(57)【要約】本発明は、バクテリオファージセラピーに関する。さらに詳細には、本発明は、Pseudomonas aeruginosa株に対して高い特異性を有する新規なバクテリオファージ、それらの製造、それらの成分、それらを含有する組成物、及びファージセラピーにおけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株に対する溶菌活性を有する少なくとも二種のバクテリオファージを含む抗菌性組成物であって、前記少なくとも二種のバクテリオファージが、配列番号：１〜７のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される組成物。
【請求項２】
配列番号：１〜７のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される少なくとも三種、さらに好ましくは少なくとも四種の異なるバクテリオファージを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも、配列番号：３若しくは４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；及び
配列番号：６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ
を含む請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
表４のバクテリオファージのカクテルのいずれか一つを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；及び
配列番号：７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ
を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
抗生物質耐性P. aeruginosa株に対して溶菌性である請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
ＬＭＧコレクションの全菌種の９０％より多くに対して溶菌性である請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容し得る賦形剤又は担体をさらに含む請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
液状、半液状、固体又は凍結乾燥された製剤である請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
１０ｅ４から１０ｅ１２PFUまでの各バクテリオファージを含む請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳動物における感染の処置において使用するための前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
気道の感染の処置において使用するための請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における微生物細菌叢を改変することにより前記哺乳動物の状態の改善のために使用するための請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
材料の除染のために使用するための請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも二種のバクテリオファージを別々に生成し、該バクテリオファージを好適な担体又は賦形剤と組み合わせることを含む請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物を調製するための方法。
【請求項１７】
Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株への溶菌活性を有し、配列番号：２〜７のいずれか一つ又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。
【請求項１８】
配列番号：２〜７のいずれか一つ又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１７に記載のバクテリオファージによって、又は請求項１８に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
哺乳動物における感染の処置において使用するための請求項１７〜１９のいずれか一項記載のバクテリオファージ、核酸又はポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なバクテリオファージ組成物、それらの製造及びそれらの使用に関する。本発明は、哺乳動物における感染、特に呼吸器系における感染の処置に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージ（又はファージ）は、細菌に感染して死滅させる能力を示す小ウイルスであるが、他の生物からの細胞には影響を及ぼさない。ほぼ１世紀前に初めてWilliam Twortが報告したが、その後まもなくFelix d’Herelleによって別途に発見され、今までのところ６０００を超える、異なるバクテリオファージが発見されており形態学的に報告されているが、これらには細菌性及び原始（archeal）ウイルスが含まれる。これらのウイルスの圧倒的多数が尾状であるが、ごく一部は多角体、糸状又は多形である。それらは、それらの形態、それらの遺伝的内容（ＤＮＡ対ＲＮＡ）、それらの特異的なホスト、それらが生存する場所（海洋ウイルス対他の生息地）、及びそれらの生活環に従って分類されうる。細菌細胞（菌体）の細胞内寄生生物として、ファージは細菌ホスト内で異なる生活環：溶菌性、溶原性、擬溶原性、及び慢性感染を呈する（Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012）。溶菌性ファージは、それらの生活環の正常な部分として、ホスト細菌細胞の溶菌を引き起こす。溶原性ファージ（テンペレート（temperate）ファージとも呼ぶ）は、溶菌生活環によって複製してホスト細菌の溶菌を引き起こすことができるか、又はホスト細菌ＤＮＡの中にそれらのＤＮＡを組み入れて非感染性プロファージになることができる。いずれのファージの環のタイプでも、第一工程は、ファージ材料が細菌に入り得る前に細菌細胞壁のレセプターに接着することである。この特異的のプロセスは、ファージと細菌との可能な相互作用のスペクトルに影響を及ぼす。
【０００３】
バクテリオファージは、実験室での実験において細菌を改変するための研究ツールとして、よく使用される。
【０００４】
それらのターゲットホスト細胞特異性のゆえに、急性及び慢性感染を処置するための療法（セラピー）としてのファージの使用は、特に皮膚科学、眼科学、泌尿器科学、口腔医学、小児科学、耳鼻咽喉科学又は外科学において考慮されている。細菌感染を処置するためのファージの治療的使用のこのコンセプトはしかしながら、当初から非常に議論の余地があり、公共又は医学界によって広く容認されなかった。初期の研究は、適切な対照がないことと、矛盾する結果のために大幅に批判された。再現性がないことと、公開された種々の研究にて得られた多くの矛盾する結果とのために、Council on Pharmacy and Chemistry of the American Medical Associationは、溶菌濾液の治療的価値に対するエビデンスがほとんどの部分つじつまが合わず、確証的でなく、その恩恵とされるものを確認するさらなる研究が推奨されると結論するに至った。
【０００５】
１９４０年代に抗生物質が導入されて以来、治療学の本分野には、とりわけ西側社会において、あまり注目が払われなかった。しかし、抗生物質の大量使用は、世界中で抗生物質耐性細菌の広汎な出現及び蔓延をもたらしており、ますます深刻な問題を引き起こしている。それゆえ、主たる多剤耐性微生物を処理するために残されている治療の選択肢の限定を克服することが、主要な治療的試みになっている。
【０００６】
１９世紀終盤（Fordos 1859）に最初に発見されて以降、グラム陰性菌Pseudomonas aeruginosaは、不評なヒト病原体のリスト（Williams and al, 1894, Freeman and al, 1916）で悪名高い地位を獲得している。抗生物質時代の到来は、健康な患者における急性感染の従来致死的であった結果を大幅に緩和した。嚢胞性線維症若しくは重症の熱傷に罹患している個体又は免疫無防備状態の個体で主に発症する慢性感染の撲滅において、相対的な改善のみ成し遂げられているに過ぎない（Gang et al, 1999, Jones and al, 2010）。これらの患者における感染の致死的な結果での、本質的に関連する２つの因子は、不適切な抗生物質処置の早計な処方と、多剤耐性株の発生又は獲得である。適切な抗生物質（一種以上）の使用はP. aeruginosa感染の撲滅に必須の因子と報告されている（Kang and al, 2005, Micek and al, 2005）のではあるが、逆に抗生物質の濫用は、耐性能力獲得のために継続した選択的な圧力をかけることによってこのような耐性を高めるのに有意に寄与する。抗生物質単独では、多剤耐性変異体の高い蔓延の原因を説明できない。すなわち、P. Aeruginosaは、細胞エンベロープの低透過性及び多くの多剤排出ポンプを含む、多数の、染色体的にコードされる内因性の、耐性機構を複数有している。本細菌の首尾良い侵襲的挙動及び持続の原因となる別の主要因子は、その高い適応性であり、異なる環境の迅速なコロニー形成が可能である。
【０００７】
さらに、P. aeruginosaなどの病原菌は、抗生物質に対するそれらの耐性の増大に寄与するバイオフィルムを形成することができる。このようなバイオフィルムは、排出された細胞外マトリックスによって取り囲まれ担持された一種以上の細菌を含み得、そして細菌が種々の表面をコロニー形成させるのを助ける。バイオフィルムは、細菌を表面に接着させて、それなくしては担持不能であるはずの個体群密度に達することを可能とし、抗生物質のみならず重金属などの毒素、漂白剤及び他の洗浄剤を含む多くの環境ストレスにも対して高められた耐性を付与する。バイオフィルム内の細菌は、浮遊（planktonic）形態で成長している細菌の同じ株よりも抗生物質に対して１００〜１０００倍の耐性であることが可能なことが公知である。このように高められた耐性は、実験室での試験で抗生物質に対して明らかに感受性である細菌が、臨床の現場で療法に対して耐性であり得ることを意味する。たとえいくつかが明らかになっているとしても、バイオフィルムは、一旦抗生物質がもはや存在しなくなれば迅速なコロニー形成を許容する耐性リザーバーを提供し得る。それゆえバイオフィルムは、多くのヒト疾患において主要因子であることが明らかである。化学処理は、これがまさにバイオフィルムが迎え撃つようになってきたものであるため、バイオフィルムに対して使用するのには不適当である。物理的擦過は、バイオフィルムを崩壊させる手段を提供する。残念ながら、バイオフィルムが細菌性病変形成を担持する多くの表面、すなわち骨、関節、移植された医療装置などは、厳しい擦過に適していない。例えば、創傷又は熱傷の表面は、極めて感受性が高くて傷付きやすい。擦過が好適であって日常的に使用されている場合であっても、バイオフィルムの排除には限りがある。歯の表面上の口腔プラークはバイオフィルムであり、規則正しいブラッシングによって部分的に排除される。しかしながら、ブラッシングされない表面（例えば、歯間の隙間の中）に細菌は維持されて、迅速且つ事実上、排除後の表面に再コロニー形成することができる。このことから、バイオフィルムを排除する既存のアプローチは、有効性が限られていることは明らかである。
【０００８】
速やかに適応する能力、及びバイオフィルムを形成するそれらの能力が、P. aeruginosaを日和見病原体として同定する主な理由である。それらは院内病原体の状態を獲得しており、創傷、痰、膀胱、尿道、膣、耳、眼及び気道から採取された臨床サンプルから単離され得る。このような臨床的P. aeruginosa株で最も強力な新しい抗生物質に対する耐性が出現すること（処置中にも起こっている）で、P. aeruginosa院内病原体との戦いが大きな課題になっている。
【０００９】
それゆえ、ヒト又は動物療法での使用や、さらには、材料を除染するために好適な、細菌バイオフィルムに組織化された場合であってもP. aeruginosa株を破壊するために使用することができる新しい抗菌薬又は組成物が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株に強く特異的な溶菌活性を呈する新しいバクテリオファージを単離及び特徴付けしている。これらのバクテリオファージは、とりわけ組み合わせで非常に強力な抗菌効果を与え、特にP. aeruginosa細菌感染を処置するために、医薬又は獣医用調剤において活性薬剤として使用されることができる。
【００１１】
本発明の目的は、Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株に対する溶菌活性を有する少なくとも二種のバクテリオファージを含む抗菌性組成物であって、前記少なくとも二種のバクテリオファージが、配列番号：１〜７のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株への溶菌活性を有し、且つ配列番号：２〜７のいずれか一つ又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージに関する。
【００１３】
本発明のバクテリオファージは、P. Aeruginosaの多剤耐性株への、特にセファロスポリナーゼ-、カルベニシリナーゼ-、カルバペネマーゼ-及び／又は基質拡張型β-ラクタマーゼ-耐性株などの抗生物質耐性病原性株への強力な溶菌活性を呈し、それゆえに細菌感染を処置するのに特に好適で有利である。
【００１４】
本発明はさらに、本発明のバクテリオファージに含有される単離された核酸分子、好ましくは配列番号：２〜７のいずれか一つ又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、さらには前記核酸によってコードされる単離されたポリペプチドに関する。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記のような核酸又はポリペプチドを含む組成物である。
【００１６】
本発明の組成物は、典型的にはさらに、薬学的又は獣医学的に許容できる賦形剤又は担体を含む。それらは、液状、半液状、固体又は凍結乾燥されている。
【００１７】
本発明の別の目的は、哺乳動物における感染の処置において使用するための、哺乳動物における細菌叢を改変するための、材料を除染するための、及び／又はP. aeruginosa細菌を死滅させるための、又は細菌バイオフィルムの完全性を損なわさせるための、前記のようなバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド又は組成物に関する。
【００１８】
本発明はまた、被検者の細菌叢を改変することによって前記被検者の状態を改善するのに使用するための、前記のようなバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド又は組成物にも関する。細菌叢は、前記細菌叢における微生物の適切なバランスを訂正、適応又は復元することによって改変され得る。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物における感染を処置するための方法であって、前記哺乳動物への前記のような少なくとも一種のバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド又は組成物の投与を含む方法にも関する。
【００２０】
本発明はまた、P. aeruginosa細菌で汚染されていると疑われる表面又は材料を処置するための方法であって、前記のような少なくとも一種のバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド又は組成物を前記表面又は材料に適用することを含む方法にも関する。表面又は材料は、装置、容器又は実験材料、布などのいずれの表面であってもよい。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、前記のような組成物と、それを被検者又は表面に適用するための手段を含むキットに関する。
【００２２】
本発明は、任意の哺乳動物において、好ましくはヒトにおいて、又は実験材料若しくは医療装置を含む任意の材料を処置するために使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１３８４の有効性
【図２】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１７７７の有効性
【図３】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１７９２の有効性
【図４】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１７９７の有効性
【図５】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１８００の有効性
【図６】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージ１９０２の有効性
【図７】ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージカクテルの有効性
【図８】ＣＦ１株に対するバクテリオファージカクテルの有効性
【図９】ＣＦ２株に対するバクテリオファージカクテルの有効性
【図１０】ＣＦ３株に対するバクテリオファージカクテルの有効性
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、特に哺乳動物における感染の処置のため、又は被検者の細菌叢を改変することによって前記被検者の状態を改善するための、新規なバクテリオファージ、それらの成分、それらを含有する組成物、それらの製造、及び抗菌薬としてのそれらの使用に関する。
【００２５】
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００２６】
本願明細書で使用する場合、用語「バクテリオファージ」又は「ファージ」とは、タンパク質性のエンベロープ又はカプシド内にパッケージングされた核酸ゲノムを含む機能的ファージ粒子をいう。この用語はまた、たとえば、頭部、又はファージ成分のアセンブリであって、実質的に同じ機能活性を与えるものを含む、前記バクテリオファージの部分をいう。
【００２７】
用語「表現型特性」は、より好ましくはバクテリオファージの形態学及び／又はホスト範囲を示す。バクテリオファージを表現型判定するための方法は、一部それ自体周知であり、例えば、細菌ホスト範囲及び／又は特定の菌種によって生成されるバイオフィルムに対する活性を求めることを含む。
【００２８】
用語「溶菌活性」は、本発明で用いる場合、バクテリオファージが細菌細胞の溶菌を引き起こす性質を示す。バクテリオファージの溶菌活性は、当技術分野において自体公知の技術にしたがってP. aeruginosa株について試験されることができる（実験セクションも参照されたい）。
【００２９】
参照バクテリオファージの「変異体」の用語は、前記参照バクテリオファージと比べて、これによりコードされるゲノム配列及び／又はポリペプチド（１つ以上）に変異（一種以上）を有するが、参照バクテリオファージと同じ表現型特性を保持しているバクテリオファージを示す。変異体は典型的には、たとえば、サイレント突然変異、保存的突然変異、軽微な欠失、及び／又は遺伝子材料の軽微な複製を含み、且つ参照バクテリオファージの表現型特性を保持している。好ましい実施形態では、本発明に係る変異体は、本発明のバクテリオファージのゲノムに依存する任意の観察可能な特性又は性質、すなわち前記バクテリオファージ及び／又はP. aeruginosa株に対する溶菌活性の表現型特性を保持している。好ましい変異体は、参照バクテリオファージのゲノムと比べて、５％未満、より好ましくは４％未満、さらに好ましくは２％未満の核酸変異を有する。あるいは、又はそれと組み合わせて、変異体は、参照バクテリオファージのポリペプチドと比べてコードされるポリペプチド配列に好ましくは５％未満のアミノ酸変異を有する。
【００３０】
用語「ESBL P. aeruginosa株」とは、セファロスポリナーゼ及び／又は基質拡張型β-ラクタマーゼを生成するP. aeruginosa株をいい、ＡｍｐＣ β-ラクタマーゼ又はクラスＡカルベニシリン加水分解性β-ラクタマーゼなどの抗生物質耐性の種々のフォームを含む。
【００３１】
バクテリオファージについて「特異的な」又は「特異性」の用語とは、前記バクテリオファージが感染することのできるホストのタイプをいう。P. Aeruginosaに「特異的な」バクテリオファージは、より好ましくは、生理的条件下に一種又数種のP. aeruginosa株に感染でき、且つ非P. aeruginosa細菌に感染できないバクテリオファージを示す。
【００３２】
本願明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、任意のサイズのポリペプチドをいい、たとえば５〜２０アミノ酸の小ペプチド、長鎖ポリペプチド、タンパク質又はそのフラグメントを含む。
【００３３】
用語「ＰＬＥ」又は「生成的溶菌性効果」は、所与のバクテリオファージのバーストサイズと生成的溶菌時間との比を示す。バーストサイズ及び生成的溶菌時間は、ファージ−ホスト相互作用を定義するパラメータであり、それぞれ、一種のファージによる一種の細菌の感染によって生成されるバクテリオファージ粒子の平均収量、及び遊離のバクテリオファージが細菌細胞を溶菌するのにかかる時間に対応する。
【００３４】
本願明細書に関連して、用語「単離されたバクテリオファージ」は、その自然環境から除かれた及び／又はその自然環境の成分から分離されたバクテリオファージを意味すると考えられるべきである。用語は特に、たとえば、インビトロで増殖されたファージ、精製されたファージ、及び／又は任意の好適な希釈剤又は賦形剤と製剤化されたファージを示す。核酸又はポリペプチドに対して、用語「単離された」は、たとえば、その自然環境の少なくとも１つの成分（たとえば、タンパク質、脂質、及び／又は核酸など）から分離された、核酸分子又はポリペプチドを示す。
【００３５】
用語「薬学的又は獣医学的に許容できる」とは、本願明細書で使用する場合、哺乳類の被検者において使用するために適合可能な任意の材料（たとえば、担体、賦形剤又は希釈剤）をいう。このようなものとして、生物に無害であるか、又は有意に特異的若しくは非特異的な免疫反応を何ら起こさないか、又は前記活性化合物の生物活性を抑止することのない、生理的に許容できる液体又は媒質が挙げられる。組成物を液剤に製剤化するためには、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝性生理食塩水、アルブミン輸液溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの混合物が、薬学的又は獣医学的に許容できる賦形剤又は担体として使用されてもよい。必要に応じて、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、表面活性剤、抗酸化物質及び静菌性薬剤などの他の従来の添加剤を添加してもよい。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに組成物に添加して、水溶液剤、懸濁剤、及び乳剤などの注射可能製剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、若しくは錠剤などの経口製剤、又は粉末製剤を調製してもよい。
【００３６】
本願明細書で使用する場合、「PFU」は、当技術分野においてよく定義されているとおり、プラーク形成単位を意味する。溶菌性バクテリオファージはホスト細胞を溶菌させて、培養プレート上に排除部（又はプラーク）のゾーンを惹起する。理論的には、各プラークは一種のファージによって形成され、希釈倍率で掛けたプラークの数は、試験調製物中のファージの総数に等しい。
【００３７】
用語「処置」又は「セラピー（療法）」は、疾患の治療的又は予防的処置を示す。治療的処置は、疾患の治療をもたらす処置、又は直接的若しくは間接的に疾患の症候若しくは疾患が起こす苦しみを緩和、低減、安定化若しくは除去するか、又は被検者の状態を改善するか若しくは疾患の進行を低減する処置として定義される。予防的処置は、疾患の防止をもたらす処置、並びに／又は疾患の出現又はその発生のリスクを低減及び／若しくは遅延する処置を含む。
【００３８】
用語「バイオフィルム」は本願明細書で使用する場合、種々の表面上で成育する不均一な細菌形成；好ましくは固体の生物学的又は非生物学的表面に接着された菌体外多糖マトリックス内に埋没して成育する細菌群集を示す。
【００３９】
用語「損なわさせる」とは、本願明細書で使用する場合、完全性の任意の改変をいう。細菌バイオフィルムを損なわさせることにより、バクテリオファージによるバイオフィルムの浸透、バイオフィルム会合細菌の感染及び／若しくはその溶菌並びに／又はバイオフィルムの部分的若しくは全体的なバイオフィルムの排除（すなわち、コロニー形成を停止すること及び／又はバイオフィルムを崩壊させることによる）が理解される。
【００４０】
用語「試料」とは、本願明細書で使用する場合、細胞含有する任意の試料を意味する。このような試料の例として、血液、血漿、唾液、又は尿などの体液や、バイオプシー、器官、組織又は細胞試料が挙げられる。試料は、その使用前に処置されてもよい。
【００４１】
本願明細書で使用する場合、用語「被検者」又は「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいい、成体及び小児を含む。用語「被検者」はまた、とりわけ非ヒト動物、特にペット（たとえば、イヌ、ネコ）、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳動物を包含する。
【００４２】
処置の「有効性」又はバクテリオファージセラピーへの「応答」の用語とは、本願明細書で使用する場合、処置の前のP. aeruginosa株の数に比べてバクテリオファージ処置後に被検者においてP. aeruginosa株の数の減少をもたらす処置をいう。「良好なレスポンダー」被検者とは、バクテリオファージセラピーで処置すると臨床的に有意な回復を示すか又は示すことになる被検者をいう。
【００４３】
バクテリオファージの「カクテル」の用語とは、異なるタイプのバクテリオファージの組み合わせを示す。カクテル中のバクテリオファージは、好ましくは同じ容器又は包装に一緒に製剤化されるが、それらは部品のキットとして使用されてもよく、キットではバクテリオファージのいくつかが別々に製剤化又は包装されており、使用又は投与時に組み合わせられる。
【００４４】
実施形態の説明
本発明は、新規なバクテリオファージセラピーに関する。さらに詳細には、本発明は、Pseudomonas aeruginosa株に対して高い特異性を有する新規なバクテリオファージ、それらの製造、それらの成分、それらを含有する組成物及びファージセラピーにおけるそれらの使用に関する。
【００４５】
バクテリオファージ
第一の態様において、本発明は、P. aeruginosa株に特異的であり、単独又は組み合わせ（一種以上）て、顕著な溶菌活性のホスト範囲スペクトルを呈する新規なバクテリオファージの単離及び特性解析を開示する。これらのバクテリオファージは、環境由来試料から選択され、単離され、配列決定されて特徴付けされている。それらは、個々に及び組み合わせ（一種以上）で、P. aeruginosa株に対して活性である。それらは、ESBL P. aeruginosa株などの抗生物質耐性P. aeruginosa株を含む病原性P. aeruginosa株に対して顕著に有効である。さらに、本発明のバクテリオファージは、１から７の間が含まれ、顕著な生成的溶菌性効果（「ＰＬＥ」）を有する。加えて、本発明のバクテリオファージは、P. aeruginosa株に特異的であり、すなわち、それらは非P. aeruginosa細菌の溶菌を引き起こさない。さらに示されるように、本発明は、これらのバクテリオファージが、医薬又は獣医用薬剤としてP. aeruginosa株のコントロールされたスペクトルに対してターゲティングされ非常に強力な抗菌効果を呈するのに用いるために好適な条件で、組み合わせ及び製剤化されることができることを示す。
【００４６】
さらに具体的には、以下のバクテリオファージが単離されている。それらの対応する核酸配列も示している。
【００４７】
【表１】
2017534684.tif 000002
【００４８】
これらのバクテリオファージの溶菌性プロファイルが、多数のP. aeruginosa株について確認されている。これらのバクテリオファージは、以下の表に開示されるようにそれらの有効性及び組み合わせでの能力に対して選択されている。この表では、参照及び病原体耐性株に対するバクテリオファージの溶菌性効果が示されており、それらの高い溶菌能力が確認されている。
【００４９】
【表２】
2017534684.tif 000003
【００５０】
見てとれるように、表２から、これらのバクテリオファージの組み合わせ（又はカクテル）は、試験されたP. aeruginosa株の全てを死滅させることができるものが生成され得、これにより広域スペクトル抗菌性組成物を生成する。具体例として、７種のバクテリオファージ全てのカクテルは、試験された細菌全てを死滅させることができる。
【００５１】
さらに、バクテリオファージの特異性が多くの非P. aeruginosa株について試験されている。さらに詳細には、実験セクションに本発明のバクテリオファージが、Escherichia coli、Acinetobacter baumanii、Enterobacter aerogenes、Enterobacter asburiae、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Proteus mirabilis、Staphylococcus aureus、Stenotrophomonas maltophila及びSerratia marcescensから選択されるいずれの細菌にも溶菌性効果を有しないことを示している。これらのバクテリオファージはこのように、単独又は組み合わせ（一種以上）て、P. aeruginosa感染を処置するための強力な薬剤であることを示す。
【００５２】
本発明の特定の目的はしたがって、P. aeruginosa株に溶菌活性を有し、且つ配列番号：２〜７のいずれか一つ又はそれと少なくとも９５％の同一性（好ましくはそれと少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージにある。
【００５３】
本発明のバクテリオファージは、下記により詳細に開示するとおり、培養され、増殖され、単離され、精製され、そしてたとえばP. aeruginosaに媒介される障害のファージセラピーに使用され得る。さらに、当該バクテリオファージの表現型（たとえば、特異性及び溶菌活性）を保持しているこれらのバクテリオファージの変異体は、当技術分野において自体公知の技術によって生成及び／又は単離されることができる。
【００５４】
本発明のバクテリオファージは、標準的な培養、単離及び精製方法によって調製されることができる。例えば、P. Aeruginosa生成細菌（P. aeruginosa producing bacteria）が培養され、バクテリオファージの試料によって感染され、次いで処理して細菌細胞及びデブリを除去する。濃縮されたバクテリオファージ溶液を、感受性（susceptible）P. Aeruginosaホスト株が埋没されている培地、例えば寒天培地に蒔いてプラークを得ることができる。次いで、引き続くバクテリオファージ精製及び増幅のために単一プラークを拾い上げることができる。本発明のバクテリオファージの選択的増幅の一以上のサイクルは、例えばバクテリオファージをコンピテントなP. Aeruginosaと混合し、その後成長培地を添加して選択された試験成育条件でインキュベーションすることによって実施され得る。遠心分離の後、除去後の増幅上清をフィルターで濾過し、選択的増幅の別のサイクルに付すか、又は溶菌活性の存在について試験する。
【００５５】
次いで、懸濁液中のファージの力価、及び本発明のバクテリオファージのプラーク形態の可視化が、公知の方法によって、例えばプラーク計数によって評価され得る。加えて、短期保存、長期保存、凍結保存又は他の任意の種類の保存のための種々の形態（液状、凍結乾燥など）への本発明のバクテリオファージの加工を、当技術分野において周知のような任意の好適な方法によって実施することができる（たとえば、Clark, 1962を参照のこと）。
【００５６】
本発明のバクテリオファージの活性は、二重寒天法としても公知であるプラークアッセイなどの、当技術分野において周知の方法により評価されることができ、これは潜在性ホスト細菌とのバクテリオファージの成育と、その後のホスト細菌細胞を死滅させるそれらの能力の評価に基づく。プラークアッセイ法において、バクテリオファージは軟寒天培地でのインキュベーション期間の後にターゲットP. aeruginosa株の溶菌を誘導し、その結果プラークとして公知であるプレート上の排除のゾーンが得られる。
【００５７】
核酸及びポリペプチド
本発明は、本発明のバクテリオファージに含まれる核酸、又はこのような核酸の任意のフラグメントに関する。フラグメントの用語は、より好ましくは、オープンリーディングフレームを含む（又はオープンリーディングフレームからなる）フラグメントを示す。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、単鎖又は二本鎖であり得る。
【００５８】
核酸は、寄託されたバクテリオファージから単離されるか、又はリコンビナントＤＮＡ技術（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）、酵素による合成若しくは化学合成又はこれらの組み合わせを用い、一般的当技術分野において自体公知の技術に従って生成されることができる。また含まれるのは、相同配列及びそれらのフラグメントであって、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は反転されている天然アレル変異体及び改変核酸配列を非限定的に含む。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号：２〜７のいずれか一つから選択される配列、又は配列番号：２〜７のいずれか一つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む核酸に関する。
【００６０】
本発明の核酸は、遊離の形態か、又はプラスミド、ウイルスベクター、発現カセット、コスミドなどのベクターにクローニングされているものであることができる。
【００６１】
さらなる態様において、本発明はまた、前記のような核酸配列、好ましくは配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、又は配列番号：７から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドにも関する。ポリペプチド（１つ以上）は、合成、リコンビナント技術、又はこれらの組み合わせなどの当技術分野において自体公知の技術によって生成され得る。ポリペプチドは、単離又は精製され得、そして抗菌薬として又はインビトロ分析用の試薬として使用され得る。
【００６２】
本発明の組成物
本発明の一態様は、前記のとおりに少なくとも一種のバクテリオファージ（より好ましくは少なくとも二種以上）と、場合により、薬学的又は獣医学的に許容できる賦形剤とを含む組成物に関する。前記のとおり、本発明のバクテリオファージは非常に強力なP. aeruginosa株に対する溶菌活性を有する。これらのバクテリオファージの組み合わせを生成して、ホストスペクトルを広げて、非常に有効な抗菌性組成物を生成してもよい。
【００６３】
さらに詳細には、本発明は、Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）株に対する溶菌活性を有する少なくとも二種のバクテリオファージを含む抗菌性組成物に関し、前記少なくとも二種のバクテリオファージは配列番号：１〜７のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、配列番号：１〜７のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される少なくとも三種、さらに好ましくは少なくとも四種の別異のバクテリオファージを含む。
【００６５】
本発明の特定の組成物は、少なくとも、配列番号：３若しくは４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージを含む。
【００６６】
本発明の組成物の具体例は、
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号：５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージを含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は少なくとも、
配列番号：１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号：６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；及び
配列番号：７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージを含む。
【００６８】
本発明の組成物はさらに、追加の抗菌薬、特に、別異のホスト特異性を有する他のバクテリオファージを含み得る。
【００６９】
最も好ましい本発明の組成物は、BCCM/LMG Bacteria Collectionから入手されるＬＭＧコレクションの全菌種の８５％より多くに対して溶菌性である。このコレクションは、細菌種のうち高い遺伝的多様性を備えた膨大な数の株を含んでいる。
【００７０】
本発明の組成物は、任意の有効量の選択されたバクテリオファージ（一種以上）を含み得る。好ましくは、それらは１０ｅ４から１０ｅ１２PFUまでの前記バクテリオファージの各々、好ましくは１０ｅ５から１０ｅ１０PFUを含む。本発明の組成物中のバクテリオファージの各タイプの相対的な量は、当業者によって調整され得る。典型的には、抗菌性組成物が前記のようないくつかの（ｎ種の）別異のバクテリオファージを含む場合、組成物中の各バクテリオファージの総相対量％Ａは、より好ましくは％Ａ＝（１００／ｎｉ）ｘＶであり、式中ｎｉは、バクテリオファージの別異のタイプの数を表し、Ｖは変動性の要因で０．２から５までを含む。最も好ましくは、Ｖは０．３から３まで、より好ましくは０．５から２まで、一般的には０．８から１．５までを含む。好ましい典型的な実施形態において、各タイプのバクテリオファージは、本発明の組成物中におよそ等しい相対量で存在する。
【００７１】
本発明の抗菌性組成物は、液状、半液状、固体又は凍結乾燥された製剤などの種々の形態であってよい。本発明の組成物は好ましくは、薬学的又は獣医学的に許容できる賦形剤又は担体などの好適な希釈剤又は担体を含む。本発明の組成物は、選択されたバクテリオファージ（一種以上）に加えて、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、表面活性剤などの任意の賦形剤又は担体を含んでもよい。このようなものとして、生物に無害であるか、又は有意に特異的若しくは非特異的な免疫反応を何ら起こさないか、又はバクテリオファージの生物活性を抑止することのない、生理的に許容できる液体又は媒質が挙げられる。液剤製剤化のためには、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝性生理食塩水、アルブミン輸液溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの混合物が、薬学的又は獣医学的に許容できる賦形剤又は担体として使用されてもよい。適切であれば、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、表面活性剤、抗酸化物質及び静菌性薬剤などの他の従来の添加剤を添加してもよい。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに組成物に添加して、水溶液剤、懸濁剤、及び乳剤などの注射可能製剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、若しくは錠剤などの経口製剤、又は粉末製剤を調製してもよい。局所投与用の製剤は、バンドエイド、創被覆材（ドレッシング）、パッチ、フィルム、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、滴剤、座薬、スプレー、タンポン、生理用ナプキン、液剤及び粉末剤を含み得る。除染用又は医学的使用のための製剤は、エアロゾル又はスプレーも含み得る。
【００７２】
本発明の組成物は、ヒト又は獣医領域を含む医療分野において、たとえば哺乳動物における感染の処置のため、又は被検者の状態を改善するために使用されてもよい。組成物は、感染を処置するために、生物においてP. aeruginosa細菌を死滅させるのに使用されてもよい。組成物は、哺乳動物における微生物細菌叢を改変することにより前記哺乳動物の状態を改善するためにも使用され得る。特に、本発明の組成物は具体的に、哺乳動物の皮膚又は粘膜上のP. aeruginosa株を除去することができ、したがって微生物フローラが改変され、適正なバランスが復元される。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明はまた、哺乳動物における感染を処置するための方法にも関し、前記のような組成物又はバクテリオファージ又は核酸又はポリペプチドの前記哺乳動物への投与を含む。
【００７４】
本発明はまた、哺乳動物における感染の処置用の、又は前記哺乳動物において細菌叢を復元させるための、前記のような組成物、バクテリオファージ、核酸又はポリペプチドの医薬の製造のための使用にも関する。
【００７５】
本発明の組成物は、特に呼吸器系の、種々のP. aeruginosaに媒介される感染を処置するために使用されてもよい。肺炎の患者の数は、２０１３年に米国で２〜３百万人、欧州で３〜４百万人に達した。Pseudomonas aeruginosaは、とりわけ幼児及び老年世代や、免疫無防備状態の、嚢胞性線維症、酷い火傷及び多発外傷患者における病状を引き起こす主要な微生物物質の一つである。疫学的なソースは変動するものの、グラム陰性感染（P. Aeruginosaを含む）は最近増加しているが、２０１４度の見積もりでは、少なくとも１５％の肺炎がP. Aeruginosaによって引き起こされる（たとえば、ECDC Annual Surveillance Report − 2013によれば１５．９％）ことが示唆されている。控えめに見て、これらの細菌の約２０％が、我々の治療兵器からのいくつかの、又は全ての抗生物質に対して耐性である（顕著に、最高数又は耐性症例は集中治療室において観察されている：http://www.infectio-lille.com/diaporamas/DUAC/pyo-DUAC09-Cattoen.pdf）。結果として、見積もり数値は米国で少なくとも９００００の肺炎症例、欧州では１２００００症例が、多種抗生物質耐性のP. aeruginosa菌種によって誘発されることを示唆している。本発明はしたがって、P. aeruginosa感染に関連するか又はこれによって引き起こされる肺炎を処置するために特に好適である。本発明の目的はしたがって、処置を必要とする被検者において肺炎を処置する方法にあり、この方法は本発明の組成物を前記被検者に投与することを含む。この方法は、抗生物質耐性P. aeruginosa細菌によって誘発された肺炎を処置するために特に好適である。被検者は、小児、成人又は老人など、任意のヒト被検者であり得る。
【００７６】
本発明の組成物は、静脈内、経口、経皮、皮下、経粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経口、直腸、膣内及び局所を含む任意の都合のよい経路によって投与され得る。好ましい実施形態では、バクテリオファージ又は組成物は、肺内又は鼻腔内滴注によって投与される。組成物は、直接的に、又は間接的に、たとえば、サポートを介して投与されてもよい。これに関し、組成物は罹患領域に、例えば、塗布又はスプレーされてもよい。本発明の組成物は、経口又は非経口経路によって投与されることもできる。本発明の組成物の塗布、スプレー又は投与に好適な投薬量は、製剤、投与方法、投与時に処置される哺乳動物の年齢、体重、性、状態、食事、投与経路、及び反応感度を含む様々な因子に応じて、当業者により調整されることができる。当該技術分野の通常の知識を有する医師は、必要とされる組成物の有効量を難なく決定及び処方できる。
【００７７】
投薬もまた、抗生物質耐性P. aeruginosa株に対する溶菌活性が得られるように、当業者によって調整されることができる。インビボで溶菌活性を得るために効果的な服用量は典型的には、投与経路に応じて、少なくとも１０ｅ４PFU/ml、好ましくは約１０ｅ２から１０ｅ１２PFU/mlまでの濃度を含む。
【００７８】
実験セクションに示すように、本発明のバクテリオファージ及び組成物は、インビトロ又はインビボでP. aeruginosa細菌を選択的に死滅させることができる。組成物は、インビボであっても、低投薬量であっても、異なるP. aeruginosa細菌の混合物を破壊することができる。さらに、本発明の組成物が有効なのは、バイオフィルムに埋没された細菌を死滅させることで、これが病原菌に対して特に重要である。また、本発明の組成物及びバクテリオファージは厳密に、哺乳類細胞に影響を及ぼすことができず、それゆえ特異的であってインビボの副作用がない。
【００７９】
本発明はまた、材料を除染するための、本発明の組成物、バクテリオファージ、核酸又はポリペプチドの使用にも関する。それらの強力な抗菌効果のゆえに、また細菌バイオフィルムの完全性を損なわせさえするそれらの能力のゆえに、本発明の組成物は除染剤として使用され、材料上の細菌数を除去又は少なくとも低減させることができる。このような方法は、固体材料又は装置、例えばコンタクトレンズ、身体内に移植されるべき装置の表面、パイプ、ダクト、実験用容器、繊維製品などを含め、医療及び非医療状況の双方にある、生物学的又は非生物学的な様々な表面の処置に適用され得る。
【００８０】
本発明の診断的／予測的試験
本発明はまた、被検者におけるバクテリオファージセラピーの有効性を予測又は判定するための方法にも関し、この方法は、前記被検者からの試料由来のP. aeruginosa株への、本発明の一種以上のバクテリオファージの溶菌活性を判定する工程を含み、かかる溶菌活性は効果的な処置の指標である。好ましい態様において、この方法はさらに、前記被検者からの試料由来のP. aeruginosa株への溶菌活性を有する一種以上のバクテリオファージによって、前記被検者を処置する工程を場合により含む。
【００８１】
別の態様において、本発明は、被検者を選択する、又はバクテリオファージセラピーからの恩恵に被検者が高感受性かどうかを判定するための方法を提供し、この方法は、前記被検者の試料からのP. aeruginosa株への、本発明の一種以上のバクテリオファージの溶菌活性を判定する工程を含み、少なくとも一種のP. aeruginosa株への本発明の一種以上のバクテリオファージの溶菌活性は、レスポンダー被検者を示唆する。
【００８２】
本発明の別の目的は、バクテリオファージセラピーに対する被検者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、前記被検者の試料からのP. aeruginosa株への、本発明の一種以上のバクテリオファージの溶菌活性を判定する工程を含み、少なくとも一種のP. aeruginosa株への本発明の一種以上のバクテリオファージの溶菌活性は、前記セラピーへの良好な応答の指標である。
【００８３】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実験セクションに開示されるが、これは例示に過ぎない。
【実施例】
【００８４】
材料及び方法
ホスト範囲判定
バクテリオファージのホスト範囲を、ＬＭＧコレクションからの２０種のP. Aeruginosaの一群より判定した。１０９の細菌細胞を、溶かした寒天と混合し、この混合物を固体寒天に注加して二層の寒天板を作った。凝固後に、単離されたバクテリオファージ原液を、異なる細菌株と共に各プレートにスポットした。スポットを２０分間吸収させた後、プレートを反転させ、溶菌の程度を記録する前に３７℃で２４時間インキュベーションした（Postic, 1961; Yang, 2010）。
【００８５】
ファージゲノムの配列決定、分析及びアノテーション
ファージＤＮＡを単離するために、前記のとおりにファージを増殖させた。ファージＤＮＡを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、V/V）での抽出、エタノール沈殿、及び水中での溶解によって単離した。全体のゲノム配列決定を行い、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、National Center for Biotechnology Information [NCBI]データベースの報告済みの遺伝子との類似性を判定した。ゲノムを潜在的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）についてスキャンした。
【００８６】
実施例１：バクテリオファージ単離
バクテリオファージを環境由来試料から単離した。環境水から各病原性バクテリオファージを単離して濃縮するために、多剤耐性（ＭＤＲ）P. aeruginosa細菌を用いた。さらに詳細には、環境由来試料と、Luria Bertani（ＬＢ）における細菌の一晩培養物とを混合して振盪しながら３７℃で２４時間インキュベーションし、特異的なバクテリオファージを増やした。インキュベーション終了時に、クロロホルムの液滴を培養物に添加した。培養物を１１，０００ｇで５分間遠心沈降させて細菌細胞及びデブリを除去した。上清を０．２μmのフィルターに付して残留細菌細胞を除去した。濃縮されたファージ溶液をP. aeruginosaが埋没されたＬＢ寒天培地に蒔いた。３７℃で２４時間インキュベーションした後、プラークが形成された。単一プラークを、引き続いてのファージ精製及び増幅用に拾い上げた。ファージを次いで、ＬＢブロス又は生理食塩水中の懸濁液にて４℃で保存した。
【００８７】
懸濁液中のファージの力価は、プラーク計数によって見積もられた（Postic, 1961）。懸濁液の１０倍希釈液を、増殖している株の乾燥したローン（lawn）上に送った。プレートを、一晩インキュベーションした後に読み取った。プラーク計数方法により、プラーク形態の可視化もできた。
【００８８】
７種の高活性バクテリオファージを選択した。それらの配列を判定し、以下の表により本願において提供する。
【００８９】
【表３】
2017534684.tif 000004
【００９０】
単独又は組み合わせて、バクテリオファージの活性を、以下の実施例に記載のとおり、異なるモデル及び条件にてさらに試験した。
【００９１】
実施例２：バクテリオファージホスト特性及び反応速度
一工程成長実験を以前の報告に従って実施し、先ず生成的溶菌時間、吸着速度、次いでファージバーストサイズを判定した。吸着速度を判定するために、試料を異なる時間間隔で採取し、溶液中の遊離ファージ粒子を分析した。生成的時間及びファージバーストサイズの判定のため、P. aeruginosa細菌をファージ溶液と混合して、ファージを１５分間吸着させた。混合物を直ちに５０００rpmで１０分の遠心分離に付して遊離のファージ粒子を除去した。ペレットを５の新鮮なＬＢ培地に再懸濁させて培養物を続けて３７℃でインキュベーションした。試料を５分間隔で採取して、ファージ力価を判定した。これらの結果によって、以下の表３に示すように、細菌あたりの生成したファージ数（バーストサイズ）、生成的時間及び生成的溶菌性効果（ＰＬＥ）を求めることができた。
【００９２】
【表４】
2017534684.tif 000005
【００９３】
これらの結果は、全てのファージが強力なウイルス生成能及び吸着速度を有することを示す。ほとんどのファージは、７未満のＰＬＥを有し、これは顕著なプロファイルを示す。ファージ1777は、これに関して特に有効である。加えて、異なるＰＬＥ及び吸着時間によって、選択された可変性を備えたカクテルを作製することができるようになる。
【００９４】
実施例３：バクテリオファージの組成物
以下のカクテル組成物を構成するが、各々、１０９から１０１１pfuまでの各バクテリオファージを含んでいる。
【００９５】
【表５】
2017534684.tif 000006
【００９６】
実施例４：抗菌活性
細菌の種々の株を本発明のバクテリオファージカクテルと、２．１０９バクテリオファージ/ml、３７℃で２４時間インキュベーションする。カクテルを表２に列挙する１６の別異のP. aeruginosa細菌について試験する。カクテルに感受性の細菌種の％を以下の表５に列挙する。
【００９７】
【表６】
2017534684.tif 000007
【００９８】
細菌を数え、カクテルＶＩとの耐性割合（インキュベーション後の細菌数／播種された細菌数）の算出のために使用した。耐性割合は、以下の表６に示すとおりに得られた。
【００９９】
【表７】
2017534684.tif 000008
【０１００】
試験された細菌は全て、本発明の組成物に感受性である。
【０１０１】
実施例５：カクテル特異性
カクテル特異性は、Escherichia coli (数種)、Acinetobacter baumanii、Enterobacter aerogenes C、Enterobacter asburiae、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Proteus mirabilis、Staphylococcus aureus、Stenotrophomonas maltophila、Serratia marcescensを含む、１０の異なるグラム陰性及びグラム陽性菌種にて試験することにより確認された。
【０１０２】
表７は、前記7種のバクテリオファージを含有するカクテルに溶菌活性がないことを示す。
【０１０３】
【表８】
2017534684.tif 000009
【０１０４】
前記の表は、細菌に対して溶菌活性がないがP. aeruginosa株では惹起されることを明らかに示す。本発明のバクテリオファージ及びカクテルはそれゆえ、P. aeruginosa株に非常に特異的である。
【０１０５】
実施例６：P. aeruginosa PAO1株に対する各バクテリオファージの効果
PAO1株は、それが一般的に用いられる実験用株であることから選択された。細菌を個々に成育し、各バクテリオファージを個々に（図１〜６）又はカクテル中（図７）、１〜１０ｅ−４のＭＯＩで、すなわち１〜１００００の希釈比（細菌／ファージ）で添加した。
【０１０６】
図１は、バクテリオファージ1384が、１、０．１又は０．０１のＭＯＩで効果的であることを示す。
【０１０７】
図２は、バクテリオファージ1777が、１のＭＯＩで効果的であることを示す。
【０１０８】
図３は、バクテリオファージ1792が、１０ｅ−４のＭＯＩでも、少なくとも６時間のあいだPAO1株に対して活性であることを示す。
【０１０９】
図４は、バクテリオファージ1797が、１０ｅ−４のＭＯＩでも、少なくとも６時間のあいだPAO1株に対して活性であることを示す。
【０１１０】
図５は、バクテリオファージ1800が、１０ｅ−４のＭＯＩでも、少なくとも６時間のあいだPAO1株に対して活性であることを示す。
【０１１１】
図６は、ＭＯＩに応じて、バクテリオファージ1800が、少なくとも６時間のあいだPAO1株に対して活性であることを示す。
【０１１２】
図７は、ＰＡＯ１株に対するバクテリオファージカクテルＶＩの有効性を示す。カクテルは、１０ｅ−４のＭＯＩでも、少なくとも６時間のあいだPAO1株に対して非常に活性であり、個々にファージよりもさらに効果的である。
【０１１３】
実施例７：嚢胞性線維症抗生物質耐性P. aeruginosa株に対する本発明のバクテリオファージカクテルの効果
呼吸困難を引き起こすP. aeruginosaを表す、いくつかの株を選択した。それらを個々に成育して、バクテリオファージカクテルＶＩを１〜１０ｅ−４のＭＯＩで、すなわち１〜１００００の希釈比（細菌／ファージ）で添加した。
【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
結果を図８、９及び１０に示す。
【０１１６】
図８は、カクテルが、６時間後でも、また非常に低いＭＯＩでも、CF1株に対して十分に効果的であることを示す。
【０１１７】
図９は、カクテルが、６時間後でもCF2株に対して非常に効果的であることを示す。
【０１１８】
図１０は、カクテルが、CF3株に対して効果的であることを示す。
【０１１９】
その結果は、入院患者から単離された３つの院内細菌性P. aeruginosa株に対して、バクテリオファージカクテルＶＩが、１００００倍まで希釈された後でも非常に効果的であることを示す。これらの結果はしたがって、本発明の組成物が、インビボでのP. aeruginosa感染を処置するために使用することができ、多剤耐性菌種に対して活性であることを示している。
【０１２０】
参照
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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