(57)【要約】  本発明は、腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基を含む抗がん化合物およびその使用を開示した。前記抗がん化合物式は、下式に示すように、ただし、Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；かつＲ４は、ヒドロキシまたはアミノで接続された薬物基であり、該当薬物の一般式は、Ｒ４−Ｈである。前記化合物は、腫瘍の局所にのみ活性化され、従来の化学療法薬物が免疫システムを損害するという欠点を避けるだけではなく、さらに腫瘍免疫抑制細胞を除去することで、抗腫瘍免疫を促進する。該抗がん化合物またはその薬物組成物は、免疫治療と同時に併用できて、腫瘍を治癒する効果を増え、かつ腫瘍の転移と骨転移を有効に抑制できる。2017531029.tif 000176【選択図】なし
2017531029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下の式（Ｉ）（ＩＩ）で示される開裂可能な連結基を含有する化合物であって、上記の開裂可能な連結基は、−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｒ１は、開裂可能な連結基でＲ４に接続され、Ｒ１は、そのカルボニルでＲ２とアミド結合を形成して、開裂可能な連結基と接続して、Ｒ４は、その酸素原子で上記の開裂可能な連結基とカルボナート形成して、上記の開裂可能な連結基と接続して、またはその窒素原子で上記の開裂可能な接続ジョイントとカルバメートを形成して、上記の開裂可能な連結基と接続して、
Ｒ１｛−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−｝  Ｒ４  （Ｉ）
2017531029.tif 000164
ただし、
Ｒ１は、可溶性を増える官能基または保護基である；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとイソロイシンから選ばれるアミノ酸基である；
Ｒ３は、アラニン、トレオニン、バリンとアスパラギンから選ばれるアミノ酸基である；
Ｒ２とＲ３及びＲ３とＡｓｎは、アミド結合の接続を形成する；Ａｓｎは、そのカルボニルで−ＮＨ−と接続する；
Ｒ４は、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−と接続する化合物である；
上記の開裂可能な連結基は、アスパラギンエンドペプチダーゼと接触して、開裂する特徴を有して、
かつ上記の化合物は、アスパラギンエンドペプチダーゼとの接触と開裂で、連結基を開裂して、Ｒ４を放出する特徴を有する、化合物。
【請求項２】
Ｒ１は、６−マレイミドＣ１−１０アルキルカルボニル、ヒドロキシアミノカルボニルＣ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−（Ｃ１−４アルコキシ）ｎ−Ｃ１−６アルキルカルボニル、２−（２−メトキシエトキシ）アセチル（
2017531029.tif 000165
）  、または
2017531029.tif 000166
から選ばれるものであり、
ただし、各Ｒは、それぞれ独立にＣ１−４アルキルであり、各ｎは、それぞれ独立に１〜３００であり、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ４は、抗がん化合物の活性部分を示して、上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、アドリアマイシンとマイトマイシンから選ばれるものである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
上記の化合物は、下式（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、（ＩＩＣ）、（ＩＩＤ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される構造式を有する請求項１に記載の化合物：
2017531029.tif 000167
2017531029.tif 000168
ただし、
Ｒ１は、６−マレイミドＣ１−１０アルキルカルボニル、ヒドロキシアミノカルボニルＣ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−（Ｃ１−４アルコキシ）ｎ−Ｃ１−６アルキルカルボニル、または
2017531029.tif 000169
である、
ただし、各Ｒは、それぞれ独立にＣ１−４アルキルであり、各ｎは、それぞれ独立に１〜３００であり、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である；
Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；
Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；
Ｒ５は、ヒドロキシを有する抗がん化合物（Ｒ５−ＯＨ）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＯＨ以外の他の部分）であり、上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルとドセタキセルから選ばれるものである；及び
Ｒ６は、アミノ基を有する抗がん化合物（Ｒ６−ＮＨ２）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＮＨ２基以外の他の部分）であり、上記の抗がん化合物は、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、アドリアマイシンとマイトマイシンから選ばれるものである。
【請求項５】
上記の化合物は、以下から選ばれるものである請求項１に記載の化合物：
2017531029.tif 000170
【請求項６】
上記の化合物は、以下から選ばれるものである請求項１に記載の化合物：
（１）化合物Ｓ１−Ｓ５、Ｓ７−Ｓ１５、Ｓ１７−Ｓ４３；
（２）化合物Ｓ２’−Ｓ４’とＳ１０’−Ｓ２４’；
（３）化合物Ａ１、Ａ３−Ａ４とＡ１０−Ａ２４；
（４）化合物Ｂ１、Ｂ３−Ｂ４とＢ１０−Ｂ２４；
（５）化合物Ｄ２−Ｄ４とＤ１０−Ｄ２４；と
（６）化合物Ｅ２−Ｅ４とＥ１０−Ｅ２４。
【請求項７】
開裂可能な連結基と以下の活性化過程を有する化合物であって、
2017531029.tif 000171
開裂可能な連結基が、Ｒ４の立体障害を克服して、アスパラギンエンドペプチダーゼのレグマインの接触活性化を許して、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ４とＲ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−の分離を引き起す；
ただし、Ｒ１は、可溶性を増える官能基または保護基である；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとイソロイシンから選ばれるアミノ酸基であり、Ｒ２とＲ１は、カルボニルアミド結合を形成する；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとアスパラギンから選ばれるアミノ酸基であり、Ｒ２とＲ３は、アミド結合の接続を形成する；
Ｒ４は、ヒドロキシまたはアミノで接続する化合物である、化合物。
【請求項８】
開裂可能な連結基と以下の活性化過程を有する化合物であって、  
2017531029.tif 000172
，
2017531029.tif 000173
効果的にＲ４立体障害と極性を克服して、アスパラギンエンドペプチダーゼの接触と切断を許して、４−アミノベンジル  −ＯＣ（Ｏ）−とＲ４の間の開裂を引いて、Ｒ４と開裂可能な連結基とを分離して、Ｒ４を放出する；
ただし、Ｒ１は、可溶性を増える官能基または保護基である；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとイソロイシンから選べるアミノ酸基であり、Ｒ２とＲ１は、カルボニルアミド結合を形成する；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとアスパラギンから選べるアミノ酸基であり、Ｒ２とＲ３は、アミド結合の接続を形成する；
Ｒ４は、ヒドロキシまたはアミノで接続する化合物である、化合物。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する薬物組成物。
【請求項１０】
以下に示す式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）化合物の調製方法：
2017531029.tif 000174
2017531029.tif 000175
ただし、式（ＩＩＩ）化合物の調製において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、アルコール性ヒドロキシを含有する薬物（Ｒ５−ＯＨ）と反応して、式（ＩＩＩ）の化合物を生成する；上記の薬物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルまたはドセタキセルである；
式（ＩＶ）の化合物の調製において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、更にアミノ基を含有する薬物（Ｒ６−ＮＨ２）と反応して、式（ＩＶ）の化合物を生成する；上記の薬物は、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、アドリアマイシンまたはマイトマイシンである；
ただし、Ｒ１は、可溶性を増える官能基または保護基であり；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅであり；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）化合物の調製方法。
【請求項１１】
上記のがんは、膀胱、脳、乳房／乳腺、子宮頸、結腸−直腸、食管、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、睾丸と血液部位のがんである請求項１−８のいずれかに記載の化合物と請求項９に記載の薬学的に許容される塩と薬学的に許容される担体または賦形剤の使用。
【請求項１２】
眼科疾患を治療または予防する薬物の調製における式（ＩＸ）で表されるマイトマイシン誘導体またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１３】
上記の使用は、傷跡瘢痕または脈絡膜新生血管の治療または予防、マクロファジの抑制、または角膜移植、緑内障、翼状片の手術の続発症の治療または予防である請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩または請求項９に記載の薬物組成物の、腫瘍関連マクロファジの抑制、腫瘍生長の抑制、血管形成の抑制、がん細胞の浸潤と転移の抑制および／または抗腫瘍免疫を促進する薬物の調製における使用。
【請求項１５】
需要がある対象に治療または予防に対する有効な量の請求項１−８のいずれかに記載の上記の化合物またはその薬学的に許容される塩または請求項９に記載の薬物組成物を投与することを含むがん治療または予防方法。
【請求項１６】
同時または先後に、該当対象に放射線治療または免疫治療を実施することを含む請求項１５に記載の方法。
腫瘍免疫抑制細胞、例えば腫瘍関連マクロファジとＴｒｅｇ細胞を清除または抑制して、腫瘍におけるＴ細胞の浸潤を増え、腫瘍関連マクロファジの生長を抑制、抗腫瘍免疫を促進するための使用も含む。
【請求項１７】
薬物をがん細胞転移と腫瘍骨転移位置に運んで、がん細胞の転移を低減・抑制、および腫瘍の骨転移を減少または治癒するために用いられる請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学分野に属して、抗腫瘍薬物化合物に関して、具体的に、腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基、結合体を含有する抗がん化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常ヒト細胞や免疫システムに対して、従来の細胞毒性化学療法薬物は、巨大な毒性を有する。例えば、現在には、ドセタキセルとパクリタキセルは、広く採用されている効果的な抗腫瘍剤であって、主に卵巣がんと乳がんのような各種の固形腫瘍に用いられ、更に肺がん、結腸直腸がん、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、脳腫にもある程度の効能を有する。臨床の場合、該当化合物の応用は、厳重な毒性副作用（例えば骨髄抑制）と感作反応があるため、その使用量は規制された。ドセタキセルは、骨髄毒性を有し、好中球の減少を引き起こし、神経毒性と心血管毒性を有するとともに、アネルギー反応を引き起こす；血管外部へ溢れ出ると、局所的な炎症、脱毛、無力ないし肝臓毒性を引き起こしてしまう。マイトマイシンは、現在広く採用されている別の効果的な抗腫瘍剤であって、主に胃がん、結腸がん、肝がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、乳がんのような各種の固形腫瘍及びがん性胸・腹水などに用いられる。しかしながら、臨床の場合、該当化合物の応用は、厳重な毒性副作用と有害反応があるため、その使用量は規制された。マイトマイシンは、骨髄毒性を有し、白細胞や血小板の減少を引き起こす。静脈炎を引き起こす可能性があり、血管外部へ溢れ出ると、組織の壊死、脱毛、無力を引き起こして、肝腎臓機能の損害になる。
2017531029.tif 000003
【０００３】
腫瘍微環境において、腫瘍細胞は、たくさんのアスパラギンエンドペプチダーゼを発現・分泌する。腫瘍関連マクロファジ（M2タイプ）を、単球と炎症型マクロファジ（M1タイプ）と区別するための確認マークもアスパラギンエンドペプチダーゼの発現産物である。腫瘍が分泌したサイトカインは、単球を腫瘍関連マクロファジに誘導して、腫瘍関連マクロファジが刺激を行い、強烈な免疫抑制を産生して、かつ腫瘍細胞の浸潤と転移に直接に寄与するとともに、一般的に、転移の際に、腫瘍細胞は、細胞外マトリックスを分解するように、たくさんのタンパク質分解酵素を分泌する。 そのため、化学合成によって、更に生物化学及び薬理学の検出・選択を結び付け、アスパラギンエンドペプチダーゼに活性化され、連結アームを二次的活性化する結合体を選択でき、結合体は、必要に応じて、異なる可溶化・修飾基を特定の細胞毒などの化学療法薬物に結合させることができ、そして、標的、活性化、安定化、可溶性、代謝、毒性と効能などの点で新機能を有する新規薬物を産生する。
【０００４】
発明の内容
本発明は、式（I）（II）で示されるように、抗腫瘍薬物を開発するため、標的結合活性化と溶解治療特性などの機能を変化する開裂可能な連結基を作成し、かつ開裂可能な連結基を含有する新しい化合物を提供する。本発明の腫瘍微環境特異的活性化の開裂可能な連結基の使用は、効果的に連結される薬物R4の毒性を閉鎖でき、それから腫瘍微環境にのみアスパラギンエンドペプチダーゼで標的的に活性化されて、それによりｐ−アミノベンジルアルコール（4-アミノベンジル -OC（O）-）を自己放出して、最終薬物に新しい標的、活性化と代謝特性を付与する。
【０００５】
具体的に、上記の開裂可能な連結基構造を含有する化合物において、開裂可能な連結基は、引用符号で囲む修飾トリペプチドの−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−であり、化合物は、開裂可能な連結基でＲ１とＲ４と接続して、Ｒ１のカルボニルは、アミド結合を形成して、開裂可能な連結基と接続して、Ｒ４は、二つの接続方式を含み、Ｒ４の酸素原子は、カルボナートを形成して開裂可能な連結基と接続して、またはＲ４の窒素原子は、カルバメートを形成して開裂可能な連結基と接続して：
Ｒ１｛−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−｝Ｒ４    （Ｉ）
2017531029.tif 000004
ただし、
Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；
Ｒ２は、アラニン、トレオニン、バリンとイソロイシンから選ばれるアミノ酸基であり、Ｒ２とＲ１は、カルボニルアミド結合を形成する；
Ｒ３は、アラニン、トレオニン、バリンとアスパラギンから選ばれるアミノ酸基である；
Ｒ２とＲ３及びＲ３とＡｓｎは、それぞれにアミド結合の接続を形成する；Ａｓｎは、そのカルボニルで−ＮＨ−と接続する；
Ｒ４は、そのヒドロキシまたはアミノで接続する薬物基であり、カルボナートまたはカルバメートの形成で、開裂可能な連結基と接続する；
開裂可能な連結基を含有する化合物は、アスパラギンエンドペプチダーゼとの接触で分解して、Ｒ１と分離する；
開裂可能な連結基を含有する化合物は、アスパラギンエンドペプチダーゼとの接触で分解してから、Ｒ４と形成するカルボナートまたはカルバメート結合が更に分解することになり、その結果、Ｒ４は、開裂可能な連結基と分離する。
【０００６】
本発明には、開裂可能な連結基を含有する化合物の合成により、本発明の前記の開裂可能な連結基を含有する化合物（Ｉ）（ＩＩ）は、以下の構造と、活性化された構造・効果関係を有する：（１）開裂可能な連結基は、基の転換により、Ｒ４の毒性機能キー部位における適当な活性化度のヒドロキシまたはアミノと反応して、結合して、新構造の薬物を形成する。 立体障害のため、結合した最終の化合物は、アスパラギンエンドペプチダーゼに活性化される効率も異なり、それは、アスパラギンエンドペプチダーゼの酵素活性センターはバルーン形状の凹みのボトムにあると共に、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に接続しようとする化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、接続サイトの極性に対して、非常に重要なことであるためである。ｐ−アミノベンジルアルコール（４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−）連結アームの延長と二次開裂により、効果的に一部の薬物の立体障害を減少できる。しかしながら、本文におけるＳ６、Ｓ２０と開示されない化合物は、相変わらず立体障害のため活性化不可になり、そのため、合成できるが、開裂可能な連結基を含有する、機能を有する化合物を形成できない。（２）腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファジで特異的に発現するアスパラギンエンドペプチダーゼでの特異的活性化により、開裂可能な連結基を含有する化合物は、腫瘍の局所で標的的に活性化され、標的的な細胞毒性を有することになる；立体障害のため活性化不可の化合物は、その薬物は無細胞毒性または低毒の薬物であり、抗がん薬物にならない。（３）結合体が化合物を接続した後、薬物の毒性が大幅に減少され、それは、結合体は薬物のヒドロキシまたはアミノと反応して、かつ一般的に、表面における活躍のヒドロキシまたはアミノは、薬物の毒性に関与する大事の基であるためである。（４）血液、正常器官、免疫システムのような非腫瘍微環境の部位において、開裂可能な連結基を含有する化合物は安定であり、かつ中性ｐＨに対しても安定であり、そのため、低い毒性或いは無毒性になる。（５）アスパラギンエンドペプチダーゼは、Ａｓｎの場所に結合体を切断する；代謝産物解析によって、開裂された場合だけｐ−アミノベンジルアルコール（４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−）とＲ４の間の活性化を開始して、カスケード活性化という補助役割を果たす。（６）ｐ−アミノベンジルアルコール（４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−）は、連結アームとして接続を延長して、Ｒ４化合物に接続した後のアスパラギンエンドペプチダーゼ反応中心との立体障害を効果的に減少できるが、アスパラギンエンドペプチダーゼによる接触活性化は、相変わらずＲ４の構造と極性に影響される。（７）Ｒ１による極性や可溶性も、結合体の活性化効率に関連し、かつ開裂可能な連結基の化合物の可溶性、安定性と有効性にも緊密に関連する。一般的な基を接続すること以外、Ｒ１は、特別な親水基または標的基と接続可能であり、そして、開裂可能な連結基を含有する化合物に、例えば実施例における可溶性の向上と効能の向上のような特別の機能を付与することも可能になる。（８）アスパラギンエンドペプチダーゼの分布特徴によって、開裂可��な連結基を含有する化合物は、複数の腫瘍において活性化でき、更に可溶性の変更を加えて、接続された薬物の腫瘍適応症の制限状況を直接に変更でき、広域性または特異向けの抗腫瘍薬物を開発する。（９）腫瘍細胞が転移する際に、細胞外マトリックスを分解するため、一般的に、たくさんのアスパラギンエンドペプチダーゼを分泌するから、接続された標的薬物は、腫瘍の転移に対する治療には特別の効能を有する。（１０）開裂可能な連結基を含有する化合物は、低毒かつ高効能の特徴を有し、免疫システムに対する毒性もなく、免疫治療と同時に併用でき、相乗効能を産生する。 
【０００７】
具体的に、以下の表のように、産生した一連の化合物と実施例を説明する：
（１）化合物Ｓ１−Ｓ４３、Ｓ１５’、Ｂ１５とＥ１５：二つ異なる接続方式で、開裂可能な連結基は複数の異なる新規抗がん化合物（実施例１〜９）を合成でき、その接続された抗がん化合物の異なりは、異なる合成効率と毒性減少の変化を引き起こし（実施例９）、更に異なる活性化効率（実施例１０、１１）と効能（実施例１２）をもたらすことを説明して、異なるＲ１、Ｒ２、Ｒ３の場合の開裂可能な的連結基の比較を研究した（実施例１３〜１４）；
（２）化合物Ｓ２’−Ｓ４’とＳ１０’−Ｓ２４’；化合物Ａ１、Ａ３−Ａ４とＡ１０−Ａ２４：異なるＲ１、Ｒ２、Ｒ３を含有する開裂可能な連結基と接続するパクリタキセル化合物（実施例１６、１７、２７、２８）を合成でき、その接続位置、立体障害、接続長さ、ないしＲ１の変化による可溶性の異なり（実施例１７、２８は水溶性の改善）及び異なる活性化効率（実施例２０、３０）とその低毒、高効能と新適応症の特性（実施例２０〜２６、３１〜３５、６６）を説明した；
（３）化合物Ｂ１、Ｂ３−Ｂ４とＢ１０−Ｂ２４；化合物Ｄ２−Ｄ４とＤ１０−Ｄ２４：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を含有する開裂可能な連結基と接続するドセタキセル化合物（実施例３６、３７、４６、４７）を合成でき、その接続位置、立体障害、接続長さ、ないしＲ１の変化による可溶性の異なり（実施例３７、４７は水溶性の改善）及び異なる活性化効率（実施例３８、４９）とその低毒、高効能と新適応症の特性（実施例４０〜４５、５０〜５４）を説明した；
（４）化合物Ｅ２−Ｅ４とＥ１０−Ｅ２４。異なるＲ１、Ｒ２、Ｒ３を含有する開裂可能な連結基と接続するマイトマイシン化合物（実施例５６、５７）を合成でき、その接続位置、立体障害、接続長さ、ないしＲ１の変化による可溶性の異なり（実施例５７は水溶性の改善）及び異なる活性化効率（実施例５８）とその低毒、高効能と新適用症の特性（実施例５９〜６５）を説明した；
具体的な実施例の一つにおいて、上記の式（ＩＩ）化合物は、下式（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、（ＩＩＣ）、（ＩＩＤ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される構造式を有する：
2017531029.tif 000005
2017531029.tif 000006
ただし、
Ｒ１は、６−マレイミドＣ１−１０アルキルカルボニル、ヒドロキシアミノカルボニルＣ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−（Ｃ１−４アルコキシ）ｎ−Ｃ１−６アルキルカルボニル、または
2017531029.tif 000007
から選ばれるものであり、
ただし、各Ｒは、それぞれ独立にＣ１−４アルキルであり、各ｎは、それぞれ独立に１〜３００であり、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である；
Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；
Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；
Ｒ５は、ヒドロキシを有する抗がん化合物（Ｒ５−ＯＨ）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＯＨ以外の他の部分）であり、上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルとドセタキセルから選ばれるものである；及び
Ｒ６は、アミノ基を有する抗がん化合物（Ｒ６−ＮＨ２）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＮＨ２基以外の他の部分）、上記の抗がん化合物は、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロンとマイトマイシンから選ばれるものである。
【０００８】
本発明は、更に本発明の式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩と薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する薬物組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、以下に示す式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）化合物の調製方法を提供する：
2017531029.tif 000008
2017531029.tif 000009
ただし、式（ＩＩＩ）化合物の調製において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、更にアルコール性ヒドロキシを含有する薬物（Ｒ５−ＯＨ）と反応して、式（ＩＩＩ）の化合物を生成する；上記の薬物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルまたはドセタキセルである；
式（ＩＶ）の化合物の調製において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、更にアミノ基を含有する薬物（Ｒ６−ＮＨ２）と反応して、式（ＩＶ）の化合物を生成する；上記の薬物は、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロンまたはマイトマイシンである；
ただし、Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである。
【００１０】
本発明は、がんを治療または予防する薬物の調製における式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩、または本発明の薬物組成物の使用も提供する。
【００１１】
本発明は、更に、眼科疾患を治療または予防する薬物の調製における式（ＩＸ）で表されるマイトマイシン誘導体またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
本発明は、更に腫瘍関連マクロファジの抑制、腫瘍生長の抑制、血管形成の抑制、がん細胞の浸潤と転移の抑制および／または抗腫瘍免疫を促進する薬物の調製における式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩または本発明の薬物組成物の使用を提供する。
【００１２】
本発明は、更にがんを治療または予防する方法であって、治療または予防に対する有効な量で、需要がある対象へ、式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩または本発明の薬物組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明は、更に、抗がん化合物の毒性副作用を低減する方法であって、該当抗がん化合物を、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３と接続することを含む方法を提供し、ただし、Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ドセタキセルとマイトマイシンから選ばれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＨＴ１０８０モデルにおいて、レグタキセルとアブラキサン、パクリタキセル注射液について、高使用量で、同等モル使用量と同等毒性使用量の比較試験を示す。
【図２】図２は、パクリタキセルとレグタキセルの免疫刺激特性試験の結果、およびレグタキセルで処理された腫瘍組織は浸透して、毒性ＣＤ８  Ｔ細胞（右図の矢印で指すもの）がもっと出現することを示す。
【図３】図３は、パクリタキセルとレグタキセルの免疫刺激特性試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一、化合物
本発明の化合物は、式（Ａ）で表される結合体と、該当結合体が薬物Ｒ４と結合してなる式（ＩＩ）化合物を含む。 本発明の式（ＩＩ）の化合物は、腫瘍部位に集めて、かつ特異的に活性化され、抗腫瘍化合物を放出する。
本発明の式（Ａ）の化合物は、以下のような構造を有する：
2017531029.tif 000010
式中、Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；およびＲ７は、Ｈ、ＸＣ（Ｏ）−または置換されても良い（例えばニトロ、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノから選ばれる置換基の１つ、２つまたは３つで置換された）ベンジルオキシカルボニルであり、ただし、Ｘは、ハロゲンである；ただし、Ｒ１は、そのカルボニルでＲ２とアミド結合を形成することで、Ｒ２と接続し、Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＡｓｎおよびＡｓｎと−ＮＨ−は、それぞれにアミド結合の接続を形成する。
本発明は、更に下式ＩＩの化合物を提供する：
2017531029.tif 000011
式中、Ｒ１は、一般的な官能基または保護基である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎである；かつＲ４は、ヒドロキシまたはアミノで接続された薬物基であり、該当薬物の一般式は、Ｒ４−Ｈである。
【００１６】
一部の実施例において、本発明の化合物においては、Ｒ１は、そのカルボニルでＲ２とアミド結合を形成することで、Ｒ２と接続する；Ｒ２、Ｒ３とＡｓｎは、トリペプチドを形成する；Ａｓｎは、そのカルボニルで、−ＮＨ−と接続する；Ｒ４は、その酸素原子で上記の開裂可能な連結基とカルボナートを形成することで、上記の開裂可能な連結基と接続し、またはその窒素原子で上記の開裂可能な接続ジョイントとカルバメートを形成することで、上記の開裂可能な連結基と接続する。
【００１７】
一部の好ましい実施例において、Ｒ４は、その芳香族環におけるアミノ置換基の窒素原子で上記の開裂可能な接続ジョイントとカルバメートを形成することで、上記の開裂可能な連結基に接続する；または、その芳香族環または複素環におけるヒドロキシ置換基の酸素原子で上記の開裂可能な連結基とカルボナートを形成することで、上記の開裂可能な連結基に接続する。
一部の実施例において、好ましいＲ３は、Ａｌａである。
【００１８】
本発明において、Ｒ１は、水素またはアミノ保護基であって良い。例えば、Ｒ１は、親水基または疎水基であっても良い。または、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル）、ポリエチレングリコール−Ｃ１−Ｃ５アルキルカルボニル、スクシニル、グルクロニド、マレイミドＣ１−１０アルキルカルボニル（例えば６−マレイミドヘキサノイル）、２−メトキシエトキシＣ１−６アルキルカルボニル、ヒドロキシアミノカルボニルＣ１−１０アルキルカルボニル（例えばＮ−ヒドロキシアミノ−１，８−スベリン酸−１−モノアシル）とヘキサノイル（すなわちＣ１−５アルキルカルボニル）から選ばれるいずれかの一つであっても良い。
【００１９】
好ましいのは、Ｒ１は、６−マレイミドＣ１−１０アルキルカルボニル、ヒドロキシアミノカルボニルＣ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−（Ｃ１−４アルコキシ）ｎ−Ｃ１−６アルキルカルボニル、または
2017531029.tif 000012
から選ばれるものであり、
ただし、各Ｒは、それぞれ独立にＣ１−４アルキルであり、各ｎは、それぞれ独立に１〜３００であり、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である。
【００２０】
好ましいのは、Ｒ４−Ｈは、水不溶性薬物である場合に、Ｒ１は、ＰＥＧタイプの基、例えばポリエチレングリコール−Ｃ１−Ｃ５アルキルカルボニル、または
2017531029.tif 000013
であることが好ましい。
【００２１】
一般的に、Ｒ１とＲ２アミノ酸のアミノ基とは接続する；Ｒ１とＲ２を接続する基は、カルボニルである場合に、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成する。
【００２２】
本発明において、Ｒ４は、抗がん化合物の活性部分を表示して、上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ドセタキセルとマイトマイシンを含むが、それらに限定されない。
【００２３】
式（ＩＩ）の化合物の例は、以下の構造式の化合物を含む：
2017531029.tif 000014
具体的な実施例の一つにおいて、Ｒ４は−Ｏ−Ｒ５であり、一般式（ＩＩ）の化合物は、下式（ＩＩＩ）で示される：
2017531029.tif 000015
ただし、Ｒ５は、ヒドロキシを有する抗がん化合物（Ｒ５−ＯＨ）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＯＨ以外の他の部分）であり、上記の抗がん化合物は、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルとドセタキセルから選ばれる。
【００２４】
具体的な実施例の一つにおいて、Ｒ４はＲ６−ＮＨであり、一般式（ＩＩ）の化合物は、下式（ＩＶ）で示される：
2017531029.tif 000016
式中、Ｒ６は、アミノ基を有する抗がん化合物（Ｒ６−ＮＨ２）の活性部分（すなわち、該当接続に用いられるＮＨ２基以外の他の部分）、上記の抗がん化合物は、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロンとマイトマイシンから選ばれる。式（ＩＶ）において、「（Ｈ）」は、Ｈが存在してもしなくても良いことを示す；存在しない場合に、Ｎは、二重結合でＲ６と接続する。
【００２５】
本発明の各構造式おけるｎは、一般的に、１〜３００の整数であり、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０……１００、１０１、１０２、１０３……２０１、２０２、２０３……２９５、２９６、２９７、２９８、２９９と３００である。ここは、１から３００までの各整数の値を具体的に述べないが、当業者にとって、該当範囲における各整数の値は、自明なものであり、かつ本発明はそれらの整数の値も詳しく開示したことが理解されるべく。本発明において、各構造式におけるｎは、一般的に、１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、および例えば５〜１０、５〜５０、５〜１００のようなまちまちの値である。
【００２６】
具体的な実施例の一つにおいて、式（ＩＩＩ）の化合物の例は、以下の化合物を含む：
（１）化合物Ｓ１；ただし、Ｒ１は、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルであり、Ｒ２は、Ｔｈｒであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、１０−ヒドロキシカンプトテシンである
2017531029.tif 000017
；
（２）化合物Ｓ２；ただし、Ｒ１は、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルであり、Ｒ２は、Ａｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、カンプトテシンである
2017531029.tif 000018
；
（３）化合物Ｓ３；ただし、Ｒ１は、（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−１，８−スベリン酸−１−モノアシルであり、Ｒ２は、Ａｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、カペシタビンである
2017531029.tif 000019
；
（４）および化合物Ｓ７〜Ｓ１８；ただし、Ｒ１は、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルであり、Ｒ２は、Ｔｈｒであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、それぞれにカンプトテシン（Ｓ７）、１０−ヒドロキシカンプトテシン（Ｓ８）、トポテカン（Ｓ９）、フルオロウリジン（Ｓ１０）、デオキシフルオロウリジン（Ｓ１１）、シタラビン（Ｓ１２）、フルダラビン（Ｓ１３）、エトポシド（Ｓ１４）、カペシタビン（Ｓ１５）、ゲムシタビン（Ｓ１６）、ビンクリスチン（Ｓ１７）、エポチロンＢ（Ｓ１８）であり，それに接続する化合物およびヒドロキシの位置は以下のようになる：
2017531029.tif 000020
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−カンプトテシン（Ｓ７）
2017531029.tif 000021
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−１０−ヒドロキシカンプトテシン（Ｓ８）
2017531029.tif 000022
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−トポテカン（Ｓ９）
2017531029.tif 000023
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−フルオロウリジン（Ｓ１０）
2017531029.tif 000024
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−デオキシフルオロウリジン（Ｓ１１）
2017531029.tif 000025
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−シタラビン（Ｓ１２）
2017531029.tif 000026
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−フルダラビン（Ｓ１３）
2017531029.tif 000027
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−エトポシド（Ｓ１４）
2017531029.tif 000028
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−カペシタビン（Ｓ１５）
2017531029.tif 000029
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ゲムシタビン（Ｓ１６）
2017531029.tif 000030
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ビンクリスチン（Ｓ１７）
2017531029.tif 000031
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−エポチロンＢ（Ｓ１８）
具体的な実施例の一つにおいて、式（ＩＶ）の化合物の例は、以下の化合物を含む：
（１）化合物Ｓ４；ただし、Ｒ１は、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルであり、Ｒ２は、Ｔｈｒであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、ダウノルビシンである
2017531029.tif 000032
；
（２）化合物Ｓ５；ただし、Ｒ１は、６−マレイミドヘキサノイルであり、Ｒ２は、Ａｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａであり、Ｒ４は、ダウノルビシンである
2017531029.tif 000033
；
（３）および化合物Ｓ１９〜Ｓ２８；ただし、Ｒ１は、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルであり、Ｒ２とＲ３いずれもＡｌａであり、Ｒ４は、それぞれにダウノルビシン（Ｓ１９）、エピルビシン（Ｓ２０）、フルダラビン（Ｓ２１）、ゲムシタビン（Ｓ２２）、ニムスチン（Ｓ２３）、ミトキサントロン（Ｓ２４）、メトトレキサート（Ｓ２５）、シタラビン（Ｓ２６）、メルファラン（Ｓ２７）、アドリアマイシン（Ｓ２８）であり、その化合物の構造とアミノに接続する位置は以下のようになる：
2017531029.tif 000034
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ダウノルビシン（Ｓ１９）
2017531029.tif 000035
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−エピルビシン（Ｓ２０）
2017531029.tif 000036
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−フルダラビン（Ｓ２１）
2017531029.tif 000037
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ゲムシタビン（Ｓ２２）
2017531029.tif 000038
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ニムスチン（Ｓ２３）
2017531029.tif 000039
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−ミトキサントロン（Ｓ２４）
2017531029.tif 000040
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−メトトレキサート（Ｓ２５）
2017531029.tif 000041
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−シタラビン（Ｓ２６）
2017531029.tif 000042
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−メルファラン（Ｓ２７）
2017531029.tif 000043
腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基−アドリアマイシン（Ｓ２８）
具体的な実施例の一つにおいて、本発明は、腫瘍微環境によって標的活性化するパクリタキセル誘導体を提供して、該当誘導体は、下式（Ｖ）で表される構造を有する：
2017531029.tif 000044
ただし、Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅから選ばれるものである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎから選ばれるものである；ｎは、１〜３００、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である。
【００２７】
式（Ｖ）の化合物の詳しい実例は、以下で示す化合物を含むが、それらに限定されない：
（１）化合物Ｓ１’；ただし、ｎ＝１、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３はＡｌａである
2017531029.tif 000045
；
（２）化合物Ｓ２’；ただし、ｎ＝５、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000046
；
（３）化合物Ｓ３’；ただし、ｎ＝１１、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000047
；
（４）化合物Ｓ４’；ただし、ｎ＝３００、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000048
；
（５）および下表Ｓ１０’〜Ｓ２４’；そのｎは１であり、Ｒ２とＲ３は、それぞれに表に示す：
2017531029.tif 000049
【００２８】
具体的な実施例の一つにおいて、本発明は、水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体を提供して、該当化合物は、下式（ＶＩ）で示される構造を有する： 
2017531029.tif 000050
式中、Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅから選ばれるものである；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎから選ばれるものである；ｎは、１〜３００、好ましいのは１〜１５０の任意の整数である。
【００２９】
式（ＶＩ）の化合物の詳しい実例は、以下で示す化合物を含むが、それらに限定されない：
（１）化合物Ａ１；ただし、ｎ＝１、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３はＡｌａである
2017531029.tif 000051
；
（２）化合物Ａ２；ただし、ｎ＝５、Ｒ２は、Ａｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000052
；
（３）化合物Ａ３；ただし、ｎ＝１１、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000053
；
（４）化合物Ａ４；ただし、ｎ＝１５０、Ｒ２はＡｌａであり、Ｒ３は、Ａｌａである
2017531029.tif 000054
。
式（ＶＩ）の他の化合物の例は、更に以下の化合物を含み、ただし、ｎは５であり、Ｒ２とＲ３は、以下の表に示す：
2017531029.tif 000055
【００３０】
本発明は、更に水溶性の腫瘍によって標的活性化するドセタキセル誘導体を提供して、該当ドセタキセル誘導体の構造式は、下式（ＶＩＩ）で示される： 
2017531029.tif 000056
ただし、Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；ｎ＝１〜３００、好ましいのは、１〜１５０の任意の整数である。
【００３１】
式（ＶＩＩ）の化合物の詳しい実例は、以下で示す化合物を含むが、それらに限定されない：
（１）化合物Ｂ１；ただし、ｎ＝１、Ｒ２は、Ａｌａアミノ酸にして、Ｒ３は、Ａｌａアミノ酸にする
2017531029.tif 000057
；
（２）化合物Ｂ２；ただし、ｎ＝５、Ｒ２は、Ａｌａアミノ酸にして、Ｒ３は、Ａｌａアミノ酸にする
2017531029.tif 000058
；
（３）化合物Ｂ３；ただし、ｎ＝11、Ｒ２は、Ａｌａアミノ酸にして、Ｒ３は、Ａｌａアミノ酸にする
2017531029.tif 000059
；
（４）化合物Ｂ４；ただし、ｎ＝１５０、Ｒ１は、Ａｌａアミノ酸にして、Ｒ２は、Ａｌａアミノ酸にする
2017531029.tif 000060
。
【００３２】
式（ＶＩＩ）の他の化合物の例は、更に以下の化合物を含む：
2017531029.tif 000061
【００３３】
本発明は、更に、腫瘍微環境によって標的活性化するドセタキセル誘導体を提供して、該当腫瘍微環境によって標的活性化するドセタキセル誘導体の構造式は、下式（ＶＩＩＩ）で示される： 
2017531029.tif 000062
ただし、Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；ｎは、１〜３００、好ましいのは、１〜１５０、より好ましいのは、１〜２０、最も好ましいのは、１〜１１の任意の整数である。 
【００３４】
式（ＶＩＩＩ）の化合物の実例は、以下の化合物を含む：
（１）化合物Ｄ１；ただし、ｎ＝１、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000063
；
（２）化合物Ｄ２；ただし、ｎ＝５、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000064
；
（３）化合物Ｄ３；ただし、ｎ＝１１、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000065
；
（４）化合物Ｄ４；ただし、ｎ＝３００、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000066
。
【００３５】
式（ＶＩＩＩ）の他の化合物の例は、以下を含む：
2017531029.tif 000067
【００３６】
具体的な実施例の一つにおいて、本発明は、標的活性化で放出されるマイトマイシン誘導体を提供して、上記の標的活性化で放出されるマイトマイシン誘導体の構造式は、下式（ＩＸ）で示される：
2017531029.tif 000068
ただし、Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；ｎは、１〜３００、好ましいのは、１〜１５０、より好ましいのは、１〜２０、最も好ましいのは、１〜１１の任意の整数である。 
式（ＩＸ）の化合物の実例は、以下の化合物を含む：
（１）化合物Ｅ１；ただし、ｎ＝１、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000069
；
（２）化合物Ｅ２；ただし、ｎ＝５、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000070
；
（３）化合物Ｅ３；ただし、ｎ＝１１、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000071
；
（４）化合物Ｅ４；ただし、ｎ＝３００、Ｒ２とＲ３はいずれもＡｌａである
2017531029.tif 000072
。
【００３７】
式（ＩＸ）の化合物の例は、更に以下の化合物を含む：
2017531029.tif 000073
【００３８】
本発明は、前記の化合物の薬学的に許容される塩を含む。薬学的に許容される塩の例として、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸およびシュウ酸塩のような無機と有機酸塩；および例えば、ナトリウムヒドロキシ、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、トロメタモール）およびＮ−メチルグルコサミンのような塩基と形成する無機と有機塩基塩を含む。
【００３９】
二、化合物の調製
本発明は、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールを重要な中間体として、本発明の化合物を調製する。好ましいのは、本発明の化合物を調製する反応経路は以下のように示す：
スキーム１
2017531029.tif 000074
スキーム２
2017531029.tif 000075
【００４０】
スキーム１において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールをｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、更にアルコール性ヒドロキシを含有する薬物Ｒ５−ＯＨと反応して、産物として、結合体炭酸ジエステルを生成する。スキーム１は、Ｒ４がカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセルまたはドセタキセルである本発明の化合物を調製することを適用する。
【００４１】
スキーム２において、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコールをｐ−ニトロフェニルクロロホルメートまたはトリホスゲンの活性化反応で、活性カルボナートまたはクロロホルメートを生成した後、更にアミノを含有する薬物Ｒ６−ＮＨ２と反応して、産物として、結合体炭酸ジエステルを生成する。スキーム２は、Ｒ４がダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロンまたはマイトマイシンである化合物を調製することを適用する。
【００４２】
本明細書の実施例における調製例を閲覧してから、当業者にとって、調製方法に係る他の試薬、反応条件、精製方法などは自明なものである。
【００４３】
三、薬物組成物
本発明は、薬物組成物を含み、該当薬物組成物は、本発明の前記の構造式の一つに係る化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
薬物組成物において、更に薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでも良い。担体または賦形剤は、本分野に公知される各種の薬学的に許容される担体または賦形剤にしても良く、かつ薬物の剤型または使用方式に応じて、異なってもよい。
【００４４】
具体的な実施例の一つにおいて、薬物組成物には、溶媒、可溶化剤／共溶媒、ｐＨ調整剤、凍結乾燥賦形剤と浸透圧調整剤の一つまたは以上を含む。
【００４５】
本発明に適用される凍結乾燥賦形剤は、糖類（例えばラクトース、マルトース、デキストラン、グルコース、フルクトース）、アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、マンニトール、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、塩化ナトリウムとシクロデキストリン（例えばヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、スルホブチルβシクロデキストリン）の一つまたは以上を含む。
【００４６】
本発明に適用されるｐＨ調整剤は、塩酸、リン酸、硫酸、炭酸、硝酸、酢酸、クエン酸、ＤＬ-酒石酸、Ｄ-酒石酸、Ｌ-酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、メグルミン、マレイン酸、エチレンジアミン、トリエチルアミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムの一つまたは以上を含む。
【００４７】
本発明に適用される好ましい溶媒は、有機溶媒であり、エタノール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、tert-ブタノール、グリセリン、Ｔｗｅｅｎ、大豆油、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン溶液とスルホブチルβシクロデキストリン溶液の一つまたは以上を含む。
【００４８】
本発明に適用される浸透圧調整剤は、グルコース、塩化ナトリウム、マンニトールと乳酸ナトリウムの一つまたは以上を含む。
【００４９】
本発明に適用される可溶化剤／共溶媒は、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０、ポロキサマー、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ドデカヒドロキシステアリン酸リチウム、スルホブチルβシクロデキストリン、ＰＶＰ、グリセリンとポリオキシエチレンヒマシ油の一つまたは以上を含む。
【００５０】
一般的には、毎日に、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を哺乳類に経口投与して、その用量は、一般的に、約０．００２５〜５０ミリグラム／キログラム体重であり、最も好ましいのは、約０．０１〜１０ミリグラム／キログラム体重である。同時に、既知の抗がん薬物を使用または他の治療を採用する場合に、その使用量は、効果的にその予想される目的を達成できるように設定するべく。当業者にとって、それらの既知の抗がん薬物の最適使用量は、公知なものである。
【００５１】
単位の経口使用量は、約０．０１〜５０ミリグラム、最も好ましいのは約０．１〜１０ミリグラムの本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでも良い。単位の使用量は、一回または複数回で投与してもよく、毎日に一服または複数服にして、一服につき約０．１〜５０ミリグラム、適当のは約０．２５〜１０ミリグラムの本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５２】
本発明の薬物組成物は、任意の適当な剤型に調製されても良く、錠剤、カプセル剤、注射剤などを含むが、それらに限定されない。例えば経口、静脈内注射、筋肉内注射などの本分野に公知の手段で、本発明の薬物組成物を投与してもよい。
【００５３】
四、化合物と薬物組成物の使用
腫瘍に分泌されるサイトカインは、単球を腫瘍関連マクロファジ（ＴＡＭ）に転化させるように誘導して、腫瘍関連マクロファジは刺激を行い、強烈な免疫抑制を産生できて、かつ腫瘍細胞の浸潤と転移に直接に寄与できる。腫瘍関連マクロファジ（Ｍ２タイプ）を、単球と炎症型マクロファジ（Ｍ１タイプ）と区別するための確認マークは、アスパラギンエンドペプチダーゼの発現産物である。本発明の化合物は、アスパラギンエンドペプチダーゼが存在する場合に、活性化、放出される。アスパラギンエンドペプチダーゼに特異的活性化される結合体の異なる部分は、最終薬物の標的、活性化、安定化、毒性と効能などの機能に巨大の影響があるから、本発明のアスパラギンエンドペプチダーゼで特異的活性化される結合体は、接続される薬物の毒性を効果的に低減でき、最終薬物は、新しい標的、活性化と代謝特性を有して、腫瘍を治療する効果を増加して、かつ新しい腫瘍適応症を産生して、腫瘍の転移に対抗する役割を産生して、新しい構造と機能を産生する。
【００５４】
本発明は更に、本発明の腫瘍微環境による放出性結合体（例えば、式（ＩＩＩ）〜式（ＩＸ）化合物）は、腫瘍関連マクロファジの死滅、微環境における免疫を抑制するサイトカインの低減化、および毒性ＣＤ８細胞の免疫を増強する現象の促進という効果を有することを見出した。より重要なことに、それらの腫瘍微環境による放出性化合物は、腫瘍の局所にのみ活性化され、従来の化学療法薬物が免疫システムの全体を損害することと異なる。試験において、腫瘍微環境による放出性化合物とＰＤ−１（プログラム細胞死分子１、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）抑制抗体（ＰＤＬ１−抗体、市販品、現在、免疫治療効果を有する候補薬物と認める）は、強烈な相乗治療作用を有して、免疫治療が化学療法薬物と相乗的に結合し難いという欠点を解決できる。
【００５５】
そして、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、または薬物組成物は、本分野において既知のカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウリジン、デオキシフルオロウリジン、シタラビン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポチロンＢ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロンまたはマイトマイシンが治療できるがんと眼科疾患のような各種の疾患を治療または予防できる。
【００５６】
例えば、本分野において公知されているものとして、カンプトテシンは、悪性の腫瘍、乾癬、疣、急性／慢性白血病および住血吸虫症による肝脾腫大などを治療または予防できる；１０−ヒドロキシカンプトテシンは、胃がん、肝がん、頭頸部がんおよび白血病などを治療できる；パクリタキセルは、主に卵巣がんと乳がんを治療するが、肺がん、結腸直腸がん、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、脳腫などにも効能がある；マイトマイシンは、慢性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、食管がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、悪性の腔内滲出液などを治療できる。
【００５７】
そのため、例えば、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩または薬物組成物で治療または予防できる疾患は、膀胱、脳、乳房／乳腺、子宮頸、結腸−直腸、食管、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、睾丸と血液などの部位のがんを含むが、それらに限定されない。具体的に、それらのがんは、膀胱がん、脳がん、乳房／乳がん、子宮頸がん、結腸−直腸がん、食管がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、鼻咽頭がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、睾丸がんと血がんを含む。
【００５８】
具体的な実施例の一つにおいて、本発明の式（ＩＸ）で表されるマイトマイシン誘導体またはその薬学的に許容される塩は、更に眼科疾患の治療または予防に用いられても良く、傷跡瘢痕または脈絡膜新生血管の治療または予防、またはマクロファジの抑制を含む。他の実施例において、式（ＩＸ）で表されるマイトマイシン誘導体は、更に角膜移植、緑内障、翼状片の手術の続発症などの治療または予防に用いられてもよい。
【００５９】
本発明の化合物または薬物組成物は、更に腫瘍の転移の防止、特に腫瘍の肺転移の防止に用いられてもよい。実施例の一つにおいて、本発明の化合物または薬物組成物は、乳がんの肺転移の防止に用いられてもよい。
【００６０】
そして、本発明は、疾患を治療または予防する方法を含み、該当方法は、治療または予防に対する有効な量で、需要がある対象へ、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する薬物組成物を投与することを含む。
【００６１】
そして、本発明は、腫瘍の転移を防止する方法を含み、該当方法は、有効な量で、需要がある対象へ、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する薬物組成物を投与することを含む。腫瘍の転移の防止は、腫瘍の肺転移および／または骨転移の防止を含むが、それらに限定されない。
【００６２】
重要の炎症性細胞として、腫瘍関連マクロファジ（ＴＡＭ）は、腫瘍に関連する炎症において、重要の役割を有する。腫瘍微環境において、ＴＡＭは、腫瘍の各方面の生物学特性を影響することによって、腫瘍の発展を促進する。それは、ある分子（例えばＥＧＦ）の分泌で、直接に腫瘍細胞の生長を促進して、血管の形成を促進して、そしてがん細胞の浸潤と転移の条件を用意するとともに、後天性の免疫機能を発揮することも抑制できる。そして、本発明は、更に腫瘍関連マクロファジを抑制する方法を含み、該当方法は、有効な量で、需要がある対象へ、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する薬物組成物を投与することを含む。腫瘍関連マクロファジを抑制することで、腫瘍の生長を抑制して、血管の形成を抑制して、かつがん細胞の浸潤と転移を抑制して、抗腫瘍の免疫を促進して、そしてがんの予防および／または治療を実現できる。具体的な実施例の一つにおいて、腫瘍関連マクロファジは、アスパラギンエンドペプチダーゼを発現して、Ｍ２タイプである。
【００６３】
本発明の前記の方法は、本分野に既知の放射線治療または免疫療法と併用してもよい。
【００６４】
従って、本発明は、更に前記の各種の方法または使用に用いられる本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、または本発明の薬物組成物を含む。
【００６５】
本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩または本発明の薬物組成物の、前記の疾患（例えばがん及がん転移）を治療または予防する薬物の調製における使用を含む。本発明は、更に本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩または本発明の薬物組成物の、腫瘍関連マクロファジの抑制、腫瘍生長の抑制、血管形成の抑制、がん細胞の浸潤と転移の抑制および／または抗腫瘍免疫を促進する薬物の調製における使用を含む。
【００６６】
本発明は、更に抗がん化合物（Ｒ４−Ｈ）の毒性副作用を低減する方法を提供して、上記の方法は、該当抗がん化合物とＲ１−Ｒ２−Ｒ３と接続することを含み、ただし、Ｒ１、Ｒ２とＲ３は上記の通りである。
【００６７】
本発明の治療または予防の方法は、該当需要がある対象へ、本発明の化合物または薬物組成物を投与することを含む。投与方法は、経口、静脈内注射、筋肉内注射などを含むが、それらに限定されない。対象として、哺乳類を含むが、特に人を含む。
【００６８】
本発明の「含有」、「含む」は、「……からなる」、「……で構成する」を含むことを理解するべく。全ての重量百分率または体積百分率の和は、１００％であるべく。特に断らない限り、実施例に使用される各種の試薬と製品は、市販品である；特に断らない限り、係る方法は、一般的な技術で実施する。下記の実施例は、本発明の範囲に対する制限にならない。
【００６９】
五、実施例
以下、実施例で、本発明の技術方案をされに説明する。
実施例１：化合物中間体的合成
１）Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニンメチルエステル（Ｉ）的合成
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Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（１００ｇ、０．４５ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３Ｌ）に溶解させ、攪拌しながら、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔともいう、７２．６ｇ、０．５４ｍｏｌ）と１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣともいう、１０３．３ｇ、０．５４ｍｏｌ）を添加して、攪拌して、１時間反応させた後、氷浴させ、０℃にして、Ｌ−アラニンメチルエステル（４６．２ｇ、０．４５ｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７３．８ｇ、１．３４ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）溶液を滴下して、滴下完了後、室温において１０ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗製品をジクロロメタン（２Ｌ）に溶解させ、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去した後に、粗産物を再結晶して、白色固体Ｉ（１０１ｇ、収率：７３．１％）を得た。
【００７０】
２）Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニン（ＩＩ）の合成
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Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニンメチルエステル（１００ｇ、０．３４ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）と水（１Ｌ）の混合溶液に溶解させ、０℃まで冷却して、１Ｍの水酸化リチウム溶液（４００ｍＬ）を滴下して、攪拌して、１０時間反応させ、ｐＨ＜６まで濃塩酸の滴下で中和して、回転蒸発して大部のテトラヒドロフランを除去して、残る水相をジクロロメタン（１Ｌ×３）で抽出して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸発して、白色固体ＩＩ（８８ｇ、収率：９２．２％）を得た。
【００７１】
３）４−Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＩＩＩ）の合成
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三つ口フラスコに、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギン（２０ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２００ｍＬ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれにｐ−アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を添加して、室温において３ｈ攪拌して、回転蒸発で大部のＤＭＦを除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品からビーティングを経て、白色固体ＩＩＩ（２１．３ｇ、収率：９０％）を得た。
【００７２】
４）４−Ｎ−（Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＩＶ）の合成
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４−Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（１３．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（３０ｍＬ）を添加して、室温において２ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、次に、真空乾燥炉において高真空乾燥で少量のピペリジンを除去して、薄黄色固体ＩＶを得、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
【００７３】
５）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（Ｖ）の合成
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三つ口フラスコにＮ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニン（６．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１１．６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５０ｍＬ）を添加して、氷浴において３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれに化合物４−Ｎ−（Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコールのＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品から再結晶を経て、白色固体Ｖ（１５ｇ、収率：９７％）を得た。
【００７４】
６）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＶＩ）の合成
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４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（５．０ｇ、６．６１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解させ、１０％パラジウム炭素（１ｇ）を添加して、水素ガスを導入して、常温常圧において攪拌して５ｈ反応して、濾過でパラジウム炭素を除去して、メタノールで洗浄して、ろ液と洗液を合併して、回転蒸発で大部の溶剤を除去して、粗産物を得、カラムクロマトグラフィーで白色固体ＶＩ（２．０ｇ、収率：４９％）を得た。
【００７５】
７）４−Ｎ−（Ｎ−Ｎ−（Ｎ−２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩ）の合成
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２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（４３２ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．８３ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌して、次に、４−Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（２．０ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）を滴下して、完了後に、緩慢に室温に加温して、１０ｈ攪拌した。減圧蒸留で大部のＤＭＦを除去して、得られた残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和的塩化アンモニウム溶液と飽和的塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、回転蒸発で溶剤を除去して、得られた粗製品からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て、白色固体ＶＩＩ（１．２ｇ、収率：５０％）を得た。
【００７６】
８）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩＩ）の合成
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化合物４−Ｎ−（Ｎ−Ｎ−（Ｎ−２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩ）（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加して、室温において５時間攪拌した。反応液を水洗を経た後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、高真空蒸留で残るトリフルオロ酢酸を除去して、粗産物をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、ＶＩＩＩ（６００ｍｇ、収率：８９％）を得た。
【００７７】
９）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルの合成
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化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（５００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、５℃まで氷浴して、窒素ガスの保護において、順次に、p−ニトロフェニルクロロホルメート（４０６ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液とピリジン（１６０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を滴下して、完了後、室温において一夜攪拌して、反応液を水洗を経た後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。回転蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、薄黄色固体（４５０ｍｇ、収率：６７％）を産物を得た。
【００７８】
実施例２：化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−トレオニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−１０−ヒドロキシカンプトテシン−炭酸ジエステル（Ｓ１）の合成
2017531029.tif 000085
４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステル（３３０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と１０−ヒドロキシカンプトテシン（１８２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を乾燥のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）で溶解させ、０℃まで冷却して、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１２２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌した。反応液を酢酸エチル（１００ｍＬ）に添加して、順次に水（５０ｍＬ×３）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、回転蒸発で溶剤を除去させ、粗産物を得、カラムクロマトグラフィーを経て分離・精製して、目的産物Ｓ１として薄黄色固体（８２ｍｇ、収率：１９％）を得た。
【００７９】
実施例３：化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−カンプトテシン−炭酸ジエステル（Ｓ２）の合成
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トリホスゲン（６００ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を乾燥のジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、−１０℃まで冷却して、窒素ガスの保護において、化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（５００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）とピリジン（０．３５ｍＬ、１２．１２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を滴下して、０℃において攪拌しながら、１時間反応して、自然に室温まで昇温して、２時間攪拌した後、カンプトテシン（３４８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を滴下して、室温において６時間反応して、反応液を順次に水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）と飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過して、減圧蒸発して、残留物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て白色固体（２９１ｍｇ、５３．５％）を得た。
【００８０】
実施例４：化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（８−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−１、８−スベリン酸−１−モノアシル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−カペシタビン−炭酸ジエステル（Ｓ３）の合成
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４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（８−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−１、８−スベリン酸−１−モノアシル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステル（７１５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）とカペシタビン（３６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を乾燥のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で溶解させ、０℃まで冷却して、ＤＭＡＰ（２４４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌した。反応液を酢酸エチル（１００ｍＬ）に添加して、順次に水（１００ｍＬ×３）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、回転蒸発で溶剤を除去させ、粗産物を得、カラムクロマトグラフィーを経て分離・精製して、目的産物Ｓ３として薄黄色固体（１９８ｍｇ、収率：２１％）を得た。
【００８１】
実施例５：化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−トレオニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ダウノルビシン−カルバメート（Ｓ４）の合成
2017531029.tif 000088
４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−トレオニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステル（２６４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、２０℃においてダウノルビシン（２１１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を滴下して、完了後、室温において３時間反応して、反応液をメチル−tert−ブチルエーテルに添加して、半時間攪拌した後、濾過して、得られた赤色固体をカラムクロマトグラフィーを経て精製した後、赤色固体産物Ｓ４（１７７ｍｇ、収率：４２．２％）を得た。
【００８２】
実施例６：化合物Ｓ５の合成
１）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコールの合成
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６−マレイミドヘキサン酸（１２０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（９２ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加して、窒素ガスの保護において、４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（３５３ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加して、半時間攪拌した後、０℃まで氷浴して、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１２０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を滴下して、完了後、室温まで昇温して、一夜攪拌して、反応液を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に添加して、順次に水（１００ｍＬ×３）、５％希塩酸（５０ｍＬ）と５％炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）で洗浄して、有機相を無水硫酸ナトリウムでの乾燥を経て、減圧蒸発した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、産物として白色固体（３００ｍｇ、収率：６４．８％）を得た。
【００８３】
２）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコールの合成
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化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｎ’−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（１６３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加して、室温において５時間攪拌した。反応液を水洗を経た後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、高真空蒸留で残るトリフルオロ酢酸を除去して、粗産物をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、産物として薄黄色固体（９７ｍｇ、収率：８５％）を得た。
【００８４】
３）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルの合成
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化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール（８１４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、０℃まで氷浴して、窒素ガスの保護において、順次に、p−ニトロフェニルクロロホルメート（４０６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液とピリジン（０．１６ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下完了後に、室温まで昇温して、一夜攪拌して、反応液を水洗を経た後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、産物として白色固体（５９７ｍｇ、収率：８１％）を得た。
【００８５】
４）４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ダウノルビシン−カルバメート（Ｓ５）の合成
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４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステル（２００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）に溶解させ、ダウノルビシン塩酸塩（１５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加して、５℃まで氷浴して、窒素ガスの保護において、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の溶液を滴下して、完了後、室温まで昇温して、攪拌して、一夜反応して、反応液をメチル−tert−ブチルエーテル（６００ｍＬ）に添加して、半時間攪拌した後、濾過して、赤色沈殿を収集して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て、産物として、赤色固体Ｓ５（１６４ｍｇ、収率：５４％）を得た。
【００８６】
実施例７：化合物４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ＭＭＡＥ−カルバメート（Ｓ６）の合成
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４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステル（２９８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）に溶解させ、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）の略称）塩酸塩（３０５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加して、５℃まで氷浴して、窒素ガスの保護において、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の溶液を滴下して、完了後、室温まで昇温して、攪拌して、一夜反応して、反応液をメチル−tert−ブチルエーテル（６００ｍＬ）に添加して、半時間攪拌した後、濾過して、赤色沈殿を収集して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て、産物として、赤色固体Ｓ６（４３４ｍｇ、収率：８２．４％）を得た。
【００８７】
化合物Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５の合成結果は、以下の表１に示し、質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、表１の通り、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５に相応する質量電荷比は、それぞれに９１６、８８５、８８０、１０７９と１５１３であり、構造の計算より得た分子量と同じであった。
【００８８】
表１：Ｓ１−Ｓ５の性状と質量分析法試験データ
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【００８９】
Ｒ２とＲ３の異なりは、アミノ酸を接続する際に原料の異なりだけであり、その異なるアミノ酸側鎖は、合成の過程には影響しない、相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸を合成過程に用いる以外は、前記の方法と同様にした。Ｒ４の接続反応は、前記の通り、触媒反応の条件と反応薬物の異なりだけである。 
【００９０】
実施例８：腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基は、異なるＲ４化合物と接続する条件も異なる
１）上記の化合物において、Ｒ４の、ヒドロキシで接続する方法とアミノで接続する方法は、完全に異なる。
Ｒ１Ｒ２Ｒ３−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルと、薬物Ｒ６とのアミノで接続する反応が成功できるか否かは、Ｒ６の選択によって決めって、例えばＲ１Ｒ２Ｒ３−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルと、カンプトテシンとの反応は、ＭＭＡＥとの反応の異なりは主に、ＭＭＡＥとの反応は、そのＭＭＡＥのアミノの強い求核性で反応（８２．４％）を行うが、カンプトテシンとの反応は、カンプトテシンにおけるヒドロキシの求核性で、ｐ−ニトロフェノールを置換する反応であり、ヒドロキシの求核性は、アミノの求核性より弱いが、ｐ−ニトロフェノールと相当するまたはやや弱いであるから、該当ステップの反応は、理論上で完成できない、ということにある。
【００９１】
出願人は、以下の事情を見出した：該当ステップの反応に、触媒としてＨＯＢＴなどを添加して、かつ厳格に選択した温度に固定するとともに、最後に反応終止時間を制御することでのみ、ＨＯＢＴのヒドロキシは、ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）と交換互変可能になるから、脱離しやすいＨＯＢＴと結合する遷移状態を形成して、そして効果的なカンプトテシンのヒドロキシとの交換を可能にするとともに、大量の反応の不純物を生成せず、現在の最大収量（５３．５％）を得た。
【００９２】
２）ＡＡＮ−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルと、薬物Ｒ５とのアミノで接続する反応が成功できるか否かは、完全にＲ５の選択によって決める
接続反応に対して、Ｒ５におけるアミノの立体障害および置換基は、決定的な影響があり、脂肪族基で置換されたアミノと、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルとの接続反応は、緩和の条件において高い産量（例えばＭＭＡＥ）を得られるが、芳香族アミノには、アミノの孤立電子対は、芳香族環と共役するから、その求核性を低減して、同じ反応条件において、産物を得られない。高スループットの選択や劇烈の反応条件で、例えばニムスチンとＲ１−Ｒ２−Ｒ３−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルとを接続する反応で、最終に、アルカリとしてＤＭＡＰを使用して、８０℃〜８５℃の温度にする場合だけを選択し、少量の産物（収率：２０％）を得た。
【００９３】
３）上記の化合物において、Ｒ１の選択は、Ｒ４の接続に異なる影響がある
異なるＲ１基は、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−アスパラギン−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルとＲ４とを接続する反応の条件に対して、重要な影響があり、例えば４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギン）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルとカンプトテシンとを接続する反応は、産物を得られない。異なる反応物と試験条件を選択する場合だけ、産物を得られ、例えば、４−Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アラニル）−Ｌ−アスパラギニル）−アミノベンジルアルコール−ｐ−ニトロフェノール−炭酸ジエステルを採用する場合だけ、カンプトテシンとの反応で、特定の温度条件において、相応の産物を生成できる。
【００９４】
実施例９：腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基との接続で、生成可能の化合物と毒性変化
Ｒ１を、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルにして、Ｒ２をＴｈｒにして、Ｒ３をＡｌａにする際に、Ｓ１〜Ｓ３反応と似ている触媒を採用する場合に、選択された開裂可能な連結基は、ヒドロキシと接続できる化合物： すなわち、Ｒ４は、カンプトテシン（Ｓ７）、１０−ヒドロキシカンプトテシン（Ｓ８）、トポテカン（Ｓ９）、フルオロウリジン（Ｓ１０）、デオキシフルオロウリジン（Ｓ１１）、シタラビン（Ｓ１２）、フルダラビン（Ｓ１３）、エトポシド（Ｓ１４）、カペシタビン（Ｓ１５）、ゲムシタビン（Ｓ１６）、ビンクリスチン（Ｓ１７）、エポチロンＢ（Ｓ１８）、パクリタキセル（Ｓ１３’）、ドセタキセル（Ｂ１３）である。
【００９５】
Ｒ１を２−（２−メトキシエトキシ）アセチルにして、Ｒ２とＲ３をＡｌａにする際に、Ｓ４〜Ｓ５反応と似ている触媒を採用する場合に、腫瘍微環境によって特異的活性化する結合体は、成功的に、アミノで接続できる化合物： すなわち、Ｒ４は、ダウノルビシン（Ｓ１９）、エピルビシン（Ｓ２０）、フルダラビン（Ｓ２１）、ゲムシタビン（Ｓ２２）、ニムスチン（Ｓ２３）、ミトキサントロン（Ｓ２４）、メトトレキサート（Ｓ２５）、シタラビン（Ｓ２６）、メルファラン（Ｓ２７）、アドリアマイシン（Ｓ２８）、マイトマイシン（Ｅ１３）である。
【００９６】
表２：合成可能の化合物の性状と質量分析法試験データ
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2017531029.tif 000096
【００９７】
毒性の検出方法： 生体外の細胞毒性試験は、標準の汎用プロトコールを採用して、９６ウェルプレートに、２５００個ＨＥＫ２９３細胞を培養して、一夜成長させた。異なる濃度の細胞毒性化合物と、相応する結合後の化合物とは、各ウェルに添加され、細胞とともに３７℃において７２時間インキュベートし、ＭＴＴ試薬で処理して，ＯＤ値の変化を読み取り，改造した薬物と毒素ＩＣ５０を比較して、毒性の変化のおおよその倍率を得た。 
【００９８】
実施例10：腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基は、異なる化合物と接続する場合に、異なる活性化効率を有する
連結基と接続しようとする化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、活性化効果を決める。３７℃において、１０マイクログラム／ミリリットルの酸化されたアスパラギンエンドペプチダーゼまたは異なる腫瘍組織ホモジネート（３０マイクログラム／ミリリットル）に、１ミリグラム／ミリリットルのＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とＳ６を添加して、ＨＰＬＣで、反応物の減少と産物の増加を検出して、それらの化合物の活性化効率（酵素に切断されて放出される薬物が、元化合物に占める比率を指して、活性化効率が大きいほど、活性化効果が高い）を比較して、選択より、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４とＳ５は、高い腫瘍組織に活性化される効率を有するが、Ｓ６の腫瘍組織に活性化される効率は低いことを見出した（表２）。試験の結果として、Ｓ３において、Ｒ１は（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−１、８−スベリン酸−１−モノアシルである場合に、腫瘍に高発現の金属プロテイナーゼｍｍｐ２と標的的に結合できて、Ｓ５において、Ｒ１は６−マレイミドヘキサノイルである場合に、腫瘍に高発現のカテプシンと標的的に結合できて、そして標的活性化効果を一層に向上することを見出した。
【００９９】
表３：Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とＳ６の活性化効率（％）
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【０１００】
実施例11：腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基は、異なる化合物と接続する場合に、異なる的活性化効率を有する
連結基と接続しようとする化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、活性化効果を決める。３７℃において、１０マイクログラム／ミリリットルの酸化されたアスパラギンエンドペプチダーゼに、１ミリグラム／ミリリットルのＳ７〜Ｓ２７化合物を添加して、ＨＰＬＣで、反応物の減少と産物の増加を検出して、それらの化合物の活性化効率を比較して、結果は、表３に示す。  
【０１０１】
表４：Ｓ７〜Ｓ２７の活性化効率（％）
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【０１０２】
表４にように、試験で、最終の異なる化合物の、アスパラギンエンドペプチダーゼに活性化される効率も異なることを見出して、選択された合成のＳ７〜Ｓ２７化合物の活性化される効率は、基本的に６０％より大きいが、Ｓ６、Ｓ１６の活性化される効率は、３０％よりの低い値である。アスパラギンエンドペプチダーゼの活性化サイトは、アスパラギニル−ｐ−アミノベンジルアルコールの接続箇所であり、活性化で開裂した後、ｐ−アミノベンジルアルコール（４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−）は、自己放出できて、更にＲ４−Ｈ薬物を放出した。アスパラギンエンドペプチダーゼの酵素活性センターは、バルーン形状の凹みのボトムにあり、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に接続しようとする化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、接続サイトの極性に対して、非常に重要なことになる。試験の結果より、Ｓ６、Ｓ１６の立体障害と極性は活性化に影響することから、そしてＳ６、Ｓ１６の活性化効率は低い、他の化合物の活性化効率は高いという状況が発生したことを見出した。
【０１０３】
結果と検討：結果によって、該当腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基は、異なる化合物に、接続・活性化できることを判明して、ただし、立体障害の異なりによって、活性化可能と活性化不可に分ける。
【０１０４】
実施例１２：ヌードマウスにおけるＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８注射液の効能研究
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８化合物の抗腫瘍効能を了解する。
試験の際に、生理食塩水で、治療薬物Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８注射液を相応の濃度に希釈する。
【０１０５】
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ２３１（細胞）を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地（略称、ＤＭＥＭ培養液）を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程：Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８を、ＩＶ（静脈）注射で臨床投与して、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８、カンプトテシン、カペシタビンとダウノルビシンをいずれも１３．２ミクロモル／キログラムの使用量で、週に1回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５に示す。
表５：ヌードマウスに対するＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１６、Ｓ２２とＳ２８薬物の腫瘍を治療する効果
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５）結果与検討：表５に示すように、コントロール、カンプトテシングループ、カペシタビングループとダウノルビシングループと比べて、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ２２とＳ２８は、腫瘍の生長の抑制において強い効果を有するが、Ｓ６、Ｓ１６は、活性化されないため、効能があまりないことから、結合体は、薬物の効能を大きく向上して、かつ活性化の効率が、治療の効果を決めることを判明した。Ｓ６、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ１９〜Ｓ２７の構造を比較すると、Ｓ６において、ＭＭＡＥに結合されたアミノの位置は、ＭＭＡＥにおける二つのつながっている疎水性のバリンのアミノにあり、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−連結アームと接続した後、逆に、Ｓ６は、バリンの疎水性領域と低分子ペプチドによって、アスパラギンエンドペプチダーゼ活性センターに対して不利の位置に連れられて、立体障害を発生して、アスパラギンエンドペプチダーゼの活性中心が切断結合へ接近することを障害して、そして切断、活性化される効率は、低くなることを見出した。 Ｓ６の活性化効率は、ＡＡＮＶＶペプチドより低いから、ここに、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−連結アームは、無効である。合成の点で、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−連結アームの添加は、ペプチド結合の形成より複雑である。Ｓ４、Ｓ５、Ｓ１９〜Ｓ２７が結合されたアミノの位置は、ペプチドにおけるアミノではなく、芳香族環におけるアミノであり、発明人は、案外に、芳香族環は、連結アームの極性にあまり影響しないとことをはじめて見出すから、４−アミノベンジル−ＯＣ（Ｏ）−連結アームの使用は、アミノに直接に接続する際の立体障害を解消できて、優れた活性化効果を得られ、その活性化効率は、直接に連結する化合物より普遍的に高いだけではなく、該当作用は、芳香族環化合物に限られない。
【０１０６】
実施例１３  ＭＭＡＥとアドリアマイシンの異なる開裂可能な連結基に対する比較研究
Ｒ１を、２−（２−メトキシエトキシ）アセチルにして、Ｒ３を、Ａｌａにする際に、異なる開裂可能な連結基を含有するものに対して、活性化研究と効能研究を行い，その研究方法は、実施例１０、１１、１２と同じ、アスパラギンエンドペプチダーゼで、生体外の活性化効率を検出して、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ２３１モデルで、腫瘍抑制率を検出した。
表６：ＭＭＡＥとアドリアマイシンの異なる開裂可能な連結基に対する比較研究
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【０１０７】
実施例１４
合成に採用されたアミノ酸原料が異なる以外、化合物Ｓ２９〜Ｓ４３の合成方法は、化合物Ｓ１と同じである。本実施例は、それぞれに、異なるアミノ酸構造を有する化合物の活性化特性と腫瘍抑制率に対して、試験を行い、その試験方法は、前記の実施例４、６、８、１２、１３と同じ、試験結果は、表７に示す：
表７：化合物Ｓ２８〜Ｓ４３の活性化特性、腫瘍抑制率結果
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結果と検討：表７に示すように、Ｓ２９〜Ｓ４３のいずれも、一定の活性化活性と腫瘍生長と転移抑制効果を有して、試験結果として、効果的に活性化された化合物において：Ｒ２は、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＡｌａのいずれも一つアミノ酸であってもよい；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれも一つアミノ酸であってもよい。 
【０１０８】
実施例１５：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とＳ６薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とＳ６薬物の抗腫瘍効能を了解する。
試験薬物：Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、カンプトテシン、カペシタビンとダウノルビシンいずれも１３．２ミクロモル／キログラムの使用量を採用して、ＰＤＬ１−抗体の使用量は、５マイクログラム／キログラムである。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。 免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。
３）腫瘍の産生：３２日目に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめた。
４）腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞解析。腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＣＤ８−ＦＩＴＣで標識された抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析した。
５）グループの分けと結果の測定は表8に示す。
表８：Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６およびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
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６）結果と検討：免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５の治療効果は、大きく向上されて、Ｓ６グループは、ダウノルビシングループと比較すると、治療効果も一定の程度に向上された。Ｓ１とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有する。試験の結果から、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５は、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できることを判明した。
【０１０９】
実施例１６：腫瘍微環境によって標的活性化されたパクリタキセルの合成
１）（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）プロピオニルアミノ）プロピオン酸メチルエステル（Ｉ）の合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（１００ｇ、０．４５ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３Ｌ）に溶解させ、攪拌しながら、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７２．６ｇ、０．５４ｍｏｌ）と１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０３．３ｇ、０．５４ｍｏｌ）を添加して、０−５℃において攪拌して、１時間反応させた後、氷浴において、Ｌ−アラニンメチルエステル（４６．２ｇ、０．４５ｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７３．８ｇ、１．３４ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）溶液を滴下して、滴下完了後、室温（２５℃）において１０ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗製品をジクロロメタン（２Ｌ）に溶解させ、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去した後に、粗産物を再結晶して、白色固体Ｉ（１０１ｇ、収率：７３．１％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： ３０９［Ｍ＋１］＋。
【０１１０】
２）（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）プロピオニルアミノ）プロピオン酸（ＩＩ）の合成
（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）プロピオニルアミノ）プロピオン酸メチルエステル（１００ｇ、０．３４ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）と水（１Ｌ）の混合溶液に溶解させ、０℃まで冷却して、１Ｍの水酸化リチウム溶液（４００ｍＬ）を滴下して、室温（２５℃）において攪拌して、１０時間反応させ、ｐＨ＜６まで濃塩酸の滴下で中和して、回転蒸発して大部のテトラヒドロフランを除去して、残る水相をジクロロメタン（１Ｌ×３）で抽出して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸発して、白色固体ＩＩ（８８ｇ、収率：９２．２％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 295［Ｍ＋１］＋。
【０１１１】
３）（Ｒ）−２−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニルアミノ）−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（ＩＩＩ）の合成
５００ｍＬの三つ口フラスコに、（Ｒ）−２−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニルアミノ）−４−（トリフェニルメチルアミノ）ブタン酸（２０ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれにｐ−アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を添加して、室温（２５℃）において３ｈ攪拌して、回転蒸発で大部のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品からｎ−ヘキサン／酢酸エチル（５／１、３００ｍＬ）によるビーティングを経て、白色固体ＩＩＩ（２１．３ｇ、収率：９０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 702［Ｍ＋１］＋。
【０１１２】
４）（Ｒ）−２−アミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（ＩＶ）の合成
（Ｒ）−２−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニルアミノ）−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（１３．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（３０ｍＬ）を添加して、室温（２５℃）において２ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、次に、真空乾燥炉において高真空乾燥（１００℃）で少量のピペリジンを除去して、薄黄色固体ＩＶ（８．４３ｇ、収率：９５％）を得、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
【０１１３】
５）  （Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（Ｖ）の合成
三つ口フラスコに（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオン酸（６．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１１．６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）を添加して、氷浴において３０ｍｉｎ攪拌した。０℃において、それぞれに化合物（Ｒ）−２−アミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温（２５℃）において１７時間攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液（１００ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（１００ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過した後、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品から再結晶を経て、白色固体Ｖ（１５ｇ、収率：９７％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 756［Ｍ＋１］＋。
【０１１４】
６）（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−アミノプロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（ＶＩ）の合成
（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（５．０ｇ、６．６１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解させ、１０％パラジウム炭素（１ｇ）を添加して、水素ガスを導入して、常温（２２℃）において攪拌して、５ｈ反応して、濾過でパラジウム炭素を除去して、メタノール（１００ｍＬ）で洗浄して、ろ液と洗液とを合併して、回転蒸発で大部の溶剤を除去して、粗産物を得、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て（２００−３００メッシュ、ジクロロメタン／メタノール＝２０／１−１０／１、２．５Ｌ）白色固体ＶＩ（２．０ｇ、収率：４９％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 622［Ｍ＋１］＋。
【０１１５】
７）（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（ＶＩＩ）の合成
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（４３２ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．８３ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌して、次に、（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−アミノプロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（２．０ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）を滴下して、完了後に、緩慢に室温（２５℃）に加温して、１０ｈ攪拌した。減圧蒸留で大部のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを除去して、得られた残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和的塩化アンモニウム溶液（１５０ｍＬ）と飽和的塩化ナトリウム溶液（１５０ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過して、回転蒸発で溶剤を除去させ、得られた粗製品からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て（２００−３００メッシュ、ジクロロメタン／メタノール＝２０／１−１０／１、２Ｌ）、白色固体ＶＩＩ（１．２ｇ、収率：５０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 738［Ｍ＋１］＋。
【０１１６】
８）（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸ジアミド（ＶＩＩＩ）の合成
（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−（トリフェニルメチルアミノ）−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸モノアミド（ＶＩＩ）（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加して、室温（２５℃）において５時間攪拌した。反応液を水洗（２０ｍＬ）した後、分液した後、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥した。減圧蒸留で溶剤を除去して、蒸留で残るトリフルオロ酢酸を除去して、粗産物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て（２００−３００メッシュ、ジクロロメタン／メタノール＝１５／１−８／１、１．５Ｌ）Ｘ（６００ｍｇ、収率：８９％）を分離した。ＬＣ−ＭＳ： 496［Ｍ＋１］＋。
【０１１７】
９）４−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−アミノスクシニル））アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＸ）の合成
５０ｍＬの三つ口フラスコに化合物（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−１−ヒドロキシルメチルフェニルコハク酸ジアミド（５００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を添加して、ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴（０−５℃）において、窒素ガスの保護において、それぞれにp−ニトロフェニルクロロホルメート（４０６ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１６０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を滴下した。 室温（２５℃）において、１８時間攪拌した。反応液を水洗（１０ｍＬ）した後、分液した後、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥した。回転蒸発で溶剤を除去させ、得られた粗製品からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て（２００−３００メッシュ、ジクロロメタン／メタノール＝３０／１−２０／１、１Ｌ）、白色固体ＩＸ（４５０ｍｇ、収率：６７％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 661［Ｍ＋１］＋。
【０１１８】
１０）２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルパクリタキセル（化合物Ｓ１’）の合成
４−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（メトキシエトキシアセチルアミノ）プロピオニルアミノ）プロピオニルアミノ−４−アミノスクシニル））アミノベンジルパクリタキセルカルボナート（２５０ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）とパクリタキセル（１９４ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）とを、乾燥されたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、４−ジメチルアミノピリジン（５４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加して、室温（２５℃）において、１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチル（２０ｍＬ）に添加して、有機相を合併して、水（３０ｍＬ）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。回転蒸発で溶剤を除去させ、得られた粗製品からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て（２００−３００メッシュ、ジクロロメタン／メタノール＝２０／１−１５／１、５００ｍＬ）、目的産物として、化合物Ｓ１（１５０ｍｇ、収率：５７％）を得た。ＬＣ−ＭＳ： 1375［Ｍ＋１］＋。 ＬＣ−ＭＳの検出結果は以下のように：８．５９溶出ピークに相応する質量電荷比は１３７５、構造計算で得られた分子量１３７４．５と一致した。
【０１１９】
化合物Ｓ２’、Ｓ３’、Ｓ４’の合成は、Ｓ１’の合成に参照して、結果は下表に示すように、区別としては、ステップ７）における合成に使用したアルコキシ置換酢酸の分子量は異なることである。ただし、Ｓ２’の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサノナデカン酸を使用することである；Ｓ３’の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサヘプタトリアコンタン酸を使用することである；Ｓ４’の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸に代わりに、直接に購入した長鎖ポリオキサ脂肪酸（吉爾生化の注文品、ｎ＝３００のポリマー）を使用することである；質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ｓ２’、Ｓ３’に相応する質量電荷比は、それぞれに１５５１と１８１６であり、構造計算より得た分子量１５５０．６と１８１５．９と一致した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で検出されたＳ４’分子量は、約１４５２４であり、構造計算より得た分子量１４５２４．７と一致した。
表９
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【０１２０】
実施例１７：Ｓ１０’〜Ｓ２４’の合成
合成方法は、アミノ酸に接続する際の原料は以下の表１０に示すように異なる以外に、化合物Ｓ１’と似ていた。相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、それぞれに同じ縮合剤（１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を添加して、反応させ、０℃−２５℃において、０．５−２ｈ反応して、更にアスパラギンを添加して、０℃−２５℃において２−２４ｈ反応して、トリペプチドを得た。質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、Ｓ１０’−Ｓ２４’化合物（ｎ＝１）の分子量は、順次に以下の表に示すように、構造計算より予測された分子量と一致することを確認した。 
表１０
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【０１２１】
実施例１８：腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル誘導体とコントロール化合物の性能の比較
（１）サンプル処理
化合物Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’（実施例１６に得られた）とコントロール化合物Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５とＣ６は、凍結乾燥（−７０℃）を経て、無菌室にサブパッケージされた。動物試験の前に、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’は、無菌室において、下記の二つの溶剤方案で再溶解された： 溶剤１（注射用水）、または溶剤２（５０％注射用水、４２％〜４９％プロパンジオール、１％〜８％Ｔｗｅｅｎ８０）。以下の表１１に示すように、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’は、溶剤１と溶剤２に完全に溶解できて、再溶解の濃度は、１０ミリグラム／ミリリットルにしても良く、更に注射用水で所要の濃度まで希釈するが、比較化合物（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）は、薬物の製剤需要に満たさない。
表１１：コントロール化合物における近似組成の欠失、またはパクリタキセルの７位または２位の接続（すなわち、それぞれに基をパクリタキセル分子式の７位または２位のＯＨに接続すること）が、薬物の製剤の可溶性に対する影響
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表１１におけるＡＡＮ、ＡＡＮＬ、ＡＡＮＫは、それぞれに化合物における低分子ペプチドアミノ酸の接続を示して、Ａ：Ａｌａ、Ｎ：Ａｓｎ、Ｌ：Ｌｅｕ、Ｋ：Ｌｙｓ。溶剤１は、注射用水である；溶剤２は、１０ミリグラム／ミリリットルの溶解濃度で、５０％注射用水、４５％〜４９％プロパンジオールと１％〜５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む。
【０１２２】
表１１の結果から、本発明のパクリタキセル誘導体の可溶性は大きく変化し、溶剤１または溶剤２において、可溶性が増加して、溶解特性の変化は、薬物の製剤に大きく影響することを判明した。しかし、比較化合物（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）の可溶性は、薬物の製剤需要に満足できない。そして、水に不溶のパクリタキセル薬物を比べて、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’は、可溶性の薬物製剤に調製できて、注射の使用量と効能を向上できて、現在のパクリタキセル薬物におけるアネルギー性補助原料（ヒマシ油など）の使用という欠点を避けられ、革新性と応用将来性を有する。
【０１２３】
実施例１９：Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の含量を測定する方法および含量の範囲
Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’は、解析型ＨＰＬＣ（アジレント１２２０  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ｓｅｒｉｅｓ）、Ｃ８カラム５μｍ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動相は、０〜９５％アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用して、純度は９５％−９９％であることを測定した。
【０１２４】
実施例２０：腫瘍組織が、腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル誘導体を活性化する効率の試験
溶剤（５０％注射用水、４５％〜４９％アルコールと１％〜５％Ｔｗｅｅｎ８０）で、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’サンプル化合物をまとめ溶解して、水で１０倍に希釈して、１ミリグラム／ミリリットルにした。３７℃において、１００マイクログラムの酸化された腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に１ミリグラム／ミリリットルのサンプル化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートにおける酵素は、パクリタキセルの放出を引き出して、ＨＰＬＣで化合物の減少とパクリタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較して、選択より、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の接続は、選択された化合物において、最高の活性化効率を有することを見出した。
【０１２５】
表１２：異なる腫瘍組織ホモジネートにおけるＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の化合物の活性化された比率（％）
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溶剤（５０％注射用水、４２％〜４９％アルコールと１％〜８％Ｔｗｅｅｎ８０）で、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’サンプル化合物をまとめ溶解して、水で１０倍に希釈して、１ミリグラム／ミリリットルにした。３７℃において、１００マイクログラムの酸化されたヒト乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ４３５）腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に、１ミリグラム／ミリリットルのサンプル化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートにおける酵素は、パクリタキセルの放出を引き出して、ＨＰＬＣで化合物の減少とパクリタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較した。結果として、以下の表１３に示すように。
【０１２６】
表１３：コントロール化合物における近似組成の欠失が、薬物活性化に対する影響
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【０１２７】
前記の結果から、本発明の腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル誘導体における、異なる基の接続とパクリタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有することを判明した。パクリタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。異なる腫瘍種類（１０種類の異なる腫瘍）におけるＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の活性化は、薬物活性化の広域性を表した（表１３）。 同時に、化合物を選択する過程に、産生された特定化合物を比較すると、一つのヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ４３５腫瘍組織における活性化効率を解析して、試験は、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’化合物の各基の選択は、活性化効率が相対的に高い組み合わせであることを証明した（表１３）。
【０１２８】
本発明に提供された腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル誘導体の試験の設計構想は、大量の合成試験の設計で異なる接続方式の複雑な化合物を調製して、次に複雑な化合物をパクリタキセルにおける２位または７位（すなわち、それぞれに複雑な化合物を、パクリタキセル分子式における７位または２位のＯＨに接続すること）に接続して、さらに腫瘍組織の活性化効率の大きさにより選択して、順次に、Ｒ２、Ｒ３、およびｎを異なる値にする際に、得られた化合物の、腫瘍に対する抑制作用より選択することである。腫瘍組織特異的活性化サイトは、ＡＡＮと基２の間における接続箇所であり、活性化より開裂された後、基２は自己放出できて、更にパクリタキセルを放出する。アスパラギン酸酵素の酵素活性センターは、バルーン形状の凹みのボトムにあり、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に複雑な化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、非常に重要なことになる。
【０１２９】
選択試験の結果より、本発明において、基２の接続は、効果的にパクリタキセルに直接に接続する場合の立体障害を避けられ、アスパラギン酸酵素の接近を影響しない。基１の構造・効果関係は、切断サイトの極性を増加できて、水溶性の良いプロテアーゼは制限酵素切断部位により接近しやすい、そして切断の効率を向上する。パクリタキセルの２位への接続も明らかに、プロテアーゼに対するパクリタキセルの立体障害を低減するとともに、より多くの全体的親水極性基を露出して、切断効率と水溶性を向上する。更に、それぞれに一つの極性アミノ酸Ｋと一つの極性アミノ酸Ｌを添加すると、活性化効率が低減される。
【０１３０】
実施例２１：腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル誘導体の静脈内投与における被験薬の最大耐量（ＭＴＤ）の測定
試験目的：マウス静脈内投与のＭＴＤ（最大耐受量）を測定する試験より、本発明のパクリタキセル誘導体の急性毒性を了解する。
試験薬物：溶剤（５０％注射用水、４２％〜４９％アルコール、１％〜８％Ｔｗｅｅｎ８０）にまとめて溶解されたＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’サンプル化合物を使用して、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’注射液を得た。
動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス（上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社）、体重１９−２１ｇ、全てはメス。 
方法と結果：３６匹の被験ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、体重よりランダムに７グループに分けて、グループごとに６匹であった。表１４に示すように、０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９６０ｍｇ／ｋｇで、それぞれに１回にＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’を静脈内注射した。同時に、生理食塩水グループ、パクリタキセル注射液（市販品、北京悦康社）グループにおいて、コントロール試験を行い、マウスごとの投与体積は０．２ｍｌとした。連続に１７日を観察して、毎日に、動物が毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応などを出現か否かを観察して、体重と死亡状況を記録した。３、５、１４日目に血液サンプルを収集して、全血算定を行い、１４日目に動物を解剖して、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を収集して、ＨＥ染色で観察した。
【０１３１】
表１４：被験マウスは、それぞれに異なる使用量のＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’注射液、および生理食塩水、パクリタキセル注射液を投与された場合の死亡率の結果比較
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【０１３２】
結果と検討：表１１に示すように、本発明において、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’溶液を注射したマウスグループには、９０ｍｇ／ｋｇの使用量で、動物は毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応と死亡という状況を出現しなかった。Ｓ１’とＳ２’溶液のＭＴＤ値（最大耐量）は９０ｍｇ／ｋｇであり、パクリタキセルのＭＴＤ値６ｍｇ／ｋｇよりはるかに大きい。静脈内投与における被験薬の最大耐量は、薬物毒性の重要な参照指標であり、標的活性化・放出されたパクリタキセルの毒性は、パクリタキセルより著しくに低減することを判明した。
【０１３３】
実施例２２：ヌードマウスにおけるＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の効能研究
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’化合物の抗腫瘍効能を了解する。
試験薬物：Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’溶液（実施例２１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス、上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社から購入。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからヒト前立腺がんＰＣ−３細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＰａｎｃ−１細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の臨床投与において、ＩＶ注射した。Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’のいずれも、１／６ＭＴＤより低い使用量、すなわち２４ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、パクリタキセルは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち８ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に1回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表１５に示す。
表１５：ヌードマウスに対して、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、Ｓ４’、パクリタキセルおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
2017531029.tif 000110
５）結果と検討：表１５に示すように、同等モル濃度のパクリタキセル薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０１３４】
実施例23：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’薬物の抗腫瘍効能を了解する。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス、上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社から購入。
試験薬物：Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’溶液（実施例２１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。以下の表１６における免疫グループは、Ｄ１２１肺がん細胞で免疫され、Ｄ１２１死腫瘍細胞で免疫されないグループは、生理食塩水を注射して、コントロールとする。
３）腫瘍の産生：免疫過程を完了した後（４週後）に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめ、マウスの腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を記録して、腫瘍の抑制率を計算した。
４）腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔリンパ球サブセット）の解析。腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄て、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＣＤ８−ＦＩＴＣで標識された抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析した。
５）グループの分けと結果の測定は表１６に示す。
表１６：Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、Ｓ４’、パクリタキセル治療グループおよびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
2017531029.tif 000111
６）結果と検討：免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’化合物の治療効果は大きく向上され、Ｓ１’とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有して、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できる。
【０１３５】
実施例２４：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルにおけるＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’の効能研究
試験目的：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルによって、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’化合物の抗腫瘍効能を了解する。
試験薬物：Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’溶液（実施例２１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
１．動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス、６−８週齢、全てはメス、上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社から購入。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから４Ｔ１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍転移の産生：１０６個のＴ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が１．５ｃｍ前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、手術で皮下腫瘍を除去して、薬物治療をはじめて、２７日目にマウスを麻酔して、殺して、全肺を取り出して、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置いて、染色を行って、解剖顕微鏡で、肺部へ転移した腫瘍の数を統計した。
３）治療の過程：ＩＶ注射を使用して、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１２ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、パクリタキセル薬物治療グループは、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち４ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、三日に１回、合わせて４回に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表１７に示す。
表１７：ヌードマウス腫瘍の転移に対するＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’、パクリタキセル治療グループおよびコントロールの抑制効果
2017531029.tif 000112
５）結果と検討：表１７に示すように、パクリタキセル治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’とＳ４’グループにおいて、腹腔投与した後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移を抑制する効果は、大きく向上され、このような薬物は、良い抗腫瘍転移の効能を有することを判明した。
【０１３６】
実施例２５：複数の腫瘍モデルにおけるＳ１’化合物の効能研究
試験目的：マウスの複数の腫瘍モデルによって、Ｓ１’の抗腫瘍薬物の広域性を了解する。
治療薬物：Ｓ１’溶液（実施例２１のサンプルと同じ）、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス、上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社から購入。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから相応の細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６の相応の細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｓ１’溶液において、ＩＶ注射した。Ｓ１’は、１／６  ＭＴＤの使用量、すなわち１７．６ミクロモル／キログラムで使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて３週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表１８に示す。
表１８：複数の腫瘍モデルにおけるＳ１’の治療効果
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５）結果と検討：表１８に示すように、Ｓ１’は、複数の腫瘍モデルに優れた効能を有して、該当薬物は、広域性の腫瘍治療薬物になることを判明した。
【０１３７】
実施例２６：Ｓ１０’〜Ｓ２４’の活性化特性、腫瘍抑制率と抑制転移率
それぞれに、Ｓ１０’〜Ｓ２４’の活性化特性、腫瘍抑制率および抑制転移率を試験して、試験方法は、前記の実施例２０、２２、２４と同じ、試験結果は、表１９に示す。
表１９：Ｓ１０’〜Ｓ２４’の活性化特性、腫瘍抑制率と抑制転移率の結果
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本発明は、更に他の腫瘍微環境によって標的活性化されるパクリタキセル化合物を合成して、ただし、ｎは、１−３００のいずれかの整数である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；かつ前記の活性化試験（方法として、実施例１７と同じ）、腫瘍に対する効能の研究（方法として、実施例２３、２４と同じ）、転移効能（方法として、実施例２５と同じ）および複数の腫瘍に対する効能（方法として、実施例２６と同じ）の試験を行って、Ｓ１’−Ｓ４’と似ている試験結果を得た。試験で、ｎ＝１−３００の範囲において、ｎの増えとともに、腫瘍抑制率は、やや低減することを証明した。ｎの増えとともに、活性化活性は、やや低減して、かつ同等モル使用量の薬物の質量数も増大するが、ｎ値の増えより、薬物の代謝半減期も延長され、そのため、全体の効能は、やや低減するだけ、ｎは１〜３００の範囲において、いずれもＳ１’−Ｓ４’と似ている技術効果を得られる。  
【０１３８】
実施例２７：水溶性の標的活性化されるパクリタキセルの合成
１）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジンエチルエステル（Ｉ）の合成
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（１６１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴で冷却した後、攪拌しながら、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３１３ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）とＬ−リジンエチルエステル二塩酸塩（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加して、その後、室温において一夜攪拌した、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を、逆相カラムを経て、精製して、Ｉ（１２８ｍｇ、収率：７７．８％）を得た。
【０１３９】
２）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジン（ＩＩ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジン（１２２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、水酸化リチウム（３９ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）水溶液（５ｍＬ）を滴下して、室温において攪拌して、２時間反応した。氷浴で冷却しながら、濃塩酸でｐＨを２まで調整して、蒸留でテトラヒドロフランを除去した後に、凍結乾燥して、粗産物ＩＩ（１１２ｍｇ、収率：９９％）を得て、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
【０１４０】
３）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＩＩ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジン（１１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、３−（ジエトキシ−ｏ−アシルオキシ）−１、２、３−ベンゾトリアジン−４−オン（１０９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１８８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１７ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を滴下して、そのあと、室温において一夜攪拌した。減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を逆相カラムを経て、精製して、ＩＩＩ（１５９ｍｇ、収率：５４．０％）を得た。
【０１４１】
４）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＶ）の合成
三つ口フラスコに、ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１６７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加して、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（７３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）とピリジン（３９ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を滴下した。室温において一夜攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を逆相カラムを経て、精製して、ＩＶ（１５３ｍｇ、収率：７８．５％）を得た。
【０１４２】
５）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（Ｖ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＶ）（１００ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）に溶解させ、２滴の水を滴らして、すぐオイルポンプで吸い出して、粗産物Ｖ（８０ｍｇ）を得て、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
【０１４３】
６）ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルパクリタキセル（Ａ１）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（８０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）とパクリタキセル（７６ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を、乾燥されたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、ＤＭＡＰ（２２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌した。更にパクリタキセル（３８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を添加して、続いて一夜攪拌した。反応液を酢酸エチルに添加して、有機相を合併して、水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、回転蒸発で溶剤を除去させ、粗産物を逆相カラムを経て精製して、目的産物としてＡ１（２５ｍｇ、収率：３７．５％）を得た。ＬＣ−ＭＳの検出結果は、以下のように：溶出ピークに相応する質量電荷比は、１６１９である。構造計算より得られた分子量と一致した。
【０１４４】
７）化合物Ａ２、Ａ３、Ａ４の合成は、Ａ１の合成に参照して、区別としては、ステップ７）における合成に使用したアルコキシ置換酢酸の分子量は異なることである。ただし、Ａ２の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサノナデカン酸を使用することである；Ａ３の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサヘプタトリアコンタン酸を使用することである；Ａ４の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸に代わりに、ポリオキサ脂肪酸を使用することである；質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ａ２、Ａ３、Ａ４に対応する質量電荷比は、それぞれに１６１９、１９７２、２５００であり、構造計算より得た分子量１６１９．７１、１９７２．１３と２５００．７７と一致した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で検出されたＡ４分子量は、約１４７３９であり、構造計算より得た分子量１４７３９．５９と一致した。具体的な検出結果は、以下の表２０に示す。
表２０
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【０１４５】
８）化合物Ａ１０〜Ａ２４（それらの化合物においてｎ＝５）の合成方法は、アミノ酸と接続する際の原料は以下の表２１に示すように異なる以外に、化合物Ａ２と似ていた。相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、それぞれに縮合剤（例えば１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を添加して、反応させ、０℃−２５℃において、０．５−２ｈ反応して、更にアスパラギンを添加して、０℃−２５℃において２−２４ｈ反応した。反応液を精製処理して、トリペプチドを得て、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎの代わりに、前記の方法でトリペプチドを合成中間体として、Ａ１０−Ａ２４化合物を調製した。質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、Ａ１０−Ａ２４化合物の分子量は、順次に以下の表２１に示すように、構造計算より予測された分子量と一致することを確認した。  
【０１４６】
表２１
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【０１４７】
実施例２８：本発明の水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体とコントロール化合物の性能の比較
凍結乾燥された（−７０℃）化合物Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４とコントロール化合物Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５とＣ６は、無菌室にサブパッケージされた。動物試験の前に、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４は、無菌室において、下記の二つの溶剤方案で再溶解された：溶剤１（注射用水）または溶剤２（４５％アルコールと５５％注射用水）。以下の表２２に示すように、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４は、溶剤１と溶剤２に完全に溶解できて、再溶解の濃度は、１０ミリグラム／ミリリットルにしても良く、更に注射用水で所要の濃度まで希釈するが、比較化合物（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）は、薬物の製剤需要に満たさない。
【０１４８】
表２２：コントロール化合物における近似組成の欠失、またはパクリタキセルの７位または２位の接続（すなわち、それぞれに基をパクリタキセル分子式の７位または２位のＯＨに接続すること）が、薬物の製剤の可溶性に対する影響
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【０１４９】
表２２におけるＡＡＮ、ＡＡＮＬ、ＡＡＮＫは、それぞれに化合物における低分子ペプチドアミノ酸の接続を示して、Ａ：Ａｌａ、Ｎ：Ａｓｎ、Ｌ：Ｌｅｕ、Ｋ：Ｌｙｓ。  
【０１５０】
表２２に示すように、パクリタキセルは、水に溶解できず、改造されたパクリタキセルの溶解特性は、大きく変化して、水における可溶性を増加して、溶解特性の変化は、薬物の製剤に大きく影響した。現在の水に不溶のパクリタキセル薬物と比べて、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４は、可溶性の薬物製剤を生成できて、Ａ２、Ａ３とＡ４は、直接に水に溶解できて、注射の使用量と効能を向上できて、現在のパクリタキセル薬物におけるアネルギー性補助原料（ヒマシ油）の使用という欠点を避けられ、薬物の開発・使用方面において、それは、大きい進歩であり、水溶性の標的活性化されるパクリタキセルは、革新性と応用将来性を有する。しかし、比較化合物（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）の可溶性は、薬物の製剤需要に満足できない。
【０１５１】
実施例２９：Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４の含量を測定する方法および含量の範囲
Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４は、解析型ＨＰＬＣ（アジレント１２２０  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ｓｅｒｉｅｓ）、Ｃ８カラム５μｍ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動相は、０〜９５％アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用して、純度は９５％−９９％であることを測定した。
【０１５２】
実施例３０：腫瘍組織が、本発明の水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体を活性化する効率の試験
溶剤（５０％注射用水、４５％〜４９％アルコールと１％〜５％Ｔｗｅｅｎ８０）で、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４サンプル化合物をまとめ溶解して、水で１０倍に希釈して、１ミリグラム／ミリリットルにした。３７℃において、１００マイクログラムの酸化された腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に、１ミリグラム／ミリリットルのサンプル化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートにおける酵素は、パクリタキセルの放出を引き出して、ＨＰＬＣで化合物の減少とパクリタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較した。選択により、選択された化合物において、化合物Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４は、最高の活性化効率を有することを見出した。
【０１５３】
表２３：異なる腫瘍組織ホモジネートにおけるＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４の化合物の活性化された比率（％）
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【０１５４】
コントロール化合物における近似組成の欠失の、薬物活性化に対する影響より選択した。溶剤（５０％注射用水、４２％〜４９％アルコールと１％〜８％Ｔｗｅｅｎ８０）で、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４サンプル化合物をまとめ溶解して、水で１０倍に希釈して、１ミリグラム／ミリリットルにした。３７℃において、１００マイクログラムの酸化されたヒト乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ４３５）腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に、１ミリグラム／ミリリットルのサンプル化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートにおける酵素は、パクリタキセルの放出を引き出して、ＨＰＬＣで化合物の減少とパクリタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較した。結果として、表２４に示す。
【０１５５】
表２４
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【０１５６】
前記の結果から、本発明の水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体における、異なる基の接続とパクリタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有することを判明した。パクリタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。異なる腫瘍種類（１０種類の異なる腫瘍）におけるＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４の活性化は、薬物活性化の広域性を表した（表２４）。同時に、化合物を選択する過程に、産生された特定化合物を比較すると、一つのヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ４３５腫瘍組織における活性化効率を解析して、試験は、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４化合物の各基の選択は、活性化効率が相対的に高い組み合わせであることを証明した（表２４）。
【０１５７】
本発明に提供された水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体Ａ１〜Ａ４とＡ１０〜Ａ２３の試験の設計構想は、大量の合成試験の設計で異なる接続方式の複雑な化合物を調製して、次に複雑な化合物をパクリタキセルにおける２位または７位（すなわち、それぞれに複雑な化合物を、パクリタキセル分子式における７位または２位のＯＨに接続すること）に接続して、さらに腫瘍組織の活性化効率の大きさにより選択して、順次に、Ｒ２、Ｒ３、およびｎを異なる値にする際に、得られた化合物の、腫瘍に対する抑制作用より選択することである。腫瘍組織によって特異的活性化サイトは、ＡＡＮと基２の間における接続箇所であり、活性化より開裂された後、基２は自己放出できて、更にパクリタキセルを放出する。アスパラギン酸酵素の酵素活性センターは、バルーン形状の凹みのボトムにあり、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に複雑な化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、非常に重要なことになる。
【０１５８】
選択試験の結果より、本発明において、基２の接続は、効果的にパクリタキセルに直接に接続する場合の立体障害を避けられ、アスパラギン酸酵素の接近を影響しないと推測する。基１の構造・効果関係は、切断サイトの極性を増加できて、水溶性の良いプロテアーゼは制限酵素切断部位により接近しやすい、そして切断の効率を向上する。パクリタキセルの２位への接続も明らかに、プロテアーゼに対するパクリタキセルの立体障害を低減するとともに、より多くの全体的親水極性基を露出して、切断効率と水溶性を向上する。更に、それぞれに一つの極性アミノ酸Ｋと一つの極性アミノ酸Ｌを添加すると、活性化効率が低減される。
【０１５９】
実施例３１：水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体の静脈内投与における被験薬の最大耐量（ＭＴＤ）の測定
試験目的：マウス静脈内投与のＭＴＤを測定する試験より、本発明のパクリタキセル誘導体の急性毒性を了解する。  
試験薬物：溶剤（５０％注射用水、４２％〜４９％アルコール、１％〜８％Ｔｗｅｅｎ８０）にまとめて溶解されたＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４を使用して、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４注射液を得た。
動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス（上海ＳＬＡＣ試験動物有限会社）、体重１９−２１ｇ、全てはメス。  
方法と結果：３６匹の被験ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、体重よりランダムに７グループに分けて、グループごとに６匹であった。表２５に示すように、０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９６０ｍｇ／ｋｇで、それぞれに１回にＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４を静脈内注射した。同時に、生理食塩水グループ、パクリタキセル注射液（市販品、北京悦康社）グループにおいて、コントロール試験を行い、マウスごとの投与体積は０．２ｍｌとした。連続に１７日を観察して、毎日に、動物が毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応などを出現か否かを観察して、体重と死亡状況を記録した。３、５、１４日目に血液サンプルを収集して、全血算定を行い、１４日目に動物を解剖して、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を収集して、ＨＥ染色で観察した。
【０１６０】
表２５：被験マウスは、それぞれに異なる使用量のＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４注射液、および生理食塩水、パクリタキセル注射液を投与された場合の死亡率の結果比較
2017531029.tif 000122
結果と検討：本発明において、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４溶液を注射したマウスグループには、９０ｍｇ／ｋｇの使用量で、動物は毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応と死亡という状況を出現しなかった、表２５に示すように、Ａ１とＡ２溶液のＭＴＤ値（最大耐量）は９０ｍｇ／ｋｇであり、パクリタキセルのＭＴＤ値６ｍｇ／ｋｇよりはるかに大きい。静脈内投与における被験薬の最大耐量は、薬物毒性の重要な参照指標であり、標的活性化・放出されたパクリタキセルの毒性は、パクリタキセルより著しく低減することを判明した。
【０１６１】
実施例３２：ヌードマウスにおける本発明のＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４溶液の効能研究
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４化合物の抗腫瘍効能を了解する。
試験薬物：Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４溶液（実施例３１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからヒト前立腺がんＰＣ−３細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＰａｎｃ−１細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
３）治療の過程：Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４のいずれも、１／６ＭＴＤより低い使用量、すなわち２４ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、パクリタキセル薬物治療グループは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち８ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表２６に示す。
表２６：ヌードマウスに対して、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４、パクリタキセルおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
2017531029.tif 000123
５）結果と検討：表２６に示すように、同等モル濃度のパクリタキセル薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０１６２】
実施例３３：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス。
試験薬物：Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４溶液（実施例３１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。以下の表における免疫グループは、Ｄ１２１肺がん細胞で免疫され、Ｄ１２１死腫瘍細胞で免疫されないグループは、生理食塩水を注射して、コントロールとする。
３）腫瘍の産生：免疫過程を完了した後（４週後）に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめ、マウスの腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を記録して、腫瘍の抑制率を計算した。
４）腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔリンパ球サブセット）の解析。腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＣＤ８−ＦＩＴＣで標識された抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析した。
５）グループの分けと結果の測定は表２７に示す。
表２７：Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、パクリタキセル治療グループおよびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
2017531029.tif 000124
６）結果と検討：表２７に示すように、免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４化合物の治療効果は大きく向上され、Ａ１とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有して、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できる。
【０１６３】
実施例３４：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルにおけるＡ１、Ａ２、Ａ３とＡ４の効能研究
試験目的：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルによって、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４化合物の抗腫瘍効能を了解する。
試験薬物：Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４溶液（実施例３１のサンプルを同じ）；パクリタキセル注射液（市販品、同上）、試験の際に、生理食塩水で相応の使用量に希釈して、コントロールとして、生理食塩水を使用した。
１．動物：ＢＡＬＢ／Ｃマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから４Ｔ１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍転移の産生：１０６個のＴ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が１．５ｃｍ前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、手術で皮下腫瘍を除去して、薬物治療をはじめて、２７日目にマウスを麻酔して、殺して、全肺を取り出して、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置いて、染色を行って、解剖顕微鏡で、肺部へ転移した腫瘍の数を統計した。
３）治療の過程：ＩＶ注射を使用して、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１２ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、パクリタキセル薬物治療グループは、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち４ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、三日に１回、合わせて４回に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表２８に示す。
表２８：ヌードマウス腫瘍の転移に対するＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、パクリタキセル治療グループおよびコントロールの抑制効果
2017531029.tif 000125
５）結果と検討：表２８に示すように、パクリタキセル治療グループおよびコントロールと比較すると、Ａ１、Ａ２、Ａ３とＡ４グループにおいて、腹腔投与した後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移を抑制する効果は、大きく向上され、このような薬物は、良い抗腫瘍転移の効能を有することを判明した。
【０１６４】
実施例３５：複数の腫瘍モデルにおけるＡ１化合物の効能研究
試験目的：マウスの複数の腫瘍モデルによって、Ａ１の抗腫瘍薬物の広域性を了解する。
治療薬物：Ａ１溶液（実施例３１のサンプルと同じ）、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから相応の細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６の相応の細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
ＩＶ注射を使用して、全てのグループに１／６  ＭＴＤの使用量、すなわち１７．６ミクロモル／キログラムの使用量で使用した；コントロールとして、生理食塩水を使用した。週に１回、合わせて３週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表２９に示す。
表２９：複数の腫瘍モデルにおけるＡ１の治療効果
2017531029.tif 000126
５）結果と検討：表２９に示すように、Ａ１は、複数の腫瘍モデルに優れた効能を有して、該当薬物は、広域性の腫瘍治療薬物になることを判明した。
【０１６５】
本発明の他の実施例（Ａ１０〜Ａ２４）において、異なるアミノ酸構造の水溶性の標的活性化されるパクリタキセルの活性化特性、腫瘍抑制率および抑制転移率に対して、それぞれに試験を行って、試験方法は、前記の実施例３０、３２、３４と同じであり、試験結果は、表３０に示す：
表３０：Ａ１０〜Ａ２４の活性化特性、腫瘍抑制率と抑制転移率の結果
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結果と検討：表３０に示すように、Ａ１０〜Ａ２４の化合物は、一定の活性化活性および腫瘍生長と転移の抑制効果を有して、本発明の選択過程は、活性化と効能を最適化できることを判明した。前記の好ましい化合物の実施例により、前記の記載は本発明の制限にならないことを説明した。当業者にとって、前記の内容に基づき、本発明のＲ２とＲ３のアミノ酸に対する交換と改変は、自明なことである。
【０１６６】
本発明の一部の実施例において、更に他の水溶性の標的活性化されるパクリタキセル化合物を合成して、ただし、ｎは、１−１５０のいずれかの整数である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；かつ前記の活性化試験（方法として、実施例２８と同じ）、腫瘍に対する効能の研究（方法として、実施例３２、３３と同じ）、転移効能（方法として、実施例３４と同じ）および複数の腫瘍に対する効能（方法として、実施例３５と同じ）の試験を行って、Ａ１−Ａ４と似ている試験結果を得た。試験で、ｎ＝１−３００の範囲において、ｎの増大とともに、腫瘍抑制率は、やや低減することを証明した。ｎの増えとともに、活性化活性は、やや低減して、かつ同等モル使用量の薬物の質量数も増大するが、ｎ値の増えより、薬物の代謝半減期も延長され、そのため、全体の効能は、やや低減するだけ、ｎは１〜１５０の範囲において、いずれも本発明の実施例Ａ１−Ａ４と似ている技術効果を得られる。  
【０１６７】
実施例３６：水溶性の標的活性化的ドセタキセルＢ１の合成
１．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジンエチルエステル（Ｉ）の合成
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（１６１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴で冷却した後、攪拌しながら、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３１３ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）とＬ−リジンエチルエステル二塩酸塩（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加して、その後、室温において一夜攪拌した、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を、逆相カラムを経て、精製して、Ｉ（１２８ｍｇ、収率：７７．８％）を得た。
２．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジン（ＩＩ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジンエチルエステルＩ（１２２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、水酸化リチウム（３９ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）水溶液（５ｍＬ）を滴下して、室温において攪拌して、２時間反応した。氷浴で冷却しながら、濃塩酸でｐＨを２まで調整して、蒸留でテトラヒドロフランを除去した後に、凍結乾燥して、粗産物ＩＩ（１１２ｍｇ、収率：９９％）を得て、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
３．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＩＩ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−リジン（１１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、３−（ジエトキシ−ｏ−アシルオキシ）−１、２、３−ベンゾトリアジン−４−オン（１０９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１８８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１７ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を滴下して、そのあと、室温において一夜攪拌した。減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を逆相カラムを経て、精製して、ＩＩＩ（１５９ｍｇ、収率：５４．０％）を得た。
４．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＶ）の合成
三つ口フラスコに、ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１６７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加して、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（７３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）とピリジン（３９ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を滴下した。室温において一夜攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物を逆相カラムを経て、精製して、ＩＶ（１５３ｍｇ、収率：７８．５％）を得た。
５．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（Ｖ）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＶ）（１００ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）に溶解させ、２滴の水を滴らして、すぐオイルポンプで吸い出して、粗産物Ｖ（８０ｍｇ）を得て、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
６．ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルドセタキセル（Ｂ１）の合成
ジ（２−メトキシエトキシアセチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（１１７６ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）とドセタキセル（１２９３ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、乾燥されたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、ＤＭＡＰ（３１８ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌した。反応液をジクロロメタンルに添加して、有機相を合併して、水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、回転蒸発で溶剤を除去させ、粗産物を逆相カラムを経て精製して、目的産物としてＢ１（５１１ｍｇ、収率：２５％）を得た。質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ｂ１に相応する質量電荷比は、１５７３であり、構造計算より得た分子量１５７３．６９と一致した。
【０１６８】
化合物Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４の合成は、Ｂ１の合成に参照して、区別としては、ステップ１における合成に使用したアルコキシ置換酢酸の分子量は異なることである。Ｂ２の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサノナデカン酸を使用することである；Ｂ３の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサヘプタトリアコンタン酸を使用することである；Ｂ４の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸に代わりに、ポリオキサ脂肪酸を使用することである。質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ｂ２、Ｂ３に相応する質量電荷比は、１９２６と２４５４であり、構造計算より得た分子量１９２６．１１と２４５４．７４と一致した。表３１に示すように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で検出されたＢ４分子量は、約１４９６４であり、構造計算より得た分子量１４９６４．５６と一致した。
【０１６９】
表３１：化合物Ｂ１−Ｂ４の性状、質量分析法および蛍光試験結果
2017531029.tif 000128
【０１７０】
実施例３７：化合物Ｂ１０〜Ｂ２４の合成
合成方法は、アミノ酸に接続する際の原料は以下の表３２に示すように異なる以外、実施例Ｂ１と似ていた。
相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、それぞれに縮合剤（例えば１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を添加して、反応させ、０℃−２５℃において、０．５−２ｈ反応して、更にアスパラギンを添加して、０℃−２５℃において２−２４ｈ反応した。反応液を精製処理して、トリペプチドを得て、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎの代わりに、実施例３６の方法でトリペプチドを合成中間体として、Ｂ１０−Ｂ２４化合物を調製した。質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、Ｂ１０−Ｂ２４化合物の分子量は、順次に以下の表に示すように、構造計算より予測された分子量と一致することを確認した。  
【０１７１】
表３２：化合物Ｂ１０−Ｂ２４の性状および質量分析法の結果
2017531029.tif 000129
【０１７２】
実施例３８：水溶性の標的活性化されるドセタキセルにおける化合物の異なる基が、薬物の製剤方案に対する巨大な影響
合成されたＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４と各種のコントロール化合物は、それぞれに真空乾燥を経て、気体で殺菌して、無菌処理して、無菌室にサブパッケージされた。以下の表３３に示すように、動物試験の前に、無菌室において、溶剤１（注射用水）または溶剤２（４５％アルコールと５５％注射用水）でＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４を溶解して、更に注射用水で所要の濃度まで希釈する；比較化合物（Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、Ｃ５’、Ｃ６’）は、薬物の製剤需要に満たさない。ドセタキセルは、水に溶解できず、改造されたドセタキセルの溶解特性は、大きく変化して、水における可溶性を増加して、溶解特性の変化は、薬物の製剤に大きく影響した。現在の水に不溶のドセタキセル薬物と比べて、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４は、可溶性の薬物製剤を生成できて、注射の使用量と効能を向上できて、現在のドセタキセル薬物におけるアネルギー性補助原料（ヒマシ油）の使用という欠点を避けられ、薬物の開発・使用方面において、それは、大きい進歩であり、水溶性の標的活性化されるドセタキセルは、革新性と応用将来性を有する。
表３３：選択した薬物の可溶性試験による、コントロール化合物における近似組成の欠失、またはドセタキセルの７位または２位の接続（すなわち、それぞれに基２をドセタキセル分子式の７位または２位のＯＨに接続すること）が、薬物の製剤の可溶性に対する影響
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2017531029.tif 000131
以下の基１と基２はそれと同じである。
表３３におけるＡＡＮ、ＡＡＮＬ、ＡＡＮＫは、それぞれに化合物における低分子ペプチドアミノ酸の接続を示して、ＡはＡｌａ、ＮはＡｓｎ、ＬはＬｅｕ、ＫはＬｙｓである。
【０１７３】
本発明に提供された水溶性の標的活性化されるドセタキセル誘導体の試験の設計構想は、大量の合成試験の設計で異なる接続方式の複雑な化合物を調製して、次に複雑な化合物をドセタキセルにおける２位または７位（すなわち、それぞれに複雑な化合物を、ドセタキセル分子式における７位または２位のＯＨに接続すること）に接続して、さらに腫瘍組織またはアスパラギンエンドペプチダーゼが存在する際の活性化効率の大きさにより、ドセタキセルの効率を選択して、順次に、Ｒ２、Ｒ３、およびｎを異なる値にする際に、得られた化合物の、腫瘍に対する抑制作用より選択することである；腫瘍組織によって特異的活性化サイトは、ＡＡＮと基２の間における接続箇所であり、活性化より開裂された後、基２は自己放出できて、更にドセタキセルを放出する。アスパラギンエンドペプチダーゼの酵素活性センターは、バルーン形状の凹みのボトムにあり、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に複雑な化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、非常に重要なことになる。
【０１７４】
選択試験の結果より、本発明において、基２の接続は、効果的にドセタキセルに直接に接続する場合の立体障害を避けられ、アスパラギンエンドペプチダーゼの接近を影響しないと推測する。基１の構造・効果関係は、切断サイトの極性を増加できて、水溶性の良いプロテアーゼは制限酵素切断部位により接近しやすい、そして切断の効率を向上する。ドセタキセルの２位への接続も明らかに、プロテアーゼに対するドセタキセルの立体障害を低減するとともに、より多くの全体的親水極性基を露出して、切断効率と水溶性を向上する。
【０１７５】
実施例３９：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の含量を測定する方法および含量の範囲
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４は、解析型ＨＰＬＣ（アジレント１２２０  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ｓｅｒｉｅｓ）、Ｃ８カラム５μｍ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動相は、０〜９５％アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用して、純度は９５％−９９％であることを測定した。
【０１７６】
実施例４０：水溶性の標的活性化されるドセタキセルにおける、異なる基の接続とドセタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有する
ドセタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。３７℃の温度において、１００マイクログラムの酸化された腫瘍組織ホモジネートにおけるプロテアーゼに、１ミリグラム／ミリリットル的化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートは、ドセタキセルの放出を促進できる。ＨＰＬＣで化合物の減少とドセタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較した。
【０１７７】
表３４：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の活性化測定（％）、異なる腫瘍組織ホモジネートにおけるＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の化合物の活性化比率
2017531029.tif 000132
【０１７８】
表３５：比較化合物における近似組成の変化、またはドセタキセルの７位または２位接続が、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍による薬物の活性化に対する影響
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表３５において、
2017531029.tif 000134
表３５から、ドセタキセルの２位接続の活性化効率は、７位接続よりはるかに高いことを知られる。
【０１７９】
前記の結果から、本発明の水溶性の標的活性化されるパクリタキセル誘導体における、異なる基の接続とパクリタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有することを判明した。パクリタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。異なる腫瘍種類（１０種類の異なる腫瘍）におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の活性化は、薬物活性化の広域性を表した（表３６）。同時に、化合物を選択する過程に、産生された特定化合物を比較すると、一つのヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ４３５腫瘍組織における活性化効率を解析して、試験は、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４化合物の各基の選択は、活性化効率には相対的に高いことを証明した（表３６）。
【０１８０】
実施例４１：静脈内投与における被験薬の最大耐量（ＭＴＤ）の測定
試験目的：マウス静脈内投与のＭＴＤを測定する試験より、本発明の新薬製剤の急性毒性を了解する。  
治療薬物：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス、体重１９−２１ｇ、全てはメス。  
方法と結果：２１０匹の被験ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、体重よりランダムに２１グループに分けて、グループごとに１０匹であった。表３７に示すように、按０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇで、それぞれに１回にＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液を静脈内注射して、同時に、生理食塩水グループ、ドセタキセルグループにおいて、コントロール試験を行い、投与体積は０．２ｍｌとして。連続に１７日を観察して、毎日に、動物が毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応などを出現か否かを観察して、体重と死亡状況を記録した。３、５、１４日目に血液サンプルを収集して、全血算定を行い、１４日目に動物を解剖して、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を収集して、ＨＥ染色で観察した。
【０１８１】
表３７：被験マウスは、それぞれに異なる使用量のＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液、および生理食塩水、ドセタキセル注射液を投与された場合の死亡率の結果比較
2017531029.tif 000135
結果と検討：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液を注射したマウスグループには、１７５ｍｇ／ｋｇの使用量で、動物は毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応と死亡という状況を出現しなかった、表３７に示すように、Ｂ１とＢ２注射液のＭＴＤ値は約１５０ｍｇ／ｋｇであり、ドセタキセルのＭＴＤ値２５ｍｇ／ｋｇよりはるかに大きい。静脈内投与における被験薬の最大耐量は、薬物毒性の重要な参照指標であり、標的活性化・放出されたドセタキセルの毒性は、ドセタキセルより著しく低減することを判明した。
【０１８２】
実施例４２：ヌードマウスにおけるＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液の効能研究
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液とドセタキセル注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからヒト前立腺がんＰＣ−３細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＰａｎｃ−１細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
３）治療の過程：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の臨床投与において、静脈内注射（すなわちＩＶ注射）を使用して、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４のいずれも、１／６ＭＴＤより低い使用量、すなわち２５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、ドセタキセル薬物治療グループは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち８．３ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表３８に示す。
表３８：ヌードマウスに対して、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４薬物、ドセタキセルおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
2017531029.tif 000136
５）結果と検討：表３８から知られるように、同等モル濃度のドセタキセル薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０１８３】
実施例４３：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
試験用薬：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とドセタキセルのいずれも、１３．２ｕｍｏｌ／ｋｇの使用量で投与され、ＰＤＬ１−抗体の使用量は、５マイクログラム／キログラムである。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。
３）腫瘍の産生：３２日目に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめた。
４）腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞解析：腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＴリンパ球抗原ＣＤ８−ＦＩＴＣに標識されたの抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析して、該当比率が高くなると、Ｔリンパ免疫細胞も増えて、動物体内の腫瘍に対する免疫力も向上したことを判明した。
５）グループの分けと結果の測定は表３９に示す。
表３９：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４薬物、ドセタキセル治療グループおよびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
2017531029.tif 000137
６）結果と検討：表３９から分かるように、免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の治療効果は大きく向上され、Ｂ１とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有して、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できる。
【０１８４】
実施例４４：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルにおけるＢ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の効能研究
試験目的：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルによって、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４注射液とドセタキセル注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
１．動物：ＢＡＬＢ／Ｃマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから４Ｔ１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍転移の産生：１０６個のＴ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が１．５ｃｍ前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、手術で皮下腫瘍を除去して、薬物治療をはじめて、２７日目にマウスを麻酔して、殺して、全肺を取り出して、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置いて、染色を行って、解剖顕微鏡で、肺部へ転移した腫瘍の数を統計した。
３）治療の過程：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１７．６ミクロモル／キログラムの使用量で使用され、ドセタキセル薬物治療グループは、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち３ミクロモル／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、三日に１回、合わせて４回に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表４０に示す。
表４０：ヌードマウス腫瘍の転移に対するＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、ドセタキセル治療グループおよびコントロールの抑制効果
2017531029.tif 000138
５）結果と検討：表４０に示すように、ドセタキセル治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とＢ４グループにおいて、腹腔投与した後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移を抑制する効果は、大きく向上され、このような薬物は、良い抗腫瘍転移の効能を有することを判明した。
【０１８５】
実施例４５：複数の腫瘍モデルにおけるＢ１注射液の効能研究
試験目的：マウスの複数の腫瘍モデルによって、Ｂ１の抗腫瘍薬物の広域性を了解する。
治療薬物：Ｂ１注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから相応の細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６の相応の細胞を、ヌードマウス（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）の背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｂ１の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｂ１は、１／６  ＭＴＤの使用量、すなわち１７．６ミクロモル／キログラムで使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて３週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表４１に示す。
表４１：複数の腫瘍モデルにおけるＢ１の治療効果
2017531029.tif 000139
５）結果と検討：表４１に示すように、Ｂ１は、複数の腫瘍モデルに優れた効能を有して、該当薬物は、すでに広域性の腫瘍治療薬物になったことを判明した。
本発明において、異なるアミノ酸構造の水溶性の標的活性化されるドセタキセル（化合物Ｂ１０〜Ｂ２４）の活性化特性、腫瘍抑制率および抑制転移率に対して、それぞれに試験を行って、試験方法は、前記の実施例４０、４２、４４と同じであり、試験結果は、表４２に示す：
表４２：化合物Ｂ１０〜Ｂ２４の活性化特性、腫瘍抑制率と抑制転移率の結果
2017531029.tif 000140
結果と検討：表４２に示すように、化合物Ｂ１０〜Ｂ２４の化合物は、一定の活性化活性と腫瘍生長と転移抑制効果を有して、本発明の選択過程は、活性化と効能を最適化できることを判明して、前記の好ましい化合物の実施例により、前記の記載は、本発明の制限にならないことを説明した。当業者にとって、前記の内容に基づき、本発明のＲ２とＲ３のアミノ酸に対する交換と改変は、自明なことである。
【０１８６】
本発明の一部の実施例において、更に他の水溶性の標的活性化されるドセタキセル化合物を合成して、ただし、ｎは、１−１５０のいずれかの整数である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；かつ前記の製剤（方法として、実施例３８と同じ）、ＭＴＤ試験（方法として、実施例４１と同じ）、腫瘍に対する効能の研究（方法として、実施例４２、４３と同じ）、転移効能（方法として、実施例４４と同じ）および複数の腫瘍に対する効能（方法として、実施例４５と同じ）の試験を行って、Ｂ１−Ｂ４と似ている試験結果を得た。試験で、ｎ＝１−１５０の範囲において、ｎの増大とともに、腫瘍抑制率は、やや低減することを証明した。ｎの増えとともに、活性化活性は、やや低減して、かつ同等モル使用量の薬物の質量数も増大するが、ｎ値の増えより、薬物の代謝半減期も延長され、そのため、全体の効能は、やや低減するだけ、ｎは１〜１５０の範囲において、いずれも本発明の化合物Ｂ１−Ｂ４と似ている技術効果を得られる。  
【０１８７】
実施例４６：腫瘍微環境によって標的活性化されたドセタキセル誘導体の合成
該当合成過程は、以下のステップを含む：
ステップ１：Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ（ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニンメチルエステル）（Ｉ）の合成。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｌａ）（１００ｇ、０．４５ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３Ｌ）に溶解させ、攪拌しながら、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７２．６ｇ、０．５４ｍｏｌ）と１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０３．３ｇ、０．５４ｍｏｌ）を添加して、攪拌して、１時間を反応した後、０℃まで氷浴して、Ｌ−アラニンメチルエステル（４６．２ｇ、０．４５ｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７３．８ｇ、１．３４ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）溶液を滴下して、滴下完了後、室温において１０ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗製品をジクロロメタン（２Ｌ）に溶解させ、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去した後に、粗産物を再結晶して、白色固体Ｉ（１０１ｇ、収率：７３．１％）を得た。
ステップ２：Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（ＩＩ）の合成。
ステップ１で得られたＣｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ（１００ｇ、０．３４ｍｏｌ）（１００ｇ、０．３４ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）と水（１Ｌ）の混合溶液に溶解させ、０℃まで冷却して、１Ｍの水酸化リチウム溶液（４００ｍＬ）を滴下して、攪拌して、１０時間を反応させ、ｐＨ＜６まで濃塩酸の滴下で中和して、回転蒸発して大部のテトラヒドロフランを除去して、残る水相をジクロロメタン（１Ｌラ３）で抽出して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸発して、白色固体ＩＩ（８８ｇ、収率：９２．２％）を得た。
ステップ３：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＩＩ）の合成。
三つ口フラスコに、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（フルオレニルメトキシカルボニル−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギン）（２０ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２００ｍＬ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれにｐ−アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を添加して、室温において３ｈ攪拌して、回転蒸発で大部のＤＭＦを除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品からビーティングを経て、白色固体ＩＩＩ（２１．３ｇ、収率：９０％）を得た。
ステップ４：Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＶ）の合成。
ステップ３で得られたＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（１３．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（３０ｍＬ）を添加して、室温において２ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、次に、真空乾燥炉において高真空乾燥で少量のピペリジンを除去して、薄黄色固体ＩＶを得、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
ステップ５：Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（Ｖ）の合成。
三つ口フラスコにステップ２で得られたＣｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（６．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１１．６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５０ｍＬ）を添加して、氷浴において３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれに化合物Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコールのＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品から再結晶を経て、白色固体Ｖ（１５ｇ、収率：９７％）を得た。
ステップ６：Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＶＩ）の合成。
ステップ５で得られたＣｂｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（５．０ｇ、６．６１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解させ、１０％パラジウム炭素（１ｇ）を添加して、水素ガスを通じて、常温常圧において攪拌して５ｈ反応して、濾過でパラジウム炭素を除去して、メタノールで洗浄して、ろ液と洗液を合併して、回転蒸発で大部の溶剤を除去して、粗産物を得、カラムクロマトグラフィーで白色固体ＶＩ（２．０ｇ、収率：４９％）を得た。
ステップ７：２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩ）の合成。
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（４３２ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．８３ｇ、６．８３ｍｍｏｌ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌して、次に、ステップ６で得られたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（２．０ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）を滴下して、完了後に、緩慢に室温に加温して、１０ｈ攪拌した。減圧蒸留で大部のＤＭＦを除去して、得られた残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和的塩化アンモニウム溶液と飽和的塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、回転蒸発で溶剤を除去して、得られた粗製品からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て、白色固体ＶＩＩ（１．２ｇ、収率：５０％）を得た。
ステップ８：２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩＩ）の合成。
ステップ７で得られた化合物２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１．０ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加して、室温において５時間攪拌した。反応液を水洗した後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、高真空蒸留で残るトリフルオロ酢酸を除去して、粗産物をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、Ｘ（６００ｍｇ、収率：８９％）を得た。
ステップ９：２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＸ）の合成。
三つ口フラスコにステップ８で得られた化合物２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルアルコール（５００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を添加して、ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴において、窒素ガスの保護において、それぞれにｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（４０６ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１６０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を滴下した。  室温において一夜攪拌した。反応液を水洗した後、分液した後、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥した。回転蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品をカラムクロマトグラフィーを経て、分離して、ＩＸ（４５０ｍｇ、収率：６７％）を得た。
ステップ１０：２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルドセタキセル（Ｃ１）の合成。
ステップ９で得られた２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（８８０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）とドセタキセル（１．３ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、乾燥されたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、ＤＭＡＰ（３２６ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌した。反応液をジクロロメタンルに添加して、有機相を合併して、水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、回転蒸発で溶剤を除去させ、粗産物を得て、カラムクロマトグラフィーを経て精製して、目的産物としてＤ１（３４０ｍｇ、収率：４９．２％）を得た。
化合物Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４の合成は、Ｄ１の合成に参照して、区別としては、ステップ７における合成に使用したアルコキシ置換酢酸の分子量は異なることである。Ｄ２の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサノナデカン酸を使用することである；Ｄ３の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサヘプタトリアコンタン酸を使用することである；Ｄ４の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸に代わりに、ポリオキサ脂肪酸を使用することである；質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４に対応する質量電荷比は、それぞれに１３２９、１５０５と１７７０であり、構造計算より得た分子量１３２９．４０、１５０５．６１と１７６９．９３と一致した。表４３に示すように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で検出されたＤ４分子量は、約１４４９７であり、構造計算より得た分子量１４４９７．３１と一致した。
表４３：化合物Ｃ１〜Ｃ４の性状、質量分析法および蛍光試験結果
2017531029.tif 000141
【０１８８】
実施例４７：腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルにおける化合物の異なる基が、薬物の製剤方案に対する影響
腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルにおける化合物の異なる基が、薬物の製剤方案に対する巨大な影響がある。合成されたＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４と各種のコントロール化合物は、真空乾燥を経て、気体で殺菌して、無菌処理して、無菌室にサブパッケージされた。以下の表４４に示すように、動物試験の前に、無菌室において、溶剤１（注射用水）または溶剤２（４５％アルコールと５５％注射用水）でＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４を溶解して、更に注射用水で所要の濃度まで希釈する；比較化合物（Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、Ｃ５’、Ｃ６’）は、薬物の製剤需要に満たさない。ドセタキセルは、水に溶解できず、改造されたドセタキセルの溶解特性は、大きく変化して、水における可溶性を増加して、溶解特性の変化は、薬物の製剤に大きく影響した。現在の水に不溶のドセタキセル薬物と比べて、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４は、可溶性の薬物製剤を生成できて、注射の使用量と効能を向上できて、現在のドセタキセル薬物におけるアネルギー性補助原料（ヒマシ油）の使用という欠点を避けられ、薬物の開発・使用方面において、それは、大きい進歩であり、腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルは、革新性と応用将来性を有する。
表４４：コントロール化合物における近似組成の欠失、またはドセタキセルの７位または２位の接続（すなわち、それぞれに基をドセタキセル分子式の７位または２位のＯＨに接続すること）が、薬物の製剤の可溶性に対する影響
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以下の基１と基２はそれと同じである。
表４４におけるＡＡＮ、ＡＡＮＬ、ＡＡＮＫは、それぞれに化合物における低分子ペプチドアミノ酸の接続を示して、Ａ：Ａｌａ、Ｎ：Ａｓｎ、Ｌ：Ｌｅｕ、Ｋ：Ｌｙｓ。
腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルの基１は、薬物の全体の活性化と効能に重要な影響があり、基１を有しない場合に、可溶性、活性化効率に重大な影響がある。
腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルの基２は、薬物の全体の活性化と効能に重要な影響があり、基２を有しない場合に、活性化効率と閉鎖毒性に重大な影響がある。
【０１８９】
本発明に提供された腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセル誘導体の試験の設計構想は、大量の合成試験の設計で異なる接続方式の複雑な化合物を調製して、次に複雑な化合物をドセタキセルにおける２位または７位（すなわち、それぞれに複雑な化合物を、ドセタキセル分子式における７位または２位のＯＨに接続すること）に接続して、さらに腫瘍組織またはアスパラギン酸エンドペプチダーゼが存在する際の活性化効率の大きさにより、ドセタキセル効率を選択して、順次に、Ｒ２、Ｒ３、およびｎを異なる値にする際に、得られた化合物の、腫瘍に対する抑制作用より選択することである。腫瘍組織によって特異的活性化サイトは、ＡＡＮと基２の間における接続箇所であり、活性化より開裂された後、基２は自己放出できて、更にドセタキセルを放出する。アスパラギン酸エンドペプチダーゼの酵素活性センターは、バルーン形状の凹みのボトムにあり、切断サイトは酵素活性センターの付近にあることは必要であり、この際に複雑な化合物は、切断サイトに対して立体障害を発生するか否かは、非常に重要なことになる。
【０１９０】
選択試験の結果より、本発明において、基２の接続は、効果的にドセタキセルに直接に接続する場合の立体障害を避けられ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼの接近を影響しないと推測する。基１の構造・効果関係は、切断サイトの極性を増加できて、水溶性の良いプロテアーゼは制限酵素切断部位により接近しやすい、そして切断の効率を向上する。ドセタキセルの２位への接続も明らかに、プロテアーゼに対するドセタキセルの立体障害を低減するとともに、より多くの全体的親水極性基を露出して、切断効率と水溶性を向上する。
【０１９１】
実施例４８：得られた産物におけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４の含量を測定する方法および含量の範囲
得られた産物におけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４は、解析型ＨＰＬＣ（アジレント１２２０  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ｓｅｒｉｅｓ）、Ｃ８カラム５μｍ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動相は、０〜９５％アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用して、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４の純度は９５％−９９％であることを測定した。
【０１９２】
実施例４９：腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルにおける、異なる基の接続とドセタキセルの、薬物の腫瘍組織における活性化に対する影響
腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルにおける、異なる基の接続とドセタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有する。ドセタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。本願において、３７℃の温度において、１００マイクログラムの酸化された腫瘍組織ホモジネートにおけるプロテアーゼに、１ミリグラム／ミリリットル的化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートは、ドセタキセルの放出を促進できて、ＨＰＬＣで化合物の減少とドセタキセルの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較して、選択により、選択された化合物において、本発明の化合物接続は、最高の活性化効率を有することを見出して、同時に、異なる腫瘍種類における活性化は、薬物活性化の広域性を表した（表４５）。同時に、化合物の選択過程において産生した特定化合物を比較して、同じ組織における活性化効率を解析して、試験は、Ｄ１化合物の各基の選択は、最も効果的な組み合わせ（表４５）であることを証明したが、Ｄ２〜Ｄ４の異なる腫瘍組織ホモジネートにおける活性化は、Ｄ１と近い。
【０１９３】
表４５：異なる腫瘍組織ホモジネートにおけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４の化合物の活性化された比率
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【０１９４】
表４６：比較化合物における近似組成の変化、またはドセタキセルの７位接続または２位接続が、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍による薬物の活性化に対する影響
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表４６から、ドセタキセルの２位接続の活性化効率は、７位接続より高いことを知られる。
【０１９５】
前記の結果から、本発明の腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセル誘導体における、異なる基の接続とパクリタキセルは、薬物の腫瘍組織における活性化に対して、異なる影響を有することを判明した。パクリタキセルと、つながっている化合物の基の間の互いの構造・効果関係は、組織部位での標的化と活性化効果を決める。
【０１９６】
実施例５０：静脈内投与における被験薬の最大耐量（ＭＴＤ）の測定
試験目的：マウス静脈内投与のＭＴＤを測定する試験より、本発明の新薬製剤の急性毒性を了解する。  
治療薬物：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス、体重１９−２１ｇ、全てはメス。  
方法と結果：２１０匹の被験ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、体重よりランダムに２１グループに分けて、グループごとに１０匹であった。表４７に示すように、按０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇで、それぞれに１回にＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４を静脈内注射して、同時に、生理食塩水グループ、ドセタキセルグループにおいて、コントロール試験を行い、投与体積は０．２ｍｌとした。連続に１７日を観察して、毎日に、動物が毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応などを出現か否かを観察して、体重と死亡状況を記録した。３、５、１４日目に血液サンプルを収集して、全血算定を行い、１４日目に動物を解剖して、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を収集して、ＨＥ染色で観察した。
表４７：被験マウスは、それぞれに異なる使用量のＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液、および生理食塩水、ドセタキセル注射液を投与された場合の死亡率の結果比較
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結果と検討：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液を注射したマウスグループには、１５０ｍｇ／ｋｇの使用量で、動物は毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応と死亡という状況を出現しなかった、表４７に示すように、Ｄ１とＤ２注射液のＭＴＤ値は約１５０ｍｇ／ｋｇであり、ドセタキセルのＭＴＤ値２５ｍｇ／ｋｇよりはるかに大きい。静脈内投与における被験薬の最大耐量は、薬物毒性の重要な参照指標であり、標的活性化・放出されたドセタキセルの毒性は、ドセタキセルより著しく低減することを判明した。
【０１９７】
実施例５１：ヌードマウスにおけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液の効能研究
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液とドセタキセル注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからヒト前立腺がんＰＣ−３細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＰＣ−３細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
３）治療の過程：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４の臨床投与において、静脈内注射（すなわちＩＶ注射）を使用して、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４のいずれも、１／６ＭＴＤより低い使用量、すなわち２５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、ドセタキセル薬物治療グループは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち８．３ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表４８に示す。
表４８：ヌードマウスに対して、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、ドセタキセルおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
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５）結果と検討：表４８に示すように、同等モル濃度のドセタキセル薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０１９８】
実施例５２：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
試験用薬：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４とドセタキセルのいずれも、１３．２ｕｍｏｌ／ｋｇの使用量で投与され、ＰＤＬ１−抗体の使用量は、５マイクログラム／キログラムである。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。
３）腫瘍の産生：３２日目に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめた。
４）腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞解析。腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＴリンパ球抗原ＣＤ８−ＦＩＴＣに標識されたの抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析して、該当比率が高くなると、Ｔリンパ免疫細胞も増えて、動物体内の腫瘍に対する免疫力も向上したことを判明した。
５）グループの分けと結果の測定は表４９に示す。
表４９：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、ドセタキセル治療グループおよびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
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６）結果と検討：免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４化合物の治療効果は大きく向上され、Ｄ１とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有して、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できる。’
【０１９９】
実施例５３：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルにおけるＤ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４の効能研究
試験目的：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移治療モデルによって、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４注射液とドセタキセル注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
１．動物：ＢＡＬＢ／Ｃマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから４Ｔ１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍転移の産生：１０６個のＴ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が１．５ｃｍ前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、手術で皮下腫瘍を除去して、薬物治療をはじめて、２７日目にマウスを麻酔して、殺して、全肺を取り出して、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置いて、染色を行って、解剖顕微鏡で、肺部へ転移した腫瘍の数を統計した。
３）治療の過程：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ６とＤ４の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４のいずれも、１／６ＭＴＤより低い使用量、すなわち２５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、ドセタキセル薬物治療グループは、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち４．２ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、三日に１回、合わせて４回に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５０に示す。
表５０：ヌードマウス腫瘍の転移に対するＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、ドセタキセル治療グループおよびコントロールの抑制効果
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５）結果と検討：表５０に示すように、ドセタキセル治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３とＤ４グループにおいて、腹腔投与した後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移を抑制する効果は、大きく向上され、このような薬物は、良い抗腫瘍転移の効能を有することを判明した。
【０２００】
実施例５４：複数の腫瘍モデルにおけるＣ１注射液の効能研究
試験目的：マウスの複数の腫瘍モデルによって、Ｃ１の抗腫瘍薬物の広域性を了解する。
治療薬物：Ｃ１注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから相応の細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６の相応の細胞を、ヌードマウス（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）の背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｄ１の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｄ１は、１／６ＭＴＤの使用量（２５ｍｇ／ｋｇ使用量）で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて３週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５１に示す。
表５１：複数の腫瘍モデルにおけるＤ１の治療効果
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５）結果と検討：表５１に示すように、Ｄ１は、複数の腫瘍モデルに優れた効能を有して、該当薬物は、すでに広域性の腫瘍治療薬物になったことを判明した。
本発明において、さらに化合物Ｄ１０〜Ｄ２４を調製して、その合成方法は、アミノ酸と接続する際の原料は以下の表５２に示すように異なる以外、化合物Ｄ１の合成方法と似ていた。相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、それぞれに同じ縮合剤（１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を添加して、反応させ、０℃−２５℃において、０．５−２ｈ反応して、更にアスパラギンを添加して、０℃−２５℃において２−２４ｈ反応して、トリペプチドを得た。質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、Ｄ１０−Ｄ２４化合物（ｎ＝１）の分子量は、順次に以下の表４７に示すように、構造計算より予測された分子量と一致することを確認した。  
ただし、異なるアミノ酸構造の腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルの活性化特性、腫瘍抑制率および抑制転移率に対して、それぞれに試験を行って、試験方法は、前記の実施例４９、５１、５３と同じであり、試験結果は、表４７に示すように：実施例４９、５１、５３から、ｎ値の好ましい範囲を１〜１１にする際に、治療効果が一致することを判明したので、以下の化合物Ｄ１０〜Ｄ２４において、Ｒ２、Ｒ３の選択が異なる以外に、ｎ値はいつも１を選択する。
【０２０１】
表５２：化合物Ｄ１０〜Ｄ２４の腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセルの活性化特性、腫瘍抑制率および抑制転移率の結果
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【０２０２】
結果と検討：表５２に示すように、化合物Ｄ１０〜Ｄ２４は、一定の活性化活性および腫瘍生長と転移の抑制効果を有して、本発明の選択過程は、活性化と効能を最適化できることを判明した。
【０２０３】
本発明の一部の実施例において、更に他の腫瘍微環境によって標的活性化されるドセタキセル誘導体を合成して、ただし、ｎは、１−３００のいずれかの整数である；Ｒ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＩｌｅのいずれか一つのアミノ酸である；Ｒ３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｓｎのいずれか一つのアミノ酸である；かつ前記の製剤配合の研究、ＭＴＤ試験、腫瘍に対する効能研究、転移効能および複数の腫瘍に対する効能の試験を行って、いずれもＤ１〜Ｄ４と似ている試験結果を得た。試験で、ｎ＝１−３００の範囲において、ｎの増大とともに、腫瘍抑制率は、やや低減することを証明した。ｎの増えとともに、活性化活性は、やや低減して、かつ同等モル使用量の薬物の質量数も増大するが、ｎ値の増えより、薬物の代謝半減期も延長され、そのため、全体の効能は、やや低減するだけ、ｎは１〜３００の範囲において、いずれも本発明の実施例Ｄ１〜Ｄ４と似ている技術効果を得られる。  
【０２０４】
実施例５５：腫瘍微環境を標的とするマイトマイシンの合成。
１）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ（フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニンメチルエステル）（Ｉ）の合成。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−アラニン）（３３ｇ、０．１ｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）に溶解させ、攪拌しながら１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０．２ｇ、０．１５ｍｏｌ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３４ｇ、０．１５ｍｏｌ）とＬ−アラニンメチルエステル（１３．９ｇ、０．１ｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５．８ｇ、０．２ｍｏｌ）のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００ｍＬ）溶液を添加して、室温において１０時間攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗製品をジクロロメタン（２Ｌ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去した後に、粗産物を再結晶した後に、純物質として、白色固体Ｉ（３０ｇ、収率：７５．１％）を得た。
２）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン）（ＩＩ）の合成。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ（４０ｇ、０．１ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）と水（１Ｌ）の混合溶液に溶解させ、冷却した後に、１Ｍ水酸化リチウム溶液（４００ｍＬ）を添加して、攪拌して１０時間反応して、濃塩酸を滴下して、ｐＨ＜６まで中和して、減圧蒸留でテトラヒドロフランを除去して、ジクロロメタン（１Ｌ×３）で残る水相を抽出して、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥して、減圧蒸発で白色固体ＩＩ（３６ｇ、収率：９４％）を得た。
３）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＩＩ）の合成。
三つ口フラスコにＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（フルオレニルメトキシカルボニル−トリフェニルメチル−Ｌ−アスパラギン）（２０ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２００ｍＬ）を添加して、３０ｍｉｎ攪拌した後、それぞれにｐ−アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を添加して、室温において３ｈ攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品をビーティングして、白色固体ＩＩＩ（２１．３ｇ、収率：９０％）を得た。
４）Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＩＶ）の合成。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（１３ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（３０ｍＬ）を添加して、室温において２時間攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、次に、真空乾燥炉において高真空乾燥で少量のピペリジンを除去して、薄黄色固体ＩＶを得、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
５）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（Ｖ）の合成。
三つ口フラスコにＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（５．４ｇ、１４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（８ｇ、２１ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５０ｍＬ）を添加して、氷浴において、窒素ガスの保護において、３０ｍｉｎ攪拌した。次に、０℃において、それぞれに化合物Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（６．７ｇ、１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．５ｇ、４２ｍｍｏｌ）を添加して、室温において一夜攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させ、順次に、飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に、蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品をビーティングして、白色固体Ｖ（１８．５ｇ、収率：７８％）を得た。
６）Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＶＩ）の合成。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌ−ｐ−アミノベンジルアルコール（８６４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）の混合溶液に溶解させ、ピペリジン（１０ｍＬ）を添加して、室温において２時間攪拌した後に、減圧蒸留で溶剤を除去して、薄黄色固体ＶＩを得て、精製しないでそのまま次のステップに用いられた。
７）２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＶＩＩ）の合成。
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸（１３４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却して、３−（ジエトキシホスホオキシ）−１、２、３−ベンゾトリアジン−４−オン（ＤＥＰＢＴ）（４５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加して、半時間攪拌して、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（６２１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）とＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３８７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加して、遮光下で、反応温度を緩慢に室温まで昇温して、５時間攪拌して、反応液を２００ｍＬ酢酸水溶液に添加して、ジクロロメタンで抽出して、有機相を合併して、水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、橙赤色の粗産物を得て、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て精製して、白色粉末ＶＩＩ（４７９ｍｇ、収率：６５％）を得た。
８）２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＶＩＩＩ）の合成。
三つ口フラスコに２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジルアルコール（１．９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）、ピリジン（４００ｍｇ、５．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を滴下した。室温において一夜攪拌した。反応液を水洗して、分液した後、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥した。減圧蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、ＶＩＩＩ（１．８ｇ、収率：８０％）を得た。
９）２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＩＸ）の合成。
２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナートをジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加して、室温において２時間攪拌した。反応液を水洗を経た後、分液して、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧蒸留で溶剤を除去して、粗産物をカラムクロマトグラフィーを経て分離して、ＩＸ（６２５ｍｇ、収率：４７％）を得た。
１０）２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジルマイトマイシン（Ｅ１）の合成。
２−（２−メトキシエトキシ）アセチル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ｐ−アミノベンジル−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（４００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させ、マイトマイシンＣ（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した後に、室温まで昇温して、１０時間攪拌して、減圧蒸留で溶剤を除去して、残留物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解して、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後に蒸留で溶剤を除去して、得られた粗製品から、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを経て、黄色固体として、目的化合物Ｅ１（２３７ｍｇ、収率：４６  ％）を得た。
化合物Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の合成は、Ｅ１の合成に参照して、区別としては、ステップ１における合成に使用したアルコキシ置換酢酸の分子量は異なることである。Ｅ２の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサノナデカン酸を使用することである；Ｅ３の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸の代わりに、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサヘプタトリアコンタン酸を使用することである；Ｅ４の合成は、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸に代わりに、ポリオキサ脂肪酸を使用することである；質量分析法（ＭＳ）の検出結果によって、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４に対応する質量電荷比は、それぞれに８５５、１０３２と１２９６であり、構造計算より得た分子量８５５．８５、１０３２．０６と１２９６．３７と一致した。表４８に示すように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で検出されたＥ４分子量は、約１４０３２であり、構造計算より得た分子量１４０２３．７６と一致した。
【０２０５】
表５３：化合物Ｅ１〜Ｅ４の性状、質量分析法および蛍光試験結果
2017531029.tif 000153
【０２０６】
実施例５６：注射剤Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４を得る
合成されたＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４は、真空乾燥を経て、気体で殺菌して、無菌処理して、無菌室にサブパッケージされた。動物試験の前に、無菌室において、Ｅ１を、５０％アルコールを含有する注射用水で溶解して、更に注射用水で所要の濃度まで希釈した。Ｅ２、Ｅ３とＥ４は、直接に注射用水で所要の濃度まで希釈した。
【０２０７】
実施例５７：得られた産物におけるＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の含量を測定する方法および含量の範囲
解析型ＨＰＬＣ（アジレント１２２０  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ｓｅｒｉｅｓ）、Ｃ８カラム５μｍ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動相は、０〜９５％アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の純度は９５％−９９％であることを測定した。
【０２０８】
実施例５８：異なる腫瘍組織において腫瘍微環境によって標的活性化されるマイトマイシンの活性化の影響。
本願において、３７℃の温度において、１００マイクログラムの酸化された腫瘍組織ホモジネートにおけるプロテアーゼに、１ミリグラム／ミリリットル的化合物を添加して、腫瘍組織ホモジネートは、マイトマイシンの放出を促進できて、ＨＰＬＣで化合物の減少とマイトマイシンの増加を検出して、腫瘍組織が薬物を活性化する効率を比較して、選択により、選択された化合物において、現在の化合物接続は、最高の活性化効率を有することを見出して、同時に、異なる腫瘍種類における活性化は、薬物活性化の広域性を表した（表５４を参照する）。    
【０２０９】
表５４：異なる腫瘍組織ホモジネートにおけるＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の化合物の活性化された比率
2017531029.tif 000154
【０２１０】
実施例５９：静脈内投与における被験薬の最大耐量（ＭＴＤ）の測定
試験目的：マウス静脈内投与のＭＴＤを測定する試験より、本発明の新薬製剤の急性毒性を了解する。  
治療薬物：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
動物：一級ＢＡＬＢ／Ｃマウス、体重１９−２１ｇ、全てはメス。  
方法と結果：２１０匹の被験ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、体重よりランダムに２１グループに分けて、グループごとに１０匹であった。表５５に示すように、０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇで、それぞれに１回にＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４を静脈内注射して、同時に、生理食塩水グループ、マイトマイシングループにおいて、コントロール試験を行い、投与体積は０．２ｍｌとした。連続に１７日を観察して、毎日に、動物が毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応などを出現か否かを観察して、体重と死亡状況を記録した。３、５、１４日目に血液サンプルを収集して、全血算定を行い、１４日目に動物を解剖して、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を収集して、ＨＥ染色で観察した。
【０２１１】
表５５：被験マウスは、それぞれに異なる使用量のＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液、および生理食塩水、マイトマイシン注射液を投与された場合の死亡率の結果比較
2017531029.tif 000155
【０２１２】
結果と検討：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液を注射したマウスグループには、９０ｍｇ／ｋｇの使用量で、動物は毛の立ちやごちゃご又は暗い、昏睡、猫背、過剰反応と死亡という状況を出現しなかった、表５５に示すように、Ｅ１とＥ２注射液のＭＴＤ値は約９０ｍｇ／ｋｇであり、マイトマイシンのＭＴＤ値６ｍｇ／ｋｇよりはるかに大きい。静脈内投与における被験薬の最大耐量は、薬物毒性の重要な参照指標であり、標的活性化・放出されたマイトマイシンの毒性は、マイトマイシンより著しく低減することを判明した。
【０２１３】
実施例６０：ヌードマウスにおいてＰａｎｃ−１細胞に対するＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液の効能研究。
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液とマイトマイシン注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからＰａｎｃ−１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＰａｎｃ−１細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
３）治療の過程：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の臨床投与において、静脈内注射（すなわちＩＶ注射）を使用して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、マイトマイシン薬物治療グループは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち２ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５６に示す。
表５６：ヌードマウスに対して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、マイトマイシンおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
2017531029.tif 000156
５）結果と検討：表５６に示すように、同等モル濃度のマイトマイシン薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０２１４】
実施例６１：ヌードマウスにおいてＨＴ１０８０細胞に対するＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液の効能研究。
試験目的：マウスの腫瘍治療モデルによって、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液とマイトマイシン注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣからＨＴ１０８０（細胞）を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６のＨＴ１０８０細胞を、ヌードマウス（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）の背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、マイトマイシン薬物治療グループは、１／３ＭＴＤの使用量、すなわち２ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて４週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５２に示す。
表５７：ヌードマウスに対して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４薬物、マイトマイシンおよびコントロールの腫瘍を治療する効果
2017531029.tif 000157
５）結果と検討：表５７に示すように、同等モル濃度のマイトマイシン薬物治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４治療グループの腫瘍の生長を抑制する効果は、大きく向上された。
【０２１５】
実施例６２：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移モデルにおけるＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物の効能研究
試験目的：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移治療モデルによって、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
治療薬物：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４注射液とマイトマイシン注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
１．動物：ＢＡＬＢ／Ｃマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから４Ｔ１細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍転移の産生：１０６個のＴ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が１．５ｃｍ前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、手術で皮下腫瘍を除去して、薬物治療をはじめて、２７日目にマウスを麻酔して、殺して、全肺を取り出して、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置いて、染色を行って、解剖顕微鏡で、肺部へ転移した腫瘍の数を統計した。
３）治療の過程：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６とＥ４臨床用薬物により、ＩＶ注射を使用して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４のいずれも、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１５ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、マイトマイシン薬物治療グループは、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１ミリグラム／キログラムの使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、三日に１回、合わせて４回に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表５８に示す。
表５８：ＢＡＬＢ／Ｃマウス腫瘍転移に対するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、マイトマイシン治療グループおよびコントロールの抑制効果
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５）結果と検討：表５８に示すように、マイトマイシン治療グループおよびコントロールと比較すると、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４グループにおいて、腹腔投与した後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腫瘍転移を抑制する効果は、大きく向上され、このような薬物は、良い抗腫瘍転移の効能を有することを判明した。
【０２１６】
実施例６３：Ｄ１２１腫瘍免疫モデルにおけるＥ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物の効能に対する研究
試験目的：Ｄ１２１肺がん腫瘍免疫モデルの治療モデルによって、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物の抗腫瘍効能を了解する。
試験用薬：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４とマイトマイシンのいずれも、１３．２ｕｍｏｌ／ｋｇの使用量で投与され、ＰＤＬ１−抗体の使用量は、５マイクログラム／キログラムである。
動物：Ｃ５７マウス、６−８週齢、全てはメス。
腫瘍モデルの産生：
１）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣから、Ｄ１２１肺がん腫瘍細胞を購入して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％の二酸化炭素条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍免疫：照射によって殺傷された５×１０５のＤ１２１肺がん細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入）をマウスに腹腔内注射して、２週間おきに、３回の免疫注射を行った。免疫を完了した後に、腫瘍細胞を注射して、次に、週に一回、合わせて４週間で、再度に薬を投与した。
３）腫瘍の産生：３２日目に、１０６個の生きているＤ１２１肺がん腫瘍細胞を腫瘍免疫されるＣ５７マウスの背部に皮下注射して、腫瘍が０．３〜０．４ｃｍ前後まで成長した際から、治療をはじめた。
４）腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞解析。腫瘍組織をホモジナイズして、濾過で腫瘍におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、白血球共通抗原ＣＤ４５−ＰＥとＣＤ８−ＦＩＴＣに標識されたの抗体を室温において、１時間結合して、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率を解析して、該当比率が高くなると、Ｔリンパ免疫細胞も増えて、動物体内の腫瘍に対する免疫力も向上したことを判明した。
５）グループの分けと結果の測定は表５９に示す。
表５９：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、マイトマイシン治療グループおよびコントロールの腫瘍抑制と免疫活性化の効果
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６）結果と検討：免疫コントロールおよび他の治療コントロールと比較すると、Ｃ５７マウスにおいて、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の治療効果は大きく向上され、Ｅ１とＰＤＬ１−抗体は、優れた免疫を相乗的に促進する作用と相乗的に治療する効果作用を有して、免疫を向上することで、腫瘍の生長を抑制できる。’
【０２１７】
実施例６４：複数の腫瘍モデルにおけるＥ１注射液の効能研究
試験目的：マウスの複数の腫瘍モデルによって、Ｅ１の抗腫瘍薬物の広域性を了解する。
治療薬物：Ｅ１注射液であり、試験の際に、生理食塩水で相応の濃度に希釈する。
方法と結果：
１．動物：ヌードマウス、６−８週齢、全てはメス。
２．腫瘍モデルの産生
１）ＡＴＣＣから相応の細胞を購入して、ＡＴＣＣが提供した取扱書により細胞の同定を行い、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して、３７℃、５％二酸化炭素の条件において、細胞を培養した。３日毎に継代を行い、１５代以内に細胞を使用した。
２）腫瘍の産生：５ｘ１０６の相応の細胞を、ヌードマウスの背部に皮下注射して、腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３前後まで成長した際に、ランダムにグループを分けて、治療をはじめて、治療を開始した日を一日目とした。
３）治療の過程
Ｅ１の臨床投与において、ＩＶ注射を使用して、Ｅ１は、１／６ＭＴＤの使用量、すなわち１５ｍｇ／ｋｇ使用量で使用され、コントロールとして、生理食塩水を使用して、週に１回、合わせて３週に投与した。
４）グループの分けと結果の測定は表６０に示す。
表６０：複数の腫瘍モデルにおけるＥ１の治療効果
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５）結果と検討：表６０に示すように、Ｅ１は、複数の腫瘍モデルに優れた効能を有して、該当薬物は、すでに広域性の腫瘍治療薬物になったことを判明した。
【０２１８】
実施例６５：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４滴眼液が、瘢痕と脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を抑制する研究。
動物：Ｃ５７マウス、１６週齢、全てはメス、グループごとに８匹。
傷跡の産生と治療：１５０ｍＷ、レーザー光凝固照射後、毎日Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４薬物を滴入して、２週後、グループごとに４匹マウスの眼部組織を取って、免疫組織化学（ＨＥ）染色を行った。他の４匹は、５０ｍＷ、レーザー光凝固照射後、治療後の４８時間に、眼部組織を取ってホモジネートにして、濾過で瘢痕とＣＮＶ組織におけるシングルな細胞を分離して、緩衝液で２回洗浄して、ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−Ｆ４／８０（ビオチンで標識されたマクロファジの前駆細胞抗原）とＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４５  （イソチオシアン酸蛍光色素で標識された白血球共通抗原）を使用して、室温において、１時間結合して染色を行って、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝液ＰＢＳで２回洗浄して、次に、フローサイトメトリーで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞におけるマクロファジの前駆体抗原陽性細胞の比率を解析して、該当比率が低減すると、該当マクロファジの前駆体抗原陽性細胞も減少して、動物体内の該当疾患に関連するマクロファジも抑制されたことを判明した。結果として、表６１に示す。
表６１：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４滴眼液が、瘢痕と脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を抑制する研究。
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結果と検討：コントロールおよびマイトマイシン治療コントロールと比較すると、傷跡半径とマクロファジの抑制には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３とＥ４の治療効果は大きく向上された。
【０２１９】
本発明において、さらに化合物Ｅ１０〜Ｅ２４を調製して、その合成方法は、アミノ酸と接続する際の原料は以下の表６２に示すように異なる以外、化合物Ｅ１の合成方法と似ていた。具体的に、相応するＲ２アミノ酸とＲ３アミノ酸をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、それぞれに縮合剤（例えば１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を添加して、反応させ、０℃−２５℃において、０．５−２ｈ反応して、更にアスパラギンを添加して、０℃−２５℃において２−２４ｈ反応した。反応液を、精製処理して、トリペプチドを得て、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎの代わりに、実施例５５の方法でトリペプチドを合成中間体として、Ｅ１０−Ｅ２４化合物を調製した。質量分析法（ＭＳ）の検出結果として、Ｅ１０−Ｅ２４化合物の分子量は、順次に以下の表５７に示すように、構造計算より予測された分子量と一致することを確認した。  
表６２：化合物Ｅ１０−Ｅ２４の性状および質量分析法測定の結果
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【０２２０】
前記の実施例に対して、それぞれに前記の的ＭＴＤ試験（方法として、実施例５９と同じ）、腫瘍に対する効能ｍｐ研究（方法として、実施例６０、６１と同じ）、転移効能（方法として、実施例６２と同じ）および複数の腫瘍に対する効能（方法として、実施例６４と同じ）の試験を行って、かつＥ１−Ｅ４と似ている試験結果を得た。試験で、ｎ＝１−３００の範囲において、ｎの増大とともに、腫瘍抑制率は、やや低減することを証明した。ｎの増えとともに、活性化活性は、やや低減して、かつ同等モル使用量の薬物の質量数も増大するが、ｎ値の増えより、薬物の代謝半減期も延長され、そのため、全体の効能は、やや低減するだけ、ｎは１〜３００の範囲において、いずれも本発明の実施例Ｅ１−Ｅ４と似ている技術効果を得られる。  
【０２２１】
実施例６６：レグタキセル（Ｓ１’）の腫瘍モデル毒性、効能と免疫特性の比較研究
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試験目的：製品の効能と抗腫瘍免疫を刺激する特性を考察する。
試験方法と結果は、以下のようになった：
マウス尾にレグタキセルを週に一回、合わせて３回に静脈内注射して、２１日の観察期における毒性試験結果の使用量は、それぞれに１４０、１５０、１６０ｍｇ／ｋｇ／日である場合に、死亡がなく、そしてレグタキセルの治療濃度域は、少なくとも１６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに達する。  
【０２２２】
ＨＴ１０８０モデルにおいて、レグタキセルとアブラキサン、パクリタキセル注射液について、高使用量で、同等モル使用量と同等毒使用量の比較試験を行った。治療結果として、大い効能差別を出現して、パクリタキセル注射液の場合に、三回目の治療後、死亡が出現した。図１を参照。
【０２２３】
更にレグタキセルの免疫刺激特性を了解する。腫瘍治療マウスの免疫検出で見出されたように、担腫瘍組と担腫瘍パクリタキセル治療組の腫瘍免疫抑制Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇ：ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋）の指標は、大幅に上昇して、レグタキセル治療組の腫瘍免疫抑制Ｔ細胞の指標は、逆に標的化学療法のため低減して（図３のａ図とｂ図を参照）、同時に、腫瘍組織は、浸透され、より多くの毒性ＣＤ８  Ｔ細胞を出現した（図２においてブラウン色は、ＣＤ  ８＋陽性であり、矢印を参照）。そして、肺がん腫瘍治療モデルより、レグタキセルは、強烈な免疫刺激特性を有することを説明した。
【０２２４】
固形腫瘍の治療において、現在の化学療法薬物のパクリタキセルの全身毒性がヒト体の免疫に対する損害、およびそれによる薬剤耐性は、患者のがんの治癒に影響する重要な障害である。試験で、パクリタキセルなど現在の化学療法薬物は、白細胞に巨大に損害することを見出した。レグタキセルは、腫瘍の局所にのみ活性化されて、現在の化学療法薬物が、免疫システムを損害するという欠点を避ける。最も重要のは、レグタキセルは、抗腫瘍免疫を刺激する作用を有するから、免疫治療と相乗して、併用によってがんを完全に治癒する。
【０２２５】
前記の好ましい実施例より本発明の内容を詳しくに説明したが、それらに制限されない。Ｓ１〜Ｓ２７の実施例から、腫瘍微環境によって特異的活性化する開裂可能な連結基は、異なる化合物に接続・活性化してもよいから、本発明のＲ４位の基の薬物または化合物の交換と改変は自明なことであり、Ｒ１を、水素、親水基または標的基にする実施例から、本発明のＲ１位の基の薬物または化合物の交換と改変は自明なことである。そして、本発明の範囲は、請求の範囲より確定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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