(57)【要約】本発明は、美容の分野、より具体的には保護性の美容スキンケアの分野に関する。本発明は、熱ストレス、特に冷熱ストレスまたは繰り返す温度変化により引き起こされる損傷から皮膚を保護するためのアルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物の美容上の使用に関する。  本発明の別の目的は、保護作用を得るために、より具体的には熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するための、生理的に許容可能な媒体を含む組成物中のアルテミア・サリーナ抽出物の、身体または顔の皮膚の少なくとも一部への局所適用を含む美容ケア方法である。【選択図】図１
2017502050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＩＲＢＰの生理的レベルを維持することにより冷熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するための美容ケアの方法であって、生理的に許容可能な媒体、ならびに以下の
ａ）アルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）の嚢胞を、３０℃〜７５℃の温度および４〜７のｐＨで蒸留水に３０分間〜６時間再水和するステップと、
ｂ）次に前記嚢胞を粉砕するステップと
ｃ）このように得られた前記抽出物を遠心してろ過するステップと
を含む前記方法により得たアルテミア・サリーナ抽出物を含む組成物を、身体または顔の皮膚の少なくとも一部に局所適用することを含む、方法。
【請求項２】
冷熱ストレスによる損傷に関連するかぶれ、乾燥、またはひび割れから前記皮膚を保護するための、請求項１に記載の美容ケア方法。
【請求項３】
前記アルテミア抽出物を、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化ジグリコール、またはプロポキシル化ジグリコール、環式ポリオール、またはこれら溶媒のいずれかの混合物から選択される１つまたは複数の生理的に適した溶媒に希釈する、請求項１または２に記載の美容ケア方法。
【請求項４】
前記アルテミア・サリーナ抽出物が、前記組成物の総重量の０．０００１％〜２０％の濃度、好ましくは前記組成物の総重量の０．０５％〜５％の濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の美容ケア方法。
【請求項５】
前記組成物が、ビタミンＡ、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＨ、ビタミンＫ、ビタミンＰＰ、コエンザイムＱ１０、メタロプロテナーゼ阻害剤、アミノ酸、カルニチン、カルノシン、タウリン、天然または合成ペプチド、植物性ペプチド抽出物、酵母抽出物、天然または合成フィトステロール、サリチル酸、オリゴ糖、多糖、アミノ糖、ポリフェノール、フラボノイド、脂質、リン脂質、環状ＡＭＰおよびその誘導体、酵素アデニル酸シクラーゼの活性化剤および酵素ホスホジエステラーゼの阻害剤、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、フォルスコリン、エスクリン、ＡＣＥ阻害剤、ヤマノイモ抽出物、ガラナ抽出物、ツタ抽出物、ヒバマタ抽出物、ダルスダルス抽出物などの海藻の抽出物、ウツボグサの加水分解抽出物またはニワトコの抽出物から選択される少なくとも１つの追加的な活性剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の美容ケア方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容の分野、より具体的には保護的な美容スキンケアの分野に関する。本発明は、熱ストレスにより生じる損傷から、特には冷熱ストレスまたは繰り返す温度変化から皮膚を保護するためのアルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物の美容上の使用に関する。
【０００２】
本発明の別の目的は、保護作用を得るため、より具体的には熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するための、生理学的に許容可能な媒体を含む組成物中のアルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物の、身体または顔の表面の少なくとも一部への局所適用を含む美容ケア方法である。
【背景技術】
【０００３】
表皮の主な機能は、外部環境と身体との間に保護的な障壁を保つことである。皮膚は、外部環境と直接接触しており、多くの環境条件の変化に晒されている。変化の性質および度合いに応じて、これらの変化は物理的、化学的、または生物学的なストレスの原因となる損傷を引き起こし得る。主なストレスは、熱ストレス、酸素のフリーラジカルに対する暴露、紫外線および赤外線の照射、重金属、浸透圧ショック、および圧力ショック、ならびに発熱、炎症、ウイルス感染症などの病的状態である。
【０００４】
熱ストレスは、身体の最適な機能に影響を与え、身体の生理学的な温度調節機構を超えるストレスとして定義される。熱ストレスは、環境または内部原因の温度の低下（冷熱ストレス）または温度の上昇（熱ストレス）の後に生成される。この最適な温度からの数度の逸脱が、有意な結末を引き起こし得る。
【０００５】
熱的ショックは、突然かつ有意な温度変化（少なくとも１０℃の温度変化）により引き起こされるストレスとして定義される。
【０００６】
皮膚は、多くの生理学的または偶発的な状況で熱ストレスに曝露され得る。平均的な皮膚の温度は、定常値として、最適に機能するには約３３℃であると推定することができるが、環境への曝露に応じて迅速に変化することができ、たとえば、２４℃の浴槽に浸漬した後では２７℃に低下し（Ｍａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｂｏｏｔｈ，  １９９８）、太陽に曝露した後は３７℃超に上昇し得る。
【０００７】
冷熱ストレスは、組織および臓器の温度が２５℃を下回る（極度の低温への曝露、または低酸素から臓器および皮膚を保護するための特定の医学技術でなど）超低体温と、たとえば、夏および冬、または入浴において毎日室内と室外とを移動する際のエアーコンディショニングへの繰り返す曝露による中等度の低体温（２５℃〜３５℃の温度）とを含み得る。
【０００８】
皮膚はしばしば、中等度の冷熱ストレスの後に連続的な加温に供される。以下は、低温への曝露により起こる細胞の生理学的な作用である（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．）：
タンパク質の変性および脱凝集の増加
細胞周期を通しての進行の遅延（一般にＧ１期が最も感受性がある）
タンパク質合成の全般的な低減をもたらす、転写および翻訳の阻害
細胞の細胞骨格のエレメントの破壊
サイトゾルのＮａ＋およびＨ＋イオンの増加をもたらす膜透過性の変化。
【０００９】
さらに、繰り返しの温度変化に皮膚を繰り返し曝露することにより、細胞の表現型または細胞膜の構造および脂質組成に有害な影響がもたらされ、それによって皮膚のバリア機能が変化し、かぶれ、乾燥、またはひび割れが起こり得る。温度変化および冷熱ストレスによるこれらの作用は皮膚の老化プロセスを加速させる。
【００１０】
熱ストレスに対する抵抗性は、特異的細胞応答の確立により可能となる。冷熱ストレスの場合、細胞は、熱ショックタンパク質または「ＨＳＰ」とは異なる低温ショックタンパク質または「ＣＳＰ」の合成および細胞内蓄積をもたらす特異的な遺伝子ファミリーの転写を誘導することにより保護システムを確立する。
【００１１】
ＣＳＰのうち、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質またはＣＩＲＢＰは、ヒトにおいてＣＩＲＢＰ遺伝子によりコードされるタンパク質である。これらのタンパク質は、構成的に発現されると共に低温への曝露後に発現される。ＣＩＲＢＰは、短い波長の紫外光、低酸素、および低体温を含む様々な細胞ストレスに対する細胞応答の制御において重要な役割を果たしている。ＣＩＲＢＰの発現は、中等度の低体温の際に迅速かつ有意に増加し（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９９；  Ｌａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００２）、ＣＩＲＢＰの他の役割では、以下がある：
ＲＮＡ分解の阻害
これら遺伝子のプロモーター領域からのエレメントを介した特異的な標的遺伝子の転写の増加
プレｍＲＮＡの選択的スプライシング。
ＣＩＲＢＰの特別な特性により、ＣＩＲＢＰは温度のショックに対する身体の反応の興味深い生物学的なマーカーである。
【００１２】
アルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物は、すでに化粧品に使用されている。たとえば仏国特許第２８１７７４８号は、ＵＶによるダメージによる皮膚の老化を防止するためのアルテミア・サリーナ抽出物を記載しており、仏国特許第２８３５７４３号は、レチノイドの副作用を制限するためのアルテミア・サリーナ抽出物を記載しており、国際特許公開公報第１９９９０３８４８３号は、皮膚細胞の再生および刺激のためのアルテミア・サリーナ抽出物に基づく美容製品を記載する。
【００１３】
しかしながら、現在まで、アルテミア・サリーナ抽出物と熱ストレスによる損傷に対する皮膚の保護との間の関連は確立していなかった。
【００１４】
本発明者らは、アルテミア・サリーナ抽出物の有効量の適用が、皮膚に損傷を与え得る熱ストレス、特に冷熱ストレスまたは繰り返す温度変化から細胞を保護できることを証明した。
【００１５】
本発明および本発明からもたらされる利点は、本記載を読むことにより良好に理解されるものである。
【００１６】
本発明の開示
本発明は、熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するためのアルテミア・サリーナ抽出物の美容上および／または皮膚科学的な使用に関する。
【００１７】
本発明によると、用語「皮膚」は、身体の表面に存在するすべてのケラチン質の付属器、特に体毛、まつげ、眉、爪、および毛髪を含む。
【００１８】
よって、「温度変化による損傷から皮膚を保護する」は、本発明の意味では、繰り返す温度変化または冷熱ストレスにより引き起こされる皮膚の損傷および刺激を低減または予防するために使用されるアルテミア・サリーナ抽出物を意味すると理解される。繰り返す皮膚損傷は見栄えが悪いと考えられており、多くの場合皮膚老化の加速に関連している。
【００１９】
また本発明は、熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するためのアルテミア・サリーナ抽出物の美容上および／または皮膚科学的な使用に関する。
【００２０】
また本発明は、突然のおよび／または繰り返す温度変化による損傷から皮膚を保護するためのアルテミア・サリーナ抽出物の美容上および／または皮膚科学的な使用に関する。
【００２１】
また本発明は、冷熱ストレスに曝露された皮膚細胞におけるＣＩＲＢＰの生理的レベルを維持するためのアルテミア・サリーナ抽出物の美容上および／または皮膚科学的な使用に関する。
【００２２】
実際に、アルテミア・サリーナは、汽水で生存している小さな甲殻類である。環境上の条件が厳しくなると（脱水、ミネラル含有量の増加）、アルテミアは休眠卵を形成し（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）、数年間維持し得る休眠期間に入る。条件が再び好ましい状態になると、アルテミアは再水和し、その発達サイクルを円滑に再開する。
【００２３】
その超ミネラル化生息空間に適応することにより、アルテミア・サリーナは、重要な適応術を発達させた。アルテミア・サリーナは、ＧＰ４Ｇ（ジグアノジンテトラホスファート）、ＡＴＰの前駆体分子、ＧＴＰ、およびＧタンパク質のアクチベーターを合成する。アルテミアは、プランクトンの良好な水電解質バランスの結果として、モル浸透圧濃度の調節に特化した細胞を有する。
【００２４】
特定の実施形態では、アルテミア抽出物は、１２０〜１９５ｍｇ／リットルのジグアノジンテトラホスファート、好ましくは少なくとも１５０ｍｇ／リットルのジグアノジンテトラホスファートを含む。
【００２５】
以下では、用語「活性剤」および「アルテミア・サリーナ抽出物」は、互換可能に使用される。
【００２６】
「局所適用」は、皮膚または粘膜の表面に、本発明に係る活性剤または当該活性剤を含む組成物を適用するまたは広げる行為を指すと理解される。
【００２７】
「生理的に許容可能な」は、本発明に係る活性剤または当該薬剤を含む組成物が、毒性または不耐性反応を引き起こすことなく、皮膚または粘膜と接触するために適切であることを意味すると理解される。
【００２８】
「熱ストレスによる損傷」は、損傷した皮膚領域の衰え、乾燥、かぶれ、またはひび割れを生じる低温への曝露を意味すると理解される。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明に係るアルテミア抽出物は、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化ジグリコール、またはプロポキシル化ジグリコール、環式ポリオール、またはこれら溶媒のいずれかの混合物などの１つまたは複数の生理的に適切な溶媒中で希釈できる。
【００３０】
本発明の別の目的は、熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するための、生理学的に許容可能な媒体を含む組成物中のアルテミア・サリーナ抽出物の、身体または顔の皮膚の少なくとも一部への局所適用を含む美容ケア方法である。
【００３１】
また本発明は、繰り返す温度変化および／または冷熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するための、生理的に許容可能な媒体を含む組成物中のアルテミア・サリーナ抽出物の、身体または顔の皮膚の少なくとも一部への局所適用を含む美容ケア方法に関する。
【００３２】
好ましくは、アルテミア抽出物は、生理的に許容可能な媒体中、組成物の総重量の０．０００１％〜２０％の濃度、好ましくは組成物の総重量の０．０１％〜１０％の濃度、さらにより好ましくは組成物の総重量の０．０５％〜５％の濃度で存在する。
【００３３】
本発明の別の有益な実施形態では、活性剤は、化粧品の分野で使用されるリポソームまたは他のいずれかのマイクロカプセルなどの美容上のキャリアーに封入もしくは含まれていてもよく、または粉末状の有機ポリマー、タルクおよびベントナイトなどのミネラル支持体に吸着されてもよい。
【００３４】
本発明を実施するための組成物は、特に、水溶液、ハイドロ‐アルコールまたは油状溶液の形態；水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、また複数のエマルジョンの形態で存在してもよい。これら組成物はまた、皮膚、粘膜、唇、および／または毛髪への適用に適している懸濁剤または粉剤の形態で存在してもよい。
【００３５】
これら組成物は、おおよそ流体であってもよく、クリーム、ローション、ミルク、セラム、ポマード、ゲル、ペースト、またはフォームの外観を有してもよい。またこれら組成物は、スティックなどの固体で存在してもよく、またはエアロゾル形態で皮膚に適用してもよい。
【００３６】
またこれらの組成物は、溶媒、増粘剤、希釈剤、抗酸化剤、着色剤、日焼け止め、セルフタンニング剤、色素、充填剤、保存剤、芳香剤、消臭剤、美容上または薬学的活性成分、エッセンシャルオイル、ビタミン、必須脂肪酸、表面活性薬、活性剤、フィルム形成ポリマーなどの、企図される適用分野で一般的に利用されているいずれかの添加剤ならびにその製剤化に必要な補助剤を含み得る。
【００３７】
すべての場合、当業者は、本発明に係る組成物の望ましい有益な特性を害することなくこれらの補助剤および比率が選択されることを確認する。たとえばこれらの補助剤は、組成物の総重量の０．０１〜２０％に対応する。本発明の組成物がエマルジョンである場合、脂質相は、組成物の総重量に関して５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％を表し得る。組成物に利用される乳化剤および乳化助剤は、考慮される分野で従来より利用されるものの中から選択される。たとえばこれらは、組成物の総重量に関して、０．３〜３０重量％の比率で利用され得る。
【００３８】
好ましくは、本発明を達成するために使用可能な組成物は、本発明に係る活性剤に加えて、本発明の活性剤と類似かつ／または補完する作用を示す少なくとも１つの他の活性剤を含んでもよい。本発明によると、この活性剤は、「追加的な活性剤」として定義される。
【００３９】
たとえば、追加的な活性剤は、アンチエイジング剤、安定剤、清澄剤、保湿剤、排出剤、微小循環促進剤、医薬品、角質除去剤、皮膚落剥剤、細胞外マトリックス刺激剤、エネルギー代謝活性剤、抗生剤、抗真菌剤、緩和剤、抗ラジカル剤、抗ＵＶ剤、抗アクネ剤、抗炎症剤、麻酔薬、熱感覚調達剤、低温感覚調達剤、痩身剤の中から選択することができる。
【００４０】
当該追加的な薬剤は、
ビタミンＡ、および特にレチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール、
ビタミンＢ３、より具体的には、ナイアシンアミド、ニコチン酸トコフェロール、
ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パンテノール、
ビタミンＣ、特にアスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、テトラパルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウムおよびリン酸アスコルビルナトリウム、
ビタミンＥ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＰＰ、コエンザイムＱ１０、
メタロプロテナーゼ阻害剤、またはＴＩＭＰ活性化剤、
ＤＨＥＡ、その前駆体および誘導体
アルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ニパルミチン酸ヒドロキシプロリン、パルミトイルグリシン、ヒドロキリシン、メチオニンおよびその誘導体、Ｎ−アシルアミノ酸化合物、
ジ‐、トリ‐、テトラ‐、ペンタ‐、およびヘキサペプチドおよびその脂溶性誘導体、アイソマー、および金属イオン（たとえば銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、およびその他）などの他の種との複合体を含む天然または合成ペプチド。たとえばＭＡＴＲＩＸＹＬ（登録商標）、ＡＲＧＩＲＥＬＩＮＥ（登録商標）、ＣＯＬＬＡＸＹＬ（商標）、ＰＥＰＴＩＤＥ  ＶＩＮＣＩ  ０２（商標）、ＣＨＲＯＮＯＧＥＮ（商標）、ＬＡＭＩＮＩＸＹＬ  ＩＳ（商標）、ＰＥＰＴＩＤＥ  Ｑ１０（商標）の名称により商業的に知られているペプチド、
ダイズ、スペルトコムギ、ブドウ、ナタネ、アマニ、コメ、トウモロコシ、エンドウマメの抽出物などの植物性ペプチド抽出物、
酵母抽出物、
デヒドロ酢酸（ＤＨＡ）、
合成または天然のフィトステロール、
サリチル酸およびその誘導体、αおよびβヒドロキシ酸、シラノール、
アミノ糖、グルコサミン、Ｄ‐グルコサミン、Ｎ‐アセチル‐グルコサミン、Ｎ−アセチル‐Ｄ‐グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
ブドウ抽出物、マツ抽出物、オリーブ抽出物などの、ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイドの抽出物、
セラミドまたはリン脂質などの脂質、スクアレンまたはスクアランなどの動物由来の油；スイートアーモンド油、ココナッツ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、ナタネ油、ピーナッツ油、ヒマワリ油、麦芽油、トウモロコシ胚芽油、ダイズ油、綿実油、アルファファ油、ケシ油、セイヨウカボチャ油、月見草オイル、アワ、オオムギ、ライムギ、ベニバナ、トケイソウ、ヘーゼルナッツ、パーム、杏仁、アボカド、キンセンカの油などの植物油；エトキシル化植物油、シアバター、
すべてのＵＶフィルターおよび日焼け止め、
環状ＡＭＰおよびその誘導体、酵素アデニル酸シクラーゼの活性化剤および酵素ホスホジエステラーゼの阻害剤、ツボクサ抽出物、アシアチコシドおよびアシアト酸、メチルキサンチン、カフェイン（ｔｈｅｉｎｅ）、カフェインおよびその誘導体、テオフィリン、テオブロミン、フォルスコリン、エスクリン、およびエスクロシド、ＡＣＥ阻害剤、ペプチドＶａｌ−Ｔｒｐ、ニューロペプチドＹ阻害剤、エンケファリン、イチョウ抽出物、ヤマノイモ抽出物、ルチン、イェルバ・マテ抽出物、ガラナ抽出物、オリゴ糖、多糖、カルニチン、ツタ抽出物、ヒバマタ抽出物、ウツボグサの加水分解抽出物、ケイトウの加水分解抽出物、アノゲイススレイオカルプス（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ  ｌｅｉｏｃａｒｐｕｓ）の抽出物、キャッサバの葉の抽出物、パルミトイルカルニチン、カルノシン、タウリン、ニワトコ抽出物、ダルスダルスなどの海藻の抽出物、ＡＴＰｅｐｔｉｄｅ（商標）の名称により販売されているＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＮＨ２の配列の合成ペプチド
を含む群から選択できる。
【００４１】
本発明に係る使用可能な組成物は、いずれかの適切な経路、特には経口または局所外用経路により適用され、組成物の製剤は、当業者により適合されるものである。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る組成物は、局所適用に適した形態で存在する。よってこれらの組成物は、生理的に許容可能な媒体、すなわち皮膚および上皮の付属器と適合する媒体を含まなければならず、美容上の形態をすべて包有しなければならない。
【００４３】
当然、本発明は、一般的には哺乳類、具体的にはヒトのためのものであることは明らかである。
【００４４】
この美容処置方法の特定の実施形態は、これまでの記載からももたらされる。本発明の他の利点および特徴は、以下の例示的かつ非限定的な目的のため作製された実施例を読むことにより、より明らかとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】アルテミア抽出物で処置または処置されていない細胞における、冷熱ストレス後のＣＩＲＢＰの発現。
【図２】アルテミア抽出物で処置または処置されていない細胞における、冷熱ストレス後のＣＩＲＢＰのｍＲＮＡの評価
【００４６】
実施例１：アルテミア・サリーナ抽出物の調製
アルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）嚢胞５０グラムを、ｐＨ４〜７、３０℃〜７５℃の範囲の温度の、主に水で構成されている適切な媒体中で蒸留水１リットルに３０分〜６時間再水和する。次にこれら嚢胞を粉砕する。得られた抽出物を遠心し、ろ過する。次に抽出物を、ろ過滅菌により滅菌し、６５℃に加熱する。次に抽出物を、美容上の必要条件（色、芳香、外観、滅菌性など）に一致するよう処理する。
【００４７】
次に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるアッセイを行い、ジグアノジンテトラホスファート含有量が１５０ｍｇ／リットル超であることを確認する。
【００４８】
実施例２：本発明に係るアルテミア抽出物により処置または処置されていない細胞における、冷熱ストレス後のＣＩＲＢＰの発現
この試験の目的は、低体温ストレスを与えたケラチノサイトに及ぼすアルテミア・サリーナによる前処置の効果を決定することである。特に、ＣＩＲＢＰ（低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質）を、実施例１に係るアルテミア・サリーナ抽出物による前処置の存在下または非存在下で中等度の低体温（３２℃）に供したケラチノサイトにおいてウェスタンブロットによりアッセイした。
【００４９】
プロトコル：正常なヒトの皮膚からのケラチノサイト（ＮＨＫ）を、実施例１に係るアルテミア・サリーナ抽出物を、１％および３％でケラチノサイト増殖培地に添加することにより処置する。この適用を、４８時間のあいだ１日に１回繰り返す。同時に、無処置対照を構成するために、処置を行わないＮＨＫ培養物を維持する。この培養は３７℃で行われる。
【００５０】
次に、前処置したまたは前処置していないＮＨＫ培養物を、３２℃の場所に６時間配置することにより、低体温ストレスを与えた。このインキュベーションの後、ＮＨＫを溶解してウェスタンブロットによりＣＩＲＢＰ発現を分析する。この従来のイムノブロッティング技術は、以下のステップを含む：１×ＴＢＳ／５％のミルクの溶液による１時間の転写メンブレンの飽和、一次抗体ＣＩＲＢＰ（Ｎｏｖｕｓｂｉｏ）を用いた４℃、一晩のインキュベーション、およびその後の、ペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に結合した二次抗体を用いた、周囲温度で１時間のインキュベーション。発光を、カメラ（Ｃｈｅｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより明らかにする。
【００５１】
結果
この結果は、図１を参照して、３７℃の対照と比較して、細胞を３２℃で６時間インキュベートした場合にＣＩＲＢＰ発現の２７％の増加を示し、これは文献のデータと一致する。
【００５２】
細胞が、実施例に係る１％のアルテミア・サリーナ抽出物により前処理されている場合、ＣＩＲＢＰレベルは、３２℃の対照と比較して、３２℃では１７％有意に減少する。細胞が、実施例１に係る３％のアルテミア・サリーナ抽出物により前処理されている場合、ＣＩＲＢＰレベルは、３２℃の対照と比較して、３２℃では２８％有意に減少する。
【００５３】
結論
ＣＩＲＢＰ発現の減少は、無処置の対照細胞と比較して、実施例１に係る１％または３％のアルテミア・サリーナ抽出物より前処置して冷熱ストレスを与えた細胞において観察される。
【００５４】
実施例３：冷熱ストレス後のＣＩＲＢＰのｍＲＮＡの評価
この試験の目的は、ＣＩＲＢＰのｍＲＮＡは、中等度の低体温ストレス（３２℃）の前に、実施例１により得られた（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物による処置により調節されているかどうかを決定することである。ＣＩＲＢＰのｍＲＮＡのレベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により評価した。
【００５５】
プロトコル
ケラチノサイト（ＮＨＫ）を、増殖培地中１％のアルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物により処置する。同時に、無処置対照を構成するため、ＮＨＫ培養物を、処置を行うことなく維持する。この培養は３７℃で行われる。次に処置した培養物および無処置培養物を３２℃に６時間置く。
【００５６】
インキュベートの後、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ７４１０４）を使用して抽出し、リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ４３６８８１４）を含むＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いで逆転写した。定量的ＰＣＲを、Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。標的ＣＩＲＢＰおよび内在性対照の１８Ｓのプライマーおよびプローブは、Ｔａｑｍａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  １８Ｓに関してＨｓ９９９９９９０１＿ｓ１およびＣＩＲＢＰ：  Ｈｓ００９８９７６２＿ｇ１）から得て、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得た滅菌水に希釈する。
【００５７】
結果
図２に示される結果は、３７℃の対照と比較して、中等度の低体温（３２℃）に供した無処置のケラチノサイトにおけるＣＩＲＢＰのｍＲＮＡの発現が５９％有意に減少したことを証明した。
【００５８】
ケラチノサイトを、低体温ストレスへの曝露の前に１％アルテミア・サリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）抽出物により処置した場合、ＣＩＲＢＰのｍＲＮＡのレベルは、３７℃で抽出物により前処置したケラチノサイトと比較して１２％増加し、３２℃の無処置対照のケラチノサイトと比較して３３％減少した。
【００５９】
結論
実施例１に係るアルテミア・サリーナ抽出物により前処置して低温に供したケラチノサイトでは、無処置対照細胞と比較して、より低いレベルのＣＩＲＢＰのｍＲＮＡが観察された。
【００６０】
実施例４：経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）に及ぼす実施例１由来の抽出物の効果
目的：
この試験は、熱ストレスに曝露した皮膚の保護に及ぼす、詳しくは熱／低熱ストレスの際の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）に及ぼす実施例１に従って得られたアルテミア・サリーナ抽出物の有効性を評価する。経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）は、皮膚の透過性およびバリア機能を間接的に反映するパラメータである（Ｔｏｂｙ  Ｍａｔｈｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）。熱／低熱ストレスは、夏および冬の両方の屋内と屋外との間の温度差を模倣する。
【００６１】
プロトコル
この試験を、９名の「熟年」群（４８〜５７歳）および１０名の「若年」群（２１〜３４歳）を含む、２１歳から５２歳の１９名のボランティアで行った。ボランティアに応じて、皮膚の性質は、病態のない、表現型２〜４の正常肌または乾燥肌であった。
【００６２】
この試験を、実施例１に係るアルテミア・サリーナ抽出物に対して二重盲検で行い、３週間継続した。
【００６３】
実施例１由来のアルテミア・サリーナ抽出物およびプラセボを、左右それぞれの太腿の同一の領域に生成物濃度で朝および夜に１日に２回適用した。適用した生成物の量は２ｍｇ／ｃｍ２であった。
【００６４】
熱ストレスのプロセス：まず、加熱パッド（ＷＥＬＬＹＳ（登録商標）電熱パッド）を太腿に１０分間適用した。その直後、アイスパックを１０分間適用した（ＦｉｒｓｔＩｃｅ（登録商標）（ＥＺＹ  ＷＲＡＰ）アイスパック）。
【００６５】
経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を、Ｄｅｒｍａｌａｂ蒸発計（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して評価した。この測定を、ｇ／ｍ２／ｈで表し、標準偏差が０．１である場合、または６０秒後に中断する。測定は、制御された温度および湿度条件（２１℃±１および５０％±５）で行った。
【００６６】
調製方法：
１）ベースラインの測定、
２）生成物の適用
３）ストレスの０日〜２１日前、およびストレス後２１日目での測定
結果を分析するために、本出願人は、ＴＥＷＬ測定曲線のプラトーを得る時間を観察した。この時間は、皮膚が回復に要する時間、すなわち熱ストレス後にそのベースライン状態に戻る時間に対応する。本出願人は、この時間を「回復時間」と呼ぶ。次に、本出願人は、実施例１に係る抽出物で処置した側の大腿およびプラセボで処置した側の大腿の回復時間を統計的に比較する。
ストレス後、ＴＥＷＬの測定を２分ごとに行う。
【００６７】
結果
本出願人は、プラセボで処置した領域よりもアルテミア抽出物で処置した領域において、より迅速に曲線の平衡に達することに注目する。
【００６８】
回復時間は、プラセボで処置した領域よりもアルテミア抽出物で処置した領域において、平均で２７％有意に早い。
【００６９】
結論：
ＴＥＷＬ値は、プラセボと比較して、実施例１に係るアルテミア・サリーナ抽出物で処置した領域では、冷‐温の熱ストレス後により迅速に正常状態に戻る。この結果は、アルテミア・サリーナ抽出物が、温／冷熱ストレス後に皮膚がより迅速に回復するのを助けることを示す。
【００７０】
実施例５：組成物の調製
１．保護クリーム
【表１】
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【００７１】
調製方法
１．メインタンクにフェーズＡをホモジナイズする。
２．フェーズＢの上に振りかけて１０分間ホモジナイズし、次に５０℃に加熱しはじめ、３０分間良好に混合する。
３．温度を低下させ、フェーズＣを添加する。十分に混合してホモジナイズする。
４．残しておいたビーカーでフェーズＤを調製し、ホモジナイズするまで５５〜６０℃に加熱し、温度を低下させる。
５．フェーズＥ由来のエレメントを１つずつメインタンクに添加し、各添加の間で良好に混合する。
６．フェーズＤをメインの容器に（雰囲気温度で）添加し、ホモジナイズするまで混合する。
７．２５℃でフェーズＦを添加し十分に混合する。
８．メインタンクに添加する前にフェーズＧをあらかじめ混合する。
９．フェーズＨ由来のエレメントを１つずつ添加し、各添加の間で十分に混合する。
１０．２５℃で停止する。
【表２】
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【００７２】
調製方法
１．メインタンクにフェーズＡをホモジナイズする。
２．フェーズＢの上に振りかけて、ホモジナイズするまで１０分間ホモジナイズする。
３．残しておいたビーカーで、フェーズＣを調製し、ホモジナイズするまでホモジナイズする。フェーズＤに拡散し、ホモジナイズするまで十分に混合する。
４．２５℃で、フェーズＣ＋Ｄをメインの容器に添加し、ホモジナイズするまで混合する。
５．２５℃で、フェーズＥをメインの容器に添加し、ホモジナイズするまで混合する。
６．２５℃で、フェーズＣをメインの容器に添加し、ホモジナイズするまで混合する。
７．２５℃で停止する。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
調製方法
１．水をメインタンクに添加し、８０℃に加熱し始める。
２．６０℃でフェーズＢの上に振りかけて、ホモジナイズするまで十分に混合する。
３．８０℃で、フェーズＣを添加し、十分に混合してフェーズＤを添加する。
４．フェーズＥの成分を取り置きしたビーカーに添加し、７５〜８０℃に加熱する。
５．８０℃で、フェーズＥをメインタンクに添加し、十分に混合する。エマルジョンを必ずホモジナイズする。
６．冷却を開始する。
７．６５℃で、フェーズＦを添加し、十分に混合する。
８．３０℃に冷却し、フェーズＧ、次にフェーズＨを添加し、各フェーズの間でホモジナイズするまで十分に混合する。
９．２５℃で停止する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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