(57)【要約】  圧力サイクル技術による試料調製のためのデバイスおよび方法を開示する。試料調製用のデバイスは、内表面、上部および底部を有するチューブであって、底部に試料を含み試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたチューブと、チューブの上部に着脱可能に連結されたキャップと、キャップからチューブ内に延びるテーパー付きの細長い部材であって、チューブの内表面およびチューブの底部の試料に接触するように構成された細長い部材とを備え、チューブは、圧力下の操作でチューブがテーパー付きの細長い部材に対して変形して試料の破砕を促進するように変形可能である。
2017518497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内表面、上部、および底部を有するチューブであって、前記底部に試料を含み試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたチューブと、
前記チューブの前記上部に着脱可能に連結されたキャップと、
前記キャップから前記チューブ内に延びるテーパー付きの細長い部材であって、前記チューブの前記内表面および前記チューブの前記底部の中の前記試料に接触するように構成された細長い部材と
を備える試料調製デバイスであって、
前記チューブは、圧力下の操作で前記チューブが前記テーパー付きの細長い部材に対して変形して、前記試料の破砕を促進するように変形可能であることを特徴とする試料調製デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスであって、前記試料が細針生検試料であることを特徴とするデバイス。
【請求項３】
請求項１に記載のデバイスであって、前記試料の大きさが約３０ｍｇ未満であることを特徴とするデバイス。
【請求項４】
請求項１に記載のデバイスであって、前記チューブおよび前記テーパー付きの細長い部材のうちの少なくとも１つがポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはフッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）から作製されていることを特徴とするデバイス。
【請求項５】
請求項１に記載のデバイスであって、前記チューブおよび前記テーパー付きの細長い部材のうちの少なくとも１つが単回使用向けの消耗品であることを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項１に記載のデバイスであって、前記テーパー付きの細長い部材が前記キャップと一体であることを特徴とするデバイス。
【請求項７】
各ウェルが内壁および底部を備えるウェルのアレーを有するマルチウェルプレートであって、各ウェルの前記底部に試料を含み試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたマルチウェルプレートと、
前記マルチウェルプレートと対をなして各ウェル用のキャップを形成するように構成されたマットと、
前記マットから前記ウェルのアレー内に延びる複数のテーパー付きの細長い部材であって、前記ウェルの内表面および前記ウェルの前記底部の中の前記試料に接触するように構成された細長い部材と
を備える試料調製キットであって、
前記マルチウェルプレートは、圧力下の操作で前記ウェルが前記テーパー付きの細長い部材に対して変形して、前記試料の破砕を促進するように変形可能であることを特徴とする試料調製キット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットであって、前記試料が細針生検試料であることを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項７に記載のキットであって、試薬または酵素の供給源をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項７に記載のキットであって、前記チューブおよび前記テーパー付きの細長い部材のうちの少なくとも１つがポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはフッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）から作製されていることを特徴とするキット。
【請求項１１】
内壁、上部および底部を有するチューブに試料を導入するステップであって、前記チューブは試料調製のために圧力サイクル技術システム内に受容されるように構成されているステップと、
前記チューブにキャップを着脱可能に連結するステップであって、前記キャップは前記チューブ内に延びるテーパー付きの細長い部材を備え、前記テーパー付きの細長い部材は前記チューブの内表面に接触し前記チューブの前記底部の中の前記試料を捕捉するように構成されているステップと、
前記チューブの前記内壁および前記底部が前記テーパー付きの細長い部材に対して交互に圧縮および減圧して前記試料の破砕を促進するように、前記チューブを昇圧した静水圧Ｐ１から実質的により低い圧力Ｐ２への圧力サイクル変化にかけるステップと、
圧力サイクルに続いて前記試料から成分を単離するステップと、
単離された試料成分を下流の分離および／または分析装置に導入するステップと
を含むことを特徴とする試料調製方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記単離された試料成分が分析のために質量分析装置に向けられることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記圧力サイクルの範囲が２０，０００ｐｓｉから１００，０００ｐｓｉであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、圧力サイクルに先立ち前記チューブに試薬および／または酵素を導入するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、前記試料が細針生検試料であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１つ以上の態様は、試料調製、より詳細には閉鎖容器内の試料の機械的破砕のための統合されたデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、これによりすべての目的に対してその全体を本願に引用して援用する、２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，６６２号の優先権の利益を主張する。
【０００３】
生物学または環境面の被験物の分析には通常、試料由来の分子が溶液中に存在することが必要である。しかしながら、多くの種類の試料は（動物および植物の組織、土壌試料など）比較的堅固な構造を有しており、関心のある分子は細胞および細胞外基質中に含まれているため、溶解で利用できない。抽出が困難な試料の例は、植物の種子、昆虫体全体および繊維組織である。このような試料の分析のための調製では、通常好適な試薬中での粉砕、均一化または離解の操作による被験物構造の機械的破砕を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０２８１９５５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
被験物分子の分離および検出のたいていの分析方法は高度に自動化されているが、最初の試料調製工程はしばしば操作者の関与と手動操作を必要とする。一般に、哺乳類もしくは植物の細胞の培養物、細菌、または真菌などの単細胞生物の大型被験物および懸濁液は、大規模バッチモードもしくは連続的高流量のホモジナイザー、または超音波キャビテーションとしても知られる高エネルギー超音波を使用するシステムで処理される。少量の細胞懸濁液の小さな組織試料は、そのような装置では効率的に処理することができない。分析方法の感度が増加するに連れて、開発研究や臨床診断の応用から少量の生物学的材料（微小組織生検など）を分析する要求が増加し、そのような試料を分析するための新規の調製方法が求められる。しかしながら、小さな試料の処理用に特化した装置も、低い均一化効率、試料損失または潜在的な有害試料への操作者の曝露などの制約から自由ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つ以上の態様によれば、試料調製デバイスは、内表面、上部および底部を有するチューブであって、底部に試料を含み試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたチューブと、チューブの上部に着脱可能に連結されたキャップと、キャップからチューブ内に延びるテーパー付きの細長い部材であって、チューブの内表面およびチューブの底部の試料に接触するように構成された細長い部材とを備えることができ、チューブは、圧力下の操作でチューブがテーパー付きの細長い部材に対して変形して、試料の破砕を促進するように変形可能である。
【０００７】
１つ以上の態様によれば、試料調製キットは、各ウェルが内壁および底部を備えるウェルのアレーを有するマルチウェルプレートであって、各ウェルの底部に試料を含み試料調製のために圧力チャンバー内に受容されるように構成されたマルチウェルプレートと、マルチウェルプレートと対をなして各ウェルのキャップを形成するように構成されたマットと、マットからウェルのアレー内に延びる複数のテーパー付きの細長い部材であって、ウェルの内表面とウェルの底部の試料に接触するように構成された細長い部材とを備えることができ、マルチウェルプレートは、圧力下の操作でウェルがテーパー付きの細長い部材に対して変形して、試料の破砕を促進するように変形可能である。
【０００８】
１つ以上の態様によれば、試料調製方法は、内壁、上部および底部を有するチューブに試料を導入するステップであって、チューブは試料調製のために圧力サイクル技術システム内に受容されるように構成されているステップと、チューブにキャップを着脱可能に連結するステップであって、キャップはチューブ内に延びるテーパー付きの細長い部材を備え、テーパー付きの細長い部材はチューブの内表面に接触しチューブの底部の中の試料を捕捉するように構成されているステップと、チューブの内壁および底部がテーパー付きの細長い部材に対して交互に圧縮および減圧して試料の破砕を促進するように、チューブを昇圧した静水圧Ｐ１から実質的により低い圧力のＰ２への圧力サイクル変化にかけるステップと、圧力サイクルに続いて試料から成分を単離するステップと、単離した試料成分を下流の分離および／または分析装置に導入するステップとを含むことができる。
【０００９】
さらに他の態様、実施形態ならびに、これらの例示的な態様および実施形態の利点を以下で詳細に考察する。本明細書で開示する任意の実施形態は、任意の他の実施形態と、本明細書で開示される目的、意図および必要性の少なくとも１つと調和する任意の方法で組み合わせることができ、「実施形態」、「いくつかの実施形態」、「別の実施形態」、「様々な実施形態」、「一実施形態」などの参照は、必ずしも相互に排他的ではなく、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれてよいことを示すことを意図している。本明細書でのそのような用語の出現は、必ずしもすべてが同一の実施形態を参照している訳ではない。添付図面は、種々の態様および実施形態の例示とさらなる理解を提供するために備えられており、この明細書に含まれ、その一部分を構成する。明細書の残りと合わせて、図面は、記載されて主張される態様と実施形態の原理および操作の説明を提示する。
【００１０】
少なくとも一実施形態の種々の態様を添付の図面に関して以下で考察するが、図面は縮尺通り描くことを意図していない。図面は、種々の態様および実施形態の例示とさらなる理解を提供するために備えられており、この明細書に含まれ、その一部分を構成するが、如何なる特定の実施形態を限定する定義として意図するものではない。明細書の残りと合わせて、図面は、記載され主張される態様と実施形態の原理および操作の説明を提示する。図面では、種々の図面で例示された、それぞれ同一のまたはほぼ同一の部品は同様の数値により表される。見やすくする目的で、すべての部品がすべての図面でラベル付けされている訳ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】少なくとも一実施形態による代表図である。
【図２ａ】少なくとも一実施形態による代表図である。
【図２ｂ】少なくとも一実施形態による代表図である。
【図２ｃ】少なくとも一実施形態による代表図である。
【図３】少なくとも一実施形態による斜視図である。
【図４ａ】支持された上部キャップを除くすべての側面からの静水圧がかかるときの、少なくとも一実施形態による側面図である。
【図４ｂ】支持された上部キャップを除くすべての側面からの静水圧がかかるときの、少なくとも一実施形態による側面図である。
【図５ａ】試料に対してすべての方向に均一な静水圧がかかるときの、少なくとも一実施形態による側面図である。
【図５ｂ】試料に対してすべての方向に均一な静水圧がかかるときの、少なくとも一実施形態による側面図である。
【図６】少なくとも一実施形態による静水圧縮に起因する容器変形を実証するコンピュータ生成モデルである。
【図７ａ】少なくとも一実施形態による、収縮され拡大された挿入体の側面図である。
【図７ｂ】少なくとも一実施形態による、収縮され拡大された挿入体の側面図である。
【図８ａ】種々の実施形態による、異なる挿入体形状の側面図である。
【図８ｂ】本発明の態様による、４種の試料の均一化結果の特徴である。
【図９】実施例による、挿入体の直径寸法とタンパク質収率との間の関係を示すグラフである。
【図１０】実施例による、圧力サイクル数とタンパク質収率との間の関係を示すグラフである。
【図１１】実施例による、少なくとも一実施形態による圧力と、圧力サイクル数とタンパク質収率との間の関係を示すグラフである。
【図１２ａ】実施例による、試料寸法とタンパク質収率との間の関係を示すグラフである。
【図１２ｂ】実施例による、試料寸法とタンパク質収率との間の関係を示すグラフである。
【図１３】実施例による、挿入体、超音波処理を伴う挿入体、および超音波処理のみでの有効性の比較を示すグラフである。
【図１４】実施例による、挿入体の有効性の比較グラフである。
【図１５】実施例による、挿入体を伴う圧力サイクルと挿入体を伴わない圧力サイクルとのタンパク質収率の間の関係を示すグラフである。
【図１６】実施例による、圧力程度とタンパク質収率との関係を示すグラフおよび表である。
【図１７】１つ以上の実施形態による、変形可能なキャップおよび細長い部材部品の斜視図である。
【図１８】１つ以上の実施形態による、カートリッジ運搬体の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１つ以上の実施形態によれば、ゲノミクス、プロテオミクス、トランスクリプトミクスおよびメタボロミクスなどの分野の前処理試料調製を、試料分析に先だって容易にすることができる。種々の実施形態を、試料調製のために圧力サイクル技術（ＰＣＴ）と組み合わせて使用して、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質および小分子ならびに分子複合体（例えば、細胞内小器官、クロマチン、ポリリボソーム、筋原線維、膜画分）を固形組織、特に比較的小さな試料から抽出するのを向上させることもできる。ＰＣＴ技術では、静水圧反応チャンバー中で、試料が周囲圧と高圧の交互サイクルにかけられると、溶解が起こる。例えば、高圧は、約２０，０００ｐｓｉから約１００，０００ｐｓｉの範囲である。種々の本実施形態では、圧力は非硬質のチューブ状容器の周囲とペッスル挿入体とを圧縮してもよく、チューブ状容器の壁がペッスル表面の近傍まで移動するようになり、試料物質を破壊する。試料材料の追加の機械的分解は、より効率的な試料調製プロセスをもたらす。いくつかの実施形態では、試料調製の促進のために、入出運動などの直線的な運動、またはチューブ状容器に対してペッスルの円運動は必要ない。少なくともいくつかの実施形態では、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．から市販されているＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＴ機器を、試料容器の圧縮を容易にするために使用してもよく、試料調製の間に試料の分解を増強させる。いくつかの実施形態では、操作者が試料調製の間に挿入体を手動で操作することはない。下流では、種々の分離および分析の工程が遂行されてもよい。例えば、クロマトグラフ分離、質量分析およびデータ解析法が実施されてもよい。少なくともいくつかの実施形態では、以前には試料材料の損失および相互汚染をもたらす従来型の装置では容易に実施できなかった細針生検試料から、下流の質量分析のために十分なタンパク質が有利に放出され得る。いくつかの実施形態は、バイオマーカーの発見、診断、法医学、創薬および薬物設計、バイオ治療の特性評価、土壌および植物生物学、ワクチン開発および組織学の応用の分野での使用法を見出すことができる。
【００１３】
１つ以上の実施形態によれば、静水圧および／または機械力が変形のために使用できる。恒久的または着脱可能にキャップに連結されたペッスルなどの細長い部材は、試料調製を容易にし得る。いくつかの実施形態では、すべての側面からの均一な静水圧により変形がなされる。他の実施形態では、キャップが上部カバーに固定されているとき、底面および／または側面からの圧力により変形がなされる。いくつかの実施形態では、ペッスルが装着された柔軟性のあるキャップを通しての上部からの圧力により変形がなされる。チューブは硬質のウェル内で支持されてもよい。さらに別の実施形態では、ペッスルが装着された柔軟性のあるキャップを通して上部からの機械力により変形がなされる。チューブは硬質のウェルにより支持されてもよい。さらに別の実施形態では、ペッスルが装着された柔軟性のあるキャップを通して上部からの圧力により変形がなされる。
【００１４】
１つ以上の実施形態によれば、試料は、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．から市販されているＰＣＴ  μＴｕｂｅ（登録商標）などの試料容器内に入れることができる。試料容器は、通常ＰＣＴ装置と互換性のある寸法および形状にしてもよい。試料容器は、通常目的とする試料と両立する任意の不活性材料で作製することができ、通常ＰＣＴ処理に耐えることができる。少なくともいくつかの実施形態では、容器は非常に高い静水圧の下で著しく収縮する材料で作製することができる。材料は通常、非硬質でもよい。材料はまた、例えば、−２００℃から１００℃までの、広い温度範囲に渡って完全性を保持することができる。耐薬品性ならびに無視できるほどのタンパク質および核酸の吸着は、ほぼ完全な試料の回復を確実にする助けになり、特に少量試料で重要である。例えば、容器は、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）プラスチックで作製されていてもよい。いくつかの実施形態では、内表面などの容器表面は、興味のある分子（タンパク質、核酸または脂質など）の選択的結合をもたらすために改変され、試料の均一化の間に前記分子の濃縮を容易にすることができる。
【００１５】
１つ以上の実施形態によれば、本明細書に記載したような試料調製の種類に資する任意の試料を使用できる。いくつかの実施例では、試料はポリマー材料でもよい。例えば、試料はアクリルアミドまたはアガロースゲルでもよい。いくつかの実施形態では、試料は生物学的試料でもよい。例えば、生物学的試料は、植物試料、動物もしくは微生物の細胞試料、または組織試料も可能である。いくつかの実施形態では、組織試料は心臓または骨格筋組織、脈管構造組織、皮膚組織、腫瘍組織および軟組織のうちの少なくとも１つでもよい。例えば、軟組織試料は、肝臓、脾臓、脳、肺、腸または胃の組織のうちの少なくとも１つでもよい。組織試料は、外科的処置の間に生物から抽出でき、パンチ生検または針生検により、培養による増殖により、または固定および続いて定着薬および保管基質の除去により得られる。試料はまた、固定または新鮮凍結の病理スライドからレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により得ることができる。試料はまた、試料容器に全体が入り込む生物体全体（節足動物、線虫など）であってもよい。少なくともいくつかの実施形態では、試料は、微小な針生検またはパンチ生検などからの、生検組織試料でもよい。試料は、精密医療を支援するための、正常または疾病の被験物に関してもよい。その他の実施形態では、均一化すべき被験物は、ろ紙の打ち出し上の乾燥した血液スポット、上皮細胞を含む綿棒、接触試料を含む法医学用の綿棒、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルの打ち出しのタンパク質または核酸のスポット／バンド、でもよい。試料は、固体、ゲル、半流動体または懸濁液でもよい。
【００１６】
比較的小さな試料は、試料容器に収容されてもよい。例えば、試料の大きさは約３０ｍｇ未満でもよい。いくつかの実施形態では、試料の大きさは１０ｍｇ未満でもよい。少なくともいくつかの実施形態では、試料の大きさは約０．５から約３．０ｍｇの範囲でもよい。さらに他の実施形態では、試料の大きさは１個または数個の細胞のみでもよい。小さな試料の大きさの収容に加えて、試料の損失が最小化される。熱の発生および／または高い剪断応力もまた、抽出された成分の完全性を保つために避けるべきである。
【００１７】
１つ以上の実施形態によれば、続いて１種以上の試薬が試料容器に導入されてもよい。この目的のためにピペットを使用してもよい。比較的低体積の抽出薬を使用してもよく、例えば約２０μＬから約３０μＬの低さの程度である。広範囲の試薬が使用できる。試薬は、例えば、タンパク質の抽出のために一般に使用される任意の試薬でよく、ＲＩＰＡバッファー、尿素バッファー、グアニジン−ＨＣｌバッファー、リン酸緩衝食塩水、または有機溶媒などである。試薬はまた、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出に使用する任意の試薬でもよく、グアニジン−ＨＣｌ、フェノールまたは界面活性剤などである。その他のバッファーおよび試薬（トリス、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）など）、ならびに炭酸水素アンモニウムもまた使用できる。いくつかの実施形態では、内生酵素活性の特定の阻害薬を試料の分解の前に抽出バッファーに添加して、プロセスの間または試料の分解もしくは溶解の完了にあたって、放出された内生酵素への曝露から、および内生酵素による損傷から試料成分を保護してもよい。
【００１８】
１つ以上の実施形態によれば、１種以上の酵素が試料容器に導入されてもよい。酵素は自然起源または合成用に設計されたものでもよい。代表的な酵素には、トリプシン、ＰＮＧアーゼＦ、エンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃ、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼ  Ｇｌｕ−Ｃを含んでもよい。代表的な酵素にはまた、例えばエンドプロテアーゼ  Ａｓｐ−Ｎ、エンドプロテアーゼ  Ａｒｇ−Ｃ、ペプシンおよびパパインを含んでもよい。
【００１９】
試薬はまた、ある種の試料成分の消化作用を伴う酵素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、酵素は、試料中のＤＮＡの消化作用のためのＤＮアーゼ酵素、またはＲＮＡの消化作用のためのＲＮアーゼ酵素でもよい。いくつかの実施形態では、不必要なタンパク質の消化作用のために、酵素はベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ、またはプロナーゼもしくはプロテイナーゼＫなどの一般のタンパク質分解酵素でもよい。さらに別の実施形態では、酵素は、特定のタンパク質分解酵素でもよく、試料ペプチドの単離のためのトリプシンなど、または細菌および真菌の細胞壁の溶解のための酵素である、リゾチームおよびザイモラーゼなどである。
【００２０】
１つ以上の実施形態によれば、少なくとも多少の量の空気が容器内の試料の上部に残っていてもよく、本明細書で考察するように、チューブの十分な変形を可能にする圧縮性をもたらすようにする。試料容器を適切に満たしたとき、試料材料および試薬は容器の約２／３を満たされてもよい。試料容器の残りの１／３は残留空気で満たされてもよい。
【００２１】
１つ以上の実施形態によれば、次いで細長い部材を満たされた試料容器に導入して、軟組織の効果的な破砕を容易にし、圧力駆動の機械的分解による細胞溶解を増加させる。いくつかの非限定的な実施形態では、細長い部材は通常テーパー付きであり、例えばペッスルを真似るようにする。様々な大きさと形状が、本明細書で考察したように実施されてもよい。細長い部材は任意の材料で作製できる。いくつかの実施形態では、細長い部材は不活性材料で作製できる。いくつかの実施形態では、細長い部材は、例えば試料を濃厚にしたり純度を高めたりするために、関心のある試料成分に特異的に結合する成分を含んでもよい。試料調製の間に試料の破砕の原因となるように、通常材料は相対的に試料よりも硬質であるべきである。材料はまた、いくつかの実施形態で同じ目的のために、非硬質な容器よりも相対的に同等またはより硬質であるとよい。少なくともいくつかの非限定的実施形態では、細長い部材は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｒｐ．から市販されているテフロン（登録商標）で作製されている。細長い部材を試料容器に挿入するために、手動の工具またはロボット遠隔操縦機を使用してもよい。細長い部材は、試料容器用の変形可能なキャップに一体化されるか、または着脱可能に連結されてもよい。
【００２２】
１つ以上の実施形態によれば、試料容器と細長い部材との一方または両方は、通常単回使用向けでもよい。したがって一方または両方は、消耗品のような使い捨てでもよい。一方または両方は、独立にバルクで提供されてもよい。あるいは、一方または両方のアレーは、ラックに入れるように提供されてもよい。例えば、複数の試料容器および／または細長い部材は、標準形式で提供されてもよく、使用を容易にするために、９６ユニットラックのような、標準的な試料調製および分析装置と互換性があってもよい。いくつかの実施形態では、試料容器は、書き込みできる表面を備えてもよい。
【００２３】
１つ以上の実施形態によれば、挿入された細長い部材を含む満たされた試料容器を、次いで、ＰＣＴチャンバーに入れ、安全に保管する。いくつかの実施形態では、多数試料処理のために、複数の試料容器を、ＰＣＴカートリッジに入れてもよい。カートリッジを次いでＰＣＴチャンバーに入れる。次いで、ＰＣＴ装置でＰＣＴプログラムを走らせる。いくつかの実施形態では、ＰＣＴプログラムは、昇圧した静水圧Ｐ１から実質的により低い圧力Ｐ２への、圧力サイクル変化を伴う。少なくともいくつかの実施形態では、ＰＣＴ装置は、前述したＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）でもよい。少なくともいくつかの実施形態では、ＰＣＴ装置および／またはＰＣＴプログラムおよび／または試料容器は、米国特許第６，１１１，０９６号、第６，１２０，９８５号および第７，６２６，０１７号、ならびに米国特許公開第２０１０−０２８１９５５−Ａ１号（すべてＰｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．に譲渡されている）のいずれかに記載されたことに一致してよく、それらのすべての開示は、これによりすべての目的に対してその全体を本願に引用して援用する。
【００２４】
ＰＣＴプログラムの完了に際してＰＣＴチャンバーは開放されてもよく、均一化された試料は、さらなる処理、分離、抽出および／または分析のために回収されてもよい。均一化された試料は、元の試料材料の構造とは異なる構造を備えてもよい。いくつかの実施形態では、細胞間基質およびその結合は破壊されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質、脂質、膜、小器官、細菌、ウイルスおよび核酸などの成分を溶媒または抽出試薬に放出するために、細胞性膜を破砕できる。
【００２５】
少なくともいくつかの実施形態では、取扱を単純化するためにＰＣＴに適合の作業ステーションを使用してもよい。キットは人間工学的に設計されており、使用者が複数の試料を一度に処理することを可能にする器具およびハードウェアを含む。例えば、前述したＰＣＴカートリッジまたは試料ホルダーは、１つ以上の試料容器を受容するために組み立てられていてもよい。カートリッジは、積層アレーを運搬でき、アレーおよび／またはレベルに基づいてそれらの唯一の位置により試料を識別できる。カートリッジはキャップをチューブの上部部分に無理やり押し込み、チューブの上部部分はウェルの中に入り、静水圧による圧縮の下でチューブの変形が起こったときでさえも、各チューブの強固な密封を確実にする。キットは、例えば、１つ以上の試料チューブおよび１つ以上の細長い部材を備えてよい。キットはまた、試薬および／または酵素の供給源などの他の成分を含んでもよい。
【００２６】
操作においては、試料容器の底部で細長い部材の末端によって試料を捕捉してもよい。試料は、毎回の圧力サイクルで、試料容器の収縮に起因して、本明細書でさらに説明したように、上から、周囲から、および／または細長い部材に対して、押しつぶされてもよい。この機械的作用は、高圧下でのバッファーの抽出能力と相まって、結果として効果的な均一化と抽出をもたらす。高静水圧では、空気は完全に水中に溶解し、さらにそのことはまた、試料調製を容易にし得る。
【００２７】
１つ以上の実施形態は、均一化、超音波キャビテーション（超音波処理）、および振動叩解などの高エネルギーの機械的破砕プロセスの代替として使用されてもよく、またはこれらと共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提示したデバイスおよび方法は、硬質表面の間で押された試料の機械的破壊力と、試料容器および細長い部材との相対的形状に起因する狭い環状ギャップを通る繰り返しの押出しとを結合し、結果として、従来の方法による試料分解と同等または優れている密閉可能な容器での被験物の均一化をもたらす。
【００２８】
１つ以上の実施形態によれば、試料の収集から機械的破砕、抽出まで使用できる、完全に密閉可能な単体の使い捨て容器の使用は、試料の完全性、生産物流管理、異物の混入防止、および試料材料の曝露による潜在的危険性からの使用者保護を保証する。細長い部材の挿入体と試料容器との間の直線的運動の生成と同時に、制御された機械的破砕作用による生物学的試料成分の抽出のために強固に密封された試料を維持することについて、種々のデバイスおよび方法を本明細書で考察する。
【００２９】
１つ以上の実施形態によれば、抽出のための開示したデバイスおよび方法を用いて閉鎖系中で、分析のために試料を調製できる。いくつかの実施形態では、試料調製に先立って溶解または抽出のバッファーを試料容器に添加する。溶解または抽出のバッファーの選択は、所望の分析的な適用に基づく。例えば、抽出バッファーは、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロット法で、試料調製のためのその妥当性確認に基づいて選択できる。いくつかの実施形態では、試料をすりつぶし、均一化し、裏ごしし、離解し、混合し、混濁し、または他の目的のための機械的操作を施す。
【００３０】
試料を均一化し、制御された機械的破砕作用により成分を抽出する。いくつかの実施形態では、制御された機械的破砕作用は、相対的に硬質な挿入体が装着された弾性キャップの強制的な変位により創り出すことができる。挿入体は本明細書で記載したような細長い部材でもよい。挿入体は、種々の実施形態において、ピストン、プランジャー、ランマー、リーマー、マッシャー、マレット、インピンジャー、ペッスルまたは破砕器として記載されてもよい。挿入体は、キャップに装着する第１の末端と、調製のために試料と接触するように構成された第２の末端とを有する。キャップは、周囲の圧力および環境から試料媒体を隔離するために、試料容器を密封できる。いくつかの実施形態では、キャップは、静水圧縮から生じる直線状の変形に合わせるために、弾性があってもよい。少なくとも一実施形態では、キャップは挿入体の一部分でもよい。他の実施形態では、動作は、試料ウェルの圧力誘起の収縮により創り出されてもよく、圧力誘起の収縮はウェルの底部を挿入体の先端と接触するように持ち上げることができる。１回以上の圧力サイクルのように、その力は１回または繰り返して加えることができ、試料破砕を所望の程度に最適化する。試料ウェルは、種々の実施形態で、容器、器、ホルダーまたはチューブと呼ぶことができる。本明細書で考察したいくつかの実施形態では、試料ウェルは弾性または変形可能な材料で作製されていてもよい。いくつかの実施形態では、試料ウェルの弾性率は約８０，０００ｐｓｉから１００，０００ｐｓｉである。他の実施形態では、材料は半硬質または硬質な材料でもよい。例えば、試料ウェルは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはフッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）である。試料ウェルは試料材料よりも硬質でもよい。例えば、試料ウェルは少なくともロックウェル硬度でＲ５５の硬度を有してもよい。
【００３１】
挿入体は通常、試料よりも硬い任意の材料で作製できる。いくつかの実施形態では、挿入体は、ステンレス鋼のような金属合金、ガラス、セラミックまたはテフロン（登録商標）などの硬質材料で作製できる。一代替実施形態では、硬質挿入体と共に作用する表面の硬度を増加させるために、硬質の物体または砂礫をウェルに挿入することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、挿入体はかなり小さな直径であり、試料容器中で柔軟性のある膜から懸濁される。キャップ上方の部材または膜もしくはマットなどのキャップのシートは、膜の内周に沿った円運動で圧力をかけて、水平面内での揺動運動を創り出す。他の実施形態では、キャップ上方の部材または膜もしくはマットなどのキャップのシートは、密閉した容器の中で細長い部材の上に同一運動を伝えることなどで、垂直往復運動で圧力をかけることができる。
【００３２】
試料が均一化された後で、抽出された成分は、細胞および組織の成分、医薬品または環境汚染物質およびそれらの代謝物の検出および定量化のために、下流の分析方法に移送される。いくつかの実施形態では、抽出成分の下流での分析は、ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、化学親和性または免疫親和性での濃縮を使用して実施できる。いくつかの実施形態では、抽出成分の下流での分析は、クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィー）、マイクロアレー、質量分析またはタンデム質量分析（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析および液体クロマトグラフィータンデム質量分析）を使用して実施できる。いくつかの実施形態では、抽出成分の下流での分析は、ポリメラーゼ連鎖反応および縦列型反復配列解析を使用して実施できる。
【００３３】
いくつかの非限定的実施形態では、使い捨ての挿入体が、柔軟性のカバーマット（通常シリコーンまたは同様の材料）により所望の配置で（通常９ｍｍ間隔）保持されてもよい。マットは、配置した試料ウェルのプレート用のキャップとして機能し得る。マットに圧力または力がかかると、マットは変形して、対応するウェルのさらに中へ挿入体を押し、結果として各ウェルの中で内容物を均一化する動作となり得る。いくつかの実施形態では、ウェルは、個々の空洞がそれぞれのウェルの輪郭に適合しているホルダーの中で支えられてもよい。ホルダーはプラスチックまたは金属などの硬質な材料で作製できる。いくつかの実施形態では、金属は耐腐食性でもよい。例えば金属は、少なくとも真鍮、ステンレス鋼およびアルミニウムのうちの１つであってもよい。ホルダーの目的は、ウェルを支え、ウェルの壁のはぎ取りを防止し、容器とキャップとの間の締りばめを容易にし、容器、キャップまたはその両方の変形の間、密封を維持することである。いくつかの実施形態では、ホルダーのないものも存在する。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態では、ウェルホルダーの位置は固定されていて、力または圧力はマットの上部にかけられ、結果としてマットがゆがみ、続いて挿入体の下方への動きになる。液体取扱ロボットの腕で下方への力を加えてもよい。他の実施形態では、トッププレートが固定され、その代わりにウェルまたはウェルホルダーが動かされてもよい。
【００３５】
さらに他の実施形態では、トッププレートとウェルホルダーの両方が静止状態におかれてもよく、ホルダーが加圧されて、その結果各ウェルは半径方向および軸方向につぶされてもよい。これはまた結果として、挿入体の先端とウェルの底部との間の空間が減少することになる。いくつかの実施形態では、例えば約１０，０００ｐｓｉ以上、例えば２０，０００ｐｓｉ以上の超高静水圧を、抽出を高めるためにかける。試料容器にかけられる最低圧力は被験物の特性に依存する。例えば、試料容器にかけられる最低圧力は被験物の硬度に依存する。試料容器にかけられる最低圧力は試料容器および挿入体の組成に依存する。いくつかの実施形態では、最低圧力は５０００ｐｓｉでもよい。試料容器にかけられる最大圧力は、装置の技術仕様に依存する。いくつかの実施形態では、最大圧力は１００，０００ｐｓｉでもよい。いくつかの実施形態では、部分的な均一化が求められない限り、最大圧力はすべての試料にかけられる。本明細書で考察したさらに他の実施形態では、試料の機械的破砕の原因となるように、挿入体は拡大してもよい。
【００３６】
１つ以上の実施形態によれば、試料調製プロセスは隔離状態で、かつ近代的な流体取扱装置と互換性のある試料容器アレー中で実行されてもよい。例えば試料容器は、中心間で測定して約９ｍｍ離れた間隔でアレー状に配置されてもよい。これは、マイクロタイタープレート用のＡＮＳＩ−ＳＢＳ規格と互換性がある。いくつかの態様では、その技術は回転せずに試料を機械的粉砕することを伴ってもよい。分析用の試料調製および引き続く抽出は、すべて閉鎖または密封された容器で実行され、実質的にその環境から隔離されていてもよい。
【００３７】
１つ以上の実施形態によれば、チューブの間隔およびアレーの構成は、特定の状況の必要に応じて修正できる。例えば、９ｍｍ間隔を有する長方形アレーの代わりに、何か他の間隔を有する円形アレーを使用できる。
【００３８】
そのような技術は、一度に莫大な数の試料を高スループットで処理するために適用できる。例えば、９６ウェルＰＣＲプレートのような工業標準形式で配置された試料が処理できる。いくつかの実施形態では、９６ウェル米国標準規格マイクロプレートを使用できる。基板底面の外形寸法は、出隅から１．７ｍｍ内側を測定して、約１２７ｍｍの長さ、約８５ｍｍの幅である。プレートの底部フランジの４個の出隅は、外側に約３ｍｍのコーナー半径を有してもよい。前述のとおり、ウェルは、中心間で測定して約９ｍｍ離れた間隔でアレー状に配置される。開示したメカニズムは、関心のある生物学的試料からタンパク質、ＤＮＡならびに、ＲＮＡおよび脂質を含むその他の分析物を抽出する能力がある。特に、従来型のモーターとペッスルでの回転動作は、種々の実施形態によれば本質的ではない。ある実施形態での直線状運動もまた本質的ではない。
【００３９】
熱の発生および／または高い剪断応力は、抽出された成分の完全性を保つために避けるべきである。いくつかの実施形態では、プロセスの温度を、冷却ジャケット、ペルチェ素子冷却器、または他の種類の冷却器により、能動的に維持する。いくつかの実施形態では、ジャケットは水、不凍剤、または任意の他の液体を含む。圧力サイクルのプロセスでの水の圧縮に起因する断熱性の発熱、および試料への水の浸水は比較的少ない。例えば、プロセスを室温で実施し、圧力媒体として水を使用する場合、断熱性の発熱は約１℃から約２０℃の間である。それに対して、通常の機械的手段の試料均一化では、装置の運動エネルギーが試料の内部エネルギー、すなわち熱に変換される。試料成分を破砕するためにキャビテーションエネルギーを使用する超音波ホモジナイザーも同様である。キャビテーションはまた、運動エネルギーを主として熱に変える。試料均一化の従来型の機械的手段とキャビテーションとの両方で、それらを間欠的に冷却しない場合、試料は１００℃まで達する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、図１および図２ａ〜図２ｃに示すように、破砕される微小被験物１０５は、試料容器１０１の底部と挿入部材１０２との間に形成された狭い空洞１０４に、それが挿入部材と容器壁との間の環状のギャップ６を通って挿入部材上部の空間１０７に押し出されるまで、閉じ込められる。このプロセスは図２に示すように、挿入部材の垂直次元の往復運動によって駆動できる。挿入部材は、発生するそのような動作に対して十分に柔軟性がある、変形可能なキャップ材料１０３に装着される。いくつかの実施形態では、挿入体の動作は、柔軟なキャップに加えられる機械的な力によって促進できる。他の実施形態では、試料、抽出溶液および残留空気を完全に封入した容器を静水圧器内に置き、静水圧の交互サイクルを施すことができる。被験物容器の内外の圧力差から生じる膜キャップ１０３の柔軟な変形は、結果として被験物容器内部の挿入部材の往復運動となり、その一方で容器は密閉されたままである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、図３に示すように、挿入体ホルダー３０９は、変形可能なキャップ材料３０３に装着される。挿入体ホルダーは、挿入部材３０２の最近接末端で挿入ナブ３０８を受け入れて保持する形状と寸法である。
【００４２】
他の実施形態では、図４および図５に示すように、試料容器は挿入部材を備え前記容器内に延びる変形しないキャップで閉鎖される。閉鎖したチューブに高静水圧をかけると、チューブは変形してその容積がより小さくなる。低圧縮性材料で作製されている挿入部材の寸法は、比較的変化なく維持される。挿入部材に対するチューブのこの軸方向運動の結果として、上述したように、試料材料は挿入部材とチューブの壁との間で圧縮され、生成した環状ギャップを通して押し出される。チューブ内に存在する空気は、結果として挿入部材に対するチューブの大きな圧縮を生み、より大きな程度の機械的な運動と試料の均一化をもたらす。あるいは他の実施形態では、形成された挿入体の本体は、閉鎖されたチューブ中により多くの空気を残せるように、へこんだ領域を備える。外側から圧縮されたチューブのＦＥＡコンピューターシミュレーション（図６）では、静水圧で交互に圧力のかかる条件で、軸方向の収縮および拡大はチューブの好ましい変形であることを確認している。チューブの設計および材料に特異的な圧縮性またはその他のパラメーターは、変形の性質に強い影響を与える。
【００４３】
図４ａは、静水圧をかけることに起因する、部分的収縮の略図を提示する。圧力をかけると、試料容器４０１の壁は圧縮されて、圧縮された試料容器４２１になる。加えて、試料４０２は壁によって押しつぶされ、均一化された試料４２２を生成する。
【００４４】
図４ｂは、静水圧をかけることに起因する部分的収縮の略図を提示する。ウェルの下部にかかる静水圧は、ウェルの半径方向の収縮、ウェルの長さ方向の軸圧縮および挿入体に対して通り過ぎる試料の上昇動作の原因となる。各被験物は、マルチウェル試料容器４１２の個々の変形可能なウェルに置かれる。続いて、ウェルのアレーは、各ウェルの中に突き出るように装着された硬質の挿入体４１４を含む容器キャップアレー４１３で閉じられる。各ウェルの密封が確立した後で、マルチウェル容器全体を静水圧チャンバー４１１の内部に入れ、剛体のチャンバー蓋４１０で閉鎖する。加圧された流体が、次いで圧力チャンバー４１５に流し込まれ、試料ウェルを取り囲み、硬質の挿入体に対して試料ウェルの壁を圧縮する原因となり、被験物の破壊と均一化に導く。必要であれば、プロセスを複数回繰り返すことができる。この実施形態では、キャップアレーは剛体の蓋に支えられているので、著しく変形される訳ではない。
【００４５】
図５ａは、均一な静水収縮の略図を提示する。圧力をかけると、試料容器５０３の壁は圧縮されて、圧縮された試料容器５２３になり、変形可能なキャップ５０８は圧縮されて、圧縮された変形可能なキャップ５２８になる。加えて、試料５０７は壁によって押しつぶされ、均一化された試料５２７を生成する。
【００４６】
図５ｂは、均一な静水収縮の略図を提示する。各被験物は、マルチウェル試料容器５０３の個々の変形可能なウェルに置かれる。続いて各ウェルは、各ウェルの中に突き出るように装着された硬質の挿入体５０５を含む変形可能な容器キャップアレー５０４によって閉じられる。各ウェルの密封が確立した後で、マルチウェル容器全体を静水圧チャンバー５０２の内部に置き、チャンバー蓋５０１で閉鎖する。加圧された流体が次いで圧力チャンバー５０６に流し込まれ、試料ウェルを取り囲み、硬質の挿入体に対して試料ウェルの壁を圧縮する原因となり、被験物の破壊と均一化に導く。加えて、容器キャップアレーの上方の静水圧が、個々のキャップが変形して各ウェルの内部に入り、さらに被験物を均一化する原因となる。必要であれば、プロセスを複数回繰り返すことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、挿入体はキャップを通過し、圧縮により密封される。すなわち隔壁である。これにより挿入体がキャップと独立に動くことができるため、プロセスに回転動作を追加できるようになる。
【００４８】
図７ａおよび図７ｂは、拡大する挿入体に関係する実施形態を提示する。キャップ／挿入体の構成部品の組合せは、圧力により半径方向に拡大して膨脹させることができる。これにより挿入体とウェルの壁との間で試料を破壊できる。ウェルは支えられて、動くことができない。キャップ（７０４）と挿入体（７０５）の構成部品の組合せの使用では、圧力により膨張させられ、軸方向および半径方向に拡大される。挿入体の拡大は、挿入体とウェルの壁との間で試料を破壊することになる。ウェルの壁（７０３）は剛体ブロック（７０１）に支えられることになり、それらは外側に向かって動くことができない。流体またはガスをモジュールカバー（７０２）中のマニホールド（７０７）により挿入体の内部キャビティー（７０６）に入れることにより、膨張を媒介する。
【００４９】
１つ以上の実施形態によれば、デバイスは、試料を均一化した後の例えば還元、アルキル化、および酵素消化などの複数の下流の反応工程を統合できる。均一化された試料を試料チューブ中に残す一方で、長さなどの寸法を減少させた細長い部材を含むキャップを、必要な試薬を段階的に添加するためにより多くの余地もたらすために、使用できる。
【００５０】
これらおよびその他の実施形態の機能および利点は、以下の非限定的実施例からより十分に理解されるであろう。実施例は本質的に例示的であることが意図されており、本明細書で考察した実施形態の範囲を限定するものとして理解すべきではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：最適な挿入体形状
腎臓組織試料を分析用調製のために試料容器に置いた。約３〜６ｍｇの腎臓組織試料をそれぞれ８個の試料容器に置いた。試料容器を、水を満たしたチャンバーに入れ、２０，０００ｐｓｉ、１０サイクルで加圧した。各サイクルは、２０，０００ｐｓｉで２０秒間と、その後に続く大気圧での１０秒間を含む。組織の破砕の程度を視覚的に評価した。図８ｂに示すように、破砕されていない組織片は黒くチューブの底に残っている。破砕された組織の破砕物は薄い色で現れ、チューブの壁に沿って分布する。
【００５２】
図８ａおよび図８ｂに示すように、少なくともいくつかの挿入体形状が使用できる。図８ｂに示すように、試料の均一化の程度によってギャップ寸法の効果を評価した。試料チューブの内径は０．１２５インチで一定に保った。挿入体とチューブ壁との間のすき間の量は、挿入体の直径を変えることで変化させた。直径が０．１００インチ、０．１１２インチおよび０．１２４インチの直線挿入体を使用すると、挿入体とチューブ壁との間が緊密に適合することが、良好な組織破砕のために必要であることが実証された。同一の先端直径で異なる形状の挿入体の比較では、挿入体とチューブ壁との間の環状ギャップを通った試料の押出しが、均一化のメカニズムに著しく寄与することを確認している。この実験ではまた、このデザインでは先端の直径が重要な因子であることが実証される。テーパー付きの挿入体を使用することは付加的な利点を有し、チューブ内の利用可能な試料容積が直線挿入体よりも大きく、結果として加圧時のチューブの変形の程度がより大きい。
【００５３】
実施例２：最適な挿入体の適合
テーパー付きの挿入体で種々の直径のものを肝臓組織試料の均一化のために使用した。分析用調製のために、肝臓組織試料を内径が０．１２５インチの試料容器に置いた。約０．５から約１．５ｍｇの肝臓組織試料をそれぞれ８０個の試料容器に置いた。試料容器を、水を満たしたチャンバーに入れ、３５，０００ｐｓｉ、６０サイクルで加圧した。各サイクルは、３５，０００ｐｓｉで２０秒間と、その後に続く大気圧での１０秒間を含む。組織破砕の程度を視覚的に評価し、抽出されたタンパク質の収率をブラッドフォード法で測定し、組織の重量（ｍｇ）あたりのタンパク質（μｇ）で表現した。図９は、先端直径（およびそれにより環状ギャップの寸法）の効果、組織破砕の効果および組織被験物からのタンパク質抽出効率を示す。テーパー付きの挿入体で異なる直径のものを使用するとき、過剰に緊密に適合させることは、結果として効果的な組織破砕にならないことが実証されており、恐らく組織がチューブの底に堅固に圧縮されてしまい、組織がチューブの側面に沿って挿入体先端を通り過ぎて押し出されるための十分な隙間が取れなかった結果による。図９に見られるように、挿入体直径が０．１１８〜０．１２２インチでは、挿入体直径が０．１１４〜０．１１８インチよりも高いタンパク質収率で製造された。挿入体直径が０．１１４〜０．１１８インチでは、挿入体直径が０．１１０〜０．１１４インチ（この場合は挿入体直径が０．１２２〜０．１２６インチよりも高いタンパク質収率で製造されている）よりも高いタンパク質収率で製造された。
【００５４】
実施例３：最適な圧力サイクル数
約０．６〜１．７ｍｇのラットの肝臓に約３０μｌのＩＥＦ抽出試薬（脱イオン水中に、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素および４％のＣＨＡＰＳ）を加えた試料を各チューブに添加した。圧力サイクル破砕を３５，０００ｐｓｉで示されたサイクル数で実施した。陰性対照は、抽出試薬に浸漬された、破砕されていない組織片であった。
【００５５】
図１０は、タンパク質抽出効率に関する圧力サイクル数の効果を示す。高圧チューブ圧縮による試料破砕の間に組織の均一化が発生する作用のメカニズムを調査するために、テーパー付きの挿入体を使用した。
【００５６】
３５，０００ｐｓｉの高圧と大気圧での低圧のサイクルで、０、１０、６０または９９サイクルを使用して、異なる時間の長さで試料を均一化した。チューブ中に試料が留まる全時間は一定に維持し、圧力サイクル数のみを変化させた。図１０に見られるように、全６０回の圧力サイクルは、全１０回の圧力サイクルよりも高いタンパク質収率で製造された。９９回の圧力サイクルを使用して破砕された試料では、タンパク質収率が低下していることにより、過剰均一化の効果が明白である。この過剰均一化の効果は、タンパク質の凝集または沈殿に起因すると思われ、同時に高静水圧で部分的に展開状態にあると思われる。１０、６０および９９回の各圧力サイクル数では、圧力サイクルのない場合よりも、高いタンパク質収率で製造された。
【００５７】
実施例４：最適な圧力および圧力サイクル数
２ｍｇ未満のラット肝臓に３０μＬのＩＥＦ抽出試薬を加えた試料を各チューブに添加した。圧力サイクル破砕を３５，０００ｐｓｉで、示された圧力として示されたサイクル数で、テーパー付きの挿入体を用いて実施した。陰性対照は、試験試料と同様に扱われたが、圧力サイクルにはかけなかった。
【００５８】
図１１は、組織試料からのタンパク質抽出効率に関する、圧力および拡大／収縮サイクル数との効果を示す。
【００５９】
異なる程度の圧力およびサイクル数を使用して試料を均一化した。チューブ中に試料が留まる全時間は一定に維持し、圧力サイクルのみを変化させた。９９回の圧力サイクルを使用して破砕した試料では、タンパク質収率のわずかな低下により、過剰均一化の効果が明白である。この過剰均一化の効果は、圧力誘起のタンパク質凝集またはタンパク質の沈殿に起因すると思われる。１０，０００ｐｓｉと比べて３５，０００ｐｓｉで処理された試料での、わずかなタンパク質収率の向上は、より高圧でのより過酷なチューブ圧縮が、わずかに良い組織の均一化をもたらすことを示唆する。
【００６０】
実施例５：試料寸法の減少が効率を改善する
解凍したラットの肝臓および心筋組織の試料をＰＢＳでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った（群あたりｎ＝６）。約３０μＬの溶解バッファーを各試料に添加した。図１２ａに見られるように、テーパー付きの挿入体を使用して、試料毎に試料の質量を≦２ｍｇに減少させると、より大きな試料（試料あたり５〜１０ｍｇ）と比較して、結果としてより良好な収率となった（組織の質量（ｍｇ）あたりのタンパク質（μｇ）として測定した）。図１２ｂに見られるように、比較できる質量および体積の条件を使用したとき、テーパー付きの挿入体（図中で「Ｍｉｃｒｏ  Ｐｅｓｔｌｅ（微小ペッスル）」とラベル付けしたもの）を、圧力をかけて使用して、肝臓組織から得られたタンパク質収率は、陽性対照を使用する収率と同等である。陽性対照は、使い捨てのプラスチックペッスルを使用して手動で均一化した。陰性「浸漬」対照は、どのような方法においても破砕せず、その組織を溶解バッファー中でその他の試料と同一の全時間インキュベートした。挿入体は、圧力サイクルと併せて使用した。
【００６１】
実施例６：超音波処理よりも効果的な挿入体
通常の手順（４０，０００ｐｓｉで６０サイクル）、または超音波処理のみで（超音波浴で２回×３０秒）、または組合せ（４０，０００ｐｓｉで３０サイクルの後、超音波処理を３０秒の後、４０，０００ｐｓｉで３０サイクルの後、超音波処理を３０秒）を使用して、ＩＦＥ中で肝臓組織を抽出した。すべての試料は＜２ｍｇの組織を含み、３０μＬの溶解バッファーに入れた。群あたり６個の試料であった。
図１３に見られるように、通常の微小ペッスルによる手順は、超音波処理単独よりも高収率であった２種の方法の組合せよりも、高収率であった。
【００６２】
実施例７：タンパク質収率に関する挿入体の再使用の効果
ラットの肝臓組織を用いた１−６−１４に関して、挿入体の２つのバッチを使用した。多数回使われてきたより古いバッチである１つは、約０．１２０インチから約０．１２３インチの先端直径を有するペッスルを備えた。約０．１２７インチのやや広いペッスル直径を有する新規のバッチは、結果として全体的な収率が低かった。それらはその後洗浄され、一試行あたり６０サイクルを１４回の、全部で８４０サイクル再試行された。挿入体をチューブから取り除き、試行毎に再挿入した。これら同一の２０個の「新」挿入体を、続いて肝臓組織で再度、１−１０−１４で使用した。
【００６３】
図１４に見られるように、挿入体の再使用は、それらの有効性の改善または毀損が見られなかった。加えて、これらの結果は、古いバッチが純粋により良いことを示しており、その差異は、古いものの再使用によるものではない。これらの結果は、最適な性能のためには、試料容器と挿入体との間の寸法の許容誤差が重要であることを確認するものである。すき間が広すぎたり、または狭すぎたりする場合、均一化は不十分となる。
【００６４】
実施例８：挿入体がある圧力サイクル対挿入体がない圧力サイクル
約０．５から約１．５ｍｇの間のラットの肝臓組織の試料をＰＢＳでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った（群あたりｎ＝１２）。すべての試料（陰性対照を除く）を圧力４５，０００ｐｓｉで６０サイクルの処理をした。サイクルの長さは、溶解バッファー中ですべてのインキュベーション時間を修正するために調製した。０．５時間の試料用には、３０秒毎のサイクルを使用した。１時間の試料用には、１分毎のサイクルを使用した。図１５に見られるように、挿入体無しでは、組織試料が圧力にかけられるか否かにかかわらず収率は同一であり、圧力サイクル単独では、体積（３０μＬ対６０μＬ）またはインキュベーション時間（０．５対１時間）などのその他の要因に関係なく、細胞タンパク質を放出するための組織構造の破砕が効果的でないことを示唆している。収率は、テーパー付きの挿入体と共に加圧した試料でのみ、著しく向上する。
【００６５】
実施例９：テーパー付きの挿入体を伴う抽出の有効性に関する圧力程度の効果
０．５から１．５ｍｇの間の組織の試料をＰＢＳでリンスし、計量の前に乾燥のために吸い取った（別段の指示がない限り、群あたりｎ＝１０）。３０μＬの溶解バッファーを各試料に添加した。挿入体は、圧力サイクルが有りおよび無しで使用した。示された圧力で３０サイクルの圧力サイクルを実施した。棒は、肝臓組織からのタンパク質抽出の平均±標準偏差を示す。表は、心筋組織からのタンパク質抽出の収率および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。０ｋｐｓｉの対照は、挿入体は配置するが、圧力サイクルはかけない設定をすることを意味する。これは、「浸漬のみ」の対照と同一ではない。図１６に見られるように、４５ｋｐｓｉの圧力のものが最大量のタンパク質をもたらした。
【００６６】
実施例１０：圧力および挿入体を伴う抽出は、分析に先立って、試料調製用のその他の方法と組み合わせることができる。
図１７に示すように、テーパー付きの挿入体８０１は、圧力下で試料チューブ８０５と共に使用できるいくつかの互換的な密封器８０２、８０３、８０４のうちの１つである。そのため、以下のような手順は、試料を１つの容器から他の容器に移転すること無しに実行でき、試料の損失、相互汚染および使用者への曝露の危険性を低減する。
１．  ４Ｍの尿素を含む３０μＬの溶解バッファーと共に組織を試料チューブに入れ、テーパー付きの挿入体で密封する。
２．  挿入体の入った密封チューブを、ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ内での圧力処理（図１８）の間に、チューブ９０２を保持するように設計されたカートリッジ９０１に入れる。カートリッジは、チューブを安全に保ち、キャップのゆるみ（試料の漏れ出し、または加圧媒体の漏れ込みをもたらす）を防ぐように設計されている。
３．  圧力サイクルで試料を処理する。
４．  ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒおよびカセットからチューブを取り出す。テーパー付きの挿入体を取り除く。
５．  チューブ内の均一化された試料に１０μｌの適切なバッファーを添加して、溶解バッファー中の尿素を４Ｍから３Ｍに希釈する。タンパク質分解酵素のＬｙｓ−Ｃなどの適切な酵素を添加する。
６．  チューブをキャップ（過剰な空気を排除して圧力下でのチューブのへこみを防ぐのに十分な長さであるが、試料容積を収容するのに十分な短さである）で密封し、密封されたチューブを、圧力処理の間チューブを保持するように設計されたカートリッジに入れる。
７．  試料を、Ｌｙｓ−Ｃによる消化を加速するために適当な条件の下で、圧力サイクルで処理する。
８．  ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒおよびカセットからチューブを取り出す。長いキャップを取り出す。
９．  チューブ内の部分的に消化された試料に１００μｌの適切なバッファーを添加して、バッファー中の尿素を３Ｍから０．８Ｍに希釈する。トリプシンなどの適切な酵素を添加する。
１０．  全試料容積を収容できる短いキャップで、満たしたチューブを密封する。密封チューブを、圧力処理の間にチューブを保持するように設計されたカートリッジに入れる。
１１．  試料をトリプシンによる消化を加速するために、適当な条件の下で圧力サイクル処理する。
【００６７】
いくつかの例示的な実施形態を説明したが、前述のことは単に例示にすぎず、限定ではなく、例としてのみ提示されていることは当業者には明白である。多くの変形および他の実施形態は、当業者の視野内にあり、本発明の範囲内に置かれると考えられる。特に、本明細書中で提示された多くの実施例は、行為の方法またはシステム要素の特定の組合せを伴っているが、それらの行為およびそれらの要素は、同一の目的を成し遂げるためのその他の方法で組み合わせることもできる、と理解すべきである。
本明細書で考察したデバイス、システムおよび方法の実施形態は、構成の詳細な適用において、および続く説明または添付図面で例示して明らかにした構成部品の配置において、限定されないことが理解されよう。デバイス、システムおよび方法は、他の実施形態でも実施でき、様々な方法で実行または履行され得る。特定の実施態様の実施例は、例示的な目的のみで本明細書に提供されており、限定されることを意図していない。特に、任意の１つ以上の実施形態に関連して考察した行為、要素および特徴は、任意のその他の実施形態での同様の役割から排除されることを意図していない。
【００６８】
当業者は、本明細書で説明したパラメーターおよび構成は例示的であり、実際のパラメーターおよび／または構成は、本発明のシステムおよび技術が使用される特定の応用に依存することになる、と認識すべきである。当業者はまた、本発明の特定の実施形態に均等である日常的な実験を超えることなく使用することも、認めるか確認できるであろう。そのため、本明細書で説明した実施形態は、例としてのみ提示されており、しかも、添付の特許請求の範囲内であり、およびその均等物の範囲内であると理解すべきである。本発明は、特に説明したようなもの以外で実施されることができる。
【００６９】
さらに、本発明は、本明細書で説明した各特徴、システム、サブシステムまたは技術、および本明細書で説明した２つ以上の特徴、システム、サブシステムまたは技術の任意の組合せに向けるものであり、２つ以上の特徴、システム、サブシステムおよび／または方法の任意の組合せにおいて、そのような特徴、システム、サブシステムおよび技術が相互に矛盾しない場合、特許請求の範囲の中で具体化する本発明の範囲内であると考えることも、また認識すべきである。さらに、一実施形態に関連してのみ考察した行為、要素および特徴は、その他の実施形態での同様の役割から排除されることを意図していない。
【００７０】
本明細書で使用した表現法および用語法は、説明の目的のためであり、限定とみなすべきではない。本明細書で使用する用語「複数」は、２つ以上の物品または部品を意味する。用語「備える」、「含む」、「保有する」、「有する」、「含む」、および「関わる」は、記載された説明または特許請求の範囲などのいずれにせよ、開放型の用語であり、すなわち「含むが、限定されない」ことを意味する。したがって、そのような用語の使用は、その後に列挙された事項、およびその等価物、ならびに追加の事項を包含することを意味する。接続語句の「からなる」および「本質的にからなる」のみは、特許請求の範囲の観点では、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型の接続語句である。特許請求の範囲で請求要素を改変するための「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の使用は、単独では何らの優先度、上位または１個の請求要素の別のものに対する順序、または方法の行為が実行される一時的な順序を意味せず、単に、ある名称を有する１個の請求要素を同一の名称を有する別の要素から識別するラベルとして使用するにすぎず、（順序を示す用語での使用を除いて）、請求要素を区別するためである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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