(57)【要約】本明細書において抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体及び眼科学におけるその使用を報告する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であって、該抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、該抗体。
【請求項２】
ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であって、該抗体は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、該抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４である、請求項１〜２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトＰＤＧＦ受容体へのヒトＰＤＧＦ−Ｂの結合を阻害することによって、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を遮断する、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体と場合により薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。
【請求項６】
抗ＡＮＧ２抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体から選択された追加の治療剤をさらに含む、請求項５記載の医薬製剤。
【請求項７】
医薬品としての使用のための請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
医薬品の製造における請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項９】
前記医薬品が、眼血管疾患の処置のための、好ましくは黄班変性症の処置のためのものである、請求項７及び８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品がＰＤＧＦ−ＢとＰＤＧＦ−Ｂ受容体との間の相互作用を阻害するためである、請求項７〜９のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体及びその使用法に関する。
【０００２】
背景
眼血管疾患、例えば加齢黄班変性症（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、それぞれ、異常な脈絡膜又は網膜の新血管新生に起因する。それらは工業国における視力低下の主因である。網膜は、神経細胞成分、グリア細胞成分、及び血管成分の詳細に明らかにされた層からなるので、血管増殖又は浮腫に見られる障害などの比較的小さな障害は、著しい視力機能の低下を引き起こし得る。網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性症もまた、細動脈狭窄及び血管萎縮症などの血管異常症を伴う。それらに３，５００人中１人もの個体が罹患し、それらは進行性の夜盲症、視野減少、視神経萎縮症、細動脈狭細、及び完全な失明に進行することが多い中心視野の減少によって特徴付けられる。
【０００３】
虚血性網膜症は、血流減少及び低酸素症をもたらす網膜血管の減少又は機能不全によって特徴付けられる。網膜は、新血管を成長させるためのシグナルを発生することによって低酸素症に応答するが、これらの新血管は通常脆弱で組織化されていない。視力に対する大半の脅威を作るのはこれらの異常な新血管の成長である。なぜならそれらは漏出し得るか、出血に至り得るか、又は瘢痕をもたらし得、これらは最終的には網膜剥離となる可能性があるからである。虚血性網膜症に対する現在の処置は、病的血管の成長を停止させることを探索しているが、その成長を駆り立てる基礎となる虚血には取り組まない。さらに、数百万人が罹患している虚血性網膜症である糖尿病性網膜症に対する標準的な処置は、新血管の成長を止め中心視野を保存する試みで、レーザを用いての網膜の一部の破壊を含む。血管増殖の主要な促進因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の機能を遮断するための戦略が使用されている。短期間で、抗ＶＥＧＦ療法は視力を改善させることができるが、基礎にある虚血に取り組まず、事実、有益な側副血管をはじめとする全ての血管増殖を抑制するのでこの容態を悪化させる可能性がある。また、虚血性脳、心臓、又は四肢に新血管の増殖が必要とされ得る高齢者及び／又は糖尿病患者において、これらの薬物が全身に曝されることには深刻な懸念がある。
【０００４】
典型的には、眼疾患では、硝子体内への適用を介してＦａｂ又はＦａｂ２のようなより小さな抗体断片が使用されることが多い。なぜなら、それらは血清中半減期が短く、全身毒性のリスクがより低いからである。しかしながら、このより小さな断片は典型的には、硝子体内半減期がより短く（例えば血清中へのより急速な拡散に因る）、典型的にはより頻繁に投与しなければならない。
【０００５】
１つの結合アーム内にドメインの置換／交換を有する多重特異的抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ−ＶＬ）が、国際公開公報第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191（これは本明細書に参照として組み入れられる）に詳述されている。それらは、第一抗原に対する軽鎖と、第二抗原に対する間違った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を明らかに低減させる（このようなドメインの交換を行なわないアプローチと比較して）。しかしながら、その調製は完全に副産物を除外できない。主な副産物は、ベンス・ジョーンズ型相互作用に基づく。Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191；補足の図Ｓ１Ｉも参照されたい。
【０００６】
国際公開公報第２０１４／０７２８７６号では、血小板由来増殖因子Ｂ特異的抗体、並びにその組成物及び使用が報告されている。ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの増殖因子に関する多価抗体材料及び方法は、国際公開公報第２００５／０８７８１２号に報告されている。Vassbotn, F.S., et al. （Biochim. Biophys. Acta. Mol. Cell Res. 1054（1990) 246-249）は、ＰＤＧＦ Ｂ鎖に対するモノクローナル抗体が、Ｃ３Ｈ線維芽細胞においてＰＤＧＦにより誘発されるＤＮＡ合成を抑制し、かつＰＤＧＦのその受容体への結合を妨げることを報告している。
【０００７】
要約
本発明は、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体及びその使用法を提供する。具体的な実施態様では、該抗体はヒト化抗体である。
【０００８】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する単離された抗体であり、ここで該抗体は、マウス抗体のヒト化変異体であり、ここでのマウス抗体は配列番号０１の重鎖可変ドメインと配列番号０６の軽鎖可変ドメインとを含む。
【０００９】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒト化抗体はさらに、重鎖可変ドメイン内の２７位にチロシンアミノ酸残基、４０位にアルギニンアミノ酸残基、４３位にヒスチジンアミノ酸残基、７３位にトリプトファンアミノ酸残基を含む（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【００１０】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒト化抗体はさらに、重鎖可変ドメイン内の７８位にアラニンアミノ酸残基を含む（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【００１１】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒト化抗体はさらに、重鎖可変ドメイン内の４３位にヒスチジンアミノ酸残基、７１位にアラニンアミノ酸残基、７８位にアラニンアミノ酸残基を含む（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【００１２】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒト化抗体はさらに、軽鎖可変ドメイン内の４３位にアミノ酸残基プロリン、６８位にアミノ酸残基アルギニンを含む（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【００１３】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒト化抗体はさらに、軽鎖可変ドメイン内の４３位にアミノ酸残基プロリンを含む（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【００１４】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００１５】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体と同じヒトＰＤＧＦ−Ｂのエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００１７】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、
ａ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｃ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｄ）（ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｅ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｆ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む。
【００１８】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、
ａ）（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｖｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｂ）（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｃ）（ｖｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｖｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｄ）（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｖｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【００１９】
１つの実施態様では、前記抗体は、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
【００２０】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、
ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００２１】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２２】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２３】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２４】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２５】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２６】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２７】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２８】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００３０】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００３１】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００３２】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００３３】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号１０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３４】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号１５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３５】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号２５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３７】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号３０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３８】
本明細書において報告されているような１つの態様は、配列番号３５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８及び配列番号５２の群から選択された軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体である。
【００３９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢとヒトＰＤＧＦ−ＡＢに特異的に結合するが、ヒトＰＤＧＦ−ＡＡには結合しない抗体である。
【００４０】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４１】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４２】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４３】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４４】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４５】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＡＡに特異的に結合する抗体である。
【００４７】
１つの実施態様では、前記抗体は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００４８】
１つの実施態様では、前記抗体はさらに、（ａ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４９】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４である。
【００５０】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はκ軽鎖を有するヒトサブクラスＩｇＧ１である。
【００５１】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００５２】
１つの実施態様では、前記抗体は二重特異的抗体である。
【００５３】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はヒトＰＤＧＦ−Ｂには特異的に結合するが、ヒトＰＤＧＦ−Ｃには結合しない。
【００５４】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体は、ヒト、ラット、マウス、及びカニクイザルＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【００５５】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はＰＤＧＦ−Ｂのその受容体への結合を阻害することによって、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を抑制する。
【００５６】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体は細胞遊走を抑制することによってヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を抑制する。
【００５７】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体はＰＤＧＦ−Ｂ受容体リン酸化を阻害することによって、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を抑制する。
【００５８】
全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体は細胞増殖を阻害することによって、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を抑制する。
【００５９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されているような抗体をコードしている（単離された）核酸である。
【００６０】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されているような核酸を含む宿主細胞である。
【００６１】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されているような宿主細胞を培養して抗体を生成し、宿主細胞又は培養培地から該抗体を回収する工程を含む、本明細書において報告されているような抗体の生成法である。
【００６２】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されているような抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤である。
【００６３】
１つの実施態様では、医薬製剤はさらに、追加の治療剤を含む。１つの実施態様では、追加の治療剤は抗ＡＮＧ２抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体である。
【００６４】
本明細書において報告されているような１つの態様は、医薬品として使用するための本明細書において報告されているような抗体である。
【００６５】
本明細書において報告されているような１つの態様は、眼血管疾患の処置に使用するための、好ましくは黄班変性症の処置に使用するための本明細書に報告されているような抗体である。
【００６６】
ＰＤＧＦ−Ｂとその受容体との間の相互作用を抑制するために使用するための本明細書において報告されているような抗体。
【００６７】
細胞遊走を抑制するために使用するための本明細書において報告されているような抗体。
【００６８】
増殖を抑制するために使用するための本明細書において報告されているような抗体。
【００６９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、医薬品の製造における本明細書において報告されているような抗体の使用である。
【００７０】
１つの実施態様では、前記医薬品は、眼血管疾患の処置のための、好ましくは黄班変性症の処置のためのものである。
【００７１】
１つの実施態様では、前記医薬品は、ＰＤＧＦ−Ｂとその受容体との間の相互作用を抑制するためのものである。
【００７２】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されていりような抗体の有効量を個体に投与する工程を含む、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症を有する個体を処置する方法である。
【００７３】
本明細書において報告されているような１つの態様は、本明細書において報告されているような抗体の有効量を個体に投与して、ＰＤＧＦ−Ｂとその受容体との間の相互作用を抑制する工程を含む、個体におけるＰＤＧＦ−Ｂとその受容体との間の相互作用を抑制する方法である。
【００７４】
発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における目的での「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されているような、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共通フレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク若しくはヒト共通フレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでいても、又は、アミノ酸配列の変化を含有していてもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒト共通フレームワーク配列の配列と同一である。
【００７５】
「親和性」は、分子（例えば抗体）の１つの結合部位とその結合対（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。特記しない限り、本明細書において使用する「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその対のＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（ｋｄ）によって示され得る。親和性は、本明細書に記載のものをはじめとする、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施態様を以下に記載する。
【００７６】
「親和性の成熟した」抗体は、以下のような改変を有さない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有する抗体を指し、このような改変により、抗原に対する抗体の親和性は改善される。
【００７７】
「抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体」及び「ＰＤＧＦ−Ｂに結合する抗体」という用語は、十分な親和性でＰＤＧＦ−Ｂに結合することのできる抗体を指し、よって該抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂへの標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用である。１つの実施態様では、関連性のない非ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質に対する抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の結合度は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴によって測定したところ、ＰＤＧＦ−Ｂに対する該抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する抗体は、１μＭ以下、１００nM以下、１０nM以下、１nM以下、又は０．１nM以下の解離定数（ＫＤ）を有する（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ）。特定の実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、様々な種に由来するＰＤＧＦ−Ｂ間で保存されているＰＤＧＦ−Ｂのエピトープに結合する。
【００７８】
本明細書における「抗体」という用語は最も広義の意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおける抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００７９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ；鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
基準抗体としての「同じエピトープに結合する抗体」は、基準抗体と少なくとも同じアミノ酸残基との相互作用を有する抗体を指す。これらの相互作用は、例えば、荷電アミノ酸残基間のイオン性相互作用、又は、疎水性アミノ酸残基間の疎水性相互作用である。
【００８１】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定の起源又は種に由来しているが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分は異なる起源又は種に由来している、抗体を指す。
【００８２】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。５つの主なクラスの抗体が存在し（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）。クラスの異なる免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、及びμとそれぞれ呼ばれる。
【００８３】
「イムノコンジュゲート」という用語は、抗体と非抗体部分との間の共有結合によるコンジュゲートを示す。このような非抗体部分は、検出可能な標識、エフェクター分子、又は細胞傷害性薬剤であってもよい。
【００８４】
本明細書において使用する「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を抑制若しくは妨げる、及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤）；増殖抑制剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば低分子毒素又は酵素的に活性な細菌、真菌、植物、又は動物起源の毒素、例えばその断片及び／又は変異体；並びに、以下に開示されている様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
「エフェクター機能」は、抗体のクラスによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因するそうした生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑへの結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体への結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えばＢ細胞受容体）；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００８６】
薬剤、例えば医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な用量及び必要とされる期間を指す。
【００８７】
本明細書の「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有している免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。１つの実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで延びている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシル−リジンジペプチド（Ｇｌｙ４４６Ｌｙｓ４４７）は存在していても存在していなくてもよい。本明細書において特記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付け体系に従う。
【００８８】
「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般的に、４つのＦＲドメインからなる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）内で以下の順序で出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８９】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「完全抗体」という用語は本明細書において同義として使用され、天然の抗体の構造と実質的に類似した構造を有しているか、又は本明細書において定義されているようなＦｃ領域を含有している重鎖を有している、抗体を指す。
【００９０】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養液」という用語は同義語として使用され、外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、初回に形質転換された細胞、及び継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでいても良い。最初に形質転換された細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫も本明細書において含まれる。
【００９１】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する、抗体のアミノ酸配列に相当する、アミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００９２】
「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通して存在しているアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の亜群からである。一般的に、配列の亜群は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3におけるような亜群である。１つの実施態様では、ＶＬでは、亜群は、上記のKabat et al. におけるような亜群κＩである。１つの実施態様では、ＶＨでは、亜群は、上記のKabat et al. におけるような亜群ＩＩＩである。
【００９３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基とヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のそれに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のそれに相当する。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００９４】
本明細書において使用する「超可変領域」すなわち「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変的で（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に定められたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触部」）を含有している、抗体可変ドメインの各々の領域を指す。一般的には、抗体は６つのＨＶＲを含み；３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。
【００９５】
本明細書におけるＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）；
（ｃ）２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ（ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む）
を含む。
【００９６】
特記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書において、上記のKabat et al.に従って番号付けされる。
【００９７】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子（群）にコンジュゲートした抗体である。
【００９８】
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は被験者はヒトである。
【００９９】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から隔離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度となるまで精製される。抗体純度の評価法の総説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【０１００】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から隔離された核酸分子を指す。単離された核酸は、普通に核酸分子を含有しているが、該核酸分子は染色体外に存在しているか又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している、細胞に含有されている核酸分子を含む。
【０１０１】
「抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をコードしている単離された核酸」は、重鎖と軽鎖（又はその断片）をコードしている１つ以上の核酸分子（１つのベクター又は別々のベクター内のこのような核酸分子（群）、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在しているこのような核酸分子（群）を含む）を指す。
【０１０２】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち、該集団を含む個々の抗体は同一である及び／又は同じエピトープに結合し、ただし、例えば天然に起こる突然変異を含有しているか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、例えばあり得る変異抗体は除外され、このような変異体は一般的に少量存在する。様々な決定基（エピトープ）に対して指向される様々な抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体の生成が必要とされると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製され得、このような方法及び他の例示的なモノクローナル抗体の作製法が本明細書に記載されている。
【０１０３】
「裸抗体」は、異種部分（又は細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。裸抗体が、医薬製剤中に存在していてもよい。
【０１０４】
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２本の同一な軽鎖と２つの同一な重鎖とから構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各々の重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各々の軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の中の１つに割り当てられ得る。
【０１０５】
「添付文書」という用語は、適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌、及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告に関する情報を含有している、治療用製品の市販のパッケージに通例含まれる説明書を指すために使用される。
【０１０６】
基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一率（％）」は、配列をアラインさせ、必要であれば、最大の配列同一率を達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的な置換を全く考慮せずに、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基の比率として定義される。アミノ酸配列同一率を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の技能範囲内である様々な方法で、例えば公共的に利用できるコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較する配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一率値％は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して算出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc.によって作成され、ソースコードがユーザー文書と共にワシントンＤ.Ｃ.２０５５９のアメリカ合衆国著作権局に提出され、そこでアメリカ合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Genentech, Inc.（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から公共的に入手可能であるか、又は、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【０１０７】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列の比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一率％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、特定のアミノ酸配列同一率％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして表現されてもよい）は、以下のように計算される：
Ｘ／Ｙの分率×１００
【０１０８】
ここで、Ｘは、プログラムによるＡとＢのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一率％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一率％とは等しくないことが理解されるだろう。具体的に特記しない限り、本明細書において使用する全てのアミノ酸配列同一率値％は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して直前の段落で記載されているように得られる。
【０１０９】
「医薬製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が効果的であることが可能となるような形態であり、かつ、該製剤が投与されるであろう被験者に対して受け入れられない程に毒性である追加の成分を全く含有していない、調製物を指す。
【０１１０】
「薬学的に許容される担体」は、被験者に対して無毒性である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１１】
本明細書において使用する「ＰＤＧＦ−Ｂ」という用語は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂを指す。該用語は、「完全長」のプロセシングされていないＰＤＧＦ−Ｂ、並びに細胞内でのプロセシングから得られたあらゆる形態のＰＤＧＦ−Ｂを包含する。該用語はまた、天然に存在するＰＤＧＦ−Ｂの変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。ヒトＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸配列を配列番号１１０に示す。
【０１１２】
本明細書において使用する「処置」（及びその文法上の変化形、例えば「処置する」又は「処置している」）は、処置される個体の自然経過を改変させる試みでの臨床的介入を指し、予防のために又は臨床上の病態の経過中のいずれかに行なわれ得る。処置の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の寛解、疾患の全ての直接的又は間接的な病的結果の消失、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の軽減又は緩和、及び緩解又は改善された予後が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体を使用して、疾患の発生を遅延させるか又は疾患の進行を緩徐化する。
【０１１３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは一般的に、類似した構造を有し、各々のドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007)、91頁を参照されたい）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、該抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし得る（例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照）。
【０１１４】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、核酸分子が連結されている別の核酸を増殖させることのできる該核酸分子を指す。該用語は、自己複製性の核酸構造としてのベクター、並びに、それが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれた該ベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【０１１５】
ＩＩ．組成物及び方法
本発明のモノクローナル抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂの受容体への結合及び増殖活性に関与する、ＰＤＧＦ−Ｂ分子上の決定基の部位に特異的に結合する。モノクローナルヒト化抗体は、ＰＤＧＦ−Ｃには結合しない。本明細書において報告されているような具体的な抗体は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＢには結合しない。本明細書において報告されているような他の具体的な抗体は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢ並びにＰＤＧＦ−ＡＡに結合する。
【０１１６】
Ａ．例示的な抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体
本明細書において様々な新規な抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。
【０１１７】
第一の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号０１のＶＨ及び配列番号０６のＶＬを有する、新規なマウス抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。この抗体は以下においてｍｕｍＡｂと命名される。この抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスのＰＤＧＦ−Ｂに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂとその受容体との間の相互作用を阻害する。
【０１１８】
前記抗体は、以下の表に列挙されているような以下の特性を有する。
【０１１９】
【表１】
2017534645.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2017534645.tif 000003
【０１２１】
【表３】
2017534645.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2017534645.tif 000005
【０１２３】
【表５】
2017534645.tif 000006
【０１２４】
【表６】
2017534645.tif 000007
【０１２５】
【表７】
2017534645.tif 000008
【０１２６】
【表８】
2017534645.tif 000009
【０１２７】
【表９】
2017534645.tif 000010
【０１２８】
抗体の保存安定性を以下の表に示す（基準表面での有効濃度）。
【０１２９】
【表１０】
2017534645.tif 000011
【０１３０】
抗体の熱安定性を、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することによって評価した（以下の表を参照）。
【０１３１】
【表１１】
2017534645.tif 000012
【０１３２】
マウスｍｕｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号０１及び配列番号０６）に基づいて、対応するヒト化抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を作製した。ＶＨのヒト化変異体は、ヒトＪ配列生殖系列ＩＧＨＪ５−０１と組み合わせたヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿１＿６９、ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿４＿５９及びＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿３＿２３に基づく。
【０１３３】
復帰突然変異を、ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿１＿６９変異体のフレームワーク領域１の２７位（Ｇ２７Ｙ）及び／又はフレームワーク領域２の４０位（Ａ４０Ｒ）及び／又は４３位（Ｑ４３Ｈ）及び／又はフレームワーク領域３の７３位（Ｅ７３Ｔ）に導入した。
【０１３４】
１つの復帰突然変異を、ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿４＿５９のフレームワーク領域３の７８位（Ｆ７８Ａ）に導入した。復帰突然変異をＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿３＿２３のフレームワーク領域２の４３位（Ｋ４３Ｈ）、並びにフレームワーク領域３の７１位（Ｒ７１Ａ）及び７８位（Ｌ７８Ａ）に導入した。
【０１３５】
ＶＬのヒト化変異体は、ヒトＪ配列生殖系列ＩＧＫＪ２−０１と組み合わせたヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿２０、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿４＿１及びＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿２７に基づく。
【０１３６】
復帰突然変異を、１つの変異体について、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿２０のフレームワーク領域２の４３位（Ａ４３Ｐ）及びフレームワーク領域３の６８位（Ｇ６８Ｒ）に導入した。１つの復帰突然変異を、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿２７のフレームワーク領域３の４３位（Ｖ４３Ｐ）に導入した。
【０１３７】
この抗体は、単一特異的抗体としての抗体００４４、及び追加のＡＮＧ２結合特異性を有する二重特異的ＣｒｏｓｓＭａｂとしての抗体０１４６として示される。
【０１３８】
他の抗体は、ヒトＩｇ遺伝子座トランスジェニックウサギから得られたヒト抗体である。該抗体は、以下の表に列挙されているような結合特性を有する。
【０１３９】
【表１２】
2017534645.tif 000013
【０１４０】
【表１３】
2017534645.tif 000014
【０１４１】
【表１４】
2017534645.tif 000015
【０１４２】
１つの実施態様では、ヒト化抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ヒト、ラット、マウス、及びカニクイザルのＰＤＧＦ−Ｂに結合する。
【０１４３】
【表１５】
2017534645.tif 000016
【０１４４】
【表１６】
2017534645.tif 000017
【０１４５】
多様な活性アッセイでは、前記抗体は、以下の表に提示されるデータから示され得るような生物学的活性を示す。
【０１４６】
【表１７】
2017534645.tif 000018
【０１４７】
【表１８】
2017534645.tif 000019
【０１４８】
様々な抗体の速度論的結合特性を、表面プラズモン共鳴技術を使用して決定した（以下の表を参照）。
【０１４９】
【表１９】
2017534645.tif 000020
【０１５０】
【表２０】
2017534645.tif 000021
【０１５１】
【表２１】
2017534645.tif 000022
【０１５２】
様々な抗体の保存安定性を以下の表に示す（基準表面での有効濃度）。
【０１５３】
【表２２】
2017534645.tif 000023
【０１５４】
抗体の熱安定性を、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定することによって評価した（以下の表を参照）。
【０１５５】
【表２３】
2017534645.tif 000024
【０１５６】
抗体０１４４は、ＰＤＧＦ−Ｂ結合特異性として抗体００８５のＶＨドメインとＶＬドメインとを含む、二重特異的抗ＡＮＧ２／ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０１５７】
抗体０１１７は、ＰＤＧＦ−Ｂ結合特異性として抗体００８５のＶＨドメインとＶＬドメインとを含む、二重特異的抗ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。
【０１５８】
速度論的結合値の決定のために、実施例３２に報告されているようなアッセイを使用した。
【０１５９】
【表２４】
2017534645.tif 000025
【０１６０】
【表２５】
2017534645.tif 000026
【０１６１】
【表２６】
2017534645.tif 000027
【０１６２】
全ての二重特異的抗体が、両方のその抗原に同時に結合する特性を有することがＳＰＲ分析によって示された。
【０１６３】
二重特異的抗体は、細胞に基づいたアッセイで結合活性及び生物学的活性を示す。
【０１６４】
【表２７】
2017534645.tif 000028
【０１６５】
【表２８】
2017534645.tif 000029
【０１６６】
ＡＮＧ２特異的ｐＴｉｅ２−ＥＬＩＳＡでは、抗体０１４４は、国際公開公報第２０１４／０９４６５号に報告されている抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体と比べて６倍活性が高い。
【０１６７】
ＶＥＧＦ特異的レポーターアッセイでは、抗体０１１７は、国際公開公報第２０１４／０９４６５号に報告されている抗ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ抗体と類似した活性を有する。
【０１６８】
抗体００８５は、配列番号９２〜１００の配列と共に記載されている（結合部位、ＨＶＲ、ＶＨ、ＶＬ）。抗体００８５の二重特異的形式は、配列番号１３１〜１３４、１４７〜１５０、及び１６３〜１６６の配列に記載されている。これらの全ての配列は、単独で及び本発明の組合せ態様で構成される。
【０１６９】
抗体００８６は、配列番号１０１〜１０９の配列と共に記載されている（結合部位、ＨＶＲ、ＶＨ、ＶＬ）。抗体００８６の二重特異的形式は、配列番号１３５〜１３８、１５１〜１５４、及び１６７〜１６７の配列に記載されている。これらの全ての配列は、単独で及び本発明の組合せ態様で構成される。
【０１７０】
抗体０１４４は、配列番号１４７〜１５０の配列と共に記載されている（ＣｒｏｓｓＭａｂ形式、２本の重鎖、２本の軽鎖）。
【０１７１】
抗体０１１７は、配列番号１７１〜１７４の配列と共に記載されている（ＣｒｏｓｓＭａｂ形式、２本の重鎖、２本の軽鎖）。
【０１７２】
抗体０１４４及び０１４５を、様々なｐＨ値で２週間インキュベートし、その後、それぞれＰＤＧＦ−ＢＢ及びＡＮＧ２に対するその結合を決定した。
【０１７３】
【表２９】
2017534645.tif 000030
【０１７４】
【表３０】
2017534645.tif 000031
【０１７５】
本明細書において報告されているような１つの態様は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒト化抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。１つの実施態様では、該抗体はさらに、（ｄ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒト化抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。１つの実施態様では、該抗体はさらに、（ｄ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７７】
本明細書において報告されているような１つの態様は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。１つの実施態様では、該抗体はさらに、（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１７８】
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。
【０１７９】
１つの好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。また１つの好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号９７のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。また１つの好ましい実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は二重特異的抗体である。
【０１８０】
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施態様では、該抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、該抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、該抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１８１】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施態様では、該抗体は、（ａ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１８２】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９６から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１８３】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１００から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１８４】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一率を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一率を有するＶＨ配列は、基準配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しているが、該配列を含んでいる抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに対する結合能を保持している。特定の実施態様では、配列番号９２における合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわちＦＲ内）で起こる。場合により抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号９２のＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾も含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。
【０１８５】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一率を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一率を有するＶＬ配列は、基準配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しているが、その配列を含む抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに対する結合能を保持している。特定の実施態様では、配列番号９７における合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわちＦＲ内）で起こる。場合により、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号９７のＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾も含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。
【０１８６】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供され、ここで該抗体は、上記に提供された実施態様のいずれかにおけるようなＶＨと、上記に提供された実施態様のいずれかにおけるようなＶＬとを含む。１つの実施態様では、該抗体は、それぞれ配列番号９２及び配列番号９７のＶＨ配列及びＶＬ配列（そうした配列の翻訳後修飾も含む）を含む。
【０１８７】
本明細書において報告されているような１つの態様は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。１つの実施態様では、該抗体はさらに、（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１８８】
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。
【０１８９】
１つの好ましい実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。また１つの好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号１０１のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む。また１つの好ましい実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は二重特異的抗体である。
【０１９０】
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施態様では、該抗体は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、該抗体は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、該抗体は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施態様では、該抗体は、（ａ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１９２】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１０９から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体を提供する。
【０１９４】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一率を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一率を有するＶＨ配列は、基準配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しているが、その配列を含んでいる抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに対する結合能を保持している。特定の実施態様では、配列番号１０１における合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわちＦＲ内）で起こる。場合により、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号１０１のＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾も含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。
【０１９５】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一率を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一率を有するＶＬ配列は、基準配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しているが、その配列を含む抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに対する結合能を保持している。特定の実施態様では、配列番号１０６における合計で１〜１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわちＦＲ内）で起こる。場合により、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、配列番号１０６のＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾も含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。
【０１９６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む抗体であり、ここでａ）第一の重鎖は、配列番号１４７のアミノ酸配列を有し、第二の重鎖は配列番号１４８のアミノ酸配列を有し、第一の軽鎖は配列番号１４９のアミノ酸配列を有し、第二の軽鎖は配列番号１５０のアミノ酸配列を有するか、又はｂ）該抗体は、項目ａ）のアミノ酸配列（Ｆｃ領域内での突然変異である翻訳後修飾を含む）を含む。
【０１９７】
１つの好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような二重特異的抗体は、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３４Ａの突然変異（番号付けはＫａｂａｔのインデックスによる）を有する。
【０１９８】
別の態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供され、ここで該抗体は、上記に提供された実施態様のいずれかにおけるようなＶＨと、上記に提供された実施態様のいずれかにおけるようなＶＬとを含む。１つの実施態様では、該抗体は、それぞれ配列番号１０１及び配列番号１０６のＶＨ配列及びＶＬ配列（そうした配列の翻訳後修飾も含む）を含む。
【０１９９】
本発明のさらなる態様では、上記の実施態様のいずれかに記載の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体はモノクローナル抗体である。
【０２００】
１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ディアボディ、又はＦ（ａｂ'）２断片である。
【０２０１】
別の実施態様では、該抗体は、完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書に定義されているような他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
【０２０２】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、エフェクターサイレントな抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、エフェクターサイレントな抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体であり、ヒトＦｃＲｎには結合しない。本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体であり、両方の重鎖においてＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３４Ａの突然変異を有する（番号付けはＫａｂａｔのインデックスによる）。
【０２０３】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は二重特異的抗体である。
【０２０４】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いによって置換されている）
を含む二価の二重特異的抗体であり、ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２０５】
ａ）の下の抗体は、ｂ）の下で報告されているような改変を含有せず、ａ）の下の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２０６】
ｂ）の下の抗体では、軽鎖内では、軽鎖可変ドメインＶＬは該抗体の重鎖可変ドメインＶＨによって置換され、重鎖内では、重鎖可変ドメインＶＨは該抗体の軽鎖可変ドメインによって置換されている。
【０２０７】
１つの実施態様では、
ｉ）ａ）の下の第一の軽鎖の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸（番号付けはＫａｂａｔによる）は正に荷電したアミン酸によって置換され、ａ）の下の第一の重鎖の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）は、負に荷電したアミノ酸によって置換されている、
又は、
ｉｉ）ｂ）の下の第二の軽鎖の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸（番号付けはＫａｂａｔによる）は正に荷電したアミン酸によって置換され、ｂ）の下の第二の重鎖の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）は、負に荷電したアミノ酸によって置換されている。
【０２０８】
１つの好ましい実施態様では、
ｉ）ａ）の下の第一の軽鎖の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（番号付けはＫａｂａｔによる）（１つの好ましい実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の下の第一の重鎖の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、あるいは
ｉｉ）ｂ）の下の第二の軽鎖の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（番号付けはＫａｂａｔによる）（１つの好ましい実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、ｂ）の下の第二の重鎖の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている。
【０２０９】
１つの実施態様では、第二の重鎖の定常ドメインＣＬにおける１２４位及び１２３位のアミノ酸は、Ｋによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２１０】
１つの好ましい実施態様では、第二の軽鎖の定常ドメインＣＨ１における１４７位及び２１３位のアミノ酸は、Ｅによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２１１】
１つの実施態様では、第一の軽鎖の定常ドメインＣＬにおける１２４位及び１２３位のアミノ酸はＫによって置換され、第一の重鎖の定常ドメインＣＨ１における１４７位及び２１３位のアミノ酸はＥによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２１２】
１つの実施態様では、第二の重鎖の定常ドメインＣＬにおける１２４位及び１２３位のアミノ酸はＫによって置換され、第二の軽鎖の定常ドメインＣＨ１における１４７位及び２１３位のアミノ酸はＥによって置換され、第一の軽鎖の可変ドメインＶＬにおける３８位のアミノ酸はＫによって置換され、第一の重鎖の可変ドメインＶＨにおける３９位のアミノ酸はＥによって置換され、第二の重鎖の可変ドメインＶＬにおける３８位のアミノ酸はＫによって置換され、第二の軽鎖の可変ドメインＶＨにおける３９位のアミノ酸はＥによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２１３】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いによって置換され、第二の軽鎖及び第二の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている）
を含む、二価の二重特異的抗体であり、ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２１４】
ａ）の下の抗体は、ｂ）の下で報告されているような改変を含有せず、ａ）の下の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２１５】
ｂ）の下の抗体では、軽鎖内では、軽鎖可変ドメインＶＬは該抗体の重鎖可変ドメインＶＨによって置換され、軽鎖定常ドメインＣＬは該抗体の重鎖定常ドメインＣＨ１によって置換され、そして、重鎖内では、重鎖可変ドメインＶＨは該抗体の軽鎖可変ドメインＶＬによって置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１は該抗体の軽鎖定常ドメインＣＬによって置換されている。
【０２１６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置換されている）
を含む、二価の二重特異的抗体であり、ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２１７】
ａ）の下の抗体は、ｂ）の下で報告されているような改変を含有せず、ａ）の下の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２１８】
ｂ）の下の抗体では、軽鎖内では、軽鎖定常ドメインＣＬは該抗体の重鎖定常ドメインＣＨ１によって置換され、重鎖内では、重鎖定常ドメインＣＨ１は該抗体の軽鎖定常ドメインＣＬによって置換されている。
【０２１９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、かつ２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長の抗体、及び
ｂ）１から４つのさらに他の抗原（すなわち、第二及び／又は第三及び／又は第四及び／又は第五の抗原、好ましくは１つのさらに他の抗原、すなわち第二の抗原に特異的に結合する）に特異的に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つの一本鎖Ｆａｂ断片
を含む、多重特異的抗体であり、
ここで、ｂ）の下の前記の一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端でペプチド性リンカーを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合し、
ここで第一の抗原又はさらに他の抗原の中の１つはヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２２０】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する１つ又は２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２１】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する１つ又は２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の重鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２２】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する１つ又は２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の軽鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２３】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の各々の重鎖又は軽鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２４】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の各々の重鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２５】
１つの実施態様では、第二の抗原に結合する２つの同一な一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の各々の軽鎖のＣ末端でペプチド性リンカーを介して前記の完全長抗体に融合している。
【０２２６】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、かつ２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長の抗体、
ｂ）ｂａ）抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
ｂｂ）抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体の定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第一のポリペプチド（ここで、前記の第一のポリペプチドは、そのＶＨドメインのＮ末端で、前記の完全長抗体の２本の重鎖の片方のＣ末端にペプチド性リンカーを介して融合している）、
ｃ）ｃａ）抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第二のポリペプチド（ここで、前記の第二のポリペプチドは、ＶＬドメインのＮ末端で、前記の完全長抗体の２本の重鎖の他方のＣ末端にペプチド性リンカーを介して融合している）
を含む、三価の二重特異的抗体であり、
ここで、第一のポリペプチドの抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第二のポリペプチドの抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は第二の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２２７】
１つの実施態様では、ｂ）の下のポリペプチドの抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びｃ）の下のポリペプチドの抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド橋を介して連結され安定化されている：
ｉ）重鎖可変ドメイン４４位と軽鎖可変ドメイン１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位と軽鎖可変ドメイン４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位と軽鎖可変ドメイン１００位（番号付けは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２２８】
安定化のために非天然のジスルフィド橋を導入する技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。１つの実施態様では、ｂ）及びｃ）の下でのポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、４４位の重鎖可変ドメインと１００位の軽鎖可変ドメインとの間である。１つの実施態様では、ｂ）及びｃ）の下でのポリペプチドの可変ドメイン間の任意選択のジスルフィド結合は、１０５位の重鎖可変ドメインと４３位の軽鎖可変ドメインとの間である。（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。１つの実施態様では、一本鎖Ｆａｂ断片の可変ドメインＶＨとＶＬとの間に前記の任意選択のジスルフィドによる安定化を含まない三価の二重特異的な抗体が好ましい。
【０２２９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第二の（改変された）軽鎖及び第二の（改変された）重鎖（ここで、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている）、
を含む、三重特異的又は四重特異的な抗体であり、
ｃ）ここで、１つ又は２つのさらに他の抗原（すなわち第三及び／又は第四の抗原）に特異的に結合する１から４つの抗原結合性ペプチドは、ペプチド性リンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合し、
ここで、第一の抗原若しくは第二の抗原又はさらに他の抗原の中の１つはヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２３０】
ａ）の下の抗体は、ｂ）の下で報告されているような改変を含有せず、ａ）の下の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２３１】
１つの実施態様では、三重特異的又は四重特異的抗体は、ｃ）の下で、１つ又は２つのさらに他の抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合性ペプチドを含む。
【０２３２】
１つの実施態様では、抗原結合性ペプチドは、ｓｃＦｖ断片及びｓｃＦａｂ断片の群から選択される。
【０２３３】
１つの実施態様では、抗原結合性ペプチドはｓｃＦｖ断片である。
【０２３４】
１つの実施態様では、抗原結合性ペプチドはｓｃＦａｂ断片である。
【０２３５】
１つの実施態様では、抗原結合性ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。
【０２３６】
１つの実施態様では、三重特異的又は四重特異的抗体は、ｃ）の下で、１つのさらに他の抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合性ペプチドを含む。
【０２３７】
１つの実施態様では、三重特異的又は四重特異的抗体は、ｃ）の下で、第三の抗原に特異的に結合する２つの同一な抗原結合性ペプチドを含む。１つの好ましい実施態様では、このような２つの同一な抗原結合性ペプチドは、両方共、同じペプチド性リンカーを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。１つの好ましい実施態様では、２つの同一な抗原結合性ペプチドは、ｓｃＦｖ断片又はｓｃＦａｂ断片のいずれかである。
【０２３８】
１つの実施態様では、三重特異的又は四重特異的抗体は、ｃ）の下で、第三及び第四の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合性ペプチドを含む。１つの実施態様では、前記の２つの抗原結合性ペプチドは、両方共、同じペプチド性コネクターを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。１つの好ましい実施態様では、前記の２つの抗原結合性ペプチドは、ｓｃＦｖ断片又はｓｃＦａｂ断片のいずれかである。
【０２３９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する（及び２つのＦａｂ断片を含む）、抗体の２本の軽鎖及び２本の重鎖、
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する、抗体の２つのさらなるＦａｂ断片（ここで、前記のさらなるＦａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している）
を含む二重特異的な四価の抗体であり、
ここで、Ｆａｂ断片において以下の改変が行なわれている
ｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、又はｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている、あるいは
ｉｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、
そして、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されているか、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている、あるいは
ｉｉｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されているか、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、
そして、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている、あるいは
ｉｖ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている、あるいは
ｖ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２４０】
１つの実施態様では、前記の追加のＦａｂ断片は両方共、ペプチド性リンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はａ）の重鎖のＮ末端のいずれかに融合している。
【０２４１】
１つの実施態様では、前記の追加のＦａｂ断片は両方共、ペプチド性リンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端に融合している。
【０２４２】
１つの実施態様では、前記の追加のＦａｂ断片は両方共、ペプチド性コネクターを介してａ）の重鎖のＮ末端に融合している。
【０２４３】
１つの実施態様では、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、又はｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されている、及び／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている。
【０２４４】
１つの実施態様では、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、及び／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている。
【０２４５】
１つの実施態様では、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている。
【０２４６】
１つの実施態様では、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、及び／又は
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている。
【０２４７】
１つの実施態様では、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ｂ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている。
【０２４８】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合しかつ第一のＶＨ−ＣＨ１ドメイン対を含む、第一の抗体の（改変された）重鎖（ここで、該重鎖のＣ末端に、前記の第一の抗体の第二のＶＨ−ＣＨ１ドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合している）、
ｂ）ａ）の前記の第一の抗体の２本の軽鎖、
ｃ）第二の抗原に特異的に結合しかつ第一のＶＨ−ＣＬドメイン対を含む、第二の抗体の（改変された）重鎖（ここで、該重鎖のＣ末端に、前記の第二の抗体の第二のＶＨ−ＣＬドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合している）、及び
ｄ）ｃ）の前記の第二の抗体の２本の（改変された）軽鎖（各々がＣＬ−ＣＨ１ドメイン対を含む）
を含む、二重特異的で四価の抗体であり、
ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２４９】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する第一の完全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する第二の完全長抗体の重鎖及び軽鎖（ここで、重鎖のＮ末端は、ペプチド性リンカーを介して軽鎖のＣ末端に接続されている）
を含む、二重特異的な抗体であり、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２５０】
ａ）の下の抗体は、ｂ）の下で報告されているような改変を含有せず、重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２５１】
本明細書において報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、かつ２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長の抗体、及び
ｂ）ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含んでいる第二の抗原に特異的に結合するＦｖ断片（ここで、両方のドメインが互いにジスルフィド橋を介して接続されている）
を含む二重特異的抗体であり、
ここで、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれか一方のみが、ペプチドリンカーを介して、第一の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合し、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである。
【０２５２】
二重特異的では、ａ）の下の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０２５３】
１つの実施態様では、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第一の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合していない。
【０２５４】
本明細書において報告されているような全ての態様では、第一の軽鎖はＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第一の重鎖はＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【０２５５】
全ての態様の１つの実施態様では、本明細書において報告されているような抗体は、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異的抗体であり、ここで該抗体は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂ及び第二の非ヒトＰＤＧＦ−Ｂ抗原に特異的に結合する。
【０２５６】
ヘテロ二量体化を支援するためのＣＨ３改変のためのいくつかのアプローチが、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７/１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１/９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載され、これらは参照により本明細書に含まれる。典型的には、当技術分野において公知であるアプローチでは、第一の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第二の重鎖のＣＨ３ドメインは両方共、一方の工学操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖が、同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化できないように、相補的な様式で工学操作されている（例えば、ＣＨ３の工学操作された第一の重鎖は、別のＣＨ３の工学操作された第一の重鎖とはもはやホモ二量体化できない；ＣＨ３の工学操作された第二の重鎖は、別のＣＨ３の工学操作された第二の重鎖ともはやホモ二量体化できない）。それにより、一方の工学操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的な様式で工学操作されているＣＨ３ドメインを含む別の重鎖と強制的にヘテロ二量体化する。本発明のこの実施態様では、第一の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第二の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸の置換によって相補的な様式で工学操作され、よって第一の重鎖及び第二の重鎖は強制的にヘテロ二量体化し、一方、第一の重鎖及び第二の重鎖はもはやホモ二量体化できない（例えば立体的な理由のために）。
【０２５７】
上記に引用され含まれている、当技術分野において公知である重鎖ヘテロ二量体化を支援するための様々なアプローチは、第一の抗原に特異的に結合する第一の抗体に由来する「交差していないＦａｂ領域」及び第二の抗原に特異的に結合する第二の抗体に由来する「交差しているＦａｂ領域」を、本発明のために上記された特定のアミノ酸置換と組み合わせて含む、本発明に記載の多重特異的抗体に使用される様々な代替選択肢として考えられる。
【０２５８】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体のＣＨ３ドメインを、例えば国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681にいくつかの例と共に詳述されている「ノブ・イントゥ・ホール（突起を空隙に）（knob-into-holes）」技術によって改変させることができる。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変させて、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有している両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２本の重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は「突起」であり得、一方、他方は「空隙」である。ジスルフィド橋の導入はさらにヘテロ二量体を安定化させ（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を増加させる。
【０２５９】
１つの好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、「突起鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異を、そして「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド橋も、例えばＹ３４９Ｃ突然変異を「突起鎖」のＣＨ３ドメインに、「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって使用することができる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。したがって、別の好ましい実施態様では、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメイン内の追加のＹ３４９Ｃ突然変異と、他方のＣＨ３ドメイン内の追加のＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド橋を形成している）（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２６０】
しかしまた、欧州特許第１８７０４５９Ａ１号によって記載されているような他のノブ・イン・ホール技術も代替的に又は追加して使用することができる。１つの実施態様では、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、「突起鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異を、「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２６１】
１つの実施態様では、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、「突起鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異、並びに「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異、並びにさらに「突起鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異、並びに「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２６２】
１つの実施態様では、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異、並びに２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は、本明細書において報告されているような多重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異、並びに２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異、並びにさらに「突起鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異、並びに「空隙鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２６３】
「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別の、ヘテロ二量体化を強制する多重特異的抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変させるための他の技術も当技術分野において公知である。これらの技術、特に、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号及び国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載されている技術は、本明細書において報告されているような多重特異的抗体と組み合わせて「ノブ・イントゥ・ホール技術」に対する代替選択肢として本明細書において考えられている。
【０２６４】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。このアプローチは、第一の重鎖と第二の重鎖の両方の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸の位置への逆の荷電を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。
【０２６５】
したがって、この実施態様は、本明細書において報告されているような多重特異的抗体に関し、ここで、該抗体の３次構造において、第一の重鎖のＣＨ３ドメインと第二の重鎖のＣＨ３ドメインは、それぞれの抗体のＣＨ３ドメイン間に位置する界面を形成し、ここで、第一の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第二の重鎖のＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は各々、該抗体の３次構造内の該界面内に位置する一連のアミノ酸を含み、ここで、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面内に位置する一連のアミノ酸に由来する第一のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸によって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面内に位置する一連のアミノ酸に由来する第二のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸によって置換されている。この実施態様に記載された多重特異的抗体は本明細書において、「ＣＨ３（＋／−）の工学操作された多重特異的抗体」とも称される（「＋／−」という略称は、それぞれのＣＨ３ドメインに導入された逆に荷電したアミノ酸を意味する）。
【０２６６】
本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（＋／−）の工学操作された多重特異的抗体の１つの実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。
【０２６７】
本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（＋／−）の工学操作された多重特異的抗体の１つの実施態様では、正に荷電したアミノ酸はＫ及びＲから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。
【０２６８】
本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（＋／−）の工学操作された多重特異的抗体の１つの実施態様では、正に荷電したアミノ酸はＫであり、負に荷電したアミノ酸はＥである。
【０２６９】
本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（＋／−）の工学操作された多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４０９位のアミノ酸ＲはＤによって置換され、位のアミノ酸ＫはＥによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３９９位のアミノ酸ＤはＫによって置換され、３５７位のアミノ酸ＥはＫによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７０】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＫによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３５１位のアミノ酸ＬはＤによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような前記の多重特異的抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＫによって置換され、３５１位のアミノ酸ＬはＫによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３５１位のアミノ酸ＬはＤによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７１】
本明細書において報告されているような前記の多重特異的抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＫによって置換され、３５１位のアミノ酸ＬはＫによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３５１位のアミノ酸ＬはＤによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。さらに、以下の置換の少なくとも１つが、他方の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれている：３４９位のアミノ酸ＹはＥによって置換され、３４９位のアミノ酸ＹはＤによって置換され、３６８位のアミノ酸ＬはＥによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。１つの実施態様では、３６８位のアミノ酸ＬはＥによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７２】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３５１位のアミノ酸ＬはＹによって置換され、４０７位のアミノ酸ＹはＡによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＡによって置換され、４０９位のアミノ酸ＫはＦによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。別の実施態様では、前記の置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４１１位（元来Ｔ）、３９９位（元来Ｄ）、４００位（元来Ｓ）、４０５位（元来Ｆ）、３９０位（元来Ｎ）、及び３９２位（元来Ｋ）における少なくとも１つのアミノ酸が置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。好ましい置換は以下である：
−４１１位のアミノ酸Ｔを、Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、及びＷから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、
−３９９位のアミノ酸Ｄを、Ｒ、Ｗ、Ｙ、及びＫから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、
−４００位のアミノ酸Ｓを、Ｅ、Ｄ、Ｒ、及びＫから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、
−４０５位のアミノ酸Ｆを、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、及びＷから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、
−３９０位のアミノ酸Ｎを、Ｒ、Ｋ、及びＤから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、並びに
−３９２位のアミノ酸Ｋを、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ、及びＥから選択されたアミノ酸によって置換（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７３】
本明細書において報告されているような前記の多重特異的抗体（国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に従って工学操作）の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３５１位のアミノ酸ＬはＹによって置換され、４０７位のアミノ酸ＹはＡによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＶによって置換され、４０９位のアミノ酸ＫはＦによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４０７位のアミノ酸ＹはＡによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＡによって置換され、４０９位のアミノ酸ＫはＦによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。最後の前記の実施態様では、前記の他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３９２位のアミノ酸ＫはＥによって置換され、４１１位のアミノ酸ＴはＥによって置換され、３９９位のアミノ酸ＤはＲによって置換され、４００位のアミノ酸ＳはＲによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７４】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の１つの実施態様では、両方の重鎖のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸の改変は、３６８位及び／又は４０９位に導入されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７５】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。国際公開公報第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸の改変に関する。本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（ＫｉＨ）の工学操作された多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＷによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４０７位のアミノ酸ＹはＡによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような前記のＣＨ３（ＫｉＨ）の工学操作された多重特異的抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３６６位のアミノ酸ＴはＹによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４０７位のアミノ酸ＹはＴによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７６】
ＩｇＧ２アイソタイプである、本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。
【０２７７】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３９２位のアミノ酸Ｋ又はＮは負に荷電したアミノ酸（好ましい実施態様ではＥ又はＤによって、１つの好ましい実施態様ではＤによって）によって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては３９９位のアミノ酸Ｄ、３５６位のアミノ酸Ｅ若しくはＤ、又は３５７位のアミノ酸Ｅは正に荷電したアミノ酸（１つの好ましい実施態様ではＫ又はＲによって、１つの好ましい実施態様ではＫによって、１つの好ましい実施態様では３９９位又は３５６位のアミノ酸はＫによって置換されている）によって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。１つのさらなる実施態様では、前記の置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４０９位のアミノ酸Ｋ又はＲは、負に荷電したアミノ酸（１つの好ましい実施態様ではＥ又はＤによって、１つの好ましい実施態様ではＤによって）によって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。１つのまたさらなる実施態様では、前記の置換に加えて又はその代わりに、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては４３９位のアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位のアミノ酸Ｋは、互いに独立して、負に荷電したアミノ酸（１つの好ましい実施態様ではＥ又はＤによって、１つの好ましい実施態様ではＤによって）によって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７８】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。本明細書において報告されているような該多重特異的抗体の１つの実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては２５３位のアミノ酸ＫはＥによって置換され、２８２位のアミノ酸ＤはＫによって置換され、３２２位のアミノ酸ＫはＤによって置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいては２３９位のアミノ酸ＤはＫによって置換され、２４０位のアミノ酸ＥはＫによって置換され、２９２位のアミノ酸ＫはＤによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２７９】
本明細書において報告されているような多重特異的抗体の１つの実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されたアプローチを使用して、多重特異的抗体の第一の重鎖と第二の重鎖のヘテロ二量体化を支援する。
【０２８０】
本明細書において報告されているような全ての態様及び実施態様の中の１つの実施態様では、多重特異的抗体は、二重特異的抗体又は三重特異的抗体である。本発明の１つの好ましい実施態様では、多重特異的抗体は二重特異的抗体である。
【０２８１】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、前記抗体は二価又は三価抗体である。１つの実施態様では、該抗体は二価抗体である。
【０２８２】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、多重特異的抗体はＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１であるか、又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ１であることを特徴とする。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がヒトサブクラスＩｇＧ２であることを特徴とする。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がヒトサブクラスＩｇＧ３であることを特徴とする。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がヒトサブクラスＩｇＧ４であるか、又は追加のＳ２２８Ｐの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ４であることを特徴とする。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４であることを特徴とする。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ１であることを特徴とする（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ１であることを特徴とする（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ４であることを特徴とする（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。本明細書において報告されているような全ての態様の１つのさらなる実施態様では、多重特異的抗体は、該多重特異的抗体がＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ４であることを特徴とする（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０２８３】
本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、本明細書に明記されたＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のＣ末端のグリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む。本明細書において報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、本明細書に明記されたＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のＣ末端のグリシン残基（Ｇ４４６、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む。
【０２８４】
さらなる態様では、上記の実施態様のいずれかに記載の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、以下の第１〜５章に記載のような特色のいずれかを単独で又は組み合わせて取り込み得る。
【０２８５】
１．抗体の親和性
特定の実施態様では、本明細書に提供された抗体は、１μM以下、１００nM以下、１０nM以下、１nM以下、又は０．１nM以下の解離定数（ＫＤ）を有する（例えば１０−８M以下、例えば１０−８M〜１０−１０M、例えば１０−９M〜１０−１０M）。
【０２８６】
ＫＤ値を決定するための方法は、以下の実施例に概略が示されている。
【０２８７】
ビアコア（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用する場合、ＫＤ値は以下のように代替的に測定され得る：ビアコア（登録商標）−２０００又はビアコア（登録商標）−３０００（ビアコア社、ピスカタウェイ、ＮＪ州）を使用したアッセイを、２５℃で、約１０のレスポンスユニット（ＲＵ）で抗原の固定されたＣＭ５チップを用いて行なう。１つの実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ビアコア社）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて業者の説明書に従って活性化する。抗原を１０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて５μg/ml（約０．２μM）となるまで希釈し、その後、５μl/分の流速で注入して、約１０レスポンスユニット（ＲＵ）の結合タンパク質に到達した。抗原の注入後、１Mのエタノールアミンを注入して、未反応の基を遮断する。速度論の測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中のＦａｂの２倍連続希釈液（０．７８nMから５００nM）を、２５℃で約２５μl/分の流速で注入した。結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を、結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に当てはめることによって、単純一対一ラングミュア結合モデル（ビアコア（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａ比として計算される（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照）。結合速度値が上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６M−１s−１を上回る場合、結合速度は、分光光度計、例えばストップフローを備えた分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）で測定されるような、漸増濃度の抗原の存在下におけるｐＨ７．２のＰＢＳ中の２０nMの抗原に対する抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmのバンドパス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。
【０２８８】
２．抗体断片
特定の実施態様では、本明細書において提供された抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに下記した他の断片が挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照されたい；また、国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みかつインビボでの延長された半減期を有する、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ'）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０２８９】
ディアボディは、二価又は二重特異的であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開公報第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはもまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med.9 (2003) 129-134に記載されている。
【０２９０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は、軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む、抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。
【０２９１】
抗体断片は、本明細書に記載のような、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、並びに、組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製され得る。
【０２９２】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書において提供された抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体とは変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０２９３】
特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化されているが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持している。一般的には、ヒト化抗体は１つ以上の可変ドメインを含み、この中のＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）は非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来している。ヒト化抗体は場合によりまた、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むだろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基を、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基の由来する抗体）に由来する対応する残基で置換することにより、例えば、抗体の特異性又は親和性は回復又は改善される。
【０２９４】
ヒト化抗体及びそれらの作製法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説され、さらに、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (「リサーフェシング」を記載); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods36 (2005) 43-60 (「ＦＲシャッフリング」を記載)；並びにOsbourn, J. et al., Methods36 (2005) 61-68、及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載）に記載されている。
【０２９５】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定の亜群のヒト抗体の共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞の突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及び、ＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 and Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９６】
４．多重特異的抗体
特定の実施態様では、本明細書において提供された抗体は、多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体である。多重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一方はＰＤＧＦ−Ｂに対するものであり、他方はいずれかの他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異的抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異的抗体はまた、ＰＤＧＦ−Ｂを発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用され得る。二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
【０２９７】
多重特異的抗体の作製技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983)537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659参照）、及び「ノブ・イン・ホール」工学操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。多重特異的抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子の作製のための静電的ステアリング効果の工学操作（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan, M. et al., Science229 (1985) 81-83を参照）；二重特異的抗体を生成するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）；二重特異的抗体断片の作製のための「ディアボディ」技術の使用（例えば、Holliger, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照）；及び、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374参照）；及び例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991)60-69に記載のような三重特異的抗体の調製によって作製され得る。
【０２９８】
「タコ抗体」をはじめとする、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する工学操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば米国特許第２００６／００２５５７６号参照）。
【０２９９】
本明細書における抗体又は断片はまた、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Ｆａｂ（Dual Acting Fab）」すなわち「ＤＡＦ」、並びに、別の異なる抗原（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号参照）も含む。
【０３００】
本明細書における抗体又は断片はまた、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、国際公開公報第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開公報第２０１０／１４５７９３号に記載の多重特異的抗体も含む。
【０３０１】
５．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供された抗体のアミノ酸配列変異体も考えられる。例えば、該抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、該抗体をコードしているヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、該抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換のあらゆる組合せを行なって最終構築物に到達することができる。ただし、最終構築物は、所望の特徴、例えば抗原への結合を有する。
【０３０２】
ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸の置換を有する抗体変異体が提供される。置換による突然変異誘発のための関心対象の部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、表中に「好ましい置換」という表題の下で示されている。「例示的な置換」という表題の下で表１に、より実質的な変化が提供され、アミノ酸の側鎖のクラスに関して以下にさらに記載されている。アミノ酸の置換を関心対象の抗体に導入し得、産物を所望の活性、例えば保持された／改善された抗原への結合、低減された免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングし得る。
【０３０３】
【表３１】
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【０３０４】
アミノ酸は、側鎖の共通の特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）側鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０３０５】
非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのメンバーを別のクラスのものと交換することを含む。
【０３０６】
１種類の置換変異体は、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域の残基を置換することを含む。一般的に、さらなる研究のために選択された得られた変異体（群）は、親抗体と比較して特定の生物学的活性の改変（例えば改善）（例えば高まった親和性、低減された免疫原性）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換変異体は、例えば本明細書に記載の技術のようなファージディスプレイに基づいた親和性成熟技術を使用して慣用的に作製され得る、親和性の成熟した抗体である。端的に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【０３０７】
例えば、抗体の親和性を改善させるために、ＨＶＲに改変（例えば置換）を行ない得る。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞突然変異過程の最中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196参照）、及び／又は抗原と接触する残基において行なわれ得、結果として得られた変異体ＶＨ又はＶＬを結合親和性について試験する。第二ライブラリーを構築しこれから再度選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、多様性を、様々な方法（例えばエラーしがちなＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟について選択された可変的な遺伝子に導入する。次いで、第二のライブラリーを作成する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、ＨＶＲに向けられたアプローチを含み、ここではいくつかのＨＶＲ残基（例えば一度に４〜６個の残基）を無作為化する。抗原との結合に関与するＨＶＲ残基を、例えば、アラニン走査突然変異誘発又はモデリングを使用して具体的に同定し得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が特に標的化されることが多い。
【０３０８】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は１つ以上のＨＶＲ内で、このような改変が実質的に、抗原に対する抗体の結合能を低減させない限り、起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供されているような保存的置換）がＨＶＲ内で行なわれ得る。このような改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外であり得る。上記に提供されたＶＨ及びＶＬの変異配列の特定の実施態様では、各々のＨＶＲは改変されていないか、又は１つ以下、２つ以下、若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有している。
【０３０９】
突然変異誘発のために標的化され得る抗体の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって記載されているような「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の中の１つの残基又は基（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）によって置換し、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸の位置に導入してもよい。代わりに又は追加して、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基を、置換のための候補として標的化又は排除し得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有しているかどうかを決定し得る。
【０３１０】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有しているポリペプチドまでの長さにおよぶアミノ末端及び／又はカルボキシル末端への融合、並びに、１つ又は複数のアミノ酸残基の配列間への挿入を含む。末端への挿入例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体のＮ末端又はＣ末端への酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又は抗体の血清中半減期を延長させるポリペプチドの融合が挙げられる。
【０３１１】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体を改変させて、該抗体がグリコシル化される程度を増加又は低減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成されるか又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって慣用的に成し遂げられ得る。
【０３１２】
前記抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した糖鎖を改変させ得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般的に付着している分岐した、二分岐のオリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32参照）。オリゴ糖としては、様々な糖鎖、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに、二分岐オリゴ糖構造の「基部」にあるＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体内のオリゴ糖の改変は、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行なわれ得る。
【０３１３】
１つの実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）付着しているフコースを欠失した糖鎖構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、このような抗体内のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているような、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるような、Ａｓｎ２９７に付着している全ての糖構造（例えば複合構造、ハイブリッド構造、及び高マンノース構造）の合計と比較した、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵによる番号付け）；しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の僅かな配列の変異に因り、２９７位より約±３アミノ酸だけ上流又は下流に、すなわち２９４位から３００位の間に位置し得る。このようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善させ得る。例えば、米国特許第２００３／０１５７１０８号；米国特許第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠失」抗体変異体に関連した刊行物の例としては、米国特許第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９；国際公開公報第２００１／２９２４６号；米国特許第２００３／０１１５６１４号；米国特許第２００２／０１６４３２８号；米国特許第２００４／００９３６２１号；米国特許第２００４／０１３２１４０号；米国特許第２００４／０１１０７０４号；米国特許第２００４／０１１０２８２号；米国特許第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；国際公開公報第２００３／０８４５７０号；国際公開公報第２００５／０３５５８６号；国際公開公報第２００５／０３５７７８号；国際公開公報第２００５／０５３７４２号；国際公開公報第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することのできる細胞株の例としては、タンパク質のフコシル化の欠失したＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号参照）が挙げられる。
【０３１４】
二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供され、例えば、ここでは抗体のＦｃ領域に付着した二分岐のオリゴ糖はＧｌｃＮＡｃによって二分されている。このような抗体変異体は、低減されたフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４号；及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０３１５】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸の改変を、本明細書において提供された抗体のＦｃ領域に導入し得、これによりＦｃ領域変異体を作製し得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸の位置にアミノ酸の改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０３１６】
特定の実施態様では、本発明は、いくつかのエフェクター機能を有しているか全てのエフェクター機能を有しているわけではない抗体変異体を考え、これにより、該抗体変異体は、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）は不必要であるか又は有害であるような適用のための望ましい候補となる。インビトロ及び／又はインビボでの細胞傷害アッセイを行なって、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行なって、該抗体がＦｃγＲ結合を欠失しているが（したがってＡＤＣＣ活性を欠失しているようである）、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃを発現する（ＲＩＩＩのみ、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する）。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４頁の表３に要約されている。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非制限的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502参照）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射能アッセイ法を使用し得る（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc.、マウンテンビュー、ＣＡ州）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、マディソン、ＷＩ州）を参照）。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに又は追加して、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルにおいて評価し得る。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた行なって、該抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠失していることを確認し得る（例えば国際公開公報第２００６／０２９８７９号並びに国際公開公報第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡ参照）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ない得る（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743参照）。ＦｃＲｎへの結合及びインビボでのクリアランス／半減期の決定もまた、当技術分野において公知の方法を使用して行なうことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18（2006: 1759-1769）を参照）。
【０３１７】
エフェクター機能の低減された抗体は、Ｆｃ領域の２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９残基の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体としては、２６５及び２９７残基のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体をはじめとする、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０３１８】
ＦｃＲに対する改善された結合又は消失した結合を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604参照）。
【０３１９】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善させる１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位に置換を有するＦｃ領域を含む（ＥＵによる残基の番号付け）。
【０３２０】
いくつかの実施態様では、例えば米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載のような、改変された（すなわち改善されるか又は消失するかのいずれかの）Ｃ１ｑへの結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす、Ｆｃ領域内の改変を行なう。
【０３２１】
半減期が延長され、母体ＩｇＧから胎仔への移行に関与する（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、米国特許第２００５／００１４９３４号に記載されている。そうした抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善させる１つ以上の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基（２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４）の１つ以上における置換を有する変異体、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有する変異体（米国特許第７，３７１，８２６号）が挙げられる。
【０３２２】
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R.及びWinter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；並びに国際公開公報第９４／２９３５１号を参照されたい。
【０３２３】
ｄ）システインの工学操作された抗体変異体
特定の実施態様では、システインの工学操作された抗体、例えば「チオモノクローナル抗体」を作製することが望ましくあり得、ここでは抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の近づきやすい部位に存在する。こうした残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基はこれにより抗体の近づきやすい部位に位置し、これを使用して抗体を他の部分に、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせて、本明細書においてさらに記載されているようなイムノコンジュゲートを作製し得る。特定の実施態様では、以下の残基のいずれか１つ以上をシステインで置換し得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵによる番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵによる番号付け）。システインの工学操作された抗体は、例えば米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製され得る。
【０３２４】
ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体を、当技術分野において公知であり容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変させ得る。抗体の誘導体化に適した部分としては水溶性ポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性に因り製造において利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であり得、分岐していても分岐していなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得、１つを超えるポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善しようとする抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体を規定の条件下で療法に使用するであろうかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮に基づいて決定され得る。
【０３２５】
別の実施態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱される可能性がある抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。１つの実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長であり得、これには、普通の細胞は害さないが、抗体−非タンパク質性部分の近くにある細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱させる波長が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２６】
Ｂ．組換え法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような、組換え法及び組成物を使用して産生され得る。１つの実施態様では、本明細書に記載の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をコードしている単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列をコードし得る（例えば抗体の軽鎖及び／又は重鎖）。さらなる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのこのような実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクターを含む（例えばこれで形質転換されている）。１つの実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の作製法が提供され、ここで該方法は、上記に提供されたような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養し、場合により宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から該抗体を回収する工程を含む。
【０３２７】
抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の組換え産生のために、例えば上記のような抗体をコードしている核酸を単離し、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。このような核酸は、慣用的な手順を使用して容易に単離及びシークエンスすることができる（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。
【０３２８】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、抗体を細菌において産生し得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載した、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい）。
【０３２９】
発現後、抗体を、細菌細胞ペーストから可溶性画分中へと単離し得、さらに精製することができる。
【０３３０】
原核細胞に加えて、真核微生物、例えば線維状真菌又は酵母が、抗体をコードするベクターのために適したクローニング用又は発現用の宿主であり、これには、そのグリコシル化経路が「ヒト化」され、その結果、部分的な又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が産生される真菌株及び酵母株が挙げられる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０３３１】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクション用の、昆虫細胞と共に使用し得る、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０３３２】
植物細胞培養液はまた、宿主として使用することもできる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術）を記載）を参照）。
【０３３３】
脊椎動物細胞もまた宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中での増殖に適合した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えばGraham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載のような２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばMather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；並びに骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体の生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０３３４】
Ｃ．アッセイ
本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、当技術分野において公知である様々なアッセイによってその物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けられ得る。例示的なアッセイを実施例において報告する。
【０３３５】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、１つ以上の細胞傷害性薬剤、例えば化学療法剤若しくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、又は動物起源の毒素、又はその断片）、又は放射性同位体にコンジュゲートさせた、本明細書において報告されているような、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０３３６】
１つの実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（antibody-drug conjugate）（ＡＤＣ）であり、ここでは抗体は、メイタンシノイド（例えば米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号）；オーリスタチン、例えばモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号、及び米国特許第７，４９８，２９８号参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号及び米国特許第５，８７７，２９６号；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343；及び米国特許第６，６３０，５７９号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテシン；並びにＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない１つ以上の薬物にコンジュゲートしている。
【０３３７】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ抑制物質、クルシン、クロチン、サボウンソウ抑制物質、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類を含むがこれらに限定されない酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした本明細書に記載のような抗体を含む。
【０３３８】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性元素にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成した本明細書に記載のような抗体を含む。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートの生成のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法のためのスピン標識（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）、例えば再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄を含んでいてもよい。
【０３３９】
抗体と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートは、様々な二官能基を有するタンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science238 (1987) 1098-1104に記載のように調製され得る。１４Ｃの標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲートのための例示的なキレート剤である。国際公開公報第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の遊離を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用し得る。
【０３４０】
本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、（例えばPierce Biotechnology, Inc.（ロックフォード、ＩＬ州、米国）から）市販されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない、架橋試薬を用いて調製されたこのようなコンジュゲートを考えるがこれらに限定されない。
【０３４１】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のいずれかが、生物学的試料中のＰＤＧＦ−Ｂの存在を検出するのに有用である。本明細書において使用する「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。
【０３４２】
１つの実施態様では、診断法又は検出法に使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＰＤＧＦ−Ｂの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、ＰＤＧＦ−Ｂに対する抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の結合を許容する条件下で、生物学的試料を、本明細書に記載のような抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体と接触させ、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体とＰＤＧＦ−Ｂとの間に複合体が形成されるかどうかを検出する工程を含む。このような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を使用して、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を用いての治療に適格な被験者を選択し、例えばここではＰＤＧＦ−Ｂは患者の選択のためのバイオマーカーである。
【０３４３】
特定の実施態様では、標識された抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。標識としては、直接的に検出される標識又は部分（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を通して間接的に検出される部分、例えば酵素又はリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート剤又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ、及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を使用する酵素と結合して、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化させるヘテロ環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３４４】
Ｆ．医薬製剤
本明細書に記載のような抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は液剤の剤形で調製される。薬学的に許容される担体は一般的に、使用される用量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、これには、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体としてはさらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性で中性で活性のヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０をはじめとする、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許第２００５／０２６０１８６号及び米国特許第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと配合する。
【０３４５】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されたものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０３４６】
本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応症にとって必要とされるような１つを超える活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有する。例えば、抗ＡＮＧ２抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体をさらに提供することが望ましくあり得る。このような活性成分は、意図する目的にとって有効な量で組み合わせられて適切に存在する。
【０３４７】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システムに（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルションに封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.（編）(1980)に記載されている。
【０３４８】
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含有している固体で疎水性のポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形状である。
【０３４９】
インビボでの投与のために使用される製剤は一般的に無菌である。無菌性は、例えば滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に成し遂げられ得る。
【０３５０】
Ｇ．治療法及び組成物
本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のいずれかを治療法に使用し得る。
【０３５１】
１つの態様では、医薬品としての使用のための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。さらなる態様では、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症の処置に使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。特定の実施態様では、処置法に使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を個体に投与する工程を含む、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症を有する個体を処置する方法において使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。１つのこのような実施態様では、該方法はさらに、例えば下記したような少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与する工程を含む。さらなる実施態様では、本発明は、血管新生を抑制するために使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、血管新生を抑制するために有効量の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を個体に投与する工程を含む、個体における血管新生を抑制する方法において使用するための抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を提供する。上記のいずれかの実施態様に記載の「個体」は好ましくはヒトである。
【０３５２】
さらなる態様では、本発明は、医薬品の製造又は調製における抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の使用を提供する。１つの実施態様では、医薬品は、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症の処置用である。さらなる実施態様では、医薬品は、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症を有する個体に有効量の医薬品を投与する工程を含む、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症を処置する方法に使用するためである。１つのこのような実施態様では、該方法はさらに、例えば下記したような少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与する工程を含む。さらなる実施態様では、医薬品は血管新生を抑制するためである。さらなる実施態様では、医薬品は、血管新生を抑制するために有効量の医薬品を個体に投与する工程を含む、個体における血管新生を抑制する方法において使用するためである。上記のいずれかの実施態様に記載の「個体」はヒトであり得る。
【０３５３】
さらなる態様では、本発明は、眼血管疾患、好ましくは黄班変性症の処置法を提供する。１つの実施態様では、該方法は、このような眼血管疾患、好ましくは黄班変性症を有する個体に、有効量の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を投与する工程を含む。１つのこのような実施態様では、該方法はさらに、以下に記載したような少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与する工程を含む。上記のいずれかの実施態様に記載の「個体」はヒトであり得る。
【０３５４】
さらなる態様では、本発明は、個体における血管新生を抑制するための方法を提供する。１つの実施態様では、該方法は、血管新生を抑制するために有効量の抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を個体に投与する工程を含む。１つの実施態様では、「個体」はヒトである。
【０３５５】
さらなる態様では、本発明は、例えば上記のいずれかの治療法に使用するための、本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。１つの実施態様では、医薬製剤は、本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書において提供される抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のいずれか及び例えば以下に記載されているような少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【０３５６】
本発明の抗体は、療法において単独で又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＡＮＧ２抗体である。
【０３５７】
上記のこのような併用療法は、併用投与（ここでは２つ以上の治療剤が同じ製剤又は別々の製剤に含まれる）及び別々の投与（この場合には、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤又は治療剤群の投与前、同時に、及び／又は投与後に行なわれ得る）を包含する。１つの実施態様では、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約１か月間以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行なう。
【０３５８】
本発明の抗体（及び追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、局所的処置を所望する場合には病巣内投与をはじめとする、任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投与は、一部には投与が瞬時であるか慢性であるかに依存して、任意の適切な経路によって、例えば注射、例えば静脈内又は皮下注射によってであり得る。様々な時点におよぶ１回又は複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与計画が本明細書において考えられる。
【０３５９】
本発明の抗体は、良質な医療に沿った様式で製剤化、用量化、及び投与されるだろう。この脈絡で考慮される因子としては、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳動物、個体の患者の臨床容態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与計画、及び医療従事者には公知である他の因子が挙げられる。抗体は、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される必要はないが、場合によりそれと共に製剤化されてもよい。有効量のこのような他の薬剤は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記に考察される他の因子に依存する。これらは一般的に本明細書に記載のものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の用量の１〜９９％で、又は適切であると経験的に／臨床的に決定された任意の用量及び経路によって使用される。
【０３６０】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で又は１つ以上の他の追加の治療剤と併用して使用する場合）は、処置しようとする疾患の種類、抗体の種類、疾患の重度及び経緯、抗体が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに担当医師の裁量に依存するだろう。該抗体は患者に一度に又は一連の処置におよび適切に投与される。疾患の種類及び重度に依存して、約１μg/kgから１５mg/kg（例えば０．５mg/kgから１０mg/kg）の抗体が、例えば１回以上の別々の投与によるものであれ、又は連続注入によるものであれ、患者への投与のための初回候補用量であり得る。１回の典型的な１日量は、上記の因子に依存して、約１μg/kgから１００mg/kg又はそれ以上の範囲であり得る。数日間又はそれ以上におよぶ反復投与では、容態に依存して、処置は一般的に、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の例示的な１回量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲内であろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、又は１０mg/kgの１つ以上の用量（又はその任意の組合せ）を患者に投与し得る。このような用量は、断続的に、例えば１週間に１回又は３週間に１回投与されてもよい（例えば患者が約２から約２０、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）。初回のより高い添加用量に続いて、１回以上のより低用量を投与してもよい。しかしながら、他の投与処置計画も有用であり得る。この療法の進行は、慣用的な技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０３６１】
上記のいずれかの製剤又は治療法は、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して行なわれ得ることが理解される。
【０３６２】
ＩＩＩ．製品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有している製品が提供される。製品は、容器と、容器上の又は容器と付随したラベル若しくは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注用バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、単独で存在するか又は容態を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物と配合されている組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注用バッグ又はバイアルであり得る）。該組成物中の少なくとも１つの活性成分が本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、該組成物が、選択された容態を処置するために使用されることを表示する。さらに、製品は、（ａ）組成物が含有されている第一の容器（ここで該組成物は、本発明の抗体を含む）；及び（ｂ）組成物が含有されている第二の容器（ここで、該組成物はさらに他の細胞傷害性剤又は別様の治療剤を含む）を含み得る。本発明のこの実施態様における製品はさらに、該組成物を使用して特定の容態を処置することができることを表示する添付文書を含み得る。代わりに又は追加して、製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を含む、第二（又は第三）の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジをはじめとする、商業的見地及びユーザーの見地から望ましい他の材料も含んでいてもよい。
【０３６３】
上記のいずれかの製品は、抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の代わりに又はそれに追加して本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【０３６４】
ＩＶ．具体的な実施態様
１．ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体であって、ここでの該抗体は、配列番号０１の重鎖可変ドメインと配列番号０６の軽鎖可変ドメインとを含むマウス抗体のヒト化変異体である。
【０３６５】
２．ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合するヒト化抗体であって、ここでのヒト化抗体は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０３６６】
３．ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合するヒト化抗体であって、ここでのヒト化抗体は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０３６７】
４．ヒト化抗体は、（ａ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様２〜３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０３６８】
５．（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体。
【０３６９】
６．（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体。
【０３７０】
７．前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様５〜６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３７１】
８．（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体。
【０３７２】
９．（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、ヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体。
【０３７３】
１０．前記抗体はさらに、（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様８〜９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３７４】
１１．実施態様１〜４のいずれか１つに記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体、又は実施態様５〜７のいずれか１つに記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体、又は実施態様８〜１０のいずれか１つに記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体。
【０３７５】
１２．前記抗体がヒトサブクラスＩｇＧ１又はヒトサブクラスＩｇＧ４である、実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。
【０３７６】
１３．前記抗体はκ軽鎖を有するヒトサブクラスＩｇＧ１である、実施態様１〜１２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３７７】
１４．前記抗体はモノクローナル抗体である、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の抗体。
【０３７８】
１５．配列番号９２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号９７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体、又は、配列番号１０１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１０６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む抗体。
【０３７９】
１６．前記抗体は二重特異的抗体である、実施態様１〜１５のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８０】
１７．前記抗体は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂには特異的に結合するが、ヒトＰＤＧＦ−Ｃには結合しない、実施態様１〜１６のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８１】
１８．前記抗体は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ、及びヒトＰＤＧＦ−ＡＡに特異的に結合する、実施態様１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８２】
１９．前記抗体は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂのその受容体への結合を阻害することによって、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性を遮断する、実施態様１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８３】
２０．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されている）
（ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである）
を含む二価の二重特異的抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８４】
２１．前記抗体は、
ｉ）ａ）の下の第一の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）によって独立的に置換され（番号付けはＫａｂａｔによる）（１つの好ましい実施態様では独立的にリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の下の第一の重鎖の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は独立的にグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、あるいは
ｉｉ）ｂ）の下の第二の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸は独立的にリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（番号付けはＫａｂａｔによる）（１つの好ましい実施態様では独立的にリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、ｂ）の下の第二の重鎖の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は独立的にグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）
を含む、実施態様２０に記載の抗体。
【０３８５】
２２．前記抗体は、第二の重鎖の定常ドメインＣＬにおいてＫによって置換された１２４位及び１２３位のアミノ酸を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、実施態様２０〜２１のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８６】
２３．前記抗体は、第二の軽鎖の定常ドメインＣＨ１においてＥによって置換された１４７位及び２１３位のアミノ酸を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、実施態様２０〜２２のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８７】
２４．前記抗体は、第一の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいてＫによって置換された１２４位及び１２３位のアミノ酸、及び、第一の重鎖の定常ドメインＣＨ１においてＥによって置換された１４７位及び２１３位のアミノ酸を含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、実施態様２０〜２３のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８８】
２５．前記抗体は、第二重鎖の定常ドメインＣＬにおいてＫによって置換された１２４位及び１２３位のアミノ酸を含み、ここで、第二の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において１４７位及び２１３位のアミノ酸はＥによって置換され、第一の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて３８位のアミノ酸はＫによって置換され、第一の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて３９位のアミノ酸はＥによって置換され、第二の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて３８位のアミノ酸はＫによって置換され、第二の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて３９位のアミノ酸はＥによって置換されている（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、実施態様２０〜２４のいずれか１つに記載の抗体。
【０３８９】
２６．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、第二の軽鎖及び第二の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている）
（ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである）
を含む二価の二重特異的抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９０】
２７．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖（ここで、第二の軽鎖及び第二の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている）
（ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである）
を含む二価の二重特異的抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９１】
２８．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、及び
ｂ）１〜４つのさらに他の抗原に特異的に結合する１、２、３、又は４つの一本鎖Ｆａｂ断片（すなわち、第二及び／又は第三及び／又は第四及び／又は第五の抗原、好ましくは１つのさらに他の抗原、すなわち第二の抗原に特異的に結合する）
（ここで、ｂ）の下の前記の一本鎖Ｆａｂ断片は、前記の完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端でペプチド性リンカーを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合し、
ここで第一の抗原又はさらに他の抗原の中の１つはヒトＰＤＧＦ−Ｂである）
を含む多重特異的抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９２】
２９．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、かつ２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長の抗体、
ｂ）ｂａ）抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
ｂｂ）抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体の定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第一のポリペプチド（ここで、前記の第一のポリペプチドは、そのＶＨドメインのＮ末端で、前記の完全長抗体の２本の重鎖の片方のＣ末端にペプチド性リンカーを介して融合している）、
ｃ）ｃａ）抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第二のポリペプチド（ここで、前記の第二のポリペプチドは、ＶＬドメインのＮ末端で、前記の完全長抗体の２本の重鎖の他方のＣ末端にペプチド性リンカーを介して融合している）
（ここで、第一のポリペプチドの抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第二のポリペプチドの抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は第二の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである）
を含む、三価の二重特異的抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９３】
３０．ｂ）の下のポリペプチドの抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及びｃ）の下のポリペプチドの抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置：
ｉ）重鎖可変ドメイン４４位と軽鎖可変ドメイン１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位と軽鎖可変ドメイン４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位と軽鎖可変ドメイン１００位（番号付けは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド橋を介して連結され安定化されている、実施態様２９に記載の抗体。
【０３９４】
３１．ａ）第一の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第二の（改変された）軽鎖及び第二の（改変された）重鎖（ここで、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されている）、
を含む、三重特異的又は四重特異的な抗体であり、
ｃ）ここで、１つ又は２つのさらに他の抗原（すなわち第三及び／又は第四の抗原）に特異的に結合する１から４つの抗原結合性ペプチドは、ペプチド性リンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合し、
ここで、第一の抗原若しくは第二の抗原又はさらに他の抗原の中の１つはヒトＰＤＧＦ−Ｂである、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９５】
３２．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する（及び２つのＦａｂ断片を含む）、抗体の２本の軽鎖及び重鎖、
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する、抗体の２つの追加のＦａｂ断片（ここで、前記の追加のＦａｂ断片は両方共、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかにペプチド性リンカーを介して融合している）
を含む二重特異的な四価の抗体であり、
ここで、Ｆａｂ断片において、以下の改変が行なわれている：
ｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、又はｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されている、並びに／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されているか、あるいは
ｉｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、
ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されているか、あるいは
ｉｉｉ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換されているか、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、
ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されているか、あるいは
ｉｖ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いによって置換されているか、あるいは
ｖ）ａ）の両方のＦａｂ断片において、定常ドメインＶＬ及びＣＨ１は互いによって置換され、ｂ）の両方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いによって置換され、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９６】
３３．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合しかつ第一のＶＨ−ＣＨ１ドメイン対を含む、第一の抗体の（改変された）重鎖（ここで、該重鎖のＣ末端に、前記の第一の抗体の第二のＶＨ−ＣＨ１ドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合している）、
ｂ）ａ）の前記の第一の抗体の２本の軽鎖、
ｃ）第二の抗原に特異的に結合しかつ第一のＶＨ−ＣＬドメイン対を含む、第二の抗体の（改変された）重鎖（ここで、該重鎖のＣ末端に、前記の第二の抗体の第二のＶＨ−ＣＬドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合している）、及び
ｄ）ｃ）の前記の第二の抗体の２本の（改変された）軽鎖（各々がＣＬ−ＣＨ１ドメイン対を含む）
を含む、二重特異的で四価の抗体であり、
ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９７】
３４．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する第一の完全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する第二の完全長抗体の重鎖及び軽鎖（ここで重鎖のＮ末端は軽鎖のＣ末端にペプチド性リンカーを介して接続されている）
を含む二重特異的抗体であり、ここで第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９８】
３５．前記抗体は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合し、かつ２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、及び
ｂ）ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含んでいる第二の抗原に特異的に結合するＦｖ断片（ここで、両方のドメインは互いにジスルフィド橋を介して接続されている）
を含む二重特異的抗体であり、
ここで、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのどちらか一方のみが、第一の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖又は軽鎖にペプチド性リンカーを介して融合し、
ここで、第一の抗原又は第二の抗原はヒトＰＤＧＦ−Ｂである、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
【０３９９】
３６．前記抗体は、第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ここで、ｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、
−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｋ３９２Ｄの突然変異を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４、及び
−Ｎ３９２Ｄの突然変異を有するヒトＩｇＧ３
を含む群から選択され、
ｉｉ）第二のＦｃ領域ポリペプチドは、
−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域ポリペプチド、
−ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド、
−Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、及び／又はＥ３５７Ｋの突然変異を有するヒトＩｇＧ１、並びに
−Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及び／又はＥ３５７Ｋの突然変異を有するヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４
を含む群から選択される、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４００】
３７．前記抗体が、第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ここで
ｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｉｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｖ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉｉｉ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｘ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｘ）第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドでであり、第二のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０１】
３８．前記抗体は第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ここで、該抗体は、第一のＦｃ領域ポリペプチド及び第二のＦｃ領域ポリペプチドにおいて
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）ｉ）からｉｉｉ）の組合せ
という突然変異の組合せを含む、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０２】
３９．前記抗体は第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、ここで
ａ）第一及び第二のＦｃ領域ポリペプチドは両方共、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源に由来）であり、そして第一のＦｃ領域ポリペプチドにおいてｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａの群、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａの群、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄの群（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け体系による）から選択された１つ又は２つの突然変異、並びに第二のＦｃ領域ポリペプチドにおいてＬ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａの突然変異（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け体系による）を含む群から選択された１つ又は２つの突然変異を含み、よって第一及び第二のＦｃ領域ポリペプチドにおける全ての突然変異を合わせると、ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄの突然変異が変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるか、あるいは
ｂ）第一及び第二のＦｃ領域ポリペプチドは両方共にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（すなわちヒト起源に由来）であり、どちらもＦｃ領域においてＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はその組合せ（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け体系による）を含み、これにより全ての突然変異が第一若しくは第二のＦｃ領域ポリペプチドに存在するか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第一のＦｃ領域ポリペプチドに存在し、１つ若しくは２つの突然変異が第二のＦｃ領域ポリペプチドに存在し、よって第一及び第二のＦｃ領域ポリペプチド内の全ての突然変異を合わせると、ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、及びＬ４３２Ｄの突然変異がＦｃ領域に含まれるか、あるいは
ｃ）第一及び第二のＦｃ領域ポリペプチドは両方共にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（すなわちヒト起源に由来）であり、第一並びに第二のＦｃ領域ポリペプチドにおいてＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄの突然変異を含むか（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け体系による）、又は第一のＦｃ領域ポリペプチドにおいてＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａの突然変異の組合せ、及び、第二のＦｃ領域ポリペプチドにおいてＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａの突然変異の組合せを含む（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け体系による）、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０３】
４０．前記抗体は第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、ここで
ａ）第一の変異Ｆｃ領域ポリペプチドは、第一の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドに由来し、第二の変異Ｆｃ領域ポリペプチドは、第二の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドに由来し、これにより、第一の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドは、第二の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドと同一であるか又は異なり、
ｂ）第一の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドが第二の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドとは異なっているアミノ酸残基以外の１つ以上のアミノ酸残基において、第一の変異Ｆｃ領域ポリペプチドは第二の変異Ｆｃ領域ポリペプチドとは異なり、及び
ｃ）第一の変異Ｆｃ領域ポリペプチドと第二の変異Ｆｃ領域ポリペプチドとを含むＩｇＧクラスＦｃ領域は、ａ）の第一の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドとａ）の第二の親ＩｇＧクラスＦｃ領域ポリペプチドとを含むＩｇＧクラスＦｃ領域とは異なる、ヒトＦｃ受容体に対する親和性を有し、
ここで、第一のＦｃ領域ポリペプチド若しくは第二のＦｃ領域ポリペプチドのいずれか、又は両方のＦｃ領域ポリペプチドは、互いに独立して、以下の突然変異の１つ又は突然変異の組合せを含む：
−Ｔ３０７Ｈ、又は
−Ｑ３１１Ｈ、又は
−Ｅ４３０Ｈ、又は
−Ｎ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｑ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｅ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｎ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＥ４３０Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｈ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ａ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＱ３１１Ｈ及びＥ４３０Ｈ及びＮ４３４Ｙ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、又は
−Ｔ３０７Ｑ及びＶ３０８Ｐ及びＮ４３４Ｙ及びＹ４３６Ｈ及びＭ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、
実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０４】
４１．前記抗体は、第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ここで、第一のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を含み（空隙鎖）、第二のＦｃ領域ポリペプチドはＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗの突然変異を含み（突起鎖）、
ここで、第一のＦｃ領域ポリペプチド（空隙鎖）は、
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ
の突然変異を含み、
ここで、第一のＦｃ領域ポリペプチドと第二のＦｃ領域ポリペプチドは１つ以上のジスルフィド橋によって接続され、
ここで、第一のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び第二のポリペプチドのＣＨ３ドメインは両方共プロテインＡに結合しているか又は両方共プロテインＡに結合していない（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）、
実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０５】
４２．前記抗体は、
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６Ｅ又はＴ２５６Ａ
の突然変異を含む、実施態様４１に記載の抗体。
【０４０６】
４３．前記抗体は、
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）場合によりａ）Ｔ２５０Ｑ及び／又はＴ２５６Ｅ又はＴ２５６Ａ、並びに
ｉｖ）ａ）Ｌ２５１Ａ若しくはＬ２５１Ｇ若しくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０Ａ若しくはＨ３１０Ｇ
の突然変異を含む、実施態様４１〜４２のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０７】
４４．前記抗体は、
ｉ）Ｉ２５３Ａ又はＩ２５３Ｇ、及び
ｉｉ）Ｌ３１４Ａ又はＬ３１４Ｇ又はＬ３１４Ｄ、及び
ｉｉｉ）ａ）Ｔ２５０Ｑ及び／又はＴ２５６Ｅ又はＴ２５６Ａ、並びに
ｉｖ）ａ）Ｌ２５１Ａ若しくはＬ２５１Ｇ若しくはＬ２５１Ｄ、及び／又はｂ）Ｈ３１０Ａ若しくはＨ３１０Ｇ、
ｖ）場合によりａ）Ｔ３０７Ａ若しくはＴ３０７Ｈ若しくはＴ３０７Ｑ若しくはＴ３０７Ｐ、及び／又はｂ）Ｑ３１１Ｈ、及び／又はｃ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又はｄ）Ｓ２５４Ｔ
の突然変異を含む、実施態様４１〜４３のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０８】
４５．前記抗体は、
ｉ）Ｔ２５０Ｑ、及び／又は
ｉｉ）Ｍ２５２Ｙ、及び／又は
ｉｉｉ）Ｓ２５４Ｔ、及び／又は
ｉｖ）Ｔ２５６Ｅ若しくはＴ２５６Ａ、及び／又は
ｖ）Ｔ３０７Ａ若しくはＴ３０７Ｈ若しくはＴ３０７Ｑ若しくはＴ３０７Ｐ、及び／又は
ｖｉ）Ｑ３１１Ｈ
の突然変異を含む、実施態様４１〜４４のいずれか１つに記載の抗体。
【０４０９】
４６．医薬品としての使用のための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４１０】
４７．眼血管疾患の処置に使用するための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４１１】
４８．眼疾患、特に眼血管疾患の処置のための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体の使用。
【０４１２】
４９．眼疾患の処置に使用するための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４１３】
５０．眼疾患、特に眼血管疾患の処置に使用するための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
【０４１４】
５１．実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体の有効量を個体に投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法。
【０４１５】
５２．実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体を含む医薬製剤。
【０４１６】
５３．眼血管疾患の処置に使用するための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体を含む医薬製剤。
【０４１７】
５４．眼血管疾患の処置のための医薬品の製造のための実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体の使用。
【０４１８】
５５．実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによる、眼血管疾患を患う患者の処置法。
【０４１９】
５６．前記抗体を硝子体内適用を介して投与する、実施態様５２〜５３のいずれか１つに記載の医薬製剤。
【０４２０】
５７．投与が硝子体内への適用である、実施態様５５〜５６のいずれか１つに記載の投与。
【０４２１】
５８．実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体をコードしている核酸。
【０４２２】
５９．実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体をコードしている１つ以上の核酸を含む細胞。
【０４２３】
６０．前記方法は、以下の工程：
ａ）場合により、哺乳動物細胞に、実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体をコードしている１つ以上の核酸をトランスフェクトする工程、
ｂ）細胞を培養して該抗体を発現させる工程、及び
ｃ）細胞又は培養培地から該抗体を回収し、これにより該抗体を生成する工程
を含む、実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体を生成するための方法。
【０４２４】
Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に提供された一般的な記述があれば、様々な他の実施態様が実践され得ることが理解される。
【０４２５】
実施例１
免疫化
マウス（ＮＭＲＩマウス）及びウサギ（ヒトＩｇ遺伝子座トランスジェニックウサギ）の免疫化のために、ＲＩＭＭＳ（「迅速な免疫化、複数の部位（Rapid Immunization, Multiple Sites）」）に基づいた計画を使用した。抗原はヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling Tech.）であった。
【０４２６】
実施例２
抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体血清力価の決定
ヒト組換えＰＤＧＦ−Ｂを、ＰＢＳ中２．５μg/ml（マウス）又は１．０μg/ml（ウサギ）、１００μl/ウェルで９６ウェルNUNC Maxisorbプレート上に固定し、その後、該プレートをＰＢＳ中２％クロテインＣ（２００μl/ウェル）を用いて遮断し；ＰＢＳ中０．５％クロテインＣ中の抗血清の連続希釈液（１００μl/ウェル）（２つ複製）を適用；マウス血清についてはＰＢＳ中０．５％クロテインＣで１：１６，０００で希釈されたＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch）を用いるか又は１：５，０００で希釈されたビオチニル化ヤギ抗ヒトκ抗体（Southern Biotech）を用いて、及びウサギ血清についてはＰＢＳ中０．５％クロテインＣで１：８，０００で希釈されたＨＲＰにコンジュゲートしたストレプトアビジン（１００μl/ウェル）を用いて検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間で、プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＭブルーＰＯＤ基質、可溶性（Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、独国）（１００μl/ウェル）の添加によってシグナルを発生させ；１M ＨＣｌ（１００μl/ウェル）の添加によって停止させた。基準としての６９０nmに対して、４５０nmの吸光度を解読した。力価は、シグナルの最大半量を生じる抗血清の希釈率として定義された。
【０４２７】
実施例３
ウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
血液試料を、３匹の免疫化ウサギから採取した。ＥＤＴＡを含有している全血を、１×ＰＢＳ（ＰＡＡ、パシング、オーストリア）を用いて２倍に希釈し、その後、製造業者の仕様書に従って哺乳動物用のlympholyte（Cedarlane Laboratories、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を使用して密度勾配遠心分離にかけた。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０４２８】
ＥＬ−４Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（Hyclone、ローガン、ＵＴ州、米国）、２mMグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ、パシング、オーストリア）、２mMピルビン酸ナトリウム、１０mM ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech、アイデンバッハ、独国）及び０．０５mM βメルカプトエタノール（Gibco、ペイズリー、スコットランド）で補充された、ＲＰＭＩ １６４０（Pan Biotech、アイデンバッハ、独国）を使用した。
【０４２９】
プレートのコーティング
無菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸塩緩衝液（０．１M 重炭酸ナトリウム、３４mM炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．５５）中のＰＢＧＦ−ＢＢタンパク質（２μg/ml）、又はＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質とＰＤＧＦ−ＣＣタンパク質の混合物（１μg/mlのＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＣＣ）のいずれかを用いて一晩かけて４℃でコーティングした。プレートを使用前に無菌ＰＢＳで３回洗浄した。
【０４３０】
マクロファージ／単球の枯渇
血液試料の半分のＰＢＭＣを、非特異的な接着を通してマクロファージ及び単球を枯渇させるために滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）に播種した。残りの５０％のＰＢＭＣを、ＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質とＰＤＧＦ−ＣＣタンパク質の混合物で予めコーティングされたプレートに播種して、これらのタンパク質に結合しているＢ細胞を除去し、かつ一工程でマクロファージ及び単球を除去した。
【０４３１】
各ウェルを、最大で４mlの培地及び免疫化ラットに由来する６×１０６個以下のＰＢＭＣで充填し、３７℃のインキュベーター中で１時間かけて結合させた。
【０４３２】
上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パンニング工程に使用した。
【０４３３】
ＰＤＧＦ ＢＢタンパク質上におけるＢ細胞の濃縮
ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質でコーティングされた６ウェル組織培養プレートに、培地４mlあたり６×１０６個以下のＰＢＬを播種し、３７℃のインキュベーター中で１時間結合させた。ウェルを１×ＰＢＳで１〜２回注意深く洗浄することによって非接着細胞を除去した。残りの粘着性細胞を３７℃のインキュベーター中で１０分間かけてトリプシンによって剥離した。トリプシン化をＥＬ−４Ｂ５培地を用いて停止した。免疫蛍光染色を行なうまで細胞を氷上で保持した。
【０４３４】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ抗体ＦＩＴＣ（AbD Serotec、デュッセルドルフ、独国）を単一細胞選別のために使用した。表面染色のために、枯渇工程及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中でＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗ＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、暗所で４℃で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した。最後にＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析に直ちにかけた。死滅細胞と生細胞とを区別するために、５μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen、サンディエゴ、ＣＡ州、米国）をＦＡＣＳ分析前に加えた。
【０４３５】
コンピューター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD Biosciences、米国）を備えたBecton Dickinson社のＦＡＣＳＡｒｉａを単一細胞選別のために使用した。
【０４３６】
Ｂ細胞の培養
端的に言えば、単一細胞選別されたウサギＢ細胞を、９６ウェルプレート中で、パンソルビン細胞（１：１００，０００）（Calbiochem (Merck)、ダルムシュタット、独国）、５％ウサギ胸腺細胞上清（MicroCoat、ベルンリエド、独国）及びγ線照射されたマウスＥＬ−４Ｂ５胸腺腫細胞（２．５×１０４個の細胞／ウェル）を含有している２００μl/ウェルのＥＬ−４Ｂ５培地と共に３７℃のインキュベーター中で７日間インキュベートした。Ｂ細胞培養上清を、スクリーニングのために除去し、残りの細胞を直ちに収集し、ＲＬＴ緩衝液 １００μl（Qiagen、ヒルデン、独国）中で−８０℃で凍結させた。
【０４３７】
実施例４
ハイブリドーマの作製
細胞培養液
マウス骨髄腫細胞株Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３を、マウス−マウスハイブリドーマの生成のための融合対として使用した。細胞を融合の約１４日前に解凍し、８−アザグアニンの存在下で培養する。３から４日間毎に細胞を分割し、１〜２×１０５個の細胞/mの濃度に調整した。
【０４３８】
細胞融合
材料：
室温に調整された、マウスハイブリドーマ培地（ＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＮ）、ＦＢＳウルトラロー（ultra-low）−ＩｇＧ、２mM Ｌ−グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ、マウスＩＬ−６を有するニュートリドーマＣＳ、ＨＡＺ（SIGMA、Ａ９６６６番）。
ＲＰＭＩ １６４０培地（３７℃）
ＲＰＭＩ １６４０培地（４℃）
ＰＥＧ（３７℃）
【０４３９】
融合前に骨髄腫細胞を遠心分離にかける（２５０rpm、７分間）。細胞ペレットを培養培地に再懸濁する。１つの脾臓について約１〜５×１０７個の細胞が必要とされる。
【０４４０】
細胞融合のために、約５：１のリンパ球対骨髄腫細胞の比を使用するべきである。Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞をＲＰＭＩ １６４０培地 ５０mlに再懸濁し、遠心分離にかける（２５０rpm、７分間）。上清を除去する。その後、細胞を脾臓細胞に加える。
【０４４１】
融合中の水浴の温度を３７℃に調整する。
【０４４２】
ＰＥＧ溶液（３７℃）を細胞に滴下して加える。
【０４４３】
融合混合物を３７℃のインキュベーター中で１５〜１２０分間インキュベートする。その後、融合混合物を遠心分離にかけ（２５０rpm、７分間）、再懸濁した１２００μlの培地に再懸濁する。細胞懸濁液 １００μlを半固体ハイブリドーマ培地 ５０mlに加え、ホモジナイズし、６ウェルプレートの１ウェルあたり各４mlを加える。９〜１３日間培養した後、単一クローンを拾い上げる。
【０４４４】
実施例５
ハイブリドーマ培養
約５×１０６個の細胞をハイクローン培地 ５０mlに懸濁する。培養混合物を９６時間インキュベートする。その後、ハイクローン培地 ７５mlを加える。培養を７日間継続する。生存率が４０％未満に下降すると、細胞懸濁液を０．２２μフィルターを通してろ過し、ろ液を精製のために使用した。
【０４４５】
実施例６
Ｂ細胞クローニング
ＶドメインのＰＣＲによる増幅
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、NucleoSpin 8/96 RNAキット（Macherey&Nagel; 740709.4, 740698）を使用してＢ細胞溶解液（ＲＬＴ緩衝液−Qiagen−製造番号７９２１６に再懸濁）から調製した。ＲＮＡをリボヌクレアーゼフリーの水 ６０μlを用いて溶出した。ＲＮＡ ６μlを使用して、製造業者の説明書に従ってSuperscript IIIファーストストランド合成スーパーミックス（Invitrogen 18080-400）及びオリゴｄＴ−プライマーを使用して逆転写酵素によってｃＤＮＡを作製した。全ての工程をHamilton社のML Starシステムで行なった。ｃＤＮＡ ４μlを使用して、野生型ウサギＢ細胞の重鎖についてはプライマーｒｂＨＣ．ｕｐ及びｒｂＨＣ．ｄｏ、軽鎖についてはｒｂＬＣ．ｕｐ及びｒｂＬＣ．ｄｏ、トランスジェニックウサギＢ細胞の軽鎖についてはＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ及びＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖを使用して最終容量 ５０μl中でAccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）を用いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅した。全ての正方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）シグナルペプチドに対して特異的であるが、逆方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）定常領域に対して特異的であった。ＲｂＶＨ＋ＲｂＶＬのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間；９４℃で２０秒間、７０℃で２０秒間、６８℃で４５秒間の３５サイクル；及び６８℃で７分間の最終伸張というホットスタート。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間；９４℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、６８℃で４５秒間の４０サイクル、及び６８℃で７分間の最終伸張というホットスタート。
【０４４６】
【表３２】
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【０４４７】
５０μL中８μlのＰＣＲ溶液を、４８Ｅ−Ｇｅｌ２％（Invitrogen G8008-02）にローディングした。陽性ＰＣＲ反応を、製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin Extract IIキット（Macherey&Nagel; 740609250）を使用して洗浄し、溶出緩衝液 ５０μlで溶出した。全ての洗浄工程をHamilton ML Starletシステムで行なった。
【０４４８】
実施例７
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードしているＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518; MZ Li et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によってｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーター及び３’ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有していた。発現カセットに加えて、プラスミドは、ｐＵＣに由来する複製起点、及びＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有していた。３つの基本的なプラスミド変異体を使用した：１つのプラスミドは、ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含有し；２つのプラスミドは、ＶＬ領域を受け入れるためのウサギ又はヒトκＬＣ定常領域を含有している。
【０４４９】
κ又はγ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入断片をコードしている鎖状化発現プラスミドを、重複しているプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。
【０４５０】
精製されたＰＣＲ産物を、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。反応をｄＣＴＰの添加によって停止した。
【０４５１】
次の工程では、プラスミド及び挿入断片を合わせ、部位特異的組換えを誘導したｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。翌日、成長したコロニーを拾い上げ、プラスミド調製、制限酵素分析、及びＤＮＡシークエンスによって正しい組換えプラスミドについて試験した。
【０４５２】
抗体の発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを一過性にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、上清を１週間後に収集した。
【０４５３】
実施例８
ウサギモノクローナル一価抗体の組換え発現
モノクローナル一価抗体として選択された候補の組換え発現のために、全てのＶＨ鎖のウサギ定常領域を、ＣＨ３セグメントに突起突然変異を封入したヒト定常領域へと変換した。ウサギ野生型Ｂ細胞に由来するＶＬ鎖については、ウサギＣκ定常領域をヒトに変換した。選択された候補のｃＤＮＡ ４μlを使用して、最終容量 ５０μl中でAccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）を用いて、シグナルペプチドに特異的な正方向プライマー、及び（それぞれＶＨ及びＶＬの）ヒト定常領域に相同な（３’末端における）重複配列（２０ｂｐ）を有するＣＤＲ３−Ｊ領域に対して特異的な逆方向プライマーを用いて免疫グロブリン重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を増幅した。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖増幅のＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間；９４℃で２０秒間、６８℃で２０秒間、６８℃で４５秒間を３５サイクル、及び６８℃で７分間の最後の伸張というホットスタート。
【０４５４】
ＶＨ又はＶＬをコードしているＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518; MZ Li et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によって発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーター及び３’ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有していた。発現カセットに加えて、プラスミドは、ｐＵＣに由来する複製起点、及びＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有していた。２つの基本的プラスミド変異体を使用した：一方のプラスミドは、新たに増幅されたＶＨ鎖を受け入れるように設計されたヒトＩｇＧ定常領域を含有し、第二のプラスミドは、ＶＬ鎖を受け入れるためのヒトκＬＣ定常領域を含有している。
【０４５５】
κ又はγ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入断片をコードしている鎖状化発現プラスミドを、重複プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。
【０４５６】
精製ＰＣＲ産物を、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。反応をｄＣＴＰの添加によって停止した。
【０４５７】
次の工程では、プラスミド及び挿入断片を合わせ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。翌日、成長したコロニーを拾い上げ、プラスミド調製、制限酵素分析、及びＤＮＡシークエンスによって正しい組換えプラスミドについて試験した。
【０４５８】
実施例９
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Cell Signaling、製造番号８９２１ＢＦ）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上のＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中、２５μL中、１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μlを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４５９】
実施例１０
カニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ抗原を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μl、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６０】
実施例１１
マウスＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。マウスＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Peprotec 315-18）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μl、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６１】
実施例１２
ラットＰＤＧＦ−ＢＢ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ラットＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Ｒ＆Ｄ、５２０−ＢＢ）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μl、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６２】
実施例１３
ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ抗原（Peprotec、製造番号ＡＦ−１００−１３Ａ）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μl、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６３】
実施例１４
ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ結合ＥＬＩＳＡ
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ抗原（Peprotec ＡＦ−１００−００Ｃ）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中１２５ng/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μl、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体で１時間；３）検出抗体、希釈率＝１：３０００（ＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３４０Ｖ＋ＥＣＬ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤ、ＮＡ９３３Ｖ又は代替的にはマウス抗体についてはＥＣＬ抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＯＤ；ＮＡ９３１０Ｖ）。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＥＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６４】
実施例１５
タンパク質間相互作用阻害アッセイ：ヒトＰＤＧＦ−Ｂ：ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ受容体
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ受容体に対するヒトＰＤＧＦ−ＢＢのタンパク質間相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＦｃタグ化ＰＤＧＦ−ＢＢ受容体タンパク質（ＲｎＤ、製造番号３８５−ＰＲ−１００）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（Thermo Scientific、製造番号４６４７１８）上でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の２５μL中７５０μg/mLの濃度で固定した。以下の各々の工程の後に、通常のＰＢＳ ９０μlを用いての３回の洗浄と分注と吸引を行なった：１）遮断工程：非結合表面の飽和（１時間、２％ＢＳＡ）；２）漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体 １５μLを、３０μLの容量中７５nMのビオチニル化ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Cell Signaling、製造番号８９２１ＢＦ）１５μLと共にインキュベートした；３）検出を、ペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、独国、製造番号１１０８９１５３００１）を使用して行なった。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Piercenet、製造番号３４０２１）を添加してから２０〜３０分後、３７０nmにおける吸光度を決定した。ＩＣ５０を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して４つのパラメーターロジスティックモデルを用いて計算した。
【０４６５】
実施例１６
マウスハイブリドーマからの抗体の精製
抗体を含有しているハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程によって精製する。抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＧ（GE Healthcare）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって捕捉した。非結合タンパク質を、平衡緩衝液を用いての洗浄によって除去し、抗体をｐＨ３．０の２５mMクエン酸緩衝液を用いて回収し、溶出後直ちにｐＨ９．０の１Ｍトリス塩基を用いてｐＨ６．０まで中和する。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを２回目の精製工程として使用する。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で行なう。抗体含有溶液をBiomax-SK膜（Millipore、ビレリカ、ＭＡ州）を備えたUltrafree-CL遠心式フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存する。
【０４６６】
抗体を含有しているハイブリドーマ上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程によって精製する。上清を５０％ｖ/ｖ２Ｍグリシン、ｐＨ８．６、６００mM ＮａＣｌと混合し、１Ｍグリシン、ｐＨ８．６、３００mM ＮａＣｌを備えたHiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって捕捉する。非結合タンパク質を平衡緩衝液を用いての洗浄によって除去し、抗体を１００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて回収し、溶出後直ちに１Ｍトリス塩基（ｐＨ８．５）を用いてｐＨ６．０まで中和する。Superdex（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを２回目の精製工程として使用する。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で行なう。抗体を含有している溶液を、Biomax-SK膜（Millipore、ビレリカ、ＭＡ州）を備えたUltrafree-CL遠心式フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存する。
【０４６７】
実施例１７
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ
結合分析を、ビアコアＢ４０００システム（GE Healthcare）を適用している表面プラズモン共鳴分光法に基づいた技術を使用して行なった。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Cell Signaling、製造番号８９２１ＢＦ）を、Ｃ１センサーチップ（GE Healthcare、製造番号ＢＲ−１００５−３５）上でのアミンカップリング化学反応を使用してＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ中１μg/mLの濃度で固定した。漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体を１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０mM ＮａＣｌ中に適用した。１８０秒間の会合相及び６００秒間の解離相の読取時間を使用して、見かけのｋａ及び見かけのｋｄを計算した。見かけのＫＤ（結合力）を、ビアコアT200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して計算した。
【０４６８】
実施例１８
カニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢ結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ
結合分析を、ビアコアＢ４０００システム（GE Healthcare）を適用する表面プラズモン共鳴分光法に基づいた技術を使用して行なった。カニクイザルＰＤＧＦ−ＢＢ抗原をＣ１センサーチップ（GE Healthcare、製造番号ＢＲ−１００５−３５）上でのアミンカップリング化学反応を使用してＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ中１μg/mLの濃度で固定した。漸増濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体を１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０mM ＮａＣｌ中に適用した。１８０秒間の会合相及び６００秒間の解離相の読取時間を使用して、見かけのｋａ及び見かけのｋｄを計算した。見かけのＫＤ（結合力）を、ビアコアT200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して計算した。
【０４６９】
実施例１９
ＨＥＫ細胞におけるヒト化抗体のトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬２９３−free（Novagen）を用いて懸濁液に適応したＨＥＫ２９３Ｆ（FreeStyle 293-F細胞；Invitrogen）細胞における抗体の一過性発現。
【０４７０】
細胞を、１２５mlの振とうフラスコ中での解凍後に希釈によって少なくとも４回（容量３０ml）継代した（３７℃で、７％ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmでインキュベート／振とう）。
【０４７１】
細胞を、２５０mlの容量中で３×１０５個の細胞/mlまで増殖させた。３日後、細胞を分割し、１リットルの振とうフラスコ中の２５０mlの容量中に７×１０５個の細胞/mlの密度で新たに播種した。トランスフェクションは、約１．４〜２．０×１０６個の細胞/mlの細胞密度で２４時間後であろう。
【０４７２】
トランスフェクション前に、予め加熱した（水浴；３７℃）Opti-MEM（Gibco）を用いて、最終容量１０ml中のプラスミド−ＤＮＡ ２５０μg（軽鎖 １２２μg及び重鎖 １２８μg）を希釈する。溶液を穏やかに混合し、室温で５分間以下インキュベートする。その後、２９３−freeトランスフェクション試薬 ３３３．３μlを、DNA-OptiMEM溶液に加える。穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベートする。全容量の混合物を、ＨＥＫ−細胞培養容量 ２５０mlと共に１Ｌの振とうフラスコに加える。
【０４７３】
３７℃、７％ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmで６又は７日間インキュベート／振とう。
【０４７４】
２，０００rpm、４℃で１０分間、１回目の遠心分離工程によって上清を収集する。その後、４，０００rpm、４℃で２０分間の２回目の遠心分離のために新たな遠心分離用フラスコに上清を移す。その後、無細胞上清を０．２２μmのボトルトップフィルターを通してろ過し、冷凍庫（−２０℃）で保存する。
【０４７５】
実施例２０
ＨＥＫ上清からの抗体の精製
抗体を含有している培養上清をろ過し、２回のクロマトグラフィー工程によって精製する。抗体を、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（GE Healthcare）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって捕捉した。非結合タンパク質を、平衡緩衝液を用いての洗浄によって除去し、抗体を、１００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて回収し、溶出直後に１M トリス塩基（ｐＨ９．０）を用いてｐＨ６．０まで中和した。Superdex200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、２回目の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーを２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で行なった。抗体を含有している溶液を、Biomax-SK膜（Millipore、ビレリカ、ＭＡ州）を備えたUltrafree-CL遠心式フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４７６】
実施例２１
抗体調製物の分析
抗体調製物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmでの吸光度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
【０４７７】
抗体の純度及び完全度を、プロテイン・エクスプレス・チップ及びＨＴプロテイン・エクスプレス試薬キットと共にLabChip GX II（PerkinElmer）を使用してＣＥ−ＳＤＳによって分析した。
【０４７８】
抗体調製物の凝集物の含量を、ランニング緩衝液として２×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用してＴＳＫ−ＧＥＬ ＱＣ−ＰＡＫ ＧＦＣ３００を使用して高性能ＳＥＣによって、又は、ランニング緩衝液として２００mM ＫＨ２ＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ（ｐＨ７．０）を使用してBioSuite高分解能ＳＥＣ、２５０Å、５μmの分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用して高性能ＳＥＣによって決定した。
【０４７９】
実施例２２
抗体からのＦａｂ断片の調製及び分析：
抗体 ５mg（２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で約１mg/ml）を、Ｌ−システイン溶液 ９０μl（Merck Millipore；２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で２５０mM）及びパパイン １２μl（Roche Life Science；３．２U/mgの抗体）と共に３７℃で１２０分間インキュベートした。切断後、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（GE Healthcare）を使用したアフィニテイクロマトグラフィーを、インタクトなＩｇＧ及びＦｃ断片の除去のために使用した。続いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅクロマトグラフィーのフロースルーをさらに、２回目の精製工程としてのSuperdex 200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で行なった。Ｆａｂ断片を含有している溶液を、Biomax-SK膜（Millipore、ビレリカ、ＭＡ州）を備えたUltrafree-CL遠心式フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４８０】
Ｆａｂ断片のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して２８０nmでの吸光度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
【０４８１】
Ｆａｂ断片の純度及び完全度を、還元剤（５mMの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でSimply Blue Safe Stain（Invitrogen）で染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ビス−トリスゲル、Invitrogen）によって分析した。
【０４８２】
Ｆａｂ調製物の凝集物の含量を、ランニング緩衝液として２×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用してSuperdex200 10/300GL分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare）を使用して高性能ＳＥＣによって決定した。
【０４８３】
実施例２３
３Ｔ３細胞増殖ＥＬＩＳＡ
増殖抑制の決定のために、製造業者のマニュアルによるＢｒｄＵ比色定量アッセイを使用した（Roche Diagnostics GmbH、独国、１１６４７２２９００１番）。アッセイでは５ng/mlのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗体を使用した。
【０４８４】
実施例２４
リン酸化ＰＤＧＦ−Ｒβ（Ｔｒｙ７５１）サンドイッチＥＬＩＳＡ
１０，０００個の３Ｔ３細胞／ウェルを、１０％新生仔胎児血清の補充されたＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。その後、細胞を、Ｈｕｎｇｅｒ培地（０．５％新生仔胎児血清を有するＤＭＥＭ培地）中で２４時間インキュベートした。
【０４８５】
添加前に抗体（１μg/ml）を、５ng/mlのＰＤＧＦ−ＢＢを含有している培地中で２時間プレインキュベートした。３Ｔ３細胞を、５ng/mlのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗体を含むＨｕｎｇｅｒ培地中で１０分間インキュベートした。
【０４８６】
溶解前に、細胞を、ＰＢＳで４回洗浄した。細胞の溶解を、１００μlの溶解緩衝液中で行なった。
【０４８７】
溶解溶液を、ウサギ抗ＰＤＧＦ−Ｒβ抗体でコーティングされた９６ウェルプレートのウェル中で４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、ＰＢＳで４回洗浄した。マウス抗リン酸化ＰＤＧＦ受容体β抗体と共に１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。検出のために、ウェルをＴＭＢ基質溶液 １００μlと共に３０分間インキュベートした。反応を停止溶液 １００μlの添加によって停止した。４５０nmにおける吸光度を決定した。
【０４８８】
実施例２５
細胞遊走アッセイ
ＣＩＭプレート１６の使用（ACEA Biosciences Inc.、０５６６５８１７００１番、膜の孔径８μm）。
【０４８９】
プロトコール
使用前に初代ヒト網膜周皮細胞（（ACBRI 183 CellSystems）、ｈＴＥＲＴで不死化）を、増殖因子を含まないCellSystems CSC無血清培地（ＳＦ−４ＺＲ−５００−Ｓ番）中で一晩飢餓させる（５０〜７０％の集密度）。
【０４９０】
プレート調製
上のチャンバー：（培地 ５０μl＋細胞懸濁液 １００μl）
両面をＰＢＳ中フィブロネクチン（Sigma F0895番、２mg）２０μg/mlでコーティングする。
【０４９１】
各ウェルのセンサー側（下側）にフィブロネクチン溶液 ４０μlを加え、フード中で上のチャンバーを３０分間インキュベートする。センサー側からフィブロネクチン溶液を注意深く吸引し、電極に触れるのを回避する。ＵＣをひっくり返し、ウェル側を上に、センサー側を下にする。フィブロネクチン溶液 ５０μlをウェルに加え、室温でフード下で３０分間インキュベートする。ウェル内から溶液を注意深く吸引する。ウェル内に増殖因子を含まないＣＳＣ無血清培地 ５０μlを加える。
【０４９２】
下のチャンバー：試験すべき１６０μl／ウェルの試料（１倍濃縮）。
【０４９３】
増殖因子を含まないCellSystems CSC無血清培地中の全ての希釈液（ＳＦ−４ＺＲ−５００−Ｓ番）；フード中で試料／抗体の混合液を２時間インキュベートする；試料 １６０μl／ウェルを加える；ＣＩＭ−プレート１６アセンブリツールを使用してＵＣ及びＬＣを構築する；平衡化するためにＣＩＭ−プレート１６を３７℃のインキュベーターに１時間入れる；RTCA DP分析装置にＣＩＭ−プレート１６を置く；ＲＴＣＡソフトウェアで工程１を開始することによってバックグラウンド測定を開始する。
【０４９４】
細胞の調製
細胞解離緩衝液で細胞を剥離し、増殖因子を含まないCellSystems CSC無血清培地（ＳＦ−４ＺＲ−５００−Ｓ番）中に細胞を１．５×１０５個の細胞/mlで再懸濁する；ＲＴＣＡ分析装置からＣＩＭ−プレート１６を取り出し、ＵＣに、基礎培地（増殖因子を含まないCell Systems CSC無血清培地、ＳＦ−４ＺＲ−５００−Ｓ番））中の１５，０００個の初代ヒト網膜周皮細胞（（ACBRI 183 CellSystems））、ｈＴＥＲＴで不死化）／ウェル／１００μlを加える；ＲＴＣＡ分析装置にプレートを戻し、１０〜２０時間以内に直ちに測定を開始する。
【０４９５】
実施例２６
細胞増殖アッセイ
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega, G3580）。
初代ヒト網膜周皮細胞（（ACBRI 183 CellSystems)）、ｈＴＥＲＴで不死化）、２５００個の細胞／ウェル／１００μl。
【０４９６】
培地
増殖培地＝ＣＳＣ完全培地、培養ブースト（ACBRI ４Ｚ＝−５００番）。
アッセイ培地＝増殖因子を含まないＣＳＣ無血清培地（ＡＣＢＲＩ ＳＦ−４ＺＲ−５００−Ｓ番）。
Ｂａｌｂｓ３Ｔ３、５０００個の細胞／ウェル／１００μl。
【０４９７】
培地
増殖培地＝ＤＭＥＭ（Gibco ４１９６６番）、１０％ＮＢＣＳ（新生仔胎児血清）。
アッセイ培地＝ＤＭＥＭ（Gibco ４１９６６番）、０．４％ＮＢＣＳ。
【０４９８】
増殖アッセイ
アッセイの２４〜４８時間前に増殖培地に細胞を播種する。細胞が８０〜９０％集密となると、トリプシン溶液を用いて細胞を収集する。細胞を増殖培地に０．２５×１０５個の細胞／ml（又は０．５×１０５個の細胞／ml）で再懸濁する。細胞懸濁液 １００μlを９６ウェルプレートの各ウェルに加える。３７℃で２４時間インキュベートする。増殖培地を除去し、アッセイ培地 １００μlを各ウェルに加える。２４時間インキュベートする。標準物質又は試料 １００μlを各ウェルに加える（２倍濃縮、アッセイ培地で希釈）。３７℃で５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。細胞上に色素溶液 ４０μlを加え、３７℃でインキュベートする。様々な時点（１時間から８時間まで）で４９０nmで解読する。
【０４９９】
実施例２７
抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の動態スクリーニング
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（５μg/ml；発注番号２２０−ＢＢ；R&D Systems）の約２０共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ４．０でシリーズＳ Ｃ１チップ（GE Healthcare BR-1005-35）上に結合させた。固定のためのランニング緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）であった。以下の動態特徴付けのために、ランニング緩衝液及び希釈緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）であった。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液を用いて２回刺激した。
【０５００】
溶液中３０nM及び３nMの濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の１００μl/分の流速での３０秒間の注入によって会合を測定した。解離相を６００秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液まで切り替えることによってトリガーした。５μl/分の流速で６０秒間の０．８５％Ｈ３ＰＯ４（リン酸）溶液の２回の連続注入を用いて洗浄することによって表面を再生した。ブランク表面から得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率の差を修正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５０１】
実施例２８
抗ＰＤＧＦ−ＢＢ Ｆａｂ抗体の動態特徴付け
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ Ｆａｂ試料の結合を、ビアコアＴ２００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。約５０共鳴単位（ＲＵ）の組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．５μg/ml；発注コード２２０−ＢＢ；R&D Systems）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ４．０でシリーズＳ ＣＭ３チップ（GE Healthcare BR-1005-36）上に結合させた。固定のためのランニング緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｎであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）。以下の動態特徴付けのために、ランニング緩衝液及び希釈緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｐであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回刺激した。
【０５０２】
１：３の連続希釈液で３００nMから始めて３０μl/分の流速で溶液中の様々な濃度の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ Ｆａｂ抗体の１８０秒間の注入によって会合を測定した。解離相を９００秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液へと切り替えることによってトリガーした。表面を、０．８５％Ｈ３ＰＯ４（リン酸）溶液で５μ/分の流速で６０秒間洗浄することによって表面を再生した。ブランク表面から得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率の差を修正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５０３】
実施例２９
化学物質分解試験
試料を３つのアリコートに分け、２０mM Ｈｉｓ／Ｈｉｓ＊ＨＣｌ、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又はＰＢＳ中にそれぞれ再緩衝化し、４０℃で（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃で（ＰＢＳ）保存した。対照試料を−８０℃で保存した。
【０５０４】
インキュベーション終了後、試料を、相対的な有効濃度（ビアコア）、凝集（ＳＥＣ）、及び断片化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）について分析し、非処置対照と比較した。
【０５０５】
実施例３０
熱安定性
試料を、２０mMヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中１mg/mLの濃度で調製し、０．４μmフィルタープレートを通しての遠心分離によって光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィン油で覆った。流体力学的半径を、DynaProプレートリーダー（Wyatt）での動的光散乱によって繰り返し測定したが、試料を０．０５℃／分の割合で２５℃から８０℃まで加熱した。
【０５０６】
あるいは、試料を１０μLのマイクロキュベットアレイに移し、静的光散乱データ並びに２６６nmレーザーでの励起時の蛍光データを、Optim1000装置（Avacta Inc.）を用いて記録し、その間、それらを０．１℃／分の速度で２５℃から９０℃まで加熱した。
【０５０７】
凝集開始温度は、流体力学的半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Optim1000）が増加し始める温度として定義される。
【０５０８】
融解温度は、蛍光強度対波長のグラフにおける変曲点として定義される。
【０５０９】
前記の本発明は幾分詳細に説明及び実施例を用いて理解を明瞭とするために記載されているが、記載及び実施例は、本発明を範囲を制限すると捉えるべきではない。本明細書に引用されている全ての特許文献及び科学文献の開示は、その全体が参照により明瞭に組み入れられる。
【０５１０】
実施例３１
二重特異的抗体の生成及び精製
トランスフェクション試薬293-free（Novagen）を用いてのＤＮＡのトランスフェクション後の、懸濁液に適合したＨＥＫ２９３Ｆ（FreeStyle 293-F細胞；Invitrogen）細胞中の二重特異的抗体の一過性発現。
【０５１１】
細胞を、３日間毎又は４日間毎に、１２５mlの振とうフラスコ中で解凍した後、希釈によって少なくとも４回（容量 ３０ml）継代した（３７℃、７％ＣＯ２、８５％湿度、１３５rpmでインキュベート／振とう）。細胞を、３×１０５個の細胞/mlの細胞密度で２５０mlの培地に播種することによって細胞を増殖させた。３日後、細胞を分割し、２×１０５個の細胞/mlの密度で５００mlの培地に新しく播種した。４日後、細胞を分割し、７×１０５個の細胞/mlで１リットルの培地に新しく播種した（３７℃、７％ＣＯ２、８５％湿度、１１０rpmでインキュベート／振とう）。約１．４〜２．０×１０６個の細胞/mlの細胞密度で２４時間後にトランスフェクションを行なった。
【０５１２】
トランスフェクション前に、プラスミド−ＤＮＡ １０００μg（軽鎖をコードしているプラスミドＤＮＡ ２×２５０μg、及び重鎖をコードしているプラスミドＤＮＡ ２×２５０μg）を予め加熱された（水浴；３７℃）Opti-MEM（Gibco）を有する最終容量 ４０mlで希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分間以内インキュベートした。その後、293-freeトランスフェクション試薬 １３３３μlをDNA-Opti-MEM溶液に加えた。混合物を穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間インキュベートした。混合物の全容量を注意深くＨＥＫ細胞培養液 １リットルに加えた。細胞をさらに、１１０rpmで３７℃、７％ＣＯ２、８５％湿度で振とうしながら７日間インキュベートした。
【０５１３】
上清を、２０００rmで４℃で１０分間の１回目の遠心分離工程によって７日後に収集した。その後、上清を、４０００rpm、４℃で２０分間の２回目の遠心分離工程のために新たな遠心分離用フラスコに移した。無細胞上清を０．２２μmフィルター（Millipore）を通してろ過し、精製手順が開始されるまで冷凍庫（−２０℃）で保存した。
【０５１４】
抗体を含有している培養上清をろ過し、少なくとも２回のクロマトグラフィー工程によって精製した。抗体を、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）（ｐＨ７．４）で平衡化したCaptureSelectプレパックカラムＩｇＧ−ＣＨ１（life technologies、４９４３２０００５番）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって捕捉した。非結合タンパク質を、平衡緩衝液で洗浄することによって除去し、抗体を２５mMクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて回収し、溶出直後に１Mトリス塩基（ｐＨ９．０）を用いてｐＨ６．０まで中和した。
【０５１５】
Superdex200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを２回目の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で行なった。抗体を含有している溶液を、Biomax-SK
膜（Millipore、ビレリカ、ＭＡ州）を備えたUltrafree-CL遠心式フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０５１６】
抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体／抗ＡＮＧ２抗体（クローン０１４４−０００４）をさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製した。硫酸アンモニウムを、抗体含有溶液に１Mの最終濃度となるまで加えた。溶液を１M硫酸アンモニウム、３５mM酢酸塩（ｐＨ５．６）で平衡化されたButyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）カラムに適用した。抗体を３５mM酢酸塩（ｐＨ５．６）を用いて線形勾配（０〜１００％）で溶出した。抗体含有画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーに適用した。
【０５１７】
抗体調製物のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmでの吸光度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
【０５１８】
抗体の純度及び完全度を、プロテイン・エクスプレス・チップ及びＨＴプロテイン・エクスプレス試薬キットと共にLabChip GX II（PerkinElmer）を使用してＣＥ−ＳＤＳによって分析した。
【０５１９】
抗体調製物の凝集物含量は、２００mM Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０をランニング緩衝液として使用して、BioSuite高分解能ＳＥＣ、２５０Å、５μmの分析用サイズ排除カラム（Waters GmbH）を使用して高性能ＳＥＣによって決定した。
【０５２０】
【表３３】
2017534645.tif 000034
【０５２１】
抗体０１４４は、配列番号１１７（ＶＨ）及び配列番号１１８（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位、並びに配列番号９２（ＶＨ）及び配列番号９７（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位を含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５２２】
抗体０１１７は、配列番号１１９（ＶＨ）及び配列番号１２０（ＶＬ）のＶＥＧＦ結合部位、並びに配列番号９２（ＶＨ）及び配列番号９７（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位を含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５２３】
抗体０１４５は、配列番号１１９（ＶＨ）及び配列番号１２０（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位、並びに配列番号１０１（ＶＨ）及び配列番号１０６（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位を含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５２４】
抗体０１４６は、配列番号１１７（ＶＨ）及び配列番号１１８（ＶＬ）のＡＮＧ２結合部位、並びに配列番号１２１（ＶＨ）及び配列番号１２２（ＶＬ）のＰＤＧＦ−Ｂ結合部位を含む、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。
【０５２５】
実施例３２
二重特異的抗体の動態特徴付け
ＰＤＧＦ−ＢＢ
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する二重特異的抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体／抗ＡＮＧ２抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。約５０共鳴単位（ＲＵ）の組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．５μg/ml；発注番号２２０−ＢＢ；R&D Systems）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ４．０のシリーズＳ ＣＭ３チップ（GE Healthcare ＢＲ−１００５−３６）上に結合させた。固定のためのランニング緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｎであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）。以下の動態特徴付けのための、ランニング緩衝液及び希釈緩衝液はｐＨ７．４のＨＢＳ−Ｐであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、GE Healthcare）。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回刺激した。
【０５２６】
１：３連続希釈液の３００nMで始めて溶液中の様々な濃度の二重特異的抗体の３０μl/分の流速での１８０秒間の注入によって会合を測定した。解離相を、９００秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによってトリガーした。０．８５％のＨ３ＰＯ４（リン酸）溶液を５ml/分の流速で用いて６０秒間洗浄することによって表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランク表面から得られた応答を差し引くことによって修正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０５２７】
ＡＮＧ２
ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−マウスＦｃ領域融合に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。約４０００ＲＵの抗マウスＦｃ領域抗体（１０μg/mlの抗マウス（Ｆｃ）抗体）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ５．０のシリーズＳ ＣＭ５チップ（GE Healthcare ＢＲ−１００５−３６）上に結合させた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）を、固定手順中のランニング緩衝液として使用した。以下の動態特徴付けのための、試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、動態特徴付けの前にランニング緩衝液で２回刺激した。
【０５２８】
ヒトＡＮＧ２−ＲＢＤ−マウスＦｃ領域融合物を、５μl/分の流速で１μg/ml溶液を３０秒間注入することによって捕捉した。１：３の連続希釈液の３００nMで始めて９０μl/分の流速での溶液中の様々な濃度の二重特異的抗体の９０秒間の注入によって会合を測定した。解離相を６００秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによってトリガーした。５μl/分の流速で３M ＭｇＣｌ２溶液を用いて６０秒間洗浄することによって全ての表面を再生した。バルク屈折率の差を、抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことによって修正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを。
【０５２９】
ＶＥＧＦ
ヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。抗ヘキサヒスチジン抗体を、製造業者の説明書に従って、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによってＣＭ５チップ（GE Healthcare ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、GE Healthcare）を、固定手順中にランニング緩衝液として使用した。以下の動態特徴付けのための、試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare）。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、動態特徴付けの前にランニング緩衝液で２回刺激した。
【０５３０】
ヒスチジンタグを含むヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１を、５μl/分の流速で３０秒間溶液を注入することによって捕捉した。１：３の連続希釈液で３００nMで始めて９０μl/分の流速での溶液中の様々な濃度の二重特異的抗体の９０秒間の注入によって会合を測定した。解離相を６００秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。５μl/分の流速で３M ＭｇＣｌ２溶液を用いて６０秒間洗浄することによって全ての表面を再生した。バルク屈折率の差を、抗ヘキサヒスチジン抗体表面から得られた応答を差し引くことによって修正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017534645.tif 000036
2017534645.tif 000037