(57)【要約】一部の実施形態では、本開示の態様は、細胞内のゲノム遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子を修飾する（例えば、変異導入する）のに有用である方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメントにスプライシングされた、転写されたエクソンを含む、キメラスプライシングＲＮＡ分子を生成することを伴う。一部の実施形態では、キメラスプライシングＲＮＡは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ヌクレアーゼ）を、細胞におけるゲノム遺伝子座にガイドし、その結果、該遺伝子座の修飾をもたらす。
2017502683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において、ＤＮＡヌクレアーゼをゲノム標的にガイドする能力がある標的特異的ＲＮＡ分子を生成する方法であって、組換え核酸を真核細胞に導入するステップを含み、該組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む、方法。
【請求項２】
真核細胞において、ＤＮＡヌクレアーゼをゲノム標的にガイドする能力がある標的特異的ＲＮＡ分子を生成する方法であって、組換え核酸を真核細胞のゲノム遺伝子座に組み込むステップを含み、該組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む、方法。
【請求項３】
細胞内のゲノムＤＮＡの、ＲＮＡによりガイドされる切断を促進する方法であって、
真核細胞において、第２のＲＮＡセグメントにスプライシングされた第１のＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子を生成するステップであって、該第１のＲＮＡセグメントは、ゲノム遺伝子座から転写されたエクソン配列を含み、該第２のＲＮＡセグメントは、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントを含む、ステップ、および
該真核細胞において、前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを発現させるステップ
を含む、方法。
【請求項４】
前記組換え核酸がＤＮＡ分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え核酸がトランスポゾン末端配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスポゾン末端配列が逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスポゾン末端配列が直接末端反復配列を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記直接末端反復配列がＩＴＲに隣接する、請求項６に従属する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスポゾン末端配列が、５’末端のＣＣＹ、および３’末端のＧＧＧを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスポゾン末端配列が、５’末端のＣＣＣ、および３’末端のＧＧＧを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスポゾン末端配列がＴＴＡＡ挿入部位を標的化する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスポゾン末端配列が、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスポゾン末端配列が、Ｔａｇａｌｏｎｇトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
組換え核酸が、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードする第３の核酸領域をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択マーカーまたはスクリーニングマーカーが、抗生物質耐性タンパク質、または蛍光タンパク質もしくは生物発光タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記スプライスアクセプター部位が、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３−３’
（式中、
Ｘ１はＡであり、
Ｘ２は、ＧまたはＣであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり、ここで、３’スプライスジャンクションは、Ｘ２とＸ３の間にある）として記載される配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘ２がＧである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘ３が、Ａ、Ｇ、またはＣである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記スプライスアクセプター部位が、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５−３’
（式中、
Ｘ１は、Ａ、Ｃ、またはＵであり、
Ｘ２はＡであり、
Ｘ３はＧであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｇ、またはＣであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｕ、またはＣであり、ここで、３’スプライスジャンクションは、Ｘ３とＸ４の間にある）として記載される配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記スプライスアクセプター部位が、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２−３’（配列番号１８）
（式中、
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵからそれぞれ独立して選択され、
Ｘ２は、ＣまたはＧであり、
Ｘ４はＵであり、
Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１４は、Ｇ、Ｃ、およびＵからそれぞれ独立して選択され、
Ｘ１８は、Ａ、Ｃ、またはＵであり、
Ｘ１９はＡであり、
Ｘ２０はＧであり、
Ｘ２１は、Ａ、Ｃ、またはＧであり、
Ｘ２２は、Ａ、Ｕ、またはＣであり、ここで、３’スプライス部位は、Ｘ２０とＸ２１の間にある）として記載される配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼ相互作用セグメントが、前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する少なくとも１つのステム部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼ相互作用セグメントが、非相補的ＲＮＡヌクレオチドにより分離される第１および第２のステム部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のステム部分が、５’−ＧＵＵＧＵＡＧＣ−３’として記載されるヌクレオチド配列を有する鎖を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のステム部分が、５’−ＵＵＣＵＣ−３’として記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のステム部分の２本の鎖の相補的塩基対が、ループ構造を通じて共有結合で連結している、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼ相互作用セグメントが、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号１）として記載される配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換え核酸が、前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼをコードする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣａｓヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＮｍＣａｓ９）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼが、ＤＮＡにおいて一本鎖切断を導入する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼが、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を導入する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼが、ｉ）該ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子の前記第２のＲＮＡセグメントとの間の相互作用、およびｉｉ）前記エクソン配列をコードする１つまたは複数のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ切断を促進する条件下で発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数のゲノム遺伝子座が、前記エクソン配列をコードする２つまたはそれ超の対立遺伝子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記２つまたはそれ超の対立遺伝子が、哺乳動物細胞における２つの対立遺伝子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＤＮＡ切断が、前記エクソン配列のスプライスドナー部位の上流の５塩基対以内で生じる、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
真核細胞において、ＤＮＡ修飾酵素をガイドする標的特異的核酸を生成する方法であって、組換え核酸を真核細胞に導入するステップを含み、該組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、該ＤＮＡ修飾酵素と相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む、方法。
【請求項４３】
前記ＤＮＡ修飾酵素がＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記真核細胞が幹細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＤＮＡ修飾酵素と相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む核酸。
【請求項４６】
前記ＤＮＡ修飾酵素がＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼである、請求項４５に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法§１１９の下、２０１４年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／９２７，４５８号に基づく優先権を主張し、その内容の全体は、本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、部位特異的ガイドＲＮＡを使用して、目的の特異的ゲノム標的部位に標的化することができる。部位特異的ガイドＲＮＡは、ｉ）目的のゲノム標的部位の１本の鎖に相補的である、標的化セグメント、およびｉｉ）ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する、ヌクレアーゼ相互作用セグメント両方を含むようデザインされ得る。使用中、ガイドＲＮＡの標的化セグメントは、標的ゲノム部位における相補的配列に結合し、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼをゲノム標的部位に動員し、その部位において標的化核酸切断（cleavage）（例えば、二本鎖の切断）がもたらされる。多くの細胞において、ゲノム部位の切断は、切断部位において変異を導入することができる細胞内修復メカニズムを介して、修復される。それ故、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼを使用して、目的の公知の部位においてゲノム変異を導入することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼを使用してゲノム変異を引き起こす、現在のシステムは、標的部位が同定され、ガイドＲＮＡにデザインにより取り込まれるという要件により制限される。対照的に、本明細書において記載されるシステムは、それぞれのゲノム部位について特異的な合成ガイドＲＮＡ、または特異的な合成ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物をデザインすることなく、任意の発現されたゲノム部位に変異を導入するのに有用である。むしろ、本明細書において記載されるシステムは、ゲノム遺伝子座から転写されて、ヌクレアーゼをゲノム遺伝子座に標的化することができるキメラスプライシングＲＮＡ（chimeric  spliced  RNA）が生成される、エクソン上に（エクソンから下流に）スプライシングされ得る配置のヌクレアーゼ相互作用セグメントを提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメントをスプライスアクセプター部位から下流にコードする、挿入核酸構築物は、遺伝子（例えば、遺伝子のイントロン）に組み込まれる。結果として、遺伝子の転写、続いて、転写されたＲＮＡのスプライシングは、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメントにスプライシングされた遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む、キメラスプライシングＲＮＡを生成する。このキメラスプライシングＲＮＡは、ｉ）対応するゲノム遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子を（キメラスプライシングＲＮＡの１つまたは複数のエクソンとゲノム遺伝子座の対応する相補鎖との間での塩基対形成を介して）標的化し、ｉｉ）（キメラスプライシングＲＮＡのヌクレアーゼ相互作用セグメントとの相互作用を介して）ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼを１つまたは複数の対立遺伝子に動員することができ、それにより、ゲノム遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子においてヌクレアーゼベースの切断が促進される。一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼは、キメラスプライシングＲＮＡ分子により標的化される、エクソンの３’末端において、またはその近くでゲノム遺伝子座を切断する（ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼは、キメラスプライシングＲＮＡ分子の標的化部分との相補的塩基対形成を介して、エクソンに結合されたキメラスプライシングＲＮＡ分子により、その位置にガイドされる）。キメラスプライシングＲＮＡ分子が、細胞において、ゲノム遺伝子座のそれぞれの対立遺伝子（例えば、二倍体細胞における対立遺伝子両方）上の対応するエクソンに結合し得ることは理解されるべきである。それ故、発現されたゲノム遺伝子座のそれぞれの対立遺伝子は、同一位置において、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼにより標的化され得、結果として、変異は、発現されたゲノム遺伝子座のそれぞれの対立遺伝子において、同一位置において導入され得る。したがって、２つまたはそれ超の対立遺伝子（例えば、複数倍体細胞（multiploid  cell）の３、４、５、６つ、またはそれ超の対立遺伝子）が、本明細書において記載される通り、変異導入され得ることは理解されるべきである。
【０００４】
一部の実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法を使用して、複数の発現された遺伝子座の対立遺伝子両方において変異を引き起こすことができ、ここで、それぞれの遺伝子座は、スプライスドナー部位を有する転写物を生成し、ここで、発現は、ＲＮＡスプライシングする能力がある宿主細胞内で生じる。例えば、本明細書において記載される組成物および方法は、真核生物である宿主細胞において有用である。一部の実施形態では、宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにある。一部の実施形態では、宿主細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、宿主細胞は、生物、例えば、マウス、非ヒト霊長類、またはヒトのような哺乳動物における細胞である。真核生物の宿主細胞の非限定的な例は、哺乳動物、鳥類、昆虫、酵母、植物、および他の真核生物の宿主細胞を含む。一部の実施形態では、宿主細胞はヒト宿主細胞である。宿主細胞の非限定的な例は、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞などを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞はヒト幹細胞である。
【０００５】
本明細書において記載される組成物および方法を使用して、複数の異なる発現されたゲノム遺伝子座のそれぞれにおいて変異を有する宿主細胞のライブラリーを生み出すことができる。ライブラリーは、開示の挿入核酸構築物を宿主細胞に（例えば、トランスフェクションにより）送達すること、次に、１つまたは複数の核酸構築物が挿入された、ＤＮＡを含有する細胞を単離することにより、生成され得る。トランスフェクション行為中に細胞と混合する挿入核酸構築物の比率を調節することにより、異なる数の変異を有する宿主細胞を生成することができる。一部の実施形態では、ライブラリーにおけるそれぞれの変異細胞は、平均して、二倍体細胞の１つまたは両方の対立遺伝子（またはより大きな倍数性、例えば、３ｎ、４ｎ、５ｎ、６ｎ、７ｎ、８ｎなどの倍数性の細胞における複数の対立遺伝子）において１つのゲノム遺伝子座のみにおける変異を有する。それぞれの対立遺伝子において導入される変異は、二倍体細胞の対立遺伝子両方がＤＮＡ切断修復（DNA  break  repair）を経験するとき、異なってもよいことは理解されるべきである。しかしながら、一部の実施形態では、二倍体細胞のライブラリーにおけるそれぞれの変異細胞（mutant  cell）は、平均して、１つまたは両方の対立遺伝子において２つまたはそれ超の異なるゲノム遺伝子座における変異を有する。一部の実施形態では、二倍体細胞のライブラリーにおけるそれぞれの変異細胞は、平均して、単一のゲノム遺伝子座の対立遺伝子両方における変異を有する。異なる変異は、所定のゲノム遺伝子座において生成することができ、ライブラリーにおける異なる宿主細胞において存在し得ることも理解されるべきである。例えば、本明細書において記載される挿入構築物は、発現されたゲノム遺伝子座の異なる位置（例えば、イントロン）に組み込まれ、ゲノム遺伝子座の異なるエクソン（例えば、３’末端のそれぞれの異なるエクソン）において変異を結果的に生み出し得る。一部の実施形態では、それぞれが異なる組み込み部位を有する、多くの異なる細胞を有するライブラリーが生成される。一部の実施形態では、それぞれの細胞が異なる組み込み部位を有する、最大１０３、１０２〜１０４、１０２〜１０５、１０２〜１０６、１０２〜１０７、１０２〜１０９、１０３〜１０６、１０３〜１０７、１０４〜１０６、１０４〜１０７、または１０４〜１０８の範囲内の多数の細胞を有するライブラリーが生成される。一部の実施形態では、ライブラリーは、特定の種類の遺伝子内に挿入（ランダムまたは標的）を有する細胞を選び出すことにより、異なる種類の遺伝子を含有するライブラリーが構築され、配置され得る。例えば、ライブラリーの細胞は、制御因子、代謝因子、発生因子、受容体（例えば、免疫チェックポイント受容体、Ｇタンパク質共役受容体）、酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、転写因子、構造タンパク質、モータータンパク質をコードする遺伝子、およびｍｉＲＮＡ、非コードＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）などのような制御性ＲＮＡをコードする遺伝子を含む、他の種類の遺伝子内に挿入を有してもよい。
【０００６】
一部の実施形態では、ゲノム変異のライブラリーをスクリーニングして、１つまたは複数の候補化合物での処置に感受性のある、１つまたは複数の遺伝子座が同定され得る。しかしながら、変異のライブラリーを、任意のアッセイを使用してスクリーニングして、目的の表現型または特性に関連する１つまたは複数の遺伝子座が同定され得ることは理解されるべきである。
【０００７】
本発明の態様は、真核細胞のような、スプライシングする能力がある細胞において、ＤＮＡヌクレアーゼをゲノム標的にガイドする能力がある標的特異的ＲＮＡ分子を生成する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、組換え核酸を真核細胞に導入するステップを含み、組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む。一部の実施形態では、方法は、組換え核酸を、真核細胞のゲノム遺伝子座に組み込むステップを含み、組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む。
【０００８】
本発明の一部の態様は、細胞内のゲノムＤＮＡのＲＮＡによりガイドされる切断を促進する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、細胞において、第２のＲＮＡセグメントにスプライシングされた第１のＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子を生成するステップを含み、第１のＲＮＡセグメントは、ゲノム遺伝子座から転写されたエクソン配列を含み、第２のＲＮＡセグメントは、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞において、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを発現させるステップをさらに含む。
【０００９】
本発明の態様は、真核細胞において、ＤＮＡ修飾酵素をガイドする標的特異的核酸を生成する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、組換え核酸を真核細胞に導入するステップを含み、組換え核酸は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＤＮＡ修飾酵素と相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素は、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼである。一部の実施形態では、真核細胞は幹細胞である。
【００１０】
本発明の態様は、スプライスアクセプター部位をコードする第１の核酸領域を、ＤＮＡ修飾酵素と相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする第２の核酸領域の上流に含む核酸に関する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素は、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼである。
【００１１】
一部の実施形態では、組換え核酸はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、組換え核酸は、トランスポゾン末端配列を（例えば、線状組換え核酸の５’末端および３’末端において）含む。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、直接末端反復配列を含む。一部の実施形態では、直接末端反復配列はＩＴＲに隣接する。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、５’末端のＣＣＹ、および３’末端のＧＧＧを含む。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、５’末端のＣＣＣ、および３’末端のＧＧＧを含む。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、ＴＴＡＡ挿入部位を標的とする。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、トランスポゾン末端配列は、Ｔａｇａｌｏｎｇトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、組換え核酸は、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードする第３の核酸領域をさらに含む。一部の実施形態では、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーは、抗生物質耐性タンパク質、または蛍光タンパク質もしくは生物発光タンパク質である。
【００１２】
一部の実施形態では、スプライスアクセプター部位は、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３−３’（式中、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧまたはＣであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり、ここで、３’スプライスジャンクションはＸ２とＸ３の間にある）として記載される配列を含む。一部の実施形態では、Ｘ２はＧである。一部の実施形態では、Ｘ３はＡ、Ｇ、またはＣである。一部の実施形態では、スプライスアクセプター部位は、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５−３’（式中、Ｘ１はＡ、Ｃ、またはＵであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４はＡ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ５はＡ、Ｕ、またはＣであり、ここで、３’スプライスジャンクションはＸ３とＸ４の間にある）として記載される配列を含む。一部の実施形態では、スプライスアクセプター部位は、５’−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２−３’（配列番号１８）（式中、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵからそれぞれ独立して選択され、Ｘ２はＣまたはＧであり、Ｘ４はＵであり、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１４は、Ｇ、Ｃ、およびＵからそれぞれ独立して選択され、Ｘ１８はＡ、Ｃ、またはＵであり、Ｘ１９はＡであり、Ｘ２０はＧであり、Ｘ２１は、Ａ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ２２は、Ａ、Ｕ、またはＣであり、ここで、３’スプライス部位はＸ２０とＸ２１の間にある）として記載される配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと相互作用する少なくとも１つのステム部分を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、非相補的ＲＮＡヌクレオチドにより分離される第１および第２のステム部分を含む。一部の実施形態では、第１のステム部分は、５’−ＧＵＵＧＵＡＧＣ−３’として記載されるヌクレオチド配列を有する鎖を含む。一部の実施形態では、第２のステム部分は、５’−ＵＵＣＵＣ−３’として記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のステム部分の２本の鎖の相補的塩基対は、ループ構造を通じて共有結合で連結している。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号１）として記載される配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、真核細胞は植物細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１５】
一部の実施形態では、組換え核酸は、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖切断（single-stranded  break）を導入する。一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を導入する。一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、ｉ）ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼとＲＮＡ分子の第２のＲＮＡセグメントとの間の相互作用、およびｉｉ）エクソン配列をコードする１つまたは複数のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ切断を促進する条件下で発現される。一部の実施形態では、ＤＮＡ切断は、エクソン配列のスプライスドナー部位の上流５塩基対内で生じる。
【００１６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のゲノム遺伝子座は、エクソン配列をコードする、２つまたはそれ超の対立遺伝子である。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の対立遺伝子は、哺乳動物細胞における２つの対立遺伝子である。
【００１７】
これらの態様、および他の態様は、本明細書においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、キメラスプライシングＲＮＡ分子（エクソンａ’を含有する）の生成の非限定な実施形態を説明する図である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、キメラスプライシングＲＮＡ分子（エクソンａ’を含有する）の生成の非限定な実施形態を説明する図である。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、複数の対立遺伝子を標的化するキメラスプライシングＲＮＡ分子（エクソンａ’を含有する）によりガイドされる核酸切断システム、および標的化核酸切断後のＤＮＡ修復により誘導される変異誘発の非限定的な実施形態を説明する図である。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、複数の対立遺伝子を標的化するキメラスプライシングＲＮＡ分子（エクソンａ’を含有する）によりガイドされる核酸切断システム、および標的化核酸切断後のＤＮＡ修復により誘導される変異誘発の非限定的な実施形態を説明する図である。
【図３】図３は、ＤＮＡ修復により誘導される変異誘発後の非限定的な実施形態のトランスポゾン切除を説明する図である。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、標的化ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の配列を含む、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの非限定的な実施形態を説明する図である。配列番号２は図４Ａにおいて挙げられ、配列番号３は図４Ｂにおいて挙げられ、配列番号４は図４Ｃにおいて挙げられる。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、標的化ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の配列を含む、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの非限定的な実施形態を説明する図である。配列番号２は図４Ａにおいて挙げられ、配列番号３は図４Ｂにおいて挙げられ、配列番号４は図４Ｃにおいて挙げられる。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、標的化ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の配列を含む、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの非限定的な実施形態を説明する図である。配列番号２は図４Ａにおいて挙げられ、配列番号３は図４Ｂにおいて挙げられ、配列番号４は図４Ｃにおいて挙げられる。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来の、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列により隣接される、標的化ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの配列を含むヌクレアーゼ相互作用セグメントを含む、挿入組換え核酸を利用するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを説明する図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ヒトジストロフィン遺伝子の２つのエクソン／イントロン境界を説明する図である。エクソン１３は配列番号５であり、エクソン２４は配列番号６である。
【図５Ａ】図５Ａは、コンセンサススプライスドナーおよびアクセプター部位の非限定的な実施形態を説明する図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、キメラＲＮＡの非限定的な実施形態を説明する図である。配列番号７は、図５Ｂにおいて挙げられる。
【図６】図６Ａは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の付いたエクソン、ならびにスプライスアクセプターおよびヌクレアーゼ相互作用セグメントを含むＲＮＡをコードする部分を含有する、核酸構築物の非限定的な実施形態を説明する図である。図６Ｂは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼをコードする核酸構築物の非限定的な実施形態を説明する図である。
【図７】図７は、ＣＲＩＳＰＲ活性を評価するためのワークフローの非限定的な実施形態を説明する図である。
【図８】図８は、修飾されたヌクレアーゼをゲノム部位に標的化するためのシステム（ここで、エクソンａ’は、スプライシングされたＲＮＡ分子を示す）の非限定的な実施形態を説明する図である。
【図９−１】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図９−２】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図９−３】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図９−４】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図９−５】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図９−６】図９は、挿入組換え核酸の配列（配列番号１９）の非限定的な例を提供する図である。組換え核酸は、スプライスアクセプター部位を、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流に含む。
【図１０−１】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−２】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−３】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−４】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−５】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−６】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−７】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−８】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−９】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【図１０−１０】図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する図である。ＤＮＡ配列は、配列番号２０に対応し、タンパク質配列は、左から右に、配列番号２１、２２、および２３に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一部の実施形態では、本開示の態様は、細胞内のゲノム遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子を修飾する（例えば、変異導入する）のに有用である、方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメントにスプライシングされた、転写されたエクソンを含む、キメラスプライシングＲＮＡ分子を生成することを伴う。
【００２０】
本開示の態様は、標的核酸を細胞内で修飾する方法および組成物に関する。一部の実施形態では、標的核酸は、標的核酸に（例えば、標的部位における二本鎖ＤＮＡ分子の１本の鎖に）相補的である第１の標的化セグメントを含み、ヌクレアーゼと相互作用する能力がある第２のセグメントにスプライシングされる、キメラスプライシングＲＮＡ分子による標的核酸にガイドされるヌクレアーゼにより、細胞内で修飾される。一部の実施形態では、第１のセグメントは、少なくとも１つのエクソンを含み、第２のセグメントは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）と相互作用する能力があるＲＮＡを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、キメラスプライシングＲＮＡ分子は、細胞内で生成され、組換えＲＮＡセグメントにスプライシングされた、転写されたゲノム領域（例えば、１つまたは複数のエクソンを含む）に対応するＲＮＡセグメントを含み、ここで、組換えＲＮＡセグメントは、転写されたゲノム領域のイントロンに組み込まれる、組換え核酸上にコードされる。したがって、一部の実施形態では、本開示の態様は、細胞内で、ヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡに連結した、スプライスアクセプター部位を含有するＲＮＡを提供することに関する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、構築物をゲノム部位に組み込むことにより、提供される。
【００２２】
一部の実施形態では、キメラスプライシングＲＮＡ分子は、発現されたゲノム遺伝子座に（例えば、発現された遺伝子座における標的化セグメントとゲノムＤＮＡの相補鎖との間の相補的塩基対形成を介して）、およびキメラスプライシングＲＮＡ分子のヌクレアーゼ相互作用セグメントに結合するヌクレアーゼに結合する。結果として、ヌクレアーゼは、ゲノム遺伝子座にガイドされる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、キメラスプライシングＲＮＡ上の標的化セグメントに相補的である配列を有するゲノム部位において、またはその近くで、（例えば、１つまたは両方の鎖上の）ゲノムＤＮＡを切断する。一部の実施形態では、宿主細胞修復メカニズムは、切断されたＤＮＡを修復し、修復プロセス中に、切断部位において変異を導入する。たとえ、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをコードする組換え核酸が、ゲノム遺伝子座の１つの対立遺伝子のみに組み込まれても、このプロセスが、発現されたゲノム遺伝子座（例えば、二倍体生物における対立遺伝子両方）の複数の対立遺伝子に標的化され得ることは、理解されるべきである。したがって、本明細書において記載される方法および組成物を使用して、細胞における遺伝子座の複数の対立遺伝子（例えば、二倍体細胞における２つの対立遺伝子）に対するヌクレアーゼ活性を標的化することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つまたは複数の対立遺伝子において二本鎖切断を導入する。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示の態様は、発現されたゲノム遺伝子座において（例えば、標的化される、それぞれの発現された遺伝子座の２つまたはそれ超の対立遺伝子において）１つまたは複数の修飾（例えば、変異）を有する宿主細胞を生成するのに有用である。一部の実施形態では、異なる遺伝子座における変異を有する宿主細胞のライブラリーが生成され得、これらのライブラリーをスクリーニングして、目的の（例えば、疾患もしくは治療に対する応答、または目的の特性に関連する）１つまたは複数の遺伝子座が同定され得る。
【００２４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、修復中のエラーの頻度を増大させ、それにより、本明細書において記載されるプロセスにおいて生み出される変異の頻度を増大させる、１つまたは複数の変異を有する細胞であり得る。
【００２５】
本明細書において開示される組換え核酸は、任意の適切なベクターにおいて送達され得る。例えば、組換え核酸は、組換えを促進するか、または目的の挿入部位を標的化するいずれかの末端において配列を有し得る。一部の実施形態では、組換え核酸は、例えば、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型）などのようなウイルスベクターにおいて送達され得る。
【００２６】
一部の実施形態では、組換え核酸は、トランスポゾンにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、トランスポゾンシステムのＴＴＡＡ特異的な、短鎖反復エレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、ＴＴＡＡ標的部位の優先を提示し、かつＦＰ遺伝子座内、またはゲノムの他の領域に挿入するエレメントを含むベクターにおいて送達される。
【００２７】
一部の実施形態では、組換え核酸は、「切り貼り」メカニズムを介して効率的に転位する可動性遺伝子エレメントである、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンエレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、転位中、ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンベクターの末端両方に配置されたトランスポゾン特異的な逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動させ、それをＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。
【００２８】
一部の実施形態では、適当なトランスポザーゼ（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ、スリーピングビューティー（ＳＢ）トランスポザーゼ、トランスポザーゼＴｎ５など）を発現するよう操作された組換え核酸は、宿主細胞に送達されて、細胞において所望のタイプの転位がもたらされる。
【００２９】
一部の実施形態では、組換え核酸は、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶまたはＧｍＭＮＰＶの少数多面体（few-polyhedra）（ＦＰ）遺伝子座内の可動性宿主ＤＮＡ挿入エレメントの配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、付いて回る（あるいは、ＴＦＰ３として言及される）トランスポゾンのトランスポゾン配列を含むベクターにおいて送達される。
【００３０】
一部の実施形態では、組換え核酸は、ｐｉｇｇｙＢａｃに相同な配列を有する、ＬＯＯＰＥＲエレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、ＬＯＯＰＥＲエレメントは、５’ＣＣＹ．．．．ＧＧＧ３’において終結し、ＴＴＡＡ挿入部位を標的化するＤＮＡエレメントである。
【００３１】
一部の実施形態では、組換え核酸は、例えば、ＭＥＲ７５およびＭＥＲ８５のようなＴＴＡＡ特異的化石反復エレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、ＴＴＡＡ特異的化石反復エレメントは、５’ＣＣＣ．．．．ＧＧＧ３’において終結し、ＴＴＡＡ挿入部位を標的化する。
【００３２】
一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｍａｉｚｅ  Ａｃ／Ｄｓシステムのフランキングトランスポゾン配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｐエレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｔｎファミリーに属する細菌のトランスポゾンの配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、Ａｌｕ配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｍａｒｉｎｅｒ様エレメントを含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｍｕファージ転位を促進する配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、レトロトランスポゾンファミリーＴｙ１、Ｔｙ２、Ｔｙ３、Ｔｙ４、またはＴｙ５由来のトランスポゾン配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、ヘリトロンのトランスポゾン配列を含むベクターにおいて送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、スリーピングビューティートランスポゾンにおいて送達される。
【００３３】
一部の実施形態では、組換え核酸は、（例えば、植物細胞への送達のため）Ｔ−ＤＮＡベクターにおいて送達される。
【００３４】
組換え核酸は、任意の適当な方法を使用して、ゲノム遺伝子座に挿入され得ることは理解されるべきである。一部の実施形態では、挿入組換え核酸は、例えば、相同組換えを通じた標的ゲノム遺伝子座への標的化挿入を促進するために、目的のゲノム遺伝子座（例えば、がん遺伝子、または組み込まれたウイルス遺伝子）に相同である、隣接配列を含有するよう操作され得る。一部の実施形態では、挿入組換え核酸は、目的のゲノム遺伝子座に相同である、隣接配列を含有し、ここで、隣接配列は、最大１００ｂｐ、最大５００ｂｐ、最大１ｋｂ、最大２ｋｂ、最大３ｋｂ、または最大５ｋｂである。一部の実施形態では、隣接配列は、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜１ｋｂ、１００ｂｐ〜２ｋｂ、５００ｂｐ〜３ｋｂ、または１ｋｂ〜５ｋｂの範囲にある。
【００３５】
一部の実施形態では、ＲＮＡ分子のヌクレアーゼ相互作用セグメントを、スプライスアクセプター部位から下流にコードする組換え核酸が提供される。組換え核酸が、宿主細胞に（例えば、トランスフェクション、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、または他の技法を介して）導入されるとき、それは、発現された鋳型核酸内、発現された鋳型核酸のエクソンのスプライスドナー部位から下流に（例えば、ゲノム核酸の発現された領域のイントロン内）組み込まれ得る。一部の実施形態では、組換え核酸は、転写を促進する担体（例えば、脂質ベースの担体）を用いた、または用いないトランスフェクションを介して細胞に送達される。一部の実施形態では、組換え核酸は、ウイルス形質導入を介して細胞に送達される。
【００３６】
この部位から得られた転写物は、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメント上にスプライシングされた、発現された核酸から上流のエクソンを含有する、キメラスプライシングＲＮＡ分子を生成するようスプライシングされ得る。このキメラスプライシング分子は、ヌクレアーゼを、発現された鋳型核酸に標的化するための標的化分子として作用し得る。キメラスプライシングＲＮＡ分子のエクソン部分は、標的化配列として作用し、それは、発現された鋳型核酸の１本の鎖に相補的であり、相補的塩基対形成により結合され得る。これは、ヌクレアーゼを、、結合したキメラスプライシングＲＮＡの部位にヌクレアーゼを動員する相互作用ＲＮＡセグメントを介して、その鋳型核酸（例えば、ゲノム核酸）に標的化する。
【００３７】
したがって、一部の実施形態では、開示の態様は、ヌクレアーゼを核酸上の特定の標的部位または領域に標的化する、ＲＮＡ分子を生成する組成物および方法に関する。一部の実施形態では、標的化ＲＮＡ分子は、標的化領域とヌクレアーゼ相互作用領域両方を含有する。一部の実施形態では、２つの領域は、標的化ＲＮＡを細胞内で生成するために、細胞内で一緒にスプライシングされる。標的核酸およびヌクレアーゼ両方の存在下で、標的化ＲＮＡは、標的核酸およびヌクレアーゼを一緒にもたらし、それにより、ヌクレアーゼによる標的核酸の切断を促進する、剤として作用する。標的化ＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸から転写される部分に対応し、それ故、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の１本の鎖に相補的であり、標的核酸に（例えば、標的ＤＮＡとの相補的塩基対形成を介して）結合し得る。一部の実施形態では、標的化ＲＮＡのヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ヌクレアーゼと相互作用し、それにより、標的核酸の切断を促進する。しかしながら、一部の実施形態では、修飾されたヌクレアーゼが使用され得ることは、理解されるべきである。修飾されたヌクレアーゼは、標的化ＲＮＡのヌクレアーゼ相互作用セグメントに結合するその能力を保持するが、核酸切断活性を取り除き、および／または１つもしくは複数のさらなるエフェクター機能（例えば、本明細書においてより詳細に記載される通り、制御性および／または酵素的）を導入するよう修飾され得る。
【００３８】
したがって、一部の実施形態では、標的化ＲＮＡは、２つの領域、ｉ）核酸標的に相補的である領域、およびｉｉ）ヌクレアーゼと相互作用する領域を含む。細胞においてヌクレアーゼと共に提供されるとき、標的化ＲＮＡは、標的核酸に（その相補的な第１の領域を介して）結合し、（ヌクレアーゼと相互作用する領域を介して）ヌクレアーゼと相互作用することにより、標的核酸の切断を促進する。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示のある態様は、図１Ａおよび図１Ｂを参照して説明される。特に、標的化ゲノムＤＮＡ切断システムの生成の非限定的な実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂにおいて説明される。図１Ａにおいて、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをスプライスアクセプター（ＳＡ）部位の下流に含むＲＮＡをコードする組換え核酸が提供される。一部の実施形態では、転写終止配列（停止）は、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの下流にコードされる。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの下流にコードされる。
【００４０】
ステップ１００Ａは、第１のエクソン（エクソンａ）のスプライスドナー（ＳＤ）部位の下流、２つのエクソン（エクソンａ、およびエクソンｂ）の間のゲノム遺伝子座のイントロンへの組換え核酸の挿入を描写する。組換え核酸の挿入は、ゲノムにおける部位（例えば、イントロン内の部位）へのランダム組み込みまたは標的化組み込みからもたらされ得ることは、理解されるべきである。ランダムな組み込みまたは標的化組み込みの場合において、異なる組み込み部位を有する異なる細胞は、（例えば、ランダムに、または選択もしくはスクリーニングを使用して）単離され、さらに評価され得る。組換え核酸は、遺伝子における任意のイントロンに組み込まれ得ることも、理解されるべきである。特定のイントロンに依存して、得られた相違は、切断（およびもしあれば、続くエラー修正）が、異なる対立遺伝子位置、例えば、異なるエクソンに存在し得るということである。開示される方法は、挿入がイントロン内で生じる例に限定されないことも、理解されるべきである。一部の実施形態では、挿入は、所望のスプライシングが依然有効であるという条件で、イントロン、エクソン、非翻訳領域、もしくは別の位置内、または隣接して生じ得る。
【００４１】
図１Ａおよび図１Ｂにおいて、エクソンａのスプライスドナー部位は、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのスプライスアクセプター部位から、最大で組換え核酸のゲノム挿入部位までを導くイントロンの部分により分離される。ステップ１０１Ａにおいて、ゲノム遺伝子座のプロモーターからの転写は、そのスプライスドナー部位を有するエクソンａ’を、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのスプライスアクセプター部位から上流に含むＲＮＡ転写物を生成する。ＲＮＡ転写物のスプライシングは、ステップ１０１Ａにおいて示される通り、エクソンａ’の直ぐ下流にヌクレアーゼ相互作用セグメントを含むスプライシングされたキメラＲＮＡ分子を生成する。図１Ａはまた、ステップ１０１Ａにおいて、スプライシング反応からもたらされる、スプライス副産物も説明する。スプライス副産物は、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびにイントロンの部分を含む。
【００４２】
図１Ｂにおいて、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをスプライスアクセプター（ＳＡ）部位の下流に含むＲＮＡをコードする組換え核酸は、トランスポゾン末端反復（ＴＲ）に挟まれている。トランスポゾン末端反復は、組換え核酸のゲノムへの組み込みを促進する。図１Ｂにおいて、トランスポゾン構築物は、ステップ１００Ｂ〜１０１Ｂにおいて示される通り、ゲノム遺伝子座の２つのエクソン（エクソンａ、およびエクソンｂ）の間のイントロンに組み込まれる。図１Ａと同様、ＲＮＡ転写物のスプライシングは、ステップ１０１Ｂにおいて示される通り、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをエクソンａの直ぐ下流に含む、スプライシングされたキメラＲＮＡ分子を生成する。図１Ｂはまた、ステップ１０１Ｂにおいて、スプライシング反応からもたらされる、スプライス副産物を説明する。スプライス副産物は、スプライスドナーおよびアクセプター部位、イントロンの部分、ならびに第１のトランスポゾン末端反復を含む。
【００４３】
本明細書において記載される通り、ゲノム遺伝子座の複数の対立遺伝子は、単一の組み込まれた核酸から発現される、キメラスプライシングＲＮＡ分子により標的化され得る。図２Ａおよび図２Ｂは、組換え核酸が組み込まれた、対立遺伝子の１つのみから発現される、キメラスプライシングＲＮＡ分子により標的化されるゲノム遺伝子座の２つの対立遺伝子の非限定的な実施形態を説明する。図２Ａおよび図２Ｂにおいて説明されるプロセスが、ゲノム変異の生成を、細胞内の遺伝子座の複数の対立遺伝子（例えば、二倍体生物における対立遺伝子両方）においてもたらし得ることも、理解されるべきである。
【００４４】
図２Ａにおいて描写される通り、（例えば、図１Ａまたは図１Ｂのステップにより生み出される）キメラスプライシングＲＮＡ分子は、ステップ２００Ａにおいて説明される通り、（イントロンにおいて組み込まれた核酸を含有しない）ゲノム遺伝子座の対立遺伝子への、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ標的結合を促進し得る。ステップ２００Ａにおいて、キメラスプライシングＲＮＡ分子（スプライシングされたＲＮＡ転写物）は、エクソンａを（スプライシングされたＲＮＡ上のエクソンａセグメントとゲノム遺伝子座におけるエクソンａの相補鎖の間での塩基対形成相互作用を介して）コードするゲノム遺伝子座に結合する。ゲノムエクソンａ遺伝子座に結合したキメラスプライシングＲＮＡ分子はまた、同一細胞において発現された、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼも（ヌクレアーゼとキメラスプライシングＲＮＡ分子のヌクレアーゼ相互作用セグメントとの間の相互作用を介して）動員する。
【００４５】
キメラスプライシングＲＮＡ分子により、ゲノム部位に動員されるヌクレアーゼは、ステップ２０１Ａにおいて説明される通り、ゲノム核酸を切断し得る。
【００４６】
得られた切断されたゲノム領域は、細胞内修復酵素により修復され得る。しかしながら、一部の例では、修復プロセスは、ステップ２０２Ａにおいて説明される通り、変異を切断部位において導入する。したがって、図２Ａにおいて説明されるプロセスは、切断部位においてゲノム変異の生成をもたらし得る。
【００４７】
図２Ｂにおいて描写される通り、キメラスプライシングＲＮＡ分子は、ステップ２００Ｂにおいて説明される通り、（イントロンにおいて組み込まれた核酸を含有する）ゲノム遺伝子座の別の対立遺伝子への、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ標的結合を促進し得る。キメラスプライシングＲＮＡは、ステップ２００Ｂにおいて示される通り、ＤＮＡヌクレアーゼをエクソンａのゲノム遺伝子座にガイドする。ゲノム部位に動員されるヌクレアーゼは、ステップ２０１Ｂにおいて説明される通り、ゲノム核酸を切断し得る。続いて、細胞内ＤＮＡ修復酵素は、ステップ２０２Ｂにおいて説明される通り、修復プロセス中に、変異を切断部位において導入して、修復により誘導される変異を有するゲノム遺伝子座をエクソンａにおいて生成し得る。
【００４８】
したがって、図２Ａおよび図２Ｂにおいて説明される通り、変異は、本明細書において記載される通り、ゲノム遺伝子座の複数の対立遺伝子に細胞のＤＮＡ修復プロセスを介して導入され得る。
【００４９】
一部の実施形態では、（トランスポゾン反復により挟まれた）組み込まれた組換え核酸は、図３において説明される通り、（例えば、トランスポザーゼにより誘導される切除を介して）切除され、それにより、修復により誘導される変異はエクソンａのゲノム遺伝子座に残るが、組換え核酸は（ヌクレアーゼ相互作用セグメントと共に）ゲノムから取り除かれる。
【００５０】
一部の実施形態では、転写終止配列は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、組換え核酸（ヌクレアーゼ相互作用セグメントをスプライスアクセプター部位から下流にコードする、組換え核酸）上の、ヌクレアーゼ相互作用セグメントから下流に配置される。これは、組換え核酸によりコードされる配列内のキメラＲＮＡの転写を終結させ、転写が、ゲノム組み込みの部位から下流の任意のさらなるイントロンまたはエクソンまでにわたり継続することを妨げる。
【００５１】
一部の実施形態では、宿主ゲノムに挿入される組換え核酸は、プロモーター配列をスプライスアクセプター部位から上流に含まない。
【００５２】
一部の実施形態では、１つまたは複数のトランスポゾン末端反復配列（例えば、直接もしくは間接反復、またはその組合せ）は、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをスプライスアクセプター部位から下流にコードする組換え核酸の末端両方に存在する。これらのトランスポゾン末端反復配列は、組換え核酸の宿主細胞のゲノムへの挿入を促進し得る。
【００５３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性マーカー）は、ヌクレアーゼ相互作用セグメントをスプライスアクセプター部位から下流にコードする組換え核酸上でコードされる。１つまたは複数の選択可能なマーカーを使用して、組換え核酸がゲノムに組み込まれた宿主細胞について選択され得る。
【００５４】
一部の実施形態では、トランスポゾン組み込み、および／または切除を促進する、１つまたは複数の酵素（例えば、１つまたは複数のトランスポザーゼ）は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる組換え核酸上でコードされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる組換え核酸上でコードされる。しかしながら、トランスポゾン組み込み、および／もしくは切除を促進する１つまたは複数の酵素、ならびに／または１つもしくは複数の、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼは、別々の核酸（例えば、他のベクター、例えば、自己複製ベクター、または宿主細胞内の１つもしくは複数の他のゲノム遺伝子座において）上でコードされ得ることは、理解されるべきである。
【００５５】
ヌクレアーゼ相互作用セグメント
一部の実施形態では、本開示は、ヌクレアーゼ相互作用セグメントを有するＲＮＡをコードする組換え核酸を提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する二次構造の形成を促進し得る、１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する実質的に二本鎖のＲＮＡ構造（例えば、ステム）の形成を促進し得る、１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の天然の構造の特徴を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて標的化ｃｒＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子との間で形成する、塩基対形成構造を模倣するステムを形成する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのステムは、１つまたは複数の、表１において示される配列またはその部分を有する塩基対形成構造を含む。例えば、一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのステムは、（例えば、表１の塩基対形成構造またはその部分の１つのステムまたは両方のステムの）表１において示される塩基対形成構造またはその部分の少なくとも５つのヌクレオチド（例えば、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、またはそれ超のヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのステムは、（例えば、表１の塩基対形成構造またはその部分の１つのステムまたは両方のステムの）表１において示される塩基対形成構造、またはその部分の配列と９０％、９０〜９５％、およそ９５％、または９５〜１００％同一である配列を有する、少なくとも５つのヌクレオチド（例えば、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、またはそれ超のヌクレオチド）を含む。
【表１】
2017502683.tif 000003
【００５６】
ヌクレアーゼ相互作用セグメントにより形成され得、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する塩基対形成構造のさらなる例は、２０１３年１１月２８日付けで公開され、「METHODS  AND  COMPOSITIONS  FOR  RNA-DIRECTED  TARGET  DNA  MODIFICATION  AND  FOR  RNA-DIRECTED  MODULATION  OF  TRANSCRIPTION」と表題を付けられた、国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１３／１７６７７２（（例えば、該刊行物の図８において描写されるものを含む）塩基対形成構造と関連するその内容は、全体として参照により本明細書に取り込まれる）において開示される。
【００５７】
一部の実施形態では、ループは、ヌクレアーゼ相互作用セグメントのステム部分の鎖を連結する。一部の実施形態では、４塩基ループが含まれる。しかしながら、他のサイズ（例えば、２、３、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）のループが含まれ得ることは理解されるべきである。一部の実施形態では、ループは、次の配列５’−ＧＡＡＡ−３’を有する。しかしながら、開示の態様はこの点において制限されないので、他の配列がループのため使用され得ることは、理解されるべきである。
【００５８】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、表１において示される塩基対形成ステムの５’塩基（上側の鎖）の５〜３５、および３’塩基（下側の鎖）の５〜３５を含み得、ここで、ステムは、ループ（例えば、５’−ＧＡＡＡ−３’ループ）により連結して、ＲＮＡセグメントを形成する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、表１において示される塩基対形成ステムの５’塩基（上側の鎖）の１０〜２５、および３’塩基（下側の鎖）の１０〜２５を含み得、ここで、ステムは、ループ（例えば、５’−ＧＡＡＡ−３’ループ）により連結して、ＲＮＡセグメントを形成する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用セグメントは、表１において示される塩基対形成ステムの５’塩基（上側の鎖）の１５〜２０、および３’塩基（下側の鎖）の１５〜２０を含み得、ここで、ステムは、ループ（例えば、５’−ＧＡＡＡ−３’ループ）により連結して、ＲＮＡセグメントを形成する。
【００５９】
ヌクレアーゼ相互作用セグメントを形成するために使用され得る、表１由来の塩基対形成構造の部分の非限定的な例は、表１において示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の塩基対形成ステムの５’塩基（上側の鎖）の１８、および３’塩基（下側の鎖）の１８を含み、ここで、ステムは、５’−ＧＡＡＡ−３’ループにより連結して、次の配列：
【００６０】
【化１】
2017502683.tif 000004
（配列番号２、ループには下線を引かれる）
を有するＲＮＡセグメントを形成する。
【００６１】
同様に、表１において示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓステムの部分は、ループ（例えば、５’−ＧＡＡＡ−３’ループ）により連結して、ヌクレアーゼ相互作用セグメントを形成し得る。非限定的な例は、次の配列：
【化２】
2017502683.tif 000005
（配列番号１、ループには下線を引かれる）
を有する。
【００６２】
しかしながら、ヌクレアーゼと相互作用する能力がある他の配列を有する他のステムループ構造が、本明細書において記載される通り、使用され得ることは、理解されるべきである。
【００６３】
一部の実施形態では、尾部部分は、ヌクレアーゼ相互作用領域の下流ストレッチの３’直ぐに含まれる。一部の実施形態では、尾部部分は、ステム−ループ構造の形成を促進しない、配列を有する。一部の実施形態では、尾部部分は、少なくとも５ヌクレオチド長（例えば、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０ヌクレオチド長）である。しかしながら、より短い、またはより長い尾部部分が含まれ得ることは、理解されるべきである。さらに、一部の実施形態では、ステム−ループ構造の形成を促進する配列を有する尾部部分が、提供される。
【００６４】
一部の実施形態では、尾部部分は、ＲＮＡ分子の安定性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性）を促進する、ヌクレアーゼ相互作用領域の下流ストレッチの３’直ぐに含まれる。
【００６５】
図４Ａは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼと相互作用する塩基対形成領域である、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ相互作用領域を含む、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの非限定的な実施形態を説明する。塩基対形成構造は、ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来の標的化ｃｒＲＮＡの配列に対応する、５’ＧＵＵＧＵＡＧＣＵＣＣＣＵＵＵＣＵＣ３’（配列番号１６）として記載される配列を有する第１の鎖、およびｉｉ）活性化ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に対応する、５’ＧＡＧＡＡＣＣＧＵＵＧＣＵＡＣＡＡＵ３’（配列番号１７）として記載される配列を有する第２の鎖を含み、ここで、第１および第２の鎖は、５’ＧＡＡＡ３’として記載される配列を有するループにより結合する。図４Ｂおよび図４Ｃは、異なる長さの尾部部分を含み、それぞれの尾部部分が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来の活性化ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の３’配列に対応する、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの非限定的な実施形態を説明する。図４Ｃにおいて描写される尾部部分は、ステムループ構造を形成する能力がある配列を含む。
【００６６】
図４Ｄにおいて説明される通り、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的化ＲＮＡセグメントにハイブリダイズされない、５’ＧＴＮＮＧＮＮ３’モチーフから直ぐ上流のいくつかの塩基（３〜４塩基）を、キメラスプライシングＲＮＡ分子の相補的標的化セグメントにハイブリダイズされる、ゲノム遺伝子座の部分内で、優先的に切断する。
【００６７】
図４Ｅは、複数のイントロンを含有し、そのいくつかが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのための好ましいヌクレアーゼ切断部位を含有する、遺伝子（ヒトジストロフィン遺伝子）の非限定的な実施形態を説明する。図４Ｅは、本明細書に記載される組換え核酸の、説明されたイントロンへの組み込み（続いて、転写、およびスプライシング）からもたらされるキメラスプライシングＲＮＡの標的化セグメントにハイブリダイズするゲノムエクソンから直ぐ下流に、ハイブリダイズされない５’ＧＴＮＮＧＮＮ３’モチーフを生成する、ヒトジストロフィン遺伝子の２つのエクソン／イントロン境界を説明する。例えば、本明細書において記載される組換え核酸のイントロン１３〜１４（またはイントロン２４〜２５）への組み込みは、エクソン１３ＲＮＡ（またはエクソン２４）を、標的化セグメント、続いて、ヌクレアーゼ相互作用セグメントとして含む、キメラスプライシングＲＮＡ分子をもたらす。キメラスプライシングＲＮＡが、ゲノムエクソン１３（またはエクソン２４）の相補鎖に結合するとき、エクソン１３（またはエクソン２４）から直ぐ下流であり、キメラスプライシングＲＮＡの標的化セグメントに相補的でないか、またはハイブリダイズされない、ゲノム配列は、５’ＧＴＮＮＧＮＮ３’モチーフ（イントロン１３〜１４について５’ＧＴＣＡＧＡＴ３’、およびイントロン２４〜２５について５’ＧＴＡＡＧＡＴ３’）に対応する。しかしながら、本開示の態様はこの点において制限されないので、（例えば、たとえ他の配列が、切断モチーフに正確に対応しなくても）たとえ切断が常に効率的でなくても、他の配列は切断を支持し得ることは、理解されるべきである。
【００６８】
一部の実施形態では、転写終結因子は、尾部部分の下流にコードされ得る。一部の実施形態では、転写終結因子は、ステム−ループ構造の形成を促進する配列を含む。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ヌクレアーゼ相互作用セグメントの下流にコードされる。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、組換え核酸によりコードされるＲＮＡの３’部分を切断し、この切断により生成された末端をポリアデニル化する、１つまたは複数の因子（例えば、酵素、補助因子）により認識される。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ヌクレオチド配列：ＡＡＵＡＡＡを含む。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０初期シグナル、ＳＶ４０後期シグナル、またはＢＧＨポリアデニル化シグナルである。
ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ
【００６９】
一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、次の生物、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａの１つまたは複数に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼが使用され得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのオルソログのＣａｓ９ヌクレアーゼもまた使用され得る。使用され得るＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼのさらなる非限定的な例は、２０１３年１１月２８日付けで公開され、「METHODS  AND  COMPOSITIONS  FOR  RNA-DIRECTED  TARGET  DNA  MODIFICATION  AND  FOR  RNA-DIRECTED  MODULATION  OF  TRANSCRIPTION」と表題を付けられた、国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１３／１７６７７２（ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと関連するその内容は、全体として参照により本明細書に取り込まれる）において開示されるものを含む。
【００７０】
本明細書において記載される通り、異なるヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡの異なる相互作用セグメント、および異なる標的配列について、異なる相対的選好を示す。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの相互作用セグメントはヌクレアーゼに結合し、次に、活性化され、ＲＮＡのガイド部分に相補的なゲノム配列に特異的となる。ＲＮＡのガイド部分は、典型的には、２０ヌクレオチド長である。しかしながら、一部の実施形態では、ガイド部分は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ超のヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、ガイド部分は、５〜２５、１０〜３０、１５〜２５、または１８〜２２ヌクレオチド長の範囲にある。
【００７１】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡに相補的なゲノム標的配列は、３’末端に隣接する、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、分解のためのゲノム標的の区別において、ヌクレアーゼを助ける。開示の態様では、ヌクレアーゼは、スプライスドナー部位に対して、５’位におけるエクソンに相補的な（本明細書において記載されるキメラスプライシングＲＮＡの）ガイド配列により、ゲノム部位に標的化される。かかる実施形態では、ドナー部位を含む配列が、標的化されたヌクレアーゼにより認識されるＰＡＭ配列であるなら、ヌクレアーゼは、エクソン内のゲノム部位を切断する。したがって、一部の実施形態では、スプライスドナー部位（例えば、ＰＡＭ配列、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのＣａｓ９酵素により認識されるＮＮＮＮＧＴＮＮ）を含有するＰＡＭ配列を有するゲノム標的に対して活性であるヌクレアーゼが、選択される。
【００７２】
以下の表２は、異なる生物のＣａｓ９ヌクレアーゼにより認識される、異なるＰＡＭ配列を挙げる。
【表２】
2017502683.tif 000006
【００７３】
一部の実施形態では、特定のヌクレアーゼにより認識されるＰＡＭ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの天然のヌクレアーゼにより認識されるＰＡＭ配列）は、ある種のコンセンサス配列スプライス配列と一致し得ない。しかしながら、かかる配列を認識する酵素は、ある種の事情において、例えば、ＰＡＭ配列がスプライス部位として作動的である配列を含む、ある種の細胞タイプにおいて有用であり得る。
【００７４】
スプライスアクセプター部位
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ相互作用領域の５’にスプライスアクセプター部位を有するＲＮＡをコードする組換え核酸が、提供される。一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞において転写されるゲノム部位のイントロン内に挿入される。得られた転写物は、内在性スプライスドナー部位と、ヌクレアーゼ相互作用領域に融合された上流エクソン配列を含み、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼを、エクソンをコードするゲノム部位に標的化する、キメラガイドＲＮＡをもたらす組換え核酸のスプライスアクセプターとの間でスプライシングされる。
【００７５】
したがって、開示の態様は、ＲＮＡスプライシングを利用して、イントロンをキメラＲＮＡ転写物から取り除いて、ヌクレアーゼを特定のゲノム部位に標的化するガイドＲＮＡを生成する。それぞれのイントロンは、スプライスドナー部位をその５’末端において、およびスプライスアクセプター部位をその３’末端において含む。図５Ａは、配列ＧＵ（ＧＴによりコードされる）をイントロンの５’末端において有する、スプライスドナー部位のコンセンサス配列の非限定的な実施形態を描写する。しかしながら、一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列ＡＵ（ＡＴによりコードされる）、または配列ＧＣ（ＧＣによりコードされる）をイントロンの５’末端において有してもよい。
【００７６】
図５Ａはまた、配列ＡＧをイントロンの３’末端において有する、スプライスアクセプター部位のコンセンサス配列の非限定的な実施形態を描写する。しかしながら、一部の実施形態では、アクセプター部位は、配列ＡＣをイントロンの３’末端において有してもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、それぞれ、ＧＴおよびＡＧを含有する、スプライスドナーおよびアクセプター部位の対が提供される。一部の実施形態では、それぞれ、ＡＴおよびＡＣを含有する、スプライスドナーおよびアクセプター部位の対が提供される。一部の実施形態では、それぞれ、ＧＣおよびＡＧを含有する、スプライスドナーおよびアクセプター部位の対が提供される。かかる実施形態では、スプライスアクセプター部位は、組換え核酸構築物上で一般に提供され、スプライスドナー部位は、（組換えで提供されるのとは対照的に）ゲノムにおける天然部位である。
【００７８】
図５Ｂは、ヌクレアーゼと相互作用する、ＲＮＡ相互作用セグメントに３’末端において結合したイントロンの３’末端においてスプライスアクセプター部位を有するキメラＲＮＡの部分の非限定的な実施形態を描写する。
【００７９】
修飾されたＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ
一部の実施形態では、修飾されたヌクレアーゼは、本明細書において記載されるキメラスプライシングＲＮＡ分子により、ゲノム標的部位にガイドされ得る。一部の実施形態では、修飾されたヌクレアーゼは、酵素的に不活性であり得る（例えば、それはＤＮＡを切断しない）。一部の実施形態では、酵素的に不活性なヌクレアーゼは、エクソン（例えば、キメラスプライシングＲＮＡ分子に含まれるエクソン）についてゲノム遺伝子座に関連するキメラスプライシングＲＮＡ分子に結合し、転写遮断として作用して、修飾されたヌクレアーゼが結合される部位を過ぎて、転写の効率を妨げるか、または低減し得る。図９は、組換え核酸の組み込み、転写、およびスプライシングが、図１において説明されるものと一致する、本明細書において記載されるシステムの非限定的な実施形態を説明する。しかしながら、細胞において存在するヌクレアーゼは、キメラスプライシングＲＮＡに結合するが、関連するゲノム配列を切断しない、修飾されたヌクレアーゼである。
【００８０】
結合し、転写を妨げるか、または転写効率を低減する能力がある修飾されたヌクレアーゼは、細胞における遺伝子座の対立遺伝子両方上で（または遺伝子座の複数の対立遺伝子において）作用し得る。したがって、本明細書において記載される方法および組成物を使用して、細胞における遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子をサイレンシングし得る。
【００８１】
一部の実施形態では、異なるゲノム遺伝子座に（例えば、異なる遺伝子のイントロンに、および／または１つもしくは複数の遺伝子の異なるイントロンに）組み込まれた挿入構築物を有する宿主細胞のライブラリーが、作られ得る。ライブラリー中の異なる宿主細胞は、それぞれの宿主細胞内の独立した組み込み事象の数および場所に依存して、１つまたは複数のサイレンシングされた遺伝子座（例えば、２、３、４、５、またはそれ超）を有し得る。一部の実施形態では、本明細書において記載される宿主細胞のライブラリーをスクリーニングして、目的の表現型（例えば、１つまたは複数の治療化合物に対する応答または感受性）に関連する１つまたは複数の遺伝子座が同定され得る。
【００８２】
一部の実施形態では、修飾されたヌクレアーゼは、酵素的に不活性であることに加えて、またはその代わりに、１つまたは複数の新規機能を有し得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、検出可能な部分を含むよう修飾され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、さらなるペプチドセグメントを含むよう修飾され得る。さらなるペプチドセグメントは、Ｎ末端、Ｃ末端において、および／またはヌクレアーゼのＮ末端位置とＣ末端位置との間で結合され得る。一部の実施形態では、さらなるペプチドセグメントは、エフェクター機能を有するドメインである。一部の実施形態では、さらなるペプチドセグメントは、リンカーペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクター機能は、酵素機能、および／または制御機能である。本開示の態様はこの点において制限されないので、エフェクター機能の非限定的な例は、転写の増強、転写の抑制、メチル化（例えば、ＤＮＡ、および／またはＤＮＡ関連タンパク質のメチル化）、脱メチル化（例えば、ＤＮＡ、および／またはＤＮＡ関連タンパク質の脱メチル化）、他のＤＮＡもしくはＲＮＡ修飾活性、１つもしくは複数の制御タンパク質への結合、および／または他の機能を含む。
【００８３】
したがって、本明細書において記載される方法および組成物をまた使用して、それぞれが、異なる遺伝子座（例えば、異なる遺伝子のイントロン、および／または１つもしくは複数の遺伝子の異なるイントロン）に標的化されるエフェクター機能を有する修飾されたヌクレアーゼを有する、宿主細胞のライブラリーが生成され得る。これらの宿主細胞を、本明細書において記載される通りスクリーニングして、目的の特性を有する１つまたは複数の細胞が同定され得ることは理解されるべきである。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法を使用して、単一の細胞または複数の細胞において（例えば、細胞培養物において）、１つまたは複数の遺伝子座における（例えば、本明細書において記載される通り、１つまたは複数の遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子における）修飾（例えば、変異）が導入され得る。一部の実施形態では、修飾された細胞（例えば、本明細書において記載される通り、修飾される胚性幹細胞または他の幹細胞）を使用して、元の細胞の修飾（例えば、１つまたは複数の変異）を有する、多細胞生物が生み出され得る。
【００８５】
一部の実施形態では、本明細書において記載される組成物または方法を使用して、多細胞生物において１つまたは複数の細胞が修飾され得る。一部の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、胚（または多細胞生物の他の多細胞発生ステージ、例えば、胚盤胞）に（例えば、注射、または他の技法により）導入され得る。これは、全ての細胞または細胞のサブセットが修飾される、成体多細胞生物を生成するように、１つまたは複数の細胞（例えば、全ての細胞）の修飾をもたらし得る（例えば、多細胞生物が、１つまたは複数の遺伝子座における１つまたは複数の修飾についてキメラである）。異なる修飾は、初期発生ステージにおいて異なる細胞に導入されている可能性があるので、この実施形態では、多細胞生物における異なる細胞は異なる修飾を有し得ることは、理解されるべきである。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法を使用して、若年または成体の多細胞生物の１つまたは複数の細胞が修飾され得る。例えば、本明細書において記載される組成物は、若年または成体の多細胞生物における１つまたは複数の場所において（例えば、注射、または他の技法により）導入され得る。それぞれの場所において、１つまたは複数の細胞は、本明細書において記載される通り、修飾され得る。
【００８７】
多細胞生物の非限定的な例は、哺乳動物、トリ、爬虫類を含む。哺乳動物の非限定的な例は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマを含む。
【００８８】
本発明の典型的な実施形態は、以下の実施例により、より詳細に記載される。これらの実施形態は、本発明の典型であり、当業者は、本発明が典型的な実施形態に限定されないことを理解する。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
図６は、ｉｉ）ヌクレアーゼ相互作用セグメントにスプライシングされたエクソンに対応する、ｉ）ＲＮＡ標的化セグメントを含む、キメラスプライシングＲＮＡを生成するための実験システムの非限定的な実施形態を説明する。図６Ａにおいて説明される核酸構築物は、ｉ）実験標的セグメント（エクソン）を、ｉｉ）スプライスドナー部位（ＳＤ）の直ぐ上流に、続いて、ｉｉｉ）介在性セグメント（トランスポゾン反復−ＰＢＲを含有）を、ｖ）ヌクレアーゼ相互作用セグメントとそれに続くｖｉ）ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ｐＡ）の上流にあるｉｖ）スプライスアクセプター部位（ＳＡ）の上流に含有する、ＲＮＡ分子の転写を駆動し得るプロモーター（ＣＭＶプロモーター）を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、タグ（例えば、ＭＹＣエピトープ）もしくは標識をコードする配列、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードする配列、核酸によりコードされる転写物由来の１つもしくは複数のタンパク質を発現するよう設計される内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列などを含むが、これらに限定されない、１つまたは複数のさらなるエレメントを含有してもよい。この転写されたＲＮＡ分子がスプライシングされた後、得られたキメラスプライシングＲＮＡは、ヌクレアーゼ相互作用セグメントにスプライシングされたエクソンを含有する（スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位は、介在性ＲＮＡセグメントと共に切り出される）。このキメラスプライシングＲＮＡの、エクソン（例えば、続いて、適当な切断部位との関係におけるスプライスドナー部位）を含有するＤＮＡ分子を標的化する能力を、適当なアッセイを使用して評価することができる。一部の実施形態では、アッセイは、キメラスプライシングＲＮＡが、エクソンを含有するＤＮＡ分子の切断を促進し得るかどうかを決定するためのＣａｓ９ヌクレアーゼの使用を含み得る。一部の実施形態では、図６Ａの試験構築物（例えば、ゲノム遺伝子座に組み込まれた、独立して複製するベクター上にある）、およびＣａｓ９ヌクレアーゼを発現する構築物両方を含む細胞において、アッセイを行うことができる。図６Ｂは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現し得る構築物の非限定的な実施形態を説明する。図６Ｂの構築物はまた、ゲノム遺伝子座に組み込まれた、独立して複製するベクター上にあることもできる。
【００９０】
１つまたは複数の選択可能なマーカーを使用して、目的の宿主細胞における、図６Ａおよび図６Ｂの構築物の存在について選択し得ることは理解されるべきである。図６Ａおよび図６Ｂにおいて示されるマーカーは、それぞれ、ネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性マーカーおよびピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性マーカーである。しかしながら、本開示の態様はこの点において制限されないので、他の選択可能なマーカーが使用され得ることは、理解されるべきである。
【００９１】
図６Ａにおいて説明されるような構築物を使用して、異なる標的配列、異なる切断配列、異なるヌクレアーゼ相互作用配列、および／または変動し得る他の因子の有効性を評価し得ることは、理解されるべきである。
【００９２】
（実施例２）
一部の実施形態では、図６Ａにおいて説明される構築物を使用して、ゲノム遺伝子座から転写される天然のエクソンの３’末端にスプライシングされるヌクレアーゼ相互作用セグメントの能力を評価するために、トランスポゾン末端（ＰＢＲ、およびＰＢＬ）間にあるセグメントをゲノム遺伝子座へと（例えば、イントロンへと）組み込むことができる。トランスポゾン末端間のセグメントのゲノム組み込みを、トランスポザーゼ（例えば、ＰＢａｓｅ）により促進することができる。これは、実施例１において記載されるものとは、異なる図６Ａの構築物の使用をもたらすことは、理解されるべきである。実施例１において、スプライシングは、構築物上のＣＭＶプロモーターから転写される実験エクソン（エクソン）で生じる。対照的に、ゲノムイントロンへの組み込み後、スプライシングは、ゲノム遺伝子座から転写される、天然のエクソンで生じる。したがって、ＣＭＢエクソン−ＳＤ部分は、組み込みに必要とされないことは、理解されるべきである。
【００９３】
図７は、宿主細胞において、１つまたは複数のゲノム遺伝子座で変異を生成するための、本明細書において記載されるシステムの有効性を評価するための実験の概要の非限定的な実施形態を説明する。１）において、図６Ａにおいて説明されるもののような構築物（例えば、ＰＢＲとＰＢＬの間、およびそれらを含む、セグメント）をトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）と共に宿主細胞に共トランスフェクトして、宿主細胞のゲノム遺伝子座への組み込みを促進する。２）において、選択可能なマーカー（Ｐｕｒｏ）もコードする構築物から、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のＣａｓ９（ＮＭＣａｓ９）を発現する宿主細胞も使用し得る。３）において、それぞれが、組み込まれたトランスポゾンセグメント（図６Ａのトランスポゾン反復間のセグメント）を含有する、複数の異なる個々の宿主細胞クローンを、トランスポゾンセグメント（Ｎｅｏ）上でコードされる選択可能なマーカーを使用して、選択し得る。４）において、異なる宿主細胞クローン由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し得る。５）において、ｇＤＮＡを配列決定して、ａ）異なる宿主細胞クローンにおける異なる挿入部位（ＰＢ挿入部位）、およびｂ）挿入部位から直ぐ上流のエクソンにおける潜在的な切断部位を同定し得る。６）において、エラーを潜在的な切断部位において見出す頻度を決定することにより、（例えば、切断、および切断部位のエラー関連修復により生じる）変異率を計算し得る。ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ超の対立遺伝子における変異率を決定し得ることは、理解されるべきである。
【００９４】
一部の実施形態では、トランスポザーゼ（例えば、ＰＢａｓｅ）のさらなる作用により、（例えば、変異をエクソンにおいて導入後）トランスポゾンセグメントを切除し得ることは、理解されるべきである。一部の実施形態では、図６Ａにおいて説明されるＫａｔマーカーのようなトランスポゾンセグメント上でコードされるさらなるマーカーを有することにより、トランスポゾンセグメントを切除した細胞を同定し得る。Ｋａｔは、Ｋａｔｕｓｈｋａ赤色蛍光タンパク質を指し、アクチンプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、Ｋａｔ転写物は、ポリアデニル化尾部を欠くので、細胞において比較的不安定であることは、理解されるべきである。したがって、一部の実施形態では、転写物をコードする核酸を、ポリアデニル化部位の上流のイントロンに挿入するとき、転写物の安定性は増大する。この配置（configuration）は、安定なポリアデニル化転写物を有する細胞においてのみ検出閾値より上で発現し得る、蛍光タンパク質の発現を検出することにより、有用なトランスポゾン挿入を有する細胞の同定を促進する。一部の実施形態では、マーカーの検出を使用して、転写単位へのトランスポゾン挿入を用いて、細胞を同定、および／または選別し得る。トランスポザーゼのさらなる作用後、Ｋａｔを含まない細胞を、（例えば、配列決定を介して）さらに評価して、トランスポゾンセグメントが切除されたかどうかを確認することができる。しかしながら、本開示の態様はこの点において制限されないので、他のマーカーまたは技法を使用して、トランスポゾンセグメントを取り除いた細胞を同定し得ることは、理解されるべきである。
【００９５】
（実施例３）
図９は、挿入組換え核酸の配列の非限定的な例を提供する。組換え核酸は、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼと相互作用する能力があるＲＮＡセグメントをコードする核酸領域の上流にスプライスアクセプター部位を含む。
【００９６】
図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するよう操作された核酸の配列の非限定的な例を提供する。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態が本明細書に記載され、説明される一方、当業者は、機能を遂行するため、ならびに／あるいは結果、および／または本明細書において記載される利点の１つもしくは複数を取得するための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、かかるバリエーションおよび／または修飾のそれぞれは、本発明の範囲内にあることとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および配置は典型であることを意味し、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または配置は、本発明の教示が使用される具体的な適用（単数または複数）に依存することは、容易に理解する。当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。それ故、上記の実施形態は例示の目的でのみ提示され、添付の特許請求の範囲、およびそれに対する均等物の範囲内で、具体的に記載され、請求される以外に、本発明は実施され得ることは理解されるべきである。本発明は、本明細書において記載される、それぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法に向けられる。加えて、２つまたはそれ超のかかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組合せは、かかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法が、互いに不一致でないなら、本発明の範囲内に含まれる。
【００９８】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、明確に反対のことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することは理解されるべきである。
【００９９】
語句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、そのように結合された構成要素、すなわち、ある場合において結合的に存在し、他の場合において離接的に存在する構成要素の「いずれか、または両方」を意味することは理解されるべきである。明確に反対のことが示されない限り、具体的に同定されるそれらの構成要素に関連または無関連であろうとなかろうと、「および／または」節により具体的に同定される構成要素以外の他の構成要素は、任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含んでいる」のような制限のない言語と共に使用されるとき、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態では、Ｂを含まないＡ（Ｂ以外の構成要素を任意選択で含む）、別の実施形態では、Ａを含まないＢ（Ａ以外の構成要素を任意選択で含む）、なお別の実施形態では、ＡおよびＢ両方（他の構成要素を任意選択で含む）などを指すことができる。
【０１００】
本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、「または」は、上で定義された「および／または」と同一の意味を有することは理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分けるとき、「または」、または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも１つだが、多数の構成要素または構成要素のリスト、および任意選択で、さらなる挙げられない項目の１つより多くを含む包含として、解釈される。「のうち１つのみ」、もしくは「のうち正確に１つ」のような、明確に反対のことが示される用語のみ、または特許請求の範囲において使用されるとき、「からなる」は、多数の構成要素または構成要素のリストの正確な１つの構成要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される用語「または」は、「いずれか」、「のうち１つ」、「のうち１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」のような排他的な用語が先行するとき、排他的代替物（すなわち、「一方、または他方だが、両方ではない」）を示すとしてただ理解される。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有する。
【０１０１】
本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、語句「少なくとも１つ」は、１つまたは複数の構成要素のリストを参照して、構成要素のリスト内で具体的に挙げられるそれぞれおよび全ての構成要素の少なくとも１つを必ずしも含まないが、構成要素のリストにおける構成要素の任意の組合せを排除しない、構成要素のリストにおける構成要素の任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの構成要素を意味することは理解されるべきである。この定義はまた、具体的に同定されるそれらの構成要素に関連または無関連であろうとなかろうと、語句「少なくとも１つ」が指す構成要素のリスト内で具体的に同定される構成要素以外の、構成要素が任意選択で存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、均等的な「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または均等的な「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在することなく（およびＢ以外の構成要素を任意選択で含む）、１つより多くのＡを任意選択で含む、少なくとも１つのＡ、別の実施形態では、Ａが存在することなく（およびＡ以外の構成要素を任意選択で含む）、１つより多くのＢを任意選択で含む、少なくとも１つのＢ、なお別の実施形態では、１つより多くのＡを任意選択で含む、少なくとも１つのＡ、および１つより多くのＢを任意選択で含む、少なくとも１つのＢ（および他の構成要素を任意選択で含む）などを指すことができる。
【０１０２】
特許請求の範囲、ならびに上記明細書において、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有している」、「有している」、「含有している」、「含んでいる（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持している」などのような全ての移行句は、無制限であること、すなわち、制限されないが、含むことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」、および「から本質的になる」のみは、United  States  Patent  Office  Manual  of  Patent  Examining  Procedures、２１１１．０３節に記載される通り、それぞれ、閉じられたまたは半分閉じられた移行句である。
【０１０３】
請求項の構成要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」などのような序数の用語の使用は、それだけで、別のものに対する１つの請求項の構成要素のいかなる優先事項、先行、もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序を含意しないが、請求項の構成要素を区別するため（だが序数の用語の使用のため）の同一の名称を有する別の構成要素から、ある種の名称を有する１つの請求項の構成要素を区別するための単に標識として使用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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