(57)【要約】  ボレリア・ブルグドルフェリ組換えタンパク質およびボレリア・ブルグドルフェリのあるタンパク質に対する抗体の存在についてサンプルを判断するための方法が記載され、ライム病を診断するための方法も記載される。ボレリア・ブルグドルフェリのタンパク質のマイクロアレイもまた、記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つのボレリア組換えタンパク質抗原を含む組換えボレリア融合タンパク質構築物であって、前記組換え抗原が、表１から選択される組換えボレリア融合タンパク質構築物。
【請求項２】
前記融合タンパク質構築物の分子量が、約１００ｋＤａまたはそれ以下である、請求項１に記載のタンパク質融合構築物。
【請求項３】
前記組換え抗原が、配列番号１および配列番号２を含むプライマーによりＰＣＲによって増幅される、請求項１に記載のボレリア融合構築物。
【請求項４】
請求項１に記載の組換えボレリア融合タンパク質構築物を含むベクター。
【請求項５】
表５の構築物のグループから選択されるボレリア組換え融合タンパク質構築物。
【請求項６】
表５の１つまたは複数のボレリアキメラタンパク質抗原を含むマイクロアレイ。
【請求項７】
表１の１つまたは複数の組換えボレリアタンパク質抗原をさらに含む請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
ＯｓｐＢ−ＯｓｐＣ−フラジェリン（Ｂ−Ｃ−Ｆｌａ）、ＯｓｐＡ−ｐ３９−ｐ９３（Ａ−３９−９３）、およびＯｓｐＣ  Ｂ型およびＨ型からなるＯｓｐＣ二量体（ＯＣ２／９）からなる群から選択される１つまたは複数のボレリア組換えタンパク質抗原をさらに含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
表６の組換えボレリアタンパク質抗原および融合タンパク質抗原を含むマイクロアレイ。
【請求項１０】
表８の組換えボレリアタンパク質抗原および融合タンパク質抗原を含むマイクロアレイ。
【請求項１１】
試験サンプル中のボレリア・ブルグドルフェリタンパク質に対する抗体の存在についてライム病を有することが疑われる対象から得られた前記サンプルを判断するステップを含むライム病を診断するための方法であって、表５、６、または８の１つまたは複数のボレリア融合タンパク質抗原を含むマイクロアレイと前記サンプルを接触させるステップおよび前記ボレリア融合タンパク質抗原に対して反応性の前記サンプル中の抗体の存在を検出するステップを含み、１つまたは複数のボレリアキメラ抗原に対する抗体の存在の検出が、前記対象におけるライム病の存在を示す方法。
【請求項１２】
前記マイクロアレイが、表６の組換え抗原および融合タンパク質抗原のすべてからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロアレイが、表８の組換え抗原および融合タンパク質抗原のすべてからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
試験サンプル中のボレリア・ブルグドルフェリタンパク質に対する抗体の存在についてライム病を有することが疑われる対象から得られた前記サンプルを判断するステップを含む対象におけるライム病を診断するための方法であって、表６の組換えボレリアタンパク質抗原を含むマイクロアレイと前記サンプルを接触させるステップおよび前記組換えボレリア抗原に対して反応性の前記サンプル中の抗体の存在を検出するステップを含み、１つまたは複数の組換えボレリア抗原に対する抗体の存在の検出が、前記対象におけるライム病の存在を示す方法。
【請求項１５】
試験サンプル中のボレリア・ブルグドルフェリタンパク質に対する抗体の存在についてライム病を有することが疑われる対象から得られた前記サンプルを判断するステップを含む対象におけるライム病を診断するための方法であって、表８の組換えボレリアタンパク質抗原を含むマイクロアレイと前記サンプルを接触させるステップおよび前記組換えボレリア抗原に対して前記反応性のサンプル中の抗体の存在を検出するステップを含み、１つまたは複数の組換えボレリア抗原に対する抗体の存在の検出が、前記対象におけるライム病の存在を示す方法。
【請求項１６】
試験サンプルにおいてボレリア・ブルグドルフェリに対する抗体を検出するための方法であって、表５の１つまたは複数の組換えボレリア融合タンパク質抗原のマイクロアレイと前記サンプルを、前記サンプル中の前記抗体が前記融合タンパク質抗原と反応するのに十分な条件下で接触させるステップおよび抗体−抗体反応を検出するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記マイクロアレイが、表６の組換え抗原および融合タンパク質抗原を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロアレイが、表８の組換え抗原および融合タンパク質抗原を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
試験サンプルにおいてボレリア・ブルグドルフェリに対する抗体を検出するための方法であって、表６の組換えボレリア抗原および融合タンパク質抗原からなるマイクロアレイと前記サンプルを、前記サンプル中の前記抗体が前記抗原と反応するのに十分な条件下で接触させるステップならびに抗原−抗体反応を検出するステップを含む方法。
【請求項２０】
試験サンプルにおいてボレリア・ブルグドルフェリに対する抗体を検出するための方法であって、表８の組換えボレリアタンパク質抗原および融合タンパク質抗原からなるマイクロアレイと前記サンプルを、前記サンプル中の前記抗体が前記抗原と反応するのに十分な条件下で接触させるステップならびに抗原−抗体反応を検出するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月６日に提出された米国仮特許出願第６２／０７６，０５９号明細書および２０１４年１０月７日に提出された米国仮特許出願第６２／０６０，８６７号明細書の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイル中の資料の参照による組み込み
本出願は、これとともに同時に提出されている以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含有される配列表を参照により組み込む。
ａ）ファイル名：４３３８１００１００２＿ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ；２０１５年１０月６日に作成、サイズ１２０ＫＢ。
【０００３】
政府による支援
本発明は、疾病対策センター（ＣＤＣ）からのＣＫ０００１５０の下での政府による支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ライム病は、北米および欧州において、最も多い、媒介動物によって運ばれる疾患であり、その範囲および発生率は、増加しつつある。ヒトライム病は、ライム病の原因となる細菌複合種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する密接に関係のあるスピロヘータのグループのいくつかのメンバーによって引き起こされる。スピロヘータは、マダニ属のマダニを介してヒトに伝染する（Ｓｔｅｅｒｅ，Ａ．Ｃ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８９；３２１：５８６−９６）。それは、神経系、心臓、および関節を含む二次的な部位に感染で初期に広がり得る初期皮膚感染症によって特徴付けられる進行性の多臓器障害である（Ｍａｓｕｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；４０：５３９−４５；Ｓｔａｎｅｋ，Ｇ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １９９１；１９：２６３−７）。ライム病の正確な診断および治療は、客観的な臨床的異常を、Ｂ．ブルグドルフェリへの暴露についての血清学的な証拠と相関させることに依存している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新規な組換えボレリア・ブルグドルフェリタンパク質および対象におけるライム病を診断するための非常に高感度で特異的な方法におけるそれらの使用を包含する。特に、本発明は、少なくとも３つの組換えボレリア・ブルグドルフェリタンパク質抗原を含む組換えボレリア融合タンパク質構築物に関する。これらの構築物はまた、ボレリアキメラタンパク質抗原またはボレリアキメラとも本明細書において呼ばれる。融合タンパク質構築物は、表４、５、６および８に本明細書において記載される。
【０００６】
本発明はまた、試験サンプル中のボレリア・ブルグドルフェリに対する抗体の存在を検出するために試験サンプルを判断するためのアッセイにおいて、これらの組換えボレリア融合タンパク質の１つまたは複数またはすべてを使用するための方法にも関する。たとえば、本明細書において記載されるボレリア融合タンパク質（たとえば表４、５、６、および８）は、検出方法においておよびＥＬＩＳＡ、他の免疫学的アッセイ、または抗体−抗原結合もしくは抗体−抗原結合複合体を検出することができる任意のアッセイ方法において使用するためのタンパク質アレイまたはマイクロアレイを調製するために使用することができる。これらの検出アッセイにおける表４、５、６、および８のボレリア融合タンパク質の使用に加えて、１つまたは複数のさらなる組換えボレリア抗原を、表１に列挙される組換えボレリア抗原などのように、そのようなアッセイまたはマイクロアレイに含むことができる。本発明の一実施形態では、マイクロアレイが、表６の２５の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。別の実施形態では、マイクロアレイが、表８の１１の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。
【０００７】
表４、５、６、もしくは８の１つもしくは複数の組換えボレリア・ブルグドルフェリ融合タンパク質またはさらに１つもしくは複数の表１に列挙される組換えボレリア抗原と反応性の抗体について、対象から得られた試験サンプルを判断することによって、対象（ヒトを含む哺乳動物など）におけるライム病を診断するための方法であって、抗体−抗原反応物（抗体−抗原反応産物とも本明細書において呼ばれる抗体−抗原結合複合体など）の検出が、その個人がライム病であることを示す方法が、本発明によってさらに包含される。抗体−抗原複合体を検出するためのそのようなアッセイは、当業者らによく知られている。本発明の特定の実施形態では、マイクロアレイが、検出／診断アッセイにおいて使用され、マイクロアレイは、表４、５、６、および８に本明細書において記載される組換えボレリアキメラタンパク質ならびにさらに表１に記載される組換えボレリア抗原を含む。本発明の一実施形態では、マイクロアレイが、表６の２５の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。別の実施形態では、マイクロアレイが、表８の１１の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。
【０００８】
この発見の結果として、非常に高感度で特異的な方法およびマイクロアレイが、ボレリアのタンパク質に対する抗体の存在についての試験サンプルの評価に現在利用可能である。そのような抗体の存在は、ライム病についての診断に役立つ。そのうえ、方法は、ライム病に関する、可能性として考えられる診断に役立つ候補およびワクチンの候補を同定するのに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
同様の参照記号が様々な図の全体にわたって同じ部分を指す添付の図面において示されるように、前述のものは、本発明の例となる実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに、本発明の実施形態を説明することに重点を置いている。
【図１】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図２】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図３】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図４】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図５】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図６】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図７】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図８】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図９】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【図１１】図は、表６のキメラ抗原（配列番号３〜２７）およびＯＣ２／９の変異体（配列番号２８〜３０）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の例となる実施形態の説明が続く。
【００１１】
ライム病についての正確で信頼できる診断アッセイは、治療および回復の成功を確実にするのに不可欠である。しかしながら、その疾病の血清診断法は、Ｂ．ブルグドルフェリ分離株の遺伝子異質性が高レベルなために、一つの場所から収集されたものの中でさえ著しく困難となる。さらに、ライム病のための現在の血清診断試験は、その疾病の初期においてＢ．ブルグドルフェリ感染症を検出するための感度および特異度が不足している。本発明では、４８の非常に抗原性のボレリア・タンパク質を同定した。これらの組換えボレリアタンパク質抗原は、初期のライム病を有する患者由来の血清を含む、分析されたすべての血清サンプルの大部分によって認識される。さらに、非常に抗原性のボレリアタンパク質のこのライブラリーは、表４、５、および６に示される組換えボレリアキメラ抗原タンパク質のセットならびに本明細書において記載される表６の２５の組換えおよびキメラ抗原または１１の組換え抗原および組換えキメラ抗原（表８）を含有する非常に高感度で特異的な組換えタンパク質ベースアッセイを開発するために使用された。
【００１２】
ある細胞外被タンパク質に対する抗体が、ライム病を有する個人の血清中に存在することが発見された。本明細書において記載されるように、組換えボレリア・ブルグドルフェリ抗原性タンパク質およびキメラ抗原を含有するマイクロアレイを調製した。マイクロアレイを、播種性ライム病とあらかじめ診断された個人由来の血清などのような試験サンプルに暴露した。結果は、ライム病を有する個人の血清が、表１、４、５、６、および８に示される特異的な組換えボレリアタンパク質と反応したことを示した。特に、個人由来の多数の血清は、表６および８に示されるタンパク質のようなタンパク質の特異的なサブセットと反応した。結果は、ライム病を有する個人の血清が、表１および４および５に示す組換えおよびキメラボレリアタンパク質と、特に、表６および８に示す非常に免疫原性のタンパク質と反応したことを示した。本明細書において記載されるライム病アッセイの全体的な感度および特異度を表２、３、７、９、および１０に示す。
【００１３】
本発明のある方法およびマイクロアレイにおいて、１つまたは複数の組換え細胞外被タンパク質抗原、組換え抗原、および／またはキメラ抗原（融合タンパク質構築物）が、使用される。ある実施形態では、２つ以上の抗原のセットが、使用される。本明細書において包含される他の実施形態は、表８の３つの抗原、４つの抗原、５つの抗原など、１１までの抗原、表４の１６の抗原、表６の２５の抗原、表５の９６の抗原、もしくは表１の４８の抗原または前述の表のすべての抗原を含む。代表的なセットは、表１、４、５、６、および８に示すタンパク質のセットを含む。そのようなセットは、細胞外被タンパク質の相同体およびパラログをさらに含むことができる。特定の一実施形態では、セットが、表６に示す抗原から本質的になる。別の特定の実施形態では、セットが、表８に示す抗原から本質的になる。
【００１４】
本発明のさらなる方法およびマイクロアレイでは、本明細書において同定される１つまたは複数の他のタンパク質が、使用され、タンパク質の他の組み合わせが、使用される（たとえば、表１、４、５、６、および８のいずれかから選択されるタンパク質を組み合わせて）。そのような組み合わせは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上またはタンパク質の他のグループのセット（たとえば、表１、表５、および／もしくは表６から選択される１つもしくは複数を有する）を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、個人由来の試験サンプルが、Ｂ．ブルグドルフェリの１つまたは複数のタンパク質（たとえば組換えまたはキメラ抗原）に対する抗体の存在について判断される。「試験サンプル」は、個人由来の血液、血清、脳脊髄液、または他の適切な生体液のサンプルである。方法において、試験サンプルは、当技術分野において確立されたルーチン的な方法を使用して、１つまたは複数のタンパク質に対する抗体の存在について判断される。特定の一実施形態では、評価が、ボレリアタンパク質のマイクロアレイを使用して実行される。ある方法では、たとえばアレイ、たとえば、下記に記載されるマイクロアレイまたは本明細書において記載されるタンパク質もしくはタンパク質のセットが、個人由来の試験サンプルに暴露され、タンパク質に対する抗体のあらゆる、結果として生ずる結合（試験サンプル中に存在する場合）が決定される。１つまたは複数の抗原に結合する（本明細書において「〜と反応性の」とも言われる）抗体の存在は、抗体がＢ．ブルグドルフェリのタンパク質に特異的であることを示す。そのような抗体の存在は、試験サンプルを得た個人におけるライム病についての診断に役立つ。
【００１６】
本明細書において記載されるアッセイ方法は、Ｂ．ブルグドルフェリ抗原のアレイを包含する。一実施形態では、アレイが、表１、４、５、６、または８に記載されるタンパク質セットなどのような、Ｂ．ブルグドルフェリの組換えタンパク質のサブセットを含む。他の実施形態では、他のアレイが、表１、５、または６に記載される抗原性タンパク質の２つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上または他のグループのセットなどのような、Ｂ．ブルグドルフェリのタンパク質の様々なサブセットを含む。特定の一実施形態では、マイクロアレイが、表６に記載されるタンパク質のすべてから本質的になるまたは表６に記載されるタンパク質のすべてからなる。別の特定の実施形態では、マイクロアレイが、表８に記載されるタンパク質のすべてから本質的になるまたは表８のタンパク質のすべてからなる。さらなる実施形態では、他のマイクロアレイが、表１または表５に記載されるタンパク質のサブセットなどのような、Ｂ．ブルグドルフェリのタンパク質の様々なサブセットを含む（２つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上または表６もしくは表８に記載されるタンパク質の他のグループのセット）。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、ライム病のための診断試験の開発のための有力候補としてのＢ．ブルグドルフェリの他のまたはさらなるタンパク質の判定／評価のためのおよびさらにライム病から保護するためのワクチンの開発のための有力候補としてのＢ．ブルグドルフェリのタンパク質の評価のための方法を包含する。これらの方法において、表６または表８において本明細書において記載されるものなどのようなＢ．ブルグドルフェリの１つまたは複数のタンパク質は（たとえば上記に記載されるマイクロアレイにおいて）、ライム病を有することが知られている１つまたは複数の個人由来の血清に暴露され、次いで、血清由来の抗体が結合するタンパク質が、決定される。たとえば、蛍光のＣｙ５強度／Ｃｙ３強度比が、実施例において記載されるように、使用することができる。ネガティブコントロールに対するライム血清の反応性の平均の比プラス標準偏差の３倍を超える任意のタンパク質の比は、ライム血清中に存在する抗体およびＢ．ブルグドルフェリタンパク質の間の有意な相互作用を示す。そのようなタンパク質は、下記に記載されるように、対象において免疫応答を誘発するためのワクチン組成物に有用であると考えるのは合理的である。そのようなタンパク質はまた、ライム病のための診断試験において（たとえば上記に記載される方法において）および本明細書において記載されるマイクロアレイにおいて使用することができるタンパク質であり、そのうえ、可能性として考えられるワクチン候補として使用することができる。
【００１８】
ライム病を有する個人の血清と反応するとして本明細書において同定されたタンパク質は、ボレリア感染症に対するワクチン免疫原として有用である。したがって、本発明はまた、動物またはヒトにおいてワクチン接種するおよび／またはボレリア感染症を治療するために使用することができる医薬組成物にも関する。特定の実施形態では、医薬組成物が、表５、６、もしくは８に示されるものなどのような、１つもしくは複数のボレリア・ブルグドルフェリ抗原または表１に示されるものなどのような別のボレリア・ブルグドルフェリ抗原または細胞外被タンパク質に由来するタンパク質または他のタンパク質（たとえば、全教示が本明細書において参照によって組み込まれる米国特許第６，２４８，５６２号明細書；米国特許第７，００８，６２５号明細書；米国特許第７，０６０，２８１号明細書；および米国特許第７，１７９，４４８号明細書において記載されるものなどのような、挿入、欠失、もしくは他の改変などのような修飾を有するタンパク質またはキメラタンパク質の一部を形成するタンパク質）を含む。本明細書において記載されるタンパク質（たとえば表１、５、６、および８のタンパク質）の組み合わせもまた、使用することができる。
【００１９】
医薬組成物はまた、生理学的に許容され得るキャリヤ、賦形剤、および／または補助剤と一緒に投与することができる。適した補助剤は、当技術分野においてよく知られており（たとえば、全教示が本明細書において参照によって組み込まれる国際公開第９６／４０２９０号パンフレットを参照）、たとえば、治療される動物におけるタンパク質の免疫原性、効力、または半減期を増強するために使用することができる。
【００２０】
ワクチン接種するおよび／またはボレリア感染症を治療するために使用される医薬組成物は、当技術分野においてよく知られているワクチンを調製するための方法を使用して調製することができる。たとえば、本明細書において記載されるタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、調製用の電気泳動法、選択的沈殿、またはその組み合わせによってなどのように、既知の技術によって単離するおよび／または精製することができる。調製されたタンパク質は、タンパク質が適した濃度となるように、本明細書において記載される適切な他の試薬と混合することができる。タンパク質の投薬量は、変動するであろう、また、治療されることとなる動物、たとえば哺乳動物、ヒトの年齢、体重、および／または身体的な状態に依存する。最適な投薬量は、適した動物モデルを使用し、ルーチン的な最適化技術によって決定することができる。
【００２１】
ワクチンとして使用される医薬組成物の投与は、任意の適した技術によるものとすることができる。医薬組成物の投与に適した技術は、注射、たとえば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射；粘膜投与、たとえば、本発明のタンパク質を含有する点鼻剤への鼻粘膜の暴露；経口投与；およびＤＮＡ免疫を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
そのうえ、ライム病を有する個人の血清と反応するとして本明細書において同定されたタンパク質（たとえば、表１および／または表４および／または表５、特に表６および８に示されるタンパク質）ならびに本明細書において記載される方法は、当業者がそれらの特異的なタンパク質を標的にすることによって疾患のための治療を調整するのを可能にする予診マーカーとして使用することができる。たとえば、万一、個人の血清がタンパク質の特定のサブセットと反応性を示せば、それらのタンパク質との個人の血清の反応性を低下させるおよび／または排除することによって示されるように、個人におけるそれらのタンパク質の存在を低下させるおよび／または排除するために療法を開始することができる。
【００２３】
本発明はまた、本明細書において記載されるタンパク質を含む診断および／または予診キットにも関する（たとえば、上記に記載されるマイクロアレイにおいて）。キットはまた、タンパク質およびサンプル、たとえば使用者により提供された宿主サンプル中に存在する抗体の間で形成される抗体−抗原複合体を検出するための試薬をも含む。
【００２４】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは、限定するものとして決して解釈されないものとする。
【００２５】
実施例１：４８のボレリア抗原の発見
タンパク質アレイ。合計４１６の遺伝子がＢ．ブルグドルフェリゲノムの比較で同定された。これらのうち、３５０（８４％）が、ＰＣＲを実行した場合にサイズが正確であった産物を産生し、３５０すべてがＴ７発現ベクターｐＥＴ２８ｂへのクローニングに成功した。配列を確認したプラスミドは、その一晩自動発現系を使用して発現させ、発現したタンパク質は、ＩＤＡ樹脂を使用して精製し、ニトロセルロースコーティングＦＡＳＴスライド上にプリントした（たとえば、教示が本明細書において組み込まれる米国特許出願公開第１２／７８４，５８４号明細書および米国特許出願公開第１２／９８９，００３号明細書を参照）。そのうえ、代表的ないくつかの異なるＯｓｐＣ型をヒト分離株から増幅した。この研究に含まれたＯｓｐＣ型は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、およびＵ型であった。この研究はまた、初期のタンパク質アレイ研究において同定された非常に抗原性のＢ３１細胞外被タンパク質をも含んだ（Ｘｕ  Ｙｅｔ  ａｌ，２００８）。全体で、アレイは、発現ボレリアタンパク質、陰性コントロール、およびブランクを含めて、およそ４００のサンプルを含有した。アレイをライム病患者由来の血清によりプローブし、抗体は、抗体アイソタイプを決定するためにＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＭにより視覚化した（Ｘｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【００２６】
血清サンプル。初期アレイ研究のために、ライム病を有する患者の血清を疾病対策センター（ＣＤＣ）から得た。ＣＤＣサンプルは、初期症状（サンプルＣ＝０日）の際にならびに症状が出た１０日（サンプルＤ）、２０日（サンプルＥ）、３０日（サンプルＦ）、６０日（サンプルＧ）、および９０日（サンプルＨ）後に収集された３１人の患者由来の血清を含んだ。Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒから得られた末期臨床症状（ライム関節炎または神経ボレリア症）を示した患者由来の１４の末期ライムサンプル（末期）もまた分析した。２１のサンプルＣ、２９のサンプルＤ、１５のサンプルＥ、８のサンプルＦ、１のサンプルＧ、および１２のサンプルＨを含んだ合計１１５のサンプルを分析した。正常コントロール血清（ｎ＝１４）は、健康なドナーから得た。
【００２７】
タンパク質アレイをさらに判断するために、血清をＭａｒｋ  Ｓｏｌｏｓｋｉ博士、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤから得た。サンプルは、初期症状（サンプルＶ１＝初期ライムと診断、治療前）の際にならびに症状が出た３週間（サンプルＶ２＝診断の３週間後／および治療の始め）、７週間（サンプルＶ３＝診断／治療の７週間後）、ならびに１５〜１７週間（サンプルＶ４＝診断／治療の約１５〜１７週間後）後に収集された５０人の患者由来の血清を含んだ。グループ当たり合計４６のサンプルを分析した。特異度研究のために、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する患者から血清を得た。これらは、梅毒、狼瘡、および関節リウマチを有する患者を含んだ。正常コントロール血清は、健康なドナーから得た。
【００２８】
結果。アレイタンパク質のおよそ１４０が、喜ばしいことに、両方の二次抗体を使用し、自然感染を有するヒトにおいて抗体応答を誘発した。これらの１４０の抗原のうち、８０のタンパク質が、各時点由来の血清サンプルの少なくとも半分によって認識された。重要なことには、大部分の血清は、ＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を使用し、４８の非常に抗原性のボレリアタンパク質のサブセット由来の少なくとも１つの抗原を認識した（表１）。この高度な陽性は、患者に遊走性紅斑が最初に見られた時に収集された血清をすべて含んだ。これらの４８のタンパク質のＣｙ５／Ｃｙ３比は、アレイにおいて最高水準で観察され、平均して、ネガティブコントロールに対するライム血清の反応性の平均の比を標準偏差の５倍超えた。そのうえ、記録されたボレリア配列をすべて除くＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースに対する、非常に免疫原性のボレリアタンパク質によるＢＬＡＳＴｘ検索は、他の生物体に対する有意なマッチを示さなかった。興味深いことには、４８の抗原のうちの４０は、プラスミドにコードされており、大部分のコードタンパク質は、細胞表層タンパク質、リポタンパク質、または推定外膜タンパク質である。プラスミド遺伝子配列の９０％超は、非Ｂ．ブルグドルフェリ遺伝子に対して有意な相同体を有していない。プラスミド配列の特有性は、それらが自然界および種々様々の宿主においてボレリアの生存および増殖のための特殊な、適応を助ける役割を果たすことを示唆する。さらに、プラスミド配列の変異性に関連する、プラスミドによってコードされる多数の細胞表層リポタンパク質は、これらの配列が寄生動物−宿主相互作用に直接関与し、そのため、ほぼ間違いなく鍵となる免疫原となるという見解を支持する。（Ｃａｓｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。
【００２９】
【表１】
2017531657.tif 000002
【００３０】
本明細書において記載されるアッセイの感度は、疾病の初期の患者において、市販で入手可能なライム病アッセイにはるかにまさっている。本発明のアッセイの感度を、２９人の初期ライム病患者を使用して、４８のボレリア抗原で２段階制試験（ｔｗｏ−ｔｉｅｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ）において比較した。ＥＭを有する２９人の患者の中で、ＩｇＭまたはＩｇＧ二次抗体を用いる発明者らのタンパク質アレイの感度は、初期症状時に９６％（サンプルＶ１）および３週間後の回復期の間で９７％（サンプルＶ２）であった。比較すると、パーセンテージは、標準の２段階制試験について、それぞれ４８％および６９％であった。血清検体のこのセットについての本明細書において記載されるライムアッセイの全体的な感度および特異度を、表２および表３において下記に示す。
【００３１】
【表２】
2017531657.tif 000003
【００３２】
【表３】
2017531657.tif 000004
【００３３】
実施例２：組換えキメラボレリアタンパク質を使用するタンパク質アレイ。
概要。４８の非常に抗原性のボレリアタンパク質を使用するキメラタンパク質のライブラリーは、ライム病についての組換えキメラベースの診断アッセイを開発する際に使用するためにデザインした。いくつかの遺伝種由来の遺伝子を含有する組換えキメラ構築物は、複数の株に抗原性を付与するあるタンパク質を生成することを可能にし、この技術の素晴らしい可能性および適応性を示す。そのうえ、抗原としての純粋なタンパク質調製物の使用は、様々なアッセイ方式に試験を適応させる際に、より素晴らしい柔軟性を与える。組換えキメラタンパク質のアッセイが、最良の全細胞アッセイと比較した場合に、初期の疾患についてＢ．ブルグドルフェリに対する抗体を検出する際に優れた感度および末期の疾病について同等の感度を示すであろうと考えることは合理的である。
【００３４】
キメラタンパク質。４８の非常に抗原性のボレリアタンパク質の発明者らのライブラリーから、発明者らは、ボレリア抗原のうちの３つをそれぞれ含有する１６セットのキメラタンパク質を構築した（表４）。それぞれのボレリアタンパク質を、ある融合構築物に無作為に割り当て、二次構造の特徴がタンパク質エピトープの提示に影響を与え得るかどうかを決定するために、６つの考え得るタンパク質の順序の組み合わせをすべて合成した。９６の融合構築物を表５に示す。３つのボレリア抗原のキメラは、タンパク質サイズが有意に影響を与え得るタンパク質収率を最適化するために、約１００ｋＤａまたはそれ以下（それより下）の分子量の融合タンパク質を保つように選んだ。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
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【００３７】
【表６】
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【００３８】
【表７】
2017531657.tif 000008
【００３９】
【表８】
2017531657.tif 000009
【００４０】
組換え融合タンパク質のクローニング。４８のＢ．ブルグドルフェリ抗原をコードするボレリア遺伝子は、発明者らがキメラタンパク質構築のために特別にデザインした特有の遺伝子特異的プライマー対を使用して増幅した。プライマーは、Ｂ．ブルグドルフェリ株のゲノム配列からデザインし、それぞれ、遺伝子コード配列とインフレームである３つの制限エンドヌクレアーゼについての認識配列をコードする新規なＤＮＡカセットを含有する。５’プライマー（５’−ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧ＋１５ＭＥＲ  ＯＲＦ特異的配列）（配列番号１）は、Ｋｐｎｌ（下線）、ＢａｍＨＩ（太字）、およびＮｄｅｌ（イタリック体）認識配列を含有する。３’プライマー（５’ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣ＋１５ｍｅｒ  ＯＲＦ特異的配列）（配列番号２）は、ＢａｍＨＩ、Ｋｐｎｌ、およびＳａｌｌ（破線のアンダーライン）認識配列を含有する。増幅のために、１０ｎｇのゲノムＤＮＡを、２つのＯＲＦ特異的プライマー対を含有する５０μｌ  ＰＣＲ反応液において鋳型として使用した。発現された細胞外被タンパク質の可溶性特性を増加させるために、プライマーセットは、膜アンカーシグナル配列なしのコード領域を増幅するようにデザインした（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＰＣＲ増幅は、発明者らが以前に記載した条件を使用し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてストリンジェントな条件下で実行した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法によって視覚化した。定量化のために、産物は、精製し（ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）、ＵＶ吸光度によって定量化した。３つの遺伝子フラグメントから構成される組換え融合タンパク質のライブラリーを作るために、増幅産物は、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ（１’１位置の断片について）またはＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ（第２の位置の断片について）またはＫｐｎＩ／Ｓａｌｌ（第３の位置の断片について）により切断した。第１の位置の断片は、Ｔ７ベースの発現ベクターｐＥＴ−２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）の特有のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の中に方向性をもたせてクローニングした。このベクターは、ニッケル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上での精製を助けるために、発現タンパク質に融合されるＮ−末端ポリ（Ｈｉｓ）アフィニティータグを提供する。ラーゲ−ション反応物は、大腸菌ＧＣ５コンピテント細胞の中に形質転換し、プラスミドは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ９６  ＶＡＣ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｎｄ  Ｋｉｔを使用して精製し、挿入物全体にわたってシークエンシングすることによって検証した。ここで断片１を含有するプラスミドは、すべての続くクローニングのためのベクターとして果たした。断片２および３の方向性をもつクローニングのために、ベクターをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩｌにより消化し、断片２および３の制限消化アンプリコンを、消化されたベクターの中に同時にライゲーションした。形質転換後、プラスミドを精製し、シークエンシングした。
【００４１】
タンパク質の発現および精製。精製されたプラスミドは、発現のために大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３コンピテント細胞の中に形質転換した。Ｎ−末端ポリ（Ｈｉｓ）アフィニティータグを含有するキメラボレリアタンパク質は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎプロトコールを使用して発現させる。誘導された細胞を遠心分離法によって回収し、８Ｍ尿素中に再懸濁する。一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流した。Ｎ−末端ポリＨｉｓタグタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、変性条件下でニッケル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で精製した。キットは、Ｈｉｓタグ融合タンパク質の迅速なスクリーニングおよび精製のためにデザインする。タンパク濃度は、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０がタンパク質と反応した場合の吸光度シフトの測定によって決定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。
【００４２】
血清サンプル。キメラタンパク質の抗原性は、上記に記載されるＣＤＣ血清サンプルＣ（１２のサンプル）およびＥ（１１のサンプル）ならびにボルティモア血清サンプルＶ１（２８のサンプル）およびＶ２（２３のサンプル）を使用して試験した。そのうえ、さらに３２の血清サンプルをＣＤＣ（ＣＤＣ−Ｒ１）から得た。これらは、１２のライム患者由来の血清を含んだ。ライム病試験における交差反応性に関連する疾患を有する１２人の患者および８人の正常コントロール。さらに、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する患者から３５の血清をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹから得た。これらは、梅毒、狼瘡、および関節リウマチを有する患者を含んだ。７つの正常コントロール血清もまた、健康なドナーから得た。
【００４３】
マイクロアレイ。タンパク質マイクロアレイのために、組換えタンパク質および個々の４８のボレリア抗原のそれぞれを、ニトロセルロースコーティングＦＡＳＴスライドガラス上にプリントした。そのうえ、初期研究由来の組換えタンパク質ＯｓｐＢ−ＯｓｐＣ−フラジェリン（Ｂ−Ｃ−Ｆｉａ）、ＯｓｐＡ−ｐ３９−ｐ９３（Ａ−３９−９３）、およびＯｓｐＣ  Ｂ型およびＨ型から構成されるＯｓｐＣ二量体（ＯＣ２／９）もまたプリントした（Ｇｏｍｅｓ  Ｓｏｌｅｃｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，２０００）。アレイ中のそれぞれのスライドはまた、バックグラウンド決定のために１０の固定ＢＳＡスポットをも含有した。プロテオームチップは、Ｆａｓｔ  Ｐａｋタンパク質アレイキットを使用し、未治療初期ライム病を有する患者および非ライムの病気の患者由来の血清によりプローブした。手短かに言えば、スライドは、２時間、一次抗体（ヒト血清および定量化のためのマウス抗Ｈｉｓタグ）中でのインキュベーションの前に、タンパク質アレイ遮断バッファー中で４℃で一晩、最初に遮断した。抗体は、Ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＭ（結合したヒト抗体を検出するため）およびＣｙ３コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（それぞれのスポットにおける組換えタンパク質の量を定量化するため）により視覚化した。２時間のインキュベーションの後、スライドは、厳重に洗浄し、次に、Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４２００Ａマイクロアレイスキャナによりスキャンした。未加工のデータを捕らえ、Ｇｅｎｅ  Ｐｉｘ  Ｐｒｏ画像解析ソフトウェアにより分析した。サンプルの間でばらつきを最小限にするために、ＰＭＴ  ｇａｉｎは、すべてのアレイにおいて等しく１．０に調節し、パワー設定は５０％にした。グローバル背景差分法（ｇｌｏｂａｌ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）は、それぞれのスライド由来のＢＳＡの平均強度値を使用して、それぞれのスポットからバックグラウンドを差し引くために使用した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００４４】
データ分析。ヒト血清を有するアレイから生成されたデータの分析のために、スポットの中央蛍光強度が１０００を超え、かつスポットのＳＮＲ（シグナルノイズ比）が４を超える場合、スポットは、陽性と見なされ、さらなる比の分析に含めた。次いで、それぞれのタンパク質についてのＣｙ５強度／Ｃｙ３強度（タンパク質／Ｈｉｓタグ）の比を計算した。実験はすべて２回行い、それぞれのタンパク質のＣｙ５／Ｃｙ３比を平均する。タンパク質に対する１７人の非ライムの病気の患者の反応性の平均の比プラス標準偏差の３倍よりも大きな、いかなるキメラタンパク質のＣ５／Ｃ３比も、ライム血清中の抗体および固定タンパク質の間の有意な相互作用を示した。
【００４５】
結果。初期ライム病を有する患者由来のサンプルから構成される血清パネルは、抗Ｂ．ブルグドルフェリ抗体を検出するためのそれらの感度を決定するために、キメラタンパク質のアレイをスクリーニングするために使用した。アレイタンパク質に対する個々の血清サンプルの反応性においてかなりの不均一性が観察されたが、それぞれの組換えタンパク質の６つの組み合わせに対する個々のサンプルの反応性において著しい一貫性があった。実際、２８８のアレイタンパク質の中で、それらの大部分が、喜ばしいことに、両方の二次抗体を使用し、自然感染を有するヒトにおいて抗体応答を誘発した。さらに、キメラ構築物は、個々のタンパク質と比較した場合、それらの免疫反応性において有意に異ならなかった。サンプル特異的な応答があったが、血清の大部分によって共通して認識されるタンパク質のサブセットがあった。重要なことには、大部分の血清は、ＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を使用し、２５の非常に抗原性のボレリア組換えタンパク質およびキメラタンパク質のサブセット由来の少なくとも１つの抗原を認識した（表６  図の配列番号３〜２７）。そのような抗原は、診断試験の開発のための最良の候補に相当し、これらの２５の抗原のアレイをすべての続く感度および特異度評価において使用した。そのうえ、変異体を、キメラ抗原ＯＣ２／９（配列番号２７）から作製し、図の配列番号２８〜３０として示す。本明細書において記載されるこれらの変異体および他のキメラ抗原の変異体は、作製し、本明細書において記載される手順を使用して効能について試験することができる。
【００４６】
【表９】
2017531657.tif 000010
【００４７】
血清検体のこのセットについてのライムアッセイの全体的な感度および特異度を、表７において下記に示す。表から容易にわかるように、２５の組換えボレリアタンパク質を含有するタンパク質アレイは、上記に記載されるライム病血清パネルを使用すると、２段階制試験よりも優れていた。たとえば、本明細書において記載されるタンパク質アレイの感度を、２９人の初期ライム病患者を使用して、２段階制試験で比較した。ＥＭを有する２９人の患者の中で、ＩｇＭまたはＩｇＧ二次抗体を用いる本発明のタンパク質アレイの感度は、初期症状時に１００％（サンプルＶ１）および３週間後の回復期の間で８７％（サンプルＶ２）であった。比較すると、パーセンテージは、標準の２段階制試験について、それぞれ４８％および７１％であった。
【００４８】
【表１０】
2017531657.tif 000011
【００４９】
実施例３：ライム病のための診断試験。
概要。ゲノムおよびプロテオミクスアプローチを使用して、タンパク質マイクロアレイは、ライム病を検出する際に広範囲の特異性を有するであろう、非常に高感度で特異的な１段階制アッセイの開発において有用となり得る抗原を同定するために、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトの複数の遺伝子型に基づいて製造した。上記に記載される２５の組換えボレリアタンパク質を含有するアッセイは非常に正確で高感度であるが、研究は、高い感度および特異度を維持しながら、最小の数まで組換え抗原性タンパク質の数を低下させるようにデザインした。
【００５０】
血清サンプル。７０人のライム病患者由来の血清は、２５の組換えタンパク質のタンパク質アレイの感度のために使用した。これは、上記に記載されるＣＤＣ、ボルティモアサンプルＶ１およびＶ２の２８人の初期ライム患者ならびにこれらもまたＣＤＣ由来の８人のライム関節炎、６人の神経性ライム、および２人の心ライム患者を含んだ。そのうえ、特異度研究のために、梅毒、線維筋痛、および関節リウマチを含む、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する８３人の患者（非ライムの病気）から血清を得た。正常コントロール血清は、風土性の地域の１６人の健康なドナーおよび非風土性の地域の３６人の健康なドナーから得た。
【００５１】
マイクロアレイ。タンパク質マイクロアレイについては、表６の２５の組換えタンパク質を、ニトロセルロースコーティングＦＡＳＴスライドガラス上にプリントした。プロテオームチップは、上記に記載されるように、血清によりプローブし、分析した。
【００５２】
結果。様々なステージのライム病を有する患者由来の７０のサンプルから構成される血清パネルは、キメラタンパク質のアレイをスクリーニングするために使用し、抗Ｂ．ブルグドルフェリを検出するためのそれらの感度を決定した。サンプル特異的な応答があったが、血清の大部分によって共通して認識されるタンパク質のサブセットがあった。重要なことには、大部分の血清は、合計１１の個々のタンパク質について、ＩｇＭ二次抗体を使用して、９の非常に抗原性のボレリアキメラおよびＩｇＧ二次抗体を使用して、７のキメラを認識した（表８）。
【００５３】
【表１１】
2017531657.tif 000012
【００５４】
これらの１１の組換えおよびキメラ抗原のＣｙ５／Ｃｙ３比は、アレイにおいて最高水準で観察され、それぞれ、正常な血清および他の慢性感染症または自己免疫性疾患を有する患者由来の血清を使用して、＞９９％の特異度を有した。１１の抗原を、アレイスライド上にプリントし、感度および特異度の分析のために使用した。
【００５５】
１１のタンパク質の発明者らのアレイの全体的な感度を表９に示す。初期のライム患者については、ＩｇＭまたはＩｇＧ二次抗体を用いるタンパク質アレイの感度は、ＣＤＣ由来の血清については７１％、ボルティモアサンプルについては、初期症状時８８％（サンプルＶ１）および３週間後の回復期の間で８８％（サンプルＶ２）であった。比較すると、感度は、これらの同じ初期ライム患者について標準の２段階制試験では４４％であった。アレイの感度は、ライム関節炎、神経性ライム、および心ライム血清について１００％であった（表９）。
【００５６】
【表１２】
2017531657.tif 000013
【００５７】
１１の抗原アレイアッセイの特異度（表１０）は、正常コントロール由来のおよび現在使用されている試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患（非ライムの病気）を有する患者由来の血清を試験することによって評価した。ライム病が風土性の地域の５２の健康なコントロールの中で、誰もアッセイで陽性の結果を有しなかった。潜在的交差反応性患者については、８３のサンプルのうちの１１が、発明者らのアッセイにおいて陽性ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体応答を有した。したがって、アレイアッセイについての全体的な特異度は、正常コントロールについて１００％および非ライムの病気患者において８７％であった。
【００５８】
【表１３】
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【００５９】
これらのデータは、本明細書において記載されるマイクロアレイアッセイは、疾病の初期に、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗体を検出する際に優れた感度、特異度、および精度を与え、それだけではなく、同様に、疾病の末期についても同等の感度を示すことを実証する。その結果、ライム病に対する広範囲のカバー度および特異性を潜在的に有するだろう組換えキメラボレリアタンパク質の標準化された高感度で特異的な１段階制ライム病アッセイが現在利用可能である。さらに、これらのアッセイは、次世代の迅速な１段階制ポイント・オブ・ケアアッセイの開発について、有意な商業上の可能性を有するであろう。
【００６０】
本明細書において引用されるすべての特許、公開出願、および参考文献の教示は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｓ．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｎ．，ｖａｎ  Ｖｕｇｔ，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｇ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｂ．，Ｒｏｓａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ｆｌｕｘ：  ｔｈｅ  ｔｗｅｌｖｅ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｎｉｎｅ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００；３５，４９０−５１６．
Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｌａｄｅ，Ｂ．Ｎ．，Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，Ｏｕｔｅｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＯｓｐＡ）ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ：  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＯｓｐＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９０；１：１５９−６８．
Ｇｏｍｅｓ−Ｓｏｌｅｃｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．，Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｕｆｔ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２０００；３８：２５３０−２５３５．
Ｘｕ，Ｙ．，Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｕｆｔ，Ｂ．Ｊ．，Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２００８；４５：４０３−４０７．
Ｘｕ，Ｙ．，Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｕｆｔ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｌａｓｍ  ｉｄｓ  ２８−３  ａｎｄ  ３６  ｉｎ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｂｙ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２００３；３５：２６９−７８．
【００６１】
本発明が、その例となる実施形態への参照により特に示され、記載されたが、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細における様々な変化がその中でなされてもよいことが当業者らによって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2017531657.tif 000020
【図７】
2017531657.tif 000021
【図８】
2017531657.tif 000022
【図９】
2017531657.tif 000023
【図１０】
2017531657.tif 000024
【図１１】
2017531657.tif 000025
【配列表】
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【国際調査報告】
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