(57)【要約】標的ファージのゲノムを改変する方法を記述する。そのような改変ファージを含む組成物も同様に記述する。組成物は、ヒトの治療にとって有用な薬剤として調合することができ、細菌感染症を含む様々な状態を治療しうる。
2017531432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ファージゲノム改変エレメントを含み、β−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードするファージ標的化領域を含有するベクターを提供するステップと；
（ｂ）標的ファージのゲノムを改変するために、ベクターを標的ファージと混合するステップと；
（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性の存在下で標識を放出する条件下で、得られたファージをレポーター標識によって標識されたβ−ガラクトシダーゼ基質の存在下でレポーター宿主細胞において増殖させるステップと；
（ｄ）レポーター宿主細胞においてβ−ガラクトシダーゼ活性を示すファージを回収するステップと
を含む、標的ファージのゲノムを改変する方法。
【請求項２】
標的ファージが溶菌性ファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクターを標的ファージと混合するステップが、標的ファージが感染した宿主細胞で行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的ファージゲノムが、第一の標的配列と第二の標的配列とを含み、ベクターのファージ標的化領域が、組み換えが起こるように標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接して、それによって標的ファージのゲノムが改変される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が不連続である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が、組み換え後の遺伝子の不活化のためにファージ遺伝子またはその一部に隣接する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ファージ遺伝子が溶菌遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ベクターのファージ標的化領域が、標的ファージのゲノムに取り込むための外因性のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
外因性のＤＮＡが抗菌タンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
外因性のＤＮＡが、α／β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードする遺伝子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＡＳＰがＳＡＳＰ−Ｃである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子が構成的プロモーターの制御下にある、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
構成的プロモーターが、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｄａ、ｌａｓＢ、およびそれらと９０％超の配列同一性を有するプロモーターから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第一および第二の隣接配列の少なくとも１つが、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と比較して変異を含有する、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
変異が点突然変異である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ファージ標的化領域が、β−ガラクトシダーゼのαおよびγサブユニットの１つをコードし、レポーター宿主細胞が、β−ガラクトシダーゼのαおよびγサブユニットの他方を発現する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ファージ標的化領域がβ−ガラクトシダーゼのαサブユニットをコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
レポーター標識が比色分析標識である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
採取したファージが、β−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードする配列を除去するように処置される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ファージのゲノムを改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは、世界中で最も豊富な生物であり、常に１０３０個存在すると推定されている。バクテリオファージは、想像可能なあらゆる環境に住むことができると報告されており（Ｂｒａｂｂａｎら、２００５）、このため、生物工学において使用するために生物学的多様性の巨大な宝庫を提供することができる。ファージは、タンパク質−タンパク質相互作用を特徴付けするためのファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ、１９９７）、細菌病原体を迅速に同定するための診断試験（Ｄｏｂｏｚｉ−Ｋｉｎｇら、２００５）、および「ファージ療法」による細菌感染症の治療（Ｈａｒｐｅｒら、２０１１）などの多様な応用において使用されている。ファージの別の用途は、標的病原性細菌に毒性タンパク質をコードする遺伝子を送達するために使用することができる、ニーズに合わせた遺伝子送達ビヒクルを作製するための改変の基礎としての使用である。そのようなアプローチは、ＳＡＳＰｊｅｃｔシステム（国際公開第２００９／０１９２９３号パンフレット）に記述されており、このシステムでは、バクテリオファージを非溶菌性となるように、このため最終的に非生存となるように、およびＳＡＳＰ遺伝子発現カセットを有するように改変し、これを標的細菌に送達して、それによって迅速にＳＡＳＰを発現させる。ＳＡＳＰは、休眠時のグラム陽性菌芽胞のＤＮＡを保護する低分子酸可溶性芽胞タンパク質である。しかし、栄養細胞においてＳＡＳＰが発現されると、ＳＡＳＰが非配列特異的に細胞ＤＮＡに急速に結合することにより、急速な細胞死が起こる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）。
【０００３】
ファージは、テンペレートファージと非テンペレートファージに広く分類することができる（Ａｂｅｄｏｎ、２００８）。テンペレートファージは、２つの異なる生活環で存在することができる。１つの生活環において、テンペレートファージは、「溶菌的」に複製する−すなわち、ファージは宿主細胞に感染して、複製し、新しいファージ子孫を作製し、このプロセスは、細胞の溶解および成熟ファージ粒子の放出で終わる。他の生活環において、テンペレートファージは、細胞に感染して、通常、特異的結合部位で宿主細胞ゲノムに組み込まれ、「プロファージ」となる。その際に、ファージは、宿主細胞ゲノムの一過性の一部となり、宿主細胞ＤＮＡと共に複製される。組み込まれたプロファージは一般的に、その組み込まれた状態ではその宿主細胞に対して無害であり、細胞に追加の遺伝子を提供することによって、しばしば細胞に対して選択的利点を提供することができ、例えばＣＴＸ毒素遺伝子は、ＣＴＸプロファージによってビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ）に提供され、非毒素遺伝子を有する株と比較してそのような株のビルレンスを増加させる（Ｗａｌｄｏｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、１９９６）。これに対し、非テンペレートファージは、「溶菌性ファージ」としても知られ、上記の溶菌性の生活環に限って複製することができ、宿主ＤＮＡに組み込まれることはなく、したがって、決して宿主細胞ゲノムの一部となることはない。本明細書において以降、そのようなファージを、溶菌的複製とプロファージ複製の両方を行うことができるテンペレートファージと区別するために、「絶対溶菌性」として記述する。
【０００４】
遺伝子改変のためのファージを選択する場合、例として、そのようなファージがＳＡＳＰなどの抗菌タンパク質をコードする遺伝子の送達ベクターとして作用する場合には、遺伝子改変に対するファージの従順性は重要な要因である。概して、テンペレートバクテリオファージは、細菌宿主種を、組み換えおよび耐性マーカー選択、またはリコンビニアリングシステム（Ｔｈｏｍａｓｏｎら、２０１４）を伴う標準的な分子遺伝子学技術によって操作することができる限り、容易に遺伝子改変される。
【０００５】
組み込まれたファージＤＮＡをプロファージとして有する溶原菌の形態でのテンペレートファージを、抗生物質耐性または重金属耐性マーカーなどの任意の多様な選択可能マーカーに結合した外因性のＤＮＡを有するように改変することができる。そのようなマーカーを、外因性のＤＮＡに結合させて、プロファージＤＮＡの領域に隣接させ、細菌宿主（溶原菌）において複製できない適切なベクター（自殺ベクター）にクローニングすることができる。そのようなプラスミドを、接合または化学もしくは電気的形質転換などの一般的な方法により細菌溶原菌に導入した後、プラスミドに存在する相同な配列を介して組み込まれた組み換え体を、外因性のＤＮＡに結合した耐性マーカーを介して選択することができる。カウンターセレクタブルマーカーも同様にテンペレートファージを改変するために使用することができる。耐性マーカーを保持している組み換え型ファージを、ＰＣＲなどの一般的な方法によってスクリーニングすることができる。あるいは、ｓａｃＢなどのカウンターセレクタブルマーカーによって、そのようなファージを改変するために使用されるプラスミドの骨格を改変することができ、外因性のＤＮＡに結合した耐性マーカーを選択し、カウンターセレクタブルマーカーを選択しないことによって、外因性のＤＮＡのみを有する組み換え型プロファージを単離することができる。遺伝子型はＰＣＲによって確認することができる。そのようなベクターは市販されている。そのような改変ファージは、例えばマイトマイシンＣの添加によって溶原化した株から誘導することができ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、２００２）、ファージが宿主染色体から切り離されてその溶菌相に入ると、保持されたマーカーをもはや選択することができないが、マーカーおよび外因性のＤＮＡはファージゲノムにとどまることができる。
【０００６】
しかし、遺伝子改変された溶菌性ファージの単離は、上記の同じ方法を使用して達成することはできない。例えば、細菌に耐性を付与する抗生物質耐性および重金属耐性マーカーは、ファージの絶対溶菌性の生活環により選択することができないことから、改変された絶対溶菌性ファージを単離するために通常の正の選択を使用することは不可能である。ファージのＤＮＡは、決して宿主細胞ゲノムの一部とならず、したがって宿主に耐性を伝達する選択可能耐性マーカーは、絶対溶菌性ファージに存在する場合は選択可能ではない。
【０００７】
溶菌性ファージを改変するためにいくつかの技術が開発されている。そのような１つの例は、ＢＲＥＤ技術（電気穿孔ＤＮＡのバクテリオファージリコンビニアリング）（Ｍａｒｉｎｅｌｌｉら、２００８）であり、これは「リコンビニアリング」アプローチを使用して、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ファージの改変に関して記述されている。細菌ゲノムを操作するためのリコンビニアリング法は、λＲｅｄシステムで最初に記述された（Ｙｕら、２０００）。この技術において、組み換えタンパク質ＥｘｏおよびＢｅｔａは、形質転換により宿主細胞に導入される直線状のＤＮＡ配列の効率的な組み換えを触媒する。ＢＲＥＤアプローチも同様に、ファージゲノムがＭ．スメグマティス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）細胞に直線状の「標的化」ＤＮＡ断片と同時形質転換される場合に、高レベルの組み換えを促進するために、組み換え促進タンパク質−マイコバクテリウムバクテリオファージ由来のＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ様タンパク質ｇｐ６０およびｇｐ６１を利用する。それによって、組み換え型ファージをスクリーニングすると、高い効率の組み換えにより比較的容易に同定される。しかし、そのようなアプローチは、選択された細菌種における効率的なリコンビニアリングシステムの開発に依存する。さらに、ファージゲノムは大きく（Ｈｅｎｄｒｉｘ、２００９）、大きいＤＮＡ分子の形質転換は、大腸菌などの容易に形質転換可能な細菌においても非効率的であり（Ｓｈｅｎｇら、１９９５）、効率的な形質転換技術は、多くの細菌種で開発されていない。
【０００８】
特定のバクテリオファージを改変するために特異的な技術が開発されている。例として、ＲＩＰｈ（ファージ複製のＲｈｏ＊媒介阻害）として知られる技術が、ファージＴ４に関して開発されている（Ｐｏｕｉｌｌｏｔら、２０１０）。ファージ複製に必須の初期遺伝子は、初期タンパク質を産生するために宿主転写ターミネーター因子Ｒｈｏを必要とするコンカテマー化ランスルーＲＮＡとして転写される。大腸菌を、Ｒｈｏ＊と呼ばれるＲｈｏの誘導物質制御過剰発現変異コピーを含有するように改変すると、初期Ｔ４タンパク質の産生を阻害し、このように、Ｔ４ファージ複製を可逆的に阻害するが、宿主細胞生存率に及ぼす効果は最小限であることが見出された。この状態では、Ｔ４ゲノムは複製せず、ファージの生活環を成熟ファージ合成および溶解まで継続させないが、細胞から失われることはなく、組み換えのための基質である。ＲＩＰｈ技術において、λＲｅｄシステムは、この安定な中断状態にある間にＴ４ゲノムへの組み換えを標的化するために使用される。誘導物質を除去すると、ファージはその生活環を継続して成熟することができ、改変されたファージが形成される。
【０００９】
特異的絶対溶菌性ファージ改変システムのもう１つの例は、Ｔ７ファージにおいて見出される。大腸菌遺伝子ｔｒｘＡおよびｃｍｋは、ファージＴ７の増殖にとって必要であるが、宿主細胞の増殖にとっては必要ではない（Ｑｉｍｒｏｎら、２００６；Ｍａｒｋ、１９７６）。したがって、Ｔ７は、マーカー遺伝子を欠如する改変宿主細胞上で組み換え型ファージを選択することによって、これらの「マーカー」遺伝子のいずれかを有するように改変することができる。しかし、Ｔ４およびＴ７の例のいずれにおいても、ファージの複製機構、またはファージ複製に特に必要な宿主細胞遺伝子に関する非常に具体的で詳細な知識が必要である。
【００１０】
ファージの複製経路に関係する遺伝子または細胞におけるファージ増殖に必要な宿主細胞の遺伝子に関する具体的で詳細な知識に依存しない、テンペレートファージおよび溶菌性ファージの両方に使用することができるファージのゲノムを改変する技術があれば望ましいであろう。そのような技術は、任意の細菌種由来のファージに広く応用可能であればさらに望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０２／４０６７８号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｂｅｄｏｎ  ＳＴ．（２００８）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １．
【非特許文献２】Ｂｒａｂｂａｎ  ＡＤ，Ｈｉｔｅ  Ｅ，Ｃａｌｌａｗａｙ  ＴＲ．（２００５）．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｖｉａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２：２８７−３０３．
【非特許文献３】Ｄｏｂｏｚｉ−Ｋｉｎｇ  Ｍ，Ｓｅｏ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＪＵ，Ｙｏｕｎｇ  Ｒ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｋｉｓｈ  ＬＢ．（２００５）．Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ＳＥｎｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃａｓｃａｄｅ（ＳＥＰＴＩＣ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５：３−７．
【非特許文献４】Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉ，Ｓ．Ｃ．，ＭａｃＡｌｉｓｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｂ．，＆  Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．（１９８８）．Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ，  ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５９６３−５９６７．
【非特許文献５】Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎ，Ｄ．，Ｓａｃｋ，Ｒ．，Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｅ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｂｕｌｌｉｔｔ，Ｅ．＆  Ｗｏｌｆ，Ｓ．Ｇ．（２００４）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ＳｓｐＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ，  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｏｒｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３５２５−３５３０．
【非特許文献６】Ｈａｒｐｅｒ  ＤＲ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｅｎｗｒｉｇｈｔ  ＭＣ．（２０１１）．Ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２：９３５−４７．
【非特許文献７】Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＲＷ．（２００９）．Ｊｕｍｂｏ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２８：２２９−４０．
【非特許文献８】Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｕｍｂａｃａ，Ｄ．，Ｋｏｓｍａｎ，Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．，＆  Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ，Ｍ．Ｊ．（２００８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ-ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２８０６−２８１１．
【非特許文献９】Ｍａｒｋ  ＤＦ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（１９７６）．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３：７８０−４．
【非特許文献１０】Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ  ＬＪ，Ｐｉｕｒｉ  Ｍ，Ｓｗｉｇｏｎｏｖａ  Ｚ，Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  Ａ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＬＭ，ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＪＣ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．（２００８）．ＢＲＥＤ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３：ｅ３９５７．
【非特許文献１１】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＷＬ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｂ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｐ．（１９９０）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ，ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９００−６９０６．
【非特許文献１２】Ｐｏｕｉｌｌｏｔ  Ｆ，Ｂｌｏｉｓ  Ｈ，ａｎｄ  Ｉｒｉｓ  Ｆ．（２０１０）．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ：  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ，  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ．８：１５５−１６９．
【非特許文献１３】Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ，Ｍａｒｉｎｔｃｈｅｖａ  Ｂ，Ｔａｂｏｒ  Ｓ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（２００６）．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｔ７  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３：１９０３９−４４．
【非特許文献１４】Ｓｈｅｎｇ  Ｙ，Ｍａｎｃｉｎｏ  Ｖ，Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂ．（１９９５）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：１９９０−６．
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，Ｐｅｔｒｅｎｋｏ  ＶＡ．２００５）．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０．
【非特許文献１６】Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ＬＣ  Ｓａｗｉｔｚｋｅ  ＪＡ，Ｌｉ  Ｘ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  Ｎ，Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１−１６．
【非特許文献１７】Ｗａｌｄｏｒ  Ｍ，Ｍｅｋａｌａｎｏｓ  Ｊ．（１９９６）．Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：１９１０−１９１４．
【非特許文献１８】Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＳＪ，Ｈｏｕｃｈｉｎ  ＬＡ，ＭｃＤａｎｉｅｌ  Ｌ，Ｐａｕｌ  ＪＨ．（２００２）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ａｓ  ｄｅｐｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔａｍｐａ  Ｂａｙ，Ｆｌｏｒｉｄａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：４３０７−１４．
【非特許文献１９】Ｙｕ  Ｄ，Ｅｌｌｉｓ  ＨＭ，Ｌｅｅ  ＥＣ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：５９７８-５９８３．
【非特許文献２０】Ｗｅｌｐｌｙ  ＪＫ，Ｆｏｗｌｅｒ  ＡＶ，Ｚａｂｉｎ  Ｉ．ｂｅｔａ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｌｐｈａ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  （１９８１）．  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：６８０４−１０．
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、
（ａ）ファージゲノム改変エレメントを含み、β−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードするファージ標的化領域を含有するベクターを提供するステップと；
（ｂ）標的ファージのゲノムを改変するために、ベクターを標的ファージと混合するステップと；
（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性の存在下で標識を放出する条件下で、得られたファージをレポーター標識によって標識されたβ−ガラクトシダーゼ基質の存在下でレポーター宿主細胞において増殖させるステップと；
（ｄ）レポーター宿主細胞においてβ−ガラクトシダーゼ活性を示すファージを回収するステップと
を含む、標的ファージのゲノムを改変する方法を提供する。
【００１４】
意外にも、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする）を選択可能マーカーとして使用して、組み換え型ファージを単離して、例えば典型的にＳ−ＧａｌまたはＸ−Ｇａｌなどの標識されたガラクトースまたはそのアナログである標識された基質の存在下、細菌叢で増殖させることによって組み換え型ファージを同定することができる。本発明は、それが宿主細胞の特徴の選択に依存せず、その代わりにその溶菌状態でファージによって受け継がれる特徴に関して選択する遺伝子選択手段を提供することから、溶原菌を形成することができない絶対溶菌性ファージの遺伝子改変にとって特に有用である。
【００１５】
この技術は、ファージの複製経路に関係する遺伝子および／または細胞におけるファージの増殖にとって必要な宿主細胞遺伝子に関する具体的で詳細な知識に依存せず、したがって、操作の前にファージに対して過度の実験を必要としない。さらに、この技術は、任意の細菌種由来のファージに広く応用可能である。このことは、本出願によって示されるように、当業者が容易に実行することができる。
【００１６】
ベクターと標的ファージとの混合は、標的ファージが感染している宿主細胞において行われうる。プラスミドでありうるベクターを、標的ファージの宿主である宿主細胞に導入する。次に、標的ファージは、細胞に感染して、複製が起こる。標的ファージのゲノムの改変は、組み換えによって起こりうる。
【００１７】
ベクターのファージ標的化領域は、組み換えを促進するように設計されうる。好ましくは、標的ファージゲノムは、第一の標的配列と第二の標的配列とを含む。ベクターのファージ標的化領域は、組み換えが起こるように標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接する。このようにして、標的ファージのゲノムが改変される。
【００１８】
標的ファージのゲノムは、外因性のＤＮＡ配列をその中に組み込むことによって、点突然変異などの変異を組み込むことによって、または欠失を作製することによって改変することができる。これらの改変の組み合わせも同様に行うことができる。
【００１９】
ファージ標的化領域の第一および第二の隣接配列は、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同であることから、標的ファージの宿主細胞がベクターと標的ファージの両方を含有する場合、ファージは複製することができ、互いに相同な配列が対を形成する部位で組み換えが起こりうる。組み換え後、β−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードする配列を有する、それらの得られたファージのみが、レポーター宿主細胞において標識を放出する。これによって、改変ゲノムを含有する、得られた所望のファージを選択することができる。
【００２０】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列は、連続であっても不連続であってもよい。１つの構成において、標的ファージの第一および第二の標的配列は、一般的に不連続である。この構成に従って、組み換え事象が第一および第二の隣接配列と第一および第二の標的配列の間で起こる場合、第一および第二の標的配列の間のＤＮＡの領域が標的ファージゲノムから切除されて、その結果、欠失が起こる。都合のよいことに、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が、ファージ遺伝子またはその一部に隣接する場合、そのような欠失によって、組み換え後に遺伝子の不活化が起こる。１つの構成において、ファージ遺伝子は、エンドライシンなどの溶菌遺伝子である。このようにして、溶菌性の標的ファージを非溶菌性にすることができる。
【００２１】
標的ファージのゲノムの改変が、外因性のＤＮＡ配列の組み込みを伴う場合、ベクターのファージ標的化領域は、標的ファージのゲノムに組み込むための外因性のＤＮＡ配列をさらに含む。外因性のＤＮＡ配列およびβ−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードする配列はいずれも、ファージ標的化領域の第一および第二の隣接配列内に入ることから、β−ガラクトシダーゼに関して選択するためのファージの組み換えによって、得られたファージにおける外因性のＤＮＡ配列の取り込みが起こる。この構成に従って、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列は、連続または不連続でありうる。それらが不連続である場合、外因性のＤＮＡ配列の取り込みによって、同時にゲノム領域の欠失が起こる。第一および第二の標的配列がファージ遺伝子に存在する、またはそれらがファージ遺伝子もしくはその一部に隣接する場合には、外因性のＤＮＡ配列の取り込みによって同時に、組み換え後の遺伝子の不活化が起こる。
【００２２】
点突然変異などの変異を標的ファージに組み込む必要がある場合、ファージ標的化領域における第一および第二の隣接配列の少なくとも１つは標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と比較して変異を含有する。ファージの複製および組み換えによって、標的ファージのゲノムは変異を組み込むように改変される。このようにして、変異体ファージがβ−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードする配列を含有することから、レポーター宿主細胞において変異体ファージを選択して、これを変異の存在に関してスクリーニングすることができる。
【００２３】
上記のように、そのような変異の導入を、任意選択で標的ファージにおける欠失と共に、外因性のＤＮＡ配列の組み込みと組み合わせることができる。
【００２４】
ベクターのファージ標的化領域は、β−ガラクトシダーゼまたはそのサブユニットをコードする。β−ガラクトシダーゼは、αおよびωサブユニットを含有し、そのそれぞれが、互いがなければ不活性である。β−ガラクトシダーゼは、ｌａｃＺ遺伝子によってコードされ、αおよびωサブユニットはそれぞれ、ｌａｃＺαおよびｌａｃＺ△Ｍ１５によってコードされる。本発明の方法に従って、完全なｌａｃＺ遺伝子をマーカーとして使用することにより、得られたファージをレポーター宿主細胞において選択することができる。不活性なサブユニットの１つまたは他方を、得られたファージのマーカーとして用いる場合、サブユニットの他方は、β−ガラクトシダーゼ活性が組み換え型ファージの存在下で検出されるように、宿主細胞によってコードされなければならない。β−ガラクトシダーゼのαサブユニットは比較的小さい（１８０塩基対）ことから、ファージ標的化領域は、β−ガラクトシダーゼのαサブユニットをコードすることが都合がよい。この構成において、宿主細胞は、ωサブユニットをコードするｌａｃＺ△Ｍ１５を含有する。
【００２５】
レポーター標識は任意の検出可能な標識でありえて、典型的にガラクトース又はそのアナログに共有結合によって結合した有機部分である。適した標識には、比色分析標識が挙げられる。
【００２６】
意外にも、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする、本明細書において以降「ＬａｃＺ」）をマーカーとして使用して、比色分析基質Ｓ−Ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ９８１１）と組み合わせて組み換え型ファージを単離することができる。ｌａｃＺ遺伝子のファージゲノムへの付加をマーカーとして使用すると、Ｓ−Ｇａｌの存在下で細菌叢において増殖させることによって、組み換え型ファージを同定することができ、ｌａｃＺおよび他の遺伝子変化を有する組み換え型プラークは、非組み換え型プラークと比較して容易に同定可能である（図４）。Ｘ−Ｇａｌなどの他の一般的に使用されるβ−ガラクトシダーゼ基質は、かすかに青色のプラークを生成する。組み換え型ファージのハイスループットスクリーニングのためのマーカーとしてｌａｃＺαを使用することはこれまで不可能であると考えられていた。本発明は、宿主細胞の特徴の選択に依存せず、その代わりにその溶菌状態でファージによって受け継がれる特徴に関して選択する遺伝子選択手段を提供することから、溶原菌を形成することができない絶対溶菌性ファージの遺伝子改変にとって特に有用である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、完全長（３０７５ｂｐ）の大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を選択可能マーカーとして使用することである。本発明の特に好ましい実施形態は、ｌａｃＺα配列を選択可能マーカーとして使用することである。クローニングを容易にするために、切断型ｌａｃＺα配列（ＬａｃＺαペプチドをコードする１８０ｂｐ）をファージゲノムに組み込んで、そのゲノムの適した位置にｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子（ＬａｃＺω−ペプチドをコードする）を有する細菌宿主を選択することが好ましい。αおよびω−ＬａｃＺペプチドは、個々のタンパク質としては不活性であるが、同じ細胞において発現されると機能的β−ガラクトシダーゼ酵素を形成する（Ｗｅｌｐｌｅｙら、１９８１）。このように、ｌａｃＺの代わりにｌａｃＺαを使用することは、細菌ゲノムに挿入されるマーカーＤＮＡのサイズを最小限にする。
【００２８】
それぞれの場合において、プロモーターは、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットが発現されるように選択される。好ましいプロモーターは、宿主細胞において活性である。特に好ましいプロモーターはｌａｃプロモーターである。
【００２９】
このアプローチは、調整を行いながらｌａｃＺまたはｌａｃＺα配列をファージゲノムに導入する場合、溶菌性ファージゲノムの改変のための技術として使用することができる。
【００３０】
本発明の１つの構成において、ｌａｃＺ／ｌａｃＺα選択を使用して、外因性のＤＮＡ配列を有するファージを同定することができる。ファージの挿入部位に隣接する相同性配列を、選択した細菌宿主において複製することができるプラスミドにおいてクローニングすることができ、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαを外因性のＤＮＡ配列と共に相同性アームの間にクローニングすることができる。プラスミドを、ファージの細菌宿主において形質転換して、改変プラスミドを有する細菌にファージを感染させて、ファージ溶解物を単離する。ファージ溶解物を使用して、Ｓ−Ｇａｌの存在下で適した株（ｌａｃＺα組み換え体の場合にはω−ペプチドをコードするｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を有する）においてｌａｃＺ／ｌａｃＺα発現プラークを黒色のプラークとして同定する。黒色のプラークを採取して、予想される組み換え体配列の存在に関してＰＣＲによって試験することができる。
【００３１】
本発明の別の構成において、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαマーカーを除去して、マーカーレスの挿入部分を残すことができる。これは、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットを欠如すること以外は同質遺伝子である上記のプラスミドのバージョンを作製することによって行うことができ、ファージにおける挿入部位に隣接する相同性配列を、選択した細菌宿主において複製することができるプラスミドにおいてクローニングすることができ、ＤＮＡ配列を相同性配列の間にクローニングすることができる。プラスミドを、ファージの細菌宿主において形質転換して、改変プラスミドを有する細菌にファージを感染させ、ファージ溶解物を単離する。ファージ溶解物を使用して、Ｓ−Ｇａｌの存在下でｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子発現株におけるプラーク形成によって、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαを失っているプラークを同定する。透明なプラークを採取して、予想される組み換え体配列の存在およびｌａｃＺ／ｌａｃＺαの非存在に関してＰＣＲによって試験することができる。
【００３２】
本発明の別の構成において、ｌａｃＺ／ｌａｃＺα選択を使用して、配列が欠失されているファージを同定することができる。ファージにおける提唱される欠失部位に隣接する不連続な相同性配列を、選択された細菌宿主において複製することができるプラスミドにおいてクローニングすることができ、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαを相同性アームの間にクローニングすることができる。プラスミドは、ファージの細菌宿主において形質転換され、改変プラスミドを有する細菌にファージを感染させて、ファージ溶解物を単離する。ファージ溶解物を使用して、Ｓ−Ｇａｌの存在下で適した株（ｌａｃＺα組み換え体の場合にはω−ペプチドをコードするｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を有する）においてｌａｃＺ／ｌａｃＺα発現プラークを黒色のプラークとして同定する。黒色のプラークを採取して、ファージＤＮＡ配列における予想される欠失の存在に関してＰＣＲによって試験することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットを欠如する誘導体プラスミドを使用して除去することができ、その後上記のように透明なプラークに関してスクリーニングすることができる。
【００３３】
本発明の別の構成において、ｌａｃＺ／ｌａｃＺα選択を使用して、点突然変異を有する配列を有するファージを同定することができ、標的化ファージと比較してＤＮＡ配列において１つまたは複数の点突然変異を有し、およびファージにおける適したマーカー挿入部位に隣接する相同性配列を、選択した細菌宿主において複製することができるプラスミドにおいてクローニングすることができ、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαを相同性アームの間にクローニングすることができる。プラスミドをファージの細菌宿主において形質転換して、改変プラスミドを有する細菌にファージを感染させて、ファージ溶解物を単離する。ファージ溶解物を使用して、Ｓ−Ｇａｌの存在下で適した株（ｌａｃＺα組み換え体の場合にはω−ペプチドをコードするｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を有する）においてｌａｃＺ／ｌａｃＺα発現プラークを黒色のプラークとして同定する。黒色のプラークを採取して、ＰＣＲおよびシークエンシングによって試験して、所望の点突然変異の挿入に関してチェックすることができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットを欠如する誘導体プラスミドを使用して除去することができ、その後上記のように透明なプラークに関してスクリーニングすることができる。
【００３４】
別の構成において、上記のアプローチの組み合わせによって、標的化ファージにおける欠失と共に、外因性のＤＮＡ配列をファージに付加することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、上記のアプローチによって除去することができる。
【００３５】
別の構成において、上記のアプローチの組み合わせによって、標的化ファージにおける点突然変異と共に、外因性のＤＮＡ配列をファージに付加することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、上記のアプローチによって除去することができる。
【００３６】
別の構成において、標的化ファージにおける欠失および上記のアプローチの組み合わせによって導入された点突然変異と共に、外因性のＤＮＡ配列をファージに付加することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、上記のアプローチによって除去することができる。
【００３７】
別の構成において、標的化ファージにおいて欠失を行い、および上記のアプローチの組み合わせによって点突然変異を導入することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、上記のアプローチによって除去することができる。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明を使用して、改変絶対溶菌性バクテリオファージを同定することができる。別の実施形態において、本発明を使用して、溶原菌として、または溶原性の増殖の間に、改変されたテンペレートファージを同定することができる。ｌａｃＺ／ｌａｃＺαカセットは、上記のアプローチによって除去することができる。
【００３９】
１つの構成において、本発明を使用して、絶対溶菌性バクテリオファージを改変することができる。もう１つの構成において、本発明を使用して、溶菌的増殖の際にテンペレートファージを改変することができる。
【００４０】
さらなる構成において、本発明は、遺伝子送達ビヒクルとして使用するための絶対溶菌性バクテリオファージの改変において特に有用である。好ましい構成において、本発明を使用して、抗菌タンパク質の遺伝子を有するように溶菌性ファージを改変することができる。
【００４１】
従来の抗生物質に対する代替として、細菌内部で広いスペクトルの抗菌活性を証明する１つのタンパク質ファミリーは、α／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（今後ＳＡＳＰとして知られる）を含む。細菌内部で、ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡに結合し、クライオ電子顕微鏡を使用するこのプロセスの可視化により、最も研究されているＳＡＳＰであるＳｓｐＣが、ＤＮＡを被覆して、突出ドメインを形成し、ＤＮＡ構造（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４）をＢ様（ピッチ３．４ｎｍ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）に改変することが示されている。突出するＳｓｐＣモチーフは、隣接するＤＮＡ−ＳｓｐＣフィラメントと相互作用して、フィラメントを核タンパク質ヘリックスの堅固なアセンブリに詰め込む。２００８年に、Ｌｅｅらは、１０ｂｐ  ＤＮＡ二本鎖に結合したα／β型ＳＡＳＰの結晶構造を２．１Åの解像度で報告した。複合体において、α／β型ＳＡＳＰは、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを採用し、副溝の接触を通してＤＮＡと相互作用し、二量体としてＤＮＡのおよそ６ｂｐに結合し、ＤＮＡはＡ−Ｂ型コンフォメーションで存在する。このようにして、ＤＮＡの複製は停止し、ＳＡＳＰが結合している場合、ＳＡＳＰは、ＤＮＡの転写を防止する。ＳＡＳＰは、非配列特異的にＤＮＡに結合し（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）、そのため細菌ＤＮＡに変異があっても、ＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさない。α／β型ＳＡＳＰの配列は、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＳＡＳＰ−Ｃを含む、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に見出されうる。国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記述する。
【００４２】
ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般的にＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと呼ばれている。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、ＳＡＳＰがそれらの細菌内で産生され、細菌ＤＮＡに結合して、ＤＮＡのコンフォメーションをＢ様からＡ様に変化させる。標的細菌細胞内で十分量のＳＡＳＰが産生されると、感染細胞の生存率の低下を引き起こす。
【００４３】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法を使用して、ＳＡＳＰ発現カセットによりファージを改変してＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することができ、この技術を同様に使用して、ＳＡＳＰ発現カセットによりファージを改変すると同時に溶菌遺伝子を欠失させて、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することもできる。
【００４４】
したがって、本発明に従う１つの構成において、外因性のＤＮＡは、α／β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードする遺伝子を含む。このようにして、本発明の方法を使用して、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを産生することができる。改変バクテリオファージは、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰを含み、バクテリオファージは典型的に非溶菌性である。
【００４５】
ＳＡＳＰ遺伝子は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの別紙１に開示されるＳＡＳＰをコードする遺伝子のいずれか１つから選択することができる。好ましい構成において、ＳＡＳＰはＳＡＳＰ−Ｃである。ＳＡＳＰ−Ｃは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に由来しうる。
【００４６】
１つの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、α／β型ＳＡＳＰ活性、すなわちＤＮＡに結合してその構造をそのＢ型からＡ型に改変する能力を有するタンパク質を指し、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質を含むのみならず、その任意の相同体、ならびに同様にα／β型ＳＡＳＰ活性を有する任意の他のタンパク質も含む。代わりの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質、または国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質の任意の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、もしくは９９％配列同一性を有する任意の相同体を指す。別の代替の態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質を指す。
【００４７】
ＳＡＳＰ遺伝子は、改変バクテリオファージが標的細菌に複数のコピーで存在する場合に、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強力であることが都合がよい構成的プロモーターの制御下に存在することが好ましい。有用な構成的プロモーターには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のｒｐｓＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼのｐｇｉ、およびフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターｆｄａが挙げられる。感染の際に活性な好ましい調節型プロモーターは、エラスターゼのｌａｓＢである。これらのプロモーターは、典型的には緑膿菌に由来する。これらのプロモーター配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を有するプロモーターも同様に使用することができる。
【００４８】
さらなる態様において、本明細書において定義される改変バクテリオファージとその担体とを含む細菌細胞増殖を阻害または予防する組成物が提供される。そのような組成物は、広範囲の用途を有し、したがって意図される使用に従って調合される。組成物は、薬剤、特にヒト治療のための薬剤として調合されてもよく、細菌感染症を含む様々な状態を治療しうる。本発明に従って治療可能な感染症は、血流中の感染症、局所感染症、虫歯、呼吸器感染症、および眼の感染症を含む、局所組織および臓器の感染症、または多臓器感染症である。担体は、薬学的に許容されるレシピエントまたは希釈剤でありうる。そのような組成物の成分の正確な性質および量は、経験的に決定されてもよく、組成物の投与経路に一部依存する。
【００４９】
レシピエントに対する投与経路には、静脈内、動脈内、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入、局所（眼科を含む）、筋肉内、皮下、および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明に従う投薬量は、治療または予防される感染症の部位およびタイプに依存する。呼吸器感染症は吸入投与によって治療され、眼の感染症は点眼液を使用して治療されうる。改変バクテリオファージを含有する口腔内衛生製品も同様に提供される。歯垢の形成に関連する細菌を消失させるように調合された、本発明に従う改変バクテリオファージを含有するマウスウォッシュまたは練り歯磨きを使用してもよい。
【００５０】
本発明に従って産生された改変バクテリオファージは、例えば表面細菌汚染の処理ならびに土壌の改良または水の処理における除菌剤として使用されうる。バクテリオファージは、医療従事者および／または患者の処置において、例えばハンドウォッシュ中の除菌剤として使用されうる。特に病院での手順または食品調製に使用する作業表面および機器の処置も同様に提供される。１つの特定の実施形態は、１人の個体から他の個体への細菌の伝達および汚染を予防、消失、または低減するために、局所使用のために調合された組成物を含む。これは、特に従来の抗生物質に対して耐性の細菌が流行している病院の環境において微生物感染症の伝播を制限するために重要である。そのような使用に関して、改変バクテリオファージを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水に含めてもよく、またはゲルもしくはクリームに調合してもよい。何回も使用する場合、保存剤を添加してもよい。あるいは、製品を凍結乾燥して、賦形剤、例えばスクロースなどの糖を添加してもよい。
【００５１】
本発明を、単なる例として、以下の添付の図面を参照してさらに詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】ｌａｃＺ△Ｍ１５とＰｈｉ３３エンドライシンとをトランスに有するように緑膿菌を遺伝子改変するための、これらの遺伝子を含有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。
【図１Ｂ】ｌａｃＺ△Ｍ１５とＰｈｉ３３エンドライシンとをトランスに有するように緑膿菌を遺伝子改変するための、これらの遺伝子を含有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。
【図２Ａ】エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換した後、ｌａｃＺαマーカーを除去するようにＰｈｉ３３を遺伝子改変するためのプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。
【図２Ｂ】エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換した後、ｌａｃＺαマーカーを除去するようにＰｈｉ３３を遺伝子改変するためのプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。
【図２Ｃ】エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換した後、ｌａｃＺαマーカーを除去するようにＰｈｉ３３を遺伝子改変するためのプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。
【図２Ｄ】エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換した後、ｌａｃＺαマーカーを除去するようにＰｈｉ３３を遺伝子改変するためのプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。
【図３Ａ】本発明に従う、ｌａｃＺα遺伝子マーカーの獲得およびその後の喪失によって構築された、エンドライシンがｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃによって置換されたマーカーレス非溶菌性ファージであるＰｈｉ３３ファージ誘導体の構築を示す概略図（その１）である。
【図３Ｂ】本発明に従う、ｌａｃＺα遺伝子マーカーの獲得およびその後の喪失によって構築された、エンドライシンがｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃによって置換されたマーカーレス非溶菌性ファージであるＰｈｉ３３ファージ誘導体の構築を示す概略図（その２）である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
図４はプレートＡを示す：ｌａｃＺα配列がゲノムに組み込まれている組み換え型Φ３３およびプレートＢ：野生型Φ３３を示す。両方のプレートにおいて、ファージを、Ｓ−Ｇａｌおよびクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムの存在下でｌａｃＺ△Ｍ１５を発現する緑膿菌株ＰＡＯ１においてプラーク形成させた。
【００５４】
溶菌性バクテリオファージを非溶菌性にする、および遺伝子改変ファージの同定手段としてｌａｃＺαマーカーを利用して３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ２遺伝子（ｒｐｓＢ）の発現を通常制御するプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃを有するようにする、溶菌性バクテリオファージの遺伝子改変の概要。
【００５５】
相同組み換えによって遺伝子を除去してファージゲノムに付加することができる。外来遺伝子を有するファージおよびプロモーターを構築するいくつかの方法があり、以下はそのような方法の例である。
【００５６】
Ｐｈｉ３３誘導体を構築するために、単なる例として、大腸菌／緑膿菌の広い宿主域ベクターを使用して、ファージを非溶菌性にする方法、および組み換え型ファージの同定のためにｌａｃＺαマーカーを利用して、ｒｐｓＢプロモーターの制御下のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を相同組み換えによってバクテリオファージゲノムに付加する方法が示される。同様に、ｌａｃＺαマーカーを、その後の相同組み換えステップを介して除去して、ｒｐｓＢプロモーターの制御下のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を有するマーカーレス非溶菌性ファージを取得しうる方法も示される。
【００５７】
改変されるこれらのバクテリオファージは、溶菌性（テンペレートではなくて）であることから、これらの記述のバクテリオファージ構築ステップの必要条件は、所望の組み換え型バクテリオファージの△エンドライシン、ｌａｃＺα表現型を相補するために、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５の両方を有する適切な宿主緑膿菌株の構築である。一例として、これらの緑膿菌株の構築は、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターを使用して相同組み換えによって行うことができる。エンドライシンおよびｌａｃＺ△Ｍ１５トランスジーンを挿入するためのゲノム位置は、必須の遺伝子が影響を受けないように、および隣接する遺伝子の発現に対する極性効果を通して望ましくない表現型が生成されないように選択すべきである。一例として、１つのそのような位置は、緑膿菌株ＰＡＯ１  ｐｈｏＡ相同体のすぐ下流でありうる。
【００５８】
Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子は、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体を、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って選択することができる。次に、２回目の相同組み換え事象を受けた単離体（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）を、１０％スクロースを含有する培地において単離することができる（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用する）。
【００５９】
相同組み換えを使用して、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下のＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子、および大腸菌ｌａｃプロモーターの制御下の大腸菌ｌａｃＺα遺伝子マーカーの両方を導入しながら、Ｐｈｉ３３のエンドライシン遺伝子を置換すると同時に非溶菌性にすることができる。ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ−Ｃと、ｌａｃプロモーターによって制御される大腸菌ｌａｃＺα遺伝子マーカーとからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてエンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、適した緑膿菌（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）株に伝達して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）においてプラーク形成させて、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する色素形成基質を含有する培地においてｌａｃＺαレポーターの獲得に関して調べることによって二重組み換え体を同定することができる。
【００６０】
次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、エンドライシン遺伝子を、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子に置換するように改変されている、既に記述された（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去することができる。ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ−Ｃからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてエンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、適した緑膿菌（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）株に伝達して、得られた株に、エンドライシン遺伝子を緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子に置換するように改変されている、既に記述された（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）においてプラーク形成させて、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する色素形成基質を含有する培地においてｌａｃＺαレポーターの喪失に関して調べることによって二重組み換え体を同定することができる。
【００６１】
（実験技法）
クローニング目的でＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記述される方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応から精製して、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β−ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ−ＧａｌはＳｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができ、これはβ−ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。
【００６２】
プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場合、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの消化を確実にするために、さらなる２〜６ヌクレオチドを５’末端に付加することができる。
【００６３】
クローニングは全て、特に明記していない限り、他所で記述されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡを一晩ライゲートした後、ＤＨ５αまたはＴＯＰ１０などの大腸菌クローニング株にそれらを形質転換して、選択培地で単離することによって行うことができる。
【００６４】
ｐＳＭ１０８０などの大腸菌／緑膿菌の広い宿主域ベクターを使用して、大腸菌と緑膿菌の間で遺伝子を伝達することができる。ｐＳＭ１０８０は、ｐＲＫ２由来の、緑膿菌プラスミド由来の広い宿主域の複製開始点ｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌と緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、およびプラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶを結合させることによって既に産生された。
【００６５】
緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターｐＳＭ１１０４を使用して、対立遺伝子交換によって緑膿菌変異体を生成することができる。ｐＳＭ１１０４は、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、プラスミドｐＵＣ１９由来の高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶ、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８由来のｓａｃＢ遺伝子を、カウンターセレクタブルマーカーとして使用するために、強力なプロモーターの制御下で結合させることによって既に産生された。
【００６６】
（バクテリオファージゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子の両方を有する緑膿菌株を生成する、プラスミドの構築）
１．緑膿菌ＰＡＯ１  ｐｈｏＡ相同体の３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を含むプラスミドｐＳＭＸ６００（図１）は、以下のように構築することができる。
【００６７】
緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端のおよそ１ｋｂを含む領域を、プライマーＢ４６００およびＢ４６０１を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次にＰＣＲ産物を精製して、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩによって消化することができる。ＰＡ３２９７オープンリーディングフレームの３’末端を含む、緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流のおよそ１ｋｂを含む第二の領域は、プライマーＢ４６０２およびＢ４６０３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによって消化することができる。２つの消化物を再度精製して、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによって消化されているｐＳＭ１１０４に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ６００を得ることができる（図１）。
【００６８】
プライマーＢ４６００は、５’ＳｐｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡの終止コドンのおよそ１ｋｂ上流に位置する配列とからなる（図１）。プライマーＢ４６０１は、５’ＢｇｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（終止コドンを小文字で示す；図１）。プライマーＢ４６０２は、５’ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の終止コドンのすぐ下流の配列とからなる（図１）。プライマーＢ４６０３は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子のおよそ１ｋｂ下流の、ＰＡ３２９７オープンリーディングフレーム内の配列とからなる（図１）。
【００６９】
【化１】
2017531432.tif 000003
【００７０】
２．エンドライシンプロモーターの制御下で、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子を有するｐＳＭＸ６００を含むプラスミドｐＳＭＸ６０１（図１）は以下のように構築することができる。
【００７１】
エンドライシン遺伝子プロモーターを、プライマーＢ４６０４およびＢ４６０５を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。エンドライシン遺伝子そのものは、プライマーＢ４６０６およびＢ４６０７を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、２つのＰＣＲ産物を、２つの外側のプライマーＢ４６０４およびＢ４６０７を使用してＳｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによって共に結合することができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化して、同様にＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化されているｐＳＭＸ６００にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ６０１を得ることができる（図１）。
【００７２】
プライマーＢ４６０４は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーター（ｓｏｘＲターミネーター、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ０５８７１４の６０〜９６塩基）と、Ｐｈｉ３３エンドライシンプロモーター領域の開始部の配列（下線、太字）とからなる（図１）。プライマーＢ４６０５は、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子の開始コドンと重なり合う領域と相補的な配列の５’領域と、その後に続くエンドライシンプロモーター領域の末端と相補的な配列（下線、太字；図１）とからなる。プライマーＢ４６０６は、プライマーＢ４６０５の逆相補体である（同様に図１を参照されたい）。プライマーＢ４６０７は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（図１）。
【００７３】
【化２】
2017531432.tif 000004
【００７４】
３．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ６０１を含むプラスミドｐＳＭＸ６０２（図１）は、以下のように構築することができる。
【００７５】
ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子を、プライマーＢ４６０８およびＢ４６０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、同様にＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化されているｐＳＭＸ６０１にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ６０２を得ることができる（図１）。
【００７６】
プライマーＢ４６０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４６０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーターおよびｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字；図１）。
【００７７】
【化３】
2017531432.tif 000005
【００７８】
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流にＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ６０２（図１）を、接合によって、緑膿菌に伝達して、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
【００７９】
２．次に、二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによってｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。
【００８０】
３．次に、１０％スクロースで増殖する単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、エンドライシン遺伝子およびｌａｃＺ△Ｍ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。
【００８１】
４．単離体（ＰＡＸ６０）の確認後、エンドライシン変異とｌａｃＺαレポーターの両方の相補が必要である場合には、この株をＰｈｉ３３のさらなる改変のための宿主として使用することができる。
【００８２】
（ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαによってＰｈｉ３３および類似のファージのエンドライシン遺伝子を置換する、プラスミドの構築）
１．エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の領域を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ６０３（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８３】
エンドライシン遺伝子のすぐ下流のＰｈｉ３３配列の領域を、プライマーＢ４６６５およびＢ４６６６を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、このＰＣＲ産物を精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。エンドライシン遺伝子のすぐ上流のＰｈｉ３３配列の領域を、プライマーＢ４６６７およびＢ４６６８を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。次に、２つのＰＣＲ産物を再度精製して、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されたｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。２つのＰＣＲ産物のそれぞれの１つのインサートを有するクローンを、プライマーＢ４６６５およびＢ４６６８を使用してＰＣＲによって同定して、精製された推定クローンのＮｄｅＩ制限消化物の分析により、プラスミドｐＳＭＸ６０３を同定する（図２）。
【００８４】
プライマーＢ４６６５は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ下流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図２）。プライマーＢ４６６６は、５’ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４６６７は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のすぐ上流に位置する配列と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４６６８は、５’ＮｈｅＩ部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ上流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図２）。
【００８５】
【化４】
2017531432.tif 000006
【００８６】
２．ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃを含有するｐＳＭＸ６０３を含むプラスミドｐＳＭＸ６０４（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８７】
バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を、プライマーＢ４６６９およびＢ４６７０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＮｃｏＩによって消化することができる。ｒｐｓＢプロモーターを、プライマーＢ４６７１およびＢ４６７２を使用して緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｄｅＩによって消化することができる。２つの消化されたＰＣＲ産物を精製して、ＫｐｎＩおよびＮｄｅＩによって消化されているｐＳＭＸ６０３にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ６０４を得ることができる（図２）。
【００８８】
プライマーＢ４６６９は、５’ＫｐｎＩ制限部位と、その後に５塩基が続き、その後に続く二方向の転写ターミネーターと、Ｂ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の３’末端と相補的な配列（下線、太字；図２）とからなる。プライマーＢ４６７０は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くＢ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の５’末端の配列（図２）とからなる。プライマーＢ４６７１は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの末端と相補的な配列（図２）とからなる。プライマーＢ４６７２は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの開始部の配列（図２）とからなる。
【００８９】
【化５】
2017531432.tif 000007
【００９０】
３．ｌａｃＺαを含有するｐＳＭＸ６０４を含むｐＳＭＸ６０５（図２）は、以下のように構築することができる。
【００９１】
ｌａｃＺαは、プライマーＢ４６７３およびＢ４６７４を使用してＰＣＲ増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩによって消化して、同様にＫｐｎＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ６０４にライゲートして、ｐＳＭＸ６０５を得ることができる（図２）。
【００９２】
プライマーＢ４６７３は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの３’末端と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４６７４は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの発現を促進するｌａｃプロモーターの配列とからなる（図２）。
【００９３】
【化６】
2017531432.tif 000008
【００９４】
（エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換する、Ｐｈｉ３３および類似のファージの遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ６０５（図２）を、接合によって、緑膿菌株ＰＡＸ６０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ６０を得ることができる。
【００９５】
２．株ＰＴＡ６０に、個々の実験においてファージＰｈｉ３３または類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。
【００９６】
３．エンドライシン遺伝子がｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαに置換されている組み換え型ファージは、Ｓ−Ｇａｌを含有する培地において、緑膿菌株ＰＡＸ６０においてステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β−ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色プラークを調べることによって同定することができる。
【００９７】
４．ＰＣＲを行って、エンドライシン遺伝子が置換されていること、ならびにｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαが存在していることをチェックすることができる。
【００９８】
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ６０；図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ６０においてさらに２回プラーク精製することができる。
【００９９】
（ＰＴＰＸ６０由来のｌａｃＺαマーカーを除去して、非溶原性にされていてｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃを有するＰｈｉ３３のマーカーレスバージョンを生成する、遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ６０４（図２）を、接合によって、緑膿菌株ＰＡＸ６０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ６１を得ることができる。
【０１００】
２．株ＰＴＡ６１に、個々の実験においてファージＰＴＰＸ６０（図３）を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
【０１０１】
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ−Ｇａｌを含有する培地において、緑膿菌株ＰＡＸ６０においてステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β−ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である透明なプラークを調べることによって同定することができる。
【０１０２】
４．ＰＣＲを行って、ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃがなおも存在することを確実にしながら、ｌａｃＺαマーカーの除去を確認することができる。
【０１０３】
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ６１；図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ６０においてさらに２回プラーク精製することができる。
【０１０４】
参考文献
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Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ  ＬＪ，Ｐｉｕｒｉ  Ｍ，Ｓｗｉｇｏｎｏｖａ  Ｚ，Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  Ａ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＬＭ，ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＪＣ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．（２００８）．ＢＲＥＤ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３：ｅ３９５７．
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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2017531432.tif 000018
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