(57)【要約】抗血管新生治療剤を、対象に投与するかどうかを選択する方法は、該対象由来のサンプルにおいて、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価する工程を含み、該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、抗血管新生治療剤は禁忌である。関連する予後についての方法および処置方法もまた提供する。本発明は、特に、卵巣がんおよび結腸直腸がんに適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に抗血管新生治療剤を投与するかどうかを選択する方法であって:
対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定すること;
１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することを含み、
対象がバイオマーカーサインについて陽性である場合、抗血管新生治療剤が禁忌である、方法。
【請求項２】
サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することが:
１個以上のバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること;
該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
該サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象が、がんに罹患している、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
がんが、卵巣がんまたは結腸直腸がんである、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
対象が、化学療法剤による処置を受けているか、または、受けたことがある、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
がんを処置する方法であって、対象に化学療法剤を投与すること、および、抗血管新生治療剤を投与しないことを含み、該対象が、請求項１〜６のいずれか記載の方法に基づいて処置のために選択され、該対象がバイオマーカーサインについて陽性である、方法。
【請求項８】
がんを処置する方法であって、対象に化学療法剤を投与すること、および、抗血管新生治療剤を投与しないことを含み、
対象が、
対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定すること;
バイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することにより、処置のために選択され、
対象がバイオマーカーサインについて陽性である場合に、該対象が処置のために選択される、方法。
【請求項９】
対象におけるがんを処置するのに使用するための化学療法剤であって、
対象が、処置のために、請求項１〜８のいずれか記載の方法に基づいて選択され、対象がバイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象を抗血管新生治療剤で処置しない、化学療法剤。
【請求項１０】
対象におけるがんの処置に使用するための化学療法剤であって、
対象が、
対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定すること;
バイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか、または陰性であるかを評価すること
により処置のために選択され、
サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象を処置のために選択し、該対象を抗血管新生治療剤で処置しない、化学療法剤。
【請求項１１】
がんを処置する方法であって、対象に化学療法剤を投与することを含み、
表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルにより決定されるバイオマーカーサインについて対象が陽性であり、抗血管新生治療剤が投与されない、方法。
【請求項１２】
対象におけるがんの処置に使用するための化学療法剤であって、
対象が、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルにより定義されるバイオマーカーサインについて陽性であり、該対象が抗血管新生剤で処置されない、化学療法剤。
【請求項１３】
化学療法剤が、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せを含む、請求項６〜８および１１のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項１４】
化学療法剤が、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せを含む、請求項６〜８および１１のいずれか記載の方法、または請求項９、１０および１２のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項１５】
化学療法剤がカルボプラチンおよび/またはパクリタキセルを含む、請求項６〜８および１１のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項１６】
抗血管新生治療剤が、ＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤または免疫調節剤である、請求項１〜８、１１および１３〜１５のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜１５のいずれか記載の使用のための化学療法剤。
【請求項１７】
ＶＥＧＦ経路標的治療剤が、ベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、ＩＭＣ−１１２１Ｂ(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、ＢＩＢＦ １１２０(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アキシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９、ＴＫＩ−２５８またはその組合せから選択される、請求項１６記載の方法、または使用のための化学療法剤。
【請求項１８】
アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤が、ＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツズマブ (ハーセプチン)またはその組合せから選択される、請求項１６記載の方法、または使用のための化学療法剤。
【請求項１９】
内在性血管新生阻害剤が、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ツムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファまたはその組合せから選択される、請求項１６記載の方法、または使用のための化学療法剤。
【請求項２０】
免疫調節剤が、サリドマイドおよびレナリドミドから選択される、請求項１６記載の方法または、使用のための化学療法剤。
【請求項２１】
ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブである、請求項１６記載の方法または、使用のための化学療法剤。
【請求項２２】
バイオマーカーが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項１〜８、１１および１３〜２１のいずれか記載の方法、または請求項９、１０および１２〜２１のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２３】
該バイオマーカーが、表２に記載のバイオマーカーを含む、請求項１〜８、１１および１３〜２１のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜２１のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２４】
サンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるか、または陰性であるかを評価することが、
１個以上のバイオマーカーについてのサンプル発現スコアを決定すること;
サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、
該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である、請求項７〜８、１１および１３〜２３のいずれか記載の方法、または請求項９、１０および１２〜２３のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２５】
対象が、がんに罹患している、請求項７〜８、１１および１３〜２４のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜２４のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２６】
がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんであってよい卵巣がんまたは、結腸直腸がんである、請求項２５記載の方法または、使用のための化学療法剤。
【請求項２７】
発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が、表２に定義される、請求項２または２４に記載の方法、または請求項２４に記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２８】
発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に定義するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、請求項２または２４に記載の方法、または請求項２４に記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項２９】
バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、請求項１〜８、１１および１３〜２８のいずれか記載の方法、または請求項９、１０および１２〜２８のいずれか記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項３０】
バイオマーカーパネルがＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、請求項１〜８、１１および１３〜２８のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜２８のいずれか記載の使用のための化学療法剤。
【請求項３１】
がんに罹患している対象の臨床予後を決定する方法であって:
対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定すること;
１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価すること
を含み、対象がバイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象は良好な予後を有する、方法。
【請求項３２】
サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか、または陰性であるかを評価することが:
バイオマーカーについてのサンプル発現スコアを決定すること;
該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
該サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、
該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
良好な予後が、バイオマーカーサインについて陰性であるサンプル（閾値スコアを下回るサンプル発現スコアを有する）と比較して、無増悪生存率または全生存率の上昇を示す、請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
がんが、卵巣がんまたは結腸直腸がんである、請求項３１〜３３のいずれか記載の方法。
【請求項３５】
卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
対象が、化学療法処置を受けている、受けたことがある、および/または受ける予定があり、かつ/または抗血管新生治療剤による処置を受ける予定がない、請求項３１〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
化学療法処置が、パクリタキセルおよびカルボプラチンの投与を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
バイオマーカーが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項３１〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
バイオマーカーが、表２に記載のバイオマーカーを含む、請求項３１〜４０のいずれか記載の方法。
【請求項４２】
発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が、表２に定義される、請求項３２〜４１のいずれか記載の方法。
【請求項４３】
発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に定義するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、請求項３２〜４１のいずれか記載の方法。
【請求項４４】
バイオマーカーが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、請求項３１〜４３のいずれか記載の方法。
【請求項４５】
バイオマーカーが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、請求項３１〜４４のいずれか記載の方法。
【請求項４６】
ベバシズマブを対象に投与するかどうかを選択する方法であって:
プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いた処置を受けているか、受けたことがあるか、および/または受ける予定がある、卵巣がんに罹患している対象より得た試験サンプルにおいて；
１個、２個、またはそれより多い、最大で全ての、表２または３から選択されるバイオマーカーの発現レベルを評価すること；
１個、２個またはそれより多くのバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価すること；
サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかどうかに基づいて、処置を選択すること、を含み、
該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、ベバシズマブが禁忌である、方法。
【請求項４７】
サンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することが：
１個、２個またはそれより多くのバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること;
サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、
該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
卵巣がんが、漿液性卵巣がんを含む、請求項４６または４７記載の方法。
【請求項４９】
漿液性卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ベバシズマブが禁忌である場合、該患者を、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤で処置する、請求項４６〜４９のいずれか記載の方法。
【請求項５１】
サンプル発現スコアが閾値スコアを下回る場合、該患者を、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を、ベバシズマブとともに用いて処置する、請求項４６〜４９のいずれか記載の方法。
【請求項５２】
プラチナベースの化学療法剤がカルボプラチンを含む、請求項４６〜５１のいずれか記載の方法。
【請求項５３】
有糸分裂阻害剤がタキサンを含み、パクリタキセルを含んでいてよい、請求項４６〜５２のいずれか記載の方法。
【請求項５４】
バイオマーカーが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項４６〜５３のいずれか記載の方法。
【請求項５５】
バイオマーカーが、表２に記載のバイオマーカーを含む、請求項４６〜５３のいずれか記載の方法。
【請求項５６】
該発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が表２に定義される、請求項４７〜５５のいずれか記載の方法。
【請求項５７】
該発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に定義するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、請求項４７〜５５のいずれか記載の方法。
【請求項５８】
バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、請求項４６〜５７のいずれか記載の方法。
【請求項５９】
バイオマーカーパネルが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、請求項４６〜５８のいずれか記載の方法。
【請求項６０】
対象の臨床予後を決定する方法であって:
ａ．プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いて処置されている、処置されたことがある、および/または処置される予定がある、卵巣がんまたは結腸直腸がんに罹患している対象より得た試験サンプルにおいて;
ｂ．表２または表３から選択される１個以上、最大で全てのバイオマーカーの発現レベルを測定すること;
ｃ．１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することを含み、
該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象が良好な予後を有する、方法。
【請求項６１】
サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することが：
ａ．１個以上のバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること;
ｂ．サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
ｃ．サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
卵巣がんが、漿液性卵巣がんを含む、請求項６０または６１記載の方法。
【請求項６３】
漿液性卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
患者が良好な予後を有する場合、ベバシズマブを用いた処置が禁忌である、請求項６０〜６３のいずれか記載の方法。
【請求項６５】
サンプル発現スコアが、閾値スコアを下回る場合、該患者を、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を、ベバシズマブとともに用いて処置する、請求項６０〜６３のいずれか記載の方法。
【請求項６６】
プラチナベースの化学療法剤がカルボプラチンを含む、請求項６０〜６５のいずれか記載の方法。
【請求項６７】
有糸分裂阻害剤が、タキサンを含み、パクリタキセルを含んでいてよい、請求項６０〜６６のいずれか記載の方法。
【請求項６８】
バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項６０〜６７のいずれか記載の方法。
【請求項６９】
該バイオマーカーパネルが表２に記載のバイオマーカーを含む、請求項６０〜６７のいずれか記載の方法。
【請求項７０】
発現スコアを、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が表２に定義される、請求項６１〜６９のいずれか記載の方法。
【請求項７１】
発現スコアを各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に定義するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、請求項６１〜６９のいずれか記載の方法。
【請求項７２】
バイオマーカーが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、請求項６０〜７１のいずれか記載の方法。
【請求項７３】
バイオマーカーが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、請求項６０〜７２のいずれか記載の方法。
【請求項７４】
良好な予後が、バイオマーカーサインについて陰性であるサンプル（閾値スコアを下回るサンプル発現スコアを有する）と比較して、無増悪生存率または全生存率の上昇を示す、請求項６０〜７３のいずれか記載の方法。
【請求項７５】
対象由来のサンプルにおいて、表２または表３から選択される２つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む、請求項１〜８、１１および１３〜７４のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜３０のいずれか記載の使用のための化学療法剤。
【請求項７６】
対象由来のサンプルにおいて、表２または表３から選択される５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む、請求項１〜８、１１および１３〜７４のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜３０のいずれか記載の使用のための化学療法剤。
【請求項７７】
サンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することが、分類ツリーまたはランダムフォレストを用いることを含む、請求項１〜８、１１および１３〜７６のいずれか記載の方法、または、請求項９、１０および１２〜３０のいずれかに記載の、使用のための化学療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の解剖学的な部位からのがんの予後の提供または直接的な処置に有用な、分子診断試験に関する。本発明は、遺伝子発現レベルからの遺伝子分類モデルの派生を含む。１つの適用は、特定の治療法、例えば抗血管新生療法を、標準的ながん治療法を受けている患者に行うべきかどうかの選択である。他の適用は、がん患者の、臨床的な予後が良好であるか、または不良であるかの階層化である。本発明は、治療選択の指針となり得ると同時に、新規治療剤の臨床試験評価中の強化戦略のための患者群の選択の指針となり得る試験を提供する。本発明は、卵巣がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肺がんおよび神経膠芽腫を含む、特定のがんの予後指標として使用できる。血管新生サブタイプは、新鮮／凍結(ＦＦ)またはホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)患者サンプルから同定できる。
【背景技術】
【０００２】
医薬業界は、継続して、従来投与されている薬剤よりも有効である、より特異的である、または副作用がより少ない新規の処置の選択肢を追求している。薬物療法の代替法が常に開発されているのは、ヒト人口における遺伝的な変動により、多くの確立された薬物の有効性に実質的な差異が生じるためである。そのため、広範囲の薬物療法の選択肢が現在利用可能になっているにもかかわらず、患者が応答することのできない場合におけるさらなる治療法が常に必要とされている。
【０００３】
従来、医師により用いられている処置パラダイムは、疾患の処置に成功する割合が最も高い可能性がある第一選択治療を処方することであった。その後、第一治療が有効でない場合に、代替となる薬物療法を処方する。このパラダイムは、特定の疾患については、明らかに、最適の処置方法ではない。例えば、がんのような疾患では、第一治療が最も重要であることがしばしばであり、治療が成功する最適の機会となるため、特定の患者の疾患に対して最も効果的となる最初の薬物を選択する必要性が高まっている。
【０００４】
卵巣がんは、西洋諸国において、全ての婦人科がんの中で一番の死因となっている。この高い死亡率は、ほとんどの患者において、進行したステージで診断が行われることによる。上皮卵巣がん（ＥＯＣ）は、卵巣悪性がんの９０％を構成し、漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、移行性、混合性および未分化サブタイプを含む明確な組織学的カテゴリーに分類される。これらの異なる組織像は、異なる病因から発生するとの根拠が増えている。上皮性卵巣がんの分類に使用する方法について最近進歩があった(McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis”, PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32)。この結果の一つは、以前は類内膜として分類されていたであろう多くの腫瘍が現在では漿液性と分類されることである。
【０００５】
卵巣がんの現在の標準的な処置は、減量手術および標準的なプラチナ/タキサンベースの細胞毒性化学療法である。しかしながら、全ての患者がこれに応答するわけではなく、応答した内で約７０％が再発を経験する。組織学的分類または分子分類に基づく卵巣がんのための特異的標的治療もなお上市に至っていない。他のタイプのがんと同様、適当な細胞毒性化学療法剤を選択する正確な方法はまだない。
【０００６】
マイクロアレイおよび分子ゲノミクスの出現は、疾患の診断能力および予後分類に顕著な影響を与える可能性を有しており、個々の患者の規定の治療レジメンに対する応答の予測の一助となり得る。マイクロアレイは、大量の遺伝情報の解析を提供し、それにより個々の遺伝的フィンガープリントを提供する。この技術が最終的にオーダーメイドの薬物処置レジメンのための必要なツールを提供するであろうとの大きな期待がある。
【０００７】
現在、医療従事者は、化学療法剤が有益であろうがん患者を同定する助けとなる手段をほとんど持たない。最適な第一選択薬物の同定は、どの薬物処置が特定のがんの生理学に最も有効であるかを正確に予測できる方法が利用できないため、困難である。この欠陥が、相対的に低い単剤応答率と、がん罹患率および死亡者数の増加という結果をもたらす。さらに、患者は、しばしば、不必要に無効かつ有毒性の薬物治療を受けることになる。
【０００８】
血管新生は、腫瘍における新血管系形成の鍵となる要素であり、腫瘍形成および転移に必須である。したがって、治療介入の鍵となる領域であり、予後不良および生存低下と相関している。これにより、血管新生と関係する過程および経路を標的とする多くの薬物の開発が促進されており、Genentech/Rocheにより製造され、最初にＦＤＡにより承認された市場のリーダーである抗血管新生剤ベバシズマブ(アバスチン)もこれに含まれる。
【０００９】
ベバシズマブを含む処置レジメンは広い臨床的活性を有することが証明されている１〜１０。しかしながら、全生存率(ＯＳ)における有益性は、細胞毒性化学療法にベバシズマブを追加した後の殆どのがんで示されていない８、１２〜１３。これにより、かなりの割合の腫瘍が、ＶＥＧＦ遮断(ベバシズマブの作用機序)に対して初めから耐性であるか、または急速に耐性を獲得することが示唆される。実際、卵巣がん患者の２１％、腎がん患者の１０％および直腸がん患者の３３％が、ベバシズマブ単剤療法を受けたときに部分退縮を示し、ベバシズマブが患者の小サブグループで活性であり得ることが示唆されるが、このような部分的有効性は、任意抽出患者では有意に至らない１５〜１８。したがって、ベバシズマブに対する応答のバイオマーカーの使用は、処置成績の評価を改善し、それにより、ベバシズマブ処置から最良の臨床的利益を受けるであろう患者サブグループの同定を可能にする。これは、臨床的に有益なバイオマーカーが存在しないために、ベバシズマブの使用が妨げられている転移乳がんの場合に特に当てはまる。これまで、ベバシズマブ有効性を予測するためのこのようなバイオマーカーは、臨床的に検証されていない。高血圧およびＶＥＧＦ多型が、従来可能性を示す唯一のバイオマーカーであったが、臨床の現場におけるその使用については、重要な問題が残ったままである。
【００１０】
抗血管新生治療への他の取り組みは、ＶＥＧＦ経路の選択的標的化ではなく、複数血管新生経路の同時標的化である。理論上、多標的抗血管新生剤は、ベバシズマブのような薬剤よりも血管新生をより完全に阻害し、それにより、より大きな治療利益を生じ得るはずである。ある腫瘍において、血管新生は、疾患の初期段階ではＶＥＧＦしか必要としないが、疾患が進行するに連れて、さらなる血管新生経路により促進されるとの仮説が立てられている。したがって、複数経路を標的化することにより、ＶＥＧＦ阻害に対する耐性に至る代償性回避機構に対抗することが可能であり得る。
【００１１】
他のタイプのがんについては、抗血管新生治療的療法または単剤抗血管新生治療を用いる標準治療に応答する、または応答しない患者を選択する正確な方法はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis”, PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、標準治療と組み合わせた、または単剤治療としての抗血管新生治療剤に対する予測される応答に基づいた患者の階層化を促進する分子診断試験が必要とされている。これは、代替療法を受けるべき患者の迅速な同定を可能にする。このような分子診断試験は、十分な精度で種々のがんタイプの治療応答性を予測するはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書中において「非血管新生」または「免疫サブタイプ」と称する、免疫応答に関連する分子シグナル伝達の上方制御および、血管新生および脈管構造の発達と関係する分子シグナル伝達の下方制御を伴うがんのサブタイプを同定する方法であって、がんにおいて発現される１個以上のバイオマーカーまたはバイオマーカーのコレクションを使用する方法を、本明細書中に開示する。バイオマーカーのコレクションは、発現サインにより定義してよく、該発現サインは、バイオマーカーのコレクションの測定された発現値に累積スコアを割り当てるために使用する。異なる局面において、バイオマーカーおよび発現サインは、ｍＲＮＡまたは蛋白質発現を定量できるマイクロアレイ、次世代シークエンス（ＮＧＳ）、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたは他の科学技術のような当技術分野で公知の方法を使用して実施し得る単一パラメータまたは多重パラメータ予測的試験の基礎を形成し得る。
【００１５】
さらに、本明細書に記載のがんのサブタイプは、多くのタイプのがんに共通するものであり、単一のタイプのがんに限定されるものではない。したがって、本発明の発現サインは、単一のタイプのがんに限定されるものではない。特定の例示的な態様において、非血管新生発現サインは、表１に記載のバイオマーカーから選択される２つ以上のバイオマーカーを含む。他の例示的な態様において、非血管新生発現サインは、表２または３に記載するバイオマーカーを２つ以上含む。特定の他の態様において、発現サインは、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２ＰＡ、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３およびＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む。他の例示的態様において、非血管新生サインは、表２に挙げるバイオマーカーおよびＰＬＳ分類指標を使用して決定された、それらの対応する重みを含む。他の例示的な態様において、非血管新生サインは、表３に記載のバイオマーカーおよび、それらの、決定関数内の対応するランクを含む。
【００１６】
一の局面において、本発明は、抗血管新生治療剤を対象に投与するかどうかを選択する方法であって：
対象由来のサンプルにおける、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定すること；
かかる１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することを含み、
該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、抗血管新生治療剤が禁忌である、方法を提供する。特定の態様において、バイオマーカーサインについてサンプルが陽性であるか陰性であるかを評価することは：１個以上のバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること；該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること；および、該サンプル発現スコアが該閾値発現スコアを上回るか、または同等であるかを決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルは、該バイオマーカーサインについて陽性である。さらなる態様において、該対象は、化学療法剤による処置を受けているか、または受けたことがある。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、対象に化学療法剤を投与すること、および、抗血管新生治療剤を投与しないことを含み、該対象が、本明細書に記載の方法に基づいて、処置のために選択され、該対象がバイオマーカーサインにおいて陽性である、方法を提供する。本発明のさらなる局面によって、がんを処置する方法であって：対象に、化学療法剤を投与すること、および、抗血管新生治療剤を投与しないことを含み、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの、対象由来のサンプルにおける発現レベルを測定すること；該バイオマーカーの発現レベルから、該対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるか評価することにより、該対象が処置のために選択され、該サンプルが該バイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象が処置のために選択される、方法を提供する。なおさらなる局面において、本発明は、対象におけるがんを処置するのに用いるための化学療法剤に関し、該対象は、本明細書に記載の方法に基づいて、処置のために選択され、該バイオマーカーサインについて陽性であり、該対象が抗血管新生治療剤で処置されない。本発明はまた、対象におけるがんの処置に用いるための化学療法剤に関し、ここで、対象は、対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現を測定すること；バイオマーカーの発現レベルから、該対象由来のサンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することにより処置のために選択され、該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象は処置のために選択され、該対象は抗血管新生治療剤により処置されない。さらなる局面において、本発明は、化学療法剤を対象に投与することを含むがんの処置方法であって、対象が、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルによって定義されるバイオマーカーサインについて陽性であり、抗血管新生治療剤が投与されない、処置方法に関する。なおさらなる局面において、本発明は、対象におけるがんの処置に用いるための化学療法剤に関し、ここで、該対象は、表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルにより定義されるバイオマーカーサインについて陽性であり、該対象は、抗血管新生治療剤により処置されない。特定の態様において、該化学療法剤は、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、抗代謝剤（例えば５ＦＵ）、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、またはその組み合わせを含んでいてよい。該化学療法剤は、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤、またはその組み合わせを含んでいてよい。特定の態様において、化学療法剤は、カルボプラチンおよび/またはパクリタキセルを含む。該化学療法剤は、がんの標準治療処置に影響を与え得る。標準治療処置は、がんのタイプにより異なってよく、例えば、卵巣がんにおけるカルボプラチン、結腸直腸がんにおける５ＦＵ、頭頸部がんにおけるプラチナが挙げられる。本発明の全ての局面によれば、バイオマーカーサインについてサンプルが陽性であるか陰性であるかを評価すること��、１個以上のバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること；および該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること；および、サンプル発現スコアが閾値発現スコアより上であるか、または同等であるかを決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアより上であるか、または同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である。本発明の全ての局面によれば、該対象は、がんに罹患していてよい。がんは卵巣がんであってよく、ハイグレードの漿液性卵巣がんであってよい。本明細書において、剤を「投与すること」は、剤「を用いて処置すること」と互換的に用いる。
【００１８】
本発明のさらなる局面によって、がんに罹患している対象の臨床予後の決定方法であって: 対象由来のサンプルにおける表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み; かかる１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することを含み、該サンプルが該バイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象は良好な予後を有する、方法を提供する。該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することは: バイオマーカーについてのサンプル発現スコアを決定すること; 該サンプル発現スコアを閾値発現スコアと比較すること; および、該サンプル発現スコアが閾発現値スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含んでいてよく、ここで、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である。特定の態様において、良好な予後は、バイオマーカーサインについて陰性であるサンプル、場合によっては、閾値スコアを下回るサンプル発現スコアを有するサンプルと比較して、無増悪生存率または全生存率が上昇していることを示す。特定の態様において、該対象は、化学療法処置を受けているか、受けたことがあるか、および/または受ける予定があり、かつ/または、抗血管新生治療剤による処置を受けることがない。化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含んでいてよい。化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含んでいてよい。特定の態様において、化学療法処置は、パクリタキセルおよびカルボプラチンの投与を含む。がんは、卵巣がんまたは結腸直腸がんであってよい。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、ベバシズマブを対象に投与するかどうかを選択する方法であって：卵巣がんに罹患している対象であって、プラチナ−ベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤による処置を受けているか、受けたことがあるおよび/または受ける予定がある対象より得た試験サンプル中において；表２から選択される１個、２個またはそれより多く、最大で全てのバイオマーカーの発現レベルを測定すること；かかる１個、２個またはそれより多くのバイオマーカーの発現レベルから、該対象由来のサンプルが、バイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価すること、バイオマーカーサインについて該サンプルが陽性であるかどうかに基づいて処置を選択することを含み、該サンプルがバイオマーカーサインについて陽性である場合、ベバシズマブが禁忌である、方法に関する。特定の態様において、サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるか陰性であるかを評価することは、１個、２個またはそれより多くのバイオマーカーのサンプル発現スコアを決定すること; 該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および、該サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である。
【００２０】
本発明はまた、対象の臨床予後を決定する方法であって：（ａ）卵巣がんに罹患している対象であって、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いた処置を受けている、受けたことがある、および/または受ける予定がある対象より得た、試験サンプルにおいて；（ｂ）表２または表３から選択されるバイオマーカーの１個以上、最大で全ての発現レベルを測定すること；（ｃ）かかる１個以上のバイオマーカーの発現レベルから、対象由来のサンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することを含み、該サンプルが該バイオマーカーサインについて陽性である場合、該対象が良好な臨床予後を有する、方法に関する。サンプルがバイオマーカーサインについて陽性であるかまたは陰性であるかを評価することは: (ｉ) １個以上のバイオマーカーについてのサンプル発現スコアを決定すること; (ｉｉ) 該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および (ｉｉｉ) 該サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかを決定することを含んでいてよく、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るかまたは同等である場合、該サンプルはバイオマーカーサインについて陽性である。特定の態様において、良好な予後は、該バイオマーカーサインについて陰性であるサンプルと比較して、場合によっては、閾値スコアを下回る発現スコアを有するサンプルと比較して、無増悪生存率または全生存率が上昇していることを示す。
【００２１】
本発明の全ての局面によれば、表２または表３から選択される、２つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、対象由来のサンプルにおいて測定してよい。表２または表３から選択される、５つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、対象由来のサンプルにおいて測定してよい。バイオマーカーサインについてサンプルが陽性であるか陰性であるかを評価することは、分類ツリーまたはランダムフォレストの使用を含んでいてよい。分類ツリー(Breiman, Leo; Friedman, J. H.; Olshen, R. A.; Stone, C. J. (1984). Classification and regression trees. Monterey, CA: Wadsworth &#38; Brooks/Cole Advanced Books &#38; Software. ISBN 978-0-412-04841-8) は、論理および法則に基づいて結果を予測する方法を提供する。分類ツリーは、バイナリ再帰分割と呼ばれるプロセスにより構築し、該プロセスは、データを区分/分岐に分割する、反復性の手法である。目的は、事前に定義したクラス間を区別させるツリーを構築することである。ノードにおける最適な分割を選択するために、各変数を順番に考慮し、ここで、可能な全ての分割を試して考慮し、最適な分割は、各区分における分類ラベルの多様性を最も低下させるものである。これを全ての変数について繰り返し、勝者を当該ノードについて最適な分割として選択する。このプロセスを次のノードでも続け、この方法により、ツリー全体を作成する。他の管理的(supervised)学習アプローチ、例えば、判別分析に対する分類ツリーの利点の１つは、ツリーの構築に用いる変数が、カテゴリー的であるか、または、数値的であるか、または両方の混合であってよいことである。この方法により、遺伝子発現の方向性に基づいて結果を予測するための、分類ツリーを作成することが可能である。ランダムフォレストアルゴリズム (Breiman, Leo (2001).“Random Forests”. Machine Learning 45 (1): 5−32. doi:10.1023/A:1010933404324)により、分類ツリーへのさらなる拡張が提供され、これにより、分類ツリー群を、「フォレスト」を形成するために無作為に作成し、各ツリーから予測した結果の平均を、該結果についての推測を行うのに用いる。
【００２２】
一の局面において、本明細書に記載の発現サインを用いて、対象に抗血管新生治療剤を投与するかどうかを選択する方法であって、該対象から試験サンプルを得ること、該試験サンプルからバイオマーカーパネルの発現レベルを測定すること、該バイオマーカーパネルについてのサンプル発現スコアを決定すること、該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較することおよび、該発現スコアが閾値スコアを同等であるかまたは上回るかに基づいて処置を選択することを含む、方法を提供する。特定の例示的な態様において、サンプル発現スコアが閾値スコアと同等であるかまたは上回ることは、抗血管新生剤が禁忌であり、該対象に投与するべきでないことを示す。特定の例示的な態様において、閾値スコアを下回るサンプル発現スコアは、抗血管新生剤が禁忌ではなく、該対象に投与し得ることを示す。がんの成長速度が治療剤との接触の結果、該治療剤との接触がない場合の成長と比較して加速している場合、該治療剤は患者に対して「禁忌」または「有害」である。がんの成長は、種々の方法により測定し得る。例えば、腫瘍サイズまたは、腫瘍のタイプに適当な腫瘍マーカーの発現の測定が挙げられる。また、治療剤の投与により患者の全体的な予後(無増悪生存および全生存)が低下する場合も、該治療剤は、「禁忌」または「有害」であると考えてよい。一の例示的な態様において、本明細書に記載の発現サインにより、がんの標準治療の後に抗血管新生剤を投与した際の患者の臨床予後を決定し得る。
【００２３】
特定の例示的な態様において、該対象は、がんに罹患している。がんとしては、卵巣がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、腎細胞がんを含む腎がん、肝細胞がん、甲状腺がん、膵臓がん、神経内分泌がん、食道がん、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、胃がん、成人原発性肝がんを含む肝がん、リンパ腫、黒色腫または多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例示的な態様において、がんは、卵巣がんである。特定の他の例示的な態様において、卵巣がんは、ハイグレード漿液性卵巣がんである。特定の例示的な態様において、患者は、該対象のがんのタイプの治療的処置の標準であり得る処置を受けたことがあるか、受けているか、および/または受ける予定であってよい。特定の例示的な態様において、標準治療処置であり得る処置としては、化学療法剤を用いた処置が挙げられる。該化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含んでいてよい。特定の例示的な態様において、該化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む。他の特定の例示的な態様において、該化学療法処置は、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与を含む。一の例示的な態様において、該対象は、ハイグレード漿液性卵巣がんに罹患しており、以前に、プラチナベースの化学療法剤および有糸分裂阻害剤の投与を受けている。他の例示的な態様において、該対象はハイグレード漿液性卵巣がんに罹患しており、以前に、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与を受けている。抗血管新生治療剤は、ＶＥＧＦ経路標的治療剤 (例えば、ベバシズマブまたはアフリベルセプト)、アンジオポエチン-ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤または、免疫調節剤であってよい。一の例示的な態様において、抗血管新生治療剤は、ＶＥＧＦ経路標的治療剤である。他の例示的な態様において、抗血管新生治療剤は、ベバシズマブである。
【００２４】
他の局面において、本明細書に記載の発現サインを用いて、対象の臨床予後を決定する方法であって、該対象から試験サンプルを得ること、試験サンプルからバイオマーカーパネルの発現レベルを測定すること、該バイオマーカーパネルからサンプル発現スコアを決定すること、サンプル発現スコアを閾値スコアと比較することを含み、該発現スコアが閾値発現スコアと同等であるかまたは上回る場合、臨床予後は、良好な予後である、方法を提供する。特定の例示的な態様において、良好な予後は、閾値スコアを下回る発現スコアを有する対象と比較して、生存率が上昇していることを示す。特定の例示的な態様において、対象は、がんに罹患している。がんとしては、卵巣がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、または神経膠芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例示的な態様において、がんは、卵巣がんである。他の特定の例示的な態様において、卵巣がんは、ハイグレード漿液性卵巣がんである。特定の例示的な態様において、該対象は、化学療法処置を受けていてよいか、受けたことがあるか、および/または受ける予定がある。該化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含んでいてよい。特定の例示的な態様において、化学療法処置は、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む。他の特定の例示的な態様において、化学療法処置は、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与を含む。一の例示的な態様において、対象は、ハイグレード漿液性卵巣がんに罹患しており、プラチナベースの化学療法剤および有糸分裂阻害剤、例えばタキサンの投与を受けていてよいか、受けたことがあるか、および/または受ける予定がある。他の例示的な態様において、対象は、ハイグレード漿液性卵巣がんに罹患しており、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与を受けていてよいか、受けたことがあるか、および/または受ける予定がある。
【００２５】
他の局面において、本発明は、ｑＰＣＲ、ＮＧＳ、マイクロアレイおよび免疫アッセイ、例えば免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどのような上記の慣用の診断用キットに関する。このようなキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイするためおよびｍＲＮＡまたは蛋白質発現を定量するために適当な試薬および指示書を含む。
【００２６】
また、非血管新生表現型を有するまたは有しないヒト腫瘍を同定する方法を開示する。特定の例示的態様において、このような方法を使用して、血管新生と関係する工程を直接的または間接的に阻害する薬物に対して感受性であり、応答する患者を同定し得る。ある他の例示的態様において、このような方法を使用して、血管新生と関係するプロセスを直接的または間接的に阻害する薬物に耐性である、または応答しない、または、有害な応答をする、患者を同定し得る。
【００２７】
本発明はまた、患者の有効な処置への指針にも関する。さらに、患者処置レジメンの選択に関する方法および血管新生に直接的または間接的に影響する現在のまたは開発段階の薬物の臨床試験のために患者を選択する方法を提供する。
【００２８】
さらに、全ての転写物のアッセイのために、保存されたホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)生検材料ならびに新鮮／凍結(ＦＦ)組織の使用に順応し、それゆえに、最も広く利用可能な種類の生検材料と適合する方法を本明細書に記載する。バイオマーカー発現レベルを、ＦＦＰＥ組織、新鮮凍結組織またはRNAlater(登録商標)のような溶液に保存されている新鮮組織から得たＲＮＡを使用して決定し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】２６５のハイグレード漿液性卵巣がんにおける遺伝子発現データの非管理的(unsupervised)階層クラスタリングを示すヒートマップを示す。各カラムは、１つの腫瘍内のこれらのプローブセットの発現を表す。全クラスターにわたるプローブセットの発現を、水平方向に示す。ヒートマップの上のバーは、説明ボックスに記載するように、クラスターにより色分けされている。二番目のバーは、説明ボックスに記載するように、クラスラベルについて色分けされている。各プローブセットクラスターに対応する機能プロセスを、図の右にラベルする。
【図２】２６５のハイグレード漿液性卵巣がんにおける遺伝子発現の非管理的解析からの、クラスターによる全生存率のカプランマイヤー解析を示す。
【図３】Edinburgh (発見) データセットにおける、６３−遺伝子サイン分類指標により定義される、２つのクラスの生存率のカプランマイヤー解析を示す。Ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ群は、ＡｎｇｉｏサブグループおよびＡｎｇｉｏｉｍｍｕｎｅサブグループからなる。Ａ．無増悪生存率。Ｂ．全生存率。
【図４】Tothill (確認) データセットにおける、６３−遺伝子サイン分類指標により定義される、２つのクラスの生存率のカプランマイヤー解析を示す。Ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ群は、ＡｎｇｉｏサブグループおよびＡｎｇｉｏｉｍｍｕｎｅサブグループからなる。Ａ．無増悪生存率。Ｂ．全生存率。
【図５】ＩＣＯＮ７治験コホートにおける、Ｉｍｍｕｎｅ (図５Ａ) およびＰｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ(図５Ｂ)サブグループの患者の無増悪生存率についてのカプランマイヤー曲線を示す。各図において、２つの無作為化処置群：１）カルボプラチンおよびパクリタキセルによる化学療法および２）カルボプラチンおよびパクリタキセル化学療法ならびに、ベバシズマブの間の生存率の差異を示す。
【図６】ＩＣＯＮ７治験コホートにおける、Ｉｍｍｕｎｅ(図６Ａ) およびＰｒｏａｎｉｇｉｏｇｅｎｉｃ(図６Ａ)サブグループの患者の全生存率についてのカプランマイヤー曲線を示す。各図において、２つの無作為化処置群：１）カルボプラチンおよびパクリタキセルによる化学療法および２）カルボプラチンおよびパクリタキセル化学療法ならびに、ベバシズマブの間の生存率の差異を示す。
【図７】６３遺伝子サインにより定義される、カルボプラチンおよびパクリタキセルにより処置した、ＩＣＯＮ７治験患者の無増悪生存率 (Ａ) および全生存率(Ｂ) についてのカプランマイヤー曲線を示す。
【図８】結腸直腸がんサンプルに適用した、例示的な非血管新生サインの特定の分類パフォーマンスのベンチマークを示すグラフである。
【図９】サイン展開：ＣＶ下のトレーニングセットのＡＵＣ。
【図１０】サイン展開：ＣＶ下のトレーニングセットのＣ指標。
【図１１】サイン展開：ＣＶ下のトレーニングセットのＨＲ。
【図１２】サイン展開：ＣＶ下のＩＣＯＮ７ ＳＯＣサンプルのＨＲ。
【図１３】サイン展開：ＣＶ下のＩＣＯＮ７ ＳＯＣサンプルのＣ指標。
【図１４】サイン展開：ＣＶ下の、ＩＣＯＮ７ ＩｍｍｕｎｅサンプルのＨＲ。
【図１５】サイン展開：ＣＶ下のＩＣＯＮ７ ＰｒｏＡｎｇｉｏサンプルのＨＲ。
【図１６】コアセット解析：Immune63GeneSig_CoreGenes_InternalVal.png.
【図１７】コアセット解析：Immune63GeneSig_CoreGenes_Tothill.png.
【図１８】コアセット解析：Immune63GeneSig_CoreGenes_ICON7_SOC.png.
【図１９】最小遺伝子セット解析：Immune63GeneSig_MinGenes_Tothill.png.
【図２０】ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ：最小遺伝子セット解析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_SOC.png.
【図２１】ＩＣＯＮ７ Ｉｍｍｕｎｅ：最小遺伝子セット解析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_Immune.png.
【図２２】６３遺伝子サインにより、Ａｎｇｉｏ−Ｏｆｆ (不活性)と予測されたサンプル対 Ａｎｇｉｏ−Ｏｎ (活性)と予測されたサンプルの間の、無増悪生存の可能性の差異を示すカプランマイヤー曲線。
【図２３】血管新生を定義する遺伝子リストを用いた、Marrisa et al (2013)に記載の５２９のＣＲＣサンプルの半非管理的階層クラスタリング。
【図２４】Marissa CRCデータにおける、血管新生活性サブタイプと血管新生不活性サブタイプの間の６３遺伝子サインスコアの区別を示すROC曲線。
【図２５】GSE14333 CRCデータにおける、６３遺伝子サインにより予測される、血管新生活性および血管新生不活性の患者（処置のみ）の間の生存率の差異を示すカプランマイヤー曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
特に断らない限り、本明細書で使用する学術用語および化学用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義はBenjamin Lewin, Genes IX、Jones and Bartletにより出版、2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.により出版1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.により出版、1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley &#38; Sons (New York, N.Y. 1994)およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley &#38; Sons (New York, N.Y. 1992)に見ることができる。
【００３１】
文脈から明らかに矛盾しない限り、単数表現は複数を含む。同様に、用語「または」は、文脈から明らかに矛盾しない限り、「および」を含むことを意図する。用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「バイオマーカーマーカーパネル」、「発現分類指標」、「分類指標」、「発現サイン」または「サイン」は相互交換可能に使用し得る。パネルは、典型的には、複数のバイオマーカーを含むが、バイオマーカーが、単独で本発明の方法において有用である場合、単一のバイオマーカーのみを含んでいてもよい。
【００３３】
本明細書において引用する全ての刊行物、公開特許明細書および特許出願は、本出願が関係する技術分野における技術レベルの指標である。本明細書に引用する全ての刊行物、公開特許明細書および特許出願は、個々の刊行物、公開特許明細書および特許出願が具体的におよび個々に引用により包含されたのと同程度に、引用により本明細書に包含される。
【００３４】
概説
がんにおける現在の研究努力の主な目標は、臨床的治療判断に分子パラメータを組み入れることによる、患者における術前術後の全身的治療の有効性を高めることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは、外来化合物または薬物に対する個々の応答に関与する遺伝子／ゲノム因子の研究である。本発明のバイオマーカーの発現に対して刺激性または阻害性効果を有する因子またはモジュレーターを個体に投与して、患者のがんを(予防的または治療的に)処置し得る。このような処置と組み合わせて個体の薬理ゲノミクスを考慮することも理想である。治療剤の代謝における差異は、薬理学的活性薬物の投与量と血中濃度の間の相関を変えることにより、重度の毒性または治療失敗に至る可能性がある。それゆえに、個体の薬理ゲノミクスの理解は、予防処置または治療処置に有効な薬剤(例えば、薬物)の選択を可能にする。このような薬理ゲノミクスは、さらに、適当な投与量および治療レジメンの決定のために使用できる。したがって、個体での本発明のバイオマーカーの発現レベルを決定し、それにより、該個体の治療的処置または予防的処置のための適当な薬剤を選択することができる。
【００３５】
本発明は、血管新生と関係する１つ以上の一般的サブタイプの使用を含む、種々の解剖学的部位由来のがんを診断するのに有用な分子診断試験に関する。本発明は、抗臨床予後良好または臨床予後不良であるとして、対象を同定する発現サインおよび、抗血管新生治療剤を対象に投与するかどうかの指標となる発現サインを含む。該発現サインは、病理および／または臨床成績が知られるサンプルセットからのサンプルの発現プロファイルを得ることにより得られる。サンプルは、同一サンプル組織型に由来しても、異なる組織型に由来してもよい。本明細書で使用する「発現プロファイル」は、特定のサンプルから解析した各バイオマーカーの発現レベルを表す値のセットを含む。
【００３６】
サンプルセット由来の発現プロファイルを、続いて数学モデルを使用して解析する。種々の数学モデルを適用でき、パターン認識(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)、機械学習(Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、統計学(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、バイオインフォマティクス(Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572)または計量化学(VandegＩＮＳte, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998)の分野からのモデルが挙げられるが、これらに限定されない。数学モデルは、サンプルセットにおいて発現する、特定の疾患表現型について最も予測的である１個以上のバイオマーカーを同定する。これらの１個以上のバイオマーカーは発現サインを決定する。したがって、発現サインは、特定の疾患表現型について最も予測的であるとして同定したバイオマーカーを含む。特定の例示的態様において、数学モデルは、同定されたバイオマーカーのそれぞれについて、例えば重みのような変数を決定する。特定の例示的態様において、数学モデルは、決定関数を決定する。決定関数は、さらに、サンプルセットを２つの疾患表現型、例えば、非限定的には、臨床予後が良好であるサンプルおよび臨床予後不良であるサンプルに分類する閾値スコアを決定し得る。一の例示的態様において、線形分類指標を使用して、決定関数および発現サインを決定する。
【００３７】
既定の発現サインを使用して新規サンプルを分類するために、バイオマーカーパネルとも称する、発現サインにより定義されたバイオマーカーを単離し、該バイオマーカーパネルの発現プロファイルを決定する。新規サンプルバイオマーカーパネルの発現プロファイルを発現サインを定義するのに用いた同じ数学モデルを使用して解析する。該バイオマーカーパネルは、発現サインにより決定されるバイオマーカーを１個以上含んでいてよい。該バイオマーカーパネルは、発現サインにより決定されるバイオマーカーを１個以上含んでいてよい。特定の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、表２に記載のバイオマーカーを１個以上含む。他の特定の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、表２に記載の全てのバイオマーカーを含む。特定の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、表２に記載の１個以上のバイオマーカーを含む。他の特定の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、表２に記載の全てのバイオマーカーを含む。特定の例示的態様において、数学モデルは、新規サンプルの発現スコアを決定する。発現スコアは、バイオマーカーの発現値を、単一スカラー値を得るための非線形手段、代数的手段、三角法手段または相関手段を使用して、対応するスカラー重みと組み合わせることにより決定し得る。発現スコアを閾値スコアと比較し、発現スコアが閾値スコアより大きいか、等しいか、または小さいかに基づいてサンプルを分類する。特定の例示的な態様において、閾値スコアと同等であるか、または上回るサンプル発現スコアは、対象が良好な臨床予後を有することを示し、閾値スコアを下回るサンプル発現スコアは、対象が不良な臨床予後を有することを示す。特定の例示的な態様において、閾値スコアと同等であるか、または上回るサンプル発現スコアは、対象が該サインを有することを示す。このことは、良好な臨床予後を示し得る。閾値スコアを下回るサンプル発現スコアは、対象が該サインを有さないことを示す。このことは、不良な臨床予後を示し得る。
【００３８】
本明細書に開示する発現サインの一つの適用は、予後良好および予後不良の患者の同定である。予後が良好であるかまたは不良であるかは、特定の処置バックグラウンド（例えば、本明細書に記載するカルボプラチン/パクリタキセル療法）の状況において決定し得る。例えば、対象は、該対象のがんのタイプについての標準的な化学療法処置を受けているか、または受けたことがあってよい。本明細書に記載の発現サインは、また、処置バックグラウンドを考慮して、さらなる治療剤、例えば、抗血管新生治療剤を、患者に投与するべきかどうかを決定するために用いてよい。腫瘍における同定されたバイオマーカーの少なくとも１個、場合によって、バイオマーカーのコレクションの発現を調べることにより、患者の、予想される臨床成績を決定することが可能である。したがって、少なくとも１個のバイオマーカー、場合によってはバイオマーカーのコレクションの発現を調べることにより、より積極的な治療レジメンを最も必要とする患者を同定し、同様に不要な治療処置または患者の臨床成績を有意に改善しない、または害する可能性がある治療処置を排除することが可能である。本発明は、少なくとも無増悪生存率または全生存率を用いた、臨床予後の予測に関する。したがって、「良好な予後」は、他のがんのサブタイプと比較して生存率の上昇を示すサブタイプのがんに罹患している対象集団を示す。一方、「不良な予後」または「悪い予後」は、他のがんサブタイプと比較して、生存率の低下を示すがんサブタイプの対象集団を示す。考慮に入れてよい、予後に関するさらなる要因は、民族性および人種、年齢、疾患ステージ、病歴、腫瘍グレード、腫瘍マーカー(例えばＣＡ１２５)、部位特異的な外科処置、残存病変のサイズおよび腫瘍応答である。特定の例示的な態様において、閾値スコアと同等であるかまたは上回る発現スコアを有する対象を、非血管新生サブタイプを有すると分類する。他の例示的な態様において、閾値スコアを上回るサンプル発現スコアを有する対象を、良好な臨床予後を有すると分類する。さらに他の例示的な態様において、閾値スコアを上回るかまたは同等であるサンプル発現スコアを有する対象は、良好な臨床予後を有すると分類される。さらに他の例示的な態様において、閾値スコアを上回るかまたは同等であるサンプル発現スコアを有する対象は、抗血管新生治療剤を投与された場合、該対象が有害な作用を受けるか、または、臨床予後が不良になる可能性が高いことを示す。
【００３９】
特定の例示的な態様において、対象の臨床予後の決定、または、さらなる治療剤の選択は、化学療法処置が過去に行われた、現在行われている、または計画されている状況において行ってよい。例えば、該対象は、該対象のがんのタイプの標準治療である化学療法処置をまだ開始していなくても、現在受けていても、または完了したところであってもよい。特定の例示的な態様において、該化学療法処置は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、プラチナベースの薬物、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド、ホルモンベースの治療剤またはその組合せの投与を含んでいてよい。例示的なアルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、スルホン酸アルキル、トリアジンおよびエチレンイミンが挙げられる。例示的なプラチナ薬物としては、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが挙げられる。例示的な代謝拮抗薬としては、５-フルオロウラシル、６-メルカプトプリン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド、ペントスタチンおよびチオグアニンが挙げられる。例示的な抗腫瘍抗生物質としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃおよびミトキサントロンが挙げられる。例示的なトポイソメラーゼ阻害剤としては、トポテカン、イリノテカン、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。例示的な有糸分裂阻害剤としては、タキサン、エポチロン、ビンカアルカロイドおよびエストラムスチンが挙げられる。例示的なコルチコステロイドとしては、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾンが挙げられる。特定の例示的な態様において、化学療法は、Ｌ−アスパラギナーゼ、イマチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、ボルテゾミブ、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、亜ヒ酸、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、プロゲスチン、エストロゲン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン作動薬または類似体、リツキシマブ、アレムツズマブ、ＢＣＧ、インターロイキン−２、インターフェロンα、サリドマイド、およびレナリドミドを用いた処置を含んでいてよい。
【００４０】
特定の例示的な態様において、化学療法処置は、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびフルオロウラシル（ＣＭＦ）処置レジメン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびフルオロウラシル（ＣＡＦ）処置レジメン、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＥＣ）処置レジメン、フルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＦＣ）処置レジメン、パクリタキセルおよびシクロホスファミド処置レジメン、パクリタキセルおよびカルボプラチン処置レジメン、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド処置レジメンまたはドキソルビシンおよびパクリタキセル処置レジメンを含んでよい。一の例示的な態様において、ネオアジュバントがん療法は、プラチナベースの化学療法処置レジメンを含む。一の例示的な態様において、プラチナベースの化学療法処置レジメンは、パクリタキセルおよびカルボプラチンを含む。
【００４１】
本明細書に開示する発現サインの他の適用は、抗血管新生治療剤を含む治療剤クラスに対する患者の応答の層化および選択である。腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を調べることにより、どの治療剤または、薬剤の組み合わせががんの成長速度を最も低下させる可能性があるかを決定することが可能である。また、どの治療剤または薬剤の組み合わせが、がんの成長速度を最も減少させない可能性があるか、および/または、どれが有害な影響を及ぼし、禁忌となり得るかを決定することが可能である。従って、バイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、無効なまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことに、ある態様において、これらの決定は患者毎原則または薬剤毎原則でなし得る。それゆえに、特定の治療レジメンが特定の患者または患者タイプに有益であるか否かおよび／または特定のレジメンを継続すべきか否かを決定できる。本発明は、治療選択の指針となり得るだけでなく、新規治療剤の臨床試験評価中の濃縮戦略のための患者群を選択できる試験を提供する。例えば、推定抗血管新生剤または処置レジメを評価するとき、ここに開示する発現サインおよび方法を使用して、抗血管新生剤に応答性である、がんサブタイプを有する個体を臨床試験に選択し得る。
【００４２】
がんは、治療剤との接触の非存在下での成長と比較して、治療剤との接触の結果として成長速度が抑制されるならば、該治療剤に対して「応答性」である。がんの成長は多様な方法で測定できる。例えば、腫瘍サイズまたはその腫瘍タイプに適する腫瘍マーカーの発現の測定が挙げられる。一の例示的な態様において、本明細書に記載の発現サインは、該患者のがんタイプのための標準治療である化学療法の後、抗血管新生剤の投与時に、患者の臨床予後を決定することができる。
【００４３】
がんは、治療剤との接触の非存在下での成長と比較して、治療剤との接触の結果として成長速度が抑制されないまたは極めて低い程度にしか抑制されないならば、該治療剤に対して「非応答性」である。上記のとおり、がんの成長は、多様な方法で、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍タイプに適する腫瘍マーカーの発現の測定により測定できる。治療剤に対して非応答性であるという性質は高度に変動的であり、異なるがんは、異なる条件下で、特定の治療剤に対して異なるレベルの「非応答性」を示す。なおさらに、非応答性の尺度は、患者のクオリティ・オブ・ライフおよび転移の程度のような、しかしこれらに限定されない腫瘍成長サイズ以外の付加的基準を使用して評価できる。
【００４４】
血管新生サブタイプを、新鮮／凍結(ＦＦ)またはホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)患者サンプルから同定できる。一つの例示的態様において、がんタイプは卵巣がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がんまたは神経膠芽腫である。他の例示的態様において、がんタイプは卵巣がんである。さらなる例示的態様において、がんタイプは乳がんである。他の例示的態様において、がんタイプは肺がんである。他の例示的態様において、がんタイプは結腸がんである。他の例示的態様において、がんタイプは前立腺がんである。他の例示的態様において、がんタイプは神経膠芽腫である。
【００４５】
発現サインの同定
本発明の発現サインを、患者サンプルセットにおける特定のバイオマーカーの発現プロファイルの解析により同定する。本発明における使用に適するバイオマーカーとしてはＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質が挙げられる。一の例示的な態様において、本発明に使用するのに適当なバイオマーカーとしては、ＲＮＡおよびｃＤＮＡが挙げられる。バイオマーカーを患者サンプルから単離し、その発現レベルを測定して、患者サンプルセットにおいて分析した各サンプルについての発現プロファイルのセットを得る。特定の例示的な態様において、発現サインは、閾値を上回るか、または同等である、バイオマーカーの組合せについてのサインスコアとして同定される、がん組織で観察される非血管新生表現型であって、免疫応答関連遺伝子の上方制御および血管新生または脈管構造の発達に関連するプロセスと関連する遺伝子の下方制御により特徴付けられる表現型を特定する。
【００４６】
ａ. 発現プロファイル
特定の態様において、得られる発現プロファイルは、ゲノムまたは核酸発現プロファイルであり、ここで、サンプル中の１つ以上の核酸の量またはレベルを決定する。これらの態様において、診断方法または予後についての方法において用いる発現プロファイルを作成するためにアッセイするサンプルは、核酸サンプルである。該核酸サンプルは、分析する細胞または組織の表現型確定的バイオマーカーの発現情報を含む核酸集団である。ある態様において、核酸は、サンプルが由来するホスト細胞または組織の発現情報を保持する限り、ＲＮＡまたはＤＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ等であってよい。サンプルは当分野で知られるとおり、多くの多様な方法で、例えば、細胞からのｍＲＮＡの単離により製造してよく、ここで、差次的遺伝子発現の分野において知られるとおり、単離ｍＲＮＡを単離したままで使用するか、増幅して使用するか、またはｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等を製造するために使用する。したがって、サンプル中のｍＲＮＡレベルの測定は、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの製造と、続くｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの測定を含む。サンプルは、典型的に、処置を必要とする対象から、例えば、組織生検を介して採取した細胞または組織から標準的プロトコルを使用して調製し、ここで、このような核酸を産生し得る細胞型または組織は、疾患細胞または組織、体液などを含むが、これらに限定されない、測定する表現型の発現パターンが存在するあらゆる組織を含む。
【００４７】
発現プロファイルは、任意の慣用のプロトコルを使用して、最初の核酸サンプルから作成し得る。差次的遺伝子発現／バイオマーカー分析の分野で用いられているもののような、発現プロファイルを作成するための多種多様な方法が知られているが、発現プロファイルを作成するための一つの代表的かつ簡便なプロトコルのタイプは、アレイに基づく遺伝子発現プロファイル作成プロトコルである。このような適用は、作成するプロファイルにおいてアッセイ／プロファイルする遺伝子の各々に対する「プローブ」核酸を呈する核酸を用いるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイにおいて、最初に、標的核酸のサンプルをアッセイする最初の核酸サンプルから調製し、該調製は、標識、例えば、シグナル生成系のメンバーでの標的核酸の標識を含み得る。標的核酸サンプル調製後、サンプルをアレイとハイブリダイゼーション条件下に接触させ、それにより、アレイ表面に結合したプローブ配列と相補的である標的核酸の間で複合体が形成される。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在を、定性的または定量的に検出する。対象方法において用いる発現プロファイルの作成のために実施し得る具体的ハイブリダイゼーション技術としては、米国特許第５,１４３,８５４号；第５,２８８,６４４号；第５,３２４,６３３号；第５,４３２,０４９号；第５,４７０,７１０号；第５,４９２,８０６号；第５,５０３,９８０号；第５,５１０,２７０号；第５,５２５,４６４号；第５,５４７,８３９号；第５,５８０,７３２号；第５,６６１,０２８号；第５,８００,９９２号明細書；ならびに国際公開第９５／２１２６５号；国際公開第９６／３１６２２号；国際公開第９７／１０３６５号；国際公開第９７／２７３１７号；欧州特許第３７３２０３号；および欧州特許第７８５２８０号明細書に記載された科学技術が挙げられる(これらの開示は、引用により本明細書に包含される)。これらの方法において、発現をアッセイするバイオマーカーの各々に対するプローブを含む「プローブ」核酸のアレイを、上記のとおり標的核酸と接触させる。接触を、上記のとおりハイブリダイゼーション条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行い、未結合核酸をその後除去する。得られたハイブリダイズした核酸のパターンは、プローブされたバイオマーカーの各々の発現に関する情報を提供し、ここで、発現情報は、該遺伝子が発現しているか、していないか、および典型的には、どの程度のレベルかの観点によるものであり、該発現データ、すなわち、発現プロファイルは定性的および定量的の両者であり得る。
【００４８】
ｂ. 疾患およびサンプル組織スコア
特定の例示的な態様において、患者サンプルは、保存されたサンプルのようながん組織サンプルを含む。該患者サンプルは、好ましくはがん組織由来であり、予後、再発の可能性、長期生存、臨床成績、処置応答、診断、がん分類または個別化ゲノミクスプロファイルにより特徴付けられているサンプル由来であってよい。本明細書において、がんは、白血病、脳がん、前立腺がん、肝がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、咽頭がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、肺がん、肉腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱がん、内分泌がん、子宮内膜がん、食道がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽腫、骨肉腫、膵がん、下垂体がん、腎がんなどを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する結腸直腸がんは、直腸および結腸の他の部分の両方の組織におけるがんを含み得るがんならびに結腸がんまたは直腸がんのいずれかに分類され得るがんを含んでいてよい。一の態様において、本明細書に記載する方法は、抗血管新生剤、抗血管新生標的治療、血管新生シグナル伝達の阻害剤で処置されるがんに言及するが、これらのクラスに限定されない。これらのがんはまた、種々の病理学的ステージにあるこれらのがんのサブクラスおよびサブタイプを含む。特定の例示的態様において、患者サンプルは、卵巣がんサンプルを含む。特定の例示的な態様において、該卵巣がんサンプルは、漿液性卵巣がんサンプル、例えばハイグレード漿液性卵巣がんサンプルである。他の例示的な態様において、患者サンプルは乳がんサンプルを含む。さらに他の例示的な態様において、患者サンプルは神経膠芽腫サンプルを含む。
【００４９】
「生物学的サンプル」、「サンプル」および「試験サンプル」は、個体から得たまたは他の方法でもたらされた任意の物質、体液、組織または細胞を指すためにここで交換可能に使用する。これは血液(全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿および血清を含む)、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻咽頭吸引液、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、腹水、細胞、細胞抽出物および脳脊髄液を含む。これはまた、前記の全ての、実験的に分離させたフラクションも含む。例えば、血液サンプルを血清、または赤血球もしくは白血球(ロイコサイト)のような特定の種類の血球を含むフラクションに分画し得る。所望により、サンプルは一個体からの、組織サンプルと体液サンプルの組み合わせのようなサンプルの組み合わせであり得る。用語「生物学的サンプル」はまた、例えば、便サンプル、組織サンプルまたは組織生検由来のような均質化固形物を含む物質も含む。用語「生物学的サンプル」はまた、組織培養物または細胞培養物由来の物質、例えば、切除組織および生検組織も含む。生物学的サンプルを得るのに適する任意の方法を使用してよく、方法の例としては、例えば、静脈切開術、スワブ(例えば、口腔スワブ)および穿刺吸引細胞診法が挙げられる。サンプルはまた、例えば、マイクロダイセクション(例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(ＬＣＭ)またはレーザーマイクロダイセクション(ＬＭＤ))、膀胱洗浄、スメア(例えば、ＰＡＰスメア)または乳管洗浄細胞診によっても採取できる。個体から得たまたは個体に由来する「生物学的サンプル」は、個体から得られた後、任意の適当な方法、例えば、新鮮凍結またはホルマリン固定および／またはパラフィン包埋で処理されている任意のこのようなサンプルを含む。本明細書に定義する本発明の方法を、得たサンプルで開始してよく、それゆえに、患者からサンプルを得る工程は必ずしも含まれない。方法は、単離サンプル上で実施するインビトロの方法であり得る。
【００５０】
本明細書で使用する用語「患者」はヒトおよび非ヒト動物を含む。処置のための好ましい患者はヒトである。「患者」、「個体」および「対象」は、ここでは相互交換可能に使用する。
【００５１】
ｃ. バイオマーカー
ここで使用する用語「バイオマーカー」は遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペチド、蛋白質、蛋白質フラグメントまたは遺伝子発現レベルもしくは蛋白質産生レベルのいずれかを示す任意の他の核酸配列またはポリペチド配列を指していてよい。バイオマーカーが個体における異常な過程、疾患または他の状態の徴候を示すか、または徴候であるとき、該バイオマーカーは、個体における正常な過程、疾患または他の状態の不在の徴候を示すか、または徴候であるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、一般に過剰発現または過小発現していると表現される。「上方制御」、「上方制御された」、「過剰発現」、「過剰発現した」およびそのあらゆる異形を、健常なまたは正常な個体由来の同等な生物学的サンプルで典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より大きな、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用する。本用語はまた、特定の疾患の異なるステージで検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より大きい、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指していてもよい。
【００５２】
「下方制御」、「下方制御された」、「過小発現」、「過小発現した」およびそのあらゆる異形を、健常なまたは正常な個体由来の同等な生物学的サンプルで典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より低い生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用する。本用語はまた、特定の疾患の異なるステージで検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より小さい、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指していてもよい。
【００５３】
さらに、過剰発現または過小発現しているバイオマーカーはまた、個体における正常なプロセス、または疾患、疾患サブタイプもしくは他の状態の不在の徴候を示すか、または徴候であるバイオマーカーの「正常」発現レベルまたは値と比較して、「差次的に発現している」または「差次的レベル」または「差次的な値」を有するということもできる。したがって、バイオマーカーの「差次的発現」はまた、バイオマーカーの「正常」発現レベルからの変動ということもできる。
【００５４】
用語「差次的バイオマーカー発現」および「差次的発現」は、正常対象における発現と比較して、または特定の治療に対して異なる応答を示す、または異なる予後の患者における発現と比較して、特定の疾患に罹患している対象において発現がより高いまたはより低いレベルに活性化されているバイオマーカーを指すのに相互交換可能に使用する。本用語はまた、同じ疾患の異なるステージで、発現がより高いまたは低いレベルに活性化されているバイオマーカーも含む。差次的に発現しているバイオマーカーは、核酸レベルまたは蛋白質レベルで活性化されていても、阻害されていてもよく、選択的スプライシングに付されて、異なるポリペチド産物を生じてもよいことも理解される。このような差異は、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベルまたは蛋白質表面発現、分泌またはポリペチドの他の分割を含む、広範な変化により証明され得る。差次的バイオマーカー発現は、２個以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現の比較；または２個以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現の割合の比較；または正常対象と疾患に罹患している対象の間で異なる同じ遺伝子の２個の異なって処理された産物の比較；または同じ疾患の種々のステージでの比較を含み得る。差次的発現は、例えば、正常細胞と罹患細胞の間のまたは異なる疾患事象または疾患ステージにある細胞間の、バイオマーカーにおける一過性または細胞性発現パターンの定量的および定性的差異の両方を含む。
【００５５】
特定の例示的な態様において、バイオマーカーはＲＮＡ転写物である。本明細書で使用する「ＲＮＡ転写物」は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)およびアンチセンスＲＮＡを含む、コードＲＮＡおよび非コードＲＮＡの両者を指す。生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの測定を、該生物学的サンプルにおける対応する蛋白質および遺伝子のレベルを検出するための代用として使用し得る。そのため、本明細書に記載する任意のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを、適当なＲＮＡの検出によっても検出できる。バイオマーカー発現プロファイリングの方法としては、定量的ＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、免疫アッセイ(ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、凝集、比濁分析、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ)および質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。特定のサンプルの全体的発現データを、異なる量の出発物質、抽出および増幅反応の効率変動を補正するために、当業者に公知の方法を使用して正規化し得る。
【００５６】
特定の例示的な態様において、良好な臨床予後および不良な臨床予後を示すがんサブタイプを区別するために有用なバイオマーカーを、上記発現検出方法および患者サンプルセットを使用して決定した、患者データセットにおけるサンプル間で最も高度な可変性を示すバイオマーカーの同定により決定できる。発現データの高度に可変的なデータポイントを同定するための当分野で公知の標準的統計法を使用して、高度に可変的なバイオマーカーを同定し得る。例えば、バックグラウンドフィルタおよび分散フィルタの組み合わせを患者データセットに使用する。例えば、バックグラウンドフィルタおよび分散フィルタの組み合わせを患者データセットに使用する。バックグラウンドフィルタは、発現Ｅならびにバックグラウンド標準偏差σＢｇにより決定した閾値(Expression Consoleソフトウェアから)を超える発現分散を有するプローブセットの選択に基づき、
【数１】
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であるならば、プローブセットは、特定の有意性ａでの標準正規分布の分位点ｚαが維持されている。特定の例示的態様において、有意性閾値は６.３×１０−５である。他の例示的態様において、有意性閾値は１.０×１０−７〜１.０×１０−３であり得る。
【００５７】
特定の例示的態様において、高度に可変的なバイオマーカーをさらに分析して、患者データセットのサンプルを類似遺伝子発現プロファイルに基づき、サブタイプまたはクラスターに群別けしてよい。例えば、バイオマーカーを、その発現の上方制御または下方制御が互いにどの程度高度に相関するかに基づき、クラスター化してよい。当分野で知られる多様なクラスタリング解析技術を使用し得る。一の例示的態様において、階層凝縮型クラスタリングを使用して、がんサブタイプを同定する。各サブタイプの生物学的関連性を決定するために、各クラスター内のバイオマーカーを、それらの対応する遺伝子にさらにマッピングし、該遺伝子と関係する生物学的活性および生物学的経路についての情報を含む１つ以上の遺伝子オントロジーデータベースへの相互参照により注釈付けしてよい。他の例示的態様において、免疫応答の一般的な機能的用語について上方制御および濃縮されたクラスターにおけるバイオマーカーを、推定非血管新生サンプル群に分類し、発現サインの作成に用いる。他の例示的な態様において、血管新生および脈管構造の発達について下方制御および濃縮されており、免疫応答の一般的な機能的な用語について上方制御および濃縮されているクラスター中のバイオマーカーを、推定非血管新生サンプル群に分類し、発現サインの作成に用いる。バイオマーカークラスターの機能解析を実施するためのさらなる詳細は、下記の実施例に示す。
【００５８】
一の例示的な態様において、本発明で使用するための発現サインの抽出において有用なバイオマーカーは表１に挙げるバイオマーカーである。これらのバイオマーカーは、治療剤に対する患者応答を決定するための予測的価値および／または個体が良好な臨床予後を有するか、または不良な臨床予後を有するかの同定における予後価値を有するとして同定されている。
【００５９】
特定の例示的な態様において、本明細書に記載のバイオマーカーの発現は、患者が、抗血管新生治療剤の投与から、有害なまたは有益な効果を得るかどうかと相関する。バイオマーカーのコレクションの発現を調べることにより、無効なまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことに、特定の態様において、これらの決定は患者毎原則または薬剤毎原則でなし得る。それゆえに、特定の治療レジメンが特定の患者または患者タイプに有益であるか、および／または特定のレジメンを継続すべきかどうかを決定できる。
【００６０】
他の特定の例示的な態様において、本明細書に開示するバイオマーカーの発現は、患者の全体的臨床予後と相関する。腫瘍において同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を調べることにより、該個体が臨床予後良好または臨床予後不良と相関するがんサブタイプを有するかどうかを決定することが可能である。重要なことに、特定の態様において、これらの決定は患者毎原則でなし得る。したがって、当業者は、望まないまたは医学的に不当な有害副作用を生じる可能性が最も高い処置レジメンを排除しながら、根底の疾患を処置するのに適当な処置レジメンを選択する助けとして、予測予後を使用できる。
【００６１】
表１に挙げる配列番号は、例示的なトランスクリプトームアレイにおける、遺伝子の発現レベルを測定するために使用するプローブセット識別子を指す。本発明の発現サインは、下記の実施例にさらに詳述する、異なるプローブセットを有する異なるアレイからの発現データを使用して交差検証されている。したがって、本明細書に開示する発現サインおよび方法は、本明細書に開示するプローブセットを使用して測定した発現値に限定されない。
【表１−１】
2017506506.tif 000003
【表１−２】
2017506506.tif 000004
【表１−３】
2017506506.tif 000005
【表１−４】
2017506506.tif 000006
【表１−５】
2017506506.tif 000007
【００６２】
【表１−６】
2017506506.tif 000008
【表１−７】
2017506506.tif 000009
【表１−８】
2017506506.tif 000010
【表１−９】
2017506506.tif 000011
【表１−１０】
2017506506.tif 000012
【００６３】
【表１−１１】
2017506506.tif 000013
【表１−１２】
2017506506.tif 000014
【表１−１３】
2017506506.tif 000015
【表１−１４】
2017506506.tif 000016
【００６４】
特定の例示的態様において、表１に記載するバイオマーカーの全てまたは一部を発現サインに使用し得る。例えば、表１のバイオマーカーを含む発現サインを、本明細書中に提供する方法を使用して作成してよく、該発現サインは、表１に示すマーカーセットの１つおよび全て、および間のそれぞれのおよび全ての組み合わせ(例えば、４個の選択されたマーカー、１６個の選択されたマーカー、７４個の選択されたマーカーなど)を含み得る。いくつかの態様において、発現サインは、少なくとも５個、１０個、２０個、４０個、６０個、１００個、１５０個、２００個または３００個またはそれより多くのマーカーを含む。他の態様において、予測的バイオマーカーパネルは、５個以下、１０個以下、２０個以下、４０個以下、６０個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下または７００個以下のマーカーを含む。一の例示的な態様において、発現サインは表１に挙げる複数のマーカーを含む。いくつかの態様において、発現サインは、表１に挙げたマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％を含む。選択した発現サインを、本明細書に記載の方法および類似した当技術分野で知られる方法を使用して提供されるバイオマーカーから組み立てることができる。一の態様において、発現サインは、表１の全ての遺伝子および遺伝子産物を含む。
【００６５】
４. 数学モデル
次の方法を使用して、抗血管新生治療剤に対して応答性または非応答性である対象を区別するための、または特定のがんタイプの予後指標としての、上記のバイオマーカー由来の発現サインを含む、発現サインを得ることができる。他の特定の例示的態様において、発現サインを、線形、斜め線形、二次およびロジスティック判別分析、ＰＡＭ (Prediction Analysis for Microarray、(Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572))またはＳＩＭＣＡ (Soft Independent Modeling of Class Analogy、(Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139))解析を含むが、これらに限定されない、決定ツリー(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、ランダムフォレスト(Breiman, 2001 Random Forests, Machine Learning 45:5)、ニューラル・ネットワーク(Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、判別分析(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)を使用して導く。
【００６６】
バイオマーカー発現値を、種々の強度の実規模での対応するスカラー重みと組み合わせて定義してよく、これを、さらに、線形または非線形、代数的、三角法または相関手段を経て、代数的、統計的学習、ベイジアン、回帰または類似のアルゴリズムを介して単一スカラー値に併せ、これは、スカラー値上の数学的に導かれる決定関数と共に予測的モデルを提供し、これにより、サンプル由来の発現プロファイルを、特定の薬物、薬物群、分子サブタイプまたは処置レジメンに対するレスポンダーまたは非レスポンダー、耐性または非耐性の別個の群に分解し得る。バイオマーカーメンバーシップを含むこのような予測的モデルは、薬物応答および／または耐性が知られる歴史的患者サンプルからの代表的発現プロファイルのセットから、交差検証、ブートストラッピングまたは類似するサンプリング技術下に、感度、特異性、陰性および陽性予測的値、ハザード比またはこれらの組み合わせのいずれかに対して最適化された、重み学習および判定閾値により開発される。
【００６７】
一の態様において、バイオマーカーを使用してこれらのシグナルの加重和を形成し、ここで、個々の重みは陽性でも陰性でもよい。得られた和(「発現スコア」)を定義済み対照点または値と比較する。対照点または値との比較を、臨床状態または臨床成績の診断または予測に使用し得る。
【００６８】
上記のとおり、当業者は、表１で提供する分類指標に含まれるバイオマーカーが、臨床予後の決定のための分類指標において、同等ではない重みを持つことを認識する。それゆえに、わずか１個のバイオマーカーを、臨床予後または治療剤に対する応答の診断または予測に使用し得るが、特異性および感度、または診断もしくは予測精度はバイオマーカーが多いほど上昇し得る。
【００６９】
本明細書で使用する用語「重み」は、統計的計算における項目の絶対的な大きさを指す。遺伝子発現分類指標における各バイオマーカーの重みを、当技術分野で公知の学習方法を使用して、患者サンプルのデータセットで決定し得る。本明細書で使用する用語「バイアス」または「オフセット」は、トレーニングセットにおけるサイン遺伝子の平均発現を使用して導いた定数項を指し、試験データセットで解析される各遺伝子の中心に併せることを意味するために使用される。
【００７０】
特定の例示的な態様において、発現サインを決定関数により決定する。決定関数は、線形分類指標を使用して導いた重み付けした発現値のセットである。全ての線形分類指標は、次の等式:
【数２】
2017506506.tif 000017
を使用して決定関数を決定する。
【００７１】
ある特定のサンプルのマイクロアレイ遺伝子発現強度Ｘｉのような全測定値をベクトルｘに集める。次いで、各強度を対応する重みｗｉで乗算し、オフセット項ｂを加算して、決定関数ｆ(ｘ)の値を得る。決定関数を導くとき、線形分類指標は、さらに、遺伝子発現データ領域を2個の互いに素なセクションに分ける閾値をさらに決定する。線形分類指標の例としては、部分最小二乗法(ＰＬＳ)(Nguyen et al., Bioinformatics 18 (2002) 39-50)、サポートベクターマシン(ＳＶＭ)(Schoelkopf et al., Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)および縮小判別分析(ＳＤＡ)(Ahdesmaeki et al., Annals of applied statistics 4, 503-519 (2010))が挙げられるが、これらに限定されない。一つの例示的態様において、線形分類指標はＰＬＳ線形分類指標である。
【００７２】
決定関数は、例えば良好または不良な臨床予後を示す患者からの、大きなトレーニングサンプルセット上で経験的に導かれる。閾値は、特定の治療的処置の前後の臨床予後を含むが、これに限定されない異なる特徴に基づき、患者群を分ける。この量の解釈、すなわちカットオフ閾値は、成績が知られている患者のセットからの開発段階(「トレーニング」)で得られる。決定スコアについての対応する重みおよび応答性／耐性カットオフ閾値は、当業者に公知の方法により、トレーニングデータから推測的に固定される。一の例示的な態様において、部分最小二乗法判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を重みの決定に使用する(L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50)。
【００７３】
実際上、これは、データ領域、すなわちバイオマーカー発現値の全ての可能な組み合わせのセットを、異なる臨床的分類または予測に対応する、２つの背反する群、例えば、良好な臨床予後と不良な臨床予後に分けることを意味する。全体的分類指標において、特定のバイオマーカーの相対的過剰発現は、判定スコアを上昇 (正の重み)または低下(負の重み)させることができ、それにより、例えば、良好な臨床予後の、全体的決定に寄与する。
【００７４】
本発明の特定の例示的な態様において、データを、上記のとおり加重和を適用する前に非線形的に変換する。この非線形変換は、データの次元性の増加を含む可能性がある。非線形変換および加重総和法はまた、例えば、核関数の使用を介して、陰関数により実施される可能性がある(Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)。
【００７５】
特定の例示的な態様において、患者トレーニングセットデータは、対応するがん組織サンプルセットからＲＮＡを単離し、単離ＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズすることにより発現値を測定することにより導く。特定の例示的態様において、発現サインを導くのに使用するマイクロアレイはトランスクリプトームアレイである。本明細書で使用する「トランスクリプトームアレイ」は、目的の罹患組織において発現されることが立証されている配列にハイブリダイズするように設計されたプローブセットを含むマイクロアレイを指す。組織および生物学的状況での選択的スプライシングおよび可変性ポリＡテイルプロセシングを考慮すると、他の組織源または生物学的状況に由来する同じ遺伝子配列に対して設計したプローブは、目的の罹患組織において発現する転写物に効果的に結合せず、潜在的に関連する生物学的情報の損失に至る可能性がある。したがって、どの配列が目的の罹患組織で発現するかを、マイクロアレイプローブセットを得る前に検証することは有益である。特定の疾患状況で発現された配列の検証は、例えば、罹患組織サンプルセットから全ＲＮＡを単離および配列決定し、単離配列と公知の核酸配列データベースを相互参照して、トランスクリプトームアレイ上のプローブセットが目的の罹患組織で実際発現している配列に対して設計されていることを検証することにより行い得る。トランスクリプトームアレイの製造方法は、米国特許出願公開第２００６／０１３４６６３号明細書に記載されており、当該文献は、引用により本明細書に包含される。特定の例示的態様において、トランスクリプトームアレイのプローブセットを転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するように設計する。標的転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するプローブセットを備えたトランスクリプトームアレイを設計する方法は、米国特許出願公開第２００９／００８２２１８号明細書に記載されており、これを引用により本明細書に包含させる。特定の例示的態様において、本発明の遺伝子発現プロファイルを導くのに使用するマイクロアレイは、Almac Ovarian Cancer DSATMマイクロアレイ(Almac Group, Craigavon, United Kingdom)である。
【００７６】
最適な線形分類指標を、「曲線下面積」(ＡＵＣ)のような診断を使用して、線形分類指標の性能を評価することにより選択できる。ＡＵＣは、受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線の曲線下面積を指し、このいずれも当分野で公知である。ＡＵＣ尺度は、完全データ範囲にわたる分類指標の精度の比較に有用である。線形分類指標のＡＵＣが高い程、未知のものを目的の２群(例えば、卵巣がんサンプルと正常または対照サンプル)に正確に分類する能力が高い。ＲＯＣ曲線は、２つの集団(例えば、治療剤に応答する個体および、応答しない個体)の区別において、特定の特性(例えば、ここに記載するバイオマーカーのいずれかおよび／または付加的生物医学的情報のいずれかの項目)の性能をプロットするのに有用である。典型的には、集団全体(例えば、症例と対照)にわたる特性データを、単一特性の値に基づき昇順でソートする。次いで、この特性の各値について、データの真陽性率および偽陽性率を計算する。真陽性率は、この特性について該値を超える症例の数を計数し、陽性症例の総数で除算することにより決定する。偽陽性率は、この特性について該値を超える対照の数を計数し、対照の総数で除算することにより決定する。この定義は、特性が対照と比較して症例で上昇しているシナリオを参照しているが、特性が対照と比較して症例で低下しているシナリオにもこの定義は適用される(このようなシナリオにおいて、この特性について該値を下回るサンプルを計数する)。ＲＯＣ曲線は単一特性と同様に他の単一結果で作成でき、例えば、２個以上の特性の組み合わせを数学的に併せ(例えば、加算、減算、乗算など)、単一合計値を得ることができ、この単一合計値をＲＯＣ曲線にプロットしてよい。さらに、単一結果値を導く複数特性のあらゆる組み合わせをＲＯＣ曲線にプロットしてよい。これらの特性の組み合わせは試験を構成し得る。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率(１−特異性)に対する試験の真陽性率(感度)のプロットである。
【００７７】
一の例示的な態様において、血管新生発現サインは、表２に詳述する対応するランク、重みおよび関係するバイアスまたは、例えば、病状に依存する他のランク付け、重み付けおよび関連するバイアスを有する、表２に詳述する６３個のバイオマーカーに関する。表２は、化合物決定スコア関数において、例示的分類指標における重みの絶対値が小さくなる順で、バイオマーカーをランク付けする。本発明の方法は、１個以上、最大で全ての表２に記載のバイオマーカーを測定することに依存し得る。本発明の方法は、表２に記載のバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０個またはそれぞれの発現レベルを測定することを含んでいてよい。特定の態様において、本方法は、表２に記載のバイオマーカーの２〜５個の発現レベルを測定することを含んでいてよい。
【表２−１】
2017506506.tif 000018
【表２−２】
2017506506.tif 000019
【００７８】
他の例示的な態様において、血管新生発現サインは、表３に詳述する対応するランクまたは、例えば、病状に依存する他のランクを有する、表３に詳述する６３個のバイオマーカーに関する。表３は、化合物決定スコア関数において、例示的な分類指標における、重みの絶対値が小さくなる順に、バイオマーカーをランク付けする。本発明の方法は、表３に記載の１個以上、最大全てのバイオマーカーを測定することに依存し得る。本発明の方法は、表３のバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０個またはそれぞれの発現レベルを測定することを含んでいてよい。特定の態様において、該方法は、表３のバイオマーカーの２〜５個の発現レベルを測定することを含んでいてよい。
【００７９】
【表３−１】
2017506506.tif 000020
【表３−２】
2017506506.tif 000021
【００８０】
バイオマーカーの発現を測定するのに使用し得るプローブセットを表４に示す。
【表４−１】
2017506506.tif 000022
【表４−２】
2017506506.tif 000023
【表４−３】
2017506506.tif 000024
【表４−４】
2017506506.tif 000025
【表４−５】
2017506506.tif 000026
【００８１】
【表４−６】
2017506506.tif 000027
【００８２】
一の例示的な態様において、発現サインは、次のバイオマーカー：ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３、ＲＴＰ４、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＲＡＲＲＥＳ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＮＵＡＫ１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＳＲＰＸ、ＳＰＡＲＣ、ＧＪＢ１、ＴＩＭＰ３、ＩＳＬＲ、ＴＵＢＡ１Ａ、ＤＥＸＩ、ＢＡＳＰ１、ＰＸＤＮ、ＧＢＰ４、ＳＬＣ２８Ａ３、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＴＡＰ２、ＡＣＳＬ５、ＣＤＨ１１、ＰＳＭＢ９、ＭＭＰ１４、ＣＤ７４、ＬＯＸＬ１、ＣＩＩＴＡ、ＺＮＦ６９７、ＳＨ３ＲＦ２、ＭＩＲ１９８、ＣＯＬ１Ａ２、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＣＯＬ８Ａ１、Ｃ２１ｏｒｆ６３、ＴＡＰ１、ＰＤＰＮ、ＲＨＯＢＴＢ３、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＬＡ−ＤＯＢ、ＸＡＦ１、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＰＯＬＤ２、ＤＰＹＳＬ２、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＤ３、ＣＦＢ、ＮＩＤ１、ＦＫＢＰ７、ＴＩＭＰ２、ＲＣＢＴＢ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＥＮＴＰＤ７、ＳＨＩＳＡ４およびＨＩＮＴ１の全てまたは一部を含む。
【００８３】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００８４】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００８５】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、ＬＯＸＬ１ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【００８６】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００８７】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１、ＣＤＲ１、ＭＡＴＮ３、ＳＯＸ１１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＣＯＬ３Ａ１ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【００８８】
他の例示的態様において、発現サインはＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００８９】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ８Ａ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＭＭＰ１４ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【００９０】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００９１】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【００９２】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４ならびに表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５である。
【００９３】
他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａを含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ８Ａ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＭＭＰ１４を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１、ＣＤＲ１、ＭＡＴＮ３、ＳＯＸ１１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＣＯＬ３Ａ１を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくともＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、ＬＯＸＬ１を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１を含む。他の例示的な態様において、発現サインは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７を含む。
【００９４】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＧＦ２および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【００９５】
他の例示的な態様において、発現サインはＳＯＸ１１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【００９６】
他の例示的な態様において、発現サインはＩＮＳおよび表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【００９７】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＸＣＬ１７および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【００９８】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＤＲ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【００９９】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＯＬ３Ａ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１００】
他の例示的な態様において、発現サインはＳＰＡＲＣおよび表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０１】
他の例示的な態様において、発現サインはＴＩＭＰ３および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０２】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＯＬ８Ａ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０３】
他の例示的な態様において、発現サインはＮＵＡＫ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０４】
他の例示的な態様において、発現サインはＭＡＴＮ３および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０５】
他の例示的な態様において、発現サインはＴＭＥＭ４５Ａおよび表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０６】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＸＣＲ２Ｐ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０７】
他の例示的な態様において、発現サインはＳＲＰＸおよび表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０８】
他の例示的な態様において、発現サインはＣＤＨ１１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１０９】
他の例示的な態様において、発現サインはＢＣ１１Ａおよび表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１１０】
他の例示的態様において、発現サインはＬＯＸＬ１および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１１１】
他の例示的態様において、発現サインはＭＭＰ１４および表２のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１１２】
他の例示的態様において、例示的な発現サインは、表２に挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー重み値を含む。他の例示的な態様において、例示的な発現サインは表２に挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー重み値からなる。他の例示的な態様において、例示的な発現スコアは、表３に記載のバイオマーカーおよびランクを含む。他の例示的な態様において、例示的な発現サインは、表３に記載のバイオマーカーおよび対応するランクからなる。
【０１１３】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために、個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルは、表２または３に記載のバイオマーカーの全てまたは一部を含む。
【０１１４】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【０１１５】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【０１１６】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、ＬＯＸＬ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【０１１７】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【０１１８】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１、ＣＤＲ１、ＭＡＴＮ３、ＳＯＸ１１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＣＯＬ３Ａ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【０１１９】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【０１２０】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ８Ａ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＭＭＰ１４ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【０１２１】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。
【０１２２】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３である。
【０１２３】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５である。
【０１２４】
他の例示的な態様において、バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａを含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ８Ａ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＭＭＰ１４を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＲ１、ＳＲＰＸ、ＭＡＴＮ３を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１、ＣＤＲ１、ＭＡＴＮ３、ＳＯＸ１１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＣＯＬ３Ａ１を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＮＵＡＫ１を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくともＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、ＬＯＸＬ１を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＯＬ８Ａ１を含む。他の例示的な態様において、該バイオマーカーパネルは、少なくとも、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７を含む。
【０１２５】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１２６】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＯＸ１１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１２７】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＮＳならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１２８】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＸＣＬ１７ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１２９】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＰＡＲＣならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３０】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＴＭＥＭ４５Ａならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３１】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＯＬ８Ａ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３２】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＯＬ３Ａ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３３】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＤＲ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３４】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＮＵＡＫ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３５】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＴＩＭＰ３ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３６】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＬＯＸＬ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３７】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＸＣＲ２Ｐ１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３８】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＰＡＲＣならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１３９】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＭＡＴＮ３ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４０】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＮＯＲＤ１１４−１４ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４１】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＲＰＸならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４２】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＤＨ１１ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４３】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＢＣ１１Ａならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４４】
さらなる局面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＭＭＰ１４ならびに表２または３に挙げるバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。
【０１４５】
発現サインを使用する新規試験サンプル分類
上記のような発現サインを使用して新規試験サンプルを分類するために、がん組織における１個以上のバイオマーカーの相対的発現レベルを測定して、試験サンプル発現プロファイルを作成する。特定の例示的な態様において、試験サンプル発現プロファイルを化合物決定スコア(「発現スコア」)の形で要約し、患者データのトレーニングセットから数学的に導かれる閾値スコアと比較する。スコア閾値は、良好/不良臨床予後を含むが、これに限定されない、特徴に基づき患者群を異なる群に分けることができる能力を最大化するために、確立する。患者トレーニングセットデータは、好ましくは予後、再発の可能性、長期生存、臨床成績、処置応答、診断、がん分類または個別化ゲノミクスプロファイルにより特徴付けされているがん組織サンプルに由来する。患者サンプルからの発現プロファイルおよび対応する決定スコアを、トレーニングセットにおける、数学的に導かれるスコア決定閾値の同じ側にある患者サンプルの特徴と相関させ得る。特定の例示的な態様において、線形分類指標スカラー出力の閾値を、トレーニングデータセット内で観察された交差検証下の感度および特異性の和を最大化するために最適化する。
【０１４６】
異なる量の出発物質、抽出および増幅反応の効率変動などについて補正するために、サンプルの全体的発現データを、当業者に知られる方法を使用して正規化する。
【０１４７】
一の態様において、患者組織サンプルのバイオマーカー発現プロファイルを線形分類指標で評価する。本明細書で使用する、線形分類指標は、個々のバイオマーカー強度の化合物決定スコア(「決定関数」)への加重和を指す。次いで、サンプルがスコア閾値と同等であるか、もしくは、上回るか(決定関数正)または、下回るか (決定関数負)を示す、感度および特異性の観点でのある設定値に対応する、定義済みカットオフスコア閾値と、決定スコアを比較する。
【０１４８】
正規化データで線形分類指標を使用して診断または予後コール(例えば良好または不良な臨床予後)を作成するのは、データ領域を分ける、すなわち分類指標における全遺伝子の発現値の全ての可能な組み合わせを、分離超平面の手段により２個の互いに素なセグメントに分ける、効果的な手段である。この分割は、例えば治療剤に応答性または耐性を示す患者からの、例示的な大きなトレーニングセットにおいて経験的に導かれる。普遍性を損なうことなく、一つを除いて全てのバイオマーカーについてある特定の固定された値のセットを仮定でき、これにより、例えば、治療剤に対する応答性または耐性から判定が変わるところで、この残ったバイオマーカーの閾値が自動的に決定される。この動的閾値を上回る発現値は、不良臨床予後(負の重みを有するバイオマーカーについて)または良好臨床予後(正の重みを有するバイオマーカーについて)を示す。この閾値の厳密な値は、分類指標内の他の全てのバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルに依存するが、特定のバイオマーカーの一般的指標は固定されたままであり、すなわち高値または「相対的過剰発現」は常に良好臨床予後(正の重みを有する遺伝子)または不良臨床予後(負の重みを有する遺伝子)に貢献する。したがって、全体的遺伝子発現分類指標において、相対的発現は、特定のバイオマーカーの上方制御または下方制御のいずれが良好または不良な臨床予後の指標であるかを示し得る。特定の例示的な態様において、閾値発現スコアを上回るサンプル発現スコアは、対象が非血管新生サブタイプを有することを示す。特定の他の例示的な態様において、閾値スコアを上回るサンプル発現スコアは、対象が、閾値スコアを下回るサンプル発現スコアを示す対象と比較して、良好な臨床予後を有することを示す。特定の他の例示的な態様において、閾値スコアを上回るサンプル発現スコアは、抗血管新生剤を投与した場合に、対象が、有害な効果を受けるか、または、予後が不良になる可能性があることを示す。
【０１４９】
試験サンプルの発現プロファイルを測定するための多数の適切な方法があり、該方法は、アッセイするバイオマーカーの種類に依存する。生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの測定は、該生物学的サンプルにおける対応する蛋白質レベルの検出の代用として使用し得る。したがって、本明細書に記載するバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれも、適当なＲＮＡの検出により検出できる。遺伝子発現プロファイリングの方法としては、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲと、それに続くｑＰＣＲ)で測定される。ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製するために使用する。該ｃＤＮＡを、ＤＮＡ増幅過程が進行するに連れて蛍光を発するように、ｑＰＣＲアッセイに使用し得る。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡコピー数のような絶対測定値を生じ得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲは、全て、キャピラリー電気泳動と組み合わせて、サンプルにおけるｍＲＮＡの発現レベルの測定に使用されている。Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004参照。
【０１５１】
ｍｉＲＮＡ分子は、非コードであるが、遺伝子発現を制御し得る低分子ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適する方法は、いずれも対応するｍｉＲＮＡについて使用し得る。近年、多くの研究所で、疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用が検討されている。多くの疾患は、広汎な転写制御が関与し、ｍｉＲＮＡのバイオマーカーとしての役割が発見されたとしても驚きではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患の関係は、蛋白質レベルと疾患の関係よりもはるかに不明であることがしばしばであるが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの値は実質的なものであり得る。言うまでもないことであるが、疾患によって差次的に発現されるＲＮＡと同様、インビトロ診断製品の開発中に直面する問題としては、ｍｉＲＮＡが罹患細胞で生存し、解析のために容易に抽出されるか、またはｍｉＲＮＡが血中または他のマトリックスに遊離され、その場所で、測定するのに十分長く生存しなければならないとの要件が挙げられる。蛋白質バイオマーカーも類似の要件を有するが、多くの潜在的蛋白質バイオマーカーが、疾患の間、病変部位で、傍分泌により選択的に分泌され、機能する。多くの潜在的蛋白質バイオマーカーが、これらの蛋白質が合成される細胞の外側で機能するようになっている。
【０１５２】
遺伝子発現は、質量分析方法を使用して評価してもよい。質量分析計の種々の配置を使用してバイオマーカー値を検出できる。数種の質量分析計が利用可能であるかまたは種々の設計で製造し得る。一般的に、質量分析計は、主として、サンプル注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系および装置制御系およびデータ系によって構成される。サンプル注入口、イオン源および質量分析器の差により、一般に装置のタイプおよびその性能が決定される。例えば、注入口はキャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であっても、マトリックス支援レーザー脱離に使用されるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器としては、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析器および飛行時間型質量分析器が挙げられる。さらなる質量分析方法は当分野で周知である(Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)参照)。
【０１５３】
蛋白質バイオマーカーおよびバイオマーカー値を、次のいずれか：エレクトロスプレーイオン化質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／(ＭＳ)ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析(ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)、シリコン上の脱離／イオン化(ＤＩＯＳ)、二次イオン質量分析(ＳＩＭＳ)、四重極飛行時間型(Ｑ−ＴＯＦ)、ultraflex III TOF/TOFと呼ばれるタンデム飛行時間型(ＴＯＦ／ＴＯＦ)技術、大気圧化学イオン化質量分析(ＡＰＣＩ−ＭＳ)、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−(ＭＳ).ｓｕｐ.Ｎ、大気圧光イオン化質量分析(ＡＰＰＩ−ＭＳ)、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＡＰＰＩ−(ＭＳ).ｓｕｐ.Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析(ＦＴＭＳ)、定量的質量分析およびイオントラップ質量分析、を使用して検出および測定し得る。
【０１５４】
サンプル調製戦略を使用して、蛋白質バイオマーカーの質量分光学的な定性分析およびバイオマーカー値の決定の前に、サンプルを標識および濃縮する。標識方法としては、相対的および絶対的定量のための同重体標識(ｉＴＲＡＱ)および細胞培養物におけるアミノ酸での安定同位体標識(ＳＩＬＡＣ)が挙げられるが、これらに限定されない。質量分光分析に先だって、候補バイオマーカー蛋白質についてサンプルを選択的に濃縮するのに使用する捕捉剤としてはアプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体スキャフォールド(例えば二重特異性抗体等)、刷り込みポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体および合成受容体ならびにこれらの修飾物およびフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
前記アッセイは、患者の臨床予後を決定し、適当な処置レジメンを選択する方法において有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、該方法は、個体からの生物学的サンプルにおいて、表１または表２に示すバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する、少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出することを含み、バイオマーカー値を使用する分類は、下に詳述するように、該個体が、良好な予後を有するか、もしくは不良な予後を有するか、または、特定の治療剤を投与する場合に、有害な効果を受けるか、もしくは有益な効果を受けるかを示す。記載した予測的バイオマーカーのいくつかは、臨床予後予測に単独で有用であるが、２個以上のバイオマーカーのパネルとして、それぞれ有用であるバイオマーカーの複数のサブセットのグループ分けの方法も本明細書に記載する。したがって、本発明の多様な態様は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここで、Ｎは少なくとも３個のバイオマーカーである。Ｎは上記範囲、ならびに類似であるが、より高次の範囲のいずれかから選択される任意の数であることは理解されることである。本明細書に記載する任意の方法によって、バイオマーカー値を個々に検出および分類しても、または、例えば多重アッセイフォーマットにおけるように、集合的に検出および分類してもよい。
【０１５６】
ｂ)マイクロアレイ方法
一の態様において、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」(本明細書では「マイクロアレイ」とも称する)を利用する。マイクロアレイを、細胞におけるバイオマーカーの発現の解析に、特にがん組織のバイオマーカーの発現の測定に使用し得る。
【０１５７】
一の態様において、バイオマーカーアレイを、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能に標識されたポリヌクレオチド(例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成した蛍光標識ｃＤＮＡまたは標識ｃＲＮＡ)をマイクロアレイにハイブリダイズすることにより調製する。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノムにおける多くの遺伝子、好ましくは遺伝子の大部分またはほとんど全ての産物のための、規則正しく配列した結合(例えば、ハイブリダイゼーション)の部位を有する表面である。マイクロアレイは当分野で知られる多くの方法で製造できる。どのように製造しても、マイクロアレイは、一定の特徴を共有する。アレイは再現性があり、アレイの複数コピーの製造と互いの容易な比較を可能にする。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常５cm２より小さく、結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)条件下で安定な物質から製造される。マイクロアレイにおける特定の結合部位または独特の結合部位のセットは、細胞における単一遺伝子の産物と特異的に結合する。具体的態様において、各位置に付着させた公知配列の核酸を含む、位置指定の可能なアレイを使用する。
【０１５８】
細胞のＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを作製し、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズするとき、任意の特定の遺伝子に対応する、アレイ中の部位へのハイブリダイゼーションレベルが、該遺伝子／バイオマーカーから転写されたｍＲＮＡの細胞内の分布を反映することは理解されることである。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な、検出可能に(例えば、フルオロフォアで)標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズするとき、細胞において転写されない遺伝子に対応する(すなわち、遺伝子の産物と特異的に結合できる)アレイ上の部位のシグナル(例えば、蛍光シグナル)はわずかであるか、シグナルは全くなく、コードされているｍＲＮＡが分布している遺伝子は、相対的に強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、プローブが特異的アレイ部位に「特異的に結合」または「特異的にハイブリダイズ」するように選択し、すなわち、プローブは、相補性核酸配列を有する配列アレイ部位とハイブリダイズ、二本鎖化または結合するが、非相補性核酸配列を有する部位とはハイブリダイズしない。本明細書において、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基以下であれば、標準塩基対形成法則を使用してミスマッチがないとき、または、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基より長いならば、ミスマッチが５％を超えないとき、あるポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと相補的であると見なす。ポリヌクレオチドは完全に相補的(ミスマッチなし)であることが好ましい。慣用的な実験を使用した、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することにより、特異的ハイブリダイゼーション条件が特異的なハイブリダイゼーションを生じることを示すことができる。
【０１５９】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、オリゴマー対２００塩基より大きいポリヌクレオチド)および種類(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ)による。核酸のための特異的(すなわち、ストリンジェント)なハイブリダイゼーション条件の一般的パラメータは、Sambrook et al.、上掲およびAusubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing and Wiley-interscience, NY (1987)に記載され、当該文献は、その全体が、全ての目的のために本明細書に包含される。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用するとき、典型的ハイブリダイゼーション条件は、０.２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中、６５℃で４時間のハイブリダイゼーションおよび、それに続く、２５℃における低ストリンジェントな洗浄緩衝液(０.２％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ)での洗浄、続いて１０分間、２５℃における、高ストリンジェントな洗浄緩衝液(０.２％ＳＤＳを含む０.１ＳＳＣ)での洗浄である(Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996)参照)。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen, “Hybridization With Nucleic Acid Probes”, Elsevier Science Publishers B.V. (1993)およびKricka, “Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Academic Press, San Diego, Calif. (1992)に示される。
【０１６０】
ｃ)免疫アッセイ方法
免疫アッセイ方法は、抗体の、その対応する標的または分析物への反応に基づくものであり、具体的なアッセイフォーマットによりサンプル中の分析物を検出できる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異性および感度を改善するために、モノクローナル抗体がしばしば使用されるが、これは、エピトープ認識が特異的であるためである。ポリクローナル抗体もまた、モノクローナル抗体免疫アッセイと比較して、標的に対する親和性が高いため、多様な免疫アッセイにおいて成功裏に使用されている。免疫アッセイフォーマットは定性的、半定量的および定量的結果を提供するように設計されている。
【０１６１】
定量的結果は、濃度が知られている、検出する具体的な分析物で作成した標準曲線の使用を介して作製してよい。未知サンプルからの応答またはシグナルを標準曲線にプロットし、未知サンプル中の標的に対応する量または値を確立する。
【０１６２】
多数の免疫アッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物／バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の結合に依存し、標識成分は、直接的または間接的に、酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接、間接、競合またはサンドイッチ検出のためのフォーマットでよい。他の方法は、例えば、放射性同位体(Ｉ１２５)または蛍光のような標識に依存する。さらなる技術としては、例えば、凝集、比濁分析、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイおよびその他が挙げられる(ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law、Taylor &#38; Francis, Ltd.により出版、2005 edition参照)。
【０１６３】
アッセイフォーマットの例としては、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ、蛍光、化学発光および蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)または時間分解ＦＲＥＴ(ＴＲ−ＦＲＥＴ)免疫アッセイが挙げられる。バイオマーカーの検出方法の例としては、バイオマーカーおよびそれに続く、免疫沈殿ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなどのようなサイズおよびペプチドレベルの区別を可能にする定量的方法が挙げられる。
【０１６４】
検出可能標識またはシグナル発生物質を検出および／または定量する方法は標識の性質による。適当な酵素(検出可能標識は酵素である；上記参照)により触媒される反応産物は、非限定的に、蛍光性、発光性または放射性であってよく、または可視光または紫外線を吸収してよい。このような検出可能標識の検出に適する検出器の例は、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーターおよび濃度計を含むが、これらに限定されない。
【０１６５】
検出のためのあらゆる方法を、反応物のあらゆる適切な調製、処理および解析を可能にするあらゆるフォーマットで実施してよい。これは、例えば、多ウェルアッセイプレート(例えば、９６ウェルまたは３８４ウェル)中または任意の適切なアレイまたはマイクロアレイの使用であり得る。多様な試薬の原液を手動でまたはロボット制御で製造し、その後のピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベート、サンプル読み出し、データ収集および解析の全てを、市販の解析ソフトウェア、ロボット工学および検出可能標識の検出可能な検出器具類を使用してロボット制御で実施してよい。
【０１６６】
キット
本明細書に記載する方法を実施するための試薬、ツールおよび／または指示書をキットで提供してよい。例えば、キットは、がん患者の適当な治療を決定するための試薬、ツールおよび指示書を含み得る。このようなキットは、生検によるような患者から組織サンプルを採取するための試薬および該組織を処理するための試薬を含む。キットはまた、患者のサンプルにおける遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルを決定するための核酸増幅(例えばＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ)、配列決定(例えば次世代配列決定)、ノーザンブロット、プロテオミクス解析または免疫組織化学を実施するための試薬のような、遺伝子または遺伝子産物発現分析を実施するための１種以上の試薬を含み得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマー、ノーザンブロット分析を実施するためのプローブおよび／またはウェスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ分析のようなプロテオミクス分析を実施するための抗体を、このようなキットが含んでよい。アッセイのための適当な緩衝液も含むことができる。これらのアッセイに必要な任意の検出試薬も含んでよい。適当な試薬および方法を下にさらに詳述する。キットは、表２におけるバイオマーカーの少なくとも１個(最大全て)の発現レベルを検出するための適切なプライマーおよび／またはプローブを含み得る。発現を蛋白質レベルで測定する場合、キットは目的の蛋白質に特異的な結合試薬を含み得る。結合試薬は、その全てのフラグメントおよび誘導体を含むために、抗体を含み得る。本発明の多様な態様の文脈において、用語「抗体」は、関係のある蛋白質に対する特異的結合親和性を有する全ての免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子(例としては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの組み合わせおよび任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスのような哺乳動物において免疫応答中に生じる類似分子が挙げられるが、これらに限定されない)を含む。本発明の多様な態様において有用な具体的免疫グロブリンとしては、ＩｇＧアイソタイプが挙げられる。本発明の多様な態様において有用な抗体は、本来はモノクローナルでもポリクローナルでもよいが、典型的にモノクローナル抗体である。抗体はヒト抗体、非ヒト抗体または非ヒト抗体のヒト化バージョンまたはキメラ抗体であり得る。抗体のヒト化のための種々の技術は十分確立されており、任意の適切な技術を用いてよい。用語「抗体」はまた、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含むポリペチドリガンドも指し、関係のある蛋白質と特異的に結合する能力を維持する限り、全ての抗体誘導体およびフラグメントまで拡大される。これらの誘導体およびフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆｃフラグメントなどが挙げられる。抗体という用語は、重鎖および軽鎖の両者からなる抗体だけでなく、重鎖(のみ)抗体(これは、多様な軟骨魚類種またはラクダ科の動物に由来し得る)を含む。具体的な態様において、抗体を、２つ以上の蛋白質に特異的であるように、例えば本明細書に示すように、２つの標的蛋白質へ���結合を可能にするために二特異的であるように操作し得る(表２参照)。
【０１６７】
いくつかの態様において、該キットはまた、試験により応答性と予測された場合に投与する、特定の抗血管新生治療剤も含み得る。この薬剤は、特定の処置に合わせた形態、例えば剤形で提供し得る。キットは、適当な処置レジメンにしたがう投与のための、適切な指示書を備え得る。
【０１６８】
本明細書で考慮するキットは、遺伝子または遺伝子産物発現を測定するためのアッセイをどのように行うかを記載した指示書も含み得る。該指示書はまた、対照コホートにおける遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルをどのように測定するかおよび、試験する患者との比較のための対照を確立するためにどのように発現データを構築するかを含む、対照コホートをどのように決定するかの指示も含み得る。該指示書はまた、試験する患者における遺伝子または遺伝子産物発現のアッセイの実施および、該発現レベルを対照コホートにおける発現と比較し、次いで、試験した患者のための適当な化学療法を決定するための指示も含み得る。適当な化学療法を決定する方法は上に記載され、指示書に詳細に記載してよい。
【０１６９】
キットに含まれる情報資料は、本明細書に記載する方法および／または本明細書に記載する方法のための試薬の使用と関係する、説明的資料、指示的資料、マーケティング資料または他の試料であり得る。例えば、キットの情報資料は、特に、特定の治療剤に対してヒトが陽性応答を有する可能性に応用されるときに、キット使用者が遺伝子発現解析の実施および、結果の解釈に関する実質的な情報が得られる、問い合わせ先情報、例えば、医師のアドレス、メールアドレス、ウェブサイトまたは電話番号を含んでよい。
【０１７０】
本明細書で考慮するキットはまた、遺伝子産物マーカー発現から、患者が特定の治療剤に対して陽性応答を有する可能性を推測するために必要なソフトウェアも含んでよい。
【０１７１】
治療剤
上記のとおり、本明細書に記載する方法は、化学療法剤処置後、または、化学療法剤処置と組み合わせた、抗血管新生治療剤の投与時または投与後に、良好な臨床予後を有する、または不良な臨床予後を有するとして患者を分類することを可能にする。がんの処置に使用される現在のこのような抗血管新生治療剤は、次の薬剤：多標的経路阻害剤(ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ／ＦＧＦ／ＥＧＦＴ／ＦＬＴ−３／ｃ−ｋｉｔ)を含むＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤、免疫調節剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ特異的阻害剤としては、ベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、ＩＭＣ−１１２１Ｂ(ラムシルマブ)が挙げられるが、これらに限定されない。多標的経路阻害剤としては、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、ＢＩＢＦ１１２０(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アキシチニブ(ＡＧ013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９、ＴＫＩ−２５８が挙げられるが、これらに限定されない。アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤としては、ＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツマブ(ハーセプチン)が挙げられるが、これらに限定されない。内在性血管新生阻害剤としては、トロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファが挙げられるが、これらに限定されない。免疫調節剤としては、サリドマイドおよびレナリドマイドが挙げられるが、これらに限定されない。一の例示的な態様において、該抗血管新生剤は、ベバシズマブである。
【０１７２】
本発明を、次の番号付けした項においてさらに定義する。
１. 対象に抗血管新生治療剤を投与するかどうかを選択する方法であって、
対象から試験サンプルを得；
該対象から得た試験サンプルから、バイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、該バイオマーカーは表２または表３から選択される１個以上のバイオマーカーを含み；
バイオマーカーパネルについてのサンプル発現スコアを決定し；
サンプル発現スコアを閾値スコアと比較し；かつ
サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等であるかに基づき、処置を選択することを含み、該サンプル発現スコアが閾値スコアを上回る場合、該抗血管新生剤が禁忌である、方法。
２．対象が、がんに罹患している、項１に記載の方法。
３．がんが卵巣がんである、項２に記載の方法。
４．卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、項３に記載の方法。
５．対象が、化学療法処置を受けているか、または、受けたことがある、項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、項５に記載の方法。
７．化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、項６に記載の方法。
８．化学療法処置が、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与を含む、項６記載の方法。
９．抗血管新生治療剤がＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤および免疫調節剤である、項１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、ＩＭＣ−１１２１Ｂ(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、ＢＩＢＦ１１２０(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アキシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９、ＴＫＩ−２５８またはこれらの組み合わせを含む、項９に記載の方法。
【０１７３】
１１．アンジオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤がＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツマブ(ハーセプチン)またはこれらの組み合わせを含む、項１６に記載の方法。
１２．内在性血管新生阻害剤がトロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファまたはこれらの組み合わせを含む、項９に記載の方法。
１３．免疫調節剤がサリドマイドおよびレナリドマイドまたはこれらの組み合わせを含む、項９に記載の方法。
１４．ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブである、項１０記載の方法。
１５．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、項１〜１４のいずれか記載の方法。
１６．バイオマーカーパネルが表２に記載のバイオマーカーを含む、項１〜１４のいずれか記載の方法。
１７．発現スコアを、バイオマーカーパネル中の各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が、表２に定義される、項１６記載の方法。
１８．発現スコアを、バイオマーカーパネル中の各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に記載のように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、項１６記載の方法。
１９．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、項１〜１４のいずれか記載の方法。
２０．バイオマーカーパネルが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、項１〜１４のいずれか記載の方法。
【０１７４】
２１．対象の臨床予後を決定する方法であって：
がんに罹患している対象から試験サンプルを得;
該対象より得た試験サンプルからバイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、該バイオマーカーパネルは、表２から選択される１個以上のバイオマーカーを含み;
バイオマーカーパネルについてのサンプル発現スコアを決定し；
サンプル発現スコアを閾値スコアと比較し；かつ
サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかどうかに基づいて、該対象について臨床予後を決定することを含み、該サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るかまたは同等である場合、臨床予後が良好な予後である、方法。
２２．良好な予後が、閾値スコアを下回るサンプル発現スコアを有するサンプルと比較して、無増悪生存率または全生存率の上昇を示す、項２１記載の方法。
２３．がんが、卵巣がんである、項２１または２２記載の方法。
２４．卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、項２３記載の方法。
２５．化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、項２１〜２４のいずれか記載の方法。
２６．化学療法処置が、プラチナベースの化学療法剤、有糸分裂阻害剤またはその組合せの投与を含む、項２５記載の方法。
２７．化学療法処置が、パクリタキセルおよびカルボプラチンの投与を含む、項２５記載の方法。
２８．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、項２１〜２７のいずれか記載の方法。
２９．バイオマーカーパネルが、表２記載のバイオマーカーを含む、項２１〜２８のいずれか記載の方法。
【０１７５】
３０．発現スコアをバイオマーカーパネル中の各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が表２で定義される、項２９記載の方法。
３１．発現スコアをバイオマーカーパネルの各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に記載のように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、項２９記載の方法。
３２．バイオマーカーパネルがＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、項２１〜２８のいずれか記載の方法。
３３．該バイオマーカーパネルが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、項２１〜２８のいずれか記載の方法。
３４．ベバシズマブを対象に投与するかどうかを選択する方法であって:
プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いて処置されている、処置されたことがある、および/または処置される予定がある、卵巣がんに罹患している対象より得た試験サンプルにおいて;
表２から選択される１個以上、最大で全てのバイオマーカーの発現レベルを測定し;
１個以上のバイオマーカーについて、サンプル発現スコアを決定し;
該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較し；かつ
サンプル発現スコアが、閾値発現スコアを上回るかどうかに基づいて、処置を選択することを含み、サンプル発現スコアが閾値スコアを上回るか、または同等である場合、ベバシズマブが禁忌である、方法。
３５．卵巣がんが、漿液性卵巣がんを含む、項３４記載の方法。
３６．漿液性卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、項３５記載の方法。
３７．ベバシズマブが禁忌である場合、該患者をプラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いて処置する、項３４〜３５のいずれか記載の方法。
３８．該サンプル発現スコアが該閾値スコアを下回る場合、該対象を、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を、ベバシズマブとともに用いて処置する、項３４〜３７のいずれか記載の方法。
３９．プラチナベースの化学療法剤が、カルボプラチンを含む、項３４〜３８のいずれか記載の方法。
４０．有糸分裂阻害剤がタキサンを含み、パクリタキセルを含んでいてよい、項３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１７６】
４１．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、項３４〜４０のいずれか記載の方法。
４２．バイオマーカーパネルが表２に記載のバイオマーカーを含む、項３４〜４０のいずれか記載の方法。
４３．発現スコアを、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が表２に定義される、項４２記載の方法。
４４．発現スコアを、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に記載するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、項４２記載の方法。
４５．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、項３４〜４０のいずれかに記載の方法。
４６．バイオマーカーパネルが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、項３４〜４０のいずれかに記載の方法。
４７．対象の臨床予後を決定する方法であって：
ａ.  プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を用いて処置されている、処置されたことがある、および/または処置される予定がある、卵巣がんに罹患している対象より得た試験サンプルにおいて；
ｂ.  表２から選択される１個以上、最大で全てのバイオマーカーの発現レベルを測定すること；
ｃ.  １個以上のバイオマーカーについてサンプル発現スコアを決定すること;
ｄ.  該サンプル発現スコアを閾値スコアと比較すること; および
ｅ.  サンプル発現スコアが閾値発現スコアを上回るか、または同等であるかに基づいて、臨床予後を決定することを含み、該サンプル発現スコアが、閾値スコアを上回るか、または同等である場合、該臨床予後が良好な臨床予後である、方法。
４８．卵巣がんが、漿液性卵巣がんを含む、項４７に記載の方法。
４９．漿液性卵巣がんが、ハイグレード漿液性卵巣がんである、項４８に記載の方法。
５０．患者が良好な予後を示す場合、ベバシズマブを用いた処置が禁忌である、４７〜４８のいずれかに記載の方法。
【０１７７】
５１．サンプル発現スコアが、閾値スコアを下回る場合、該患者を、プラチナベースの化学療法剤および/または有糸分裂阻害剤を、ベバシズマブとともに用いて処置する、項４７〜５０のいずれか記載の方法。
５２．プラチナベースの化学療法剤が、カルボプラチンを含む、項４７〜５１のいずれか記載の方法。
５３．有糸分裂阻害剤が、タキサンを含み、パクリタキセルを含んでいてよい、項４７〜５２のいずれかに記載の製剤または方法。
５４．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、項４７〜５３のいずれか記載の方法。
５５．バイオマーカーパネルが、表２に記載のバイオマーカーを含む、項４７〜５３のいずれか記載の方法。
５６．発現スコアを、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重み値およびバイアス値が表２に定義される、項５５記載の方法。
５７．発現スコアを、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーについての重み値を用いて計算し、各バイオマーカーについての重みが、表３に記載するように、絶対値が順番に減少するようにランク付けされる、項５５記載の方法。
５８．バイオマーカーパネルが、ＩＧＦ２、ＣＤＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ３、ＩＮＳ、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＵＡＫ１、ＭＡＴＮ３、ＴＭＥＭ４５Ａの１個以上を含む、項４７〜５２のいずれかに記載の方法。
５９．バイオマーカーパネルが、ＩＮＳ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬＡ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＮＵＡＫ１、ＴＩＭＰ３、およびＭＭＰ１４の１個以上を含む、項４７〜５２のいずれか記載の方法。
【０１７８】
本発明をさらに次の実施例により説明するが、これは、決してそれに範囲を限定するものとして解釈してはならない。むしろ、本明細書の記載により、本発明の精神および／または末尾の特許請求の範囲から逸脱することなければ、多様な他の態様、修飾および同等物を有し得ることが当業者に示唆され得ることは、明確に理解するべきである。
【実施例】
【０１７９】
実施例１：組織プロセシング、階層クラスタリング、サブタイプ同定および分類指標構築
腫瘍材料
発現サインの例を、NHS LothianおよびUniversity of Edinburghから入手したマクロダイセクションした上皮性漿液性卵巣腫瘍ＦＦＰＥ組織サンプルのコホートの遺伝子発現解析から同定した。
【表５】
2017506506.tif 000028
【０１８０】
ＦＦＰＥからの遺伝子発現プロファイリング
全ＲＮＡを、マクロダイセクションしたＦＦＰＥ組織から、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換し、これを続いてWT-OvationTM FFPE RNA Amplification System V2(NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA)のＳＰＩＡ(登録商標)技術を使用して増幅し、一本鎖形態に変換した。増幅した一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-OvationTM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを、次いでAlmac Ovarian Cancer DSATMにハイブリダイズさせた。AlmacのOvarian Cancer DSATM研究ツールはＦＦＰＥ組織サンプルの解析に最適化されており、有用な保存された組織バンクの使用を可能とする。Almac Ovarian Cancer DSATM研究ツールは、正常およびがん性の両者の卵巣組織のトランスクリプトームを表す革新的マイクロアレイプラットフォームである。結果的に、Ovarian Cancer DSATMは、一般的なマイクロアレイプラットフォームでは利用不可能な、卵巣疾患および組織状況におけるトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイを、Affymentrix Genechip(登録商標) Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用して走査した。
【０１８１】
データ調製
プロファイルしたサンプルの品質管理(ＱＣ)を、ＭＡＳ５処理アルゴリズムを使用して実施した。平均ノイズおよびバックグラウンド均一性、現コールのパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質の種々の技術的側面に対処した。対応するパラメータの分布および中央絶対偏差を解析し、潜在的外れ値の特定に使用した。
【０１８２】
AlmacのOvarian Cancer DSATMは、３’末端から３００ヌクレオチド以内の領域を一次標的とするプローブを含む。それゆえに標準Affymetrix ＲＮＡ品質尺度を適用した−ハウスキーピング遺伝子に関しては、通常の３’／５’比に加えて、３’末端プローブセット強度対平均バックグラウンド強度の比と共に３’末端プローブセットの強度を使用した。ハイブリダイゼーション対照を確認して、それらの強度および現コールを、Affymetrixにより特定される要件に確実に一致させた。
【０１８３】
階層クラスタリングおよび機能解析
RMA (Robust Multi-array Average) を用いて、サンプルの前処理を行った[16]。分散を低下させ、強度を低下させ、ｃＤＮＡ収量に対する相関を上昇させることにより、データマトリクスを分類した。ｃＤＮＡ収量と相関した、プローブセットのフィルタリングの後、データマトリクスの増加的なサブセットを、クラスター安定性について調べた: ＧＡＰ統計 [17]を、サンプルおよびプローブセットクラスターの数を計算するのに適用し、クラスター構成の安定性を、分配比較法を用いて評価した [18,19]。最終的な最も可変的なプローブセットリストを、選択した数のサンプルクラスターの最小および最も安定したデータマトリクスに基づいて決定した。
【０１８４】
データマトリクスの中央プローブセット発現値への標準化後、ユークリッド距離およびウォード連結法（Ward's linkage method）を用いて、凝集型階層クラスタリングを行った [20]。サンプルおよびプローブセットクラスターの最適数を、ＧＡＰ統計を用いて決定した[17]。サンプルクラスター間の、臨床パラメータ因子レベルの分散の有意性を、ＡＮＯＶＡ (連続因子)またはカイ二乗解析(離散因子) を用いて評価し、ＦＤＲ（false discovery rate；ｐ値と実施した試験の数の積)について補正した。補正ｐ値の閾値（０．０５）を、有意性の基準として用いた。
【０１８５】
Ovarian Cancer DSA（登録商標）プローブセットを、Ensembl v60 [http://oct2012.archive.ensembl.org/]に基づいたアノテーションパイプラインを用いて、遺伝子に再配置した。Gene Ontology生物学的プロセス分類を用いて、クラスター遺伝子セットに関連していることが明らかになった生物学的エンティティーの同定およびランク付けのために、ＦＥＡ（Functional enrichment analysis）を行った[21]。エンティティーを統計的に得た濃縮スコアによりランク付けし [22]、多重検定に適合させた[23]。補正ｐ値０.０５を、有意性の閾値として用いた。同定した濃縮プロセスを、各プローブセット/遺伝子クラスターについて、全体的な集団機能に集約した。
【０１８６】
サイン開発および評価
サブタイプ同定の後、分子群の予測のために、遺伝子サインを開発した。異なるプラットフォーム上でプロファイルしたサンプルへのサインの適用を促進するために、全てのプローブセットをその中央発現値にまとめ、データをｌｏｇ２変換することにより、プローブセットを遺伝子に再配置した。ＰＬＳ（partial least squares）モデル[24]を、フィルタ特性選択に基づく特性/遺伝子の選択とともに用いて、５分割交差検証を１０回繰り返す間に、サイン作成を行った。
【０１８７】
一変量および多変量生存解析を、R 2.15.0の生存パッケージを用いて行った[25]。多変量解析を次の要因: ハイグレード漿液性: 診断時の減量(debulking)状態、ステージ、化学療法および年齢; Tothill: グレード、ステージ、ネオアジュバント処置および残存病変について補正した。全てのカプランマイヤーグラフは、生存データの単変量提示である。
【０１８８】
結果
２６５個のＨＧＳ腫瘍について、１４００の最も可変的なプローブセット（１０４０遺伝子に対応）に基づいて、非管理的階層クラスタリング (unsupervised hierarchical clustering)を行った。３つのサンプルクラスターおよび４つの遺伝子クラスターを同定した(図１)。ＨＧＳクラスターと臨床病理学的徴候の間には有意な相関は存在しなかった。機能解析 (図１) により、クラスターＨＧＳ３は、免疫応答および血管新生/血管発達に関連する遺伝子の上方制御により特徴付けられていることが明らかになった(以降Ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｅと称するクラスター)。クラスターＨＧＳ１は、(クラスターＨＧＳ３よりは明らかに低い程度であったが)血管新生/血管発達の上方制御と関連していたが、免疫応答に関連する遺伝子の高発現は伴っていなかった(以降Ａｎｇｉｏと称するクラスター)。クラスターＨＧＳ２は、血管新生または血管発達に関連する遺伝子の上方制御を伴わない、免疫応答に関連する遺伝子の上方制御により特徴付けられた(以降、Ｉｍｍｕｎｅと称するクラスター)。
【０１８９】
サブグループによる多変量生存解析より、Ｉｍｍｕｎｅクラスターの患者は、Ａｎｇｉｏｉｍｕｎｅクラスター (ＨＲ＝０.５８［０.４１〜０.８２］、ｐａｄｊ＝０.００１)およびＡｎｇｉｏクラスター (ＨＲ＝０.５５［０.３７〜０.８０］、ｐａｄｊ＝０.００１)の両方の患者と比較して、ＯＳが有意に延長していることが明らかになった。カプランマイヤー曲線を図２に示す(単変量ＨＲおよびｐ値を示す)。
【０１９０】
Ｉｍｍｕｎｅクラスターの患者が、他のクラスターの患者よりも有意に優れた結果を示すため、臨床においてこれらの患者を予め特定するためのアッセイの開発をすすめた。さらに、ｉｍｍｕｎｅクラスターにおける血管新生遺伝子の低発現を考慮し、このアッセイが、血管新生を標的とする治療から益を得ない集団を特定し得ることを仮定したが、この理論を試験するためにはさらなるデータセットが必要となる。サイン作成のために、ＡｎｇｉｏクラスターおよびＡｎｇｉｏｉｍｍｕｎｅクラスターを同じ群とし、「ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ」群とラベルした。
【０１９１】
次いで、Ｉｍｍｕｎｅクラスターの患者を特定し得る、６３遺伝子バイオマーカーアッセイを開発した（表２）。該アッセイによりＩｍｍｕｎｅクラスターに分類された患者は、階層クラスタリング解析と一致して、他のＨＧＳ患者と比較して、有意に改善した無増悪生存（ＰＦＳ）（多変量解析；ＨＲ＝０.７２［０.５２〜０.９９］、ｐ＝０.０４３）およびＯＳ（多変量解析；ＨＲ＝０.６１［０.４４〜０.８６］、ｐ＝０.００４）を示した。これらの多変量解析を、減量状態、ステージ、化学療法および診断時の年齢により補正した。Edinburghデータセットにおけるサインコールによる、ＰＦＳおよびＯＳについてのカプランマイヤー曲線をそれぞれ、各図に表示する単変量ＨＲ成績とともに、図３Ａおよび３Ｂに表す。
【０１９２】
予後アッセイとして本発明のバイオマーカーを独立して検証するために、Tothill et al. Clinical Cancer Research 2008: 14(16):5198-208に記載のデータセット内のＨＧＳ卵巣腫瘍に適用した。Ｉｍｍｕｎｅクラスターに含まれると同定された患者は、他のＨＧＳ患者と比較して、ＰＦＳ（多変量解析; ＨＲ＝０.６２［０.４１〜０.９５］、ｐ＝０.０２９）およびＯＳ（多変量解析; ＨＲ＝０.３２［０.１９〜０.５４］、ｐ＝０.００００１）の有意な改善を示した。これらの多変量解析を、グレード、ステージ、ネオアジュバント処置および残存病変について補正した。Tothillデータセットにおけるサインコールによる、ＰＦＳおよびＯＳについてのカプランマイヤー曲線を、各図に示す多変量ＨＲ成績とともに、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示す。
【０１９３】
実施例２: 「ｉｍｍｕｎｅ」サインの予測的有用性の独立した検証
背景
International Collaboration on Ovarian Neoplasms 7 (ＩＣＯＮ７)治験は、原発性腹膜がん、ファロピウス管がんおよび上皮性卵巣がんに罹患する患者における、カルボプラチンおよびパクリタキセルを用いた標準化学療法に、同時におよび継続して、ベバシズマブを追加した効果を評価する婦人科がん群間第３相治験である(Perren TJ, Swart AM, Pfisterer J, Ledermann JA, Pujade-Lauraine E, Kristensen G, et al. A phase ３ trial of bevacizumab in ovarian cancer. N Engl J Med. 365(26): 2484-96, Aghajanian C, Blank SV, Goff BA, Judson PL, Teneriello MG, Husain A, et al. OCEANS: A randomized, double-blind, placebo-controlled phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian, primary peritoneal, or fallopian tube cancer. Journal of Clinical Oncology. 2012; 30(17): 2039-45)。
【０１９４】
患者特徴、無増悪生存、毒性および予備的全生存データおよびクオリティ・オブ・ライブ(ＱｏＬ)データの要約はＩＣＯＮ７から報告されている。標準化学療法群において、７６４名のうち６９６名（９１％）の女性が、プロトコルにより１８週の化学療法を受けた。ベバシズマブ群において、７６４名のうち７１９名(９４％)の女性が１８週の化学療法およびベバシズマブを受け、４７２名（６２％）が５４週のプロトコル終了までベバシズマブを続けた。標準化学療法およびベバシズマブに関する無増悪生存のハザード比は０.８１(９５％ＣＩ＝０.７０〜０.９４、ｐ＝０.００４)であった。減量手術後、１.０cmを超える残留疾患を有する、世界産婦人科連合（ＦＩＧＯ）ステージＩＶ疾患またはステージＩＩＩ疾患と定義される、進行のリスクが高い患者において、ベバシズマブ群における死亡のハザード比は０.６４（９５％ＣＩ＝０.４８〜０.８５；ｐ＝０.００２）であった。
【０１９５】
方法
医学研究審議会(ＭＲＣ)を介してＩＣＯＮ７治験サンプルにアクセスした。公正な仲介者がＭＲＣからの関係する臨床的データを保持した。サンプルをプロファイリングするための無作為化戦略は、臨床的因子に基づいて成されていた。全反応剤、アレイおよび対照サンプルは予め検査し、品質基準を通過していた。
【０１９６】
診断および組織診断タイプを確認するために、２人の専門の婦人科病理学者が、Ｈ＋Ｅスライドを用いて全てのサンプルを独立して再調査し、問題になる症例では、ＷＴ１染色を用いて漿液性の組織診断を確認した。切片は、ＦＦＰＥブロック(腹腔または大網疾患よりも、むしろ殆ど独占的に付属器腫瘤由来である)より採取し、明視野顕微鏡下で、マクロディセクションし、間質の混入を最小化した（＜１０％）。用いた１０μm切片の数は、ブロック中の腫瘍のパーセンテージにより：それぞれ、ブロック中の腫瘍含量が＞５０％の場合２個、２５〜５０％の場合３個、および＜２５％の場合、４個であった。
【０１９７】
全ＲＮＡを、High Pure RNA Paraffin Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) を使用してマクロダイセクションしたＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に変換し、これを続いてWT-OvationTM FFPE RNA Amplification System V2 (NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA) のＳＰＩＡ（登録商標）技術を使用して増幅し、一本鎖形態に変換した。増幅した一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-OvationTM cDNA Biotin Module V2 (NuGEN Technologies Inc.) を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを、次にサインを構築すべきAlmac Ovarian Cancer DSAにハイブリダイズした。アレイをAffymentrix Genechip(登録商標) Scanner 7G (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) を使用して走査する。
【０１９８】
病態の再調査後では、ハイグレード漿液性卵巣がんに罹患しているサンプルには２８６人の患者がおり；そのうち１４４人の患者は、ベバシズマブ群 (arm)、１４２人はベバシズマブなしの群からであった。患者の６９％が、Ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ群に含まれると評価され、これは両方の試験群で同じである。
【０１９９】
一次試験仮説は、「Ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ」サブグループ内では、ｉｍｍｕｎｅサブグループと比較して、無増悪生存についてのハザード比を少なくとも半減させるのに相当する、ベバシズマブの顕著な効果が見られるというものであった。対照的に、「ｉｍｍｕｎｅ」サブグループでは、ベバシズマブは、最良の場合で、効果を全く示さないか、または、わずかに不利益であり得ることさえ予測されている。
【０２００】
５つのサンプルが、プロセシングＱＣを通過しなかったため、ハイグレード漿液性臨床試験データセットには、２３８の無増悪生存事象(８３%)が見られた。
【数３】
2017506506.tif 000029
（前段落で概要を示したベバシズマブの差次的な効果に相当）を検出するための、検定の検出力 (C Schmoor, W Sauerbrei, and M Schumacher Sample size considerations for the evaluation of prognostic factors in survival analysis Statist. Med. 2000; 19:441-452に記載の式６を使用) は、片側有意水準１０％で、８８%と推定された。データセット中には、１４７の死亡例があり、生存についての同じ解析についての検出力は７５%であった。
【０２０１】
無増悪生存期間は、一次的なエンドポイントであり; これは、該データセットで提供される、ＭＲＣにより計算される時間である。これは、無作為化から、進行または（任意の原因による）死亡のうちの、いずれか先に起こる方までの時間である。全生存期間は、二次試験エンドポイントであった。これは、無作為化から任意の原因による死亡までの時間である。
【０２０２】
層別化コックス比例ハザードモデルを、最初に、無増悪生存データにあてはめた。該モデルは、無作為化試験群について単一の効果タームを有していた。次いで、二次層別化コックス比例ハザードモデルを、無増悪生存データに適合させた。このモデルもまた層別化されていたが、各層中の無作為化試験群の効果について、個別のタームを有していた。
【０２０３】
２つの適合モデルのｌｏｇ尤度を比較し、無作為化試験群の効果が、血管新生促進状態（層の数−１に相当する自由度を用いたχ二乗検定）に依存するかどうかを決定した。上記の試験が、５％有意水準で統計学的に有意である場合、各層中の無作為化試験群について個別のタームを有するモデルについての、比例ハザード仮説の適合性を評価する。
【０２０４】
比例ハザードについての検定は、Grambsch-Therneau検定[P. Grambsch and T. Therneau (1994), Proportional hazards tests and diagnostics based on weighted residuals. Biometrika, 81, 515-26]により行った。該検定のために、無増悪生存期間を、対数目盛りに変換した。各層内の試験群の各タームについての検定を、個別に、有意水準５％を用いて概算した。１つ以上の層において、比例ハザードについての検定が棄却された場合、各層において、フレキシブルパラメトリック生存分析モデルを用いて、制限平均生存（restricted mean survival）モデルを適合させる[P Royston, MKB Parmar The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt Stat Med, 30 (2011), pp. 24092421]。これらのモデルは、ベースラインの分布関数を推定するのに、自由度３を用い、時間依存性処置効果については自由度１を用いる。それぞれの場合についての制限平均を計算する最大時間は３年であった。
【０２０５】
上記の解析を、全生存期間について繰り返す。
【０２０６】
結果
Ｉｍｍｕｎｅサブタイプ（３９％）と分類された患者については、ベバシズマブの追加により、ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃの患者と比較して、無増悪生存（ＨＲ１.７３（１.１２〜２.６８））および全生存（ＨＲ２.００（１.１１〜３.６１））が悪化した。図５Ａ〜Ｂおよび６Ａ〜Ｂ参照のこと。したがって、Ｉｍｍｕｎｅがんサブタイプの対象は、ベバシズマブをその処置レジメンに加えたとき、Ｉｍｍｕｎｅがんサブタイプに罹患していない対象と比較して、不良な予後を示した。
【０２０７】
実施例３：免疫サインの予後についての有用性の独立した検証
試験の一次的な目的は：１. 患者の遺伝子発現データ上の６３遺伝子サインを用いた、腫瘍再発の個々の危険性の予測；２.患者の無増悪生存（ＰＦＳ）結果ならびに全生存（ＯＳ）についての、サイン予後予測の性能の評価；３. 無増悪生存事象に関する、サイン予後の性能への臨床共変数の影響の検討、である。
【０２０８】
この探索試験は、試験の対照群の１３９人の患者全てを含んでいた。８５人の患者（６１.２％）が、遺伝子サインによって、血管新生促進性（サイン陰性）であるとカテゴリー分けされた。チャートおよび事後観察から、該群において、７２人が無増悪生存事象を示し、４６人が死亡している（全生存事象）ことが示された（患者数およびパーセンテージについての情報は、Jim Paulにより提供）。
【０２０９】
サンプルサイズおよび検出力の計算方法を用いた(Freedman, L.S. (1982). Tables of the number of patients required in clinical trials using the log-rank test. Statistics in Medicine. 1: 121-129)、コックス比例ハザード回帰下の後ろ向き検出力計算により、「Ｉｍｍｕｎｅのみ」の無増悪生存を、「ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ」分子サブグループの患者と、両側有意水準５％で比較したときに、ハザード比（ＨＲ）０．５を検出するための約８５％の検出力が、上述の試験の図により示されることが示された。
【０２１０】
予後として、無増悪生存を用いた時間事象（生存）解析を、サインの予後効果を評価するために行った。血管新生状態（「ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃまたはサイン陰性」および「Ｉｍｍｕｎｅのみまたはサイン陽性」）により決定する患者群の生存分布を、カプランマイヤー（ＫＭ）曲線を用いて可視化した。
【０２１１】
患者の血管新生状態（陰性または陽性）を、無増悪生存事象に関連付けるために、コックス比例ハザード回帰を行った。単変量（未調整）調査に加えて、他の重要な臨床共変数についてのＰＦＳおよびＯＳ調整へのサイン分子サブグループ（陽性または陰性）の影響を調べるために、多変量（調整）コックスモデルを行った。概算した効果は全て、その有意性にかかわらず、該サインおよび標準予後変数が含まれる解析から、９５％信頼区間で報告されている(P Royston, MKB Parmar The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt Stat Med, 30 (2011), pp. 24092421)。サイズ限定により、ごく少数の重要な共変数のみが考慮されており、これらには、ＦＩＧＯステージ、腫瘍グレード、減量状態、活動指標（ＥＣＯＧ）および患者年齢が含まれる。
【０２１２】
分子サブグループにおける比例ハザード仮説の適合性を、コックスモデルの結果を解釈する前に検討した。治験データの以前の解析に沿って、比例ハザードについての検定が棄却される場合、制限平均生存モデルを各分子サブグループに適合させた。制限平均を計算する最大時間は４年間であった。
【０２１３】
結果
ＩＣＯＮ７治験データにおいて、対照群（カルボプラチンに加えてパクリタキセルの化学療法処置を受けている）の、ハイグレード漿液性（ＨＧＳ）卵巣がん患者において、６３遺伝子サインは、予後の指標となる。コックス比例ハザード回帰を用いた結果により、遺伝子サインにより「ｉｍｍｕｎｅ」分子サブグループに分類された患者は、年齢、グレード、ＥＣＯＧ、減量状態およびステージを含む他の臨床共変数について調整する前(単変量ＨＲ＝０.４８、９５％ＣＩ＝０.３２、０.７２；ｐ＜０.００１)および後(多変量ＨＲ＝０.５０；９５％ＣＩ＝０.３２、０.７９；ｐ＝０.００３)において、ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃと分類された患者と比較して、統計学的に有意に改善した無増悪生存を有することが示された。図７Ａ参照。同様に、ｉｍｍｕｎｅ分子サブグループに分類された患者は、他の臨床共変数について調整する前(単変量ＨＲ＝０.４６；９５％ＣＩ＝０.２６、０.８０；ｐ＝０.００６)および後(多変量ＨＲ＝０.５３；９５％ ＣＩ＝０.２９、０.９７；ｐ＝０.０４１)において、ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃの患者と比較して、統計学的に改善した全生存を有する。図７Ｂを参照のこと。データは、比率仮定の重大な逸脱がないことを示している。
【０２１４】
実施例４：結腸直腸がんにおける非血管新生サインの予測有用性
プラス２アレイ上の再発性または転移性結腸直腸がんのベバシズマブに対するレスポンダーおよび非レスポンダーのコホートについての、Gene Expression Omnibus databaseより得た公共のアレイデータセット(E-GEOD-19862)を得、表２の６３個の遺伝子サイン例を使用して解析した。６３個の遺伝子卵巣免疫サインは、ＡＵＣ：０.８６(０.６０〜１.００)でベバシズマブに対する応答を予測する。図８参照。
【０２１５】
実施例５: ６３遺伝子サインの概要
サンプル：
・内部トレーニングサンプル: このサンプルセットは、Edinburgh Ovarian Cancer Databaseより検索した１９３のハイグレード漿液性卵巣がんサンプルを含んでいた。
・Tothillサンプル: これは、公開で利用可能なデータセットであり、ここから、１５２のハイグレード漿液性卵巣がんサンプルを解析に用いた。
・ＩＣＯＮ７サンプル: このサンプルセットは、ＭＲＣ (Medical Research Council)を介して入手した、ベバシズマブの第一選択がん処置を伴う、もしくは伴わない、カルボプラチンおよびパクリタキセルの、第ＩＩＩ相無作為試験より得た２８４のハイグレード漿液性卵巣がんサンプルを含む。
・ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ(標準治療)−１４０サンプル−ベバシズマブの追加投与を受けていない患者を指す
・ＩＣＯＮ７ Ｉｍｍｕｎｅ群−１１６サンプル：Ｉｍｍｕｎｅ６３遺伝子サインにより、Ｉｍｍｕｎｅ群であると予測されたＩＣＯＮ７サンプルを指す。
・ＩＣＯＮ７ ＰｒｏＡｎｇｉｏ群−１６８サンプル：Ｉｍｍｕｎｅ６３遺伝子サインにより、ＰｒｏＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ群であると予測されたＩＣＯＮ７サンプルを指す。
【０２１６】
方法: 
サイン開発
１９３の卵巣がんＨＧＳサンプルのバランスサンプルセットを用いて、５分割交差検証（ＣＶ）を１０回繰り返す間に、ＰＬＳ(Partial Least Squares)法を用いて、サインを展開した(Dejong S. Simpls - an Alternative Approach to Partial Least-Squares Regression. Chemometr Intell Lab 1993;18:251-63)。サイン開発には次の工程を用いた:
・  プローブセットを遺伝子に配置し、各遺伝子についての中央値プローブセット発現値のlog２変換を用いて、遺伝子発現を測定した；
・  ネステッドＣＶ内で、低分散、低強度およびｃＤＮＡとの高い相関を示す遺伝子の７５％を除くために、前フィルタリング後に正規化を行った；
・  遺伝子/特性を、相関調整ｔ−スコアに基づいてランク付けし、特性縮小は、５遺伝子が残るまで、重要度の最も低い遺伝子の１０％の切り捨てることを伴った；
・  無増悪生存（ＰＦＳ）を交差検証下で予測するハザード比（ＨＲ）が最適であった特性セットとして、６３遺伝子サインを同定した。
【０２１７】
ＣＶ内で次のデータセットを比較し、６３遺伝子サインのパフォーマンスを評価した:
・  内部トレーニングセット−１９３サンプル
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ (標準治療)−１４０サンプル
・  ＩＣＯＮ７ Ｉｍｍｕｎｅ群−１１６サンプル
・  ＩＣＯＮ７ ＰｒｏＡｎｇｉｏ群−１６８サンプル
【０２１８】
コア遺伝子解析
サインのコア遺伝子セットを評価する目的は、サインから除いたときのパフォーマンスへの影響に基づいて、遺伝子のランクを決定することである。
この解析には、元の６３サイン遺伝子セット由来の、１０サイン遺伝子の１,０００,０００の無作為サンプリングを用いた。各反復において、１０個の無作為に選択したサイン遺伝子を除き、残りの５３遺伝子のパフォーマンスを、ＰＦＳエンドポイントを用いて評価し、次の３つのデータセットにおける、これらの１０遺伝子を除いたときのＨＲパフォーマンスへの影響を決定した:
・  内部検証−７２サンプル
・  Tothill HGS (Tothill RW, Tinker AV, George J, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clin Cancer Res 2008;14:5198-208) (ハイグレード漿液性)−１５２サンプル
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ (標準治療)−１４０サンプル
【０２１９】
これらの３つのデータセットのそれぞれにおいて、サイン遺伝子を、それが含まれるか、または除かれているかに基づく、ＨＲパフォーマンスの変化（デルタＨＲ）に基づいて、重み付けした。「１」とランク付けされる遺伝子は、除いたときのパフォーマンスへの悪影響が最も大きく、「６３」とランク付けした遺伝子は、除いたときの影響が最も小さい。
【０２２０】
最小遺伝子解析
最も少ない数の遺伝子を評価する目的は、元のサインの、より小さいサブセットにおいて、有意なパフォーマンスを達成し得るかどうかを決定することである。
この解析には、１遺伝子/特性から開始して、最大で２５遺伝子/特性までの、６３サイン遺伝子の１０，０００の無作為サンプリングを伴った。無作為に選択した特性の長さ(feature length)のそれぞれについて、ＣＶおよび得たモデルパラメーター下で、ＰＬＳ機械学習法を用いて、サインを再開発した。それぞれの特性の長さにおいて、無作為に選択したサインを全て適用し、次の３つのデータセットについてのサインスコアを計算した: 
・  Tothill HGS (ハイグレード漿液性)−１５２サンプル
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ (標準治療)−１４０サンプル
・  ＩＣＯＮ７ Ｉｍｍｕｎｅ群−１１６サンプル
【０２２１】
連続的なサインスコアを、ＰＦＳ (無増悪生存) を用いて評価し、ＨＲ（ハザード比）効果を決定した。各特性の長さ(feature length)における、全ての無作為サインについてのＨＲをまとめ、ＣＶにおけるパフォーマンスを可視化するために図を作成した。
【０２２２】
結果
サイン開発
ここでは、ＣＶ内におけるサイン開発の結果を示す。
・  内部トレーニングセット: 図９、１０および１１は、トレーニングセットのＡＵＣ (Area under the receiver operating curve)、Ｃ指標(Concordance Index) およびＨＲを示し、ここから６３遺伝子サインを同定した。
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ: 図１２および１３は、ＣＶ下における、(６３遺伝子サインにより同定された)ＩＣＯＮ７ ＳＯＣサンプルのＨＲおよびＣ指標を示す。
・  ＩＣＯＮ７ ＰｒｏＡｎｇｉｏ群: 図１５は、ＣＶ下における、(６３遺伝子サインにより同定された)ＩＣＯＮ７ ＰｒｏＡｎｇｉｏサンプルのＨＲを示す。
【０２２３】
コア遺伝子解析
３つのデータセット中の、６３遺伝子サインのコア遺伝子解析についての結果を示す。
・  内部検証: このデータセットにおいて、６３サイン遺伝子について測定したデルタＨＲパフォーマンスを図１６に示す。この図は、このデータセット内で、良好なＨＲパフォーマンスを維持するのに最も重要な、該サイン内の上から１０番目までにランク付けされた遺伝子を強調している。
・  Tothill HGS: このデータセットにおいて、６３サイン遺伝子について測定したデルタＨＲパフォーマンスを図１７に示す。この図は、このデータセット内で、良好なＨＲパフォーマンスを維持するのに最も重要である、該サイン内の上から１０番目までにランク付けされた遺伝子を強調している。
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ: このデータセットにおいて、６３サイン遺伝子について測定したデルタＨＲパフォーマンスを図１８に示す。この図は、このデータセット内で、良好なＨＲパフォーマンスを維持するのに最も重要である、該サイン内の上から１０番目までにランク付けされた遺伝子を強調している。
・  これらの３つのデータセットのデルタＨＲを評価し、サイン遺伝子のそれぞれについての、組合せ遺伝子ランクを得た。コアセット解析に基づいてサイン遺伝子に割り当てられたランクは、Immune63GeneSig_CoreGenes_HR.txtに要約されている。
【０２２４】
最小遺伝子解析
３つのデータセット中の６３遺伝子サインの最小遺伝子解析についての結果をこの段落に示す。
・  Tothill HGS：特性の長さ(feature length) １..２５のサイン遺伝子の無作為サンプリングを用いて、このデータセットで測定した平均ＨＲパフォーマンスを図１９に示す。この図は、有意なＨＲパフォーマンス(すなわちＨＲ＜１)を維持するためには、最小で５個のサイン遺伝子を選択しなければならないことを示す。
・  ＩＣＯＮ７ ＳＯＣ：特性の長さ(feature length) １..２５のサイン遺伝子の無作為サンプリングを用いて、このデータセットで測定した平均ＨＲパフォーマンスを図２０に示す。この図は、有意なＨＲパフォーマンス(すなわちＨＲ＜１)を維持するためには、最小で２個のサイン遺伝子を選択しなければならないことを示す。
・  ＩＣＯＮ７ Ｉｍｍｕｎｅ：特性の長さ(feature length) １..２５のサイン遺伝子の無作為サンプリングを用いて、このデータセットで測定した平均ＨＲパフォーマンスを図２１に示す。この図は、有意なＨＲパフォーマンス(すなわちＨＲ＜１)を維持するためには、最小で５個のサイン遺伝子を選択しなければならないことを示す。
まとめると、最小で、少なくとも５個の遺伝子を用いることで、有意なパフォーマンスが維持されることが推奨されている。 
【０２２５】
実施例６: 結腸がんサンプル
サンプルおよび方法
サンプル
うち２３２人が、アジュバント化学療法を受けた後の経過観察で、無増悪生存データを示した、ステージＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの疾患に罹患している患者由来の５２９の新鮮凍結 (ＦＦ) 原発性腫瘍サンプルを６３遺伝子サインを用いて評価した。Affymetrix U133 Plus 2.0 platform上での遺伝子発現プロファイリングからのマイクロアレイデータを、パブリックドメイン (GEO accession number GSE40967)より得た。
【０２２６】
サインスコア計算
サインスコアは次の工程を用いて計算した:
RMA (Robust Multi-array Analysis) バックグラウンド補正。
発現中央値を用いた、プローブのプローブセットへの集約。
発現中央値を用いた、プローブセットの遺伝子への集約。
正規化モデルを、サンプルごとに、遺伝子レベルマトリクス（またはベクター）に適用し、これにより、個々の患者の遺伝子プロファイルの分布がトレーニングデータと同様に変換される。
サインスコアを、該サイン中の核遺伝子の発現の重みの合計を用いて、サンプルごとに計算する:
【数４】
2017506506.tif 000030
［式中：Ｗｉが各遺伝子についての重みであり、ｂｉが遺伝子特異的なバイアスであり、χｉが、前処理の後に観察される遺伝子発現レベルであり、
【数５】
2017506506.tif 000031
が、定常オフセットである。］
【０２２７】
統計解析
コックス比例ハザード回帰モデルを、アジュバント化学療法後の、無増悪生存についての６３遺伝子サインの単変量ハザード比（ＨＲ）効果を推定するのに用いる。ＨＲ推定についてのｐ値を、ログランク検定を用いて計算する。
【０２２８】
結果
図２２は、アジュバント化学療法を受けた２３２人の患者における、サイン予測のためのカプランマイヤー曲線を提供し、これにより、予後を予測するために６３遺伝子サインを使用し得ることが示される。コックス比例ハザード回帰モデルから計算した単変量ＨＲは、０.４９（ログランクｐ＝０.００１）である。「Ａｎｇｉｏ ｏｎ」は、バイオマーカーサインについて陰性であることと同等であり、「Ａｎｇｉｏ ｏｆｆ」は、バイオマーカーサインについて陽性であることと同等である。
【０２２９】
実施例７: 結腸直腸がんにおけるサブタイプの予後についての有用性
サンプル
結腸直腸がんに罹患している５２９人の患者のコホートを含む (Marrisa et al, 2013)、Gene Expression Omnibus database (GSE40967)より公共のアレイデータセットを得た。サンプルをAffymetrix Plus 2.0アレイプラットフォーム上でプロファイルした。該データは、ステージＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの疾患に罹患している患者および、アジュバント化学療法を受け、その後の無再発生存（ＲＦＳ）経過観察データが得られている２３２人の患者を含む。
【０２３０】
方法
ＲＭＡを用いて全てのサンプルを前処理し、図１で「ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」遺伝子クラスター（クラスター４）を定義するEntrez Gene IDを用いて、半管理的階層クラスタリングを行い、データマトリクスをフィルタリングした。フィルタリングしたデータマトリクスを、遺伝子発現中央値に標準化した後、ユークリッド距離およびウォード連結法（Ward’s linkage method）を用いて凝集型階層クラスタリングを行った。サンプルと遺伝子クラスターの最適数を、ＧＡＰ統計法を用いて決定した。サンプルのクラスタリングに用いた遺伝子リストが、血管新生生物学に高度に濃縮されていたため、これらの遺伝子の上方制御を伴うサンプルクラスターを、血管新生活性（またはａｎｇｉｏ ｏｎ）とクラス標識し；これらの遺伝子の下方制御を伴うサンプルクラスターを血管新生不活性（またはａｎｇｉｏ ｏｆｆ）とクラス標識した。
【０２３１】
サンプルをさらに、６３遺伝子サインを用いて試験し、６３遺伝子サインスコアとサンプルクラスター（血管新生活性または血管新生不活性）の間の相関関係を、ＲＯＣ (Receiver Operating Characteristic) 曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて評価した。結腸直腸がんにおいて、患者を血管新生活性/不活性と分類するための閾値を、階層クラスタリング解析により決定される、サブタイプの予測についての感度＋特異性を最大化するために最適化した。
【０２３２】
６３遺伝子サイン予測の臨床有意性を、カプランマイヤー曲線およびコックス比例ハザード生存解析を用いて評価した。エンドポイントを、無増悪生存と決定し、コックス比例ハザードモデリングは、臨床共変数：年齢；性別；ステージ；腫瘍部位およびＭＳＩ状態についての調整を含んでいた。
【０２３３】
結果
５２０のサンプルについて、２１９遺伝子（図２３においてクラスター４を定義する遺伝子）に基づく、半非管理的クラスタリングを行った。２つのサンプルクラスターおよび３遺伝子クラスターを同定した（図２３）。サンプルクラスター１（２７３患者）は、血管新生遺伝子の発現の上方制御により特徴付けられており、そのため、血管新生活性であるとラベルし; サンプルクラスター２（２５６患者）は、血管新生遺伝子の発現の下方制御により特徴付けられており、そのため、血管新生不活性とラベルした。
【０２３４】
２つのサンプルクラスターの予測に関する、６３遺伝子サインについてのＡＵＣは、図２４のＲＯＣ曲線に示すように、０.８６［０.８３〜０.８９］であった。サブタイプの予測についての感度および特異性の最大合計を、サインスコア閾値０.６６０４で決定し; これは、患者が血管新生活性または不活性サブタイプにあてはまることを予測するのに適用される閾値である。サインスコアが０.６６０４を超える患者を、血管新生活性と分類し、サインスコアが０.６６０４以下の患者を、血管新生不活性と分類する。
【０２３５】
該サインにより予測される無増悪生存についてのコックス比例ハザードモデル（臨床共変数について調整）により、血管新生不活性群の患者は、血管新生活性群の患者と比較して、無増悪生存が有意に上昇していることが明らかになった(表４: ＨＲ＝０.４７ [０.３０〜０.７６])。カプランマイヤー曲線は、表２２に示す。
【表６】
2017506506.tif 000032
【０２３６】
実施例８: ６３遺伝子サインの予後についての有用性の独立検証
サンプル
公共のアレイデータセットを、結腸直腸がんに罹患している２９０人の患者のコホートを含むGene Expression Omnibus database (GSE14333)より得た。サンプルをAffymetrix Plus ２.０プラットフォーム上でプロファイルした。８７人の患者は、アジュバント化学療法を受けており、無再発生存（ＲＦＳ）について経過観察を受けている。
【０２３７】
方法
実施例５で決定した、０.６６０４の閾値を用いて、血管新生活性か、または、血管新生不活性に分類される６３遺伝子サインを用いて、サンプルを試験した。
６３遺伝子サイン予測の臨床有意性は、カプランマイヤー曲線およびコックス比例ハザード生存解析を用いて評価した。エンドポイントは、無増悪生存と定義し、コックス比例ハザードモデリングは、利用可能な全ての臨床共変数：年齢；性別；ステージおよび腫瘍部位についての調整を含んでいた。
【０２３８】
結果
１５９人の患者は、サインスコアが０.６６０４を上回り、血管新生活性に分類され; １３１人の患者は、サインスコアが０.６６０４以下となり、血管新生不活性と分類された。
該サインにより予測される無増悪生存のコックス比例ハザードモデリング（臨床共変数についての調整）により、血管新生不活性群の患者は、血管新生活性群の患者と比較して、無増悪生存が有意に上昇していることが明らかになった(表５: ＨＲ＝０.３３ [０.１４〜０.８３])。カプランマイヤー曲線を図２５に示す。
【表７】
2017506506.tif 000033
【０２３９】
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【図１】
2017506506.tif 000034
【図２】
2017506506.tif 000035
【図３】
2017506506.tif 000036
【図４】
2017506506.tif 000037
【図５】
2017506506.tif 000038
【図６】
2017506506.tif 000039
【図７】
2017506506.tif 000040
【図８】
2017506506.tif 000041
【図９】
2017506506.tif 000042
【図１０】
2017506506.tif 000043
【図１１】
2017506506.tif 000044
【図１２】
2017506506.tif 000045
【図１３】
2017506506.tif 000046
【図１４】
2017506506.tif 000047
【図１５】
2017506506.tif 000048
【図１６】
2017506506.tif 000049
【図１７】
2017506506.tif 000050
【図１８】
2017506506.tif 000051
【図１９】
2017506506.tif 000052
【図２０】
2017506506.tif 000053
【図２１】
2017506506.tif 000054
【図２２】
2017506506.tif 000055
【図２３】
2017506506.tif 000056
【図２４】
2017506506.tif 000057
【図２５】
2017506506.tif 000058
【配列表】
2017506506000001.app
【国際調査報告】
2017506506.tif 000059
2017506506.tif 000060
2017506506.tif 000061
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