(57)【要約】本発明は、組換えタンパク質の細胞発現を向上させるための、灌流細胞培養と外部膜系細胞保持システムとの新規使用を提供する。組換えタンパク質は、特にｒＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン切断ｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＩＸ又はｒＦＶＩＩ／ｒＦＶＩＩａ等の凝固タンパク質である。このようなシステムを高細胞密度で利用すると、該保持システム操作中に誘起される機械的力（例えばファイバーを通じたポンピングで誘起される細胞の循環）によってより均一な細胞培養が達成される。また、細胞成分や培地成分の一部が保持されるため細胞には最適な環境となる。本発明の方法を利用すると細胞当たりの生産性と体積当たりの生産性が向上する。本外部膜系細胞保持システムは使い捨てであり、使い捨てバイオリアクターに接続した場合、培地と産物を使い捨てバッグに保存しておけば灌流システム全体が使い捨てとなる。この使い捨て灌流バイオリアクターシステムは孤立（クローズ）システムとして稼働させることができ、洗浄、スチーム処理、ハードパイプ設備を必要としない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の細胞発現を増強させる方法であって、膜系外部細胞保持システムを灌流細胞培養と共に利用することを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞の細胞発現を増強させる方法は組換えタンパク質の製造に利用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現された組換えタンパク質は凝固タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現された凝固タンパク質は、組換え因子ＩＸ、組換えＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン切断組換え因子ＦＶＩＩＩ、組換えＶＩＩ及び組換え因子ＶＩＩａからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞及び哺乳動物細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記灌流細胞培養と共に利用する膜系外部細胞保持システムは、Ｂ−ドメイン切断組換え因子ＶＩＩＩを発現させることができ、且つＢ−ドメイン切断組換えＦＶＩＩＩタンパク質の産生を、膜ろ過システムを利用しない細胞保持システムで得られる場合と比較して少なくとも５０％増強させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記灌流細胞培養は使い捨てバイオリアクターにて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記膜系細胞保持システムは使い捨てである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞培養システムは、前記灌流システムを含むバイオリアクターと前記外部膜系細胞保持システムの両者が使い捨てという理由から使い捨てである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／９４０，４９３に基づき、その優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
組換えタンパク質は、バッチ式又は連続（灌流）式で行われる細胞培養プロセスにより製造されてきた。灌流式はバッチ式操作に比べ高い細胞密度を維持できるため、高い容量収率（体積当たりの日生産量）をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
灌流操作は、モノクローナル抗体や、凝固タンパク質、酵素、他の治療関連のタンパク質を含む血液因子等の組換え生物産物の生産に産業的に利用されている。灌流システムを利用する主な理由はバイオリアクターに細胞を保持し、バイオリアクターの容量当たりの生産量を大きく向上させることにある。幾つかのタイプの細胞保持装置が市販されており、実験室内や商業規模生産のために実際に備えられてきた。本出願人が知るところ、細胞密度の向上は文献に開示されているが、外部細胞保持膜を利用した灌流システムによる細胞当たりの生産性の向上は未だ報告されていない。
【０００４】
当該分野での２文献を次に挙げる。１）S. S. Ozturk and D. S. Kompala, Optimizationof High cell Density Perfusion Bioreactors（高細胞密度灌流バイオリアクターの最適化）, in Cell Culture Technologyfor Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Edited by Sadettin S. Ozturk andWei-Shou Hu, CRC Press 2005, Pages 387-416、及び2)W. M. Woodside, B.D. Bowen, and J. M. Piret, Mammalian Cell Retention Devicesfor Stirred Perfusion Bioreactors（攪拌灌流バイオリアクターのための哺乳動物細胞保持デバイス）, Cytotechnology, 1998, November; 28(1-3): 163-175。
【０００５】
上の第一の文献（Ozturkら、２００５年）では、高細胞密度灌流バイオリアクターの利点と、ケモスタットバイオリアクターとの対比におけるこの種のバイオリアクターの取り扱い方法について論じられている。灌流システムでは、栄養物の連続的流入と使用済み媒体の排出流が組合わされる一方、細胞は全体的に或いは部分的にバイオリアクターに保持される。灌流バイオリアクターの主な利点としては、タンパク質の高い生産率が挙げられる。灌流バイオリアクターに対して内部に関しても外部に関しても、多岐に亘る細胞保持方法が存在する。このようなシステムは異種細胞培養に有用であり、該文献に詳述されており、固定床、セラミックマトリックス固定手段、中空糸リアクター、マイクロカプセル化及びマクロポーラスマトリックス流動システムを含む。同種細胞培養のための細胞保持システムは哺乳動物細胞の培養に産業的に利用されることが多い。これは、用いられる浮遊培養物中の均一な環境により、スケールアップ、モニター及び制御が比較的簡単なためである。
【０００６】
哺乳動物細胞培養に利用される多数の細胞保持デバイスが論じられている。これらにはスピンフィルター（バイオリアクター内部）や、外部ろ過（交互接触フロー、細胞沈降（垂直沈降及び傾斜沈降）、遠心分離、超音波分離及びヒドロサイクロンが含まれる。
【０００７】
外部ろ過には、平板カートリッジ及び中空糸カートリッジの両者が使われている。このデバイスでは詰まりが問題となり得るが、詰まりによりにフローが許容限界を下回ったとき外部フィルターを交換することができる。これは通常５日〜７日毎に行われる。
【０００８】
上の第二の文献（Woodsideら、１９９８年、Cytology）では、攪拌灌流バイオリアクターのための哺乳動物細胞保持デバイスも論じられている。ウッドサイドの指摘によれば、細胞培養システム内の変動に伴い大型分子の治療関連タンパク質に不定な転写後修飾が起こり、このタンパク質の市場での規制承認を得るために一貫性のあるプロセス性能と製品品質を示すことが必要となりうるという理由で、灌流リアクターの設計と操作についての大きな問題は細胞保持デバイスの信頼性である。
【０００９】
中空糸カートリッジ及び平板カートリッジは交差フロータイプのフィルターである。使用時には、バイオリアクターで得られるサスペンジョンをポンプで外部カートリッジに移送し、膜を通過流通させることにより濃縮する。濃縮サスペンジョン流はリアクターにリサイクルされ、細胞を含まないパーミエートは排液流となる（Woodside、１６４〜１６６頁参照）。
【００１０】
上に記した文献は本発明の方法に関連すると考えられるが、それ以外にも発明者の注目を引く文献として次の３文献を挙げる。１）米国特許出願公開第２００９／０２６３８６６号（譲受人をNovo Nordisk, Inc.とする米国特許出願）、２）国際特許公開第ＷＯ２０１１／０１２７２７号（譲受人をBaxter Healthcare SA 及びBaxter International Inc.とする国際出願）、及び３）スウェーデンで開催されたFSACT 2001におけるWAVE Bio Techによるプレゼンテーション。
【００１１】
米国特許出願第’８６６号は、哺乳動物細胞による組換えＦＶＩＩの血清フリー且つ工業的スケールでの製造に関する。この出願は、バッチ式、供給バッチ式及び灌流を含む種々の細胞培養方法を概説している。培養容器内で使われる細胞保持デバイスが多数提案されている。培養容器には、外部沈澱ヘッド、内部沈澱ヘッド、連続遠心分離、内部又は外部スピンフィルター、外部フィルター又は中空糸カートリッジ、超音波細胞分離デバイス及び１本のパイプが含まれる（７頁、０１０６〜０１１３）。細胞系としてはＣＨＯを用いた。この発明の主たる適用目的は細胞保持システムとしてのマイクロキャリアーの使用にある。
【００１２】
国際特許公開第’７２５号は連続細胞培養における目的ポリペプチド又は目的ウイルスの製造方法に関する。この出願には「ケモスタット様」連続細胞培養システムが記載され、このシステムは灌流オープンシステムとケモスタットオープンシステムの両者の利点を併せ持つ。このハイブリッドシステムは哺乳動物細胞の培養に利用される。細胞保持システムとしてはマクロポーラスマイクロキャリアー（例えばセルロース系粒子）が言及されている。
【００１３】
この特殊な目的ポリペプチドはディスインテグリン様で、メタロペプチダーゼとトロンボスポンジン・タイプ１・モチーフ１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）とのタンパク質である。
【００１４】
WAVE Biotechのプレゼンテーションは使い捨てバイオリアクターにおける灌流細胞培養を開示しており、具体的には「新コンセプト−フローティングフィルター」に関する。このフローティング灌流フィルターは、「Wave Bioreactor（登録商標）」内の波動と連動する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２６３８６６号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ２０１１／０１２７２７号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】S. S. Ozturk and D. S. Kompala, Optimizationof High cell Density Perfusion Bioreactors, inCell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Edited bySadettin S. Ozturk and Wei-Shou Hu, CRC Press 2005, Pages 387-416
【非特許文献２】W. M. Woodside, B.D. Bowen, and J. M. Piret,Mammalian Cell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors,Cytotechnology, 1998, November; 28(1-3): 163-175
【非特許文献３】スウェーデンで開催されたFSACT 2001におけるWAVE Bio Techによるプレゼンテーション
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述の全ての文献においては、灌流を利用して細胞密度を上げ、もって容量生産性を向上させることを主眼としていた。灌流の利点は、製品のより良い品質と一貫性であるとも論じられていた。本発明の有用性は細胞当たりの生産性向上であり、これは外部膜系細胞保持システムと共に灌流細胞培養システムを利用稼働することにより達成された。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、哺乳動物細胞の細胞発現を増強させる方法であって、外部膜系細胞保持システムと共に灌流バイオリアクターを利用することを含む方法を提供する。哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞及びヒト細胞であることが好ましい。組換えタンパク質は、膜系細胞保持システムを利用する発現のための特に良い候補である。このシステムは灌流細胞培養物と共に利用して、組換え因子ＩＸ（ｒＦＩＸ）、組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）、Ｂ−ドメイン切断組換えＶＩＩＩ（ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ）、組換え因子ＦＶＩＩ及び組換え因子ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩ／ｒＦＶＩＩａ）からなる群から選択される凝固タンパク質を製造するために有用である。本方法は、使い捨てバイオリアクターを備える使い捨て灌流システムと使い捨て外部膜系細胞保持システムとを利用することにより最適化することができる。外部膜系細胞保持システムは中空糸からなることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｘ軸が日数、ｙ軸がＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ生成物の相対的（規格化）タイターを表すグラフ。
【図２】ｘ軸が日数、ｙ軸が比生産性（規格化）を表すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本膜システムはリファインテクノロジー社（Refine Technologies）（ニュージャージー州パインブルック）から入手した。各グラフにおいて中黒の四角は、アプリコン社（Applikon）（カリフォルニア州フォスターシティ）より入手した、従来の非膜系細胞保持システムであるBioSepで得られた結果を示す。各グラフにおいて中抜きの丸は、リファインテクノロジー社（ニュージャージー州パインブルック）より入手した本膜系細胞保持システムで得られた結果を示す。本バイオリアクターは、所望の組換えタンパク質であるＢ−ドメイン切断ｒＦＶＩＩＩを製造することができるＣＨＯ細胞系に対し同一条件下で稼働させた。
【００２１】
これらデータは本膜系保持システムを利用して２０１２年に得たもので、この性能を従来の非膜系細胞保持システムと比較した。図面に明らかなように、本膜系保持システムによりタイターと細胞当たりの比生産性が２倍となっている。これらバイオリアクターは同一の細胞と培地を用い、同一のｐＨ、温度、他条件にて稼働させた。
【００２２】
この細胞生産性（細胞当たり１日当たりの生産量）は、当該細胞に固有の性質であり、稼働方式により変化するとは予想されない。ここで、本発明は、細胞環境とバイオリアクター中の細胞の生理学的状態を直接制御することにより、細胞からのタンパク質発現に実質的影響を及ぼすことができる灌流細胞培養システムを提供する。本発明は、細胞のみならず細胞から誘導される培養物中の因子を保持する外部細胞保持膜と灌流システムとを共に利用することにより、細胞当たりの生産性、特に哺乳動物細胞当たりの生産性を向上させる。本発明はＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系及びヒト細胞系等の種々の哺乳動物細胞培養物、特にＣＨＯに適用可能であり、種々の組換えタンパク質の発現に適用可能である。このような組換えタンパク質としては、各種抗体や凝固タンパク質（例えば組換え因子ＩＸ（ｒＦＩＸ）、組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）、Ｂ−ドメイン切断組換えＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ）、組換え因子ＶＩＩ及び組換え因子ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩ／ｒＦＶＩＩａ））が挙げられる。本細胞保持膜は平坦な膜であってよく、好ましくは中空糸膜である。
【００２３】
細胞培養による組換えタンパク質製造のための膜系細胞保持システムの利用は、コーポレートパートナーとの２０１１年の検討により提案された。専門家の中には悲観的観測もあったが、他の（非膜）細胞保持システムに対してテストしたところ、５０％以上１００％（２倍）までという顕著な生産性改善が確認された。
【００２４】
好ましい一態様においては、バイオリアクターと細胞保持膜システムは両者とも使い捨て材料からなり、洗浄、スチーム処理、ハードパイプシステム不要のシングルユースを提供する。好ましい細胞保持膜はバイオリアクターの外部にあり、中空糸からなる。
【００２５】
バイオリアクターとして適切に利用することができる使い捨て容器は数多くの商業的材料から購入することができる。これらの例としては、ＧＥヘルスケア社(GE Healthcare)のWave（商品名）又はXcellerex（商品名）、サーモフィッシャー社(ThermoFisher)のHyclone SUB（商品名）、ザルトリウス社(Sartorius)のBiostatSTR（商品名）が挙げられる。
【００２６】
外部細胞保持カートリッジで使用する平板細胞膜及び中空糸膜は、ＧＥヘルスケア(GE Healthcare)（マサチューセッツ州ボストン）、スペクトラムラボ(Spectrum Labos)（カリフォルニア州ランチョドミンゲス）、リファインテクノロジー(Refine Technologies)（ニュージャージー州パインブルック）又はポール・コーポレーション(Pall Corporation)（ニューヨーク州ポートワシントン）から入手可能である。
【実施例】
【００２７】
灌流バイオリアクター２セットを同一条件（ｐＨ、温度、細胞密度、溶存酸素、体積流量、培地、細胞系等）で稼働させた。１セットは膜系灌流システム（Bioreactor run 3D53）で、もう１セットは非膜システム（Bioreactor run 3D51）であった。これらバイオリアクター中の細胞密度は同レベルに調節し、バイオリアクターの生産性はタイター（生成物濃度）を測定することにより毎日モニターした。細胞密度とバイオリアクターの生産性を元に、細胞の比生産性を算出した。
【００２８】
この膜システムはリファインテクノロジー(Refine Technologies)（ニュージャージー州パインブルック）から得た。また、従来型の非膜システムBIOSEPはアプリコン社(Applikon)（カリフォルニア州フォスターシティ）から得た。
【００２９】
図面から明らかなように、本膜系保持システムによりタイターと細胞の比生産性は２倍となった。図１及び図２における中黒の四角は従来の非膜系細胞保持システムであるBioSep（アプリコン社(Applikon)（カリフォルニア州フォスターシティ）より入手）で得られた結果を示す。各グラフにおいて中抜きの丸は、リファインテクノロジー社(Refine Technologies)（ニュージャージー州パインブルック）より入手した本膜系細胞保持システムで得られた結果を示す。
【００３０】
当業者であれば本明細書の開示をもとに種々の変形例を想起すると理解される。従って、上の開示及び例示はあくまで一例であり、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
2017506077.tif 000005