(57)【要約】本発明は、薬剤耐性癌の治療及び／又は癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に又は逐次使用するための（ｉ）ＤＮＡメチル化阻害剤と（ｉｉ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。また、本発明は、癌に罹患している患者において、癌に罹患している患者の化学療法薬に対する感受性を増大、回復、又は増強させるための、（ｉ）ＤＮＡメチル化阻害剤と（ｉｉ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤耐性癌の治療において同時に若しくは逐次使用するため、及び／又は造血器悪性腫瘍に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に若しくは逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせ。
【請求項２】
前記造血器悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項３】
前記急性骨髄性白血病が、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ、及びＭＬＬからなる群から選択される遺伝子に変異を有する正常核型のＡＭＬである、請求項２記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項４】
前記急性骨髄性白血病が、変異型ＦＬＴ３−ＩＴＤを発現している、請求項３記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項５】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、アザシチジンである、請求項１〜４のいずれか一項記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項６】
前記ビタミンＤ受容体アゴニストが、ビタミンＤ３又はイネカルシトールである、請求項１〜５のいずれか一項記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項７】
造血器悪性腫瘍に罹患している患者の化学療法剤に対する感受性の増大、回復、又は増強において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせ。
【請求項８】
前記造血器悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項７記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項９】
前記急性骨髄性白血病が、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ、及びＭＬＬからなる群から選択される遺伝子に変異を有する正常核型のＡＭＬである、請求項８記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項１０】
前記急性骨髄性白血病が、変異型ＦＬＴ３−ＩＴＤを発現している、請求項９記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項１１】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、アザシチジンである、請求項７〜１０のいずれか一項記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項１２】
前記ビタミンＤ受容体アゴニストが、ビタミンＤ３又はイネカルシトールである、請求項７〜１１のいずれか一項記載の通り使用するための組み合わせ。
【請求項１３】
薬剤耐性癌に罹患している患者の治療及び／又は造血器悪性腫瘍に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと、
ｉｉｉ．  薬学的に許容し得る担体と、
ｉｖ．  場合により、化学療法薬と
を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記造血器悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１３記載の通り使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
薬剤耐性癌を治療する及び／又は造血器悪性腫瘍に罹患している患者における腫瘍再燃を予防する方法であって、
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせを同時に又は逐次投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性癌の治療及び／又は癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に又は逐次使用するための（ｉ）ＤＮＡメチル化阻害剤と（ｉｉ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。また、本発明は、癌に罹患している患者において、癌に罹患している患者の化学療法薬に対する感受性を増大、回復、又は増強させるための、（ｉ）ＤＮＡメチル化阻害剤と（ｉｉ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。
【０００２】
発明の背景
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、予後不良の異質性障害であり、そして、成人において診断される急性白血病のうちで最も頻度の高い形態である。ＡＭＬは、造血前駆細胞における体細胞的に獲得された遺伝子変化の蓄積を特徴とするクローナルな悪性腫瘍である（Patel et al., 2012）。正常核型ＡＭＬ（患者のほぼ５０％を占める）における再発突然変異は、約３０個の遺伝子を数セット含み、最も再発の多いのは、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ、及びＭＬＬに作用するものである（Patel et al, 2012；Welch et al, 2012）。これら突然変異は、自己再生能、細胞の生存／増殖、及び骨髄分化等の様々な細胞機構に介入し、最終的には正常造血の障害と共に未分化芽球の蓄積につながる（Ferrara and Schiffer, 2013；Lowenberg et al., 1999；Mardis et al., 2009）。
【０００３】
化学療法及び同種幹細胞移植レジメンにもかかわらず、ＡＭＬの管理は依然として課題であるが、その理由は、白血病細胞の大部分は、通常、化学療法に対して感受性であるにもかかわらず、再燃が生じ、そして、死につながるためである。ＡＭＬの復活は、化学療法が、自己再生及び該疾患を増殖させることができる静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を有効に標的とすることができないことに起因する（Bonnet and Dick, 1997；Terpstra et al., 1996）。したがって、化学療法に対するＬＩＣの感受性を回復させることを目的とする療法は、該疾患を根絶することができる。
【０００４】
近年、遺伝学研究によって、エピジェネティック修飾が病因に関連していることが示された（Akalin et al., 2012；Figueroa et al., 2010）ので、患者の処置についての指針が提供された。それにもかかわらず、ＡＭＬにおけるエピジェネティック修飾に起因する分子機構を理解することが依然として必要とされており（Abdel-Wahab and Levine, 2013）、そして、これは、標的療法のための患者群をよりうまく同定するのに役立ち得る。
【０００５】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）では、ＤＮＡのメチル化は、療法に対する応答性を予測することが示されている（Shen et al., 2010）。更に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、５−アザシチジン（５−ＡＺＡ）又はデシタビンは、ＡＭＬにおけるＭＤＳの移行までの時間を延長することが示されている（Fenaux et al., 2010）。しかし、奏効率は時間が限定されており、そして、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の効果に関与する分子機構は知られていない（Garcia-Manero and Fenaux, 2011）。したがって、これら分子経路を同定することにより、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の効果を増大させることができる新たな処置的関連性を決定するのを支援することができる。
【０００６】
本発明者らは、鉄欠乏療法が、活性酸素種（ＲＯＳ）の誘導を通してＡＭＬ細胞の単球分化を促進することを既に示した（Callens et al., 2010a）。遺伝子発現パターンの解析によって、鉄恒常性標的療法によって誘導される最上位の遺伝子のうちの３０％が、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）シグナル伝達サインを示すことが明らかになった。鉄キレート剤は、ＶＤＲシグナル伝達の誘導及び下流のＭＡＰＫ経路の活性化を通してＶＤと相乗的に作用した。近年、本発明者らは、後向き研究において、鉄キレート剤及びビタミンＤ併用療法が、高齢患者の後向きコホートにおける全生存の増大に関連していることを示した（Paubelle et al., 2013）。したがって、ＶＤＲの発現／活性の誘導は、ＡＭＬにおける潜在的処置標的である。
【０００７】
本発明者らは、更に、ＶＤＲの発現／活性とＡＭＬの病状に関与している分子機構との間に存在する相関関係について調べ、そして、エピジェネティック機構によってＡＭＬにおけるＶＤＲの発現がダウンレギュレートされること、及びこれが、患者の予後と相関していることを示した。ＶＤＲの発現／活性が障害されると、正常モデル及び悪性モデルの両方において腫瘍芽球の分化が制限され、そして、幹細胞性が増大した。ＤＮＡ脱メチル化剤及びＶＤＲアゴニストによるＡＭＬ細胞の併用処置は、マウスにおける腫瘍増殖を妨害し、細胞の幹細胞性を低減し、そして、化学療法に対するＬＩＣの感受性を回復させた。したがって、本発明者らは、ＶＤＲの発現が、ＡＭＬの発病において重要である単球分化、造血幹細胞の自己再生、及びＬＩＣの長寿命に関与する主な分子機構を制御することを提唱する。
【０００８】
発明の概要
第１の実施態様では、本発明は、薬剤耐性癌の治療において同時に又は逐次使用するための、ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤とｂ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。
【０００９】
第２の実施態様では、本発明は、癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に又は逐次使用するための、ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤とｂ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。
【００１０】
第３の実施態様では、本発明は、癌に罹患している患者における化学療法薬に対する感受性の増強において同時に又は逐次使用するための、ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤とｂ）ビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせに関する。
【００１１】
発明を実施するための形態
本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤が、特に、ＶＤＲプロモータの脱メチル化を介するエピジェネティック修飾を通して、ビタミンＤ受容体アゴニストと相乗的に作用し、ＶＤＲ発現の妨害を解除するという本発明者らによる予想外の知見から得られた。この関連性は、インビトロのＡＭＬ芽球において、そして、インビボのマウスにおけるＡＭＬ異種移植腫瘍において有効であることが証明されている。本発明者らは、また、併用療法が、化学療法に対するＡＭＬ患者の不応性の状態を改善し、そして、患者における静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）の細胞分化を誘導することも示した。
【００１２】
本発明者らは、また、驚くべきことに、本発明の組み合わせの投与が、癌細胞、静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を化学療法に対して感受性にすることを見出した。特に、ＶＤＲの発現の回復は、癌細胞をより低用量の化学療法薬に対して感受性にすることができる。
【００１３】
したがって、本発明者らは、薬剤耐性疾患、特に、薬剤耐性癌を治療するための新規標的療法を提唱する。本発明は、ＶＤＲを発現している癌を治療するために特に有利である。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＶＤＲの発現が著しく減少している薬剤耐性腫瘍等の薬剤耐性細胞におけるＶＤＲの再発現が、非耐性細胞において薬剤耐性が発現するのを防ぎ、治療剤又は予防剤に対する薬剤耐性細胞の感受性を増大又は回復させ、そして、特にタキサン等の有糸分裂阻害剤に対する感受性を増大させると考える。結果として、より低用量の有糸分裂阻害剤を患者に投与して、該有糸分裂阻害剤の効力を維持しながら副作用を低減することができる。
【００１４】
薬剤耐性癌の治療及び／又は腫瘍再燃の予防において使用するためのＤＮＡメチル化阻害剤とビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせ
本発明は、癌に罹患している患者における薬剤耐性癌の治療において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせを提供する。
【００１５】
また、本発明は、癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせを提供する。
【００１６】
本明細書で定義するとき、「脱メチル化剤」とも呼ばれる「ＤＮＡメチル化阻害剤」という表現は、シトシンピリミジン環の５位又はアデニンプリン環の６位における窒素に対するメチル基の付加であるＤＮＡメチル化に干渉する化合物の分類を指す。ＤＭＡメチル化は、安定的に、細胞における遺伝子発現パターンを変化させる、すなわち、（すなわち、ビタミンＤ受容体の）遺伝子発現を減少させる。
【００１７】
脱メチル化剤は、メチル化を阻害して、既に過剰メチル化されている発現抑制遺伝子を発現させることができる化合物である。５−アザシチジン（アザシチジン）及び５−アザデオキシシチジン（デシタビン又はダコゲン）等のシチジンアナログは、最も一般的に用いられる脱メチル化剤である。これら化合物は、メチル化反応を触媒する酵素、すなわち、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに結合することによって作用する。
【００１８】
アザシチジン及びデシタビンは、本発明の枠内で用いることができる好ましいＤＮＡメチル化阻害剤である。アザシチジン又はデシタビンについて用いられる用量は、１〜１０μM、好ましくは２．５μM〜５μMである。
【００１９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡメチル化阻害剤は、アザシチジンである。
【００２０】
本明細書で定義するとき、「ビタミンＤ受容体アゴニスト」という表現は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化することができ、そして、好ましくは、ＶＤＲに結合したときに細胞分化を誘導することができる化合物を指す。
【００２１】
好ましくは、「ビタミンＤ受容体アゴニスト」は、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤアナログ及び／又はビタミンＤ受容体調節因子からなる群から選択される。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ又はその前駆体の全ての形態、例えば、ビタミンＤ１、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ４（２２−ジヒドロエルゴカルシフェロール）、及びビタミンＤ５（シトカルシフェロール）を含む。好ましくは、本発明に係る「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ３であり、より好ましくは、その活性型１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３又はカルシトリオール）であるビタミンＤ３である。
【００２３】
好ましくは、本発明に係る「ビタミンＤ前駆体」は、ビタミンＤ３前駆体（すなわち、カルシフェジオール（カルシジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールとしても知られているビタミンＤ３前駆体））である。
【００２４】
本明細書で意図するとき、「ビタミンＤアナログ」又は「ビタミンＤ受容体調節因子」は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に結合することができ、そして、好ましくは、ＶＤＲに結合したときに細胞分化を誘導することができる。
【００２５】
ビタミンＤアナログ又はビタミンＤ受容体調節因子のビタミンＤ受容体に結合する能力を判定する試験は、当業者に周知である。好ましくは、この能力は、細胞抽出物における該アナログ又はビタミンＤ受容体調節因子の特異的結合を推定することによって評価することができる。例えば、典型的な結合実験では、超音波処理によって得られた可溶性細胞抽出物を漸増濃度のビタミンＤアナログ又はビタミンＤ受容体調節因子と共にインキュベートする。結合体と遊離アナログとは、ヒドロキシルアパタイト法によって分離することができる。特異的結合は、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の非存在下で測定された全結合から過剰の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の存在下で得られた非特異的結合を減じることによって算出することができる（Skowronski et al. (1995) Endocrynology 136(1): 20-26）。
【００２６】
該アナログ又はビタミンＤ受容体調節因子の細胞分化を誘導する能力は、当業者に周知の様々な方法によって測定することができる。例えば、この能力は、Skowronskiら（Skowronski et al. (1995) Endocrynology 136(1): 20-26)）に記載されている通り、該アナログ又はビタミンＤ受容体調節因子と共にインキュベートした後、ＬＮＣａＰ細胞株における単球分化又はＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４の発現（細胞分化のマーカー）の誘導を測定することによって推定することができる。
【００２７】
多くのビタミンＤアナログは、当技術分野において周知である。「ビタミンＤアナログ」という表現は、特に、ビタミンＤ代謝物、ビタミンＤ誘導体、及びビタミンＤ前駆体を包含し、好ましくは、ビタミンＤ３代謝物、ビタミンＤ３誘導体、及びビタミンＤ３前駆体を包含する。
【００２８】
本発明に係るビタミンＤアナログは、Ｃ−２４位の周囲に修飾側鎖構造を有するセコステロイド構造を保持することができる。例えば、ビタミンＤアナログは、パリカルシトール（１９−ノル−１α（ＯＨ）２Ｄ２）、ＩＬＸ２３−７５５３（１６−エン−２３−イン−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、ＯＣＴ（マキサカルシトール、２２−オキサ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、及びＥＢ１０８９（セオカルシトール、１α−ジヒドロキシ−２２，２４−ジエン−２４，２６，２７−トリホモ−ビタミンＤ３）であってよい。
【００２９】
より好ましくは、本発明に係るビタミンＤアナログは、パリカルシトール、ＯＣＴ、ＥＢ１０８９、１，２５Ｄ３の１４−エピ−アナログ、及びイネカルシトール［１９−ノル−１４−エピ−２３−イン−１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３；ＴＸ５２２］からなる群から選択される。
【００３０】
特定の実施態様では、本発明に係る「ビタミンＤアナログ」は、イネカルシトール［１９−ノル−１４−エピ−２３−イン−１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３；ＴＸ５２２］である。
【００３１】
本発明に係るビタミンＤ受容体調節因子（ＶＤＲＭ）は、好ましくは、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２００５５２号、国際公開公報第２００５０５１９３６号、国際公開公報第２００５０５１９３８号、国際公開公報第２００５０５１８９３号、及び国際公開公報第２００６０６９１５４号において言及されている化合物等、ＶＤアナログよりも高カルシウム血性が低いことが示されている非セコステロイド化合物（大部分は化学実体）である。より好ましくは、ビタミンＤ受容体調節因子（ＶＤＲＭ）は、ＬＹ２１０８４９１、ＬＹ２１０９８６６、及びＬＧ１９０１１９からなる群から選択される（Ma et al. (2006) J Clin Invest 116(4):892-904、Polek et al (2001) Prostate 49(3):224-33）。
【００３２】
最も好ましい実施態様では、ビタミンＤ受容体アゴニストは、ビタミンＤ３又はイネカルシトールである。
【００３３】
本発明の文脈では、用語「治療又は予防」とは、このような用語が適用される障害若しくは病態、又はこのような障害若しくは病態の１つ以上の症状を正常に戻す、軽減する、進行を阻害する、又は予防することを意味する。特に、障害の治療は、悪性細胞の数を減少させることからなり得る。最も好ましくは、このような治療は、悪性細胞を完全に枯渇させる。
【００３４】
好ましくは、治療される個体は、癌に罹患しているか又は罹患している可能性のあるヒト又は非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、又は霊長類）である。好ましくは、該個体は、ヒトである。
【００３５】
「薬剤耐性癌」又は「薬剤耐性細胞」又は「薬剤耐性疾患」等の表現で使用するとき、「薬剤耐性」は、疾患（例えば、癌）が処置剤に対して応答しない状況を意味する。薬剤耐性は、内因性（該疾患が該処置剤に対して応答したことがないことを意味する）又は後天性（該疾患が以前に応答したことのある該剤に対して応答しなくなることを意味する）であり得る。癌の場合、このような処置剤は、コルヒチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド、エトポシド、タキサン、又は癌の化学療法において用いられる他の小分子等の化学療法薬であってよい。薬剤耐性は、癌及び他の病態、例えば、細菌、ウイルス、原虫、及び真菌の疾患に関連し得る。
【００３６】
「腫瘍再燃」又は「癌再発」とは、処置後かつ癌を検出することができないある期間後に癌が再び発症することを意味し、別の用語では、無病期間後の癌の再出現を意味する。
【００３７】
用語「癌」、「悪性腫瘍」、及び「腫瘍」は、典型的に、制御されていない細胞成長を特徴とする、哺乳類における病状を指すか又は説明する。より正確には、本発明の使用において、疾患、すなわち、ビタミンＤ受容体を発現する腫瘍は、ビタミンＤ調節因子に応答する可能性が最も高い。特に、癌は、固形腫瘍又は未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の制御されていない成長に関連し得る。固形腫瘍の形成に関連している癌の例は、乳癌、子宮／子宮頸癌、食道癌、膵臓癌（Albrechtsson et al Pancreatology 2003）、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、及び胃癌を含む。好ましくは、固形腫瘍は、乳癌である。
【００３８】
好ましくは、本発明に係る癌又は悪性腫瘍又は腫瘍は、未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の制御されていない成長に起因する。
【００３９】
本明細書で意図するとき、「造血幹細胞（ＨＳＣ）」という表現は、例えば、骨髄細胞系列（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球）、赤血球、巨核球／血小板、及びリンパ系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血球型を生じさせる成体多能性幹細胞を指す。
【００４０】
本発明に係る「造血幹細胞悪性腫瘍」又は「造血器悪性腫瘍」という表現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性リンパ性白血病、リンパ腫、及び骨髄異形成症候群（２００８年ＷＨＯ分類に定義の通り）を含む。好ましくは、本発明に係る造血器悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病からなる群から選択される。
【００４１】
好ましくは、本発明に係る急性骨髄性白血病は、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ、及びＭＬＬからなる群から選択される遺伝子に変異を有する正常核型のＡＭＬである（Patel et al, 2012；Welch et al, 2012）。
【００４２】
ＡＭＬにおいて過去１０年間に幾つかの変異の影響が調べられており、最も高頻度なのは、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）の膜近傍ドメインにおける遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）であり、これは、この受容体の構成的活性化を導く（Nakao M et al, Leukemia 1996）。この変異は、特に、正常核型ＡＭＬに関連しており（Thiede C et al, Blood 2002）、そして、現在ＡＭＬの最も最近の予後分類の一部である（Dohner H et al, Blood 2010）。正常な骨髄造血中、ＦＬＴ３が高度に発現し、そして、顆粒−単球前駆細胞のレベルで重要な役割を果たすことが報告されている（Boiers C et al, Blood 2010）。
【００４３】
より好ましくは、本発明に係る急性骨髄性白血病は、変異型ＦＬＴ３−ＩＴＤを発現しているＡＭＬである。
【００４４】
ＤＮＡメチル化阻害剤は、上に定義した通り、癌、より具体的には薬剤耐性癌を発現していた、発現している、又は発現しやすい個体にビタミンＤ受容体アゴニストを投与する前に、同時に、又は後に投与してよい。ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストは、第１の結合分子が第２の結合分子と共に作用して、他の方法で投与した場合よりも高い効果を提供するような順序で、そして、時間間隔内に、個体に投与することができる。好ましくは、ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストは、一緒に投与される。
【００４５】
また、本発明は、造血幹細胞悪性腫瘍に罹患している患者における薬剤耐性癌の治療において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせであって、静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を根絶することができる組み合わせを提供する。
【００４６】
また、本発明は、造血幹細胞悪性腫瘍に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において同時に又は逐次使用するための
ｉｉｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｖ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせであって、静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を根絶することによって再燃を予防することができる組み合わせを提供する。
【００４７】
「静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を根絶する」とは、本発明の組み合わせが、白血病幹細胞のサブセット、したがって、再燃の原因を抑制できることを意味する。
【００４８】
本発明の組み合わせがＬＩＣを抑制する能力は、当業者に周知の様々な方法によって測定することができる。例えば、この能力は、実施例７及び図６、そして、Passegue et al (2005)にも記載されている通り、未処理細胞と比較した、本発明の組み合わせで処理した細胞の幹細胞性の低減を測定することによって推定することができる。
【００４９】
癌に罹患している患者における化学療法薬に対する感受性の増大、回復、又は増強において使用するための、ＤＮＡメチル化阻害剤とビタミンＤ受容体アゴニストとの組み合わせ
本発明者らは、ＶＤＲシグナル伝達のターゲティングが、ＡＭＬモデルにおいてＬＩＣを根絶することによって化学療法に対する感受性を回復させることを見出した。ＬＩＣは、化学療法に対する耐性を有するバルク白血病集団における白血病細胞のサブセットであり、したがって、再燃の原因となる。
【００５０】
また、本発明は、癌に罹患している患者における化学療法剤に対する感受性の増大、回復、又は増強において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせを提供する。
【００５１】
したがって、本発明は、また、癌に罹患している患者における薬剤耐性癌の治療において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニスト（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉｉ．  有糸分裂阻害剤である化学療法薬と
の組み合わせを提供する。
【００５２】
また、本発明は、癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において使用するための、ＤＮＡメチル化阻害剤と、ビタミンＤ受容体アゴニストと、有糸分裂阻害剤である化学療法薬との組み合わせを提供する。
【００５３】
本発明に係る組成物は、薬剤耐性癌の治療又は癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において用いてよい。好ましくは、薬剤耐性癌は、固形腫瘍（ビタミンＤ受容体を発現している）又は造血器悪性腫瘍である。
【００５４】
１つの実施態様では、薬剤耐性癌は、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、及び非小細胞肺癌腫からなる群から選択される固形腫瘍（ビタミンＤ受容体を発現している）である。
【００５５】
好ましい実施態様では、造血器悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病からなる群から選択される。
【００５６】
別の好ましい実施態様では、ＤＮＡメチル化阻害剤は、アザシチジンである。
【００５７】
更に別の好ましい実施態様では、ビタミンＤ受容体アゴニストは、ビタミンＤ３又はイネカルシトールである。
【００５８】
「化学療法薬」とは、癌の治療に対する有効性が証明されている薬剤、すなわち、販売が承認されている薬剤、又は癌の治療についての臨床又は前臨床試験中の薬剤を意味する。
【００５９】
「紡錘体毒」又は「有糸分裂毒」とも呼ばれる「有糸分裂阻害剤」は、有糸分裂を減速及び／又は阻害することができる剤を意味する。このような有糸分裂阻害剤は、例えば、チューブリンを安定化させ、それによって、（大部分のタキサンの場合のように）有糸分裂プロセスを「凍結」するか、又は（大部分のビンカアルカロイドの場合のように）有糸分裂紡錘体を破壊することができる。
【００６０】
好ましい実施態様では、化学療法薬は、タキサンである。タキサンは、元来タクスス属の植物に由来するジテルペンである。現在では、タキサンは、通常合成される。タキサンは、例えば、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、及びカバジタキセル等の様々な化学療法薬を生産するために用いられている。これらタキサン、特に、パクリタキセル（タキソール）が、本発明の枠内で用いることができる好ましい化学療法薬である。
【００６１】
あるいは、化学療法薬は、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、又はビノレルビン等のビンカアルカロイドであってよい。
【００６２】
また、化学療法薬は、例えば、コルセミド、コルヒチン、又はノコダゾール等、タキサンでもビンカアルカロイドでもない有糸分裂阻害剤であってもよい。
【００６３】
ＤＮＡメチル化阻害剤、ビタミンＤ受容体アゴニスト、及び有糸分裂阻害剤である化学療法薬の組み合わせは、患者に同時に又は逐次投与してよい。逐次投与される場合、ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせは、好ましくは、患者を感受性にするために、有糸分裂阻害剤である化学療法薬の前に投与される。
【００６４】
有糸分裂阻害剤、並びにＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせに加えて、患者の処置レジメンは、更に、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、及び／又は他の化学療法薬の投与を含んでよい。
【００６５】
ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせは、癌細胞を有糸分裂阻害剤に対して感受性にするので、有利なことに、単独で投与される処置レジメンよりも低用量で該有糸分裂阻害剤を使用することができる。
【００６６】
したがって、本発明に係る組み合わせの好ましい実施態様では、化学療法薬は、低用量で、すなわち、ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせ無しに該薬を投与するときに推奨される用量よりも低用量で使用するためのものである。
【００６７】
当業者は、所与の化学療法薬についての低用量を即座に決定することができる。このような低用量は、特に、処置される癌及び処置プロトコールに依存する。
【００６８】
本発明の枠内では、「低用量」とは、ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせの非存在下で化学療法薬を投与するときに患者に与えられる推奨用量よりも少ない用量を意味する。該低用量は、好ましくは、推奨用量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％少ない。
【００６９】
ＤＮＡメチル化阻害剤及びビタミンＤ受容体アゴニストの組み合わせの非存在下で化学療法薬を投与するときに患者に与えられる推奨用量は、当業者に公知である。このような推奨用量は、例えば、販売承認を与える当局によって与えられる情報（例えば、ＥＭＥＡによって公開されているＥＰＡＲ）に見出すことができる。
【００７０】
例示的な例として、低用量のドセタキセルが意味するものについて以下に説明する。
【００７１】
例えば、局所進行又は転移性の乳癌患者の治療の場合、ドセタキセルの推奨用量は、単剤療法で１００mg/m2である。したがって、局所進行又は転移性の乳癌患者の単剤療法における治療の枠内で、低用量のドセタキセルは、１００mg/m2よりも少ない、好ましくは、９０mg/m2、７５mg/m2、又は５０mg/m2よりも少ない用量である。
【００７２】
これとは対照的に、ドセタキセルを手術可能な節陽性及び節陰性の乳癌の補助治療として用いる場合、ドセタキセルの推奨用量は、３週間毎に６サイクル５０mg/m2 ドキソルビシン及び５００mg/m2 シクロホスファミドの１時間後に投与される７５mg/m2（ＴＡＣレジメン）である。より一般的には、ドセタキセルは、別の薬剤（例えば、シクロホスファミド又はカペシタビン）を伴う場合、又は患者が積極的化学療法に対して耐容性を示さないリスクを有する場合、通常７５mg/m2で投与される。したがって、別の薬剤を伴う場合、又は患者が積極的化学療法に対して耐容性を示さないと考えられる場合、低用量のドセタキセルは、７５mg/m2よりも少ない、好ましくは、５０mg/m2、４０mg/m2、又は３０mg/m2よりも少ない用量である。
【００７３】
別の例示的な例として、低用量のパクリタキセル（タキソール）が意味するものについて以下に説明する。
【００７４】
パクリタキセルは、通常、１週間に１回８０又は９０mg/m2で投与される（例えば、１、８、１５日目に、次いで２８日目に、そして、それぞれの翌週に、任意で他の薬剤と組み合わせて）。したがって、低用量のパクリタキセルは、８０mg/m2よりも少ない、好ましくは、７０mg/m2、６０mg/m2、５０mg/m2、又は４０mg/m2よりも少ない用量である。
【００７５】
更なる実施態様では、本発明は、また、造血器悪性腫瘍に罹患している患者における化学療法剤に対する感受性の増大、回復、又は増強において同時に又は逐次使用するための
ｉｉｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤と、
ｉｖ．  ビタミンＤ受容体アゴニストと
の組み合わせであって、静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を根絶することができる組み合わせを提供する。
【００７６】
したがって、本発明は、また、造血悪性腫瘍に罹患している患者における薬剤耐性癌の治療において同時に又は逐次使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニスト（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉｉ．  有糸分裂阻害剤である化学療法薬と
の組み合わせであって、静止期の白血病幹細胞（ＬＩＣ）を根絶することができる組み合わせを提供する。
【００７７】
医薬組成物及び処置方法
また、本発明は、
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニスト（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉｉ．  薬学的に許容し得る担体と、
ｉｖ．  場合により、化学療法薬（本明細書で上に定義した通り）と
を含む医薬組成物を提供する。
【００７８】
「薬学的に許容し得る担体」という表現は、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与したときに副作用、アレルギー反応、又は他の有害反応の生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とは、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の種類の製剤補助剤を指す。
【００７９】
本発明に係る医薬組成物の形態、投与経路、投与量、及びレジメンは、処置される病態、病気の重篤度、患者の年齢、体重、及び性別等に依存する。
【００８０】
ヒトへの投与に適した様式で製剤化された医薬組成物は、当業者に公知である。本発明の医薬組成物は、更に、安定剤、緩衝剤等を含んでよい。
【００８１】
本発明の組成物は、例えば、経口投与の場合、錠剤、カプセル剤、又はエリキシル剤として、直腸内投与の場合、坐剤として、注射によって投与される場合、滅菌溶液又は懸濁液として製剤化され、そして、使用され得る。
【００８２】
製剤の選択は、最終的には、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、若しくは経口の経路投与、又は腫瘍注射を介した局所投与等の意図する投与経路に依存する。
【００８３】
本発明に係る医薬組成物は、溶液又は懸濁液、例えば、注射可能な溶液又は懸濁液であってよい。それは、例えば、単位剤形にパッケージ化してよい。
【００８４】
好ましい実施態様では、本発明のタキサンは、好ましくは、静脈内経路によって投与され、本発明のスタチンは、好ましくは、経口経路によって投与される。
【００８５】
また、本発明は、薬剤耐性癌に罹患している患者の治療及び／又は癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において使用するための
ｉ．  ＤＮＡメチル化阻害剤（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉ．  ビタミンＤ受容体アゴニスト（本明細書で上に定義した通り）と、
ｉｉｉ．  薬学的に許容し得る担体と、
ｉｖ．  場合により、化学療法薬（上に定義した通り）と
を含む医薬組成物を提供する。
【００８６】
本発明に係る医薬組成物は、薬剤耐性癌の治療又は癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防において用いてよい。好ましくは、抗癌剤耐性癌は、固形腫瘍（ビタミンＤ受容体を発現している）又は造血器悪性腫瘍である。
【００８７】
１つの実施態様では、薬剤耐性癌は、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、及び非小細胞肺癌腫からなる群から選択される固形腫瘍（ビタミンＤ受容体を発現している）である。
【００８８】
１つの実施態様では、造血器悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病である。
【００８９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡメチル化阻害剤は、アザシチジンである。
【００９０】
好ましい実施態様では、ビタミンＤ受容体アゴニストは、ビタミンＤ３又はイネカルシトールである。
【００９１】
本発明は、更に、それを必要としている個体を処置する方法であって、有効量の
−  ＤＮＡメチル化阻害剤（本明細書で上に定義した通り）と、
−  ビタミンＤ受容体アゴニスト（本明細書で上に定義した通り）と、
−  場合により、有糸分裂阻害剤である化学療法薬と
を、それを必要としている個体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００９２】
薬剤は、「有効量」、すなわち、癌を処置するのに十分な量で投与される。この量は、使用される処置剤の有効性、使用される任意の担体の性質、疾患の重篤度、及び患者の年齢によって変動することが理解される。任意の所与の組成物についての適切な量の決定は、適切な処置レベルを評価するために設計された標準的な一連の試験を通して当技術分野の技能の範囲内である。
【００９３】
「それを必要としている個体」とは、癌、より具体的には、薬剤耐性癌に罹患している個体、又は癌に罹患した後寛解している個体を意味する。
【００９４】
本発明の枠内では、個体は、好ましくは、ヒト個体である。
【００９５】
用語「処置」とは、治療方法及び予防方法の両方、すなわち、癌、より具体的には、薬剤耐性癌に罹患している個体の治癒、病態の改善、及び／又は寿命の延長を目的とする方法を包含することを意味する。また、癌に罹患している患者における腫瘍再燃の予防を目的とする方法も指す。
【００９６】
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、決して、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＶＤＲ発現は、ＡＭＬにおける分化及び生存に関連する。（Ａ〜Ｂ）ＶＤＲ発現は、ＡＭＬサンプル及び健常サンプルにおいて骨髄分化に関連する。（Ａ）正常核型ＡＭＬ患者のコホートにおけるＦＡＢサブタイプに従ってＶＤＲ発現を示すgenebankデータセット研究（ＧＳＥ１２４１７；ｎ＝１６３）の後向き分析。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）健常サンプル（骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞、ｎ＝８；Ｇ−ＣＳＦ動員ドナーから精製されたＣＤ３４＋細胞、ｎ＝８；骨髄有核細胞（ＢＭＭＣ）、ｎ＝１０；末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ｎ＝１０を含む）及びＦＡＢサブタイプに従って分類されたＡＭＬ患者由来の白血病性芽球（ＡＭＬ０〜２、ｎ＝８；ＡＭＬ４〜５  ｎ＝９）におけるＶＤＲ発現を示すgenebankデータセット研究（ＧＳＥ９４７６シリーズ）の後向き分析。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ〜Ｄ）ＶＤＲ欠損形質転換細胞における制限された骨髄分化。（Ｃ）ＶＤＲ−／−マウス及び野性型マウス（Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド）由来の骨髄造血前駆細胞に、ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＬＬ−ＡＦ９、又はＦＬＴ３−ＩＴＤをコードしているレトロウイルスを形質導入した。ＣＤ１１ｂ汎骨髄マーカー及びＦ４／８０単球マーカーを用いてフローサイトメトリーによって細胞分化を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）（Ｃ）において生成された細胞の細胞形態（May-GrunwaldGiemsa/MGG染色）。（Ｅ〜Ｇ）ＶＤＲ及びＶＤＲ標的遺伝子発現は、ＡＭＬの予後と相関する。（Ｅ）ＶＤＲ発現に従ったＧＳＥ１２４１７シリーズ由来の患者の全生存（ＡＭＬ４又はＡＭＬ５サブタイプの集計ｎ＝６２）。相対的ＶＤＲ発現（低ＶＤＲ発現（ｎ＝２１、Ａライン）；中ＶＤＲ発現（ｎ＝２０、Ｂライン）、及び高ＶＤＲ発現（ｎ＝２１、Ｃライン））に従った、異なる群の患者（三分位数で分離）を比較するログランク解析。（Ｆ〜Ｇ）ＣＡＭＰ発現に従った無症候生存（ＥＦＳ）（Ｆ）及び全生存（ＯＳ）（Ｇ）のログランク解析（四分位数で分離、患者コホートの高ｎ＝２３（Ａライン）ｎ＝２３  低（Ｃライン）ｎ＝９０、及び中央生存（Ｂライン）ｎ＝９０を示す）。データは、Castaigneらによる研究（Castaigne et al., 2012）から得た。
【図２】ＶＤＲ−／−の癌遺伝子形質転換は、造血前駆細胞の頻度増大及び幹細胞性の増大に関連する。（Ａ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞におけるＬＳＫ細胞の頻度増大。（Ａ）上−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＫＩＴ＋の代表的なドットプロット（ＭＬＬ−ＡＦ９癌遺伝子による白血病形質転換後の野性型及びＶＤＲ−／−の骨髄細胞由来のＬＳＫ細胞）。（Ａ）下−ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＬＬ−ＡＦ９、又はＦＬＴ３−ＩＴＤをコードしているレトロウイルスを形質導入した野性型細胞及びＶＤＲ−／−細胞におけるＬＳＫ＋細胞の定量。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞における幹細胞性関連遺伝子の発現増加。野性型細胞及びＶＤＲ−／−ＦＬＴ３−ＩＴＤ形質転換細胞を、ｑＰＣＲ分析によってＥＶＩ−１、ＨＯＸＡ−９、及びＭＥＩＳ−１の発現について分析した。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ≧３マウス）として提示する。（Ｃ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞のクローン形成能の増大。癌遺伝子で形質転換した野性型及びＶＤＲ−／−の一次造血前駆細胞を、サイトカイン（Ｍ−３４３４）を含有する半固体メチルセルロース培地にプレーティング（３０，０００細胞／条件）し、そして、７〜１０日間の培養後にスコア化した。再プレーティングアッセイについては、各条件につき３０，０００細胞をプレーティングした。ヒストグラムは、コロニーの数（３つの独立した実験の平均±ＳＥＭ）を表す。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧６マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）ＶＤＲ−／−細胞の癌遺伝子形質転換によって、化学療法に対する耐性が得られる。野性型細胞及びＶＤＲ−／−形質転換細胞を、７２時間、擬処理したか又はシタラビン（１μM）若しくはバルプロ酸（ＶＰＡ；１mM）で処理した。発光によってＡＴＰ含量を求めることにより細胞の生存を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】ＶＤＲの不活化によって、単球分化に関与している骨髄前駆細胞が増加し、そして、ＬＳＫ細胞の寿命が延長された。（Ａ〜Ｃ）定常状態条件では、ＶＤＲ欠損マウスは、正常数の白血球（ＷＢＣ）、単球、及び顆粒球を示す。８〜１６週齢の野性型（ｎ＝１４）及びＶＤＲ−／−（ｎ＝１１）マウスにおけるＷＢＣ（Ａ）、顆粒球（Ｃ）、及び単球（Ｃ）の数。データは、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｄ〜Ｅ）定常状態条件では、ＶＤＲ欠損マウスは、骨髄及び脾臓において正常な細胞充実性を示す。２４週齢の野性型（ｎ＝６）及びＶＤＲ−／−（ｎ＝６）のマウスにおける骨髄（Ｄ）及び脾臓（Ｅ）の細胞充実性。データは、平均±ＳＥＭである。（Ｆ）ＶＤＲ−／−マウスにおける造血前駆細胞の数の増大。野性型及びＶＤＲ−／−の１２週齢マウス（ｎ＝５〜８／群）の骨髄における造血前駆細胞集団のマルチパラメトリックフローサイトメトリー定量。系列限定前駆細胞（ＬＲＰ）、共通の骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、単球−マクロファージ前駆細胞（ＭＭＰ）、共通のリンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）。（Ｇ）ＶＤＲ−／−マウスにおける単球前駆細胞の数の減少。野性型及びＶＤＲ−／−マウス由来の骨髄細胞のＣＦＣアッセイ。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧４マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｈ）ＶＤＲ−／−マウスにおけるＬＳＫ、長期（ＬＴ）、及び短期（ＳＴ）の造血幹細胞（ＨＳＣ）の数の増大。１２週齢の野性型及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝５〜８動物／群）の骨髄における造血前駆細胞集団のマルチパラメトリックフローサイトメトリー定量。ＬＳＫ、ＬＫ、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、集団。合計生存骨髄細胞のうちの所与の集団の比率を示す。（Ｈ）ＶＤＲ欠損マウス由来の造血前駆細胞は、静止状態の増大を示した。野性型マウス及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝６動物／群）由来の骨髄ＬＳＫ細胞からＫｉ６７及びＰＩ標識によって実施した細胞周期解析。左−代表的なヒストグラム；右−Ｇ０細胞の平均±ＳＥＭ百分率をプロットする。（Ｈ）ＶＤＲ欠損マウス由来の造血前駆細胞は、ＲＯＳレベルの低下を示した。野性型マウス及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝４動物／群）由来の細胞からの骨髄ＬＳＫ細胞のＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ標識。左−代表的なヒストグラム；右−ＲＯＳ高細胞の平均±ＳＥＭ百分率をプロットする。
【図４】プロモータの過剰メチル化は、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲ発現を制限し、そして、ＶＤＲ欠損細胞は、低メチル化剤に対して耐性である。（Ａ）ＶＤＲプロモータの概略図。５’−ＣｐＧ−３’島は、破線によって表されるＶＤＲプロモータ（エクソン１ａの転写開始コドンに対して−１０３５〜−７５＋ｂｐの範囲の領域）に存在する。ＮＦ−κｂ、ＳＰ１、及びＡＰ−２の結合部位を示す。（Ｂ）ＶＤＲプロモータは、ＡＭＬにおいてメチル化によって調節される。（Ｂ〜Ｃ）低メチル化剤は、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲプロモータのメチル化を調節する。９６時間、５−アザシチジン（５−ＡＺＡ；１μM）で処理した又は処理していないＡＭＬ患者（ｎ＝３）由来の白血病細胞。ヒストグラムは、ＶＤＲプロモータ（開始コドンから−１０３５〜−７５ｂｐを含む領域）についてのメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を示す。（Ｃ）ＴＨＰ１細胞を９６時間５−ＡＺＡ（１μM）で処理したか又は処理せず、そして、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩によって変換した。ＶＤＲプロモータ（開始コドンから−１０３５〜−７５ｂｐを含む領域）についての高解像度融解ＰＣＲを実施した。未処理細胞（Ａライン）５−ＡＺＡ処理細胞（Ｂライン）。（Ｄ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞は、５−ＡＺＡ処理に対して耐性である。ＭＬＬ−ＥＮＬで形質転換された野性型及びＶＤＲ−／−の細胞を、７２時間、漸増濃度の５−ＡＺＡで処理した又はしなかった。ＡＴＰアッセイによって細胞の生存を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎｓ有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｅ〜Ｆ）５−ＡＺＡ処理は、ＡＭＬ細胞株においてＶＤＲ及びＶＤＲ標的遺伝子の発現を誘導する。ＨＬ６０を、６時間擬処理したか又は５−ＡＺＡ（５μM）若しくはビタミンＤ（１０００μM；ポジティブコントロールとして）で処理した。（Ｅ）ＶＤＲ又はＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ及びＣＹＰ２４Ａ１）の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｇ）５−ＡＺＡ処理は、ＡＭＬ患者由来の白血病細胞においてＶＤＲ標的遺伝子の発現を誘導する。初代細胞（ｎ＝３患者）を、６時間擬処理したか、あるいは５−ＡＺＡ（５μM）若しくはイネカルシトール（ＩＮＥＣ；１０μM）又は両方で処理した。ＶＤＲ又はＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ及びＣＹＰ２４Ａ１）の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。
【図５】５−ＡＺＡ及びＶＤＲアナログは、相乗的に作用して、ＡＭＬ細胞の分化を促進し、そして、腫瘍成長を低減する。（Ａ）１−２５ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ）及びＶＤＲアゴニストイネカルシトールの構造式。http://www.chemblink.com/products/163217-09-2.htm.（Ｂ〜Ｄ）低メチル化剤は、ＶＤＲアゴニストと相乗的に作用して、骨髄分化及びＶＤＲ活性を促進する。（Ｂ）Ｕ９３７細胞を、７２時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０μM）、又は両方で処理した。ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の発現をフローサイトメトリーによって評価した。結果は、ビヒクルと比較した倍数増加で提示する。ヒストグラムは、平均±ＳＥＭである（ｎ≧１０；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＨＬ６０細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ビタミンＤ（３００nM）、若しくはＩＮＥＣ（１０μM）で処理した。顆粒球分化遺伝子（ＰＲＴＮ３及びＮＥ）及び単球分化遺伝子（ＴＲＥＭＬ２及びＳＥＲＰＩＮＢ８）をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｄ）Ｕ９３７細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０nM）、又は両方で処理した。ＶＤＲ活性化を、抗ホスホＶＤＲ特異的抗体を用いてイムノブロットによって評価した。ＶＤＲ抗体を用いて、タンパク質負荷を制御した。（Ｅ〜Ｇ）低メチル化剤／ＶＤＲアゴニストの併用療法は、腫瘍成長を障害する。（Ｅ）ＨＬ６０細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０nM）、又は両方で処理した。トプロ−３標識によって細胞周期解析を実施した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期の細胞の百分率をプロットする（ｎ≧３；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｆ）細胞周期制御因子遺伝子ｐ１５、ｐ２１、及びｐ２７の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｇ）Ｕ９３７細胞（各群ｎ＝８腫瘍）の皮下異種移植後、ビヒクル（ＰＢＳ）、５−アシチジン（５mg/kg、１週間に３回腹腔内、５回注射）、及び／又はＩＮＥＣ（２０μg／マウス、腹腔内、１週間に３回）で処理したマウスの生存のKaplan-Meierプロット。ｐ値は、ログランク検定を用いて決定した。
【図６】ＶＤＲアナログは、ＡＭＬ細胞の幹細胞性を低減する。（Ａ）イネカルシトールは、形質転換細胞のＦＬＴ３−ＩＴＤのクローン形成能を低下させる。ＦＬＴ３−ＩＴＤ形質転換骨髄造血前駆細胞を、サイトカイン（Ｍ−３４３４）を含有し、ＩＮＥＣ（１０nM）を含有するか又は含有しない半固体メチルセルロース培地にプレーティング（３０，０００細胞／条件）し、そして、７〜１０日間の培養後にスコア化した。再プレーティングアッセイについては、１０〜３０，０００細胞を、各条件につきＩＮＥＣ（１０nM）の存在下又は非存在下でプレーティングした（指定の通り）。ヒストグラムは、コロニーの数（３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ）を表す。結果は、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｂ）ＶＤＲアゴニストは、β−カテニン経路を阻害する。ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞を、４８時間擬処理したか、又は漸増濃度のＩＮＥＣ（１０、１００、又は１０００nM）で処理した。β−カテニンの発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【００９８】
実施例：
実施例１：実験手順
臨床サンプル及び細胞株
文書によるインフォームドコンセント及びNecker倫理委員会による承認を得た後にＡＭＬ患者から末梢血液細胞を得た。任意の処理を投与する前の初期診断時に末梢血を回収した。単核細胞をフィコール・ハイパック（PAA laboratories）密度遠心分離によって精製し、そして、１５％ ＦＣＳ（Biowest）、１００ng/mL 幹細胞因子、１０ng/mL ＩＬ−３、及び２５ng/mL ＦＬＴ３−Ｌ（Peprotech）を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen）に再懸濁させた。前骨髄芽球（ＨＬ−６０）、骨髄球（ＯＣＩ−ＡＭＬ３）、単芽球（ＴＨＰ１及びＵ９３７）。細胞を１０％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）で培養した。
【００９９】
フローサイトメトリー
標準的なプロトコールに従ってフローサイトメトリー分析を実施した。簡潔に述べると、単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーバッファ（Ｍｇ２＋もＣａ２＋も含まないＰＢＳ（ＰＢＳ−／−）、０．５％ ＦＣＳ、０．１％ アジ化ナトリウム（pH７．４）に再懸濁した。トリパンブルーで染色した後、細胞計数によって生存細胞数を決定した。フローサイトメトリー分析については、２４Ｇ２及びフルオロフォア結合抗体（BD Biosciences, eBioscience, Biolegend）で免疫染色した細胞を用いてＦｃブロッキングを実施した。系列（Ｌｉｎ）陽性細胞の免疫染色については、ＣＤ５、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、７−４、Ｇｒ−１、及びＴｅｒ−１１９に対するビオチン標識一次抗体を含有するカクテル（BD Biosciences）を用い、続いて、ストレプトアビジン結合フルオロフォア標識二次抗体で染色した。
【０１００】
Fix and Permキット（BD Biosciences）を用いてＫｉ−６７（クローン、biolegend）に対する細胞内染色を実施した。染色された細胞を、FACS LSR Fortessaを用いて分析した。FACS Aria II（BD Biosciences）を用いて細胞選別を実施した。
【０１０１】
３７℃で３０分間、１０μM ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（５−（及び−６）−クロロメチル−２９，７９−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート、アセチルエステル）レドックス感受性プローブ（Abcam）で細胞（１．１０６）を標識することによって、ＲＯＳレベルを評価した。
【０１０２】
組み換えレトロウイルスの調製
全てＭＳＣＶ−ＩＲＥＳベクターにクローニングされたヒトＭＬＬ−ＥＮＬ又はＭＬＬ−ＡＦ９又はＦＬＴ３−ＩＴＤをコードしているプラスミド（Dr Patrice Dubreuil, Cancerology Research Centre of Marseille (CRCM), Franceから供与頂いた）。レトロウイルスの生成は、Lipofectamine LTX plus（Invitrogen）を使用することによってレトロウイルスパッケージング細胞（Plat-E, Cell Biolabs）を一過的にトランスフェクションすることによって実施した。培養上清に放出されたレトロウイルスを、製造業者の手順に従ってレトロネクチン（Takara）でコーティングされたプラークを使用してマウス造血細胞の感染のために用いた。
【０１０３】
ＡＭＬモデルの作製
記載の通り（Somervaille et al., 2009）、マウスＭＬＬ−ＥＮＬ  ＡＭＬを惹起した。簡潔に述べると、５０mg/kg ５−ＦＵを注射した５日間後の４〜８週齢のマウスの長骨からＢＭ細胞を押し出した。細胞を、１５％ ＦＣＳ、１０ng/mL ＩＬ３、５０ng/mL ＳＣＦ、及び１０ng/mL ＩＬ６（Peprotech）を添加したＤＭＥＭ中３７℃で４８時間インキュベートして、細胞周期への移行を促進した。次いで、細胞を、３７℃で４８時間、製造業者の指示書に従って、レトロネクチン（Takara）上にレトロウイルス上清を遠心分離接種した。
【０１０４】
遠心分離接種の直後、亜致死的に放射線照射したマウス（３５０cGy；１０６細胞／マウス）の後眼窩静脈に細胞を注射した。白血病性骨髄細胞及び脾細胞を病気のマウス（典型的な潜伏期６０〜１００日間）から回収し、そして、後続の実験のために凍結保存した。
【０１０５】
細胞周期解析
Ｋｉ−６７／ＰＩ染色については、細胞を、まず、製造業者の指示書（BD Biosciences）に従ってFix and Perm試薬で処理し、Ｋｉ−６７抗体（１６Ａ８、Biolegend）と共にインキュベートし、次いで、５μg/mL ＲＮａｓｅＡ及びＰＩを含むＰＢＳで洗浄し、そして、再懸濁した。染色された細胞を、FACS Fortessa（BD Biosciences）を用いて分析した。
【０１０６】
細胞死アッセイ
製造業者の指示書（BD Biosciences）に従って細胞をAnnexin V及びヨウ化プロピジウムで染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析して、アポトーシスのレベルを評価した。
【０１０７】
細胞を９６ウェルプレートに播種し、次いで、特に指定しない場合、様々な反応物質又はビヒクルコントロールＤＭＳＯ及びエタノールを添加した後、３７℃のインキュベータに戻した。Celltiter Glo試薬（Promega）を４８〜９６時間後に添加して、ＡＴＰレベルを測定することによって細胞生存を判定した。製造業者の指示通り、plate-reading Tecan Infinimite M1000 Pro（Tecan）において各サンプルの発光を求めた。
【０１０８】
ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ分析
全ＲＮＡを抽出し、RNeasyキット（Qiagen）を用いて精製し、そして、ＲＴ（iScript Reverse Transcriptase supermix, Bio-Rad）に供した。CFX96 PCRシステム（Bio-Rad）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを実施し、そして、Ssofast Eva Green（Bio-Rad）を用いてＰＣＲ産物を定量した。デルタ−デルタＣｑ法（Livak 2001）を用いてＭＩＱＥ指針（Bustin SA Clin Chem 2009）に従ってリアルタイム定量ＰＣＲの結果を解析した。
【０１０９】
メチル化分析
対象となる細胞株からメチル化レベルを分析するために、製造業者の指示書に従ってQIAamp DNA Micro Kit（Qiagen）を用いて、各細胞株から全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。精製後、各細胞株由来のｇＤＮＡ ２μgを、製造業者の指示書に従ってEpiTect Bisulfite Kit（Qiagen）を介して重亜硫酸ナトリウム処理に供した。対象となる各領域を、ＰＣＲ増幅した。プライマー対は、ウェブベースのソフトウェアMethPrimerを用いて設計し、そして、その最適なアニーリング温度は、グラジエントＰＣＲを介して求めた。
【０１１０】
ＶＤＲプロモータ領域配列に対応するプライマーを用いてメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析を実施した。重亜硫酸修飾から得られた配列差を利用して、重亜硫酸修飾ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別するためのＰＣＲプライマーを設計することができる。
【０１１１】
リアルタイムＨＲＭ分析で構成されるリアルタイムメチル化感受性高解像度融解曲線分析（ＭＳ−ＨＲＭ）を実施した。CFX96 PCRシステム（Bio-Rad）においてＰＣＲ増幅及びＨＲＭ分析を逐次実施した。ＨＲＭ分析は、６０〜９５℃の勾配の温度で実施した。２検量線相対定量法に基づいて比を算出した。サンプル間の比較を可能にするためにＨＲＭ曲線をソフトウェアによって正規化した。全てのサンプルをデュープリケートで分析した。
【０１１２】
腫瘍異種移植
腫瘍を確立するために、指定通りＵ９３７又はＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞をMatrigel（BD Biosciences）と混合し（１：１、vol/vol）、そして、１０週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（Janvier laboratories, France）に皮下注射（５×１０６／側腹部）した。次いで、マウスに、５−アザシチジン（Celgene）（５、７、９、１１、及び１３日目に５mg/kg）、イネカルシトール（Hybrigenics）（２０μg/日  １週間に３回）、及び５−アザシチジンとイネカルシトールとの組み合わせ、又はビヒクルコントロールとしてのＰＢＳをi.p.注射した。既に記載されている通り（Lepelletier 2007）、腫瘍成長を測定した。
【０１１３】
メチルセルロースコロニー形成アッセイ
Methocult培地（MethoCult GF M3434, StemCell Technologies）を用いて形質転換された又はされていないマウス細胞によるコロニー形成について調べた。感染させたＷＴ細胞及びＶＤＲ−／−細胞を、癌遺伝子を有するか又は有しないＢＭＴから回収し、そして、Methocult培地に移した。コロニー数を求めるために、プレーティングの１週間後、コロニーをスコア化した。連続プレーティングについては、細胞をメチルセルロースから回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして、Methocultに再プレーティングした。幾つかの実験では、１０nM イネカルシトール（hybrigenics）を培養培地に添加した。
【０１１４】
ヒトサンプルマイクロアレイ分析
この試験で用いたＡＭＬ及びＨＳＰＣサンプルは、既に報告されており（Metzeler et al Blood., 2008）、そして、ＧＥＯデータベースにおいてアクセッション番号ＧＳＥ１２４１７で入手可能である。R 2.14.0及びBioConductorを用いて解析を実施した。ＲＭＡパッケージを用いて生データを作製した。異なるアレイセットを比較するために、生の発現データを、コントロールＧＡＰＤＨプローブセットの平均に対して正規化した。
【０１１５】
統計解析
データは、平均±ＳＥＭとして表す。統計解析は、Prism 5ソフトウェア（GraphPad Software, Inc.）を用いて実施した。２つの群を比較するためにスチューデントｔ検定又はMann-Whitney検定を用い、そして、複数の群の比較は、一元配置分散分析、続いて、事後Bonferroni検定を用いて行った。指示されている場合、ノンパラメトリック比較のために、Kruskal-Wallis検定、続いて事後Dunn検定を用いた。無腫瘍動物曲線を比較するために、ログランク検定を用いた。結果は、ｐ値＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、又は＜０．００１（＊＊＊）において統計的に有意であるとみなした。
【０１１６】
結果
実施例２：ＶＤＲ発現は、ＡＭＬにおける単球の分化及び生存に関連する。
ＶＤＲシグナル伝達の誘導は、ＡＭＬにおける処置標的として示されている（Elstner et al., 1994; Kim et al., 2012；Munker et al., 1986）。しかし、ＡＭＬの病理におけるＶＤＲの役割は知られていない。ＡＭＬにおけるＶＤＲ発現／活性の結果を評価するために、フランス−アメリカ−イギリス（ＦＡＢ）システム（Bennett et al., 1976）に従って分類された正常核型患者（ｎ＝１６３）を含む、公開されている遺伝子発現データセット（ＧＳＥ１２４１７シリーズ、Dr. K.H. Metzeler, University of Munich, Munich, Germanyによって寄付された）（Metzeler et al., 2008）の後向き解析を実施した。この患者コホートでは、未成熟／未分化ＡＭＬサブタイプ（ＡＭＬ０、ＡＭＬ１、及びＡＭＬ２）に比べて、単球分化の特徴を表すＡＭＬサブタイプ（ＡＭＬ４及びＡＭＬ５）においてＶＤＲ発現が増加することが分かった（図１Ａ）。ＣＤ１４又はＣＳＦ１Ｒ（Friedman, 2002）等の他の単球分化マーカーの発現は、ＡＭＬ０〜２サブタイプとＡＭＬ４〜５サブタイプとの間で差がなく、これは、ＡＭＬサブタイプによる発現の差が単球分化のマーカーに制限されないことを示唆する。ＳＥＲＰＩＮＢ８（ＶＤＲ標的遺伝子）の発現の評価によって、ＡＭＬ５患者におけるＶＤＲ発現の増加がＶＤＲシグナル伝達の誘導に関連していることが確認された。したがって、未分化／未成熟ＡＭＬサブタイプは、単球経路に関与しているＡＭＬサブタイプに比べてＶＤＲ発現及びＶＤＲ活性の減少を示した。
【０１１７】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ）は、その能力によって、骨髄前駆細胞の単球への分化を誘導することが周知である（Munker et al., 1986；Nagler et al., 1986）。しかし、正常造血中のＶＤＲ発現の分布は報告されていない。健常個体由来サンプル及びＡＭＬサンプルにおけるＶＤＲ発現の変動における見識を更に得るために、更なる後向き解析を実施した（Dr. Derek L Stirewalt, Clinical Research Division, Seatle, WA, USAによって寄付されたＧＳＥ９４７６シリーズ）（Stirewalt et al., 2008）。この試験の解析によって、ＡＭＬ０〜２サブタイプに比べてＡＭＬ４〜５サブタイプにおけるＶＤＲ発現が増加することが確認された（図１Ｂ）。また、この解析は、ＡＭＬ０〜２患者と骨髄又はＧ−ＣＳＦ動員患者から精製されたＣＤ３４＋細胞との間でＶＤＲ発現に差がないことも示した。更に、ＶＤＲ発現は、骨髄有核細胞（ＢＭＭＣ）とＡＭＬ４〜５サブタイプとの間で同様であった（図１Ｂ）が、ＡＭＬ４〜５サブタイプにおけるＶＤＲ発現は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と比べて減少した（図１Ｂ）。ヒトの正常造血中のＶＤＲ発現を更に調べることによって（http://servers.binf.ku.dk/hemaexplorer/）、ＶＤＲ発現が造血前駆細胞及び骨髄前駆細胞では低く、次いで、完全に分化した単球では増加することが確認された。したがって、これら試験は、ＶＤＲ発現が健常細胞において骨髄の分化に関連すること、ＡＭＬ０〜２サブタイプにおけるＶＤＲ発現がＣＤ３４＋細胞で観察されるものと同様であること、そして、ＡＭＬ４〜５サブタイプが、血流中で提示される成熟単核細胞に比べてＶＤＲ発現の減少を示すことを示唆した。
【０１１８】
ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲ発現減少による細胞の結果についての見識を得るために、ＡＭＬ及び骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）癌遺伝子によるＶＤＲノックアウトマウス（ＶＤＲ−／−）由来の造血前駆細胞の形質転換を誘導することによって最小細胞モデルに移った。ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＬＬ−ＡＦ９融合タンパク質、又はＦＬＴ３−ＩＴＤコンストラクトをコードしているレトロウイルスで骨髄前駆細胞を形質転換し、そして、フローサイトメトリー及び細胞形態（May-Grunwald Giemsa/MGG染色）によってＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０の発現により単球分化を評価した。ＶＤＲ−／−造血前駆細胞の形質導入によって、野性型形質導入細胞と比べたとき、より少ないＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋二重陽性細胞が生じ、そして、これら細胞は、未成熟な形態を示した（図１Ｃ〜Ｄ）。したがって、ＶＤＲ発現の不活化は、ＡＭＬ／ＭＰＮモデルにおいて骨髄の分化を制限するのに十分である。
【０１１９】
ＡＭＬにおけるＶＤＲの発現の変動の関連性について更に調べるために、ＶＤＲ発現と患者の予後との相互関係を調べた。ＡＭＬ０〜２患者におけるＶＤＲ発現は低かったので、ＧＳＥ１２４１７シリーズ由来のＡＭＬ４〜５集団（ｎ＝６２患者）をそのベースラインＶＤＲ発現レベルに従って層別化することを決定した。高ＶＤＲ発現（第３の三分位数、ｎ＝２１患者）、中ＶＤＲ発現（第２の三分位数、ｎ＝２０患者）、及び低ＶＤＲ発現（第１の三分位数；ｎ＝２１患者）を示す患者において全生存（ＯＳ）を評価した。プロットした曲線のログランク検定によって、高ＶＤＲ発現を示す患者が、低ＶＤＲ発現を示す患者と比べてＯＳの増大を示すことが示された（図１Ｅ）。したがって、ＶＤＲ発現の減少は、未成熟なＡＭＬの表現型及びＡＭＬ４／５における予後不良と相関している。
【０１２０】
患者の予後をＶＤＲ標的遺伝子の発現と比較することによって、ＡＭＬの再燃におけるＶＤＲシグナル伝達経路の関連性を更に評価した。これら実験では、詳細に明らかにされている患者のコホートを用いた（Castaigne et al., 2012）（全てのＡＭＬサブタイプは、ＡＭＬ３  ｎ＝９０を除いて交絡された）。高いＣＡＭＰ（カテリシジン抗菌ペプチド、ＶＤＲ標的遺伝子）発現を示す患者（ｎ＝２３、第４の四分位数群）は、低レベルのＣＡＭＰを示す患者（ｎ＝２３、第１の四分位数群）に比べて無症候生存（ＥＦＳ）及び無再燃生存（ＲＦＳ）の増大を示した（図１Ｆ〜Ｇ）。特に、この患者のコホートによって、単球分化の特徴を示すＡＭＬサブタイプにおけるＶＤＲ発現の増加も明らかになり、これによって、遺伝子セットデータベースＧＳＥ１２４１７及びＧＳＥ９４７６から得られた以前の知見が更に確認された。したがって、ＶＤＲ／ＶＤＲ標的遺伝子の発現は、単球分化と相関しており、そして、全てのＡＭＬサブタイプにおいてＡＭＬ患者の予後を改善した。
【０１２１】
実施例３：プロモータのメチル化は、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲ発現を減少させ、そして、脱メチル化剤の感受性は、ＶＤＲ発現に依存する。
次に、単球分化が障害される原因となるＡＭＬ細胞におけるＶＤＲ発現の減少の原因となる分子機構を評価しようとした。ＡＭＬは、ＣｐＧ島におけるメチル化プロファイルの変化を特徴とし（Akalin et al., 2012）、そして、ＶＤＲプロモータは、メチル化によって調節されることが示されている（Marik et al., 2010）ので、メチル化がＡＭＬにおけるＶＤＲ抑制を誘導するかどうかを評価した。ＶＤＲプロモータの解析によって、ＣｐＧ島がＶＤＲプロモータ、特に、ＡＴＧ開始コドンの−７５〜−１０３５ｂｐの領域において頻出することが明らかになった（図４Ａ）。次いで、脱メチル化剤５−ＡＺＡで処理した又は処理していない一次ＡＭＬサンプル由来の重亜硫酸塩変換ゲノムＤＮＡにおいてＶＤＲプロモータメチル化解析を実施した。５−ＡＺＡで処理した細胞では、メチル化が減少しており、これは、ＶＤＲプロモータにおけるＣｐＧ島がＡＭＬ細胞においてメチル化されることを示唆する（図４Ｂ）。ＴＨＰ−１細胞における更なるメチル化感受性高解像度融解（ＭＳ−ＨＲＭ）分析によって、ＶＤＲプロモータが、高レベルのメチル化の読み取り値の大部分を含む単峰性ピークを有し、そして、５−ＡＺＡが、ＶＤＲプロモータのメチル化を元に戻すことができることが確認された（図４Ｃ）。ＡＭＬ一次サンプルにおける試験によって、これら知見が確認された。
【０１２２】
次いで、脱メチル化剤に対する細胞の感受性におけるＶＤＲの無効化の結果について試験した。用量決定試験によって、野性型ＭＬＬ−ＥＮＬ形質転換細胞は、５−ＡＺＡに対して感受性であるが、ＶＤＲ−／−細胞の生存は、５−ＡＺＡによって変化しない（図４Ｄ）ことが示され、これは、５−ＡＺＡ感受性がＶＤＲ発現に依存することを示唆する。ＨＬ６０細胞におけるエピジェネティック修飾因子処理の機能的結果の評価によって、５−ＡＺＡ処理細胞ではＶＤＲ発現が２倍増加したが、５−ＡＺＡ及びＶＤがいずれもＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ及びＣＹＰ２４Ａ１）の発現を誘導したことが明らかになり（図４Ｅ及び４Ｆ）、これは、プロモータのメチル化がＶＤＲ不活化に寄与することを示唆し、これは、ＡＭＬ一次サンプルにおいて更に確認された（図４Ｇ）。したがって、これらデータは、ＶＤＲプロモータがＡＭＬ細胞でメチル化されてＶＤ活性を障害すること、そして、ＡＭＬ細胞の５−ＡＺＡに対する感受性が、ＶＤＲ発現に依存することを示唆する。
【０１２３】
実施例４：脱メチル化剤及びＶＤＲアナログを用いる併用療法は、ＡＭＬ細胞における細胞の分化、細胞周期の停止、及びアポトーシス誘導を誘導する相乗効果を促進して、マウスにおける腫瘍進行を低減する。
ＶＤＲアゴニストは、ＡＭＬ細胞における単球分化を促進することが示されている。しかし、臨床試験では、ＶＤ及びＶＤＲアゴニストは、生命を脅かす高カルシウム血症の発症が原因で臨床応答を誘導することができなかった（Kim et al., 2012）。イネカルシトール（ＩＮＥＣ）は、患者における高カルシウム血症を避けるために開発された非常に強力なＶＤＲアゴニストである（Kim et al., 2012；Petrini et al., 1991）。用量応答試験は、ＡＭＬ細胞の分化を促進するのにＩＮＥＣがＶＤよりも１０００倍有効であることを示した（図５Ａ）。ＡＭＬサンプルにおいてＶＤＲ発現が阻害されることが示されたので、５−ＡＺＡ及びＶＤＲアゴニストによるプロモータのメチル化を低減する併用療法が、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲシグナル伝達を強化することができると仮定した。５−ＡＺＡ及びＩＮＥＣは骨髄分化を有意ではあるがわずかな増加を促進した（５−ＡＺＡについては１．３倍、そして、ＩＮＥＣについては４．５倍）が、併用療法は、ＡＭＬ細胞株におけるＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の発現の大きな増加（８倍）を促進した（図５Ｂ）。この相乗効果は、併用療法によって処理された細胞において発現がアップレギュレートされる単球分化マーカー（ＴＥＲＭＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ８）の発現でも観察されたが、顆粒球マーカーの発現（ＮＥ、ＰＲＴＮ３）は、コントロールと比べてダウンレギュレートされ、これは、併用療法が、ＶＤについて既に示されている通り（Callens et al., 2010a）、顆粒球分化を損害して単球分化を支持することを示唆する（図５Ｃ）。更なる形態学的分析によって、これら知見が確認された。これらの結果は、ＡＭＬ一次サンプルにおいても確認された。予想通り、ＶＤＲアゴニストと脱メチル化剤との間の相乗効果は５−ＡＺＡに制限されなかったが、その理由は、デシタビンがＡＭＬ細胞分化の促進において同様の結果を示したためである。
【０１２４】
ＡＺＡ／ＩＮＥＣ併用療法は、ＶＤＲのリン酸化（図５Ｄ）と共に下流のＭＡＰＫ経路の活性化を促進した。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＭＡＰＫ／ＪＵＮＫ阻害剤は併用療法によって誘導される細胞分化を完全に阻害したが、ＭＡＰＫ／ｐ３８阻害剤は、細胞分化の減少においてより小さな効果しか有していない。したがって、ＡＺＡ／ＩＮＥＣ併用療法は、ＡＭＬ細胞を分化させるＶＤＲ及びＭＡＰＫの活性化を誘導する。また、ＡＺＡ／ＩＮＥＣ併用療法は、細胞周期の停止、並びにｐ１５、ｐ２１、及びｐ２７を含むサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害剤のアップレギュレーション（図５Ｅ〜Ｆ）、並びに白血病細胞株のアポトーシスの誘導においても有効であり、これは、更に、関連する療法が、強力な細胞の潜在的抗白血病効果を提供することを示唆する。
【０１２５】
更に、インビボにおけるマウス腫瘍異種移植モデルでは、ＡＺＡ／ＩＮＥＣ療法において、コントロールマウスと比べて、異種移植マウスの生存率が増大し、そして、腫瘍サイズが減少した（図５Ｇ）。腫瘍成長の低減は、アポトーシスする細胞の数の増加及び細胞分化の特徴に関連していた。このモデルでは、コントロールと比べて、５−ＡＺＡ及びイネカルシトールを単剤療法として用いた場合、生存率又は腫瘍成長において有意な効果は観察されなかった（図５Ｇ）。要するに、これら結果は、ＶＤＲアゴニスト及び５−ＡＺＡによる併用処置が相乗的に作用してＶＤＲシグナル伝達経路を促進し、これによって、ＡＭＬ細胞の成長障害及びアポトーシスが生じ、これが、ＡＭＬモデルにおける腫瘍量を抑制するのに有効であることを示す。
【０１２６】
実施例５：ＶＤＲの不活化によって、単球分化に関与している骨髄前駆細胞が増加し、そして、ＬＳＫ細胞の寿命が延長された。
以前の研究で、ＶＤＲ−／−マウスが正常数の循環単球を示すことが示されており、これは、ＶＤＲが骨髄の分化にとって必須ではないことを示唆する（O'Kelly et al., 2002）。定常状態条件におけるＶＤＲ−／−及び野性型のマウス由来の全血液細胞の分析によって、これら結果が確認され、そして、拡大解釈されたが、その理由は、野性型マウスとＶＤＲ−／−マウスとの間に血小板、顆粒球、赤血球、及び単球の数の差が見られなかったためである（図３Ａ）。更に、骨髄細胞数及び脾臓細胞数の両方において、ＶＤＲ−／−動物と野性型動物との間に差は存在しなかった（図３Ｂ）。しかし、前駆細胞の分析によって、系列限定前駆細胞（ＬＲＰ）、共通の骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）が、野性型マウスに比べてＶＤＲ−／−マウスで増加することが明らかになった。しかし、単球マクロファージ前駆細胞（ＭＭＰ）集団は、野性型マウスと比べてＶＤＲ−／−マウスにおいて減少し（図３Ｃ）、これは、ＶＤＲ−／−マウスにおいて単球分化が障害されたことを示唆する。これに一致して、ＣＦＣアッセイによって、ＶＤＲ−／−ＢＭがマクロファージ（Ｍ）／顆粒球（Ｇ）コロニーの比の低下を示すことが明らかになった（図３Ｄ）。したがって、ＶＤＲ−／−マウスは、単球前駆細胞の数の減少を示し、これは、ＶＤＲ発現によって単球分化に関与している細胞が生じることを示す以前の結果を更に確認するものである。
【０１２７】
次いで、ＶＤＲ−／−マウスにおいてＶＤＲの不活化が造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）コンパートメントに対して影響を及ぼすかどうかを評価した。骨髄のフローサイトメトリー分析によって、系列陰性（Ｌｉｎ−）Ｓｃａ−１＋ＫＩＴ＋（ＬＳＫ）集団が、野性型マウスと比べてＶＤＲ−／−マウスにおいて約３倍増加することが明らかになった（図３Ｅ）。ＬＳＫ亜集団における更なる研究によって、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）の両方がＶＤＲ−／−マウスにおいて増加することが示された（図３Ｅ）。
【０１２８】
活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルは、ＨＳＣの恒常性を制御することが示されており、そして、ＲＯＳレベルの低下は、ＨＳＣの寿命延長に関連していたが、高レベルのＲＯＳは、骨髄の分化に関連していた（Callens et al., 2010a；Callens et al., 2010b；Jung et al., 2013；Tothova et al., 2007）。ＲＯＳ指示薬ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを用いることによって、ＬＳＫ細胞におけるＲＯＳレベルを評価した。相対ＲＯＳレベルの分析によって、ＶＤＲ−／−マウスでは、野性型コントロールと比べて高レベルのＲＯＣを発現するＬＳＫ細胞の数が減少することが明らかになり（図３Ｆ）、これは、ＶＤＲ発現が欠損している細胞における寿命増大を更に示唆する。
【０１２９】
定常状態条件中のＨＳＣの維持は、その静止状態に依存する（Passegue et al., 2005）ので、野性型マウスとＶＤＲ−／−マウスとの間の細胞周期の差について調べた。ＬＳＫゲート細胞におけるＰＩ及びＫｉ−６７によるフローサイトメトリー標識によって、ＶＤＲ−／−細胞では、静止Ｇ０細胞の割合が増大し、そして、周期中のＧ１及びＳ−Ｇ２／Ｍ細胞の割合が減少することが明らかになった（図３Ｇ）。したがって、ＶＤＲ−／−マウスでは、静止状態が増加し、そして、ＲＯＳレベルが低下し、これは、ＨＳＰＣコンパートメントの寿命延長と関連している。
【０１３０】
実施例６：ＶＤＲ欠損細胞の癌遺伝子形質転換によって、白血病幹細胞性能が増大したＡＭＬが生じる。
ＶＤＲ−／−細胞において単球分化が障害された結果についての更なる見識を得るために、得られたＣＤ１１ｂ−Ｆ４／８０−形質転換細胞の表現型を精査することを決定した。したがって、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＬＬ−ＥＮＬ、及びＭＬＬ−ＡＦ９融合タンパク質のコンストラクトで形質転換した野性型細胞及びＶＤＲ欠損細胞における造血前駆細胞の表現型マーカーの発現について試験した。マルチパラメトリックなフローサイトメトリー分析によって、正常造血細胞において既に観察されている通り、ＬＳＫ細胞の頻度が、野性型形質転換細胞と比べてＶＤＲ−／−形質転換細胞において増加することが示された（図２Ａ）。これに一致して、ＬＳＫの表現型に関連し（ＥＶＩ−１、ＨＯＸＡ−９、及びＭＥＩＳ−１）、そして、骨髄前駆細胞の拘束によって容易にダウンレギュレートされた（Chen et al., 2008）遺伝子の発現は、ＶＤＲ−／−形質転換細胞において増加した（図２Ｂ）。したがって、癌遺伝子形質転換細胞におけるＶＤＲの不活化によって、未成熟な表現型の、そして、ＬＩＣ潜在力の可能性を有する細胞が生じた。
【０１３１】
次いで、ＬＩＣの再生能の維持におけるＶＤＲの役割について調べた。癌遺伝子形質転換細胞をメチルセルロースにプレーティングし、そして、培養７日目と１０日目との間にコロニーを計数した（図２Ｄ）。野性型及びＶＤＲ−／−形質転換から、このプレーティングの最初のラウンドにおいて同様の数のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）が生じた（図２Ｄ）。しかし、連続再プレーティングした後、ＶＤＲ−／−形質転換細胞では野性型細胞に比べてクローン形成能が増大した（図２Ｄ）。したがって、ＶＤＲ−／−細胞の癌遺伝子形質転換によって、ＬＩＣの特徴であるクローン形成能が増強される。
【０１３２】
したがって、融合タンパク質による白血病形質転換の３つの異なるモデルにおいて、細胞は、ＶＤＲを発現し、より成熟した表現型を有し、ＶＤＲ−／−細胞と比べてＬＩＣコンパートメントの減少及び化学療法に対する感受性の増大を示すことができる。要するに、これらデータは、白血病誘発中のＶＤＲ発現が、形質転換細胞の単球分化を調節することができ、そして、ＶＤＲ発現が存在しないことによって、未成熟な形態及び表現型の、そして、幹細胞性が増大したＡＭＬ細胞が生じることを示唆した。
【０１３３】
実施例７：ＶＤＲシグナル伝達を標的とすることにより、化学療法に対する感受性が回復し、そして、ＡＭＬモデルにおいてＬＩＣを根絶する。
ＬＩＣは、化学療法に対する耐性を有するバルク白血病集団における白血病細胞のサブセットであり、したがって、再燃の原因となる。次に、ＬＩＣ細胞の標的化におけるＶＤＲアゴニスト療法の有効性について調べた。この仮説について試験するために、野性型マウス及びＶＤＲ−／−マウスに由来する骨髄前駆細胞をＦＬＴ３−ＩＴＤコンストラクトで形質導入した。ＩＮＥＣ又はコントロールとしてのビヒクルを含有する半固体培地に細胞をプレーティングした（図６Ａ）。ＩＮＥＣを含有するメチルセルロース中におけるＦＬＴ３−ＩＴＤ形質転換細胞の成長によって、ビヒクル処理細胞と比べてクローン形成能が５倍低下し（図６Ａ）、そして、再プレーティングアッセイによって、ＩＮＥＣ処理は、プレーティングの第４ラウンドにおいて成長しているコロニーが実質的に存在しないＬＩＣの能力の進行性消失を誘導するが、ビヒクル処理細胞は、メチルセルロースへの連続プレーティング中にクローン形成能を維持することが明らかになった（図６Ａ）。ＩＮＥＣの効果が可逆的であることを更に調べるために、２回目の再プレーティングでＩＮＥＣ処理された培地をＩＮＥＣ又はビヒクルを含有する２つのグループに分けた。ＩＮＥＣの洗い流しによってＣＦＣが再確立され、これは、ＶＤＲアゴニストによる連続処理がＬＩＣを根絶するための選択圧を維持することを示唆する（図６Ａ）。したがって、インビトロコロニー再プレーティングアッセイは、ＶＤＲシグナル伝達が、ＬＩＣの恒常性を制御する主な経路であり、そして、ＶＤＲアゴニストがＬＩＣを根絶することができることを示唆する。
【０１３４】
これら知見と一致して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ／ＮＰＭ１  ＡＭＬ芽球（Mupo et al., 2013）のＩＮＥＣによるインビトロ処理によって、骨髄分化マーカーの発現が増加した（図６Ｂ）。ＩＮＥＣ処理細胞が養子導入されたマウスは、白血病を発現することができなかった。これと一致して、白血病細胞の生物学的及び免疫表現型マーカーをＩＮＥＣ処理動物において正規化した（図６Ｃ）。これと一致して、ＩＮＥＣ処理動物由来のＢＭ細胞の受動伝達によって、擬処理動物と比べて白血病の発現が大きく遅れた（図６Ｄ）。したがって、ＶＤＲシグナル伝達の誘導は、クローン形成前駆細胞の成長停止を促進して、ＬＩＣの寿命を低減し、そして、ＶＤＲアゴニスト処理によって、腫瘍量及びＬＩＣ標的化が減少した。まとめると、これらデータは、ＡＭＬの処理におけるＶＤＲアゴニストを処置的に使用するための根拠を提供する。
【０１３５】
実施例８：考察
メチル化は、哺乳類ゲノムにおいて頻繁に生じるプロセスであり、そして、ゲノムワイドな脱メチル化は、肺発生に必須である（Feng et al., 2010）。更に、エピジェネティック修飾は、近年、体細胞発生中に観察され、そして、５’−ＣｐＧ−３’ジヌクレオチドの脱メチル化は、赤血球生成の進行に必須であることが示されている（Shearstone et al., 2011）。しかし、ＡＭＬの特徴である骨髄分化の妨害において影響を及ぼすエピジェネティック修飾によって抑制される遺伝子の同定については、詳細に言及されていなかった。本発明者らによるデータは、プロモータの過剰メチル化によるＶＤＲ発現の不活化が、分化／ＦＡＢ分類だけではなく、ＡＭＬの進行にも関連する新規機構であることを示唆しているが、その理由は、ＶＤＲ／ＶＤＲ標的遺伝子の発現が、患者の生存の増大に関連していたためである。また、本発明者らによる研究によって、ＶＤＲが低メチル化剤の標的として同定されたが、その理由は、ＶＤＲ−／−形質転換細胞が５−ＡＺＡ処理に対して耐性であったためである。したがって、エピジェネティック修飾によるＶＤＲ発現の制御は、低メチル化剤療法における結果と共に、ＡＭＬにおけるこの核受容体の新規役割を規定する。
【０１３６】
５，８４８人のＡＭＬ患者を用いた最近の研究では、ＡＭＬ０サブタイプが、無再燃生存及び全生存の減少に関連しており、これは、未成熟な表現型によって疾患の転帰が悪化し得ることを示唆する（Walter et al., 2013）。ＡＭＬ患者における本発明者らによる研究は、ＶＤＲの抑制が、ＡＭＬ細胞分化を制御する新規遺伝子であり得ること、そして、ＶＤＲの低発現がＡＭＬ０〜２表現型の特徴であることを示唆する。ＶＤＲが無効化された細胞を用いた相補的研究では、ＡＭＬ癌遺伝子による癌遺伝子形質転換によって、未成熟な表現型の特徴を有する細胞が生じることが示された。したがって、本発明者らによるデータは、ＶＤＲが、患者の管理において適用できる可能性のある、様々なＡＭＬサブタイプの発現に寄与する新規遺伝子調節因子であることを示唆しているが、その理由は、ＡＭＬ４／５サブタイプにおけるＶＤＲ発現の増加が予後の改善と関連していたためである。
【０１３７】
ＶＤＲの不活化は、造血幹細胞及び骨髄前駆細胞の分化制御に必須であると考えられた。これと一致して、ＶＤＲ−／−マウス由来のＨＳＣは、静止状態の増加及びＲＯＣを蓄積する能力の低下を示し、これらは、いずれも、ＨＳＣプールが早期に消耗するのを防ぐのに関与していたので、その長期維持が可能になった（Amrani et al., 2011；Takubo et al., 2013；Tothova et al., 2007）。ＲＯＳは、造血にとって重要である細胞運命決定に関与しており、そして、骨髄分化及びＨＳＣ恒常性は、いずれもＲＯＳレベルに依存している。造血制御におけるＲＯＳの重要性は、ショウジョウバエ、マウス、及びヒトに及ぶ様々な種において進化全体を通して保存されていることによって強調される（Callens et al., 2010a；Owusu-Ansah and Banerjee, 2009；Sasaki et al., 2012）。更に、ＲＯＳの勾配は、骨髄分化を維持するために必須であることも示されている（Callens et al., 2010a；Owusu-Ansah and Banerjee, 2009）ので、ＶＤＲ発現の不活化は、骨髄造血も制限した。ＲＯＳレベルは、ＶＤＲ欠損細胞において低下し、これは、ヒト白血病細胞及び形質転換された癌遺伝子形質転換マウス細胞の両方において観察されたＲＯＳの調節を通してＨＳＣの恒常性を制御する新規経路の存在を示唆する。幹細胞の静止及び骨髄分化の維持は、いずれも、様々なストレス条件においてＭＡＰＫ経路を活性化することが示されている（Ito et al., 2006）。骨髄分化がＭＡＰＫの活性化を通してＶＤＲシグナル伝達に依存することを示す本発明者らによるデータは、ＶＤＲシグナル伝達が、ＭＡＰＫの活性化の上流の主な経路であることを示唆している。したがって、ＶＤＲシグナル伝達は、正常造血及び悪性造血の両方に関与しているＲＯＳ恒常性及びＭＡＰＫシグナル伝達を制御する重要な要素であると考えられた。
【０１３８】
ＤＮＡメチル化剤の使用は、ＭＤＳ及びＡＭＬの処置において提唱されているが、臨床試験における単剤療法としてのその有効性は限定的であることが示されており、その理由は、応答は促進されたが（約２０％）、中央応答期間は短かったためである（Fenaux, 2005；Quintas-Cardama et al., 2012；Sekeres et al., 2010）。ここで、本発明者らは、脱メチル化剤とＶＤＲアゴニストとの併用によって、ＶＤＲシグナル伝達経路が強力に活性化され、これによって、白血病の進行が制限され、そして、ＬＩＣのクローン形成能が消滅することを示す。したがって、脱メチル化剤療法とＶＤＲアゴニストとの関連によって、ＡＭＬにおいてＤＮＡ低メチル化剤の有効性を改善することができる。更なる臨床試験によって、ＡＭＬ患者においてこの仮説を確認することができるであろう。
【０１３９】
ＡＭＬにおける死は、通常、再燃後の進行性疾患によって生じる。再燃は、化学療法によって発揮される選択圧に起因するクローン進化に関連しており、そして、腫瘍量の大部分における白血病幹細胞（細胞周期の制限に起因する長寿命及び化学療法に対する耐性を特徴とする）に関連していると考えられる。本発明者らは、ＶＤＲシグナル伝達の誘導によって、単球分化、アポトーシス、及び化学療法に対する感受性が生じることを示すが、その理由は、癌遺伝子形質転換ＶＤＲ−／−細胞が、分化の障害、化学療法によるアポトーシスに対する耐性の増大を示したためであり、これは、ＶＤＲの活性化がＬＩＣ恒常性を制御する主な経路を標的とすることを示唆する。ＶＤＲ発現及びＶＤＲシグナル伝達の誘導によって、白血病細胞の大部分の細胞分化及びＬＩＣ自己再生の制限の両方が促進された。更に、ＶＤＲアゴニストによるＡＭＬ細胞分化の促進によって、マウスにおけるＬＩＣが根絶された。加えて、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲシグナル伝達の誘導における機構が、ＡＭＬ処置の標的であると考えられる。
【０１４０】
以前の研究では、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート（ＴＰＡ）によって誘導される末梢血単球及び骨髄の分化における差は明らかにならず、これは、ＶＤＲ発現が単球分化に必須ではないことを示唆している（O'Kelly et al., 2002）。本発明者らによる結果によって、ＶＤＲ−／−マウスでは定常状態条件において単球数が変化しないという知見が確認された。しかし、ＨＳＣＰ及び単球前駆細胞はＶＤＲ−／−において減少し、これは、ＶＤＲ−／−マウスにおいて単球分化が影響を受けることを示唆する。したがって、ＶＤＲは、正常造血及び悪性造血の両方に関与しており、そして、細胞の幹細胞性に重要であることが見出された。
【０１４１】
要約すると、本発明者らは、本発明において、正常造血及び悪性造血におけるＶＤＲ及びＶＤＲシグナル伝達の新規役割を同定した。正常造血では、ＶＤＲ発現は、ＨＳＰＣＳ恒常性に重要であることが見出され、そして、ＶＤＲ欠損マウスは、造血前駆細胞及び骨髄前駆細胞集団の過剰出現を示した。ＶＤＲ発現／機能の変動も、造血器悪性腫瘍に影響を与えたが、その理由は、ＶＤＲ／ＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ）の発現がＡＭＬ患者の予後と相関しており、そして、改善したが、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲの不活化によって、骨髄分化が制限され、そして、ＬＩＣのクローン形成能が増大したためである。プロモータのメチル化の増大に起因するＶＤＲの不活化及び白血病細胞におけるＶＤＲプロモータの過剰メチル化の復帰によって、骨髄分化、ＬＩＣ長寿命の消滅、及び化学療法に対する応答性の再確立が生じた。したがって、ＶＤＲの不活化によって、骨髄分化が制限され、そして、ＨＳＰＣＳの長寿命が維持され、そして、ＶＤＲシグナル伝達の誘導は、ＬＩＣを根絶するための有効な標的経路であると考えられるので、ＡＭＬ療法における再燃を防ぐ（図６Ｄ）。
【０１４２】
参照文献：
本願全体を通して、様々な参照文献が、本発明が関連する技術分野の状況について説明している。これら参照文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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