(57)【要約】インテグリンアルファ６の阻害物質を用いて対象において血液系腫瘍及び／または固形腫瘍を治療するための方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、前記阻害物質はモノクローナル抗体である。前記抗体は、追加の治療用物質に結合されてもよい。前記抗体は、追加の治療用物質と連続的または同時に共投与されてもよい。2017500286.tif 000005
2017500286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において血液系腫瘍を治療するための方法であって、
（ａ）インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、
（ｂ）前記対象において癌を治療するために前記阻害物質の有効量を投与することと
を含む、方法。
【請求項２】
それを必要とする対象において固形腫瘍を治療するための方法であって、
（ａ）インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、
（ｂ）前記対象において癌を治療するために前記阻害物質の有効量を投与することと
を含む、方法。
【請求項３】
それを必要とする対象においてインテグリンアルファ６の発現増加に関連する疾患状態を治療するための方法であって、
（ａ）インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、
（ｂ）前記対象において癌を治療するために前記阻害物質の有効量を投与することと
を含む、方法。
【請求項４】
前記血液系腫瘍が、白血病、リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リンパ腫が、エイズ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
固形腫瘍が、副腎皮質腫瘍（腺腫及び癌腫）、癌腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍（固形腫瘍）、肝芽細胞腫、肝細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫以外の軟部組織肉腫、及び／またはウィルムス腫瘍のうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害物質が、ペプチド、タンパク質、小分子、核酸、アプタマー、オリゴヌクレオチド、抗体、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、モノクローナル抗体もしくはその断片、ポリクローナル抗体もしくはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、モノクローナル抗体もしくはその断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片、Ｐ１Ｈ８もしくはその断片、またはこれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、インテグリンアルファ４阻害物質、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上をさらに含む、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法剤、前記チロシンキナーゼ阻害物質、前記インテグリンアルファ４阻害物質、またはこれらの組み合わせが、前記インテグリンアルファ６阻害物質を含む前記組成物と連続的または同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が治療用物質に結合されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
インテグリンアルファ６の阻害物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
前記阻害物質が、ペプチド、タンパク質、小分子、核酸、オリゴヌクレオチド、抗体、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、モノクローナル抗体もしくはその断片、ポリクローナル抗体もしくはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記阻害物質がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、Ｐ５Ｇ１０、Ｐ１Ｈ８、またはこれらの組み合わせである、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ｉ．インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物と、
ｉｉ．血液疾患の治療のための前記組成物についての使用説明書と
を含む、キット。
【請求項２１】
前記阻害物質が、ペプチド、タンパク質、小分子、核酸、オリゴヌクレオチド、抗体、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
前記抗体が、モノクローナル抗体もしくはその断片、ポリクローナル抗体もしくはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記阻害物質がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体が、Ｐ５Ｇ１０、Ｐ１Ｈ８、またはこれらの組み合わせである、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号第ＣＡ１７２８９６号の下に、政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明に対してある特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
それを必要とする対象においてインテグリンアルファ６の阻害物質の有効量を用いて血液系腫瘍を治療するための方法、組成物、及びキットが提供される。この阻害物質は、モノクローナル抗体、例えば、Ｐ５Ｇ１０またはＰ１Ｈ８であり得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書に引用された全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。以下の記述は、本発明を理解する上で有用であり得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれも、先行技術であるか、もしくは現在特許請求されている発明に関連するものであること、または具体的もしくは非明示的に参照されたいずれの刊行物も、先行技術であることは認めるものではない。
【０００４】
微小残存病変は、急性リンパ芽球性白血病の治療において重大な障壁である。過去数十年を通しての大きな進歩にもかかわらず、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者の全生存率は、成人では約４０パーセントであり、子供では約８０パーセントである（Ｐｕｉら、Ｆａｄｅｒｌら、Ｌａｒｓｏｎ及びＳｔｏｃｋ）。小児ＡＬＬが再発する場合、５０〜９５％の子供が治癒しない（Ｇａｙｎｏｎら）。血液病及び固形腫瘍に効果的な治療に対する必要性が当該技術分野において存在する。本明細書において、本発明者らは、新しいＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌマウスモデル（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）におけるならびに原発性ＡＬＬにおけるＩＴＧＡ６の役割を評価し、かつＡＬＬのインテグリンＩＴＧＡ６特異的標的化を、白血病を根絶するための新規療法として同定している。
【発明の概要】
【０００５】
以下の実施形態及びそれらの態様は、例示的かつ例証的であることを意味し、範囲を限定するものではない系、組成物、及び方法と併せて記載され、例証される。
【０００６】
インテグリンアルファ６特異的モノクローナル抗体が、本明細書に提供される。一実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ５Ｇ１０またはその断片、誘導体、もしくは変異体である。別の実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ１Ｈ８またはその断片、誘導体、もしくは変異体である。
【０００７】
それを必要とする対象において血液系腫瘍を治療し、前記血液系腫瘍を阻害し、前記血液系腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記血液系腫瘍の再発を予防するかもしくは前記血液系腫瘍の再発の可能性を低下させるための方法も、本明細書に提供される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、この阻害物質は、インテグリンアルファ６に結合するモノクローナル抗体である。様々な実施形態では、この方法は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、他の接着分子の阻害物質（例えば、インテグリンアルファ４の阻害物質）、またはこれらの組み合わせを投与することをさらに含む。
【０００８】
それを必要とする対象において固形腫瘍を治療し、前記固形腫瘍を阻害し、前記固形腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記固形腫瘍の再発を予防するかもしくは前記固形腫瘍の可能性を低下させるための方法が、本明細書にさらに提供される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、この阻害物質は、インテグリンアルファ６に結合するモノクローナル抗体である。様々な実施形態では、この方法は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、他の接着分子の阻害物質（例えば、インテグリンアルファ４の阻害物質）、またはこれらの組み合わせを投与することをさらに含む。
【０００９】
インテグリンアルファ６の過剰発現に関連する疾患状態を治療し、前記疾患状態を阻害し、前記疾患状態の重症度を低下させ、かつ／または前記固形腫瘍の再発を予防するかもしくは前記疾患状態の可能性を低下させるための方法も、本明細書に提供される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、この阻害物質は、インテグリンアルファ６に結合するモノクローナル抗体である。様々な実施形態では、この方法は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、他の接着分子の阻害物質（例えば、インテグリンアルファ４の阻害物質）、またはこれらの組み合わせを投与することをさらに含む。
【００１０】
インテグリンアルファ６の阻害物質を含む薬学的組成物及びキットも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、この阻害物質は、インテグリンアルファ６に結合するモノクローナル抗体である。一実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ５Ｇ１０、またはその断片、誘導体、もしくは変異体である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
例示の実施形態が、参照図面で例証される。本明細書に開示される実施形態及び図面は、限定的よりはむしろ例示的とみなされるべきであることが意図される。
【図１】本発明の様々な実施形態により、インテグリンＩＴＧＡ６が、初代プレＢ  ＡＬＬ中で高度に発現されることを示す。図１Ａ、Ｊａｍｅｓ  Ｄｏｗｎｉｎｇ（Ｒｏｓｓら）及びＪａｃｑｕｅｓ  ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ（ｖａｎ  Ｚｅｌｍら）の群からの２つの遺伝子発現データセットが再分析された。ＡＬＬ患者と正常なプレＢドナー細胞との間のＩＴＧＡ６の異なる発現が、ヒートマップによって表現された。図１Ｂ、初代プレＢ  ＡＬＬサンプルの臨床情報及びＦＡＣＳによって決定されたそれらのヒトＩＴＧＡ６の発現。図１Ｃ、プレＢ  ＡＬＬ及び正常なプレＢサンプルのＩＴＧＡ６発現についての代表的ドットプロット。
【図２】本発明の様々な実施形態により、診断時のＩＴＧＡ６の高発現レベルが、２９日目の陽性ＭＲＤを予測することを示す。図２Ａ、２Ｂ、ＣＯＧ  Ｐ９９０６研究のＭＲＤ＋及びＭＲＤ−ＡＬＬ症例におけるＩＴＧＡ６の２つのプローブセットが分析された。ＭＲＤは、導入療法の終わりに（２９日目）にフローサイトメトリーによって測定された。Ｐ値を、各プローブセットについてのウィルコクソン検定から得た。
【図３】本発明の様々な実施形態により、ＩＴＧＡ６欠失が、ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＡＬＬ細胞の脱接着を誘発することを示す。図３Ａ、誘発性ＩＴＧＡ６欠失を有するマウス白血病モデル（左パネル）及びＢＣＲ−ＡＢＬ１（ｐ２１０）＋ＡＬＬの表現型（右パネル）についての概要。図３Ｂ、タモキシフェン（１．５μＭ）によって誘発されたＩＴＧＡ６の欠失が、フローサイトメトリーによって、タモキシフェンとのインキュベーション後１４４時間に確認された。図３Ｃ、ＩＴＧＡ６の欠失が、ＰＣＲによって確認された。図３Ｄ、ｍラミニンコートプレート上の接着ＣｒｅＥＲＴ２ならびに空ＥＲＴ２細胞（４００倍）（左パネル）及び接着のパーセント（右パネル）。
【図４】本発明の様々な実施形態により、ＩＴＧＡ６欠失が、ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＡＬＬ細胞中のアポトーシスを誘発することを示す。図４Ａ、ＩＴＧＡ６の誘発性欠失。図４Ｂ、欠失後のアネキシンＶ及び７−ＡＡＤ染色の様々な時間点における、ＣｒｅＥＲＴ２及び空ＥＲＴ２細胞のアポトーシス分析。図４Ｃ、ＢｒｄＵフローサイトメトリーによる、欠失後の様々な時間点におけるＣｒｅＥＲＴ２及び空ＥＲＴ２細胞の細胞周期分析。図４Ｄ、欠失後３日目及び５日目のＣｒｅＥＲＴ２及び空ＥＲＴ２細胞中のタンパク質変化のウェスタンブロット。
【図５】本発明の様々な実施形態により、ＩＴＧＡ６欠失が、ＡＬＬ細胞をニロチニブに対して感受性にすることを示す。ＣｒｅＥＲＴ２及び空ＥＲＴ２の生存率である。ＩＴＧＡ６ｆ／ｆＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣｒｅＥＲＴ２及び空ＥＲＴ２細胞を、組織培養プレート（さらなるリガンドがコートされていない）上に蒔き、タモキシフェン（１．５μＭ）及びニロチニブ（０．０２μＭまたは０．２μＭ）で１〜３日間処理した。細胞生存率を、トリパンブルー排除法によって決定した。Ｙ軸は、初期に対する細胞生存率を示す。
【図６】本発明の様々な実施形態により、ＩＴＧＡ６のインビボ欠失とチロシンキナーゼ阻害の組み合わせが、白血病細胞を根絶することを示す。図６Ａ、生物発光画像法をＡＬＬ細胞注入後の示した日数で行った。図６Ｂ、カプラン・マイヤー生存曲線を分析し、各群についてのＭＳＴは、空ＥＲＴ２（ｎ＝６）（ＭＳＴ＝２７日間）、ＣｒｅＥＲＴ２（ｎ＝５）（ＭＳＴ＝５４．５日間）、空ＥＲＴ２＋ニロチニブ（ｎ＝６）（ＭＳＴ＝３９．５日間）、ＣｒｅＥＲＴ２＋ニロチニブ（ｎ＝５）（ＭＳＴ＝全てのマウスが生きているために、日数が特定されず）であった。＊ｐ＝０．０００１、ログランク検定。図６Ｃ、６Ｄ、ＩＴＧＡ６欠失を、白血病の死亡時に処分したマウスのＢＭ細胞中で、ＦＡＣＳによって確認した。図６Ｅ、残存白血病細胞を、ＲＴ−ＰＣＲによって、脾臓及び骨髄中で決定した。図６Ｆ、群空ＥＲＴ２＋ニロチニブ及びＣｒｅＥＲＴ２＋ニロチニブにおけるＰＣＲ。
【図７】本発明の様々な実施形態により、抗アルファ６ｍＡｂのＰ５Ｇ１０を用いるインテグリンアルファ６の遮断が、初代ＡＬＬ細胞を脱接着させることを示す。図７Ａ、７Ｂ：４つの初代ＡＬＬ事例について、ＬＡＸ７Ｒ（正常核型）、ＩＣＮ１、ＰＤＸ２、ＴＸＬ３（ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）を、５０μｇ／ｍｌのヒトのラミニン−１（ラミニン−１）もしくはフィブロネクチンまたは対照としてのＰＢＳでコートしたプレート上で、精製抗ヒトα６抗体（Ｐ５Ｇ１０、灰色の棒）またはそのアイソタイプ対照のＩｇＧ１（白色の棒）で前インキュベートした。ＡＬＬ細胞の接着（４００倍）％を評価した。図７Ｃ：α６の遮断（Ｐ５Ｇ１０）の有無で、及びＶＤＬ（ＬＡＸ７Ｒ、左パネル）もしくはニロチニブ（０．０２μＭ）またはＤＭＳＯ対照（ＳＦＯ２、右パネル）で処理された、ＡＬＬ細胞（ＬＡＸ７Ｒ、ＳＦＯ２）の生存率が示されている。図７Ｄ、７Ｅ：ＬＡＸ７Ｒ及びＳＦＯ２（図７Ｆ、７Ｇ）を、ＯＰ９細胞とともに長期１７日間にわたって共培養し、Ｐ５Ｇ１０（２０μＭ）、対照ＩｇＧ１単独で、またはＶＤＬ（ビンクリスチン、デキサメタゾン、Ｌ−アスパラギナーゼ）（ＬＡＸ７Ｒ）もしくはニロチニブ（ＮＴＢ）（ＳＦＯ２）と組み合わせて処理した。細胞生存率を、トリパンブルー色素カウントによって（図７Ｄ、７Ｆ）またはネキシンＶ／７ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリー（図７Ｅ、７Ｇ）によって決定した。
【図８】本発明の様々な実施形態により、ＩＴＧＡ６の遮断が、インビボで、白血病を末梢血液へ動員させないことを示す。初代ＡＬＬ細胞、ＴＸＬ３（図８Ａ〜Ｃ）ならびにＰＤＸ２（図８Ｄ及びＦ）（両方ともにＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）及びＬＡＸ７Ｒ（図８Ｇ〜Ｉ）（ＢＣＲ−ＡＢＬ陰性）を、ＮＳＧマウスに注入した（２．５×１０６細胞／マウス）。受容マウスの末梢血中で白血病細胞を確認した後に、マウスは３０ｍｇ／ｋｇのＰ５Ｇ１０またはＰＢＳ対照を受けた。処理（Ｔｘ）前（前）、処理後（後）１日目及び３日目に、末梢血液（ＰＢ）中のヒトＣＤ４５＋及びＣＤ１９＋の％を、フローサイトメトリーによって分析した（図８Ａ及びＢ、８Ｄ及びＥ、８Ｇ及びＨ）。（図８Ｃ、８Ｆ、８Ｉ）カプラン・マイヤー生存曲線を分析し、生存期間中央値（ＭＳＴ）を、各白血病症例及び群について計算した（ｎ＝３／群）。
【図９】ＩＴＧＡ６の遮断が、白血病細胞を化学療法に対して感受性にし、インビボで白血病を根絶することを示す。（Ａ）治療レジメン（上部パネル）及びＬＡＸ７Ｒ細胞（正常核型）を移植されたマウスの生物発光画像法である。ＮＳＧマウスを、ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＩＴＧＡ６阻止Ａｂ（Ｐ５Ｇ１０）（ｎ＝５）、ＶＤＬ（ｎ＝５）、またはＶＤＬ＋Ｐ５Ｇ１０（ｎ＝５）で処理し、白血病細胞移植後６６日目及び９２日目に画像撮影した。白血病細胞を注入しなかったマウスを、撮像時にルシフェリンのみで処理し、バックグラウンド対照（画像対照）として含めた。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線を分析し、各群についてＭＳＴを計算した：ＰＢＳ（ＭＳＴ＝３９日間）、Ｐ５Ｇ１０（ＭＳＴ＝３１日間）、ＶＤＬ（ＭＳＴ＝７１日間）、ＶＤＬ＋Ｐ５Ｇ１０（ＭＳＴ＝１８５日間）。（Ｃ）注入後１８６日目で殺処分した動物、または注入後１８５日目で死亡が確認された動物の骨髄（ＢＭ）または脾臓細胞（ＳＰＣ）のヒトＣＤ４５及びＣＤ１９のフローサイトメトリー分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書に引用された全ての参考文献は、あたかも完全に明記されたかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。別段の定めがない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されている意味と同様な意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）、Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）、及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用される多くの用語に対する一般的な指針を、当業者に提供する。抗体の調製方法に関する参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）、Ｋoｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９、Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６  Ｄｅｃ）、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。
【００１３】
小児科学に関する参考文献については、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ５−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（Ｊｕｎｅ  １６，２００５）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｌａｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｏｕｓｅ  Ｏｆｆｉｃｅｒｓ  １７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ（Ｊｕｎｅ  ２４，２００５）、及びＨａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）１８ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００６）を参照されたい。
【００１４】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと同様なまたは等価な多くの方法及び材料で、本発明の実行で使用することができるものを認識するであろう。実際に、本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されるものではない。本発明の目的上、以下の用語は下記で定義される。
【００１５】
本明細書で使用される「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどのその断片、ならびに親抗体の抗原結合機能を保持する他の断片を指す。様々な実施形態では、抗体の断片は、本明細書に記載される抗体をプロテアーゼで処理することによって生成されてもよい。例えば、モノクローナル抗体をパパインで処理すると、３つの断片、すなわち、２つのＦａｂ断片と、１つのＦｃ断片を産出する。あるいは、モノクローナル抗体をペプシンで処理すると、２つの断片、すなわち、Ｆ（ａｂ'）２とＦｃとを産出する。いくつかの実施形態では、抗体の断片は、完全長抗体と同様に、インテグリンアルファ６を阻害するために、インテグリンアルファ６を認識し、かつこれに結合する。
【００１６】
「有益な結果」としては、疾患状態の重症度を軽減または緩和すること、疾患状態が悪化するのを防止すること、疾患状態を治癒すること、疾患状態が発症することを防止すること、患者が疾患状態を発症する確率を低下させること、及び患者の寿命または平均寿命を延長させることが含まれるが、これらに決して限定されない。いくつかの実施形態では、この疾患状態は、癌である。いくつかの実施形態では、この疾患状態は、自己免疫疾患である。
【００１７】
本明細書で使用される「化学療法薬」または「化学療法剤」とは、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アクチノマイシン、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチオニン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、癌を治療するために用いられる薬物を指す。
【００１８】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される「血液病」または「血液疾患」または「血液系腫瘍」は、白血病、リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上が含まれるが、これらに限定されない、疾患を指す。様々な実施形態では、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である。様々な実施形態では、リンパ腫は、エイズ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である。
【００２０】
本明細書で使用される「固形腫瘍」は、血液、骨髄またはリンパ細胞以外の体組織細胞の異常増殖によって形成された新生物または病変を指す。固形腫瘍は、肝臓、大腸、乳房、または肺などの異なる組織に由来し得る、異常細胞の塊からなり、他の臓器に転移し得る。固形腫瘍の例としては、副腎皮質腫瘍（腺腫及び癌腫）、癌腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍（固形腫瘍）、肝芽細胞腫、肝細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫以外の軟部組織肉腫、及び／またはウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用される「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、競技用動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛等の愛玩動物、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー等の霊長類、イヌ及びオオカミ等のイヌ科、ネコ、ライオン、及びトラ等のネコ科、ウマ、ロバ、及びシマウマ等のウマ類、乳牛、ブタ、及びヒツジ等の食用動物、シカ及びキリン等の有蹄類、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等の齧歯類等が含まれるが、これらに限定されない、哺乳網のいずれかの構成員を指す。ある特定の実施形態では、この哺乳動物は、ヒト対象である。この用語は、特定の年齢または性別を意味するものではない。したがって、男性であろうと女性であろうと、成人ならびに新生児の対象、及び胎児が、この用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００２２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種または源に関して限定されるものはなく、これが作製される方法によって限定されるようにも意図されない。この用語は、全免疫グロブリンならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、及び抗体の抗原結合機能を保持する他のものなどの断片を包含する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体が、本発明において使用され得る。しかしながら、実際問題として、抗体は、通常、ウサギまたはネズミ起源であり、これは、モノクローナル抗体を生成するために必要とされるハイブリッド細胞系またはハイブリドーマを作成するために用いられるウサギまたはネズミの細胞系が入手可能であるためである。
【００２３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、その診断、予後、または治療が望まれる、任意の対象、特に哺乳動物の対象を意味する。いくつかの実施形態では、この対象は、血液系腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、この対象は、対象の寿命のある時点で、血液系腫瘍を有したことがある。様々な実施形態では、この対象の血液系腫瘍は、寛解期にあり、再発性であり、または非再発性である。
【００２４】
本明細書で使用される「単鎖抗体」とは、結合抗体の結合ドメイン（重鎖及び軽鎖の両方）を決定し、及び結合機能の保持を可能にする連結部分を供給することによって調製される抗体を指す。これは、本質的には、抗原への結合に必要な可変ドメインのその一部のみを有する、完全に簡略化された抗体を形成する。単鎖抗体の決定及び構築は、Ｌａｄｎｅｒらへの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００２５】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「治療（処置）」及び「治療（処置）する」とは、治療的処置及び予防的もしくは防止的処置の両方を指し、この目的は、目標の病的状態を防止もしくは減速し（減少させ）、病的状態を防止し、有益な結果を追求もしくは取得し、または、たとえ治療が最終的に不成功であるとしても、個体が状態を発症する確率を低下させることである。治療が必要とされるものとしては、この状態を既に有するもの、ならびにこの状態を有する傾向があるもの、またはこの状態が予防されるものが含まれる。癌治療の例としては、積極的サーベイランス、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（体外照射療法、定位放射線手術（ガンマナイフ）、及び分別された定位放射線治療（ＦＳＲ）など）、焦点療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される「治療用物質」とは、例えば、疾患を処置し、前記疾患を阻害し、前記疾患を予防し、前記疾患の作用を軽減し、前記疾患の重症度を低下させ、前記疾患を発症する可能性を低下させ、前記疾患の進行を遅らせ、かつ／または前記疾患を治癒するために用いられる作用物質を指す。治療用物質によって標的とされる疾患としては、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液病、自己免疫疾患、及び／または炎症性疾患に関連する細胞上で発現される抗原が含まれるが、これらに限定されない。加えて、これらは、固形腫瘍、例えば、乳癌ならびに神経膠芽腫、及び標的遺伝子のインテグリンアルファ６を発現する他の腫瘍を含む。
【００２８】
本明細書で使用される「チロシンキナーゼ阻害物質」とは、分子及び医薬品を指し、この対象への投与が、チロシンキナーゼ、すなわち、ＡＴＰからのリン酸塩基をタンパク質中のチロシン残基まで転移させ得る酵素の阻害をもたらす。チロシンキナーゼの例としては、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォレチニブ、フォスタマチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、ニンテダニブ、ラドチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バタラニブ、ベムラフェニブ、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
治療方法
白血病細胞は、骨髄中で安全な避難所を見つけ、これにより化学療法に抵抗して、疾患の再発につながりうる。本発明者らは、白血病細胞の中心的なアンカー分子のインテグリンアルファ６を同定し、インテグリンアルファ６の阻害物質を用いて、この分子を標的化することにより、白血病細胞のこの安全な避難所への結合が妨害され、ひいては白血病細胞を療法に対して無防備な状態にすることができることを示した。インテグリンアルファ６の遺伝子コンディショナルノックアウトマウスモデルを用いる本発明者らのデータは、（ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）白血病におけるインテグリンアルファ６の役割を裏付けている。チロシンキナーゼ阻害と組み合されたインテグリンアルファ６欠失は、ＴＫＩ単独治療とは対照的に、白血病を消散させる。本発明は、少なくとも部分的には、これらの発見に基づく。したがって、インテグリンアルファ６は、血液系腫瘍の治療のための新規な治療標的であり得る。
【００３０】
したがって、それを必要とする対象において血液系腫瘍及び／または固形腫瘍を治療するための方法が、本明細書に記載される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、対象において血液系腫瘍を治療するために、この組成物の有効量を対象に投与することとを含む。
【００３１】
それを必要とする対象において血液系腫瘍及び／または固形腫瘍を阻害するための方法も提供される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、対象において血液系腫瘍を阻害するために、この組成物の有効量を対象に投与することとを含む。
【００３２】
それを必要とする対象において血液系腫瘍及び／または固形腫瘍の重症度を低下させるための方法がさらに提供される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、対象において血液系腫瘍の重症度を低下させるために、この組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【００３３】
それを必要とする対象において血液系腫瘍及び／または固形腫瘍の再発を予防するかまたは前記腫瘍の可能性を低下させるための方法も本明細書に記載される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、対象において血液系腫瘍の再発を予防するかまたは前記血液系腫瘍の再発の可能性を低下させるために、この組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【００３４】
それを必要とする対象において、インテグリンアルファ６の過剰発現に関連する疾患状態を治療するか、前記疾患状態を阻害するか、または前記疾患状態の重症度を低下させるための方法も本明細書に記載される。この方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物を提供することと、対象においてインテグリンアルファ６の過剰発現に関連する疾患状態を治療するか、前記疾患状態を阻害するか、または前記疾患状態の重症度を低下させるために、この組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【００３５】
例示の実施形態において、血液系腫瘍または固形腫瘍としては、白血病、リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、リンパ腫は、エイズ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、インテグリンアルファ６の阻害物質としては、ペプチド、タンパク質、小分子、核酸、オリゴヌクレオチド、抗体、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸阻害物質は、インテグリンアルファ６の合成を阻害するｓｉＲＮＡ分子またはインテグリンアルファ６に特異的なアプタマーである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、インテグリンアルファ６の阻害物質は、インテグリンアルファ６を認識し、かつこれに結合する抗体である。この抗体は、モノクローナル抗体もしくはその断片、ポリクローナル抗体もしくはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体のうちのいずれか１つであってもよい。一実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ５Ｇ１０である。別の実施形態では、このモノクローナル抗体はＰ１Ｈ８である。Ｐ５Ｇ１０及びＰ１Ｈ８抗体は、その全体が本明細書に組み込まれるＷａｙｎｅｒ  Ｅ．ａｎｄ  Ｈｏｆｆｓｔｒｏｍ  Ｂ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００７；４２６：１１７−５３）に記載されるように生成される。
【００４０】
本明細書に記載されるように、様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、追加の癌治療を提供すること（同時にまたは連続的に）をさらに含む。追加の癌治療としては、積極的サーベイランス、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（体外照射療法、定位放射線手術（ガンマナイフ）、及び分別された定位放射線治療（ＦＳＲ）など）、焦点療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、モノクローナル抗体）は、治療用物質に結合され、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）もしくはシュードモナスエンドトキシンＡ（ＰＥ）、またはリシン様毒素（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０１１，  Ｖｏｌ  ７１：６３００−６３０９）が含まれるが、これらに限定されない抗体−タンパク質毒素複合体（免疫毒素）、抗体−放射性核種複合体、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＥ  Ｆ）、カルケアマイシン、マイタンシノイドＤＭ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１１、Ｔｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｉ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０１１  Ｖｏｌ  １７；６３８９−６３９７）が含まれるが、これらに限定されない抗体−薬物複合体を形成する。
【００４１】
本明細書に記載される方法の様々な実施形態では、治療用組成物は、インテグリンアルファ６の阻害物質と、癌細胞の表面上のマーカーを標的とする標的化要素とを含む。本明細書に記載される組成物の標的化要素によって標的とされ得る癌細胞の表面上のマーカーとしては、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ胎児型タンパク質、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水素酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒ  α、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、またはビメンチンが含まれるが、これらに限定されない。癌に特異的な他の抗原は、当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態と併せて用いられてもよい。
【００４２】
治療用組成物
本明細書に記載される方法は、インテグリンアルファ６の阻害物質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、この阻害物質は、モノクローナル抗体もしくはその断片である。一実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片である。別の実施形態では、このモノクローナル抗体は、Ｐ１Ｈ８もしくはその断片である。いくつかの実施形態では、インテグリンアルファ６の阻害物質（モノクローナル抗体もしくはその断片など）は、追加の治療用物質に結合される。
【００４３】
様々な実施形態では、この組成物は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、インテグリンアルファ４の阻害物質、細胞接着分子の阻害物質、白血病細胞の微小環境の内皮性、間質性、または骨芽細胞性ニッチ（他のインテグリン、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４４、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、パキシリンなど）との相互作用を標的とする阻害物質、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、インテグリンアルファ４の阻害物質、細胞接着分子の阻害物質、またはこれらの組み合わせは、インテグリンアルファ６特異的モノクローナル抗体（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片）を含む組成物に対して連続的に投与される。いくつかの実施形態では、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害物質、インテグリンアルファ４の阻害物質、細胞接着分子の阻害物質、またはこれらの組み合わせは、インテグリンアルファ６特異的モノクローナル抗体（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片）を含む組成物と同時に投与される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、細胞傷害性抗生物質、抗代謝剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害物質、タキサン、ヌクレオシド類縁体、植物アルカロイド、及び毒素、ならびにこれらの合成誘導体のうちのいずれか１つまたはそれ以上から選択されてもよい。例示の化合物としては、アルキル化剤：トレオスルファン、及びトロフォスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害物質：ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、テニポシド、クリスナトール、及びマイトマイシン；抗葉酸：メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びヒドロキシウレア；ピリミジン類縁体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、及びシトシンアラビノシド；プリン類縁体：メルカプトプリン及びチオグアニン；ＤＮＡ抗代謝剤：２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィジコリングリシネート、及びピラゾロイミダゾール；ならびに抗有糸分裂剤；ハリコンドリン、コルヒチン、及びリゾキシンが含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の化学療法剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）が、用いられてもよい。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、及びＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１及び／またはＰＡＲＰ−２）阻害物質が用いられ、このような阻害物質は、当該技術分野において周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国再交付特許第３６，３９７号）；及びＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００４５】
様々な実施形態では、チロシンキナーゼ阻害物質としては、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォレチニブ、フォスタマチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、ニンテダニブ、ラドチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バタラニブ、ベムラフェニブ、またはこれらの組み合わせのいずれか１つまたはそれ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、インテグリンアルファ４の阻害物質の例が、インテグリンアルファ６阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０モノクローナル抗体もしくはその断片またはＰ１Ｈ８モノクローナル抗体もしくはその断片などのインテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物に加えて投与されてもよい。インテグリンアルファ４の阻害物質の例は、ナタリズマブ、ＢＩＯ５１９２、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
インテグリンアルファ６阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０モノクローナル抗体もしくはその断片またはＰ１Ｈ８モノクローナル抗体もしくはその断片などのインテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物に加えて施され得る追加の療法としては、放射線、免疫療法及び／またはホルモン療法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
様々な実施形態では、療法は、例えば、放射線療法を含む。放射線療法で用いられる放射線は、電離放射線であり得る。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線、または陽子ビームであり得る。放射線療法の例としては、体外照射療法、放射性同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、及び／または全腹部ならびに骨盤放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。放射線療法の総括については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔放射線源から向けられる体外照射療法または遠隔放射線療法として施され得る。放射線治療は、放射線源が癌細胞または腫瘍塊に近接する体内に配置されている、内照射療法または近距離照射療法としても施される。ヘマトポルフィリンもしくはその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ、及び２ＢＡ−２−ＤＭＨＡなどの光増感剤の投与を含む光線力学療法の使用も包含される。
【００４９】
様々な実施形態では、療法は、例えば、免疫療法を含む。免疫療法は、例えば、癌ワクチン及び／または感作抗原提示細胞の使用を含んでもよい。この免疫療法は、癌抗原または疾患抗原に直接向けられる前形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤または毒素に結合されたモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期保護のための受動免疫を伴うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、治療用物質に結合され、例えば、抗体−タンパク質毒素複合体（免疫毒素）、抗体−放射線核種複合体、抗体−薬物複合体を形成する（Ｔｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｉ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０１１  Ｖｏｌ  １７；６３８９−６３９７）。免疫療法は、癌細胞系の細胞傷害性リンパ球に認識されるエピトープを用いることに焦点を当てることもできる。
【００５０】
様々な実施形態では、療法は、例えばホルモン療法を含む。ホルモン治療的処置は、例えば、ホルモン作動薬、ホルモン拮抗薬（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨ拮抗薬）、ホルモン生合成ならびにプロセッシングの阻害物質、及びステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類縁体、アンチゲスタゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含むことができる。
【００５１】
本明細書に記載される療法による治療の持続時間及び／または用量は、特定の治療用物質により変化してもよい。特定の治療用物質についての適切な治療時間は、当業者であれば理解されるであろう。
【００５２】
様々な実施形態では、対象は哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの家畜）であり、好ましくはヒトである。
【００５３】
様々な実施形態では、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０などのインテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物の有効量は、約０．０１〜０．０５μｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１μｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５μｇ／ｋｇ／日、０．５〜５μｇ／ｋｇ／日、５〜１０μｇ／ｋｇ／日、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日、２０〜５０μｇ／ｋｇ／日、５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、１００〜１５０μｇ／ｋｇ／日、１５０〜２００μｇ／ｋｇ／日、２００〜２５０μｇ／ｋｇ／日、２５０〜３００μｇ／ｋｇ／日、３００〜３５０μｇ／ｋｇ／日、３５０〜４００μｇ／ｋｇ／日、４００〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜６００μｇ／ｋｇ／日、６００〜７００μｇ／ｋｇ／日、７００〜８００μｇ／ｋｇ／日、８００〜９００μｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたはそれ以上である。
【００５４】
１つ以上の組成物の有効量の通常の投与量は、既知の治療用化合物が用いられる、製造業者によって推奨される範囲であり得、また、動物モデルにおけるインビトロ応答または応答によって当業者に示される。このような投与量は、通常、関連する生物活性を失うことなく、濃度または量において、最大約１桁まで減少することができる。実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、及び、例えば、生検悪性腫瘍などの関連する培養細胞もしくは組織培養組織試料のインビトロ応答性、または適切な動物モデルにおいて観察された応答に基づく治療法の有効性に依存することができる。様々な実施形態では、レチノイド作動薬を含む本発明の組成物は、レチノイド作動薬の有効量を対象に投与するために、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上投与されてもよく、この有効量は、本明細書に記載される用量のうちのいずれか１つまたはそれ以上である。
【００５５】
薬学的組成物
様々な実施形態では、対象における血液系悪性腫瘍を治療し、前記血液系悪性腫瘍を阻害し、前記血液系悪性腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記血液系悪性腫瘍の再発を予防するかもしくは前記血液系悪性腫瘍の再発の可能性を低下させるために、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０などのインテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）の治療的有効量とともに、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【００５６】
「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に安全で、非毒性で、かつ望ましいものである、薬学的組成物を調製する上で有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用に、ならびにヒトの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体であってもよく、エアロゾル組成物の場合には、ガス状であってもよい。
【００５７】
様々な実施形態では、本発明による薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達用に製剤化され得る。「投与経路」とは、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、非経口、または経腸が含まれるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の投与経路を指してもよい。「非経口」とは、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心内、皮内、筋内、腹腔内、肺内、脊椎内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管が含まれる、通常、注射に関連する経路を指す。非経口経路を介しては、組成物は、点滴用または注射用に、液剤または懸濁剤の形態であってもよいか、または凍結乾燥散剤であってもよい。非経口経路を介しては、組成物は、点滴用または注射用に、液剤または懸濁剤の形態であってもよい。経腸経路を介しては、組成物は、錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、液剤、散剤、顆粒剤、乳剤、ミクロスフェアもしくはナノスフェア、または徐放性を可能にする脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であり得る。通常、抗体は、静脈内または腹腔内のいずれかの注射によって投与される。これらの投与の方法は、当業者には既知である。
【００５８】
本発明による薬学的組成物は、任意の薬学的に許容される担体も含有することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」とは、１つの組織、臓器、または身体の一部から別の組織、臓器、または身体の一部まで関心の化合物を搬送もしくは輸送することに関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、この担体は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または封入材料、もしくはこれらの組み合わせであってもよい。担体の各構成成分は、これが製剤の他の成分と相溶性でなければならないという点に関して、「薬学的に許容される」なければならない。これはまた、各構成成分が接触し得る任意の組織または臓器と接触する使用に好適でなければならず、これが毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または治療的な有益性を過度に上回る任意の他の合併症のリスクを伴ってはならないことを意味する。
【００５９】
本発明による薬学的組成物は、経口投与用に、カプセル化され、錠剤化され、または乳剤またはシロップ剤で調製され得る。薬学的に許容される固体もしくは液体担体は、組成物を増強させもしくは安定化させるために、または組成物の調製を容易にするために添加されてもよい。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、及び水が含まれる。固体担体としては、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアガム、寒天、またはゼラチンが含まれる。この担体はまた、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放性材料を、単独でまたはワックスとともに含んでもよい。
【００６０】
薬学的調製物は、錠剤形態には、必要な場合、粉砕、混合、造粒、及び圧縮を伴う、または硬質ゼラチンカプセル形態には、粉砕、混合、及び充填を伴う、調剤の通常の技術に従って作成される。液体担体が用いられる場合、この調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性懸濁剤となる。このような液体製剤は、経口（ｐ．ｏ．）で直接投与されてもよいか、または軟質ゼラチンカプセルに充填されてもよい。
【００６１】
本発明による薬学的組成物は、治療的有効量で送達され得る。正確な治療的有効量は、所定の対象における治療の有効性に関して、最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療用化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティを含める）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患タイプならびにステージ、一般的健康状態、所定の投与量に対する応答性、及び医薬品のタイプを含める）、製剤中の１つまたは複数の薬学的に許容される担体の性質、及び投与経路が含まれるが、これらに限定されない、様々な因子に依存して変化する。臨床的及び薬理的技術分野における当業者は、日常的な実験を通して、例えば、化合物の投与に対する対象の応答を監視し、状況に応じて投与量を調整することによって、治療的有効量を決定することができるであろう。追加の指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【００６２】
患者への投与前に、補助成分（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）が、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片またはＰ１Ｈ８もしくはその断片などの、インテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物に添加されてもよい。液体製剤が好ましい場合がある。例えば、これらの補助成分としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、増量剤、またはこれらの組み合わせが含まれてもよい。
【００６３】
炭水化物補助成分としては、単糖類、二糖類、または多糖類などの糖もしくは糖アルコール、または水溶性グルカンが含まれる。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、乳糖、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファならびにベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物を含むことができる。「糖アルコール」は、−−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及びアラビトールが含まれる。上述したこれらの糖もしくは糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて用いられてもよい。糖もしくは糖アルコールが水性調製物中に可溶性である限りにおいて、用いられる量に対する一定の制限はない。一実施形態では、糖もしくは糖アルコールの濃度は、１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％、より好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％である。
【００６４】
アミノ酸補助成分としては、カルニチン、アルギニン、及びベタミンの左旋性（Ｌ）型が含まれるが、他のアミノ酸が添加されてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、補助成分としてのポリマーとしては、２，０００〜３，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または３，０００〜５，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【００６６】
凍結乾燥前または再構成後の溶液中のｐＨ変化を最小限に抑えるために、緩衝液を使用することも好ましい。クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、及びグルタミン酸塩緩衝液、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない、ほとんどの生理学的緩衝液が用いられてもよい。いくつかの実施形態では、この濃度は、０．０１〜０．３モルである。製剤に添加することができる界面活性剤は、ＥＰ番号２７０，７９９、及び同２６８，１１０に示されている。
【００６７】
さらに、抗体（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片またはＰ１Ｈ８もしくはその断片などの、インテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）は、例えば、それらの循環半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合的結合によって化学的に修飾され得る。好ましいポリマー、及びそれらをペプチドに付着させるための方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、及び同第４，６０９，５４６号に示され、これら全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、いくつかの実施形態では、１０００〜４０，０００、２０００〜２０，０００、または３，０００〜１２，０００の平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、末端ヒドロキシ基などの、少なくとも１つのヒドロキシ基を有する。このヒドロキシ基は、活性化され、阻害物質上の遊離アミノ基と反応することができる。しかしながら、本発明の共有結合的に結合されたＰＥＧ／抗体を達成するために、反応基のタイプ及び量は様々であってもよいことが理解される。
【００６８】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。これらとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等が含まれる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖が、モノグリセリド中、ジグリセリド中−、トリグリセリド中の例えば、動物またはヒトで天然に発生するものと同一の主鎖であるためである。したがって、この分岐は、体内において外来物質として必ずしも見なされることにならない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同様な分子量範囲を有する。ＰＯＧについての構造は、Ｋｎａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０に示され、ＰＯＧ／ＩＬ  Ｃ  ２複合体の考察は、米国特許第４，７６６，１０６号に見出され、これらの双方ともに、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
循環半減期を増加させるための別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法が、Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４、Ｃａｆｉｓｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９、及びＳｚｏｋａ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７に論じられている。他の薬物送達系は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．１９８０），ｐｐ．２５３−３１５、Ｍ．ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ（１９８４）３６：２７７に記載されている。
【００７０】
液体薬学的組成物が調製された後に、分解を防止するために、及び無菌性を維持するために、凍結乾燥されることが望ましい場合がある。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に既知である。使用の直前に、追加の成分を含んでもよい、無菌希釈剤（例えば、リンガー溶液、蒸留水、または無菌生理食塩水）で、組成物は再構成され得る。再構成時に、組成物は、当業者に既知であるこれらの方法を用いて、対象に投与される。
【００７１】
投与量及び投与のモードは、個体に依存するであろう。通常、組成物は、抗体が１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように、投与される。いくつかの実施形態では、これは、急速投与量として与えられ、循環レベルを１０〜２０倍まで、及び急速投与後４〜６時間で増加させる。大量投与後に、連続点滴が用いられてもよい。その場合、抗体は、５μｇ／ｋｇ／分〜２０μｇ／ｋｇ／分、または７μｇ／ｋｇ／分〜１５μｇ／ｋｇ／分の用量で注入され得る。
【００７２】
キット
本発明は、それを必要とする対象において血液系腫瘍を治療し、前記血液系腫瘍を阻害し、前記血液系腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記血液系腫瘍の再発を予防するかもしくは前記血液系腫瘍の可能性を低下させるためのキットも提供する。このキットは、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０などの、インテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物と、それを必要とする対象において血液系腫瘍を治療し、前記血液系腫瘍を阻害し、前記血液系腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記血液系腫瘍を予防するかもしくは前記血液系腫瘍の再発の可能性をを低下させるための組成物に関する使用説明書とを含む。
【００７３】
このキットは、本明細書に記載される組成物の少なくとも１つを含む、材料または構成成分の集合体である。したがって、いくつかの実施形態では、キットは、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片またはＰ１Ｈ８もしくはその断片などの、インテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物を含有する。
【００７４】
本発明のキット中に構成される構成成分の実際の性質は、その意図される目的に応じる。一実施形態では、キットは、特にヒト対象用に構成される。さらなる実施形態では、キットは、限定されないが、家畜、飼育動物、及び実験動物などの対象を処置する獣医学的用途のために構成される。
【００７５】
使用説明書は、キット中に含まれ得る。「使用説明書」は、通常、対象において血液系腫瘍を治療し、前記血液系腫瘍を阻害し、前記血液系腫瘍の重症度を低下させ、かつ／または前記血液系腫瘍の再発を防止するかもしくは前記血液系腫瘍の再発の可能性を低下させるために、望ましい結果に影響を及ぼすように、キットの構成成分を使用する上で採用される技術を記載する有形的表現を含む。任意に、キットは、当業者に容易に認識されるように、測定器具、希釈剤、緩衝液、薬学的に許容される担体、注射器、または他の有用な道具一式などの、他の有用な構成成分も含有する。
【００７６】
キット中に組み立てられた材料または構成成分は、それらの操作性及び有益性を保つ任意の便利かつ好適な方法で保存されて、医師に提供され得る。例えば、構成成分は、溶解型、脱水型、または凍結乾燥型であり得、これらは、室温で、冷蔵または冷凍温度で提供され得る。構成成分は、通常、好適な包装材料に入れられる。本明細書で使用される「包装材料」という語句は、例えば、本発明の組成物等のキットの内容物を収容するために用いられる１つ以上の物理的構造を指す。包装材料は、好ましくは、無菌の、無汚染物質の環境を提供するために、周知の方法によって構成される。本明細書で使用される「パッケージ」という用語は、個々のキット構成成分を保持することができる、例えば、ガラス、プラスチック、紙、フォイル等の好適な固体マトリックスまたは材料を指す。したがって、例えば、パッケージは、インテグリンアルファ６の阻害物質（例えば、Ｐ５Ｇ１０もしくはその断片またはＰ１Ｈ８もしくはその断片などの、インテグリンアルファ６に特異的なモノクローナル抗体）を含む組成物の適切な量を含有するために用いられる瓶であり得る。包装材料は、通常、キットの内容物ならびに／もしくは目的及び／またはその構成成分を表示する外側ラベルを有する。
【００７７】
抗体の生成
Ｗａｙｎｅｒ  Ｅ．及びＨｏｆｆｓｔｒｏｍ  Ｂ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００７；４２６：１１７−５３）に記載された方法によって生成されたＰ５Ｇ１０抗体に加えて、インテグリンアルファ６に特異的な任意の他のモノクローナル抗体（Ｐ１Ｈ８など）が、本明細書に記載される方法で用いられてもよい。このような抗体の作製方法は、当業者には明らかである。
【００７８】
インテグリンアルファ６を特異的に認識し、かつこれに結合する抗体は、当該技術分野において既知のいくつかの方法のいずれか１つによって生成され得る。例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４３：３２９，１９８７、Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｉｃｈｉｍａｎ，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：４６１，１９８４、ならびに米国特許第５，７７０，２０８号  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，１９８８）、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、及びＡｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。慣行的に、抗原特異的抗体は、宿主動物を抗原（例えば、本明細書に記載される抗原）で免疫化し、その後、抗体含有血清を動物から収集することによって生成される。
【００７９】
抗原に対して応答して抗体を生成することができる任意の動物が、本発明で使用されてもよい。通常使用される動物としては、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、モルモット、ニワトリ、及びヒトが含まれる。宿主動物は、抗原による注射によって免疫化される。好ましくは、最初の免疫化の後に、宿主動物は、抗体生成及び親和性を増大させるために、１つ以上の抗原のブースター注射を受ける。ヒトの免疫化については、潜在的な有害反応（例えば、フロイントの完全アジュバントによる肉芽腫形成、アナフィラキシーショック）を回避するために、適切な抗原、アジュバント、及び／または担体タンパク質を選択するために注意が払われなければならない。
【００８０】
免疫学的応答を増強させるために、抗原は、宿主動物またはヒトへの注射の前に、通常、アジュバントと混合される。抗体生成を増大させる上で有用なアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全ならびに不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ＫＬＨ、及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）などの界面活性剤が含まれる。潜在的に有用なヒトアジュバントの例としては、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が含まれる。抗原はまた、それらの抗原性を増強させるために、脂質小胞に架橋され、または組み込まれ得る。
【００８１】
本発明の範囲内の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化、及びキメラ抗体が含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫化宿主動物からの血清を収集することによって単離され得る。モノクローナル抗体は、上述した抗原及び標準ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５１１，１９７６、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：２９２，１９７６、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９７を参照されたい。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体分泌細胞（例えば、ヒト血漿細胞）を不死化することによって、調製される。例えば、米国特許第４，６３４，６６４号を参照されたい。モノクローナル抗体を得るために、ハイブリドーマまたは他の不死化抗体分泌細胞が、インビトロで（例えば、組織培養中で）またはインビボで（例えば、無胸腺またはＳＣＩＤマウス中で）培養される。抗体は、インビトロ培養基またはインビボ培養からの体液（例えば、血清または腹水）を収集することによって、単離される。
【００８２】
さらに、異なる動物種に由来する異なる部分（例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域に融合されたラットの免疫グロブリンの可変領域）を有する抗原結合分子であるキメラ抗体は、本発明で有用であると期待される。このようなキメラ抗体は、当該技術分野において既知の方法によって、調製され得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４，１９８４、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２，１９８４である。同様に、抗体は当該技術分野において既知の方法によって、ヒト化され得る。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は、商業的にヒト化され（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、または米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、または同第５，５８５，０８９号に記載される通りである。同様に、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ結合免疫グロブリンの定常領域の一部は、変更され、欠失され、または突然変異を起こされ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇの反応性を除去することができる。
【００８３】
一旦単離されると、抗体は、塩除去（例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿法）、低温アルコール分画法（例えば、コーン−オンクレー低温アルコール分画プロセス）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー（例えば、抗ヒト免疫グロブリン抗体に結合したクロマトグラフィービーズが、ヒト免疫グロブリンを単離するために用いられ得る）、及び抗原親和性クロマトグラフィーを含める、従来の技術によってさらに精製され得る。例えば、上記のＣｏｌｉｇａｎらを参照されたい。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇを用いる従来の抗体精製技術（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇクロマトグラフィー）が用いられてもよい。
【００８４】
免疫学及びタンパク質化学における標準技術を用いて、本発明の抗体を分析かつ操作することができる。例えば、透析を用いて、抗体が溶解されている溶媒を変更することができる。抗体はまた、保存用に凍結乾燥されてもよい。抗体は、ウェスタンブロット、免疫沈降分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、及び放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）などのいくつかの標準法のうちのいずれか１つを用いて、特定の抗原に結合するための能力について試験され得る。例えば、上記のＣｏｌｉｇａｎらを参照されたい。
【００８５】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）  ２５６：４９５−９６の方法、またはその修正型を用いて調製されてもよい。通常、マウスまたはラットは、上述のように免疫化される。しかしながら、血清を抽出するために動物に出血させるよりはむしろ、脾臓（及び任意に、いくつかの肥大したリンパ節）を取り出し、単一細胞に解離させる。必要ならば、脾臓は、細胞懸濁液を、タンパク質抗原でコートしたプレートまたはウェルに加えることによって、スクリーニングされてもよい（非特異的接着細胞の除去後に）。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、残りの懸濁液によって濯ぎ流されない。得られたＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞が、次いで、骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを形成するように誘導され、選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養される。得られたハイブリドーマは、限界希釈法によって蒔かれ、所望の免疫化細胞表面抗原に特異的に結合し（及び無関係な抗原には結合しない）抗体の生成についてアッセイ法が行われる。次いで、選択されたｍＡｂ分泌ハイブリドーマが、インビトロで（例えば、組織培養瓶もしくは中空繊維反応器中で）、またはインビボで（マウスの腹水など）のいずれかで培養される。
【００８６】
必要ならば、抗体（ポリクローナルであっても、またはモノクローナルであっても）は、従来の技術を用いて、標識されてもよい。好適な標識としては、フルオロフォア、発色団、放射活性原子（特に３２Ｐ及び１２５Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、及び特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、通常、それらの活性によって検出される。例えば、西洋わさびペルオキシダーゼは、通常、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青色色素に変換するその能力によって、検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原及びそれに特異的なモノクローナル抗体の場合など、リガンド分子と高い特異性で結合することができるタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーとしては、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとタンパク質Ａ、及び当該技術分野で既知の多数の受容体−リガンド複合体が含まれる。上記説明は、同じ標識が、いくつかの異なるモードで働く場合があるために、種々の標識を別々の部類に分類することを意味するものではないことを理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射活性標識として、または高電子密度試薬としても働くことができる。ＨＲＰは、酵素として、またはｍＡｂに対する抗原としても働くことができる。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせてもよい。例えば、ｍＡｂ及びアビジンはまた、本発明の実施のために標識を必要とし、したがって、ｍＡｂをビオチンで標識し、その存在を、１２５Ｉで標識したアビジンにより、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂにより検出してもよい。他の並べ換え及び可能性は、当業者には容易に明らかになり、本発明の範囲内の等価物と見なされる。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、特許請求されている発明をより良く例証するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。特定の材料が言及されているという点では、これは単に例証の目的のためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の許容能力を用いることなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、等価な手段または反応体を構築することができる。
【００８８】
実施例１
Ｐ５Ｇ１０及びＰ１Ｈ８抗体の生成
細胞ベースのＥＬＩＳＡ
材料
１０％のＦＢＳで補充したＲＰＭＩ  １６４０中で増殖させたＰＣ３細胞の６または７継代（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）；９６ウェルＴＣプレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０７２）；０．０２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ−１３９３からの２％原液）を、プレートをコーティングするために、ＰＢＳ中で１／１００に希釈；洗浄緩衝液としてのＰＢＳ（細胞の抽出または透過化が望ましい場合でない限り、界面活性剤が、この緩衝液に添加されなくてもよい）；２％のホルムアルデヒド（３７％の原液をＰＢＳで希釈）；トリプシン０．２５％／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ＃２５２００）；ブロッキング溶液：５％の脱脂粉乳、ＮＦＤＭ（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）２％の正常ヤギ血清、ＧＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１６２１０−０６４）；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ  ＃１０３０−０５）；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１０２０−０５）；ＨＲＰに対する基質（ＡＢＴＳは、ＨＲＰの存在下で青緑色に変化する、Ｋｉｒｋｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  ＃５０−６６−１８）；ＳＢＴＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−９７７７）１ｍｇ／ｍｌの原液；Ｏ．Ｄ．４０５に設定したフィルタを備えるプレートリーダー。
【００８９】
手法
９６ウェルプレートを、室温で１〜２時間、または４°で一晩、ゼラチンでコートした。ＰＣ３細胞を、３７°で５〜１０分間、トリプシン処理し（０．０２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ）、１０％のＦＢＳまたは０．５ｍｇ／ｍｌのＳＢＴＩで補充したＲＰＭＩ中で２回洗浄した。ＰＣ３細胞を、１０％のＦＢＳで補充したＲＰＭＩ  １６４０中で、１ウェル当たり５×１０３細胞で蒔き、ウェルが集密状態になるまで、３７°で１〜２日間インキュベートし、細胞がＥＬＩＳＡの持続時間にプレート上に留まるように、細胞を過増殖させないことを確実にした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％のホルムアルデヒドで、室温にて１５〜３０分間固定した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、５％のＮＦＤＭ／２％のＧＳで、室温にて３０分間ブロックした。プレートを１回洗浄し、抗血清を第１のウェル（Ａ１）中で、１：１００で希釈し、二重希釈をプレート全体で行った（１：１００、１：２００、１：４００等）。各血清を二通り（２列）で行い、これにより、１列がＨＲＰ結合抗ＩｇＧを受容し、もう１列がＨＲＰ結合抗ＩｇＭを受容した。プレートを、一次抗体とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ結合抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭを、ブロックして１ウェル当たり１／２０００（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で添加し、揺らしながらＲＴで３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＡＢＴを添加した。プレートを、ＲＴで１０〜１５分間インキュベートし、プレートリーダー上でＯ．Ｄ．４０５にて読み取った。
【００９０】
細胞接着アッセイ法
細胞は、アッセイ法の前に、放射性同位元素（Ｃｒ５１）もしくはカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などの蛍光染料で、またはアッセイ法が完結した後に（クリスタルバイオレット染色）標識され得る。接着アッセイ法において、カルセイン標識細胞を使用することについての優れたプロトコールが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウェブサイト上（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １５．６，"Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ"）にある。本明細書に記載されたプロトコールの目的は、標準プレートリーダー（Ｏ．Ｄ．６００フィルターセット）で使用するために、接着細胞をクリスタルバイオレットで染色することである。
【００９１】
材料
１５ｃｍの組織培養皿で増殖させたＰＣ３細胞。１回の融合で、６×９６ウェルプレートをスクリーニングするために、４枚の１５ｃｍプレートが必要となる；ブロッキング溶液（１０ｇ／ｌの熱変性ＢＳＡで補充されたＰＢＳ（ＢＳＡをＰＢＳ中に溶解し、８０°に３分間加熱し、４°の水浴に完全に冷却されるまで投入する；過熱してはならない））；接着緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌのＨＢＳＡ（熱変性ＢＳＡ）で補充されたＲＰＭＩ  １６４０−ＨＥＰＥＳ）；４８ウェルプレート（ＴＣまたは非ＴＣ）；ＰＢＳまたはＶｏｌｌｅｒの緩衝液（ｐＨ９．６の０．０５Ｍの重炭酸塩）中、２〜５μｇ／ｍｌに構成された精製ＥＣＭ成分（Ｃｈｅｍｉｃａｎ、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙｌｉｓｔｉｎｇ）を含有するタンパク質溶液；（希釈される場合、より高いｐＨが、ＥＣＭタンパク質を可溶化させることを助けることができる。純度及びタンパク質濃度を制御するために、還元条件下で精製タンパク質にゲル上を泳動させることが望ましい）；３７％のホルムアルデヒド（原液の１０倍希釈）；クリスタルバイオレット染色法については、ＭｅＯＨ中、０．５％のクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−３８８６）（原液の５倍希釈）；３Ｎ  ＮａＣｌ（原液の２０倍希釈）；メタノール。
【００９２】
手法
融合をスクリーニングするために必要なプレートの数を決定した。融合プレート１枚当たり、２枚の４８ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０７８）を使用した。バックグラウンド接着が、結果の解釈を複雑にする可能性があるために、９６ウェルプレートは使用しなかった。タンパク質を、ＰＢＳまたはＶｏｌｌｅｒの緩衝液（０．０５Ｍの重炭酸塩、ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍｌに希釈した。タンパク質溶液２００μｌを、ウェル毎に添加した。４８ウェルプレート１枚当たり１０ｍｌのタンパク質溶液が必要であった。プレートを４°で２４時間インキュベートした。細胞接着アッセイ法を開始する前に、タンパク質でコートしたプレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェル当たり０．５ｍｌのＰＢＳ／ＨＢＳＡで、室温で３０分間ブロックした。１回目の洗浄後に、接着緩衝液５０μｌを、ウェル毎に添加した。プレートがブロックされている間に、細胞を組織培養皿から取り出し（トリプシン、ＥＤＴＡ、または剥ぎ取り）、トリプシンが使用された場合、２０μｇ／ｍｌのＳＢＴＩで補充した接着緩衝液で２回洗浄した。最終洗浄後に、細胞はペレット状になり、接着緩衝液中、１ミリリットル当たり１×１０６個で再懸濁させ、使用するまで室温で保持した。ハイブリドーマ上清２００μｌを、ウェル毎に添加した。陽性（抗β１）対照及び陰性（抗体なし）対照のウェルの両方が含まれた。細胞懸濁液５０μｌを、１ウェル当たり５×１０４個の細胞を含有する各ウェルに添加し、４８ウェル上でハイブリドーマ上清とともに、揺らしながら室温で１５分間インキュベートし、抗体を細胞表面に予備結合させた。１５分後に、プレートをインキュベータ内に配置し、３０分間インキュベートした。３０分後に、対照ウェルにおいるアッセイ法では接着が適切であり、かつ拡散していることを確認するために、プレートをチェックした。陰性対照ウェル内の細胞が接着及び／または拡散されなかった場合、アッセイ法は、さらに１５〜３０分間のインキュベートの継続が可能であった。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、接着細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで少なくとも３時間または一晩、固定化した。ホルムアルデヒドを、ＰＢＳで少なくとも４回洗い流し、クリスタルバイオレット染料を調製し（０．１５ｍＭのＮａＣｌ／０．１％のクリスタルバイオレット、２０％のＭｅＯＨ）、染料２００μｌを、各ウェルに、室温で１０分間にわたって添加した。染料を、１．０ｍｌの水道水を添加することによって、またはウェルを縁まで満たすことによって、各ウェルで希釈した。染料を吸引し、ウェルを、水道水でさらに２回再充填した。いかなる残留する染料も除去することが、非常に重要である。プレートを顕微鏡で読み取り、機能的抗体の存在を決定した。プレートをブロット乾燥し、空気乾燥させた。接着細胞中のクリスタルバイオレットを、１ウェル当たり２００μｌのＭｅＯＨで放出させ、各ウェルの内容物を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、標準ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で、Ｏ．Ｄ．６００で読み取った。
【００９３】
機能的阻害抗体が得られる場合、データは、通常、明確であり、簡単に顕微鏡でウェルを見ることによって評価され得る。機能ブロッキング抗体を有するウェルが空である場合もあった。時には、シート状の凝集された細胞が観察され、これは、多くの場合、細胞間接着（細胞凝集）を誘起する細胞基質接着の破壊から生じる。さらに、細胞の約５０％がそのまま残っている、部分的阻害を認めることもある。多くの場合、これは、機能的抗体の存在を示唆することができ、クローニングを行った。抗体が一旦クローンされると、その機能的能力が、より正確に特性評価された。
【００９４】
細胞融合によるモノクローナル抗体の生成
免疫脾臓との融合を実施する前の最初のステップは、ポリクローナル抗血清が、適切な抗体レパートリーを含有することを確認することであった。これが確立されたら、最終の注射（−３日目）または一連の注射（−３日目、−２日目、−１日目）に実施することによって、脾臓を骨髄腫細胞との融合用に調製した。０日目に、マウスを殺処分し、脾臓を取り出した。脾臓は、非常に大きく、胚中心（白色領域）の証拠を示した。ＩＦＡが複数回使用されていた場合、脾臓が腹部内の結合組織に埋め込まれている可能性があった。これは、胃または腸に穴をあけないように注意しながら、鈍的に切開した。脾臓を取り出し、７０％のエタノール中に浸漬し、その後スクリーン上で粉砕した。
【００９５】
材料
免疫化ＲＢＦ／ＤｎＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、在庫＃０００７２６）；胸腺細胞フィーダー細胞用の３〜４周齢のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、在庫＃００１０２６）；滅菌器具；ＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫細胞（本研究室またはＡＴＣＣ［ＣＲＬ−１７３２］から入手可能）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）；細胞を洗浄するための無血清ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ＃１１８７５）（融合のために３０ｍｌを３７°に加熱する）；ＡＡＴ培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃１１８７５）、５００ｍｌ；１００×ｌ−グルタミン溶液（Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０）、５ｍｌ；１００×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）、５ｍｌ；１００×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）；１０００×ゲンタマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−１５２２）、０．５ｍｌ；５０×アデニン／アミノプテリン／チミジン（ＡＡＴ  Ｓｉｇｍａ  Ａ−５５３９）、１バイアル瓶）；５０％のポリエチレングリコール  １５００（ＰＥＧ  １５００、Ｒｏｃｈｅ＃７８３  ６４１）；１００メッシュのスクリーン（Ｓｉｇｍａ  Ｓ３８９５−５ＥＡ）；空気中５％ＣＯ２に設定されたＣＯ２インキュベータ；培養フード内で使用するための当座の水浴（×３）を準備するためのガラスビーカー；５０ｍｌの遠心管；４００×ｇに設定された遠心分離機；プラスチック製ピペット（２ｍｌ及び１０ｍｌ）；４〜８×９６ウェルプレート；ハイブリドーマがクローンされたら、得られたハイブリドーマを引き離すための、５０×バイアル瓶のアデニン／チミジン（ＡＴ、Ｓｉｇｍａ  Ａ−７４２２）（しかしながら、一般には、ハイブリドーマが数ラウンドのクローニングを経るまで、ハイブリドーマをＡＡＴ培地中で増殖させることによって、選択圧力が維持され得る）。
【００９６】
ＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫細胞を調製する
ＦＯＸ−ＮＹ細胞を解凍し、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩに半分を蒔き、半分を１×ＡＡＴ（以下を参照）で補充した培地に蒔いた。このＡＡＴ試験の目的は、骨髄腫細胞が、アミノプテリン非感受性状態に戻っていないことを確認するためである。これは、ＦＯＸ−ＮＹ細胞が組織培養中で、長期にわたって維持される場合に、確実に発生する。ＦＯＸ−ＮＹ細胞は、必要とされる場合のみ解凍する。これらは、他の全ての場合に、液体窒素中で保管する。本発明者らは、数百ものバイアル瓶を、それらの融合及び抗体発生を支援する能力について品質管理した本発明者らのＬＮ２バンクで保管している。非融合ＦＯＸ−ＮＹ細胞は、全てが３〜４日間で死滅するはずである。そうでなければ、別のより早く凍結されたシードにまたはオリジナルストックに戻る必要がある。ＦＯＸ−ＮＹ細胞を、１０％のＦＢＳを加えたＲＰＭＩ  １６４０中で、１ミリリットル当たり５×１０５〜１０６個まで培養する。融合には、指数関数的増殖状態の１×１０８個のＦＯＸ−ＮＹが必要となる。通常、融合前に、３日間、５０〜７５ｍｌの培地を備えた３つのＴ７５フラスコで培養する。ＦＯＸ−ＮＹは、抗生物質の存在下で増殖させてはならない。これらの細胞が汚染されているかどうかを知るべきである。０日目に、ＦＯＸ−ＮＹ細胞を５０ｍｌの管に注ぎ、４００×ｇで遠心分離し、１つの管にプールし、ＲＰＭＩ−１６４０（無ＦＢＳ）中で３回洗浄する。２０ｍｌ中に再懸濁させ、血球計算盤で計数する。１×１０８個の細胞が必要とされる。
【００９７】
融合のための脾臓の調製
３日目に、生き残ったＰＣ３細胞を、３枚の１５ｃｍ組織培養プレートからラバーポリスマンで擦り取った。細胞を３回洗浄し、０．５ｍｌの最終体積に再懸濁させ、１８ゲージの針を備えた１ｍｌ注射器で吸い上げた。２３ゲージの針を用いて、融合用に選択されたＲＢＦマウス−この場合、１Ｌマウスに、細胞を腹腔内注射した。アジュバントは使用しなかった。精製タンパク質が用いられる場合、−２日目及び−１日目に追加の注射が施されてもよい。タンパク質またはペプチド調製物を用いる場合、選択ＲＩＢＩは、最終注射について選択されてもよい。０日目に、脾臓を除去し、６ｃｍのペトリ皿内の無菌スクリーン上に配置した。このスクリーンは、Ｓｉｇｍａから購入され、オートクレーブによって滅菌されてもよい。１００メッシュのスクリーン（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ３８９５０５ＥＡ）が用いられてもよい。脾臓は、細胞を除去するよう処理されるまで、ウェットアイス上で乾燥状態に保持された。脾細胞の単細胞懸濁液を作成するために、２ｍｌのＲＭＰＩ  １６４０（無血清）をプレート内の脾臓に添加した。脾臓を、滅菌１０ｍｌ注射器のプランジャーで、赤色塊がそれ以上見えなくなるまで破砕した。一部の結合組織がスクリーン上に残る場合があり、これを処分した。脾細胞を、スクリーン及びペトリ皿から、無血清ＲＰＭＩ−１６４０を有する５０ｍｌの管に流し入れた。血清は、これが細胞膜を安定化し得るために、添加しなかった。融合プロトコールの目的は、細胞膜を不安定にすることである。遠心分離を、室温にて４００×ｇで５分間行い、ＲＰＭＩ  １６４０（無ＦＢＳ）で１回洗浄した。脾臓を、ＲＰＭＩ（無ＦＢＳ）１０ｍｌ中に再懸濁させた。
【００９８】
融合
５ｍｌのＰＥＧ  １５００及び３０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０（無ＦＢＳ）を３７°まで温め、当座の水浴内のフードまで移動した。脾臓の調製を、ＦＯＸ−ＮＹ細胞の調製と同期して行った。ＦＯＸ−ＮＹ細胞を洗浄し、２０ｍｌのＲＰＭＩ（無ＦＢＳ）中に再懸濁させた。脾臓細胞及びＦＯＸ−ＮＹ細胞を計数した。融合については、融合比が、少なくとも０．５：１．０の脾臓細胞対ＦＯＸ−ＮＹ細胞であるように、５×１０７〜１０８個の脾臓細胞を、１×１０８個のＦＯＸ−ＮＹ細胞と融合させた。５×１０７個の脾臓細胞については、４枚の９６ウェルプレートを使用し、１０×１０８個の脾臓細胞については、８枚の９６ウェルプレートを使用した。融合１回当たり８枚超のプレートは、設定されなかった。少なくとも５×１０７個の脾臓細胞が、良好な融合には必要であった。融合比が設定され、ＰＥＧ及びＲＰＭＩが３７°まで温められると、Ｏｉ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇによって記載されたプロトコール（"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ、ｅｄｓ．、ｐｐ．３５１−３７２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて、１９８０  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．）に記載された通りに従い、融合中に、温度をできるだけ３７°に近づけて維持するために、無菌フード内のミニ水浴のセットアップを用いた。脾臓細胞及びＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫細胞を、一緒に混合し、５０ｍｌの管内で、室温において４００×ｇで１０分間、遠心分離した。吸引によって、ペレットから全ての上清を除去し、ペレットを当座の水浴内で３７°まで温め、全てのさらなる操作用に、３７°で維持した。２ｍｌのプラスチック製ピペットを用いて、温ＰＥＧ  １５００（培地中、５０％ｖ／ｖ）１ｍｌを細胞ペレットに、穏やかに撹拌しながら、１分間にわたって添加した。ピペットの先端部を用いて、ペレットを撹拌し、水浴中に浸漬された状態を保った。撹拌を１分間継続した。同じピペットを用いて、温めた１ｍｌの無血清ＲＰＭＩを、穏やかに撹拌しながら、１分間にわたって徐々に添加した。同じピペットを用いて、温培地の別の１ｍｌを、穏やかに撹拌しながら、添加した。次いで、さらに２〜３分にわたって、同じピペットを用いて、温培地の別の７ｍｌを添加した。これにより、５０ｍｌ管内の体積を１０ｍｌにした。遠心分離を、４００×ｇで１０分間行った。１０ｍｌのプラスチック製ピペットを用いて、細胞ペレットを破壊し、２０％のＦＢＳで補充したＡＡＴ培地中に蒔いた。これは、公開されたＯｉ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８０）プロトコールから離れたものであった。融合を、３日目及び７日目に再供給し、１０日目にスクリーニングした。胸腺細胞を、融合中または後のクローニングのためのフィーダー細胞として用いてもよい。胸腺細胞を用いる場合、３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを殺処分し、１つの胸腺が、４×９６ウェルプレート用の十分なフィーダー細胞を提供する。胸腺はまた、冷凍機用バイアル瓶２つ当たり１つの胸腺の割合で凍結され得る（凍結混合物は、９０％のＦＢＳ及び１０％のＤＭＳＯである）。次いで、１つの冷凍機用バイアル瓶を、２枚の９６ウェルプレート毎に解凍した。
【００９９】
３日目までに、コロニーが、ウェルの底部で見えるようになった（１０〜２０個の細胞）。本明細書に記載される播種比が脾臓細胞の数に従うのであれば、１ウェル当たり３〜４個のコロニーが、７日目までに見えるようになるはずである。各ウェルをキャプチャーＥＬＩＳＡによってスクリーニングする場合、良好な融合で、全ての単一ウェルが、マウスＩｇＧに対して陽性になるはずである。１０日目または１１日目に、培地はかなり黄色であり、プレートを光にかざした場合にコロニーは肉眼で見ることができた。融合を決められた基準についてスクリーニングし、マスターウェル（９６ウェルプレート）から直接クローンした。これらのプレートは凍結され得るか、または細胞は凍結混合物（９０％のＦＢＳ及び１０％のＤＭＳＯ）中でマルチクラスタ管（Ｃｏｓｔａｒ  ４４１１）に移されて凍結され得る。マルチクラスタプレートは、−８０°で保管されても、または長期保存用にＬＮ２蒸気中で凍結されてもよい。
【０１００】
クローニング
陽性のハイブリドーマ培養ウェルを、以下のプロトコールを介してクローンした。２つの希釈物を作成した。初めの希釈物は、細胞が１×１０４個／ｍｌに希釈されるように作成した。次に、この細胞懸濁液１００μｌを、２０％のＦＢＳで補充したＲＰＭＩ  １Ｘ  ＡＡＴ中で１０ｍｌにさらに希釈し、９６ウェルプレート中に１００μｌ／ウェルで蒔き、１つの細胞／ウェルとした。胸腺フィーダー細胞は、１ウェル当たり１×１０５個で添加されてもよい（または、時折本発明者らが行ったように、ハイブリドーマクローニング因子［Ｂｉｏｖｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＃２１０００１］を１０％で使用する）。しかしながら、細胞を増殖因子に操られるようにさせることは、望ましくない。他の希釈法（限界希釈法）が用いられてもよいが、１ウェル当たり１つの細胞でのクローニングが、ほとんどの細胞系の範囲内に収まることを、本発明者らは見出している。できるだけ早いクローニングが望ましく、可能であれば、オリジナルのマスターウェル（９６ウェルプレート）から直接行われることが賢明である。融合プレートは、上清を吸引し、各ウェルに凍結混合物（９０％のＦＢＳ及び１０％のＤＭＳＯ）１００〜２００μｌを添加することによって、凍結され得る。次いで、プレートを−８０°の冷凍機に配置し、最大１年間保管することができる。
【０１０１】
アイソタイピング
ハイブリドーマ培養上清は、２つの方法：（１）キャプチャーＥＬＩＳＡ及び特異的ＨＲＰ結合二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）との反応、または（２）マウスモノクローナル抗体イソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ  ＃１−４９３−０２７）を用いることのうちの１つでアイソタイプ化され得る。キャプチャーＥＬＩＳＡプロトコールは、ウェルの底部にある細胞の代わりに、精製ヤギ抗マウス試薬が１〜２μｇ／ｍｌでコートされることを除けば、本発明者らが細胞について記載したものと同じである。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈは、それらが低交差反応性及び良好なバッチ間変動を示すために、用いられた。キャプチャー試薬を、１〜２μｇ／ｍｌで、または１／１０００でコートした場合、ウェルはブロックされ、ハイブリドーマ培養上清を、１００μｌ／ウェルで添加した。次いで、特異的ＨＲＰ結合二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ブロックされた状態で、１ウェル当たり１／２０００で、室温で３０分間添加した。次いで、プレートを洗浄し、ＨＲＰ−基質ＡＢＴＳを１００μｌ／ウェルで添加した。Ｒｏｃｈｅアイソストリップが使用された場合、プロゾーン効果（Ｈｏｆｆｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｗａｙｎｅｒ、１９９４；Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４５、３１６−３４７）が観察され、培養上清サンプルを、少なくとも１：１００、またはさらに１：１０００に希釈した。
【０１０２】
インテグリン同定のための免疫沈降法
細胞調製
細胞を培養し、トリプシン処理、剥離によって、または２ｍＭのＥＤＴＡで１０分間以下処理することによってのいずれかで、集密状態の前に採取した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した（以下のレシピを参照）。トリプシンを用いた場合、１回目の洗浄は、ダイズトリプシン阻害物質を０．５ｍｇ／ｍｌで含んだ。細胞密度を、ＰＢＳ（カチオン）中、５×１０６個／ｍｌに調整した。
【０１０３】
細胞のビオチニル化及び溶解
ビオチンの原液を、ジメチルスルホキシド中（ＤＭＳＯ、非スルホン酸塩型、Ｐｉｅｒｃｅ＃２１３４３）、または水中（スルホン酸塩型、Ｐｉｒｃｅ＃２１２１７）で、１０ｍｇ／ｍｌに、使用の直前に調製した。ビオチン原液を、細胞懸濁液に、１：１０００（１００μｇ／ｍｌ）の最終濃度で添加し、混合し、細胞の沈降を防止するために揺らしながら、室温で６０分間インキュベートした。細胞を、遊離アミンをブロックするための１００ｍＭのグリシンを加えたＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ単独で１回洗浄した。細胞ペレットを、ホルムアルデヒド固定黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）１０％懸濁液（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ７１５５）またはパンソルビン（Ｃａｌｂｉｏ−ｃｈｅｍ＃５０７８５８）の１００μｌ中に、バイアル瓶から直接、再懸濁させた。ピペット操作を用いて、細胞を黄色ブドウ状球菌とともに再懸濁させた。細胞１×１０７個当たりに１．０ｍｌの抽出（溶解）緩衝液を添加した。この溶解緩衝液は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（またはＮＰ−４０）、１ｍＭのＰＭＳＦ（無水エタノール中、２００ｍＭの原液）、１ｍＭのＮ−エチルマレミド（無水エタノール中、２００ｍＭの原液）、及びプロテアーゼ阻害物質としての１０μｇ／ｍｌのＳＢＴＩを含有した。細胞を、時々、撹拌しながら、４°にて３０〜４５分間溶解した。溶解緩衝液は、特にα４受容体を扱う場合、二価のカチオンを１ｍＭで含んでもよい。細胞溶解液を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって、透明化させた。これは、核及び細胞骨格成分を除去するために必須のステップである。溶解物を−８０°で凍結するか、または免疫沈降法用にプレクリアした。
【０１０４】
溶解物のプレクリアリング
１．７ｍｌ微小遠心管中の溶解物１ミリリットル当たり、パックされたフェツイン−アガロース（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｆ−３２５６）５００μｌを添加し、揺らしながら４°で１時間インキュベートし、４°にて１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清をデカントし、新鮮なフェツイン−アガロースを添加し、溶解物を再度プレクリアした。溶解物を、このような方法で、合計３回プレクリアした。最後のプレクリアは、必要であれば、一晩行うことができる。
【０１０５】
タンパク質Ａアガロースの調製及び保存
凍結乾燥したタンパク質Ａアガロース（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ−１４０６）１ｇを、４０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．４中で、０．０２％のアジドとともに、ミキサー上で、４°で（約４ｍｌに対し１ｇの膨潤）、一晩膨潤させた。このゲルを、遠心分離によってペレット状にし、上清をデカントし、ゲルを、再懸濁床によって洗浄し、ＰＢＳ／アジドで５０ｍｌにした。ゲルを３回洗浄した。最終の洗浄後に、ゲルを、ＰＢＳ／アジド中に、１０％（ｖ／ｖ）溶液で再懸濁し、暗所で４°で保管した。
【０１０６】
ウサギ抗マウスＩｇＧのタンパク質Ａ−アガロースへの結合
マウスモノクローナル抗体をタンパク質Ａビーズ上に捕捉するためにウサギ抗マウスＩｇＧを使用する理由は、ウサギＩｇＧが、タンパク質Ａに対して非常に高い親和性（マウスＩｇＧよりも高い）を有するためであった。ウサギＩｇＧはまた、タンパク質Ａ上の部位に対して、ウシＩｇＧの競合に打ち勝つ。ハイブリドーマ培養上清は、通常、最大１０％のＦＢＳを含有し、これは、転じて最大２００μｇ／ｍｌのウシＩｇＧを含有することができる。したがって、タンパク質Ａが、抗マウスへの予備結合の恩恵を受けずに直接ＩＰに用いられる場合には、タンパク質をビーズに結合するために、マウスＩｇＧのタンパク質Ａビーズへの十分な結合があり得ない。さらに、精製されたマウス抗体を使用しない限り、培養上清が用いられ、これは、１０％ＦＢＳを含有する可能性が高いために、タンパク質Ｇアガロースを用いることを推奨しない。低ＩｇＦＢＳが用いられない限り、ほとんどのＦＢＳバッチは、１００〜２００μｇ／ｍｌのウシＩｇＧを含有し、これは、マウスＩｇＧとの競合に、１０：１〜５０：１の比で打ち勝つ（ほとんどのマウスハイブリドーマ培養上清は、２〜１０μｇ／ｍｌの特異的抗体を含有するために）。したがって、タンパク質Ｇが用いられる場合、関心のタンパク質をＩＰするために、ビーズ上に十分なマウスＩｇＧが存在しない可能性が高い。ハイブリドーマ培養上清による最適な結果のために、ウサギ抗マウス血清または精製されたウサギＩｇＧを用いて、マウスＩｇＧをタンパク質Ａアガロースに捕捉させる。
【０１０７】
使用するウサギ抗マウス血清の量を計算するために、１０μｌのパックタンパク質Ａビーズに対して、１０μｌの血清または２μｇの精製ＩｇＧを使用した。次いで、ＩＰ反応１回当たり、１０μｌのパックウサギ抗マウスビーズを用いた。ウサギ抗マウス抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  カタログ番号６１−６５００）を、２ｍｌの脱イオン水中に溶解した。使用されたＩｇＧを分取し、−８０°で保管した。タンパク質Ａアガロース及びウサギ抗マウスを、４°で１〜２時間混合した。１ｍｌの１０％タンパク質Ａビーズに対して０．１ｍｌのウサギ抗マウスの割合を用いた。精製ウサギ抗マウス血清を用いた場合、体積を同一に保ちながら（１ｍｌの１０％タンパク質Ａビーズに対して０．１ｍｌのウサギ抗マウス）、ＩＰ反応１回当たり２μｇを用いた。ウサギ抗マウスのタンパク質Ａビーズへの結合を、細胞溶解物をプレクリアリングしながら行った。ウサギ抗マウス結合タンパク質Ａアガロースを、遠心分離によってペレット状にし、上清をデカントし、１×ＩＰ緩衝液で、総体積を最大１０ビーズ体積に持っていくことによって、ペレットを３回洗浄した（以下を参照）。最終洗浄後に、５０μｌのアリコートが、１０μｌのパックゲルを含有するように（すなわち、２０％の懸濁液）、ペレットを１×ＩＰ緩衝液中に再懸濁した。ウサギ抗マウスタンパク質Ａビーズもまた、溶解物をプレクリアするために用いられてもよい。
【０１０８】
試験マウス抗体含有上清のウサギ抗マウスＩｇＧタンパク質Ａアガロースへの結合
各１．７ｍｌの微小遠心管に、０．４５ｍｌの試験上清、０．０５ｍｌの１０×ＩＰ緩衝液（以下を参照）、及び０．０５ｍｌの２０％ウサギ抗マウスＩｇＧ結合タンパク質Ａアガロースを添加した。この管を、揺らしながら、４°で２時間（一晩も可能である）混合した。試験マウスＩｇＧ結合ウサギ抗マウスタンパク質Ａアガロースビーズを、遠心分離によって（最高の設定で微量遠心分離機を３〜５分間用いる）、ペレット状にした。上清を吸引し、５０μｌの最終容積を残し、１．０の１×ＩＰ緩衝液で１回洗浄した。
【０１０９】
細胞溶解物の免疫沈降法
洗浄し、ペレット状にしたＩＰビーズを含有する各管に、１００μｌのプレクリアした溶解物を添加し、ＩＰ管１本当たり１×ＩＰ緩衝液を添加することによって、最終体積を０．５ｍｌにした。溶解物をビーズと、ロッカー上で４°にて、少なくとも２時間インキュベートした。ビーズを遠心分離によって（最大の設定で微量遠心分離機を３〜５分間用いる）、ペレット状にし、上清を吸入し、０．０５ｍｌの最終体積を残し、ＩＰを、撹拌しながら緩衝液で４回洗浄して、各洗浄後に、ペレットを再懸濁させた。元の上清は、まったく別の抗体を用いるＩＰに溶解物を再利用するために確保されかつ循環してもよく、またこれらは、試験抗体の同一性を決定するための後続のプレクリア分析に用いられ得る。通常、特定の抗体が別の抗体をプレクリアすることができる（すなわち、それらが同一のタンパク質と反応する）ことを証明するために、完結までに３ラウンドのプレクリアを要した。最終洗浄及びペレット状にした後に、上清を約０．０２５ｍｌまで吸引し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析用に、０．０２５ｍｌの２×サンプル緩衝液（還元型または非還元型）中に再懸濁させた。
【０１１０】
ビーズからの免疫沈降材料の放出
上記からの管を５分間煮沸し、ビーズを撹拌し、本明細書に記載されるようにペレット状にした。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃縮用ゲルに移した。ＩＰについては、ＩＰ全体が、コームによって作られたウェルに適合するように、１．５ｍｍのゲルが使用されてもよい。数個のビーズも移される場合、これらは、ゲルがどのように泳動するかに影響を及ぼすことはない。本発明者らは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２分子量マーカーを、これらが良好に泳動しかつ良好に転写するために、使用した。ビオチン化され、かつ免疫沈降されたインテグリン受容体を検出するために、ウェスタンブロット分析を行った。
【０１１１】
実施例２
実験法
患者サンプル
ＡＬＬ患者からの骨髄及び末梢血サンプル（図２ｂ）を、各施設の施設内倫理委員会基準に従って取得した。細胞バンクに関するインフォームドコンセントを、全てのヒト被験者から得た。患者由来の（初代）白血病細胞を、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ−１６４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ内で３７℃にて維持した。初代白血病細胞を、前に述べたように（１０、１１）、ネズミＯＰ−９間質細胞上で、２０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したアルファ最小必須培地（ＭＥＭ）を用いて培養した。
【０１１２】
マイクロアレイ
６０のＡＬＬ症例のマイクロアレイデータの２つの遺伝子発現データセット（プレＢ  ＡＬＬのサブタイプ：Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、及びＭＬＬ遺伝子再構成の１５の患者症例）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ＡＬＬ３）（１２）及び１５の正常プレＢ細胞症例（１４のヒト臍帯血ＣＤ３４＋ｌｉｎ−及びＢ細胞前駆体サブセット）（ｈｔｔｐ：／／ｆｒａｎｋｌｉｎ．ｅｔ．ｔｕｄｅｌｆｔ．ｎｌ）（１３）を、ＢＲＢアレイツールを用いて、ＩＴＧＡ６発現について分析した。ＩＴＧＡ６過剰発現の倍数を、プレＢ  ＡＬＬ症例の各サブタイプにおける１５の患者サンプルの平均したシグナル強度の、１４の正常Ｂ細胞前駆体症例の平均したシグナル強度に対する比によって計算した。プローブセットの計算されたシグナル比は、Ｊａｖａ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗによって作成したヒートマップとして可視化した。
【０１１３】
初代ＡＬＬ細胞の接着
初代プレＢ  ＡＬＬ細胞を、抗機能的ＩＴＧＡ６抗体（Ｐ５Ｇ１０）または対照Ａｂ  ＩｇＧ２ａ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のいずれかで、３７℃で３０分間、予備処理し、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を、ヒトラミニンでコートした、またはネズミＯＰ９間質細胞で積層した２４ウェルプレート上に３連で蒔いた。一晩のインキュベーション後に、培地上清からピペット操作で取り出すことによって、上清中の浮遊細胞を除去した。プレートを１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。位相差オリンパスＩＸ７１顕微鏡を用いて、接着細胞を写真撮影した。上下のピペット操作によって、接着細胞を引き離し、顕微鏡下の観察によって、監視した。接着細胞計数を、死細胞のトリパンブルー色素排除法によって決定した。
【０１１４】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ  ＡＬＬについてのインビトロモデル及びインビボモデルならびに生物発光画像法
ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌマウス（Ｇｅｏｒｇｅｓ−Ｌａｂｏｕｅｓｓｅら）マウスからの骨髄細胞を採取し、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）でコートしたプレート中、１０ｎｇのＩＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で、ＢＣＲ−ＡＢＬ１によって、レトロウイルスを用いて形質転換した（Ｐｅａｒら）。マウスの骨髄由来の全てのＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換ＡＬＬ細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、２０％のウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＧｌｕｔａＭＡＸとともに、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ内で３７℃にて維持した。サイトカイン非依存性増殖の後に、ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ細胞を、空ＥＲＴ２またはＣｒｅＥＲＴ２で、レトロウイルスを用いて形質導入した。生物発光画像法については、前に述べたように（Ｐａｒｋら）、これらの細胞を、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）でコートした２４ウェルプレート中、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウィルスベクター（ｐＣＣＬ−ＭＮＤＵ３−ＬＵＣ）で、及びネオマイシン選択マーカーで、４８時間にわたって形質導入した。１μｇ／ｍｌのピューロマイシンによる選択の後に、１．０μＭのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって、ＶＬＡ６欠失をインビトロで誘発させた。ＩＴＧＡ６のインビボ欠失については、０．５×１０６個のルシフェラーゼ標識ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ  ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋空ＥＲＴ２またはＣｒｅＥＲＴ２  ＡＬＬ細胞を、尾静脈を介して、亜致死線量照射された（３５０ｃＧｙ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。ＩＴＧＡ６のインビボ欠失を、白血病細胞移入後３〜８日及び１６〜２０日に、経口強制栄養法（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）１回当たり１００ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンの連日投与によって誘発させた。マウスにおける白血病の進行の連続的監視を、前に述べたように（Ｐａｒｋら）、インビボＩＶＩＳ  １００生物発光／光学画像システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて、指示した時点で行った。ＰＢＳ中に溶解したＤ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、マウス１匹当たり２．５ｍｇの用量で、腹腔内注射し、その１５分後、生物発光シグナルを測定した。５％のイソフルランで、全身麻酔を誘導し、処理中に、鼻先端部を介して２％のイソフランを導入し続けた。マウスの体重減少及び他の白血病の症状を監視した。瀕死状態のマウスを殺処分し、白血病を死亡の原因として裏付けるために、組織を白血病細胞浸潤について分析した。全てのマウスの実験は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  ＩＡＣＵＣによる施設内承認を受けた。
【０１１５】
ウェスタンブロッティング
細胞を、１％のプロテアーゼ阻害物質カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）で補充したＭ−ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解させ、４％〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気泳動させた。ウェスタンブロットによるマウス及びヒトタンパク質の検出については、一次抗体を、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ免疫検出システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに使用した。βアクチンに対する抗体を、負荷対照（ＡＣ−１５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として用いた。アルカリ性ホスファターゼ結合二次抗体溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いて化学発光基質検出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び青色オートラジオグラフフィルム（ＧｅｎｅＭａｔｅ）への曝露を用いて、ブロットを可視化した。
【０１１６】
ＰＣＲ
タモキシフェン処理後６日目に、空ＥＲＴ２またはＣｒｅＥＲＴ２で形質導入されたＢＣＲ−ＡＢＬ−１＋ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）。
【０１１７】
フローサイトメトリー
アポトーシス分析用のアネキシンＶ及び７−ＡＡＤを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。抗体には、ヒト及びマウスのＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４９ｆならびに対応のアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）が含まれた。
【０１１８】
白血病芽細胞上のＩＴＧＡ６遺伝子発現とプレＢ  ＡＬＬ患者の臨床転帰との相関性
患者の臨床データ及び遺伝子発現マイクロアレイデータを、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＣＯＧ）臨床試験Ｐ９９０６（Ｋａｎｇら）からの２０７人の高リスクＢ前駆体ＡＬＬ患者のＧＥＯデータベース受託番号ＧＳＥ１１８７７から得た。患者を修正拡張Ｂｅｒｌｉｎ−Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ−Ｍｕｎｓｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＢＦＭ）レジメンで均一に処置し、非常に高リスクの特徴（ＢＣＲ−ＡＢＬ１または低二倍性）を有する患者を、この調査から除外した（Ｐａｒｋら）。大部分の患者（ｎ＝１９１）は、フローサイトメトリーによって評価されたＭＲＤを有し、導入療法の終わりに（２９日目）、０．０１％の閾値を用いて、症例を、ＭＲＤ陽性またはＭＲＤ陰性と定義した。ＭＲＤ＋及びＭＲＤ−患者群におけるＶＬＡ６発現の比較を、Ｒパッケージ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）でのウィルコクソン検定を用いて行った。
【０１１９】
インビトロ薬物検査
ＩＴＧＡ６欠失及び非欠失ネズミ細胞について、ネズミラミニンまたは照射されたネズミＯＰ−９上で培養した細胞を、ＶＤＬ（０．５ｎＭのビンクリスチン、５ｎＭのデキサメタゾン、及び０．０００５ＩＵのＬ−アスパラギナーゼ）で処理した。ヒトプレＢ  ＡＬＬについては、細胞を、ＶＤＬまたはニロチニブと組み合わせて、抗機能的抗ＩＴＧＡ６（ＣＤ４９ｆ）抗体のＰ５Ｇ１０またはＩｇＧ１対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であらかじめ処理した。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除法によって決定した。ヒトＡＬＬ細胞を、精製された抗機能的抗ＩＴＧＡ６  Ａｂまたは対照Ａｂ（ｅｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ）で３０分間ブロックし、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を、ヒトラミニンでコートした２４ウェルプレート上に３連で蒔き、ＶＤＬ（ＬＡＸ７Ｒ）またはイマチニブ（ＴＸＬ３、ＩＣＮ１）で２日間処理した。
【０１２０】
ＮＫ細胞の単離及びカルセイン−ＡＭ放出アッセイ法
初代ＡＬＬ細胞のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）を、前に述べたように、カルセイン−ＡＭ放出アッセイ法を用いて決定した。健康なドナーからの３１個のＮＫ細胞（９４％超のＣＤ５６＋ＣＤ３−）を、Ｎｏｒａ  Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ博士から寄贈していただいた。初代ＡＬＬ細胞を、５μＭのカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７Ｃにて３０分間標識し、次いで、Ｐ５Ｇ１０または対照ＡｂのＩｇＧ１及びＩｇＧ４で処理し、ＰＢＳで１回洗浄した。標的細胞（Ｔ）としての初代ＡＬＬ細胞を、エフェクタ細胞（Ｅ）としての単離されたＮＫ細胞と、５：１〜１５：１のＥ／Ｔ比で混合した。１時間のインキュベーション後に、細胞を黒色のＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６プレートに移し、４８５ｎｍの励起／５３５ｎｍの放射のフィルターセットを用いて、Ｆｉｌｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｆ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）で読み取った。特異的溶解％を、次の等式３１：特異的溶解％＝（実験放出平均値−同時放出平均値）／（最大放出平均値−同時放出平均値）×１００％によって、計算した。
【０１２１】
実施例３
正常プレＢ細胞よりもプレＢ  ＡＬＬ細胞においてインテグリンＩＴＧＡ６発現は高い
６０人のプレＢ  ＡＬＬ患者（１２）及び１５人の健康なドナー（１３）からの２つの比較遺伝子発現データを、初めに分析し、正常プレＢ細胞事例と比べて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１陽性患者において、顕著なＩＴＧＡ６の過剰発現を示した（図１Ａ）。ＩＴＧＡ６のこの差異的発現を確認するために、患者由来の（初代）プレＢ  ＡＬＬ事例を、フローサイトメトリーによって、ＩＴＧＡ６発現について、さらに分析した（図１Ｂ、Ｃ）。ＩＴＧＡ６は、プレＢ  ＡＬＬ中で発現し、発現レベルは、健康な骨髄ドナーのＣＤ１９＋プレＢ細胞よりも有意に高かった（図１Ｃ）。
【０１２２】
実施例４
診断時のＩＴＧＡ６の高発現レベルにより２９日目の陽性ＭＲＤが予測される
ＡＬＬ患者のインテグリンＩＴＧＡ６の有意性を決定するために、ＩＴＧＡ６の発現を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＣＯＧ）Ｐ９９０６臨床試験（Ｋａｎｇら）に従って均一に処置された１９１人の高リスク（ＢＣＲ−ＡＢＬ１−）プレＢ  ＡＬＬ患者における臨床転帰と相関させた。この分析は、ＩＴＧＡ６の高発現、ＩＴＧＡ６のアルファ鎖が、患者の臨床転帰の不良の予兆であり、微小残存病変を有する（ＭＲＤ＋、導入の２９日目に測定）ＡＬＬ患者が、ＭＲＤ事例よりも高いＩＴＧＡ６発現を有すること（２つのＩＴＧＡ６プローブセットについて、それぞれｐ＝０．０００５及びｐ＝０．００１）を明らかにした（図２Ａ、Ｂ）。
【０１２３】
実施例５
ＩＴＧＡ６欠失はＢＣＲ−ＡＢＬ１＋白血病において脱接着してアポトーシスを誘発する
これらのインテグリン受容体の機能を、遺伝的実験において研究するために、インテグリンＩＴＧＡ６の機能欠損についてのＢＣＲ−ＡＢＬ１＋マウスモデル（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）を開発した。ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ細胞を、ＢＣＲ−ＡＢＬ１（ｐ２１０）を用いて、腫瘍学的に形質転換し、リンパ球スキューイング条件下で培養した（図３Ａ）。プレＢ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）ＡＬＬの誘発を、フローサイトメトリーで確認した（図３Ｂ、左パネル）。引き続いての、ＣｒｅＥＲＴ２または空ＥＲＴ２による形質導入が、タモキシフェンのインビトロ添加によって、ＩＴＧＡ６破壊が誘発され得る（ＣｒｅＥＲＴ２）、白血病細胞を生成した（図３Ｂ）。インビトロでのインテグリンＩＴＧＡ６の条件的な破壊を、フローサイトメトリーによって（図３Ｂ、右パネル）及びＰＣＲ（図３Ｃ）によって、決定した。ＩＴＧＡ６欠失は、タモキシフェン処理後６日目までに、非欠失の対照と比べて、接着を有意に減少させた（７．６％±０．０８％対６８％±１．８％、ｐ＜０．０５）（図３Ｄ）。注目すべきは、タモキシフェンによる誘導性欠失が、数日間のプロセスであることである。（図４Ａ）。フローサイトメトリーによるアネキシンＶならびに７−ＡＡＤの分析（図４Ｂ）及びＢｒＤＵフローサイトメトリーによる細胞周期分析（図４Ｃ）によって決定されたように、ＩＴＧＡ６欠失白血病細胞のアポトーシス増加を観察した。ＩＴＧＡ６コンピテント細胞と比較された、ＩＴＧＡ６欠失細胞のウェスタンブロッティングは、タモキシフェン処理後３日目及び５日目の総ＦＡＫ、ＩＬＫ１における減少ならびに抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ２及びサバイビンの、タモキシフェン処理後５日目の減少を示した（図４Ｄ）。
【０１２４】
実施例６
ＩＴＧＡ６欠失はネズミ白血病をチロシンキナーゼ阻害に対して感受性にする
ＩＴＧＡ６の化学療法抵抗性における役割を決定するために、空ＥＲＴ２またはＣｒｅＥＲＴ２で形質導入されたＢＣＲ−ＡＢＬ−１＋ＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ細胞を、ＩＴＧＡ６欠失の導入のためにタモキシフェンで、同時にチロシンキナーゼ阻害物質のニロチニブ（０．０２及び０．２μＭ）で、または対照としての溶解剤ＤＭＳＯ（０．１％）で処理した。ニロチニブ（０．０２μＭ）による処理後３日目の白血球細胞の生存率によって裏付けられるように、ＩＴＧＡ６欠失は、空ＥＲＴ２細胞と比べて、ＣｒｅＥＲＴ２細胞のニロチニブに対する薬物抵抗性を著しく減少させ（１０．２％±０．１％対８３．７％±２．５％、ｐ＜０．０５）（図５）、これは、ＩＴＧＡ６欠失がネズミ白血病をチロシンキナーゼ阻害に対して感受性にすることを示している。
【０１２５】
実施例７
ＩＴＧＡ６欠失とチロシンキナーゼ阻害の組み合わせがネズミ白血病を根絶する
インビボで、ＶＬＡ６欠失が白血病の進行に及ぼす効果を決定するために、ＩＴＧＡ６コンピテントＩＴＧＡ６ｆｌ／ｆｌ  ＢＣＲ／ＡＢＬ１＋プレＢ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）ＣｒｅＥＲＴ２＋または対照で形質導入されたＡＬＬ細胞を、レンチウイルスを用いてルシフェラーゼ標識し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した（図６Ａ）。その後、３日目に、全ての動物への２サイクル、５日間のタモキシフェン投与によって、ＩＴＧＡ６欠失を誘発させた（図６Ｂ）。ＩＴＧＡ６のインビボ欠失は、ＩＴＧＡ６コンピテント対照と比べて、白血病細胞注入後２７日の生存期間中間値（ＭＳＴ）に対して白血病細胞注入後５４．５日のＭＳＴであることから、白血病の進行を遅延させた（ｐ＝０．００２１、ログランク検定）（図６Ｂ）。生物発光画像法もまた、ＩＴＧＡ６の場合のＩＴＧＡ６コンピテント細胞と比較して、ＩＴＧＡ６欠失白血病細胞の進行における有意な遅延を示した（図６Ａ）。ニロチニブと組み合わせたＩＴＧＡ６のインビボ欠失は、ＩＴＧＡ６コンピテント細胞の受容体が、ニロチニブ処理にもかかわらず、３９．５日のＭＳＴで死亡し、一方、ＩＴＧＡ６が破壊された白血病細胞のニロチニブ処理受容体が、生存していたために、白血病細胞移植後の生存を有意に延長させた（ｐ＝０．００１４）（図６Ｂ）。動物を殺処分したときに、ＩＴＧＡ６の欠失状態を決定し、ＩＴＧＡ６がほとんど完全に欠失されていたことを示した（図６Ｃ、Ｄ）。微小残存病変の分析のために、白血病細胞注入後１２７日目に、動物を殺処分した。この目的のために、白血病受容体動物の脾細胞及び骨髄細胞を単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＢＣＲ−ＡＢＬ１  ｍＲＮＡ発現について分析し（図６Ｅ）、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡ中のＢＣＲ−ＡＢＬ１発現を分析した（図６Ｆ）。このように、ＩＴＧＡ６欠失とチロシンキナーゼ阻害の組み合わせはネズミ白血病を根絶した。
【０１２６】
実施例８
インテグリンＩＴＧＡ６の遮断によってプレＢ  ＡＬＬ細胞が脱接着されかつ薬物抵抗性が克服される。
ＩＴＧＡ６が骨髄接着媒介化学療法抵抗性における中心的な接着分子であることを支援する予備データに基づいて、対リガンド（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｌｉｇａｎｄ）のラミニン−１有り及び無しで、リガンド結合をブロックすることが立証された（参考文献３０、Ｗａｙｎｅｒ  ＆  Ｈｏｆｆｓｔｒｏｍ）抗機能的ＩＴＧＡ６抗体（Ｐ５Ｇ１０）を用いて、４つの患者由来（初代）ＡＬＬ細胞（ＩＣＮ１、ＰＤＸ２、ＴＸＬ３、ＬＡＸ７Ｒ）中のインテグリンＩＴＧＡ６の遮断を評価した。ＩＴＧＡ６の遮断は、対照処理ＡＬＬ細胞と比べて、４つの全てのＡＬＬ事例をラミニンから脱接着し（図７Ａ、Ｂ）、接着のパーセントは、著しく異なった。Ｐ５Ｇ１０は、白血病細胞をフィブロネクチンプレートから脱接着せず、インテグリンアルファ６−ラミニン−１相互作用の特異的遮断を示している。ＩＴＧＡ６調節の化学療法抵抗性ＡＬＬに及ぼす効果を決定するために、ＰＤＸ３が、フィラデルフィア染色体陽性（ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）であるために、初代ＡＬＬ細胞（ＰＤＸ２）を、チロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）のニロチニブで処理した。初代ＡＬＬ細胞（ＬＡＸ７Ｒ、ＢＣＲ−ＡＢＬ陰性、ＳＦＯ２、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋）は、Ｐ５Ｇ１０による単剤処理後に生存率の減少を示し（図７Ｃ）、ＩＴＧＡ６遮断が化学療法またはＴＫＩと組み合わされる場合、ＴＫＩ単剤処理と比べて、感受性になった。重要なことに、初代ＡＬＬ細胞とネズミＯＰ９細胞との長期共培養において、ＶＤＬ（図７Ｄ、Ｅ）またはＮＴＢ（図７Ｆ、Ｇ）と組み合わせたアルファ６遮断は、ＶＤＬまたはＮＴＢ処理と比べて、ＡＬＬ細胞の生存率における著しい減少につながった。
【０１２７】
実施例９
ＩＴＧＡ６遮断は、白血病細胞を末梢血に動員させず、白血病細胞を化学療法に対して感受性にし、かつインビボで白血病を根絶する
ＩＴＧＡ６遮断が、白血病細胞の末梢血への動員を誘発するかどうかを決定するために、患者由来のＡＬＬ細胞、ＴＸＬ３及びＰＤＸ２（両方ともＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）、ならびにＬＡＸ７Ｒ（Ｇ〜Ｉ）（ＢＣＲ−ＡＢＬ陰性）を、ＮＳＧマウスに注射した。次いで、ヒトＣＤ４５のフローサイトメトリーによって、白血病の生着を決定した後、受容体マウスを、３０ｍｇ／ｋｇのＰ５Ｇ１０またはＰＢＳ対照で、静脈内注射または腹腔内注射によって処理した。末梢血（ＰＢ）中のヒトＣＤ４５＋及びＣＤ１９＋の％を、Ｐ５Ｇ１０（Ｔｘ）による動員処理前（前）、動員処理後（後）１日目及び３日目に、フローサイトメトリーによって分析した。全ての３つの事例で、Ｐ５Ｇ１０処理前（０日目）と比べて、または対照受容体マウスと比べて、末梢血中の白血病細胞の増加を観察しなかった（図８Ａ、Ｄ、Ｇ）。カプラン・マイヤー生存曲線の分析は、対照処理マウスと比べて、Ｐ５Ｇ１０単剤処理ＮＳＧマウスの延長増加を示した（図８Ｃ、Ｆ、Ｉ）（ｐ＜０．０５、ログランク検定、ｎ＝３／群）。
【０１２８】
次に、Ｐ５Ｇ１０が、インビボで白血病細胞の化学療法抵抗性を回復することができるかどうかを決定した。この目的のために、ルシフェラーゼ標識ＬＡＸ７Ｒ細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。白血病細胞注射後３日目に、担白血病細胞マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのブロッキングアルファ６  ｍＡｂ（Ｐ５Ｇ１０、非ヒト化ＩｇＧ１）または生理食塩水±ＶＤＬの毎週注射を４回施した（図９Ａ）。Ｐ５Ｇ１０で処理したマウスは、対照マウスと同様に生存した（ＰＢＳ：ＭＳＴ＝３９日対Ｐ５Ｇ１０：ＭＳＴ＝３１日、ｐ＝０．０５）。化学療法処理マウスは、４週間の処理が終わった直後に再発して、白血病で死亡した（ＭＳＴ＝７１日）（図９Ｂ）。これとは著しく対照的に、化学療法に加えてＰ５Ｇ１０で処理されたマウスは、無疾患状態で生存した（ＭＳＴ＝１８５日、ｐ＝０．００４）。組合せ処理された動物は、白血病細胞注射後１８５日目または１８６日目に、死亡または生存していることを確認し、ヒトＣＤ１９またはＣＤ４５の発現をフローサイトメトリーで分析し、これらは、観察されなかった（図９Ｃ）。
【０１２９】
参考文献
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【０１３０】
上述された種々の方法及び技術は、本出願を実行するために多数の方法を提供する。当然ながら、記載された全ての目的または利点が、本明細書に記載されるいずれか特定の実施形態に従って必ずしも達成され得るわけではないことを理解するべきである。したがって、例えば、当業者は、方法が、本明細書に教示される１つの利点または利点の群を達成もしくは最適化する方法で、本明細書に教示もしくは示唆される他の目的または利点を必ずしも達成することなく、実行され得ることを認識するであろう。様々な代案が、本明細書に記述されている。いくつかの好ましい実施形態は、１つの、別の、またはいくつかの特徴を具体的に包含するが、一方他のものは、１つの、別の、またはいくつかの特徴を具体的に除外し、一方さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有益な特徴を含めることによって、特定の特徴を緩和することが理解される。
【０１３１】
さらに、当業者は、異なる実施形態からの種々の特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記で論じられた種々の要素、特徴、及びステップ、ならびにそれぞれのこのような要素、特徴、またはステップに対する他の既知の等価物は、本明細書に記載された原理に従って方法を実行するために、当業者によって種々の組み合わせで採用され得る。種々の要素、特徴、及びステップの中でも、様々な実施形態において、そのいくつかは具体的に含まれ、その他は具体的に除外される。
【０１３２】
本出願は、ある特定の実施形態及び実施例に関して開示されてきたが、本出願の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態ならびに／もしくは用途及びその修正物ならびに等価物にまで拡大することが、当業者には理解されるであろう。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本出願の特定の実施形態を説明することに関して（特に、以下のある特定の特許請求に関して）用いられる用語「１つの（ａ）」ならびに「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」ならびに同様な言及は、単数及び複数の両方をカバーすると解釈され得る。本明細書の値の範囲の列挙は、範囲内に入る各々の別個の値を個別に指すための簡略表記法としての役割を果たすことを意図しているに過ぎない。本明細書に特段の表示がない限り、各々の個々の値は、これが個々に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特段の表示がない限り、そうでなければ、前後関係によって明らかに否定されない限り、任意の好適な順序で実施され得る。ありとあらゆる例の使用、または本明細書のある特定の実施形態に対して提供される例示の言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、本出願の理解を容易にすることを意図しているにすぎず、別途特許請求される本出願の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言語は、本出願の実行に必須な非特許請求要素を示すものと決して解釈されるべきではない。
【０１３４】
本出願の好ましい実施形態は、本出願を実行するために、本発明者らに既知の最適モードを含めて、本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態に対する変形は、前述の説明を読む際に、当業者には明らかになるであろう。当業者は、このような変形を適宜採用し、本出願が、本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実行され得る。したがって、本出願の多くの実施形態は、請求項に列挙された主題の全ての修正物及び等価物を、適用可能な法律によって許されるものとして包含する。さらに、上述の要素のその可能な全ての変形におけるいかなる組み合わせも、本明細書に特段表示されない限り、またはそうでなければ、前後関係によって明らかに否定されない限り、本出願によって包含される。
【０１３５】
本明細書で言及される、全ての特許、特許出願、特許出願の公報、及び、例えば、記事、書籍、明細書、広報、文書、事物等の他の資料は、それらに関連するいずれかの出願審査履歴、本文書と矛盾するか、もしくは一致しないそれらのうちのいずれか、または現在もしくは後に本文書と関連付けられる特許請求の最も幅広い範囲に関して限定的な影響を有し得る、それらのうちのいずれかを除いて、全ての目的のために、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。一例として、組み込まれた資料のいずれかに関連する、記述、定義、及び／または用語の使用と、本文書に関連する記述、定義、及び／または用語の使用との間に、いかなる不一致または矛盾も存在する場合、本文書の記述、定義、及び／または用語の使用を優先する。
【０１３６】
本明細書に開示される実施形態は、本出願の実施形態の原理の例証であることを理解するべきである。採用され得る他の修正物は、本出願の範囲内にあり得る。したがって、一例として、限定されるものではないが、本出願の実施形態の代替構成は、本明細書の教示に従って用いられ得る。結果的に、本出願の実施形態は、正確に表示かつ記載されたものに限定されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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