(57)【要約】本文書は、回旋筋腱板異常(例えば、回旋筋腱板腱炎、または回旋筋腱板の部分的断裂などの回旋筋腱板損傷)を処置することに関連する方法および物質を提供する。例えば、BMP-5ポリペプチドを用いて回旋筋腱板異常を処置するための方法および物質、ならびにSIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を用いて回旋筋腱板異常を処置するための方法および材料が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法であって、BMP-5ポリペプチド含む組成物を該哺乳動物の回旋筋腱板領域内に注入する段階を含み、該組成物の注入が、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記回旋筋腱板異常が回旋筋腱板腱炎である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記注入が関節腔内への関節内注入である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記注入が肩峰下腔内への注入である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記注入が損傷を受けた腱内への直接注入である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記BMP-5ポリペプチドがヒトBMP-5ポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記BMP-5ポリペプチドがSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該哺乳動物の回旋筋腱板領域内に組成物を投与する段階を含み、組成物が、BMP-5ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む細胞を含み、該細胞が該BMP-5ポリペプチドを発現し、かつ該組成物の投与が、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる、前記方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
前記回旋筋腱板異常が回旋筋腱板腱炎である、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が関節腔内への関節内注入である、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が肩峰下腔内への注入である、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が損傷を受けた腱内への直接注入である、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
前記BMP-5ポリペプチドがヒトBMP-5ポリペプチドである、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
前記BMP-5ポリペプチドがSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該哺乳動物の回旋筋腱板領域に組成物を投与する段階を含み、該組成物が、SIRT6、SIRT7、またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含み、該組成物の投与が、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる、前記方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記回旋筋腱板異常が、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
前記回旋筋腱板異常が回旋筋腱板腱炎である、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が関節腔内への関節内注入である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が肩峰下腔内への注入である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
前記投与が損傷を受けた腱内への直接注入である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物がSIRT6ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物がSIRT7ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物がHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
前記阻害剤が、CUDC-907、プラシノスタット、アベキノスタット、またはキシノスタットである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物がBMP-5ポリペプチドをさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、BMP-5ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む細胞をさらに含み、該細胞が該BMP-5ポリペプチドを発現する、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年7月9日に出願された米国特許仮出願第62/022,516の恩典を主張する。先行出願のこの開示は、本出願の開示の一部とみなされる（および参照により本出願の開示に組み入れられる）。
【０００２】
1.  技術分野
本文書は、回旋筋腱板異常（例えば、回旋筋腱板腱炎または回旋筋腱板損傷、部分的なまたは完全な回旋筋腱板断裂など）を処置することに関連する方法および物質を提供する。例えば、本文書は、BMP-5ポリペプチド、ならびに/またはSIRT6、SIRT7、および/もしくはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を用いて回旋筋腱板異常を処置するための方法および物質を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2.  背景情報
回旋筋腱板は、肩関節を囲む筋肉および腱の一群であり、肩の浅い受け口内に上腕骨の上部を堅固に維持する。回旋筋腱板損傷は、痛みおよび肩機能の喪失を引き起こす可能性がある。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本文書は、回旋筋腱板異常（例えば、回旋筋腱板腱炎または回旋筋腱板損傷、部分的なまたは完全な回旋筋腱板断裂など）を処置することに関連する方法および物質を提供する。例えば、本文書は、BMP-5ポリペプチドを用いて回旋筋腱板異常を処置するための方法および物質を提供する。いくつかの場合において、BMP-5ポリペプチドおよび/またはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞（例えば、幹細胞）を含む組成物は、回旋筋腱板異常を患っている哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与する（例えば、その中に注入する）ことができる。いくつかの場合において、BMP-5ポリペプチドおよび/またはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞（例えば、幹細胞）を含む組成物は、外科的修復時に導入することができる。そのような場合において、投与された（例えば、注入された）組成物は、腱変性を減少もしくは回復させる、治癒を促進する、および/または腱の強さを向上させることができる。
【０００５】
本文書はまた、SIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を用いて回旋筋腱板異常を処置するための方法および物質も提供する。いくつかの場合において、SIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の1つまたは複数の阻害剤を含む組成物は、回旋筋腱板異常を患っている哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与する（例えば、その中に注入する）ことができる。そのような場合において、投与された（例えば、注入された）組成物は、腱変性を減少もしくは回復させる、治癒を促進する、および/または腱の強さを向上させることができる。いくつかの場合において、SIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤は、単独でまたはBMP-5ポリペプチドとの組み合わせで用いて回旋筋腱板異常を処置することができる。例えば、HDAC10発現の阻害剤は、BMP-5ポリペプチドと組み合わせて、回旋筋腱板異常を患っている哺乳動物を処置するのに用いられる組成物を形成することができる。
【０００６】
概して、本文書の1つの局面は、回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、BMP-5ポリペプチドを含む組成物を哺乳動物の回旋筋腱板領域内に注入する段階を含むか、または本質的にそれからなり、ここで、組成物の注入は、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる。哺乳動物はヒトであってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は回旋筋腱板腱炎であってもよい。注入は関節腔内への関節内注入であってもよい。注入は肩峰下腔内への注入であってもよい。注入は、損傷を受けた腱内への直接注入であってもよい。BMP-5ポリペプチドはヒトBMP-5ポリペプチドであってもよい。BMP-5ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０００７】
別の局面において、本文書は、回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、BMP-5ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む細胞を含む組成物を、哺乳動物の回旋筋腱板領域内に投与する段階を含むか、または本質的にそれからなり、ここで、細胞はBMP-5ポリペプチドを発現し、かつ組成物の投与は、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる。哺乳動物はヒトであってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は回旋筋腱板腱炎であってもよい。投与は関節腔内への関節内注入であってもよい。投与は肩峰下腔内への注入であってもよい。投与は、損傷を受けた腱内への直接注入であってもよい。BMP-5ポリペプチドはヒトBMP-5ポリペプチドであってもよい。BMP-5ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に記載されたアミノ酸配列を含んでもよい。
【０００８】
別の局面において、本文書は、回旋筋腱板異常を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、SIRT6、SIRT7、またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含む組成物を、哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与する段階を含むか、または本質的にそれからなり、ここで、組成物の投与は、腱変性を減少もしくは回復させる、腱の治癒を促進する、または腱の強さを向上させる。哺乳動物はヒトであってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が部分的に断裂している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は、回旋筋腱板の腱が破断している回旋筋腱板異常であってもよい。回旋筋腱板異常は回旋筋腱板腱炎であってもよい。投与は関節腔内への関節内注入であってもよい。投与は肩峰下腔内への注入であってもよい。投与は、損傷を受けた腱内への直接注入であってもよい。組成物は、SIRT6ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含んでもよい。組成物は、SIRT7ポリペプチドの発現または活性の阻害剤を含んでもよい。組成物は、HDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤（例えば、CUDC-907、プラシノスタット(pracinostat)、アベキノスタット(abexinostat)、またはキシノスタット(quisinostat)）を含んでもよい。組成物はBMP-5ポリペプチドをさらに含んでもよい。組成物は、BMP-5ポリペプチドを発現する、BMP-5ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む細胞をさらに含んでもよい。
【０００９】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は本発明を実施するのに使用することができるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。相反する場合には、定義を含む本明細書が適用される。加えて、材料、方法、および例は単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００１０】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、対象、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】骨、軟骨、筋肉、腱(棘上筋、肩甲下筋、膝蓋腱、後脛骨筋腱、およびアキレス腱)、および靱帯を含む様々な組織型におけるBMP5発現のレベルをプロットするグラフである。
【図２】ヒトBMP-5ポリペプチドのアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)一覧である。
【図３】BMP-5ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:2)一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本文書は、BMP-5ポリペプチド、BMP-5ポリペプチドを発現する細胞、SIRT6ポリペプチドの発現または活性の阻害剤、SIRT7ポリペプチドの発現または活性の阻害剤、HDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤、またはそれらの組み合わせを用いて回旋筋腱板異常を処置することに関連する方法および物質を提供する。例えば、BMP-5ポリペプチドおよび/またはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞(例えば、幹細胞)を含む組成物を、回旋筋腱板異常を患っている哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与する（例えば、その中に注入する）ことができる。そのような場合において、投与された（例えば、注入された）組成物は、腱変性を減少もしくは回復させる、治癒を促進する、および/または腱の強さを向上させることができる。任意の適切な回旋筋腱板異常が本明細書に記載のように処置されうる。例えば、回旋筋腱板腱炎または回旋筋腱板損傷、例えば、回旋筋腱板の部分的断裂または回旋筋腱板破断が、本明細書に記載のように処置されうる。加えて、任意の適切な哺乳動物が本明細書に記載のように処置されうる。例えば、ヒト、サル、イヌ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスが本明細書に記載のように処置されうる。
【００１３】
いくつかの場合において、BMP-5ポリペプチドを含む組成物が回旋筋腱板異常を処置するために用いることができる。本明細書に記載のように用いることができるBMP-5ポリペプチドの例には、これらに限定されるわけではないが、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有するヒトBMP-5ポリペプチドが含まれる。本明細書に記載のように、ヒトBMP-5ポリペプチドを含む組成物は、回旋筋腱板異常を有するヒトに、組成物が、腱変性を減少もしくは回復させる、治癒を促進する、および/または腱の強さを向上させる条件下で投与することができる。
【００１４】
いくつかの場合において、SIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の1つまたは複数の阻害剤を含む組成物が、回旋筋腱板異常を処置するために用いることができる。SIRT6ポリペプチドの発現または活性の阻害剤の例には、これらに限定されるわけではないが、抗SIRT6抗体、SIRT6に対するsiRNA分子、SIRT6を標的とするマイクロRNA、およびSIRT6の発現を低下させるようにゲノムDNAを編集するよう設計された構築物(例えば、CRISPRに基づくストラテジー)が含まれる。SIRT6ポリペプチドの発現または活性の阻害剤のさらなる例には、これらに限定されるわけではないが、他の文献(例えば、Parenti et al., J. Med. Chem., 57(11):4796-804 (2014)およびHe et al., Org. Biomol. Chem., 12(38):7498-502 (2014)を参照)に記載された阻害剤が含まれる。いくつかの場合において、SIRT6ポリペプチド活性の阻害剤は、以下の構造を有しうる：
2017525675.tif 000002
いくつかの場合において、SIRT6阻害剤を同定するために市販のキットを用いることができる。例えば、BioVision Inc.から入手できるSIRT6 Inhibitor Screening Kit(Cat. No. K323-100)がSIRT6阻害剤を同定するために用いることができる。
【００１５】
SIRT7ポリペプチドの発現または活性の阻害剤の例には、これらに限定されるわけではないが、抗SIRT7抗体、SIRT7に対するsiRNA分子、SIRT7を標的とするマイクロRNA、およびSIRT7の発現を低下させるようにゲノムDNAを編集するよう設計された構築物(例えば、CRISPRに基づくストラテジー)が含まれる。
【００１６】
HDAC10ポリペプチドの発現または活性の阻害剤の例には、これらに限定されるわけではないが、抗HDAC10抗体、HDAC10に対するsiRNA分子、HDAC10を標的とするマイクロRNA、HDAC10の発現を低下させるようにゲノムDNAを編集するよう設計された構築物(例えば、CRISPRに基づくストラテジー)、CUDC-907、プラシノスタット(SB939；(E)-3-(2-ブチル-1-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾ-ル-5-イル)-N-ヒドロキシアクリルアミドとしても公知)、アベキノスタット(PCI-24781; 3-[(ジメチルアミノ)メチル]-N-{2-[4-(ヒドロキシカルバモイル)フェノキシ]エチル}-1-ベンゾフラン-2-カルボキサミドとしても公知)、キシノスタット(N-ヒドロキシ-2-[4-({[(1-メチル-1H-インドール-3-イル)メチル]アミノ}メチル)-1-ピペリジニル]-5-ピリミジンカルボキサミド)、プラシノスタット (SB939)、CUDC-101、CUDC-907、PCI-34051、およびN-ヒドロキシ-4-(2-((2-ヒドロキシエチル)(フェニル)アミノ)-2-オキソエチル)ベンズアミド(CAS 1429651-50-2)が含まれる。
【００１７】
本明細書に記載のように、SIRT6、SIRT7、および/またはHDAC10ポリペプチドの発現または活性の1つまたは複数の阻害剤を含む組成物は、回旋筋腱板異常を有するヒトに、組成物が、腱変性を減少もしくは回復させる、治癒を促進する、および/または腱の強さを向上させる条件下で投与することができる。
【００１８】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、インタクトな抗体、ならびにエピトープに結合する一部の能力を保持する抗体断片を指す。そのような断片には、これらに限定されるわけではないが、Fab、F(ab')2、およびFv抗体断片が含まれる。「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープ決定基(Epitopic determinant)は通常、分子の化学的に活性な表面集団(例えば、アミノ酸または糖残基)からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。
【００１９】
本明細書で提供される抗体は、SIRT6、SIRT7、またはHDAC10ポリペプチドに対する結合親和性(例えば、特異的結合親和性)を有する任意の抗体(例えば、モノクローナル抗体)であることができる。例えば、本明細書で提供される抗SIRT6抗体調製物または抗SIRT7抗体調製物は、SIRT6(例えば、ヒトSIRT6)またはSIRT7(例えば、ヒトSIRT7)に結合する能力を有するFab断片の調製物であることができる。任意の適切な方法を用いて、インタクトな抗体からFab断片を生成することができる。例えば、標準的なパパイン消化法を用いて、Fab抗体調製物を作製することができる。
【００２０】
本明細書で提供される抗体は、任意の適切な方法を用いて調製することができる。例えば、ヒトSIRT6ポリペプチドを含有する試料を免疫原として用いて、動物において免疫反応を誘発して、特異的抗体を作製することができる。動物に免疫性を与えるために用いられる免疫原は、化学的に合成されるか、または翻訳されたcDNAから生じうる。いくつかの場合において、免疫原は、必要に応じて、担体ポリペプチドにコンジュゲートすることができる。免疫性を付与するポリペプチドに化学的に連結される、通常用いられる担体には、これらに限定されるわけではないが、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風トキソイドが含まれる。
【００２１】
ポリクローナル抗体の調製は当業者に周知である。例えば、Green et al., Production of Polyclonal Antisera, in IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS (Manson, ed.), 第15頁(Humana Press 1992)およびColigan et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, in CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, section 2.4.1 (1992)を参照。加えて、当業者は、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体の精製および濃縮のための、免疫学分野において一般的な種々の技法を知っている(Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994)。
【００２２】
モノクローナル抗体の調製もまた、当業者に周知である。例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975); Coligan et al., sections 2.5.1 2.6.7;およびHarlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, 第726頁 (Cold Spring Harbor Pub. 1988)を参照。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注入すること、血清試料を分析することによって抗体産生の存在を検証すること、脾臓を取り出してBリンパ球を得ること、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養から抗体を単離することによって得ることができる。モノクローナル抗体は、さまざまなよく確立された技法によりハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。そのような単離技法には、プロテインAセファロースによるアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフィが含まれる。例えば、Coligan et al., sections 2.7.1 2.7.12およびsections 2.9.1 2.9.3; Barnes et al., Purification of Immunoglobulin G(IgG), in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, 第79頁 第104頁(Humana Press 1992)を参照。
【００２３】
加えて、モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボでの増殖の方法も当業者に周知である。インビトロでの増殖は、ウシ胎仔血清などの哺乳動物血清、または微量元素ならびに成長維持補充物、例えば正常なマウスの腹腔滲出細胞、脾臓細胞、および骨髄マクロファージを任意で補充した、Dulbecco変法イーグル培地またはRPMI1640培地などの適切な培養培地中で行うことができる。インビトロでの産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を生じるための大規模化を可能にする。大規模ハイブリドーマ培養は、エアリフトリアクター、連続撹拌リアクター、または固定化細胞培養もしくはエントラップ細胞培養(entrapped cell culture)での均一懸濁培養によって行うことができる。インビボでの増殖は、親細胞との組織適合性を有する哺乳動物(例えば、同系マウス(osyngeneic mice))内に細胞クローンを注入し、抗体産生腫瘍の増殖を生じさせることによって行ってもよい。任意で、動物は注入前に、炭化水素、特にプリスタン(テトラメチルペンタデカン)などの油類でプライミングされていてもよい。1〜3週後、所望のモノクローナル抗体が動物の体液から回収される。
【００２４】
いくつかの場合において、本明細書で提供される抗体は、非ヒト霊長類を用いて作製することができる。ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を生じさせるための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al., 国際特許公報WO 91/11465 (1991)およびLosman et al., Int. J. Cancer, 46:310 (1990) において見出すことができる。
【００２５】
いくつかの場合において、抗体はヒト化モノクローナル抗体であることができる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖由来のマウス相補性決定領域(CDR)をヒト可変ドメインに移し、次いで、マウス対応物のフレームワーク中のヒト残基を置換することによって産生することができる。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体構成成分の使用は、ヒトを処置するときにマウス定常領域の免疫原性に付随する潜在的問題を未然に防ぐ。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技法は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技法は、例えば、Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988); Carter et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992);およびSandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992); Singer et al., J. Immunol. 150:2844 (1993)に記載されている。いくつかの場合において、スーパーヒト化などのヒト化が、他の文献(Hwang et al., Methods, 36:35-42 (2005))に記載されているように用いることができる。いくつかの場合において、SDR移植(Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005))、ヒトストリング内容最適化(human string content optimization) (Lazar et al., Mol. Immunol., 44:1986-1998 (2007))、フレームワークシャッフリング(framework shuffling) (Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005)；およびDamschroder et al., Mol. Immunol., 44:3049-3060 (2007))、およびファージディスプレイ法(Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996); Radar et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); およびHuse et al., Science, 246:1275-1281 (1989))が、抗SIRT6抗体調製物、抗SIRT7抗体調製物、または抗HDAC10抗体調製物を得るために用いることができる。いくつかの場合において、完全ヒト抗体が、他の文献(Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994);およびKnappik et al., J. Mol. Biol., 296:57-86 (2000))に記載されているような組換えヒト抗体ライブラリスクリーニング技法から作製することができる。
【００２６】
本明細書で提供される抗体は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリから単離したヒト抗体断片由来であることができる。例えば、Barbas et al., METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 2, 第119頁 (1991)およびWinter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)を参照。ヒト免疫グロブリンファージライブラリを産生するのに有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA)から入手することができる。
【００２７】
加えて、本明細書で提供される抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であることができる。そのような抗体は、抗原投与に反応して特異的ヒト抗体を産生するように「操作されて」いるトランスジェニックマウスから得ることができる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素が、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株から生じたマウスの系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するのに用いることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al.(Nature Genet., 7:13 (1994))、Lonberg et al.(Nature, 368:856 (1994))、およびTaylor et al. (Int. Immunol., 6:579 (1994))によって記載されている。
【００２８】
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質加水分解によって、または断片をコードする核酸の発現によって調製することができる。抗体断片は、従来の方法によりインタクトな抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、Fab断片は、パパインによる抗体の酵素的切断によって生成することができる。いくつかの場合において、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され、F(ab')2と表される5S断片を提供することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意でジスルフィド結合の切断にから生じるスルフヒドリル基の保護基を用いてさらに切断され、3.5S Fab'一価断片を生成することができる。いくつかの場合において、ペプシンを用いる酵素的切断を用いて、2つの一価Fab'断片およびFc断片を直接的に生成することができる。これらの方法は、例えば、Goldenberg(米国特許第4,036,945号および同第4,331,647号)によって記載されている。Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959); Edelman et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967);およびColigan et al. at sections 2.8.1 2.8.10 and 2.10.1 2.10.4も参照。
【００２９】
抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽重鎖断片を形成する重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的技法も用いられ、そのエピトープに結合する(例えば、選択的に結合する)一部の能力を保持する断片を提供しうる。
【００３０】
本明細書で提供される抗体は実質的に純粋であることができる。抗体に関連して本明細書で用いられる「実質的に純粋」という用語は、抗体が、それに天然には付随する他のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸を実質的に含まないことを意味する。よって、実質的に純粋な抗体は、その天然の環境から取り出された任意の抗体であり、かつ少なくとも60％純粋である。実質的に純粋な抗体は、少なくとも約65、70、75、80、85、90、95、または99％純粋であることができる。
【００３１】
いくつかの場合において、BMP-5ポリペプチド阻害剤の1つまたは複数の阻害剤を含む組成物は、回旋筋腱板異常を処置するために用いることができる。BMP-5ポリペプチド阻害剤の例には、これらに限定されるわけではないが、ノギンポリペプチド、コーディン、グレムリン(gremlin)、グリコサミノグリカン(GAG)、およびGAG改変酵素が含まれる。BMP-5ポリペプチド阻害剤の阻害剤の例には、これらに限定されるわけではないが、抗ノギン抗体、抗コーディン抗体、および抗グレムリン抗体、ならびにノギン、コーディン、およびグレムリンに対するsiRNA分子が含まれる。このようなBMP-5ポリペプチド阻害剤の阻害剤の投与は、BMP-5ポリペプチド阻害剤の活性を低減または阻止し、損傷または変性した回旋筋腱板の腱におけるBMP-5シグナル伝達を増強する。
【００３２】
いくつかの場合において、BMP-5ポリペプチドを発現する細胞を含む組成物は、回旋筋腱板異常を処置するために用いることができる。例えば、細胞(例えば、幹細胞)は、BMP-5ポリペプチドをコードする外因性核酸(例えば、発現ベクター)を含むようにトランスフェクトすることができる。そのような場合において、細胞はBMP-5ポリペプチドを発現することができる。BMP-5ポリペプチドを発現するように設計することができ、かつ回旋筋腱板異常を処置するために用いることができる細胞の例には、これらに限定されるわけではないが、幹細胞(例えば、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、人工多能性幹細胞、および初代間葉系細胞)、骨芽細胞、および増骨細胞、エクスビボで培養した骨または骨断片内の細胞、ならびに組換えポリペプチドを産生することができる細胞株(例えば、CHO細胞、COS細胞、およびHela細胞)が含まれる。いくつかの場合において、細胞は、処置される哺乳動物(例えば、ヒト)から得られた細胞であることができる。例えば、幹細胞は、患者から得られ、ヒトBMP-5ポリペプチドを発現するように設計され、その同じ患者に投与することができる。細胞内でのBMP-5の発現を誘導するために用いることができるベクターの例には、これらに限定されるわけではないが、プラスミド、合成mRNA、およびウイルスベクター(例えば、AAV、泡沫状ウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、またはアデノウイルスベクター)が含まれる。
【００３３】
本明細書で提供される組成物(例えば、BMP-5ポリペプチドまたはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞を含有する組成物)は、関節腔内への関節内注入、肩峰下腔内への注入、損傷を受けた腱内への直接注入、腱自体への送達が含まれる外科的修復時の局所への送達、骨腱結合部への送達、または関節腔内への直接送達によって哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与することができる。いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物(例えば、BMP-5ポリペプチドまたはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞を含有する組成物)は、関節内に、腱に隣接して、または骨腱結合部に置かれた縫合糸を用いて哺乳動物の回旋筋腱板領域に投与することができる。
【００３４】
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物(例えば、BMP-5ポリペプチドまたはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞を含有する組成物)は、組織スキャフォールド(例えば、生分解性ナノファイバースキャフォールドまたはコラーゲンスキャフォールド)を欠くことができる。例えば、組織スキャフォールド構造なしの液体組成物は、BMP-5ポリペプチドまたはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞を含むように設計することができ、哺乳動物に投与(例えば、その中に注入)され、回旋筋腱板異常を処置することができる。
【００３５】
いくつかの場合において、本明細書で提供される方法および物質(例えば、BMP-5ポリペプチドまたはBMP-5ポリペプチドを発現するように設計された細胞を含有する組成物)は、腱炎または腱障害、例えば、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、四頭筋腱障害、または上顆炎を処置するために用いることができる。
【００３６】
本発明は以下の実施例においてさらに記載され、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例1−損傷を受けた/破断した回旋筋腱板の腱の評価
無傷の回旋筋腱板の腱および破断した回旋筋腱板の腱のハイスループットRNA配列決定を実施した。配列決定解析は初めに、損傷を受けた/破断した回旋筋腱板の腱に対して無傷の腱で上方制御されているものとして、BMP受容体、ACVR1Cを同定した(表1)。
【００３８】
（表１）回旋筋腱板の腱におけるBMP受容体の発現
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【００３９】
ACVR1C受容体を同定したら、次に、ACVR1C受容体に結合するリガンドならびにこの受容体に関連する下流シグナル伝達分子を評価した。配列決定データの評価によって、BMP5が、ACVR1C受容体リガンド候補のうち最大の発現の増加を呈示し、疾患を有する破断した腱と比較して無傷の回旋筋腱板の腱で11.06倍増加を示すことが明らかになった(表2)。損傷を受けた回旋筋腱板の腱におけるBMPシグナル伝達の減少もまた、BMPのACVR1C 受容体への結合により正常には活性化される、BMP特異的SMADタンパク質(SMAD1、SMAD5、およびSMAD9) のmRNAレベルの低下によって確認された(表3)。
【００４０】
（表２）疾患を有する回旋筋腱板の腱に対する無傷の回旋筋腱板の腱でのBMPの発現
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【００４１】
（表３）ACVR1Cを通る下流シグナル伝達により活性化されるSMADポリペプチドの発現
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【００４２】
BMP5発現を、骨、軟骨、筋肉、腱、および靱帯を含むさまざまな組織型の間でも試験した。BMP5は骨で最高レベルの発現を示したが、腱で2番目に高いレベルの発現を示した(図1)。これらの結果は、BMP5が正常な腱の表現型の維持に関与することを示唆する。これらの結果はまた、BMP5ポリペプチドが、例えば、破断前に予防剤として、または修復(例えば、外科的修復)を受けている腱を処置する補助剤として、変性回旋筋腱板疾患を処置するために治療的に用いられうることを示唆する。
【００４３】
何百もの制御性転写因子を含むRNA配列決定データによっても、疾患を有する回旋筋腱板の腱における遺伝子発現の全般的な下方制御が明らかになった。SIRT6、SIRT7、HDAC10、RING1、およびCARM1は、遺伝子サイレンシングを促すエピジェネティックな制御因子であり、変性腱試料において発現レベルの上昇が見られた(表4)。
【００４４】
（表４）回旋筋腱板の腱における遺伝子サイレンシングエピジェネティック制御因子の発現
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【００４５】
これらの結果は、SIRT6、SIRT7、HDAC10、RING1、およびCARM1が、疾患を有する回旋筋腱板の腱の表現型に関与することを示唆する。これらの結果はまた、SIRT6、SIRT7、HDAC10、RING1、およびCARM1の発現または活性の阻害剤が、例えば、破断前に予防剤として、または修復(例えば、外科的修復)を受けている腱を処置する補助剤として、変性回旋筋腱板疾患を処置するために治療的に用いられうることを示唆する。
【００４６】
実施例2−BMP-5ポリペプチドを注入し、損傷を受けた/破断した回旋筋腱板の腱を処置する
BMP-5ポリペプチドは、真核細胞株(例えば、CHO細胞、HeLa細胞、または脂肪由来間葉系幹細胞)を用いてBMP-5を産生し、GMPグレード施設において合成される。BMP-5は細胞抽出物から精製される。0.5から10 mgのBMP-5ポリペプチドを、1から10 mLの4 mM HClまたは他の可溶性溶液で製剤化し、約0.5から5 mg/mLの最終濃度を有する液体組成物を得る。この液体組成物を0.1から5 mg/mLの用量で、変性もしくは手術で修復した腱内にまたは関節腔内に直接注入し、1回の投与あたり0.1 mgから50 mg範囲の合計量のBMP-5を送達する。
【００４７】
実施例3−BMP-5ポリペプチドを発現するように設計した細胞を注入し、損傷を受けた/破断した回旋筋腱板の腱を処置する
細胞中で構成的にBMP-5を発現するように設計されたウイルスベクターまたは他の核酸ベースのベクターを、幹細胞または他の体細胞型に導入する。これらの改変された細胞を生理食塩水または他の細胞培養培地で製剤化し、約100,000から20×106 細胞/mLの最終濃度を有する液体組成物を得る。この液体組成物を約100,000から20×106 細胞/mLの用量で、損傷を受けた腱または関節腔/肩峰下腔内に直接導入し、1回の投与あたり100,000から20×106個の範囲の合計数の細胞を送達する。BMP-5発現幹細胞は超音波誘導でまたはそれなしで注入される。いくつかの場合において、これらの技法は、破断するリスクがある変性腱を処置する、または以前に破断した腱の外科的修復を強化するために用いることができる。
【００４８】
他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して説明されているが、前述の説明は例示を意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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