(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを検出するための装置において、
リガンドと結合することによりリセプター−リガンド複合体を形成することができる少なくとも一つのリセプターであって、該リセプター−リガンド複合体が信号を生成するリセプターと；
増幅機構であって、該リセプターに連結したリオトロピック液晶物質であり且つ該リセプター−リガンド複合体が形成する際に該信号を増幅する増幅機構と；から構成されることを特徴とするリガンド検出装置。
【請求項２】
前記リセプターが、モノクロナール、ポリクロナール及び分子組換抗体でなる群から選択される抗体であり、且つリガンドが病原性因子であることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記増幅された信号が液晶物質の光学的特性の変化によって発生されることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項４】
リガンドの存在を検出及び監視するための装置において、
各々予め決められたリセプターを内部に有する多数のウェルであって、該リセプターはリガンドと結合することによりリセプター−リガンド複合体を形成することができ且つ該リセプター−リガンド複合体の形成により信号を生成する、多数のウェルと；及び
増幅機構であって、該予め決められたリセプターに連結したリオトロピック液晶物質であり且つ該リセプター−リガンド複合体が形成する際に該信号を増幅する増幅機構と；から構成されることを特徴とするリガンドの存在を検出及び監視するための装置。
【請求項５】
前記増幅された信号が認知可能な信号に変換されることを特徴とする請求項４記載の装置。
【請求項６】
リガンドを検出する方法において、
リガンドと結合することによりリセプター−リガンド複合体を形成することができる少なくとも一つのリセプターであって、該リセプター−リガンド複合体の形成により信号を生成するリセプターと；増幅機構であって、該リセプターに連結したリオトロピック液晶物質であり且つ該リセプター−リガンド複合体が形成する際に該信号を増幅する増幅機構と；から構成される装置を提供し、
該リセプターに特異的なリガンドを含有する試料を暴露し、
該リセプターと該リガンドとの複合体を形成させ、および
該リセプター−リガンド複合体の形成により発生した該信号を測定する工程から構成されることを特徴とするリガンドを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般的にはリセプターによるリガンドの検出に係る。さらに詳述すれば、本発明は、極めて特異的なリセプター、及びリガンド、特に病原体及び／又はそれらの毒素の迅速かつ自動的な検出のための増幅機構への該リセプターの応用に係る。
【０００２】
リセプターによるリガンドの検出（例えば、微生物又は毒素の如き病原性因子の抗体による検出；又は血液中の抗体の他の抗体による検出；又は神経ガスの如き化学毒素のそのリセプターへの結合）は、病気原因因子にさらされた個人の診断及び治療において重要である。病原性因子の早期検出は、症状が現れる又は悪化する前の病気の予防又は治療にとって大いに有益であろう。
【０００３】
微生物のいずれの種、菌株又は毒素もユニークな表面リガンドを含有する。分子組換え及び／又は免疫学的技術を使用することにより、前記リガンドと高度の特異性をもってを結合するであろう抗体の如きリセプター分子が単離される。抗体の如きリセプターを、結合の際に活性化される信号機構とリンクさせる方法も提案されている。しかしながら、これまでのところ、ただ１つの又は少数のリガンドの結合から発生されるリセプター信号を迅速かつ自動的に検出及び増幅できるシステムは開発されていない。このようなシステムは、リガンドの迅速かつ正確な早期検出には避けられないものである。
【０００４】
最もよく利用される診断テストは抗体に基づくものであり、病気原因因子又は該因子に応答して患者によって生産された生物学的生成物を検出するために使用されている。現在、リガンド（抗原）認識用の抗体の製造については３つの汎用されている方法がある：多数のエピトープに関する認識性を持つ動物全体におけるポリクロナール抗体の製造、ただ１つのエピトープ（スクリーニング後）に関する認識性をもつ形質転換された細胞系におけるモノクロナール抗体の製造、及びただ１つのエピトープ（スクリーニング後）の認識性をもつ細菌における分子組換えファージ表示抗体の製造である。これらの各リセプターシステムはリガンドを結合及び同定できるが、それぞれの感度はインターフェースされる特殊なイムノアッセイ検出システムに制限される。
【０００５】
固相酵素免疫測定法（ELISA）、酵素免疫測定法（EIA）、及び放射免疫測定法（RIA）の如きイムノアッセイは抗原の検出に関してよく知られている。これら測定法の多くにおける基本的な原理は、酵素−、クロモーゲン−、フルオロゲン−、又はラジオヌクレオチド−結合抗体が抗体の結合時に抗原の検出を許容することにある。この相互作用が色、蛍光又は放射活性の変化として検出されるようにするため、重大な数の抗体が多数の抗原エピトープに対応して結合されなければならない。
【０００６】
このように、特に非常に少量で存在する際にも、迅速、信頼性よく、しかも自動的にリガンドを検出し、その結果、測定可能な信号を提供するシステムが求められている。
【０００７】
従って、本発明の目的は、高い感度及び高い特異性をもってリガンドを検出できるシステムを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、リガンドのリセプターへの結合によって発生された信号を増幅できるシステムを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ケージ化酵素増幅機構を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、結合されたリセプターによって脱活性化された酵素を活性化するシステムを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、リガンドのリセプターへの結合の際に液晶アレイを歪曲させるシステムを提供することにある。
【００１２】
本発明の更なる目的は、環境又は身体を連続して監視し、リガンドが存在する際にその所有者を表示する検出装置を提供することにある。
【００１３】
一般に、本発明は、少なくとも１つのリセプター及び該リセプターと組み合わされた増幅機構（リセプターがリガンドに結合した結果として増幅された信号が発生される）からなる病原性因子の如きリガンドの検出及び増幅システムを提供する。
【００１４】
本発明では、リガンド−特異リセプターを増幅機構とインターフェースさせて、リセプター−リガンドの相互作用がリセプターの配座を変化させ、信号を発生する。好ましくは、増幅は、測光法で検出される色、蛍光又は複屈折のシフトを介して生ずる。ついで、検出された信号を電子的に増幅してシステムを自動化する。
【００１５】
リガンド検出要素
リガンドのリセプターへの結合が検出可能なリセプターのディストーションを生ずるものであれば、抗体又はリガンド用の生物学的／生物学的組換えリセプターの如きいかなるリセプターも装置に組み込むことができる。例えば、各種のモノ特異性抗体（ポリクロナール、モノクロナール、又はファージ−表示）がリセプターとして有効に機能でき、このようなタイプの抗体の各々について以下に記載する。ファージ−表示抗体は新しいリガンドの同定のために迅速に変性されるものであり、この特許出願においてリセプターの例として使用されているが、各種の物理的に歪曲可能なリセプター−リガンドの相互作用が検出要素として適している。
【００１６】
ポリクロナール抗体：数１０年の間、抗体に基づく抗原検出法が開発されてきた。製したリガンドの宿主動物への注射は、抗原上の各種の反応部位に対する一連の抗体を生成する免疫システムを模倣するものである。いくつかのリンパ球は異なる抗原エピトープに応答するため、多特異抗体カクテル（ポリクロナール）が創造され、抗原検出のために精製される。
【００１７】
モノクロナール抗体：ただ１つの限定された特異性をもつほぼ無限の量の抗体を提供するハイブリドーマを創造するために抗体−生産脾臓細胞（Ｂリンパ球）を不死化ミエローマ細胞と融合させる。これらの「モノクロナール」抗体の菌株間及び種間ハイブリッドが遺伝子組換え技術を介して生成される。これらの高度に特異的な抗体は、U.S. Food and Drug Administrationの選ばれた病気の治療に関するマウス−ヒトキメラ抗体の使用許可によって実証されているように、重要な治療能力を有する。
【００１８】
ファージ−表示モノ−特異性抗体：各種の病原性因子に対するシングル鎖キメラ抗体を単離するためにファージ−表示技術を使用する。Ｂリンパ球のゲノムDNAは、実質的にすべてのリガンド（抗原）に対して抗体を生産するコードを含有する。ファージ表示抗体システム（PDA）において、抗体の長鎖をコード付けるDNAと抗体の短鎖をコード付けるDNAとを結合させ、その間にリンカーをコード付けるDNAを挿入することによって、自生抗体の超可変のリガンド−結合領域のシングル鎖キメラをコード付けるDNAが合成される。リンカー領域の所望のアミノ酸配列は、一定の増幅機構について要求される特性に左右される。リンカー領域はタンパク質又は他の物質と相互作用及び／又は結合できなければならないであろう。したがって、ポリペプチド配列は、例えば、特殊な配座、イオン又は水素結合を誘発するように特異的に配置された官能基、又は増幅機構と適合する疎水性を有していなければならないであろう。しかしながら、増幅機構の種類にかかわらず、リンカー領域は、増幅機構をリセプターにインターフェイスすることにおいて重要な役割を果たす。
【００１９】
シングル鎖キメラ抗体をコード付ける、好ましくはヒト又はマウスのDNAを、ここに参考として引用する公知の技術（Marks ら, J. Mol. Biol. Vol. 222:581 (1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993)；及び Winters ら, Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994)）を使用することによって、バクテリオファージ（ファージ）ベクターにクローン化される。ついで、シングル鎖キメラ抗体は、外方に向かって延びる超可変の抗原−結合部位をもつフィラメント状ファージの表面で表示されるようになる。
【００２０】
リガンドの添加後、ここに参考として引用する公知の技術（Marks ら, J. Mol. Biol. Vol. 222:581 (1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993)；及び Winters ら, Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994)）を使用することによって、非標的リガンドに対して反応性のファージがファージライブラリーから排除される。残りのファージを、それらの特異リガンド及び選ばれた特異リガンドと反応性であるファージと反応させる。ついで、これらのファージの各々を単離し、所望の表面−表示抗体を含有する多量のファージを生成するために大腸菌（E. coli）の如き細菌宿主において発現させる。DNAの合成及びクローン化、ファージの排除、ファージの単離及び発現及びウイルスDNAの回収に関する各方法は公知であり、Marks ら, J. Mol. Biol. (1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993)；及び Winters ら, Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994)（これらのすべてを参考として引用する）によって充分に記載されている。
【００２１】
増幅要素
リガンド−リセプター複合体形成の検出を可能にする各種の機構は増幅器として機能し、装置に組み合わされる。３つの増幅機構が提案される。第１に、液晶は、リガンドがリセプターに結合する際に生ずるディストーションを増幅する。第２に、酵素が生物学的ケージ内に置かれ、リセプターが該生物学的ケージに付着されて酵素−基質相互作用を阻止する。リガンドのリセプターへの付着は、基質チャンネルを開き、その結果、酵素−基質の相互作用が生じ、これによって、検出可能なレベルの反応生成物を生成できる。第３に、ファージ−表示抗体の如きリセプターのリンカー領域を、酵素の活性部位を結合及び阻害するように組換える。リセプター−リガンド複合体の形成時にリセプター−酵素複合体の分離が生じ、その結果、酵素の活性化及び生成物の生成が生ずる。
【００２２】
液晶：液晶は、分子がいくかの配向秩序、ただし小さい位置秩序を示す物質の状態である。この中間的オーダーリングは液晶を固体（位置及び配向秩序の両方を有する）と等方性流体（長距離秩序を示さない）との間に位置させる。固体結晶又は等方性流体は、温度を変化させる（サーモトロピック液晶を創製する）ことによって、又は適切な希釈溶媒を使用して固体結晶の濃度を変化させる（リオトロピック液晶を生成する）ことによって液晶へ遷移される。リオトロピック液晶は本発明の増幅システムに使用される。
【００２３】
図１に見られるように、最良のリオトロピック液晶（符号１で示される）は、バイフィリック分子３、例えば、極性（親水性）脂肪族部分４及び非極性（疎水性）脂肪族部分５を有する分子用の溶媒として水２を使用して形成される。水２がカチオン界面活性剤、塩化エチルピリジウム（C21H38ClN）の如きバイフィリック分子３に添加される際、疎水性領域が合体して水２との相互作用を最少にすると共に、極性成分の水との相互作用を増大させるため二分子層６が形成する。特異分子の濃度及び幾何学的形状は液晶の分子上の結晶秩序を限定する。分子は凝集して、ネマッチク又はコレステリック相を形成するディスク様又はロッド様のミセルと共に、ラメラを形成できる。C21H38ClNは、水及びバイフィリック分子の交互層のラメラを形成する。配向秩序は水及びバイフィリック分子の交互層によって創製され、このようにして、液晶は、液晶の平面に対して直角に配置された光源によって与えられる偏光７に対して不透明である（光学異方性を示す）。
【００２４】
最良の生物学的リセプターは、親水性領域及び疎水性領域の両方を有し、このようにして、バイフィリックリオトロピック液晶に容易に組み込まれる。さらに、不活性化されたリセプターは液晶の光学異方性を破壊せず、したがって、リセプター−富有化液晶は偏光に対して不透明ままである（図１Ｂ）。しかしながら、光学異方性は、リセプターの配座がリセプター−リガンド複合体の形成の間にシフトする際には崩壊される（図１Ｃ）。液晶の弾性はリセプター−リガンド複合体の付近における局部的なディストーションを増大させ、これを光学的に検出可能なミクロンより上のスケールまで拡大させる。生物学的物質はサーモトロピック液晶の表面上で検出される（V.K. Guptaら, Science 279: 277-2080, 1998）。しかしながら、リオトロピック液晶はリガンド−特異リセプターを容易に組込み、したがって、生物学的分子の検出には明らかに優れている。
【００２５】
リガンド検出システムの配置
例えば、本発明の考えられる１つの適用は、マルチウエルシステムにおけるものである。システムの各ウエルは、本発明の増幅機構とインターフェイスされた病原性微生物の如き特異リガンドに対するPDAを収容する。微生物因子が抗体と相互作用する際、生ずる抗体ディストーションが増幅機構のトリガーとなる。好ましくは、ついで増幅された信号が認知可能な信号に変換される。したがって、このようなシステムは医師のオフィスに配置され、日常の診断操作に使用されることが想像される。別法として、このようなシステムを戦場の兵士又はその近くに配置することができ、兵士に対して毒薬の存在を警戒させるために本発明を使用できる。さらに、後述するルシフェラーゼ又はケージ化酵素の如き他の具体例についても使用できるが、マルチウエルシステムは、好ましくは、ここに記載の液晶の例と組み合わせて使用される。
【００２６】
このように、図１Ｂ及び図１Ｃ概略して示す本発明の１具体例では、増幅機構としてリオトロピック液晶物質が使用される。図１Ｂに示されるように、装置は、光源１０、第１偏光子（図の平面内に偏光方向をもつ）１２、病原体検出システム（バイフィリックリオトロピック液晶物質１４ｃ内に埋め込まれたモノ特異性抗体１４ｂでなる）１４ａ、第２偏光子（図の平面に対して直角の偏光方向をもつ）１６、及び光検出器１８でなる。
【００２７】
操作に当たって、第１偏光子１２は図の平面内で直線的に偏光された光ビーム２２を発生する。不活性化された装置の光学軸２０は病原体検出システム１４ａに対して直角であり、このようにして、直線的に偏光された光ビーム２２の複屈折は生じない。第２偏光子１６の偏光方向が直線的に偏光された光２２に対して直角であるため、第２偏光子は光が光検出器１８に到達することを妨げる。
【００２８】
微生物の如きリガンド２４の抗体の如きリセプターへの結合は液晶１４ｃを歪曲させ、複屈折を誘発し、このようにして、検出可能な光を発生させる。この活性化法を図１Ｃに示す。リセプター（抗体）１４ｂがバイフィリックリオトロピック液晶１４内に埋め込まれている。抗原−抗体複合体の形成によって生じた特殊なディストーションは接触する液晶１４ｃに伝達される。液晶の弾性特性は、ディストーションがリセプター−リガンド複合体のサイズよりもかなり広い領域にわたって伝達されることを可能にする。これは、リセプター−リガンド複合体によって生じたディストーションを検出するために複屈折の標準的な光学的現象を利用することを許容する。変成された液晶秩序は光学軸２０を傾け、複屈折を誘発する。換言すれば、入射偏光光２２は２つの屈折した光の波動、すなわち、相互に直角の偏光をもつ通常の波動及び異常な波動を生ずる（ここで参考として引用するMax Born 及びE. Wolf., Principals of Optics, ６版, Pergaman Press, Oxford, 1980参照）。このようにして、光学部品が第２偏光子１６の方向で振動する一部の光２６が存在する。第２偏光子（アナライザー）１６はこの光部分が光検出器１８に通過することを許容する。光の強さにおける検出された変化又は増幅は認知可能な信号に電子的に変換される。
【００２９】
図２Ａ−２Ｃに概略して示す本発明の他の具体例では、増幅のため酵素−基質相互作用が利用される。図２Ａを参照して、酵素３０は、酵素３０と基質３４との時期尚早の相互作用を防止するためにケージ３２内に捕捉される。基質３４は、潜在的に、ケージ３２を横切る１以上のチャンネルを通る酵素３０へのアクセスを獲得できる。しかしながら、チャンネル３６は、病原性因子の不存在下では２倍の結合能力を有する１以上のリセプター（ディアボディー）３８によって、矢印３７で示されるようにブロックされる。
【００３０】
ディアボディーを生産するため、好ましくは、ここに参考として引用するHolligerらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444, 1993）に従って、それぞれチャンネル３６及びリガンド４８に向かう２つの別個の抗原−結合領域４０及び４１を有するディアボディー３８を形成するために２つの抗体を結合させる。リガンド−結合領域４０は、長鎖免疫グロブリン４２ａ及び短鎖免疫グロブリン４３ｂでなる。リガンド−結合領域４１は長鎖免疫グロブリン４３ｂ及び短鎖免疫グロブリン４２ｂでなる。いかなる特別な理論によって拘束されることなく、１以上のディアボディー３８に対する結合領域４０のケージ３２上のエピトープへの結合はチャンネル３６をブロックし、基質−酵素の相互作用を阻止する。このようにして、基質３４は非模倣条件下では処理されない。
【００３１】
図２Ｂを参照して、結合領域４１がリガンド４８に付着する際、ディアボディー３８のリンカー領域４４及び４６は歪曲されて、チャンネル３６が非ブロック化されるようになり、矢印４９で示されるように基質３４がチャンネル３６を通り、酵素３０と相互作用する。リガンド４８によって活性化されると、チャンネル３６は開放されたままになり、多量の基質３４が入ることができ、作用して生成物３４ａ及び３４ｂ（発色性又は蛍光性である着色生成物である）を生産する。ついで、生成物３４ａ及び３４ｂの一方又は両方が検出又は増幅され、認知可能な信号に変換される。
【００３２】
当業者であれば、ケージ３２として各種の球状構造体、好ましくはタンパク質が使用されることは理解できるであろうが、酵素ケージとしての作用についてはα−２−マクログロブリンが特によく研究されているがこれは、いくつかの酵素（トリプシン及びトロンビンを含む）がα−２−マクログロブリンを部分的に劣化し、タンパク質に入り込み、及び単にα−２−マクログロブリン及び酵素を混合することによって捕捉されるようになるためである。
【００３３】
酵素３０は、分子ケージに捕捉され、その基質の検出可能な変化を生ずるいかなるものでもよい。当業者であれば、無数の酵素−基質ペアが検出可能であり、したがって、好適であることが理解されるであろう。例えば、トロンビン及びトリプシンは好適な２つの酵素である。好適な基質は、認識部位及び酵素−基質結合の際に検出可能な発色の変化を生ずる発色団を有する。
【００３４】
リンカー領域４４及び４６は、基質３４がリガンド４８の抗原結合領域４１への結合の際にチャンネル３６に入ることができるように組換えられる。リンカー領域４４及び４６は好ましくは中位の長さのものである。当業者は、リンカー領域の長さが短すぎる又は長すぎる場合には、これらの領域は、チャンネル３６を脱ブロック化するようには適切に歪曲しないことを理解するであろう。リンカー領域の長さの好適な範囲は、主としてケージ３２及びチャンネル３６の性質に左右される。
【００３５】
リンカー領域４４及び４６も、好ましくは、イオン、水素、又は他の結合によって一緒に結合される。そうでなければ、リンカー領域４４及び４６は分離に影響され易く、その結果、病原性因子の結合の際に不適切なディストーションを生ずる。
【００３６】
図３Ａ−３Ｃに概略して示す本発明の他の具体例も酵素−基質増幅機構を使用する。図３Ａに示されるように、シングル鎖キメラ抗体５０は、リンカー領域５２が特異的に酵素５４と結合して、矢印５８によって示されるように酵素５４への基質５６の結合を阻害するように組換えられる。この具体例では、リンカー領域５２は、酵素５４の活性部位に対して相補性であるそのポリペプチド配列の一部を有する。好適な相補性ポリペプチドの決定に関する技術は公知である。
【００３７】
図３Ｂに示されるように、抗体５０の結合領域６０がリガンド６２を結合すると、リンカー領域における配座の変化は酵素５４からの抗体５０の解離を生ずる。遊離された酵素５４は今や基質に作用できる。遊離された各々の酵素は多量の基質と反応して、増幅された信号を提供できる。単なる例として、特に好適な具体例を図３Ｃ（ルシフェラーゼの如き酵素がどのようにその基質を変性するか、この例では、ルシフェラーゼの酸化及び解離を生ずるかを示す）に示した。この反応は、反応生成物のピコグラムレベル以下で検出可能な蛍光性の化学種５７ａ及び非蛍光性の化学種５７ｂを生成する。ついで、蛍光性の化学種５７は検出又は増幅され、認知可能な信号に変換される。酵素５４は、その基質の検出可能な変換を生ずるいかなる酵素でもよい。
【００３８】
実験例
液晶増幅機構
液晶増幅機構を使用するリガンド検出システムを開発した。大腸菌リポ多糖類（LPS）（グラム陰性細菌について見られる表面抗原）に対するネズミ抗体を市販の源（Biodesign International, cat. #C61212M, クローン #26-5, lot #5D1197）から入手し、ｐＨ７.２の滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）で希釈（１：１０）してサンプル100 ng/μlを得た。
【００３９】
大腸菌の後期対数期培養物をブレーンハートインフュージョン（BHI）中で増殖させ、０.９％滅菌生理食塩水で洗浄して生育培地を除去した。細菌の数（600nmにおける光学密度によって測定；コロニー−形成単位（CFUs））を増殖曲線データから外挿法によって定量した。ついで、細菌を滅菌生理食塩水での希釈によって４.６×１０1CFU／５μlに調節した。
【００４０】
混合物の相状態の制御を助けるため補助界面活性剤としてヘキサノールを使用して、ラメラ相においてリオトロピック液晶溶液を調製した。塩化セチルピリジウム（CpCl）をヘキサノールとヘキサノール／CpCl＝0.651（w/w）の割合で合わせた。ついで、混合物を食塩水（水中NaCl１％）によって食塩水８５重量％となるまで希釈した。得られた液晶はラメラではあるが、ミセル相に近いものであった（Nastishin, Langmuir. Vol. 12, pp. 5011-5015, 1996；ここに参考として引用する）。この相では、リオトロピック液晶はバイフィリックであり、このようにして、いくつかの異なった種類のリセプターと相互作用できる。
【００４１】
テスト用の検出システムを、ヘキサノール／CpCl／食塩水リオトロピック液晶にリセプターを挿入することによって作製した。各アッセイについて、大腸菌（LPS）に対して特異的に反応性の抗体（500ng）溶液５μlをリオトロピック液晶溶液５μlに添加し、混合した。ついで、実験サンプル（５μl）を一定量（１０μl）の液晶−抗体混合物に添加し、混合した。実験サンプルを次のように抗体−液晶混合物に添加した：サンプルＡ−大腸菌（４.６×１０1 CFU）(システムによって検出される予定の特殊な細菌)５μl；サンプルＢ−PBS５μl、又はサンプルＣ−Ｓ．アウレウス（Ｓ. Aureus）（２×１０6 CFU）（システムが検出できない不適切な細菌）５μl。サンプルを遠心分離（3,500×ｇ；５秒）して泡を除去し、反応混合物１０μlをエタノールで浄化した顕微鏡スライドに置き、エタノールで浄化したガラスカバースリップで覆い、偏光光を使用して複屈折について混合物を評価した。実験条件及び結果を表１に示す。抗体がその特異的な抗原に結合した場合にのみ複屈折が生じ、複屈折における目視により認識可能な変化は、４６−460 CFU／５μl程度の細菌濃度について検出された。
【００４２】
【表１】
0004377058.tif 000002
他の実験では、LPS抗体、大腸菌（２.７×１０７CFU）及び液晶物質を、上記実験例と同様にして反応させ、代表的な顕微鏡写真（110×倍率；図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ）をBio-Quantイメージ分析システムによって評価した。イメージ分析は、大腸菌、PBS、又はＳ．アウレウスをリセプター−リガンド結合システムによって評価した際の伝わる光の透過率を定量的に比較するために行ったものである。写真イメージをデジタル化し、下記の式に従って積分光学密度（IOD）を自動的に算定した。
【００４３】
【式１】
0004377058.tif 000003
【００４４】
図５に示す得られたデータは、液晶が抗体の大腸菌（LPS）への結合を増幅する際の伝わる光の透過率の充分な増加が生じたことを示した。
【００４５】
ケージ化酵素増幅機構
α−２−マクログロブリン増幅機構の感受性を実証した。ヒトα−２−マクログロブリン（α2Ｍ，Calbiochem Co., 生成物番号441251）、トリプシン（Sigma Chemical Co., T-8003）及びトロンビン（Sigma Chemical Co., T-4648）の標準２mg/100μl溶液を、０.１Ｍ HEPES 緩衝液（ｐＨ７.６）にプロテアーゼ又はアンチプロテアーゼを溶解させることによって調製した。α2Ｍ及び酵素の１つに等しい容量（100μl）を混合し、室温において１０分間相互作用させ、ついで４℃に冷却させた。サンプル200μlを、Sephadex Ｇ-100を充填したゲル瀘過カラム（１cm×２４cm；床容量 18.8ml；流量 0.44ml/分；４℃の冷たい室内に設置）に加えて、未複合化酵素からケージ化酵素を分離した。カラム溶離剤を１.０mlのフラクションで集めた。各フラクションにおけるタンパク質濃度を測定するため280nmにおける光吸収率の変化を測定し、ケージ化酵素を含有するフラクションを同定するため酵素の活性度を測定した。これらの測定の結果（図６Ａ及び６Ｂに示す）は、フラクション１５−１７がケージ化酵素の比較的純なサンプルを含有していることを示した。これらのフラクションを次の評価に使用した。
【００４６】
それぞれケージ化トリプシン（図６Ｃ）及びケージ化トロンビン（図６Ｄ）の酵素の活性度を測定するために、合成基質、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−arg−ｐ−ニトロアナライド及びＮ−ｐ−トシル−gly−pro−arg−ｐ−ニトロアナライドを使用した。いずれのシステムも用量反応特性を発揮するが、ケージ化トロンビンはより高い感度を示した。酵素の活性度は継時的にも劣化しない。ケージ化トリプシンの酵素活性度は、４℃で６日間保存した後も未変化にままであった。同様に、ケージ化トロンビンの活性度は、調製後２４時間で測定した際にも安定であった。
【００４７】
ルシフェラーゼ増幅機構
ルシフェラーゼに基づく増幅機構の例外的な感度を、Berthold Lumat Luminometerを使用して実証した。Luminometerの反応チャンバーに、各種の量のルシフェラーゼ（0.15％NaCl ４mg/ml，１０mM HEPES，１mM EDTA，２mM MgCl2，２mM ジチオトレイトール；Sigma Chemical Co.）を添加した。反応チャンバーに、５０mM HEPES緩衝液（ｐＨ７.８）中に０.５nmルシフェラーゼ（Progema, E1483）、０.５mMアデノシン三リン酸（Sigma Chemical Co., A-7699）、５mM MgSO4、１.０mMジチオトレイトール（Sigma Chemical Co.）を含む溶液を迅速に注入することによって酵素の反応を開始させた。図７Ｂは、酵素濃度わずか0.0017％で検出可能なルシフェラーゼの活性度が測定され、酵素濃度における進行評価によって活性度の直線的な増加が観察されることを示している。
【００４８】
いかなる変更も請求の範囲に記載した発明の範囲に属するものであり、特異抗体、ケージ化酵素、リセプター−脱活性化酵素又は液晶の選択は、ここに開示し、記載した発明の精神を逸脱することなく決定されることが理解されなければならない。また、特に病原体の検出について研究されているが、本発明はいかなるリガンドの検出も包含するものであることが理解されなければならない。さらに、本発明の範囲は請求の範囲に記載した範囲に属するすべての変形及び変更も包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  水及びバイフィリック分子の交互相によって形成されたリオトロピック液晶の層状構造体を概略して示す図である。
【図１Ｂ】  リオトロピック液晶に挿入されたリセプターをもつ増幅機構を概略して示す図である。
【図１Ｃ】  液晶の変形及び偏光の透過率の変更を生ずるリセプターに結合した特異リガンドをもつ増幅機構を概略して示す図である。
【図２Ａ】  １以上のリセプターがリガンドの不存在下において酵素につながるチャンネルをブロックするケージ化酵素増幅機構を概略して示す図である。
【図２Ｂ】  リガンドがリンカー領域のディストーション及び酵素につながるチャンネルの非ブロッキングを生ずるリセプターに結合するケージ化酵素増幅機構を概略して示す図である。
【図２Ｃ】  リセプターへのリガンドの結合によって活性化された後、酵素につながるチャンネルは開放されたままであり、多量の基質が酵素と相互作用できるケージ化抗体増幅機構を概略して示す図である。
【図３Ａ】  分子組換えされたリセプターによって非活性化された酵素を概略して示す図である。
【図３Ｂ】  酵素の活性部位が基質にさらされる際、リセプターのリガンドからの解離を生ずる分子組換えされたリセプターへのリガンドの結合を概略して示す図である。
【図３Ｃ】  ピコレベルのリガンドがリセプターに結合された後における酵素による基質の変換を概略して示す図である。
【図４Ａ】  特異リガンドのリセプターへの結合に応答して液晶−リセプターアレイを通る偏光された光の複屈折を表す写真である。
【図４Ｂ】  液晶、リセプター及びPBSを含有する反応混合物では液晶−リセプターアレイを通る偏光された光の複屈折が存在しないことを表す写真である。
【図４Ｃ】  液晶、リセプター及び不適切なリガンドを含有する反応混合物では液晶−リセプターアレイを通る偏光された光の複屈折が存在しないことを表す写真である。
【図５】  非選択的リセプター−リガンド結合及びバックグラウンドリセプター−リガンド結合と比較して、選択的リセプター−リガンド結合用のリガンド検出システムの液晶−リセプターアレイを通る偏光された光の複屈折の定量分析を表すグラフである。
【図６Ａ】  α−２−マクログロブリン−トリプシン複合体を含有する溶出フラクションの酵素活性度を表すグラフである。
【図６Ｂ】  α−２−マクログロブリン−トリプシン複合体を含有する溶出フラクションのタンパク質濃度（μg/ml）を表すグラフである。
【図６Ｃ】  時間（分）に対する検出可能な酵素活性度に及ぼすケージ化トリプシンの濃度の影響を表すグラフである。
【図６Ｄ】  時間（分）に対する検出可能な酵素活性度に及ぼすケージ化トロンビンの濃度の影響を表すグラフである。
【図６Ｅ】  時間（日）に対するケージ化トリプシンの安定性を表すグラフである。
【図７Ａ】  時間（秒）に対するルシフェラーゼの活性度（相対光単位）を表すグラフである。
【図７Ｂ】  ルシフェラーゼの濃度（pg/μl）を関数とするルシフェラーゼの活性度（相対光単位）を表すグラフである。
【符号の説明】
１    リオトロピック液晶
２    水
３    バイフィリック分子
４    極性脂肪族部分
５    非極性脂肪族部分
６    二分子層
１０    光源
１２    第１偏光子
１４ａ    病原体検出システム
１４ｂ    モノ特異性抗体
１４ｃ    バイフィリックリオトロピック液晶物質
１６    第２偏光子
１８    光検出器
２２    光ビーム
２６    光
３０、５４    酵素
３２    ケージ
３４、５６    基質
３６    チャンネル
３８    ディアボディー
４０、４１    リガンド結合領域
４２ａ、４３ｂ    長鎖免疫グロブリン
４２ｂ、４３ａ    短鎖免疫グロブリン
４４、４６    リンカー領域
４８    リガンド
５０    シングル鎖キメラ抗体
５７ａ    蛍光化学種
５７ｂ    非蛍光化学種
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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