(57)【要約】本発明は、アダプター連結アンプリコンもしくは標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するために使用されるべき新規方法およびキットそれぞれに関する。一局面では、アダプター連結アンプリコンを調製する方法が提供され、この方法は、（ｉ）２本鎖アンプリコンと、少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、およびＤＮＡアダプター分子とを接触させて、反応混合物を得る工程、（ｉｉ）上記反応混合物を、上記ポリヌクレオチドキナーゼによる上記２本鎖アンプリコンの５’リン酸化、および上記ＤＮＡリガーゼによる上記２本鎖アンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への上記ＤＮＡアダプター分子の連結を同時に可能にする条件下でインキュベートして、アダプター連結アンプリコンを得る工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アダプター連結アンプリコンを調製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）２本鎖アンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉ）前記反応混合物を、
−前記ポリヌクレオチドキナーゼによる前記２本鎖アンプリコンの５’リン酸化、および
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖アンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への前記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、アダプター連結アンプリコンを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記２本鎖アンプリコンは、２本鎖ＰＣＲアンプリコンであるという点で特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲから生じるという点で特徴付けられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウフラグメント、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ−ポリメラーゼ、Ｔｍａ−ポリメラーゼ、Ｔｎｅ−ポリメラーゼおよびＴｔｈ−ポリメラーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡアダプター分子は、Ｔ突出部を含むという点で特徴付けられる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３’ホスファターゼマイナス）からなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡアダプター分子は、配列決定ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、次世代配列決定（ＮＧＳ）のためのＤＮＡアダプター分子であるという点で特徴付けられる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）において、前記接触させる工程は、前記２本鎖アンプリコン、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および前記ＤＮＡアダプター分子を、１つの単一反応容器へと供することによって実現されるという点で特徴付けられる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）の後に、以下の工程：
（ｉｉｉ）アダプター連結ＰＣＲアンプリコンを単離する工程、
が行われるという点で特徴付けられる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記標的ＤＮＡを、前記標的ＤＮＡの２本鎖ＰＣＲアンプリコンを生じる条件下でＰＣＲに供する工程、
（ｉｉ）前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉｉ）前記反応混合物を、
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンの５’リン酸化、および
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への前記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、前記標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
アダプター連結ＰＣＲアンプリコンを調製するためのキットであって、前記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｉｉ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖ）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を行うためのマニュアル、
を含む、キット。
【請求項１３】
標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するためのキットであって、前記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含む、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｖ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖ）ＰＣＲ緩衝液、
（ｖｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖｉ）請求項９に記載の方法を行うためのマニュアル、
を含む、キット。
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであるという点で特徴付けられる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、クレノウフラグメント、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ−ポリメラーゼ、Ｔｍａ−ポリメラーゼ、Ｔｎｅ−ポリメラーゼおよびＴｔｈ−ポリメラーゼからなる群より選択され、好ましくは、前記ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１０〜１２のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アダプター連結アンプリコンまたは標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するために使用されるべき新規方法およびキットそれぞれに関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に、より詳細には、アダプター連結アンプリコンの調製に、および具体的には、標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーの調製に、それぞれ関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アダプター連結された、増幅されたＤＮＡフラグメントは、現代分子生物学技術における多くの適用のために必要とされる。例えば、アダプター連結アンプリコンは、配列決定分析が意図された標的ＤＮＡのライブラリーを構成する。ＤＮＡサンプル中の標的領域は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅手順に供される。ＰＣＲから生じるアンプリコンは、その後、アダプター分子へと連結される。標的ＤＮＡのアダプター連結アンプリコンもしくはフラグメントは、次いで、配列決定反応へと供される。ＤＮＡアダプター分子は、従って、配列決定プライマーに対して特異的であるヌクレオチド配列とともに提供され得る。アダプター連結アンプリコンの生じる集団は、いわゆるライブラリー、特に、アンプリコン配列決定ライブラリーといわれる。
【０００４】
現在、アンプリコン配列決定ライブラリーを生成するには、いくつかの共通する方法がある。
【０００５】
１つの方法は、従来のマルチステップ酵素反応を使用して、アダプターをアンプリコンに連結する。この方法は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍａｎｕａｌ、「Ｍａｔｅ  Ｐａｉｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、２００９に開示される。アンプリコンは、ＰＣＲによって標的特異的プライマーを用いて生成され、次いで、末端修復される。その末端修復工程は、通常、２つの酵素：ポリヌクレオチドキナーゼ（通常は、２本鎖アンプリコンもしくはＰＣＲ生成物の５’末端をそれぞれリン酸化するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ））、ならびに充填反応およびトリミング反応のいずれかによって、ＰＣＲ生成物の末端を平滑にするポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、を必要とする。末端修復工程の後、いくつかのプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供されるもの）で配列決定するために、アデニンヌクレオチドの付加が、いわゆるＡ付加工程によって必要とされる。この工程において、Ａ突出部は、その末端修復されたＰＣＲ生成物の３’末端へと、例えば、クレノウフラグメント・エキソマイナス（５’→３’ポリメラーゼ活性を有するが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠いているＤＮＡポリメラーゼＩの大きい方のフラグメント）によって付加される。これは、チミジンヌクレオチドによって形成される突出部、すなわち、Ｔ突出部を有する配列決定アダプターのためのドッキング部位を生成することである。Ａ付加の後、配列決定アダプターは、ＤＮＡリガーゼ、通常は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによってアンプリコンへと連結され得る。他の配列決定プラットフォーム（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）のもの、例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭもしくはＰｒｏｔｏｎ、ＳＯＬｉｄ）に関しては、Ａ付加工程は必要ではなく、平滑末端化アダプターが、末端修復されたアンプリコンへと直接連結される。
【０００６】
別のライブラリー調製法は、標的特異的配列およびアダプター配列のうちの一部の両方を含む融合プライマーを使用することである。標的特異的領域のＰＣＲおよび増幅の第１ラウンドの後に、ＰＣＲの第２ラウンドを、完全アダプター配列を含むプライマーで行って、アダプター配列をアンプリコンに付加し得る。
【０００７】
文書ＷＯ  ２００９／０７２９７２は、ｄｓＲＮＡ分子へのｄｓＲＮＡアダプター分子の酵素的連結のための方法を開示する。
【０００８】
当該分野での全てのこれらの方法は、面倒でありかつ時間を浪費する。さらに、融合プライマーを使用する方法はまた、大量の非特異的生成物を生じることなく、同じ多重ＰＣＲ反応において数百から数千ものアンプリコンを増幅するべきである適切なＰＣＲプライマーの設計に難題を呈示し得る。
【０００９】
この背景に対して、先行技術の方法と関連する課題が低減もしくは回避され得るアダプター連結アンプリコンを調製するための方法を提供することが、本発明の目的である。標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための改善された方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１０】
本発明は、これらおよび他のニーズを満たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７２９７２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、アダプター連結アンプリコンを調製するための方法を提供し、上記方法は、
（ｉ）２本鎖アンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉ）上記反応混合物を、
−上記ポリヌクレオチドキナーゼによる上記２本鎖アンプリコンの５’リン酸化、および
−上記ＤＮＡリガーゼによる上記２本鎖アンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への上記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、アダプター連結アンプリコンを得る工程、
を包含する。
【００１３】
本発明はまた、標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法を提供し、上記方法は、
（ｉ）上記標的ＤＮＡを、上記標的ＤＮＡの２本鎖ＰＣＲアンプリコンを生じる条件下でＰＣＲに供する工程、
（ｉｉ）上記２本鎖ＰＣＲアンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子、
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉｉ）上記反応混合物を、
−上記ポリヌクレオチドキナーゼによる上記２本鎖ＰＣＲアンプリコンの５’リン酸化、および
−上記ＤＮＡリガーゼによる上記２本鎖ＰＣＲアンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への上記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、上記標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを得る工程、
を包含する。
【００１４】
本発明者らは、増幅法によって標的ＤＮＡを増幅した後に、得られるアンプリコンを、アダプター分子（例えば、配列決定プラットフォーム特異的アダプター）と、中間改変工程なしで、特に、時間を浪費しかつ効率の悪い一般に要求される末端修復およびＡ付加工程を排除して１工程で直接連結し得ることを、驚くべきことに実現した。
【００１５】
従って、アダプター連結アンプリコンを調製するための方法の工程（ｉ）において、および標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法の工程（ｉｉ）において、２本鎖アンプリコンは、３’末端および／もしくは５’末端のその後の化学的改変なしで、すなわち、ヌクレオチド（例えば、アデニンもしくはチミジンヌクレオチド）、ホスフェート基などのその後の付加も除去もなしで、先行する増幅反応から直接生じる構成で提供される。
【００１６】
本発明に従う方法は、１工程のみで、アダプター連結アンプリコンまたは標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーの生成を可能にし、作業時間を有意に短縮する。その得られたアダプター連結ＤＮＡアンプリコンは、次いで、従来のプラットフォームにおいて、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）のために使用され得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「２本鎖アンプリコン」とは、分子増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅法（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＮＥＡＲ）によるＤＮＡの増幅の供給源または生成物であるＤＮＡの小片をいう。この状況において、「増幅」とは、遺伝子フラグメントもしくは標的配列、具体的にはアンプリコンの１もしくはこれより多くのコピーの生成をいう。増幅反応の生成物であるアンプリコンは、増幅生成物のような一般的実験用語と交換可能に使用される。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「標的ＤＮＡ」とは、２本鎖アンプリコンを生成するための増幅法に供され得る目的の任意の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をいう。「標的ＤＮＡ」は、任意のインビボ供給源またはインビトロ供給源由来であり得る（例えば、生きていようが死んでいようが、原核生物であろうが真核生物であろうが、１もしくは複数の細胞、組織、器官、または生物に由来するか、あるいは任意の生物学的もしくは環境上の供給源に由来する）。代表的ではあるが排他的ではなく、「標的ＤＮＡ」とは、ヌクレオチド配列が配列決定（例えば、ＮＧＳ）によって解明される予定であるそのようなｄｓＤＮＡをいう。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「配列決定ライブラリー」は、標的ＤＮＡフラグメントまたは標的ＤＮＡアンプリコンそれぞれの収集物である。通常は、上記収集物は、貯蔵され得、分子クローニングというプロセスを通じて微生物の集団中で増やされ得る。用語「ライブラリー」とはまた、集団または生物（それらの各々は、クローニングベクターの中へと挿入された標的ＤＮＡフラグメントを有する）に、または代わりに、そのクローニングされたベクター分子のうちの全ての収集物に言及し得る。本発明によれば、上記ライブラリーは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を解明するために、その後の配列決定反応において使用されることが意図される。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「キナーゼ」は、高エネルギードナー分子（例えば、ＡＴＰ）から２つの特異的基質へとホスフェート基を移動させる（リン酸化といわれるプロセス）酵素の１タイプである。「ポリヌクレオチドキナーゼ」とは、その基質としてＤＮＡもしくはＲＮＡのようなポリヌクレオチドを有するが、オリゴヌクレオチドもしくはモノヌクレオチドをリン酸化することもできるキナーゼをいう。顕著なポリヌクレオチドキナーゼの例は、Ｔ４バクテリオファージの生成物であるＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「リガーゼ」とは、新たな化学的結合を形成することによって、通常は、大きい方の分子のうちの一方に従属している小さな化学基の加水分解が付随して、２つの大きな分子の連結を触媒し得る酵素、または２つの成分を一緒に連結することを触媒する酵素（例えば、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｓ、Ｃ−Ｎなどの連結を触媒する酵素）を表す。「ＤＮＡリガーゼ」とは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することによって、ＤＮＡ鎖を一緒に連結することを促進する酵素をいう。適切なＤＮＡリガーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ  Ｉ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶなどを含む。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡアダプター分子」とは、ＤＮＡのフラグメントの一方の末端もしくは両末端に連結され得る２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子をいう。代表的には、「ＤＮＡアダプター分子」は、およそ５〜１００ｂｐの間の長さを有する。本発明に従う方法の工程（ｉ）または（ｉｉ）において提供されるとおりのＤＮＡアダプター分子の構成は、アンプリコンの構成に依存する。ＤＮＡアダプター分子は、アンプリコンが平滑末端化された構成で提供される場合には、平滑末端化され得る。ＤＮＡアダプター分子は、増幅反応から生じるアンプリコンがそれぞれの鎖の３’末端および／または５’末端に付加された相補的突出部を有する場合には、それぞれの鎖の３’末端および／または５’末端に付加されたヌクレオチド突出部を含み得る。例示的突出部は、それぞれ、１もしくはこれより多いチミジンヌクレオチドからなるＤＮＡアダプター分子によって構成されるＴ突出部、および１もしくはこれより多いアデニンヌクレオチドからなるアンプリコンによって構成される相補的Ａ突出部である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１」とは、１より多くの要素が使用され得ることを意味する。例えば、本発明は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくはより多くの異なる要素（例えば、キナーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼなど）を含み得る。
【００２４】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２５】
上記ＤＮＡリガーゼによる２本鎖アンプリコンの５’リン酸化および上記ＤＮＡリガーゼによる上記２本鎖アンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への上記ＤＮＡアダプター分子の連結の条件は、当業者に周知である。このような条件は、ポリヌクレオチドキナーゼがその酵素活性を発揮しかつＤＮＡリガーゼがその酵素活性を同時に発揮することを可能にする環境を提供する。さらに、このような条件は、アンプリコン、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡアダプター分子が相互作用し得、アダプター連結アンプリコンの形成を可能にし得ることを確実にする。好ましくは、このような条件は、ホスフェートドナー（例えば、ＮＴＰ、特に、ＡＴＰ）、塩およびイオン（例えば、Ｍｇ＋＋）などの存在によって実現される。いくつかのリガーゼはまた、補因子としてＮＡＤを必要とし得る。
【００２６】
アダプター連結アンプリコンの調製はまた、アンプリコンがフラグメント化標的ＤＮＡの増幅から生じるアダプター連結アンプリコンのライブラリーの生成という概念を含む。増幅されかつアダプター連結された標的ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定のようなその後の分析のために使用され得る。アダプター連結アンプリコンは、従って、標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを形成し得る。
【００２７】
本発明の根底にある目的は、ここで完全に解決される。
【００２８】
説明の中で示されるとおりの本発明の特徴、特性、および実施形態は、アダプター連結アンプリコンを調製するための方法に、ならびに標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法に、相応して当てはまる。
【００２９】
本発明に従う方法の一実施形態によれば、上記２本鎖アンプリコンは、２本鎖ＰＣＲアンプリコンである。
【００３０】
この手段は、大部分の分子生物学実験室の標準ツールに属する十分に確立された増幅法が使用されるという利点を有する。「ＰＣＲアンプリコン」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって生成される増幅生成物をいう。用語「ＰＣＲアンプリコン」は、「ＰＣＲ生成物」と交換可能に使用され得る。
【００３１】
本発明に従う方法の一実施形態によれば、上記２本鎖ＰＣＲアンプリコンは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲから生じている。
【００３２】
この手段は、本発明者らが、ＤＮＡポリメラーゼの末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を利用して、２本鎖ＰＣＲアンプリコン上に、好ましくは、それぞれの鎖の３’末端においてＡ突出部を生成するという利点を有する。その後の接触させる工程（ｉ）または（ｉｉ）において提供されるＤＮＡアダプター分子は、次いで、Ｔ突出部を、好ましくは、それぞれの鎖の３’末端において含み得る。Ａ突出部を含む２本鎖ＰＣＲアンプリコンは、次いで、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子にハイブリダイズする。ＤＮＡアダプター分子にハイブリダイズした２本鎖ＰＣＲアンプリコンは、次いで、連結反応によって互いに共有結合される。
【００３３】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含む上記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウフラグメント、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ−ポリメラーゼ、Ｔｍａ−ポリメラーゼ、Ｔｎｅ−ポリメラーゼおよびＴｔｈ−ポリメラーゼからなる群より選択される。
【００３４】
この手段は、本発明を実現するために適していると証明された、このようなＤＮＡポリメラーゼが提供されるという利点を有する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＤＮＡアダプター分子は、Ｔ突出部を含む。
【００３６】
この状況において、「Ｔ突出部」とは、ＤＮＡアダプター分子のそれぞれの鎖の３’末端もしくは５’末端に付加された少なくとも１もしくはこれより多くのチミジンヌクレオチドをいう。好ましい実施形態によれば、Ｔ突出部は、３’末端に位置する。すなわち、１もしくはこれより多くのチミジンヌクレオチドは、ＤＮＡアダプター分子の３’末端に付加された。Ｔ突出部に起因して、ＤＮＡアダプター分子は、相補的なアデニンヌクレオチドの相当する突出部、すなわち、Ａ突出部を有するＤＮＡフラグメント（例えば、上記２本鎖アンプリコン）にハイブリダイズし得る。上記Ａ突出部は、ＤＮＡフラグメントもしくは２本鎖アンプリコンのそれぞれの鎖の３’末端もしくは５’末端に位置し得る。別の好ましい実施形態において、Ａ突出部は、ＤＮＡフラグメントもしくはアンプリコンのそれぞれの鎖の３’末端にそれぞれ位置する。ＤＮＡリガーゼの存在下では、ＤＮＡフラグメントもしくはアンプリコン（それぞれ）、およびＤＮＡアダプター分子は、一緒に連結され、アダプター連結アンプリコンを生じる。
【００３７】
本発明に従う方法の一実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３’ホスファターゼマイナス）からなる群より選択される。
【００３８】
この手段は、本発明に特に適していると示され得る、このようなポリヌクレオチドキナーゼが使用されるという利点を有する。
【００３９】
本発明に従う方法の別の実施形態において、上記ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼからなる群より選択される。
【００４０】
この手段は、最適な結果を提供すると証明された、このようなＤＮＡリガーゼが提供されるという利点を有する。
【００４１】
本発明に従う方法の別の好ましい実施形態によれば、上記ＤＮＡアダプター分子は、配列決定ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、次世代配列決定（ＮＧＳ）のためのＤＮＡアダプター分子である。
【００４２】
この手段は、得られるアダプター連結アンプリコンが、ヌクレオチド配列のその後の解明を可能にする構成において、好ましくは、ＮＧＳの状況内で、従来の配列決定プラットフォーム上で提供されるという利点を有する。
【００４３】
本発明に従う方法の別の好ましい実施形態において、アダプター連結アンプリコンを調製するための方法の工程（ｉ）では、または標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法の工程（ｉｉ）では、上記接触させる工程は、上記２本鎖アンプリコン、上記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、上記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および上記ＤＮＡアダプター分子を、１つの単一反応容器へと供することによって実現される。
【００４４】
この手段は、「１工程」方法の原理を具現化するという利点を有する。本発明に従う方法は接触させる工程およびインキュベートする工程にそれぞれ細分され得るとしても、この細分は、方法の事象の時系列順序を例証することを意図するに過ぎない。しかし、上記方法のユーザーは、規定された条件下で反応混合物を作ることしか必要とされない。インキュベート期間の後に、アダプター連結アンプリコンまたは標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーは、自動的に生成される、すなわち、実質的に１工程で生成される。特に、２本鎖アンプリコンに対して行われる先行する改変工程（例えば、末端修復およびＡ付加工程）は、必要ない。
【００４５】
本発明に従う方法の別の実施形態において、アダプター連結アンプリコンを調製するための方法の工程（ｉｉ）の後に、または標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法の工程（ｉｉｉ）の後に、以下の工程（ｉｉｉ）または（ｉｖ）が行われる：アダプター連結アンプリコンを単離する工程。
【００４６】
この手段は、アダプター連結アンプリコンが、配列決定反応への後者の直接適用を可能にする条件の中で提供されるという利点を有する。「単離」は、この状況において、関与する酵素、塩、反応緩衝液、不純物などのような反応物を除去することによるアダプター連結アンプリコンの精製、および長期間の貯蔵もしくはその後の反応を確実にする条件においてアンプリコンを提供することを意味する。
【００４７】
本発明の別の主題は、アダプター連結アンプリコンを調製するためのキットに関し、上記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｉｉ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖｉ）上記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび上記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖ）本発明に従うアダプター連結アンプリコンを調製するための方法を行うためのマニュアル、
を含む。
【００４８】
本発明の別の主題は、標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するためのキットに関し、上記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含む少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｖ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖ）ＰＣＲ緩衝液、
（ｖｉ）上記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび上記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖｉ）本発明に従う標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するための方法を行うためのマニュアル、
を含む。
【００４９】
反応緩衝液の組成は、当業者によって、例えば、従来のポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液およびＤＮＡリガーゼ緩衝液、ならびに適用可能である場合には、成分の個々の調節に基づいて、容易に決定され得る。一連の実験において、特定の反応緩衝液中の両方の酵素の個々の活性が決定され得、両方の酵素が適切に働く最適な緩衝液組成の同定を可能にし得る。このような反応緩衝液は、ホスフェートドナー（例えば、ＮＴＰ、特に、ＡＴＰ）、塩およびイオン（例えば、Ｍｇ＋＋）などを含み得る。いくつかのリガーゼはまた、補因子としてＮＡＤを必要とし得る。適切な反応緩衝液の例は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標）（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）のＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５℃においてその最終濃度、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、７．５％  ＰＥＧ  ６０００、ｐＨ  ７．６を含む）である。
【００５０】
本発明に従う方法の特徴、特性、利点および実施形態は、本発明に従うキットに相応して当てはまる。
【００５１】
上述の特徴および以下でなお説明される予定である特徴が、それぞれの特定された組み合わせにおいて使用され得るのみならず、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組み合わせにおいて、もしくはそれら自体でも使用され得ることは、当然のことである。
【００５２】
さらなる特徴、特性および利点は、好ましい実施形態または添付の図面の説明のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明に従うアダプター連結ＰＣＲアンプリコンおよびアンプリコン配列決定ライブラリーの１工程構築のスキームを示す。
【図２】図２は、第１の例証実験の結果を示すダイアグラムを示す。全４サンプルにおいて、ＩＬ１Ｒ２アンプリコンは、類似の量で存在する（Ａ）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＰＮＫの両方での反応は、アンプリコンへの配列決定アダプターの直接連結を可能にする（Ｂ）。
【図３Ａ】図３は、Ｇｅｎｅ  ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐａｎｅｌｓアンプリコン配列決定のための標準的ライブラリー調製物構築作業（Ａ）、および本発明に従うＧｅｎｅ  ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐａｎｅｌｓアンプリコン配列決定のための１工程ライブラリー調製物構築作業フロー（Ｂ）を図示するスキームを示す。
【図３Ｂ】図３は、Ｇｅｎｅ  ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐａｎｅｌｓアンプリコン配列決定のための標準的ライブラリー調製物構築作業（Ａ）、および本発明に従うＧｅｎｅ  ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐａｎｅｌｓアンプリコン配列決定のための１工程ライブラリー調製物構築作業フロー（Ｂ）を図示するスキームを示す。
【図４】図４は、第２の例証実験の結果を示す。標準的方法もしくは本発明に従う１工程方法のいずれかで生成した配列決定ライブラリーは類似のサイズ分布パターンを示すことが実証された。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
実施例
１．本発明の原理
本発明の目的は、アンプリコン配列決定のための次世代ライブラリー調製作業フローにおける面倒でありかつ時間を浪費する末端修復およびＡ付加工程を回避することである。本発明者らは、ＰＣＲポリメラーゼの末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を利用して、ＰＣＲの間にアンプリコンの３’末端にＡ突出部を生成する。ＰＣＲの後に、アンプリコンを、組み合わされたリン酸化および連結反応に供する。この反応において、Ａ突出部を有するアンプリコンを、それぞれの鎖の３’末端にＴ突出部を含む配列決定アダプター、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）、ＤＮＡリガーゼと混合し、リガーゼおよびキナーゼの両方にとって機能する反応緩衝液中でインキュベートする；図１を参照のこと。このスキームにおいて、ｇＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを表し、Ｐｉは、無機ホスフェート残基を表す。
【００５５】
２．実験的試験１
本発明の原理を証明するために、本発明者らは、上記の方法を使用して、Ｔａｑポリメラーゼを使用するＰＣＲを行い、次いで、Ｔ突出部を有するＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  ＴｒｕＳｅｑ配列決定アダプターへとアンプリコンを直接連結した。簡潔には、４つの同一の５０μｌ  ＰＣＲ反応を、各々テンプレートとして、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、１×最終濃度でのＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（化学改変されたＴａｑポリメラーゼを含む）、ならびに各々０．２μＭのヒトＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＬ１Ｒ２  Ｆ（配列１）およびＩＬ１Ｒ２  Ｒ（配列２）を特異的に認識するＰＣＲプライマーで設定した。ＰＣＲサイクリング条件は、以下のとおりであった：最初の変性のために９５℃、５分間；次いで、９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；および７２℃、６０秒を３５サイクル；続いて、最終伸長およびＡ付加のために７２℃、２０分間。ＰＣＲが完了したら、ＰＣＲ反応を、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔできれいにし、各反応からのＰＣＲ生成物を、２０μｌ  ＲＮａｓｅ非含有水中に溶離し、一緒にプールした。次いで、精製したＰＣＲ生成物（サンプル１およびサンプル２）のうちの１９μｌの１つの複製物を、組み合わされたリン酸化および連結反応に、１×Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））、二重鎖を形成するために２つのオリゴをアニールすることによって生成した１μＭのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定アダプター（ＩＤＴ，  配列３および配列４）、３μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｒａｐｉｄ、６００Ｕ／μｌ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））および２μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ、１０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））とともに供した。精製したＰＣＲ生成物（サンプル３およびサンプル４）のうちの１９μｌの別の複製物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなしであるが上記の成分とのみ連結反応に供した；表１を参照のこと。全４つの反応は、５０μｌの反応容積を有し、室温で３０分間行った。
【表１】
2017525369.tif 000002
【００５６】
連結反応の後に、生成物を、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットで精製し、２０μｌのＲＮａｓｅ非含有水中に溶離した。その溶離液を、ＲＮａｓｅ非含有水で１：１０００に希釈し、定量的リアルタイムＰＣＲにおいてテンプレートとして使用して、連結生成物の存在もしくは非存在を検出した。２つのプライマーセットを使用した：一方のプライマーセットである、ライブラリープライマーＦおよびライブラリープライマーＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）アダプター配列（配列５および配列６）を認識し；他方のプライマーセットは、ＩＬ１Ｒ２アンプリコンを生成するために使用されるのと同じであり、ＩＬ１Ｒ２アンプリコン配列（配列１および配列２）の全てを認識する。内部ＩＬ１Ｒ２アンプリコン配列を特異的に認識する５’  ＦＡＭ標識を含むＴａｑＭａｎプローブ（配列７）を、ライブラリープライマーもしくはＩＬ１Ｒ２プライマーのいずれかと組み合わせて使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）アダプター連結アンプリコンもしくは全ＩＬ１Ｒ２アンプリコンの量それぞれを定量した。ｑＰＣＲ反応を、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲミックス（１×最終濃度）、０．４μＭの各プライマー、０．２μＭのＴａｑＭａｎプローブ、およびサンプル１〜サンプル４の２μｌの希釈連結生成物で設定した。ｑＰＣＲを、以下のサイクリング条件で、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＲｏｔｏｒｇｅｎｅリアルタイムＰＣＲサイクラーで行った：９５℃、３分間；および９５℃、３秒；６０℃、３０秒の４０サイクル。
【００５７】
この実験の結果を、図２および表１に示す。全４サンプル（２連で）は、ＩＬ１Ｒ２プライマーでのｑＰＣＲにおいて類似のＣｔ値を示し、全ＩＬ１Ｒ２アンプリコンの類似の量を示す；図２Ａ。しかし、Ｔ４  ＰＮＫが連結反応に存在するサンプル１およびサンプル２のみが、ライブラリープライマーＦおよびＲでのｑＰＣＲ反応において低いＣｔを有する陽性シグナルを示した一方で、連結反応にＴ４  ＰＮＫが存在しないサンプル３およびサンプル４は、ライブラリープライマーＦおよびＲで検出可能なｑＰＣＲ生成物を生じなかった；図２Ｂ。
【００５８】
結果は、アンプリコン配列決定のための次世代ライブラリーが、ＰＣＲの直後に、成功裡にかつ迅速に１工程の組み合わされたリン酸化および連結工程で調製され得、当該分野で一般に使用される、時間浪費型かつエラーの起こりやすい複数酵素工程を排除し得るという原理を肯定的に証明した。
【００５９】
３．実験的試験２
本発明者らはさらに、本発明の原理を、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＧｅｎｅＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐａｎｅｌを使用するアンプリコン配列決定実験で証明した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＧｅｎｅＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐａｎｅｌは、多重ＰＣＲを使用して、目的の遺伝子のエキソンを選択的に増幅する。多重ＰＣＲの後、アンプリコンは、配列決定のために、プラットフォーム特異的配列決定アダプターと連結される必要がある。
【００６０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームでの標的アンプリコン配列決定のための標準的ライブラリー構築法は、３つの酵素工程：非特異的副生成物を除去するために、数回のクリーンアップ工程およびサイズ選択工程と組み合わせて、末端修復、Ａ付加、および連結を要する。連結後のＰＣＲ工程はまた、配列決定ライブラリーを増幅するために含められる；図３Ａを参照のこと。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＧｅｎｅＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡｓｅｑ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐａｎｅｌｓ  Ｖ２ハンドブックもまた参照のこと。
【００６１】
本発明者らは、本発明に従う１工程ライブラリー構築法と標準的ライブラリー構築プロトコルの実施を比較した。本発明に従う１工程方法は、図３Ｂに概説される。具体的には、匿名ドナーに由来するヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をテンプレートとして使用し、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＧｅｎｅＲｅａｄＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐａｎｅｌ  Ｖ２（Ｃａｔ．  ＃  ＮＧＨＳ−０１１Ｘ）で増幅した。多重ＰＣＲの後、アンプリコンを、標準的ライブラリー調製作業フロー（「コントロール」）、または本発明に従う１工程ライブラリー調製プロトコル（「１工程」）のいずれかに供した。１工程プロトコルを用いて、精製したＰＣＲ生成物を、最終容積９０μｌで、１×Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））中の３μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｒａｐｉｄ、６００Ｕ／μｌ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））および２μｌのＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ、１０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））でアダプターに直接連結した。組み合わされたリン酸化および連結を伴う１工程反応を、３０分間室温で行った。両方の配列決定ライブラリーを、ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒでＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップを用いて特徴付けた。
【００６２】
図４に示されるように、標準的方法（「コントロール」）および本発明に従う１工程方法（「１工程」）で構築したライブラリーは、非常に類似したサイズ分布パターンを有する。
【００６３】
この２つのライブラリーを、次いで、二重層３００  ｎｔ  Ｆｌｏｗ  ＣｅｌｌｓおよびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  ｍｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ２（３００）を使用するｍｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））で配列決定した。２×１５０ｎｔ読み取り長でのペアードエンド配列決定（Ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）モードを、試行のために使用した。データを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＧｅｎｅＲｅａｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｅｘｏｎ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓツールで分析した。
【００６４】
アンプリコン配列決定品質のための測定規準（ｍｅｔｒｉｃｓ）を表２にまとめたところ、標準的方法（「コントロール」）および本発明に従う新規な１工程方法（「１工程」）の両方で生成されたアンプリコン配列決定ライブラリーに関して良好な配列決定品質を示した。表２に示されるように、標準的方法および本発明に従う新規方法の両方によって生成されたライブラリーは、測定規準（例えば、全読み取り、標的領域およびコントロールアンプリコンに対して整列された読み取りのパーセンテージ、メジアンの＞＝２０％でカバーされた塩基のパーセンテージ、＞＝１０×、３０×、もしくは１００×カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）でカバーされた塩基のパーセンテージ、ならびに平均およびメジアンカバレッジ）に基づいて、同様に良好な配列決定結果を与えた。
【表２】
2017525369.tif 000003
【００６５】
４．結論
まとめると、本発明に従う新規な１工程アンプリコン配列決定ライブラリー調製法は、良好な品質を伴って、配列決定ライブラリーを生成することにおいて有効であると示された。さらに、１工程方法はまた、ライブラリー調製作業フローを顕著に能率的にし、プロトコルにおける多重酵素工程および取り扱い工程を除去することによって、潜在的に変動を低減し得る。
【化１】
2017525369.tif 000004
【図１】
2017525369.tif 000005
【図２】
2017525369.tif 000006
【図３Ａ】
2017525369.tif 000007
【図３Ｂ】
2017525369.tif 000008
【図４】
2017525369.tif 000009
【配列表】
2017525369000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月8日(2017.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
４．結論
まとめると、本発明に従う新規な１工程アンプリコン配列決定ライブラリー調製法は、
良好な品質を伴って、配列決定ライブラリーを生成することにおいて有効であると示され
た。さらに、１工程方法はまた、ライブラリー調製作業フローを顕著に能率的にし、プロ
トコルにおける多重酵素工程および取り扱い工程を除去することによって、潜在的に変動
を低減し得る。
【化１】
2017525369.tif 000010
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
さらなる特徴、特性および利点は、好ましい実施形態または添付の図面の説明のとおり
である。
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
アダプター連結アンプリコンを調製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）２本鎖アンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉ）前記反応混合物を、
−前記ポリヌクレオチドキナーゼによる前記２本鎖アンプリコンの５’リン酸化、および
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖アンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への前記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、アダプター連結アンプリコンを得る工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記２本鎖アンプリコンは、２本鎖ＰＣＲアンプリコンであるという点で特徴付けられる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲから生じるという点で特徴付けられる、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウフラグメント、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ−ポリメラーゼ、Ｔｍａ−ポリメラーゼ、Ｔｎｅ−ポリメラーゼおよびＴｔｈ−ポリメラーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＤＮＡアダプター分子は、Ｔ突出部を含むという点で特徴付けられる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３’ホスファターゼマイナス）からなる群より選択されるという点で特徴付けられる、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ＤＮＡアダプター分子は、配列決定ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、次世代配列決定（ＮＧＳ）のためのＤＮＡアダプター分子であるという点で特徴付けられる、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
工程（ｉ）において、前記接触させる工程は、前記２本鎖アンプリコン、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および前記ＤＮＡアダプター分子を、１つの単一反応容器へと供することによって実現されるという点で特徴付けられる、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
工程（ｉｉ）の後に、以下の工程：
（ｉｉｉ）アダプター連結ＰＣＲアンプリコンを単離する工程、
が行われるという点で特徴付けられる、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記標的ＤＮＡを、前記標的ＤＮＡの２本鎖ＰＣＲアンプリコンを生じる条件下でＰＣＲに供する工程、
（ｉｉ）前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンと、
−少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
−少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、および
−ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
とを接触させて、反応混合物を得る工程、
（ｉｉｉ）前記反応混合物を、
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンの５’リン酸化、および
−前記ＤＮＡリガーゼによる前記２本鎖ＰＣＲアンプリコンのうちの少なくとも一方の末端への前記ＤＮＡアダプター分子の連結、
を同時に可能にする条件下でインキュベートして、前記標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを得る工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
アダプター連結ＰＣＲアンプリコンを調製するためのキットであって、前記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｉｉ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖ）項目１〜１０のいずれかに記載の方法を行うためのマニュアル、
を含む、キット。
（項目１３）
標的ＤＮＡの配列決定ライブラリーを調製するためのキットであって、前記キットは、
（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、末端アデニリルトランスフェラーゼ活性を含む、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼ、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ、
（ｉｖ）ＤＮＡアダプター分子、好ましくは、Ｔ突出部を含むＤＮＡアダプター分子、
（ｖ）ＰＣＲ緩衝液、
（ｖｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドキナーゼおよび前記少なくとも１つのＤＮＡリガーゼが酵素として機能することを同時に可能にするように構成された反応緩衝液、ならびに
（ｖｉ）項目９に記載の方法を行うためのマニュアル、
を含む、キット。
（項目１４）
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであるという点で特徴付けられる、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、クレノウフラグメント、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ−ポリメラーゼ、Ｔｍａ−ポリメラーゼ、Ｔｎｅ−ポリメラーゼおよびＴｔｈ−ポリメラーゼからなる群より選択され、好ましくは、前記ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、項目１０〜１２のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】
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