル配列）を備えた完全長のＩＬ１３タンパク質を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号２５と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一の配列を含む。本開示による核酸は該シグナルペプチドをコードする。一実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸は配列番号９からなる。
【０１０８】
当業者は、異種のシグナル配列（ＩＬ１３ではない分泌型タンパク質又は膜貫通タンパク質由来のシグナルペプチド）が使用可能であることを理解している。シグナルペプチド（シグナル配列）は、膜結合型ポリペプチド又は分泌型ポリペプチドの膜移行に必要とされ、かつ膜移行後若しくは膜移行中にプロセシングを受ける、該ポリペプチドの不可欠な部分である。シグナル配列は、約１３及び３６アミノ酸の長さを有し、かつアミノ末端に少なくとも１つの、正電荷を有する残基を含有する。シグナル配列の中央部は疎水性の高い１０〜１５残基の部分であり、例えば、ヌナリ、ジェイ（Ｎｕｎｎａｒｉ，ｊ．）ら、カレント・オピニオン・イン・セル・バイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）、１９９２年、第４巻、ｐ．５７３−５８０及びギルモア、アール．（Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｒ．）ら、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９２年、第６７４巻、ｐ．２７−３７に記載されている。シグナルペプチドのいくつかの例には、限定するものではないが、ＶＨＣＡＭＰ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ又はＴＮＦ−Ｒのシグナルペプチドが挙げられる。シグナルペプチドは標的細胞の細胞膜に組み込まれると切断される。さらに、ＩｇＧ様タンパク質のシグナル配列のような異種のシグナル配列が使用されうることも企図される。
【０１０９】
＜ヒンジ領域＞
本明細書中に開示されるようなＩＬ１３ＣＡＲは、ＩＬ１３リガンドドメイン（抗原結合ドメイン）と膜貫通ドメインとの間に配置された、ヒンジ領域又はヒンジドメインとも呼ばれるスペーサー領域を含むことが可能である。本開示に包含されるＩＬ１３ＣＡＲは、ヒンジ領域を含む場合もあれば、含まない場合もある。目下記載されるＣＡＲのヒンジ領域は、抗原結合ドメインが抗原認識を容易にするために様々な方向に配向することを可能にするのに十分な可撓性を一般に有する、ペプチド配列である。当業者には十分理解されるように、他の適切なスペーサーが設定されることも可能である。例えば、短いオリゴペプチド又はポリペプチドのリンカー（例えば長さ２〜１０アミノ酸）が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間の連結を形成してもよい。ヒンジ領域の例は、免疫グロブリン由来のヒンジ領域（例えばＩｇＧ１のヒンジ領域）であり、限定するものではないが、免疫グロブリン様のタンパク質又はドメイン由来のヒンジ領域、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、及びＣＤ３の一部が挙げられる。一実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ８アルファ鎖由来のＩｇ様ドメインを含む。
【０１１０】
ＩＬ１３ＣＡＲの一実施形態では、ヒンジ領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含むか又は同配列からなる。別例として、ヒンジ領域は、配列番号２７と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一である配列を含むか又は同配列からなる。本開示による核酸はヒンジ領域をコードする。一実施形態では、ヒンジ領域をコードする核酸は配列番号１２を含む。一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号１２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一である核酸を含む。
【０１１１】
＜膜貫通ドメイン＞
本明細書中に記載されるように、ＣＡＲは１つ以上の膜貫通ドメインを含む。典型的には、膜貫通ドメインは、膜の両側を架け渡す疎水性領域（例えば疎水性アルファヘリックス）である。様々な膜貫通ドメインのうち任意のものが使用可能である。適切な膜貫通ドメインの例には、限定するものではないが、ＣＤ３（例えばＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメイン）又はＣＤ２８膜貫通ドメインが挙げられる。膜貫通ドメインは天然又は組換えの供給源のいずれかに由来することができる。供給源が天然のものである場合、ドメインは任意の膜結合型又は膜貫通型のタンパク質に由来しうる。１つの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合済みであるときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達を行うことができる。本発明に特に有用な膜貫通ドメインには、少なくとも、例えばＴ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を挙げることができる。
【０１１２】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖の少なくとも一部分、例えば配列番号２８を含むか、又はヒトＣＤ３ゼータ鎖の少なくとも一部分からなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２８と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一である配列を含むか又は前記配列からなる。本開示による核酸は膜貫通ドメインをコードする。一実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸は、配列番号１４、又は配列番号１４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％同一である核酸を含む。
【０１１３】
＜細胞質シグナル伝達ドメイン＞
本明細書中に記載されるように、ＩＬ１３ＣＡＲは、抗原が結合した後にＴ細胞に対して活性化及び／又は刺激シグナル（例えば、Ｔ細胞の活性化、始動、増殖、存続性及び／又は増幅、並びに腫瘍抗原に対するＴ細胞応答（例えば細胞傷害性に必要なシグナル）をもたらすもの）を伝達する細胞質ドメインを有する。細胞質ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば共刺激ドメイン）、及び／又は、Ｔ細胞受容体の、又はＴ細胞受容体に関連した、１つ以上の活性化ドメインを含む。適切な細胞質シグナル伝達ドメインの例には、限定するものではないが、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するＣＤ３−ζ（ＣＤ３−ゼータ）、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８（例えば、キメラＣＤ２８）、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ２４４、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、白血球Ｃ末端ＳＲＣキナーゼ（ＬＣＫ）、及びＣＤ１３７の細胞質シグナル伝達ドメインが挙げられる（例えば、サデライン（Ｓａｄｅｌａｉｎ）ら、キャンサー・ディスカバリー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ）、２０１３年、第３巻、第４号、ｐ．３８８−３９８；リー（Ｌｅｅ）ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２０１２年、第１８巻、第１０号、ｐ．２７８０−２７９０）。１つ以上のこれらの細胞質ドメインの存在により、ＺＡＰ７０、ＴＮＦ受容体関連因子１（ＴＲＡＦ１）、ＰＩ３Ｋ及び成長因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）と、ＣＡＲの細胞質ドメイン内の要素との会合によって経路を始動させ、シグナル伝達中間体の発動及び遺伝子転写をもたらすことが可能である。
【０１１４】
「共刺激ドメイン」又は「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子とは、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な第２のシグナルを提供する、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。共刺激ドメインは、例えばＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを通した細胞への活性化シグナルをもたらす立体配座変化を生じる。共刺激リガンドには、限定するものではないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激イガンド（ｉｇａｎｄ）（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンフォトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。ＩＬ１３ＣＡＲに１つ以上の共刺激ドメインを含めることにより、ＩＬ１３ＣＡＲを発現するＴ細胞の効力及び増殖が増強されうる。一実施形態では、共刺激ドメインはさらに、数ある中でも特に、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、限定するものではないがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、と特異的に結合する抗体も包含する。
【０１１５】
当業者には明白であろうが、ＩＬ１３ＣＡＲは任意の数の活性化ドメイン及び／又は刺激ドメインを有することができる。シグナル伝達ドメインは各々、ペプチド結合によって連結されてＩＬ１３ＣＡＲ構築物の細胞質ドメインを形成する。１つの態様では、ＩＬ１３ＣＡＲは活性化ドメイン及び刺激ドメインを有する。別の態様では、ＩＬ１３ＣＡＲは１、２、３、４、５個等の活性化ドメイン及び１、２、３、４、５個等の刺激ドメインを有する。
【０１１６】
一実施形態では、本開示のＩＬ１３ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８タンパク質及び／又はヒトＣＤ３−ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ３−ゼータ鎖シグナル伝達ドメインをいずれも含み、ＣＤ２８共刺激ドメインはＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインのＮ末端側にある。さらに、ＣＤ３−ゼータドメインがＣＤ２８共刺激ドメインのＮ末端側にあるＣＡＲ細胞質ドメインも企図される。本明細書中に記載されるように、ＣＤ２８共刺激ドメインは配列番号２９の配列を含む。ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインは配列番号３０の配列を含むか、又は前記配列からなる。本開示による核酸はＣＤ２８共刺激ドメインをコードする。一実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインをコードする核酸は配列番号１６からなる。本開示による核酸はＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをコードする。一実施形態では、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸は配列番号１８からなる。これらのシグナル伝達ドメインはそれぞれ、１つ以上の欠失、挿入、又は点突然変異（天然のもの又は人為的なもの）であって各ドメインのシグナル伝達機能が１つ以上の欠失、挿入、又は点突然変異を含有していないタンパク質のシグナル伝達機能とほぼ同じである、欠失、挿入、又は点突然変異を含有することができる。
【０１１７】
一実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲの細胞質ドメインは、配列番号１のヌクレオチド６７３〜１１４０、又は配列番号１のヌクレオチド６７３〜１１４３を含む核酸配列によってコードされる。別の実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸残基２２１〜３７６を含む細胞質ドメインを含む。
【０１１８】
図１Ａは、ＩＬ１３リガンドがＥ１３Ｋ置換及びＲ１０９Ｋ置換を含有しているバリアントであるＩＬ１３ＣＡＲ構築物の実施形態を示している。
＜薬物抵抗性ポリペプチド＞
本開示は、少なくとも部分的には、上記に詳述されたような脳腫瘍細胞に対して選択的なＣＡＲタンパク質と、薬物抵抗性ポリペプチドとの両方をコードしている核酸であって、ＣＡＲ及び薬物抵抗性ポリペプチドの両方の発現ががんを治療するのに有用である核酸に関する。例えば、ＣＡＲ及び薬物抵抗性ポリペプチドは、化学療法剤及び／又は化学療法剤の細胞毒性を増強する作用薬を用いた治療を受けている対象者に投与される細胞において発現させることが可能である。化学療法剤の例には、悪性神経膠腫（例えば多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ））を治療するために一般に使用される、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（ＢＣＮＵ又はカルムスチン）、ホテムスチン、ロムスチン及びテモゾロミド（ＴＭＺ）が挙げられる。いくつかの化学療法剤の細胞毒性作用は、致死的な鎖内架橋を形成する再編成をなす能力を有しているＯ６−メチルグアニン傷害の形成を伴う。しかしながらこれらのメチル化剤の有効性は、処理された細胞のＤＮＡから細胞毒性のＯ６−アルキルグアニン付加物を取り除くタンパク質であるＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６−メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の、腫瘍での過剰発現により、限定的である。したがって、高レベルのＭＧＭＴを発現する腫瘍細胞は、ＴＭＺ化学療法による殺滅に対して部分的又は完全に抵抗性である。メチル化剤の効力の低減を防止する１つの手段は、ＭＧＭＴの阻害剤、具体的にはＯ６−ベンジルグアニンを用いてＴＭＺ化学療法を受けている対象者を治療することである。しかしながら、Ｏ６−ベンジルグアニンの投薬は、造血細胞に対する同剤の毒性作用により制限されている。
【０１１９】
テモゾロミド（ＴＭＺ）は、Ｔ細胞を含む造血細胞に対する細胞毒性効果を有する抗神経膠腫化学療法薬である。ＦＤＡにより指示されるようなＴＭＺの標準投薬量、かつ従って抗神経膠腫治療における不可避なステップは、ＴＭＺが腫瘍細胞を破壊するのとまさしく同じ様式で、Ｔ細胞のＤＮＡをメチル化することによりＴ細胞を殺滅する（セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）ら、クリニカル・アンド・ディベロプメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２０１２年、ｐ．８３１０９０）。しかしながら、細胞における野性型ＭＧＭＴの過剰発現又は１つ以上のＭＧＭＴ突然変異体（例えばＧ１５６Ａ；Ｐ１４０Ｋ）の発現は、その細胞をＴＭＺのようなメチル化剤から保護するであろうことが示されている（ウールフォード（Ｗｏｏｌｆｏｒｄ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ジーン・メディシン（Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ）、２００６年、第８巻、第１号、ｐ．２９−３１）。従って、上記の核酸によってコードされる薬物抵抗性ポリペプチドは、ＴＭＺに対する抵抗性を付与するＭＧＭＴ又はＭＧＭＴバリアントである。これらのＴＭＺ抵抗性バリアントには、限定するものではないが、Ｐ１４０Ｋ−ＭＧＭＴ（配列番号３３）、Ｐ１４０Ｋ−ＭＧＭＴ（配列番号４３）、Ｇ１５６Ａ−ＭＧＭＴ（配列番号３８）、ＭＧＭＴ−２（配列番号３９）、ＭＧＭＴ−３（配列番号４０）及びＭＧＭＴ−５（配列番号４１）が挙げられる（フォンテス（Ｆｏｎｔｅｓ）ら、モレキュラー・キャンサー・セラピューティクス（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ）、第５巻、第１号、ｐ．１２１−１２８）。随所に記載されたＭＧＭＴバリアント中のアミノ酸置換についての表示部位（場所）（例えばＰ１４０Ｋ及びＧ１５６Ａ）は、配列番号３３の配列に基づいたアミノ酸部位である。ＭＧＭＴ−２バリアントは、Ｓ１５２Ｈ、Ａ１５４Ｇ、Ｙ１５８Ｈ、Ｇ１６０Ｓ及びＬ１６２Ｖ置換を有する。ＭＧＭＴ−３バリアントは、Ｃ１５０Ｙ、Ａ１５４Ｇ、Ｙ１５８Ｆ、Ｌ１６２Ｐ及びＫ１６５Ｒ置換を有する。ＭＧＭＴ−５バリアントは、Ｎ１５７Ｔ、Ｙ１５８Ｈ及びＡ１７０Ｓ置換を有する。
【０１２０】
本明細書中において開示及び使用される構築物について特に好ましいのは、Ｐ１４０Ｋ−ＭＧＭＴバリアントである。本開示による核酸はＭＧＭＴバリアントをコードする。一実施形態では、Ｐ１４０Ｋ−ＭＧＭＴをコードする核酸は配列番号２２からなる。同様に企図されるのは、Ｇ１５６Ａ−ＭＧＭＴ（配列番号３８）、ＭＧＭＴ−２（配列番号３９）、ＭＧＭＴ−３（配列番号４０）又はＭＧＭＴ−５（配列番号４１）をコードする核酸であって、各々がＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴ構築物中に存在しうる。同様に企図されるのは、配列番号４３（Ｐ１４０Ｋ点突然変異を有しているＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２４０３）、及びＧ１５６Ａ−ＭＧＭＴ（配列番号３８）、ＭＧＭＴ−２（配列番号３９）、ＭＧＭＴ−３（配列番号４０）又はＭＧＭＴ−５（配列番号４１）の突然変異に相当する任意の点突然変異を含むＭＧＭＴタンパク質配列である。
【０１２１】
本明細書中に開示されたキメラ核酸配列によってコードされたＭＧＭＴ又はそのバリアントは、核酸配列のＩＬ１３ＣＡＲタンパク質をコードする部分の下流又は上流に位置することが可能である。一実施形態では、このキメラ核酸配列はモノシストロニックであって、構築物は単一の転写物の転写を駆動するための単一のプロモーター配列を含み、該転写物が次に翻訳されて単一タンパク質となり該タンパク質が後に切断される。このモノシストロニック構築物の使用には、ＩＬ１３ＣＡＲタンパク質とＭＧＭＴタンパク質との間に配置された自己切断要素が必要である。例えば、キメラ核酸配列は、宿主細胞において発現された時、最初に単一タンパク質であってＮ末端→Ｃ末端の方向にＣＡＲ（例えば上述のＩＬ１３  ＣＡＲ）、自己切断ペプチド、及び本明細書中に記載されたＭＧＭＴタンパク質又はＭＧＭＴバリアントを含む単一タンパク質を生じる。このタンパク質はその後、切断されて個別のＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質を生じる。ＣＡＲタンパク質はプロセシングを受けて細胞表面に提示される一方、ＭＧＭＴタンパク質は細胞核内に保持されることが可能である。別例の構築物は、Ｎ末端→Ｃ末端の方向に、ＭＧＭＴタンパク質、自己切断タンパク質、及びＣＡＲを含む。
【０１２２】
一実施形態では、ＣＡＲポリペプチド及びＭＧＭＴポリペプチドの部分は自己切断ペプチドによって隔てられる。自己切断配列の一例は、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列を含む２Ａ要素である。典型的な実施形態では、自己切断配列は配列番号３２の配列を含むか又は該配列からなる。
【０１２３】
別例の実施形態では、上述のようなＣＡＲと上述のようなＭＧＭＴ又はそのバリアントとの両方をコードする核酸配列はポリシストロニックであって、該配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のようなタンパク質をコードしない配列によって隔てられた、ＣＡＲをコードする核酸配列とＭＧＭＴ又はそのバリアントをコードする核酸配列とを含む。使用可能なＩＲＥＳ配列の例には、限定するものではないが、脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＳＶ）、ポリオウイルス（ＰＯＬＩＯ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びペスチウイルス（例えば豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）及びウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ））のＩＲＥＳ要素が挙げられる（例えば、レ（Ｌｅ）ら、ヴァイラス・ジーンズ（Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）、１９９６年、第１２巻、ｐ．１３５−１４７、；及びレ（Ｌｅ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９７年、第２５巻、ｐ．３６２−３６９を参照のこと、前記文献はそれぞれその全体が参照により組込まれる）。
【０１２４】
ポリシストロニックなキメラ核酸の別例の実施形態は、ＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸配列と、ＭＧＭＴ又はそのバリアントをコードする核酸配列との間に第２のプロモーターが配置されているものである。この実施形態では、自己切断ペプチドをコードする核酸配列は存在しない。
【０１２５】
さらに企図されるのは、ＩＬ１３ＣＡＲ及びＭＧＭＴバリアントをコードする核酸がそれぞれ個別の核酸ベクター内にあることである。すなわち、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸を含む第１のベクターと、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする第２のベクターとを含む系又はキットも企図される。
【０１２６】
当業者には十分理解されるように、少なくともＩＬ１３ＣＡＲタンパク質及びＭＧＭＴタンパク質又はそれらのバリアントをコードする核酸配列は、宿主細胞におけるＣＡＲ及び／又はＭＧＭＴの発現及び機能を促進及び／又は増強するための追加の構成要素をさらに含むことができる。例えば、ＣＡＲは、翻訳を開始する（１つ以上の）配列（例えば、コザック配列及び／又はプロモーター配列）、並びに相同組換えのための配列（レトロウイルスの５’ＬＴＲ；レトロバイアル（ｒｅｔｒｏｖｉａｌ）３’ＬＴＲ）をさらに含むことができる。コザック配列は、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−ＭＧＭＴをコードする核酸配列を含むキメラ核酸構築物において使用されうる。
【０１２７】
本開示による使用のためのキメラ核酸配列は、５’→３’の方向に次の要素すなわちコザック配列、シグナル配列をコードする核酸、ＩＬ１３リガンドをコードする核酸、ヒンジ領域をコードする核酸、膜貫通ドメインをコードする核酸、ＣＤ２８共刺激（シグナル伝達）ドメインをコードする核酸、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸、自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチド）をコードする核酸、及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸であって、それぞれ上述されたもの、を合わせてライゲーション又は連結することにより生成される。キメラ核酸配列は、上記の要素を含みかつコードする単一配列を合成することにより生成可能である。別例として、上記の要素がそれぞれ当業者に既知の方法を用いて個別に生成されることも可能である。例えば、要素はそれぞれ、各要素の５’端及び３’端に必要に応じて制限エンドヌクレアーゼ部位を生成するように設計されたＰＣＲを使用して増幅され、かつ個々の要素は適切なエンドヌクレアーゼで消化されて所望の構築物を得るために共にライゲーションされた。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を生成するための本方法の結果として、短いリンカーペプチドが個々の要素の間に存在する。
【０１２８】
例えば、２、３、４、５又は６個のアミノ酸をコードする核酸が、リガンドドメインとヒンジ領域との間、ヒンジ領域と膜貫通ドメインとの間、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインとの間、ＣＤ２８共刺激ドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン及び／又は自己切断ペプチドの間に、配置されることが可能である。
【０１２９】
典型的な実施形態では、ＩＬ１３ＣＡＲは、２個のアミノ酸プロリン−アルギニンからなる、リガンドとヒンジドメインとの間のリンカーを含む。ヒンジ領域と膜貫通ドメインとの間のリンカーはグルタミン−リジンである。膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインとの間のリンカーはバリン−トレオニンである。ＣＤ２８共刺激ドメインとＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインとの間のリンカーはトレオニン−アルギニンである。ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインと２Ａペプチドとの間のリンカーは、グルタミン−プロリン−アラニン−アラニン−アラニンである。上述のリンカーはそれぞれ、他のリンカーとは無関係にＩＬ１３ＣＡＲタンパク質中に存在する場合もあれば存在しない場合もあることが企図される。
【０１３０】
従って、Ｔ細胞のような宿主細胞をトランスフェクトするのに使用するための、及びＩＬ１３Ｒα２を発現しておりかつＴＭＺに曝露される細胞の生育を阻害又は防止するのに使用するための、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物の好ましい実施形態には、限定するものではないが、ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号１のヌクレオチド配列；配列番号４のアミノ酸配列）；ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号２のヌクレオチド配列；配列番号５のアミノ酸配列）；及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号３のヌクレオチド配列；配列番号６のアミノ酸配列）が挙げられる。図２Ａは、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物の概略図を提示している。これらのＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物の追加の実施形態には、限定するものではないが、タンパク質ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号４５）、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−ＰＡＲ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号４６）、及びＩＬ１３）Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号４７）をコードするものが挙げられる。
【０１３１】
当業者には十分理解されるであろうが、本明細書中に開示されるようなシグナルペプチド、ＩＬ１３リガンド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８共刺激ドメイン、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン、自己切断ペプチドリンカー並びにＭＧＭＴタンパク質又はそのバリアントをコードする核酸配列はそれぞれ、コードされるタンパク質には影響することなくコドン縮重を原因とした変化を有することが可能である。さらに、ポリペプチド配列も、例えば保存的なアミノ酸置換などにより、明示的に記述されたタンパク質の機能にはあまり影響することなく、変化を有することが可能である。従って、本明細書中でさらに企図されるのは、本明細書中に記載されたヌクレオチド配列それぞれのバリアントであって、本開示の核酸配列が、配列番号１〜３、７〜２４及び３４〜３５のそれぞれと少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一である配列を含むようなバリアントである。同様に、本明細書中でさらに企図及び開示されるのは、配列番号４〜６、２５〜３３、３６〜４１及び４３のそれぞれと少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるポリペプチドである。
【０１３２】
２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性（％）は、該配列を最適な比較を目的としてアラインすることにより決定可能である（例えば、ギャップが第１の配列の配列中に導入されることが可能である）。次いで対応する位置のヌクレオチド又はアミノ酸が比較され、２つの配列間の同一性（％）は、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性（％）＝（同一な位置の＃／位置の合計＃）×１００）。ある実施形態では、比較の目的でアラインされるアミノ酸又はヌクレオチド配列の長さは、参照配列、例えば図７Ａ（配列番号１）、７Ｂ（配列番号４）、８Ａ（配列番号２）、８Ｂ（配列番号５）、９Ａ（配列番号３）及び９Ｂ（配列番号６）に提供された配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。２つの配列の実際の比較は、例えば数学的アルゴリズムを使用して、良く知られた方法によって遂行可能である。そのような数学的アルゴリズムの好適で非限定的な例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８７３−５８７７に記載されている。そのようなアルゴリズムは、シェーファー（Ｓｃｈａｆｆｅｒ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２００１年、第２９巻、ｐ．２９９４−３００５に記載されるようなＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用可能である。一実施形態では、検索されるデータベースは非冗長性の（ＮＲ）データベースであり、配列比較用のパラメータは以下すなわち：フィルタ処理なし；期待値１０；ワードサイズ３；マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２；及び、ギャップコストは存在１１及び伸展１、に設定可能である。別の実施形態では、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの間の同一性（％）は、対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドの全長にわたって決定される。
【０１３３】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい非限定的な例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれるが、該プログラムは、ＧＣＧ配列アラインメント・ソフトウェア・パッケージ（米国カリフォルニア州サンディエゴのアクセルリス（Ａｃｃｅｌｒｙｓ））の一部である。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０の残基重み付け表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用可能である。配列解析用の追加のアルゴリズムは当分野において知られており、トレリス（Ｔｏｒｅｌｌｉｓ）及びロボッティ（Ｒｏｂｏｔｔｉ）、コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．）、１９９４年、第１０巻、ｐ．３−５に記載されているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；並びにピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）及びリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、１９８８年、第８５巻、ｐ．２４４４−８に記載されているＦＡＳＴＡが挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性（％）は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６３行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、並びにギャップ加重１２、１０、８、６、又は４、及び長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）２、３、又は４を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて遂行可能である。さらに別の実施形態では、２つの核酸配列の間の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、ギャップ加重を５０、及び長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を３として遂行可能である。
【０１３５】
ポリペプチド間の類似性は、典型的には保存的アミノ酸置換によって決定される。そのような置換は、ポリペプチド中の所与のアミノ酸を似た特性の別のアミノ酸によって置換するものである。保存的置換は、表現型上はサイレントである可能性が高い。保存的置換として典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの中の１つを別のものとする置き換え；ヒドロキシル残基であるＳｅｒ及びＴｈｒの相互交換；酸性残基であるＡｓｐ及びＧｌｕの交換；アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換；塩基性残基であるＬｙｓ及びＡｒｇの交換；並びに芳香性残基であるＰｈｅ及びＴｙｒの中での置き換えである。どのアミノ酸変化が表現型上サイレントである可能性が高いかについての手引きは、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９０年、第２４７巻、ｐ．１３０６−１３１０に見出される。
【０１３６】
バリアントポリペプチドは、１つ以上の置換、欠失、挿入、転位、融合、及び切断又はこれらのうち任意のものの組み合わせによるアミノ酸配列の違いを有することが可能である。さらに、バリアントポリペプチドは、完全に機能性（例えば細胞を感染させ、かつ子ウイルスを生産する能力）を有することも可能であるし、１つ以上の活性（例えば子ウイルスを生産する能力）において機能を欠くことも可能である。完全に機能性のバリアントは、典型的には、保存的な変異又は重要でない残基若しくは重要でない領域における変異のみを含有する。機能性のバリアントはさらに、機能に変化をもたらさないか又は軽微な変化しかもたらさない類似アミノ酸の置換も含有することが可能である。別例として、そのような置換はある程度まで機能に正又は負の影響を及ぼす場合もある。非機能性のバリアントは、典型的には、１つ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失、挿入、転位、若しくは切断を含有するか、又は重要な残基若しくは重要な領域における置換、挿入、転位、若しくは欠失を含有する。
【０１３７】
機能にとって不可欠なアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発のような、当分野で既知の方法によって同定可能である（カニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年、第２４４巻、ｐ．１０８１−１０８５）。後者の手法は分子内の残基それぞれにおいて単一のアラニン突然変異（１分子当たり１突然変異）を導入する。その後、結果として生じる突然変異体分子はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的活性に関して試験される。ポリペプチドの活性にとって重要な部位も、結晶化、核磁気共鳴、又はフォトアフィニティーラベリングのような構造解析によって決定可能である（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９２年、第２２４巻、ｐ．８９９−９０４；及びデ・ヴォス（ｄｅ  Ｖｏｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９２年、第２５５巻、ｐ．３０６−３１２を参照のこと）。
【０１３８】
本明細書中でさらに開示されるのは、配列番号４、５又は６のアミノ酸１〜１４６の配列として本明細書中に記載されたＩＬ１３ＣＡＲタンパク質を含むか又は該タンパク質からなる、ほぼ純粋なポリペプチド、及び配列番号４、５又は６のアミノ酸１〜１４６の配列に対して好ましくは少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド、並びに、配列番号１のアミノ酸４００〜６０６の配列として本明細書中に記載されたＰ１４０ＫＭＧＭＴバリアント、及び配列番号１のアミノ酸４００〜６０６の配列に対して、本明細書中に記載されたＢＬＡＳＴプログラム及びパラメータを使用して決定されるように好ましくは少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有しているポリペプチドを含む組成物である。別の実施形態では、ポリペプチドの例には、配列番号４、５及び／又は６を含むか又は配列番号４、５及び／又は６からなる、ほぼ純粋なポリペプチド；並びに、本明細書中に記載されたＢＬＡＳＴプログラム及びパラメータを使用して決定されるように、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列番号４との配列類似性を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１３９】
特定の態様では、本開示は配列番号１（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせによってコードされた単離ポリペプチドに関する。他の態様では、本開示は、ポリペプチド（配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７又はこれらの組み合わせのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。
【０１４０】
脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原に対する１つ以上のリガンド（例えば抗体）を含むＴ細胞受容体を含むＣＡＲポリペプチドも企図される。特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは脳腫瘍を治療するのに有用な１つ以上の追加の作用物質をさらに含む。他の態様では、本発明は単離ポリペプチド並びにそのフラグメント、誘導体、及びバリアントのほかに、本明細書中に記載されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド（例えば他のバリアント）に関する。本明細書中で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指すが、特定の長さを指すものではなく；よって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。
【０１４１】
ポリペプチドは既知のタンパク質合成方法を使用して合成可能である。一実施形態では、ポリペプチドは組換えＤＮＡ及び組換えタンパク質の発現及び精製技法によって生産される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子が発現ベクター中にクローニングされ、該発現ベクターが宿主細胞に導入され、該宿主細胞中でポリペプチドが発現され、所望のタンパク質が精製されてパッケージング及び投与のために製剤化される。
【０１４２】
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドは、組換え若しくは非組換え細胞から単離された場合には物質をほとんど含まないときに、又は化学合成された場合には前駆体化学物質若しくは他の化学物質を含まないときに、「単離された」、「ほぼ純粋な」、又は「ほぼ純粋であり単離された」と言われる。加えて、ポリペプチドは、通常は細胞内において関連のない別のポリペプチドに（例えば「融合タンパク質」中で）接合されて、なおも「単離された」、「ほぼ純粋な」、又は「ほぼ純粋であり単離された」状態であることが可能である。単離された、ほぼ純粋な、又はほぼ純粋であり単離されたポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載されたアフィニティー精製技法、及び本明細書中に記載されかつ当業者に知られた他の技法を使用して、得られうる。
【０１４３】
本発明のポリペプチドは均質になるように精製可能である。しかしながら、当然のことであるがポリペプチドが均質になるまで精製されていない調製物も有用である。重要な特徴は、かなりの量の他の構成成分が存在する状態であっても該調製物がポリペプチドの所望の機能を可能にするということである。よって、本発明は様々な程度の純度を包含する。一実施形態では、「物質をほとんど含まない」という言葉には、約３０％未満（乾燥重量比）の他のタンパク質（すなわち混在タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、約５％未満、又は約１％未満の他のタンパク質を有しているポリペプチドの調製物が含まれる。
【０１４４】
ポリペプチドが組換え生産される場合、該ポリペプチドは培地をほとんど含まないということも可能である、すなわち、培地はポリペプチド調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満に相当する。「前駆体化学物質又は他の化学物質をほとんど含まない」という言葉には、ポリペプチドの合成に関与する前駆体化学物質又は他の化学物質から分離されているポリペプチドの調製物が含まれる。一実施形態では、「前駆体化学物質又は他の化学物質をほとんど含まない」という言葉には、約３０％未満（乾燥重量比）の前駆体化学物質若しくは他の化学物質、約２０％未満の前駆体化学物質若しくは他の化学物質、約１０％未満の前駆体化学物質若しくは他の化学物質、又は約５％未満の前駆体化学物質若しくは他の化学物質を有しているポリペプチドの調製物が含まれる。
【０１４５】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、３、及び／又は５の核酸分子並びにその相補体及び一部分によってコードされたアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドはさらに、配列番号１、３及び／又は５のヌクレオチド配列を含む核酸分子並びにその相補体及び一部分によってコードされたポリペプチドに対してかなりの相同性を有しているフラグメント及び配列バリアントをも包含する。
【０１４６】
［核酸発現構築物］
本開示の別の態様は、核酸発現構築物すなわちベクター、レトロウイルスベクター及び／又はレトロウイルス粒子、並びにこれらの使用に関する。当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の方法が、本明細書中に詳細に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ、自己切断ペプチド、及びＭＧＭＴバリアントをコードするキメラ核酸配列を設計及び生成するために使用される。キメラ核酸構築物はその後、例えば該構築物の配列を確認するためのシーケンシングを可能にするために、プラスミドベクター中にクローニングされる。所望の配列が確認されると、キメラ核酸構築物は哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのレトロウイルス粒子を生産するために使用される。従って、本明細書中に記載されるような配列番号１〜３並びに配列番号７〜２４、３４及び／又は３４〜３５の組み合わせの核酸配列を含むキメラ構築物が、その後のレトロウイルス粒子中へのパッケージングのためのそのようなプラスミドベクター中にクローニングされる。特定の態様では、キメラ構築物及びプラスミドベクターは、上述のような配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３を含む１つ以上の核酸配列を含む。ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ配列（配列番号１）、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（配列番号２）、又はＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ配列（配列番号３）を含有するプラスミドベクターは、レトロウイルス粒子の生産（実施例２）に先立って、本明細書中に記載されたフラグメントを実施例１に記載されるようにしてｐＵＣ５７ベクター中に、次にｐＭＦＧベクター中にクローニングすることにより生成された。
【０１４７】
図１Ｂは、ＭＧＭＴ遺伝子がまだ導入されていないＩＬ１３ＣＡＲ構築物を含むプラスミドベクターを示している。図２Ｂは、同じプラスミド骨格であってＩＬ１３ＣＡＲ構築物を含有しかつさらにＩＬ１３ＣＡＲをコードする配列の下流にＰ１４０ＫＭＧＭＴをコードする配列も含有するものを示している。
【０１４８】
別例の実施形態では、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸は第１のベクターにクローニングされ、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸は第２のベクターにクローニングされる。従って、本開示はさらに、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲをコードする核酸を含む第１のベクター（プラスミドベクター、発現ベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）と、本明細書中に記載されるようなＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸を含む第２のベクター（プラスミドベクター、発現ベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）とについて説明する。
【０１４９】
適切な核酸構築物の例には、プラスミド（例えば環状の二本鎖ＤＮＡループ）及びウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター）が挙げられる。ある種のベクターは、該ベクターが導入される宿主細胞の中で自己複製することができる（例えば細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及び哺乳動物のエピソームベクター）。その他のベクター（例えば哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、該ベクターが作動可能なように連結された核酸の発現を導くことが可能である。一般に、組換えＤＮＡ技法における発現構築物はプラスミドの形態であることが多い。しかしながら、本発明は、同等な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むように意図されている。
【０１５０】
本発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸分子の発現に適した形態の本発明の核酸分子を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能なように連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を備えていることを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動可能なように連結された」とは、対象とするヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の発現を（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）可能にする方式で調節配列に連結されることを意味するように意図されている。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。そのような調節配列は、例えば、ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的な発現を導くもの、及びある一定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば組織特異的な調節配列）が含まれる。
【０１５１】
当業者には十分理解されることであるが、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び所望されるポリペプチドの発現のレベルのような要因に応じて変化することが可能である。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、本明細書中に記載されるような核酸分子によってコードされた、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを、生産することが可能である。
【０１５２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞、例えば大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳動物細胞（霊長類（例えばヒト）、ネズミ科動物（例えばマウス）、ネコ科動物、イヌ科動物、げっ歯動物、ヒツジ、ウシの細胞）における本発明のポリペプチドの発現のために設計されることが可能である。
【０１５３】
キメラ核酸構築物を含有するレトロウイルス粒子の生産は、実施例１及び２に記載されているようにＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴをコードするキメラ核酸配列を含有するように生成することに成功した。実施例及び本明細全体にわたって記載され、かつ当業者に既知の方法と組み合わされた方法を、本明細書中に記載されたようなキメラ核酸構築物のうち任意のものを含有するレトロウイルス粒子を生産するために使用可能である。該プロセスによるトランスフェクション効率は、フローサイトメトリーによってＩＬ１３リガンドの細胞表面での発現を測定することによりモニタリング可能である。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を用いて形質導入された細胞は、例えば蛍光染色細胞選別機を使用して、富化することが可能である。図３Ａ及び３Ｂは、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ａ２−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物でトランスフェクトされたＰＧ１３細胞の富化を示す。図３Ａは、エコトロピックレトロウイルスを用いた最初の形質導入の後のＩＬ１３を発現する細胞の相対数を示す（例えば４．０％）。図３Ｂは、エコトロピックレトロウイルスを用いて形質導入された細胞の富化の後のＩＬ１３を発現する細胞の相対数を示す（例えば９６．６％）。細胞溶解産物のウエスタンブロット解析は、宿主細胞によるＰ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質の発現を確認及び測定するための常套的な方法を使用して実施可能である。図３Ｃに示されるように、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ａ２−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を用いて形質導入された細胞の富化により、形質導入されていない細胞又は図１Ａ〜１Ｂに示されたようなＩＬ１３ＣＡＲ構築物のみを発現する構築物を用いて形質導入された細胞と比較して、Ｐ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質が過剰発現される。
【０１５４】
図１Ａ及び２ＡはプラスミドベクターにクローニングされたＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴの概略図を提供する一方、図１Ｂ及び２Ｂは宿主細胞ゲノムに組み込むための５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲが隣接したキメラの直線的表現を示す。
【０１５５】
本明細書中に記載された核酸構築物は、宿主哺乳動物細胞に導入されて該細胞に腫瘍細胞殺滅機能及びＴＭＺのようなＤＮＡメチル化剤である化学療法薬に対する抵抗性の両方を付与する。哺乳動物の宿主細胞への核酸の導入は、例えば実施例３に記載されたようにして、例えばレトロウイルスベクターを使用して遂行される。一時的又は安定的に哺乳動物細胞に形質導入するためのレトロウイルスベクターは当分野において良く知られており、またまもなく説明されるタンパク質発現及び治療システムにおいて使用されるため以下に記載される。
【０１５６】
ある実施形態は、本明細書中に記載された発現系を用いてＴ細胞のようなプラズマ細胞を形質導入するためにウイルスベクターを使用する。ウイルスベクターの例には、限定するものではないが、ＭＦＧベクター、アデノウイルスに基づいたベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づいたベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルス−アデノウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクターが挙げられる。
【０１５７】
典型的には、最小限のレトロウイルスベクターは、ある種の５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ配列と、１つ以上の対象の（標的細胞において発現されるべき）遺伝子と、１つ以上のプロモーターと、ＲＮＡのパッケージングのためのシス作用配列とを含む。本明細書中に記載されており当分野で知られているような、その他の調節配列が含まれることも可能である。ウイルスベクターは、典型的には、プラスミドであって真核細胞（例えばＰＧ１３マウス繊維芽細胞）のようなパッケージング用細胞株にトランスフェクトされることが可能であり、かつさらに典型的には細菌中における該プラスミドの複製に有用な配列を含むプラスミド中にクローニングされる。レトロウイルスベクターのようなある種のウイルスベクターは１つ以上の異種のプロモーター、エンハンサー、又は両方を使用する。ある実施形態は、ウイルスベクターの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置し、かつ対象とする遺伝子に作動可能なように連結された「内部」プロモーター／エンハンサーを使用する。「機能的な関係」及び「作動可能なように連結された」とは、限定するものではないが、遺伝子がプロモーター及び／又はエンハンサーに関して正確な位置及び配向にあって、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な調節分子と接触した時に該遺伝子の発現が影響を受けるようになっていることを意味する。パッケージング用細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を調節する（例えば、増大させる、減少させる）か、感染した標的細胞における選択された対象遺伝子の発現を調節するか、又は両方であるかのいずれかの、任意のエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用されうる。
【０１５８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を可能にするＤＮＡ配列によって形成された発現制御要素である。プロモーターは、選択された対象遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置し（典型的には約１００〜１０００ｂｐ以内）、該プロモーターが作動可能なように連結されているポリヌクレオチドのコード配列の転写及び翻訳を制御する、翻訳されない配列である。プロモーターは誘導型であってもよいし構成型であってもよい。誘導型プロモーターは、温度の変化のような培養条件の何らかの変化に応答して該プロモーターの制御下にあるＤＮＡからの転写のレベルの上昇を引き起こす。
【０１５９】
様々なプロモーターが、該プロモーターをポリヌクレオチドのコード配列に作動可能なように連結する方法もそうであるように、当分野において既知である。本来のプロモーター配列及び数多くの異種プロモーターの両方が、選択された対象の遺伝子の発現を導くために使用されうる。ある実施形態は異種プロモーターを使用するが、これは該異種プロモーターが一般に本来のプロモーターと比較してより大量の転写及び所望のタンパク質のより高い収量を可能にするからである。
【０１６０】
ある種のウイルスベクターは、ウイルス粒子内へのウイルスゲノムＲＮＡの組み込みを促進するためにシス作用性のパッケージング配列を含有する。例としてはプサイ配列が挙げられる。そのようなシス作用配列は当分野において既知である。
【０１６１】
ウイルスベクターの生成は、当分野で既知の任意の適切な遺伝子操作技法、例えば、限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質変換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅、及びＤＮＡ塩基配列決定の標準的な技法であって、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）、コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）ら（レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー研究所出版、１９９７年）及び「ＲＮＡヴァイラシズ：ア・プラクティカル・アプローチ（ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（アラン・ジェイ．カン（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ）編、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２０００年）に記載されたような技法を使用して遂行することが可能である。
【０１６２】
当分野で既知の任意の様々な方法が、ゲノムにウイルスベクターのＲＮＡ複製物を含む適切なレトロウイルス粒子を生産するために使用されうる。１つの方法として、ウイルスベクターは、該ウイルスベクターに基づいたウイルスゲノムＲＮＡをパッケージングして所望の標的細胞特異性を備えたウイルス粒子とする、パッケージング用細胞株に導入されうる。パッケージング用細胞株は、典型的には、ウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングして標的細胞を感染させるのに必要なウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質であるｇａｇ、酵素タンパク質ｐａｌ、及び外被の糖タンパク質を、トランスに提供する。
【０１６３】
ある実施形態では、パッケージング用細胞株は、必要又は所望されるウイルスタンパク質（例えばｇａｇ、ｐｏｌ）のいくつかを安定的に発現しうる（例えば米国特許第６，２１８，１８１号明細書を参照されたい）。ある実施形態では、パッケージング用細胞株は、必要又は所望されるウイルスタンパク質（例えばｇａｇ、ｐｏｌ、糖タンパク質）のいくつか、例えば本明細書中に記載された麻疹ウイルス糖タンパク質配列をコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトされてもよい。１つの典型的な実施形態では、パッケージング用細胞株はｇａｇ配列及びｐｏｌ配列を安定的に発現し、かつ該細胞株は次にウイルスベクターをコードするプラスミド及び糖タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。所望のプラスミドの導入に続いて、ウイルス粒子が回収されて、ウイルス粒子の濃縮ストックを得るための超遠心分離などにより適宜処理される。典型的なパッケージング用細胞株には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）及びＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）細胞株が挙げられる。
【０１６４】
［宿主細胞］
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用される。当然のことであるが、そのような用語は特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫をも指す。ある種の改変が突然変異又は外界の影響のいずれかにより次の世代に生じるかもしれないので、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでもなお本明細書中で使用されるような該用語の範囲内に含まれる。
【０１６５】
宿主細胞は任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。例えば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞において発現させることが可能である。１つの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞（霊長類（例えばヒト）、ネズミ科動物（例えばマウス）、ネコ科動物、イヌ科動物、げっ歯動物、ヒツジ、ウシの細胞）である。特定の態様では、哺乳動物細胞は免疫細胞である。さらに別の態様では、哺乳動物細胞はＴ細胞である。その他の適切な宿主細胞は当業者には明白である。
【０１６６】
本明細書中の目的のためには、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば培養されたＴ細胞（例えば初代Ｔ細胞）、又は培養されたＴ細胞株由来のＴ細胞（例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）、又は哺乳動物から得られたＴ細胞であってよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は数々の供給源から、例えば、限定するものではないが、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又はその他の組織若しくは体液から、得ることが可能である。Ｔ細胞はさらに、富化されることも可能であるし精製されることも可能である。Ｔ細胞はヒトのＴ細胞であってよい。Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、かつ任意の発生段階のもの、例えば、限定するものではないが、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などであってよい。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であってよい。
【０１６７】
一実施形態では、本発明の組成物及び方法において使用される宿主細胞は、ＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２細胞株、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６６７２）である。
核酸構築物は従来の形質変換又はトランスフェクションの技法によって原核細胞又は真核細胞に導入可能である。本明細書中で使用されるように、用語「感染」、「形質変換」、「形質導入」、及び「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来核酸分子（例えばＤＮＡ）を導入するための様々な当分野で認識された技法、例えばリン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン介在型トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを指すように意図されている。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法は、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、米国ニューヨークのＣＳＨＰ、１９８９年及びその他の実験手引き書に見出すことが可能である。
【０１６８】
本発明の宿主細胞、例えば原核生物又は真核生物の宿主培養細胞は、本開示の１つ以上のＣＡＲを生産（発現）するために使用可能である。従って、本開示は、本発明の宿主細胞を使用してＣＡＲを生産する方法をさらに提供する。一実施形態では、該方法は、適切な培地中で本開示の宿主細胞（ここに本開示のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターを導入済み）を培養して１つ以上のＣＡＲが生産される（例えば、宿主細胞の表面に発現される）ようにすることを含む。
【０１６９】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションについては、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、ごく一部の細胞だけがそのゲノムに外来ＤＮＡを組み込むことが知られている。これらの組み込み体を同定及び選択するために、一般に選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性に関するもの）をコードする遺伝子が対象とする遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、又はメトトレキセートのような薬物に対する抵抗性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクター上で宿主細胞に導入されることも可能であるし、別のベクター上で導入されることも可能である。導入された核酸分子で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定されることが可能である（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残ることになる一方、他の細胞は死滅する）。
【０１７０】
本明細書中で例証されるように、企図されるのは免疫細胞、例えば、限定するものではないがＴ細胞であって、ＩＬ１３ＣＡＲを発現し、かつ化学療法剤テモゾロミドへの曝露に抵抗性であるものである。具体的には、本明細書中に示されるのは、上記に詳述されるようなＩＬ１３ＣＡＲ（配列番号４、配列番号５又は配列番号６）及びＰ１４０ＫＭＧＭＴ突然変異体（配列番号３３）をコードしかつ発現する核酸配列を用いて形質導入されたＴ細胞が、ＴＭＺの存在下でＩＬ１３のみを発現するＣＡＲを発現するＴ細胞と比較してより高い生存率を有するということである。よって、特定の態様では、本発明は、ＩＬ１３及び／又はＩＬ１３のバリアントを発現するＣＡＲ（例えば配列番号４（ＷＴ  ＩＬ１３  ＣＡＲ）、配列番号５（ＩＬ１３Ｅ１３ＹＣＡＲ）又は配列番号６（ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９ＫＣＲ）及び／又はＲ１０９Ｋ  ＩＬ１３ＣＡＲ）と、細胞を化学防護（ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔ）するＭＧＭＴ突然変異体（例えばＰ１４０ＫＭＧＭＴ突然変異体（配列番号３３、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１））とに関する。一実施形態では、細胞は、ＭＧＭＴタンパク質が野性型ＭＧＭＴタンパク質（配列番号４９）ではないＩＬ１３ＣＡＲ−Ａ２−ＭＧＭＴ構築物を用いて形質導入される。
【０１７１】
＜宿主Ｔ細胞の採取及びトランスフェクション＞
高度に特異的な腫瘍の認識及び殺滅を可能にするためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子操作されたＴ細胞は、有望な臨床結果を経てかなりの注目を集めてきた（グラップ（Ｇｒｕｐｐ）ら、ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ）、２０１３年、第３６８巻、ｐ．１５０９−１５１８；ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）ら、ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ）、２０１１年、第３６５巻、ｐ．７２５−７３３；サデライン（Ｓａｄｅｌａｉｎ）ら、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００９年、第２１巻、ｐ．２１５−２２３）。ＣＡＲ遺伝子を用いたＴ細胞の再プログラム化は、腫瘍細胞と結合して同細胞を溶解するためのＭＨＣ非依存的メカニズムを提供する。そのような改変Ｔ細胞は、別例として「デザイナーＴ細胞」、「Ｔ−ボディ（Ｔ−ｂｏｄｙ）」又は「ＣＡＲ−Ｔ細胞」とも呼ばれてきた（マ（Ｍａ）ら、「キャンサー・ケモセラピー・アンド・バイオロジカル・レスポンス・モディファイア―ズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）」、エルゼビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、ｐ．３１９−３４５；パーク（Ｐａｒｋ）ら、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．５５０−５５７；マ（Ｍａ）ら、ザ・プロステート（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、２０１４年、第７４巻、ｐ．２８６−２９６）。
【０１７２】
別の態様では、本開示は、脳腫瘍の１又は（ｏｎｅ  ｏｒ）腫瘍抗原に対する１つ以上のリガンド（例えば抗体）を含むＴ細胞受容体を含むＣＡＲと、ＭＧＭＴタンパク質であってＣＡＲ及びＭＧＭＴタンパク質をコードする核酸で形質導入されてＴＭＺのようなＤＮＡメチル化剤に曝露された細胞の生存可能性を増大させるＭＧＭＴタンパク質とを発現する細胞を生産する方法に関する。特定の態様では、本開示は、配列番号４（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号５（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号６（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせのアミノ酸配列を有するＣＡＲを発現する細胞を生産する方法に関する。該方法は、配列番号１（ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又は配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）を含む核酸配列を細胞に導入することと；該細胞をＣＡＲが該細胞によって発現される条件下に維持することにより、配列番号４（ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号５（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号６（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせのアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体を発現する細胞を生産することとを含む。
【０１７３】
特定の態様では、核酸配列は、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はこれらの組み合わせ）を使用して細胞に導入される。別の態様では、細胞は、哺乳動物Ｔ細胞（例えばヒトＴ細胞又はマウスＴ細胞）のような哺乳動物細胞である。特定の態様では、細胞は、自己由来の細胞又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致細胞である。さらに別の態様では、細胞は、脳腫瘍（例えば、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、退形成性星細胞腫又は小児神経膠腫のような悪性度の高い神経膠腫）を有する１人以上の個体から得られる。
【０１７４】
したがって、さらなる態様は、本開示による少なくとも１つのＣＡＲ及び薬物抵抗性ポリペプチドを発現する組換えＴ細胞に関する。特に好ましい形質転換宿主細胞は、本開示による核酸構築物を含むということを特徴とする、トランスジェニックＴ−前駆細胞又は幹細胞である。宿主細胞及び／又は幹細胞の形質変換又は形質導入のための方法は当業者に良く知られており、例えば、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションが挙げられる。特に好ましい形質転換宿主細胞は患者に固有のＴ細胞であって、これは採取後に本開示による核酸構築物でトランスフェクトされる。本開示によれば、宿主細胞は特に、１個又は数個の細胞、好ましくはＴ細胞、特にＣＤ８＋−Ｔ細胞が採取され、続いて該細胞が１つ以上の本開示による核酸構築物を用いてｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクト又は形質導入され、これにより本開示による宿主細胞が得られることにより、入手可能である。
【０１７５】
増殖及び遺伝子改変に先立ち、Ｔ細胞の供給源が対象者から得られる。用語「対象者」は、免疫応答が誘発されることが可能な生体（例えば哺乳動物）を含むように意図されている。対象者の例には、ヒト及び他の霊長類  イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びトランスジェニックなげっ歯動物類が挙げられる。Ｔ細胞は、数多くの供給源、例えば末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、及び腫瘍などから得ることが可能である。本発明のある態様では、当分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用されうる。本開示のある態様では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）による分離のような当業者に知られた任意の数の技法を使用して対象者から収集された血液１ユニットから得ることが可能である。１つの好ましい態様では、個体の循環血由来の細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的にはリンパ球、例えばＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、及び血小板などを含有する。１つの態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿分画を除去して細胞をその後の処理ステップのための適切な緩衝液又は培地中に入れるために、洗浄されうる。本発明の１つの態様では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。別例の態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、かつマグネシウムを欠く場合もあれば全てではないにせよ多数の２価カチオンを欠く場合もある。カルシウム不在下での最初の活性化ステップは活性化の拡大をもたらす可能性がある。当業者であれば容易に認識するであろうが、洗浄ステップは当業者に既知の方法によって、例えば半自動化された「フロースルー式」遠心分離機を製造業者の指示に従って使用することにより、遂行されうる。洗浄の後、細胞は、生物学的適合性を有する様々な緩衝液、又は緩衝剤の有無は問わず他の生理食塩水の中に、再懸濁されることができる。別例として、アフェレーシス試料の望ましからぬ構成成分が除去されて細胞が培地に直接再懸濁されてもよい。
【０１７６】
１つの態様では、Ｔ細胞は、末梢血リンパ球から、赤血球の溶解及び単球の消去により、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によるか、又は対向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によって、単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のような特定のＴ細胞亜集団は、ポジティブ又はネガティブセレクション技法によってさらに単離可能である。当業者であれば、多数回にわたるセレクションが本発明に関連して使用されることも可能であることを認識するであろう。ある態様では、セレクション手技を実施して「セレクトされない」細胞を活性化及び増殖のプロセスに使用することが望ましい場合もある。「セレクトされない」細胞はさらなる回のセレクションに供されることも可能である。
【０１７７】
ネガティブセレクションによるＴ細胞集団の富化は、ネガティブセレクションの対象となる細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて遂行可能である。１つの方法は、ネガティブセレクションの対象となる細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の混合物を使用する、ネガティブな磁気免疫粘着（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）又はフローサイトメトリーを介した細胞の選別及び／又は選択である。例えば、ネガティブセレクションによるＣＤ４＋細胞の富化のためには、モノクローナル抗体混合物は典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある態様では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を、富化するか又はポジティブセレクションすることが望ましい場合がある。別例として、ある態様では、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５抗体がコンジュゲートしたビーズ又は他の同様のセレクション方法によって消去される。
【０１７８】
＜Ｔ細胞の活性化及び増殖＞
望ましいＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前後いずれであっても、Ｔ細胞は通常、例えば；米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載されているような方法を使用して活性化及び増殖させることが可能である。
【０１７９】
トランスフェクション又は形質導入されたＴ細胞がＩＬ１３ＣＡＲを表面膜タンパク質として所望の調節のもとに所望のレベルで発現可能であることが確立されれば、該キメラ受容体が所望のシグナル誘導を提供するべき宿主細胞において機能性を有するかどうかを決定することが可能である。続いて、形質導入されたＴ細胞は、対象者の抗腫瘍性反応を活性化するために対象者に再導入又は投与される。
【０１８０】
［医薬組成物］
さらに別の態様では、本開示は、本明細書中に記載されるような形質導入Ｔ細胞の、必要としている対象者への投与を容易にするための医薬組成物に関する。本開示による形質導入Ｔ細胞は、適切な、さらには薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて、医薬組成物となされることも可能であるし、ｉｎ  ｖｉｖｏの投与に適した移植物となされることも可能である。そのような組成物又は移植物を作製する手段は当分野において説明がなされている（例えば、「レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１６版、マック（Ｍａｃｋ）、編（ｅｄ．）１９８０年を参照されたい）。適切な場合は、形質導入Ｔ細胞は、それぞれの投与経路のための通常の方法で、カプセル剤、溶液、注射剤、吸入薬、又はエアロゾルのような半固体又は液体の形態の調製物に製剤化されることが可能である。組成物が標的の組織若しくは器官に到達するまで該組成物の放出及び吸収を防止するか若しくは最小限にするために、又は組成物の持続放出を確実にするために、当分野で既知の手段が利用可能である。しかしながら望ましくは、細胞がキメラ受容体を発現するのを妨げない、薬学的に許容される形態が使用される。よって、望ましくは形質導入Ｔ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩溶液、又は通常の生理食塩水を含有する医薬組成物となされることができる。例えば、組成物は、医薬組成物を調製するために生理学的に許容される担体又は賦形剤を用いて製剤化されることが可能である。担体及び組成物は無菌であることができる。製剤は、投与の様式に適合しているべきである。
【０１８１】
適切な薬学的に許容される担体には、限定するものではないが、水、塩類溶液（例えばＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生食水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプン、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのほかに、これらの組み合わせが挙げられる。医薬調製物は、必要に応じて、補助的薬剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩類、緩衝剤、着色用、着香用及び／又は芳香用の物質などであって活性化合物と有害な反応を起こさない補助的薬剤と、混合されてもよい。
【０１８２】
組成物はさらに、必要に応じて、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することも可能である。組成物は、液体の溶液、懸濁物、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤であってよい。組成物は、従来の結合剤及びトリグリセリドのような担体と共に、坐薬として製剤化可能である。経口用製剤は、標準的な担体、例えば製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
【０１８３】
組成物は、常套的な手法に従ってヒトへの投与に適合した医薬組成物として製剤化されることが可能である。例えば、静脈内投与用の組成物は、典型的には無菌の等張の水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤及び注射部位の疼痛を緩和するための局所麻酔薬も含みうる。一般に成分は、例えば、活性化合物の量が表示されたアンプル又はサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封容器中に、乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、別々に又は単位投薬形態中にともに混合されて、供給される。組成物が注入によって投与されることになっている場合、組成物は、無菌の製薬グレードの水、生理食塩水又はデキストロース／水が入っている注入用ボトルを用いて調剤されることが可能である。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供されて成分が投与に先立ち混合されうるようになっていてもよい。
【０１８４】
これらの組成物を導入する方法には、限定するものではないが、頭蓋内、髄内、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内への導入が挙げられる。他の適切な導入方法にはさらに、遺伝子治療（下記に記載されるようなもの）、充填式（ｒｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅ）又は生物分解性のデバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）及び徐放性のポリマーデバイスも含まれうる。本発明の医薬組成物はさらに、他の化合物との併用療法の一部として投与されることも可能である。
【０１８５】
局所への適用については、噴霧不可能な形態、局所への適用に適合性のある担体を含みかつ好ましくは水より大きな動粘性率を有する粘性〜半固体又は固体の形態が使用されうる。適切な製剤には、限定するものではないが、溶液、懸濁物、乳剤、クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、浣腸剤、ローション剤、ゾル剤、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、エアロゾル剤などであって、必要に応じて、滅菌されるか、又は補助的薬剤であって例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、若しくは浸透圧に影響を及ぼすための塩類などと混合されるものが挙げられる。化合物は化粧用製剤に組み込まれる場合もある。局所への適用については、同じく適切なのは、噴霧可能なエアロゾル調製物であって、活性成分が、好ましくは固体又は液体の不活性担体材料と組み合わされて、スクイーズボトル中に入っているか、又は加圧された揮発性の通常は気体の噴射剤（例えば加圧空気）との混合剤中にあるものである。
【０１８６】
本明細書中に記載された化合物は、中性又は塩の形態として製剤化可能である。薬学的に許容される塩には、遊離アミノ基を備えて形成されたもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの、及び遊離カルボキシル基を備えて形成されたもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものが挙げられる。
【０１８７】
［キット］
本開示はさらに、本開示の医薬組成物の成分のうち１つ以上で満たされた１つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。そのような容器に任意選択で付随するのは、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知書であってよく、その通知書は、該機関によるヒトへの投与についての製造、販売の使用（ｕｓｅ  ｏｆ  ｓａｌｅ）の承認を示すものである。該パック又はキットには、投与様式、薬物投与の順序（例えば別々に、順次又は同時に）などに関する情報を示すラベルが付されることが可能である。該パック又はキットはさらに、治療処置を行うことを患者に思い出させるための手段を備えてもよい。パック又はキットは、併用療法の単回分の単位投薬量であってもよいし、複数回分の単位投薬量であってもよい。特に、化合物は、別々に、任意の組み合わせで混合されて、単一のバイアル又は錠剤の中に存在することが可能である。ブリスターパック又はその他の投薬手段の中に結集された化合物が好ましい。本発明の目的では、単位投薬量は、各化合物の個々の薬力学によって決まる投薬量を意味するように意図され、かつＦＤＡの承認を受けた投薬量で標準的な時間経過で投与される。
【０１８８】
［治療方法］
別の態様では、本開示は、治療を必要とする個体の悪性腫瘍を治療する方法であって、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質に対する１つ以上のリガンド（例えば抗体）を含むＩＬ１３ＣＡＲと、ＭＧＭＴタンパク質とを発現する１つ以上のＴ細胞を投与することを含む方法に関する。特定の態様では、本開示は、治療を必要とする個体の脳腫瘍を治療する方法であって、配列番号２６、配列番号３６又は配列番号３７（リガンド）、配列番号２８（ＴＭ）、配列番号２９及び３０（ＣＤ２８及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン）を含み、かつ任意選択で配列番号２７（ヒンジ）をさらに含むタンパク質をコードする核酸配列を担持しかつ発現する１つ以上のＴ細胞を投与することを含む方法に関する。別の実施形態では、核酸配列は配列番号１（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせを含む。１つの態様では、Ｔ細胞は自己由来のＴ細胞又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致細胞である。別の態様では、脳腫瘍は、悪性度の高い神経膠腫、例えば悪性度の高い神経膠腫は多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、退形成性星細胞腫又は小児神経膠腫である。一実施形態では、本明細書中に開示された方法は有害なＩＬ１３Ｒα２発現に関連したがんを治療するために使用される。
【０１８９】
ＩＬ１３Ｒα２を過剰発現する細胞を有することが実証されているその他のがんには、限定するものではないが、乳がん、膵臓がん、頭頚部がん、卵巣がん及び結腸直腸がんが挙げられる。別の実施形態では、がんは転移したがんである。従って、さらに企図されるのは、これらのがんのうち１つ以上を、上述のようなＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴ構築物のうち１つ以上で形質導入された１つ以上のＴ細胞を対象者に投与することにより、治療する方法である。
【０１９０】
Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し、またＭＧＭＴの過剰発現又はＭＧＭＴバリアント（例えばＰ１４０Ｋ）の薬物抵抗性からの保護を付与する突然変異体ＭＧＭＴを発現するので、脳腫瘍の治療方法は、個体（脳腫瘍患者）に１つ以上の化学療法剤を順次又は同時に投与することをさらに含むことができる。換言すれば、改変Ｔ細胞は、化学療法剤の投与前、投与中又は投与後に投与される。化学療法剤の例には、テモゾロミド（ＴＭＺ）、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（ＢＣＮＵ又はカルムスチン）、ホテムスチン及びロムスチンが挙げられる。特定の態様では、１つ以上のＴ細胞は、配列番号１（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせを含む核酸配列を発現し、かつ１つ以上の化学療法剤は個体に同時に投与される。特定の態様では、個体は、ヒト若しくは他の霊長類のような哺乳動物、又はマウス若しくはラットのようなげっ歯動物である。
【０１９１】
ＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴキメラをコードして発現する構築物で形質導入されたＴ細胞の効力は、部分的には以下の実施例４及び５によって示されている。実施例４は、ＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質をコードするベクターで形質導入された単離Ｔ細胞が、Ｐ１４０ＫＭＧＭＴタンパク質の同時発現を伴わないＩＬ１３ＣＡＲをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞と比較して、ＴＭＺに曝露された時の抵抗性を増大させた（生存率を増大させた）ことを示している（例えば、図５を参照されたい）。従って、構想されるのは、本明細書中に記載されたもののようなＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴ構築物で形質導入された免疫細胞の生存率を増大させる方法である。典型的な実施形態では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の核酸配列を含むレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞が、ＴＭＺを用いた治療を順次又は同時に受けている脳腫瘍と診断された対象者を治療するための方法のように、提供される。
【０１９２】
さらなる研究から、本明細書中に開示されたＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴ構築物は、対象者に投与されることが可能でありかつ対象者の生存率を増大させることが可能であるＴ細胞の改変にも有効であることが示される。実施例５によって示されかつ図６に描写されるように、Ｕ２５１ＭＧ神経膠腫細胞を注射されたマウスは、ＴＭＺを用いて、かつＩＬ１３ＣＡＲ（ＭＧＭＴを伴わない）をコードする構築物又はＩＬ１３ＣＡＲ−Ａ２−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物で形質導入されたＴ細胞を用いて、治療された。Ｐ１４０ＫＭＧＭＴの不在下におけるＩＬ１３ＣＡＲの発現はＣＡＲ  Ｔ細胞の投与未実施と比較して生存率を増大させたが、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ａ２−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴキメラをコードする核酸配列で形質導入されたＴ細胞とともにＴＭＺを投与された動物が最も高い生存率を有している（図６）。従って、本明細書中において企図されるのは、脳腫瘍と診断された対象者を治療するための方法であって、本明細書中に記載されるようなＩＬ１３ＣＡＲ−ＭＧＭＴタンパク質を発現する免疫細胞を対象者に投与することを含む方法である。
【０１９３】
Ｔ細胞及び／又は化学療法剤は、任意の適切な投与経路を使用して個体に投与されることが可能である。適切な投与経路の例には、限定するものではないが、頭蓋内、髄内、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内への送達が挙げられる。
【０１９４】
１つの態様では、方法は、個体から１つ以上のＴ細胞を入手することと、該Ｔ細胞に、本発明のキメラ核酸配列、例えば配列番号１（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号２（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）、配列番号３（ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｋ  Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ）又はこれらの組み合わせを含む核酸配列を導入することと、をさらに含む。個体からＴ細胞を入手する方法は当分野で知られており、例えばプラズマフェレーシスが挙げられる。いくつかの態様では、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、該細胞が例えば数十億個に達するまで実験室で生育（増殖）させる。その後、増殖したＣＡＲ  Ｔ細胞の集団は患者に注入されることが可能である。注入後、Ｔ細胞は患者の体内で増加し、該細胞の遺伝子操作済み受容体の誘導で、細胞表面上に抗原を担持するがん細胞を認識して殺滅する。
【０１９５】
本明細書中に記載されたＩＬ１３ＣＡＲ及び突然変異体ＭＧＭＴを発現する宿主細胞は、治療上有効な量（すなわち、その疾患に関連した症状を改善すること、その疾患の発病を防止するか又は遅延させること、及び／又は、さらにその疾患の症状の重症度又は頻度を減少させることにより、その疾患を治療するのに十分な量）で投与される。特定の個体の障害又は状態の治療において治療上有効であろう量は、その疾患の症状及び重症度に応じて変化しうるものであり、標準的な臨床技術によって決定されることが可能である。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイが、最適な投薬範囲を同定するのを支援するために任意選択で使用されうる。製剤中で使用される正確な用量はさらに、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度にも応じて変化することになり、かつ施術者の判断及び各患者の状況に従って決断されるべきである。有効な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデルの試験システムに由来する用量−応答曲線から推定されうる。
【０１９６】
望ましくは、有効な量又は十分な数の単離されたトランスフェクションＴ細胞又は改変Ｔ細胞が組成物中に存在して対象者に導入されて、その結果長期的で特異的な抗腫瘍性の応答が確立され、そのような治療がなければ生じたであろうよりも、腫瘍の大きさを縮小するか、又は腫瘍の成長若しくは再成長を排除する。望ましくは、対象者に投与される改変Ｔ細胞の量は、改変Ｔ細胞が存在しないことを除いて同一の条件と比較した時に、腫瘍の大きさの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の減少を引き起こす。
【０１９７】
従って、投与される改変Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮に入れるべきであり、かつ所望の治療反応を達成するように十分な数の形質導入Ｔ細胞が導入されるようになっているべきである。更に、本明細書中に記載された組成物に含まれる個々の活性作用薬の量（例えば、接触される各細胞あたりの量又は一定の体重あたりの量）は、様々な適用において変動することが可能である。一般に、改変Ｔ細胞の濃度は、望ましくは治療を受けている対象者に少なくとも約１×１０６〜約１×１０９個の形質導入Ｔ細胞を、さらにより望ましくは、約１×１０７〜約５×１０８個の形質導入Ｔ細胞を提供するのに十分であるべきであるが、これより多いか又は少ない任意の適切な量、例えば５×１０８個を超える細胞、又は例えば１×１０７個未満の細胞も利用することが可能である。投薬スケジュールは、確立した細胞療法（例えば、トパリアン（Ｔｏｐａｌｉａｎ）及びローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、アクタ・ヘマトロジカ（Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．）、１９８７年、第７８巻、増補１、ｐ．７５−６；米国特許第４，６９０，９１５号明細書を参照のこと）を基にすることも可能であるし、代替の持続注入方策が使用されることも可能である。
【０１９８】
実施例
テモゾロミド抵抗性神経膠芽腫の免疫療法のためのＩＬ１３ＣＡＲ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ
実施例１：発現プラスミドの構築
ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ構築物をコードするｃＤＮＡ、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ構築物をコードするｃＤＮＡ、及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ構築物をコードするｃＤＮＡを、ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ構築物について図１Ａ及び１Ｂに例証されるようにしてＭＦＧレトロウイルスベクターのＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩクローニング部位に挿入し、ホストプラスミドであるＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−ｐＭＦＧ、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−ｐＭＦＧ、及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−ｐＭＦＧプラスミドを生成した。（コン（Ｋｏｎｇ）ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２０１２年、第１８巻、第２１号、ｐ．５９４９−５９６０を参照されたい）。ＩＬ１３ＣＡＲ及びＰ１４０Ｋ．ＭＧＭＴのｃＤＮＡ配列を両方とも有しているモノシストロニックな転写物を生成するために、５’にＮｏｔＩ端及び３’にＥａｇＩ端を備えた２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴフラグメントをジェンスクリプト・ユーエスエイ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ）（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって合成した。この２．３ｋｂのフラグメントを、配列を確認するためのｐＵＣ５７クローニングベクターにクローニングした。確認されたら、該フラグメントを一括してＩＬ１３ＣＡＲ−ｐＭＦＧレトロウイルスベクターの３’ＮｏｔＩ部位に移行させ、ＩＬ１３（ＷＴ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ．ＭＧＭＴ−ｐＭＦＧ、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ．ＭＧＭＴ−ｐＭＦＧ、及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ．ＭＧＭＴ−ｐＭＦＧプラスミドをそれぞれ生成した。図２Ａ及び２Ｂは、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ．ＭＧＭＴ構築物及びｐＭＦＧプラスミド構築物を示している。
【０１９９】
実施例２：レトロウイルス粒子の生産
実施例１に記載されたＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物をコードする構築物を含有するＭＦＧレトロウイルス粒子を、「ピンポン」法の使用により生成した。実施例１由来のホストプラスミドをそれぞれ、同種指向性レトロウイルスを生成するためにｐｈｏｅｎｉｘ（商標）−ｅｃｏ細胞に最初にトランスフェクションした。トランスフェクション効率をＩＬ１３発現のフローサイトメトリーによって測定した。培養上清を保存し、両指向性ウイルスをコードしているマウス繊維芽細胞株ＰＧ１３（米国バージニア州マナッサスのＡＴＣＣ）に形質導入するために使用した。形質導入されたＰＧ１３細胞をＩＬ１３に関して試験し、ＩＬ１３陽性の細胞を蛍光染色細胞選別機によって富化させた（図３Ａ〜３Ｂ）。ＩＬ１３富化細胞におけるＭＧＭＴの過剰発現も、細胞溶解産物のウエスタンブロット解析によって試験した（図３Ｃ）。
【０２００】
図３Ａ及び３Ｂに示されるように、形質導入細胞はＩＬ１３を発現し、かつ富化されて約９７％の細胞がＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を発現するようになった。図３Ｃはさらに、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴでトランスフェクトされた細胞における、トランスフェクトされていない細胞又はＩＬ１３ＣＡＲのみの構築物でトランスフェクトされた細胞と比較して高いＰ１４０ＫＭＧＭＴの発現を示している。
【０２０１】
富化された細胞を、高力価のＣＡＲをコードする両指向性レトロウイルスを含有した培養上清を採取するために組織培養条件下で増殖させた。
実施例３：ヒトＴ細胞の遺伝子改変
実施例２の方法によって生成されたＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ及びＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含むレトロウイルス粒子を、ヒトＴ細胞を形質導入するために使用した。ヒトのＰＢＭＣは血液フィルタ廃棄物（米国ロードアイランド州プロビデンスのロードアイランド輸血センター（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ））から単離された。ＰＢＭＣを、Ｔ細胞集団を富化するためにＯＫＴ３（１０μｇ／ｍｌ）及びＩＬ２（３０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で３６〜４８時間培養した。富化されたＴ細胞を、プロタミン及びＩＬ２が存在する状態で、レトロネクチン（登録商標）でコーティングされたプレート中にて室温で１時間、レトロウイルスを含有する培養上清を用いて遠心感染させた。このステップは以降の２４時間に３回繰り返された。３回の感染の後、細胞をレトロウイルスを含有する培地中でさらに２４時間生育させ、次いで今後の実験用に、１０％ウシ胎児血清、抗生物質、及びＩＬ２を含有する新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地に移した。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ（Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ無し）での形質導入に成功したＴ細胞及び形質導入未実施のＴ細胞を、すべての実験において対照群として使用した。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物を含むレトロウイルス粒子でトランスフェクトされたＴ細胞のおよそ２０〜２５％は、細胞表面上のＩＬ１３を検出するフローサイトメトリーによる測定でＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴについて陽性であった（データは示されない）。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴについての形質導入効率は、形質導入未実施のＴ細胞を対照として使用した場合、約６９．２％であった。
【０２０２】
実施例４：形質導入されたＴ細胞におけるテモゾロミド抵抗性
上述のようなＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ（図１Ａ）又はＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ（図２Ａ）を用いて形質導入されたＴ細胞を、別々に、テモゾロミドの濃度を増大させて（ＴＭＺ；０〜１０００μＭ）４８時間インキュベートした。培地を２４時間ごとに交換し、新鮮なＴＭＺを補充した。ＴＭＺを用いた処理の後、細胞の生存率を、トリパンブルー色素排除の原理、加えてアネキシンＶ／７ＡＡＤ染色法によって解析した。アネキシンＶ／７−ＡＡＤ陰性の細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定し、その結果は細胞の生存率を表した。生存率及びＴＭＺ活性の濃度を推定するために生存曲線を構築した。図４に示されるように、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴで形質導入されたＴ細胞は、ＴＭＺへの曝露後に、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と比較してより多く生き残った。この観察は、Ｐ１４０ＫＭＧＭＴを発現するＣＡＲを用いたＴ細胞の遺伝子改変が、改変Ｔ細胞に化学防護を与えたことを示している。
【０２０３】
実施例５：ＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴの機能的特徴解析
形質導入された細胞の免疫調節機能についても、神経膠腫細胞とともに同時培養された時の形質導入細胞によるサイトカインＩＬ２及びＩＦＮγの分泌を測定することにより解析された。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴレトロウイルスを用いて形質導入済みのＴ細胞を、２００μＭのＴＭＺとともに、又はＴＭＺを伴わずに、通常の組織培養条件で（５％血清及びＩＬ２（３０００Ｕ／ｍｌ）を含んだＲＰＭＩ１６４０培地並びに２００μＭのＴＭＺを使用）４８〜７２時間培養した。次に、細胞をＵ２５１ＭＧ神経膠腫細胞とともに７２時間（Ｕ２５１ＭＧ同時培養に関して本明細書中に記載されたようにして）培養した。培養上清をＥＬＩＳＡによってサイトカイン分泌について試験した。
【０２０４】
インターロイキン２（ＩＬ２）はＴ細胞の生存能力及び増殖のマーカーである一方、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）は細胞傷害性Ｔ細胞の機能性のマーカーである。図５Ａ及び５Ｂに見られるように、形質導入された細胞はＴＭＺの不在下又は存在下においてＩＬ２及びＩＦＮγの両方を分泌した。さらに、ＴＭＺの存在は、形質導入された細胞によるいずれのサイトカインの分泌も顕著には減少させなかった。ＴＭＺ抵抗性のＴ細胞はＴＭＺへの曝露の後もその正常な細胞傷害性機能を維持することが可能であり、これらの遺伝的改変が実際にこれらの細胞にＴＭＺ誘発性の白血球を減少させる細胞毒性に対する抵抗性を与えたことが示された。
【０２０５】
実施例６：ＩＬ１３ＣＡＲ−２Ａ−ＭＧＭＴのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効力
ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効力を、実施例２に記載されるようにして生成されたウイルス粒子を使用してマウスにおいて試験した。５０匹の無胸腺ヌードマウスに、Ｕ２５１ＭＧ神経膠腫細胞（４０匹のマウス；群Ｉ〜ＩＶ）又はＰＢＳ（１０匹のマウス）を皮下注射した（左脇腹）。神経膠腫移植の４日後に、３群のマウス（群Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ、マウス１０匹／群）に４日間ＴＭＺを経口投与した（強制経口投与により６４ｍｇ／ｋｇ／日）。神経膠腫移植後５日目に、ＴＭＺを経口投与された３群のマウスを以下のように処理した：群Ｉ：ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９ＫＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴ構築物（ＴＭＺ抵抗性）の腫瘍内注射；群ＩＩ：ＭＧＭＴを伴わないＩＬ１３  ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ構築物（ＴＭＺ感受性）；群ＩＩＩ：ＰＢＳのみを用いた処理（Ｔ細胞の注射なし）。群ＩＶはＴ細胞やＴＭＺ処理を受けなかった。マウスは、視覚的な腫瘍の成長、行動変化、及び死亡率についてＴ細胞の注射後９０日目までモニタリングされ、９０日目にはＩＡＣＵＣの規制により必要とされるようにしてマウスを屠殺した。
【０２０６】
マウス実験の結果から描かれた生存曲線は、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲ−２Ａ−Ｐ１４０ＫＭＧＭＴのＴ細胞及びＴＭＺで処理された腫瘍担持マウス（群Ｉ）が生存期間中央値７３日であって４０％の動物が生き残り、対してＭＧＭＴを伴わないＴＭＺ感受性のＩＬ１３（Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）ＣＡＲのＴ細胞及びＴＭＺで処理された群ＩＩの動物では６１日であって１４％が生き残ったことを示した。未処理の腫瘍担持マウス（群ＩＶ）は生存期間中央値が２９日であった。Ｔ細胞での処理は受けなかったがＴＭＺ単独を経口投与された群ＩＩＩの腫瘍担持動物は、２０％が生き残ったが、同時にわずか３６日の低い生存期間中央値を示し、これはＴＭＺ処理によるバックグラウンドの抗腫瘍効果であると考えられた（図９及び１０）。この観察は、３Ｇ  ＴＭＺ抵抗性ＣＡＲを投与される群Ｉの動物が、ＣＡＲ免疫療法及びＴＭＺ化学療法の相乗効果によって腫瘍の排除に最も効率的であったことを示している。
【０２０７】
本明細書中で引用されたすべての特許文献、公開出願及び参照文献の教示は参照によりその全体が援用される。
本発明についてその実例の実施形態を参照して具体的に示しかつ説明してきたが、該実施形態に、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく形態及び細部の様々な変更が行なわれうることは、当業者には理解されるであろう。
【図１Ａ】
2017537622.tif 000004
【図１Ｂ】
2017537622.tif 000005
【図２Ａ】
2017537622.tif 000006
【図２Ｂ】
2017537622.tif 000007
【図３Ａ】
2017537622.tif 000008
【図３Ｂ】
2017537622.tif 000009
【図３Ｃ】
2017537622.tif 000010
【図４】
2017537622.tif 000011
【図５Ａ】
2017537622.tif 000012
【図５Ｂ】
2017537622.tif 000013
【図６】
2017537622.tif 000014
【図７Ａ】
2017537622.tif 000015
【図７Ｂ】
2017537622.tif 000016
【図８Ａ】
2017537622.tif 000017
【図８Ｂ】
2017537622.tif 000018
【図９Ａ】
2017537622.tif 000019
【図９Ｂ】
2017537622.tif 000020
【配列表】
2017537622000001.app
【国際調査報告】
2017537622.tif 000021
2017537622.tif 000022
2017537622.tif 000023
2017537622.tif 000024