(57)【要約】  ミガラスタットの微生物合成法であって、特に、少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で微生物を培養すること、並びに、前記微生物から生産したイミノ糖を検出することおよび／または単離すること、並びに、前記方法で使用される微生物を含む方法。本発明は、前記方法により生産されたミガラスタット並びにそれらの医薬組成物および使用も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で微生物を培養すること、並びに
該微生物により生産されたイミノ糖を検出することおよび／または単離すること
を含む、ミガラスタットの生産方法。
【請求項２】
ｄ．少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で微生物を培養する工程、
ｅ．該微生物により生産されたイミノ糖を検出および／または収集する工程、並びに、
ｆ．もし検出および／または収集した該イミノ糖がミガラスタットでない場合、検出および／または単離した該イミノ糖をミガラスタットへ変換する工程
を含む、ミガラスタットの生産方法。
【請求項３】
前記微生物が細菌を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バチルス（Bacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、コリネバクテリウム（Cornyebacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococci）属、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラシア（Serratia）属およびプロテウス（Proteus）属からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・アヌラトス（Streptomyces anulatus）、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）およびストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075株からなる群から選択されるストレプトマイセス（Streptomyces）菌を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養が、回分発酵、流加発酵および連続発酵からなる群から選択される発酵法により実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵法が、シード発酵および最終発酵を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程が、α−ガラクトシダーセＡ活性アッセイを用いて実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記収集工程が、脱汚泥、ろ過、分別、ｐＨ調節、濃縮、塩への変換、および再結晶化からなる群から選択される少なくとも一つの工程を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記条件が、細菌がミガラスタットを生産するのに好適であり、並びに、方法が培地中のミガラスタットを検出すること、および培地からミガラスタットを収集することを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、ラクトースを含む培地で培養される、請求項３〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記条件が、細菌がガラクトスタチンを生産するのに好適であり、並びに、方法が培地中のガラクトスタチンを検出すること、および前記ガラクトスタチンをミガラスタットへ変換することを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガラクトスタチンが、培地中でミガラスタットへ変換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガラクトスタチンが、ミガラスタットへ変換される前に単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
変換工程が、化学的変換および生体内変化からなる群から選択される方法で実施される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ミガラスタットをミガラスタット塩酸塩へ変換するさらなる工程を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により生産したミガラスタットまたは請求項１６に記載の方法により生産したミガラスタット塩酸塩。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により生産したミガラスタットまたは請求項１６に記載の方法により生産したミガラスタット塩酸塩を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ファブリー病の治療に用いるための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミガラスタット、または請求項１６に記載の方法により生産されたミガラスタット塩酸塩。
【請求項２０】
療法における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミガラスタット、または、請求項１６に記載の方法により生産したミガラスタット塩酸塩。
【請求項２１】
請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を投与することによる、ファブリー病の治療を必要とする患者におけるファブリー病の治療方法。
【請求項２２】
単離されたストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）。
【請求項２３】
変異ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTM4株（NCIMB 42358株）。
【請求項２４】
ミガラスタットの生産方法における、単離されたストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）の使用、または、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）NCIMB 42142株変異BTM4株（NCIMB 42358株）の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、一般名称がミガラスタット(migalastat)である、イミノ糖Ｄ−１−デオキシガラクトノジリマイシン（DGJ）の製造方法に関する。
【０００２】
ミガラスタットは、ファブリー病の治療に使用することができる(Fan et al., Nat Med 1999 5:1, 112-5)。ミガラスタットへのいくつかの化学的経路が文献において開示されている。Santoyo-Gonzalez らは、Synlett 1999 593-595において、望ましくないアジド化学を含んだ８工程からなる化学的経路による、Ｄ−ガラクトーゼからのミガラスタットの合成を記載している。１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースから開始するミガラスタットへの１２工程化学的経路が、Legler & Pohl, Carbohydr. Res., 155 (1986) 119-129において記載されている。当該方法の最終工程には、ミガラスタットへ付加したガラクトスタチン亜硫酸水素塩を変換することを含む。ミガラスタットは、ガラクトピラノース( (Bernotas et al., Carbohydr. Res. 167 (1987) 305-11)、Ｌ−酒石酸(Aoyagi et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 815);ケブラコイトール(Chida et al., J. Chem. Soc., Chem Commun. 1994, 1247)、ガラクトフラノース(Paulsen et al., Chem. Ber. 1980, 113, 2601)、ベンゼン(Johnson et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 653)、アラビノ−ヘキソース−５−ウロース(Barili et al., Tetrahedron 1997, 3407)、５−アジド−１、４−ラクトン(Shilvock et al., Synlett, 1998, 554)、デオキシノジリマイシン (Takahashi et al., J. Carbohydr. Chem. 17 (1998) 117); アセチルグルコサミン (Heightman et al., Helv. Chim. Acta 1995, 78, 514)、ミオ−イノシトール(Chida N, et al., Carbohydr. Res. 1992 Dec 31 ;237: 185-94)、ジオキサニルピペリデン (Takahata et al., Org. Lett. 2003; 5(14); 2527-2529)、および（Ｅ）−２，４−ペンタジエノール (Martin et al., Org Lett. 2000 Jan、2(1):93-5, Hughes et al., Nat Prod Rep. 1994 Apr;11(2):135-62)からも合成されてきた。 ＷＯ2008/045015号公報 (アミカス  セラピューティックス  インコーポレイテッド(Amicus Therapeutics, Inc))は、ミガラスタットの調製のための別の化学的方法を記載している。
【０００３】
ミガラスタットへの現存の化学的方法に関する課題は、費用がかかること、少なくとも８段階の方法を必要とすること、および有毒なアジド化学を潜在的に含むことである。ミガラスタットが、よりコスト効率よく、且つ持続的な方法で生産できるならば有益である。発酵法は、抗生物質アミノ酸やビタミンなどの生体分子を、大規模で且つ比較的低コストで生産する手段として、当産業で十分に確立されている(Atkinson & Mavittma, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd Edition, New York, Stockton Press, 1991)。ガラクトスタチンは、ストレプトマイセス・ライジカス(Streptomyces lydicus) PA-5726培養液 (Miyake and Ebata, Agric. Biol. Chem., 52(7), 1649-1654 (1988))からの亜硫酸水素塩付加物として単離してきたが、これまでにミガラスタットを生産すると知られた微生物は確認されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ミガラスタットの微生物合成のための方法に関する。特に、特定の自然発生的な微生物が、ミガラスタットまたはその前駆体を生産することを見出した。
【０００５】
一側面において、本発明は、少なくとも１種のイミノ糖が生産される条件下で微生物を培養すること、並びに、微生物により生産されたイミノ糖を検出することおよび／または単離することを含む、ミガラスタットの生産方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の側面は、
ａ．少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で微生物を培養する工程、
ｂ．前記微生物により生産されたイミノ糖を検出および／または収集する工程、並びに、
ｃ．もし前記の検出および／または収集したイミノ糖がミガラスタットでない場合、前記の検出および／または単離したイミノ糖をミガラスタットへ変換する工程を含む、
ミガラスタットの生産方法を提供する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、上記の方法で使用される微生物を提供する。
【０００８】
別の側面において、本発明は、上記の方法により生産されるミガラスタットを提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、上記の方法により生産されたミガラスタットを含む、医薬組成物を提供する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、上記の方法により生産されたミガラスタットを使用する治療方法を提供する。
【００１１】
本発明は、ミガラスタットおよび／またはその前駆体を生産する微生物を確認するアッセイ法も提供する。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明は、ミガラスタットおよび／またはその前駆体を生産する、自然発生的な微生物の発見およびミガラスタットへの基本的な微生物方法経路の使用に基づく。
【００１３】
「ミガラスタット」とは、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールである、１−デオキシガラクトノジリマイシン（DGJ）を指す。本明細書で使用されるとおり、全体を通して「ミガラスタット」、「１−デオキシガラクトノジリマイシン」または「DGJ」の意味は、本明細書で特段の記載がない限り、遊離塩基および塩酸塩を含むそれらの任意の塩形態の両方を含む。ミガラスタットの塩酸塩は、ミガラスタット塩酸塩として知られている。ミガラスタットの意味には、ミガラスタットの誘導体も含む（例：Ｎ−アセチルミガラスタット）。
【００１４】
「ガラクトスタチン」とは、６−（ヒドロキシメチル）−２，３，４，５−ピペリジンテトロールである、ガラクトノジリマイシンを指す。本明細書で使用されるとおり、全体を通して「ガラクトスタチン」の意味は、本明細書で特段の記載がない限り、遊離塩基および亜硫酸水素塩付加物を含む任意の塩形態の両方を含む。ガラクトスタチンの意味は、ガラクトスタチンの誘導体を含む（例：Ｎ−アセチルガラクトスタチン）。
【００１５】
「イミノ糖」とは、酸素原子環内の位置に窒素原子を有する糖の任意の類似体を意味する。本発明に従い生産および検出しうるイミノ糖は、下記の式を有してもよい：
【化１】
2017506520.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、ＨまたはＯＨであり、且つＲ２は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、且つＲ３は、独立してＨまたは置換または未置換のＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ４〜Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル、Ｃ４〜Ｃ１２ヘテロシクリル、Ｃ６〜Ｃ１２ヘテロ環式アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルまたはＣ２〜Ｃ１２アシルである。］。イミノ糖の例としては、ガラクトスタチン、ノジリマイシンおよびマンノジリマイシン並びにそれらのデオキシ型ミガラスタット、１−デオキシノジリマイシンおよび１−デオキシマンノジリマイシンが挙げられる。用語「イミノ糖」には、上記でイミノ糖と名付けられた任意の生合成の前駆体も含まれ、環式または直鎖式でもよい。用語「イミノ糖」には、本内容で特段の記載がない限り、上記でイミノ糖と名付けられた鎖式形態、並びに、上記でイミノ糖と名付けられた遊離塩基および任意の塩形態の付加物（例えば、亜硫酸水素塩付加物）も含む。
【００１６】
本発明の様々な側面は、下記の段落においてさらに詳細に記載されている。
【００１７】
１．好適な微生物の同定
一側面において、本発明は、少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で、微生物を培養すること、且つ、微生物により生産されたイミノ糖を検出および／または単離することを含む、ミガラスタットの生産方法を提供する。一実施態様において、イミノ糖を検出する。別の実施態様において、イミノ糖を単離する。
【００１８】
一実施態様において、検出および／または単離したイミノ糖は、ミガラスタットまたはその誘導体である。別の実施態様において、検出および／または単離したイミノ糖は、ガラクトスタチンまたはその誘導体である。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ミガラスタットが生産されるような条件下で微生物を培養することを含む、ミガラスタットの生産方法を提供する。
【００２０】
別の側面において、本発明は、ミガラスタットの製造において、ガラクトスタチンが生産されるような条件下で微生物を培養することを含む方法により生産されたガラクトスタチンの使用を提供する。
【００２１】
別の側面において、本発明は、
ａ．少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で微生物を培養する工程、
ｂ．前記微生物により生産されたイミノ糖を検出および／または収集する工程、並びに、
ｃ．もし前記の検出および／または収集したイミノ糖がミガラスタットでない場合、前記の検出および／または単離したイミノ糖をミガラスタットへ変換する工程を含む、
ミガラスタットの生産方法を提供する。
【００２２】
微生物は、好適には、細菌、例えばグラム陽性菌である。例えば、微生物は、好適にはアクチノ細菌である。好適な微生物は、ストレプトマイセス（Streptomycetacaeae）科に属し、例としてストレプトマイセス（Streptomyces）属またはストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）属の微生物が挙げられる。あるいは、好適な微生物は、バチルス（Bacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、コリネバクテリウム（Cornyebacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属およびラクトコッカス（Lactococci）属からなる群から選択される属に属する。微生物は、好適には、グラム陰性菌である。例えば、好適な微生物は、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラシア（Serratia）属およびプロテウス（Proteus）属からなる群から選択される属に属する。一実施態様において、微生物は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、バチルス（Bacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、コリネバクテリウム（Cornyebacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococci）属、サルモネラ（Salmonella）、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラシア（Serratia）属およびプロテウス（Proteus）属からなる群から選択される細菌である。一実施態様において、微生物は、エシェリキア（Escherichia）属に属する。一実施態様において、微生物は、大腸菌（Escherichia coli.）である。
【００２３】
好適な細菌の例としては、ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・アヌラトス（Streptomyces anulatus）などが挙げられる。本発明の当該側面で使用してもよい細菌の特定の菌株には、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株, ２０１３年４月１８日付で寄託）およびストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075株が含まれる。一実施態様において、細菌は、ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・アヌラトス（Streptomyces anulatus）、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）およびストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075株からなる群から選択されるストレプトマイセス（Streptomyces）菌を含む。
【００２４】
本発明のこれらの側面において、使用に好適な微生物は、微生物の培養液中のイミノ糖の存在をスクリーニングすることにより同定してもよい。イミノ糖を、商業的な供給源からのグリコシダーセアッセイを使用した培養ブロス中で検出してもよい。
【００２５】
例えば、ミガラスタットおよびガラクトスタチンは、両方ともα−ガラクトシダーセＡの可逆的競合阻害剤であり、これらミガラスタットおよびガラクトスタチンによると、イミノ糖を、α−ガラクトシダーセＡ活性のために十分に認められている任意のアッセイを使用した培養ブロス中で検出してもよい。培養ブロス中のミガラスタットおよびガラクトスタチンの定量化を、次に、ＬＣ／ＭＳなどの、十分に認められている分析的化学技術により実施してもよい。
【００２６】
本発明の方法において使用に好適と認識される微生物は、イミノ糖の生産向上のためにさらに改良してもよい。例えば、本発明の方法において使用に好適と認識される微生物を、ガラクトスタチンまたはミガラスタットなどのイミノ糖の生産向上のため、ランダムスクリーニングの対象としてもよい。産業用菌株改良のため使用してもよい好適なランダムスクリーニングの手法は当技術分野において周知であり、例としてR.T. Rowlands (1984) “Industrial strain improvement: mutagenesis and random screening procedures” Enzyme and Microbial  Technology 6(1) 3-10が挙げられる。この様なランダムに変異した微生物の一種は、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）変異BTM4株（NCIMB 42358株）である。当該菌株は、紫外線による変異照射の生き残りとして、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）から誘導された単一コロニー分離株の群内でミガラスタットの増加生産のためスクリーニングすることにより選択された。
【００２７】
単離したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp） BTA530株（NCIMB 42142株）は、本発明の一側面を形成する。変異ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTM4株（NCIMB 42358株）は、本発明の別の側面を形成する。本発明のさらなる別の側面は、ミガラスタットの生産方法において、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp） BTA530株（NCIMB 42142株）の使用、または、変異ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）BTM4株（NCIMB 42358株）の使用である。
【００２８】
２．微生物の培養および発酵
用語「培養」には、生きた微生物を維持および／または育成することが含まれる（例えば、培養物または菌株の維持および／または育成）。本発明の方法の実行において、微生物を、液体培地中に培養してもよい。あるいは、微生物を、固体培地または半固体培地中で培養してもよい。
【００２９】
２．１  培地
本発明の一実施態様において、微生物を、微生物の維持および／または育成に必要なまたは有益な栄養素を含んだ培地（例えば、滅菌の液体培地）中で培養する。栄養素の例として、炭素源、炭素基質、窒素源、リン源、微量元素および成長因子が挙げられる。
【００３０】
好適な炭素源または炭素基質には、炭水化物、炭化水素、油、脂質、脂肪酸、有機酸およびアルコールが含まれる。好適な炭素源の例として、グリセロール、デキストリン、マルトデキストリン、菜種油、ラクトース、ガラクトース、タガトース、グルコース、ラクツロースおよびデキストロース（メリトース（Meritose）、即ち、デキストロース一水和物など）が挙げられる。
【００３１】
一実施態様において、炭素源としてラクトースを使用する。一実施態様において、炭素源としてラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％使用する。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％含む。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまで含む。別の実施態様において、炭素源としてラクツロースを使用する。一実施態様において、炭素源としてラクツロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％使用する。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまで含む。別の実施態様において、培地は、グリセロールを含む。一実施態様において、培地は、グリセロールを最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、グリセロールを最終濃度約３〜５％まで、例えば約４％含む。
【００３２】
別の実施態様では、炭素源としてガラクトースを使用する。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまで含む。
【００３３】
炭素源（複数可）は、本発明の方法における所望のイミノ糖生産に影響を与えるために選択してもよい。例えば、本発明の方法において、発明者らは、ラクトースを含む培地の使用が、イミノ糖生産微生物によるミガラスタットの生産を向上させることを見出した。ラクトースを含まない培地の使用は、微生物によるガラクトスタチンの生産を好む。本発明の一実施態様において、ミガラスタットの生産方法は、ラクトースを含む培地中で微生物を培養することを含む。
【００３４】
培地は、好適には１種以上の炭素源を含んでよい。一実施態様において、微生物を、グリセロール、デキストリン、マルトデキストリン、菜種油、ラクトース、ガラクトース、タガトース、グルコースおよびラクツロースから選択される、１種以上の炭素源の存在下で培養する。一実施態様において、培地は、ラクトースおよびデキストロースを含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースおよびデキストロースを含む。一実施態様において、培地は、ラクトース、デキストロースおよびグリセロールを含む。一実施態様において、培地は、ラクツロース、デキストロースおよびグリセロールを含む。一実施態様において、培地は、デキストロースおよびグリセロールを含む。
【００３５】
一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％含む。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまで含む。
【００３６】
一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを、最終濃度約１．５％ｗ／ｖまで含む。
【００３７】
一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまで含む。
【００３８】
一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびグリセロールを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％およびグリセロールを最終濃度約３〜５％まで、例えば約４％含む。一実施態様において、培地は、ラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまでおよびグリセロールを最終濃度約４％まで含む。
【００３９】
一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびグリセロールを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％およびグリセロールを最終濃度約３〜５％まで、例えば約４％含む。一実施態様において、培地は、ラクツロースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまでおよびグリセロールを最終濃度約４％まで含む。
【００４０】
一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびデキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびグリセロールを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約２％およびデキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％およびグリセロールを最終濃度約３〜５％まで、例えば約４％含む。一実施態様において、培地は、ガラクトースを最終濃度約１．７％ｗ／ｖまでおよびデキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまでおよびグリセロールを最終濃度約４％まで含む。
【００４１】
一実施態様において、培地は、デキストロースを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびグリセロールを最終濃度０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、デキストロースを最終濃度約１〜３％まで、例えば約１．５％およびグリセロールを最終濃度約３〜５％まで、例えば約４％含む。一実施態様において、培地は、デキストロースを最終濃度約１．５％ｗ／ｖまでおよびグリセロールを最終濃度約４％まで含む。
【００４２】
好適な窒素源には、大豆タンパク（Arcon Fなど）、綿実粉、CSL（コーンスティープリカー）、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カザミノ酸およびリン酸アンモニウムが含まれる。綿実粉は、シグマ社（Sigma）のProFlo, Pharmamediaを含む、多様な商業的供給源から入手可能である。一実施態様において、窒素源は、大豆タンパクである。一実施態様において、培地は、大豆タンパクを最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、大豆タンパクを最終濃度約１〜５％まで、例えば約２．５％含む。一実施態様において、窒素源は、綿実粉である。一実施態様において、培地は、綿実粉を最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、綿実粉を最終濃度約１〜５％まで、例えば約２．５％含む。一実施態様において、窒素源は、CSLである。一実施態様において、培地は、CSLを最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、CSLを最終濃度約０．５％まで含む。
【００４３】
培地は、好適には、１種以上の窒素源を含んでもよい。一実施態様において、微生物を、大豆タンパク（Arcon Fなど）、綿実粉、CSL（コーンスティープリカー）、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カザミノ酸およびリン酸アンモニウムから選択される、１種以上の窒素源を含む培地中で培養する。一実施態様において、培地は、綿実粉を最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％およびCSLを最終濃度約０〜５０％ｗ／ｖまで、例えば０〜３０％、例えば０〜１０％、例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％含む。一実施態様において、培地は、綿実粉を最終濃度約１〜５％まで、例えば約２．５％、ＣＳＬを最終濃度約０．５％まで含む。
【００４４】
好適なリン源は、リン酸、それらのナトリウム塩およびカリウム塩を含む。好適な微量元素は、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩化カリウムおよび／またはコバルト塩を含む。
【００４５】
好適な微量元素の例として、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、塩化亜鉛、塩化第二銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化ナトリウムおよび硫酸マンガンが挙げられる。一実施態様において、微生物を、炭酸カルシウムを含む培地で培養する。
【００４６】
好適な成長因子は、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウムおよびロイシンなどのアミノ酸（それらの塩を含む）、ビタミンＢ６およびクエン酸を含む。
【００４７】
本発明の方法の側面の一実施態様において、培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）例えば０〜５％を含む。一実施態様において、培地は、デキストリン（水溶性でんぷん）例えば０〜４％を含む。一実施態様において、培地は、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）例えば０〜０．７％を含む。一実施態様において、培地は、ＫＨ２ＰＯ４  例えば０〜０．８％を含む。一実施態様において、培地は、菜種油例えば０〜０．２％を含む。一実施態様において、培地は、炭酸カルシウム例えば０〜０．１２％を含む。一実施態様において、培地は、Foam Doctorなどの消泡剤例えば０〜０．４％を含む。一実施態様において、培地は、綿実粉例えば０〜５％を含む。一実施態様において、培地は、グルコース例えば０〜３％を含む。一実施態様において、培地は、ラクトース例えば０〜７％を含む。一実施態様において、培地は、ラクツロース例えば０〜７％を含む。一実施態様において、培地は、グリセロール例えば０〜８％を含む。一実施態様において、培地は、CSL例えば０〜１％を含む。一実施態様において、培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）、デキストリン（水溶性でんぷん）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、ＫＨ２ＰＯ４、菜種油、炭酸カルシウム、消泡剤、綿実粉、グルコース、ラクトース、ラクツロース、グリセロールおよびCSLのいずれか１種以上を含む。
【００４８】
一実施態様において、培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）、デキストリン（水溶性でんぷん）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、ＫＨ２ＰＯ４、菜種油、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。別の実施態様において、培地は、綿実粉、ラクツロース、メリトース（即ちデキストロース）グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００４９】
２．２  培養条件
本発明の方法において、微生物を、制御ｐＨの下で培養してもよい。用語「制御ｐＨ」には、所望の生産物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）の生産をもたらす、任意のｐＨを含む。一実施態様において、微生物を、ｐＨ６．０〜９．０の間で培養する。別の実施態様において、微生物を、ｐＨ７．０〜８．０の間で培養する。別の実施態様において、微生物を、ｐＨ約７で培養する。別の実施態様において、微生物を、ｐＨ約７．２または約７．７または約７．８で培養する。
【００５０】
一実施態様において、例えば微生物の培養中、維持するなど、ｐＨを調整する。一実施態様において、ｐＨを０〜５０時間維持し、別の実施態様において、ｐＨを５０〜２２０時間維持した。別の実施態様において、ｐＨを０〜２２０時間維持した。
【００５１】
好適には、培養の初期ｐＨを好適なレベルに調節してもよいが、本発明の工程中、その後調整または維持しないことである。関連の実施態様において、初期ｐＨを、６．５〜７．６０に調節し、その後調整しなかった。所望のｐＨは初期調節し、且つ、当業者に周知のいくつかの手法を使用して、任意にその後調整または維持してもよい。好適なｐＨ調整剤の例として、Ｈ２ＳＯ４、水酸化アンモニウム、アンモニアガス、ＮａＯＨおよび酢酸ｐＨ調整剤が挙げられる。一実施態様において、ｐＨを７〜８の間で維持する。一実施態様において、ＮａＯＨ  を使用してｐＨを７〜８で維持する。一実施態様において、ｐＨをｐＨ７．８に調節する。一実施態様において、ＮａＯＨを使用してｐＨを調節する。一実施態様において、ＮａＯＨ  を使用してｐＨをｐＨ  ７．８に調整する。別の実施態様において、ｐＨをｐＨ７．７に調節する。一実施態様において、ＮａＯＨを使用してｐＨを調節する。一実施態様において、ＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７．７に調節する。一実施態様において、ｐＨをｐＨ７．２に調節する。一実施態様において、ＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７．２に調節する。
【００５２】
本発明の方法において、微生物を、制御した通気の下で培養してもよい。用語「制御」には、所望のイミノ糖生産物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）の生産をもたらす任意の通気を含む。通気は、培地を介する散布された滅菌空気の導入および／またはプロペラまたはインペラまたは類似の撹拌装置からの機械的投入により提供される撹拌によるか、または培養容器通気孔を調整することで得られる圧力により、好適に制御することができる。例えば、エアリフト培養装置（airlift fermenter）を使用してもよい。
【００５３】
一実施態様において、微生物を、通気量０．５ｖｖｍ（１分間あたりの容器容積量）〜１．５ｖｖｍの間で培養する。例えば、本発明の微生物を、０．５ｖｖｍ、０．６ｖｖｍ、０．７ｖｖｍ、０．８ｖｖｍ、０．９ｖｖｍ、１．０ｖｖｍ、１．１ｖｖｍ、１．２ｖｖｍ、１．３ｖｖｍ、１．４ｖｖｍ、１．５ｖｖｍで好適に培養してもよい。関連の実施態様において、通気を撹拌により制御する。一実施態様において、撹拌先端速度は、１．０ｍ／ｓ〜６．０ｍ／ｓの間である。
【００５４】
本発明の方法において、微生物を、制御圧力の下で培養してもよい。用語「制御圧力」には、所望のイミノ糖生産物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）の生産をもたらす、任意の圧力を含む。一実施態様において、制御圧力は、圧力０．３Ｂａｒ〜１．５Ｂａｒの間を含む。一実施態様において、微生物を、圧力０．３Ｂａｒ〜１．１Ｂａｒの間で培養する。例えば、本発明の微生物を、圧力０．５Ｂａｒ、０．６Ｂａｒ、０．７Ｂａｒ、０．８Ｂａｒ、０．９Ｂａｒで好適に培養してもよい。関連の実施態様において、通気を、培養容器を振動することにより制御する。例えば、微生物を、１８０ｒｐｍ〜２８０ｒｐｍで好適に培養してもよい。例えば、微生物を、２００ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍで好適に培養してもよい。例えば、微生物を、約２２０ｒｐｍで好適に培養してもよい。関連の実施態様において、通気を、撹拌の調整およびまたは通気量の調整を通して、培地中の溶存酸素レベルを調整することにより制御する。一実施態様において、溶存酸素を、１０〜５０％以上で調整する。例えば、本発明の微生物を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％以上で好適に培養してもよい。例えば、本発明の微生物を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％で好適に培養してもよい。例えば、本発明の方法において、培養中の酸素レベルを２０％以上に調整してもよい。
【００５５】
本発明の方法において、微生物を、過剰な発泡をすることなく（例えば、Foam Doctorなどの消泡剤の添加を通じて）好適に培養してもよい。
【００５６】
さらに、本発明の方法において、微生物を、制御温度の下で培養することができる。用語「制御温度」には、所望のイミノ糖生産物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）の生産をもたらす任意の温度を含む。一実施態様において、制御温度は、温度１５°Ｃ〜３５°Ｃの間を含む。別の実施態様において、制御温度は、温度２０°Ｃ〜５３°Ｃ、例えば２５°Ｃ〜４０°Ｃの間である。例えば、本発明の微生物を、２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、３１°Ｃ、３２°Ｃ、３３°Ｃ、３４°Ｃ、３５°Ｃで好適に培養してもよい。例えば、本発明の方法において、微生物を約２８°Ｃで培養してもよい。
【００５７】
２．３  培養方法
微生物を、液体培地中で培養（例えば、維持および／または育成）することができ、且つ、連続的または断続的のいずれかで、静置培養、試験管培養、振とう培養（例えば、回転振とう培養、振とうフラスコ培養等）、曝気撹拌（aeration spinner）培養、あるいは撹拌槽またはエアリフト培養装置内の発酵などの、従来の培養方法により好適に培養することができる。一実施態様において、微生物を、振とうフラスコで培養する。別の実施態様において、微生物を、発酵装置内で培養する（例えば、発酵法）。本発明の発酵法は、特に限定されないが、回分発酵、流加発酵および発酵の連続的方法または手法を含む。語句「回分法」または「回分発酵」とは、閉ざされたシステムを指し、培地、栄養素、補助的添加剤等が発酵開始から設定し、発酵中、変更の対象としないが、培地の過剰な酸性化および／または微生物死滅を防ぐためにｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みを行ってもよい。語句「流加法」または「流加発酵」とは、回分発酵を指すが、例外として、発酵が進むにつれ、１種以上の基質または補助剤(supplement)を添加する（例えば、段階的にまたは連続的に添加する）。語句「連続法」または「連続発酵」とは、所望のイミノ糖生産物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）収集のため好適に、画定した発酵培地を、連続的に発酵装置へ添加し、使用したか、または、「調整した」培地と同量を同時に取り除くシステムを指す。このような多様な方法が開発され、且つ、当技術分野で周知である。
【００５８】
本発明の一実施態様において、回分発酵法を使用する。別の実施態様において、流加発酵法を使用する。
【００５９】
語句「少なくとも１種のイミノ糖が生産されるような条件下で培養する」には、少なくとも１種のイミノ糖の生産を得るか、または少なくとも１種のイミノ糖の所望の収率を得るために適切または十分な条件下（例えば、温度、圧力、ｐＨ、粘度、持続時間等）で、微生物を維持および／または育成することを含む。例えば、所望量のイミノ糖化合物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチンまたはそれらの前駆体）を生産するため、十分な時間培養を継続する。好ましくは、培養を、化合物の好適な生産に実質的に到達するため、十分な時間継続する（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチンまたは好適なミガラスタット：ガラクトスタチンの比の好適な濃度に到達するための十分な時間）。一実施態様において、培養を、約１２〜２４時間継続する。別の実施態様において、培養を、約２４〜３６時間、３６〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間、１２０〜１４４時間、１４４〜１６８時間、１６８〜１９２時間、１９２〜２１６時間、２１６〜２４０時間、２４０〜２６４時間、２６４〜２８８時間、２８８〜３１２時間、３１２〜３３６時間または３３６時間を超えて継続する。その一方で、別の実施態様において、微生物を、発酵の間中、少なくとも０．５〜１０ｇ／Ｌの化合物を生産するように培養する。
【００６０】
本発明の方法は、別々のシード（seed）発酵段階および最終発酵段階を含んでもよい。あるいは、接種胞子を最終段階培地に直接接種してもよい。一実施態様において、方法には、シード発酵および最終発酵を含む。一実施態様において、方法には、シード発酵段階を含まない。一実施態様において、方法には、シード発酵段階がない最終発酵段階を含む。別々のシード発酵段階および最終発酵段階を使用した場合、シード発酵段階において、シード発酵培地をシードするために接種材料を使用する。これは、胞子接種材料または植物性接種材料の使用により達成してもよい。シードされた発酵培地を、次に、本明細書で上記に記載した好適な条件下でインキュベートしてもよい。最終発酵段階において、シード発酵を、最終段階培地を接種するために使用する。
【００６１】
本発明の一実施態様において、方法には、初期シード発酵段階を含む。一実施態様において、方法には、シード発酵段階および最終発酵段階を含む。最終段階の発酵は、典型的には、２８０時間まで行われる一方で、シード段階として発酵段階は、典型的には、７２時間まで行われる。
【００６２】
２．３．１  シード発酵
典型的には、接種材料は、培地１ｍｌあたり１．５ｘ１０４〜２．５ｘ１０５個の胞子の濃度を提供する胞子を含む。一つの好適な胞子濃度は、培地１ｍｌあたり胞子６Ｘ１０４個である。シード発酵段階に好適な培地は、本明細書の上記第２．１節で定義したとおりである。一実施態様において、シード培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）を含む。一実施態様において、シード培地は、デキストリン（水溶性でんぷん）を含む。一実施態様において、シード培地は、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）を含む。一実施態様において、シード培地は、ＫＨ２ＰＯ４を含む。一実施態様において、シード培地は、菜種油を含む。一実施態様において、シード培地は、炭酸カルシウムを含む。一実施態様において、シード培地は、消泡剤を含む。一実施態様において、シード培地は、綿実粉（タンパク源）を含む。一実施態様において、シード培地は、メリトース（デキストロース）を含む。一実施態様において、シード培地は、CSL（タンパク源）を含む。
【００６３】
一実施態様において、シード培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）、デキストリン（水溶性でんぷん）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、ＫＨ２ＰＯ４、菜種油、炭酸カルシウム、消泡剤、綿実粉、メリトース（デキストロース）およびCSLのいずれか１種以上を含む。
【００６４】
一実施態様において、シード培地は、大豆タンパク濃縮物（大豆タンパク濃縮物Arcon Fなど）、デキストリン（水溶性でんぷん）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、ＫＨ２ＰＯ４、菜種油、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００６５】
一実施態様において、シード培地は、Arcon Fなどの大豆タンパク質  例えば０〜５％、水溶性でんぷん  例えば０〜４％、硫酸マグネシウム  例えば０〜０．７％、リン酸カリウム  例えば０〜０．８％、菜種油  例えば０〜０．２％、塩化カルシウム  例えば０〜０．１２％、塩化マグネシウム  例えば０  〜０．０４％、塩化ナトリウム  例えば０〜０．０４％、塩化鉄  例えば０〜０．０２％、塩化亜鉛  例えば０〜０．００２％、塩化第二銅  例えば０〜０．００２％、硫酸マンガン  例えば０〜０．００２％、および、消泡剤  例えば０〜０．４％のいずれか１種以上または全種を含む。
【００６６】
一実施態様において、シード育成段階において使用する培地は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL  例えば０〜１．０％、ラクトース  例えば０〜４％、グルコース  例えば０〜２．５％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％、硫酸マグネシウム  例えば０〜０．２％および消泡剤  例えば０〜０．２％のいずれか１種以上または全種を含む。
【００６７】
一実施態様において、シード培地は、綿実粉、メリトース（デキストロース）、デキストリン、CSLおよび炭酸カルシウムを含む。
【００６８】
一実施態様において、シード育成段階において使用する培地は、綿実粉  例えば０〜５％、メリトース（デキストロース）例えば０〜３％、デキストリン  例えば０〜８％、CSL  例えば０〜１．０％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％のいずれか１種以上または全種を含む。
【００６９】
別の実施態様において、シード培地は実質的に、本明細書の任意の実施態様において記載するとおりである。
【００７０】
シード培地のｐＨを、シード発酵段階の前および／または最中に、好適に調節してもよい。シード培地のｐＨを、本明細書の上記第２．２節で記載されるとおりに好適に調節してもよい。一実施態様において、シード培地を、例えば約７．８のｐＨなど、７．０〜８．０の間のｐＨに調節する。一実施態様において、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して調節する。
【００７１】
シード発酵段階を、本明細書の上記第２．２節で記載したとおり、制御された通気の条件下で好適に実施してもよい。一実施態様において、通気を、撹拌および培地を介する滅菌空気により制御する。
【００７２】
シード発酵段階を、本明細書の上記段落第２．２節で記載したとおり、制御された温度の条件下で好適に実施してもよい。一実施態様において、シード発酵を１５°Ｃ〜３５°Ｃで実施する。例えば、シード発酵を２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、３１°Ｃ、３２°Ｃ、３３°Ｃ、３４°Ｃまたは３５°Ｃで実施する。
【００７３】
接種されたシード培地を、最終発酵段階のため、所望のバイオマスを生産するのに十分な時間培養する。一実施態様において、培養を約１２〜２４時間継続する。別の実施態様において、培養を約２４〜３６時間、３６〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間、１２０〜１４４時間または１４４時間を超えて継続する。
【００７４】
２．３．２  最終発酵
典型的には、最終段階培地に、最終段階培地開始量０．１％〜８％ｖ／ｖの間のレベルでシード培養を接種する。
【００７５】
最終発酵段階に好適な培地は、本明細書の上記第２．１節に記載したとおりである。一実施態様において、最終段階培地は、綿実粉を含む。別の実施態様において、最終段階培地は、グルコースを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、ラクトースを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、グリセロールを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、CSLを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、炭酸カルシウムを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、Foam Doctorなどの消泡剤を含む。別の実施態様において、最終段階培地は、ラクツロースを含む。別の実施態様において、最終段階培地は、メリトース（デキストロース）を含む。別の実施態様において、最終段階培地は、ガラクトースを含む。
【００７６】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、グルコース、ラクトース、グリセロール、ＣＳＬ、炭酸カルシウム、消泡剤、ラクツロースおよびメリトース（デキストロース）の１種以上を含む。
【００７７】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、グルコース、ラクトース、グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００７８】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、グルコース、ラクツロース、グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００７９】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、グルコース、グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００８０】
一実施態様において、最終段階培地は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL  例えば０〜１．０％、ラクトース  例えば０〜４％、グルコース  例えば０〜２．５％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％および消泡剤  例えば０〜０．２％のいずれか１種または全種を含む。
【００８１】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、ラクトース、メリトース（デキストロース）、グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよび消泡剤を含む。
【００８２】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL  例えば０〜１．０％、ラクトース例えば０〜４％、メリトース（デキストロース）例えば０〜３．０％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％および消泡剤  例えば０〜０．２％  のいずれか１種または全種を含む。
【００８３】
別の実施態様において、最終段階培地は、綿実粉、ラクツロース、メリトース（デキストロース）、グリセロール、CSL、炭酸カルシウムおよびFoam Doctorを含む。
【００８４】
一実施態様において、最終段階培地は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL  例えば０〜１．０％、ラクツロース  例えば０〜４％、メリトース（デキストロース）例えば０〜３．０％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム例えば０〜１．６％および消泡剤  例えば０〜０．２％のいずれか１種または全種を含む。
【００８５】
一実施態様において、最終段階培地は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL例えば０〜１．０％、ガラクトース  例えば０〜４％、デキストロース  例えば０〜３．０％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％および消泡剤  例えば０〜０．２％のいずれか１種または全種を含む。
【００８６】
別の実施態様において、最終段階培地は、実質的に、本明細書の実施例のいずれかにおいて記載されるとおりである。
【００８７】
別の実施態様において、生産局面（最終段階）は、綿実粉  例えば０〜５％、CSL  例えば０〜１．０％、ラクトース  例えば０〜４％、グルコース  例えば０〜３．０％、グリセロール  例えば０〜８％、炭酸カルシウム  例えば０〜１．６％および消泡剤  例えば０〜０．２％を含む液体培地中の有機物を培養することを含む。
【００８８】
最終段階培地のｐＨを、最終発酵段階の前および／または最中に、好適に調節してもよい。最終段階培地のｐＨを、本明細書の上記第２．２節に記載したとおりに好適に調節してもよい。一実施態様において、最終段階培地を、例えば約７．２のｐＨなど、７．０〜８．０の間のｐＨに調節する。一実施態様において、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して調節する。
【００８９】
最終発酵段階を、本明細書の上記第２．２節に記載したとおりの制御された通気の条件下で好適に実施してもよい。一実施態様において、通気を、撹拌および培地を介する滅菌空気の通過により制御する。
【００９０】
最終発酵段階を、本明細書の上記第２．２節に記載したとおりの制御された温度の条件下で好適に実施してもよい。一実施態様において、シード発酵を１５°Ｃ〜３５°Ｃの間で実施する。例えば、最終段階発酵を２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、３１°Ｃ、３２°Ｃ、３３°Ｃ、３４°Ｃまたは３５°Ｃで実施する。例えば、最終段階発酵を、約２８°Ｃで実施する。
【００９１】
最終発酵段階を、少なくとも１種のイミノ糖を生産するのに十分な時間培養する。一実施態様において、培養を、約１２〜２４時間継続する。別の実施態様において、培養を、約２４〜３６時間、３６〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間、１２０〜１４４時間、１４４〜１６８時間、１６８〜１９２時間、１９２〜２１６時間、２１６〜２４０時間、２４０〜２６４時間、２６４〜２８８時間または２２８時間を超えて、例えば２８０時間以上、継続する。
【００９２】
３．所望の化合物の検出、収集および単離
本発明の方法側面の実施態様において、微生物はミガラスタットを生産する。別の実施態様において、ミガラスタットは、ガラクトスタチンを生産する。別の実施態様において、微生物は、ミガラスタットおよびガラクトスタチンを生産する。
【００９３】
本発明の手法には、所望の化合物（例えば、ミガラスタットまたはガラクトスタチン）を収集する工程をさらに含むことが可能である。用語、所望の化合物を「収集する」には、培地から化合物を、抽出すること、採取すること、単離することまたは精製することを含む。化合物の収集は、特に限定されないが、従来の樹脂（例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸収樹脂等）による処理、従来の吸収剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）による処理、ｐＨの変更、溶剤摘出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサン等の従来の溶剤による）、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調節、凍結乾燥等を含む、当技術分野で公知の、任意の従来の単離または浄化の手法により行うことができる。例えば、第一に培養から微生物を除去することにより、化合物を培地から収集することができる。培地を、次いで、カチオンを除去するためにカチオン交換樹脂へ通すかまたは渡し、次いで、目的の化合物より強い酸性を有する無機アニオンおよび有機酸を除去するためにアニオン交換樹脂へ通すかまたは渡す。単離した目的のイミノ糖は、本明細書で記載したとおり、続けて塩（例えば、塩酸塩）へ変換することができる。
【００９４】
一実施態様において、収集は以下の１工程以上を含む。
【００９５】
（ａ）脱汚泥（desludging）：例えばディスクスタック遠心単離機などの好適なプロセス遠心分離機を用いて、後のろ過段階を容易にするため、有利には、ブロス固体を除去する。後のろ過装置の規模および配置次第で、この段階を省略してもよく、例えば、採取でのブロスを、平面シートで配置したか、または、より非効果的には、スパイラル網状に配置した膜の使用により直接的に清澄してもよい。
【００９６】
（ｂ）ろ過−初期の清澄には、好適には、分子量１０〜５０ｋＤａの切断膜（例えば、１０ｋＤａ膜）を、理想的には平面シート配置で使用する。任意の親水性膜を使用してもよく、典型的には、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）またはＣＡ（酢酸セルロース）である。膜未透過流、即ち不要流中のイミノ糖の濃度を下げるための透析ろ過を使用することにより、所望のイミノ糖収集を改善することができる。典型的には、３透析ろ過工程を行い、各工程で加える透析ろ液量と等しい透過液量を除外する。当初の１０〜５０ｋＤａ透過液および１ｋＤａ分子量の切断膜により添加した任意の透析ろ液を限外ろ過することにより、分別前にさらなる精製を達成することができる。再度、典型的には、既に記載した方法の３つの透析ろ過を使用した、１ｋＤａシステム内での透析ろ過により、所望のイミノ糖の収集を改善することができる。
【００９７】
（ｃ）分別、例えばカチオン交換樹脂を使用して−一実施態様において、所望のイミノ糖（amino sugar）を、カチオン交換カラムに捕捉し、塩酸の段階勾配を使用して、樹脂から溶離する。１０〜５０ｋＤａまたは１ｋＤａのいずれかで処理した、５〜２５ｂｅｄの間の量の限外ろ液を、カチオン交換樹脂へ搭載することができる。典型的には、樹脂を、好適なカラムに収容するが、所望の生産物を、撹拌による限外ろ液への樹脂を添加することで捕捉し、且つ、その後ろ過により、任意の好適な培地および装置に収集することもできる。好適な樹脂は、典型的には、しかし排他的でなく、例えばスルホンなどの、好適な官能基を有する、スチレンジビニルベンゼン共重合体である。樹脂に好適な粒子サイズは、カラム内に収容された際、良好な流動特性に適合するサイズであり、例えば２００〜２５０ミクロンである。より小さい粒子サイズでより高い単離有効性を達成することができる。より大きな樹脂粒子については逆であり、より高いカラム流動率を達成することができる。残渣限外ろ液の空隙容量の排出の後、典型的には塩酸などの、酸の希釈溶液で樹脂を溶離することにより、所望のイミノ糖を収集することができる。好適な酸濃度は、０．１〜０．５モルである。有利的には、溶離を勾配溶離として行うことができ、所望のイミノ糖の精製を容易にする。カチオン交換段階の溶離を、他のカチオン、特にＮＨ４＋を使用して実行することもできる。
【００９８】
（ｄ）ｐＨの調節：一実施態様において、（ｃ）からの滞留分（pooled fraction）のｐＨを、撹拌と、例えば水酸化ナトリウムなどの好適な滴定剤の添加により、ｐＨ６〜７へ調節する。さらなる実施態様において、（ｃ）からの滞留分のｐＨを、好適なアニオン交換樹脂を使用して調節する。好適なアニオン交換樹脂には、Dow IRA 67またはDowex marathon WBAを含む。ｐＨを調節するためのアニオン交換樹脂の使用により、有利には、液体中の付加的無機物の望ましくないレベルにつながる滴定剤の追加を回避する。
【００９９】
（ｅ）濃縮：これは、未透過液中のイミノ糖を濃縮するのに十分保持力がある膜を使用してナノろ過（逆浸透）することにより、好適に実施してもよい。あるいは、カチオン交換工程（ｃ）からの選択部分を濃縮またはさらに濃縮するために、蒸発を使用してもよい。
【０１００】
（ｆ）塩への変換：これは、濃縮塩酸などの酸を添加することにより、好適に実施してもよい。塩を、エタノールなどの抗溶剤の添加を原因とする沈殿の後に、固体として単離する。本発明の方法側面の実施態様において、ミガラスタット遊離塩基を、例えばミガラスタットＨＣｌなどのミガラスタット塩に変換する。
【０１０１】
（ｇ）再結晶化：一実施態様において、これは、水中でミガラスタット塩酸塩を溶解し、エタノールなどの抗溶剤の添加により引き起こされる沈殿の後、固体を単離することにより、実施してもよい。
【０１０２】
一実施態様において、ミガラスタットの収集は、上記の工程の全てを含む。別の実施態様において、ガラクトスタチンの収集は、上記の工程の全てを含む。一実施態様において、収集工程には、脱汚泥、ろ過、分別、ｐＨ調節、濃縮、塩への変換および再結晶化からなる群から選択される少なくとも１つの方法を含む。
【０１０３】
別の実施態様において、イミノ糖を、結果として得た製剤が、他の培地成分を実質的に含まない（例えば、培地成分および／または発酵副産物を含まない）ように「抽出される」、「単離される」または「精製される」。用語「他の培地成分を実質的に含まない」とは、化合物が、それ自体が生産された培地からの培地成分または発酵副産物から分離された、所望の化合物の製剤を含む。一実施態様において、製剤は、所望の化合物の約８０％（乾燥重量にて）より多い（例えば、他の培地成分または発酵副産物の約２０％より少ない）。別の実施態様において、製剤は、所望の化合物の約９０％より多い（例えば、他の培地成分または発酵副産物の約１０％より少ない）。別の実施態様において、製剤は、所望の化合物の約９５％より多い（例えば、他の培地成分または発酵副産物の約５％より少ない）。また別の実施態様において、製剤は、所望の化合物の約９８〜９９％より多い（例えば、他の培地成分または発酵副産物の約１〜２％より少ない）。所望の化合物が塩へ誘導体化されると、化合物は、塩の形成に関連して化学的汚染物をさらに含まないことがある。所望の化合物がアルコールへ誘導体化されると、アルコールの形成に関連して化学的汚染物をさらに含まないことがある。
【０１０４】
別の実施態様において、イミノ糖は、例えば、微生物が生物学的に無害（即ち、安全）である場合、微生物から精製されない。例えば、培養物（または培養浮遊物）全体を生産物（即ち、粗生産物）源として使用することができる。一実施態様において、培養物（または培養浮遊物）を改良なく使用する。別の実施態様において、培養物（または培養浮遊物）を濃縮する。また別の実施態様において、培養物（または培養浮遊物）を乾燥または凍結乾燥する。
【０１０５】
好適には、本発明の生産方法は、顕著に高い収率での所望の化合物の生産をもたらす。語句「顕著に高い収率」とは、十分に高まっているか、または競合の生産方法で通常とされる生産レベルまたは収率を上回っている、生産レベルまたは収率、例えば、所望の生産物の商業的生産に十分なレベルまで高まっている、生産レベルまたは収率を含む（例えば、商業的実行可能なコストによる生産物の生産）。一実施態様において、本発明は、所望の生産物（例えば、ミガラスタット）が０．５ｇ／Ｌを超えたレベルで生産されるような条件下で、組換え微生物を培養することを含む生産方法を特色とする。本発明の任意の側面の一実施態様において、少なくとも０．５ｇ／Ｌのイミノ糖が生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．０ｇ／Ｌのイミノ糖が生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．３ｇ／Ｌのイミノ糖が生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．５ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．０ｇ／Ｌのイミノ糖が生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．４ｇ／Ｌのイミノ糖が生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．０ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．３ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．５ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．０ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．４ｇ／Ｌのミガラスタットが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．０ｇ／Ｌのガラクトスタチンが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．３ｇ／Ｌのガラクトスタチンが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも１．５ｇ／Ｌのガラクトスタチンが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．０ｇ／Ｌのガラクトスタチンが生産されるまで培養を継続する。一実施態様において、少なくとも２．４ｇ／Ｌのガラクトスタチンが生産されるまで培養を継続する。
【０１０６】
好適には、本発明の微生物には、ミガラスタットが生産されるように、少なくとも１種の生合成エンハンサー（biosynthetic enhancer）が提供される（即ち、供給される）。用語「生合成エンハンサー」または「エンハンサー」とは、微生物の培地中に提供されたか、接触のために持ち込まれたか、または含まれた際に、例えばミガラスタットなどの生合成を向上させるかまたは増加させるのに役立つ薬剤または化合物を含む。用語「生合成エンハンサー」または「エンハンサー」には、それらの範囲において「生合成前駆体」または「前駆体」を含む。本発明の一側面において、生合成エンハンサーの存在下でイミノ糖を生産する細菌を培養することを含む、ミガラスタットの生産方法を提供する。
【０１０７】
好適なイミノ糖生産細菌を、細菌を培養すること、および、培養ブロス中のイミノ糖の存在をスクリーニングすることにより同定してもよい。上記の第１節で記載したとおり、商業的供給源からのグリコシダーセアッセイの使用により、イミノ糖を培養ブロス中で検出してもよい。本発明の側面において、使用に好適な細菌は、上記の第１節に記載したとおりであり、ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・アヌラトス（Streptomyces anulatus）、ストレプトマイセス・エスピー （Streptomyces sp）BTA530株（NCIMB 42142株）およびストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075株からなる群から選択される、ストレプトマイセス（Streptomyces）菌を含む。第２節に記載した培地、培養条件および培養方法が、本発明の側面において使用に好適である。
【０１０８】
好適な生体エンハンサー(bioenhancer)は、培養される微生物の生き残りおよび複製だけではなく、むしろ、本発明の方法における所望のイミノ糖の生産を特異的に誘導する、任意の添加基質を含む。例えば、一実施態様において、生合成エンハンサーまたはエンハンサーは、ラクトースである。別の実施態様において、生合成エンハンサーまたはエンハンサーは、ラクツロースである。添加される生合成エンハンサー（例えば、ラクトース、ラクツロース）の量は、好ましくは、微生物の生産性を向上させるのに十分な濃度を培地中にもたらす量である（例えば、ミガラスタットの生産を向上させるのに十分な濃度）。用語「過剰ラクトース」および「過剰ラクツロース」とは、ラクトースまたはラクツロースの、問題の微生物を培養するのに通常使用されるレベルより増加したか、またはより高いレベルを含む。従って、過剰ラクトースレベルは、５０％のレベルまで、例えば１〜１０％、例えば４％を含むことができる。本発明の生合成エンハンサーは、濃縮された溶液または懸濁液の形態（例えば、水または緩衝液などの好適な溶剤）または固体の形態（例えば、パウダーの形態）で添加することができる。さらに、本発明の生合成エンハンサーは、単一アリコートで、所与の時間中、連続的または断続的に添加することができる。
【０１０９】
微生物がガラクトスタチンを生産する本発明の実施態様において、ガラクトスタチンを、ミガラスタットへ変換してもよい。一実施態様における、条件が、細菌がガラクトスタチンを生産するのに好適である本発明の方法において、方法には、培地中でガラクトスタチンを検出し、当該ガラクトスタチンをミガラスタットへ変換することが含まれる。一実施態様において、ガラクトスタチンを、培養中にミガラスタットへ変換してもよい。別の実施態様において、ガラクトスタチンを、ミガラスタットへ変換する前に単離する。一実施態様において、ガラクトスタチンの変換を、化学的変換を介して行ってもよい。例えば、プラチナ触媒との触媒的水素化またはＮａＢＨ４との化学的還元により、ガラクトスタチンをＤＧＪに変換することができる。好適な方法は、Legler& Pohl, Carbohydr. Res., 155 (1986) 119-129に記載されている。本実施態様において、ガラクトスタチンを、ミガラスタットへの化学的変換前に単離してもよい。別の実施態様において、ガラクトスタチンを、ミガラスタットへの化学的変換前には単離しない。
【０１１０】
別の実施態様において、ガラクトスタチンのミガラスタットへの変換を、生体内変化を経由して実施してもよい。これは、生体内変化微生物を使用することで好適に実施してもよい。「生体内変化微生物(biotransformation microorganism)」とは、ガラクトスタチンをミガラスタットへ変換する酵素を含む任意の微生物である。好適な生体内変化微生物は、ガラクトスタチンを含む培地で培養されている微生物の培養ブロス中のミガラスタットの存在をスクリーニングすることにより同定してもよい。生体内変化微生物は、イミノ糖を生産すると既に知られている微生物であってもよい。あるいは、イミノ糖を生産すると既に知られていない微生物であってもよい。生体内変化微生物は、好適には、グラム陽性菌である。例えば、微生物は好適には、アクチノ細菌である。好適な微生物は、ストレプトマイセス（Streptomycetacaeae）科に属し、例としてストレプトマイセス（Streptomyces）属またはストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）属の微生物が挙げられる。あるいは、好適な微生物は、バチルス（Bacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、コリネバクテリウム（Cornyebacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属およびラクトコッカス（Lactococci）属からなる群から選択される属に属する。
【０１１１】
生体内変化微生物は、好適にはグラム陰性菌である。例えば、好適な微生物は、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラシア（Serrtia）属およびプロテウス（Proteus）属からなる群から選択される属に属する。一実施態様において、微生物は、エシェリキア（Escherichia）属に属する。一実施態様において、微生物は、大腸菌である。別の実施態様において、微生物は、真核微生物である。一実施態様において、微生物は、真菌である。一実施態様において、微生物は、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１１２】
本発明の当該側面の一実施態様において、生体内変化微生物は、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）である。別の実施態様において、生体内変化微生物は、バチルス・エスピー（Bacillus sp）である。別の実施態様において、生体内変化微生物は、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）またはストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）である。本発明の側面において使用しうる特定の細菌株には、本発明者らが、１種のイミノ糖から別のイミノ糖への生体内変化の能力があることを見出した、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ATCC 27064株を含む。
【０１１３】
生体内変化は、例えば培養中の植物細胞などの他の手段により好適に実施してもよい。培養に好適な植物細胞には、クワ（Morus alba ）（桑の実）またはコメリナ・コムニス（Commelina communis）（ツユクサ）からの植物細胞を含んでもよい。
【０１１４】
一実施態様において、ガラクトスタチンが、ミガラスタットへの生体内変化前に単離される。別の実施態様において、ガラクトスタチンが、ミガラスタットへの生体内変化前に単離されない。
【０１１５】
ミガラスタットを単離し、塩形態で使用する場合、ミガラスタットの塩は薬学的に許容可能であるべきである。好適な薬学的に許容可能な塩は、当業者にとり明白である。薬学的に許容可能な塩は、Berge, Bighley and Monkhouse J.Pharm.Sci (1977) 66, pp 1-19に記載されたものを含む。当該薬学的に許容可能な塩は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および、例えばコハク酸、マレイン酸、酢酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸などの有機酸とで形成される酸付加塩を含む。例えばシュウ酸塩またはギ酸塩などの他の塩を使用してもよく、例えば、ミガラスタットの単離に用いられてもよく、かつ本発明の範囲内に含まれる。本発明の一実施態様において、ミガラスタットは、ミガラスタット塩酸として単離される。
【０１１６】
ミガラスタットは、１種以上の等価の酸と酸付加塩を形成してもよい。本発明は、本発明の範囲内において、全ての可能な化学量論および非化学量論の形態におけるミガラスタットの使用を含む。
【０１１７】
ミガラスタットは、結晶性または非結晶性の形態で調製してもよく、結晶性の場合、場合により、例えば水和物として、溶媒和されていてもよい。本発明は、本発明の範囲内において、可変的量の溶媒（例えば、水）を含むミガラスタットだけでなく、化学量論的溶媒（例えば、水和物）を含む。さらに、異なる結晶化条件により、結晶生産物の異なる多様型形態の形成がもたらされてもよい。本発明は、本発明の範囲内において、任意の多様型形態におけるミガラスタットの使用を含む。
【０１１８】
本発明は、ミガラスタットの医薬組成物における使用に関するため、化合物が、実質的に純粋な形態で好ましくは提供されることは容易に理解されることであり、例として、少なくとも純度６０％、より好適には少なくとも純度７５％、および好ましくは少なくとも純度８５％、特に少なくとも純度９８％が挙げられる（％は、重量対重量に基づく(weight for weight basis)）。化合物の純粋でない処方物は、医薬組成物において使用される、より純粋な形態に調製するために使用してもよい。
【０１１９】
本発明は、療法における使用のための、本発明の方法に従い生産したミガラスタット、または、それらの薬学的に許容可能な塩も提供する。本発明は、ファブリー病の治療または予防を必要とする対象における、ファブリー病の治療または予防の方法であって、前記対象に、本発明の方法により生産したミガラスタットまたはそれらの薬学的に許容可能な塩の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、ファブリー病の治療または予防で使用するための薬剤の製造における、本発明の方法に従い生産したミガラスタットまたはそれらの薬学的に許容可能な塩の使用も提供する。療法における使用のため、ミガラスタットは、通常、医薬組成物として投与される。
【０１２１】
ミガラスタットまたはそれらの薬学的に許容可能な塩は、例えば、経口、非経口、口腔、舌下、鼻腔、直腸または経皮投与によるなど、任意の便宜的方法で投与してもよく、医薬組成物は、適宜適応される。
【０１２２】
経口的に与えられた際に有効である、ミガラスタットまたはそれらの薬学的に許容可能な塩は、例えば、シロップ、懸濁液、乳液、錠剤、カプセルまたは薬用ドロップなどの液体または固体に製剤化することができる。
【０１２３】
液体製剤は、例えば、水、エタノールまたはグリセリンなどの水溶性溶剤、または、ポリエチレングリコールまたは油などの非水溶性溶剤などの、好適な液体担体内の有効成分の懸濁液または溶液から一般的に構成される。製剤には、懸濁剤、防腐剤、着香料および／または着色料が含まれてもよい。
【０１２４】
錠剤形態の組成物は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、でんぷん、ラクトース、スクロースおよびセルロースなどの固体製剤を調製するために通常使用する、任意の好適な薬学的担体を使用して調製することができる。
【０１２５】
カプセル形態の組成物は、通常の封入方法を使用して調製することができ、例として、有効成分を含むペレットは、標準担体を使用し、次いで硬ゼラチンカプセルに充填することで調製することができ、あるいは、分散剤または懸濁剤は、例えば、水溶性ガム、セルロース、ケイ酸塩または油などの任意の好適な薬学的担体を使用して、分散剤または懸濁剤を次いで軟ゼラチンカプセルに充填することにより調製することができる。
【０１２６】
典型的な非経口組成物は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油またはごま油などの滅菌水溶性担体または非経口的許容な油内の有効成分の溶液または懸濁液から構成される。あるいは、溶液を凍結乾燥し、次いで投与直前に好適な溶剤によって再構成することができる。
【０１２７】
鼻腔投与用組成物は、エアゾール、ドロップ、ゲルおよびパウダーとして便宜的に製剤化することができる。エアゾール製剤は、典型的には、薬学的に許容可能な水溶性または非水溶性溶剤内の有効成分の溶剤または純度の高い懸濁剤を含み、通常は単一または複数投薬量で、滅菌形態で、使用のため噴射器付きのカートリッジまたは詰め替えの形態をとることができる密封容器で提供される。あるいは、密封容器は、単回投与鼻吸入器または絞り弁付きエアゾールディスペンサー（aerosol dispenser）などの使い捨て投薬装置であってもよい。投薬形態がエアゾールディスペンサーを含む場合、例えば空気などの圧縮ガスであってもよい高圧ガス、または、例えばフルオロクロロ炭化水素またはヒドロフルオロカーボンなどの有機高圧ガスを含むことになる。エアゾール投薬形態は、ポンプ式吸入器の形態を採用してもよい。
【０１２８】
口腔投与または舌下投与に好適な組成物は、錠剤、薬用ドロップおよびトローチ剤を含み、有効成分は、砂糖およびアカシア、トラガカントまたはゼラチンおよびグリセリンなどの担体と製剤される。
【０１２９】
直腸投与の組成物は、便宜的に、ココアバターなどの従来の坐薬基質を含む坐薬の形態である。
【０１３０】
経皮投与に好適な組成物は、塗り薬、ゲルおよびパッチを含む。
【０１３１】
一実施態様において、組成物は、錠剤、カプセルまたはアンプルなどの投与形態単位である。
【０１３２】
組成物は、投与方法により、有効成分に対して０．１〜１００重量％、例えば１０〜６０重量％含んでもよい。組成物は、投与方法により、担体に対して０〜９９重量％、例えば４０〜９０重量％含んでもよい。組成物は、投与方法により、有効成分に対して０．０５〜１０００ｍｇ、例えば１．０〜５００ｍｇ含んでもよい。組成物は、投与方法により、担体中５０〜１０００ｍｇ、例えば１００〜４００ｍｇ含んでもよい。前記疾患の治療において使用される化合物の投薬量は、疾患の重症度、患者の体重、および他の同様因子により、通常のように可変的である。しかし、一般的指針として、好適な投薬単位は、０．０５〜１０００ｍｇ、より好適には１．０〜５００ｍｇであってもよく、且つ、それらの投薬単位は、１日あたり１回以上、例えば１日２回または３回投与されてもよい。当該療法は、数週または数か月延長されてもよい。投薬量およびレジメンは次から選択されてもよい：１日２回２５ｍｇ；１日１回５０ｍｇ；１日２回５０ｍｇ；２日に１回５０ｍｇ；１日１回７５ｍｇ；１日２回７５ｍｇ；１日１回１００ｍｇ；１日２回１００ｍｇ；１日１回１５０ｍｇ；１日２１５０ｍｇ回；２日に１回１５０ｍｇ；１日１回２５０ｍｇ；１日２回２５０ｍｇ；および２日に１回２５０ｍｇ。特定の実施態様において、投薬量およびレジメンは２日に１回１５０ｍｇである。特定の一実施態様において、投薬量およびレジメンは、２日に１回１５０ｍｇミガラスタットＨＣｌである。
【０１３３】
本明細書で記載されるとおり、治療に関する任意の参照は、確立された予後および予防治療の両方を含むものと理解されるべきである。
【０１３４】
本発明の別の側面において、ミガラスタット、その塩および／または薬学的に許容可能な組成物は、別の治療的に有効な薬剤と組み合わせて使用してもよい。一実施態様において、本発明の方法に従い生産したミガラスタットを、ファブリー病の治療のため、置換α−ガラクトシダーセＡ酵素（α−Ｇａｌ  Ａ）との組合せで使用してもよい。ファブリー病の治療には、現在２種のα−Ｇａｌ  Ａ製品が入手可能である：アガルシダーゼアルファ（agalsidase alfa） （Replagal（商標）、シャーヒューマンジェネティックセラピーズ社（Shire Human Genetic Therapies）） およびアガルシダーゼベータ（ agalsidase beta）（Fabrazyme（商標）、ゲンザイム社（Genzyme Corporation））。上記による組合せは、医薬組成物の形態で、使用のため便宜的に提供されてもよく、従って、１種以上の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤とあわせて、上記で定義される組合せを含む医薬組成物は、さらに本発明の側面を表す。
【０１３５】
当該組合せの個々の化合物を、別々の、または組み合わせた１種または複数の医薬組成物で、連続的にまたは同時のいずれかにより投与してもよい。
【０１３６】
本発明は、本明細書で定義する組合せを調製する方法であって、
（ａ）組合せの個々の化合物を連続的に、または同時に、のいずれかで投与するために別々の医薬組成物を調製すること、または
（ｂ）組合せの個々の化合物を同時に投与するために、組み合わせた医薬組成物を調製すること、
のいずれかを含む方法を提供し、
該医薬組成物が、１種以上の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤との組合せを含む方法を提供する。
【実施例】
【０１３７】
本発明は、以下の特定の実施例を参照して説明されるが、これらの実施例により限定されるものではない。
【０１３８】
実施例１：DGJおよびガラクトスタチンを生産する微生物を同定するためのGCaseアッセイの使用
DGJおよびガラクトスタチンの生化学的検出のために、商業的供給源からの数個のグリコシダーセアッセイが設定された（即ち、生コーヒー豆由来のα―ガラクトシダーセおよび米由来のα−グルコシダーセ）。これらのアッセイで、酸性ｐＨにおける基質として対応の４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グリコピラノシドを使用して、酵素活性を測定した。反応は、室温下で、炭酸ナトリウムの添加により１時間後に終了し、各ウェル（well）内の塩基性ｐＨにおけるその後の４−ニトロフェノラートの形成を、３８４ｗミクロプレートリーダーを使用して４００ｎｍでの吸収率（Abs）により測定した。これらアッセイが、商業的供給源からの数種のイミノ糖の使用により、妥当性が確認された。
【０１３９】
ピペリジンイミノ糖は、非常に極性であるため、アッセイ内の細胞外培地中で検出することができる。各菌株を、５０ｍｌの培地を含む２５０ｍｌErlenmeyerフラスコ中で、２８℃で、２００ｒｐｍの軌道撹拌器内で育成した。４発酵日後、培養ブロスを５０ｍｌ  Falconへ移し、２０分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで４℃で保管した。
【０１４０】
培養ブロスの遠心分離で得た浮遊物を含むスクリーニングサンプルを、１０％最終アッセイ濃度で、α−ガラクトシダーセおよびα−グルコシダーセに対して、二度試験した。
【０１４１】
α−ガラクトシダーセアッセイを阻害する浮遊物を、HILICカラムを使用してＬＣ／ＭＳ（トリプル四重極に接続したuPLC）によりさらに分析し、ギ酸勾配０．１％を含む水／アセトニトリルで、０．６ｍｌ／分で、４０℃で溶離した。この分析的方法により、０．５ｐｐｂまでの対応の商業的標準に対する培養ブロス中の１−デオキシガラクトノジリマイシンの量が定量化される。しかし、ガラクトスタチンの量を、１−デオキシガラクトノジリマイシンと同量（equivalent）と決定した。
【０１４２】
収集した微生物のスクリーニングの間、総じて１３個の放線菌株を、１−デオキシガラクトノジリマイシンおよび／またはガラクトスタチンの生産菌株として同定した。表１において、それらの株菌および参考株としてのストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus ）ATCC_31975株を報告する。
【０１４３】
【表１】
2017506520.tif 000003
【０１４４】
実施例２：1lDGJ発酵
（ａ）ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）胞子株の調製
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）NCIMB 42142株を２６℃で、湿度４０％で、デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％を含む寒天上で９〜１１日間育成した。胞子を除去し、１０％スクロース中で懸濁し、且つ、およそ−７０℃で保管した。必要なアリコートを室温で解凍し、Triton X/Saline（０．０５％  TritonX 100、０．８５％ＮａＣｌ）を使用して、必要な濃度を提供するために希釈した。
【０１４５】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器（batching vessel）内で、Arcon F（タンパク質源）  ２．５％、デキストリン  ２．０％、硫酸マグネシウム  ０．２５％、オルトリン酸塩二水素カリウム  ０．１％、菜種油  ０．１％、塩化カルシウム  ０．０２％、塩化マグネシウム  ０．０２％、塩化ナトリウム  ０．０２％、塩化鉄  ０．０１％、塩化亜鉛  ０．００１％、塩化銅  ０．００１％、硫酸マンガン  ０．００１％を計量することにより、３Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．７に調節し、５００ｍｌ振とうフラスコ内へ容積１００ｍｌを分注し、２０分間１２１℃で滅菌した。６ｘ１０４個／ｍＬの最終濃度を提供するため、１．０ｍＬｓの胞子を各シードフラスコへ導入し、２８℃および２２０ｒｐｍで、４８時間インキュベートした。
【０１４６】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、ラクトース  １．７％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、CSL（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％およびFoam Doctor（消泡剤）０．１％を計量することにより、１９Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、１２１℃で３０分間滅菌し、シードフラスコからのシードと接種するために準備された各滅菌最終段階容器へ１．４Ｌｔｓを移した。
最終段階容器を１４００ｒｐｍ、通気量１．１Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
４８時間育成した４０ｍｌｓのシードを、各最終段階容器内へ移し、上記条件下で２１４時間インキュベートした。この規模では、溶存酸素レベルを測定または維持しなかった。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したミガラスタットの製造について測定し、且つ、ミガラスタット濃度が１７００ｕｇ／ｍｌのレベルとなった時に採取した。
【０１４７】
実施例３  10l DGJ発酵スケールアップ
（ａ）ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）胞子株の調製
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）NCIMB 42142株を２６℃で、湿度４０％で、デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％を含む寒天上で９〜１１日間育成した。
胞子を除去し、１０％スクロース中で懸濁し、且つ、およそ−７０℃で保管した。必要なアリコートを室温で解凍し、Triton X/Saline（０．０５％  TritonX 100、０．８５％ＮａＣｌ）を使用して、必要な濃度を提供するために希釈した。
【０１４８】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器内で、Arcon F（タンパク質源）  ２．１２％、Foam Doctor（消泡剤）０．１９４％、デキストリン  １．８２％、硫酸マグネシウム  ０．３２３％、オルトリン酸塩二水素カリウム  ０．０３６４％、菜種油  ０．０９７１％、炭酸カルシウム  ０．０６０７％を計量することにより、１９Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．８に調節し、４０分間１２１℃で滅菌し、接種のために準備した滅菌シード容器へ４Ｌｔｓを移した。
シード容器を３００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
シード容器内に最終濃度１ｍＬあたり６ｘ１０４個の胞子を提供するため、１０ｍＬｓの胞子をシード容器内へ導入し、上記条件下で５４時間インキュベートした。
【０１４９】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、ラクトース  １．７％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、CSL（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％、および、Foam Doctor（消泡剤）  ０．１％を計量することにより、２５０Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、１２１℃で３０分間滅菌し、シード容器からのシードとの接種に準備された各滅菌最終段階容器へ１０Ｌｔｓを移した。
最終段階容器を３００ｒｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
５４時間育成した２５０ｍｌｓのシードを、各最終段階容器内へ移し、上記条件下で２１４時間インキュベートした。発酵の間中、撹拌の増加により、溶存酸素レベルを２０％超で維持した。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したミガラスタットの生産について測定し、且つ、ミガラスタット濃度が１５００ｕｇ／ｍｌのレベルとなった時に採取した。
【０１５０】
実施例４  1000/3000l DGJ発酵スケールアップ
（ａ）ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）胞子株の調製
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）NCIMB 42142株を２６℃で、湿度４０％で、デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％を含む寒天上で９〜１１日間育成した。胞子を除去し、１０％スクロース中で懸濁し、且つ、およそ−７０℃で保管した。必要なアリコートを室温で解凍し、Triton X/Saline（０．０５％TritonX 100、０．８５％ＮａＣｌ）を使用して、必要な濃度を与えるために希釈した。
【０１５１】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器内で、Arcon F（タンパク質源）  ２．１２％、Foam Doctor（消泡剤）  ０．１９４％、デキストリン  １．８２％、硫酸マグネシウム  ０．３２３％、オルトリン酸塩二水素カリウム  ０．０３６４％、菜種油  ０．０９７１％および炭酸カルシウム  ０．０６０７％を計量することにより、１０００Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．８に調節し、４０分間１２１℃で滅菌し、接種のために準備した滅菌シード容器に移した。
シード容器を８０ｒｐｍ、通気量３０Ｎｍ３／Ｈｒ、圧力０．７ｂａｒ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
接種缶(inoculation can)を経由して、６ｘ１０４／ｍＬの濃度で、５００  ｍＬｓの胞子をシード容器へ導入し、上記条件下で５２時間インキュベートした。
【０１５２】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、ラクトース  １．７％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、CSL（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％およびFoam Doctor（消泡剤）  ０．１％を計量することにより、２ｘ３０００Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、１２１℃で４０分間滅菌し、シード容器からのシードとの接種に準備された２個の滅菌最終段階容器へ移した。最終段階容器を７０ｒｐｍ、通気量１１０Ｎｍ３／Ｈｒ、圧力０．７ｂａｒ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
シード容器からの、５２時間育成した９０Ｌｔｓのシードを、滅菌した移し糸(sterile transfer line)を経由し、各最終段階容器内へ移し、上記条件下で２８２時間インキュベートした。発酵の間中、溶存酸素レベルを２０％超で維持した。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したミガラスタットの生産について測定し、且つ、ミガラスタット濃度が１３００ｕｇ／ｍｌのレベルとなった時に採取した。
【０１５３】
（ｄ）限外ろ過によるブロス固体の除去−この作業は、平面シート配置された１０ｋＤａ膜を採用することで成功した。生産物の収集は、この段階で透析ろ過により、向上させてもよい。
【０１５４】
（ｅ）高分子量材料(high MWt material)の除去−上記の限外ろ過段階からの透過液（加えて任意の透析ろ液）を、１ｋＤａ膜を使用してさらに限外ろ過する。１ｋＤａ透過液内に、顕著な量の減色を達成できる。重ねて、生産物の収集を、透析ろ過により向上させてもよい。
【０１５５】
（ｆ）分別−１ｋＤａ限外ろ過からの透過液を、ミガラスタット生産物を捕捉するカチオン交換樹脂（UBK550）のカラム上に搭載する。脱イオン化水との置換洗浄に続けて、ミガラスタットを、塩酸の段階勾配を使用して、樹脂から溶離する。段階勾配は、生産物から幾つかの不純物の分離をもたらす。
【０１５６】
（ｇ）滞留分のワークアップ（work-up）−滞留分は、固体アニオン交換樹脂（IRA67）を添加し、よく混合することでｐＨ６〜７の範囲に調節する。（これにより、溶液中の望ましくないレベルの付加的無機物につながる、滴定剤（例えば、ＮａＯＨ）の添加を回避できる。）アニオン交換樹脂を、ろ過により除去し、混入している濃厚ミガラスタット溶液を除去するために洗浄し、次いで継続中の別の方法サイクルへ向け再生する。ろ液を濃縮工程へ進める。
【０１５７】
（ｈ）滞留分の濃縮−ｐＨ調節した滞留分をナノろ過（別名：逆浸透膜）により濃縮する。この方法で得ることができるミガラスタットの最終濃縮は、器具および膜に依存する。大きな規模での試行は、この段階で他の不純物を加えて３０〜４０ｍｇ／ｍｌを含む濃縮された滞留分が、約４０ｂａｒｇの浸透圧を有することを示唆する。高度な操作圧力を有する器具により、水の除去が容易になり、ミガラスタットのより高い滴定量につながる。最終所望濃度は、蒸発によってのみによって得られてもよい。
【０１５８】
実施例５  ミガラスタットＨＣｌ塩の単離
全ての重量、容積および等価は、遊離塩基に関する。
【０１５９】
（ａ）プレろ過
ミガラスタット遊離塩基の水溶液をアッセイし、溶液中のミガラスタット遊離塩基の質量を決定した。遊離塩基水溶液（１．０ｗｔのミガラスタット遊離塩基に相当する）をＧＦタイプフィルター（１．２μｍ）でろ過し、ろ液を回転蒸発器フラスコ内へ充填する。
【０１６０】
（ｂ）蒸留および酸分解法
内容物を、次いで真空下（ジャケット温度（jacket temperature） 約４５℃）で投入遊離塩基に対しておよそ重量１．８に濃縮する。内容物を２０〜２５℃に冷却し、次いで３６〜３７％ｗ／ｗの塩酸（１９．５ｅｑ＝１０ｖｏｌ）を添加する。内容物を、次いで４５〜５０℃に暖め、約３０分間撹拌した。得られたスラリー(slurry)を、沈殿した塩化ナトリウムを収集するため、約３０〜３５℃でろ過した。フラスコおよびケーキを３６〜３７％ｗ／ｗの塩酸（１．２ｅｑ＝０．６ｖｏｌ）で洗浄する。
【０１６１】
（ｃ）結晶化
ろ液を結晶化容器へ移し、１５〜２０℃に冷却する。スラリーを生じさせるため、無水エタノール（２５ｖｏｌ）を、１５〜２５℃で、結晶化容器内へ、少なくとも３０分間にわたり添加する。内容物を約２０℃で少なくとも１時間撹拌した。生産物をろ過し、無水エタノール（２×２．５ｖｏｌ）で洗浄し、生産物を、溶液を含まずに吸い取る。生産物を、次いで一定の重量を達成するまで、４０°Ｃ以下で乾燥する。
【０１６２】
期待収率：理論上８０〜９０％
観察した収率パーセントの範囲：理論上８０〜９０％
Ｖｍｉｎ＝２ｖｏｌ
Ｖｍａｘ＝３７ｖｏｌ
【０１６３】
実施例６  ガラクトスタチンの発酵
（ａ）ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075胞子株の調製
ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）ATCC319075株（Streptomyces lydicus ATCC317095）を２６℃で、湿度４０％で、デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％を含む寒天上で５〜７日間育成した。胞子を除去し、１０％スクロース中で懸濁し、且つ、およそ−７０℃で保管した。必要なアリコートを室温で解凍し、Triton X/Saline（０．０５％  TritonX 100、０．８５％ＮａＣｌ）を使用して、必要な濃度を提供するために希釈した。
【０１６４】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器内で、Arcon F（タンパク質源）  ２．５％、デキストリン  ２．０％、硫酸マグネシウム  ０．２５％、オルトリン酸塩二水素カリウム  ０．１％、菜種油  ０．１％、塩化カルシウム  ０．０２％、塩化マグネシウム  ０．０２％、塩化ナトリウム  ０．０２％、塩化鉄  ０．０１％、塩化亜鉛  ０．００１％、塩化銅  ０．００１％、硫酸マンガン  ０．００１％を計量することにより、３Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．７に調節し、５００ｍｌ振とうフラスコ内へ容量１００ｍｌを分注し、２０分間１２１℃で滅菌した。
各シードフラスコに、６ｘ１０４／ｍＬの濃度で、１．０ｍＬｓの胞子を導入し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。
【０１６５】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、CSL（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％およびFoam Doctor（消泡剤）  ０．１％を計量することにより、１９Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、次いで１２１℃で３０分間滅菌し、シードフラスコからのシードとの接種に準備された各滅菌最終段階容器へ１．４Ｌｔｓを移した。
最終段階容器を１４００ｒｐｍ、通気量１．１Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
４８時間育成した４０ｍｌｓのシードを、各最終段階容器に移し、上記条件下で２１４時間インキュベートした。この規模では、溶存酸素レベルを測定または維持しない。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したガラクトスタチンの生産について測定し、且つ、ガラクトスタチン濃度が１７００ｕｇ／ｍｌに到達した時に採取した。
【０１６６】
実施例７  ガラクトスタチン硫酸水素塩、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−２−スルホン酸からのミガラスタット、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールの調製
メタノール（３ｍＬ）中のガラクトスタチン硫酸水素塩、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−２−スルホン酸の懸濁液（５０ｍｇ，  ０．２０６ｍｍｏｌ）に、アセトン酸（２．５ｅｑｓ、２９μＬ、０．５１４ｍｍｏｌ）およびアダムス触媒 （ＰｔＯ２、２０ｍｇ）を添加した。混合物を、放出前に４０℃および圧力５．５ｂａｒで１８時間水酸化した。粗混合物を、次いで、触媒および他の不溶性物質を取り除くためにろ過し、低減された圧力下でろ液を乾燥するまで濃縮して、オフホワイト色の固体として（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオール、アセトン酸（１１ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ、２４％）を得た。
1H NMR: (400MHz, D2O): 4.21-4.18 (1H, m, CHeq), 4.11 (1H, ddd, J = 5.0, 10.0, 12.0 Hz, CHax), 3.91 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, CHaHb), 3.83 (1H, dd, J = 9.0, 12.0 Hz, CHaHb), 3.66 (1H, dd, J = 2.0, 10.0 Hz, CHax), 3.54 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, CHeq), 3.44 (1H, dd, J = 5.0, 9.0 Hz, CHax), 2.90 (1H, app. t, J = 12.0 Hz, CHax)。
【０１６７】
実施例８：ラクツロースを使用した1lDGJ発酵
（ａ）ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）胞子株の調製
ｐＨ７．３の、酵母エキス  ０．５％、麦芽エキス  １．０％、グリセロール  ０．５％、およびBacto寒天  ２％上で育成したBTA530 Y3株の表面育成物を、胞子形成を促進する寒天（デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、  ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％）上に取り出し、画線した。２６℃で、湿度４０％で９〜１１日間のインキュベート後、胞子を取り除き、１０％スクロース中で懸濁した。胞子の懸濁液をマスターストック(Master Stock)(MS)として使用し、容積１．２ｍＬ、およそ−７０℃で保存した。
MS冷凍胞子を、室温で解凍し、前記寒天またはデキストリンを除いた同様のものを含んだThompsonボトルを接種するために使用した。２６℃、湿度４０％で９〜１１日間のインキュベート後、ボトルを４℃下で１８〜４８時間置いた。胞子を、寒天の表面から取り出し、１０％スクロース中に懸濁し、発酵容器への播種に必要となるまで、およそ−７０℃で、容積１．２、５または１５ｍＬで保管した。
【０１６８】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、メリトース（デキストロース）１．５％、デキストリン  ４％、CSL（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％を計量することにより、３Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、５００ｍｌ振とうフラスコ内に容積１００ｍｌを分注し、２０分間１２１℃で滅菌した。Triton Xを使用してBTA530 Y3胞子株を希釈し、各シードフラスコ内で１ｍＬあたり胞子１．５ｘ１０７個の濃度を提供するため、１ｍＬをシードフラスコに添加した。フラスコを、２８℃および２２０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。
【０１６９】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、ラクツロース  １．７％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、ＣＳＬ（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％およびFoam Doctor（消泡剤）  ０．１％を計量することにより、１９Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、次いで１２１℃で３０分間滅菌し、シードフラスコからのシードとの接種に準備された各滅菌最終段階容器内に１．４Ｌｔｓを移した。最終段階容器を１４００ｒｐｍ、通気量１．１Ｌ／ｍｉｎ、２８℃に設定し、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
４８時間育成した４０ｍｌｓのシードを、各最終段階容器に移し、上記条件下で２１４時間インキュベートした。この規模では、溶存酸素レベルを測定または維持しない。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したミガラスタットの生産について測定し、且つ、ミガラスタット濃度が１７００ｕｇ／ｍｌのレベルとなった時に採取した。
【０１７０】
実施例９：変異ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）を使用した1LDGJ発酵
（ａ）ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）胞子株の調製
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）変異BTM4株 (NCIMB 42358株)を２６℃で、湿度４０％で、デキストリン  ０．３％、トレハロース二水和物  １％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５％、ＮａＣｌ  ０．１％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＣａＣｌ２  ０．０５％、カザミノ酸  ０．２％、ＭＯＰＳ緩衝液  １．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．０００１％、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．００００７６％、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ROKO寒天  ３％を含む寒天上で９〜１１日間育成した。胞子を除去し、１０％スクロース中で懸濁し、且つ、およそ−７０℃で保管した。必要なアリコートを室温で解凍し、Triton X/Saline（０．０５％ TritonX 100、０．８５％ＮａＣｌ）を使用して、必要な濃度を提供するために希釈した。
【０１７１】
（ｂ）シード段階発酵の調製および接種
計量容器内で、Arcon F（タンパク質源）  ２．５％、デキストリン  ２．０％、硫酸マグネシウム  ０．２５％、オルトリン酸塩二水素カリウム  ０．１％、菜種油  ０．１％、塩化カルシウム  ０．０２％、塩化マグネシウム  ０．０２％、塩化ナトリウム  ０．０２％、塩化鉄  ０．０１％、塩化亜鉛  ０．００１％、塩化銅  ０．００１％、硫酸マンガン  ０．００１％を計量することにより、３Ｌｔｓのシード培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．７に調節し、５００ｍｌ振とうフラスコ内に容積１００ｍｌを分注し、２０分間１２１℃で滅菌した。
各シードフラスコへ、１０ｍＬｓの胞子を、最終濃度６ｘ１０４個／１ｍＬとなるように導入し、２８℃および２２０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。
【０１７２】
（ｃ）最終段階発酵の調製および接種
計量容器内で、綿実粉（タンパク質源）  ２．５％、ラクトース  １．７％、メリトース  １．５％、グリセロール  ４％、ＣＳＬ（タンパク質源）  ０．５％、炭酸カルシウム  ０．８％およびFoam Doctor（消泡剤）  ０．１％を計量することにより、１９Ｌｔｓの最終段階培地を調製した。水酸化ナトリウムにより、培地をｐＨ７．２に調節し、１２１℃で３０分間滅菌し、シードフラスコからのシードとの接種に準備された各滅菌最終段階容器内に１．４Ｌｔｓを移した。最終段階容器を１４００ｒｐｍ、通気量１．１Ｌ／ｍｉｎ、２８℃に設定し、且つ、培地は、滅菌後ｐＨ調節しなかった。
４８時間育成した４０ｍｌｓのシードを、各最終段階容器に移し、上記条件下で２１４時間インキュベートした。この規模では、溶存酸素レベルを測定または維持しなかった。
最終段階発酵を、ｐＨ、粘度および全体を通したミガラスタットの生産について測定し、且つ、ミガラスタット濃度が２４００ｕｇ／ｍｌのレベルとなった時に採取した。
【国際調査報告】
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