(57)【要約】  ＺＭ４株のゲノム配列中のＺＭＯ０３５３と呼ばれるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム領域によりコードされるタンパク質の発現を破壊すると、組換えキシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞のキシロース使用が改善することが見出された。さらに、この破壊を有する、キシロースおよびアラビノース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞において、キシロースおよびアラビノースの両方の利用が改善し、かつエタノール生産の増大が達成された。
2017518756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞であって、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を含み、前記遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されており、前記遺伝子改変がないことを除いて同一である細胞のＤ−キシロース利用と比較して、キシロース利用が増大する、組換えＤ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞。
【請求項２】
０．０５のＯＤ６００で開始する前記細胞の培養物が、約９６ｇ／ＬのＤ−キシロースを最初に含有する培地中で４６時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約５６ｇ／ＬのＤ−キシロースを使用する、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
前記細胞がＬ−アラビノースを利用し、前記遺伝子改変がないことを除いて同一である細胞のＬ−アラビノース利用と比較して、アラビノース利用が増大する、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項４】
０．０６のＯＤ６００で開始する前記細胞の培養物が、約４９ｇ／ＬのＬ−アラビノースを最初に含有する培地中で４３時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約２８ｇ／ＬのＬ−アラビノースを使用する、請求項３に記載の組換え細胞。
【請求項５】
前記遺伝子改変がないことを除いて同一である細胞のＤ−キシロース利用およびＬ−アラビノース利用と比較して、Ｄ−キシロース利用およびＬ−アラビノース利用が増大する、請求項３に記載の組換え細胞。
【請求項６】
０．０６のＯＤ６００で開始する前記細胞の培養物が、約９７ｇ／ＬのＤ−キシロースを最初に含有する培地中で４３時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約２０ｇ／ＬのＤ−キシロース使用し、かつ約４９ｇ／ＬのＬ−アラビノースを最初に含有する培地中で４３時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約２８ｇ／ＬのＬ−アラビノースを使用する、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
Ｌ−アラビノース利用が、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースキナーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼをコードする異種遺伝子の発現により付与される、請求項３に記載の組換え細胞。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、前記内因性遺伝子における挿入、欠失、または突然変異である、請求項１または３に記載の組換え細胞。
【請求項９】
ａ）グルコース−フルクトース酸化還元酵素活性の低下；
ｂ）リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性の発現増大；および
ｃ）前記コード領域を短縮してＣ末端短縮タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内因性遺伝子の配列中の少なくとも１つの遺伝子改変
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１または３に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
エタノールを生産するための方法であって、
ａ）請求項１または３に記載の組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞であって、任意選択的に、
ｉ）グルコース−フルクトース酸化還元酵素活性の低下；
ｉｉ）リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性の発現増大；および
ｉｉｉ）前記コード領域を短縮してＣ末端短縮タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内因性遺伝子の配列中の少なくとも１つの遺伝子改変
の少なくとも１つを含む、組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を準備するステップと、
ｂ）Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの少なくとも１つを含む培地中で（ａ）の前記細胞を培養するステップであって、それによってＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースの前記少なくとも１つがエタノールに変換される、ステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
前記培地が、Ｄ−キシロースおよびアラビノースを含む糖類の混合物、または唯一の糖としてＤ−キシロースまたはＬ−アラビノースのいずれかを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が遺伝子改変を有しないことを除いて同一である方法と比較して、エタノール生産が増大する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２４日に出願された米国特許出願第１４／３１２７２５号明細書に関連し、それに対する優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、微生物学および遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムの遺伝子を不活性化すると、Ｄ−キシロース利用のために操作されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株のＤ−キシロース利用が改善され、かつＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用の両方のために操作されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株のＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用の両方が改善される。
【背景技術】
【０００３】
微生物によるエタノール生産は化石燃料に対する代替エネルギー源を提供し、そのため、最新研究の重要な領域となっている。Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースが、加水分解されたリグノセルロース系原料中の主要なペントース糖であるため、エタノールを生産する微生物は、他の有用な生産物と同様に、炭素源としてＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースを使用することができる。リグノセルロース系原料は、発酵で使用するための、生体触媒に対する豊富に入手可能な炭素源基質を供給することができる。
【０００４】
Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースを天然には利用しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）および他のエタノール生産菌を、これらの糖を利用するように遺伝子操作することができる。Ｄ−キシロース利用に対応するために、菌株は、以下のタンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作された：１）Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの変換を触媒するＤ−キシロースイソメラーゼ；２）Ｄ−キシルロースをリン酸化してＤ−キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼ（特許文献１、特許文献２；非特許文献１）。アラビノース利用に対応するために、以下のタンパク質をコードする遺伝子が導入された：１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース５−リン酸をＤ−キシルロース５−リン酸に変換するＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（特許文献３）。
【０００５】
Ｄ−キシロース利用経路遺伝子の導入後、Ｄ−キシロースの利用は典型的には最適になっていない。Ｄ−キシロース利用のために遺伝子操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、Ｄ−キシロース含有培地上での増殖に適応させて、Ｄ−キシロースの使用が改善された菌株が得られている（特許文献４および特許文献５）。Ｄ−キシロース利用を改善するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムのさらなる遺伝子改変が、特許文献６および特許文献７に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５１４，５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５６６，１０７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４３，７６０号明細書
【特許文献４】米国特許第７，２２３，５７５号明細書
【特許文献５】米国特許第７，７４１，１１９号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特に加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを含有する培地中で、エタノール生産を増強するために、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノース、またさらにはＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースの両方を効果的に利用するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｄ−キシロースを利用するように操作され、かつさらにはＺＭＯ０３５３として同定されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムの遺伝子座が不活性化されている組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞と、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの両方を利用するように操作され、かつさらにはＺＭＯ０３５３として同定されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムの遺伝子座が不活性化されている組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞とを提供する。
【００１０】
したがって、本発明は、組換えＤ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞であって、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を含み、その遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されている、組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を提供する。
【００１１】
一実施形態では、組換えＤ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、Ｌ−アラビノース利用細胞でもある。
【００１２】
別の実施形態では、Ｄ−キシロース利用細胞またはＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用細胞は、
ａ）グルコース−フルクトース酸化還元酵素活性の低下；
ｂ）ＥＣ５．３．１．６として分類されるリボース−５−リン酸イソメラーゼの発現増大；および
ｃ）コード領域を短縮してＣ末端短縮タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内因性遺伝子の配列中の少なくとも１つの遺伝子改変
の少なくとも１つさらに含む。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、エタノールを生産するための方法であって、
ａ）上記の組換え細胞のいずれかを準備するステップと、
ｂ）Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの少なくとも１つを含む培地中で（ａ）の細胞を培養するステップであって、それによってＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースの少なくとも１つがエタノールに変換される、ステップと
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの利用ならびにエタノール生産のための代謝経路の図を示し、ここで、ｇｌｆはＤ−グルコース促進拡散トランスポーターを意味する。
【図２】ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉのプラスミドマップを示す。
【図３】ｐ３２３ｄｅｌのプラスミドマップを示す。
【図４】ｐＡＲＡ３００３のプラスミドマップを示す。
【図５】ｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤのプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列の説明
本発明は、本出願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、より詳細に理解され得る。
【００１６】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件  −  配列規則）」に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）規格ＳＴ．２５（２００９）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の２０８項および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に準拠する。
【００１７】
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ１１１６３のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号３は、ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３とも呼ばれる、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−１２５２６のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号５は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９１９１のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号６は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１０９８８のＺＭＯ０３５３  ＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号７は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）由来の野生型ＧＦＯＲコード領域の完全なヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号８は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４由来のＲＰＩのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＰＩのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＰＩをコードするヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４のＺＭＯ０９７６コード領域のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４のＺＭＯ０９７６コード領域によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１３は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＭ４由来のｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１４は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＭ４由来のｐｎｐコード化ポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１５は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＮＣＩＭＢ１１１６３由来のｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１６は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＮＣＩＭＢ１１１６３由来のｐｎｐコード化ポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１７は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ１０９８８由来のｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１８は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ１０９８８由来のｐｎｐコード化ポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１９は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ポマセアエ（ｐｏｍａｃｅａｅ）ＡＴＣＣ２９１９２由来のｐｎｐコード領域のヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号２０は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ２９１９２由来のｐｎｐコード化ポリヌクレオチドホスホリラーゼのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号２１は、７０９個の天然Ｎ末端アミノ酸および１４個の追加のＣ末端アミノ酸を有する、Ｉ株の改変ｐｎｐコード化融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２２は、６９５個の天然Ｎ末端アミノ酸および２個の追加のＣ末端アミノ酸を有する改変ｐｎｐコード化融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号２３は、３６８個の天然Ｎ末端アミノ酸および１０個の追加のＣ末端アミノ酸を有する改変ｐｎｐコード化融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号２４は、３２個の天然Ｎ末端アミノ酸および１７個の追加のＣ末端アミノ酸を有する改変ｐｎｐコード化融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２５および２６はそれぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＡ遺伝子に対するアミノ酸配列およびコード領域である。
【００４２】
配列番号２７および２８はそれぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＢ遺伝子に対するアミノ酸配列およびコード領域である。
【００４３】
配列番号２９および３０はそれぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＤ遺伝子に対するアミノ酸配列およびコード領域である。
【００４４】
配列番号３１は、ＰｇａｐＳとも呼ばれるＳｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号３２は、ＲＰＩ発現カセットのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号３３は、ｐ３２３ｄｅｌと命名されたプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号３４〜３６および４０〜４３はプライマーである。
【００４８】
配列番号３７は、１，３１８ｂｐのＰＮＰ−Ｌ断片のヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号３８は、１，２２５ｂｐのＰＮＰ−Ｒ断片のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３９は、キメラＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを含有するＳｐｅＩ−ＦｓｅＩ  ＤＮＡ断片である。
【００５１】
配列番号４４は、Ｐｇａｐ−Ｒｐｉ発現カセットに融合した、Ｉ株ゲノムのトランスポゾン挿入ｐｎｐ遺伝子領域の一部（Ｉ株中に短縮ｐｎｐタンパク質をもたらす、ｐｎｐ遺伝子の３’末端近傍にフレームシフトを引き起こしたＭＥを含む）を含有する、Ｉ株由来の２３４０ｂｐのＰＣＲ増幅キメラＤＮＡ分子のヌクレオチド配列である。
【００５２】
以下の定義は、特許請求の範囲および本明細書の解釈のために使用され得る：本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはその任意の他の変化形は、非限定的包含を表すことが意図されている。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的にリストされていない、またはそのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含むことができる。さらに、明示的にその反対を述べていない限り、「または（ｏｒ）」は、包括的または（ｏｒ）を意味し、排他的または（ｏｒ）を意味しない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つを満足する。Ａは真であり（または存在し）かつＢは偽である（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在せず）かつＢは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢは両方とも真である（または存在する）。
【００５３】
さらに、本発明の要素または成分の前にある不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その要素または成分の実例（すなわち存在）の数に関して非限定的になるように意図されている。したがって、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数であることを意味しない限りは複数も含む。
【００５４】
本明細書で使用される「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の単一実施形態を指すことを意図するものではなく、本明細書および特許請求の範囲に記載されるあらゆる可能な実施形態を包含するものである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、使用される本発明の成分または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実世界における、通常の測定、濃度または使用溶液を作製するために使用される液体処理手順を通して；これらの手順における偶発的な誤差を通して；組成物の作製または方法の実施のために使用される成分の製造、供給源、または純度における相違を通して；および同種のことを通して生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はその量と均等な量を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００５６】
「遺伝子」は、特定のタンパク質または機能性ＲＮＡ分子を発現する核酸断片を指し、任意選択的に、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される形式とは異なる形式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。「内因性遺伝子」は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物では通常見出されないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００５７】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するものであっても、または天然に見出される様々なプロモーターに由来する様々なエレメントから構成されるものであっても、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示し得ることを当業者は理解している。一定の細胞型で一定の遺伝子を発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に呼ばれる。
【００５８】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子に由来するコードＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。「過剰発現」とは、正常な生物または非形質転換生物における生成レベルを超える、トランスジェニック生物における遺伝子産物の生成を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物への核酸断片の移入を指す。移入された核酸は、プラスミドの形態で宿主細胞中に維持されることも、または一部の移入された核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれることもある。移入された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」もしくは「組換え」もしくは「形質転換された」生物、または「形質転換体」と呼ばれる。
【００６０】
本明細書で使用される「プラスミド」および「ベクター」という用語は、多くの場合細胞の中心的代謝の役割にはない遺伝子を担持し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ、または任意の供給源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの線状もしくは環状のヌクレオチド配列であり得、その中では、いくつかのヌクレオチド配列が連結または再結合されて、プロモーター断片および適切な３’非翻訳配列を一緒に伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することができるユニークな構築物になっている。
【００６１】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が関連していることを指す。例えば、プロモーターは、あるコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【００６２】
「選択可能マーカー」という用語は、識別用因子、通常は抗生物質または化学薬品の耐性遺伝子を意味し、これはマーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することができ、この効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するために、かつ／または目的の核酸を遺伝した細胞または生物を同定するために使用される。
【００６３】
本明細書で使用される「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」について十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが好ましい場合がある。
【００６４】
「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する場合、ポリペプチドの配列を変更することなくＤＮＡによりコードされるポリペプチドの産生を最適化するように、遺伝子または核酸分子のコード領域中のコドンを変更することを指す。
【００６５】
「Ｄ−キシロース上での増殖に適応した」という用語は、Ｄ−キシロースを含有する培地中での長期間の増殖後に単離された細胞または株を指す。適応には、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルコースを含有する培地中での増殖期間、次いでＤ−キシロースのみを含有する培地中での増殖期間が含まれ得、各培地はＤ−キシロース含有培地である。典型的には、長期の増殖期間は少なくとも約４日である。
【００６６】
「適応株」という用語は、産物の生産のために特定の炭素源を使用する能力を改善するために、その炭素源上での増殖に対して選択された微生物を指す。例えば、「アラビノース適応株」は、炭素源としてのアラビノース上での増殖に対して選択された微生物株である。
【００６７】
「キシロース代謝経路」または「キシロース利用代謝経路」という用語は、Ｄ−キシロースをＤ−フルクトース−６−リン酸および／またはグリセルアルデヒド−３−リン酸に代謝する一連の酵素（遺伝子によりコードされた）を指し、１）Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの変換を触媒するＤ−キシロースイソメラーゼ；２）Ｄ−キシルロースをリン酸化してＤキシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼを含む。
【００６８】
「Ｄ−キシロースイソメラーゼ」または「キシロースイソメラーゼ」という用語は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換を触媒する酵素を指す。ＥＣ５．３．１．５として分類された酵素は、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）であることが公知である。キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換に加えて、他の反応を触媒することがあり、その他の活性に基づいて分類されることがある。
【００６９】
「キシロース」という用語は、Ｄ−キシロースを指す。
【００７０】
「アラビノース」という用語は、Ｌ−アラビノースを指す。
【００７１】
「リボース−５−リン酸イソメラーゼ」または「ＲＰＩ」という用語は、Ｄ−リブロース５−リン酸とＤ−リボース５−リン酸との相互変換を触媒する酵素を指す。ＥＣ５．３．１．６として分類された酵素は、リボース−５−リン酸イソメラーゼであることが公知である。リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素の一部は、Ｄ−リブロース５−リン酸とＤ−リボース５−リン酸との相互変換に加えて、他の反応を触媒することがあり、その他の活性に基づいて分類されることがある。
【００７２】
「Ｌ−アラビノースイソメラーゼ」という用語は、Ｌ−アラビノースとＬ−リブロースとの相互変換を触媒する酵素を指す。ＥＣ５．３．１．４として分類された酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼであることが公知である。Ｌ−アラビノースイソメラーゼ活性を有する酵素の一部は、Ｌ−アラビノースとＬ−リブロースとの相互変換に加えて、他の反応を触媒することがあり、その他の活性に基づいて分類されることがある。
【００７３】
「Ｌ−リブロースキナーゼ」という用語は、Ｌ−リブロースのＬ−リブロース５−リン酸への変換を触媒する酵素を指す。ＥＣ２．７．１．１６として分類された酵素は、Ｌ−リブロースキナーゼであることが公知である。Ｌ−リブロースキナーゼ活性を有する酵素の一部は、Ｌ−リブロースのＬ−リブロース５−リン酸への変換に加えて、他の反応を触媒することがあり、その他の活性に基づいて分類されることがある。
【００７４】
「Ｌ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ」という用語は、Ｌ−リブロース５−リン酸とＤ−キシルロース５−リン酸との相互変換を触媒する酵素を指す。ＥＣ５．１．３．２２として分類された酵素は、Ｌ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼであることが公知である。Ｌ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ活性を有する酵素の一部は、Ｌ−リブロース５−リン酸とＤ−キシルロース５−リン酸との相互変換に加えて、他の反応を触媒することがあり、その他の活性に基づいて分類されることがある。
【００７５】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、微生物が代謝することができる炭素源を指す。炭素基質の一種は、「発酵性糖類」であり、これは発酵プロセスにおいて微生物が炭素源として使用することができるオリゴ糖類および単糖類を指す。
【００７６】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンおよびセルロースの両方を含む組成物を示す。リグノセルロース系原料はまた、ヘミセルロースを含んでもよい。
【００７７】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースを含む追加の成分とを含む組成物を指す。
【００７８】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類の生成を指す。
【００７９】
「前処理バイオマス」という用語は、バイオマス中の多糖類が糖化酵素に一層利用可能になるように、熱的、物理的、および／または化学的前処理に付されたバイオマスを意味する。
【００８０】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含み、かつ任意選択的にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類、および／または単糖類をさらに含む材料を含む。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加成分を含むこともある。バイオマスは単一供給源に由来することも、または２つ以上の供給源に由来する混合物を含むこともある。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎との混合物、または草と葉との混合物を含むこともある。バイオマスとしては、以下に限定されるものではないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙汚泥、工場廃棄物、木材、および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定されるものではないが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮などの作物残渣、トウモロコシ茎、草、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、穀物製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果物、花、ならびに動物糞尿が挙げられる。
【００８１】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生ずる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化前に前処理または前加工されることもある。
【００８２】
「異種」という用語は、目的の場所に天然には見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、宿主生物中に天然には見出されないが、遺伝子移入により宿主生物に導入されている遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、キメラ遺伝子の他のセグメントと関連して天然には見出されない核酸分子であり、例えば、天然には相互に関連していないコード領域とプロモーターセグメントを有する核酸分子である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「単離核酸分子」とは、任意選択的に合成、非天然、または改変のヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
【００８４】
「パーセント同一性」という用語は、当技術分野で公知のように、配列の比較により判定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当技術分野では、「同一性」とは、任意選択的に、そのような配列の鎖間の一致により判定される、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に限定されるものではないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含む、公知の方法により容易に算出することができる。
【００８５】
同一性を判定するための好ましい方法は、試験する配列間に最良の一致を与えるように設計されている。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手できるコンピュータプログラム中に成文化されている。配列アライメントおよびパーセント同一性の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムを使用して実施することができる。
【００８６】
配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載される）と標記され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムに見出されるアライメント法に相当する「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」を含む、数種類のアルゴリズムを包含する「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の算出のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後に、同じプログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００８７】
さらに、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が入手可能であり、これは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４に記載される）と標記され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出されるアラインメント法に相当する。多重アラインメントのデフォルトパラメーター（タンパク質／核酸として記述（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用する配列のアラインメント後に、同じプログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００８８】
多くのレベルの配列同一性が、同じまたは同様の機能または活性を有する、他の種に由来するポリペプチドを同定するのに有用であることは、当業者には十分理解されている。パーセント同一性の有用な例としては、以下に限定されるものではないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％が挙げられ、または５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％など、５０％〜１００％の任意の整数パーセントが目的のポリペプチドを同定するのに有用であることもある。また適切な核酸断片は、上記の同一性のいずれかを有し、かつ典型的には、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２５アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８９】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでも、独立に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、以下に限定されるものではないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および６）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられる。本出願に関連して、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別段の定めがない限り、分析の結果は、関係プログラムの「デフォルト値」に基づくものであることは理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００９０】
本明細書に使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング手法は当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈＥｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載されている。
【００９１】
本発明は、Ｄ−キシロース利用を増強したザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に関する。細胞はさらに、Ｌ−アラビノース利用を増強していることもある。本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞はエタノールの生産に有用である。
【００９２】
内因性ＺＭＯ０３５３遺伝子の改変
本発明は、操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の細胞を対象とし、この細胞は組換え細胞であり、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの少なくとも１つを利用し、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含有する改変内因性遺伝子を有する。配列番号１の配列は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株のゲノム配列中でＺＭＯ０３５３  ＯＲＦ（翻訳領域）として標記される（ＡＴＣＣ３１８２１株；ゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））およびＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿００６５２６．２）。機能タンパク質の発現を破壊するＺＭＯ０３５３  ＯＲＦの改変は、Ｄ−キシロース、またはＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースを利用する、操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の細胞におけるＤ−キシロース利用を改善することが、本明細書において見出された。さらに、アラビノースの使用が、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースを利用する、操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の細胞で改善された。
【００９３】
ＺＭＯ０３５３コード領域は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼをコードするものとしてアノテートされている。しかしながら、ＺＭＯ０３５３にコードされたタンパク質に相同な酵素が、リブロース−５−リン酸還元酵素およびＣＤＰ−リビトールピロホスホリラーゼ活性の両方を有することが、Ｆｏｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９９）Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８１：２００１−２００７）により見出された。この酵素はさらに、Ｄ−リブロースリン酸還元活性（Ｚｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：５０４１−５０４８）を有するとして特徴づけられた。
【００９４】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の他株のゲノムはそれぞれ、ＺＭＯ０５３５  ＯＲＦに均等な内因性遺伝子を有する。例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ１１１６３は、配列番号１に対して９９％の同一性を有するＯＲＦ（配列番号２）を有し、ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３とも呼ばれるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４は、配列番号１に対して９８％の同一性を有するＯＲＦ（配列番号３）を有し、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−１２５２６は、配列番号１に対して９８％の同一性を有するＯＲＦ（配列番号４）を有し、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）、ＡＴＣＣ２９１９１は、配列番号１に対して９８％の同一性を有するＯＲＦ（配列番号５）を有し、またザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）亜種モビリス（ｍｏｂｉｌｉｓ）、ＡＴＣＣ１０９８８は、配列番号１に対して９７％の同一性を有するＯＲＦ（配列番号６）を有する。したがって、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のあらゆる株は、配列番号１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を有すると予測され、また本明細書においてＺＭＯ０３５３に言及されるとき、これらのコード領域は含まれる。本細胞では、ＺＭＯ０３５３として同定されたコード領域を含有する遺伝子による機能タンパク質の発現は破壊されている。
【００９５】
ＺＭＯ０３５３として同定されたコード領域を含有する遺伝子による機能タンパク質の発現の破壊は、ｍＲＮＡもしくはタンパク質のその発現またはコード化タンパク質の機能もしくは安定性に影響を及ぼす方法など、当業者に公知の任意の方法により達成することができる。遺伝子改変は、例えば、コード領域またはプロモーターなどの遺伝子の他の領域における挿入、欠失、または突然変異であり得る。方法としては、以下に限定されるものではないが、遺伝子の全体または一部の欠失、コード化タンパク質が発現できないようにＤＮＡ断片を遺伝子に挿入すること（プロモーターまたはコード領域のいずれかにおいて）、機能タンパク質が発現されないように、停止コドンまたはフレームシフトを付加する突然変異をコード領域に導入すること、および非機能タンパク質が発現されるように、アミノ酸を変えるための１つまたは複数の突然変異をコード領域に導入することが挙げられる。これらの方法はすべて、公知の標的ＺＭＯ０３５３コード配列（配列番号１など）および完全なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列（例えば、ＺＭ４についてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）中で利用可能な配列など、この標的配列を取り囲むザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡ配列を使用して容易に実行することができる。
【００９６】
標的遺伝子を含有するＺＭＯ０３５３中に遺伝子改変を作製するために特に適切な方法は、本明細書の実施例１および２において例示されるように、ゲノムからコード配列を欠失させることである。標的コード領域に隣接して位置するゲノム配列領域を含有するプラスミドを構築する。このプラスミドでザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を形質転換すると、２つの組換え事象が起こり、第１の事象でプラスミド全体が組み込まれ、第２の事象でプラスミド配列および標的コード領域が欠失する。
【００９７】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のＺＭＯ０３５３配列を欠失させると、ＺＭＯ０３５３欠失がなく、かつ他の点では同一である細胞と比較して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＤ−キシロース利用細胞においてＤ−キシロース利用が増大することが本明細書の実施例３で示された。９６．１ｇ／ＬのＤ−キシロースで開始して培地中で増殖させると、第１の培養物では、２３時間後にＤ−キシロース利用が１３．２％増大すること、および４６時間後に１９．６％増大することが示された。欠失株によるＤ−キシロース利用は、１４４時間の実験全体を通して欠失がない株よりも大きいままであり、１４４時間時点でのＤ−キシロース利用は３．３％の増大であった。第２の培養物では、キシロース利用の増大は一層大きかった。
【００９８】
ＺＭＯ０３５３の欠失を有する、Ｄ−キシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞である細胞の培養物は、０．０５のＯＤ６００から開始して、約９６ｇ／ＬのＤ−キシロースを最初に含有する培地中で４６時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約５６ｇ／ＬのＤ−キシロースを使用した。種々の実施形態では、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を有し、この遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されている細胞の培養物は、これらの条件下で増殖させると、少なくとも約５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０ｇ／Ｌ、またはそれを超えるＤ−キシロースを使用する。
【００９９】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中のＺＭＯ０３５３配列を欠失させると、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用細胞のＤ−キシロース利用およびＬ−アラビノース利用が増大することが、本明細書の実施例６に示された。９６．８ｇ／ＬのＤ−キシロースで開始して培地中で増殖させると、Ｄ−キシロース利用は、欠失がなく他の点では同一である株の培養物と比較して、欠失株培養物では、平均して２４時間後に７倍超、６７時間後に４倍超高くなった。４８．８ｇ／ＬのＬ−アラビノース上で増殖する培養物では、Ｌ−アラビノース利用は、欠失がなく他の点では同一である株の培養物と比較して、培養物または欠失株では、平均して２４時間後に２倍超になり、６７時間後でも依然として５０％超大きかった。
【０１００】
Ｄ−キシロース利用細胞またはＤ−キシロースおよびＬ−ラビノース利用細胞における、Ｄ−グルコースまたはＬ−アラビノースの利用増大は、細胞の他の遺伝子改変、増殖培地、培養条件、および分析時間などの因子に応じて異なることになる。ＺＭＯ０３５３改変がないこと以外は同一の細胞と比較して、本細胞によるキシロース利用の増大は、少なくとも約１％、５％、８％、１０％、１２％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％であるか、またはそれを超える。ＺＭＯ０３５３改変がないこと以外は同一の細胞と比較して、本細胞によるＬ−アラビノース利用の増大は、少なくとも約１％、５％、８％、１０％、１２％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％であるか、またはそれを超える。
【０１０１】
ＺＭＯ０３５３の欠失を有する、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞である細胞の培養物は、０．０６のＯＤ６００から開始
して、約４９ｇ／ＬのＬ−アラビノースを最初に含有する培地中で４３時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約２８ｇ／ＬのＬ−アラビノースを使用した。種々の実施形態では、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を有し、この遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されている細胞の培養物は、これらの条件下で増殖させると、少なくとも約２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０ｇ／Ｌ、またはそれを超えるＬ−アラビノースを使用する。
【０１０２】
ＺＭＯ０３５３の欠失を有する、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞である細胞の培養物は、０．０６のＯＤ６００から開始して、約９７ｇ／ＬのＤ−キシロースを最初に含有する培地中で４３時間にわたって振盪させながら３３℃で増殖させると、少なくとも約２０ｇ／ＬのＤ−キシロースを使用した。種々の実施形態では、配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を有し、この遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されている細胞の培養物は、これらの条件下で増殖させると、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５ｇ／Ｌ、またはそれを超えるＤ−キシロースを使用する。
【０１０３】
種々の実施形態では、細胞は、上記の培養条件下で、少なくとも約２０ｇ／ＬのＤ−キシロースおよび少なくとも約２８ｇ／ＬのＬ−アラビノースなど、上記それぞれの使用に対して示された量の任意の組合せでＬ−アラビノースおよびＤ−キシロースを使用する。
【０１０４】
さらに、本明細書の実施例６に示されるように、エタノール生産も、ＺＭＯ０３５３欠失株で改善された。９６．８ｇ／ＬのＤ−キシロース上での増殖により、欠失がなくその他の点では同一の株と比較して、エタノール生産が、欠失株の培養物で利用されるキシロース量の増大に比例して増大した。エタノール生産の増大は、２．４倍〜６倍以上で変動した。また、４８．８ｇ／ＬのＬ−アラビノース上での増殖により、欠失がなくその他の点では同一の株と比較して、エタノール生産が、欠失株の培養物におけるアラビノース利用の増大に比例して増大した。エタノール生産の増大は、１８％〜５８％以上で変動した。
【０１０５】
本細胞によるエタノール生産の増大は、細胞の他の遺伝子改変、増殖培地、培養条件、および分析時間などの因子に応じて異なることになる。ＺＭＯ０３５３改変がないこと以外は同一の細胞と比較して、本細胞によるエタノール生産の増大は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％であるか、またはそれを超える。
【０１０６】
Ｄ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
Ｄ−キシロースを使用する能力を付与する任意の遺伝子改変を、本組換えＤ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中に存在させることができる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、および／またはスクロースを発酵基質として使用してエタノールを天然に生産するが、Ｄ−キシロースは代謝されない。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）など、エタノールを生産するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、エタノールへのＤ−キシロース発酵用に操作されている。典型的には、米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１）、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載のように、Ｄ−キシロース代謝に関与する４種の酵素を発現させてＤ−キシロース利用代謝経路を形成させるために、４つのコード領域がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入された（図１を参照）。これらの酵素には、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの変換を触媒するＤ−キシロースイソメラーゼ、およびＤ−キシルロースをリン酸化してＤ−キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼが含まれる。さらに、解糖系のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ経路にペントース代謝を連結させる中間体にキシルロース５−リン酸を変換するペントースリン酸経路の２種の酵素であるトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼが発現され、これによりＤ−キシロースのエタノールへの代謝が可能になる（図１を参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌ならびに一部の酵母および真菌など、Ｄ−キシロースを代謝することができる数多くの微生物のいずれかから得ることができる。これらのコード領域に対する供給源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を挙げることができる。
【０１０７】
これらのタンパク質およびそのコード領域の配列は周知であるため、適切なタンパク質およびコード領域は、上記に記載のものなどのＤ−キシロース利用微生物において、酵素活性、Ｅ．Ｃ．番号、および／またはバイオインフォマティクスを使用する配列類似性に基づいて、またＬ−アラビノース利用経路遺伝子について下記に記載の実験的方法によって、当業者により容易に同定することができる。
【０１０８】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）、アクチノプラネス・ミソリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子のプロモーター（ＧＩプロモーター、Ｐｇｉ）など、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に発現をもたらすプロモーターに作動可能に連結される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９８９，２０６号明細書に開示される、発現を増大させる突然変異ＧＡＰプロモーターも、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に有用である。これらのコード領域を、プロモーターから個別に発現させることも、または２つ以上のコード領域を１つのオペロンに連結して同じプロモーターから発現させることもできる。得られるキメラ遺伝子は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入し、プラスミド上で維持することも、または例えば、相同組換え、部位特異的組込み、またはランダム組込みを使用して、ゲノムに組み込むこともできる。
【０１０９】
ベクターは当技術分野で周知である。米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８など、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）との両方で複製することができるベクターは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に特に有用である。ベクターとしては、細胞中で自律複製するプラスミド、および細胞ゲノムに組み込まれるコンストラクトを担持するプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組込み用のプラスミドとしては、トランスポゾン、標的細胞ゲノムに相同な核酸配列領域、部位特異的組込み配列、または組込みを支援する他の配列を挙げることができる。相同組換えでは、標的組込み部位に両端で隣接するＤＮＡ配列が、所望のキメラ遺伝子および任意選択的に選択可能マーカーに接して配置され、キメラ遺伝子の標的ゲノム部位への組込みがもたらされる。
【０１１０】
Ｄ−キシロース利用代謝経路を発現するように操作された菌株の例としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、ならびにＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）と誘導体ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）、およびＺＷ７０５（米国特許第８，２４７，２０８号明細書）が挙げられる。Ｄ−キシロース代謝経路について操作された細胞は、Ｄ−キシロース含有培地中での適応期間後にＤ−キシロース利用の改善を示し得るため、Ｄ−キシロース利用代謝経路を発現するように操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞も、Ｄ−キシロース含有培地に適応させてもよい。Ｄ−キシロース含有培地への適応は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２２３，５７５号明細書および米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されている。
【０１１１】
一実施形態では、Ｄ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、上記に記載されるとおりである。他の実施形態では、Ｄ−キシロース利用を改善する１つまたは複数のさらなる改変が細胞中に存在する。Ｄ−キシロース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中に存在し得る、Ｄ−キシロース利用を改善するさらなる改変としては、以下に記載のものが挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４１，１１９号明細書に開示されるように、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）活性を低減する遺伝子改変を細胞中に存在させることができる。ＧＦＯＲ発現の低減は、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載のものおよびＺＭＯ０３５３コード領域を含有する遺伝子の破壊について下記に記載のものなど、当業者に公知の任意の方法によるものでよい。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株のＧＦＯＲに対するコード領域の配列は、配列番号７である。９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の均等な配列が、他のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株中に存在し得る。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）について完全なゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）で入手可能なものなど、ＧＦＯＲコード配列を取り囲むＤＮＡ配列も、一部の改変手順（下記に記載）に有用である。
【０１１２】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２−０１５６７４６号明細書に開示されるように、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性を増大させる遺伝子改変を細胞中に存在させることができる。ＲＰＩ発現の増大は、当業者に公知の任意の方法により達成することができる。例えば、天然プロモーターよりも高度に活性なプロモーターを用いて内因性ＲＰＩコード遺伝子の発現を増大させる改変、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における、リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有する任意のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子の発現による改変を行うことができる。米国特許出願公開２０１２−０１５６７４６号明細書に記載されるように、ＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂと呼ばれる２群のリボース−５−リン酸イソメラーゼ酵素があり、これらはいずれも発現され得る。内因性ならびに異種ＲＰＩの例にはそれぞれ、配列番号８のアミノ酸配列を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＭ４由来のもの、ならびに配列番号９および１０のアミノ酸配列およびコード配列をそれぞれ有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものがある。ＲＰＩ活性を増大させるために発現させることができる配列としては、米国特許出願公開第２０１２−０１５６７４６号明細書で同定されたもの、および当業者によるＢＬＡＳＴ分析により同定されたものが挙げられる。
【０１１３】
アルドース還元酵素活性、具体的には、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰに変換される）またはＮＡＤＨ（ＮＡＤに変換される）などのコファクターの存在下でキシロースをキシリトールに変換する酵素を低減する遺伝子改変を細胞中に存在させることができる。この反応においてＮＡＤＰＨを使用する酵素は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３２号明細書に開示されるように、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素と呼ばれ、ＥＣ１．１．１．２１に帰属させることができる。この改変により、キシロース利用経路遺伝子を含有する細胞による、炭素源としてＤ−キシロースのみを含有する培地上での増殖が即時に可能になる。このような遺伝子改変は、ＺＭＯ０９７６コード領域（配列番号１１；Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４株の配列番号１２のタンパク質をコードする（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２））、ならびに／またはＺＭＯ０９７６、ＺＭＯ１３４４、ＺＭＯ１６７３、およびＺＭＯ１７７３と命名された、他の推定上のアルド／ケト還元酵素の１つまたは複数のコード領域において行うことができる。
【０１１４】
さらに、Ｄ−キシロース利用代謝経路の一部として発現されるＤ−キシロースイソメラーゼを、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９８９，２０６号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書に開示される、変異した高度に活性なプロモーターを使用して発現させてもよい。この中に開示された変異プロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである。さらに、Ｄ−キシロース利用代謝経路の一部として発現されるＤ−キシロースイソメラーゼは、米国特許第８，６２３，６２３号明細書に開示される、ＥＣ５．３．１．５により識別される酵素クラスに含まれる群ＩのＤ−キシロースイソメラーゼであってもよい。Ｄ−キシロース利用細胞で発現されるＤ−キシロースイソメラーゼは、群１のＤ−キシロースイソメラーゼとすることができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，６２３号明細書に開示されるように、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）において、群２のＤ−キシロースイソメラーゼよりも良好な活性を示す。
【０１１５】
さらに、米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３１号明細書に開示されるように、本細胞は、コード領域を短縮してＣ末端短縮タンパク質の発現をもたらす、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ｐｎｐ）をコードする内因性遺伝子の配列中の少なくとも１つの遺伝子改変を有し得る。この改変は、キシロース利用細胞のキシロース利用を改善することができる。ポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするとして同定されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の任意の遺伝子は、改変のための標的内因性ｐｎｐ遺伝子を提供することができる。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＭ４のｐｎｐコード領域は、配列番号１３の配列を有する。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の他株に由来する公知の内因性ｐｎｐコード領域は、配列番号１に対して９９％（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＮＣＩＭＢ１１１６３；配列番号１５）、９８％（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１０９８８；配列番号１７）、および８３％（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ポマセアエ（ｐｏｍａｃｅａｅ）ＡＴＣＣ２９１９２；配列番号１９）の同一性がある配列を有する。これらの配列のいずれか、またはこれらの配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、かつポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするとして同定される任意の配列は、改変のための標的として使用することができる。さらなる標的内因性ｐｎｐ遺伝子配列は、ＢＬＡＳＴ分析または当業者に周知の他の配列比較分析を使用して同定することができる。
【０１１６】
ｐｎｐコード領域は、天然にコードされたタンパク質と比較して、３’末端のコード領域を短縮してＣ末端短縮タンパク質の発現をもたらすように改変することができる。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の天然にコードされたポリヌクレオチドホスホリラーゼは、約７４８アミノ酸のタンパク質であり、これは、配列番号１４、１６、１８、２０のいずれか、またはこれらの配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、かつポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼとして同定される任意の配列である。改変ｐｎｐコード領域から発現される短縮タンパク質は、天然のＮ末端アミノ酸である、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内因性遺伝子によりコードされるＮ末端アミノ酸配列の少なくとも３５０アミノ酸および最大約７１０アミノ酸を保持することができる。米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３１号明細書に開示されるように、短縮された天然コード領域に隣接し、かつインフレームにある非天然アミノ酸のさらなるコード配列を、融合タンパク質を生成するように加えることができる。融合タンパク質の例は配列番号２１〜２４である。この改変は、当業者に公知の任意の方法により実施することができる。典型的には、標的化組込み事象が実施される。内因性ｐｎｐ遺伝子の遺伝子改変を含有するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の一例は、Ｉ株であり、これは本明細書の実施例の部に記載される。
【０１１７】
アラビノース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
アラビノースを使用する能力を付与する任意の遺伝子改変を、本Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中に存在させることができる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は天然にはアラビノースを代謝しない。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）など、エタノール生産ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株は、エタノールへのアラビノース発酵用に操作されている。典型的には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されるように、アラビノース利用代謝経路を形成させる目的で、３種の異種コード領域が、アラビノース代謝に関与する酵素の発現のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入された（図１を参照のこと）。これらの酵素には、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースをＬ−リブロース５−リン酸に変換するＬ−リブロースキナーゼ、およびＬ−リブロース５−リン酸をＤ−キシルロース５−リン酸に変換するＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼが含まれる。
【０１１８】
これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、アラビノースを代謝することができる任意の微生物から得ることができる。このコード領域に対する供給源には、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が含まれる。特に有用であるのは、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ：ａｒａＡのコード領域（コード領域配列番号２５；タンパク質配列番号２６）、Ｌ−リブロキナーゼ：ａｒａＢのコード領域（コード領域配列番号２７；タンパク質配列番号２８）、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ：ａｒａＤのコード領域（コード領域配列番号２９；タンパク質配列番号３０）に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。上記に示す配列に例示されるように、これらのタンパク質およびそのコード領域の配列は周知であるため、さらなる適切なタンパク質およびコード領域を、バイオインフォマティクスを使用する配列類似性に基づいて、また実験的方法によっても、当業者により、上記に記載のものなどの他のアラビノース利用微生物中に容易に同定することができる。典型的には、本明細書に提示のものなど、公知のＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースキナーゼ、またはＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼのアミノ酸配列による、公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記）検索を使用して、本株に使用することができる、同じ機能を有するさらなるタンパク質およびそのコード配列を同定する。これらのタンパク質は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースキナーゼ、またはＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼの活性を有する一方、配列番号２６、２８、または３０のそれぞれＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースキナーゼ、またはＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼのアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％の配列同一性を有し得る。同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメーターを使用する、アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づくものである。
【０１１９】
タンパク質またはコード領域の配列およびバイオインフォマティクスの方法を使用して、同じ活性を有するさらなるタンパク質を同定することに加えて、本明細書に記載の配列または当技術分野で列挙される配列を使用して、天然にある他のホモログを実験的に同定することができる。例えば、本明細書に記載のコード核酸断片のそれぞれを使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを使用する相同遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、以下に限定されるものではないが、１．）核酸ハイブリダイゼーション法；２．）核酸増幅技術の種々の使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］；ならびに３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。
【０１２０】
例えば、本明細書に記載する、公知のＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースキナーゼ、またはＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼのコード配列に類似のタンパク質またはポリペプチドのコード領域は、インスタント核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用い、当業者に周知の方法を使用して、所望の任意の生物からライブラリーをスクリーニングすることにより直接単離することができよう。開示核酸配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の方法により設計および合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、配列全体を直接使用して、当業者に公知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識化、ニックトランスレーション法、もしくは末端標識化手法）によるＤＮＡプローブ合成、または利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを用いるＲＮＡプローブ合成を行うことができる。さらに、特定のプライマーを設計および使用して、インスタント配列の一部（または全長）を増幅することができる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識するか、または増幅反応の後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションにより全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして使用することができる。
【０１２１】
典型的には、ＰＣＲ型増幅手法では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ正確な複製を実現するように設計されるべきである。ＰＣＲプライマー設計の方法は、当技術分野で一般的でありかつ周知である（Ｔｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ  Ｅｄ．，（１９８６）ｐｐ３３−５０，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ３１−３９，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１２２】
一般に、記載する配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコールで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸断片のライブラリーで実施することができ、この場合、一方のプライマー配列は記載の核酸断片に由来するものであり、他方のプライマー配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端のポリアデニル酸領域の存在を利用するものとなる。
【０１２３】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクター由来の配列に基づくものでもよい。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従い、ＰＣＲを使用して転写物の一地点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを生成させることができる。３’および５’方向に向けたプライマーをインスタント配列から設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【０１２４】
あるいは、目的のコード配列は、ホモログの同定のためのハイブリダイゼーション試薬として使用することができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素としては、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると推測される試料、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的には、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５塩基から数万塩基まで変動し得るものであり、実施される特定の試験に依存することになる。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出すべき核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイズした領域にある塩基の特定の分画が適切な相補的塩基と対を形成しない結果となりながらも、ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間で起こる。
【０１２５】
アラビノース利用経路をコードする領域は、プロモーターに作動可能に連結してベクター中にキメラ遺伝子を作製し、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を形質転換するために使用することができ、すべては、キシロース利用経路をコードする領域について上記したとおりである。
【０１２６】
さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの活性は、アラビノースからエタノールへの生合成経路中で使用され（図１を参照のこと）、上記のＤ−キシロース利用経路と共通である。
【０１２７】
アラビノース含有培地への適応により、アラビノース代謝経路について操作された細胞の一部でアラビノース利用が改善されるため、アラビノース利用代謝経路を発現するように操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞も、アラビノース含有培地に適応させてもよい。
【０１２８】
アラビノース利用細胞はさらに、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１４３４０８号明細書にアラビノース利用を改善することが開示されたａｒａＥ遺伝子由来のコード領域を発現させることによって、アラビノース−プロトン共輸送体を発現させてもよい。
【０１２９】
さらなるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の改変
バイオマス加水分解物を含有する培地中での増殖およびエタノール生産を改善するさらなる改変を、本Ｄ−キシロース利用またはＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース利用のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中に存在させることができる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４７，２０８号明細書に開示されるように、エタノールおよび酢酸アンモニウムを含有するストレス培養物中での増殖に適応した可能性がある。酢酸許容性が改善されたこれらのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、酢酸を含有するセルロース系バイオマス加水分解物含有発酵培地を使用する場合、特に有用である。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４７６，０４８号明細書に開示されるように、加水分解物培地中の連続流動培養に適応した可能性がある。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、米国特許第８，４７６，０４８号明細書に開示されるように、ＺＭＯ１４３２翻訳領域（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿００６５２６．２）の遺伝子改変を有することができ、これによりバイオマス加水分解物に対するより高度な許容性が付与される。
【０１３０】
エタノール生産のための発酵
Ｄ−キシロース利用経路を有するか、またはＤ−キシロース利用経路およびＬ−アラビノース利用経路を有し、かつ配列番号１に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む内因性遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を有し、この遺伝子による機能タンパク質の発現が破壊されている操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、エタノールを生産するための発酵に使用することができる。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）は、天然のエタノール生産菌であり、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生産は図１に示される。
【０１３１】
一例として、本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞によるエタノールの生産を記載する。エタノール生産のために、糖類の混合物、またはＤ−キシロースもしくはＬ−アラビノースのいずれかを唯一の糖として含有する培地と組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞とを接触させる。典型的には、培地は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、およびＤ−グルコースを含む糖類の混合物を含有する。培地は、処理されたセルロース系またはリグノセルロース系のバイオマスに由来するこれらの糖を含むバイオマス加水分解物を含有することができる。
【０１３２】
混合の糖類濃度が高いために増殖が阻害される場合、米国特許第７，６２９，１５６号明細書に開示されるように、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含むことができる。ガラクチトールもしくはリビトールをソルビトールもしくはマンニトールと交換または組み合わせることができる。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、培地中で増殖し、そこで発酵が起こり、エタノールが生産される。発酵は、空気、酸素、または他のガスを補充することなく（これには嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵の条件が含まれ得る）、少なくとも約２４時間実行され、また３０時間以上実行され得る。最大のエタノール生産に到達するタイミングは、発酵条件に応じて変動し得る。典型的には、阻害物質が培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の温度、約４．５〜約７．５のｐＨで実行することができる。
【０１３３】
本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、実験室規模の発酵槽において、また商業規模のエタノール量を生産するスケールアップした発酵において、Ｄ−キシロースを含む混合糖類を含有する培地中で増殖せることができる。エタノールの商業生産が所望される場合には、種々の培養方法が適用され得る。例えば、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株による大規模生産は、バッチによっても連続培養法によっても生産することができる。古典的バッチ培養法は、培地の組成が培養の開始時に設定されており、培養工程の間に人為的に変更されない閉鎖系である。したがって、培養工程の開始時に所望の生物を培地に接種し、系に何も添加せずに増殖または代謝活性を生じさせる。しかしながら、典型的には、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関してのバッチであり、多くの場合、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成は、培養を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的な誘導期を通して高度な対数増殖期に、かつ最終的には増殖速度が減退または停止する静止期に落ち着く。処理をしないと、静止期にある細胞はやがて死滅することになる。いくつかの系では、対数期にある細胞が、最終産物または中間体の生産の大半に関与することが多い。他の系では、静止期または対数期後に生産が得られ得る。
【０１３４】
標準バッチ系の変法は、フェドバッチ系である。フェドバッチ培養工程も、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の増殖に適し、培養の進行につれて基質を徐々に添加することを除いて、典型的なバッチ系を構成する。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、また培地中の基質量が限定されることが望ましい場合、フェドバッチ系は有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、およびＣＯ２などの排ガスの分圧等、測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチの培養法は当技術分野において一般的かつ周知であり、例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）に見出すことができる。
【０１３５】
エタノールの商業生産はまた、連続培養でも達成することができる。連続培養は、合成培養培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を処理のために取り出す開放系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、固定化細胞を用いて実施することもでき、そこでは、炭素および栄養素を連続的に添加し、有用産物、副産物、または老廃物を細胞塊から連続的に取り出す。細胞の固定化は、当業者に公知のように、天然および／または合成材料で構成される広範な固体支持体を使用して実施することができる。
【０１３６】
連続培養または半連続培養は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの要素または任意の数の要素の調節を可能にする。例えば、一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を一定の比率に保持して、すべての他のパラメーターの調節を可能にする。他の系では、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に保持しながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更することができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持することに取り組み、したがって培地の抜き取りによる細胞損失に培養中の細胞増殖速度を均衡させなければならない。連続培養工程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに産物形成速度を最大化する手法は、工業微生物学の技術分野で周知であり、種々の方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０１３７】
エタノール生産に特に適するのは、以下のような発酵計画である。本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を、振盪させることなく、約３０℃〜約３７℃で復活させて増殖させた後、軌道振盪機によって約１５０ｒｐｍで振盪しながら、約３０℃〜約３７℃の半天然培地を含む振盪フラスコに移し、次いで同様の培地を含有する種発酵槽に移す。必要に応じて、所望の生物量を生成させるために一連の種発酵槽が必要とされることがある。種培養物を、所望の生物密度まで嫌気的に種発酵槽中で増殖させ、そこで発酵パラメーターがエタノール生産用に最適化されている生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移す典型的な接種量は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、培地量の５０％超でバイオマス加水分解物を含有する。最終濃度が約１０ｍＭのソルビトールまたはマンニトールを培地中に存在させることができる。発酵は、苛性アルカリ溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に制御される。発酵槽の温度は３０℃〜３５℃に制御される。起泡を最小限に抑えるために、消泡剤（任意の種類  −  シリコーンベース、有機ベースなど）を必要に応じて容器に加える。
【０１３８】
上記の任意の条件セット、およびさらに当技術分野で周知のこれらの条件のバリエーションは、本組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生産のための適切な条件である。
【実施例】
【０１３９】
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方、例示としてのみ示されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対する種々の変更形態および修正形態をなして、様々な使用および条件に本発明を適合させることができる。
【０１４０】
一般的方法
略語の意味は以下のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」または「Ｃｍ−Ｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓはスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＤＣＯ」は二重交差を意味し、「ＵＴＲ」は非翻訳領域を意味し、「〜」は約を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍでの光学濃度を意味する。
【０１４１】
プライマーは、特に明記されない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）により合成された。
【０１４２】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のコンピテント細胞は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の凍結バイアルに由来する、ＭＲＭＧ５培地の５ｍＬ培養物を最初に接種することにより生成させた。この５ｍＬ培養物を、１２５ｒｐｍで振盪させながら３３℃で約１８時間増殖させた。この時点で、５ｍＬ培養物を、１００ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５培地中に希釈した。この１００ｍＬ培養物を、ＯＤ６００が約０．４に達するまで、１２５ｒｐｍ、３３℃で増殖させた。この時点で、培養物を氷上に３０分間置き、次いで遠心分離により細胞を回収した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを１０％（ｖ／ｖ）グリセロールの０℃無菌水溶液に再懸濁し、最終容積２０ｍＬにした。細胞を再度遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを１０％グリセロールの０℃無菌水溶液に再懸濁し、最終容積５ｍＬにした。細胞を再度遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを１０％グリセロールの０℃無菌水溶液に再懸濁し、最終容積０．５ｍＬにした。必要になるまで、０．０５ｍＬのアリコートを別々に−８０℃に凍結した。
【０１４３】
基本的に米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるように、エレクトロポレーションを使用して、プラスミドＤＮＡをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞に導入した。手短に言えば、５０μｌの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の約１０１０細胞／ｍｌと、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０細胞から単離された１〜２μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡとを含有した。対照反応物は同様に処理されたが、いかなるプラスミドＤＮＡも導入されなかった。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦとし、キュベットのギャップ幅は０．１ｃｍとした。エレクトロポレーションに続いて、形質転換反応物をＭＭＧ培地で希釈し、細胞を３０℃で回収した後、示されるように抗生物質添加または無添加の１．５％寒天（ＭＭＧ寒天プレート）を含有するＭＭＧ培地上に播種した。コロニーが出現するまで、プレートを３０〜３３℃の嫌気性チャンバー内でインキュベートした。さらなる詳細は実施例に記載される。
【０１４４】
培地
ＭＭＧ培地：５０ｇ／ＬのＤ−グルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４
ＭＲＭ３：１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ
ＭＲＭ３Ｘ１０：１００ｇ／ＬのＤ−キシロース添加ＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ｇ５：５０ｇ／ＬのＤ−グルコース添加ＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ｇ１０：１００ｇ／ＬのＤ−グルコース添加ＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ａ１０：１００ｇ／ＬのＬ−アラビノース添加ＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ａ５：５０ｇ／ＬのＬ−アラビノース添加ＭＲＭ３
【０１４５】
ＨＰＬＣ分析
発酵サンプルを一定間隔で取り出し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）；条件＝０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を０．６ｍＬ／分、注入量＝１０μＬ、カラム温度＝６５℃、実行時間＝３０分、屈折率による検出（４０℃に維持））を使用して、エタノールおよび残存糖類について分析した。ＨＰＬＣカラムは、ＢｉｏＲａｄ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。検体は屈折率検出により定量し、既知標準と比較した。
【０１４６】
Ｚ．モビリス株ＺＭ４
Ｚ．モビリス株ＺＭ４はＡＴＣＣ＃３１８２１であり、ＺＷ１はＺＭ４株の別名である。
【０１４７】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））およびＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿００６５２６．２は両方ともＺＭ４株のゲノム配列に関するものである。
【０１４８】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
野生型親株ＺＷ１から開始する、Ｄ−キシロース利用組換え株ＺＷ８０１−４の構築に関する詳細な説明は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４１，１１９号明細書に示されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４１，０８４号明細書にすべて記載されるように、株ＺＷ８０１−４は株ＺＷ８００に由来し、株ＺＷ８００は株ＺＷ６５８に由来する。ＺＷ６５８は、Ｄ−キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、キシルロキナーゼ（ｘｙｌＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、およびトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）をコードする４つのＤ−キシロース利用遺伝子を含有する、２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子由来のコード領域と共に、逐次遺伝子転位事象によりＺＷ１（株ＺＭ４の改称；ＡＴＣＣ＃３１８２１）ゲノムに組み込み、次いでＤ−キシロースを含有する選択培地に適応させて、ＺＷ６４１と改名した株Ｘ１３Ｌ３を生成させることにより構築した。Ｄ−キシロース含有増殖培地にＺＷ６４１をさらに適応させると、ＺＷ６５８が生じ、これはＤ−キシロース中ではるかに良好に増殖し、ブダペスト条約の下でＡＴＣＣＰＴＡ−７８５８として寄託した。参照により本明細書に組み込まれる同一譲渡人米国特許第７，９８９，２０６号明細書に開示されるように、ＺＷ６５８は、ｘｙｌＡコード領域を発現するプロモーター（Ｐｇａｐ）中の点突然変異により、はるかに高いＤ−キシロースイソメラーゼ活性を有する。本明細書において８０１ＧＡＰプロモーターまたはＳｕｐｅｒ  ＧＡＰプロモーターまたはＰｇａｐＳのいずれかで呼ばれるこのプロモーター（配列番号３１）は、ＺＷ６４１中の天然Ｐｇａｐ（６４１ＧＡＰプロモーター）と比較すると、配列番号３１の位置１１６において「Ｇ」の代わりに「Ｔ」を有する。ＰｇａｐＳは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＰｇａｐよりも３〜４倍高い発現強度を有する。
【０１４９】
ＺＷ６５８では、グルコース−フルクトース酸化還元酵素をコードする遺伝子を、宿主媒介二重交差相同組換えを使用して挿入的に不活化し、選択可能マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して株ＺＷ８００を作製した。ｌｏｘＰ部位に隣接するスペクチノマイシン耐性マーカーを、Ｃｒｅレコンビナーゼを使用して部位特異的組換えにより除去し、株ＺＷ８０１−４を作製した。
【０１５０】
株ＺＷ７０５は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４７，２０８号明細書に記載されるように、酢酸アンモニウム含有培地中のストレス条件下での増殖に適応させることにより、ＺＷ８０４−１から生成した。
【０１５１】
Ｉ株は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１５７３３１号明細書、実施例１および２に記載されるように、株ＺＷ８０１−４から生成した。Ｉ株は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ発現カセット（ＰｇａｐＲＰＩ；配列番号３２）およびＳｐｅｃｒ−カセットを含むｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−Ｓｐｅｃ−ＧａｐＲｐｉ（図２）から作製したトランスポソームのランダム組込みから得た。Ｉ株中のＲＰＩ発現トランスポゾンの挿入部位は、ＤＮＡシークエンシングにより、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））のｎｔ５４３５０６と５４３５０７との間にあることが判明した。挿入領域のシークエンシングから、トランスポゾンの組込みにより、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするｐｎｐ遺伝子の翻訳領域の３’末端にフレームシフトが生じることが示された。得られた翻訳領域は、天然タンパク質の最後の３９アミノ酸残基を欠失し（Ｎ末端から始まる７０９アミノ酸を保持する）、そのＣ末端に１４個の新しいアミノ酸を有する突然変異タンパク質をコードする（配列番号２１）。Ｉ株は、Ｄ−キシロース培地中で、親株よりも良好な増殖を示すことが見出された。
【０１５２】
実施例１
ＺＭＯ０３５３翻訳領域の欠失のための構築物
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＭ４の公開されたゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））中のＺＭＯ０３５３（配列番号１）と命名された翻訳領域をザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムから容易に欠失させるために、ｐ３２３ｄｅｌ（配列番号３３）と命名されたプラスミドを構築した。
【０１５３】
ｐ３２３ｄｅｌはｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−ＣＭに由来し、その構築は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１５７３３２号明細書、実施例３に記載されている。クロラムフェニコールに対する耐性を付与するＤＮＡ断片（Ｃｍｒ；市販プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）に由来する、その関連プロモーターを含むＣｍｒコード領域）を、米国特許第７，９８９，２０６号明細書に詳細に記載されるｐＭＯＤ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＳｐｅｃプラスミドのＮｏｔＩとＰａｃＩの部位間に、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｒ）に対する耐性を付与するＤＮＡ断片と交換するように挿入して、ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−ＣＭを作製した。ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−ＣＭは、Ｔｎ５トランスポサーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）間に位置してトランスポソームを形成するｌｏｘＰ両端隣接Ｃｍｒ−カセットを有する。
【０１５４】
プラスミドｐ３２３ｄｅｌの概略を図３に示す。３２３−Ｌと命名された領域（位置３５５〜１３５８０）は、ＺＭＯ０３５３の５’側に隣接して位置する、ＺＭ４ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））のヌクレオチド３５０３９２〜３５１３９５に関連する。３２３−Ｒと命名された領域（位置１３６７〜２３３８）は、ＺＭＯ０３５３の３’側に隣接して位置する、ＺＭ４ゲノム配列のヌクレオチド３５２７４０〜３５３７１１に関連する。
【０１５５】
ＺＭＯ０９７６およびＣＤＳ５７１と命名されたｐ３２３ｄｅｌのヌクレオチド２４１２〜３６２５は、ＺＭ４ゲノム配列のヌクレオチド９９２１４３〜９９３２３０に関連する。この配列は、ＺＭ４ゲノム配列中のＺＭＯ０９７６と命名されたアルドース還元酵素のコード領域と、推定上のプロモーターを含有する上流領域とを含有する。
【０１５６】
位置３６９０〜３０９の配列は、ｐＭＯＤｌｉｎｋｅｒ−ＣＭプラスミド由来である。このプラスミドを構築するために使用する制限酵素を図３に示す。
【０１５７】
実施例２
ＺＭＯ０３５３翻訳領域欠失株の構築
Ｄ−キシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＡＲ３  ７−３１を、ｐ３２３ｄｅｌで形質転換した（実施例１）。株ＡＲ３  ７−３１は、株ＺＷ７０５に由来した（一般的方法を参照のこと）。株ＡＲ３  ７−３１は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４７６，０４８号明細書に記載されるように、タービドスタット中で株ＺＷ７０５を増殖させた後で単離した。この株はここでは適応７−３１とも呼ばれる。この連続流動培養装置において、酢酸アンモニウムおよびエタノールの濃度は、加水分解物培地中で時間経過と共に増大した。ＡＲ３  ７−３１の全ゲノムをシークエンシングし、ＺＷ７０５ゲノムの配列と比較した。株ＡＲ３  ７−３１は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿００６５２６．２）のＺＭＯ１４３２翻訳領域に遺伝子改変を有することが見出された。ＺＭＯ１４３２は「フザリン酸耐性タンパク質」をコードするとしてアノテートされている。
【０１５８】
一般的方法に記載するように、株ＡＲ３  ７−３１のコンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞を、実施例１に記載する１μｇのｐ３２３ｄｅｌプラスミドを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換細胞をＭＭＧ培地１ｍＬに再懸濁し、３３℃で３時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により回収し、上清を除去し、細胞をＭＭＧ培地２００μＬに再懸濁した。再懸濁した細胞を、１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｂｉｏｍｙｘ）を含有する、２つのＭＭＧ寒天プレート（１プレート当たり１００μＬ）上に広げた。これらの寒天プレートを、嫌気性を維持するためのＧａｓ  Ｐａｋ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する密封ボックス内において３３℃で３日間インキュベートした。プレート上で増殖することが観察されたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちの３つを採取し、同じ培地のプレートに再度画線した。これらの新しいプレートを、同じ条件下でさらに３日間インキュベートした。クロラムフェニコール選択下での増殖中に、第１の組換え事象で、全プラスミドがゲノムに組み込まれる。
【０１５９】
３日インキュベーション後に、これらのプレートから３つの単一コロニーを採取し、ＭＭＧプレート上に画線し、同じ条件下で１日間インキュベートした。１日インキュベーション後に、３つの画線それぞれの単一コロニーを採取し、ＭＭＧプレートに再度画線し、さらに１日間インキュベートした。この時点で、３つの画線それぞれに由来する単一コロニーを採取し、別々のＭＲＭ３Ｘ１０プレート上に画線した。４日インキュベーション後に、これらのプレートから細胞を採取し、別々のＭＭＧプレート上に画線して、十分に分離した単一コロニーを得た。１日インキュベーション後に、単一コロニーを採取し、ＰＣＲによりスクリーニングしてＺＭＯ０３５３翻訳領域の欠失を確認した。プライマー３２３−Ｆ１および３２３−Ｒ６（それぞれ配列番号３４および３５）をＰＣＲ反応に使用した。所望の欠失を有することが確認された株をＡＲ３  Ｄ３２３と命名した。クロラムフェニコールを欠く培地上での増殖期間により、全プラスミドおよびＺＭＯ０３５３配列を欠失する第２の組換えが生じることが可能になる。炭素源としてＤ−キシロースを含有する培地上での増殖では、オリジナルプラスミド上のアルドース還元酵素の発現を使用して、第２の組換え事象に対する選択が得られる。米国特許出願公開第２０１３−０１５７３３２号明細書に開示されるように、アルドース還元酵素はＤ−キシロース利用に対する有害作用を有することが以前に見出されていた。
【０１６０】
実施例３
Ｄ−グルコースおよびＤ−キシロースを含有する培地における、ＺＭＯ０３５３翻訳領域欠失株によるＤ−キシロース使用の改善
実施例２に記載したＡＲ３  Ｄ３２３株の炭水化物消費能を、親株ＡＲ３  ７−３１と比較した。各株の凍結保存バイアルからＭＲＭ３Ｇ５培地の２つの２ｍＬ培養物を接種した（各株についてａおよびｂと標識）。４つの培養物をすべて、３３℃で振盪（１２５ｒｐｍ）させながら、約２０時間インキュベートした。この時点で、新鮮なＭＲＭ３Ｇ５培地３ｍＬを各培養物に加え、これらの培養物を同じ条件下でさらに５時間インキュベートした。この時点で、各培養物のＯＤ６００を測定し、０．０５のＯＤ６００計算値になるように、十分な量の各培養物をＭＲＭ３Ｘ１０培地１０ｍＬに加えた。これらの１０ｍＬ培養物を、１４４時間にわたって振盪（１２５ｒｐｍ）させながら、３３℃でインキュベートした。表１および２に示す時間にサンプルを取り出し、各培養物中のＤ−キシロースおよびエタノールの濃度を、一般的方法に記載のＨＰＬＣにより測定した。
【０１６１】
【表１】
2017518756.tif 000003
【０１６２】
【表２】
2017518756.tif 000004
【０１６３】
表１および２に示すように、ＡＲ３  Ｄ３２３株は、これらの条件下で、ＡＲ３  ７−３１株よりも迅速にＤ−キシロースを消費し、エタノールを生産し、翻訳領域ＺＭＯ０３５３の欠失により付与される利点が示された。
【０１６４】
実施例４
ｐｎｐ遺伝子座にアラビノース利用遺伝子を挿入するためのプラスミドの構築
ｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤと命名されたプラスミドをプラスミドｐＺＸ６（配列番号３６）に基づいて構築した。この構築は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１５７３３２号明細書、実施例２に記載されている。ｐＺＸ６は、ｐｎｐコード配列の末端近くでポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードする内因性ｐｎｐ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２においてＺＭＯ０５４９と命名）において、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへの組込みを誘導し、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおいてｐｎｐコード配列のセグメント（ｎｔ−２，０８４〜ｎｔ−２，１８８）を交換する二重交差ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターである。この位置が、使用している番号と同じ配列番号を使用して呼ばれていることを確認されたい。１，３１８ｂｐのＰＮＰ−Ｌ断片（配列番号３７）は、ｎｔ−７６７〜ｎｔ−２，０８４のｐｎｐコード配列（配列番号１３）のセグメントであり、一方、１，２２５ｂｐのＰＮＰ−Ｒ断片（配列番号３８）は、ｐｎｐコード配列の最後の５９ｂｐ（ｎｔ−２１８９〜ｎｔ−２２４７）および１，１６６ｂｐの下流ゲノム配列を含む。ｐＺＸ６は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞においてこのベクターが複製することを可能にする複製起点を含有する２，５８２ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片（図４のＺｙｍｏ  ＤＮＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体のいずれかの選択のための９１１ｂｐのクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ−Ｒ）、および９０９−ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（Ｏｒｉ）を含む。
【０１６５】
アラビノース利用に向けてザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を操作するための遺伝子を含めるために、キメラＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを含有するＳｐｅＩ−ＦｓｅＩ  ＤＮＡ断片（配列番号３９）をＳｐｅＩおよびＦｓｅＩ部位間でｐＺＸ６に挿入して、ＰｇａｐＴ−ｔａｌ−ｔｋｔオペロンおよびＰｅｎｏ−ｒｐｉ−ｒｐｅオペロンを置換し、ｐＡＲＡ３００３と命名される、図４に示す１２，３１１−ｂｐのＤＣＯシャトルベクターを得た。Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１−０１４３４０８号明細書、実施例１に記載されている。ＳｐｅＩ−ＦｓｅＩ断片は、このオペロンの３’側にＦｓｅＩ部位を含む配列を加えた、ｐＡＲＡ３５４（米国特許出願公開第２０１１−０１４３４０８号明細書の図３）のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片と同じである。ＳｐｅＩ−ＦｓｅＩ  ＤＮＡ断片は、３０５−ｂｐのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐ（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の１，７０１−ｂｐのａｒａ
Ｂコード領域（Ｌ−リブロースキナーゼをコードする、ＥＣａｒａＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の１，５０３−ｂｐのａｒａＡコード領域（Ｌ−アラビノースイソメラーゼコードする、ＥＣａｒａＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の６９６−ｂｐのａｒａＤコード領域（Ｌ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼをコードする、ＥＣａｒａＤ）、およびＥＣａｒａＤ遺伝子由来の１６６−ｂｐの３’ＵＴＲ（ＥＣａｒａＤ  ３’ＵＴＲ）を含む。
【０１６６】
ｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤ（図５に示す）を作製するために、ｐＡＲＡ３００３中のＳａｃＩ／ＳｐｅＩ断片を、オーバーラップＰＣＲにより作製した新しいＳａｃＩ／ＳｐｅＩ断片で置換した。プライマーＩＲｐｉ−Ｆ（配列番号４０）は、ＳａｃＩ部位と、それに後続する、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｉ株のゲノムに存在するｌｏｘＰ両端隣接Ｓｐｅｃｒ−カセットおよびＰｇａｐ−ＲＰＩ発現カセットのためのトランスポゾン挿入部位（ＭＥ）の上流にあるｐｎｐ遺伝子に結合する２４ｎｔとを有する順方向プライマーである。プライマーＩＲｐｉ−ｏ−Ｒ（配列番号４１）は逆方向プライマーである。その最後の２０ｎｔは、Ｉ株に存在するｌｏｘ両端隣接Ｓｐｅｃｒ−カセットのすぐ上流にある、同じＭＥ部位の下流にハイブリダイズし、一方、その最初の１６ｎｔは、Ｉ株においてＲＰＩ発現を駆動するＰｇａｐプロモーターの最初の１６ｎｔの逆相補鎖に相当する。プライマーＩＲｐｉ−ＦおよびＩＲｐｉ−ｏ−Ｒを使用して、Ｉ株ゲノムＤＮＡ由来のｐｎｐ遺伝子領域をＰＣＲ増幅し、オーバーラップＰＣＲ反応のためのＤＮＡ断片の１つを作製した。
【０１６７】
オーバーラップＰＣＲ反応ための他の断片は以下のように作製した。プライマーＩＲｐｉ−ｏ−Ｆ（配列番号４２）は順方向プライマーであり、プライマーＩＲｐｉ−ｏ−Ｒの逆相補鎖である。プライマーＩＲｐｉ−Ｒ（配列番号４３）は、その５’末端にＳｐｅＩ部位と、それに後続する、Ｉ株のｐｎｐ遺伝子座に存在するＰｇａｐ−ＲＰＩ発現カセットの３’末端にあるＸｙｌＡターミネーターのすぐ下流にハイブリダイズする２４ｎｔとを含有する逆方向プライマーである。ＩＲｐｉ−ｏ−ＦおよびＩＲｐｉ−Ｒを使用して、Ｉ株由来のＰｇａｐ−ＲＰＩ遺伝子領域をＰＣＲ増幅した。次いで、上記の２つのＰＣＲ産物を、プライマーＩＲｐｉＦおよびＩＲｐｉ−Ｒのみを使用するオーバーラップＰＣＲ反応のために組み合わせた。得られたオーバーラップＰＣＲ断片は、Ｐｇａｐ−Ｒｐｉ発現カセットに融合した、Ｉ株ゲノムのトランスポゾン挿入ｐｎｐ遺伝子領域の一部（Ｉ株中に短縮ｐｎｐタンパク質をもたらす、ｐｎｐ遺伝子の３’末端近くにフレームシフトを引き起こすＭＥを含む（一般的方法を参照のこと））を含有する。上記のオーバーラッピングＰＣＲ断片と、プライマーＩＲｐｉ−ＦおよびＩＲｐｉ−Ｒのみを使用してＩ株から増幅されたであろうオリジナル断片との間の唯一の本質的な相違は、オーバーラップＰＣＲ産物中にｌｏｘＰ両端隣接Ｓｐｅｃｒ−カセットがないことである。次いで、この新しい２３４０ｂｐのＰＣＲ増幅キメラＤＮＡ分子（配列番号４４）を、以下に記載のプラスミドｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤの構築のために使用した。
【０１６８】
ｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤの構築の最終ステップは、上記のオーバーラップＰＣＲ反応産物の２．３ｋｂのＳａｃＩ／ＳｐｅＩ断片と、ｐＡＲＡ３００３の１１ｋｂのＳａｃＩ／ＳｐｅＩ断片とのライゲーションであった。ライゲーション産物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、形質転換体を２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。プラスミドＤＮＡをＣｍｒコロニーから単離し、プラスミドの配列をシークエンシングにより確認した。
【０１６９】
実施例５
Ｄ−キシロースおよびアラビノースを利用し、Ｒｐｉを発現し、ｐｎｐの挿入およびＺＭＯ０３５３の欠失を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
株ＡＲ３  ７−３１およびＡＲ３  Ｄ３２３  １のコンピテント細胞を、一般的方法に記載するように調製し、エレクトロポレーションにより、実施例４に記載する１μｇのｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤプラスミドで形質転換した。１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＭＭＧ寒天プレート上に播種することにより、形質転換体を選択した。ＡＲ３  ７−３１の形質転換体を「ＡＲ３ＢＡＤ」と命名し、ＡＲ３  Ｄ３２３  １の形質転換体を「ＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤ」と命名した。単一コロニーを選択し、ＭＭＧクロラムフェニコールプレート上に再度画線した。８つの単一コロニーをこのプレートから選択し、ＭＲＭ３Ａ１０プレート上に再度画線した。次いで、コロニーを採取し、ＭＲＭ３Ａ１０プレート上に再度画線し、２日間インキュベートした。ＭＲＭ３Ａ１０上へのこの再播種をさらに３回繰り返した。ＭＲＭ３Ａ１０寒天上への４回目の播種後、ＡＲ３ＢＡＤおよびＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤのそれぞれについて４つのコロニーを採取し、ＭＲＭ３Ｘ１０寒天プレートおよびＭＭＧ寒天プレート上に画線した。ＡＲ３ＢＡＤ細胞の４つの画線はすべて、ＭＲＭ３Ｘ１０寒天上で極めて貧弱な増殖を示したが、ＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤ細胞の４つの画線はすべて、２４時間以内に可視的な増殖を示した。ＭＭＧ寒天プレートからの個々のコロニー（両株とも良好に増殖した）は、１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＭＭＧ寒天上に画線して、ｐＺＢｐｎｐＩＢＡＤプラスミドが染色体と組換えを起こし、その結果クロラムフェニコール耐性マーカーが消失したことを確認した。クロラムフェニコール感受性であると確認されたＡＲ３ＢＡＤおよびＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤのそれぞれについて４つのコロニーをさらなる評価のために保存した。
【０１７０】
実施例６
ＺＭＯ０３５３欠失株における、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースの消費の増大ならびにエタノールの生産
実施例５に記載のＡＲ３ＢＡＤおよびＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤのそれぞれについて４つの別々のコロニーを、種々の炭水化物を消費する能力についてさらに評価した。８株すべてを、凍結バイアルから接種したＭＲＭ３Ｇ５培地の２ｍＬ培養物中で約１８時間増殖させた。培養物を１２５ｒｐｍで振盪させながら１５ｍＬチューブ内において３３℃でインキュベートした。１８時間後、ＯＤ６００を測定し、ＭＲＭ３Ａ５またはＭＲＭ３Ｘ１０のいずれかの１０ｍＬ培養物を接種して、最終ＯＤ６００計算値が０．０６になるように十分な量を移した。これらの１０ｍＬ培養物を１２５ｒｐｍで振盪させながら３３℃でインキュベートし、表３、４、５、および６に示す時間にサンプルを取り出した。各培養物中の一次炭水化物（Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノース）およびエタノールの濃度を、一般的方法に記載するようにＨＰＬＣにより測定した。
【０１７１】
【表３】
2017518756.tif 000005
【０１７２】
【表４】
2017518756.tif 000006
【０１７３】
【表５】
2017518756.tif 000007
【０１７４】
【表６】
2017518756.tif 000008
【０１７５】
表に示すように、ＡＲ３Ｄ３２３ＢＡＤ株は、これらの条件下でＡＲ３ＢＡＤ株よりも迅速にＬ−アラビノースまたはＤ−キシロースを消費し、翻訳領域ＺＭＯ０３５３の欠失により付与される、５炭糖の消費速度に対する利点が示された。エタノール生産もまた、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの両培地中でΔＺＭＯ０３５３株でより迅速であった。
【図１】
2017518756.tif 000009
【図２】
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【図３】
2017518756.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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