(57)【要約】  本発明は、薬物合成の技術分野に属し、それぞれFmoc-HArg(Et)２-OH及びFmoc-D-HArg(Et)２-OHの代わりに、Fmoc-Lys(Boc)-OH及びFmoc-D-Lys(Boc)-OH、又はFmoc-Lys(Alloc)-OH及びFmoc-D-Lys(Alloc)-OHを使用し、予めガニレリクス前駆体I又はガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を合成し、さらに前駆体I又は前駆体II-ペプチド樹脂におけるLys及びD-Lysの側鎖アミノ基を修飾、処理すれば、酢酸ガニレリクスを得ることができる酢酸ガニレリクスの製造方法を開示する。本発明により合成された酢酸ガニレリクスは、純度が高く、不純物が少なく、且つコストが低く、大規模生産に適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ac-D-２-Nal-D-Phe(４-Cl)-D-３-Pal-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Lys-Pro-D-Ala-NH２の構造を有するガニレリクス前駆体I。
【請求項２】
Fmoc-D-Ala-OHと樹脂とを反応させ、Fmoc-D-Ala-樹脂を得るステップ１）と、
１つずつカップリングさせる方式によりFmoc-D-Ala-樹脂をFmoc保護基の他のアミノ酸にカップリングさせ、アセチル化して、ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂を得るステップ２）と、
ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂に対し切断反応をして、ガニレリクス前駆体Iを得るステップ３）と、
を含む請求項１に記載のガニレリクス前駆体Iの製造方法。
【請求項３】
ステップ２）に記載の前記Fmoc保護基の他のアミノ酸は、それぞれFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH、及びFmoc-D-Nal-OHである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のガニレリクス前駆体Iを製造するステップ１）と、
ステップ１）で得られたガニレリクス前駆体IのLys及びD-Lysの側鎖アミノ基を修飾して、粗製のガニレリクスを得るステップ２）と、
ステップ２）で得られた粗製のガニレリクスを精製、塩化、凍結乾燥して、純粋な酢酸ガニレリクスを得るステップ３）と、
を含む酢酸ガニレリクスの製造方法。
【請求項５】
ステップ２）に記載の側鎖アミノ基の修飾に用いられる試薬は、エチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸であり、溶媒はDMF、NMP、DMSO、アセトニトリル、THF、１,４-ジオキサン又はMeOHであり、アルカリはDIPEA、Et３N、TMP、ピリジン、NaHCO３又はNa２CO３である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ac-D-２-Nal-D-Phe(４-Cl)-D-３-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Lys-Leu-Lys-Pro-D-Ala-樹脂の構造を有するガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂。
【請求項７】
Fmoc-D-Ala-OHと樹脂とを反応させ、Fmoc-D-Ala-樹脂を得るステップ１）と、
１つずつカップリングさせる方式により、Fmoc-D-Ala-樹脂をFmoc保護基の他のアミノ酸にカップリングさせ、アセチル化及びリジンの脱保護をして、ガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を得るステップ２）と、
を含む請求項６に記載のガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ２）に記載のFmoc保護基の他のアミノ酸は、それぞれはFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH、及びFmoc-D-Nal-OHである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６に記載のガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を製造するステップ１）と、
ステップ１）で製造されたガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂におけるLys及びD-Lysの側鎖アミノ基を修飾し、樹脂を切断して、粗製のガニレリクスを得るステップ２）と、
ステップ２）で得られた粗製のガニレリクスを精製、塩化及び凍結乾燥して、純粋な酢酸ガニレリクスを得るステップ３）と、
を含む酢酸ガニレリクスの製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ２）に記載の側鎖アミノ基の修飾に用いられる試薬はエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸であり、溶媒はDMF、DCM又はDMSOであり、アルカリはDIPEA、Et３N又はNMMである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記樹脂は、リンクアミド樹脂（Rink Amide resin）、リンクアミドAM樹脂（Rink Amide AM resin）、又はリンクアミドMBHA樹脂（Rink Amide MBHA resin）である請求項２又は７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ３）又はステップ２）に記載の切断反応に用いられる切断試薬はTFA: アニソール（Anisole）: チオアニソール（thioanisole）: TIS: H２O: EDT=９０〜９５: ０〜５: ０〜３: ０〜３: ０〜５: ０〜２（V/V）である請求項２又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断試薬はTFA: アニソール: チオアニソール: EDT=９０: ５: ３: ２（V/V）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ３）に記載の精製はHPLCにより行われる請求項４又は９に記載の方法。
【請求項１５】
前記HPLCによる精製はカラムクロマトグラフィーにより行われ、固定相はオクタアルキルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aにおける過塩素酸ナトリウム溶液の溶解度が２０mMであり、リン酸でpHを１.５に調整し、B相がアセトニトリルであり、勾配溶出により７５%A+２５% Bを６５%A+３５% Bに変化させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
塩化はカラムクロマトグラフィーにより行われ、固定相はＣ８逆相クロマトグラフィー用充填剤であり、移動相は、A相が０.２０%氷酢酸（V/V）溶液であり、B相がクロマトグラフィーグレードのアセトニトリルであり、勾配溶出により、９５%A+５%Bを移動相として２０分間溶出してから２分以内で、移動相が９５%A+５%Bから５０%A+５０%Bに変化し、その後、５０%A+５０%Bを移動相として溶出する請求項４又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の合成技術分野に関し、具体的に、ガニレリクス前駆体、及びそれを用いた酢酸ガニレリクスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸ガニレリクスは（英：Ganirelix acetate）、化学名：N-acetyl-３-(２-napthyl)-D-alanyl-４-chloro-D-phnylalanyl-３-(３-pyridyl)-D-alanyl-L-tyrosyl-N９,N１０diethyl-D-homoarginyl-L-leucyl-N９,N１０-diethyl-L-homoarginyl-L-prolyl-D-alanylamide acetate、一般式：C８０H１１３ClN１８O１３、相対分子量：１５７０.３、CAS登録番号：１２３２４６-２９-７である。その化学構造は下記式：
2017521487.tif 000002
で表される。
【０００３】
酢酸ガニレリクスは、合成された、内因性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）とも呼ばれる）に類似するデカペプチド化合物で、GnRHのアンタゴニストであり、性腺を刺激するGnRH受容体を競合的に拮抗することができることで、性腺刺激ホルモン（黄体形成ホルモンLH及び卵胞刺激ホルモンFSH）の分泌を迅速、且つ可逆的に抑制することができる。酢酸ガニレリクスは、下垂体からのLH分泌に対する抑制が、FSH分泌に対する抑制よりも顕著であるため、性ホルモンの生成を減少させることができる。酢酸ガニレリクスは、中周期GnRHのLHサージに対する誘導を抑制することにより、排卵、卵母細胞の成熟分裂、及び黄体化を抑制することができる。卵巣過剰刺激症候群の患者に対して、酢酸ガニレリクスはLHサージ及び関連刺激を予防し、着床率と妊娠率を向上させることができる。従って、酢酸ガニレリクスは、高い薬用価値及び広範な市場を有する。
現在、酢酸ガニレリクスの合成方法には、主にUS ５７６７０８２で用いられるBoc固相合成法、及びCN １０２５８４９４５Aで用いられるFmoc固相合成法がある。
US ５７６７０８２で用いられるBoc固相合成法はHFにより分解する必要があるため、環境への汚染が極めてひどく、生産に不利であった。CN １０２５８４９４５Aで用いられるFmoc固相合成法はFmoc-HArg(Et)２-OH及びFmoc-D-HArg(Et)２-OHを原料として使用する必要があり、この２つのアミノ酸の合成コストが高いため、大規模生産に不利で、また、該二つのアミノ酸は分解しやすく、樹脂に結合した後にも複数回のカップリング反応が必要であるため、多くの不純物を生ずる問題があった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、従来技術における前記問題を解決するために、HFを使用する必要がなく、且つFmoc-HArg(Et)２-OH及びFmoc-D-HArg(Et)２-OHを原料として使用しない酢酸ガニレリクスの製造方法を提供する。
【０００５】
そのため、本発明は、ガニレリクス前駆体I及びその製造方法、並びに前記前駆体Iで酢酸ガニレリクスを製造する方法を提供する。前駆体Iは以下の構造：
Ac-D-２-Nal-D-Phe(４-Cl)-D-３-Pal-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Lys-Pro-D-Ala-NH２
を有する。
該前駆体Iの製造方法は、
Fmoc-D-Ala-OHと樹脂とを反応させ、Fmoc-D-Ala-樹脂を得るステップ１）と、
１つずつカップリングさせる方式によりFmoc-D-Ala-樹脂をFmoc保護基の他のアミノ酸にカップリングさせ、アセチル化して、ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂を得るステップ２）と、
ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂に対し切断反応をして、ガニレリクス前駆体Iを得るステップ３）と、を含む。
【０００６】
好ましい実施態様において、ステップ２）のFmoc保護基の他のアミノ酸は、それぞれFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH 及びFmoc-D-Nal-OHである。
【０００７】
前記前駆体Iで酢酸ガニレリクスを製造する方法は、
前記構造を有するガニレリクス前駆体Iを製造するステップと、
ステップ１）で得られたガニレリクス前駆体IのLys及びD-Lysの側鎖アミノ基を修飾して、粗製のガニレリクスを得るステップ２）と、
ステップ２）で得られた粗製のガニレリクスを精製、塩化、凍結乾燥して、純粋な酢酸ガニレリクスを得るステップ３）と、を含む。
【０００８】
好ましい実施態様において、ステップ２）の側鎖アミノ基の修飾に用いられる試薬は、エチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸であり、溶媒はDMF、NMP、DMSO、アセトニトリル、THF、１,４-ジオキサン又はMeOHであり、アルカリはDIPEA、Et３N、TMP、ピリジン、NaHCO３又はNa２CO３である。
【０００９】
本発明は、さらに、ガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂及びその製造方法、並びに前記前駆体II-ペプチド樹脂で酢酸ガニレリクスを製造する方法を提供する。ここで、前駆体II-ペプチド樹脂は、以下の構造：
Ac-D-２-Nal-D-Phe(４-Cl)-D-３-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Lys-Leu-Lys-Pro-D-Ala-樹脂
を有する。
【００１０】
該前駆体II-ペプチド樹脂の製造方法は、
Fmoc-D-Ala-OHと樹脂とを反応させ、Fmoc-D-Ala-樹脂を得るステップ１）と、
１つずつカップリングさせる方式により、Fmoc-D-Ala-樹脂をFmoc保護基の他のアミノ酸にカップリングさせ、アセチル化及びリジンの脱保護をして、ガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を得るステップ２）と、を含む。
【００１１】
好ましい実施態様において、ステップ２）のFmoc保護基の他のアミノ酸は、それぞれFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys (Alloc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH及びFmoc-D-Nal-OHである。
【００１２】
該前駆体II-ペプチド樹脂で酢酸ガニレリクスを製造方法は、
前記構造を有するガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を製造するステップ１）と、
ステップ１）で製造されたガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂におけるLys及びD-Lysの側鎖アミノ基を修飾し、粗製のガニレリクスを得るステップ２）と
ステップ２）で得られた粗製のガニレリクスを精製、塩化及び凍結乾燥して、純粋な酢酸ガニレリクスを得るステップ３）と、を含む。
【００１３】
好ましい実施態様において、ステップ２）の側鎖アミノ基の修飾に用いられる試薬は、エチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸であり、溶媒はDMF、DCM又はDMSOであり、アルカリはDIPEA、Et３N又はNMMである。
【００１４】
前記ガニレリクス前駆体I及びガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂の製造方法において、樹脂として、好ましく、リンクアミド樹脂、リンクアミドAM樹脂又はリンクアミドMBHA樹脂を使用する。
【００１５】
前記ガニレリクス前駆体Iの製造方法、及びガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂で酢酸ガニレリクスを製造する方法において、切断反応に用いられる切断試薬は、TFA: アニソール: チオアニソール: TIS: H２O: EDT=９０〜９５: ０〜５: ０〜３: ０〜３: ０〜５: ０〜２（V/V）であることが好ましく、TFA: アニソール: チオアニソール: EDT=９０: ５: ３: ２（V/V）であることがより好ましい。
【００１６】
本発明は、酢酸ガニレリクスの製造過程において、HPLC法により粗製のガニレリクスを精製した後、塩化処理する。具体的には、
１）体積比が１:３のアセトニトリル及び精製水でガニレリクス固体である粗ペプチドを溶解し、超音波によりサンプルを完全に溶解させた後、ろ過膜でろ過し、ろ液を回収するサンプル処理と、
２）カラムクロマトグラフィーにより行われ、固定相がオクタアルキルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aにおける過塩素酸ナトリウム溶液の溶解度が２０mMであり、リン酸でpHを１.５に調整し、B相がアセトニトリルで、勾配溶出により７５%A+２５% Bを６５%A+３５% Bに変化させるHPLC精製と、
３）カラムクロマトグラフィーにより行われ、固定相がＣ８逆相クロマトグラフィー用充填剤であり、移動相のA 相が０.２０%氷酢酸（V/V）溶液であり、B相がクロマトグラフィーグレードのアセトニトリルであり、勾配溶出により、９５%A+５%Bを移動相として２０分間を溶出してから２分以内で、移動相が９５%A+５%Bから５０%A+５０%Bに変化し、その後５０%A+５０%Bを移動相として溶出する塩化処理と、
を含む。
【００１７】
以上より、従来技術と比べると、本発明は、それぞれFmoc-HArg(Et)２-OH及びFmoc-D-HArg(Et)２-OHの代わり、Fmoc-Lys(Boc)-OH及びFmoc-D-Lys(Boc)-OH、又はFmoc-Lys(Alloc)-OH及びFmoc-D-Lys(Alloc)-OHを使用し、予め醋酸ガニレリクス前駆体I又は醋酸ガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を合成し、さらに、前駆体I又は前駆体II-ペプチド樹脂におけるLys及びD-Lysの側鎖アミノ基をそれぞれ修飾、処理すれば、酢酸ガニレリクスを得ることができる。本発明に記載の製造方法は、HFを使用する必要がなく、環境への汚染を大幅に低減し、Fmoc-HArg(Et)２-OH及びFmoc-D-HArg(Et)２-OHも使用する必要がなく、合成されたガニレリクスは、純度が高く、不純物が少なく、且つコストが低く、大規模生産に適する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１で製造されたガニレリクス前駆体Iのペプチドスペクトルである。
【図２】実施例１５で製造された純粋な酢酸ガニレリクスの精製ペプチドスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、それらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、本発明の主旨を超えない範囲内において、様々な変更や修飾を加えることができ、且つこれらの変更、修飾が本発明の範囲内に含まれることは当業者にとって明らかである。
本発明で使用される略語の意味を以下の表に示す。
2017521487.tif 000003
【００２０】
実施例１ ：ガニレリクス前駆体I の合成
【００２１】
１．Fmoc-D-Ala-Rink Amide 樹脂の製造
１）小規模実験
代替度が０.５mmol/gであるRink Amide 樹脂１０gを固相反応カラムに入れ、DMF洗浄を２回行った後、DMF膨潤を３０分間し、その後それぞれ１０分間及び１５分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
Fmoc-D-Ala-OH（４.６７g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化した後、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回した後、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
２）拡大実験
代替度が０.５mmol/gであるRink Amide 樹脂１００g を固相反応カラムに入れ、DMF洗浄を２回した後、DMF膨潤を３０分間し、その後、それぞれ１０分間及び１５分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回した後、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
Fmoc-D-Ala-OH（４６.７g、１５０mmol）及びHOBt（２１.３g、１５７.５mmol）を４００ml DMFに溶解し、氷浴にてDIC（２４.７ml、１５７.５mmol）を加え５分間活性化した後、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回した後、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
【００２２】
２．Fomc保護基の他のアミノ酸のカップリング、アセチル化によりガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂を得たこと
１）小規模実験
上記の手順を繰り返し、１つずつカップリングさせる方式により、順次にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH及びFmoc-D-Cpa-OHのカップリングを完成した。
Fmoc-D-Nal-OH（６.５４g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DMF洗浄を３回行い、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回し、その後、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回した後、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。 
無水酢酸（１０.２g、１００mmol）及びピリジン（７.９g、１００mmol）をDCM ３０mlに溶解し、室温で固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DCM洗浄を６回し、それぞれ５分間、５分間及び１０分間で、MeOHで収縮を３回させた後、真空乾燥してガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂１７.５gを得た。
２）拡大実験
上記の手順を繰り返し、１つずつカップリングの方式により、順次にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH及びFmoc-D-Cpa-OHのカップリングを完成した。
Fmoc-D-Nal-OH（６５.４g、１５０mmol）及びHOBt（２１.３g、１５７.５mmol）を４００ml DMF中に溶解させ、氷浴にてDIC（２４.７ml、１５７.５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回し、その後、DMF洗浄を６回、DCMを洗浄２回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。 
無水酢酸（１０２g、１０００mmol）及びピリジン（７９g、１０００mmol）を３００ml DCMに溶解し、室温で固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DCM洗浄を６回し、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させた後、真空乾燥して１７８gガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂を得た。
【００２３】
３．分解により粗ペプチドであるガニレリクス前駆体Iを製造し、粗ペプチドであるガニレリクス前駆体Iを得ること
１）小規模実験
ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂７.９４gが入った丸底フラスコに２時間冷凍した分解液（TFA: アニソール：チオアニソール：EDT=９０：５：３：２）８０mlを入れ、室温で撹拌しながら２時間反応させ、ろ過し、ろ液を冷凍無水エーテル８００mlに加え、遠心して固体を回収し、乾燥して粗ペプチドである醋酸ガニレリクス前駆体Iを６.７３g得た。収率：９８%、純度：９０%であった。
２）拡大実験
ガニレリクス前駆体I-ペプチド樹脂１７８gが入った丸底フラスコに２時間冷凍した分解液（TFA: アニソール：チオアニソール：EDT=９０：５：３：２）１７８０ml を入れ、室温で撹拌しながら２時間反応させ、ろ過し、ろ液を冷凍無水エーテル１７８００mlに加え、遠心して固体を回収し、乾燥して粗ペプチドである醋酸ガニレリクス前駆体Iを６８.５g得た。収率：９９.８%、純度：９１%であった。
検出した結果、ガニレリクス前駆体IのMSデータは、それぞれ：１３７３.４９８（M+１）、１３９５.５２４(M+２３)及び１４１１.５０９(M+３９)であった。ペプチドスペクトルは、図１に示すように、保持時間T=１６.００９分のところが製品の目標ピークであり、純度が９０.６７%であった。
【００２４】
実施例２ ：ガニレリクス前駆体II-Rink Amideペプチド樹脂の合成
１．Fmoc-D-Ala-Rink Amide 樹脂の製造
代替度が０.５mmol/gのRink Amide 樹脂１０g を固相反応カラムに入れ、DMF洗浄を２回し、DMF膨潤を３０分間した後、それぞれ１０分間及び１５分間でDBLK脱保護を２回し、その後DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
Fmoc-D-Ala-OH（４.６７g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にて加入DIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回した後、DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
【００２５】
２．Fmoc保護基の他のアミノ酸のカップリング、アセチル化及びリジン脱保護によりガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を得ること
上記の手順を繰り返し、１つずつカップリングさせる方式により、順次にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH及びFmoc-D-Cpa-OHのカップリングを完成した。
Fmoc-D-Nal-OH（６.５４g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回した後、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
無水酢酸（１０.２g、１００mmol）及びピリジン（７.９g、１００mmol）をDCM ３０mlに溶解し、室温で固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DCM洗浄を６回した。
固相反応カラムにDCM ４０ml及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１.１６gを入れ、窒素雰囲気において１分間撹拌した後、フェニルシラン１０.８gを入れ、０.５時間反応させ、吸引して除去し、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を６回し、その後、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクス前駆体II-Rink Amideペプチド樹脂１６.９gを得た。
【００２６】
実施例３ ：ガニレリクス前駆体II-Rink Amide AMペプチド樹脂の合成
１．Fmoc-D-Ala-Rink Amide AM樹脂の製造
代替度が０.６mmol/gのRink Amide AM 樹脂８.３３gを個相反応カラムに入れ、DMF洗浄を２回し、DMF膨潤を３０分間した後、それぞれ１０分間及び１５分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
Fmoc-D-Ala-OH（４.６７g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回した後、DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
【００２７】
２．Fomc保護基の他のアミノ酸のカップリング、アセチル化及びリジン脱保護によりガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を得ること
上記の手順を繰り返し、１つずつカップリングさせる方式により、順次にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH及びFmoc-D-Cpa-OHのカップリングを完成した。
Fmoc-D-Nal-OH（６.５４g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回した後、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
無水酢酸（１０.２g、１００mmol）及びピリジン（７.９g、１００mmol）をDCM ３０mlに溶解し、室温で固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DCM洗浄を６回した。
固相反応カラムにDCM ４０ml 及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム １.１６gに入れ、窒素雰囲気において１分間撹拌した後フェニルシラン１０.８gを加え、０.５時間反応させ、吸引して除去し、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を６回し、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクス前駆体II-Rink Amide AMペプチド樹脂１５.３gを得た。
【００２８】
実施例４ ：ガニレリクス前駆体II-Rink Amide MBHAペプチド樹脂の合成
１．Fmoc-D-Ala-Rink Amide MBHA樹脂の製造
代替度が０.７５mmol/gのRink Amide MBHA 樹脂６.６７gを固相反応カラムに入れ、DMF洗浄を２回した後、DMF膨潤を３０分間し、それぞれ１０分間及び１５分間でDBLK脱保護を２回し、その後、DMF洗浄を６回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
Fmoc-D-Ala-OH（４.６７g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回し、DMF洗浄を６回した後、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
【００２９】
２．Fmoc保護基の他のアミノ酸のカップリング、アセチル化及びリジン脱保護によりガニレリクス前駆体II-ペプチド樹脂を得ること
上記の手順を繰り返し、１つずつカップリングさせる方式により、順次にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH及びFmoc-D-Cpa-OHのカップリングを完成した。
Fmoc-D-Nal-OH（６.５４g、１５mmol）及びHOBt（２.１３g、１５.７５mmol）をDMF ４０ml に溶解し、氷浴にてDIC（２.４７ml、１５.７５mmol）を加え５分間活性化し、活性化された溶液を固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去し、DMF洗浄を３回し、それぞれ５分間及び７分間でDBLK脱保護を２回した後、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回し、ニンヒドリン検出をした結果、陽性であった。
無水酢酸（１０.２g、１００mmol）及びピリジン（７.９g、１００mmol）をDCM ３０mlに入れ、室温で固相反応カラムに入れ、窒素雰囲気において撹拌しながら２時間反応させ、ニンヒドリン検出をした結果、陰性であった。反応液を吸引して除去した後、DCM洗浄を６回した。
固相反応カラムにDCM ４０ml及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１.１６gを入れ、窒素雰囲気において１分間撹拌した後、フェニルシラン１０.８gを加え、０.５時間反応させ、吸引して除去し、DMF洗浄を６回、DCM洗浄を６回し、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクス前駆体II-Rink Amide MBHAペプチド樹脂１４.１gを得た。
【００３０】
実施例５：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びトリエチルアミン（１.２１５g、１２mmol）をDMF ４０mlに溶解し、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むDMF溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復し２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス３.０４g得た。純度：８０%、収率：９７%であった。
【００３１】
実施例６：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びDIPEA（１.５５g、１２mmol）をNMP ４０mlに溶解し、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むNMP溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス２.８９gを得た。純度：７６%、収率：９２%であった。
【００３２】
実施例７：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びTMP（１.４５g、１２mmol）をDMSO ４０mlに溶解し、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むDMSO溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス３.１４gを得た。純度：７８%、収率：１００%であった。
【００３３】
実施例８：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びピリジン（０.９５g、１２mmol）をアセトニトリル ４０mlに溶解し、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むアセトニトリル溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス２.９９gを得た。純度：６１%、収率：９５%であった。
【００３４】
実施例９：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びNaHCO３（１.０１g、１２mmol）が入ったフラスコにTHF ４０mlを入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むTHF溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス２.７４gを得た。純度：５７%、収率：８７%であった。
【００３５】
実施例１０：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びNa２CO３（１.２７２g、１２mmol）が入ったフラスコに１,４-ジオキサン４０ml を入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含む１,４-ジオキサン溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス３.０８gを得た。純度：５５%、収率：９８%であった。
【００３６】
実施例１１：粗製のガニレリクスの合成
実施例１で得られたガニレリクス前駆体I（２.７４８g、２mmol）及びNa２CO３（１.１５３g、１２mmol）が入ったフラスコにMeOH ４０ml を入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（１.４４g、８mmol）を含むMeOH溶液２０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して２４時間反応させ、HPLCにより、原料が完全に反応したことを確認した。撹拌しながら反応液を反応液の１０倍の氷水に加え、ろ過して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス２.９５gを得た。純度：５９%、収率：９４%であった。
【００３７】
実施例１２：粗製のガニレリクスの合成
実施例２で得られたガニレリクス前駆体II-Rink Amide樹脂（１６.９g、５mmol）が入った丸底フラスコにDMF １００ml及びトリエチルアミン（５.０６g、５０mmol）を入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（５.４g、３０mmol）を含むDMF溶液５０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して撹拌しながら２４時間反応させた。反応液を固相反応カラムに移転し、反応液を吸引して除去し、樹脂に対しDMF洗浄を６回し、DCM洗浄を２回した後、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクスペプチド樹脂１７.６gを得た。
ガニレリクスペプチド樹脂を入れた丸底フラスコに冷凍分解液（TFA: アニソール: チオアニソール: EDT=９０: ５: ３: ２）２００ml を入れ、室温で撹拌しながら２時間反応させ、ろ過し、ろ液を冷凍無水エーテル２Lに加え、遠心して固体を回収し、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス７.４gを得た。純度：８２%、収率：９５%であった。
【００３８】
実施例１３：粗製のガニレリクスの合成
実施例３で得られたガニレリクス前駆体II-Rink Amide AM樹脂（１５.３g、５mmol）が入った丸底フラスコにDMF １００ml及びトリエチルアミン（５.０６g、５０mmol）を入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（５.４g、３０mmol）を含むDMF溶液５０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して撹拌しながら２４時間反応させた。反応液を固相反応カラムに移転し、反応液を吸引して除去した後、樹脂に対しDMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回し、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクスペプチド樹脂１６.７gを得た。
ガニレリクスペプチド樹脂を入れた丸底フラスコに冷凍分解液（TFA: アニソール: チオアニソール: EDT=９０: ５: ３: ２）１７０mlを入れ、室温で撹拌しながら２時間反応させ、ろ過し、ろ液を冷凍無水エーテル１.７Lに加え、遠心して固体を回収した後、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス７.２gを得た。純度：８１.７%、収率：９１.７%であった。
【００３９】
実施例１４：粗製のガニレリクスの合成
実施例４で得られたガニレリクス前駆体II-Rink Amide MBHA樹脂（１４.１g、５mmol）が入った丸底フラスコにDMF １００ml及びトリエチルアミン（５.０６g、５０mmol）を入れ、氷浴にてエチルアミノエチルイミノメタンスルホン酸（５.４g、３０mmol）を含むDMF溶液５０mlをゆっくり滴下し、滴下終了後、室温に回復して撹拌しながら２４時間反応させた。反応液を固相反応カラムに移転し、反応液を吸引して除去した後、樹脂に対しDMF洗浄を６回、DCM洗浄を２回し、その後、それぞれ５分間、５分間及び１０分間でMeOHで収縮を３回させ、真空乾燥してガニレリクスペプチド樹脂１５.１gを得た。
ガニレリクスペプチド樹脂を入れた丸底フラスコに冷凍分解液（TFA: アニソール: チオアニソール: EDT=９０: ５: ３: ２）１５０mlを入れ、室温で撹拌しながら２時間反応させ、ろ過し、ろ液を冷凍無水エーテル１.５Lに加え、遠心して固体を回収し、無水エーテルで洗浄を３回し、真空乾燥して粗製のガニレリクス７.３gを得た。純度：８１.６%、収率：９３%であった。
【００４０】
実施例１５：純粋な酢酸ガニレリクスの製造
１．サンプル処理
固体である粗ペプチドを２５%アセトニトリル/７５%水（V/V）で溶解し、超音波によりサンプルを完全に溶解した後、ろ過膜でろ過し、ろ液を回収した。
２． HPLC精製
（１）精製条件
カラム：オクタアルキルシラン結合シリカゲルを固定相とし、直径と長さ：５０ mm × ２５０ mmである。
移動相：A 相が２０mM過塩素酸ナトリウム溶液で、リン酸でpHを１.５に調整した。B相がアセトニトリルで、流速が８０ml/minである。勾配溶出により、７５%A+２５% Bを６５%A+３５% Bに変化させる。検出波長が２８０ nm、注入量が２gである。
（２）精製過程
カラムを５分間平衡化した後、サンプルを注入し、勾配精製を開始し、監視しながらピーク前、ピーク、及びピーク後の３つの段階で目標ピークに対応する留分を回収した。ピーク前、ピーク後の留分に対しほとんどのアセトニトリルを除去した後回収して精製し、ピークの留分に対しほとんどのアセトニトリルを除去した後塩化した。
３．塩化処理
（１）処理条件
カラム：Ｃ８逆相クロマトグラフィー用充填剤を固定相とし、直径と長さが ５０ mm × ２５０ mmである。
移動相：A 相が０.２０%氷酢酸（V/V）溶液、B相がクロマトグラフィーグレードのアセトニトリルであり、勾配溶出により、９５%A+５%Bを移動相として２０分間溶出してから２分以内で、移動相が９５%A+５%Bから５０%A+５０%Bに変化し、その後５０%A+５０%Bを移動相として溶出する。検出波長が２８０ nm、注入体積が２００mlである。
（２）処理過程
カラムを５分間平衡化した後、サンプルを注入し、勾配精製を開始し、監視しながら目標ピークに対応する留分を回収した。目標ピークの留分を減圧回転蒸発により２０ｍｌに濃縮した後、凍結乾燥した。凍結乾燥した後、白色である粉末状固体の純粋なペプチド０.６４gを得た。純度が９９.７１%で、単一の不純物がいずれも０.１%より小さく、精製収率が７２.２%（粗製品における酢酸ガニレリクスの含有量で算出した。）、トータルの収率が２６.１%であった。
検出した結果、酢酸ガニレリクスを精製した純粋なペプチドのMSが１５７０.８６２ (M+１)であった。ペプチドスペクトルを図２に示した。ここで、保持時間T=１５.３７５分のところが製品の目標ピークで、純度が９９.８０%であった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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