(57)【要約】  本発明は、従属栄養条件下において培養されたクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のタンパク質を富化するための方法に関する。この方法は、この従属栄養培養が、窒素を含まない栄養源を欠乏させた発酵培地を用いて微細藻類の増殖を遅らせることを目的とするステップを含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
従属栄養培養されたクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のタンパク質を富化するためのプロセスにおいて、前記従属栄養培養が、発酵培地の無窒素栄養源を欠乏させることによって、前記微細藻類の増殖を制限するように向けられたステップを含み、それによってバイオマスのタンパク質含有量を５０重量％超に到達させることが可能となることを特徴とする、プロセス。
【請求項２】
欠乏させる無窒素栄養源が、グルコースおよびリン酸塩からなる群から選択される栄養物質であることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記クロレラ属の前記微細藻類が、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記クロレラ・ソロキニアナ種の前記微細藻類の従属栄養培養が：
ａ．前記微細藻類を増殖させる第１のステップであって、大量のバイオマスを迅速に得るために、グルコース供給速度がその消費能力に合わせて調整されるステップと、
ｂ．前記微細藻類によってタンパク質を産生する第２のステップであって、貯蔵物質のさらなる蓄積を防止するか、またはさらにその消費を促進させるために、グルコース供給速度がそのグルコース消費能力を大幅に下回る値に設定されるステップと
を含むことを特徴とする、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記クロレラ・プロトセコイデス種の前記微細藻類の従属栄養培養が、リン酸塩欠乏下で培養するステップを含み、これにより増殖速度を制限し、タンパク質含有量の増加をもたらすことを特徴とする、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
発酵温度が、前記微細藻類の前記増殖速度を低下させるように調整されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記発酵温度を、最適発酵温度に対して１、２、３、４または５℃上昇させることを特徴とする、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記発酵温度を、前記最適発酵温度に対して約３℃上昇させることを特徴とする、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記発酵温度が約３１℃であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
従属栄養培養される微細藻類、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類のタンパク質を富化するためのプロセスにおいて、前記従属栄養培養が、発酵温度を最適発酵温度に対して上昇させることによって、かつ発酵培地において無窒素栄養源を欠乏させることによって、前記微細藻類の増殖を遅らせるように向けられたステップを含み、それによってバイオマスのタンパク質含有量を５０重量％超、６０重量％超または７０重量％超に到達させることが可能となることを特徴とする、プロセス。
【請求項１１】
前記発酵温度の上昇が、前記発酵温度を２８℃から３１℃まで上昇させることによって反映されることを特徴とする、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記発酵温度の上昇により、発酵槽の熱交換器の冷却能力が向上し、好ましくは倍増することを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記クロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類の前記従属栄養培養が、増殖速度を制限することにより前記タンパク質含有量が増加し、全アミノ酸の４０％を超えるグルタミン酸およびアルギニンが産生される、リン酸塩欠乏下で培養を行うステップを含むことを特徴とする、請求項５に記載のプロセス。
【請求項１４】
従属栄養培養された微細藻類、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類のグルタミン酸および／またはアルギニン含有量を富化するためのプロセスであって、前記微細藻類、好ましくは前記クロレラ・プロトセコイデス種の前記微細藻類の、リン酸塩欠乏下で培養するステップを含む従属栄養培養を含み、前記培養の結果として、全アミノ酸の４０％を超えるグルタミン酸およびアルギニンを含む微細藻類バイオマスが調製される、プロセス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロセスにより得ることができるか、または得られる、微細藻類バイオマス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類バイオマス、より詳細にはクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｇｅｎｕｓ）、さらに詳細にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）種またはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類バイオマスのタンパク質を富化するためのプロセスに関する。本発明はまた、特定の微細藻類、より詳細にはクロレラ・プロトセコイデスのバイオマスのタンパク質を富化するためのプロセスであって、そのタンパク質のアルギニンおよびグルタミン含有量が非常に高い、プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
大型藻類および微細藻類は特定の物質を豊富に含み、これらの大部分は今も未調査のままである。食物、化学製品またはバイオエネルギー用途におけるそれらの利用は、依然としてごく僅かである。しかし、それらは、豊富さおよび存在量の多さの両方の意味で、非常に価値の高い成分を含んでいる。
【０００３】
実際、微細藻類は、ビタミン類、脂質、タンパク質、糖、色素および酸化防止剤の供給源となる。
【０００４】
したがって、藻類および微細藻類は、これらを栄養補助食品、機能性食品、化粧品および医薬品の製造または水産養殖の各産業分野から注目されている。
【０００５】
微細藻類は、光が当たるあらゆる生息場所に最初にコロニーを作る光合成微生物である。
【０００６】
工業規模では、そのモノクローナル培養は光バイオリアクター内で行われる（独立栄養条件：光およびＣＯ２中）か、発酵槽内で行われる場合もある（従属栄養条件：暗所、炭素源存在下）。
【０００７】
これは微細藻類の一部の種、すなわちクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微細藻類が、光の非存在下で増殖可能なためである。
【０００８】
さらに、従属栄養条件下での培養は、光栄養条件下での培養に比べて費用が１０分の１になると見積もられている。その理由は、従属栄養条件下の培養は、当業者にとって：
−  細菌および酵母に使用されるものと同じ発酵槽が使用可能であるため、全ての培養パラメータを制御すること、
−  光を利用する培養により達成されるバイオマス生産量を大幅に上回るバイオマス生産量を達成すること
が可能になるためである。
【０００９】
一般に、微細藻類を有益に利用するためには、目的成分を蓄積させることができるように発酵条件を制御することが必要である。目的成分の例を以下に示す：
−  色素（クロロフィルａ、ｂおよびｃ、β−カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、フィコシアニン、キサントフィル、フィコエリトリン等）：これらは顕著な抗酸化性を示すだけでなく、食品の天然着色料としても使用できることから、需要が高まりつつある。
−  脂質：脂肪酸含有量を最適化する（固形分の６０重量％、またはさらに８０重量％まで）ために、特に以下の用途に使用される：
−  バイオ燃料用途、さらに、
−  食品または動物飼料用途（選択された微細藻類が「必須」（すなわち、人体または動物体内で天然に合成されないため、食事によって供給される）多価不飽和脂肪酸すなわちＰＵＦＡを産生する場合）。
−  タンパク質：栄養価を最適化する、または目的アミノ酸の供給量を高める目的で使用される。
【００１０】
対象のアミノ酸の供給に関連して、実際、アルギニンおよびグルタミン酸が豊富なタンパク質源が利用できるようになれば有利である。
【００１１】
アルギニンは、動物界において多くの機能を有するアミノ酸である。
【００１２】
アルギニンは分解することができ、それによって、エネルギー、炭素および窒素を同化する細胞の供給源として作用することができる。
【００１３】
哺乳類をはじめとする様々な動物において、アルギニンはオルニチンおよび尿素に分解される。後者は窒素を含む分子であり、（尿中に排泄されることによって）体外に排出され、それによって動物の細胞内に存在する含窒素化合物の量を調整することができる。
【００１４】
アルギニンは、一酸化窒素合成酵素を介して一酸化窒素（ＮＯ）を合成することができ、それによって動脈の血管拡張に関与し、血管の剛性を低下させ、血流量を増加させ、したがって血管機能を向上させる。
【００１５】
アルギニンを含む栄養補助食品は、心臓の健康の増進、血管機能の促進、「血小板凝集」（血栓が形成されるリスク）の予防および動脈圧の低下に推奨されている。
【００１６】
創傷治癒におけるアルギニンの関与は、コラーゲン合成におけるもう一つの重要なアミノ酸であるプロリンの形成における役割に関連付けられている。
【００１７】
最後に、アルギニンは、特にスポーツ選手向けの栄養ドリンクの成分としてよく使用されている。
【００１８】
グルタミン酸に関して言えば、これはタンパク質を合成するための構成要素の１つであるのみならず、中枢神経系（脳＋脊柱）内に最も広く分布している興奮性神経伝達物質でもあり、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに含まれるＧＡＢＡ前駆体でもある。
【００１９】
番号Ｅ６２０によれば、グルタミン酸は食品のうまみ調味料として使用される。これは食品の味を向上させるために食品調理に添加される。
【００２０】
グルタミン酸だけでなく、国際食品規格委員会は、そのナトリウム塩（Ｅ６２１）、カリウム塩（Ｅ６２２）、カルシウム塩（Ｅ６２３）、アンモニウム塩（Ｅ６２４）およびマグネシウム塩（Ｅ６２５）もうまみ調味料として認可している。
【００２１】
グルタミン酸（またはその塩）は、調理済みの食事（スープ、ソース、ポテトチップおよび出来合いの料理）によく含まれている。アジア料理にもよく使用されている。
【００２２】
現在、それはアペリティフに加える香味料（ベーコンフレーバー、チーズフレーバー）と組み合わせて使用されることが多い。こうすることにより、ベーコンやチーズ等の風味
を高めることができる。これらを一切含まないアペリティフは稀である。
【００２３】
特定の医薬品用カプセル剤に含まれる場合もあるが、これは呈味付与が目的ではない。
【００２４】
最後に、これらは調理補助材（固形スープの素、ソースベース、ソース等）の主要な成分である。
【００２５】
微細藻類の代謝が活発であることを利用して、タンパク質または脂質の収率および生産性を最大にするために、高細胞密度（ＨＣＤ）を達成することを目的とした第１の発酵法についてはこれまで十分に研究されてきた。
【００２６】
こうしたＨＣＤ培養の目的は、所望の生産物を可能な最大濃度で、かつ可能な最短時間で得ることにあった。
【００２７】
この原則は、例えば、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）によるアスタキサンチンの生合成により証明されたものであり、この微細藻類の増殖は、アスタキサンチンの生産と直接の相関があることが判明されている（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｅｎｇ，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（９），１９１５−１９２２）。
【００２８】
しかしながら、増殖を最大速度（μ：単位ｈ−１）に維持することが、必ずしも所望の生産物の生産量を高くすることと相関しているわけではない。
【００２９】
事実、例えば、微細藻類に大量の脂質貯蔵を生産させることが所望される場合は、微細藻類の増殖を制限する栄養的ストレスに晒すことが必要であることがすぐに当業者に明らかとなった。
【００３０】
したがって、発酵方法において、増殖と生産は切り離された。
【００３１】
例えば、国際公開第０１／５４５１０号パンフレットにおいては、多価不飽和脂肪酸（この例においてはドコサヘキサエン酸、すなわちＤＨＡ）の蓄積を促進させるために、多価不飽和脂肪酸の生産と細胞の増殖とを切り離すことが推奨されている。
【００３２】
より詳細には、その明細書に記載されている微生物脂質を製造するための方法は：
（ａ）微生物、炭素源および制限された栄養源を含む培地で発酵を行い、バイオマスを増加させるために、溶存酸素濃度を上記発酵培地の飽和の少なくとも約４％に維持するのに十分な条件を確保することと、
（ｂ）次いで、溶存酸素濃度を上記発酵培地の飽和の約１％以下に維持するのに十分な条件を与え、上記微生物が上記脂質を産生するのに十分な条件を与えることと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質から構成される上記微生物脂質を回収することと
を含むステップを含み、発酵過程全体で少なくとも約１００ｇ／Ｌのバイオマス密度が達成される。
【００３３】
したがって、より詳細には、微細藻類としてシゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ２０８８８株を用いる場合、第１の増殖段階は高い細胞密度の達成を促進させるために、炭素源および窒素源の存在下かつ酸素非制限下にて行い、次いで第２の段階においては、微細藻類にストレスを与えるように窒素の供給を停止すると共に、酸素の供給を徐々に低下させる（溶存酸素圧すなわちｐＯ２を１０％から４％へ、次いで０．５％へと操作する）ことにより、その増殖を遅らせて目的の脂肪酸の産生を
誘発する。
【００３４】
微細藻類としてクリプテコディニウム・コニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）を用いる場合、グルコース濃度を低く（５ｇ／Ｌ程度）、したがって増殖速度を遅くした場合に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、多価不飽和脂肪酸）が最大濃度で得られる（Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０００，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５（１０），１２０５−１２０９）。
【００３５】
これらの結果は、微細藻類の増殖が、生産物の生産速度（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に対してプラスにもマイナスにも作用することができ、その２つの組み合わせの場合さえあることの好例である。
【００３６】
したがって、生産物の形成が高細胞増殖と相関しない場合は、細胞増殖速度を制御することが賢明である。
【００３７】
一般に、当業者は、発酵条件（温度、ｐＨ）を制御するかまたは発酵培地の栄養分の供給を調整する（「フェドバッチ」と称される半連続的条件）ことによって、微細藻類の増殖を制御することを選択する。
【００３８】
微細藻類の増殖を炭素源の供給による従属栄養下に制御することを選択する場合、当業者は一般に、微細藻類（クリプテコディニウム・コニー、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）等）が生産する代謝産物（例えば、ＤＨＡ型の多価不飽和脂肪酸）に応じて炭素源（純グルコース、酢酸塩、エタノール等）を適合させることを選択する。
【００３９】
温度も重要なパラメータとなる。
−  例えば、微細藻類の一部の種における多価不飽和脂肪酸の合成（例えば、クロレラ・ミニツシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）によるＥＰＡの合成等）は、上記微細藻類の増殖に必要とされる最適温度よりも低い温度で促進されることが報告されており、
−  他方、クロレラ・プロトセコイデスの従属栄養培養においては、生産温度を２４℃から３５℃に昇温させると、ルテインの収率が増加する。
【００４０】
実際、クロレラ・プロトセコイデスは、油の生産に最適な微細藻類の１種であることが知られている。
【００４１】
クロレラ・プロトセコイデスは、従属栄養条件下において炭水化物を速やかにトリグリセリドに変換する（その固形分の５０％超）。
【００４２】
このトリグリセリドの生産を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境を操作することによって、油の生産に向かう炭素流動を最適化するに至っている。
【００４３】
したがって、窒素欠乏条件下で炭素を十分に供給した場合に、油が蓄積されることが分かっている。
【００４４】
そのため、この場合はＣ／Ｎ比が決定要因となり、窒素含有量に直接作用することによって最良の結果が得られることが認められており、グルコース含有量は制限因子ではない。
【００４５】
当然のことながら、この窒素欠乏が細胞増殖に悪影響を与え、結果として微細藻類の増
殖速度が正常な増殖速度に比べて３０％遅くなる（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５４，ｐａｇｅｓ  １００１−１０１１）。
【００４６】
この結果を説明するために、上述の論文においてＸｉｏｎｇらは実際に、クロレラバイオマスを５種類の主要な成分、すなわち炭水化物、脂質、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ（その固形分の８５％を占める）に分けた場合、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび炭水化物の含有量はＣ／Ｎ比に左右されないが、タンパク質および脂質の含有量に関してはＣ／Ｎ比が最も重要であることを実証している。
【００４７】
このようにして、低Ｃ／Ｎ比で培養されたクロレラ属細胞のタンパク質含有量は２５．８％、脂質含有量は２５．２３％であるが、高Ｃ／Ｎ比においては、脂質を５３．８％、タンパク質を１０．５％合成することが可能である。
【００４８】
したがって、当業者が油の生産を最適化するためには、炭素流動がタンパク質生産を損ねて油の生産に向かうように操作することによって、炭素流動を制御することが極めて重要である。微細藻類を窒素欠乏培地に接種すると、炭素流動が再分配されて脂質貯蔵物質として蓄積される。
【００４９】
したがって、当業者は、この教示を踏まえて、タンパク質に富むバイオマスの生産を目的とする場合、この代謝制御とは逆方向に向かう制御を行う、すなわち代わりに低Ｃ／Ｎ比を促進するように：
−  発酵培地の炭素源の添加量を一定に維持しながら、タンパク質に変換されることになる窒素源を大量に供給し、かつ
−  微細藻類の増殖を刺激する
ように発酵条件を修正するに至っている。
【００５０】
これに伴い、貯蔵脂質の生産を損ねてタンパク質（したがってバイオマス）の生産に向かうように、炭素流動が修正される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５１】
他方、本発明において、本出願人企業は、当業者が従来想定していた解決策の代替策を提案することにより、本来の経路の可能性を模索することを選択した。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
したがって、本発明は、従属栄養培養された微細藻類のタンパク質を富化するためのプロセスであって、微細藻類がクロレラ属、より詳細にはクロレラ・ソロキニアナまたはクロレラ・プロトセコイデスの微細藻類であり、従属栄養培養プロセスが、発酵培地の無窒素栄養源を欠乏させることによって、上記微細藻類の増殖が制限されるように向けられたステップを含む、プロセスに関する。
【００５３】
このステップは、培地に供給される無窒素栄養因子の量が、微細藻類を増殖させるには不十分な量である、従属栄養培養ステップである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明における「富化」という語は、バイオマスのタンパク質含有量が５０重量％超、６０重量％超、６５重量％超または７０重量％超に到達するように、バイオマスのタンパク質含有量を、少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％増加させることを意味する。
【００５５】
より正確には、本発明は、上記微細藻類を従属栄養培養するためのプロセスであって、発酵培地の無窒素栄養源を欠乏させることによって上記微細藻類の増殖を制限するように向けられたステップを含む、プロセスを包含する。微細藻類の増殖を遅らせるために、発酵温度を任意選択的に調整することもできる。発酵温度は、通常約２８℃である最適発酵温度に対し、特に１、２、３、４または５℃上昇させることができる。好ましくは、発酵温度は約３℃上昇させ、例えば２８℃から３１℃に上昇させることができる。
【００５６】
本明細書において使用される「約」という語は、±２０％、±１０％、±５％または±２％の値を指す。したがって、本発明は、従属栄養培養された微細藻類のタンパク質を富化するためのプロセスであって、微細藻類がクロレラ属、より詳細にはクロレラ・ソロキニアナまたはクロレラ・プロトセコイデスの微細藻類であり、発酵培地の無窒素栄養源を欠乏させることによって、上記微細藻類の増殖を制限するように向けられたステップを含む従属栄養培養を含み、それによってバイオマスのタンパク質含有量が５０重量％超、６０重量％超または７０重量％超に到達することを可能にする、プロセスに関する。
【００５７】
「発酵培地における無窒素栄養源の欠乏」という語は、無窒素栄養因子の少なくとも１種の微細藻類への供給量を、微細藻類を増殖させるのに不十分な量として培養を行うことを意味する。この欠乏の結果として、微細藻類の増殖速度が、栄養制限を行わない場合の上記微細藻類の増殖速度よりも遅くなる。
【００５８】
微細藻類は、この無窒素栄養因子が供給されるに従い徐々に消費していくため、これは、培養培地におけるこの栄養因子の欠如によって反映される。
【００５９】
したがって、本発明における重要な条件は、ストレスにより細胞増殖の制限を誘発することであり、この細胞ストレスは、発酵培地における無窒素栄養物質の欠乏によりもたらされる。
【００６０】
したがって、この戦略は、バイオマスのタンパク質含有量を増加させるためには、バイオマスを増加させ、したがって細胞を増殖させることが必要不可欠であると考えられていた技術的な予想に大きく反するものである。
【００６１】
「無窒素栄養源」という語は、例えば、グルコースおよびリン酸塩からなる群から選択される栄養物質を意味する。
【００６２】
以下に例示するように、有利には：
−  発酵培地のグルコースを欠乏させることによる、クロレラ・ソロキニアナの増殖制限、
−  発酵培地のリン酸塩を欠乏させることによる、クロレラ・プロトセコイデスの増殖制限
を選択することができる。
【００６３】
上記微細藻類の増殖制限は、任意選択的に、細胞増殖を抑制する物質（硫酸塩等）を培養培地に添加することにより達成することができる。
【００６４】
上記微細藻類の増殖の遅延は、発酵温度を調整することにより、例えば、最適発酵温度に対して約１〜５℃、好ましくは約３℃上昇させることによって誘導することもできる。最適発酵温度は、通常約２８℃である。
【００６５】
さらに、任意の理論に束縛されるものではないが、本出願人企業は、クロレラ・ソロキニアナ属の微細藻類において、通常、グルコース流動が非常に特定的な優先順位、すなわ
ち：
１．基礎代謝、
２．増殖、すなわちタンパク質に富むバイオマスの生産、
３．貯蔵物質（脂肪およびデンプン等の炭水化物）
の順序で使用されることを見出した。
【００６６】
この原則により、微細藻類の増殖過程において、窒素供給が一定であっても、タンパク質含有量が自然変動することが分かる。
【００６７】
したがって、本出願人企業は、微細藻類バイオマスをタンパク質で富化するためには、微細藻類の増殖を制限することが必要であり、
−  消費されるグルコースが、完全にタンパク質産生経路に割り当てられるようにし、
−  脂肪等の貯蔵物質の蓄積を回避する
ように、窒素以外の栄養源（例えばグルコース）の消費を制御する必要があることを見出した。
【００６８】
具体的には、窒素欠乏を回避することにより、代謝の流れが脂肪の生産へと向かうのを防止することができる。
【００６９】
任意選択的に、特定の阻害剤を作用させることにより、貯蔵物質の合成を可能な限り完全に阻害すると有利である。
【００７０】
具体的には、脂肪合成経路、またはさらにデンプン（緑色の微細藻類が貯蔵する炭水化物の初期の形態）合成経路の特定の数の阻害物質が知られている：
−  脂肪に関しては、例えば、セルレニンが脂肪酸合成の阻害剤として記載されており、またはストレプトマイセス・トキシトリシニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ）が産生する天然物質であるリプスタチンがリパーゼ阻害剤として記載されており、
−  デンプンに関しては、イミノ糖（糖の環内酸素原子を単純に窒素原子で置換することにより得られる）は、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼまたはＵＤＰ−Ｇａｌｐムターゼの強力な阻害剤であることが歴史的に知られている。
【００７１】
したがって、本発明のプロセスは、従属栄養条件下において微細藻類バイオマスを発酵させることを含み、バイオマスを増殖させる第１のステップと、発酵培地において無窒素栄養源を欠乏させる第２のステップとを含む。
【００７２】
この第２のステップにより、バイオマスをタンパク質で富化することが可能になる。特に、バイオマスのタンパク質含有量を、５０重量％超、６０重量％超、６５重量％超または７０重量％超（固形分の重量で）に到達させることが可能になる。
【００７３】
本発明による第１の好ましい実施形態において、上記微細藻類、特にクロレラ・ソロキニアナを従属栄養培養するためのプロセスは：
○この微細藻類を増殖させる第１のステップであって、大量のバイオマスを迅速に得るために、培地のグルコース量（バッチ方式の場合）またはグルコース供給速度（連続方式または半連続方式の場合）が、その消費能力に合わせて調整される、ステップと、
○この微細藻類によってタンパク質を産生する第２のステップであって、貯蔵物質のさらなる蓄積を防止するか、またはさらにその消費を促進させるために、グルコース供給速度がそのグルコース消費能力を大幅に下回る値に設定される、ステップと
を含む。
【００７４】
以下に例示するように、微細藻類を増殖させる第１のステップはバッチ方式で実施することができ、最初に供給されるグルコースは微細藻類によって全て消費され、それによってベースとなるバイオマスが生産される。
【００７５】
タンパク質を産生する第２のステップは、以下の条件で実施される：
ａ）最初に供給されたグルコースが消費された後は、全培地を半連続方式または「フェドバッチ」方式のいずれかで供給し、他の発酵を行うパラメータは変更しない。この場合、グルコースを連続的に供給し、その時の供給速度を、藻株が到達し得る消費速度を下回る速度とすることにより、培地の残存グルコース量がゼロに維持されるようにする。このようにして、株の増殖をグルコース利用性によって制限する（グルコース制限条件）。
ｂ）ケモスタット方式の連続運転を行い、グルコース供給量により株の増殖を制限して、株の増殖速度（μ）をその最小値に維持する。この運転方式により、グルコースを制限して増殖速度を低く抑えることによって、高いタンパク質含有量のバイオマスを得ると同時に、非常に高い生産性を確保することが可能になる。
【００７６】
本発明による第２の好ましい実施形態における、上記微細藻類、特にクロレラ・プロトセコイデスを従属栄養培養するためのプロセスは、リン酸塩の供給を制限することにより、増殖速度を制限しながら微細藻類を増殖させ、その結果としてタンパク質含有量を増加させるステップを含む。これにより、クロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類の従属栄養培養は、リン酸塩欠乏下で従属栄養培養を行い、それによって増殖速度を低下させ、その結果としてタンパク質含有量を増加させるステップを含む。
【００７７】
この本発明による第２の好ましい実施形態の一変形形態においては、この増殖ステップの発酵温度を、最適発酵温度に対して約１〜５℃、好ましくは約３℃上昇させる。最適温度は通常約２８℃である。特に好ましい実施形態によれば、増殖ステップの発酵温度は約３１℃である。
【００７８】
したがって、特定の実施形態によれば、クロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類の従属栄養培養は、最適温度（約２８℃）よりも高い温度でリン酸塩の欠乏下に従属栄養培養を行うステップを含む。この実施形態により、増殖速度をさらに低下させ、したがって、タンパク質含有量をさらに増加させることが可能になる。
【００７９】
以下に例示するように、発酵温度を上昇させることにより、発酵槽の熱交換器の冷却能力を高めることが可能になる。すなわち、発酵温度を２８℃から３１℃に上昇させることにより、発酵槽の熱交換器の冷却能力を倍増することが可能になる。
【００８０】
さらに、窒素以外の栄養素の利用性を制限することによって、クロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類の増殖を制限するように向けられたこれらの条件は、タンパク質が富化されることのみならず、そのアルギニンおよびグルタミン酸含有量がかなり増加することにも反映される。
【００８１】
任意の理論に束縛されるものではないが、本出願人企業は、これらの特定の微細藻類の増殖を制限することにより、全体の代謝活性（増殖速度に影響を与える）の減速とＣおよびＮに富む分子（アミノ酸型）の蓄積に反映され、その生合成経路は栄養欠乏に最も「耐える」と考えている。
【００８２】
クロレラ・プロトセコイデスにおいて、これに関与している分子はアルギニンおよびグルタミン酸である。
【００８３】
より詳細には、以下に例示するように、クロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類の従属栄養培養は、リン酸塩欠乏下で培養するステップを含み、それによって増殖速度が制限され、およびその結果としてタンパク質含有量が増加することになり、したがってアミノ酸全体の４０％を超えるグルタミン酸およびアルギニンを生成する。
【００８４】
したがって、本発明はまた、従属栄養培養された微細藻類、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類のグルタミン酸および／またはアルギニン含有量を富化するためのプロセスであって、微細藻類、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス種の微細藻類をリン酸塩欠乏下で培養するステップを含む従属栄養培養を含み、この培養の結果として、アミノ酸全体の４０％を超えるグルタミン酸およびアルギニンを含む微細藻類バイオマスが調製される、プロセスにも関する。好ましくは、このプロセスにより、グルタミン酸およびアルギニンの含有量を富化することも可能である。特に、このプロセスにより、タンパク質含有量を富化することも可能である。したがって、生成したバイオマスは、好ましくは、タンパク質を乾燥物質として６０重量％超、６５重量％超または７０重量％超含む。一実施形態において、発酵温度は約２８℃である。他の実施形態において、発酵温度を最適発酵温度に対して１、２、３、４または５℃上昇させる。好ましくは約３１℃である。
【００８５】
本発明は、この富化プロセスにより製造されたバイオマスに関する。本発明はまた、このプロセスにより得ることができるバイオマスにも関する。上記バイオマスは、乾燥重量でタンパク質を６０％超、６５％超または７０％超含み、かつ全アミノ酸の４０％超のグルタミン酸およびアルギニンを含む。特に、バイオマスは、全アミノ酸の４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％またはそれを超えるグルタミン酸およびアルギニンを含む。より詳細には、本発明のバイオマスは、全アミノ酸の２０％、２５％、３０％または３５％またはそれを超えるグルタミン酸を含むことができる。本発明のバイオマスは、全アミノ酸の２０％、２５％または３０％またはそれを超えるアルギニンを含むことができる。本発明のバイオマスは、クロレラ・プロトセコイデス（のバイオマスである。
【００８６】
特定の一実施形態においては、増加しているのは、グルタミン酸および／またはアルギニンに富むタンパク質、好ましくはグルタミン酸およびアルギニンである。
【００８７】
本発明を例示する以下の非限定的な実施例から、本発明がより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００８８】
実施例１：栄養培地の供給を制限しない「逐次バッチ」方式の発酵によるクロレラ・ソロキニアナの生産
藻株としてクロレラ・ソロキニアナ（ＵＴＥＸ１６６３株：米国テキサス大学オースティン校藻類カルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡ））を使用した。
【００８９】
前培養：
−  ２Ｌの三角フラスコにおける培地６００ｍＬ、
−  培地組成（以下の表１）。
【００９０】
【表１】
2017502680.tif 000002
【００９１】
滅菌を行う前に、８ＮのＮａＯＨを添加することによってｐＨを７に調整した。
【００９２】
以下の条件で培養を行う：
−  時間：７２時間、
−  温度：２８℃、
−  振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ社製Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ培養器）。
【００９３】
次いで、前培養物を３０Ｌのザルトリウス型発酵槽に移す。
【００９４】
バイオマス生産のための培養：
培地は、尿素をＮＨ４Ｃｌで置換したことを除いて前培養と同じである。
【００９５】
【表２】
2017502680.tif 000003
【００９６】
接種後の発酵槽の初発液量（Ｖｉ）を１３．５Ｌに調整する。
【００９７】
それを最終的に１６〜２０Ｌにする。
【００９８】
発酵を実施するためのパラメータは以下の通りである。
【００９９】
【表３】
2017502680.tif 000004
【０１００】
最初に添加したグルコースが全て消費されたら、発酵槽内のグルコース含有量が２０ｇ／Ｌとなるように、初発培地と同一の培地（この培地は、グルコースを５００ｇ／Ｌ含む濃縮液形態にあり、他の元素を、初発培地に含まれるグルコースに対する比率と同じ比率で含み、消泡剤を含まない）を添加する。
【０１０１】
同様に、残存グルコース濃度がゼロになるたびに、同じ添加をさらに２回行う。
【０１０２】
過度の起泡を抑えるために、消泡剤であるＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７を必要に応じて添加する。
【０１０３】
結果：
培養から４６時間後、タンパク質含有量（Ｎ  ６．２５として評価される）が３６．２％であるバイオマス３８ｇ／Ｌが得られる。
【０１０４】
実施例２：グルコース供給を制限したフェドバッチ方式の発酵によるクロレラ・ソロキニアナの生産
この例においては、最初に添加したグルコースが消費されたら全培地の供給（フェドバッチ方式）を開始する。他の発酵パラメータは変更しない。
【０１０５】
グルコースを５００ｇ／Ｌ含む濃縮液を連続的に供給する。供給速度を、藻株が到達し得る消費速度を下回るようにし、それによって、培地中の残存グルコース濃度がゼロに維持されるように、すなわち藻株の増殖がグルコースの利用により制限されるようにする（グルコース制限条件）。
【０１０６】
この速度は時間と共に指数関数的に増加される。供給速度を算出するための式は係数μ（藻株が供給されたグルコースを全て消費した場合に取ることができる増殖速度に相当する）を用いて表される。
Ｓ＝Ｓｏ×ｅｘｐ（μ・ｔ）
Ｓ＝グルコース供給速度（ｇ／ｈ）
Ｓｏ＝初期グルコース供給速度（回分操作終了時に存在するバイオマスに応じて決定される。本発明者らの条件下では１２ｇ／ｈ。）
μ＝速度加速係数。（栄養制限を行わない場合の藻株の増殖速度である０．１１ｈ−１よりも小さくすることが必要である）
ｔ＝フェドバッチ時間（ｈ）
【０１０７】
可能であれば、塩はグルコースとは別に、またはグルコースと混合して連続的に供給する。しかしながら、塩を数回に分けて連続して供給することもできる。
【０１０８】
以下の表４に、グルコース１００ｇ当たりの必要な塩を示す。
【０１０９】
【表４】
2017502680.tif 000005
【０１１０】
グルコース以外の元素の濃度は、藻株の栄養要求よりも過剰になるように決定した。
【０１１１】
過度の起泡を抑えるために、消泡剤であるＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７を必要に応じて添加する。
【０１１２】
結果：フェドバッチ方式におけるグルコース供給速度の影響
フェドバッチ方式を用いて様々なグルコース供給速度で試験を行った。適用したμに基づきこれらを評価する。Ｎ  ６．２５として表される全窒素を測定することにより、得られたバイオマスのタンパク質含有量を評価する。
【０１１３】
【表５】
2017502680.tif 000006
【０１１４】
これらの結果から、グルコース制限条件下に操作を行うことにより、タンパク質含有量を増加させることが可能であることが分かる。
【０１１５】
具体的には、μを０．０９という高い値とした場合であっても、タンパク質含有量は、実施例１に記載した非制限下で得られた値（３６．２％）よりも高くなる（３９．３％）ことが認められる。
【０１１６】
グルコース代謝制限を厳しくすると、タンパク質含有量がさらに高くなる。
【０１１７】
これらの試験条件下で５０％を超えるタンパク質含有量に到達させるためには、藻株を０．０６ｈ−１未満のμで増殖させることが必要である。
【０１１８】
この条件は、生産性の低下に繋がる（試験３で１．３５ｇ／Ｌ／ｈであったものが０．５６ｇ／Ｌ／ｈとなる）ことに留意されたい。
【０１１９】
実施例３：グルコース供給を制限したケモスタット方式の連続発酵によるクロレラ・ソロキニアナの生産
この実施例においては、発酵槽として２Ｌのザルトリウス社製バイオスタット  Ｂ発酵槽を使用する。
【０１２０】
液量を１０分の１にしたことを除いて、実施例２と同様にして発酵を行う。接種量を６０ｍＬとし、初発液量を１．３５Ｌとする。
【０１２１】
実施例２と同じ原則に従い、培養液の連続供給を開始する。この場合、塩は供給用マニホールド内でグルコースと混合する。供給速度は、μを０．０６ｈ−１とすることにより、実施例２に記載したのと同じ指数関数式に従い増加させる。
【０１２２】
ケモスタット
液量が１．６Ｌに到達したら、すなわちバイオマス濃度が約５０ｇ／Ｌに到達したら、ケモスタット方式の連続運転を実施する。
【０１２３】
１．発酵槽に、以下の組成を有する、グルコース１００ｇ／Ｌを含む栄養培地溶液を９６ｍＬ／ｈの速度で連続的に供給する。
【０１２４】
【表６】
2017502680.tif 000007
【０１２５】
グルコース以外の元素の濃度は、藻株の栄養要求よりも過剰になるように決定した。
【０１２６】
２．培養液の液量が１．６Ｌに維持されるように、培地をポンプに連結されたディップチューブを介して発酵槽から連続的に抜き取る。
【０１２７】
このようにして、１時間当たり０．０６（６％）の割合で新しい培地に交換する。この交換速度は希釈率（Ｄ）と称される。
【０１２８】
藻株の増殖はグルコース供給により制限されているため、ケモスタット培養の原則に従い、藻株の増殖速度（μ）と同じ値になる。
Ｄ＝μ＝０．０６ｈ−１
【０１２９】
結果
ケモスタット運転開始から９７時間後、バイオマス濃度は４８ｇ／Ｌ±２ｇ／Ｌとなり、タンパク質含有量は５３±２％となる。
【０１３０】
この運転方式により、グルコースを制限して増殖速度を抑えることによって、高タンパク質含有量のバイオマスを得ることが可能になり、それと同時に、バイオマス濃度を高くすることによって、２．９ｇ／Ｌ／ｈ程度の非常に高い生産性が確保される。
【０１３１】
実施例４：リン酸塩供給制限下または非制限下におけるバッチ方式の発酵によるクロレラ・プロトセコイデスの生産
藻株としてクロレラ・プロトセコイデス（ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ株  −  英国スコットランドの英国藻類原生動物カルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ））を使用する。
【０１３２】
前培養：
○５００ｍＬの三角フラスコにおける培地１５０ｍＬ、
○培地組成：グルコース４０ｇ／Ｌ＋酵母エキス１０ｇ／Ｌ。
【０１３３】
以下の条件で培養を行う：時間：７２時間、温度：２８℃、振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎ
ｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター）。
【０１３４】
次いで、前培養物を２Ｌのザルトリウス社製バイオスタット  Ｂ発酵槽に移す。
【０１３５】
バイオマス生産用培地：
培地組成を以下の通りである（ｇ／Ｌ）。
【０１３６】
【表７】
2017502680.tif 000008
【０１３７】
リン酸塩の供給量を試験１においては過剰になるように、試験２および３においては制限されるように算出する。
【０１３８】
過度の起泡を抑えるために、消泡剤であるＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７を必要に応じて添加する。
【０１３９】
接種後の発酵槽の初発液量（Ｖｉ）を１Ｌに調整する。
【０１４０】
発酵を実施するためのパラメータは、以下の通りである。
【０１４１】
【表８】
2017502680.tif 000009
【０１４２】
結果：
【０１４３】
【表９】
2017502680.tif 000010
【０１４４】
累積μ値は接種後のバイオマスの増殖速度に相当する。
【０１４５】
窒素含有量を測定することにより、タンパク質含有量を求める（Ｎ×６．２５）。
【０１４６】
これらの結果から、リン酸塩の供給を制限することにより（発酵終了時に残存リン酸塩が存在しないことにより確認）、前述の実施例におけるグルコース制限と同様に増殖する速度が制限され（増殖速度により測定）、タンパク質含有量が増加して５０％を大幅に超える値に到達することが分かる。
【０１４７】
実施例５：リン酸塩を制限した合成培地を用いたフェドバッチ方式の発酵による２８℃におけるクロレラ・プロトセコイデスの生産
バイオマスを高濃度で得るために、培養（フェドバッチ）時にグルコースを供給することによって、グルコースによる増殖阻害を回避する。
【０１４８】
塩、特にリン酸塩の供給は、発酵（回分方式）開始時は従来法で行う。
【０１４９】
培地は酵母エキスを含まないものとする。
【０１５０】
実施例４と同様に、藻株としてクロレラ・プロトセコイデス（ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ株
−  英国スコットランドの英国藻類原生動物カルチャーコレクション）を使用する。
【０１５１】
前培養：
−  ２Ｌの三角フラスコにおける培地５００ｍＬ、
−  培地組成。
【０１５２】
【表１０】
2017502680.tif 000011
【０１５３】
以下の条件で培養を行う：
−  時間：７２時間、
−  温度：２８℃、
−  振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター）。
【０１５４】
次いで、前培養物を３０Ｌのザルトリウス型発酵槽に移す。
【０１５５】
バイオマス生産用培地：
培地は以下の通りである。
【０１５６】
【表１１】
2017502680.tif 000012
【０１５７】
接種後の発酵槽の初発液量（Ｖｉ）を１７Ｌに調整する。
【０１５８】
それを最終液量の約２０〜２５Ｌにする。
【０１５９】
発酵を実施するためのパラメータは、以下の通りである。
【０１６０】
【表１２】
2017502680.tif 000013
【０１６１】
残存グルコース濃度が１０ｇ／Ｌを下回ったら、発酵槽内のグルコース含有量が０〜２０ｇ／Ｌに維持されるように、グルコースを約８００ｇ／Ｌ含む濃縮液形態で投入する。
【０１６２】
結果
結果を時間およびＣ／Ｐ比（供給されたリン（リン酸塩による）の量に対する消費された炭素（グルコース由来）の量を表す）に応じて示す。
【０１６３】
【表１３】
2017502680.tif 000014
【０１６４】
これらの結果から、供給されたリン酸塩が全て消費され、Ｃ／Ｐ比の値が６０を超えた時点から発酵終了時までにタンパク質含有量が大幅に増加していることが分かる。
【０１６５】
エネルギーに関して言えば、２５℃の水を供給するこの発酵槽の交換器の熱交換に対する冷却能力は１．７ｋＷ／ｍ2である。
【０１６６】
実施例６：リン酸塩を制限した合成培地を用いたフェドバッチ方式の発酵による３１℃におけるクロレラ・プロトセコイデスの生産
この試験は温度を（２８℃ではなく）３１℃に上昇させることを除いて、前述の実施例と同一条件で行う。
【０１６７】
結果
結果を時間およびＣ／Ｐ比（供給されたリンの量（リン酸塩による）に対する消費された炭素（グルコース由来）の量を表す）に応じて示す。
【０１６８】
累積μは接種後のバイオマスの増殖速度に相当する。
【０１６９】
窒素含有量を測定することによりタンパク質含有量を求める（Ｎ×６．２５）。
【０１７０】
【表１４】
2017502680.tif 000015
【０１７１】
これらの結果は、まず２８℃で得られた結果の正当性を裏付けるものである。さらに、温度を３１℃まで昇温することにより、増殖速度をさらに低下させると共にタンパク質含
有量を増加させる（約５％）ことが可能になる。
【０１７２】
さらに、温度を２８℃から３１℃に上昇させることにより、交換器および発酵液に供給される水の温度差が大きくなるため、発酵槽の交換器の効率を大幅に向上させることが可能になる。交換器の冷却能力が１．７ｋＷ／ｍ2から３．５ｋＷ／ｍ2に上昇する。
【０１７３】
実施例７：リン酸塩欠乏条件下で生産したクロレラ・プロトセコイデスバイオマスのアミノ酸組成
生成した微細藻類バイオマスの全アミノ酸組成を、ＩＳＯ規格１３９０３：２００５に詳述されている方法に従い測定する。
【０１７４】
以下のバイオマスを分析する：
バッチ（Ａ）：実施例６の条件に従い生産した、タンパク質含有量が６０％〜７０％（Ｎ６×２５として計算）であるクロレラ・プロトセコイデスのバイオマス。
バッチ（Ｂ）：実施例５の条件に従い生産した、タンパク質含有量が４５％〜６０％（Ｎ６×２５として計算）であるクロレラ・プロトセコイデスのバイオマス。
バッチ（Ｃ）：実施例４の試験１に従い調製した、タンパク質含有量が４５％〜５０％（Ｎ６×２５として計算）であるクロレラ・プロトセコイデスのバイオマス。
バッチ（Ｄ）：実施例３の条件に従い生産した、タンパク質含有量が５０％〜６０％（Ｎ６×２５として計算）であるクロレラ・ソロキニアナのバイオマス。
【０１７５】
以下の表１５に、バイオマスの全アミノ酸組成を相対比率で示す。
【０１７６】
【表１５】
2017502680.tif 000016
【０１７７】
得られた結果から、クロレラ・プロトセコイデスをそのタンパク質含有量を富化する条件下で培養した場合、クロレラ・プロトセコイデスバイオマスの全アミノ酸組成を基準としてアミノ酸の４０％超（相対値）がグルタミン酸およびアルギニンになることが明らか
である（標準的な培養条件下では３０％以下：バッチＣ参照）。
【０１７８】
さらにこの結果は、クロレラ・プロトセコイデスのみに関して得られるものであり、クロレラ・ソロキニアナと比較すると、この微細藻類の特定の代謝の特徴を示す傾向にある。具体的には、クロレラ・ソロキニアナ（バッチＤ）はタンパク質含有量が高いが、グルタミン酸およびアルギニンの産生量は２０％以下である。
【国際調査報告】
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2017502680.tif 000019
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